(57)【要約】実施態様において、本発明は、パーキンソン病の処置の為の手段及び方法に関する。幾つかの態様において、該手段及び方法は、任意的にＧＵＣＹ２Ｃアゴニストとともに、ＰＤＥ２阻害剤、ＰＤＥ１１阻害剤又はそれらの組み合わせに関与する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
パーキンソン病を有する個体の処置における使用の為の、ホスホジエステラーゼ１１（ＰＤＥ１１）阻害剤、ホスホジエステラーゼ２（ＰＤＥ２）阻害剤又はそれらの組み合わせ。
【請求項２】
前記処置が、グアニル酸シクラーゼ２Ｃ受容体（ＧＵＣＹ２Ｃ）アゴニストを含む、請求項１に記載の使用の為の、ＰＤＥ１１阻害剤、ＰＤＥ２阻害剤又はそれらの組み合わせ。
【請求項３】
前記個体が、段階１、段階２、段階３又は段階４のパーキンソン病を有する、請求項１又は２に記載の使用の為の、ＰＤＥ１１阻害剤、ＰＤＥ２阻害剤又はそれらの組み合わせ。
【請求項４】
前記ＰＤＥ２阻害剤が、ＥＨＮＡ  （エリスロ−９−（２−ヒドロキシ−３−ノニル）アデニン）；ＢＡＹ  ６０−７５５０  （２−［３，４−ジメトキシフェニル）メチル］−７−[（２Ｒ，３Ｒ）−２−ヒドロキシ−６−フェニルヘキサン−３−イル］−５−メチル−１Ｈ−イミダゾ［５，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−４−オン）；ＰＤＰ  （９−（６−フェニル−２−オキソヘキサ−３−イル）−２−（３，４−ジメトキシベンジル）−プリン−６−オン；又はオキシインドール  （２，３−ジヒドロインドール−２−オン）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用の為の、ＰＤＥ１１阻害剤、ＰＤＥ２阻害剤又はそれらの組み合わせ。
【請求項５】
前記ＰＤＥ１１阻害剤が、ＢＣ１１−１５；ＢＣ１１−１９；ＢＣ１１−２８；ＢＣ１１−３８；ＢＣ１１−３８−１；ＢＣ１１−３８−２；ＢＣ１１−３８−３；又はＢＣ１１−３８−４である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用の為の、ＰＤＥ１１阻害剤、ＰＤＥ２阻害剤又はそれらの組み合わせ。
【請求項６】
前記ＧＵＣＹ２Ｃアゴニストが、グアニリン又はその機能的誘導体である、請求項２〜５のいずれか１項に記載の使用の為の、ＰＤＥ１１阻害剤、ＰＤＥ２阻害剤又はそれらの組み合わせ。
【請求項７】
前記ＧＵＣＹ２Ｃアゴニストが、配列NDDCELCVNVACTGCLL；NDCCELCCNVACTGCL；NDDCELCVNVVCTGCL；QEECEL[Abu]INMACTGY；QEECELCINMACTGCL；NTFYCCELCCNPACAGCY；NTFYCCELCCAPACTGCY；又はNTFYCCELCCNPaCAGCYを含む、請求項２〜６のいずれか１項に記載の使用の為の、ＰＤＥ１１阻害剤、ＰＤＥ２阻害剤又はそれらの組み合わせ。
【請求項８】
ドーパミン作動性細胞によるヒトチロシンヒドロキシラーゼの位置４０でのセリン残基（Ｓ４０  Ｔｈ）のリン酸化を増加させる方法であって、該細胞を、ＰＤＥ１１阻害剤、ＰＤＥ２阻害剤又はそれらの組み合わせと接触させることを含む、前記方法。
【請求項９】
ドーパミン作動性細胞によるドーパミン産生を増加させる方法であって、該細胞を、ＰＤＥ１１阻害剤、ＰＤＥ２阻害剤又はそれらの組み合わせと接触させることを含む、前記方法。
【請求項１０】
前記細胞を、ＧＵＣＹ２Ｃアゴニストと接触させることを更に含む、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
パーキンソン病を有する個体又は該疾病を発生する危険性がある個体の処置の方法であって、ＰＤＥ１１阻害剤、ＰＤＥ２阻害剤又はそれらの組み合わせを、上記処置を必要とする該個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項１２】
配列NDDCELCVNVACTGCLL；NDCCELCCNVACTGCL；NDDCELCVNVVCTGCL；QEECEL[Abu]INMACTGY；QEECELCINMACTGCL；NTFYCCELCCNPACAGCY；NTFYCCELCCAPACTGCY；又はNTFYCCELCCNPaCAGCYを含むＧＵＣＹ２Ｃアゴニスト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドーパミン作動性細胞によるドーパミンの産生を誘発及び／又は高める為の手段及び方法に関する。本発明はまた、パーキンソン病を有する個体又はこの疾病を発症する危険性がある個体の処置の為の手段及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病（ＰＤ：parkinson’s  disease）は、アルツハイマーの病状の後に最もよく見られる神経障害である。その主要な特徴は、黒質緻密部（ＳＮｐｃ：substantia  nigra  pars  compacta）におけるドーパミン作動性ニューロンの進行性変性である（Kalia  LV  and  Lang  AE,  2015）。この解剖学的領域は、発症の間に中脳から生じ、最終的に、脳基底核が構成される前脳区域の１つである背側線条体の方向に突起を作り出す（Smidt  MP  and  Burbach  JP,  2007；Baladron  J  and  Hamker  FH,  2015）。両方の構造の間の機能的接合（functional  connectivity）は、黒質線条体路と広く称され、ドーパミンの放出に依存する（Ikemoto  S  et  al.,  2015）。この神経伝達物質は、黒質遠心路によって放出された後に線条体のシナプス後受容体と相互作用し、最終的に運動制御を調節する。従って、該ＳＮｐｃにおけるニューロンの顕著な喪失があるＰＤ患者において、結果として生じる線条体へのドーパミン放出の欠如は、運動症状の開始をもたらす。古典的には、これらのパーキンソン病の徴候は、動作緩慢又はゆっくりとした身体の動き、安静時の振戦、筋硬直及び歩行障害に分類されることができる（Kalia  LV  and  Lang  AE,  2015）。
【０００３】
それにもかかわらず、運動障害だけは、該ＳＮｐｃにおける変性が進行した段階（advanced  stage）において生じる場合に現れ、そして、それらは、多くの場合、嗅覚機能障害、うつ状態又は便秘を包含する一連の非運動症状によって先行される（Mahlknecht  P  et  al.,  2015）。これらの初期症状の生理学的な原因は完全に理解されておらず、少なくとも部分的には、黒質線条体路の外側のネットワークの機能不全及びドーパミン以外の神経伝達物質の不均衡によって媒介されると考えられている（Kalia  LV  and  Lang  AE,  2015）。興味深いことに、前駆期の発生と運動徴候との間の潜伏期は、１０年超である可能性がある（Postuma  RB  et  al.,  012）。それ故に、プレモーター期間（premotor  period）は、医師に、該疾病の更なる発症を防ぐ為に利用される可能性がある一時的なウィンドウを提供するだろう。残念ながら、ＰＤに対処する為にこの戦略を用いようとする場合に、２つの主な欠点が生じる：（１）非運動症状は、臨床眼（clinical  eye）には微妙であり、この特定の疾病に必ずしも関連しない、及び（２）ＰＤの分子的基礎の現在の理解は、完全には程遠く、該障害の基礎的病因を考慮することはめったになく、多くの場合、環境的因子及び遺伝的因子の複雑な相互作用を認める（Kalia  LV  and  Lang  AE,  2015；Mahlknecht  P  et  al.,  2015）。
【０００４】
ドーパミン生合成は、複雑であり、且つ様々な他の生合成経路と統合される。ドーパミンは、２つの反応でＬ−チロシンから生成される。酵素であるチロシンヒドロキシラーゼ（Ｔｈ：tyrosine  hydroxylase）は、Ｌ−チロシンをＬ−ドーパに転化し、そして芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ：aromatic  L-amino  acid  decarboxylase）は、Ｌ−ドーパを転化して、ドーパミンを形成する（Clarke  CE,  2004）。両方の酵素はまた、２つの追加のカテコールアミン（すなわち、ノルエピネフリン及びエピネフリン）の合成に関与することが知られており、一方、後者だけがセロトニン産生と共有される（Purves  D  et  al.,  2001）。加えて、神経伝達物質の量によって調節されるネガティブフィードバックループ（negative  feedback  loop）は、該酵素の活性を負に調節する。その上、Ｔｈは、合成経路における律速段階（rate  limiting  step）として機能する。ドーパミンは、Ｔｈの触媒領域と相互作用して、その活性を低下させる（Dunkley  PR  et  al.,  2004）。ドーパミンはまた、分解に付される。酵素であるカテコール−Ｏ−メチル基転移酵素（ＣＯＭＴ：catechol-O-methyltransferase）及びモノアミン酸化酵素Ｂ（ＭＡＯＢ：monoamine  oxidase  B）は、ドーパミンの分解に関与し、且つそれをホモバニリン酸に転化する（Clarke  CE,  2004）。
【０００５】
パーキンソン病の為の最も一般的な薬物は、レボドパ；末梢ＡＡＤＣ阻害剤（例えば、カルビドパ）と組み合わせられたレボドパ；ＭＡＯＢ阻害剤、及びＣＯＭＴ阻害剤である（Kalia  LV  and  Lang  AE,  2015）。これらの医薬は、経口で摂取されることができ、且つ中枢神経系（ＣＮＳ：central  nervous  system）に達することができないカルビドパを除いて、血液脳関門（ＢＢＢ：blood-brain  barrier）を通過することが可能である（Ahlskog  JE  et  al.,  1989；Gershanik  OS,  2015）。これらの処置の欠点は、それらが（重度の）副作用を示すことである。これらは、とりわけ、該薬物が十分に特異的ではないという事実によって、引き起こされると考えられている。
【０００６】
例えば、該薬物が、ＳＮｐｃの外側のドーパミン作動性ニューロン、例えば、腹側被蓋野又は一部の視床下核中のドーパミン作動性ニューロン、に影響を及ぼすことは知られている（Upadhya  MA  et  al.,  2016）。これらの標的細胞におけるドーパミン産生の刺激は、処置の副作用をもたらすことができる。その上、ドーパミン生合成酵素はまた、ドーパミン以外の化合物の産生にも関与する。レボドパ処置は、これらの他の化合物の合成を妨げることができ、且つノルアドレナリン作動性ニューロン及びセロトニン作動性ニューロンにおけるオフターゲット効果（off-target  effects）を発揮することができる（Carta  M  et  al.,  2007；Navailles  S  et  al.,  2014）。
【０００７】
ＰＤを標的にする利用可能な薬物の非特異性、は回避できない副作用をもたらし、レボドパ誘発ジスキネジアが最も顕著である。経口投与されたレボドパは、ＢＢＢを通過することができ、そして脳に一旦入ると、背側線条体のドーパミン作動性末端内に取り込まれることができる。そこで、それは、ＡＡＤＣによってドーパミンに更に転化され、トランスポーターｖＭＡＴ２によって小胞内に移入され、そして最終的にシナプス間隙に放出される。レボドパ処置のこの結果は、ＰＤを有する患者におけるその有益な効果を説明している。しかしながら、レボドパはまた、ＡＡＤＣが等しく存在する線条体のセロトニン作動性末端内に取り込まれることができる。ドーパミン、すなわち「偽セロトニン」が、レボドパ投与に応じて、活性依存様式で、合成され、そして更にセロトニン作動性末端から放出されることができることが報告されている。６−ＯＨＤＡ誘発性パーキンソン病ラットにおいて行われた的確な実験において、レボドパ由来のジスキネジアは、背側線条体における該セロトニン作動性末端を除去することによって、又はセロトニン自己受容体のアゴニストにより神経伝達物質放出を抑制することによって、無効にされることができた（Carta  M  et  al.,  2007）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
パーキンソン病の処置の為の手段及び方法を提供することが本発明の目的である。ドーパミンの内因性産生を増加させる方向に向けることで、該処置は、レボドパでの現在の処置よりも少ない副作用が予想される。パーキンソン病の処置の為に、既知の化合物を使用すること及び新規の化合物を特定することが本発明の更なる目的である。本発明の処置は、パーキンソン病の初期段階（early  stages）において特に有効である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、パーキンソン病を有する個体の処置における使用の為の、ホスホジエステラーゼ２（ＰＤＥ２：phosphodiesterase  2）阻害剤、ホスホジエステラーゼ１１（ＰＤＥ１１：phosphodiesterase  11）阻害剤又はそれらの組み合わせを、任意的にグアニル酸シクラーゼ２Ｃ受容体（ＧＵＣＹ２Ｃ：guanylate  cyclase  2C  receptor）アゴニストと一緒に、提供する。
【００１０】
本発明は、パーキンソン病を有する個体の処置における使用の為の、ＧＵＣＹ２Ｃアゴニスト、及びＰＤＥ２阻害剤、ＰＤＥ１１阻害剤又はそれらの組み合わせからなる群から選択される化合物を更に提供する。
【００１１】
本発明は、パーキンソン病を有する個体の処置における使用の為の、グアニル酸シクラーゼ２Ｃ受容体（ＧＵＣＹ２Ｃ）アゴニスト、並びにＰＤＥ２阻害剤、ＰＤＥ１１阻害剤、又はＰＤＥ２阻害剤及びＰＤＥ１１阻害剤の組み合わせを提供する。
【００１２】
該個体は、段階１度、段階２、段階３又は段階４のパーキンソン病を有することができる。
【００１３】
該ＰＤＥ２阻害剤は好ましくは、ＥＨＮＡ（エリスロ−９−（２−ヒドロキシ−３−ノニル）アデニン）、ＢＡＹ  ６０−７５５０、ＰＤＰ（９−（６−フェニル−２−オキソヘキサ−３−イル）−２−（３，４−ジメトキシベンジル）−プリン−６−オン、ＩＣ９３３又はオキシインドールである。
【００１４】
該ＰＤＥ１１阻害剤は好ましくは、ＢＣ１１−１５；ＢＣ１１−１９；ＢＣ１１−２８；ＢＣ１１−３８；ＢＣ１１−３８−１；ＢＣ１１−３８−２；ＢＣ１１−３８−３；又はＢＣ１１−３８−４である。
【００１５】
該ＧＵＣＹ２Ｃアゴニストは好ましくは、グアニリン、リンホグアニリン若しくはウログアニリン、又はグアニリン、リンホグアニリン若しくはウログアニリンの機能的誘導体である。
【００１６】
ドーパミン作動性細胞によるヒトチロシンヒドロキシラーゼの位置４０でのセリン残基（Ｓ４０  Ｔｈ）のリン酸化を増加させる方法であって、該細胞を、ＰＤＥ２阻害剤、ＰＤＥ１１阻害剤又はそれらの組み合わせと接触させることを含む、上記方法がまた提供される。
【００１７】
ドーパミン作動性細胞によるドーパミン産生を増加させる方法であって、該細胞を、ＰＤＥ２阻害剤、ＰＤＥ１１阻害剤又はそれらの組み合わせと接触させることを含む、上記方法が更に提供される。
【００１８】
該方法は、上記細胞を、ＧＵＣＹ２Ｃアゴニストと接触させることを更に含むことができる。
【００１９】
本発明は、パーキンソン病を有する個体又は該疾病を発生する危険性がある個体の処置の方法であって、ＰＤＥ２阻害剤、ＰＤＥ１１阻害剤又はそれらの組み合わせを、上記処置を必要とする該個体に投与することを含む、上記方法を更に提供する。好ましい実施態様において、該方法は、ＧＵＣＹ２Ｃアゴニストを該個体に投与することを更に含む。
【００２０】
本発明は、パーキンソン病を有する個体の処置における使用の為のＧＵＣＹ２Ｃアゴニストを提供する。
【００２１】
本発明は、ドーパミン作動性細胞によるドーパミン産生を増加させる方法であって、該細胞におけるグアニル酸シクラーゼ２Ｃ（ＧＵＣＹ２Ｃ）によるシグナル伝達を増加させることを含む、上記方法を更に提供する。
【００２２】
ドーパミン作動性細胞におけるチロシンヒドロキシラーゼのＳｅｒ４０のリン酸化のレベルを増加させる方法であって、該細胞中のＧＵＣＹ２Ｃによるシグナル伝達を増加させることを含む、上記方法がまた提供される。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
グアニル酸シクラーゼ２Ｃ（ＧＵＣＹ２Ｃ）は、グアニリルシクラーゼファミリーのメンバーである。タンパク質の構造及び機能の様々な観点は、Vaandrager（Mol.  Cell.  Biochem.  2002;  230:73-83）によって記載されている。該タンパク質の遺伝子の発現及び機能は、高度に調節され、且つ研究された特定の細胞／組織に依存する。
【００２４】
ＧＵＣＹ２Ｃ遺伝子及び該遺伝子によってコードされるタンパク質は、多くの別名で知られており、その中でも、ＳＴＡ受容体；腸グアニル酸シクラーゼ；グアニリルシクラーゼＣ；ＥＣ  ４．６．１．２；ＧＵＣ２Ｃ；ＨＳＴＡＲ；ＳＴＡＲ；ＧＣ−Ｃ；グアニル酸シクラーゼ２Ｃ；熱安定性エンテロトキシン受容体；ＥＣ  ４．６．１；ＤＩＡＲ６；ＭＥＣＩＬ及びＭＵＣＩＬがある。ＧＵＣＹ２Ｃ遺伝子／タンパク質の為の外部ＩＤは、ＨＧＮＣ：４６８８；Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子：２９８４；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ００００００７００１９；ＯＭＩＭ：６０１３３０及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２５０９２である。
【００２５】
チロシンヒドロキシラーゼ又はチロシン３−モノオキシゲナーゼは、アミノ酸であるＬ−チロシンのＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）への転化を触媒する為の酵素である。Ｌ−ＤＯＰＡは、ドーパミンの為の前駆体であり、それは、次に、重要な神経伝達物質であるノルエピネフリン（ノルアドレナリン）及びエピネフリン（アドレナリン）の為の前駆体である。チロシンヒドロキシラーゼは、カテコールアミンのこの合成における律速段階を触媒する。ヒトにおいて、チロシンヒドロキシラーゼは、ＴＨ遺伝子によってコードされ、且つ該酵素は、中枢神経系（ＣＮＳ：central  nervous  system）、末梢交感神経ニューロン及び副腎髄質中に存在する。該タンパク質又は遺伝子は、多くの異なる名称、例えば、チロシン３−ヒドロキシラーゼ；ＥＣ  １．１４．１６．２；ＴＹＨ；ジストニア；ＥＣ  １．１４．１６；ＤＹＴ１４；及びＤＹＴ５ｂ；で知られている。該ＴＨ遺伝子又はタンパク質の為の外部ＩＤは、ＨＧＮＣ：１１７８２；Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子：７０５４；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１８０１７６；ＯＭＩＭ：１９１２９０；及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０７１０１である。
【００２６】
ＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達は、増加した細胞の環状グアノシン−３’，５’−一リン酸（ｃＧＭＰ）を介して媒介される。多くのｃＧＭＰの下流のメディエーターがあり、それは、とりわけ、細胞型、組織及び／又はそれらの代謝状態に依存して、細胞内ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）、プロテインキナーゼ（ＰＫ）及び膜結合タンパク質並びにイオンチャネルを包含する。本明細書において、言及がドーパミン作動性ニューロンの文脈においてＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達に対して行われる場合、言及が、増加したｃＧＭＰに対して行われる。
【００２７】
ドーパミン作動性細胞は、ドーパミンを産生することができる細胞である。そのような細胞は典型的には、特殊化したニューロン細胞である。そのようなニューロン細胞は典型的には、該細胞中のドーパミンの組織化学的蛍光検出によって特徴付けられる。ドーパミン作動性細胞の様々なグループが識別されることができる。細胞グループＡ８は、そのようなグループの１つであり、それは、げっ歯類及び霊長類におけるドーパミン作動性細胞の小さなグループである。それは、赤核のレベルで且つ尾側で、黒質に対して背側の中脳網様体に位置している。マウスにおいて、それは、古典的な染色によって定義される赤核後部領域（retrorubral  field）で特定される。細胞グループＡ９は、ドーパミン作動性細胞の密集したグループであり、且つげっ歯類及び霊長類の腹外側中脳に位置している。それは、ニッスル染色に基づいて定義される黒質の緻密部とほとんど同じである。細胞グループＡ１０は、げっ歯類及び霊長類の腹側中脳被蓋におけるドーパミン作動性細胞の大きなグループである。該細胞は、腹側被蓋野の大部分、線状核、並びに霊長類において、左の動眼神経核複合体と右の動眼神経核複合体との間に位置する中脳の中心灰白質の一部に位置している。特許請求の範囲のドーパミン作動性細胞は、ＧＵＣＹ２Ｃ受容体を発現するドーパミン作動性細胞、例えば好ましくは、上記に記載されているグループＡ８、グループＡ９又はグループＡ１０の細胞、である。様々な他のドーパミン作動性細胞が知られており、そのうちの一部が、本明細書の下記において列挙されている。グループＡ１１は、マカク（macaque）における視床下部の後部周室核及び中間の周室核に位置しているドーパミン作動性細胞の小さなグループである。ラットにおいて、このグループに割り当てられた少数の細胞はまた、視床下部の後核、乳頭体上核領域及び結合核において見出される。グループＡ１２は、霊長類における視床下部の弓状核中の細胞の小さなグループである。ラットにおいて、このグループに属する幾つかの細胞が、視床下部の傍室核の前腹側部分においても見られる。グループＡ１３は、霊長類において、クラスター中に分布しており、該クラスターは、視床下部の乳頭視床路の腹側及び内側にあり、その少数は視床の結合核に延在している。マウスにおいて、Ａ１３は、不確帯における視床の乳頭視床路の腹側に位置している。グループＡ１４は、霊長類の視索前周室核中及びその近くで観察される少数の細胞を有する。マウスにおいて、前背側視索前核における細胞は、このグループに割り当てられている。グループＡ１６は、げっ歯類及び霊長類を包含する脊椎動物の嗅球に位置している。グループＡａｑは、霊長類における中脳の中心灰白質の吻側半分に位置する細胞のまばらなグループである。これは、マカクよりもリスザル（リスザル属（Saimiri））において目立つ。様々な他のグループが、霊長類、マウス及び他の種に存在する（Felten  et  al  (1983).  Brain  Research  Bulletin.  10  (2):  171−284及びDahlstrom  A  et  al  1964  Acta  Physiologica  Scandinavica.  62:  1−55）。ドーパミン作動性細胞はまた、人工的に発生されることができる。それ故に、人工細胞は、必要な酵素、受容体及び／又はコード領域を与えられることができる。本発��の文脈において、ＨＥＫ細胞は、Ｔｈ及び／又はＧＵＣＹ２Ｃを与えられている。該ドーパミン作動性細胞は好ましくは、ドーパミン作動性ニューロン細胞である。該ドーパミン作動性細胞は好ましくは、中脳又は線条体の細胞である。該ドーパミン作動性細胞は好ましくは、細胞膜においてＧＵＣＹ２Ｃを発現するドーパミン作動性ニューロン細胞である。好ましくは、黒質細胞である。ニューロン細胞は、入ってくる突起及び出て行く突起の両方の非常に大きな突起を有することができる。該細胞は典型的には、該細胞の核の存在に依存して、脳の一セクションに割り当てられる。例えば、中脳のニューロン細胞は、該中脳に位置する核を有する細胞部分を有する。該細胞は、突起、例えば、脳、例えば線条体、の他の部分を通過する及び／又はそこで終わる軸索又は樹状突起、を有することができる。
【００２８】
ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、ホスホジエステル結合を切断する酵素である。該語は通常、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼを云う。しかしながら、ホスホジエステラーゼの多くの他のファミリー、例えばホスホリパーゼＣ及びＤ、オートタキシン、スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ、ＤＮ分解酵素（DNases）、ＲＮ分解酵素（RNases）、及び（ＤＮＡ又はＲＮＡのホスホジエステル主鎖を全て切断する）制限エンドヌクレアーゼ、並びにあまり特徴付けられていない多数の低分子ホスホジエステラーゼを包含するホスホジエステラーゼの多くの他のファミリーが存在する。
【００２９】
該環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼは、セカンドメッセンジャー分子のｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ又はその両方において該ホスホジエステル結合を分解する酵素のグループを含む。ＰＤＥは、これらのセカンドメッセンジャー分子によって媒介されるシグナル伝達の調節因子である。
【００３０】
ＰＤＥの命名法は、アラビア数字でＰＤＥファミリーを意味し、そして大文字はそのファミリー中の遺伝子を示し、そして２番目及び最後のアラビア数字は単一遺伝子に由来するスプライス変異体を示す（例えば、ＰＤＥ１Ｃ３：ファミリー１、遺伝子Ｃ、スプライシング変異体３）。哺乳動物におけるＰＤＥ酵素のスーパーファミリーは、１２のファミリー、すなわちＰＤＥ１〜ＰＤＥ１２に分類されている。同じファミリーの異なるＰＤＥは、それらのアミノ酸配列がかなりの相違を示すことができるという事実にもかかわらず、機能的に関連付けられている。ＰＤＥは、異なる基質特異性を有する。幾つかは、既知のｃＡＭＰ選択的加水分解酵素（ＰＤＥ４、ＰＤＥ７及びＰＤＥ８）であり、他のものは、ｃＧＭＰ選択的（ＰＤＥ５、ＰＤＥ６及びＰＤＥ９）であることが知られている。他のものは、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの両方を加水分解することが知られている（ＰＤＥ１、ＰＤＥ２、ＰＤＥ３、ＰＤＥ１０及びＰＤＥ１１）。
【００３１】
ホスホジエステラーゼ阻害剤は、酵素であるホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）のサブタイプの１以上をブロックし、それによってそれぞれの１以上のＰＤＥサブタイプによる細胞内セカンドメッセンジャーの環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）及び環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）の不活性化を防ぐ薬剤である。様々な選択的ＰＤＥ阻害剤及び非選択的ＰＤＥ阻害剤が知られている。中でも、該非選択的ＰＤＥ阻害剤は、カフェイン、アミノフィリン、ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）、パラキサンチン、ペントキシフィリン、及びテオフィリンである。これらの化合物は、非選択的であると言われるが、しかしながら、それらの活性は、依然として変わりうる。これは、好ましさにおける、とりわけ親和性及び／又は薬物動態における、相違の結果であることができる。ＰＤＥ阻害剤は、非選択的阻害剤、例えばＩＢＭＸ、であることができる。
【００３２】
ＰＤＥ活性を５０％まで阻害する特定のＰＤＥ阻害剤のインビトロ（in  vitro）の濃度は、ＩＣ５０値として知られている。選択的ＰＤＥ阻害剤はしばしば、最も特異的に阻害されるＰＤＥのタイプによって言及される。ＰＤＥ５阻害剤は、他のＰＤＥのいずれかについてのＩＣ５０よりも低い、ＰＤＥ５についてのＩＣ５０を有する。ＰＤＥについての化合物のＩＣ５０値を決定する為の好適なアッセイは、Ceyhan  et  al（2012:  Chemistry  &  Biology  19,  155−163:  DOI  10.1016/j.chembiol.2011.12.010）において与えられている。特定のＰＤＥタンパク質についての化合物のＩＣ５０を決定する為のアッセイはまた、市販されており、例えば、ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＰＤＥ２Ａ＝カタログ番号：６０３２１）及びＰＤＥ１１Ａ＝カタログ番号：６０４１１）を参照されたい。
【００３３】
ＰＤＥ阻害剤化合物は、他のＰＤＥアイソフォームがより高い濃度でのみ阻害されるという事実に基づいて、選択的と称されることができる。幾つかの化合物、例えばジピリダモール及びザルダベリン、は、限られた数のアイソフォームについて選択的である。複数のアイソフォームを標的にする幾つかの該阻害剤は、この特性の為に、有用でありうる。例えば、ジピリダモールは、脳卒中処置のＡｇｇｒｅｎｏｘ（アスピリン／徐放性ジピリダモール）の成分である。ジピリダモールは、０．４ｕＭのＰＤＥ１１についてのＩＣ５０を有し、且つ他のＰＤＥａについてのわずかにより高いＩＣ５０を有し、例えば、ＰＤＥ１０について１ｕＭ、ＰＤＥ７について０．６ｕＭ及びＰＤＥ５について０．９ｕＭを有する（Bender  and  Beavo,  2006  Pharmacol.  Rev.  58:  488-520）。ヒトＰＤＥの少なくとも１つについてマイクロ（μ）モル濃度又はナノ（ｎ）モル濃度であるＩＣ５０を有する場合、阻害剤は、ＰＤＥ阻害剤である。該阻害剤が、５超の他のヒトＰＤＥ、好ましくは８超の他のヒトＰＤＥ、好ましくは全ての他のヒトＰＤＥ、についてのＩＣ５０よりも少なくとも１０倍低いところのそれぞれのＰＤＥについてのＩＣ５０を有する場合、該阻害剤は、選択的ＰＤＥ阻害剤である。ＰＤＥ２阻害剤は、５超の他のヒトＰＤＥ、好ましくは８超の他のヒトＰＤＥ、好ましくは全ての他のヒトＰＤＥ、についての化合物についてのＩＣ５０よりも少なくとも１０倍低いところのＩＣ５０を有する。ＰＤＥ１１阻害剤は、５超の他のヒトＰＤＥ、好ましくは８超の他のヒトＰＤＥ、好ましくは全ての他のヒトＰＤＥ、についての化合物のＩＣ５０よりも少なくとも１０倍低いところのＩＣ５０を有する。
【００３４】
ＰＤＥ２は、ＰＤＥ２Ａ遺伝子によってコードされる。３つのスプライス変異体、ＰＤＥ２Ａ１、ＰＤＥ２Ａ２及びＰＤＥ２Ａ３、が見出されている（ＰＤＥ２Ａ２は、ラットにおいてのみ見出されている）。ＰＤＥ２Ａ１は、細胞質性であり、一方、ＰＤＥ２Ａ２及びＰＤＥ２Ａ３は、膜結合性である。ＰＤＥ２Ａスプライス変異体が異なるにもかかわらず、それらの動態学的挙動における既知の相違はない。ヒトにおけるＰＤＥ１１は、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子によってコードされている。該遺伝子は、二重特異性酵素である様々なアイソフォームをコードし、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの両方を加水分解する（Ceyhan  et  al.,  2012:  Chemistry  &  Biology  19,  155-163）。ＰＤＥタンパク質及びそれらの特徴の幾つかの概要は、Bender  and  Beavo（2006  Pharmacol.  Rev.  58:  488-520）において与えられている。
【００３５】
該ＰＤＥ２阻害剤は好ましくは、ＥＨＮＡ（エリスロ−９−（２−ヒドロキシ−３−ノニル）アデニン）；ＢＡＹ  ６０−７５５０；ＰＤＰ（９−（６−フェニル−２−オキソヘキサ−３−イル）−２−（３，４−ジメトキシベンジル）−プリン−６−オン；ＩＣ９３３又はオキシインドールである（構造式が図１１に示されており、幾つかの化合物のＩＣ５０値が図１２に示されている）。一つの実施態様において、該ＰＤＥ２阻害剤はＥＨＮＡである。一つの実施態様において、該ＰＤＥ２阻害剤はＢＡＹ  ６０−７５５０である。別の実施態様において、該ＰＤＥ２阻害剤はＰＤＰである。
【００３６】
該ＰＤＥ１１阻害剤は好ましくは、ＢＣ１１−１５；ＢＣ１１−１９；ＢＣ１１−２８又はＢＣ１１−３８である。使用されることもできるＢＣ１１−３８の変異体は；ＢＣ１１−３８−１；ＢＣ１１−３８−２；ＢＣ１１−３８−３；及びＢＣ１１−３８−４である。ＢＣ１１−．．阻害剤、並びにそれらの活性及び選択の方法は、Ceyhan  et  al.（2012:  Chemistry  &  Biology  19,  155-163）に記載されている。一つの実施態様において、該ＰＤＥ１１阻害剤は、ＢＣ１１−３８；ＢＣ１１−３８−１；ＢＣ１１−３８−２；ＢＣ１１−３８−３；又はＢＣ１１−３８−４である。一つの実施態様において、該ＰＤＥ１１阻害剤は、ＢＣ１１−３８である。
【００３７】
ペプチドのグアニリンファミリーは、細菌の熱安定性エンテロトキシン（ＳＴ）において見出される３つの分子内ジスルフィド結合、又はグアニリン及びウログアニリンにおいて観察される２つのジスルフィド、又はリンホグアニリンによって例示される単一のジスルフィドのいずれかを含むペプチドの３つのサブクラスを有する。これらのペプチドは、固有のグアニル酸シクラーゼ（ＧＣ）活性、例えばＧＵＣＹ２Ｃ、を有する細胞表面受容体、に結合し且つ活性化する。
【００３８】
グアニリンは、ＧＵＣＹ２Ｃの天然のアゴニスト性リガンドである。それは１５アミノ酸のポリペプチドである。それは、結腸において杯細胞によって分泌される。グアニリンは、グアニリルシクラーゼ受容体ＧＣ−Ｃのアゴニストとして作用し、腸及び腎臓の上皮における電解質及び水の輸送を調節する。受容体が結合することに応じて、グアニリンは、ｃＧＭＰの細胞内濃度を増加させ、塩化物の分泌を誘発し、そして腸液の吸収を減少させ、最終的に下痢を引き起こす。該ペプチドは、熱安定性エンテロトキシンと同じ受容体結合領域を通じて酵素を刺激する。それは、多くの名称で知られており、そのうちの幾つかは、グアニル酸シクラーゼ活性化因子２Ａ；グアニル酸シクラーゼ活性化タンパク質１；グアニル酸シクラーゼ活性化タンパク質Ｉ；プレプロ−グアニリン；ＧＣＡＰ−Ｉ；ＧＵＣＡ２；グアニル酸シクラーゼ活性化因子２Ａ及びＳＴＡＲＡである。該グアニリン遺伝子／タンパク質の為の外部ＩＤは；ＨＧＮＣ：４６８２；Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子：２９８０；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１９７２７３；ＯＭＩＭ：１３９３９２；及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ０２７４７である。
【００３９】
ウログアニリンは、ＧＵＣＹ２Ｃの天然のアゴニスト性リガンドである。それは、十二指腸及び近位小腸において細胞によって分泌される１６個のアミノ酸ペプチドである。グアニリンは、該グアニリルシクラーゼ受容体ＧＣ−Ｃのアゴニストとして作用し、且つとりわけ、腸及び腎臓の上皮における電解質及び水の輸送を調節する。ヒトにおいて、ウログアニリンペプチドは、ＧＵＣＡ２Ｂ遺伝子によってコードされる。該遺伝子及びタンパク質は、多くの異なる名称、グアニル酸シクラーゼ活性化因子２Ｂ；プレプロ−ウログアニリン；ＧＣＡＰ−ＩＩ；及びＵＧＮ、で知られている。該遺伝子及びタンパク質の為の外部ＩＤは、ＨＧＮＣ：４６８３；Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子：２９８１；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ００００００４４０１２；ＯＭＩＭ：６０１２７１；及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１６６６１である。
【００４０】
リンホグアニリンは、ＧＵＣＹ２Ｃの天然のアゴニスト性リガンドである。それは、とりわけ、Forte  et  al.  Endocrinology.  1999  Apr;140(4):1800-6において記載されている。
【００４１】
グアニリン、リンホグアニリン又はウログアニリンの機能的誘導体は、必ずしも量ではなく、種類において同じ活性を有する。機能的誘導体は好ましくは、グアニリン、ウログアニリン若しくはＳＴｈと同じアミノ酸配列を有するか、又はグアニリン、ウログアニリン若しくはＳＴｈと非常に類似する変更されたアミノ酸配列を有する。１つのそのような誘導体はリナクロチドである。リナクロチドは、内因性のグアニリン及びウログアニリンのペプチド模倣体である。それは、配列ＣＣＥＹＣＣＮＰＡＣＴＧＣＹ（Ｈ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−ＯＨ）を有する合成テトラデカペプチド（１４個のアミノ酸のペプチド）である。リナクロチドは、Ｃｙｓ１とＣｙｓ６との間（左から右へ番号付けする場合）、Ｃｙｓ２とＣｙｓ１０との間、並びにＣｙｓ５とＣｙｓ１３との間にある３つのジスルフィド結合を有する；［９］。ＧＵＣＹ２Ｃの３つの類似のペプチドアゴニストは、臨床開発中のリナクロチド（Ｌｉｎｚｅｓｓ（商標）、Ｆｏｒｅｓｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ａｎｄ  Ｉｒｏｎｗｏｏｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）；ＳＰ−３０４（プレカナチド）；及びＳＰ−３３３（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）である。機能的誘導体は、Ｎ末端及び／又はＣ末端に結合した化学基を有することができる。該化学基は、ペプチド結合中に１つ又は２つのアミノ酸を有することができる。該機能的誘導体は、１以上のアミノ酸残基の側鎖の化学修飾によって、グアニリン又はウログアニリンから誘導されうる。１つのそのような修飾基又は化学基は、血液脳関門の通過を更に容易にする為の修飾でありうる。血流に注入されたグアニリンは、迅速に脳に入る（国際公開第２０１３／０１６６６２号パンフレット）。グアニリンは、該血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができる。脳送達は、薬物開発における挑戦であることができる。該血液脳関門は、多くの薬物がそれらの標的に達するのを防止するが、ＢＢＢシャトルとして知られている分子ベクターは、この厄介な障害を安全に克服する為の大きな保証を提供する。近年、ペプチドシャトルは、それらのより低いコスト、低減された免疫原性、並びに伝統的なトロイの木馬抗体（Trojan  horse  antibodies）及び他のタンパク質よりも高い化学的多用途性の為に、ますます注目を集めている。好適なＢＢＢシャトルは、Oller-Salvia  et  al（Chem.  Soc.  Rev.,  2016,  45,  4690-4707）において記載されており、それは、この目的の為に、参照により本明細書内に組み込まれる。好ましい実施態様において、機能的グアニリン又はウログアニリン誘導体は、Oller-Salvia  et  alの表１のペプチドＢＢＢシャトルに融合されたグアニリン又はウログアニリンである。該融合は典型的には、ペプチド結合によって行われる。リンカーは、２つの機能的ユニットの間に導入されることができる。該リンカーは好ましくは、１〜２０、好ましくは１〜１５、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜５、のアミノ酸残基のペプチドリンカーである。
【００４２】
本発明は更に、配列H-NDDCELCVNVACTGCLL-OH（ペプチド２）；H-NDCCELCCNVACTGCL-OH（ペプチド４）；H-NDDCELCVNVVCTGCL-OH（ペプチド５）；H-QEECEL[Abu]INMACTGY-OH（ペプチド６）；H-QEECELCINMACTGCL-OH（ペプチド８）；H-NTFYCCELCCNPACAGCY-OH（ペプチド９）；H-NTFYCCELCCAPACTGCY-OH（ペプチド１０）；又はH-NTFYCCELCCNPaCAGCY-OHを含むＧＵＣＹ２Ｃアゴニストを提供する。
【００４３】
該ＧＵＣＹ２Ｃアゴニストは、ペプチドとして、コンジュゲート又は該ペプチドを含むタンパク質として、提供されうる。好ましい実施態様において、該ＧＵＣＹ２Ｃアゴニストは、Oller-Salvia  et  alの表１のペプチドＢＢＢシャトルに融合された該ペプチドのコンジュゲートである。該融合は典型的には、ペプチド結合によって行われる。リンカーは、２つの機能的ユニットの間に導入されることができる。該リンカーは好ましくは、１〜２０、好ましくは１〜１５、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜５、のアミノ酸残基のペプチドリンカーである。
【００４４】
本発明は、パーキンソン病を有する個体の処置における使用の為の、配列H-NDDCELCVNVACTGCLL-OH（ペプチド２）；H-NDCCELCCNVACTGCL-OH（ペプチド４）；H-NDDCELCVNVVCTGCL-OH（ペプチド５）；H-QEECEL[Abu]INMACTGY-OH（ペプチド６）；H-QEECELCINMACTGCL-OH（ペプチド８）；H-NTFYCCELCCNPACAGCY-OH（ペプチド９）；H-NTFYCCELCCAPACTGCY-OH（ペプチド１０）；又はH-NTFYCCELCCNPaCAGCY-OHを含むＧＵＣＹ２Ｃアゴニストと一緒に、ＰＤＥ１１阻害剤、ＰＤＥ２阻害剤又はそれらの組み合わせを使用する方法を更に提供する。
【００４５】
シグナル伝達は典型的には、受容体の天然リガンドのレベルに増加される。活性化は好ましくは、その他の点では同一の条件下（当然ながら、十分に飽和した条件下）で試験された該受容体の天然リガンドによって達成される活性化のレベルの少なくとも５０％である。シグナル伝達の活性のレベルは典型的には、細胞内ｃＧＭＰの産生を測定することによって測定される。それはまた、該細胞中のｃＧＭＰのレベルから生じる活性のレベルを測定することによって測定されることができる。
【００４６】
ＧＵＣＹ２Ｃアゴニストは、ＧＵＣＹ２Ｃの細胞外部分に結合し且つタンパク質によるシグナル伝達を増加させる分子である。この文脈における増加させることとは、サイレントＧＵＣＹ２Ｃ受容体によるシグナル伝達の誘発、及び該受容体の既存のシグナル伝達活性の上へのシグナル伝達の増加を包含する。既存のシグナル伝達活性の誘発又は増加は典型的には、多くの細胞、典型的には少なくとも１０，０００個の細胞のプール、の統合された結果を比較することによって測定される。そのような場合において、シグナル伝達の誘発は、検出不能から検出可能へのシグナルである。既存の活性の上への増加は、その他の点では同一の条件下で、アゴニストの非存在と比較してより高い活性である。従って、シグナル伝達の増加は、検出不能から検出可能なシグナル伝達のレベルへの増加を包含する。
【００４７】
様々なアゴニストが当技術分野において知られている。最も周知であるものは、ペプチドの該グアニリンファミリーのメンバーである。これらは例えば、上記で挙げられた該ペプチド、及び該ＳＴ細菌ペプチド、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＴａ、コレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａ）ＳＴ及びエンテロコリチカ菌（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）を包含する（Fonteles  et  al  2011;  Can.  J.  of  Phys.  And  Pharmac.  89:  575-85）。米国特許第８，７４８，５７５号明細書（Ｗｏｌｆｅ等）は、様々な種由来のグアニリン及びウログアニリンタンパク質を記載する。Ｗｏｌｆｅ等はまた、ＧＵＣＹ２Ｃアゴニストである様々なグアニリン及びウログアニリン誘導体を記載する。上記で挙げられた該ペプチドの作用を模倣する様々な細菌ペプチドがまた記載されている。これらのペプチド及びそれらの変異体は、ＧＵＣＹ２Ｃアゴニストである。米国特許出願公開第２０１２／０１０８５２５号明細書（Ｃｕｒｉｅ等）は、様々なＧＵＣＹ２Ｃアゴニスト、及び胃腸障害の処置におけるこれらのアゴニストの使用を記載する。国際公開第２０１３／０１６６６２号パンフレット（Ｇａｎａｔ等）は、脳へのペイロードを標的にする該ペイロードを有するグアニリンコンジュゲートを記載する。それは特に、ペイロードＬ−ドーパの使用を記載する。
【００４８】
ドーパミン生合成は、複雑であり、且つ様々な他の生合成経路と統合される。ドーパミンは、２つの反応でＬ−チロシンから生成される。酵素であるチロシンヒドロキシラーゼ（Ｔｈ）は、Ｌ−チロシンをレボドパ（Ｌ−ドーパ）に転化し、そして芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）は、レボドパを脱炭酸して、ドーパミンを形成する（Clarke  CE,  2004）。チロシンヒドロキシラーゼは、多くの別名、チロシン３−モノオキシゲナーゼ；チロシン３−ヒドロキシラーゼ；ＥＣ  １．１４．１６．２；ＴＹＨ；ジストニア１４；ＥＣ  １．１４．１６；ＤＹＴ１４；及びＤＹＴ５ｂで知られている。Ｔｈの為の外部ＩＤは、ＨＧＮＣ：１１７８２；Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子：７０５４；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１８０１７６；ＯＭＩＭ：１９１２９０；及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０７１０１である。
【００４９】
語「ドーパミン産生をモジュレートすること」は、ドーパミンレベルの上方又は下方の調整を意味する。該産生は、ドーパミン作動性細胞によって行われる。従って、該産生をモジュレートすることは典型的には、該ドーパミン作動性細胞からのドーパミン放出を増加させることを目標で、ドーパミン作動性ニューロンにおけるドーパミンレベルの上方又は下方の調整を意味する。該放出は好ましくは、ドーパミン作動性中脳ニューロンの投射野、好ましくは黒質の投射野、においてである。該投射野は好ましくは、線条体である。ＧＵＣＹ２Ｃによるシグナル伝達をモジュレートすることによるドーパミン産生のモジュレーションは、該ドーパミン作動性細胞において行われることができる。該モジュレーションは好ましくは、該シグナル伝達の上方調整、すなわち、該ドーパミン作動性細胞におけるｃＧＭＰのレベルの上方調整である。該モジュレーションは典型的には、該細胞におけるチロシンヒドロキシラーゼ（Ｔｈ）活性をモジュレートすることをもたらす。Ｔｈは、様々な方法で測定されることができる。自明な方法は、それに与えられる基質の文脈においてＴｈ酵素産生物の産生を測定することである。Ｔｈ活性は、セリンリン酸化に依存することが見出されている。本発明において、方法は、Ｔｈ  Ｓｅｒ４０リン酸化のモジュレーションによりドーパミン産生をモジュレートするように開発された。本明細書において示されている通り、ドーパミン作動性細胞によるドーパミン産生は、該細胞におけるＴｈの総レベルに関して測定された、該細胞におけるＳｅｒ４０リン光体Ｔｈ（Ｐ−Ｓ４０  Ｔｈ）のレベルを増加させることによって増加される。典型的には、Ｓｅｒ４０リン光体の該レベルは、Ｓｅｒ４０におけるリン酸化されないＴｈのレベルと比較される。これは典型的には、図３〜図５に関する実施例に記載されているアッセイにおいて行われる。
【００５０】
本発明はまた、ドーパミン作動性細胞におけるチロシンヒドロキシラーゼのＳｅｒ４０のリン酸化のレベルをモジュレートする方法を提供する。該方法は、該細胞を、ＰＤＥ２阻害剤、ＰＤＥ１１阻害剤又はそれらの組み合わせと接触させることを含む。好ましくは、ＧＵＣＹ２Ｃ活性はまた、好ましくはＧＵＣＹ２Ｃアゴニストによって、上記細胞においてモジュレートされる。Ｓｅｒ４０リン酸化の上方調整は典型的には、その他の点では同一の状況下で未調整の細胞におけるレベルと比較される場合、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％、のＰ−Ｓ４０  Ｔｈのレベルの増加である。上方調整の場合において、該Ｐ−Ｓ４０  Ｔｈレベルは好ましくは、該未調整のレベルよりも、少なくとも１００％、好ましくは少なくとも２００％、高くに調整される。
【００５１】
該ドーパミンレベルの上方調整は典型的には、その他の点では同一の状況下で未調整の細胞におけるレベルと比較される場合、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％、のドーパミンレベルのそれぞれの増加である。該ドーパミンレベルは好ましくは、該未調整のレベルよりも、少なくとも１００％、好ましくは少なくとも２００％、高くに調整される。
【００５２】
ｃＧＭＰレベルの上方調整は典型的には、その他の点では同一の状況下で未調整の細胞におけるレベルと比較される場合、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％、のｃＧＭＰレベルのそれぞれの増加である。該ｃＧＭＰレベルは好ましくは、該未調整のレベルよりも、少なくとも１００％、好ましくは少なくとも２００％、高くに調整される。
【００５３】
好ましい実施態様において、本発明は、ドーパミン作動性細胞によるドーパミン産生をモジュレートする方法であって、該細胞中のグアニル酸シクラーゼ２Ｃ（ＧＵＣＹ２Ｃ）によるシグナル伝達をモジュレートすることを含む、上記方法を提供する。好ましい実施態様において、本発明は、ドーパミン作動性細胞によるドーパミン産生を増加させる方法であって、該細胞中のグアニル酸シクラーゼ２Ｃ（ＧＵＣＹ２Ｃ）によるシグナル伝達を増加させることを含む、上記方法を提供する。
【００５４】
本発明はまた、ドーパミン作動性細胞におけるチロシンヒドロキシラーゼのＳｅｒ４０のリン酸化のレベルを増加させる方法であって、該細胞中のＧＵＣＹ２Ｃによるシグナル伝達を増加させることを含む、上記方法を提供する。
【００５５】
ドーパミンのレベルの増加は典型的には、その他の点では同一の状況下で未調整の細胞におけるレベルと比較される場合、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％、のドーパミンレベルの増加である。該ドーパミンレベルは好ましくは、該未調整のレベルよりも、少なくとも１００％、好ましくは少なくとも２００％、高くに増加される。
【００５６】
ドーパミン作動性細胞によるドーパミン産生を増加させる方法は好ましくは、上記細胞中のグアニル酸シクラーゼ２Ｃ（ＧＵＣＹ２Ｃ）によるシグナル伝達を増加させることによって達成される。ｃＧＭＰレベルは典型的には、その他の点では同一の状況下で未調整の細胞におけるレベルと比較される場合、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％、まで増加される。好ましくは、該未調整のレベルよりも、少なくとも１００％、好ましくは少なくとも２００％、高くに増加される。
【００５７】
ＧＵＣＹ２Ｃのシグナル伝達は、様々な様式でモジュレートされることができる。１つの方法は、ＧＵＣＹ２ＣをコードするｍＲＮＡのレベルをモジュレートすることである。これは、ＧＵＣＹ２Ｃコード領域を有する発現カセットを上記細胞内に導入することによって行われることができる。該細胞中のＧＵＣＹ２Ｃ  ｍＲＮＡのより高いレベルは、上記膜中により多くのＧＵＣＹ２Ｃを、及び上記細胞中にＧＵＣＹ２Ｃの増加されたシグナル伝達をもたらす。
【００５８】
ＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達のレベルの上方調整は好ましくは、ＧＵＣＹ２Ｃを含む細胞にＧＵＣＹ２Ｃアゴニストを与えることによって達成される。該アゴニストは好ましくは、該グアニリンファミリーのペプチドのメンバー、好ましくはグアニリン、ウログアニリン又はそれらの機能的誘導体、である。
【００５９】
ドーパミン産生をモジュレートする、好ましくは増加させる、方法は好ましくは、該ドーパミン作動性細胞にＰＤＥ阻害剤を与えることを更に含む。一部の実施態様において、該ＰＤＥ阻害剤は、非選択的阻害剤、例えばＩＢＭＸ、である。
【００６０】
ドーパミン作動性細胞におけるＳ４０  Ｔｈのリン酸化を増加させることは、該細胞を、ＰＤＥ２阻害剤、ＰＤＥ１１阻害剤又はそれらの組み合わせと接触させることによって達成されることができる。好ましくは、該細胞はまた、ＧＵＣＹ２Ｃアゴニストと接触される。該アゴニストは好ましくは、該グアニリンファミリーのペプチドのメンバー、好ましくはグアニリン、リンホグアニリン、ウログアニリン又はそれらの機能的誘導体、である。ＧＵＣＹ２Ｃシグナル伝達のレベルの上方調整はまた、細胞膜上のＧＵＣＹ２Ｃ受容体の数を増加させることによって達成されることができる。１つの方法は、ＧＵＣＹ２Ｃコード領域を含む発現カセットを該ドーパミン作動性細胞に導入することによってである。該発現カセットは好ましくは、ウイルスベクターによって導入される。好適なベクターの非限定的な例は、アデノ随伴ウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである。
【００６１】
Ｐ−Ｓ４０  Ｔｈのレベルをモジュレートする、好ましくは増加させる、方法は好ましくは、該ドーパミン作動性細胞に、ＰＤＥ阻害剤、好ましくはＰＤＥ２阻害剤、ＰＤＥ１１阻害剤又はそれらの組み合わせ、を与えることを更に含む。
【００６２】
本発明は、パーキンソン病を有する個体の処置における使用の為の、実施態様においてＧＵＣＹ２Ｃアゴニストととともに、ＰＤＥ２阻害剤、ＰＤＥ１１阻害剤又はそれらの組み合わせを提供する。該個体は好ましくは、段階１、段階２、段階３又は段階４のパーキンソン病を有する。好ましい実施態様において、該個体は、段階１、段階２又は段階３、好ましくは段階１又は段階２、好ましくは段階１、のパーキンソン病を有する。本発明において、任意的にグアニリンアゴニストとともに、ＰＤＥ２阻害剤、ＰＤＥ１１阻害剤又はそれらの組み合わせが、生理学的方法において、関連する細胞によるドーパミンの産生を刺激し、且つレボドパでの処置よりもはるかに少ない副作用を有することに留意されたい。該処置は、該疾病の初期段階において特に有効であり、ここで、該個体におけるドーパミン産生の制限は、軽度の症状の発現において当然明らかになる。そのような場合において、該個体は、典型的にはドーパミン作動性細胞の部分的な消失に対する事実に起因して、十分なドーパミン産生を有していない。しかしながら、特に該初期段階において、該個体は典型的には、本発明の該処置の際に、ドーパミンの適切な産生を提供する為に豊富な細胞を有する。処置は、該個体を無症状に戻すのに成功することができる。該アゴニストは好ましくは、グアニリン又はその機能的誘導体である。該処置は好ましくは、ＰＤＥ阻害剤を該個体に投与することを更に含む。
【００６３】
該ＧＵＣＹ２Ｃアゴニストは、それ自体が活性である。従って、本発明は、ＧＵＣＹ２Ｃアゴニスト及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物であって、該ＧＵＣＹ２Ｃアゴニストが、パーキンソン病の処置の為の唯一の薬学的活性成分である、上記医薬組成物を提供する。国際公開第２０１３／０１６６６２号パンフレットは、パーキンソン病の処置の為のペイロードへのＧＵＣＹ２Ｃリガンドコンジュゲートを記載する。国際公開第２０１３／０１６６６２号パンフレットの発明者等は、ドーパミンの産生、及びパーキンソン病、特に初期段階の疾病、を有する個体の処置におけるＧＵＣＹ２Ｃアゴニストの効果を認識していなかった。国際公開第２０１３／０１６６６２号パンフレットは、それが治療効果を有するペイロードであることを記載する。国際公開第２０１３／０１６６６２号パンフレットに従うと、該ペイロードは、治療部分又は診断部分であることができる。本発明において、該アゴニストは、そのような追加部分なしで提供される。これは、国際公開第２０１３／０１６６６２号パンフレットに記載されている診断部分又は治療部分なしで提供される。ＧＵＣＹ２Ｃアゴニスト単独の治療効果は、国際公開第２０１３／０１６６６２号パンフレットにおいて隠れたままである。本明細書に記載されているパーキンソン病の処置は好ましくは、上記細胞にＰＤＥ阻害剤を与えることを更に含む。一部の実施態様において、該ＰＤＥ阻害剤は、非選択的阻害剤、例えばＩＢＭＸ、である。この実施態様において、該ＧＵＣＹ２Ｃアゴニストは、追加のペイロードなしであり且つ診断目的又は検出目的の為の標識なしである。該ＧＵＣＹ２Ｃアゴニスト及び該ＰＤＥ阻害剤は好ましくは、パーキンソン病の処置の為の医薬の唯一の薬学的活性成分である。
【００６４】
本発明は、ＧＵＣＹ２Ｃアゴニスト、及びＰＤＥ２阻害剤、ＰＤＥ１１阻害剤又はそれらの組み合わせを含む医薬組成物を提供する。該ＧＵＣＹ２Ｃアゴニストは好ましくは、該グアニリンファミリーのペプチドのメンバー、好ましくはグアニリン、リンホグアニリン、ウログアニリン又はそれらの機能的誘導体、である。
【００６５】
本発明はまた、ドーパミン作動性細胞によるドーパミン産生を増加させる方法であって、該細胞中のグアニル酸シクラーゼ２Ｃ（ＧＵＣＹ２Ｃ）によるシグナル伝達を増加させることを含む、上記方法を提供する。ドーパミン作動性細胞におけるチロシンヒドロキシラーゼのＳｅｒ４０のリン酸化のレベルを増加させる方法であって、該細胞中のＧＵＣＹ２Ｃによるシグナル伝達を増加させることを含む、上記方法が更に提供される。ＧＵＣＹ２Ｃによる該シグナル伝達は好ましくは、上記細胞をＧＵＣＹ２Ｃアゴニストと接触させることによって増加される。上記アゴニストは好ましくは、グアニリン又はその機能的誘導体である。該方法は好ましくは、上記細胞にＰＤＥ阻害剤を与えることを更に含む。上記細胞は好ましくは、ドーパミン作動性ニューロン、好ましくは中脳ドーパミン作動性ニューロン、である。
【００６６】
例において、本発明は、化合物、好ましくはＧＵＣＹ２Ｃリガンド、好ましくはＧＵＣＹ２Ｃアゴニスト、が、ＧＵＣＹ２Ｃを活性化することができるか、又はチロシンヒドロキシラーゼのＳｅｒ４０リン酸化のレベルを増加させることができるか、又はドーパミン産生を増加させることができるかを決定する為の試験システムを記載する。そのような試験システムは好適には、ヒトＧＵＣＹ２Ｃの異所性発現（ectopic  expression）及び／又はヒトチロシンヒドロキシラーゼの異所性発現を含む単離されたヒト細胞又は組換えヒト細胞を含むことができる。そのような細胞は理想的には、天然ＧＵＣＹ２Ｃアゴニストと同様の特性又はそれよりも良好な特性を有するＧＵＣＹ２Ｃアゴニストを特定する為の方法を行う為に適している。好ましい実施態様において、該細胞は、ヒトＧＵＣＹ２Ｃの異所性発現及びヒトチロシンヒドロキシラーゼの異所性発現を含む。異所性発現は、そのような細胞が、インビトロ（in  vitro）のスクリーニング系において良好な性能の為に選択されることができるので好ましい。Ｔｈを典型的には発現する神経細胞は、しばしば、最高の実行細胞ではなく、頑強、容易且つ迅速なインビトロ培養に好適である場合、結果の分析を妨げる特性を失っているか又は得ている。異所性発現系はまた、対照として働く化合物が容易に産生される経路の容易な特定／確認を可能にする（１以上のタンパク質の異所性発現がない同じ細胞）。後「異所性発現」は、それが通常は発現しない組織又は細胞における遺伝子の発現又はタンパク質の存在を意味する。様々な細胞がこの文脈において使用されることができる。これは好ましくは、不死化細胞である。好ましくは、インビトロ培養に適合した細胞である。好ましい実施態様において、該細胞は、霊長類細胞、好ましくはヒト細胞、である。特に好ましい実施態様において、該細胞はＨＥＫ細胞である。挙げられた細胞は、ドーパミン作動性細胞によるドーパミン産生を改変する為の候補化合物を特定する為に特に適している。従って、本発明はまた、ドーパミン作動性細胞によるドーパミン産生を改変する為の候補化合物を特定する為の方法であって、この段落で挙げられた細胞を培養すること、該細胞を該候補化合物と接触させること、そして該細胞中のチロシンヒドロキシラーゼの活性を決定することを含む、上記方法を提供する。Ｔｈの活性は、様々な方法で測定されることができる。好ましい実施態様において、該活性は、Ｔｈのリン酸化を測定することによって測定され、好ましくは、チロシンヒドロキシラーゼのｓｅｒ４０のリン酸化が決定される。
【００６７】
パーキンソン病を有する個体又は該疾病を発生する危険性がある個体の処置の方法であって、ＧＵＣＹ２Ｃアゴニストを、上記処置を必要とする該個体に投与することを含む、上記方法が更に提供される。好ましい実施態様において、該方法は、ＰＤＥ阻害剤を該個体に投与することを更に含む。該ＰＤＥ阻害剤は、ＰＤＥ２阻害剤、ＰＤＥ１１阻害剤又はそれらの組み合わせであることができる。
【００６８】
パーキンソン病を有する個体又は該疾病を発生する危険性がある個体の処置の方法であって、ＰＤＥ２阻害剤、ＰＤＥ１１阻害剤又はそれらの組み合わせを、上記処置を必要とする該個体に投与することを含む、方法が更に提供される。該処置は任意的に、ＧＵＣＹ２Ｃアゴニストを該個体に投与することを更に含みうる。
【００６９】
パーキンソン病を有する個体又は該疾病を発生する危険性がある該個体は好ましくは、ヒトである。ＧＵＣＹ２Ｃタンパク質及び／又は遺伝子は好ましくは、ヒトＧＵＣＹ２Ｃタンパク質又は遺伝子である。該グアニリンファミリーのペプチドのメンバーは好ましくは、ヒトのメンバーである。グアニリン又はウログアニリンは好ましくは、ヒトのグアニリン又はウログアニリンである。グアニリン又はウログアニリンの機能的誘導体は好ましくは、ヒトのグアニリン又はウログアニリンの機能的誘導体である。
【００７０】
該リガンド、例えばアゴニスト、該ＰＤＥ阻害剤又はそれらの組み合わせ、は好ましくは、該個体の脳に投与される。
【００７１】
パーキンソン病は典型的には、軽度の症状でゆっくりと始まる。該疾病は、ゆっくり又は速く進行することができる。この進行の間、該症状は悪化し、且つ新たな症状が明らかになることができる。黒質からのドーパミン作動性ニューロンの進行性の喪失と多かれ少なかれ相関する疾病の様々な段階が、特定されることができる。多くの場合、５つの段階が特定される。段階１は典型的には、一般に、日常活動を妨げない軽度の症状によって特徴付けられる。振戦及び他の運動症状は典型的には、身体の片側のみに起こる。友人及び家族は、姿勢、歩行及び顔の表情における変化に気が付きうる。段階２において、該症状は悪化し始める。振戦、硬直及び他の運動症状は、身体の両側に影響を及ぼす。歩行の問題及び悪い姿勢が明らかになりうる。この段階において、人は依然として一人で生きることが可能であるが、毎日の作業を完了するのがより困難になり、且つより時間がかかりうる。段階３は、該疾病の進行における中間段階と考えられる。平衡感覚障害及び動作緩慢は、このフェーズの特徴である。転倒がより一般的である。該人は依然として完全に自立しているが、症状は、日常生活動作、例えば着替え及び食事、を有意に損なう。パーキンソン病の症状は、段階４において、重症で且つ非常に制限される。支援なしで立つことは可能であるが、移動は歩行器を必要としうる。該人は、日常生活動作の助けを必要とし、一人で生きることはできない。段階５は、パーキンソン病の最も進行した衰弱した段階である。下肢のこわばりは、立つこと又は歩くことを不可能にしうる。該人は、車椅子を必要とするか又は寝たきりである。２４時間の看護が、全ての活動の為に必要とされる。該人は、幻覚及び妄想を経験しうる。段階５は、運動症状に焦点を合わせているが、パーキンソン病のコミュニティは、同様に、多くの重要な非運動症状が存在することを認識している。
【００７２】
パーキンソン病の文脈における医学的使用の為に且つパーキンソン病を有する個体の処置の為に、該個体は完全に進行した形態のパーキンソン病を有さないことが好ましい。そのような場合において、該黒質は、（ほぼ）完全に破壊されている。本発明について、該個体は、段階１、段階２、段階３又は段階４のパーキンソン病を有することが好ましい。好ましい実施態様において、該個体は、段階１、段階２又は段階３のパーキンソン病を有する。好ましくは、段階１又は段階２を有する。本発明の利点は、該疾病の初期段階が、現在の標準的治療に関連付けられた多くの副作用を誘発することなしに、適切に処置されることができることである。該黒質のドーパミン作動性ニューロンは、刺激されて、より多くのドーパミンを産生して、該黒質におけるドーパミン作動性細胞の喪失を代償し、一方で、それと同時に、ドーパミンを過剰産生せずに、又は非標的細胞、すなわち該黒質中に存在しないドーパミン作動性ニューロン、において過剰のドーパミン産生を有しない。
【００７３】
好ましくは、本発明の該化合物は医薬として使用される。本発明の医薬は、パーキンソン病を有する個体又はパーキンソン病を有する危険性がある個体の処置の為に好適に使用されることができる。本発明の医薬組成物は、本明細書に記載されているドーパミン作動性細胞によるドーパミンの産生を増加させる為に、特に適している。
【００７４】
送達方法
一旦製剤化されると、本発明の化合物又は組成物は、対象に直接投与されることができるか又はインビトロで細胞に送達されることができる。
【００７５】
該組成物の対象への直接送達は一般に、皮下、腹腔内、静脈内若しくは筋肉内のいずれかの注射によって達成されるか又は組織の間質腔に送達される。投与の他の様式は、局所、経口、カテーテル挿入及び肺投与、坐剤、並びに経皮適用、針、及びパーティクルガン又は皮下噴射器を包含する。投薬処置は、単回投与スケジュール又は複数回投与スケジュールでありうる。送達は好ましくは、該個体の脳に対してである。投与の好ましい経路は、鼻部の上皮を介してである。
【００７６】
一般に、エクスビボ（ex  vivo）及びインビトロ（in  vitro）適用の両方の為の核酸の送達は、例えば、当技術分野において全て周知である、ウイルスを含むベクター、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（商標）媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、１以上のポリヌクレオチドのリポソームへのカプセル化、及びＤＮＡの核への直接マイクロインジェクションを使用する遺伝子導入によって、達成されることができる。
【００７７】
理論によって拘束されないが、パーキンソン病を有する個体又は該疾病を発生する危険性がある個体のドーパミン作動性細胞におけるＧＵＣＹ２Ｃの該シグナル伝達のモジュレーション、好ましくはそれを増加させること、は、該細胞におけるＴｈ活性をモジュレートする、好ましくは増加させる、と考えられる。該処置は、ＰＤを有する個体又はその危険性がある個体における運動異常を軽減する。この酵素は、ドーパミン産生における律速段階を触媒することによって、生合成経路全体の全体的な速度を設定する。Ｔｈは、Ｎ末端の調節ドメイン、中央の触媒ドメイン及びＣ末端の四量体化ドメインを有する（Tekin  I  et  al.,  2014）。Ｔｈ活性を増加させる為の最も魅力的なドメインは、Ｎ末端領域に位置し、それは、リン酸化の影響を受けやすい３つのセリン（すなわちＳｅｒ１９、Ｓｅｒ３１及びＳｅｒ４０）を含む。これらの残基の調節の重要さは、それらの幅広い進化的保存に反映されている（図１）。Ｓｅｒ３１及びＳｅｒ４０の独立したリン酸化は、インビトロ及びインシチュ（in  situ）でＴｈ活性を増加させることが知られている。Ｓｅｒ３１リン酸化は、その補助因子（すなわちＢＨ４）の１つについてＴｈの親和性を上昇させることによって独占的に作動する一方、Ｓｅｒ４０は、ドーパミンとＴｈの該触媒ドメインとの相互作用を遮断することによってネガティブフィードバックループも妨げる（Dunkley  PR  et  al.,  2004）。従って、Ｓｅｒ４０は有望な標的であり、及び本発明者等は、そのリン酸化の強化が、レボドパ処置の重要な制限を解決すると考えている。
【００７８】
本発明の目的は、中脳において特異的にＳｅｒ４０リン酸化を誘発することによって、Ｔｈ活性を増加させることである。この残基をリン酸化することが知られている主なキナーゼは、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ及びｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ（それぞれ、ＰＫＡ及びＰＫＧ）である（Campbell  DG  et  al.,  1986;  Roskoski  R  Jr  et  al.,  1987）。両方の酵素は、調節領域と触媒中心との相互作用に起因して、基本的に不活性である。ＰＫＡの調節対応物及び触媒対応物は、個々のポリペプチドに対応するが、ＰＫＧは、両方のドメインを含む単一のアミノ酸鎖である。活性化される為に、両方のキナーゼは、対応する環状ヌクレオチドと該酵素の該調節領域との相互作用に依存し、従って、該触媒中心が異なる基質をリン酸化する為に放出される（Scholten  A  et  al.,  2008）。それらの様々な標的の中でも、ＴｈにおけるＳｅｒ４０が、本発明における好ましい標的である。
【００７９】
脳における粒子状のグアニリルシクラーゼ２Ｃ（ＧＵＣＹ２Ｃ）がGong  R  et  al.,  2011によって報告された。同一の観察が、Ａｌｌｅｎ  Ｂｒａｉｎ  Ａｔｌａｓに登録されている。ＧＵＣＹ２Ｃの発現は、Ａ８〜Ａ１０ニューロンに制限される。１０年未満前まで、この受容体は、消化管において独占的に発現され、これは、内因性リガンド、例えばグアニリン、ウログアニリン、又は大腸菌によって分泌される熱安定性毒素（ＳＴ毒素）、と相互作用すると考えられていた。活性化に応じて、この受容体はｃＧＭＰを産生し、そして最終的に、外向きの塩素チャネル（outward-chlorine  channel）（ＣＦＴＲ）を刺激すること、及び内向きのナトリウムチャネル（inward-sodium  channel）（ＮＨＥ３）を阻害することによって、水分吸収を減少させる（Fiskerstrand  T  et  al.,  2012）。
【００８０】
本発明は、ＧＵＣＹ２Ｃの活性化が、Ｓｅｒ４０リン酸化、従って中脳において特異的にＴｈ活性を増加させることを示す。理論によって拘束されないが、これは２つの機構によって達成されると考えられている。ｃＧＭＰの産生は、ＰＫＧを活性化し、且つｃＡＭＰのその非環状形態への破壊に関与する酵素であるホスホジエステラーゼ３の阻害によってＰＫＡを間接的に活性化する（図２）（Fiskerstrand  T  et  al.,  2012）。
【００８１】
本アプローチは、それが、黒質線条体路に影響を及ぼし、ドーパミン合成及びその最終的な放出を誘発する能力を維持するので、脳における特異性の問題に対処する。Ｔｈは、中脳においてＧＵＣＹ２Ｃと共発現され、及びＧＵＣＹ２Ｃノックアウトマウスは、それらの野生型（ｗｔ）同腹仔と比較して、線条体におけるより少ないドーパミン放出を示す（Gong  R  et  al.,  2011）。
【００８２】
明確性且つ簡潔な記載の目的の為に、特徴が、同じ又は個々の実施態様の一部として本明細書に記載され、しかしながら、本発明の範囲は、記載されている該特徴の全て又は幾つかの組み合わせを有する実施態様を包含しうることが理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】異なる種にわたるＴｈ調節ドメインの多重配列アライメント（Multiple  sequence  alignment）。３つの強調されたセリン残基（Ｓｅｒ１９、Ｓｅｒ３１及びＳｅｒ４０）は、リン酸化の影響を受けやすく、進化を通じて、十分に保存されている。Ｓｅｒ３１及びＳｅｒ４０のリン酸化は、酵素の増加された活性と直接的に相関する。両方の残基の周囲のアミノ酸が事実上変化せず、それによってコンセンサス配列が保存され、なぜそれらのセリンが異なる生物体においてリン酸化されるかを説明することに留意されたい。「＊」は、最大の保存を表し、それに「：」及び「．」が続く。[Xenopus.laevis]  アフリカツメガエル[Columba.livia  カワラバト[Gallus.gallus]   セキショクヤケイ[Pseudopodoces.humilis]  ヒメサバクガラス[Zonotrichia.albicollis]  ノドジロシトド[Orcinus.orca]  シャチ[Ovis.aries]  ヒツジ[Bos.taurus]  ウシ[Mus.musculus]  ハツカネズミ[Rattus.norvegicus]  ドブネズミ[Pan.troglodytes]  チンパンジー[Homo.sapiens]  ヒト[Felis.catus]  ネコ[Odobenus.rosmarus]  セイウチ[Canis.lupus]  オオカミ
【図２】ＧＵＣＹ２Ｃの活性化が増加されたＴｈ活性をもたらす可能性がある仮説上の経路。１つの代替は、ｃＧＭＰによるＰＫＧの直接的な活性化であり、一方、他の代替は、ｃＡＭＰをその非環状形態への分解に関与する酵素であるＰＤＥ３のｃＧＭＰが媒介する阻害を介したＰＫＡの間接的な活性化からなる。
【図３Ａ】ＨＥＫ細胞は、ＧＵＣＹ２Ｃが誘発するＳｅｒ４０リン酸化を研究する為の好適なモデルである。（図３Ａ）インタクトＨＥＫ抽出物からのＲＴ−ｑＰＣＲデータ。インプット材料（Input  material）は、１０ｎｇの総ＲＮＡであった。Ｃｐは、発現が陽性とみなされ始めるサイクル数に相当する。（−）は、全ての場合において陰性である水対照を表す。
【図３Ｂ】ＨＥＫ細胞は、ＧＵＣＹ２Ｃが誘発するＳｅｒ４０リン酸化を研究する為の好適なモデルである。（図３Ｂ）ＨＥＫ培養物は、Ｔｈでトランスフェクションされ、プレーティングの４８時間後にｃＧＭＰ類似体で処置された。Ｓｅｒ４０リン酸化における変化が研究された。グラフは統計分析を表す（ｎ＝６；平均±ＳＥＭ）。対応のないスチューデントのｔ検定（Unpaired  Student’s  t-test）（ｐ値：＊＊＊＊＜０．０００１）。ここで、「倍数変化」は比Ｐ−Ｓｅｒ４０／総Ｔｈに対応する。
【図４Ａ】ＧＵＣＹ２Ｃの活性化は、Ｓｅｒ４０リン酸化を増加させる。Ｔｈ又はＴｈ＋ＧＵＣＹ２ＣでトランスフェクションされたＨＥＫ培養物の免疫細胞化学画像（図４Ａ）。
【図４Ｂ】ＧＵＣＹ２Ｃの活性化は、Ｓｅｒ４０リン酸化を増加させる。Ｔｈ又はＴｈ＋ＧＵＣＹ２ＣでトランスフェクションされたＨＥＫ培養物のウェスタンブロッティング分析（図４Ｂ）。
【図４Ｃ】ＧＵＣＹ２Ｃの活性化は、Ｓｅｒ４０リン酸化を増加させる。（図４Ｃ）共トランスフェクションされたＨＥＫ細胞は、グアニリン（Ｇ）又はウログアニリン（ＵｒｏＧ）で処置され、そしてＳｅｒ４０リン酸化における変化が研究された。グラフは統計分析を表す（対照についてｎ＝３；グアニリンについてｎ＝６；ウログアニリンについてｎ＝９；平均±ＳＥＭ）。対応のないスチューデントのｔ検定（ｐ値：＊＊＜０．０１）。
【図５Ａ】Ｓｅｒ４０リン酸化における増加は、ＧＵＣＹ２Ｃ刺激に応じてｃＧＭＰの産生された量に比例する。（図５Ａ）ＨＥＫ培養物は、ＩＢＭＸの存在下又は非存在下でグアニリンで処置された。グラフは統計分析を示す（対照±グアニリンについてｎ＝３；ＩＢＭＸ±グアニリンについてｎ＝６；平均±ＳＥＭ）。対応のないスチューデントのｔ検定（ｐ値：＊＊＊＊＜０．０００１、＊＊＜０．０１、＊＜０．０５）。
【図５Ｂ】Ｓｅｒ４０リン酸化における増加は、ＧＵＣＹ２Ｃ刺激に応じてｃＧＭＰの産生された量に比例する。（図５Ｂ）ＨＥＫ細胞は、Ｔｈ、及びｗｔＧＵＣＹ２Ｃ又は機能獲得変異体（gain-of-function  mutant）（Ｒ７９２Ｓ）のいずれかで共トランスフェクションされた。Ｓｅｒ４０リン酸化は、グアニリン処置（Ｇ）の後に研究された。グラフは統計分析を示す（ｗｔについてｎ＝４；ｗｔ＋グアニリンについてｎ＝４；Ｒ７９２Ｓ±グアニリンについてｎ＝４；平均±ＳＥＭ）。対応のないスチューデントのｔ検定（ｐ値：＊＊＊＜０．００１、＊＊＜０．０１）。
【図６】ＰＤＥ２ａは、ＭＮ９Ｄ細胞においてＳｅｒ４０リン酸化を調節する重要なエフェクターである。ＭＮ９Ｄ培養物は、ＰＤＥ２Ａ選択的阻害剤である、ＩＢＭＸ又はＢＡＹ−６０−７５５０（５０μＭ）で処置された。細胞は、Ｓｅｒ４０のリン酸化、総Ｔｈ及びアクチンについて、ウェスタンブロッティングで分析された。グラフは分析を示す（ｎ＝２、平均±ＳＥＭ）。
【図７】ＰＤＥ２ａは、ＭＮ９Ｄ細胞においてＳｅｒ４０リン酸化を調節する重要なエフェクターである。ＭＮ９Ｄ細胞（ｎ＝９、赤色）及びＨＥＫ細胞（ｎ＝４、青色）におけるＢＡＹ−６０−７５５０の用量曲線及び代表例（平均±ＳＥＭ）。細胞は、様々な濃度のＢＡＹ  ６０−７７５０で処置され、そしてＳｅｒ４０におけるＴｈリン酸化、総Ｔｈ及びアクチンについて分析された。ドーパミン作動性モデルにおけるＩＣ５０が、ＨＥＫ細胞が何らかの効果をほとんど示さない濃度である１μＭであることに留意されたい。
【図８】ヒト前頭前野ニューロンとヒト中脳ドーパミンニューロンとの間でのＲＮＡ発現の相対的富化。負の値（Ｌｏｇ２）は、中脳ドーパミンニューロンにおける転写物の過剰出現を表す。死後のＲＮＡｓｅｑ分析に由来する。
【図９】ＰＤＥ１１ａは、中脳ドーパミンニューロンを含む領域において富化される。全脳と比較した、ドーパミン作動性ニューロンを含む領域におけるＰＤＥ１１Ａの相対富化を示すグラフ。データは、公開的に利用可能なウェブサイトＡｌｌｅｎ  Ｂｒａｉｎ  Ａｔｌａｓ及びヒト対象のマイクロアレイデータのデータベースから収集された。３つのバーは、３つの異なるマイクロアレイプローブを示す。
【図１０】ＰＤＥ１１は、ＭＮ９Ｄ細胞においてＳｅｒ４０リン酸化を調節する重要なエフェクターである。ＭＮ９Ｄ（ｎ＝２）におけるＢＣ  １１−３８の用量曲線及び代表例（平均±ＳＥＭ）。ＩＢＭＸは、対照としての役割を果たし、且つ１００μＭで用いられた。細胞は、Ｓｅｒ４０におけるＴｈのリン酸化について分析され、及び総Ｔｈは、リン酸化特異的効果を決定する為に、ローディング対照として用いられた。
【図１１−１】幾つかのＰＤＥ２ａ阻害剤の構造。
【図１１−２】幾つかのＰＤＥ２ａ阻害剤の構造。
【図１２】幾つかのＰＤＥ２ａ阻害剤のＩＣ５０値。
【図１３Ａ】ＢＡＹ  ６０−７５５０及びグアニリンは相乗作用を与えて、Ｓｅｒ４０リン酸化を誘発する。示された化合物で処置された線条体の切片の分析。セリン４０におけるＴｈのリン酸化を示すＷＥＳデータは、総Ｔｈレベル（ａ）と同様に示されている。左から右に、吻側（rostral）から尾側（caudal）への連続的な線条体の切片である。全ての切片は、左半球及び右半球に分けられ、化合物又はビヒクルのいずれかで処置される。左側に陽性対照（positive  control：Ｃｔｒｌ＋）及び陰性対照（negative  control：Ｃｔｒｌ−）が示されている（Ｔｈ又は空のベクターでトランスフェクションされたＮｅｕｒｏ２ａ細胞）。
【図１３Ｂ】ＢＡＹ  ６０−７５５０及びグアニリンは相乗作用を与えて、Ｓｅｒ４０リン酸化を誘発する。示された化合物で処置された線条体の切片の分析。Ｔｈ  Ｓｅｒ４０の量は、総Ｔｈの量に対して補正され、且つ棒グラフ（ｂ）に示されている。それぞれの個々の切片は、異なる記号によって示されている。有意性が、両側の対応のあるｔ検定（2-tailed  paired  t-test）を用いて決定される。両側の対応のあるｔ検定：ｐ＝０．００６。
【図１４Ａ】ＢＡＹ  ６０−７５５０及びグアニリンは相乗作用を与えて、Ｓｅｒ４０リン酸化を誘発する。示された化合物で処置された線条体の切片の分析。セリン４０におけるＴｈのリン酸化を示すＷＥＳデータは、総Ｔｈレベル（ａ）と同様に示されている。左から右に、吻側から尾側への連続的な線条体の切片である。全ての切片は、左半球及び右半球に分けられ、化合物又はビヒクルのいずれかで処置される。左側に陽性対照及び陰性対照が示されている（Ｔｈ又は空のベクターでトランスフェクションされたＮｅｕｒｏ２ａ細胞）。
【図１４Ｂ】ＢＡＹ  ６０−７５５０及びグアニリンは相乗作用を与えて、Ｓｅｒ４０リン酸化を誘発する。示された化合物で処置された線条体の切片の分析。Ｔｈ  Ｓｅｒ４０の量は、総Ｔｈの量に対して補正され、棒グラフ（ｂ）に示されている。それぞれの個々の切片は、異なる記号によって示されている。有意性が、両側の対応のあるｔ検定を用いて決定される。両側の対応のあるｔ検定：ｐ＝０．４０３。
【図１５Ａ】ＢＡＹ  ６０−７５５０及びグアニリンは相乗作用を与えて、Ｓｅｒ４０リン酸化を誘発する。示された化合物で処置された線条体の切片の分析。セリン４０におけるＴｈのリン酸化を示すＷＥＳデータは、総Ｔｈレベル（ａ）と同様に示されている。左から右に、吻側から尾側への連続的な線条体の切片である。全ての切片は、左半球及び右半球に分けられ、化合物又はビヒクルのいずれかで処置される。左側に陽性対照及び陰性対照が示されている（Ｔｈ又は空のベクターでトランスフェクションされたＮｅｕｒｏ２ａ細胞）。
【図１５Ｂ】ＢＡＹ  ６０−７５５０及びグアニリンは相乗作用を与えて、Ｓｅｒ４０リン酸化を誘発する。示された化合物で処置された線条体の切片の分析。Ｔｈ  Ｓｅｒ４０の量は、総Ｔｈの量に対して補正され、棒グラフ（ｂ）に示されている。それぞれの個々の切片は、異なる記号によって示されている。有意性が、両側の対応のあるｔ検定を用いて決定される。両側の対応のあるｔ検定：ｐ＝０．０１８。
【図１６Ａ】ＢＡＹ  ６０−７５５０及びグアニリンは相乗作用を与えて、Ｓｅｒ４０リン酸化を誘発する。示された化合物で処置された線条体の切片の分析。セリン４０におけるＴｈのリン酸化を示すＷＥＳデータは、総Ｔｈレベル（ａ）と同様に示されている。左から右に、吻側から尾側への連続的な線条体の切片である。全ての切片は、左半球及び右半球に分けられ、化合物又はビヒクルのいずれかで処置される。左側に陽性対照及び陰性対照が示されている（Ｔｈ又は空のベクターでトランスフェクションされたＮｅｕｒｏ２ａ細胞）。
【図１６Ｂ】ＢＡＹ  ６０−７５５０及びグアニリンは相乗作用を与えて、Ｓｅｒ４０リン酸化を誘発する。示された化合物で処置された線条体の切片の分析。Ｔｈ  Ｓｅｒ４０の量は、総Ｔｈの量に対して補正され、棒グラフ（ｂ）に示されている。それぞれの個々の切片は、異なる記号によって示されている。有意性が、両側の対応のあるｔ検定を用いて決定される。両側の対応のあるｔ検定：ｐ＝０．０７３。
【図１７Ａ】ＢＡＹ  ６０−７５５０及びグアニリンは相乗作用を与えて、Ｓｅｒ４０リン酸化を誘発する。示された化合物で処置された線条体の切片の分析。セリン４０におけるＴｈのリン酸化を示すＷＥＳデータは、総Ｔｈレベル（ａ）と同様に示されている。左から右に、吻側から尾側への連続的な線条体の切片である。全ての切片は、左半球及び右半球に分けられ、化合物又はビヒクルのいずれかで処置される。左側に陽性対照及び陰性対照が示されている（Ｔｈ又は空のベクターでトランスフェクションされたＮｅｕｒｏ２ａ細胞）。
【図１７Ｂ】ＢＡＹ  ６０−７５５０及びグアニリンは相乗作用を与えて、Ｓｅｒ４０リン酸化を誘発する。示された化合物で処置された線条体の切片の分析。Ｔｈ  Ｓｅｒ４０の量は、総Ｔｈの量に対して補正され、棒グラフ（ｂ）に示されている。それぞれの個々の切片は、異なる記号によって示されている。有意性が、両側の対応のあるｔ検定を用いて決定される。両側の対応のあるｔ検定：ｐ＝０．０２４。
【図１８Ａ】ＧＵＣＹ２Ｃリガンド分析。潜在的なＧＵＣＹ２Ｃリガンドは、ＧＵＣＹ２Ｃ及びＴｈでトランスフェクションされたＨＥＫ−２９３細胞において試験され、そして引き続き、処置され、そして自動ウエスタン（ＷＥＳ）によって分析された。Ｔｈ  Ｓｅｒ４０は、総Ｔｈに対して補正された。対照が、１に設定された。有意性は、ｎ＝３で、両側ｔ検定によって決定される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊＊ｐ＜０．００１。Ａ）グアニリン対照１０μＭ。
【図１８Ｂ】ＧＵＣＹ２Ｃリガンド分析。潜在的なＧＵＣＹ２Ｃリガンドは、ＧＵＣＹ２Ｃ及びＴｈでトランスフェクションされたＨＥＫ−２９３細胞において試験され、その後処置され、自動ウエスタン（ＷＥＳ）によって分析された。Ｔｈ  Ｓｅｒ４０は、総Ｔｈに対して補正された。対照が、１に設定された。有意性は、ｎ＝３で、両側ｔ検定によって決定される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｂ）１０μＭの量におけるペプチド１〜ペプチド５。
【図１８Ｃ】ＧＵＣＹ２Ｃリガンド分析。潜在的なＧＵＣＹ２Ｃリガンドは、ＧＵＣＹ２Ｃ及びＴｈでトランスフェクションされたＨＥＫ−２９３細胞において試験され、その後処置され、自動ウエスタン（ＷＥＳ）によって分析された。Ｔｈ  Ｓｅｒ４０は、総Ｔｈに対して補正された。対照が、１に設定された。有意性は、ｎ＝３で、両側ｔ検定によって決定される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｃ）１０μＭの量におけるペプチド６〜ペプチド１１。
【００８４】
実施例
実施例１
材料及び方法
ＩＢＭＸ又はＢＡＹ−６０−７５５０は、ｃｈｅｍｃｒｕｚ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手された。ＨＥＫ細胞は、ＡＴＣＣから入手された。
【００８５】
細胞培養
ＨＥＫ細胞は、１００ｍｍのペトリ皿において維持され、そしてＬ−グルタミン、ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐｅｎ＆Ｓｔｒｅｐ）及び１０％の熱失活されたウシ胎仔血清（ＨＩＦＢＳ：heat-inactivated  fetal  bovine  serum）で補充されたＤＭＥＭ培地中で成長された。成長条件は、３７℃及び５％のＣＯ２であった。１日おきの継代の為に、ＨＥＫ培養物は、１：３希釈で分割された。金曜日から月曜日まで、分割割合は、全ての細胞株について２倍にされた。継代の為に、培養物は、ＰＢＳですすがれ、そして１ｍＬのトリプシンと共に５分間インキュベートされた。細胞は、成長培地に再懸濁され、そして最後に、適した希釈に分割された。実験は、１２ウェルプレートにおいて行われた。免疫細胞化学分析の為に、無菌の１８ｍｍカバースリップが、プレーティングの前に加えられた。５００μＬの細胞再懸濁物は、それぞれのウェルに播種された。実験がプレート調製の４８時間後に行われるならば、１：５が、ＨＥＫ細胞についての播種比であった。実験が、プレーティングの９６時間後に行われる場合、１：７が、ＨＥＫ細胞についての作業希釈であった。特に明記されない限り、ＨＥＫ培養物は、プレーティングの９６時間後に処理された。
【００８６】
細胞トランスフェクション
マウスＴｈ及びヒトＧＵＣＹ２Ｃをコードするプラスミドは、ｐｃＤＮＡ３．１バックボーン（backbone）を有していた。ＨＥＫ細胞は、リン酸カルシウム法を用いて、トランスフェクションされた。１２ウェルプレートは、トランスフェクションの前に、５００μＬの成長培地でリフレッシュされた。ウェルのそれぞれのペアについて、目的のプラスミドは、２．５μｇを超えず、空のコンストラクトｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔで５μｇまで満たされた。プラスミド混合物は、１１０μＬの総体積中、２５０ｍＭのＣａＣｌ２の最終濃度に入れられた。補充チューブは、１１０μＬのＨＥＰＥＳ緩衝食塩水２Ｘ（ＨＥＢＳ  ２Ｘ：１．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０５、２８０ｍＭのＮａＣｌ）で満たされた。ＣａＣｌ２を有する該チューブは、該ＨＥＢＳにピペットで滴下され、そして穏やかに混合された。６０秒のインキュベーション後、５５μＬの最終混合物は、それぞれのウェルに添加された。該培地は、次の２４時間以内に取り替えられた。
【００８７】
化学処置
異なる化合物の投与の２４時間前に、細胞は、Ｌ−グルタミン及びＰｅｎ＆Ｓｔｒｅｐで補充されたＤＭＥＭ培地で血清不足にされた。特に明記されない限り、異なる試薬の濃度は、表１において報告されており、及び該処置の時間は１時間であった。
【００８８】
ウェスタンブロッティング
細胞は、１５０μＬのＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（２％のＳＤＳ、１０％のグリセロール、６０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ６．８、０．０１％のブロモフェノールブルー、５０ｍＭの新たに添加されたＤＴＴ）中に採取された。ウェルは、２つ１組で重複され、そして変動を最小化する為に同じチューブにプールされた。試料は、３分間、最大効力で超音波処理され、９５℃で５分間加熱され、そしてローディングの前に簡単に遠沈された。ランニングゲルは、ＧＵＣＹ２Ｃ検出を除いて１０％のポリアクリルアミドであり、それは７％ゲル（３７５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．８、０．１％のＡＰＳ、０．１％のＳＤＳ、０．０４％のＴＥＭＥＤ）において最適であった。スタッキングゲルは、５％ポリアクリルアミド（１２５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ６．８、０．１％のＡＰＳ、０．１％のＳＤＳ、０．０４％のＴＥＭＥＤ）であった。
【００８９】
最大で３５μＬの試料が、それぞれのスロットにロードされ、そしてｔｒｉｓ−グリシン緩衝液及び０．１％のＳＤＳの存在下で実行された。ランニング条件は、最初の２０分間は１００Ｖ、続いて泳動の先頭が該ゲルの下部に達するまで、１６０Ｖであった。移動は、ｔｒｉｓ−グリシン緩衝液及び２０％のメタノールの存在下で、０．２μｍのニトロセルロース膜において１００Ｖで行われた。ブロッティングの時間は、０．１％のＳＤＳの存在下で２４０分間移動されたＧＵＣＹ２Ｃの検出を除いて、１４０分であった。次に、膜は、ブロッティング効率をチェックする為に、Ｐｏｎｃｅａｕ  Ｓ溶液（０．１％のＰｏｎｃｅａｕ  Ｓ、５％の酢酸）に浸された。ＤＥＭＩ水による数回の洗浄後、ブロットは、５％の粉乳及びＴＢＳ−Ｔ（１５４ｍＭのＮａＣｌ、４９．５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．４、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）の存在下で、１時間インキュベートされた。一次抗体とのインキュベーションは、ＴＢＳ−Ｔ中、一晩、４℃で行われた（希釈及び種について表２を参考にされたい）。膜は、１時間ＴＢＳ−Ｔ中ですすがれて、過剰の抗体が除去された。二次抗体とのインキュベーションは、室温で６０分間行った（ＴＢＳ−Ｔ中１：１０，０００希釈、１：２０，０００で希釈されたヤギ二次抗体を除く）。二次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼと融合され、そして該一次抗体の宿主種に対して産生された。１時間の追加の洗浄後、ブロットは、強化された化学発光溶液に曝露され、シグナルは、Ｏｄｙｓｓｅｙイメージャー（ＬＩ−ＣＯＲ）を用いて検出された。バンド濃度測定は、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｌｉｔｅで行われた。グラフの定量化の為に、「倍数変化」は、Ｐ−Ｓｅｒ４０／総Ｔｈの比を表す。群のペアの間の統計比較は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍで計算される対応のないスチューデントのｔ検定に相当する。アスタリスクは、以下のｐ値を表す：＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１、＊＊＊＊＜０．０００１。
【００９０】
免疫細胞化学
成長培地が、１８ｍｍのカバースリップを含む該１２ウェルプレートから除去された。氷冷ＰＢＳでの洗浄工程の後、細胞は、４％のパラホルムアルデヒド中、２０分間固定され、そして引き続き、ＰＢＳ（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２．７ｍＭのＫＣｌ）で３回洗浄された。ブロッキングは、４％の胎仔ロバ血清及び０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在下で、１時間行われた。次に、カバースリップは、ＰＢＳ及び０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に希釈された該一次抗体と共に、一晩、４℃でインキュベートされた（抗体の情報については表２を参照されたい）。該細胞をＰＢＳで３回すすいだ後、該二次抗体とのインキュベーションを、室温で２時間行った（ＰＢＳ中１：１，０００希釈）。ＰＢＳによる追加の洗浄工程は、ＰＢＳ中１：３，０００で希釈されたＤＡＰＩとの５分間のインキュベーションに先行した。ＰＢＳによる最後のすすぎの後、カバースリップは、６０×２０ｍｍのスライドにＦｌｕｏｒｏｓａｖｅを用いて埋め込まれた。最終調製物は、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）下で分析を行う前に、一晩、４℃で硬化された。
【００９１】
ＲＮＡ単離及びＲＴ−ｑＰＣＲ
該成長培地は培養皿から廃棄され、そして１ｍＬのトリゾールがそれぞれのウェルに添加された。細胞は、該プレート中で直接的に溶解され、エッペンドルフチューブ中に採取された。２００μＬのクロロホルムが添加され、そして混合物が、激しい振とう後に３分間インキュベートされた。試料は、１２，０００ｒｃｆで、４℃で１５分間、遠心分離された。次に、上部水性相が、新しいチューブに集められ、下部相は廃棄された。１０μｇのグリコーゲン及び５００μＬのイソプロパノールが該調製物に添加された。１０分のインキュベーション後、試料は、１２，０００ｒｃｆで、４℃で１０分間、遠心分離された。上清は、該チューブから注意深く除去され、ペレットはその後、１ｍＬの７５％のエタノールですすがれた。簡易のボルテックス工程に続いて、１２，０００ｒｃｆで、４℃で５分間、遠心分離された。上清は廃棄され、そして該ペレットが適度に乾燥されると、再懸濁を３０μＬのＲＮＡｓｅを含まない水中で行った。ＲＴ−ｑＰＣＲ分析に関して、精製されたＲＮＡ試料は、２．６ｎｇ／μＬの最終濃度に希釈された。それぞれの反応ウェルについて、該異なる試薬の体積は以下であった：５μＬのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ緩衝液２Ｘ、０．１μＬの逆転写酵素、０．１μＬのＲＮＡｓｅ阻害剤、０．５μＬのフォワードプライマー１０μＭ、０．５μＬのリバースプライマー１０μＭ、３．８μＬの精製ＲＮＡ  ２．６ｎｇ／μＬ。反応は、QuantiTect  SYBR  Green  RT-PCR  handbook（Quiagen）に従い、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０（Ｒｏｃｈｅ）において行われた。リボソームＲＮＡ  １８Ｓは、ローディング対照として用いられた。プライマーは、プライマー−ＢＬＡＳＴを用いて設計され、及びそれらの特異性は、ＲＴ−ｑＰＣＲが完了すると、１．５％のアガロースゲルにおいて試験された。
【００９２】
結果
ＨＥＫ細胞は、ＧＵＣＹ２Ｃ活性化に応じてＳｅｒ４０リン酸化の誘発を研究する為に用いられることができる。
【００９３】
本発明者等は、インビトロでのＧＵＣＹ２Ｃ活性化を介したＴｈの調節を研究した。入手可能である様々な細胞株の中で、ＨＥＫ細胞が、容易にトランスフェクション可能であり、ｃＧＭＰ産生におけるＧＵＣＹ２Ｃの役割を研究する為に以前に使用されていたので、本発明者等は最初に、ＨＥＫ細胞を利用した（Fiskerstrand  T  et  al.,  2012；Muller  T  et  al.,  2015）。本発明者等は、キナーゼをコードするｍＲＮＡの存在をチェックした。ＲＴ−ｑＰＣＴデータは、ＰＫＧの異なるアイソフォーム（ＰＲＫＧ１及びＰＲＫＧ２）の陽性の発現、及びＰＫＡ（ＰＲＫＡＣＡ及びＰＲＫＡＣＢ）の触媒中心を示し、及びＨＥＫ細胞が本発明者等の目的の為に好適なモデルであることを示唆した（図３Ａ）。しかしながら、ＴＨもＧＵＣＹ２Ｃも、この細胞株において内因性発現されない。ｃＧＭＰ誘発シグナル伝達がＳｅｒ４０リン酸化を促進することができるかをチェックする目的で、本発明者等は、ＴｈをコードするプラスミドでＨＥＫ細胞をトランスフェクションし、そしてそれらを人工ｃＧＭＰ類似体（すなわち、８−ブロモ−ｃＧＭＰ）で処置した。予想通り、本発明者等は、化合物の投与に応じて、Ｐ−Ｓｅｒ４０レベルの少ないが有意な増加を検出した（図３Ｂ）。
【００９４】
次に、Ｔｈリン酸化におけるＧＵＣＹ２Ｃ活性化の潜在的な効果を研究する為に、本発明者等は、両方のタンパク質をコードする該プラスミドでの共トランスフェクションを行った。ウェスタンブロッティング分析は、Ｔｈ及びＧＵＣＹ２Ｃを発現するＨＥＫ培養物を明らかにした。Ｔｈでの単独トランスフェクションは、ＧＵＣＹ２Ｃ発現及び認識についての対照としての役割を果たした（図４Ｂ）。免疫細胞化学分析は、本発明者等が、受容体及びＳｅｒ４０リン酸化の間の潜在的な関連を研究する為の必須の要件である、両方のタンパク質を共発現する個々の細胞を特定することを可能にした（図４Ａ）。最も重要なことには、Ｔｈ及びＧＵＣＹ２Ｃが共トランスフェクションされながら該キナーゼが内因性発現されるこの実験的パラダイム内で、本発明者等は、異なる受容体のリガンド（すなわち、グアニリン及びウログアニリン）のそれぞれの投与の際に、Ｐ−Ｓｅｒ４０レベルを増加させることが可能であった（図４Ｃ）。
【００９５】
ＧＵＣＹ２Ｃ活性化に応じてのＰ−Ｓｅｒ４０の誘発は、ｃＧＭＰのレベルに比例する
該受容体の活性化がＳｅｒ４０リン酸化を誘発する可能性がある２つの方法に関して、両方ともｃＧＭＰの初期産生に依存する（Fiskerstrand  T  et  al.,  2012）。この仮定を試験する為に、本発明者等は、グアニリンをホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）の一般的な阻害剤であるＩＢＭＸの投与と組み合わせた。この酵素のファミリーは、環状ヌクレオチドをそれらの非環状形態に破壊する（Bender  AT  and  Beavo  JA,  2006）。それ故に、環状変異体はＰＫＡ及びＰＫＧを活性化することができるので、本発明者等は、ＰＤＥを阻害することで、ＧＵＣＹ２Ｃ刺激の際にＰ−Ｓｅｒ４０の誘発を高めるであろうと仮説を立てた。驚くべきことに、ＩＢＭＸによる処置は、グアニリン投与と比較して、Ｓｅｒ４０リン酸化における増加を高めた（図５Ａ）。これらのデータは、ＨＥＫ細胞における環状ヌクレオチドの基底プールが、大きく、且つネガティブフィードバック機構としてＰＤＥによる分解に連続して付されることを示す。グアニリンのＩＢＭＸとの組み合わせ処置は、ＩＢＭＸ単独に関連するＳｅｒ４０リン酸化を更に増加させ、環状ヌクレオチドの該基底プール及びＧＵＣＹ２Ｃ由来プールが相加効果を示すことを示唆した（図５Ａ）。
【００９６】
しかしながら、ＩＢＭＸは一般的なＰＤＥ阻害剤である故に、Ｓｅｒ４０リン酸化に対するその効果は、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの両方のレベルの増加から生じる。Ｓｅｒ４０リン酸化の程度を該受容体によって産生されたｃＧＭＰの量だけと相関させる為に、本発明者等は、代替アプローチを考案した。以前の論文は、一連の機能獲得受容体を与えるＧＵＣＹ２Ｃをコードする遺伝子において、ヒトの天然に存在する変異の存在を記載していた（Muller  T  et  al.,  2015）。これらの変異体は、グアニリンの存在下でｗｔ形態よりも多くのｃＧＭＰを産生する。最も高い活性を有する変異体は、触媒ドメインの開始ポイントに位置する、７９２位におけるアルギニンのセリンへの置換（Ｒ７９２Ｓ）を含む。
【００９７】
ＨＥＫ培養物は、Ｔｈと、ＧＵＣＹ２Ｃの該ｗｔ又はＲ７９２Ｓ変異体のいずれかとをコードするプラスミドで共トランスフェクションされた。ｗｔ受容体と比較された場合、グアニリン処置の際のＳｅｒ４０リン酸化の上昇は、Ｒ７９２Ｓ変異体が共トランスフェクションされた場合よりも１．５倍高かった（図５Ｂ）。
【００９８】
ＩＢＭＸは非選択的ＰＤＥ阻害剤であり、それ故に、本発明者等は、Ｓｅｒ４０リン酸化における特異的ＰＤＥを選択的に阻害する効果を調査した。Ｓｅｒ４０リン酸化におけるＰＤＥ２Ａ阻害の効果を研究する為に、本発明者等は、ドーパミン作動性細胞株のＭＮ９ＤをＢＡＹ−６０−７５５０で処置し、効果を分析した。ＢＡＹ−６０−７７５０は、Ｓｅｒ４０のリン酸化の４倍を超える増加をもたらし、半分の濃度ではあるがＩＢＭＸよりも良好に機能した（図６）。ＢＡＹ  ６０−７７５０は、該ドーパミン作動性細胞株ＭＮ９Ｄにおいて非常に良好に機能した故に、本発明者等は、ＭＮ９Ｄ細胞におけるＢＡＹ  ６０−７７５０の効果を、Ｔｈでトランスフェクションされた非ドーパミン作動性ＨＥＫ２９３細胞と比較した。ＢＡＹ  ６０−７５５０で処置された細胞の用量反応曲線は、ＰＤＥ２Ａ阻害がＭＮ９Ｄ細胞においてより完全な効果を有することを明確に示す。低濃度のＢＡＹ  ６０−７７５０は、Ｓｅｒ４０リン酸化の増加の明確な倍数変化をもたらすが、ＨＥＫ−２９３細胞においてほとんど効果は観察されず（図７）、ドーパミン作動性細胞に対する特異性を示唆する。
【００９９】
次に、本発明者等は、追加の選択的ＰＤＥ阻害剤として、Ｓｅｒ４０におけるＴｈリン酸化に対するＰＤＥ１１阻害剤の効果を調査した。ａｌｌｅｎ  ｂｒａｉｎ  ａｔｌａｓ（https://www.brain-map.org/）から収集された発現データ、及びレーザーで捕捉されたドーパミンニューロンは、ＰＤＥ１１ａがヒトドーパミン作動性中脳区域において発現されること、及びドーパミンニューロンにおいてまた富化されることを示す（図８、図９）。
【０１００】
特異的ＰＤＥ１１阻害剤のＢＣ  １１−３８でのＭＮ９Ｄ細胞の処置は、総Ｔｈと比較して、Ｓｅｒ４０におけるＴｈのリン酸化の増加をもたらした（図１０）。用いられた最高濃度でのＢＣ  １１−３８は、同様に同じ濃度で用いられた陽性対照のＩＢＭＸほどよく機能せず、それは、ＰＤＥ２Ａと比較してＰＤＥ１１Ａのより低いレベルに起因しうる。
【０１０１】
本発明は、黒質線条体路においてＴｈ活性を特異的に増加させる方法を示す。本発明者等は、その調節ドメインのリン酸化に注目した。Ｓｅｒ４０リン酸化は、そのような効果を促進することが報告されている（Dunkley  PR  et  al.,  2004）。
【０１０２】
本発明は、ＧＵＣＹ２Ｃリガンド、ＰＤＥ阻害剤及び／又はそれらの組み合わせが、ドーパミン作動性細胞によるドーパミン産生を増加させる働きをすることを示す。この知見は、ＰＤの為の治療として使用される。
【０１０３】
現在のレボドパ処置は、しばしば、脳に達することができないが、末梢組織においてドーパミン合成を予防するＡＡＤＣ阻害剤で補われる（Ahlskog  JE  et  al.,  1989）。本発明の該治療は、ＳＮｐｃにおけるＧＵＣＹ２Ｃの選択的な脳の発現を与えられる特異的成分、及びＰＤＥの広範な発現によって提供される成分を提供する。ＰＤＥの阻害は、臨床処置に対する主な合併症ではない。実際に、幾つかの広く使用される薬物は、様々なオフターゲット組織において発現されるＰＤＥの阻害剤である。代表的な例は、ＰＤＥ５選択的阻害剤であるシルデナフィル（バイアグラ）である。このホスホジエステラーゼは、その効果を発揮することが意図される陰茎において発現されるが、心臓、膵臓、腎臓又は小脳においても発現される（Lin  CS,  2004）。該ドーパミン作動性中脳において発現されるＰＤＥ、例えばＰＤＥ２Ａ又はＰＤＥ１１Ａの特異的標的化は、該処置の特異性及び／又は有効性を増加させる方法として使用されることができる。
【０１０４】
実施例２
切片調製及び処置
平均５週齢の成体マウスが屠殺され、そして脳が素早く取り出され、そしてビブラトーム（vibratome）を用いて、２５０μｍの冠状セクションに薄切された。線条体を含むセクションは、顕微解剖されて、非線条体構造が除去された。半球は分けられ、そして、一方の半球は化合物で処置され、一方、逆の半球はビヒクルで処置された。切片の処置は、炭化された人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）中で生じた。処置後、切片が、試料緩衝液を含むＳＤＳに溶解され、超音波処理され、そして９５℃で加熱された。試料は、製造者の指示に従って、ＷＥＳ自動化ウェスタンシステム（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ）において分析された。
【０１０５】
ＰＤＥ２阻害及びＧＵＣＹ２Ｃ活性化は、マウス線条体におけるチロシンヒドロキシラーゼ活性化を結果としてもたらす
マウス脳におけるＰＤＥ２阻害の効果を調査する為に、脳切片を使用するエクスビボ（ex-vivo）アプローチが利用された。マウス線条体の冠状切片が、調製され、そしてａＣＳＦに希釈されたＢＡＹ−６０  ７５５０で処置され、そして引き続き、ＷＥＳ自動化ウェスタンシステムによって分析された。１０μＭのＢＡＹ  ６０−７５５０が、図１３ａに示されている通り、Ｓｅｒ４０リン酸化における増加を結果として生じた。ＢＡＹ  ６０−７７５０はＰＤＥ２を標的にし、及び本発明者等は、阻害がＴｈリン酸化に影響を与えることを観察したので、これは、両方のタンパク質が同じ細胞（コンパートメント（compartment））において発現されることを示す。従って、ＰＤＥ２は、ドーパミン作動性ニューロンにおいて発現され、及びＰＤＥ２タンパク質及びＴｈタンパク質は、中脳ドーパミン系から線条体に突出するニューロンのシナプス末端において存在する。１μＭのＢＡＹ  ６０−７５５０の濃度は、Ｓｅｒ４０リン酸化における有意な増加を結果として生じず、且つ図１４ａ及び１４ｂに示された。Ｔｈ活性化に対するＧＵＣＹ２Ｃリガンドの効果を調査する為に、該マウス線条体の冠状切片は、調製され、グアニリンで処置され、そしてＢＡＹ−６０−７５５０について行われた通り、Ｔｈ  Ｓｅｒ４０リン酸化について分析された。１０μＭのグアニリンの適用は、図１５ａに示されている通り、Ｓｅｒ４０リン酸化の増加を結果として生じた。グアニリンは、線条体切片においてＴｈ活性の増加を結果として生じたので、ＧＵＣＹ２Ｃ受容体は、該線条体に突出する中脳ドーパミンニューロンの該シナプス末端において発現される。従って、ドーパミンを産生する為の機構は、ドーパミンが放出される該シナプス末端に存在する。１μＭのグアニリンは、Ｓｅｒ４０リン酸化における有意な増加を結果として生じなかった（図１６ａ）。ＢＡＹ  ６０−７５５０及びグアニリンは両方とも、１０μＭでＴｈリン酸化を増加させたが、１μＭでは増加させなかった故に、本発明者等は、ＢＡＹ  ６０−７７５０及びグアニリンを組み合わせることの効果を１μＭで調べた。グアニリン及びＢＡＹ  ６０−７５５０の組み合わせは、Ｔｈリン酸化における有意な増加を結果として生じ、両方の化合物の組み合わせがいずれかの化合物単独よりも有効であることを示した（図１７ａ）。該ＧＵＣＹ２Ｃ受容体、ＰＤＥタンパク質及び該Ｔｈタンパク質が、同じ細胞環境中に全て存在すること、並びに上流の産物／シグナルが、経路、例えばＴｈリン酸化及びドーパミン産生、の下流の成分に影響を与えることが可能であることがまた示されている。
【０１０６】
ＧＵＣＹ２Ｃを活性化する新規ペプチド
本発明者等は、内因性ＧＵＣＹ２Ｃリガンドに関して、異なる活性を有する新規ペプチドを設計した（表３）。該ペプチドは、Ｔｈ及びＧＵＣＹ２ＣでトランスフェクションされたＨＥＫ−２９３細胞において分析され、そして引き続き、マウス線条体切片においてエクスビボ（ex-vivo）で試験された。市販のラット／マウスグアニリン（Ｃｈｅｍｃｒｕｚ）は、図１８において見ることができる通り、ＨＥＫ−２９３細胞におけるＳｅｒ４０リン酸化の中程度であるが有意な増加をもたらし、ＷＥＳシステムが伝統的なウェスタンブロッティングによって得られた結果に匹敵することを示す。本発明者等は、ウログアニリン、及び合成されたペプチドについての対照としての熱安定性毒素を合成し、従って、それらは、市販のウログアニリン及び熱安定性毒素と異なる起源由来である。驚くべきことに、ペプチド１は、ＨＥＫ−２９３細胞又はマウス線条体切片において試験された場合に何らの有意な効果を示さず、一方、ペプチド２、４、６、８、９、１０及び１１は、ＨＥＫ−２９３細胞において有意な効果を示し、及びペプチド５、９、１０は線条体切片において有意な効果を示した。ペプチド２は、線条体切片において有意ではなかったが、それは、最も大きな倍数変化を示した。おそらく、該ペプチドの効果は、刺激される該線条体における領域に依存して異なる可能性がある。
【０１０７】
引用文献
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【０１０８】
【表１】
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【０１０９】
【表２】
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【０１１０】
【表３】
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【０１１１】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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