(57)【要約】  本発明は、細胞において自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）抑制活性を持つポリペプチド、これを有効成分として含む細胞において、特に腫瘍細胞における自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）抑制用組成物及びこれを含む薬学的組成物に関し、より具体的に自食作用（オートファージ；ａｕｔｏｐｈａｇｙ）の調節機序を抑制するポリペプチドを有効成分として含む細胞における自食作用抑制用組成物及びこれを含む腫瘍性疾患の予防または治療用、あるいは抗がん剤の耐性抑制用薬学的組成物に関する。本発明によれば、本発明によるポリペプチドは、自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）関連タンパク質であるｐ−ＡＭＰＫ、ＡＴＧ５−ＡＴＧ１２、Ｂｅｃｌｉｎ１、ｐ−Ｂｅｃｌｉｎ１、ＬＣ３−Ｉ、ＬＣ３−ＩＩ、ｐ−ｍＴＯＲ及びｐ６２の発現を調節することにより、自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）を抑制することができ、これによって腫瘍性疾患を予防または治療するのに効果があるだけでなく、抗がん剤の耐性も抑制しうる。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の配列の一般式で表される、細胞において自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）を抑制する活性を持つポリペプチド。
[一般式]
Ｘ３−Ｘ１−Ｔ−Ｘ１−Ｋ−Ｘ２
（前記配列の一般式において、Ｔは、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）であり、
前記Ｋは、リシン（ｌｙｓｉｎｅ）であり、
前記Ｘ１は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）、イソロイシン（Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）、メチオニン（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）及びバリン（ｖａｌｉｎｅ）からなる群から選ばれた一つ以上のアミノ酸であり、
前記Ｘ２は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）及びセリン（ｓｅｒｉｎｅ）からなる群から選ばれた一つ以上のアミノ酸であり、
前記Ｘ３は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）及びグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）からなる群から選ばれた一つ以上のアミノ酸、または部材である。）
【請求項２】
前記Ｘ１及びＸ２は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）であるものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記Ｘ１は、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）であり、
前記Ｘ２は、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）であるものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記Ｘ１は、イソロイシン（Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）であり、
前記Ｘ２は、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）であるものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記Ｘ３は、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）及びトレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）であるものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記Ｘ３は、セリン（ｓｅｒｉｎｅ）であるものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記Ｘ３は、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）及びトレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）であるものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドは、ｐ−ＡＭＰＫ、ＡＴＧ５−ＡＴＧ１２、Ｂｅｃｌｉｎ１、ｐ−Ｂｅｃｌｉｎ１、ＬＣ３−Ｉ及びＬＣ３−ＩＩからなる群から選ばれる１つ以上のタンパク質の発現を減少させることにより、細胞においてオートファジー（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）を抑制するものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドは、ｐ−ｍＴＯＲまたはｐ６２タンパク質の発現を増加させることにより、細胞におけるオートファジー（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）を抑制するものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドは、発色酵素、放射性同位元素、クロモフォア（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）、発光物質、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）、磁気共鳴映像物質、常磁性粒子（ｓｕｐｅｒ  ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）及び超常磁性粒子（ｕｌｔｒａｓｕｐｅｒ  ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）からなる群から選ばれる標識物質のいずれかで標識されたものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記細胞は、腫瘍細胞であるものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリペプチドを有効成分として含む腫瘍細胞における自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）抑制用組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載のポリペプチドを有効成分として含む腫瘍性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１４】
前記腫瘍性疾患は、肺癌、肝臓癌、大腸癌、膵臓癌、胃癌、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、食道癌、前立腺癌、脳癌、皮膚癌、骨肉腫、軟部組織肉腫、神経膠腫、リンパ腫、鼻咽頭癌、喉頭癌、副腎癌、結腸癌、尿管癌、胆嚢癌、膀胱癌、精巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、絨毛癌、頭頸部癌、悪性黒色腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、神経芽腫からなる群から選ばれるものである、請求項１３に記載の腫瘍性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１５】
請求項１に記載のポリペプチドを有効成分として含む、抗がん剤の耐性抑制用薬学組成物。
【請求項１６】
前記組成物は、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、セラストロール（ｃｅｌａｓｔｒｏｌ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、タグリッソ（ｔａｇｒｉｓｓｏ）、タキソール（ｔａｘｏｌ）、ペメトレキセド（Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）及びタモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）からなる群から選ばれた一つ以上の抗がん剤に対する耐性を持つものである、請求項１５に記載の抗がん剤の耐性抑制用医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１に記載のポリペプチドの腫瘍性疾患の予防又は治療用薬学組成物の製造のための用途。
【請求項１８】
治療学的有効量の請求項１に記載のポリペプチドをオブジェクトに投与することを含む、腫瘍性疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大韓民国産業通商資源部の支援の下、課題番号「１４１５１５４５６８」によりなされたものであり、前記課題の研究管理専門機関は、韓国産業技術振興院、研究事業名は、「技術成果活用促進」、研究課題名は、「Ｔ７９０Ｍ突然変異により耐性が誘発された非小細胞肺がんの耐性を克服するためのオリゴペプチド低分子医薬品開発」、主管機関は、（株）エルベース、研究期間は、２０１７．０６．０１〜２０１８．０５．３１である。
【０００２】
本発明は、細胞において自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）抑制活性を持つポリペプチド、これを有効成分として含む自食作用抑制用組成物及びこれを含む薬学的組成物に関し、より具体的に自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）の調節機序を抑制するポリペプチドを有効成分として含む細胞、特に腫瘍細胞における自食作用抑制用組成物、及びこれを含む腫瘍性疾患の予防または治療用、あるいは抗がん剤の耐性抑制用薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）は、細胞において不必要であるか、または機能を失った細胞小器官とタンパク質を除去する過程で、細胞の恒常性を維持するのに役立ち、細胞生存メカニズムである。
【０００４】
自食作用は、特にがん、炎症疾患、退行性神経疾患、免疫疾患などの様々な疾病において多くの役割を果たすことが知られており、特に、多くの研究において、がんの進行段階、種類、遺伝子型などによって複雑な役割を果たし、がんと密接な関連があることが知られている。
【０００５】
激しい細胞数の増加によってがんを形成するようになると、細胞は、周辺環境から栄養分がまともに供給されないので、飢餓状態になり、このとき、自食作用を介して有害なタンパク質沈殿物と損傷を受けた細胞小器官を再活用して栄養分が供給されるため、がんの成長が不利な環境で自食作用によってエネルギー供給を受けるようになると、がん細胞の生存が促進される。
【０００６】
このような環境において、細胞の生存に関与するものとして知られているタンパク質がＡＭＰＫ（ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）であるが、ＡＭＰＫは、エネルギー枯渇、細胞外基質離脱、活性酸素増加及び低酸素状況で活性化されて、代謝作用を誘導するのに重要な役割を果たすものとしてよく知られている。また、活性化されたＡＭＰＫは、自食信号体系においてｍＴＯＲ作用を抑制するものとして知られている。
【０００７】
ｍＴＯＲ（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ）は、ＰＩ３Ｋ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ  ｆａｍｉｌｙに属するｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅで細胞の成長と増殖、生存、移動、タンパク質の合成、転写を調節し、自食作用を抑制すると知られている。このようなｍＴＯＲ機序は、がんだけでなく、代謝性疾患、退行性神経疾患及び心血管疾患などの様々な疾病に関与するという多くの研究結果が発表されている。
【０００８】
Ｂｅｃｌｉｎ１は、ＢＥＣＮ１遺伝子で暗号化されるタンパク質であって、自食インダクタンスである。Ｂｅｃｌｉｎ１は、腫瘍抑制に重要な役割を果たすが、このような腫瘍抑制機能は、自己消化作用の予定細胞死に関連しているものとして知られている。
【０００９】
最近、自食作用が腫瘍の形成、成長及び治療に重要な役割を果たすという研究結果に関心が高まっている。がんにおいて自食作用の役割は、非常に複雑であるので、腫瘍抑制因子であるか、腫瘍促進因子として二つの相反する機能を果たすと知られている。したがって、がんのいくつかの条件によって自食作用の役割を区別し、適切に調節することががんの治療の新たな戦略的な方法となっており、治療において大きな問題である抗がん剤の耐性に関連して自食作用の阻害が、様々な抗がん療法による抗がん剤の耐性を減少させるという研究結果が発表されている（２０１７、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １７、５２８−５４２）。
【００１０】
そこで、本発明者らは、がんにおいて重要な役割を果たす自食作用を調節できるポリペプチドを開発しようと努力した結果、自食作用（オートファージ；ａｕｔｏｐｈａｇｙ）の調節機序を抑制するポリペプチドを有効成分として含む、細胞において、特に腫瘍細胞における自食作用抑制用組成物及びこれを含む腫瘍性疾患の予防または治療用、あるいは抗がん剤の耐性抑制用薬学的組成物の場合、自食作用を抑制するｍＴＯＲを活性化して自食作用を誘発するＡＭＰＫ及びＢｅｃｌｉｎ１の非活性化による自食作用を抑制することにより、自食作用による腫瘍の発達促進を抑制し、抗がん剤の耐性を減少させる効果があることを確認し、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、自食作用を抑制するｍＴＯＲを活性化し、自食作用を誘発するＡＭＰＫ及びＢｅｃｌｉｎ１の非活性化による自食作用を抑制することにより、自食作用による腫瘍の発達促進を抑制し、抗がん剤の耐性を減少させることができる細胞、特に腫瘍細胞における自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）抑制活性を持つポリペプチドを提供することを目的とする。
【００１２】
本発明は、さらに、前記ポリペプチドを用いた細胞、特に腫瘍細胞における自食作用抑制用組成物を提供することを目的とする。
【００１３】
本発明は、さらに、前記ポリペプチドを用いた腫瘍性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することを目的とする。
【００１４】
本発明は、さらに、前記自食作用抑制用組成物を用いた抗がん剤の耐性抑制用薬学的組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一態様によれば、本発明は、下記の配列の一般式で表される、細胞において自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）を抑制する活性を持つポリペプチドを提供する。
【００１６】
［一般式］
Ｘ３−Ｘ１−Ｔ−Ｘ１−Ｋ−Ｘ２
【００１７】
（前記配列の一般式において、Ｔは、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）であり、
前記Ｋは、リシン（ｌｙｓｉｎｅ）であり、
前記Ｘ１は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）、イソロイシン（Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）、メチオニン（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）及びバリン（ｖａｌｉｎｅ）からなる群から選ばれた一つ以上のアミノ酸であり、
前記Ｘ２は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）及びセリン（ｓｅｒｉｎｅ）からなる群から選ばれた一つ以上のアミノ酸であり、
Ｘ３は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）及びグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）からなる群から選ばれた一つ以上のアミノ酸、または部材である。）
【００１８】
自食作用（オートファージ；ａｕｔｏｐｈａｇｙ）は、細胞生存メカニズムであってストレスを受ける細胞で誘導されるが、がんが進行する前に、がんが発達している間、腫瘍を抑制するが、がんが生成された後は、腫瘍細胞の生存に寄与するため、がんが生成された腫瘍細胞における自食作用機序を抑制する場合、腫瘍細胞の活性を減少させることができると考えられる。
【００１９】
そこで、本発明者らは、がんが生成された細胞において、特に腫瘍細胞における自食作用を抑制するためのポリペプチドを発明し、一般式で表されるポリペプチドの場合、自食作用を抑制することにより、自食作用による腫瘍の発達促進を抑制し、抗がん剤の耐性を減少させることができることを確認し、本発明を完成した。
【００２０】
本発明の自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）を抑制する活性を持つポリペプチドにおいて、前記細胞は、腫瘍細胞であることを特徴とする。
【００２１】
本発明の前記用語の「腫瘍細胞において」は、がんが生成された後の腫瘍細胞を意味し得、固形がんを称することができる。また、前記用語の「腫瘍細胞」は、抗がん剤に対する耐性を持つ腫瘍細胞であってもよい。
【００２２】
本発明の自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）を抑制する活性を持つポリペプチドにおいて、前記Ｘ１は、非極性でありながら脂肪族Ｒ基を有するアミノ酸であってもよく、Ｘ２は、非極性でありながら比電荷Ｒ基を有するアミノ酸であってもよく、好ましくは、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）であることを特徴とする。
【００２３】
また、本発明の自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）を抑制する活性を持つポリペプチドにおいて、前記Ｘ１は、非極性でありながら脂肪族Ｒ基を有するアミノ酸であってもよく、好ましくは、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）であり、Ｘ２は、極性でありながら比電荷Ｒ基を有するアミノ酸であってもよく、好ましくは、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）であることを特徴とする。
【００２４】
また、本発明の自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）を抑制する活性を持つポリペプチドにおいて、前記Ｘ１は、非極性でありながら脂肪族Ｒ基を有するアミノ酸であってもよく、好ましくは、イソロイシン（Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）であり、前記Ｘ２は、極性でありながら比電荷Ｒ基を有するアミノ酸であってもよく、好ましくは、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）であることを特徴とする。
【００２５】
本発明の自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）を抑制する活性を持つポリペプチドにおいて、前記Ｘ３は、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）及びトレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）であることを特徴とする。
【００２６】
また、本発明の自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）を抑制する活性を持つポリペプチドにおいて、Ｘ３は、セリン（ｓｅｒｉｎｅ）であることを特徴とする。
【００２７】
本発明の自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）を抑制する活性を持つポリペプチドにおいて、前記Ｘ３は、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）及びトレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）であることを特徴とする。
【００２８】
本発明の自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）を抑制する活性を持つポリペプチドは、ｐ−ＡＭＰＫ、ＡＴＧ５−ＡＴＧ１２、Ｂｅｃｌｉｎ１、ｐ−Ｂｅｃｌｉｎ１、ＬＣ３−Ｉ及びＬＣ３−ＩＩからなる群から選ばれる１つ以上のタンパク質の発現を減少させることにより、細胞における自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）を抑制することを特徴とする。
【００２９】
本発明の一実施例によると、非小細胞肺がん細胞株及び抗がん剤に耐性を持つ非小細胞肺がん細胞株の間の自食作用機序に関与するタンパク質の関連性を確認した結果、非小細胞肺がん細胞株に対して抗がん剤に耐性を持つ非小細胞肺がん細胞株において、ｐ−ＡＭＰＫ、ＡＴＧ５及びＡＴＧ５−ＡＴＧ１２の発現が増加し、ｐ６２タンパク質の発現は、減少することを確認した。
【００３０】
ｐ−ＡＭＰＫは、自食作用による腫瘍の開発及び抗がん剤の耐性を増加させる因子であり、ＡＴＧ５は、腫瘍を促進させる因子であり、ＡＴＧ５−ＡＴＧ１２は、自食作用においてオートファゴソーム（ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ）を形成するのに必須の機能を担当する因子であるため、ｐ−ＡＭＰＫ、ＡＴＧ５及びＡＴＧ５−ＡＴＧ１２タンパク質発現の増加は、本発明によるポリペプチドは、がん細胞の耐性に関与することを意味する（実施例１及び図１〜３参照）。すなわち、本発明の一実施例によると、ｐ−ＡＭＰＫ、ＡＴＧ５及びＡＴＧ５−ＡＴＧ１２タンパク質の発現の増加ががん細胞の耐性に関与することを意味する（実施例１及び図１〜３参照）。
【００３１】
本発明のポリペプチドを抗がん剤に耐性を持つ非小細胞肺がん細胞株に濃度別に処理した結果、自食作用の開始者として知られているＢｅｃｌｉｎ１、ｐ−Ｂｅｃｌｉｎ１、ＡＴＧ５−ＡＴＧ１２、ＬＣ３−Ｉ及びＬＣ３−ＩＩタンパク質の発現が減少したことが確認できた。これらの結果は、本発明によるポリペプチドは、前記自食作用の活性剤として知られているタンパク質の発現を減少させて自食作用を抑制することにより、腫瘍発達促進を抑制し、抗がん剤の耐性を減少させることができることを示唆している（実施例２、図４〜図６参照）。
【００３２】
本発明の自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）を抑制する活性を持つポリペプチドにおいて、前記腫瘍細胞における自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）の抑制は、ｐ−ｍＴＯＲまたはｐ６２タンパク質の発現を増加させることにより、細胞において自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）を抑制することを特徴とする。
【００３３】
本発明の一実施例によると、ｉｎ−ｖｉｖｏで本発明のポリペプチドの自食作用の抑制効果、抗腫瘍効果及び抗がん剤の耐性の抑制効果を確認した結果、本発明のポリペプチドを濃度別にマウスに注入した場合、腫瘍組織が濃度依存的に減少することを確認した（実施例４、図８参照）。
【００３４】
また、前記腫瘍組織における自食作用に関与する因子の発現程度を確認した結果、自食作用を抑制する役割を果たすｐ−ｍＴＯＲ及びｐ６２タンパク質の発現が増加し、自食作用の活性剤であるｐ−ＡＭＰＫ、Ｂｅｃｌｉｎ１及びｐ−Ｂｅｃｌｉｎ１タンパク質の発現が減少することを確認した。
【００３５】
これらの結果は、本発明によるポリペプチドが、自食作用を抑制する因子を増加させて自食作用を誘発するｐ−ＡＭＰＫ、Ｂｅｃｌｉｎ１及びｐ−Ｂｅｃｌｉｎ１を非活性化させることにより、自食作用による腫瘍発達促進の減少及び抗がん剤の耐性を減少させることができることを示唆している（実施例４、図９参照）。
【００３６】
本発明の自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）を抑制する活性を持つポリペプチドにおいて、前記ポリペプチドは、発色酵素、放射性同位元素、クロモフォア（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）、発光物質、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）、磁気共鳴映像物質、常磁性粒子（ｓｕｐｅｒ  ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）及び超常磁性粒子（ｕｌｔｒａｓｕｐｅｒ  ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）からなる群から選ばれる標識物質の一つとして標識されることを特徴とするが、必ずしも標識物質として標識され得ることを意味するわけではない。
【００３７】
本発明の他の態様によると、本発明は、下記一般式で表されるポリペプチドを有効成分として含む細胞における自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）抑制用組成物を提供する。
【００３８】
[一般式]
Ｘ３−Ｘ１−Ｔ−Ｘ１−Ｋ−Ｘ２
【００３９】
（前記配列の一般式において、Ｔは、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）であり、
前記Ｋは、リシン（ｌｙｓｉｎｅ）であり、
前記Ｘ１は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）、イソロイシン（Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）、メチオニン（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）及びバリン（ｖａｌｉｎｅ）からなる群から選ばれた一つ以上のアミノ酸であり、
前記Ｘ２は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）及びセリン（ｓｅｒｉｎｅ）からなる群から選ばれた一つ以上のアミノ酸であり、
Ｘ３は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）、及びグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）からなる群から選ばれた一つ以上のアミノ酸、または部材である。）
【００４０】
本発明の他の態様によると、本発明は、下記一般式で表されるポリペプチドを有効成分として含む腫瘍性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００４１】
[一般式]
Ｘ３−Ｘ１−Ｔ−Ｘ１−Ｋ−Ｘ２
【００４２】
（前記配列の一般式において、Ｔは、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）であり、
前記Ｋは、リシン（ｌｙｓｉｎｅ）であり、
前記Ｘ１は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）、イソロイシン（Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）、メチオニン（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）及びバリン（ｖａｌｉｎｅ）からなる群から選ばれた一つ以上のアミノ酸であり、
前記Ｘ２は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）及びセリン（ｓｅｒｉｎｅ）からなる群から選ばれた一つ以上のアミノ酸であり、
Ｘ３は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）、及びグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）からなる群から選ばれた一つ以上のアミノ酸、または部材である。）
【００４３】
本発明の腫瘍性疾患の予防または治療用薬学的組成物において、腫瘍性疾患は、肺癌、肝臓癌、大腸癌、膵臓癌、胃癌、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、食道癌、前立腺癌、脳癌、皮膚癌、骨肉腫、軟部組織肉腫、神経膠腫、リンパ腫、鼻咽頭癌、喉頭癌、副腎癌、結腸癌、尿管癌、胆嚢癌、膀胱癌、精巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、絨毛癌、頭頸部癌、悪性黒色腫、白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、神経芽腫及び再生不良性貧血からなる群から選ばれる１つ以上の腫瘍性疾患であってもよく、好ましくは、肺癌または乳癌であることを特徴とするが、これに限定されない。
【００４４】
本発明の腫瘍性疾患の予防または治療用薬学的組成物において、前記組成物は、自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）を抑制することにより予防または治療できる疾患の薬学的組成物として使用されてもよいが、好ましくは、腫瘍性疾患を予防または治療することを特徴とする。
【００４５】
本発明の他の態様によると、本発明は、下記の一般式で表されるポリペプチドを有効成分として含む抗がん剤の耐性抑制用薬学的組成物を提供する。
【００４６】
[一般式]
Ｘ３−Ｘ１−Ｔ−Ｘ１−Ｋ−Ｘ２
【００４７】
（前記配列の一般式において、Ｔは、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）であり、
前記Ｋは、リシン（ｌｙｓｉｎｅ）であり、
前記Ｘ１は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）、イソロイシン（Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）、メチオニン（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）及びバリン（ｖａｌｉｎｅ）からなる群から選ばれた一つ以上のアミノ酸であり、
前記Ｘ２は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）及びセリン（ｓｅｒｉｎｅ）からなる群から選ばれた一つ以上のアミノ酸であり、
Ｘ３は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）及びグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）からなる群から選ばれた一つ以上のアミノ酸、または部材である。）
【００４８】
本発明の抗がん剤の耐性抑制用薬学的組成物において、前記組成物は、腫瘍性疾患を治療するために使用される何らかの抗がん剤に対する耐性を持っていてもよく、好ましくは、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、セラストロール（ｃｅｌａｓｔｒｏｌ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、タグリッソ（ｔａｇｒｉｓｓｏ）、タキソール（ｔａｘｏｌ）、ペメトレキセド（Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）及びタモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）からなる群から選ばれた１つ以上の抗がん剤に対する耐性を持つことを特徴とする。
【００４９】
本発明の抗がん剤の耐性抑制用薬学的組成物において、前記組成物は、自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）を抑制することにより、抗がん剤の耐性を抑制することを特徴とする。
【００５０】
本発明の一実施例によると、様々な抗がん剤に対して耐性を持つがん細胞株であるＰＣ９−ＥＲ、Ｈ１９７５及びＭＣＦ７Ｒで本願発明のポリペプチドを処理した結果、細胞の成長が抑制されることを確認した（図６、図１１及び図１４参照）。
【００５１】
これらの結果は、本願発明のポリペプチドが抗がん剤の耐性がん細胞株において自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）を抑制することにより、抗がん剤の耐性を抑制（減少）させることができることを示唆する。
【００５２】
また、本発明は、下記一般式で表されるポリペプチドの腫瘍性疾患の予防または治療用薬学組成物の製造のための用途を提供する。
【００５３】
また、本発明は、治療的有効量の下記一般式で表されるポリペプチドをオブジェクトに投与することを含む腫瘍性疾患の治療方法を提供する。
【００５４】
[一般式]
Ｘ３−Ｘ１−Ｔ−Ｘ１−Ｋ−Ｘ２
【００５５】
（前記配列の一般式において、Ｔは、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）であり、
前記Ｋは、リシン（ｌｙｓｉｎｅ）であり、
前記Ｘ１は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）、イソロイシン（Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）、メチオニン（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）及びバリン（ｖａｌｉｎｅ）からなる群から選ばれた一つ以上のアミノ酸であり、
前記Ｘ２は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）及びセリン（ｓｅｒｉｎｅ）からなる群から選ばれた一つ以上のアミノ酸であり、
Ｘ３は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）及びグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）からなる群から選ばれた一つ以上のアミノ酸、または部材である。）
【００５６】
発明において、前記「オブジェクト」は、人間を含む哺乳動物であってもよく、これらの例に限定されるものではない。
【００５７】
本発明による薬学的組成物は、前記ポリペプチドの純粋な形態または薬学的に許容される担体とともに適切な形態で剤形化することにより提供されてもよい。「薬学的に許容される」とは、生理学的に許容され、人間に投与されるとき、通常、胃腸障害、めまいなどのアレルギー反応、またはこれと類似した反応を起こさない非毒性の組成物をいう。前記担体としては、すべての種類の溶媒、分散媒質、水中油または油中水エマルジョン、水性組成物、リポソーム、マイクロビーズ及びマイクロソーム、生分解性ナノ粒子などが含まれてもよいが、これに限定されない。
【００５８】
一方、本発明による薬学的組成物は、投与経路によって適切な担体とともに剤形化されてもよい。前記本発明による薬学的組成物の投与経路としては、これに限定されないが、経口的または非経口的に投与されてもよい。非経口投与経路としては、例えば、経皮、鼻腔、腹腔、筋肉、皮下または静脈などの多くの経路が含まれるが、これに限定されない。
【００５９】
本発明の薬学的組成物を経口投与する場合、本発明の薬学的組成物は、適切な経口投与用担体とともに、当業界で公知の方法によって粉末、顆粒、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、懸濁液、ウエハなどの形態で剤形化されてもよく、これに限定されない。
【００６０】
本発明の薬学的組成物は、哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続または遅延した放出を提供できるように、当業界で公知の方法を使用して剤形化されてもよい。
【００６１】
前記のような方法で剤形化された薬学的組成物は、有効量として経口、経皮、皮下、静脈または筋肉を含む様々な経路を通じて投与されてもよい。前記において、「有効量」とは、患者に投与したとき、診断または治療効果の追跡を可能にする物質量（ａｍｏｕｎｔ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）をいう。
【００６２】
本発明による薬学的組成物の投与量は、投与経路、投与対象、対象疾患及びその重症度、年齢、性別、体重、個人差及び疾病状態に応じて適宜選択してもよい。好ましくは、本発明のポリペプチドを含む薬学的組成物は、疾患の程度に応じて、有効成分の含量を異にすることができるが、通常、成人を基準にするとき、１回の投与時、１ｍｇ〜１０００ｍｇの有効容量で一日に数回反復投与されてもよい。
【発明の効果】
【００６３】
前述したように、本願発明によるポリペプチドは、腫瘍細胞における自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）を抑制することにより、腫瘍性疾患を予防または治療効果があるだけでなく、抗がん剤の耐性を抑制するのに効果的である。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１−３】図１〜３は、本願発明の実施例１による結果を示す。
【図４−６】図４〜６は、本願発明の実施例２による結果を示す。
【図７】図７は、本願発明の実施例３による結果を示す。
【図８−９】図８及び図９は、本願発明の実施例４による結果を示す。
【図１０−１１】図１０及び図１１は、本願発明の実施例５による結果を示す。
【図１２−１４】図１２〜１４は、本願発明の実施例６による結果を示す。
【発明を行うための最良の形態】
【００６５】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものと解釈されない。
【００６６】
実施例１：がん細胞株において自食作用機序確認
本発明に使用されたがん細胞株（ＰＣ９）は、条件化された培養器（３７℃）で１０％ウシ胎児血清及び抗生剤が補充された最小必須培地で培養した。抗がん薬物耐性がん細胞株（ＰＣ９−ＥＲ）は、抗がん剤としてＥｒｌｏｔｉｎｉｂに長期間露出させて抵抗性を持つように製作した。
【００６７】
がん細胞株（ＰＣ９）及び抗がん剤耐性細胞株（ＰＣ９−ＥＲ）において自食作用調節機序のタンパク質が関与するかを調べるため、ＡＭＰＫ（ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）、ｐ−ＡＭＰＫ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ＡＭＰＫ）、ＡＴＧ５（自食−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ５）、ＡＴＧ５−ＡＴＧ１２及びｐ６２のタンパク質の発現程度をウェスタンブロット法によって比較し、その結果を図１に示した。
【００６８】
その結果、図１から確認できるように、抗がん剤耐性細胞株（ＰＣ９−ＥＲ）は、ＰＣ９細胞株に対してｐ−ＡＭＰＫ、ＡＴＧ５、ＡＴＧ５−ＡＴＧ１２タンパク質の発現が増加することが確認でき、自食作用抑制分子であるｐ６２タンパク質の発現は低くなることが確認できた。
【００６９】
また、ＰＣ９細胞株及びＰＣ９−ＥＲ細胞株の免疫蛍光染色（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）を行った。
【００７０】
具体的には、ＰＣ９及びＰＣ９−ＥＲ細胞株を４％ホルムアルデヒドを用いて室温で固定した。次に、前記細胞を０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳを用いて抗体の不正確な結合を防ぐため、常温で３０分間反応させた後、ＬＣ３抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）と４℃で２４時間の間反応させた。抗体を除去した後、ＰＢＳで洗浄した後、Ａｌｅｘａ４８８蛍光が付いた２次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）と室温で１．５時間の間反応させた。反応後、抗体を除去した細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で１分染色した。蛍光染色は、共焦点蛍光顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いて確認し、その結果を図２に示した。
【００７１】
その結果、図２から確認できるように、ＰＣ９−ＥＲ細胞株は、ＰＣ９細胞株に対してＬＣ３  ｐｕｎｃｔａ発現程度が高いことが確認できた。
【００７２】
また、ＰＣ９細胞株及びＰＣ９−ＥＲ細胞株の抗がん剤に対する耐性を確認するため、ＭＴＴ  ａｓｓａｙを行った。
【００７３】
具体的には、ＰＣ９及びＰＣ９−ＥＲ細胞株を同じ数で９６ｗｅｌｌ細胞培養プレートに培養した後、抗がん剤を１／１０倍ずつ希釈して２４時間処理した後、ＭＴＴを用いて確認した。生きている細胞のミトコンドリアに存在するＮＡＤＨがＭＴＴと反応してホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）を形成する原理を用いる実験では、ホルマザンをＤＭＳＯで溶かした後、５７０ｎｍで吸光度を測定して細胞の成長活性を確認し、その結果を図３に示した。
【００７４】
その結果、図３から確認できるように、自食作用調節機序がより活性化されたＰＣ９−ＥＲ細胞株は、ＰＣ９細胞株に比べて既知の抗がん剤であるＤｏｃｅｔａｘｅｌ、Ｔａｘｏｌに対する抵抗性が高いことを確認した。
【００７５】
実施例２：ポリペプチドの自食作用調節効果確認
抗がん剤耐性がん細胞株（ＰＣ９−ＥＲ）において自食作用に関与するものとして知られているＡＴＧ５、ＡＴＧ５−ＡＴＧ１２タンパク質の発現が増加する結果に基づいて、ＳＰＴＰＫＴ（ポリペプチド１）及びＱＴＡＴＡＫＡ（ポリペプチド２）の自食作用抑制効果を確認した。
【００７６】
具体的には、ＰＣ９−ＥＲ細胞株に前記ポリペプチド１及びポリペプチド２をそれぞれ処理して自食作用機序に関連したタンパク質であるＢｅｃｌｉｎ１、ｐ−Ｂｅｌｃｌｉｎ１、ＡＴＧ５−ＡＴＧ１２、ＬＣ３  Ｉ及びＬＣ３  ＩＩの発現程度をウェスタンブロット法により比較し、その結果を図４に示した。
【００７７】
その結果、図４から確認できるように、ポリペプチド１及びポリペプチド２を処理したとき、自食作用開始者として知られているＢｅｃｌｉｎ１、ｐ−Ｂｅｃｌｉｎ１及び自食作用活性分子であるＡＴＧ５−ＡＴＧ１２、ＬＣ３  Ｉ及びＬＣ３  ＩＩタンパク質の発現が低くなることを確認した。
【００７８】
また、ＰＣ９−ＥＲ細胞株においてポリペプチド２を処理した後、免疫蛍光染色（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）を行った。
【００７９】
具体的には、ＰＣ９−ＥＲ細胞株にポリペプチド２を２４時間処理した後、４％ホルムアルデヒドを用いて室温で固定した。次に、前記細胞を０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳを用いて抗体の不正確な結合を防ぐため、室温で３０分間反応させた後、ＬＣ３抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）と４℃で２４時間反応させた。抗体を除去した後、ＰＢＳで洗浄した後、Ａｌｅｘａ４８８蛍光が付いた２次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）と室温で１．５時間反応させた。反応後、抗体を除去した細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で１分染色した。蛍光染色は、共焦点蛍光顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いて確認し、その結果を図５に示した。
【００８０】
その結果、図５から確認できるように、ポリペプチド２を処理したとき、ＰＣ９−ＥＲ細胞株でＬＣ３  ｐｕｎｃｔａ発現程度が低くなることを確認した。
【００８１】
また、ＰＣ９−ＥＲ細胞株でポリペプチド１、ポリペプチド２及びＧＮＴＩＴＩＫＴ（ポリペプチド３）をそれぞれ処理した後、抗がん剤に対する耐性を確認するためにＭＴＴ  ａｓｓａｙを行った。
【００８２】
具体的には、ＰＣ９−ＥＲ細胞株を同じ数で９６ｗｅｌｌ細胞培養プレートに敷いた後、それぞれのポリペプチド（１〜３）を２４時間処理した。次に、抗がん剤を１／１０倍ずつ希釈して２４時間処理した後、ＭＴＴを用いて確認した。生きている細胞のミトコンドリアに存在するＮＡＤＨがＭＴＴと反応してホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）を形成する原理を用いる実験では、ホルマザンをＤＭＳＯに溶かした後５７０ｎｍで吸光度を測定して細胞の成長活性を確認し、その結果を図６に示した。
【００８３】
その結果、図６から確認できるように、ＰＣ９−ＥＲ細胞株でそれぞれのポリペプチド（１〜３）は、抗がん剤であるＥｒｌｏｔｉｎｉｂ（Ｔａｃｅｖａ）に対する抵抗性を減少させたことを確認した。
【００８４】
これらの結果は、抗がん剤耐性がん細胞株においてポリペプチド１、ポリペプチド２及びポリペプチド３による自食作用抑制効果を示す。
【００８５】
実施例３：ポリペプチドの細胞内発現確認
本願発明の実施例１による免疫蛍光染色の方法のように、ポリペプチド２を緑色蛍光（ＦＩＴＣ；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）で標識し、既知の方法によってＰＣ９−ＥＲ細胞株にトランスフェクション（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させ、その結果を図７に示した。
【００８６】
その結果、図７から確認できるように、ＦＩＴＣ−ポリペプチド２は、時間依存的に細胞内に伝達されることが分かる。
【００８７】
実施例４：ポリペプチドの腫瘍形成抑制効果確認
ポリペプチド２がｉｎ−ｖｉｔｒｏの条件で自食抑制による抗がん作用を示した結果に基づいて、ｉｎ−ｖｉｖｏでポリペプチド２の抗がん作用を確認した。
【００８８】
具体的には、無胸腺ヌードマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ  ｎｕｄｅ、５〜６週齢の雌）にＰＣ９−ＥＲ（２×１０６個／匹）細胞株をマウスの脇腹に皮下注射して腫瘍を誘導した後、腫瘍の体積が１５０ｍｍ３程度になったとき、ポリペプチド２を計５回尾静脈を通じて注射し、腫瘍の体積変化を調べた。腫瘍の体積は、キャリパーで直接測定して、次式により計算した（長さ×幅×高さ×０．５）。腫瘍形成抑制力に対するポリペプチド２の効果を確認するため、ペプチド（０、５０、１００、２００μｇ／ｍｏｕｓｅ）を、細胞注入２５日から３日間隔で５回尾静脈を通じて注射した。４１日目の日、腫瘍を分離して腫瘍の体積を測定し、腫瘍組織において各標識された抗体を用いてウエスタンブロットを行い、その結果を図８及び図９に示した。
【００８９】
その結果、図８から確認できるように、ポリペプチド２は、腫瘍の体積を有意に減少させた。
【００９０】
また、図９から確認できるように、腫瘍組織では、ｐ−ｍＴＯＲとｐ６２タンパク質の発現が濃度−依存的増加する様相を示し、ｐ−ＡＭＰＫ、Ｂｅｃｌｉｎ１、ｐ−Ｂｅｃｌｉｎ１タンパク質の発現は、濃度−依存的減少する様相を示した。
【００９１】
これはポリペプチド２が自食作用機序の抑制による抗がん作用を示す結果である。
【００９２】
実施例５：ポリペプチドの自食作用調節効果確認
実施例１〜４と異なる非小細胞肺がん細胞株であるＨ１９７５において、ポリペプチド１及びポリペプチド２の自食作用調節タンパク質による抗がん活性効果に対する影響を調べるため、Ｈ１９７５細胞において各標識された抗体を用いてウェスタンブロットを行い、その結果を図１０に示した。
【００９３】
その結果、図１０から確認できるように、ポリペプチド１及びポリペプチド２をそれぞれ処理したとき、がん調節機序に関与するものとして知られているｐ−ＡＭＰＫと自食作用調節機序のタンパク質であるｐ−Ｂｅｃｌｉｎ１、ＡＴＧ５、ＡＴＧ５−ＡＴＧ１２、ＬＣ３  Ｉ及びＬＣ３  ＩＩのタンパク質の発現が低くなることを確認した。
【００９４】
また、Ｈ１９７５細胞株でポリペプチド１、ポリペプチド２及びポリペプチド３をそれぞれ処理した後、抗がん剤であるＯｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ（Ｔａｇｒｉｓｓｏ）に対する耐性を確認するため、ＭＴＴ  ａｓｓａｙを行った。
【００９５】
具体的には、Ｈ１９７５細胞株を同じ数で９６  ｗｅｌｌ細胞培養プレートに分注した後、それぞれのポリペプチド（１〜３）を２４時間処理した。次に、抗がん剤であるＯｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ（Ｔａｇｒｉｓｓｏ）を１／１０倍ずつ希釈して２４時間処理した後、ＭＴＴを用いて確認した。生きている細胞のミトコンドリアに存在するＮＡＤＨがＭＴＴと反応してホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）を形成する原理を用いる実験では、ホルマザンをＤＭＳＯに溶かした後、５７０ｎｍで吸光度を測定して細胞の成長活性を確認し、その結果を図１１に示した。
【００９６】
その結果、図１１から確認できるように、Ｈ１９７５細胞株でそれぞれのポリペプチド（１〜３）は、抗がん剤であるＯｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ（Ｔａｇｒｉｓｓｏ）に対する抵抗性を減少させることを確認した。
【００９７】
これはポリペプチド１、ポリペプチド２及びポリペプチド３が自食作用の抑制による抗がん活性を持つことを示す結果である。
【００９８】
また、ポリペプチド２を濃度を異にして処理したとき、Ｈ１９７５細胞株において抗がん剤であるＯｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ（Ｔａｇｒｉｓｓｏ）に対する抵抗性が濃度−依存的に減少することを確認した。
【００９９】
実施例６：ポリペプチドの抗がん活性効果確認
抗がん薬物耐性がん細胞株（ＭＣＦ７Ｒ）は、抗がん剤としてＣｅｌａｓｔｒｏｌに長期間露出させて抵抗性を持つように製作した。
【０１００】
抗がん剤耐性細胞株（ＭＣＦ７Ｒ）においてポリペプチド１及びポリペプチド２の自食作用調節機序のタンパク質に対する影響を確認するため、ＭＣＦ７Ｒ細胞株において各標識された抗体を用いてウエスタンブロットを行い、その結果を図１２に示した。
【０１０１】
その結果、図１２から確認できるように、ポリペプチド１及びポリペプチド２をそれぞれ処理したとき、自食作用抑制分子であるｐ６２タンパク質の発現が増加し、自食作用活性分子であるｐ−Ｂｅｃｌｉｎ１、ＡＴＧ５、ＡＴＧ５−ＡＴＧ１２、ＬＣ３  Ｉ及びＬＣ３  ＩＩタンパク質の発現は減少した。
【０１０２】
また、ＭＣＦ７Ｒ細胞株においてポリペプチド２を処理した後、免疫蛍光染色（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）を行った。
【０１０３】
具体的には、ＭＣＦ７Ｒ細胞株においてポリペプチド２を２４時間処理した後、４％ホルムアルデヒドを用いて室温で固定した。次に、前記細胞を０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳを用いて抗体の不正確な結合を防ぐため、常温で３０分間反応させた後、ＬＣ３抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）と４℃で２４時間反応させた。抗体を除去した後、ＰＢＳで洗浄した後、Ａｌｅｘａ４８８蛍光が付いた２次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）と室温で１．５時間反応させた。反応後、抗体を除去した細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で１分染色した。蛍光染色は、共焦点蛍光顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いて確認し、その結果を図１３に示した。
【０１０４】
その結果、図１３から確認できるように、ＭＣＦ７Ｒ細胞株においてポリペプチド２を処理したとき、ＬＣ３  ｐｕｎｃｔａ発現程度が低くなることを確認した。
【０１０５】
また、ＭＣＦ７Ｒ細胞株においてポリペプチド１、ポリペプチド２及びポリペプチド３をそれぞれ処理した後、抗がん剤に対する耐性を確認するため、ＭＴＴ  ａｓｓａｙを行った。
【０１０６】
具体的には、ＭＣＦ７Ｒ細胞株を同じ数で９６ｗｅｌｌ細胞培養プレートに敷いた後、それぞれのポリペプチド（１〜３）を２４時間処理した。次に、抗がん剤を１／１０倍ずつ希釈して２４時間処理した後、ＭＴＴを用いて確認した。生きている細胞のミトコンドリアに存在するＮＡＤＨがＭＴＴと反応してホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）を形成する原理を用いる実験では、ホルマザンをＤＭＳＯに溶かした後、５７０ｎｍで吸光度を測定して細胞の成長活性を確認し、その結果を図１４に示した。
【０１０７】
その結果、図１４から確認できるように、ＭＣＦ７Ｒ細胞株においてそれぞれのポリペプチド（１〜３）は、Ｃｅｌａｓｔｒｏｌ、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、Ｄｏｃｅｔａｘｅｌなど様々な抗がん剤に対する抵抗性を減少させた。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
前述したように、本願発明によるポリペプチドは、腫瘍細胞における自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）を抑制することにより、腫瘍性疾患を予防または治療効果があるだけでなく、抗がん剤の耐性を抑制するのに効果的であるため、腫瘍性疾患を予防または治療するための組成物として用いることができる。
【図１】
2021522284.tif 000003
【図２】
2021522284.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2021522284.tif 000009
【図８】
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【図９】
2021522284.tif 000011
【図１０】
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【図１１】
2021522284.tif 000013
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
2021522284000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年12月18日(2020.12.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の配列の一般式で表される、細胞において自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）を抑制する活性を持つポリペプチド。
[一般式]
Ｘ３−Ｘ１−Ｔ−Ｘ１−Ｋ−Ｘ２
（前記配列の一般式において、Ｔは、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）であり、
前記Ｋは、リシン（ｌｙｓｉｎｅ）であり、
前記Ｘ１は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）、イソロイシン（Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）、メチオニン（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）及びバリン（ｖａｌｉｎｅ）からなる群から選ばれた一つ以上のアミノ酸であり、
前記Ｘ２は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）及びセリン（ｓｅｒｉｎｅ）からなる群から選ばれた一つ以上のアミノ酸であり、
前記Ｘ３は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）及びグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）からなる群から選ばれた一つ以上のアミノ酸、または部材である。）
【請求項２】
前記Ｘ１及びＸ２は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）であるものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記Ｘ１は、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）であり、
前記Ｘ２は、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）であるものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記Ｘ１は、イソロイシン（Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）であり、
前記Ｘ２は、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）であるものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記Ｘ３は、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）及びトレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）であるものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記Ｘ３は、セリン（ｓｅｒｉｎｅ）であるものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記Ｘ３は、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）及びトレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）であるものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドは、ｐ−ＡＭＰＫ、ＡＴＧ５−ＡＴＧ１２、Ｂｅｃｌｉｎ１、ｐ−Ｂｅｃｌｉｎ１、ＬＣ３−Ｉ及びＬＣ３−ＩＩからなる群から選ばれる１つ以上のタンパク質の発現を減少させることにより、細胞においてオートファジー（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）を抑制するものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドは、ｐ−ｍＴＯＲまたはｐ６２タンパク質の発現を増加させることにより、細胞におけるオートファジー（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）を抑制するものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドは、発色酵素、放射性同位元素、クロモフォア（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）、発光物質、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）、磁気共鳴映像物質、常磁性粒子（ｓｕｐｅｒ  ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）及び超常磁性粒子（ｕｌｔｒａｓｕｐｅｒ  ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）からなる群から選ばれる標識物質のいずれかで標識されたものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記細胞は、腫瘍細胞であるものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリペプチドを有効成分として含む腫瘍細胞における自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）抑制用組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載のポリペプチドを有効成分として含む腫瘍性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１４】
前記腫瘍性疾患は、肺癌、肝臓癌、大腸癌、膵臓癌、胃癌、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、食道癌、前立腺癌、脳癌、皮膚癌、骨肉腫、軟部組織肉腫、神経膠腫、リンパ腫、鼻咽頭癌、喉頭癌、副腎癌、結腸癌、尿管癌、胆嚢癌、膀胱癌、精巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、絨毛癌、頭頸部癌、悪性黒色腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、神経芽腫からなる群から選ばれるものである、請求項１３に記載の腫瘍性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１５】
請求項１に記載のポリペプチドを有効成分として含む、抗がん剤の耐性抑制用薬学組成物。
【請求項１６】
前記組成物は、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、セラストロール（ｃｅｌａｓｔｒｏｌ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、タグリッソ（ｔａｇｒｉｓｓｏ）、タキソール（ｔａｘｏｌ）、ペメトレキセド（Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）及びタモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）からなる群から選ばれた一つ以上の抗がん剤に対する耐性を持つものである、請求項１５に記載の抗がん剤の耐性抑制用医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１に記載のポリペプチドの腫瘍性疾患の予防又は治療用薬剤の製造のための使用。
【国際調査報告】
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