(57)【要約】  本発明は、（ａ）免疫学的有効量の豚レンサ球菌（Streptococcus suis）ＩｇＭプロテアーゼ抗原、（ｂ）免疫学的有効量の大腸菌線毛抗原、および（ｃ）免疫学的有効量のクロストリジウムトキソイドを含むワクチンに関し、豚レンサ球菌、大腸菌およびクロストリジウムによる感染から豚を保護する方法における当該ワクチンの使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の成分（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）： 
（ａ）免疫学的有効量の豚レンサ球菌（Streptococcus suis）ＩｇＭプロテアーゼ抗原、
（ｂ）免疫学的有効量の大腸菌線毛抗原、および
（ｃ）免疫学的有効量のクロストリジウムトキソイド
を含むワクチン。
【請求項２】
前記成分（ｂ）が、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ１８、およびＦ４１から選択される大腸菌線毛抗原を１以上含むことを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記成分（ｂ）が、少なくとも線毛大腸菌抗原Ｆ４、Ｆ５およびＦ６を含むことを特徴とする、請求項２に記載のワクチン。
【請求項４】
前記成分（ｂ）が、大腸菌トキソイドをさらに含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項５】
前記大腸菌トキソイドが、大腸菌ＬＴトキソイドであることを特徴とする、請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
前記成分（ｃ）が、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）Ｃ型トキソイドを含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項７】
前記成分（ｃ）が、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）Ｂ型トキソイドをさらに含むことを特徴とする、請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
前記成分（ｂ）が、大腸菌線毛抗原Ｆ４、Ｆ５、およびＦ６を含み、
前記成分（ｃ）が、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）Ｃ型トキソイドを含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項９】
アジュバントを含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１０】
筋肉内注射に適応されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１１】
豚レンサ球菌、大腸菌およびクロストリジウムから豚を保護する方法において使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１２】
豚レンサ球菌、大腸菌およびクロストリジウムによる病原性感染から豚を保護するための方法において使用するための請求項１１に記載のワクチンであって、
当該ワクチンを雌豚に投与して、ワクチン接種した当該雌豚の初乳の摂取を介して、豚レンサ球菌による病原性感染から子豚を保護することを特徴とするワクチン。
【請求項１３】
複数の別個のワクチン容器を含む部分のキットであって、
そのうちの１つが、免疫学的有効量の豚レンサ球菌ＩｇＭプロテアーゼ抗原を含み、
組み合わせた１以上の追加の容器が、免疫学的有効量の大腸菌線毛抗原と免疫学的有効量のクロストリジウムトキソイドとを含む、キット。
【請求項１４】
動物を豚レンサ球菌感染、大腸菌感染およびクロストリジウム感染から保護する方法において使用するためのワクチンであって、
免疫学的有効量の豚レンサ球菌ＩｇＭプロテアーゼ抗原を含み、
当該ＩｇＭプロテアーゼ抗原が、ワクチンの投与前に、免疫学的有効量の大腸菌線毛抗原と免疫学的有効量のクロストリジウムトキソイドと混合される、ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の一般的な分野
本発明は、豚レンサ球菌（Streptococcus suis）、大腸菌（Escherichia coli）およびクロストリジウム（Clostridium）による病原性感染に対する、豚の保護のための混合ワクチンに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本発明は、獣医ワクチン学の分野、すなわち、豚用の混合ワクチンに関するものである。特に、本発明は、豚レンサ球菌（Streptococcus suis（S. suis））、大腸菌（Escherichia coli（E. coli））およびクロストリジウム（Clostridium）由来の抗原を含む混合ワクチンに関する。
【０００３】
今日の集約的養豚は、動物を健康に保ち、経済的な運営を可能にするために動物用医薬品に大きく依存している。飼料および農場管理システムの最適化に続いて、様々な治療法が定期的に用いられており、例えば、ホルモンもしくは抗生物質などの医薬品、細菌性またはウイルス性の病原体に対するワクチン接種である。
【０００４】
細菌性病原体に対する防御のために現在用いられているワクチンは、主に全細胞バクテリンである。しかしながら、現場報告では疾患の制御および管理の困難さが記述されており、特に「ワクチン効果不全（vaccine failure）」がよくみられる。保菌豚が主要な感染源であり、群れ内での本疾患の拡大には、垂直伝播と水平伝播の両方が関与している。離乳や輸送などのストレスの多い条件下で保菌動物と感受性動物とを混合すると、通常、臨床疾患が生じる。したがって、疾病を予防するための効果的な管理措置は、（許される場合には）予防／予防処置およびワクチン接種にかかっているであろう。現在、現場の予防接種の取り組みにおいて、市販または自家バクテリンの使用に焦点が当てられている。これらのワクチン戦略は、子豚または雌豚のいずれかに適用されている。雌豚へのワクチン接種は費用も労力も少ないため、子豚へのワクチン接種に代わる経済的な方法となっている。しかしながら、利用可能な結果は、バクテリンの雌豚へのワクチン接種も議論の余地があることを示しているように思われる。多くの場合、ワクチン接種を受けた雌豚は、分娩前に２回ワクチン接種した場合でも、ワクチン接種にあまり反応しないか、まったく反応しないため、同腹児に移行する母体免疫が低くなる。そして、母親の免疫が十分なレベルで移入されても、多くの場合、母親の抗体が低すぎて、４〜７週齢という最も重要な時期に防御ができない。雌豚のワクチン接種は、大腸菌、クロストイジウム、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）、豚サーコウイルスなどによる感染など、様々な病原性感染に対する防御に従来から用いられている。
【０００５】
豚レンサ球菌は、豚の共生病原体および日和見病原体である。特にストレス下では、細菌は病原性感染を誘発し、疾患を誘発する可能性がある。早期の薬物治療による離乳および隔離早期離乳は、豚レンサ球菌感染を排除しない。離乳期以降の子豚は、離乳に伴うストレス、およびその後の一般的な輸送に起因する豚レンサ球菌感染に感受性が高い。そのため、母豚の分娩前免疫化は、子豚に受動免疫を試行および伝達すべく用いられ、生後早期にこれらのストレスの多い状況下で豚レンサ球菌に対する防御を提供する。
【０００６】
現代の養豚条件下では、例えば子豚の離乳や若齢子豚の輸送などにより大きなストレスが誘発される。これにより、豚レンサ球菌は主要な豚病原体となっている。また、ヒト髄膜炎やレンサ球菌毒素性ショック様症候群の新たな人畜共通病原体でもある。豚レンサ球菌は、高被包性の（well-encapsulated）病原体であり、莢膜多糖類抗原多様性に基づいて複数の血清型が記述されている。豚レンサ球菌は宿主免疫系を回避するための毒性因子の工廠である。まとめると、これらの特徴が、この重要な病原体と闘うための有効なワクチンの開発の課題となっている。近年、豚レンサ球菌に対するワクチンに関して概説論文が発表された（Mariela Segura: "Streptococcus suis vaccines: 候補抗原と進歩、Expert Review of Vaccines、Volume 14、2015、Issue 12、p.1587-1608）。本報告では、豚レンサ球菌に対するワクチン開発の現状を概観するため、臨床現場情報および実験データをまとめ、比較した。その概要を以下に示す。
【０００７】
豚では、特にヨーロッパにおいて、豚レンサ球菌に対する防御のために自家バクテリンが現場で頻繁に使用されている。これらは、臨床的に問題のある農場で分離された病毒菌株から調製され、同一農場に適用する。自家バクテリンの欠点の１つは、ワクチンの安全性データが不足しており、重度の副作用が発生する可能性があることである。サンプリングミス（１頭または２頭の豚またはサンプルのみの使用による）は、近年の感染増大に関連する株または血清型の特定に失敗する可能性がある。この失敗は、流行群において特に問題となる可能性がある。最後に、自家バクテリンの最も重要なジレンマは、その実際の有効性についてほとんど研究されていないことである。自家ワクチンの適用は経験的であるため、これらのワクチンで得られた結果が一貫していないことは驚くにあたらない。
【０００８】
他の実験的ワクチンも当技術分野に開示されている。Kai-Jen Hsuehらは、「雌豚における、豚レンサ球菌バクテリン＋組換えＳａｏ蛋白質による免疫化は、その子豚に受動免疫を伝える」ことを示している（: BMC Veterinary Research, BMC series - open, inclusive and trusted, 13:15, 7 January 2017における“Immunization with Streptococcus suis bacterin plus recombinant Sao protein in sows conveys passive immunity to their piglets”）。
【０００９】
当技術分野では、生弱毒化ワクチンもまた検討されている。豚レンサ球菌血清型２の非莢膜同質遺伝子変異体は、非病原性であることが明確に示されている。しかし、非莢膜血清型２突然変異体に基づく生ワクチン製剤は、死亡率に対して部分的な防御しか誘導せず、野生型株で攻撃された豚の臨床徴候の発現を防ぐことはできなかった（Wisselink HJ, Stockhofe-Zurwieden N, Hilgers LA, et al. “Assessment of protective efficacy of live and killed vaccines based on a non-encapsulated mutant of Streptococcus suis serotype 2.” in:  Vet Microbiol. 2002, 84:155-168.）。
【００１０】
過去数年間、抗原性または免疫原性豚レンサ球菌分子の広範なリストが報告されており、これらのほとんどは感染豚またはヒト由来の回復期血清および／または実験室産生免疫血清のいずれかを用いた免疫プロテオミクスによって発見されている。国際公開第２０１５／１８１３５６号（IDT Biologika GmbH）は、ＩｇＭプロテアーゼ抗原（全タンパク質、または、完全タンパク質の約３５％に相当する高度に保存されたＭａｃ−１ドメイン）が、任意にバクテリンを含むプライムワクチン接種と組み合わせて、２回のＩｇＭプロテアーゼ抗原の投与というワクチン接種スキームにおいて、子豚において防御免疫応答を誘発できることを示している。国際公開第２０１７／００５９１３号（Intervacc AB）はまた、ＩｇＭプロテアーゼ抗原（特に、ヌクレオチダーゼに融合したＩｇＭプロテアーゼポリペプチド）の使用についても記載しているが、血清応答を誘発できる特性のみが示されていることに注意されたい。この国際特許出願において、ＩｇＭプロテアーゼ抗原に対する保護作用は示されていない。
【００１１】
大腸菌は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｔｔｅｒｉａｃｅａｅ科に属するグラム陰性の周毛性鞭毛を有する細菌であり、豚において広範な疾患の原因菌であり、これらの疾患は、哺乳豚および離乳豚のそれぞれにおいて世界中で発生している重要な死因である。大腸菌感染症、すなわち大腸菌症は、屋内および屋外の両方の群れを侵し、慢性的にも散発的にも発生する。大腸菌感染は、新生子豚の下痢（分娩後最初の数日間）、若齢子豚の下痢（分娩後最初の１週間から離乳まで）および離乳後下痢（離乳後最初の数週間）の、主に３つの段階で起こる。また、ロタウイルスを含む他の病原体と組み合わせて存在し、浮腫病や尿路感染症などの他の疾患を引き起こすこともある。
【００１２】
ある種の大腸菌株は、空腸や回腸の吸収上皮細胞に付着したり定着したりする線毛や線毛を有する。病原性に関連する線毛の共通抗原タイプは、Ｆ４（＝Ｋ８８）、Ｆ５（＝Ｋ９９）、Ｆ６（９８７Ｐ）、Ｆ４１である。病原性株は腸管毒素を産生し、腸管内腔に液体と電解質を分泌させ、下痢、脱水、アシドーシスを引き起こす。新生児における感染は、一般にＫ８８株および９８７Ｐ株によって引き起こされるが、離乳後大腸菌症は、ほぼ常にＫ８８株に起因する。Rec. 2002 Jan12; 150(2): 35-7を参照のこと。
【００１３】
大腸菌症の予防には様々なアプローチが用いられており、特に離乳後の下痢には、特異抗体による受動的投与、プレバイオティクスやプロバイオティクスなどの食事による補給、食事による予防措置、ＥＴＥＣ耐性群に対する遺伝子育種、経口非毒素原性大腸菌生ワクチンが挙げられる（Luppi A., Swine enteric colibacillosis: diagnosis, therapy and antimicrobial resistance, Porcine Health Manag. 2017; 3: 16; Zhang W. Progress and Challenges in Vaccine development against enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) - Associated porcine Post-weaning Diarrhea (PWD) J Vet Med Res. 2014;1(2):1006)。市販のワクチンとしては、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓ (MSD Animal Health社）、Ｇｌｅｔｖａｘ（登録商標）およびＬｉｔｔｅｒｇｕａｒｄ（登録商標）（いずれもＺｏｅｔｉｓ社）、Ｃｌｏｓｔｒｉｃｏｌ（登録商標）(IDT Biologika社）、Ｅｎｔｅｒｉｃｏｌｉｘ（登録商標）(Boehringer Ingelheim社）などがある。ワクチン接種した母動物の初乳の摂取を通して、大腸菌から子豚を適切に防御することができる。
【００１４】
クロストリジウムは、嫌気性、グラム陽性、胞子形成桿菌であり、主に新生豚に下痢を引き起こす重要な新興病原体である。この病原体は、ヒトにおいて、抗生物質関連下痢の原因として最初に認識された。最も一般的には、１〜７日齢の子豚および他の家畜および実験動物において疾患を引き起こす。クロストリジウム感染症には、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）およびクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）による感染症がある。この微生物は、腸内の塗布標本の直接グラム染色によって証明することができる。環境中でのクロストリジウムの生存および保菌雌豚による排泄は、伝播において重要であると考えられている。クロストリジウム・パーフリンジェンスＣ型、および、程度は低いがＢ型は、豚の重要な病原体である。対応するトキソイドは、豚において防御免疫応答を誘導することができることが知られている。Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標） ＣｏｌｉＣｌｏｓ（MSD Animal Health)、Ｇｌｅｔｖａｘ（登録商標）およびＬｉｔｔｅｒｇｕａｒｄ（登録商標）（いずれもＺｏｅｔｉｓ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｃｏｌ（登録商標）（IDT Biologika)、Ｅｎｔｅｒｉｃｏｌｉｘ（登録商標）(Boehringer Ingelheim) など、さまざまな市販のワクチンが入手可能である。ワクチン接種した母豚の初乳を摂取することにより、クロストリジウムから子豚を適切に保護することができる。
【００１５】
動物へのストレスと、管理人の費用および労力を制限するために、複数の疾患に対する防御を提供することが一般に望まれる。したがって、他の豚疾患に対する防御に加えて、豚レンサ球菌に対する防御のための豚ワクチンを提供する必要がある。しかし、混合ワクチンの有効性は、抗原または他のワクチン成分の間の負の干渉のような、ワクチン成分の不適合の可能性のため、事前に予測することができず、これは、ワクチン効果の低下または有害作用の増強につながる可能性がある。一つのワクチンにおける、かかる抗原の組み合わせは、任意の混合ワクチンに関して、これまで一般的な要求であり、未だにそうであるが、特に抗原間の干渉の課題は、多価ワクチンにおいて、多くではないにしても、開発される抗原組み合わせのほとんどを妨げる、非常に一般的な課題である。これに関しては、以下のMichel De Wildeの２０１６年３月の講演：タイトル“Combination vaccines: how and why? Lessons learned”（ 世界保健機関のウェブサイトからアクセス可能）を引用する。講演では、混合ワクチンに努力したいという共通の要求があるが、他の問題の中でも、克服すべき科学的かつ技術的な問題が多いことが確認された。一般的な抗原を用いた混合ワクチンの開発失敗例が示された。
【００１６】
本発明の目的
したがって、本発明の目的は、豚レンサ球菌を含む病原性感染から、豚、特に子豚を保護するための混合ワクチンを見出すことである。さらに、複数の病原性感染から子豚を保護するための混合ワクチンを見出すことが本発明の目的であり、ここで、これらの感染に対する子豚の保護は、雌豚のワクチン接種によって達成される。
【００１７】
発明の概要
驚くべきことに、本発明において、豚レンサ球菌、大腸菌およびクロストリジウムによる病原性感染に対する豚の防御のための混合ワクチンが提供できることが見出されている。さらに、驚くべきことに、ワクチン接種した雌豚の初乳の摂取を介して、豚レンサ球菌、大腸菌およびクロストリジウムによる病原性感染から子豚を防御するために、このワクチンを雌豚に投与することができることが見出だされた。
【００１８】
本発明の目的を充足するために、請求項１に記載のワクチンは、以下の成分（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む：
（ａ）免疫学的有効量の豚レンサ球菌ＩｇＭプロテアーゼ抗原、
（ｂ）免疫学的有効量の大腸菌線毛抗原、および
（ｃ）免疫学的有効量のクロストリジウムトキソイド。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態は、従属項において定義される。
【００２０】
従って、本発明は、豚レンサ球菌によって引き起こされる感染を含む複数の病原性感染に対して防御を提供する混合ワクチン（即ち、本発明によるワクチン）を初めて提供する。さらに、本発明により、雌豚のワクチン接種を介して、豚レンサ球菌による感染を含む複数の病原性感染から子豚を防御することが可能になった。
【００２１】
従って、本発明は、複数の別々のワクチン容器を含む部分のキットも提供し、そのうちの１つは、免疫学的有効量の豚レンサ球菌ＩｇＭプロテアーゼ抗原を含み、１以上の追加の容器の組合せは、免疫学的有効量の大腸菌線毛抗原および免疫学的有効量のクロストリジウムトキソイド（例えば、大腸菌およびクロストリジウム抗原の双方を含む１つの容器、または、それぞれが１以上の各抗原を含む、別々の２以上の容器）を含む。
【００２２】
本発明はまた、豚レンサ球菌感染、大腸菌感染およびクロストリジウム感染に対して動物を保護するための方法において使用するための、免疫学的有効量の豚レンサ球菌ＩｇＭプロテアーゼ抗原を含むワクチンを提供し、ここで、ＩｇＭプロテアーゼ抗原は、ワクチンの投与前に、免疫学的有効量の大腸菌線毛抗原、および、免疫学的有効量のクロストリジウムトキソイドと混合される。
【００２３】
定義
ワクチンは、被験動物に投与するのに安全であり、病原性微生物に対してその動物に防御免疫を誘導すること、すなわち、微生物に対する防御を成功的に誘導することができる医薬組成物である。
【００２４】
豚レンサ球菌ＩｇＭプロテアーゼ抗原は、ブタＩｇＭ（ブタＩｇＧ又はブタＩｇＡではない。Seele et al., Journal of Bacteriology, 2013, 195 930-940、及び、Vaccine 33:2207-2212; 5 May 2015）を特異的に分解する酵素であり、ＩｄｅSsuisと表されるタンパク質、又は、その免疫原性部分（典型的には全長酵素の少なくとも約３０〜３５％の長さを有する）である。酵素全体は、重量が、約１０００〜１１５０個のアミノ酸に対応する約１００〜１２５ｋＤａであり、豚レンサ球菌の血清型によって大きさが異なる。国際公開第２０１５／１８１３５６号では、豚レンサ球菌のＩｇＭプロテアーゼ抗原を示すいくつかの配列、配列番号１、配列番号２、配列番号６、配列番号７および配列番号５が示されており、配列番号５は、全長酵素の免疫原性部分である（Ｍａｃ−１ドメイン、すなわち、配列番号７のアミノ酸８０〜４１４として表される）。完全長酵素の免疫原性部分の他の例は、国際公開第２０１７／００５９１３号に示されている。特に、ＩｇＭプロテアーゼは、国際公開第２０１５／１８１８３５６号の配列番号１に従うプロテアーゼであってもよく、または、重複領域において少なくとも９０％、もしくは、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、１００％までの配列同一性を有するタンパク質であってもよい。アミノ酸配列の同一性は、デフォルトパラメータを有するｂｌａｓｔｐアルゴリズムを用いて、ＢＬＡＳＴプログラムで確立することができる。様々な血清型の豚レンサ球菌のＩｇＭプロテアーゼは、９０％超、特に９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、１００％までの配列同一性を有することが予想される。例えば、抗原の組換え生産系における収率を最適化するために作られた人工タンパク質は、必要とされる免疫原性機能を維持しながら、酵素の全体と比較して、８５％、８０％、７５％、７０％、またはさらに６０％のような、より低いアミノ酸配列同一性を導くことができ、本発明の意味において、豚レンサ球菌のＩｇＭプロテアーゼ抗原であると理解される。
【００２５】
微生物に対する防御は、例えば、その微生物による病原性感染、またはその感染から生じる障害を予防し、改善し、または治癒するのを助け、例えば、病原体による感染から生じる１以上の臨床徴候を予防するか、または減少させる。
【００２６】
本明細書に用いられる「免疫学的有効量」は、非免疫化豚における野生型感染性物質、すなわち豚レンサ球菌、大腸菌またはクロストリジウムによる感染によって引き起こされる病理学的作用と比較した場合、野生型感染性物質、すなわち豚レンサ球菌、大腸菌またはクロストリジウムによる感染を伴う感染またはその感染によって引き起こされる病理学的作用を減少させる程度に、豚において免疫応答を誘導するのに必要な抗原またはトキソイドの量に関する。免疫学的有効量は、例えば、ワクチン接種動物に実験的攻撃感染を施し、次いで標的動物の疾患の臨床徴候、血清学的パラメータを測定すること、または病原体の再分離を測定することによって、当業者によって一般的に既知のルーチンの方法によって確立することができる。
【００２７】
実施態様の説明
本発明によるワクチンの成分（ａ）は、免疫学的有効量の豚レンサ球菌ＩｇＭプロテアーゼ抗原を含み、豚レンサ球菌による感染に対する防御を提供する。
【００２８】
したがって、成分（ａ）は、豚レンサ球菌による病原性感染に関連する臨床的徴候に対する防御を付与するために慣例的に含まれている。豚レンサ球菌の病原性感染に関連する典型的な臨床徴候は、直腸温の上昇、運動障害（跛行、腫脹関節）、呼吸数の増加および神経学的徴候（振戦、痙攣、斜頸、運動失調など）である。これらの徴候の１または複数を予防、改善または治癒することは、病原性感染が抑制されていることの徴候であるだけでなく、豚にとっても有益であろう。さらに別の実施態様において、ワクチンは、豚レンサ球菌による病原性感染に関連する死亡率の増加に対する防御を付与するためのものである。
【００２９】
本発明に係るワクチンは、通常、ワクチン１用量あたり２５０μｇ未満、より好ましくは１用量あたり１２０μｇ以下の量のＩｇＭプロテアーゼ抗原を含む。最少量は、防御免疫が依然として得られる量である。これは通常の実験によって確立することができ、とりわけ、選択したＩｇＭプロテアーゼ抗原の免疫原性特性に依存するが、必要な防御レベルにも依存する。現行のワクチンについては、最少量は、１用量当たり抗原１μｇと考えられているが、より高い任意の用量、例えば２、３、４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１５、１４、１７、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３７、３８、４０、４１、４３、４４、４６、４７、４８、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０またはそれ以上の整数が、６１〜１１９μｇの範囲で、最高１２０μｇをであってもよい。
【００３０】
本発明のワクチンの成分（ｂ）は、免疫学的有効量の大腸菌線毛抗原、および、任意にトキソイドを含み、大腸菌による感染に対する防御を提供する。したがって、成分（ｂ）は、通常、急速な脱水、アシドーシス、および死亡を伴う多量の水様性下痢を含む大腸菌による病原性感染に関連する臨床徴候に対する防御を付与するために含まれる。まれに、下痢が始まる前に豚が虚脱して死亡することがある。
【００３１】
大腸菌による病原性感染は、典型的には、それに限定されるものではないが、腸管毒素原性大腸菌によって引き起こされる感染、および、腸管病原性大腸菌株によって引き起こされる感染を含む。
【００３２】
大腸菌は、動物において免疫応答を誘発することができる要素、すなわち大腸菌抗原に基づいて分類することができる。これらの抗原は、単独または組み合わせてワクチン接種に用いることができ、大腸菌感染に対する防御を提供する。大腸菌抗原は、リポ多糖層の一部を形成するＯ抗原、莢膜を形成するＫ抗原、フラゲリンを形成するＨ抗原、線毛のＦ抗原を含む。本発明によるワクチンの成分（ｂ）は、少なくとも１以上のＦ抗原を含む。
【００３３】
さらに、エンテロトキシンのような大腸菌毒素の１以上を、本発明によるワクチン中のトキソイドとして使用することができる。大腸菌エンテロトキシンには、ＳＴエンテロトキシンおよびＬＴエンテロトキシンが含まれるが、これらに限定されない。腸管性大腸菌症の原因となる最も重要な抗原およびエンテロトキシンは、例えばLuppi A., Swine enteric colibacillosis: diagnosis, therapy and antimicrobial resistance, Porcine Health Manag. 2017; 3: 16、Zhang W. Progress and Challenges in Vaccine development against enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) - Associated porcine Post-weaning Diarrhea (PWD) J Vet Med Res. 2014;1(2):1006に記載されている。
【００３４】
典型的には、本発明によるワクチンは、１以上の大腸菌Ｆ抗原と、任意の大腸菌ＬＴトキソイドとを含む。好ましい実施形態において、本ワクチンは、線毛タンパクＦ４（Ｆ４ａｂ（＝Ｋ８８ａｂ）およびＦ４ａｃ（＝Ｋ８８ａｃ）、Ｆ５（＝Ｋ９９）、Ｆ６（＝９８７Ｐ）、Ｆ１８、Ｆ４１を含む）から選択される１つ以上の抗原と、任意の大腸菌ＬＴトキソイドとを含む。より好ましくは、ワクチンは、少なくとも線毛タンパクＦ４（Ｆ４ａｂ（＝Ｋ８８ａｂ）およびＦ４ａｃ（＝Ｋ８８ａｃ）、Ｆ５およびＦ６を含む）を含む。別の好ましい実施形態では、ワクチンは、線毛抗原Ｆ４（Ｆ４ａｂ（＝Ｋ８８ａｂ）およびＦ４ａｃ（＝Ｋ８８ａｃ）、Ｆ５、Ｆ６を含む）と、任意の大腸菌ＬＴトキソイドとを含む。
【００３５】
本発明のワクチンの成分（ｃ）は、免疫学的有効量のクロストリジウムトキソイドを含み、クロストリジウムによる感染に対する防御を提供する。したがって、成分（ｃ）は、下痢、呼吸困難、腹部膨満、および陰嚢浮腫を含む、クロストリジウムの病原性感染に関連する臨床徴候に対する防御を付与するために慣例的に含まれている。
【００３６】
好ましくは、成分（ｃ）は、クロストリジウムトキソイドＢおよびクロストリジウムトキソイドＣから選択されるクロストリジウムトキソイドを１以上含む。より好ましくは、成分（ｃ）は、クロストリジウム・パーフリンジェンスＢ型トキソイド（ｐｅｒｆＢ）、クロストリジウム・パーフリンジェンスＣ型トキソイド（ｐｅｒｆＣ）およびクロストリジウムノービイ（Clostridium novyi）Ｂ型トキソイド（ｎｏｖｙｉＢ）から選択されるトキソイドを１以上、および、最も好ましくはクロストリジウムパーフリンジェンスＣ型トキソイド（ｐｅｒｆＣ）を含む。最も好ましい実施形態では、成分（ｃ）はクロストリジウム・パーフリンジェンスＣ型トキソイドを含み、任意にクロストリジウム・パーフリンジェンスＢ型トキソイドをさらに含んでもよい。
【００３７】
本発明による特に好ましい実施形態では、成分（ｂ）は、少なくとも大腸菌線毛抗原Ｆ４、Ｆ５、およびＦ６を含み、成分（ｃ）はクロストリジウム・パーフリンジェンスＣ型トキソイドを含む。
【００３８】
さらなる好ましい実施形態において、本発明によるワクチンの免疫学的有効成分は、豚レンサ球菌ＩｇＭプロテアーゼ抗原、大腸菌抗原Ｆ４、Ｆ５およびＦ６、ならびに任意のＬＴトキソイド、ならびにクロストリジウム・パーフリンジェンスＣ型トキソイドからなる。
【００３９】
本発明によるワクチンにおいて、抗原は、典型的には、薬学的に許容可能な担体、すなわち、生体適合性媒体、すなわち、ワクチンの投与後に宿主動物の免疫系に抗原を提示することができる、被験動物において重大な有害反応を誘発しない媒体と結合される。このような薬学的に許容可能な担体は、例えば、水および／または任意の他の生体適合性溶媒、または、（糖および／またはタンパク質に基づく）凍結乾燥ワクチンを得るために一般的に使用されるような固体担体、任意に免疫刺激剤（アジュバント）を含む液体であってよい。任意に、ワクチンの意図された使用または必要な特性に応じて、安定剤、粘度改変剤または他の成分などの他の物質を添加する。
【００４０】
本発明によるワクチンは、典型的にはアジュバントを含む。従来のアジュバント、例えば、フロイント完全および不完全アジュバント、トコフェロール−アルファ、ビタミンＥ、非イオン性ブロックポリマー、ムラミルジペプチド、Ｑｕｉｌ  Ａ（登録商標）、鉱油、例えばＢａｙｏｌ（登録商標）またはＭａｒｋｏｌ（登録商標）、植物油、およびＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）（ホモポリマー）、またはＤｉｌｕｖａｃ（登録商標）Ｆｏｒｔｅである。
【００４１】
ワクチンは、いわゆる「ビヒクル」をも含み得る。ビヒクルとは、ポリペプチドに共有結合することなく、そのポリペプチドが接着する化合物である。しばしば使用されるビヒクル化合物は、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたはアルミニウムオキシド、または、シリカ、カオリンおよびベントナイトである。
【００４２】
本発明によるワクチンは、非経口投与を含む任意の適切な投与経路で投与することができ、例えば、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮内、粘膜下、または皮下の、皮膚への、または、皮膚を介した全ての注射経路によって投与することができ、典型的には、筋肉内注射に適応して（すなわち、適して）いる。
【００４３】
別の実施形態では、本発明は、豚レンサ球菌、大腸菌およびクロストリジウムによる病原性感染から豚を保護するための方法に使用するための、本明細書に記載のワクチンに関する。
【００４４】
別の実施形態では、本発明は、豚レンサ球菌、大腸菌およびクロストリジウムによる病原性感染から豚を保護するのに使用するための医薬の製造のための本明細書に記載されるワクチンの使用に関する。
【００４５】
本発明のワクチンは、特に、豚レンサ球菌、大腸菌株、およびクロストリジウム・パーフリンジェンスＣ型に起因する死亡率及び／又は病原性感染症の臨床的兆候を減少させるために、母豚及び苗の積極的接種により進歩の受動的予防接種として利用されており、ここで、大腸菌株は特に、付着因子Ｆ４ａｂ（Ｋ８８ａｂ）、Ｆ４ａｃ（Ｋ８８ａｃ）、Ｆ５（Ｋ９９）及び／又はＦ６（９８７Ｐ）を発現する。
【００４６】
大腸菌およびクロストリジウムによって引き起こされるこのような感染に対する防御を提供するための市販のワクチンは、ＭＳＤアニマルヘルスから入手可能なPorcilis ColiClos（登録商標）であり、これには大腸菌成分Ｆ４ａｂ線毛、Ｆ４ａｃ線毛付着因子、Ｆ５線毛付着因子、Ｆ６線毛付着因子、ＬＴトキソイド、および、クロストリジウム・パーフリンジェンス成分Ｃ型（５７８株）ベータが含まれる。したがって、別の好ましい実施形態では、本発明によるワクチンは、市販のワクチンPorcilis ColiClos（登録商標）を適量の豚レンサ球菌ＩｇＭ抗原と混合することによって調製することができる。
【００４７】
驚くべきことに、ＩｇＭプロテアーゼ抗原を用いて（したがって、豚抗原として豚レンサ球菌のＩｇＭプロテアーゼ抗原のみを含むワクチンを使用した場合でも）雌動物に抗体を誘導することにより、子豚はワクチン接種した動物の初乳の摂取を介して豚レンサ球菌に対する十分な防御に到達することがわかった。したがって、子豚において防御効果を有することが示された抗原は、雌豚にワクチン接種して、子豚において明確な防御効果に、典型的には少なくとも離乳後２〜３週間の期間に到達することが示されている。
【００４８】
したがって本発明はまた、豚レンサ球菌のＩｇＭプロテアーゼ抗原を用いて、雌豚に混合ワクチンを投与し、子豚がワクチン接種した雌豚から初乳を取り込めるようにすることによって、豚レンサ球菌、大腸菌およびクロストリジウムから子豚を保護するための混合ワクチンの製造にも関連する。上記に示すように、最適な防御に到達するために、初乳は、典型的には４８時間以内に、特に子豚の生後２４時間以内に取り込まれる。
【００４９】
別の好ましい実施態様において、本発明のワクチンは、ワクチン接種された雌ブタの初乳の摂取を介して、豚レンサ球菌、大腸菌およびクロストリジウムによる病原性感染から子ブタを保護するために、雌ブタに投与される。
【００５０】
さらに、本発明は、以下の非限定的な例によって説明される。
【００５１】
例
例１：
【００５２】
目的
本研究の目的は、異なる年齢、４、６、８および１０週齢で、子豚の豚レンサ球菌攻撃に対する妊娠豚におけるＩｇＭプロテアーゼサブユニットワクチンの有効性を検証することであった。
【００５３】
試験デザイン
本研究のために、１２頭の妊娠未経産雌豚を用いた。６頭の未経産雌豚に組換えｒＩｄｅSsuis ＩｇＭプロテアーゼ抗原（Seele et al: Vaccine 33:2207-2212; 5 May 2015, par. 2.2.）を、ＸＳｏｌｖｅアジュバント(MSD Animal Health, Boxmeer, The Netherlands)中、１用量あたり１２０μｇ（ＢＳＡを標準としたＢｒａｄｆｏｒｄ蛋白質アッセイにより確立）で、推定分娩前６週および２週に接種した。未経産雌豚６頭をワクチン未接種の対照群とした。出産後、雌豚の子豚を２０頭ずつ４つの攻撃群に分け（ワクチン接種した雌豚からの子豚１０頭と対照雌豚からの子豚１０頭）、各群の同腹仔の均等な分布を得た。４群はそれぞれ４、６、８および１０週齢時に、豚レンサ球菌血清型２の病原性培養物で攻撃感染（challenge）させた。攻撃接種後９〜１１日間、子豚のうつ病、自発運動障害および／または神経学的徴候などの豚レンサ球菌感染の臨床徴候を毎日観察し、０（徴候なし）から、重症例については３までの通常のスコアリングシステムを用いた。パラメータごとに同じスコアリングシステム（パラメータが見えない場合は０、重症例の場合は最高数）を用いた。ヒトのエンドポイントに達した動物は安楽死させた。ワクチン接種前後（雌豚）および攻撃直前（子豚）の定期的な時期に、血清を採取し、抗体測定を行った。攻撃感染（challenge）前後の定期的な時期に、攻撃株の再分離のために子豚からヘパリン血液を採取した。追加ワクチン接種から１３週間後、雌豚４頭を剖検し、注射部位の局所反応またはワクチン残留物の有無を調べた。
【００５４】
結果
ワクチン接種した雌豚４頭を、注射部位の剖検に供した。２頭では、追加投与（booster injection）部位に、組織の硬さが増した変色からなる小さな（直径２〜３ｃｍ）局所反応が認められた。膿瘍やワクチン遺残は認められなかった。したがって、ワクチンの投与は安全であると結論づけることができた。.
【００５５】
初回ワクチン接種日（分娩予定日の６週間前）に、未経産雌豚は抗原に対するＩｇＧ抗体価が（低）であった。ワクチン接種後、ワクチン接種した未経産雌豚は明らかな血清変換を示したが、対照群の動物は低レベルのままであった。初乳中の平均ＩｇＧ力価は、対照群と比較してワクチン接種群の方が８．８ ｌｏｇ2高かった。哺乳後、ワクチン接種した母豚の子豚は、対照動物と比較して約７．７ ｌｏｇ2高い血清力価を示した。４、６、８および１０週齢における抗体価の差異はそれぞれ、６．７、５．３、４．８および３．６ｌｏｇ 2であった。表１に、供試前期間（９〜１１日）の攻撃感染後データを示す。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
結論
以上の結果から、ＩｇＭプロテアーゼサブユニットワクチンの雌豚への接種は、子豚の豚レンサ球菌感染を抑制するための適切なワクチン接種戦略であると結論付けることができる。このワクチンは、自然感染した母動物から初乳を受け取った子豚において到着した防御と比較して、１０週齢までの豚レンサ球菌攻撃に対する顕著に良好な防御を誘導した。このことは、離乳後２〜３週間の完全な期間、すなわち子豚が４〜７週齢の期間内、さらにはその期間を過ぎても防御可能であることを示している。
【００５８】
例２：
目的
本研究の目的は、組換え豚レンサ球菌のＩｇＭ抗原ｒＩｄｅ Ssuisを含む様々な併用ワクチンの血清学的反応を、単一ワクチンと比較して検査することであった。特に、大腸菌／クロストリジウム混合ワクチン（線毛大腸菌抗原およびクロストリジウム・パーフリンジェンスＣ型トキソイドを含む）、ならびに、パスツレラ／ボルデテラ混合ワクチン（パスツレラ毒素および不活化ボルデテラ細胞を含む）との併用について評価した。具体的には、単一ワクチンと比較して、ｒＩｄｅ Ssuisサブユニットワクチンと市販ワクチンＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓまたはＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＡＲ−Ｔ ＤＦとの関連混合使用後に、血清学的反応を試験した。
【００５９】
試験デザイン
本研究では、健康な１７週齢の豚４８頭を用い、それぞれ８頭ずつ６群に割り付けた。第１群は、Ｄｉｌｕｖａｃ（登録商標）フォルトアジュバント中のサブユニット抗原でワクチン接種し、第２群は、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓ中のサブユニット抗原でワクチン接種し、第３群は、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＡＲ−Ｔ ＤＦ中のサブユニット抗原でワクチン接種し、第４群および第５群はそれぞれ、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓまたはＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＡＲ−Ｔ ＤＦのいずれかでワクチン接種した。ワクチン接種は、１７週齢および２１週齢時に頸部筋肉内に投与した。２３週齢時に、全動物を剖検し、注射部位の局所反応を調べた。各ワクチン接種の直前および剖検時の安楽死中に血液サンプルを採取した。
【００６０】
材料および方法
濃縮ｒＩｄｅSsuis抗原
商品名：サブユニット抗原（ｒＩｄｅ Ssuis）
医薬形態：抗原０．６４ｍｇ／ｍｌを含む懸濁液
プレゼンテーション：１．５０ｍｌ充填（１．８ｍｌクライオチューブ）
【００６１】
Ｄｉｌｕｖａｃ（登録商標）・Ｆｏｒｔｅアジュバント
商品名：Ｄｉｌｕｖａｃ（登録商標）Ｆｏｒｔｅ
医薬形態：筋肉内適用のエマルション
プレゼンテーション：２０ｍｌ充填（２０ｍｌ  ＰＥＴバイアル）
【００６２】
Ｖａｃｃｉｎｅ Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓ
商品名：Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＣｏｌｉＣｌｏｓ
医薬形態：筋肉内適用のエマルション
プレゼンテーション：２０ｍｌ充填（２０ｍｌ  ＰＥＴバイアル）
【００６３】
ワクチンＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）  ＡＲ−Ｔ  ＤＦ
商品名：Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）  ＡＲ−Ｔ  ＤＦ
医薬形態：筋肉内適用のエマルション
プレゼンテーション：２０ｍｌ充填（２０ｍｌ  ＰＥＴバイアル）
【００６４】
ｒＩｄｅSsuisワクチン
Ｄｉｌｕｖａｃ Ｆｏｒｔｅ、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ ＣｏｌｉＣｌｏｓおよびＰｏｒｃｉｌｉｓ ＡＲ−Ｔ ＤＦ中のSsuisワクチンを、１バイアル（２０ｍｌ）のＤｉｌｕｖａｃ Ｆｏｒｔｅ、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ ＣｏｌｉＣｌｏｓまたはＰｏｒｃｉｌｉｓ ＡＲ−Ｔ ＤＦのいずれかに１．３ｍｌの精製ｒＩｄｅ Ssuis（濃度０．６４ｍｇ／ｍｌ）を添加して使用直前に調製し、１回当たり４０μg/ml＝８０μｇを含むワクチンとした。ワクチンは２〜８℃で輸送した。
【００６５】
試験系
動物、個体識別、飼育および飼育
番号付き耳標で識別した４８頭の豚を用いた。初回ワクチン接種日の豚は１７週齢であった。最初の治療の１週間前に豚を飼育した。実験期間中、標準的な手順に従って豚に給餌し、淡水道水を自由に摂取させた。馴化は１週間とした。実験には健常動物のみを対象とした。豚を５つの治療群に割り付け、手元に来たときにワクチン接種した。
【００６６】
治療
豚には以下のようにワクチンを接種した。
【００６７】
【表２】
2021535138.tif 000003
【００６８】
したがって、第２群は本発明による混合ワクチンを表し、第１群および第３群から第５群は比較ワクチン（対照群）を表す。
【００６９】
動物実験の手順
実験期間中、豚の全身の健康状態および行動に異常がないか、標準的な手順に従って担当動物技術者または動物飼育者が毎日観察した。すべての異常（局所反応の有無を含む）を記録した。異常が認められた場合は、担当獣医師に相談した。血液サンプル（血清）は、各ワクチン接種の直前と追加ワクチン接種の２週間後に採取した。検体は常温で採血のために搬送した。凝固後、血清を実験的ｒＩｄｅSsuis抗体ＥＬＩＳＡで試験するまで凍結保存した。追加ワクチン接種の３週間後に、標準的な手順に従って、すべての動物を注射部位の剖検に供した。
【００７０】
実験室の実験手順
ｒＩｄｅSsuisの血清学
美容液サンプルを、実験的なｒＩｄｅSsuis ＥＬＩＳＡで試験した。要するに、ｒＩｄｅSsuis抗原をマイクロタイタープレート上に被覆した。コーティング後、プレートを洗浄し、血清の連続希釈を行った。インキュベーションおよびその後の洗浄の後、抗豚ＩｇＧ結合体および基質としてＴＭＢを用いて結合抗体を定量した。力価はｌｏｇ2で表された。この試験では４．３未満は陰性と考えられる。計算のため、＜４．３を３．３に置き換える。
【００７１】
大腸菌の血清学
美容液サンプルをＫ８８ａｂ、Ｋ８８ａｃ、Ｋ９９、９８７ＰおよびＬＴ抗体力価について検査した。要するに、それぞれの大腸菌抗原をマイクロタイタープレート上にコーティングした。コーティング後、プレートを洗浄し、血清の連続希釈を行った。培養後およびその後の洗浄後、抗豚ＩｇＧ抱合体および基質としてＴＭＢを用いることにより、結合した抗体を定量した。力価はｌｏｇ2で表された。この試験では、力価５．６未満は陰性であると考えられる。計算のため、＜５．６を４．６に置き換える。
【００７２】
クロストリジウム・パーフリンジェンスの血清学
クロストリジウム・パーフリンジェンスベータ毒素抗体価をＥＬＩＳＡ法で検査した。要するに、クロストリジウム・パーフリンジェンス（５７８株）ベータ毒素をマイクロタイタープレート上にコーティングした。プレートをコーティングし、続いてブロックした後、プレートを洗浄し、血清の２倍連続希釈を行った。インキュベーションおよびその後の洗浄の後、基質として抗反芻動物結合体およびＴＭＢを用いることにより、結合した抗体を定量した。力価はｌｏｇ2で表された。この試験では、力価４．６未満は陰性であると考えられる。計算のため、＜４．６を３．６に置き換える。
【００７３】
パスツレラ・ムルトシダ（P. Multocida）の血清学
パスツレラ・ムルトシダ（P. Multocida）毒素（ＰＭＴ）中和抗体を以下のように測定した：血清の２倍連続希釈液をマイクロタイタープレートでパスツレラ・ムルトシダ １型毒素とプレインキュベートした後、ＶＥＲＯ単層上に接種した。細胞をインキュベートし、毒素の細胞変性効果（ＣＰＥ）の阻害を測定した。力価は、ＣＰＥが観察されない相反最高希釈のｌｏｇ2として表される。この試験では、力価３未満は陰性であると考えられる。計算のため、＜３を２に置き換える。
【００７４】
気管支敗血症菌の血清学
Ｂｌｏｂｅｌ試験にて、気管支敗血症菌（ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）凝集抗体を測定した。要するに、血清の２倍段階希釈液を気管支敗血症菌の懸濁液とインキュベートし、凝集反応を読み取る。力価は、完全な凝集を与えた最高血清希釈液のｌｏｇ2逆数で表した。この試験では、力価１未満は陰性であると考えられる。計算のため、＜１を０に置き換える。
【００７５】
結果の評価と統計解析
ワクチン成分のすべてについて血清学的結果を群間で比較する。すなわち、関連混合使用群をそれぞれの単一ワクチン群と比較する。選択したグループは、２面２標本ｔ検定と統計プログラムＭｉｎｉｔａｂ １７を用いて比較した。ワクチン接種後に単一ワクチン群で明確な血清変換が認められた場合、本試験は有効であった。
【００７６】
結果
rIdeSsuisの血清学
試験開始時、全頭がｒＩｄｅ Ssuis に対して血清陰性を示した（表２）。Ｐｏｒｃｉｌｉｓ ＣｏｌｉＣｌｏｓおよびＰｏｒｃｉｌｉｓ ＡＲ−Ｔ ＤＦとの２つの関連使用群は、単一ワクチンと比較してそれぞれ３．３および２．１ ｌｏｇ 2低かった。これらの差はそれぞれｐ＝０．００３、ｐ＝０．０２０と統計学的に有意であった。２つの対照群４および５は、試験期間中、血清陰性のままであった。
【００７７】
Ｐｏｒｃｉｌｉｓ ＣｏｌｉＣｌｏsの血清学: Ｋ８８ａｂ、Ｋ８８ａｃ、Ｋ９９、９８７Ｐ、ＬＴおよび抗原β−トキシン
ｒＩｄｅ S.suisの追加は、ブタ大腸菌の抗原に対する血清学的反応に負の影響を及ぼさなかった（表３−８）。関連混合使用群における９８７Ｐ反応の負の傾向が観察された（ｐ＝０．０６１）が、９８７Ｐ力価の差は非常に小さく（１ｌｏｇ2のみ）、おそらく生物学的に関連性がないであろう。
【００７８】
それぞれの対照群は試験開始時に血清陰性であり、試験期間中低レベルのままであった。
【００７９】
Ｐｏｒｃｉｌｉｓ ＡＲ−Ｔ ＤＦの血清学: ＰＭＴ毒素および気管支敗血症菌
試験開始時、豚はＰＭＴ毒素に対して血清陰性を示した（表）。ｒＩｄｅSsuisがＰＭＴ毒素抗体産生に及ぼす明らかな統計的有意な負の影響が認められ（ｐ＝０．０２１）、これら２種のワクチン抗原を併用することは不可能であった。
【００８０】
ワクチン接種後、関連混合使用による、気管支敗血症菌抗体価への負の影響は観察されなかった。
【００８１】
注射部位局所反応
ワクチン注射部位の剖検は、最大／ピーク反応が予測されるワクチン接種から２週間後に実施し、初回免疫（priming）（右側）および／または追加免疫（booster）（左側）ワクチン接種後に局所反応の存在を示した（図示せず）。Ｐｏｒｃｉｌｉｓ ＣｏｌｉＣｌｏｓまたはＰｏｒｃｉｌｉｓ ＡＲ−Ｔ ＤＦへのｒＩｄｅ Ssuisの追加は、単一ワクチンの場合と比較して局所反応を悪化させなかった。
【００８２】
血清学的検査の結果を以下の表２〜１０に示す。各群は８頭の豚から構成されていたため、第１群〜第５群（第１群と第３〜５群は比較例を示す）の表に示した抗体価は平均８つの値である。
【００８３】
【表３】
2021535138.tif 000004
【００８４】
【表４】
2021535138.tif 000005
【００８５】
【表５】
2021535138.tif 000006
【００８６】
【表６】
2021535138.tif 000007
【００８７】
【表７】
2021535138.tif 000008
【００８８】
【表８】
2021535138.tif 000009
【００８９】
【表９】
2021535138.tif 000010
【００９０】
【表１０】
2021535138.tif 000011
【００９１】
【表１１】
2021535138.tif 000012
【００９２】
結論
表２〜１０の結果からわかるように、ｒＩｄｅ S.suisを加えても、ブタ大腸菌の抗原の血清学的反応に負の影響は認められなかった。ｒＩｄｅ Ssuis の追加は、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ ＡＲＴ−ＤＦにおけるボルデテラ抗原に対する血清学的反応にも負の影響を及ぼさなかったが、パスツレラ・ムルトシダの力価には有意な負の影響を及ぼした。
【００９３】
特に、ワクチン接種２８日後の初回測定時点において、ｒＩｄｅ S.suis抗原に対する反応は、陽性対照（ｒＩｄｅ S.suisのみ）と比較すると、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ ＣｏｌｉＣｌｏｓとの混合ワクチンではほぼ同程度であるが、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ ＡＲＴ−ＤＦとの混合ワクチンでは大幅に低い（表２）。従って、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ ＣｏｌｉＣｌｏｓ抗原はＰｏｒｃｉｌｉｓ ＡＲＴ抗原よりもｒＩｄｅ S.suisに対する反応に悪影響を及ぼさない。さらに、ワクチン接種後４２日間の２回目の時点では、Porcilis AR-T DFと比較してｒＩｄｅ S.suisとＰｏｒｃｉｌｉｓ ＡＲＴ−ＤＦの併用ではパスツレラ・ムルトシダに対する反応が大幅に低い（表９）。このため、混合ワクチン中のｒＩｄｅ S.suisの存在は、パスツレラ・ムルトシダに対する反応に有意な負の影響を及ぼす。
【００９４】
これらの知見は、ｒＩｄｅ S.suis抗原とパスツレラ・ムルトシダおよび気管支敗血症菌抗原とＰｏｒｃｉｌｉｓ ＡＲＴ−ＤＦに含まれるトキソイドとの併用は実行不可能であるが、ｒＩｄｅ S.suisと、大腸菌およびクロストリジウム抗原ならびにＰｏｒｃｉｌｉｓ ＣｏｌｉＣｌｏｓに含まれるトキソイドとの併用は優れた成績をもたらし、この併用は混合ワクチンの提供に特に適していることを示している。本質的には、大腸菌に対する適切な防御を提供するための必須抗原である大腸菌線毛抗原のみを含む組合せワクチンについても同様の結論を下すことができる。
【００９５】
したがって、ｒＩｄｅS.suisと大腸菌およびクロストリジウム抗原およびトキソイドとの併用は、豚レンサ球菌、大腸菌およびクロストリジウムによって引き起こされる病原性感染に対する防御を提供するための混合ワクチンの使用に適していると結論できる。したがって、豚レンサ球菌、大腸菌およびクロストリジウムによる病原性感染を含む複数の疾患を防御し、かつ雌豚のワクチン接種に適したワクチンを提供することが、驚くべきことに本発明において可能となった。また、初乳の摂取を介して（他の抗原については、この効果は先行技術の形で既知）子孫が豚レンサ球菌による感染に対して適切に防御され得ることが示されたという事実を考えると、ワクチン接種した雌動物において高力価を提供する組合せワクチンは、初乳の摂取を介して３種類すべての病原体に対して十分な防御を提供することができると考えられる。
【国際調査報告】
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