(57)【要約】  本発明は、生体適合性層によって少なくとも部分的に覆われたセンサモジュールを含む、検体を決定するためのバイオセンサであって、前記生体適合性層は、−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基（式中、Ｒ１及びＲ２は、−Ｈ及びＣ１〜Ｃ６アルキルから独立して選ばれる）を有するポリマーを含む、バイオセンサに関する。本発明はさらに、前記バイオセンサを製造するための方法、ならびに、前記バイオセンサに関連する使用及び使用方法に関する。
2021514640.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体適合性層によって少なくとも部分的に覆われたセンサモジュールを含む、検体を決定するためのバイオセンサであって、前記生体適合性層は、−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基（式中、Ｒ１及びＲ２は、−Ｈ及びＣ１〜Ｃ６アルキルから独立して選ばれる）を有するポリマーを含む、バイオセンサ。
【請求項２】
Ｒ１及びＲ２は−Ｈ及びＣ１〜Ｃ３アルキルから独立して選ばれ、１つの実施形態において、メチル、−Ｈ及びエチルから独立して選ばれ、１つの実施形態において、Ｒ１及びＲ２はメチルである、請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項３】
−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有する前記ポリマーは、一般構造（Ｉ）：
【化１】
2021514640.tif 000016
（上式中、Ｒ３は重合性基であり、１つの実施形態において、ビニル、プロペニル及びイソプロペニルから選ばれ、１つの実施形態において、Ｒ３はビニルである）のモノマーを含む組成物から得られたものであるか、又は得ることができる、請求項１又は２記載のバイオセンサ。
【請求項４】
−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有する前記ポリマーはコポリマーであり、１つの実施形態において、統計コポリマーである、請求項１〜３のいずれか１項記載のバイオセンサ。
【請求項５】
−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有する前記ポリマーは、モノ−Ｎ−又はジ−Ｎ−置換アクリルアミドモノマー及び／又はＯ−置換メタクリレートモノマーのコポリマーであり、１つの実施形態において、前記Ｏ−置換メタクリレートモノマーは４−ベンゾイルフェニルメタクリレートモノマーである、請求項１〜４のいずれか１項記載のバイオセンサ。
【請求項６】
前記ポリマーは式（ＩＩ）又は（ＩＩａ）：
【化２】
2021514640.tif 000017
（上式中、Ｒ４は架橋可能な又は架橋した側基であり、ｎは０．０１〜０．９９であり、ｍは０．９９〜０．０１であり、１つの実施形態において、ｍとｎの合計は１である）に示される化学構造を有する、請求項１〜５のいずれか１項記載のバイオセンサ。
【請求項７】
ｎは０．５〜０．９９であり、ｍは０．０１〜０．５であり、ｍとｎの合計は１である、請求項１〜６のいずれか１項記載のバイオセンサ。
【請求項８】
前記ポリマーは、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）及び／又は（ＩＩＩｃ）：
【化３】
2021514640.tif 000018
（上式中、ｎは０．０１〜０．９９であり、ｍは０．９９〜０．０１であり、１つの実施形態において、ｍとｎの合計は１であり、Ｒ５はさらなるポリマー分子又は拡散膜の分子である）に示される化学構造を含む、請求項１〜７のいずれか１項記載のバイオセンサ。
【請求項９】
拡散膜をさらに含み、前記拡散膜は親水性ポリウレタンポリマーを含む、請求項１〜８のいずれか１項記載のバイオセンサ。
【請求項１０】
前記バイオセンサはインプラント可能であり、１つの実施形態において、皮下にインプラント可能である、請求項１〜９のいずれか１項記載のバイオセンサ。
【請求項１１】
前記検体は、グルコース、マレート、エタノール、アスコルビン酸、コレステロール、グリセロール、尿素、３−ヒドロキシブチレート、ラクテート、ピルベート、ケトン及びクレアチニンからなるリストから選ばれ、１つの実施形態において、グルコースであり、１つの実施形態において、前記検体の決定は連続グルコースモニタリングである、請求項１〜１０のいずれか１項記載のバイオセンサ。
【請求項１２】
検体を決定するためのインプラント可能なバイオセンサを製造するための方法であって、請求項１〜８のいずれか１項に特定された生体適合性層で前記バイオセンサを少なくとも部分的にコーティングすることを含む、方法。
【請求項１３】
インプラント可能なバイオセンサを製造するための、請求項１〜８のいずれか１項に特定された生体適合性層の使用。
【請求項１４】
対象における検体の連続決定のための方法であって、前記方法は請求項１〜１１のいずれか１項記載のバイオセンサによって前記検体を決定することを含む、方法。
【請求項１５】
前記連続決定は、同じバイオセンサを使用した、少なくとも１週間、１つの実施形態において、少なくとも２週間、さらなる実施形態において、少なくとも３週間、さらなる実施形態において、少なくとも４週間の決定である、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生体適合性層によって少なくとも部分的に覆われたセンサモジュールを含む検体を決定するためのバイオセンサであって、前記生体適合性層は、−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基（式中、Ｒ１及びＲ２は−Ｈ及びＣ１〜Ｃ６アルキルから独立して選ばれる）を有するポリマーを含む、バイオセンサに関する。本発明はさらに、前記バイオセンサを製造するための方法ならびに前記バイオセンサに関連する使用及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術
生体液中の検体を測定するためのバイオセンサ、特に埋め込み用に設計されたセンサは、様々な機能を発揮しなければならず、一方で、センサは、例えば、細胞などの体液の特定の化合物などから干渉されずに特定の敏感な測定を提供しなければならない。この目的のために、バイオセンサは、頻繁に、特定の化合物を排除する膜で覆われ、それにより、低分子量の化合物のみが実際のセンサモジュールにアクセスすることができる。さらに、埋め込まれたセンサでは、患者が頻繁にセンサを交換するのを避けるために、測定を悪化させることなく長期間にわたって適所に存続できるセンサが存在することが好ましい。したがって、埋め込まれたセンサは、身体が埋め込まれたセンサを認識して拒絶することを回避するために、生体適合性ポリマーで覆われる。さらに、適切な生体適合性層は、体液の成分がポリペプチド又は細胞などの膜上に堆積するのを防止すべきであり、堆積は膜の細孔の閉塞をもたらし、ノイズの増加及び測定の信号強度の低下を引き起こすからである。
【０００３】
特に、埋め込まれたバイオセンサ上にしばしば細胞層が形成し、これにより、例えばグルコースを含む、細胞層を通して容易に拡散できない分子の通過を妨げることが観察された。したがって、バリア細胞層の形成を妨害する膜を提供し、生物活性剤をバイオインターフェース膜に含めることにより、インプラント可能なデバイスの感受性領域を生物付着物から保護することが提案された（ＵＳ２００６／０１９８８６４Ａ１）。さらに、ＡＤＡＰＴ（商標）製剤などの生体適合性ポリマーは、バイオセンサの性能を向上させるために使用されてきた。Ｈｕ及び同僚は、電気化学誘導原子移動ラジカル重合（ｅＡＴＲＰ）を使用したｐＳＢＭＡ（ポリＮ−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（メタ−アクリルオキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムベタイン）をベースとする酵素系バイオセンサのための防汚性双性イオンコーティングを開発した（Ｈｕら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ，  ２０１６，  ３２，  １１７６３−１１７７０）。Ｋｒｉｓｈｎａｎ及び同僚は、親水性ＰＥＧ化ポリマー、双性イオンポリマー、及び、オリゴ糖部分を組み込んだポリマーを含む抗生物付着活性を有する様々なポリマーについて、主に海洋コーティングの関係で議論している（Ｋｒｉｓｈｎａｎら、Ｊ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｃｈｅｍ．，  ２００８，  １８，  ３４０５−３４１３）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
それにもかかわらず、現在使用されている生体適合性ポリマー、例えば、インプラント型連続グルコースモニタリング（ＣＧＭ）バイオセンサは比較的短い装着時間の後に、測定可能な汚染の兆候を示し始めることがある。
【０００５】
解決すべき問題
したがって、本発明の目的は、特に汚染及びカプセル化プロセスに関する先行技術の欠点を少なくとも部分的に回避して、バイオセンサをコーティングするための改善された手段及び方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
この問題は、独立請求項の特徴を備えた本発明の手段及び方法によって解決される。独立した方法又は任意の組み合わせで実現できる好ましい実施形態は従属請求項に記載されている。
【０００７】
したがって、本発明は、生体適合性コーティングによって少なくとも部分的に覆われたセンサモジュールを含む、検体を決定するためのセンサであって、前記生体適合性コーティングは、−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基（式中、Ｒ１及びＲ２は−Ｈ及びＣ１〜Ｃ６アルキルから独立して選ばれる）を有するポリマーを含む、センサに関する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下で使用されるときに、「有する」、「備える」又は「含む」という用語、又はそれらの任意の文法上の変形は非排他的な様式で使用される。したがって、これらの用語は、これらの用語によって導入された特徴以外に、この関係で記載されているものに対してさらなる特徴が存在しない状況と、１つ以上のさらなる特徴が存在する状況の両方を指す場合がある。例として、「ＡはＢを有する」、「ＡはＢを備える」及び「ＡはＢを含む」という表現は、Ｂ以外に他の要素がＡに存在しない状況（つまり、ＡはＢのみで排他的になる）と、Ｂ以外に、要素Ｃ、要素ＣとＤ又はなおもさらなる要素などの１つ以上のさらなる要素が実体Ａに存在する状況との両方を指す場合がある。
【０００９】
さらに、以下で使用されるときに、「好ましくは」、「より好ましくは」、「最も好ましくは」、「特に」、「より具体的に」、「詳細に」、「より詳細に」又は類似の用語は、さらなる可能性を制限することなく、任意的な特徴との組み合わせで使用される。したがって、これらの用語によって導入される特徴は任意的特徴であり、いかなる方法でも特許請求の範囲を制限することが意図されない。本発明は、当業者が認識するように、代替的な特徴を使用することによって実施されうる。同様に、「本発明の実施形態」又は同様の表現によって導入される特徴は、本発明のさらなる実施形態に関する制限なし、本発明の範囲に関する制限なし、そして、このようにして導入される特徴を本発明の他の任意的又は非任意的特徴と組み合わせる可能性に関する制限なしに、任意的特徴であることが意図される。
【００１０】
本明細書において使用されるときに、「標準条件」という用語は、特に明記しない限り、ＩＵＰＡＣ標準周囲温度及び圧力（ＳＡＴＰ）条件、つまり、１つの実施形態において、温度２５℃及び絶対圧力１００ｋＰａに関係し、さらに、１つの実施形態において、標準条件はｐＨ７を含む。さらに、特に明記しない限り、「約」という用語は、関連分野で一般に受け入れられている技術的精度で示される値に関係し、１つの実施形態において、示された値±２０％に関係し、さらなる実施形態において±１０％、さらなる実施形態において±５％に関係する。さらに、「本質的に」という用語は、示された結果又は使用に影響を与える偏差が存在しないことを示す。すなわち、潜在的な偏差は、示された結果を±２０％を超えて、さらなる実施形態において±１０％を超えて、さらなる実施形態において±５％を超えて逸脱させない。したがって、「から本質的になる」とは、指定された成分を含むが、不純物として存在する材料、成分を提供するために使用されるプロセスの結果として存在する不可避な材料、及び、本発明の技術的効果の達成以外の目的で添加された成分を除く他の成分を排除するすることを意味する。例えば、「から本質的になる」という語句を使用して定義される組成物は、任意の既知の許容される添加剤、賦形剤、希釈剤、キャリアなどを包含する。１つの実施形態において、本質的に一組の成分からなる組成物は、５質量％未満、さらなる実施形態において３質量％未満、さらなる実施形態において１質量％未満、さらなる実施形態において０．１質量％未満の非指定成分を含む。
【００１１】
「バイオセンサ」という用語は、本明細書で使用されるときに、本明細書で示されるとおりの手段を含むデバイスに関する。バイオセンサは、本明細書で以下に特定されるとおり、少なくともセンサモジュール及び生体適合性層を含む。１つの実施形態において、バイオセンサはインプラント可能なバイオセンサであり、１つの実施形態において、皮下にインプラント可能である。１つの実施形態において、バイオセンサは完全にインプラント可能であり、すなわち、外部通信手段を含むバイオセンサはインプラント可能であり、１つの実施形態において、手術のために対象の皮膚に開口部を必要とせずにインプラント可能である。したがって、１つの実施形態において、バイオセンサによる外部デバイスとの通信は無線である。当業者によって理解されるように、バイオセンサの挿入は、対象の皮膚に開口部を必要とする場合がある。
【００１２】
１つの実施形態において、センサは、アパチャ、すなわち、センサモジュールが周囲媒体、特に体液と接触することを可能にする開口部をさらに含む。１つの実施形態において、前記アパチャは、センサモジュールの近傍に配置され、生体適合性層は、場合により拡散膜と組み合わせて、センサモジュールを分析流体から分離する。さらに、特にバイオセンサがインプラント可能なバイオセンサである場合に、バイオセンサはさらなる電気的及び電子的手段を含み、該手段として、例えば、バッテリーのようなエネルギー源、及び／又は、例えば、検体の測定値を報告するため外部デバイスと情報を交換するための通信ユニットが挙げられる。エネルギー源及び通信ユニットを提供するための適切な手段は当該技術分野でよく知られている。１つの実施形態において、バイオセンサは、検出可能な信号又はそこから導出される物理信号、例えば、電気信号を、読み出しユニット、例えばリーダに通信する信号に変換する処理ユニットをさらに含む。さらなる実施形態において、処理ユニットは、検出可能な信号又はそこから導出される物理信号を測定値、例えば、検体濃度に変換する。上記の手段は追加の機能を実行することができ、バイオセンサは当業者によって適切であると認められるさらなる手段を含むことができることが理解されるであろう。
【００１３】
１つの実施形態において、バイオセンサは拡散膜をさらに含む。「拡散膜」という用語は、本明細書で使用されるときに、特に１μｍ〜１００μｍ、１つの実施形態において２．５μｍ〜５０μｍの厚さを有する、検体の拡散を可能にするポリマーに関する。１つの実施形態において、拡散膜は、生体適合性ポリマー、特に、ブチルメタクリレート（ＢＵＭＡ）及び／又は２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）モノマーを重合することによって生成されるポリマーを含むか、又はそれからなる。さらなる実施形態において、拡散膜は親水性ポリウレタンポリマー（ＨＰＵ）を含む。さらなる実施形態において、拡散膜は検体の拡散を可能にするが、体液などの分析流体に含まれる高分子量成分の拡散は可能ではない。したがって、拡散膜は、１つの実施形態において、１０ｋＤａ未満、１つの実施形態において５ｋＤａ未満、さらなる実施形態において１ｋＤａ未満の分子量を有する分子の拡散を特に可能にする。したがって、１つの実施形態において、拡散膜は、半透膜、特に透析膜であり、１つの実施形態において、生体適合性透析膜である。
【００１４】
１つの実施形態において、バイオセンサは、生体適合性層によって完全に覆われている。さらなる実施形態において、センサは不活性材料から製造され、本明細書で上記に指定されたとおりのアパチャを含み、前記アパチャは少なくとも部分的に生体適合性層によって覆われ、又は、前記アパチャ及び／又はセンサモジュールは、少なくとも生体適合性層によって少なくとも部分的に覆われており、ここで、「少なくとも部分的に覆われた」とは、少なくとも、実施される検体の測定に十分な領域が生体適合性層によって覆われることを意味する。１つの実施形態において、少なくとも２５％、さらなる実施形態において、少なくとも５０％、さらなる実施形態において、少なくとも７５％、さらなる実施形態において、少なくとも９０％のアパチャ及び／又は本明細書中に特定されるとおりのセンサモジュールの試験フィールドの面積は生体適合性膜で覆われている。
【００１５】
１つの実施形態において、バイオセンサは電気化学バイオセンサであり、したがって、バイオセンサは、さらなる電気リード線及び接点を含むことができる。１つの実施形態において、バイオセンサはさらなる電極を含み、該電極は以下に記載されるとおりの特徴を有する電極であることができ、又は、それと構造的及び／又は機能的に異なる電極であることができる。さらなる電極は、例えば、充填制御、温度センサなどとしての使用に適合されていることができる。１つの実施形態において、バイオセンサは、対電極をさらに含み、さらなる実施形態において、参照電極及び対電極をさらに含む。バイオセンサは、３つの電極であって、その１つがそれぞれ作用電極、対電極及び参照電極である電極（３電極構成）を含むことができ、あるいは、バイオセンサは、一方が作用電極であり、他方が対電極及び参照電極である２つの電極（「２電極構成」）を含むことができることが当該技術分野で知られている。上記のように、バイオセンサはまた、さらなる電極を含むことができる。本開示の関係で使用されるときに、少なくとも作用電極は、試験フィールドの少なくとも一部と電気的に接触しており、すなわち導電性である。
【００１６】
１つの実施形態において、バイオセンサは光学バイオセンサであり、したがって、バイオセンサは、さらなる光学的手段、例えば、照明ユニット及び／又は光感受性要素、例えば、フォトセルを含むことができる。１つの実施形態において、センサモジュールは、本明細書の他の場所で特定されるとおりの試験フィールドの少なくとも一部を照らすための少なくとも１つの光源を含み、前記試験フィールドからの検出光を決定するように適合された少なくとも１つの光感受性要素を含む。したがって、１つの実施形態において、センサモジュールは、少なくとも１つの光源、例えば、発光ダイオード（ＬＥＤ）を含む。１つの実施形態において、検出光は、試験フィールドによって反射された光、試験フィールドによって透過された光及び試験フィールドによって放出された光からなる群より選ばれる。１つの実施形態において、光感受性要素は、光源によって放出され、そして試験フィールドによって反射及び／又は透過された光を検出するように適合された少なくとも１つの要素を含む。前記光感受性要素は、例えば、フォトダイオードであることができる。１つの実施形態において、光感受性要素は、光感受性要素の少なくとも１つの１次元又は２次元マトリックスを含み、１つの実施形態において、少なくとも１つのカメラチップを含み、そしてさらなる実施形態において、少なくとも１つのＣＣＤチップを含む。１つの実施形態において、光信号は、その検出後に電気信号に変換され、したがって、バイオセンサは、当業者によって適切であると認められるような電気化学センサのための本明細書で上述したさらなる要素を含むことができる。
【００１７】
「センサモジュール」という用語は、本明細書で使用されるときに、検体の存在下で検出可能な信号を生成する少なくとも１つの試験フィールドを含むユニット、及び、場合により、検出可能な信号を検出し及び／又はそれを出力信号、例えば電流、電圧などの電気出力信号に変換する信号検出ユニットに関する。１つの実施形態において、センサモジュールは、上記に特定されるとおりの光学センサモジュール及び電気化学センサモジュールから選ばれる。両方のタイプのセンサモジュールは、原則として、当該技術分野で知られている。
【００１８】
「検出可能な信号」という用語は、本明細書で使用されるときに、検体の存在下で変化し、任意の種類の物理信号に変換することができる試験化学物質の任意の特性に関する。１つの実施形態において、測定可能な特性及び／又はそこから生成可能な信号の変化は、サンプル中の検体の濃度に比例する。１つの実施形態において、上述のように、測定可能な特性は、試験化学物質の色及び／又は色強度の変化、すなわち、１つの実施形態において、試験化学物質の吸収及び／又は発光スペクトルの変化である。したがって、測定可能な特性の変化において、１つの実施形態における光学特性は、反射特性、１つの実施形態において、反射率及び／又は低減率、透過特性、１つの実施形態において、吸収、色、発光、１つの実施形態において蛍光からなる群より選ばれる。また、１つの実施形態において、測定可能な特性は、還元又は酸化されたレドックス化合物、例えば、本明細書の他の場所に記載されているとおりのメディエータの濃度である。上記で規定されるとおりの測定可能な特性を測定値として読み取ることができる物理信号に変換する方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、ＥＰ  ０  ８２１  ２３４、ＥＰ  ０  ９７４  ３０３及びＵＳ  ２００５／００２３１５２に記載されている。
【００１９】
１つの実施形態において、測定可能な特性は、試験化学物質に含まれるレドックス化合物のレドックス状態であり、電気化学的手段によって、例えば、電圧、容量、アドミタンス、電流又は当業者によって適切であると認められる任意のパラメータを測定することによって検出される。したがって、試験化学物質が検体と反応してサンプル流体中の検体の存在を表す電気化学信号を生成する化学試薬を含むことも本発明によって想定される。好ましい検体としてのグルコースの場合に、試験化学物質の活性成分は、典型的には、酵素を含み、１つの実施形態において、グルコース、そして場合により、レドックスメディエータを具体的に利用する。さらなる実施形態において、前記酵素はグルコースオキシダーゼ及びグルコースデヒドロゲナーゼのうちの少なくとも１つを含む。１つの実施形態において、酵素は、還元された補因子を生成し、例えば、検体の存在下でＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成し、そしてメディエータは、次いで、還元された補因子と反応する。その後、メディエータは、拡散により、検体生成物のレドックス相当物を電極表面にシャトルする。そこでメディエータは規定されたアノード電位で定量的に酸化され、結果として生じる電流は見かけのグルコース濃度に関連する。一般に、好ましいレドックスメディエータは、急速に還元及び酸化可能な分子である。例としては、フェリシアン化物、ニトロソアニリン及びそれらの誘導体、ならびにフェロセン及びその誘導体が挙げられる。別の実施形態において、酵素、例えば、グルコースオキシダーゼは、電気化学的に検出される過酸化物、特に過酸化水素を生成する。グルコースの検出に適した幾つかの試薬システムがあり、例は、ＡＣ励起、検体センサ及びバイオセンサ用途、米国特許第５，３８５，８４６号及び同第５，９９７，８１７号、ならびに米国（再発行）特許出願第１０／００８，７８８号（“Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  Ｔｅｓｔ  Ｓｔｒｉｐ”），”），”）、ＷＯ２００７／０１２４９４、ＷＯ２００９／１０３５４０、ＷＯ２０１１／０１２２６９、ＷＯ２０１１／０１２２７０及びＷＯ２０１１／０１２２７１に記載されるとおりのｃＮＡＤ化学及びＥＰ  ０  ３５４  ４４１、ＥＰ  ０  ４３１  ４５６に記載されるとおりのＳＣＶ化学物質を含む。
【００２０】
別の実施形態において、検出反応は試験化学物質又は少なくともその一部の色の変化を意味する。１つの実施形態において、試験化学物質は少なくとも１つの酵素を含み、それは、１つの実施形態において、直接又は間接的に検体と、１つの実施形態において、高い特異性をもって反応し、さらに、１つ以上の光学指標物質は試験化学物質中に存在し、少なくとも１つの酵素が検体と反応すると、少なくとも１つの光学的に検出可能な特性変化をもたらす。したがって、少なくとも１つの指示薬は、少なくとも１つの酵素と検体の酵素反応を示す変色反応を行う１つ以上の染料を含むことができる。光学的検出の例示的な実施形態はＷＯ  ２０１５／００５９５３  Ａ１に開示されている。
【００２１】
「試験フィールド」という用語は、本明細書で使用されるときに、１つの実施形態において、少なくとも１つのキャリアフィルムなどの少なくとも１つのキャリアによって保持される、連続又は不連続量の試験化学物質に関する。したがって、本明細書の他の場所で特定される試験化学物質は、試験フィールドの１つ以上のフィルム又は層を形成するか、又はそれらに含まれ、及び／又は、試験フィールドは、１つ以上の層を有する層構成を含むことができ、これらの層のうちの少なくとも１つは試験化学物質を含む。したがって、試験フィールドは、キャリア上に配置された層構成を含むことができ、サンプルは、少なくとも１つの適用側から層構成に接触することができる。１つの実施形態において、試験フィールドは多層構成を有し、該多層構成は、少なくとも１つの試験化学物質を有する少なくとも１つの検出層を含み、体液に含まれる少なくとも１つの粒子成分を分離するように適合された少なくとも１つの分離層をさらに含み、ここで、分離層は、検出層とサンプルアクセス部位との間に位置する。
【００２２】
「試験化学物質」又は「試験材料」という用語は、検体の存在下で少なくとも１つの測定可能な特性を変化させるように適合された１つの物質又は物質の混合物を指す。１つの実施形態において、試験材料は、検体の存在下で、少なくとも１つの光学的又は電気化学的に検出可能な検出反応を行う。１つの実施形態において、試験反応は、少なくとも部分的に少なくとも１つの酵素によって媒介され、したがって、１つの実施形態において、試験材料は、検体の存在下で少なくとも１つの酵素反応を行うように適合された少なくとも１つの酵素を含む。試験化学物質に関して、試験化学物質を設計する様々な可能性は当該技術分野で知られている。試験化学物質は評価される検体に関して選ばれる。
【００２３】
「酵素」という用語は、本明細書で使用されるときに、検体の存在下で、検出可能な信号を提供する化合物を生成又は消費する化学反応を触媒する、生体高分子、特にポリペプチドに関する。１つの実施形態において、酵素は、酸化還元酵素、特に酸化酵素であり、さらなる実施形態において、酵素は検体の存在下で過酸化物を生成し、特に過酸化水素を生成し、したがって、１つの実施形態において、酵素は、過酸化水素生成性オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．４）、ヘキソースオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．５）、コレステロールオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．６）、ガラクトースオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．９）、アルコールオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．１３）、Ｌ−グロノラクトンオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．８）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２生成性、ＥＣ  １．６．３．１）、ＮＡＤＨオキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２生成性、ＥＣ  １．６．３．３）又はカタラーゼ（ＥＣ  １．１１．１．６）である。１つの実施形態において、本明細書の他の場所で特定されるとおり、検体はグルコースである。したがって、少なくとも１つの酵素は、基質としてグルコースを有する酵素、１つの実施形態においてオキシドレダクターゼ、特にグルコースオキシダーゼ及び／又はグルコースデヒドロゲナーゼを含むことができる。さらなる実施形態において、酵素はグルコースオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．４）である。これに関して、上述の先行技術文献を参照することができる。具体的には、Ｊ．  Ｈｏｅｎｅｓ  ら：  Ｔｈｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｅｈｉｎｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｍｅｔｅｒｓ：  Ｔｅｓｔ  Ｓｔｒｉｐｓ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  Ｖｏｌｕｍｅ  １０，  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １，  ２００８，  Ｓ−１０  ｔｏ  Ｓ−２６を参照することができる。しかしながら、他のタイプの酵素及び／又は他のタイプの試験化学物質又は試験化学物質の活性成分は使用されうる。
【００２４】
「生体適合性層」という用語は、本明細書で使用されるときに、生体適合性材料からなる層、特にバイオセンサの最外層又はその一部に関する。１つの実施形態において、生体適合性層は、５ｎｍ〜１００μｍ、１つの実施形態において１０ｎｍ〜１μｍの厚さを有する。１つの実施形態において、生体適合性層は、センサモジュールの試験フィールドを少なくとも部分的に覆い、さらなる実施形態において、センサモジュールを少なくとも部分的に覆い、さらなる実施形態において、バイオセンサの他の要素と接触しないセンサモジュールの部分を完全に覆い、さらなる実施形態において、バイオセンサを少なくとも部分的に又は完全に覆う。１つの実施形態において、生体適合性層は、センサモジュール及び／又はバイオセンサの最外層である。したがって、１つの実施形態において、生体適合性層の少なくとも一部は対象の体液と接触する。１つの実施形態において、生体適合性層は、本明細書の他の場所で特定されるとおりの検体に対して拡散を制限せず、さらなる実施形態において、生体適合性層は、２，０００Ｄａ未満、１つの実施形態において１０００Ｄａ未満の分子量を有する小分子に対して拡散を制限しない。１つの実施形態において、生体適合性層は添加された酵素を含まず、さらなる実施形態において、生体適合性層は添加されたポリペプチドを含まず、当業者に理解されるように、これは、酵素又はポリペプチド分子が隣接する層、組織又は体液から生体適合性層中に拡散することを排除するものではない。
【００２５】
「生体適合性材料」という用語は、本明細書で使用されるときに、毒性、有害又は生理学的に反応性がない又は低いこと、及び／又は免疫学的拒絶を減少した程度に引き起こすか又は引き起こさないことにより、生体組織又は生体系での使用に適した材料に関する。。１つの実施形態において、生体適合性材料は、身体反応を誘発しない材料、例えば、不活性材料又は生体適合性層の近傍で身体反応が起こるのを防ぐ化学化合物を含む材料である。別の実施形態において、生体適合性材料は、細胞が前記生体適合性層に付着するのを防ぐ材料である。さらなる実施形態において、本明細書の上記に示されるように、バイオセンサは少なくとも２つの層を含み、その外層は、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ１Ｒ２側基を有する前記ポリマーを含む層、すなわち生体適合性層である。１つの実施形態において、第二の層は、本明細書の他の場所で特定されるとおりの拡散膜である。１つの実施形態において、生体適合性層及び拡散膜は、１つの実施形態において、本明細書で下記に特定されるとおりの架橋可能な側基を介して光活性化によって共有結合される。
【００２６】
本明細書に開示されるとおりの生体適合性層は、−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基（式中、Ｒ１及びＲ２はＨ及びＣ１〜Ｃ６アルキルから独立して選ばれる）を有するポリマーを含み、又は、１つの実施形態において、該ポリマーからなる。したがって、１つの実施形態において、ポリマーは非置換アミド側基を含む。１つの実施形態において、Ｒ１及びＲ２の最大で１つが−Ｈである。したがって、１つの実施形態において、ポリマーは、モノ−及び／又はジ−Ｎ−置換アミド側基を含む。
【００２７】
本明細書で使用されるときに、「アルキル」という用語は、任意の炭素原子からの水素原子の除去によってアルカンから誘導される一価の側基に関する。１つの実施形態において、アルキルは直鎖又は分岐鎖の飽和炭化水素基である。さらに、アルキル基は、直鎖アルキルであり、例えば、１つの実施形態において、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル又は分岐鎖アルキル基であり、例えば、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２、−Ｃ（ＣＨ３）３、−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）３、−ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２、−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）３、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）３又は−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２である。したがって、アルキル基としては、第一級アルキル基、第二級アルキル基及び第三級アルキル基が挙げられる。さらに想定されるアルキル基は、低級アルキル基、すなわち、１つの実施形態において、最大６個の炭素原子、さらなる実施形態において、最大３個の炭素原子、さらなる実施形態において、１つの炭素原子を有するアルキル基、すなわちメチル基である。１つの実施形態において、アルキルは直鎖低級アルキルであり、１つの実施形態において、ｎ−ヘキシル、ｎ−ペンチル、ｎ−ブチル、ｎ−プロピル、エチル及びメチルからなるリストから選ばれる。１つの実施形態において、Ｒ１及びＲ２は、−Ｈ及びＣ１〜Ｃ３アルキルから独立して選ばれる。さらなる実施形態において、Ｒ１及びＲ２は、−Ｈ、エチル及びメチルから独立して選ばれ、さらなる実施形態において、Ｒ１及びＲ２のうちの少なくとも１つはメチルであり、さらなる実施形態において、Ｒ１及びＲ２は両方ともメチルである。
【００２８】
１つの実施形態において、−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有するポリマーは、本明細書において「モノマー組成物」と呼ばれる、本明細書において以下に特定されるモノマーを含む組成物から得られたものか又は得ることができる。１つの実施形態において、−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有するポリマーは、一般構造（Ｉ）
【００２９】
【化１】
2021514640.tif 000003
【００３０】
（上式中、Ｒ３は重合性基である）のモノマーを含む組成物から得られたものであるか、又は得ることができる。適切な重合可能な化学基及びそれらの重合方法は当該技術分野で知られている。１つの実施形態において、Ｒ３は、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル基から選ばれる。
【００３１】
本明細書で使用されるときに、「アルケニル」という用語は、水素がアルケンから除去されたときに形成される炭化水素基に関する。１つの実施形態において、Ｒ３は、ビニル（すなわち、エテニル、−ＣＨ＝ＣＨ２）、プロペニル（−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ３）及びイソプロペニル（−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２）から選ばれる。さらなる実施形態において、Ｒ３はビニルであり、したがって、１つの実施形態において、−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有するポリマーは、アクリルアミドモノマーを含み、１つの実施形態において、モノ−及び／又はジ−Ｎ−置換アクリルアミドモノマーを含む、モノマー組成物から得られたものであるか、又は得ることができる。
【００３２】
１つの実施形態において、モノマー組成物は、上記で特定したとおりの一般構造（Ｉ）の多数の同一でないモノマー、例えば、一般構造（Ｉ）の少なくとも２つの同一でないモノマーを含む。例示的な実施形態において、モノマー組成物は、アクリルアミドモノマー及び少なくとも１つのタイプのモノ−及び／又はジ−Ｎ−置換アクリルアミドモノマーを含み、又は、モノマー組成物は、少なくとも１つのタイプのモノ−及び／又はジ−Ｎ−置換モノマー（Ｒ１及び／又はＲ２はＣ１〜Ｃ３アルキルであり、１つの実施形態において、ポリマーの生体適合性を改善する）、及び、少なくとも１つのタイプのモノ−及び／又はジ−Ｎ−置換モノマー（Ｒ１及び／又はＲ２はＣ４〜Ｃ６アルキルであり、１つの実施形態において、ポリマーの機械的特性を改善する）を含み、又は、モノマー組成物は、少なくとも１つのタイプのモノ−及び／又はジ−Ｎ−置換モノマー（Ｒ１及びＲ２はＣ１〜Ｃ３アルキルである）、及び、少なくとも１つのタイプのモノ−及び／又はジ−Ｎ−置換モノマー（Ｒ１及びＲ２はＣ４〜Ｃ６−アルキルである）を含む。
【００３３】
１つの実施形態において、本明細書で特定されるとおりのモノマー組成物は、一般構造（Ｉ）に対応しない少なくとも１つのさらなるモノマーをさらに含む。１つの実施形態において、そのようなモノマーは、ポリマー鎖を架橋し及び／又は分岐させるのに適したモノマーである。両方のタイプのモノマーは当該技術分野で知られている。したがって、１つの実施形態において、モノマー組成物は、架橋可能な側基を含む少なくとも１つのモノマーをさらに含む。
【００３４】
本明細書において使用されるときに、用語「架橋可能な側基」は、前記架橋可能な側基を含む分子からさらなる化学分子又は同じ分子の異なる部分への共有結合を確立するのに適した化学反応性又は活性化可能な基に関する。１つの実施形態において、架橋は、本明細書の他の場所で特定されているとおり、ポリマーのさらなる分子又は拡散膜に対するものである。当該技術分野で知られているように、架橋は、化学反応性基と反応することができる側基をポリマーに含めることによって、又は化学反応性又は活性化可能な側基をポリマーに含めることによって得ることができる。１つの実施形態において、架橋可能な基は、ポリマーに含まれる−ＯＨ又はＮＨ２基を含む側基であり、該ポリマーは、当該技術分野で既知の多官能性の、１つの実施形態において二官能性の架橋剤によって架橋されることができ、該架橋剤としては、例えばジグリシジルエーテル、例えばポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル及びポリ（プロピレングリコール）ジグリシジルエーテル、ビスアルデヒド及びスクシンイミジルエステルが挙げられる。さらなる実施形態において、架橋可能な側基は、活性化可能な側基、すなわち、標準条件下及び／又は暗所で化学的に本質的に非反応性であるが、適切な波長の照明によるなどの活性化後に化学的に反応性である側基である。１つの実施形態において、架橋可能な側基は、ベンゾフェノン、アリールアジド、アジドメチルクマリン、アントラキノン、特定のジアゾ化合物、ジアジリン及びソラレン誘導体からなるリストより選ばれる。さらなる実施形態において、架橋可能な側基はベンゾフェノン側基である。さらなる実施形態において、架橋可能な側基は、Ｏ−置換メタクリレートモノマーから、１つの実施形態において４−ベンゾイルフェニルメタクリレートモノマーから得られたものであるか、又は得ることができる。
【００３５】
１つの実施形態において、−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有するポリマーは、モノ−Ｎ−又はジ−Ｎ−置換アクリルアミドモノマーを含み、１つの実施形態においてＮ，Ｎ−ジメチル−アクリルアミドモノマーを含む組成物から得られたものであるか、又は、得ることができる。さらなる実施形態において、−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有するポリマーはコポリマーであり、１つの実施形態において、統計コポリマーである。さらなる実施形態において、−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２以外に、コポリマーは、上記で特定したように、架橋、改善された生体適合性、又は機械的特性などの追加の機能を提供することができる、さらなる繰り返し単位を含む。
さらなる実施形態において、−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有するポリマーは、モノ−Ｎ−又はジ−Ｎ−置換アクリルアミドモノマー及び／又はＯ−置換メタクリレートモノマーのコポリマーである。さらなる実施形態において、ポリマーは、式（ＩＩ）又は（ＩＩａ）
【００３６】
【化２】
2021514640.tif 000004
【００３７】
（上式中、Ｒ４は架橋可能な側基であり、ｎは０．０１〜０．９９であり、ｍは０．９９〜０．０１であり、１つの実施形態においてｍとｎの合計は１である）に示される化学構造を含む。１つの実施形態において、ｎは０．５〜０．９９であり、ｍは０．５〜０．０１であり、ｍとｎの合計は１である。当業者によって理解されるように、ｍとｎの合計は、他の側鎖又は側基がポリマー中に含まれる場合に、１未満であることができる。したがって、１つの実施形態において、ｍとｎの合計は最大で１であり、１つの実施形態において、ｍとｎの合計は１であり、すなわち、ポリマーは、式（ＩＩ）に示されるとおりの側基のみを有する。さらなる実施形態において、ポリマーは式（ＩＩａ）に示されるとおりの側基を有する。また、当業者に理解されるように、架橋可能な側基Ｒ４は、架橋された側基、すなわち、架橋後の架橋可能な側基であってもよく、ポリマーのさらなる分子又は拡散膜への共有結合を提供する。
【００３８】
１つの実施形態において、−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有するポリマーは、上記で特定されるとおりの一般構造（Ｉ）のモノマー、及び、架橋可能な側基を含むモノマー、１つの実施形態においてベンゾフェノン側基を含むモノマーを含む組成物から得られたものであるか、又は得ることができるコポリマーである。さらなる実施形態において、−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有するポリマーは、−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有するポリマーの合計量に基づいて、１〜５０モル％、１つの実施形態において２〜２５モル％、さらなる実施形態において３〜１０モル％の、架橋可能な側基を含むモノマーから誘導される単位を含む。１つの実施形態において、ポリマーは、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）及び／又は（ＩＩＩｃ）：
【００３９】
【化３】
2021514640.tif 000005
（上式中、Ｒ５はさらなるポリマー分子又は拡散膜の分子である）に示される化学構造を含む。
【００４０】
１つの実施形態において、ポリマーは、式（ＩＩＩ）又は（ＩＩＩａ）に示されるとおりの化学構造を含む。１つの実施形態において、ポリマーは、式（ＩＩＩｂ）又は（ＩＩＩｃ）に示されるとおりの化学構造を含む。
【００４１】
したがって、１つの実施形態において、ポリマーは、式（ＩＶ）又は（ＩＶａ）に示されるとおりの化学構造を有する。
【００４２】
【化４】
2021514640.tif 000006
【００４３】
（上式中、ｎは０．０１〜０．９９であり、ｍは０．９９〜０．０１であり、Ｒ６は−ＣＯ−Ｃ６Ｈ５（ベンゾイル）又はＣ（ＯＨ）Ｒ５−Ｃ６Ｈ５であり、Ｒ５は本明細書中、上記に特定されたとおりであり、１つの実施形態において、ｍとｎの合計は１である）。１つの実施形態において、ｎは０．５〜０．９９であり、ｍは０．５〜０．０１であり、ｍとｎの合計は１である。
【００４４】
さらなる実施形態において、−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有するポリマーは、本明細書の他の場所で特定されるとおりの少なくとも２つの同一でないモノ−Ｎ−又はジ−Ｎ−置換アクリルアミドモノマー及びＯ−置換メタクリレートモノマー、１つの実施形態において４−ベンゾイルフェニルメタクリレートモノマーのターポリマーである。
【００４５】
「検体」という用語は、本明細書で使用されるときに、液体、特に体液中に存在する化合物に関する。１つの実施形態において、検体は有機分子であり、さらなる実施形態において、本発明による酵素の存在下でレドックス反応を受けることができる有機分子である。１つの実施形態において、検体は、対象の代謝の分子、すなわち、前記対象の少なくとも１つの組織で起こる少なくとも１つの化学反応によって生成及び／又は消費される分子である。また、１つの実施形態において、検体は低分子量の化合物であり、さらなる実施形態において、分子量が５０００  ｕ（５０００Ｄａ；  １ｕ＝１．６６×１０−２７ｋｇ）未満、さらなる実施形態において１０００ｕ未満、さらなる実施形態において５００ｕ未満である化合物であり、すなわち、１つの実施形態において、検体は生体高分子ではない。さらなる実施形態において、検体は、グルコース、マレート、エタノール、アスコルビン酸、コレステロール、グリセロール、尿素、３−ヒドロキシブチレート、ラクテート、ピルベート、ケトン及びクレアチニンからなるリストより選ばれ、さらに別の実施形態において、検体はグルコースである。
【００４６】
「決定する」という用語は、本明細書で使用されるときに、体液のサンプル中に存在する検体の量の定量化、すなわち、１つの実施形態において、半定量的又は定量的に前記検体の量又は濃度を測定することに関する。検体の量の検出は、当業者に知られている、又は本明細書の他の場所で詳述されている様々な方法で達成することができる。本発明によれば、検体の量を検出することは、サンプル中の前記検体の量を検出するためのすべての既知の手段によって達成することができる。１つの実施形態において、決定は、本発明の検体を特異的に検出することである。１つの実施形態において、検体の決定は、生体内での前記検体の決定であり、さらなる実施形態において、検体の決定は、連続グルコースモニタリングであり、さらなる実施形態において連続生体内グルコースモニタリングであり、さらなる実施形態において、本明細書の他の場所で特定されるとおりの対象における連続生体内グルコースモニタリングである。
【００４７】
「量」という用語は、本明細書で使用されるときに、本明細書で言及される検体の絶対量、本明細書で言及される検体の相対量又は濃度、ならびにそれに相関する任意の値又はパラメータを包含する。そのような値又はパラメータは、測定によって本明細書で言及される検体から得られるすべての特定の物理的又は化学的特性からの強度信号値を含む。前述の量又はパラメータに相関する値は、すべての標準的な数学的演算によっても取得できることを理解されたい。
【００４８】
本明細書で使用されるときに、「体液」という用語は、間質液、血液、血漿、涙液、尿、リンパ液、脳脊髄液、胆汁、便、汗及び唾液を含む、本発明の検体を含むことが知られている又は含むものと思われる対象のすべての体液に関する。１つの実施形態において、体液は間質液又は血液であり、したがって、１つの実施形態において、体液は、少なくとも１つの粒子状成分、特に細胞を含む。さらなる実施形態において、体液は間質液である。「サンプル」という用語は当業者に理解されており、サンプルを試験要素に適用する前に対象から取り出された実施形態において、体液の任意の下位部分に関する。サンプルは、例えば、静脈又は動脈の穿刺、表皮の穿刺などを含む周知の技術によって得ることができる。
【００４９】
有利なことに、本発明の基礎をなす研究において、記載のポリマーがバイオセンサ用の生体適合性コーティングとして特に適していることが見出された。驚くべきことに、本明細書に記載のポリマーは、生体高分子の蓄積及び／又は細胞の付着による汚染の傾向が低く、細胞毒性が低く、免疫活性化活性が低いことが判った。したがって、本発明のバイオセンサは、使用可能期間が長く、カプセル化の傾向が低い。
【００５０】
上記の定義は、必要な変更を加えて以下に適用される。以下でさらに行われる追加の定義及び説明は、必要な変更を加えて、本明細書で説明されるすべての実施形態にも適用される。
【００５１】
本発明はさらに、本発明による生体適合性層で前記バイオセンサを少なくとも部分的にコーティングすることを含む、検体を決定するためのインプラント可能なバイオセンサを製造する方法に関する。
【００５２】
バイオセンサ及び／又はセンサモジュール上にポリマー層及びコーティングを製造する方法は当該技術分野で知られている。本明細書で使用されるときに、コーティングの方法は当業者によって適切であると考えられる任意の方法によって達成することができ、重合の開始の前に、それと同時に又はその後に、モノマーの溶液を塗布することによりコーティングを生成する方法を含み、また、製造済みの膜をバイオセンサに適用する方法を含む。１つの実施形態において、インプラント可能なバイオセンサを製造するための方法は、ディップコーティング、スプレイコーティング及び接触コーティングのうちの少なくとも１つを含む。また、ディップコーティング、スプレイコーティング、スピンコーティング、プレス法、ナイフ法又は滴下法から選ばれる方法を用いることができる。しかしながら、述べられた方法及び／又は他の方法の組み合わせも基本的に使用することができる。１つの実施形態において、生体適合性層は拡散膜上に生成される。１つの実施形態において、方法は、生体適合性層を下層、特に拡散膜に、例えば、３６５ｎｍでの照射などにより架橋させる工程をさらに含む。１つの実施形態において、インプラント可能なバイオセンサを製造するための方法は、例えば、バイオセンサを溶媒、例えば有機溶媒及び／又は水で処理することにより、バイオセンサの生体適合性層から非重合モノマー及びオリゴマーを抽出する追加の工程をさらに含む。
【００５３】
本発明はまた、インプラント可能なバイオセンサを製造するための本発明の生体適合性層の使用に関する。
【００５４】
本発明はまた、検体の連続現場決定のための、本発明によるバイオセンサの使用に関する。本明細書の他の場所で特定されるように、検体は、１つの実施形態において、グルコースである。
【００５５】
さらに、本発明は、対象における検体の連続決定方法であって、前記方法は、本発明によるバイオセンサにより前記検体を決定することを含む方法に関する。
【００５６】
さらに、本発明は、対象中の検体の連続決定のための方法であって、前記方法は、
（ａ）本発明によるバイオセンサを前記対象の少なくとも１つの組織に埋め込むこと、及び、
（ｂ）前記センサにより前記検体を決定すること、
を含む方法に関する。
【００５７】
１つの実施形態において、本発明の検体の連続決定のための方法はインビボ法である。さらに、方法は、上記で明示的に言及されたものに加えて、工程を含むことができる。例えば、さらなる工程は、例えば、前記検体の決定に基づいて検体の量又は濃度を提供すること、又は前記検体が第一のしきい値未満又は第二のしきい値を超えると決定された場合に警報を提供することに関することができる。さらに、前記工程の１つ以上は自動機器によって実行されうる。１つの実施形態において、前記方法は前記測定に基づく疾患の診断を含まない。
【００５８】
本明細書で使用されるときに、「対象」という用語は脊椎動物に関する。１つの実施形態において、対象は哺乳動物であり、さらなる実施形態において、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ハムスタ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ又はウマである。さらに別の実施形態において、対象は霊長類である。さらなる実施形態において、対象はヒトである。１つの実施形態において、対象は、少なくとも１つの検体の正常からの測定可能な逸脱に関連する疾患又は状態に罹患しているか、又は罹患している疑いがある。さらなる実施形態において、対象は糖尿病に罹患している。
【００５９】
「連続測定」という用語は、本明細書で使用されるときに、対象における同じバイオセンサ、特に本明細書において開示されるバイオセンサの繰り返し使用による検体の測定に関する。したがって、連続決定という用語は、個別の複数の測定、１つの実施形態において少なくとも６時間ごとの測定、さらなる実施形態において少なくとも２時間ごとの測定、さらなる実施形態において少なくとも１時間ごとの測定を含む。しかしながら、より頻繁な測定、特に少なくとも３０分ごと、さらなる実施形態において少なくとも１５分ごと、さらなる実施形態において少なくとも１０分ごと、さらなる実施形態において少なくとも５分ごとの測定も用語に含まれる。１つの実施形態において、この用語は、１つの実施形態において３０秒ごと、さらなる実施形態において少なくとも２０秒ごと、さらなる実施形態において少なくとも１０秒ごと、さらなる実施形態において少なくとも５秒ごとの準連続測定に関する。しかしながら、さらに頻繁な測定も想定される。１つの実施形態において、連続決定は、同じバイオセンサを使用した、少なくとも１週間、１つの実施形態において少なくとも２週間、さらなる実施形態において少なくとも３週間、さらなる実施形態において少なくとも４週間の決定である。
【００６０】
上記を考慮して、以下の実施形態は特に考えられる。
【００６１】
１．生体適合性層によって少なくとも部分的に覆われたセンサモジュールを含む、検体を決定するためのバイオセンサであって、前記生体適合性層は、−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基（式中、Ｒ１及びＲ２は、−Ｈ及びＣ１〜Ｃ６アルキルから独立して選ばれ、１つの実施形態において、最大でＲ１及びＲ２の１つは−Ｈである）を有するポリマーを含む、バイオセンサ。
【００６２】
２．Ｒ１及びＲ２は−Ｈ及びＣ１〜Ｃ３アルキルから独立して選ばれる、実施形態１記載のバイオセンサ。
【００６３】
３．Ｒ１及びＲ２は−Ｈ、エチル及びメチルから独立して選ばれる、実施形態１又は２記載のバイオセンサ。
【００６４】
４．Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つはメチルである、実施形態１〜３のいずれか１項記載のバイオセンサ。
【００６５】
５．Ｒ１及びＲ２はメチルである、実施形態１〜４のいずれか１項記載のバイオセンサ。
【００６６】
６．−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有する前記ポリマーは、一般構造（Ｉ）
【００６７】
【化５】
2021514640.tif 000007
【００６８】
（上式中、Ｒ３は重合性基であり、１つの実施形態において、ビニル、プロペニル及びイソプロペニルから選ばれ、１つの実施形態において、Ｒ３はビニルである）のモノマーを含む組成物から得られたものであるか、又は得ることができる、実施形態１〜５のいずれか１項記載のバイオセンサ。
【００６９】
７．−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有する前記ポリマーは、モノ−Ｎ−及び／又はジ−Ｎ−置換アクリルアミドモノマーを含み、１つの実施形態においてＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドモノマーを含む組成物から得られたものであるか、又は得ることができる、実施形態１〜６のいずれか１項記載のバイオセンサ。
【００７０】
８．−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有する前記ポリマーはコポリマーであり、１つの実施形態において統計コポリマーである、実施形態１〜７のいずれか１項記載のバイオセンサ。
【００７１】
９．−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有する前記ポリマーは、モノ−Ｎ−又はジ−Ｎ−置換アクリルアミドモノマー及び／又はＯ−置換メタクリレートモノマーのコポリマーである、実施形態１〜８のいずれか１項記載のバイオセンサ。
【００７２】
１０．前記Ｏ−置換メタクリレートモノマーは４−ベンゾイルフェニルメタクリレートモノマーである、実施形態９記載のバイオセンサ。
【００７３】
１１．前記ポリマーは式（ＩＩ）又は（ＩＩａ）：
【００７４】
【化６】
2021514640.tif 000008
【００７５】
（上式中、Ｒ４は架橋可能な又は架橋した側基であり、ｎは０．０１〜０．９９であり、ｍは０．９９〜０．０１であり、１つの実施形態においてｍとｎの合計は１である）に示される化学構造を有する、実施形態１〜１０のいずれか１項記載のバイオセンサ。
【００７６】
１２．ｎは０．５〜０．９９であり、ｍは０．０１〜０．５であり、ｍとｎの合計は１である、実施形態１〜１１のいずれか１項記載のバイオセンサ。
【００７７】
１３．−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有する前記ポリマーは、実施形態６又は７において特定されるモノマー、及び、架橋可能な側基、１つの実施形態においてベンゾフェノン側基を含むモノマーを含む組成物から得られたものであるか、又は得ることができるコポリマーである、実施形態１〜１２のいずれか１項記載のバイオセンサ。
【００７８】
１４．−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有する前記ポリマーは、−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有する前記ポリマーの合計量に基づいて、１〜５０モル％、１つの実施形態において２〜２５モル％、さらなる実施形態において３〜１０モル％の、架橋可能な側基を含むモノマーに由来する単位を含む、実施形態１〜１３のいずれか１項記載のバイオセンサ。
【００７９】
１５．前記ポリマーは、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）及び／又は（ＩＩＩｃ）：
【００８０】
【化７】
2021514640.tif 000009
【００８１】
（上式中、ｎは０．０１〜０．９９であり、ｍは０．９９〜０．０１であり、１つの実施形態においてｍとｎの合計は１であり、Ｒ５はさらなるポリマー分子又は拡散膜の分子である）に示される化学構造を含む、実施形態１〜１４のいずれか１項記載のバイオセンサ。
【００８２】
１６．拡散膜をさらに含み、前記生体適合性層は最外層である、実施形態１〜１５のいずれか１項記載のバイオセンサ。
【００８３】
１７．拡散膜をさらに含み、前記拡散膜は親水性ポリウレタンポリマーを含む、実施形態１〜１６のいずれか１項記載のバイオセンサ。
【００８４】
１８．前記バイオセンサはインプラント可能であり、１つの実施形態において皮下にインプラント可能である、実施形態１〜１７のいずれか１項記載のバイオセンサ。
【００８５】
１９．前記検体は１０００Ｄａ未満の分子量を有する検体である、実施形態１〜１８のいずれか１項記載のバイオセンサ。
【００８６】
２０．前記検体は、グルコース、マレート、エタノール、アスコルビン酸、コレステロール、グリセロール、尿素、３−ヒドロキシブチレート、ラクテート、ピルベート、ケトン及びクレアチニンからなるリストから選ばれ、１つの実施形態において、前記検体はグルコースである、実施形態１〜１９のいずれか１項記載のバイオセンサ。
【００８７】
２１．前記検体の決定は、前記検体を生体内で決定することである、実施形態１〜２０のいずれか１項記載のバイオセンサ。
【００８８】
２２．前記検体の決定は連続グルコースモニタリングである、実施形態１〜２１のいずれか１項記載のバイオセンサ。
【００８９】
２３．検体を決定するためのインプラント可能なバイオセンサを製造するための方法であって、前記バイオセンサを生体適合性層で少なくとも部分的にコーティングすることを含み、前記生体適合性層は、−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基（式中、Ｒ１及びＲ２は、Ｈ及びＣ１〜Ｃ６アルキルから独立に選ばれ、１つの実施形態において、最大でＲ１及びＲ２の１つは−Ｈである）を有するポリマーを含む、方法。
【００９０】
２４．Ｒ１及びＲ２は−Ｈ及びＣ１〜Ｃ３アルキルから独立して選ばれる、実施形態２３記載の方法。
【００９１】
２５．Ｒ１及びＲ２はＨ、エチル及びメチルから独立して選ばれる、実施形態２３又は２４記載の方法。
【００９２】
２６．Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つはメチルである、実施形態２３〜２５のいずれか１項記載の方法。
【００９３】
２７．Ｒ１及びＲ２はメチルである、実施形態２３〜２６のいずれか１項記載の方法。
【００９４】
２８．−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有する前記ポリマーは、一般構造（Ｉ）：
【００９５】
【化８】
2021514640.tif 000010
【００９６】
（上式中、Ｒ３は重合性基であり、１つの実施形態において、ビニル、プロペニル及びイソプロペニルから選ばれ、１つの実施形態において、Ｒ３はビニルである）のモノマーを含む組成物から得られたものであるか、又は得ることができる、実施形態２３〜２７のいずれか１項記載の方法。
【００９７】
２９．−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有する前記ポリマーは、モノ−Ｎ−及び／又はジ−Ｎ−置換アクリルアミドモノマーを含み、１つの実施形態においてＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドモノマーを含む組成物から得られたものであるか、又は得ることができる、実施形態２３〜２８のいずれか１項記載の方法。
【００９８】
３０．−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有する前記ポリマーはコポリマーであり、１つの実施形態において統計コポリマーである、実施形態２３〜２９のいずれか１項記載の方法。
【００９９】
３１．−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有する前記ポリマーは、モノ−Ｎ−又はジ−Ｎ−置換アクリルアミドモノマー及び／又はＯ−置換メタクリレートモノマーのコポリマーである、実施形態２３〜３０のいずれか１項記載の方法。
【０１００】
３２．前記Ｏ−置換メタクリレートモノマーは４−ベンゾイルフェニルメタクリレートモノマーである、実施形態３１記載の方法。
【０１０１】
３３．前記ポリマーは式（ＩＩ）又は（ＩＩａ）：
【０１０２】
【化９】
2021514640.tif 000011
【０１０３】
（上式中、Ｒ４は架橋可能な側基であり、ｎは０．０１〜０．９９であり、ｍは０．９９〜０．０１であり、１つの実施形態においてｍとｎの合計は１である）に示される化学構造を有する、実施形態２３〜３２のいずれか１項記載の方法。
【０１０４】
３４．ｎは０．５〜０．９９であり、ｍは０．５〜０．０１であり、ｍとｎの合計は１である、実施形態２３〜３３のいずれか１項記載の方法。
【０１０５】
３５．−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有する前記ポリマーは、実施形態２８又は２９において特定されるモノマー、及び、架橋可能な側基、１つの実施形態においてベンゾフェノン側基を含むモノマーを含む組成物から得られたものであるか、又は得ることができるコポリマーである、実施形態２３〜３４のいずれか１項記載の方法。
【０１０６】
３６．−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有する前記ポリマーは、−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有する前記ポリマーの合計量に基づいて、１〜５０モル％、１つの実施形態において２〜２５モル％、さらなる実施形態において３〜１０モル％の、架橋可能な側基を含むモノマーに由来する単位を含む、実施形態２３〜３５のいずれか１項記載の方法。
【０１０７】
３７．前記ポリマーは、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）及び／又は（ＩＩＩｃ）：
【０１０８】
【化１０】
2021514640.tif 000012
【０１０９】
（上式中、ｎは０．０１〜０．９９であり、ｍは０．９９〜０．０１であり、１つの実施形態においてｍとｎの合計は１である）に示される化学構造を含む、実施形態２３〜３６のいずれか１項記載の方法。
【０１１０】
３８．前記バイオセンサを拡散膜で少なくとも部分的にコーティングすることをさらに含み、前記生体適合性層は最外層である、実施形態１〜３７のいずれか１項記載の方法。
【０１１１】
３９．前記拡散膜は親水性ポリウレタンポリマーを含む、実施形態３８記載の方法。
【０１１２】
４０．インプラント可能なバイオセンサを製造するための生体適合性層の使用であって、前記生体適合性層は、−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基（式中、Ｒ１及びＲ２は、−Ｈ及びＣ１〜Ｃ６アルキルから独立して選ばれ、１つの実施形態において、最大でＲ１及びＲ２の１つは−Ｈである）を有するポリマーを含む、使用。
【０１１３】
４１．Ｒ１及びＲ２は−Ｈ及びＣ１〜Ｃ３アルキルから独立して選ばれる、実施形態４０記載の使用。
【０１１４】
４２．Ｒ１及びＲ２はＨ、エチル及びメチルから独立して選ばれる、実施形態４０又は４１記載の使用。
【０１１５】
４３．Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つはメチルである、実施形態４０〜４２のいずれか１項記載の使用。
【０１１６】
４４．Ｒ１及びＲ２はメチルである、実施形態４０〜４３のいずれか１項記載の使用。
【０１１７】
４５．−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有する前記ポリマーは、一般構造（Ｉ）
【０１１８】
【化１１】
2021514640.tif 000013
（上式中、Ｒ３は重合性基であり、１つの実施形態において、ビニル、プロペニル及びイソプロペニルから選ばれ、１つの実施形態において、Ｒ３はビニルである）のモノマーを含む組成物から得られたものであるか、又は得ることができる、実施形態４０〜４４のいずれか１項記載の使用。
【０１１９】
４６．−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有する前記ポリマーは、モノ−Ｎ−及び／又はジ−Ｎ−置換アクリルアミドモノマーを含み、１つの実施形態においてＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドモノマーを含む組成物から得られたものであるか、又は得ることができる、実施形態４０〜４５のいずれか１項記載の使用。
【０１２０】
４７．−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有する前記ポリマーはコポリマーであり、１つの実施形態において統計コポリマーである、実施形態４０〜４６のいずれか１項記載の使用。
【０１２１】
４８．前記ポリマーは線形ポリマーである、請求項４０〜４７のいずれか１項記載の使用。
【０１２２】
４９．−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有する前記ポリマーは、モノ−Ｎ−又はジ−Ｎ−置換アクリルアミドモノマー及び／又はＯ−置換メタクリレートモノマーのコポリマーである、実施形態４０〜４８のいずれか１項記載の使用。
【０１２３】
５０．前記Ｏ−置換メタクリレートモノマーは４−ベンゾイルフェニルメタクリレートモノマーである、実施形態４９記載の使用。
【０１２４】
５１．前記ポリマーは式（ＩＩ）又は（ＩＩａ）：
【０１２５】
【化１２】
2021514640.tif 000014
【０１２６】
（上式中、Ｒ４は架橋可能な側基であり、ｎは０．０１〜０．９９であり、ｍは０．９９〜０．０１であり、１つの実施形態においてｍとｎの合計は１である）に示される化学構造を有する、実施形態４０〜５０のいずれか１項記載の使用。
【０１２７】
５２．ｎは０．５〜０．９９であり、ｍは０．５〜０．０１であり、ｍとｎの合計は１である、実施形態４０〜５１のいずれか１項記載の使用。
【０１２８】
５３．−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有する前記ポリマーは、実施形態４５又は４６において特定されるモノマー、及び、架橋可能な側基、１つの実施形態においてベンゾフェノン側基を含むモノマーを含む組成物から得られたものであるか、又は得ることができるコポリマーである、実施形態４０〜５２のいずれか１項記載の使用。
【０１２９】
５４．−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有する前記ポリマーは、−ＣＯ−ＮＲ１Ｒ２側基を有する前記ポリマーの合計量に基づいて、１〜５０モル％、１つの実施形態において２〜２５モル％、さらなる実施形態において３〜１０モル％の、架橋可能な側基を含むモノマーに由来する単位を含む、実施形態４０〜５３のいずれか１項記載の使用。
【０１３０】
５５．前記ポリマーは、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）及び／又は（ＩＩＩｃ）：
【０１３１】
【化１３】
2021514640.tif 000015
【０１３２】
（上式中、ｎは０．０１〜０．９９であり、ｍは０．９９〜０．０１であり、１つの実施形態においてｍとｎの合計は１である）に示される化学構造を含む、実施形態４０〜５４のいずれか１項記載の使用。
【０１３３】
５６．検体の連続現場決定のための、実施形態１〜５５のいずれか１項記載のバイオセンサの使用。
【０１３４】
５７．対象における検体の連続決定のための方法であって、前記方法は実施形態１〜２２のいずれか１項記載のバイオセンサによって前記検体を決定することを含む、方法。
【０１３５】
５８．対象における検体の連続決定のための方法であって、前記方法は、
（ａ）実施形態１〜２２のいずれか１項記載のバイオセンサを、前記対象の少なくとも１つの組織に埋め込むこと、及び、
（ｂ）前記センサにより前記検体を決定すること、
を含む、方法。
【０１３６】
５９．前記連続決定は、同じバイオセンサを使用した、少なくとも１週間、１つの実施形態において少なくとも２週間、さらなる実施形態において少なくとも３週間、さらなる実施形態において少なくとも４週間の決定である、実施形態５７又は５８記載の方法。
【０１３７】
本明細書で引用されるすべての参考文献は、それらの開示内容全体及び本明細書で具体的に言及される開示内容に関して、参照により本明細書に組み込まれる。
図面の説明
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１ａ】図１ａ：ＱＣＭ実験におけるタンパク質吸着研究。周波数変化（Δｆ、［Ｈｚ］）は時間［ｍｉｎ］に対してプロットされており、タンパク質添加及びバッファー洗浄の時点を矢印で示す。ａ）２０分における下方の曲線はｐ（ＢＵＭＡ／ＨＥＭＡ／ＨＰＭＡ）を使用した実験を表す曲線であり、２０分における上方の曲線はｐ（ＤＭＡＡ）を使用した実験を表す曲線である。試験タンパク質はＡ）アルブミン及びＢ）フィブリノーゲンであった。
【図１ｂ】ｂ）ＱＣＭ実験におけるポリスチレン（ＰＳ）のタンパク質吸着研究。試験タンパク質は、Ａ）アルブミン及びＢ）フィブリノーゲンであった。
【０１３９】
【図２】図２：機能化されていないガラス表面（−）、ｐ（ＢＵＭＡ／ＨＥＭＡ／ＨＰＭＡ）ポリマーで機能化されたガラス基材、ｐ（ＤＭＡＡ）ネットワーク（ｐ（ＤＭＡＡ））で機能化されたガラス基材又はポリスチレン（ＰＳ）に対する２０日間のインキュベーション時間後の細胞接着テスト。倍率は２．５倍又は２０倍であった。ｐ（ＤＭＡＡ）で２０倍の倍率で見える細胞は、基材に付着していない細胞の塊であった。
【０１４０】
【図３】図３：３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）アッセイ、又は２，３−ビス−（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキサニリド（ＸＴＴ）アッセイにおける基準（培地）と比較した％細胞増殖であって、２４時間のインキュベーション後に、ｐ（ＤＭＡＡ）でコーティングされたサンプル（ｐ（ＤＭＡＡ））、ｐ（ＢＵＭＡ／ＨＥＭＡ／ＨＰＭＡ）でコーティングされたサンプル又はラテックス片から抽出した。未処理の細胞培養培地を１００％対照として使用した。ラテックス片を陽性対照として使用し、コーティングを有しないＰＥＴ基材を陰性対照として使用した。
【０１４１】
【図４】図４：ｐ（ＢＵＭＡ／ＨＥＭＡ／ＨＰＭＡ）でコーティングされたポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）又はｐ（ＤＭＡＡ）でコーティングされたＰＥＴによって活性化されたフィブリノーゲンと接触するＴＨＰ−１細胞による相対的サイトカイン産生。コーティングされていないＰＥＴを陰性対照として使用し、ＰＥＴ上に直接コーティングされたフィブリノーゲンを基準として使用した（１００％）。フィブリノーゲンで直接コーティングされたＰＥＴ基材を基準として使用した（１００％）。
【実施例】
【０１４２】
以下の実施例は、本発明を単に説明するものである。それらは、決して本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【０１４３】
実施例において使用される試薬
ｐ（ＢＵＭＡ／ＨＥＭＡ／ＨＰＭＡ）：９０：５：５のモル比を有するヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート及びブチルメタクリレートのコポリマー、ＰＳ：ポリスチレン、ｐ（ＤＭＡＡ）：９７％のジメチルアクリルアミドと３％のベンゾフェノンメタクリレートのコポリマー、ラテックス：ＡＣＣＵＴｅｃｈ  ＬＯＴ  １３０７５３０７０４、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液（Ｌｏｎｚａにより入手可能なカルシウム又はマグネシウムを含まないＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水（ＢＥ１７−５１２Ｆ）；０．２ｇ／ｌのＫＣｌ、０．２ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、８．０ｇ／ｌのＮａＣｌ、２．１６ｇ／ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ）、滅菌生理食塩水溶液（ＳＰＳＳ）。
【０１４４】
タンパク質溶液：アルブミン溶液：ＰＢＳバッファー中１０ｍｇ／ｍＬ、フィブリノーゲン溶液：ＰＢＳ：ＳＰＳＳ＝１：１の混合物中０．５ｍｇ／ｍＬ。
【０１４５】
細胞及び細胞増殖培地：Ｌ−９２９線維芽細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１（商標）；  ＲＰＭＩ−培地１６４０  ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ  ７２４００−０２１）中に維持され、１０％ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｆ７５２４）、１％ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ  １１３６０−０７０）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ  １５１４０−１２２）が補充されている。
【０１４６】
ＸＴＴアッセイ：細胞をおよそ１０５／ｍＬの密度に調整した。この懸濁液のうち、９６ウェルプレートのウェルあたり１００μＬを使用した。
【０１４７】
実施例１：タンパク質吸着
ポリマー層によるタンパク質吸着は、Ｑ−Ｓｅｎｓｅ  ＱＳＸ３０１デバイスを使用した水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）実験で研究した。これらの実験において、まずＱＣＭ基材（Ｑ−Ｓｅｎｓｅ）をポリマー又はポリマーネットワークでコーティングした。コーティングされたサンプルを測定セルに入れ、振動させた。共振振動周波数を記録した。その後、サンプル表面をＰＢＳ緩衝液で覆い、ポリマーコーティングが平衡状態になるまで膨潤し始め、平衡状態により共鳴振動周波数は変化しなくなった。次に、振動周波数を再度記録し、緩衝液中の最終共振振動周波数を記録することにより、タンパク質吸着実験を開始した。約１５分後、サンプルの表面を緩衝液でさらに覆い、タンパク質溶液を測定セルに添加し、サンプルの表面を約１５分間覆い、その後、表面を緩衝液で再度洗浄して、付着していないタンパク質を除去した。サンプル表面上に吸着されたタンパク質は周波数の低下を引き起こし、この低下は吸着されたタンパク質の量と相関している。我々の実験において、ｐ（ＢＵＭＡ／ＨＥＭＡ／ＨＰＭＡ）ポリマーをＱＣＭ基材表面に直接コーティングした。ｐ（ＤＭＡＡ）ネットワークでの機能化のために、最初にポリスチレン層を基材にコーティングし、その上にｐ（ＤＭＡＡ）をスピンコーティングでコーティングし、次いで、ＵＶ照射によりネットワークとして固定化した。
【０１４８】
ｐ（ＢＵＭＡ／ＨＥＭＡ／ＨＰＭＡ）及びｐ（ＤＭＡＡ）ネットワークのタンパク質吸着実験の結果を図１に示す。表面にアルブミン溶液を添加すると、ｐ（ＢＵＭＡ／ＨＥＭＡ／ＨＰＭＡ）でコーティングされた表面を有意な周波数の低下を生じる。この低下の大部分は、バッファーで表面を洗浄することで回復できるが、周波数はベースラインに戻らず、少量のタンパク質がｐ（ＢＵＭＡ／ＨＥＭＡ／ＨＰＭＡ）でコーティングされた表面に不可逆的に吸着されたことを示す。アルブミン溶液をｐ（ＤＭＡＡ）表面に添加した後に、ずっと低い周波数の低下は観察され、これはバッファーで洗浄することで完全に回復できた。フィブリノーゲン吸着の場合には、ｐ（ＢＵＭＡ／ＨＥＭＡ／ＨＰＭＡ）でコーティングされた表面にタンパク質溶液を添加することにより生じる周波数の低下は、バッファーでの洗浄では元に戻せず、吸着されたタンパク質は２Ｈｚの周波数低下を引き起こした。一方、アルブミンと同様に、ｐ（ＤＭＡＡ）でコーティングされたサンプルの周波数は、表面がタンパク質溶液に曝露された後に、わずかしか低下しなかった。バッファーでタンパク質を除去することにより、周波数をベースラインに戻すことができた。したがって、ｐ（ＤＭＡＡ）ネットワークは、アルブミン及びフィブリノーゲン吸着に対する耐性の向上を示した。
【０１４９】
実施例２：細胞接着
細胞接着を基材としてのガラスカバーガラスで試験した。カバーガラスは石英ガラスからなり、直径１．５ｃｍの円形を有した（ＶＷＲ、ＥＣＮ６３１−１５７９）。カバーガラスは、各実験工程の間に、コーティングを上向きにして、低発塵及び低細菌環境で２４ウェルプレートに単独で保管した。カバーガラスを真空ピンセットで取り扱った。カバーガラスの表面を、スピンコーティングにより直接ｐ（ＢＵＭＡ／ＨＥＭＡ／ＨＰＭＡ）でコーティングした。ｐ（ＤＭＡＡ）コーティングの場合に、最初にカバーガラス表面をスピンコーティングによってポリスチレン（ＰＳ）でコーティングし、次にスピンコーティングによってｐ（ＤＭＡＡ）でコーティングし、その後再びＵＶ照射した（３６５ｎｍ、０．３５Ｗ／ｍ２、２分）。コーティングを有しないカバーガラス及びＰＳのみのコーティングを有するカバーガラスを対照として使用した。
【０１５０】
細胞の微生物汚染を避けるために、コーティングされたカバーガラスは、７０％エタノール／水又はパフォーム（Ｐｅｒｆｏｒｍ）（２５％エタノール、３５％プロパン−１−オール及び４０％水）に１５秒間浸し、無菌フード内でカバーガラスを取り扱うことによって滅菌された。滅菌溶液を乾燥させた後に、５００μＬの細胞増殖培地を含む２４ウェルプレートのウェルにカバーガラスを入れた。カバーガラスの下の気泡を、ピンセットでカバーガラスをウェルの底に押し付けることで回避した。使用前に、コーティングされたカバーガラスを細胞増殖培地中で約１時間膨潤させた。
【０１５１】
Ｌ９２９細胞をＴ７５ボトル又はフラスコで最大９０％の集密度まで培養した。Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で洗浄し、次いで、１ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡを加えることで、細胞を培養ボトルから分離した。細胞を３７℃で約５分間トリプシン処理した後に、９ｍＬの培地を加えた。細胞を注意深く再懸濁し、５００ｘ  ｇで２分間遠心分離した。細胞ペレットを５ｍＬの新鮮な培地に再懸濁した（最初に１０ｍＬの血清ピペットで、次に１ｍＬのエッペンドルフピペットで再懸濁させた）。再懸濁した２ｍＬの細胞を７３ｍＬの細胞増殖培地で希釈することにより、細胞密度を調整した。調整した懸濁液のうち、各１ｍＬをカバーガラス上に置き、それにより、ウェルあたり約３０，０００個の細胞を適用した。播種後に、細胞を標準的なＣＯ２インキュベータで培養した。
【０１５２】
２０日間のインキュベーション時間後のこの実験の結果を図２に示す。理解されるように、機能化されていないガラス基材の表面は完全に、例えば、集密的に、細胞層で覆われており、この表面が細胞接着に対して耐性がないことを示した。ｐ（ＢＵＭＡ／ＨＥＭＡ／ＨＰＭＡ）でコーティングされた表面上において、細胞は最初の３日間は接着できなかった。より長いインキュベーション時間の後に、一部の細胞は表面にうまく不可逆的に付着し、成長及び増殖し始めた。２０日後に、ｐ（ＢＵＭＡ／ＨＥＭＡ／ＨＰＭＡ）表面の大部分は細胞で覆われた（図２）。有意な細胞接着は、ｐ（ＤＭＡＡ）ネットワークでコーティングされた表面では観察されなかった。細胞は２０日後にのみ互いに付着し、細胞塊を形成した。サンプルを静かに動かしたときに、細胞塊が浮き上がり、ｐ（ＤＭＡＡ）ネットワークでコーティングされた表面に付着できなかったことが観察された。この実験の結果は、ｐ（ＤＭＡＡ）ネットワークでコーティングされた表面が細胞接着に対して強い耐性を有することを示した。
【０１５３】
実施例３：毒性試験
毒性試験のために、ＰＥＴ基材（２＊２ｃｍ）の両面を、ｐ（ＤＭＡＡ）でスピンコーティングし、次いでＵＶ照射を行うことにより、ｐ（ＤＭＡＡ）ネットワークでコーティングした。サンプルを使用前に電子線（２５ｋＧｙ）で滅菌した。３つの試験サンプルを４ｍＬの細胞培養培地に３７℃で２４時間浸した。インキュベートした細胞培養培地（溶出液）１ｍＬを新しい９６ウェルプレートのウェルに移し、Ｌ９２９線維芽細胞を加えてさらに２４時間インキュベートし、その後に、細胞の生存率をＸＴＴ−テストを使用して測定した。結果は、基準（例えば１００％）として未処理の細胞培養培地を使用して、％細胞増殖として示す。したがって、％増殖値が低いほど、細胞内のサンプルの毒性効果が強くなる。ラテックス手袋から切断された断片及びｐ（ＢＵＭＡ／ＨＥＭＡ／ＨＰＭＡ）でコーティングされたＰＥＴ基材から上記のように調製された溶出液を対照として使用した。例えば、ラテックス手袋から切り取った断片を陽性対照として使用し、コーティングを有しないＰＥＴ基材を陰性対照として使用した。図３に示すように、ｐ（ＤＭＡＡ）コーティングはＬ９２９細胞上で検出可能な毒性を示さなかった。
【０１５４】
実施例４：フィブリノーゲンでコーティングされたポリマーによる細胞活性化
ポリマーの炎症誘発可能性を試験するために、ヒト細胞株ＴＨＰ−１を使用した。ＴＨＰ−１細胞は単球様細胞であり、外因性の刺激によって活性化されることができ、該刺激は細胞に培養培地へのサイトカインの分泌を増加させる。この活性化は、誘導材料との表面接触によって直接、又は、材料から放出された可溶性成分によって誘導することができる。さらなる選択肢は、ポリマーの表面との接触により活性化されるフィブリノーゲンによる細胞の活性化である。フィブリノーゲンのこの活性化は、構造の変化を引き起こし、ＴＨＰ−１細胞上の免疫受容体に結合する結合部位を露出させ、それによって細胞の活性化を引き起こす。さらに別の選択肢は、フィブリノーゲン吸着によるコーティング表面上の細胞の活性化である。この表面付着は、フィブリノーゲンの構造変化を引き起こし、それを介して結合部位が露出し、ＴＨＰ−１細胞上の免疫受容体に結合することができ、それによって細胞の活性化が引き起こされる。
【０１５５】
実験において、小さなＰＥＴプレート基材の片側をポリマー（ｐ（ＢＵＭＡ／ＨＥＭＡ／ＨＰＭＡ）又はｐ（ＤＭＡＡ））でコーティングした。フィブリノーゲンでのコーティングは、２ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲンの溶液を基材に添加し、３７℃で１６時間インキュベートすることにより行った。余剰のフィブリノーゲン溶液を除去し、ＴＨＰ−１細胞を加えた。インキュベータで３７℃で４８時間インキュベートした後に、上清を細胞から分離し、上清中に解放されたサイトカインを分析した。サイトカイン分析は、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅの「Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）」アッセイキット（Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｋｉｔ及びＨｕｍａｎ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｋｉｔ、どちらも製造元の指示に従って）を使用して行った。フィブリノーゲンのみでコーティングされた基材を基準として使用した。
【０１５６】
ｐ（ＢＵＭＡ／ＨＥＭＡ／ＨＰＭＡ）及びｐ（ＤＭＡＡ）表面上で観察されたサイトカインレベルは、対照表面上のサイトカインレベルに対して正規化され、図４に百分率として示す。ｐ（ＢＵＭＡ／ＨＥＭＡ／ＨＰＭＡ）でコーティングされたサンプル及びｐ（ＤＭＡＡ）でコーティングされたサンプルは、ヒトＩＬ−１β、ヒトＴＮＦ及びヒトＩＬ−８の活性化についての比較結果を示した。さらに、サイトカインＭＣＰ−１、ヒトＶＥＧＦの産生は、ｐ（ＢＵＭＡ／ＨＥＭＡ／ＨＰＭＡ）表面上よりもｐ（ＤＭＡＡ）表面上でわずかに低かった。興味深いことに、ｐ（ＤＭＡＡ）表面は、ｐ（ＢＵＭＡ／ＨＥＭＡ／ＨＰＭＡ）表面よりも有意に低いヒトＩＰ−１０レベルを示した。このテストの結果は、ｐ（ＢＵＭＡ／ＨＥＭＡ／ＨＰＭＡ）と比較して、ｐ（ＤＭＡＡ）ネットワークでコーティングされた表面は生体適合性の向上を示していることを示した。
【０１５７】
引用文献：
ＵＳ  ２００６／０１９８８６４  Ａ１
ＥＰ  ０  ８２１  ２３４
ＥＰ  ０  ９７４  ３０３
ＵＳ  ２００５／００２３１５２
ＵＳ  ５，３８５，８４６
ＵＳ  ５，９９７，８１７
ＵＳ  １０／００８，７８８
ＷＯ  ２００７／０１２４９４
ＷＯ  ２００９／１０３５４０
ＷＯ  ２０１１／０１２２６９
ＷＯ  ２０１１／０１２２７０
ＷＯ  ２０１１／０１２２７１
ＥＰ  ０  ３５４  ４４１
ＥＰ  ０  ４３１  ４５６
ＷＯ  ２０１５／００５９５３  Ａ１
Ｊ．  Ｈｏｅｎｅｓ  ら：  Ｔｈｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｅｈｉｎｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｍｅｔｅｒｓ：Ｔｅｓｔ  Ｓｔｒｉｐｓ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  Ｖｏｌｕｍｅ  １０，  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １，  ２００８，  Ｓ−１０〜Ｓ−２６。
【図１ａ】
2021514640.tif 000019
【図１ｂ】
2021514640.tif 000020
【図２】
2021514640.tif 000021
【図３】
2021514640.tif 000022
【図４】
2021514640.tif 000023
【国際調査報告】
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