(57)【要約】  本発明は、宿主細胞のゲノムへの導入遺伝子組込みのための分子ツールおよび方法、特に、導入遺伝子の転位依存性発現を可能にし、それによって効果的に形質転換された宿主の同定および選択を促進するツールおよび方法を提供することを対象とする。
2021522838.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）プロモータと、
ｂ）目的の遺伝子（ＧＯＩ）と、
ｃ）ＤＮＡトランスポゾンの５’ＩＴＲを含むか、またはそれからなる第１の配列およびＤＮＡトランスポゾンの３’ＩＴＲを含むか、またはそれからなる第２の配列にある２つの配列のセットであって、前記第１の配列および前記第２の配列が互いに対して反対の方向にある、２つの配列のセットと、
を含み、
前記セットの２つの配列のうちの１つが、前記プロモータと前記目的の遺伝子（ＧＯＩ）の少なくとも一部との間に位置しており、
前記目的の遺伝子の配列の少なくとも一部が、前記プロモータの方向に対してアンチセンス方向にある、組換えベクター。
【請求項２】
前記２つの配列のセットの前記第１の配列が、カットアンドペーストＤＮＡトランスポゾンの５’ＩＴＲを含むか、またはそれからなり、前記２つの配列のセットの前記第２の配列が、カットアンドペーストＤＮＡトランスポゾンの３’ＩＴＲを含むか、またはそれからなる、請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項３】
前記２つの配列のセットの前記第１の配列が、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン、Ｔｏｌ２トランスポゾン、およびＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンからなるリストにおいて選択されるＤＮＡトランスポゾンからの５’ＩＴＲを含むか、またはそれからなり、前記２つの配列のセットの前記第２の配列が、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン、Ｔｏｌ２トランスポゾン、およびＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンからなるリストにおいて選択されるＤＮＡトランスポゾンからの３’ＩＴＲを含むか、またはそれからなる、請求項１または２に記載の組換えベクター。
【請求項４】
ｄ）プロモータと、
ｅ）目的の遺伝子（ＧＯＩ）と、
ｆ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの５’ＩＴＲを含むか、またはそれからなる第１の配列およびｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの３’ＩＴＲを含むか、またはそれからなる第２の配列にある２つの配列のセットであって、前記配列が互いに対して反対の方向にある、２つの配列のセットと、
を含み、
−前記目的の遺伝子の配列の少なくとも一部が、前記プロモータの配列に対してアンチセンス方向にあり、
−ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの５’ＩＴＲを含むか、またはそれからなる前記セットの配列が、前記プロモータの方向に対してセンス方向で、前記プロモータ配列の下流に局在しており、前記プロモータを前記プロモータの配列に対してアンチセンス方向にある前記目的の遺伝子の配列の少なくとも一部から分離する、請求項１〜３のいずれかに記載の組換えベクター。
【請求項５】
ｄ）プロモータと、
ｅ）目的の遺伝子（ＧＯＩ）と、
ｆ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの５´ＩＴＲを含むか、またはそれからなる第１の配列およびｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの３´ＩＴＲを含むか、またはそれからなる第２の配列にある２つの配列のセットであって、前記配列が互いに対して反対の方向にある、２つの配列のセットと、
を含み、
−前記目的の遺伝子の配列が前記目的の遺伝子の５’末端部分および前記目的の遺伝子の３’末端部分にある２つのフラグメントの形で本発明の組換えベクターに存在し、
−前記目的の遺伝子の配列の３’末端部分が前記プロモータの配列に対してアンチセンス方向にあり、
−前記目的の遺伝子の配列の５’末端部分が前記プロモータ配列の下流に局在しており、前記プロモータの方向に対してセンス方向にあり、
−前記セットの２つの配列の１つが前記プロモータと前記目的の遺伝子の配列の３’末端との間に位置している、請求項１〜４のいずれかに記載の組換えベクター。
【請求項６】
ｄ）プロモータと、
ｅ）目的の遺伝子（ＧＯＩ）と、
ｆ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの５’ＩＴＲを含むか、またはそれからなる第１の配列およびｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの３’ＩＴＲを含むか、またはそれからなる第２の配列にある２つの配列のセットであって、前記配列が互いに対して反対の方向にある、２つの配列のセットと
を含み、
−前記目的の遺伝子の配列が前記目的の遺伝子の５’末端部分および前記目的の遺伝子の３’末端部分にある２つのフラグメントの形で本発明の組換えベクターに存在し、
−前記目的の遺伝子の配列の３’末端部分が前記プロモータの配列に対してアンチセンス方向にあり、
−前記目的の遺伝子の配列の５’末端部分が前記プロモータ配列の下流に局在しており、前記プロモータの方向に対してセンス方向にあり、
−ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの５’ＩＴＲを含むか、またはそれからなる前記セットの配列が前記プロモータ配列の下流に局在しており、前記プロモータの方向に対してセンス方向にあり、前記プロモータを前記目的の遺伝子の配列の３’末端から分離する、請求項５に記載の組換えベクター。
【請求項７】
トランスポサーゼをコードする配列をさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載の組換えベクター。
【請求項８】
好ましくは請求項１〜７のいずれかに記載の組換えベクターを作製するための、空の組換えベクターであって、
ａ）第１のマルチクローニング部位と、
ｂ）第２のマルチクローニング部位と、
ｃ）ＤＮＡトランスポゾンの５’ＩＴＲを含むか、またはそれからなる第１の配列およびＤＮＡトランスポゾンの３’ＩＴＲを含むか、またはそれからなる第２の配列からなる２つの配列のセットであって、前記配列が互いに対して反対の向きにある、２つの配列のセットと
を含み、
前記セットの２つの配列のうちの１つが、前記第１のマルチクローニング部位と前記第２のマルチクローニング部位との間に位置している、空の組換えベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の空の組換えベクターまたは請求項１〜７のいずれかに記載の組換えベクターと、
好ましくはタンパク質として、またはトランスポサーゼ発現ベクターの形で提供されるトランスポサーゼ酵素と、
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学および遺伝子工学の技術分野、特に単離された細胞または生物におけるＤＮＡ修飾に関する。本発明は、宿主細胞のゲノムへの導入遺伝子組込みのための分子ツールおよび方法、特に、導入遺伝子の転位依存性発現を可能にし、それによって効果的に形質転換された宿主の検出および選択を促進するツールおよび方法を提供することを対象とする。本発明はまた、本発明の分子ツールおよび／または方法で形質転換された組換え宿主の作製および使用を対象とする。本発明はさらに、本発明による分子ツールまたは組換え宿主の生物工学的および治療的用途を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
導入遺伝子の適切な組込みおよび発現を達成することは、遺伝子工学における基本的な要求である。レンチウイルスおよびレトロウイルスベクターは、この意図に長い間使用されてきたが、それらは、本質的にカーゴ容量が限定されており、サイレンシングが発生しやすく、それらの調製に時間がかかり、大きな労働力を要しかつ高価であり、それらの保管と出荷には特定の条件が必要であり、それらの使用法は、厳しい規制を受ける。裸のプラスミドＤＮＡベクターおよびアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）などのＤＮＡベースのウイルスベクターは、作製および取り扱いがはるかに便利である。それらは、ランダムまたは遺伝子座特異的組込みを強化する技術、特に、ｐｉｇｇｙＢａｃ、Ｔｏｌ２、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙなどの脊椎動物種において活性であるトランスポゾン（Ｗｕら，２００６）、ならびに特に、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を含めた部位特異的エンドヌクレアーゼ（Ｇａｊら，２０１３）のおかげで、ゲノム構成で導入遺伝子発現を達成するためにますます使用されている。しかしながら、ＤＮＡベクターの一般的な問題は、組換え細胞の同定であり、通常はベクターから特定のマーカ（例えば、薬剤耐性または蛍光タンパク質マーカ）を発現させることで達成される。遺伝子または関心（ＧＯＩ）がプロモータの制御下に配置される古典的なベクター構成では、ゲノム組込み導入遺伝子を有する組換え細胞の確立と分析は、導入遺伝子組込み前にベクターのエピソーム形からのマーカ発現によって妨げられる。これは通常、トランスフェクション後に、組み込まれた導入遺伝子からの発現を隠す一過性の発現バーストを引き起こし、２つの有害な結果をもたらす。第一に、ゲノム導入遺伝子からの発現は、エピソームの除去前に確実に評価することができず、これは典型的に、複数ラウンドの細胞分裂を必要とし、トランスジェニック細胞の選択と分析に数週間の遅延（１０〜２０日以上）をもたらす。第二に、異常に高いレベルでのエピソーム発現は、代謝および遺伝子発現を混乱させ、標的細胞の挙動、同一性、生存率に潜在的に有害な影響を与える可能性がある。誘導性発現戦略は、導入遺伝子発現を遅らせ、エピソームからの一過性の発現バーストを回避するために使用され得るが、細胞の追加操作が必要であり、しばしば漏出に苦しみ、ゲノム組込み導入遺伝子をアッセイするための細胞分裂によるエピソーム除去になお従属しており、遺伝子導入手順の１週間にわたる遅延を導入する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、遺伝子組換えに有用であり、上記の欠点を克服し、特に、導入遺伝子を運ぶベクターのエピソーム発現を防止または限定する、改良された分子ツールおよび方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、ゲノムへの目的の遺伝子（ＧＯＩ）の組込みに有用な分子ツール、特にベクターを開発し、最上のプロモータの制御下で、遺伝子の組込みと発現を連結することを可能にした。言い換えれば、ベクターがエピソーム形である場合、ベクターの構成は、ＧＯＩの発現と適合性がなく、したがって、サイレンシングされ、それによって、そのようなエピソーム形からの発現を限定または防止する。本発明のベクターの構成は、転位によるゲノムへのＧＯＩの組込みが、ベクターの配列内の構成変化を誘発するようなものであり、これらの変化は、ＧＯＩの発現と適合性のある組み込まれた配列をもたらす。この系は、転位依存スイッチと呼ぶことができ、ＧＯＩの発現は、ＧＯＩがいったん転位された後にのみ可能である。
【０００５】
本発明のベクターは、当技術分野で既に知られている様々な分子エレメント、特にプロモータ配列、目的の遺伝子をコードする配列、およびＤＮＡトランスポゾンからの５’および３’ＩＴＲに由来する、好ましくはそれらを含む、またはそれらからなる２つの配列のセットを利用し、ゲノムへの目的のポリヌクレオチド配列の組込みを誘導する能力があり、これらのエレメントは、ゲノムへのその組込み前の目的の導入遺伝子の発現を防ぐような様式でベクター内に配置されている。
【０００６】
本発明のベクターは、特に、ＤＮＡトランスポゾンからの５’および３’ＩＴＲに由来する、好ましくはそれらを含む、またはそれらからなる配列のセットの使用に依存している。
【０００７】
クラスＩＩ転位因子（ＴＥ）とも称されるＤＮＡトランスポゾンは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接するトランスポサーゼタンパク質をコードする中央配列を含むＤＮＡ分子で典型的に形成されている。これらのトランスポゾンは、脊椎動物細胞において活性のあるｐｉｇｇｙＢａｃ、Ｔｏｌ２、およびＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  ＴＥを含む。ＤＮＡトランスポゾンは一般に、カットアンドペースト機構によってそれらの遺伝子座から除去され、外来ゲノムまたは配列に組み込まれる。カットアンドペースト機構は、２つのトランスポサーゼモノマーがＩＴＲ配列に結合することから始まる。次いで、トランスポゾン末端は、両方のトランスポサーゼ単量体によって一緒にされて、二量体を形成する。二量体が形成されると、トランスポゾンＤＮＡ本体の切除が行われ、ペアエンド複合体と称される一過性の構造が産出される。切除部位では、トランスポゾンが除去されたドナーＤＮＡ分子の連続性が、宿主細胞ＤＮＡ修復機構によって回復され得る。最後に、ペアエンド複合体のトランスポサーゼ二量体がＤＮＡ組込み部位に結合し、そこでＤＮＡが切断され、組込みが行われる。挿入されると、ＤＮＡ組込み部位が複製され、トランスポゾンフットプリントと称されるものが産出され、これは、最終的に組み込まれたトランスポゾンに隣接する。ＩＴＲ配列の配列とそれらの互いに対する方向の両方は、これらの分子事象が起こるために決定的であり、トランスポゾン組込みをもたらす。
【０００８】
トランスポゾンに由来する、好ましくはそれを含む、またはそれからなる逆方向末端反復（ＩＴＲ）のセットは、当技術分野でよく知られており、遺伝子組換えのための分子ツールとして使用されてきた。これらの配列は、上で詳述した分子機構に基づいて、それらが、挿入される配列を含むヌクレオチド分子に両方が存在する場合にのみ、それらがゲノムへの目的の配列の導入を可能にするという点で、セットとして機能する。
【０００９】
典型的に、それらの位置および方向は、通常、導入遺伝子配列と称される、実際にゲノムに組み込まれることになる配列を定義し、この導入遺伝子配列は、作動可能に配置されたＩＴＲのセットが隣接するベクターの配列に相当し、つまり、ここで、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、ゲノムへの目的の遺伝子の組込みを可能にするように置かれ、方向付けられている。通常、当技術分野では、以下のセンス方向（目的の遺伝子のオープンリーディングフレームに対して）での５’末端から３’末端までの読取りの場合、組込みカセットが形成される：５’−ＩＴＲ１−プロモータ−目的の遺伝子−ＩＴＲ２−３’。
【００１０】
このスキームでは、５’ＩＴＲ（ＩＴＲ１）および３’ＩＴＲ（ＩＴＲ２）は、それらが目的の導入遺伝子を組み立て、宿主細胞のゲノムへのその統合を駆動するが、ベクターの残りの部分は組み込まれないように置かれ、方向付けられている。この古典的なスキームにおける５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの方向は、以下、「センス」方向として定義される。ＩＴＲ１およびＩＴＲ２配列が、上記の配置に対して、アンチセンス向きで方向付けられている場合、導入遺伝子配列は、プロモータの制御下にある目的の遺伝子を含有しないベクターの部分に相当することになる。この場合、目的の遺伝子およびプロモータは、ゲノムを組み込まない。したがって、ＩＴＲ配列に関するセンスおよびアンチセンス方向を同定し、それにより、目的の遺伝子の配列のオープンリーディングフレームに対して、それらがどのように配置されているかを決定することが可能である。
【００１１】
本発明のベクターでは、導入遺伝子のサイレンシングは、プロモータの配列および目的の遺伝子の配列を、プロモータの配列がセンス方向にあるが、目的の遺伝子の配列の少なくとも一部は、アンチセンス方向にあり、プロモータの配列と目的の遺伝子の配列の一部とは、ＤＮＡトランスポゾンに由来する、好ましくはそれを含むかまたはそれからなるＩＴＲ配列の１つによってさらに分離されているように、ベクター内に配置することによって得られる。したがって、ゲノムへのその組込み前、つまり、エピソーム形でのベクター内では、目的の遺伝子は、プロモータの制御下にない。
【００１２】
上記に加えて、本発明のベクターでは、ＩＴＲ配列のセットは、互いに反対に方向付けられている、つまり、プロモータの方向に対して、一方はセンス方向にあり、他方はアンチセンス方向にある。
【００１３】
興味深いことに、組込み配列のセットのこの特定の位置および方向は、直感に反するものの、最上のプロモータ（つまり、本発明のベクターに含まれる）の制御下での目的の遺伝子の組込みを宿主細胞のゲノムにもたらす。
【００１４】
理論に拘束されることなく、本発明のベクターは、宿主細胞へのトランスフェクション時に、宿主細胞のゲノムへのそれらの組込みに適切なトランスポサーゼ酵素と一緒に、コンフォメーション変化を受けて、ベクターを構成する様々なエレメントの再配置をもたらし、目的の遺伝子に対するプロモータ領域の反転を引き起こし、プロモータと目的の遺伝子を互いに隣接させ、その後、目的の遺伝子は、プロモータの制御下で終わることが提唱されている。
【００１５】
それらのエレメントの直感に反する配置にもかかわらず、本発明のベクターは、目的の遺伝子の組込みおよび発現を可能にする。この発現は、転位依存性であるため、本発明のベクターおよび方法は、古典的なプラスミドベースのベクターで細胞分裂によるそれらの希釈の前に起こる（エピソームベクターからの）一過性の発現バーストを防ぐ。代わりに、本発明のベクターおよび方法で、エピソームがサイレントに保たれている間、持続的発現がゲノム組込み導入遺伝子コピーから得られ、それにより毒性効果または他の望ましくない生物学的結果を限定し、目的の遺伝子の配列が実際にゲノムに組み込まれている宿主細胞を容易かつ効率的に検出することが可能になる。
【００１６】
本発明の方法を用いて宿主細胞にトランスフェクトされる場合、本発明のベクターは、最上のプロモータの制御下で目的の遺伝子の組込みを可能にし、これは、誘導性プロモータ（例えば、特定の細胞型、ステージ、細胞周期の段階において、またはある薬剤の適用時に特異的に誘導される）が必要である場合、特に興味深いことがある。
【００１７】
本発明の第１の目的は、
ａ）プロモータと、
ｂ）目的の遺伝子（ＧＯＩ）と、
ｃ）ＤＮＡトランスポゾンの５’ＩＴＲに由来する、好ましくはそれを含む、またはそれからなる第１の配列およびＤＮＡトランスポゾンの３’ＩＴＲに由来する、好ましくはそれを含む、またはそれからなる第２の配列にある２つの配列のセットであって、第１の配列および第２の配列が互いに対して反対の方向にある、２つの配列のセットと
を含み、
セットの２つの配列のうちの１つがプロモータと目的の遺伝子（ＧＯＩ）の少なくとも一部との間に位置しており、目的の遺伝子の配列の少なくとも一部がプロモータの方向に対してアンチセンス方向にある、組換えベクターである。
【００１８】
セットの２つの配列のうちの１つは、プロモータとＧＯＩの少なくとも一部との間に位置している。好ましくは、ＧＯＩの少なくとも一部は、プロモータとＧＯＩの少なくとも一部との間に位置するセットの２つの配列のうちの１つ、およびセットの２つの配列のうちの他の１つが隣接している。したがって、ベクターのエレメントの方向のセンスは、プロモータの配列のセンスに対して定義され得ることを理解されたい。
【００１９】
プロモータ配列が転写の向きを定義し、それによってどのＤＮＡ鎖が転写されることになるかを示し、したがって、鎖は「センス鎖」と称されることが分子生物学においてよく知られている。本発明の文脈では、その配列が５’末端から３’末端まで読み取られる核酸分子において、プロモータの配列のセンス方向は、配列の下流、つまりプロモータの３’に局在するエレメントの転写を可能にする方向である。本発明のベクターに適切なプロモータは、よく知られており、分子生物学で日常的に使用されているので、当業者は、それらのセンスおよびアンチセンス向きを容易に決定し、その結果、ベクターの他のエレメントを適切に設計することができる。
【００２０】
本発明の文脈では、核酸の配列は、ＩＵＰＡＣ規則を使用して５’末端から３’末端まで提示された、分子を構成するヌクレオチド残基の連続であり、ここで、アデニン残基は、文字Ａで表され、シトシン残基は、文字Ｃで表され、グアニン残基は、文字Ｇで表され、チミン残基は、文字Ｔで表される。核酸分子がＤＮＡなどの二本鎖分子である場合、特に明記しない限り、分子の配列は、センス鎖のものである。「プロモータの配列」とは、本明細書では、特定の核酸配列の発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列を指す。プロモータ配列は、ポリヌクレオチドの発現を調節する転写制御配列を含有する。プロモータは、突然変異体、切断型、およびハイブリッドプロモータを含めた最上の宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列とすることができ、宿主細胞に対して相同または異種の細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。プロモータが核酸に対してその機能を発揮する場合、核酸配列は、プロモータの制御下にある。
【００２１】
プロモータおよびそれらの配列は、当技術分野でよく知られており、例えば、構成的プロモータおよび誘導性プロモータを含む。
【００２２】
本発明のベクターに適切な構成的プロモータは、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）最初期プロモータ、ＳＶ４０プロモータ、リゾチームプロモータ、初期および後期ＣＭＶプロモータ、初期および後期ＨＳＶプロモータ、アクチンプロモータ、合成ＣＡＧプロモータ（ＣＭＶ前初期エンハンサー、ニワトリベータアクチン遺伝子の第１エクソンと第１イントロン、およびウサギベータグロビン遺伝子のスプライスアクセプターからなる）、伸長因子−１アルファ（ＥＦ−１アルファ）プロモータ、チューブリンプロモータ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータ、ならびに熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）プロモータを含むが、これらに限定されない。本発明のベクターに適切な構成的プロモータの他の例は、キメラＳＭ２２アルファ／テロキンプロモータ、ユビキチンＣプロモータ、Ｈｓｆ２プロモータを含めた平滑筋ＳＭ２２プロモータ、マウスＣＯＭＰ（軟骨オリゴマー基質タンパク質）プロモータ、初期Ｂ細胞特異的ｍｂ−１プロモータ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）プロモータ、松果体発現促進エレメントプロモータ、神経および肝臓のセラミダーゼ遺伝子プロモータ、ＰＳＰ９４遺伝子プロモータ、ヒトＦＡＴ／ＣＤ３６遺伝子のプロモータ、ＶＬ３０プロモータ、ならびにＩＬ−１０プロモータを含むが、これらに限定されない。
【００２３】
本発明のベクターに適切な誘導性プロモータは、組織特異的プロモータ、発生的に調節されるプロモータ、および化学的に誘導性のプロモータを含むが、これらに限定されない。組織特異的プロモータの例は、ビテロゲニンプロモータ、卵白アルブミンプロモータ、オボムコイドプロモータ、コンアルブミンプロモータ、オボトランスフェリンプロモータ、プロラクチンプロモータ、腎臓ウロモジュリンプロモータ、および胎盤性ラクトゲンプロモータを含む。発生的に調節されるプロモータの例は、ホメオボックスプロモータおよびいくつかのホルモン誘導プロモータを含む。化学的に誘導性のプロモータの例は、生殖ホルモン誘導性プロモータ、ならびにテトラサイクリン誘導性プロモータおよび亜鉛誘導性メタロチオニンプロモータなどの抗生物質誘導性プロモータを含む。本発明のベクターに適切な他の誘導性プロモータ系は、ＩＰＴＧ（イソプロピルベータ−Ｄ−チオガラクトシド）によって誘導可能なＬａｃオペレーターリプレッサー系、エクジソンベースの誘導性系、エストロゲンベースの誘導性系、プロゲステロンベースの誘導性系を含む。
【００２４】
プロモータの機能を改善し、それにより、ゲノムに組み込まれた場合の目的の遺伝子の発現を増加させ安定化するために、本発明のベクターは、好ましくは、プロモータエンハンサーおよび／またはエピジェネティックレギュレータをさらに含む。これらのエレメントは、本発明のベクターに存在する場合、好ましくはプロモータ配列と同じ方向に方向付けられている。プロモータエンハンサーは、当技術分野でよく知られており、例えば、ＨＡＣＮＳ１、ＧＡＤＤ４５Ｇ、およびＣＭＶ最初期エンハンサーを含む。エピジェネティックレギュレータは、当技術分野でよく知られており、境界またはインスレータエレメント、遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）、安定化および抗抑制（ＳＴＡＲ）エレメント、遍在性クロマチンオープニング（ＵＣＯＥ）エレメント、ならびにマトリックス結合領域（ＭＡＲ）を含む。これらのエピジェネティックレギュレータはすべて、哺乳類細胞株での組換えタンパク質作製（Ｚａｈｎ−Ｚａｂａｌら，２００１）および遺伝子治療に使用されている。
【００２５】
「目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードする配列」とは、本明細書では、５’末端から３’末端に提示され、そのオープンリーディングフレームに対応するセンス方向で読み取られる、目的のペプチドをコードするヌクレオチド配列を指し、これは、その翻訳、つまり、それがコードするペプチドの生成に必要な構造エレメントを含む。本発明の文脈では、目的の遺伝子は、目的のペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドとすることができ、その発現が望まれ、したがって、その配列が転写および翻訳され得る。好ましくは、目的の遺伝子（ＧＯＩ）の配列は、その５’末端部分での開始コドンをコードする３つの連続したヌクレオチドを含む。本発明の文脈では、開始コドンは、リボソームによって翻訳されるメッセンジャーＲＮＡ転写物の最初のコドンである。開始コドンは、真核生物で最も一般的な開始コドンであるＡＵＧ、およびＡＵＡ、ＡＵＵ、ＧＵＧ、ＵＵＧなどの代替開始コドンを含む。最も好ましくは、目的の遺伝子の配列は、その５’末端部分に、３つの連続するヌクレオチドＡＴＧを含む。
【００２６】
目的の遺伝子の配列は、タンパク質分解シグナルをさらに含み得る。本発明の文脈では、デグロンとも称される「タンパク質分解シグナル」という用語は、分子生物学の分野で一般的に理解されるように、つまり、タンパク質の配列内に含まれる核配列を指すものとして解釈されるべきであり、これは、タンパク質の半減期を減少させる。タンパク質破壊シグナルが同定されており、その対応する核配列がタンパク質のＮ末端に導入されて、高速分解性組換えタンパク質を操作することができる。本発明の文脈において適切なタンパク質分解シグナルは、ＰＥＳＴ配列およびサイクリン破壊ボックスを含むが、これらに限定されない。
【００２７】
目的の遺伝子の配列は、好ましくは、タンパク質タグをコードする配列をさらに含む。本発明の文脈において適切なタンパク質タグをコードする配列は、それらが融合しているタンパク質の検出および精製に有用な、ＦＬＡＧ、ＨＢＨ、ＭＢＰ、ＣＢＰ、Ｖ５、ヘマグルチニン抗原（ＨＡ）、ｃ−ｍｙｃおよびポリヒスチジン（Ｈｉｓ）タグをコードする遺伝子を含むが、これらに限定されない。
【００２８】
好ましくは、本発明のベクターでは、目的の遺伝子は、ポリアデニル化シグナルおよび／または転写ターミネータに作動可能に連結されている。
【００２９】
本発明の文脈では、目的の遺伝子の配列およびポリアデニル化シグナルの配列が、目的の遺伝子の転写によって生成されたメッセンジャーＲＮＡへのポリ（Ａ）テールの付加を可能にするように置かれ、方向付けられている場合、目的の遺伝子は、ポリアデニル化シグナルに「作動可能に連結」されている。本発明の文脈では、目的の遺伝子の配列および転写ターミネータの配列が、目的の遺伝子の転写によって生成されたメッセンジャーＲＮＡへのポリ（Ａ）テールのエンドヌクレアーゼ的切断および付加を可能にするように置かれ、方向付けられている場合、目的の遺伝子は、転写ターミネータに「作動可能に連結」されている。
【００３０】
本発明の文脈では、「ポリアデニル化シグナル」という用語は、分子生物学で一般的に理解されるように、つまり、メッセンジャーＲＮＡ転写物のテールへの複数のアデニン（Ａ）ヌクレオチドの転写後付加を媒介するヌクレオチド配列を指すと解釈されるべきである。ポリアデニル化シグナルは通常、終止コドンの後、転写される遺伝子の配列の下流に局在する。本発明の文脈では、それらは、目的の遺伝子の配列のオープンリーディングフレームに対してセンス方向に方向付けられている。上記で詳述したように、本発明のベクターが２つ以上の目的の遺伝子を含む実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、好ましくは、目的の遺伝子の配列の３’末端部分の最後の終止コドンの下流に局在する。
【００３１】
本発明の文脈では、「転写ターミネータ」という用語は、分子生物学で一般的に理解されるように、つまり、目的の遺伝子の転写終結を媒介し、したがってＲＮＡへのその転写の終わりをマークするヌクレオチド配列を指すと解釈されるべきである。転写ターミネータは通常、転写される遺伝子の配列の下流、典型的に、ポリアデニル化シグナルなどの任意の３’調節エレメントの直後に局在する。
【００３２】
本発明の文脈において適切な転写ターミネータおよびポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、およびラビベータグロビン（ｒｂＧｌｏｂ）ポリアデニル化シグナルを含む。これらのシグナルは、ポリアデニル化と終結の両方を促進する配列モチーフ（ＡＡＵＡＡＡ）を含む。
【００３３】
本発明のベクターでは、目的の遺伝子の配列の少なくとも一部は、プロモータの配列に対してアンチセンス方向にある。言い換えれば、目的の遺伝子の少なくとも一部は、目的の遺伝子の対応する部分の相補的配列の形で存在する。
【００３４】
「相補的」または「相補体」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列などのヌクレオチド配列を指す場合、当技術分野で一般的に理解されているように解釈されるべきである。したがって、ヌクレオチド配列は、２つのヌクレオチド配列が塩基対形成によってハイブリダイズした二重鎖を形成する場合、参照のヌクレオチド配列に相補的であると見なされる。ヌクレオチド配列と参照のヌクレオチド配列との間の相補性の程度は、完全な相補性（各ヌクレオチドがその反対物の真向かいにある）から部分的な相補性（５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％）まで変化し得る。ヌクレオチド配列は、配列内のすべてのヌクレオチドが、参照の配列の対応する逆平行位置にあるヌクレオチドと塩基対形成を形成する場合、参照のヌクレオチド配列に完全に相補的であると見なされる。塩基対形成という用語は、ヌクレオチド塩基ＡとＴ、およびヌクレオチドＣとＧの対形成を指す。好ましくは、本発明の文脈では、参照の配列に相補的な配列は、参照の配列に完全に相補的である。
【００３５】
目的の遺伝子の配列は、本発明の組換えベクターにおいて、１つのヌクレオチドセグメントの形で、または非連続的に配置されている目的の遺伝子の配列のいくつかのフラグメントの形で、存在し得るが、ただし、フラグメントの少なくとも１つは、プロモータの配列に対してアンチセンス方向にあり、本明細書で定義されるセットの２つの配列のうちの１つによってプロモータの配列から分離されていることが理解されるべきである。
【００３６】
したがって、本発明によれば、目的の遺伝子の配列が１つのヌクレオチドセグメントの形で存在する場合、目的の遺伝子の配列全体は、プロモータの配列に対してアンチセンス方向にあり、目的の遺伝子の配列とプロモータの配列とは、本明細書で定義されるセットの２つの配列のうちの１つによって分離されている。この実施形態では、本発明のベクターでは、目的の遺伝子は、最初はプロモータの制御下にない、または言い換えれば、プロモータは、目的の遺伝子に作動可能に連結されていない。
【００３７】
代わりに、目的の遺伝子の配列がいくつかのフラグメントの形で本発明の組換えベクターに存在する場合、好ましくは、目的の遺伝子の配列の５’末端部分および目的の遺伝子の配列の３’末端部分、好ましくは、目的の遺伝子の配列の少なくとも３’末端部分にある２つのフラグメントは、プロモータの配列に対してアンチセンス方向にあり、本明細書で定義されるセットの２つの配列のうちの１つによってプロモータの配列から分離されている。
【００３８】
好ましい実施形態では、本発明のベクターでは、目的の遺伝子は、目的の遺伝子の配列の５’末端部分および目的の遺伝子の配列の３’末端部分にある２つのフラグメントの形で存在し、ここで、
−目的の遺伝子の配列の３’末端部分は、プロモータの配列に対してアンチセンス方向にあり、目的の遺伝子の配列の３’末端部分とプロモータの配列とは、本明細書で定義されるセットの２つの配列のうちの１つによって分離されており、
−目的の遺伝子の配列の５’末端部分は、プロモータ配列の下流に局在し、好ましくは、本明細書で定義されるセットの２つの配列のいずれによってもプロモータから分離されておらず、プロモータの配列に対してセンス方向にある。
【００３９】
上記の実施形態は、目的の遺伝子が、隣接しておらず、さらに互いにアンチセンス方向にある２つのフラグメントの形で存在し、目的の遺伝子の産物が発現され得ず、転位の前の目的の遺伝子の転写の潜在性の開始の場合でさえも、ベクターのエピソーム形に対するサイレンシング効果をさらに強化するという点で、特に有利である。それにもかかわらず、遺伝子組換え中に誘導される分子事象中に、ベクターの異なるエレメントは、目的の遺伝子の配列の５’および３’末端部分を連続的に、同じ方向で、さらにプロモータの制御下に再び置くように再配置され、これにより、目的の遺伝子が完全に転写および翻訳され得るように、配列全体が回復される。
【００４０】
本発明のベクターは、目的の遺伝子に加えて、目的の遺伝子の配列と一緒に新しいゲノムに組み込まれることが意図された１つまたは複数の追加の別個の目的の遺伝子をさらに含み得る。１つまたは複数の追加の別個の目的の遺伝子の配列の位置および方向は、本発明の組換えベクターの期待される使用、特に、１つまたは複数の追加の別個の目的の遺伝子の期待される発現のパターンに従って適合され得る。例えば、１つまたは複数の追加の別個の目的の遺伝子のエピソーム形での発現が望まれる場合、１つまたは複数の追加の別個の目的の遺伝子の配列は、ベクター中のプロモータの制御下にあるように置かれ、方向付けられ得る。逆に、１つまたは複数の追加の別個の目的の遺伝子の転位依存性発現が望まれる場合、それらの配列の方向は、それがプロモータの配列に対してアンチセンス方向にあり、配列とプロモータの配列とが、本明細書で定義されるセットの２つの配列のうちの１つによって分離されているという点で、上記の主要な目的の遺伝子の方向を模倣し得る。
【００４１】
本発明のベクターが、目的の遺伝子に加えて、１つまたは複数の追加の別個の目的の遺伝子を含む本発明の実施形態では、１つまたは複数の追加の別個の目的の遺伝子の配列は、プロモータの制御下にあり、好ましくは、プロモータ配列の下流に局在し、好ましくは、本明細書で定義されるセットの２つの配列のいずれによってもプロモータから分離されていない。
【００４２】
本発明のベクターが、目的の遺伝子に加えて、１つまたは複数の追加の別個の目的の遺伝子を含む本発明の別の実施形態では、１つまたは複数の追加の別個の目的の遺伝子の配列は、プロモータの配列に対してアンチセンス方向にあり、１つまたは複数の追加の別個の目的の遺伝子の配列とプロモータの配列とは、本明細書で定義されるセットの２つの配列の１つによって分離されている。好ましくは、この実施形態では、本発明の組換えベクターに組み込まれた目的の遺伝子のすべての転位依存性発現を可能にするために、それらのそれぞれの配列は、転写および翻訳の意図で作動可能に連結され得る。この特色は、転写の意図で、遺伝子の配列を単一の機能ユニットとして組織化することによって、遺伝子を融合し、それによって融合タンパク質を得ることによって、おそらくそれぞれの遺伝子配列の間に内部リボソーム侵入部位ＩＲＥＳ）または２Ａエレメントを挿入することによって、容易に達成され得る。目的の遺伝子が、目的の遺伝子の配列の５’末端部分および目的の遺伝子の配列の３’末端部分にある２つのフラグメントの形でベクター中に存在するこれらの実施形態では、１つまたは複数の追加の別個の目的の遺伝子の配列は、目的の遺伝子の配列の３’末端部分に隣接しており、目的の遺伝子の配列の３’末端部分と同じ向きに方向付けられ、目的の遺伝子の配列の３’末端部分のオープンリーディングフレームに対して、目的の遺伝子の配列の３’末端部分の下流に置かれており、目的の遺伝子の配列の３’末端部分と１つまたは複数の追加の別個の目的の遺伝子の配列とは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメントまたは２Ａエレメントによって分離されている。
【００４３】
ＩＲＥＳと２Ａエレメントの両方は、当技術分野でよく知られており、分子生物学、特にベクターおよび他の核酸構築物において日常的に使用されている。本発明の文脈において適切な２Ａエレメントは、例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、およびＦ２Ａエレメント、つまり、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、およびＦ２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
【００４４】
好ましくは、追加の別個の目的の遺伝子の少なくとも１つは、レポーター遺伝子および選択マーカをコードする遺伝子からなるリストから選択される。
【００４５】
本発明の文脈では、「レポーター遺伝子」という用語は、分子生物学の分野で一般的に理解されるように、つまり、当技術分野で知られている技術または方法を使用して容易に検出され得るペプチド産物をコードする遺伝子を指すと解釈されるべきである。本発明の文脈において適切なレポーター遺伝子は、蛍光タンパク質のいずれか（例えば、緑色（ＧＦＰ）、赤色、近赤外、黄色、シアン、または青色の蛍光タンパク質、高感度緑色、赤色、黄色、シアン、または青色蛍光タンパク質）、ベータラクタマーゼ、ベータガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）、レニラ（ＲＬｕｃ）ルシフェラーゼ、ＮＡＮＯＬＵＣルシフェラーゼ（ＮｌｕｃＰ）（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ＷＩ）、細菌ルシフェラーゼ、コメツキムシルシフェラーゼレッド（ＣＢＲｌｕｃ）、コメツキムシシフェラーゼグリーン（ＣＢＧ６８１ｕｃおよびＣＢＧ９９１ｕｃ）、メトリディア・パシフィカルシフェラーゼ（ＭｅｔＬｕｃ）、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）、ウミホタルルシフェラーゼ、およびガウシア−Ｄｕｒａルシフェラーゼ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ｄｓＲｅｄ、ｄｓＲｅｄ２、ｄｓＲｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＡｃＧＦＰ１、ＺｓＧｒｅｅｎｌ、Ｒｅｄ  Ｆｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼ、高感度コメツキムシルシフェラーゼ（ＥＬｕｃ）、渦鞭毛藻ルシフェラーゼ、ピロフォルス・プラギオフタラムス、ルシフェラーゼ（ｌｕｃＧＲ）、細菌ルシフェラーゼ（Ｌｕｘ）、ｐｍｅＬＵＣ、フリクソトリクス・ヒルタスルシフェラーゼ、ガウシア−Ｄｕｒａルシフェラーゼ、ＲｅｎＳＰ、バルグラ・ヒルゲンドルヒルシフェラーゼ、Ｆｕｃｉａルシフェラーゼ、メトリディア・ロンガルシフェラーゼ（ＭｅｔＬｕｃ）、ＨａｌｏＴａｇ、ＳＮＡＰタグ、ＣＦＩＰタグ、β−グルクロニダーゼ、エクオリン、分泌型胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＰＡＰ）、ジェミニ、ＴａｇＢＦＰ、ｍＴａｇＢＦＰ２、アズライト、ＥＢＦＰ２、ｍＫａｌａｍａｌ、Ｓｉｒｉｕｓ、サファイア、Ｔ−サファイア、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＳＣＦＰ３Ａ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、緑石シアン、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴＦＰ１、エメラルド、スーパーフォルダーＧＦＰ、アザミグリーン、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵ  Ｇ、ｍＷａｓａｂｉ、クローバー、シトリン、ヴィーナス、ＳＹＦＰ２、ＴａｇＹＦＰ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−オレンジ、ｍＫＯ、ｍＫ０２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＲｕｂｙ、ｍＲｕｂｙ２、ｍＰｌｕｍ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ｍＫａｔｅ２、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、ＮｉｒＦＰ、ＴａｇＲＦＰ６５７、ＩＦＰ１．４、ｉＲＦＰ、ｍ  ｅｉｍａ  Ｒｅｄ、ＬＳＳ−ｍＫａｔｅｌ、ＬＳＳ−ｍＫａｔｅ２、ＰＡ−ＧＦＰ、ＰＡｍＣｈｅｒｒｙｌ、ＰＡＴａｇＲＦＰ、Ｋａｅｄｅ（緑）、Ｋａｅｄｅ（赤）、ＫｉｋＧＲ１（緑）、ＫｉｋＧＲ１（赤）、ＰＳ−ＣＦＰ２、ＰＳ−ＣＦＰ２、ｍＥｏｓ２（緑）、ｍＥｏｓ２（赤）、ｍＥｏｓ３．２（緑）、ｍＥｏｓ３．２（赤）、ＰＳｍＯｒａｎｇｅ、ＰＳｍＯｒａｎｇｅ、Ｄｒｏｎｐａ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ＴｕｒｂｏＦＰ６３５、ＴｕｒｂｏＦＰ６５０、ｈｒＧＦＰ、ｈｒＧＦＰ  ＩＩ、Ｅ２−Ｃｒｉｍｓｏｎ、ＨｃＲｅｄｌ、Ｄｅｎｄｒａ２、ＡｍＣｙａｎｌ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ、ｍＢａｎａｎａ、ＥＢＦＰ、Ｔｏｐａｚ、ｍＥＣＦＰ、ＣｙＰｅｔ、ｙＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ、Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ２、Ｊｒｅｄ、ＡｓＲｅｄ２、ｄＫｅｉｍａ−Ｔａｎｄｅｍ、ＡＱ１４３、ｍＫｉｋＧＲ、ならびにその同族体およびその変異体を含むが、これらに限定されない。
【００４６】
本発明のベクターは、好ましくは、選択マーカをコードする遺伝子を含む。本発明の文脈では、「選択マーカをコードする遺伝子」という用語は、分子生物学の分野で一般的に理解されるように、つまり、選択剤、好ましくは、抗生物質に対する耐性を付与するペプチド産物をコードする遺伝子を指すと解釈されるべきである。本発明の文脈において適切な選択マーカをコードする遺伝子は、クロラムフェニコール、アンピシリン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、カナマイシン、ネオマイシン、ピューロマイシン、ヒスチジノール、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むが、これらに限定されない。
【００４７】
本発明のベクターは、好ましくは、少なくとも多重クローニング部位をさらに含む。本発明の文脈では、「多重クローニング部位」または「多重制限酵素切断部位」という用語は、複数の制限酵素部位を含むヌクレオチド配列を指す。多重クローニング部位は、よく知られており、分子生物学で日常的に使用されており、様々な制限フラグメントの直接クローニングを可能にする。
【００４８】
本明細書で定義される本発明のベクターは、ＤＮＡトランスポゾンの５’ＩＴＲに由来する、好ましくはそれを含む、またはそれからなる第１の配列およびＤＮＡトランスポゾンの３’ＩＴＲに由来する、好ましくはそれを含む、またはそれからなる第２の配列にある２つの配列のセットを含む。
【００４９】
「ＤＮＡトランスポゾン」という用語は、分子生物学で一般的に理解されているように、つまり、２つのＤＮＡ分子間で、または配列環境で転位する能力があるクラスＩＩ転移因子（ＴＥ）として解釈されるべきである。真核生物のＤＮＡトランスポゾンは、以下の３つの主要なサブクラスに分類され得る：（ｉ）「カットアンドペースト」トランスポゾンとも称される、二本鎖ＤＮＡとして切り出し、ゲノムの他の場所に再挿入するもの、（ｉｉ）おそらくローリング・サークル複製に関連する機構を利用するもの、ヘリトロン、および（ｉｉｉ）Ｍａｖｅｒｉｃｋｓ、その転位の機構は、まだよく理解されていないが、自己コード化ＤＮＡポリメラーゼを使用して複製する可能性が高い。
【００５０】
クラスＩＩカットアンドペーストＴＥとも称されるカットアンドペーストＤＮＡトランスポゾンは、典型的に、逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接するトランスポサーゼタンパク質をコードする中央配列を含むＤＮＡ分子で典型的に形成されている。トランスポゾンに言及する場合、「逆方向末端反復配列」という用語は、トランスポサーゼ遺伝子に隣接し、相補的な塩基対形成（互いに塩基対形成できる領域）の能力がある２つの配列のセットを指す。言い換えると、トランスポゾンの逆方向末端反復配列は、第１および第２の配列のセットを形成し、第１の配列は、トランスポサーゼ遺伝子の５’（上流）に局在し、第２の配列は、トランスポサーゼ遺伝子の３’（下流）に局在し、第１および第２の配列は、相補的な塩基対形成の能力がある。
【００５１】
したがって、５’末端から３’末端まで読み取られるカットアンドペーストＤＮＡトランスポゾンの配列であって、センス方向がトランスポサーゼをコードする遺伝子のオープンリーディングフレームによって定義され、ＩＴＲが作動可能に配置されている、つまり、別の配列またはゲノムへのトランスポサーゼ遺伝子の組込みを可能にするように置かれ、方向付けられているカットアンドペーストＤＮＡトランスポゾンの配列は、典型的に、以下で形成される：５’−ＩＴＲ１−トランスポサーゼ遺伝子−ＩＴＲ２−３’。
【００５２】
ここで、ＩＴＲ１およびＩＴＲ２の配列は、相補的な塩基対形成の能力がある。したがって、すべての既知のカットアンドペーストＤＮＡトランスポゾンについて、トランスポゾンの５’または３’のいずれかに局在するＩＴＲの配列および方向のセンスを定義することが可能である。
【００５３】
したがって、本発明の文脈では、「５’ＩＴＲ」という用語は、カットアンドペーストＤＮＡトランスポゾンを指す場合、トランスポサーゼ遺伝子の上流に局在するＩＴＲの配列を指すために使用されることになり、ここで、センス方向がトランスポサーゼをコードする遺伝子のオープンリーディングフレームによって定義され、ＩＴＲが上記で定義されたように作動可能に配置されている。「３’ＩＴＲ」という用語は、カットアンドペーストＤＮＡトランスポゾンを指す場合、トランスポサーゼ遺伝子の下流に局在するＩＴＲの配列を指すために使用されることになり、ここで、センス方向がトランスポサーゼをコードする遺伝子のオープンリーディングフレームによって定義され、ＩＴＲが上記で定義されたように作動可能に配置されている。
【００５４】
本明細書で定義されるように、本発明のベクターは、ＤＮＡトランスポゾンの５’ＩＴＲに由来する、好ましくはそれを含む、またはそれからなる第１の配列およびＤＮＡトランスポゾンの３’ＩＴＲに由来する、好ましくはそれを含む、またはそれからなる第２の配列にある２つの配列のセットであって、第１の配列および第２の配列が互いに対して反対の方向にある、２つの配列のセットを含む。本発明の文脈では、これらの用語は、参照のＤＮＡトランスポゾンの５’ＩＴＲに由来する、好ましくはそれを含む、もしくはそれからなる配列、または３’ＩＴＲに由来する、好ましくはそれを含む、もしくはそれからなる配列のいずれかが、それが由来するトランスポゾンに見られる古典的な配置に対して反対の方向にあることを示すものとして解釈されるべきである。参照のＤＮＡトランスポゾンでは、５’ＩＴＲと３’ＩＴＲは、両方ともセンス方向にあり、ここで、センス方向は、トランスポサーゼをコードする遺伝子のオープンリーディングフレームによって定義されることを考慮すると、本発明のベクターでは、第１または第２の配列の一方はセンス方向にあり、他方はアンチセンス方向にある。
【００５５】
一実施形態では、第１の配列は、センス方向にあり、第２の配列は、アンチセンス方向にある。別の実施形態では、第１の配列は、アンチセンス方向にあり、第２の配列は、センス方向にある。
【００５６】
好ましくは、本発明のベクターの配列は、ＤＮＡトランスポゾンの５’ＩＴＲに由来する、好ましくはそれを含む、またはそれからなる第１の配列およびＤＮＡトランスポゾンの３’ＩＴＲに由来する、好ましくはそれを含む、またはそれからなる第２の配列にある２つの配列のセットであって、第１の配列または第２の配列の一方は、ＤＮＡトランスポゾンからの５’ＩＴＲまたは３’ＩＴＲと同一であり、他方は、ＤＮＡトランスポゾンからの５’ＩＴＲまたは３’ＩＴＲに逆相補的である。一実施形態では、第１の配列は、ＤＮＡトランスポゾンからの５’ＩＴＲと同一であり、第２の配列は、ＤＮＡトランスポゾンからの３’ＩＴＲに逆相補的である。別の実施形態では、第２の配列は、ＤＮＡトランスポゾンからの３’ＩＴＲと同一であり、第１の配列は、ＤＮＡトランスポゾンからの５’ＩＴＲに逆相補的である。
【００５７】
「逆相補」または「逆相補体」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列などのヌクレオチド配列を指す場合、当技術分野で一般的に理解されているように解釈されるべきである。参照のヌクレオチド配列の逆相補体は、文字を逆にし、ＡとＴを交換し、ＣとＧを交換することによって決定され得る。例えば、ＡＣＣＴＧＡＧの逆相補体は、ＣＴＣＡＧＧＴであり、どちらもそれらの５’末端から３’末端まで読み取られる。
【００５８】
好ましくは、本発明のベクターでは、２つの配列のセットの第１の配列は、カットアンドペーストＤＮＡトランスポゾンの５’ＩＴＲに由来し、２つの配列のセットの第２の配列は、カットアンドペーストＤＮＡトランスポゾンの３’ＩＴＲに由来する。より好ましくは、本発明のベクターでは、２つの配列のセットの第１の配列は、ＤＮＡトランスポゾン、有利には、カットアンドペーストＤＮＡトランスポゾンの５’ＩＴＲを含むか、またはそれからなり、２つの配列のセットの第２の配列は、ＤＮＡトランスポゾン、有利には、カットアンドペーストＤＮＡトランスポゾンの３’ＩＴＲを含むか、またはそれからなる。示されるように、本発明のベクターでは、配列の一方は、プロモータの配列に対してセンス方向にあり、他方は、アンチセンス方向にある。
【００５９】
カットアンドペースト真核生物ＤＮＡトランスポゾンのいくつかのスーパーファミリーが記載されており、これは、Ｔｃｌ／ｍａｒｉｎｅｒファミリー、ｈＡＴファミリーＰエレメント、ＭｕＤＲ／Ｆｏｌｄｂａｃｋ、ＣＡＣＴＡ、ＰｉｇｇｙＢａｃ、ＰＩＦ／Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ、Ｍｅｒｌｉｎ、Ｔｒａｎｓｉｂ、およびＢａｎｓｈｅｅを含む。本発明のベクターに適切なＤＮＡトランスポゾンからのＩＴＲは、Ｃ．エレガンスからのＴｃ１およびＴｃ３を含めた、Ｔｃｌ／ｍａｒｉｎｅｒトランスポゾンからのＩＴＲ、カスリショウジョウバエからのＭｉｎｏｓ、モーリシャスショウジョウバエからのＭｏｓ１、ヨーロッパクギヌキハサミムシ（フォルフィクラ・アウリクラリア）のＦａｍａｒ１、イネ（オリザ・サティバ）からのＯｓｍａｒ５、真菌フサリウム・オキシスポラムからのＦｏｉ１およびＩｍｐａｌａ、細菌において単離されたＩＳＹ１００、ならびにアリメッサー・ボウビエリのＭｂｏｕｍａｒ−９を含むが、これらに限定されない。加えて、非アクティブなエレメントから再構築されたＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒトランスポゾンからのＩＴＲ：サケ型の魚からのＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、ノサシバエ（ヘマトビア・イリタンス）からのＨｉｍａｒｌ、Ｈ．サピエンスからのＳＥＴＭＡＲ遺伝子に組み込まれたカエルＲａｎａ  ｐｉｐｉｅｎｓおよびＨｓｍａｒｌからのＦｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ、Ｔｏｌ１、Ｔｏｌ２、およびＡｃ／Ｄｓトランスポゾンを含めた、ｈＡＴトランスポゾンからのＩＴＲ、ＭｕＤＲ／ＦｏｌｄｂａｃｋトランスポゾンからのＩＴＲ、ＣＡＣＴＡトランスポゾンからのＩＴＲ、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンからのＩＴＲ、ＰＩＦ／ＨａｒｂｉｎｇｅｒトランスポゾンからのＩＴＲ、ＭｅｒｌｉｎトランスポゾンからのＩＴＲ、ＴｒａｎｓｉｂトランスポゾンからのＩＴＲ、ＢａｎｓｈｅｅトランスポゾンからのＩＴＲ。
【００６０】
好ましくは、本発明のベクターでは、２つの配列のセットの第１の配列は、好ましくは、ｐｉｇｇｙＢａｃ、Ｔｏｌ２、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン、さらに好ましくはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンからなるリストから選択されるＤＮＡトランスポゾンからの５’ＩＴＲに由来する、さらに好ましくは、それを含む、またはそれからなり、２つの配列のセットの第２の配列は、好ましくは、ｐｉｇｇｙＢａｃ、Ｔｏｌ２、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン、さらに好ましくはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンからなるリストから選択されるＤＮＡトランスポゾンからの３’ＩＴＲに由来する、さらに好ましくは、それを含む、またはそれからなる。
【００６１】
本発明の文脈では、「ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン」という用語は、Ｃａｒｙら，１９８９に記載されているｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン、およびそれらに由来するトランスポゾンを指す。ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンおよびそれに由来するトランスポゾンからの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの配列は、当技術分野でよく知られている。例えば、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンからの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの配列は、Ｃａｒｙら，１９８９、Ｆｒａｓｅｒら，１９９５、およびＦｒａｓｅｒら，１９９６に記載されており、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンに由来する５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの配列は、Ｆａｃｏｓｔｅら（２００９）に記載されている。
【００６２】
好ましくは、本発明の文脈では、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンからの５’ＩＴＲに由来する配列は、配列番号１を含むか、またはそれからなる。
ＴＴＡＡＣＣＣＴＡＧＡＡＡＧＡＴＡＧＴＣＴＧＣＧＴＡＡＡＡＴＴＧＡＣＧＣＡＴＧＣＡＴ
【００６３】
さらに好ましくは、本発明の文脈では、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンからの５’ＩＴＲに由来する配列は、配列番号２を含むか、またはそれからなる。
ＴＴＡＡＣＣＣＴＡＧＡＡＡＧＡＴＡＧＴＣＴＧＣＧＴＡＡＡＡＴＴＧＡＣＧＣＡＴＧ
【００６４】
好ましくは、本発明の文脈では、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンからの３’ＩＴＲに由来する配列は、配列番号３を含むか、またはそれからなる。
ＴＴＡＡＣＣＣＴＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＴＣＡＴＡＴＴＧＴＧＡＣＧＴＡＣＧＴＴＡＡＡＧＡＴＡＡＴＣＡＴＧＣＧＴＡＡＡＡＴＴＧＡＣＧＣＡＴＧ
【００６５】
有利には、本発明のベクターでは、２つの配列のセットの第１の配列は、好ましくは、配列番号１または配列番号２に由来する、好ましくは、それを含む、またはそれからなり、第２の配列は、好ましくは、配列番号３に由来する、好ましくは、それを含む、またはそれからなる。上記の脊椎動物種で活性のある通常のトランスポゾンのうち、ｐｉｇｇｙＢａｃは、より高いトランスポサーゼ活性およびより大きなカーゴ容量を有する。さらに、ｐｉｇｇｙＢａｃは、カットアンドペースト転位中にＤＮＡ合成をバイパスし、ドナー部位と標的部位の両方で無傷の二重鎖ＤＮＡの正確な切除および再生を可能にすることが知られている。より好ましくは、本発明のベクターでは、２つの配列のセットの第１の配列は、好ましくは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの５’ＩＴＲに由来する、好ましくはそれを含む、またはそれからなり、第２の配列は、好ましくは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの３’ＩＴＲに由来する、好ましくはそれを含む、またはそれからなる。
【００６６】
好ましい実施形態では、本発明の組換えベクターは、
ａ）プロモータと、
ｂ）目的の遺伝子（ＧＯＩ）と、
ｃ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの５’ＩＴＲに由来する、好ましくは、それを含む、またはそれからなる第１の配列およびｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの３’ＩＴＲに由来する、好ましくは、それを含む、またはそれからなる第２の配列にある２つの配列のセットであって、配列が互いに対して反対の方向にある、２つの配列のセットと
を含み、
−目的の遺伝子の配列の少なくとも一部が、プロモータの配列に対してアンチセンス方向にあり、
−ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの５’ＩＴＲに由来する、好ましくは、それを含む、またはそれからなるセットの配列がプロモータの方向に対してセンス方向でプロモータ配列の下流に局在し、プロモータの配列に対してアンチセンス方向にある目的の遺伝子の配列の少なくとも一部からプロモータを分離する。
【００６７】
さらに最も好ましい実施形態では、本発明の組換えベクターは、
ａ）プロモータと、
ｂ）目的の遺伝子（ＧＯＩ）と、
ｃ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの５’ＩＴＲに由来する、好ましくは、それを含む、またはそれからなる第１の配列およびｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの３’ＩＴＲに由来する、好ましくは、それを含む、またはそれからなる第２の配列にある２つの配列のセットであって、配列が互いに対して反対の方向にある、２つの配列のセットと
を含み、
−目的の遺伝子の配列が、目的の遺伝子の５’末端部分および目的の遺伝子の３’末端部分にある２つのフラグメントの形で本発明の組換えベクターに存在し、
−目的の遺伝子の配列の３’末端部分が、プロモータの配列に対してアンチセンス方向にあり、
−目的の遺伝子の配列の５’末端部分が、プロモータ配列の下流に、プロモータの方向に対してセンス方向で局在しており、
−セットの２つの配列の１つが、プロモータと目的の遺伝子の配列の３’末端の間に位置している。
【００６８】
好ましい実施形態では、本発明の組換えベクターは、
ａ）プロモータと、
ｂ）目的の遺伝子（ＧＯＩ）と、
ｃ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの５’ＩＴＲに由来する、好ましくは、それを含む、またはそれからなる第１の配列およびｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの３’ＩＴＲに由来する、好ましくは、それを含む、またはそれからなる第２の配列にある２つの配列のセットであって、配列が互いに対して反対の方向にある、２つの配列のセットと
を含み、
−目的の遺伝子の配列が、目的の遺伝子の５’末端部分および目的の遺伝子の３’末端部分にある２つのフラグメントの形で本発明の組換えベクターに存在し、
−目的の遺伝子の配列の３’末端部分が、プロモータの配列に対してアンチセンス方向にあり、
−目的の遺伝子の配列の５’末端部分が、プロモータ配列の下流に局在しており、プロモータの方向に対してセンス方向にあり、
−ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの５’ＩＴＲに由来する、好ましくは、それを含む、またはそれからなるセットの配列が、プロモータ配列の下流に局在し、プロモータの方向に対してセンス方向にあり、目的の遺伝子の配列の３’末端からプロモータを分離する。
【００６９】
当技術分野でよく知られており、上記で説明したように、トランスポゾン系は、遺伝子組換えを誘発するためにトランスポサーゼ酵素の存在を必要とする。「トランスポサーゼ」とは、本明細書では、少なくとも１つのトランスポゾンのＩＴＲ配列に特異的に結合し、カットアンドペースト機構を触媒して、別のゲノムへのトランスポゾンの切除および組込みを可能にする酵素を指す。
【００７０】
好ましくは、本発明のベクターは、トランスポサーゼをコードする配列をさらに含む。より好ましくは、トランスポサーゼをコードする配列は、プロモータの制御下にある。本実施形態では、トランスポサーゼをコードする配列は、プロモータの下流に局在しており、そのオープンリーディングフレームは、プロモータの方向と同じ方向にあることを理解されたい。好ましくは、プロモータとトランスポサーゼの遺伝子とは、本明細書で定義されるセットの配列の１つによって分離される。トランスポサーゼをコードする配列は、任意の既知のトランスポサーゼ遺伝子またはそれらのそれぞれのｃＤＮＡから選択され得る。好ましいトランスポサーゼは、本明細書で列挙されているトランスポゾンによってコードされるものである。
【００７１】
参照のトランスポサーゼの機能的変異体は、そのペプチド配列が、参照の配列の１つまたは複数の位置でのアミノ酸残基の挿入、置換、および／または欠失によって参照のトランスポサーゼの配列に由来し、同じＩＴＲに特異的に結合する能力を保持しているペプチドを包含する。特に興味深いのは、その配列が保存的置換を含有する、つまり、参照の配列のアミノ酸残基が、同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基に対して置換されており、したがって、分子の機能的特性を変化させない機能的変異体である。同様の特性を有するアミノ酸は、当技術分野でよく知られている。例えば、アルギニン、ヒスチジン、およびリジンは、親水性塩基性アミノ酸であり、交換可能であり得る。同様に、疎水性アミノ酸であるイソロイシンは、ロイシン、メチオニン、またはバリンで置き換えられ得る。互いに置換され得る中性の親水性アミノ酸は、アスパラギン、グルタミン、セリン、およびスレオニンを含む。好ましくは、トランスポサーゼの機能的変異体は、その配列が１つまたは複数の保存的置換によって参照の配列に由来するペプチドである。さらに好ましくは、参照のトランスポサーゼの機能的変異体は、参照の配列と少なくとも８０、８５、９０、または９５％の同一性を有する配列を有する。好ましい実施形態では、参照のトランスポサーゼの機能的変異体は、参照の配列と少なくとも８０、８５、９０、または９５％の同一性を有する配列を有し、その配列が保存的置換によって参照の配列に由来するペプチドである。
【００７２】
本発明の意味では、核酸またはアミノ酸の２つの配列間の「パーセンテージ同一性」または「％同一性」は、最適な整列後に得られる、比較される２つの配列間の同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージを意味し、このパーセンテージは、純粋に統計的であり、２つの配列間の差異は、それらの全長に沿ってランダムに分布している。２つの核酸またはアミノ酸配列の比較は、伝統的に、それらを最適に整列させた後に配列を比較することによって行われ、比較は、セグメントごとに、または「整列ウィンドウ」を使用することによって行われ得る。比較のための配列の最適な整列は、手動での比較に加えて、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのローカルホモロジーアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）の類似性検索方法、またはこれらのアルゴリズムを使用するコンピューターソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、または比較ソフトウェアＢＥＡＳＴＮＲもしくはＢＥＡＳＴＰによる）によって行われ得る。２つの核酸またはアミノ酸配列間のパーセンテージ同一性は、２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、比較する核酸またはアミノ酸配列は、２つの配列間の最適な整列のための参照配列に対して付加または欠失を有し得る。パーセンテージ同一性は、アミノ酸またはヌクレオチド残基が２つの配列間、好ましくは、２つの全配列間で同一である位置の数を決定し、同一の位置の数を整列ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて、２つの配列間のパーセンテージ同一性を得ることによって計算される。
【００７３】
トランスポサーゼは、ＩＴＲの各セットへの異なる親和性を有し得る。典型的に、トランスポゾンベースの遺伝子組換え系では、ベクターで使用されるＩＴＲ由来の配列を認識する、つまり、これに特異的に結合するトランスポサーゼを使用することが好ましい。これは、トランスポゾンと同じトランスポゾンファミリー、特に、本明細書で定義される２つの配列のセットが由来するＩＴＲ配列に由来するトランスポサーゼを選択することによって達成され得る。
【００７４】
好ましくは、本発明のベクターは、本発明のベクターに含まれる２つの配列のセットが由来するＩＴＲ配列に特異的なトランスポサーゼをコードする配列を含む。本発明の文脈では、トランスポサーゼは、ＩＴＲ配列に特異的に結合し、転位を誘導する能力がある場合、ＩＴＲ配列に特異的である。
【００７５】
有利には、本発明のベクターでは、本明細書で定義される２つの配列のセットの第１の配列は、ＤＮＡトランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃからの５’ＩＴＲに由来する、さらに好ましくは、それを含む、またはそれからなり、本明細書で定義される２つの配列のセットの第２の配列は、ＤＮＡトランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃからの３’ＩＴＲに由来する、さらに好ましくは、それを含む、またはそれからなり、本発明のベクターは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼをコードし、さらに好ましくはプロモータの制御下にある配列を含む。有利には、本発明のベクターでは、本明細書で定義される２つの配列のセットの第１の配列は、ＤＮＡトランスポゾンＴｏｌ２からの５’ＩＴＲに由来する、さらに好ましくは、それを含む、またはそれからなり、本明細書で定義される２つの配列のセットの第２の配列は、ＤＮＡトランスポゾンＴｏｌ２からの３’ＩＴＲに由来する、さらに好ましくは、それを含む、またはそれからなり、本発明のベクターは、Ｔｏｌ２トランスポサーゼをコードし、さらに好ましくはプロモータの制御下にある配列を含む。有利には、本発明のベクターでは、本明細書で定義される２つの配列のセットの第１の配列は、ＤＮＡトランスポゾンＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙからの５’ＩＴＲに由来する、さらに好ましくは、それを含む、またはそれからなり、本明細書で定義される２つの配列のセットの第２の配列は、ＤＮＡトランスポゾンＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙからの３’ＩＴＲに由来する、さらに好ましくは、それを含む、またはそれからなり、本発明のベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポサーゼをコードし、さらに好ましくはプロモータの制御下にある配列を含む。
【００７６】
古典的なｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンなどのｐｉｇｇｙＢａｃ系に基づくベクターでは、トランスポサーゼの作用は、ｐｉｇｇｙＢａｃベースのベクター自体のエピソーム形（Ｗａｎｇら，２０１４）、またはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼをコードするベクターへの望ましくない自動または相互組込みにつながり得る。エピソーム間組込みの可能性を減らし、したがってゲノム組込みを支持するために、本明細書で定義される２つの配列のセットの第１の配列は、ＤＮＡトランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃからの５’ＩＴＲに由来する、さらに好ましくは、それを含む、またはそれからなり、本明細書で定義される２つの配列のセットの第２の配列は、ＤＮＡトランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃからの３’ＩＴＲに由来する、さらに好ましくは、それを含む、またはそれからなる実施形態では、本発明の組換えベクターは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの端にあるものを除いて、ＴＴＡＡ部位を含有しない。言い換えれば、実施形態では、好ましくは、本発明の組換えベクターは、その配列中に２回を超える配列ＴＴＡＡを含有しない。当業者が、古典的ベクター骨格を使用して、本発明の組換えベクターを作製する場合、上記の実施形態は、細菌で複製するベクターの能力または宿主細胞での機能などのベクターの機能性に影響を及ぼさない方法で古典的骨格ベクターのＴまたはＡ残基を置換することによって容易に得られ得る。
【００７７】
本発明の組換えベクターは、分子生物学の確立された方法および技術を使用して作製され得る。これらの方法および技術は、当技術分野でよく知られており、例えば、当業者が参照し得る、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｂｙ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒ．Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００２）およびＧｉｂｓｏｎら（２００９）の記事で詳述されている。
【００７８】
本発明の方法の実施を促進にするために、発明者らは、適切な方向での本発明による組込み配列のセット、ならびにエンドユーザー、すなわち、当業者がＧＯＩおよび選択したプロモータを容易に組み込むことができるマルチクローニング部位を既に含む空の組換えベクターをさらに開発した。本発明の文脈では、「空の組換えベクター」という用語は、本明細書で定義される目的の遺伝子を含まないが、レポーター遺伝子、および／または本明細書で定義される選択マーカをコードする遺伝子を含み得るベクターを指す。
【００７９】
したがって、本発明はさらに、好ましくは本発明の組換えベクターを作製するために使用される空の組換えベクターであって、
ａ）第１のマルチクローニング部位と、
ｂ）第２のマルチクローニング部位と、
ｃ）ＤＮＡトランスポゾンの５’ＩＴＲに由来する、好ましくはそれを含む、またはそれからなる第１の配列およびＤＮＡトランスポゾンの３’ＩＴＲに由来する、好ましくはそれを含むかまたはそれからなる第２の配列からなる２つの配列のセットであって、配列が互いに対して反対の方向にある、２つの配列のセットと
を含み、
セットの２つの配列のうちの１つが第１のマルチクローニング部位と第２のマルチクローニング部位の間に位置している、空の組換えベクターに関する。
【００８０】
好ましくは、本発明の空の組換えベクターは、本明細書で定義されるプロモータを含む。好ましくは、本発明の空の組換えベクターは、レポーター遺伝子、および／または本明細書で定義される選択マーカをコードする遺伝子を少なくとも含み、遺伝子のオープンリーディングフレームは、同じ方向にある。好ましい実施形態では、空の組換えベクターは、プロモータと、少なくともレポーター遺伝子、選択マーカをコードする遺伝子またはタンパク質タグをコードする遺伝子とを含み、ゲノムへのポリヌクレオチド配列の組込みを誘導する能力がある２つの配列のうちの１つが、プロモータとレポーター遺伝子、選択マーカをコードする遺伝子および／またはタンパク質タグをコードする遺伝子の間に位置しており、遺伝子のオープンリーディングフレームが、プロモータの方向に対してアンチセンス方向にある。
【００８１】
本発明の組換えベクター、および本明細書で定義される空の組換えベクターは、分子生物学の意図、および治療的用途に使用され得、これについては後で詳述する。この文脈では、これらのベクターは、それらの意図された使用に適切な組成物中で製剤化され得る。
【００８２】
本発明はさらに、本発明の空の組換えベクターまたは組換えベクターと、薬学的に許容される担体とを含む組成物に関する。
【００８３】
本発明はさらに、本発明の空の組換えベクターまたは組換えベクターと、トランスポサーゼ酵素とを含むキットに関する。トランスポサーゼ酵素は、タンパク質として、またはトランスポサーゼ発現ベクターの形で提供され得る。
【００８４】
本発明の文脈では、トランスポサーゼ発現ベクターは、トランスポサーゼをコードし、その発現を可能にする配列を含むベクターである。有利には、本発明のトランスポサーゼ発現ベクターは、プロモータの制御下でトランスポサーゼをコードし、好ましくは、ポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されている配列を含む。
【００８５】
本発明はさらに、宿主細胞のゲノムへの目的の遺伝子をコードする配列の組込みのための、上記に開示された組換えベクター、それを含む組成物またはキットの使用に関する。
【００８６】
好ましくは、遺伝子組換えに使用される場合、本発明のベクターは、トランスポサーゼをコードする配列を含む。代わりに、宿主のゲノムへの目的の遺伝子の遺伝子導入を達成するために、本発明の組換えベクターは、上記で定義されたように、トランスポサーゼ発現ベクターと組み合わせて使用される。
【００８７】
上に示したように、上で開示した第１の実施形態による本発明のベクターは、宿主細胞に導入されると、好ましくは本発明のベクターに適合されたトランスポサーゼが宿主細胞に存在するのであれば、宿主細胞のゲノムへの目的の遺伝子の効率的な導入を可能にする。
【００８８】
既に示したように、トランスポサーゼは、プロモータの制御下で本発明のベクターに含まれるそれをコードする、好ましくはポリアデニル化シグナルに作動可能に連結された配列として提供され得る。あるいは、トランスポサーゼは、トランスポサーゼ発現ベクターの形で提供され得る。
【００８９】
本発明はさらに、宿主細胞のゲノムへの目的の遺伝子の組込みのための方法に関し、方法は、以下のステップを含む。
ａ）宿主細胞への本発明による組換えベクターのトランスフェクション、
ｂ）任意選択で、宿主細胞へのトランスポサーゼ酵素のトランスフェクション。
【００９０】
本明細書で教示されるように、本発明のベクターは、好ましくは、さらに好ましくはプロモータの制御下でトランスポサーゼをコードし、ポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されている配列を含む。代わりに、宿主のゲノムへの目的の遺伝子の遺伝子導入を達成するために、本発明の組換えベクターは、上記で定義されたように、タンパク質として、またはトランスポサーゼ発現ベクターの形で提供され得るトランスポサーゼ酵素と組み合わせて使用される。
【００９１】
組換えベクターは、例えば、化学物質ベースのトランスフェクション（例えば、シクロデキストリン、ポリマー、リポソーム、またはナノ粒子を使用する）、エレクトロポレーション、細胞スクイージング、マイクロインジェクション、またはソノポレーションなどの細胞生物学で知られている通常の技術のいずれかを使用して、最上の宿主細胞にトランスフェクトされ得る。
【００９２】
本発明の文脈では、宿主細胞は、好ましくは真核細胞、さらに好ましくは哺乳動物細胞である。
【００９３】
したがって、本発明の方法は、本発明の組換えベクターを含む組換え宿主細胞の産出を可能にする。
【００９４】
本発明はさらに、好ましくは、上記で定義されたプロモータおよび目的の遺伝子が宿主細胞のゲノムに組み込まれている、上で詳述した目的の遺伝子の組込みのための方法によって得られやすい組換え宿主細胞に関する。そのような組換え宿主細胞は、目的の遺伝子の産物を発現するそれらの能力に基づいて容易に同定かつ／または選択され得る。
【００９５】
加えて、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系が配列ＴＴＡＡを含むＤＮＡ組込み部位の特異性を有することはよく知られている。本明細書で考察するＤＮＡトランスポゾン組込みに関与する分子機構のため、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系を使用して行われる遺伝子組換えは、通常、ゲノム内でこの標的配列（ＴＴＡＡ）の重複をもたらし、ＴＴＡＡ配列のそれぞれは、導入遺伝子に隣接し、これは、ｐｉｇｇｙＢａｃ  ＩＴＲ配列の存在と一緒に、典型的な「ｐｉｇｇｙＢａｃフットプリント」と見なされ得る。しかしながら、本発明のベクターは、そのエレメント（プロモータ、目的の遺伝子、およびＤＮＡトランスポゾンからのＩＴＲ配列に由来する、好ましくは、ＤＮＡトランスポゾンを含むかまたはそれからなる配列のセット）の非常に異なる配置に依存するため、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの５’および３’ＩＴＲに由来する２つの配列のセットを含む本発明による組換えベクターを使用して得られた組換え宿主細胞は、それらのゲノムにおいて、異なる特異的なフットプリントを有する。このフットプリントは、プロモータの配列と目的の遺伝子の配列との間に、組換え宿主細胞のゲノムに局在するＴＴＡＡモチーフの存在として定義され得、プロモータおよび目的の遺伝子には、さらに好ましくは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの５’および３’ＩＴＲに由来する配列が隣接している。
【００９６】
したがって、組換え宿主細胞が、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの５’ＩＴＲに由来する、好ましくは、それを含む、またはそれからなる第１の配列およびｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの３’ＩＴＲに由来する、好ましくは、それを含む、またはそれからなる第２の配列にある２つの配列のセットを含む本発明による組換えベクターを使用して得られる実施形態では、宿主細胞は、好ましくは、それらのゲノムにおいて、プロモータの配列と目的の遺伝子の配列との間に局在するＴＴＡＡモチーフを含み、プロモータおよび目的の遺伝子には、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの５’および３’ＩＴＲに由来する配列が有利に隣接している。
【００９７】
本発明はさらに、医薬としての使用のための本発明の組換えベクター、もしくはそれを含む医薬組成物、および／または上記で定義された組換え宿主細胞に関する。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】ｐｉｇｇｙＢａｃ系に基づく転位依存性発現を可能にするＰＢ−ＩＤ転写スイッチの原理および検証を示す図である。  Ａ：古典的なトランスポゾンベクター（ＰＢＣＡＧ：：ＲＦＰ、左）、およびｐｉｇｇｙＢａｃ転位系（ＰＢ−ＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰ、右）に基づくＧＯＩの転位依存性転写を可能にする導入遺伝子構成。Ｂ：トランスフェクションの３日後に落射蛍光イメージング（上）およびＦＡＣＳ分析（下）によって分析された、ＨＥＫ−２９３細胞におけるインビトロでの検証。グラフは、トランスフェクトされた細胞と非蛍光プラスミドでトランスフェクトされたコントロール細胞を比較している。ＲＦＰは、ＰＢａｓｅの存在下でＰＢ−ＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰベクターからのみ発現されるが、それは、古典的な転移性ベクターのエピソーム形では活性がある。Ｃ：エピソーム、トランスポゾンベース、およびＰＢ−ＩＤベクターのトランスフェクション後のＨＥＫ−２９３細胞における蛍光タンパク質発現の経時的分析。Ｄ：ニワトリ胚脊髄におけるＰＢ−ＩＤスイッチのインビボでの検証（Ｅ２でのエレクトロポレーション、全載脊髄標本におけるＥ６での分析）。エピソームベクター（ＣＡＧ：：Ｃｅｒｕｌｅａｎ）は、エレクトロポレーションの直後に生まれた単離されたニューロンに見出されるが、ＰＢ−ＩＤベクターは、心室表面から移動するニューロンの放射状クローンを標識する。
【図２】転位依存性ＧＯＩ発現のための導入遺伝子構成を示す図である。  Ａ：ｐｉｇｇｙＢａｃ  ＩＴＲ、プロモータ、およびＧＯＩの相対的な配置および方向に応じて、４つの別個のＰＢ−ＩＤ構成（ＰＢ−ＩＤ  １Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ）が予想され得る。Ｂ１およびＢ２：ＨＥＫ−２９３細胞における３つのＰＢ−ＩＤ構成を有するＰＢａｓｅ依存性発現の検証（トランスフェクションの３日後の落射蛍光イメージング）。
【図３】デフォルトでＰＢａｓｅを発現し、ゲノム組込み時にＧＯＩのものに切り替えるオールインワンＰＢ−ＩＤベクターを示す図である。  Ａ：ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼ（ＰＢａｓｅ）が最初にエピソームＩＤベクターによって発現され、転位時に発現がＧＯＩのものに切り替わる「オールインワン」ＰＢ−ＩＤベクターの構成（ＰＢ−ＩＤＣＡＧ：：ＰＢａｓｅ∞ＲＦＰ）。Ｂ：ＨＥＫ−２９３細胞における検証（トランスフェクションの３日後の落射蛍光イメージングおよびＦＡＣＳ分析）。
【図４】３つの別個の蛍光タンパク質の発現を駆動するＰＢ−ＩＤ翻訳スイッチおよびベクターの原理を示す図である。  Ａ：最初にブロックされるＥＧＦＰ、ｍＲＦＰ１、またはＩＲＦＰ６７０の完全な翻訳が、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼによって媒介されるゲノム組込みによって活性化されるＰＢ−ＩＤベクターの構成（ＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＥＧＦＰ、ＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰ、ＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＩＲＦＰ）。Ｂ１およびＢ２：ＨＥＫ−２９３細胞における検証。落射蛍光イメージングおよびＣ：ＰＢａｓｅの非存在下でのＰＢ−ＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰ（左）対ＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰ（右）のトランスフェクションの３日後のＦＡＣＳ分析。
【図５】ＰＢ−ＩＤ翻訳スイッチでの転位依存性Ｃｒｅ組換えを示す図である。  Ａ：最初にブロックされるＣｒｅの完全な翻訳が、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼによって媒介されるゲノム組込みによって活性化されるＰＢ−ＩＤベクターの構成（ＰＢ−ｚＩＤＣＭＶ∞Ｃｒｅ）。  Ｂ１およびＢ２：Ｃｒｅアクション時にＲＦＰからＹＦＰ発現に切り替わるｌｏｘＰが導入されたレポーター導入遺伝子（ＣＡＧ：：ｌｏｘＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｌｏｘＰ−ＥＹＦＰ）を安定して発現するＨＥＫ−２９３細胞における検証（上）。落射蛍光画像をＰＢａｓｅの存在下（左）または非存在下（右）で３つのベクターのトランスフェクション３日後に取得した。抗ＦＬＡＧ抗体による免疫染色により、ＰＢａｓｅ依存的にＣｒｅの発現が確認される（下）。
【図６】自殺的自動組込みを防ぐために修飾されたＰＢ−ＩＤベクターを示す図である。  ＨＥＫ−２９３細胞における検証。通常（左）および修飾ＰＢ−ＩＤベクター（右）をＨＥＫ−２９３細胞にトランスフェクトした。修飾ベクター（ＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰ）では、ＴＴＡＡ部位が、ＴＲ部位を除いて、別のコピーへのベクターの１つのコピーのＰＢａｓｅ媒介自殺的組込み（自動組込み）を防ぐために変異されている。修飾ベクターは、ＰＢａｓｅの存在下で効率的なＲＦＰ発現を駆動する。
【図７】ＰＢ−ＩＤスイッチによる細胞表現型の実験的操作を示す図である。  Ａ１〜Ａ３。ニワトリ胚脊髄でのエレクトロポレーションの３日後のＲＦＰ（ＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰ−２Ａ−ＮＩＣＤ）とともにＮｏｔｃｈ細胞内受容体（ＮＩＣＤ）を共発現するＰＢ−ＩＤベクターの効果。コントロール状況（動揺の欠如、右）と比較して、神経発生の強力かつ持続的な阻害が観察される（左）。ＮＩＣＤを一過的に発現するベクターは、あまり目立たない効果を示す（中央）。Ｂ：同じ表現型が、ＰＢａｓｅの存在下でＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰ−２Ａ−ＮＩＣＤおよびＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＥＧＦＰを用いたエレクトロポレーションの６日後に背側ニワトリ脊髄で観察される。
【図８】ＧＯＩの発現が目的の調節配列によって制御されているＰＢ−ＩＤベクターを示す図である。  Ａ：網膜ニューロンのサブセットでアクティブな、Ａｔｏｈ７プロモータの制御下でＲＦＰを発現するＰＢ−ｚＩＤＡｔｏｈ７∞ＲＦＰベクターのエレクトロポレーションの５日後のＥ６ニワトリ胚の網膜全体の図。網膜神経節細胞における導入遺伝子発現の予想される制限が観察される。Ｂ：同様のパターンが、「ｌｏｘＰが導入された」多色レポーター導入遺伝子（核、細胞質および膜結合のＢｒａｉｎｂｏｗ導入遺伝子、Ｌｏｕｌｉｅｒら，２０１４）を伴うＰＢ−ｚＩＤＡｔｏｈ７∞Ｃｒｅベクターのエレクトロポレーションで観察される。
【図９】ＰＢ−ＩＤで１つまたは複数の導入遺伝子を発現する細胞株の迅速な選択を示す図である。  Ａ：インビトロで安定的にトランスフェクトされた細胞株を確立するための古典的なプロトコルとＰＢ−ＩＤベースのプロトコルの比較（上）。トランスフェクションの２日後にＰＢ−ＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰベクターまたは古典的トランスポゾンベクター（ＰＢＣＡＧ：：ＲＦＰ）からＲＦＰを発現する細胞を選別すると、最初のケースでＲＦＰ＋クローンの収量が高くなる（下）。Ｂ：ＰＢ−ＩＤスイッチを使用した、ＲＦＰ、ＧＦＰ、ＩＲＦＰを高収率で共発現するトリプルトランスジェニック細胞株の樹立。
【図１０】ＰＢ−ＩＤベクターを用いた細胞系統追跡およびクローン分析を示す図である。  Ａ：マウス大脳皮質におけるＰＢ−ＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰベクターの胚エレクトロポレーションは、心室表面から放射状に移動するニューロンのＥ１８．５ストリームで産出し、一方、エピソームプラスミド（ＣＡＧ：：ＧＦＰ）は、エレクトロポレーションの直後に生まれた細胞のみを標識する（左）。Ｐ１０では、星状細胞もＰＢ−ＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰベクターで標識されているが、ＣＡＧ：：ＧＦＰプラスミドでは標識されておらず、ＰＢ−ＩＤベクターの長期的な組込みと発現を実証している。Ｂ、Ｃ：ＰＢ−ＩＤベクターを用いた多色クローン分析。異なるレベルで発現する蛍光タンパク質マーカの組合せは、心室表面から放射状に移動する神経細胞のクローンを同定する。  インビトロで安定的にトランスフェクトされた細胞株を確立するための古典的なプロトコルとＰＢ−ＩＤベースのプロトコルの比較（上）。トランスフェクションの２日後にＰＢ−ＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰベクターまたは古典的トランスポゾンベクター（ＰＢＣＡＧ：：ＲＦＰ）からＲＦＰを発現する細胞を選別すると、最初のケースでＲＦＰ＋クローンの収量が高くなる（下）。
【図１１】培養細胞におけるＰＢ−ＺＩＤベクター発現を示す図である。  Ａ、上：ＧＦＰタンパク質をコードするＰＢ−ｚＩＤベクター（ＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＧＦＰ−Ｋｒａｓ）を発現する細胞を選別した後、８日間および１８日間増殖させたマウス胚性幹（ＥＳ）細胞クローン。トランスフェクションの２日後に選別を行った。左：ＧＦＰ陽性および陰性ＥＳ細胞クローンを示す低倍率の写真。右：クローンのすべての細胞におけるＧＦＰの膜局在を示す陽性クローンのより高い倍率。下：古典的なトランスポゾンベクター（ＰＢＣＡＧ：：ＧＦＰ−Ｋｒａｓ）とＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＧＦＰ−Ｋｒａｓベクターの比較。ＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＧＦＰ−Ｋｒａｓベクターからの細胞の選別は、ＰＢＣＡＧ：：ＧＦＰ−Ｋｒａｓベクターからの細胞と比較してＧＦＰ陽性クローンのより高い収量をもたらす。値およびエラーバーは、平均およびｓ．ｅ．ｍまたは４つの別個の複製（ドット）を表す。ｘ２検定は、２つの状況の間に有意差があることを示した（ｐ＜０．００ｌ）。Ｂ：ＰＢ−ｚＩＤおよびコントロールベクターによるＨＥＫ２９３細胞トランスフェクションの２日後のトリパンブルーアッセイによる細胞生存率の評価。すべての条件で９５％を超える生存が観察される。Ｃ：ＰＢａｓｅの存在下でのＰＢＣＡＧ：：ＲＦＰおよびＰＢ−ＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰでのトランスフェクション後に選別された単一のＲＦＰ陽性細胞から確立された１０日でのクローンの生存（図９Ａに示されている実験からの測定値）。Ｄ：ＰＢａｓｅの存在下および非存在下でのトランスフェクションの３日後のＨｅＬａおよびＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＰＢ−ＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰベクターからのＰＢａｓｅ依存性発現（上：落射蛍光イメージング、下：ＦＡＣＳ分析）。
【図１２】ＰＢ−ＩＤベクターを用いた高効率のマルチプレックス安定トランスフェクションを示す図である。  ４５日間増殖させた３色ＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＦＰベクターでコトランスフェクトされた細胞に由来するヒトｉＰＳ細胞クローンの例。すべての細胞は、３つの蛍光タンパク質ＦＰ（ＧＦＰ、ＲＦＰ、およびＩＲＦＰ）を共発現する。
【図１３】導入遺伝子の概略図である。すべての構築物をｐＵＣ５７−ｍｉｎｉプラスミド骨格にアセンブルした。ＧＯＩおよびプロモータを交換するために利用できる制限部位が示されている。マルチクローニング部位を備えたＰＢ−ＩＤベクターも、様々なＧＯＩのクローニングを促進するために設計した。ｐＡ１、ｐＡ２、ｐＡ３：ｂＧＨ、ウサギベータグロビン、およびＳＶ４０転写ターミネータ。Ｐ：ＰＥＳＴ分解シグナル。
【図１４】Ａ．ＣＡＧプロモータ（ＣＭＶ初期エンハンサー＋ニワトリベータアクチンプロモータ＋ウサギベータグロビンスプライスアクセプター）の制御下でｍＲＦＰの発現を駆動し、ＰＢａｓｅトランスポサーゼによるＣＡＧ：：ＲＦＰカセットの転位を可能にするｐｉｇｇｙＢａｃ系に基づく古典的なトランスポゾンベクターのマップ。Ｂ１およびＢ２：ＰＢ−ＣＡＧ：：ＲＦＰベクターの配列。ｐｉｇｇｙＢａｃ  ５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲには、配列において下線が引かれている。この配列は、以下のエレメントを含有する：ヌクレオチド２８５８〜ヌクレオチド３５２９までの遺伝子ＲＦＰのコード配列、ヌクレオチド４２〜ヌクレオチド７０１までの遺伝子ＡｍｐＲのコード配列、ヌクレオチド１１３３〜ヌクレオチド１５１３までのＣＭＶエンハンサー、ヌクレオチド３７８５〜ヌクレオチド３８５１までのｐｉｇｇｙＢａｃ  ３’ＩＴＲ、ヌクレオチド１０６１〜ヌクレオチド１１０２までのｐｉｇｇｙＢａｃ  ５’ＩＴＲ、およびヌクレオチド１５１６〜ヌクレオチド１７９１までのニワトリのｂ−アクチンプロモータ。
【図１５】Ａ．ＣＡＧプロモータ（ＣＭＶ初期エンハンサー＋ニワトリベータアクチンプロモータ＋ウサギベータグロビンスプライスアクセプター）の制御下でｍＲＦＰのＰＢａｓｅ依存性発現を駆動するＰＢ−ＩＤスイッチに基づくプラスミドベクターのマップ。Ｂ１およびＢ２：ＰＢ−ＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰベクターの配列。ｐｉｇｇｙＢａｃ  ５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲには、配列において下線が引かれている。この配列は、以下のエレメントを含有する：ヌクレオチド２２４１〜ヌクレオチド２３０７までのｐｉｇｇｙＢａｃ  ３’ＩＴＲ、ヌクレオチド２３４３〜ヌクレオチド２８８１までのウサギｂ−グロビンポリＡ、ヌクレオチド２２０２〜ヌクレオチド２２１０までの配列ＫＯＺＡＫ＋ＡＴＧ、ヌクレオチド１１３３〜ヌクレオチド１５１３までのＣＭＶエンハンサー、ヌクレオチド３７０８〜ヌクレオチド４３６７までの遺伝子ＡｍｐＲのコード配列、ヌクレオチド１５３０〜ヌクレオチド２０２０までの遺伝子ＲＦＰのコード配列、ヌクレオチド５１０６〜ヌクレオチド５２２３およびヌクレオチド１〜ヌクレオチド１５８までのニワトリのｂ−アクチンプロモータ、およびヌクレオチド１２２８〜ヌクレオチド１２６９までのｐｉｇｇｙＢａｃ  ５’ＩＴＲ。
【図１６】Ａ．ＣＡＧプロモータ（ＣＭＶ初期エンハンサー＋ニワトリベータアクチンプロモータ＋ウサギベータグロビンスプライスアクセプター）の制御下でｍＲＦＰのＰＢａｓｅ依存性発現を駆動するＰＢ−ｚＩＤスイッチに基づくプラスミドベクターのマップ。Ｂ１およびＢ２：ＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰベクターの配列。ｐｉｇｇｙＢａｃ  ５’ＩＴＲと３’ＩＴＲは、配列で下線が引かれている。この配列は、以下のエレメントを含有する：ヌクレオチド７６８〜ヌクレオチド１０４３までのニワトリβ−アクチンプロモータ、ヌクレオチド３２０６〜ヌクレオチド３７４４までのウサギβ−グロビンポリＡ、ヌクレオチド２４４６〜ヌクレオチド３１０２までの配列「ＡＴＧｌｅｓｓＲＦＰｒｃ」、ヌクレオチド２１１７〜ヌクレオチド２１２５までの配列ＫＯＺＡＫ＋ＡＴＧ、ヌクレオチド２１３６〜ヌクレオチド２１７７までのｐｉｇｇｙＢａｃ  ５’ＩＴＲ、ヌクレオチド３８５〜ヌクレオチド７６５までのＣＭＶエンハンサー、ヌクレオチド４５７４〜ヌクレオチド５２０１までおよびヌクレオチド１〜ヌクレオチド２９までの遺伝子ＡｍｐＲのコード配列、およびヌクレオチド３１０４〜ヌクレオチド３１７０までのｐｉｇｇｙＢａｃ  ３’ＩＴＲ。  特に指定のない限り、ベクターを示す図では、−ＩＴＲは、頭がトランスポサーゼ切断部位を指す矢印で示されており、−プロモータは、矢印が上にある長方形で示され、矢印は、プロモータの配列のセンスで向けられており、−目的の遺伝子（ＧＯＩ）は矢印で示され、矢印は、オープンリーディングフレームのセンスで向けられている。
【実施例】
【００９９】
Ａ．材料および方法
培養細胞。ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３Ｔ）、ＨｅＬａおよび３Ｔ３細胞をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中の１０％ウシ胎児血清中で培養した。ヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ株ＷＴＳＩｉ００８−Ａ、ＥＢｉＳＣ、ＵＫ）を、Ｇｅｌｔｒｅｘコーティング（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上のＥ８培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養し、ＥＤＴＡで継代した。マウスＥＳ細胞（Ｃ５７ＢＬ／６×１２９／Ｓｖ、株ＫＨ２）（Ｂｅａｒｄら，２００６）を、初代胚性線維芽細胞フィーダ細胞上で培養した。
【０１００】
マウス。スイス系統の雌（Ｊａｎｖｉｅｒ  ｌａｂｓ）を、餌を自由に摂取できる、１２時間の明期／ｌ２時間の暗期のサイクルで収容し、動物手順を、施設のガイドラインに従って実施した。動物プロトコルは、チャールズダーウィン動物実験倫理委員会（ＣＥＥＡＣＤ／Ｎ°５）によって承認された。膣栓の日付を、胚の日（Ｅ）０．５として記録し、生年月日を、出生後日数（Ｐ）０として記録した。
【０１０１】
ニワトリ胚。ＪＡ５７ニワトリの受精卵は、ＥＡＲＬ  Ｍｏｒｉｚｅａｕ（８  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｍｏｕｌｉｎ、２８１９０  Ｄａｎｇｅｒｓ、Ｆｒａｎｃｅ）から提供され、ＦＩＥＭインキュベーター（イタリア）内で適切な時間３８°Ｃでインキュベートした。
【０１０２】
ＤＮＡ構築物。ＰＢ−ＩＤスイッチに基づくプラスミドベクターは、無差別にＰＢ−ＩＤベクターまたはｉｏｎベクターと呼ばれる。ＰＢ−ｚＩＤスイッチに基づくプラスミドベクターは、無差別にＰＢ−ｚＩＤベクターまたはｚｉｏｎベクターと呼ばれる。
【０１０３】
この研究のために設計されたプラスミドの図式化されたマップは、図１３〜１６に見出され得る。導入遺伝子アセンブリは、ＤＮＡ合成（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｉｎｃ）、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ（ＮＥＢ）、ならびに標準的な制限およびライゲーションベースのクローニングの組合せに基づいた。ＧｉｂｓｏｎアセンブリのＰＣＲをＣｌｏｎｅ  Ａｍｐ  ＨｉＦｉ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびＱ５ハイファイＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して実行した。すべてのｉＯｎおよびコントロールｐｉｇｇｙＢａｃベクターを、最小限のｐｉｇｇｙＢａｃ５’および３’ＴＲ（Ｍｅｉｒら（２０１１）、Ｌｉら（２００５））を使用して、３’ＴＲにおける野生型トランスポゾン（ｒｅｆ）から追加の３ｂｐで、１８３５ｂｐの長さのｐＵＣ５７−ｍｉｎｉプラスミド骨格（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｉｎｃ）でアセンブルした。ＧＯＩおよびプロモータは、制限部位で挿入され得る。強力な真核生物ＣＡＧ（Ｎｉｗａら（１９９１））およびＣＭＶプロモータ、ならびにヒトＡｔｏｈ７遺伝子の発現を調節する２１４５ｂｐフラグメント（Ｃｈｉｏｄｉｎｉら（２０１３））を使用した。ＧＯＩの後には、ウシ成長ホルモン転写ターミネータが続いた（Ｋａｋｏｋｉら（２００４））（ｐＡ１）。最終的なｉＯｎベクターの設計では、潜在的なエピソーム転写を防ぐために、ＰＢ  ３’ＩＴＲの上流にウサギベータグロビンターミネータ（ｐＡ２）ターミネータを追加した。ＧＯＩとして使用されたＦＰは、ＲＦＰ（ｍＲＦＰｌ、Ｃａｍｐｂｅｌｌら（２００２）、ＧＦＰ（ＥＧＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、およびＩＲＦＰ（ＩＲＦＰ６７０、Ｓｈｃｈｅｒｂａｋｏｖａら（２０１３））を含んだ。ｚｉＯｎベクターでは、これらのＦＰのＯＲＦを、Ｎ末端（Ｎｔ）の近くで、ＴＴＡＡフットプリントを取り込んだ転位によって再結合する２つの反対に方向付けられたフラグメントに分割した。ＰＢ−ｚＩＤＣＭＶ∞Ｃｒｅベクターでは、ＣｒｅリコンビナーゼＯＲＦを、Ｊｕｌｌｉｅｎ（２００３）のように、Ｎｔ部分とＣｔ部分に分離し、サイレント位置（Ｌｅｕ１０４）にＴＴＡＡフットプリントが取り込まれている。転位前のＣｒｅ  Ｎｔフラグメントの発現を限定するために、そのコード配列を、ＰＥＳＴデグロン（Ｌｉら（１９９８））およびそれに続く翻訳停止を用いてフレーム内に（ＰＢ  ５’ＴＲを通して）置いた。膜制限ＧＦＰを、アニーリングされたオリゴヌクレオチドを使用して、ＥＧＦＰのＣｔ末端に短いＫｒａｓテザリング配列（Ａｖｅｒａｉｍｏら（２０１６））を追加することによって産出した。Ｃｒｅ活性をアッセイするために、我々は、発現が組換え時にｍＣｈｅｒｒｙ（Ｓｈａｎｅｒら（２００４）からＥＹＦＰ（Ｚａｃｈａｒｉａｓ（２００２））に切り替わるｌｏｘＰが導入されたレポーター（Ｔｏｌ２−ＣＡＧ：：ｌｏｘＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ｌｏｘＰ−ＥＹＦＰ、Ｔｏｌ２−ＣＡＧ：：ＲＹと略される）を設計した。この導入遺伝子を、ゲノム組込みを可能にするために、Ｔｏｌ２転位エンドフィート（Ｓａｔｏら（２００７））を用いて形作った。ＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰ−２Ａ−ＮＩＣＤベクターを、ＲＦＰとＮＩＣＤ  ＯＲＦの間に２Ａ切断配列（Ｋｉｍ���（２０１１））を導入して、それらの共発現を可能にすることによってアセンブルした。非組込みコントロールとして、ＣＡＧ：：ＮＩＣＤ−２Ａ−ＧＦＰプラスミド（Ｒｉｏｓら（２０１１））を使用した。この研究で使用された他のプラスミドは、Ｃｒｅ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２（Ｇｏｅｄｈａｒｔら（２０１２））およびＩＲＦＰ６７０（Ｓｈｃｈｅｒｂａｋｏｖａら（２０１３））を発現するＣＭＶ駆動型ベクター、ならびにＥＧＦＰを生成するＣＡＧ駆動型ベクター、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ（Ｒｉｚｚｏら（２００４））、Ｔｏｌ２トランスポサーゼ（Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｋ．＆Ｎｏｄａ，Ｔ．（２００４））および最適化されたｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼ（ｈｙＰＢａｓｅ  Ｌｏｕｌｉｅｒら（２０１４））を含んだ。古典的なトランスポゾンＰＢ−ＣＡＧ：：ＲＦＰ、ＰＢ−ＩＤスイッチに基づくベクターＰＢ−ＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰ、およびＰＢ−ｚＩＤスイッチに基づくベクターＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰのマップが図１４〜１６にそれぞれ表示される。これらの３つのベクターの配列は、それぞれ、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１６である。その他の詳細なマップおよび配列は、要求に応じて入手可能である。
【０１０４】
細胞培養実験。ｉＯｎおよびｐｉｇｇｙＢａｃプラスミドを、カチオン性脂質を使用してＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、またはマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトした。すべての図は、少なくとも３回の実験の複製を示している。特に断りのない限り、１×１０５細胞／ウェルを２４ウェルディッシュに蒔き、０．７μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２０ｎｇのＰＢａｓｅ発現プラスミド（ＣＡＧ：：ｈｙＰＢａｓｅ）を有するまたは有さない１００ｎｇ  ｉＯｎベクターを１ＤＩＶでトランスフェクトした。トリプル色標識実験では、１００ｎｇ／ウェルの各ＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＦＰプラスミドおよび６０ｎｇのＰＢａｓｅベクターを使用した。ＰＢ−ｚＩＤＣＭＶ∞Ｃｒｅ導入遺伝子を検証するために、５０ｎｇの対応するプラスミドにＴｏｌ２−ＣＡＧ：：ＲＹレポーター構築物を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞株において１０ｎｇのＰＢａｓｅベクターをコトランスフェクトした。この系統を、Ｔｏｌ２転位の連続使用、Ｇ４１８（３００μｇ／ｍＬ）による薬剤選択、およびＲＦＰ陽性クローンの選択によって確立した。いくつかの実験では、ｉＯｎベクター（ＣＭＶ：：ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、ＣＭＶ：：ＩＲＦＰまたはＣＡＧ：：ＧＦＰ）とは別個のＦＰマーカを発現する５０ｎｇの非組込みプラスミドをトランスフェクションコントロールとして適用した。ＦＡＣＳ分析に関して、トランスフェクションをスケールアップした濃度の６ｃｍディッシュで行った。ｉＯｎプラスミドトランスフェクション後のＨＥＫ２９３細胞の生存率を、０．４％トリパンブルー溶液（Ｓｉｇｍａ）による色素排除によって評価した。２〜３ＤＩＶ後、ＦＰ発現を、生細胞でのフローサイトメトリー、または落射蛍光、共焦点顕微鏡法、もしくはＡｒｒａｙｓｃａｎハイコンテンツ系（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による固定細胞のイメージングによってアッセイした（以下を参照）。固定観察のために、１３ｍｍカバースリップ上で増殖した細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｍｉｃｒｏｍ  Ｍｉｃｒｏ  ｔｅｃｈ）中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）に浸し、ＰＢＳですすぎ、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ）を補充したＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤に乗せた。
【０１０５】
ＦＡＣＳ分析および安定な細胞株の確立。ＦＡＣＳ分析に関して、トランスフェクションの３日後に６ｃｍディッシュで増殖したＨＥＫ２９３細胞を解離させ、ＤＡＰＩで染色し、ＭｏＦｌｏ  Ａｓｔｒｉｏｓセルソータ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で以下のレーザーラインを使用して分析した：４０５ｎｍ（ＤＡＰＩ）、４８８ｎｍ（ＧＦＰ）、５６１ｎｍ（ＲＦＰ）、６４０ｎｍ（ＩＲＦＰ）。各条件で１００００個のセルを分析し、非蛍光コントロールを、ＤＡＰＩで染色されたモックトランスフェクト細胞から調製した。単一細胞選別に関して、ＨＥＫ２９３細胞を、トランスフェクションの２日後に単一細胞として選別した。選択ウィンドウを、ＦＰ陽性集団のほとんどを選択し、陰性細胞を除外するように選択した。３色細胞選別に関して、最初に生解離細胞を選択し、続いてＧＦＰ＋集団内のＲＦＰ＋、ＩＲＦＰ＋細胞を選択した。細胞を単一細胞として９６ウェルプレートに蒔き、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地中で７〜１０日間増殖させた。ＦＰ発現を、落射蛍光顕微鏡法またはＡｒｒａｙｓｃａｎハイコンテンツ系によってアッセイした（以下を参照）。いくつかの陽性クローンを、配列決定のためにより大きな皿で拡大した。この目標のために、ゲノムＤＮＡを、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−ｎａｇｅｌ）を用いてコンフルエントな３．５または１０ｃｍディッシュから単離した。プロモータとＧＯＩの間の再配列された領域（５００〜６００ｂｐ）を、ＣｌｏｎｅＡｍｐ  ＨｉＦｉ  ＰＣＲプレミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して増幅し、サンガーシーケンシング（Ｇｅｎｅｗｉｚ、ＵＫ）によって直接評価した。
【０１０６】
ヒトｉＰＳ細胞のトランスフェクションおよび分化。分化中のｉＰＳ細胞のＰＢ−ＩＤ標識に関して、コロニーをＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で解離させ、ポリ−Ｌ−オルニチン（２０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｐ４９５７）およびラミニン（３μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  ２３０１７−０１５）でコーティングした９６ウェルプレートに再び蒔いた。２日目に、製造元の指示に従って、細胞にＤｒｅａｍｆｅｃｔ（ＯＺＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）をトランスフェクトした。次いで、細胞を脊髄運動ニューロンとして分化させ、１４日目に４％ＰＦＡで固定し、以前に行われたようにＴｕｊｌ抗体で染色した（Ｍａｕｒｙら，２０１５）。ｉＰＳ系統産出に関して、ＷＴＳＩｉ００８−Ａ  ｉＰＳ細胞を蒔き、製造元のプロトコルに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、手動またはＥＤＴＡ継代によって単離し、均一なコロニーをトランスフェクションの１８日後に得た（４継代）。
【０１０７】
マウスＥＳ細胞のトランスフェクションおよびクローン選択。ＫＨ２  ＥＳ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬を使用して、ＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＧＦＰ−ＫｒａｓおよびＣＡＧ：：ｈｙＰＢａｓｅ（最適化されたｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼを発現するプラスミド（ｈｙＰＢａｓｅ，Ｙｕｓａら，２０１１））プラスミド（４対１の重量比）でトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ＧＦＰ陽性細胞（１．５％）をＡｓｔｒｉｏｓ  ＭｏＦｌｏ  ＥＱセルソータを使用して選別し、フィーダ細胞に低密度（１０３細胞／１０ｃｍディッシュ）で蒔いた。８日後、ＧＦＰ陽性クローンを蛍光実体顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｖ２０）下で採取した。
【０１０８】
胚エレクトロポレーション。マウスおよびニワトリの胚における子宮内および卵内エレクトロポレーションを、以前に記載されたように行った（Ｌｏｕｌｉｅｒら（２０１４））。マウスを、餌を自由に摂取できる、１４時間の明期／１０時間の暗期のサイクルで収容し、動物手順を、施設のガイドラインに従って実施した。ＰＢａｓｅベクターと５：１で混合した１μｇ／ｐｌの各ｉＯｎプラスミド１μｇ／ｐｌを含有するＤＮＡミックスを、ガラスキャピラリーピペットでＥ１２マウス胚の側脳室、Ｅ２ヒヨコ胚脊髄の中心管、またはＥ．１５ヒヨコ胚の眼杯に注入した。胚を、犠牲になるまで発達させた。組織を、４％ＰＦＡにおいて固定した。Ｅ１４胚性マウス脳の１４ｐｍの切片をクリオスタットで得た。出生後のマウスの脳およびＥ８ヒヨコの脊髄を、振動ブレードミクロトーム（ＶＴ１０００、Ｌｅｉｃａ）を用いて２００〜４００ｐｍの厚さで切断した。ヒヨコＥ６脊髄およびＥ１４網膜をスライドガラスに平らに乗せた。すべての試料を、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤に乗せた。
【０１０９】
免疫染色。細胞培養物に関して：細胞を、コラーゲン（５０μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）でコーティングされた１３ｍｍのガラスカバースリップ上に蒔いた。ＰＢＳ（Ｍｉｃｒｏｍ  Ｍｉｃｒｏｔｅｃｈ）中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した後、１０％正常ヤギ血清（Ｓｉｇｍａ）および０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ中で、室温で１時間ブロッキングした。次いで、細胞をウサギ抗ＦＦＡＧ一次抗体（１：２５０、Ｓｉｇｍａ）とともにブロッキング溶液中で、４℃で終夜インキュベートした。ＰＢＳで洗浄し、二次抗体（１：５００、Ａｌｅｘａ  ６４７抗ヤギＩｇＧ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、室温で１時間インキュベートした後、細胞を、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ培地に乗せる前にＰＢＳで再び洗浄した。ニワトリ脊髄切片に関して：ヒヨコ胚を氷冷４％ＰＦＡで１時間固定し、ＰＢＳで３回すすいだ。次いで、胚を３０％スクロースで平衡化し、ＴｉｓｓｕｅＴｅｋ（Ｓａｋｕｒａ）に包埋し、ドライアイスで凍結し、クリオスタット切断（Ｍｉｃｒｏｍ  ＨＭ５６０、１４ｐｍセクション）の前に−８０℃で保存した。室温での平衡化後、切片をＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ−０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−１０％正常ロバ血清（ＮＤＳ）でブロッキングステップを行い、ＰＢＳ−０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−１％ＮＤＳで１：５０希釈した一次抗体（ａｎｔｉ−ＨｕＣ／Ｄ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で終夜インキュベートした。翌日、スライドをＰＢＳで３回洗浄し、上記のバッファー中の二次抗体（Ａｌｅｘａ６４７ロバ抗マウス、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：５００）で１時間インキュベートし、再度３回洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤とともに乗せた。
【０１１０】
蛍光イメージングおよび画像分析。落射蛍光画像を、ＶＴ１０００カメラおよびＧＦＰ、ＲＦＰ、およびＩＲＦＰ用の個別のフィルターキューブを備えたＦｅｉｃａＤＭ６０００顕微鏡で１０×０．６ＮＡまたは２０×０．７ＮＡの対物レンズを用いて収集した。共焦点画像スタックを、オリンパスＦＶ１０００顕微鏡で２０×０．８ＮＡ  Ｏｉｌおよび４０×１．３ＮＡ  Ｓｉｌｉｃｏｎｅ対物レンズを用いて、ＧＦＰ、ＲＦＰ、およびＩＲＦＰ／Ａｌｅｘａ６４７をそれぞれ励起する４８８、５６０、および６３３ｎｍレーザーラインで得た。画像解析をＦｉｊｉ（Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎら（２０１２））およびＩｍａｒｉｓを用いて行った。Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して、画像全体でＦｅｖｅｌを均一に調整した。Ａｒｒａｙｓｃａｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた分析に関して、２４ウェルプレートで増殖した細胞を４％ＰＦＡで１５分間固定し、３００ｎＭ  ＤＡＰＩで染色した後、以下のレーザーラインでイメージングした：３８６ｎｍ（ＤＡＰＩ）、４８５ｎｍ（ＧＦＰ）、５７０ｎｍ（ＲＦＰ）、および６５０ｎｍ（ＩＲＦＰ）。タイムラプスイメージングに関して、ｓＣＭＯＳ  Ｃａｍｅｒａ（Ｏｒｃａ  Ｆｌａｓｈ４ＬＴ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ）および１０倍の対物レンズ（ＣＦＩ  Ｐｌａｎ  ＡＰＯ  ＬＢＤＡ、ＮＡ  ０．４５、Ｎｉｋｏｎ）を備えたＭｉｃｒｏｍａｎａｇｅｒソフトウェアで動作する倒立広視野顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｔｉ  Ｅｃｌｉｐｓｅ）を使用した。ガラス底の３５ｍｍディッシュ（Ｍａｔｅｋ）で増殖している細胞を、加湿雰囲気中、５％ＣＯ２下、３７°Ｃの顕微鏡チャンバー内でインキュベートした。画像解析を、Ｆｉｊｉを用いて行った。
【０１１１】
統計分析
分析されたサンプルの数を、図の凡例に示す。統計分析を、ＲまたはＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して実行した。有意性を、スチューデントのｔ、ｘ２、クラスカル・ウォリス（一元配置分散分析）検定、およびノンパラメトリックなマンホイットニーＵ検定を使用して評価した。データは、平均＋ＳＥＭ、ｎｓ、ｐ＞０．０５、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を意味する。
【０１１２】
ＦＡＣＳ分析。各条件で１００００個のセルを分析し、非蛍光コントロールを、ＤＡＰＩで染色されたモックトランスフェクト細胞から調製した。
【０１１３】
Ｂ．結果および考察
ｐｉｇｇｙＢａｃ転位系に基づく転位依存性発現スイッチ（ＰＢ−ＩＤスイッチ）
【０１１４】
１）ＰＢ−ＩＤスイッチのコア特色（図１）
「カットアンドペースト」機構に従って機能するトランスポゾン系（例えば、ｐｉｇｇｙＢａｃ、Ｔｏｌ２、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ；Ｗｕら，２００６）は、ランダムな遺伝子座でのゲノム組込みを実現するために広く使用されている。組込み駆動型（ＩＤ）遺伝子スイッチを構築するために、その既知の効率、大きな貨物容量、および正確なカットアンドペースト機構（Ｌａｃｏｓｔｅら，２００９、Ｗｏｏｄａｒｄ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，２０１５、Ｗｕら，２００６）のために、ｐｉｇｇｙＢａｃ転位系を使用した。ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼ（以下、設計されたＰＢａｓｅ）は、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの２つの末端反復に隣接するエレメントを動員し（Ｌａｃｏｓｔｅら，２００９、以下、設計された５’ＴＲおよび３’ＴＲ）、これらのエレメントをＴＴＡＡ部位での標的細胞のゲノムに挿入する。トランスポゾンを切除すると、これらのＴＴＡＡ部位は正確に復元される。ｐｉｇｇｙＢａｃ系に基づく古典的なプラスミドベクター（図１Ａ、左）では、プロモータ（つまり、転写開始を駆動する配列）と、通常は転写ターミネータが後に続く目的の遺伝子（ＧＯＩ）で構成される導入遺伝子が、２つのｐｉｇｇｙＢａｃ  ＴＲの間に置かれ、トランスポサーゼが最初に骨格ベクターからそれを切除し、続いてそれを宿主細胞のゲノムに挿入する。したがって、導入遺伝子は、ドナープラスミドからのＰＢａｓｅを介した切除の前に発現される（図１Ｂ、左）。対照的に、ＰＢ−ＩＤベクターは、導入遺伝子をエピソーム形でサイレントに維持するプロモータ、ＧＯＩ、およびＴＲの配置を備えている（図１Ａ、右）。つまり、まず、２つのｐｉｇｇｙＢａｃ  ＩＴＲの１つが、２つのＩＴＲが逆平行ではなく平行になる、古典的なトランスポゾン構成（５’ＩＴＲと３’ＩＴＲの両方がセンス方向）と比較して、ドナープラスミドにおいて逆方向（センス方向に５’ＩＴＲ、アンチセンス方向に３’ＩＴＲ）に配置される。第二に、導入遺伝子が、完全に機能する産物を生成することができない２つのエレメントに分割され、ＴＲの１つによって分離され、互いに対して反対の方向に置かれる。したがって、ＧＯＩは、組込み前は発現されないか（図１Ｂ、右）、またはその５’部分のみが発現される。この構成は、ｐｉｇｇｙＢａｃを介した挿入と切除の両方が一致して、ドナープラスミドを宿主ゲノムに組み込むと同時に、導入遺伝子の２つの部分を機能的な発現ユニットに再結合する再配置を引き起こし、ＧＯＩ発現をトリガーする状況を作り出す。古典的なｐｉｇｇｙＢａｃベクターとは異なり、ベクター全体が宿主細胞のゲノムに組み込まれる。この導入遺伝子構成を、以後ＰＢ−ＩＤと名付け、プロモータ（Ｐｒｏｍ）から目的の遺伝子（ＧＯＩ）を発現するこの原理に基づく導入遺伝子を、以下のように表す：ＰＢ−ＩＤＰｒｏｍ∞ＧＯＩ、ここで無限大記号∞は、ＧＯＩが構成的にプロモータの制御下にある古典的なトランスポゾン構成（以下、ＰＢＰｒｏｍ：：ＧＯＩと表記）とは対照的に、転位中に起こる再配置を表す。ＰＢ−ＩＤの原理に基づいて、以下に示すいくつかのタイプのベクターを設計および検証した。
【０１１５】
２）ＰＢ−ＩＤスイッチの検証および反復
２．１）最初にブロックされたＧＯＩの転写がｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼによって媒介されるゲノム組込みによって活性化されるＰＢ−ＩＤベクター（ＰＢ−ＩＤ転写スイッチ、図１および図２）
【０１１６】
ａ）原理：
ＰＢ−ＩＤ転写スイッチでは、プロモータおよびＧＯＩがエピソームベクター内でヘッドトゥーヘッド（反転）方向に置かれ、ｐｉｇｇｙＢａｃ  ＩＴＲの１つによって分離されているため、転写が防止される。上で説明したように、ＰＢａｓｅ作用によるゲノム組込みの際、ＰＢ−ＩＤベクターの再配置により、ＧＯＩがプロモータの制御下になり、正しい方向になり、その転写がトリガーされる（図１Ａ右）。この状況は、ＧＯＩがその組込み前に既にプロモータの制御下にある古典的なｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターの設計とは対照的である（図１Ａ、左）。
【０１１７】
ｂ）様々なＰＢ−ＩＤ転写スイッチ構成の設計（図２）：
プロモータ、ＧＯＩ、末端反復配列、およびベクター骨格の相対的な配置に応じて、ＰＢ−ＩＤ転写スイッチの別個の構成を使用して、ｐｉｇｇｙＢａｃ転位によるＧＯＩの発現をトリガーすることができる（図２Ａ）。特に、以下の２つの側面に応じて、様々なタイプのＰＢ−ＩＤ構成を考案した。
【０１１８】
ｉ）プロモータ、ＧＯＩ、およびベクター骨格の相対的配置。タイプＡおよびタイプＢとそれぞれ称される２つのＰＢ−ＩＤ構成は、プロモータの５’末端（プロモータおよびＧＯＩは、それらの５’末端にある骨格配列によって分離される）、またはＧＯＩの３’末端（プロモータとＧＯＩとは、それらの３’末端にある骨格配列によって分離されている）に近いベクター骨格の位置に応じて定義され得る。
【０１１９】
ｉｉ）導入遺伝子の他のエレメントに対する５’および３’ｐｉｇｇｙＢａｃ  ＩＴＲの位置５’または３’のｐｉｇｇｙＢａｃ  ＩＴＲがプロモータとＧＯＩの間に置かれているかどうかに応じて、タイプ１とタイプ２の２つのＰＢ−ＩＤ構成が定義され得る。
これらの配置の組合せにより、ＰＢ−ＩＤ（１Ａ）、ＰＢ−ＩＤ（１Ｂ）、ＰＢ−ＩＤ（２Ａ）、およびＰＢ−ＩＤ（２Ｂ）で表記されるＰＢ−ＩＤスイッチの４つの構成が定義される（図２Ａ）。
【０１２０】
ｃ）インビトロでの検証：
上で定義した様々なタイプのＰＢ−ＩＤ構成が転位依存性ＧＯＩ発現を駆動できるかどうかを試験するために、ＰＢ−ＩＤベクターを、最小限のｐｉｇｇｙＢａｃ  ５’および３’ＴＲ（Ｌａｃｏｓｔｅら，２００９）、広く活性な合成ＣＡＧプロモータ（ＣＭＶエンハンサー、ニワトリベータアクチンプロモータ、およびウサギベータグロビンスプライスアクセプターからなる、（Ｎｉｗａら，１９９１）、およびＧＯＩとしてのＲＦＰ（ｍＲＦＰｌ、Ｃａｍｐｂｅｌｌら，２００２）、それに続くウシ成長ホルモン転写ターミネータ（ｂＧＨ  ｐｏｌｙＡ、Ｋａｋｏｋｉら，２００４）を使用して、ｐＵＣ５７−ｍｉｎｉプラスミド骨格でアセンブルした。３つのＰＢ−ＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰベクターを、ＰＢ−ＩＤ（１Ａ）、ＰＢ−ＩＤ（１Ｂ）、およびＰＢ−ＩＤ（２Ａ）設計に従って構築し、以下、ＰＢ−ＩＤ（１Ａ）ＣＡＧ∞ＲＦＰ、ＰＢ−ＩＤ（１Ｂ）ＣＡＧ∞ＲＦＰ、およびＰＢ−ＩＤ（２Ａ）ＣＡＧ∞ＲＦＰと表記し、これにより、タイプＡ対タイプＢ、およびタイプ１対タイプ２配置を試験することができた。
【０１２１】
３つのＰＢ−ＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰプラスミドを、カチオン性脂質（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＣＡＧプロモータ（Ｎｉｗａら，１９９１）の下で最適化されたｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼ（ｈｙＰＢａｓｅ、Ｙｕｓａら，２０１１、以下ＰＢａｓｅと略記）を発現する２番目のプラスミドとともに、またはこれなしで、ＨＥＫ−２９３細胞にトランスフェクトした。培養３日後、トランスポサーゼの非存在下ではなく、ＰＢａｓｅをトランスフェクトした細胞でのＲＦＰの強い発現は、３つすべてのＰＢ−ＩＢ導入遺伝子構成がＰＢａｓｅ依存性ＧＯＩ発現を駆動したことを示した（図２Ｂ）。タイプＡの構成は、タイプＢの構成と比較して、ＰＢａｓｅの非存在下のＧＯＩのバックグラウンド発現が少ないことが見出された。これは、この２番目の構成でのＣＭＶエンハンサー（Ｋｅｉｌら，１９８７）の逆プロモータ活性が原因である可能性がある。ＰＢａｓｅで高いシグナル、ＰＢａｓｅの非存在下でＧＯＩの低いバックグラウンド発現を示したＰＢ−ＩＤ（１Ａ）構成を、後続の実験用に選択した。骨格ベクターからの残留バックグラウンド転写活性をさらに抑制するために、追加の転写ターミネータ（ウサギベータグロビンポリアデニル化配列）を、３’ＴＲの直後のＰＢ−ＩＤ（１Ａ）ＣＡＧ∞ＲＦＰベクターのＧＯＩの５’に置いた（図１Ａ右）。簡単にするためにＰＢ−ＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰと表記されたこのＰＢ−ＩＤ設計を、その後のすべての実験で使用した。ＰＢ−ＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰベクターと古典的なトランスポゾン（ＰＢＣＡＧ：：ＲＦＰ）を比較すると、それが、トランスポサーゼの非存在下で転写漏出性が低く、効率的なＰＢａｓｅ依存性ＲＦＰ発現を達成したが、古典的なトランスポゾンベクターは、ＲＦＰをエピソーム形で容易に発現したことが分かった（図１Ｂ）。
【０１２２】
ＰＢ−ＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰベクターを古典的な非組込みエピソーム（ＣＡＧ：：ＲＦＰ）およびｐｉｇｇｙＢａｃベース（ＰＢＣＡＧ：：ＲＦＰ）のベクターと比較する経時的実験により、ＰＢ−ＩＤ戦略は、細胞分裂によるそれらの希釈の前に、古典的なエピソームプラスミドに関連する発現のバーストを抑制することが示された（図１Ｃ）。ＰＢ−ＩＤによる発現レベルは、個々の細胞間での変動が少なく、エピソーム形で活性なベクターよりも迅速に安定化することも見出された（図１Ｃ）。
【０１２３】
ｄ）ニワトリにおけるインビボでの検証：
ＰＢ−ＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰプラスミドを、ＰＢａｓｅを発現する２番目のプラスミドを有するまたは有さないニワトリ胚脊髄に卵内にエレクトロポレーションした（図１Ｄ）。トランスフェクションの４日後、ＲＦＰの発現をＶＺから神経管の外層に流れる細胞の放射状の流れでＰＢａｓｅに依存して観察した。この発現パターンは、心室表面を裏打ちするエレクトロポレーションされた神経前駆細胞のゲノムへの導入遺伝子組込みを示しており、したがって、放射状のクローンパターンを形成することが知られている、これらの細胞およびそれらのニューロンの子孫の長期標識を達成している（Ｌｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｓａｎｅｓ，１９９５；Ｌｏｕｌｉｅｒら，２０１４）。対照的に、非組込みベクター（ＣＡＧ：：Ｃｅｒｕｌｅａｎ）からの発現は、エレクトロポレーションの直後に生まれた単離されたニューロンにほとんど制限されていた（図１Ｄ）。
【０１２４】
ｅ）マウスにおけるインビボでの検証：
古典的なエピソームベクター（ＣＡＧ：：ＧＦＰ）を、Ｅ１２で子宮内、マウス大脳皮質にエレクトロポレーションし、ＧＦＰ発現をエレクトロポレーションの直後に生まれたニューロンで観察し、次いで、分裂する前駆細胞で急速に希釈されるため、中間層で観察した。対照的に、同じ方法でエレクトロポレーションされたＰＢ−ＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰでは、ＲＦＰの発現は、前駆細胞および後期に生まれた上層ニューロンと星状細胞を含めたそれらの放射状に移動するすべての誘導体で、厳密なＰＢａｓｅ依存的に観察された。同様に、マウス網膜では、神経発生の開始時にＰＢ−ＩＤベクターがエレクトロポレーションされ、ＲＦＰがすべての網膜層で観察されたが、エピソームは、初期に生じた網膜神経節細胞のみをマークした。重要なことに、それは、おそらく複数の組込みされていないコピーの継承のために、古典的なトランスポゾンおよびエピソームで得られた孤立したニューロンの強く不規則な標識を回避した。
【０１２５】
２．２）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼが最初にエピソームＩＤベクターによって発現され、転位時に発現がＧＯＩのものに切り替わる「オールインワン」ＰＢ−ＩＤベクター（ａｕｔｏ−ＰＢ−ＩＤスイッチ、図３）。
【０１２６】
ａ）プリンシペ：
ａｕｔｏ−ＰＢ−ＩＤスイッチでは、ＩＤスイッチのすべてのコンポーネントが単一の「オールインワン」ベクターによってコードされる（図３）。設計は、以下の修正を有する転写ＩＤスイッチ（１．２．１）の設計に従う。ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼ遺伝子（Ｙｕｓａら，２０１１）が、それがベクターのエピソーム形で発現されるようにプロモータの制御下に置かれる。ＰＢａｓｅ作用によってゲノム組込みおよび再配置が引き起こされると、ＧＯＩは、プロモータの下流に再び置かれ、その転写がトリガーされる一方、ＰＢａｓｅ遺伝子は、プロモータに対して反対の方向に終了するため、もはやその制御下にない。したがって、発現は、ＰＢａｓｅからＧＯＩのものに切り替わる（図３Ａ）。これにより、単一のベクターで転位依存性ＧＯＩ発現を実現できる。以下、この構成をＰＢ−ＩＤＰｒｏｍ：：ＰＢａｓｅ∞ＧＯＩと表記する。
【０１２７】
ｂ）検証：
ａｕｔｏ−ＰＢ−ＩＤベクターを、１．２．１に記載したＰＢ−ＩＤベクターにおいて、プロモータに続く５’ＴＲの直後にｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼ遺伝子（ｈｙＰＢａｓｅ；Ｙｕｓａら，２０１１）を配置し、続いて転写ターミネータを配置することによってアセンブルした。ＰＢ−ＩＤＣＡＧ：：ＰＢａｓｅ∞ＲＦＰと名付けられたこの構成では、トランスポサーゼを介したゲノム組込み時に、発現がＰＢａｓｅからＲＦＰ発現に切り替わる（図３Ａ）。トランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞での試験は、予想通り、ＰＢ−ＩＤＣＡＧ：：ＰＢａｓｅ∞ＲＦＰベクターが他のヘルパーベクターの非存在下でＧＯＩ発現を駆動することを示している（図３Ｂ）。
【０１２８】
２．３）最初にブロックされたＧＯＩの完全な翻訳がｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼによって媒介されるゲノム組込みによって活性化されるＰＢ−ＩＤベクター（ＰＢ−ＩＤ翻訳スイッチ、図４および図５）
【０１２９】
ａ）プリンシペ：
ＰＢ−ＩＤ転写スイッチ（Ｉ．２．１）では、エピソームベクターからの漏れのある転写が発生した場合は、ＧＯＩの翻訳および対応するタンパク質の生成が続くことになっている。このような可能性を回避するために、ＧＯＩの転写と翻訳の両方がベクターのエピソーム形においてブロックされるＰＢ−ＩＤ翻訳スイッチを設計した（図４）。このスイッチでは、ＧＯＩオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が２つの部分に分割される：少なくとも翻訳開始コドンおよびタンパク質の非機能的Ｎ末端部分をコードする可変数のアミノ酸を含む５’部分、およびＳＴＯＰコドンまでの残りのタンパク質をコードする３’部分（図４Ａ）。ＧＯＩの５’部分に関連するプロモータは、ＧＯＩの３’部分に対してヘッドトゥーヘッド（反転）方向に置かれ、導入遺伝子のこれら２つのエレメントは、ｐｉｇｇｙＢａｃ  ＴＲの１つによって分離されている。ＰＢａｓｅの作用に駆動されたゲノム組込み時に、ＰＢ−ＩＤベクターの再配置により、ＧＯＩの２つの部分がプロモータの制御下に置かれた機能的なＯＲＦに再結合し、ＧＯＩ転写および翻訳の完了が可能になる。ＧＯＩ配列のマイナーな変更は、リーディングフレームを変更することなく、結果として生じるタンパク質の配列の最小限の変更で、ＯＲＦにｐｉｇｇｙＢａｃフットプリント（組込み時にＧＯＩの２つの部分の再結合から生じるＴＴＡＡ配列）を組み込むために行われる。このような構成をＰＢ−ｚＩＤＰｒｏｍ∞ＧＯＩと表記する。
【０１３０】
ｂ）検証：
ＰＢ−ＩＤ翻訳スイッチに基づいて以下のＧＯＩを発現するために４つの異なるベクターを設計した（図４および５）。ＥＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ｍＲＦＰ１（赤色蛍光タンパク質、Ｃａｍｐｂｅｌｌら，２００２）、ＩＲＦＰ６７０（近赤外蛍光タンパク質、Ｓｈｃｈｅｒｂａｋｏｖａ  ａｎｄ  Ｖｅｒｋｈｕｓｈａ，２０１３）、および部位特異的リコンビナーゼＣｒｅ。ＧＯＩ  ＯＲＦを、以下の方法で５’と３’の部分に分割した：最初の３つのベクターである、ＣＡＧプロモータからの蛍光タンパク質を発現しているＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＥＧＦＰ、ＰＢ−ｚＩＤＣＡＧｃｏＲＦＰ、およびＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＩＲＦＰでは、ＧＯＩの５’部分は、タンパク質の最初の３〜６個のアミノ酸をコードしている（図４Ａ）。ＣＭＶプロモータから部位特異的Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする４番目のベクター（ＰＢ−ｚＩＤＣＭＶ∞Ｃｒｅ）では、ＣｒｅＯＲＦは、別々に不活性であることが知られている２つの５’および３’部分に分割される（Ｊｕｌｌｉｅｎ，２００３）（図５Ａ）。さらに、エピソームベクターによる組込み前に発現されるＣｒｅのＮｔ部分（ＮｔＣｒｅ）を不安定化するために、以下の変更が行われる：Ｃｒｅコード配列の対応する５’部分の後に、急速分解のためのＰＥＳＴ配列である下流ｐｉｇｇｙＢａｃ５’ＴＲ（Ｒｏｇｅｒｓら，１９８６）、および生じた融合産物（ＮｔＣｒｅ−５’ＴＲ−ＰＥＳＴ）が転写かつ翻訳され得るように配置された転写ターミネータが続く。
【０１３１】
上記の４つのベクターを用いたＨＥＫ−２９３細胞における試験は、ＰＢ−ＩＤ翻訳スイッチがＰＢａｓｅ依存性のＧＯＩの発現を可能にすることを示している（図４Ｂおよび５Ｂ）。ＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰは、ＰＢ−ＩＤ転写スイッチに基づくＰＢ−ＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰベクターと比較して、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼの非存在下で漏出の減少を示した（図４Ｃ）。ＰＢ−ｚＩＤＣＭＶ∞Ｃｒｅベクターを、Ｃｒｅ組換え時に色を切り替える「ｌｏｘＰが導入された」レポーター導入遺伝子（ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＲＦＰ−ｌｏｘＰ−ＹＦＰ）を安定して発現するＨＥＫ−２９３細胞にトランスフェクトした。ｌｏｘＰが導入されたレポーター導入遺伝子の色の変化またはＣｒｅに対する免疫染色によって明らかにされたＣｒｅの発現は、ＰＢａｓｅでコトランスフェクトされた細胞でのみ発生した（図５Ｂ）。
【０１３２】
２．４）コトランスフェクトされた細胞の同定を可能にする異なる色の蛍光タンパク質をコードするＰＢ−ＩＤベクター
【０１３３】
ａ）プリンシペ：異なる導入遺伝子を有する個々の細胞のコトランスフェクションは、異なるレポーター遺伝子を発現するベクターを使用して評価できる。この目標のために、広く活性なＣＡＧプロモータから蛍光タンパク質ＥＧＦＰ（緑、ＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＥＧＦＰ）、ｍＲＦＰ１（赤、ＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰ）、およびＩＲＦＰ６７０（近赤外線、ＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＩＲＦＰ）を発現するＰＢ−ＩＤ翻訳スイッチ（１．２．３）に基づく上記の３つのベクターを設計した（図４Ａ）。
【０１３４】
ｂ）検証：３つのベクターを、ＨＥＫ−２９３細胞におけるトランスフェクションによって検証した（１．２．３、図４Ｂを参照されたい）。別個の蛍光タンパク質の共発現が頻繁に観察され、個々の細胞への複数の異なる導入遺伝子コピーの組込みを示している。迅速な細胞株の確立（１．３．２）および細胞系統の追跡（１．３．４）については、以下のこれらの導入遺伝子の適用を参照されたい。
【０１３５】
２．５）配列修飾がベクターの１つのコピーの別のコピーへのＰＢａｓｅを介した組込み（自動およびエピソーム間組込み）を妨げるベクター（図６）
【０１３６】
ａ）プリンシペ：
古典的なｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンおよびＰＢ−ＩＤベクターなどのｐｉｇｇｙＢａｃ系に基づくベクターでは、トランスポサーゼの作用は、ｐｉｇｇｙＢａｃベースのベクター自体のエピソーム形（Ｗａｎｇら，２０１４）、またはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼをコードするベクターへの望ましくない自動または相互組込みにつながり得る。このようなエピソーム間（「自殺」とも称される）組込みの可能性を可能な限り減らし、ゲノム組込みを支持するために、ｐＵＣ５７−ｍｉｎｉプラスミドに基づき、ＣＡＧプロモータおよび単一塩基対の置換によってすべてのＴＴＡＡサイトを除去したＲＦＰレポーター導入遺伝子を含有するベクター骨格を設計し、アセンブルした。置換を、細菌におけるベクターの複製にも、真核細胞におけるその機能にも影響を及ぼさない方法で行った。この設計に基づいて、２つのベクターをアセンブルした。
【０１３７】
−トランスポゾン切除に必要なＰＢ５’および３’ＴＲの端にある２つの部位を除いて、ＴＴＡＡ配列を含有しないＰＢ−ＩＤ翻訳スイッチに基づくＩＤベクター。これらのＴＴＡＡ配列は、自動組込みにつながることはめったにないことが示されている（Ｗａｎｇら，２０１４）。ゲノム組込み時にＣＡＧプロモータからＲＦＰを発現するこの変異ベクターは、以下、ＴＴＡＡ部位の変異を表記するためのアスタリスクを使用して、ＰＢ＊−ｚＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰと名付ける。
【０１３８】
−ＴＴＡＡ配列を完全に欠いているＣＡＧプロモータからの活動亢進トランスポサーゼｈｙＰＢａｓｅを発現するベクター、以下、＊ＣＡＧ：：ＰＢａｓｅと名付ける。
【０１３９】
ｂ）インビトロおよびインビボでの検証：
ＴＴＡＡのないＰＢ＊−ｚＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰおよび＊ＣＡＧ：：ＰＢａｓｅベクターを、Ｅ．Ｃｏｌｉコンピテント細胞において形質転換し、それらは、正常に複製した。次いで、それらを、ＨＥＫ−２９３細胞においてインビトロで試験し、ニワトリ胚脊髄での卵内エレクトロポレーションによってインビボで試験した（図６）。どちらの場合も、ＰＢａｓｅに依存したＧＯＩ（ＲＦＰ）の発現が観察された。
【０１４０】
２．６）遺伝子改変細胞を同定する意図で、ＧＯＩの発現がマーカ遺伝子とともに共発現されるＰＢ−ＩＤベクター（図７）
【０１４１】
ａ）プリンシペ：ＰＢ−ＩＤ系でのＧＯＩと一緒のマーカ遺伝子の発現は、安定的にトランスフェクトされた細胞株の選択またはインビトロもしくはインビボでのＧＯＩ発現の効果のアッセイなど、様々な意図でＧＯＩを発現する細胞を同定するのに有用である。
【０１４２】
ｂ）検証：２Ａペプチド（単一のｍＲＮＡからの２つの連続するＯＲＦの翻訳を可能にする）を使用して、目的の遺伝子（ＮＩＣＤ、Ｎｏｔｃｈ受容体細胞内ドメイン；（Ｐｉｅｒｆｅｌｉｃｅら，２０１１他）とともに蛍光マーカ（ＲＦＰ）のＰＢａｓｅ依存性共発現を可能にするＰＢ−ＩＤ翻訳スイッチに基づくベクターを設計し、アセンブルした。このベクター（ＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰ−２Ａ−ＮＩＣＤ）を、ＰＢａｓｅとともにニワトリ胚脊髄でのエレクトロポレーションによってインビボで試験した（図７）。インキュベーションの３日または６日後、標識された細胞の分析は、ＮＩＣＤの長期発現に期待される効果：ＲＦＰを発現する摂動神経前駆細胞からの神経発生の著しい減少、およびコントロール条件と比較した心室表面でのこれらの前駆細胞の拡大（ｚＰＢ−ＩＤＣＡＧ∞ＥＧＦＰのエレクトロポレーションに対応）を示した。
【０１４３】
２．７）ＧＯＩの発現が目的の調節配列によって制御されているＰＢ−ＩＤベクターを示す図である（図８）。
【０１４４】
ａ）プリンシペ：ゲノム組込み構成で目的の調節配列（例えば、プロモータまたはエンハンサー）からのＧＯＩの発現を達成することは、様々な調節配列のアッセイ、エピジェネティック効果に対するそれらの回復力の試験、または細胞型もしくは段階特異的なＧＯＩ発現の制御などの様々な意図に有用である。
【０１４５】
ｂ）検証：ヒトＡｔｏｈ７遺伝子の調節配列からの蛍光マーカ（ＲＦＰ）またはＣｒｅリコンビナーゼの転位依存性発現を可能にするＰＢ−ＩＤ翻訳スイッチに基づくベクターを設計し、アセンブルした（Ｓｋｏｗｒｏｎｓｋａ−Ｋｒａｗｃｚｙｋら，２００９）。脊椎動物では、Ａｔｏｈ７は、網膜ニューロンのサブセットで発現される。網膜神経節細胞は発現されるが、双極性細胞およびアマクリン細胞では発現されない（Ｃｈｉｏｄｉｎｉら，２０１３）。２つのベクター（ＰＢ−ｚＩＤＡｔｏｈ７∞ＲＦＰおよびＰＢ−ｚＩＤＡｔｏｈ７∞Ｃｒｅ）を、ＰＢａｓｅとともにニワトリ胚網膜でのエレクトロポレーションによってインビボで試験した（図８）。Ｃｒｅ発現を報告するために、ＰＢ−ｚＩＤＡｔｏｈ７∞Ｃｒｅ導入遺伝子を、Ｃｒｅ依存的に蛍光タンパク質の発現を切り替えるゲノム組込み型の「ｌｏｘＰが導入された」Ｂｒａｉｎｂｏｗレポーター導入遺伝子とともにコトランスフェクトした（Ｌｏｕｌｉｅｒら，２０１４）。５日間のインキュベーション後、標識パターンの分析により、ＰＢ−ｚＩＤＡｔｏｈ７駆動導入遺伝子からの発現が予想される網膜サブタイプに制限されていることが示された。
【０１４６】
３）ＰＢ−ＩＤスイッチの使用法の実証
３．１）ＰＢ−ＩＤベクターを用いた迅速な薬物を含まない安定な細胞株の確立（図９）
【０１４７】
ａ）理論的根拠：
古典的なゲノム組込みベクターで安定な細胞株を確立する場合、宿主細胞のゲノムに組み込まれた導入遺伝子からのＧＯＩ（または選択マーカ）の発現は、エピソームベクターの除去前に確実に評価することはできない。これは、典型的に、複数回の細胞分裂を必要とし、トランスジェニック細胞の選択と分析に数週間の遅延をもたらす。さらに、異常に高いレベルでのＧＯＩの一過性エピソーム発現は、代謝および遺伝子発現を混乱させ、標的細胞の挙動、同一性、生存率に潜在的に有害な影響を与える可能性がある。ＰＢ−ＩＤスイッチは、ＧＯＩおよび／またはマーカの発現をゲノム組込み導入遺伝子に制限することにより、これらの問題を回避することができる。したがって、導入遺伝子が組み込まれている細胞は、トランスフェクションの直後（４８時間）にＧＯＩおよび／またはマーカの発現によって同定でき、一過性のエピソームに関連する発現のバーストが回避される。
【０１４８】
ｂ）実施（図９Ａ）：
ＰＢ−ＩＤスイッチによる高効率の薬物を含まない安定な細胞株の確立を、ＰＢ−ＩＤ転写スイッチ（ＰＢ−ＩＤＣＡＧｃｏＲＦＰ）に基づくＲＦＰを発現するベクターで検証した。この目標のために、ＨＥＫ−２９３細胞を、ＰＢａｓｅとともにＰＢ−ＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰベクターまたは古典的なｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクター（ＰＢＣＡＧ：：ＲＦＰ）のいずれかでトランスフェクトした。培養２日後、ＲＦＰ陽性細胞を選別し、ＦＡＣＳにより９６ウェルディッシュに単一細胞として蒔いた。１０日間の増殖後（薬剤選択の非存在下）、ＰＢ−ＩＤベクターでトランスフェクトされた細胞に由来するクローンの９５．７８％±０．７３ＳＥＭがＲＦＰを発現したが、同じ条件では、古典的なｐｉｇｇｙＢａｃベクターに由来するクローンの５５．１８％±５．０７ＳＥＭのみがＲＦＰ陽性であった（図９Ａ）。これらの結果は、エピソーム希釈を待たずに、ＧＯＩまたはマーカ発現に基づいて陽性細胞を選別することにより、高効率でトランスジェニック細胞株を産出するためのツールとしてＰＢ−ＩＤスイッチを検証している。
【０１４９】
ｃ）胚性幹（ＥＳ）細胞におけるインビトロでの検証（図１１）
マウスからのＥＳ細胞にＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＧＦＰ−ＫｒａｓおよびＣＡＧ：：ｈｙＰＢａｓｅベクターをトランスフェクトした。マウスＥＳ細胞では、ＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＧＦＰ−Ｋｒａｓベクターを用いた蛍光ベースのクローン選択により、古典的なトランスポゾンと比較して組込み事象が高度に強化されていることが実証された（図１１Ａ）。したがって、転位へのＰＢ−ＩＤスイッチの依存性は、効率的な導入遺伝子活性化および効率的なゲノム組込みを可能にする。重要なことに、ＰＢ−ＩＤベクターを用いた短期および長期の生存率は、古典的なトランスポゾンの生存率と同等であり（図１１Ｂおよび１１Ｃ）、スイッチは、ＨｅＦａおよび３Ｔ３を含めたすべての試験した細胞で活性であった（図１１Ｄ）。これらの結果は、ＰＢ−ＩＤを、エピソーム発現を妨げることなく、トランスフェクションの直後にＧＯＩのゲノム発現を評価できる非常に効率的な薬物を含まない遺伝子組換えのツールとして確立している。
【０１５０】
３．２）ＰＢ−ＩＤを用いた複数の導入遺伝子（マルチプレックス遺伝子導入）を共発現する細胞株の産出（図９Ｂ）
【０１５１】
ａ）理論的根拠：
複数の導入遺伝子を安定して共発現する細胞株を選択して確立することは、古典的なプロトコルでは困難である。例えば、薬剤耐性に基づくマルチプレクシング選択には、いくつかの別個の薬剤の同時または連続適用、トランスフェクトされた細胞に有害な効果を与える可能性のある繊細で複雑な手順が必要である。さらに、安定な遺伝子導入のための古典的なアプローチの限定された収量のために、複数の導入遺伝子を共組込みする細胞は、典型的に、トランスフェクトされた細胞の少数のみを表す。別個の蛍光タンパク質マーカを有するＰＢ−ＩＤベクターを用いて細胞をコトランスフェクトすると、複数の導入遺伝子を迅速かつ高収率で共発現する細胞株を選択できる可能性がある。
【０１５２】
ｂ）実施（図９Ｂ）：
ＰＢ−ＩＤでの高効率の薬物を含まないマルチプレックスで安定な細胞株の確立を、ＰＢ−ＩＤ翻訳スイッチ（ＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰ、ＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＥＧＦＰ、およびＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＩＲＦＰ）に基づいてｍＲＦＰ１、ＥＧＦＰ、およびＩＲＦＰ６７０を発現する３つのベクターを使用して検証した。この目標のために、ＨＥＫ−２９３細胞を、ＰＢａｓｅの存在下で、３つのＰＢ−ＩＤベクターの混合物、または古典的なｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクター（ＰＢＣＡＧ：：ＲＦＰ、ＰＢＣＡＧ：：ＥＧＦＰおよびＰＢＣＡＧ：：ＩＲＦＰ）のいずれかでコトランスフェクトした。培養２日後、３つの蛍光タンパク質を共発現する細胞を選別し、ＦＡＣＳにより９６ウェルディッシュに単一細胞として蒔いた。１０日間の増殖後（薬物選択の非存在下）、３つのマーカを共発現する細胞に由来するクローンの大部分（７９．６４％±３．７６ＳＥＭ）は、発現を維持したが、３つのｐｉｇｇｙＢａｃベクターでのトランスフェクションでは、トリプルトランスジェニッククローンの２２．４３％±２．２２ＳＥＭのみをもたらした。これらの結果は、エピソーム希釈を待たずに、マーカ共発現に基づいて陽性細胞を選別することにより、高効率で複数の導入遺伝子を安定して発現する細胞株を産出するためのツールとしてＰＢ−ＩＤスイッチを検証している。
【０１５３】
ｃ）ヒト誘導多能性幹（ｉＰＳ細胞）におけるインビトロでの検証（図１２）
ｉＰＳ細胞を、３つのＰＢ−ＩＤベクター（ＰＢ−ｚＩＤＣＡＧｃｏＲＦＰ、ＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＧＦＰ、およびＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＩＲＦＰ）の混合物でコトランスフェクトした。３つの蛍光タンパク質を共発現するクローンは、同様に、複数の継代にわたってほぼ均一なレベルでそれらの発現を維持した（図１２）。３色のＰＢ−ｚＩＤ導入遺伝子は、ｉＰＳ細胞が神経系統に分化する間の長期的な発現も可能にした。したがって、ＰＢ−ＩＤは、細胞培養モデルにおけるマルチプレックス遺伝子組換えのための効率的なツールを提供する。
【０１５４】
３．３）ＰＢ−ＩＤベクターを用いた機能的に活性なＧＯＩのゲノム発現およびその効果の読取り（図７）
【０１５５】
ａ）理論的根拠：
（エピソーム導入遺伝子の効果とは対照的に）トランスフェクトされた細胞のゲノムに組み込まれた導入遺伝子の効果をモニタリングすることは、例えば、一定の生理学的レベルで、かつ／または後成的因子の調節下で長期間発現された場合に、機能獲得および機能喪失実験において、ある遺伝子産物の機能を実験的に評価することなど、様々な意図のために望ましい。エピソーム形で活性な古典的なベクターでは、エピソームからの一過性の導入遺伝子の発現が、組み込まれた導入遺伝子の発現を隠し、非生理学的レベルでの発現のバーストおよび発現の急速な変化を引き起こす。誘導性戦略は、ある場合にこの問題を回避することを可能にする場合があるが、それでも分析を著しく遅らせるエピソーム希釈を必要とする。ＰＢ−ＩＤスイッチは、発現をゲノム組込み導入遺伝子に制限するため、これらの導入遺伝子によって生成されるＧＯＩの効果を明確にモニタリングできる。次いで、蛍光タンパク質などのマーカの共発現を使用して、機能的実験においてＧＯＩを生成する細胞を特定できる。
【０１５６】
ｂ）実施：
ＰＢ−ＩＤベクターを用いて遺伝子モザイク分析を行う可能性を検証するために、神経前駆細胞の分化に及ぼす阻害効果で知られるＮｏｔｃｈ受容体細胞内ドメインをＧＯＩとして使用した（Ｐｉｅｒｆｅｌｉｃｅら，２０１１）。ＲＦＰおよびＮＩＣＤのＰＢａｓｅ依存性共発現を可能にする（１．２．６）に提示したＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰ−２Ａ−ＮＩＣＤベクターを使用した（図７）。このベクターを、ニワトリ胚脊髄において、ＰＢａｓｅおよびコントロールベクター（ＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＥＧＦＰ）でコトランスフェクトした。インキュベーションの３日または６日後、標識された細胞の分析は、ＮＩＣＤの長期発現に期待される効果：ＧＦＰ＋細胞への影響が少ない一方でＲＦＰ＋細胞に影響を与える神経新生の大幅な減少、およびコントロール条件と比較した心室表面に位置するＲＦＰ＋前駆細胞の拡大（ｚＰＢ−ＩＤＣＡＧ∞ＥＧＦＰのエレクトロポレーションに対応）を示した。したがって、ＰＢ−ＩＤスイッチを使用して、特定の遺伝的動揺を誘導し、影響を受けた細胞および影響を受けていない細胞を別個の色標識で追跡できる。
【０１５７】
３．４）ＰＢ−ＩＤベクターを用いた細胞系統追跡およびクローン分析（図１０）
【０１５８】
ａ）理論的根拠：
細胞系統追跡およびクローン分析アプローチは、細胞集団または個々の細胞のレベルで、インビトロまたはインビボで幹／前駆細胞の運命を分析するための組織発達およびホメオスタシスの研究で広く使用されている。これには、目的の細胞を、それらの分裂を通して伝達される永続的な標識でマークする必要がある。この意図で利用できるツールの中で、ゲノム組込み型トランスポゾンベースのベクターは、それらの単純さおよび幅広いモデルへの直接的な適用性のために魅力的である。さらに、トランスポゾンに基づく多色標識アプローチが開発され、子孫または異なる個々の前駆細胞を別個の色マーカでマークすることにより、クローンおよび／またはクローン境界の同定を促進した（Ｆｉｇｕｅｒｅｓ−Ｏｎａｔｅら，２０１６；Ｇａｒｃｉａ−Ｍｏｒｅｎｏら，２０１４；Ｆｏｕｌｉｅｒら，２０１４；Ｓｉｄｄｉｑｉら，２０１４）。しかしながら、トランスポゾンベースのクローン標識スキームの一般的な問題は、組み込まれていないトランスポゾンベクターから発現されたマーカが、細胞分裂によるエピソーム希釈の前に組み込まれた導入遺伝子と最初に重なるため、クローン同定が妨げられることである。マーカ発現をゲノム組込み標識に制限することにより、ＰＢ−ＩＤスイッチは、この問題を回避することを可能にする。したがって、発達中の脊椎動物の神経系におけるインビボでの長期の細胞系統追跡および多色クローン分析のためのＰＢ−ＩＤベクターの有効性が実証された。
【０１５９】
ｂ）実施：
−長期的な細胞系統追跡（図１０Ａ）：
モデルとしてマウス大脳皮質を使用して前駆細胞系統を追跡するためのＰＢ−ＩＤベクターの適用性を検証した。ＰＢ−ＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰベクターを、ＰＢａｓｅおよびコントロールＣＡＧ：：ＧＦＰプラスミドとともに、大脳室を裏打ちする胚性皮質前駆細胞においてＥ１２で子宮内にエレクトロポレーションした。Ｅ１８（エレクトロポレーションの６日後）では、予想通り、ＧＦＰ発現は、エレクトロポレーション時またはその直後に生じた大脳皮質の中間層を占めるニューロンに制限された（前駆細胞分裂を通したＣＡＧ：：ＧＦＰプラスミドの希釈から予想されるように、その後に生じた細胞は標識されなかった）。対照的に、ＲＦＰの発現は、親前駆細胞の恒久的な標識の場合に予想されるように、心室表面から中間および上部皮質層に向かって放射状に移動する細胞の流れで見出された。Ｐ１０（エレクトロポレーションの１５日後）では、ＲＦＰ標識は、中間層および上部皮質層の分化したニューロン、ならびに皮質壁全体に位置する星状細胞で観察されたが、ＧＦＰ発現は、再び中間層ニューロンに制限されていた。この発現のパターンは、ＰＢ−ＩＤベクターを用いた皮質前駆細胞の恒久的な標識とのみ適合性がある。したがって、ＰＢ−ＩＤスイッチを使用して、長期間の発生期間にわたって、インビボで前駆細胞／幹細胞の系統を追跡することができる。
【０１６０】
−クローン分析（図１０Ｂ）：
蛍光タンパク質メーカーの別個の色を発現するベクターの混合物を使用して、ＰＢ−ＩＤスイッチに基づく多色細胞系統追跡スキームを開発した。この目標のために、ＰＢａｓｅとともにＥ２ニワトリ胚の脊髄に半疎な方法で、卵内で同時エレクトロポレーションした（１．２．３）で述べた３つのベクター（ＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＲＦＰ、ＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＥＧＦＰ、およびＰＢ−ｚＩＤＣＡＧ∞ＩＲＦＰベクター）を用いた。Ｅ６での分析により、様々な異なる色で均一に標識されている心室表面から放射状に移動する細胞の平行な流れが明らかになった。このような分布は、他のアプローチにより脊髄で観察されたクローンパターンに対応していた（Ｌｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｓａｎｅｓ，１９９５；Ｌｏｕｌｉｅｒら，２０１４）。細胞は、３つの蛍光マーカの豊富な組合せを発現し、単色のクローン標識で必要な密度よりも高い全体的な標識密度でクローンを同定することを可能にした。ＰＢ−ＩＤベクターを用いて観察された色パレットは、以前のトランスポゾンベースの多色系統追跡方法で得られたものと同じかそれ以上に拡張されていた。したがって、ＰＢ−ＩＤスイッチは、クローンに関連する細胞の群および／または他のクローンに対するそれらの境界を標識し、マッピングするための効率的なツールである。
【０１６１】
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【図１Ａ】
2021522838.tif 000003
【図１Ｂ】
2021522838.tif 000004
【図１Ｃ】
2021522838.tif 000005
【図１Ｄ】
2021522838.tif 000006
【図２Ａ】
2021522838.tif 000007
【図２Ｂ１】
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【図２Ｂ２】
2021522838.tif 000009
【図３Ａ】
2021522838.tif 000010
【図３Ｂ】
2021522838.tif 000011
【図４Ａ】
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【図４Ｂ１】
2021522838.tif 000013
【図４Ｂ２】
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【図５Ａ】
2021522838.tif 000015
【図５Ｂ１】
2021522838.tif 000016
【図５Ｂ２】
2021522838.tif 000017
【図６Ａ】
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【図７Ａ１】
2021522838.tif 000019
【図７Ａ２】
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【図７Ａ３】
2021522838.tif 000021
【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
2021522838.tif 000023
【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
2021522838.tif 000027
【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ１】
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【図１４Ｂ２】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ１】
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【図１５Ｂ２】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ１】
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【図１６Ｂ２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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