(57)【要約】  一態様において、異種発現カセットを含む操作された造血幹細胞が、提供される。一部の実施形態において、発現カセットは、１α−ヒドロキシラーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動的に連結されたプロモーターを含み、１α−ヒドロキシラーゼタンパク質は、ヒトシトクロムＰ４５０ファミリー２７サブファミリーＢメンバー１（ＣＹＰ２７Ｂ１）である。
2021526865.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種発現カセットを含む操作された造血幹細胞であって、前記発現カセットが、１α−ヒドロキシラーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動的に連結されたプロモーターを含み、前記１α−ヒドロキシラーゼタンパク質が、ヒトシトクロムＰ４５０ファミリー２７サブファミリーＢメンバー１（ＣＹＰ２７Ｂ１）である、操作された造血幹細胞。
【請求項２】
前記プロモーターが、構成的に活性なプロモーターである、請求項１に記載の操作された造血幹細胞。
【請求項３】
前記プロモーターが、ＳＦＦＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＥＦ１αプロモーターまたはＣＭＶプロモーターである、請求項２に記載の操作された造血幹細胞。
【請求項４】
前記プロモーターが、組織特異的プロモーターである、請求項１に記載の操作された造血幹細胞。
【請求項５】
前記プロモーターが、誘導可能なプロモーターである、請求項１に記載の操作された造血幹細胞。
【請求項６】
前記造血幹細胞が、ヒトである、請求項１に記載の操作された造血幹細胞。
【請求項７】
前記造血幹細胞が、臍帯血由来細胞である、請求項１に記載の操作された造血幹細胞。
【請求項８】
前記造血幹細胞が、骨髄由来細胞である、請求項１に記載の操作された造血幹細胞。
【請求項９】
前記造血幹細胞が、５−アザシチジンで処置された対象から入手される、請求項１に記載の操作された造血幹細胞。
【請求項１０】
前記操作された造血幹細胞が、ＣＹＰ２７Ｂ１を過剰発現する、請求項１に記載の操作された造血幹細胞。
【請求項１１】
前記操作された造血幹細胞が、１つまたは複数のサイトカインで刺激される、請求項１に記載の操作された造血幹細胞。
【請求項１２】
前記異種発現カセットを含むベクターを含む、請求項１に記載の操作された造血幹細胞。
【請求項１３】
前記ベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項１２に記載の操作された造血幹細胞。
【請求項１４】
請求項１に記載の操作された造血幹細胞の集団を含み、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、医薬組成物。
【請求項１５】
白血病を有するヒト対象を処置する方法であって、前記対象に操作された造血幹細胞の集団または操作された造血幹細胞の集団を含む医薬組成物を投与する工程を含み、前記操作された造血幹細胞が、ヒトＣＹＰ２７Ｂ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動的に連結されたプロモーターを含む異種発現カセットを含む、方法。
【請求項１６】
前記白血病が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＡＭＬが、ＡＭＬサブタイプＭ０、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６またはＭ７である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＡＭＬが、ＦＬＴ３内に突然変異を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＡＭＬが、ＦＬＴ３内に内部直列重複（ＩＴＤ−ＦＬＴ３）を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が、成人である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象が、若年者である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記プロモーターが、構成的に活性なプロモーターである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記プロモーターが、組織特異的プロモーターである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記プロモーターが、誘導可能なプロモーターである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記対象が、前記操作された造血幹細胞の投与の１日以内に５−アザシチジンで事前に処置されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記操作された造血幹細胞が、対象に対して自家である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
前記自家細胞が、５−アザシチジンによる処置後に前記対象から入手される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記操作された造血幹細胞が、対象に対して同種である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
前記操作された造血幹細胞が、１つまたは複数のサイトカインで刺激される、請求項１５に記載の方法。
【請求項３０】
前記操作された造血幹細胞が、全身的に投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項３１】
前記操作された造血幹細胞が、注入または注射によって投与される、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、高齢者を主に冒す血液がんである。ＡＭＬに対する従来の処置は、化学療法により白血病性芽球に細胞障害効果を送達することに主に焦点を合わせてきた。しかしながら、多くの高齢患者は、この集中的な治療的レジメンに耐えることができない。例えば年齢の進行のため、標準的な導入化学療法を受けることから除外される患者の場合、予後は悪く、生存期間の中央値は５〜１０カ月間である。Dohner et al., N Engl J Med, 2015, 373:1136-1152。したがって、ＡＭＬを処置するための方法および組成物の必要性が残っている。
【発明の概要】
【０００２】
一態様において、操作された造血幹細胞が提供される。一部の実施形態において、操作された造血幹細胞は、異種発現カセットを含み、発現カセットは、１α−ヒドロキシラーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動的に連結されたプロモーターを含み、１α−ヒドロキシラーゼタンパク質は、ヒトシトクロムＰ４５０ファミリー２７サブファミリーＢメンバー１（ＣＹＰ２７Ｂ１）である。
一部の実施形態において、プロモーターは、構成的に活性なプロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは、ＳＦＦＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＥＦ１αプロモーターまたはＣＭＶプロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは、誘導可能なプロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。
一部の実施形態において、造血幹細胞はヒトである。一部の実施形態において、造血幹細胞は臍帯血由来細胞である。一部の実施形態において、造血幹細胞は骨髄由来細胞である。一部の実施形態において、造血幹細胞は、５−アザシチジンで処置された対象から入手される。
【０００３】
一部の実施形態において、操作された造血幹細胞は、ＣＹＰ２７Ｂ１を過剰発現する。一部の実施形態において、操作された造血幹細胞は、異種発現カセットを欠く造血幹細胞と比較して少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも７５倍または少なくとも１００倍濃度の活性１，２５−ＶＤ３を産生する。
一部の実施形態において、操作された造血幹細胞は、１つまたは複数のサイトカインで刺激される。
一部の実施形態において、操作された造血幹細胞は、異種発現カセットを含むベクターを含む。一部の実施形態において、ベクターは、レンチウイルスベクターである。
別の態様において、本明細書に開示される操作された造血幹細胞の集団を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、医薬組成物は、操作された造血幹細胞の集団を含み、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
【０００４】
さらに別の態様において、操作された造血幹細胞を含む治療的方法および操作された造血幹細胞の集団を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、本方法は、白血病を有するヒト対象を処置する方法である。一部の実施形態において、本方法は、対象に操作された造血幹細胞の集団または操作された造血幹細胞の集団を含む医薬組成物を投与する工程を含み、操作された造血幹細胞は、ヒトＣＹＰ２７Ｂ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動的に連結されたプロモーターを含む異種発現カセットを含む。
一部の実施形態において、プロモーターは構成的に活性なプロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは、ＳＦＦＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＥＦ１αプロモーターまたはＣＭＶプロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは誘導可能なプロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは組織特異的プロモーターである。
【０００５】
一部の実施形態において、白血病は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。一部の実施形態において、ＡＭＬは、ＡＭＬサブタイプＭ０、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６またはＭ７である。一部の実施形態において、ＡＭＬは、ＦＬＴ３内に突然変異を含む。一部の実施形態において、ＡＭＬは、ＦＬＴ３内に内部直列重複（ＩＴＤ−ＦＬＴ３）および／またはＦＬＴ３内に点突然変異を含む。
一部の実施形態において、対象は成人である。一部の実施形態において、対象は若年者である。一部の実施形態において、対象は、操作された造血幹細胞の投与の１日以内に５−アザシチジンで事前に処置されている。
一部の実施形態において、操作された造血幹細胞は、対象に対して自家である。一部の実施形態において、自家細胞は、５−アザシチジンによる処置後に対象から入手される。一部の実施形態において、操作された造血幹細胞は、対象に対して同種である。
一部の実施形態において、操作された造血幹細胞は、１つまたは複数のサイトカインで刺激される。
一部の実施形態において、操作された造血幹細胞は、全身的に投与される。一部の実施形態において、操作された造血幹細胞は、注入または注射によって投与される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ＣＹＰ２７Ｂ１酵素の細胞媒介性送達に応答するＡＭＬ細胞の分化を示す図である。ＣＹＰ２７Ｂ１遺伝子を保有する間葉系プロジェニター細胞を、ＶＤ３（左パネル）なし、異なる濃度の２５−ＶＤ３（ＣＹＰ２７Ｂ１遺伝子の不活性基質、中間のパネル）、または陽性対照として活性ＶＤ３（右パネル）と培養した。ＭＯＬＭ１４細胞を４８時間で採集し、分化マーカーＣＤ１４の発現についてフローサイトメトリーによって判定した。ＭＯＬＭ１４  ＡＭＬ細胞は、ＣＤ１４発現において用量依存的増大を示した。
【図２Ａ】ＶＤ３およびＡＺＡの併用処置の相乗効果を示す図である。ＭＯＬＭ１４および初代ヒトＡＭＬ細胞を、活性ＶＤ３およびＡＺＡを単独、並びに併用して４８時間処置した。（Ａ）は、処置終了時に、ＭＯＬＭ１４細胞を、ＣＤ１４分化マーカーの発現、および生存度色素による染色に対してフローサイトメトリーによりアッセイした。併用処置は、有意により少ない生存芽球を示した（象限４、差し込み図にグラフで示した）。
【図２Ｂ】ＶＤ３およびＡＺＡの併用処置の相乗効果を示す図である。ＭＯＬＭ１４および初代ヒトＡＭＬ細胞を、活性ＶＤ３およびＡＺＡを単独、並びに併用して４８時間処置した。（Ｂ）は、処置後のＭＯＬＭ１４の細胞周期分析は、活性ＶＤ３がＤＮＡ合成を阻害し、ＡＺＡがアポトーシスを増大させ、併用処置が両方を増大させたことを示した。
【図２Ｃ】ＶＤ３およびＡＺＡの併用処置の相乗効果を示す図である。ＭＯＬＭ１４および初代ヒトＡＭＬ細胞を、活性ＶＤ３およびＡＺＡを単独、並びに併用して４８時間処置した。（Ｃ）は、異なる５つのＡＭＬサブタイプ、細胞遺伝学および分子突然変異を持つＡＭＬ患者試料のｅｘ  ｖｉｖｏデータである。併用処置は、５名の患者全てにおいて芽球の最も大きな減少をもたらした。
【図３Ａ】ＣＹＰ２７Ｂ１−ルシフェラーゼ−ＧＦＰ形質導入ＭＯＬＭ１４細胞の樹立を示す図である。生ＭＯＬＭ１４細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで追跡するのに役立つように、新たなレンチウイルス構築物ＣＹＰ２７Ｂ１−ルシフェラーゼ−ＧＦＰを構築した。ＭＯＬＭ１４細胞への高効率のウイルス形質導入後、ＣＹＰ２７Ｂ１−ルシフェラーゼ−ＧＦＰ形質導入されたＭＯＬＭ１４（ＣＬＧＭ１４）細胞株が生成された。次に、ＣＬＧＭ１４細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで機能的に試験した。（Ａ）は、Ｄ−ルシフェリンをＣＬＧＭ１４細胞に添加して、ルシフェラーゼ活性を試験した。ＣＬＧＭ１４細胞は基質を変換し、生物発光を生成した。
【図３Ｂ】ＣＹＰ２７Ｂ１−ルシフェラーゼ−ＧＦＰ形質導入ＭＯＬＭ１４細胞の樹立を示す図である。生ＭＯＬＭ１４細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで追跡するのに役立つように、新たなレンチウイルス構築物ＣＹＰ２７Ｂ１−ルシフェラーゼ−ＧＦＰを構築した。ＭＯＬＭ１４細胞への高効率のウイルス形質導入後、ＣＹＰ２７Ｂ１−ルシフェラーゼ−ＧＦＰ形質導入されたＭＯＬＭ１４（ＣＬＧＭ１４）細胞株が生成された。次に、ＣＬＧＭ１４細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで機能的に試験した。（Ｂ）は、さらに、ＣＬＧＭ１４細胞が、顕微鏡検査下で緑色蛍光（ＧＦＰ）を示すことが観察された。
【図３Ｃ】ＣＹＰ２７Ｂ１−ルシフェラーゼ−ＧＦＰ形質導入ＭＯＬＭ１４細胞の樹立を示す図である。生ＭＯＬＭ１４細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで追跡するのに役立つように、新たなレンチウイルス構築物ＣＹＰ２７Ｂ１−ルシフェラーゼ−ＧＦＰを構築した。ＭＯＬＭ１４細胞への高効率のウイルス形質導入後、ＣＹＰ２７Ｂ１−ルシフェラーゼ−ＧＦＰ形質導入されたＭＯＬＭ１４（ＣＬＧＭ１４）細胞株が生成された。次に、ＣＬＧＭ１４細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで機能的に試験した。（Ｃ）は、２５−ＶＤ３をＣＬＧＭ１４細胞に添加して、細胞分化を誘導した。フローサイトメトリーは、対照（２５−ＶＤ３の添加なし）におけるより少ないＣＤ１４＋細胞と比較して、２５−ＶＤ３でより多くのＣＤ１４＋（単球マーカー）ＭＯＬＭ１４細胞を示す。
【図４】ＭＴＴアッセイが、併用療法の相乗効果を明らかにすることを示す図である。ＨＬ−６０細胞（上パネル）およびＭＯＬＭ−１４細胞（下パネル）を、９６ウェルプレート中で培養し、様々な組み合わせのＶＩＤＡＺＡ（登録商標）（アザシチジン）および活性ＶＤ３で４８時間処置した。ＭＴＴアッセイを使用して処置による抗増殖性効果を測定し、組み合わせインデックス（ＣＩ）を算出して相乗効果を評価した（相乗効果＝ＣＩ＜１）。相乗処置条件は、太字の赤色文字列で示される。
【図５】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＹＰ２７Ｂ１−ＬＵＣ−ＧＦＰを過剰発現する患者由来ＨＳＣの生成を示す図である。上パネル：ヒトＣＤ３４＋細胞を、製造業者のプロトコールに従ってＣＤ２４  ＭｉｃｒｏＢｅａｄ  ＫｉｔおよびＭＡＣＳ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＡＭＬ患者末梢血から単離した。下パネル：ＣＹＰ２７Ｂ１−ＬＵＣ−ＧＦＰウイルス形質導入を実行し、ＦＡＣＳ分析によって６２．３％のＣＹＰ−ＧＦＰ＋ＣＤ３４＋ＨＳＣを得た。
【図６】ＭＶ４−１１  ＡＭＬ細胞株を、ＣＤ１４分化マーカーの発現および生存度色素による染色に対してフローサイトメトリーによってアッセイした図である。併用処置は、生存芽球（ゲーティング戦略における生存／ＣＤ１４−細胞）のパーセンテージを無処置による９５．５％（ｐ＜０．０５）および５μＭ  ＡＺＡ単独による７４．８％（ｐ＜０．０５）から３４．１％に有意に減少させた。８０ｎＭ  １，２５−Ｄ３単独療法は、５μＭ  ＡＺＡ単独と比較して、３８．５％対７４．８％（ｐ＜０．０５）でより多くの芽球を減少させた。
【図７】ＦＬＴ３−ＩＴＤ患者の初代細胞試料を、ＣＤ１４分化マーカーの発現および生存度色素による染色に対してフローサイトメトリーによってアッセイした図である。５μＭ  ＶＩＤＡＺＡ（登録商標）＋８０ｎＭ  ＶＤ３による併用処置は、対照と比較して、無処置（ｐ＜０．０５）による６８．２％、８０ｎＭ  １，２５−Ｄ３単独による６１．８％（ｐ＜０．０５）および５μＭ  ＡＺＡ単独による４２．６％（ｐ＜０．０５）から３６．６％へと芽球細胞の最も有意な減少を示した。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
Ｉ．導入
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の処置のための分化療法の組成物および方法が、本明細書に開示される。ＡＭＬ細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける活性ビタミンＤ（ＶＤ３）への曝露後に分化を受けることがこれまでに示されてきた。しかしながら、この手法の臨床的成功は、高用量ＶＤ３による全身性高カルシウム血症によって限定される。本明細書に開示されるように、造血幹細胞を操作して１α−ヒドロキシラーゼを過剰発現させ、それによりｉｎ  ｓｉｔｕで活性ＶＤ３の高い局所レベルを作って、白血病性芽球の分化を促進させ得ることが判明した。特定の理論に束縛されるものではないが、これらの操作された造血幹細胞を用いる養子療法は、オフターゲット高カルシウム血症なしに局所標的への高濃度のＶＤ３の送達を達成すると考えられる。
【０００８】
加えて、化学療法剤５−アザシチジン（ＡＺＡ）および活性ＶＤ３が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏで白血病細胞に対して相乗的に作用することが、驚くべきことに判明した。例えば図２Ａ−図２Ｃを参照のこと。したがって、一態様において、本開示は、操作された造血幹細胞の投与前にＡＺＡを使用して、骨髄を条件づける組成物および方法を提供する。
【０００９】
ＩＩ．定義
本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになるので、本明細書に使用される専門用語は、特定の実施形態だけを記載することを目的とし、限定されることを意図するものではない。別段の規定がない限り、本明細書に使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書および以下の特許請求の範囲において、反対の意図が明らかでない限り、参照は、以下の意味を有すると定義されるものとするいくつかの用語に作られることになる。一部の場合において、一般に理解されている意味を持つ用語が、明瞭さおよび／または簡単な参照のために本明細書において定義され、本明細書にそのような定義を含めることは、当業者に一般に理解されている用語の定義に対する実質的な差異を表すと解釈されるべきでない。
【００１０】
全ての数値表記、例えばｐＨ、温度、時間、濃度および分子量は、範囲を含めて、必要に応じて０．１または１．０の増分により（＋）または（−）変化する近似値である。必ずしも明確に記載されるわけではないが、全ての数値表記が、用語「約」の後にあることは理解されるべきである。
単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈に別段の明確な指図がない限り複数の指示対象を含む。したがって例えば、「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」への参照は、複数の化合物（ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）を含む。
用語「含む」は、化合物、組成物および方法が、列挙された要素を含むが、他を排除しないことを意味することを目的とする。「本質的になる」は、化合物、組成物および方法を定義するために使用される場合、請求される本発明の基礎となる新規の特性に具体的に影響を及ぼすだろう他の要素を排除することを意味するものとする。「からなる」は、請求項で指定されていないあらゆる要素、ステップまたは成分を排除することを意味するものとする。これら転換用語のそれぞれによって定義される実施形態は、この発明の範囲内である。
【００１１】
本明細書では、「１α−ヒドロキシラーゼ」とは、２５−ヒドロキシビタミンＤ−１アルファヒドロキシラーゼのことを指す。１α−ヒドロキシラーゼは、２５−ヒドロキシビタミンＤ３［２５（ＯＨ）Ｄ］の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３［１，２５（ＯＨ）2Ｄ］への変換を触媒する酵素である。１α−ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子は、ヒトシトクロムＰ４５０ファミリー２７サブファミリーＢメンバー１（ＣＹＰ２７Ｂ１）である。ヒトＣＹＰ２７Ｂ１  ｍＲＮＡおよび１α−ヒドロキシラーゼタンパク質の配列は、例えば、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００７８５．３およびＮＰ＿０００７７６．１にそれぞれ示される。一部の実施形態において、本明細書に記載の造血幹細胞は、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００７７６．１に示される１α−ヒドロキシラーゼタンパク質と少なくとも７０％、少なくとも７５％少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有する１α−ヒドロキシラーゼタンパク質を発現するように操作されている。
【００１２】
２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈において、用語「同一の」または「パーセント同一性」とは、指定された領域にわたって同一のアミノ酸残基若しくはヌクレオチドまたは指定されたパーセンテージ（例えば、約６０％同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはより高い同一性）で同一のアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有する２つ以上の配列のことを指す。ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を比較し、パーセント同一性を決定する方法は、当技術分野に記載されている。例えば、参照により本明細書に組み込まれるRoberts et al., BMC Bioinformatics, 7:382, 2006を参照のこと。
【００１３】
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書において互換的に使用され、一本鎖若しくは二本鎖いずれかの形態およびその相補形のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマーのことを指す。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドはＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）である。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。特に明記しない限り、特定の核酸配列は、保存的に修飾されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換）、多形性バリアント（例えば、ＳＮＰ）、スプライスバリアント、およびタンパク質の切断型をコードしている核酸配列、相補配列、並びに明確に示される配列も暗黙のうちに包含する。
用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書において互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーのことを指す。本明細書では、本用語は、全長タンパク質および短縮タンパク質を含めた任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。
【００１４】
本明細書では用語「プロモーター」とは、細胞内でコード配列の転写を駆動する能力があるポリヌクレオチド配列のことを指す。一部の実施形態において、プロモーターは、遺伝子の転写のタイミング並びに／または速度の調節若しくは変調に関係するシス作動性転写制御因子および調節配列を含む。例えば、プロモーターは、エンハンサー、プロモーター、転写ターミネータ、複製起点、染色体組み込み配列、５’および３’非翻訳領域、または転写調節に関係するイントロン配列を含めたシス作動性転写制御因子であり得る。これらのシス作動性配列は、タンパク質または他の生体分子と一般に相互作用して、遺伝子転写を実行する（例えば、オン／オフ、調節、変調）。「構成的プロモーター」は、ほとんど全ての組織型において転写を開始する能力があるプロモーターであり、一方で「組織特異的プロモーター」は、１つまたは少数の特定の組織型においてのみ転写を開始する。
【００１５】
ポリヌクレオチド配列は、外来種起源である場合、または同一種起源でも元の形態から修飾されている場合、生物または第２のポリヌクレオチド配列に対して「異種性」である。例えば、プロモーターが、異種性コード配列に作動的に連結されていると言われる場合、それは、コード配列が１つの種から得られる一方でプロモーター配列が別の異なる種から得られることを意味し；または両方とも同一種から得られる場合、コード配列は、プロモーターと天然では関連がない（例えば、プロモーターは、同一種内の異なる遺伝子由来である）。
本明細書では、「対象」は哺乳動物であり、一部の実施形態においてヒトである。哺乳動物は、家畜（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、等）、競技用動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウスおよびラットも含み得るが、これに限定されない。
本明細書では、用語「処置」、「処置する」および「処置」とは、傷害、疾患若しくは症状の処置若しくは改良における任意の成功の兆候のことを指し、軽減；寛解；徴候の減弱、または対象にとって傷害、疾患若しくは症状をより耐えられるようにする；変性若しくは衰弱の速度を遅らせる；変性の最終点をより衰弱させない；および／または対象の身体的若しくは精神的幸福感を改善するなどあらゆる客観的若しくは主観的パラメータを含む。
【００１６】
本明細書では、薬剤（例えば、本明細書に記載の操作された造血幹細胞、操作された造血幹細胞の集団または操作された造血幹細胞を含む医薬組成物）の「治療量」または「治療有効量」は、対象において疾患（例えば、急性骨髄性白血病）の徴候の重症度を予防する、緩和する、軽減する、または減少させる薬剤の量である。例えば、所与のパラメータの場合、治療有効量は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、または少なくとも１００％の治療的効果の増減を示すことになる。治療有効性は、「倍」増減としても表され得る。例えば、治療有効量は、対照に比べて少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、５倍またはより高い効果を有し得る。
【００１７】
本明細書では用語「投与」、「投与される」または「投与する」とは、ヒトなどの対象または患者に薬剤（例えば、本明細書に記載の操作された造血幹細胞、操作された造血幹細胞の集団または操作された造血幹細胞を含む医薬組成物）を導入することを指す。本明細書では、その用語は、直接投与（例えば、自己投与または医療専門家による患者への投与）および間接投与（例えば、対象に化合物または組成物を処方する行為）の両方を包含する。
本明細書では、用語「医薬組成物」とは、対象への投与に適した組成物のことを指す。一般的に、医薬組成物は、無菌であり、対象に望ましくない応答を誘発する可能性がある汚染物質を好ましくは含まない。医薬組成物は、経口、静脈内、口腔、直腸、非経口、腹膜内、真皮内、気管内、筋肉内、皮下、吸入、その他を含めた異なる多数の投与経路によってそれを必要とする対象へ投与するために設計され得る。
【００１８】
ＩＩＩ．操作された造血幹細胞
一態様において、本開示は、１α−ヒドロキシラーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現するまたは過剰発現するために操作された造血幹細胞（ＨＳＣ）を提供する。一部の実施形態において、ＨＳＣは、１α−ヒドロキシラーゼタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ＨＳＣは、１α−ヒドロキシラーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む異種発現カセットを含む。
本開示の操作されたＨＳＣの場合、細胞は、任意の適切な供給源から入手されるまたは得られ得る。一部の実施形態において、ＨＳＣは骨髄由来細胞である。一部の実施形態において、ＨＳＣは臍帯血由来細胞である。一部の実施形態において、ＨＳＣは末梢血由来細胞である。ＨＳＣを単離および生成する方法は、当業者に公知である。例えば、Horwitz, 2007, "Sources of Human and Murine Hematopoietic Stem Cells," Current Protocols in Immunology, 79:A:22A:2:22A.2.1-22A.2.6を参照のこと。
【００１９】
一部の実施形態において、ＨＳＣは、ヒト対象から得られる。一部の実施形態において、ＨＳＣは、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウスから得られる。一部の実施形態において、ＨＳＣは、対象（例えば、白血病の処置のために操作されたＨＳＣを投与しようとする対象）に対して自家である。一部の実施形態において、ＨＳＣは、対象に対して同種である。一部の実施形態において、ＨＳＣは、化学療法剤、例えば、５−アザシチジンを投与された対象から入手される。例えば、一部の実施形態において、ＨＳＣは、化学療法剤、例えば、５−アザシチジンによる導入療法および末梢血計数の回復後に対象（例えば、ヒト対象またはヒト以外の哺乳動物）から入手される。ＨＳＣを入手する方法は当業者に公知である。例えば、ＨＳＣは、骨髄穿刺によってまたは移動性末梢血細胞のアフェレーシスによって入手され得る。
【００２０】
一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ヒトシトクロムＰ４５０ファミリー２７サブファミリーＢメンバー１（ＣＹＰ２７Ｂ１）（例えば、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００７８５．３またはそのバリアントのポリヌクレオチド配列）である１α−ヒドロキシラーゼタンパク質をコードする。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００７７６．１に示される１α−ヒドロキシラーゼタンパク質の配列を有するヒト１α−ヒドロキシラーゼタンパク質またはそのバリアント（例えば、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００７７６．１に示される１α−ヒドロキシラーゼタンパク質と少なくとも７０％、少なくとも７５％少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するタンパク質）をコードする。
【００２１】
一部の実施形態において、ヒトＣＹＰ２７Ｂ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに作動的に連結されている。一部の実施形態において、プロモーターは構成的に活性なプロモーターである。適切なプロモーターの例には、脾臓フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ＥＦ１αプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ニワトリ肉腫ウイルスプロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、マローニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーターまたはエプスタインバーウイルス前初期プロモーターがあるが、これに限定されない。一部の実施形態において、プロモーターは、ＳＦＦＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＥＦ１αプロモーターまたはＣＭＶプロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは、誘導可能なプロモーター（例えば、テトラサイクリン誘導可能なプロモーター）である。一部の実施形態において、プロモーターは、組織特異的プロモーター（例えば、造血細胞特異的プロモーター）である。
【００２２】
一部の実施形態において、操作されたＨＳＣは、１α−ヒドロキシラーゼタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドに作動的に連結されたプロモーター（例えば、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００７８５．３のポリヌクレオチド配列などのヒトＣＹＰ２７Ｂ１ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに作動的に連結された構成的に活性なプロモーター）を含む発現カセットを含む。一部の実施形態において、操作されたＨＳＣは、１α−ヒドロキシラーゼタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドに作動的に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含むベクターを含む。
【００２３】
一部の実施形態において、１α−ヒドロキシラーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ウイルスまたはウイルスベクターを使用してＨＳＣ内で発現される。一部の実施形態において、ウイルスは、アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはレトロウイルスである。一部の実施形態において、ウイルスは、レンチウイルスである。１α−ヒドロキシラーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するウイルスおよびウイルスベクターは、それだけには限らないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿またはリポフェクションなど当業者に公知の方法によってＨＳＣに導入され得る。
【００２４】
一部の実施形態において、操作されたＨＳＣ（例えば、本明細書に開示される発現カセットまたはベクターを含む操作されたＨＳＣ）は、異種ポリヌクレオチドを欠いているＨＳＣと比較して、１α−ヒドロキシラーゼタンパク質を過剰発現する。一部の実施形態において、異種ポリヌクレオチドを含む操作されたＨＳＣは、異種ポリヌクレオチドを欠いているＨＳＣより、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍または少なくとも５０倍高いレベルで１α−ヒドロキシラーゼタンパク質を発現する。
【００２５】
タンパク質発現は、当業技術者に公知の免疫アッセイ、二次元ゲル電気泳動並びに定量的質量分析などの通常の技術を使用して検出および定量化され得る。タンパク質定量化技術は、"Strategies for Protein Quantitation," Principles of Proteomics, 2nd Edition, R. Twyman, ed., Garland Science, 2013に一般に記載されている。一部の実施形態において、タンパク質発現は、酵素多重免疫測定法（ＥＭＩＴ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＩｇＭ抗体捕捉ＥＬＩＳＡ（ＭＡＣ  ＥＬＩＳＡ）および微小粒子酵素免疫測定法（ＭＥＩＡ）などの酵素免疫測定法（ＥＩＡ）；キャピラリー電気泳動免疫アッセイ（ＣＥＩＡ）；放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）；免疫放射線測定法（ＩＲＭＡ）；免疫蛍光（ＩＦ）；蛍光偏光免疫測定法（ＦＰＩＡ）；並びに化学発光アッセイ（ＣＬ）などがあるがこれに限定されない免疫アッセイによって検出される。一部の実施形態において、タンパク質発現は、定量的質量分析、例えば、それだけには限らないが、スペクトル計数ＭＳ、イオン強度ＭＳ、代謝標識［例えば、細胞培養におけるアミノ酸による安定同位体標識（ＳＩＬＡＣ）］、酵素的標識、同位体標識［例えば、同位体コード化タンパク質標識（ＩＣＰＬ）または同位体コード化親和性タグ（ＩＣＡＴ）］および等圧標識［例えば、タンデム質量タグ（ＴＭＴ）］によって検出される。
【００２６】
一部の実施形態において、１α−ヒドロキシラーゼタンパク質を過剰発現する操作されたＨＳＣ（例えば、本明細書に開示される発現カセットまたはベクターを含む操作されたＨＳＣ）は、異種ポリヌクレオチドを欠いているＨＳＣより多量または高濃度の活性１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（ＶＤ３）を産生する。例えば、一部の実施形態において、１α−ヒドロキシラーゼタンパク質を過剰発現する操作されたＨＳＣは、異種ポリヌクレオチドを欠いているＨＳＣによって産生される活性ＶＤ３の量若しくは濃度より少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍または少なくとも１００倍多量若しくは高濃度の活性ＶＤ３を産生する。一部の実施形態において、活性ＶＤ３の産生は、不活性ＶＤ３［２５（ＯＨ）−Ｄ３］の存在下で細胞（例えば、１α−ヒドロキシラーゼタンパク質を過剰発現する操作されたＨＳＣ）を数時間、例えば、２４時間、４８時間または７２時間培養し、１，２５（ＯＨ）２−Ｄ３について細胞上清をその後定量的に分析することによって測定される。１，２５（ＯＨ）２−Ｄ３について細胞上清を定量的に分析する方法は、当業者に公知である。一部の実施形態において、質量分析または液体クロマトグラフィー質量分析を使用して、１，２５（ＯＨ）２−Ｄ３について細胞上清を定量的に分析する。一実施形態において、活性ＶＤ３産生は、下記実施例の節に開示されている方法にしたがって測定される。
【００２７】
一部の実施形態において、操作されたＨＳＣをｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させて、操作されたＨＳＣの集団を形成する。ＨＳＣを拡大する方法は、当業技術に記載されている。例えば、Kumar et al., Trends Mol Med, 2017, 23:799-819を参照のこと。一部の実施形態において、操作されたＨＳＣは、拡大培地、例えば、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ）の存在下で拡大される。一部の実施形態において、拡大は、１つ若しくは複数の成長因子またはサイトカインの存在下（例えば、１つ若しくは複数の成長因子またはサイトカインで補充された拡大培地中）で起こる。
【００２８】
一部の実施形態において、操作されたＨＳＣまたは操作されたＨＳＣの集団は、１つ若しくは複数のサイトカインまたは走化性因子で刺激される。特定の理論に束縛されるものではないが、骨髄中に放出されたサイトカインまたは走化性因子でＨＳＣを処置することは、骨髄へのＨＳＣのホーミングおよびその後の生着の効率を改善し得ると考えられる。適切な走化性因子には、α−ケモカイン間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、生理活性リンスフィンゴ脂質であるスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）およびセラミド（ｃｅｒａｍｉｄ）−１−リン酸（Ｃ１Ｐ）などがあるが、これに限定されない。適切なサイトカインには、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ−３、ＩＬ−６およびＩＬ−１１があるが、これに限定されない。一部の実施形態において、操作されたＨＳＣまたは操作されたＨＳＣの集団は、ＳＣＦおよび／またはＩＬ−３で処置される。
一部の実施形態において、本明細書に記載の操作されたＨＳＣまたは操作されたＨＳＣの集団を含む組成物が、提供される。一部の実施形態において、組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。本発明において使用する製剤を調製する指針は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Philadelphia, PA. Lippincott Williams & Wilkins, 2005、に見られる。
【００２９】
一部の実施形態において、医薬組成物は、許容可能な担体および／または賦形剤を含む。薬学的に許容可能な担体には、生理的に適合し、治療的薬剤の活性に好ましくは干渉しない、さもなければ活性を阻害しない任意の溶媒、分散媒またはコーティング剤がある。一部の実施形態において、担体は、静脈内、筋肉内、経口、腹膜内、経皮、局所または皮下投与に適している。薬学的に許容可能な担体は、例えば、組成物を安定化するまたは活性薬剤の吸収を増大若しくは減少させるように働く１つ若しくは複数の生理的に許容可能な化合物を含有することができる。生理的に許容可能な化合物には、例えば、グルコース、スクロース若しくはデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸若しくはグルタチオンなどの酸化防止剤、キレート薬、低分子量タンパク質、活性薬剤のクリアランス若しくは加水分解を減少させる組成物、または賦形剤若しくは他の安定化剤および／若しくは緩衝液があり得る。他の薬学的に許容可能な担体およびその製剤は周知であり、例えば、上記のRemington: The Science and Practice of Pharmacyに一般に記載されている。様々な薬学的に許容される賦形剤が当業者に周知であり、例えば、Handbook of Pharmaceutical Excipients (5th ed., Ed. Rowe et al., Pharmaceutical Press, Washington, D.C.)に見ることができる。
【００３０】
注射または注入による投与のために、操作されたＨＳＣまたは操作されたＨＳＣの集団は、植物性若しくは他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステルまたはプロピレングリコールなどの水溶性若しくは非水性溶媒中に；必要に応じて、可溶化剤、等張化剤、懸濁化剤、安定化剤および防腐剤などの従来通りの添加物と一緒に、それらを溶解、懸濁若しくは乳化させることによって調剤に製剤化され得る。一部の実施形態において、ハンクス溶液、リンガー溶液などの生理的に適合する緩衝液、または生理的食塩水緩衝液などの水溶性溶液が使用される。製剤は、添加された防腐剤を含む単位剤形、例えば、アンプルまたは多回投与用容器で存在し得る。
【００３１】
ＩＶ．処置の方法
別の態様において、ＡＭＬなどの白血病を処置するための治療的方法が、提供される。一部の実施形態において、白血病を有するヒト対象を処置する方法が、提供される。一部の実施形態において、本方法は、対象に操作された造血幹細胞の集団または操作された造血幹細胞の集団を含む医薬組成物を投与する工程を含み、操作された造血幹細胞は、ヒトＣＹＰ２７Ｂ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動的に連結されたプロモーターを含む異種発現カセットを含む。一部の実施形態において、治療的方法は、上の第ＩＩＩ節に開示される操作されたＨＳＣ、操作されたＨＳＣの集団または医薬組成物を投与する工程を含む。
【００３２】
一部の実施形態において、処置される対象は、ＡＭＬを有する。ＡＭＬが、２つの分類体系、フランス−アメリカ−イギリス（ＦＡＢ）分類および世界保健機構（ＷＨＯ）分類のうちの１つにしたがってサブタイプに分類されることは、当業者によって認識されよう。一部の実施形態において、対象は、ＦＡＢ分類によって分類されたＡＭＬの以下のサブタイプのうちの１つを有する：ＦＡＢ分類によって分類される最未分化型骨髄芽球性白血病（Ｍ０）、急性未分化型骨髄芽球性白血病（Ｍ１）、急性分化型骨髄芽球性白血病（Ｍ２）、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）（Ｍ３）、急性骨髄単球性白血病（Ｍ４）、好酸球増加型急性骨髄単球性白血病（Ｍ４  ｅｏｓ）、急性単球性白血病（Ｍ５）、急性赤白血病（ｅｒｙｔｒｏｉｄ）（Ｍ６）または急性巨核球性白血病（Ｍ７）。一部の実施形態において、対象はＡＭＬサブタイプＭ０、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６またはＭ７のうちの１つを有する。
【００３３】
一部の実施形態において、対象は、ＷＨＯ分類によって分類されたＡＭＬの以下のサブタイプのうちの１つを有する：遺伝的異常を伴うＡＭＬ（例えば、染色体８と２１間の転座、染色体１６における転座若しくは逆位、染色体９と１１間の転座、染色体１５と１７間の転座、染色体６と９間の転座、染色体３における転座若しくは逆位、または染色体１と２２間の転座）、骨髄異形成関連変化を伴うＡＭＬ、以前の化学療法または放射線に関連するＡＭＬ、他に特定されないＡＭＬ（例えば、未分化型ＡＭＬ、無成熟ＡＭＬ、分化型ＡＭＬ、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、急性巨核芽球性白血病、急性好塩基性白血病、または線維症を伴う急性汎骨髄症）、骨髄性肉腫、ダウン症候群に関連する骨髄増殖、または未分化および混合形質性急性白血病（リンパマーカーを伴うＡＭＬまたは混合表現型急性白血病とも称される）。
【００３４】
一部の実施形態において、対象は、受容体型チロシンキナーゼＦＬＴ３をコードしている遺伝子に１つまたは複数の突然変異を含むＡＭＬの形態を有する。内部直列重複（ＩＴＤ）または点突然変異などのＦＬＴ３における突然変異は、全ＡＭＬ患者の約１／３で見つかる。Small, Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 2006, 1:178-184。一部の実施形態において、ＡＭＬは、ＦＬＴ３遺伝子内に内部直列重複（ＩＴＤ−ＦＬＴ３）および／またはＦＬＴ３遺伝子内に点突然変異を含む。
一部の実施形態において、処置される対象は、ヒトである。一部の実施形態において、対象は成人である。一部の実施形態において、対象は若年者である。
一部の実施形態において、処置される対象は、５−アザシチジン（ＡＺＡ）で事前に処置されている。一部の実施形態において、処置される対象は、操作された造血幹細胞を投与する１、２、３、４、５、６または７日間以内にＡＺＡで事前に処置されている。一部の実施形態において、対象は、導入療法に適切な投薬量で、ＡＺＡで処置される。一部の実施形態において、対象は、維持療法に適切な投薬量で、ＡＺＡで処置される。ＡＺＡ療法に対する適切な投薬量は、当業者によって容易に決定され得る。
【００３５】
一部の実施形態において、対象に投与される操作された造血幹細胞は、１つ若しくは複数のサイトカインまたは走化性因子で刺激されている。例えば、一部の実施形態において、操作された造血幹細胞は、α−ケモカイン間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）またはセラミド−１−リン酸（Ｃ１Ｐ）などに限定されない走化性因子で刺激される。一部の実施形態において、操作された造血幹細胞は、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ−３、ＩＬ−６およびＩＬ−１１などに限定されないサイトカインで刺激される。一部の実施形態において、操作された造血幹細胞は、ＳＣＦおよび／またはＩＬ−３で刺激される。
一部の実施形態において、対象は、対象にとって自家である操作された造血幹細胞を投与される。一部の実施形態において、対象は、対象にとって同種である操作された造血幹細胞を投与される。一部の実施形態において、造血幹細胞は、対象が、化学療法剤、例えば、５−アザシチジンを投与された後に処置しようとする対象から入手される。例えば、一部の実施形態において、造血幹細胞は、化学療法剤、例えば、５−アザシチジンによる導入療法および末梢血計数のその後の回復後に対象から入手される。一部の実施形態において、造血幹細胞は、（例えば、化学療法剤による導入療法後に）対象から入手され、その細胞を本明細書に開示される通り操作して、１α−ヒドロキシラーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現させ、次いで、操作された細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大して、対象にその後投与される操作された造血幹細胞の集団を形成する。
【００３６】
操作されたＨＳＣまたは操作されたＨＳＣを含む医薬組成物（例えば、上の第ＩＩＩ節に記載）の投与経路は、経口、腹膜内、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、吸入、局所、病巣内、直腸、気管支内、リンパ腺内、真皮内、鼻、経粘膜、腸、眼若しくは耳送達、または当業者に公知の他の任意の方法であり得る。一部の実施形態において、本明細書に記載の操作されたＨＳＣ、操作されたＨＳＣの集団または操作されたＨＳＣを含む医薬組成物は、静脈注射または皮下注射によって投与される。一部の実施形態において、本明細書に記載の操作されたＨＳＣ、操作されたＨＳＣの集団または操作されたＨＳＣを含む医薬組成物は、全身的に投与される。一部の実施形態において、本明細書に記載の操作されたＨＳＣ、操作されたＨＳＣの集団または操作されたＨＳＣを含む医薬組成物は、局所投与される。
【００３７】
本開示の操作されたＨＳＣの投薬量および所望の濃度は、想定される特定の使用に応じて変動し得る。適当な投薬量または投与経路の決定は、当業者に周知である。一般に、対象に投与される細胞および／または組成物の量は、治療有効量である。一部の実施形態において、操作されたＨＳＣまたは操作されたＨＳＣを含む組成物の治療有効量は、ＡＭＬの１つ若しくは複数の徴候を予防または後退させる量である。例えば、一部の実施形態において、治療有効量は、（例えば、投与当たり）少なくとも約１００、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、または１０，０００，０００個の細胞またはより多い。一部の実施形態において、操作されたＨＳＣまたは操作されたＨＳＣを含む組成物の治療有効量は、約１日に１回、１週間に１回、１週間に２回、１カ月に１回または１カ月に２回投与される。
【００３８】
操作されたＨＳＣ、操作されたＨＳＣの集団および操作されたＨＳＣを含む組成物は、予め定めた時間、不確定の時間、または終点に達するまでそれを必要とする対象に投与されてもよい。一部の実施形態において、処置は、継続的な毎日または毎週の基準で、少なくとも２〜３カ月間、６カ月間、１年間、またはより長く続けられる。一部の実施形態において、処置は、少なくとも３０日間、少なくとも６０日間、少なくとも９０日間、少なくとも１２０日間、少なくとも１５０日間または少なくとも１８０日間である。一部の実施形態において、処置は、少なくとも６カ月間、少なくとも７カ月間、少なくとも８カ月間、少なくとも９カ月間、少なくとも１０カ月間、少なくとも１１カ月間、または少なくとも１年間続けられる。一部の実施形態において、処置は、患者の終生、または投与が、意味のある治療利益を提供するのにもはや効果的でなくなるまで続けられる。
【００３９】
Ｖ．キット
別の態様において、本明細書に記載の操作されたＨＳＣ、操作されたＨＳＣの集団または操作されたＨＳＣ若しくは操作されたＨＳＣの集団を含む医薬組成物を含むキットが提供される。一部の実施形態において、キットは、上の第ＩＩＩ節に開示される操作されたＨＳＣ、操作されたＨＳＣの集団または医薬組成物を含む。
一部の実施形態において、キットは、この開示の方法を実践するための使用法（すなわち、プロトコール）を含有する指示書（例えば、ＡＭＬを処置するためにキットを使用する説明書）をさらに含む。指示書は、書面または印刷物を一般に含むが、それに限定されない。そのような説明書を格納し、最終使用者にそれを通信する能力がある任意の媒体が、この発明によって予期される。そのような媒体には、電子記憶装置媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学式媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ）などがあるが、これに限定されない。そのような媒体は、そのような指示書を提供するインターネットサイトへのアドレスを含んでもよい。
【実施例】
【００４０】
ＶＩ．
以下の例は、請求された発明を例示するために提供されるが、限定するものではない。
【００４１】
（実施例１）
ＣＹＰ２７Ｂ１の細胞媒介性送達に応答するＡＭＬ細胞の分化
この例は、２５［ＯＨ］Ｄ（カルシジオール）を１，２５［ＯＨ］2Ｄ（カルシトリオール）に変換する酵素である２５−ＯＨ−Ｄ３  １−α−ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子ＣＹＰ２７Ｂ１を発現するレンチウイルスベクターによるＡＭＬ細胞株の形質導入について記載する。
プラスミドの調製：５’ＫＯＺＡＫリボソーム進入配列を含む１．６ｋｂのマウスＣＹＰ２７Ｂ１（ｍＣＹＰ２７Ｂ１）ｃＤＮＡ断片を、修飾されたｐＲＳＣ−ＳＦＦＶ−ルシフェラーゼ−Ｅ２Ａ−ＧＦＰ−ＷＰＲＥレンチウイルスベクターにクローニングした。得られた構築物を、ＳＦＦＶ−ＣＹＰ２７Ｂ１−ルシフェラーゼ−Ｅ２Ａ−ＧＦＰ（「ｌｅｎｔｉ−ＣＹＰ−Ｌｕｃ−ＧＦＰ」）と指定した。
レンチウイルス形質導入：６ウェルプレートにおいて１×１０6個細胞／ウェルをウイルス（ＭＯＩ＝２０）５０μＬおよび８μｇ／ｍＬプロタミンを含有する総容積０．５ｍＬの培養培地中で培養した。２４時間後、ウイルスを除去し、培地を補充した。細胞を、さらに２４時間培養し、蛍光顕微鏡下で形質導入効率について調査した。必要に応じて、上記の形質導入手順を、もう１回繰り返した。
【００４２】
ＣＹＰ−ＧＦＰ−Ｃ２Ｃ１２およびＣＹＰ−ＧＦＰ−ＭＯＬＭ−１４の機能性の試験：一連の濃度の２５（ＯＨ）−Ｄ３（不活性ＶＤ３）を、下記表１に示すように３日間（７２時間）培養細胞に添加した。細胞上清を採集し、液体クロマトグラフィー−質量分析（Ｈｅａｒｔｌａｎｄ  Ａｓｓａｙｓ）を使用して１，２５（ＯＨ）2−Ｄ３（活性ＶＤ３）について定量的に分析した。活性ＶＤ３産生アッセイの結果を、下記表１に示す。
ＡＺＡ／１，２５−Ｄ３併用療法の最終分化能力：最終分化を使用して、成熟した単球の表面マーカーであるＣＤ１４の発現を測定する。フローサイトメトリーを使用して、ＣＤ１４マーカー発現を定量化した。
【００４３】
結果：ＭＯＬＭ１４（ヒトＡＭＬ白血病）およびＣ２Ｃ１２（マウス間葉性プロジェニター）細胞株を、ＣＹＰ２７Ｂ１−ＧＦＰレンチウイルスベクターにより高効率（それぞれ９８．８％および９５．６％）で成功裏に形質導入した。これらの細胞は、不活性（２５−ＯＨ−Ｄ３）で補充した共培養において高濃度の活性ＶＤ３を産生することができた（下記表１を参照のこと；正常ヒト血清レベルは０．１ｎＭである）。さらに、図１に示すように、共培養から採集した上清は、ＭＯＬＭ１４  ＡＭＬ細胞の最終分化を誘導した。
【表１】
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【００４４】
（実施例２）
活性ＶＤ３との併用におけるＡＺＡの相乗的抗白血病効果
この例は、ＡＺＡおよび活性ＶＤ３が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏで白血病細胞に対して相乗的に作用することを実証するデータについて記載する。
ＶＤ３とＡＺＡの併用で処置したＭＯＬＭ１４細胞のＭＴＴ減少アッセイを実行して、ＶＤ３とＡＺＡの相乗効果を評価した。ＨＬ−６０およびＭＯＬＭ−１４細胞を、９６ウェルプレート中で培養し、様々な組み合わせのＶＩＤＡＺＡ（登録商標）（アザシチジン）および活性ＶＤ３で４８時間処置した。ＭＴＴアッセイを使用して処置による抗増殖性効果を測定し、組み合わせインデックス（ＣＩ）を算出して相乗効果を評価した（相乗効果＝ＣＩ＜１）。図４に示すように、ＭＴＴ減少アッセイの結果、様々な濃度に対して１未満のＣＩが得られ、その結果は、ＶＤ３とＡＺＡの相乗効果を示す。この相乗効果を、処置したＭＯＬＭ１４細胞が生存度色素およびＣＤ１４（単球に分化したＡＭＬ細胞のマーカー）で染色されているフローサイトメトリーによってさらに確認した（図２Ａ）。
【００４５】
併用処置の機序を説明する研究を行った。ＭＯＬＭ１４細胞を、異なる濃度のＶＩＤＡＺＡ（登録商標）、ＶＤ３、およびそれらの併用で４８時間処置した。処置の４８時間後に、細胞を、細胞周期研究に一般に使用される、ＤＮＡを染色する蛍光化合物である７−ＡＡＤで染色した。図２Ｂに示すように、ＶＩＤＡＺＡ（登録商標）は有意なアポトーシスを引き起こし、ＶＤ３はＤＮＡ合成を阻害した。加えて、図２Ｂに示すように、ＶＩＤＡＺＡ（登録商標）とＶＤ３の併用処置は、アポトーシスの増大およびＤＮＡ合成の阻害の両方をもたらした。
【００４６】
ｅｘ  ｖｉｖｏ実験を実行して、１，２５−Ｄ３／ＡＺＡ併用療法の効果を調査した。５名の患者の白血球除去輸血試料を、Ｌｏｍａ  Ｌｉｎｄａ  Ｂｉｏｓｐｅｃｉｍｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。フローサイトメトリー、細胞遺伝学、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および分子マーカーを含む患者データを再検討し、上の表に整理した。各患者試料を、異なる濃度の１，２５−Ｄ３単独、ＡＺＡ単独および１，２５−Ｄ３／ＡＺＡ併用で次いで処置した。処置の４８時間後に、採集した細胞を、生存色素、一連の芽球ＣＤマーカーで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。図２Ｃに示すように、試験した５つの初代ＡＭＬ患者試料において、単一処置と比較して、併用処置の優れた有効性が観察された。
【００４７】
（実施例３）
骨髄への治療的ＶＤ３のＨＳＣ媒介性送達
この例は、造血幹細胞（ＨＳＣ）が、ＡＭＬの処置のために骨髄（ＢＭ）へ治療的用量のＶＤ３を送達する媒体として使用され得る方法について記載する。
ＣＹＰ２７Ｂ１−ルシフェラーゼ−ＧＦＰレンチウイルスベクターを構築した。５’ＫＯＺＡＫリボソーム進入配列を含む１．６ｋｂのマウスＣＹＰ２７Ｂ１（ｍＣＹＰ２７Ｂ１）ｃＤＮＡ断片を、修飾されたｐＲＳＣ−ＳＦＦＶ−ルシフェラーゼ−Ｅ２Ａ−ＧＦＰ−ＷＰＲＥレンチウイルスベクターにクローニングした。得られた構築物を、ＳＦＦＶ−ＣＹＰ２７Ｂ１−ルシフェラーゼ−Ｅ２Ａ−ＧＦＰ（「ｌｅｎｔｉ−ＣＹＰ−Ｌｕｃ−ＧＦＰ」）と指定した。このベクターを、図３Ａ−図３Ｃに示すように試験した。
【００４８】
ＨＳＣを、ＣＹＰ２７Ｂ１−ルシフェラーゼ−ＧＦＰレンチウイルスベクターで形質導入する。操作されたＨＳＣのホーミングおよび拡大を評価するために、ｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光の画像化を使用して、ＢＭ内に限局されるＨＳＣを最長３週間定量化する。ＣＹＰ２７Ｂ１（ＣＤ４５＋ＧＦＰ＋ＲＦＰ−）を発現するＨＳＣ後代の拡大を、最長３週間、週１回の時点で安楽死させた動物の群から採取したＢＭのフローサイトメトリー分析によって確認する。
治療的処置のために対象（例えば、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物）をＡＺＡ化学療法で前処置して、操作されたＨＳＣのホーミングおよび保持のためにＢＭを条件づける。操作されたＨＳＣを、化学療法の２４時間後に注射する。
治療的処置のために注入されるＣＹＰ２７Ｂ１−ＨＳＣの数を最適化するために、血清カルシウムレベルをマーカーとして使用し得る。１Ｅ５  ＨＳＣを対象に最初に注入し、血清カルシウムレベルを９６時間以内で測定する。血清カルシウムレベルは、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ、Ｍｉｌｐｉｔａｓ、ＣＡ）を使用して測定され得る。高カルシウム血症が検出されない場合、高カルシウム血症が検出されるまで対象（例えば、マウス）に動物当たり１００万個細胞になるまで、１００，０００個の増分で、ＨＳＣの数を増大させながら注入する。最適な数は、１００万個までの、高カルシウム血症を引き起こさない最多数である。
ＶＤ３の局所濃度が白血病性芽球を分化させるのに十分かどうか決定するために、分化した芽球の量を処置後の定義された期間で測定し得る。例えば、ＣＹＰ２７Ｂ１−ＨＳＣを投与したマウスの場合、処置１週間後にマウスを安楽死させ、そのＢＭを採取してフローサイトメトリーによって分化した芽球（ＣＤ１４＋ＲＦＰ＋）を判定できる。
【００４９】
一実験において、ヒトＣＤ３４＋細胞を、製造業者のプロトコールに従ってＣＤ２４  ＭｉｃｒｏＢｅａｄ  ＫｉｔおよびＭＡＣＳ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＡＭＬ患者末梢血から単離した。これらのＣＤ３４＋細胞を１日間培養し、次いでＦＡＣＳ分析を受けた。図５に示すように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤ３４＋ＨＳＣの高い集団を確認した後、ＣＹＰ２７Ｂ１−ＬＵＣ−ＧＦＰウイルス形質導入を実行した。ＦＡＣＳ分析を使用して、細胞の６２．３％が、ＣＹＰ−ＧＦＰ＋ＣＤ３４＋ＨＳＣであることが判明した。これらの細胞を、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ）中で次いで拡大させた。
【００５０】
（実施例４）
１，２５活性ビタミンＤは、ＦＬＴ３−ＩＴＤ  ＡＭＬ細胞株およびｅｘ  ｖｉｖｏ  ＦＬＴ３−ＩＴＤ患者初代細胞両方に作用する
ＦＬＴ３は、ＡＭＬの病因に役割を果たす鍵となる分子のうちの１つである。受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ＦＬＴ３の（ＩＴＤ）内部直列重複または点突然変異は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）症例の１／３に見られる。この遺伝子異常は、受容体の構成的活性化をもたらす可能性があり、したがって、より悪い臨床的予後を伴う増殖刺激を持続させる分子基盤を提供する。
ＡＭＬのサブセットに対する正確な療法におけるビタミンＤの役割を説明するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究において４つのＡＭＬ由来細胞株をスクリーニングした。突然変異対立遺伝子だけを持つＭＶ４−１１細胞株並びに遺伝子の突然変異および野生型バージョンを持つＭＯＬＭ−１４細胞株を含め、２つの細胞株が、ＦＬＴ３遺伝子のＩＴＤを含有した。加えて、ＨＬ−６０およびＴＨＰ−１などＦＬＴ３突然変異を含まないＡＭＬ細胞株２つを、研究に含めた。
【００５１】
ＭＶ４−１１  ＡＭＬ細胞株を、異なる濃度のＶＩＤＡＺＡ（登録商標）、ＶＤ３およびそれらの併用で４８時間処置した。処置４８時間後に、細胞を、生存色素およびＣＤ１４マーカーで染色した。ＣＤ１４は、単芽球の成熟に対するマーカーである。図６に示すように、比較データは、８０ｎＭ  １，２５−Ｄ３＋ＡＺＡ併用療法が、生存芽球（ゲーティング戦略における生存／ＣＤ１４−細胞）のパーセンテージを無処置による９５．５％（ｐ＜０．０５）および５μＭ  ＡＺＡ単独による７４．８％（ｐ＜０．０５）から３４．１％に有意に減少させることを実証した。加えて、８０ｎＭ  １，２５−Ｄ３単独による療法は、５μＭ  ＡＺＡ単独と比較して、３８．５％対７４．８％（ｐ＜０．０５）でより多くの芽球を減少させた。ＶＩＤＡＺＡ（登録商標）／ＶＤ３併用療法のいかなる治療的効果も、ＴＨＰ−１  ＡＭＬ芽球に対して観察されなかった（データ不掲載）。
【００５２】
ｅｘ  ｖｉｖｏアッセイを実行して、ＦＬＴ３−ＩＴＤ患者初代細胞においてＶＩＤＡＺＡ（登録商標）／ＶＤ３併用療法に誘導されるＣＤ１３＋ＣＤ１１７＋芽球減少について試験した。患者試料（患者２４３１）を、異なる濃度のＶＩＤＡＺＡ（登録商標）、ＶＤ３およびそれらの併用で４８時間処置した。図７に示すように、処置の４８時間後に、細胞を生存色素および異なる芽球ＣＤマーカーで染色した。５μＭ  ＶＩＤＡＺＡ（登録商標）＋８０ｎＭ  ＶＤ３の併用は、対照と比較して、無処置（ｐ＜０．０５）による６８．２％、８０ｎＭ  １，２５−Ｄ３単独による６１．８％（ｐ＜０．０５）および５μＭ  ＡＺＡ単独による４２．６％（ｐ＜０．０５）から３６．６％へと芽球細胞の最も有意な減少を示した。
本明細書において引用される刊行物および特許の全ては、各個別の刊行物または特許が、具体的且つ個別に指示されて参照により組み込まれるかのように参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が引用されることと関連して本方法および材料を開示し、記載するために参照により本明細書に組み込まれる。
【００５３】
本発明は、本明細書において広く一般的に記載されている。包括的開示に属する狭義の種および下位の包括的群のそれぞれも、本発明の部分を形成する。加えて、本発明の特徴または態様が、マーカッシュ群で表して記載される場合、当業者は、本発明がまた、それによってマーカッシュ群の任意の個別のメンバーまたはメンバーのサブグループで表して記載されることを認識することになる。
【００５４】
本発明が、特定の態様、実施形態および任意選択の特徴によって具体的に開示されてきたが、そのような態様、実施形態および任意選択の特徴の修飾、改善および変形が、当業技術者によって用いられ得、そのような修飾、改善および変形は、本開示の範囲内であると見なされることを理解すべきである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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