(57)【要約】本開示は、栄養要求性因子の投与をともなう遺伝子療法の向上のための改変された栄養要求性宿主細胞を作製および使用するための組成物および方法を提供する。2021522865.tif 000042
2021522865.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)栄養要求性誘導座位の断片に相同な、または該栄養要求性誘導座位の相補体に相同な、1種または複数種のヌクレオチド配列、および
(b)任意で発現制御配列に連結された、治療的因子をコードする導入遺伝子
を含むドナーテンプレート。
【請求項２】
一本鎖である、請求項1記載のドナーテンプレート。
【請求項３】
二本鎖である、請求項1記載のドナーテンプレート。
【請求項４】
プラスミドまたはDNA断片またはベクターである、請求項1記載のドナーテンプレート。
【請求項５】
複製に必要なエレメントを含み、任意でプロモーターおよび3’UTRを含むプラスミドである、請求項4記載のドナーテンプレート。
【請求項６】
(a)前記栄養要求性誘導座位の断片に相同な、または前記栄養要求性誘導座位の相補体に相同な、1種または複数種のヌクレオチド配列、および
(b)治療的因子をコードする導入遺伝子
を含むベクター。
【請求項７】
ウイルスベクターである、請求項6記載のベクター。
【請求項８】
レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および単純ヘルペスウイルスのベクターからなる群より選択される、請求項7記載のウイルスベクター。
【請求項９】
前記ウイルスベクターの複製に必要な遺伝子をさらに含む、請求項7記載のウイルスベクター。
【請求項１０】
前記導入遺伝子の両側に、前記栄養要求性誘導座位の断片またはその相補体に相同なヌクレオチド配列が隣接している、先行請求項のいずれか一項記載のドナーテンプレートまたはベクター。
【請求項１１】
前記栄養要求性誘導座位が、栄養要求性因子の合成、再利用またはサルベージに関与するタンパク質をコードする遺伝子である、先行請求項のいずれか一項記載のドナーテンプレートまたはベクター。
【請求項１２】
前記栄養要求性誘導座位が、表1の遺伝子内または表1の遺伝子の発現を制御する領域内にある、先行請求項のいずれか一項記載のドナーテンプレートまたはベクター。
【請求項１３】
前記栄養要求性誘導座位が、ウリジン一リン酸合成酵素をコードする遺伝子内にある、先行請求項のいずれか一項記載のドナーテンプレートまたはベクター。
【請求項１４】
前記栄養要求性誘導座位が、ホロカルボキシラーゼ合成酵素をコードする遺伝子内にある、先行請求項のいずれか一項記載のドナーテンプレートまたはベクター。
【請求項１５】
前記栄養要求性誘導座位の断片に相同な前記ヌクレオチド配列が、前記栄養要求性誘導座位の少なくとも200個の連続したヌクレオチドと98％同一である、先行請求項のいずれか一項記載のドナーテンプレートまたはベクター。
【請求項１６】
前記栄養要求性誘導座位の断片に相同な前記ヌクレオチド配列が、ヒトウリジン一リン酸合成酵素またはホロカルボキシラーゼ合成酵素または表1の遺伝子のいずれかの少なくとも200個の連続したヌクレオチドと98％同一である、先行請求項のいずれか一項記載のドナーテンプレートまたはベクター。
【請求項１７】
前記導入遺伝子に機能的に連結された発現制御配列をさらに含む、先行請求項のいずれか一項記載のドナーテンプレートまたはベクター。
【請求項１８】
前記発現制御配列が組織特異的発現制御配列である、請求項17記載のドナーテンプレートまたはベクター。
【請求項１９】
前記発現制御配列がプロモーターまたはエンハンサーである、請求項17記載のドナーテンプレートまたはベクター。
【請求項２０】
前記発現制御配列が誘導性プロモーターである、請求項17記載のドナーテンプレートまたはベクター。
【請求項２１】
前記発現制御配列が構成的プロモーターである、請求項17記載のドナーテンプレートまたはベクター。
【請求項２２】
前記発現制御配列が転写後調節配列である、請求項17記載のドナーテンプレートまたはベクター。
【請求項２３】
前記発現制御配列がマイクロRNAである、請求項17記載のドナーテンプレートまたはベクター。
【請求項２４】
マーカー遺伝子をさらに含む、先行請求項のいずれか一項記載のドナーテンプレートまたはベクター。
【請求項２５】
前記マーカー遺伝子が、NGFRもしくはEGFRの少なくとも断片、CD20もしくはCD19の少なくとも断片、Myc、HA、FLAG、GFP、または抗生物質抵抗性遺伝子を含む、請求項24記載のドナーテンプレートまたはベクター。
【請求項２６】
前記導入遺伝子が、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン結合タンパク質、酵素、抗体、Fc融合タンパク質、増殖因子、転写因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質、受容体、細胞表面抗原、受容体アンタゴニスト、および共刺激因子、構造タンパク質、細胞表面抗原、イオンチャネル、エピジェネティック修飾因子、またはRNA編集タンパク質からなる群より選択される、先行請求項のいずれか一項記載のドナーテンプレートまたはベクター。
【請求項２７】
前記導入遺伝子がT細胞抗原受容体をコードする、先行請求項のいずれか一項記載のドナーテンプレートまたはベクター。
【請求項２８】
前記導入遺伝子がRNA、任意で調節性マイクロRNAをコードする、先行請求項のいずれか一項記載のドナーテンプレートまたはベクター。
【請求項２９】
(a)cas9タンパク質、および
(b)栄養要求性誘導座位に対して特異的なガイドRNA
を含む、栄養要求性誘導座位に導入遺伝子の組み込みをターゲティングするためのヌクレアーゼシステム。
【請求項３０】
栄養要求性誘導座位に対して特異的なメガヌクレアーゼを含む、該栄養要求性誘導座位に導入遺伝子の組み込みをターゲティングするためのヌクレアーゼシステム。
【請求項３１】
前記メガヌクレアーゼがZFNまたはTALENである、請求項27記載のヌクレアーゼシステム。
【請求項３２】
請求項1〜28のいずれか一項記載のドナーテンプレートまたはベクターをさらに含む、請求項29〜31のいずれか一項記載のヌクレアーゼシステム。
【請求項３３】
栄養要求性誘導座位に組み込まれた治療的因子をコードする導入遺伝子を含む、エクスビボの改変宿主細胞であって、該改変宿主細胞が栄養要求性因子について栄養要求性であり、かつ該治療的因子を発現することができる、改変宿主細胞。
【請求項３４】
哺乳動物細胞である、請求項33記載の改変宿主細胞。
【請求項３５】
ヒト細胞である、請求項33記載の改変宿主細胞。
【請求項３６】
胚性幹細胞、幹細胞、前駆細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹（iPS）細胞、体性幹細胞、分化細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、脂肪幹細胞、ケラチノサイト、骨格幹細胞、筋肉幹細胞、線維芽細胞、NK細胞、B細胞、T細胞、および末梢血単核球（PBMC）からなる群より選択される、請求項33記載の改変宿主細胞。
【請求項３７】
前記改変宿主細胞を用いて治療される対象からの細胞に由来する、請求項33記載の改変宿主細胞。
【請求項３８】
改変された哺乳動物宿主細胞を作製する方法であって、
(a)前記栄養要求性誘導座位のDNAを標的としかつ開裂させる1種もしくは複数種のヌクレアーゼシステム、または該1種もしくは複数種のヌクレアーゼシステムの1種もしくは複数種の構成成分をコードする核酸を該哺乳動物宿主細胞に導入すること、および
(b)請求項1〜28のいずれか一項記載のドナーテンプレートまたはベクター
を含む、前記方法。
【請求項３９】
第2のゲノム遺伝子座のDNAを標的としかつ開裂させるための、第2のヌクレアーゼもしくは第2のガイドRNA、または該第2のヌクレアーゼもしくは第2のガイドRNAをコードする核酸、および任意で、
(b)第2のドナーテンプレートまたはベクター
を導入することをさらに含む、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
エクスビボで、哺乳動物細胞の栄養要求性誘導座位に導入遺伝子の組み込みをターゲティングする方法であって、請求項1〜28のいずれか一項記載のドナーテンプレートまたはベクターおよびヌクレアーゼと該哺乳動物細胞を接触させることを含む、前記方法。
【請求項４１】
前記ヌクレアーゼがZFNである、請求項38〜40のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
前記ヌクレアーゼがTALENである、請求項38〜40のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
改変された哺乳動物宿主細胞を作製する方法であって、
(a)Cas9ポリペプチドまたは該Cas9ポリペプチドをコードする核酸、
(b)栄養要求性誘導座位に特異的なガイドRNA、または該ガイドRNAをコードする核酸、および
(c)請求項1〜28のいずれか一項記載のドナーテンプレートまたはベクター
を該哺乳動物宿主細胞に導入することを含む、前記方法。
【請求項４４】
(a)第2の栄養要求性誘導座位に特異的な第2のガイドRNA、または該ガイドRNAをコードする核酸、および任意で、
(b)第2のドナーテンプレートまたはベクター
を前記哺乳動物宿主細胞に導入することをさらに含む、請求項42記載の方法。
【請求項４５】
エクスビボで、哺乳動物細胞の栄養要求性誘導座位に導入遺伝子の組み込みをターゲティングする方法であって、請求項1〜28のいずれか一項記載のドナーテンプレートまたはベクター、Cas9ポリペプチド、およびガイドRNAと該哺乳動物細胞を接触させることを含む、前記方法。
【請求項４６】
前記ガイドRNAがキメラRNAである、請求項43〜45のいずれか一項記載の方法。
【請求項４７】
前記ガイドRNAが2つのハイブリダイズしたRNAを含む、請求項43〜45のいずれか一項記載の方法。
【請求項４８】
前記栄養要求性誘導座位内に1つまたは複数の一本鎖切断を生じさせることをさらに含む、請求項38〜45のいずれか一項記載の方法。
【請求項４９】
前記栄養要求性誘導座位内に二本鎖切断を生じさせることをさらに含む、請求項38〜45のいずれか一項記載の方法。
【請求項５０】
前記栄養要求性誘導座位が、前記ドナーテンプレートまたはベクターを使用する相同組換えによって改変される、請求項38〜49のいずれか一項記載の方法。
【請求項５１】
工程(a)および(b)が、前記細胞の拡大、および任意で、前記細胞の培養の前または後に行われる、請求項38〜49のいずれか一項記載の方法。
【請求項５２】
(c)前記栄養要求性誘導座位に組み込まれた前記導入遺伝子を含む細胞を選択することをさらに含む、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
前記選択することが、
(i)生存するために前記栄養要求性因子を必要とする細胞を選択すること；および任意で、
(ii)前記栄養要求性誘導座位に組み込まれた前記導入遺伝子を含む細胞を選択すること
を含む、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
前記栄養要求性誘導座位がウリジン一リン酸合成酵素をコードする遺伝子であり、前記細胞が、5-FOAと接触させることにより選択される、請求項52記載の方法。
【請求項５５】
請求項1〜28のいずれか一項記載のドナーテンプレートもしくはベクターまたは請求項29〜32のいずれか一項記載のヌクレアーゼシステム、および滅菌水または薬学的に許容される賦形剤を含む、無菌組成物。
【請求項５６】
請求項33〜37のいずれか一項記載の改変された哺乳動物宿主細胞および滅菌水または薬学的に許容される賦形剤を含む、無菌組成物。
【請求項５７】
先行請求項のいずれか一項記載のドナーテンプレートもしくはベクターもしくはヌクレアーゼシステムもしくは改変宿主細胞、またはこれらの組み合わせを、任意で容器またはバイアルとともに含む、キット。
【請求項５８】
対象において治療的因子を発現させる方法であって、
(a)請求項33〜37のいずれか一項記載の改変宿主細胞を投与すること；
(b)任意で、改変細胞が生着するのを可能にするために、前処置レジメを施すこと；および
(c)前記栄養要求性因子を投与すること
を含む、前記方法。
【請求項５９】
前記改変宿主細胞および栄養要求性因子を投与することが同時に行われる、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
前記改変宿主細胞および栄養要求性因子を投与することが連続して行われる、請求項58記載の方法。
【請求項６１】
前記治療的因子の発現を促進するのに十分な期間にわたって、前記栄養要求性因子の投与を定期的に続けることをさらに含む、請求項58記載の方法。
【請求項６２】
前記治療的因子の発現を低下させるために、前記栄養要求性因子を投与する速度を低下させることをさらに含む、請求項58記載の方法。
【請求項６３】
前記治療的因子の発現を増大させるために、前記栄養要求性因子の投与を増加させることをさらに含む、請求項58記載の方法。
【請求項６４】
前記改変宿主細胞の増殖阻害または死をもたらす状態を引き起こすために、前記栄養要求性因子の投与を中止することをさらに含む、請求項58記載の方法。
【請求項６５】
前記改変宿主細胞の増殖阻害をもたらす状態を引き起こすために、前記栄養要求性因子の投与を一時的に中断することをさらに含む、請求項58記載の方法。
【請求項６６】
対象において治療効果を発揮するのに十分な期間にわたって、前記栄養要求性因子の投与を続けることをさらに含む、請求項58記載の方法。
【請求項６７】
前記改変宿主細胞が再生性である、請求項58記載の方法。
【請求項６８】
前記改変宿主細胞の投与が局所的送達を含む、請求項58記載の方法。
【請求項６９】
前記栄養要求性因子の投与が全身送達を含む、請求項58記載の方法。
【請求項７０】
改変前に、治療される対象から前記宿主細胞を得ることをさらに含む、先行請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項７１】
疾患、障害、または状態を有する対象を治療する方法であって、治療量の前記治療的因子の発現をもたらすのに十分である量で、(a)前記改変宿主細胞および(b)前記栄養要求性因子を該対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項７２】
前記疾患、前記障害、または前記状態が、癌、パーキンソン病、移植片対宿主病（GvHD）、自己免疫性状態、過剰増殖性の障害または状態、悪性形質転換、肝臓の状態、遺伝性遺伝子欠陥を含めた遺伝的状態、若年型糖尿病、および眼の区画の状態からなる群より選択される、請求項67記載の方法。
【請求項７３】
前記疾患、前記障害、または前記状態が、筋肉系、骨格系、循環系、神経系、リンパ系、呼吸器系、内分泌系、消化器系、排出系、および生殖器系からなる群より選択される、体の少なくとも1つの系に影響を及ぼす、請求項67記載の方法。
【請求項７４】
疾患、障害、または状態の治療のための、請求項33〜37のいずれか一項記載の改変宿主細胞の使用。
【請求項７５】
ヒトへの投与で使用するための、または疾患、障害、もしくは状態の治療で使用するための、請求項33〜37のいずれか一項記載の改変宿主細胞。
【請求項７６】
請求項33〜37のいずれか一項記載の改変ヒト宿主細胞が与えられたヒトへの投与で使用するための栄養要求性因子。
【請求項７７】
その必要のある対象において、疾患または障害を緩和または治療する方法であって、
(a)栄養要求性誘導座位に組み込まれたタンパク質をコードする導入遺伝子を含む改変宿主細胞を含む組成物であって、該改変宿主細胞が栄養要求性因子について栄養要求性である、組成物；および
(b)該タンパク質の治療的発現をもたらすのに十分である量の該栄養要求性因子
を該対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項７８】
前記栄養要求性誘導座位が、ウリジン一リン酸合成酵素（UMPS）をコードする遺伝子内にある、請求項77記載の方法。
【請求項７９】
前記栄養要求性因子がウリジンである、請求項78記載の方法。
【請求項８０】
前記栄養要求性誘導座位が、ホロカルボキシラーゼ合成酵素（HLCS）をコードする遺伝子内にある、請求項77記載の方法。
【請求項８１】
前記栄養要求性因子がビオチンである、請求項80記載の方法。
【請求項８２】
前記タンパク質が酵素である、請求項77記載の方法。
【請求項８３】
前記タンパク質が抗体である、請求項77記載の方法。
【請求項８４】
前記改変宿主細胞が、胚性幹細胞、幹細胞、前駆細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹（iPS）細胞、体性幹細胞、分化細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、脂肪幹細胞、ケラチノサイト、骨格幹細胞、筋肉幹細胞、線維芽細胞、NK細胞、B細胞、T細胞、または末梢血単核球（PBMC）である、請求項77記載の方法。
【請求項８５】
前記改変宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項77記載の方法。
【請求項８６】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項85記載の方法。
【請求項８７】
前記改変宿主細胞が前記改変宿主細胞を用いて治療される前記対象に由来する、請求項77記載の方法。
【請求項８８】
前記組成物および前記栄養要求性因子を投与することが同時に行われる、請求項77記載の方法。
【請求項８９】
前記組成物および前記栄養要求性因子が連続して投与される、請求項77記載の方法。
【請求項９０】
前記組成物が前記栄養要求性因子の前に投与される、請求項89記載の方法。
【請求項９１】
前記組成物および前記栄養要求性因子が同時に投与される、請求項77記載の方法。
【請求項９２】
前記栄養要求性因子の投与が、前記タンパク質の治療的発現を促進するのに十分な期間にわたって定期的に続けられる、請求項77記載の方法。
【請求項９３】
前記タンパク質の発現を低下させるために、前記栄養要求性因子の投与が減らされる、請求項77記載の方法。
【請求項９４】
前記タンパク質の発現を増大させるために、前記栄養要求性因子の投与が増やされる、請求項77記載の方法。
【請求項９５】
前記栄養要求性因子の投与の中止が、前記改変宿主細胞の増殖阻害または細胞死を誘導する、請求項77記載の方法。
【請求項９６】
前記栄養要求性因子の投与が、前記対象において治療効果を発揮するのに十分な期間にわたって続けられる、請求項77記載の方法。
【請求項９７】
前記改変宿主細胞が再生性である、請求項77記載の方法。
【請求項９８】
前記組成物の投与が局所的送達を含む、請求項77記載の方法。
【請求項９９】
前記栄養要求性因子の投与が全身送達を含む、請求項77記載の方法。
【請求項１００】
前記疾患がリソソーム蓄積症（LSD）である、請求項77記載の方法。
【請求項１０１】
前記リソソーム蓄積症（LSD）が、ゴーシェ病（タイプ1/2/3）、MPS2（ハンター）病、ポンペ病、ファブリー病、クラッベ病、低ホスファターゼ症、ニーマン・ピック病タイプA/B、MPS1、MPS3A、MPS3B、MPS3C、MPS3、MPS4、MPS6、MPS7、フェニルケトン尿症、MLD、サンドホフ病、テイ・サックス病、またはバッテン病である、請求項100記載の方法。
【請求項１０２】
前記酵素が、グルコセレブロシダーゼ、イデュルスルファーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、アガルシダーゼアルファ、アガルシダーゼベータ、ガラクトシルセラミダーゼ、アスホターゼアルファ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ラロニダーゼ、ヘパランN-スルファターゼ、アルファ-N-アセチルグルコサミニダーゼ、ヘパラン-α-グルコサミニドN‐アセチルトランスフェラーゼ、N-アセチルグルコサミン6-スルファターゼ、エロスルファーゼアルファ、グラスルフェート、B-グルクロニダーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アリールスルファターゼA、ヘキソサミニダーゼ-B、ヘキソサミニダーゼ-A、またはトリペプチジルペプチダーゼ1である、請求項82記載の方法。
【請求項１０３】
前記疾患が、フリートライヒ運動失調症、遺伝性血管性浮腫、または脊髄性筋萎縮症である、請求項77記載の方法。
【請求項１０４】
前記タンパク質が、フラタキシン、C1エステラーゼインヒビター、またはSMN1である、請求項77記載の方法。
【請求項１０５】
対象において腫瘍のサイズを縮小させるか、または腫瘍の増殖の速度を低下させる方法であって、請求項33〜37のいずれか一項記載の改変宿主細胞を該対象に投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本国際出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、2018年5月10日に出願された米国特許仮出願第62/669,848号に対する優先権を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、電子フォーマットの配列表とともに出願されている。2158_1001PCT_SL.txtと題する配列表ファイルは2019年5月10日に作成され、1,970バイトのサイズである。配列表の電子フォーマットの情報は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００３】
本開示の分野
本明細書の開示は、有効性および安全性が向上している、遺伝子療法の方法、組成物、およびキットに関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
細胞療法は、有望な治療を提供することが示されている。それにもかかわらず、ヒト宿主への改変細胞の再導入は、免疫反応、悪性形質転換、または導入遺伝子の過剰産生もしくは導入遺伝子の制御の欠如を含めた危険性をともなう。
【０００５】
遺伝子操作のいくつかのアプローチによって、細胞のシグナリング、増殖、またはアポトーシスのようなヒト細胞の機能に関する制御が可能になり（Bonifant, et al. Mol. Ther. - Oncolytics 3, 16011 (2016)（非特許文献1）；Sockolosky et al., (2018). Science (80-. ). 359, 1037-1042（非特許文献2） Tey, (2014) Clin. Transl. Immunol. 3, e17（非特許文献3）を参照されたい。これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）、細胞療法の重度の副作用さえ制御することが可能になった（Bonifant et al., 2016）。こうした進展にもかかわらず、他の適用は、広範な適用、例えば、再生医療のための操作された多能性細胞の使用を遂げることが妨げられており（Ben-David and Benvenisty, 2011, Nat. Rev. Cancer 11, 268-277.（非特許文献4）；Lee et al., 2013, Nat. Med. 19, 998-1004（非特許文献5）；Porteus, M. (2011) Mol. Ther. 19, 439-441（非特許文献6）を参照されたい。これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）、これは、遺伝的にコードされる制御メカニズムを細胞へ導入することに依拠する制御システムに複数の制限があるという事実による（Tey, 2014）。
【０００６】
起こり得る主な問題のうちの2つは、「漏出性」、すなわち、その誘発因子の非存在下での前記メカニズムの低レベルの活性（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Ando et al. (2015) Stem Cell Reports 5, 597-608（非特許文献7）を参照されたい）および前記メカニズムの活性化の際に細胞集団全体の除去がないこと（Garin et al. (2001) Blood 97, 122-129（非特許文献8）；Di Stasi et al. (2011) N Engl J Med 365, 1673-1683（非特許文献9）；Wu et al. (2014) N Engl J Med 365, 1673-1683（非特許文献10）; Yagyu et al. (2015) Mol. Ther. 23, 1475-1485（非特許文献11）を参照されたい。これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）であり、これは、外部制御からのいくつかの逃避メカニズムが理由である。例えば、ウイルス形質導入によって導入される導入遺伝子は、細胞による発現がサイレンスされ得る（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Sulkowski et al. (2018) Switch. Int. J. Mol. Sci. 19, 197（非特許文献12）を参照されたい）か、または細胞がエフェクターメカニズムに対して抵抗性を発達させ得る（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Yagyu et al. (2015) Mol. Ther. 23, 1475-1485（非特許文献11）を参照されたい）。別の懸念は、遺伝的不安定性を有する細胞タイプ、例えば、長期間培養された細胞株、または腫瘍細胞株における導入遺伝子の突然変異である（Merkle et al. (2017) Nature 545, 229-233（非特許文献13）；D’Antonio et al. (2018) Cell Rep. 24, 883-894（非特許文献14）。これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。さらに、一次細胞集団は、エクスビボ培養において限られた時間だけの間その機能性を保持することが多く、多くのタイプは、クローン単離によって純化することができない。
【０００７】
安全スイッチの既存の様式は、いくつかの危険性、例えば、
(1)細胞株の発癌性形質転換につながる、腫瘍抑制因子への導入遺伝子の挿入、および
(2)発現の欠如、それによる有効性の欠如、またはその後の、挿入後の導入遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングにつながるエピジェネティックにサイレンシングされた領域への導入遺伝子の挿入
も有する。ゲノム不安定性は、細胞の発癌性形質転換における共通の表現型である。さらに、外来性自殺スイッチの点変異または遺伝的喪失が、急速に選択され、増幅されるであろう。細胞のシグナリング経路を標的とすることに基づく安全スイッチは、細胞の生理機能に依存する。例えば、「生存促進性」様式にある細胞は、カスパーゼインヒビターを発現することができ、自殺スイッチの誘導時に細胞死を防止する。
【０００８】
遺伝子療法の特に魅力的な適用は、遺伝子産物の不全によって引き起こされるか、または遺伝子産物、例えば、治療的タンパク質、抗体、もしくはRNAの発現の増大によって治療可能であるかのいずれかである障害の治療を含む。
【０００９】
最近の進展によって、ヒト細胞のゲノムの正確な改変が可能になる。この遺伝子操作によって、幅広い適用が可能になるが、細胞挙動を制御するための新しい方法も必要となる。細胞に対する代替制御システムは、代謝における遺伝子を標的とすることによって操作することができる栄養要求性である。この概念は、微生物について探究され（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Steidler et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21, 785-789（非特許文献15）を参照されたい）、酵母遺伝学者によって、ほぼ普遍的な研究ツールとして広く使用されている。これは、複雑な制御メカニズムの導入による代わりに遺伝子のノックアウトによって作り出されるならば、および栄養要求性が、細胞の内在性代謝の一部である非毒性化合物に対するものであるならば、哺乳動物細胞において特に強力であろう。これは、代謝経路の必須遺伝子を破壊し、その経路の産物が外部から供給され、その環境から細胞によって取り込まれる場合のみ細胞が機能することが可能になることによって、達成することができる。さらに、それぞれの遺伝子が細胞毒性作用物質の活性化にも関与するならば、遺伝子ノックアウト（KO）は、その薬物に対して細胞を抵抗性にし、それによって、細胞集団において非改変細胞の枯渇および操作された細胞の純化を可能にするであろう。代謝に関するいくつかの一遺伝子性先天的エラーは、代謝産物の供給によって治療することができ、したがって、ヒト栄養要求性のモデルと考えることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Bonifant, et al. Mol. Ther. - Oncolytics 3, 16011 (2016)
【非特許文献２】Sockolosky et al., (2018). Science (80-. ). 359, 1037-1042
【非特許文献３】Tey, (2014) Clin. Transl. Immunol. 3, e17
【非特許文献４】Ben-David and Benvenisty, 2011, Nat. Rev. Cancer 11, 268-277.
【非特許文献５】Lee et al., 2013, Nat. Med. 19, 998-1004
【非特許文献６】Porteus, M. (2011) Mol. Ther. 19, 439-441
【非特許文献７】Ando et al. (2015) Stem Cell Reports 5, 597-608
【非特許文献８】Garin et al. (2001) Blood 97, 122-129
【非特許文献９】Di Stasi et al. (2011) N Engl J Med 365, 1673-1683
【非特許文献１０】Wu et al. (2014) N Engl J Med 365, 1673-1683
【非特許文献１１】Yagyu et al. (2015) Mol. Ther. 23, 1475-1485
【非特許文献１２】Sulkowski et al. (2018) Switch. Int. J. Mol. Sci. 19, 197
【非特許文献１３】Merkle et al. (2017) Nature 545, 229-233
【非特許文献１４】D’Antonio et al. (2018) Cell Rep. 24, 883-894
【非特許文献１５】Steidler et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21, 785-789
【発明の概要】
【００１１】
本開示の概要
いくつかの態様では、
(a)栄養要求性誘導座位の断片に相同な、または該栄養要求性誘導座位の相補体に相同な、1種または複数種のヌクレオチド配列、および
(b)任意で発現制御配列に連結された、治療的因子をコードする導入遺伝子
を含むドナーテンプレートが、本明細書に開示される。ある場合には、ドナーテンプレートは一本鎖である。ある場合には、ドナーテンプレートは二本鎖である。ある場合には、ドナーテンプレートはプラスミドまたはDNA断片またはベクターである。ある場合には、ドナーテンプレートは、複製に必要なエレメントを含み、任意でプロモーターおよび3’UTRを含むプラスミドである。いくつかの態様では、
(a)栄養要求性誘導座位の断片に相同な、または該栄養要求性誘導座位の相補体に相同な、1種または複数種のヌクレオチド配列、および
(b)治療的因子をコードする導入遺伝子
を含むベクターが、本明細書に開示される。ある場合には、ベクターはウイルスベクターである。ある場合には、ベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および単純ヘルペスウイルスのベクターからなる群より選択される。ある場合には、ベクターは、ウイルスベクターの複製に必要な遺伝子をさらに含む。ある場合には、導入遺伝子の両側に、栄養要求性誘導座位の断片またはその相補体に相同なヌクレオチド配列が隣接している。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、栄養要求性因子の合成、再利用またはサルベージに関与するタンパク質をコードする遺伝子である。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、表1の遺伝子内または表1の遺伝子の発現を制御する領域内にある。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、ウリジン一リン酸合成酵素をコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、ホロカルボキシラーゼ合成酵素をコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性誘導座位の断片に相同なヌクレオチド配列は、栄養要求性誘導座位の少なくとも200個の連続したヌクレオチドと98％同一である。ある場合には、栄養要求性誘導座位の断片に相同なヌクレオチド配列は、ヒトウリジン一リン酸合成酵素またはホロカルボキシラーゼ合成酵素または表1の遺伝子のいずれかの少なくとも200個の連続したヌクレオチドと98％同一である。ある場合には、ドナーテンプレートまたはベクターは、前記導入遺伝子に機能的に連結された発現制御配列をさらに含む。ある場合には、発現制御配列は組織特異的発現制御配列である。ある場合には、発現制御配列はプロモーターまたはエンハンサーである。ある場合には、発現制御配列は誘導性プロモーターである。ある場合には、発現制御配列は構成的プロモーターである。ある場合には、発現制御配列は転写後調節配列である。ある場合には、発現制御配列はマイクロRNAである。ある場合には、ドナーテンプレートまたはベクターはマーカー遺伝子をさらに含む。ある場合には、マーカー遺伝子は、NGFRまたはEGFRの少なくとも断片、CD20またはCD19の少なくとも断片、Myc、HA、FLAG、GFP、抗生物質抵抗性遺伝子を含む。ある場合には、導入遺伝子は、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン結合タンパク質、酵素、抗体、Fc融合タンパク質、増殖因子、転写因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質、受容体、細胞表面抗原、受容体アンタゴニスト、および共刺激因子、構造タンパク質、細胞表面抗原、イオンチャネル、エピジェネティック修飾因子、またはRNA編集タンパク質からなる群より選択される。ある場合には、導入遺伝子はT細胞抗原受容体をコードする。ある場合には、導入遺伝子はRNA、任意で調節性マイクロRNAをコードする。
【００１２】
いくつかの態様では、cas9タンパク質、および栄養要求性誘導座位に対して特異的なガイドRNAを含む、栄養要求性誘導座位に導入遺伝子の組み込みをターゲティングするためのヌクレアーゼシステムが、本明細書に開示される。いくつかの態様では、栄養要求性誘導座位に対して特異的なメガヌクレアーゼを含む、栄養要求性誘導座位に導入遺伝子の組み込みをターゲティングするためのヌクレアーゼシステムが、本明細書に開示される。ある場合には、メガヌクレアーゼはZFNまたはTALENである。ある場合には、ヌクレアーゼシステムは本明細書に開示されるドナーテンプレートまたはベクターをさらに含む。
【００１３】
いくつかの態様では、栄養要求性誘導座位に組み込まれた治療的因子をコードする導入遺伝子を含む、エクスビボの改変宿主細胞であって、該改変宿主細胞が栄養要求性因子について栄養要求性であり、かつ治療的因子を発現することができる、改変宿主細胞が、本明細書に開示される。ある場合には、改変宿主細胞は哺乳動物細胞である。ある場合には、改変宿主細胞はヒト細胞である。ある場合には、改変宿主細胞は、胚性幹細胞、幹細胞、前駆細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹（iPS）細胞、体性幹細胞、分化細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、脂肪幹細胞、ケラチノサイト、骨格幹細胞、筋肉幹細胞、線維芽細胞、NK細胞、B細胞、T細胞、または末梢血単核球（PBMC）である。ある場合には、改変宿主細胞は、改変宿主細胞を用いて治療される対象からの細胞に由来する。
【００１４】
いくつかの態様では、改変された哺乳動物宿主細胞を作製する方法であって、
(a)栄養要求性誘導座位のDNAを標的としかつ開裂させる1種もしくは複数種のヌクレアーゼシステム、または該1種もしくは複数種のヌクレアーゼシステムの1種もしくは複数種の構成成分をコードする核酸を該哺乳動物宿主細胞に導入すること、および
(b)本明細書に開示されるドナーテンプレートまたはベクター
を含む方法が、本明細書に開示される。ある場合には、方法は、第2のゲノム遺伝子座のDNAを標的としかつ開裂させるための、第2のヌクレアーゼもしくは第2のガイドRNA、または該第2のヌクレアーゼもしくは第2のガイドRNAをコードする核酸、および任意で、(b)第2のドナーテンプレートまたはベクターを導入することをさらに含む。
【００１５】
いくつかの態様では、エクスビボで、哺乳動物細胞の栄養要求性誘導座位に導入遺伝子の組み込みをターゲティングする方法であって、本明細書に開示されるドナーテンプレートまたはベクター、およびヌクレアーゼと該哺乳動物細胞を接触させることを含む方法が、本明細書に開示される。ある場合には、ヌクレアーゼはZFNである。ある場合には、ヌクレアーゼはTALENである。
【００１６】
いくつかの態様では、改変された哺乳動物宿主細胞を作製する方法であって、
(a)Cas9ポリペプチドまたは該Cas9ポリペプチドをコードする核酸、
(b)栄養要求性誘導座位に特異的なガイドRNA、または該ガイドRNAをコードする核酸、および
(c)本明細書に開示されるドナーテンプレートまたはベクター
を該哺乳動物宿主細胞に導入することを含む方法が、本明細書に開示される。方法は、
(a)第2の栄養要求性誘導座位に特異的な第2のガイドRNA、または該ガイドRNAをコードする核酸、および任意で、
(b)第2のドナーテンプレートまたはベクター
を前記哺乳動物宿主細胞に導入することをさらに含む。
【００１７】
いくつかの態様では、エクスビボで、哺乳動物細胞の栄養要求性誘導座位に導入遺伝子の組み込みをターゲティングする方法であって、本明細書に開示されるドナーテンプレートまたはベクター、Cas9ポリペプチド、およびガイドRNAと該哺乳動物細胞を接触させることを含む方法が、本明細書に開示される。ある場合には、ガイドRNAはキメラRNAである。ある場合には、ガイドRNAは2つのハイブリダイズしたRNAを含む。ある場合には、方法は、栄養要求性誘導座位内に1つまたは複数の一本鎖切断を生じさせる。ある場合には、方法は、栄養要求性誘導座位内に二本鎖切断を生じさせる。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、前記ドナーテンプレートまたはベクターを使用する相同組換えによって改変される。ある場合には、工程(a)および(b)は、前記細胞の拡大、および任意で、前記細胞の培養の前または後に行われる。ある場合には、方法は、(c)栄養要求性誘導座位に組み込まれた導入遺伝子を含む細胞を選択することをさらに含む。ある場合には、選択は、
(i)生存するために栄養要求性因子を必要とする細胞を選択すること、および任意で、
(ii)栄養要求性誘導座位に組み込まれた導入遺伝子を含む細胞を選択すること
を含む。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、ウリジン一リン酸合成酵素をコードする遺伝子であり、細胞は、5-FOAと接触させることにより選択される。
【００１８】
いくつかの態様では、前記ドナーテンプレートもしくはベクター、または前記ヌクレアーゼシステム、および滅菌水または薬学的に許容される賦形剤を含む無菌組成物が、本明細書に開示される。いくつかの態様では、改変された哺乳動物宿主細胞、および滅菌水または薬学的に許容される賦形剤を含む無菌組成物が、本明細書に開示される。いくつかの態様では、先行請求項のいずれか一項記載のドナーテンプレートもしくはベクターもしくはヌクレアーゼシステムもしくは改変宿主細胞、またはこれらの組み合わせを任意で容器またはバイアルとともに含むキットが、本明細書に開示される。
【００１９】
いくつかの態様では、対象において治療的因子を発現させる方法であって、
(a)改変宿主細胞を投与すること、
(b)任意で、改変細胞が生着するのを可能にするために、前処置レジメを施すこと、および
(c)栄養要求性因子を投与すること
を含む方法が、本明細書に開示される。ある場合には、改変宿主細胞および栄養要求性因子は同時に投与される。ある場合には、改変宿主細胞および栄養要求性因子は連続して投与される。ある場合には、前記栄養要求性因子の投与は、治療的因子の発現を促進するのに十分な期間にわたって定期的に続けられる。ある場合には、治療的因子の発現を低下させるために、前記栄養要求性因子の投与は減らされる。ある場合には、治療的因子の発現を増大させるために、前記栄養要求性因子の投与は増やされる。ある場合には、改変宿主細胞の増殖阻害または死をもたらす状態を引き起こすために、前記栄養要求性因子の投与は中止される。ある場合には、改変宿主細胞の増殖阻害をもたらす状態を引き起こすために、前記栄養要求性因子の投与は一時的に中断される。ある場合には、前記栄養要求性因子の投与は、対象において治療効果を発揮するのに十分な期間にわたって続けられる。ある場合には、改変宿主細胞は再生性である。ある場合には、改変宿主細胞の投与は局所的送達を含む。ある場合には、栄養要求性因子の投与は全身送達を含む。ある場合には、改変前の宿主細胞は治療される対象に由来する。
【００２０】
いくつかの態様では、疾患、障害、または状態を有する対象を治療する方法であって、治療量の治療的因子の発現をもたらすのに十分である量で、
(a)前記改変宿主細胞および
(b)前記栄養要求性因子
を対象に投与することを含む方法が、本明細書に開示される。ある場合には、疾患、障害、または状態は、癌、パーキンソン病、移植片対宿主病（GvHD）、自己免疫性状態、過剰増殖性の障害または状態、悪性形質転換、肝臓の状態、遺伝性遺伝子欠陥を含めた遺伝的状態、若年型糖尿病、および眼の区画の状態からなる群より選択される。ある場合には、疾患、障害、または状態は、筋肉系、骨格系、循環系、神経系、リンパ系、呼吸器系、内分泌系、消化器系、排出系、および生殖器系からなる群より選択される、体の少なくとも1つの系に影響を及ぼす。
【００２１】
いくつかの態様では、疾患、障害、または状態の治療のための、本明細書に開示される改変宿主細胞の使用が、本明細書に開示される。いくつかの態様では、ヒトへの投与で使用するための、または疾患、障害、もしくは状態の治療で使用するための本明細書に開示される改変宿主細胞が、本明細書に開示される。
【００２２】
いくつかの態様では、改変ヒト宿主細胞が与えられたヒトへの投与で使用するための栄養要求性因子が、本明細書に開示される。
【００２３】
いくつかの態様では、その必要のある対象において、疾患または障害を緩和または治療する方法が、本明細書において開示され、方法は、
(a)栄養要求性誘導座位に組み込まれたタンパク質をコードする導入遺伝子を含む改変宿主細胞を含む組成物であって、改変宿主細胞が栄養要求性因子について栄養要求性である、組成物；および
(b)該タンパク質の治療的発現をもたらすのに十分である量の栄養要求性因子
を対象に投与することを含む。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、ウリジン一リン酸合成酵素（UMPS）をコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はウリジンである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、ホロカルボキシラーゼ合成酵素（HLCS）をコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はビオチンである。ある場合には、タンパク質は酵素である。ある場合には、タンパク質は抗体である。ある場合には、改変宿主細胞は、胚性幹細胞、幹細胞、前駆細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹（iPS）細胞、体性幹細胞、分化細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、脂肪幹細胞、ケラチノサイト、骨格幹細胞、筋肉幹細胞、線維芽細胞、NK細胞、B細胞、T細胞、または末梢血単核球（PBMC）である。ある場合には、改変宿主細胞は哺乳動物細胞である。ある場合には、哺乳動物細胞はヒト細胞である。ある場合には、改変宿主細胞は改変宿主細胞を用いて治療される対象に由来する。ある場合には、組成物および栄養要求性因子は同時に投与される。ある場合には、組成物および栄養要求性因子は連続して投与される。ある場合には、組成物は栄養要求性因子の前に投与される。ある場合には、組成物および栄養要求性因子は同時に投与される。ある場合には、栄養要求性因子の投与は、タンパク質の治療的発現を促進するのに十分な期間にわたって定期的に続けられる。ある場合には、タンパク質の発現を低下させるために、栄養要求性因子の投与は減らされる。ある場合には、タンパク質の発現を増大させるために、栄養要求性因子の投与は増やされる。ある場合には、栄養要求性因子の投与の中止は、改変宿主細胞の増殖阻害または細胞死を誘導する。ある場合には、栄養要求性因子の投与は、対象において治療効果を発揮するのに十分な期間にわたって続けられる。ある場合には、改変宿主細胞は再生性である。ある場合には、組成物の投与は局所的送達を含む。ある場合には、栄養要求性因子の投与は全身送達を含む。ある場合には、疾患はリソソーム蓄積症（LSD）である。ある場合には、LSDは、ゴーシェ病（タイプ1/2/3）、MPS2（ハンター）病、ポンペ病、ファブリー病、クラッベ病、低ホスファターゼ症、ニーマン・ピック病タイプA/B、MPS1、MPS3A、MPS3B、MPS3C、MPS3、MPS4、MPS6、MPS7、フェニルケトン尿症、MLD、サンドホフ病、テイ・サックス病、またはバッテン病である。ある場合には、酵素は、グルコセレブロシダーゼ、イデュルスルファーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、アガルシダーゼアルファ／ベータ、ガラクトシルセラミダーゼ、アスホターゼアルファ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ラロニダーゼ、ヘパランN-スルファターゼ、アルファ-N-アセチルグルコサミニダーゼ、ヘパラン-α-グルコサミニドN-アセチルトランスフェラーゼ、N-アセチルグルコサミン6-スルファターゼ、エロスルファーゼアルファ、グラスルフェート（Glasulfate）、B-グルクロニダーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アリールスルファターゼA、ヘキソサミニダーゼ-B、ヘキソサミニダーゼ-A、またはトリペプチジルペプチダーゼ1である。ある場合には、疾患は、フリートライヒ運動失調症、遺伝性血管性浮腫、または脊髄性筋萎縮症である。ある場合には、タンパク質は、フラタキシン、C1エステラーゼインヒビター（HAEGAARDA（登録商標）皮下注射剤とも称され得る）、またはSMN1である。
【００２４】
本明細書に記載される様々な態様は、本明細書に記載される改変ヒト宿主細胞を対象に投与することを含む、対象において腫瘍のサイズを縮小させるか、または腫瘍の増殖の速度を低下させる方法を提供する。
【００２５】
参照による組み入れ
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願のそれぞれが参照により組み込まれることが具体的におよび個々に示される場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
本開示に包含される主題の特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載される。本開示の特徴および利点のより良い理解は、本明細書の開示によって包含される主題の原理が利用される、例示的な態様を記載する以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することにより得られるであろう。
【図１】図1Aおよび図1Bは、エレクトロポレーション後の至適な回復に対する血清の効果を例示する。図1Aは、至適なエレクトロポレーション回復条件を決定するために使用するアッセイの例示的な概略図である。エレクトロポレーション後に、細胞は、血清、5-フルオロオロト酸（5-FOA）、または外来性ウラシル供給源（ウリジン）が供給される／されない。図1Bは、示される培地条件における、エレクトロポレーション後の4日間の回復後の、CytoFLEXフローサイトメーター（Beckman Coulter）による細胞数を図示する。図は、血清が投与された細胞、5-FOAで処理された／処理されていない血清なしのモック編集細胞、および5-FOAで処理された／処理されていない細胞血清なしウリジン一リン酸合成酵素（UMPS）ノックアウトを示す。
【図２Ａ】図2A〜図2Fは、UMPS InDel含有細胞の維持および増殖が外来性ウラシル供給源を必要とすることを例示する。図2Aは、エレクトロポレーションおよび回復後のUMPSまたはモック編集T細胞の増殖のアッセイに使用される手順の例示的な概略図である。
【図２Ｂ】図2A〜図2Fは、UMPS InDel含有細胞の維持および増殖が外来性ウラシル供給源を必要とすることを例示する。図2Bは、示される培養条件における、UMPS InDelのTIDE（tracking of indels by decomposition）解析を図示する。TIDE解析は、オリゴヌクレオチドUMPS-O-1およびUMPS-O-2を用いて、UMPS座位のサンガーシークエンシングで行った。
【図２Ｃ】図2A〜図2Fは、UMPS InDel含有細胞の維持および増殖が外来性ウラシル供給源を必要とすることを例示する。図2Cは、8日目に行ったTIDEによって解析した、フレームシフトInDelを含むアレルのパーセンテージを図示する。
【図２Ｄ】図2A〜図2Fは、UMPS InDel含有細胞の維持および増殖が外来性ウラシル供給源を必要とすることを例示する。図2Dは、TIDEによって特定されたアレルを含む8日目の細胞の予測絶対数を図示する。
【図２Ｅ】図2A〜図2Fは、UMPS InDel含有細胞の維持および増殖が外来性ウラシル供給源を必要とすることを例示する。図2Eは、UMPあり／なしの細胞数のタイムコースを図示する。
【図２Ｆ】図2A〜図2Fは、UMPS InDel含有細胞の維持および増殖が外来性ウラシル供給源を必要とすることを例示する。図2Fは、ウリジンあり／なしの細胞数のタイムコースを図示する。
【図３Ａ】図3A〜図3Cは、5-FOAはUMPS標的化細胞株において毒性が低いことを例示する。図3Aは、5-FOA選択手順の例示的な概略図である。
【図３Ｂ】図3A〜図3Cは、5-FOAはUMPS標的化細胞株において毒性が低いことを例示する。図3Bおよび図3Cは、示される培養条件における、4日間の5-FOA選択後の細胞数を図示する。図3Bおよび図3Cでは、モックの結果は各培養条件について左のバーによって表され、UMPS-7の結果は各培養条件について右のバーによって示される。
【図３Ｃ】図3Bの説明を参照のこと。
【図４Ａ】図4A〜図4Dは、5-FOAで選択したUMPS標的化細胞株が外来性ウラシル供給源の存在下でのみ至適増殖を示すことを例示する。図4Aは、ウラシル栄養要求性の実証のためのプロトコールの例示的な概略図である。5-FOAにおける4日間の選択後に細胞培養を試験培地に分け、これをさらに4日間増殖させて、細胞計数を行った。
【図４Ｂ】図4A〜図4Dは、5-FOAで選択したUMPS標的化細胞株が外来性ウラシル供給源の存在下でのみ至適増殖を示すことを例示する。図4B〜図4Dは、外来性ウラシル（UMPまたはウリジン）を含む、または欠く培地中における、5-FOAで選択した細胞の細胞数を図示する。
【図４Ｃ】図4Bの説明を参照のこと。
【図４Ｄ】図4Bの説明を参照のこと。
【図５Ａ】図5Aは、ICE解析によってUMPS座位で行われたInDelの定量化を例示する。
【図５Ｂ】図5Bは、モック処理後のT細胞、CCR5ノックアウト、またはUMPSノックアウトの増殖を例示する。
【図５Ｃ】図5Cは、UMPまたはウリジンがあるまたはない、UMPSノックアウトを有するT細胞の増殖を図示する。
【図５Ｄ】図5Dは、異なる培養条件を用いた、UMPSノックアウト後8日目のInDelの頻度を図示する。
【図５Ｅ】図5Eは、フレームシフトにつながると予想されるInDelの頻度を図示する。
【図６Ａ】図6Aは、UMPS座位のターゲティングのためのDNAドナーコンストラクトを例示する。
【図６Ｂ】図6Bは、K562細胞のターゲティング後の表面マーカーの発現を図示する。
【図６Ｃ】図6Cは、ナノルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質（GFP）をHBB座位に組み込むためのターゲティングアプローチを例示する。
【図６Ｄ】図6Dは、細胞ソーティング前の、K562細胞に組み込まれた3種のマーカーの発現を図示する。
【図６Ｅ】図6Eは、様々なウリジン濃度の存在下で培養した場合の8日目のK562細胞の増殖および細胞数を図示する。
【図６Ｆ】図6Fは、5-FOAを用いた培養中のUMPSKO/KO細胞の選択を図示する。
【図６Ｇ】図6Gは、5-FOAの存在下でのUMPSKO/KO細胞の増殖を図示する。
【図７Ａ】図7Aは、T細胞のUMPSターゲティング後の表面マーカーの発現を例示する。図7Bは、UMPSKOまたは野生型（WT）T細胞の栄養要求性増殖を図示する。図7Cは、5-FOAがUMPSノックアウトを有するT細胞を選択することを図示する。群は、Prism7（GraphPad）を使用して示される統計的検定によって比較した。アステリスクは、統計的有意性のレベルを示す：*=p<0.05、**=p<0.01、***=p<0.001、および****=p<0.0001。
【図７Ｂ】図7Aの説明を参照のこと。
【図７Ｃ】図7Aの説明を参照のこと。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
詳細な説明
I.序論
最近の進展によって、ヒト細胞のゲノムの正確な改変が可能になる。この遺伝子操作によって、幅広い適用が可能になるが、細胞挙動を制御するための新しい方法も必要となる。細胞に対する代替制御システムは、代謝における遺伝子を標的とすることによって操作することができる栄養要求性である。代謝の中心遺伝子を破壊することによって栄養要求性を遺伝子操作するという、本明細書に記載されるアプローチは、ヒト細胞について探究されていない細胞機能に関して外部制御メカニズムを作り出すための代替パラダイムである。ピリミジン代謝で重要な遺伝子を破壊することによって、受動的抑制系（passive containment system）が作り出され（Steidler et al., 2003）、これは、以前に言及された制限を回避する、ヒト細胞のためのシステムの既存のツールボックスに対する追加および代替である。これは、非有害物質のウリジンの添加または休薬を介して、ヒト細胞の増殖に関する制御を可能にする。栄養要求性は、例えば、操作された遺伝子回路の導入によって非天然物質に対して（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Kato, Y. (2015) An engineered bacterium auxotrophic for an unnatural amino acid: a novel biological containment system. PeerJ 3, e1247を参照されたい）、または細菌遺伝子のノックアウトによってピリミジンに対して（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Steidler et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21, 785-789を参照されたい）、微生物において以前に操作された。後者の概念は魅力的であり、なぜならば、これは、細胞が遺伝子改変または抵抗性メカニズムの発達を逆転させるのを妨げる複雑な発現カセットの導入の代わりに、遺伝子のノックアウトに依拠し、したがって、代替システムのこの問題に対処するからである。ピリミジンヌクレオシドおよびヌクレオチドが、DNAおよびRNA合成、エネルギー移動、シグナル伝達、ならびにタンパク質修飾を含めた幅広い細胞プロセスにおいて重要な役割を果たすという事実（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、van Kuilenburg, A.B.P. and Meinsma, R. (2016). Biochem. Biophys. Acta - Mol. Basis Dis. 1862, 1504-1512を参照されたい）によって、それらの合成経路が理論的に魅力的な標的になる。
【００２８】
ヒト細胞は、外部供給源または共生生物のいずれかから獲得しなければならないアミノ酸のようなある特定の化合物に対して、天然に栄養要求性である（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Murray, P.J. (2016). Nat. Immunol. 17, 132-139を参照されたい）。さらに、栄養要求性は、例えば、細胞が栄養要求性である代謝産物の差次的な供給または枯渇によって免疫細胞の機能をモジュレートするための、天然のメカニズムである（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Grohmann et al., (2017). Cytokine Growth Factor Rev. 35, 37-45を参照されたい）。細胞の栄養要求性はまた、例えば、アルギニンを除去することによって腫瘍増殖を阻害するマクロファージの場合において、悪性増殖に対する防御メカニズムで重要な役割を果たす（Murray, 2016）。さらに、いくつかの悪性細胞タイプは、ある特定の代謝産物について栄養要求性であることが示されており（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Fung, M.K.L. and Chan, G.C.F. (2017). J. Hematol. Oncol. 10, 144を参照されたい）、これは、白血病患者の治療のために、アスパラギンの治療的枯渇に活用される（Hill et al., (1967). JAMA 202, 882を参照されたい）。
【００２９】
微生物について以前に開発された抑制ストラテジーに加えて、Cas9リボ核タンパク質（RNP）／rAAV6に基づく遺伝子編集を使用する、本明細書に記載されるアプローチは、一次ヒト細胞タイプおよび治療的に関連するヒト細胞タイプの非常に効率的な操作を可能にする。栄養要求性および5-FOAに対する抵抗性は、UMPS遺伝子の完全な破壊を有するすべての細胞に固有であるが、概念実証を示すために、選択マーカーのターゲティングされた組み込みによる両アレルのノックアウトを用いて、集団の特定が容易になった。一次ヒト細胞の効率的なターゲティングされた改変を可能にする方法の最近の開発（Bak et al. (2017)。
【００３０】
CRISPR/Cas9およびAAV6を使用するヒトの造血幹細胞および造血前駆細胞の多重遺伝子操作（Elife 6, e27873; Bak, et al. (2018). Nat. Protoc. 13, 358-376；Porteus, M.H. and Baltimore, D. (2003). Science (80-. ). 300, 763-763；これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）は、代謝的栄養要求性の確立とともに、ヒト細胞の使用が必要な状況において、例えば、幹細胞もしくは幹細胞由来組織または特定のエフェクター機能および低減した免疫原性を有する他の自己体細胞の使用において、治療的アプローチのさらなる開発のための基礎を築く。特に、迅速な臨床解釈を容易にすると考えられるコンストラクトおよび試薬、例えば、免疫原性を回避する、ターゲティングコンストラクト中の選択マーカーtNGFRおよびtEGFR、ならびにそのFDA承認プロドラッグを使用してインビボモデルで供給されるウリジンが使用されている。
【００３１】
細胞機能を制御するための操作されたメカニズムには、制御メカニズムを媒介するタンパク質を発現する細胞の完全に純粋な集団を選択するというさらなる問題がある。細胞毒性作用物質に対して抵抗性にすることによって操作された細胞を選択することが可能であることは、これが、非有害物質を使用して制御することができる細胞の非常に純粋な集団の作製を可能にすることによって実質的に効率を高めることができ、かつ、生命の維持に必要な代謝経路の機能に極めて重要な遺伝子の除去が、細胞が逃避メカニズムを発生するのを防ぐので、特に魅力的である。したがって、この方法は、遺伝的不安定性および悪性形質転換の危険性が役割を果たす状況、および例えば、体性または多能性幹細胞の使用において、それらの抑制を逃れる少数の細胞でさえも悲惨な影響を与え得る状況において、既存の制御メカニズムと比べていくつかの利点を与える。
【００３２】
この概念は、微生物について探究され（Steidler et al., 2003）、酵母遺伝学者によって、ほぼ普遍的な研究ツールとして広く使用されている。これは、複雑な制御メカニズムの導入による代わりに遺伝子のノックアウトによって作り出されるならば、および栄養要求性が、細胞の内在性代謝の一部である非毒性化合物に対するものであるならば、哺乳動物細胞において特に強力であろう。これは、代謝経路の必須遺伝子を破壊し、その経路の産物が外部から供給され、その環境から細胞によって取り込まれる場合のみ、細胞が機能することが可能になることによって、達成することができる。さらに、それぞれの遺伝子が細胞毒性作用物質の活性化にも関与するならば、遺伝子ノックアウト（KO）は、その薬物に対して細胞を抵抗性にし、それによって、細胞集団において非改変細胞の枯渇および操作された細胞の純化を可能にするであろう。代謝に関するいくつかの一遺伝子性先天的エラーは、代謝産物の供給によって治療することができ、したがって、ヒト栄養要求性のモデルと考えることができる。
【００３３】
ある特定の態様では、栄養要求性は、ゲノム編集を介してデノボピリミジン合成経路中のUMPSを破壊することによって、ヒト細胞に導入される。これによって、細胞の機能が外来性ウリジンの存在に依存するようになる。さらに、これは、5-フルオロオロト酸を5-FUに代謝する細胞の能力を無効にし、これによって、インタクトなUMPSアレルを有する残存細胞の枯渇が可能になる。遺伝子操作された栄養要求性によってヒト細胞の機能に影響を及ぼすために、および他の細胞を枯渇させるために、代謝産物を使用する能力は、制御可能な細胞の純粋な集団が必要である様々な適用のための本アプローチの開発をもたらす。
【００３４】
一例は遺伝性オロト酸尿症であり、これは、UMPS遺伝子中の突然変異が、高用量のウリジンの補給によって治療することができる機能障害をもたらす（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Fallon et al (1964). N. Engl. J. Med. 270, 878-881を参照されたい）。この概念を関心対象の細胞タイプに移して、遺伝子操作を使用して、ヒト細胞でUMPS遺伝子をノックアウトし、これによって、ウリジンに対して栄養要求性であり、5-フルオロオロト酸（5-FOA）に抵抗性である細胞を作製する。本発明者らは、UMPS-/-細胞株および一次細胞は、インビトロにおいて、ウリジンの存在下でのみ生存および増殖すること、ならびにUMPSが操作された細胞の増殖は、インビボにおいて、ウリジンの補給がない場合に阻害されることを示す。さらに、本細胞は、5-FOAの存在下で培養することによって混合集団より選択することができる。
【００３５】
ある特定の態様では、栄養要求性は、ゲノム編集を介してデノボピリミジン合成経路中のUMPSを破壊することによって、ヒト細胞に導入される。これによって、細胞の機能が外来性ウリジンの存在に依存するようになる。さらに、これは、5-フルオロオロト酸を5-FUに代謝する細胞の能力を無効にし、これによって、インタクトなUMPSアレルを有する残存細胞の枯渇が可能になる。遺伝子操作された栄養要求性によってヒト細胞の機能に影響を及ぼすために、および他の細胞を枯渇させるために、代謝産物を使用する能力は、制御可能な細胞の純粋な集団が必要である様々な適用のための本アプローチの開発をもたらす。
【００３６】
栄養要求性の一例は遺伝性オロト酸尿症であり、これは、UMPS遺伝子中の突然変異が、高用量のウリジンの補給によって治療することができる機能障害をもたらす（Fallon et al., 1964）。この概念を関心対象の細胞タイプに移して、遺伝子操作を使用して、ヒト細胞でUMPS遺伝子をノックアウトし、これによって、ウリジンに対して栄養要求性であり、5-フルオロオロト酸（5-FOA）に抵抗性である細胞を作製した。UMPS-/-細胞株および一次細胞は、インビトロにおいて、ウリジンの存在下でのみ生存および増殖すること、ならびにUMPSが操作された細胞の増殖は、インビボにおいて、ウリジンの補給がない場合に阻害されることが、本明細書において示される。さらに、本細胞は、5-FOAの存在下で培養することによって混合集団より選択することができる。
【００３７】
II.ある特定の態様の組成物および使用方法
遺伝子療法で使用するための方法および組成物のいくつかの態様が、本明細書に開示される。ある場合には、方法は、改変宿主細胞を栄養要求性にする、および導入遺伝子の発現を介して、遺伝子療法の有効性、効力、および／または安全性の向上を提供することができる方法で、治療的因子をコードする導入遺伝子を宿主細胞へ送達することを含む。特定の栄養要求性誘導座位への導入遺伝子の送達は、例えば、遺伝子の破壊もしくはノックアウト、または遺伝子の活性のダウンレギュレーションを介して、栄養要求性細胞を作製し、これは、今や、増殖および複製のために、栄養要求性因子の継続投与に依存している。ある場合には、方法は、栄養要求性誘導座位を標的とするヌクレアーゼシステム、導入遺伝子を挿入するためのドナーテンプレートまたはベクター、キット、および栄養要求性であり、導入された導入遺伝子を発現することができる改変細胞を作製するためのそのようなシステム、テンプレート、またはベクターの使用方法を含む。
【００３８】
いくつかの態様では、改変細胞の増殖および複製を制御する − 増大させる、低下させる、または停止させる − ための、ならびに導入遺伝子の発現を制御するための、ならびに治療的因子のレベルを制御するための、薬学的組成物、治療方法、および栄養要求性因子の投与の方法を含めた、改変宿主細胞の使用のための方法、組成物、およびキットも、本明細書に開示される。
【００３９】
ある場合には、所望の座位への導入遺伝子の送達は、相同組換えなどの方法を介して達成することができる。本明細書において使用する場合、「相同組換え（HR）」は、相同組換え修復メカニズムを介したDNA中の二本鎖切断の修復の間のヌクレオチド配列の挿入を指す。このプロセスは、二本鎖切断を修復するためのテンプレートとして、切断の領域中のヌクレオチド配列に対する相同性を有する「ドナー」分子または「ドナーテンプレート」を使用する。二本鎖切断の存在は、ドナー配列の組み込みを容易にする。ドナー配列は物理的に組み込まれ得るか、または相同組換えを介する切断の修復のためのテンプレートとして使用され、その結果、ヌクレオチド配列の全部または一部が導入され得る。このプロセスは、二本鎖切断を生じさせるいくつかの異なる遺伝子編集プラットフォーム、例えばメガヌクレアーゼ、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、およびCRISPR-Cas9遺伝子編集システムによって使用される。
【００４０】
いくつかの態様では、遺伝子は、例えば、複数の治療的因子の発現のために、または合成制御因子として作用するか、もしくは（例えば、第2の座位から転写因子を発現させることによって）改変細胞をある特定の系列に偏らせるように作用する第2の遺伝子の導入のために、2つ以上の座位に送達される。いくつかの態様では、遺伝子は、2つ以上の栄養要求性誘導座位に送達される。例えば、異なる遺伝子または同じ遺伝子の第2のコピーが第2の栄養要求性誘導座位に送達される。
【００４１】
いくつかの態様では、細胞が栄養要求性因子を生成する能力をもはや有さないので、細胞は栄養要求性である。本明細書において使用する場合、「細胞」、「改変細胞」、または「改変宿主細胞」は、同じ細胞に由来する細胞の集団であって、集団の各細胞が同様の遺伝的構成を有し、同じ改変を保持する細胞の集団を指す。
【００４２】
いくつかの態様では、栄養要求性因子は、1種または2種またはそれ以上の栄養素、酵素、変化したpH、変化した温度、非有機分子、非必須アミノ酸、もしくは（正常な生理的濃度と比較して）成分の変化した濃度、またはこれらの組み合わせを含む。本明細書おける栄養要求性因子に対するすべての言及は、複数の因子の投与を企図する。本明細書に記載される態様のいずれかでは、栄養要求性因子は、改変宿主細胞を維持するのに十分である濃度において、対象において有毒でもなく生物学的に利用可能でもない栄養素または酵素であり、本出願の全体を通した「栄養要求性因子」へのいかなる言及も、栄養素または酵素への言及を含み得ることを理解されたい。
【００４３】
ある場合には、改変細胞に栄養要求性因子が継続的に供給されない場合、細胞は増殖を停止するか、または死ぬ。ある場合には、改変細胞は、発癌性形質転換を含む他の細胞ベース療法と関連する危険性を低下させる安全スイッチを提供する。
【００４４】
本明細書に開示される方法および組成物は、いくつかの利点、例えば以下を提供する：レンチベクターを用いるような無秩序な組み込みではなく、同じ座位へ組み込むことによる、一貫性がある結果および状態；天然のプロモーターもしくはエンハンサーを有する領域、またはサイレンシングされる領域が避けられることによる、導入遺伝子の一定の発現；ポアソン分布ではなく、1または2コピーである、組み込みの一貫性があるコピー数；および発癌性形質転換の可能性が限られていること。ある場合には、本開示の改変細胞は、レンチベクターまたは他のウイルスベクターによって操作された生成物よりも不均一性が少ない。
【００４５】
いくつかの態様では、100％栄養要求性であり、非栄養要求性状態への復帰の可能性を制限する細胞の集団を生成するための対抗選択方法が、本明細書に開示される。現在の安全性スイッチは導入遺伝子の挿入に依拠し、改変細胞は導入遺伝子の突然変異またはその発現のエピジェネティックなサイレンシングを介して逃れることができる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Wu et al., Mol Ther Methods Clin Dev. 1:14053 (2014)を参照されたい）。したがって、導入遺伝子の挿入と栄養要求性メカニズムを作り出すことの組み合わせは、一般に、長期的により安全である。
【００４６】
いくつかの態様では、栄養要求性因子の投与を低レベルに低減させることにより、改変細胞は、殺されるのではなく静止状態に入ることができ、既に宿主中に存在する細胞を用いた療法の一時的な中断および再開が可能になる。これは、宿主細胞を再編集し、改変宿主細胞を再導入しなければならないことと比較して、利点であろう。
【００４７】
いくつかの態様では、栄養要求性因子の投与を停止することにより、改変細胞の死が、それが望まれる場合に、例えば、異常な増殖または発癌性形質転換が検出された場合に、または治療の停止が望まれる場合に、もたらされると考えられる。
【００４８】
いくつかの態様では、栄養要求性因子の投与を増大させることにより、改変細胞の増殖および複製が増大され、導入遺伝子の発現の増大がもたらされ、それにより、治療的因子のレベルの増大がもたらされる。ある場合には、栄養要求性因子の投与は、遺伝子産物の投薬量を制御するための手段を提供する。
【００４９】
栄養要求性ベースの安全性メカニズムは、現在の細胞療法と関連する、患者に対する危険性の多くを回避する。療法の過程において、規定された栄養要求性因子を患者に補給し、療法停止またはいくつかの他の安全性に基づく指摘の際に該因子を除去することによって、細胞増殖が物理的に制限される。ある場合には、栄養要求性因子が細胞にとってもはや利用可能でない場合、細胞は分裂を止め、抵抗性発現のための自明のメカニズムを有さない。栄養要求性因子のレベルを操作することによって、インビボでの細胞の増殖速度が制御される。別々の栄養要求性を使用することによって、複数の細胞株をインビボで独立に制御することができる。局所的栄養素放出、例えば、栄養素を放出し、細胞逃避を防止する生体適合性装置中に投与された外部で増殖した膵臓B細胞によって、位置特異的増殖を制御することができる。例えば、本明細書に開示される方法および組成物は、キメラ抗原受容体（CAR）-T細胞技術とともに使用して、インビボでの、CAR-T細胞の活性に関してより規定された制御を可能にすることができる。ある場合には、本明細書に開示される組成物は、腫瘍増殖を阻害するかまたは低減させるために使用される。例えば、栄養要求性因子（例えば、ウリジンまたはビオチン）の休薬は、腫瘍退縮につながり得る。
【００５０】
かなりの数の障害は、遺伝子産物の不全によって引き起こされるか、または治療的因子、例えば、タンパク質、ペプチド、抗体、もしくはRNAの発現の増大によって治療可能であるかのいずれかである。いくつかの態様では、改変宿主細胞が栄養要求性因子について栄養要求性である、栄養要求性誘導座位に組み込まれた関心対象の治療的因子をコードする導入遺伝子を含む改変宿主細胞を含む組成物が、本明細書に開示される。いくつかの態様では、該因子の治療的発現をもたらすのに十分である量で栄養要求性因子を与えることによって、それらを必要とする個体において状態を治療するために、本開示の組成物を使用する方法が、本明細書においてさらに開示される。
【００５１】
例示的な治療的因子
以下の態様は、栄養要求性宿主細胞中で治療的因子を生成することによって治療される状態を提供する。
【００５２】
例えば、凝固障害は、凝固カスケード中の因子がないか、または突然変異のために機能が低減している、かなり一般的な遺伝性障害である。これは、血友病A（第VIII因子欠損）、血友病B（第IX因子欠損）、または血友病C（第XI因子欠損）を含む。
【００５３】
アルファ-1アンチトリプシン（A1AT）欠損は、血液および肺において不適切なA1ATレベルをもたらす、アルファ1-アンチトリプシンの不完全な生成に引き起こされる、常染色体劣性疾患である。これは、慢性閉塞性肺疾患（COPD）および肝臓障害の発生と関連し得る。
【００５４】
I型糖尿病は、膵ベータ細胞の免疫介在性破壊がインスリン生成の極めて大きな欠損をもたらす障害である。合併症としては、虚血性心疾患（狭心症および心筋梗塞）、卒中、ならびに末梢血管疾患、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、ならびに透析を必要とする慢性腎疾患をもたらす可能性がある糖尿病性腎障害が挙げられる。
【００５５】
抗体は、疾患を引き起こす標的タンパク質の中和またはクリアランス、ならびにある特定のタイプの細胞（例えば、癌細胞、自己免疫疾患におけるある特定の免疫細胞、ウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、RSV、Flu、Ebola、CMVなどに感染した細胞）の非常に選択的な死滅に使用される分泌性タンパク質産物である。抗体療法は、腫瘍学、リウマチ学、移植、および眼疾患を含めた、多くのヒトの状態に広く適用されている。ある場合には、本明細書に開示される組成物にコードされる治療的因子は、癌、感染症、および自己免疫疾患などの状態を予防または治療するために使用される抗体である。ある特定の態様では、癌は、対象において、腫瘍の増殖の速度を低下させることによって、または腫瘍のサイズを縮小させることによって、治療される。
【００５６】
治療的使用のためにFDAによって承認されたモノクローナル抗体としては、アダリムマブ、ベズロトクスマブ、アベルマブ、デュピルマブ、デュルバルマブ、オクレリズマブ、ブロダルマブ、レスリズマブ、オララツマブ、ダラツムマブ、エロツズマブ、ネシツムマブ、インフリキシマブ、オビルトキサキシマブ、アテゾリズマブ、セクキヌマブ、メポリズマブ、ニボルマブ、アリロクマブ、イダルシズマブ、エボロクマブ、ジヌツキシマブ、ベバシズマブ、ペンブロリズマブ、ラムシルマブ、ベドリズマブ、シルツキシマブ、アレムツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、ペルツズマブ、インフリキシマブ、オビヌツズマブ、ブレンツキシマブ、ラキシバクマブ、ベリムマブ、イピリムマブ、デノスマブ、デノスマブ、オファツムマブ、ベシレソマブ、トシリズマブ、カナキヌマブ、ゴリムマブ、ウステキヌマブ、セルトリズマブペゴル、カツマキソマブ、エクリズマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、ナタリズマブ、カツマキソマブ、ベバシズマブ、オマリズマブ、セツキシマブ、エファリズマブ、イブリツモマブチウキセタン、ファノレソマブ、アダリムマブ、トシツモマブ、アレムツズマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、インフリキシマブ、パリビズマブ、ネシツムマブ、バシリキシマブ、リツキシマブ、ボツムマブ、スレソマブ、アルシツモマブ、イミシロマブ（Imiciromab）、カプロマブ、ノフェツモマブ、アブシキシマブ、サツモマブ、およびムロモナブ-CD3が挙げられる。治療的使用のためにFDAによって承認された二重特異性抗体としては、ブリナツモマブが挙げられる。いくつかの態様では、抗体は、HIVまたは他の感染症を予防または治療するために使用される。HIVの治療で使用するための抗体としては、ヒトモノクローナル抗体（mAb）VRC-HIVMAB060-00-AB（VRC01）；mAb VRC-HIVMAB080-00-AB（VRC01LS）；mAb VRC-HIVMAB075-00-AB（VRC07-523LS）；mAb F105；mAb C2F5；mAb C2G12；mAb C4E10；抗体UB-421（T-リンパ球および単球のCD4分子（ドメイン1）上のHIV-1受容体を標的とする）；Ccr5mab004（Ccr5に対するヒトモノクローナルIgG4抗体）；mAb PGDM1400；mAb PGT121（HIV外被タンパク質のV1V2（PGDM1400）およびV3グリカン依存的（PGT121）エピトープ領域を標的とする組換えヒトIgG1モノクローナル抗体）；KD-247（ヒト化モノクローナル抗体）；PRO140（モノクローナルCCR5抗体）；mAb 3BNC117；ならびにPG9（抗HIV-1 gp120モノクローナル抗体）が挙げられる。
【００５７】
治療的RNAとしては、アンチセンス、siRNA、アプタマー、マイクロRNA模倣物／抗miR、および合成mRNAが挙げられ、これらのうちのいくつかは、導入遺伝子によって発現され得る。
【００５８】
LSDは、酵素欠乏の結果として、体の細胞中の様々な有毒物質の異常な蓄積を特徴とする、遺伝性代謝疾患である。全部でほぼ50のこれらの障害が存在し、これらは、骨格、脳、皮膚、心臓、および中枢神経系を含めた体の様々な部分に影響を及ぼす。一般的な例としては、スフィンゴリピドーシス、ファーバー病（ASAH1欠損）、クラッベ病（ガラクトシルセラミダーゼまたはGALCの欠損）、ガラクトシアリドーシス、ガングリオシドーシス、アルファ-ガラクトシダーゼ,ファブリー病（α-ガラクトシダーゼ欠損-GLA、またはアガルシダーゼアルファ／ベータ）、シンドラー病（アルファ-NAGA欠損）、GM1ガングリオシドーシス、GM2ガングリオシドーシス（ベータ-ヘキソサミニダーゼ欠損）、サンドホフ病（ヘキソサミニダーゼ-B欠損）、テイ・サックス病（ヘキソサミニダーゼ-A欠損）、ゴーシェ病タイプ1/2/3（グルコセレブロシダーゼ欠損−遺伝子名：GBA）、ウォルマン病（LAL欠損）、ニーマン・ピック病タイプA/B（スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ1欠損--SMPD1または酸性スフィンゴミエリナーゼ）、スルファチドーシス、異染性白質ジストロフィー、ハーラー症候群（アルファ-Lイズロニダーゼ欠損--IDUA）、ハンター症候群またはMPS2（イズロネート-2-スルファターゼ欠損-イデュルスルファーゼまたはIDS）、サンフィリポ症候群、モルキオ、マロトー・ラミー症候群、スライ症候群（β-グルクロニダーゼ欠損）、ムコリピドーシス、I細胞病、リピドーシス、=神経セロイドリポフスチン症、バッテン病（トリペプチジルペプチダーゼ-1欠損）、ポムペ（アルグルコシダーゼアルファ欠損）、低ホスファターゼ症（アスホターゼアルファ欠損）、MPS1（ラロニダーゼ欠損）、MPS3A（ヘパリンN-スルファターゼ欠損）、MPS3B（アルファ-N-アセチルグルコサミニダーゼ欠損）、MPS3C（ヘパリン-a-グルコサミニドN‐アセチルトランスフェラーゼ欠損）、MPS3D（N-アセチルグルコサミン6-スルファターゼ欠損）、MPS4（エロスルファーゼアルファ欠損）、MPS6（グラスルフェート欠損）、MPS7（B-グルクロニダーゼ欠損）、フェニルケトン尿症（フェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠損）、およびMLD（アリールスルファターゼA欠損）が挙げられる。一まとめにして、LSDは、7000人の出生に約1人の個体数の発生率があり、早期死を含めた深刻な影響がある。これらの疾患のうちのいくつかについて可能性のある治療に対して臨床試験は進行中であるが、多くのLSDについて承認された治療は現在存在しない。すべてではないがいくつかのLSDについての現在の治療選択は、酵素補充療法（ERT）を含む。ERTは、体内において不足しているかまたは存在しない酵素を補充する医学的治療である。ある場合には、これは、酵素を含む溶液の静脈内（IV）注入を患者に与えることによって行われる。
【００５９】
いくつかの態様では、それらを必要とする個体においてLSDを治療する方法が、本明細書において開示され、方法は、本明細書に開示される組成物を使用して、個体に酵素補充療法を提供することを含む。ある場合には、方法は、栄養要求性誘導座位に組み込まれた酵素をコードする導入遺伝子を含む、エクスビボの改変宿主細胞を含み、該改変宿主細胞は栄養要求性因子について栄養要求性であり、かつ個体で不足している酵素を発現することができ、それによって、個体においてLSDを治療する。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、表1の遺伝子内または表1の遺伝子の発現を制御する領域内にある。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、ウリジン一リン酸合成酵素（UMPS）をコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はウリジンである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、ホロカルボキシラーゼ合成酵素（HLCS）をコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はビオチンである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、アスパラギン合成酵素をコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はアスパラギンである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、アスパルテートトランスアミナーゼをコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はアスパルテートである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、アラニントランスアミナーゼをコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はアラニンである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、シスタチオニンβ合成酵素をコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はシステインである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、シスタチオニンガンマ−リアーゼをコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はシステインである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、グルタミン合成酵素をコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はグルタミンである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はセリンまたはグリシンである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、グリシン合成酵素をコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はグリシンである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、ホスホセリントランスアミナーゼをコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はセリンである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、ホスホセリンホスファターゼをコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はセリンである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼをコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はチロシンである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、アルギニノコハク酸合成酵素をコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はアルギニンである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、アルギニノコハク酸リアーゼをコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はアルギニンである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、ジヒドロ葉酸還元酵素をコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子は葉酸またはテトラヒドロ葉酸である。
【００６０】
いくつかの態様では、それらを必要とする個体において疾患または障害を治療する方法が、本明細書においてさらに開示され、方法は、本明細書に開示される組成物を使用して、タンパク質補充療法を個体に提供することを含む。ある場合には、方法は、栄養要求性誘導座位に組み込まれたタンパク質をコードする導入遺伝子を含む、エクスビボの改変宿主細胞を含み、該改変宿主細胞は栄養要求性因子について栄養要求性であり、かつ個体で不足しているタンパク質を発現することができ、それによって、個体において疾患または障害を治療する。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、表1の遺伝子内または表1の遺伝子の発現を制御する領域内にある。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、ウリジン一リン酸合成酵素（UMPS）をコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はウリジンである。ある場合には、栄養要求性誘導座位は、ホロカルボキシラーゼ合成酵素（HLCS）をコードする遺伝子内にある。ある場合には、栄養要求性因子はビオチンである。ある場合には、疾患はフリードライヒ失調症であり、タンパク質はフラタキシンである。ある場合には、疾患は遺伝性血管性浮腫であり、タンパク質はC1エステラーゼインヒビター（例えば、HAEGAARDA（登録商標）皮下注射剤）である。ある場合には、疾患は脊髄性筋萎縮症であり、タンパク質はSMN1である。
【００６１】
III.組成物および改変細胞を作製するための方法
A.細胞
いくつかの態様では、（栄養要求性誘導座位における治療的因子をコードする導入遺伝子の挿入を介して）栄養要求性であるように遺伝子操作されており、治療的因子を発現することができる改変宿主細胞、好ましくはヒト細胞を含む組成物が、本明細書に開示される。エクスビボ、インビトロ、またはインビボで改変された動物細胞、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞が企図される。他の霊長類；商業関連の哺乳動物、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、ラットを含めた哺乳動物；商業関連のトリ、例えば、家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／またはシチメンチョウを含めたトリの細胞も含まれる。
【００６２】
いくつかの態様では、細胞は、胚性幹細胞、幹細胞、前駆細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹（iPS）細胞、体性幹細胞、分化細胞、間葉系幹細胞もしくは間葉系間質細胞、神経幹細胞、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、脂肪幹細胞、ケラチノサイト、骨格幹細胞、筋肉幹細胞、線維芽細胞、NK細胞、B細胞、T細胞、または末梢血単核球（PBMC）である。例えば、細胞は、CARを発現するように操作することができ、それによって、CAR-T細胞を作製する。いくつかの態様では、細胞株は、栄養要求性であるように遺伝子操作されているT細胞である。操作された栄養要求性T細胞は、栄養要求性因子とともに、癌を有する患者に投与することができる。癌の破壊の際に、栄養要求性の栄養素を除去することができ、これによって、操作された栄養要求性T細胞が排除される。いくつかの態様では、細胞株は、栄養要求性であるように遺伝子操作されている多能性幹細胞である。操作された栄養要求性多能性幹細胞は、栄養要求性因子とともに、患者に投与することができる。操作された栄養要求性多能性幹細胞の癌性細胞への変換の際に、栄養要求性因子を除去することができ、これによって、癌性細胞および操作された栄養要求性多能性幹細胞が排除される。
【００６３】
対象に投与した場合に改変細胞の免疫拒絶反応を予防するために、改変される細胞は、好ましくは、対象自身の細胞に由来する。したがって、好ましくは、哺乳動物細胞は改変細胞で治療される対象に由来する。ある場合には、哺乳動物細胞は自家細胞であるように改変される。ある場合には、哺乳動物細胞は、同種異系細胞であるようにさらに改変される。ある場合には、改変T細胞は、例えば、T細胞受容体座位を不活性化することによって、同種異系であるようにさらに改変され得る。ある場合には、改変細胞は、例えば、B2Mを欠失させて、細胞の表面上のMHCクラスIを除去することによって、またはB2Mを欠失させ、次いでHLA-G-B2M融合体を表面に戻して、その表面にMHCクラスIを有さない細胞のNK細胞拒絶反応を予防することによって、同種異系であるようにさらに改変され得る。
【００６４】
細胞株は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるU.S.8,945,862に示されるような以下の技法を使用して、維持され、分化させられた幹細胞を含むことができる。いくつかの態様では、幹細胞はヒト胚性幹細胞ではない。さらに、細胞株は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、WO2003/046141またはChung et al.（Cell Stem Cell, February 2008, Vol. 2, pages 113-117）に開示される技法によって作製された幹細胞を含むことができる。
【００６５】
例えば、細胞は、上皮、軟骨、骨、平滑筋、横紋筋、神経上皮、重層扁平上皮、および神経節のいずれかにおける再生医学的治療で使用するために対象から単離した幹細胞でもよい。1種または少数種の細胞タイプの死または機能障害に起因する疾患、例えば、パーキンソン病および若年型糖尿病も一般に幹細胞を使用して治療される（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Thomson et al., Science, 282:1145-1147, 1998を参照されたい）。
【００６６】
いくつかの態様では、細胞は、対象から収集され、本明細書に開示される方法に従って改変され、方法は、ある特定の細胞タイプを選択すること、任意で、細胞を拡大すること、および任意で、細胞を培養することを含むことができ、栄養要求性誘導座位に組み込まれた導入遺伝子を含む細胞を選択することをさらに含むことができる。
【００６７】
B.導入遺伝子を挿入するためのドナーテンプレートまたはベクター
いくつかの態様では、本明細書に開示される組成物は、栄養要求性誘導座位に導入遺伝子を挿入するためのドナーテンプレートまたはベクターを含む。
【００６８】
いくつかの態様では、ドナーテンプレートは、
(a)栄養要求性誘導座位の断片に相同な、または該栄養要求性誘導座位の相補体に相同な、1種または複数種のヌクレオチド配列、および
(b)任意で発現制御配列に連結された、治療的因子をコードする導入遺伝子
を含む。例えば、ヌクレアーゼシステムを使用してDNAを開裂させた後、ドナーテンプレートの導入は、DNAの切断の修復の間に導入遺伝子配列を挿入するために、相同組換え修復メカニズムを利用することができる。ある場合には、ドナーテンプレートは、ドナーテンプレートが切れ目に隣接する領域にハイブリダイズして、切断を修復するためのテンプレートとして使用されるように、切断の領域中のヌクレオチド配列に相同な領域を含む。
【００６９】
いくつかの態様では、導入遺伝子の両側に、栄養要求性誘導座位の断片またはその相補体に相同なヌクレオチド配列が隣接している。
【００７０】
ある場合には、ドナーテンプレートは一本鎖、二本鎖、プラスミド、またはDNA断片である。
【００７１】
ある場合には、プラスミドは、プロモーターおよび任意で3’UTRを含めた、複製に必要なエレメントを含む。
【００７２】
(a)栄養要求性誘導座位の断片に相同な、または該栄養要求性誘導座位の相補体に相同な、1種または複数種のヌクレオチド配列、および
(b)治療的因子をコードする導入遺伝子
を含むベクターが、本明細書においてさらに開示される。
【００７３】
ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス（組み込み能力のあるレンチウイルスベクターと組み込みに欠陥があるレンチウイルスベクターの両方）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、または単純ヘルペスウイルスのベクターでもよい。ウイルスベクターは、ウイルスベクターの複製に必要な遺伝子をさらに含むことができる。
【００７４】
いくつかの態様では、ターゲティングコンストラクトは、
(1)ウイルスを生成するための、ウイルスベクター骨格、例えば、AAV骨格；
(2)標的部位への高レベルの再現性のあるターゲティングを確実にするために、両側に少なくとも200bpであるが、理想的には400bpである、標的部位に相同なアーム（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Porteus, Annual Review of Pharmacology and Toxicology, Vol. 56:163-190 (2016)を参照されたい）；
(3)治療的因子をコードし、かつ治療的因子を発現することができる導入遺伝子、ならびに；
(4)導入遺伝子に機能的に連結される発現制御配列；ならびに任意で、
(5)改変宿主細胞の濃縮および／またはモニタリングを可能にする追加的なマーカー遺伝子
を含む。
【００７５】
適切なマーカー遺伝子は、当技術分野において公知であり、Myc、HA、FLAG、GFP、トランケートされたNGFR、トランケートされたEGFR、トランケートされたCD20、トランケートされたCD19、および抗生物質抵抗性遺伝子が挙げられる。
【００７６】
当技術分野において公知である任意のAAVを使用することができる。いくつかの態様では、主要なAAV血清型はAAV6である。
【００７７】
先行態様のいずれかでは、ドナーテンプレートまたはベクターは、栄養要求性誘導座位の断片、任意で、以下の表1の遺伝子のいずれかに相同なヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、栄養要求性誘導座位の少なくとも200、250、300、350、または400個の連続したヌクレオチドに対して、少なくとも85、88、90、92、95、98、または99％同一であり；400ヌクレオチドまでが、通常、正確な組換えを確実にするのに十分である。前述のパラメーターの任意の組み合わせが想定され、例えば、少なくとも200個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも85％同一であり、または少なくとも200個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも88％同一であり、または少なくとも200個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも90％同一であり、または少なくとも200個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも92％同一であり、または少なくとも200個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも95％同一であり、または少なくとも200個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも98％同一であり、または少なくとも200個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも99％同一であり、または少なくとも250個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも85％同一であり、または少なくとも250個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも88％同一であり、または少なくとも250個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも90％同一であり、または少なくとも250個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも92％同一であり、または少なくとも250個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも95％同一であり、または少なくとも250個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも98％同一であり、または少なくとも250個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも99％同一であり、または少なくとも300個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも85％同一であり、または少なくとも300個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも88％同一であり、または少なくとも300個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも90％同一であり、または少なくとも300個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも92％同一であり、または少なくとも300個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも95％同一であり、または少なくとも300個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも98％同一であり、または少なくとも300個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも99％同一であり、または少なくとも350個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも85％同一であり、または少なくとも350個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも88％同一であり、または少なくとも350個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも90％同一であり、または少なくとも350個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも92％同一であり、または少なくとも350個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも95％同一であり、または少なくとも350個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも98％同一であり、または少なくとも350個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも99％同一であり、または少なくとも400個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも85％同一であり、または少なくとも400個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも88％同一であり、または少なくとも400個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも90％同一であり、または少なくとも400個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも92％同一であり、または少なくとも400個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも95％同一であり、または少なくとも400個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも98％同一であり、または少なくとも400個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも99％同一である。
【００７８】
本明細書の開示は、前記ドナーテンプレートまたはベクター、cas9タンパク質、およびガイドRNAを含む、栄養要求性誘導座位に導入遺伝子の組み込みをターゲティングするためのシステムも企図する。
【００７９】
本明細書の開示は、前記ドナーテンプレートまたはベクター、および前記栄養要求性誘導座位に対して特異的なメガヌクレアーゼを含む、栄養要求性誘導座位に導入遺伝子の組み込みをターゲティングするためのシステムをさらに企図する。メガヌクレアーゼは、例えば、ZFNまたはTALENでもよい。
【００８０】
挿入されるコンストラクトは、急性毒性の理由から細胞の急速な除去が必要とされ得る状況で、座位中に他の安全スイッチ、例えば、標準的な自殺遺伝子（例えば、iCasp9）を含めることもできる。本開示は、栄養要求性因子の除去によって、体内に移植された任意の操作された細胞を排除することができるように、確固たる安全スイッチを提供する。これは、操作された細胞が癌性細胞に形質転換した場合に特に重要である。
【００８１】
ある場合には、ドナーポリヌクレオチドまたはベクターは、任意で、前記導入遺伝子に機能的に連結された発現制御配列をさらに含む。いくつかの態様では、発現制御配列は、プロモーターもしくはエンハンサー、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、または発現制御配列、転写後制御配列、またはマイクロRNAである。
【００８２】
C.ヌクレアーゼシステム
いくつかの態様では、本明細書に開示される組成物は、栄養要求性誘導座位を標的とするヌクレアーゼシステムを含む。例えば、本開示は、
(a)前記栄養要求性誘導座位のDNAを標的としかつ開裂させる、メガヌクレアーゼ、または
(b)該メガヌクレアーゼを発現させるためのベクターシステムを含めた、該メガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド
を企図する。一例として、メガヌクレアーゼは、
(i)栄養要求性誘導座位に結合する転写活性化因子様エフェクター（TALE）DNA結合ドメインであって、TALE DNA結合タンパク質が複数のTALE反復単位を含み、各TALE反復単位が、栄養要求性誘導座位の標的配列のヌクレオチドに結合するアミノ酸配列を含む、転写活性化因子様エフェクター（TALE）DNA結合ドメイン、および
(ii)DNA開裂ドメイン
を含む融合タンパク質である、TALENである。
【００８３】
(a)Cas（例えば、Cas9）もしくはCpf1ポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および
(b)前記栄養要求性誘導座位に特異的にハイブリダイズするガイドRNA、または該ガイドRNAをコードする核酸
を含む、前記栄養要求性誘導座位のDNAを標的としかつ開裂させるCRISPR/CasまたはCRISPR/Cpf1システムも、本明細書に開示される。自然界では、Cas9システムは、Cas9ポリペプチド、crRNA、およびトランス活性化crRNA（tracrRNA）から構成される。本明細書において使用する場合、「Cas9ポリペプチド」は、天然に存在するCas9ポリペプチド、またはDNAの少なくとも1つの鎖を開裂させる能力を保持する改変Cas9ポリペプチドを指す。改変Cas9ポリペプチドは、例えば、天然に存在するCas9ポリペプチドに対して少なくとも75％、80％、85％、90％、または95％同一であり得る。様々な細菌種由来のCas9ポリペプチドを使用することができ；化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）が一般に市販されている。Cas9ポリペプチドは、通常は二本鎖切断を生じさせるが、HNHまたはRuvCドメインに不活性化突然変異を導入することによって、DNAの一本鎖のみを開裂させる（すなわち、「一本鎖切断」を生成する）ニッカーゼに変換させることができる。同様に、天然に存在するtracrRNAおよびcrRNAは、これらが、引き続き望ましいDNAにハイブリダイズして所望のDNAを標的化する能力、およびcas9に結合する能力を保持する限り、改変することができる。ガイドRNAは、2つのRNAが例えば人工のループを用いて一緒に縮合しているキメラRNAでもよく、またはガイドRNAは、2つのハイブリダイズしたRNAを含むことができる。メガヌクレアーゼまたはCRISPR/CasまたはCRISPR/Cpf1システムは、例えば、突出を含む開裂末端を生成するために、栄養要求性誘導座位内に二本鎖切断または1つまたは複数の一本鎖切断を生じさせることができる。
【００８４】
ある場合には、本明細書に記載されるヌクレアーゼシステムは、本明細書に記載されるドナーテンプレートをさらに含む。
【００８５】
例えば、遺伝子ノックアウトを引き起こす、または遺伝子の発現をダウンレギュレートさせるために、核酸を編集するための様々な方法が、当技術分野において公知である。例えば、様々なヌクレアーゼシステム、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、メガヌクレアーゼ、またはこれらの組み合わせは、核酸を編集するために使用されることが当技術分野において公知であり、本開示で使用することができる。メガヌクレアーゼは、典型的には、延長した、または融合したDNA認識配列を有する、天然に存在する制限酵素の改変バージョンである。
【００８６】
CRISPR/Casシステムは、例えば、WO2013/176772、WO2014/093635、およびWO2014/089290で詳しく述べられており、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。T細胞におけるその使用は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるWO2014/191518で示唆されている。T細胞のCRISPR操作は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるEP3004349で論じられている。
【００８７】
突然変異体（ノックアウト、ノックイン、または遺伝子置換された）細胞株の生成についての時間制限因子は、CRISPR/Cas9プラットフォームの開発の前は、クローンのスクリーニングおよび選択であった。本明細書において使用する場合、用語「CRISPR/Cas9ヌクレアーゼシステム」は、Cas9に対する結合部位および改変される領域に対して特異的なターゲティング配列を有するガイドRNA（gRNA）配列を含む遺伝子操作ツールを指す。Cas9はgRNAに結合して、標的領域に結合し、標的領域を開裂させるリボ核タンパク質を形成する。CRISPR/Cas9により、複数の遺伝子編集の容易な多重化が可能になる。いくつかの態様では、gRNAはSEQ ID NO:1の核酸配列を含む。
【００８８】
CRISPR/Cas9プラットフォーム（これは、タイプII CRISPR/Casシステムである）に加えて代替システムが存在し、これには、タイプI CRISPR/Casシステム、タイプIII CRISPR/Casシステム、およびタイプV CRISPR/Casシステムが含まれる。様々なCRISPR/Cas9システムが開示されており、数例を挙げれば、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Cas9（SpCas9）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）Cas9（StCas9）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）Cas9（CjCas9）、およびナイセリア・シネレア（Neisseria cinerea）Cas9（NcCas9）が挙げられる。Casシステムの代替物としては、フランシセラ・ノビサイダ（Francisella novicida）Cpf1（FnCpf1）、アシダミノコッカス属種Cpf1（AsCpf1）、およびラクノスピラ科（Lachnospiraceae）細菌ND2006 Cpf1（LbCpf1）のシステムが挙げられる。上記のCRISPRシステムのいずれかを、本明細書に開示される細胞株を作製するための方法で使用することができる。例えば、使用されるCRISPRシステムはCRISPR/Cas9システム、例えば、化膿性連鎖球菌CRISPR/Cas9システムでもよい。
【００８９】
IV.改変宿主細胞を作製する方法
いくつかの態様では、栄養要求性誘導座位は、表1に開示されるものより選択される標的遺伝子、またはその遺伝子の発現を制御する領域の中にある。いくつかの態様では、標的遺伝子は、UMPS（ウラシルについて栄養要求性の細胞株を作製する）およびホロカルボキシラーゼ合成酵素（ビオチンについて栄養要求性の細胞株を作製する）より選択される。いくつかの態様では、栄養要求性因子は、ビオチン、アラニン、アスパルテート、アスパラギン、グルタメート、セリン、ウラシル、およびコレステロールより選択される。
【００９０】
本明細書に記載される改変宿主細胞を作製するために前記ヌクレアーゼシステムを使用する方法が、本明細書においてさらに開示され、これは、
(a)栄養要求性誘導座位でDNAを標的としかつ開裂させる1種または複数種のヌクレアーゼシステムの構成成分、例えば、メガヌクレアーゼ、例えば、ZFNもしくはTALEN、またはCRISPR/Casヌクレアーゼ、例えばCRISPR/Cas9、および
(b)本明細書に記載されるドナーテンプレートまたはベクター
を細胞に導入することを含む。各構成成分は、細胞に直接導入することができ、または前記1種または複数種のヌクレアーゼシステムの構成成分をコードする核酸を導入することによって、細胞中で発現させることができる。方法は、第2の座位のDNAを標的としかつ開裂させる第2のヌクレアーゼシステム、例えば、第2のメガヌクレアーゼもしくは第2のCRISPR/Casヌクレアーゼ、または第2の座位のDNAを標的とする第2のガイドRNA、または前述のもののいずれかをコードする核酸、および(b)第2のドナーテンプレートまたはベクターを導入することを含むこともできる。第2のドナーテンプレートまたはベクターは、異なる導入遺伝子、または同じ導入遺伝子の第2のコピーを含むことができ、これらは、次いで、そのような方法に従って、第2の座位に組み込まれるであろう。
【００９１】
そのような方法は、エクスビボで、宿主細胞中の栄養要求性誘導座位に治療的因子をコードする導入遺伝子の組み込みをターゲティングするであろう。
【００９２】
そのような方法は、
(a)任意で、細胞を拡大させた後に、または任意で、細胞を拡大させる前に、ドナーテンプレートまたはベクターを細胞に導入すること、および
(b)任意で、細胞を培養すること
をさらに含むことができる。
【００９３】
いくつかの態様では、本明細書の開示は、改変された哺乳動物宿主細胞を作製する方法であって、
(a)Cas9ポリペプチドまたは該Cas9ポリペプチドをコードする核酸、
(b)栄養要求性誘導座位に特異的なガイドRNA、または該ガイドRNAをコードする核酸、および
(c)本明細書に記載されるドナーテンプレートまたはベクター
を哺乳動物細胞に導入することを含む方法を企図する。方法は、
(a)第2の栄養要求性誘導座位に特異的な第2のガイドRNAおよび
(b)第2のドナーテンプレートまたはベクター
を導入することを含むこともできる。そのような方法では、ガイドRNAはキメラRNAでもよく、または2つのハイブリダイズしたRNAでもよい。
【００９４】
これらの方法のいずれかでは、ヌクレアーゼは、栄養要求性誘導座位内に1つまたは複数の一本鎖切断を、または栄養要求性誘導座位内に1つの二本鎖切断を生じさせることができる。これらの方法では、栄養要求性誘導座位は、前記ドナーテンプレートまたはベクターを用いる相同組換えによって改変されて、該座位へ導入遺伝子が挿入される。
【００９５】
方法は、
(c)栄養要求性誘導座位に組み込まれた導入遺伝子を含む細胞を選択すること
をさらに含むことができる。選択工程は、
(i)生存するために栄養要求性因子を必要とする細胞を選択すること、および任意で、
(ii)栄養要求性誘導座位に組み込まれた導入遺伝子を含む細胞を選択すること
を含むことができる。
【００９６】
いくつかの態様では、栄養要求性誘導座位は、ウリジン一リン酸合成酵素をコードする遺伝子であり、細胞は、細胞を5-FOAと接触させることにより選択される。UMPS遺伝子は、5-FOAを5-FUMPに代謝するのに必要とされ、5-FUMPは、RNA/DNAへの取り込みの理由から細胞に対して毒性がある。したがって、UMPS遺伝子中に破壊がある細胞は、5-FOA処理を切り抜けて生き残ると考えられる。得られた細胞は、すべての細胞が導入遺伝子を含み得るとは限らないが、すべて栄養要求性であると考えられる。導入遺伝子に対するその後のポジティブ選択は、栄養要求性であり、導入遺伝子を発現することもできる改変宿主細胞のみを単離すると考えられる。
【００９７】
いくつかの態様では、本明細書の開示は、改変ヒト宿主細胞を作製する方法であって、
(a)細胞のプールを得る工程、
(b)ヌクレアーゼを使用して、例えば、遺伝子の発現をノックアウトまたはダウンレギュレーションすることによって、栄養要求性誘導座位に導入遺伝子を導入する工程、および
(c)栄養要求性についてスクリーニングする工程、および
(d)導入遺伝子の存在についてスクリーニングする工程
を含む方法を提供する。
【００９８】
スクリーニング工程は、表1に開示される栄養要求性因子のうちの1つとともにまたはそのまま細胞を培養することによって、行うことができる。
【００９９】
機能的因子、抗体、および細胞表面レセプターを発現することができる、大きな導入遺伝子を含めた導入遺伝子の挿入のための技法は、当技術分野において公知である（例えば、Bak and Porteus, Cell Rep. 2017 Jul 18; 20(3): 750-756（EGFRの組み込み）；Kanojia et al., Stem Cells. 2015 Oct;33(10):2985-94（抗Her2抗体の発現）；Eyquem et al., Nature. 2017 Mar 2;543(7643):113-117（CARの部位特異的組み込み）；O’Connell et al., 2010 PLoS ONE 5(8): e12009（ヒトIL-7の発現）；Tuszynski et al., Nat Med. 2005 May;11(5):551-5（線維芽細胞におけるNGFの発現）；Sessa et al., Lancet. 2016 Jul 30;388(10043):476-87（MLDを治療するためのエクスビボ遺伝子療法におけるアリールスルファターゼAの発現）；Rocca et al., Science Translational Medicine 25 Oct 2017: Vol. 9, Issue 413, eaaj2347（フラタキシンの発現）；Bak and Porteus, Cell Reports, Vol. 20, Issue 3, 18 July 2017, Pages 750-756（単一座位への大きな導入遺伝子カセットの組み込み）、Dever et al., Nature 17 November 2016: 539, 384-389（改変細胞を選択し濃縮するための、造血幹細胞（HSC）およびHSPCへのtNGFRの付加）を参照されたい；これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１００】
A.栄養要求性誘導座位および栄養要求性因子
いくつかの態様では、単一遺伝子の破壊が所望の栄養要求性を生じさせる。代替の態様では、複数の遺伝子の破壊が所望の栄養要求性をもたらす。
【０１０１】
いくつかの態様では、栄養要求性誘導座位は、栄養要求性因子を生成するタンパク質をコードする遺伝子であり、タンパク質には、栄養要求性因子を生成するための経路の上流のタンパク質が含まれる。
【０１０２】
本明細書に記載されるいくつかの態様では、栄養要求性誘導座位は、ウリジン一リン酸合成酵素（UMPS）をコードする遺伝子（対応する栄養要求性因子はウラシルである）、またはホロカルボキシラーゼ合成酵素をコードする遺伝子（対応する栄養要求性因子はビオチンである）である。いくつかの態様では、栄養要求性誘導座位は、表1の以下の遺伝子より選択される。表1の遺伝子は、サッカロミセス属（Saccharomyces）ゲノムデータベース（SGD）（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Cherry et al. 2012, Nucleic Acids Res. 40:D700-D705を参照されたい）の酵母表現型オントロジーデータベースからの「化学」データとともにダウンロードした、「栄養要求性」と注釈が付けられた表現型を有する出芽酵母（S. cerevisiae）遺伝子を選択することによって、照合された。これらの遺伝子は、YeastMine（登録商標）データベースを使用して、または代替の態様では、サッカロミセス属ゲノムデータベース（SGD）を使用して、ヒト相同体に変換された。遺伝子は、ENSEMBLデータベース（www.ensembl.org）に見られる、そのENSEMBL遺伝子記号およびENSG識別子によって、特定される。ENSG識別子（例えば、ENSG00000）の最初の5つの0は、除去した。
【０１０３】
（表１）栄養要求性誘導座位
2021522865.tif 000003
2021522865.tif 000004
2021522865.tif 000005
【０１０４】
CCBL1はKYAT1とも称され得る。CCBL2はKYAT3とも称され得る。DHFRL1はDHFR2とも称され得る。PYCRLはPYCR3とも称され得る。HRSP12はRIDAとも称され得る。
【０１０５】
栄養要求性因子は、1種または2種またはそれ以上の栄養素、酵素、変化したpH、変化した温度、非有機分子、非必須アミノ酸、もしくは（正常な生理的濃度と比較して）成分の変化した濃度、またはこれらの組み合わせでもよい。本明細書おける栄養要求性因子に対するすべての言及は、複数の因子の投与を企図する。対象に対して毒性がなく、かつ生物学的に利用可能でないか、または未治療の対象おいて、改変宿主細胞の増殖および複製を維持するのに十分な濃度で存在しない限り、いかなる因子も適切である。
【０１０６】
例えば、栄養要求性因子は、増殖に必要とされる物質である、または改変宿主細胞の代謝において補助因子として機能する、栄養素でもよい。様々な栄養要求性因子が表1に開示される。ある特定の態様では、栄養要求性因子は、ビオチン、アラニン、アスパルテート、アスパラギン、グルタメート、セリン、ウラシル、バリン、およびコレステロールより選択される。ビタミンB7としても公知であるビオチンは、細胞増殖に必要である。ある場合には、バリンは、造血幹細胞の増殖および維持に必要とされる。ある場合には、バリン補給の必要を軽減し、それによって、バリンが食事から除かれる場合に細胞に非改変細胞と比較して選択的利点を与える酵素をHSCにおいて発現するために、本明細書に開示される組成物は使用される。
【０１０７】
B.導入遺伝子
改変宿主細胞のゲノムにコードされる治療的実体は、治療効果、例えば、分子輸送、細胞死の誘導、さらなる細胞の動員、または細胞増殖をもたらし得る。いくつかの態様では、治療効果は治療的タンパク質の発現である。いくつかの態様では、治療効果は、腫瘍細胞の細胞死を含めた誘導性細胞死である。
【０１０８】
C.導入遺伝子の発現の制御
ある場合には、導入遺伝子は、任意で、遺伝子の内在性プロモーター、または異種性の構成的もしくは誘導性プロモーター、エンハンサー、組織特異的プロモーター、あるいは転写後調節配列を含めた、1種または複数種の発現制御配列に連結される。例えば、導入遺伝子の発現を駆動するために、組織特異的プロモーター（転写性ターゲティング）を使用することができ、またはある特定の組織において発現を避けるために、RNA中に調節配列（マイクロRNA（miRNA）標的部位）を含むことができる（転写後ターゲティング）。ある場合には、発現制御配列は正常個体と同じ発現パターン（生理的発現）に従って治療的導入遺伝子を発現するように、機能する（プロモーターおよび調節配列への参照のために、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Toscano et al., Gene Therapy (2011) 18, 117-127 (2011)を参照されたい）。
【０１０９】
構成的哺乳動物プロモーターとしては、限定されないが、以下の遺伝子：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPTR）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼのためのプロモーター、α-アクチンプロモーター、および他の構成的プロモーターが挙げられる。真核細胞で構成的に機能する例示的なウイルスプロモーターとしては、例えば、シミアンウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニーマウス白血病ウイルスのロングターミナルリピート（LTR）、および他のレトロウイルス由来のプロモーター、ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。一般に使用されるプロモーターとしては、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター／エンハンサー、EF1a（伸長因子1a）、SV40（シミアンウイルス40）、ニワトリβ-アクチンおよびCAG（CMV、ニワトリβ-アクチン、ウサギβ-グロビン）、ユビキチンCおよびPGKが挙げられ、これらすべては、ほとんどの細胞タイプにおいて構成的に活性な高レベルの遺伝子発現を提供する。他の構成的プロモーターは当業者に公知である。
【０１１０】
誘導性プロモーターは、誘導作用物質の存在下で活性化される。例えば、メタロチオネインプロモーターは、ある特定の金属イオンの存在下で転写および翻訳を増大するように活性化される。他の誘導性プロモーターとしては、アルコール調節型、テトラサイクリン調節型、ステロイド調節型、金属調節型、栄養素調節型プロモーター、および温度調節型プロモーターが挙げられる。
【０１１１】
肝臓特異的ターゲティングについて：第VIIa因子、第VIII因子または第IX因子の発現を肝細胞にターゲティングするために、天然およびキメラのプロモーターおよびエンハンサーが、ウイルスおよび非ウイルスベクターに組み込まれている。アルブミンおよびヒトα1アンチトリプシン（hAAT）などの肝臓特異的遺伝子由来のプロモーター領域は、天然プロモーターの好例である。あるいは、キメラプロモーターが、特異性および／またはベクター効率を高めるために開発された。好例は、4コピーの肝臓特異的ApoE/hAATエンハンサー／プロモーターの組み合わせを内部に持つ(ApoE)4/hAATキメラプロモーター／エンハンサー、ならびに1コピーのhAATプロモーターおよび2コピーのα(1)-ミクログロブリンエンハンサーからなるDC172キメラプロモーターである。
【０１１２】
筋肉特異的ターゲティングについて：効率的かつ特異的な筋肉発現を達成するために、天然（クレアチンキナーゼプロモーター−MCK、デスミン）および合成（α-ミオシン重鎖エンハンサー−／MCKエンハンサー−プロモーター（MHCK7））プロモーターがウイルスおよび非ウイルスベクターに含まれている。
【０１１３】
内皮特異的ターゲティングについて、内皮特異的発現を駆動するために、天然プロモーター（vWF、FLT-1、およびICAM-2）と合成プロモーターの両方が使用されている。
【０１１４】
骨髄細胞ターゲティングについて、骨髄性転写因子CAATボックスエンハンサー結合ファミリータンパク質（C/EBP）および顆粒球の分化の間に高発現しているPU.1に対する結合部位を含む合成キメラプロモーターが、主として骨髄細胞での導入遺伝子の発現を指示することが報告されている（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Santilli et al., Mol Ther. 2011 Jan;19(1):122-32を参照されたい。CD68も骨髄ターゲティングのために使用することもできる。
【０１１５】
遺伝性疾患の遺伝子療法のための組織特異的ベクターの例を表2に示す。
【０１１６】
（表２）組織特異的ベクター
2021522865.tif 000006
2021522865.tif 000007
2021522865.tif 000008
【０１１７】
遺伝性疾患の遺伝子療法のための生理的に調節されるベクターの例を表3に示す。
【０１１８】
（表３）生理的に調節されるベクター
2021522865.tif 000009
【０１１９】
組織特異的および／または生理的に調節される発現は、導入遺伝子のmRNA安定性および／または翻訳効率を改変する（転写後ターゲティング）ことによって、遂行することもできる。あるいは内在性宿主細胞機構を動員して、特定の組織または細胞タイプにおいて導入遺伝子の発現を遮断する（脱ターゲティング）ために、発現mRNAへのmiRNA標的認識部位（miRT）の組み込みが使用されている。miRNAは、miRTと称される特定のmRNAの3’UTR領域に完全にまたは部分的に相補的である、およそ22ヌクレオチドの非コードRNAである。特定のmiRTへのmiRNAの結合は、翻訳の減衰／不活性化および／または分解を促進する。miRNAを介する発現の調節は、Geisler and Fechner, World J Exp Med. 2016 May 20, 6(2): 37-54；Brown and Naldini, Nat Rev Genet. 2009 Aug, 10(8):578-85；Gentner and Naldini, Tissue Antigens. 2012 Nov, 80(5):393-403に記載されており、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。特定のmiRNA細胞タイプによって認識されるmiRT-ベクターを操作することは、所望されない細胞タイプにおいて治療的遺伝子の発現をノックダウンするための有効な方法であることが示されている（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Toscano et al.、前記を参照されたい）。
【０１２０】
D.薬学的組成物
いくつかの態様では、改変細胞の増殖および複製を制御する − 増大させる、低下させる、または停止させる − ための、および導入遺伝子による治療的因子の発現を制御するための、薬学的組成物、治療方法、および栄養要求性因子の投与の方法を含む、改変細胞の使用のための方法、組成物、およびキットが、本明細書に開示される。
【０１２１】
改変された哺乳動物宿主細胞は、栄養要求性因子とは別に、または栄養要求性因子と組み合わせて、対象に投与することができる。本明細書において提供される薬学的組成物の説明は、主にヒトへの投与に適している薬学的組成物に関するが、そのような組成物は、一般に任意の動物への投与に適していることが当業者によって理解されるであろう。
【０１２２】
薬学的組成物の投与が企図される対象としては、限定されないが、ヒトおよび／または他の霊長類；商業関連の哺乳動物、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、ラットを含めた哺乳動物、商業関連のトリ、例えば、家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／またはシチメンチョウを含めたトリが挙げられる。いくつかの態様では、組成物はヒト、ヒト患者、または対象に投与される。
【０１２３】
ある場合には、本明細書に記載される薬学的組成物は、対象において疾患、障害、または状態を治療する方法で使用され、方法は、
(i)栄養素、酵素、変化したpH、変化した温度、およびニッチ環境が対象中に存在しないように、栄養素、酵素、変化したpH、変化した温度、成分の変化した濃度、および／またはニッチ環境について栄養要求性である細胞株を作製すること；
(ii)工程(i)の得られた栄養要求性の細胞株と対象を接触させること；
(iii)栄養要求性因子が栄養要求性のシステムまたは要素を活性化し、細胞株の増殖および／または対象のための1種もしくは複数種の治療的実体の発現をもたらすように、栄養素、酵素、pHおよび／または温度を変化させる成分、ならびに対象の細胞のニッチ環境より選択される栄養要求性因子と(ii)の対象を接触させること
を含む。
【０１２４】
本明細書の開示の薬学的組成物は、
(a)本明細書の開示に従って改変宿主細胞を対象に投与すること、および
(b)改変宿主細胞の増殖を促進するのに十分である量で、栄養要求性因子を対象に投与すること
を含む、対象において疾患、障害、または状態を治療する方法で使用することもできる。
【０１２５】
本明細書の開示の改変宿主細胞を含むヒトへの投与のために、栄養素栄養要求性因子を含む組成物を使用することもできる。
【０１２６】
V.製剤
A.細胞操作製剤
改変宿主細胞は、栄養要求性誘導座位に治療的因子をコードする導入遺伝子を挿入するように、遺伝子操作されている。所望の座位を標的とするCas9タンパク質／gRNAリボ核タンパク質複合体（Cas9 RNP）の送達は、リポソーム媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、または核局在化によって行うことができる。いくつかの態様では、改変宿主細胞は、エレクトロポレーション後に、血清を含む培地と接触する。いくつかの態様では、改変宿主細胞は、エレクトロポレーション後に、還元血清を含むかまたは血清を含まない培地と接触する。
【０１２７】
B.治療製剤
本明細書の開示の改変宿主細胞または栄養要求性因子は、
(1)安定性を高める；
(2)生体内分布を変化させる（例えば、細胞株を特定の組織もしくは細胞タイプにターゲティングする）；
(3)コードされる治療的因子の放出プロファイルを変化させる；および／または
(4)栄養要求性因子の取り込みを向上させる
ために、1種または複数種の賦形剤を使用して製剤化することができる。
【０１２８】
本開示の製剤は、非限定的に、生理食塩水、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、およびこれらの組み合わせを含むことができる。
【０１２９】
本明細書に記載される薬学的組成物の製剤は、薬理学の分野において公知の、または今後開発される任意の方法によって、調製することができる。本明細書において使用する場合、用語「薬学的組成物」は、少なくとも1種の活性成分、および任意で、薬学的に許容される1種または複数種の賦形剤を含む組成物を指す。本開示の薬学的組成物は無菌であってもよい。
【０１３０】
一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤および／または1種もしくは複数種の他の補助成分と混合させる工程を含む。本明細書において使用する場合、フレーズ「活性成分」は、一般に、
(a)栄養要求性誘導座位に挿入された、治療的因子を発現することができる導入遺伝子を含む、改変宿主細胞もしくはドナーテンプレート、または
(b)対応する栄養要求性因子、または
(c)栄養要求性誘導座位内の開裂をターゲティングするためのヌクレアーゼシステム
のいずれかを指す。
【０１３１】
改変宿主細胞または栄養要求性因子と本明細書に記載される薬学的組成物の製剤は、当技術分野において公知である様々な方法によって、調製することができる。
【０１３２】
本開示による薬学的組成物は、単一単位用量として、および／または複数の単一単位用量として、バルクで、調製、包装、および／または販売することができる。本明細書において使用する場合、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む薬学的組成物の個別の量を指す。
【０１３３】
本開示による薬学的組成物中の活性成分（例えば、改変宿主細胞もしくは栄養要求性因子）、薬学的に許容される賦形剤、および／または任意のさらなる成分の相対量は、治療を受ける対象の同一性、サイズ、および／または状態に応じて、およびさらに、組成物が投与される経路に応じて、変動し得る。例えば、組成物は、0.1％〜99％（w/w）の活性成分を含むことができる。例として、組成物は、0.1％〜100％、例えば、0.5〜50％、1〜30％、5〜80％、または少なくとも80％（w/w）の活性成分を含むことができる。
【０１３４】
C.賦形剤および希釈剤
いくつかの態様では、薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％純粋でもよい。いくつかの態様では、賦形剤は、ヒトについての使用について、および獣医学的使用について承認されている。いくつかの態様では、賦形剤は、米国食品医薬品局によって承認されていてもよい。いくつかの態様では、賦形剤は、薬学的グレードのものであり得る。いくつかの態様では、賦形剤は、米国薬局方（USP）、欧州薬局方（EP）、英国薬局方、および／または国際薬局方の基準を満たし得る。
【０１３５】
本明細書において使用する場合、賦形剤としては、限定されないが、所望の特定の剤形に適する、あらゆるすべての溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性作用物質、等張作用物質、増粘もしくは乳化作用物質、防腐剤などが挙げられる。薬学的組成物を製剤化するための様々な賦形剤および組成物を調製するための技法は、当技術分野において公知である（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006を参照されたい）。任意の所望されない生物学的効果をもたらすこと、または薬学的組成物の任意の他の構成成分と有害な方法で相互作用することなどによって、任意の従来の賦形剤媒体がある物質またはその誘導体と不適合であり得る場合を除いて、従来の賦形剤媒体の使用も本開示の範囲内で企図され得る。
【０１３６】
例示的な希釈剤としては、限定されないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウムラクトース、ショ糖、セルロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、粉糖など、および／またはこれらの組み合わせが挙げられる。
【０１３７】
D.不活性成分
いくつかの態様では、製剤は、少なくとも1つの不活性成分を含むことができる。本明細書において使用する場合、用語「不活性成分」は、製剤に含まれる薬学的組成物の活性成分の活性に寄与しない1種または複数種の作用物質を指す。いくつかの態様では、本開示の製剤で使用することができる不活性成分のすべてが米国食品医薬品局（FDA）によって承認されていてもよく、いくつかが承認されていてもよく、またはどれも承認されていなくてもよい。
【０１３８】
E.薬学的に許容される塩
栄養要求性因子は、その薬学的に許容される塩として投与することができる。本明細書において使用する場合、「薬学的に許容される塩」は、（例えば、遊離塩基の基を適切な有機酸と反応させることによって）既存の酸または塩基成分をその塩形態に変換することによって、親化合物が改変されているような、開示される化合物の誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例としては、限定されないが、アミンなどの塩基性残基のミネラルまたは有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機塩などが挙げられる。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩（acetate）、酢酸（acetic acid）塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩（benzenesulfonate）、ベンゼンスルホン酸（benzene sulfonic acid）塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、2-ヒドロキシ-エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3-フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに無毒のアンモニウム、四級アンモニウム、およびアミンカチオン、例えば、限定されないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどが挙げられる。本開示の薬学的に許容される塩としては、例えば無毒の無機または有機酸から形成される、親化合物の従来の無毒塩が挙げられる。
【０１３９】
VI.服用および投与
上記の薬学的組成物中に含まれる本開示の改変宿主細胞または栄養要求性因子は、治療的に有効な転帰をもたらす、任意の送達経路、全身送達、または局所送達によって投与することができる。これらとしては、限定されないが、腸内（腸管中）、胃腸内、硬膜外（硬膜中）、経口（口経由）、経皮、脳内（大脳中）、脳室内（脳室中）、皮膚上（皮膚への塗布）、皮内（皮膚自体の中）、皮下（皮膚の下）、経鼻投与（鼻部を介する）、静脈内（静脈中）、静脈内ボーラス、静脈内点滴、動脈内（動脈中）、筋肉内（筋肉中）心臓内（心臓中）、骨内注入（骨髄中）、髄腔内（脊柱管中）、実質内（脳組織中）、腹腔内（腹膜中への注入または注射）、膀胱内注入、硝子体内（眼を介する）、空洞内注射（病的空洞中）、空洞内（陰茎の基部）、腟内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身的分布のためのインタクトな皮膚を介する拡散）、経粘膜（粘膜を介する拡散）、経腟、吹送（鼻からの吸引）、舌下、口唇下、浣腸、点眼（結膜上）、または点耳剤中、耳（耳の中または耳経由）、頬側（頬に向けて）、結膜、皮膚、歯（1本の歯または複数の歯へ）、電気浸透、頸管内、洞内（endosinusial）、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質内、腹腔内、羊水内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、軟骨内（軟骨中）、仙骨内（馬尾中）、大槽内（小脳延髄槽（cisterna magna cerebellomedularis）中）、角膜内（角膜中）、歯冠内（dental intracornal）、冠動脈内（冠動脈中）、海綿体内（陰茎の海綿体の膨張可能な空間中）、椎間板内（椎間板内）、管内（腺の管の中）、十二指腸内（十二指腸中）、硬膜内（硬膜の中または下）、表皮内（表皮へ）、食道内（食道へ）、胃内（胃の中）、歯肉内（歯肉中）、回腸内（小腸の遠位部分中）、病巣内（限局性病変部中、または限局性病変部に直接的に導入される）、管腔内（管の内腔中）、リンパ内（リンパ中）、髄内（骨の骨髄腔中）、髄膜内（髄膜中）、心筋内（心筋中）、眼内（眼の中）、卵巣内（卵巣中）、心膜内（心膜中）、胸膜内（胸膜中）、前立腺内（前立腺中）、肺内（肺またはその気管支中）、腔内（intrasinal）（鼻腔または眼窩周囲洞中）、脊髄内（脊柱中）、滑液包内（関節の滑膜腔中）、腱内（腱中）、精巣内（精巣中）、髄腔内（任意のレベルの脳脊髄軸における脳脊髄液中）、胸腔内（胸腔中）、管内（臓器の細管中）、腫瘍内（腫瘍中）、鼓膜内（中耳中）、血管内（1つの血管または複数の血管中）、心室内（心室中）、イオントフォレーシス（可溶性塩のイオンが体の組織中に移動する電流による）、潅注（開放創または体腔を浸すまたは洗い流す）、喉頭（喉頭上に直接）、鼻腔胃（鼻部から胃へ）、密封包帯技法（包帯によって覆われ、その領域が塞がれる、局部経路投与）、眼部（外部の眼へ）、口咽頭（口および咽頭に直接的に）、非経口、経皮的、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器（局所または全身作用のために経口的または経鼻的に吸入することによる気道中）、眼球後（脳橋の後ろまたは眼球の後ろ）、軟部組織、くも膜下、結膜下、粘膜下、局部、経胎盤性（胎盤を介する、または横断る）、経気管（気管壁を介する）、経鼓膜（鼓膜を横断するまたは介する）、尿管（尿管へ）、尿道（尿道へ）、腟、仙骨ブロック、診断的、神経ブロック、胆管灌流、心臓灌流、フォトフェレーシス、ならびに脊髄が挙げられる。
【０１４０】
A.非経口および注射可能な投与
いくつかの態様では、改変宿主細胞は非経口的に投与することができる。
【０１４１】
注射可能な調製物、例えば、無菌の注射可能な水性または油性の懸濁剤は、公知の技術に従って、適切な分散作用物質、湿潤作用物質、および／または懸濁化作用物質を使用して、製剤化することができる。無菌の注射可能な調製物は、例えば、1,3-ブタンジオールの溶液として、無毒の非経口的に許容される希釈剤および／または溶媒中の無菌の注射可能な溶液剤、懸濁剤、および／または乳濁剤であってもよい。用いることができる許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル溶液、U.S.P.、および等張塩化ナトリウム溶液がある。無菌不揮発性油は、溶媒または懸濁媒として、慣習的に用いられる。この目的のために、合成のモノまたはジグリセリドを含めた任意の無刺激性不揮発性油を用いることができる。オレイン酸などの脂肪酸を注射剤の調製で使用することができる。
【０１４２】
注射可能な製剤は、例えば、細菌保持フィルターによる濾過によって、および／または使用前に滅菌水または他の無菌の注射可能な媒体に溶解または分散させることができる無菌固体組成物の形態で無菌作用物質を組み入れることによって、無菌化することができる。
【０１４３】
活性成分の効果を延ばすために、皮下または筋肉内注射から活性成分の吸収を遅らせることが望ましいことが多い。これは、水溶性が乏しい結晶性または非結晶性材料の液体懸濁液の使用によって達成され得る。活性成分の吸収速度は、溶解速度に依存し、ひいては、結晶サイズおよび結晶形態に依存し得る。あるいは、非経口的に投与された薬物形態の吸収の遅延は、油状ビヒクル中に薬物を溶解または懸濁させることによって達成され得る。注射可能なデポー形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に薬物のマイクロカプセル化マトリックスを形成することによって作製される。薬物対ポリマーの比および用いられる特定のポリマーの性質に依存して、薬物放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。注射可能なデポー製剤は、体組織に適合するリポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬物を封入することによって調製される。
【０１４４】
B.デポー投与
本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、本開示の改変宿主細胞を含む薬学的組成物は、持続放出のためにデポー剤に製剤化される。一般に、特定の臓器または組織（「標的組織」）が、投与のために標的とされる。いくつかの態様では、局所的放出は生体適合性装置の利用を介して影響を受ける。例えば、生体適合性装置は対象において細胞株の拡散を制限することができる。
【０１４５】
本明細書の開示のいくつかの局面では、本開示の改変宿主細胞を含む薬学的組成物は、標的組織内に、または標的組織の近位に空間的に保持される。改変宿主細胞または栄養要求性因子を含む薬学的組成物を、標的組織中でそれらが実質的に保持される、つまり、組成物の少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、99.9、99.99、または99.99％より多くが標的組織中に保持されるような条件下で、（1つまたは複数標的細胞を含む）標的組織を改変宿主細胞または栄養要求性因子を含む薬学的組成物と接触させることによって、哺乳動物対象の標的組織にもたらす方法が提供される。例えば、対象に投与される改変宿主細胞または栄養要求性因子を含む薬学的組成物の少なくとも1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％、または99.99％より多くが、投与後に一定期間存在する。
【０１４６】
本開示のある特定の局面は、本開示の改変宿主細胞または栄養要求性因子を含む薬学的組成物を、それらが標的組織中で実質的に保持されるような条件下で改変宿主細胞を含む薬学的組成物と標的組織を接触させることによって、哺乳動物対象の標的組織にもたらす方法に関する。改変宿主細胞を含む薬学的組成物は、少なくとも1つの標的細胞で関心対象の効果がもたらされるように十分な活性成分を含む。いくつかの態様では、改変宿主細胞を含む薬学的組成物は、一般に、1種または複数種の細胞侵入作用物質を含むが、薬学的に許容される賦形剤を有する、または有さない、（例えば、細胞侵入作用物質または他の作用物質を有さない）「ネイキッド」製剤も企図される。
【０１４７】
C.治療方法
本開示は、薬学的組成物または製剤の一部として含む、上記の改変宿主細胞または栄養要求性因子のいずれかを、哺乳動物対象を含めた対象に送達する方法をさらに提供する。
【０１４８】
D.用量およびレジメン
本開示は、本開示による改変宿主細胞または栄養要求性因子をそれらを必要とする対象に投与する方法を提供する。改変宿主細胞または栄養要求性因子を含む薬学的組成物および本開示の組成物は、疾患、障害、および／または状態を予防する、治療する、管理する、または診断するのに有効な、投与の任意の量および任意の経路を使用して、対象に投与することができる。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、および全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与様式、その活性様式になど応じて、対象ごとに変動すると考えられる。対象は、ヒト、哺乳動物、または動物でもよい。任意の特定の個体に対する、特定の治療的に有効な、予防的に有効な、または適切な診断の用量レベルは、治療を受ける障害および障害の重症度；用いられる特定のペイロードの活性；用いられる特定の組成物；患者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別、および食事;投与時間、投与経路、および栄養要求性因子の排出速度；治療の継続期間；用いられる特定の改変宿主細胞または栄養要求性因子と組み合わせて、または同時に使用される薬物;医学分野で周知な因子などを含めた、様々な因子に依存すると考えられる。
【０１４９】
ある特定の態様では、本開示による改変宿主細胞または栄養要求性因子の薬学的組成物は、所望の治療的、診断的、または予防的効果を得るために、1日あたり1回または複数回で、1日あたり、対象の体重について、約0.0001mg/kg〜約100mg/kg、約0.001mg/kg〜約0.05mg/kg、約0.005mg/kg〜約0.05mg/kg、約0.001mg/kg〜約0.005mg/kg、約0.05mg/kg〜約0.5mg/kg、約0.01mg/kg〜約50mg/kg、約0.1mg/kg〜約40mg/kg、約0.5mg/kg〜約30mg/kg、約0.01mg/kg〜約10mg/kg、約0.1mg/kg〜約10mg/kg、または約1mg/kg〜約25mg/kgを送達するのに十分である投薬量レベルで投与することができる。
【０１５０】
ある特定の態様では、本開示による、改変宿主細胞または栄養要求性因子の薬学的組成物は、約10〜約600μl/部位、50〜約500μl/部位、100〜約400μl/部位、120〜約300μl/部位、140〜約200μl/部位、約160μl/部位で投与することができる。非限定例として、改変宿主細胞または栄養要求性因子は、50μl/部位および／または150μl/部位で投与することができる。
【０１５１】
本開示の改変宿主細胞または栄養要求性因子の所望の投薬量は、1回のみ、1日3回、1日2回、1日1回、隔日、3日ごと、毎週、2週間ごと、3週間ごと、または4週間ごと送達され得る。ある特定の態様では、所望の投薬量は、複数回投与（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14回、またはそれ以上の投与）を使用して、送達され得る。
【０１５２】
本開示の改変宿主細胞の所望の投薬量は、1回または複数回投与することができる。栄養要求性因子は、ある期間にわたって設定された頻度で定期的に、または「連続フロー」として継続的に、投与される。24時間で与えられるまたは処方される量である全1日用量は、これらの方法のいずれかによって、またはこれらの方法の組み合わせとして、投与することができる。
【０１５３】
いくつかの態様では、本開示の改変宿主細胞または栄養要求性因子の対象への送達は、少なくとも1か月、2か月、3か月、4か月、5か月、6か月、7か月、8か月、9か月、10か月、11か月、1年、13か月、14か月、15か月、16か月、17か月、18か月、19か月、20か月、20か月、21か月、22か月、23か月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、または10年より多くにわたって、治療効果をもたらす。
【０１５４】
改変宿主細胞は、1種または複数種の他の治療的、予防的、研究用、もしくは診断的作用物質、または医学手順と組み合わせて、連続してまたは同時に、使用することができる。一般に、各作用物質は、その作用物質について決定された用量および／またはタイムスケジュールで投与されると考えられる。いくつかの態様では、本開示は、薬学的、予防的、研究用、または診断的組成物を、それらの生物学的利用能を向上させる、それらの代謝を低減させるおよび／もしくは改変する、それらの排出を阻害する、ならびに／または体内のそれらの分布を改変することができる作用物質と組み合わせて送達することを包含する。
【０１５５】
例えば、改変宿主細胞または栄養要求性因子は、治療のために標的とされる領域で生物学的利用能を高めるために、対象において拡散を制限する生体適合性装置として投与される。改変宿主細胞または栄養要求性因子は、局所送達によっても投与され得る。
【０１５６】
本明細書の開示は、対象において治療的因子を発現させる方法であって、
(a)前記改変細胞を投与すること、
(b)任意で、改変細胞が生着するのを可能にするために前処置レジメを施すこと、および
(c)前記栄養要求性因子を投与すること
を含む方法を企図する。
【０１５７】
用語「前処置レジメ」は、幹細胞移植の前に患者が受ける療法の過程を指す。例えば、造血幹細胞移植前に、患者は、たとえ幹細胞が同じ患者に由来したとしても、幹細胞移植の拒絶反応を予防するために、骨髄破壊的療法、非骨髄破壊的療法、または強度が低減された前処置を受け得る。前処置レジメは、細胞毒性作用物質の投与をともない得る。前処置レジメは、免疫抑制、抗体、および照射を含み得る。他の可能性のある前処置レジメントとしては、抗体媒介性前処置（例えば、Czechowicz et al., 318(5854) Science 1296-9 (2007)；Palchaudari et al., 34(7) Nature Biotechnology 738-745 (2016)；Chhabra et al., 10:8(351) Science Translational Medicine 351ra105 (2016)を参照されたい）およびCAR-T媒介性前処置（例えば、Arai et al., 26(5) Molecular Therapy 1181-1197 (2018)を参照されたい。これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）が挙げられる。前処置は、操作されたHSCに由来するミクログリアが移動して、関心対象のタンパク質を送達するための空間を脳内に作り出すために使用される必要がある（ALDおよびMLDに対する最近の遺伝子療法試験）。前処置レジメンは、移植細胞が生着および増殖するための場所を体内に有することを可能にするニッチ「空間」を作り出すようにも設計される。造血幹細胞移植では、例えば、前処置レジメンは、移植造血幹細胞が生着するためのニッチ空間を骨髄中に作り出す。前処置レジメンなしでは、移植造血幹細胞は生着することができない。いくつかの態様では、細胞株は、栄養要求性であるように遺伝子操作されているT細胞である。操作された栄養要求性T細胞は、生きている薬物として作用するように、CAR T細胞として使用することができ、造血幹細胞移植のために患者を前処理するために、栄養要求性因子とともに患者に投与することができる。ドナー造血幹細胞の送達より前に、栄養要求性因子を除去することができ、これによって、操作された栄養要求性T細胞が排除される。いくつかの態様では、細胞株は、栄養要求性であるように遺伝子操作されている同種異系T細胞である。操作された栄養要求性同種異系T細胞は、治療効果をもたらすために、栄養要求性因子とともに患者に投与することができる。患者が移植片対宿主病（GvHD）を発生した際に、栄養要求性因子を除去することができ、これによって、アロ反応性になった操作された栄養要求性同種異系T細胞が排除される。
【０１５８】
いくつかの態様では、前記栄養要求性因子の投与は、治療的因子を発現するのに十分な期間にわたって、好ましくは、治療的因子が治療効果を発揮するのに十分な期間にわたって、定期的に続けられる。いくつかの態様では、治療的因子の発現を低下させるために、前記栄養要求性因子の投与は減らされる。いくつかの態様では、治療的因子の発現を増大させるために、前記栄養要求性因子の投与は増やされる。いくつかの態様では、前記栄養要求性因子の投与は、改変細胞の増殖阻害または死をもたらす状態を引き起こすために、中止される。いくつかの態様では、前記栄養要求性因子の投与は、改変細胞の増殖阻害をもたらす状態を引き起こすために、一時的に中断される。
【０１５９】
本明細書の開示は、疾患、障害、または状態を有する対象を治療する方法であって、治療量の治療的因子の発現をもたらすのに十分である量で、
(a)前記改変された哺乳動物宿主細胞および
(b)前記栄養要求性因子
を対象に投与することを含む方法も企図する。
【０１６０】
疾患、障害、または状態の治療のための、本開示による改変された哺乳動物宿主細胞の使用も、本開示によって包含される。
【０１６１】
ある特定の態様は、癌、パーキンソン病、移植片対宿主病（GvHD）、自己免疫性状態、過剰増殖性の障害または状態、悪性形質転換、肝臓の状態、遺伝性遺伝子欠陥を含めた遺伝的状態、若年型糖尿病、および眼の区画の状態からなる群より選択されるような、疾患、障害、または状態を提供する。
【０１６２】
ある特定の態様では、疾患、障害、または状態は、筋肉系、骨格系、循環系、神経系、リンパ系、呼吸器系、内分泌系、消化器系、排出系、および生殖器系からなる群より選択される、体の少なくとも1つの系に影響を及ぼす。対象において1種より多い細胞タイプに影響を及ぼす状態は、各細胞株が異なる栄養要求性因子によって活性化される、1種より多い改変宿主細胞で治療することができる。場合によっては、１種より多い栄養要求性因子を対象に投与することができる。
【０１６３】
ある特定の態様は、再生性として細胞株を提供する。本開示の一局面では、対象を、1種より多い改変宿主細胞と、および／または1種または複数種の栄養要求性因子と、接触させてもよい。ある特定の態様は、栄養要求性因子、例えば、栄養素または酵素の局所的放出を提供する。代替の態様は全身送達を提供する。例えば、局所的放出は、生体適合性装置の利用を介して影響を受ける。本開示の一局面では、生体適合性装置は対象において細胞株の拡散を制限することができる。方法のある特定の態様は、対象において、改変宿主細胞の治療効果を枯渇させるために、または改変宿主細胞において細胞死を誘導するために、栄養要求性因子を除去することを提供する。方法のある特定の態様は、分子輸送、細胞死の誘導、細胞死、およびさらなる細胞の動員からなる群より選択される少なくとも1つを含むような治療効果を提供する。方法のある特定の態様は、非改変宿主細胞が、改変宿主細胞による対象の治療より前の同じ対象に由来することを提供する。
【０１６４】
本開示は、そのような組成物またはそのような組成物の構成成分を任意で容器またはバイアルとともに含むキットを企図する。
【０１６５】
VII.定義
数値xに関する用語「約」は、例えば、x±10％を意味する。
【０１６６】
用語「活性成分」は、概して、治療効果の発揮に関与する、組成物中の成分を指す。本明細書において使用する場合、これは、概して、
(a)本明細書に記載される導入遺伝子を含む、改変宿主細胞またはドナーテンプレート、
(b)本明細書に記載される対応する栄養要求性因子、または
(c)栄養要求性誘導座位内の開裂をターゲティングするためのヌクレアーゼシステム
を指す。
【０１６７】
本明細書において使用する場合、用語「変化した濃度」は、本明細書に記載される薬学的組成物の投与より前の対象における栄養要求性因子の濃度と比較した場合の、栄養要求性因子の濃度の増大を指す。
【０１６８】
本明細書において使用する場合、用語「変化したpH」は、本明細書に記載される薬学的組成物の投与より前の対象におけるpHと比較した場合の、対象において誘導されるpHの変化を指す。
【０１６９】
本明細書において使用する場合、用語「変化した温度」、本明細書に記載される薬学的組成物の投与より前の対象における温度と比較した場合の、対象において誘導される温度の変化を指す。
【０１７０】
本明細書において使用する場合、用語「栄養要求性」または「栄養要求性の」は、細胞の増殖および複製を維持するために栄養要求性因子の外来性投与を必要とする細胞の状態を指す。
【０１７１】
本明細書において使用する場合、用語「栄養要求性誘導座位」は、破壊された場合に細胞を栄養要求性にする、細胞中の染色体の領域を指す。例えば、細胞は、栄養要求性因子の合成、再利用またはサルベージに関与する酵素をコードする遺伝子を（直接的に、もしくは栄養要求性因子を生成するために使用される中間体を合成することを介して上流で）破壊することによって、または遺伝子の発現を調節する発現制御配列を破壊することによって、栄養要求性になり得る。
【０１７２】
本明細書において使用する場合、用語「生物学的利用能」は、対象に投与される改変宿主細胞または栄養要求性因子の所与の量の全身利用能を指す。
【０１７３】
本明細書において使用する場合、用語「Cas9」は、ゲノム編集で使用するためのエンドヌクレアーゼであるCRISPR関連タンパク質9を指す。
【０１７４】
用語「含む（comprising）」は、「含む（including）」および「からなる」を意味し、例えば、Xを「含む（comprising）」組成物は、Xのみからなり得るか、または追加的な何か、例えば、X＋Yを含み（include）得る。
【０１７５】
用語「前処置レジメ」は、幹細胞移植の前に患者が受ける療法の過程を指す。
【０１７６】
本明細書において使用する場合、用語「連続フロー」は、単一経路／単一接触点で、ある期間にわたって継続的に投与される治療剤の投与、すなわち、継続投与事象を指す。
【０１７７】
本明細書において使用する場合、用語「CRISPR」は、侵入する細胞のRNAヌクレオチドを切断する酵素を配備する、DNAのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）を指す。
【０１７８】
本明細書において使用する場合、用語「CRISPR/Cas9ヌクレアーゼシステム」は、Cas9に対する結合部位および標的DNA中の開裂される部位に対して特異的なターゲティング配列を有するガイドRNA（gRNA）配列を含む遺伝子操作ツールを指す。Cas9はgRNAに結合して、標的部位に結合しかつ標的部位を開裂させるリボ核タンパク質複合体を形成する。
【０１７９】
細胞の文脈で使用される場合、用語「拡大する」は、後代の生成を介して細胞の数を増加させること指す。
【０１８０】
用語「発現制御配列」は、関心対象のヌクレオチド配列の発現を調節または制御することができるヌクレオチド配列を指す。例としては、プロモーター、エンハンサー、転写因子結合部位、miRNA結合部位が挙げられる。
【０１８１】
用語「相同組換え」（HR）は、相同組換え修復メカニズムを介したDNA中の切断の修復の間のヌクレオチド配列の挿入を指す。このプロセスは、切断を修復するためのテンプレートとして、切断の領域中のヌクレオチド配列と相同性を有する「ドナー」分子または「ドナーテンプレート」を使用する。挿入されるヌクレオチド配列は、ゲノム中の一塩基変化でもよく、または大きなDNA配列の挿入でもよい。
【０１８２】
2つ以上のヌクレオチド配列の文脈で使用する場合、用語「相同な」または「相同性」は、生理的条件下で、細胞中で2つのヌクレオチド配列が一緒に特異的に結合するのに十分である、塩基対形成またはハイブリダイゼーションの程度を指す。相同性は、例えば、特定の塩基数にわたって、少なくとも70％の同一性、好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれより高い同一性で、相補的配列とワトソン・クリック塩基対形成を受けるであろうヌクレオチドのパーセンテージを計算することによって、説明することもできる。ドナーテンプレートについては、例えば、相同性は200〜400塩基にわたり得る。ガイド配列については、例えば、相同性は15〜20塩基にわたり得る。
【０１８３】
用語「機能的に連結される」は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、シグナル配列、または一連の転写因子結合部位）と第2の核酸配列の間の機能的連結であって、発現制御配列が第2の核酸配列の転写および／または翻訳に影響を及ぼす、機能的連結を指す。
【０１８４】
本明細書において使用する場合、用語「薬学的組成物」は、少なくとも1種の活性成分、および任意で、薬学的に許容される1種または複数種の賦形剤を含む組成物を指す。
【０１８５】
本明細書において使用する場合、用語「薬学的に許容される塩」は、（例えば、遊離塩基の基を適切な有機酸と反応させることによって）既存の酸または塩基成分をその塩形態に変換することによって、親化合物が改変されているような、開示される化合物の誘導体を指す。本明細書における化合物または構成成分に対するすべての言及は、その薬学的に許容される塩を含む。
【０１８６】
本明細書において使用する場合、用語「再生性」は、対象の臓器または系の一新または修復を指す。
【０１８７】
用語「治療的因子」は、対象の疾患、障害、または状態の症状を治療および／または緩和する、挿入される導入遺伝子にコードされる生成物を指す。
【０１８８】
用語「治療量」は、疾患、障害、または状態の症状の緩和または改善を意味する「治療効果」を発揮するのに十分である治療的因子の量を指す。
【０１８９】
本明細書において使用する場合、用語「単位用量」は、所定量の活性成分を含む薬学的組成物の個別の量を指す。
【実施例】
【０１９０】
実施例1. 一般的なT細胞培養方法
K562細胞（ATCCから入手した）およびNalm6細胞（C. Mackallの好意により提供された）を、10％ウシ増殖血清、2mM L-グルタミン、ならびに100U/mlペニシリンおよび100U/mlストレプトマイシンが補給されたRPMI 1640（HyClone）中で培養した。T細胞は、健康なドナーから得たバフィーコートから単離した後、新鮮な状態で使用した。T細胞は、フィコール密度勾配遠心、それに続く、Pan T Cell Isolationキット（Miltenyi Biotec）を使用する磁気濃縮を介して単離した。
【０１９１】
細胞はBAMBANKER商標培地中で凍結保存した。解凍後、5％ヒト血清（Sigma-Aldrich）および100個のヒト組換えIL-2（Peprotech）および10ng/mlヒト組換えIL-7（BD Biosciences）を補給した、または補給しないX-Vivo 15（Lonza）中で、37℃、5％CO2で、細胞を培養した。UMPまたはウリジンを250μg/mlで添加した。5-FOAを100μg/ml〜1mg/mlで添加した。培養の間、2日ごとに培地を新しくした。
【０１９２】
固定化した抗CD3（クローンOKT3、Tonbo Biosciences）および可溶性抗CD28（クローンCD28.2、Tonbo Biosciences）を使用して、エレクトロポレーションの前の3日間T細胞を活性化した。
【０１９３】
140万個の活性化T細胞をエレクトロポレーション溶液に再懸濁し、事前に複合体化したRNPと混合し、EO-115プログラムを使用する4D-NUCLEOFECTOR商標システム（Lonza）を使用して、エレクトロポレーションした。RNPは、2.5のsgRNA:Cas9モル比を使用して、300μg/mlのCas9タンパク質（化膿性連鎖球菌に基づくAlt-R（登録商標）CRISPR/Cas9システム、IDT）およびsgRNAからなっていた。
【０１９４】
QUICKEXTRACT商標 DNA抽出キット（Epicentre）を使用して、ゲノムDNAを収集した。トリパンブルー染色を使用する自動化された細胞カウンターで、または値を正規化するための参照としてCOUNTBRIGHT商標ビーズ（ThermoFisher）を使用する自動プレートリーダーを有するCytoFLEXフローサイトメーター（Beckman Coulter）で、細胞を計数した。あるいは、蛍光色素標識抗体（Biolegend）で染色した後に、体積も測定するACCURI商標C6フローサイトメーター（BD Biosciences）、またはFACS ARIA商標II SORPセルソーター（BD Biosciences）で、細胞を解析した。Excel（Microsoft）およびFlowJoソフトウェア（Tree Star）を使用して、データを解析した。
【０１９５】
PHUSION商標Hot Start Flex 2×Master Mix（New England Biolabs, Inc.）を使用して増幅した領域を用いて、UMPS-O-1およびUMPS-O-2を使用するUMPS座位のサンガーシークエンシングを行った。編集後に挿入および欠失（InDel）を特定するために、TIDE解析（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Brinkman et al, 2014, Nucleic Acids Res. 42(22):e168を参照されたい）によって、サンガーシークエンシングトレースを解析した。TIDEオンラインツール（www.deskgen.com/landing/tide.html）（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、M. Sadelain, N. Engl. J. Med. 365, 1735-7 (2011)を参照されたい）を使用して、配列に対してInDelの定量化を行った。
【０１９６】
gRNA配列（PAMとも称されるプロトスペーサー隣接モチーフを含む）：
UMPS-7
2021522865.tif 000010
【０１９７】
UMPS座位のTIDE解析のためのシークエンシングオリゴヌクレオチド：
2021522865.tif 000011
【０１９８】
最初のスクリーニングの後、さらなる解析のために、InDelの最高の頻度を示したsgRNA「UMPS-7」を選択した。
【０１９９】
実施例2. ヒトT細胞におけるCas9-sgRNAのエレクトロポレーションによるUMPSの編集
T細胞を解凍し、培養し、続いて活性し、その後に上記のCas9-UMPS-7 sgRNA RNPを用いてエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後に、血清、5-FOA、または外来性ウラシル供給源があるまたはない培地中で、細胞を回復させた（図1A）。エレクトロポレーション後の細胞生存は、培地中に血清が含まれる場合に顕著に増大し（図1B）、それにより、すべてのその後の実験において、血清、ウリジン、およびUMPを有する培地中で4日の回復期間を行った。エレクトロポレーション後の細胞数を表4に示す。
【０２００】
（表４）細胞数
2021522865.tif 000012
【０２０１】
実施例3. 混合したUMPS編集集団の増殖およびUMPS突然変異の維持
実施例2と同様にT細胞をエレクトロポレーションし、編集し、血清、ウリジン、およびUMPを有する培地中で4日間回復させた。4日目に、UMP、ウリジン、またはウラシル供給源培地に細胞を移した。本実験は、選択工程を特徴としておらず、それにより、得られた細胞の集団は、野生型（WT）細胞とヘテロ接合突然変異体細胞とホモ接合突然変異体細胞との不均一な混合物であった。ホモ接合UMPS突然変異体細胞の増殖は、外来性ウラシル供給源に依存することが観察され、これは、これらが栄養要求性であるはずだからである（図2A）。UMPSが標的とされる場合、InDelは、約50％の細胞で生成されることが観察された（TIDE解析によってアッセイした場合（Brinkman et al, 2014, Nucleic Acids Res. 42(22):e168を参照されたい）。その全体は、参照により本明細書に組み入れられる）。
【０２０２】
外来性ウラシル供給源を除去した場合、3日間の増殖後に集団中のInDelの頻度は低減した（7日目＝4日間の回復および試験培地中に3日間）。これは、任意のホモ接合栄養要求性UMPS突然変異体細胞は、編集後に依然として存在する非栄養要求性ヘテロ接合突然変異体およびWT細胞によって集団中で打ち負かされると考えられ、見かけ上のInDelの頻度の低減をもたらすことを示すモデルと矛盾がなかった（図2Bを参照されたい）。InDelを有するアレルのパーセンテージを表5に示す。
【０２０３】
（表５）InDelを有するアレル
2021522865.tif 000013
【０２０４】
不均一なUMPS編集集団の至適な増殖は、ウラシルの外来性供給源の存在に依存することが観察された（図2C〜図2F）。フレームシフトInDelを有するアレルのパーセントを図2Cに示し、値を表6に示す。
【０２０５】
（表６）フレームシフトInDelを有するアレル
2021522865.tif 000014
【０２０６】
図2Dは、TIDEによって特定されたアレルを含む8日目の細胞の予測絶対数を比較する。値を表7に示す。
【０２０７】
（表７）予測される生細胞数
2021522865.tif 000015
【０２０８】
図2Eは、UMPあり／なしの細胞数のタイムコース（8日間）を示す。値を表8に示す。
【０２０９】
（表８）細胞密度［mlあたりの細胞］
2021522865.tif 000016
【０２１０】
図2Fは、ウリジンあり／なしの細胞数のタイムコース（8日間）を示す。値を表9に示す。
【０２１１】
（表９）細胞密度［mlあたりの細胞］
2021522865.tif 000017
【０２１２】
UMPおよびウリジンは、UMPS編集培養物の増殖をモック編集細胞と同じレベルまでレスキューした。増殖のこのレスキューは、UMPSの編集に依存し、外来性ウラシル供給源で処理したモック細胞では見られず、これは、編集したUMPSが、至適な細胞増殖のために、ヒトT細胞を特にウラシル補給に依存させることを示す。
【０２１３】
UMPS編集集団は、栄養要求性であるとは期待されない編集されていないまたはヘテロ接合の細胞を含んでおり、それにより、ウラシル欠乏培地におけるUMPS編集細胞の増殖の完全な欠如は期待されないことを何度も繰り返して言う価値がある。
【０２１４】
実施例4. 5-FOA処理はUMPS標的化細胞を選択する
5-FOAは、他の生物においてウラシル栄養要求性細胞を選択する（例えば、Boeke et al. 1984, Mol. Gen. Genet. 197(2):345-6）。これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。ヒト細胞の中でのウラシル栄養要求株の選択に対する5-FOAの潜在的な有用性を研究するために、Cas9-gRNA複合体のエレクトロポレーション、続いて回復（実施例2に示す通り）、続いて5-FOA処理に対する抵抗性のアッセイ（図3A）によって、ヒトT細胞においてUMPS遺伝子を標的とした。5-FOAおよび血清とウラシル供給源の様々な組み合わせにおいて、4日間細胞を増殖させてから、細胞計数を行った。
【０２１５】
表10は、血清ありまたはなしで増殖させた細胞集団について細胞数を比較する。
【０２１６】
（表１０）細胞数
2021522865.tif 000018
【０２１７】
血清は、エレクトロポレーション後の細胞の回復に重要であるが、5-FOAにおける細胞の生存率に対して効果がなかった（図3B）。血清なしの5-FOAにおける増殖したさらなる試料に対する細胞数を図3Cおよび表11に示す。
【０２１８】
（表１１）細胞数
2021522865.tif 000019
【０２１９】
ウリジンおよびUMPは、対照と比較して、5-FOAにおいてモック処理細胞とUMPS標的化細胞の両方の生存を向上させた。これは、競合ベースのメカニズムを介する可能性がある（ウリジンは、ヒトにおいて5-フルオロウラシルの毒性を逆転させ得る（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、van Groeningen et al. 1992, Semin. Oncol. 19(2 Suppl 3):148-54を参照されたい））（図3Bおよび図3C）。すべての場合において、UMPS標的化細胞は、モック標的化細胞と比較して生存の増加を示した。このデータは、ヒト細胞培養におけるウラシル栄養要求性細胞の選択に5-FOAを使用することができることを示した。
【０２２０】
実施例5. 5-FOAで選択したUMPS標的化細胞はウラシル栄養要求性を示す
5-FOA処理によって選択された細胞がウラシル栄養要求株であったかどうかをアッセイするために、実施例4に示すように、モックまたはUMPS標的化T細胞を5-FOAに曝露した。4日間の5-FOA選択後、細胞の集団をウラシル含有培地（UMP、ウリジン、または両方）とウラシル欠乏培地に分けた。続いて、試験培地での4日間のインキュベーション後（8日目）に、細胞計数によって増殖アッセイを行った（図4A）。すべての場合において、モック標的化細胞培養における細胞増殖は無視できるほどでありかつウラシル供給源の補給と無関係であり、これは、5-FOA選択工程中の非UMPS標的化細胞の死滅の成功を示す（図4B〜図4D）。UMPS標的化集団では、すべての条件で、ウラシルの添加によって細胞増殖が刺激され、ウラシルの非存在下では不十分な細胞増殖が観察された（図4B〜図4D）。
【０２２１】
図4Bは、血清なしの試料について、8日目の培養における細胞数を比較する。値を表12に示す。
【０２２２】
（表１２）8日目の細胞数
2021522865.tif 000020
【０２２３】
図4Cは、UMPが補給されかつ血清なしの培養における細胞数を比較する。値を表13に示す。
【０２２４】
（表１３）8日目の細胞数
2021522865.tif 000021
【０２２５】
図4Dは、ウリジンが補給されかつ血清なしの培養における細胞数を比較する。値を表14に示す。
【０２２６】
（表１４）8日目の細胞数
2021522865.tif 000022
【０２２７】
まとめると、実施例1〜5の結果は、ヒトT細胞におけるCas9によるUMPS座位の編集は、至適な細胞増殖のために外来性ウラシル供給源に依存する細胞を作製することを示す。これらの結果は、T細胞の増殖または他の一部の細胞療法を制御するためのメカニズムとして、操作されたヒト栄養要求性を使用することができることを実証する。さらに、UMPS編集細胞の5-FOA選択は、T細胞の真の栄養要求性集団の選択に有用なメカニズムを提供する。
【０２２８】
実施例6. 幹細胞の培養
潜在的な治療的関連性がある別の細胞タイプを評価するために、ヒト多能性細胞でUMPSを操作した。本明細書の開示の主題である改変宿主細胞は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるU.S.8,945,862に示されるような以下の技法を使用して維持されおよび分化させられた幹細胞を含むことができる。
【０２２９】
失活させたマウス胚線維芽細胞（MEF）支持細胞層（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Stem Cells, 2007. 25(2): p. 392-401）上で、未分化hESC（WICELL（登録商標）のH9株、継代35〜45）を増殖させた。手短に言えば、前記細胞を、0.1％ゼラチンでコーティングしたプレート上の照射した低継代MEF支持細胞層上で、未分化段階で維持した。培地は毎日変えた。培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）/F-12、20％ノックアウト血清代替品、0.1mM非必須アミノ酸、2mM L-グルタミン、0.1mM β-メルカプトエタノール、および4ng/ml rhFGF-2（R&D Systems Inc.、Minneapolis）からなる。未分化hESCをDMEM/F12中で1mg/mlコラゲナーゼタイプIVによって処理し、継代の当日に機械的にばらばらにした。分化に先立って、以下のようにMEFから調製した馴化培地（CM）中のMATRIGEL（登録商標）タンパク質混合物（Corning, Inc.）でコーティングしたプレート上にhESCを播種した（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Nat Biotechnol, 2001. 19(10): p. 971-4）。MEF細胞を収集し、50Gyで照射し、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）を有さないhES培地で培養した。CMは毎日採取し、追加的な4ng/mlのbFGFを補給してから、hES細胞に供給した。
【０２３０】
実施例7. ヒト胚性幹細胞（ESC）から内皮細胞（EC）へのインビトロ分化
hESCの分化を誘導するために、先に記載されているように（Proc Natl Acad Sci USA, 2002. 99(7): p. 4391-6およびStem Cells, 2007. 25(2): p. 392-401を参照されたい。これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）、懸濁胚様体（EB）を形成するための超低付着プレートにおいて、イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）および15％の規定されたウシ胎仔血清（FBS）（Hyclone, Logan, Utah）、0.1mM非必須アミノ酸、2mM L-グルタミン、450μMモノチオグリセロール（Sigma, St. Louis, Mo.）、50U/mlペニシリン、および50μg/mlストレプトマイシンを含む分化培地中で、未分化hESCを培養した。手短に言えば、馴化培地とともにMATRIGEL（登録商標）タンパク質混合物（Corning, Inc.）でコーティングしたプレート上で培養したhESCを、2mg/mlディスパーゼ（Invitrogen, Carlsbad, Calif.）によって37℃で15分間処理して、コロニーをほぐした。次いで、コロニーを削りとり、胚様体形成のために、超低付着プレート（Corning Incorporated, Corning、N.Y.）に移した。
【０２３１】
実施例8. 栄養要求性の改変宿主細胞の選択
Cas9 RNPのエレクトロポレーション、ならびにゲノム遺伝子座の増幅およびサンガーシークエンシングによって評価したエクソン1にInDelを有するクローンの選択によって、hESCにおいてUMPS座位を破壊した。遺伝子編集のために、hESCを10μm ROCKインヒビター（Y-27632）で24時間処理してから、エレクトロポレーションを行った。ACCUTASE（登録商標）溶液（Life Technologies）を用いて、70〜80％コンフルエンスの細胞を収集した。150μg/mLのSpCas9濃度（Integrated DNA Technologies）および1:3のCas9:sgRNAのモル比で、反応あたり、500,000細胞を使用し、エレクトロポレーションは、4D NUCLEOFECTORシステム（Lonza）のNUCLEOCUVETTE商標ストリップの16ウェルにおいて、P3一次細胞溶液（Lonza）中で行った。エレクトロポレーションの直後に、10μM Y-27632を有する500μlのmTeSR商標培地（STEMCELL Technologies）を含む、MATRIGEL（登録商標）タンパク質混合物（Corning, Inc.）でコーティングした24ウェルプレートの1ウェルに、細胞を移した。編集から24時間後に培地を変え、48時間後にY-27632を除去した。
【０２３２】
サンガーシークエンシングによって、編集前のhESC集団、RNPエレクトロポレーション後のバルク集団、および選択されたクローンの遺伝子型を比較した。結果によって、sgRNA標的領域の周囲に10bpの欠失が示された。この領域中にシークエンストレースがないことによって、両アレルが改変されたことが示された。
【０２３３】
栄養要求性アッセイは、様々な濃度のウリジンを用いて4日間にわたって行った。UMPSKO/KO hESCを同様の密度で播種し、様々なウリジン濃度の存在下で培養してから4日目に、ウェルの顕微鏡写真を撮った。写真によって、細胞は2.5〜250μg/mlの存在下で増殖することが示されたが、ウリジンの添加なしでは増殖は示されなかった。様々なウリジン濃度の効果を評価するための、播種から4日目の生細胞の定量化を表15に示す。
【０２３４】
（表１５）生細胞数
2021522865.tif 000023
【０２３５】
ノックアウトされた遺伝子の生成物の外来的補給バージョンが細胞株の栄養要求性の表現型をレスキューすることを実証するために、対照と対比して様々な濃度の補給物の死滅曲線を作成した。
【０２３６】
5-FOAに対する抵抗性を評価するため、UMPS-WT細胞との共培養においてより容易に特定するために、セーフハーバー座位に組み込まれた発現カセットからGFPを発現させるようUMPS-KO hESCを遺伝子操作した。
【０２３７】
GFPの明るくかつ安定な発現を示すクローンを選択した。これらのUMPSKO/KO hESCをGFPを発現していないUMPSWT/WT細胞と混合し、様々な濃度の5-FOAの存在下で、蛍光活性化セルソーティング（FACS）解析によって追跡調査した。表16は、様々な5-FOA濃度で培養した後の生存可能なGFP+およびGFP-細胞の数を提供する。
【０２３８】
（表１６）生細胞数
2021522865.tif 000024
【０２３９】
以前の細胞タイプと同様に、経時的なGFP+細胞の濃縮が観察された。5-FOAなしの群で54.8％の細胞がGFP+であり、5-FOAありの群で95.0％の細胞がGFP+であった。この細胞タイプでは、UMPS-WT細胞はすべての試験した5-FOA濃度に感受性であり、UMPS-KO細胞は0.25μg/mlの濃度に十分耐性を示したが、表16に示すように、より高い濃度で増殖障害を示した。
【０２４０】
結論として、これらの結果は、代謝の重要な経路を効率的に操作して、白血病細胞株から多能性株および一次免疫細胞までの様々なヒト細胞で栄養要求性をもたらすことができることを裏づける。両UMPSアレルの遺伝子ターゲティングを使用して、ホモ接合ノックアウトを有する細胞集団を作製し、純化する、または5-FOAを使用してそうした細胞を濃縮することができる。複数のノックアウトおよび突然変異を有する細胞株を作製して、急速な多重ゲノム操作および選択（例えば、5つの栄養要求性突然変異および5つの抗生物質）を提供することもできる。
【０２４１】
実施例9. インビボ解析
インビトロで検証された栄養要求性ノックアウト細胞株は、インビボでも解析することができる。これらの細胞株は、ヒトにおいて、栄養要求性因子の毒性および生物学的利用能に制約される。遺伝子ノックアウト細胞株は、ヒトT細胞または任意の他のリンパ球から操作される。細胞株による条件付きインビトロ増殖は、栄養要求性因子の存在下で実証され、栄養要求性因子の非存在下では実証されない。前記因子について栄養要求性であること、および導入遺伝子を発現することができることが確認された改変された哺乳動物宿主細胞を、マウスモデルで投与することができる。栄養要求性因子補給物を摂取するマウスのみ、ヒトリンパ球の増殖を維持する。さらに、細胞増殖は、マウスの飼料源から栄養素を除去すると、インビボで止まる。
【０２４２】
実施例10. 遺伝子操作によるヒト細胞における栄養要求性の創出
バイオインフォマティクスツール（crispor.tefor.net）を使用して、spCas9について、UMPS遺伝子のエクソン1中の可能性のあるsgRNA標的部位を特定した。COSMID（crispr.bme.gatech.edu/）（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Majzner et al. Cancer Cell. 31, 476-485 (2017)を参照されたい）を使用して、推定上のオフターゲット（OT）効果を予測した。ウェブベースのバイオインフォマティクスプログラムCOSMID（crispr.bme.gatech.edu）を使用して、19個のPAM近位塩基に3個までのミスマッチまたは1個のミスマッチをともなう1bp欠失／挿入を許可して、ヒトゲノム（hg38）中の潜在的なオフターゲット部位を特定した。sgRNAを非常に類似したオフターゲット部位（COSMIDスコア＜1）の数でランク付けし、次いで、より高いスコアを有するOT部位の数によってランク付けした。すべての部位を増幅するためのプライマーもCOSMIDプログラムによって設計した。すべての部位を座位特異的PCRによって増幅し、第2ラウンドのPCRによってバーコード化し、等モル量でプールし、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Porteus, M. Mol. Ther. 19, 439-441 (2011)で以前に記載されたように、250bpのペアードエンドリードを使用して、Illumina MiSeqを使用してシークエンスした。得られたデータは、カスタムスクリプトindelQuantificationFromFastqPaired-1.0.1.pl(10)（https://github.com/piyuranjan/NucleaseIndelActivityScript/blob/master/indelQuantificationFromFastqPaired-1.0.1.pl）使用して解析した。
【０２４３】
最低数のOT部位を有する3つのsgRNAを特定し、活性のインビトロスクリーニングに使用した。これらのsgRNAを表17に示す。
【０２４４】
（表１７）最少のOT部位を有するsgRNA
2021522865.tif 000025
【０２４５】
sgRNAは、化学修飾を有して、Synthego Corporationから得た。2.5:1（sgRNA：タンパク質）のモル比でsgRNAをCas9タンパク質（IDT）と複合体化し、これを、4D-NUCLEOFECTOR商標システム（Lonza）を使用して活性化T細胞中にエレクトロポレーションした。4日後、細胞を収集し、製造業者のプロトコールに従ってQUICKEXTRACT商標DNA抽出キット（Epicentre）を使用してゲノムDNAを抽出した。特異的プライマー（表18）でsgRNA標的部位を増幅し、サンガーシークエンシング（MCLab, South San Francisco）によって増幅産物をシークエンスした。
【０２４６】
（表１８）プライマー
2021522865.tif 000026
【０２４７】
interference of CRISPR edits（ICE）およびICE-Dオンラインツール（ice.synthego.com）を使用して、配列に対してInDelの定量化を行った（図5A）。結果を表19に示す。
【０２４８】
（表１９）InDelの定量化
2021522865.tif 000027
【０２４９】
sgRNA「UMPS-7」をさらなる実験のために選択した。このsgRNAは、CRISPR編集の推論−不一致（inference of CRISPR edits - discordance：ICE-D）により検出可能であるが、従来のICEまたはTIDE解析（www.deskgen.com/landing/tide.html）では検出可能ではなかった、高比率の大きな（30bpより大きい）欠失を生じさせることにつながった。
【０２５０】
ウリジンまたはウリジン一リン酸（UMP）を添加せずに培養した場合に、UMPSノックアウトが差次的な細胞増殖につながるかどうかを評価するために、トリパンブルー染色を用いる自動細胞計数によって、培養中の細胞数を経時的に追った。UMPSノックアウトは、モックエレクトロポレーションした、または異なるゲノム遺伝子座（すなわち、CCR5）を標的とするCas9を使用してエレクトロポレーションした細胞と比較して、エレクトロポレーション後の2日目から、より少ない細胞数につながった（図5B）。細胞数を表20に示す。
【０２５１】
（表２０）InDelの定量化
2021522865.tif 000028
【０２５２】
これに対して、UMPまたはウリジンが高濃度（各250μg/ml）で補給された場合、UMPSノックアウト後に細胞増殖は障害されなかった（図5C）。mlあたりの生細胞数を表21に示す。
【０２５３】
（表２１）mlあたりの生細胞数
2021522865.tif 000029
【０２５４】
ゲノムレベルで結果を裏づけるために、実験の終わりにゲノムDNAを収集し、InDelを定量化した（図5D〜図5E）。図5Dは、5-FOAに曝露されていない細胞について、異なる培養条件におけるInDelの頻度を比較する。パーセンテージを表22に示す。
【０２５５】
（表２２）全体的なInDel頻度のパーセンテージ
2021522865.tif 000030
【０２５６】
図5Eは、5-FOAに曝露されていない細胞について、異なる培養条件におけるフレームシフトInDelの頻度を比較する。パーセンテージを表23に示す。
【０２５７】
（表２３）フレームシフトInDel頻度のパーセンテージ
2021522865.tif 000031
【０２５８】
全体的なInDelの頻度はウリジンまたはUMPなしの培養後にわずかに低減したが、フレームシフト（+3/-3の倍数ではない）につながるであろうInDelを定量化すると、代謝産物の添加がない細胞集団でInDelの低減があった。これは、エクソン1のフレームシフトInDelが理由でUMPSノックアウトを有する細胞は、UMPS野生型細胞またはリーディングフレームを保持していたエクソン1にInDelを有する細胞と比較して生存および増殖において不利であることを裏づける。
【０２５９】
次に、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Bak et al., , Elife 28:6 (2017)に記載されているアプローチを使用して、UMPS座位への2つの異なるマーカーの組み込みを可能にし、それによって、遺伝子発現を破壊し、tEGFRおよびtNGFRの共発現を介して両アレルの遺伝子ノックアウトを有する細胞の特定を可能にする、遺伝子ターゲティングコンストラクトを生成した（図6A）。本コンストラクトを、AAV2逆位末端配列（ITR）が隣接するプラスミド骨格を用いて、標準的な分子生物学方法を使用して、ギブソンアセンブリによってクローニングした。
【０２６０】
幹細胞および一次ヒト細胞のターゲティングのために、コンストラクトを組換えアデノ随伴ウイルスタイプ6（rAAV6）中にパッケージングして、二本鎖切断を生じさせた後にDNAを送達し、それによって、相同組換えを刺激して、導入遺伝子を組み込んだ。rAAV6の生成のためのトランスファープラスミドは、ギブソンアセンブリ（NEBUILDER（登録商標）HiFi DNA Assembly Master Mix、New England Biolabs Inc.）によって、導入遺伝子と標的とされたゲノム領域に相同な周囲のアームとを、フランキング逆位末端配列（ITR）に隣接するpAAV-MCSプラスミド（Agilent Technologies）の骨格にクローニングすることによって、作製した。相同性アームは、健康なドナーのゲノムDNAからPCRによって増幅した。表面マーカーの発現のために、tNGFRおよびtEGFR（Teixeira et al. Curr. Opin. Biotechnol. 55, 87-94 (2019)；Chen et al. Sci. Transl. Med. 3 (2011)を参照されたい；これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）を使用した。転写終結のために、ウシ成長ホルモン（bGH）由来のポリアデニル化配列を使用した。
【０２６１】
AAVの生成は、トランスファープラスミドとpdgm6パッケージングプラスミドの同時トランスフェクションによりHEK293T細胞中で行い、イオジキサノール勾配遠心分離によって精製した。HEK293細胞を、ポリエチレンイミンを用いて、pDGM6ヘルパープラスミドと、AAV2 ITRが隣接する相同性アーム間に導入遺伝子を保有するそれぞれのトランスファープラスミドとを、同時トランスフェクトした。48時間後、細胞を剥離し、上清から分離し、溶解した。懸濁液をベンゾナーゼ（Sigma Aldrich）で処理し、残屑をペレットにした。粗製のAAV抽出物をイオジキサノール密度勾配で精製し、次いで、1×104分子量カットオフ（MWCO）SLIDE-A-LYZER商標G2透析カセット（Thermo Fisher Scientific）中で、PBSに対して2サイクル、5％ソルビトールを含むPBSに対して1サイクルの透析に供した。AAVの力価は、QUICKEXTRACT商標DNA抽出キット（Epicentre）によってゲノムDNAを抽出し、以前に報告されたプライマーおよびプローブセット（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Jaen et al., Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 6, 1-7 (2017を参照されたい）を使用して、製造者のプロトコールに従って、ドロップレットデジタルPCR（Bio-rad）によってITRコピー数の絶対濃度を測定することによって、決定した。
【０２６２】
プラスミドとして使用されるこれらのドナーコンストラクトを用いるターゲティングは、骨髄性白血病細胞株K562（ATCC（登録商標）CCL-243商標）で最初に試験した。製造業者のプロトコールに従って、SF Cell Line 4D NUCLEOFECTOR商標システム（Lonza）で、2μgの各プラスミドを用いて前記細胞をエレクトロポレーションした。2種のマーカーをUMPS座位にターゲティングした場合、両方のマーカーの共発現を示す小さいが安定な細胞集団を特定した（図6B）。
【０２６３】
磁気ビーズ濃縮を使用して、表面マーカーEGFRおよびNGFRを発現する細胞を連続して濃縮した。磁気分離については、LSまたはMSカラム（Miltenyi）で、蛍光色素としてPEおよびAPCを有するNGFRおよびEGFRに対する抗体（Biolegend）、抗フィコエリトリン（PE MultiSortキット（Miltenyi）、および抗APCミクロビーズ（Miltenyi）を使用する、連続的な磁気ビーズソーティングによって、tNGFRとtEGFRの両方を発現する細胞を濃縮した。FACSソーティングは、FACS ARIA商標II SORPセルソーター（BD Biosciences）で行った。
【０２６４】
特定をより容易にするために、ホタルルシフェラーゼおよびTurboGFPを有する発現カセットがセーフハーバー座位（HBB）（図6C）にターゲティングされる、第2の編集工程を行った。K562細胞を6μg Cas9タンパク質（IDT）および3.2μg sgRNA（Trilink）を有する20ul SF cell line溶液に懸濁し、エレクトロポレーションした。K562細胞培地（10％ BGSを有し、GLUTAMAX商標およびペニシリン／ストレプトマイシンが補給されたRPMI）に再懸濁にした後、発現カセットを保有するrAAVを用いて細胞に形質導入した。これにより、フローサイトメトリーによってソーティングされる、3マーカー（tNGFR、tEGFR、およびGFP）すべてを発現する細胞集団がもたらされた。フローサイトメトリーの結果を図6Dに示す。各群のGFP+細胞のパーセントを図6Fに示す。
【０２６５】
ソーティングされたUMPSKO/KO/GFP+細胞集団を、それらの栄養要求性および5-FOAに対するそれらの抵抗性を評価するアッセイに供した。細胞を同数の試料に分け、様々な濃度のウリジンの存在下で、またはウリジンなしで培養した。高濃度のウリジン（250μg/ml）の補給で、細胞は急速に拡大した。細胞増殖は低濃度（25μg/ml）で阻害され、同時に、細胞数は、低濃度またはウリジンなしで減少した（図6E）。mlあたりの細胞の数を表24に示す。
【０２６６】
（表２４）1日目から8日目のmlあたりの細胞の数
2021522865.tif 000032
【０２６７】
Nalm6細胞を用いて同じ実験を行い、培養中のウリジン濃度への同様の依存が観察され、これは、インタクトなUMPSを有する細胞については明らかでなかった。表25は、様々なウリジン濃度で培養したUMPSKO/KO Nalm6細胞の増殖曲線のデータを提供する。野生型細胞については、ウリジン補給処理を受けた群と受けなかった群の間で差異は観察されなかった。
【０２６８】
（表２５）UMPSKO/KO Nalm6細胞の細胞数
2021522865.tif 000033
【０２６９】
ウリジンが補給された群、特に25μg/mlおよび250μg/mlのウリジンが補給された群において、著しく大きな増殖が観察された。
【０２７０】
5-FOAに対するUMPSノックアウト細胞の抵抗性を決定するために、精製したUMPSKO/KO/GFP+ K562細胞をUMPSWT/WT/GFP陰性K562細胞と等比で混合した。細胞をウリジンおよび様々な濃度の5-FOAの存在下で培養した（図6F）。表26は、異なる培養条件下でのGFP陽性（+）細胞のパーセンテージを提供する。
【０２７１】
（表２６）GFP+細胞のパーセンテージ
2021522865.tif 000034
【０２７２】
図6Gは、様々な量の5-FOAにおけるGFP+細胞についての増殖曲線を示す。値を表27に示す。
【０２７３】
（表２７）μlあたりのGFP+細胞の数
2021522865.tif 000035
【０２７４】
使用したすべての濃度で、UMPSKO/KO細胞の割合が経時的に増大した。UMPノックアウトを有する細胞は、10および100μg/mlの5-FOAの濃度で十分に増殖したが、最高濃度はそれらの細胞増殖を遅くした。
【０２７５】
実施例11. UMPSの編集はT細胞において栄養要求性をもたらし、5-FOAによる選択を可能にする
フィコール密度勾配およびMACSネガティブ選択（MiltenyiT細胞濃縮キット）を使用して、Stanford Blood Center（Palo Alto, CA）から得たバフィーコートからT細胞を単離した。5％ヒト血清（Sigma）および100IU/ml IL-2が補給されたX-VIVO15培地で、T細胞を培養した。
【０２７６】
エレクトロポレーションの前に、当技術分野においてDynabeadsとも称される抗CD3/-CD28ビーズ（STEMCELL Technologies）およびIL-2（100IU/ml）でT細胞を3日間活性化した。エレクトロポレーションの前に、磁気固定化によって活性化ビーズを除去した。エレクトロポレーションの前に、K562細胞およびNalm6細胞を対数増殖期に維持した。sgRNAは、両端の3末端ヌクレオチドに2’-O-メチル-3’-ホスホロチオエート修飾を有して、Synthegoから得た（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Bonifant, et al. Mol. Ther. - Oncolytics. 3, 16011 (2016)を参照されたい）。
【０２７７】
健康なドナーからCD3+T細胞を単離し、該細胞を活性化した後に、2つの選択マーカーであるtEGFRおよびtNGFRを、一次ヒトT細胞のUMPS座位にターゲティングした。
【０２７８】
大規模なsgRNAは、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）精製によって得た。ハイフィデリティー（HiFi）Cas9タンパク質は、IDTから購入した。2.5:1（sgRNA：タンパク質）のモル比でsgRNAをHiFi spCas9タンパク質（IDT）と複合体化し、16-キュベットストリップ中で4D-NUCLEOFECTOR商標システム（Lonza）を使用して、細胞株または活性化T細胞にエレクトロポレーションした。
【０２７９】
ゲノムの特定の座位への導入遺伝子のターゲティングのために、記載されるように細胞を編集し、エレクトロポレーション直後に80μlの培地に再懸濁し、次いで、5000vg/細胞の感染多重度（MOI）での形質導入のために、rAAV6とともにインキュベートした。8〜12時間後、懸濁液を培地で希釈して、mlあたり0.5〜1E6細胞の細胞濃度にした。HBB座位のターゲティングのために、以前に特徴づけされた、標的配列
2021522865.tif 000036
を有するsgRNAを使用した（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Teixeira et al., Curr. Opin. Biotechnol. 55, 87-94 (2019)を参照されたい）。Cas9およびsgRNAをRNPに複合体化して、P3緩衝液に再懸濁したT細胞と混合し、EO-115プログラムを使用する4D NUCLEOFECTOR（商標）システム（Lonza）でエレクトロポレーションした。ヒトT細胞は、RNP/rAAV6遺伝子ターゲティング方法を使用して両アレルのUMPSノックアウトを有する細胞の集団を作製するために、Bak et al., 2018に記載されているように低い毒性で高い編集頻度を可能にすることが当技術分野において公知である。両方のマーカーを発現する細胞を同時に発現させた。エレクトロポレーションあたりの細胞数に従って、以下のエレクトロポレーション溶液およびプログラムを使用した：FF-120プログラムを使用するSF cell line溶液中の2E5 K562細胞、SF cell line溶液およびCV-104プログラムの2E5 Nalm6細胞、ならびにP3溶液中の1E6活性化T細胞。CCR5座位で編集した対照については、sgRNAのゲノム標的配列は
2021522865.tif 000037
であった。エレクトロポレーション後、細胞を培地に再懸濁し、rAAVを添加した。
【０２８０】
ターゲティングから3日後、EGFR+/NGFR+細胞の集団を特定し、高ウリジン濃度の存在下で抗CD3/-CD28磁気ビーズと共培養することによって拡大させた。AAVからのエピソーム発現とは対照的に安定な組み込みを示すより明るい発現により、EGFR+/NGFR+細胞の集団をAAVのみが与えられた細胞から区別した。
【０２８１】
拡大後、フローサイトメトリーを使用してEGFR+/NGFR+集団をソーティングして、両アレルのUMPSノックアウトを有するT細胞の集団を得た。図7Aに結果を示す。
【０２８２】
これらのT細胞を栄養要求性アッセイにも供し、これらの細胞を5-FOAで選択する可能性を試験した。抗CD3/-CD28ビーズおよび様々な濃度のウリジンの存在下で細胞を培養する場合、細胞はウリジンの存在下でのみ増殖し、これにより、その栄養要求性細胞増殖が裏づけられた。より高いウリジン濃度はより高い増殖速度につながった。UMPS KOまたは野生型（WT）T細胞の栄養要求性増殖を図7Bおよび表28に示す。
【０２８３】
（表２８）mlあたりの生細胞
2021522865.tif 000038
【０２８４】
表29は4日目の細胞集団の相対的生存率を示す。
【０２８５】
（表２９）mlあたりの生細胞
2021522865.tif 000039
【０２８６】
5-FOAでUMPSKO/KO細胞を選択する可能性を評価するために、ソーティングした細胞を異なる追跡用色素で標識されている野生型細胞と混合し、5-FOAの存在または非存在下で培養した。試料の一部では、初日（0日目）のみ5-FOAを添加したが、別の群では、5-FOAを毎日補給した。表30および図7Cは、5-FOAありまたはなしで培養した場合の、UMPS-KO T細胞（eFluor670で標識されている）のパーセント（％）を経時的に示す。
【０２８７】
（表３０）混合細胞集団中のUMPSKO/KO細胞のパーセント
2021522865.tif 000040
【０２８８】
独立t検定を使用して、統計的に有意な差について群を比較した。5-FOAで処理した群間で統計的有意性は観察されなかったが、未処理群と比較して、処理群のUMPS-KO T細胞のパーセントで有意な増大があった。
【０２８９】
両方の5-FOA処理群で、UMPSノックアウトを有する細胞の割合が経時的に増大し、これは、野生型細胞と比較して化合物に対するそれらの抵抗性の増大を示し、5-FOAによる1回限りの処理が、数日にわたって改変細胞の濃縮をもたらすのに十分であったことを示す。表30のデータは、5-FOAがUMPSノックアウトを有するT細胞を選択することを示す。
【０２９０】
実際、5-FOAを用いた、UMPSノックアウトT細胞と野生型T細胞の混合集団の培養のFACS解析。UMPS-KO T細胞はeFluor670で標識し、野生型細はカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）で標識した。結果は、初日（0日目）にのみ5-FOAで処理した群の0日目では、43.7％の細胞がUMPS-KO T細胞であり、一方56.0％が野生型細胞であることが観察された。5-FOAで処理していない対照群の0日目では、47.7％の細胞がUMPS-KO T細胞であり、52.1％が野生型細胞であった。5-FOAが毎日補給された群の3日目では、74.0％の細胞がUMPS-KO T細胞であり、一方25.8％は野生型細胞であった。5-FOAで処理していない対照群の3日目では、43.1％の細胞がUMPS-KO T細胞であり、56.4％が野生型細胞であった。
【０２９１】
実施例12. 細胞療法
多能性幹細胞を遺伝子操作して、外部から供給される因子に依存させた。外部から供給される化合物の休薬によって奇形腫形成を予防する安全性システムを評価するために、奇形腫形成アッセイとして、これらの細胞を免疫不全NSGマウスに注射した。使用した細胞株は、iPSC：iLiF3、iSB7-M3（出所：Nakauchi Lab at Stanford University）、およびhES：H9である。
【０２９２】
実施例13. 腓腹筋における奇形腫形成アッセイ
多能性細胞に由来する奇形腫を安全スイッチが根絶することができるかどうかを明らかにするために、遺伝子組換されたiPSCまたはES細胞（または対照細胞）をマウスに移植した。細胞は、インビボ検出のために、ルシフェラーゼを発現した。1×106個のUMPS操作hESCを100μlのMATRIGEL（登録商標）タンパク質混合物（Corning, Inc.）およびPBS混合液に再懸濁し、これを麻酔をかけたNSGマウスの右後肢の腓腹筋に注射した。腫瘍サイズの測定によって、および生物発光イメージングによって、腫瘍形成についてマウスを追跡調査した。腫瘍の確立後、ウリジントリアセテート（UTA）の休薬が腫瘍退縮につながるかどうかを試験した。エンドポイント（1.7cmを超える腫瘍サイズ、またはマウスの活動の障害、そうでなければ24週）で、組織学的解析のために、腫瘍を外植し、固定した。
【０２９３】
実施例14. K562異種移植モデル
K562異種移植アッセイのために、PBSで1:1希釈したMATRIGEL（登録商標）タンパク質混合物（Corning, Inc.）中に再懸濁した1×106個のK562細胞を6〜12週齢の雄のNOD SCIDガンママウス（NSG）マウスに麻酔下で移植した。すべての動物は、機関の指針に従って維持および取り扱い、実験プロトコールは、Stanford大学の実験動物管理に関する管理委員会（Administrative Panel on Laboratory Animal Care）によって承認された。
【０２９４】
UMPSKO/KOの操作された細胞の増殖を、動物に高用量のウリジンを供給することによって、モデル生物への移植後にインビボで解析した。ウリジンは、遺伝性オロト酸尿症の治療のために、およびフルオロピリミジン過剰投与からの毒性のためにヒトで使用されている（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、van Groeningen, et al. Ann. Oncol. 4, 317-320 (1993)；Becroft, et al. J. Pediatr. 75, 885-91 (1969)を参照されたい）が、これは、消化管で吸収されにくく、肝臓で壊される（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Gasser, et al. Science. 213, 777-8 (1981)を参照されたい）。その生物学的利用能は、ウリジントリアセテート（UTA、PN401）をプロドラッグとして投与することにより高めることができ、これは、上記の適応症についてFDA承認を得ている（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Weinberg et al., PLoS One. 6, e14709 (2011)；Ison et al., Clin. Cancer Res. 22, 4545-9 (2016)を参照されたい）。ヒトおよびマウスモデルでは、これは、ウリジン血清レベルを10倍より大きく効果的に増大させることができる（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Garcia et al., Brain Res. 1066, 164-171 (2005); FDA, “XURIDEN - Highlights of prescribing information.” (2015)、（https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2015/208169s000lbl.pdfで入手可能）を参照されたい）。
【０２９５】
ホタルルシフェラーゼ（FLuc）を発現する以前に操作したUMPSKO/KO K562細胞株をNSGマウスにおける異種移植モデルで使用した。野生型UMPSを有する対照K562細胞は、生物発光イメージングによって腫瘍をモニターすることができる両方のUMPS遺伝子型に対して比較可能な異種移植モデルを確立するために、FLucおよびGFPを有する発現カセットをセーフハーバー座位にターゲティングすることによって操作した。Cas9 RNPは、SFFVプロモーターの制御下でFLuc-2A-GFP-ポリAカセットを保有するrAAV6によって形質導入されたガイドRNAおよびDNAドナーテンプレートを用いて、HBB座位のエクソン1にターゲティングされる。K562細胞のターゲティングから4日後にFACS解析を行って、GFP+集団のソーティング前のGFP発現を評価した。AAVのみを投与した対照群では、1.61％の細胞がGFP+であり、および13.4％の細胞。
【０２９６】
通常のマウス飼料、またはマウスにおいて血清レベルを増大させ、一方で良好な耐容性が示されることが以前に示された量（Garcia et al., 2005を参照されたい）である8％（w/w）UTAで強化された特注飼料のいずれかをマウスに与えた。UTAはAccela ChemBio Inc.から得て、Tekladマウス飼料（Envigo）に8％（w/w）になるように添加し、使用前に飼料を照射した。対照飼料は、（照射した）標準的なマウス飼料Teklad 2018であった。
【０２９７】
あるいは、飼料にウリジン一リン酸を補給した。これらの細胞は、局所（後肢）で、または静脈内（iv）注射を介して全身的に、免疫無防備状態マウスに植え付けることができる。
【０２９８】
UMPSKO/KO K562細胞または対照細胞を皮下に移植し、生物発光イメージングで毎週観察した。K562細胞の発光イメージングを、125mg/kg D-ルシフェリン（PerkinElmer）の腹腔内（ip）注射から5分後に、IVISスペクトラムイメージングシステム（PerkinElmer）で行った。皮下異種移植の後に、K562細胞について記載された局所的増殖が観察された（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Sontakke, et al. Stem Cells Int. 2016, 1625015 (2016)を参照されたい）。マウスは、瀕死になった場合、または最長腫瘍直径が1.75cmを超えた場合に、安楽死させた。生着が失敗した1匹のマウスを除いては、通常の飼料またはUTAが補給された飼料の両方を用いて、UMPS野生型細胞で腫瘍量の増大が観察された。これに対して、UMPSKO/KO K562由来腫瘍の発光は、8％UTAを与えたマウスでのみ増大することが観察されたが、腫瘍量は、UTAがない飼料を与えたマウスの大部分で安定なままであることが観察された。
【０２９９】
インビボでのUMPSKO/KO操作hES細胞の栄養要求性細胞増殖も解析した。奇形腫を形成するのに失敗した1匹のマウスを除いては、NSGマウスの後肢に多能性細胞を注射した後に、補給したUTAを与えたすべてのマウスで腫瘤が観察された。細胞の注射から7週後にマウスを安楽死させた時に、UTAを与えたマウスの注射領域に形成された大きな奇形腫が採取され、一方、通常の飼料のマウスでは、奇形腫は目に見えたが著しく小さく、表31に示すように重量が少なかった。動物が死亡した、または屠殺された（注射後最も遅くて16週）時に骨髄を解析した。表31は、奇形腫重量の定量化の結果を示す（群間ですべてのマウスを比較する独立T検定によってp<0.05、生着なしのマウスを打ち切る場合p<0.01）。群は、Prism7（GraphPad）を使用して示される統計的検定によって比較した。
【０３００】
（表３１）奇形腫重量
2021522865.tif 000041
【０３０１】
インビボの結果は、2.5μg/ml（=10nmol/ml）のウリジン濃度で低減するが、完全には抑止されないUMPSKO/KO細胞の増殖を示した以前のインビトロの結果と矛盾がなかった。この濃度は、8〜11.8nmol/mlに及ぶと文献で報告されているマウスの血清ウリジンレベルに相当する（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Karle, et al. Anal. Biochem. 109, 41-46 (1980)を参照されたい）。
【０３０２】
全体として、これらの結果は、代謝的栄養要求性を操作して、インビトロとインビボの両方でヒト細胞の細胞増殖に関して制御メカニズムを加えることができる証拠である。
【０３０３】
実施例15. GvHDモデル
安全性システムが異種GvHDの副作用を予防することができるかどうかをマウスモデルで明らかにする。照射した免疫無防備状態マウスに遺伝子改変ヒトT細胞または対照T細胞を移植し、マウスにUTAを供給するかまたは供給しない。体重減少またはGvHDの他のサインについてマウスを評価し、疾患の確立（遅くとも16週）の際に屠殺する。続いて細胞を生物発光イメージングにかけ、採血する。
【０３０４】
実施例16. リソソーム蓄積症（LSD）における酵素補充療法
UMPS座位に組み込まれる関心対象の酵素をコードするように多能性幹細胞を遺伝子操作して、これを外部から供給されるウリジンに依存させる。LSDを治療するために、特定の酵素について酵素補充療法を必要としている個体に、ウリジンとともにこれらの細胞を含む組成物を投与して、個体で不足している酵素の発現を促進する。ウリジンの投与の服用およびタイミングは酵素の所望の発現に基づいて調整される。
【０３０５】
ある場合には、HLC座位で関心対象の酵素をコードするように細胞を遺伝子操作して、これを外部から供給されるビオチンに依存させる。
【０３０６】
本明細書において本開示の態様を示し、説明してきたが、そのような態様は例示目的としてのみ提供されることが当業者に明白であろう。多数の変形、変更、および置換が、本開示を逸脱することなく、今や当業者に見出されるであろう。本開示の主題の実施において、本明細書に記載される本開示の態様に対する様々な代替案を用いることができることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本明細書の開示の範囲を定義すること、ならびにこれらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物が特許請求の範囲よってカバーされることが意図される。
【図１】
2021522865.tif 000043
【図２Ａ】
2021522865.tif 000044
【図２Ｂ】
2021522865.tif 000045
【図２Ｃ】
2021522865.tif 000046
【図２Ｄ】
2021522865.tif 000047
【図２Ｅ】
2021522865.tif 000048
【図２Ｆ】
2021522865.tif 000049
【図３Ａ】
2021522865.tif 000050
【図３Ｂ】
2021522865.tif 000051
【図３Ｃ】
2021522865.tif 000052
【図４Ａ】
2021522865.tif 000053
【図４Ｂ】
2021522865.tif 000054
【図４Ｃ】
2021522865.tif 000055
【図４Ｄ】
2021522865.tif 000056
【図５Ａ】
2021522865.tif 000057
【図５Ｂ】
2021522865.tif 000058
【図５Ｃ】
2021522865.tif 000059
【図５Ｄ】
2021522865.tif 000060
【図５Ｅ】
2021522865.tif 000061
【図６Ａ】
2021522865.tif 000062
【図６Ｂ】
2021522865.tif 000063
【図６Ｃ】
2021522865.tif 000064
【図６Ｄ】
2021522865.tif 000065
【図６Ｅ】
2021522865.tif 000066
【図６Ｆ】
2021522865.tif 000067
【図６Ｇ】
2021522865.tif 000068
【図７Ａ】
2021522865.tif 000069
【図７Ｂ】
2021522865.tif 000070
【図７Ｃ】
2021522865.tif 000071
【配列表】
2021522865000001.app
【国際調査報告】
2021522865.tif 000072
2021522865.tif 000073
2021522865.tif 000074
2021522865.tif 000075