(57)【要約】  本発明は、ポリペプチド、特に免疫グロブリンドメインを含み、ヒトプログラム細胞死リガンド-1（huPDL1）に結合するポリペプチド、及び医薬としての使用、又は診断薬として、例えば免疫トレーサーとしての使用等へのかかるポリペプチドの適用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトプログラム細胞死リガンド-1（PD-L1）に結合する免疫グロブリン可変ドメイン（IVD）を含むポリペプチドであって、該ポリペプチドのアミノ酸配列がCDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域を含み、該CDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域が配列番号1、配列番号5、配列番号8又は配列番号11のいずれかに存在するそれらのCDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域から選択される、ポリペプチド。
【請求項２】
前記CDR領域がKabat法、Chothia法、Martin法又はIMTG法によって決定される、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記CDR領域がIMTG法によって決定され、前記CDR1領域が配列番号2及び配列番号6から選択され、前記CDR2領域が配列番号3、配列番号7又は配列番号9から選択され、前記CDR3領域が配列番号4、配列番号10又は配列番号12から選択される、請求項1又は2に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記CDR領域が配列番号5に存在するCDR領域である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記CDR領域がヒト化されている、及び／又は前記IVDがヒト化されている、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
機能性部分を更に含む請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記機能性部分がHisタグ又はソルターゼ認識配列である、請求項6に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記機能性部分が検出可能部分である、請求項6に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記検出可能部分が前記ポリペプチドに含まれる特異的部位に連結されている、請求項8に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
請求項1〜7のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離核酸。
【請求項１１】
請求項10に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１２】
請求項1〜7のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現するか、又は請求項10に記載の核酸を含むか、又は請求項11に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１３】
請求項1〜9のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１４】
医薬として使用される、診断に使用される、手術に使用される、治療に使用される、治療法のモニタリングに使用される、又は樹状細胞ワクチン接種に使用される、請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項13に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
イメージング剤として使用される、請求項8若しくは9に記載のポリペプチド、又は請求項13に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項1〜7のいずれか一項に記載のポリペプチドを製造する方法であって、
請求項12に記載の宿主細胞において前記ポリペプチドを発現させることと、
前記発現されたポリペプチドを精製することと、
を含む、方法。
【請求項１７】
前記精製されたポリペプチドに検出可能部分を結合することを更に含む、請求項16に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチド、特に免疫グロブリンドメインを含み、ヒトプログラム細胞死リガンド-1（huPDL1：human Programmed Death Ligand-1）に結合するポリペプチド、及び医薬としての使用、又は診断薬として、例えば免疫トレーサーとしての使用等へのかかるポリペプチドの適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
プログラム細胞死-1（PD-1）及びそのリガンドPD-L1（プログラム細胞死リガンド-1）からなる免疫チェックポイント軸は、癌細胞の抗癌免疫応答からの回避において中心的な要素である。PD-1及びPD-L1に対するモノクローナル抗体（mAb）は、様々な癌タイプの治療に対して承認されており、例えば、非特許文献1の表1に概要が示されている。これらのmAbの全身投与は、腫瘍における十分な取り込みを確実にするために高用量で行われる。高用量での投与は、mAbの組織透過能力が低いため必要とされるが、免疫関連の副作用及び毒性のリスクが高まることは抑えられる（例えば、非特許文献2）。患者の適格性及びモニタリングの問題だけでなく、PD-L1標的部分を腫瘍に送達することは、動的免疫チェックポイント発現の評定を可能にし、また腫瘍内のPD-L1を効率的に標的とすることができる手段の必要性を強調する。
【０００３】
国際特許出願公開の特許文献1及び特許文献2はいずれも、huPD-L1を用いて作製されたナノボディのセット（両文献で同じセットのナノボディ）を開示している。非特許文献3による公表では、分子イメージング用のマウスPD-L1（ただしヒトPD-L1には対するものではない）に反応するナノボディの適合性が評定された。ヒトPD-L1に結合するアフィボディの分子イメージングに対する適用性は、非特許文献4、更には国際特許出願公開の特許文献3及び特許文献4で検討されている。同様に、抗PD-L1アドネクチン（adnectins）（モノボディ）が非特許文献5、さらには国際特許出願公開の特許文献5及び特許文献6に開示されている。PD-L1結合大環状ペプチドが、同じ目的で設計されている（非特許文献6及び国際特許出願公開の特許文献7）。非特許文献7は、親和性が操作された外部ドメインPD-1がin vivoでのPD-L1イメージングに有用であると報告した（国際特許出願公開の特許文献8も参照されたい）。mRNAの形態でコードされるPD-1（及びPD-L1）の外部ドメインは非特許文献8による樹状細胞ワクチン接種の関連で使用されている。最後に、非小細胞肺癌の画像診断のための99m-Tc標識抗PD-L1 VHHを用いた臨床試験が報告されている（https：//clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02978196）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第2008/071447号
【特許文献２】国際公開第2009/030285号
【特許文献３】国際公開第2017/072273号
【特許文献４】国際公開第2017/072280号
【特許文献５】国際公開第2016/086021号
【特許文献６】国際公開第2016086036号
【特許文献７】国際公開第2016/039749号
【特許文献８】国際公開第20160229号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Gong et al. 2018 (J Immunother Cancer 6:8)
【非特許文献２】Roberts et al. 2017, Asia Pac J Clin Oncol 13:277-288
【非特許文献３】Broos et al. 2017 (Oncotarget 8:41932)
【非特許文献４】Gonzalez et al. 2017 (J Nucl Med 58:1852)
【非特許文献５】Donnely et al. 2017 (J Nucl Med doi:10.2967/jnumed.117.199596)
【非特許文献６】Chatterjee et al. 2017, Biochem Biophys Res Comm 483:258
【非特許文献７】Maute et al. 2015 (Proc Natl Acad Sci 112:E6506)
【非特許文献８】Pen et al. 2014 (Gene Therapy 21:262-271)
【発明の概要】
【０００６】
一態様において、本発明は、ポリペプチド、例えばヒトプログラム細胞死リガンド-1（huPDL1）に結合する免疫グロブリン可変ドメイン（IVD）を含むポリペプチドであって、該ポリペプチドのアミノ酸配列がCDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域を含み、該CDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域が配列番号1、配列番号5、配列番号8又は配列番号11のいずれかに存在するそれらのCDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域からそれぞれ選択される、ポリペプチドに関する。CDR領域を画定する又は決定する方法としては、Kabat法、Chothia法、Martin法及びIMTG法が挙げられる。特に、huPDL1結合ポリペプチドは、IMTG法によって決定される配列番号1、配列番号5、配列番号8又は配列番号11のいずれかのCDR領域を含み、CDR1領域は配列番号2及び配列番号6から選択され、CDR2領域は配列番号3、配列番号7又は配列番号9から選択され、CDR3領域は配列番号4、配列番号10又は配列番号12から選択される。更に具体的には、前記CDR領域は配列番号5に存在するCDR領域である。
【０００７】
上記において、前記CDR領域はヒト化されていてもよい、及び／又は前記IVDはヒト化されていてもよい。
【０００８】
さらに上記において、huPDL1結合ポリペプチドは、機能性部分を更に含んでもよい。かかる機能性部分は、例えばHisタグ若しくはソルターゼ（sortase）認識配列であってもよく、又は検出可能部分であってもよい。特に、検出可能部分は、ランダムに連結されてもよく、又はhuPDL1結合IVDを含むポリペプチドに含まれる特異的部位に連結されてもよい。特異的部位への連結の場合、これは、限定されるものではないが、例えば、huPDL1結合IVDを含むポリペプチドに含まれるHisタグ又はソルターゼ認識配列に対するものであってもよい。
【０００９】
本発明はまた、上記のhuPDL1結合ポリペプチドをコードする単離核酸、かかる核酸を含むベクターに関する。上記のhuPDL1結合ポリペプチドを発現する宿主細胞、上記の核酸又は上記のベクターを含む宿主細胞が更に含まれる。
【００１０】
上記のhuPDL1結合ポリペプチドのいずれかを含む医薬組成物は、同様に本発明の一部である。
【００１１】
上記のhuPDL1結合ポリペプチド又は上記の医薬組成物は、医薬としての使用、診断における使用、手術における使用、治療における使用、治療法のモニタリングにおける使用、又は樹状細胞ワクチン接種における使用、更に具体的には、イメージング剤としての使用等に適用される。
【００１２】
本発明は更に、上記のhuPDL1結合ポリペプチドを製造する方法に関し、かかる方法は、
上に記載される宿主細胞においてhuPDL1結合ポリペプチドを発現させる工程と、
発現されたhuPDL1結合ポリペプチドを精製する工程と、
を含む。
【００１３】
一実施の形態では、かかる方法は、精製されたhuPDL1結合ポリペプチドに検出可能部分を結合することを更に含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】IMTG法により決定されたhuPDL1結合VHHドメインのアミノ酸配列、並びにCDR1、CDR2及びCDR3のアミノ酸配列を示す図である。
【図２−１】PD-L1特異的sdAbの特性評価を示す図である。（A）sdAb K2、K3及びK4のアミノ酸配列アラインメント。該配列は、3つの相補性決定領域（CDR1、CDR2、CDR3）及び4つのフレームワーク領域（CDRに隣接しているFR1〜FR4）を含む。（B）SPRで決定した固定化組換えPD-L1タンパク質と相互作用する精製sdAb K2の親和性／動態を示す代表的なグラフ。種々の濃度のsdAbのセンソグラム（Sensogram）を示す（n=1）。（C）HEK293T細胞対PD-L1発現HEK293T細胞のPD-L1に特異的な抗体（mAb）又はsdAb K2による標識を示す代表的なフローサイトメトリーグラフ。（D）SPRで決定された固定化組換えPD-L1タンパク質と相互作用する精製されたsdAb K2、K3及びK4の親和性（KD）、並びにフローサイトメトリーにより決定された、対照sdAbと比較したsdAb K2、K3及びK4のヒトPD-L1に対する結合の平均蛍光強度（MFI）の増加倍率を要約した表。
【図２−２】同上
【図３−１】（A）健康なC57BL/6マウス（n=3）における99mTc標識されたsdAb K2及びK3の生体分布を示すSPECT/CT画像。（B）健康なC57BL/6マウスの器官におけるsdAb K2及びK3の生体分布のex vivo分析を示すグラフ（%IA/gとして表される、n=3）。
【図３−２】同上
【図４】（A）PD-L1-（左）又はPD-L1+（右）の624-MEL細胞を持つ胸腺欠損ヌードマウス（n=6）における99mTc標識sdAb K2の生体分布を示すSPECT/CT画像。（B）腫瘍におけるsdAb K2の蓄積を示すグラフ（%IA/gとして表される、n=6）。（C）腫瘍におけるPD-L1の発現を表すグラフ（%）（n=6）。
【図５−１】（A）精製sdAb K2のIC50値の分析。曲線は、固定化ヒトPD-1-Fcタンパク質と相互作用する、25 nM組換えPD-L1-Fcタンパク質の存在下での種々の濃度の精製sdAbの相対応答を表す。sdAbの対数濃度の関数で、これらの応答は、プリズムソフトウェアの「Log阻害剤対応答（可変勾配（variable slope））」モデルに従って適合される。これらの曲線から、相対応答が半分まで阻害されるsdAb濃度（IC50）（n=1）が計算される。（B）第1のグラフ：抗PD-1 mAbで染色された、2D3細胞又はPD-1+2D3細胞を示す代表的なヒストグラム（n=6）。第2のグラフ：moDC上のPD-L1発現を示す代表的なヒストグラム。アイソタイプ対照（IC）又は抗PD-L1 mAbで細胞を染色した（n=3）。第3のグラフ：MCF7細胞又はPD-L1+MCF7細胞の代表的なヒストグラム。抗PD-L1 mAbで細胞を染色した（n=3）。（C）［1-（%CD8poseGFPposPD-1posTCRpos2D3細胞/%CD8poseGFPposPD-1negTCRpos2D3細胞）］として計算した、抗原提示moDCで活性化された場合のPD-1posTCRpos2D3細胞対PD-1negTCRpos2D3細胞におけるTCRシグナル伝達の減少。X軸の説明は、mAb又はsdAbを添加しない［なし］、又はアイソタイプ一致対照mAb［IC］、抗PD-L1 mAb［MIH1］、sdAb R3B23［R3B23］若しくはsdAb K2［K2］を添加した共培養を表す。グラフは、TCRシグナル伝達の減少を平均値±SEM［n=3］として要約する。（D）パーセントeGFP+CD8+2D3細胞で表される活性のパーセント減少（PD-L1+対PD-D-L1-MCF7細胞）。グラフは、パーセントeGFPを平均値±SEM（n=3）として要約する。（E）未処理［なし］、sdAb R3B23［R3B23］、sdAb K2［K2］又はLPSで処理したmoDC上でのCD40、CD80、CD83及びHLA-Iの発現を要約したグラフ。グラフは、パーセントマーカー発現を平均値±SEM［n=2］として要約する。
【図５−２】同上
【図５−３】同上
【図６−１】（A）アイソタイプ一致対照（IC）又は抗PD-L1 mAb（29E.2A3）又はsdAb R3B23（対照）又はsdAb K2の存在下又は不在下でTriMixDC-MELと共培養した後の総Melan-A特異的T細胞の平均±SEMを要約したグラフ（n=5）。（B）対照sdAb又はsdAb K2の存在下でTriMixDC-MELと共培養した後のCD8+T細胞増殖の増加倍率を要約したグラフ（n=3）。（C）アイソタイプ一致対照若しくは抗PD-L1 mAb、又はsdAb R3B23（対照）若しくはsdAb K2の存在下でTriMixDC-MELと共培養したCD8+T細胞によるIFN-γ分泌の増加倍率を要約したグラフ（n=2）。（D）総Melan-A特異的T細胞の平均±SEMを要約したグラフ（n=4）。（E）対照sdAb又はsdAb K2の存在下でDC-MELと共培養したCD8+T細胞による増殖の増加倍率を要約したグラフ（n=2）。（F）アイソタイプ一致対照若しくは抗PD-L1 mAb、又はsdAb R3B23（対照）若しくはsdAb K2の存在下でDC-MELと共培養したCD8+T細胞によるIFN-γ分泌の増加倍率を要約したグラフ（n=3）。（G）TriMixDC-MEL上のPD-L1、CD70及びCD86の発現を示す代表的なヒストグラム。細胞をアイソタイプ対照［IC］又は表面マーカー特異的mAb［n=3］で染色した。（H）CD8posT細胞上のPD-1発現を示す代表的なヒストグラム。細胞をアイソタイプ対照［IC、*］又は抗PD-1 mAb［n=3］で染色した。（I）DC-MEL上のPD-L1、CD70及びCD86の発現を示す代表的なヒストグラム。細胞をアイソタイプ対照［IC］又は表面マーカー特異的mAb［n=3］で染色した。（J）アイソタイプ一致対照mAb［IC］、抗PD-L1 mAb［29E.2A3］、sdAb R3B23［R3B23］又はsdAb K2［K2］の存在下又は不在下でDC-MELと共培養した後の総Melan-A特異的T細胞の平均±SEMを要約したグラフ［n=4］。
【図６−２】同上
【図６−３】同上
【図７−１】（A）MCF7（左）又は624-MEL（右）上のPD-L1、又は標識にmAbを用いたPD-L1の操作されたそれらの対応物の発現を示す代表的なヒストグラム（n=3）。（B）PD-L1+若しくはPD-L1-MCF7細胞（左）、又は624-MEL（右）細胞の胸腺欠損ヌードマウスにおける増殖を示すグラフ（n=12）。
【図７−２】同上
【図８】（A）PD-L1-（左）又はPD-L1+（右）MCF7細胞を持つ胸腺欠損ヌードマウス（n=6）における99mTc標識sdAb K2の生体分布を示すSPECT/CT画像。（B）腫瘍におけるsdAb K2の蓄積を示すグラフ（%IA/gとして表される、n=6）。（C）腫瘍におけるPD-L1の発現を表すグラフ（%）（n=6）。
【図９−１】（A）DC-MEL及びTriMixDC-MELのフェノタイピング。代表的なヒストグラムをアイソタイプ一致抗体染色と比較して示す（n=3）。（B）アイソタイプ一致対照又は抗抗原抗体で染色したCD8+T細胞の表現型を示す代表的なヒストグラム（n=3）。（C）TriMixDC-MELとの共培養前後のCD8+T細胞でのPD-1の検出を示すグラフ（n=3）。
【図９−２】同上
【図９−３】同上
【図１０−１】（A）部位特異的68Ga標識sdAb K2（各条件の左バー）及びランダム68Ga標識sdAb K2（各条件の右バー）のPD-L1+細胞（「陽性細胞株」）、標識sdAbと接触する前にPD-L1が遮断されていたPD-L1+細胞（「遮断」）、及びPD-L1-細胞（「陰性細胞株」）への結合（%結合活性として）。（B）PD-L1-（「-mel624」）又はPD-L1+（「+mel624」）624-MEL細胞を持つマウスにおける部位特異的68Ga標識sdAb K2及びランダム68Ga標識sdAb K2の取り込み。各器官又は腫瘍について、左から右に、それぞれ1〜4のバーに示される。バー1は、PD-L1-624-MEL細胞を持つマウスにおける部位特異的68Ga標識sdAb K2の取り込み値を表し（「-mel624で部位特異的」）、バー2は、PD-L1+624-MEL細胞を持つマウスにおける部位特異的68Ga標識sdAb K2の取り込み値を表し（「+mel624で部位特異的」）、バー3は、PD-L1-624-MEL細胞を持つマウスにおけるランダム68Ga標識sdAb K2の取り込み値を表し（「-mel624でランダム」）、バー4は、PD-L1+624-MEL細胞を持つマウスにおけるランダム68Ga標識sdAb K2の取り込み値を表す（「+mel624でランダム」）。（C）PD-L1陽性624-MEL細胞を持つマウスにおける部位特異的67Ga標識sdAb K2の取り込み。実施例3を参照されたい。
【図１０−２】同上
【図１１】PD-L1posmoDC対293T細胞上での抗PD-L1 mAb及びsdAb K2の結合を示す図である。mAb 29E.2A3、MIH1若しくはアベルマブ、又はsdAb K2で染色した際にフローサイトメトリーで検出されたPD-L1posmoDC細胞（A）又は293T細胞（B）の割合を要約したグラフ。アイソタイプ一致対照mAb又はsdAb R3B23で染色された細胞は、対照としての役割を果たした［n=3］。
【図１２】放射性標識抗ヒトPD-L1 sdAb K2は、健康なマウスにおいて低い非特異的シグナルを示すことを示す図である。（A）健康なC57BL/6マウス（n=3）における静脈内投与から1時間後の99mTc-sdAb K2又は99mTc-R3B23（対照sdAb）の生体分布を示すSPECT/CT画像。（B）健康なC57BL/6マウスにおける静脈内投与から80分後に解剖された組織及び器官における99mTc-sdAb K2又は99mTc-R3B23（対照sdAb）の生体分布のex vivo分析（1グラム当たりのパーセント注射活性として表される、%IA/g；n=3）。****p<0.0001。
【図１３−１】放射性標識sdAb K2は、核イメージングによるヒトPD-L1発現乳房腫瘍の可視化を可能にすることを示す図である。（A）実験構成のスキーム。（B）PD-L1NEG（左）又はレンチウイルスにより形質導入されたPD-L1POS（右）MCF7腫瘍を持つヌードマウス（n=6）における静脈内投与から1時間後の99mTc-sdAb K2又は99mTc-R3B23（対照sdAb）の生体分布を示すSPECT/CT画像。（C、D）静脈内放射性トレーサー注入（n=6）から80分後の解剖されたPD-L1neg又はPD-L1posMCF7腫瘍における99mTc標識sdAbの蓄積のex vivo分析（（C）、%IA/gとして表される）、及び腫瘍対血液取り込み比（D）。（E）腫瘍単一細胞解離物（tumour single cell dissociates）のフローサイトメトリー分析によって測定される、親MCF7細胞（PD-L1neg）又はヒトPD-L1形質導入対応物（PD-L1pos）のいずれかを皮下移植したマウスから解剖された腫瘍（n=6）におけるヒトPD-L1及びHLA-A2発現細胞の割合。**p<0.01；****p<0.0001。
【図１３−２】同上
【図１４−１】放射性標識sdAb K2は、核イメージングによるヒトPD-L1発現黒色腫腫瘍の可視化を可能にすることを示す図である。（A）実験構成のスキーム。（B）PD-L1NEG（左）又はレンチウイルスによって形質導入されたPD-L1POS（右）624-MEL腫瘍を持つヌードマウス（n=6）における静脈内投与から1時間後の99mTc-sdAb K2又は99mTc-R3B23（対照sdAb）の生体分布を示すSPECT/CT画像。（C、D）静脈内放射性トレーサー注入（n=6）から80分後の解剖されたPD-L1neg又はPD-L1pos624-MEL腫瘍における99mTc標識sdAbの蓄積のex vivo分析（（C）%IA/gとして表される）、及び腫瘍対血液取り込み比（D）。（E）腫瘍単一細胞解離物のフローサイトメトリー分析によって測定される、親624-MEL細胞（PD-L1neg）又はヒトPD-L1形質導入対応物（PD-L1pos）のいずれかを皮下移植したマウスから解剖された腫瘍（n=6）におけるヒトPD-L1及びHLA A2発現細胞の割合。**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。
【図１４−２】同上
【図１５−１】放射性標識sdAb K2は、938-MEL腫瘍においてIFN-γによって誘導されるヒトPD-L1の特異的可視化を可能にすることを示す図である。（A）フローサイトメトリー分析により評価した100 IU/mL組換えヒトIFN-γによる938-MEL細胞のin vitro刺激後又は未処理938-MEL細胞のPD-L1発現を示す代表的なヒストグラム。（B）実験構成のスキーム。（C）PBS（左）又はヒトIFN-γ（右）（n=4）のいずれかを腫瘍内注射したPD-L1NEG938-MEL腫瘍を持つ胸腺欠損ヌードマウスにおける99mTc-sdAb K2の静脈内投与から1時間後の代表的なSPECT/CT画像。（D）放射線トレーサー注入の80分後に解剖した腫瘍のγ計測によって決定される、PBS又はIFN-γのいずれかで腫瘍内処理した938-MEL腫瘍における99mTc-sdAb K2の蓄積（%IA/gとして表される、n=4）。（E）PBS又はIFN-γのいずれかで腫瘍内処理した938-MEL腫瘍におけるヒトPD-L1発現レベル（n=4）。解剖及び解離された腫瘍のフローサイトメトリー分析によってPD-L1発現を評価した。PD-L1レベルは、アイソタイプ対照染色と比較した平均蛍光強度（MFI）の増加倍率として表される。*p<0.05。
【図１５−２】同上
【図１６−１】sdAb K2及びmAbアベルマブは、タンパク質及び細胞レベルでPD-1：PD-L1相互作用を拮抗する。（A）等モル量のアベルマブ及びsdAb K2を用いる競合研究は、SPRによって決定されるように、両方がヒトPD-L1上の同じエピトープを結合することを示す。1：sdAb K2；2：sdAb K2+アベルマブ；3：アベルマブ+sdAb K2；4：アベルマブ；破線の垂直線：競合物質の添加。（B）SPRによって決定されるように、sdAb K2、対照sdAb、アベルマブ又は対照mAbを、濃度を増加させて固定化ヒトPD-1組換えタンパク質に混合した、可溶性組換えヒトPD-L1タンパク質の用量反応曲線。条件ごとに、組換えPD-L1タンパク質のみを含む試料に対する、最大RUシグナルが示される。2つの同様の実験のうち代表的な実験を示す。（C、D）PD-1POS2D3レポーターアッセイの実験構成の概略図。（C）gp100ペプチドでパルスされる、親細胞（PD-L1NEG）、又はレンチウイルスで形質導入されたPD-L1POSHLA-A2POS624-MEL細胞若しくはMCF7細胞におけるヒトPD-L1及びHLA-A2の発現を示す代表的なフローサイトメトリーヒストグラム。（D）gp100を認識するTCRをコードするmRNAで電気穿孔した、親2D3細胞又はPD-1POS2D3細胞を示す、代表的なフローサイトメトリーヒストグラム。ヒトPD-1を収容するレンチウイルスベクターを用いて2D3細胞に形質導入を行った。特異的TCRが誘導されると、2D3細胞はNFATプロモーターの制御下でeGFPを発現する（右）。（E、F）アベルマブ及びsdAb K2はいずれも、PD-1pos2D3レポーター細胞の活性化に際して624-MEL細胞（E）又はMCF7細胞（F）に対するPD-L1の抑制効果を抗原特異的に復帰させる。グラフは、平均±SEM（n=3）として、PD-1POS2D3細胞がPD-L1POS細胞と共培養される場合に、PD-L1NEG細胞との共培養と比較して、eGFP発現が減少していることを表す。処理していない対照sdAb又はアイソタイプ対照mAbは陰性対照としての役割を果たす。パーセントeGFP陽性CD8POSPD-1POS2D3細胞を、フローサイトメトリーを用いて評価した。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
【図１６−２】同上
【図１６−３】同上
【図１７−１】sdAb K2及びアベルマブは、異なる動態によるin vitro治療効果を示すことを示す図である。（A〜C）実験構成の概略図。（A）抗CD3 mAb及びIL-2で刺激された又は刺激されていないPD-1又はPD-L1を発現するCD8POSPBMC（平均±SEM）の割合を示す棒グラフ。（B）ヒトPD-L1及びeGFPをコードするベクターを用いてレンチウイルスで導入したHLA-A2POS624-MEL細胞上のPD-L1、HLA-A2及びeGFPのレベルを示す代表的なヒストグラム（n=3）。（C）健康な癌細胞の尺度である、腫瘍細胞の緑色被写体総面積（Total Green Object area）（μm2/ウェル）を、incuCyte装置を用いて1時間ごとに7日連続（seven consecutive days）で追跡した。（D〜G）3Dスフェロイド腫瘍細胞の細胞傷害性アッセイにおける抗PD-L1化合物による処理に対する相対的な応答を示すグラフ（n=3）。PD-L1POS腫瘍細胞スフェロイドの緑色被写体総面積を、刺激されたPBMCとの共培養の際に、3.6 μMの抗PD-L1又は対照mAb若しくはsdAb、或いはそれらの両方の存在下で経時的に測定した。データを、化合物が添加されていない条件に対して正規化した。（D）アベルマブ対アイソタイプ対照mAb、いずれも最初から添加した。（E）sdAb K2対対照sdAb、いずれも最初から添加した。（F）sdAb K2及びアベルマブの混合物対対照sdAb及びアイソタイプ対照mAbの混合物、全て最初から添加した。（G）新しいsdAbが24時間毎に添加されたことを除いて（E）と同一のアッセイ（X軸の上の矢印で示される）。
【図１７−２】同上
【発明を実施するための形態】
【００１５】
in vivoでの画像診断又は分子イメージングの目的と並んで治療目的の場合、イメージング剤又は治療剤は、高効率でその標的に到達できなければならない。これは、十分な組織透過を達成することができる十分に小さいサイズと、標的部位で高いシグナル／ノイズ比を達成するための標的への選択的結合（特にイメージング剤に当てはまるが、同様に治療剤の特異性にも寄与する）と、標的部位のシグナルに悪影響を及ぼす高バックグラウンドシグナルの部位を避けるため（イメージング剤）又は可能性のある望ましくない副作用を避けるため（治療剤）の低い全体的な体内保留又は蓄積（身体、典型的には肝臓又は腎臓からの排除の結果として、またサイズが小さいイメージング剤の場合なおさら問題となる）との組み合わせを必要とする。
【００１６】
本発明に至る作業では、まず、ヒトPD-L1（huPDL1）に対して高い特異性で結合する多くの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）分子（本明細書では単一ドメイン抗体（sdAb）とも称する）を同定した。驚くべきことに、マウス（但しヒトではない）PD-L1に結合する同様のISVD分子とは対照的に、他の対照ISVD分子とは対照的に、及び他の低分子PD-L1イメージング剤とは対照的に、huPDL1結合型ISVDは、in vivoで優れた標的シグナル／バックグラウンド比を提供しながら、極めて低い腎保留（renal retention）を特徴とした。
【００１７】
アルパカ免疫ライブラリのスクリーニング後に抗PD-L1 sdAbを同定し、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、フローサイトメトリー及び表面プラズモン共鳴（SPR）を用いて結合及び親和性について評価した。テクネチウム−99m（99mTc）標識抗PD-L1 sdAbの静脈内注射に続くマウスにおける単一光子発光コンピュータ断層撮影画像は、このsdAbが（i）高いシグナル対ノイズ比、（ii）黒色腫及び乳房腫瘍においてヒトPD-L1を特異的に検出する高い能力、並びに（iii）比較的低い腎保留（典型的には放射性金属標識sdAbが近位尿管に高い保留を示すことから、このことは特有である）を含む、興味深い診断とする幾つかの特性を有することを明らかにした。さらに、本発明者らは、SPRを用いて、抗PD-L1 sdAbがFDA承認mAbアベルマブと同じPD-L1上のエピトープに結合し、抗PD-L1 sdAbがPD-1：PD-L1相互作用を効率的に拮抗することを示した。異なるin vitroヒト細胞系アッセイは、PD-1：PD-L1遮断活性を裏付け、PD-L1陽性腫瘍細胞と相互作用するPD-1発現T細胞の増強された抗原特異的T細胞受容体シグナル伝達及び腫瘍細胞殺滅能を示すと共に、T細胞活性化及びサイトカイン産生を刺激する樹状細胞（DC）の能力の増強を示し、DCワクチン接種プロトコルにこれらの抗PD-L1 ISVDを含める道を開いた。これらの特性の組み合わせは、免疫チェックポイント阻害剤を伴う治療法に有用であることに加えて、同定されたhuPDL1結合ISVDを、例えば分子イメージングのための診断剤として非常に適したものとする。
【００１８】
本明細書に基づき、本発明は、以下の態様及び実施形態において定義され、以下に、より詳細に記載される。本発明は、相補性決定領域（CDR）を含むポリペプチドに関することから、かかるCDRがどのように決定されるかについて、まず幾つかの説明を提供する。
【００１９】
抗体／免疫グロブリン配列におけるCDR領域の決定は、一般的には、適用されるアルゴリズム／方法論（Kabat、Chothia、Martin（強化されたChothia）、IMGT（ImMunoGeneTics情報システム）のナンバリングスキーム（例えばhttp://www.bioinf.org.Uk/abs/index.html#kabatnum及びhttp://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/IMGTnumbering.htmlを参照されたい）による。同じ抗体／免疫グロブリン配列に異なる方法を適用すると、抗体／免疫グロブリン／IVD配列内のCDR配列長及び／又は画定に違いがあるかもしれない異なるCDRアミノ酸配列を生じさせる可能性がある。したがって、本発明のhuPDL1結合ポリペプチドのCDRを、本明細書で特性評価される抗ヒトPD-L1抗体の単一可変ドメインに存在するCDR配列として、或いはKabat、Chothia、Martin（強化されたChothia）若しくはIMGTのナンバリングスキーム又は方法等による良く知られている方法論に従って決定若しくは画定されるように記載することができる。例えば、配列番号2〜配列番号4、配列番号6及び配列番号7、配列番号9及び配列番号10、並びに配列番号12に定義されるCDR配列は、IMGT法を用いて、配列番号1、配列番号5、配列番号8及び配列番号11によって定義される抗ヒトPD-L1単一ドメイン抗体から画定されている（図1を参照されたい）。別の方法を適用すると、配列番号2〜配列番号4、配列番号6及び配列番号7、配列番号9及び配列番号10、並びに配列番号12に定義されているものとは（わずかに）異なるCDR配列をもたらす場合がある。
【００２０】
第1の態様では、本発明は、ヒトPD-L1に特異的に結合するポリペプチドに関し、該ポリペプチドのアミノ酸配列は、CDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域を含み、該CDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域は、配列番号1、配列番号5、配列番号8又は配列番号11によって定義されるhuPDL1結合単一ドメイン抗体のいずれかに存在するそれらのCDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域からそれぞれ選択される。
【００２１】
特に、ヒトPD-L1に特異的に結合するポリペプチドは、IVDがCDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域を含むヒトPD-L1に結合するためのポリペプチドの特異性を伝達する免疫グロブリン可変ドメイン（IVD）を含み、該CDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域は、配列番号1、配列番号5、配列番号8又は配列番号11によって定義されるhuPDL1結合単一ドメイン抗体のいずれかに存在するそれらのCDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域からそれぞれ選択される（図1を参照されたい）。
【００２２】
それに対する或る実施形態では、CDR領域は、Kabat法、Chothia法、Martin法又はIMTG法を配列番号1、配列番号5、配列番号8又は配列番号11に適用することによって決定される。より具体的な実施形態では、CDR領域はIMTG法によって決定され、配列番号2及び配列番号6から選択されるCDR1領域、配列番号3、配列番号7又は配列番号9から選択されるCDR2領域、及び配列番号4、配列番号10又は配列番号12から選択されるCDR3領域として更に定義される。個々のCDR1アミノ酸配列間、個々のCDR2アミノ酸配列間、及び個々のCDR3アミノ酸配列間の類似度が高いことを考えると、CDR1-CDR2-CDR3アミノ酸配列（上記の方法のいずれかで決定される）の任意の可能な組み合わせを含む任意のhuPDL1結合ポリペプチドが、ここで想定される（例えば、IMTGで画定されるCDRの場合： 幾つか例を挙げると、配列番号2-配列番号3-配列番号4、又は配列番号6-配列番号7-配列番号4、又は配列番号2-配列番号9-配列番号10、又は配列番号6-配列番号3-配列番号12、又は配列番号2-配列番号7-配列番号4、又は配列番号2-配列番号9-配列番号12、又は配列番号6-配列番号9-配列番号10等をそれぞれ有するCDR1-CDR2-CDR3）。一実施形態では、CDR領域は、配列番号5に存在するCDR領域、或いはCDR1、CDR2及びCDR3に対してそれぞれ配列番号6、配列番号7及び配列番号4としてIMTGによって定義されるCDR領域である。
【００２３】
上記のいずれでも、CDR領域及び／又はIVDがヒト化され得る。ヒト化CDR及び／又はIVDは、既知の任意の好適な方法で得ることができるため、厳密には開始材料として天然起源のVHHドメインを含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドに限定されない。ヒト化免疫グロブリン単一可変ドメインは、対応する天然起源のVHHドメインと比較して、免疫原性の低下等の幾つかの利点を有し得る。かかるヒト化は、一般に、天然起源のCDR及び／又はフレームワーク領域（FR）の配列中の1個以上のアミノ酸残基を、ヒトVH3ドメイン等のヒトVHドメイン内の同じ位置で生じるアミノ酸残基で置き換えることを含む。ヒト化置換は、得られたヒト化免疫グロブリンドメインが引き続き元の（originator）免疫グロブリンの好ましい特性を保持する（又は例えば親和性成熟によって更に改良される）ように選択されなければならない。当業者は、ヒト化置換又はヒト化置換の好適な組み合わせを選択することができ、一方のヒト化置換によって提供される好ましい特性と、他方の天然起源のVHHドメインの好ましい特性との間の好適なバランスを最適化又は達成することができる。一般に、標的に対する結合の特異性は、ヒト化抗体／免疫グロブリン／IVD（又はかかる抗体／免疫グロブリン／IVDを含むポリペプチド）において顕著な（負の）影響を受けず、一般に、標的に対する結合の親和性及び／又はアビディティは、ヒト化抗体／免疫グロブリン／IVD（又はかかる抗体／免疫グロブリン／IVDを含むポリペプチド）において顕著な（負の）影響を受けない。
【００２４】
本発明のhuPDL1結合ポリペプチドは、（融合、それとの共役、又はそれとの複合体形成において）1つ以上の非（ポリ）ペプチド構成要素（検出可能部分等−更に参照されたい；又はペグ化等−例えば、国際公開第2017/059397号を参照されたい）、本明細書で「機能性部分」と称される1つ以上の更なるポリペプチド又はポリペプチドドメイン（例えばHisタグ、又はsortagモチーフ、すなわちソルターゼアミノ酸基質モチーフLPXTG（配列番号17）、例えばLPETG（配列番号18））を含んでもよい。或る1つの例では、huPDL1結合ポリペプチド自体が複製又は倍加して（ここで、モノマーは、例えばGly-Proリピート、Pro-Alaリピート、Gly-Serリピート又はそれらの組み合わせに基づくリンカー等の柔軟なリンカーを介して接続されている）、多価（但し、単一特異的）結合分子を形成する。別の例では、更なるポリペプチド又はポリペプチドドメイン（Gly-Proリピート、Pro-Alaリピート、Gly-Serリピート、又はそれらの組み合わせに基づくリンカー等の柔軟なリンカーを介してhuPDL1結合ポリペプチドに接続され得る）が、huPDL1とは異なる実体への結合を与える可能性があり、酵素的機能を発揮する可能性があり（限定されるものではないが、ADEPT（抗体指向性酵素プロドラッグ療法）等の場合）、毒性機能を発揮する可能性があり（限定されるものではないが、ADC（抗体−薬物コンジュゲート）等の場合）、複合ポリペプチドに蛍光シグナル伝達機能を付与する可能性があり（例えば蛍光タンパク質）、血清半減期を増加させる可能性があり（例えば、血清アルブミン結合タンパク質又はペプチド；イメージング目的ではあまり望ましくないが、治療目的では望ましい）、又は追加の治療機能を与える可能性がある。明らかに、これらのいずれかを、本発明のhuPDL1結合ポリペプチドにおいて任意の方法で組み合わせることができる。
【００２５】
そのため、上記のいずれでも、huPDL-1結合ポリペプチドは、機能性部分を更に含んでもよい。一実施形態では、機能性部分は検出可能部分である。本明細書で定義され、それに付随する検出可能部分を保有するhuPDL1結合ポリペプチドは、免疫追跡ツールであり得て、該検出可能部分が放射性標識である場合、huPDL-1結合ポリペプチドは、放射性免疫トレーサーであり得る。
【００２６】
一般的に「検出可能部分」とは、シグナルを発する部分、又は適切な刺激でシグナルを発することができる部分を指し、ヒト体内に入ると任意の手段、好ましくは非侵襲的手段によって検出可能である。さらに、検出可能部分は、画像のコンピュータ化された合成を可能にし、かかる検出可能部分は、イメージング剤と呼ばれることがある。検出可能部分としては、蛍光エミッタ、陽電子エミッタ、放射線エミッタ等が挙げられる。
【００２７】
検出可能部分／イメージング剤（huPDL1結合ポリペプチドに含まれ、それによって運ばれ、それにカップリングされ、そこでキレート化される）の量を測定することは、典型的には、放射能を計測する装置、又は放射線（光量子の性質であり得る）密度若しくは放射線濃度を決定する装置で行われる。計測又は決定された放射能を、画像に変換することができる。検出可能部分による放射の性質に応じて、PET（陽電子放射断層撮影）、SPECT（単光子放射コンピュータ断層撮影）、蛍光イメージング、蛍光断層撮影、近赤外イメージング、近赤外断層撮影、光断層撮影等の手法によって検出可能となり得る。
【００２８】
放射線エミッタ／放射性標識の例としては、68Ga、110mIn、18F、45Ti、44Sc、47Sc、61Cu、60Cu、62Cu、66Ga、64Cu、55Ca、72As、86Y、90Y、89Zr、125I、74Br、75Br、76Br、77Br、78Br、111In、114mIn、114In、99mTc、11C、32Cl、33Cl、34Cl、123I、124I、131I、186Re、188Re、177Lu、99Tc、212Bi、213Bi、212Pb、 225Ac、153Sm及び67Gaが挙げられる。蛍光エミッタとしては、シアニン色素（例えばCy5、Cy5.5、Cy7、Cy7.5）、インドレニン系色素、ベンゾインドレニン系色素、フェノキサジン、BODIPY色素、ローダミン、Si−ローダミン、アレクサ色素及びそれらのいずれかの誘導体が挙げられる。
【００２９】
放射性核種の多くは金属性を有し、典型的にはタンパク質又はペプチドと安定な共有結合を形成することができない。1つの解決策は、キレート剤、すなわち金属イオンとキレートと呼ばれる非共有化合物を形成する多座配位子を用いて、放射性金属でタンパク質又はペプチドを標識することである。そのため、huPDL1結合ポリペプチドは、かかるキレート剤に任意の方法でカップリングされ、放射性核種の組込みを可能とし、これにより、放射性核種をhuPDL1結合ポリペプチドに配位させ、キレート化し、又は複合体形成することができる。キレート剤は、大環状又は非環状であり得るポリアミノポリカルボン酸塩型キレート剤を含む。ポリアミノポリカルボン酸キレート剤は、例えばシステイン残基のチオール基を介して、又はリジン残基のイプシロンアミン基を介してhuPDL1結合ポリペプチドに共役され得る。インジウム、ガリウム、イットリウム、ビスマス、放射性アクチニド及び放射性ランタニド等の放射性同位元素のための大環状キレート剤は、DOTA（1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸）、及び上記ポリペプチドを含むそれらの誘導体、例えばマレイミドモノアミド-DOTA（1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7-トリス-酢酸-10-マレイミドエチルアセトアミド）、DOTAGA（2,2',2''-（10-（2,6-ジオキソテトラヒドロ-2H-ピラン-3-イル）-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7-トリイル）三酢酸を含む。その他のキレート剤は、NOTA（1,4,7-トリアザシクロノナン-1,4,7-三酢酸）及びNODAGA（2,2'-（7-（1-カルボキシ-4-（（2,5-ジオキソピロリジン-1-イル）オキシ）-4-オキソブチル）-1,4,7-トリアゾナン-1,4-ジイル）二酢酸）等のそれらの誘導体を含む。非環状ポリアミノポリカルボン酸キレート剤は、DTPA（ジエチレントリアミン五酢酸）の様々な誘導体を含む。更なるキレート剤は、DFO、CB-DO2A、3p-C-DEPA、TCMC、Oxo-DO3A、TE2A、CB-TE2A、CB-TE1A1P、CB-TE2P、MM-TE2A、DM-TE2A、diamsar、NODASA、NETA、TACN-TM、1B4M-DTPA、CHX-A''-DTPA、TRAP、NOPO、AAZTA、DATA、H2dedpa、H4octapa、H2azapa、H5decapa、H6phospa、HBED、SHBED、BPCA、CP256、PCTA、HEHA、PEPA、EDTA、TETA及びTRITAを含む。
【００３０】
huPDL1結合ポリペプチド内の検出可能部分は、それ自体が補欠分子族で構成され得て、補欠分子族は、huPDL1結合ポリペプチド上のアミン官能基、カルボキシル官能基、カルボニル官能基又はチオール官能基と共有結合を形成する反応性基を含むシクロオクチン等のキレー剤又はコンジュゲート部分を介してポリペプチドに連結され得る。シクロオクチンは、ジベンゾシクロオクチン（DIBO）、ビアリールアザシクロオクチノン（BARAC）、ジメトキシアザシクロオクチン（DIMAC）及びジベンゾシクロオクチン（DBCO）、DBCO-PEG4-NHS-エステル、DBCO-スルホ-NHS-エステル、DBCO-PEG4-酸、DBCO-PEG4-アミン又はDBCO-PEG4-マレイミドを含む。18F標識補欠分子族の例は、18F-3-（2-（2-（2-（2-アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エトキシ）-2-フルオロピリジン（18F-FFPEGA）を含む。その他の18F標識補欠分子族は、N-スクシンイミジル-4-[18F]フルオロベンゾエート（[18F]SFB）（例：Li et al. 2014, Applied Radiation and Isotopes 94:113-117）を含む。I標識補欠分子族は、N-スクシンイミジル4-グアニジノメチル-3-[(*)I]ヨードベンゾエート（[(*)I]SGMIB）及びN-スクシンイミジル3-グアニジノメチル-5-[(*)I]ヨードベンゾエート（イソ-[(*)I]SGMIB）（ここで、(*)Iは例えば、131Iである）（例えば、Choi et al. 2014, Nucl Med Biol 41:802-812を参照）を含む。
【００３１】
上に記載される共役方法は、異種トレーサー集団をもたらす場合がある。部位特異的な共役戦略は、この欠点を克服しようとするものであり、ソルターゼ媒介ペプチド転移等を介してキレート剤又は検出可能部分と抗体／免疫グロブリン／IVD等のポリペプチドをカップリングする化学酵素的方法を含む（Antos et al. 2009, Curr Protoc Protein Sci, Chapter 15:unti-15.3）（例えばMassa et al. 2016, Exp Opin Drug Deliv 13:1149-1163によって概説される）。
【００３２】
他の態様は、本明細書で上に記載されるhuPDL1結合ポリペプチドをコードする単離核酸、かかる核酸を含むベクター、並びにかかる核酸若しくはベクターを含む及び／又は本明細書で上に記載されるhuPDL1結合ポリペプチドを発現する宿主細胞に関する。
【００３３】
更なる態様は、本明細書で上に記載されるhuPDL1結合ポリペプチド（機能性部分を伴わない／含まないhuPDL1結合ポリペプチド、機能性部分を伴う／含むhuPDL1結合ポリペプチド、又は検出可能部分を伴う／含むhuPDL1結合ポリペプチド）を含む医薬組成物に関する。
【００３４】
なお、更なる態様は、医薬として使用される、診断に使用される、手術に使用される、治療に使用される、治療法のモニタリングに使用される、樹状細胞ワクチン接種に使用される、特にイメージング剤として使用される、本明細書で上に記載されるhuPDL-1結合ポリペプチド、又はそれを含む医薬組成物に関する。
【００３５】
診断
本明細書において一般的に「診断」は、ヒトPD-L1の検出を指す。これは、ヒト被験体由来の試料（及び例えば、ELISA、免疫細胞化学（ICH）、ウェスタンブロット、又は表面プラズモン共鳴等による）等のex vivo又はin vitroのものであり得る。これは、in vivo診断、特に本明細書で上に記載される医用イメージング又は分子イメージング等による非侵襲的in vivo診断とすることもできる。診断は、ヒト被験者に由来する試料に対するものであろうと、in vivo（イメージング）法によるものであろうと、PD1系又はPDL-1系の免疫チェックポイント阻害剤での（検出可能部分を伴わない／含まない本発明のhuPDL1結合ポリペプチド等での）治療に適格な患者を識別することを可能にし、それにより、有効でない治療を回避して支払者の予算を節約し、及び／又はかかる免疫チェックポイント療法の効果をモニタリングし、また適宜かかる免疫チェックポイント療法がまだ有効であると予想されるかを監視する。診断、特にイメージングは、例えば外科的切除を必要とする腫瘍の判断、したがって手術の補助に役立つ可能性もある。
【００３６】
治療
「治療」／「治療すること」とは、治療せずに放置した場合、疾患若しくは障害、又はその単一の症状の進行若しくは予想される進行と比較して、疾患若しくは障害、又はその単一の症状の進行の任意の速度の減少、遅延又は遅滞を指す。より望ましくは、治療は、疾患若しくは障害、又はその単一症状の無／ゼロ進行（すなわち、「阻害」又は「進行の阻害」）、更には既に発症した疾患若しくは障害、又はその単一の症状の任意の速度の後退をもたらす。この関連で「抑制／抑制すること」を「治療／治療すること」に代えて用いることができる。また、治療／治療することは、疾患若しくは障害に関連する1つ以上の臨床症状、又はその任意の単一の症状の顕著な改善を達成することを指す。状況に応じて、顕著な改善は定量的又は定性的に採点され得る。定性的基準は、例えば患者の幸福又は生活の質による場合がある。定量的評価の場合、顕著な改善は、典型的には、治療前の状況に対して、10%以上、20%以上、25%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、75%以上、80%以上、95%以上、又は100%の好転である。好転が評価される時間枠は、観察される基準／疾患の種類に依存し、当業者によって決定され得る。治療はまた、疾患の再発予防も指す。この関連で再発は、好転期間後の疾患、又は疾患の徴候及び症状の再発を指す。特に本明細書では、治療は、PD1系又はPDL1系の免疫チェックポイント阻害剤（検出可能部分を伴わない／含まない本発明のhuPDL1結合ポリペプチド等を用いる）を含む治療を意味する。PD1系又はPDL-1系の免疫チェックポイント阻害剤を含むかかる治療はまた、手術、化学療法、放射線療法、腫瘍溶解性ウイルス、PD1若しくはPDL-1以外の免疫チェックポイントの遮断、天然若しくは操作された免疫細胞（いわゆるキメラ抗原受容体T細胞、すなわちCAR-T細胞等）の養子移植、及び／又はタンパク質、核酸若しくは細胞（樹状細胞等）を用いるワクチン接種等の他の補完的な形態の治療と組み合わせてもよい。代替的には、本明細書に記載される抗PD-L1 IVDSは、任意の方法（同じ又は別々の（医薬）組成物において；同時に又は任意の順序で逐次的に；1つ以上の又は複数の用量又は投与において）で、１つ以上の他の免疫療法剤又は免疫原性剤と組み合わせることができる。
【００３７】
治療法モニタリング
FDAは、抗PD-1 mAbであるペンブロリズマブ及びニボルマブ、並びに抗PD-L1 mAbであるデュルバルマブ、アテゾリズマブ及びアベルマブを承認し、これらはその後、幾つかの癌タイプに対する標準治療として利用可能になった。この成功事例の欠点は、かかる治療が高コストで、患者1人当たり10万ドルを容易に上回ることであり（Aguiar et al. 2017, Ann Oncol 28:2256-2263）、またこれらの免疫チェックポイント遮断薬は、患者集団の一部にのみ利益があるという観察結果（Alsaab et al. 2017, Front Pharmacol 8:561）である。失敗率は、社会に対する高コストと合わせて、適切な患者に適切な治療を選択するのに役立つことのできる予測バイオマーカーの探索を推進する。現在、最も一般的に使用される予測バイオマーカーは、腫瘍生検に際してIHCを介して評定されるPD-L1発現であるが、制限は明らかに存在する。異種発現、腫瘍外での発現の役割、及び疾患過程の間のその動的発現等の制限は、深部腫瘍の透過を可能にする放射線標識トレーサーを用いた非侵襲的分子イメージング、並びにPD-1及び／又はPD-L1発現の繰り返し定量によって克服され得て、これらは治療前及び治療中の両方で原発性腫瘍及び転移性病変のマッピングを可能にするはずである。England et al. 2018 (Eur J Nucl Med Mol Imaging 45:110-120)によって生成されたデータは、in vivoでのPD-1タグ付き腫瘍イメージングが、疾患の診断、（免疫療法に応答する可能性がより高い患者を決定する）患者の層別化、疾患モニタリング（治療の間に得られた腫瘍画像の変化は免疫療法に対する応答又は非応答を反映する）、並びに新たな免疫療法の設計及び開発（前臨床又は臨床開発を通じて）を補助し得ることを示す。特に、本発明の標識抗PL1部分に基づく癌及び免疫細胞のイメージング（免疫PETイメージング等）は、同様に免疫療法又は免疫原性療法の有効性のモニタリングを支援すると同時に、患者の層別化を支援し、新たな免疫療法又は免疫原性療法を設計及び／又は開発する際に貴重な情報を提供する。
【００３８】
樹状細胞（DC）及びDCワクチン接種
樹状細胞［DC］ワクチンは、以前に治療された末期癌患者の少なくとも一部で永続性のある臨床応答を誘導することができる。幾つかの前臨床研究は、DC表面上のプログラム細胞死リガンド1［PD-L1］を遮蔽することは、より大きな患者集団にかかる臨床的利益を拡張するための魅力的な戦略となり得ることを示唆している。したがって樹状細胞［DC］ワクチン接種は、癌特異的細胞傷害性Tリンパ球［CTL］を活性化する戦略として広く研究されている。強力な抗腫瘍性CTLを誘導するには、3つの要件を満たす必要がある。第1に、DC表面上のペプチド／MHC-I複合体は、CD8posT細胞上で発現されるT細胞受容体［TCR］によって正しく認識されなければならない。第2に、DC上で発現されるCD80及びCD86のような共刺激分子は、CD8posT細胞上で発現されるCD28のような共刺激受容体と結合する必要がある。最後に、第3のシグナルは、サイトカイン分泌の形態のもとDCによって提供される。これらの要件が満たされている場合にのみ、活性化されて有効なT細胞が腫瘍細胞を攻撃することができる（Santos & Butterfield 2018, J Immunol 200:443-449）。
【００３９】
DCはまた、活性化されたCTL上でその受容体プログラム細胞死-1［PD-1］に結合し、T細胞活性化のブレーキとして作用するプログラム細胞死リガンド1［PD-L1］のような阻害分子を発現する（Liechtenstein et al. 2012, J Clin Cell Immunol S12）。抗原提示中のPD-L1とPD-1との相互作用により、TCRダウンモジュレーション（down-modulation）がもたらされる（Karwacz et al. 2011, EMBO Mol Med 3:581-592、Yokosuka et al. 2012, J Exp Med 209:1201-1217）。その結果、TCRシグナル伝達も同様にダウンレギュレートされ、T細胞の過剰活性化を防止する（Boding et al. 2009, J Immunol 183:4994-5005）。しかしながら、癌の状況でのワクチン接種の場合は、感染性疾患と同様に（例えば、Qu et al. 2014, Int J Infect Dis 19：1-5 "Monocyte-derived dendritic cells: targets as potent antigen-presenting cells for the design of vaccines against infectious diseases"を参照されたい）、T細胞の過剰活性化が保証される。
【００４０】
CD8posT細胞へのDCによる抗原提示中のPD-L1：PD-1相互作用を妨害する幾つかの戦略を採用することに成功している。これらには、PD-L1のサイレンシング（Karwacz et al. 2011, EMBO Mol Med 3:581-592、Hobo et al. 2010, Blood 116:4501-4511）、可溶性PD-1又はPD-L1の使用（He et al. 2005, Anticancer Res 25:3309-3313、Pen et al. 2014, Gene Ther 21:3309-3313）、及び抗体の使用（Karwacz et al. 2011, EMBO Mol Med 3:581-592、Ge et al. 2013, Cancer Lett 336:253-259、Lichtenegger et al. 2018, Front Immunol 9:385）が含まれる。
【００４１】
モノクローナル抗体［mAb］アベルマブと同じエピトープ上で、高い親和性でヒトPD-L1を結合する単一ドメイン抗体［sdAb］の開発が本明細書の実施例で報告される。本明細書の実施例では、このsdAbが、腫瘍細胞上に発現するPD-L1のイメージングに高い可能性を有することを実証した。さらに、sdAbがタンパク質レベルでPD-1とPD-L1との間の相互作用を遮断し、この遮断能が末梢血単核細胞［PBMC］に存在する細胞溶解性免疫細胞による腫瘍細胞の死滅を促進することが確立された。sdAbは多目的な抗原結合部分であることから、更なる研究は、単球由来のDC［moDc］による腫瘍抗原特異的CD8posT細胞の活性化を増強するsdAbの適用性を指摘した。特に、高親和性で拮抗性のPD-L1特異的sdAb（単一ドメイン抗体）を、DC媒介T細胞活性化を増強するその能力について評価し、モノクローナル抗体［mAb］、MIH1、29E.2A3及びアベルマブの使用に対して評価基準とした。mAbと同様に、sdAbは、DCによって活性化されたPD-1posレポーター細胞における抗原特異的T細胞受容体シグナル伝達を増強した。さらに、DCによって活性化された抗原特異的CD8posT細胞の活性化及び機能は、sdAbを含めることによって増強されたが、mAbでは増強されなかったことを示した。これは、T細胞活性化に使用する成熟DCが少ない場合に最も顕著であった。mAbがT細胞活性化を増強するのに失敗したことは、非免疫細胞上でのPD-L1の結合及びsdAbによるPD-L1の結合と比較した場合、DC上でPD-L1に結合するそれらの効率が低いことによって説明される可能性がある。これらのデータは、（癌又は感染性疾患の治療又は阻害等に対する）DC系免疫療法戦略に抗PD-L1 sdAbを含めるための論理的根拠を提供する。
【００４２】
免疫療法及び免疫原性療法
免疫療法は一般に、身体それ自体の免疫系を用いて疾患、より具体的には本発明の関連では癌と戦うのに役立つ治療として定義される。本明細書で使用される免疫療法的処置とは、正常な免疫監視を回避する及び／又はそれから逃れる及び／又はそれを抑制する、腫瘍、癌又は新生物等の状態に対する哺乳動物の免疫応答の再活性化及び／又は賦活及び／又は再構成を指す。哺乳動物の免疫応答の再活性化及び／又は賦活及び／又は再構成は、順に部分的に、哺乳動物の免疫系（抗癌、抗腫瘍又は抗新生物免疫応答；腫瘍、癌又は新生物に対する適応免疫応答）による腫瘍性、癌性又は新生物の細胞の排除の促進をもたらす。特に関心のある免疫療法剤としては、免疫チェックポイント阻害剤（抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体又は抗CTLA-4抗体等）、癌細胞と免疫細胞をつなぐ二重特異性抗体、樹状細胞ワクチンが挙げられる。免疫療法は、癌治療薬の有望な新しい領域であり、幾つかの免疫療法は、前臨床だけでなく臨床試験でも評価されており、有望な活性を実証した（Callahan et al. 2013, J Leukoc Biol 94:41-53、Page et al. 2014, Annu Rev Med 65:185-202）。しかしながら、全ての患者が免疫チェックポイント遮断に感受性であるとは言えず、PD-1又はPD-L1の遮断抗体は腫瘍の進行を促進することもある。免疫チェックポイント療法の分野における臨床開発の概要は、Fan et al. 2019 (Oncology Reports 41：3-14)によって示される。PD-1を標的とし阻害するモノクローナル抗体としては、ペンブロリズマブ、ニボルマブ及びセミプリマブが挙げられる。PD-L1を標的とし阻害するモノクローナル抗体としては、アテゾリズマブ、アベルマブ及びデュルバルマブが挙げられる。CTLA-4を標的とし阻害するモノクローナル抗体としては、イピリムマブが挙げられる。化学療法を含むコンビナトリアル癌治療（combinatorial cancer treatments）は、腫瘍生物学の別々の要素に影響して相乗的な抗腫瘍効果を得ることによって、より高い疾病管理率（rates of disease control）を達成することができる。或る特定の化学療法は、免疫原性細胞死を誘導することによって、また癌免疫エディティングにおける逃避を促進することによって腫瘍免疫を高め得ることが現在受け入れられており、したがって、かかる治療法は免疫原性応答を誘発することから免疫原性療法と呼ばれる。免疫原性細胞死を誘導することが知られている薬物部分としては、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、マフォスファミド、ミトキサントロン、オキサリプラチン及びパトゥピロン（Bezu et al. 2015, Front Immunol 6:187）が挙げられる。免疫療法の他の形態は、腫瘍ネオ抗原及び癌細胞に優先的に感染して死滅させる腫瘍溶解性ウイルスを認識するように同種T細胞を適合する、キメラ抗原受容体（CAR）T細胞療法を含む。例えばMLKLをコードするRNAによる治療は、免疫原性応答を誘発する（Van Hoecke et al. 2018, Nat Commun 9:3417)と共に、ネオエピトープによるワクチン接種（Brennick et al. 2017, Immunotherapy 9:361-371）の更なる手段である。
【００４３】
最終的な態様では、本発明は、本発明によるhuPDL1結合ポリペプチドを製造する方法に関し、かかる方法は、
好適な宿主細胞（本明細書に記載されている核酸又はベクター等を含む）においてhuPDL1結合ポリペプチドを発現する工程と、
発現されたhuPDL1結合ポリペプチドを精製する工程と、
を含む。
【００４４】
かかる方法は、精製されたhuPDL1結合ポリペプチドに検出可能部分を共有結合的に又は非共有結合的に、カップリング（coupling）、組込み、結合（binding）、ライゲーティング、接着、複合体形成、キレート化、共役（例えば、部位特異的共役）、又はそうでなければ連結する工程を更に含んでもよい。
【００４５】
その他の定義
本発明は、特定の実施形態に関して、及び或る特定の図面を参照して記載されるが、本発明はこれらに限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。特許請求の範囲にある任意の引用符号は、発明の範囲を限定するものと解釈されない。記載の図面は概略的なものにすぎず、限定するものではない。図面において、要素のうちの幾つかのもののサイズは、誇張されている場合があり、例示の目的で一律の縮尺で描かれていない場合がある。本明細書及び特許請求の範囲で「含む／含んでいる（comprising）」という用語が使用される場合、他の要素又は工程を除外しない。単数の名詞に言及する場合に不定冠詞又は定冠詞、例えば、「一（a又はan）」「その（the）」が使用されるとき、特に別段の指定がない限り、これは、その名詞の複数形を含む。さらに、本明細書及び特許請求の範囲における第1、第2、第3等の用語は、同様の要素を区別するために用いられており、必ずしも、連続した順序又は時間順を説明するために用いられているとは限らない。そのように用いられる用語は、適切な状況下では交換可能であり、本明細書において説明する本発明の実施形態は、本明細書において説明又は図示するもの以外の順序で動作することができることが理解されるべきである。本明細書において特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての用語は、本発明の当業者に対するものと同じ意味を有する。実施者らは、当該技術分野の定義及び用語に関して、特にSambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York (2012)、及びAusubel et al., current Protocols in Molecular Biology (Supplement 100), John Wiley & Sons, New York (2012)に向けられる。本明細書で提供される定義は、当業者によって理解されるよりも小さい範囲を有すると解釈されるべきではない。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「配列番号Xによって定義される」という用語は、配列番号Xに指定されるアミノ酸又はヌクレオチドの配列からなる生物学的配列を指す。例えば、配列番号Xにおいて／それによって定義されたCDRは、配列番号Xに指定されるアミノ酸配列からなる。更なる例は、配列番号Xを含むアミノ酸配列であり、これは、配列番号Xに指定されるアミノ酸配列よりも長いが、配列番号Xに指定されるアミノ酸配列を完全に含む（ここで、配列番号Xに指定されるアミノ酸配列は、より長いアミノ酸配列中でN末端若しくはC末端に位置されてもよく、又はより長いアミノ酸配列に埋め込まれてもよい）アミノ酸配列を指すか、又は配列番号Xに指定されるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を指す。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン（Ig）分子を指す。抗体は、天然源又は組換え源に由来するインタクト免疫グロブリンであってもよく、インタクト免疫グロブリンの免疫反応性部分であってもよい。抗体は、典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。本明細書で使用される場合、「免疫グロブリンドメイン」という用語は、抗体鎖の球状（globular）領域（例えば、従来の4鎖抗体の鎖又は重鎖抗体の鎖）、又は、かかる球状領域から本質的に構成されるポリペプチドを指す。免疫グロブリンドメインは、抗体分子の免疫グロブリンフォールド特性を保持することを特徴とし、これは、任意に保存されたジスルフィド結合によって安定化される2枚のβシートに配置された約7個の逆平行βストランドの2層サンドイッチからなる。
【００４８】
抗体／免疫グロブリン／IVDの抗原に対する特異性は、抗体／免疫グロブリン／IVD（通常、1つ以上のCDR、抗原と相互作用してパラトープを形成する抗体／免疫グロブリン／IVDの特定のアミノ酸）における抗原結合ドメインの組成、及び抗原の組成（エピトープを形成する抗体／免疫グロブリン／IVDと相互作用する抗原の部分）によって定義される。結合の特異性は、抗体／免疫グロブリン／IVDと単一の標的分子、又は抗体／免疫グロブリン／IVDによって認識されるエピトープを（図らずも）共有する限られた数の標的分子との間の結合を指すと理解される。
【００４９】
抗体／免疫グロブリン／IVDのその標的に対する親和性は、標的（抗原）上のエピトープと、抗体／免疫グロブリン／IVDにおけるエピトープ／抗原結合部位との間の相互作用の強さの尺度である。親和性は次のように定義することができる。
【数１】
2021514649.tif 000002
【００５０】
式中、KAは親和性定数であり、［Ab］は抗体／免疫グロブリン／IVD上の非占有結合部位のモル濃度であり、［Ag］は抗原上の非占有結合部位のモル濃度であり、［Ab-Ag］は抗体−抗原複合体のモル濃度である。
【００５１】
アビディティは抗体／免疫グロブリン／IVD−抗原複合体の全体的な強さに関する情報を提供し、一般に、上記の親和性、抗体／免疫グロブリン／IVD及び抗原の結合価、並びに結合パートナーの構造的相互作用に依存する。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン可変ドメイン」（「IVD」と略記される）という用語は、当該技術分野及び本明細書において以下、「フレームワーク領域1」又は「FR1」、「フレームワーク領域2」又は「FR2」、「フレームワーク領域3」又は「FR3」、「フレームワーク領域4」又は「FR4」とそれぞれ称される4つの「フレームワーク領域」から本質的になる免疫グロブリンドメインを意味し、フレームワーク領域は、当該技術分野及び本明細書で以下、「相補性決定領域1」又は「CDR1」、「相補性決定領域2」又は「CDR2」、及び「相補性決定領域3」又は「CDR3」とそれぞれ称される3つの「相補性決定領域」又は「CDR」によって中断される。そのため、免疫グロブリン可変ドメインの一般的な構造又は配列を、次のように示すことができる：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。抗原結合部位を保有することにより抗体に抗原に対する特異性を付与するのは免疫グロブリン可変ドメイン（IVD）（複数の場合もある）である。抗体／免疫グロブリン／IVDにあるCDRを画定する／限定する方法は本明細書において上に記載される。
【００５３】
「免疫グロブリン単一可変ドメイン」（「ISVD」と略記される）という用語は、「単一可変ドメイン」という用語と同等であり、抗原結合部位が単一の免疫グロブリンドメインに存在し、それによって形成される分子を定義する。これは、免疫グロブリン単一可変ドメインを「従来の」免疫グロブリン又はそれらのフラグメントとは別に設定し、ここでは、2つの免疫グロブリンドメイン、特に2つの可変ドメインが相互作用して抗原結合部位を形成する。典型的には、従来の免疫グロブリンでは、重鎖可変ドメイン（VH）と軽鎖可変ドメイン（VL）とが相互作用して抗原結合部位を形成する。この場合、VH及びVLの両相補性決定領域（CDR）は、抗原結合部位に寄与し、すなわち合計6つのCDRが抗原結合部位の形成に関与することになる。上記の定義を考慮すると、従来の4鎖抗体（IgG、IgM、IgA、IgD又はIgE分子等、当該技術分野で知られている）、又はFabフラグメント、F(ab')2フラグメント、ジスルフィド結合Fv若しくはscFvフラグメント等のFvフラグメント、又はかかる従来の4鎖抗体に由来するダイアボディ（いずれも技術分野で知られている）の抗原結合ドメインは、これらの場合は、抗原のそれぞれのエピトープへの結合が、通常、1つの（単一の）免疫グロブリンドメインによっては生じないが、軽鎖及び重鎖可変ドメイン等の（会合した）免疫グロブリンドメインのペアによって（すなわち、免疫グロブリンドメインのVH-VLペアによって）生じ得て、それぞれの抗原のエピトープに一緒に結合することから、通常、免疫グロブリン単一可変ドメインとは見なされない。対照的に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、追加の免疫グロブリン可変ドメインと対合することなく、抗原のエピトープに特異的に結合することができる。免疫グロブリン単一可変ドメインの結合部位は、単一のVH/VHH又はVLドメインによって形成される。したがって、免疫グロブリン単一可変ドメインの抗原結合部位は、3つ以下のCDRによって形成される。そのため、単一可変ドメインは、単一の抗原結合単位（すなわち、単一抗原結合ドメインが機能的抗原結合単位を形成するために別の可変ドメインと相互作用する必要がないように、本質的に単一可変ドメインからなる機能的抗原結合単位）を形成することができる限り、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、VL配列）若しくはその好適なフラグメントであってもよく、又は重鎖可変ドメイン配列（例えば、VH配列又はVHH配列）若しくはその好適なフラグメントであってもよい。本発明の一実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、重鎖可変ドメイン配列（例えば、VH配列）であり、より具体的には、免疫グロブリン単一可変ドメインは、従来の4鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列又は重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列であり得る。例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインは、（単一）ドメイン抗体（又は（単一）ドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸配列）、「dAb」又はdAb（又はdAbとして使用するのに適したアミノ酸配列）又はNanobody（商標）（本明細書で定義され、限定されるものではないがVHHを含む）、他の単一可変ドメイン、又はそれらのいずれか1つの任意の好適なフラグメントであってもよい。特に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、Nanobody（商標）（本明細書で定義���れる）又はその好適なフラグメントであってもよい。注：Nanobody（商標）、Nanobodies（商標）及びNanoclone（商標）は、Ablynx N.V.の登録商標である。Nanobodies（商標）の一般的な説明については、以下の更なる記載、並びに、例えば国際公開第2008/020079号等に記載される本明細書で引用される従来技術が参照される。
【００５４】
「VHHドメイン」はまた、VHH、VHHドメイン、VHH抗体フラグメント及びVHH抗体としても知られ、もともと「重鎖抗体」の（すなわち、「軽鎖を欠いた抗体」の；Hamers-Casterman et al (1993) Nature 363:446-448）抗原結合免疫グロブリン（可変）ドメインとして記載されている。「VHHドメイン」という用語は、これらの可変ドメインを、従来の4鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン（本明細書では「VHドメイン」と称される）、及び従来の4鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（本明細書では「VLドメイン」と称される)と区別するために選択された。VHH及びNanobody（商標）の更なる概説に関しては、Muyldermansによる総説（Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001）、及び包括的な背景技術として言及される以下の特許出願：Vrije Universiteit Brusselの国際公開第94/04678号、国際公開第95/04079号、及び国際公開第96/34103号；Unileverの国際公開第94/25591号、国際公開第99/37681号、国際公開第00/40968号、国際公開第00/43507号、国際公開第00/65057号、国際公開第01/40310号、国際公開第01/44301号、欧州特許第1134231号及び国際公開第02/48193号；Vlaams Instituut voor Biotechnologie（VIB）の国際公開第97/49805号、国際公開第01/21817号、国際公開第03/035694号、国際公開第03/054016号及び国際公開第03/055527号；Algonomics N.V.及びAblynx N. V.の国際公開第03/050531号；カナダ国立研究評議会による国際公開第01/90190号；Institute of Antibodiesによる国際公開第03/025020号（＝欧州特許第1433793号）；並びにAblynx N.V.による国際公開第04/041867号、国際公開第04/041862号、国際公開第04/041865号、国際公開第04/041863号、国際公開第04/062551号、国際公開第05/044858号、国際公開第06/40153号、国際公開第06/079372号、国際公開第06/122786号、国際公開第06/122787号及び国際公開第06/122825号、並びにAblynx N.V.によるさらに公開された特許出願を参照する。これらの引用文献に記載されているように、Nanobody（商標）（特にVHH配列及び部分的にヒト化されたNanobody（商標））は、1つ以上のフレームワーク配列における1つ以上の「顕著な特徴がある（Hallmark）残基」の存在によって特に特徴づけることができる。Nanobody（商標）のヒト化及び／又はラクダ化、並びに他の修飾、部分若しくはフラグメント、誘導体若しくは「Nanobody（商標）融合物」、多価コンストラクト（リンカー配列の幾つかの非限定的な例を含む）を含むNanobody（商標）の更なる記載、並びにNanobody（商標）の半減期を増加させるための種々の修飾及びそれらの調製は、例えば国際公開第08/101985号及び国際公開第08/142164号に見ることができる。
【００５５】
「Dab」（GlaxoSmithKlineのグループ会社によって商標として使用される「ドメイン抗体」及び「dAb」という用語）としても知られる「ドメイン抗体」は、例えば欧州特許第0368684号、Ward et al. (Nature 341:544-546, 1989)、Holt et al. (Tends in Biotechnology 21:484-490, 2003)、及び国際公開第03/002609号と並んで、例えば国際公開第04/068820号、国際公開第06/030220号、国際公開第06/003388号、及びDomantis Ltd.の他の公開された特許出願に記載されている。ドメイン抗体は、本質的に非ラクダ哺乳動物のVHドメイン又はVLドメイン、特にヒト4鎖抗体に対応する。エピトープを単一の抗原結合ドメインとして（すなわち、それぞれ、VL又はVHドメインと対にならずに）結合するためには、例えばヒト単一VH又はVLドメイン配列のライブラリを用いて、かかる抗原結合性の特異的選択が必要である。ドメイン抗体は、VHHと同様に、およそ13 kDa〜およそ16 kDaの分子量を有し、完全ヒト配列に由来する場合、例えばヒトにおける治療用途のためにヒト化する必要がない。また、単一可変ドメインは、或る特定の種のサメに由来し得ることにも留意されたい（例えば、いわゆる「IgNARドメイン」、例えば国際公開第05/18629号を参照されたい）。
【００５６】
ドメイン抗体及びNanobody（商標）（VHHドメイン及びヒト化VHHドメインを含む）等の免疫グロブリン単一可変ドメインは、1つ以上のCDRのアミノ酸配列中に1つ以上の変更を導入することによって親和性成熟を受けることができ、その変更はそれぞれの親分子と比較して、そのそれぞれの抗原に対して得られる免疫グロブリン単一可変ドメインの親和性の改善をもたらす。本発明の親和性成熟免疫グロブリン単一可変ドメイン分子は、例えばMarks et al. (Biotechnology 10:779-783, 1992)、Barbas, et al. (Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813, 1994)、Shier et al. (Gene 169:147-155, 1995)、Yelton et al. (Immunol. 155:1994-2004, 1995)、Jackson et al. (J. Immunol. 154:3310-9, 1995)、Hawkins et al. (J. Mol. Biol. 226:889 896, 1992)、Johnson and Hawkins (Affinity maturation of antibodies using phage display, Oxford University Press, 1996)によって記載される、当該技術分野で既知の方法によって調製され得る。ドメイン抗体又はNanobody（商標）等の免疫グロブリン単一可変ドメインから開始してポリペプチドを設計／選択及び／又は調製するプロセスはまた、本明細書において、上記免疫グロブリン単一可変ドメインを「フォーマットする（formatting）」と称され、一部がポリペプチドで構成される免疫グロブリン単一可変ドメインは、上記ポリペプチドに「フォーマットされる」又はその「フォーマットとする」と言われる。免疫グロブリン単一可変ドメインをフォーマットすることができる方法の例、及び例えばグリコシル化を回避するためのかかるフォーマットの例は、本明細書における開示に基づいて当業者に明らかとなる。
【００５７】
ドメイン抗体及びNanobody（商標）（VHHドメインを含む）等の免疫グロブリン単一可変ドメインをヒト化に供することができ、すなわち最も近いヒト生殖細胞系列配列により配列同一性の程度を増大させることができる。特に、Nanobody（商標）（VHHドメインを含む）等のヒト化免疫グロブリン単一可変ドメインは、先の段落で一般的に定義されているが、（本明細書で定義される）ヒト化置換である及び／又はそれに対応する少なくとも1つのアミノ酸残基（及び、特に少なくとも1つのフレームワーク残基）が存在する、免疫グロブリン単一可変ドメインであり得る。潜在的に有用なヒト化置換は、天然起源のVHH配列のフレームワーク領域の配列と、1つ以上の密接に関連するヒトVH配列の対応するフレームワーク配列とを比較することによって確認することができ、その後、そのように決定された1つ以上の潜在的に有用なヒト化置換（又はその組み合わせ）を上記VHH配列に（本明細書で更に説明される、それ自体が既知の任意の方法で）導入することができ、得られたヒト化VHH配列を、標的に対する親和性、安定性、発現の容易さ及びレベル、及び／又は他の所望の特性について試験することができる。このようにして、試行錯誤の程度が限られている手段によって、他の好適なヒト化置換（又はそれらの好適な組み合わせ）が当業者によって決定され得る。また、前に説明した内容に基づいて、Nanobody（商標）（VHHドメインを含む）等の免疫グロブリン単一可変ドメイン（のフレームワーク領域）は、部分的にヒト化されてもよく又は完全ヒト化されてもよい。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「血清アルブミン結合剤」又は「血清アルブミン結合ポリペプチド」とは、血清アルブミンに特異的に結合することができるタンパク質系薬剤である。様々な実施形態において、血清アルブミン結合剤は、全長及び／又は成熟形態及び／又はアイソフォーム及び／又はスプライス変異体及び／又はフラグメント及び／又は任意の他の天然起源の若しくは合成の類縁体、血清アルブミンの変異体若しくは突然変異体に結合し得る。様々な実施形態において、本発明の血清アルブミン結合剤は、単量体、二量体、三量体、四量体、ヘテロ二量体、多量体及び会合形態を含む血清アルブミンの任意の形態に結合し得る。或る実施形態では、血清アルブミン結合剤は、血清アルブミンの単量体形態に結合する。或る実施形態では、本血清アルブミン結合ポリペプチドは、3つの相補性決定領域（CDR1、CDR2及びCDR3）を含む抗原結合部位を有する免疫グロブリン可変ドメインを含む。或る実施形態では、上記抗原結合部位は、血清アルブミン上に存在する1つ以上のエピトープを認識する。様々な実施形態において、血清アルブミン結合剤は、全長抗体又はそのフラグメントを含む。或る実施形態では、血清アルブミン結合剤は、単一ドメイン抗体又は免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）を含む。具体的な実施形態では、血清アルブミン結合剤は、ラットの血清アルブミン（Uniprot P02770）に結合する。具体的な実施形態では、血清アルブミン結合剤は、マウスの血清アルブミン（Uniprot P07724）に結合する。具体的な実施形態では、血清アルブミン結合剤は、ヒト血清アルブミン（Uniprot P02768）に結合する。
【００５９】
上に記載される態様及び実施形態は、一般に、huPDL1結合ポリペプチド又はそれを含む医薬組成物を、それを必要とする、すなわち（非侵襲的な）医用画像、診断、治療、手術、療法、モニタリング又は樹状細胞ワクチン接種を必要とする腫瘍、癌又は新生物を持つ哺乳動物に投与することを含み得る。一般に、huPDL1結合ポリペプチド又はそれを含む医薬組成物の（治療）有効量は、所望の効果を満たすため、それを必要とする哺乳動物に投与される。（治療）有効量は投与経路等の多くの要因に依存し、医師によってケースバイケースで決定される必要がある。一般に、哺乳動物に投与され得るhuPDL1結合ポリペプチド又はそれを含む医薬組成物の（治療）有効量の最大用量は、可能性のある毒性によって決定され、最大耐量（MTD）（すなわち許容できない副作用を引き起こすことのない最も高い用量）に反映される。「投与／投与すること」とは、薬剤（例えば、本明細書に記載されるhuPDL1結合ポリペプチド）又は該薬剤を含む組成物（医薬又は医薬組成物等）と、上記薬剤又は組成物を接触させる対象物（例えば細胞、組織、器官、体腔）との間の相互作用をもたらす任意の様式の接触を意味する。薬剤又は組成物と、対象物との間の相互作用は、薬剤若しくは組成物の投与により即時に若しくはほぼ即座に開始して起こり得るか、長期間（薬剤又は組成物の投与により即時に又はほぼ即座に開始する）にわたって起こり得るか、又は薬剤若しくは組成物の投与の時間に対して遅延され得る。より具体的には「接触／接触すること／接触させること」は、有効量の薬剤又は薬剤を含む組成物の対象物への送達をもたらす。
【００６０】
「有効量」という用語は、薬剤（例えば本明細書に記載されるhuPDL1結合ポリペプチド）又は薬剤を含む組成物（例えば医薬又は医薬組成物）の投薬計画を指す。有効量は、一般的には、接触又は投与の様式に依存する及び／又はそれらに合わせる必要がある。有効量を得るか又はそれを維持するため、薬剤又は薬剤を含む組成物は、単回用量又は複数用量で投与され得る。有効量は、診断、画像化又は治療が必要な状態の重症度によって更に異なる場合があり、これは、哺乳動物又は患者の全体的な健康状態及び体調に依存する可能性があり、通常、医師又は内科医の評定は、有効量が何であるかを確立するために必要とされる。有効量は、更に、異なるタイプの接触又は投与の組み合わせによって得られてもよい。
【００６１】
特定の実施形態、具体的な構成、並びに材料及び／又は分子を本発明による細胞及び方法について本明細書で検討してきたが、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、形態及び詳細に種々の変更又は修正がなされ得ることを理解されたい。以下の実施例は、特定の実施形態をより良く解説するために提供され、また、それらは本出願を限定するものとはみなされない。本出願は、特許請求の範囲によってのみ限定される。本明細書に引用される文書の内容は、引用することにより本明細書の一部をなす。
【実施例】
【００６２】
1.材料及び方法
1.1.試薬
Biacoreの消耗品はいずれもGE Healthcare製であった。組換えHisタグ付きヒトPD-L1タンパク質（SINO Biologicals、10084-H08H）を用いて、表面プラズモン共鳴（SPR）で精製された単一ドメイン抗体（sdAb）の親和性を決定した。組換えFcタグ付きヒトPD-L1（R&D Systems、156-B7）タンパク質又はPD-1（R&D Systems、1086-PD）タンパク質を使用して、SPRでIC50を評価した。アベルマブ（Bavencio）はMerck KGaA［EMD Serono］及びPfizerより提供された。R3B23（Lemaire et al. 2014, Leukemia 28:444-447）及びトラスツズマブ（Herceptin（商標）、Roche）という多発性骨髄腫パラプロテインに特異的なsdAbが陰性対照としての役割を果たした。
【００６３】
次のブロッキング抗PD-L1 mAb：IgG1 mAb、MIH1［eBioscience］及びアベルマブ［Bavencio（商標）、Merck KGaA］、及びIgG2b mAb 29E.2A3［Bioxcell］を機能アッセイで使用した。アイソタイプ一致対照mAbである、P3.6.2.8.1［IgG1、eBiosciences］及びMOPC-21［IgG2b、Bioxcell］を対照として使用した。ヒトPD-L1特異的sdAb K2について、本明細書に記載する。5T2MMパラプロテインに特異的なsdAbであるsdAb R3B23を対照として使用した（Lemaire et al. 2014, Leukemia 28:444-447）。
【００６４】
抗Hisモノクローナル抗体（mAb）（AbD Serotec、AD1.1.10）及びフィコエリスリン（PE）共役抗マウスIgG抗体（BD biosciences、A85-1）を使用して、精製されたHisタグ付きsdAbの細胞上に発現されるPD-L1への結合をフローサイトメトリーで検出した。ヒトPD-L1に特異的なアロフィコシアニン（APC）共役抗体（eBioscience、MIH5）をフローサイトメトリーで使用し、細胞上でのPD-L1発現を評価した。PE共役抗HLA-A2抗体（BD Biosciences、BB7.2）及びPE共役抗CD45抗体を使用して、腫瘍細胞を免疫細胞と区別した。抗ヒトPE標識IgG1抗体（Miltenyi Biotec、IS11-12E4.23.20）を使用して、PD-L1POS293T細胞へのアベルマブの結合を検出した。
【００６５】
細胞上のPD-L1の発現をアロフィコシアニンにカップリングした抗PD-L1抗体（APC、eBioscience、MIH1）又はPE-CF594（Biolegend、MIH1）により、HLA-A2の発現をPE共役抗HLA-A2抗体（BD biosciences、BB7.2）により、PD-1の発現をPE共役抗PD-1抗体（Biolegends、EH12.2H7）により、評価した。2D3細胞を、APC-H7標識抗CD8抗体（BD biosciences、SK1）を用いる2D3機能アッセイにおいて腫瘍細胞と区別した。電気穿孔した2D3細胞上でのT細胞受容体（TCR）の発現を、PE標識抗TCRα/β抗体（Biolegend、IP26）で評価した。アイソタイプ一致抗体は、対照としての役割を果たした（BD biosciences）。
【００６６】
以下の抗体は、機能アッセイで使用される細胞の表現型に使用した：PECF594共役抗CD3（Biolegend、UCHT1）及び抗CD70（BD Biosciences、Ki-24）、PerCP-Cy5.5共役抗CD4（BD Biosciences、RPA-T4）、APC-H7共役抗CD8（BD Biosciences、SKI）、PE共役抗PD-1（BD Biosciences、MIH4）及び抗HLA-A2（BD Biosciences、BB7.2）、PE-Cy7共役抗HLA-DR（BD Biosciences、G46-6）、フルオレセインイソチオシアネート共役抗CD86（BD Biosciences、FUN-1）、APC共役抗PD-L2（BD Biosciences、MIH18）、PerCPEF710共役抗CD80（eBiosciences、2D10.4）、抗PD-L1-APC[eBioscience、MIH5]、抗PD-l-PE[Biolegend、EH12.2H7]、抗CD11c-AF700[BD biosciences、クローンB-ly6]、抗PD-L1-PE-CF594[BD biosciences、クローンMIH1]、抗CD86-BV421[BD biosciences、クローンHB15e]、抗CD83-PE[BD Biosciences、クローンHB15e]、抗CD40-APC[Biolegend、クローン5C3]、抗CD80-PerCP-EF710[eBioscience、クローン2D10.4]、抗HLA-ABC-FITC[BD biosciences、クローンG46-2.6]。アイソタイプ一致対照（IC）抗体は、BD Biosciencesから購入されました。
【００６７】
PEに共役されたMelan-A/MART-1 HLA-A2デキストラマー（dextramer）（ELAGIGILTV、配列番号19；Immudex）を使用して、フローサイトメトリーでMelan-A特異的T細胞を検出した。PEに共役されたgp100 HLA-A2デキストラマー（YLEPGPVTV、配列番号20；Immudex）を対照として使用した。
【００６８】
gp100280〜288ペプチド（YLEPGPVTA、配列番号21；Eurogentec）を使用して、2D3アッセイにおいて抗原提示細胞をパルスした。2D3アッセイでは、ブロッキング抗PD-L1抗体（eBioscience、MIH1）及びアイソタイプ一致対照抗体（eBioscience、P3.6.2.8.1）を用いた。Bioxcellから購入した抗PD-L1抗体（29E.2A3）及びそのアイソタイプ一致対照抗体（MPC-11）を他の機能アッセイに使用した。
【００６９】
アベルマブ（Bavencio（商標）、Merck KGaA［EMD Serono］及びPfizerにより提供される）、アイソタイプ一致対照抗体（Bioxcell、MOPC-21）及びR3B23を、2D3及び3Dスフェロイドのアッセイで対照として使用した。
【００７０】
1.2.PD-L1特異的sdAbの生成及び選択
ヒトPD-L1特異的sdAbをアルパカで生成した。簡潔に言えば、アルパカに、10×106個のRAW264.7細胞又は100 μgの組換えヒトPD-L1-Fcタンパク質（R&D Systems、156-B7）のいずれかを用いて、毎週〜2週間の間隔で5回〜6回皮下免疫した。末梢血リンパ球を精製し、sdAbファージディスプレイライブラリを作成するソースとして使用した。PD-L1反応性sdAbを、このライブラリのバイオパニング及び組換えマウス又はヒトPD-L1タンパク質に対する個々のsdAbクローンのペリプラズム抽出物のELISAスクリーニングによって同定した。PD-L1を特異的に結合したsdAbクローンに対して配列解析を行った。記載される通りに抗PD-L1 sdAb及び対照sdAb R3B23を製造し、精製した（非特許文献3）。そのようにして、sdAb cDNAをベクターpHEN6にクローニングし、C末端HISタグを組み込んだ。
【００７１】
1.3.sdAbの大規模な選択、製造及び精製
5T2MMパラプロテイン（Lemaire et al. 2014, Leukemia 28:444-447）に特異的である、選択されたsdAb及びsdAb R3B23を製造し、精製し、これにはC末端HISタグを組み込むためのベクターpHEN6へのcDNAをコードするsdAbのクローニングが含まれる。
【００７２】
1.4.表面プラズモン共鳴
全ての測定を、Biacore T200デバイス（GE Healtcare）で、25℃にてHepes緩衝生理食塩水（0.01 M HEPES、pH 7.4；0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.005% Tween20）をランニングバッファーとして用いて行った。全ての組換えタンパク質を10 mM酢酸ナトリウム（pH5.0）中に10 μg/mLまで溶解し、1-（3-（ジメチルアミノ）プロピル）-3-エチルカルボジイミド（EDC）及びN-ヒドロキシ-スクシンイミド（NHS）によるリンケージケミストリー（linkage chemistry）を用いてCM5センサーチップに固定化した。未反応のEDC-NHSリンカーを1Mエタノールアミン-HClでブロックした。全ての測定について、固定化されたタンパク質を含むフローセル内のSPRシグナルを、同じ操作を行ったが組換えタンパク質が省略されたフローセル内のシグナルで差し引きし、特異的結合シグナル（応答単位、RU）を得た。精製されたsdAbのヒトPD-L1に対する親和性を、固定化PD-L1タンパク質について評価した。
【００７３】
PD-1とPD-L1との間の相互作用の相対的応答が半分に阻害されるsdAb濃度であるsdAbのIC50を評価するため、FC-PD-1タンパク質をCM5チップに固定化した。異なる濃度（2倍希釈系列を使用して400 nM〜0.78 nM又は過剰量1000 nM）のsdAbを、PD-L1:PD-1相互作用のKD値濃度（25 nM）を用いて組換えヒトFc-PD-L1タンパク質と混合し、チップ上で実行した。最大相対応答値は、競合するsdAb濃度の関数にプロットし、IC50値を計算するためにPrismの「Log阻害剤対応答（可変勾配（slope））」モデルで分析した。PD-L1への結合に対するsdAbとアベルマブとの間の競合を評価するため、記載される通りに競合研究を行った（Vaneycken et al.2011, FASEB J 25:2433-2446）。
【００７４】
1.5.マウス及び細胞株
6週齢の雌性C57BL/6マウス及び胸腺欠損ヌードマウス（Crl:NU(NCr)-Foxn1nu）はCharles River Laboratories（フランス）により供給された。全ての実験は、LA1230214及びLA1230272のライセンスのもと、動物実験に関する欧州ガイドラインに従って行われた。実験は、ブリュッセル自由大学の実験動物の使用に関する倫理委員会によって承認された（ECD15-214-1及びECD17-272-6）。
【００７５】
ヒト胚腎（HEK）293T細胞及びHLA-A*0201+乳癌細胞（MCF7）を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）から購入した。
【００７６】
HLA-A*0201+624-MEL細胞又は938-MEL細胞はS.L.Topalian（米国国立癌研究所）によって提供された。624-MEL細胞及び938-MEL細胞を、10%胎児クローンI血清（Thermoscientific）、2 mM L-グルタミン、100 U/mlペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシン、1 mMピルビン酸ナトリウム及び非必須アミノ酸（Sigma-Aldrich）を添加したRPMI1640培地で培養した。HEK293T細胞は、10%胎児ウシ血清（FBS、Harlan）、2 mM L-グルタミン（L-Glu、Sigma-Aldrich）及び100 U/mlペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシン（PS、Sigma-Aldrich）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Sigma-Aldrich）で培養した。MCF7細胞を、FBS、L-Glu、PS、1 mMピルビン酸ナトリウム及び非必須アミノ酸（Sigma-Aldrich）を添加したRoswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培地で培養した。2D3細胞をVersteven et al. 2018 (Oncotarget 9:27797-27808)に記載されているように生成し、10%FBSを添加したイスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM、Invitrogen）で維持した。
【００７７】
実験は、ブリュッセル大学病院（ベルギー国ブリュッセル）の輸血センターが提供する健康なHLA-A*0201+ドナーからの血液試料を用いて行った。末梢血単核細胞（PBMC）、CD14+単球の単離、及び単球由来樹状細胞（moDC）へのそれらの分化、並びに残りのPBMCからのCD8+T細胞の単離を、Tuyaerts et al. 2002 (J Immunol Methods 264:135-151)に記載される通りに行った。この研究は、ブリュッセル大学病院の倫理委員会によって承認された（2013/198）。
【００７８】
1.6.レンチウイルスの製造、特性評価及び形質導入
プラスミドpCMVΔR8.9及びpMD.Gは、D. Trono（スイス国のスイス連邦工科大学ローザンヌ校）から贈られた。eGFP、ヒトPD-L1及びPD-1をコードするトランスファープラスミドが記載された（非特許文献8、Breckpot et al. 2003, Gene Med 5:654-667）。レンチウイルスベクターの製造及び特性評価については、Goyvaerts et al. 2013 (Gene Ther 19:1133-1140)に記載された。PD-L1又はeGFPをコードするレンチウイルスベクターによるHEK293T細胞、MCF7細胞及び624-MEL細胞の形質導入をMOI 10で行い、一方で、PD-1をコードするレンチウイルスベクターによる2D3細胞の形質導入は、ヒトmoDCを形質導入するために記載されたプロトコルを用いてMOI 5で行った（Breckpot et al. 2003, J Gene Med 5:654-667）。
【００７９】
1.7.腫瘍チャレンジ
胸腺欠損ヌードマウスに、5×106個のMCF7細胞、624-MEL細胞、938-MEL細胞、又はPD-L1修飾されたMCF7細胞若しくは624-MEL細胞を皮下注射した。MCF7細胞を移植する1日前に、マウスにエストロゲンペレットを移植した（Innovative research of America；0.36 mg/マウス）。マウスが触知可能な腫瘍を発症した場合に、電子キャリパーを用いて腫瘍体積を追った。電子キャリパーを使用して腫瘍の長さ及び幅を測定し、式：（長さ×幅2）/2を用いて腫瘍体積を計算するために使用した。イメージングの1日前に、938-MEL腫瘍を担持するマウスを50 μlリン酸緩衝生理食塩水（PBS；Sigma-Aldrich）又はIFN-γ（2×106 IU/ml、ImmunoTools）で腫瘍内注入した。腫瘍組織を、GentleMACS腫瘍解離プロトコル（Miltenyi Biotec）を使用して単一細胞まで減らした（Maenhout et al. 2014, Oncotarget 30:6801-6815）。
【００８０】
1.8.99mTc-sdAb標識、ピンホールSPECT-マイクロCT画像及び画像解析
sdAbを、Xavier et al. 2012 (Methods Mol Biol 911:485-490)によって記載される通りに標識した。簡潔に言えば、Isolink（商標）ラベリングキット（Mallinckrodt Medical BV）を用いて合成したsdAbのC末端HISタグを、99mTc-トリカルボニル中間体［99mTc(H2O)3(CO)3］99mにカップリングした。99mTc-sdAb溶液をPBSで事前に平衡化したNAP-5カラム（GE Healthcare）で精製し、結合していない(99mTc(H20)3(CO)3)+を除去し、最終的に0.22 μmフィルター（Millipore）で濾過して凝集体を除去した。標識効率を、標識直後、及び移動相として100%アセトンを用いる簡易薄層クロマトグラフィー（iTLC）による精製後の両方で決定した。ピンホールSPECT−マイクロCTイメージングの1時間前に、マウスに45 MBq〜155 MBqの99mTc標識sdAb（10 μg）100 μL〜200 μLを静脈内注射した。メージングを記載される通りに行った（Put et al. 2013, J Nucl Med 54:807-814）。マイクロCTを、解像度83 μmで60 kV及び615 mAのデュアル−ソースCTスキャナ（Skyscan 1178；Skyscan）を用いて行った。CT画像を、フィルターされたバックプロジェクション（NRecon；Skyscan）を用いて再構成した。ナイーブC57BL6マウス、MCF7及び624-MELの腫瘍モデルにおけるピンホールSPECTマイクロCTイメージング及び画像解析を記載される通りに行った（非特許文献3）。938-MELモデルでは、MILabs VECTor/CTカメラでSPECT/CTを行った。CTスキャンを60 kV及び615 mAに設定した。CTスキャン時間は139秒であった。SPECT画像は、スパイラルモード（全身イメージングの場合6箇所の位置、1つの位置当たり150秒）でラットSPECTコリメータ（1.5 mmピンホール）を用いて得られ、全身SPECTスキャンは15分であった。画像を、再構成後フィルターを用いずに、2つのサブセット及び4回の反復で0.4 mMボクセルで再構築した。
【００８１】
SPECT画像は、3ピンホール幾何学に対して修正された反復再構成アルゴリズム（期待値最大化法（ordered-subset expectation maximization））を使用して再構築され、6つの57Coランドマークに基づいてCT画像と融合させるため自動的に再配向された（Vanhove et al. 2009, Eur J Nucl Med Mol Imaging 36:1049-1063）。画像を更に視覚的に分析し、AMIDE（Medical Image Data Examinerソフトウェア）を使用して必要に応じて定量した（Loening & Gambhir 2003, Mol Imaging 2:131-137）。最大値投影像（MIP）をOsiriX Liteソフトウェアを使用して生成した。イメージング後、マウスを屠殺し、選択した器官を分離し、γカウンター（Cobra Inspector 5003、Packard）を用いて放射能を測定した。器官の放射能の量は、1グラム当たりのパーセント注入活性（%IA/g）として表される。
【００８２】
1.9.mRNAの製造、電気穿孔
ヒトgp100 TCRα及びTCRβ pGEMのベクターは、N. Schaft教授（ドイツ国、エルランゲン大学）の厚意により提供された（Schaft et al. 2003, J Immunol 170:2186-2194）。CD40リガンド、CD70及び構成的活性型TLR4をコードするpeTheRNAプラスミドは、De Keersmaecker et al（印刷中）に記載された。DC-LampのHLA-IIターゲッティング配列に連結された最適化された免疫優性Melan-A:HLA-A2 エピトープを含有する、全長Melan-A/MART-1抗原をコードするpGEM-sig-Melan-A-DCLampプラスミドは、Bonehill et al. 2008 (Mol Ther 16:1170-1180)に記載された。mRNAの製造、精製、定量及び品質管理を記載される通りに行った（Tuyaerts et al. 2002, J Immunol Meth 264:135-151）。
【００８３】
ヒトgp100 TCRα及びβのmRNA（各2.5 μg/106細胞）を、時間定数プロトコル（300 V、7 ms）及びGene Pulser Xcell（商標）デバイス（BIORAD）を用いて4 mmの電気穿孔キュベット（Cell Projects）でOptiMEM培地（Life Technologies）200 μL中で2D3細胞に電気穿孔した。mRNAを用いたmoDCの電気穿孔を記載される通りに行った（Tuyaerts et al. 2002, J Immunol Meth 264:135-151）。
【００８４】
1.10.2D3アッセイ
2D3アッセイは他で詳述されている（Versteven et al.、投稿中）。簡潔に言えば、HLA-A2に制限され、PD-1を発現するように（又は発現しないように）修飾されたgp100280〜288ペプチド（YLEPGPVTA、配列番号21）を認識するTCRを発現するように電気穿孔された2D3細胞を、10%FBSを含有する200 μL IMDM中、105細胞で96ウェル丸底プレートに播種した（3連で行った）。moDC細胞、MCF7細胞、624-MEL細胞、PD-L1で操作されたMCF7細胞又は624-MEL細胞を50 μg/mL gp100280〜288ペプチドでパルスし、100 μL培地中、10:1のエフェクター−刺激因子比で培養物に添加した。共培養を、1 μg/200 μL中和抗PD-L1抗体、アベルマブ（360 nM）又は抗PD-L1 sdAbの存在下、37℃、5%CO2で24時間行った。アイソタイプ一致対照抗体又はsdAb R3B23を対照として用いた。2D3細胞の活性化を、CD8+2D3細胞内のeGFP+細胞の割合としてフローサイトメトリーで測定した。
【００８５】
1.11.樹状細胞によるCD8+Melan-A特異的T細胞の刺激
CD8+T細胞を、1%熱不活性化ヒトAB血清（Innovative Research）、PS、L-Glu及び非必須アミノ酸を含有する100  μL IMDM中105細胞で、96ウェル丸底プレートに3連で播種した。CD40リガンド、CD70及び構成的活性型TLR4（4×106細胞当たりそれぞれ10 μg）と10 μg Melan-A mRNA（TriMixDC-MELと称される）、又は10 μg Melan-A mRNA単独（DC-MELと称される）を用いてmoDCに電気穿孔した。電気穿孔されたDCを、100μLの培地中、エフェクター：刺激因子比10：1でT細胞に添加した。TriMixDC-MELとの共培養を、1 μg/200 μL中和抗PD-L1抗体又は抗PD-L1 sdAbの存在下で37℃にて5%CO2で7日間行った。アイソタイプ一致対照抗体又はsdAb R3B23を対照として用いた。DC-MELによるT細胞の刺激をTriMixDC-MELによる刺激と同様に行ったが、この場合、T細胞を7日目に再刺激し、デキストラマー染色（フローサイトメトリー）によるT細胞活性化の分析及びサイトカインIFN-γ（ELISA、Thermo Scientific）の産生の評価を14日目に行った。
【００８６】
1.12.増殖アッセイ 
健康なドナーに由来するCD14+細胞から枯渇させたPBMCを、0.5 μM CellTrace Violet（Invitrogen）で標識した。これらの細胞（105）を、1%熱活性化ヒトAB血清、PS、L-Glu及び非必須アミノ酸を含有する200 μLのIMDMにおいて、エフェクター：刺激因子比10：1でTriMixDC-MEL（4×106細胞当たりそれぞれ4.8 μg）又はDC-MEL（4.8 μgのMelan-A mRNA）と共に又はそれを含まずに6日間共培養した。T細胞増殖は、CD8+T細胞集団におけるCellTrace Violet色素の希釈物としてフローサイトメトリーで測定した。TriMixDC-MEL又はDC-MELを含まない培養物で観察された増殖を、バックグラウンドとみなした。
【００８７】
1.13.定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応
CD8+T細胞からの全RNAの単離及びcDNAへの逆転転写をVan der Jeught et al. 2014 (Oncotarget 5:10100-10113)に記載される通りに行った。PD-1 mRNAレベルを評価するため、試料をBIORADデバイス上でSYBRgreen（Thermofisher）ベースのリアルタイムPCR分析に供した。PD-1の増幅のためのプライマーは次の通りであった：リバース:5'-CTTCTCTCGCCACTGGAAAT-3'（配列番号13）及びフォワード:5'-CCGCACGAGGGACAATAG-3'（配列番号14）（Integrated DNA Technologies）。ペプチジルプロリルイソメラーゼA（Ppia）の増幅のためのプライマーは次の通りであった：5'-TTCACCTTCCCAAAGACCAC-3'（配列番号15）及び5'CAAACACAAACGGTTCCCAG-3'（配列番号16）（Integrated DNA Technologies）。
【００８８】
1.14.in vivo増殖腫瘍からの単細胞懸濁液の調製
腫瘍細胞上のPD-L1の発現を解析するフローサイトメトリーを行うため、単細胞懸濁液を、GentleMACS単細胞分離プロトコル（Miltenyi Biotec）を用いてマウスから腫瘍を分離した後に調製した。
【００８９】
1.15.フローサイトメトリー
細胞表面マーカーの染色手順については、先に記載されている（Breckpot et al. 2003, J Gene Med 5:654-667）。全ての細胞をLSRFortessaフローサイトメーター（BD Biosciences）で取得し、データをFACSDiva（BD Biosciences）又はFlowJo（Tristar Inc.）のソフトウェアで分析した。
【００９０】
1.16.統計分析
結果は平均±平均の標準誤差として表される。データセットを比較するためにノンパラメトリックマン−ホイットニーU検定を実施した。試料サイズ及び実験を繰り返した回数を、図の凡例に示す。図中のアスタリスクの数は、次の統計的有意性を示す：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
【００９１】
1.17.3Dスフェロイド細胞傷害性アッセイ
eGFP及びPD-L1を発現するように操作された624-MEL細胞を、超低接着96ウェルプレート（Costar（商標）、ref 7007）に200細胞で播種し、1日培養して3Dスフェロイドを形成させた。その後、10 ng/mLインターロイキン-2（IL-2）（Peprotech）及び10 ng/mL抗CD3 mAb（BioLegend、ref.317302）で24時間刺激したPBMCを、3.6 μMのアベルマブ、アイソタイプ一致mAb、K2、R3B23、又はmAbとsdAbとの組み合わせの存在下で1:50の比で細胞に添加した。別のアッセイでは、1200 rpmでプレートを10分間遠心し、50 μlの共培養物を除去した後、K2又はR3B23を24時間ごとに共培養物に添加した。eGFPPOS細胞及びPD-L1POS細胞を含む各ウェル内の緑色被写体面積の総量の減少を、IncuCyte Zoom（商標）生細胞イメージングシステム（EssenBio）で連続して7日間にわたり毎時間評価した。
【００９２】
1.18.sdAb調製物中に存在するエンドトキシンに応じたDC成熟の評価
sdAb溶液中の任意のエンドトキシンの効果を評価するため、本発明者らは、37℃及び5%CO2で10 μgのsdAb K2又はsdAb R3B23と共に24時間moDCをインキュベートした。未処理のmoDC及び1 ng/mlリポ多糖［LPS］で処理したmoDCは、それぞれ陰性対照及び陽性対照としての役割を果たした。成熟マーカーのアップレギュレーションをフローサイトメトリーで評価した。
【００９３】
2.結果
2.1.PD-L1に特異的な高親和性単一ドメイン抗体の生成
組換えヒトPD-L1タンパク質又はマウスPD-L1を発現したRAW624.7マクロファージを用いてアルパカを免疫化することにより、PD-L1に対するsdAbを作製した。これらのアルパカ由来の末梢血リンパ球を用いて、sdAbファージディスプレイライブラリを作成した。免疫原に対するバイオパンニング及びスクリーニングを行ったところ、組換えタンパク質上及び細胞上の両方でヒト及び／又はマウスのPD-L1への結合に選択された合計42個のsdAbを生じた。CDR1領域、CDR2領域及びCDR3領域のアミノ酸配列に基づいて、これらのsdAbを13種類の配列ファミリーに分け、これらのマウスPD-L1結合sdAbは非特許文献3に報告された。幾つかのsdAbは、ヒトPD-L1に結合した。このうち、配列ファミリーKは、sdAb K2、K3及びK4で表され、ヒトPD-L1に対して高い親和性結合を示した（図1、図2A及び図2B）。本発明者らは、sdAb K2、K3及びK4がヒトPD-L1に対して同様のナノモル親和性（それぞれ、KD=5.2 nM、3.5 nM及び4.5 nM）で結合することを示した（図2B〜図2D）。さらに、本発明者らは、sdAb K2、K3及びK4、並びにアベルマブがHEK293T細胞上に発現されるヒトPD-L1と結合することができることを示した（図2C）。ヒトPD-L1に対するアベルマブの親和性をKD=1.6 nMと決定した。
【００９４】
2.2.PD-L1特異的sdAb K2はSPECT/CTイメージングで強いポジティブコントラストを生成する
本発明者らは、99mTc−トリカルボニルのそのHISタグとの複合体化を通じて99mTcでsdAb K2、K3及びK4を放射性標識し、続いて濾過及びNAP-5カラムによる精製を行った。この結果、sdAb K2及びK3の放射化学的純度は98%超であったが、sdAb K4の場合は低い放射性化学的純度（93%）を生じた（表1）。したがって、更なる分析ではsdAb K4を除外した。sdAb K2及びK3の生体分布を、SPECT/CTイメージングを用いて健康なC57BL/6マウスで評価し、肝臓、腎臓及び膀胱における低いシグナルを示した（図3A）。これらのシグナルは、典型的には、sdAb媒介イメージングで観察される代謝及び腎排泄の結果である。ex vivo生体分布分析によるトレーサー取り込みの定量により、肝臓（それぞれ1.292±0.063%IA/g及び3.191±0.060%IA/g）、左腎（33.99±1.014%IA/g及び55.39±4.27%IA/g）及び右腎（34.06±1.530%IA/g及び57.42±4.219%IA/g）におけるsdAb K2及びK3の取り込みが、他のマーカーのイメージングに使用されるsdAbで典型的に得られる値と比較して非常に低かったことが明らかになった（Broisat et al. 2012, Circ Res 110:927-937）（図3B）。本発明者らは、このsdAbが肝臓及び腎臓で最も低い取り込みを示したことから、更なる分析にsdAb K2を選択した。
【表１】
2021514649.tif 000003
【００９５】
本発明者らは、MCF7乳癌細胞及び624-MEL黒色腫細胞、又はそれらのPD-L1が操作された対応物を胸腺欠損ヌードマウスの皮下に移植した（図7A及び図7B）。SPECT/CTイメージングを行ったところ、PD-L1+腫瘍を持つマウスにおいて強いポジティブコントラスト画像を生成した（図4A及び図8A）。ex vivo分析（ガンマ計測）は、PD-L1-MCF7及び624-MELの腫瘍（それぞれ、0.73±0.15%IA/g及び0.85±0.24%IA/g）と比較した場合にPD-L1+MCF7及び624-MELの腫瘍におけるsdAb K2の蓄積を確認した（それぞれ、3.07±0.24%IA/g及び4.86±0.73%IA/g）（図3B及び図8B）。フローサイトメトリーを用いて、本発明者らは、腫瘍細胞上でのPD-L1の発現を確認した（図3C及び図8C）。図13及び図14も参照されたい。
【００９６】
2.3.sdAb K2は樹状細胞及び腫瘍細胞による2D3細胞の活性化を促進する
sdAb K2は腫瘍を透過する能力が高いことを示したことから、本発明者らは、遮断活性を有し、したがって治療剤として使用される可能性があるかどうかを評価することにした。本発明者らは、SPRにおいて、sdAb K2が9.5 nMのIC50値でPD-1:PD-L1間の相互作用を低減することができることを示した（図5A）。本発明者らは以前、特異的TCR及びPD-1を発現するように操作された2D3細胞を用いて、PD-1又はPD-L1を標的とするmAbの遮断能力を評価するために機能細胞系アッセイを最適化した（Versteven et al, Oncotarget、査読中）。したがって、本発明者らは、このプラットフォームを使用して、HLA-A2との関係で、gp100280〜288を認識するTCRを発現するPD-1-2D3細胞又はPD-1+2D3細胞を活性化するため、gp100280〜288ペプチドをパルスしたHLA-A2+moDC細胞又はMCF7細胞を用いてsdAb K2の遮断能力を評価することにした（図5B）。本発明者らは、フローサイトメトリーでeGFPの発現によって測定される2D3細胞の活性化が、PD-1:PD-L1の相互作用により阻害され、この阻害は、ブロッキング抗PD-L1 mAb［MIH、IgG1］又はsdAb K2を加えることにより緩和され得たが、アイソタイプ一致mAb又はsdAb R3B23（5T2MMパラプロテインを認識する）では緩和されないことを観察した（図5C及び図5D）。mAb MIH1及びsdAb K2と同等の結果が、IgG1 mAbであるアベルマブで得られた（結果は示されていない）。moDC刺激との関係で2D3細胞の活性化が、sdAb調製物中に存在するエンドトキシン（3.96 EU/mL）によるmoDCの成熟に起因するものであることを除外するため、本発明者らは、処理されなかったmoDCの表現型をsdAb K2又はsdAb R3B23で処理されたmoDCと比較した。PD-L1、CD83、CD40、CD80及びMHC-Iのような活性化に関連する表現型マーカーのアップレギュレーションは、moDCがLPSで処理されたときにのみ観察された（図5E）。これらの結果は、sdAb K2の存在下でのPD-L1posmoDCによる抗原提示中のPD-1pos2D3細胞におけるTCRシグナル伝達の増加が、PD-1/PD-L1相互作用の阻害によるものであるがHLA-I発現の増加、したがって抗原提示によるものではないことを示している。
【００９７】
結論としてsdAb K2は、moDCによる抗原提示中のPD-1/PD-L1間の相互作用を強力に阻害し、PD-1pos2D3細胞におけるeGFPのNFAT媒介アップレギュレーションによって示されるように、それ自体がTCRシグナル伝達を増強する。
【００９８】
上記のプラットフォームは更に、図16C、図16Dで図式化されたsdAbK2の遮断能力を評価することに依拠していた。HLA-A2POSPD-L1POS又はPD-L1NEG624-MEL黒色腫細胞又はMCF7乳癌細胞（図16C）をgp100280〜288ペプチドでパルスし、HLA-A2との関係でGP100280〜288を認識するTCRαβを発現しているPD-1POS2D3細胞を活性化するために使用した（図16D）。PD-L1遮断剤がない場合（図16E及び図16F、条件「なし」）、PD-L1POS624-MEL腫瘍細胞とのPD-1POS2D3細胞の共培養は、PD-L1NEG腫瘍細胞との共培養と比較してeGFPPOS細胞の割合を減少させた。これは、2D3細胞上のPD-1と黒色腫細胞上のPD-L1との相互作用を反映しており、TCRシグナル伝達を阻害する（Karwacz et al. 2011, EMBO Mol Med 3:581-592）。アベルマブ又はsdAb K2の添加によって阻害を緩和することができたが、アイソタイプ一致mAb又はR3B23の添加では緩和できなかった（図16E）。同様の実験をHLA-A2POSPD-L1POS又はPD-L1NEGMCF7乳癌細胞を刺激細胞として用いて行い、sdAb K2がPD-1とPD-L1との間の相互作用を遮断して、それ自体がTCRシグナル伝達を増強することができることを別の腫瘍モデルで確認した（図16F）。
【００９９】
2.4.sdAb K2は樹状細胞によるT細胞の活性化を促進する
本発明者らは、以前、moDCを4つの異なるmRNA分子で電気穿孔するDC製造プロトコルを開発した。より具体的には、HLA-IIターゲッティングシグナルに融合されたメラノーマ抗原をコードするmRNA、及びmoDCの免疫原性を高めるタンパク質をコードする3つのmRNA分子；CD40リガンド、CD70及び構成的活性型toll様受容体4（合わせてTriMixと称される）。これらのmoDCはTriMixDCと称され、抗原特異的CD8posT細胞の強力な活性化因子であることが示された（Bonehill et al. 2009, Clin Cancer Res 15:3366-3375）。さらに、これらのTriMixDCは、予め治療されている末期の黒色腫患者15人のうち4人［26.7%］に持続的奏功（durable objective response）を誘導することから、文献に記載されている最も強力なDCワクチンの1つとなっている（Wilgenhof et al. 2013, Ann Oncol 24:2686-2693）。
【０１００】
moDC、特にTriMixDC-MELによるワクチン接種は、黒色腫患者を治療するための有望な戦略であることが示された（Wilgenhof et al. 2013, Annals Oncol 24:2686-2693、Van Lint et al. 2014, Cancer Immunol Immunother 63:959-967、Wilgenhof et al. 2015, Cancer Immunol Immunother 64:381-388）。TriMixDC-MELは、成熟した、PD-L1を発現するmoDCとなることから、本発明者らは、抗原提示プロセス中にTriMixDC-MELワクチンにsdAb K2を補うことで、このワクチン接種戦略を改善することができるかどうかを評定した（図9A）。本発明者らは、ブロッキング抗PD-L1 mAb（mAb 29E.2A3、IgG2b）、sdAb K2、アイソタイプ一致mAb又はsdAb R3B23が存在する状況で、TriMixDC-MEL（Melan-Aを提示するように修飾されたTriMixDC、図6G）を用いて、HLA-A2陽性の健康なドナーに由来するCD8+T細胞を刺激した。これらの培養では、CD8+T細胞は、フローサイトメトリーによって評定されるように、培養開始時にPD-1、PD-L1又はCD80の発現を示さなかった（図6H及び図9B）。定量的リアルタイムPCRは、培養開始時のPD-1の欠如を確認したが、刺激の間はPD-1のアップレギュレーションを示した（図9C）。本発明者らは、TriMixDC-MELによるCD8+T細胞への抗原提示中にsdAb K2又はブロッキング抗PD-L1 mAb 29E.2A3の存在が、Melan-A特異的T細胞の数を有意に増加しなかったことを示した。これらのデータの裏付けにより、Melan-A特異的T細胞によるIFN-γの分泌の有意な増加は、アイソタイプ一致対照mAbと比較してmAb 29E.2A3の存在下で、又はsdAb R3B23と比較してsdAb K2の存在下で観察されなかった（図6A〜図6C）。これらの結果は、CD70、CD86等の共刺激シグナルが抗原提示細胞（この場合TriMixDC-MEL）によって豊富に提供される場合、PD-L1によって提供される共抑制シグナルがT細胞活性化の程度に関してはより弱い決定要因であることを示唆している。
【０１０１】
本発明者らは、T細胞活性化に統計学的に有意な増加がないことは、強力な共刺激分子であるCD70、CD80及びCD86を発現するTriMixDC-MELが既にT細胞を活性化するのに既に最適に備わっているが、これは成熟度が低く、更にはCD70、CD80及びCD86発現を欠いているDCワクチンには当てはまらない可能性があるという事実に起因し得ると仮定した。そこで、本発明者らは、抗原提示細胞としてMelan-A mRNAを用いて電気穿孔したmoDCであるDC-MELを用いてT細胞刺激実験を繰り返した（図6I及び図9A）。成熟度の低いこれらのMelan-A提示moDCにより2ラウンドの刺激を行って、いずれもブロッキング抗PD-L1 mAb（29E.2A3）、sdAb K2、アイソタイプ一致mAb又はsdAb R3B23の存在下で分析に十分なMelan-A特異的CD8+T細胞を得た。本発明者らは、mAbではなくsdAb K2の存在が、有意に多い量のMelan-A特異的T細胞をもたらし、増殖及びIFN-γの分泌がより高いことを示した（図6D〜図6F及び図6J）。
【０１０２】
PBMCとの培養において抗原特異的CD8posT細胞の増加は、IgG2bアイソタイプ［29E.2A3］と共にmAbを用いた場合と比較して、IgG1アイソタイプ［アベルマブ、MIH1］と共にmAbを用いた場合により顕著であったことが以前に示されている（Grenga et al. 2016, Clin Transl immunol 5:e83）。したがって、本発明者らは、これらの実験をIgG1ブロッキングmAbとしてアベルマブを用いて繰り返した。IgG2b mAb 29E.2A3による知見と同様に、本発明者らは、アベルマブの存在下でDC-MELによって増強されたCD8posT細胞活性化を観察しなかった［データを示していない］。
【０１０３】
DC-MEL研究で使用した抗PD-L1 mAb（29E.2A3及びアベルマブの両方）は、いずれもブロッキングmAbとして記載され、以前はPBMCによる抗原特異的CD8posT細胞の活性化を増強するために使用されていた（Grenga et al. 2016, Clin Transl immunol 5:e83）ことから、DC-MELによってMelan-A特異的CD8posT細胞の活性化を増強することができなかったことは予想外であった。この効果の欠如の説明を求めて、本発明者らは、moDCへのmAb 29E.2A3及びアベルマブの結合を研究した。比較のためmAb MIH1及びsdAb K2を用いたmoDCの染色を行った。本発明者らは、mAb MIH1がmoDC上でPD-L1を検出する際に最も効率的であり、sdAb K2、アベルマブ及びmAb 29E.2A3と続くことを観察した［図11a］。実際、フローサイトメトリーでは、mAb 29E.2A3はPD-L1を染色することができなかった。これに対し、PD-L1pos293T細胞上のPD-L1の効率的な染色が観察され［図11b］、免疫細胞対非免疫細胞上でのPD-L1への結合についてmAb 29E.2A3の異なる感受性を示唆した。免疫組織化学（IHC）でPD-L1の検出に用いたmAbの免疫細胞対腫瘍細胞のかかる感受性の違いは、以前に記載されている（Schats et al. 2018, Arch Pathol Lab Med 142:982-991）。
【０１０４】
結論として、これらの結果は、非免疫細胞上のPD-L1との結合と比較した場合にmoDC上でPD-L1に結合することができないこと及びその有効性が低いことは、それぞれmAb 29E.2A3及びアベルマブによる効果の欠如を説明することを示唆している。さらに、TriMixDC-MEL及びDC-MELに媒介されるCD8posT細胞活性化との関係でsdAb K2により生成された結果は、強力な共刺激シグナルがない場合、PD-L1がT細胞活性化の主な決定因子であることを示唆している。最後に、DC-MEL及びsdAb K2で生成されたデータは、DC系免疫療法の戦略にsdAb K2を含めるための根拠を提供する。
【０１０５】
DCによるT細胞に対する抗原提示中のPD-1/PD-L1相互作用の阻害機能が一般に認識されており、この阻害経路をDCワクチンの効力を高める魅力的な治療標的として特定する。幾つかの戦略が、前臨床研究において採用され、CD8posT細胞へのDCによる抗原提示中のPD-1/PD-L1相互作用を妨害することに成功した。特に、DCワクチン接種と組み合わせたmAbの使用は、悪性腫瘍の範囲で多くの臨床試験によって証明されるように、その臨床（clinic）への道を見出した（Versteven et al. 2018, Front Immunol 9:394）。しかしながら、免疫シナプスは、mAbを含む一定のサイズを超える分子を除去し、更には排除する（Cartwright et al. 2014, Nat Commun 5:5479）。したがって、小型のPD-1/PD-L1遮断剤の使用がより有利となる可能性がある。高い標的特異性及び親和性を有するPD-1/PD-L1中和部分としてヒトPD-L1特異的sdAb、より具体的にはsdAb K2が本明細書に記載される。そのサイズが小さいことから（約15 kDa）、免疫シナプスのような細胞−細胞のインターフェース内に透過する可能性が高いと予想され（Cartwright et al. 2014, Nat Commun 5:5479）、DCとの併用療法の実施では興味深い候補となる。
【０１０６】
本発明者らは、sdAb K2が低刺激プロファイルを伴うDCを使用する場合、T細胞活性化の初期段階の間に刺激シグナルと抑制シグナルとの間のバランスを変えることができることを示した。DC活性化は、本明細書ではTriMix mRNAの送達によって達成され、PD-L1発現の増強をもたらすが、本発明者らは、成熟したDCによる抗原提示中にsdAb K2を添加した場合にはCD8posT細胞活性化の有意な増加を観察することができなかった。moDCの活性化は、様々な共刺激分子のアップレギュレーションと一致し、共刺激シグナルが共抑制シグナルに取って代わる環境を作り出すという事実によって説明されるかもしれない。この知見は、同種CD4posT細胞を活性化するために、PD-L1ブロッキングmAbの存在下で異なる効力のmoDCを使用した以前の研究（Brown et al. 2003, J Immunol 170:1257-1266）を裏付け、PD-1/PD-L1経路の遮断が「弱い」刺激条件において最も影響を及ぼすことを示唆している。
【０１０７】
本発明者らは、moDC-CD8posT細胞共培養物にmAbを加えることについて何らの利点も示すことができなかった。これは、健康なドナーのヒトT細胞集団の活性化を高めるためにアベルマブ及び／又はmAb 29E.2A3の使用について報告する他の研究（Grenga et al. 2016, Clin Transl immunol 5:e83、Brown et al. 2003, J Immunol 170:1257-1266）とは対照的である。この不一致は幾つかの理由により説明することができる。Grenga et al. 2016 (Clin Transl immunol 5:e83)は、moDCとCD8posT細胞とではなく、PBMCとCD8posT細胞との間の相互作用を研究し、この設定では、ウイルス特異的CD8posT細胞の活性化がmAb 29E.2A3と比較した場合にアベルマブの存在下で最も顕著であったことを示した。この場合、ナイーブT細胞ではなくメモリCD8posT細胞が活性化される可能性が最も高いため、抗原としてウイルスペプチドを使用することが大きな違いである。しかしながら、Brown et al. 2003 (J Immunol 170:1257-1266)は、moDCを刺激細胞として使用し、同種混合リンパ球反応を行ってmAb 29E.2A3の存在下でCD4posT細胞活性化を評価した。この設定では、同種HLA抗原の存在が危険シグナルとしてはたらき、また、メモリT細胞活性化を含む全体的なT細胞活性化を誘導する可能性がある（Merrick et al. 2008, Cancer Immunol immunother 57:897-906）。抗原経験のあるエフェクターメモリT細胞の再活性化は、ヒト癌療法におけるPD-L1/PD1遮断の有効性の推進要因であることが示唆されたが、CD8POSエフェクターT細胞の活性化は報告されなかった（Ribas et al. 2016, Cancer Immunol Res 4:194-203）。刺激細胞の供給源もまた、実験結果の違いに寄与する可能性がある。本発明者らは、mAb 29E.2A3は、本発明者らが生成したmoDcに対するフローサイトメトリーでPD-L1を検出することができず、アベルマブによるPD-L1の検出はmAb MHI1及びsdAb K2と同様にあまり明らかでないことを観察した。293T細胞上で発現されたPD-L1の（of）染色は、アベルマブ、mAb 29E.2A3及びMIH1と並んでsdAb K2が、これらの細胞上のPD-L1を染色することができたことから、この観察が技術的アーティファクトであることは排除される。moDC細胞対293T細胞上で発現されるPD-L1に対するこの異なる感受性の理由は現時点では不明であるが、本発明者らの研究では、これらのmAbの存在下で抗原特異的CD8posT細胞のde novo活性化が観察されなかった理由についての説明を提供する。本発明者らのmoDCは、異なる培養条件［例えば培養培地］を用いたことから、Brown et al. 2003 (J Immunol 170:1257-1266)が使用するmoDCとは異なると考えられる。確かに、この研究で使用されるmoDCは、Grenga et al. 2016 (Clin Transl immunol 5:e83)が使用するPBMCとは異なる。DCを含む異なるPD-L1pos免疫及び非免疫細胞集団への異なるmAbの結合を評定するため、更なる研究が必要とされる。かかる研究は、腫瘍組織及びリンパ節におけるPD-L1の免疫組織化学的検出の関係で既に他の抗体を用いて行われており、異なる抗体は実際に腫瘍細胞対免疫細胞上のPD-L1に結合する傾向が異なり、時にはリンパ球様細胞対DCを区別することさえあることを示した（Schats et al. 2018, Arch Pathol Lab Med 142:982-991）。本発明者らの研究では、sdAb K2はmAb MIH1と同様に、moDC対293T細胞上に発現されるPD-L1を区別しなかった。
【０１０８】
本発明者らは、以前、sdAb K2がPD-L1への結合についてアベルマブと競合することを示した。研究は、アベルマブが主にPD-L1のIgVドメインの前部βシート面の鎖上のVHドメインと結合することを示し、これは、デュルバルマブ、アテゾリズマブ及びBMS-936559のような他のPD-L1ターゲッティングmAbによって結合されるエピトープとは異なる（Liu et al. 2017, Cell Res 27:151-153、Tan et al. 2018, Protein Cell 9:135-139）。これをふまえると、PD-L1に対してデュルバルマブと同様の結合を示す抗PD-L1 sdAb KN035及び非ペプチド抗PD-L1阻害剤（BMS-202及びBMS-8）等の他の小分子阻害剤と比較した場合、sdAb K2は特有で小型の生物学的阻害剤である（Tan et al. 2018, Protein Cell 9:135-139、Zhang et al. 2017, Cell Discov 3:17004）。本発明者らは、sdAb K2は、タンパク質レベル及び腫瘍細胞−T細胞レベルでPD-1/PD-L1相互作用を遮断することを示した。本発明者らはここで、sdAb K2はまた、DCがCD8posT細胞と相互作用する際に作製される免疫シナプスでPD-1/PD-L1相互作用を遮断することができることを示した。sdAbの単一ドメインの性質は、DCワクチン開発の観点から興味深い視点を提供する。多くのプロトコルはDCに腫瘍抗原及び活性化刺激を送達するために利用可能である。これらの多くは、ウイルス及び非ウイルスベクターを用いた遺伝子工学に基づいている（Breckpot et al. 2004, J Gene Med 6:1175-1188、Benteyn et al. 2015, Expert Rev Vaccines 14:161-176）。古典的なmAb又はmAbフラグメントのクローニングは深刻な課題を提供するが、sdAbのクローニングは簡単であるため、既存のDC操作プロトコルに容易に組み込むことができる。また、これらのex vivo DC操作戦略の幾つかは、腫瘍環境であっても、in situでDCを特異的に操作するために使用されている（Van Lint et al. 2012, Cancer Res 72:1661-1671、 Van Lint et al. 2016, Cancer Immunol Res 4:146-156、Goyvaerts et al. 2013, J Virol 87:11304-11308、Van der Jeught et al. 2018, ACS Nano 12:9815-9829、Verbeke et al. 2019, ACS Nano）。sdAb K2の標的化送達、及び免疫シナプスにおけるその放出は、mAb又はsdAbの全身投与と比較して魅力的な安全上の検討事項を提供する。抗原とsdAb K2により操作されたDCと同族T細胞との間のみにおいて免疫抑制シグナルから免疫刺激シグナルへとバランスを取ることで、オフターゲットT細胞活性化をほとんど又は全く伴わずにオンターゲットT細胞応答を高めることを保証する。
【０１０９】
結論として、本発明者らは、T細胞活性化及びサイトカイン産生を刺激するDCの能力を高めるために、多目的なPD-L1/PD-1ブロッキング部分であるsdAb K2の使用について報告する。DCワクチン接種プロトコルにsdAb K2を含めることは、T細胞活性化のためにDCを修飾する幾つかの技術が癌と並んで感染性疾患の状況で調査される臨床現場で治療上の可能性を有し得る。
【０１１０】
2.5.sdAb K2は腫瘍細胞と相互作用する間、T細胞の活性化を維持する
PD-1:PD-L1免疫チェックポイント軸は、腫瘍微小環境の主要な原因である。したがって、本発明者らは、HLA-A2との関係で、gp100280〜288を提示しているHLA-A2+腫瘍細胞（PD-L1-又はPD-L1+である）との相互作用によって、PD-1をコードするmRNA及びgp100280〜288を認識するTCRを用いて電気穿孔されたT細胞の増殖及びIFN-ガンマを産生する能力が妨げられたかどうかを評価した。
【０１１１】
2.6.sdAb K2は有望なセラノスティック（theranostic）である
ブロッキング抗体による最初の患者研究は、腫瘍生検の免疫組織化学的染色（IHC）を用いた腫瘍のPD-L1状態と相関し、PD-L1発現腫瘍において応答が有意に高いことを確認した。それにもかかわらず、その後の研究では、PD-L1陰性癌においても応答が認められたが、程度はより低かった（Topalian et al. 2012, N Engl J Med 366:2443-2454）。これらの観察は、PD-L1発現の評定を可能にし、T細胞の機能を維持するために腫瘍微小環境内でPD-L1を標的にすることができるツールの必要性を強調する。sdAb K2はPD-L1のイメージングに適しており、本発明者らのin vitroアッセイがCD8+T細胞の機能を活性化及び維持する可能性があることを示唆しているため、本発明者らは、腫瘍特異的T細胞との相互作用により624-MEL細胞に対するPD-L1アップレギュレーションを99m-Tc sdAb K2によるSPECT/CTイメージングで可視化できるかどうか、及びsdAb K2による治療法の結果をシグナルが予測するかどうかを検討した。
【０１１２】
2.7各種huPDL1結合剤の腎取り込み
表2は、本発明のhuPDL1結合型ナノボディ、並びに他のhuPDL1結合剤及びマウスPDL1結合ナノボディの腎取り込み値を列挙する。
マウスPDL1結合ナノボディC3：非特許文献3
アフィボディ：非特許文献4
アドネクチン：非特許文献5
大環状ペプチド：非特許文献6
外部ドメインhuPD-1：非特許文献7。
%IA/g（図3、図4及び図8の凡例、並びに実施例1.8及び実施例2も参照されたい）：種々の組織における放射性標識の取り込みは、%IA/g又は組織1グラム当たりの注入放射能（activity）の%によって表される。器官（腎臓等）に言及する場合、指定の時点に注射された後に、マウスを屠殺し、解剖して器官（腎臓等）を摘除したことを意味する。全ての器官の重さを測り、放射能をガンマカウンターで計測した。これは1分（又は秒）当たりのカウント数をもたらす。放射性核種の崩壊と共に経時的に低下することから、これは任意（arbitrary）である。したがって、標準もガンマカウンターで測定し、そして器官（例えば腎臓）におけるカウントを、注入された放射能の量（IA）に外挿される標準のカウントに対応付ける。器官における取り込みは、注入された放射能の相対的な取り込みとして表される（したがって、注入された放射能の総量の%又は%IA）。次いで、これを器官の重量で除算し、%IA/g単位の値とする。腎臓はマウスでは全重量（full gram）（通常は約100 mg）を計量しないため、これは100%よりも高くなる場合がある。
【表２−１】
2021514649.tif 000004
【表２−２】
2021514649.tif 000005
【０１１３】
3.部位特異的放射性標識
プログラム細胞死リガンド1（PD-L1）等の免疫チェックポイントはT細胞機能を制限し、腫瘍細胞は抗腫瘍免疫応答を逃れるためにこの受容体を発達させた。モノクローナル抗体ベースの治療は、患者のサブセットでのみ長期的な応答を示した。したがって、治療に対する応答を予測する必要がある。これを支持して、PETイメージングを用いたヒトPD-L1（hPD-L1）発現を評定するIVD系プローブは、抗PD-L1 sdAbを68Ga標識用のNOTAキレート剤又は［18F］AlF標識用のRESCAキレート剤に部位特異的にカップリングさせることによって開発された。比較研究として、この戦略が臨床試験で他のsdAbの製造で既に実施されているため、ランダムカップリング戦略によって抗PD-L1 IVDもNOTAキレート剤にカップリングした。
【０１１４】
C末端にsortagモチーフ（ソルターゼAアミノ酸基質モチーフ）を有する抗hPD-L1 sdAb K2を、ソルターゼA酵素カップリング反応を介して部位特異的に二官能キレート剤（BFC）にカップリングした。GGGYKペプチドにp-SCN-Bn-NOTA又はRESCA-(tBu)-COOHを付着させることによりBFCを合成した。部位特異的に修飾された抗hPD-L1 sdAb K2は、150 M EDTA溶液とのインキュベーション、IMAC及びサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）によって精製された。
【０１１５】
ランダム機能化の場合、0.05 M炭酸ナトリウムバッファー（pH 8.7）中の6×ヒスチジンタグ付き抗hPD-L1 sdAb K2を20倍過剰のp-SCN-Bn-NOTA BFCに加え、pHを0.2 M Na2CO3で8.5〜8.7に調整した。室温（RT）で2時間インキュベーションした後、HCl 1 Nを添加して反応混合物のpHをpH7.4まで低下させた。NOTA-（抗hPD-L1 sdAb K2）タンパク質溶液をSECカラムに充填した。単量体NOTA-抗hPD-L1 sdAb K2タンパク質を含有する収集された画分をプールした。
【０１１６】
修飾抗hPD-L1 sdAb K2を、質量分析（ESI-Q-TOF）、SDS-PAGE及びウェスタンブロットによって特性評価した。NOTA-（抗hPD-L1 sdAb K2）は、部位特異的及びランダムに68Gaで標識されRESCA-（抗hPD-L1 sdAb K2）は［18F］AlFで標識された。放射性化学純度（RCP）をSEC及びiTLCによってアッセイした。部位特異的に放射性標識されたプローブの安定性をin vitroで評価した。［68Ga］Ga-NOTA-（抗hPD-L1 sdAb K2）の結合能を、PD-L1陽性mel624細胞上でin vitroで評価し、ランダムに68Ga標識された抗hPD-L1 sdAb K2と比較し、一方で、100倍過剰の非標識sdAb K2の存在下、PD-L1陰性細胞及びPD-L1陽性細胞で親和性及び特異性を試験した。異なる時間点に由来する血液及び尿の試料を分析することにより、ランダム及び部位特異的の両方の［68Ga］Ga-NOTA-（抗hPD-L1 sdAb K2）、並びに部位特異的［67Ga］Ga-NOTA-（抗hPD-L1 sdAb K2）を用いてin vivo安定性（血液曲線及び代謝研究）を行った。C57BL/6マウスにおけるin vivo生体分布を、ランダム及び部位特異的の両方の［68Ga］Ga-NOTA-（抗hPD-L1 sdAb K2）、並びに部位特異的［67Ga］Ga-NOTA-（抗hPD-L1 sdAb K2）及び［18F］AlF-RESCA-（抗hPD-L1 sdAb K2）を用いて行った。in vivo腫瘍ターゲッティング研究を、PD-L1陽性細胞又は対照としてPD-L1陰性細胞を持つ異種移植胸腺欠損ヌードマウスにおいて、ランダム及び部位特異的の両方の［68Ga］Ga-NOTA-（抗hPD-L1 sdAb K2）を用いて行った。in vivo腫瘍ターゲッティングを、PD-L1陽性細胞を持つ異種移植胸腺欠損ヌードマウスにおいて部位特異的［67Ga］Ga-NOTA-（抗hPD-L1 sdAb K2）でも行った。担腫瘍マウスのPET/CT及びSPECT/CTイメージングを、それぞれ部位特異的［68Ga］Ga-NOTA-（抗hPD-L1 sdAb K2）及び［67Ga］Ga-NOTA-（抗hPD-L1 sdAb K2）を用いて行った。
【０１１７】
NOTA及びRESCAによって部位特異的に機能化された抗hPD-L1 sdAb K2を、高純度（99%以上）で、それぞれ56%及び59%の収率で得た。機能化は、親和性にも特異性にも影響を与えなかった。ランダムに機能化した抗hPD-L1 sdAb K2を52%の収率で得た。
【０１１８】
ランダム及び部位特異的の両方のNOTA-（抗hPD-L1 sdAb K2）の68Gaによる放射性標識を、80%崩壊補正放射性化学収率（DC-RCY）及び99%以上のRCPで、pH 4.4〜4.7で10分間、室温にて行った。部位特異的に放射性標識されたsdAb K2では85 GBq/μmolの見かけのモル比活性を得て、ランダムに放射性標識されたsdAb K2では63 GBq/μmolを得た。4時間にわたり、部位特異的に放射性標識されたプローブ及び金属錯体は、注入バッファーにおいて及び過剰なDTPA（99%以上のRCP）の存在下で安定していた。ヒト血清において37℃で1時間後のRCPは94%以上であった。
【０１１９】
67Gaの部位特異的放射性標識を、86%のDC-RCY、95%以上のRCPでpH 4.4〜4.7にて室温で10分間行ったところ、見かけのモル比活性は最大40 GBq/μmolであった。放射性標識プローブは、注入バッファー（98%以上のRCP）中で17時間にわたり、及びヒト血清中で37℃にて4時間（95%以上のRCP）にわたり安定していた。
【０１２０】
in vivo代謝研究では、部位特異的［67Ga］Ga-NOTA-（hPD-L1）は、プローブが血液中で95%以上無傷であり、2時間後には尿中で90%以上が無傷であることを示した。
【０１２１】
ランダム及び部位特異的の両方の［68Ga］Ga-NOTA-（抗hPD-L1sdAb K2）を用いるin vivo腫瘍ターゲッティング及び生体分布の研究では、ランダムの場合の（1.551±0.467）%IA/g器官と比較して部位特異的の場合（3.664±0.764）%IA/g器官の高い腫瘍取り込みを明らかにした（図10Bを参照されたい）。腎臓（図10Bを参照されたい）及び膀胱への排泄（予想される排泄経路）を除いて、非特異的器官ターゲティングは観察されなかった。ランダム68Ga標識sdAb K2と比較して、部位特異的68Ga標識sdAb K2の腎臓蓄積は低いが、部位特異的68Ga標識sdAb K2の腫瘍取り込みは高く、それによりシグナル／ノイズ比を高め、腫瘍選択的標識を増す。ランダム68Ga標識sdAb K2と比較して、部位特異的68Ga標識sdAb K2の同様の選択性がPD-L1+細胞で観察された（図10Aを参照されたい）。
【０１２２】
部位特異的［67Ga］Ga-NOTA-（抗hPD-L1 sdAb K2）で得られたin vivo腫瘍ターゲッティング及び生体分布の研究プロファイルは、68Ga標識プローブの場合と同様であった（図10Cを参照されたい）。腫瘍取り込みは以前の実験と同様にわずかに低く、これは腫瘍の位置が異なること（脚の代わりに頸部領域）及びin vivoでの腫瘍増殖期間がより長く、壊死性腫瘍につながることで説明することができる。67Ga標識によるSPECT/CTスキャンの定量により、腫瘍取り込みの定量が可能となり、ex-vivo測定と同様の結果、すなわち解剖された腫瘍から算出された総注入活性の0.350%と比較して、スキャンから定量された総注入活性0.328%が得られた。
【０１２３】
［18F］AlFによるRESCA-（抗hPD-L1 sdAb K2）の放射性標識を、29%DC-RCY及びRCP 99%以上で、pH 4.4〜4.7にて12分間室温で行った。放射性標識されたプローブは、注入バッファー中で2.5時間にわたり安定していた（RCP 98%以上）。健康な動物における生体分布は、わずかに高い骨取り込みを除いて［68Ga］Ga-NOTA-（hPD-L1）の場合と同様であった。
【０１２４】
このように、ソルターゼ酵素媒介標識アプローチは、67Ga、67Ga又は［18F］AlFで容易に放射性標識することができる部位特異的に機能化された抗hPD-L1 sdAbを得ることを可能にした。［68Ga］Ga-NOTA-（抗hPD-L1 sdAb）は、in vivoでhPD-L1受容体を特異的に標的とすることが証明され、ターゲッティング実験を［18F］AlF-RESCA-（抗hPD-L1 sdAb）で繰り返す。67Ga標識プローブで得られたSPECT/CT画像は定量可能であることが判明した。
【０１２５】
4.sdAb K2による異種移植腫瘍モデルにおいてIFN-γによって誘導されるヒトPD-L1の検出
PDL1が操作された2種類の腫瘍細胞マウスモデルにおける検証の後、本発明者らは、sdAb K2を使用して、IFN-γに応答するPD-L1発現を検出することができるかどうかを評価した。本発明者らがフローサイトメトリーで100 IU/mL IFN-γによる938-MEL細胞のin vitro処理がPD-L1のアップレギュレーションにつながること観察したことから、938-MELモデルを使用した（図15A）。本発明者らは、次に、胸腺欠損ヌードマウスで増殖させた938-MEL腫瘍に組換えIFN-γを注入し、99mTc-sdAb K2及びSPECT/CTイメージングを使用してPD-L1発現を評価した（図15B）。平均150 mm3の腫瘍にPBS（陰性対照）又は104 IU IFN-γを注入した。1日後、本発明者らはSPECT/CTイメージングを行い、IFN-γ処理したマウスの腫瘍におけるPD-L1の検出を示したが、PBS処理したマウスの腫瘍におけるPD-L1の検出は示さなかった（図15C）。さらに、ex vivoでのγ計測は、PBSで処理したマウス（0.28±0.02%IA/g）と比較してIFN-γで処理したマウス（0.55±0.08%IA/g）において99mTc-sdAb K2の取り込み量がより高いことを示した（図15D）。フローサイトメトリーを用いる腫瘍細胞上でのPD-L1発現の評価は、PBS処理腫瘍と比較してIFN-γ処理腫瘍に対するPD-L1の発現が高いことを確認したが、PD-L1発現レベルは低かった（図15E）。
【０１２６】
5.sdAb K2はPD-L1への結合についてアベルマブと競合し、PD-1:PD-L1遮断能力を有する
本発明者らは、sdAb K2が腫瘍細胞上においてin vivoでPD-L1発現レベルを検出する可能性のある診断ツールとしてはたらき、これをふまえて抗PD-L1治療に患者を選択する可能性があることを示した。本発明者らは、次に、sdAb K2も治療の可能性を持っているかどうか疑問に思い、sdAb K2がPD-1:PD-L1相互作用を阻害してT細胞活性の増強につながるかどうかを評価した。本発明者らは、SPRにより、sdAb K2がPD-L1上でアベルマブと同じエピトープを認識することを示した（図16A）。さらに、sdAb K2は、8.5 nMのIC50でPD-1:PD-L1との間の相互作用を阻害することができる。同じアッセイにおいて、アベルマブのIC50値は4 nMであったのに対し、対照であるR3B23及びトラスツズマブはいずれも、PD-1:PD-L1相互作用に影響を与えなかった（図16B）。
【０１２７】
6.sdAb K2は活性化されたPBMCの腫瘍細胞を死滅させる能力を回復する
本発明者らは、活性化されたPBMCs及び腫瘍細胞の共培養にsdAb K2を添加する効果を検討した。まず、本発明者らは、抗CD3抗体及びIL-2のカクテルで刺激されたPBMCのプール内に存在するCD8POST細胞（これらの細胞は腫瘍細胞の死滅を媒介するのに重要である）上のPD-1及びPD-L1の発現を評価した。本発明者は、フローサイトメトリーを用いて、PD-1及びPD-L1の両方がCD8POST細胞上でアップレギュレートされたことを示し、これらの細胞の活性化を確認した（図17A）。活性化された細胞を、eGFPを発現するようにレンチウイルスによって操作され（図17B）、3Dスフェロイドで増殖させたPD-L1pos624-MEL細胞に加えた。PD-1:PD-L1ブロッキング部分がない場合、本発明者らは、緑色被写体面積として測定されたeGFPPOS腫瘍細胞の量は時間とともに増加し、又は言い換えれば活性化されたT細胞によって十分に破壊されなかったことを観察し、T細胞が媒介する腫瘍細胞の死滅に対するPD-L1の阻害的役割を確認した（図17C）。アベルマブ又はsdAb K2をPD-L1POS腫瘍細胞に添加すること及びPBMCの刺激は、緑色被写体面積の減少として測定されるように、対照mAb又はR3B23の添加と比較した場合、腫瘍細胞の死滅を増強した（図17D及び図17E）。腫瘍細胞の死滅に対するアベルマブ添加の効果は80時間で観察することができたが（図17D）、sdAb K2の効果は培養の最初の数時間に観察された（図17E）。したがって、sdAb K2は早期及び短期の治療活性を示し、アベルマブはより持続性のある遮断活性を示した。遮断活性を高めるため、本発明者らは、329例のsdAb K2及びアベルマブ治療の併用効果を評価したところ、アベルマブ又はsdAb K2を別々に添加したものと比較して、より効率的な腫瘍細胞の死滅（70時間後）を示した（図17F）。sdAb K2の作用が短いことを救済するため、本発明者らは、24時間間隔のsdAb K2反復投与の効果を試験した。この結果、活性化されたPBMCによる効率的な腫瘍細胞の死滅は50時間後であり（図17G）、sdAb K2の治療可能性を支持した。
【０１２８】
7.考察
この研究では、本発明者らは、sdAb K2というsdAbが腫瘍微小環境においてヒトPD-L1発現レベルを検出することができ、腫瘍細胞上のPD-L1を遮断する結果、T細胞活性を増強することを示した。sdAb K2は、ヒトPD-L1に対してナノモル親和性で結合し、注入後1時間で早くも腫瘍においてPD-L1発現を検出するため、診断薬として使用することができる。PD-L1発現は、IFN-γの腫瘍内投与後であっても検出することができた（これはPD-L1のin situアップレギュレーションにつながったが、発現レベルは低いままであった）。さらに、本発明者らは、sdAb K2は、8.5 nMのIC50を示してPD-1:PD-L1相互作用を遮断し、抗原特異的TCRシグナル伝達及びin vitroにおける腫瘍死滅活性の破壊を解放することから、治療上の可能性を有することを示した。今日、臨床試験では、PD-L1発現は主にIHCによって評価され、これには幾つかの制限がある。選択された固定組織試料の染色は、腫瘍マーカーの不均一な発現、又は治療中の動的PD-L1発現の評定ができない。分子イメージングは、この非侵襲的な方法が、腫瘍環境内の領域差を示し、転移性病変におけるPD-L1発現を評定することができることから、PD-L1発現を評定する良い代替手段である。本明細書では、本発明者らは、sdAb K2には興味深い診断をするための幾つかの特性があることを示した。理想的な放射線トレーサーは、速い腎クリアランス及び効率的な腫瘍透過と、それらの標的に対する良好な親和性とを併せ持ち、トレーサー投与直後に高い腫瘍対バックグラウンド比をもたらす。本発明者らは、それらのサイズが小さいことから腎取り込み及び腎排泄に起因して、健康なC57BL/6マウスにおける投与が腎臓及び膀胱を除く全ての器官においてほとんど又は全くシグナルを示さなかったことから、99mTc-sdAb K2がこれらの要件を満たしていることを示した（Chakravarty et al. 2014, Theranostics 4:386-398）。注意すべきは、腎臓における99mTc-sdAb K2の取り込みは、99mTc-R3B23、陰性対照として使用されるsdAb、及び本発明者らが知る限り同様の方法で標識された任意の他のsdAbと比較してはるかに低かった。この腎保留の低さは、かかる重要な腎保留の低下が患者の照射負担を軽減するだけでなく、腎臓の近傍における病変の評定を改善することから、sdAb K2を放射性トレーサーに特に適したものとする。これらの患者は、かかる治療から利益を得ることができるため、これは、PD-L1の発現について腎細胞癌を有する患者を評定するのに有用となり得る（Alsaab et al. 2017, Front Pharmacol 8:561）。99mTc-sdAb K2は、2種類のヒトPD-L1発現腫瘍モデル、黒色腫及び乳癌において、それぞれ20.2及び8.9の腫瘍対血液比で強烈で特異的な取り込みを示した。さらに、PD-L1発現をIFN-γの腫瘍内注入後に検出することができ、フローサイトメトリーで確認されるように、腫瘍細胞上のPD-L1発現レベルは依然として低いものの上昇した。全てのイメージング研究では、高い腫瘍対バックグラウンド取り込みレベルを、注入後1時間で早くも得ることができた。患者に置き換えられた場合、これは18F-FDGによる現在の日常的な実施と非常によく似た短い、即日のイメージング手順を可能にするであろう（Vaneycken et al. 2011, FASEB J 25:2433-2446）。sdAb K2で本発明者らが観察した絶対的な腫瘍取り込みは、腫瘍を標的とするsdAbを使用した他の研究と比較して同じレベルにある（Xavier et al. 2013, J Nucl Med 54:776-784、Xavier et al. 2019, Mol Imaging Biol）。sdAbの絶対腫瘍取り込みは一般的にmAbで得られるものよりも低いが、結合していないトレーサーのクリアランスが非常に速いため、早い時間点で得られるコントラストがより一層高くなる。将来の臨床への置き換えのため、本明細書で提案されるSPECTトレーサーは、他のsdAbの置き換えで行われたことと同様に、臨床PETトレーサーへと更に設計される（Keyaerts et al. 2016, J Nucl Med 57:27-33、Xavier et al. 2013, J Nucl Med 54:776-784、Xavier et al. 2019, Mol Imaging Biol）。他の研究グループもまた両方のmAb（Bensch et al. 2018, Nat Med 12:1852-1858、Lesniak et al. 2016, Bioconjug Chem 27:2103-2110）又はより小さなタンパク質（非特許文献6、Donnelly et al. 2017, J Nucl Med 59:529-535、Niemeijer et al. 2018, Nat Commun 9:4664）を用いるPD-L1イメージング用の放射性トレーサーを開発し、それらの一部は臨床試験に入っている。Bensch et alは、癌患者の分子イメージングに臨床的に承認された治療用mAbである89Zr標識アテゾリズマブを使用した（Bensch et al. 2018, Nat Med 12:1852-1858）。IHCと比較してPET画像と臨床応答との間のより良い相関関係が報告された。しかしながら、最適な腫瘍対血液比は注入後7日目にのみ得られた（Bensch et al. 2018, Nat Med 12:1852-1858）。この時間点を、完全な抗体（150 kDa）よりも小さい（80 kDa）ものの、依然としてsdAb K2（15 kDa）等のsdAbよりも大幅に大きい89Zr標識された重鎖のみの抗体KN035（すなわちFcドメインに融合した抗PD-L1 sdAb）を使用して確実に5日まで減らすことができた。しかしながら、報告された腫瘍対血液比は低かった（すなわち1.1）（Li et al. 2018, Mol Pharm 15:1674-1681）。18F標識アドネクチンである18F-BMS-986192は、約10 kDaのサイズを有するため、少なくともサイズに関してはsdAbに近い。この化合物は、マウスでPETイメージングを使用してPD-L1POS対PD-L1NEG腫瘍の3.5倍高い取り込みでPD-L1POS腫瘍を視覚化することができた。しかしながら、18F-BMS-986192の腎臓取り込みは比較的高かった（Donnelly et al. 2017, J Nucl Med 59:529-535）。この化合物は、最近、癌患者（非小細胞肺癌）でも評価された。腫瘍におけるトレーサー取り込みは、IHCで評価された腫瘍細胞上のPD-L1発現レベルと相関した。しかしながら、腫瘍のサブセットはIHCによる低PD-L1発現を示したものの、18F標識アドネクチンによる取り込みは比較的高く、これは病変におけるPD-L1の不均一性によって説明することができた。さらに、応答率はトレーサーの取り込みと相関し、応答者は非応答者と比較してより高いトレーサー取り込み量を示した（Niemeijer et al. 2018, Nat Commun 9:4664）。これらの観察により、本発明者らは、本明細書で提示されたsdAb K2等の小さなイメージング剤が癌患者において診断ツールとして使用可能であると考える。実際、sdAb K2は、注入後1時間で早くも高コントラストレベルでPD-L1を画像化することができ、これは89Zr標識アテゾリズマブでのイメージングよりもはるかに速い。第2に、そのサイズが小さいため、sdAb K2は効率的に腫瘍を透過することができ、化合物KN035と比較して高い腫瘍対血液比（KN035の1.1と比較して、sdAb K2の場合は8.9及び20.2）をもたらす。最後に、sdAb K2は、同じようなサイズの395 18F標識アドネクチンと比較して高いコントラスト（sdAb K2の場合に腫瘍対血液比8.9及び20.2に対して、同じ時間点のアドネクチンで3未満）及びより低い腎保留でPD-L1発現レベルを検出することができる。その診断値に加えて、本発明者らは、さらにsdAb K2の治療値を評価した。治療法に対するsdAbの使用は、mAbと比較して幾つかの利点を示す。sdAbはmAbよりも10倍小さいため、迅速で均質な腫瘍透過に適している。PD-（L）1免疫チェックポイントは、主に他の免疫器官ではなく腫瘍微小環境に関連しているため（Zou et al. 2016, Sci Transl Med 8:328rv4）、これは、例えばHAC-I変異体（10 kDa；KD=100 pM；IC50=210 pM）の場合に観察された、より大きくて透過しにくい腫瘍における最適な治療効果の重要な特徴となり得る。この小さなブロッキング部分は、より小さな腫瘍を治療する際にヒトPD-L1を標的とするmAbと比較して等しい腫瘍減少を誘導したが、より大きな腫瘍が治療される際には、mAbはその治療有効性を失ったのに対して、HAC-I変異体では治療効果は失われなかった（非特許文献7）。また、以前に記載されるsdAb-Fc化合物KN035は、異種移植モデルにおける腫瘍細胞の死滅を増強した（Zhang et al. 2017, Cell Discov 3:17004）。しかしながら、ヒトPD-L1を標的とするsdAbは、治療現場ではまだ一価のフォーマットで研究されていない。本発明者らは、sdAb K2がFDAにより承認された抗体アベルマブと同じPD-L1上のエピトープに結合し、sdAb K2のIC50値がわずかに高かったにもかかわらず、ヒト抗原特異的T細胞アッセイでアベルマブと同様の大きさのPD-1:PD-L1相互作用を遮断できることを示すことができた。このIC50の違いは、アベルマブの二価フォーマットによって説明することができ、このフォーマットは、sdAb K2の場合は1つの結合場所を与えるのに対して、アベルマブの場合には2つの結合場所を与える。3D腫瘍細胞死滅アッセイで両方の化合物を評価する際、本発明者らは、sdAb K2添加後に腫瘍細胞の死滅が急速に始まったことを観察したのに対し、アベルマブの場合、効果は80時間後にのみ観察された。これは、両薬剤間のイオン価、IC50並びに拡散の違いによって説明され得る。sdAb K2は小さく、その標的に迅速に結合できるはずであるが、同時に標的から急速に離れる可能性が高い。対照的に、アベルマブはより大きく、おそらくは、より後で標的に達するが、二価フォーマットに起因する高いアビディティはより良いオフレート（off-rate）及びより長い保持時間をもたらす。したがって、アベルマブと同じ効果を得るためには、治療としてのsdAb K2の反復投与が必要となり得る。代替的には、sdAb K2を二価フォーマットに変更して、その効果を最適化することもできる。本発明者らは既に、24時間ごとにsdAb K2を添加することが、1回の用量のアベルマブを添加するのと比較して、活性化されたPBMCが媒介する腫瘍細胞の死滅に同じ効果を有することをin vitroで確認することができている。しかしながら、これが更に臨床結果を改善し得るかどうかはまだ示されていない。薬物動態及びアビディティの違いを活用して、本発明者らは、sdAb K2及びアベルマブによる併用療法が優れた抗腫瘍死滅効果（antitumour killing effect）をもたらすことを更に実証した。in vivo腫瘍環境におけるかかる組み合わせアプローチの正確な値を決定するために更なる研究が認められる。まとめると、これらのデータは、sdAb K2がヒトPD-L1を標的とする小さな拮抗性の治療用化合物として期待されることを示している。
【符号の説明】
【０１２９】
図面訳
図1
Amino acid sequence of IVD K1  IVD K1のアミノ酸配列
SEQ ID NO:  配列番号
Amino acid sequence of CDR1 of IVD K1 as determined with IMTG  IMTGで決定されたIVD K1のCDR1のアミノ酸配列
Amino acid sequence of CDR2 of IVD K1 as determined with IMTG  IMTGで決定されたIVD K1のCDR2のアミノ酸配列
Amino acid sequence of CDR3 of IVD K1 as determined with IMTG  IMTGで決定されたIVD K1のCDR3のアミノ酸配列
Amino acid sequence of IVD K2  IVD K2のアミノ酸配列
Amino acid sequence of IVD K3  IVD K3のアミノ酸配列
Amino acid sequence of IVD K4  IVD K4のアミノ酸配列
図2
B
relative response (RU)  相対応答（RU）
Time (sec)  時間（秒）
Immobilized protein： huPD-L1  固定化タンパク質：huPD-L1
C
count  カウント
PD-L1 binding  PD-L1結合
D
Affiniteit  親和性（Affinity）
MFI PD-L1 binding  MFI PD-L1結合
(fold increase)  （増加倍率）
図3
A
transverse  横断
sagital  矢状
coronal  冠状
B
Organ uptake%IA/g  器官取り込み%IA/g
Thymus  胸腺
heart  心臓
lungs  肺 
liver  肝臓
spleen  脾臓
pancreas  膵臓
Left kidney  左腎
Right kidney  右腎
Stomach  胃
small intestine  小腸
large intestine  大腸
Muscle  筋
bone  骨
Lymph nodes  リンパ節
White fat pelvis  骨盤由来の白色脂肪（white fat from pelvis）
Brown fat  褐色脂肪
Blood  血液
図4
A
transverse  横断
sagital  矢状
coronal  冠状
Tumor  腫瘍
B
%IA/g Tumor  %IA/g腫瘍
C
total PD-L1+ cells(%)  総PD-L1+細胞（%）
図5
A
relative response (RU)  相対応答（RU）
time (sec)  時間（秒）
Immobilized protein： PD-L1 Fc  固定化タンパク質：PD-L1 Fc
B
2D3 CELLS  2D3細胞
count  カウント
HUMAN DENDRITIC CELLS  ヒト樹状細胞
Antibody  抗体
TUMOR CELLS  腫瘍細胞
C
Reduction in TCR-signaling  TCRシグナル伝達の減少
NO  なし
D
% Reduction In activity  活性の減少%
(PD+L1POS vs PD-L1NEG MCF7 cells)  （PD+L1POS対PD-L1NEG MCF7細胞）
no  なし
E
Marker positive cells (%)  マーカー陽性細胞（%）
NO  なし
図6
A
Mel-A-specific CD8POS T cells (#)  Mel-A特異的CD8POST細胞（数）
B
Fold increase  増加倍率
CD8+ T-cell proliferation  CD8+T細胞の増殖
control  対照
C
Fold increase in IFN-γ production  IFN-γ産生の増加倍率
D
Total melA specific T cells  総melA特異的T細胞
control  対照
E
Fold increase  増加倍率
CD8+ T-cell proliferation  CD8+T細胞の増殖
control  対照
F
fold increase IFN-y  IFN-yの増加倍率
G
COUNTS  カウント
H
COUNTS  カウント
T CELLS  T細胞
J
Mel-A-specific CD8POS T cells (#)  Mel-A特異的CD8POST細胞（数）
I
COUNTS  カウント
図7
A
MCF7 CELLS  MCF7細胞
count  カウント
624-MEL CELLS  624-MEL細胞
B
MCF7 CELLS  MCF7細胞
Tumor volume (mm3)  腫瘍体積（mm3）
days after inoculation  接種後の日数
624-MEL CELLS  624-MEL細胞
図8
A
transverse  横断
sagital   矢状 
coronal  冠状
Tumor  腫瘍
B
%IA/g Tumor  %IA/g腫瘍
C
Total HLA-A2+PD-L1+cells(%)  総HLA-A2+PD-L1+細胞（%）
図9
A
DC-MEL versus TriMixDC-MEL  DC-MEL対TriMixDC-MEL
count  カウント
IC control antibody  IC対照抗体
B
T cells  T細胞
count  カウント
IC control antibody  IC対照抗体
Staining antibody  染色抗体
C
before  前
after  後
図10
A
% of bound activity: site-specific VS random  結合活性の%：部位特異的対ランダム
% bound activity  %結合活性
Site-specific  部位特異的
Random  ランダム
Positive cell line  陽性細胞株
Blocked  遮断
Negative cell line  陰性細胞株
B
Tumor uptake in %IA/g organ VS kidneys  %IA/g単位の腫瘍取り込み  臓器対腎臓
%IA/g organ  %IA/g臓器
Site-specific in -mel624  -mel624で部位特異的
Site-specific in +mel624  +mel624で部位特異的
Random in -mel624  -mel624でランダム
Random in +mel624  +mel624でランダム
Blood  血液
Thymus  胸腺
Heart  心臓
Lungs  肺
Liver  肝臓
Spleen  脾臓
Kidney  腎臓
Bone  骨
Lymphnodes  リンパ節
Brown fat  褐色脂肪
Tumor  腫瘍
C
［67Ga］Ga-NOTA-(anti-hPD-L1 sdAb K2) biodistribution & tumor targeting  ［67Ga］ Ga-NOTA−（抗hPD-L1 sdAb K2）生体内分布及び腫瘍ターゲティング
%IA/g organ(%)  %IA/g臓器（%）
Blood  血液
Thymus  胸腺
Heart  心臓
Lungs  肺
Liver  肝臓
Spleen  脾臓
Pancreas  膵臓
Kidneys  腎臓
Stomach (without content)  胃（内容物なし）
Small intestine (without content)  小腸（内容物なし）
Large intestine (without content)  大腸（内容物なし）
White fat from pelvis  骨盤由来の白色脂肪
Muscle  筋
Bone  骨
Lymphnodes  リンパ節
Brown fat  褐色脂肪
Tumor  腫瘍
図11
a
Marker positive moDCs (%)  マーカー陽性moDC（%）
avelumab  アベルマブ
b
Marker positive 293T cells (%)  マーカー陽性293T細胞（%）
avelumab  アベルマブ
図12
A
control sdAb  対照sdAb
kidneys  腎臓
bladder  膀胱
B
Organ uptake (%IA/g)  器官取り込み（%IA/g）
Thymus  胸腺
heart  心臓
lungs  肺
liver  肝臓
spleen  脾臓
pancreas  膵臓
Left kidney  左腎
Right kidney  右腎
Stomach  胃
small intestine  小腸
large intestine  大腸
Muscle  筋
bone  骨
Lymph nodes  リンパ節
White fat pelvis  骨盤由来の白色脂肪（white fat from pelvis)
Brown fat  褐色脂肪
図13
A
Athymic nude mice  胸腺欠損ヌードマウス
Subcutaneous inoculation  皮下接種
PD-L1NEG or PD-L1POS MCF7 cells  PD-L1NEG又はPD-L1POSMCF7細胞
-SPECT/CT imaging 99mTc-labeled sdAb K2 or ctrl sdAb  −99mTc標識sdAb K2又はctrl sdAbのSPECT/CT画像
-Ex vivo uptake 99mTc-labeled sdAb K2 or ctrl sdAb using gamma-counting  −ガンマ計測を用いる99mTc標識sdAb K2又はctrl sdAbのex vivoでの取り込み
-Ex vivo PD-L1 expression levels using flow cytometry  −フローサイトメトリーを用いるex vivoでのPD-L1発現レベル
B
Tumor  腫瘍
C
%IA/g tumor  %IA/g腫瘍
D
tumor/blood uptake ratio  腫瘍／血液取り込み比
E
Total HLA-A2+PD-L1+ cells (%)  総HLA-A2+PD-L1+細胞（%）
図14
A
Athymic nude mice  胸腺欠損ヌードマウス
Subcutaneous inoculation  皮下接種
PD-L1NEG or PD-L1POS 624-MEL cells  PD-L1NEG又はPD-L1POS624-MEL細胞
-SPECT/CT imaging 99mTc-labeled sdAb K2 or ctrl sdAb  −99mTc標識sdAb K2又はctrl sdAbのSPECT/CT画像
-Ex vivo uptake 99mTc-labeled sdAb K2 or ctrl sdAb using gamma-counting  −ガンマ計測を用いる99mTc標識sdAb K2又はctrl sdAbのex vivoでの取り込み
-Ex vivo PD-L1 expression levels using flow cytometry  −フローサイトメトリーを用いるex vivoでのPD-L1発現レベル
B
Tumor  腫瘍
C
%IA/g tumor  %IA/g腫瘍
D
tumor/blood uptake ratio  腫瘍／血液取り込み比
E
total PD-L1+ cells (%)  総PD-L1+細胞（%）
図15
A
count  カウント
B
Athymic nude mice  胸腺欠損ヌードマウス
Subcutaneous inoculation  皮下接種
938-MEL cells  938-MEL細胞
-Intratumoral injection of PBS or 1 x 105 IU rec. hIFN-y  −PBS又は1×105 IU rec.hIFN-yの腫瘍内注射
-SPECT/CT imaging 99mTc-labeled sdAb K2 or ctrl sdAb  −99mTc標識sdAb K2又はctrl sdAbのSPECT/CT画像
-Ex vivo uptake 99mTc-labeled sdAb K2 or ctrl sdAb using gamma-counting  −ガンマ計測を用いる99mTc標識sdAb K2又はctrl sdAbのex vivoでの取り込み
-Ex vivo PD-L1 expression levels using flow cytometry  −フローサイトメトリーを用いるex vivoでのPD-L1発現レベル
C
Tumor  腫瘍
D
%IA/g tumor  %IA/g腫瘍
E
(fold increase compared to isotype control)  （アイソタイプ対照と比較して増加倍率）
図16
A
relative response (RU)  相対応答（RU）
Time (sec)  時間（秒）
Immobilized protein: huPD-L1  固定化タンパク質：huPD-L1
B
% binding  %結合
control sdAb  対照sdAb
control mAb  対照mAb
avelumab  アベルマブ
log concentration (nM)  対数濃度（nM）
Immobilized protein: huPD-1  固定化タンパク質：huPD-1
C
PD-L1NEG OR PD-L1POS HLA-A2POS GP100 PULSED TUMOR CELLS  PD-L1NEG又はPD-L1POSHLA-A2POSのGP100パルスした腫瘍細胞
count  カウント
isotype  アイソタイプ
staining  染色
D
PD-1POS TCR GP100POS 2D3 CELLS  PD-1POSTCR GP100POS2D3細胞
non EP  EPなし
%EGFPPOS 2D3 CELLS  %eGFPPOS2D3細胞
E
Reduction in eGFP expression  eGFP発現の減少
no  なし
control mAb  対照mAb
avelumab  アベルマブ
control sdAb  対照sdAb
F
Reduction in eGFP expression  eGFP発現の減少
no  なし
control mAb  対照mAb
avelumab  アベルマブ
control sdAb  対照sdAb
図17
A
PD-1POS STIMULATED PBMCS  PD-1POS刺激PBMC
% on CD8+ cells  CD8+細胞上での%
unstimulated  刺激なし
stimulated  刺激あり
B
PD-L1POS HLA-A2POS EGFPPOS TUMOR CELLS  PD-L1POSHLA-A2POSeGFPPOS腫瘍細胞
count  カウント
isotype  アイソタイプ
staining  染色
non TD  TDなし
C
Total green object area  緑色被写体総面積
(μm2/well)  （μm2／ウェル）
Time (hours)  時間（時）
D
Relative total green object area compared to no treatment (μm2/well)  未処理と比較した相対緑色被写体総面積（μm2／ウェル）
control mAb  対照mAb
avelumab  アベルマブ
Time (hours)  時間（時）
E
Relative total green object area compared to no treatment (μm2/well)  未処理と比較した相対緑色被写体総面積（μm2／ウェル）
control sdAb  対照sdAb
Time (hours)  時間（時）
F
Relative total green object area compared to no treatment (μm2/well)  未処理と比較した相対緑色被写体総面積（μm2／ウェル）
control sdAb+mAb  対照sdAb+mAb
sdAb K2+avelumab  sdAb K2+アベルマブ
Time (hours)  時間（時）
G
Relative total green object area compared to no treatment (μm2/well)  未処理と比較した相対緑色被写体総面積（μm2／ウェル）
control sdAb added every 24 hours  24時間ごとに添加される対照sdAb
sdAb K2 added every 24 hours  24時間ごとに添加されるsdAb K2
Time (hours)  時間（時）
【図１】
2021514649.tif 000006
【図２−１】
2021514649.tif 000007
【図２−２】
2021514649.tif 000008
【図３−１】
2021514649.tif 000009
【図３−２】
2021514649.tif 000010
【図４】
2021514649.tif 000011
【図５−１】
2021514649.tif 000012
【図５−２】
2021514649.tif 000013
【図５−３】
2021514649.tif 000014
【図６−１】
2021514649.tif 000015
【図６−２】
2021514649.tif 000016
【図６−３】
2021514649.tif 000017
【図７−１】
2021514649.tif 000018
【図７−２】
2021514649.tif 000019
【図８】
2021514649.tif 000020
【図９−１】
2021514649.tif 000021
【図９−２】
2021514649.tif 000022
【図９−３】
2021514649.tif 000023
【図１０−１】
2021514649.tif 000024
【図１０−２】
2021514649.tif 000025
【図１１】
2021514649.tif 000026
【図１２】
2021514649.tif 000027
【図１３−１】
2021514649.tif 000028
【図１３−２】
2021514649.tif 000029
【図１４−１】
2021514649.tif 000030
【図１４−２】
2021514649.tif 000031
【図１５−１】
2021514649.tif 000032
【図１５−２】
2021514649.tif 000033
【図１６−１】
2021514649.tif 000034
【図１６−２】
2021514649.tif 000035
【図１６−３】
2021514649.tif 000036
【図１７−１】
2021514649.tif 000037
【図１７−２】
2021514649.tif 000038
【配列表】
2021514649000001.app
【国際調査報告】
2021514649.tif 000039
2021514649.tif 000040
2021514649.tif 000041