(57)【要約】加水分解アレルゲンの調製物をヒト血液試料と接触させる工程、及びＩＬ１０産生制御性Ｂ細胞の増殖を測定する工程を含み、前記調製物の適性が増殖によって示される、加水分解アレルゲンの調製物の評価のための方法。
2021521867.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
加水分解アレルゲンの調製物をヒト血液試料と接触させる工程、及び
ＩＬ１０産生制御性Ｂ細胞の増殖を測定する工程
を含み、
前記調製物の適性が増殖によって示される、
加水分解アレルゲンの調製物の評価のための方法。
【請求項２】
ＩｇＥ介在型アレルギーの治療又は予防についての前記加水分解アレルゲンの調製物の適性の評価のためのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記評価が生産プロセスにおける品質管理である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記評価が医薬品開発におけるスクリーニングである、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項５】
非加水分解アレルゲンの調製物を第２の同一の血液試料と接触させること、
ＩＬ１０産生制御性Ｂ細胞の増殖を測定すること、及び
前記２つの試料における増殖を比較すること
をさらに含み、
前記非加水分解アレルゲンと接触している試料よりも前記加水分解アレルゲンの調製物と接触している試料において増殖が亢進していることによって適性が示される、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記血液試料が前記アレルゲンに対するアレルギーがある対象から得たものである、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記血液試料が前記アレルゲンに対するアレルギーが無い対象から得たものである、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記アレルゲンは、花粉アレルゲン、ミルクアレルゲン、毒液アレルゲン、卵アレルゲン、雑草アレルゲン、牧草アレルゲン、樹木アレルゲン、灌木アレルゲン、花アレルゲン、野菜アレルゲン、穀物アレルゲン、菌類アレルゲン、果物アレルゲン、液果アレルゲン、ナッツアレルゲン、種子アレルゲン、豆アレルゲン、魚類アレルゲン、甲殻類アレルゲン、海産物アレルゲン、肉類アレルゲン、香辛料アレルゲン、昆虫アレルゲン、ダニアレルゲン、カビアレルゲン、動物アレルゲン、ハトダニアレルゲン、蠕虫アレルゲン、軟質珊瑚アレルゲン、動物鱗屑アレルゲン、線虫アレルゲン、パラゴムノキのアレルゲンの中から選択されるアレルゲンより選択される、請求項１〜請求項７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記加水分解アレルゲンを調製するための
（ａ）アレルゲン性タンパク質を含む天然アレルゲン源を抽出処理して抽出物を生成する工程、
（ｂ）前記抽出物を精製して非タンパク質成分を除去して精製抽出物を生成する工程、
（ｃ）前記精製抽出物を変性させて精製変性抽出物を生成する工程、
（ｄ）前記精製変性抽出物を加水分解して加水分解アレルゲンのペプチドを生成する工程
を含む、請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記加水分解アレルゲンを調製するための
（ａ）アレルゲン性タンパク質を含むアレルゲン源を抽出処理して抽出物を生成する工程、
（ｂ）前記抽出物を精製して非タンパク質成分を除去して精製抽出物を生成する工程、
（ｃ）前記精製抽出物を第１の変性剤で変性させて精製変性抽出物を生成する工程、
（ｄ）前記精製変性抽出物を純化して不純物を除去して純化変性抽出物を生成する工程、
（ｅ）前記純化変性抽出物を第２の変性剤で変性して変性アレルゲン混合物を生成する工程、及び
（ｆ）前記変性アレルゲン混合物を加水分解して前記加水分解アレルゲンのペプチドを生成する工程
を含む、請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＩＬ１０産生制御性Ｂ細胞がＣＤ１９＋ＩＬ１０＋Ｂ細胞である、請求項１〜請求項１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＩＬ１０産生制御性Ｂ細胞がＣＤ１９＋ＣＤ２７＋ＩＬ１０＋Ｂ細胞である、請求項１〜請求項１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＩＬ１０産生制御性Ｂ細胞がＣＤ１９＋ＣＤ５＋ＣＤ３８ｈｉＣＤ２４ｈｉＩＬ１０＋Ｂ細胞である、請求項１〜請求項１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＩＬ１０産生制御性Ｂ細胞がＣＤ１９＋ＣＤ５＋ＣＤ３８ｉｎｔＣＤ２４ｉｎｔＩＬ１０＋Ｂ細胞である、請求項１〜請求項１０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は加水分解アレルゲンの調製物の評価に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー（Ｉ型過敏症）における疾患緩和効果のある唯一利用可能な解決法は免疫治療である。これはアレルギー反応の危険性を伴う原因アレルゲンの反復投与によって達成される。副作用及び治療期間を低減するための１つの解決法は加水分解アレルゲンを使用することであり、これはアレルギー患者において寛容を誘導するための有効成分（active principle）として益々期待されている。国際公開第２００８／０００７８３号パ及び国際公開第２０１２／１７２０３７号を参照されたい。
【０００３】
アレルゲンをペプチド（アレルゲン断片）に加水分解することの主な利点はアレルゲン性の低下、及びその結果としての全身反応のリスクの低下である。しかしながら、有効成分における免疫再プログラム化に必要な全情報の保存が保護されている必要がある。したがって、十分に加水分解されていない調製物は高いアレルゲン性及び免疫原性を有し、投与時に高い危険性を伴うことがあり得るが、一方で過剰に加水分解された調製物はもはや有効ではなくなる。そのため安全性と有効性との間のバランスがアレルギー免疫治療についての最良の製品候補の選択にとって重要である。
【０００４】
免疫治療後の寛容発生プロセスでは、サイトカインＩＬ１０が免疫系の再プログラム化における重要なプレーヤーである。ＩＬ１０産生Ｔ細胞がＩｇＥ介在型アレルギーにおける効率的な免疫治療に必要不可欠であることが幾つかの研究から示された。ネコアレルギーの患者及びリウマチ性関節炎（ＲＡ）の患者のペプチド免疫治療により、Ｔ細胞サブセットからのＩＬ１０の誘導及び培養上清中の高レベルのＩＬ１０が示されている（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＪＤ，Ｂｕｃｋｌａｎｄ  ＫＦ，ＭｃＭｉｌｌａｎ  ＳＪ，Ｋｅａｒｌｅｙ  Ｊ，Ｏｌｄｆｉｅｌｄ  ＷＬＧ，Ｓｔｅｒｎ  ＬＪ，ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００９；２０６（７）：１５３５−４７；Ｐｒａｋｋｅｎ  ＢＪ，Ｓａｍｏｄａｌ  Ｒ，Ｌｅ  ＴＤ，Ｇｉａｎ−ｎｏｎｉ  Ｆ，Ｙｕｎｇ  ＧＰ，Ｓｃａｖｕｌｌｉ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００４；１０１（１２）：４２２８−３３；Ｖｅｒｈｏｅｆ  Ａ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｃ，Ｋａｙ  ＡＢ，Ｌａｒｃｈe  Ｍ．ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ．２００５；２（３）：０２５３−６１）。
【０００５】
マウスにおけるＨＤＭペプチド免疫治療の研究により、ＣＤ１９＋Ｂ細胞ではなくＣＤ４＋ＩＬ１０＋の上方制御も示されている（Ｍｏｌｄａｖｅｒ  ＤＭ，Ｂｈａｒｈａｎｉ  ＭＳ，Ｗａｔｔｉｅ  ＪＮ，Ｅｌｌｉｓ  Ｒ，Ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ  Ｈ，Ｌｌｏｙｄ  ＣＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｒ  Ｄｅｎｔ  Ｊ．２０１４；２１７（２）：３７９−９０）。これらの研究は、ペプチド免疫治療後のＩＬ１０の産生は、Ｂ細胞ではなく主にＩＬ１０＋Ｔ細胞によって引き起こされることを明確に実証している。これらのＩＬ１０＋Ｔ細胞はＩＬ１０などの調節性サイトカインの増加と同時に抗原特異的Ｔｈ２応答を下方制御する能力を有する。
【０００６】
他方、制御性Ｂ細胞は免疫寛容において役割を有する。例えばＥ．Ｃ．Ｒｏｓｓｅｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍａｕｒｉ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４２（２０１５）６０７−６１２、又はＣ．Ｍａｕｒｉ  ａｎｄ  Ｍ．Ｒ．Ｅｈｒｅｎｓｔｅｉｎ，ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２９（２００７）３４−４０を参照されたい。活性型Ｂ細胞は、ＣＤ４０Ｌの存在下でＴＬＲ４アゴニスト及びＴＬＲ９アゴニストにより活性化されるとＩＬ１０を分泌することもできる。また、ＩＬ１０産生Ｂ細胞は別の種類の（ＩＶ型）過敏症、すなわち非ＩｇＥ介在型アレルギーの寛容誘導に関与することが主に知られている。後者のアレルギーは、ＩｇＥ介在型アレルギーと比較すると、通常は曝露から数時間〜数週間後に遅れて症状が現れる。また、後者のアレルギーは、Ｔｈ２応答の活性化の代わりにマクロファージの過剰活性化及び炎症をもたらすＴｈ１応答の活性化を伴う様々な免疫機構にも関与する。
【０００７】
Ｓ．Ｊ．Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．５（２０１３）４８−５４は、非ＩｇＥ介在型ミルクアレルギーにおけるインターフェロンγによるアレルゲン特異的ＩＬ１０産生制御性Ｂ細胞応答のインビトロ誘導を開示している。
【０００８】
Ｊ．Ｎｏｈ  ａｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２７３（２０１２）１４０−１４９は、非ＩｇＥ介在型食物アレルギーにおけるアレルゲン特異的インターロイキン１０産生制御性Ｂ細胞の変化の誘導を伴うインターフェロンγの寛容誘発作用を開示している。
【０００９】
予期せぬことに、ＩｇＥ介在型アレルギーの背景における寛容機構として、ペプチドにより新規ＩＬ１０＋Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋ＩＬ１０＋Ｂ細胞、ＣＤ１９＋ＣＤ５＋ＣＤ２４ｉｎｔＣＤ３８ｉｎｔＢ細胞、ＣＤ１９＋ＣＤ５＋ＩＬ１０＋Ｂ細胞）の生成が可能であったが、一方で恒常的発現性ＩＬ１０＋制御性Ｂ細胞サブセット（ＣＤ１９＋ＣＤ５＋ＣＤ２４ｈｉＣＤ３８ｈｉ）も活性化したことがわかった。これらは以前に文献中に記載されていなかったＩ型過敏症についての新しい発見であり、ペプチド免疫治療の機序を理解するための現行の定説に異議を唱えるものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の目的は、加水分解アレルゲンの調製物の評価のための方法を提供することである。この目的は、加水分解アレルゲンの調製物をヒト血液試料と接触させる工程、及びＩＬ１０産生制御性Ｂ細胞の増殖を測定する工程を含み、前記調製物の適性が増殖によって示される、加水分解アレルゲンの調製物の評価のための方法によって達成される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】３つのバッチの牧草花粉加水分解物のＳＥＣデータを示す図である。
【図１Ｂ】３つのバッチの牧草花粉加水分解物のＳＥＣデータを示す図である。
【図１Ｃ】３つのバッチの牧草花粉加水分解物のＳＥＣデータを示す図である。
【図２Ａ】牧草花粉ｓＩｇＧの産生動態を示す図である。
【図２Ｂ】ピーナッツｓＩｇＧの産生動態を示す図である。
【図２Ｃ】イエダニｓＩｇＧの産生動態を示す図である。
【図３Ａ】ウエスタンブロットによるホソムギ（Lolium perenne）アレルゲンに対する抗体反応性を示す図である。
【図３Ｂ】ウエスタンブロットによるピーナッツ（Arachis hypogaea）アレルゲンに対する抗体反応性を示す図である。
【図３Ｃ】ウエスタンブロットによるヤケヒョウヒダニ（Dermatophagoides pteronyssinus）アレルゲンに対する抗体反応性を示す図である。
【図４Ａ】非アトピー対照と比較した牧草花粉アレルギー患者に対するアレルゲン性、すなわち抗原結合亢進（Facilitated Antigen Binding）（ＦＡＢ）を示す図である。
【図４Ｂ】非アトピー対照と比較した牧草花粉アレルギー患者に対するアレルゲン性、すなわち抗原結合亢進（ＦＡＢ）を示す図である。
【図５Ａ】非アトピー対照と比較したアレルギー患者に対する牧草花粉調製物のアレルゲン性、すなわち好塩基球活性化試験（ＢＡＴ）を示す図である。
【図５Ｂ】非アトピー対照と比較したアレルギー患者に対するピーナッツ調製物のアレルゲン性、すなわち好塩基球活性化試験（ＢＡＴ）を示す図である。
【図５Ｃ】非アトピー対照と比較したアレルギー患者に対するイエダニ調製物のアレルゲン性、すなわち好塩基球活性化試験（ＢＡＴ）を示す図である。
【図６Ａ】非アトピー対照と比較したアレルギー患者に対する牧草花粉調製物の免疫原性、すなわちＣＤ１９＋ＩＬ１０＋Ｂ細胞の誘導を示す図である。
【図６Ｂ】非アトピー対照と比較したアレルギー患者に対するピーナッツ調製物の免疫原性、すなわちＣＤ１９＋ＩＬ１０＋Ｂ細胞の誘導を示す図である。
【図６Ｃ】非アトピー対照と比較したアレルギー患者に対するイエダニ調製物の免疫原性、すなわちＣＤ１９＋ＩＬ１０＋Ｂ細胞の誘導を示す図である。
【図７Ａ】非アトピー対照と比較したアレルギー患者に対する牧草花粉調製物の免疫原性、すなわちＣＤ１９＋ＣＤ２７＋ＩＬ１０＋Ｂ細胞の誘導を示す図である。
【図７Ｂ】非アトピー対照と比較したアレルギー患者に対するピーナッツ調製物の免疫原性、すなわちＣＤ１９＋ＣＤ２７＋ＩＬ１０＋Ｂ細胞の誘導を示す図である。
【図７Ｃ】非アトピー対照と比較したアレルギー患者に対するイエダニ調製物の免疫性、すなわちＣＤ１９＋ＣＤ２７＋ＩＬ１０＋Ｂ細胞の誘導を示す図である。
【図８Ａ】非アトピー対照と比較したアレルギー患者に対する牧草花粉調製物の免疫原性、すなわちＣＤ１９＋ＣＤ５＋ＣＤ３８ｈｉＣＤ２４ｈｉＩＬ１０＋Ｂ細胞の誘導を示す図である。
【図８Ｂ】非アトピー対照と比較したアレルギー患者に対するピーナッツ調製物の免疫原性、すなわちＣＤ１９＋ＣＤ５＋ＣＤ３８ｈｉＣＤ２４ｈｉＩＬ１０＋Ｂ細胞の誘導を示す図である。
【図８Ｃ】非アトピー対照と比較したアレルギー患者に対するイエダニ調製物の免疫原性、すなわちＣＤ１９＋ＣＤ５＋ＣＤ３８ｈｉＣＤ２４ｈｉＩＬ１０＋Ｂ細胞の誘導を示す図である。
【図９Ａ】非アトピー対照と比較したアレルギー患者に対する牧草花粉調製物の免疫原性、すなわちＣＤ１９＋ＣＤ５＋ＣＤ３８ｉｎｔＣＤ２４ｉｎｔＩＬ１０＋Ｂ細胞の誘導を示す図である。
【図９Ｂ】非アトピー対照と比較したアレルギー患者に対するピーナッツ調製物の免疫原性、すなわちＣＤ１９＋ＣＤ５＋ＣＤ３８ｉｎｔＣＤ２４ｉｎｔＩＬ１０＋Ｂ細胞の誘導を示す図である。
【図９Ｃ】非アトピー対照と比較したアレルギー患者に対するイエダニ調製物の免疫原性、すなわちＣＤ１９＋ＣＤ５＋ＣＤ３８ｉｎｔＣＤ２４ｉｎｔＩＬ１０＋Ｂ細胞の誘導を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の方法によると加水分解アレルゲンの調製物は血液試料と接触させられる。これはインビトロで実施される。
【００１３】
その後、接触によりＩＬ１０産生制御性Ｂ細胞が増殖するか測定し、ここで調製物の適性は増殖によって示される。この文脈での適性とは前記調製物が将来の使用に適切であることを意味する。これにより調製物の品質が何らかの方法で示される。したがって、ある実施形態では、本方法は生産プロセスにおける品質管理として使用される。
【００１４】
別の実施形態では、本方法はスクリーニング及び医薬品開発に使用されてよい。この実施形態では、加水分解アレルゲンの調製物のバッチが調製される。評価の結果に応じて、プロセスに若干の修正が加えられて産物が改良されてもよい。例えば、加水分解に使用される酵素の量、加水分解の時間、温度、又はアレルゲンの濃度が修正されてもよい。
【００１５】
ある実施形態では、本方法は
非加水分解アレルゲンの調製物を第２の血液試料と接触させること、
ＩＬ１０産生制御性Ｂ細胞の増殖を測定すること、及び
前記２つの試料における増殖を比較すること
をさらに含み、
ここで、前記非加水分解アレルゲンと接触している試料よりも前記加水分解アレルゲンの調製物と接触している試料において増殖が亢進していることによって適性が示される。
【００１６】
この実施形態では、同じ対象の２つの血液試料を２つの形態のアレルゲン（１つの試料を加水分解型のアレルゲン、もう１つの試料は非加水分解型のアレルゲン）と接触させる。アレルゲンの量は両方の調製物で同じである。
【００１７】
これらの２つの試料中での増殖を比較することにより、調製物の適性をさらに検討することができる。適正のある調製物は、非加水分解アレルゲンと接触しているＬ１０産生制御性Ｂ細胞よりも加水分解調製物と接触しているＩＬ１０産生制御性Ｂ細胞で増殖の亢進を示す。
【００１８】
幾つかの実施形態では、血液試料は特定のアレルゲンに対するアレルギーがある対象から得たものであってよく、好ましい実施形態では血液試料はアレルゲンに対するアレルギーが無い対象、又は典型的なアレルゲンに対するアレルギーが全く無い対象から得たものである。
【００１９】
本発明に従って使用される適切なアレルゲンは、植物アレルゲン、花粉アレルゲン、ミルクアレルゲン、毒液アレルゲン、卵アレルゲン、雑草アレルゲン、牧草アレルゲン、樹木アレルゲン、灌木アレルゲン、花アレルゲン、野菜アレルゲン、穀物アレルゲン、菌類アレルゲン、果物アレルゲン、液果アレルゲン、ナッツアレルゲン、種子アレルゲン、豆アレルゲン、魚類アレルゲン、甲殻類アレルゲン、海産物アレルゲン、肉類アレルゲン、香辛料アレルゲン、昆虫アレルゲン、ダニアレルゲン、カビアレルゲン、動物アレルゲン、ハトダニアレルゲン、蠕虫アレルゲン、軟質珊瑚アレルゲン、動物鱗屑アレルゲン、線虫アレルゲン、パラゴムノキアレルゲンの中から選択される。
【００２０】
幾つかの実施形態では、本方法は加水分解アレルゲンを調製する追加の工程を含む。
【００２１】
ある実施形態では、本方法は
（ａ）アレルゲン性タンパク質を含む天然アレルゲン源を抽出処理して抽出物を生成する工程、
（ｂ）前記抽出物を精製して非タンパク質成分を除去して精製抽出物を生成する工程、
（ｃ）前記精製抽出物を変性させて精製変性抽出物を生成する工程、
（ｄ）前記精製変性抽出物を加水分解して加水分解アレルゲンのペプチドを生成する工程を含む。
【００２２】
他の実施形態では、本方法は
（ａ）アレルゲン性タンパク質を含むアレルゲン源を抽出処理して抽出物を生成する工程、
（ｂ）前記抽出物を精製して非タンパク質成分を除去して精製抽出物を生成する工程、
（ｃ）前記精製抽出物を第１の変性剤で変性させて精製変性抽出物を生成する工程、
（ｄ）前記精製変性抽出物を純化して不純物を除去して純化変性抽出物を生成する工程、
（ｅ）前記純化変性抽出物を第２の変性剤で変性して変性アレルゲン混合物を生成する工程、及び
（ｆ）前記変性アレルゲン混合物を加水分解して前記加水分解アレルゲンのペプチドを生成する工程を含んでいてもよい。
【００２３】
好ましい実施形態には、前記ＩＬ１０産生制御性Ｂ細胞が、ＣＤ１９＋ＩＬ１０＋Ｂ細胞である方法、ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋ＩＬ１０＋Ｂ細胞である方法、ＣＤ１９＋ＣＤ５＋ＣＤ３８ｈｉＣＤ２４ｈｉＩＬ１０＋Ｂ細胞である方法、ＣＤ１９＋ＣＤ５＋ＣＤ３８ｉｎｔＣＤ２４ｉｎｔＩＬ１０＋Ｂ細胞である方法が含まれる。
【００２４】
本明細書において引用される全ての参照文献は、本明細書の明白な教示と矛盾しない限り、本明細書中に参照により取り込まれる。
【実施例】
【００２５】
以下の非限定的な実施例により本発明をさらに説明する。
【００２６】
実施例１：牧草花粉（Lolium perenne）ペプチドの調製
実施例１．１：抽出
１％（ｗ／ｖ）の花粉（ＡＬＬＥＲＧＯＮのホソムギ）を炭酸水素ナトリウム（１２．５ｍＭ）に添加し、撹拌しながら２時間インキュベートした。次にセライト（ＡＣＲＯＳ）を２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、０．２μｍフィルターに通すことにより溶液を清澄化及び濾過した。この試料を粗抽出物とする。
【００２７】
花粉アレルギー患者血清を使用するウエスタンブロッティングにより抽出物中のアレルゲンの存在を分析した。抗ヒトＩｇＧ抗体又は抗ヒトＩｇＥ抗体を使用してＩｇＧエピトープとＩｇＥエピトープを可視化する。
【００２８】
粗抽出物をｐＨ３．０まで酸性化し、Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％、ｖ／ｖ）を添加した。この試料を酸性化抽出物とする。
【００２９】
実施例１．２：アレルゲンタンパク質の精製
以下の方法によりアレルゲン抽出物を精製した。
【００３０】
陽イオン交換クロマトグラフィー
２８倍ベッド体積（Ｂｖ）の１２．５ｍＭ  炭酸水素ナトリウム、３０ｍＭ  クエン酸、ｐＨ３．０、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）を使用してザルトバインドＳ−メンブレン（ＳＡＲＴＯＲＩＵＳ）を平衡化した。平衡化した膜に前記酸性化抽出物をロードした。カラムを最初に３５倍Ｂｖの１２．５ｍＭ炭酸水素ナトリウム、３０ｍＭ  クエン酸、ｐＨ３．０、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）で洗浄し、次に４２倍Ｂｖの１２．５ｍＭ  炭酸水素ナトリウム、３０ｍＭ  クエン酸、ｐＨ３．０で洗浄した。０．１Ｍ  炭酸、０．５Ｍ  塩化ナトリウム、ｐＨ９．１５でタンパク質を溶出した。タンパク質の存在を２８０ｎｍのＯＤで追跡した。目的の画分をプールした。
【００３１】
硫酸アンモニウム沈殿
この工程は０〜４℃で実施された。
前記産物に９０％の飽和度に達する量の硫酸アンモニウムを撹拌しながら添加した。塩が完全に溶解した後に撹拌を停止した。懸濁液を一晩インキュベートし、１００００ｇで１５分間、２回遠心分離した。各回で上清を注意深く廃棄した。
【００３２】
変性
６Ｍ  尿素、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０の中に沈殿物を９ｍｇ／ｍｌの濃度で再懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。
【００３３】
Ｇ２５樹脂（ＡＭＥＲＳＨＡＭのファインＳｅｐｈａｄｅｘ）でのサイズ排除クロマトグラフィー
変性試料をカラムにロードし、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．５Ｍ  尿素、ｐＨ８．０を使用してタンパク質を溶出した。
【００３４】
２８０ｎｍのＯＤ測定によりタンパク質の存在を追跡した。目的の画分をプールして精製変性アレルゲン抽出物とした。
【００３５】
精製アレルゲン抽出物をさらに分析した。タンパク質純度を評価するためにタンパク質含量（ＢＣＡアッセイ）及び乾燥重量を求めた。炭水化物の除去（オルシノール試験）とＯＤ２６０／ＯＤ２８０比の低下によっても精製効率を追跡した。
【００３６】
【表１】
2021521867.tif 000003
【００３７】
表１に示されているように精製プロセスによって、抽出物中のタンパク質の割合が約１５％から約８０％まで上昇し、ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比が純粋なタンパク質の特徴である０．５に近づき、炭水化物が顕著に除去される（残留含有量はタンパク質の炭水化物部分を表し得る）ことになる。
【００３８】
実施例１．３：変性アレルゲン抽出物の加水分解
以下のプロトコルを用いて抽出物を加水分解した。
前記精製アレルゲン抽出物をｐＨ２．０まで酸性化した。２．５ｍｇ／ｍｌの濃度の花粉タンパク質、及び３３７ｍｇのタンパク質に対して１欧州薬局方単位のペプシン（ＭＥＲＣＫ）で、３７℃で２時間、消化を行った。
【００３９】
実施例１．４：精製
１００００Ｄａ以上のＭＷを有するペプチド及び１０００Ｄａ以下のＭＷを有するペプチドを除外するために以下の方法により加水分解物を精製した。
【００４０】
Ｇ５０樹脂（ＡＭＥＲＳＨＡＭのファインＳｅｐｈａｄｅｘ）でのサイズ排除クロマトグラフィー
１６．５％（ｖ／ｖ）のイソプロパノール及び０．１ＭのＮａＣｌを前記加水分解物に添加した。この試料を直ちにＧ５０カラムにロードした。ペプチドを溶出し、これらのペプチド（１０ｋＤａ以下のＭＷ）を含む画分をプールした。
【００４１】
１ｋＤａメンブレン（ＰＡＬＬの限外濾過カセットＯｍｅｇａ  ＰＥＳ）での透析濾過
ペプチドを１０倍に濃縮し、１０倍体積の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に対して透析濾過し、最終的に２．５倍に濃縮した。この試料を精製アレルゲン加水分解物とする。
【００４２】
サイズ排除ＨＰＬＣにより精製効率を制御した。５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、ｐＨ６．８を１ｍｌ／分の流速で用いて、ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ  Ｓ２０００カラム（ＰＨＥＮＯＭＥＮＥＸ）を平衡化した。２１４ｎｍでペプチドを検出した。
【００４３】
サイズ排除クロマトグラフィーの３つの例が図１に示されている。
【００４４】
実施例２：ピーナッツ（Arachis hypogaea）ペプチドの調製
実施例２．１：ピーナッツアレルゲンの抽出
３種類のピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａのランナー種、バージニア種、及びスパニッシュ種）の混合物の皮をむき、すりつぶし、混合した。２％（ｗ／ｖ）のピーナッツ混合物をリン酸ナトリウム（１２．５ｍＭ）に添加し、撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。次にセライトを２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、０．４５μｍのフィルターに通すことにより溶液を清澄化及び濾過した。この試料を粗タンパク質抽出物とする。
【００４５】
ピーナッツアレルギー患者血清を使用するウエスタンブロットにより粗タンパク質抽出物中のアレルゲンの存在を確認した。
【００４６】
実施例２．２：ピーナッツアレルゲンタンパク質の精製
以下の方法によりアレルゲン抽出物を精製した。
【００４７】
トリクロロ酢酸沈殿
この工程は室温（２０〜２５℃）で実施された。
前記産物に１０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸を撹拌しながら添加した。次に沈殿した抽出物を１００００ｇで１５分間、遠心分離した。上清を注意深く廃棄した。
【００４８】
１回目の変性
８Ｍ  尿素、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に沈殿物を２５ｍｇ／ｍｌの濃度で再懸濁し、８０ｍＭのＤＴＴを添加した。この溶液を３７℃で１時間インキュベートした。
【００４９】
Ｇ２５樹脂カラム（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのファインＳｅｐｈａｄｅｘ）でのサイズ排除クロマトグラフィー
精製変性抽出物を直ちにカラムにロードし、２Ｍ  尿素、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を使用してタンパク質を溶出した。
【００５０】
２８０ｎｍの吸光度によりタンパク質の存在を追跡した。目的の画分をプールして純化変性アレルゲン抽出物とした。
【００５１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びピーナッツアレルギー患者血清を使用するウエスタンブロッティングにより純化変性抽出物をさらに分析した。
【００５２】
２回目の変性
８Ｍ  尿素及び４０ｍＭ  ＴＣＥＰを純化変性抽出物に添加した。その後、ｐＨを２．５に調節した。この溶液を３７℃で１時間インキュベートした。
【００５３】
実施例２．３：変性ピーナッツアレルゲンの加水分解
以下のプロトコルを用いて変性アレルゲンを加水分解した。
前記変性アレルゲン混合物を１０ｍＭのＨＣｌで４倍に希釈し、６ＮのＨＣｌを使用してｐＨ２．０まで酸性化した。１００ｍｇのタンパク質に対して１６欧州薬局方単位のペプシンを使用して３７℃で２時間、タンパク質加水分解を実施した。その後、ＮａＯＨ溶液を使用してｐＨを１０．０まで上昇させることにより加水分解を停止させた。
【００５４】
実施例２．４：加水分解ピーナッツアレルゲンの精製
１００００Ｄａ以上のＭＷを有するペプチド及び１０００Ｄａ以下のＭＷを有するペプチドを除外するために以下の方法により加水分解アレルゲンを精製した。
【００５５】
Ｇ５０樹脂（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのファインＳｅｐｈａｄｅｘ）でのサイズ排除クロマトグラフィー
ｐＨの上昇後、加水分解アレルゲンを直ちにＧ５０カラムにロードした。２Ｍ  尿素、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５を使用してペプチドを溶出した。２８０ｎｍの吸光度により溶出を追跡した。これらのペプチド（１０ｋＤａ以下のＭＷ）を含む画分が存在した。
【００５６】
１ｋＤａメンブレン（ＰＡＬＬの限外濾過カセットＯｍｅｇａ  ＰＥＳ）での透析濾過
ペプチドを２５倍に濃縮し、１０倍体積の５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）に対して透析濾過し、最終的に２倍に濃縮した。この試料を精製加水分解物とする。
【００５７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製加水分解物を分析した。プロファイルは、１０ｋＤａ超の分子量の残留タンパク質が存在しないことを示す。
【００５８】
サイズ排除ＨＰＬＣにより精製効率を制御した。５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、ｐＨ６．８を１ｍｌ／分の流速で用いて、ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ  Ｓ２０００カラムを平衡化した。２１５ｎｍでペプチドを検出した。
【００５９】
実施例３：イエダニ（Dermatophagoides pteronyssinus）ペプチドの調製
実施例３．１：イエダニのタンパク質抽出
リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中、室温で撹拌しながら１時間インキュベートすることにより、イエダニのタンパク質を抽出した。セライトを２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、０．４５μｍのＰＶＤＦフィルターに通すことにより溶液を清澄化及び濾過した。この試料を粗タンパク質抽出物とする。
【００６０】
粗タンパク質抽出物は、分子量（それぞれ２５ｋＤａ及び１４ｋＤａ）にしたがって局在し得る主要アレルゲン（Ｄｅｒｐ１、Ｄｅｒｐ２）を示すようである。
【００６１】
実施例３．２：イエダニ由来のアレルゲンタンパク質の精製
以下の方法により精製を実施した。
【００６２】
トリクロロ酢酸沈殿
粗タンパク質抽出物に１０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸を撹拌しながら室温で５分間添加した。１００００ｇで２０分間の遠心分離によりタンパク質を収集した。
【００６３】
１回目の変性
上清の除去後に８Ｍ  尿素、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７〜８）中に沈殿物を再懸濁した。ｐＨを７．５に調節して８０ｍＭのＤＴＴを添加した後、この溶液を３７℃で１時間インキュベートした。
【００６４】
Ｇ２５樹脂でのサイズ排除クロマトグラフィーカラム
変性抽出物のタンパク質をカラムにロードし、２Ｍ  尿素、０．１Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ９．０）を使用してこれらのタンパク質を溶出した。
【００６５】
２８０ｎｍの吸光度の測定によりタンパク質の存在をモニタリングした。
【００６６】
２回目の変性
ｐＨを２．５に調整した４Ｍ  尿素、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、及び４０ｍＭ  ＴＣＥＰ中で３７℃、１時間インキュベートすることで変性が生じた。
【００６７】
実施例３．３：イエダニ変性アレルゲンの加水分解
変性タンパク質混合物を１０ｍＭのＨＣｌで予め２倍に希釈し、６ＮのＨＣｌを使用してｐＨ２．０まで酸性化した。１００ｍｇ当たり１６欧州薬局方単位のペプシンを使用して３７℃で１時間、タンパク質加水分解を実施した。
【００６８】
実施例４：ペプチドの安全性及び有効性の評価
実施例４．１：マウス免疫後のｓＩｇＧ産生
実施例１〜実施例３に従って、数バッチの加水分解アレルゲンを調製した。
【００６９】
８〜１０匹のマウスからなるグループにミョウバンと組み合わせた１００μｇの異なるバッチのアレルゲン断片を一週間の間隔で６回腹腔内注射して免疫化を行った。陽性対照として非加水分解全長アレルゲン（タンパク質）を１つのグループのマウスに免疫した。特定のＩｇＧ抗体の産生動態をＥＬＩＳＡにより最大で５６日目まで測定した。
【００７０】
牧草花粉アレルゲン（Lolium perenne）断片についての結果が図２Ａに示されており、ピーナッツアレルゲン（Arachis hypogaea）断片についての結果が図２Ｂに示されており、イエダニアレルゲン（Dermatophagoides pteronyssinus）断片についての結果が図２Ｃに示されている。データは平均値±ＳＥＭとして提示されており、１グループ当たりの試料数（ｎ）は１０である。これらの３種類のアレルゲンについて、全てのペプチドバッチが、免疫原性に関する未処理タンパク質からの統計学的差異が存在した。さらに、ペプチドバッチ間では統計学的差異が存在しなかった。
【００７１】
実施例４．２：アレルゲン断片に対する抗体の反応性
（実施例４．１において説明したように）異なるグループのマウスの血清を４２日目に収集し、ウエスタンブロッティング分析により全長のアレルゲンに対する血清の反応性について評価した。タンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲルにロードし、電気泳動を行い、電場下でＰＶＤＦ膜に転写した。このＰＶＤＦ膜を試験試料毎に１つずつの断片に切断し、１つのグループのマウスの血清と共にインキュベートした。結合をビオチン結合抗マウスＩｇＧにより検出し、蛍光標識（ユーロピウム）結合ストレプトアビジンにより可視化した。
【００７２】
図３Ａは牧草花粉（Lolium perenne）のタンパク質又はアレルゲン断片で免疫されたマウスの結果、図３Ｂはピーナッツ（Arachis hypogaea）のタンパク質又はアレルゲン断片で免疫されたマウスの結果、及び図３Ｃはイエダニ（Dermatophagoides pteronyssinus）のタンパク質又はアレルゲン断片で免疫されたマウスの結果を示している。全てのアレルゲンについて、ペプチドで免疫されたマウスの血清が全長アレルゲンを認識した。しかしながら、未消化アレルゲンで免疫されたグループの血清を用いた場合と同様に、ペプチド間でも幾らかの差を認めることができる。
【００７３】
実施例４．３：アレルゲン性  抗原結合亢進（ＦＡＢ）
種々のバッチのアレルゲン産物のアレルゲン性をＳｈａｍｊｉ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＩｇＥ−ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  （ＦＡＢ）  ａｓｓａｙ：Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｌｏｗ−ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｂａｓｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３１７，７１−９（２００６）に記載されるように、Ｂ細胞へのＩｇＥ促進性アレルゲン結合によって評価した。アレルギー対象（ＧＰＡ、ｎ＝８）及び非アトピー対象（ＮＡＣ、ｎ＝８）の血清を、種々の産物の濃度を増加させて、３７℃で１時間、予備インキュベートした。次に１×１０５個のＥＢＶ形質転換Ｂ細胞をアレルゲンＩｇＥ混合物に添加し、さらに４℃で１時間インキュベートした。ＰＥ標識ポリクローナルヒト抗ＩｇＥ抗体によりこれらのアレルゲンＩｇＥ複合体を決定し、ＦＡＣＳにより取得した。結果は図４（図４Ａ、４Ｂ）に示されている。アレルギーの対象の場合ではアレルゲンＩｇＥ複合体の用量依存的な結合が特異的に観察され、非アトピー対象の血液試料を使用した場合には結合が認められなかった。さらに、ペプチドに比べて、非加水分解アレルゲンはより強力、且つ、より効果的に複合体のＢ細胞への結合を誘導した。
【００７４】
実施例４．４：アレルゲン性  好塩基球活性化試験（ＢＡＴ）
牧草花粉断片、ピーナッツ断片、及びイエダニ断片から得た種々のアレルゲンバッチのアレルゲン性を好塩基球活性化試験、及びフローサイトメトリーによるジアミンオキシダーゼにより決定した。
【００７５】
１つのバッチのタンパク質（非加水分解アレルゲン）及び異なるバッチのアレルゲン断片の濃度を増加させて、アレルギー個体（ＡＰ、ｎ＝１６）及び非アトピー個体（ＮＡＣ、ｎ＝６）の全血と共にインキュベートした。活性化細胞の細胞膜上のＣＤ６３マーカーの発現についてのフローサイトメトリー方法を用いて好塩基球活性化を測定した。
【００７６】
牧草花粉（Lolium perenne）アレルゲン断片についての結果が図５Ａに示されている。アレルゲンはアレルギー対象の好塩基球活性化を特異的に誘導し、非アトピー対象の血液試料では活性化が認められなかった。図５Ａに示されるように、ペプチドに比べて、非加水分解アレルゲンは２０〜４０倍強力に好塩基球の脱顆粒反応を誘導した。
【００７７】
ピーナッツ（Arachis hypogaea）アレルゲン断片についての結果が図５Ｂに示されている。アレルゲンはアレルギー対象の好塩基球活性化を特異的に誘導し、非アトピー対象の血液試料では活性化が認められなかった。図５Ｂに示されるように、ペプチドに比べて、非加水分解アレルゲンは５倍強力に好塩基球の脱顆粒反応を誘導した。
【００７８】
イエダニ（Dermatophagoides pteronyssinu）アレルゲン断片についての結果が図５Ｃに示されている。アレルゲンはアレルギー対象の好塩基球活性化を特異的に誘導し、非アトピー対象の血液試料では活性化が認められなかった。図５Ｃに示されるように、ペプチドに比べて、非加水分解アレルゲンは１０倍強力に好塩基球の脱顆粒反応を誘導した。
【００７９】
実施例４．５：免疫原性  すなわちＣＤ１９＋ＩＬ１０＋Ｂ細胞の誘導
フローサイトメトリーを用いて、アレルギー個体（ＡＰ、ｎ＝１６）及び非アトピー個体（ＮＡＣ、ｎ＝６）から単離されたＰＢＭＣに対するアレルゲン断片及び非加水分解アレルゲン（タンパク質）の効果を評価した。０μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、及び１０μｇ／ｍＬの濃度のアレルゲン断片又は全長アレルゲンを用いて、ＰＢＭＣを３７℃で７２時間刺激した。ＰＭＡ、イオノマイシン、及びＢＦＡ（ブレフェルジンＡ）を使用して細胞を刺激して、３７℃で合計５時間インキュベートした。インキュベートした後に細胞をＣＤ１９について室温で３０分間免疫染色した。サイトフィックス／サイトパーム（Cytofix/Cytoperm）試薬を４℃で２０分間使用して細胞を固定及び透過処理し、ＩＬ１０について３０分間免疫染色した。細胞を洗浄し、細胞染色緩衝液に再懸濁した後にＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ機器上で計測を行った。
【００８０】
牧草花粉（Lolium perenne）アレルゲン断片の結果については図６Ａに示されており、ピーナッツ（Arachis hypogaea）アレルゲン断片の結果については図６Ｂに示されており、イエダニ（Dermatophagoides pteronyssinu）アレルゲン断片の結果については図６Ｃに示されている。３つのアレルゲンの全てについて、ＣＤ１９＋ＩＬ１０＋Ｂ細胞の割合は、非アトピー対象において、未処理タンパク質と比較してペプチドバッチでの刺激後に著しく上昇した。この上昇はＣＤ１９＋ＩＬ１０＋Ｂ細胞において用量依存的に観察された。同様の傾向がアレルギー対象で認められた。
【００８１】
実施例４．６：免疫原性  ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋ＩＬ１０＋Ｂ細胞の誘導
フローサイトメトリーを用いて、アレルギー患者（ＡＰ、ｎ＝１６）及び非アトピー個体（ＮＡＣ、ｎ＝６）からＰＢＭＣを単離した。異なるバッチのペプチド又は未処理タンパク質を０μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、及び１０μｇ／ｍＬの濃度で用いてＰＢＭＣを３７℃で７２時間刺激した。ＰＭＡ、イオノマイシン、及びＢＦＡ（ブレフェルジンＡ）を使用して細胞を刺激して、３７℃で合計５時間インキュベートした。インキュベートした後に細胞を、ＣＤ１９、ＣＤ２７について室温で３０分間免疫染色した。サイトフィックス／サイトパーム試薬を４℃で２０分間使用して細胞を固定及び透過処理し、ＩＬ１０について３０分間免疫染色した。細胞を洗浄し、細胞染色緩衝液に再懸濁した後にＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ機器上で計測を行った。
【００８２】
図７Ａは牧草花粉（Lolium perenne）のアレルゲン断片についての結果、図７Ｂはピーナッツ（Arachis hypogaea）のアレルゲン断片についての結果、及び図７Ｃはイエダニ（Dermatophagoides pteronyssinus）のアレルゲン断片についての結果を示している。ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋ＩＬ１０＋Ｂ細胞の割合は、非アトピー対象及びアレルギー患者において未処理タンパク質と比較してペプチドバッチでの刺激後に著しく上昇した。この上昇は用量依存的に観察された。上昇の程度は非アトピー対象で最も顕著であった。
【００８３】
実施例４．７：免疫原性  ＣＤ１９＋ＣＤ５＋ＣＤ３８ｈｉＣＤ２４ｈｉＩＬ１０＋Ｂ細胞の誘導
フローサイトメトリーを用いて、アレルギー患者（ＡＰ、ｎ＝１６）及び非アトピー個体（ＮＡＣ、ｎ＝６）からＰＢＭＣを単離した。異なるバッチのペプチド又は未処理タンパク質を０μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、及び１０μｇ／ｍＬの濃度で用いてＰＢＭＣを３７℃で７２時間刺激した。ＰＭＡ、イオノマイシン、及びＢＦＡ（ブレフェルジンＡ）を使用して細胞を刺激して、３７℃で合計５時間インキュベートした。インキュベートした後に細胞を、ＣＤ１９、ＣＤ５、ＣＤ３８、ＣＤ２４について室温で３０分間免疫染色した。サイトフィックス／サイトパーム試薬を４℃で２０分間使用して細胞を固定及び透過処理し、ＩＬ１０について３０分間免疫染色した。細胞を洗浄し、細胞染色緩衝液に再懸濁した後にＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ機器上で計測を行った。
【００８４】
図８Ａは牧草花粉（Lolium perenne）のアレルゲン断片についての結果、図８Ｂはピーナッツ（Arachis hypogaea）のアレルゲン断片についての結果、及び図８Ｃはイエダニ（Dermatophagoides pteronyssinus）のアレルゲン断片についての結果を示している。ＰＢＭＣ中のＣＤ１９＋ＣＤ５＋ＣＤ３８ｈｉＣＤ２４ｈｉＢ細胞の割合は、非アトピー対象において未処理タンパク質と比較してペプチドバッチでの刺激後に著しく上昇した。この上昇は用量依存的に観察された。また、ＰＢＭＣ中のＣＤ１９＋ＣＤ５＋ＣＤ３８ｈｉＣＤ２４ｈｉＢ細胞の割合は、アレルギー対象において未処理タンパク質と比較してペプチドバッチでの刺激後に著しく上昇した。
【００８５】
実施例４．８：免疫原性  ＣＤ１９＋ＣＤ５＋ＣＤ３８ｉｎｔＣＤ２４ｉｎｔＩＬ１０＋Ｂ細胞の誘導
フローサイトメトリーを用いて、アレルギー患者（ＧＰＡ、ｎ＝１６）及び非アトピー個体（ＮＡＣ、ｎ＝６）からＰＢＭＣを単離した。異なるバッチのペプチド又は未処理タンパク質を０μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、及び１０μｇ／ｍＬの濃度で用いてＰＢＭＣを３７℃で７２時間刺激した。ＰＭＡ、イオノマイシン、及びＢＦＡ（ブレフェルジンＡ）を使用して細胞を刺激して、３７℃で合計５時間インキュベートした。インキュベートした後に細胞を、ＣＤ１９、ＣＤ５、ＣＤ３８、ＣＤ２４について室温で３０分間免疫染色した。サイトフィックス／サイトパーム試薬を４℃で２０分間使用して細胞を固定及び透過処理し、３０分間ＩＬ１０について免疫染色した。細胞を洗浄し、細胞染色緩衝液に再懸濁した後にＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ機器上で計測を行った。
【００８６】
図９Ａは牧草花粉（Lolium perenne）のアレルゲン断片についての結果、図９Ｂはピーナッツ（Arachis hypogaea）のアレルゲン断片についての結果、及び図９Ｃはイエダニ（Dermatophagoides pteronyssinus）のアレルゲン断片についての結果を示している。ＰＢＭＣＳ中のＣＤ１９＋ＣＤ５＋ＣＤ３８ｉｎｔＣＤ２４ｉｎｔＢ細胞の割合は、非アトピー対象において未処理タンパク質と比較してペプチドバッチでの刺激後に著しく上昇した。この上昇は用量依存的に観察された。また、ＰＢＭＣ中のＣＤ１９＋ＣＤ５＋ＣＤ３８ｈｉＣＤ２４ｈｉＢ細胞の割合は、アレルギー対象において未処理タンパク質と比較してペプチドバッチでの刺激後に著しく上昇した。
【図１Ａ】
2021521867.tif 000004
【図１Ｂ】
2021521867.tif 000005
【図１Ｃ】
2021521867.tif 000006
【図２Ａ】
2021521867.tif 000007
【図２Ｂ】
2021521867.tif 000008
【図２Ｃ】
2021521867.tif 000009
【図３Ａ】
2021521867.tif 000010
【図３Ｂ】
2021521867.tif 000011
【図３Ｃ】
2021521867.tif 000012
【図４Ａ】
2021521867.tif 000013
【図４Ｂ】
2021521867.tif 000014
【図５Ａ】
2021521867.tif 000015
【図５Ｂ】
2021521867.tif 000016
【図５Ｃ】
2021521867.tif 000017
【図６Ａ】
2021521867.tif 000018
【図６Ｂ】
2021521867.tif 000019
【図６Ｃ】
2021521867.tif 000020
【図７Ａ】
2021521867.tif 000021
【図７Ｂ】
2021521867.tif 000022
【図７Ｃ】
2021521867.tif 000023
【図８Ａ】
2021521867.tif 000024
【図８Ｂ】
2021521867.tif 000025
【図８Ｃ】
2021521867.tif 000026
【図９Ａ】
2021521867.tif 000027
【図９Ｂ】
2021521867.tif 000028
【図９Ｃ】
2021521867.tif 000029
【国際調査報告】
2021521867.tif 000030
2021521867.tif 000031
2021521867.tif 000032
2021521867.tif 000033