(57)【要約】自己免疫疾患を処置するための方法および組成物が本明細書において記載されている。本明細書に記載の方法の態様は、部分的に、ＣＸＣＲ６を標的とする薬剤を対象に投与することに関する。本明細書に記載の方法の別の態様は、部分的に、セルピンＢ１を阻害する薬剤を対象に投与することに関する。１つの態様では、自己免疫疾患を処置するための方法であって、ＣＸＣＲ６を標的とする薬剤を、自己免疫疾患を有する対象に投与するステップを含み、ＣＸＣＲ６を標的とすることは、ＣＸＣＲ６を発現する細胞またはその集団の枯渇をもたらす、方法が本明細書に記載されている。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫疾患を処置するための方法であって、ＣＸＣＲ６を標的とする薬剤を、自己免疫疾患を有する対象に投与するステップを含み、ＣＸＣＲ６を標的とすることは、ＣＸＣＲ６を発現する細胞またはその集団の枯渇をもたらす、方法。
【請求項２】
自己免疫疾患を処置するための方法であって、セルピンＢ１を阻害する薬剤を、自己免疫疾患を有する対象に投与するステップを含む方法。
【請求項３】
前記細胞集団を、適切な対照と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれより多く枯渇させる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞集団が、Ｔｈ１７細胞集団またはＴｈ１７由来細胞集団である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＣＸＣＲ６を標的とする前記薬剤が、少なくとも第２の薬剤に連結している、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、クローン病、ループス、セリアック病、シェーグレン症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性硬化症、強直性脊椎炎、１型糖尿病、円形脱毛症、血管炎、自己免疫性ブドウ膜炎、若年性特発性関節炎、および側頭動脈炎からなるリストから選択される、請求項１〜２に記載の方法。
【請求項７】
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症である、請求項１〜２に記載の方法。
【請求項８】
前記対象が、ヒトである、請求項１〜２に記載の方法。
【請求項９】
ＣＸＣＲ６を標的とする前記薬剤が、小分子、抗体、およびペプチドからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
セルピンＢ１を阻害する前記薬剤が、小分子、抗体、ペプチド、ゲノム編集系、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＲＮＡｉからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
抗体が、枯渇抗体である、請求項８〜９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＲＮＡｉが、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
セルピンＢ１を阻害することは、セルピンＢ１の発現レベルおよび／または活性を阻害することである、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
セルピンＢ１の発現レベルおよび／または活性が、適切な対照と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれより多く阻害される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
Ｔｈ１７細胞またはＴｈ１７由来細胞の集団を選択するための方法であって、候補細胞の集団においてＣＸＣＲ６のレベルを測定するステップと、ＣＸＣＲ６の発現を呈する細胞を選択するステップとを含む方法。
【請求項１６】
ＣＸＣＲ６のレベルが、参照レベルと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、またはそれより高い倍率で増加する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
自己免疫疾患を処置する方法であって、
ａ．適切な対照と比較して、対象由来の生体試料中のＣＸＣＲ６レベルの増加を示すアッセイの結果を受容するステップと、
ｂ．セルピンＢ１のレベルまたは活性を阻害する薬剤を前記対象に投与するステップと
を含む方法。
【請求項１８】
前記アッセイが、フローサイトメトリー、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮＡシーケンシング、または免疫組織化学である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象が、自己免疫疾患を有していると疑われているか、または自己免疫疾患を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
対象のＴｈ１７細胞によって発現されるセルピンＢ１レベルを検出するステップと、適切な対照と比較して、セルピンＢ１レベルの増加を示すアッセイの結果を受容するステップとをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象における、パーフォリン−Ａ、グランザイムＡ（ＧｚｍＡ）、ＧｚｍＣ、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）、ＩＬ−６、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、インターロイキン−２３受容体（ＩＬ−２３Ｒ）、ＩＬ−７ＲαおよびＩＬ−１Ｒ１、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、ＲＡＲ関連オーファン受容体Ｃ（Ｒｏｒｃ）、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のうちの１つまたは複数のレベルを検出するステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
脊髄における白血球の蓄積を検出するステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、クローン病、ループス、セリアック病、シェーグレン症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性硬化症、強直性脊椎炎、１型糖尿病、円形脱毛症、血管炎、自己免疫性ブドウ膜炎、若年性特発性関節炎、および側頭動脈炎からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記対象が、ヒトである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（ａ）のアッセイの結果を受容する前に、前記対象から生体試料を得る、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
前記生体試料が、滑液、脊髄液、組織、または血液である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
ＣＸＣＲ６を発現するＴ細胞の集団を減少させる方法であって、白血球におけるセルピンＢ１のレベルまたは活性を低下させる薬剤を投与するステップを含む方法。
【請求項２９】
白血球におけるセルピンＢ１のレベルまたは活性を前記低下させることが、セルピンＢ１の阻害剤を投与することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｔ細胞集団が、適切な対照と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれより多く枯渇される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｔ細胞集団が、Ｔｈ１７細胞集団またはＴｈ１７由来細胞集団である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
セルピンＢ１のレベルまたは活性を前記低下させることが、自己免疫疾患に対する処置を必要とする対象におけるものである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、クローン病、ループス、セリアック病、シェーグレン症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性硬化症、強直性脊椎炎、１型糖尿病、円形脱毛症、血管炎、自己免疫性ブドウ膜炎、若年性特発性関節炎、および側頭動脈炎からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記薬剤が、小分子、抗体、ペプチド、ゲノム編集系、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＲＮＡｉからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗体が、枯渇抗体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＲＮＡｉが、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
セルピンＢ１の前記レベルおよび／または活性が、適切な対照と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれより多く阻害される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
前記投与するステップが、炎症を阻害する、請求項２８に記載の方法。
【請求項４０】
前記投与するステップが、脊髄における白血球の蓄積を阻害する、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年４月９日に出願された米国仮出願第６２／６５４，８７９号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）による利益を主張し、この出願の内容は参照により全体として本明細書に組み込まれる。
技術分野
【０００２】
本発明の分野は、自己免疫疾患の処置に関する。
政府の支援
【０００３】
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）によって与えられた認可番号第Ｒ２１ＡＩ１１７４４０号の下、政府の支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
多発性硬化症（ＭＳ）は、絶縁ミエリン鞘が損傷を受ける／破壊される中枢神経系（ＣＮＳ）の慢性炎症性自己免疫疾患である。主に原因となる細胞は、ＣＮＳに浸潤する成熟したサイトカイン産生ミエリン指向性の自己免疫ＣＤ４細胞（ｅｘ−Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ１／Ｔｈ１７細胞、または病原性Ｔｈ１７細胞として多様に公知である）であり、ＣＮＳにおいて、これらは、神経の損傷および炎症の直接的な原因である浸潤した単球および単球由来細胞との相互増幅およびそれとの相互作用の活性化をさらに受ける。これまでに、ＭＳは健康な若年成人（ピーク年齢が２０〜３５歳）およびそれより低い程度で年長の小児に罹患し、米国では４００，０００人が罹患している。女性が男性より高い頻度で罹患している（有病率３：１）。この疾患は、複数のレベル：否定的および不確実という両方の予後による精神的ストレス、身体的苦痛、活動の制限および収入の喪失、ならびに家族と社会に対する経済的費用に関して破壊的である。ＭＳに対しては現在も処置は存在するが、ＭＳに対する治療法は存在しない。よって、再発寛解型ＭＳを含めた、ＭＳを処置することを目的とする新たな治療が必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書に記載の組成物および方法は、部分的に、ケモカイン受容体であるＣＸＣＲ６が、マウスモデル（病原性Ｔ細胞）において、ＩＦＮγおよびＧＭ−ＣＳＦを含む多発性炎症性サイトカインを産生し；急速に増殖し；かつ実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を誘発するＣＤ４エフェクター細胞上で発現し、かつＣＤ４エフェクター細胞に対するバイオマーカーであるという発見に関連する。
【０００６】
１つの態様では、自己免疫疾患を処置するための方法であって、ＣＸＣＲ６を標的とする薬剤を、自己免疫疾患を有する対象に投与するステップを含み、ＣＸＣＲ６を標的とすることは、ＣＸＣＲ６を発現する細胞またはその集団の枯渇をもたらす、方法が本明細書に記載されている。
【０００７】
別の態様では、自己免疫疾患を処置するための方法であって、セルピンＢ１を阻害する薬剤を、自己免疫疾患を有する対象に投与するステップを含む方法が本明細書に記載されている。
【０００８】
別の態様では、Ｔｈ１７細胞またはＴｈ１７由来細胞の集団を選択するための方法であって、候補細胞の集団においてＣＸＣＲ６のレベルを測定するステップと、ＣＸＣＲ６の発現を呈する細胞を選択するステップとを含む方法が本明細書に記載されている。
【０００９】
別の態様では、自己免疫疾患を処置する方法であって、適切な対照と比較して、対象由来の生体試料におけるＣＸＣＲ６レベルの増加を示すアッセイの結果を受容するステップと；セルピンＢ１のレベルまたは活性を阻害する薬剤を対象に投与するステップとを含む方法が本明細書に記載されている。
【００１０】
別の態様では、ＣＸＣＲ６を発現するＴ細胞の集団を減少させる方法であって、白血球におけるセルピンＢ１のレベルまたは活性を減少させる薬剤を投与するステップを含む方法が本明細書に記載されている。
【００１１】
任意の態様の１つの実施形態では、細胞集団を、適切な対照と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれより多く枯渇させる。
【００１２】
任意の態様の別の実施形態では、細胞集団は、Ｔｈ１７細胞集団またはＴｈ１７由来細胞集団である。
【００１３】
任意の態様の別の実施形態では、ＣＸＣＲ６を標的とする薬剤は、少なくとも第２の薬剤に連結している。
【００１４】
任意の態様の別の実施形態では、自己免疫疾患は、関節リウマチ、クローン病、ループス、セリアック病、シェーグレン症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性硬化症、強直性脊椎炎、１型糖尿病、円形脱毛症、血管炎、自己免疫性ブドウ膜炎、若年性特発性関節炎、および側頭動脈炎からなるリストから選択される。
【００１５】
任意の態様の別の実施形態では、自己免疫疾患は、多発性硬化症である。
【００１６】
任意の態様の別の実施形態では、対象は、ヒトである。
【００１７】
任意の態様の別の実施形態では、ＣＸＣＲ６を標的とする薬剤は、小分子、抗体、およびペプチドからなる群から選択される。
【００１８】
任意の態様の別の実施形態では、セルピンＢ１を阻害する薬剤は、小分子、抗体、ペプチド、ゲノム編集系、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＲＮＡｉからなる群から選択される。
【００１９】
任意の態様の別の実施形態では、抗体は、枯渇抗体である。
【００２０】
任意の態様の別の実施形態では、ＲＮＡｉは、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡである。
【００２１】
任意の態様の別の実施形態では、セルピンＢ１を阻害することは、セルピンＢ１の発現レベルおよび／または活性を阻害することである。
【００２２】
任意の態様の別の実施形態では、セルピンＢ１の発現レベルおよび／または活性は、適切な対照と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれより多く阻害される。
【００２３】
任意の態様の別の実施形態では、ＣＸＣＲ６のレベルは、参照レベルと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、またはそれより高い倍率で増加する。
【００２４】
任意の態様の別の実施形態では、アッセイは、フローサイトメトリー、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮＡシーケンシング、または免疫組織化学である。
【００２５】
任意の態様の別の実施形態では、対象は、自己免疫疾患を有していると疑われているか、または自己免疫疾患を有する。
【００２６】
任意の態様の別の実施形態では、方法は、対象のＴｈ１７細胞によって発現されるセルピンＢ１レベルを検出するステップと、適切な対照と比較して、セルピンＢ１レベルの増加を示すアッセイの結果を受容するステップとをさらに含む。
【００２７】
任意の態様の別の実施形態では、方法は、対象における、パーフォリン−Ａ、グランザイムＡ（ＧｚｍＡ）、ＧｚｍＣ、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）、ＩＬ−６、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、インターロイキン−２３受容体（ＩＬ−２３Ｒ）、ＩＬ−７ＲαおよびＩＬ−１Ｒ１、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、ＲＡＲ関連オーファン受容体Ｃ（Ｒｏｒｃ）、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のうちの１つまたは複数のレベルを検出するステップをさらに含む。
任意の態様の別の実施形態では、方法は、脊髄における白血球の蓄積を検出するステップをさらに含む
【００２８】
任意の態様の別の実施形態では、方法は、アッセイの結果を受容する前に、対象から生体試料を得るステップを含む。
【００２９】
任意の態様の別の実施形態では、生体試料は、滑液、脊髄液、組織、または血液である。
【００３０】
任意の態様の別の実施形態では、白血球におけるセルピンＢ１のレベルまたは活性を低下させることは、セルピンＢ１の阻害剤を投与することを含む。
【００３１】
任意の態様の別の実施形態では、Ｔ細胞集団は、適切な対照と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれより多く枯渇される。
【００３２】
任意の態様の別の実施形態では、Ｔ細胞集団は、Ｔｈ１７細胞集団またはＴｈ１７由来細胞集団である。
【００３３】
任意の態様の別の実施形態では、セルピンＢ１のレベルまたは活性を低下させることは、自己免疫疾患に対する処置を必要とする対象におけるものである。
【００３４】
任意の態様の別の実施形態では、薬剤は、小分子、抗体、ペプチド、ゲノム編集系、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＲＮＡｉからなる群から選択される。
【００３５】
任意の態様の別の実施形態では、セルピンＢ１のレベルおよび／または活性は、適切な対照と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれより多く阻害される。
【００３６】
任意の態様の別の実施形態では、投与するステップは、炎症を阻害する、請求項２８に記載の方法。
【００３７】
任意の態様の別の実施形態では、投与するステップは、脊髄における白血球の蓄積を阻害する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、Ｔｈ１７細胞のシグネチャー遺伝子（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅ）であるセルピンｂ１（Ｓｂ１）（プロテアーゼインヒビター）を示すデータを表す。図１Ａは、Ｔｈ１７細胞におけるセルピンＢ１のレベルを示すウエスタンブロットを示す。図１Ｂは、ＥＡＥマウス（１０日目）とナイーブマウス（０日目）のエフェクターＣＤ４細胞における指定した遺伝子のｍＲＮＡレベルを示す。
【００３９】
【図２−１】図２Ａおよび２Ｂは、セルピンｂ１（Ｓｂ１−／−）が全体的に欠失したマウスにおけるＥＡＥを示すデータを表す。図２Ａは、指定したマウスにおける疾患の特徴を示す。図２Ｂは、指定したマウスにおける脊髄細胞の特徴付けを示す。Ｓｂ１は、ＥＡＥの病原性に必須である。Ｓｂ１は、ＣＤ４細胞のＣＮＳ浸潤に必須である。
【図２−２】図２Ａおよび２Ｂは、セルピンｂ１（Ｓｂ１−／−）が全体的に欠失したマウスにおけるＥＡＥを示すデータを表す。図２Ａは、指定したマウスにおける疾患の特徴を示す。図２Ｂは、指定したマウスにおける脊髄細胞の特徴付けを示す。Ｓｂ１は、ＥＡＥの病原性に必須である。Ｓｂ１は、ＣＤ４細胞のＣＮＳ浸潤に必須である。
【００４０】
【図３−１】図３Ａおよび３Ｂは、Ｔ細胞においてＳｂ１が欠失した２つのモデルにおけるＥＡＥを示すデータを表す。図３Ａは、免疫した野生型マウスもしくはｓｂ１−／−マウスから回収したＣＤ４  Ｔ細胞のナイーブＷＴマウス（上）への、またはＷＴマウスから回収したＣＤ４  Ｔ細胞のナイーブＷＴマウスもしくはｓｂ１−／−マウスへの養子移入を示す。図３Ｂは、ナイーブ野生型マウスまたはｓｂ１−／−マウス由来のナイーブＣＤ４  Ｔ細胞をＲａｇ−／マウスへと移入し、次いで、Ｒａｇ−／マウスは免疫されて、ＥＡＥを誘発することを示す。疾患の軽快には、Ｔ細胞におけるセルピンｂ１の欠失のみが必要とされるか、またはＣＤ４  Ｔ細胞におけるセルピンｂ１のみが必要とされる。
【図３−２】同上。
【図３−３】同上。
【００４１】
【図４−１】図４Ａおよび４Ｂは、Ｓｂ１−／−：ＷＴ混合キメラマウスにおけるＥＡＥを示すデータを表す。図４Ａは、疾患の重症度を示す臨床スコアを示す。図４Ｂは、指定した時点でのＣＤ４細胞比、および様々な器官におけるＣＤ４細胞比を示す。Ｓｂ１−／−ＣＤ４細胞は、脊髄において優先的に枯渇する。
【図４−２】図４Ａおよび４Ｂは、Ｓｂ１−／−：ＷＴ混合キメラマウスにおけるＥＡＥを示すデータを表す。図４Ａは、疾患の重症度を示す臨床スコアを示す。図４Ｂは、指定した時点でのＣＤ４細胞比、および様々な器官におけるＣＤ４細胞比を示す。Ｓｂ１−／−ＣＤ４細胞は、脊髄において優先的に枯渇する。
【００４２】
【図５−１】図５Ａ〜５Ｉは、末梢リンパ系器官におけるＣＤ４細胞のＴｈ１７細胞への分化を示すデータを表す。図５Ａは、免疫細胞の定量を示す。図５Ｂは、Ｔ−エフェクターを示す。図５Ｃは、Ｔ調節細胞（Ｔｒｅｇ）を示す。図５Ｄは、ケモカイン受容体を示す。図５Ｅは、抗原リコールとＩＬ−１７の産生を示す。図５Ｆは、ＩＬ−１受容体を示す。図５Ｇは、代謝酵素を示す。図５Ｈは、インテグリンを示し、図５Ｉは、野生型マウス（黒色の棒）またはＳｂ１−／−マウス（灰色の棒）におけるサイトカインを示す。セルピンｂ１は、抗原特異的ＩＬ−１７＋ＣＤ４エフェクター細胞を生成することを必要としない。
【図５−２】同上。
【図５−３】同上。
【００４３】
【図６−１】図６Ａ〜６Ｃは、ＷＴマウスおよびＳｂ１−／−マウスにおけるＩＦＮγ＋エフェクターＣＤ４細胞およびＧＭ−ＣＳＦ＋エフェクターＣＤ４細胞を示すデータを表す。図６Ａは、ＰＭＡおよびイオノマイシン後の様々なサイトカイン産生ＣＤ４エフェクター細胞の定量を示す。図６Ｂは、抗原リコールの定量を示す。図６Ｃは、リアルタイムＰＣＲによって定量したリンパ節のエフェクターＣＤ４細胞におけるｍＲＮＡレベルを示す。灰色の記号はＳｂ１−／−を示し；黒色の記号はＷＴを示し、Ｓｂ１−／−マウスでは、−ＩＦＮγ＋およびＧＭ−ＣＳＦ＋エフェクターＣＤ４細胞が減少する。
【図６−２】同上。
【図６−３】同上。
【図６−４】同上。
【００４４】
【図７−１】図７Ａ〜７Ｅは、Ｓｂ１−／−ＣＤ４エフェクター細胞およびＷＴ  ＣＤ４エフェクター細胞において差示的に発現された遺伝子を同定するデータを表す。図７Ａは、指定したマウスのＣＤ４エフェクター細胞のＲＮＡシーケンシングによって決定した９６４９遺伝子の発現レベルを示す。図７Ｂは、ＷＴマウスと比較してＳｂ１−／−において２分の１またはそれより低く発現が低下した２１８遺伝子を示す。図７Ｃは、リアルタイムＰＣＲによって定量したｍＲＮＡレベルを示す。図７Ｄは、指定したマウスにおけるＣＤ４細胞におけるＣＸＣＲ６の発現を示す。図７Ｅは、脊髄に浸潤したＣＤ４細胞におけるＣＸＣＲ６の発現を示す。灰色の記号はＳｂ１−／−を示し；黒色の記号はＷＴを示す。ｓｂ１−／−マウスのＣＤ４エフェクター細胞に少数しか存在しない遺伝子は、ＩＦＮγ（Ｉｆｎｇ）およびＧＭ−ＣＳＦ（ｃｓｆ２）をコードし（予想通り）、また、細胞表面ＣＸＣＲ６（Ｃｘｃｒ６）、顆粒プロテアーゼグランザイム−Ｃ（Ｇｚｍｃ）および孔形成顆粒タンパク質パーフォリン（Ｐｆｒ１）もコードする。
【図７−２】同上。
【図７−３】同上。
【図７−４】同上。
【００４５】
【図８−１】図８Ａ〜８Ｆは、ＷＴ  ＣＤ４エフェクター細胞のＣＸＣＲ６を有するサブセットが複数のサイトカインを産生し、ＧｚｍｃおよびＰｒｆ１を発現し、かつ表面にＩＬ−１およびＩＬ−２３受容体を高度に発現することを示すデータを表す。図８Ａは、ＣＸＣＲ６が、ＥＡＥにおいて、ＩＬ−１７＋、ＧＭ−ＣＳＦ＋およびＩＦＮγ＋ＣＤ４エフェクター細胞を同定することを示す。図８Ｂは、ＥＡＥのＷＴマウスの指定したＣＤ４細胞の遺伝子発現を示す。図８Ｃは、ＥＡＥの指定したＣＤ４細胞の表面における活性化マーカーおよびサイトカイン受容体の発現を示す。図８Ｄ〜８Ｆは、グランザイムＣおよびパーフォリンが、ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞、特に、サイトカインＩＬ−１７および／またはＩＦＮγおよび／またはＧＭ−ＣＳＦのうちの２つまたはそれより多くを産生する細胞において高度に発現することを示す。免疫した野生型マウスを使用して、ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞の特性を特徴付けた。
【図８−２】同上。
【図８−３】同上。
【図８−４】同上。
【図８−５】同上。
【図８−６】同上。
【図８−７】同上。
【００４６】
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、セルピンＢ１がグランザイムＣを阻害することを示すデータを表す。図９Ａは、純粋なセルピンＢ１を純粋なグランザイムＣとインキュベートする際の不活性で、共有結合性のより分子量の大きな複合体の形成を示すタンパク質の金染色を示す。図９Ｂは、セルピンＢ１との共有結合複合体におけるグランザイムＣのウエスタンブロット解析を示す。標的プロテアーゼとの共有結合複合体の形成は、セルピンに特有の抑制機序である。
【００４７】
【図１０−１】図１０Ａ〜１０Ｆは、ＣＸＣＲ６が、抗原に応答して生成される「遅延過敏性」ＣＤ４細胞もマークし、複数のサイトカインを産生し、抗原を負荷した際に足蹠腫脹の拡大および誘導にセルピンＢ１を必要とすることを示すデータを表す。図１０Ａ〜１０Ｃは、ナイーブＷＴオボアルブミン（ＯＶＡ）感受性（ＯＴ−ＩＩ）細胞をナイーブＷＴマウスへと移入し、次いで、ＯＶＡペプチドで免疫したことを示す。図１０Ａは、指定した日に定量したＣＸＣＲ６＋ＯＴ−ＩＩ細胞を示す。図１０Ｂは、ＣＸＣＲ６＋ＯＴ−ＩＩ細胞が、ＥＡＥ系におけるように、複数のサイトカインを産生することを示す。図１０Ｃは、ＣＸＣＲ６＋ＯＴ−ＩＩ細胞が、ＥＡＥ系におけるように、グランザイムＣを高度に発現することを示す。図１０Ｄ〜１０Ｅは、ＷＴ細胞およびｓｂ１−／−ＯＴ−ＩＩ細胞をナイーブＷＴマウスへと移入し、次いで、ＯＶＡペプチドで免疫したことを示す。図１０Ｄは、１０日目に、ＯＴ−ＩＩ細胞とＣＸＣＲ６＋ＯＴ−ＩＩ細胞のすべてを定量したことを示す。図１０Ｅは、７日目に、指定したマウスの足蹠にＯＶＡペプチドを負荷し、足蹠腫脹を２４時間後に定量したことを示す。図１０Ｆは、ＷＴマウスおよびｓｂ１−／−マウスを、ＥＡＥを誘発する方法によってＭＯＧペプチドで免疫したことを示す。６日目に、マウスの足蹠にＭＯＧペプチドを負荷し、足蹠腫脹を指定した時間に測定した。図１０Ｄ〜Ｆの灰色の記号はＳｂ１−／−を示し；黒色の記号はＷＴを示す。
【図１０−２】同上。
【図１０−３】同上。
【００４８】
【図１１−１】図１１Ａ〜１１Ｇは、ＥＡＥにおいて、ＣＸＣＲ６＋ＷＴ  ＣＤ４エフェクター細胞とＳｂ１−／−ＣＤ４エフェクター細胞の増殖のマーカーおよび生存のマーカーを示すデータを表す。図１１Ａは、指定したＣＤ４細胞のサブセットにおけるＫｉ−６７標識を示す。図１１Ｂは、指定したＣＤ４細胞のＢｒｄＵのｉｎ  ｖｉｖｏでの標識の定量を示す。図１１Ｃは、ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞におけるＢｒｄＵの取り込みの動的解析を示す。ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞の増殖は頑健であり、ＷＴ細胞とｓｂ１−／−細胞との間で異ならない。しかし、ｓｂ１−／−ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞の細胞死は増加した。図１１Ｄは、指定したＣＤ４細胞のアネキシンＶ染色の定量を示す。図１１Ｅは、活性カスパーゼ３を発現する指定した細胞の定量を示す。図１１Ｆ〜１１Ｇは、指定したマウスにおいてミトコンドリアが損傷した細胞の定量を示す。Ｓｂ１は、ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４エフェクター細胞の増殖に必要ではない。しかし、ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４エフェクター細胞の細胞死は、ｓｂ１−／−マウスにおいて増加している。灰色の記号はＳｂ１−／−を示し；黒色の記号はＷＴを示す。
【図１１−２】同上。
【図１１−３】同上。
【図１１−４】同上。
【図１１−５】同上。
【図１１−６】同上。
【００４９】
【図１２−１】図１２Ａ〜１２Ｄは、抗ＣＸＣＲ６抗体による処置がＥＡＥを防止することを示すデータを表す。ＷＴマウスをＥＡＥについて誘発し、次いで、５、７、９および１２日目にアイソタイプ対照抗体（８匹のマウス）または抗マウスＣＸＣＲ６抗体（７匹のマウス）（注射１回当たりマウス１匹につき３００μｇ）で処置した。図１２Ａは、平均臨床スコアを示す。図１２Ｂは、平均体重を示す。図１２Ｃは、罹患したマウスの出現頻度を示す。図１２Ｄは、２７日目に、脊髄に浸潤したリンパ球および骨髄性細胞を示す。
【図１２−２】同上。
【００５０】
【図１３−１】図１３Ａおよび１３Ｂは、抗ＣＸＣＲ６抗体による処置が、ＥＡＥに対する処置として有効であることを示すデータを表す。図１３Ａは、ＷＴマウスをＥＡＥについて誘発したことを示す。アイソタイプ対照抗体（処置１回当たり４００μｇ）（１１匹のマウス）または抗ＣＸＣＲ６抗体（８匹のマウス）による処置を、疾患が最初に検出された日（１１〜１５日目；初期スコア１〜３）に、個々のマウスに対して開始した。２および４日後に、次の処置を投与した（矢印）。（図１３Ａ、上のパネル）平均臨床スコア。（図１３Ａ、下のパネル）体重。図１３Ｂは、６匹のＷＴマウスをＥＡＥについて誘発し、１０日目に、それぞれ３匹のマウスを４００μｇのアイソタイプ対照または抗ＣＸＣＲ６抗体で処置し；１１日目にマウスを屠殺したことを示す。（図１３Ｂ、上のパネル）リンパ節のＣＤ４細胞によるサイトカインＩＬ−１７およびＧＭ−ＣＳＦの産生を測定する代表的フローサイトメトリー。（図１３Ｂ、下のパネル）。これらのサイトカインの産生に対する累積結果。サイトカイン産生細胞の減少は、抗ＣＸＣＲ６抗体による処置がサイトカイン産生ＣＸＣＲ６＋病原性ＣＤ４細胞を枯渇させることを示す。
【図１３−２】同上。
【００５１】
【図１４−１】図１４Ａ〜１４Ｃは、ヒトＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞が関節リウマチを有する患者の炎症性滑液中に存在し、これらの細胞がマウスのＥＡＥ系におけるように複数のサイトカインを産生することを示すデータを表す。図１４Ａは、自己免疫障害における病原性ＣＤ４細胞に関するバックグラウンド情報を示す。図１４Ｂ〜１４Ｃは、ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞の出現頻度ならびにそれらのＩＬ−１７、ＩＦＮγおよびＧＭ−ＣＳＦの産生を含む、関節リウマチを有する２名の患者の滑液細胞の解析を示す。
【図１４−２】同上。
【図１４−３】同上。
【００５２】
【図１５】図１５は、ＥＡＥデータに基づくＣＸＣＲ６＋細胞の生成を示す概略図を表す。ｓｂ１が、プロテアーゼ（マウスのグランザイムＣのヒト等価物であり得る）を阻害することによって、頑健に増殖するＣＸＣＲ６＋細胞の細胞死を妨げ、それによって、得られる病原性ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞の集団のサイズを決定する調節ステップが示される。
【００５３】
【図１６−１】図１６Ａ〜１６Ｅは、セルピンｂ１ａ（Ｓｂ１）がＥＡＥにおいてＴＨ細胞に高度に発現されることを示す。図１６Ａは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化し、ウエスタンブロットによって解析されたｗｔ  Ｔ細胞のサブセットにおけるセルピンＢ１の発現を示す。データは、５回の実験の代表例である。図１６Ｂは、Ｓｂ１、ＲｏｒｃおよびＩｌ１７ａが、ＥＡＥの発症時にエフェクターＣＤ４細胞において発現されることを示す。ナイーブマウス（０日目）および疾患発症時のＭＯＧ／ＣＦＡ誘発ＥＡＥマウス（１０日目）のリンパ節から単離されたＣＤ４４＋（エフェクター）ＣＤ４細胞に関するｑＲＴ−ＰＣＲによって、転写物を定量した。データは、９匹のナイーブマウスと９匹のＥＡＥマウスからプールされた細胞に関する２回の実験の代表例である。図１６Ｃ〜Ｄは、ＲＮＡ  Ｓｅｑ解析を示す。混合キメラマウス（ＣＤ４５．１  ｗｔ／ＣＤ４５．２  Ｉｌ２３ｒΔＣＤ４）をＭＯＧ／ＣＦＡで免疫し、ＥＡＥを誘発した。１３日目に、エフェクター（ＣＤ４４＋）ＣＤ４細胞を流入領域リンパ節から選別した。図１６Ｃは、ｗｔおよびＩｌ２３ｒΔＣＤ４エフェクター（ＣＤ４４＋）ＣＤ４細胞における遺伝子発現を示す。データは、１回の反復当たり３〜４匹のキメラマウスによる５回の反復の平均である。図１６Ｄは、同一性の上位のヒットを示す。図１６Ｅは、ＩＬ−２３による処置が、Ｔｈ１７細胞におけるＳｂ１、ＲｏｒｃおよびＩｌ１７ａの発現を維持することを示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化したＴＨ１７細胞をＩＬ−２中で２日間維持し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８および指定したサイトカインで２４時間再刺激し、次いで、ｑＲＴ−ＰＣＲで解析した。データは、３回の実験の代表例である。
【図１６−２】同上。
【図１６−３】同上。
【図１６−４】同上。
【００５４】
【図１７−１】図１７Ａ〜１７Ｇは、ＣＤ４細胞によるｓｂ１の自発性欠損によってＥＡＥが軽快されることを示す。（Ａ〜Ｃ）ｗｔマウスおよびｓｂ１−／−マウスをＭＯＧ／ＣＦＡで免疫し、ＥＡＥを誘発した。図１７Ａは、ｗｔマウス（ｎ＝１３）およびｓｂ１−／−マウス（ｎ＝１４）の平均臨床スコア（左）および体重（右）を示す。同じパターンで実験を５回より多く繰り返した。図１７Ｂは、フローサイトメトリーによって解析した、１０日目の脊髄浸潤物を示す。５回の実験のｎ＝４〜５のマウスのそれぞれの遺伝子型の代表例。図１７Ｃは、ｑＲＴ−ＰＣＲによって解析した脊髄浸潤物の相対的遺伝子発現を示す。データは、それぞれ、遺伝子型毎に２〜３匹のマウスからプールした細胞に関する、４つの生物学的反復の平均を表す。図１７Ｄは、養子移入ＥＡＥを示す。ＭＯＧで免疫したマウスからのｗｔ  Ｔ細胞またはｓｂ１−／−Ｔ細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大し、ナイーブｗｔレシピエントまたはｓｂ１−／−レシピエントに移入した。遺伝子型毎に６匹のマウスに対する平均臨床スコア。図１７Ｅは、ナイーブＣＤ４細胞の移入によるＥＡＥを示す。ｗｔナイーブＣＤ４細胞またはｓｂ１−／−ナイーブＣＤ４細胞をＲａｇ１／−マウスに移入し、次いで、ＭＯＧで免疫してＥＡＥを誘発した。遺伝子型毎に６匹のマウスに対する平均臨床スコア。図１７Ｆは、ＭＯＧによる免疫後６日目のＭＯＧまたはビヒクルによる足蹠への負荷に対するｗｔマウスおよびｓｂ１−／−マウスのＤＴＨ応答を示す。図１７Ｇは、キメラマウスの活動型ＥＡＥにおけるｗｔ  ＣＤ４細胞に対するｓｂ１−／−ＣＤ４細胞の比を示す。記号は個々のマウスを示す。データは、２回の実験（図１７Ｄ、１７Ｆ、および１７Ｇ）または３回の実験（図１７Ｅ）の代表例である。エラーバーは±ＳＥＭを示す。＊ｐ＜０．０５；ステューデントのｔ検定による＊＊ｐ＜０．０１（図１７Ｃおよび２Ｆ）；一元ＡＮＯＶＡによる＊＊＊ｐ＜０．００１（図１７Ｇ）。
【図１７−２】同上。
【図１７−３】同上。
【図１７−４】同上。
【図１７−５】同上。
【００５５】
【図１８−１】図１８Ａ〜１８Ｆは、ｓｂ１−／−マウスのリンパ節におけるＩＦＮγ＋ＣＤ４細胞およびＧＭ−ＣＳＦ＋ＣＤ４細胞の出現頻度の低下によって、病原性ＴＨ細胞のシグネチャー遺伝子に対する鍵が提供されたことを示す。図１８Ａ〜３Ｂは、ＥＡＥの発症時のｓｂ１−／−  ＩＦＮγ＋およびＧＭ−ＣＳＦ＋ＣＤ４細胞の出現頻度の低下を示す。図１８Ａは、ｍＲＮＡを示す。ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定したエフェクター（ＣＤ４４＋）ＣＤ４細胞の相対的遺伝子発現。示したデータは、３回の実験において、遺伝子型毎に３〜５匹のマウスのプールした細胞に関する平均±ＳＥＭである。図１８Ｂは、ｅｘ  ｖｉｖｏでのＰ＋Ｉによる刺激後に、フローサイトメトリーによって解析したサイトカイン産生ＣＤ４細胞を示す。（左）ＬＮ  ＣＤ４細胞の代表的な等高線プロット。（右）ＬＮ  ＣＤ４細胞および脊髄ＣＤ４細胞に関する累積出現頻度。遺伝子型毎に５匹のマウスに関するデータは、５回の実験の代表例である。図１８Ｃは、ＲＮＡ  Ｓｅｑ解析を示す。ｗｔエフェクター（ＣＤ４４＋）ＣＤ４細胞およびｓｂ１−／−ＬＮエフェクター（ＣＤ４４＋）ＣＤ４細胞のＲＮＡを疾患発症時に回収し、Ｐ＋Ｉと共にインキュベートした。発現レベル（ＦＰＫＭ）が１．０を超える９，６５０遺伝子を示す（左および真中）。真中のパネルの破線より上の領域は、ｗｔに対してｓｂ１−／−の発現が２．０分の１未満に低下した２５８遺伝子を示す。検証した遺伝子に関する同一性を示す（右パネル）。図１８Ｄは、ｓｂ１−／−ＬＮエフェクターＣＤ４細胞において、Ｐｒｆ１、Ｇｚｍａ、Ｇｚｍｃ、ＩｆｎｇおよびＣｓｆ２の発現が低下した、ｑＲＴ−ＰＣＲによる検証を示す。示したデータは、Ｐ＋Ｉによる刺激後に解析した２つの細胞単離株の代表例である。図１８Ｅ〜１８Ｆは、ＭＯＧで免疫したｗｔマウスおよびｓｂ１−／−マウスのＣＤ４細胞におけるＣＸＣＲ６の発現を示す。０日目（ナイーブマウス）、７日目（疾患前）および１０日目（疾患発症）のリンパ節（図１８Ｅ）ならびに１４日目（疾患ピーク）の脊髄（図１８Ｆ）に関する、代表的プロット（左）および平均出現頻度（真中）および絶対細胞数（右）が示される。実験毎の１時点当たり３〜６匹のマウスに関するデータは、２回の実験の代表例である。（図１８Ｆ）の記号は個々のマウスを示し；横線は平均を示す。エラーバーは±ＳＥＭを表す。ステューデントのｔ検定による＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１８−２】同上。
【図１８−３】同上。
【図１８−４】同上。
【図１８−５】同上。
【図１８−６】同上。
【図１８−７】同上。
【００５６】
【図１９−１】図１９Ａ〜１９Ｆは、病原性ＴＨ細胞が、ＣＸＣＲ６によってマークされ、複数のサイトカインを産生し、ＧｚｍＣおよびパーフォリンを発現することを示す。ＭＯＧで免疫したｗｔマウスをＥＡＥの発症時に屠殺し、リンパ節の細胞を解析した。図１９Ａ〜４Ｂは、サイトカイン産生ＣＤ４細胞におけるＣＸＣＲ６の発現を示す。図１９Ａは、代表的なドットプロットを示す。図１９Ｂは、３回の実験からの累積出現頻度を示す。記号は個々のマウスを示し；横棒は平均を示す。図１９Ｃは、フローサイトメトリーによって解析したナイーブエフェクターＣＤ４細胞、ＣＸＣＲ６ｎｅｇ−エフェクターＣＤ４細胞およびＣＸＣＲ６＋エフェクターＣＤ４細胞におけるＧｚｍＣおよびＧｚｍＢを示す。４回の実験の代表的データを示す。図１９Ｄは、細胞内染色およびフローサイトメトリーによって検出したサイトカイン産生細胞におけるパーフォリンの発現を示す。記号は個々のマウスを示し；横棒は平均を示す。データは、２回の実験の代表例である。図１９Ｅは、ＲＴ−ｑＰＣＲによって解析したＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ６ｎｅｇ−エフェクターＣＤ４細胞およびＣＸＣＲ６＋エフェクターＣＤ４細胞の相対的遺伝子発現を示し、データは２回の実験の代表例である。図１９Ｆは、ＣＸＣＲ６ｎｅｇ  ＣＤ４エフェクター細胞およびＣＸＣＲ６＋ＣＤ４エフェクター細胞に関するＩＬ−７Ｒａ、ＩＬ−２３Ｒ、ＩＬ−１Ｒ１およびＣＤ６９のヒストグラムを示す。示したデータは、実験毎に５〜９匹のｗｔマウス（5-9  mice  wt  mice）のプールした細胞に関するものであり、２回の実験の代表例である。エラーバーは±ＳＥＭを表す。
【図１９−２】同上。
【図１９−３】同上。
【図１９−４】同上。
【図１９−５】同上。
【図１９−６】同上。
【００５７】
【図２０−１】図２０Ａ〜２０Ｅは、抗ＣＸＣＲ６処置によってＥＡＥが防止され、確立した疾患が逆転されることを示す。図２０Ａ〜５Ｂは、疾患防止プロトコールを示す。ｗｔマウスをＭＯＧで免疫し、５日目（疾患前）、７、９および１２日目（矢印）に抗マウスＣＸＣＲ６  ｍＡｂまたはアイソタイプ対照で処置した（３００ｊｉｇ  ｉ．ｐ．）。図２０Ａは臨床スコア（平均±ＳＥＭ）を示し、図２０Ｂは疾患の頻度を示す（１群当たりｎ＝８）。アイソタイプで処置した群の１匹の罹患したマウスは、２２日目に自然に回復した。図２０Ｃ〜２０Ｅは、治療用プロトコールを示す。ｗｔマウスをＭＯＧで免疫し、疾患が最初に検出された際に（臨床スコア１〜３）、マウスを無作為に割り当て、その日ならびに２日および４日後に（矢印）、抗ＣＸＣＲ６抗体（ｎ＝８）またはアイソタイプ対照（ｎ＝１１）のいずれかを受けさせた（４００ｊｉｇ  ｉ．ｐ．）。図２０Ｃは臨床スコアを示し、図２０Ｄは体重を示す。データは、平均±ＳＥＭである。図２０Ｅは、組織学を示す。治療処置の１１日目に代表的な脊髄切片をヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。組織病理学スコア（炎症、変性）を右に示す。ビデオ１〜５（実施例３）は、ｍＡｂで処置したマウスおよびアイソタイプ対照マウスの挙動を示す。
【図２０−２】同上。
【図２０−３】同上。
【００５８】
【図２１−１】図２１Ａ〜２１Ｅは、ＯＴ−ＩＩ細胞におけるＣＸＣＲ６の発現を示す。（Ａ〜Ｃ）ＯＴ−ＩＩ細胞移入研究。ナイーブＯＴ−ＩＩ細胞（ＣＤ４５．２）をナイーブコンジェニックＣＤ４５．１マウスへと移入し、続いて、ＯＶＡで免疫した。図２１Ａは、４日目と１２日目にフローサイトメトリーによって解析した、ＬＮにおけるＣＸＣＲ６＋ＯＴ−ＩＩ細胞を示す。左：代表的な等高線プロット；右：細胞の出現頻度。図２１Ｂは、１２日目のＣＸＣＲ６ｎｅｇ  ＯＴ−ＩＩ細胞およびＣＸＣＲ６＋ＯＴ−ＩＩ細胞におけるＩＬ−１７およびＧＭ−ＣＳＦの発現を示す。図２１Ｃは、１２日目のＬＮの  ＣＸＣＲ６ｎｅｇ  ＯＴ−ＩＩ細胞およびＣＸＣＲ６＋ＯＴ−ＩＩ細胞におけるＧｚｍＣの発現のヒストグラムを示す。図２１Ｄ〜６Ｅは、ｓｂ１−／−  ＯＴ−ＩＩ移入研究を示す。ナイーブｗｔ  ＯＴ−ＩＩ細胞およびｓｂ１−／−ＯＴ−ＩＩ細胞をパネルＡにおけるように別々に移入し、マウスをＯＶＡで免疫した。図２１Ｄは、フローサイトメトリーによって解析した、１０日目のＬＮにおけるＣＸＣＲ６を発現するｗｔ  ＯＴ−ＩＩ細胞およびｓｂ１−／−  ＯＴ−ＩＩ細胞を示す。（左）代表的な等高線プロット；（右）平均細胞出現頻度。図２１Ｅは、ＯＶＡ誘発ＤＴＨを示す。ｗｔ  ＯＴ−ＩＩ細胞またはｓｂ１−／−  ＯＴ−ＩＩ細胞を移入し、ＯＶＡで免疫し、かつ足蹠にＯＶＡペプチドを負荷したマウスの足蹠腫脹。負荷の２４時間後に、足蹠腫脹を測定した。記号は個々のマウスを表す。データは、３回の実験（図２１Ａ）および２回の実験（図２１Ｂ〜２１Ｅ）の代表例である。ステューデントのｔ検定による＊ｐ＜０．０５。
【図２１−２】同上。
【図２１−３】同上。
【図２１−４】同上。
【００５９】
【図２２−１】図２２Ａ〜２２Ｄは、炎症性関節炎を有する患者の滑液（ＳＦ）のＣＤ４細胞におけるＣＸＣＲ６の発現を示す。図２２Ａは、２名の患者のＳＦにおけるＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞に関する代表的ヒストグラムを示す。図２２Ｂは、９名の患者のＳＦおよび２名の健康なドナーのＰＢＭＣにおけるＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞の累積出現頻度を示す。図２２Ｃは、炎症性関節炎の患者の滑液のＣＤ４細胞におけるサイトカインおよびＣＸＣＲ６の共発現を示す代表的なＦＡＣＳプロットを示す。細胞をＰ＋Ｉと共に４時間インキュベートした。図２２Ｄは、ＣＸＣＲ６＋細胞および異なるサイトカイン発現細胞の出現頻度のピアソンの相関係数を示す。サイトカイン産生細胞のＰ＋ＩとのインキュベーションによりＣＸＣＲ６が下方調節されるため、別々のアッセイの結果を使用して、相関係数を決定した。記号は個々の患者を示す。ステューデントのｔ検定による＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１。
【図２２−２】同上。
【図２２−３】同上。
【００６０】
【図２３−１】図２３Ａ〜２３Ｇは、Ｓｂ１−／−マウスのＣＸＣＲ６＋ＴＨ細胞が、頑健な増殖の間の細胞死の増強の対象になることを示す。ｗｔマウスおよびｓｂ１−／−マウスをＭＯＧ／ＣＦＡで免疫し、ＥＡＥを誘発した。図２３Ａは、６時間または２時間または１時間のｉｎ  ｖｉｖｏ標識後に、フローサイトメトリーによって定量したＢｒｄＵ＋ＣＤ４細胞の出現頻度を示す。データは、２〜３回の実験の代表例である。記号は個々のマウスを表し；横線は平均を表す。図２３Ｂは、疾患発症時に新たに単離したＬＮ  ＣＤ４細胞のＫｉ−６７  ｍＡｂ染色を示す。示したヒストグラムは、２回の実験における遺伝子型毎の７匹のマウスの代表例である。図２３Ｃは、疾患発症時に新たに単離したＬＮ  ＣＤ４細胞の活性カスパーゼ−３染色を示す。図２３Ｄは、サイトカイン産生細胞の活性化したカスパーゼ−３を示す。ＬＮ細胞をＰ＋Ｉで２．５時間刺激し、サイトカインおよび活性化したカスパーゼ−３に関して染色した。示したデータは、２〜３回の実験の代表例である。図２３Ｅは、ミトコンドリア色素ＤｉＯＣ６の貯留によって測定した（ΔΨｍ）を示す。代表的なヒストグラムを示す。図２３Ｆは、ミトコンドリア色素ＪＣ−１で測定した（ΔΨｍ）を示す。インタクトなミトコンドリアを有する細胞はＪＣ−１を保持し、赤色蛍光を発する；破壊されたミトコンドリアを有する細胞は緑色蛍光を発する。（図２３Ｅおよび２３Ｆ）のデータはそれぞれ、遺伝子型毎に５匹のマウスを含む２回の実験の代表例である。図２３Ｇは、組換えヒトセルピンＢ１（ｒｈＳＢ１）が、ｒＧｚｍＣと阻害性複合体を形成することを示す。ウサギ抗ＧｚｍＣで染色したウエスタンブロット。矢印は、２６ｋＤのＧｚｍＣ（Ｇｌｕ１９３Ｇｌｙ）および６６ｋＤの共有結合性ＳＢ１−ＧｚｍＣ複合体（ｃｐｘ）を示す。並列のタンパク質染色ゲルで検出されたＳＢ１は、４２ｋＤに移動する。データは、３回の実験の代表例である。ステューデントのｔ検定による＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図２３−２】同上。
【図２３−３】同上。
【図２３−４】同上。
【図２３−５】同上。
【図２３−６】同上。
【００６１】
【図２４−１】図２４Ａ〜２４Ｊは、セルピンｂ１欠損ＣＤ４細胞は、ＥＡＥのプライミング相には欠陥がないことを示す。図２４Ａ〜２４Ｅ、２４Ｇ〜２４Ｉは、Ｗｔマウスおよびｓｂ１−／−マウスをＭＯＧで免疫し、流入領域リンパ節（ＬＮ）の細胞をＥＡＥの発症時に研究したことを示す。図２４Ａは、免疫細胞の総数を示す。図２４Ｂは、エフェクターＴ細胞の出現頻度を示す。図２４Ｃは、Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３＋）の出現頻度を示す。図２４Ｄは、ＣＣＲ２＋ＣＤ４細胞およびＣＣＲ６＋ＣＤ４細胞の出現頻度を示す。データは、フローサイトメトリーによって決定され、それぞれの遺伝子型の９匹のマウスに対する平均であった。図２４Ｅは、抗原リコール反応におけるＩＬ−１７の産生を示す。図２４Ｆは、抗原リコールにおけるＩＬ−２３に対する応答性を示す。疾患発症時に回収した脾細胞（図２４Ｅ）またはＬＮ細胞（図２４Ｆ）をＩＬ−２３の存在下または非存在下でＭＯＧと共にまたはＭＯＧを含まずに４８時間培養し、上清中のＩＬ−１７（図２４Ｅ）をＥＬＩＳＡによって定量するかまたはＢＦＡ（図２４Ｆ）を最後の８時間に添加し、ＩＬ−１７＋細胞を細胞内フローサイトメトリーによって定量した。示したデータは、２〜３回の実験を代表する、遺伝子型毎に８匹のマウス（図２４Ｅ）および５匹のマウス（図２４Ｆ）に関する平均である。図２４Ｇは、ＩＬ−１受容体の上方調節を示す。ナイーブｗｔ  ＣＤ４細胞およびｓｂ１−／−  ＣＤ４細胞を移入したＲａｇ１／−マウスの免疫後０日目、６日目（疾患前）および１０日目（ＥＡＥの発症）のＬＮにおけるＩＬ−１Ｒ＋ＣＤ４細胞の出現頻度。示したデータは、１時点当たり遺伝子型毎に３〜４匹のマウスに関する平均である。図２４Ｈは、エフェクター（ＣＤ４４＋）ＣＤ４細胞のｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した代謝酵素の相対的発現を示す。図２４Ｉは、ＬＮエフェクターＣＤ４細胞のインテグリンサブユニットの細胞表面における発現（平均蛍光強度；ＭＦＩ）を示す。データは、３回の実験を代表する、遺伝子型毎に３〜５匹のマウスに関する平均である。図２４Ｊは、全ＬＮ免疫細胞のｑＲＴ−ＰＣＲ解析によって決定した骨髄性細胞サイトカインの相対的発現を示す。図２４Ｈ、２４Ｊは、示したデータが、３回の実験において、遺伝子型毎に３〜５匹のマウスのプールした細胞に関する平均であることを示す。ステューデントのｔ検定による＊ｐ＜０．０５。エラーバーはＳＥＭを表す。
【図２４−２】同上。
【図２４−３】同上。
【図２４−４】同上。
【図２４−５】同上。
【図２４−６】同上。
【図２４−７】同上。
【００６２】
【図２５−１】図２５Ａ〜２５Ｂは、ＥＡＥ（図１８に関する）におけるサイトカイン発現ｓｂ１−／−ＣＤ４細胞の減少を示す。図２５Ａは、ＬＮ（左）および脊髄（右）における疾患発症時のＩＦＮγ＋ＣＤ４細胞およびＧＭ−ＣＳＦ＋ＣＤ４細胞の数の低下を示す。図１８Ｂ、１８Ｃの実験に関する絶対細胞数を示す。図２５Ｂは、Ｐ＋Ｉによるｅｘ  ｖｉｖｏでの刺激後に、フローサイトメトリーによって決定した疾患のピークにおける混合キメラマウスのサイトカイン産生ｗｔ  ＣＤ４細胞およびｓｂ１−／−ＣＤ４細胞の出現頻度を示す。線は、同じキメラからのｗｔ細胞（黒色の円）とｓｂ１−／−細胞（灰色の円）とをつなぐ。同じパターンで２回、実験を繰り返した。ステューデントの対応のあるｔ検定による＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図２５−２】同上。
【図２５−３】同上。
【図２５−４】同上。
【図２５−５】同上。
【００６３】
【図２６−１】図２６Ａ〜２６Ｂは、疾患（図２０Ｃ〜２０Ｅに関する）に関する抗ＣＸＣＲ６処置の効果を示す。図２６Ａは、フィジビリティスタディを示す。抗ＣＸＣＲ６処置によってリンパ節におけるサイトカイン＋ＣＤ４細胞の出現頻度が変更されるかどうかの試験。ＭＯＧで免疫したｗｔマウスは、疾患発症時に単回用量（４００μｇ  ｉ．ｐ．）の抗ＣＸＣＲ６  ｍＡｂまたはアイソタイプ対照を受け、２４時間後に屠殺された。ＬＮ細胞をＰ＋Ｉで刺激し、フローサイトメトリーによってサイトカインの発現を解析した。記号は個々のマウスを表す。結果は、２回の実験の代表例である。図２６Ｂは、防止プロトコールを示す。図２０Ａ、２０Ｂの研究の３０日目（終了）の、アイソタイプで処置したｗｔマウスおよび抗ＣＸＣＲ６で処置したｗｔマウスの脊髄から収集した骨髄性細胞およびリンパ球。（左）代表的なフローサイトメトリー。（右）骨髄性細胞およびリンパ球の平均総数。ステューデントのｔ検定による＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。エラーバーは±ＳＥＭを表す。
【図２６−２】同上。
【００６４】
【図２７】図２７は、炎症性関節炎を有する患者の表１の滑液試料を示す。
【００６５】
【図２８】図２８は、表２すなわちプライマー配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
本明細書に記載の発明は、部分的に、細胞表面タンパク質であるＣＸＣＲ６が、ＩＦＮγおよびＧＭ−ＣＳＦを産生するならびに増殖性の高い病原性ＣＤ４細胞を同定し、ならびに細胞を直接的な研究をし易くする追跡可能なマーカーであり、ならびに操作が革新的であるという発見に関連する。ＣＸＣＲ６を標的とする薬剤（例えば、抗ＣＸＣＲ６枯渇抗体）の自己免疫疾患を有する対象への投与によって、ＣＸＣＲ６を発現する細胞が効果的に殺滅され、自己免疫疾患の重症度が減らされるか、または自己免疫疾患が処置されることが本明細書において企図される。
【００６７】
さらに、セルピンＢ１によって、マウスの多発性硬化症モデル（ＥＡＥ）における病原性ＣＤ４細胞の拡大が調節されることを示すデータが本明細書に提示される。セルピンＢ１を阻害する薬剤の自己免疫疾患を有する対象への投与によって、ＣＸＣＲ６＋病原性ＣＤ４細胞が標的とされて、これらの細胞の拡大が妨げられ、かつ自己免疫疾患が処置されることが本明細書において特に企図される。さらに、本明細書に提示した研究では、ＥＡＥにおける病原性ＣＤ４細胞が細胞傷害性顆粒を含有することを示す。
定義
【００６８】
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用されるいくつかの用語および語句の意味を以下に提供する。別段に記載されていなければ、または文脈から暗示されていなければ、以下の用語および語句は以下に提供される意味を含む。本技術の範囲は特許請求の範囲によってのみ制限されるため、定義は、特定の実施形態を説明するのを助けるために提供され、特許請求された技術を限定することを意図するものではない。別段に定義されていなければ、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、この技術の属する分野における当業者によって通常理解されているのと同じ意味を有する。本技術分野における用語の使用と本明細書で提供する定義の間に明らかな矛盾がある場合には、本明細書内に提供した定義が優先される。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「処置する」、「処置」、「処置すること」、または「軽快」という用語は、目的が、自己免疫疾患または障害、例えば、多発性硬化症に関連する状態の進行または重症度を逆転、軽減、軽快、阻害、緩徐化または阻止することである治療処置を指す。「処置すること」という用語は、自己免疫疾患または障害、例えば、多発性硬化症（例えば、筋振戦）の少なくとも１つの有害作用または症状を低減または軽減することを含む。処置は、一般的に、１つまたは複数の症状または臨床マーカーが低減する場合に「有効」である。あるいは、処置は、疾患の進行が低下または停止する場合に「有効」である。すなわち、「処置」は、症状またはマーカーの改善だけでなく、処置がない場合に予想されるものと比較して、症状の進行または悪化の、休止、または少なくとも緩徐化も含む。有益なまたは所望の臨床結果としては、以下に限定されないが、１つもしくは複数の症状の軽減、疾患の程度の減退、安定化した（すなわち、悪化していない）疾患状態、疾患の進行の遅延もしくは緩徐化、疾患状態の軽快もしくは緩和、寛解（部分的であるか全体的であるかにかかわらず）、および／または死亡率の減少が、検出可能であるか検出不可能であるかにかかわらず挙げられる。疾患の「処置」という用語はまた、疾患の症状または副作用からの解放の供与（緩和的処置を含む）を含む。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「投与すること」という用語は、薬剤の対象への少なくとも部分的な送達をもたらす方法または経路によって、本明細書に開示されている治療（例えば、ＣＸＣＲ６を標的とするかまたはセルピンＢ１を阻害する薬剤）または医薬組成物を対象中に置くことを指す。本明細書に開示されている薬剤を含む医薬組成物は、対象に有効な処置をもたらす任意の適切な経路によって投与され得る。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「接触させること」という用語は、細胞または器官に関連して使用される場合、薬剤、表面、ホルモンなどを、細胞の薬剤、表面、ホルモンなどとの物理的接触を可能にするように、細胞、組織、または器官に導入することまたは投与すること、およびｍｉＲＮＡ、ポリペプチド、または細胞内の他の発現産物などの薬剤の発現を可能にする遺伝子構築物またはベクターなどのエレメントを導入することの両方を包含する。薬剤を発現するように遺伝子修飾された細胞が、薬剤を発現する細胞の子孫の場合のように、薬剤と「接触する」ことを理解されたい。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「対象」は、ヒトまたは動物を意味する。通常、動物は、霊長類、げっ歯類、飼育動物または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類としては、例えば、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えば、アカゲザルが挙げられる。げっ歯類としては、例えば、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギおよびハムスターが挙げられる。飼育動物および狩猟動物としては、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、例えば、イエネコ、イヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、トリ種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、ならびに魚、例えば、マス、ナマズおよびサケが挙げられる。一部の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、霊長類、例えば、ヒトである。「個体」、「患者」および「対象」という用語は、本明細書において交換可能に使用される。
【００７３】
好ましくは、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであってもよいが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、疾患、例えば、自己免疫疾患の動物モデルを表す対象として有利に使用することができる。対象は、雄性であっても雌性であってもよい。
【００７４】
対象は、処置を必要とする疾患もしくは障害（例えば、自己免疫疾患）またはこのような疾患もしくは障害に関連する１つもしくは複数の合併症を患っているかまたは有すると以前に診断または同定される対象であってもよく、必要に応じて、疾患もしくは障害または疾患もしくは障害に関連する１つもしくは複数の合併症に対する処置を既に受けていてもよい。あるいは、対象は、このような疾患もしくは障害（例えば、自己免疫疾患）または関連する合併症を有すると以前に診断されていない対象であってもよい。例えば、対象は、疾患もしくは障害または疾患もしくは障害に関連する１つもしくは複数の合併症に関する１つまたは複数のリスク因子を呈する対象あるいはリスク因子を呈さない対象であってもよい。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「標的とする」または「標的とすること」は、所与の標的（例えば、ＣＸＣＲ６）に局在化し、結合する薬剤を指す。薬剤は、標的（例えば、配列番号１のヌクレオチド配列、または配列番号３のアミノ酸配列）の全長、またはその薬剤が局在化もしくは結合するのに十分であるその断片に局在化または結合することができる。薬剤は、例えば、直接的または間接的に、ＣＸＣＲ６を標的とし得る。ここで、「標的とすること」は、所与の標的（例えば、ＣＸＣＲ６）に結合する薬剤をもたらし、結合は、不可逆的であっても可逆的であってもよい。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「薬剤」は、例えば、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの発現を阻害するか、またはポリペプチドもしくはポリヌクレオチドに結合する、その刺激を部分的もしくは全体的にブロックする、その活性化を低下させる、妨げる、遅延させる、その活性を不活性化する、脱感作する、もしくは下方調節する分子、タンパク質、ペプチド、抗体、または核酸を指す。セルピンＢ１を阻害する、例えば、発現、例えば、ポリペプチドの翻訳、翻訳後のプロセシング、安定性、分解、または核もしくは細胞質への局在化、またはポリヌクレオチドの転写、転写後のプロセシング、安定性もしくは分解を阻害する、あるいはポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する、その刺激、ＤＮＡ結合、転写因子活性または酵素活性を部分的または全体的にブロックする、その活性化を低下させる、妨げる、遅延させる、その活性を不活性化する、脱感作する、または下方調節する薬剤。薬剤は、直接的または間接的に、作用し得る。
【００７７】
「薬剤」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、以下に限定されないが、小分子、核酸、ポリペプチド、ペプチド、薬物、イオンなどの任意の化合物または物質を意味する。「薬剤」は、合成および天然に存在するタンパク質性および非タンパク質性実体を限定することなく含む、任意の化学的実体または化学的部分であり得る。一部の実施形態では、薬剤は、タンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡザイム、糖タンパク質、ｓｉＲＮＡ、リポタンパク質、アプタマーならびにその改変および組合せなどを限定することなく含む、核酸、核酸類似体、タンパク質、抗体、ペプチド、アプタマー、核酸のオリゴマー、アミノ酸、または炭水化物である。ある特定の実施形態では、薬剤は、化学的部分を有する小分子である。例えば、化学的部分は、マクロライド、レプトマイシンおよびそれらの関連天然産物または類似体を含む、非置換もしくは置換アルキル、芳香族、またはヘテロシクリル部分を含んでいた。化合物は、所望の活性および／もしくは特性を有することが公知であってもよく、または多様な化合物のライブラリーから選択されてもよい。
【００７８】
薬剤は、１つまたは複数のケミカルクラスに由来する分子、例えば、有機分子であってもよく、有機金属分子、無機分子、遺伝子配列などを含んでもよい。薬剤は、１つまたは複数のタンパク質からの融合タンパク質、キメラタンパク質（例えば、関連するかまたは異なる分子の機能的に有意な領域のドメインスイッチングまたは相同組み換え）、合成タンパク質または置換、欠失、挿入および他のバリアントを含む他のタンパク質バリアントであってもよい。
【００７９】
本明細書に記載の方法および組成物は、ＣＸＣＲ６が標的とされることを必要とする。本明細書で使用される場合、「Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン受容体６（ＣＸＣＲ６）」は、ＣＤ４細胞のサブセット上の受容体を指す。ＢＯＮＺＯ、ＣＤ１８６、ＳＴＲＬ３３、およびＴＹＭＳＴＲとしても公知のＣＸＣＲ６に関する配列は、いくつかの種、例えば、ヒトＣＸＣＲ６（ＮＣＢＩ遺伝子番号：１０６６３）のポリペプチド（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００６５５５．１）およびｍＲＮＡ（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００６５６４．１）に関しても公知である。ＣＸＣＲ６は、ヒトＣＸＣＲ６（その天然に存在するバリアント、分子、および対立遺伝子を含む）を指し得る。ＣＸＣＲ６は、哺乳動物のＣＸＣＲ６、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタなどのＣＸＣＲ６を指し得る。配列番号１のヒトの核酸配列は、ＣＸＣＲ６をコードする核酸配列を含む。配列番号３のヒトのポリペプチド配列は、ＣＸＣＲ６のポリペプチド配列を含む。
【００８０】
本明細書に記載の方法および組成物は、セルピンＢ１のレベルおよび／または活性が阻害されることを必要とする。本明細書で使用される場合、「セルピンファミリーＢのメンバー１（セルピンＢ１）」または「白血球エラスターゼインヒビター」は、例えば、好中球由来プロテイナーゼ、好中球エラスターゼ、カテプシンＧ、グランザイムＨ、およびプロテイナーゼ−３を阻害することが公知のタンパク質を指す。セルピンＢ１は、炎症部位において、組織を損傷から保護する役割を有する。セルピンＢ１は、ＣＸＣＲ６＋病原性ＣＤ４細胞の拡大を促進するよう機能する。セルピンＢ１の配列は、いくつかの種、例えば、ヒトのセルピンＢ１（ＮＣＢＩ遺伝子番号：１９９２）のポリペプチド（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿１０９５９１．１）およびｍＲＮＡ（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０３０６６６．３）に関して公知である。セルピンＢ１は、ヒトセルピンＢ１（その天然に存在するバリアント、分子、および対立遺伝子を含む）を指し得る。セルピンＢ１は、哺乳動物のセルピンＢ１、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタなどのセルピンＢ１を指す。配列番号２の核酸配列は、セルピンＢ１をコードする核酸配列を含む。配列番号４のヒトのポリペプチド配列は、セルピンＢ１のポリペプチド配列を含む。
【００８１】
「減少する」、「低減した」、「低減」、または「阻害する」という用語はすべて、統計的に有意な量での低下を意味するために本明細書で使用される。一部の実施形態では、「減少する」、「低減した」、「低減」、または「阻害する」は、典型的には、適切な対照（例えば、所与の処置の非存在下）と比較して、少なくとも１０％の減少を意味し、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれより高いパーセンテージの減少を含み得る。本明細書で使用される場合、「低減」または「阻害」は、参照レベルと比較して、完全な阻害や低減を包含しない。「完全な阻害」は、適切な対照と比較して、１００％の阻害である。
【００８２】
「枯渇」、「枯渇した」、または「枯渇する」という用語は、減少に対する別の用語として本明細書において交換可能に使用される。本明細書に記載の方法に関して、枯渇するは、集団における細胞数の減少を意味し得る。例えば、枯渇するは、特定のマーカー（例えば、ＣＸＣＲ６）を発現する細胞数が低減する；もはや生存可能ではない；またはもはや数を拡大しないことを意味し得る。枯渇は、物理的または免疫学的に生じ得る。
【００８３】
「増加する」、「増強する」、または「活性化する」という用語はすべて、再現性のある統計的に有意な量での増加を意味するために本明細書で使用される。一部の実施形態では、「増加する」、「増強する」、または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、参照レベルと比較して、少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％の増加、または１００％を含む最大１００％の増加または１０〜１００％の間の任意の増加、あるいは適切な対照と比較して、少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍もしくは少なくとも約１０倍の増加、２０倍の増加、３０倍の増加、４０倍の増加、５０倍の増加、６倍の増加、７５倍の増加、１００倍の増加など、または２倍〜１０倍の間の任意の増加もしくはそれより多い増加を意味し得る。マーカーの文脈では、「増加する」は、このようなレベルの再現性のある統計的に有意な増加である。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「モジュレートする」という用語は、これらの用語が本明細書において定義されている場合、所与のパラメーターを増加させることまたは低下させることを含む作用を指す。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「参照レベル」は、正常な、そうでなければ罹患していない細胞集団または組織（例えば、健康な対象から得られた生体試料、または以前の時点で対象から得られた生体試料、例えば、自己免疫疾患を有すると診断される前に患者から得られた生体試料、または本明細書に開示されている薬剤と接触していない生体試料）を指す。
【００８６】
本明細書で使用される場合、「適切な対照」は、未処置の、そうでなければ同一の細胞または集団（例えば非対照細胞と比較して、本明細書に記載の薬剤を投与されなかったか、または本明細書に記載の薬剤のサブセットのみによって投与された患者）を指す。
【００８７】
「統計的に有意な」または「有意に」という用語は、統計的有意性を指し、一般的には、２標準偏差（２ＳＤ）またはそれより大きな差を意味する。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「含むこと」または「含む」という用語は、方法または組成物に対して必須であり、さらに、必須であるか否かにかかわらず、不特定の要素を含める余地がある組成物、方法、およびそれらのそれぞれの構成成分（複数可）に関して使用される。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要とされるこれらの要素を指す。この用語は、本発明のその実施形態の基本的かつ新規または機能的特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさない追加の要素の存在を可能にする。
【００９０】
単数形の用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、別段に文脈において明確に示されていなければ、複数の指示対象を含む。同様に、「または」という語は、別段に文脈において明確に示されていなければ、「および」を含むことを意図する。本明細書に記載のものと類似するかまたはそれに対して均等である方法および材料を、この開示の実践または試験において使用することができるが、好適な方法および材料については以下に記載されている。「例えば（ｅ．ｇ．）」という略語は、ラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ  ｇｒａｔｉａに由来し、非限定的な例を示すために本明細書において使用される。よって、「例えば（ｅ．ｇ．）」という略語は、「例えば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）」という用語と同義である。
自己免疫疾患を処置すること
【００９１】
実施形態のうちのいずれかの一態様では、ＣＸＣＲ６を標的とする薬剤を、自己免疫疾患を有する対象に投与するステップを含む、自己免疫疾患を処置するための方法が本明細書に記載されている。
【００９２】
実施形態のうちのいずれかの別の態様では、本明細書に記載されているものは、セルピンＢ１を阻害する薬剤を、自己免疫疾患を有する対象に投与するステップを含む、自己免疫疾患を処置するための方法を提供する。
【００９３】
これらの態様のうちのいずれかの一部の実施形態では、自己免疫疾患は、関節リウマチ、クローン病、ループス、セリアック病、シェーグレン症候群、リウマチ性多発筋痛症（polymyalgia  rheumatic）、多発性硬化症、強直性脊椎炎、１型糖尿病、円形脱毛症、血管炎、自己免疫性ブドウ膜炎、若年性特発性関節炎、および側頭動脈炎からなるリストから選択される。
【００９４】
これらの態様のうちのいずれかの一部の実施形態では、自己免疫疾患は、多発性硬化症である。
【００９５】
これらの態様のうちのいずれかの一部の実施形態では、投与するステップによって、炎症が阻害される。これらの態様のうちのいずれかの一部の実施形態では、投与するステップによって、脊髄における白血球の蓄積が阻害される。
【００９６】
本明細書で使用される場合、「自己免疫疾患」または「自己免疫障害」は、その免疫系が、外来細胞と健康な細胞とを識別することができないことによって特徴付けられる。これは、プログラム細胞死に関するその健康な細胞を標的とするその免疫系を生じる。自己免疫疾患または障害の非限定的な例としては、炎症性関節炎、１型糖尿病、多発性硬化症、乾癬、炎症性腸疾患、ＳＬＥ、および血管炎、アレルギー性の炎症、例えば、アレルギー喘息、アトピー性皮膚炎、および接触過敏症が挙げられる。自己免疫関連疾患または障害の他の例としては、以下に限定されると解釈されるべきではないが、関節リウマチ、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス、グレーブス病（過活動甲状腺）、橋本甲状腺炎（低活動甲状腺）、セリアック病、クローン病および潰瘍性大腸炎、ギランバレー症候群、原発性胆汁性硬化症／肝硬変、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、レイノー現象、強皮症、シェーグレン症候群、グッドパスチャー症候群、ウェゲナー肉芽腫症、リウマチ性多発筋痛症、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、慢性疲労症候群（ＣＦＳ）、乾癬、自己免疫性アディソン病、強直性脊椎炎、急性播種性脳脊髄炎、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、眼球クローヌスミオクローヌス症候群、視神経炎、オード甲状腺炎、天疱瘡、悪性貧血、イヌにおける多発性関節炎、ライター症候群、高安動脈炎、温式自己免疫性溶血性貧血、ウェゲナー肉芽腫症および線維筋痛症（ＦＭ）が挙げられる。
［０００１］
自己免疫疾患は、典型的には、炎症によって特徴付けられる。本明細書で使用される場合、「炎症」または「炎症した」という用語は、免疫系または免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ）の活性化または動員を指す。炎症を有する組織は、赤くなる、白くなる、腫れる、熱を帯びる、痛む場合があり、機能の喪失を呈する、または被膜もしくは粘液を有する場合がある。炎症を特定する方法は、当技術分野で周知である。炎症は、典型的には、傷害または微生物による感染の後に起こるが、異常なまたは特発的な炎症状態でもあり得る。
【００９７】
自己免疫疾患の症状の例としては、以下に限定されないが、脊髄への白血球の蓄積、滑液における白血球の蓄積、疼痛、歩行困難もしくは呼吸困難、麻痺、胃腸不快感もしくは下痢、または極度の疲労が挙げられる。熟練した開業医や医師は、標準的技法、例えば、血液検査、腰椎穿刺、および非侵襲的イメージング（例えば、ＣＴスキャン、またはＭＲＩ）を使用して、対象の自己免疫疾患を診断し得る。
【００９８】
自己免疫疾患または障害を処置する現在の方法としては、薬物治療、理学療法、手術および／または運動が挙げられる。自己免疫疾患に対する薬物治療としては、以下に限定されないが、ミトキサントロン、インターフェロンβ１ａ療法、ペグインターフェロンベータ１ａ、アザチオプリン、フィンゴリモド、ナタリズマブ、グラチラマー、ステロイド（例えば、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、ブデソニド）、鎮痛剤および抗炎症薬（例えば、カプサイシン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、メサラミン）、スルファサラジン、オキシコドン、メトトレキサート、アザチオプリン、アダリムマブ、インフリキシマブ、メルカプトプリン、ヒドロキシクロロキン（hydroxycholoroquine）、抗生剤（例えば、クリンダマイシン、メトロニダゾール、アミノサリチル酸、ペニシリン）、ならびにビタミン類（ビタミンＤ）が挙げられ得る。本明細書に記載されている自己免疫疾患を処置する方法は、自己免疫疾患に対する処置の標準的方法に加えて行うことができることに留意されたい。
【００９９】
本明細書に記載の方法は、とりわけ、多発性硬化症（ＭＳ）または関節炎に適用することができ、これは、これらの疾患が、炎症および異常なＴ細胞活性によって引き起こされる慢性かつ衰弱性の自己免疫疾患であるためである。疲労、移動の問題、および衰弱などのいくつかの態様において臨床症状が重複する。
【０１００】
自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）のマウスモデルは、自己反応性ヘルパーＴ細胞によって駆動される中枢神経系の慢性脱髄障害などの哺乳動物の疾患をモデル化することができる。マウスモデルは、多発性硬化症および他の自己免疫疾患の機序を同定するのに有用であることが示されてきた。ＭＳの原因であるヘルパーＴ細胞がＣＸＣＲ６を発現するものとして同定されるという発見が、本明細書に部分的に記載されている。さらに、本明細書に記載のこれらのＣＸＣＲ６細胞集団は、炎症性関節炎の患者の滑液（ＳＦ）において非常に富化されている。ＣＸＣＲ６によって、ＣＤ４  Ｔ細胞活性化に媒介される病理発生のプロトタイプであるＯＴ−ＩＩ  ＣＤ４  Ｔ細胞系および遅延型過敏症反応を使用することによって、様々な自己免疫障害における病原性ＣＤ４  Ｔ細胞を広範囲に同定することができる。よって、マウスとヒト両方のヘルパーＴ細胞（例えば、Ｔｈ１７細胞）に駆動される自己免疫障害において、ＣＸＣＲ６によって、複数の重要な病原性サイトカインを産生し、炎症した組織において富化されるＣＤ４細胞が同定される。
【０１０１】
実施形態のうちのいずれかの別の態様では、自己免疫疾患を診断する方法が本明細書に記載されている。実施形態のうちのいずれかの別の態様では、自己免疫疾患を処置する方法であって、適切な対照と比較して、対象由来の生体試料におけるＣＸＣＲ６レベルの増加を示すアッセイの結果を受容するステップと；セルピンＢ１のレベルまたは活性を阻害する薬剤を対象に投与するステップとを含む方法が本明細書に記載されている。
【０１０２】
これらの態様のうちのいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象のＴｈ１７細胞によって発現されるセルピンＢ１レベルを検出するステップと；適切な対照と比較して、セルピンＢ１レベルの増加を示すアッセイの結果を受容するステップとをさらに含む。これらの態様のうちのいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象における、パーフォリン−Ａ、グランザイムＡ（ＧｚｍＡ）、ＧｚｍＣ、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）、ＩＬ−６、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、インターロイキン−２３受容体（ＩＬ−２３Ｒ）、ＩＬ−７ＲαおよびＩＬ−１Ｒ１、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、ＲＡＲ関連オーファン受容体Ｃ（Ｒｏｒｃ）、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のうちの１つまたは複数のレベルを検出するステップをさらに含む。これらの態様のうちのいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、脊髄における白血球の蓄積を検出するステップをさらに含む。
【０１０３】
これらの態様のうちのいずれかの一部の実施形態では、アッセイの結果を受容するステップの前に、方法は、対象から生体試料を得るステップをさらに含む。
【０１０４】
生体試料は、採血または手術方法などの当技術分野において公知の方法によって得ることができる。これらの態様のうちのいずれかの別の実施形態では、生体試料は、滑液、脊髄液、血液試料、バフィーコート、血清、または組織である。一部の実施形態では、組織は、胃腸管に由来する。一部の実施形態では、組織は、結腸組織である。腸組織を手術によって取り除くことは医療専門家には標準的であり、方法は当技術分野で公知である。例えば、結腸切除術は、結腸の部分または結腸由来の組織試料を取り除く手順である。これは、クローン病または潰瘍性大腸炎の形態などの自己免疫疾患を特定する際の典型である。
【０１０５】
任意の細胞マーカー（例えば、ＣＸＣＲ６またはセルピンＢ１）を測定する方法は当技術分野で公知であり、実験室でのアッセイによって行うことができる。一部の実施形態では、アッセイは、フローサイトメトリー、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮＡシーケンシング、または免疫組織化学である。本明細書に記載のアッセイは、細胞培養に関する当業者にとって利用可能な任意の好適な容器または装置において実施することができる。例えば、アッセイは、２４、９６、または３８４ウェルプレートにおいて実施することができる。これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、アッセイは、３８４ウェルプレートにおいて実施される。
【０１０６】
本明細書に開示されている態様に関する細胞は、当業者にとって利用可能な任意の供給源から得ることができる。さらに、細胞は、任意の起源のものであってもよく、任意の対象に由来してもよい。したがって、一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物の供給源に由来する。これらの態様のうちのいずれかの一部の実施形態では、細胞は、白血球、リンパ球、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、リンパ系細胞、内皮細胞、幹細胞、または当技術分野で公知の任意の細胞型である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞、Ｔｈ１７細胞、またはＴｈ１７由来細胞である。一部の実施形態では、Ｔｈ１７細胞は、ＣＸＣＲ６またはセルピンＢ１に対して陽性である。これらの態様のうちのいずれかの一部の実施形態では、細胞は、対象、例えば、患者に由来する。これらの態様のうちのいずれかの一部の実施形態では、対象は、自己免疫疾患に対する処置を必要とする患者である。
Ｔｈ１７細胞およびＴｈ１７由来細胞
【０１０７】
これらの態様のうちのいずれかの一部の実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞集団をモジュレートするステップを含む。これらの態様のうちのいずれかの一部の実施形態では、細胞集団は、Ｔｈ１７細胞集団またはＴｈ１７由来細胞集団である。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、「ヘルパーＴ１７細胞」または「Ｔｈ１７細胞」という用語は、炎症促進性Ｔ細胞の種類を指す。ヘルパーＴ１７細胞は、適応免疫応答の調節に関する多種多様な細胞機能を有する。例えば、Ｔｈ１７細胞は、他の炎症性白血球（例えば、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、樹状細胞など）を体内の作用部位に動員する炎症促進性サイトカイン、インターフェロン、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を放出する。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、「サイトカイン」という用語は、標的サイトカイン受容体を介して作用し、免疫応答、細胞成長、または他の細胞機能をモジュレートする低分子タンパク質（約５〜２０ｋＤａ）を指す。サイトカインの例としては、以下に限定されないが、インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１７、ＩＬ−２５、ＩＬ−６、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−１Ｒ１が挙げられる。
【０１１０】
本明細書に記載の方法の態様は、自己免疫疾患を処置するために、プログラム細胞死に関するヘルパーＴ１７細胞（Ｔｈ１７）またはＴｈ１７由来細胞を標的とする。ＭＳ様マウス疾患、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の研究によって、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＧＦβに依存する機序によるナイーブＣＤ４細胞のＩＬ−１７産生Ｔｈ１７細胞への分化によって開始し（Weaver,  2006;  Littman,  2010で概説されている）、次のＴｈ１７細胞のＩＦＮγおよびＧＭ−ＣＳＦ産生ｅｘ−Ｔｈ１７細胞（病原性Ｔｈ１７細胞）への変換へと進行する（Hirota,  2011）、これらの細胞型についての理解の幅が広がった。ＩＬ１／ＩＬ１Ｒ（Sutton,  2006）に加えて、この後者の変換には、ＩＬ−２３／ＩＬ−２３Ｒ（McGeachy,  2009）が必要とされる。これらのヘルパーＴ細胞の脊髄脳炎に関する機能（myeloencephalitic  function）には、それらがＧＭ−ＣＳＦを産生すること（El-Behi,  2011;  Codarri,  2011）およびプロテアーゼインヒビターであるセルピンｂ１（ｓｂ１）を発現すること（Hou,  2016）が必要であるが、最も下流にある公知の要件はＣＤ４細胞の病原性である。
ＣＸＣＲ６を発現する細胞の枯渇
【０１１１】
これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、ＣＸＣＲ６を標的とする薬剤の投与は、ＣＸＣＲ６を発現する細胞集団の枯渇をもたらす。これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、薬剤は、ヒトＣＸＣＲ６に対して特異的な抗ＣＸＣＲ６枯渇抗体である。これらの態様のうちのいずれかの別の実施形態では、薬剤は、ヒト化抗ＣＸＣＲ６枯渇抗体である。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、「枯渇抗体」は、意図された標的（例えば、ＣＸＣＲ６）に結合する際に、意図された標的を発現する細胞を細胞死（例えば、プログラム細胞死）させる抗体を指す。「枯渇抗体」という用語は、細胞集団を除去、低減、またはモジュレートする抗体も指す。免疫学的枯渇は、ｅｘ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ（抗体は対象に直接投与される）、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ（抗体は培養中の細胞集団を処置する）で起こり得る。ｅｘ  ｖｉｖｏでの枯渇では、血液細胞は、対象から取り除かれ、枯渇抗体で処置され、血液細胞を患者に戻すよう注入することができる。これは、例えば、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）におけるＴ細胞の枯渇を達成するために一般的である。
【０１１３】
これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、枯渇は、ＣＸＣＲ６を発現する細胞のプログラム細胞死をもたらす。当業者であれば、例えば、本明細書に記載の技法を使用して、細胞がプログラム細胞死を受けているかまたは受けたかどうかを評価し得る。これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、枯渇は、ＣＸＣＲ６を発現する細胞の不活性化または中和（例えば、例えば細胞シグナルをもはや産生しないかもしくは受容しない、または例えば酵素、もしくはサイトカインを分泌しない細胞）をもたらす。当業者であれば、例えば、例えば所与のシグナル伝達経路に関する機能的アッセイを使用して、細胞シグナルを送受信する細胞の能力を、または例えばＥＬＩＳＡを使用して、サイトカインを分泌する細胞の能力を評価することによって、細胞が不活性であるかもしくは中和されているかどうかを評価し得る。
【０１１４】
これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、ＣＸＣＲ６を発現する細胞集団は、ヘルパーＴ１７（Ｔｈ１７）細胞集団である。これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、ＣＸＣＲ６を発現する細胞集団は、Ｔｈ１７由来細胞集団である。Ｔｈ１７細胞は、炎症促進性ヘルパーＴ細胞のサブセットである。Ｔｈ１７は、例えば、インターロイキン−１７を発現する。Ｔｈ１７細胞集団および／またはＴｈ１７由来細胞集団は、本明細書の以下に記載の技法を使用して同定することができる。さらに、Ｔｈ１７細胞およびＴｈ１７由来細胞は、転写因子Ｒｏｒｃ、またはその遺伝子産物、例えば、ＲｏｒγＴの発現によって同定することができる。ＲｏｒｃまたはＲｏｒγＴのｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルは、本明細書に記載されているように測定することができる。
【０１１５】
これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、ＣＸＣＲ６を標的とする薬剤は、適切な対照と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、またはそれより高いパーセンテージで、ＣＸＣＲ６を発現する細胞集団を枯渇させる。これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、この薬剤は、ＣＸＣＲ６を発現する細胞集団の完全な枯渇（例えば、細胞集団の１００％の枯渇）をもたらす。本明細書で使用される場合、適切な対照は、薬剤（例えば、抗ＣＸＣＲ６枯渇抗体）の投与前のＣＸＣＲ６発現細胞の数を指す。
Ｔｈ１７細胞またはＴｈ１７由来細胞の集団の同定
【０１１６】
本明細書に記載の本発明の一態様は、Ｔｈ１７細胞またはＴｈ１７由来細胞の集団を同定する方法であって、候補細胞の集団においてＣＸＣＲ６のレベルを測定するステップと、ＣＸＣＲ６の高発現を呈する細胞を選択するステップとを含む方法を提供する。
【０１１７】
これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、細胞は、ＣＸＣＲ６のレベルが、参照レベルと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、またはそれより高い倍率で、あるいは参照レベルと比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９９％またはそれより高いパーセンテージで増加する場合、Ｔｈ１７細胞またはＴｈ１７由来細胞である。参照レベルは、Ｔｈ１７細胞でもＴｈ１７由来細胞でもない細胞中のＣＸＣＲ６のレベルであり得る。
【０１１８】
これらの態様のうちのいずれかの別の実施形態では、候補細胞は、生体試料中に含有されている。これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、候補細胞は培養中である。これらの態様のうちのいずれかの別の実施形態では、ＣＸＣＲ６のレベルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ  ｖｉｖｏで測定される。候補細胞中のＣＸＣＲ６のレベルは、標準的な技法、例えば、ＦＡＣＳ解析、または免疫蛍光法を使用して測定することができる。ＣＸＣＲ６のタンパク質およびｍＲＮＡレベルは、それぞれ、ウエスタンブロッティングまたはＰＣＲベースのアッセイを使用して評価することができる。これらの方法は、当業者に公知である。
【０１１９】
これらの態様のうちのいずれかの別の実施形態では、生体試料は、自己免疫疾患を有すると以前に診断されたことがある対象から採取される。これらの態様のうちのいずれかの別の実施形態では、生体試料は、自己免疫疾患を有すると診断されたことがない対象から採取される。
薬剤
【０１２０】
これらの実施形態のうちのいずれかの一態様では、ＣＸＣＲ６を標的とする薬剤が、自己免疫疾患を有する対象に投与されることが本明細書において記載されている。これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、ＣＸＣＲ６を標的とする薬剤は、小分子、抗体もしくは抗体断片、またはペプチドである。
【０１２１】
これらの実施形態のうちのいずれかの別の態様では、セルピンＢ１を阻害する薬剤が、自己免疫疾患を有する対象に投与される。これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、セルピンＢ１を阻害する薬剤は、小分子、抗体もしくは抗体断片、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ゲノム編集系、またはＲＮＡｉである。
【０１２２】
これらの実施形態のうちのいずれかの別の態様では、ＣＸＣＲ６を発現するＴ細胞の集団を減少させる方法であって、白血球におけるセルピンＢ１のレベルまたは活性を低下させる薬剤を投与するステップを含む方法が本明細書に記載されている。
【０１２３】
本明細書に記載の薬剤は、セルピンＢ１を阻害するためにそれを標的とする。薬剤は、例えば、投与の際に、細胞内のセルピンＢ１の存在、量、活性および／またはレベルを阻害する場合に、セルピンＢ１を阻害するのに有効であると考えられる。
【０１２４】
これらの実施形態のうちのいずれかの一態様では、ＣＸＣＲ６を標的とすることは、ＣＸＣＲ６を発現する細胞またはその集団の枯渇をもたらす。
【０１２５】
これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、セルピンＢ１を阻害することは、ＣＸＣＲ６＋病原性ＣＤ４細胞の拡大を阻害する。
【０１２６】
薬剤は、例えば、細胞内のセルピンＢ１の転写、または翻訳を阻害することができる。薬剤は、細胞内のセルピンＢ１（例えば、セルピンＢ１の発現）の活性を阻害するかまたは活性を変更することができる（例えば、活性がもはや生じないか、または低下した速度で生じるように）。
【０１２７】
これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、ＣＸＣＲ６を発現する細胞を標的とする薬剤は、プログラム細胞死を促進する、例えば、細胞を死滅させる。細胞をプログラム細胞死の標的としたかどうかを決定するために、所与の標的（例えば、ＣＸＣＲ６）のｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルを、それぞれ、ＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロッティングを使用して評価し、未処置であるが同一の細胞集団と比較することができる。ＣＸＣＲ６の活性を検出する生物学的アッセイを使用して、ＣＸＣＲ６を発現する細胞がプログラム細胞死を受けたかどうかを評価することができる。あるいは、細胞死マーカー（例えば、カスパーゼ）と組み合わせて、ＣＸＣＲ６に特異的な抗体を使用する免疫蛍光検出を使用して、細胞死がＣＸＣＲ６を標的とする薬剤の投与後に生じたかを決定することができる。細胞死または細胞の枯渇を評価するための追加の方法は、本明細書の実施例および図面、例えば、図１３Ｂに記載されている。
【０１２８】
これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、セルピンＢ１を阻害する薬剤は、プログラム細胞死を促進する、例えば、細胞を死滅させる。薬剤がセルピンＢ１を阻害するのに有効であるかを決定するために、所与の標的（例えば、セルピンＢ１）のｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルを、それぞれ、ＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロッティングを使用して評価することができる。セルピンＢ１の活性を検出する生物学的アッセイ（例えば、ＣＸＣＲ６＋病原性ＣＤ４細胞）を使用して、プログラム細胞死が生じたかを評価することができる。あるいは、細胞死マーカー（例えば、カスパーゼ）と組み合わせて、セルピンＢ１に特異的な抗体を使用する免疫蛍光検出を使用して、細胞死が薬剤の投与後に生じたかを決定することができる。
【０１２９】
これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、薬剤は、適切な対照と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％またはそれより高いパーセンテージで、セルピンＢ１のレベルおよび／または活性を阻害する。本明細書で使用される場合、「適切な対照」は、薬剤の投与前のセルピンＢ１のレベルおよび／もしくは活性、または薬剤と接触しなかった細胞集団におけるセルピンＢ１のレベルおよび／もしくは活性を指す。セルピンＢ１の阻害によって、ＣＸＣＲ６＋病原性ＣＤ４細胞の拡大が妨げられる。
【０１３０】
薬剤は、それが投与される形態で直接機能することができる。あるいは、薬剤は、細胞内で修飾または利用され、核酸配列の細胞内への導入ならびに細胞内でのセルピンＢ１の核酸および／もしくはタンパク質のインヒビター、またはＣＸＣＲ６を標的とする核酸および／もしくはタンパク質の産生をもたらす転写などの、ＣＸＣＲ６を標的とするかまたはセルピンＢ１を阻害するものを産生し得る。一部の実施形態では、薬剤は、限定されないが、合成および天然に存在する非タンパク質性実体を含む、任意の化学的な実体または部分である。ある特定の実施形態では、薬剤は、化学的部分を有する小分子である。例えば、化学的部分は、マクロライド、レプトマイシンおよびそれらの関連天然産物または類似体を含む、非置換もしくは置換アルキル、芳香族、またはヘテロシクリル部分を含んでいた。薬剤は、所望の活性および／もしくは特性を有することが公知であってもよく、または多様な化合物のライブラリーから同定されてもよい。
【０１３１】
様々な実施形態では、薬剤は、ＣＸＣＲ６を標的とするかまたはセルピンＢ１を阻害する小分子である。小分子をスクリーニングするための方法は当技術分野で公知であり、例えば、所望の標的（例えば、ＣＸＣＲ６またはセルピンＢ１）がある場合、病原性ＣＤ４細胞の細胞死を誘導するのに効率的である小分子を同定するために使用することができる。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、「小分子」という用語は、以下に限定されないが、ペプチド、ペプチド模倣体、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、アプタマー、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、１モル当たり約１０，０００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物（例えば、ヘテロ有機化合物および有機金属化合物を含む）、１モル当たり約５，０００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、１モル当たり約１，０００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、１モル当たり約５００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、ならびにこのような化合物の塩、エステル、および他の薬学的に許容される形態を含み得る化学薬剤を指す。
【０１３３】
一部の実施形態では、小分子は、ＣＸＣＲ６またはセルピンＢ１を標的とする。
【０１３４】
一部の実施形態では、薬剤は、ポリペプチドである。本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」および複数の「ポリペプチド」を包含することを意図し、２つまたはそれより多いアミノ酸の任意の鎖（複数可）を含む。よって、本明細書で使用される場合、以下に限定されないが、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「タンパク質」、「酵素」、「アミノ酸鎖」、および「連続するアミノ酸配列」を含む用語はすべて、「ポリペプチド」の定義内に包含され、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはこれらの用語のいずれかと交換可能に使用することができる。この用語は、例えば、以下に限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク質分解による切断、翻訳後のプロセシング、または１つもしくは複数の天然に存在しないアミノ酸を含むことによる修飾を含む１つまたは複数の翻訳後修飾を受けたポリペプチドをさらに含む。従来の命名法は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド構造に関して、当技術分野に存在する。例えば、１文字および３文字の略記は以下のアミノ酸を記載するために広く用いられている：アラニン（Ａ；Ａｌａ）、アルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）、アスパラギン（Ｎ；Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ｄ；Ａｓｐ）、システイン（Ｃ；Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｑ；Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｅ；Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇ；Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈ；Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉ；Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌ；Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍ；Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｆ；Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐ；Ｐｒｏ）、セリン（Ｓ；Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔ；Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｗ；Ｔｒｐ）、チロシン（Ｙ；Ｔｙｒ）、バリン（Ｖ；Ｖａｌ）、およびリシン（Ｋ；Ｌｙｓ）。本明細書に提供されるアミノ酸残基は、「Ｌ」異性体形態であることが好ましい。しかし、ポリペプチドの所望の特性が保持されるならば、「Ｄ」異性体形態の残基が任意のＬ−アミノ酸残基と置換されてもよい。
【０１３５】
これらの態様のうちのいずれかの様々な実施形態では、ＣＸＣＲ６またはセルピンＢ１を標的とする薬剤は、抗体もしくはその抗原結合性断片、またはＣＸＣＲ６もしくはセルピンＢ１に対して特異的である抗体試薬である。
【０１３６】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、所与の抗原に特異的に結合するポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、「抗体試薬」という用語は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、所与の抗原に特異的に結合するポリペプチドを指す。抗体試薬は、抗体または抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含み得る。これらの態様のうちのいずれかの一部の実施形態では、抗体試薬は、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含み得る。例えば、抗体は、重鎖（Ｈ）可変領域（本明細書においてＶＨと略される）、および軽鎖（Ｌ）可変領域（本明細書においてＶＬと略される）を含み得る。別の例では、抗体は、２つの重鎖（Ｈ）可変領域および２つの軽鎖（Ｌ）可変領域を含む。「抗体試薬」という用語は、抗体の抗原結合性断片（例えば、単鎖抗体、ＦａｂおよびｓＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ＣＤＲ、ならびにドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、de  Wildt  et  al.,  Eur  J.  Immunol.  1996;  26(3):629-39を参照のこと））および完全な抗体を包含する。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭ（ならびにこれらのサブタイプおよび組合せ）の構造的特色を有し得る。抗体は、マウス、ウサギ、ブタ、ラット、および霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類）の抗体ならびに霊長類化抗体を含む任意の供給源に由来してもよい。抗体は、ミディボディ、ナノボディ、ヒト化抗体、キメラ抗体なども含む。
【０１３７】
これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、ＣＸＣＲ６またはセルピンＢ１を標的とする薬剤は、ヒト化、モノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、または抗体試薬である。本明細書で使用される場合、「ヒト化」は、タンパク質の配列が、ヒトにおいて天然に生じる抗体バリアントに対して類似性を増加させるように改変された非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ヒツジなど）に由来する抗体を指す。これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。これらの態様のうちのいずれかの別の実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト化ポリクローナル抗体である。これらの態様のうちのいずれかの別の実施形態では、ヒト化抗体は、治療用途のためのものである。
【０１３８】
これらの態様のうちのいずれかの別の実施形態では、抗ＣＸＣＲ６抗体は、枯渇抗体である。
【０１３９】
これらの態様のうちのいずれかの別の実施形態では、抗ＣＸＣＲ６抗体または抗体試薬は、最低でも、ＣＸＣＲ６に結合するのに十分であるが、細胞は枯渇させない。この実施形態では、抗ＣＸＣＲ６が、抗ＣＸＣＲ６標的化抗体（anti-CXCR6  targeting  antibody）であることが特に企図される。この文脈では、「抗ＣＸＣＲ６標的化抗体」は、ＣＸＣＲ６を発現する細胞、またはその集団を標的とするために使用され、細胞の枯渇をもたらさない抗体を指す。「抗ＣＸＣＲ６標的化抗体」は、ＣＸＣＲ６に結合するのに十分である、全長抗体の断片のみ、例えば、Ｆａｂ領域のみ、またはＣＤＲ領域のみを含んでもよい。「抗ＣＸＣＲ６抗体を標的とする抗体」は、他の薬剤、部分、毒素、または物質に係留されるかまたは連結されてもよく；これらの係留されたかまたは連結された薬剤、部分、毒素、または物質は、例えば、抗ＣＸＣＲ６抗体を標的とする抗体のＣＸＣＲ６への結合によって、ＣＸＣＲ６を発現する細胞またはその集団に送達され得る。
【０１４０】
これらの態様のうちのいずれかの別の実施形態では、抗ＣＸＣＲ６標的化抗体は、セルピンＢ１を阻害する薬剤に係留されるかまたは連結される。
【０１４１】
これらの態様のうちのいずれかの別の実施形態では、抗体または抗体試薬は、ＣＸＣＲ６をコードするアミノ酸配列（配列番号３）に対応するアミノ酸配列に結合する。
【化１】
2021521121.tif 000003
【０１４２】
これらの態様のうちのいずれかの別の実施形態では、抗ＣＸＣＲ６抗体または抗体試薬は、配列番号３の配列を含むアミノ酸配列に結合するか；または配列番号３の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくはそれより高い配列同一性を有する配列を含むアミノ酸配列に結合する。これらの態様のうちのいずれかの別の実施形態では、抗ＣＸＣＲ６抗体または抗体試薬は、配列番号３の配列全体を含むアミノ酸配列に結合する。これらの態様のうちのいずれかの別の実施形態では、抗体または抗体試薬は、配列番号３の配列の断片を含むアミノ酸配列に結合し、断片は、その標的、例えば、ＣＸＣＲ６に結合し、かつＣＸＣＲ６を発現する細胞またはその集団の枯渇をもたらすのに十分である。
【０１４３】
これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、抗体または抗体試薬は、セルピンＢ１をコードするアミノ酸配列（配列番号４）に対応するアミノ酸配列に結合する。
【化２】
2021521121.tif 000004
【０１４４】
これらの態様のうちのいずれかの別の実施形態では、抗セルピンＢ１抗体または抗体試薬は、配列番号４の配列を含むアミノ酸配列に結合するか；または配列番号４の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくはそれより高い配列同一性を有する配列を含むアミノ酸配列に結合する。これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、抗セルピンＢ１抗体または抗体試薬は、配列番号４の配列全体を含むアミノ酸配列に結合する。これらの態様のうちのいずれかの別の実施形態では、抗体または抗体試薬は、配列番号４の配列の断片を含むアミノ酸配列に結合し、断片は、その標的、例えば、セルピンＢ１に結合し、かつＣＸＣＲ６を発現する細胞またはその集団の枯渇をもたらすのに十分である。
【０１４５】
これらの態様のうちのいずれかの別の実施形態では、抗体または抗体試薬は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および／または配列番号８の配列を含むアミノ酸配列に結合する。これらの態様のうちのいずれかの別の実施形態では、抗体または抗体試薬は、配列番号１〜８のいずれか１つまたは以下の表における配列のいずれかの配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれより高い配列同一性を有する配列を含むアミノ酸配列に結合する。一部の実施形態では、抗体または抗体試薬は、任意の組合せで、配列番号１〜８のいずれか１つの配列を含むアミノ酸配列に結合する。
【表２】
2021521121.tif 000005
【０１４６】
これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、ＣＸＣＲ６を標的とする薬剤は、少なくとも第２の薬剤に連結している。少なくとも第２の薬剤に連結しているＣＸＣＲ６を標的とする薬剤の送達は、少なくとも１つの第２の薬剤を、ＣＸＣＲ６を発現する細胞に向ける。第２の薬剤は、直接的または間接的に、ＣＸＣＲ６を標的とする、それに影響を与える、かつそれと相互作用する必要もない。あるいは、第２の薬剤は、直接的または間接的に、ＣＸＣＲ６を標的とするか、それに影響を与えるか、またはそれと相互作用することができる。これらの態様のうちのいずれかの別の実施形態では、少なくとも第２の薬剤は、ＣＸＣＲ６を発現する細胞のプログラム細胞死を促進する。
【０１４７】
これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ナノ粒子に係留される抗ＣＸＣＲ６標的化抗体である。例えば、ナノ粒子に結合した抗ＣＸＣＲ６標的化抗体は、例えば、抗ＣＸＣＲ６標的化抗体の、細胞表面のＣＸＣＲ６への結合によって、ＣＸＣＲ６を発現する細胞、またはその集団にナノ粒子を送達することができる。これらの態様のうちのいずれかの別の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、小分子に係留される抗ＣＸＣＲ６標的化抗体である。これらの態様のうちのいずれかの別の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、部分に係留される抗ＣＸＣＲ６標的化抗体である。これらの態様のうちのいずれかの別の実施形態では、本明細書に記載の抗体は毒素に係留される抗ＣＸＣＲ６標的化抗体である。例示的な毒素としては、以下に限定されないが、微小管阻害剤ＤＭ−１、メイタンシンの誘導体、またはモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）が挙げられる。
【０１４８】
これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、セルピンＢ１を阻害する薬剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列に対して相補的である合成された核酸配列、例えば、マイクロＲＮＡのものを指す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、標的に結合すること、および転写、翻訳、またはスプライシングのレベルでの発現を停止させることによって、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的の発現をブロックするよう設計される。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞条件下で、遺伝子、例えば、セルピンＢ１にハイブリダイズするよう設計された相補的核酸配列である。よって、標的に対して十分に相補的である、すなわち、所望の効果を得るために、細胞環境の文脈で、十分に良好にかつ十分な特異性を伴ってハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが選択される。例えば、セルピンＢ１を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それぞれ、ヒトのセルピンＢ１遺伝子のコード配列（例えば、配列番号２）の一部に相補的な、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、またはそれより多い塩基を含み得る。
【０１４９】
これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、以下に限定されないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む任意のゲノム編集系を使用して、セルピンＢ１を細胞のゲノムから枯渇させる。これらの態様のうちのいずれかの別の実施形態では、１つまたは複数のガイドＲＮＡをコードする核酸を細胞のゲノムに組み込むために使用されるゲノム編集系は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ではなく；これは、少量のＣａｓ酵素／タンパク質を保持する細胞内で、望ましくない細胞死を妨げることができる。また、Ｃａｓ酵素またはｓｇＲＮＡのいずれかはそれぞれ、異なる誘導性プロモーターの制御下で発現され、それによって、それぞれの一時的な発現を可能にして、このような干渉を妨げることが本明細書において企図される。
【０１５０】
１つまたは複数のｓｇＲＮＡをコードする核酸およびＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸がそれぞれ、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与される必要がある場合、アデノ随伴ウイルスベクター（adenovirus  associated  vector）（ＡＡＶ）の使用が、特に企図される。ゲノム編集／断片化系の両方の構成成分（例えば、ｓｇＲＮＡ、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ）に核酸を同時に送達するための他のベクターとしては、レンチウイルスベクター、例えば、エプスタインバーウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）が挙げられる。ＲＮＡ誘導型ゲノム編集系のそれぞれの構成成分（例えば、ｓｇＲＮＡおよびエンドヌクレアーゼ）は、当技術分野で公知であるかまたは本明細書に記載されている別のベクターにおいて送達することができる。
【０１５１】
これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、薬剤は、ＲＮＡの阻害によってセルピンＢ１を阻害する。所与の遺伝子の発現の阻害剤は、阻害性核酸であり得る。これらの態様のうちのいずれかの一部の実施形態では、阻害性核酸は、阻害性ＲＮＡ（ｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ）である。ＲＮＡｉは、一本鎖または二本鎖であってもよい。
【０１５２】
「ＲＮＡｉ」という用語は、本明細書で使用される場合、干渉ＲＮＡまたはＲＮＡ干渉を指す。ＲＮＡｉは、ｍＲＮＡに結合してｍＲＮＡのプロセシングを阻害する、例えば、ｍＲＮＡの翻訳を阻害するかまたはｍＲＮＡの分解をもたらす分子によって特定のｍＲＮＡを破壊することによる、選択的転写後遺伝子サイレンシングの手段を指す。本明細書で使用される場合、「ＲＮＡｉ」という用語は、以下に限定されないが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、内因性マイクロＲＮＡおよび人工的マイクロＲＮＡを含む任意の種類の干渉ＲＮＡを指す。例えば、ＲＮＡｉは、ＲＮＡの下流のプロセシングの機序にかかわらず、ｓｉＲＮＡとして以前に同定された配列を含む（すなわち、ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの切断をもたらすｉｎ  ｖｉｖｏプロセシングの特定の方法を有すると考えられるが、このような配列は、本明細書に記載の隣接配列に関して、ベクター中に組み込まれ得る）。
【０１５３】
ｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、内因性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または人工的ｍｉＲＮＡであり得る。これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、本明細書に記載されているｉＲＮＡは、標的、例えば、セルピンＢ１の発現および／または活性の阻害をもたらす。これらの態様のうちのいずれかの一部の実施形態では、薬剤は、セルピンＢ１を阻害するｓｉＲＮＡである。これらの態様のうちのいずれかの一部の実施形態では、薬剤は、セルピンＢ１を阻害するｓｈＲＮＡである。
【０１５４】
当業者であれば、例えば、公的に利用可能な設計ツールを使用して、セルピンＢ１を標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを設計できるはずである。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡは、通常、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｙｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）またはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）などの会社を使用して作製される。
【０１５５】
これらの態様のうちのいずれかの一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡであり得る。ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡが使用される条件下で、二重構造を形成するためにハイブリダイズするのに十分相補的である２本のＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、標的配列に対して実質的に相補的であり、一般的には、完全に相補的である相補性領域を含む。標的配列は、標的の発現の間に形成されるｍＲＮＡの配列に由来してもよい。他方の鎖（センス鎖）は、２本の鎖がハイブリダイズして、適切な条件下で組み合わされた場合に二重構造を形成するように、アンチセンス鎖に相補的である領域を含む。
【０１５６】
ｉＲＮＡのＲＮＡは、安定性または他の有益な特徴を増強するために化学的に修飾されてもよい。本発明の特色とされる核酸は、当技術分野で十分に確立された方法、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、"Current  protocols  in  nucleic  acid  chemistry,"  Beaucage,  S.L.  et  al.  (Edrs.),  John  Wiley  &  Sons,  Inc.,  New  York,  NY,  USAに記載されている方法によって、合成および／または修飾されてもよい。
【０１５７】
これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、薬剤は、セルピンＢ１を阻害するｍｉＲＮＡである。マイクロＲＮＡは、平均が２２ヌクレオチド長である小さな非コードＲＮＡである。これらの分子は、通常、３’非翻訳（３’ＵＴＲ）領域の、ｍＲＮＡ分子内の相補配列に結合することによって作用し、それによって、標的ｍＲＮＡの分解またはｍＲＮＡの翻訳の阻害を促進する。マイクロＲＮＡとｍＲＮＡとの間の相互作用は、不完全なワトソン−クリック塩基対合により、ｍＲＮＡへの配列特異的結合を指示するマイクロＲＮＡの６〜８ヌクレオチドの領域である「シード配列」として公知であるものによって媒介される。９００を超えるマイクロＲＮＡが、哺乳動物において発現されることが公知である。これらの多くは、それらのシード配列に基づいてファミリーに群分けされ、それによって、類似するマイクロＲＮＡの「クラスター」を同定することができる。ｍｉＲＮＡは、細胞内で、例えば、ネイキッドＤＮＡとして発現され得る。ｍｉＲＮＡは、例えば、ネイキッドＤＮＡとして、細胞内で発現される核酸によってコードされ得るか、またはベクター内に含有される核酸によってコードされ得る。
【０１５８】
薬剤は、例えば、ＲＮＡｉ分子（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）に関して、標的遺伝子（例えば、セルピンＢ１）の遺伝子サイレンシングをもたらすことができる。このことは、薬剤が存在しない細胞内に見出されるｍＲＮＡレベルの少なくとも約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％の、標的に関する細胞内のｍＲＮＡレベルの低下を必然的に伴う。好ましい一実施形態では、ｍＲＮＡレベルは、少なくとも約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％低下する。当業者であれば、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを細胞内にトランスフェクトし、ウエスタンブロッティングによって細胞内に見出される遺伝子（例えば、セルピンＢ１）のレベルを検出することによって、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡが、その下方調節に関して、例えば、セルピンＢ１を有効に標的とする（effective  target）かどうかを容易に評価し得る。
【０１５９】
薬剤は、ベクター内に含有されてもよく、よって、さらにベクターを含んでもよい。外因性遺伝子を標的哺乳動物細胞中に移入するのに有用な多くのこのようなベクターを利用することができる。ベクターは、エピソーム、例えば、プラスミド、サイトメガロウイルス、アデノウイルスなどのウイルス由来のベクターであってもよく、または相同組換えもしくはランダム組込み、例えば、ＭＭＬＶ、ＨＩＶ−１、ＡＬＶなどのレトロウイルス由来のベクターによって標的細胞ゲノム中に組み込まれてもよい。一部の実施形態では、レトロウイルスと適切なパッケージング細胞株との組合せはまた、カプシドタンパク質が標的細胞への感染に関して機能的である場合、用途を見い出すことができる。通常、細胞とウイルスとは、培養培地中で少なくとも約２４時間インキュベートされる。次いで、細胞を、一部の適用においては短期間、例えば、２４〜７３時間、または少なくとも２週間、培養培地において成長させ、分析前に、５週間またはそれよりも長い間成長させてもよい。一般的に使用されるレトロウイルスベクターは、「欠損性」であり、すなわち、産生性感染のために必要とされるウイルスタンパク質を産生することができない。ベクターの複製は、パッケージング細胞株中における成長を必要とする。
【０１６０】
「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、宿主細胞への送達のために、または異なる宿主細胞間での移入のために設計される核酸構築物を指す。本明細書で使用される場合、ベクターは、ウイルスであっても非ウイルスであってもよい。「ベクター」という用語は、適当な制御エレメントと会合した場合に複製することが可能であり、遺伝子配列を細胞に移入することができる任意の遺伝子エレメントを包含する。ベクターとしては、以下に限定されないが、クローニングベクター、発現ベクター、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、人工染色体、ウイルス、ビリオンなどが挙げられ得る。
【０１６１】
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、ＲＮＡまたはポリペプチド（例えば、セルピンＢ１インヒビター）の発現を、ベクター上の転写調節配列に連結したその中に含有される核酸配列から指示するベクターを指す。発現される配列は、細胞に対して異種であることが多いが、必ずしもその必要はない。発現ベクターは、追加のエレメントを含んでもよく、例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有してもよく、よって、２つの生物において、例えば、発現のためのヒト細胞において、ならびにクローニングおよび増幅のための原核細胞宿主において維持されることが可能になる。「発現」という用語は、適用可能であれば、以下に限定されないが、例えば、転写、転写物プロセシング、翻訳ならびにタンパク質フォールディング、修飾およびプロセシングを含むＲＮＡおよびタンパク質の産生、ならびに必要に応じてタンパク質の分泌に関与する細胞プロセスを指す。「発現産物」は、遺伝子から転写されたＲＮＡ、および遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳によって得られたポリペプチドを含む。「遺伝子」という用語は、適切な調節配列に作動可能に連結した場合に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでＲＮＡに転写される核酸配列（ＤＮＡ）を意味する。遺伝子は、コード領域の前および後の領域、例えば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）または「リーダー」配列および３’ＵＴＲまたは「トレーラー」配列、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）の間に介在配列（イントロン）を含んでも含まなくてもよい。
【０１６２】
組込みベクターは、宿主細胞の染色体中に永続的に組み込まれた、それらの送達されたＲＮＡ／ＤＮＡを有する。非組込みベクターはエピソームのままであり、その中に含有される核酸は宿主細胞の染色体中に組み込まれていないことを意味する。組込みベクターの例としては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ハイブリッドアデノウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられる。
【０１６３】
非組込みベクターの一例は、非組込みウイルスベクターである。非組込みウイルスベクターは、それらがそのゲノムを宿主ＤＮＡ中に導入しないため、組込みレトロウイルスによってもたらされるリスクを排除する。一例は、エプスタインバーｏｒｉＰ／核抗原−１（「ＥＢＮＡ１」）ベクターであり、これは、自己複製の制限が可能であり、哺乳動物細胞において機能することが公知である。エプスタイン−バーウイルス由来の２つのエレメントｏｒｉＰおよびＥＢＮＡ１を含有するため、ＥＢＮＡ１タンパク質のウイルスレプリコン領域ｏｒｉＰへの結合によって、哺乳動物細胞のプラスミドについて、比較的長期間のエピソームの存在が維持される。ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１ベクターのこの特定の特色は、組込みを含まない細胞の生成に関して理想的となる。別の非組込みウイルスベクターは、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
【０１６４】
別の非組込みウイルスベクターは、ＲＮＡセンダイウイルスベクターであり、これは、感染細胞の核に侵入することなくタンパク質を産生することができる。Ｆ欠損センダイウイルスベクターは、２、３回の継代の間、感染細胞の細胞質中に残るが、迅速に希釈され、いくつかの継代（例えば、１０回の継代）後には完全に失われる。
【０１６５】
非組込みベクターの別の例は、ミニサークルベクターである。ミニサークルベクターは、真核生物プロモーターおよび発現されるべきｃＤＮＡ（複数可）のみを残してプラスミド骨格が放出された環状ベクターである。
【０１６６】
本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも１つのエレメントを含み、ウイルスベクター粒子中にパッケージングされる能力を有する、核酸ベクター構築物を指す。ウイルスベクターは、非必須ウイルス遺伝子の代わりに、本明細書に記載されているポリペプチドをコードする核酸を含有することができる。ベクターおよび／または粒子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで、核酸を細胞中に移入するために利用することができる。ウイルスベクターの多数の形態が、当技術分野で公知である。
【０１６７】
これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、薬剤は、ＣＸＣＲ６＋病原性ＣＤ４細胞に結合するポリペプチドに結合させることができ、例えば、薬剤をＣＸＣＲ６＋病原性ＣＤ４細胞に向かわせることができる。例えば、ＣＸＣＲ６リガンド、例えば、ＣＸＣＬ１６またはその機能的断片（例えば、最低でも、ＣＸＣＲ６またはその一部に結合するが、走化性を誘導しない断片）をコードするポリペプチドは、小分子に結合させて、小分子をＣＸＣＲ６発現細胞に向かわせることができる。これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、薬剤は、非活性化ＣＸＣＲ６リガンドをコードするポリペプチドに結合させる。これらの態様のうちのいずれかの別の実施形態では、毒素は、ＣＸＣＲ６＋病原性ＣＤ４細胞に結合するポリペプチド、またはその機能的断片に結合させることができ、毒素をＣＸＣＲ６発現細胞に向かわせることができる。ペプチドのＣＸＣＲ６への結合によって、受容体の活性化が誘導されない、例えば、その結合は走化性を誘導しないことが、本明細書において特に企図される。
【０１６８】
本明細書において提供される薬剤はまた、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＥＰ１００３５４６Ｂ１；ＵＳ７９３１９００Ｂ２；ＵＳ８８１５２３６Ｂ２；ＵＳ６３２９４９９Ｂ１；ＵＳ６９３６５９９Ｂ２；ＵＳ６４９５５７９Ｂ１；ＵＳ８３９９５１４Ｂ２；ＵＳ７３２０９９９Ｂ２；ＥＰ０９４１０８９Ｂ１；ＥＰ０９６６３００Ｂ１；ＵＳ９８２２４００Ｂ２；ＵＳ９５４６２１２Ｂ２；ＵＳ２０１７０２５３６５１Ａ１に記載されているものを含むかまたはこれらと組み合わせて使用することができる。
医薬組成物
【０１６９】
これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、本明細書に記載の薬剤は、医薬組成物と共に製剤化される。
【０１７０】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、有効成分（例えば、ＣＸＣＲ６に対する抗体）と組み合わせた場合に、この成分に生物活性を保持させ、対象の免疫系と非反応性である任意の材料または物質を含み得る。例としては、以下に限定されないが、リン酸緩衝食塩水溶液、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、および様々な種類の湿潤剤など、標準的な薬学的担体のいずれかが挙げられる。「薬学的に許容される」という語句は、本明細書において、妥当なベネフィット／リスク比に相応し、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、健全な医学的判断の範囲内で、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに好適である、これらの化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために用いられる。
【０１７１】
「薬学的に許容される担体」という語句は、本明細書で使用される場合、１つの器官、または体の部分から、別の器官、または体の部分へと主題の薬剤を運ぶまたは輸送することに関与する、液体もしくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料などの薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクルを意味する。「薬学的に許容される担体」という用語は、組織培養培地を除外する。各担体は、製剤の他の成分と適合するという意味で「許容される」ものでなければならず、例えば、担体は、処置の際の薬剤の影響を低下させない。言い換えれば、担体は、薬学的に不活性である。「生理学的に認容できる担体」および「生体適合性送達ビヒクル」という用語は、交換可能に使用される。医薬担体の非限定的な例としては、ナノ粒子、マイクロ粒子、ポリマーマイクロスフィア、またはポリマー−薬物コンジュゲートなどの粒子またはポリマーベースのビヒクルが挙げられる。
【０１７２】
一部の実施形態では、医薬組成物は、液体剤形または固体剤形である。経口投与用の液体剤形としては、以下に限定されないが、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤が挙げられる。さらに、液体剤形は、当技術分野において通常使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカーボネート、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物などを含有し得る。不活性希釈剤の他に、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味料、香味剤、ならびに香料などのアジュバントも含んでもよい。
【０１７３】
経口投与用の固体剤形としては、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、および顆粒剤が挙げられる。このような固体剤形では、本明細書に記載の薬剤は、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウムならびに／またはａ）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸などの充填剤もしくは増量剤、ｂ）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、およびアカシアなどの結合剤、ｃ）グリセロールなどの保湿剤、ｄ）寒天−寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のシリケート、および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、ｅ）パラフィンなどの溶解遅延剤、ｆ）第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、ｇ）例えば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレートなどの湿潤剤、ｈ）カオリンおよびベントナイトクレーなどの吸収剤、ならびにｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムなどの滑沢剤、ならびにこれらの混合物などの少なくとも１種類の不活性な薬学的に許容され得る賦形剤または担体と混合される。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合には、剤形は緩衝剤も含んでもよい。
【０１７４】
類似の種類の固体組成物はまた、ラクトースまたは乳糖のような賦形剤だけでなく、高分子量ポリエチレングリコールなどを使用する軟質および硬質充填ゼラチンカプセルにおいて、充填剤として用いることもできる。錠剤、ドラジェ、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤という固体剤形は、腸溶性コーティングおよび製薬分野で周知である他のコーティングなどのコーティングおよびシェルを用いて調製することができる。これらは、必要に応じて、乳白剤を含有してもよく、また、腸管のある特定の部分において、必要に応じて、遅延様式で、有効成分（複数可）のみ、または優先的にそれを放出するような組成のものであってもよい。使用され得る包埋組成物の例として、ポリマー物質およびロウが挙げられる。類似の種類の固体組成物はまた、ラクトースまたは乳糖のような賦形剤だけでなく、高分子量ポリエチレングリコールなどを使用する軟質および硬質充填ゼラチンカプセルにおいて、充填剤として用いることもできる。
【０１７５】
薬剤は、上記のような１つまたは複数の賦形剤と共にマイクロカプセル化形態であってもよい。錠剤、ドラジェ、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤という固体剤形は、腸溶性コーティング、放出制御コーティングおよび製薬分野で周知である他のコーティングなどのコーティングおよびシェルを用いて調製することができる。このような固体剤形では、薬剤は、スクロース、ラクトースおよびデンプンなどの少なくとも１つの不活性希釈剤と共に混合することができる。このような剤形は、通常の慣行でのように、不活性希釈剤以外の追加の物質、例えば、ステアリン酸マグネシウムおよび微結晶セルロースなどの錠剤化滑沢剤および他の錠剤化補助剤も含み得る。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合には、剤形は緩衝剤も含んでもよい。これらは、必要に応じて、乳白剤を含有してもよく、また、腸管のある特定の部分において、必要に応じて、遅延様式で、有効成分（複数可）のみ、または優先的にそれを放出するような組成のものであってもよい。使用され得る包埋組成物の例として、ポリマー物質およびロウが挙げられる。
【０１７６】
経口投与に好適な医薬組成物を含む製剤は、それぞれ所定量の活性化合物を含有する、錠剤、カプセル剤、カシェ剤、シロップ剤、エリキシル剤、調理済みの食品、マイクロエマルジョン、液剤、懸濁剤、ロゼンジ剤、もしくはゲルコーティングされたアンプルなどの別個の単位として；散剤もしくは顆粒剤として；水性もしくは非水性の液体中の液剤もしくは懸濁剤として；または水中油型もしくは油中水型のエマルジョンとして提供されてもよい。
【０１７７】
したがって、直腸投与に好適な製剤としては、ゲル剤、クリーム剤、ローション剤、水性または油性の懸濁剤、分散性の散剤または顆粒剤、エマルジョン、溶解性固体材料、注水（douche）などが使用されてもよい。これらの製剤は、好ましくは、坐剤基剤を形成する１つまたは複数の固体担体、例えば、カカオ脂中に有効成分を含む単位用量坐剤として提供される。このような製剤に好適な担体としては、石油ゼリー、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、およびこれらの組合せが挙げられる。あるいは、結腸または直腸投与のために、本開示の迅速再定着展開剤（ｒａｐｉｄ  ｒｅｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｄｅｐｌｏｙｍｅｎｔ  ａｇｅｎｔ）を用いた結腸洗浄液を製剤化してもよい。
投与
【０１７８】
これらの態様のうちのいずれかの一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載されているＣＸＣＲ６を標的とする薬剤を投与するステップを含む、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症）を有するかまたは有すると診断された対象を処置することに関する。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載されているセルピンＢ１を阻害する薬剤を投与するステップを含む、自己免疫疾患を有するかまたは有すると診断された対象を処置することに関する。自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症）を有する対象は、状態を診断する現在の方法を使用して医師によって特定することができる。自己免疫疾患を特徴付け、かつ診断の助けとなる、この疾患の症状および／または合併症は、当技術分野で周知であり、以下に限定されないが、かすみ目もしくは複視、協調運動の喪失、筋振戦、または手足のしびれを含む。例えば、自己免疫疾患の診断の助けとなり得る試験としては、以下に限定されないが、脳内の病変を探すためのＭＲＩが挙げられ、所与の自己免疫疾患に対して当技術分野で公知である。自己免疫疾患の家族歴もまた、対象が状態を有する可能性があるかどうかを決定するか、または自己免疫疾患の診断を行う際の助けとなる。
【０１７９】
本明細書に記載の薬剤（例えば、ＣＸＣＲ６を標的とする薬剤、またはセルピンＢ１を阻害する薬剤）は、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症）を有するかまたは有すると診断された対象に投与することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、自己免疫疾患の少なくとも１つの症状を軽減するために、有効量の薬剤を対象に投与するステップを含む。本明細書で使用される場合、「自己免疫疾患の少なくとも１つの症状を軽減すること」は、自己免疫疾患に関連するいずれかの状態または症状（例えば、筋振戦、膀胱の問題、手足のしびれ、複視）を軽快することである。同等の未処置の対照と比較した場合、このような低減は、いずれかの標準的技法によって測定した場合、少なくとも５％、１０％、２０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれより多くである。本明細書に記載の薬剤を対象に投与するための種々の手段は、当業者に公知である。これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、薬剤は、全身的または局所的に（例えば、脳、または他の罹患した器官、例えば、結腸に）投与される。
【０１８０】
これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、薬剤は、静脈内に投与される。これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、薬剤は、連続的に、間隔を空けて、または散発的に投与される。薬剤の投与経路は、送達される薬剤の種類（例えば、抗体、小分子、ＲＮＡｉ）に対して最適化され、熟練した開業医によって決定され得る。
【０１８１】
「有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、自己免疫疾患の少なくとも１つまたは複数の症状を軽減するために必要とされる、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症）を有するかまたは有すると診断された対象に投与され得る薬剤（例えば、ＣＸＣＲ６を標的とする薬剤、またはセルピンＢ１を阻害する薬剤）の量を指す。したがって、「治療有効量」という用語は、典型的な対象に投与された場合に、特定の抗自己免疫疾患作用をもたらすのに十分である薬剤の量を指す。様々な文脈において、有効量は、本明細書で使用される場合、自己免疫疾患の症状の発症を遅延させる、自己免疫疾患の症状の経過を変更する（例えば、筋振戦、膀胱の問題、手足のしびれ、複視の進行を緩徐化する）、または自己免疫疾患の症状を回復させる（例えば、視力の矯正、筋振戦の停止、または膀胱の問題の修正）のに十分な薬剤の量を含むはずである。よって、正確な「有効量」を特定することは、一般的には実行可能ではない。しかし、いずれかの所与の場合には、適切な「有効量」は、日常的な実験のみを使用して、当業者によって決定され得る。
【０１８２】
これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、薬剤は、連続的に投与される（例えば、一定期間をかけて一定のレベルで）。薬剤の連続的投与は、例えば、表皮パッチ、連続放出製剤、またはオンボディインジェクターによって達成することができる。
【０１８３】
有効量、毒性、および治療有効性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学の手順によって評価することができる。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて変化し得る。毒性作用と治療効果の間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。大きな治療指数を呈する組成物および方法が好ましい。治療有効用量は、最初に、細胞培養アッセイから推定することができる。また、用量は、動物モデルで製剤化され、細胞培養において、または適切な動物モデルにおいて決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する薬剤の濃度）を含む、循環血漿中濃度範囲を達成することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。いずれかの特定の投与量の効果は、好適なバイオアッセイ、例えば、とりわけ、神経学的機能を測定すること、または血液検査によって、モニターすることができる。投与量は、医師によって決定され、必要であれば、観察された処置の効果に適合するように調整することができる。
投与量
【０１８４】
「単位剤形」は、この用語が本明細書において使用される場合、好適な１回の投与のための投与量を指す。例として、単位剤形は、送達デバイス、例えば、シリンジまたは点滴静注バック内に配置される治療薬の量であってもよい。これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、単位剤形は、単回投与で投与される。別の実施形態では、２つ以上の単位剤形が同時に投与されてもよい。
【０１８５】
本明細書に記載されている薬剤の投与量は、医師によって決定され、必要であれば、観察された処置の効果に適合するように調整することができる。処置の持続期間および頻度に関して、処置が治療利益をもたらしている時点を決定するため、およびさらなる細胞を投与するかどうか、処置を中止するかどうか、処置を再開するかどうか、または処置レジメンに対して他の変更を行うかどうかを決定するために、対象をモニターすることは、熟練の臨床医にとって典型的なことである。投与量は、サイトカイン放出症候群などの有害な副作用を引き起こすほど多量であるべきではない。一般的に、投与量は、患者の年齢、状態、および性別に関して変動し、当業者によって決定され得る。投与量は、いずれかの合併症事象では個々の医師によって調整されてもよい。
【０１８６】
有効用量は、最初に、細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、動物に処方されてもよい。一般的に、本明細書において、本開示の化合物は、１μｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ；１μｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ；１μｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの用量で使用されるかまたは与えるように、組成物を投与する。ここで与えられる範囲は、すべての中間の範囲を含む、例えば、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇという範囲は、１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜４ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜６ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜７ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜９ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇなどを含むことが理解されるべきである。約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または０．５ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇの用量（ボーラスまたは連続注入のいずれか）がさらに企図される。上記で与えられた範囲の中間範囲もこの開示の範囲内であることがさらに理解されるべきである：例えば、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲において、例えば、２ｍｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ〜７ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ〜６ｍｇ／ｋｇなどの使用範囲または用量範囲。
併用療法
【０１８７】
これらの態様のうちのいずれかの一実施形態では、本明細書に記載の薬剤は、単剤療法として使用される。これらの態様のうちのいずれかの別の実施形態では、本明細書に記載の薬剤は、自己免疫疾患に対する他の公知の薬剤および療法と組み合わせて使用することができる。「組み合わせて」投与されるとは、本明細書で使用される場合、障害を有する対象の苦痛の過程で、２つの（またはそれより多い）異なる処置が対象に送達されること、例えば、２つまたはそれより多い処置が、対象が障害（自己免疫疾患）を有すると診断された後でかつ、障害が治癒もしくは排除されるか、または処置が他の理由で終了する前に送達されることを意味する。一部の実施形態では、１つの処置の送達は、２回目の送達が開始するときに依然として行われており、その結果、投与に関して重複している。これは、本明細書において、「同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）」または「併用送達（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」と称されることがある。他の実施形態では、１つの処置の送達は、他の処置の送達が開始される前に終了する。いずれかの場合の一部の実施形態では、処置は、組み合わされた投与のためにより効果的である。例えば、２回目の処置はより効果的であり、例えば、より少ない２回目の処置により同等の効果が見られるか、または２回目の処置は、２回目の処置が１回目の処置の非存在下で投与されるか、もしくは１回目の処置により類似の状況が見られる場合に見られるはずのものよりも高い程度に症状を低減する。一部の実施形態では、送達は、症状、または障害に関連する他のパラメーターの低減が、一方の処置が他方の処置の非存在下で送達されることにより観察されるものよりも大きくなるようなものである。２つの処置の効果は、部分的に相加的であるか、全体的に相加的であるか、または相加的であるよりも大きい場合がある。送達は、送達される１回目の処置の効果が２回目の処置を送達したときに依然として検出可能であるようなものであってもよい。本明細書に記載の薬剤および少なくとも１つの追加の療法は、同一組成物中もしくは別々の組成物中で同時に、または逐次的に投与されてもよい。逐次的投与では、本明細書に記載の薬剤が１回目に投与されてもよく、追加の薬剤が２回目に投与されてもよく、または投与の順序が逆転してもよい。薬剤および／または他の治療剤、手順もしくはモダリティは、活動性障害の期間中、または寛解期もしくは活動性の低い疾患の期間中に投与されてもよい。薬剤は、別の処置の前、処置と併せて、処置後、または障害の寛解中に投与されてもよい。
【０１８８】
自己免疫疾患を処置するために現在使用されている治療としては、以下に限定されないが、ミトキサントロン、インターフェロンβ１ａ療法、ペグインターフェロンベータ１ａ、アザチオプリン、フィンゴリモド、ナタリズマブ、グラチラマー、ステロイド（例えば、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、ブデソニド）、鎮痛剤および抗炎症薬（例えば、カプサイシン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、メサラミン）、スルファサラジン、オキシコドン、メトトレキサート、アザチオプリン、アダリムマブ、インフリキシマブ、メルカプトプリン、ヒドロキシクロロキン、抗生剤（例えば、クリンダマイシン、メトロニダゾール、アミノサリチル酸、ペニシリン）、ビタミン類（ビタミンＤ、ビタミンＢ１２）、免疫抑制剤、ミコフェノレート、ＦＫ５０６、抗体、ＣＡＭＰＡＴＨなどの免疫除去剤、抗ＣＤ３抗体もしくは他の抗体療法、サイトキシン、フルダラビン、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、または参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Izumoto  et  al.  2008  J  Neurosurg  108:963-971に記載されているものなどのペプチドワクチンが挙げられる。
【０１８９】
組み合わせて投与される場合、薬剤および追加の薬剤（例えば、第２または第３の薬剤）、またはそのすべては、個々に、例えば、単剤療法として使用される各薬剤の量または投与量よりも多い、少ないまたは同じ量または用量で投与することができる。ある特定の実施形態では、薬剤、追加の薬剤（例えば、第２または第３の薬剤）、またはそのすべての投与される量または投与量は、個々に使用される各薬剤の量または投与量よりも少ない（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％）。他の実施形態では、所望の効果（例えば、自己免疫疾患の処置）をもたらす薬剤、追加の薬剤（例えば、第２または第３の薬剤）、またはそのすべての量または投与量は、同じ治療効果を達成するために個々に必要とされる各薬剤の量または投与量よりもより少ない（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％少ない）。
非経口剤形
【０１９０】
本明細書に記載の薬剤の非経口剤形は、以下に限定されないが、皮下、静脈内（ボーラス注射を含む）、筋肉内、および動脈内を含む様々な経路で対象に投与することができる。非経口剤形の投与は、典型的には、汚染物質に対する患者の天然の防御を回避するため、非経口剤形は、好ましくは、滅菌されているかまたは患者に投与される前に滅菌されることが可能である。非経口剤形の例としては、以下に限定されないが、注射の準備ができている液剤、注射用の薬学的に許容されるビヒクルに溶解または懸濁させられる準備ができている乾燥製品、注射の準備ができている懸濁剤、制御放出非経口剤形、およびエマルジョンが挙げられる。
【０１９１】
「非経口投与」および「非経口投与される」という語句は、本明細書で使用される場合、通常は、注射による、経腸および局所投与以外の投与方式を意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、および胸骨内の注射、注入および他の注射または注入技術含むが、限定されない。限定されないが、経口投与は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出製剤、洗口薬、散剤などの形態であってもよい。
【０１９２】
本開示の非経口剤形を提供するために使用することができる好適なビヒクルは、当業者に周知である。例としては、限定されないが、滅菌水；注射用水ＵＳＰ；食塩水溶液；グルコース溶液；水性ビヒクル、例えば、以下に限定されないが、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、ならびに乳酸リンゲル注射液；水混和性ビヒクル、例えば、以下に限定されないが、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコール；ならびに非水性ビヒクル、例えば、以下に限定されないが、コーン油、綿実油、ラッカセイ油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、および安息香酸ベンジルが挙げられる。
制御放出剤形および遅延放出剤形
【０１９３】
本明細書に記載の態様のうちのいずれかの一部の実施形態では、薬剤は、制御放出手段または遅延放出手段によって対象に投与される。理想的には、医学的処置において最適に設計された制御放出調製物の使用は、最低限の時間量で、状態を治癒または制御するために用いられている最小限の薬物物質によって特徴付けられる。制御放出製剤の利点としては、１）薬物の活性の延長；２）投薬頻度の低減；３）患者コンプライアンスの増加；４）薬物全使用量の減少；５）局所副作用または全身副作用の低減；６）薬物蓄積の最小化；７）血中レベル変動の低減；８）処置有効性の改善；９）薬物活性の増強または損失の低減；および１０）疾患または状態の制御速度の改善が挙げられる。（Kim,  Cherng-ju,  Controlled  Release  Dosage  Form  Design,  2  (Technomic  Publishing,  Lancaster,  Pa.:  2000）)。制御放出製剤を使用して、式（Ｉ）の化合物の作用の開始、作用の持続期間、治療域内の血漿レベル、およびピーク血中レベルを制御することができる。特に、制御放出または徐放性剤形または製剤を使用して、薬物を過小投与すること（すなわち、最小治療レベルを下回る）および薬物の毒性レベルを超えることのどちらからも起こり得る、潜在的な有害作用および安全性の問題を最小限に抑えると同時に、薬剤の最大限の有効性が達成されることを確実にすることができる。
【０１９４】
種々の公知の制御放出剤形または徐放性剤形、製剤、およびデバイスは、本明細書に記載の任意の薬剤と共に使用するために適応させることができる。例としては、以下に限定されないが、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第３，８４５，７７０号；第３，９１６，８９９号；第３，５３６，８０９号；第３，５９８，１２３号；第４，００８，７１９号；第５６７４，５３３号；第５，０５９，５９５号；第５，５９１，７６７号；第５，１２０，５４８号；第５，０７３，５４３号；第５，６３９，４７６号；第５，３５４，５５６号；第５，７３３，５６６号；および第６，３６５，１８５号に記載されているものが挙げられる。これらの剤形を使用して、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過性膜、浸透システム（ＯＲＯＳ（登録商標）（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡ）など）、多層コーティング、微粒子、リポソーム、もしくはマイクロスフィアまたはこれらの組合せを使用して、様々な比率の所望の放出プロファイルを提供する、１つまたは複数の有効成分の緩徐性放出または制御放出を提供することができる。さらに、イオン交換材料を使用して、本開示の化合物の固定した、吸着塩形態を調製することができ、よって、薬物の制御送達がもたらされる。具体的な陰イオン交換体の例としては、以下に限定されないが、ＤＵＯＬＩＴＥ（登録商標）Ａ５６８およびＤＵＯＬＩＴＥ（登録商標）ＡＰ１４３（Ｒｏｈｍ＆Ｈａａｓ、Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈｏｕｓｅ、Ｐａ．ＵＳＡ）が挙げられる。
有効性
【０１９５】
例えば、自己免疫疾患の処置のための、本明細書に記載の薬剤の有効性は、熟練した開業医によって決定され得る。しかし、処置は、この用語が本明細書で使用される場合、自己免疫疾患の兆候または症状のうちの１つもしくは複数が有益に変更されるか、他の臨床的に容認される症状が改善されるか、もしくは軽快される場合でも、または例えば、本明細書に記載の方法に従う処置後に少なくとも１０％、所望の応答が誘導される場合に、「有効な処置」と考えられる。有効性は、例えば、本明細書に記載の方法に従って処置された状態のマーカー、指標、症状、および／もしくは発生率、または視力、膀胱の機能、筋肉の安定性、および手足の感覚などの適切な任意の他の測定可能なパラメーターを測定することによって評価することができる。有効性はまた、入院により評価される場合に個体の悪化が起きないこと、または医学的介入の必要性（すなわち、筋振戦、膀胱の問題、手足のしびれ、複視の進行）により測定することができる。これらの指標を測定する方法は、当業者に公知であり、かつ／または本明細書に記載されている。
【０１９６】
有効性は、本明細書に記載の状態の動物モデル、例えば、場合に応じて、自己免疫疾患または炎症性疾患のマウスモデルまたは適切な動物モデルで評価することができる。実験的動物モデルを使用する場合、処置の有効性は、マーカーの統計的に有意な変化が観察される（例えば、筋振戦、膀胱の問題、手足のしびれ、複視の緩徐化）場合に証明される。
【０１９７】
特定されたすべての特許、特許出願、および刊行物は、例えば、本発明と関連して使用され得るこのような刊行物に記載されている方法論を説明および開示するために、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの刊行物は、本発明の出願日の前の開示に対してのみ提供される。この点について、いかなるものも、本発明者らが、先行する発明のためにまたはいずれかの他の理由のために、このような開示に先行する権利を与えられていないことの自認として解釈されるべきではない。これらの文書の日付または内容についての表示に関するすべての記載は、出願人に利用可能な情報に基づくものであり、これらの文書の日付または内容の正確さについてのいかなる自認も構成しない。
【０１９８】
本明細書に記載の様々な態様の一部の実施形態は、以下のパラグラフのように記載することができる。
１．  自己免疫疾患を処置するための方法であって、ＣＸＣＲ６を標的とする薬剤を、自己免疫疾患を有する対象に投与するステップを含み、ＣＸＣＲ６を標的とすることは、ＣＸＣＲ６を発現する細胞またはその集団の枯渇をもたらす、方法。
２．  自己免疫疾患を処置するための方法であって、セルピンＢ１を阻害する薬剤を、自己免疫疾患を有する対象に投与するステップを含む方法。
３．  前記細胞集団を、適切な対照と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれより多く枯渇させる、項１に記載の方法。
４．  前記細胞集団が、Ｔｈ１７細胞集団またはＴｈ１７由来細胞集団である、項１に記載の方法。
５．  ＣＸＣＲ６を標的とする前記薬剤が、少なくとも第２の薬剤に連結している、項１に記載の方法。
６．  前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、クローン病、ループス、セリアック病、シェーグレン症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性硬化症、強直性脊椎炎、１型糖尿病、円形脱毛症、血管炎、自己免疫性ブドウ膜炎、若年性特発性関節炎、および側頭動脈炎からなるリストから選択される、項１〜２に記載の方法。
７．  前記自己免疫疾患が、多発性硬化症である、項１〜２に記載の方法。
８．  前記対象が、ヒトである、項１〜２に記載の方法。
９．  ＣＸＣＲ６を標的とする前記薬剤が、小分子、抗体、およびペプチドからなる群から選択される、項１に記載の方法。
１０．  セルピンＢ１を阻害する前記薬剤が、小分子、抗体、ペプチド、ゲノム編集系、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＲＮＡｉからなる群から選択される、項２に記載の方法。
１１．  抗体が、枯渇抗体である、項８〜９に記載の方法。
１２．  前記ＲＮＡｉが、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡである、項９に記載の方法。
１３．  セルピンＢ１を阻害することは、セルピンＢ１の発現レベルおよび／または活性を阻害することである、項２に記載の方法。
１４．  セルピンＢ１の発現レベルおよび／または活性が、適切な対照と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれより多く阻害される、項１２に記載の方法。
１５．  Ｔｈ１７細胞またはＴｈ１７由来細胞の集団を選択するための方法であって、候補細胞の集団においてＣＸＣＲ６のレベルを測定するステップと、ＣＸＣＲ６の発現を呈する細胞を選択するステップとを含む方法。
１６．  ＣＸＣＲ６のレベルが、参照レベルと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、またはそれより高い倍率で増加する、項１４に記載の方法。
１７．  自己免疫疾患を処置する方法であって、
ａ．適切な対照と比較して、対象由来の生体試料中のＣＸＣＲ６レベルの増加を示すアッセイの結果を受容するステップと、
ｂ．セルピンＢ１のレベルまたは活性を阻害する薬剤を前記対象に投与するステップと
を含む方法。
１８．  前記アッセイが、フローサイトメトリー、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮＡシーケンシング、または免疫組織化学である、項１７に記載の方法。
１９．  前記対象が、自己免疫疾患を有していると疑われているか、または自己免疫疾患を有する、項１７に記載の方法。
２０．  対象のＴｈ１７細胞によって発現されるセルピンＢ１レベルを検出するステップと、適切な対照と比較して、セルピンＢ１レベルの増加を示すアッセイの結果を受容するステップとをさらに含む、項１７に記載の方法。
２１．  前記対象における、パーフォリン−Ａ、グランザイムＡ（ＧｚｍＡ）、ＧｚｍＣ、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）、ＩＬ−６、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、インターロイキン−２３受容体（ＩＬ−２３Ｒ）、ＩＬ−７ＲαおよびＩＬ−１Ｒ１、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、ＲＡＲ関連オーファン受容体Ｃ（Ｒｏｒｃ）、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のうちの１つまたは複数のレベルを検出するステップをさらに含む、項１７に記載の方法。
２２．  脊髄における白血球の蓄積を検出するステップをさらに含む、項１７に記載の方法。
２３．  前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、クローン病、ループス、セリアック病、シェーグレン症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性硬化症、強直性脊椎炎、１型糖尿病、円形脱毛症、血管炎、自己免疫性ブドウ膜炎、若年性特発性関節炎、および側頭動脈炎からなる群から選択される、項１７に記載の方法。
２４．  前記自己免疫疾患が、多発性硬化症である、項１７に記載の方法。
２５．  前記対象が、ヒトである、項１７に記載の方法。
２６．  ステップ（ａ）のアッセイの結果を受容する前に、前記対象から生体試料を得る、項１７に記載の方法。
２７．  前記生体試料が、滑液、脊髄液、組織、または血液である、項１７に記載の方法。
２８．  ＣＸＣＲ６を発現するＴ細胞の集団を減少させる方法であって、白血球におけるセルピンＢ１のレベルまたは活性を低下させる薬剤を投与するステップを含む方法。
２９．  白血球におけるセルピンＢ１のレベルまたは活性を前記低下させることが、セルピンＢ１の阻害剤を投与することを含む、項２８に記載の方法。
３０．  前記Ｔ細胞集団が、適切な対照と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれより多く枯渇される、項２８に記載の方法。
３１．  前記Ｔ細胞集団が、Ｔｈ１７細胞集団またはＴｈ１７由来細胞集団である、項２８に記載の方法。
３２．  セルピンＢ１のレベルまたは活性を前記低下させることが、自己免疫疾患に対する処置を必要とする対象におけるものである、項２８に記載の方法。
３３．  前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、クローン病、ループス、セリアック病、シェーグレン症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性硬化症、強直性脊椎炎、１型糖尿病、円形脱毛症、血管炎、自己免疫性ブドウ膜炎、若年性特発性関節炎、および側頭動脈炎からなる群から選択される、項３２に記載の方法。
３４．  前記自己免疫疾患が、多発性硬化症である、項３２に記載の方法。
３５．  前記薬剤が、小分子、抗体、ペプチド、ゲノム編集系、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＲＮＡｉからなる群から選択される、項２８に記載の方法。
３６．  前記抗体が、枯渇抗体である、項３５に記載の方法。
３７．  前記ＲＮＡｉが、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡである、項３５に記載の方法。
３８．  セルピンＢ１の前記レベルおよび／または活性が、適切な対照と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれより多く阻害される、項２８に記載の方法。
３９．  前記投与するステップが、炎症を阻害する、項２８に記載の方法。
４０．  前記投与するステップが、脊髄における白血球の蓄積を阻害する、項２８に記載の方法。
【０１９９】
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態および態様を例証する。様々な修正、付加、置換などを本発明の趣旨または範囲を変更することなく実施することができ、このような修正および変更は、以下の特許請求の範囲に定義される通り、本発明の範囲内に包含されることが関連する技術分野の当業者にとっては明らかである。以下の実施例は、決して、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０２００】
（実施例１）
ＣＤ４細胞のＳＢ１は、ＣＮＳにおける病原性細胞の蓄積に極めて重要な遅発ステップを実行する
粘膜表面では、ＩＬ−１７＋ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１７細胞）ならびにサイトカインＩＬ−１７およびＩＬ−２２が、真菌および細菌の感染からの保護をもたらすが、自己免疫の状況では、Ｔｈ１７細胞が、ＩＦＮγおよびＧＭ−ＣＳＦを産生し、多発性硬化症（ＭＳ）の病原体である多機能細胞（ｅｘ−Ｔｈ１７、Ｔｈ１７／Ｔｈ１、非古典的Ｔｈ１細胞とも称される）へと変換される。本明細書に記載の研究では、多機能ＣＤ４  Ｔ細胞集団がＭＳにおいて生じ、拡大する際に、中枢神経系（ＣＮＳ）に病原性Ｔ細胞として蓄積することが示される。野生型多機能ＣＤ４  Ｔ細胞の拡大を制御し、セルピンｂ１欠損Ｔｈ１７に由来する多機能細胞がＣＮＳにおいて病原性Ｔ細胞として拡大および蓄積するのを妨げる分子機序を記載するデータも本明細書において提供される。
【０２０１】
以前より、セルピンＢ１（ｓｂ１）は、（ｉ）プロテアーゼインヒビター、（ｉｉ）調節遺伝子のファミリーの古くからのメンバー、および（ｉｉｉ）上位のＴｈ１７シグネチャー遺伝子として定義されてきた。Ｔｈ１７細胞の生成は、セルピンＢ１によって負に調節されることが示された（Hou,  2015）。しかし、ＭＯＧによる免疫の際に、ｓｂ１−／−マウスはＥＡＥに対する抵抗性が高く（Hou,  2016）、疾患の減弱と一致し、ＣＮＳにおけるＣＤ４細胞の欠乏を有する。養子移入により、疾患の減弱とＣＮＳにおけるＣＤ４細胞の欠如の両方が、ＣＤ４  Ｔ細胞におけるｓｂ１の欠失によることが確立された。ＣＤ４細胞におけるｓｂ１の欠失が、ＩＬ−２３Ｒ、ＩＬ−１Ｒ、およびＩＬ−７Ｒの発現／応答性を変更せず、ＩＬ１７産生、抗原リコール応答、ＣＤ４細胞の増殖または代謝変化にも影響を及ぼさないことを示すデータも本明細書において示されている。これらのデータは、自己免疫Ｔｈ１７細胞生成の早期事象が、ｓｂ１欠損マウスにおいて正常に進行することを示す。このデータは、ＣＤ４細胞のｓｂ１が、ＣＮＳにおける病原性細胞の蓄積に極めて重要な遅発ステップを実行することを強く示す。
【０２０２】
上流のステップを排除した場合、疾患発症時のリンパ節におけるエフェクター（ＣＤ４４＋）ＣＤ４細胞が注目された。ｓｂ１欠損エフェクターＣＤ４細胞は、依然としてさらに分化して、ＩＦＮγ＋およびＧＭ−ＣＳＦ＋ＣＤ４細胞となる（これは病原性に必要とされる重要な機能である）が、これらの細胞数は、野生型マウスと比較して減少することが見出された。ｓｂ１欠損マウスにおける多機能エフェクターＣＤ４細胞は、野生型多機能ＣＤ４細胞の他のすべての特性を有するが、ＣＮＳにおいて相当数は蓄積せず、疾患を引き起こさないという発見は、ｓｂ１−／−  ＣＤ４エフェクター細胞とＷＴ  ＣＤ４エフェクター細胞の遺伝子発現の比較解析、特にそれらの異なる出現頻度を活用して、ＩＦＮγ＋ＧＭ−ＣＳＦ＋多機能ＣＤ４細胞において発現される他の遺伝子を同定し、ＥＡＥにおけるこれらの細胞の異なる運命をおそらく説明できることを示した。
【０２０３】
ＲＮＡシーケンシングを使用することによって、ＩＦＮγ＋細胞とＧＭ−ＣＳＦ＋細胞において共発現される追加の遺伝子が同定された。ＥＡＥの他のＣＤ４細胞には存在しないセリンプロテアーゼであるグランザイム、おそらくはグランザイム−Ｃ（ｇｚｍＣ）が、増殖誘導細胞死を媒介し、具体的には、セルピンＢ１によって阻害されることが見出された。ｓｂ１がｇｚｍＣを阻害するという発見および病原性ＣＤ４細胞が「多機能」である、すなわち、複数のサイトカイン、特にＧＭ−ＣＳＦを産生するだけでなく、「細胞溶解性の」顆粒を含有し、極端に急速に増殖し、かつ集団拡大の程度を決定する活性化誘導死の機序を自己調節するという発見も、本明細書において実証される。細胞死の機序によって、顆粒プロテアーゼとセルピンＢ１の対立する作用が、多機能病原性ＣＤ４細胞の拡大の程度を制御すると考えられる。
【０２０４】
重要なことに、ミエリンペプチドで免疫したマウスの細胞溶解性顆粒を含有し、複数のサイトカインを産生する病原性ＣＤ４細胞を特異的に「マークする」ケモカイン受容体ＣＸＣＲ６である表面タンパク質も同定した。
【０２０５】
ＭＳおよび他の自己免疫障害を有する対象における病原性ＣＤ４細胞を枯渇させる（例えば、死滅させる、またはその活性を中和する、または細胞を不活性化する）抗ヒトＣＸＣＲ６抗体を利用することが、本明細書において特に企図される。マウスモデルで研究した際に、ＣＸＣＲ６−／−動物は、ＣＸＣＲ６＋（野生型）マウスと同様にＥＡＥを発症し（Kim,  2009）、ＣＸＣＲ６が、ＥＡＥ疾患における走化性応答などのいずれの必要とされる機能も働かせないことを示す。よって、本明細書で提示したデータは、ＥＡＥにおけるＣＸＣＲ６が、完全に、細胞が直接的な研究および操作を受けることができるような、病原性ＣＤ４細胞の追跡可能なマーカーとしての役割を果たすことを示す。
【０２０６】
ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞がＥＡＥマウスの流入領域リンパ節におけるＣＤ４細胞全体の小さなサブセットであるが、脊髄に浸潤した主要なＣＤ４細胞であることが決定され、ＣＸＣＲ６が多機能病原性ＣＤ４細胞を同定することを示す。
【０２０７】
ＣＸＣＲ６＋病原性ＣＤ４  Ｔ細胞における重要なシグネチャー遺伝子によってコードされるタンパク質の機能的な関与が実証される。細胞死の誘導物質としての、細胞溶解性顆粒およびおそらくはグランザイムＣを含むそれらのグランザイムの関与ならびに細胞の生存を支持しかつ細胞死を防止するという反対の作用を有するセルピンＢ１の関与がＣＸＣＲ６＋病原性ＣＤ４細胞の拡大の程度を決定する細胞死機序を構成することを調査する。
【０２０８】
ＣＸＣＲ６は、マウスの遅延型過敏症（ＤＴＨ）のモデルにおいても、病原性ＣＤ４細胞の追跡可能なマーカーとしての役割を果たすことが本明細書において決定される。ＤＴＨ反応は、ＣＤ４細胞の活性化によって媒介され、関節リウマチ、多発性硬化症、接触性皮膚炎、炎症性腸疾患、自己免疫性心筋炎、１型糖尿病など多くの細胞免疫媒介性自己免疫応答のプロトタイプである。データは、セルピンｂ１−顆粒プロテアーゼ細胞死の機序ならびにサイズおよびそれによって病原性ＣＸＣＲ６＋集団の破壊能力を調節するセルピンＢ１の作用は、ＥＡＥ／ＭＳにおいて作動するだけでなく、他の自己免疫障害および自己免疫様傷害にも拡大する機序と一致して、ＤＴＨモデルにおいても作動することを示す。
【０２０９】
ＷＴ  Ｂ６マウスにＯＴ−ＩＩ細胞を移入し、次いでオボアルブミンペプチド（ＯＶＡ）で免疫される系を使用して、本明細書において提示されるデータは、ＣＸＣＲ６が、サイトカインＩＬ−１７およびＧＭ−ＣＳＦを産生する多機能ＯＴ−ＩＩ細胞を同定することを示す。これらのデータによって、ＣＸＣＲ６が、自己免疫の設定で、他のＴｈ１７に駆動される障害において多機能Ｔ細胞を広くマークすることが実証される。
【０２１０】
健康な対照の循環血液中でより少ない集団を表すヒトＣＸＣＲ６＋細胞が、自己免疫障害である関節リウマチを有する患者の炎症性滑液において多数存在すること、ならびにＣＸＣＲ６が、この自己免疫障害において、サイトカインＩＬ−１７、ＩＦＮγおよびＧＭ−ＣＳＦを産生する病原性ＣＤ４細胞を同定および定量するための追跡可能なマーカーとして使用するのに好適であることが、本明細書においてさらに決定される。
【０２１１】
アイソタイプ対照の抗体を除く、抗マウスＣＸＣＲ６モノクローナル抗体のミエリンペプチドで免疫したマウスへの送達によって、ＥＡＥ疾患の発症が防止されることが本明細書においてさらに決定される。疾患のすべての症状は、ＣＸＣＲ６抗体の処置によって防止される。
【０２１２】
ＥＡＥの症状を既に発症した（平均疾患スコアが２）マウスの、抗マウスＣＸＣＲ６抗体による処置によって、さらなる疾患の発症およびさらなる体重減少が完全に停止され、疾患症状が逆転することも本明細書において決定される。抗ＣＸＣＲ６抗体による処置後の疾患症状の非存在と一致して、処置したマウスは、脊髄中に病原性ＣＤ４細胞を蓄積することができない。
【０２１３】
どのように抗ＣＸＣＲ６抗体がＥＡＥを防止し、疾患の処置として有効であるかを説明するために、複数の機序が想定され得る。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ＣＸＣＲ６はケモカイン受容体であるため、ＣＸＣＲ６抗体が、ＣＸＣＲ６＋細胞の脊髄への化学誘引をブロックし、それによって疾患をブロックすると仮定することができる。そうであれば、抗ＣＸＣＲ６抗体による有効な処置により、リンパ節に残っている標的細胞の数は増加すると予想される。しかし、抗マウスＣＸＣＲ６抗体により、２４時間、ＥＡＥのモデルマウスを処置したところ、リンパ節におけるＩＬ−１７＋ＧＭ−ＣＳＦ＋ＣＤ４細胞およびＧＭ−ＣＳＦ単一陽性のＣＤ４細胞の数は増加することができないだけでなく、実際に減少したことが本明細書において決定される。これらのデータによって、脊髄への化学誘引のブロッキングをもたらす機序モデルが排除される。むしろ、データは、抗ＣＸＣＲ６抗体が、多機能Ｔ細胞の枯渇の原因となる簡単な機序を示す。
【０２１４】
本明細書に提示される発見によって、病原性ＣＤ４細胞が直接的な詳細な分子の特徴付けおよび操作を受けることを可能にすることによって、新たな研究領域を開いた。ＣＸＣＲ６の発現とセルピンＢ１に調節される事象は、ＥＡＥ病理発生の非常に遅い段階で生じ、したがって、ＭＳにおいてこの経路を標的とすることは、他の保護的なＣＤ４細胞の機能に有害な影響を及ぼさないことが重要である。例えば、真菌および細菌による感染からのＴｈ１７に媒介される保護は、影響を受けないと予想される。最後に、これらの提案される知見は、ＭＳに関連するだけでなく、他の侵襲性の自己免疫障害にも関連する。
（実施例２）
ＣＸＣＲ６の発現およびセルピンＢ１がＥＡＥの病理発生を調節する
【０２１５】
図１Ａおよび１Ｂは、Ｔｈ１７細胞のシグネチャー遺伝子（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅ）であるセルピンｂ１（Ｓｂ１）（プロテアーゼインヒビター）を示すデータを表す。（図１Ａ）Ｔｈ１７細胞におけるセルピンＢ１のレベルを示すウエスタンブロット。（図１Ｂ）ＥＡＥマウス（１０日目）とナイーブマウス（０日目）のエフェクターＣＤ４細胞における指定した遺伝子のｍＲＮＡレベル。
【０２１６】
図２Ａおよび２Ｂは、セルピンｂ１（Ｓｂ１−／−）が全体的に欠失したマウスにおけるＥＡＥを示すデータを表す。（図２Ａ）指定したマウスにおける疾患の特徴。（図２Ｂ）指定したマウスにおける脊髄細胞の特徴付け。Ｓｂ１は、ＥＡＥの病原性に必須である。Ｓｂ１は、ＣＤ４細胞のＣＮＳ浸潤に必須である。
【０２１７】
図３Ａおよび３Ｂは、Ｔ細胞においてＳｂ１が欠失した２つのモデルにおけるＥＡＥを示すデータを表す。（図３Ａ）免疫した野生型マウスもしくはｓｂ１−／−マウスから回収したＣＤ４  Ｔ細胞のナイーブＷＴマウス（上）への、またはＷＴマウスから回収したＣＤ４  Ｔ細胞のナイーブＷＴマウスもしくはｓｂ１−／−マウスへの養子移入。（図３Ｂ）ナイーブ野生型マウスまたはｓｂ１−／−マウス由来のナイーブＣＤ４  Ｔ細胞をＲａｇ−／マウスへと移入し、次いで、Ｒａｇ−／マウスは免疫されて、ＥＡＥを誘発する。疾患の軽快には、Ｔ細胞におけるセルピンｂ１の欠失のみが必要とされるか、またはＣＤ４  Ｔ細胞におけるセルピンｂ１のみが必要とされる。
【０２１８】
図４Ａおよび４Ｂは、Ｓｂ１−／−：ＷＴ混合キメラマウスにおけるＥＡＥを示すデータを表す。（図４Ａ）疾患の重症度を示す臨床スコア。（図４Ｂ）指定した時点でのＣＤ４細胞比、および様々な器官におけるＣＤ４細胞比。Ｓｂ１−／−ＣＤ４細胞は、脊髄において優先的に枯渇する。
【０２１９】
図５Ａ〜５Ｉは、末梢リンパ系器官におけるＣＤ４細胞のＴｈ１７細胞への分化を示すデータを表す。（図５Ａ）免疫細胞、（図５Ｂ）Ｔ−エフェクター、（図５Ｃ）Ｔ調節細胞（Ｔｒｅｇ）、（図５Ｄ）ケモカイン受容体、（図５Ｅ）抗原リコールとＩＬ−１７の産生、（図５Ｆ）ＩＬ−１受容体、（図５Ｇ）代謝酵素、（図５Ｈ）インテグリン、および（図５Ｉ）野生型マウス（黒色の棒）またはＳｂ１−／−マウス（灰色の棒）におけるサイトカインの定量。セルピンｂ１は、抗原特異的ＩＬ−１７＋ＣＤ４エフェクター細胞を生成することを必要としない。
【０２２０】
図６Ａ〜６Ｃは、ＷＴマウスおよびＳｂ１−／−マウスにおけるＩＦＮγ＋エフェクターＣＤ４細胞およびＧＭ−ＣＳＦ＋エフェクターＣＤ４細胞を示すデータを表す。（図６Ａ）ＰＭＡおよびイオノマイシン後の様々なサイトカイン産生ＣＤ４エフェクター細胞の定量。（図６Ｂ）抗原リコールの定量。（図６Ｃ）リアルタイムＰＣＲによって定量したリンパ節のエフェクターＣＤ４細胞におけるｍＲＮＡレベル。赤色の記号はＳｂ１−／−を示し；黒色の記号はＷＴを示し、Ｓｂ１−／−マウスでは、−ＩＦＮγ＋およびＧＭ−ＣＳＦ＋エフェクターＣＤ４細胞が減少する。
【０２２１】
図７Ａ〜７Ｅは、Ｓｂ１−／−ＣＤ４エフェクター細胞およびＷＴ  ＣＤ４エフェクター細胞において差示的に発現された遺伝子を同定するデータを表す。（図７Ａ）指定したマウスのＣＤ４エフェクター細胞のＲＮＡシーケンシングによって決定した９６４９遺伝子の発現レベル。（図７Ｂ）ＷＴマウスと比較してＳｂ１−／−において２分の１またはそれより低く発現が低下した２１８遺伝子。（図７Ｃ）リアルタイムＰＣＲによって定量したｍＲＮＡレベル。（図７Ｄ）指定したマウスにおけるＣＤ４細胞におけるＣＸＣＲ６の発現。（図７Ｅ）脊髄に浸潤したＣＤ４細胞におけるＣＸＣＲ６の発現。赤色の記号はＳｂ１−／−を示し；黒色の記号はＷＴを示す。ｓｂ１−／−マウスのＣＤ４エフェクター細胞に少数しか存在しない遺伝子は、ＩＦＮγ（Ｉｆｎｇ）およびＧＭ−ＣＳＦ（ｃｓｆ２）をコードし（予想通り）、また、細胞表面ＣＸＣＲ６（Ｃｘｃｒ６）、顆粒プロテアーゼグランザイム−Ｃ（Ｇｚｍｃ）および孔形成顆粒タンパク質パーフォリン（Ｐｆｒ１）もコードする。
【０２２２】
図８Ａ〜８Ｆは、ＷＴ  ＣＤ４エフェクター細胞のＣＸＣＲ６を有するサブセットが複数のサイトカインを産生し、ＧｚｍｃおよびＰｒｆ１を発現し、かつ表面にＩＬ−１およびＩＬ−２３受容体を高度に発現することを示すデータを表す。（図８Ａ）ＣＸＣＲ６が、ＥＡＥにおいて、ＩＬ−１７＋、ＧＭ−ＣＳＦ＋およびＩＦＮγ＋ＣＤ４エフェクター細胞を同定する。（図８Ｂ）ＥＡＥのＷＴマウスの指定したＣＤ４細胞の遺伝子発現。（図８Ｃ）ＥＡＥの指定したＣＤ４細胞の表面における活性化マーカーおよびサイトカイン受容体の発現。（図８Ｄ〜Ｆ）グランザイムＣおよびパーフォリンが、ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞、特に、サイトカインＩＬ−１７および／またはＩＦＮγおよび／またはＧＭ−ＣＳＦのうちの２つまたはそれより多くを産生する細胞において高度に発現する。免疫した野生型マウスを使用して、ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞の特性を特徴付けた。
【０２２３】
図９Ａおよび９Ｂは、セルピンＢ１がグランザイムＣを阻害することを示すデータを表す。（図９Ａ）純粋なセルピンＢ１を純粋なグランザイムＣとインキュベートする際の不活性で、共有結合性のより分子量の大きな複合体の形成を示すタンパク質の金染色。（図９Ｂ）セルピンＢ１との共有結合複合体におけるグランザイムＣのウエスタンブロット解析。標的プロテアーゼとの共有結合複合体の形成は、セルピンに特有の抑制機序である。
【０２２４】
図１０Ａ〜１０Ｆは、ＣＸＣＲ６が、抗原に応答して生成される「遅延過敏性」ＣＤ４細胞もマークし、複数のサイトカインを産生し、抗原を負荷した際に足蹠腫脹の拡大および誘導にセルピンＢ１を必要とすることを示すデータを表す。（図１０Ａ〜１０Ｃ）ナイーブＷＴオボアルブミン（ＯＶＡ）感受性（ＯＴ−ＩＩ）細胞をナイーブＷＴマウスへと移入し、次いで、ＯＶＡペプチドで免疫した。（図１０Ａ）指定した日に定量したＣＸＣＲ６＋ＯＴ−ＩＩ細胞。（図１０Ｂ）ＣＸＣＲ６＋ＯＴ−ＩＩ細胞が、ＥＡＥ系におけるように、複数のサイトカインを産生する。（図１０Ｃ）ＣＸＣＲ６＋ＯＴ−ＩＩ細胞が、ＥＡＥ系におけるように、グランザイムＣを高度に発現する。（図１０Ｄおよび１０Ｅ）ＷＴ細胞およびｓｂ１−／−ＯＴ−ＩＩ細胞をナイーブＷＴマウスへと移入し、次いで、ＯＶＡペプチドで免疫した。（図１０Ｄ）１０日目に、ＯＴ−ＩＩ細胞とＣＸＣＲ６＋ＯＴ−ＩＩ細胞のすべてを定量した。（図１０Ｅ）７日目に、指定したマウスの足蹠にＯＶＡペプチドを負荷し、足蹠腫脹を２４時間後に定量した。（図１０Ｆ）ＷＴマウスおよびｓｂ１−／−マウスを、ＥＡＥを誘発する方法によってＭＯＧペプチドで免疫した。６日目に、マウスの足蹠にＭＯＧペプチドを負荷し、足蹠腫脹を指定した時間に測定した。（図１０Ｄ〜１０Ｆ）赤色の記号はＳｂ１−／−を示し；黒色の記号はＷＴを示す。
【０２２５】
図１１Ａ〜１１Ｇは、ＥＡＥにおいて、ＣＸＣＲ６＋ＷＴ  ＣＤ４エフェクター細胞とＳｂ１−／−ＣＤ４エフェクター細胞の増殖のマーカーおよび生存のマーカーを示すデータを表す。（図１１Ａ）指定したＣＤ４細胞のサブセットにおけるＫｉ−６７標識。（図１１Ｂ）指定したＣＤ４細胞のＢｒｄＵのｉｎ  ｖｉｖｏでの標識の定量。（図１１Ｃ）ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞におけるＢｒｄＵの取り込みの動的解析。ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞の増殖は頑健であり、ＷＴ細胞とｓｂ１−／−細胞との間で異ならない。しかし、ｓｂ１−／−ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞の細胞死は増加した。（図１１Ｄ）指定したＣＤ４細胞のアネキシンＶ染色の定量。（図１１Ｅ）活性カスパーゼ３を発現する指定した細胞の定量。（図１１Ｆおよび１１Ｇ）指定したマウスにおいてミトコンドリアが損傷した細胞の定量。Ｓｂ１は、ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４エフェクター細胞の増殖に必要ではない。しかし、ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４エフェクター細胞の細胞死は、ｓｂ１−／−マウスにおいて増加している。赤色の記号はＳｂ１−／−を示し；黒色の記号はＷＴを示す。
【０２２６】
図１２Ａ〜１２Ｄは、抗ＣＸＣＲ６抗体による処置がＥＡＥを防止することを示すデータを表す。ＷＴマウスをＥＡＥについて誘発し、次いで、５、７、９および１２日目にアイソタイプ対照抗体（８匹のマウス）または抗マウスＣＸＣＲ６抗体（７匹のマウス）（注射１回当たりマウス１匹につき３００μｇ）で処置した。（図１２Ａ）平均臨床スコア。（図１２Ｂ）平均体重。（図１２Ｃ）罹患したマウスの出現頻度。（図１２Ｄ）２７日目に、脊髄に浸潤したリンパ球および骨髄性細胞。
【０２２７】
図１３Ａおよび１３Ｂは、抗ＣＸＣＲ６抗体による処置が、ＥＡＥに対する処置として有効であることを示すデータを表す。（図１３Ａ）ＷＴマウスをＥＡＥについて誘発した。アイソタイプ対照抗体（処置１回当たり４００μｇ）（１１匹のマウス）または抗ＣＸＣＲ６抗体（８匹のマウス）による処置を、疾患が最初に検出された日（１１〜１５日目；初期スコア１〜３）に、個々のマウスに対して開始した。２および４日後に、次の処置を投与した（矢印）。（図１３Ａ、上のパネル）平均臨床スコア。（図１３Ａ、下のパネル）体重。（図１３Ｂ）６匹のＷＴマウスをＥＡＥについて誘発し、１０日目に、それぞれ３匹のマウスを４００μｇのアイソタイプ対照または抗ＣＸＣＲ６抗体で処置し；１１日目にマウスを屠殺した。（図１３Ｂ、上のパネル）リンパ節のＣＤ４細胞によるサイトカインＩＬ−１７およびＧＭ−ＣＳＦの産生を測定する代表的フローサイトメトリー。（図１３Ｂ、下のパネル）。これらのサイトカインの産生に対する累積結果。サイトカイン産生細胞の減少は、抗ＣＸＣＲ６抗体による処置がサイトカイン産生ＣＸＣＲ６＋病原性ＣＤ４細胞を枯渇させることを示す。
【０２２８】
図１４Ａ〜１４Ｃは、ヒトＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞が関節リウマチを有する患者の炎症性滑液中に存在し、これらの細胞がマウスのＥＡＥ系におけるように複数のサイトカインを産生することを示すデータを表す。（図１４Ａ）自己免疫障害における病原性ＣＤ４細胞に関するバックグラウンド情報。（図１４Ｂ〜Ｃ）ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞の出現頻度ならびにそれらのＩＬ−１７、ＩＦＮγおよびＧＭ−ＣＳＦの産生を含む、関節リウマチを有する２名の患者の滑液細胞の解析。
【０２２９】
図１５は、ＥＡＥデータに基づくＣＸＣＲ６＋細胞の生成を示す概略図を表す。ｓｂ１が、プロテアーゼ（マウスのグランザイムＣのヒト等価物であり得る）を阻害することによって、頑健に増殖するＣＸＣＲ６＋細胞の細胞死を妨げ、それによって、得られる病原性ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞の集団のサイズを決定する調節ステップが示される。
（実施例３）
セルピンＢ１は神経炎症における脳炎惹起性ＴＨ細胞を制御する
【０２３０】
プロテアーゼインヒビターおよび好中球生存因子であるセルピンＢ１は、近年、ＩＬ−１７を発現するＴ細胞と関連付けられている。ここで、結果により、セルピンＢ１（Ｓｂ１）が、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）におけるエフェクターＣＤ４細胞のサブセットにおいて劇的に誘導されることが示される。正常なＴ細胞のプライミングにもかかわらず、Ｓｂ１−／−マウスは、サイトカインであるＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１７のうちの２つまたはそれより多くを産生する少数のＴＨ細胞を有するＥＡＥに対して抵抗性である。これらの複数のサイトカイン産生ＣＤ４細胞は、極端に急速に増殖し、細胞溶解性顆粒タンパク質であるパーフォリン−Ａ、グランザイムＡ（ＧｚｍＡ）およびＧｚｍＣ、ならびに表面受容体であるＩＬ−２３Ｒ、ＩＬ−７ＲαおよびＩＬ−１Ｒ１を高度に発現し、表面マーカーＣＸＣＲ６によって同定することができる。Ｓｂ１−／−マウスでは、ＣＸＣＲ６＋ＴＨ細胞は生成されるが、自殺細胞死を導く顆粒プロテアーゼに媒介されるミトコンドリア損傷の増強により拡大することができない。最後に、抗ＣＸＣＲ６抗体による処置は、Ｓｂ１の欠失と同様に、ＥＡＥを劇的に回復させ、ＣＸＣＲ６＋Ｔ細胞が脳炎の駆動体であることを強く示す。
序論
【０２３１】
多発性硬化症およびマウスの実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、自己反応性ＴＨ細胞によって駆動される中枢神経系の慢性脱髄障害である（１）。末梢に少数で存在し、ＣＮＳでは拡大された集団として存在する疾患を誘発する自己免疫Ｔ細胞は、疾患が、ＩＬ−１２のサブユニットｐ４０の欠失によって抑止されるため、最初はＴＨ１細胞であると考えられていた（２、３）。ｐ４０はＩＬ−２３のサブユニットでもあり、ＩＬ−２３が疾患を媒介する際に極めて重要な役割を果たすという発見により（４〜７）、ＭＳは、ＴＨ１７に駆動されるものと再度解釈された（８、９）。より最近の研究では、ＴＨ１７細胞自体は病原性ではないが、ｉｎ  ｖｉｖｏでの、骨髄性細胞に由来するＩＬ−１βおよびＩＬ−２３のプライミング下で、疾患の真の駆動体である、病原性（脳炎惹起性）ＴＨ細胞へと変換されることが確立された（４、１０〜１４）。これらの細胞は、ＩＦＮγおよびＧＭ−ＣＳＦを産生し（１０、１５〜１８）、後者は、脳炎惹起性状態に必要とされる（１６〜１８）。脳炎惹起性ＴＨ細胞の重要性にもかかわらず、それらの性質またはそれらの発症を駆動する因子および経路についてはほとんど知られていない。
【０２３２】
細胞溶解性のＣＤ８細胞およびＮＫ細胞では、セルピンと称される内因性インヒビターによって調節される強力な顆粒セリンプロテアーゼが、免疫の恒常性を同時に維持しながら、腫瘍およびウイルス感染に対する免疫サーベイランスにおいて極めて重要な役割を果たす（１９〜２６）。類似するグランザイム−セルピンによる調節もＣＤ４細胞にも存在するかどうかは知られていない。以前にＭＮＥＩ（単球／好中球エラスターゼインヒビター）と称されていたセルピンＢ１は、セルピンのスーパーファミリーの先祖のメンバーである（セリンプロテアーゼインヒビター）。これは、好中球において最もよく研究されてきた、エラスチン分解性プロテアーゼおよびキモトリプシンプロテアーゼの非常に効率的なインヒビターである（２７〜３１）。例えば、細菌による肺感染では、セルピンＢ１は炎症性組織傷害および好中球の死滅から保護し、ナイーブマウスでは、顆粒セリンプロテアーゼであるカテプシンＧとプロテイナーゼ−３によって媒介される自然に起こる細胞死を制限することによって、成熟好中球の骨髄での貯蔵を保存する（３２〜２５）。最近では、Ｓｂ１がＴｈ１７細胞のシグネチャー遺伝子として同定された（３８）、本発明者らを適応性Ｔｈ細胞の開発の研究に導いた発見として、セルピンＢ１がＩＬ−１７を発現するγδＴ細胞（３６）およびＮＫ  Ｔ細胞（３７）の拡大を選択的に制限することが実証されている。
【０２３３】
Ｓｂ１の発現が、ＭＯＧで免疫したマウスにおける麻痺の発症に必要とされるという驚くべき結果が本明細書において提供される。本明細書では、ＩＦＮγおよびＧＭ−ＣＳＦを発現するＩＬ１７＋セルピンＢ１依存性ＣＤ４細胞の非常に選択的なサブセットが、疾患発症時の免疫したマウスの末梢において同定される。これらのセルピンＢ１依存性のプライミングされたＴ細胞の単離およびそれらの分子シグネチャーと機能シグネチャーならびにＥＡＥの発症経路を示す。この結果は、これらが疾患の原因であるヘルパーＴ細胞であることを実証する。
結果
セルピンＢ１はＥＡＥにおいてＴＨ細胞に高度に発現される。
【０２３４】
以前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１２９Ｓ６株のマウス細胞を研究することによって、Ｓｂ１をＴＨ１７細胞において優先的に発現されるものとして同定した。ＥＡＥモデルを用いて研究するための準備では、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスのナイーブＣＤ４細胞を分極化して、以前の発見（３８）と一致して、ＴＨ１７細胞におけるＳｂ１がＩＬ−６とＴＧＦ３によって駆動される選択的発現を有することを確認した（図１６Ａ）。次いで、Ｓｂ１が、ＥＡＥの発症中に、エフェクターＣＤ４細胞において、ＲｏｒｃおよびＩｌ１７ａと一緒にｉｎ  ｖｉｖｏで劇的に上方調節されることを決定した。これまでに、ＴＨ細胞においてＳｂ１の発現を制御する因子は知られていない。Ｔｈ１７の誘導物質であるセリン／トレオニンプロテインキナーゼ（Ｓｇｋ）−１を欠失したマウスに関するオンライン遺伝子アレイ（３９）により、Ｓｂ１がＩＬ−２３に刺激されたＳｇｋ１欠損ＴＨ１７細胞における上位の下方調節遺伝子の中にあることが明らかとなり、ＴＨ１７細胞におけるＩｌ２３ｒとＳｂ１の間の相関を示唆した。この推定される関連について調査するために、Ｉｌ２３ｒｆｌ／ｆｌマウスをＣＤ４−Ｃｒｅマウスと交雑することによって、ＣＤ４細胞においてＩｌ２３ｒが欠失したマウス（Ｉｌ２３ｒΔＣＤ４）を生成した。ＥＡＥ発症時の、混合キメラマウスのリンパ節由来のｗｔエフェクターＣＤ４細胞とＩｌ２３ｒΔＣＤ４エフェクター（ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｌｏ）ＣＤ４細胞のトランスクリプトームを比較した。驚くべきことに、ｗｔエフェクターＣＤ４細胞とＩｌ２３ｒΔＣＤ４エフェクターＣＤ４細胞はトランスクリプトームレベルがあまり異ならず（図１６Ｃ）、１ダースの遺伝子のみが、ｗｔ細胞において２倍を超えて増加した（図１６Ｄ）。歪んだ発現と公知の免疫機能を有する顕著な遺伝子の中で、Ｓｂ１が発見され、エフェクターＣＤ４細胞におけるＳｂ１の発現を誘導または維持する際の、ＩＬ−２３Ｒシグナルの必要不可欠かつ直接的な役割を確認した。ＴＨ１７細胞におけるＩｌ２３ｒとＳｂ１との間の相関をさらに調査するために、ＩＬ−６／ＴＧＦ３によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴｈ１７細胞の分化系を調査した。ＩＬ−１３および／またはＩＬ−２３の添加によって、Ｓｂ１の発現はさらには増加しなかったが（データは示さず）、一方、再刺激の際に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成したＴＨ１７細胞は、Ｓｂ１、ＲｏｒｃおよびＩｌ１７の発現を維持するためにＩＬ−２３Ｒのシグナル伝達を必要とした（図１６Ｅ）。
Ｓｂ１のＣＤ４細胞による自発性欠損を原因とするＥＡＥの軽快
【０２３５】
Ｓｂ１の発現が脳炎惹起性ＴＨ細胞に影響を及ぼすかどうかを決定するために、Ｓｂ１遺伝子を欠失したマウスにおいてＥＡＥを誘発した。ＭＯＧで免疫したｗｔマウスにおいて発症した重度の脳脊髄炎と比較して、Ｓｂ１−／−マウスは、疾患の遅延と軽快を呈した（図１７Ａ）。わずかな白血球、すなわちリンパ球と骨髄性細胞の両方しか脊髄に浸潤しなかった（図１７Ｂ）。細胞の欠乏は、ｍＲＮＡレベルで、ＴＨ細胞および骨髄性細胞のサイトカインの減少において反映された（図１７Ｃ）。Ｓｂ１は、複数の細胞および非常に顕著には骨髄性細胞において発現されるため、Ｓｂ１についてのＴ細胞固有の特性を決定するために、養子移入研究を実施した。ｗｔ  Ｔ細胞と比較して、免疫したマウスのＳｂ１−／−  Ｔ細胞の脳炎惹起性がより低いことを発見した。さらに、相互実験では、疾患が軽快せず（図１７Ｄ）、Ｓｂ１がＴ細胞の潜在的病原性に影響を及ぼすという考えが固まった。相補的モデルでは、免疫の前に、ナイーブＣＤ４細胞をＲａｇ１／−マウスに移入した。ｗｔ  ＣＤ４細胞を受けているマウスと比較して、Ｓｂ１−／−  ＣＤ４細胞を受けているマウスでは臨床疾患が減弱され、脊髄における免疫細胞の蓄積が鈍化した（図１７Ｅ）。さらに、ＭＯＧで免疫したｗｔマウスとＳｂ１−／−マウスのＭＯＧ特異的遅延型過敏症（ＤＴＨ）の応答の比較により、Ｓｂ１−／−マウスでは、Ｔ細胞のプライミングが末梢で既に損なわれたことが示された（図１７Ｆ）。最後に、混合キメラマウスモデルによって、末梢におけるｗｔ  ＣＤ４細胞に対するＳｂ１−／−  ＣＤ４細胞の比は、ＭＯＧによる免疫後には変化しなかったが、ｗｔ：Ｉｌ２３ｒ欠損混合キメラマウスの表現型を大部分複製する表現型である、脊髄において低下したｗｔ  ＣＤ４細胞に対するＳｂ１−／−  ＣＤ４細胞の比（図１７Ｇ）は、ＭＯＧによる免疫後に変化したことが明らかとなった（１１）。発見の累積により、脳脊髄炎の減弱およびＳｂ１−／−マウスの脊髄における免疫細胞が少数であることは、ＣＤ４細胞にＳｂ１が存在しないことが原因であることが示される。
Ｓｂ１は、プライミング中にＩＦＮγ＋ＣＤ４細胞およびＧＭ−ＣＳＦ＋ＣＤ４細胞を制御する
【０２３６】
脊髄のＴ細胞の欠乏の原因を決定するために、疾患発症時の流入領域ＬＮのＣＤ４細胞を検査した。Ｓｂ１−／−マウスとｗｔマウスの免疫細胞の総数またはエフェクター（ＣＤ４４＋）ＣＤ４  Ｔ細胞、Ｔ調節細胞またはＣＣＲ６およびＣＣＲ２を発現するＣＤ４細胞の出現頻度の間に差は見られなかった（図２４Ａ〜Ｄ）。リコール特性、ＩＬ−１７の産生、ＩＬ−２３に対する応答性、ＩＬ−１Ｒ１の上方調節、ＴＨ１７代謝酵素、ＶＬＡ４およびＬＦＡ１を含むインテグリンの発現ならびに骨髄性サイトカインの発現における遺伝子型の間にも差はなかった（図２４Ｅ〜Ｊ）。さらに、ＩＬ−２３Ｒおよび一般的にＴＨ１７細胞と関連する多くの他の遺伝子は、Ｓｂ１−／−エフェクターＣＤ４細胞において正常レベルで発現される（図１８Ａ）。しかし、それぞれ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮγをコードするＣｓｆ２およびＩｆｎｇの発現は、Ｓｂ１−／−エフェクターＣＤ４細胞のリンパ節において、対応するｗｔ細胞と比較して低下した（図１８Ａ）。
【０２３７】
Ｃｓｆ２およびＩｆｎｇの発現の低下が、細胞１個当たりのサイトカインの減少またはサイトカイン発現細胞の少数化を表すかどうかを決定するために、リンパ節と脊髄のＣＤ４細胞をフローサイトメトリーによって検査した。ＩＬ−１７の単一陽性（ＳＰ）細胞の出現頻度は、Ｓｂ１−／−マウスおよびｗｔマウスと異ならなかったが、サイトカイン二重陽性（ＤＰ）（ＩＬ１７＋ＩＦＮγ＋、ＩＬ１７＋ＧＭ−ＣＳＦ＋）細胞の出現頻度は、ＧＭ−ＣＳＦγ  ＳＰ、およびＩＦＮγ  ＳＰ細胞と同様に、Ｓｂ１−／−マウスのリンパ節および脊髄で低下した（図１８Ｂ）。複数のサイトカインを産生するＴＨ細胞は、自己免疫を有する患者の罹患した器官において以前に記載されており（４０、４１）、ＧＭ−ＣＳＦ＋細胞は、自己免疫神経炎症に必要不可欠であることが公知である（１６〜１８）。ｗｔマウスとｓｂ１−／−マウスのリンパ節では、サイトカイン産生細胞の絶対数は、出現頻度のパターンを反映したが、脊髄では、すべてのＳｂ１−／−  ＣＤ４細胞の絶対数が大きく減少した（図２５Ａ）。ＭＯＧで免疫した混合骨髄キメラでは、ほとんどのサイトカイン二重陽性（ＤＰ）Ｓｂ１−／−  ＣＤ４細胞の出現頻度が下方へ歪んだ（図２５Ｂ）。累積的に、この発見は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮγの産生によって同定可能である脳炎惹起性ＴＨ細胞は、両方の遺伝子型のＭＯＧで免疫したマウスのリンパ節で既に拡大しているが、Ｓｂ１−／−マウスではそれらの出現頻度が低下するという概念を支持する。
ＥＡＥにおけるセルピンＢ１依存性ＴＨ細胞のために同定したシグネチャー遺伝子
【０２３８】
次に、セルピンＢ１によってＴＨ細胞に脳炎惹起性の特性を付与する遺伝子を同定した。疾患発症時にＬＮから単離したＳｂ１−／−エフェクターＣＤ４細胞およびｗｔエフェクターＣＤ４細胞のトランスクリプトームを解析し、他の脳炎惹起性を付与する遺伝子が、Ｓｂ１−／−エフェクター細胞の中で、Ｃｓｆ２およびＩｆｎｇと共に減少するはずであることが予期された。９，６５０の発現した遺伝子のうち、２５８の遺伝子が、ｗｔ細胞と比較して、Ｓｂ１−／−において２分の１未満に減少し、２倍を超えて増加した遺伝子はなかった（図１８Ｃ）。減少した遺伝子の中から、さらなる研究のために、免疫に関連する機能を有するサブセットを選択した。ｑＲＴ−ＰＣＲによって検証したものは、予期した通り、ＩｆｎｇとＣｓｆ２であり、細胞毒性顆粒の構成成分であるＧｚｍｃ（ＧｚｍＣ）、Ｇｚｍａ（ＧｚｍＡ）およびＰｒｆ１（パーフォリンＡ）でもある（図１８Ｄ）。記憶に値するように、ＴＨ−１７細胞の分化を促進し、セルピンＢ１によって阻害されるカテプシンＬ（３８）は、Ｓｂ１−／−エフェクターＣＤ４細胞において過小にしか発現されなかった遺伝子の中にはなかった。歪んだ遺伝子は、ケモカイン受容体Ｃｘｃｒ６をコードするＣＸＣＲ６を含み（４２）、このことをフローサイトメトリーによって検証した。
ＣＸＣＲ６は、セルピンＢ１依存性脳炎惹起性ＴＨ細胞をマークする
【０２３９】
次に、ＣＸＣＲ６を発現するＣＤ４細胞を、ｗｔマウスにおけるＥＡＥ発症中の時間の関数として検査した。ナイーブマウスにおいて１％未満しか含まれなかったＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞は、リンパ節において、ＭＯＧによる免疫後に約６％まで増加し（図１８Ｅ）、疾患ピークには脊髄において主要な集団（約７０％）を構成した（図１８Ｆ）。ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞も、免疫後のＳｂ１−／−マウスのＬＮにおいて出現頻度が増加したが、ｗｔマウスでは同程度まで増加せず、Ｓｂ１−／−の脊髄に蓄積することができなかった。遺伝子型間の差は、細胞の絶対数を比較することによって最もよく認識することができる（図１８Ｅ、１８Ｆの右のパネル）。
【０２４０】
ＣＸＣＲ６とサイトカインとを組み合わせた解析によって、サイトカインであるＩＬ−１７、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＦＮγのうちの２つまたはそれより多くを産生する本質的にすべてのＬＮのＣＤ４細胞は、ＣＸＣＲ６＋であることが示され、ＩＬ−１７  ＳＰの半分、ＧＭ−ＣＳＦ−ＳＰの３分の１、およびＩＦＮγ−ＳＰ細胞のごく一部分もそうであった（図１９Ａ、１９Ｂ）。際立って、ＧｚｍＢを除くＧｚｍＣは、ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞において優先的に発現された（図１９Ｃ）。それに付随して、サイトカインｎｅｇ  ＣＤ４細胞において無視できるパーフォリンＡの発現は、ＩＬ−１７  ＳＰ細胞で増加し、ＩＬ１７／ＩＦＮγ  ＤＰ細胞でさらに増加した（図１９Ｄ）。おそらく、グランザイムとパーフォリンＡは、ｅｘ  ｖｉｖｏでの刺激の後に顆粒膜タンパク質であるＬＡＭＰ−１（ＣＤ１０７ａ）の表面での発現の増加によって示される、細胞毒性顆粒を機能化する構成成分である（データは示さず）。「細胞１個当たり」を基準に、遺伝子型の間で、ＧｚｍＣとパーフォリンの含有量は異ならなかった。Ｃｓｆ２とＩｆｎｇを除いて、ｉｎ  ｖｉｖｏで生成された脳炎惹起性ＴＨ細胞に関して、ここで同定したシグネチャー遺伝子であるＧｚｍｃ、Ｇｚｍａ、Ｐｒｆ１およびＣｘｃｒ６は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した病原性ＴＨ１７細胞のシグネチャー遺伝子と異なる（４３）。従来のＴＨ１７細胞（ＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ６ｎｅｇ）と比較して、ＥＡＥにおけるＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞は、Ｓｂ１、Ｇｚｍｃ、Ｔｂｘ２ｌ、Ｃｓｆ２、およびＩｆｎｇの発現の増加を示したが、ＲｏｒｃおよびＩｌ１０では同等のレベルであった（図１９Ｅ）。ＣＸＣＲ６ｎｅｇエフェクターＣＤ４細胞と比較して、ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞は、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ２３ＲおよびＩＬ１Ｒ１の表面での発現を増加させたが、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＣＤ６９およびＣＤ２５の表面での発現は増加させなかった（図１９Ｆおよびデータは示さず）。これらの発見は、ＣＸＣＲ６＋セルピンＢ１依存性ＣＤ４細胞が、ＥＡＥにおいてＴＨ１７に由来する脳炎惹起性ＴＨ細胞であることを強く示唆する。
ＥＡＥにおけるＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞の機能の検証
【０２４１】
ＥＡＥにおけるＣＸＣＲ６にマークされたＣＤ４細胞の役割を試験するために、細胞枯渇ストラテジーを使用した。以前の研究では、疾患が、ＭＯＧで免疫したＣｘｃｒ６−／−マウスとｗｔマウスで異ならないことが見出され、ＣＸＣＲ６分子自体は疾患に必要ではないことが示された（４４）。特定の理論に拘束されないために、ＣＸＣＲ６誘導性療法を使用して、脳炎惹起性ＴＨ細胞を枯渇させてもよいと仮定した。フィジビリティスタディでは、疾患発症時に、ＭＯＧで免疫したｗｔマウスに単回用量の抗ＣＸＣＲ６  ｍＡｂを与え、リンパ節細胞を２４時間後に検査した。アイソタイプ処置マウスと比較した、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＦＮγ  ＤＰおよびＧＭ−ＣＳＦ  ＳＰ  ＣＤ４細胞の出現頻度の低下（図２６Ａ）によって、ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞の標的化に成功したことが示唆された。症状が現れる前に開始する（「防止プロトコール」）３回用量の抗ＣＸＣＲ６  ｍＡｂで免疫したマウスを処置することにより、臨床疾患が大幅に抑止され（図２０Ａ、２０Ｂ）、わずかなリンパ球および骨髄性細胞しか脊髄に浸潤しなかった（図２６Ｂ）。さらに、症状が現れた後に（「治療プロトコール」）抗ＣＸＣＲ６  ｍＡｂを送達することにより、ベースラインの臨床スコアが回復し（図２０Ｃ）、体重減少が防止され（図２０Ｄ）、組織学スコアと脊髄における白血球の蓄積が劇的に消失した（図２０Ｅ）。
ＣＸＣＲ６は様々な自己免疫障害の病原性ＴＨ細胞を同定する
【０２４２】
ＣＸＣＲ６はまた、ＯＴ−ＩＩ細胞を養子移入し、オボアルブミンペプチド（ＯＶＡ）で免疫したマウスにおいて、複数のサイトカインおよびＧｚｍＣを発現するＣＤ４細胞の拡大した集団をマークする（図２１Ａ〜２１Ｃ）。Ｓｂ１の非存在下では、ＣＸＣＲ６＋ＯＴ−ＩＩ細胞の拡大した集団は大幅に抑止され（図２１Ｄ）、足蹠にＯＶＡを負荷した際に足蹠腫脹が減少することによって示されたように（ＤＴＨ応答）、病原性機能が欠如していた（図２１Ｅ）。ＤＴＨ応答の鈍化は、ＭＯＧペプチドを足蹠に負荷したＭＯＧで免疫したＳｂ１−／−マウスでも見られた（図１７Ｆ）。
【０２４３】
炎症性関節炎の患者の滑液（ＳＦ）のＴ細胞も評価し（表１、図２７）、ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞が高度に富化されたことが分かった（図２２Ａ、２２Ｂ）。ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞の比率は、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＦＮγ  ＤＰ細胞およびＧＭ−ＣＳＦ  ＳＰ細胞の比率と十分に相関していたが、ＩＦＮγ  ＳＰ細胞とは相関していなかった（図２２Ｃ、２２Ｄ）。よって、マウスとヒト両方のＴＨ１７に駆動される自己免疫障害において、ＣＸＣＲ６によって、複数の重要な病原性サイトカインを産生し、炎症した組織において富化されるＣＤ４細胞が同定される。
【表１】
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Ｓｂ１はＣＸＣＲ６＋脳炎惹起性ＴＨ細胞の寿命を制御する
【０２４４】
セルピンＢ１依存性ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞の分子および機能の特色を確立した後に、Ｓｂ１−／−マウスにおいてこれらの欠損を説明する機序を調査した。疾患発症時に、ＭＯＧで免疫したｗｔマウスとＳｂ１−／−マウスにチミジン類似体であるブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を注射し、増殖細胞を標識した。６時間後のリンパ節の細胞の解析により、（ｉ）ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞が、ＣＸＣＲ６ｎｅｇ細胞より高いＢｒｄＵ標識を有し、ＣＸＣＲ６＋細胞が高い増殖速度を有することが示唆され、かつ（ｉｉ）ＢｒｄＵ＋Ｓｂ１−／−  ＣＸＣＲ６＋細胞の出現頻度が、ＢｒｄＵ＋ｗｔ  ＣＸＣＲ６＋細胞の出現頻度と比較して低下したことが明らかとなった。固定したタイムスパンの後のＢｒｄＵで標識した細胞の出現頻度は、細胞死ならびに細胞増殖の両方によって影響を受け得るため、細胞死の作用を最小限にするために標識する時間を短縮した。２時間後、ＢｒｄＵ＋ｗｔ細胞の出現頻度は変化しなかったが、ＢｒｄＵ＋Ｓｂ１−／−  ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞の欠乏は大幅に消失し、１時間目には、ＢｒｄＵ＋Ｓｂ１−／−  ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞の出現頻度は、対応するｗｔ細胞と異ならず、Ｓｂ１−／−  ＣＤ４細胞とｗｔ  ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞とは同じ速度で増殖することが示された（図２３Ａ）。最近に増殖した細胞の核マーカーであるＫｉ−６７で染色するために２つの遺伝子型を比較するさらなる研究により、ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞の増殖が急速であり、Ｓｂ１−／−マウスとｗｔマウスの間で異ならないことを証明する証拠がもたらされた（図２３Ｂ）。
【０２４５】
細胞死を検査するために、新たに単離したＬＮ細胞を活性カスパーゼ−３に関して染色した。数は少ないが、カスパーゼ−３＋細胞は、ｗｔ  ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞と比較して、Ｓｂ１−／−  ＣＸＣＲ６  ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞の中で有意に増加した（図２３Ｃ）。活性カスパーゼ３を有する死んだ細胞はｉｎ  ｖｉｖｏではすぐに除去されるため、死んだ細胞の除去にはあまり好ましくない条件であるｅｘ  ｖｉｖｏで、細胞の刺激後に測定を繰り返した。ｅｘ  ｖｉｖｏでの刺激後には、活性カスパーゼ−３＋Ｓｂ１−／−細胞は、ｗｔ細胞よりも実質的に過剰であり、特に、ＩＬ−１７／ＧＭ−ＣＳＦ  ＤＰ細胞およびＧＭ−ＣＳＦ  ＳＰ細胞に関してそうであった（図２３Ｄ）。
【０２４６】
セルピンＢ１依存性ＣＤ４細胞が、ＮＫ細胞、ＣＤ８細胞および好中球などの他の顆粒含有細胞において生じるような自らが招く細胞死を被るかどうかが企図された（２２、３４、３５、４５）。この機序では、高レベルの活性化またはストレスによって顆粒膜の透過がもたらされ、グランザイムを細胞質中に漏出させる（４６）。細胞溶解性のＣＤ８細胞およびＮＫ細胞において放出されるセリンプロテアーゼであるＧｚｍＢは、細胞自殺を誘導し得るが、これは、細胞保護インヒビターによって妨害される。好中球では、細胞死は、アズール親和性顆粒プロテアーゼであるカテプシンＧおよびプロテイナーゼ−３（ＰＲ３）によって媒介され、これらのセリンプロテアーゼの両方を不可逆的に不活性化するセルピンＢ１によって妨害される（３４、３５）。
【０２４７】
ミトコンドリア膜の電位（ΔΨｍ）の喪失は、この固有の死滅プロセスの早期かつ不可逆的ステップであるため（４７）、ミトコンドリア色素であるＤｉＯＣ６を使用して、疾患発症時のΔΨｍを測定した。ｗｔマウスおよびＳｂ１−／−マウスのＣＸＣＲ６ｎｅｇ  ＣＤ４細胞の８０％より多くで、ＤｉＯＣ６が高度に保持され、インタクトなミトコンドリアであることが示された。対照的に、相当なパーセンテージのｗｔ  ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞とさらに高いパーセンテージのＳｂ１−／−  ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞では色素の保持は低く、ミトコンドリアの損傷と細胞死への不可逆的拘束が示された（図２３Ｅ）。独立したミトコンドリアプローブであるＪＣ−１を用いる研究において、これらの知見を確認した（図２３Ｆ）。全体的に、これらの知見によって、セルピンＢ１は、細胞自殺を防止することによって、十分なＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞が生存して、病理発生を実行することが可能な拡大した集団を形成するかどうかを決定することが示される。
【０２４８】
さらなる研究には、死滅プロセスを十分に文書化し、ＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞の死の原因となるセルピンＢ１により阻害可能なプロテアーゼ（複数可）を同定することが必要であるが、発現データは、ＧｚｍＢに匹敵する細胞溶解性の効率性を有し、直接的なミトコンドリア損傷に関与する細胞死経路を介して作用するセリンプロテアーゼであるＧｚｍＣを示唆する（４８）。よって、キモトリプターゼであるＧｚｍＣは、ＧｚｍＣをヒトセルピンＢ１と共にインキュベートする際に形成される共有結合複合体によって示されるように、セルピンＢ１によって直接的に阻害される（図２３Ｇ）。トリプターゼであるＧｚｍＡも、アスパーゼであるＧｚｍＢも、セルピンＢ１によって阻害され得ない（２７）。
まとめ
【０２４９】
プロテアーゼインヒビターであるセルピンＢ１が、後に、麻痺を誘発するＴ細胞として同定された末梢のエフェクターＣＤ４細胞のサブセットにおいて、ＥＡＥの発症時に発現されるという発見が本明細書において提供される。さらに、セルピンＢ１は、生存および拡大に必要とされるが、これらの細胞の生成には必要とされないことも発見された。セルピンＢ１が欠失すると、脳炎惹起性ＴＨ細胞が免疫したマウスのＣＮＳに蓄積せず、疾患は実質的に軽快する。これらのＴＨ細胞の異常な性質を証明するトランスクリプトミクスからの発見には、新たに同定したシグネチャー遺伝子ＧｚｍＣ、ＧｚｍＡおよびＰｒｆＡならびに以前に文書化されたＣｓｆ２およびＩｆｎｇが含まれる。これらのＴＨ細胞は、以前に文書化された複数のサイトカインに関する分泌系と一緒に、細胞溶解性顆粒の存在によっても識別される。重要なのは、ケモカイン受容体であるＣＸＣＲ６が、セルピンｂ１依存性脳炎惹起性ＴＨ細胞の細胞表面マーカーとして好適であるという発見でもある。ＥＡＥにおいて真に脳炎惹起性のＴ細胞を同定するマーカーを有することによって、ヒトＭＳに対する新規治療の設計に対する道が開ける。
【０２５０】
ＭＳおよび関連する自己免疫障害におけるＣＤ４細胞の機能は、分極化したＴＨ１細胞またはＴＨ１７細胞の作用によっては完全には説明されないが、むしろ、ＩＬ１βおよびＩＬ２３によって開始および維持される、未だ特徴付けられていない脳炎惹起性プログラムによって生成された細胞の作用によって説明されることが、一般的には受け入れられている（（４９）に概説されている）。セルピンＢ１の脳炎惹起性プログラムとの関連は、Ｓｂ１欠損マウスおよびＩｌ２３ｒ欠損マウスの識別不能な表現型を発見することによって強く示唆された（図１６および１７ならびに参照文献（１１））。これらのマウスに関する発見の累積により、セルピンＢ１が、そのコア機能において、プライミングされたＴＨ細胞の選択的サブセットの拡大に成功する、脳炎惹起性プログラムを調節するために、ＩＬ−２３の下流で機能することが示唆される。このプログラムでは、セルピンＢ１は、増殖に関連する顆粒プロテアーゼ媒介性のミトコンドリア損傷／自殺死の経路を制限し、よって、脳炎惹起性集団を構成する選択的ヘルパーＴ細胞の生存および拡大に重要である。それと共に、これらの発見によって、複数の病原性サイトカイン、特に、ＧＭ−ＣＳＦを産生し、急速に増殖し、急速な拡大中に生存するのにセルピンＢ１に依拠し、細胞毒性顆粒の構成成分であるパーフォリンＡ、ＧｚｍＡおよびＧｚｍＣを発現し、ＣＸＣＲ６によってマークされる細胞として、脳炎惹起性ＴＨ細胞が説明される。
【０２５１】
脳炎惹起性ＴＨ細胞の特色のほとんど、具体的には、ＣＸＣＲ６＋、複数のサイトカイン、グランザイム、病原性機能、ＩＬ−２３への依存性を発現するＴＨ細胞は、ＤＴＨのＯＴ−ＩＩ移入モデルで見られ、ここで記載される疾患を誘発するＴＨ細胞は、自己免疫神経炎症に限定されないことが示された。
【０２５２】
マウスのセルピンＢ１依存性脳炎惹起性ＴＨ細胞と類似するＴＨ細胞は、他の自己免疫障害においても見出された。最初に、クローン病患者の腸で（４０）、後にＭＳ患者の脳組織で（５０）、ＩＬ−１７／ＩＦＮγ  ＤＰ  ＣＤ４細胞が注目された。ＭＳでは、ミエリン反応性サイトカイン産生ＣＤ４細胞のクローンを、マウスの脳炎惹起性ＴＨ細胞に類似するパターンである、ＩＬ−１７／ＧＭ−ＣＳＦ  ＤＰ、ＧＭ−ＣＳＦ  ＳＰおよびＩＦＮγ  ＳＰ（４１）として特徴付けた。現在では、ＴＨ１／ＴＨ１７細胞およびＴＨ１７／ＴＨ１細胞としても公知のＩＬ−１７／ＩＦＮγ  ＤＰ  ＣＤ４細胞、ならびにＩＦＮγ  ＳＰ  ＣＤ４細胞のサブセットが、ＴＨ１細胞ではなく、むしろＴＨ１７細胞に由来することが認識されている（１５、５１）。
【０２５３】
初期の研究では、ＩＦＮγを産生するＣＸＣＲ６＋ＣＤ４細胞内で富化された炎症性関節炎の患者の滑液（ＳＦ）が見出され、これに基づいて、ＴＨ１細胞として報告された（５２）。これにより、ＣＸＣＲ６が、組織部位で炎症性ＴＨ１細胞をマークするという概念が導かれた。この研究のデータでは、炎症性関節炎ＳＦにおいて、ＣＸＣＲ６によってマークされたＣＤ４細胞がサイトカインＤＰ（ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−１７およびＧＭ−ＣＳＦ／ＩＦＮγ）細胞中で富化されることが示され、マウスのＥＡＥにおけるＴＨ１７に由来する脳炎惹起性ＴＨ細胞に対するそれらの関連性が示唆された（図２２）。マウスの炎症性腸疾患において、ＩＬ−２３に依存して出現するＩＬ１７／ＩＦＮγ  ＤＰ細胞についても関連性が示唆される（５３）。慢性腸炎のＴ細胞移入モデルでは、ＣＸＣＲ６によってマークされた病原性ＣＤ４細胞は、優勢なＩＬ−１７  ＳＰ細胞およびＩＦＮγ  ＳＰ細胞と一緒にＩＬ−１７／ＩＦＮγ  ＤＰ細胞を含み（５４）；増殖の乏しさによって、ＥＡＥにおいて、ＣＸＣＲ６＋ＴＨ細胞を急速に増殖させることからこれらの細胞が識別される。
【０２５４】
最後に、脳炎惹起性ＣＸＣＲ６＋ＴＨ細胞は、例えば、抗ウイルス保護をもたらすＣＤ４＋細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＴＬ）と同じように、細胞毒性顆粒という少なくとも１つの特色を有する。最近の研究によって、ＭＳ患者における疾患の進行は、循環するＣＤ４＋ＣＴＬの密度と相関することが示された（５５）。自己免疫疾患および慢性炎症性疾患における、これらの複数のサイトカイン産生ＣＤ４細胞とグランザイムを発現するＣＤ４細胞の関連性を決定するために、さらなる研究が必要とされると予想される。
【０２５５】
どのようにセルピンＢ１が、ＥＡＥマウスにおいて、脳炎惹起性ＴＨ細胞の密度を調節するかを決定するために、細胞増殖および細胞死を評価した。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＢｒｄＵ標識を含む増殖に対する複数のアプローチによって、脳炎惹起性ＴＨ細胞の増殖速度が、Ｓｂ１−／−マウスとｗｔマウスで異ならないことが示された。死んだ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏではすぐに除去されるため、細胞死の定量は困難であり、よって、わずかの細胞しかカウントできない。最も決定的な実験は、死滅するプロセス中の細胞、すなわち、細胞毒性顆粒の内容物の漏出によって誘導されるプロセスである（２２）、ミトコンドリア損傷により不可逆的に死に至る細胞（４７）を定量することに関与した。このアプローチにより、（ｉ）頑健な増殖と同時に起こるｗｔ脳炎惹起性ＴＨ細胞の頑健な進行中の死および（ｉｉ）セルピンＢ１を欠くマウスにおける死滅する脳炎惹起性ＴＨ細胞のさらなる増加が実証された。発見の累積によって、ＥＡＥにおけるＣＸＣＲ６＋ＴＨ細胞のサブセットの拡大の程度と、それゆえに、それらの脳炎惹起性が同時の頑健な増殖と頑健な細胞死の正味の結果であり、後者は、セルピンＢ１によって制限され、その非存在下では増加することが示される。この本質的に非効率的な細胞拡大機序の進展を駆動する因子は知られていないが、これらが、しっかりとかつ不可逆的に調節される非常に有力な細胞集団に対する生物学的需要を反映することが企図される。
【０２５６】
注目すべきことに、ＩＬ−１βとＩＬ−２３に駆動されるＴＨ細胞の脳炎惹起性プログラムの基礎として、ここで提案されるセルピンＢ１に媒介される機序は、ＣＤ４細胞にとっては新しいが、特有のものではなく、むしろ活性化したＣＤ８細胞溶解性細胞およびＮＫ細胞のヒトおよびマウスにおける集団の拡大および収縮を制御するプログラムに類似する（２２、４５）。同様のプログラムでは、セルピンＢ１は、ヒトおよびマウスの好中球の生存を制御するために、内因性顆粒プロテアーゼと化学量論的に相互作用する（３４、３５）。
【０２５７】
最後に、免疫したマウスの抗ＣＸＣＲ６による処置によるＣＸＣＲ６＋細胞の見かけの枯渇によって、臨床疾患の発症が防止され、脊髄におけるサイトカイン産生ＴＨ細胞の蓄積が減少し、罹患したマウスの臨床症状が回復または軽快した。これらの発見により、ここで記載されているセルピンＢ１依存性多機能細胞が、実際に、ＥＡＥにおける脳炎惹起性を媒介することが示される。これらは、セルピンＢ１のレベルを調節するための療法、または、より現実的には、ＣＸＣＲ６にマークされたＴＨ細胞を枯渇させる戦略により、ＭＳなどの自己免疫障害を鎮静させることができることを示唆する。
（実施例４）
材料および方法
研究設計
【０２５８】
これは、生きたマウスおよびマウスの細胞で実施される実験室研究と患者のヒト炎症性Ｔ細胞の非介入研究との組合せである。目的は、ＣＤ４  Ｔ細胞のサブセットにおいて発現されるセルピンＢ１が自己免疫を駆動する機序を明らかにすること、およびこの機序が、一旦理解されると、ＭＳのような自己免疫障害および炎症性関節炎を軽快する治療目的で利用され得るかどうかを決定することである。研究の構成成分は、予め定義されなかった。それぞれの研究に関するマウスの数および反復の数が図の凡例で示されている。マウスの細胞に関する機序の研究は、一般的に、盲検法を用いずに実施した。無作為な順序でコード化された試料を提示された病理学者によって脊髄標本の病理学的スコア化がなされた。各実験では、様々な群のマウスが同じ性別であり、年齢と体重については合わせた。すべての主要な研究を雄と雌の両方で実施したところ、性別に特異的な差は検出されなかった。時間経過の実験では、実験開始前に、マウスを複数の群に振り分けた。ＭＯＧで免疫したマウスの治療処置における無作為化のための特別な予防手段は、図の凡例で詳述される。炎症性関節炎を有する患者の滑液は、研究の時点でコード化された識別子を有した。診断および他の疾患パラメーター（表２、図２８）に関する情報は、アッセイの完了とデータの解析後にのみ利用可能となった。
ヒトの試料
【０２５９】
処分した滑液の標本は、活動性の関節炎症に対する診断および／または治療的関節穿刺を受けている炎症性関節炎を有する患者から得た。関連する臨床情報は、関連する識別用リンカー（associated  identifying  linker）が破壊される前に、２週間の試料採取中の診療記録の再調査から入手した。患者に関する情報は表１に提供される。簡潔には、滑液の標本を１０％のＦＣＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中に希釈し、次いで、３００ｇで１０分間遠心分離した。単一細胞の懸濁液を表面染色のために調製するか、またはブレフェルジンＡの存在下で、ＰＭＡおよびイオノマイシン（Ｐ＋Ｉ）で４時間刺激し、サイトカインを検出した。
マウス
【０２６０】
セルピンＢ１欠損マウス（セルピンｂ１ａ−／−、以降ではＳｂ１−／−）を１２９Ｓ６／ＳｖＥｖ／Ｔａｃ（１２９Ｓ６）バックグラウンドで生成し（３３）、１０を超える世代の間、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）（ＣＤ４５．２＋）バックグラウンドに戻し交雑した。コンジェニックＢ６．ＳＪＬ−ＣＤ４５．１（ＣＤ４５．１、ｗｔ）、ＯＴ−ＩＩ、ＣＤ４−Ｃｒｅ、およびＲａｇ１／−マウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからのものであった。ＣＤ４５．１  ｓｂ１−／−およびＯＴ−ＩＩ  ｓｂ１−／−株は、Ｓｂ１−／−  Ｂ６マウスをＣＤ４５．１またはＯＴ−ＩＩマウスと交配し、得られたヘテロ接合体を異種交配することによって生成した。もとは、Ｉｌ２３ｒｆｌ／ｆｌマウスは、Aden  et  al（５８）に記載されていた。Ｉｌ２３ｒΔＣＤ４マウスを、Ｉｌ２３ｒｆｌ／ｆｌマウス（５８）をＣｄ４ｃｒｅマウスと交配し、得られたヘテロ接合体を異種交配することによって生成した。マウスは、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの動物施設か、またはチューリッヒ大学のＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙの動物施設において維持した。動物研究は、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  ＨｏｓｐｉｔａｌのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅか、またはチューリッヒの獣医局（ｃａｎｔｏｎａｌ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｏｆｆｉｃｅ）によって承認された。ｗｔ：Ｓｂ１−／−混合骨髄キメラを生成するために、Ｒａｇ１／−マウスに、４時間間隔で５５０ラドの線量を２回、致死的に照射した。追跡可能なコンジェニックＣＤ４５マーカーを有するＴ細胞が枯渇した野生型と変異体の骨髄細胞を１：１の比で混合し、ｉ．ｖ．注射した。ｗｔ：Ｉｌ２３ｒΔＣＤ４混合骨髄キメラを生成するために、ｗｔ（ＣＤ４５．１）マウスおよびＩｌ２３ｒΔＣＤ４（ＣＤ４５．２）マウスからの合計５×１０６個の骨髄細胞を２×５５０ラドを２４時間間隔で照射したｗｔ  ＣＤ４５．１×ＣＤ４５．２マウスの尾静脈に注射した。細菌感染を防止するために、照射の１週間前から照射後の４週間まで、Ｓｕｌｆａｔｒｉｍを含有するオートクレーブした飲料水をマウスに与えるか、または２週間にわたり０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＢｏｒｇａｌを飲料水に添加した。
ヘルパーＴ細胞の分化
【０２６１】
単一細胞の懸濁液を、４〜６週齢のＢ６マウスの脾臓から調製した。ナイーブＣＤ４  Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５ｎｅｇＣＤ４４ｎｅｇＣＤ６２Ｌ＋）をＦＡＣソーティングし、Ｔｈ０、Ｔｈ１、ＴｒｅｇおよびＴｈ１７サブセットのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分極化を２４に記載したように行った。Ｔｈ２細胞を生成するために、ナイーブＣＤ４  Ｔ細胞を、ｍＩＬ−４（１０ｎｇ  ｍｌ−１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）および抗ｍＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１．２、５ｊｉｇ  ｍｌ−１、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）の存在下で、抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８とで予めコーティングした２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）中で培養した。２段階の分化では（１７）、新たに分化したＴｈ１７細胞をｍＩＬ−２（２ｎｇ  ｍｌ−１）の存在下で２日間休ませ、次いで採取し、洗浄し、ｍＩＬ−２（２０ｎｇ  ｍｌ−１）、ｍＩＬ−１２（２０ｎｇ  ｍｌ−１）またはｍＩＬ−２３（５０ｎｇ  ｍｌ−１）の非存在下または存在下で、さらに２４時間、抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８（いずれも１ｊｉｇ  ｍｌ−１、プレートをコーティング）で再刺激した。
ＥＡＥの誘発
【０２６２】
マウスには、０日目と２日目に、加熱殺菌したＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株Ｈ３７Ｒａ（４ｍｇ  ｍｌ−１）（Ｄｉｆｃｏ）を含有する完全フロイントアジュバントを用いて乳化したミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）のアミノ酸３５〜５５（ＰｒｏＳｐｅｃ、マウス１匹当たり１５０ｊｉｇ）を背面の３部位に注射し、２００ｎｇの百日咳毒素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｓ）をｉ．ｐ．注射した（以降では「ＭＯＧ免疫」と称される）。雄のマウスと雌のマウスの両方を使用し、各実験では、比較される動物の年齢および性別を合わせた。疾患を、（０）無症状、（１）元気のない尾（ｌｉｍｐ  ｔａｉｌ）、（２）後肢衰弱、（３）後肢麻痺、（４）後肢麻痺と部分的または完全な前肢麻痺としてスコア化した。マウスが、施設の規制に対して２５％の体重減少を伴うステージ４またはステージ３に到達した際に、マウスを安楽死させた。
養子移入によるＥＡＥ
【０２６３】
ＭＯＧで免疫したｗｔマウスまたはｓｂ１−／−マウスを、臨床症状の発症前の「誘導期」の間の終わり（すなわち、７〜１０日目）に屠殺した。リンパ節と脾臓を回収し、ＭＯＧペプチドおよびＩＬ−２３と共に培養した。拡大したＣＤ４  Ｔ細胞をネガティブ磁気クロマトグラフィー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によって富化し、ナイーブｗｔマウスまたはｓｂ１−／−マウスへと尾静脈を介してｉ．ｖ．注射した（マウス１匹当たり５×１０６個の細胞）。０日目と２日目に、マウスに、２００ｎｇの百日咳毒素をｉ．ｐ．注射した。
ＥＡＥのナイーブＣＤ４細胞移入モデル
【０２６４】
ナイーブＣＤ４  Ｔ細胞を、ネガティブ磁気選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によって、ナイーブｗｔマウスまたはｓｂ１−／−マウスの脾臓から単離し、マウス１匹当たり５×１０６個の細胞を、ナイーブＲａｇ１／−レシピエントマウスの尾静脈に注射した。１日後に、マウスをＭＯＧ３５−５５／ＣＦＡで免疫し、続いて、上記のように百日咳毒素を注射してＥＡＥを誘発した。
ＯＴ−ＩＩ追跡研究
【０２６５】
コンジェニックＷＴ  ＣＤ４５．１マウスに２×１０５個のナイーブＣＤ４５．２＋ＯＴ−ＩＩ細胞またはナイーブＣＤ４５．２＋ｓｂ１−／−ＯＴ−ＩＩ細胞をｉ．ｖ．により移入し、ＯＶＡ３２３−３３９／ＣＦＡでｓ．ｃ．により免疫した。免疫後の４日目と１２日目に、流入領域リンパ節を回収し、フローサイトメトリーによってＯＴ−ＩＩ細胞を定量して、その表現型を決定した。
ＤＴＨ反応
【０２６６】
ＯＴ−ＩＩ細胞またはｓｂ１−／−ＯＴ−ＩＩ細胞のｗｔレシピエントをＯＶＡ３２３−３３９／ＣＦＡで免疫し、記載したように（１１）、食塩水中５０ｊｉｇのＯＶＡ３２３−３３９を一方の後肢の足蹠に負荷した。ＭＯＧ−ＤＴＨ反応では、ｗｔマウスまたはｓｂ１−／−マウスを、ＥＡＥ誘発プロトコールに従って、ＭＯＧで免疫し、疾患前の期に、食塩水中５０ｊｉｇのＭＯＧ３５−５５を一方の後肢の足蹠に負荷した。両方の場合には、対側性の足蹠には食塩水を注射した。肢の厚みをカリパスで測定し、負荷前の肢の厚みを引くことによって腫脹を計算する。
脊髄に浸潤する細胞の単離
【０２６７】
ＥＡＥのマウスを屠殺し、脊髄を取り除いた。組織を機械的に分離し、５％のＦＣＳを含有する完全ＲＰＭＩ  １６４０培地中１ｍｇ  ｍｌ−１のコラゲナーゼＤ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および５０ユニット／ｍｌのＤＮＡｓｅ  Ｉ（Ｒｏｃｈｅ）によって、３７℃で３０分間消化した。８０％のパーコール勾配に対して３０％白血球をさらに富化した。
脊髄の組織学
【０２６８】
脊髄をブアン液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中に浸漬することによって固定し、パラフィンワックス中に包埋した。様々な位置から切片を切断し、Ｈ＆Ｅで染色した。切片は病理学者が評価し、炎症および変性の重症度について、（０）無症状、（１）軽度、（２）中程度に重度、（３）重度としてスコア化した。スコア化は盲検法によってなされた。
細胞内染色およびフローサイトメトリー
【０２６９】
ブレフェルジンＡの存在下で、細胞を、ＰＭＡ（５０ｎｇ  ｍｌ−１）およびイオノマイシン（７５０ｎｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で４時間刺激した（Ｐ＋Ｉ刺激）。細胞を、表面マーカーに対する、蛍光色素をコンジュゲートした抗体で染色した。洗浄後、細胞をフローサイトメトリー解析のために固定するか、またはＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅからの固定／透過処理試薬およびプロトコールを使用して、透過処理し、蛍光色素をコンジュゲートした抗体により、細胞内染色した。ＬＡＭＰ１染色の場合には、Ｐ＋Ｉ刺激の開始時に、抗ＬＡＭＰ１抗体を培地中に添加した。蛍光色素をコンジュゲートした抗体または細胞死に関連する色素は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄからのものである：ＦＩＴＣ−またはＰＥ−Ｃｙ７抗ｍＣＤ３（１４５−２Ｃ１１）、パシフィックブルー−またはＡＰＣ−抗ｍＣＤ４５．１（Ａ２０）、パシフィックブルー−またはＰＥ−抗ｍＣＤ４５（３０−Ｆ１１）、パシフィックブルー−抗ｍＣＤ４５．２（１０４）、パシフィックブルー−またはＰＥ−Ｃｙ７−またはＡＰＣ−抗ｍＣＤ４（ＧＫ１．５）、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ４８８−抗Ｂｒｄｕ（３Ｄ４）、ＰＥ−抗ｍグランザイムＣ（ＳＦＣ１Ｄ８）、ＦＩＴＣ−抗ｈ／ｍグランザイムＢ（ＧＢ１）、ＰＥ−抗ｍＩＬ１Ｒ１（ＪＡＭＡ−１４７）、ＦＩＴＣ−抗ｍＣＤ４４（ＩＭ７）、ＡＰＣ−抗ｍＣＸＣＲ６（ＳＡ０５１Ｄ１）、ＡＰＣ−抗ｍＣＣＲ２（ＳＡ２０３Ｇ１１）、ＡＰＣ−またはＰＥ−Ｃｙ７−抗ｍＣＣＲ６（２９−２Ｌ１７）、ＰＥ−Ｃｙ７−抗ｍＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８−抗ｍＧｒ１（ＲＢ６−８Ｃ５）、ＦＩＴＣ−抗ｍインテグリンβ２（Ｍ１８／２）、ＰＥ−抗ｍインテグリンαＬ（Ｍ１７／４）、ＰＥ−抗ｍＣＤ２５（３Ｃ７）、ＰＥ−抗ｍＩＬ７Ｒα（Ａ７Ｒ３４）、ＦＩＴＣ−抗ｈ／ｍ／ラットＩＣＯＳ（Ｃ３９８．４Ａ）、ＰＥ−Ｃｙ７−抗ｍＰＤ１（２９Ｆ．１Ａ１２）、ＰＥ−抗ｍＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ−１４）、パシフィックブルー−またはＡＰＣ−抗ｍＩＬ−１７（ＴＣ１１−１８Ｈ１０．１）、パシフィックブルー−またはＰＥ−抗ｍＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１．２）、ＦＩＴＣ−またはＰＥ−抗ｍＧＭ−ＣＳＦ（ＭＰ１−２２Ｅ９）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８−抗ＦｏｘＰ３（ＦＪＫ−１６ｓ）。ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからは：ＡＰＣ−抗パーフォリン（ｅＢｉｏＯＭＡＫ−Ｄ）、ＰＥ−抗ＬＡＭＰ１（１Ｄ４Ｂ）、ＰＥ−Ｃｙ７−抗Ｋｉ６７（Ｓ０１Ａ１５）、ＦＩＴＣ−抗ｍインテグリンβ１（ｅＢｉｏＨＭｂ１−１）、ＰＥ−抗ｍインテグリンα４（Ｒ１−２）、ＦＩＴＣ−抗ｍインテグリンβ３（２Ｃ９．Ｇ３）、ＰＥ−抗ｍインテグリンαＶ（ＲＭＶ−７）。Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍからは：ＰＥ−抗ｍＩＬ−２３Ｒ（７５３３１７）。ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからは：ＰＥ−抗ｍＣＤ６９（Ｈ１．２Ｆ３）、ＦＩＴＣ−ウサギ−抗活性カスパーゼ３（Ｃ９２−６０５）、ＦＩＴＣ−アネキシンＶ。Ｃａｎｔｏ  ＩＩサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）においてデータを得て、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を使用して解析した。
ＢｒｄＵによる標識および検出
【０２７０】
マウスを免疫し、ＥＡＥを誘発した。ＥＡＥ誘発後１０日目に、ＢｒｄＵ（マウス１匹当たり１ｍｇ）をｉ．ｖ．注射するかまたはｉ．ｐ．注射した。リンパ節の細胞を回収し、様々なマーカーの表面での発現に関して染色し、製造業者のプロトコール（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）に従ってＢｒｄＵの検出を行った。サイトカイン産生細胞におけるＢｒｄＵの取り込みをモニターするために、マウスにＢｒｄｕ（マウス１匹当たり１ｍｇ）を６時間ｉ．ｐ．注射した。次いで、ブレフェルジンＡの存在下で、リンパ節の細胞をＰＭＡ（５０ｎｇ  ｍｌ−１）およびイオノマイシン（７５０ｎｇ  ｍｌ−１）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で２．５時間刺激し、続いて、表面マーカーを染色し、サイトカインおよびＢｒｄＵを細胞内で共染色した。
ミトコンドリア膜の電位
【０２７１】
新たに回収したリンパ節の白血球を３，３’−ジヘキシルオキサカルボシアニンヨージド（ＤＩＯＣ６）（４７）（１０ｎＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で、３７℃で１５分間インキュベートし、洗浄し、フルオレセイン標識したｍＡｂで染色した。固定せずにフローサイトメトリーによって細胞を評価した。あるいは、５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンズイミダゾロカルボ−シアニンヨージド（ＪＣ−１）（５９）（２ｊｉｇ  ｍｌ−１）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を同じプロトコールにおけるミトコンドリアプローブとして使用した。
ウエスタンブロット
【０２７２】
試料を１２％のトリス−グリシンゲル上で分離し、ＰＶＤＦ上に移した。膜を５％または２０％の乳固形分でブロックし、ヒトセルピンＢ１に対して生成したウサギ抗血清またはグランザイム−Ｃ３６に対するウサギ４２８Ａ抗血清のＩｇＧ画分（ａｒＣ７０６８８）、続いてＨＲＰをコンジュゲートした２次抗体（Ｃｅｌｌ  ＳｉｇｎａｌｉｎｇまたはＢｉｏＲａｄ）で染色した。化学発光を増強することによってバンドを可視化した（ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓまたはＷｅｓｔ  Ｐｉｃｏ、Ｐｉｅｒｃｅ）。セルピンＢ１のブロットを取り去り、ＧＡＰＤＨ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に対するウサギのｍＡｂで再度染色した。
セルピン−プロテアーゼ複合体形成
【０２７３】
組換えＥ１９３Ｇ−グランザイムＣ（６０）（２０ｎｇ  ｍｌ−１）を１、２または４モル当量の組換えヒトセルピンＢ１３７と共インキュベートした。ＳＤＳおよび２−メルカプトエタノールと共に加熱することによって、反応物をウエスタンブロット（上記のように）用に調製した。並行反応のＰＶＤＦ転写物を、Ａｕｒｏｄｙｅ（コロイド金、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用してタンパク質に関して染色した。
逆転写およびｑＰＣＲ解析
【０２７４】
製造業者のプロトコールに従って、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  ｋｉｔ（７４１３４、Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを単離し、ｉＳｃｒｉｐｔ（商標）ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して逆転写した。プライマーを使用して（表２）、９５℃で３０秒の変性および９５℃で５秒および６１℃で３０秒の４０サイクルを使用して、ｉＴａｑ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いるＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で、ｑＰＣＲアッセイを実施した。各遺伝子の相対的発現レベルを、ΔΔＣｔ方法を使用し、Ａｃｔｂに対して正規化することによって算出した。
ＲＮＡシーケンシング
【０２７５】
Ｓｂ１に関連するＲＮＡｓｅｑ：ＣＤ４エフェクター細胞（ＣＤ４４＋ＣＤ４）を疾患発症時にプールしたＭＯＧで免疫したｗｔマウスとｓｂ１−／−マウスのリンパ節細胞から選別精製した。細胞を４時間±ＳＥＭの間、Ｐ＋Ｉで刺激し、ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔを使用してＲＮＡを精製し、２６０／２８０／２３０ｎｍのＲＮＡ（遺伝子型１つ当たり１ｊｉｇ）の光学密度で定量して、輸送した。
【０２７６】
Ｍａｃｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ（Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）およびＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ  Ｖ２キットを使用して、転写物特異的ライブラリーを構築し、これをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２５００でシーケンシングした。得られた４．５Ｇｂ／遺伝子型の生データをトリミングして、２千万リードをマッピングした。得られた２元データセットにおいて評価した２４，０００個以上の遺伝子のうち、１．０以上の発現レベル（ＦＰＫＭ）を有した９，６００個の遺伝子を差次的発現について解析した。
【０２７７】
ＩＬ−２３ｒに関連するＲＮＡｓｅｑ：キメラマウス（ｗｔ：Ｉｌ２３ｒΔＣＤ４）マウスをＭＯＧで免疫した。９日後に、エフェクターＣＤ４細胞（ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｌｏ  ＣＤ４＋Ｔ細胞）を以下の抗体を使用してリンパ節（腋窩、上腕および鼠径部）から選別した：ＢＤ  ＰｈａｒｍｉｇｅｎからのＣＤ４５．１（クローンＡ２０）、ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、ＣＤ８ａ（５３−６．７）；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄからのＣＤ４５．２（１０４）、ＣＤ４（ＲＭ４−５）、ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ−１４）；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのＣＤ３（１７Ａ２）およびＣＤ４４（ＩＭ７）。ＦＳＣ−Ａ／ＦＳＣ−Ｈゲーティングによってダブレットの排除を実行し、Ｚｏｍｂｉｅ  Ａｑｕａ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で細胞死を排除した。細胞選別は、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実行した。ＲＮＡ全体を製造業者の指示に従って、ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔを用いて単離した。ＲＮＡの予備増幅およびライブラリーの調製のために、Ｓｍａｒｔ−ｓｅｑ２プロトコールをＩｌｌｕｍｉｎａ’ｓ  Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）と組み合わせて使用した。ライブラリーの調製とＮＧＳは、ＨｉＳｅｑ  ２５００  ｖ４  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  Ｂａｓｅｌ（ＥＴＨ  ＺｕｒｉｃｈおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって実施した。品質管理には、ｆａｓｔｑｃ解析が含まれた。
抗ＣＸＣＲ６抗体による処置
【０２７８】
アイソタイプラットＩｇＧ２ｂ抗体（ＲＴＫ４５３０）およびラット抗マウスＣＸＣＲ６（ＳＡ０５１Ｄ１）は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄからのものであった。抗体（ＵＬＥＡＦによる純度）を滅菌濾過し（０．２μｍのフィルター）、防腐剤もアジドも含有せず、エンドトキシンは、タンパク質１μｇ当たり０．０１ＥＵ未満しか含有しなかった。アイソタイプ抗体または抗ＣＸＣＲ６抗体をｉ．ｐ．注射した。
統計解析
【０２７９】
Ｐｒｉｓｍ４（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、統計解析を実施した。ステューデントのｔ検定（対応のないものと対応のあるもの）、および一元ＡＮＯＶＡを実験の種類に従って使用した。ｐ値≦０．０５は有意差ありとみなした。
（実施例５）
ビデオ映像および実験設計の説明
【０２８０】
処置したマウスについて撮影したビデオの説明が本明細書において説明され、ビデオ１．ｍｐ４、２．ｍｐ４、３．ｍｐ４、４．ｍｐ４および５．ｍｐ４を含む。
【０２８１】
抗ＣＸＣＲ６による処置は、確立されたＥＡＥ−抗ＣＸＣＲ６で処置したマウスおよびアイソタイプ処置マウスの挙動を逆転させる。治療プロトコール。１９匹のｗｔマウス、５ケージの４〜５同腹子／ケージをＭＯＧで免疫し、疾患が最初に検出されたときに（臨床スコア１〜３）、マウスを無作為に振り分け、その日（「０日目」）と２日後および４日後に、抗ＣＸＣＲ６抗体またはアイソタイプ対照（ｎ＝１１）のいずれかを４００μｇ、ｉ．ｐ．与えた。臨床スコアを０日目に開始して、毎日記録した（図２０Ｃ）。処置３日目〜６日目に対応する単一のスコア化セッションの間にビデオを準備し、その時点で、アイソタイプ処置マウスのうちの３匹がスコア４に達し、プロトコールに従って、屠殺した。すべてのマウスを、離乳時に、イヤーパンチシステムで特定し、これに、尾のマーカーペンによるラベルをビデオテープ録画用に追加した。マーカーペンラベルシステム：番号１：１本の横線；番号２：２本の横線；番号３：３本の横線；番号４：４本の横線；番号５：１本の縦線。各ケージ内のマウスは同腹子であり、研究全体を通して一緒のままであった。各ケージのビデオでは、連続的または高頻度で移動したマウスは、ｍＡｂで処置したマウスであり、そのままの位置にいたマウス（ほとんどの場合は伏臥位で）、またはゆっくりとかつ低い頻度でのみ移動したマウスはアイソタイプ処置マウスであった。アイソタイプ処置マウスおよび抗ＣＸＣＲ６  ｍＡｂで処置したマウスの詳細な情報は、以下に提供した。
【０２８２】
ビデオ１（ケージ１１９７２８８）。３匹のマウス：抗ＣＸＣＲ６  ｍＡｂ、マウス番号３、０日目にスコア２、５日目にビデオテープ録画（３回の処置）抗ＣＸＣＲ６  ｍＡｂ、マウス番号５、０日目にスコア２、４日目にビデオテープ録画（２回の処置）アイソタイプ処置、マウス番号１、０日目にスコア１、４日目にビデオテープ録画（２回の処置）
【０２８３】
ビデオ２（ケージ１１９７２８７）。３匹のマウス：抗ＣＸＣＲ６  ｍＡｂ、マウス番号４、０日目にスコア２、４日目にビデオテープ録画（２回の処置）アイソタイプ処置、マウス番号２、０日目にスコア３、５日目にビデオテープ録画（３回の処置）アイソタイプ処置、マウス番号３、０日目にスコア１、３日目にビデオテープ録画（２回の処置）
【０２８４】
ビデオ３（ケージ１１９７２７１）。３匹のマウス：抗ＣＸＣＲ６  ｍＡｂ、マウス番号２、０日目にスコア３、６日目にビデオテープ録画（３回の処置）アイソタイプ処置、マウス番号１、０日目にスコア１、２日目にビデオテープ録画（１回の処置）アイソタイプ処置、マウス番号３、０日目にスコア２、４日目にビデオテープ録画（２回の処置）
【０２８５】
ビデオ４（ケージ１１９７３０４）。４匹のマウス：抗ＣＸＣＲ６  ｍＡｂ、マウス番号３、０日目にスコア２、６日目にビデオテープ録画（３回の処置）抗ＣＸＣＲ６  ｍＡｂ、マウス番号５、０日目にスコア１、４日目にビデオテープ録画（２回の処置）アイソタイプ処置、マウス番号１、０日目にスコア１、４日目にビデオテープ録画（２回の処置）アイソタイプ処置、マウス番号４、０日目にスコア１、５日目にビデオテープ録画（３回の処置）
【０２８６】
ビデオ５（ケージ１１９７２９８）。３匹のマウス：抗ＣＸＣＲ６  ｍＡｂ、マウス番号１、０日目にスコア２、３日目にビデオテープ録画（２回の処置）抗ＣＸＣＲ６  ｍＡｂ、マウス番号３、０日目にスコア１、６日目にビデオテープ録画（３回の処置）アイソタイプ処置、マウス番号２、０日目にスコア２、４日目にビデオテープ録画（２回の処置）。
【０２８７】
ビデオ１〜５によって、連続的または高頻度で移動したマウスは、ｍＡｂで処置したマウスであり、そのままの位置にいたマウス（ほとんどの場合は伏臥位で）、またはゆっくりとかつ低い頻度でのみ移動したマウスはアイソタイプ処置マウスであったことが明らかとなった。これらの結果は、症状が現れた後に、抗ＣＸＣＲ６  ｍＡｂを動物に送達することにより（「治療プロトコール」）、臨床スコアがベースラインへと逆転するという驚くべき結果を示す。
参照文献：
【数１−１】
2021521121.tif 000007
【数１−２】
2021521121.tif 000008
【数１−３】
2021521121.tif 000009
【数１−４】
2021521121.tif 000010
【数１−５】
2021521121.tif 000011
【数１−６】
2021521121.tif 000012
【数１−７】
2021521121.tif 000013
配列
【０２８８】
ＣＸＣＲ６をコードする核酸配列（配列番号１）。
【化３】
2021521121.tif 000014
【０２８９】
セルピンＢ１をコードする核酸配列（配列番号２）。
【化４−１】
2021521121.tif 000015
【化４−２】
2021521121.tif 000016
【０２９０】
ＣＸＣＲ６をコードするポリペプチド配列（配列番号３）
【化５】
2021521121.tif 000017
【０２９１】
セルピンＢ１をコードするポリペプチド配列（配列番号４）
【化６】
2021521121.tif 000018
【０２９２】
セルピンＢ１  Ｘ１をコードするポリペプチド配列（配列番号５）
【化７】
2021521121.tif 000019
【０２９３】
セルピンＢ１  Ｘ２をコードするポリペプチド配列（配列番号６）
【化８】
2021521121.tif 000020
【０２９４】
マウスＣＸＣＲ６をコードするポリペプチド配列（配列番号７）
【化９】
2021521121.tif 000021
【０２９５】
マウスセルピンＢ１ａをコードするポリペプチド配列（配列番号８）
【化１０】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１１−６】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１７−５】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１８−５】
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【図１８−６】
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【図１８−７】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図１９−４】
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【図１９−５】
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【図１９−６】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２３−４】
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【図２３−５】
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【図２３−６】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２４−４】
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【図２４−５】
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【図２４−６】
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【図２４−７】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【図２５−４】
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【図２５−５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年12月9日(2020.12.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫疾患を有する対象を処置するための、ＣＸＣＲ６を標的とする薬剤を含む組成物であって、ＣＸＣＲ６を標的とすることは、ＣＸＣＲ６を発現する細胞またはその集団の枯渇をもたらす、組成物。
【請求項２】
前記細胞集団を、適切な対照と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれより多く枯渇させる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記細胞集団が、Ｔ細胞集団、Ｔｈ１７細胞集団またはＴｈ１７由来細胞集団である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ＣＸＣＲ６を標的とする前記薬剤が、少なくとも第２の薬剤または少なくとも毒素に連結している、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、クローン病、ループス、セリアック病、シェーグレン症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性硬化症、強直性脊椎炎、１型糖尿病、円形脱毛症、血管炎、自己免疫性ブドウ膜炎、若年性特発性関節炎、および側頭動脈炎からなるリストから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記対象が、ヒトである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
ＣＸＣＲ６を標的とする前記薬剤が、小分子、抗体、およびペプチドからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
抗体が、枯渇抗体である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
Ｔ細胞、Ｔｈ１７細胞またはＴｈ１７由来細胞の集団を選択するための方法であって、候補細胞の集団においてＣＸＣＲ６のレベルを測定するステップと、ＣＸＣＲ６の発現を呈する細胞を選択するステップとを含む方法。
【請求項１１】
ＣＸＣＲ６のレベルが、参照レベルと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、またはそれより高い倍率で増加する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
自己免疫疾患を処置する方法における使用のための、ＣＸＣＲ６を標的とする薬剤を含む組成物であって、
ａ．適切な対照と比較して、対象由来の生体試料中のＣＸＣＲ６レベルの増加を示すアッセイの結果を受容するステップと、
ｂ．前記組成物を前記対象に投与するステップと
を含む方法。
【請求項１３】
前記アッセイが、フローサイトメトリー、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮＡシーケンシング、または免疫組織化学である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記対象が、自己免疫疾患を有していると疑われているか、または自己免疫疾患を有する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記方法が、対象のＴｈ１７細胞によって発現されるセルピンＢ１レベルを検出するステップと、適切な対照と比較して、セルピンＢ１レベルの増加を示すアッセイの結果を受容するステップとをさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
前記方法が、前記対象における、パーフォリン−Ａ、グランザイムＡ（ＧｚｍＡ）、ＧｚｍＨ（マウスＧｚｍＣのヒト対応物）、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）、ＩＬ−６、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、インターロイキン−２３受容体（ＩＬ−２３Ｒ）、ＩＬ−７ＲαおよびＩＬ−１Ｒ１、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、ＲＡＲ関連オーファン受容体Ｃ（Ｒｏｒｃ）、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のうちの１つまたは複数のレベルを検出するステップをさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１７】
前記方法が、脊髄における白血球の蓄積を検出するステップをさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１８】
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、クローン病、ループス、セリアック病、シェーグレン症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性硬化症、強直性脊椎炎、１型糖尿病、円形脱毛症、血管炎、自己免疫性ブドウ膜炎、若年性特発性関節炎、および側頭動脈炎からなる群から選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１９】
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項２０】
前記対象が、ヒトである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項２１】
前記方法が、ステップ（ａ）のアッセイの結果を受容する前に、前記対象から生体試料を得るステップを含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項２２】
前記生体試料が、滑液、脊髄液、組織、または血液である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項２３】
ＣＸＣＲ６を発現するＴ細胞の集団を減少させるための、ＣＸＣＲ６を標的とする薬剤を含む組成物。
【請求項２４】
前記Ｔ細胞集団が、適切な対照と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれより多く枯渇される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記Ｔ細胞集団が、Ｔｈ１７細胞集団またはＴｈ１７由来細胞集団である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ＣＸＣＲ６を標的化することが、自己免疫疾患に対する処置を必要とする対象におけるものである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、クローン病、ループス、セリアック病、シェーグレン症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性硬化症、強直性脊椎炎、１型糖尿病、円形脱毛症、血管炎、自己免疫性ブドウ膜炎、若年性特発性関節炎、および側頭動脈炎からなる群から選択される、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２９】
前記薬剤が、小分子、抗体およびペプチドからなる群から選択される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３０】
前記抗体が、枯渇抗体である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記組成物の投与が、炎症を阻害する、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３２】
前記細胞が、分化したＴ細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記毒素が、微小管阻害剤ＤＭ−１、メイタンシンの誘導体、またはモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である、請求項４に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
任意の態様の別の実施形態では、投与するステップは、脊髄における白血球の蓄積を阻害する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
自己免疫疾患を処置するための方法であって、ＣＸＣＲ６を標的とする薬剤を、自己免疫疾患を有する対象に投与するステップを含み、ＣＸＣＲ６を標的とすることは、ＣＸＣＲ６を発現する細胞またはその集団の枯渇をもたらす、方法。
（項目２）
自己免疫疾患を処置するための方法であって、セルピンＢ１を阻害する薬剤を、自己免疫疾患を有する対象に投与するステップを含む方法。
（項目３）
前記細胞集団を、適切な対照と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれより多く枯渇させる、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記細胞集団が、Ｔｈ１７細胞集団またはＴｈ１７由来細胞集団である、項目１に記載の方法。
（項目５）
ＣＸＣＲ６を標的とする前記薬剤が、少なくとも第２の薬剤に連結している、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、クローン病、ループス、セリアック病、シェーグレン症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性硬化症、強直性脊椎炎、１型糖尿病、円形脱毛症、血管炎、自己免疫性ブドウ膜炎、若年性特発性関節炎、および側頭動脈炎からなるリストから選択される、項目１〜２に記載の方法。
（項目７）
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症である、項目１〜２に記載の方法。
（項目８）
前記対象が、ヒトである、項目１〜２に記載の方法。
（項目９）
ＣＸＣＲ６を標的とする前記薬剤が、小分子、抗体、およびペプチドからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目１０）
セルピンＢ１を阻害する前記薬剤が、小分子、抗体、ペプチド、ゲノム編集系、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＲＮＡｉからなる群から選択される、項目２に記載の方法。
（項目１１）
抗体が、枯渇抗体である、項目８〜９に記載の方法。
（項目１２）
前記ＲＮＡｉが、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡである、項目９に記載の方法。
（項目１３）
セルピンＢ１を阻害することは、セルピンＢ１の発現レベルおよび／または活性を阻害することである、項目２に記載の方法。
（項目１４）
セルピンＢ１の発現レベルおよび／または活性が、適切な対照と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれより多く阻害される、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
Ｔｈ１７細胞またはＴｈ１７由来細胞の集団を選択するための方法であって、候補細胞の集団においてＣＸＣＲ６のレベルを測定するステップと、ＣＸＣＲ６の発現を呈する細胞を選択するステップとを含む方法。
（項目１６）
ＣＸＣＲ６のレベルが、参照レベルと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、またはそれより高い倍率で増加する、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
自己免疫疾患を処置する方法であって、
ａ．適切な対照と比較して、対象由来の生体試料中のＣＸＣＲ６レベルの増加を示すアッセイの結果を受容するステップと、
ｂ．セルピンＢ１のレベルまたは活性を阻害する薬剤を前記対象に投与するステップと
を含む方法。
（項目１８）
前記アッセイが、フローサイトメトリー、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮＡシーケンシング、または免疫組織化学である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記対象が、自己免疫疾患を有していると疑われているか、または自己免疫疾患を有する、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
対象のＴｈ１７細胞によって発現されるセルピンＢ１レベルを検出するステップと、適切な対照と比較して、セルピンＢ１レベルの増加を示すアッセイの結果を受容するステップとをさらに含む、項目１７に記載の方法。
（項目２１）
前記対象における、パーフォリン−Ａ、グランザイムＡ（ＧｚｍＡ）、ＧｚｍＣ、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）、ＩＬ−６、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、インターロイキン−２３受容体（ＩＬ−２３Ｒ）、ＩＬ−７ＲαおよびＩＬ−１Ｒ１、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、ＲＡＲ関連オーファン受容体Ｃ（Ｒｏｒｃ）、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のうちの１つまたは複数のレベルを検出するステップをさらに含む、項目１７に記載の方法。
（項目２２）
脊髄における白血球の蓄積を検出するステップをさらに含む、項目１７に記載の方法。
（項目２３）
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、クローン病、ループス、セリアック病、シェーグレン症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性硬化症、強直性脊椎炎、１型糖尿病、円形脱毛症、血管炎、自己免疫性ブドウ膜炎、若年性特発性関節炎、および側頭動脈炎からなる群から選択される、項目１７に記載の方法。
（項目２４）
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症である、項目１７に記載の方法。
（項目２５）
前記対象が、ヒトである、項目１７に記載の方法。
（項目２６）
ステップ（ａ）のアッセイの結果を受容する前に、前記対象から生体試料を得る、項目１７に記載の方法。
（項目２７）
前記生体試料が、滑液、脊髄液、組織、または血液である、項目１７に記載の方法。
（項目２８）
ＣＸＣＲ６を発現するＴ細胞の集団を減少させる方法であって、白血球におけるセルピンＢ１のレベルまたは活性を低下させる薬剤を投与するステップを含む方法。
（項目２９）
白血球におけるセルピンＢ１のレベルまたは活性を前記低下させることが、セルピンＢ１の阻害剤を投与することを含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記Ｔ細胞集団が、適切な対照と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれより多く枯渇される、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
前記Ｔ細胞集団が、Ｔｈ１７細胞集団またはＴｈ１７由来細胞集団である、項目２８に記載の方法。
（項目３２）
セルピンＢ１のレベルまたは活性を前記低下させることが、自己免疫疾患に対する処置を必要とする対象におけるものである、項目２８に記載の方法。
（項目３３）
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、クローン病、ループス、セリアック病、シェーグレン症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性硬化症、強直性脊椎炎、１型糖尿病、円形脱毛症、血管炎、自己免疫性ブドウ膜炎、若年性特発性関節炎、および側頭動脈炎からなる群から選択される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症である、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
前記薬剤が、小分子、抗体、ペプチド、ゲノム編集系、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＲＮＡｉからなる群から選択される、項目２８に記載の方法。
（項目３６）
前記抗体が、枯渇抗体である、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記ＲＮＡｉが、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡである、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
セルピンＢ１の前記レベルおよび／または活性が、適切な対照と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれより多く阻害される、項目２８に記載の方法。
（項目３９）
前記投与するステップが、炎症を阻害する、項目２８に記載の方法。
（項目４０）
前記投与するステップが、脊髄における白血球の蓄積を阻害する、項目２８に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
【図６−１】図６Ａ〜６Ｃは、ＷＴマウスおよびＳｂ１−／−マウスにおけるＩＦＮγ＋エフェクターＣＤ４細胞およびＧＭ−ＣＳＦ＋エフェクターＣＤ４細胞を示すデータを表す。図６Ａは、ＰＭＡおよびイオノマイシン後の様々なサイトカイン産生ＣＤ４エフェクター細胞の定量を示す。図６Ｂは、抗原リコールの定量を示す。図６Ｃは、リアルタイムＰＣＲによって定量したリンパ節のエフェクターＣＤ４細胞におけるｍＲＮＡレベルを示す。灰色の記号はＳｂ１−／−を示し；黒色の記号はＷＴを示す。Ｓｂ１−／−マウスでは、−ＩＦＮγ＋およびＧＭ−ＣＳＦ＋エフェクターＣＤ４細胞が減少する。
【図６−２】同上。
【図６−３】同上。
【図６−４】同上。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
【図１７−１】図１７Ａ〜１７Ｇは、ＣＤ４細胞によるｓｂ１の自発性欠損によってＥＡＥが軽快されることを示す。（Ａ〜Ｃ）ｗｔマウスおよびｓｂ１−／−マウスをＭＯＧ／ＣＦＡで免疫し、ＥＡＥを誘発した。図１７Ａは、ｗｔマウス（ｎ＝１３）およびｓｂ１−／−マウス（ｎ＝１４）の平均臨床スコア（左）および体重（右）を示す。同じパターンで実験を５回より多く繰り返した。図１７Ｂは、フローサイトメトリーによって解析した、１０日目の脊髄浸潤物を示す。５回の実験のｎ＝４〜５のマウスのそれぞれの遺伝子型の代表例。図１７Ｃは、ｑＲＴ−ＰＣＲによって解析した脊髄浸潤物の相対的遺伝子発現を示す。データは、それぞれ、遺伝子型毎に２〜３匹のマウスからプールした細胞に関する、４つの生物学的反復の平均を表す。図１７Ｄは、養子移入ＥＡＥを示す。ＭＯＧで免疫したマウスからのｗｔ  Ｔ細胞またはｓｂ１−／−Ｔ細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大し、ナイーブｗｔレシピエントまたはｓｂ１−／−レシピエントに移入した。遺伝子型毎に６匹のマウスに対する平均臨床スコア。図１７Ｅは、ナイーブＣＤ４細胞の移入によるＥＡＥを示す。ｗｔナイーブＣＤ４細胞またはｓｂ１−／−ナイーブＣＤ４細胞をＲａｇ１／−マウスに移入し、次いで、ＭＯＧで免疫してＥＡＥを誘発した。遺伝子型毎に６匹のマウスに対する平均臨床スコア。図１７Ｆは、ＭＯＧによる免疫後６日目のＭＯＧまたはビヒクルによる足蹠への負荷に対するｗｔマウスおよびｓｂ１−／−マウスのＤＴＨ応答を示す。図１７Ｇは、キメラマウスの活動型ＥＡＥにおけるｗｔ  ＣＤ４細胞に対するｓｂ１−／−ＣＤ４細胞の比を示す。記号は個々のマウスを示す。データは、２回の実験（図１７Ｄ、１７Ｆ、および１７Ｇ）または３回の実験（図１７Ｅ）の代表例である。エラーバーは±ＳＥＭを示す。＊ｐ＜０．０５；ステューデントのｔ検定による＊＊ｐ＜０．０１（図１７Ｃおよび１７Ｆ）；一元ＡＮＯＶＡによる＊＊＊ｐ＜０．００１（図１７Ｇ）。
【図１７−２】同上。
【図１７−３】同上。
【図１７−４】同上。
【図１７−５】同上。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
【図１８−１】図１８Ａ〜１８Ｆは、ｓｂ１−／−マウスのリンパ節におけるＩＦＮγ＋ＣＤ４細胞およびＧＭ−ＣＳＦ＋ＣＤ４細胞の出現頻度の低下によって、病原性ＴＨ細胞のシグネチャー遺伝子に対する鍵が提供されたことを示す。図１８Ａ〜１８Ｂは、ＥＡＥの発症時のｓｂ１−／−  ＩＦＮγ＋およびＧＭ−ＣＳＦ＋ＣＤ４細胞の出現頻度の低下を示す。図１８Ａは、ｍＲＮＡを示す。ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定したエフェクター（ＣＤ４４＋）ＣＤ４細胞の相対的遺伝子発現。示したデータは、３回の実験において、遺伝子型毎に３〜５匹のマウスのプールした細胞に関する平均±ＳＥＭである。図１８Ｂは、ｅｘ  ｖｉｖｏでのＰ＋Ｉによる刺激後に、フローサイトメトリーによって解析したサイトカイン産生ＣＤ４細胞を示す。（左）ＬＮ  ＣＤ４細胞の代表的な等高線プロット。（右）ＬＮ  ＣＤ４細胞および脊髄ＣＤ４細胞に関する累積出現頻度。遺伝子型毎に５匹のマウスに関するデータは、５回の実験の代表例である。図１８Ｃは、ＲＮＡ  Ｓｅｑ解析を示す。ｗｔエフェクター（ＣＤ４４＋）ＣＤ４細胞およびｓｂ１−／−ＬＮエフェクター（ＣＤ４４＋）ＣＤ４細胞のＲＮＡを疾患発症時に回収し、Ｐ＋Ｉと共にインキュベートした。発現レベル（ＦＰＫＭ）が１．０を超える９，６５０遺伝子を示す（左および真中）。真中のパネルの破線より上の領域は、ｗｔに対してｓｂ１−／−の発現が２．０分の１未満に低下した２５８遺伝子を示す。検証した遺伝子に関する同一性を示す（右パネル）。図１８Ｄは、ｓｂ１−／−ＬＮエフェクターＣＤ４細胞において、Ｐｒｆ１、Ｇｚｍａ、Ｇｚｍｃ、ＩｆｎｇおよびＣｓｆ２の発現が低下した、ｑＲＴ−ＰＣＲによる検証を示す。示したデータは、Ｐ＋Ｉによる刺激後に解析した２つの細胞単離株の代表例である。図１８Ｅ〜１８Ｆは、ＭＯＧで免疫したｗｔマウスおよびｓｂ１−／−マウスのＣＤ４細胞におけるＣＸＣＲ６の発現を示す。０日目（ナイーブマウス）、７日目（疾患前）および１０日目（疾患発症）のリンパ節（図１８Ｅ）ならびに１４日目（疾患ピーク）の脊髄（図１８Ｆ）に関する、代表的プロット（左）および平均出現頻度（真中）および絶対細胞数（右）が示される。実験毎の１時点当たり３〜６匹のマウスに関するデータは、２回の実験の代表例である。（図１８Ｆ）の記号は個々のマウスを示し；横線は平均を示す。エラーバーは±ＳＥＭを表す。ステューデントのｔ検定による＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１８−２】同上。
【図１８−３】同上。
【図１８−４】同上。
【図１８−５】同上。
【図１８−６】同上。
【図１８−７】同上。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
【図１９−１】図１９Ａ〜１９Ｆは、病原性ＴＨ細胞が、ＣＸＣＲ６によってマークされ、複数のサイトカインを産生し、ＧｚｍＣおよびパーフォリンを発現することを示す。ＭＯＧで免疫したｗｔマウスをＥＡＥの発症時に屠殺し、リンパ節の細胞を解析した。図１９Ａ〜１９Ｂは、サイトカイン産生ＣＤ４細胞におけるＣＸＣＲ６の発現を示す。図１９Ａは、代表的なドットプロットを示す。図１９Ｂは、３回の実験からの累積出現頻度を示す。記号は個々のマウスを示し；横棒は平均を示す。図１９Ｃは、フローサイトメトリーによって解析したナイーブエフェクターＣＤ４細胞、ＣＸＣＲ６ｎｅｇ−エフェクターＣＤ４細胞およびＣＸＣＲ６＋エフェクターＣＤ４細胞におけるＧｚｍＣおよびＧｚｍＢを示す。４回の実験の代表的データを示す。図１９Ｄは、細胞内染色およびフローサイトメトリーによって検出したサイトカイン産生細胞におけるパーフォリンの発現を示す。記号は個々のマウスを示し；横棒は平均を示す。データは、２回の実験の代表例である。図１９Ｅは、ＲＴ−ｑＰＣＲによって解析したＣＣＲ６＋ＣＸＣＲ６ｎｅｇ−エフェクターＣＤ４細胞およびＣＸＣＲ６＋エフェクターＣＤ４細胞の相対的遺伝子発現を示し、データは２回の実験の代表例である。図１９Ｆは、ＣＸＣＲ６ｎｅｇ  ＣＤ４エフェクター細胞およびＣＸＣＲ６＋ＣＤ４エフェクター細胞に関するＩＬ−７Ｒａ、ＩＬ−２３Ｒ、ＩＬ−１Ｒ１およびＣＤ６９のヒストグラムを示す。示したデータは、実験毎に５〜９匹のｗｔマウスのプールした細胞に関するものであり、２回の実験の代表例である。エラーバーは±ＳＥＭを表す。
【図１９−２】同上。
【図１９−３】同上。
【図１９−４】同上。
【図１９−５】同上。
【図１９−６】同上。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
【図２０−１】図２０Ａ〜２０Ｅは、抗ＣＸＣＲ６処置によってＥＡＥが防止され、確立した疾患が逆転されることを示す。図２０Ａ〜２０Ｂは、疾患防止プロトコールを示す。ｗｔマウスをＭＯＧで免疫し、５日目（疾患前）、７、９および１２日目（矢印）に抗マウスＣＸＣＲ６  ｍＡｂまたはアイソタイプ対照で処置した（３００ｊｉｇ  ｉ．ｐ．）。図２０Ａは臨床スコア（平均±ＳＥＭ）を示し、図２０Ｂは疾患の頻度を示す（１群当たりｎ＝８）。アイソタイプで処置した群の１匹の罹患したマウスは、２２日目に自然に回復した。図２０Ｃ〜２０Ｅは、治療用プロトコールを示す。ｗｔマウスをＭＯＧで免疫し、疾患が最初に検出された際に（臨床スコア１〜３）、マウスを無作為に割り当て、その日ならびに２日および４日後に（矢印）、抗ＣＸＣＲ６抗体（ｎ＝８）またはアイソタイプ対照（ｎ＝１１）のいずれかを受けさせた（４００ｊｉｇ  ｉ．ｐ．）。図２０Ｃは臨床スコアを示し、図２０Ｄは体重を示す。データは、平均±ＳＥＭである。図２０Ｅは、組織学を示す。治療処置の１１日目に代表的な脊髄切片をヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。組織病理学スコア（炎症、変性）を右に示す。ビデオ１〜５（実施例５）は、ｍＡｂで処置したマウスおよびアイソタイプ対照マウスの挙動を示す。
【図２０−２】同上。
【図２０−３】同上。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
【図２１−１】図２１Ａ〜２１Ｅは、ＯＴ−ＩＩ細胞におけるＣＸＣＲ６の発現を示す。（Ａ〜Ｃ）ＯＴ−ＩＩ細胞移入研究。ナイーブＯＴ−ＩＩ細胞（ＣＤ４５．２）をナイーブコンジェニックＣＤ４５．１マウスへと移入し、続いて、ＯＶＡで免疫した。図２１Ａは、４日目と１２日目にフローサイトメトリーによって解析した、ＬＮにおけるＣＸＣＲ６＋ＯＴ−ＩＩ細胞を示す。左：代表的な等高線プロット；右：細胞の出現頻度。図２１Ｂは、１２日目のＣＸＣＲ６ｎｅｇ  ＯＴ−ＩＩ細胞およびＣＸＣＲ６＋ＯＴ−ＩＩ細胞におけるＩＬ−１７およびＧＭ−ＣＳＦの発現を示す。図２１Ｃは、１２日目のＬＮの  ＣＸＣＲ６ｎｅｇ  ＯＴ−ＩＩ細胞およびＣＸＣＲ６＋ＯＴ−ＩＩ細胞におけるＧｚｍＣの発現のヒストグラムを示す。図２１Ｄ〜２１Ｅは、ｓｂ１−／−  ＯＴ−ＩＩ移入研究を示す。ナイーブｗｔ  ＯＴ−ＩＩ細胞およびｓｂ１−／−ＯＴ−ＩＩ細胞をパネルＡにおけるように別々に移入し、マウスをＯＶＡで免疫した。図２１Ｄは、フローサイトメトリーによって解析した、１０日目のＬＮにおけるＣＸＣＲ６を発現するｗｔ  ＯＴ−ＩＩ細胞およびｓｂ１−／−  ＯＴ−ＩＩ細胞を示す。（左）代表的な等高線プロット；（右）平均細胞出現頻度。図２１Ｅは、ＯＶＡ誘発ＤＴＨを示す。ｗｔ  ＯＴ−ＩＩ細胞またはｓｂ１−／−  ＯＴ−ＩＩ細胞を移入し、ＯＶＡで免疫し、かつ足蹠にＯＶＡペプチドを負荷したマウスの足蹠腫脹。負荷の２４時間後に、足蹠腫脹を測定した。記号は個々のマウスを表す。データは、３回の実験（図２１Ａ）および２回の実験（図２１Ｂ〜２１Ｅ）の代表例である。ステューデントのｔ検定による＊ｐ＜０．０５。
【図２１−２】同上。
【図２１−３】同上。
【図２１−４】同上。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
自己免疫疾患または障害を処置する現在の方法としては、薬物治療、理学療法、手術および／または運動が挙げられる。自己免疫疾患に対する薬物治療としては、以下に限定されないが、ミトキサントロン、インターフェロンβ１ａ療法、ペグインターフェロンベータ１ａ、アザチオプリン、フィンゴリモド、ナタリズマブ、グラチラマー、ステロイド（例えば、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、ブデソニド）、鎮痛剤および抗炎症薬（例えば、カプサイシン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、メサラミン）、スルファサラジン、オキシコドン、メトトレキサート、アザチオプリン、アダリムマブ、インフリキシマブ、メルカプトプリン、ヒドロキシクロロキン、抗生剤（例えば、クリンダマイシン、メトロニダゾール、アミノサリチル酸、ペニシリン）、ならびにビタミン類（ビタミンＤ）が挙げられ得る。本明細書に記載されている自己免疫疾患を処置する方法は、自己免疫疾患に対する処置の標準的方法に加えて行うことができることに留意されたい。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８８】
自己免疫疾患を処置するために現在使用されている治療としては、以下に限定されないが、ミトキサントロン、インターフェロンβ１ａ療法、ペグインターフェロンベータ１ａ、アザチオプリン、フィンゴリモド、ナタリズマブ、グラチラマー、ステロイド（例えば、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、ブデソニド）、鎮痛剤および抗炎症薬（例えば、カプサイシン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、メサラミン）、スルファサラジン、オキシコドン、メトトレキサート、アザチオプリン、アダリムマブ、インフリキシマブ、メルカプトプリン、ヒドロキシクロロキン、抗生剤（例えば、クリンダマイシン、メトロニダゾール、アミノサリチル酸、ペニシリン）、ビタミン類（ビタミンＤ、ビタミンＢ１２）、免疫抑制剤、ミコフェノレート、ＦＫ５０６、抗体、ＣＡＭＰＡＴＨなどの免疫除去剤、抗ＣＤ３抗体もしくは他の抗体療法、サイトトキシン、フルダラビン、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、または参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Izumoto  et  al.  2008  J  Neurosurg  108:963-971に記載されているものなどのペプチドワクチンが挙げられる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２０】
図６Ａ〜６Ｃは、ＷＴマウスおよびＳｂ１−／−マウスにおけるＩＦＮγ＋エフェクターＣＤ４細胞およびＧＭ−ＣＳＦ＋エフェクターＣＤ４細胞を示すデータを表す。（図６Ａ）ＰＭＡおよびイオノマイシン後の様々なサイトカイン産生ＣＤ４エフェクター細胞の定量。（図６Ｂ）抗原リコールの定量。（図６Ｃ）リアルタイムＰＣＲによって定量したリンパ節のエフェクターＣＤ４細胞におけるｍＲＮＡレベル。赤色の記号はＳｂ１−／−を示し；黒色の記号はＷＴを示す。Ｓｂ１−／−マウスでは、−ＩＦＮγ＋およびＧＭ−ＣＳＦ＋エフェクターＣＤ４細胞が減少する。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３６】
脊髄のＴ細胞の欠乏の原因を決定するために、疾患発症時の流入領域ＬＮのＣＤ４細胞を検査した。Ｓｂ１−／−マウスとｗｔマウスの免疫細胞の総数またはエフェクター（ＣＤ４４＋）ＣＤ４  Ｔ細胞、Ｔ調節細胞またはＣＣＲ６およびＣＣＲ２を発現するＣＤ４細胞の出現頻度の間に差は見られなかった（図２４Ａ〜Ｄ）。リコール特性、ＩＬ−１７の産生、ＩＬ−２３に対する応答性、ＩＬ−１Ｒ１の上方調節、ＴＨ１７代謝酵素、ＶＬＡ４およびＬＦＡ１を含むインテグリンの発現ならびに骨髄性サイトカインの発現における遺伝子型の間にも差はなかった（図２４Ｅ〜Ｊ）。さらに、ＩＬ−２３Ｒおよび一般的にＴＨ１７細胞と関連する多くの他の遺伝子は、Ｓｂ１−／−エフェクターＣＤ４細胞において正常レベルで発現される（図１８Ａ）。しかし、それぞれ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮγをコードするＣｓｆ２およびＩｆｎｇの発現は、リンパ節のＳｂ１−／−エフェクターＣＤ４細胞において、対応するｗｔ細胞と比較して低下した（図１８Ａ）。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７５】
Ｓｂ１に関連するＲＮＡｓｅｑ：ＣＤ４エフェクター細胞（ＣＤ４４＋ＣＤ４）を疾患発症時にプールしたＭＯＧで免疫したｗｔマウスとｓｂ１−／−マウスのリンパ節細胞から選別精製した。細胞を４時間±ＳＥＭの間、Ｐ＋Ｉで刺激し、ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔを使用してＲＮＡを精製し、２６０／２８０／２３０ｎｍの光学密度で定量した。ＲＮＡ（遺伝子型１つ当たり１ｊｉｇ）を輸送した。
【国際調査報告】
2021521121.tif 000121
2021521121.tif 000122
2021521121.tif 000123