(57)【要約】【課題】被験者に網膜完全性の蛍光マーカーを投与するステップと、被験者の眼のイメージを生成するステップとを備えるＣＮＳ疾患を診断する方法を提供する。【解決手段】蛍光マーカーは、鼻腔内投与によって送達され、この種の方法で用いられる網膜完全性の蛍光マーカーも提供される。また、２ｋＤａ以下の化合物に結合されるアネキシン、もしくは機能性フラグメント又はその誘導体を含む医薬組成物を提供する。組成物は、少なくとも５ｍｇ／ｍｌの濃度で結合されるアネキシン、もしくは機能性フラグメント又はその誘導体を含む。【選択図】図１
2021522215.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＮＳ疾患を診断するための網膜完全性の蛍光マーカーであって、
前記蛍光マーカーは、鼻腔内投与によって送達されることを特徴とする蛍光マーカー。
【請求項２】
前記蛍光マーカーは、粉末、懸濁液、又は溶液の形状であることを特徴とする、請求項１記載の網膜完全性の蛍光マーカー。
【請求項３】
前記蛍光マーカーは、網膜血管完全性のマーカーであることを特徴とする、請求項１又は２記載の網膜完全性の蛍光マーカー。
【請求項４】
前記蛍光マーカーは、約２ｋＤａ以下の分子量を有することを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の網膜完全性の蛍光マーカー。
【請求項５】
前記蛍光マーカーは、フルオレセインナトリウム又はインドシアニングリーン（ＩＣＧ）のうち１つ以上から選択されることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の網膜完全性の蛍光マーカー。
【請求項６】
前記蛍光マーカーは、網膜細胞完全性のマーカーであることを特徴とする、請求項１又は２記載の網膜完全性の蛍光マーカー。
【請求項７】
前記蛍光マーカーは、アポトーシス、壊死、細胞活性、細胞ストレス、又はタンパク質凝集のうち１つ以上の、蛍光標識及びマーカーを備えることを特徴とする、請求項１、２、又は６記載の網膜完全性の蛍光マーカー。
【請求項８】
前記蛍光標識は、約４００〜約１０００ナノメートルの発光波長を有することを特徴とする、請求項６又は７に記載の蛍光マーカー。
【請求項９】
前記蛍光標識は、フルオレセインナトリウム、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、クルクミン、ＩＲＤｙｅ７００、ＩＲＤｙｅ８００、Ｄｙ―７７６、Ｄｙ―４８８、及びＤ―７８１のうち１つ以上から選択されることを特徴とする、請求項６乃至８のいずれか一項に記載の蛍光マーカー。
【請求項１０】
アポトーシスの前記マーカーは、アネキシン、シナプトタグミン―ＩのＣ２Ａドメイン、デュラマイシン、非ペプチド系イサチンスルホンアミド類似体（例えばＷＣ―ＩＩ―８９）、及びＡｐｏＳｅｎｓｅ（例えばＮＳＴ―７３２、ＤＤＣ、ＭＬ―１０）のうち１つ以上から選択されることを特徴とする、請求項６乃至９のいずれか一項に記載の蛍光マーカー。
【請求項１１】
前記アネキシンは、アネキシン２、アネキシン５、アネキシン６、アネキシン１１、又はアネキシン１２８のうち１つ以上から選択されることを特徴とする、請求項１０記載の蛍光マーカー。
【請求項１２】
壊死の前記マーカーは、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ピロリン酸、抗ミオシン、グルカ酸、ヒペリシン、ヒペリシンモノカルボン酸、パモン酸、ｂｉｓ−ヒドラジド−ｂｉｓ−ＤＴＰＡパモン酸、９９ｍＴｃ―ピロリン酸、１１１Ｉｎ―抗ミオシン、９９ｍＴｃ―グルカ酸、及びメチレンブルーのうち１つ以上から選択されることを特徴とする、請求項６乃至９のいずれか一項に記載の蛍光マーカー。
【請求項１３】
細胞活性の前記マーカーは、膜染色、ミトコンドリア染色、オートファジー染色、壊死染色、及びカルシウム流のうち１つ以上から選択されることを特徴とする、請求項６乃至９のいずれか一項に記載の蛍光マーカー。
【請求項１４】
細胞ストレスの前記マーカーは、脂質過酸化、グルタチオン（ＧＳＨ）、又は活性酸素種（ＲＯＳ）（例えばスーパーオキシド、ペルオキシラジカル、過酸化水素、水酸ラジカル、及びパーオキシナイトライト）のマーカーのうち１つ以上から選択される、請求項６乃至９のいずれか一項に記載の蛍光マーカー。
【請求項１５】
タンパク質凝集の前記マーカーは、コンゴ―レッド、クルクミン、又はチオフラビンＳのうち１つ以上から選択されることを特徴とする、請求項６乃至９のいずれか一項に記載の蛍光マーカー。
【請求項１６】
前記ＣＮＳ疾患は、炎症性（例えば関節炎又は肉芽腫性）、感染性（例えばウイルス性、脳炎の、又は細菌性）、脈管（例えば脈管形成の、閉塞性、又は代謝の）、又は変形性（例えば緑内障、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、アルツハイマー病、又はパーキンソン病）であることを特徴とする、請求項１乃至１５のいずれか一項に記載の網膜完全性の蛍光マーカー。
【請求項１７】
被験者に網膜完全性の蛍光マーカーを投与するステップと、前記被験者の眼のイメージを生成するステップを備えたＣＮＳ疾患を診断する方法であって、
前記蛍光マーカーは鼻腔内投与によって送達されることを特徴とする方法。
【請求項１８】
前記蛍光マーカーは、粉末、懸濁液、又は溶液の形状であることを特徴とする、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記蛍光マーカーは、網膜血管完全性のマーカーであることを特徴とする、請求項１７又は１８記載の方法。
【請求項２０】
前記蛍光マーカーは、約２ｋＤａ以下の分子量を有することを特徴とする、請求項１７乃至１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記蛍光マーカーは、フルオレセインナトリウム又はインドシアニングリーン（ＩＣＧ）のうち１つ以上から選択されることを特徴とする、請求項１７乃至２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記蛍光マーカーは、網膜細胞完全性のマーカーであることを特徴とする、請求項１７又は１８記載の方法。
【請求項２３】
前記蛍光マーカーは、アポトーシス、壊死、細胞活性、細胞ストレス、又はタンパク質凝集のうち１つ以上の、蛍光標識及びマーカーを備えることを特徴とする、請求項１７、１８又は２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記蛍光標識は、約４００〜約１０００ナノメートルの発光波長を有することを特徴とする、請求項２２又は２３記載の方法。
【請求項２５】
前記蛍光標識は、フルオレセインナトリウム、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、クルクミン、ＩＲＤｙｅ７００、ＩＲＤｙｅ８００、Ｄｙ―７７６、Ｄｙ―４８８、及びＤ―７８１のうち１つ以上から選択されることを特徴とする、請求項２２乃至２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
アポトーシスの前記マーカーは、アネキシン、シナプトタグミン―ＩのＣ２Ａドメイン、デュラマイシン、非ペプチド系イサチンスルホンアミド類似体（例えばＷＣ―ＩＩ―８９）、及びＡｐｏＳｅｎｓｅ（例えばＮＳＴ―７３２、ＤＤＣ、ＭＬ−１０）のうち１つ以上から選択されることを特徴とする、請求項２２乃至２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記アネキシンは、アネキシン２、アネキシン５、アネキシン６、アネキシン１１、又はアネキシン１２８のうち１つ以上から選択されることを特徴とする、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
壊死の前記マーカーは、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ピロリン酸、抗ミオシン、グルカ酸、ヒペリシン、ヒペリシンモノカルボン酸、パモン酸、ｂｉｓ−ヒドラジド−ｂｉｓ−ＤＴＰＡパモン酸、９９ｍＴｃ―ピロリン酸、１１１Ｉｎ―抗ミオシン、９９ｍＴｃ―グルカ酸、及びメチレンブルーのうち１つ以上から選択されることを特徴とする、請求項２２乃至２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
細胞活性の前記マーカーは、膜染色、ミトコンドリア染色、オートファジー染色、壊死染色、及びカルシウム流のうち１つ以上から選択されることを特徴とする、請求項２２乃至２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
細胞ストレスの前記マーカーは、脂質過酸化、グルタチオン（ＧＳＨ）、又は活性酸素種（ＲＯＳ）（例えばスーパーオキシド、ペルオキシラジカル、過酸化水素、水酸ラジカル、及びパーオキシナイトライト）のマーカーのうち１つ以上から選択されることを特徴とする、請求項２２乃至２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
タンパク質凝集の前記マーカーは、コンゴ―レッド、クルクミン、又はチオフラビンＳのうち１つ以上から選択されることを特徴とする、請求項２２乃至２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＣＮＳ疾患は、炎症性（例えば関節炎又は肉芽腫性）、感染性（例えばウイルス性、脳炎の、又は細菌性）、脈管（例えば脈管形成の、閉塞性、又は代謝の）、又は変形性（例えば緑内障、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、アルツハイマー病、又はパーキンソン病）であることを特徴とする、請求項１７乃至３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
医薬組成物であって、２ｋＤａ以下の化合物に結合したアネキシン、もしくは機能性フラグメント又はその誘導体を備え、
少なくとも５ｍｇ／ｍｌの濃度で結合されるアネキシン、もしくは機能性フラグメント又はその誘導体を備えることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３４】
前記アネキシン、もしくは前記機能性フラグメント又はその誘導体は、アネキシン１２８であって、
前記２ｋＤａ以下の化合物は、Ｄｙ７７６であることを特徴とする、請求項３３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＣＮＳ疾患を診断するための蛍光マーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
網膜の評価では、多くの全身性疾患の存在及び重症度に関する情報を提供することが可能となる。例えばアポトーシス網膜細胞の検出（ＤＡＲＣ）は、緑内障の診断のために第一相（臨床）試験（Ｃｏｒｄｅｉｒｏら、２０１７年）を完了したばかりで、そして、緑内障、加齢性黄斑変性、視神経炎、及びダウン症（アルツハイマー病のモデルとして）を含む神経変性疾患を対象とする、第二相（臨床）試験を受けている最中の網膜における細胞死率をモニタする技術である。現在の技術は、Ａｎｘ７７６と呼ばれる新規な蛍光剤を静脈内に投与することから成り、この新規な蛍光剤は、内因性タンパク質アネキシンＡ５の改変体（近赤外蛍光団Ｄｙ―７７６に蛍光結合される）を含む（Ｃｏｒｄｅｉｒｏら、２０１７年）。
【０００３】
ＤＡＲＣでは、ヒトアネキシンＶの蛍光標識誘導体を使用して患者の単一神経細胞アポトーシスを直接観察するのを可能とするために、特異的な眼の視覚特性が利用される。アネキシンＶは、カルシウム存在下でホスファチジルセリン（ＰＳ）と結合する能力を有するヒトタンパク質である。ＰＳはあらゆる細胞の形質膜に存在するが、アポトーシス細胞はＰＳを形質膜の外葉に発現させる。露出したＰＳと、アネキシンＶとが結合することによりアポトーシスが同定される。
【０００４】
ＤＡＲＣの第一相及び第二相臨床試験のために、Ａｎｘ７７６が静脈内投与される。共焦点走査型レーザー検眼鏡検査（ｃＳＬＯ）イメージングを用いて、網膜疾患を検出するために使用される他の蛍光分子も、主に静脈注射により投与される。例えば、異常に増殖した血管組織（脈管形成）及び加齢黄斑変性（ＡＭＤ）に関連する漏出を同定するために、一般的には、フルオレセインナトリウムとインドシアニングリーン（ＩＣＧ）とが、網膜血管系を標識するために静脈内投与される。（Ｊｏｒｚｉｋら、２００５年）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／０１３４００１号
【特許文献２】国際公開第２００９／０７７７５０号
【特許文献３】国際公開第２０１１／０５５１２１号
【０００６】
【非特許文献１】Ｍ．Ｆ．Ｃｏｒｄｅｉｒｏ，Ｅ．Ｍ．Ｎｏｒｍａｎｄｏ，Ｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｏｓｏ，Ｓ．Ｍｉｏｄｒａｇｏｖｉｃ，Ｓ．Ｊｅｙｌａｎｉ，Ｂ．Ｍ．Ｄａｖｉｓ，Ｌ．Ｇｕｏ，Ｓ．Ｏｕｒｓｅｌｉｎ，Ｒ．Ａ’Ｈｅｒｎ，Ｐ．Ａ．Ｂｌｏｏｍ，  Ｂｒａｉｎ  ２０１７年，２７４，６１
【非特許文献２】Ｊ．Ｊ．Ｊｏｒｚｉｋ，Ａ．Ｂｉｎｄｅｗａｌｄ，Ｓ．Ｄｉｔｈｍａｒ，Ｆ．Ｇ．Ｈｏｌｚ，  Ｒｅｔｉｎａ  ２００５年，２５，４０５
【非特許文献３】Ｓ．Ｋｕｍａｒ，Ｚ．Ｂｅｒｒｉｏｃｈｏａ，Ａ．Ｄ．Ｊｏｎｅｓ，Ｙ．Ｆｕ，  Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．２０１４年，ｅ５１０６１
【非特許文献４】Ｄｅ  Ｓａｉｎｔ−Ｈｕｂｅｒｔ  Ｍ，Ｐｒｉｎｓｅｎ  Ｋ，Ｍｏｒｔｅｌｍａｎｓ  Ｌ，Ｖｅｒｂｒｕｇｇｅｎ  Ａ，Ｍｏｔｔａｇｈｙ  ＦＭ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００９年６月，４８（２）：１７８−８７
【非特許文献５】ＪＦ．Ｔａｉｔ，Ｃ．Ｓｍｉｔｈ，ＦＧ．Ｂｌａｎｋｅｎｂｅｒｇ，  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ２００５年５月１日，Ｖｏｌ．４６，Ｎｏ．５  ８０７−８１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
静脈内投与には、直接的な医学的管理が必要である。このことは、病態が疑われない限り、又は疑われるような時になるまでは、患者の評価は通常行われないということを意味する。従って、患者がこの種の評価を、そして潜在的には網膜及び神経変性疾患の初期診断を受ける機会を増やすための、網膜を評価するために利用できる代替的な技術が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の態様において、本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患を診断するための、網膜完全性（完全性を確認するため）の蛍光マーカーを提供する。この蛍光マーカーは鼻腔内投与により送達される。驚くべきことに蛍光マーカーを鼻腔内投与すると、先に同じ蛍光剤を静脈内投与した時に得たのと同じ結果を網膜像が示したので、本発明の発明者は、鼻腔内投与では蛍光が素早く網膜に蓄積されることを発見した。
【０００９】
発明者らは、理論に束縛されることなく、鼻腔内に送達された網膜完全性の蛍光マーカーは、全身的に循環血液中に吸収されると考えている。局所投与であるため、網膜完全性の蛍光マーカーの必要とされる用量は低減可能であり、同じ薬剤の全身投与製剤よりも即効性であり得る。
【００１０】
本明細書において、網膜完全性の蛍光マーカーは、網膜細胞の健康（健全性）、及び／又は網膜細胞及び／又は血管の完全性について尋問（インテラゲート）するための蛍光マーカーを意味する。例えば、マーカーは、アポトーシス細胞及び壊死細胞を同定及び／又は区別することができるか、又は血管漏出又は脈管形成の領域を同定することができる。この蛍光マーカーは、励起に反応して光を発し、約４００〜約１０００ナノメートル、好ましくは約５００〜約９００ナノメートルの発光波長を有することができる。
【００１１】
網膜完全性の蛍光マーカーは好適には、局所送達、特には鼻腔内送達に適した形状で提供される。網膜完全性の蛍光マーカーは、医薬組成物として提供され、吸入に適した溶液、懸濁液、又は乾燥粉末の形状であり得る。網膜完全性の蛍光マーカーを含む医薬品組成物は、無菌とすることができ、薬理学的に許容される担体又は賦形剤を１つ以上含んでもよい。適切な担体及び賦形剤とは、当業者が熟知するであろうものでいいし、鼻腔内送達の意図されたルートに対応するように最適化が可能である。例えば、網膜完全性の蛍光マーカーを含む組成物は、バッファ、結合剤、防腐剤、増粘剤、又は抗酸化剤（例えばトレハロース）を含んでもよい。
【００１２】
本発明の実施形態では、網膜完全性の蛍光マーカーは、網膜血管完全性の蛍光マーカーであってもよい。この種の蛍光マーカーは通常、網膜血管へ入り込み、その中で循環する。そして、異常に増殖した血管組織（脈管形成）及び／又は漏出の部位が容易に視覚化され得る。
【００１３】
網膜血管完全性の蛍光マーカーの分子量は、約２ｋＤａ以下、又は１ｋＤａ以下であり得る。本発明の実施例における網膜血管完全性の蛍光マーカーの分子量は、約１００Ｄａ又は約１ｋＤａ、好ましくは約３００〜約８００Ｄａであり得る。
【００１４】
本発明で用いられる網膜血管完全性の適切な蛍光マーカーは、蛍光団を含む。特に網膜血管完全性の好適な蛍光マーカーは、フルオレセインナトリウム及びインドシアニングリーン（ＩＣＧ）を含む。
【００１５】
前述したように、網膜血管完全性の蛍光マーカーは、鼻腔内投与されることになっているので、同じマーカーを静脈内投与するための量と同じか、より少ない量での投与が可能である。例えばフルオレセインナトリウムは、約５０〜約５００ｍｇ／ｍＬ（好ましくは約５０〜約２００ｍｇ／ｍＬ）の濃度で鼻腔内投与され得る。本発明の実施例では、フルオレセインナトリウムは、約１００ｍｇ／ｍＬで鼻腔内投与され得る。ＩＣＧは、約１〜約１００ｍｇ／ｍＬ（好ましくは約２５〜約１００ｍｇ／ｍＬ）の濃度で鼻腔内投与され得る。本発明の実施例では、ＩＣＧは、約５０ｍｇ／ｍＬで鼻腔内投与され得る。
【００１６】
本発明の実施形態では、網膜完全性蛍光マーカーは、網膜細胞完全性のマーカーであってもよい。通常は、網膜細胞完全性の蛍光マーカーは、アポトーシス、壊死（ネクローシス）、細胞活性、細胞ストレス、又はタンパク質凝集のうち１つ以上のための蛍光標識及びマーカーを備える。
【００１７】
蛍光標識は、励起に反応して光を発する化合物又は分子（例えば蛍光団）を意味する。この物質は、光毒性作用を回避するために光暴露安全性基準を順守する一方で、ＳＮ比が改善され、それゆえ画像解像度及びイメージ感度も改善されるように、選択して使用できるようにしてもよい。蛍光標識は、投与の上でほとんど又はまったく炎症を引き起こさないことが好ましい。蛍光標識は、波長赤外又は近赤外線領域を有することができる。蛍光標識は、約４００〜約１０００ナノメートル、好ましくは約５００〜約９００ナノメートル、より好適には約７００〜約９００ナノメートルの発光波長を有することができる。
【００１８】
適切な蛍光標識は、フルオレセインナトリウム、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、クルクミン、ＩＲＤｙｅ７００、ＩＲＤｙｅ８００、Ｄｙ―７７６、Ｄｙ―４８８、及びＤ―７８１のうち１つ以上を含む。本発明の好ましい実施例では、蛍光標識はＤｙ―７７６である。
【００１９】
網膜細胞完全性の蛍光マーカーは、マーカー化合物に蛍光標識を結合させるための標準的技術を利用することにより調製してもよい。こういった標識は、周知のソース（例えばＤｙｏｍｉｃｓ）より調達可能である。マーカーに標識を結合するための適切な技術は、当技術分野で周知であり、標識の製造業者により提供され得る。
【００２０】
アポトーシスのマーカーとは、アポトーシスを起こしている細胞を、生細胞と区別することができるマーカーを意味する。加えて好適には、このマーカーは、アポトーシスを起こしている細胞を、壊死細胞と区別することが可能であるべきである。例えば、生細胞又は壊死細胞ではなく、アポトーシス細胞に特異的に結合する化合物又は分子であり得る。アポトーシスのマーカーは、例えばタンパク質のアネキシンファミリーを含む。アネキシンは、陽イオン存在下で細胞膜に可逆的に結合するタンパク質である。アネキシンは特に、カルシウム存在下では、ホスファチジルセリン（ＰＳ）と結合し得る。ＰＳはあらゆる細胞の形質膜に存在するが、アポトーシス細胞はＰＳを形質膜の外葉に発現させる。露出したＰＳと、アネキシンＶとが結合することによりアポトーシスが同定される。
本発明で有用なアネキシンは、天然型でも組換え型でもよい。タンパク質は全タンパク質、もしくは機能性フラグメントであってもよい。すなわち、全タンパク質と同じ分子に特異的に結合するアネキシンのフラグメント又は部分であってもよい。また、この種のタンパク質の機能性誘導体が使用されてもよい。特に、アネキシンの機能性フラグメント又は誘導体は、「アネキシンリピート」（すなわち個々のアネキシン内及びファミリーメンバー間両方で保存されている約７０のアミノ酸のドメイン）を包含する分子を含み得る。
様々なアネキシンが利用可能であり、例えば、米国特許出願公開第２００６／０１３４００１号に記載されているようなアネキシンが挙げられる。好適なアネキシンはアネキシン５であるが、これは当技術分野では周知である。利用可能な他のアネキシンとしては、アネキシン１１、２、及び６が挙げられる。
アポトーシスの他のマーカーも当技術分野において周知であり、例えばシナプトタグミンＩのＣ２Ａドメイン、デュラマイシン、非ペプチド系イサチンスルホンアミド類似体（例えばＷＣ―ＩＩ―８９）、及びＡｐｏＳｅｎｓｅ（例えばＮＳＴ―７３２、ＤＤＣ及びＭＬ−１０）が挙げられる（Ｓａｉｎｔ−Ｈｕｂｅｒｔら、２００９年）。
【００２１】
本発明の特に好ましい実施例において、アポトーシスのマーカーは、アネキシン１２８である（Ｔａｉｔら、２００５年）。アネキシン１２８は、アネキシン５の変形型であり、２つの１アミノ酸変異により、野生型とは異なる。アネキシン１２８は、Ｎ末端基に露出したチオール基を含み、これは、分子タグ（例えば蛍光標識）のための結合効率を向上させる。
【００２２】
本発明の特に好ましい実施例において、網膜細胞完全性の蛍光マーカーは、Ｄｙ―７７６に結合されるアネキシン１２８を備える。アネキシン１２８及びＤｙ―７７６は、１：１（蛍光標識：マーカー比率）で結合され得る。
【００２３】
壊死のマーカーとは、壊死が起こっている細胞を、生細胞及びアポトーシスが起こっている細胞と区別することができるマーカーを意味する。例えばこのマーカーは、生細胞又はアポトーシス細胞でなく壊死細胞に特異的に結合する化合物又は分子であり得る。壊死のマーカーは、例えばヨウ化プロピジウム（ＰＩ）といった、配列優先性がほとんどない又はまったくない核酸と結合する挿入剤を含む。
他の壊死マーカーも当技術分野において周知であり、例えば、ピロリン酸、抗ミオシン、グルカ酸、ヒペリシン、及びその誘導体（例えばヒペリシンモノカルボン酸及びパモン酸（例えばｂｉｓ−ヒドラジド−ｂｉｓ−ＤＴＰＡパモン酸））が挙げられる。特には、９９ｍＴｃ―ピロリン酸、１１１Ｉｎ―抗ミオシン、９９ｍＴｃ―グルカ酸、及びメチレンブルーが、使用されている。
【００２４】
細胞活性の他の徴候も、アポトーシス細胞又は壊死細胞を同定するために用いることができる。例えば、ミトコンドリア機能の変化を観察することにより、活性酸素種（ＲＯＳ）をマーカーとして使用することができる（カルシウムイオンも同様）。
細胞活性のマーカーは、膜染色、ミトコンドリア染色、オートファジー染色、壊死染色及びカルシウム流のうち１つ以上を含んでもよい。より詳細には細胞活性のマーカーは、Ｆｌｕｏ−３、Ｎ―（フルオレセイン―５―チオカルバモイル）―１，２―ジヘキサデカノイル―ｓｎ―グリセロール―３―ホスホエタノールアミン、ＪＣ―１、ＪＣ―９（二重発光を備える）、薄めたローダミン及びローズアミン、ローダミン１２３、及びＤｉ−８−ＡＮｅＰＰＳのうち１つ以上を含んでもよい。
細胞ストレスのマーカーは、脂質過酸化、グルタチオン（ＧＳＨ）、又は活性酸素種（ＲＯＳ）（例えばスーパーオキシド、ペルオキシラジカル、過酸化水素、水酸ラジカル、及びパーオキシナイトライト）のマーカーのうち１つ以上を含んでもよい。
【００２５】
網膜のタンパク質凝集は、細胞内又は細胞外、もしくは網膜のニューロン周辺で発生し得るが、通常は網膜血管系の外側で発生する。タンパク質凝集物の存在は、神経変性を受ける細胞と相関性があると知られている。タンパク質凝集の適切なマーカーは、コンゴーレッド、クルクミン、又はチオフラビンＳのうち１つ以上を含む。
【００２６】
上述の通り本発明は、被験者のＣＮＳ疾患を診断するための、鼻腔内に送達される網膜完全性の蛍光マーカーを提供する。被験者は好適には、ヒトを含む哺乳類であり、小児患者でも高齢患者でもよい。ＣＮＳ疾患は、網膜完全性を分析することによって同定可能である（例えば国際公開第２００９／０７７７５０号及び国際公開第２０１１／０５５１２１号に記載されている方法を参照）。例えば網膜完全性の蛍光マーカーは、アポトーシス細胞及び／又は壊死細胞を標識し、網膜の細胞死の分布を明らかにするために用いられ得る。この分布から、アポトーシス活性及び／又は壊死活性の異なったパターンを有する、異なる神経変性疾患を区別することができる。
【００２７】
ＣＮＳ疾患は、炎症性（例えば関節炎又は肉芽腫性）、感染性（例えばウイルス性、脳炎の、又は細菌性）、脈管血管に関する（例えば脈管形成、閉塞性、又は代謝の）、又は変形性（例えば緑内障、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、アルツハイマー病、又はパーキンソン病）であり得る。
本発明の実施例においてＣＮＳ疾患は、神経変性疾患（特に眼神経変性疾患）であり得る。「眼神経変性疾患」という用語は、当業者には周知であり、眼のニューロンの段階的かつ進行性の損失によって生じる病気を意味する。この病気は、緑内障、ＡＭＤ、視神経炎、及び糖尿病性網膜症を含むが、これに限定されるものではない。神経変性疾患は、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、及びフリードライヒ運動失調症を含む。本発明の実施例におけるＣＮＳ疾患は、外傷性脳損傷、脳卒中、脳性麻痺（例えば新生児低酸素症によって生じる）及び癌（脳腫瘍を含む）を含み得る。
【００２８】
本発明はさらに、ＣＮＳ疾患を診断する方法を提供する。この方法は本明細書に記載される網膜完全性の蛍光マーカーを患者に投与するステップと、網膜完全性の蛍光マーカーを鼻腔内投与される患者の網膜のイメージを生成するステップとを含む。
患者の網膜のイメージは好適には、インビボで生成され、そして、ｃＳＬＯイメージングを用いて獲得することができる。イメージ内の蛍光シグナルの有無は、ＣＮＳ疾患の有無を示すことができるので、臨床医は病気の有無を診断することができる。イメージ内に蛍光シグナルが存在する場合は、蛍光の位置及び分布により、臨床医はＣＮＳ疾患の種類を区別することができる。例えば、蛍光シグナルは、脈管形成又は血管漏出の部位を示すことができる。また、蛍光シグナルは、アポトーシス細胞及び／又は壊死細胞の分布の数又はパターンを示すことができる。
【００２９】
本発明の診断方法はさらに、病気の進行をモニタするため、例えば、処置の有効性又は病気のステージについて評価するために用いることも可能である。患者の眼の最初の生体内イメージを、最初のイメージから数日後、数週間後、あるいは数ヶ月後に撮影される同じ患者の眼のインビボイメージと比較してもよい。蛍光シグナルの変化は、病気の進行又は効果的な処置を示し得る。例えば、蛍光シグナルの増加は、アポトーシスを起こしている細胞の数の増加を示し得るので、これは病気の進行と考えられる。イメージは、国際公開第２０１１／０５５１２１号の記載にあるように分析され得る。
【００３０】
更なる態様では本発明は、上記のような網膜細胞完全性のマーカーを含む医薬組成物を提供する。この（医薬）組成物は、２ｋＤａ以下の化合物に結合される、アネキシン、もしくは機能性フラグメント又はその誘導体を備え、アネキシン、もしくは機能性フラグメント又はその誘導体は、少なくとも５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
アネキシンが約２ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で存在するときに、アネキシンを含む組成物は沈殿を伴う課題に遭遇することが知られている。しかし本発明の発明者は、少なくとも５ｍｇ／ｍｌの濃度でアネキシンを含む組成物を提供するために、この課題を解決することが可能であった。組成物は、光から保護される場合に、２５℃で最高５０日間の安定した保存が実証された。本発明の発明者は、理論に束縛されることなく、アネキシンタンパク質のＮ末端基への、２ｋＤａ以下の化合物の結合が、立体的にタンパク質凝集を妨げるよう作用すると考えている。
【００３１】
結合は、静電（気）又は共有でもよい。化合物は、アネキシン、もしくは機能性フラグメント又はその誘導体のＮ末端基（すなわち最初の３０のアミノ酸）に、好適には結合される。本発明の実施例において、アネキシン、もしくは機能性フラグメント又はその誘導体は、約５〜約２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約５〜約１ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。
【００３２】
化合物は、有機化合物又は無機化合物でもよく、サイズは約１００Ｄａ〜約２ｋＤａ、好ましくは約２００Ｄａ〜約１ｋＤａ、より好適には約３００Ｄａ〜約８００Ｄａであり得る。化合物は上記のような蛍光標識、もしくは治療薬でもよい。適切な蛍光標識は、フルオレセインナトリウム、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、クルクミン、ＩＲＤｙｅ７００、ＩＲＤｙｅ８００、Ｄｙ―７７６、Ｄｙ―４８８、及びＤ―７８１のうち１つ以上から選択されてもよい。本発明の好ましい実施例では、蛍光標識はＤｙ―７７６である。
【００３３】
本発明の好ましい実施例において、医薬組成物は、Ｄｙ７７６に結合されるアネキシン１２８を含む。驚くべきことに、網膜細胞の完全性のマーカーを濃縮するために複数の方法が評価され、Ｄｙ７７６に結合されるアネキシン１２８が、アネキシン５より高濃度でより安定すると実証された。
【００３４】
医薬組成物は、好ましくは鼻腔内投与（例えば吸入に適した溶液、懸濁液、又は乾燥粉末）に適した形状であり、上記のような好適な担体及び／又は賦形剤を含んでもよい。医薬組成物は、凍結乾燥粉末の形状であってもよく、吸入に適した乾燥粉末として患者に投与されてもよい。あるいは凍結乾燥粉末は、投与前に懸濁液とするために再水和させてもよい。
【００３５】
単なる一例だが、図を参照し本発明が詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】Ａｎｘ７７６は、鼻腔内投与されると速やかにマウスの網膜に到達し、アポトーシス網膜細胞を標識する。同じマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）の眼のｃＳＬＯイメージであり、ベースライン時［Ａ］［Ｂ］、Ａｎｘ７７６の鼻腔内投与後３時間［Ｃ］［Ｄ］、４％ＤＭＳＯの硝子体内投与［Ｂ］［Ｄ］。アポトーシス（白斑）が、４％ＤＭＳＯを硝子体内に投与した眼［Ｄ］だけに現れた点に注意すること。［Ｅ］ベースライン時と、Ａｎｘ７７６のＩＮ（鼻腔内）投与後３時間の、ＤＡＲＣスポットの対照。［Ｆ］ホスファチジルセリン結合アッセイでは、光から保護しつつ、２５℃で５０日間保管した後のフレッシュなＡｎｘ７７６材料と比較して、凍結乾燥した濃縮Ａｎｘ７７６が良好なＰＳ結合活性を保持することが実証される（ＥＣ５０比＜２）。
【図２】マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）へ、０．０２５ｍＬのフルオレセインナトリウム（２０％ｗ／ｖ）投与後のｃＳＬＯイメージ（励起４８８ナノメートル）。
【図３】マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）へ、０．０２５ｍＬインドシアニングリーン（ＩＣＧ）を鼻腔内投与（励起７９５ナノメートル）。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
ａ）Ａｎｘ７７６は、鼻腔内投与後、循環血液及び網膜に速やかに到達する
アネキシン１２８は、マレイミドの形状のＤｙ―７７６に結合された。そして、Ａｎｘ７７６として同定される網膜細胞完全性のマーカーを提供する。クリニックにおいて現在用いられるＡｎｘ７７６の製剤（０．２ｍｇ／ｍｌ）を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２８０ｍＭブドウ糖、ｐＨ６．２の注射用蒸留水を含むバッファ内で５ｋＤａ  ＭＷＣＯフィルタを使用し、５ｍｇ／ｍＬまで２５回濃縮した。
濃縮Ａｎｘ７７６（ｈｉＡｎｘ７７６）のテストがインビボで行われた。ｈｉＡｎｘ７７６をマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）に鼻腔内投与させ（２５ｐｌ）、同時に、安定したモデル［６］を使用して、網膜細胞アポトーシスを誘発するために、硝子体内に４％ＤＭＳＯ（注入量１ｐｌ、ＰＢＳバッファ）を注入した。
図１［Ａ−Ｂ］は、投薬を受けていない網膜（図１Ａ）と、ＤＭＳＯ−ｉｎｓｕｌｔｅｄ網膜（図ＩＢ）とのベースライン時（処理前）の代表的なｃＳＬＯイメージを示している。図１［Ｃ−Ｄ］は、図１Ａ及び図Ｂにあるのと同じ眼の処置後３時間のイメージである。図１Ｃは鼻腔内Ａｎｘ７７６処置のみの結果であり、図１Ｄは４％ＤＭＳＯ注入及び鼻腔内Ａｎｘ７７６処置が行われた結果である。
ＤＭＳＯ処理した眼（図１Ｄ）では、鮮やかなＤＡＲＣスポットが明らかに確認され、このことは、静注又は硝子体内投与によるＤＡＲＣと同様に、Ａｎｘ７７６を鼻腔内投与した場合、Ａｎｘ７７６がアポトーシス網膜細胞を標識するのに十分な濃度で網膜に達することができることを示唆する第１の証拠である。ＤＡＲＣスポットの手動定量では、硝子体内ＤＭＳＯ  ｉｎｓｕｌｔｓを受ける眼のアポトーシスの上昇（増加）が示されている。これは、このモデルの硝子体内投与のＤＡＲＣによる先の観察と一致している（Ｊｏｒｚｉｋら、２００５年）。
我々は、Ａｎｘ７７６が循環血液へ吸入された後に、全身的に吸収され、網膜に入り込むと仮定する。Ａｎｘ７７６を用いた我々の実験及び臨床データにより、全身性のＡｎｘ７７６は、静脈内投与後に網膜に達し得ると確認される。（Ｃｏｒｄｅｉｒｏら、２０１７年）
Ａｎｘ７７６は、凍結乾燥粉末（凍結保護物質としてトレハロースを含む）として手軽に処方され得る。この凍結乾燥粉末は、光からは保護される一方で、２５℃で保管後、最高５０日までＰＳ結合活性を保持する（図１Ｆ）。最高１０ｍｇ／ｍＬのＡｎｘ７７６を含むＡｎｘ７７６粉末が調製され、これはＩＮ（鼻腔）送達前に再水和させるか、もしくは粉末製剤として直接投与される。
【００３８】
ｂ）網膜疾患の診断で現在用いられる小さな蛍光分子は、診断に充分な量が、鼻内投与後に循環血液に速やかに到達する
蛍光タンパク質Ａｎｘ７７６（３６ｋＤａ）が鼻腔内投与で循環血液に入り込むのを観察したので、我々は次に、現在は網膜疾患の診断のために静脈内投与される小さな蛍光分子（フルオレセインナトリウム及びＩＣＧ、３７６Ｄａ及び７７５Ｄａそれぞれ）がこのように送達できるかについても確定しようとした。
フルオレセインナトリウム（図２）又はＩＣＧ（図３）の鼻腔内投与では、蛍光が網膜血管系及び脈絡膜両方に素早く蓄積されるとわかった。
ｃＳＬＯによって得られた結果イメージは、先に、同じ蛍光剤を静脈内投与した後に得られたイメージと同じだった（Ｋｕｍａｒら、２０１４年）。そして局所投与であるため、必要とされる用量は低減可能であり、同じ薬剤の全身投与製剤よりも即効性であり得る。
【図１】
2021522215.tif 000003
【図２】
2021522215.tif 000004
【図３】
2021522215.tif 000005
【国際調査報告】
2021522215.tif 000006
2021522215.tif 000007
2021522215.tif 000008