(57)【要約】  本発明は、自己血液ドーピングの検出のための方法で使用され得る、ペプチドおよび対応するタンパク質の特定に関する。より具体的には、本発明は、単離された赤血球（ＲＢＣ）、特に単離されたＲＢＣサイトゾルの試料のトリプシン消化、続いて液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いたペプチドマッピングを含む方法に関する。本発明による方法により、非ドーピング対照被験体に由来する試料と比較した、自己血液ドーピングに供されている被験体に由来する試料中のある特定のペプチドのレベルの増加を検出することが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における自己血液ドーピングの検出のための方法であって、
ｉ）前記被験体に由来する血液試料間の１種類以上の特定ペプチドのレベルを参照血液試料に由来する同一の特定ペプチドのレベルと比較した差に基づいて、前記被験体が自己血液ドーピングされているかまたはされていないかを特定し、このようなレベルが血液試料および参照血液試料の各々に関するタンパク質分解ペプチドマップの生成によって決定されている、ステップを含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ｉ）の前に、
ｘ）前記被験体から得られた前記血液試料中の１種類以上の特定ペプチドのレベルを測定するステップ、
ｙ）参照血液試料中の１種類以上の特定ペプチドのレベルを決定するステップ、
ｚ）前記１種類以上の特定ペプチドのレベルを参照血液試料中の同一の特定ペプチドの前記レベルと比較したいずれかの差を決定するステップ、のうちの１つ以上を実施することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法が、
ａ）前記被験体から得られた血液試料のタンパク質分解ペプチドマップを生成するステップと、
ｂ）ステップａ）で得られた前記ペプチドマップにおいて特定された１種類以上の特定ペプチドのレベルを決定するステップと、
ｃ）前記１種類以上の特定ペプチドのレベルを参照血液試料から得られた参照ペプチドマップにおける同一の特定ペプチドのレベルと比較した差を決定するステップと、
ｄ）前記特定ペプチドのレベルを前記参照ペプチドマップにおける前記同一の特定ペプチドのレベルと比較した差に基づいて、前記被験体が自己血液ドーピングされているかまたはされていないかを特定するステップと、を含む、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記参照血液試料が非ドーピング被験体由来である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記１種類以上の特定ペプチドが、表３に列挙されるタンパク質のうちの１種類以上から導出される１種類以上のペプチドである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記１種類以上の特定ペプチドが、配列番号１〜７８を含むペプチドのリストから選択される１種類以上のペプチドである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記１種類以上の特定ペプチドが、配列番号１〜７８を含むペプチドのリストから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、または７８個のペプチドである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
分析される前記血液試料が、試験される前記被験体から得られた血液試料から調製された単離された赤血球の試料である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
分析される前記血液試料が、試験される前記被験体から得られた血液試料から調製された単離された赤血球サイトゾル試料である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質分解ペプチドマップを生成する前記ステップが、トリプシン、キモトリプシン、Ｌｙｓ−Ｃ、Ｇｌｙ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、Ａｒｇ−Ｃ、パパインから選択されるプロテアーゼのうちの１種類以上を用いて実施されるプロテアーゼ消化を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記プロテアーゼ消化がトリプシン消化によって実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドマッピングが、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）と質量分析法（ＭＳ）との組み合わせによって実施され、好ましくは、前記ＭＳがタンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
配列番号１〜３５および３７〜７８であるペプチドを含むペプチドのリストから選択される、ペプチド。
【請求項１４】
配列番号１〜７８を含むペプチドのリストから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、または７８個のペプチドを含む、キット。
【請求項１５】
自己血液ドーピングの検出のためのバイオマーカーの特定のための方法であって、
ｉ）自己血液の注入を受けている１つ以上の被験体から得られた血液試料と、自己血液の注入を受けていない１つ以上の対照被験体から得られた血液試料との間の１種類以上のペプチドのレベルにおける差を特定し、このようなレベルが前記血液試料のタンパク質分解ペプチドマップの生成後に特定されている、ステップと、
ｉｉ）有意差レベルで存在するペプチドを自己血液ドーピングのためのバイオマーカーとして特定するステップと、を含む、方法。
【請求項１６】
前記タンパク質分解ペプチドマップが、前記血液試料（複数可）から得られた赤血球から生成される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、
ｉ）自己血液の注入を受けている１つ以上の個体から得られた血液試料から調製された赤血球のタンパク質分解ペプチドマップを生成するステップと、
ｉｉ）自己血液の注入を受けていない１つ以上の対照個体から得られた血液試料から調製された赤血球のタンパク質分解ペプチドマップを生成するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉ）で得られたペプチドマップにおける１種類以上のペプチドのレベルをステップｉｉ）で得られたペプチドマップと比較した差を特定するステップと、
ｉｖ）有意差レベルで存在するペプチド、および対応するタンパク質を、自己血液ドーピングのためのバイオマーカーとして特定するステップと、を含む、請求項１５または１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
赤血球の前記試料が、単離された赤血球サイトゾル試料である、請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記サイトゾルは、ヘモグロビンが枯渇している、またはヘモグロビンのレベルが低下している、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己血液ドーピングの検出のための方法で使用され得る、ペプチドおよび対応するタンパク質の特定に関する。より具体的には、本発明は、単離された赤血球の試料（ＲＢＣ）、特に単離されたＲＢＣサイトゾル試料のトリプシン消化、続いて液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いたペプチドマッピングを含む方法に関する。これらの方法により、非ドーピング対照被験体に由来する試料と比較した、自己血液ドーピングに供されている被験体に由来する試料中のある特定ペプチドのレベルの増加を検出することが可能となる。
【背景技術】
【０００２】
持久力スポーツでは、最大酸素摂取量（ＶＯ２ｍａｘ）がパフォーマンスのための重要な要因である［Ｅｋｂｌｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｏｘｙｇｅｎ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｎ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９７５；３９（１）：７１−５、Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｘｙｇｅｎ  ｕｐｔａｋｅ  ａｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｓｕｂ−ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｓｐｒｉｎｔ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｉｎ  ｅｌｉｔｅ  ｍａｌｅ  ｃｒｏｓｓ−ｃｏｕｎｔｒｙ  ｓｋｉｅｒｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１４；１１４（１２）：２５８７−９５］。ＶＯ２ｍａｘにおける制限は、正常な肺機能および海面レベルの酸素分圧を想定して、最大心拍出量（Ｑｍａｘ）［Ｇｒｉｍｂｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｄｉａｃ  ｏｕｔｐｕｔ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｕｂｍａｘｉｍａｌ  ａｎｄ  ｍａｘｉｍａｌ  ｅｘｅｒｃｉｓｅ  ｉｎ  ａｃｔｉｖｅ  ｍｉｄｄｌｅ−ａｇｅｄ  ａｔｈｌｅｔｅｓ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９６６；２１（４）：１１５０−６．］、血液の酸素運搬能［Ｅｋｂｌｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｎｔｒａｌ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｘｅｒｃｉｓｅ  ａｆｔｅｒ  ｖｅｎｅｓｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９７６；４０（３）：３７９−８３、Ｂｕｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｈｅｍｉａ  ｏｎ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｗｏｒｋ  ｃａｐａｃｉｔｙ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｓｐ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｅｘｅｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９８０；４８（４）：６３６−４２］、および総ヘモグロビン量［Ｓｃｈｍｉｄｔ＆Ｐｏｍｍｅｒ．Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｏｔａｌ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｍａｓｓ  ｏｎ  ＶＯ２ｍａｘ．Ｅｘｅｒｃ  Ｓｐｏｒｔ  Ｓｃｉ  Ｒｅｖ．２０１０；３８（２）：６８−７５］である。運動中筋肉への利用可能な酸素の抽出も、少なくともエリートアスリートにおいては一つの要因である［Ｂａｎｇｓｂｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｓｃｌｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｔ  ｏｎｓｅｔ  ｏｆ  ｉｎｔｅｎｓｅ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｅｘｅｒｃｉｓｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｃｏｍｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０００；２７９（３）：Ｒ８９９−９０６］。
【０００３】
実施される作業の方式および期間、ならびにテストの方式に依存しており、身体能力におけるＶＯ２ｍａｘの影響は、クロスカントリースキーにおいて６２％から８８％［Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．同文献］および消火活動において４２％から７９％［Ｌｉｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｉｅｌｄ  ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｗｏｒｋ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  ｆｉｒｅｆｉｇｈｔｅｒｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３；８（７）：ｅ６８０４７］の範囲であることが認められている。同様なモデルが過去に、ランニング［Ｔａｎａｋａ  ＆  Ｍａｔｓｕｕｒａ．Ａ  ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｅｒｔａｉｎ  ａｎｔｈｒｏｐｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｉｎ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｒｕｎｎｉｎｇ．Ａｎｎ  Ｈｕｍ  Ｂｉｏｌ．１９８２；９（５）：４７３−８２、Ｆａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｓｍａ  ｌａｃｔａｔｅ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｒｕｎｎｉｎｇ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ．Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｓｐｏｒｔｓ．１９７９；１１（４）：３３８−４４．］、オリエンテーリング［Ｋｎｏｗｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｃｈａｍｐｉｏｎｓｈｉｐ  ｃｌａｓｓ  ｏｒｉｅｎｔｅｅｒｓ．Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｅｘｅｒｃ．１９８０；１２（３）：１６４−９］、サイクリング［Ｌａｍｂｅｒｔｓ＆Ｄａｖｉｄｏｗｉｔｚ．Ａｌｌｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｃａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｉｎ（ｗｅｌｌ−）ｔｒａｉｎｅｄ  ｆｅｍａｌｅ  ｃｙｃｌｉｓｔｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｍｅｄ．２０１４；３５（３）：２１７−２２、Ｃｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｅｌｉｔｅ  ｅｎｄｕｒａｎｃｅ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ．Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｅｘｅｒｃ．１９９１；２３（１）：９３−１０７］、水泳［Ｃｈａｔａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｗｉｍｍｉｎｇ  ｓｋｉｌｌ  ａｎｄ  ｓｔｒｏｋｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｆｒｏｎｔ  ｃｒａｗｌ  ｓｗｉｍｍｅｒｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｍｅｄ．１９９０；１１（２）：１５６−６１、Ｄｕｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｅｐｕｂｅｒｔａｌ  ｓｗｉｍｍｅｒｓ  ａｓｓｅｓｓｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｎｔｈｒｏｐｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎｄ  ｂｉｏ−ｅｎｅｒｇｅｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｏｃｃｕｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９３；６６（５）：４６７−７１］、およびトライアスロン［Ｂａｒｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｎ  ｕｌｔｒａ−ｅｎｄｕｒａｎｃｅ  ｔｒｉａｔｈｌｏｎ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｍｅ��．２０１４；３５（１４）：１１７０−８］に及んでいる。
【０００４】
サッカーのような断続的な運動では、パフォーマンスにおけるＶＯ２ｍａｘの影響は知られておらず、これは、おそらくチームスポーツでは従属的結果変数、すなわちパフォーマンスを測定することが困難であることに起因する。結果として、酸素送達を高める様々な方法が不正行為をするアスリートによって使用され得、身体能力における効果はかなりなものであり得る［Ｓｅｇｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｌｏｏｄ  ｄｏｐｉｎｇ．Ｄｒｕｇ  Ｔｅｓｔ  Ａｎａｌ．２０１２；４（１１）：８７６−８１］。
【０００５】
当初、輸血は第二次世界大戦中に高気圧で飛行する軍用航空パイロットの作業能を高めるために使用され、そのときには加圧コックピットは使用されなかった。［Ｐａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｈｙｐｏｘｉｃ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ｍｅｎ  ａｃｃｏｍｐａｎｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｃｙｔｈａｅｍｉａ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９４７，１４８，１５２−６３］。その後、準最大［Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｖｏｌｕｍｅ：ｓｔｕｄｉｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍａｘｉｍａｌ  ｅｘｅｒｃｉｓｅ  ａｎｄ  ａｔ  ｒｅｓｔ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１９６６；１９（１）：２６−３２］および最大［Ｅｋｂｌｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｅｘｅｒｃｉｓｅ  ａｆｔｅｒ  ｂｌｏｏｄ  ｌｏｓｓ  ａｎｄ  ｒｅｉｎｆｕｓｉｏｎ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９７２；３３（２）：１７５−８０］のランニングパフォーマンスが輸血によって改善されることが示された。
【０００６】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）の発見［Ｍｉｙａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ．Ｊ  ＢｉｏｌＣｈｅｍ．１９７７；２５２（１５）：５５５８−６４］は、スポーツでの血液ドーピングを単純化し、血液ドネーション、保存、およびその後の再注入を補った。６〜１２％の同様なパフォーマンス向上が、現在は簡単な組換えヒト（ｒｈ）ＥＰＯ注入によって達成され得る［Ｂｅｒｇｌｕｎｄ＆Ｅｋｂｌｏｍ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｎ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｏｍｅ  ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｍｅｎ．Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．１９９１；２２９（２）：１２５−３０、Ｅｋｂｌｏｍ．Ｂｌｏｏｄ  ｂｏｏｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｐｏｒｔ．Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ  Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．２０００；１４（１）：８９−９８、Ｔｈｏｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｓｕｂｍａｘｉｍａｌ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｍａｘｉｍａｌ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｃａｐａｃｉｔｙ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００７；１０１（４）：４８１−６］。１９８９年に公表された血液ドーピングに関するレビューにおいて、ＪｏｎｅｓおよびＴｕｎｓｔａｌｌは［Ｂｌｏｏｄ  ｄｏｐｉｎｇ−ａ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｂｒ  Ｊ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｍｅｄ．１９８９２３（２）：８４−８］、組み込まれる被験体ならびに試験およびドーピングの両方で使用される方法に依存して、パフォーマンスおよびＶＯ；２ｍａｘにおける０％から４０％の範囲にわたる増加を報告している。要約された文献から、エリートアスリートは血液ドーピングによってパフォーマンスを３％まで改善し得ることが、方法に関係なく推定できる［Ｂｉｒｋｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｒｈＥＰＯ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｓｅｒｕｍ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｓＴｆＲ  ａｎｄ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ．Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｅｘｅｒｃ．２０００；３２（７）：１２３８−４３、Ｂｅｒｇｌｕｎｄ＆Ｈｅｍｍｉｎｇｓｏｎ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｒｅｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｌｏｏｄ  ｏｎ  ｅｘｅｒｃｉｓｅ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｉｎ  ｃｒｏｓｓｃｏｕｎｔｒｙ  ｓｋｉｅｒｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｍｅｄ．１９８７；８（３）：２３１−３、Ｂｒｉｅｎ＆Ｓｉｍｏｎ．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｎ  １０−ｋｍ  ｒａｃｅ  ｔｉｍｅ．ＪＡＭＡ．１９８７；２５７（２０）：２７６１−５］。この向上は、例えば、バーサーロペット９０ｋｍクロスカントリーレースにおける７分速い優勝タイム、世界クラスレベルでの任意の所定の５０００メートル長距離走における２０〜３０秒速いタイム、およびマラソンレースにおける４分速いフィニッシュタイムに相当する。サイクリングでは、パフォーマンスの３％増加は、ツールドフランス（２０１４年版）において２時間を超えて速くなる優勝タイムに換算される。
【０００７】
世界アンチドーピング機関（ＷＡＤＡ）は血液の酸素運搬能を増加する多くの技術の使用を禁止しており、輸血、ホルモン注射、人工酸素運搬体、アロステリックＨｂモジュレータ、および遺伝子操作が含まれる。ｒｈＥＰＯ［Ｗｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ｕｒｉｎｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｔｏ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｍｅｎ．Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｅｘｅｒｃ．１９９５；２７（１１）：１５６９−７６、Ｌａｓｎｅ＆ｄｅ  Ｃｅａｕｒｒｉｚ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｉｎ  ｕｒｉｎｅ．Ｎａｔｕｒｅ．２０００；４０５（６７８７）：６３５］および同種輸血［Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｌｏｏｄ  ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｇｒｏｕｐ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．２００３；８８（１１）：１２８４−９５］を検出する方法は成功裏に開発されているが、自己血液輸血に利用できる直接的な方法はない［Ｐｉａｌｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ａｎｄ  ｈｅｍａｔｏｃｒｉｔ  ａｒｅ  ｎｏｔ  ｓｕｃｈ  ｇｏｏｄ  ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｌｏｏｄ  ｄｏｐｉｎｇ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００９；８９（５）：７１４−５、Ｊｅｌｋｍａｎｎ＆Ｌｕｎｄｂｙ．Ｂｌｏｏｄ  ｄｏｐｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ．２０１１；１１８（９）：２３９５−４０４］。
【０００８】
現在、アスリート生体パスポート（ＡＢＰ）［Ｂｅｒｇｌｕｎｄ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｄｏｐｉｎｇ  ｉｎ  ｓｐｏｒｔ．Ｓｐｏｒｔｓ  Ｍｅｄ．１９８８；５（２）：１２７−３５、Ｂｅｒｇｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｐａｓｓ  ｐｒｏｊｅｃｔ．Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｓｐｏｒｔｓ．２００７；１７（３）：２９２−７］が最良の実践であるが、知られている限界がある［Ｂｅｊｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｃｕｔｅ  ｈｙｐｅｒｈｙｄｒａｔｉｏｎ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ａｔｈｌｅｔｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐａｓｓｐｏｒｔ  ＯＦＦ−ｈｒ  ｓｃｏｒｅ．Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｓｐｏｒｔｓ．２０１６；２６（３）：３３８−４７］。したがって、不正行為をするアスリートは輸血の実施に戻っていることが想定され得る。
【０００９】
一つの研究［Ｄａｍｓｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ  ａｎｄ  ｒｅｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｎ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉ−ｄｏｐｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．２００６；９１（７）：１００６−８．］は、ヘモグロビン、ヘマトクリット、網赤血球率（％ｒｅｔ）、血清ＥＰＯレベル、および可溶性トランスフェリン受容体の測定に基づいて、ドーピング検出の感度を調査した。結果は、ドネーションの帰結として％ｒｅｔの有意な増加および［Ｈｂ］の減少を示した。しかし、凍結保存により血液の長期間（数年、さらには数十年）の保存が可能となるため、ドネーション時期を予測することは困難である［Ｈｅｎｋｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｖｏｘ  Ｓａｎｇｕｉｎｉｓ．２０１５  １０８，１０３−１１２］。血液学的［Ｂｅｒｇｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｓ  ｏｎ  ｓｏｍｅ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｖａｒｉａｂｌｅｓ  ｉｎ  ｅｎｄｕｒａｎｃｅ  ａｔｈｌｅｔｅｓ．Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｅｘｅｒｃ．１９８９；２１（６）：６３７−４２］ならびにパフォーマンス向上化の効果は、男性［Ｂｕｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｈｅｍｉａ  ｏｎ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｗｏｒｋ  ｃａｐａｃｉｔｙ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｓｐ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｅｘｅｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９８０；４８（４）：６３６−４２］および女性［Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｗｏｒｋ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｉｎ  ｗｏｍｅｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｈｅｍｉａ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９８４；５７（２）：５６８−７５］ともに数週間から数ヶ月継続し得る。したがって、ドネーションおよび再注入の両方が競技外を含めどのような時でも行われ得、輸血を検出する意図で任意のアスリートから血液をサンプリングすることは偶然に従う。
【００１０】
Ｎｉｋｏｌｏｖｓｋｉらによる研究［Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｔｏｒａｇｅ−ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｔｏｏｌ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｌｏｏｄ  ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ”．２０１２．Ｄｒｕｇ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ４：８８２−８９０］は、赤血球が冷蔵保存中に構造的変化を受け、時間とともに進行し、したがって保存それ自体および血液試料の保存の長さの両方を示し得ることを確認した。しかし、冷蔵保存は自己血液ドーピングの場合には適していない。血液のドネーションは、このようなドネーションの生理学的な負の効果が克服される、すなわち、被験体は損失した血液容量および構成成分（赤血球など）を再生して再注入の総体的な正の効果を得ることを確実にするのに十分な長い再注入前の期間でなされなければならない。これは一般的に少なくとも４週間である［Ｅｋｂｌｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｅｘｅｒｃｉｓｅ  ａｆｔｅｒ  ｂｌｏｏｄ  ｌｏｓｓ  ａｎｄ  ｒｅｉｎｆｕｓｉｏｎ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９７２；３３（２）：１７５−８０］。継続した身体的トレーニングに対するドネーションの負の効果を最小限にするため、長期間に複数回で血液のより少ない容量、すなわち４００ｍＬ未満をドネーションすることが有効であり得る。この少なくとも４週間の保存の長さの必要性は、冷蔵保存の使用を除外し、代わりにドネーション血液の凍結保存および冷凍保存が必要とされる。
【００１１】
自己血液ドーピングを検出する様々な方法の広範なレビューが最近公表された［ＭｏｒｋｅｂｅｒｇＪ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｌｏｏｄ  ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｔｈｌｅｔｅｓ：ａ  ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．２０１２；２６（３）：１９９−２０８］。
【００１２】
最近では、Ｍａｌｍら［Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｄｏｐｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  Ｒｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ−Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．２０１６．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  １１（６）：ｅ０１５６１５７］は、アマチュアの男性および女性のアスリートが自己血液ドーピングを２種の異なる輸血設定で受けた試験を発表した。４５０ｍＬまたは９００ｍＬの凍結保存された全血のドネーションの前、そして凍結保存したＲＢＣ分画の再注入後４週まで、血液学的変数および身体能力を測定した。パフォーマンス（１５±８％）およびＶＯ２ｍａｘ（１７±１０％）における有意な増加が、ＲＢＣ再注入後４８時間で測定され、いくらかの被験体によっては４週まで増加したままだった。しかし、血液学的変数は自己血液ドーピングの検出には不十分であることが認められた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｅｋｂｌｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｏｘｙｇｅｎ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｎ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９７５；３９（１）：７１−５
【非特許文献２】Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｘｙｇｅｎ  ｕｐｔａｋｅ  ａｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｓｕｂ−ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｓｐｒｉｎｔ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｉｎ  ｅｌｉｔｅ  ｍａｌｅ  ｃｒｏｓｓ−ｃｏｕｎｔｒｙ  ｓｋｉｅｒｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１４；１１４（１２）：２５８７−９５
【非特許文献３】Ｇｒｉｍｂｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｄｉａｃ  ｏｕｔｐｕｔ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｕｂｍａｘｉｍａｌ  ａｎｄ  ｍａｘｉｍａｌ  ｅｘｅｒｃｉｓｅ  ｉｎ  ａｃｔｉｖｅ  ｍｉｄｄｌｅ−ａｇｅｄ  ａｔｈｌｅｔｅｓ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９６６；２１（４）：１１５０−６．
【非特許文献４】Ｅｋｂｌｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｎｔｒａｌ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｘｅｒｃｉｓｅ  ａｆｔｅｒ  ｖｅｎｅｓｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９７６；４０（３）：３７９−８３
【非特許文献５】Ｂｕｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｈｅｍｉａ  ｏｎ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｗｏｒｋ  ｃａｐａｃｉｔｙ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｓｐ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｅｘｅｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９８０；４８（４）：６３６−４２
【非特許文献６】Ｓｃｈｍｉｄｔ＆Ｐｏｍｍｅｒ．Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｏｔａｌ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｍａｓｓ  ｏｎ  ＶＯ２ｍａｘ．Ｅｘｅｒｃ  Ｓｐｏｒｔ  Ｓｃｉ  Ｒｅｖ．２０１０；３８（２）：６８−７５
【非特許文献７】Ｂａｎｇｓｂｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｓｃｌｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｔ  ｏｎｓｅｔ  ｏｆ  ｉｎｔｅｎｓｅ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｅｘｅｒｃｉｓｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｃｏｍｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０００；２７９（３）：Ｒ８９９−９０６
【非特許文献８】Ｌｉｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｉｅｌｄ  ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｗｏｒｋ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  ｆｉｒｅｆｉｇｈｔｅｒｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３；８（７）：ｅ６８０４７
【非特許文献９】Ｔａｎａｋａ  ＆  Ｍａｔｓｕｕｒａ．Ａ  ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｅｒｔａｉｎ  ａｎｔｈｒｏｐｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｉｎ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｒｕｎｎｉｎｇ．Ａｎｎ  Ｈｕｍ  Ｂｉｏｌ．１９８２；９（５）：４７３−８２
【非特許文献１０】Ｆａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｓｍａ  ｌａｃｔａｔｅ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｒｕｎｎｉｎｇ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ．Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｓｐｏｒｔｓ．１９７９；１１（４）：３３８−４４．
【非特許文献１１】Ｋｎｏｗｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｃｈａｍｐｉｏｎｓｈｉｐ  ｃｌａｓｓ  ｏｒｉｅｎｔｅｅｒｓ．Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｅｘｅｒｃ．１９８０；１２（３）：１６４−９］
【非特許文献１２】Ｌａｍｂｅｒｔｓ＆Ｄａｖｉｄｏｗｉｔｚ．Ａｌｌｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｃａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｉｎ（ｗｅｌｌ−）ｔｒａｉｎｅｄ  ｆｅｍａｌｅ  ｃｙｃｌｉｓｔｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｍｅｄ．２０１４；３５（３）：２１７−２２、
【非特許文献１３】Ｃｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｅｌｉｔｅ  ｅｎｄｕｒａｎｃｅ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ．Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｅｘｅｒｃ．１９９１；２３（１）：９３−１０７
【非特許文献１４】Ｃｈａｔａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｗｉｍｍｉｎｇ  ｓｋｉｌｌ  ａｎｄ  ｓｔｒｏｋｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｆｒｏｎｔ  ｃｒａｗｌ  ｓｗｉｍｍｅｒｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｍｅｄ．１９９０；１１（２）：１５６−６１、
【非特許文献１５】Ｄｕｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｅｐｕｂｅｒｔａｌ  ｓｗｉｍｍｅｒｓ  ａｓｓｅｓｓｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｎｔｈｒｏｐｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎｄ  ｂｉｏ−ｅｎｅｒｇｅｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｏｃｃｕｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９３；６６（５）：４６７−７１
【非特許文献１６】Ｂａｒｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｎ  ｕｌｔｒａ−ｅｎｄｕｒａｎｃｅ  ｔｒｉａｔｈｌｏｎ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｍｅｄ．２０１４；３５（１４）：１１７０−８
【非特許文献１７】Ｓｅｇｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｌｏｏｄ  ｄｏｐｉｎｇ．Ｄｒｕｇ  Ｔｅｓｔ  Ａｎａｌ．２０１２；４（１１）：８７６−８１
【非特許文献１８】Ｐａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｈｙｐｏｘｉｃ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ｍｅｎ  ａｃｃｏｍｐａｎｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｃｙｔｈａｅｍｉａ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９４７，１４８，１５２−６３
【非特許文献１９】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｖｏｌｕｍｅ：ｓｔｕｄｉｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍａｘｉｍａｌ  ｅｘｅｒｃｉｓｅ  ａｎｄ  ａｔ  ｒｅｓｔ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１９６６；１９（１）：２６−３２
【非特許文献２０】Ｅｋｂｌｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｅｘｅｒｃｉｓｅ  ａｆｔｅｒ  ｂｌｏｏｄ  ｌｏｓｓ  ａｎｄ  ｒｅｉｎｆｕｓｉｏｎ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９７２；３３（２）：１７５−８０
【非特許文献２１】Ｍｉｙａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ．Ｊ  ＢｉｏｌＣｈｅｍ．１９７７；２５２（１５）：５５５８−６４
【非特許文献２２】Ｂｅｒｇｌｕｎｄ＆Ｅｋｂｌｏｍ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｎ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｏｍｅ  ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｍｅｎ．Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．１９９１；２２９（２）：１２５−３０、
【非特許文献２３】Ｅｋｂｌｏｍ．Ｂｌｏｏｄ  ｂｏｏｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｐｏｒｔ．Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ  Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．２０００；１４（１）：８９−９８
【非特許文献２４】Ｔｈｏｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｓｕｂｍａｘｉｍａｌ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｍａｘｉｍａｌ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｃａｐａｃｉｔｙ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００７；１０１（４）：４８１−６
【非特許文献２５】Ｂｌｏｏｄ  ｄｏｐｉｎｇ−ａ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｂｒ  Ｊ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｍｅｄ．１９８９２３（２）：８４−８
【非特許文献２６】Ｂｉｒｋｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｒｈＥＰＯ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｓｅｒｕｍ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｓＴｆＲ  ａｎｄ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ．Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｅｘｅｒｃ．２０００；３２（７）：１２３８−４３
【非特許文献２７】Ｂｅｒｇｌｕｎｄ＆Ｈｅｍｍｉｎｇｓｏｎ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｒｅｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｌｏｏｄ  ｏｎ  ｅｘｅｒｃｉｓｅ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｉｎ  ｃｒｏｓｓｃｏｕｎｔｒｙ  ｓｋｉｅｒｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｍｅｄ．１９８７；８（３）：２３１−３
【非特許文献２８】Ｂｒｉｅｎ＆Ｓｉｍｏｎ．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｎ  １０−ｋｍ  ｒａｃｅ  ｔｉｍｅ．ＪＡＭＡ．１９８７；２５７（２０）：２７６１−５
【非特許文献２９】Ｗｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ｕｒｉｎｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｔｏ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｍｅｎ．Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｅｘｅｒｃ．１９９５；２７（１１）：１５６９−７６
【非特許文献３０】Ｌａｓｎｅ＆ｄｅ  Ｃｅａｕｒｒｉｚ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｉｎ  ｕｒｉｎｅ．Ｎａｔｕｒｅ．２０００；４０５（６７８７）：６３５
【非特許文献３１】Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｌｏｏｄ  ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｇｒｏｕｐ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．２００３；８８（１１）：１２８４−９５
【非特許文献３２】Ｐｉａｌｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ａｎｄ  ｈｅｍａｔｏｃｒｉｔ  ａｒｅ  ｎｏｔ  ｓｕｃｈ  ｇｏｏｄ  ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｌｏｏｄ  ｄｏｐｉｎｇ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００９；８９（５）：７１４−５
【非特許文献３３】Ｊｅｌｋｍａｎｎ＆Ｌｕｎｄｂｙ．Ｂｌｏｏｄ  ｄｏｐｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ．２０１１；１１８（９）：２３９５−４０４
【非特許文献３４】Ｂｅｒｇｌｕｎｄ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｄｏｐｉｎｇ  ｉｎ  ｓｐｏｒｔ．Ｓｐｏｒｔｓ  Ｍｅｄ．１９８８；５（２）：１２７−３５
【非特許文献３５】Ｂｅｒｇｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｐａｓｓ  ｐｒｏｊｅｃｔ．Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｓｐｏｒｔｓ．２００７；１７（３）：２９２−７
【非特許文献３６】Ｂｅｊｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｃｕｔｅ  ｈｙｐｅｒｈｙｄｒａｔｉｏｎ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ａｔｈｌｅｔｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐａｓｓｐｏｒｔ  ＯＦＦ−ｈｒ  ｓｃｏｒｅ．Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｓｐｏｒｔｓ．２０１６；２６（３）：３３８−４７
【非特許文献３７】Ｄａｍｓｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ  ａｎｄ  ｒｅｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｎ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉ−ｄｏｐｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．２００６；９１（７）：１００６−８．
【非特許文献３８】Ｈｅｎｋｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｖｏｘ  Ｓａｎｇｕｉｎｉｓ．２０１５  １０８，１０３−１１２
【非特許文献３９】Ｂｅｒｇｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｓ  ｏｎ  ｓｏｍｅ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｖａｒｉａｂｌｅｓ  ｉｎ  ｅｎｄｕｒａｎｃｅ  ａｔｈｌｅｔｅｓ．Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｅｘｅｒｃ．１９８９；２１（６）：６３７−４２
【非特許文献４０】Ｂｕｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｈｅｍｉａ  ｏｎ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｗｏｒｋ  ｃａｐａｃｉｔｙ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｓｐ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｅｘｅｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９８０；４８（４）：６３６−４２
【非特許文献４１】Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｗｏｒｋ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｉｎ  ｗｏｍｅｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｈｅｍｉａ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９８４；５７（２）：５６８−７５
【非特許文献４２】Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｔｏｒａｇｅ−ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｔｏｏｌ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｌｏｏｄ  ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ”．２０１２．Ｄｒｕｇ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ４：８８２−８９０
【非特許文献４３】Ｅｋｂｌｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｅｘｅｒｃｉｓｅ  ａｆｔｅｒ  ｂｌｏｏｄ  ｌｏｓｓ  ａｎｄ  ｒｅｉｎｆｕｓｉｏｎ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９７２；３３（２）：１７５−８０
【非特許文献４４】ＭｏｒｋｅｂｅｒｇＪ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｌｏｏｄ  ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｔｈｌｅｔｅｓ：ａ  ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．２０１２；２６（３）：１９９−２０８
【非特許文献４５】Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｄｏｐｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  Ｒｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ−Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．２０１６．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  １１（６）：ｅ０１５６１５７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、単離された赤血球（ＲＢＣ）の試料、特に単離されたＲＢＣサイトゾル試料のトリプシン消化、続いて液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いたペプチドマッピングを含む方法を現在開発している。本発明による方法により、非ドーピング対照被験体に由来する試料と比較した、自己血液ドーピングに供されている被験体に由来する試料中のある特定のペプチドのレベルの増加を検出することが可能となる。
【００１５】
これらのペプチドおよび関連するタンパク質は、それ自体、自己血液ドーピングの検出のためのバイオマーカーとしての有用性を有する。
【００１６】
前述で考察したように、自己血液ドーピングは、ドネーション血液を保存する必要がある期間は、凍結保存および冷凍保存の使用を必要とする。したがって、本発明は、凍結融解サイクル間に赤血球タンパク質に生じる変化を検出し、これらを用いてその工程を受けている試料を特定することを目的とし、自己血液ドーピングを受けている被験体に由来する血液試料を特定することを含む。
【００１７】
本発明者らは、タンパク質分解消化の際に生成される個別のトリプシン消化ペプチドのレベルがドーピングと非ドーピング血液の間で異なる（例えば、消化後のＬＣ／ＭＳ−ＭＳ測定で示されるように）ことを確認している。理論にとらわれることは望まないが、本発明者らは凍結保存、冷凍保存、および／または融解工程が赤血球中のある特定のタンパク質、例えば赤血球サイトゾルタンパク質における構造的変化を生じ得ると考える。これらの構造的変化は、再注入後でさえ残存していると考えられ、そのため、ある特定のトリプシン部位への接近可能性のような、タンパク質分解酵素のためのある特定の切断部位の接近可能性を変化させることが考えられる。このことは今度は、タンパク質分解消化の際に生成される個別トリプシン消化ペプチドのレベルに変化を生じる得る。したがって、トリプシン消化マップにおけるある特定のペプチドのレベルの変化は、関連するタンパク質の構造における変化を示す。
【００１８】
したがって、本発明は被験体における自己血液ドーピングの検出のための方法を提供し、当該方法は赤血球を含む血液試料から得られたペプチドのレベル（量ともいわれる）における差の検出、それに続く赤血球タンパク質、好ましくは赤血球サイトゾルタンパク質のタンパク質分解ペプチドマップの生成を含む。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の一つの態様では、被験体における自己血液ドーピングの検出のための方法が提供され、当該方法は、
【００２０】
ｉ）当該被験体に由来する血液試料間の１種類以上の特定ペプチドのレベルを参照血液試料に由来する同一の特定ペプチドのレベルと比較した差に基づいて、当該被験体が自己血液ドーピングされているかまたはされていないかを特定し、このようなレベルが血液試料および参照血液試料の各々に関するタンパク質分解ペプチドマップの生成によって決定されている、ステップを含む。
【００２１】
生物学的試料のペプチドマッピングは、多くの刊行物、例えば、［Ｓａｒａｓｗａｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍａｓｓ  Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ．Ｉｎ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２０１１．Ｗｏｏｄｈｅａｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｌｔｄ．およびＣｏｔｔｒｅｌｌ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＭＳ／ＭＳ  ｄａｔａ．Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２０１１．７４（１０），１８４２−１８５１．］で報告されている。
【００２２】
１つの選択では、本方法はステップ（ｉ）の前に、
ｘ）当該被験体から得られた血液試料中の１種類以上の特定ペプチドのレベルを決定するステップ、
ｙ）参照血液試料中の１種類以上の特定ペプチドのレベルを決定するステップ、
ｚ）当該１種類以上の特定ペプチドのレベルを参照血液試料中の同一の特定ペプチドのレベルと比較したいずれかの差を決定するステップ、のうちの１つ以上を実施することをさらに含み得る。
【００２３】
本方法は、
ａ）当該被験体から得られた血液試料のタンパク質分解ペプチドマップを生成するステップ、
ｂ）ステップａ）で得られたペプチドマップにおいて特定された１種類以上の特定ペプチドのレベルを決定するステップ、
ｃ）当該１種類以上の特定ペプチドのレベルを参照血液試料から得られた参照ペプチドマップにおける同一の特定ペプチドのレベルと比較した差を決定するステップ、および
ｄ）当該特定ペプチドのレベルを当該参照ペプチドマップにおける同一の特定ペプチドのレベルと比較した差に基づいて、当該被験体が自己血液ドーピングされているかまたはされていないかを特定するステップ、を含み得る。
【００２４】
好ましくは、参照血液試料は非ドーピング被験体由来である。好ましくは、参照血液試料は、アスリートおよび非アスリートの両方で異なる年齢、性別、および民族性の複数の非ドーピング被験体から収集される。
【００２５】
本発明の別の態様では、被験体における自己血液ドーピングの検出のための方法を提供し、当該方法は、
ａ）当該被験体から得られた血液試料のタンパク質分解ペプチドマップを生成するステップと、
ｂ）ステップａ）で得られたペプチドマップにおいて特定された１種類以上の特定ペプチドのレベルを決定するステップと、
ｃ）当該１種類以上の特定ペプチドのレベルを非ドーピング被験体の参照集団から得られた参照ペプチドマップにおける同一の特定ペプチドのレベルと比較した差を決定するステップと、
ｃ）当該特定ペプチドのレベルを当該参照ペプチドマップにおける同一ペプチドのレベルと比較した差に基づいて、当該被験体が自己血液ドーピングされているとして特定するステップと、を含む。
【００２６】
本発明のさらなる態様では、被験体に由来する血液試料中の１種類以上の特定ペプチドのレベルの差を決定するための方法が提供され、本方法は、
ａ）当該被験体から得られた血液試料のタンパク質分解ペプチドマップを生成することと、
ｂ）ステップａ）で得られたペプチドマップにおいて特定された１種類以上の特定ペプチドのレベルを決定または測定することと、
ｃ）当該１種類以上の特定ペプチドのレベルを被験体の参照集団から得られた参照ペプチドマップにおける同一の特定ペプチドのレベルと比較した差を決定および／または報告することと、を含む。
【００２７】
本発明のなおさらなる態様では、被験体に由来する血液試料中の１種類以上の特定ペプチドのレベルにおける差を決定および／または報告するための方法が提供され、本方法は、当該被験体から得られた血液試料のタンパク質分解消化によって生成されるペプチドマップにおける１種類以上の特定ペプチドのレベルを、被験体の参照集団から得られた参照ペプチドマップにおける同一特定ペプチドのレベルと比較し、これによって当該１種類以上の特定ペプチドのレベルにおける差を決定および／または報告することを含む。
【００２８】
本発明の代替的な態様では、被験体における自己血液ドーピングを検出するための方法が提供され、当該方法は、
ａ）当該被験体から得られた血液試料から単離される赤血球（ＲＢＣ）またはそのサイトゾルのタンパク質分解ペプチドマップを生成することと、
ｂ）ステップａ）で得られたペプチドマップにおいて特定された１種類以上の特定ペプチドのレベルを決定することと、
ｃ）当該１種類以上の特定ペプチドのレベルを非ドーピング被験体の参照集団から得られた参照ペプチドマップにおける同一の特定ペプチドのレベルと比較した差を決定することと、
ｄ）当該特定ペプチドのレベルを当該参照ペプチドマップにおける同一特定ペプチドのレベルと比較した差に基づいて、当該被験体が自己血液ドーピングされているとして報告することと、を含む。
【００２９】
本発明のなおさらなる態様では、被験体における自己血液ドーピングを検出するための方法が提供され、当該方法は、
ａ）当該被験体から得られた血液試料から赤血球（ＲＢＣ）またはそのサイトゾルを単離することと、
ｂ）当該ＲＢＣまたはそのサイトゾルのタンパク質分解ペプチドマップを生成することと、
ｃ）ステップａ）で得られたペプチドマップにおいて特定された１種類以上の特定ペプチドのレベルを決定または測定して、当該１種類以上の特定ペプチドのレベルを被験体の参照集団から得られた参照ペプチドマップにおける同一特定ペプチドのレベルと比較して差を確認することと、
ｄ）当該特定ペプチドのレベルを当該参照ペプチドマップにおける同一特定ペプチドのレベルと比較した差に基づいて、当該被験体が自己血液ドーピングされているとして報告することと、を含む。
【００３０】
前述される本発明の態様では、次の実施形態のうちの１つ以上が適用され得る。
【００３１】
一つの実施形態では、参照血液試料は非ドーピング被験体由来である。好ましくは、参照血液試料は、アスリートおよび非アスリートの両方で異なる年齢、性別、および民族性の複数の非ドーピング被験体から収集される。
【００３２】
一つの実施形態では、当該特定ペプチド各々のレベルを当該参照ペプチドマップにおける同一ペプチドのレベルと比較した差は、１０％超、例えば、２０％、３０％、４０％、５０％を超、例えば、好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％超、さらにより好ましくは１００％、１５０％超、またはさらにより好ましくは２００％超であり得る。増加の量は、１０％超、例えば、２０％、３０％、４０％、５０％超、例えば、好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％超、さらにより好ましくは１００％、１５０％超、またはさらにより好ましくは２００％超であり得る。減少の量は、１０％超、例えば、２０％、３０％、４０％、５０％超、例えば、好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％超であり、１００％以下である減少、すなわちペプチドの完全な不存在であり得る。
【００３３】
一つの実施形態では、当該特定ペプチドは、表３に列挙されるタンパク質のうちの１種類以上から導出される１種類以上のペプチドであり得る。
【００３４】
一つの実施形態では、当該特定ペプチドは、配列番号１〜７８であるペプチドを含むペプチドのリストから選択される１種類以上のペプチドであり得る。
【００３５】
当該特定ペプチドは、配列番号１〜７８を含むペプチドのリストから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、または７８個のペプチドを含み得る。
【００３６】
一つの好ましい実施形態では、当該特定ペプチドは、配列番号１、２、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１９、２２、２３、２４、３１、３４、５１、７７、７８を含むペプチドのリストから選択される１種類以上のペプチドであり得る。
【００３７】
好ましくは、当該特定ペプチドは、配列番号１、２、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１９、２２、２３、２４、３１、３４、５１、７７、７８であるペプチドのリストからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８個のペプチドであり得る。
【００３８】
一つの好ましい実施形態では、当該特定ペプチドは、配列番号１、７、８、９、１２、１４、２２、２４、７８を含むペプチドのリストから選択される１種類以上のペプチドであり得る。
【００３９】
好ましくは、当該特定のペプチドは、配列番号１、７、８、９、１２、１４、２２、２４、７８であるペプチドのリストからの１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のペプチドであり得る。
【００４０】
好ましくは、当該特定ペプチドは、配列番号１〜７８を含むペプチドのリストから選択される５〜１０個のペプチド、または配列番号１、２、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１９、２２、２３、２４、３１、３４、５１、７７、７８を含むペプチドのリストから選択される５〜１０個のペプチド、または配列番号１、７、８、９、１２、１４、２２、２４、７８を含むペプチドのリストから選択される５〜９個のペプチドであり得る。
【００４１】
好ましくは、本発明による方法で分析される血液試料は、試験される被験体から得られた赤血球試料である。さらにより好ましくは、分析される血液試料は、試験される被験体から得られた単離された赤血球サイトゾル試料である。
【００４２】
したがって、一つの実施形態では、本発明による方法は、試験される被験体から得られた血液試料に由来する赤血球を単離するステップを、得られた赤血球のプロテアーゼ消化を含むステップの前に含み得る。赤血球の単離は、遠心分離などのこのような単離のためのいずれかの検査室技術を用いて実施され得る。
【００４３】
したがって、別の実施形態では、本発明による方法は、試験される被験体から得られた血液試料から赤血球を単離するステップ、および赤血球サイトゾル分画の単離を含むさらなるステップを、得られた赤血球サイトゾルのプロテアーゼ消化を含むステップの前に含み得る。赤血球サイトゾル分画は、赤血球の低張溶解および遠心分離による赤血球膜のその後の除去によって調製され得る。
【００４４】
したがって、別の実施形態では、本発明による方法は、試験される被験体から得られた血液試料から赤血球を単離するステップ、および赤血球サイトゾル分画の単離を含むさらなるステップ、およびヘモグロビンのサイトゾル分画の枯渇化を含むさらに別のステップを、得られた赤血球サイトゾルのプロテアーゼ消化を含むステップの前に含み得る。
【００４５】
試験される血液試料、単離された赤血球試料、または単離された赤血球サイトゾル試料は、既知量の１種類以上の参照タンパク質または参照ペプチドがさらに補充され得る。１種類以上の参照ペプチドは、安定した重同位元素標識を含んで、分子量に所定の増加を有する標識されたペプチドをもたらす、１種類以上のアミノ酸を含有し得る。同位体標識は１３Ｃまたは１５Ｎであり得る。
【００４６】
参照ペプチドは、配列番号１〜７８を含むペプチドのリストから選択されるペプチドのうちの１種類以上であり得る。
【００４７】
好ましくは、タンパク質分解ペプチドマップは、トリプシン消化ペプチドマップであり、すなわち、試験される試料のタンパク質分解消化はトリプシン消化によって実施される。タンパク質分解消化はまた、トリプシン、キモトリプシン、Ｌｙｓ−Ｃ、Ｇｌｙ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、Ａｒｇ−Ｃ、パパインから選択されるプロテアーゼのうちの１種類以上を用いることによって実施され得る。［Ｓａｒａｓｗａｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１．（上記）］
【００４８】
ペプチドマッピングは、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）と質量分析法（ＭＳ）との組み合わせによって実施され得、好ましくは、ＭＳはタンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）である。液体クロマトグラフィーは、高圧液体クロマトグラフィーとしても知られる高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、超高性能（圧力）液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）、または超高速（圧力）液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）であり得る［Ｆｅｋｅｔｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ＵＨＰＬＣ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ２０１４．６３，２−１３］。
【００４９】
本発明の一つの態様は、配列番号１〜３５および３７〜７８のペプチドを含むペプチドのリストから選択される単離されたペプチドを提供する。
【００５０】
好ましくは、単離されたペプチドは、配列番号１、２、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１９、２２、２３、２４、３１、３４、５１、７７、および７８であるペプチドを含むペプチドのリストから選択される。
【００５１】
本発明の一つの態様は、配列番号１〜７８であるペプチドのリストから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、７０、７１、７１、７３、７４、７５、７６、７７、または７８個のペプチドを含むキットを提供する。
【００５２】
本発明の一つの態様は、本発明による方法での使用のために配列番号１〜７８であるペプチドのリストから、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、７０、７１、７１、７３、７４、７５、７６、７７、または７８個のペプチドを含むキットを提供する。
【００５３】
好ましくは、本発明のキットは、次の任意の特性のうちの１つ以上を有する。
（１）ペプチドが個別容器に保存される。
（２）ペプチドの組み合わせが個別容器に保存される。
（３）ペプチドが溶液で保存される。
（４）ペプチドが凍結乾燥されている。
（５）ペプチドが４５０ｆｍｏｌ〜６００００ｆｍｏｌの量で提供される。
（６）ペプチドが溶液中に保存されるとき、０．０２５μＭ〜１００００μＭの濃度で提供される。
【００５４】
キットは、品質および性能保証のために非ヒト起源のペプチド、例えばタンパク質分解ステップの性能管理のためにタンパク質分解部位を有するペプチドをさらに含み得る。
【００５５】
本発明の別の態様は、自己血液ドーピングの検出のためのバイオマーカーの特定のための方法を提供し、当該方法は、
ｉ）自己血液の注入を受けている１つ以上の被験体から得られた血液試料と、自己血液の注入を受けていない１つ以上の対照被験体から得られた血液試料との間の１種類以上のペプチドのレベルにおける差を特定し、このようなレベルが血液試料のタンパク質分解ペプチドマップの生成によって特定されているステップと、
ｉｉ）有意差レベルで存在するペプチドを自己血液ドーピングのためのバイオマーカーとして特定するステップと、を含む。
【００５６】
好ましくは、タンパク質分解ペプチドマップは血液試料（複数可）から得られた赤血球から生成される。
【００５７】
このような方法は、
ｉ）自己血液の注入を受けている１つ以上の個体から得られた血液から調製された赤血球のタンパク質分解ペプチドマップを生成するステップと、
ｉｉ）自己血液の注入を受けていない１つ以上の対照個体から得られた血液試料から調製された赤血球のタンパク質分解ペプチドマップを生成するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉ）で得られたペプチドマップにおける１種類以上のペプチドのレベルをステップｉｉ）で得られたペプチドマップと比較した差を特定するステップと、
ｉｖ）有意差レベルで存在するペプチド、および対応するタンパク質を、自己血液ドーピングのためのバイオマーカーとして特定するステップと、を含み得る。
【００５８】
本発明の代替的な態様では、自己血液ドーピング後に変化した発現レベルを有するタンパク質を特定するための方法が提供され、当該方法は、自己血液の注入を受けている１つ以上の個体から得られた血液試料から調製された赤血球（ＲＢＣ）またはこのサイトゾルのタンパク質分解消化によって生成されるペプチドマップにおける１種類以上のペプチドのレベルを、自己血液の注入を受けていない１つ以上の個体から得られた血液試料から調製された赤血球（ＲＢＣ）またはこのサイトゾルのタンパク質分解消化によって生成される参照ペプチドマップにおける同一特定ペプチドのレベルと比較し、これによって自己血液ドーピング後に変化した発現レベルを有するペプチドを特定することを含む。
このような方法は、代替的に、
ｉ）自己血液の注入を受けている１つ以上の個体から得られた血液試料から調製された赤血球（ＲＢＣ）またはこのサイトゾルのタンパク質分解ペプチドマップを生成するステップと、
ｉｉ）自己血液の注入を受けていない１つ以上の対照個体から得られた血液試料から調製されたＲＢＣまたはこのサイトゾルのタンパク質分解ペプチドマップを生成するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉ）で得られたペプチドマップにおける１種類以上のペプチドのレベルをステップｉｉ）で得られたペプチドマップと比較した差を特定するステップと、
ｉｖ）有意差レベルで存在するペプチドを特定し、これによって対応するタンパク質を自己血液ドーピング後に変化した発現レベルを有するとして特定するステップと、を含み得る。
【００５９】
本発明の前述の２つの態様は、次の実施形態のうちの１つ以上を含み得る。
【００６０】
好ましくは、分析される赤血球試料は単離された赤血球サイトゾル試料である。
【００６１】
好ましくは、サイトゾル試料はヘモグロビンが枯渇している、またはヘモグロビンのレベルが低下している。
【００６２】
好ましくは、タンパク質分解ペプチドマップはトリプシン消化ペプチドマップであり、すなわち、タンパク質分解消化はトリプシン消化によって実施される。タンパク質分解消化はまた、トリプシン、キモトリプシン、Ｌｙｓ−Ｃ、Ｇｌｙ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、Ａｒｇ−Ｃ、パパインから選択されるプロテアーゼのうちの１種類以上を用いることによって実施され得る。
【００６３】
ペプチドマッピングは、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）と質量分析法（ＭＳ）との組み合わせによって実施され得、好ましくは、ＭＳはタンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）である。液体クロマトグラフィーは、高圧液体クロマトグラフィーとしても知られる高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、超高性能（圧力）液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）、または超高速（圧力）液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）であり得る。
【００６４】
前述の様々な態様で説明される本発明のキットおよび方法は、対象のペプチドの特定を含み得る、または可能にし得、これによって既知ペプチドの試料は、試験検査室が被験体に由来する試料および対照試料において一致するペプチドを明確に特定することを可能にする。
【００６５】
したがって、本方法は参照ペプチドとの比較によって対象のペプチドを特定する追加ステップを含み得る。
【００６６】
一つの実施形態では、このような特定は液体クロマトグラフィー（ＬＣ）と質量分析法（ＭＳ）との組み合わせによって実施され得、好ましくは、ＭＳはタンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）である。液体クロマトグラフィーは、高圧液体クロマトグラフィーとしても知られる高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、超高性能（圧力）液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）、または超高速（圧力）液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）であり得る。
【００６７】
定義
「被験体」によって、個別動物を意味する。動物は、ヒト、ウマ、またはイヌを含む哺乳動物であり得る。被験体は一般的に、排他的ではないが、競技および／またはプロスポーツに含まれる。
【００６８】
「血液ドネーション」によって、保存および被験体へのその後の再注入のための被験体からの血液の収集を意味する。試験目的のための少量の血液試料の採取を意味しない。一般的に、「ドネーション」は５０ｍＬ〜５００ｍＬの容量に適用する。血液試料は、より一般的には約５０μＬ〜５ｍＬの容量である。
【００６９】
「自己血液輸血」または「再注入」によって、被験体から既に得られている保存した血液を同一被験体に戻す再導入を意味する。
【００７０】
「血液試料」によって、限定されないが全血試料を含む血液の試料、および単離された血液細胞を含む。
【００７１】
「レベルにおける差」によって、他の試料と比較される増加または低下した量、例えば、参照試料と比較された試験試料中の特定ペプチドの量における増加、またはこれに代えて、参照試料と比較される試験試料中の特定ペプチドの量における低下を意味する。増加の量は、１０％超、例えば、２０％、３０％、４０％、５０％超、例えば、好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％超、さらにより好ましくは１００％、１５０％超、またはさらにより好ましくは２００％超であり得る。減少の量は、１０％超、例えば、２０％、３０％、４０％、５０％超、例えば、好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％超であり、１００％以下である減少、すなわちペプチドの完全な不存在であり得る。
【００７２】
「タンパク質分解ペプチドマップ」によって、タンパク質分解によるタンパク質のより小さいペプチドへの分解後の試料中の様々なペプチドの特定を意味する。マップは通常、質量および／または配列によって定められるペプチドの形態をとる［Ｔｈｉｅｄｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍａｓｓ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００５．３５，  ２３７−２４７］。
【実施例】
【００７３】
材料および方法
被験体
合計で１４名が試験に参加した。健常な女性７名および健常な男性７名が、女性では１単位および男性では２単位であるドネーションのために募集され、ここで１単位は血液４５０ｍＬに相当する。
試験デザイン
【表１】
2021515249.tif 000002
【００７４】
血液サンプリング、ドネーション、および輸血
ＶＯ２ＭＡＸの最初のトレッドミル走行テスト後、１血液試料を３週間にわたって各週採取して、個人のベースライン値を確立した。２週目と３週目に全血１単位（４５０ｍＬ）がすべての男性によってドネーションされ、すべての女性が３週目のみに４５０ｍＬをドネーションした。血液サンプリング、ドネーション、ドネーション血液の凍結保存、および再注入は、カロリンスカ大学病院アフェレーシスおよび幹細胞処理センター、フッディンゲ、スウェーデンですべて実施された。血液ドネーションは、病気、海外滞在、入れ墨、または薬物に関するスウェーデンにおける標準的な病院処理に従った。赤血球は他で報告されているように凍結保存のために単離および処理し［Ｈｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｈｕｍａｎｓ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒａｐｉｄ  ｅｘｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．２０１３；５３（１）：２８−３３．］、ＲＢＣは−８０℃で単位１および２をそれぞれ３〜４週間、ＲＢＣ再注入前に保存された。洗浄したＲＢＣの両単位の再注入は、最初の単位のドネーション３週後に実施した。血液試料（１×４．５ｍＬ  ＥＤＴＡ）を採取した。
【００７５】
血液収集
各被験者から３．５ｍＬの静脈血を抜き出し、ＥＤＴＡ含有ＢＤ  Ｖａｃａｔｉｏｎｅｒ血液収集チューブ（ＢＤ）に収集した。チューブをゆっくりと２０回まわし、３０分間室温に維持し、その後さらなる分析まで低温に維持した。
【００７６】
新鮮な血液からの赤血球の調製
溶解緩衝液（１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．６）および洗浄緩衝液（１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．６）は、使用前日に調製した。使用当日にタンパク質阻害剤錠剤（Ａｒｔｎｒ．０５０５６４８９００１，  Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を緩衝液（１錠／５０ｍＬ溶解緩衝液、１錠／１００ｍＬ洗浄緩衝液）に加えた。３５ｍＬの冷やした洗浄緩衝液を遠心分離チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ  ５０ｍＬ）に加えた。緩衝液を添加した遠心分離チューブに血液１ｍＬを移し、静かに混合し、１３００×ｇ、８℃で１０分間遠心分離した（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ａｖａｎｔｉ  Ｊ−２０  ＸＰ，ＪＡ１７または２５．５０ローター）。血漿およびバフィーコート部分を注意深く取り除いて廃棄した。ＲＢＣ分画の１．０ｍＬを清浄な遠心分離チューブに移し、氷冷洗浄緩衝液３５ｍＬを加えた。ＲＢＣが溶解するまで遠心分離チューブを静かに振とうさせた。試料を緩いブレーキ設定によって８℃で１５００×ｇ、１０分間遠心分離した（前述と同じ遠心分離機）。上清３３ｍＬを廃棄し、洗浄緩衝液を３３ｍＬ加え、ペレットを静かに振とうすることによって溶解した。遠心分離および洗浄ステップを２回繰り返した。最後の遠心分離の後、できるだけ多くの上清を（ペレットを乱すことなく）取り除いた。
【００７７】
ＲＢＣサイトゾルの調製
ＲＢＣペレットを２０ｍＬの氷冷溶解緩衝液に溶解し、−４℃で３０分振とうした。試料を緩いブレーキ設定によって、８℃で２５，０００×ｇ、１５分遠心分離した（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ａｖａｎｔｉ  Ｊ−２０  ＸＰ，ＪＡ１７または２５．５０ローター）。上清１５ｍＬ（フラクションの中央から収集）を清浄な遠心分離チューブに移した。遠心分離ステップを１回繰り返した。上清１．５ｍＬを２．０ｍＬマイクロチューブ（２．０ｍＬ  Ｃｌｅａｒ  ＭＡＸＹｃｌｅａｒ、Ａｘｙｇｅｎ）４本に小分けした。
【００７８】
タンパク質濃度測定
すべてのタンパク質濃度測定は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて実施した。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ）は、製造業者の取扱説明書によって説明されるように調製および使用した（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ、ａｒｔ．ｎｏ．＃２３２００）。１５分のインキュベーション後、ウシ血清アルブミン標準サンプル（１００〜６００ｎｇ／μＬ）およびＲＢＣサイトゾル試料について吸光度を５９５ｎｍで、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＧＯプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ）によって三重測定した。試料の濃度は、標準曲線の直線フィッティングから計算した。
【００７９】
ヘモグロビンの除去
ヘモグロビン枯渇化は、標準的なベンチトップ遠心分離機を用いて製造業者（Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｇｒｏｕｐ）によって説明されるようにＨｅｍｏＶｏｉｄレジン、緩衝液、およびフィルターチューブを用いて実施した。１５ｍｇのＨｅｍｏＶｏｉｄレジン２００μＬを含むフィルターチューブにＨｅｍｏＶｏｉｄ結合緩衝液（ＨＶＢＢ）を加え、チューブを室温で５分間転倒混合した。チューブを８２５×ｇで５分間遠心分離してＨＶＢＢを除去し、その後、洗浄をもう一度繰り返した。フィルターチューブに３００μＬのＨＶＢＢを３００μＬのＲＢＣサイトゾル試料とともに加え、チューブを室温で１５分間転倒混合した。チューブを室温で６０００ｒｐｍ、８分間遠心分離した。フロースルーを廃棄し、試料ローディングを３００μＬの追加ＲＢＣサイトゾル試料を用いて同じ方法でもう一度繰り返した。ＨｅｍｏＶｏｉｄレジンを５００μＬのＨｅｍｏＶｏｉｄ洗浄緩衝液（ＨＶＷＢ）によって、転倒式ローターで室温で５分間洗浄し、続いて前述の遠心分離およびフロースルーの廃棄をした。レジンを同様にさらに２回繰り返してから、試料溶出を１５０μＬのＨｅｍｏＶｏｉｄ溶出緩衝液（ＨＶＥＢ）の添加、室温で１５分間の転倒混合、および最後に室温で１００００ｒｐｍ、４分間の遠心分離によって実施した。
【００８０】
トリプシン消化およびクリーンアップ
等量の試料を、トリプシン消化およびＣ１８クリーンアップのために０．８ｍＬ９６ウェルフォーマットプレート（Ｗａｔｅｒｓ）に移した。ヘモグロビン枯渇化ＲＢＣ分画について３０ｋＤａの平均タンパク質ＭＷを想定して、ＭｉＬＬｉ−Ｑ（商標）グレード（ＭＱ）水に溶解した消化前内部ペプチド標準を試料に最終モル比１：１００で添加した。そして試料を最初に５．１ｍＭジチオトレイトール（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中で６０℃で６０分間還元してから、ヨードアセトアミド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の最終濃度２５ｍＭまでの添加によって２２℃で３０分間アルキル化した。Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｇｏｌｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をタンパク質試料１μｇあたり０．５４Ｕの最終比（約１：３０（ｗ／ｗ）比）まで加え、試料を３７℃で１６時間インキュベーションした。反応を停止してＣ１８結合のために試料を酸性化（３〜４の最終ｐＨまで）するため、アセトニトリルおよびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を５％（ｖ／ｖ）アセトニトリルおよび１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡの最終濃度まで加えた。
トリプシン消化試料のクリーンアップは、製造業者の取扱説明書に従い、１０ｍｇベッド重量のＨｙｐｅｒｓｅｐＣ１８プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ）を用いて、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ９６ユニット（Ｗａｔｅｒｓ）によって室温で９６ウェルフォーマットで実施した。簡単に説明すると、レジンを５００μＬの５０％（ｖ／ｖ）メタノールで２回洗浄してから、５％（ｖ／ｖ）、０．５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡで２回平衡化した。試料をレジンに加え、フロースルーは収集後に再びレジンに加えた。レジンを５００  μＬの５％（ｖ／ｖ）、０．５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡで２回洗浄し、トリプシン消化ペプチドを最後に１００μＬの７０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルで新たな０．８ｍＬ９６ウェルプレート（Ｗａｔｅｒｓ）に溶出した。アセトニトリルをＳｐｅｅｄＶａｃ中で蒸発させ、乾燥した試料を１００μＬのＭＱ水に室温で２時間溶解してから−８０℃で保存した。
【００８１】
ナノＬＣ−ＭＳＭＳ分析
分析する試料をＬＣバイアル（１ｍＬ、ＴｒｕＶｉｅｗＬＣＭＳ認定クリアガラス１２×３２ｍｍスクリューネックトータルリカバリーバイアル、キャップおよびプレスリットＰＴＦＥ／シリコーンセプタム付、Ｐｒｏｄ．Ｎｏ．１８６００５６６３ＣＶ、Ｗａｔｅｒｓ）に移した。分析に使用する試料を解凍し、ＭＱ水で所望の濃度に希釈した。内部リテンションタイム標準（ｉＲＴ、Ｂｉｏｇｎｏｓｙｓ）、プレＬＣ内部標準、およびＴＦＡをそれぞれ８ｆｍｏｌ／μＬ、８ｆｍｏｌ／μＬ、および０．１％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで加えた。５０〜４００ｎｇのペプチド試料に対応する５μＬの試料を、０．３３μＬ／分の流速で全ループ注入を有するｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ  ＵｌｔｒａＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＵＰＬＣ（商標）（Ｗａｔｅｒｓ）に注入した。ペプチドは、４０℃のカラム温度および８℃の試料温度を用いて、最初にｎａｎｏＥａｓｅ  Ｍ／Ｚ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８トラップカラム（１００Å、５μｍ、１８０μｍ×２０ｍｍ、２Ｇ、＃１８６００８８２１、Ｗａｔｅｒｓ）に結合させ、ついでｎａｎｏＥａｓｅＭＺ  ＨＳＳ  Ｔ３カラム（１５Ｋｐｓｉ、１００Å、１．８μｍ、７５μｍ×２５０ｍｍ、＃１８６００８８１８、Ｗａｔｅｒｓ）で分離した。無機相溶媒（溶媒Ａ）は水中０．１％ギ酸（ＦＡ）から、有機層溶媒（溶媒Ｂ）は９９．９％アセトニトリル（ｗ／ｖ）、０．１％（ｖ／ｖ）ＦＡから、シール洗浄は１０％（ｗ／ｖ）アセトニトリルから、弱洗浄は１％（ｗ／ｖ）アセトニトリル、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡから、ロックスプレー溶液は２５％（ｗ／ｖ）アセトニトリル、０．１％（ｖ／ｖ）ＦＡ、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｅｕ−Ｅｎｋ、１．６％（ｖ／ｖ）Ｇｌｕ−Ｆｉｂから構成された。溶媒比９５％Ａ／５％Ｂで８．５分のステップ後、試料は９５％Ａ／５％Ｂから６０％Ａ／４０％Ｂへの６０分グラジエントで分離した。その後、１５％Ａ／８５％Ｂへの１．５分グラジエントを加え、２．５分間保持してからカラムを最後に９５％Ａ／５％Ｂで３０分間洗浄した。分離したペプチドをｎａｎｏ−ＵＰＬＣ  Ｓｙｎａｐｔ  Ｇ２Ｓｉ（商標）（Ｗａｔｅｒｓ）を用いた質量分析法によって分析した。質量分析計はポジティブ分解能モードで実施し、分析物は５０〜２０００Ｄａの質量範囲、０．５秒のスキャン時間、サンプリングコーン電圧３０Ｖを用いたエレクトロスプレーイオン化（ＥＳ）によってイオン化した。データ取得および初期データ評価は、ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェア（ｖｅｒ．ＳＣＮ９０１、Ｗａｔｅｒｓ）を用いて実施した。
【００８２】
データ処理および分析
生データ処理、整列化、ペプチド同定、定量、および比較分析は、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ＱＩ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（ｖ．３．０．６０３９．３４６２８、Ｗａｔｅｒｓ）、Ｐｒｏｔｅｉｎｌｙｎｘ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｅｒｖｅｒ（ｖｅｒ．３．０．３，Ｗａｔｅｒｓ）、およびＳｋｙｌｉｎｅ  ｄａｉｌｙ（ｖｅｒ．３．７．１．１１２０８）を用いて実施した。ペプチド同定には、精選されたヒトプロテオームデータベースを使用し（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）、ＦＡＳＴＡフォーマットでＵｎｉｐｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）（ｖｅｒ．１０ｔｈ  Ａｕｇｕｓｔ  ２０１６）から、同定パラメータとしてミスクリーベージ≦２、可変修飾であるシステインのカルバミドメチル化、Ｎ末端アセチル化、メチオニンの酸化、ペプチドトレランス１０ｐｐｍ、フラグメントトレランス２５ｐｐｍ、偽発見率＜２％、ペプチドあたりのフラグメント≧１、タンパク質あたりのフラグメント≧３を用いて取得した。共通の混入物質と内部標準がデータベースに追加された。追加の多変量統計分析をＳＩＭＣＡ（商標）（ＵｍｅｔｒｉｃｓＡＢ）を用いて実施した。
【００８３】
結果
バイオマーカーの特定
自己血液輸血を受けている個体から得られた試料におけるトリプシン消化ペプチドマップでの個別ペプチドのレベルにおける差を、非輸血対照被験体の参照集団から得られた試料における参照トリプシン消化ペプチドマップでの同一の特定ペプチドのレベルと比較した。
【００８４】
レベルに有意差があるペプチドを表２に列挙し、対応するタンパク質を表３に列挙する。
【００８５】
これらのペプチド、および対応するタンパク質は、自己血液ドーピングの検出のための方法におけるバイオマーカーとして使用され得る。
【表２−１】
2021515249.tif 000003
【表２−２】
2021515249.tif 000004
【表２−３】
2021515249.tif 000005
【表３−１】
2021515249.tif 000006
【表３−２】
2021515249.tif 000007
【表３−３】
2021515249.tif 000008
【表３−４】
2021515249.tif 000009
【表３−５】
2021515249.tif 000010
【配列表】
2021515249000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月23日(2019.12.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における凍結保存血による自己血液ドーピングの検出のための方法であって、
ｉ）前記被験体に由来する血液試料から調製された単離された赤血球サイトゾル試料間の１種類以上の特定ペプチドのレベルを、参照血液試料から調製された単離された赤血球サイトゾル試料に由来する同一の特定ペプチドのレベルと比較した差に基づいて、前記被験体が自己血液ドーピングされているかまたはされていないかを特定し、このようなレベルが前記血液試料および前記参照血液試料の各々に関するタンパク質分解ペプチドマップの生成によって決定されている、ステップ、を含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ｉ）の前に、
ｘ）前記被験体から得られた前記血液試料から調製された前記単離された赤血球サイトゾル試料中の前記１種類以上の特定ペプチドのレベルを決定するステップ、
ｙ）参照血液試料から調製された単離された赤血球サイトゾル試料中の前記１種類以上の特定ペプチドのレベルを決定するステップ、
ｚ）前記１種類以上の特定ペプチドのレベルを参照血液試料中の同一の特定ペプチドの前記レベルと比較したいずれかの差を決定するステップ、のうちの１つ以上を実施することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法が、
ａ）前記被験体から得られた血液試料から調製された単離された赤血球サイトゾル試料のタンパク質分解ペプチドマップを生成するステップと、
ｂ）ステップａ）で得られた前記ペプチドマップにおいて特定された１種類以上の特定ペプチドの前記レベルを決定するステップと、
ｃ）前記１種類以上の特定ペプチドのレベルを参照血液試料から調製された単離された赤血球サイトゾル試料から得られた参照ペプチドマップにおける同一の特定ペプチドのレベルと比較した差を決定するステップと、
ｄ）前記特定ペプチドの前記レベルを前記参照ペプチドマップにおける前記同一の特定ペプチドの前記レベルと比較した差に基づいて、前記被験体が凍結保存血により自己血液ドーピングされているかまたはされていないかを特定するステップと、を含む、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記参照血液試料が非ドーピング被験体由来である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記１種類以上の特定ペプチドが、表３に列挙されるタンパク質のうちの１種類以上から導出される１種類以上のペプチドである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記１種類以上の特定ペプチドが、配列番号１〜７８を含むペプチドのリストから選択される１種類以上のペプチドである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記１種類以上の特定ペプチドが、配列番号１〜７８を含むペプチドのリストから選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、または７８個のペプチドである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記１種類以上の特定ペプチドが、トレオニン−−ｔＲＮＡリガーゼ、細胞質；２６Ｓプロテアソーム非ＡＴＰアーゼ調節サブユニット４；Ｔ複合体タンパク質１サブユニットθのアイソフォーム２；チューブリンβ−４Ｂ鎖ＵＶ除去修復タンパク質ＲＡＤ２３ホモログＢ；２６Ｓプロテアソーム非ＡＴＰアーゼ調節サブユニット１３；ユビキチン様修飾因子活性化酵素１のアイソフォーム２；カルパスタチンのアイソフォーム３；ウロポルフィリノーゲン−ＩＩＩシンターゼ；およびカゼインキナーゼＩＩサブユニットα、から選択されるタンパク質のうちの１種類以上から導出される１種類以上のペプチドである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記１種類以上の特定ペプチドが、配列番号１、７、８、９、１０、１２、１４、２２、２４、３４、および７８であるペプチドのうちの１つのアミノ酸配列からなる１種類以上のペプチドである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質分解ペプチドマップを生成する前記ステップが、トリプシン、キモトリプシン、Ｌｙｓ−Ｃ、Ｇｌｙ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、Ａｒｇ−Ｃ、パパインから選択されるプロテアーゼのうちの１種類以上を用いて実施されるプロテアーゼ消化を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記プロテアーゼ消化がトリプシン消化によって実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドマッピングが、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）と質量分析法（ＭＳ）との組み合わせによって実施され、好ましくは、前記ＭＳがタンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
凍結保存血による自己血液ドーピングの検出のための請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法における、配列番号１〜７８であるペプチドを含むペプチドのリストから選択されるペプチドの使用。
【請求項１４】
配列番号１、７、８、１４、および３４であるペプチドのうちの１つのアミノ酸配列からなる、ペプチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載のペプチドのうちの１つ以上を含む、キット。
【請求項１６】
凍結保存血による自己血液ドーピングの検出のためのバイオマーカーの特定のための方法であって、
ｉ）自己血液の注入を受けている１つ以上の被験体から得られた血液試料から調製された単離された赤血球サイトゾル試料と、自己血液の注入を受けていない１つ以上の対照被験体から得られた血液試料から調製された単離された赤血球サイトゾル試料との間の１種類以上のペプチドのレベルにおける差を特定し、このようなレベルが前記血液試料のタンパク質分解ペプチドマップの生成後に特定されている、ステップと、
ｉｉ）有意差レベルで存在するペプチドを、凍結保存血による自己血液ドーピングのためのバイオマーカーとして特定するステップと、を含む、方法。
【請求項１７】
前記方法が、
ｉ）自己血液の注入を受けている１つ以上の個体から得られた血液試料から調製された単離された赤血球サイトゾル試料のタンパク質分解ペプチドマップを生成するステップと、
ｉｉ）自己血液の注入を受けていない１つ以上の対照個体から得られた血液試料から調製された単離された赤血球サイトゾル試料のタンパク質分解ペプチドマップを生成するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉ）で得られた前記ペプチドマップにおける１種類以上のペプチドのレベルをステップｉｉ）で得られたペプチドマップと比較した差を特定するステップと、
ｉｖ）有意差レベルで存在するペプチド、および対応するタンパク質を、凍結保存血による自己血液ドーピングのためのバイオマーカーとして特定するステップと、を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記サイトゾルは、ヘモグロビンが枯渇している、またはヘモグロビンのレベルが低下している、請求項１６または１７に記載の方法。
【国際調査報告】
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