(57)【要約】  本発明は、プロバイオティクス細菌を含む可食性植物部分または組織、ならびにプロバイオティクス細菌の生物への経口送達、および生物の胃腸管マイクロバイオームを強化および／または改善するためのそれらの使用に関する。本発明はさらに、植物組織にコロニー形成することができるプロバイオティクス細菌を選択および／または生産するための方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
可食性植物部分またはそれに由来する組織にコロニー形成する少なくとも１種のプロバイオティクス細菌で強化された前記可食性植物部分またはそれに由来する組織であって、前記プロバイオティクス細菌が、動物の胃腸（ＧＩ）管に生息することができる、可食性植物部分またはそれに由来する組織。
【請求項２】
前記可食性植物部分またはそれに由来する組織が、グラム当たり少なくとも１０４コロニー形成単位（ＣＦＵ）の前記プロバイオティクス細菌を含む、請求項１に記載の可食性植物部分または組織。
【請求項３】
前記可食性植物部分またはそれに由来する組織の少なくとも８０重量％が、グラム当たり少なくとも１０５ＣＦＵの前記プロバイオティク細菌を含む、請求項１に記載の可食性植物部分または組織。
【請求項４】
前記可食性植物部分またはそれに由来する組織の少なくとも８０重量％が、グラム当たり少なくとも１０６ＣＦＵの前記プロバイオティクス細菌を含む、請求項１に記載の可食性植物部分または組織。
【請求項５】
前記少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種が、前記可食性植物部分またはそれに由来する組織にコロニー形成する全細菌種の少なくとも１５％を構成する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の可食性植物部分または組織。
【請求項６】
前記プロバイオティクス細菌が、前記可食性植物部分または組織の細胞間空間、前記可食性植物部分または組織の細胞内空間、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される部位に存在する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の可食性植物部分または組織。
【請求項７】
前記プロバイオティクス細菌が、前記可食性植物部分または組織の表面上にさらに存在する、請求項６に記載の可食性植物部分または組織。
【請求項８】
前記プロバイオティクス細菌の状態が、活性状態および休眠状態から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の可食性植物部分または組織。
【請求項９】
前記少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種が、植物内生菌種ではない、請求項１〜８のいずれか一項に記載の可食性植物部分または組織。
【請求項１０】
前記少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種が、植物内生菌種である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の可食性植物部分または組織。
【請求項１１】
前記可食性植物部分または組織中の前記プロバイオティクス細菌の濃度が、対照植物の対応する可食性植物部分の同じプロバイオティクス細菌の濃度と比較してより高く、前記対照植物は、前記プロバイオティクス細菌がいずれの成長段階においても意図的に適用されていない植物である、請求項１０に記載の可食性植物部分または組織。
【請求項１２】
前記可食性植物部分が、葉、果実、根、塊茎、球根、茎、種子、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の可食性植物部分または組織。
【請求項１３】
前記可食性植物部分または組織が、少なくとも１種のプレバイオティクス成分を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の可食性植物部分または組織。
【請求項１４】
前記プレバイオティクス成分が、可溶性食物繊維および不溶性食物繊維からなる群から選択される、請求項１３に記載の可食性植物部分または組織。
【請求項１５】
前記可食性植物部分が、β−カロテン、アスコルビン酸、リボフラビン、葉酸、鉄、カルシウム、マンガン、リン、亜鉛、およびそれらのいずれかの組み合わせのうちの少なくとも１種を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の可食性植物部分または組織。
【請求項１６】
前記可食性植物部分が、低カロリーである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の可食性植物部分または組織。
【請求項１７】
前記可食性植物部分が、生鮮植物産物である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の可食性植物部分または組織。
【請求項１８】
前記可食性植物部分が、収穫後に乾燥されている、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の可食性植物部分または組織。
【請求項１９】
前記可食性植物部分が、葉物植物産物である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の可食性植物部分または組織。
【請求項２０】
前記プロバイオティクス細菌が、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃおよびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される属のものである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の可食性植物部分または組織。
【請求項２１】
前記プロバイオティクス細菌が、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  Ｂ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される種のものである、請求項２０に記載の可食性植物部分または組織。
【請求項２２】
前記可食性植物部分または組織が、前記可食性植物部分または組織からの前記プロバイオティクス細菌の遅延放出を提供するコーティング材料でコーティングされている、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の可食性植物部分または組織。
【請求項２３】
前記コーティング材料が、少なくとも１種の侵入コーティング成分を含む、請求項２２に記載の可食性植物部分または組織。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の複数の可食性植物部分またはそれに由来する組織であって、前記複数の可食性植物部分の少なくとも８０％が、前記プロバイオティクス細菌で強化されている、複数の可食性植物部分またはそれに由来する組織。
【請求項２５】
前記プロバイオティクス細菌を対象に経口送達するための方法で使用するための、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のプロバイオティクス細菌で強化されている、可食性植物部分またはそれに由来する組織。
【請求項２６】
前記プロバイオティクス細菌が、前記対象の腸に到達する、請求項２５に記載の使用のための可食性植物部分またはそれに由来する組織。
【請求項２７】
前記使用が、前記可食性部分または組織が送達される前のプロファイルと比較して、前記対象の胃腸微生物叢プロファイルの変化をもたらす、請求項２５〜２６のいずれか一項に記載の使用のための可食性植物部分またはそれに由来する組織。
【請求項２８】
前記対象が非反芻哺乳動物である、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の使用のための可食性植物部分またはそれに由来する組織。
【請求項２９】
前記対象がヒトである、請求項２８に記載の使用のための可食性植物部分またはそれに由来する組織。
【請求項３０】
前記使用が、前記対象に対して有益な治療効果を有する、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の使用のための可食性植物部分またはそれに由来する組織。
【請求項３１】
前記使用が、前記対象に対して有益な美容効果を有する、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の使用のための可食性植物部分またはそれに由来する組織。
【請求項３２】
動物の胃腸（ＧＩ）管に生息することができる少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種で強化された植物組織またはその溶解物を、必要とする対象に、局所的に投与することを含む美容方法であって、前記植物組織が、少なくとも１０４コロニー形成単位（ＣＦＵ）の前記プロバイオティクス細菌を含む、方法。
【請求項３３】
植物組織で成長することができるという内生菌特性を有するプロバイオティクス細菌種を選択および／または生産するための方法であって、
ａ）動物の胃腸管にのみ生息することが知られている少なくとも１種のプロバイオティクス細菌の有効量を、植物またはその一部に適用することと、
ｂ）前記植物またはその一部を、少なくとも１枚の葉の拡張および／または少なくとも１枚の新しい葉の出現を可能にする条件下で成長させることと、
ｃ）細菌を、前記少なくとも１枚の拡張されたおよび／または新たに出現した葉から単離することと、
ｄ）前記単離された細菌を同定することと、
ｅ）工程（ａ）で適用された前記プロバイオティクス種の細菌またはそれに由来する菌株を選択することであって、前記プロバイオティクス細菌が、植物にコロニー形成することができる、選択することと、を含む、方法。
【請求項３４】
工程（ａ）〜（ｅ）が少なくとも１回繰り返される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記細菌が、前記少なくとも１枚の拡張されたおよび／または新たに出現した葉の細胞間空間および／または細胞内空間から単離される、請求項３３〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
動物の胃腸（ＧＩ）管に生息することができる少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種で強化された可食性植物部分を生産するための方法であって、
ａ）前記少なくとも１種の細菌種を、植物またはその一部に適用することと、
ｂ）前記植物またはその一部を成長させて、前記可食性植物部分を生産する植物を得ることと、
ｃ）前記可食性植物部分を収穫することであって、前記可食性植物部分が、前記少なくとも１種の細菌種で強化されている、収穫することと、を含む、方法。
【請求項３７】
前記方法が、
ｉ）前記少なくとも１種の細菌種を、前記工程（ｂ）の植物の前記葉または茎から単離する工程と、
ｉｉ）工程（ｉ）の前記単離された少なくとも１種の細菌種を増殖させる工程と、
ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の前記増殖させた細菌を、植物またはその一部に適用する工程と、
ｉｖ）工程（ｂ）を繰り返す工程と、をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）が少なくとも１回繰り返される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記植物部分が、種子および葉からなる群から選択される、請求項３３〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記植物またはその一部に適用されるべき前記プロバイオティクス細菌が、液体中に懸濁される、請求項３３〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記プロバイオティクス細菌が、浸潤、浸漬、ディッピング、インキュベーション、噴霧、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される方法によって、前記植物またはその一部に適用される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記植物部分が種子であり、かつ前記少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種が、種子コーティングを介して前記種子または複数の種子に適用される、請求項３３〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
腸溶コーティングでコーティングされた、少なくとも１種の生物活性剤を含む可食性植物部分またはそれに由来する組織。
【請求項４４】
前記生物活性剤が、プロバイオティクス細菌である、請求項４３に記載の可食性部分。
【請求項４５】
前記可食性植物部分または組織が、栄養活性剤、治療活性剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１種の剤をさらに含む、請求項４３〜４４に記載の可食性植物部分または組織。
【請求項４６】
前記生物活性剤が、前記可食性植物部分または組織に内因性である、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の可食性植物部分または組織。
【請求項４７】
前記生物活性剤が、前記可食性植物部分または組織と異種である、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の可食性植物部分または組織。
【請求項４８】
前記生物活性剤が、タンパク質、ポリヌクレオチド、ビタミン、化学療法剤、抗酸化剤、抗老化剤およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の可食性植物部分または組織。
【請求項４９】
前記腸溶コーティングが、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）を含む、請求項４３〜４８のいずれか一項に記載の可食性植物部分または組織。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロバイオティクス細菌で強化された可食性植物組織、ならびにプロバイオティクス細菌の生物への経口送達、および生物の胃腸管マイクロバイオームを強化および／または改善するためのその使用に関する。本発明はさらに、植物組織にコロニー形成することができるプロバイオティクス細菌を選択および／または生産するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの微生物叢は、「ヒトの体内またはその上で生活するすべての微生物生命の合計」として最もよく説明される微生物群集である（Ｆｒｉｃｋｅ，Ｗ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１６５，８−１０，２０１４）。これは、宿主に広範囲の代謝、栄養、および免疫学的影響を有する存在であり、そのため、生物医学研究コミュニティ内で関心を集めている。マイクロバイオームは、健康な宿主内で誕生から死まで進化し、宿主の免疫系との恒常性バランスを維持する。健康な成体ヒトは、それぞれ、比較的少数の既知の細菌門に属する１０００種より多い細菌であってＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓおよびＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓが卓越する門である細菌を通常保有している（Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４８９，２２０−２３０，２０１２）。腸内細菌叢は他の身体部位と比較して非常に多様であり、見かけ上健康な個体間には腸内細菌叢の構成要素にかなりの変異がある（Ｈｕｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８６，２０７−１４，２０１２）。最近、Ｈｕｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＨＭＰ）は、ヒトの健康における微生物叢の役割についての深い洞察を報告した。例えば、腸内微生物は、免疫系を訓練し、日和見病原体に対して保護し、食物から栄養素とエネルギーを収穫し、非消化性炭水化物を発酵させる。正常な腸内細菌叢の破壊（腸内毒素症）は、肥満、糖尿病、様々な炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、および自己免疫疾患に関連している。内因性または外因性の多くの要因は、腸内細菌叢の組成に影響を与える。内因性の要因は、宿主の遺伝子型、年齢、性別、および適応免疫系と自然免疫系の両方を含む。外因性の要因は、食物、薬および毒素への曝露、病気などを含み、食物は腸内細菌叢に最大の影響を及ぼす。
【０００３】
プロバイオティクスは生きた微生物であり、十分な量で投与されると、宿主に健康上の利益をもたらす（Ｂａｃｋｈｅｄ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  １２，６１１−６２２，２０１２）。ここ数十年で、プロバイオティクスは、健康を促進し、腸の障害を予防または管理するために、微生物の集団および機能を調節する手段として研究されてきた（Ｒｉｎｇｅｌ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．１，３４−４０，２０１２）。臨床試験からの蓄積されたデータは、腸内毒素症に関連するある種の腸の病状、例えば抗生物質関連性下痢、壊死性腸炎（ＮＥＣ）、潰瘍性大腸炎、炎症性腸症候群（ＩＢＳ）、および嚢炎が、いくつかのプロバイオティクス介入によって臨床的利益をもたらしたことを示す。プロバイオティクスは、主に腸内細菌叢に直接的または間接的に作用する。したがって、いくつかのプロバイオティクスは、腸内毒素症の影響を是正または軽減すると想定することができる。プロバイオティクスの状態を達成するために、微生物は、安全性、機能的効果および技術的特性に関連するある数の基準を満たさなければならない。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓのいくつかの選択された菌株は、それらの評判の高い健康上の利点のために食品製品で宣伝されてきた（Ｚｉｅｍｅｒ，Ｃ．Ｊ．ａｎｄ  Ｇｉｂｓｏｎ，Ｇ．Ｒ．，Ｉｎｔ．Ｄａｉｒｙ  Ｊ．８，４７３−４７９，１９９８；Ｐｕｕｐｐｏｎｅｎ−Ｐｉｍｉａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３，３−１１，２００２）。
【０００４】
植物は、ヒトの日常の食物の基本的かつ実質的な部分である。野菜、果物、ハーブ、ナッツ、および薬草は、生で食べられる植物の部分に属する。ヒトの食品は、このように、植物のグラム当たり最大１０４〜１０１０個の微生物よって、コロニー形成することができる関連した微生物を含む植物のすべての部分を含む。これらの微生物集団は、葉圏（レタス、キャベツ）、根圏（ニンジン、カブ）、果圏（トマト、バナナ）、ならびに種子（豆、エンドウ豆）、および対応する内圏などを含む植物器官全体の様々な生息域に生息している（Ｂｅｒｇ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ４１９−４２６，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０１５．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８−３−３１９−０８５７５−３＿４４）。
【０００５】
内生菌は、多くの場合、細菌または真菌である微生物の、植物との内部共生群である。内生細菌は、植物の内部組織にコロニー形成し、感染の外部兆候または宿主への悪影響を示さない。植物種における内生菌の個体数は非常に多様であり、例えば、宿主種、宿主の発育段階、接種密度および環境条件を含む様々な構成要素に依存する。偏性内生菌（Ｃｒｏｅｓ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６，３７１−３８４，２０１３）および通性内生菌（Ｋａｍｎｅｖ，Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１９，９１−９５，２００５）を、区別することができる。偏性内生菌は、宿主植物からその種子に伝播していく。しかし、通性内生菌は、それらのライフサイクルの一部しか植物の内部組織で過ごさない。これらの内生菌は、組織の傷、気孔（葉の表皮に見られる孔）、皮目（木本植物の茎の隆起した孔）、根の亀裂、発芽幼軸（根系に発達する胚の一部）を含む様々な場所から植物に侵入する。さらに、能動的な浸透は、ペクチン分解酵素の分泌によって可能となり得る。次に、内生菌は、細胞間または維管束を介して植物組織に生息する。上記のように、内生菌は植物組織に遍在しているようであり、様々な植物種の花、果物、葉、茎、根、および種子などの植物の様々な部分から単離されている（Ｉｎｄｉｒａ  Ｄｅｖｉ，Ｓ．ａｎｄ  Ｍｏｍｏｔａ，Ｐ．ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｓｙｍｂｉｏｓｉｓ：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｆａｃｅｔｓ  １４７−１６２，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｄｉａ，２０１５．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８−８１−３２２−２０６８−８＿７）。
【０００６】
植物内生細菌のいくつかの種は、腸のプロバイオティクス特性を持っていることが示唆されている。例えば、薬用植物Ｏｃｉｍｕｍ  ｓａｎｃｔｕｍの組織から分離されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓは、耐酸性、胆汁酸塩耐性、自己凝集、抗生物質耐性、および溶血活性の欠如などのプロバイオティクス特性を示した（Ｍｕｒｕｇａｐｐａｎ  Ｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｍｂｉｏｓｉｓ  ６０，９１−９９，２０１３，ＤＯＩ  １０．１００７／ｓ１３１９９−０１３−０２４４−０）。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子フラグメントの詳細な配列決定および細菌培養を使用して、可食性の根を持つ５種の植物種のマイクロバイオームを特性付け、Ｔｏｐｉｎａｍｂｕｒ（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ  ａｒｔｉｃｈｏｋｅ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ）の果肉に乳酸菌が存在することを明らかにした（Ｋｏｉｖ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ  ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０２１０５４２  Ｊａｎｕａｒｙ  １１，２０１９）。米国特許第９，１４４，５８８号は、抗菌活性を有するペプチドを生産する、ニシュタマリゼーションされたトウモロコシの果皮から単離されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの生物学的に純粋な培養物を開示している。Ｂａｃｉｌｌｕｓ微生物は、プロバイオティクス食品組成物に含まれ、健康な胃腸内細菌叢を維持し、動物の消化を調節するのを助け得る。
【０００７】
プロバイオティクスに起因する有益な効果を十分に活用するには、経口製剤の生産中にプロバイオティクス微生物の生存能力を維持し、胃を通過する際の生存能力の損失を最小化するために胃での保護を提供する必要がある。したがって、これらのニーズに答える大きな必要性があり、そしてプロバイオティクスを送達するための媒体を持つことは、非常に有利である。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、宿主動物対象に有益な健康効果を与えるプロバイオティクス細菌の優れた送達媒体を生産するためのプラットフォーム技術を提供する。送達媒体は、植物に基づき、有益なプロバイオティクス細菌のそれらの作用部位への非常に効率的な送達を、植物産物、特に生鮮植物産物の栄養的および健康促進成分と組み合わせている。
【０００９】
本発明の技術は、プロバイオティクス効果を有することが知られている細菌が、動物対象に、顕著な量および生存可能な形態で植物組織に馴化し、コロニー形成することができるという予想外の発見に部分的に基づく。通常、プロバイオティクス細菌は、選択および定向進化および／または強化プロセスによって馴化する。したがって、本発明は、可食性植物部分または組織にコロニー形成されたプロバイオティクス細菌で強化された可食性植物部分または組織、および細菌の経口送達のためのその使用を提供する。本発明のプロバイオティクス細菌がコロニー形成された可食性植物部分は、細菌を不利な環境条件から保護することに加えて、可食性植物部分自体が高い栄養価を有するので、これまでに知られている微生物叢送達媒体よりも有利である。可食性植物組織は、動物の宿主に利益を与える非消化性または低消化性の食品成分（プレバイオティクス）、食物繊維、微量栄養素および多量栄養素に富む。プロバイオティクス細菌および可食性植物組織のプレバイオティクス特性の組み合わせ（「共生体」と呼ばれる）は、プロバイオティクス細菌群集の成長を選択的に刺激し、非反芻動物、特にヒトの胃腸管での活性を促進する相乗効果をもたらす。通常、可食性植物部分は、生鮮食品として使用される。植物組織は、プロバイオティクス細菌にコロニー形成に適した条件を提供し、それにより、プロバイオティクス細菌は、生存可能な、好ましくは増殖形態に保たれ、その結果、大量の高品質のプロバイオティクス細菌が対象に送達される。結果として、プロバイオティクス細菌は、少なくとも健康に維持されるか、またはより健康な状態に改善される、レシピエントの胃腸細菌集団の構造および／または機能に影響を与えることができる。植物組織はさらに、過酷な環境条件からプロバイオティクス細菌を保護し、細菌の貯蔵寿命を延ばす。可食性植物部分を、プロバイオティクス細菌の遅延放出を提供する剤、特に、コロニー形成したプロバイオティクス細菌を胃の酸性ｐＨから保護する腸溶コーティング剤でさらにコーティングすることができる。
【００１０】
一態様によれば、本発明は、可食性植物部分またはそれに由来する組織にコロニー形成する少なくとも１種のプロバイオティクス細菌で強化された可食性植物部分またはそれに由来する組織を提供し、ここで、プロバイオティクス細菌は、動物の胃腸（ＧＩ）菅に生息することができる。
【００１１】
ある種の実施形態によれば、可食性植物部分またはそれに由来する組織は、可食性植物部分またはそれに由来する組織のグラム当たり、プロバイオティクス細菌の少なくとも１０４コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含む。
【００１２】
ある種の実施形態によれば、可食性植物部分またはそれに由来する組織の少なくとも８０重量％は、可食性植物部分またはそれに由来する組織のグラム当たり、プロバイオティクス細菌の少なくとも１０５ＣＦＵを含む。
【００１３】
ある種の実施形態によれば、可食性植物部分またはそれに由来する組織の少なくとも８０重量％は、可食性植物部分またはそれに由来する組織のグラム当たり、プロバイオティクス細菌の少なくとも１０６ＣＦＵを含む。
【００１４】
ある種の実施形態によれば、少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種は、可食性植物部分またはそれに由来する組織にコロニー形成する全細菌種の少なくとも１５％を構成する。
【００１５】
ある種の実施形態によれば、プロバイオティクス細菌は、可食性植物部分または組織の細胞間空間、可食性植物部分または組織の細胞内空間、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される部位に存在する。ある種の実施形態によれば、プロバイオティクス細菌は、可食性植物部分または組織表面にさらに存在する。ある種の例示的な実施形態によれば、プロバイオティクス細菌は、細胞間および細胞内空間内にコロニー形成する。追加の例示的な実施形態によれば、プロバイオティクス細菌は、可食性植物部分または組織の、細胞間空間、細胞内空間、および表面に存在する。
【００１６】
ある種の例示的な実施形態によれば、少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種は、植物組織にコロニー形成することが以前に実証されていない非内生種である。
【００１７】
ある種の実施形態によれば、少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種は、植物に天然にコロニー形成することができる内生菌種である。これらの実施形態によれば、可食性植物部分または組織中の強化されたプロバイオティクス細菌の濃度は、対照植物の対応する可食性植物部分中の同じプロバイオティクス細菌の濃度と比較してより高い。対照植物は、いずれの成長段階においてもプロバイオティクス細菌が意図的に適用されなかった植物である。対照植物は、本発明による介入なしに、天然に存在するプロバイオティクス細菌を収容することができる。
【００１８】
意図的に直接的または間接的に適用された後、植物組織内および／または植物組織上で生存および／または増殖することができるいずれかのプロバイオティクス細菌種が、本発明の教示に含まれることを明確に理解するべきである。
【００１９】
少なくとも１種のプロバイオティクス細菌細胞のＣＦＵは、活性状態または休眠状態にあり得る。
【００２０】
ある種の実施形態によれば、少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種のＣＦＵは、活性細菌細胞である。他の実施形態によれば、ＣＦＵは、胞子、嚢胞、および休止細胞からなる群から選択される休眠状態にある。他の例示的な実施形態によれば、少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種のＣＦＵは、胞子の休眠形態にある。
【００２１】
別の態様によれば、本発明は、複数の可食性植物部分またはそれに由来する組織を提供し、複数の可食性植物部分の少なくとも８０％が、可食性植物部分またはそれに由来する組織にコロニー形成する少なくとも１種のプロバイオティクス細菌で強化され、ここで、プロバイオティクス細菌は、動物の胃腸（ＧＩ）管に生息することができる。
【００２２】
プロバイオティクス細菌で強化された可食性植物部分は、上記のとおりである。
【００２３】
細菌のコロニー形成を可能にするいずれかの可食性植物部分または組織を、本発明の教示に従って使用することができる。ある種の実施形態によれば、可食性植物部分は、葉、果実、根、塊茎、球根、茎、種子、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される。
【００２４】
ある種の例示的な実施形態によれば、可食性植物部分は、プレバイオティクス成分を含む。いくつかの実施形態によれば、プレバイオティクス成分は、例えば、フラクトオリゴ糖を含む、食物可溶性および／または不溶性繊維を含む。ある種の実施形態によれば、フラクトオリゴ糖は、イヌリン、ラクツロース、および難消化性デンプンからなるがこれらに限定されない群から選択される。ある種の追加または代替の実施形態によれば、可食性植物部分は、β−カロテン、アスコルビン酸、リボフラビン、葉酸、鉄、カルシウム、マンガン、リン、亜鉛、およびそれらのいずれかの組み合わせのうちの少なくとも１種を含む。ある種の追加または代替の実施形態によれば、可食性植物部分は低カロリーである。
【００２５】
ある種の実施形態によれば、可食性植物部分は、植物から収穫された植物生鮮産物である。追加の例示的な実施形態によれば、組織は、新たに収穫された可食性植物部分に由来する生鮮組織である。
【００２６】
ある種の実施形態によれば、可食性植物部分またはそれに由来する組織は乾燥される。可食性植物部分にコロニー形成されたプロバイオティクス細菌の生存率に悪影響を与えることなく可食性植物部分を乾燥させるための当技術分野で知られているいずれかの方法を、本発明の教示に従って使用することができる。
【００２７】
可食性植物部分またはそれに由来する組織は、発酵されていないことを、明確に理解されるべきである。
【００２８】
ある種の例示的な実施形態によれば、可食性植物部分は、レタス、ホウレンソウ、エンダイブ、フダンソウ、およびルッコラを含むがこれらに限定されない、植物の葉物農産物である。
【００２９】
ある種の実施形態によれば、プロバイオティクス細菌はグラム陽性菌である。ある種の実施形態によれば、プロバイオティクス細菌はグラム陰性菌である。いくつかの実施形態によれば、プロバイオティクス細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される属のものである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００３０】
ある種の実施形態によれば、プロバイオティクス細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  Ｂ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される種のものである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００３１】
ある種の例示的な実施形態によれば、プロバイオティクス細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される種のものである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００３２】
ある種の実施形態によれば、コロニー形成されたプロバイオティクス細菌またはそれに由来する組織で強化された可食性植物部分は、細菌の遅延放出を提供する適切な剤および／または製剤でコーティングされる。ある種の例示的な実施形態によれば、コーティングは、胃の酸性ｐＨから植物組織を保護する腸溶コーティングを含む。侵入コーティングが腸内で溶解すると、可食性植物組織は、腸内にすでに存在する微生物叢による消化に従順であり、送達されたプロバイオティクス細菌は放出される。ある種の実施形態によれば、プロバイオティクス細菌が腸内で有益に活性である場合、可食性植物部分またはそれに由来する組織は腸溶コーティングでコーティングされる。
【００３３】
本発明は、腸溶コーティングでコーティングされた可食性植物部分またはそれに由来する組織が、その中に存在する生物活性成分の経口送達ために使用されることができ、活性成分がその活性形態で腸に到達することを初めて開示する。腸溶コーティングは、胃の中の可食性植物組織の消化を防ぎ、したがって、生物活性成分が胃の酸性で有害なｐＨに暴露されることを防ぐ。腸内のｐＨが上昇すると、侵入コーティングは溶解され、植物組織を消化に暴露し、そこに保存されている有効成分が放出される。
【００３４】
したがって、追加の態様によれば、本発明は、腸溶コーティングでコーティングされた、少なくとも１種の生物活性剤を含む、可食性植物部分またはそれに由来する組織を提供する。
【００３５】
ある種の実施形態によれば、生物活性剤は、プロバイオティクス細菌である。いくつかの実施形態によれば、コーティングされた可食性植物部分またはそれに由来する組織は、栄養活性剤、治療活性剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１種の追加の活性剤をさらに含む。ある種の実施形態によれば、追加の活性剤は、プロバイオティクス細菌の存在の副産物である。
【００３６】
非反芻哺乳動物の胃の酸性ｐＨに耐性があり、腸のより高いｐＨに溶解することが当技術分野で知られているいずれかの腸溶コーティング剤または剤の組み合わせを、本発明の教示に従って使用することができる。ある種の例示的な実施形態によれば、腸溶コーティングは、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）を含む。
【００３７】
追加の態様によれば、本発明は、プロバイオティクス細菌をそれを必要とする対象に経口送達するための方法を提供し、方法は、少なくとも１種のプロバイオティクス細菌で強化された可食性植物部分またはそれに由来する組織の有効量を、対象に経口投与することを含み、ここで、プロバイオティクス細菌は、前記対象の胃腸（ＧＩ）管に生息することができる。
【００３８】
追加の態様によれば、本発明は、少なくとも１種のプロバイオティクス細菌で強化された可食性植物部分またはそれに由来する組織を提供し、ここで、プロバイオティクス細菌は、プロバイオティクス細菌の有効量を、対象に経口送達するための方法で使用するために前記対象の胃腸（ＧＩ）管に生息することができる。
【００３９】
プロバイオティクス細菌で強化された可食性植物部分または組織は、上記のとおりである。
【００４０】
ある種の実施形態によれば、少なくとも１種のコロニー形成されたプロバイオティクス細菌種で強化された可食性植物部分またはそれに由来する組織は、腸溶コーティングでコーティングされている。
【００４１】
ある種の実施形態によれば、プロバイオティクス細菌は、対象の腸に到達する。いくつかの実施形態によれば、プロバイオティクス細菌は、対象の腸内で増殖する。
【００４２】
ある種の実施形態によれば、方法は、少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種で強化された可食性植物部分またはそれに由来する組織を、対象に投与する前のプロファイルと比較して、前記対象の胃腸微生物叢プロファイルを変化させるという結果をもたらす。
【００４３】
さらに追加または代替の実施形態によれば、方法は、有益な治療効果をもたらす。ある種の実施形態によれば、治療効果は、ＧＩ関連疾患または障害を処置または予防することを含む。
【００４４】
例えば、ヨーグルトなどのプロバイオティクス食品には、１０７ＣＦＵ／ｇの初期細菌負荷が推奨される。胃および腸を通過する間にプロバイオティクス細菌の数が失われる可能性を補償するために、高い数が示唆されている。好ましくは、ヨーグルトの１０１０ＣＦＵ／ｇのより高い細菌負荷でさえ、より多くの生きたプロバイオティクス細菌を標的部位、例えば小腸および結腸に確実に送達するために使用される。植物組織は、ＧＩ通過を通じての保護および活性部位での初期エネルギー源の両方を細菌に提供し、プロバイオティクス細菌の作用部位での即時増殖を可能にするので、本発明の植物に基づく送達媒体は、プロバイオティクス細菌の数桁より低い負荷を可能にし得る。
【００４５】
さらに追加または代替の実施形態によれば、方法は、有益な美容効果をもたらす。ある種の実施形態によれば、美容効果は、皮膚の外観の調節を含む。いくつかの実施形態によれば、皮膚外観調節は、皮膚ニキビの減少、皮膚剥離の減少、および皮膚老化の兆候の減少を含むが、これらに限定されない。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００４６】
ある種の実施形態によれば、対象は非反芻哺乳動物である。ある種の例示的な実施形態によれば、対象はヒトである。
【００４７】
可食性植物部分、それに由来する組織、プロバイオティクス細菌および侵入コーティングは、上記のとおりである。
【００４８】
追加の態様によれば、本発明は、植物組織において成長することができるという内生菌特性を有するプロバイオティクス細菌種を選択および／または生産するための方法を提供し、方法は、
ａ）植物またはその一部に、動物の胃腸管にのみ生息することが知られている少なくとも１種のプロバイオティクス細菌の有効量を適用することと、
ｂ）植物またはその一部を、少なくとも１枚の葉の拡張および／または少なくとも１枚の新しい葉の出現を可能にする条件下で成長させることと、
ｃ）少なくとも１種の拡張および／または新たに出現した葉から細菌を単離することと、
ｄ）単離された細菌を特定することと、
ｅ）工程（ａ）で適用されたプロバイオティクス種の細菌またはそれに由来する菌株を選択することであって、前記プロバイオティクス細菌が植物内で成長することができる、選択することと、を含む。
【００４９】
ある種の実施形態によれば、方法は、選択されたプロバイオティクス細菌が植物にコロニー形成する能力を確認するために、少なくとも１回繰り返される。
【００５０】
植物組織にコロニー形成することができるプロバイオティクス細菌種を選択するための本発明の方法は、接種の１週間後の拡張葉から、および／またはプロバイオティクス細菌を直接接種されていない新しく発達した植物組織から細菌を単離することを含むことが、明確に理解されるべきである。したがって、植物組織内で生存、増殖および拡散することができる細菌のみが選択され、本発明の教示に従って使用されるプロバイオティクス細菌の選択を最適化する。
【００５１】
植物組織にコロニー形成することができる選択されたプロバイオティクス細菌は、植物またはその一部に最初に適用された細菌株と同一であるか、または改変された特性を示し、したがって改変株または細菌の新しい菌株としてさえも同定され得るが、ただし、改変株または新しい菌株がプロバイオティクス特性を示すことを条件とする。
【００５２】
別の態様によれば、本発明は、動物の胃腸（ＧＩ）管に生息することができる少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種で強化された可食性植物部分を生産するための方法を提供し、方法は、
ａ．植物またはその一部に少なくとも１種の細菌種を適用することと、
ｂ．植物またはその一部を成長させて、可食性植物部分を生産する植物を得ることと、
ｃ．可食性植物部分を収穫し、前記可食性植物部分は、少なくとも１種の細菌種で強化されている、収穫することと、を含む。
【００５３】
ある種の実施形態によれば、方法は、
ｉ．工程（ｂ）の植物の葉または茎から少なくとも１種の細菌種を単離する工程と、
ｉｉ．工程（ｉ）の単離された少なくとも１種の細菌種を増殖させる工程と、
ｉｉｉ．工程（ｉｉ）の増殖した細菌を植物またはその一部に適用する工程と、
ｉｖ．工程（ｂ）を繰り返す工程と、をさらに含む。
【００５４】
ある種の実施形態によれば、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）は少なくとも１回繰り返される。
【００５５】
ある種の実施形態によれば、植物部分は、種子、茎および葉からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。ある種の例示的な実施形態によれば、植物部分は種子である。
【００５６】
少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種を植物またはその一部に適用するための当技術分野で知られているいずれかの方法を、本発明の教示に従って使用することができる。ある種の例示的な実施形態によれば、少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種は、液体中に懸濁される。ある種の実施形態によれば、液体は水である。他の実施形態によれば、液体は培地である。ある種の実施形態によれば、液体は、浸透、浸漬／ディッピング、インキュベーション、噴霧、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される方法によって、植物またはその一部に適用される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００５７】
ある種の実施形態によれば、植物部分は種子である。ある種の実施形態によれば、少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種は、種子コーティングを介して種子に適用される。ある種の例示的な実施形態によれば、複数の種子は、少なくともプロバイオティクス細菌種を含む種子コーティング剤でコーティングされる。これらの実施形態によれば、複数の植物が複数の種子から成長する。
【００５８】
本明細書に開示される態様および実施形態のそれぞれのいずれかの組み合わせは、本発明の開示内に明示的に包含されることを理解するべきである。
【００５９】
本発明の他の目的、特性および利点は、以下の記載および図面から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】超音波処理により分離を行った場合、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）とプロバイオティクス細菌の混合物でコーティングされた種子から発達した小植物の葉において、導入された細菌は、内生菌および外生菌に分配されることを示す。使用したプロバイオティクス細菌は、Ｅ．Ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｌ．Ｐａｒａｃａｓｅｉ、およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓであった。各分析は４回実行した。エラーバーは平均の標準誤差を表す（ｎ＝４）。
【図２Ａ】Ｅ．Ｆａｅｃａｌｉｓ（図２Ａ）、Ｌ．Ｐａｒａｃａｓｅｉ（図２Ｂ）、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（図２Ｃ）の元のプロバイオティクス単離株の生存率であって［Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）バンクから入手］ｐＨ＝２またはｐＨ＝４のペプシンを含む胃液（ＳＧＦ）をシミュレートする溶液に曝露されたレタス植物から単離された同じ単離株種の生存率と比較したものを示す（７回の成長サイクル後）。
【図２Ｂ】Ｅ．Ｆａｅｃａｌｉｓ（図２Ａ）、Ｌ．Ｐａｒａｃａｓｅｉ（図２Ｂ）、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（図２Ｃ）の元のプロバイオティクス単離株の生存率であって［Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）バンクから入手］ｐＨ＝２またはｐＨ＝４のペプシンを含む胃液（ＳＧＦ）をシミュレートする溶液に曝露されたレタス植物から単離された同じ単離株種の生存率と比較したものを示す（７回の成長サイクル後）。
【図２Ｃ】Ｅ．Ｆａｅｃａｌｉｓ（図２Ａ）、Ｌ．Ｐａｒａｃａｓｅｉ（図２Ｂ）、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（図２Ｃ）の元のプロバイオティクス単離株の生存率であって［Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）バンクから入手］ｐＨ＝２またはｐＨ＝４のペプシンを含む胃液（ＳＧＦ）をシミュレートする溶液に曝露されたレタス植物から単離された同じ単離株種の生存率と比較したものを示す（７回の成長サイクル後）。
【図３】Ｅ．Ｆａｅｃａｌｉｓ（ＥＦ）、Ｌ．Ｐａｒａｃａｓｅｉ（ＬＰ）、およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＢＳ）の元のプロバイオティクス分離株（ＡＴＣＣバンクから入手）の生存率であって、レタス植物から単離された単離株種の生存率と比較した。膵臓酵素を含む腸液（ＳＩＦ）をシミュレートする溶液に３７℃およびｐＨ＝６．８で１２０または２４０分間曝露したレタス植物（７回の成長サイクル後）から単離した同じ単離株種の生存率と比較したものを示す。
【図４】８、１３、２０および２８日後にコーティングされた種子から発育した植物のレタスの葉におけるＥ．Ｆａｅｃａｌｉｓの確立を示す。各分析を４回実行した。エラーバーは平均の標準誤差を表す（ｎ＝４）。
【図５】ＣＭＣを含むまたは含まない溶液中に、レタスカット葉をディッピングすることによって、レタスカット葉に適用されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ細菌の生存を示す。＊有意差を示す（ｐ＜０．０５）；エラーバーは平均の標準誤差を表する（ｎ＝１０）。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
腸内プロバイオティクスは、粘膜および全身の免疫を調節し、腸機能と胃腸管の微生物バランスを改善することにより、動物宿主に有益な影響を与える生きた微生物である。免疫応答の調節、血清コレステロール濃度の低下、乳糖不耐症の症状の改善、感染性腸疾患への耐性の増加、下痢の期間の短縮、血圧の低下、結腸癌の予防の補助を含む、様々な栄養的および治療的効果が、プロバイオティクスに帰せられてきた。宿主に有益なそれらの効果を発揮するためには、プロバイオティクスは生存能力を維持し、多数が腸に到達する必要がある。
【００６２】
本発明は、有益なプロバイオティクス細菌種を胃腸管、特にそれを必要とする非反芻動物の腸に経口送達するための媒体である植物材料を提供するプラットフォーム技術を提供する。植物材料は通常、食物繊維、ビタミン、微量栄養素、多量栄養素などの健康的な食品成分を提供する生鮮産物である。ある種の実施形態によれば、植物部分は、葉物生鮮産物であり、それはカロリーも低い。さらに、植物材料は、対象の胃腸管に到達すると、プロバイオティクス細菌の成長または活性を誘導するプレバイオティクス成分を含む。
【００６３】
すべての植物には、細菌、古細菌、真菌、および原生生物分類群を含む多様な微生物群集が内部に生息している。細菌は、様々な方法で植物と関係があり、その一部は植物の病気および植物の生命へのダメージをもたらすが、一部は植物の成長と特性に有益な効果を有する。内生細菌は一般に、目に見える害を引き起こすことなく植物にコロニー形成する細菌として定義される。内生細菌は、それらの宿主植物から恩恵を受け、絶え間ない食物供給を受け、環境ストレスから保護される。引き換えに、細菌内生菌は、発芽率、バイオマス、葉面積、葉緑素含有量、窒素およびタンパク質含有量、水分活性、収量、および非生物的ストレスに対する耐性の増加という点で、宿主植物にいくつかの利点を提供し得る。いくつかの内生菌は、それらの宿主植物を病原体から保護し、生物的防除剤として作用することができる。
【００６４】
定義
細菌に関する「内生菌」および「内生菌の」という用語は、植物に目に見える害を及ぼすことなく植物にコロニー形成することができる細菌を指す。内生細菌は、偏性内生菌、すなわち、そのライフサイクル全体にわたって植物組織内に生息する細菌、または通性（一過性）内生菌、すなわち、植物内のライフサイクルの一部のみを過ごし得る細菌であることができる。
【００６５】
「プロバイオティクス細菌」、「腸プロバイオティクス細菌」、および「動物の胃腸（ＧＩ）管に生息することができるプロバイオティクス細菌」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、腸内細菌のバランスを改善することによって、非反芻動物対象に有益に影響を与える非病原性細菌を指す。いくつかの実施形態において、プロバイオティクス細菌は、疾患または障害を予防および／または処置することにおいて治療上有益な効果を有する。いくつかの実施形態において、プロバイオティクス細菌は、栄養的に有益な効果を有する。さらに追加の実施形態では、プロバイオティクス細菌は、それを消費する対象の全般的健康状態を改善する。
【００６６】
本明細書で使用される「プレバイオティクス」という用語は、プロバイオティクス微生物の成長または活性を誘導または補助することができる化合物（例えば、食品中の食物化合物）を指す。いくつかの例では、プレバイオティクスは、微生物によって選択的に使用されるか、または微生物に選択的に影響を与える基質である。本発明の教示によれば、プレバイオティクスは、可食性植物組織またはそれに由来する化合物である。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「外因的に適用される」および「意図的に適用される」という用語は、少なくとも１種の単離された腸内プロバイオティクス細菌の、またはそれを含む農業組成物の適用を意味する。適用されるべきプロバイオティクス細菌は、所望の単離種または複数の種で強化されていることが明確に理解されるべきである。したがって、プロバイオティクス細菌で汚染された農業組成物（例えば、施肥に使用される堆肥、堆肥で汚染された灌漑水）の適用は、本明細書では意図しない適用を意味し、本発明の教示から特異的に除外される。
【００６８】
「コロニー形成単位」およびＣＦＵ（単数または複数で）という用語は、本明細書では、生存可能な細菌の指標数として交換可能に使用される。
【００６９】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）、（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）、（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）、（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語およびそれらの活用形は、「含むがこれらに限定されない」を意味する。
【００７０】
本明細書で使用される場合、本明細書に記載された数値ついて言及される「約」という用語は、記載された値＋／−１０％として理解されるべきである。
【００７１】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別段に明確に指示しない限り、複数の参照を包含する。例えば、「化合物」または「少なくとも１種の化合物」という用語は、それらの混合物を含む複数の化合物を含み得る。
【００７２】
一態様によれば、本発明は、可食性植物部分またはそれに由来する組織にコロニー形成する少なくとも１種のプロバイオティクス細菌で強化された可食性植物部分またはそれに由来する組織を提供し、ここで、プロバイオティクス細菌は、動物の胃腸（ＧＩ）菅に生息することができる。
【００７３】
可食性植物部分または組織は、プロバイオティクス細菌の１属および／または種および／または菌株、またはそれらの組み合わせで強化され得る。本発明の教示によれば、プロバイオティクス細菌は腸内細菌、すなわち非反芻動物の腸内微生物叢に見られる細菌である。いくつかの実施形態では、植物部分または組織は、等しい量または異なる量で、等しいまたは異なる比率で存在する様々な種または菌株で強化され得る。
【００７４】
本発明は、選択された種または複数の種について強化され単離されたプロバイオティクス細菌の、植物またはその一部への適用に部分的に基づいており、その結果、植物の可食性部分は、プロバイオティクス細菌種または複数の種で強化される。
【００７５】
ある種の実施形態によれば、少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種は、可食性植物部分またはそれに由来組織にコロニーを形成する全細菌種の少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、またはそれ以上を含む。
【００７６】
ある種の実施形態によれば、可食性植物部分またはそれに由来する組織は、可食性植物部分またはそれに由来する組織のグラム当たり、プロバイオティクス細菌の少なくとも１０４コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含む。
【００７７】
ある種の実施形態によれば、可食性植物部分またはそれに由来する組織は、約１０４ＣＦＵ／ｇ植物組織から約１０１１ＣＦＵ／ｇ植物組織またはそのいずれかの下位範囲を含む。ある種の実施形態によれば、プロバイオティクス細菌の量は、約１０４ＣＦＵ／ｇから約５×１０１０ＣＦＵ／ｇ、または約１０４ＣＦＵ／ｇから約１０９ＣＦＵ／ｇ、または約１０６ＣＦＵ／ｇ９から約５×１０９ＣＦＵ／ｇの範囲であることができる。ある種の例示的な実施形態によれば、プロバイオティクス細菌の量は、約１０４ＣＦＵ／ｇ植物組織から約１０８ＣＦＵ／ｇ植物組織の範囲である。
【００７８】
ある種の実施形態によれば、可食性植物部分またはそれに由来する組織の少なくとも８０重量％、少なくとも８１重量％、少なくとも８２重量％、少なくとも８３重量％、少なくとも８４重量％、少なくとも８５重量％、少なくとも８６重量％、少なくとも８７重量％、少なくとも８８重量％、少なくとも８９重量％、少なくとも９０重量％、少なくとも９１重量％、少なくとも９２重量％、少なくとも９３重量％、少なくとも９４重量％、少なくとも９５重量％、少なくとも９６重量％、少なくとも９７重量％、少なくとも９８重量％、少なくとも９９重量％、または１００重量％は、可食性植物部分またはそれに由来する組織のグラム当たりのプロバイオティクス細菌の少なくとも１０５ＣＦＵを含む。
【００７９】
ある種の実施形態によれば、可食性植物部分または組織の重量の少なくとも８０重量％、少なくとも８１重量％、少なくとも８２重量％、少なくとも８３重量％、少なくとも８４重量％、少なくとも８５重量％、少なくとも８６重量％、少なくとも８７重量％、少なくとも８８重量％、少なくとも８９重量％、少なくとも９０重量％、少なくとも９１重量％、少なくとも９２重量％、少なくとも９３重量％、少なくとも９４重量％、少なくとも９５重量％、少なくとも９６重量％、少なくとも９７重量％、少なくとも９８重量％、少なくとも９９重量％、または１００重量％は、可食性植物部分またはそれに由来する組織のグラム当たりのプロバイオティクス細菌の少なくとも１０６ＣＦＵを含む。
【００８０】
「コロニー形成単位」および「ＣＦＵ」という用語は、本明細書では、当技術分野で最も広い意味で交換可能に使用される。ある種の実施形態によれば、少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種のＣＦＵは、活性状態の細菌細胞である。ある種の実施形態によれば、少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種のＣＦＵは、細菌の胞子、細菌の嚢胞、および細菌の休止細胞からなる群から選択される休眠状態にある。
【００８１】
ある種の例示的な実施形態によれば、少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種は、植物組織にコロニー形成することが以前に実証されておらず、したがって、非内生細菌として定義されている。
【００８２】
ある種の実施形態によれば、プロバイオティクス細菌は、植物に天然にコロニー形成することができる内生細菌種のものである。これらの実施形態によれば、可食性植物部分または組織中の強化されたプロバイオティクス細菌の濃度は、対照植物の対応する可食性植物部分中の同じプロバイオティクス細菌の濃度と比較してより高い。対照植物は、いずれの成長段階においても、プロバイオティクス細菌が意図的に適用されなかった植物である。対照植物は、本発明による介入なしに、より少ない量で、および／または異なる種組成で、および／または異なる種比率で、天然に存在するプロバイオティクス細菌を収容することができる。
【００８３】
ある種の態様によれば、本発明は、植物にコロニー形成することができるプロバイオティクス細菌種を選択および／または生産するための方法を提供する。本発明はさらに、可食性植物部分または組織を、植物組織内で成長および増殖する能力を獲得したプロバイオティクス細菌で強化するための方法を提供する。
【００８４】
上記のように、機能性食品成分としてのプロバイオティクスは、多様な特性を実証するはずである。重要なことに、動物の体内に細菌種が存在することは、悪影響を伴わないことができる。ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓおよびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに属する細菌の大部分は、プロバイオティクスと同様に安全で有益であると認識されている。ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓおよびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属は、ヒトの胃腸管の微生物叢の通常の居住者であり、それらは出生後すぐに発生する。連鎖球菌と腸球菌のみを除いて、乳酸菌は、ヒトおよび動物に病原性を示すことはめったにないと一般に受け入れられている。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍおよびＥ．ｆａｅｃａｌｉｓの特定の菌株は、プロバイオティクスまたは飼料添加物として使用される唯一の腸球菌である（Ｆｒａｎｚ  Ｃ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５１，１２５−１４０）。これらの細菌は、古くから食品の生産に使用されてきており、ヒトに悪影響を与えることはない（Ｇｒａｊｅｋ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅｓｅｎｔ．Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｏｎｆ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００４）。プロバイオティクス細菌は、多様な種々の推定メカニズムを通じてヒトの健康にプラスの影響を与えると推測される。それらは、腸バリアの強化、免疫応答の変化、および抗菌化合物の生産による、または粘膜結合部位に対する競争活動全体のいずれかによる病原体に対する拮抗作用の発達を伴う（Ｏｕｗｅｈａｎｄ，Ａ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｄａｉｒｙ  Ｊ．９，４３−５２，１９９９）。
【００８５】
非反芻哺乳動物、特にヒト対象の胃腸管に存在する場合に有益なプロバイオティクス活性を有することが知られているいずれかの細菌種および／または菌株を、本発明の教示に従って使用することができる。
【００８６】
ある種の実施形態によれば、プロバイオティクス細菌は、グラム陽性菌である。ある種の実施形態によれば、プロバイオティクス細菌は、グラム陰性菌である。いくつかの属の細菌は、プロバイオティクス活性を有することが知られている（Ｆｉｊａｎ  Ｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｐｕｂｌｉｃ  ｈｅａｌｔｈ  １１（５），４７４５−４７６７，２０１４）。いくつかの実施形態によれば、プロバイオティクス細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃおよびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される病原性属ではない哺乳動物のものである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００８７】
ある種の実施形態によれば、プロバイオティクス細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ種のものである。
【００８８】
ある種の実施形態によれば、プロバイオティクス細菌は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ種のものである。
【００８９】
ある種の実施形態によれば、プロバイオティクス細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉの組み合わせを含む。ある種の実施形態によれば、植物において成長することができるプロバイオティクス細菌種を選択および／または生産するための本発明の方法は、
ａ）少なくとも１種の腸内プロバイオティクス細菌の有効量を、植物またはその部分に適用する工程と、
ｂ）植物またはその部分を、少なくとも１枚の葉の拡張および／または少なくとも１枚の新しい葉の出現を可能にする条件下で成長させる工程と、
ｃ）少なくとも１種の拡張および／または新たに出現した葉から細菌を単離する工程と、
ｄ）単離された細菌を同定する工程と、
ｅ）工程（ａ）で適用されたプロバイオティクス種の細菌またはそれに由来する菌株を選択する工程であって、前記プロバイオティクス細菌は、植物で成長することができる、選択する工程とを含む。
【００９０】
ある種の実施形態によれば、植物部分は、種子および葉からなる群から選択される。
【００９１】
ある種の例示的な実施形態によれば、方法は、選択されたプロバイオティクス細菌が植物中で増殖する能力、具体的には植物組織の細胞間および細胞内空間にコロニー形成する能力を確認するために少なくとも１回繰り返される。
【００９２】
少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種を、植物またはその一部に適用するための当技術分野で知られているいずれかの方法を、本発明の教示に従って使用することができる。ある種の例示的な実施形態によれば、少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種は、液体中に懸濁される。ある種の実施形態によれば、液体は、浸透、浸漬／ディッピング、インキュベーション、噴霧、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される方法によって、植物またはその一部に適用される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００９３】
ある種の実施形態によれば、植物部分は種子である。ある種の実施形態によれば、少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種は、種子コーティングを介して種子に適用される。ある種の例示的な実施形態によれば、複数の種子は、少なくともプロバイオティクス細菌種を含む種子コーティング製剤でコーティングされる。これらの実施形態によれば、複数の植物は、複数の種子から成長する。
【００９４】
本発明の教示によれば、細菌成長に適合性のあるいずれかの種子コーティング製剤を、使用することができる。いくつかの実施形態によれば、種子コーティング製剤は、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ガム、デンプン、レシチン、ホルモノネチン、ポリビニルアルコール、アルカリホルモノネチネート、ヘスペレチン、ポリ酢酸ビニル、セファリン、アラビアガム、キサンタンガム、ミネラルオイル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、アラビアガラクタン、メチルセルロース、ＰＥＧ  ４００、キトサン、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリアクリロニトリル、グリセロール、トリエチレングリコール、酢酸ビニル、ジェランガム、ポリスチレン、ポリビニル、ガムガッティ、およびポリオキシエチレン−ポリオキシブチレンブロックコポリマーからなる群から選択される少なくとも１種の粘質物を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。ある種の例示的な実施形態によれば、コーティング配合物は、カルボキシメチルセルロースを含む。
【００９５】
プロバイオティクス細菌を選択するための本発明の方法は、必ずしも直接接種されない植物部分または組織からの細菌の選択を包含する。選択された細菌は植物組織内で生き残り、増殖し、広がることができ、有効な内生菌特性を示しているため、このタイプの選択は非常に重要である。
【００９６】
工程（ｅ）で選択された細菌は、工程（ａ）で植物またはその部分に適用された細菌と同一であり得るか、または選択された細菌は、最初に適用された細菌と比較して遺伝的変異を含み得ることが明確に理解されるべきである。これらの実施形態によれば、改変されたまたは新しい亜菌株が生産され得る。
【００９７】
本発明の教示によれば、植物組織内で生存および／または増殖することができ、有益なプロバイオティクス特性を有する細菌種のみを使用することができる。したがって、当技術分野で知られているいずれかの適切なモデルを使用して、改変されたまたは新規の亜菌株のプロバイオティクス特性を調べる。ある種の実施形態によれば、マウスモデル系を使用して、改変されたまたは新しい亜菌株のプロバイオティクス特性を検証する。
【００９８】
ある種の態様によれば、本発明は、本発明の方法に従って選択または生産された少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種で強化された可食性植物部分またはそれに由来する組織を提供する。
【００９９】
別の態様によれば、本発明は、動物の胃腸（ＧＩ）管に生息することができる少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種で強化された可食性植物部分を生産するための方法を提供し、方法は、
ａ．少なくとも１種の細菌種を、植物またはその部分に適用することと、
ｂ．植物またはその部分を成長させて、可食性植物部分を生産する植物を得ることと、
ｃ．可食性植物部分を収穫することであって、前記可食性植物部分が、少なくとも１種の細菌種で強化されている、収穫することと、を含む。
【０１００】
ある種の実施形態によれば、方法は、
ｉ．工程（ｂ）の植物の葉または茎から少なくとも１種の細菌種を単離する工程と、
ｉｉ．工程（ｉ）の単離された少なくとも１種の細菌種を増殖させる工程と、
ｉｉｉ．工程（ｉｉ）の増殖した細菌を、植物またはその部分に適用する工程と、
ｉｖ．工程（ｂ）を繰り返す工程と、をさらに含む。
【０１０１】
ある種の実施形態によれば、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）は少なくとも１回繰り返される。
【０１０２】
プロバイオティクス細菌が適用される植物部分および適用方法は、上記のとおりである。
【０１０３】
上記のように、本発明は、内生細菌の現象を利用して、非反芻動物、特にヒトへのプロバイオティクス細菌の経口送達のための優れた媒体を提供する。
【０１０４】
植物は、プロバイオティクス内生細菌に、細菌のコロニー形成および増殖に必要な環境条件を提供する。コロニー形成したプロバイオティクス細菌は、通常は新鮮な植物の可食性部分内において対象に送達され、その結果、消費されるまでプロバイオティクス細菌を生存させるための特別な措置を講じる必要性がない。さらに、植物組織は、プロバイオティクス細菌を保護し、一種のカプセル化を提供し、その結果、顕著な数の生存可能なプロバイオティクス細菌が、それらの作用部位に到達する。したがって、可食性植物部分に存在する比較的少数のプロバイオティクス細菌でさえ、それを消費する対象のＧＩ内に有効な数をもたらす。
【０１０５】
さらに、植物の生鮮産物（果物、野菜、塊茎、球根、および葉物産物を含む）は、世界中で最も重要な生食される食品であり、バランスの取れた健康的な食物の重要な部分である。健康およびライフスタイルへの多くの有益な効果は、生鮮カットまたは最小限に加工された可食性植物製品の消費に帰され、それらは、ビタミン、例えばβ−カロテン、アスコルビン酸、リボフラビン、葉酸、ならびにミネラル、例えば鉄、カルシウム、マンガンおよびリンの優れた供給源を代表する。さらに、植物の生鮮産物は、特に葉物産物において、微量栄養素および食物繊維の豊富な供給源であることが知られており、これらの栄養素の摂取を可能にする。最後に、特に野菜および葉物食品に含まれる炭水化物と脂肪の量が比較的少ないことは、カロリー値が低いことと相関しており、それらを健康的な食物の有力な候補とする。さらに、非消化性または低消化性の食品成分の存在は、植物の生鮮産物をプレバイオティクス物質として特性づけ、ヒトの結腸における有益なプロバイオティクス細菌の成長または活性を刺激する（Ｂｉｅｄｒｚｙｃｋａ  Ｂ．，Ｐｏｌｉｓｈ  Ｊ．ｆｏｏｄ  Ｎｕｔｒ．Ｓｃｉ．１３，１４３−１５０，２００４）。
【０１０６】
ある種の実施形態によれば、プロバイオティクス細菌は、可食性植物部分または組織の細胞間空間、可食性植物部分または組織の細胞内空間、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される部位に存在する。いくつかの実施形態によれば、プレバイオティクス細菌は、可食性植物部分または組織表面上にさらに存在する。ある種の例示的な実施形態によれば、プロバイオティクス細菌は、細胞間および／または細胞内空間内にコロニー形成される。
【０１０７】
ある種の実施形態によれば、可食性植物部分は、活発に成長している少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種を含む。他の実施形態によれば、可食性植物部分は、その休眠形態の少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種を含む。
【０１０８】
ある種の実施形態によれば、可食性植物部分は、葉、茎、果実、根、塊茎、球根、種子、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される。
【０１０９】
ある種の例示的な実施形態によれば、可食性植物部分は、食物繊維が豊富である。ある種の追加または代替の実施形態によれば、可食性植物部分は、プレバイオティクス成分が豊富である。ある種の追加または代替の実施形態によれば、可食性植物部分は、β−カロテン、アスコルビン酸、リボフラビン、葉酸、鉄、カルシウム、マンガン、リン、亜鉛、およびそれらのいずれかの組み合わせのうちの少なくとも１種が豊富である。ある種の追加のまたは代替の実施形態によれば、可食性植物部分は、カロリーが低い。
【０１１０】
ある種の例示的な実施形態によれば、可食性植物部分は、植物の葉物産物である。
【０１１１】
ある種の例示的な実施形態によれば、プロバイオティクス細菌は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓおよびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される種のものである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１２】
上記のように、本発明のプロバイオティクス細菌の植物由来可食性媒体の追加の利点は、植物組織が、プロバイオティクス細菌に、好ましくない環境条件から保護、および細菌に、胃を通過して腸に移行する間にわたって少なくとも部分的な保護を提供することである。
【０１１３】
プロバイオティクス細菌をさらに保護するために、本発明はまた、可食性植物部分またはそれに由来する組織を適切なコーティングでコーティングし、プロバイオティクス細菌の遅延放出を得て、プロバイオティクス細菌の、胃の酸性ｐＨへの曝露を回避することを開示する。本明細書で使用される場合、「遅延放出」という用語は、プロバイオティクス細菌で強化された可食性植物部分または組織の経口投与、および植物部分または組織からの前記細菌の放出との間の時間遅延を意味する。「遅延放出」は、長期間にわたるプロバイオティクス細菌の漸進的放出を伴い得るか、または伴い得ず、したがって「持続放出」を伴い得るか、または伴い得ない。
【０１１４】
ある種の実施形態によれば、コーティングは、腸溶コーティングである。
【０１１５】
腸溶コーティング製剤は、胃腸管内のある種の標的領域での薬物または活性剤の放出を改変するための適切な媒体である。腸溶コーティングは、前記薬物または剤を胃の環境から保護し、標的部位に到達する前にその放出を防ぐ効果的な方法である。したがって、腸内ポリマーでコーティングされた製剤は、胃での酸分解を防ぐために開発された。さらに、腸溶コーティングは、アルカリ性緩衝液で容易に溶解されなければならず、その結果、薬物または活性剤は、全身吸収に容易に利用可能でなければならない。腸溶性ポリマーは、次の３つのカテゴリー、（ｉ）修飾セルロース誘導体、例えば、セルロースアセテートフタレート、ヒプロメロースフタレート、ヒプロメロースアセテートスクシネートおよび（ｉｉ）メチルアクリレート−メタクリル酸コポリマーおよび（ｉｉｉ）他の材料、例えばシェラック、ポリビニルアセテートフタレートに分類することができる（Ｃａｉｌｌａｒｄ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．４９９，３２１−３２９，２０１６）。
【０１１６】
セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）は、腸溶コーティング材料として使用されてきており、これは、その非イオン形態が酸では卓越するが、ひとたび前記フタル酸基がｐＨ６を超えイオン化されると可溶性となるためである（Ｂａｌａｍｕｒａｌｉｄｈａｒａ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖ．１，２４−４８，２０１１）。ＣＡＰは、約３５％のフタリル基および２４％のアセチル基を含む（米国特許第４，９６０，８１４および第５，０２５，００４号）。フタル酸の一方のカルボキシルは、セルロースと結合し、もう一方は、さらなる反応のために遊離であると記載されている。得られた高分子酸は、水溶性アルカリ塩を形成する。ＣＡＰはさらに臨床試験が行われ、毒性作用がなく、食物の化合物として著しく不活性であることが実証された。さらに、この製品の実験室および製造時の取り扱いには、アレルゲンまたは感作作用を示す証拠はない（Ｈｏｄｇｅ，Ｈ．Ｃ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．８０，１９４４）。Ｓａｃｈｄｅｖａｅｔ  ａｌ．による最近の研究は、腸溶性コーティングされたビオカニンＡ微粒子の生産について行われ、それらの薬理学的可能性は、高血圧性卵巣切除ラット（Ｏｖｘ−ＨＴ）で調査された（Ｓａｃｈｄｅｖａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２３，２０４４−２０５，２０１６）。これらの著者らは、ビオカニンＡの腸溶コーティングが、遅延放出能、単純なビオカニンＡよりも最大６倍の経口バイオアベイラビリティの増加、および卵巣切除ラットにおけるおそらくｅＮＯＳ依存的な態様の降圧効果を示したと結論付けた。他の研究は、ＣＡＰコーティングされた経口錠剤製剤が、アルカリ性環境が保護コーティングを溶解する腸への薬物の送達を首尾よく可能にしたことを報告した（Ｓａｃｈｄｅｖａ，ｅｔ  ａｌ．，２０１６，ｉｂｉｄ；Ｂｅｒｔｚ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６３，２４３−２４９，２０１３；Ｗｏｎｇ，Ｃ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６９，２８５−２９４，２０１７）。
【０１１７】
ある種の態様によれば、本発明は、腸溶コーティングでコーティングされた生物活性剤を含む可食性植物部分またはそれに由来する組織を提供する。
【０１１８】
本発明は、可食性植物部分に生息するか、またはその中で発現することができるいずれかの生物活性剤を含む、コーティングされた可食性植物部分または組織を包含する。ある種の実施形態によれば、生物活性成分は、栄養的に活性な剤、治療的に活性な剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０１１９】
ある種の実施形態によれば、生物活性剤は、可食性植物部分に内因性である。他の実施形態によれば、生物活性剤は、可食性植物部分と異種である。
【０１２０】
ある種の実施形態によれば、生物活性剤は、プロバイオティクス細菌である。
【０１２１】
ある種の追加のまたは代替の実施形態によれば、生物活性剤は、タンパク質、ポリヌクレオチド、ビタミン、化学療法剤、抗酸化剤、老化防止剤からなる群から選択される。
【０１２２】
追加の態様によれば、本発明は、本発明の教示による少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種またはその溶解物で強化された植物組織を含む食品製品を提供する。
【０１２３】
さらに追加の態様によれば、本発明は、本発明の教示による少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種またはその溶解物で強化された植物組織を含む経口製剤を提供する。
【０１２４】
植物組織は、無傷の組織、切断された組織、粉砕された組織、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される形態であり得る。通常、植物組織は新鮮であるが、プロバイオティクス細菌が対象の腸に到達すると増殖する能力を保持している限り、凍結および乾燥形態を含む他の形態で存在し得る。
【０１２５】
当技術分野で知られているいずれかの食品製品または経口製剤を、本発明の教示に従って使用することができる。
【０１２６】
ある種の実施形態によれば、経口製剤は、懸濁液、エリキシルおよび溶液からなる群から選択される液体製剤である。ある種の実施形態によれば、経口製剤は、粉末、錠剤、カプセル、およびピルからなる群から選択される固体製剤である。
【０１２７】
植物組織およびプロバイオティクス細菌は、上記のとおりである。
【０１２８】
追加の態様によれば、本発明は、少なくとも１種の腸内プロバイオティクス細菌を、それを必要とする対象に経口送達するための方法であって、方法は、腸内プロバイオティクス細菌で強化された可食性植物部分またはそれに由来する組織の有効量を、対象に経口投与することを含む。
【０１２９】
さらなる態様によれば、本発明は、プロバイオティクス細菌の有効量を、対象への経口送達に使用するための、少なくとも１種の腸内プロバイオティクス細菌種で強化された可食性植物部分またはそれに由来する組織を提供する。
【０１３０】
さらなる態様によれば、本発明は、プロバイオティクス細菌の経口送達のための、少なくとも１種の腸プロバイオティクス細菌種で強化された可食性植物部分またはそれに由来する組織の使用を提供する。
【０１３１】
ある種の実施形態によれば、少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種で強化された可食性植物部分またはそれに由来する組織は、腸溶コーティングでコーティングされている。
【０１３２】
ある種の実施形態によれば、プロバイオティクス細菌は、植物またはその一部を消費する対象の腸に到達する。いくつかの実施形態によれば、プロバイオティクス細菌は、対象の腸内で増殖する。
【０１３３】
ある種の実施形態によれば、プロバイオティクス細菌で強化された可食性植物部分または組織の経口送達は、消費前のプロファイルと比較して、可食性植物部分または組織を消費する対象の胃腸微生物叢プロファイルを変化させる結果となる。
【０１３４】
ある種の実施形態によれば、可食性植物部分または組織の経口送達は、対象に有益な治療効果を提供する。
【０１３５】
ある種の実施形態によれば、治療効果は、ＧＩ関連疾患または障害を処置または予防することを含むことを含む。
【０１３６】
本発明の教示による、プロバイオティクス細菌で強化された可食性植物部分または組織の経口投与は、下痢、抗生物質、関節炎、肥満、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、癌、胸焼け、乳糖不耐症の相殺；慢性疲労症候群および腸内の細菌集団の不均衡に罹患する他の形態；抗生物質療法後の腸内細菌叢の再増殖；病原菌の抑制；免疫系のサポート；コレステロールの低減；カルシウム、亜鉛、鉄、マンガン、銅およびリンの生物学的利用能を高めること；およびビタミンの合成を含むがこれらに限定されない胃腸管関連疾患または障害を処置および／または予防することにおいて治療効果を有し得る。そのような経口投与を受け利益を受ける対象の非限定的な例は、ヒトまたは、または猫、犬、豚、家禽または魚などの飼育動物または家畜を含む非反芻哺乳動物を含む。
【０１３７】
ある種の実施形態によれば、可食性植物部分または組織の経口送達は、有益な美容効果を対象に提供する。
【０１３８】
さらに別の態様によれば、本発明は、少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種で強化された植物組織またはその溶解物を、それを必要とする対象に、局所投与することを含む美容方法を提供する。溶解物は、プロバイオティクス細菌の美容上有効な量を含むことが明確に理解されるべきである。溶解物は、当技術分野で知られているいずれかの方法によって調製することができる。
【０１３９】
少なくとも１種のプロバイオティクス細菌種は、上記のとおりである。
【０１４０】
ある種の実施形態によれば、対象は非反芻哺乳動物である。ある種の例示的な実施形態によれば、対象はヒトである。
【０１４１】
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態をさらに詳しく示すために提示される。しかしながら、それらは決して本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示された原理の多くの変形および修正を容易に考案することができる。
【実施例】
【０１４２】
実施例１：内生菌特性が導入されたプロバイオティクス細菌の選択
動物のＧＩで増殖することができ、健康に有益な効果を有することが知られているいくつかのプロバイオティクス細菌種を選択し、植物組織に導入した。種々の細菌ファミリーに属するＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓを、ＡＴＴＣから購入し、すべての乳酸桿菌の成長をサポートする最適な条件で（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ＭＲＳ寒天培地（ＢＤ  Ｄｉｆｃｏ）、または多種多様な細菌を増殖させるための汎用培地であるＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ，ＢＤ  Ｄｉｆｃｏ）寒天培地で、３７℃で培養して成長させた。各細菌種を寒天プレートから収集し、ＰＢＳに再懸濁して、１０６ＣＦＵ／ｍｌの最終濃度を達成した。
【０１４３】
葉の接種
上記のようにして得られたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉの細菌培養物を、レタス小植物の葉に約１ｍｌの容量で浸透させた（培養物ＯＤ＝０．１、６００ｎｍ）。浸透後、植物を２７℃の成長チャンバーで１２時間の光の長日期で成長させた。
【０１４４】
１０日後、浸透させた葉および新たに出現した葉からサンプル（葉片）を収集した。クレーターおよび乳棒を使用してＰＢＳ中で葉を粉砕し、選択培地で段階希釈を使用して得られた混合物を直接プレーティングすることにより、各サンプルから細菌を抽出した。培地で成長した種々のコロニーを、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列決定によって同定した。表１は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉを使用して実施したアッセイの結果の例を示している。
【表１】
2021526385.tif 000002
【０１４５】
種子コーティング
上述のようＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓを最適な条件での培養で成長させ、１０６ＣＦＵ／ｍｌの最終濃度を得た。各細菌種を寒天プレートから収集し、２％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）とブレンドし（Ｓｏｎｇ，Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｓｃｉ．６，１３２，２０１４）、を激しく振とうして、最終濃度が１０７〜１０８ＣＦＵ／ｍｌである均一な懸濁液を得た。ＣＭＣは食品グレードの物質であり、食品製品の用途について米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されている。
【０１４６】
レタスの種子を、細菌およびＣＭＣの懸濁液でコーティングした。コーティングされた種子を、Ｈｏａｇｌａｎｄ  Ｎｏ．２基礎塩混合寒天（ｐＨ６．５）の無菌系で発芽させ、２２℃および１２時間の光の長日期に設定された植物成長室で成長させた。
【０１４７】
９日後、コーティングされた種子から発育した植物の葉のサンプルを収集した。細菌を、クレーターおよび乳棒を使用して生理食塩水中で葉を粉砕することにより、各サンプルから抽出した。得られた混合物を、ＢＨＩ寒天培地にプレーティングした。支持培地上で成長したコロニーは、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列決定によって同定した。各細菌種のＣＦＵ／ｍｌ培地の数を以下の表２に示す。
【表２】
2021526385.tif 000003
【０１４８】
水溶液における根の浸漬（水耕栽培）
植物の成長のための水耕培地中に、細菌を浸漬することによって腸プロバイオティクス細菌を植物に適用するには、腸プロバイオティクス細菌が、通常は肥料を含む水耕培地で成長できることが必要である。候補プロバイオティクス細菌または内生成長の能力を有することがすでに示されているプロバイオティクス細菌を増殖させて、上記のように細胞培養物を形成する。細菌培養物を植物水耕培地に接種し、当技術分野で知られている水耕植物成長の条件下で、培地内で成長させる。培地サンプルをいくつかの時点（４時間、２４時間、４８時間）で採取し、ＣＦＵ／ｍｌの数をカウントする。水耕栽培培地で増殖するプロバイオティクス細菌を選択する。
【０１４９】
選択した細菌を、細胞培養物を形成させるために成長させ、水耕栽培された植物（例えばレタス）の培地に添加する。約３日および／または５日後、葉のサンプルを採取し、緩衝液中で粉砕し、そしてＣＦＵ／葉重量の数を上記のように測定する。
【０１５０】
上記のプロトコルは、可食性の葉を有する他の植物、例えばホウレンソウを使用して、内生成長能力を有するプロバイオティクス細菌を選択および／または強化するのに適している。
【０１５１】
実施例２：植物組織内の腸内プロバイオティクス細菌の生存
選択した細菌コロニーが植物に侵入して成長する能力を、細菌が移動した新しく発達した葉から細菌を単離することによって検証する。選択した細菌を無菌培地で成長させる。そして、最初に適用した方法（葉の浸透、種子のコーティング、または浸漬）に従って、得られた培養物を新しい植物に適用する。この手順を２〜１０ラウンド繰り返す。細菌が最初に種子コーティングによって適用された例示的な実験の結果を、以下の表３に示す。
【表３】
2021526385.tif 000004
【０１５２】
実施例３：選択したプロバイオティクス細菌の内生菌成長
上記のように選択された内生菌特性を獲得した（すなわち、植物組織において有意な濃度で生存および増殖することができる）プロバイオティクス細菌は、内生菌特性を有するコロニー形成細菌として定義される。選択した細菌の内生菌特性を、葉上に存在する細菌（外生細菌）および葉組織内に存在する細菌（内生細菌）を分離することによって調査した。
【０１５３】
超音波処理による外生細菌および内生細菌の分離
レタスの種子を、上記のようにプロバイオティクス細菌（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｌ．ＰａｒａｃａｓｅｉまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）溶液でコーティングした。コーティングした種子を無菌系で発芽させた。１２日後、コーティングした種子から成長した植物の葉のサンプルを収集した。サンプルを、超音波処理槽（超音波Ｅｌｍａｓｏｎｉｃ  Ｓ  １０／Ｈ；周波数５０／６０Ｈ）内で９００μｌの滅菌生理食塩水虫で７分間超音波処理した後、生理食塩水（外生細菌を表す）および破砕、超音波処理した葉（内生細菌を表す）の両方を支持培地上にプレーティングした。さらに、超音波処理なしの葉をサンプリングした（外生細菌と内生細菌の両方のサンプリング）。データを一元配置分散分析にかけ、処置手段の対比較を、統計ソフトウェア（ＪＭＰ）を使用して、Ｐ＜０．０５でＴｕｋｅｙの手順によって実施した。図１に示すように、細菌は、葉の外側部分および内側組織の間で同等の濃度で分配した。表面に強固に付着した細菌の超音波処理による脱着は、超音波処理を受けなかった対照の葉の細菌の成長と比較して、支持培地上でのこれらの細菌の成長の改善を可能にしたことに留意するべきである。超音波処理は、表面に付着した細菌を除去するための許容可能な方法であることが最近示された（Ｒｉｃｈｔｅｒ−Ｈｅｉｔｍａｎｎ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７，Ａｒｔｉｃｌｅ  ７７３，ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｍｉｃｂ．２０１６．００７７３；Ｑｖｉｔ−Ｒａｚ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １７８（３）：１６１５−１６２２．ｄｏｉ：１０．１５３４／ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１０７．０８２１６４；Ｂｅａｔｔｉｅ  Ｇ  Ａ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｏｗ  Ｓ  Ｅ．１９９９．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ８９（５）：３５３−９．ｄｏｉ：１０．１０９４／ＰＨＹＴＯ．１９９９．８９．５．３５３）。
【０１５４】
実施例４：コロニー形成したプロバイオティクス細菌の特性
獲得した内生菌特性が、それらのプロバイオティクスの特性を失わないことを確実にするために、Ｅ．Ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｌ．Ｐａｒａｃａｓｅｉ、およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのコロニー形成した細菌単離株を調査した。調査した細菌を、種子コーティング（各細菌種の培養物を伴う）−植物の成長−植物の葉からの細菌の単離の７サイクル後の植物のレタスの葉から単離し、細菌の内生成長特性を確認した。
【０１５５】
単離した細菌を、胃液をシミュレートする溶液（２グラムのＮａＣｌを含むＳＧＦ、３．２ｇのペプシン（Ｓｉｇｍａ；および８０ｍＬの１Ｍ  ＨＣｌ；蒸留水と共に混合して１Ｌにした）で成長させた。ある実験では、ペプシンを含むＳＧＦを使用して、酸性ｐＨ（ｐＨ−２およびｐＨ＝４）の影響を調査した。実験を以下のように実施した。
上記のプロバイオティクス細菌の元の単離株（すなわち、植物組織での成長サイクルの対象となっていない単離株）を対照として使用した。細菌（試験および対照）を、ＢＨＩまたはＭＲＳまたはＮＢ（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）における１８時間の成長−遠心分離（５，０００×ｇ、１０分、４℃）による培地培養後に収穫し、そしてＰＢＳ（ｐＨ７．２）で２回洗浄した。１ｍＬの細胞懸濁液（遊離細胞）を、１０ｍＬの無菌シミュレート胃液と穏やかに混合し、そして３７℃に予熱した１０ｍｌのＳＧＦに再懸濁した。細胞懸濁液を、撹拌しながら（約２００ｒｐｍ）好気性条件で、３７℃で１２０分間インキュベートした。サンプルを０、３０、６０、１２０分に採取し、ＢＨＩ￥￥ＭＲＳ￥￥ＮＢ寒天培地上にプレーティングした。生存を、ＣＦＵの数をカウントすることによって調査し、時間０でのＣＦＵの数を対照として採用した。
【０１５６】
図２に示すように、元のプロバイオティクス単離株と比較して、内生菌特性を獲得した細菌の生存率には有意差は観察されなかった。
【０１５７】
別の実験では、膵臓酵素を含む腸液（ＳＩＦ）をシミュレートする溶液の影響を調査した。（ＳＩＦ：６．８ｇの一塩基性リン酸カリウム、１ｇのパンクレアチン（Ｓｉｇｍａ）および７７ｍｌの０．２Ｎ  ＮａＯＨを共に混合して、蒸留水で１Ｌにした。溶液のｐＨを、０．２Ｎ  ＮａＯＨを加えることによりｐＨ６．８に補正した）。上記のプロバイオティクス細菌（内生菌特性を獲得したコロニー形成細菌および元の単離株）を、本質的に上記のように成長させ、収穫した細胞をＳＩＦに再懸濁した。細胞培養物を、撹拌しながら（約２００ｒｐｍ）好気性条件で、３７℃で４時間インキュベートした。サンプルを０、１２０、２４０分に採取し、ＢＨＩ￥￥ＭＲＳ￥￥ＮＢ寒天培地上にプレーティングし、生存率を測定した。各アッセイを３回行った。胃液をシミュレートした溶液に関しては、単離されたコロニー形成した外因性細菌は、元の単離株と比較して、類似の生存率が、腸液をシミュレートする溶液であることを示した（図３）。これらの結果は、プロバイオティクス細菌の内生菌特性を与える植物組織におけるプロバイオティクス細菌のコロニー形成が、胃腸管の過酷な環境に対する耐性という細菌の本質的なプロバイオティクス特性に悪影響を及ぼさなかったことを明確に実証する。
【０１５８】
実施例５：導入された細菌の生存
レタスの種子を、Ｅ．Ｆａｅｃａｌｉｓを含むカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）でコーティングした（サイクル１０から起源した）。コーティングした種子は、Ｈｏａｇｌａｎｄ  Ｎｏ．２基礎塩混合寒天（ｐＨ６．５）の無菌系で発芽させた。コーティングした種子から発芽した植物に由来する葉を、播種の８、１３、２０、および２８日後にサンプリングした（小植物を４日目頃に浸漬した）。生理食塩水中の葉を破砕し、支持培地にプレーティングすることにより、各サンプルから細菌を抽出した。支持培地上で成長したコロニーを、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列決定によって同定した。データを一元配置分散分析にかけ、処置手段の対比較を、統計ソフトウェア（ＪＭＰ）を使用して、Ｐ＜０．０５でＴｕｋｅｙの手順によって行った。２８日間の成長中には、細菌量に有意差は観察されなかった（図４）。
【０１５９】
実施例６：植物の栄養組織を腸溶コーティングでコーティングする
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ細菌を、寒天プレートから収集し、２種の異なる溶液である、二重蒸留水（ＤＤＷ）および２％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）とブレンドした。Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ細菌の最終濃度は、１０６ＣＦＵ／ｍｌであった。細菌−ＣＭＣ懸濁液を形成するために、均一な懸濁液が得られるまで溶液を激しく振とうした。
【０１６０】
レタス切断葉を、２種の異なる細菌溶液のそれぞれに１０分間ディッピングした。コーティングした葉を、４℃の冷蔵庫の滅菌ボックスに保管した。
【０１６１】
３、７、および１４日後、ＤＤＷ中で葉を破砕し、支持培地上で段階希釈を使用して、混合物を直接プレーティングすることにより、各サンプルから細菌を抽出した。未処置の葉（細菌溶液に付されていない葉）を、対照として供し、そしてすべての実験でこれらの葉にはプロバイオティクス細菌は見出されなかった。培地で成長した種々のコロニーを、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列決定によって同定した。各分析を、１０回繰り返して実行した。データを一元配置分散分析にかけ、処置手段の対比較を、統計ソフトウェア（ＪＭＰ）を使用して、Ｐ＜０．０５でＴｕｋｅｙの手順によって行った。図５は、葉をＣＭＣを含む溶液にディッピングしたときに、かなり多くのＣＦＵが検出されたため、ＣＭＣが葉に存在する細菌を保護し、その成長を妨げなかったことを実証する。
【０１６２】
実施例７：プロバイオティクス細菌で強化された栄養組織を消費するマウスのＧＩにおけるプロバイオティクス細菌の生活力およびと生存性
マウス（８週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６ＪＯＬＡＨＳＤマウス）に３種の異なる食物を２日間連続して与える。
対照群（１）：通常のマウスの餌を含む食物（５匹のマウス）；
対照群（２）：通常のレタスと混合した通常のマウスの餌を含む食物（５匹のマウス）；
試験群：本発明の教示によるプロバイオティクス細菌Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓで強化されたレタスと混合した通常のマウスの餌を含む食物（５匹のマウス）。
【０１６３】
対照群２および試験群の各マウスに、１日当たり１ｇのレタスを２日間連続して与える。３日目以降、すべての群に通常のマウスの餌のみを与える。
【０１６４】
すべてのマウスの糞便を、暗期の初めに毎日収集し、すぐに急速凍結し、さらに処理するまで−８０℃で保存するために移送する。Ｐｏｗｅｒ  Ｓｏｉｌ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、糞便サンプルからＤＮＡを単離し、糞便中のＥ．ｆａｅｃａｌｉｓの存在をＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡおよびＥＤＡ−２遺伝子のｑ−ＰＣＲ分析によって決定する（Ｐｅｙｋｏｖ  ＳＺ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐ  ３９，７０２５−７０３０．ＤＯＩ  １０．１００７／ｓ１１０３３−０１２−１５３３−ｚ）。
【０１６５】
４日目にマウスを屠殺し、胃腸管のいくつかの部分、特に結腸と盲腸からの内容物を収集する。腸内容物中のＥ．ｆａｅｃａｌｉｓの存在を、ｑ−ＰＣＲ分析によって決定する。推定プロバイオティクスの生存性を、ＦＩＳＨ方法論によって検出するために、結腸を固定する（Ｃｈａｓｓａｉｎｇ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５．Ｎａｔｕｒｅ．５１９（７５４１），９２−６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４２３２；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ＭＥ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．８４２，２２９−３５．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８−１−６１７７９−５１３−８＿１３）。
【０１６６】
実施例８：本発明のいくつかの実施形態のプロバイオティクス内生細菌で強化された栄養組織の消費が、腸の炎症に及ぼす影響
本発明の教示によるプロバイオティクス内生細菌に富む植物栄養組織が、腸の炎症の予防および／または処置に及ぼす影響を、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）によって誘発されたＩＢＤのマウスモデルを用いて調査する。予防または処置プロトコルを、本質的に以前に記載されたように実行する（Ａｖｒａｍ−Ｈａｎａｎｅｌ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓ．Ｃｏｌｏｎ  Ｒｅｃｔｕｍ  ５３，１６７６−１６８６，２０１０）。未処置のマウスを陰性対照として使用し、同じ種の単離微生物叢内生細菌で処置したマウスを陽性対照として使用する。
【０１６７】
実施例９：プロバイオティクス細菌が強化された植物生鮮産物の生産
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓおよびまた任意にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉを、それぞれの培地の寒天上で２８℃の温度で一晩成長させる。次に、細菌コロニーを採取し、そして２％ＣＭＣを含むＤＤＷに再懸濁して、濁度（６００ｎｍでＯＤ＝０．１５）に到達させる。１０７ｃｆｕ／ｍｌを含む溶液を、適用のために採取する。
【０１６８】
レタス植物を、生鮮葉物産物の例として使用する。レタス植物（ｎ＝５０）を、当技術分野で知られているように、屋外条件下で成長させる。収穫の約５日前に、３０本の植物に細菌−ＣＭＣ溶液を噴霧する。２０個体の植物を対照として供する。
【０１６９】
５日後、すべての植物を収穫し、レタスの葉を滅菌ＤＤＷで洗浄する。サンプルを各植物から採取する（サンプル当たり１００ｇの組織）。各群（処理および対照植物）から、ＤＤＷで洗浄した直後に２０〜２５個の無作為サンプルを採取する。上記のように、５〜１０個の無作為サンプルを超音波処理して外生細菌を脱着する。５〜１０個の追加の無作為サンプルを、少なくとも１種の方法（エタノール、次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）、またはそれらの組み合わせ）によって表面滅菌する。
【０１７０】
次に、すべてのサンプルを滅菌ＤＤＷで破砕し、それぞれの培地にプレーティングする。ＣＦＵ／ｇ組織の数を計算する。超音波処理および／または表面滅菌サンプル中で同定されたＣＦＵ／ｇの数は、内生細菌を示す。
【０１７１】
特定の実施形態の前述の説明は、本発明の一般的な性質を完全に明らかにするので、他の人は、現在の知識を適用することにより、過度の実験なしに、および一般的な概念から逸脱することなく、このような特定の実施形態の様々な用途に容易に修正および／または適合でき、したがって、そのような適合および変更は、開示された実施形態の均等物の意味および範囲内で理解されるべきであり、そのように意図されている。本明細書で使用される表現または用語は、説明を目的としたものであり、限定を目的としたものではないことを理解するべきである。開示された様々な化学構造および機能を実施するための手段、材料、および工程は、本発明から逸脱することなく、様々な代替形態をとることができる。
【図１】
2021526385.tif 000005
【図２Ａ】
2021526385.tif 000006
【図２Ｂ】
2021526385.tif 000007
【図２Ｃ】
2021526385.tif 000008
【図３】
2021526385.tif 000009
【図４】
2021526385.tif 000010
【図５】
2021526385.tif 000011
【国際調査報告】
2021526385.tif 000012
2021526385.tif 000013
2021526385.tif 000014
2021526385.tif 000015
2021526385.tif 000016