(57)【要約】本発明は、改善されたインビボ半減期を有するENPP1ポリペプチドを含む。本発明はさらに、免疫グロブリンのFc領域に融合されたENPP1ポリペプチドを含み少なくとも1つの点変異を含むENPP1ポリペプチド融合体を提供する。2021535153.tif 000016
2021535153.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリンのFc領域に融合されたENPP1ポリペプチドを含むENPP1ポリペプチド融合体であって、
該Fc領域が、SEQ ID NO:7に関するM883Y、S885N、S885T、T887E、H1064K、およびN1065Fからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、該ENPP1ポリペプチド融合体。
【請求項２】
前記Fc領域が、SEQ ID NO:7に関するS885N、M883Y、M883Y/S885T/T887E、およびH1064K/N1065Fからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、請求項1記載のポリペプチド融合体。
【請求項３】
免疫グロブリンのFc領域に融合されたENPP1ポリペプチドを含むENPP1ポリペプチド融合体であって、
該ENPP1ポリペプチドが、SEQ ID NO:7に関するC25N、K27T、およびV29Nからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、該ENPP1ポリペプチド融合体。
【請求項４】
前記ENPP1ポリペプチドが、SEQ ID NO:7に関するC25N/K27TおよびV29Nからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、請求項3記載のポリペプチド融合体。
【請求項５】
免疫グロブリンのFc領域に融合されたENPP1ポリペプチドを含むENPP1ポリペプチド融合体であって、
該ENPP1ポリペプチドが、SEQ ID NO:7に関するK369NおよびI371Tからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、該ENPP1ポリペプチド融合体。
【請求項６】
前記ENPP1ポリペプチドが、SEQ ID NO:7に関する少なくとも変異K369N/I371Tを含む、請求項5記載のポリペプチド融合体。
【請求項７】
免疫グロブリンのFc領域に融合されたENPP1ポリペプチドを含むENPP1ポリペプチド融合体であって、
該ENPP1ポリペプチドが、SEQ ID NO:7に関するP534N、V536T、R545T、P554L、E592N、R741D、およびS766Nからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、該ENPP1ポリペプチド融合体。
【請求項８】
前記ENPP1ポリペプチドが、SEQ ID NO:7に関するP534N/V536T、P554L/R545T、E592N、E592N/R741D、およびS766Nからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、請求項7記載のポリペプチド融合体。
【請求項９】
免疫グロブリンのFc領域に融合されたENPP1ポリペプチドを含むENPP1ポリペプチド融合体であって、
該ENPP1ポリペプチドが、SEQ ID NO:7に関するE864NおよびL866Tからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、該ENPP1ポリペプチド融合体。
【請求項１０】
前記ENPP1ポリペプチドが、SEQ ID NO:7に関する少なくとも変異E864N/L866Tを含む、請求項9記載のポリペプチド融合体。
【請求項１１】
SEQ ID NO:7に関するC25N、K27T、V29N、C25N/K27T、K369N、I371T、K369N/I371T、P534N、V536T、R545T、P554L、E592N、R741D、S766N、P534N/V536T、P554L/R545T、E592N/R741D、E864N、L866T、E864N/L866T、M883Y、S885N、S885T、T887E、H1064K、N1065F、M883Y/S885T/T887E、H1064K/N1065Fからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、請求項1、3、5、7、および9のいずれか一項記載のポリペプチド融合体。
【請求項１２】
前記Fc領域がIgGのFc領域である、請求項1、3、5、7、および9のいずれか一項記載のポリペプチド融合体。
【請求項１３】
SEQ ID NO:7に関するP534N、V536T、R545T、P554L、S766N、およびE592Nからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、請求項1、3、5、7、および9のいずれか一項記載のポリペプチド融合体。
【請求項１４】
SEQ ID NO:7に関するS766N、P534N/Y536T、P554L/R545T、およびE592Nからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、請求項1、3、5、7、および9のいずれか一項記載のポリペプチド融合体。
【請求項１５】
SEQ ID NO:7に関するS885N、S766N、M883Y/S885T/T887E、E864N/L866T、P534N/V536T/H1064K/N1065F、P554L/R545T、S766N/H1064K/N1065F、E592N/H1064K/N1065F、およびP534N/V536T/M883Y/S885T/T887Eからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、請求項1、3、5、7、および9のいずれか一項記載のポリペプチド融合体。
【請求項１６】
ENPP1ポリペプチドと免疫グロブリンのFc領域とを含むENPP1ポリペプチド融合体であって、
SEQ ID NO:7に関する変異M883Y、S885T、およびT887Eを含む、該ENPP1ポリペプチド融合体。
【請求項１７】
ENPP1ポリペプチドと免疫グロブリンのFc領域とを含むENPP1ポリペプチド融合体であって、
SEQ ID NO:7に関する変異P534N、V536T、M883Y、S885T、およびT887Eを含む、該ENPP1ポリペプチド融合体。
【請求項１８】
ENPP1ポリペプチドと免疫グロブリンのFc領域とを含むENPP1ポリペプチド融合体であって、
SEQ ID NO:7に関する変異E592N、H1064K、およびN1065Fを含む、該ENPP1ポリペプチド融合体。
【請求項１９】
SEQ ID NO:7を含み、SEQ ID NO:7に関するS766N、P534N、V536T、P554L、R545T、およびE592Nからなる群より選択される変異を含む、ENPP1変異ポリペプチド。
【請求項２０】
SEQ ID NO:7に関するS766N、P534N/V536T、P554L/R545T、およびE592Nからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、請求項19記載の変異ポリペプチド。
【請求項２１】
SEQ ID NO:7に関するS885N、S766N、M883Y/S885T/T887E、P534N/V536T/H1064K/N1065F、P554L/R545T、S766N/H1064K/N1065F、E592N/H1064K/N1065F、およびP534N/V536T/M883Y/S885T/T887Eからなる群より選択される変異を含む、請求項19記載の変異ポリペプチド。
【請求項２２】
SEQ ID NO:7に関するS885N変異を含む、請求項19記載の変異ポリペプチド。
【請求項２３】
SEQ ID NO:7に関するS766N変異を含む、請求項19記載の変異ポリペプチド。
【請求項２４】
SEQ ID NO:7に関する変異M883Y、S885T、およびT887Eを含む、請求項19記載の変異ポリペプチド。
【請求項２５】
SEQ ID NO:7に関する変異P534N、V536T、H1064K、およびN1065Fを含む、請求項19記載の変異ポリペプチド。
【請求項２６】
SEQ ID NO:7に関する変異P554LおよびR545Tを含む、請求項19記載の変異ポリペプチド。
【請求項２７】
SEQ ID NO:7に関する変異S766N、H1064K、およびN1065Fを含む、請求項19記載の変異ポリペプチド。
【請求項２８】
SEQ ID NO:7に関する変異E592N、H1064K、およびN1065Fを含む、請求項19記載の変異ポリペプチド。
【請求項２９】
SEQ ID NO:7に関する変異P534N、V536T、M883Y、S885T、およびT887Eを含む、請求項19記載の変異ポリペプチド。
【請求項３０】
ヒトST6β-ガラクトサミドα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ（ST6GAL1としても公知）を安定的にトランスフェクトされたCHO細胞株から発現される、請求項1、3、5、7、9、16、17、および18のいずれか一項記載のポリペプチド融合体または請求項19記載の変異ポリペプチド。
【請求項３１】
シアル酸および／またはN-アセチルマンノサミン（1,3,4-O-Bu3ManNAcとしても公知）を補充した細胞培養物中で増大させた、請求項1、3、5、7、9、16、17、および18のいずれか一項記載のポリペプチド融合体または請求項19記載の変異ポリペプチド。
【請求項３２】
その必要のある対象において病的な石灰化を減少させるまたはその進行を予防する方法であって、
請求項1、3、5、7、9、16、17、および18のいずれか一項記載のポリペプチド融合体または請求項19記載の変異ポリペプチドの治療有効量を該対象に投与する工程を含む、該方法。
【請求項３３】
その必要のある対象において病的な骨化を減少させるまたはその進行を予防する方法であって、
請求項1、3、5、7、9、16、17、および18のいずれか一項記載のポリペプチド融合体または請求項19記載の変異ポリペプチドの治療有効量を該対象に投与する工程を含む、該方法。
【請求項３４】
その必要のある対象において軟組織の異所性石灰化を減少させるまたはその進行を予防する方法であって、
請求項1、3、5、7、9、16、17、および18のいずれか一項記載のポリペプチド融合体または請求項19記載の変異ポリペプチドの治療有効量を該対象に投与する工程を含む、該方法。
【請求項３５】
その必要のある対象において後縦靭帯骨化（OPLL）を処置する、それを好転させる、またはその進行を予防する方法であって、
請求項1、3、5、7、9、16、17、および18のいずれか一項記載のポリペプチド融合体または請求項19記載の変異ポリペプチドの治療有効量を該対象に投与する工程を含む、該方法。
【請求項３６】
その必要のある対象において低リン血症性くる病を処置する、それをもとに戻す、またはその進行を予防する方法であって、
請求項1、3、5、7、9、16、17、および18のいずれか一項記載のポリペプチド融合体または請求項19記載の変異ポリペプチドの治療有効量を該対象に投与する工程を含む、該方法。
【請求項３７】
慢性腎疾患（CKD）、末期腎疾患（ESRD）、尿毒症性細小動脈石灰化症（CUA）、カルシフィラキシス、後縦靭帯骨化（OPLL）、低リン血症性くる病、変形性関節症、加齢性動脈硬化、特発性乳児動脈石灰化症（IIAC）、乳児全身性動脈石灰化（GACI）、および動脈硬化プラーク石灰化からなる群より選択される少なくとも１つの疾患を、該少なくとも1つの疾患を有すると診断された対象において軽減するまたはその進行を予防する方法であって、
請求項1、3、5、7、9、16、17、および18のいずれか一項記載のポリペプチド融合体または請求項19記載の変異ポリペプチドの治療有効量を該対象に投与する工程を含む、該方法。
【請求項３８】
その必要のある対象において加齢性動脈硬化を軽減するまたはその進行を予防する方法であって、
請求項1、3、5、7、9、16、17、および18のいずれか一項記載のポリペプチド融合体または請求項19記載の変異ポリペプチドの治療有効量を該対象に投与する工程を含む、該方法。
【請求項３９】
前記病的な石灰化が、特発性乳児動脈石灰化症（IIAC）および動脈硬化プラーク石灰化からなる群より選択される、請求項32記載の方法。
【請求項４０】
前記病的な骨化が、後縦靭帯骨化（OPLL）、低リン血症性くる病、および変形性関節症からなる群より選択される、請求項33記載の方法。
【請求項４１】
軟組織石灰化が、IIACおよび変形性関節症からなる群より選択される、請求項34記載の方法。
【請求項４２】
前記軟組織が、動脈硬化プラーク、筋性動脈、関節、脊椎、関節軟骨、椎間板軟骨（vertebral disk cartilage）、血管、および結合組織からなる群より選択される、請求項34記載の方法。
【請求項４３】
ピロリン酸（PPi）正常レベルよりも低いPPiレベルを有する対象においてPPiレベルを上昇させる方法であって、
請求項1、3、5、7、9、16、17、および18のいずれか一項記載のポリペプチド融合体または請求項19記載の変異ポリペプチドの治療有効量を該対象に投与する工程を含み、それによって、投与すると該対象におけるPPiのレベルが、少なくとも2μMの正常レベルまで上昇し、かつほぼ同じレベルで維持される、該方法。
【請求項４４】
ピロリン酸（PPi）正常レベルよりも低いPPiレベルを有する対象において病的な石灰化もしくは骨化を減少させるまたはそれらの進行を予防する方法であって、
請求項1、3、5、7、9、16、17、および18のいずれか一項記載のポリペプチド融合体または請求項19記載の変異ポリペプチの治療有効量を対象に投与する工程を含み、それによって、対象における病的な石灰化もしくは骨化が減少するまたは対象における病的な石灰化もしくは骨化の進行が予防される、該方法。
【請求項４５】
その必要のある対象において細胞外ピロリン酸（PPi）濃度の減少により顕在化したENPP1欠損症を処置する方法であって、
請求項1、3、5、7、9、16、17、および18のいずれか一項記載のポリペプチド融合体または請求項19記載の変異ポリペプチドの治療有効量を該対象に投与する工程を含み、それによって該対象におけるPPiのレベルが上昇する、該方法。
【請求項４６】
前記ポリペプチド融合体または変異ポリペプチドが、哺乳類細胞において発現されたENPP1前駆タンパク質の分泌産物であり、該ENPP1前駆タンパク質がシグナルペプチド配列およびENPP1ポリペプチドを含み、該ENPP1前駆タンパク質がタンパク質分解プロセシングを受けて該ENPP1ポリペプチドが生成される、請求項32〜38および43〜45のいずれか一項記載の方法。
【請求項４７】
前記ENPP1前駆タンパク質において、前記シグナルペプチド配列が前記ENPP1ポリペプチドのN末端にコンジュゲートされている、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
前記シグナルペプチド配列が、ENPP1シグナルペプチド配列、ENPP2シグナルペプチド配列、ENPP7シグナルペプチド配列、およびENPP5シグナルペプチド配列からなる群より選択される、請求項46記載の方法。
【請求項４９】
前記ポリペプチド融合体または変異ポリペプチドが急性的または慢性的に前記対象に投与される、請求項32〜38および43〜45のいずれか一項記載の方法。
【請求項５０】
前記ポリペプチド融合体または変異ポリペプチドが、局所的、局部的、非経口的、または全身的に前記対象に投与される、請求項32〜38および43〜45のいずれか一項記載の方法。
【請求項５１】
前記ポリペプチド融合体または変異ポリペプチドが、皮下、経口、エアゾール、吸入、直腸、膣、経皮、皮下、鼻内、頬側、舌下、非経口、髄腔内、胃内、点眼、肺、および局所からなる群より選択される少なくとも1つの経路によりに前記対象に投与される、請求項32〜38および43〜45のいずれか一項記載の方法。
【請求項５２】
前記ポリペプチド融合体または変異ポリペプチドが、少なくとも1つの薬学的に許容される担体をさらに含む薬学的組成物として前記対象に投与される、請求項32〜38および43〜45のいずれか一項記載の方法。
【請求項５３】
前記対象が哺乳類である、請求項32〜38および43〜45のいずれか一項記載の方法。
【請求項５４】
前記哺乳類がヒトである、請求項53記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、35 U.S.C.§119(e)の下で、2018年8月31日に出願された米国仮特許出願第62/725,607号および2019年4月5日に出願された米国仮特許出願第62/830,247号に対する優先権を主張し、そのすべてについて、それらの全体を参照により本明細書に組み入れる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒトエクトヌクレオチドピロホスファターゼ（ENPP）タンパク質ファミリーは、ホスホジエステル結合を加水分解する7つの細胞外グリコシル化タンパク質（すなわち、ENPP1〜ENPP7）を含む。ENPPは、原形質膜に輸送されるがフリンによって切断され細胞外液に放出されるENPP2を除いて、細胞表面酵素である。ENPP酵素は、高度の配列および構造相同性を有するが、ヌクレオチドから脂質まで含む多様な基質特異性を示す。
【０００３】
ENPP1（PC-1としても公知）は、骨芽細胞および軟骨細胞のミネラル蓄積基質小胞に位置する2型細胞外膜結合糖タンパク質であり、細胞外ヌクレオチド（主にATP）をアデノシン一リン酸（AMP）および無機ピロリン酸（PPi）に加水分解する。PPiは、新たに発生するヒドロキシアパタイト（HA）結晶に結合し、それによって、これらの結晶の将来の成長を防ぐことにより異所性組織鉱質形成の強力な阻害剤として機能する。ENPP1は、ヌクレオチド三リン酸（NTP）の加水分解を通じてPPiを生成する。進行性強直症タンパク質（ANK）は、細胞内のPPiを細胞外空間に輸送し、組織非特異的アルカリホスファターゼ活性（TNAP）はPPiからPiへの直接的な加水分解を通じてPPiを除去する。
【０００４】
異所性組織鉱質形成は、慢性関節疾患および急性致死性乳幼児症候群を含む多くのヒト疾患に関連する。望まれない組織石灰化を防ぐため、組織鉱質形成を促進する因子と阻害する因子が厳格なバランスで維持されなければならない。細胞外無機ピロリン酸（PPi）とリン酸（Pi）のバランスは、異所性組織鉱質形成の重要な調節因子である。3つの細胞外酵素であるTNAP、ANK、およびENPP1の活性は、哺乳類においてPiおよびPPiの濃度をそれぞれ1〜3 mMおよび2〜3 μMに厳格に制御している。PPiは、生体内鉱質形成の調節因子であり、非晶質リン酸カルシウムからの塩基性リン酸カルシウムの形成を阻害する。
【０００５】
ENPP1ポリペプチドは、特定の異所性組織石灰化疾患を処置する上で有効であることが示されている。ENPP1-Fcは、乳幼児において発生し広範囲の動脈石灰化を伴う深刻な疾患であるGACI（乳児全身性動脈石灰化）のマウスモデルにおいて全身性動脈石灰化を軽減させることが示されている（Albright, et al., 2015, Nature Comm. 10006（非特許文献1））。ENPP1の融合タンパク質もまた、重度の組織石灰化疾患を処置することが報告されており（PCT出願公報番号WO2014/126965（特許文献1）および同WO2016/187408（特許文献2）)、骨標的化ドメインを含むENPP1の融合タンパク質はGACIを処置することが報告されている（PCT出願公報番号WO/2012/125182（特許文献3））。
【０００６】
インビボで特定の石灰化または骨化疾患を処置するために使用することができるポリペプチドが、当技術分野で必要とされている。そのようなポリペプチドは、その必要のある対象への同ポリペプチドの便利かつ効果的な投与を可能にするインビボ半減期を有するべきである。本発明は、この要望を満たすものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO2014/126965
【特許文献２】WO2016/187408
【特許文献３】WO/2012/125182
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Albright, et al., 2015, Nature Comm. 10006
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、免疫グロブリンのFc領域に融合されたENPP1ポリペプチドを含み、本明細書に記載される少なくとも1つの点変異を含む、ENPP1ポリペプチド融合体を提供する。本発明はさらに、本明細書の他所に記載される少なくとも1つの点変異を含むENPP1変異ポリペプチドを提供する。本発明はさらに、いずれもヒトST6β-ガラクトサミドα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ（ST6GAL1）を安定的にトランスフェクトされたCHO細胞株から発現される、ポリペプチド融合体および／または変異ポリペプチドを提供する。本発明はさらに、ポリペプチド融合体および／または変異ポリペプチドを提供し、それらのいずれかは、シアル酸および／またはN-アセチルマンノサミン（1,3,4-O-Bu3ManNAc）を補充した細胞培養物中で増大させる。
【００１０】
本発明はさらに、その必要のある対象において、病的な石灰化を減少させかつ／またはその進行を予防する方法であって、本発明のポリペプチド融合体および／または変異ポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、その必要のある対象において病的な骨化を減少させかつ／またはその進行を予防する方法であって、本発明のポリペプチド融合体および／または変異ポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、その必要のある対象において軟組織の異所性石灰化を減少させかつ／またはその進行を予防する方法であって、本発明のポリペプチド融合体および／または変異ポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、その必要のある対象において後縦靭帯骨化（OPLL）を処置し、好転させ、かつ／またはその進行を予防する方法であって、本発明のポリペプチド融合体および／または変異ポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、その必要のある対象において低リン血症性くる病を処置し、それをもとに戻し、かつ／またはその進行を予防する方法であって、本発明のポリペプチド融合体および／または変異ポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
【００１５】
本発明はさらに、慢性腎疾患（CKD）、末期腎疾患（ESRD）、尿毒症性細小動脈石灰化症（CUA）、カルシフィラキシス、後縦靭帯骨化（OPLL）、低リン血症性くる病、変形性関節症、加齢性動脈硬化、特発性乳児動脈石灰化症（IIAC）、乳児全身性動脈石灰化（GACI）、および動脈硬化プラーク石灰化からなる群より選択される少なくとも１つの疾患を、該少なくとも1つの疾患を有すると診断された対象において軽減させかつ／またはその進行を予防する方法であって、本発明のポリペプチド融合体および／または変異ポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、その必要のある対象において加齢性動脈硬化を減少させかつ／またはその進行を予防する方法であって、本発明のポリペプチド融合体および／または変異ポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
【００１７】
本発明はさらに、ピロリン酸（PPi）正常レベルよりも低いPPiレベルを有する対象においてPPiレベルを上昇させる方法であって、本発明のポリペプチド融合体および／または変異ポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含み、それによって、投与すると対象におけるPPiのレベルが、少なくとも2μMの正常レベルまで上昇し、かつほぼ同じレベルで維持される、方法を提供する。
【００１８】
本発明はさらに、ピロリン酸（PPi）正常レベルよりも低いPPiレベルを有する対象において病的な石灰化もしくは骨化を減少させかつ／またはそれらの進行を予防する方法であって、本発明のポリペプチド融合体および／または変異ポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含み、それによって、対象における病的な石灰化および／もしくは骨化が減少しかつ／または対象における病的な石灰化および／もしくは骨化の進行が予防される、方法を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、その必要のある対象において細胞外ピロリン酸（PPi）濃度の減少により顕在化したENPP1欠損症を処置する方法であって、本発明のポリペプチド融合体および／または変異ポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含み、それによって、対象におけるPPiのレベルが上昇する、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
以下の本発明の例示的な態様の詳細な説明は、添付図面と共に読まれることでより理解されると考えられる。本発明を説明する目的で、例示的な態様が図面に示されている。しかし、本発明は、図面に示される態様の正確な配置および手段に限定されないことが理解されるべきである。
【図１】本発明において意図されるENPP1ポリペプチド（SEQ ID NO:7）を示す。点変異は、「親化合物」または「構築物＃770」としても参照され得るSEQ ID NO:7を参照して特定される。ラベル付けスキームは、SEQ ID NO:7において示される番号付けスキームを参照してアミノ酸番号および残基を示し、それに続いてSEQ ID NO:7における残基と置換されたアミノ酸を示す。例えば、変異C25Nは、SEQ ID NO:7の25位におけるシステイン（CysまたはC）に対するアスパラギン（AsnまたはN）の置換を表す。注釈：（A)＝hENPP7由来のN末端シグナル配列；（B)すべての黒色の領域は、正式なドメインの定義を有さないhENPP1由来の配列を表す；（C)＝hENPP1のソマトメジンBドメイン；（D）＝hENPP1の触媒ドメイン；（E)＝hENPP1のエンドヌクレアーゼドメイン；（F)＝InvivogenプラスミドpFUSE-hIgG1-Fc由来のFcドメイン；（G)＝hENPP1とFcドメインの間の4アミノ酸リンカー；（H)＝既知のグリコシル化残基。
【図２】マウス（n=3〜5）における特定のENPP1ポリペプチドの1回の注射後の（チミジン5'-一リン酸 p-ニトロフェニルエステルアッセイまたはpNP-TMPアッセイを用いて測定された）血漿ホスホジエステラーゼ活性をまとめた棒グラフを示す。すべてのポリペプチドにおいて、ホスホジエステラーゼ活性は25時間後に上昇した状態を維持し、構築物＃981（関心対象の構築物は本明細書の他所に含まれる表で概説されている）において75時間でより高い活性が観察された。
【図３】構築物の皮下注射後のマウスの血漿サンプルにおける酵素活性を記録するためにpNP-TNPアッセイを用いて測定された、構築物＃981のインビボ薬物動態データを示す。その半減期は、5匹のマウスへの1回の皮下ボーラス注射に基づきおよそ122時間と概算された。半減期に到達する別の実験が、本明細書の他所に記載されている。
【図４】構築物＃1014、1,3,4-O-Bu3ManNAcを補充した培養用培地中で増殖されたCHO細胞において調製された構築物＃1014（グラフ中では「1014A」と示されている）および構築物＃981の選択されたインビボ薬物動態データを示す。構築物の半減期は、本明細書の他所に記載される等式1から導くことができる。
【図５】すべてランダムコイル領域に位置する、ENPP1における3つの既知のグリコシル化部位を示す：（A）＝Asn；（B)＝N-アセチルグルコサミン。（表面糖タンパク質ダイナミクス測定により同定された）1つのさらなるグリコシル化部位は、αヘリックス内に位置し、赤色で標識されている。グリコシル化されることが未だ知られていないPDB不安定領域に1つのコンセンサスNLT（Asn Leu Thr）が位置している。そのグリコシル化状態が未知であるhENPP1において4つのさらなるコンセンサス配列が見出される。カルシウム原子（C）；2亜鉛原子（D）；ATP分子（E）。
【図６Ａ】ヒト疾患「乳児全身性動脈石灰化」（GACI）を引き起こす既知の機能喪失変異を有するヒトENPP1の特定のドメインを示す。特定の態様において、グリコシル化部位は、GACIを引き起こす既知の機能喪失変異を有する領域付近に導入されない（図6Aに示されている）。
【図６Ｂ】GACIを引き起こす既知の機能喪失変異が強調表示された（*を付された）残基を含む、ENPP1の結晶構造を示す。（B)の残基は、触媒ドメインに位置し、T238Aに対応する。図5にあるように、カルシウム原子（C)；2亜鉛原子；（D)ATP分子（E）。
【図７】図7A〜7Dは、ホスホジエステラーゼ活性に関するENPP1ポリペプチドの高スループットTMP-pNP（チミジン一リン酸-p-ニトロフェニル）アッセイからの選択された結果を示す。これは、本発明者らが構築物＃770に導入されたグリコシル化アイソフォームを高速スクリーンするために設計された高スループットアッセイである。同図は、親化合物、つまり構築物＃770の変異形態の生物学的効果の高速評価を行うことができる高スループットスクリーンの設計および実施を示している。（＃）の構築物番号は、変異を導入する前のもとのWTクローンを表す。（＊）の構築物番号は、推定機能獲得変異を有するクローンを示す。
【図８】図8Aは、ヒトIgG1のFcドメインを示すリボン図である。このドメインは、効果を高めるために、ENPP1のC末端部分に融合される。FcRnによるpH依存性リサイクルを強化するよう、Fcドメイン内に変異を導入した。（A)＝酸性依存性の結合を排除する部位。（B)＝結合を強化する部位。（C)＝システインジスルフィド結合。マゼンタ＝既知のグリコシル化部位。図8Bは、FcRnによるpH依存性リサイクルを強化することが知られているヒトIgG1のFcドメイン内の変異を示す。
【図９】ENPP1ポリペプチドのPK（半減期、時間）および生物学的利用能におけるグリコシル化の効果を示すグラフおよび表を含む。すべての変異について、PKは、構築物＃CC07（770B）のそれと同等であった。さらに、構築物＃951は、構築物＃CC07のそれと同様のPK値を示したが、ST6GAL1を安定的にトランスフェクトされた細胞株において増大させた構築物＃951（構築物＃951-ST）は改善されたPKおよび生物学的利用能を示した。構築物＃930は、構築物＃CC07と同様の半減期を有したが、それより低い生物学的利用能を有した。これに対して、構築物＃1020は、構築物＃CC07よりも高い生物学的利用能を有した。図3、4、および12に示されるように測定し、等式1を用いて算出したPKおよび生物学的利用能データが、表に示されている。
【図１０】ENPP1ポリペプチドの半減期（PK、時間）および生物学的利用能（AUC）におけるグリコシル化およびH1064K/N1065F Fc変異の効果を示すグラフおよび表を含む。全H1064/N1065含有構築物が、構築物#770Bよりも改善された半減期およびAUC値を示した。構築物＃1048および＃1051は2つの別個のクローン内の同一cDNAに対応し、本明細書に提供されるPK/AUC分析の再現性を示すものであることを付記する。構築物＃1064をまた、ST6GAL1を安定的にトランスフェクトされた細胞株において増大させた（構築物＃1064-ST）。構築物＃1057もまた、ST6GAL1を安定的にトランスフェクトされた細胞株において増大させ（「-ST」）（構築物＃1057-ST）、かつST6GAL1を安定的にトランスフェクトされ、1,3,4-O-Bu3-ManNAcを補充した細胞株において増大させた（「-A」）（構築物＃1064-ST-A）。構築物＃1089は、推定トリプシン切断部位を除去する変異が追加されたことを除いて構築物＃1014と同一である。構築物＃1014もまた、ST6GAL1を安定的にトランスフェクトされた細胞株において増大させたが、この例ではPKおよび生物学的利用能が改善されなかった。図3、4、および12に示されるように測定し、等式1を用いて算出したPKおよび生物学的利用能データが、表に示されている。
【図１１】ENPP1ポリペプチドのPK（半減期、時間）および生物学的利用能におけるグリコシル化およびM883Y/S885T/T887E Fc変異の効果を示すグラフおよび表を含む。構築物＃1030は、おそらくS766N変異が理由で、他の構築物よりも低いAUCを有する。構築物＃981および＃1028は、ST6GAL1を安定的にトランスフェクトされた細胞において増大させた場合、PKおよびAUCの両方の値の増加を示した。図3、4、および12に示されるように測定し、等式1を用いて算出したPKおよび生物学的利用能データが、表に示されている。
【図１２】α-2,3およびα-2,6の両方の結合を有する末端シアル酸残基を有する組み換え生体物質を生成するためにヒトα-2,6-STを安定的にトランスフェクトされたCHO細胞において構築物を発現する効果を示すグラフ集を含む。これらの細胞は、ST6GAL1細胞またはST細胞と称される（「-ST」で表される）。この図はまた、シアル酸または1,3,4-O-Bu3-ManNAcとして公知のシアル酸の高フラックス前駆体（「-A」で表される）の存在下でST6GAL1細胞において構築物を増大させる効果を示す。図3、4、および12に示されるように測定し、等式1を用いて算出したPKおよび生物学的利用能データが、表に示されている。
【図１３】図13A〜13Bは、ENPP1のドメインおよび親化合物（SEQ ID NO:7）に導入された選択された点変異を示す。同図は、SEQ ID NO:7に導入された特定の点変異を示す。ヒトα-2,6-STを安定的にトランスフェクトされたCHO細胞に安定的にトランスフェクトされた構築物は、「ST」で表されている。図3、4、および12に示されるように測定し、等式1を用いて算出したPKおよび生物学的利用能データが、表に示されている。
【図１４】シグナル配列（N末端領域）領域の変異によって分類される本発明の特定の構築物についての（曲線下面積またはAUCとしての）生物学的利用能を示す。
【図１５】エンドヌクレアーゼ領域の変異によって分類される本発明の特定の構築物についての（曲線下面積またはAUCとしての）生物学的利用能を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は、1つの局面において、当技術分野で公知のENPP1-Fcポリペプチドと比較して改善されたインビボ半減期を有する特定のENPP1-Fcポリペプチドの発見に関する。
【００２２】
1つの局面において、ENPP1-Fcポリペプチドを分解から保護するためにグリコシル化を促進した。これは、ENPP1の三次元モデルによる手引きの下で、予想される三次構造の外表面に追加のN-グリカンコンセンサス配列を導入することによって達成した。
【００２３】
別の局面において、新生児受容体（FcRn）に対する融合タンパク質の親和性を強化するようFcドメインを変異させることによって、pH依存性FcRn媒介細胞リサイクルを増加させた。
【００２４】
さらに別の局面において、ヒトST6β-ガラクトサミドα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ（ST6GAL1としても公知）を安定的にトランスフェクトされたCHO細胞株においてENPP1-Fcを発現させることによって、融合タンパク質のシアリル化を増強した。
【００２５】
さらに別の局面において、細胞培養用培地にシアル酸の「高フラックス」前駆体であるN-アセチルマンノサミン（1,3,4-O-Bu3ManNAcとしても公知）を補充することによって、シアル酸のキャップを増強した。
【００２６】
特定の態様において、ヒトα-2,6-シアリルトランスフェラーゼを安定的にトランスフェクトされたCHO細胞において生体物質を発現させることによるタンパク質のシアリル化の増強は、皮下投与されたときのENPP1-Fcの生物学的利用能（Cmax）を大きく改善した。他の態様において、Fcドメインを操作することによるpH依存性FcRn媒介細胞リサイクルの増大は、インビボでの生体物質の半減期を改善した。さらに他の態様において、ヒトα-2,6-シアリルトランスフェラーゼを安定的にトランスフェクトされたCHO細胞とN-アセチルマンノサミン中での該細胞の増殖を組み合わせることで、半減期および／または生体物質の曝露（AUC）が劇的に増加した。さらに他の態様において、本明細書に記載される2つまたはそれ以上の方法を単一の構築物に組み合わせることで、半減期および／または生体物質の曝露（AUC）が劇的に増加した。
【００２７】
特定の態様において、本発明のポリペプチドは、当技術分野における他のENPP1-Fcポリペプチドよりも高度にグリコシル化される。他の態様において、本発明のポリペプチドは、当技術分野における他のENPP1-Fcポリペプチドよりも新生児オーファン受容体（FcRn）に対して高い親和性を有する。さらに他の態様において、本発明のポリペプチドは、当技術分野における他のENPP1-Fcポリペプチドよりも長いインビボ半減期を有する。さらに他の態様において、親化合物（構築物＃770）の速度論的特性は、その変化が酵素的速度定数における「機能獲得」的な変更となるよう変更される。さらに他の態様において、本発明のENPP1-Fcポリペプチドのインビボ半減期は、当技術分野で報告されているENPP-1ポリペプチドよりも少なくとも約1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、または20倍長い。さらに他の態様において、本発明のポリペプチドは、当技術分野における他のENPP1-Fcポリペプチドよりも低用量および／または低頻度で対象に投与される。さらに他の態様において、本発明のポリペプチドは、月1回、月2回、月3回、および／または月4回、対象に投与される。さらに他の態様において、本発明のポリペプチドの低頻度の投与は、当技術分野における他のENPP1-Fcポリペプチドと比較してより良い患者コンプライアンスおよび／または高い効果をもたらす。
【００２８】
特定の態様において、本発明のENPP1-Fcポリペプチドは、（およそ2μMである）正常レベルよりも低いピロリン酸（PPi）レベルを有する対象においてPPiレベルを上昇させるために使用され得る。他の態様において、本発明のENPP1-Fcポリペプチドは、正常レベルよりも低いPPiレベルを有する対象において病的な石灰化または骨化を減少させるまたはそれらの進行を予防するために使用され得る。さらに他の態様において、本発明のENPP1-Fcポリペプチドは、対象における細胞外PPi濃度の減少により顕在化したENPP1欠損症を処置するために使用され得る。
【００２９】
特定の態様において、本発明の構築物の第1用量の投与後に達成される血漿PPiの定常状態レベルは、少なくとも2日間、少なくとも4日間、少なくとも1週間、または少なくとも1か月間の期間、維持される。
【００３０】
特定の態様において、本発明の構築物の第2用量は、血漿PPiの定常状態レベルが一定または定常状態レベルで維持され、本発明の構築物の第1用量の投与前に対象が有していたより低いPPiレベルに戻らないよう、2日後、4日後、1週間後または1か月後の適切な時間間隔の後に対象に投与される。
【００３１】
理論に拘束されることを望まないが、血漿PPiの定常状態濃度を正常レベルで維持することは、対象の病的な石灰化および病的な骨化を減少させかつ／またはそれらの進行を予防すると考えられる。
【００３２】
特定のENPP1ポリペプチド、変異体、またはその変異フラグメントは、以前に、国際PCT出願公報番号WO 2012/125182、同WO 2014/126965、同WO 2016/187408、および同WO 2018/027024で開示されており、これらのすべてについて、それらの全体を参照により本明細書に組み入れる。
【００３３】
ここで、開示される本題の特定の態様が詳細に参照されると考えられる。開示される本題は列挙される請求項に関連して記載され得るものであるが、例示されている本題は特許請求の範囲を開示される本題に限定することを意図していないことが理解されると考えられる。
【００３４】
本書を通じて、範囲形式で表される値は、その範囲の限度値として明示されている数値だけを含むのではなく、その範囲内に含まれるすべての個々の数値または部分範囲も、各々の数値および部分範囲が明示されているものとして含むよう、柔軟な様式で解釈されるべきである。例えば、「約0.1％〜約5％」または「約0.1％〜5％」の範囲は、約0.1％〜約5％だけでなく、示されている範囲内の個々の値（例えば、1％、2％、3％および4％）ならびに部分範囲（例えば、0.1％〜0.5％、1.1％〜2.2％、3.3％〜4.4％）も含むものと解釈されるべきである。「約X〜Y」という表現は、そうでないことが示されていない限り、「約X〜約Y」と同じ意味を有する。同様に、「約X、Y、または約Z」という表現は、そうでないことが示されていない限り、「約X、約Y、または約Z」と同じ意味を有する。
【００３５】
定義
本明細書で使用される場合、以下の各用語は、この節でそれに関連付けられている意味を有する。それ以外の定義がなされていない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、概ね、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。概ね、本明細書で使用される命名法および動物薬学、製薬科学、分離科学および有機化学における実験手順は、当技術分野で周知でありかつ広く用いられているものである。工程の順序または特定の行動をとる順序は、本教示が実現可能である限り重要でないことが理解されるべきである。小節の表題の使用は、当該書類の読解を補助することを意図したものであり、限定と解釈されるべきでなく、小説の表題に関連する情報は、その特定の小節の中または外に存在し得る。本書で参照されるすべての刊行物、特許、および特許書類は、個別に参照により組み入れられるように、それらの全体が参照により組み入れられる。
【００３６】
本願において、ある要素または成分が、言及されている要素または成分のリストの中に含まれておりかつ／または当該リストから選択されると言われる場合、その要素または成分は、言及されている要素または成分の任意の1つであり得ること、および言及されている要素または成分の2つまたはそれ以上からなる群より選択され得ることが理解されるべきである。
【００３７】
本明細書に記載される方法において、行動は、時系列または行動系列が明示的に示されている場合を除いて、任意の順序で行われ得る。さらに、示されている行動は、それらが別々に実施されることを請求項の文言が明示していない限り、同時に実施され得る。例えば、Xを行うという特許請求の範囲に記載の行動およびYを行うという特許請求の範囲に記載の行動は、1つのオペレーションの中で同時に実施され得、それにより形成されるプロセスは、特許請求の範囲に記載のプロセスの文言上の範囲に包含される。
【００３８】
本書において、「1つの（a）」、「1つの（an）」または「その（the）」という用語は、文脈がそうでないことを明確に示していない限り、1つまたは2つ以上を含むよう使用される。「または（もしくは）」という用語は、そうでないことが示されていない限り、非排他的な「または（もしくは）」を表すよう使用される。「AおよびBのうちの少なくとも1つ」または「AまたはBのうちの少なくとも1つ」という言及は、「A、B、またはAおよびB」と同じ意味を有する。
【００３９】
以下の表記法の慣習は、明確性のために本開示に適用される。いかなる場合でも、この慣習にしたがわない本明細書の教示もまた本開示の一部であり、その教示が開示される文脈から十分に理解され得る。タンパク質記号は、非斜体の大文字で開示される。非限定的な例として、「ENPP1」は、タンパク質を表す。特定の態様において、タンパク質がヒトタンパク質である場合、タンパク質記号の前に「h」が使用される。他の態様において、タンパク質がマウスタンパク質である場合、タンパク質記号の前に「m」が使用される。したがって、ヒトENPP1は、「hENPP1」と表され、マウスENPP1は、「mENPP1」と表される。ヒト遺伝子記号は、斜体の大文字で開示される。非限定的な例として、タンパク質hENPP1に対応するヒト遺伝子は、斜体のENPP1である。マウス遺伝子記号は、最初の文字が大文字で、残りの文字が小文字で開示され、さらに、マウス遺伝子記号は斜体にされる。非限定的な例として、タンパク質mEnpp1を生成するマウス遺伝子は、斜体のEnpp1である。遺伝子変異に関する表記は、大文字で示される。
【００４０】
「約」は、測定可能な値、例えば量、時間の長さ等を参照して本明細書で使用される場合、そのようなバリエーションが開示される方法を実施するのに適切であるかぎり、示された値からの±20％または±10％、特定の態様において±5％、特定の態様において±1％、特定の態様において±0.1％のバリエーションを包含することが意味される。
【００４１】
疾患または障害は、その疾患または障害の症状の重篤度が低減する、患者がそのような症状を体験する頻度が低減する、または両方が低減する場合には、「緩和される」。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「変更」、「欠損」、「バリエーション」、または「変異」という用語は、ミスセンスおよび非センス変異、挿入、欠失、フレームシフト、および未成熟終結を含む、それがコードするポリペプチドの機能、活性、発現（転写もしくは翻訳）、または立体構造に影響する細胞内の遺伝子の変異を表す。
【００４３】
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、特定のエピトープまたは抗原に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を表す。抗体は、天然供給源または組み換え供給源由来のインタクトな免疫グロブリンであり得、かつインタクトな免疫グロブリンの免疫反応性部分であり得る。
【００４４】
ENPP1の「ATP加水分解活性」は、ATP切断アッセイを用いて測定され得る。ENPP1は、ATPをAMPおよびPPiに直ちに加水分解する。ENPP1の定常状態ミカエリス・メンテン酵素定数は、基質としてATPを用いて測定される。ENPP1は、その酵素反応物のHPLC分析によりATPを切断することが示され得、その反応の基質および生産物の正体は、ATP、AMPおよびADP標準を用いることによって確認される。ATP基質は、ENPP1の存在下で時間とともに分解し、酵素産物AMPが蓄積される。様々な濃度のATP基質を用いて、ATPの存在下でのENPP1の初期速度が導かれ、そしてそのデータは酵素速度定数を導くために曲線にフィッティングされる。生理学的pHにおいて、NPP1の動態速度定数は、Km=144 μMおよびkcat=7.8 s-1である。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「AUC」という用語は、血漿薬物濃度・時間曲線（AUC）下の面積を表し、その用量の薬物の投与後の薬物に対する実際の身体への曝露に相関する。特定の態様において、AUCは、mg*h/Lで表される。AUCは、インタクトなまま吸収され作用部位に到達する未変化の薬物の割合、または任意の経路による投与後の全身循環の割合である、薬物の生物学的利用能を測定するために使用され得る。
【００４６】
AUCは、線形台形法または対数台形法を用いて算出され得る。線形台形法は、AUCを計算するためにデータ点間の線形補間を使用する。この方法は、OGDおよびFDAにより要求され、生物学的同等性試験における標準である。与えられた時間間隔（t1〜t2）において、AUCは、以下：
2021535153.tif 000003
のとおりに算出され得、ここで、C1およびC2は時間間隔（t1およびt2）における平均濃度である。
【００４７】
対数台形法は、AUCを計算するためにデータ点間の対数補間を使用する。この方法は、薬物排除が指数関数的であるために濃度が低下する場合により正確である（それを対数スケールで線形的にする）。与えられた時間間隔（t1〜t2）において、AUCは、以下：
2021535153.tif 000004
（C1＞C2と仮定）のとおりに算出され得る。
【００４８】
「生物学的利用能」という用語は、本明細書で使用される場合、活性部分（タンパク質または薬物または代謝産物）が全身循環に入り、それによって作用部位にアクセスする程度および速度を表す。活性部分の生物学的利用能は、大部分が、剤形の特性によって決定され、これはその設計および製造に部分的に依存する。与えられた薬物またはタンパク質の製剤間での生物学的利用能の相違は、臨床的重要性を有し得、したがって薬物製剤が等価であるかどうかを知ることが必須である。薬物またはタンパク質の生物学的利用能の最も信頼性のある尺度は、血漿濃度・時間曲線下面積（AUC）である。AUCは、全身循環に到達する未変化の薬物または治療タンパク質の総量に直接的に比例する。薬物または治療タンパク質は、それらの血漿濃度曲線が本質的に重ね合わせ可能である場合に、吸収の程度および速度に関して生物学的に同等であるとみなされ得る。
【００４９】
薬物または治療製品の「生物学的利用能」という用語は、インタクトなまま吸収され作用部位に到達する未変化の薬物の割合、または任意の経路による投与後の全身循環と定義される。薬物の静脈内投与の場合、生物学的利用能は1と定義される。他の投与経路により投与される薬物の場合、生物学的利用能はしばしば、1よりも小さい。不完全な生物学的利用能は、剤形効果、膜効果、および投与部位効果のカテゴリに細分化され得る多くの要因に起因し得る。半減期およびAUCは、薬物および生体物質の生物学的利用能についての情報を提供する。
【００５０】
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「保存的バリエーション」または「保存的置換」という用語は、あるアミノ酸残基の、別の生物学的に類似する残基による置換を表す。保存的バリエーションまたは置換は、ペプチド鎖の形状を変化させない蓋然性が高い。保存的バリエーションまたは置換の例は、1つの疎水性残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンと、別の疎水性残基の置換、または1つの極性残基と別の極性残基の置換、例えばアルギニンとリジン、グルタミン酸とアスパラギン酸もしくはグルタミンとアスパラギンの置換を含む。
【００５１】
本明細書で使用される場合、本発明の「構築物」は、ENPP1ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは部位特異的変異体を含む融合ポリペプチドを表す。
【００５２】
「疾患」は、その動物が恒常性を維持することができず、その疾患が改善されない場合、その動物の健康が悪化し続ける、動物の健康状態である。
【００５３】
動物における「障害」は、その動物が恒常性を維持することができるが、その動物の健康状態がその障害の非存在下でのものよりも好ましくない、健康状態である。未処置のままでも、障害は必ずしも動物の健康状態のさらなる低下を引き起こすとは限らない。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「有効量」、「薬学的有効量」、および「治療有効量」という用語は、非毒性であるが、所望の生物学的結果を提供するのに十分な量の作用物質を表す。その結果は、疾患の兆候、症状、もしくは原因の減少および／もしくは緩和、または生体系の任意の他の所望の変化であり得る。任意の個々の例における適切な治療量は、従来的実験を用いて当業者により決定され得る。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「ENPP」または「NPP」という用語は、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼを表す。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「ENPP1タンパク質」または「ENPP1ポリペプチド」という用語は、ENPP1遺伝子によってコードされるエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ-1タンパク質を表す。コードされるタンパク質は、II型膜貫通糖タンパク質であり、ヌクレオチドおよびヌクレオチド糖のホスホジエステル結合ならびにヌクレオチドおよびヌクレオチド糖のピロリン酸結合を含む様々な基質を切断する。ENPP1タンパク質は、膜貫通ドメインおよび可溶性細胞外ドメインを有する。その細胞外ドメインはさらに、ソマトメジンBドメイン、触媒ドメインおよびヌクレアーゼドメインに細分化される。野生型ENPP1の配列および構造は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、BraddockらのPCT出願公報番号WO 2014/126965に詳細に記載されている。
【００５７】
「機能的等価体」または「機能的誘導体」という用語は、アミノ酸配列の機能的誘導体の文脈で、本明細書に示されるENPP1-Fc構築物の配列のそれと実質的に類似する生物学的活性（機能または構造のいずれか）を保持している分子を意味する。機能的誘導体または等価体は、天然の誘導体であり得るまたは合成により調製され得る。本発明の機能的に等価なポリペプチドはまた、当技術分野で公知の1つまたは複数の構造およびまたは配列アラインメント技術を用いて同定されるポリペプチドであり得る。
【００５８】
例示的な機能的誘導体は、そのタンパク質の生物学的活性が保存される、1つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含む。置換するアミノ酸は、望ましくは、置換されるアミノ酸のそれと類似する物理化学特性を有する。望ましい類似の物理化学特性は、電荷、かさ高さ、疎水性、親水性等の類似性を含む。典型的に、2つのポリペプチド間の30％超の同一性は、機能的等価性を示すとみなされる。好ましくは、本発明の機能的に等価なポリペプチドは、80％超の、ENPP1-Fc構築物に対する配列同一性の程度を有する。より好ましいポリペプチドは、それぞれ、85％、90％、95％、98％、または99％超の同一性の程度を有する。機能的等価体または機能的誘導体がENPP1-Fc構築物と同一もしくは類似またはそれより高い生物学的活性を有するかどうかを判定する方法は、WO2016/187408に記載されるATP切断に関する酵素学的アッセイを用いることによって判定され得る。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「ヒトENPP1」という用語は、NCBIアクセッションNP_006199で示されるヒトENPP1配列を表す。本明細書で使用される場合、「可溶性ヒトENPP1」という用語は、NCBIアクセッションNP_006199の残基96〜925に対応するポリペプチドを表す。本明細書で使用される場合、ENPP1に関する「酵素的に活性」という用語は、ATPに結合しそれをAMPおよびPPiに加水分解することができるならびに／またはAP3aに結合しそれをATPに加水分解することができることと定義される。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「ENPP1前駆タンパク質」という用語は、そのシグナルペプチド配列をENPP1 N末端に有するENPP1を表す。タンパク質分解により、シグナル配列はENPP1から切断され、ENPP1タンパク質が提供される。本発明において有用なシグナルペプチド配列は、ENPP1シグナルペプチド配列、ENPP2シグナルペプチド配列、ENPP7シグナルペプチド配列、および／またはENPP5シグナルペプチド配列を含むがこれらに限定されない。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「ENPP1-Fc」という用語は、IgG分子（好ましくは、ヒトIgG）のFcR結合ドメインに組み換え的に融合および／または化学的にコンジュゲート（共有結合的コンジュゲーションおよび非共有結合的コンジュゲーションの両方を含む）されたENPP1を表す。特定の態様において、ENPP1のC末端が、FcR結合ドメインのN末端に融合またはコンジュゲートされている。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「Fc」という用語は、ヒトIgG（免疫グロブリン）Fcドメインを表す。IgGのサブタイプ、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4が、Fcドメインとして使用されることが想定される。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「Fc領域」は、IgG分子のパパイン消化によって得られる結晶性フラグメントに関連するIgG分子の部分である。Fc領域は、ジスルフィド結合によって連結されるIgG分子の2つの重鎖のC末端半分を含む。それは抗原結合活性を有さないが、炭水化物部分ならびに相補体およびFcRn受容体を含むFc受容体に対する結合部位を含む。Fcフラグメントは、全第2定常ドメインCH2（Kabat番号体系にしたがう、ヒトIgG1の残基231〜340）および第3定常ドメインCH3（残基341〜447）を含む。「IgGヒンジ-Fc領域」または「ヒンジ-Fcフラグメント」という用語は、Fc領域（残基231〜447）およびFc領域のN末端から延びるヒンジ領域（残基216〜230）からなるIgG分子の領域を表す。「定常ドメイン」という用語は、抗原結合部位を含む免疫グロブリンの他の部分である可変ドメインよりも保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の部分を表す。定常ドメインは、重鎖のCH1、CH2およびCH3ドメインならびに軽鎖のCHLドメインを含む。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「Fc受容体」という用語は、免疫系の保護機能に寄与する、特定の細胞（特に、Bリンパ球、濾胞性樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、ヒト血小板およびマスト細胞を含む）の表面上で見いだされるタンパク質を表す。Fc受容体は、感染した細胞または侵入した病原体に結合した抗体に結合する。免疫グロブリンFc受容体（FcR）は、すべての造血細胞において発現され、抗体を通じた免疫応答において重要な役割を果たす。FcRに対する免疫複合体の結合は、エフェクター細胞を活性化し、IgGオプソニン化粒子の食作用、エンドサイトーシス、炎症メディエーターの放出および抗体依存的細胞傷害性（ADCC）をもたらす。Fc受容体は、免疫グロブリンのすべてのクラスで報告されている。IgGについてはFcγRおよび新生児FcR（FcRn）、IgEについてFcεR、IgAについてはFcαR、IgDについてはFcδRおよびIgMについてはFcμR。すべての公知のFc受容体は、構造的に、それぞれ構造的にクラスI主要組織適合性抗原およびC型レクチンに関連するFcRnおよびFcεRIIを除いて、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する（Fc Receptors, Neil A. Fangera, et al., in Encyclopedia of Immunology (2nd Edition), 1998）。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「FcRn受容体」という用語は、ヒトにおいてFCGRT遺伝子によってコードされるタンパク質である、Brambell受容体としても公知の、新生児Fc受容体（FcRn）を表す。FcRnは、抗体のFcドメインに特異的に結合する。FcRnは、内皮細胞におけるリソソーム分解を減少させることによってIgGおよび血清アルブミンの半減期を延ばす。IgG、血清アルブミンおよび他の血清タンパク質は、飲作用を通じて継続的に内部移行される。一般に、血清タンパク質は、エンドソームからリソソームに移され、そこで分解される。FcRnは酸性pH（＜6.5）においてIgGに結合し、中性またはそれより高いpHにおいては結合しないので、内皮細胞を通過するIgGのFcRn媒介トランスサイトーシスが起こり得る。IgGおよび血清アルブミンは、弱酸性pH（＜6.5）においてFcRnによって結合されて細胞表面にリサイクルされ、それらは血液の中性pH（＞7.0）で放出される。これにより、IgGおよび血清アルブミンは、リソソーム分解を回避する。
【００６６】
IgG分子のFc部分は、特にCH2ドメインの、重鎖の定常領域に位置する。このFc領域は、B細胞の表面受容体であり、また補体系のタンパク質であるFc受容体（FcRn）に結合する。FcRnへのIgG分子のFc領域の結合は、この受容体を有する細胞を活性化し、したがって免疫系を活性化する。マウスFc-マウスFcRnおよびヒトFc-ヒトFcRn相互作用に重要なFc残基は同定されている（Dall’Acqua et al., 2002, J. Immunol. 169(9):5171-80）。FcRn結合ドメインは、IgG分子のCH2ドメイン（またはそのFcRn結合部分）を含む。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「フラグメント」という用語は、核酸に適用される場合、より大きな核酸の部分配列を表す。核酸の「フラグメント」は、少なくとも約15、50〜100、100〜500、500〜1000、1000〜1500ヌクレオチド、1500〜2500、または2500ヌクレオチド（およびその間の任意の整数値）であり得る。本明細書で使用される場合、「フラグメント」という用語は、タンパク質またはペプチドに適用される場合、より大きなタンパク質またはペプチドの部分配列を表し、少なくとも約20、50、100、200、300、または400アミノ酸長（およびその間の任意の整数値）であり得る。
【００６８】
本明細書で使用される場合、本発明において想定されるタンパク質および／またはポリペプチド（例えば、FcRn結合部位を含むENPP1ポリペプチド）の「インビボ半減期」という用語は、動物に投与された量の半分がその動物の循環および／または他の組織から排除されるのに要する時間を表す。ENPP1-Fc融合タンパク質のクリアランス曲線が時間の関数であるとみなされる場合、その曲線は通常、（血管内空間と血管外空間の間での投与された分子の平衡を表し、一部、分子のサイズによって決定される）高速なα相および（血管内空間における分子の異化を表す）より長いβ相を含む二相性である。特定の態様において、「インビボ半減期」という用語は、実際には、β相におけるその分子の半減期に対応する。
【００６９】
「説明資料」は、この用語が本明細書で使用される場合、本明細書で言及される様々な疾患または障害を特定するまたは緩和するまたは処置する上でのキット内の本発明の核酸、ペプチド、および／または化合物の有用性を伝達するために使用され得る刊行物、記録、図、または任意の他の表現媒体を含む。
【００７０】
「単離された」は、その自然状態から変更されたまたは取り出されたことを意味する。例えば、生来的に生きた動物内に存在する核酸またはポリペプチドは、「単離され」ていないが、その自然状態の共存物質から部分的または完全に分離された同じ核酸またはポリペプチドは、「単離」されている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に純粋な形態で存在し得る、または非天然環境、例えば、宿主細胞内に存在し得る。
【００７１】
「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、少なくとも2ヌクレオチド長、特定の態様において少なくとも8、15、または25ヌクレオチド長の範囲であるが、最大50、100、1000、もしくは5000ヌクレオチド長であり得る核酸、またはポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする化合物である。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「患者」、「個体」、または「対象」という用語は、ヒトを表す。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」または「組成物」という用語は、本発明において有用な少なくとも1つの化合物と薬学的に許容される担体の混合物を表す。薬学的組成物は、患者への化合物の投与を容易にする。皮下、静脈内、経口、エアゾール、吸入、直腸、膣、経皮、鼻内、頬側、舌下、非経口、髄腔内、胃内、点眼、肺、および局所投与を含むがこれらに限定されない、化合物を投与する様々な方法が当技術分野に存在する。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、化合物の生物学的活性または特性を打ち消さず、比較的非毒性である物質、例えば担体または希釈剤を表す、すなわち、その物質は、望まれない生物学的効果を生じないでまたは含有される組成物のいずれの成分とも有害な様式で相互作用せずに個体に投与され得る、。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、その意図された機能を発揮し得るように本発明において有用な化合物を患者内にまたは患者に運搬または輸送することに関与する薬学的に許容される物質、組成物または担体、例えば液体または固体フィラー、安定化剤、分散剤、懸濁剤、希釈剤、賦形剤、増粘剤、溶媒、またはカプセル化物質を意味する。各担体は、本発明において有用な化合物を含むその製剤の他の成分と適合し、かつ患者に対して有害でないという意味で「許容される」ものでなければならない。薬学的に許容される担体として機能し得る物質のいくつかの例は、糖、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース；デンプン、例えばトウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；セルロース、ならびのその誘導体を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」はまた、本発明において有用な化合物の活性に適合しかつ患者にとって生理学的に許容される任意かつすべてのコーティング、抗細菌および抗真菌剤、ならびに吸収遅延剤等も含む。「薬学的に許容される担体」はさらに、本発明において有用な化合物の薬学的に許容される塩を含み得る。本発明を実施する際に使用される薬学的組成物に含まれ得る他の追加の成分は、当技術分野で公知であり、例えば、参照により本明細書に組み入れられるRemington’s Pharmaceutical Sciences（Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985, Easton, PA）に記載されている。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」という文言は、無機酸、無機塩基、有機酸、無機塩基を含む薬学的に許容される非毒性の酸および塩基から調製される投与される化合物の塩、それらの溶媒和物、水和物およびクラスレートを表す。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「血漿ピロリン酸（PPi）レベル」という用語は、動物の血漿中に存在するピロリン酸の量を表す。特定の態様において、動物は、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ヒト、ウシおよびウマを含む。PPiは、血小板から放出されるため、血清ではなく血漿中で測定する必要がある。PPiを測定する方法は様々あり、その1つは、改良を加えた、ウリジン-ジホスホグルコース（UDPG）ピロホスホリラーゼを用いる酵素アッセイよるものである（Lust & Seegmiller, 1976, Clin. Chim. Acta 66:241-249; Cheung & Suhadolnik, 1977, Anal. Biochem. 83:61-63）。典型的に、健常な対象における正常なPPiレベルは、約1μm〜約3μM、いくつかの例においては1〜2μMの範囲である。欠損したENPP1発現を有する対象は、正常レベルよりも少なくとも10％低い、正常レベルよりも少なくとも20％低い、正常レベルよりも少なくとも30％低い、正常レベルよりも少なくとも40％低い、正常レベルよりも少なくとも50％低い、正常レベルよりも少なくとも60％低い、正常レベルよりも少なくとも70％低い、正常レベルよりも少なくとも80％低い範囲、およびそれらの任意の組み合わせの低PPiレベルを示す傾向がある。病的な石灰化または骨化の疾患に罹患した患者において、血漿中のPPiレベルは、1μM未満であり、いくつかの例においては検出レベル未満であることが見いだされる。いくつかの例において、病的な石灰化または骨化の疾患に罹患した患者の血漿PPiレベルは、0.5μM未満である（Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2014, 34(9):1985-9; Braddock et al., 2015, Nat Commun. 6:10006.）。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合を通じて連結された、アミノ酸残基、関連する天然に存在する構造変種、およびそれらの合成性の天然に存在しないアナログから構成されるポリマーを表す。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「PPi」という用語は、ピロリン酸を表す。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「予防する」または「予防」という用語は、発症していない場合は障害もしくは疾患を発症させないこと、または障害もしくは疾患がすでに発症している場合は障害もしくは疾患をさらに進展させないことを意味する。また、障害または疾患に関連する症状の一部またはすべてを予防することは、当業者の能力であるとみなされる。
【００８１】
「サンプル」または「生物学的サンプル」は、本明細書で使用される場合、対象から単離された生物学的物質を意味する。生物学的サンプルは、mRNA、ポリペプチドまたは対象における生理学的もしくは病的プロセスの他のマーカーを検出するのに適した任意の生物学的物質を含み得、個体から得られる体液、組織、細胞、および／または非細胞物質を含み得る。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「シグナルペプチド」という用語は、タンパク質翻訳時に新たに生成される関心対象のタンパク質のアミノ末端に結合している（例えば、10〜30残基の範囲の長さの）アミノ酸残基の配列を表す。シグナルペプチドは、シグナル認識粒子（SRP）によって認識され、小胞体への輸送後にシグナルペプチダーゼによって切断される（Lodish, et al., 2000, Molecular Cell Biology, 4th edition）。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「実質的に精製」は、他の成分を本質的に含まないことを表す。例えば、実質的に精製されたポリペプチドは、その天然に存在する状態で通常付随する他の成分から分離されたポリペプチドである。非限定的な態様は、95％の純度、99％の純度、99.5％の純度、99.9％の純度、および100％の純度を含む。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「処置」または「処置する」という用語は、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、または、疾患もしくは障害を発症する可能性を治癒するか、それらを回復するか、それらを緩和するか、それらを和らげるか、それらを変更するか、それらを治療するか、それらを改善するか、それらを改良するか、またはそれらに影響を及ぼす目的での、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、または疾患もしくは障害を発症する可能性を有する患者への治療剤、すなわち本発明において有用な化合物の（単独もしくは別の薬剤と組み合わせての）適用もしくは投与、または（例えば、診断もしくはエクスビボ適用のための）患者由来の単離された組織もしくは細胞株への治療剤の適用もしくは投与と定義される。そのような処置は、ゲノム薬理学の分野から得られる知識に基づき、個人向けに仕立てられ得るまたは改変され得る。
【００８５】
「ベクター」は、単離された核酸を含み、その単離された核酸を細胞の内側に送達するために使用され得る、組成物である。直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物を伴うポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含むがこれらに限定されない多くのベクターが当技術分野で公知である。したがって、「ベクター」という用語は、自律複製性のプラスミドまたはウイルスを含む。この用語はまた、細胞への核酸の移入を容易にする非プラスミドおよび非ウイルス化合物、例えばポリリジン化合物、リポソーム等を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター等を含むがこれらに限定されない。
【００８６】
本明細書で使用される場合、「野生型」という用語は、天然に存在する供給源から単離された遺伝子または遺伝子産物を表す。野生型遺伝子は、最も多くは集団で観察され、したがってその遺伝子の任意に設計された「通常」または「野生型」形態である。対照的に、「改変された」または「変異体」という用語は、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較して配列および／または機能的特性に関する改変（すなわち、変更された特徴）を示す遺伝子または遺伝子産物を表す。天然に存在する変異体が単離され得、これらは野生型遺伝子または遺伝子産物と比較して変更された特徴（変更された核酸配列を含む）を有するという事実により同定される。
【００８７】
範囲：本開示を通じて、本発明の様々な局面は、範囲形式で提示され得る。範囲形式の記載は、利便性および簡潔性のためにすぎないことが理解されるべきであり、かつ、本発明の範囲に対する硬直的な限定であるとみなされるべきでない。したがって、範囲の記載は、その範囲内のすべての可能性のある部分範囲および個々の数値を具体的に開示するものとみなされるべきである。例えば、1〜6のような範囲の記載は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6等の部分範囲ならびにその範囲内の個々の数値、例えば1、2、2.7、3、4、5、5.3、および6を具体的に開示するものとみなされるべきである。これは、範囲の幅にかかわらず適用される。
【００８８】
ポリペプチド
1つの局面において、本発明は、ENPP1-Fcポリペプチドを提供する。本発明は、本発明のポリペプチドが本明細書に記載される変異の1つまたは複数を有し得ることを想定している。
【００８９】
特定の態様において、ENPP1ポリペプチドは、図13Aおよび／または図13Bに示されるシグナル配列領域内の少なくとも1つの変異を含む。特定の態様において、変異は、SEQ ID NO:7に関するC25N、K27T、およびV29Nからなる群より選択される。特定の態様において、変異は、SEQ ID NO:7に関するC25Nである。特定の態様において、変異は、SEQ ID NO:7に関するK27Tである。特定の態様において、変異は、SEQ ID NO:7に関するV29Nである。特定の態様において、ENPP1ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に関するC25N/K27TおよびV29Nからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む。
【００９０】
特定の態様において、ENPP1ポリペプチドは、図13Aおよび／または図13Bに示される触媒領域内の少なくとも1つの変異を含む。特定の態様において、変異は、SEQ ID NO:7に関するK369NおよびI371Tからなる群より選択される。特定の態様において、変異は、SEQ ID NO:7に関するK369Nである。特定の態様において、変異は、SEQ ID NO:7に関するI371Tである。特定の態様において、ENPP1ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に関する変異K369N/I371Tを含む。
【００９１】
特定の態様において、ENPP1ポリペプチドは、表1、表2、表3、表4、表5、図6A、図13Ａ、図13Ｂ、図14、および／または図15に示されるエンドヌクレアーゼドメイン内の少なくとも1つの変異を含む。特定の態様において、変異は、SEQ ID NO:7に関するP534N、V536T、R545T、P554L、E592N、R741D、およびS766Nからなる群より選択される。特定の態様において、変異は、SEQ ID NO:7に関するP534Nである。特定の態様において、変異は、SEQ ID NO:7に関するV536Tである。特定の態様において、変異は、SEQ ID NO:7に関するR545Tである。特定の態様において、変異は、SEQ ID NO:7に関するP554Lである。特定の態様において、変異は、SEQ ID NO:7に関するE592Nである。特定の態様において、変異は、SEQ ID NO:7に関するR741Dである。特定の態様において、変異は、SEQ ID NO:7に関するS766Nである。特定の態様において、ENPP1ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に関するP534N/V536T、P554L/R545T、E592N、E592N/R741D、およびS766Nからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む。
【００９２】
特定の態様において、ENPP1ポリペプチドは、図13Aおよび／または図13Bに示されるリンカー領域内の少なくとも1つの変異を含む。特定の態様において、変異は、SEQ ID NO:7に関するE864NおよびL866Tからなる群より選択される。特定の態様において、変異は、SEQ ID NO:7に関するE864Nである。特定の態様において、変異は、SEQ ID NO:7に関するL866Tである。
【００９３】
特定の態様において、ENPP1ポリペプチドは、少なくともSEQ ID NO:7に関する変異E864N/L866Tを含む。
【００９４】
特定の態様において、ポリペプチドは、ENPP1ポリペプチドおよびFcRn結合ドメインを含み、FcRn結合ドメインは、表1、表2、図6A、図13Ａ、図13Ｂ、図14、および／または図15に示される任意の変異を含む。特定の態様において、変異は、SEQ ID NO:7に関するM883Y、S885N、S885T、T887E、H1064K、およびN1065Fからなる群より選択される。特定の態様において、変異は、SEQ ID NO:7に関するM883Yである。特定の態様において、変異は、SEQ ID NO:7に関するS885Nである。特定の態様において、変異は、SEQ ID NO:7に関するS885Tである。特定の態様において、変異は、SEQ ID NO:7に関するT887Eである。特定の態様において、変異は、SEQ ID NO:7に関するH1064Kである。特定の態様において、変異は、SEQ ID NO:7に関するN1065Fである。特定の態様において、FcRn結合ドメインは、SEQ ID NO:7に関するS885N、M883Y、M883Y/S885T/T887E、およびH1064K/N1065Fからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む。
【００９５】
特定の態様において、ENPP1ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に関するC25N、K27T、V29N、C25N/K27T、K369N、I371T、K369N/I371T、P534N、V536T、R545T、P554L、E592N、R741D、S766N、P534N/V536T、P554L/R545T、E592N/R741D、E864N, L866T、E864N/L866T、M883Y、S885N、S885T、T887E、H1064K、N1065F、M883Y/S885T/T887E、H1064K/N1065Fからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む。
【００９６】
特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に関するS885N、S766N、M883Y/S885T/T887E、E864N/L866T、P534N/V536T/H1064K/N1065F、P554L/R545T、S766N/H1064K/N1065F、E592N/H1064K/N1065F、およびP534N/V536T/M883Y/S885T/T887Eからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む。
【００９７】
特定の態様において、ポリペプチドは、ENPP1ポリペプチドおよびFcRn結合ドメインを含み、該ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に関する変異M883Y、S885T、およびT887Eを含む。
【００９８】
特定の態様において、ポリペプチドは、ENPP1ポリペプチドおよびFcRn結合ドメインを含み、該ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に関する変異P534N、V536T、M883Y、S885T、およびT887Eを含む。
【００９９】
特定の態様において、ポリペプチドは、ENPP1ポリペプチドおよびFcRn結合ドメインを含み、該ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に関する変異E592N、H1064K、およびN1065Fを含む。
【０１００】
特定の態様において、ポリペプチドは、ENPP1変異ポリペプチドを含み、該変異ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に関するS766N、P534N、V536T、P554L、R545T、およびE592Nからなる群より選択されるENPP1変異を含む。
【０１０１】
特定の態様において、ENPP1変異ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に関するS766N、P534N/V536T、P554L/R545T、およびE592Nからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む。
【０１０２】
特定の態様において、ポリペプチドはさらに、IgGのFcRn結合ドメインを含む。
【０１０３】
特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に関するS885N、S766N、M883Y/S885T/T887E、P534N/V536T/H1064K/N1065F、P554L/R545T、S766N/H1064K/N1065F、E592N/H1064K/N1065F、およびP534N/V536T/M883Y/S885T/T887Eからなる群より選択される変異を含む。
【０１０４】
特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に関するFcRn結合ドメイン内のS885N変異を含む。
【０１０５】
特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に関するENPP1変異ポリペプチド内のS766N変異を含む。
【０１０６】
特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に関するFcRn結合ドメイン内の変異M883Y、S885T、およびT887Eを含む。
【０１０７】
特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に関するENPP1変異ポリペプチド内の変異P534NおよびV536TならびにFcRn結合ドメイン内の変異H1064KおよびN1065Fを含む。
【０１０８】
特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に関するENPP1変異ポリペプチド内の変異P554LおよびR545Tを含む。
【０１０９】
特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に関するENPP1変異ポリペプチド内の変異S766NならびにFcRn結合ドメイン内の変異H1064KおよびN1065Fを含む。
【０１１０】
特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に関するENPP1変異ポリペプチド内の変異E592NならびにFcRn結合ドメイン内の変異H1064KおよびN1065Fを含む。
【０１１１】
特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:7に関するENPP1変異ポリペプチド内の変異P534NおよびV536TならびにFcRn結合ドメイン内の変異M883Y、S885T、およびT887Eを含む。
【０１１２】
特定の態様において、ENPP1ポリペプチドは、ヌクレアーゼドメインを欠いている。他の態様において、ENPP1ポリペプチドは、ヌクレアーゼドメインが除去されるよう短縮される。さらに他の態様において、ENPP1ポリペプチドは、SEQ ID NO:1に関する残基約524から残基約885のヌクレアーゼドメインが除去され、タンパク質の触媒活性が保存されるようSEQ ID NO:1に関する残基約186から残基約586の触媒ドメインのみが残存するよう短縮される。
【０１１３】
特定の態様において、ENPP1ポリペプチドは、SEQ ID NO:1と比較して、シグナルペプチドの後かつ膜貫通ドメインと細胞外ドメインの間にペプチダーゼ切断部位を含むENPP1の細胞外領域のセグメントで改変される。
【０１１４】
特定の態様において、ENPP1ポリペプチドは、SEQ ID NO:1と比較して、膜貫通ドメインと細胞外ドメインの間にフリン切断部位を含むENPP1の細胞外領域のセグメントで改変される。他の態様において、ENPP1ポリペプチドは、SEQ ID NO:1と比較して、膜貫通ドメインと細胞外ドメインの間にフリン切断部位を含むENPP1の細胞外領域のセグメントで改変されない。
【０１１５】
特定の態様において、ENPP1ポリペプチドは、SEQ ID NO:1と比較して、シグナルペプチダーゼ切断部位を含むENPP2の細胞外領域のセグメントで改変される。他の態様において、ENPP1ポリペプチドは、SEQ ID NO:1と比較して、シグナルペプチダーゼ切断部位を含むENPP2の細胞外領域のセグメントで改変されない。
【０１１６】
特定の態様において、ポリペプチドは可溶性である。他の態様において、ポリペプチドは組み換えポリペプチドである。さらに他の態様において、ポリペプチドは、ENPP1膜貫通ドメインを欠くENPP1ポリペプチドを含む。さらに他の態様において、ポリペプチドは、ENPP1膜貫通ドメインが除去され（および／または短縮され）、別のポリペプチド、例えば、非限定的な例として、ENPP2、ENPP5、またはENPP7の膜貫通ドメインで置き換えられたENPP1ポリペプチドを含む。
【０１１７】
特定の態様において、ポリペプチドは、タンパク質分解プロセスに供されENPP1ポリペプチドを含むポリペプチドを生成する、ENPP1ポリペプチドの前駆体の分泌をもたらすシグナルペプチドを含む。他の態様において、シグナルペプチドは、ENPP2、ENPP5、およびENPP7のシグナルペプチドからなる群より選択される。さらに他の態様において、ポリペプチドは、ENPP1および別のポリペプチド、例えば、非限定的な例として、ENPP2の膜貫通ドメインを含むENPP1ポリペプチドを含む。さらに他の態様において、ENPP1ポリペプチドは、ENPP2膜貫通ドメインを含む前駆体ENPP1ポリペプチドの切断産物を含む。さらに他の態様において、ENPP2膜貫通ドメインは、
2021535153.tif 000005
に対応するSEQ ID NO:7の残基12〜30を含む。
【０１１８】
特定の態様において、ENPP1ポリペプチドは、ヒト免疫グロブリン1（IgG1）、ヒト免疫グロブリン2（IgG2）、ヒト免疫グロブリン3（IgG3）、および／またはヒト免疫グロブリン4（IgG4）のFcドメインにC末端で融合される。他の態様において、ENPP1ポリペプチドは、ヒト免疫グロブリン1（IgG1）、ヒト免疫グロブリン2（IgG2）、ヒト免疫グロブリン3（IgG3）、および／またはヒト免疫グロブリン4（IgG4）のFcドメインにN末端で融合される。さらに他の態様において、IgFcドメインの存在は、ENPP1ポリペプチドの半減期、可溶性を改善し、免疫原性を減少させ、活性を増加させる。
【０１１９】
特定の態様において、ENPP1ポリペプチドは、ヒト血清アルブミンにC末端で融合される。ヒト血清アルブミンは、天然に存在するもしくは改変されたジスルフィド結合を含むがこれらに限定されない化学リンカーを通じて、またはENPP1もしくはそのフラグメントおよび／もしくは変種への遺伝子的融合によってENPP1タンパク質にコンジュゲートされ得る。
【０１２０】
特定の態様において、ポリペプチドはさらに、ペグ化（ポリ（エチレングリコール）鎖に融合）される。
【０１２１】
特定の態様において、ポリペプチドは、約3.4（±0.4）s-1酵素-1以上の基質ATPに対するkcat値を有し、kcatはそのポリペプチドについてATPの加水分解速度を測定することによって決定される。
【０１２２】
特定の態様において、ポリペプチドは、約2μM未満または約2μMの基質ATPに対するKM値を有し、KMはそのポリペプチドについてATPの加水分解速度を測定することによって決定される。
【０１２３】
特定の態様において、ポリペプチドは、液体製剤として製剤化される。他の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドの治療量を含む乾燥製品形態の薬学的組成物を提供し、この乾燥製品は液体形態の化合物の溶液に再構成可能である。
【０１２４】
本発明は、少なくとも1つの本発明のポリペプチドまたはその塩もしくは溶媒和物および本発明の方法において当該ポリペプチドを使用するための指示書を含むキットを提供する。
【０１２５】
特定の態様において、ポリペプチドは、負に荷電した骨標的化配列を欠いている。さらに他の態様において、ポリアスパラギン酸ドメイン（約2〜約20またはそれより多い連続するアスパラギン酸残基）が、負に荷電した骨標的化配列の非限定的な例である。他の態様において、ポリペプチドは、負に荷電した骨標的化配列を有する。
【０１２６】
本発明にしたがうENPP1ポリペプチドは、ネイティブのヒトタンパク質だけでなく、ネイティブタンパク質のATP加水分解活性を有する任意のフラグメント、誘導体、融合体、コンジュゲート、または変異体を含むことが理解されると考えられる。本開示において本明細書で使用される場合、「ENPP1ポリペプチド、変異体、またはその変異フラグメント」というフレーズはまた、ENPP1ポリペプチド、変異体、またはその変異フラグメントを含む任意の化合物またはポリペプチド（例えば、非限定的に、融合タンパク質）を含む。本発明にしたがう融合タンパク質は、ENPP1の生物学的等価体とみなされるが、「曲線下面積」（AUC）または薬物動態実験における半減期の延長により判断される、より長い半減期または、インビボ生物学的曝露の増大による、より強い効力を提供することが意図される。
【０１２７】
ベクターおよび細胞
本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードする組み換え核酸を含む自律複製型または組み込み型哺乳類細胞ベクターを提供する。特定の態様において、ベクターは、プラスミドまたはウイルスを含む。他の態様において、ベクターは、哺乳類細胞発現ベクターを含む。さらに他の態様において、ベクターはさらに、ポリペプチドの発現を指示および／または制御する少なくとも1つの核酸配列を含む。さらに他の態様において、組み換え核酸は、本発明のENPP1ポリペプチドおよびシグナルペプチドを含むポリペプチドをコードし、該ポリペプチドは細胞から分泌された際にタンパク質分解的にプロセシングされて本発明のENPP1ポリペプチドを生成する。
【０１２８】
さらに別の局面において、本発明は、本発明のベクターを含む単離された宿主細胞を提供する。特定の態様において、細胞は、非ヒト細胞である。他の態様において、細胞は、哺乳類である。さらに他の態様において、本発明のベクターは、本発明のENPP1ポリペプチドおよびシグナルペプチドを含むポリペプチドをコードする組み換え核酸を含む。さらに他の態様において、ポリペプチドは、細胞から分泌された際にタンパク質分解的にプロセシングをされて本発明のENPP1ポリペプチドを生成する。
【０１２９】
ENPP1のクローニングおよび発現
ENPP1またはENPP1ポリペプチドは、その全体が参照により本明細書に組み入れられるUS 2015/0359858 A1に記載されるようにして調製される。ENPP1は、異なる膜内ドメインを有する細胞表面に局在化する膜貫通タンパク質である。ENPP1を可溶性細胞外タンパク質として発現させるために、ENPP1の膜貫通ドメインがENPP2の膜貫通ドメインと入れ替えられ得、それによって、可溶性の組み換えENPP1がバキュロウイルス培養物の細胞外液中に蓄積する。
【０１３０】
任意の他の公知のタンパク質のシグナル配列、例えば、非限定的に、免疫グロブリンカッパおよびラムダ軽鎖タンパク質のシグナル配列もまた、ENPP1の細胞外ドメインを分泌させるために使用され得る。さらに、本発明は、本明細書に記載されるポリペプチドに限定されると解釈されるべきでなく、ENPP1細胞外ドメインの任意の酵素的に活性な短縮体を含むポリペプチドも含む。
【０１３１】
ENPP1は、膜貫通ドメインを除去することによって可溶性にされる。ヒトENPP1（SEQ ID NO:1）を、その膜貫通領域（例えば、残基77〜98）をヒトENPP2の対応するサブドメイン（NCBIアクセッションNP_00112433 5、例えば、残基12〜30）で置き換えることによって、可溶性組み換えタンパク質を発現するよう改変した。改変されたENPP1配列を、TEVプロテアーゼ切断部位とそれに続くＣ末端9-F1ISタグを有する改変されたpFastbac FITベクターにクローニングし、昆虫細胞内でクローニングおよび発現させ、そして以前に記載されたように両タンパク質をバキュロウイルスシステムにおいて発現させ（Albright, et al., 2012, Blood 120:4432-4440; Saunders, et al., 2011, J. Biol. Chem. 18:994-1004; Saunders, et al., 2008, Mol. Cancer Ther. 7:3352-3362）、可溶性組み換えタンパク質を細胞外液中に蓄積させた。
【０１３２】
ENPP1およびENPP1融合タンパク質の生産および精製
特定の態様において、IgG Fcドメインまたは酵素的／生物学的に活性なそのフラグメントを含む、可溶性ENPP1ポリペプチドは、本明細書で想定される疾患または障害の処置、その軽減、および／またはその進行の予防に有効である。他の態様において、可溶性ENPP1ポリペプチドは、骨標的化ドメイン、例えば、2〜20個の連続するポリアスパラギン酸残基または2〜20個の連続するポリグルタミン酸残基を含まない。
【０１３３】
インビトロで使用するための可溶性組み換えENPP1を生産するために、ENPP1をIgGのFcドメインに融合し（「NPP1-Fc」と称する）、この融合タンパク質を安定なCHO細胞株において発現させた。このタンパク質はまた、適切なベクターを用いてHEK293細胞、バキュロウイルス昆虫細胞システムまたはCHO細胞またはピキア酵母発現システムから発現され得る。このタンパク質は、付着または懸濁細胞のいずれかにおいて産生され得る。好ましくは、この融合タンパク質は、CHO細胞において発現される。安定な細胞株を樹立するために、ENPP1構築物をコードする核酸配列は、大スケールのタンパク質生産のための適切なベクターにクローニングされる。
【０１３４】
細菌（例えば、大腸菌（E.coli）および枯草菌（Bacillus subtilis））、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveronmyces lactis）、およびピキア・パストリス（Pichia pastoris））、糸状菌（例えば、アスペルギルス）、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞を含む、多くの発現システムが公知であり、ENPP1融合タンパク質の生産に使用され得る。所望のタンパク質は、従来的な方法で、例えば、宿主染色体に挿入されたまたは遊離プラスミド上のコード配列から生産され得る。
【０１３５】
酵母は、任意の通常の方法、例えばエレクトロポレーションにより、所望のタンパク質のコード配列で形質転換され得る。エレクトロポレーションによる酵母の形質転換方法は、Becker & Guarente, 1990, Methods Enzymol. 194: 182に開示されている。形質転換に成功した細胞、すなわち、本発明のDNA構築物を含む細胞は、周知の技術により同定され得る。例えば、発現構築物の導入により得られる細胞は、所望のポリペプチドを産生するよう増殖され得る。細胞は、収集および溶解され得、そのDNAの存在について、Southern, 1975, J. Mol. Biol, 98:503および／またはBerent, et al., 1985, Biotech 3:208に記載されるような方法を用いてそれらのDNA内容が試験され得る。あるいは、上清中のタンパク質の存在が、抗体を用いて検出され得る。
【０１３６】
有用な酵母プラスミドベクターは、pRS403〜406およびpRS413〜416を含み、通常、Strat:1.gene Cloning Systems, La Jolla, CA, USAから入手可能である。プラスミドpRS403、pRS404、pRS405およびpRS406は、酵母組み込みプラスミド（Y1ps）であり、酵母選択マーカーI-llS3、TRP1、LEU2およびlJRA3を含む。プラスミドpRS413〜416は、酵母セントロメアプラスミド（YCps）である。
【０１３７】
相補的な粘着末端を通じてDNAをベクターに機能的に連結する様々な方法が開発されている。例えば、相補的ホモポリマートラクトが、ベクターDNAに挿入されるDNAセグメントに追加され得る。ベクターおよびDNAセグメントは、ついで、相補的ホモポリマーテイル間の水素結合により接続され、組み換えDNA分子が形成される。
【０１３８】
1つまたは複数の制限部位を含む合成リンカーは、DNAセグメントをベクターに接続する代替方法を提供する。エンドヌクレアーゼ制限消化によって生成されるDNAセグメントは、それらの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性により突出する3'一本鎖末端を除去し、かつそれらの重合活性により陥没している3'末端を埋める酵素であるバクテリオファージT4 DNAポリメラーゼまたは大腸菌DNAポリメラーゼIで処置される。
【０１３９】
これらの活性の組み合わせは、したがって、平滑末端化されたDNAセグメントを生成する。平滑末端化セグメントは、ついで、平滑末端化DNA分子の連結を触媒することができる酵素、例えばバクテリオファージT4 DNAリガーゼの存在下で、大モル過剰のリンカー分子と共にインキュベートされる。したがって、反応産物は、それらの末端にポリマーリンカー配列を有するDNAセグメントである。これらのDNAセグメントは、ついで、適切な制限酵素で切断され、そしてDNAセグメントのそれらに適合する末端を生成する酵素で切断された発現ベクターに連結される。
【０１４０】
ついで、単一の安定的にトランスフェクトされた細胞のクローンが樹立され、所望の融合タンパク質の高発現クローンについてスクリーニングされる。ENPP3タンパク質発現についての単一細胞クローンのスクリーニングは、以前に記載されたように合成酵素基質pNP-TMPを用いて96ウェルプレートにおいて高スループット様式で達成され得る（Albright, et al., 2015, Nat. Commun. 6:10006）。スクリーニングを通じた高発現クローンの同定の後、以前にAlbright, et al., 2015, Nat. Commun. 6:10006に記載されたようにして振とうフラスコまたはバイオリアクタにおいてタンパク質産生が達成され得る。
【０１４１】
ENPP1の精製は、当技術分野で公知の標準的な精製技術の組み合わせを用いて達成され得る。その例は、ENPP3タンパク質の生産に関して上記されている。精製後、ENPP1-Fcを、Zn2+およびMg2+を補充したPBS（PBSplus）に透析して5〜7 mg/mlに濃縮し、200〜500μlのアリコートとして-80℃で凍結させる。使用直前にアリコートを解凍し、溶液の比活性をPBSplus中での希釈により31.25 au/ml（または調製物に依存して約0.7 mg/ml）に調整する。
【０１４２】
配列
2021535153.tif 000006
2021535153.tif 000007
太字：シグナル配列
標準：ENPP1細胞外ドメイン
下線：リンカー配列
斜体：Fcドメイン
【０１４３】
方法
本発明は、その必要のある対象において病的な石灰化を減少させるまたはその進行を予防する方法であって、本発明のポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含む、方法を含む。
【０１４４】
本発明はさらに、その必要のある対象において、病的な骨化を減少させるまたはその進行を予防する方法であって、本発明のポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含む、方法を含む。
【０１４５】
本発明はさらに、その必要のある対象において、血管の石灰化の減少、改善、または予防を含む、軟組織の異所性石灰化を減少させるまたはその進行を予防する方法であって、本発明のポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含む、方法を含む。
【０１４６】
本発明はさらに、ENPP1欠損によって引き起こされる疾患を軽減するまたはその進行を予防する方法を含む。ENPP1欠損は、その必要のある対象における（正常な健常対象における、それぞれ、ENPP1活性レベルまたはENPP1発現レベルのそれと比較しての）ENPP1活性のレベルの減少およびまたは欠損したENPP1発現により特徴づけられ、上記方法は、本発明のポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含む。
【０１４７】
本発明はさらに、その必要のある対象において低い血漿PPiレベルにより引き起こされる疾患を軽減するまたはその進行を予防する方法であって、対象の血漿PPiを正常（1〜3μM）または正常以上（30％〜50％高い）レベルに増加させ、その後血漿PPiを一定の正常または正常以上レベルで維持する本発明のポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含む、方法を含む。本発明はさらに、病的な石灰化もしくは骨化を減少させるまたはその進行を予防するために対象の血漿PPiを一定の正常または正常以上レベルで維持するよう、2日、3日、1週間、または1ヵ月の間隔で追加の治療有効量を投与する工程を含む。
【０１４８】
本発明はさらに、その必要のある対象において後縦靭帯骨化（OPLL）を処置する、それを好転させる、またはその進行を予防する方法であって、本発明のポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含む、方法を含む。
【０１４９】
本発明はさらに、その必要のある対象において低リン血症性くる病を処置する、それをもとに戻す、またはその進行を予防する方法であって、本発明のポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含む、方法を含む。
【０１５０】
本発明はさらに、慢性腎疾患（CKD）、末期腎疾患（ESRD）、尿毒症性細小動脈石灰化症（CUA）、カルシフィラキシス、後縦靭帯骨化（OPLL）、低リン血症性くる病、変形性関節症、加齢性動脈硬化、特発性乳児動脈石灰化症（IIAC）、乳児全身性動脈石灰化（GACI）、および動脈硬化プラーク石灰化からなる群より選択される少なくとも１つの疾患を、当該少なくとも1つの疾患を有すると診断された対象において軽減するまたはその進行を予防する方法であって、本発明のポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含む、方法を含む。
【０１５１】
本発明はさらに、その必要のある対象において加齢性動脈硬化を軽減するまたはその進行を予防する方法であって、本発明のポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含む、方法を含む。
【０１５２】
本発明はさらに、その必要のある対象において、ENPP1欠損（例えば、正常な健常対象における、それぞれ、ENPP1活性レベルまたはENPP1発現レベルのそれと比較してのENPP1活性のレベルの減少およびまたは欠損したENPP1発現）によって引き起こされる疾患を軽減するまたはその進行を予防する方法であって、本発明のポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含む、方法を含む。
【０１５３】
本発明はさらに、その必要のある対象において正常よりも低い血漿PPiレベルにより引き起こされる疾患を軽減するまたはその進行を予防する方法であって、対象の血漿PPiを正常PPiレベル（約1〜3μM）の約90％、95％、100％、105％、110％、120％、130％、140％、または150％であるレベルに増加させかつ／またはそれを維持する本発明のポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含む、方法を含む。特定の態様において、この方法はさらに、血漿PPiレベルを正常PPiレベルの約90％、95％、100％、105％、110％、120％、130％、140％、または150％であるレベルで維持し、それによって病的な石灰化または骨化の進行を予防するための、2日、3日、1週間、または1ヵ月ごとの本発明のポリペプチドのさらなる投与を含む。
【０１５４】
本発明はさらに、その必要のある対象において弾性線維性仮性黄色腫（PXE）を処置する、それを好転させる、またはその進行を予防する方法であって、本発明のポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含む、方法を含む。
【０１５５】
本発明はさらに、その必要のある対象において動脈血管内の動脈硬化プラークの石灰化を処置する、それを好転させる、またはその進行を予防する方法であって、本発明のポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含む、方法を含む。
【０１５６】
本発明はさらに、その必要のある対象において変形性関節症を処置する、それを好転させる、またはその進行を予防する方法であって、本発明のポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含む、方法を含む。
【０１５７】
本発明はさらに、その必要のある対象において早老症に起因する動脈の硬化を処置する、それを好転させる、またはその進行を予防する方法であって、本発明のポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含む、方法を含む。
【０１５８】
本発明はさらに、その必要のある対象においてX連鎖低リン血症性くる病（XLH）、遺伝性低リン血症性くる病（HHRH）、低リン血症性骨病（HBD）、常染色体優性低リン血症性くる病（ADHR）、および／または常染色体劣性低リン血症性くる病を処置する、それを好転させる、またはその進行を予防する方法であって、本発明のポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含む、方法を含む。
【０１５９】
本発明はさらに、その必要のある対象において加齢性骨減少症を処置する、それを好転させる、またはその進行を予防する方法であって、本発明のポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含む、方法を含む。
【０１６０】
本発明はさらに、その必要のある対象において強直性脊椎炎を処置する、それを好転させる、またはその進行を予防する方法であって、本発明のポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含む、方法を含む。
【０１６１】
本発明はさらに、その必要のある対象において小児科鎌状赤血球貧血の発作を処置する、好転させる、またはその進行を予防する方法であって、本発明のポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含む、方法を含む。
【０１６２】
特定の態様において、病的な石灰化は、特発性乳児動脈石灰化症（IIAC）および動脈硬化プラークの石灰化からなる群より選択される。
【０１６３】
特定の態様において、病的な骨化は、後縦靭帯骨化（OPLL）、低リン血症性くる病、および変形性関節症からなる群より選択される。
【０１６４】
特定の態様において、軟組織の石灰化は、IIACおよび変形性関節症からなる群より選択される。他の態様において、軟組織は、動脈硬化プラークを含む、さらに他の態様において、軟組織は、筋性動脈を含む。さらに他の態様において、軟組織は、関節および脊椎からなる群より選択される。さらに他の態様において、関節は、手の関節および足の関節からなる群より選択される。さらに他の態様において、軟組織は、関節軟骨および椎間板軟骨（vertebral disk cartilage）からなる群より選択される。さらに他の態様において、軟組織は、血管を含む。さらに他の態様において、軟組織は、結合組織を含む。
【０１６５】
特定の態様において、対象は、早老症と診断された者である。
【０１６６】
特定の態様において、本発明のポリペプチドは、哺乳類細胞において発現されたENPP1前駆タンパク質の分泌産物である。他の態様において、ENPP1前駆タンパク質は、シグナルペプチド配列およびENPP1ポリペプチドを含み、ENPP1前駆タンパク質は、タンパク質分解プロセスを受けて本発明のポリペプチドになる。さらに他の態様において、ENPP1前駆タンパク質において、シグナルペプチド配列は、ENPP1ポリペプチドのN末端にコンジュゲートされている。タンパク質分解により、シグナルペプチド配列がENPP1前駆タンパク質から切断され、ENPP1ポリペプチドが提供される。特定の態様において、シグナルペプチド配列は、ENPP1シグナルペプチド配列、ENPP2シグナルペプチド配列、ENPP7シグナルペプチド配列、およびENPP5シグナルペプチド配列からなる群より選択される。
【０１６７】
特定の態様において、ポリペプチドは、対象に急性的または慢性的に投与される。他の態様において、ポリペプチドは、対象に局所的、局部的、非経口的、または全身的に投与される。
【０１６８】
特定の態様において、対象は哺乳類である。他の態様において、哺乳類はヒトである。
【０１６９】
特定の態様において、ポリペプチドまたはその前駆タンパク質は、皮下、経口、エアゾール、吸入、直腸、膣、経皮、皮下、鼻内、頬側、舌下、非経口、髄腔内、胃内、点眼、肺、および局所からなる群より選択される少なくとも1つの経路によりに投与される。他の態様において、ポリペプチドまたはその前駆タンパク質は、少なくとも1つの薬学的に許容される担体をさらに含む薬学的組成物として対象に投与される。
【０１７０】
特定の態様において、ポリペプチドまたはその前駆タンパク質は、対象に急性的または慢性的に投与される。他の態様において、ポリペプチドまたはその前駆タンパク質は、対象に局所的、局部的、または全身的に投与される。さらに別の態様において、ポリペプチドまたはその前駆タンパク質は、コードされるベクター上で送達され、ここで、ベクターはタンパク質をコードしかつそれは対象にベクターを投与するとベクターから転写および翻訳される。
【０１７１】
本明細書で詳述される方法を含む本開示を携えると、一度確立された疾患または障害の処置に本発明が限定されないことが当業者によって理解されると考えられる。特に、疾患または障害の症状は、対象に対して有害な点まで顕在化していることを要せず、実際、疾患または障害は、処置が行われる前に対象において検出されることを要しない。すなわち、疾患または障害からの実質的な病状は、本発明が利益を提供し得る前に発生している必要はない。
【０１７２】
したがって、本発明のポリペプチドが、本明細書の他所で議論されるように、疾患または障害の発生前に対象に投与され得、それによって疾患または障害の進展が予防され得るという点で、本発明は、本明細書に十分に記載されているように、対象において疾患および障害を予防する方法を含む。特に、疾患または障害の症状が対象に対して有害な点まで顕在化していない場合、実際、疾患または障害は、処置が行われる前に対象において検出されることを要しない。すなわち、疾患または障害からの実質的病状が、本発明が利益を提供し得る前に発生している必要はない。したがって、本発明のポリペプチドが疾患または障害の検出前に対象に投与され得るという点で、本発明は、対象において疾患もしくは障害の発生を予防するもしくは遅らせる、または疾患もしくは障害の進行もしくは成長を低下させる方法を含む。特定の態様において、本発明のポリペプチドは、疾患または障害の強い家族歴を有する対象に投与され、それによって、疾患または障害の発生または進行が予防されるまたは遅らせられる。
【０１７３】
したがって、本明細書の開示を携えた当業者は、対象における疾患または障害の予防が、その疾患または障害に対する予防的手段としての本発明のポリペプチドの対象への投与を含むことを理解すると考えられる。
【０１７４】
薬学的組成物および製剤
本発明は、本明細書に記載される方法に含まれる、本発明のポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。
【０１７５】
そのような薬学的組成物は、対象への投与に適した形態である、または薬学的組成物はさらに、1つもしくは複数の薬学的許容される担体、1つもしくは複数の追加の成分、またはこれらのいくつかの組み合わせを含み得る。薬学的組成物の様々な成分は、生理学的に許容される塩の形態で、例えば、当技術分野で周知のように、生理学的に許容されるカチオンまたはアニオンとの組み合わせで、調製され得る。
【０１７６】
1つの態様において、本発明の方法を実施するために有用な薬学的組成物は、1 ng/kg/日〜100 mg/kg/日の用量を送達するよう投与され得る。他の態様において、本発明の方法を実施するために有用な薬学的組成物は、1 ng/kg/日〜500 mg/kg/日の用量を送達するよう投与され得る。
【０１７７】
本発明の薬学的組成物における活性成分、薬学的に許容される担体および任意の追加の成分の相対量は、処置される対象の固有性、サイズ、および状態に依存し、さらに、その組成物を投与する経路に依存して変化し得る。例として、組成物は、約0.1％〜約100％（w/w）の活性成分を含み得る。
【０１７８】
本発明の方法において有用な薬学的組成物は、吸入、経口、直腸、膣、非経口、局所、経皮、肺、鼻内、頬側、点眼、髄腔内、静脈内、または別の投与経路用に適切に開発され得る。他の想定される製剤は、有突起ナノ粒子（projected nanoparticle）、リポソーム調製物、活性成分を含む再封赤血球（resealed erythrocyte）、および免疫ベースの製剤を含む。投与経路は、当業者に直ちと明らかになり、それは処置される疾患のタイプおよび重篤度、処置される動物またはヒト患者のタイプおよび年齢等を含む任意の多くの要因に依存する。
【０１７９】
本明細書に記載される薬学的組成物の製剤は、薬学分野において公知のまたはその後に開発される任意の方法によって調製され得る。一般に、そのような調製法は、活性成分を担体または1つもしくは複数の他の補助成分と組み合わせる工程および、その後に、必要な場合または望ましい場合、その生成物を所望の単または多用量単位に成形またはパッケージ化する工程を含む。
【０１８０】
本明細書で使用される場合、「単位用量」は、既定量の活性成分を含む薬学的組成物の個別の量である。活性成分の量は、通常、対象に投与される活性成分の用量またはそのような用量の使い勝手の良い一部分、例えば、そのような用量の2分の1または3分の1に等しい。単位剤形は、1日1回用量または1日複数回用量（例えば、1日あたり約1〜4回またはそれ以上の回数）の1つのためのものであり得る。1日複数回用量が使用される場合、単位剤形は、各用量で同じまたは異なるものであり得る。
【０１８１】
投与／投薬
投与レジメンは、有効量がどのようなものになるかに影響し得る。例えば、複数に分割された用量および互い違いの用量が、毎日もしくは連続的に投与され得るか、または用量は継続的に注入され得るか、またはボーラス注射であり得る。さらに、治療用製剤の投薬は、治療または予防状況の緊急性に比例して増加または減少され得る。特定の態様において、対象への本発明の化合物の投与は、対象の血漿PPiを正常に近いレベルまで上昇させ、ここで哺乳類におけるPPiの正常レベルは1〜3μMである。「正常に近い」は、0〜1.2μMもしくは正常より0〜40％下回るもしくは上回る、30 nM〜0.9μMもしくは正常より1〜30％下回るもしくは上回る、0〜0.6μMもしくは正常より0〜20％下回るもしくは上回る、または0〜0.3μMもしくは正常より0〜10％下回るもしくは上回るを表す。
【０１８２】
患者、例えば哺乳類、例えばヒトへの本発明の化合物の投与は、公知の方法を用いて、その患者において疾患または障害を処置するのに効果的な用量および期間行われ得る。治療効果を達成するのに必要な治療化合物の有効量は、使用される個々の化合物の活性；投与時間；その化合物の排出率；処置期間；その化合物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物または物質；疾患または障害の状態、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的健康および以前の治療歴などの要因ならびに医学分野で周知の同様の要因により変化し得る。投薬レジメンは、最適な治療応答を提供するよう調整され得る。用量は、治療化合物の生物学的活性に基づき決定され、これは半減期および治療化合物血漿時間曲線下面積に依存する。本発明にしたがうポリペプチドは、PPiの正常（1〜3μＭ）レベルに近いまたは（30〜50％高い）正常レベル以上のいずれかである血漿PPiの持続的レベルを達成するよう、2日ごと、または4日ごと、または毎週、または毎月の適切な時間間隔で投与される。本発明のポリペプチドの治療用量はまた、半減期または治療ポリペプチドが体内から除去される速度に基づき決定され得る。本発明にしたがうポリペプチドは、ENPP1の酵素活性の一定レベルを達成するよう、2日ごと、または4日ごと、または毎週、または毎月の適切な時間間隔で投与される。
【０１８３】
例えば、様々な分割用量が毎日投与され得るまたはその用量は治療状況の緊急性に比例して減少され得る。本発明の治療化合物の有効用量範囲の非限定的な例は、約0.01〜50 mg/kg体重/日である。いくつかの態様において、本発明の治療化合物の有効用量範囲は、約50 ng〜500 ng/kg、好ましくは100 ng〜300 ng/kg体重である。当業者は、過度の実験を行うことなく治療化合物の有効量に関する関連要因を研究し、決定を行うことができると考えられる。
【０１８４】
化合物は、1日に数回の頻度で患者に投与され得る、またはそれはより低頻度で、例えば1日に1回、1週間に1回、2週間に1回、1か月に1回、もしくはそれよりさらに低い頻度で、例えば数か月に1回もしくは1年に1回もしくはそれより低い頻度で投与され得る。1日あたり投薬される化合物の量は、非限定的な例として、毎日、1日おき、2日ごと、3日ごと、4日ごとまたは5日ごとに投与され得ることが理解される。例えば、1日おきの投与の場合、1日あたり5 mgの用量が月曜日に開始され、水曜日に第1の後続の1日あたり5 mgの用量が投与され、金曜日に第2の後続の1日あたり5 mgの用量が投与される等である。投薬の頻度は、当業者に直ちに明らかとなり、かつそれは任意の多くの要因、例えば処置される疾患のタイプおよび重篤度ならびに患者のタイプおよび年齢に依存する。
【０１８５】
本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の用量レベルは、患者に対して毒性を示すことなく、個々の患者、組成物および投与様式で所望の治療応答を達成するのに効果的な活性成分の量が得られるよう変更され得る。
【０１８６】
当技術分野の通常の技能を有する医師、例えば医者は、必要とされる薬学的組成物の有効量を直ちに決定し処方し得る。例えば、医者または獣医は、薬学的組成物で用いられる本発明の化合物の用量を、所望の治療効果を達成するために必要とされるよりも低いレベルから開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させ得る。
【０１８７】
特定の態様において、本発明の組成物は、1日あたり1〜5回またはそれ以上の範囲の投薬で患者に投与される。他の態様において、本発明の組成物は、1日に1回、2日ごと、3日ごと〜1週間に1回および2週間に1回を含むがこれらに限定されない投薬範囲で患者に投与される。本発明の様々な組み合わせ組成物の投与頻度は、年齢、処置される疾患または障害、性別、全般的健康および他の要因を含むがこれらに限定されない多くの要因に依存して患者ごとに異なる。したがって、本発明は、任意の特定の投薬レジメンに限定されると解釈されるべきでなく、任意の患者に投与される正確な用量および組成は、その患者についてのすべての他の要因を考慮した上で担当医によって決定されると考えられる。
【０１８８】
特定の態様において、本発明は、本発明の化合物の治療有効量を単独でまたは第2の薬剤と組み合わせて保持する容器、ならびに患者における疾患または障害の1つまたは複数の症状を処置する、予防する、または軽減するために当該化合物を使用するための指示書を含む、包装された薬学的組成物に関する。
【０１８９】
投与経路
本発明の任意の化合物の投与経路は、吸入、経口、鼻、直腸、非経口、舌下、経皮、経粘膜（例えば、舌下、舌、（経）頬側、（経）尿道、膣（例えば、経膣および膣周囲）、鼻（内）、ならびに（経）直腸）、膀胱内、肺内、十二指腸内、胃内、髄腔内、皮下、筋内、皮内、動脈内、静脈内、気管支内、吸入、および局所投与を含む。
【０１９０】
適切な組成および剤形は、例えば、錠剤、カプセル、カプレット、ピル、ジェルキャップ、トローチ、分散物、懸濁物、溶液、シロップ、顆粒、ビーズ、経皮パッチ、ジェル、粉末、ペレット、マグマ（magma）、ロゼンジ、クリーム、ペースト、石膏、ローション、ディスク、坐剤、鼻または経口投与用液体噴霧物、吸入用乾燥粉末またはエアゾール化製剤、膀胱内投与用組成物および製剤等を含む。本発明において有用であり得る製剤および組成物は、本明細書に記載されている特定の製剤および組成物に限定されない。
【０１９１】
非経口投与
本明細書で使用される場合、薬学的組成物の「非経口投与」は、対象の組織の物理的破裂および組織内の裂け目を通じた薬学的組成物の投与により特徴づけられる任意の投与経路を含む。非経口投与は、したがって、組成物の注射による、外科的切開を通じた組成物の適用による、組織を貫通する非外科的創傷を通じた組成物の適用による薬学的組成物の投与等を含むがこれらに限定されない。特に、非経口投与は、皮下、静脈内、腹腔内、筋内、胸骨内注射、および腎臓透析注入技術を含むがこれらに限定されないことが想定されている。
【０１９２】
さらなる投与形式
本発明のさらなる投薬形式は、米国特許第6,340,475号、同第6,488,962号、同第6,451,808号、同第5,972,389号、同第5,582,837号および同第5,007,790号に記載される投薬形態を含む。本発明のさらなる投薬形態はまた、米国特許出願第20030147952号、同第20030104062号、同第20030104053号、同第20030044466号、同第20030039688号、および同第20020051820号に記載される投薬形態を含む。本発明のさらなる投薬形態はまた、PCT出願番号WO 03/35041、同WO 03/35040、同WO 03/35029、同WO 03/35177、同WO 03/35039、同WO 02/96404、同WO 02/32416、同WO 01/97783、同WO 01/56544、同WO 01/32217、同WO 98/55107、同WO 98/11879、同WO 97/47285、同WO 93/18755、および同WO 90/11757に記載される投薬形態を含む。
【０１９３】
制御放出製剤および薬物送達システム
本発明の薬学的組成物の制御または持続放出製剤は、従来技術を用いて作製され得る。いくつかの例において、使用される剤形は、所望の放出プロフィールを提供するために、例えば、ヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリクス、ゲル、透過膜、浸透圧システム、多層コーティング、微粒子、リポソームもしくはマイクロスフィアまたはそれらの組み合わせを様々な比率で用いる、その中の1つまたは複数の活性成分の徐放または制御放出として提供され得る。制御放出に適合される、経口投与に適した一単位剤形、例えば錠剤、カプセル、ゲルキャップおよびカプレットは、本発明に包含される。
【０１９４】
特定の態様において、本発明の製剤は、短期、急速消失（rapid-offset）、ならびに制御、例えば持続放出、遅延放出、およびパルス放出製剤であり得るがこれらに限定されない。
【０１９５】
持続放出という用語は、その従来的な意味で使用され、長期間にわたる薬物の漸進的放出を提供し、必ず必要というわけではないが、長期間にわたる薬物の実質的に一定の血中レベルをもたらす薬物製剤を表す。期間は、1か月またはそれ以上という長いものであり得、ボーラス形態で投与される同量の剤よりも長い放出であるべきである。持続放出のために、化合物は、化合物に持続放出特性を提供する適切なポリマーまたは疎水性物質と共に製剤化され得る。その場合、本発明の方法において使用される化合物は、例えば注射により、微粒子の形態で、または移植により、ウエハースもしくはディスクの形態で投与され得る。本発明の特定の態様において、本発明の化合物は、持続放出製剤を用いて、単独でまたは別の薬剤と組み合わせて患者に投与される。
【０１９６】
遅延放出という用語は、本明細書においてその従来的な意味で使用され、薬物投与後の一定の遅延の後の薬物の初期放出を提供し、必要というわけではないが、約10分から最大約12時間の遅延を含み得る薬物製剤を表す。パルス放出という用語は、本明細書においてその従来的な意味で使用され、薬物投与後に薬物のパルス血漿プロフィールを生成する様式での薬物の放出を提供する薬物製剤を表す。即時放出という用語は、本明細書においてその従来的な意味で使用され、薬物投与直後の薬物の放出を提供する薬物製剤を表す。
【０１９７】
本明細書で使用される場合、短期は、薬物投与後の、約8時間、約7時間、約6時間、約5時間、約4時間、約3時間、約2時間、約1時間、約40分間、約20分間、または約10分間を含むそれら以下の任意の期間およびそれらの任意またはすべての全増分または部分的増分の任意の期間を表す。
【０１９８】
本明細書で使用される場合、急速消失は、薬物投与後の、約8時間、約7時間、約6時間、約5時間、約4時間、約3時間、約2時間、約1時間、約40分間、約20分間、または約10分間を含むそれら以下の任意の期間およびそれらの任意かつすべての全増分または部分的増分の任意の期間を表す。
【０１９９】
当業者は、従来的実験のみを用いて、本明細書に記載される個々の手順、態様、特許請求の範囲、および実施例の多くの等価物を認識し、確認することができると考えられる。そのような等価物は、本発明の範囲内であり、添付の特許請求の範囲に包含されるとみなされる。例えば、当技術分野で知られている代替物による、従来的実験のみを用いた反応および調製条件の改変は、本願の範囲内であることが理解されるべきである。
【０２００】
どのような値および範囲が本明細書で提供されようとも、これらの値および範囲に包含されるすべての値および範囲が、本発明の範囲に包含されることが意味されていることが理解されるべきである。さらに、これらの範囲に包含されるすべての値および値の範囲の上限または下限もまた、本願により意図されたものである。
【０２０１】
以下の実施例は、本発明の局面をさらに示すものである。しかし、それらはいかなる様式においても本明細書に示される本発明の教示または開示の限定とはならない。
【実施例】
【０２０２】
本発明は、ここで、以下の実施例を参照して解説される。これらの実施例は、例示を目的として提供されるにすぎず、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、本明細書に提供される教示の結果として明らかとなるすべてのバリエーションを包含する。
【０２０３】
方法および材料
具体的に言及されていない限り、補充ありおよびなしでのCHO細胞または改変CHO細胞内での構築物の発現、Vmaxアッセイ、Km/Kcatアッセイ、AUCアッセイ、半減期アッセイは、本明細書の他所に記載されるプロトコールを用いて実施した。
【０２０４】
ENPP1-Fc変異体構築物の作製
ヒトNPP1（ヒト：NCBIアクセッションNP 006199）を、pFUSE-hlgGl-FclまたはpFUSE-mlgGl-Fclプラスミド（InvivoGen, San Diego CA）のそれぞれへのサブクローニングによって、IgGlに融合させた可溶性組み換えタンパク質を発現するよう改変した。この構築物を、市販のキット（Q5（登録商標）Site-Directed Mutagenesis Kit/New England Biolabs）を用いた部位特異的変異誘発を用いてSEQ ID NO:7から作製した。このようにして作製した構築物を、核酸配列の検証のために配列決定し、その後にタンパク質の発現に使用した。
【０２０５】
ENPP1-Fc変異体構築物の発現
ENPPl-Fc構築物の安定なトランスフェクションを、ゼオシン／ゲンタマイシン選択下でCHO K1細胞（Sigma Aldrich, 85051005）において確立し、懸濁成長に適合させた。適合した細胞を用いて、37℃および5％CO2、120 rpmでの攪拌、高湿度の下、振盪フラスコ内のCD FortiCHO（商標）培地（A1148301、Thermo Fischer）中での液体培養成長の播種を行った。この培養物を、所望の目標量まで段階的に拡張し、その後に細胞外タンパク質を蓄積させるためにさらに2日間維持した。
【０２０６】
改変CHO細胞におけるENPP1-Fc変異体構築物の発現
CHO-K1細胞を、ヒトα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ（α-2,6-ST）酵素を安定的に発現するCHO-K1-MOD細胞を生成するよう改変した。ENPPl-Fc構築物の安定なトランスフェクションを、CHO K1-MOD細胞において確立し、上記と同じプロトコールにしたがいタンパク質を発現させた。必要に応じて一部の構築物において、対応する構築物を発現するCHO-K1-MOD細胞の培養用培地に、シアル酸または1,3,4-O-Bu3ManNAcと呼ばれるシアル酸の「高フラックス」前駆体を補充し、タンパク質産生の最中の高レベルのグリコシレートを促進した。
【０２０７】
ENPP1-Fc変異体構築物の精製
この液体培養物を、4300×gで5分間遠心分離し、その上清を、0.2μm膜を通じてろ過し、Pellicon（登録商標）3 0. 0.11 m2 Ultracell（登録商標）30 Dカセット（Millipore, Billerica MA）を用いてタンジェンシャルフローを通じて濃縮した。ついで濃縮された上清を、多工程プロセスでのクロマトグラフィー技術の組み合わせにより精製した。これらの技術は、連続的に実施され、以下のいずれかを含み得る：プロテインAもしくはプロテインGを用いた親和性クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性交換クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）、沈降工程、抽出工程、凍結乾燥工程および／または結晶化工程。これらの工程の任意の1つを順に用いることで、タンパク質化学の当業者は、記載される関心対象の組成物を、銀染色ゲルにおいて混入タンパク質バンドを示さない均質性にまで精製することができる。ついで、得られたタンパク質サンプルを、Pierce LAL Chromogenic Endotoxin Quantitation Kit（カタログ番号88282）を用いて試験し、すべてが内毒素を含まないことを確認した。
【０２０８】
クローン最適化の生物学的影響を定量化するため、選択されたENPP1-Fcアイソフォームの薬物動態効果を、各アイソフォームの1回の皮下投薬後の複数の時点での血漿PPi濃度の測定によって定量化した。
【０２０９】
Km/Kcat決定
ENPP1構築物によるATPの定常状態加水分解を、HPLCにより測定した。簡単に説明すると、20 mM Tris、pH 7.4、150 mM NaCl、4.5 nM KCl、14 mM ZnCl2、1mM MgCl2、および1mM CaCl2を含む反応緩衝液において、様々な濃度のATPに10 nM PPiを添加することによって酵素反応を開始させた。様々な時点で、50μlの反応溶液を取り出し、等量の3Mギ酸で反応停止させた。停止させた反応溶液を、5 mM酢酸アンモニウム（pH 6.0）溶液で平衡化したC-18（5 m t 250×4.6 mm）カラム（Higgins Analytical）に投入し、0％〜20％メタノール勾配で溶出させた。基質および生産物を、259 nmでのUV吸収によりモニタリングし、それらの対応ピークの積分および標準曲線にしたがい定量した。
【０２１０】
Vmaxアッセイ
調製した変異体の各々について、チミジン5'-一リン酸p-ニトロフェニルエステル（pNP-TMP）を用いてホスホジエステラーゼ活性を分析した（Saunders, et al., 2008, Mol. Cancer Ther. 7(10):3352-62; Albright, et al., 2015, Nat Commun. 6:10006）。
【０２１１】
曲線下面積アッセイ
曲線下面積（AUC）とも呼ばれる、時間に対する血漿濃度の曲線下の面積は、血管外薬物送達についての分布容積（V）、総消失クリアランス（CL）および生物学的利用能（F）を評価する尺度として使用され得る。各々の発現および精製されたENPP1-Fc構築物についての血漿時間曲線下面積を、等式1に記載されるような、標準的な等式を用いて行い、1回の生体物質の皮下注射後の半減期および生物学的利用能を測定した。
【０２１２】
半減期決定
薬物半減期（t1/2）は、体内の薬物または生体物質の血漿濃度または量が50％まで減少するのに要する時間である。各々の発現および精製されたENPP1-Fc構築物についての半減期値を、1回の生体物質の皮下注射後の半減期および生物学的利用能の決定を可能にする当技術分野でおよび／または本明細書に記載されるプロトコール、例えば等式1にしたがい行った。
【０２１３】
薬物半減期は、皮下の注射部位に1回の注射で投与された薬物の全身濃度の分数と時間の間の関係に対応する等式1を用いて計算することができる。時間（t）に対する吸収された薬物の分数（F)としてのこのデータのプロットは、このデータを時間t=0で皮下注射部位に投与された薬物の総全身吸収の等式にフィッティングさせることによる消失（ke）および吸収（ka）定数の決定を実現する。
2021535153.tif 000008
【０２１４】
実施例1：グリコシル化変異の選択および最適化
ENPP1-Fc構築物を、推定追加グリコシル化部位を導入しかつ／または新生児オーファン受容体（FcRn）に対するFcの親和性を増大させる変異に供した。試験した変異は、本明細書の他所に示されており、その議論の特定の構築物を以下で説明する。
【０２１５】
追加のN結合型グリコシル化部位を導入し、融合タンパク質のpH依存性リサイクルを強化することにより、ENPP1-Fcの薬物動態特性の改善を試みた。追加のN結合型グリコシル化部位の選択を手引きする方法として、マウスEnpp1結晶のX線回折から得た電子密度マップを使用し、これによりEnpp1において4つのグリコシル化部位が明らかになった。これらの部位が高い相同性のヒトENPP1において存在すると推定し、加えて、ヒトENPP1は、そのグリコシル化状態が未知である4つのさらなるN結合型グリコシル化コンセンサス配列を含んでいる（図6B）。
【０２１６】
触媒活性に悪影響を及ぼさないと考えられる超グリコシル化が可能なENPP1の領域を同定するため、GACI患者のENPP1に関する構造モデリング、臨床データ、および遺伝子データの組み合わせを使用した。最初に、N結合型グリコシル化コンセンサス配列をENPP2〜7において同定し、1つの隣接残基の変更を通じてグリコシル化部位の導入を容易に行える配列を評価した。ついで、標準的なソフトウェアを用いてENPP2〜7を構造的にモデル化し、マウスEnpp1構造（PDB IDコード4GTW）を通じて配列をスレッド化した。提案されたグリコシル化部位の位置を、GACIにおける既知の不活性化ENPP1変異の部位（図6A〜6B）およびこの酵素内のジスルフィド結合の位置と比較した。提案されたグリコシル化部位の空間的位置がいずれかと干渉すると予想された場合、その部位を却下した。これらのモデリング研究により、そのタンパク質の折り畳みまたは酵素活性を妨害することが予想されないENPP1に容易に導入することが可能な追加のN結合型グリコシル化手順のための53ヵ所の推定部位を同定した（図7、13、および14）。
【０２１７】
ついで、追加のN結合型グリコシル化コンセンサス配列を、部位特異的変異誘発を通じてヒトENPP1-Fc（hENPP1-Fc、構築物＃770）に導入した。このタンパク質を、96ウェルプレートにおいてCHO細胞内で一過的に発現させ、各クローンからの細胞外上清の酵素活性を、方法に記載されるようにして発色基質としてpNP-TMPを用いる高スループットアッセイにおいて三連でスクリーニングした（図7A〜7D）。53個の推定ENPP1-Fcアイソフォームのうちの10個におけるpNP-TMP加水分解の速度は、構築物＃770と同等またはそれ以上であり（図7A〜7D）、これらの10個のグリコフォームを、以下に記載される相互およびIgG1 Fcドメインとのコンビナトリアル最適化用に選択した。
【０２１８】
FcRnは、ヒトIgG1 Fc血清半減期の主な恒常性調節因子であり、FcRnに対するFcのpH依存性相互作用を強化するFcドメイン内の変異は、生物抗体の循環半減期を延長した。pH依存性リサイクルを強化することが報告された2つのFc変異である、本明細書中以降、HN変異体と呼ばれるH433K/N434F、および本明細書中以降、MST変異と呼ばれるM242Y/S254T/T246E、の効果をここで試験した（図8A〜8B）。Fcドメインの2つの変種のいずれかを、許容される加水分解速度を示した10個のENPP1-Fcグリコフォームの1つまたは複数と無作為に組み合わせ、12個のさらなるENPP1-Fcクローンを作製した（表3）。これらのクローンのいくつかを、ENPP1-Fcの薬物動態に対する複数のグリコフォームの効果を試験するために選択し、タンパク質表面領域に対する潜在的なグリカン遮蔽効果を強化するために、異なるタンパク質ドメイン上の2つの空間的に別個の推定グリコシル化部位を選択した（表3；構築物＃1057、＃1064、＃1014、＃1040）。他のクローンは、pK特性に対する単独でのまたは1つの追加の推定グリコシル化の存在下でのFc変異の効果のみを試験した（表3；それぞれ構築物＃981および＃1051）。
【０２１９】
実施例2：CHO細胞株を用いた発現、および増殖条件
非ヒトチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞は、組み換え産生されるタンパク質におけるCHOおよびヒトのグリコシル化パターンの類似性から、生体物質の産生に広く利用されている。とはいうものの、これらの2つの間にはグリコシル化の違いが存在し、最も注目すべきは、ヒトN結合型グリカンが、α-2,3およびα-2,6の両結合を有する末端シアル酸残基を含むのに対して、CHO細胞はα-2,3結合のみを含むことである。
【０２２０】
CHOとヒト細胞の間の末端シアリル化の違いが本発明のシステムにおけるPKおよび生物学的利用能に影響するかどうかを試験するため、宿主としてヒトα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ（α-2,6-ST）を安定的に発現するCHO細胞株を樹立し、このクローンを様々な構築物におけるPKおよび生物学的利用能に対するα-2,6結合の効果を比較するための7つのENPP1アイソフォームの産生に使用した（表5；「-ST」で終わる構築物番号）。PKおよび生物学的利用能に対する増殖条件の効果を調査するため、タンパク質産生の最中に、選択されたENPP1-Fcアイソフォームを安定的にトランスフェクトされた細胞（CHO K1細胞およびヒトα-2,6-STを安定的にトランスフェクトされたCHO K1細胞の両方）に1,3,4-O-Bu3ManNAcと呼ばれるシアル酸の「高フラックス」前駆体を補充した（表5）。
【０２２１】
ENPP1-Fcアイソフォームを、同一の精製スキームを用いて均質になるよう精製し、ミカエリス・メンテン酵素速度定数および薬物動態特性を、本明細書の他所に記載されるように決定した。最後に、クローン最適化の生物学的影響を定量化するため、選択されたENPP1-Fcアイソフォームの薬物動態効果を、各アイソフォームの1回の皮下投薬後の複数の時点で血漿PPi濃度を測定することによって定量した。
【０２２２】
実施例3：追加のN結合型グリコシル化部位の薬物動態効果
上記のインシリコ予測およびHTS法を用いたN結合型グリコシル化部位の追加は、ENPP1-Fcへのマウスのインビボ曝露を、グリコフォームにおいて有意に、つまり構築物＃1020において4倍、増加させた。どの配列バリエーションがグリコシル化を増加させ、グリコシル化の追加に相当する分子量の増加を示したかを判定するため、表2のENPP1-Fcアイソフォームのサイズを、SDS-PAGEゲルによって比較した。構築物＃1020における配列変化がグリコシル化を首尾よく導入したかを判定するため、MALDI-TOFを使用し、これもまたこれらの部位におけるグリコシル化の存在を確認した。
【０２２３】
実施例4：Fc IgG1変異の薬物動態効果（図10〜11）
FcRnに対するそれらの親和性を強化し、pH依存性抗体リサイクルを増加させる変異をFcドメイン内に含む抗体は、今までFcドメインに融合された治療酵素において使用されていない。いくつかのFc変異は、FcRn受容体に対するFcドメインの親和性を首尾よく増加させたが、インビボでの抗体PKにおいて好ましくないPK特性をもたらし、他のものはインビボでのPK特性を強化することが示された。
【０２２４】
同様のFc変化が酵素融合タンパク質のPK特性を強化するかどうかを判定するため、生物抗体において以前に使用されたFc内の2つの特定のIgG1変異である、H433K/N434FおよびM242Y/S254T/T246E、を調査した。概ね、M242Y/S254T/T246E変異は、ENPP1-Fcの特性の改善に関してH433K/N434Fよりも優れていることが見いだされた。例えば、構築物＃770と比較した場合、M242Y/S254T/T246E変異のみを有する構築物＃981は、半減期を3.3倍、AUCを5.8倍増加させた。これに対して、様々なENPP1変異という状況においてH433K/N434F変異を有する構築物は、1.2〜1.7倍のより小さな半減期の増加を達成した。
【０２２５】
実施例5：宿主細胞および増殖条件の効果
α-2,3およびα-2,6の両方の結合を有する末端シアル酸残基を有する組み換え生体物質を産生するヒトα-2,6-STを安定的にトランスフェクトされたCHO細胞におけるタンパク質の発現は、様々な程度の成功をおさめ、その生体物質に依存して増加および減少したPK特性が報告された。
【０２２６】
α-2,6結合がENPP1-FcのPK特性に影響するかどうかを判定するため、CHOK1細胞またはヒトα-2,6-STを安定的にトランスフェクトされたCHOK1細胞のいずれかにおいて産生された7つのENPP1-Fcアイソフォームのインビボ曝露（AUC）および半減期を直接比較した（表4）。ヒトα-2,6-STを安定的にトランスフェクトされたCHOK1細胞における生体物質の産生が有益であるという全体的傾向が確認された。最も強い効果は、薬物に対する生物の曝露（AUC）において見られ、応答したアイソフォーム（構築物＃1057、＃1028、＃951、＃930および＃981）において1.7〜4.6倍のAUCの増加を示した。別の傾向は、より低い初期AUCを有するアイソフォーム（構築物＃951および＃1057）においてAUCにおける影響度がより大きいということであった。しかし、より長期作用性のアイソフォーム（構築物＃1028および＃981）における効果も大きく、CHOK1細胞において産生されたその親化合物よりも8〜10倍高いAUC値を示した。
【０２２７】
半減期に対するα-2,6結合の効果は、より小さく、応答した構築物において20〜30％の増加であった。時間に対するAUCおよびタンパク質活性半減期に対するα-2,6結合の効果の違いを理解するため、CHOk1細胞および1078細胞において産生されたアイソフォームを比較した。
【０２２８】
実施例6：高フラックスシアル酸前駆体を用いた増殖の薬物動態効果
PK特性に対する増殖条件の効果を判定するため、選択されたクローンの培養用培地に、シアル酸の「高フラックス」前駆体である1,3,4-O-Bu3ManNAcまたはシアル酸自体を補充した。CHOK1細胞への1,3,4-O-Bu3ManNAcの補充は、ENPP1-FcのPK特性をほとんど改善しなかったが、この生体物質がヒトα-2,6-STを安定的にトランスフェクトされたCHOK1細胞において産生された場合、半減期およびAUCに対する効果が顕著であった（図12および表4）。例えば、構築物＃1014を産生するCHOK1細胞の細胞培養用培地に1,3,4-O-Bu3ManNAcを補充しても、ほとんどAUCを増強せず、当該アイソフォームの半減期を減少させるようであった。これに対して、1,3,4-O-Bu3ManNAcを、α-2,6-STを安定的にトランスフェクトされたCHOK1細胞において産生された構築物＃1057の細胞培養用培地に添加すると、その効果がより劇的であった。これらの効果は、1,3,4-O-Bu3ManNAcを補充しなかった培地中で増殖されたCHOK1において産生された同じアイソフォームと比較して4倍および2倍のAUCおよび半減期の正味の増加をもたらした（図12および表4）。
【０２２９】
（表１）
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【０２３０】
（表２）薬物動態（PK)に対する追加のN結合型グリコシル化の効果
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【０２３１】
（表３）薬物動態（PK）に対するFc変異の効果
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【０２３２】
（表４）薬物動態（PK）に対する細胞株および変異の効果。「-ST」を付された構築物は、ヒトα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ（α-2,6-ST）を安定的にトランスフェクトされた改変CHO細胞株を用いて調製され；これは、その融合タンパク質のシアリル化の量を、通常のCHO細胞株において発現された融合タンパク質と比較した場合、増強させる。構築物の増強されたシアリル化は、AUCおよび半減期の値の改善をもたらした。
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*：CHO-K1細胞にトランスフェクトされた構築物
**：CHO-K1-MOD細胞にトランスフェクトされた構築物
【０２３３】
（表５）薬物動態（PK）に対するシアル酸補充の効果。「-ST」を付された構築物は、ヒトα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ（α-2,6-ST）を安定的にトランスフェクトされた改変CHO細胞株を用いて調製され；これは、その融合タンパク質のシアリル化の量を、通常のCHO細胞株において発現された融合タンパク質と比較した場合、増強させる。「-A」を付された構築物は、タンパク質産生の最中にシアル酸の「高フラックス」前駆体である1,3,4-O-Bu3ManNAcを補充した培養用培地において増殖された細胞において調製された。
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【０２３４】
（表６）ポリペプチドおよび対応する変異の一覧
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【０２３５】
（表７）ENPP1ポリペプチドにおける変異の一覧
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【０２３６】
態様の列挙
以下の例示的な態様が提供されるが、その番号付けは重要度のレベルを指定するものとみなされるべきでない。
態様1は、免疫グロブリンのFc領域に融合されたENPP1ポリペプチドを含むENPP1ポリペプチド融合体であって、該Fc領域が、SEQ ID NO:7に関するM883Y、S885N、S885T、T887E、H1064K、およびN1065Fからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、該ENPP1ポリペプチド融合体を提供する。
態様2は、前記Fc領域が、SEQ ID NO:7に関するS885N、M883Y、M883Y/S885T/T887E、およびH1064K/N1065Fからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、態様1のポリペプチド融合体を提供する。
態様3は、免疫グロブリンのFc領域に融合されたENPP1ポリペプチドを含むENPP1ポリペプチド融合体であって、該ENPP1ポリペプチドが、SEQ ID NO:7に関するC25N、K27T、およびV29Nからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、該ENPP1ポリペプチド融合体を提供する。
態様4は、前記ENPP1ポリペプチドが、SEQ ID NO:7に関するC25N/K27TおよびV29Nからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、態様3のポリペプチド融合体を提供する。
態様5は、免疫グロブリンのFc領域に融合されたENPP1ポリペプチドを含むENPP1ポリペプチド融合体であって、該ENPP1ポリペプチドが、SEQ ID NO:7に関するK369NおよびI371Tからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、該ENPP1ポリペプチド融合体を提供する。
態様6は、前記ENPP1ポリペプチドが、SEQ ID NO:7に関する少なくとも変異K369N/I371Tを含む、態様5のポリペプチド融合体を提供する。
態様7は、免疫グロブリンのFc領域に融合されたENPP1ポリペプチドを含むENPP1ポリペプチド融合体であって、該ENPP1ポリペプチドが、SEQ ID NO:7に関するP534N、V536T、R545T、P554L、E592N、R741D、およびS766Nからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、該ENPP1ポリペプチド融合体を提供する。
態様8は、前記ENPP1ポリペプチドが、SEQ ID NO:7に関するP534N/V536T、P554L/R545T、E592N、E592N/R741D、およびS766Nからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、態様7のポリペプチド融合体を提供する。
態様9は、免疫グロブリンのFc領域に融合されたENPP1ポリペプチドを含むENPP1ポリペプチド融合体であって、該ENPP1ポリペプチドが、SEQ ID NO:7に関するE864NおよびL866Tからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、該ENPP1ポリペプチド融合体を提供する。
態様10は、前記ENPP1ポリペプチドが、SEQ ID NO:7に関する少なくとも変異E864N/L866Tを含む、態様9のポリペプチド融合体を提供する。
態様11は、SEQ ID NO:7に関するC25N、K27T、V29N、C25N/K27T、K369N、I371T、K369N/I371T、P534N、V536T、R545T、P554L、E592N、R741D、S766N、P534N/V536T、P554L/R545T、E592N/R741D、E864N、L866T、E864N/L866T、M883Y、S885N、S885T、T887E、H1064K、N1065F、M883Y/S885T/T887E、H1064K/N1065Fからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、態様1〜10のいずれかのポリペプチド融合体を提供する。
態様12は、前記Fc領域がIgGのFc領域である、態様1〜11のいずれかのポリペプチド融合体を提供する。
態様13は、SEQ ID NO:7に関するP534N、V536T、R545T、P554L、S766N、およびE592Nからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、態様1〜12のいずれかのポリペプチド融合体を提供する。
態様14は、SEQ ID NO:7に関するS766N、P534N/Y536T、P554L/R545T、およびE592Nからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、態様1〜12のいずれかのポリペプチド融合体を提供する。
態様15は、SEQ ID NO:7に関するS885N、S766N、M883Y/S885T/T887E、E864N/L866T、P534N/V536T/H1064K/N1065F、P554L/R545T、S766N/H1064K/N1065F、E592N/H1064K/N1065F、およびP534N/V536T/M883Y/S885T/T887Eからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、態様1〜12のいずれかのポリペプチド融合体を提供する。
態様16は、ENPP1ポリペプチドと免疫グロブリンのFc領域とを含むENPP1ポリペプチド融合体であって、SEQ ID NO:7に関する変異M883Y、S885T、およびT887Eを含む、該ENPP1ポリペプチド融合体を提供する。
態様17は、ENPP1ポリペプチドと免疫グロブリンのFc領域とを含むENPP1ポリペプチド融合体であって、SEQ ID NO:7に関する変異P534N、V536T、M883Y、S885T、およびT887Eを含む、該ENPP1ポリペプチド融合体を提供する。
態様18は、ENPP1ポリペプチドと免疫グロブリンのFc領域とを含むENPP1ポリペプチド融合体であって、SEQ ID NO:7に関する変異E592N、H1064K、およびN1065Fを含む、該ENPP1ポリペプチド融合体を提供する。
態様19は、SEQ ID NO:7を含み、SEQ ID NO:7に関するS766N、P534N、V536T、P554L、R545T、およびE592Nからなる群より選択される変異を含む、ENPP1変異ポリペプチドを提供する。
態様20は、SEQ ID NO:7に関するS766N、P534N/V536T、P554L/R545T、およびE592Nからなる群より選択される少なくとも1つの変異を含む、態様19の変異ポリペプチドを提供する。
態様21は、SEQ ID NO:7に関するS885N、S766N、M883Y/S885T/T887E、P534N/V536T/H1064K/N1065F、P554L/R545T、S766N/H1064K/N1065F、E592N/H1064K/N1065F、およびP534N/V536T/M883Y/S885T/T887Eからなる群より選択される変異を含む、態様19の変異ポリペプチドを提供する。
態様22は、SEQ ID NO:7に関するS885N変異を含む、態様19の変異ポリペプチドを提供する。
態様23は、SEQ ID NO:7に関するS766N変異を含む、態様19の変異ポリペプチドを提供する。
態様24は、SEQ ID NO:7に関する変異M883Y、S885T、およびT887Eを含む、態様19の変異ポリペプチドを提供する。
態様25は、SEQ ID NO:7に関する変異P534N、V536T、H1064K、およびN1065Fを含む、態様19の変異ポリペプチドを提供する。
態様26は、SEQ ID NO:7に関する変異P554LおよびR545Tを含む、態様19の変異ポリペプチドを提供する。
態様27は、SEQ ID NO:7に関する変異S766N、H1064K、およびN1065Fを含む、態様19の変異ポリペプチドを提供する。
態様28は、SEQ ID NO:7に関する変異E592N、H1064K、およびN1065Fを含む、態様19の変異ポリペプチドを提供する。
態様29は、SEQ ID NO:7に関する変異P534N、V536T、M883Y、S885T、およびT887Eを含む、態様19の変異ポリペプチドを提供する。
態様30は、ヒトST6β-ガラクトサミドα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ（ST6GAL1としても公知）を安定的にトランスフェクトされたCHO細胞株から発現される、態様1〜18のいずれかのポリペプチド融合体または態様19〜29のいずれかの変異ポリペプチドを提供する。
態様31は、シアル酸および／またはN-アセチルマンノサミン（1,3,4-O-Bu3ManNAcとしても公知）を補充した細胞培養物中で増大させた、態様1〜18のいずれかのポリペプチド融合体または態様19〜29のいずれかの変異ポリペプチドを提供する。
態様32は、その必要のある対象において病的な石灰化を減少させるまたはその進行を予防する方法であって、態様1〜18および30〜31のいずれかのポリペプチド融合体または態様19〜31のいずれかの変異ポリペプチドの治療有効量を該対象に投与する工程を含む、該方法を提供する。
態様33は、その必要のある対象において病的な骨化を減少させるまたはその進行を予防する方法であって、態様1〜18および30〜31のいずれかのポリペプチド融合体または態様19〜31のいずれかの変異ポリペプチドの治療有効量を該対象に投与する工程を含む、該方法を提供する。
態様34は、その必要のある対象において軟組織の異所性石灰化を減少させるまたはその進行を予防する方法であって、態様1〜18および30〜31のいずれかのポリペプチド融合体または態様19〜31のいずれかの変異ポリペプチドの治療有効量を該対象に投与する工程を含む、該方法を提供する。
態様35は、その必要のある対象において後縦靭帯骨化（OPLL）を処置する、それを好転させる、またはその進行を予防する方法であって、態様1〜18および30〜31のいずれかのポリペプチド融合体または態様19〜31のいずれかの変異ポリペプチドの治療有効量を該対象に投与する工程を含む、該方法を提供する。
態様36は、その必要のある対象において低リン血症性くる病を処置する、それをもとに戻す、またはその進行を予防する方法であって、態様1〜18および30〜31のいずれかのポリペプチド融合体または態様19〜31のいずれかの変異ポリペプチドの治療有効量を該対象に投与する工程を含む、該方法を提供する。
態様37は、慢性腎疾患（CKD）、末期腎疾患（ESRD）、尿毒症性細小動脈石灰化症（CUA）、カルシフィラキシス、後縦靭帯骨化（OPLL）、低リン血症性くる病、変形性関節症、加齢性動脈硬化、特発性乳児動脈石灰化症（IIAC）、乳児全身性動脈石灰化（GACI）、および動脈硬化プラーク石灰化からなる群より選択される少なくとも１つの疾患を、該少なくとも1つの疾患を有すると診断された対象において軽減するまたはその進行を予防する方法であって、態様1〜18および30〜31のいずれかのポリペプチド融合体または態様19〜31のいずれかの変異ポリペプチドの治療有効量を該対象に投与する工程を含む、該方法を提供する。
態様38は、その必要のある対象において加齢性動脈硬化を軽減するまたはその進行を予防する方法であって、態様1〜18および30〜31のいずれかのポリペプチド融合体または態様19〜31のいずれかの変異ポリペプチドの治療有効量を該対象に投与する工程を含む、該方法を提供する。
態様39は、前記病的な石灰化が、特発性乳児動脈石灰化症（IIAC）および動脈硬化プラーク石灰化からなる群より選択される、態様32の方法を提供する。
態様40は、前記病的な骨化が、後縦靭帯骨化（OPLL）、低リン血症性くる病、および変形性関節症からなる群より選択される、態様33の方法を提供する。
態様41は、前記軟組織石灰化が、IIACおよび変形性関節症からなる群より選択される、態様34の方法を提供する。
態様42は、前記軟組織が、動脈硬化プラーク、筋性動脈、関節、脊椎、関節軟骨、椎間板軟骨、血管、および結合組織からなる群より選択される、態様34の方法を提供する。
態様43は、ピロリン酸（PPi）正常レベルよりも低いPPiレベルを有する対象においてPPiレベルを上昇させる方法であって、態様1〜18および30〜31のいずれかのポリペプチド融合体または態様19〜31のいずれかの変異ポリペプチドの治療有効量を該対象に投与する工程を含み、それによって、投与すると該対象におけるPPiのレベルが、少なくとも2μMの正常レベルまで上昇し、かつほぼ同じレベルで維持される、該方法を提供する。
態様44は、ピロリン酸（PPi）正常レベルよりも低いPPiレベルを有する対象において病的な石灰化もしくは骨化を減少またはそれらの進行を予防する方法であって、態様1〜18および30〜31のいずれかのポリペプチド融合体または態様19〜31のいずれかの変異ポリペプチドの治療有効量を対象に投与する工程を含み、それによって、対象における病的な石灰化もしくは骨化が減少するまたは対象における病的な石灰化もしくは骨化の進行が予防される、該方法を提供する。
態様45は、その必要のある対象において細胞外ピロリン酸（PPi）濃度の減少により顕在化したENPP1欠損症を処置する方法であって、態様1〜18および30〜31のいずれかのポリペプチド融合体または態様19〜31のいずれかの変異ポリペプチドの治療有効量を該対象に投与する工程を含み、それによって該対象におけるPPiのレベルが上昇する、該方法を提供する。
態様46は、前記ポリペプチド融合体または変異ポリペプチドが、哺乳類細胞において発現されたENPP1前駆タンパク質の分泌産物であり、該ENPP1前駆タンパク質がシグナルペプチド配列およびENPP1ポリペプチドを含み、該ENPP1前駆タンパク質がタンパク質分解プロセシングを受けて該ENPP1ポリペプチドが生成される、態様32〜45のいずれかの方法を提供する。
態様47は、前記ENPP1前駆タンパク質において、前記シグナルペプチド配列が前記ENPP1ポリペプチドのN末端にコンジュゲートされている、態様46の方法を提供する。
態様48は、前記シグナルペプチド配列が、ENPP1シグナルペプチド配列、ENPP2シグナルペプチド配列、ENPP7シグナルペプチド配列、およびENPP5シグナルペプチド配列からなる群より選択される、態様46〜47のいずれかの方法を提供する。
態様49は、前記ポリペプチド融合体または変異ポリペプチドが急性的または慢性的に前記対象に投与される、態様32〜48のいずれかの方法を提供する。
態様50は、前記ポリペプチド融合体または変異ポリペプチドが、局所的、局部的、非経口的、または全身的に前記対象に投与される、態様32〜49のいずれかの方法を提供する。
態様51は、前記ポリペプチド融合体または変異ポリペプチドが、皮下、経口、エアゾール、吸入、直腸、膣、経皮、皮下、鼻内、頬側、舌下、非経口、髄腔内、胃内、点眼、肺、および局所からなる群より選択される少なくとも1つの経路によりに前記対象に投与される、態様32〜50のいずれかの方法を提供する。
態様52は、前記ポリペプチド融合体または変異ポリペプチドが、少なくとも1つの薬学的に許容される担体をさらに含む薬学的組成物として前記対象に投与される、態様32〜51のいずれかの方法を提供する。
態様53は、前記対象が哺乳類である、態様32〜52のいずれかの方法を提供する。
態様54は、前記哺乳類がヒトである、態様53の方法を提供する。
【０２３７】
本明細書で引用されている各々かつすべての特許、特許出願、および刊行物の開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。本発明は、具体的態様を参照して開示されているが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の他の態様およびバリエーションが当業者により導かれ得ることが明らかである。添付の特許請求の範囲は、すべてのそのような態様および等価なバリエーションを包含するとみなされることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
2021535153.tif 000027
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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