(57)【要約】真核細胞において遺伝子編集を達成するのに有用な組成物、システムおよび方法が提供される。組成物は、１つまたは複数のウイルスタンパク質がアプタマー結合タンパク質と融合されている１つまたは複数のウイルス性融合タンパク質をコードするプラスミドを含む。組成物はまた、非ウイルス性核酸配列がＣＲＩＳＰＲシステム構成成分をコードする非ウイルス性核酸配列をコードするプラスミドを含む。一部の場合には、非ウイルス性核酸配列はまた、アプタマー配列も含む。プラスミドは、ウイルス性融合タンパク質および非ウイルス性ＲＮＡ配列を含有するレンチウイルス様粒子を含むウイルス粒子を作製するために使用され得る。このようなウイルス粒子を産生するシステムが提供される。また、真核細胞において遺伝子編集を達成するために本開示のウイルス粒子を使用する方法も提供される。
2021522783.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇａｇヌクレオチド配列に作動可能に連結した真核細胞プロモーターを含むレンチウイルスパッケージングプラスミドであって、前記Ｇａｇヌクレオチド配列は、ヌクレオカプシド（ＮＣ）コード配列およびマトリックスタンパク質（ＭＡ）コード配列を含み、前記ＮＣコード配列または前記ＭＡコード配列のうち一方または両方は、少なくとも１つの非ウイルス性アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）ヌクレオチド配列を含み、前記パッケージングプラスミドは、機能的インテグラーゼタンパク質をコードしない、レンチウイルスパッケージングプラスミド。
【請求項２】
前記ＮＣコード配列が、２つの機能的ジンクフィンガータンパク質ドメインおよび機能的天然プロテアーゼプロセシング配列を含む、請求項１に記載のレンチウイルスパッケージングプラスミド。
【請求項３】
前記少なくとも１つの非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列が、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮペプチドまたはＣＯＭタンパク質をコードする、請求項１または２に記載のレンチウイルスパッケージングプラスミド。
【請求項４】
前記Ｇａｇヌクレオチド配列が、第１の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列および第２の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列をタンデムで含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングプラスミド。
【請求項５】
前記第１の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列および前記第２の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列が両方とも、同一のＡＢＰをコードし、前記ＡＢＰが、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮペプチドまたはＣＯＭタンパク質を含む、請求項４に記載のレンチウイルスパッケージングプラスミド。
【請求項６】
前記第１の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列および前記第２の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列が、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮペプチドおよびＣＯＭタンパク質からなる群から選択される異なるＡＢＰをコードする、請求項４に記載のレンチウイルスパッケージングプラスミド。
【請求項７】
前記ＮＣコード配列が、少なくとも１つの第１の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列を含み、前記ＭＡコード配列が、少なくとも１つの第２の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングプラスミド。
【請求項８】
前記少なくとも１つの第１の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列および前記少なくとも１つの第２の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列が両方とも、同一のＡＢＰをコードし、前記ＡＢＰが、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮペプチドまたはＣＯＭタンパク質を含む、請求項７に記載のレンチウイルスパッケージングプラスミド。
【請求項９】
前記少なくとも１つの第１の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列および前記少なくとも１つの第２の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列が、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮペプチドおよびＣＯＭタンパク質からなる群から選択される異なるＡＢＰをコードする、請求項７または８に記載のレンチウイルスパッケージングプラスミド。
【請求項１０】
Ｒｅｖヌクレオチド配列およびＴａｔヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングプラスミド。
【請求項１１】
その中にインテグラーゼ不活性化突然変異を有するインテグラーゼコード配列を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングプラスミド。
【請求項１２】
前記インテグラーゼ不活性化突然変異が、前記インテグラーゼコード配列によってコードされるインテグラーゼタンパク質のアミノ酸６４位でのアスパラギン酸からバリンへの突然変異（Ｄ６４Ｖ）である、請求項１１に記載のレンチウイルスパッケージングプラスミド。
【請求項１３】
インテグラーゼコード配列のすべてまたは一部の欠失を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングプラスミド。
【請求項１４】
逆転写酵素コード配列のすべてまたは一部の欠失を含む、請求項１に記載のレンチウイルスパッケージングプラスミド。
【請求項１５】
前記真核細胞プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターである、請求項１から１４のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングプラスミド。
【請求項１６】
ウイルスタンパク質Ｒ（ＶＰＲ）コード配列またはネガティブ調節因子（ＮＥＦ）コード配列に作動可能に連結した真核細胞プロモーターを含む哺乳動物発現プラスミドであって、前記ＶＰＲコード配列または前記ＮＥＦコード配列は、少なくとも１つの非ウイルス性アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）ヌクレオチド配列を含む、哺乳動物発現プラスミド。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列が、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮペプチドまたはＣＯＭタンパク質をコードする、請求項１６に記載の哺乳動物発現プラスミド。
【請求項１８】
前記ＶＰＲコード配列または前記ＮＥＦコード配列が、第１の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列および第２の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列を含む、請求項１６または請求項１７に記載の哺乳動物発現プラスミド。
【請求項１９】
前記第１の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列および前記第２の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列が、同一の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列である、請求項１８に記載の哺乳動物発現プラスミド。
【請求項２０】
前記第１の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列および前記第２の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列が、異なる非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列である、請求項１８に記載の哺乳動物発現プラスミド。
【請求項２１】
前記第１の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列および前記第２の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列が両方とも、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮペプチドおよびＣＯＭタンパク質からなる群から選択されるＡＢＰをコードする、請求項１９に記載の哺乳動物発現プラスミド。
【請求項２２】
前記第１の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列および前記第２の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列が、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮペプチドおよびＣＯＭタンパク質からなる群から選択される異なるＡＢＰを各々コードする、請求項２０に記載の哺乳動物発現プラスミド。
【請求項２３】
前記真核細胞プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターである、請求項１６から２２のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングプラスミド。
【請求項２４】
非ウイルス性核酸配列に作動可能に連結した真核細胞プロモーターを含む哺乳動物発現プラスミドであって、前記非ウイルス性核酸配列は、少なくとも１つのアプタマーコード配列を含み、前記非ウイルス性核酸配列は、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）コード配列のうち一方または両方および（ｉｉ）少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む、哺乳動物発現プラスミド。
【請求項２５】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列が、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質またはいずれかの誘導体をコードする、請求項２４に記載の哺乳動物発現プラスミド。
【請求項２６】
前記ｇＲＮＡコード配列が、ＤＮＡ標的化配列と、前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと相互作用する定常領域とを含むＲＮＡ分子をコードする、請求項２４または請求項２５に記載の哺乳動物発現プラスミド。
【請求項２７】
前記ｇＲＮＡコード配列が、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列を含むｇＲＮＡをコードする、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の哺乳動物発現プラスミド。
【請求項２８】
前記ｇＲＮＡコード配列が、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含まないｇＲＮＡをコードする、請求項２４から２７のいずれか一項に記載の哺乳動物発現プラスミド。
【請求項２９】
前記非ウイルス性核酸配列が、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列であり、それに作動可能に連結した前記真核細胞プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターである、請求項２４から２８のいずれか一項に記載の哺乳動物発現プラスミド。
【請求項３０】
前記非ウイルス性核酸配列が、ｇＲＮＡコード配列であり、それに作動可能に連結した前記真核細胞プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである、請求項２４から２８のいずれか一項に記載の哺乳動物発現プラスミド。
【請求項３１】
前記非ウイルス性核酸配列が、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列およびｇＲＮＡコード配列の両方を含み、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターが、前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列に作動可能に連結しており、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが、前記ｇＲＮＡコード配列に作動可能に連結している、請求項２４から２８のいずれか一項に記載の哺乳動物発現プラスミド。
【請求項３２】
前記少なくとも１つのアプタマーコード配列が、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮ  ＲＮＡ結合ドメインまたはＣＯＭタンパク質からなる群から選択されるＡＢＰが特異的に結合するアプタマー配列をコードする、請求項２４から３１のいずれか一項に記載の哺乳動物発現プラスミド。
【請求項３３】
前記非ウイルス性核酸配列が、２つのアプタマーコード配列を含む、請求項２４から３２のいずれか一項に記載の哺乳動物発現プラスミド。
【請求項３４】
少なくとも１つの前記非ウイルス性核酸配列が、少なくとも１つの第１のアプタマーコード配列を含むＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列および／または少なくとも１つの第２のアプタマーコード配列を含むｇＲＮＡコード配列を含む、請求項２４から３３のいずれか一項に記載の哺乳動物発現プラスミド。
【請求項３５】
少なくとも１つの前記非ウイルス性核酸配列が、少なくとも１つのアプタマーコード配列を含むＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列を含む、請求項３４のいずれか一項に記載の哺乳動物発現プラスミド。
【請求項３６】
前記ｇＲＮＡコード配列が、少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む、請求項３４に記載の哺乳動物発現プラスミド。
【請求項３７】
前記少なくとも１つのアプタマーコード配列が、前記ｇＲＮＡコード配列のテトラループ中に挿入されている、請求項３６に記載の哺乳動物発現プラスミド。
【請求項３８】
前記アプタマーコード配列が、ＣＯＭタンパク質に結合する、請求項３７に記載の哺乳動物発現プラスミド。
【請求項３９】
前記少なくとも１つの第１のアプタマーコード配列および前記少なくとも１つの第２のアプタマーコード配列が、同一のアプタマーコード配列である、請求項３４に記載の哺乳動物発現プラスミド。
【請求項４０】
前記少なくとも１つの第１のアプタマーコード配列が、第１のＡＢＰが特異的に結合するアプタマー配列をコードし、前記少なくとも１つの第２のアプタマーコード配列が、第２のＡＢＰが特異的に結合するアプタマー配列をコードし、前記少なくとも１つの第１のアプタマーコード配列および前記少なくとも１つの第２のアプタマーコード配列が、異なる第１および第２のＡＢＰが結合するアプタマー配列をコードする、請求項３４に記載の哺乳動物発現プラスミド。
【請求項４１】
前記少なくとも１つの第１のアプタマーコード配列および前記少なくとも１つの第２のアプタマーコード配列が、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮタンパク質ＲＮＡ結合ドメインおよびＣＯＭタンパク質からなる群から選択されるＡＢＰが特異的に結合するアプタマー配列をコードする、請求項４０に記載の哺乳動物発現プラスミド。
【請求項４２】
前記少なくとも１つの第１のアプタマーコード配列および前記少なくとも１つの第２のアプタマーコード配列が、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮタンパク質ＲＮＡ結合ドメインおよびＣＯＭタンパク質からなる群から選択される異なるＡＢＰが各々特異的に結合するアプタマー配列をコードする、請求項４０に記載の哺乳動物発現プラスミド。
【請求項４３】
ＲＮＡ安定化配列をコードするポリヌクレオチド配列が、前記非ウイルス性核酸配列の３’末端に位置する、請求項２４から４２のいずれか一項に記載の哺乳動物発現プラスミド。
【請求項４４】
ＲＮＡ安定化配列をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、ヒトベータグロビン遺伝子の、少なくとも１つの３’ＵＴＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項４３に記載の哺乳動物発現プラスミド。
【請求項４５】
前記プラスミドが、レンチウイルストランスファープラスミドである、請求項２４から４４のいずれか一項に記載の哺乳動物発現プラスミド。
【請求項４６】
ａ）Ｇａｇヌクレオチド配列に作動可能に連結した真核細胞プロモーターを含むパッケージングプラスミドであって、前記Ｇａｇヌクレオチド配列は、ヌクレオカプシド（ＮＣ）コード配列およびマトリックスタンパク質（ＭＡ）コード配列を含み、前記ＮＣコード配列または前記ＭＡコード配列の一方または両方は、少なくとも１つの非ウイルス性アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）ヌクレオチド配列を含み、前記パッケージングプラスミドは、機能的インテグラーゼタンパク質をコードしない、パッケージングプラスミドと、
ｂ）非ウイルス性核酸配列に作動可能に連結した真核細胞プロモーターを含む少なくとも１つの哺乳動物発現プラスミドであって、前記非ウイルス性核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）コード配列、またはＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列およびｇＲＮＡコード配列の両方を含む、哺乳動物発現プラスミドと、
ｃ）エンベロープ糖タンパク質コード配列を含むエンベローププラスミドと
を含むレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項４７】
非ウイルス性ＲＮＡ配列が、少なくとも１つのアプタマー配列を含む、請求項４６に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項４８】
前記パッケージングプラスミドが、Ｒｅｖヌクレオチド配列およびＴａｔヌクレオチド配列をさらに含む、請求項４６または請求項４７に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項４９】
Ｒｅｖヌクレオチド配列を含む第２のパッケージングプラスミドをさらに含む、請求項４６に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項５０】
前記ＮＣコード配列が、２つの機能的ジンクフィンガータンパク質ドメインおよび機能的天然プロテアーゼプロセシング配列を含む、請求項４６から４９のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項５１】
前記少なくとも１つの非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列が、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮペプチドまたはＣＯＭタンパク質をコードする、請求項４６から５０のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項５２】
前記ＮＣコード配列または前記ＭＡコード配列のうち一方または両方が、第１の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列、および第１の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列のすぐ下流の第２の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列を含む、請求項４６から５１のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項５３】
前記第１の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列および前記第２の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列が両方とも、同一のＡＢＰをコードし、前記ＡＢＰが、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮペプチドまたはＣＯＭタンパク質を含む、請求項５２に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項５４】
前記第１の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列および前記第２の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列が、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮペプチドおよびＣＯＭタンパク質からなる群から選択される異なるＡＢＰをコードする、請求項５２に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項５５】
前記ＮＣコード配列が、第１の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列を含み、前記ＭＡコード配列が、少なくとも１つの第２の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列を含む、請求項４６から５４のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項５６】
少なくとも１つの前記第１の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列および少なくとも１つの前記第２の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列が両方とも、同一のＡＢＰをコードし、前記ＡＢＰが、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮペプチドまたはＣＯＭタンパク質を含む、請求項５５に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項５７】
少なくとも１つの前記第１の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列および少なくとも１つの前記第２の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列が、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮペプチドおよびＣＯＭタンパク質からなる群から選択される異なるＡＢＰをコードする、請求項５５に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項５８】
レンチウイルスパッケージングプラスミドが、インテグラーゼ不活性化突然変異を有するインテグラーゼコード配列を含む、請求項４６から５８のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項５９】
前記インテグラーゼ不活性化突然変異が、前記インテグラーゼコード配列によってコードされるインテグラーゼタンパク質のアミノ酸６４位でのアスパラギン酸からバリンへの突然変異（Ｄ６４Ｖ）である、請求項５８に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項６０】
レンチウイルスパッケージングプラスミドが、インテグラーゼコード配列のすべてまたは一部の欠失を含む、請求項４６から５９のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項６１】
レンチウイルスパッケージングプラスミドが、逆転写酵素コード配列のすべてまたは一部の欠失を含む、請求項４６から６０のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項６２】
前記Ｇａｇヌクレオチド配列に作動可能に連結した前記真核細胞プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターである、請求項４６から６１のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項６３】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列が、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質またはいずれかの誘導体をコードする、請求項４６から６２のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項６４】
前記ｇＲＮＡコード配列が、ＤＮＡ標的化配列と、前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと相互作用する定常領域とを含むＲＮＡ分子をコードする、請求項４６から６３のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項６５】
前記ｇＲＮＡコード配列によってコードされるｇＲＮＡが、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列を含む、請求項４６から６４のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項６６】
前記ｇＲＮＡコード配列によってコードされるｇＲＮＡが、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含まない、請求項４６から６５のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項６７】
前記非ウイルス性核酸配列が、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列であり、それに作動可能に連結した前記真核細胞プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターである、請求項４６から６６のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項６８】
前記非ウイルス性核酸配列がｇＲＮＡコード配列であり、それに作動可能に連結した前記真核細胞プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである、請求項４６から６７のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項６９】
前記非ウイルス性核酸配列が、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列およびｇＲＮＡコード配列の両方を含み、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターが、前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列に作動可能に連結しており、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが、前記ｇＲＮＡコード配列に作動可能に連結している、請求項４６から６８のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項７０】
前記少なくとも１つのアプタマー配列が、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮ  ＲＮＡ結合ドメインまたはＣＯＭタンパク質からなる群から選択されるＡＢＰに対するＡＢＰ標的ＲＮＡ結合配列をコードする、請求項４７から６９のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項７１】
前記少なくとも１つの哺乳動物発現プラスミド中の前記非ウイルス性核酸配列が、２つのアプタマー配列を含む、請求項４７から７０のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項７２】
少なくとも１つの前記非ウイルス性核酸が、少なくとも１つの第１のアプタマー配列を含むＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列および／または少なくとも１つの第２のアプタマー配列を含むｇＲＮＡコード配列を含む、請求項４７から７１のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項７３】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列が、少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む、請求項４７に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項７４】
前記ｇＲＮＡコード配列が、少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む、請求項４７に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項７５】
前記少なくとも１つのアプタマーコード配列が、前記ｇＲＮＡコード配列のテトラループ中に挿入されている、請求項７４に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項７６】
前記アプタマーコード配列が、ＣＯＭタンパク質に結合する、請求項７５に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項７７】
前記少なくとも１つの第１のアプタマー配列および前記少なくとも１つの第２のアプタマー配列が、同一のアプタマー配列である、請求項７２に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項７８】
前記少なくとも１つの第１のアプタマー配列が、第１のＡＢＰに対するＡＢＰ標的ＲＮＡ結合配列であり、前記少なくとも１つの第２のアプタマー配列が、第２のＡＢＰに対するＡＢＰ標的ＲＮＡ結合配列であり、前記第１および第２のアプタマー配列が、異なる第１および第２のＡＢＰに対するＡＢＰ標的ＲＮＡ結合配列である、請求項７２に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項７９】
前記少なくとも１つの第１のアプタマー配列および前記少なくとも１つの第２のアプタマー配列が、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮタンパク質ＲＮＡ結合ドメインまたはＣＯＭタンパク質からなる群から選択されるＡＢＰに対するＡＢＰ標的ＲＮＡ結合配列である、請求項７７に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項８０】
前記少なくとも１つの第１のアプタマー配列および前記少なくとも１つの第２のアプタマー配列が、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮタンパク質ＲＮＡ結合ドメインまたはＣＯＭタンパク質からなる群から選択されるＡＢＰに対する、各々異なるＡＢＰ標的ＲＮＡ結合配列である、請求項７８に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項８１】
前記非ウイルス性核酸配列が、その３’末端に位置するＲＮＡ安定化配列を含む、請求項４６から８０のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項８２】
前記ＲＮＡ安定化配列が、ヒトベータグロビン遺伝子の、少なくとも１つの３’ＵＴＲを含む、請求項８１に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項８３】
前記プラスミドが、レンチウイルストランスファープラスミドである、請求項４６から８２のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項８４】
少なくとも１つの前記エンベローププラスミドが、エンベロープ糖タンパク質をコードするエンベロープ糖タンパク質コード配列を含む、請求項４６から８３のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項８５】
前記エンベロープ糖タンパク質コード配列が、ＶＳＶ−Ｇをコードする、請求項８４に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項８６】
前記パッケージングプラスミド、前記少なくとも１つの哺乳動物発現プラスミドおよび前記エンベローププラスミドが、真核細胞にトランスフェクトされる場合に、前記少なくとも１つのＡＢＰヌクレオチド配列が、ウイルス粒子組み立てに干渉しない、請求項４６から８５のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項８７】
ａ）機能的インテグラーゼタンパク質をコードしないパッケージングプラスミドと、
ｂ）ウイルスタンパク質Ｒ（ＶＰＲ）コード配列またはネガティブ調節因子（ＮＥＦ）コード配列に作動可能に連結した真核細胞プロモーターを含む少なくとも１つの哺乳動物発現プラスミドであって、前記ＶＰＲコード配列または前記ＮＥＦコード配列のうち一方または両方が、少なくとも１つの非ウイルス性アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）ヌクレオチド配列を含む、哺乳動物発現プラスミドと、
ｃ）非ウイルス性核酸配列に作動可能に連結した真核細胞プロモーターを含む少なくとも１つの哺乳動物発現プラスミドであって、前記非ウイルス性核酸配列が、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）コード配列、またはＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列およびｇＲＮＡコード配列の両方を含む、哺乳動物発現プラスミドと、
ｄ）エンベロープ糖タンパク質コード配列を含むエンベローププラスミドと
を含むレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項８８】
非ウイルス性ＲＮＡ配列が、少なくとも１つのアプタマー配列を含む、請求項８７に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項８９】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列が、少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む、請求項８７に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項９０】
前記ｇＲＮＡコード配列が、少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む、請求項８７に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項９１】
前記少なくとも１つのアプタマーコード配列が、前記ｇＲＮＡコード配列のテトラループ中に挿入されている、請求項９０に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項９２】
前記アプタマーコード配列が、ＣＯＭタンパク質に結合する、請求項９１に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項９３】
前記少なくとも１つの非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列が、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮペプチドまたはＣＯＭタンパク質をコードする、請求項８７から９２のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項９４】
前記ＶＰＲコード配列または前記ＮＥＦコード配列に作動可能に連結した前記真核細胞プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターである、請求項８７から９３のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項９５】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列が、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質またはいずれかの誘導体をコードする、請求項８７から９４のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項９６】
前記ｇＲＮＡコード配列が、ＤＮＡ標的化配列と、前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと相互作用する定常領域とを含むＲＮＡ分子をコードする、請求項８７から９５のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項９７】
前記非ウイルス性核酸配列が、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列であり、それに作動可能に連結した前記真核細胞プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターである、請求項８７から９６のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項９８】
前記非ウイルス性核酸配列が、ｇＲＮＡコード配列であり、それに作動可能に連結した前記真核細胞プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである、請求項８７から９７のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項９９】
前記少なくとも１つのアプタマー配列が、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮ  ＲＮＡ結合ドメインまたはＣＯＭタンパク質からなる群から選択されるＡＢＰに対するＡＢＰ標的ＲＮＡ結合配列をコードする、請求項８８から９８のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項１００】
前記非ウイルス性核酸配列が、その３’末端に位置するＲＮＡ安定化配列を含む、請求項８７から９９のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項１０１】
少なくとも１つの前記エンベローププラスミドが、エンベロープ糖タンパク質をコードするエンベロープ糖タンパク質コード配列を含む、請求項８７から１００のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステム。
【請求項１０２】
ａ）ヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質またはマトリックス（ＭＡ）タンパク質を含む融合タンパク質であって、前記ＮＣタンパク質またはＭＡタンパク質が、少なくとも１つの非ウイルス性アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）を含む、融合タンパク質と、
ｂ）少なくとも１つの非ウイルス性ＲＮＡ分子であって、非ウイルス性ＲＮＡ配列が、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、またはＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの両方を含む、非ウイルス性ＲＮＡ分子と
を含み
機能的インテグラーゼタンパク質を含まないレンチウイルス様粒子。
【請求項１０３】
前記少なくとも１つの非ウイルス性ＲＮＡ分子が、少なくとも１つのアプタマー配列を含む、請求項１０２に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１０４】
前記少なくとも１つの非ウイルス性ＲＮＡ分子が、２つのアプタマー配列を含む、請求項１０３に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１０５】
前記ＮＣタンパク質が、２つの機能的ジンクフィンガータンパク質ドメインを含む、請求項１０２から１０４のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１０６】
前記少なくとも１つの非ウイルス性ＡＢＰが、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮタンパク質ＲＮＡ結合ドメインまたはＣＯＭタンパク質である、請求項１０２から１０５のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１０７】
前記融合タンパク質が、第１の非ウイルス性ＡＢＰおよび前記第１のＡＢＰのＣ末端に融合した第２の非ウイルス性ＡＢＰを含む、請求項１０２から１０６のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１０８】
少なくとも１つの第１の非ウイルス性ＡＢＰを含むＮＣタンパク質と、少なくとも１つの第２の非ウイルス性ＡＢＰを含むＭＡタンパク質とを含む、請求項１０２から１０７のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１０９】
前記第１の非ウイルス性ＡＢＰおよび前記第２の非ウイルス性ＡＢＰが両方とも、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮタンパク質ＲＮＡ結合ドメインまたはＣＯＭタンパク質である、請求項１０７または１０８に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１１０】
前記第１の非ウイルス性ＡＢＰおよび前記第２の非ウイルス性ＡＢＰが、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮタンパク質ＲＮＡ結合ドメインおよびＣＯＭタンパク質からなる群から各々選択される異なるＡＢＰである、請求項１０７または１０８に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１１１】
アミノ酸６４位でのアスパラギン酸からバリンへの突然変異（Ｄ６４Ｖ）を含む非機能的インテグラーゼタンパク質を含む、請求項１０２から１１０のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１１２】
インテグラーゼタンパク質を含まない、請求項１０２から１１１のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１１３】
逆転写酵素タンパク質を含まない、請求項１０２から１１２のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１１４】
前記非ウイルス性ＲＮＡ分子が、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡを含む、請求項１０２から１１３のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１１５】
前記非ウイルス性ＲＮＡ分子が、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質またはいずれかの誘導体をコードするＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡを含む、請求項１０２から１１４のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１１６】
前記非ウイルス性ＲＮＡ分子が、ｇＲＮＡを含む、請求項１０２から１１５のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１１７】
前記非ウイルス性ＲＮＡ分子が、ＤＮＡ標的化配列と、前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと相互作用する定常領域とを含むｇＲＮＡを含む、請求項１０２から１１６のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１１８】
前記非ウイルス性ＲＮＡ分子が、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列を含むｇＲＮＡを含む、請求項１０２から１１７のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１１９】
前記非ウイルス性ＲＮＡ分子が、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含まないｇＲＮＡを含む、請求項１０２から１１８のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１２０】
前記少なくとも１つのアプタマー配列が、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮタンパク質ＲＮＡ結合ドメインまたはＣＯＭタンパク質からなる群から選択されるＡＢＰに対するＡＢＰ標的結合配列を含む、請求項１０３から１１９のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１２１】
前記少なくとも１つの非ウイルス性ＲＮＡ分子が、少なくとも１つの第１のアプタマー配列を含むＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡおよび少なくとも１つの第２のアプタマー配列を含むｇＲＮＡを含む、請求項１０３から１２０のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１２２】
前記少なくとも１つの第１のアプタマー配列および前記少なくとも１つの第２のアプタマー配列が、同一のアプタマー配列である、請求項１２１に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１２３】
前記少なくとも１つの第１のアプタマー配列が、第１のＡＢＰに対するＡＢＰ標的ＲＮＡ結合配列であり、前記少なくとも１つの第２のアプタマー配列が、第２のＡＢＰに対するＡＢＰ標的ＲＮＡ結合配列であり、前記少なくとも１つの第１のアプタマー配列および前記少なくとも１つの第２のアプタマー配列が、異なるＡＢＰに対するＡＢＰ標的ＲＮＡ結合配列である、請求項１２１に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１２４】
前記少なくとも１つの第１のアプタマー配列および前記少なくとも１つの第２のアプタマー配列が、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮペプチドおよびＣＯＭタンパク質からなる群から選択される、請求項１２２に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１２５】
前記少なくとも１つの第１のアプタマー配列および前記少なくとも１つの第２のアプタマー配列が、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮペプチドおよびＣＯＭタンパク質からなる群から選択される各々異なるＡＢＰである、請求項１２３に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１２６】
前記少なくとも１つの非ウイルス性ＲＮＡ分子のうち１つまたは複数が、３’末端に位置するＲＮＡ安定化配列を含む、請求項１０２から１２５のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１２７】
前記ＲＮＡ安定化配列が、ヒトベータグロビン遺伝子の、少なくとも１つの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、請求項１２６に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１２８】
前記融合タンパク質が、真核細胞のレンチウイルス様粒子形質導入に干渉しない、請求項１０２から１２７のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１２９】
前記少なくとも１つの非ウイルス性ＲＮＡ分子の前記少なくとも１つのアプタマー配列が、真核細胞のレンチウイルス様粒子形質導入に干渉しない、請求項１０３から１２８のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１３０】
前記レンチウイルス様粒子を用いる形質導入後の、真核細胞における、少なくとも１つのアプタマー配列を含む前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡからのＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの発現が、レンチウイルス様粒子を用いる形質導入後の、真核細胞における、前記少なくとも１つのアプタマー配列を有さないＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡからのＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの発現と等しいか、またはそれより大きい、請求項１０３から１２９のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１３１】
前記レンチウイルス様粒子を用いる形質導入後の、真核細胞における、すぐ下流に前記少なくとも１つのアプタマー配列を含む前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡから発現されたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、レンチウイルス様粒子を用いる形質導入後の、真核細胞における、前記少なくとも１つのアプタマー配列を有さないＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡから発現されたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと同程度に機能的である、請求項１０３から１３０のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１３２】
前記レンチウイルス様粒子を用いる形質導入後の、真核細胞における、前記少なくとも１つのアプタマー配列を含む前記ｇＲＮＡが、レンチウイルス様粒子を用いる形質導入後の、真核細胞における、前記少なくとも１つのアプタマー配列を有さないｇＲＮＡと同程度に機能的である、請求項１０３から１３１のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１３３】
ａ）ウイルスタンパク質Ｒ（ＶＰＲ）タンパク質またはネガティブ調節因子（ＮＥＦ）タンパク質を含む融合タンパク質であって、前記ＶＰＲタンパク質または前記ＮＥＦタンパク質は、少なくとも１つの非ウイルス性アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）を含む、融合タンパク質と、
ｂ）少なくとも１つの非ウイルス性ＲＮＡ分子であって、非ウイルス性ＲＮＡ配列が、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、またはＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの両方を含む、非ウイルス性ＲＮＡ分子と
を含み、
機能的インテグラーゼタンパク質を含まないレンチウイルス様粒子。
【請求項１３４】
前記少なくとも１つの非ウイルス性ＲＮＡ分子が、少なくとも１つのアプタマー配列を含む、請求項１３３に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１３５】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡが、少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む、請求項１３３に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１３６】
前記ｇＲＮＡが、少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む、請求項１３３に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１３７】
前記少なくとも１つのアプタマーコード配列が、前記ｇＲＮＡコード配列のテトラループ中に挿入されている、請求項１３６に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１３８】
前記アプタマーコード配列が、ＣＯＭタンパク質に結合する、請求項１３７に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項１３９】
前記少なくとも１つの非ウイルス性ＡＢＰが、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮタンパク質ＲＮＡ結合ドメインまたはＣＯＭタンパク質である、請求項１３３から１３８のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１４０】
前記非ウイルス性ＲＮＡ分子が、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質またはいずれかの誘導体をコードするＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡを含む、請求項１３３から１３８のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１４１】
前記非ウイルス性ＲＮＡ分子が、ｇＲＮＡを含む、請求項１３３から１４０のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１４２】
前記非ウイルス性ＲＮＡ分子が、ＤＮＡ標的化配列と、前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと相互作用する定常領域とを含むｇＲＮＡを含む、請求項１４１のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１４３】
前記少なくとも１つのアプタマー配列が、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮタンパク質ＲＮＡ結合ドメインまたはＣＯＭタンパク質からなる群から選択されるＡＢＰに対するＡＢＰ標的結合配列を含む、請求項１３４から１４２のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１４４】
前記少なくとも１つの非ウイルス性ＲＮＡ分子が、少なくとも１つの第１のアプタマー配列を含むＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡおよび少なくとも１つの第２のアプタマー配列を含むｇＲＮＡを含む、請求項１３４から１４３のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１４５】
前記少なくとも１つの第１のアプタマー配列および前記少なくとも１つの第２のアプタマー配列が、同一のアプタマー配列である、請求項１４４に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１４６】
前記少なくとも１つの第１のアプタマー配列および前記少なくとも１つの第２のアプタマー配列が、異なるアプタマー配列である、請求項１４４に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１４７】
前記少なくとも１つの非ウイルス性ＲＮＡ分子のうち１つまたは複数が、３’末端に位置するＲＮＡ安定化配列を含む、請求項１３４から１４６のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１４８】
前記ＲＮＡ安定化配列が、ヒトベータグロビン遺伝子の、少なくとも１つの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、請求項１４７に記載のレンチウイルス様粒子。
【請求項１４９】
ａ）ウイルスタンパク質Ｒ（ＶＰＲ）タンパク質またはネガティブ調節因子（ＮＥＦ）タンパク質を含む融合タンパク質であって、前記ＶＰＲタンパク質または前記ＮＥＦタンパク質は、少なくとも１つの非ウイルス性アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）を含む、融合タンパク質と、
ｂ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを含むリボヌクレオチドタンパク質（ＲＮＰ）複合体と
を含み、
機能的インテグラーゼタンパク質を含まないレンチウイルス様粒子。
【請求項１５０】
レンチウイルス粒子を産生する方法であって、
ａ）請求項４６から１０１のいずれか一項に記載のシステムの前記パッケージングプラスミド、前記少なくとも１つの哺乳動物発現プラスミドおよび前記エンベローププラスミドを複数の真核細胞にトランスフェクトすることと、
ｂ）トランスフェクトされた前記真核細胞を、レンチウイルス粒子が産生されるのに十分な時間培養することと
を含む、方法。
【請求項１５１】
前記レンチウイルス粒子が、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡを含む、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記レンチウイルス粒子が、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを含むリボヌクレオチドタンパク質（ＲＮＰ）複合体を含むＲＮＰを含む、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５３】
前記複数の真核細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１５０から１５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５４】
レンチウイルス粒子を産生する方法であって、
ａ）請求項８７から１０１のいずれか一項に記載のシステムの前記プラスミドを複数の真核細胞にトランスフェクトすることと、
ｂ）トランスフェクトされた前記真核細胞を、レンチウイルス粒子が産生されるのに十分な時間培養することと
を含む、方法。
【請求項１５５】
前記複数の真核細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
細胞においてゲノム標的配列を改変する方法であって、複数の真核細胞に、複数のウイルス粒子を用いて形質導入することを含み、前記複数のウイルス粒子は、
ｉ）請求項１０２から１４８のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子であって、前記非ウイルス性ＲＮＡ配列が、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含む、レンチウイルス様粒子、または、
ｉｉ）請求項１０２から１４８のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子であって、前記非ウイルス性ＲＮＡ配列が、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡを含む、レンチウイルス様粒子、およびｇＲＮＡまたはｇＲＮＡコード配列を含む第２のウイルス粒子、
を含み、
ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、前記レンチウイルス様粒子を用いて形質導入された細胞において前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡから発現され、
前記第２のウイルス粒子がｇＲＮＡコード配列を含む場合には、ｇＲＮＡが、前記第２のウイルス粒子を用いて形質導入された細胞において前記ｇＲＮＡコード配列から発現され、
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよび前記ｇＲＮＡは、前記細胞のゲノムＤＮＡ中の前記ゲノム標的配列に結合する複合体を形成し、前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、前記細胞の前記ゲノムＤＮＡを切断し、それによって、細胞ＤＮＡ修復機序を誘発し、前記ゲノム標的配列の改変を引き起こす、方法。
【請求項１５７】
前記第２のウイルス粒子が、ｇＲＮＡを含む第２のレンチウイルス様粒子である、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
前記第２のウイルス粒子が、ｇＲＮＡコード配列を含むレンチウイルス粒子である、請求項１５６または１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
前記第２のウイルス粒子が、アデノウイルス粒子またはアデノ随伴ウイルス粒子であり、真核細胞プロモーターに作動可能に連結したｇＲＮＡコード配列を含む、請求項１５６から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６０】
前記第２のウイルス粒子が、標的鋳型配列を含む、請求項１５６から１５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６１】
前記複数のウイルス粒子が、標的鋳型配列を含む第３のウイルス粒子も含み、前記第３のウイルス粒子が、アデノウイルス粒子、アデノ随伴ウイルス粒子またはレンチウイルス粒子である、請求項１５６から１６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６２】
前記第２のウイルス粒子または前記第３のウイルス粒子のうち一方または両方が、組み込み欠陥レンチウイルス粒子である、請求項１５８または１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
前記標的鋳型配列が、前記ゲノム標的配列に隣接するゲノムＤＮＡに対して相同な核酸配列を含む、請求項１６０または１６１に記載の方法。
【請求項１６４】
前記レンチウイルス様粒子の前記融合タンパク質が、前記複数の真核細胞のウイルス形質導入に干渉しない、請求項１５６から１６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６５】
前記レンチウイルス様粒子を用いる形質導入後の、真核細胞における、前記少なくとも１つのアプタマー配列を含む前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡからの前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの発現が、レンチウイルス様粒子を用いる形質導入後の、真核細胞における、前記少なくとも１つのアプタマー配列を有さないＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡからのＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの発現と等しいか、またはそれより大きい、請求項１５６から１６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６６】
前記レンチウイルス様粒子を用いる形質導入後の、真核細胞における、前記少なくとも１つのアプタマー配列を含む前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡから発現された前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、レンチウイルス様粒子を用いる形質導入後の、真核細胞における、前記少なくとも１つのアプタマー配列を有さないＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡから発現されたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと同程度に機能的である、請求項１５６から１６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６７】
前記レンチウイルス様粒子を用いる形質導入後の、真核細胞における、前記少なくとも１つのアプタマー配列を含む前記ｇＲＮＡが、レンチウイルス様粒子を用いる形質導入後の、真核細胞における、前記少なくとも１つのアプタマー配列を有さないｇＲＮＡと同程度に機能的である、請求項１５６から１６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６８】
細胞においてゲノム標的配列を改変する方法であって、複数の真核細胞に、複数のウイルス粒子を用いて形質導入することを含み、前記複数のウイルス粒子は、ｉ）請求項１４９に記載のレンチウイルス様粒子を含み、前記ＲＮＰは、前記細胞のゲノムＤＮＡ中の前記ゲノム標的配列に結合し、前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、前記細胞の前記ゲノムＤＮＡを切断し、それによって、細胞ＤＮＡ修復機序を誘発し、前記ゲノム標的配列の改変を引き起こす、方法。
【請求項１６９】
前記複数の真核細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１５６から１６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７０】
前記複数の真核細胞が、対象中に存在する細胞である、請求項１５６から１６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７１】
前記対象が、ヒト対象である、請求項１５６から１７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７２】
前記対象に、前記複数のウイルス粒子を注射する、請求項１７１に記載の方法。
【請求項１７３】
前記ゲノム標的配列が、ヘモグロビン遺伝子中にある、請求項１５６から１７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７４】
前記ゲノム標的配列が、癌遺伝子中にある、請求項１５６から１７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７５】
請求項１から４５のいずれか一項に記載のプラスミドを含有する細胞。
【請求項１７６】
請求項４６から１０１のいずれか一項に記載のレンチウイルスパッケージングシステムを含有する細胞。
【請求項１７７】
請求項１０２から１５０のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子を含有する細胞。
【請求項１７８】
請求項１５７から１６９のいずれか一項に記載の方法を使用して改変された細胞。
【請求項１７９】
対象において疾患を処置する方法であって、
ａ）前記対象から細胞を得ることと
ｂ）前記対象の前記細胞を、請求項１５６から１６８のいずれか一項に記載の方法を使用して改変することと、
ｃ）前記改変された細胞を前記対象に投与することと
を含む、方法。
【請求項１８０】
前記疾患ががんである、請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８１】
前記疾患が、鎌状赤血球貧血である、請求項１８０に記載の方法。
【請求項１８２】
前記細胞がＴ細胞である、請求項１７６から１８１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
先行関連出願
本出願は、その全文がここに参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年５月１日に出願された米国仮特許出願第６２／６６５，０８０号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
細菌において発見されたクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムは、遺伝子療法、遺伝子発現調節、ＤＮＡおよびＲＮＡ標識のために哺乳動物およびヒトゲノムを改変するためのツールとして使用できる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、ゲノム中の標的部位とハイブリダイズするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体形成することによって、ゲノム部位に標的化される。これは、二本鎖切断をもたらし、二本鎖または一本鎖ＤＮＡ鋳型を介するゲノムＤＮＡの非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ）（ＨＤＲ）のいずれかが開始される。一本鎖切断を導入するニッカーゼを使用する改変されたシステム（改変ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ）も開発されている。
【０００３】
現在、慣行となっているのは、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼを発現するＤＮＡをプラスミドＤＮＡ、レンチウイルスまたはアデノ随伴ウイルスによって送達することである。これらの送達システムのうちすべてで、オフターゲットおよび長期のヌクレアーゼ発現の可能性によって突然変異誘発を誘導するリスクが悩みの種となっている。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成成分の効率的な一過性送達が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、真核細胞において遺伝子編集を達成するのに有用な組成物、システムおよび方法を対象とする。一部の場合には、組成物、システムおよび方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡをウイルス粒子、例えば、レンチウイルス粒子中にパッケージングするために使用され得る。一部の場合には、組成物、システムおよび方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡ配列を、例えば、リボヌクレオタンパク質複合体として、ウイルス粒子中にパッケージングするために使用され得る。組成物は、１つまたは複数のウイルスタンパク質がアプタマー結合タンパク質と融合されている１つまたは複数のウイルス性融合タンパク質をコードするプラスミドを含む。組成物はまた、非ウイルス性核酸配列がＣＲＩＳＰＲシステム構成成分をコードする非ウイルス性核酸配列をコードするプラスミドを含む。一部の場合には、非ウイルス性核酸配列はまた、アプタマー配列を含む。一部の場合には、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする核酸は、少なくとも１つのアプタマー配列を含む。一部の例では、ｇＲＮＡコード配列は、少なくとも１つのアプタマー配列を含む。プラスミドは、レンチウイルス様粒子を含むウイルス粒子を作製するために使用され得る。このようなウイルス粒子を産生するシステムが提供される。また、真核細胞において遺伝子編集を達成するために本明細書において記載されているウイルス粒子を使用する方法も提供される。
【０００５】
また、Ｇａｇヌクレオチド配列に作動可能に連結した真核細胞プロモーターを含むレンチウイルスパッケージングプラスミドが提供され、Ｇａｇヌクレオチド配列は、ヌクレオカプシド（ＮＣ）コード配列およびマトリックスタンパク質（ＭＡ）コード配列を含み、ＮＣコード配列またはＭＡコード配列のうち一方または両方は、少なくとも１つの非ウイルス性アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）ヌクレオチド配列を含み、パッケージングプラスミドは、機能的インテグラーゼタンパク質をコードしない。
【０００６】
ウイルスタンパク質Ｒ（ＶＰＲ）コード配列またはネガティブ調節因子（ＮＥＦ）コード配列に作動可能に連結した真核細胞プロモーターを含む哺乳動物発現プラスミドがさらに提供され、ＶＰＲコード配列またはＮＥＦコード配列は、少なくとも１つの非ウイルス性アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）ヌクレオチド配列を含む。
【０００７】
また、非ウイルス性核酸配列に作動可能に連結した真核細胞プロモーターを含む哺乳動物発現プラスミドも提供され、非ウイルス性核酸配列は、少なくとも１つのアプタマーコード配列を含み、非ウイルス性核酸配列は、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）コード配列のうち一方または両方および（ｉｉ）少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む。
【０００８】
ａ）Ｇａｇヌクレオチド配列に作動可能に連結した真核細胞プロモーターを含むパッケージングプラスミドであって、Ｇａｇヌクレオチド配列は、ヌクレオカプシド（ＮＣ）コード配列およびマトリックスタンパク質（ＭＡ）コード配列を含み、ＮＣコード配列またはＭＡコード配列の一方または両方は、少なくとも１つの非ウイルス性アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）ヌクレオチド配列を含み、パッケージングプラスミドは、機能的インテグラーゼタンパク質をコードしない、パッケージングプラスミドと、ｂ）非ウイルス性核酸配列に作動可能に連結した真核細胞プロモーターを含む少なくとも１つの哺乳動物発現プラスミドであって、非ウイルス性核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）コード配列、またはＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列およびｇＲＮＡコード配列の両方を含む、哺乳動物発現プラスミドと、ｃ）エンベロープ糖タンパク質コード配列を含むエンベローププラスミドとを含むレンチウイルスパッケージングシステムがさらに提供される。
【０００９】
また、ａ）機能的インテグラーゼタンパク質をコードしないパッケージングプラスミドと、ｂ）ウイルスタンパク質Ｒ（ＶＰＲ）コード配列またはネガティブ調節因子（ＮＥＦ）コード配列に作動可能に連結した真核細胞プロモーターを含む少なくとも１つの哺乳動物発現プラスミドであって、ＶＰＲコード配列またはＮＥＦコード配列のうち一方または両方が、少なくとも１つの非ウイルス性アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）ヌクレオチド配列を含む、哺乳動物発現プラスミドと、ｃ）非ウイルス性核酸配列に作動可能に連結した真核細胞プロモーターを含む少なくとも１つの哺乳動物発現プラスミドであって、非ウイルス性核酸配列が、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）コード配列、またはＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列およびｇＲＮＡコード配列の両方を含む、哺乳動物発現プラスミドと、ｄ）エンベロープ糖タンパク質コード配列を含むエンベローププラスミドとを含む、レンチウイルスパッケージングシステムも提供される。
【００１０】
さらに、ａ）ヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質またはマトリックス（ＭＡ）タンパク質を含む融合タンパク質であって、ＮＣタンパク質またはＭＡタンパク質が、少なくとも１つの非ウイルス性アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）を含む、融合タンパク質と、ｂ）少なくとも１つの非ウイルス性ＲＮＡ分子であって、非ウイルス性ＲＮＡ配列が、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、またはＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの両方を含む、非ウイルス性ＲＮＡ分子とを含み、機能的インテグラーゼタンパク質を含まないレンチウイルス様粒子も提供される。
【００１１】
また、ａ）ウイルスタンパク質Ｒ（ＶＰＲ）タンパク質またはネガティブ調節因子（ＮＥＦ）タンパク質を含む融合タンパク質であって、ＶＰＲタンパク質またはＮＥＦタンパク質は、少なくとも１つの非ウイルス性アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）を含む、融合タンパク質と、ｂ）少なくとも１つの非ウイルス性ＲＮＡ分子であって、非ウイルス性ＲＮＡ配列が、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、またはＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの両方を含む、非ウイルス性ＲＮＡ分子とを含み、機能的インテグラーゼタンパク質を含まないレンチウイルス様粒子も提供される。
【００１２】
また、ａ）ウイルスタンパク質Ｒ（ＶＰＲ）タンパク質またはネガティブ調節因子（ＮＥＦ）タンパク質を含む融合タンパク質であって、ＶＰＲタンパク質またはＮＥＦタンパク質は、少なくとも１つの非ウイルス性アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）を含む、融合タンパク質と、ｂ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを含むリボヌクレオチドタンパク質（ＲＮＰ）複合体とを含み、機能的インテグラーゼタンパク質を含まないレンチウイルス様粒子も提供される。
【００１３】
また、レンチウイルス粒子を産生する方法であって、ａ）本明細書において記載されているシステムのいずれか１つの、パッケージングプラスミド、少なくとも１つの哺乳動物発現プラスミドおよびエンベローププラスミドを複数の真核細胞にトランスフェクトすることと、ｂ）トランスフェクトされた真核細胞を、レンチウイルス粒子が産生されるのに十分な時間培養することとを含む方法も提供される。
【００１４】
さらに、レンチウイルス粒子を産生する方法であって、ａ）本明細書において記載されているシステムのいずれか１つのプラスミドを複数の真核細胞にトランスフェクトすることと、ｂ）トランスフェクトされた真核細胞を、レンチウイルス粒子が産生されるのに十分な時間培養することとを含む方法も提供される。
【００１５】
また、細胞においてゲノム標的配列を改変する方法であって、複数の真核細胞に、複数のウイルス粒子を用いて形質導入することを含み、複数のウイルス粒子は、ｉ）非ウイルス性ＲＮＡ配列が、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含む、本明細書において記載されているレンチウイルス様粒子、または、ｉｉ）非ウイルス性ＲＮＡ配列が、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡを含み、第２のウイルス粒子がｇＲＮＡまたはｇＲＮＡコード配列を含む、本明細書において記載されているレンチウイルス様粒子を含み、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、レンチウイルス様粒子を用いて形質導入された細胞においてＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡから発現され、第２のウイルス粒子がｇＲＮＡコード配列を含む場合には、ｇＲＮＡが、第２のウイルス粒子を用いて形質導入された細胞においてｇＲＮＡコード配列から発現され、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡは、細胞のゲノムＤＮＡ中のゲノム標的配列に結合する複合体を形成し、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、細胞のゲノムＤＮＡを切断し、それによって、細胞ＤＮＡ修復機序を誘発し、ゲノム標的配列の改変を引き起こす方法も提供される。
【００１６】
さらに、細胞においてゲノム標的配列を改変する方法であって、複数の真核細胞に、複数のウイルス粒子を用いて形質導入することを含み、複数のウイルス粒子は、ｉ）リボヌクレオチドタンパク質（ＲＮＰ）複合体（少なくとも１つのｇＲＮＡと複合体形成したＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ）を含むレンチウイルス様粒子を含み、ＲＮＰは、細胞のゲノムＤＮＡ中のゲノム標的配列に結合し、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、細胞のゲノムＤＮＡを切断し、それによって、細胞ＤＮＡ修復機序を誘発し、ゲノム標的配列の改変を引き起こす方法が提供される。本明細書において記載されているゲノム改変のいずれかによって改変された細胞も提供される。また、本明細書において記載されているレンチウイルス様粒子のいずれかを含有する細胞も提供される。
【００１７】
さらに、対象において疾患を処置する方法であって、ａ）対象から細胞を得ることと、ｂ）対象の細胞を、本明細書において記載されているゲノム標的配列を改変する方法のいずれかを使用して改変することと、ｃ）改変された細胞を対象に投与することとを含む方法も提供される。一部の場合には、疾患はがんである。一部の場合には、細胞はＴ細胞である。
【００１８】
本開示は、以下の図を含む。図は、ある特定の実施形態ならびに／または組成物および方法の特性を例示し、組成物および方法の任意の記載を補足することを意図する。図は、記載が明確にそうであると示さない限り、組成物および方法の範囲を限定しない。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｂは、本開示の態様による組成物、システムおよび方法を例示する概略図である。図１Ａに示すとおり、ウイルスタンパク質ＡＢＰ融合タンパク質として図において言及される、アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）と融合されたレンチウイルスタンパク質を発現するためにプラスミドが使用される。ウイルスタンパク質ＡＢＰ融合タンパク質コード配列をコードするプラスミドは、レンチウイルスパッケージングプラスミド（例えば、ＮＣまたはＭＡ融合タンパク質のため）または哺乳動物発現ベクター（例えば、ＮＥＦまたはＶＰＲ融合タンパク質のため）であり得る。図１Ａはまた、真核細胞をトランスフェクトするためにパッケージングプラスミドおよびエンベローププラスミドと共に使用され、ウイルスタンパク質ＡＢＰ融合タンパク質および非ウイルス性ＲＮＡ分子（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡまたは両方）を含有するレンチウイルス様粒子を生成する、ＣＲＩＳＰＲシステム構成成分（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよびｓｇＲＮＡ）をコードする非ウイルス性核酸配列を含有する哺乳動物発現プラスミドを示す。必要に応じて、哺乳動物発現プラスミドによってコードされる非ウイルス性ＲＮＡ分子は、アプタマー配列を含んでよい。ウイルスタンパク質ＡＢＰ融合タンパク質コード配列が哺乳動物発現プラスミド（例えば、ＮＥＦおよびＶＰＲ融合タンパク質のため）において提供される場合、レンチウイルスパッケージングプラスミドも真核細胞をトランスフェクトするために使用される。哺乳動物発現プラスミドは、種々のウイルス遺伝子をコードするレンチウイルストランスファープラスミドであってよい。パッケージングプラスミド（それらがウイルスタンパク質ＡＢＰ融合タンパク質コード配列を含有するか否かに関わらず）、およびトランスファープラスミド（使用される場合）は、レンチウイルス様粒子を生成するためにウイルス配列を除去するように改変されてよい。レンチウイルス様粒子は、真核細胞から回収される。必要に応じて、ｓｇＲＮＡは、レンチウイルス粒子にパッケージされてよく、またはｓｇＲＮＡコード配列は、レンチウイルス様粒子の代わりにＤＮＡウイルスにパッケージされてよい。
【００２０】
【図１−２】図１Ａ〜１Ｂは、本開示の態様による組成物、システムおよび方法を例示する概略図である。図１Ｂに示すとおり、レンチウイルス様粒子は、真核細胞に形質移入するために使用されてよく、それにより、それから活性タンパク質が細胞において翻訳されるＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡ、およびｓｇＲＮＡ分子を提供する。これらの非ウイルス性ＲＮＡ分子は、同じレンチウイルス様粒子中にまたは異なるウイルス粒子中に提供されてよい。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼタンパク質およびｓｇＲＮＡは、ゲノム標的部位（ｓｇＲＮＡによって方向付けられるとおり）に結合し、ＤＮＡに切断を導入するリボヌクレオタンパク質複合体を形成するように相互作用する。切断は、相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）機構によって修復され得る。ＨＤＲが望ましい場合、真核細胞は、ゲノム標的部位の改変のための鋳型として使用され得る標的鋳型配列を含有するウイルス粒子を用いて形質導入され得る。細胞に導入されるＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡの量が有限であることから、タンパク質がｍＲＮＡから発現されるにつれて、最終的にはそれは分解される。必要に応じてｓｇＲＮＡは、レンチウイルス粒子もしくはＤＮＡウイルス粒子中にまたは、細胞が培養される場合はトランスフェクションを介して細胞に導入される合成ＲＮＡ分子として提供され得る。図１Ｂは、真核細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ形質導入を示す一方で、記載されるウイルス粒子は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子編集を生じさせるように対象に投与され得る。
【００２１】
【図２】図２は、本開示の一部の態様によるレンチウイルス様粒子でのＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡパッケージングのためＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）融合タンパク質の概略図である。ＶＰＲ：ウイルスタンパク質Ｒ、ＮＥＦ：ネガティブ調節因子；ＮＣ、ヌクレオカプシドタンパク質；ＭＡ：マトリックスタンパク質。破線は、欠失された領域を示す。
【００２２】
【図３】図３は、ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡへのＨＢＢ３’ＵＴＲ配列の付加が、本開示の一部の態様によるウイルス様粒子の遺伝子編集活性を改善したことを例示するグラフである。ＭＳ２アプタマー配列に続いて２コピーのＨＢＢ  ３’ＵＴＲ配列を含むＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡを含有する異なる量の濃縮されたウイルス様粒子を、ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を発現する等量のレンチウイルス様ベクターと共に用いてＧＦＰレポーター細胞２．５×１０４個に同時形質導入した。ＧＦＰ陽性細胞は、フローサイトメトリーによって検出された。各データ点は、２回反復の平均であった。
【００２３】
【図４】図４は、本開示の態様によるＭＣＰ−およびＰＣＰ−ベースレンチウイルスパッケージングプラスミドからのレンチウイルス様粒子の産生を例示する画像である。対照レンチウイルス粒子は、ＧＦＰを発現するレンチウイルスゲノムを有した。ＭＣＰ−およびＰＣＰ−ベースレンチウイルス様粒子は、それぞれＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２ｍＲＮＡおよびＳａＣａｓ９１ｘＰＰ７ｍＲＮＡを含有した。対照、ＭＣＰ−およびＰＣＰ−ベース粒子の平均±ｓｅｍは、それぞれ９８．５±１０．５、１０５．７±３．１および１２３．９±５．８ｎｍであった、ｎ≧１１。
【００２４】
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、本開示の態様による異なるウイルスベクターを用いて形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡの一過性発現を例示するグラフである。図５Ａは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）および組み込み欠陥レンチウイルス（ＩＤＬＶ）ベクターからのＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡの発現を示す。図５Ｂは、ＳａＣａｓ９１ｘＰＰ７、ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２、またはＳａＣａｓ９１ｘＰＰ７−３’ＵＴＲを含有するレンチウイルス様粒子からのＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡの発現を示す。ＲＮＡレベルは、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって形質導入２４、４８、７２および９６時間後に測定された。＊は、二方向ＡＮＯＶＡによるＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２とＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２−２×３’ＵＴＲとの間でのｐ＜０．０５を示す。
【００２５】
【図６】図６は、本開示の態様によるレンチウイルス様粒子を用いて形質導入されたＧＦＰレポーター細胞のＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１標的配列において観察されたインデルを示す図である。ＧＦＰレポーター細胞は、ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２−３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡを含有するレンチウイルス様粒子およびＨＢＢ−ｓｇＲＮＡ１を発現するレンチウイルスを用いて同時形質導入された。ＤＮＡは、ＰＣＲによって増幅され、次世代配列決定によって配列解析された。最も観察された上位１０個の配列は、配列番号１０３〜１１２（上から下）として列挙されている。１３．５％の対立遺伝子は、未改変であり、他はすべてインデルを有した。標的配列は、下線が付けられており、ＰＡＭ配列は、標的配列に先行する６ヌクレオチドである。矢印は、予測切断位置を示す。野生型ＨＢＢ配列は、標的配列の２番目の位置に「Ａ」を有する；その位置での「Ｔ」は野生型ＨＢＢ配列と比較したヌクレオチド差異を示す。データは、５７７４２７７配列読み取りデータ由来であった。
【００２６】
【図７−１】図７Ａ〜７Ｆは、ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡパッケージングのためのＬＶＬＰを使用して得られた組成物、システムおよび結果を例示する概略図である。図７Ａは、ＬＶＬＰにＳａＣａｓ９ｍＲＮＡをパッケージするためのＭＣＰ−ウイルスタンパク質融合タンパク質およびＳａＣａｓ９−ＭＳ２アプタマー融合ＲＮＡ（配列番号２１１に融合したＳａＣａｓ９）を示す。ＭＣＰ：ＭＳ２コートタンパク質；ＶＰＲ：ウイルスタンパク質Ｒ、ＮＥＦ：ネガティブ調節因子；ＮＣ、ヌクレオカプシドタンパク質；ＭＡ：マトリックスタンパク質。破線は、ＭＡ中の欠失された領域を示す。図７Ｂは、レンチウイルスおよびＬＶＬＰを作製するためのプラスミドを示す。アプタマー結合タンパク質（ａｐｔａｍｅｒ−ｂｉｎｇｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）ＭＣＰおよびＭＳ２アプタマーが示されている。ＬＴＲ：末端反復配列；Ψ：レンチウイルスパッケージングシグナル。図７Ｃは、レンチウイルス産生へのＭＣＰ融合タンパク質の効果を示す。６ウェルプレート中の細胞５×１０５個は、表示のプラスミド（合計ＤＮＡ  ５μｇ）を用いてトランスフェクトされた。トランスフェクション２４時間後、培地を２ｍｌ新鮮培地を用いて置き換え、ｐ２４は２４時間後にアッセイされた。個々のデータ点および平均±ＳＥＭが示されている。ＭＡ−ＭＣＰ改変だけがウイルス産生を減少させた（ｐ＜０．０５）。図７Ｄは、最良の遺伝子編集活性は、ＭＣＰがＮＣに融合された場合に得られたことを示す。ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２は、ＬＶＬＰ産生の際に発現された。２５０μｌ  ＬＶＬＰ含有上清および２５０μｌ  ＩＤＬＶ発現ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１は、ＧＦＰレポーター細胞２．５×１０４個に同時形質導入された。＊＊は、ＮＣ−ＭＣＰ融合からのＬＶＬＰが他の粒子と比較された場合のｐ＜０．０１を示す；＊は、任意の他の粒子と比較された場合のｐ＜０．０５を示す。図７Ｅは、ＮＣ−ＭＣＰ改変パッケージングプラスミドを用いてまたは用いずに作製された粒子を用いて形質導入されたＧＦＰレポーター細胞のフローサイトメトリー解析を示す。上清を、体積を増加させて、５０ｎｇのＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１発現ＩＤＬＶと共に用いてＧＦＰレポーター細胞に同時形質導入した。パッケージングプラスミドを用いずに粒子を産生した場合、パッケージングプラスミドは、ｍＲｕｂｙを発現するｐＫａｎＣＭＶ−ｍＲｕｂｙ３−１０ａａ−Ｈ２Ｂに置き換えられた。＊＊＊、ｐ＜０．００１、２つの条件のＧＦＰ陽性率を比較した場合（ＡＮＯＶＡに続くボンフェローニポストテスト）。図７Ｆは、プラスミドＤＮＡがＧＦＰ陽性レポーター細胞の生成にほとんど寄与しなかったことを示す。ｐＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２（第１のカラム）またはｐＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２−ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１プラスミドＤＮＡ（第２のカラム）は、ＧＦＰ陽性細胞を観察するためにＧＦＰレポーター細胞にトランスフェクトされた。ｐＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２−ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１は、単独で（１００ｎｇ  ｐ２４、第３のカラム）または５０ｎｇ  ｐ２４のＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を発現するＩＤＬＶを用いてＧＦＰレポーター細胞に形質導入するためのＬＶＬＰを作製するためにも使用された（第４のカラム）。＊＊＊は、ｐ＜０．００���を示す。図７Ｃ、７Ｄおよび７Ｆについて、チューキーの多重比較検定はＡＮＯＶＡ分析に続いて実施された。
【図７−２】同上。
【図７−３】同上。
【００２７】
【図８】図８は、パッケージングプラスミドを（核に位置する）ｍＲｕｂｙ発現プラスミドで置き換えることによって生成された上清を用いてＧＦＰレポーター細胞に形質導入した場合に、ｍＲｕｂｙ陽性細胞はほとんど観察されなかったことを示す図である。示されているのは、５３４μｌの上清を用いて処置された細胞の１視野からの画像である。複数の視野が検査され、１視野あたり０〜５個の陽性細胞が観察された。それぞれ２、２および３個の陽性細胞を有する３つの視野は、ｉｍａｇｅＪによって細胞９３４個／視野を有すると概算された。平均陽性率は、０．００２５％であった。
【００２８】
【図９】図９Ａ〜９Ｅは、種々のＬＶＬＰの遺伝子編集活性を示す図である。図９Ａは、ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡレベルへのＭＳ２アプタマーの効果を示す。ＳａＣａｓ９ｎｘＭＳ２を発現するプラスミドＤＮＡ（２５０ｎｇ）は、２４ウェルプレート中で増殖させたＧＦＰレポーター細胞にＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を発現するプラスミドＤＮＡ（２５０ｎｇ）と共に同時トランスフェクトされた。ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡレベルは、ＲＴ−ｑＰＣＲによって対照としてのＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１と比較された。＊＊＊および＃＃＃は、ＳａＣａｓ９０ｘＭＳ２がＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２と比較された場合、およびＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２が１つより多いＭＳ２アプタマーを含むＳａＣａｓ９と比較された場合のｐ＜０．００１を示す。図９Ｂは、ＳａＣａｓ９遺伝子編集活性へのＭＳ２アプタマーの効果を示す。ＧＦＰレポーター細胞は、図９Ａと同様にトランスフェクトされた。フローサイトメトリーは、トランスフェクション７２時間後に実施された。＊＊＊は、ＳａＣａｓ９０ｘＭＳ２が少なくとも１つのＭＳ２アプタマーを含むＳａＣａｓ９と比較された場合のｐ＜０．００１を示す。図９Ｃは、ＬＶＬＰ遺伝子編集活性へのアプタマー数の効果を示す。ＬＶＬＰ含有上清（ｐ２４  ＥＬＩＳＡによって決定された力価）を、５０ｎｇ  ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１発現ＩＤＬＶと共に用いてＧＦＰレポーター細胞２．５×１０４個に同時形質導入した。フローサイトメトリーは形質導入７２時間後に実施された。「ａ」は、４５ｎｇ  ｐ２４のＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２ＬＶＬＰが同じ投薬量でのすべての他のＬＶＬＰより有意に高いＧＦＰ陽性率（ｐ＜０．００１）を得たことを示す；「ｂ」は、４５ｎｇ  ｐ２４のＳａＣａｓ９１２ｘＭＳ２ＬＶＬＰが、ＳａＣａｓ９２ｘＭＳ２またはＳａＣａｓ９３ｘＭＳ２ＬＶＬＰより有意に低いＧＦＰ陽性率（ｐ＜０．００１）を得たことを示す；「ｃ」は、１５ｎｇ  ｐ２４のＳａＣａｓ９１２ｘＭＳ２ＬＶＬＰが同じ投薬量で他のすべてのＬＶＬＰより有意に低いＧＦＰ陽性率（ｐ＜０．０５）を得たことを示す。各データ点は、３回反復の平均である。図９Ｄは、種々のＳａＣａｓ９含有ＬＶＬＰを用いて形質導入した後に生成されたＧＦＰ陽性細胞のフローサイトメトリー解析を示す。示された量のＳａＣａｓ９含有ＬＶＬＰを、６０ｎｇ  ｐ２４  ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１発現ＩＤＬＶと共に用いてＧＦＰレポーター細胞２．５×１０４個に同時形質導入した。各点は、表示の反復（括弧内の数）の平均であった。＊は、ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２−ＨＢＢ  ３’ＵＴＲ  ＬＶＬＰが同じ投薬量の任意の他の粒子と比較された場合のｐ＜０．０５を示す；＊＊＊は、ＡＢＰおよびアプタマーを含まずに生成されたＬＶＬＰが同じ投薬量の任意の他の粒子と比較された場合のｐ＜０．００１を示す。図９Ｅは、異なる種類のＬＶＬＰにおけるＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡコピー数のＲＴ−ｑＰＣＲ比較を示す。ＲＮＡは、３０ｎｇ  ｐ２４を含有するレンチウイルスまたはＬＶＬＰから精製された。３０ｎｇ  ｐ２４のＧＦＰレンチウイルスが実験対照のために各試料に添加された。コピー数は、ＬＶ粒子１個あたり２個のＲＮＡゲノムを含有することが公知である通常のレンチウイルスベクターと比較��れた。示されているのは、個々のデータ点および平均±ＳＥＭである。ｎｓ、有意差なし；＊＊＊、任意の他の群と比較してｐ＜０．００１。図９Ａ、９Ｂおよび９Ｅについて、チューキーの多重比較検定がＡＮＯＶＡ分析に続いて実施された。図９Ｃおよび図９Ｄについて、ボンフェローニポストテストが二方向ＡＮＯＶＡに続いて実施された。
【００２９】
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｅは、ＬＶＬＰの特徴付けを示す図である。図１０Ａは、ＬＶＬＰからのＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡの一過性発現を示す。ＳａＣａｓ９発現ＩＤＬＶ（３５ｎｇ  ｐ２４）またはＬＶＬＰ（３５ｎｇ  ｐ２４）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞２．５×１０４個に形質導入した。ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡレベルは、異なる時点でアッセイされた。形質導入２４時間後のＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡレベルは、相対的ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡ発現レベルを得るためにハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨおよびＲＰＬＰ０によって正規化された。ＬＶＬＰ形質導入細胞において新たなｍＲＮＡは生成されなかったことから、潜在的細胞複製がｍＲＮＡ分解の評価に影響を与えないように、その後正規化は実施されなかった。＊＊＊は、ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２−ＨＢＢ３’ＵＴＲが同じ時点で他の粒子と比較された場合のｐ＜０．００１を示す。＃＃＃は、ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２が同じ時点で他の粒子と比較された場合のｐ＜０．００１を示す。図１０Ｂは、同じ粒子からのＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡレベルの経時変化を示す。形質導入２４時間後の各粒子のｍＲＮＡレベルが１と設定された。示されているのは、表示の反復での平均±ＳＥＭである。＊および＊＊は、同じ時点で他の粒子と比較された場合のｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１を示す。図１０Ａおよび１０Ｂについて、ボンフェローニポストテストが二方向ＡＮＯＶＡに続いて実施された。図１０Ｃは、ＳａＣａｓ９タンパク質のウエスタンブロット解析を示す。４つのレーンは、モックトランスフェクトしたＨＲＥＫ２９３Ｔ細胞（レーン１）、３００ｎｇ  ｐ２４のＣａｓ９  ＬＶＬＰおよび５０ｎｇ  ｐ２４のＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１  ＩＤＬＶを用いて同時トランスフェクトされたＧＦＰレポーター細胞（レーン２）、ＤＮＡ  ０．２５μｇを細胞１．２５×１０５個にトランスフェクトすることによってＣａｓ９１ｘＭＳ２（レーン３）またはＣａｓ９  ｍＲＮＡ（レーン４）を過発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの可溶化物であった。ＬＶＬＰ形質導入細胞における非常にかすかなバンドは矢印によって示された。図１０Ｄは、ＨＩＶプロテアーゼによるＧａｇ前駆体のプロセシングを示す図である。矢印の幅は、その部位（１〜５）でのプロセシング速度に比例している。ｐ１５−ＡＢＰ融合タンパク質の概算サイズが列挙された。図１０Ｅは、レンチウイルスタンパク質のウエスタンブロット解析を示す。２００ｎｇ  ｐ２４のＧＦＰレンチウイルス、ＮＣ−ＭＣＰおよびＮＣ−ＰＣＰ改変ＬＶＬＰが解析された。
【００３０】
【図１１】図１１は、ＮＣ−ＭＣＰおよびＮＣ−ＰＣＰ改変ＬＶＬＰの電子顕微鏡観察を示す図である。画像の下に示されているのは、平均±ＳＥＭ、括弧内に試料数である。群間に統計的有意差は観察されなかった。
【００３１】
【図１２−１】図１２Ａ〜Ｆは、ＳａＣａｓ９  ＬＶＬＰによるゲノム編集を示す図である。図１２Ａは、ＳａＣａｓ９  ＬＶＬＰが完全にマッチしたＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１標的配列に効率的にインデルを生成したことを示す。最も頻繁に観察された配列および次世代配列決定からのそれらのパーセンテージが列挙されている。赤の「Ｔ」は、ＨＢＢ中の突然変異であり、鎌状赤血球症を生じる。図１２Ｂは、図１２Ａの配列決定データから得られた各位置でのインデルの頻度を示す。図１２Ｃは、ＳａＣａｓ９  ＬＶＬＰによって生成されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＩＬ２ＲＧ遺伝子中のインデルを示す。細胞２．５×１０４個は、３０ｎｇ  ｐ２４のＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２−ＨＢＢ  ３’ＵＴＲ  ＬＶＬＰおよびＩＬ２ＲＧ  ｓｇＲＮＡを発現する６０ｎｇのＩＤＬＶを用いて同時形質導入された。図１２Ｄは、５００ｎｇ  ｐ２４のＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２−ＨＢＢ  ３’ＵＴＲ  ＬＶＬＰ（細胞２×１０５個に５００ｎｇ  ｐ２４  ＬＶＬＰ）によって生成されたリンパ芽球のＩＬ２ＲＧ遺伝子中のインデルを示す。図１２Ｅは、ＧＦＰレポーター細胞の野生型ＨＢＢ遺伝子座におけるインデル率を示す。ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１（赤で強調）と標的配列との間に１つのミスマッチがあった。図１２Ｆは、ＧＦＰレポーター細胞の予測されるオフターゲット８におけるインデル率を示す。オフターゲット８は、ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１（下線）に１つのミスマッチ、１つのＤＮＡバルジ（青）および非典型的ＰＡＭ（最後の位置の「Ｔ」の代わりの「Ｇ」、斜体）を有する。図１２Ａ〜１２Ｆについて：プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）またはその相補配列は、緑である。図１２Ａ〜１２Ｅについて：標的配列は下線付きである。縦線は、ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１と標的との間の相補性を示す。各試料について３〜４００万の読み取りデータが得られた。
【図１２−２】同上。
【図１２−３】同上。
【図１２−４】同上。
【図１２−５】同上。
【００３２】
【図１３】図１３は、ＧＦＰレポーター細胞における標的配列インデル率とＧＦＰ陽性率との間の関係を示す図である。４つのデータ点は、ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２ＬＶＬＰ（細胞１．２５×１０６個について約７５０ｎｇ  ｐ２４）、ＳａＣａｓ９  ＡＡＶ６（１０４ｖｇ／細胞）、ＳａＣａｓ９  ＩＤＬＶ（細胞１．２５×１０６個について約７５０ｎｇ  ｐ２４）およびＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２−ＨＢＢ  ３’ＵＴＲ（細胞２×５×１０４個について３０ｎｇ  ｐ２４）を用いて形質導入されたＧＦＰレポーター細胞由来である。ＧＦＰ発現カセット中の標的配列は増幅され、次世代配列決定に供された。インデル率はフローサイトメトリー解析によって得られたＧＦＰ陽性率に対してプロットされた。
【００３３】
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｄは、ＬＶＬＰ中のｓｇＲＮＡのパッケージングを示す図である。図１４Ａは未成熟ビリオンとしての異なるＣａｓ９  ｍＲＮＡ  ＬＶＬＰ（左）およびＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ  ＬＶＬＰ（右）を例示する図である。簡潔に、１つのＧＡＧ前駆体および１つのｍＲＮＡまたはＲＮＰだけが示されている。ＡＢＰは、二量体としてアプタマーに結合できる。図１４Ｂは、ｓｇＲＮＡスキャフォールドにおけるＭＳ２アプタマー挿入の位置を示す。元のｓｇＲＮＡは、左に示された（配列番号２１２）。「Ｎ」は、ガイド配列を示す。ＭＳ２アプタマー挿入について検査された３つの位置は、破線黒四角によって示された。挿入された配列は、右に示された（配列番号２１３（テトラループでのアプタマー）および配列番号２１４（３’末端でのアプタマー）。破線青色四角中の青色文字はＭＳ２アプタマーであり、黒色文字は付加リンカーであった。相補的リボヌクレオチドは、縦線で示され、非定型的塩基対合は点で示された。図１４Ｃは、改変ｓｇＲＮＡを含むＲＮＰの遺伝子編集活性へのＭＳ２アプタマー位置の効果を示す図である。ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡおよび種々の改変ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を同時発現するプラスミドＤＮＡは、ＧＦＰレポーター細胞にトランスフェクトされ、ＧＦＰ陽性パーセンテージは、フローサイトメトリーによって決定された。各データ点は、１回の独立した実験を示す。＊、＊＊および＊＊＊は、未改変ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１と比較した場合のｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１（ＡＮＯＶＡに続くチューキーの多重比較検定）を示す。図１４Ｄは、ＬＶＬＰにパッケージされた改変ｓｇＲＮＡの遺伝子編集活性へのＭＳ２アプタマー位置の効果を示す。ＭＳ２改変ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１およびＳａＣａｓ９タンパク質（またはｍＲＮＡ）を含有する表示の量のＬＶＬＰがＧＦＰレポーター細胞２．５×１０４個に形質導入するために使用され、ＧＦＰ陽性パーセンテージはフローサイトメトリーによって決定された。各データ点は、３回反復の平均である。＊＊＊、ｐ＜０．００１、ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１テトラ ＭＳ２がＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１３’ＭＳ２と比較された場合；＃＃＃、ｐ＜０．００１、ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１３’ＭＳ２がＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１ＳＴ２ ＭＳ２と比較された場合。
【００３４】
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｃは、ＬＶＬＰ中のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ＲＮＡのパッケージングのためのアプタマー／ＡＢＰ対についての比較を示す図である。図１５Ａは、ｓｇＲＮＡパッケージングのための異なるアプタマーを含む配列番号２１５におけるテトラループの置き換えを示す図である。四角で囲んだテトラループ（ＧＡＡＡ）配列は、種々のアプタマー（下線付き）（（ＭＳ２（配列番号２１６）、ｃｏｍ（配列番号２１７）、ＰＰ７（配列番号２１８）およびＢｏｘＢ（配列番号２１９））を含有するリンカーを含むまたは含まない（下線なし）配列を用いて置き換えられた。図１５Ｂは、テトラループが異なるアプタマーによって置き換えられた後の遺伝子編集活性の比較を示す。ＳａＣａｓ９を同時発現する種々の量のプラスミドＤＮＡおよびアプタマー改変ＨＢＢ  ｓｈＲＮＡ１は、ＧＦＰレポーター細胞１．２５×１０５個にトランスフェクトされた。トランスフェクション４８時間後、ＧＦＰ陽性細胞はフローサイトメトリーによって解析された。各点は、３回反復の平均であった。＊＊＊は、改変を有さないまたはｃｏｍ改変を有するｓｇＲＮＡがＰＰ７、ＢｏｘＢまたはＭＳ２改変ｓｇＲＮＡと比較された場合のｐ＜０．００１を示す（ＡＮＯＶＡに続くボンフェローニポストテスト）。図１５Ｃは、異なるアプタマー／ＡＢＰ対によって作製されたＬＶＬＰの遺伝子編集活性の比較を示す。４００ｕｌの非濃縮ＬＶＬＰは、ＧＦＰレポーター細胞２．５×１０４個に形質導入するために使用され、ＧＦＰ陽性率はフローサイトメトリーによって決定された。各点は、１回の独立したアッセイを示す。＊＊＊は、ＡＮＯＶＡ分析に続くチューキーの多重比較検定での表示の対の間のｐ＜０．００１を示す。ｎｓ、有意でない。
【００３５】
【図１６】図１６は、ＬＶＬＰが、ＧＦＰレポーター細胞においてはＧＦＰ陽性細胞を生成したが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞ではしなかったことを示す図である。細胞２．５×１０４個を２４ウェルプレートに播種し、１５０ｎｇ  ｐ２４のＣａｓ９／ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１  ＲＮＰ  ＬＶＬＰを用いて細胞に形質導入した。細胞は、蛍光顕微鏡によって形質導入４８時間後に解析された。
【００３６】
【図１７】図１７は、粒子アセンブリ効率でのＮＣ−ＣＯＭ改変の解析を示す図である。ＣＯＭ改変を有するまたは有さないパッケージングプラスミドをＣａｓ９／ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１、またはＧＦＰレンチウイルスベクターをパッケージするために使用した。トランスフェクションは６ウェルプレートで行われた；ｐ２４はトランスフェクション後２４〜４８時間の間に回収した上清においてアッセイされた。＊は、ＡＮＯＶＡに続くチューキーの多重比較検定によるｐ＜０．０５を示す。
【００３７】
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｇは、ＲＮＰが遺伝子編集活性の主要因であることを示す図である。図１８Ａは、トランスフェクトされたプラスミドＤＮＡから発現されたＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１が機能的であることを示す。表示の量のＤＮＡは、ＧＦＰレポーター細胞１．２５×１０５個にトランスフェクトされ、細胞は、フローサイトメトリーによってトランスフェクション４８時間後に解析された。同時トランスフェクション実験では、ＤＮＡ量は、Ｃａｓ９発現、およびｓｇＲＮＡ発現プラスミドＤＮＡのそれぞれを示した。各点は、３回反復の平均であった。図１８Ｂは、ＬＶＬＰの遺伝子編集活性へのｓｇＲＮＡのＣａｓ９同時パッケージングおよびｃｏｍ−アプタマー改変の重要性を示している。Ｃａｓ９発現の非存在下でパッケージされたＬＶＬＰは、機能的Ｃａｓ９−ＨＢＢ−３’ＵＴＲＭＳ２ｍＲＮＡ  ＬＶＬＰと共に用いてＧＦＰレポーター細胞に同時形質導入された場合に不活性であった。ＧＦＰレポーター細胞２．５×１０４個は、Ｃａｓ９／ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１  ＬＶＬＰ（ｃｏｍ−ＲＮＰ  ＬＶＬＰ）、Ｃａｓ９／ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１テトラ−ｃｏｍＬＶＬＰ（ｃｏｍ＋ＲＮＰ  ＬＶＬＰ）を用いて形質導入された、または４５ｎｇ  ｐ２４のＣａｓ９−ＨＢＢ−３’ＵＴＲＭＳ２ｍＲＮＡ  ＬＶＬＰおよび種々の量のＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１テトラ−ｃｏｍＬＶＬＰ（ｃｏｍ＋ｓｇＲＮＡ  ＬＶＬＰ）を用いて同時形質導入された。ＧＦＰ陽性細胞は、形質導入４８時間後にフローサイトメトリーによって決定された。各点は、３回反復の平均である。＊＊＊は、ｃｏｍ＋ＲＮＰ  ＬＶＬＰを用いて処置された細胞のＧＦＰ陽性率を同様の量の他の粒子を用いて処置された細胞と比較した場合のｐ＜０．００１を示す（ＡＮＯＶＡに続くボンフェローニポストテスト）。図１８Ｃは、同時発現Ｃａｓ９がＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１レベルを増加させたことを示す。ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１テトラ−ｃｏｍ（２００ｎｇ）だけおよびＳａＣａｓ９（２００ｎｇ）だけを発現するプラスミドは、単独でまたは一緒にＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされ、ｓｇＲＮＡレベルは、ＲＴ−ｑＰＣＲによって比較された。ＧＦＰ発現プラスミド（５０ｎｇ）は、ＧＦＰ発現がトランスフェクション効率を正規化するために使用され得るように同時トランスフェクトされた。合計プラスミドＤＮＡは、ｐＣＤＮＡ３プラスミドＤＮＡによって４５０ｎｇにされた。＊は、Ｃａｓ９同時発現を有さないｓｇＲＮＡレベルがＣａｓ９同時発現を有するものと比較された場合のｐ＜０．０５を示す。図１８Ｄは、単離されたレンチウイルスベクターおよびＬＶＬＰにおけるＣａｓ９タンパク質のウエスタンブロット解析を示す。２００ｎｇ  ｐ２４のＧＦＰレンチウイルス（レーン１）、ＮＣ−ＭＣＰ改変Ｃａｓ９−ＨＢＢ−３’ＵＴＲＭＳ２ＬＶＬＰ（ｓｇＲＮＡを有さない、レーン２）、ＮＣ−未改変Ｃａｓ９ＭＳ２ＬＶＬＰ（ｓｇＲＮＡを有さない、レーン３）、ＮＣ−ＣＯＭ改変Ｃａｓ９／ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１テトラ−ｃｏｍＬＶＬＰ（レーン４）、ＮＣ−ＣＯＭ改変Ｃａｓ９／ＩＬ２ＲＧ  ｓｇＲＮＡ１テトラ−ｃｏｍＬＶＬＰ（レーン５）およびＮＣ−ＣＯＭ改変Ｃａｓ９／ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１  ＬＶＬＰ（テトラ−ｃｏｍアプタマーを有さないｓｇＲＮＡ、レーン６）がロードされた。図１８Ｅは、ｓｇＲＮＡのテトラ−ｃｏｍ改変がＬＶＬＰにおけるＣａｓ９タンパク質含有量を増加させたことを示す。図１８Ｆは、ｃｏｍ改変ｓｇＲＮＡを有するＬＶＬＰ中のＣａｓ９タンパク質が未改変ｓｇＲＮＡを有するＬＶＬＰ中のＣａｓ９タンパク質よりも界面活性剤耐性であることを示す。同量の出発ＬＶＬＰ（２００ｎｇのｐ２４）は、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００を含むまたは含まない１ｍｌの１０％ショ糖を通して遠心分離された。（図１８Ｅおよび１８Ｆ）について、Ｃａｓ９レベルは、ドシメトリ解析（ＩＭＡＧＥ  Ｊ）に基づいて、ＣＡタンパク質によって正規化された。図１８Ｇは、ＬＶＬＰ中のｓｇＲＮＡのパッケージングが、ｃｏｍ−アプタマー依存性であるが、Ｃａｓ９タンパク質依存性でないことを示す。ＲＮＡ単離についての同様の粒子インプット（ＣＡ）の証拠に関して図１８Ｅを参照されたい。各点は１回反復を示す。＊＊＊は、ＡＮＯＶＡ分析に続くチューキーの多重比較検定での表示された対の間のｐ＜０．００１を示す。
【００３８】
【図１９】図１９は、同じプライマー対がｃｏｍアプタマーを含むまたは含まないｓｇＲＮＡ  ＤＮＡ配列を増幅するために使用された場合の標準曲線を示す図である。
【００３９】
【図２０−１】図２０Ａ〜２０Ｅは、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ  ＬＶＬＰが遺伝子編集において効率的かつ特異的であることを示す図である。図２０Ａは、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ  ＬＶＬＰがＣａｓ９  ｍＲＮＡ  ＬＶＬＰと同等の遺伝子編集活性を有することを示す。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ  ＬＶＬＰについて、粒子量は、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ  ＬＶＬＰおよびＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を発現する６０ｎｇ  ｐ２４のＬＶの合計である。図２０Ｂは、内因性ＩＬ２ＲＧ標的配列においてＣａｓ９／ＩＬ２ＲＧ  ｓｇＲＮＡ１  ＲＮＰ  ＬＶＬＰによって生成されたインデルを示す。プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）は灰色にし、標的配列は下線付きである。予測切断部位は、矢印によって示されている。破線は欠失を示す。図２０Ｃは、ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１の配列、ｇＲＮＡに完全にマッチするＳｉｃｋｌｅ突然変異体配列およびｇＲＮＡに１つミスマッチを有する内因性ＨＢＢ配列を示す図である。鎌状赤血球症を生じる突然変異は下線付きである。図２０Ｄは、他の送達ビヒクルのものを含むＣａｓ９／ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１  ＲＮＰ  ＬＶＬＰのオンターゲットおよびオフターゲットインデル率の比較である。オンターゲットインデル率のオフターゲットインデル率に対する比（「オン／オフ」比）は、オンターゲットインデル率をオフターゲットインデル率で割った結果である。細胞は処置７２時間後に採取された。２４ウェルプレートでの細胞増殖のために、細胞１．２５×１０５個および２．５×１０４個をトランスフェクションおよび形質導入のためにそれぞれ使用した。ＲＮＰ  ＬＶＬＰのために、１５０ｎｇ  ｐ２４を使用した；ｍＲＮＡ  ＬＶＬＰのために、４５ｎｇ  ｐ２４のＣａｓ９  ｍＲＮＡ  ＬＶＬＰおよび６０ｎｇ  ｐ２４のＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１発現ＩＤＬＶを使用した；Ｃａｓ９およびＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を同時発現するＬＶのために、３０ｎｇ  ｐ２４を使用した；Ｃａｓ９およびＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を同時発現するＩＤＬＶのために、３０ｎｇ  ｐ２４を使用した；ＡＡＶ６を発現するＣａｓ９およびＡＡＶ６を発現するＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１のために、１０４ウイルスゲノム／細胞を各ウイルスについて使用した。オンターゲットインデル率は、比較のためにすべて１００に正規化される。元のデータは図２２にある。図２０Ｅは、Ｃａｓ９  ＲＮＰ  ＬＶＬＰがＣａｓ９  ｍＲＮＡ  ＬＶＬＰよりも速い作用を示したことを示す。５０ｎｇ  ｐ２４のＣａｓ９／ＩＬ２ＲＧ  ｓｇＲＮＡ１  ＲＮＰ  ＬＶＬＰ、または１００ｎｇ  ｐ２４のＣａｓ９  ｍＲＮＡ  ＬＶＬＰに加えて１００ｎｇ  ｐ２４のＩＬ２ＲＧ  ｓｇＲＮＡ１を発現するＩＤＬＶを用いて、ＧＦＰレポーター細胞２．５×１０４個への形質導入を行い、スキャンニングのためにＩｎｃｕＣｙｔｅでインキュベートした。＊は、ＲＮＰ処置細胞が陰性対照またはｍＲＮＡ  ＬＶＬＰ−処置細胞よりも有意に高い（ｐ＜０．０５）ＧＦＰ陽性面積／相面積を示した時点を示す。＃は、ｍＲＮＡ  ＬＶＬＰ処置細胞が陰性対照細胞よりも有意に高い（ｐ＜０．０５）ＧＦＰ陽性面積／相面積を示した時点を示す。線は、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ  ＬＶＬＰ処置細胞がＲＮＰ処置細胞と同じレベルのＧＦＰ陽性面積／相面積に達するまでの時���差を示す。
【図２０−２】同上。
【００４０】
【図２１】図２１は、リンパ球においてＣａｓ９／ＩＬ２ＲＧ  ＲＮＰ  ＬＶＬＰによって生成されたインデルを示す図である。灰色のヌクレオチドはＰＡＭである。下線付きヌクレオチドは標的配列である。下線付き斜体ヌクレオチドは挿入物である。
【００４１】
【図２２】図２２Ａおよび２２Ｂは、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ  ＬＶＬＰが、ＩＤＬＶによって送達されたドナー鋳型の存在下で相同組換えを促進したことを示す図である。図２２Ａは、相同組換えの検出のためのドナー鋳型の設計およびＰＣＲ戦略を示す図である。図２２Ｂは、ＮＧＳによる相同組換え事象の検出を示す。ＰＡＭは緑である。標的配列は下線付きである。挿入されたＩＬ２ＲＧ  ｃＤＮＡはオレンジである。元の開始コドンおよび挿入されたｃＤＮＡについての開始コドンは赤である。ｃＤＮＡにおいて、小文字は元のｃＤＮＡ配列と同一であるが、大文字は元の配列と異なるがコードされるタンパク質は同じである。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
定義
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、明確に別に示されない限り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、複数の言及を含む。
【００４３】
「核酸」または「ヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）および一本鎖または二本鎖いずれかの形態のそのポリマーを指す。具体的に制限されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で代謝される天然ヌクレオチドの公知類似体を含有する核酸を包含する。特に断りのない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に改変されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰおよび相補配列、ならびに明確に示される配列を暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンのうち第３の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １９：５０８１  （１９９１）；  Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６０：２６０５−２６０８  （１９８５）；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８  （１９９４））。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと同義的に使用される。
【００４４】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の産生またはコード化に関与するＤＮＡのセグメントを指す場合がある。それは、コーディング領域の前および後の領域（リーダーおよびトレイラー）、ならびに個々のコーディングセグメント（エキソン）の間の介在配列（イントロン）を含み得る。あるいは、「遺伝子」という用語は、非翻訳ＲＮＡ、例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ガイドＲＮＡまたはマイクロＲＮＡの産生またはコード化に関与するＤＮＡのセグメントを指す場合がある。
【００４５】
「処置すること」とは、任意の客観的または主観的パラメーター、例えば、症状の緩解、寛解、減少または疾患状態を患者に対して、より許容できるものにすること、変性もしくは減退の速度を減速すること、または変性の最終点をあまり衰弱しないものにすることを含む、疾患、状態または障害の処置または回復または予防の成功の何らかの兆しを指す。症状の処置または回復は、医師による検査の結果を含む、客観的または主観的パラメーターに基づいたものであり得る。したがって、「処置すること」という用語は、本明細書において記載されているような疾患、状態または障害と関連する症状または状態の発症を予防または遅延する、軽減する、または停止または阻害するための本開示の化合物または薬剤の投与を含む。「治療効果」という用語は、対象における疾患の、疾患の症状の、または疾患の副作用の低減、排除または予防を指す。本開示の方法を使用する「処置すること」または「処置」は、本明細書において記載されているような疾患、状態または障害と関連する疾患または障害のリスクの増大時であり得るが、まだ症状を経験していない、もしくは示していない対象において、症状の開始を予防すること、疾患または障害の症状を阻害すること（その発症を減速または停止すること）、疾患の症状または副作用からの開放を提供すること（対症処置を含む）、および疾患の症状を緩和すること（退縮を引き起こすこと）を含む。処置は、疾患または状態の予防的（疾患の開始を予防または遅延するため、またはその臨床的もしくは無症候性症状の顕性化を予防するため）または顕性化後の症状の治療的抑制もしくは軽減であり得る。「処置」という用語は、本明細書で使用される場合、予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）（例えば、予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ））、治癒的または対症処置を含む。
【００４６】
「プロモーター」は、核酸の転写を指示する１つまたは複数の核酸制御配列として定義される。本明細書で使用される場合、プロモーターは、転写の開始部位に近い必要な核酸配列、例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合には、ＴＡＴＡエレメントを含む。プロモーターはまた、必要に応じて、転写の開始部位から数千塩基対ほどにも位置し得る、遠位エンハンサーまたはレプレッサーエレメントを含む。
【００４７】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために、本明細書において同義的に使用される。３種の用語すべてが、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに当てはまる。本明細書で使用される場合、この用語は、全長タンパク質、末端切断型タンパク質およびその断片、ならびにアミノ酸残基が共有ペプチド結合によって連結されているアミノ酸鎖を包含する。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語「相補的」または「相補性」とは、ヌクレオチドまたは核酸間の特異的塩基対形成を指す。相補的ヌクレオチドは、一般に、ＡとＴ（またはＡとＵ）およびＧとＣである。
【００４９】
全体を通して使用される、対象とは、個体を意味する。例えば、対象は、哺乳動物、例えば、霊長類、より詳しくは、ヒトである。非ヒト霊長類は、同様に対象である。対象という用語は、飼い慣らされた動物、例えば、ネコ、イヌなど、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）および実験動物（例えば、フェレット、チンチラ、マウス、ウサギ、ラット、スナネズミ、モルモットなど）を含む。したがって、獣医学的使用および医学的使用ならびに製剤が本明細書において企図される。この用語は、特定の年齢または性別を示さない。したがって、成体および新生児の対象は、雄性であろうが、雌性であろうが、対象とされるものとする。本明細書で使用される場合、患者または対象は、同義的に使用されてもよく、疾患または障害に苦しむ対象を指すことができる。
【００５０】
「発現カセット」は、宿主細胞における特定のポリヌクレオチド配列の転写を可能にする一連の指定の核酸エレメントを用いて組換えによってまたは合成によって作製された核酸構築物である。発現カセットは、プラスミド、ウイルスゲノムまたは核酸断片の一部であり得る。典型的には、発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結した転写されるべきポリヌクレオチドと、それに続く転写終結シグナル配列とを含む。発現カセットは、指定の調節配列、例えば、ヒトグロビン遺伝子由来の５’または３’非翻訳領域を含む場合も、含まない場合もある。
【００５１】
「レポーター遺伝子」は、その生化学的特徴、例えば、酵素活性または化学蛍光特性によって容易に検出可能であるタンパク質をコードする。これらのレポータータンパク質は、選択マーカーとして使用され得る。このようなレポーターの１つの具体例として、緑色蛍光タンパク質がある。このタンパク質から生じた蛍光は、商業的に入手可能な種々の蛍光検出システムを用いて検出され得る。他のレポーターは、染色することによって検出され得る。レポーターはまた、適切な基質と接触されると検出可能なシグナルを生じる酵素であり得る。レポーターは、検出可能な生成物の形成を触媒する酵素であり得る。適した酵素として、それだけには限らないが、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼ、ホスファターゼおよび加水分解酵素が挙げられる。レポーターは、基質が真核細胞原形質膜に対して実質的に不透過性であり、したがって、シグナル形成を堅固に制御することを可能にする酵素をコードし得る。酵素をコードする適したレポーター遺伝子の具体例として、それだけには限らないが、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ；Ａｌｔｏｎ  ａｎｄ  Ｖａｐｎｅｋ  （１９７９）  Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：  ８６４−８６９）、ルシフェラーゼ（ｌｕｘ）、β−ガラクトシダーゼ、ＬａｃＺ、β−グルクロニダーゼおよびアルカリホスファターゼ（Ｔｏｈ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８０）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １８２：  ２３１−２３８およびＨａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎ．  ２：  １０１）が挙げられ、それらの各々は、その全文が参照により本明細書に組み込まれる。他の適したレポーターとして、エピトープを特異的に認識する標識された抗体を用いて検出され得る特定のエピトープをコードするものが挙げられる。
【００５２】
「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」システムとは、外来核酸に対する防御のための広範なクラスの細菌システムを指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、広範な真正細菌および古細菌生物において見られる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型サブタイプを含む。
【００５３】
Ｍａｋａｒｏｖａ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０１５  Ｎｏｖ；  １３（１１）：７２２−３６）によって記載されているようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム分類は、共有される特徴および進化的類似性に基づいて５種のタイプおよび１６種のサブタイプを規定する。これらは、ゲノムＤＮＡを切断するエフェクター複合体の構造に基づいて２つの大きなクラスにグループ分けされる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ゲノム工学のために使用された最初のものであり、２０１５年にＶ型が続いた。野生型ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ガイドＲＮＡとの複合体で、ＲＮＡ媒介性ヌクレアーゼＣａｓタンパク質または相同体（本明細書において「ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ」と呼ばれる）を利用して、外来核酸を認識し、切断する。Ｃａｓ９タンパク質はまた、活性化ＲＮＡ（トランス活性化またはｔｒａｃｒＲＮＡとも呼ばれる）を使用する。ともに使用されるＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの種類に応じて、ガイドＲＮＡ、またはガイドＲＮＡと活性化ＲＮＡの両方のいずれかの活性を有するガイドＲＮＡも、当技術分野で公知である。一部の例では、このような二重活性ガイドＲＮＡは、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と呼ばれる。活性化ＲＮＡ配列を含有しない合成ガイドＲＮＡもまた、ｓｇＲＮＡとも呼ばれ得る。本開示では、ｓｇＲＮＡおよびｇＲＮＡという用語は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと複合体形成し、リボヌクレオタンパク質複合体を標的ＤＮＡ配列に局在化するＲＮＡ分子を指すために同義的に使用される。標的遺伝子、標的遺伝子の集団の転写の阻害および／または活性化を制御する（例えば、トランスクリプトームまたはその一部を制御する）ための方法および組成物は、例えば、Ｃｅｌｌ．  ２０１４  Ｏｃｔ  ２３；１５９（３）：６４７−６１に記載されており、その内容は、すべての目的のためにその全文が本明細書に参照により組み込まれる。
【００５４】
本明細書で使用される場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ活性、ｓｇＲＮＡ活性、ｓｇＲＮＡ：ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼヌクレアーゼ活性などに関連して「活性」とは、標的遺伝子エレメントに結合する能力を指す。典型的には、活性はまた、ｓｇＲＮＡ：ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼヌクレアーゼ複合体の、標的ゲノム領域で二本鎖切断を作製する能力を指す。一部の場合には、活性は、標的ゲノム領域でまたはその付近での転写をモジュレートする能力を指し得る。このような活性は、当技術分野で公知の種々の方法で測定され得る。例えば、標的ゲノム領域を含有するか、またはそれに隣接する遺伝子の発現、活性またはレベルが測定され得る。別の例では、標的ゲノム領域での細胞のゲノムにおける挿入および欠失（インデル）の作製が測定され得る。
【００５５】
本明細書で使用される場合、細胞のゲノムの編集に関連して「編集する」という語句は、標的ゲノム領域でゲノムの配列において構造変化を誘導することを指す。例えば、編集は、細胞のゲノムへのヌクレオチド配列の挿入または細胞のゲノムからのヌクレオチド配列の欠失の形をとることがある。ヌクレオチド配列は、ポリペプチドまたはその断片をコードし得る。このような編集は、標的ゲノム領域内の二本鎖切断または反対の鎖および隣接する標的ゲノム領域で一対の一本鎖ニックを誘導することによって実施され得る。標的ゲノム領域で、またはその中で一本鎖または二本鎖切断を誘導する方法は、標的ゲノム領域に向けられたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼヌクレアーゼドメインおよびガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡの対の使用を含む。
【００５６】
本明細書で使用される場合、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）とは、ＤＮＡ鎖の切断された、またはニックが入れられた末端が、相同鋳型核酸を必要とせず直接ライゲーションされ得る細胞性プロセスを指す。ＮＨＥＪは、修復する部位での１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換またはそれらの組合せにつながり得る。
【００５７】
本明細書で使用される場合、相同組換え修復（ＨＤＲ）という用語は、ＤＮＡ鎖の切断された、またはニックが入れられた末端が、相同鋳型核酸から重合によって修復される細胞性プロセスを指す。したがって、元の配列は、鋳型の配列と置き換えられる。相同鋳型核酸は、ゲノム中の別の場所の相同配列（同一または異なる染色体上の姉妹染色分体、相同染色体または反復領域）によって提供され得る。あるいは、外因性鋳型核酸が、標的部位の配列の具体的なＨＤＲ誘導性変化を得るように導入され得る。この方法では、切断部位に、特異的な突然変異が導入され得る。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「標的鋳型配列」とは、ＨＤＲの鋳型として細胞によって使用され得るＤＮＡオリゴヌクレオチドを指す。標的鋳型配列は、一本鎖ＤＮＡ鋳型または二本鎖ＤＮＡ鋳型であり得る。一般に、標的鋳型配列は、細胞のゲノム中の標的部位（ゲノム標的配列または標的ゲノム領域）に対して相同性の少なくとも１つの領域を有する。一部の例では、標的鋳型配列は、細胞のゲノム中の標的切断部位（ゲノム標的配列または標的ゲノム領域）に挿入されるべき異種配列を含有する領域に隣接する２つの相同領域を有する。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「リボヌクレオタンパク質複合体」「ＲＮＰ」という用語などは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９タンパク質およびｃｒＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡまたは単一ガイドＲＮＡ）、Ｃａｓ９タンパク質およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡまたはそれらの組合せ間の複合体（例えば、Ｃａｓ９タンパク質、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡガイドを含有する複合体を指す。
詳細な説明
【００６０】
以下の説明では、本組成物および方法の様々な態様および実施形態を列挙する。特定の実施形態は、組成物および方法の範囲を規定するものではない。むしろ、実施形態は、単に、開示されている組成物および方法の範囲内に少なくとも含まれる様々な組成物および方法の限定されない例を提供する。説明は、当業者の観点から読み取られるべきであり、したがって、当業者に周知の情報は、必ずしも含まれていない。
【００６１】
ウイルス粒子を使用してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム構成成分を真核細胞に効率的に送達するための組成物、システム、製造方法および方法が、本明細書において提供される。例えば、レンチウイルス様粒子を介してＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡまたはＲＮＰを細胞へ効率的に送達するための構成成分、システム、製造方法および方法が提供される。本明細書において記載されているシステムによって産生されたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、真核細胞における遺伝子編集にとって機能的である。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡは、真核細胞中に送達され、制限された半減期を有し、オフターゲット媒介性突然変異誘発のリスクを低減する。真核細胞へのＲＮＰの送達によって、オフターゲット効果を低減しながら、例えば、トランスフェクトすることが困難である細胞、例えば、一次細胞における効率的な送達が可能となる。
【００６２】
レンチウイルス様粒子は、アプタマー結合タンパク質との融合タンパク質である、改変されたウイルスタンパク質を含有する。改変されたウイルスタンパク質は、構造性である場合も、非構造性である場合もある。特に、改変されたウイルスタンパク質は、タンパク質に融合されたアプタマー結合タンパク質を有する、レンチウイルス調節タンパク質（ＶＰＲおよびＮＥＦ）、ヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質またはマトリックス（ＭＡ）タンパク質であり得る。レンチウイルス様粒子はまた、非ウイルス性核酸配列、具体的には、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列（ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡ）またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）のうち一方または両方も含有する。図１Ａおよび図１Ｂに示されるように、これらのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム構成成分は、レンチウイルス様粒子内にパッケージングされ、真核細胞中に送達される。一部の場合には、ｇＲＮＡは、レンチウイルス様粒子を使用して送達される。例えば、一部の場合には、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列およびｇＲＮＡは、レンチウイルス様粒子中に一緒にパッケージングされる場合がある。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列およびｇＲＮＡは、別個のレンチウイルス様粒子中にパッケージングされる場合がある。さらに、ｇＲＮＡを真核細胞中に送達するために他の送達機序が使用されることもある（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、プラスミド、ｇＲＮＡトランスフェクションまたは電気穿孔など）。
【００６３】
非ウイルス性核酸配列は、改変されたウイルスタンパク質に融合されているアプタマー結合タンパク質が特異的に結合するアプタマー配列の付加で改変され得る。一部の実施形態では、アプタマー配列は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡをコードする核酸に付着している。アプタマー配列と、改変されたウイルスタンパク質に融合されたアプタマー結合タンパク質との相互作用が、エンドヌクレアーゼｍＲＮＡのレンチウイルス粒子へのパッケージングを促進する。図１４Ａは、Ｃａｓ  ｍＲＮＡに付着しているアプタマーと、ウイルスタンパク質に融合されたアプタマー結合タンパク質との相互作用を介した、レンチウイルス粒子におけるＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡのパッケージングを例示する。一部の実施形態では、アプタマー配列は、ｇＲＮＡ配列に付着されるか、またはｇＲＮＡ配列中に挿入される。ｇＲＮＡ配列に付着されるか、またはｇＲＮＡ配列中に挿入されたアプタマー配列が、アプタマー結合タンパク質と相互作用すると、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（ＲＮＰ）と複合体形成しているｇＲＮＡ配列が、レンチウイルス粒子中にパッケージングされる。図１４Ｂは、ｇＲＮＡに付着されたアプタマーと、ウイルスタンパク質に融合されたアプタマー結合タンパク質の会合を介した、レンチウイルス粒子におけるＲＮＰ（すなわち、ｇＲＮＡと複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ）のパッケージングを例示する。
【００６４】
ウイルス性融合タンパク質の存在は、レンチウイルス様粒子内の非ウイルス性核酸配列またはＲＮＰのパッケージングを増大し得る。一部の場合には、アプタマー配列の非ウイルス性核酸配列への付加、例えば、アプタマー配列の、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡをコードする核酸配列への付加は、パッケージングされるＲＮＡの量をさらに増大し得る。他の場合には、非ウイルス性核酸配列は、ｇＲＮＡ配列、およびＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする配列を含み、アプタマー配列のｇＲＮＡ配列への付加は、パッケージングされるＲＮＰの量をさらに増大し得る。本開示は、上記で記載されているようなレンチウイルス様粒子、他のウイルス粒子構成成分、このようなレンチウイルス様粒子を作製するためのプラスミド、このようなプラスミドを使用してレンチウイルス様粒子を作製する方法およびシステム、ならびに細胞においてレンチウイルス様粒子を使用してゲノム標的配列を改変する方法を提供する。
Ｉ．緒言
【００６５】
細菌において適応免疫系を形成する２型クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）システムは、ゲノム工学のために改変されている。操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、２つの構成成分：ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とも呼ばれる）およびＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを含有する。ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとの結合に必要なスキャフォールド配列と、改変されるべきゲノム標的を定義するユーザー定義の約２０ヌクレオチドのスペーサーから構成される短い合成ＲＮＡである。したがって、ｇＲＮＡ中に存在する標的配列を簡単に変更することによって、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼのゲノム標的を変更できる。ＣＲＩＳＰＲは元々、種々の細胞種および生物において標的遺伝子をノックアウトするために利用されたが、種々のＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼへの改変によって、標的遺伝子を選択的に活性化／抑制する、ＤＮＡの具体的な領域を精製する、生細胞においてＤＮＡを画像化する、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡを正確に編集するために、ＣＲＩＳＰＲは拡張された。ゲノム標的の相同組換え修復（ＨＤＲ）が望まれる場合、例えば、目的が突然変異されたゲノム配列を修正することである場合には、システムは、突然変異されたゲノム配列の代わりにゲノム中に導入されるべき所望の配列を提供する標的鋳型配列を含む。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）が、ゲノムＤＮＡ中の切断を修復するために使用される修復機序である場合には、標的鋳型配列は使用されず、修復は、一般に、修復の部位での欠失または挿入をもたらす。この機序は、遺伝子編集からの所望の成果が、ゲノム配列の機能を不活性化することおよび／もしくは損なうこと、または欠失もしくは挿入によって破壊された遺伝子のリーディングフレームを回復させることである場合に有用である。
【００６６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを細胞中に送達するために、種々の哺乳動物発現システムが使用されてきた。これらとして、レンチウイルス形質導入、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）形質導入、哺乳動物発現ベクター、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの直接送達、ならびにＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ／ｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質複合体の直接送達が挙げられる。
【００６７】
レンチウイルスシステムの場合には、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡは、単一レンチウイルスベクター中に存在する場合も、別個のレンチウイルスベクター中に存在する場合もある。ウイルスベクターは、陽性細胞を同定し、濃縮するためにレポーター遺伝子（ＧＦＰなど）を含有し得る。レンチウイルスベクターはまた、安定な細胞系を作製するために選択マーカーも含有することが多い。レンチウイルスシステムの安全性特性は、感染性ウイルス粒子（ビリオン）を産生するのに必要な構成成分が、一般に、複数のプラスミドに分配されているということである。パッケージングプラスミドおよびエンベローププラスミドは、ウイルスカプシドおよびエンベロープの構成成分をコードし、ウイルスゲノム、およびＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼまたはｇＲＮＡのうち一方または両方をコードするトランスファープラスミドとともに使用される。これらのプラスミドは、細胞（２９３ヒト胚性腎臓細胞など）中に同時にトランスフェクトされ、細胞がインキュベートされ、次いで、ウイルス粒子を含有する上清が集められる。次いで、これらのウイルス粒子を、目的の細胞に形質導入するために使用できる。次いで、レンチウイルスベクターゲノムの一部が、標的細胞のゲノム中に組み込まれ、標的遺伝子およびその発現をモジュレートできる。しかし、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを送達するためのレンチウイルスベクターシステムの使用は、発癌性変化、感染性変化、および感染細胞に他の形質転換的変化を引き起こす可能性を有する。
【００６８】
レンチウイルスベクターシステム安全性および有効性を改善しようとする異なる種類のレンチウイルスベクターシステムが開発されている。第２世代レンチウイルスシステムは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、ＲｅｖおよびＴａｔ遺伝子をコードする単一パッケージングプラスミドを含有する。導入遺伝子発現は、内部プロモーターなしで、弱いプロモーターであるゲノム５’ＬＴＲによって駆動され、発現を活性化するためにＴａｔの存在を必要とする。第３世代システムは、第２世代システムの安全性に関して２つの方法で改善している。第１に、パッケージングシステムは、２つのパッケージングプラスミド：Ｒｅｖをコードするもの、ならびにＧａｇおよびＰｏｌをコードするものにわけられている。第２に、Ｔａｔは、第３世代システムから排除されており、このプロモーターからの導入遺伝子の発現は、もはやＴａｔトランス活性化に依存していない。第３世代トランスファープラスミドは、第２または第３世代パッケージングシステムのいずれかによってパッケージングされ得る。第２および第３世代システムは、複製能力のあるウイルスの意図しない生成に関連する懸念に対処するが、これらのシステムは依然として、形質導入された細胞において突然変異誘発およびオフターゲット効果を引き起こしやすい。
【００６９】
ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよび／またはｇＲＮＡがＡＡＶトランスファーベクター中に挿入され、ＡＡＶ粒子を生成するために使用されるＡＡＶシステムを使用できる。ＡＡＶ粒子のパッケージング限界は、およそ４．５ｋｂのみであり、これが、使用され得るＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡの大きさを制限する。
【００７０】
哺乳動物発現ベクターが使用される場合には、異種プロモーターがＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ発現を駆動するために使用される。プロモーターは、構成性または誘導性であり得る。ｇＲＮＡのためにはＵ６プロモーターが使用されることが多い。発現ベクターは、陽性細胞を同定し、濃縮するためのレポーター遺伝子（緑色蛍光タンパク質；ＧＦＰなど）または安定な細胞系を作製するための選択マーカーを含有し得る。高効率でトランスフェクトされ得る哺乳動物細胞系におけるＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよび／またはｇＲＮＡの一過性または安定発現のために、哺乳動物発現ベクターが使用され得る。
【００７１】
ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡおよびｇＲＮＡ（ｖｉｔｒｏ転写反応を使用してプラスミドから合成された）を、マイクロインジェクションまたは電気穿孔を使用して標的細胞に送達できる。同様に、精製ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼタンパク質およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたｇＲＮＡを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで組み合わせて、リボヌクレオタンパク質複合体を形成でき、これが、カチオン性脂質を使用して細胞に送達される。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡまたはタンパク質および／もしくはｇＲＮＡが細胞内で分解されるにつれて発現が減少するので、両直接送達方法とも、ＣＲＩＳＰＲ構成成分の一過性発現をもたらす。
【００７２】
本開示の態様は、改変されたレンチウイルスベクターシステムおよび構成成分を含み、一部の場合には、レンチウイルス構成成分、ＡＡＶ構成成分または哺乳動物発現ベクターのうち１つまたは複数も含み得る。一部の場合には、提供される改変されたレンチウイルスベクターシステムおよび構成成分は、レンチウイルスゲノムのすべてまたは相当な部分を排除するように改変されている。さらに、改変されたシステムおよび構成成分から産生されたレンチウイルス様粒子は、形質導入された細胞において感染粒子を生成するリスクならびに突然変異誘発およびオフターゲット効果を引き起こすリスクを低減した。
ＩＩ．プラスミド構成成分
【００７３】
本開示では、種々のプラスミド組成物が提供される。これらとして、改変されたレンチウイルスパッケージングプラスミド、改変されたレンチウイルストランスファープラスミドおよび哺乳動物発現プラスミドが挙げられる。
Ａ．改変されたウイルスタンパク質プラスミド
【００７４】
本開示の一態様は、アプタマー結合タンパク質に融合されたレンチウイルスタンパク質の融合タンパク質である改変されたレンチウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むプラスミドである。本開示に関連して、改変されたウイルスタンパク質は、構造性である場合も、非構造性である場合もある。一部の場合には、改変されたウイルスタンパク質は、構造タンパク質であり、レンチウイルスパッケージングプラスミドによって提供され得る。一部の場合には、改変されたウイルスタンパク質は、非構造タンパク質であり、哺乳動物発現ベクターによって提供され得る。例示的構造タンパク質として、レンチウイルスヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質およびマトリックス（ＭＡ）タンパク質がある。例示的非構造タンパク質として、ウイルスタンパク質Ｒ（ＶＰＲ）およびネガティブ調節因子（ＮＥＦ）がある。
【００７５】
一部の実施形態では、改変されたウイルスタンパク質は、ヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質である。他の実施形態では、改変されたウイルスタンパク質は、マトリックス（ＭＡ）タンパク質である。ＮＣタンパク質およびＭＡタンパク質は両方とも、レンチウイルスＧａｇ遺伝子によってコードされる。一部の場合には、ウイルスタンパク質のコード配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７のうち１つであり得る。一部の場合には、ウイルスタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８のうち１つであり得る。一部の場合には、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、真核細胞プロモーターに作動可能に連結した配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８のうち少なくとも１つをコードする配列を含む。一部の場合には、ウイルスタンパク質がＮＥＦである場合には、ポリペプチドは、ウイルスカプシドにおけるパッケージングを増強する３つの突然変異、例えば、以下の置換突然変異：Ｇ３Ｃ、Ｖ１５３ＬおよびＥ１７７Ｇなどを含み得る。
【００７６】
改変されたレンチウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）コード配列を含む。一部の場合には、ＡＢＰコード配列は、ウイルスタンパク質コード配列の５’末端または３’末端にある。一部の場合には、ＡＢＰコード配列は、コードされるＡＢＰがウイルスタンパク質に融合されるように、ウイルスタンパク質コード配列中に挿入され得る。ＡＢＰコード配列は、ウイルスタンパク質コード配列内の内部位置にインフレームで挿入され得る。ウイルスタンパク質コード配列の５’または３’末端付近の内部位置にインフレームで配置される場合には、ＡＢＰコード配列は、その全文が参照により本明細書に組み込まれるＪ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６５（２）：９２２−３０  （１９９１）およびＢｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  −  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ  １６１４（１）：６２−７２  （２００３）に記載されているものなどのプロセシング配列を破壊しないように配置される。例えば、Ｇａｇヌクレオチド配列は、とりわけ、ＮＣコード配列およびＭＡコード配列をコードし、Ｇａｇ前駆体タンパク質は、タンパク質分解による切断によって別個の成熟ウイルスタンパク質にプロセシングされる。ＡＢＰコード配列のインフレーム挿入は、タンパク質分解による切断のためのプロセシング配列をコードするヌクレオチドを破壊しない。一部の場合には、ウイルスタンパク質コード配列中のヌクレオチドは、ＡＢＰタンパク質コード配列と置き換えられ得る。一部の場合には、３〜６個のアミノ酸をコードするリンカー配列は、発現の際のタンパク質ドメインの適切なフォールディングを促進するのに役立つように、ウイルスタンパク質コード配列とＡＢＰコード配列との間に、またはＡＢＰコード配列に隣接して配置され得る。
【００７７】
一例では、改変されたウイルスタンパク質はＮＣであり、ＡＢＰコード配列は、ＮＣコード配列の５’末端または３’末端に挿入される。別の例では、改変されたウイルスタンパク質はＮＣであり、ＡＢＰコード配列は、ジンクフィンガー（ＺＦ）ドメインの１つの前または後に挿入される。例えば、ＡＢＰコード配列は、第２のＺＦ（ＺＦ２）ドメインの最後のコドンの後に挿入され得る。別の例では、ＡＢＰコード配列は、ＺＦ２ドメインの第１のコドンの前に挿入され得る。別の例では、ＡＢＰコード配列は、第１のＺＦ（ＺＦ１）ドメインの第１のコドンの前に挿入され得る。別の例では、ＡＢＰコード配列は、第１のＺＦ（ＺＦ１）ドメインの最後のコドンの後に挿入され得る。一部の場合には、ＡＢＰコード配列は、ＮＣタンパク質中のアミノ酸の高度に陽性のストレッチを破壊しない方法でＮＣコード配列中に挿入される。
【００７８】
別の例では、改変されたウイルスタンパク質はＭＡであり、ＡＢＰコード配列は、ＭＡコード配列の５’末端または３’末端に挿入される。別の例では、ＡＢＰコード配列は、ＭＡコード配列内の内部位置にインフレームで挿入される。一部の場合には、ＭＡコード配列中のヌクレオチドは、ＡＢＰタンパク質コード配列と置き換えられ得る。例えば、ＭＡタンパク質のアミノ酸４４〜１３２をコードするヌクレオチドは、ＡＢＰコード配列と置き換えられ得る。別の例では、ＡＢＰコード配列は、ＭＡタンパク質のアミノ酸４４をコードするコドンの前に挿入される。別の例では、ＡＢＰコード配列は、ＭＡタンパク質のアミノ酸１３２をコードするコドンの後に挿入される。
【００７９】
別の例では、改変されたウイルスタンパク質はＶＰＲであり、ＡＢＰコード配列は、ＶＰＲコード配列の５’末端または３’末端に挿入される。一例では、ＡＢＰコード配列は、ＶＰＲコード配列の５’末端に挿入される。
【００８０】
別の例では、改変されたウイルスタンパク質はＮＥＦであり、ＡＢＰコード配列は、ＮＥＦコード配列の５’末端または３’末端に挿入される。一例では、ＡＢＰコード配列は、ＮＥＦコード配列の３’末端に挿入される。
【００８１】
一態様では、Ｇａｇヌクレオチド配列に作動可能に連結した真核細胞プロモーターを含むレンチウイルスパッケージングプラスミドであって、Ｇａｇヌクレオチド配列は、ヌクレオカプシド（ＮＣ）コード配列およびマトリックスタンパク質（ＭＡ）コード配列を含み、ＮＣコード配列またはＭＡコード配列のうち一方または両方は、少なくとも１つの非ウイルス性アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）ヌクレオチド配列を含む、レンチウイルスパッケージングプラスミドが提供される。一部の場合には、パッケージングプラスミドは、機能的インテグラーゼタンパク質をコードしない。一部の場合には、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、ＮＣコード配列の第２のジンクフィンガードメインのすぐ下流の少なくとも１つの非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列を含む。このような場合には、ＮＣコード配列は、２つの機能的ジンクフィンガータンパク質ドメインおよび機能的天然プロテアーゼプロセシング配列を含み得る。ジンクフィンガータンパク質ドメインおよび天然プロテアーゼプロセシング配列の保持は、レンチウイルスパッケージングプラスミドから発現された改変されたＮＣ融合タンパク質が、機能的タンパク質に正しくプロセシングされることを確実にする。一部の場合には、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、ＭＡコード配列中に少なくとも１つの非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列を含む。
【００８２】
一部の場合には、プラスミドは、融合された２つまたはそれより多いアプタマー結合タンパク質を含む１つまたは複数のウイルスタンパク質をコードし得る。ある特定の場合には、レンチウイルスパッケージングプラスミドのＧａｇヌクレオチド配列は、ＮＣコード配列およびＭＡコード配列を含むことがあり、ＮＣコード配列またはＭＡコード配列の一方または両方は、第１の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列および第２の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列を含む。第１の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列および第２の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列は両方とも、同一のＡＢＰをコードし得る。あるいは、第１の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列および第２の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列は、異なるＡＢＰをコードする。一部の場合には、レンチウイルスパッケージングプラスミドのＧａｇヌクレオチド配列は、少なくとも１つの第１の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列を含むＮＣコード配列および少なくとも１つの第２の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列を含むＭＡコード配列を含み得る。少なくとも１つの第１の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列および少なくとも１つの第２の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列は両方とも、同一のＡＢＰをコードし得る。あるいは、少なくとも１つの第１の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列および少なくとも１つの第２の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列は、異なるＡＢＰをコードする。
【００８３】
ある特定の場合には、哺乳動物発現ベクターは、ＶＰＲコード配列またはＮＥＦコード配列をコードすることがあり、ＶＰＲコード配列またはＮＥＦコード配列は、第１の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列および第２の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列を含む。第１の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列および第２の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列は両方とも、同一のＡＢＰをコードし得る。あるいは、第１の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列および第２の非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列は、異なるＡＢＰをコードする。
【００８４】
非ウイルス性アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）ヌクレオチド配列は、ＲＮＡアプタマー配列に結合するポリペプチド配列をコードする。いくつかの非ウイルス性ＡＢＰは、本開示において使用するのに適している。特に、適したＡＢＰとして、ＲＮＡアプタマー配列と呼ばれるステム−ループ構造を形成するＲＮＡ配列に特異的に結合するバクテリオファージＲＮＡ結合タンパク質が挙げられる。例示的非ウイルス性アプタマー結合タンパク質として、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮペプチドおよびＣＯＭ（ｍｏｍの制御（Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｍｏｍ））タンパク質が挙げられる。ラムダＮペプチドは、タンパク質のＲＮＡ結合ドメインであるラムダＮタンパク質のアミノ酸１〜２２であり得る。一部の場合には、ＡＢＰは、二量体としてそのアプタマーに結合する。これらのＡＢＰおよびそれらが結合するアプタマー配列に関する情報は、以下の表１に提供されている。一部の実施形態では、少なくとも１つの非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列は、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４または配列番号１６のいずれかに示される配列を有するポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、少なくとも１つの非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３または配列番号１５のいずれかを含む。
表１．アプタマー結合タンパク質および対応するアプタマー配列
【表１】
2021522783.tif 000003
【００８５】
上記で論じられるように、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、種々のレンチウイルスタンパク質をコードし得る。一部の場合には、パッケージングプラスミドは、Ｇａｇヌクレオチド配列（遺伝子）、Ｐｏｌヌクレオチド配列（遺伝子）、Ｒｅｖヌクレオチド配列（遺伝子）およびＴａｔヌクレオチド配列（遺伝子）のみを含有し、第２世代パッケージングプラスミドと呼ばれることもある。一部の場合には、パッケージングプラスミドは、Ｇａｇヌクレオチド配列（遺伝子）およびＰｏｌヌクレオチド配列（遺伝子）のみを含有し、第３世代パッケージングプラスミドと呼ばれることもある。一部の場合には、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、ウイルス性シェル（カプシド）に必要なタンパク質のみをコードし得る。一部の場合には、１つまたは複数のレンチウイルスタンパク質のコード配列は、パッケージングプラスミドから全部または一部が除外され得る。例えば、一部の場合には、パッケージングプラスミドは、Ｇａｇヌクレオチド配列（遺伝子）のみを含有する。別の例では、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、Ｐｏｌヌクレオチド配列（遺伝子）のすべてまたは一部の欠失を含み得る。別の例では、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、インテグラーゼ（Ｉｎｔ）コード配列のすべてまたは一部の欠失を含み得る。別の例では、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、逆転写酵素（ＲＴ）コード配列のすべてまたは一部の欠失を含み得る。
【００８６】
本明細書において提供されるレンチウイルスパッケージングプラスミドの特性は、機能的インテグラーゼタンパク質をコードしないこともあるということである。パッケージングプラスミドが機能的インテグラーゼタンパク質をコードせず、本明細書において記載されているシステムおよび方法において使用される場合には、これらのパッケージングプラスミドを使用して産生されたレンチウイルス様粒子によって保持される核酸分子が、形質導入された真核細胞のゲノム中に組み込まれるリスクが実質的に低減される。一部の場合には、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、その中にインテグラーゼ不活性化突然変異を有するインテグラーゼコード配列を含む。例えば、インテグラーゼ不活性化突然変異は、インテグラーゼコード配列によってコードされるインテグラーゼタンパク質のアミノ酸６４位でのアスパラギン酸からバリンへの突然変異（Ｄ６４Ｖ）であり得る。一部の場合には、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、インテグラーゼコード配列のすべてまたは一部の欠失を含む。
【００８７】
レンチウイルスパッケージングプラスミドは、Ｇａｇヌクレオチド配列に作動可能に連結した真核細胞プロモーターを含む。哺乳動物発現プラスミドは、ＶＰＲコード配列またはＮＥＦコード配列に作動可能に連結した真核細胞プロモーターを含む。一部の場合には、真核細胞プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターである。ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター配列は、哺乳動物種から選択される。例えば、プロモーター配列は、２、３例を挙げると、ヒト、ウシ、ヒツジ、水牛、ブタまたはマウスから選択され得る。一部の例では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター配列は、ＣＭＶ、ＦＥ１αまたはＳＶ４０配列である。一部の例では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ配列は、改変されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ配列である。例えば、任意の哺乳動物種に由来する野生型ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するＲＮＡポリメラーゼＩＩ配列は、本明細書において提供される構築物において使用され得る。当業者ならば、２つのポリペプチドまたは核酸の同一性を決定する方法を容易に理解する。例えば、同一性は、２つの配列を、同一性がその最高レベルであるようにアラインした後に算出できる。同一性を算出する別の方法は、公開アルゴリズムによって実施できる。例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：  ４４３  （１９７０）のアルゴリズムを使用して、比較のための配列の最適アラインメントを実施できる。一部の場合には、真核細胞プロモーターは、誘導プロモーターである。
【００８８】
ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩプロモーターから転写されたコード配列は、コード配列の下流にポリ（Ａ）シグナルおよび転写ターミネーター配列を含む。よく使用される哺乳動物ターミネーター（ＳＶ４０、ｈＧＨ、ＢＧＨおよびｒｂＧｌｏｂ）は、ポリアデニル化および終結の両方を促進する配列モチーフＡＡＵＡＡＡを含む。ターミネーター、配列ベースのエレメントの役割は、転写単位（遺伝子など）の末端を定義し、転写機構から新規に合成されたＲＮＡを放出するプロセスを開始することである。ターミネーターは、転写されるべき遺伝子の下流に見られ、典型的には、ポリアデニル化またはポリ（Ａ）シグナルなどの任意の３’調節エレメントの直後に生じる。
【００８９】
一部の場合には、レンチウイルスパッケージングプラスミドは、発現カセットを含み得る。一部の場合には、哺乳動物発現プラスミドは、発現カセットを含み得る。
Ｂ．ＣＲＩＳＰＲシステム構成成分プラスミド
【００９０】
ＣＲＩＳＰＲ構成成分コード配列を、本開示のレンチウイルス様粒子を作製するために使用されている哺乳動物細胞中に送達するために使用される哺乳動物発現プラスミドが、本明細書において提供される。節ＩＩＡに記載されているレンチウイルスパッケージングプラスミドまたは哺乳動物発現プラスミドと一緒に、哺乳動物細胞中にひとたび導入されると、これらの哺乳動物発現プラスミドは、レンチウイルス様粒子中にパッケージングされる非ウイルス性ＣＲＩＳＰＲ構成成分ＲＮＡ分子を作製するための鋳型として作用する。一部の場合には、哺乳動物発現プラスミドは、レンチウイルストランスファーベクターである。レンチウイルストランスファーベクターは、一般に、目的の外因性遺伝子に加えてウイルスゲノムをコードする。一部の場合には、任意の哺乳動物発現プラスミドは、レンチウイルス様粒子を産生するために使用される細胞におけるＣＲＩＳＰＲ構成成分コード配列の発現に適したものであり得る。
【００９１】
本開示の一態様は、１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ構成成分のコード配列を含む哺乳動物発現プラスミドである。一部の場合には、ＣＲＩＳＰＲ構成成分コード配列は、少なくとも１つのアプタマー配列コード配列を含む。ＣＲＩＳＰＲ構成成分コード配列が哺乳動物発現ベクターから転写される場合には、アプタマー配列は同様に転写される。結果として得られる転写されたＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲ構成成分ＲＮＡ配列および少なくとも１つのアプタマー配列を含む。以下により詳細に論じられるように、ＣＲＩＳＰＲ構成成分コード配列は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列、ｇＲＮＡコード配列、または両方であり得る。一部の場合には、ＣＲＩＳＰＲ構成成分コード配列は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列であり得る。一部の場合には、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列の停止コドンの後ろであるが、任意のポリ（Ａ）シグナルおよび／または転写ターミネーターの前に少なくとも１つのアプタマーコード配列を含み得る。一部の場合には、ＣＲＩＳＰＲ構成成分コード配列は、ｇＲＮＡコード配列であり得る。一部の場合には、ｇＲＮＡコード配列は、少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む。一部の場合には、少なくとも１つのアプタマーコード配列は、ｇＲＮＡの５’末端または３’末端に配置され得る。一部の場合には、少なくとも１つのアプタマーコード配列は、ｇＲＮＡ内の内部位置に、例えば、フォールディングされたｇＲＮＡ中の形成されたループのうち１つまたは複数などに挿入され得る。例えば、ｇＲＮＡが、ＳａＣａｓ９タンパク質のためのものである場合には、少なくとも１つのアプタマーコード配列は、ｇＲＮＡのテトラループ、ステムループ２または３’末端に配置され得る。一部の場合には、アプタマー配列は、テトラループとして挿入される。
【００９２】
一部の場合には、ｇＲＮＡ配列に付着されるか、またはｇＲＮＡ配列中に挿入されるアプタマーコード配列は、ＭＳ２コートタンパク質配列に結合するアプタマー、ＰＰ７コートタンパク質に結合するアプタマー、ラムダＮペプチドに結合するアプタマーおよびＣＯＭタンパク質に結合するアプタマーからなる群から選択される。一部の場合には、アプタマーコード配列は、ＭＳ２コートタンパク質アプタマー配列、例えば、配列番号１７（ＲＮＡ）または配列番号１８（ＤＮＡ）である。一部の場合には、アプタマーコード配列は、ＰＰ７コートタンパク質アプタマー配列、例えば、配列番号１９（ＲＮＡ）または配列番号２０（ＤＮＡ）である。一部の場合には、アプタマーコード配列は、ラムダＮペプチドアプタマー配列、例えば、配列番号２１（ＲＮＡ）または配列番号２２（ＤＮＡ）である。一部の場合には、アプタマーコード配列は、ＣＯＭタンパク質タンパク質アプタマー配列、例えば、配列番号１７（ＲＮＡ）または配列番号１８（ＤＮＡ）である。
【００９３】
一部の場合には、哺乳動物発現プラスミドは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列およびｇＲＮＡコード配列を含む。一部の場合には、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列およびｇＲＮＡコード配列の各々は、少なくとも１つのアプタマーコード配列を含み得る。一部の場合には、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列は、その下流に少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む。一部の場合には、ｇＲＮＡコード配列は、少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む。一部の場合には、１〜３０ヌクレオチドのスペーサーは、ＣＲＩＳＰＲ構成成分コード配列と少なくとも１つのアプタマーコード配列との間に、または少なくとも１つのアプタマーコード配列に隣接して配置され得る。
【００９４】
本開示の一態様は、１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ構成成分のコード配列を含む哺乳動物発現プラスミドである。一部の場合には、ＣＲＩＳＰＲ構成成分コード配列は、少なくとも１つのアプタマー配列コード配列を含む。
【００９５】
全体を通して使用される、ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ部位特異的ヌクレアーゼ）と相互作用し、細胞のゲノム中の標的核酸（ゲノム標的配列）と特異的に結合するか、またはハイブリダイズし、その結果、ｓｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、細胞のゲノム中の標的核酸に共存する単一ガイドＲＮＡ配列である。各ｓｇＲＮＡは、ゲノム中の標的ＤＮＡ配列に特異的に結合するか、またはハイブリダイズする約１０〜５０ヌクレオチドの長さのＤＮＡ標的化配列またはプロトスペーサー配列を含む。例えば、ＤＮＡ標的化配列は、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０ヌクレオチドの長さであり得る。例えば、ＤＮＡ標的化配列は、約１５〜３０ヌクレオチド、約１５〜２５ヌクレオチド、約１０〜２５ヌクレオチドまたは約１８〜２３ヌクレオチドであり得る。一例では、ＤＮＡ標的化配列は、約２０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列を含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含まない。
【００９６】
一般に、ＤＮＡ標的化配列は、標的ＤＮＡ配列に対して補完する（例えば、完全に補完する）または実質的に補完する（例えば、１〜４つのミスマッチを有する）ように設計される。一部の例では、ＤＮＡ標的化配列は、複数の遺伝子エレメントに結合するためにゆらぎまたは縮重塩基を組み込むことができる。一部の例では、結合領域の３’または５’末端の１９ヌクレオチドは、標的遺伝子エレメント（単数または複数）に対して完全に相補的である。一部の例では、安定性を増大するために、結合領域を変更することができる。例えば、分解に対するＲＮＡ耐性を増大するために、非天然ヌクレオチドを組み込むことができる。一部の例では、結合領域における二次構造形成を避けるまたは低減するために、結合領域を変更または設計することができる。一部の例では、Ｇ−Ｃ含量を最適化するために、結合領域を設計できる。一部の例では、Ｇ−Ｃ含量は、好ましくは、約４０％から約６０％の間（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％）である。一部の例では、ｓｇＲＮＡの効率的な転写を促進する配列で始まるように、結合領域を選択できる。例えば、結合領域は、Ｇヌクレオチドで５’末端で始まり得る。一部の例では、結合領域は、改変されたヌクレオチド、例えば、制限するものではないが、メチル化またはリン酸化ヌクレオチドを含有し得る。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「相補的」または「相補性」という用語は、ヌクレオチドまたは核酸間の塩基対形成、例えば、制限するものではないが、ｓｇＲＮＡと標的配列との間の塩基対形成を指す。相補的ヌクレオチドは、一般に、ＡとＴ（またはＡとＵ）およびＧとＣである。本明細書において記載されているガイドＲＮＡは、ゲノム配列に対して完全に相補的または実質的に相補的である（例えば、１〜４のミスマッチを有する）配列、例えば、ＤＮＡ標的化配列を含み得る。
【００９８】
ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと相互作用するか、または結合するｓｇＲＮＡ定常領域を含む。本明細書において提供される構築物では、ｓｇＲＮＡの定常領域は、約７５〜２５０ヌクレオチドの長さであり得る。一部の例では、定常領域は、ステム、ステムループ、ヘアピン、ヘアピン間の領域、および／または定常領域のネクサス中に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多いヌクレオチド置換を含む改変された定常領域である。一部の場合には、改変された定常領域が由来する天然または野生型ｓｇＲＮＡ定常領域の活性と比較して、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の活性を有する改変された定常領域が、本明細書において記載されている構築物において使用され得る。特に、改変は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９ポリペプチドと直接相互作用するヌクレオチドで、または定常領域の二次構造にとって重要であるヌクレオチドで行われるべきではない。
［０００１］
本明細書において記載されているような哺乳動物発現プラスミドにコードされるＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとして、ＲＮＡ誘導型部位特異的ヌクレアーゼがある。例として、それだけには限らないが、ＩＩ型またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをコードする任意の細菌種に存在するヌクレアーゼが挙げられる。例えば、制限的ではないが、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ポリペプチド（ＩＩ型）またはＣｐｆ１ポリペプチド（Ｖ型）であり得る。例えば、Ａｂｕｄａｙｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１６  Ａｕｇｕｓｔ  ５；  ３５３（６２９９）：ａａｆ５５７３；Ｆｏｎｆａｒａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ５３２：  ５１７−５２１  （２０１６）、およびＺｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １６３（３）：  ｐ．７５９−７７１，  ２２  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１５を参照のこと。全体を通して使用される、「Ｃａｓ９ポリペプチド」という用語は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをコードする任意の細菌種において同定されたＣａｓ９タンパク質またはその断片もしくは誘導体を意味する。例えば、補足情報を含めて、その全文が参照により本明細書に組み込まれるＭａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ９：  ４６７−４７７  （２０１１）を参照のこと。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９およびＣａｓ９相同体は、それだけには限らないが、以下の分類学的グループの細菌：Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｑｕｉｆｉｃａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ−Ｃｈｌｏｒｏｂｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ−Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｃｈｌｒｏｆｌｅｘｉ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、ＳｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓおよびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａｅを含めた様々な真正細菌において見られる。例示的Ｃａｓ９タンパク質として、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９タンパク質（ＳｐＣａｓ９）がある。別の例示的Ｃａｓ９タンパク質として、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９タンパク質（ＳａＣａｓ９）がある。追加のＣａｓ９タンパク質およびその相同体は、例えば、Ｃｈｙｌｉｎｋｓｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＲＮＡ  Ｂｉｏｌ．  ２０１３  Ｍａｙ  １；  １０（５）：  ７２６−７３７；Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０１１  Ｊｕｎｅ；  ９（６）：  ４６７−４７７；Ｈｏｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ２０１３  Ｓｅｐ  ２４；１１０（３９）：１５６４４−９；Ｓａｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ．  ２０１３  Ｍａｙ  ９；４９７（７４４８）：２５４−７；およびＪｉｎｅｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２０１２  Ａｕｇ  １７；３３７（６０９６）：８１６−２１に記載されている。Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインは、宿主細胞における効率的な活性または安定性の増強のために最適化され得る。他のＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとして、Ｃｐｆ１（例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  Ｖｏｌｕｍｅ  １６３，  Ｉｓｓｕｅ  ３，  ｐ７５９−７７１，  ���２  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１５を参照のこと）およびその相同体が挙げられる。
【００９９】
全長Ｃａｓ９は、認識ドメインおよび２つのヌクレアーゼドメイン（それぞれ、ＨＮＨおよびＲｕｖＣ）を含むエンドヌクレアーゼであり、ＤＮＡ配列中に二本鎖切断を作出する。Ｃａｓ９のアミノ酸配列では、ＨＮＨは、直線的に連続しているが、ＲｕｖＣは、３つの領域、認識ドメインの左側の１つと、ＨＮＨドメインに隣接する認識ドメインの右側の他の２つにわかれている。Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９によって認識されるＮＧＧモチーフのすぐ前の２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列とハイブリダイズするガイドＲＮＡと相互作用することによって、細胞中のゲノム部位に標的化される。これは、細胞のゲノムＤＮＡ中に二本鎖切断をもたらす。一部の例では、ガイドＲＮＡによって標的化される領域のすぐ３’にＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を必要とするＣａｓ９ヌクレアーゼを利用できる。別の例として、直交性ＰＡＭモチーフ必要条件を有するＣａｓ９タンパク質を利用して、隣接ＮＧＧ  ＰＡＭ配列を有さない配列を標的化することができる。直交性ＰＡＭ配列特異性を有する例示的Ｃａｓ９タンパク質として、それだけには限らないが、Ｅｓｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０：  １１１６−１１２１  （２０１３）に記載されているものが挙げられる。
【０１００】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ガイドＲＮＡとの複合体の一部またはＤＮＡ鋳型との複合体の一部として標的核酸に結合している場合には、二本鎖切断が標的核酸中に導入されるように、活性エンドヌクレアーゼ形態であり得る。二本鎖切断は、ランダム突然変異を導入するＮＨＥＪ、または特異的突然変異を導入するＨＤＲによって修復され得る。種々のＣａｓ９ヌクレアーゼを、本明細書において記載されている方法で利用できる。例えば、ガイドＲＮＡによって標的化される領域のすぐ３’にＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を必要とするＣａｓ９ヌクレアーゼ、例えば、ＳｐＣａｓ９を利用できる。このようなＣａｓ９ヌクレアーゼは、ＮＧＧ配列を含有するゲノムの任意の領域に標的化され得る。別の例では、ガイドＲＮＡによって標的化される領域のすぐ３’にＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲ（Ｎ）ＰＡＭを必要とするＣａｓ９ヌクレアーゼ、例えば、ＳａＣａｓ９を利用できる。別の例として、直交性ＰＡＭモチーフ必要条件を有するＣａｓ９タンパク質を利用して、隣接ＮＧＧ  ＰＡＭ配列を有さない配列を標的化することができる。直交性ＰＡＭ配列特異性を有する例示的Ｃａｓ９タンパク質として、それだけには限らないが、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０，  １１１６−１１２１  （２０１３）に記載されているもの、およびＺｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  Ｖｏｌｕｍｅ  １６３，  Ｉｓｓｕｅ  ３，  ｐ７５９−７７１，  ２２  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１５に記載されているものが挙げられる。
【０１０１】
一部の例では、Ｃａｓ９タンパク質は、ニッカーゼであり、その結果、ガイドＲＮＡとの複合体の一部として標的核酸に結合している場合には、一本鎖切断またはニックが標的核酸中に導入される。各々構造的に異なるガイドＲＮＡに結合した一対のＣａｓ９ニッカーゼは、標的ゲノム領域の２つの近位部位に標的化され、したがって、標的ゲノム領域中に一対の近位一本鎖切断を導入できる。オフターゲット効果は、一般に塩基除去修復機序による損傷を伴わずに修復される単一ニックをもたらす可能性が高いので、ニッカーゼ対は、特異性の増強を提供できる。例示的Ｃａｓ９ニッカーゼとして、Ｄ１０ＡまたはＨ８４０Ａ突然変異を有するＣａｓ９ヌクレアーゼが挙げられる。
【０１０２】
一部の場合には、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、非活性化部位特異的ヌクレアーゼである。例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ｄＣａｓ９ポリペプチドであり得る。本開示全体を通して使用される、ｄＣａｓ９ポリペプチドは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を不活性化するように改変されている、非活性化型またはヌクレアーゼデッド型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。改変は、それだけには限らないが、１つまたは複数のアミノ酸を変更して、ヌクレアーゼ活性またはヌクレアーゼドメインを不活性化することを含む。例えば、制限的ではないが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９においてＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａ突然変異を作製して、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を不活性化することができる。他の改変は、ヌクレアーゼ活性を示す配列がＣａｓ９に存在しないように、Ｃａｓ９のヌクレアーゼドメインのすべてまたは一部を除去することを含む。したがって、ｄＣａｓ９は、ヌクレアーゼ活性を不活性化するように改変されたポリペプチド配列、またはヌクレアーゼ活性を不活性化するポリペプチド配列（単数または複数）の除去を含み得る。ｄＣａｓ９は、ヌクレアーゼ活性は不活性化されているが、ＤＮＡに結合する能力を保持している。したがって、ｄＣａｓ９は、ＤＮＡ結合に必要なポリペプチド配列（単数または複数）を含むが、改変されたヌクレアーゼ配列を含むか、またはヌクレアーゼ活性に関与するヌクレアーゼ配列を欠く。他の部位特異的ヌクレアーゼにおいて、例えば、Ｃｐｆ１またはＣ２ｃ２において、同様の改変を行って、ヌクレアーゼ活性を不活性化できるということが理解される。一部の例では、ｄＣａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインおよび／またはＨＮＨヌクレアーゼドメインのポリペプチド配列を欠き、ＤＮＡ結合機能を保持するＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の全長Ｃａｓ９配列である。他の例では、ｄＣａｓ９タンパク質配列は、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインおよび／またはＨＮＨヌクレアーゼドメインを欠き、ＤＮＡ結合機能を保持するＣａｓ９ポリペプチド配列に対して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１０３】
一部の例では、非活性化ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、エフェクタータンパク質に連結されている。必要に応じて、部位特異的ヌクレアーゼは、ペプチドリンカーを介してエフェクタータンパク質に連結されている。リンカーは、約２から約２５個のアミノ酸長であり得る。エフェクタータンパク質は、転写調節タンパク質またはその活性断片であり得る。転写調節タンパク質は、転写アクチベーターもしくは転写レプレッサータンパク質、またはアクチベータータンパク質もしくは阻害剤タンパク質のタンパク質ドメインであり得る。転写アクチベーターの例として、それだけには限らないが、ＶＰ１６、ＶＰ４８、ＶＰ６４、ＶＰ１９２、ＭｙｏＤ、Ｅ２Ａ、ＣＲＥＢ、ＫＭＴ２Ａ、ＮＦ−ＫＢ（ｐ６５ＡＤ）、ＮＦＡＴ、ＴＥＴ１、ｐ３００Ｃｏｒｅおよびｐ５３が挙げられる。転写阻害剤の例として、それだけには限らないが、ＫＲＡＢ、ＭＸＩ１、ＳＩＤ４Ｘ、ＬＳＤ１およびＤＮＭＴ３Ａ／Ｂが挙げられる。エフェクタータンパク質はまた、例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、ＤＮＡメチラーゼなどといったエピゲノムエディターでもあり得る。エフェクタータンパク質またはその活性断片は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に順次に作動可能に連結され得る。必要に応じて、２つまたはそれより多い活性化エフェクタータンパク質またはその活性ドメインが、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に作動可能に連結されてもよい。必要に応じて、２つまたはそれより多いレプレッサーエフェクタータンパク質またはその活性ドメインが、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に順次に作動可能に連結されてもよい。必要に応じて、エフェクタータンパク質は、必ずしもＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼに共有結合によって連結される必要はなく、ヌクレアーゼと会合、接合またはそうでなければ接続されてもよい。
【０１０４】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１ポリペプチドである。Ｃｐｆ１タンパク質は、ＩＩ型、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質である。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９（ｓｐＣａｓ９など）よりも小さく、より簡単なエンドヌクレアーゼである。Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインと同様であるが、ＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを有さないＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを有する。Ｃｐｆ１のＮ末端ドメインはまた、Ｃａｓ９タンパク質のようなアルファへリックス認識ローブを有さない。ＤＮＡを切断する場合は、Ｃｐｆ１が、４または５ヌクレオチドオーバーハングを有する付着末端様ＤＮＡ二本鎖切断を導入する。Ｃｐｆ１タンパク質は、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とせず、むしろ、Ｃｐｆ１タンパク質は、ｃｒＲＮＡのみとともに機能する。本開示に関連して、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがＣｐｆ１タンパク質である場合には、ｓｇＲＮＡはｔｒａｃｒ配列を含まない。Ｃｐｆ１タンパク質とともに使用されるｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列（定常領域）のみを含み得る。一部の例では、ガイドＲＮＡによって標的化される領域のすぐ５’にＴＴＴＮまたはＴＴＮ  ＰＡＭ（「Ｎ」が核酸塩基である種に応じて）を必要とするＣｐｆ１タンパク質を利用できる。公知のＣｐｆ１タンパク質およびその誘導体を、本開示に関連して使用してもよい。例えば、一部の場合には、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ＦｎＣｐｆ１ｐであり、ＰＡＭは、５’ＴＴＮ（ここで、Ｎは、Ａ／Ｃ／ＧまたはＴである）である。一部の場合には、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ＰａＣｐｆ１ｐであり、ＰＡＭは、５’ＴＴＴＶ（ここで、Ｖは、Ａ／ＣまたはＧである）である。ある特定の場合には、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ＦｎＣｐｆ１ｐであり、ＰＡＭは、５’ＴＴＮ（ここで、Ｎは、Ａ／Ｃ／ＧまたはＴである）であり、ＰＡＭは、プロトスペーサーの５’末端の上流に位置する。ある特定の場合には、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ＦｎＣｐｆ１ｐであり、ＰＡＭは、５’ＣＴＡであり、プロトスペーサーの５’末端の上流または標的遺伝子座に位置する。一例では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ＡｓＣｐｆ１ｐであり、ＰＡＭは、５’ＴＴＴＮである。
【０１０５】
哺乳動物発現プラスミドは、非ウイルス性核酸配列に作動可能に連結した真核細胞プロモーターを含む。一部の場合には、真核細胞プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターであり、非ウイルス性核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列である。他の場合には、真核細胞プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターであり、非ウイルス性核酸配列は、ｇＲＮＡコード配列である。一部の場合には、非ウイルス性核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列およびｇＲＮＡコード配列の両方を含み、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列に作動可能に連結しており、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、ｇＲＮＡコード配列に作動可能に連結している。
【０１０６】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター配列は、哺乳動物種から選択される。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター配列は、哺乳動物種から選択される。例えば、これらのプロモーター配列は、２、３例を挙げると、ヒト、ウシ、ヒツジ、水牛、ブタまたはマウスから選択され得る。一部の例では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター配列は、ＣＭＶ、ＦＥ１αまたはＳＶ４０配列である。一部の例では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター配列は、Ｕ６またはＨ１配列である。一部の例では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ配列は、改変されたＲＮＡポリメラーゼＩＩ配列である。例えば、任意の哺乳動物種に由来する野生型ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するＲＮＡポリメラーゼＩＩ配列は、本明細書において提供される構築物において使用され得る。一部の例では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ配列は、改変されたＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ配列である。例えば、任意の哺乳動物種に由来する野生型ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ配列は、本明細書において提供される構築物において使用され得る。当業者ならば、２つのポリペプチドまたは核酸の同一性を決定する方法を容易に理解する。例えば、同一性は、２つの配列を、同一性がその最高レベルであるようにアラインした後に算出できる。同一性を算出する別の方法は、公開アルゴリズムによって実施できる。例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：  ４４３  （１９７０）のアルゴリズムを使用して、比較のための配列の最適アラインメントを実施できる。一部の場合には、真核細胞プロモーターは、誘導プロモーターである。
【０１０７】
ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩプロモーターから転写されたコード配列は、コード配列の下流にポリ（Ａ）シグナルおよび転写ターミネーター配列を含む。よく使用される哺乳動物ターミネーター（ＳＶ４０、ｈＧＨ、ＢＧＨおよびｒｂＧｌｏｂ）は、ポリアデニル化および終結の両方を促進する配列モチーフＡＡＵＡＡＡを含む。ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターから転写されたコード配列は、ターミネーター配列としてコード配列の下流にＴ残基の単純な実行を含む。ターミネーター、配列ベースのエレメントの役割は、転写単位（遺伝子など）の末端を定義し、転写機構から新規に合成されたＲＮＡを放出するプロセスを開始することである。ターミネーターは、転写されるべき遺伝子の下流に見られ、典型的には、ポリアデニル化またはポリ（Ａ）シグナルなどの任意の３’調節エレメントの直後に生じる。
【０１０８】
一部の場合には、哺乳動物発現ベクターは、アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）が特異的に結合するアプタマー配列をコードする少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む。本開示に関連して、アプタマー配列は、ＡＢＰが特異的に結合する三次ループ構造を形成するＲＮＡ配列である。ＡＢＰは、ＲＮＡ結合タンパク質またはＲＮＡ結合タンパク質ドメインである。適したアプタマーコード配列は、公知のバクテリオファージアプタマー配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む。例示的アプタマーコード配列として、表１において上記で提供されるアプタマー配列をコードするものが挙げられる。一部の場合には、アプタマーには、ＡＢＰの二量体が結合している。これらのアプタマー配列は、バクテリオファージタンパク質が特異的に結合することが知られているＲＮＡ配列である。一部の状況では、少なくとも１つのアプタマーコード配列は、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮ  ＲＮＡ結合ドメインまたはＣＯＭタンパク質からなる群から選択されるＡＢＰが特異的に結合するアプタマー配列をコードする。
【０１０９】
一部の場合には、哺乳動物発現ベクターは、その下流に１つのアプタマーコード配列を含むＣＲＩＳＰＲ構成成分コード配列を含む。他の場合には、ＣＲＩＳＰＲ構成成分コード配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のアプタマーコード配列を含み得る。例えば、一部の場合には、ＣＲＩＳＰＲ構成成分コード配列は、タンデムに２つのアプタマーコード配列を含み得る。哺乳動物発現ベクターが、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列およびｇＲＮＡコード配列の両方を含む場合には、いずれかまたは両方が、１つまたは複数のアプタマーコード配列を含み得る。一例では、ベクターが、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列およびｇＲＮＡコード配列の両方を含む場合には、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列は、１つまたは複数のアプタマーコード配列を含み得る。別の例では、ベクターが、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列およびｇＲＮＡコード配列の両方を含む場合には、ｇＲＮＡコード配列は、１つまたは複数のアプタマーコード配列を含み得る。別の例では、ベクターが、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列およびｇＲＮＡコード配列の両方を含む場合には、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列およびｇＲＮＡコード配列の両方は、１つまたは複数のアプタマーコード配列を各々含み得る。ベクターが、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列およびｇＲＮＡコード配列の両方を含む場合には、両者は、１つまたは複数のアプタマーコード配列を含み、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列の１つまたは複数のアプタマーコード配列およびｇＲＮＡコード配列の１つまたは複数のアプタマーコード配列は、同一のアプタマーコード配列である場合も、異なるアプタマーコード配列である場合もある。一部の場合には、哺乳動物発現プラスミドは、ＣＲＩＳＰＲ構成成分コード配列を含み、ＣＲＩＳＰＲ構成成分コード配列は、アプタマーコード配列を含まない。
【０１１０】
一部の場合には、哺乳動物発現プラスミドは、少なくとも１つの第１のアプタマーコード配列を含むＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列および少なくとも１つの第２のアプタマーコード配列を含むｇＲＮＡコード配列を含む。一例では、少なくとも１つの第１のアプタマーコード配列および少なくとも１つの第２のコーディングアプタマー配列は、同一のアプタマーコード配列である。一部の場合には、少なくとも１つの第１のアプタマーコード配列は、第１のＡＢＰが特異的に結合するアプタマー配列をコードし、少なくとも１つの第２のアプタマーコード配列は、第２のＡＢＰが特異的に結合するアプタマー配列をコードし、少なくとも１つの第１のアプタマーコード配列および少なくとも１つの第２のアプタマーコード配列は、異なる第１および第２のＡＢＰが結合するアプタマー配列をコードする。例えば、少なくとも１つの第１のアプタマーコード配列および少なくとも１つの第２のアプタマーコード配列は、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮタンパク質ＲＮＡ結合ドメインおよびＣＯＭタンパク質からなる群から選択されるＡＢＰが特異的に結合するアプタマー配列をコードし得る。別の例では、少なくとも１つの第１のアプタマーコード配列および少なくとも１つの第２のアプタマーコード配列は、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮタンパク質ＲＮＡ結合ドメインおよびＣＯＭタンパク質からなる群から選択される異なるＡＢＰが各々特異的に結合するアプタマー配列をコードし得る。
【０１１１】
一部の場合には、哺乳動物発現プラスミドはまた、ＣＲＩＳＰＲ構成成分コード配列の下流、またはＣＲＩＳＰＲ構成成分コード配列の下流に配置される場合にはアプタマーコード配列の下流に配置されるＲＮＡ安定化配列をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列も含み得る。ＲＮＡ安定化配列をコードするポリヌクレオチド配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム構成成分コード配列の下流で転写され、転写されたＲＮＡ配列の長寿命を安定化する。一例では、ＲＮＡ安定化配列をコードするポリヌクレオチド配列は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列の下流に配置される。別の例では、ＲＮＡ安定化配列をコードするポリヌクレオチド配列は、ｇＲＮＡコード配列の下流に配置される。例示的ＲＮＡ安定化配列として、配列番号２５（ＤＮＡ）および配列番号２６（ＲＮＡ）に示されるようなヒトベータグロビン遺伝子の３’ＵＴＲの配列がある。他のＲＮＡ安定化配列は、Ｈａｙａｓｈｉ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ２３９（７）：２０３４−２０４０  （２０１０）およびＮｅｗｂｕｒｙ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ４８（２）：２９７−３１０  （１９８７）に記載されている。一部の場合には、１〜３０ヌクレオチドのスペーサーが、ＣＲＩＳＰＲ構成成分コード配列と、ＲＮＡ安定化配列をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列との間に配置される場合もある。
【０１１２】
一部の場合には、哺乳動物発現プラスミドは、発現カセットを含み得る。一部の場合には、哺乳動物発現プラスミドはまた、レポーター遺伝子も含み得る。
ＩＩＩ．システム
【０１１３】
本開示の別の態様は、レンチウイルスパッケージングシステムである。このようなシステムは、本開示に記載されているレンチウイルスパッケージングプラスミドおよび哺乳動物発現プラスミドを含む。これらのシステムは、哺乳動物細胞中に導入して、本開示に記載されているレンチウイルス様粒子を作製するための構成成分の提供において有用である。
【０１１４】
一部の場合には、システムは、Ｇａｇヌクレオチド配列に作動可能に連結した真核細胞プロモーターを含むレンチウイルスパッケージングプラスミドを含み、Ｇａｇヌクレオチド配列は、ヌクレオカプシド（ＮＣ）コード配列およびマトリックスタンパク質（ＭＡ）コード配列を含み、ＮＣコード配列またはＭＡコード配列の一方または両方は、少なくとも１つの非ウイルス性アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）ヌクレオチド配列を含み、パッケージングプラスミドは、機能的インテグラーゼタンパク質をコードしない。レンチウイルスパッケージングプラスミドは、節ＩＩ．Ａにおいて上記で記載されている立体配置のいずれかを有し得る。システムは、第２世代パッケージングプラスミドもしくは第３世代パッケージングプラスミド、またはそれらの改変されたバージョンを含み得る。一部の場合には、パッケージングプラスミドは、上記のようなＧａｇヌクレオチド配列を含み、Ｒｅｖヌクレオチド配列およびＴａｔヌクレオチド配列をさらに含む。他の場合には、システムは、上記のようなＧａｇヌクレオチド配列を含む第１のパッケージングプラスミドおよびＲｅｖヌクレオチド配列を含む第２のパッケージングプラスミドを含む。パッケージングプラスミドの各々では、ウイルスタンパク質コード配列は、真核細胞プロモーターに、例えば、各々個別に、または、複数のタンパク質コード配列に対して１つのプロモーターに作動可能に連結している。
【０１１５】
他の場合には、システムは、ＮＥＦコード配列またはＶＰＲコード配列に作動可能に連結した真核細胞プロモーターを含む哺乳動物発現プラスミドを含み、ＮＥＦコード配列またはＶＰＲコード配列は、少なくとも１つの非ウイルス性ＡＢＰヌクレオチド配列を含む。哺乳動物発現プラスミドは、節ＩＩ．Ａにおいて上記で記載されている立体配置のいずれかを有し得る。システムは、第２世代パッケージングプラスミドもしくは第３世代パッケージングプラスミドまたはその改変されたバージョンを含み得る。一部の場合には、パッケージングプラスミドは、Ｇａｇヌクレオチド配列、Ｒｅｖヌクレオチド配列およびＴａｔヌクレオチド配列を含む。他の場合には、システムは、Ｇａｇヌクレオチド配列を含む第１のパッケージングプラスミドおよびＲｅｖヌクレオチド配列を含む第２のパッケージングプラスミドを含む。
【０１１６】
システムはまた、非ウイルス性核酸配列に作動可能に連結した真核細胞プロモーターを含む少なくとも１つの哺乳動物発現プラスミドを含むことができ、非ウイルス性核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）コード配列、またはＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列およびｇＲＮＡコード配列の両方を含む。哺乳動物発現プラスミドは、節ＩＩ．Ｂにおいて上記で記載されている立体配置のいずれかを有し得る。一部の場合には、システムは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列に作動可能に連結した真核細胞プロモーターおよびｇＲＮＡコード配列に作動可能に連結した真核細胞プロモーターを含む哺乳動物発現プラスミドを含む。他の場合には、システムは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列に作動可能に連結した真核細胞プロモーターを含む第１の哺乳動物発現プラスミドおよびｇＲＮＡコード配列に作動可能に連結した真核細胞プロモーターを含む第２の哺乳動物発現プラスミドを含む。一部の場合には、少なくとも１つの哺乳動物発現プラスミド中の非ウイルス性核酸は、アプタマー配列を含まない。他の場合には、少なくとも１つの哺乳動物発現プラスミド中の非ウイルス性核酸は、少なくとも１つのアプタマー配列を含む。
【０１１７】
システムはまた、ウイルス性エンベロープ糖タンパク質をコードするエンベロープコード配列を有するエンベローププラスミドも含み得る。例えば、Ｅｎｖヌクレオチド配列は、ＶＳＶ−Ｇをコードし得る。エンベロープコード配列は、真核細胞プロモーターに作動可能に連結している。一部の場合には、真核細胞プロモーターは、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩプロモーターである。適切な真核細胞プロモーターは、節ＩＩに記載されている。
【０１１８】
また、本開示に記載されているシステムの構成成分を含むキットも本明細書において提供される。一部の実施形態では、キットは、本明細書において記載されているプラスミドのうち１つまたは複数を含む。
ＩＶ．レンチウイルス様粒子の産生
【０１１９】
本開示に記載されているプラスミドおよびシステムを使用してレンチウイルス様粒子を産生する方法が、本明細書において提供される。
【０１２０】
一態様では、レンチウイルス粒子を産生する方法であって、節ＩＩおよびＩＩＩにおいて上記で記載されているようなパッケージングプラスミド、少なくとも１つの哺乳動物発現プラスミドおよびエンベローププラスミドを複数の真核細胞にトランスフェクトするステップと、トランスフェクトされた真核細胞を、レンチウイルス粒子が産生されるのに十分な時間培養するステップとを含む方法が提供される。方法は、第２世代パッケージングプラスミドまたは第３世代パッケージングプラスミドを用い得る。一部の場合には、節ＩＩＩに記載されているような第１および第２のパッケージングプラスミドが使用される。複数の真核細胞が、哺乳動物細胞であり得る。例えば、哺乳動物細胞は、２９３ヒト胚性腎臓細胞または別の適した哺乳動物発現細胞系であり得る。
【０１２１】
一部の場合には、ウイルスタンパク質コード配列、例えば、ＮＣコード配列、ＭＡコード配列、または両方との融合は、ウイルス性融合タンパク質をコードするプラスミド、非ウイルス性ヌクレオチド配列をコードする少なくとも１つの哺乳動物発現プラスミドおよびエンベローププラスミドが、真核細胞にトランスフェクトされる場合に、１つまたは複数のＡＢＰヌクレオチド配列が、ウイルス粒子組み立てに干渉しない。一部の場合には、ＮＣ−ＡＢＰ融合タンパク質、ＭＡ−ＡＢＰ融合タンパク質、またはＮＣ−ＡＢＰ融合タンパク質およびＭＡ−ＡＢＰ融合タンパク質の両方をコードするレンチウイルスパッケージングプラスミドは、ウイルス粒子組み立てに干渉しない。一部の場合には、ＮＥＦ−ＡＢＰ融合タンパク質またはＶＰＲ−ＡＢＰ融合タンパク質のいずれかをコードする哺乳動物発現プラスミドは、ウイルス粒子組み立てに干渉しない。
【０１２２】
真核細胞にトランスフェクトするために使用されるプラスミドに応じて、異なるレンチウイルス様粒子が、提供されている方法によって産生される。一部の場合には、真核細胞に、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列を含有する哺乳動物発現プラスミドがトランスフェクトされる。このプラスミドがトランスフェクトされた細胞は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡを含有するレンチウイルス様粒子を産生する。一部の場合には、真核細胞に、ｇＲＮＡコード配列を含有する哺乳動物発現プラスミドがトランスフェクトされる。このプラスミドがトランスフェクトされた細胞は、ｇＲＮＡを含有するレンチウイルス様粒子を産生する。一部の場合には、細胞に、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列を含有する第１の哺乳動物発現プラスミドおよびｇＲＮＡコード配列を含有する第２の哺乳動物発現プラスミドがトランスフェクトされ得る。これらのプラスミドがトランスフェクトされた細胞は、ＣＲＩＳＰＲ  ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの両方を含有するレンチウイルス様粒子を産生する。一部の場合には、細胞に、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列およびｇＲＮＡコード配列を含有する哺乳動物発現プラスミドがトランスフェクトされ得る。このプラスミドがトランスフェクトされた細胞は、ＣＲＩＳＰＲ  ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの両方を含有するレンチウイルス様粒子を産生する。
【０１２３】
一般に、真核細胞にプラスミドが同時にトランスフェクトされ、細胞は、インキュベートすることが許され、次いで、ウイルス様粒子を含有する上清が回収される。培地は、トランスフェクション後、インキュベーションの前に変更され得る。回収されたウイルス様粒子は、保存され、粒子を濃縮するために遠心分離され得る。レンチウイルス粒子を作製するために日常的な細胞トランスフェクション法が使用される。次いで、粗または濃縮ウイルス様粒子を使用して、目的の細胞に形質導入できる。ウイルス性力価もまた、公知のプロトコールを使用して決定できる。
【０１２４】
提供されている方法の特性として、レンチウイルス様粒子内にパッケージングできる非ウイルス性ＲＮＡ分子の量がある。天然レンチウイルスでは、ウイルスシェル（カプシド）は、一本鎖ＲＮＡゲノムの２つのコピーを含有する。例えば、野生型ＨＩＶ−１ウイルス粒子は、およそ９．７ｋｂの一本鎖ＲＮＡゲノムの２つのコピーを含有する。本開示によって提供される方法では、ウイルスシェル内に多数の非ウイルス性ＲＮＡ分子がパッケージングされ得る。一部の場合には、方法は、最大１００の非ウイルス性ＲＮＡ分子を含有するレンチウイルス様粒子を産生し得る。例えば、レンチウイルス様粒子は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００の非ウイルス性ＲＮＡ分子を含有し得る。例えば、方法は、５〜２５の非ウイルス性ＲＮＡ分子、２５〜５０の非ウイルス性ＲＮＡ分子、５０〜７５の非ウイルス性ＲＮＡ分子または７５〜１００の非ウイルス性ＲＮＡ分子を含有する粒子を産生し得る。例えば、方法は、およそ５０〜１００の非ウイルス性ＲＮＡ分子を含有する粒子を産生し得る。一部の場合には、方法は、最大１００コピーのＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡ（例えば、ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡなど）を含有する粒子を産生し得る。一部の場合には、方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡ、ｇＲＮＡまたはその組合せのいくつかのコピーを含有するレンチウイルス様粒子を産生し得る。一部の場合には、方法において使用される哺乳動物発現プラスミドは、少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む非ウイルス性核酸配列を含み得る。他の場合には、方法において使用される哺乳動物発現プラスミドは、少なくとも１つのアプタマー配列を含まない非ウイルス性核酸配列を含有し得る。一部の場合には、哺乳動物発現プラスミドは、非ウイルス性ＲＮＡ分子のいくつかのコピーを含有するレンチウイルス粒子を生成する非ウイルス性核酸配列の下流にアプタマーコード配列を必要としない。
【０１２５】
一部の場合には、哺乳動物発現プラスミドは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡをコードする非ウイルス性核酸配列を含有し、アプタマーコード配列は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡをコードする核酸に付着している。本明細書において記載されているウイルス性融合タンパク質中のアプタマー配列とアプタマー結合タンパク質との間の相互作用は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡのレンチウイルス粒子へのパッケージングを促進する。一部の場合には、哺乳動物発現プラスミドは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡおよびｇＲＮＡをコードする非ウイルス性核酸配列を含有し、アプタマーコード配列は、ｇＲＮＡに付着されるか、またはｇＲＮＡ中に挿入される。本明細書において記載されているウイルス性融合タンパク質中の、ｇＲＮＡに付着されるか、またはｇＲＮＡ中に挿入されたアプタマー配列と、アプタマー結合タンパク質との相互作用は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（ＲＮＰ）と複合体形成されたｇＲＮＡの、レンチウイルス粒子へのパッケージングを促進する。
Ｖ．レンチウイルス様粒子
【０１２６】
別の態様では、レンチウイルス様粒子が提供される。レンチウイルス様粒子は、少なくとも１つのアプタマー結合タンパク質が、１つまたは複数のウイルスタンパク質に融合されている融合タンパク質である改変されたレンチウイルスタンパク質を含有する。本開示に関連して、改変されたウイルスタンパク質は、構造性である場合も、非構造性である場合もある。例示的構造タンパク質として、レンチウイルスヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質およびマトリックス（ＭＡ）タンパク質がある。例示的非構造タンパク質として、ウイルスタンパク質Ｒ（ＶＰＲ）およびネガティブ調節因子（ＮＥＦ）がある。一部の場合には、粒子は、ＮＣタンパク質およびＭＡタンパク質を含み、その一方または両方が、少なくとも１つの非ウイルス性アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）と融合している融合タンパク質を含有する。粒子のＮＣタンパク質は、２つの機能的ジンクフィンガータンパク質ドメインを有し得る。特に、第２のＮＣジンクフィンガードメインの保持は、ウイルス性組み立ておよび出芽の効率を保ち得る。一部の場合には、粒子は、ＶＰＲタンパク質またはＮＥＦタンパク質を含む融合タンパク質を含有し、ＶＰＲタンパク質またはＮＥＦタンパク質は、少なくとも１つの非ウイルス性ＡＢＰと融合している。粒子はまた、少なくとも１つの非ウイルス性ＲＮＡ配列を含有し、非ウイルス性ＲＮＡ配列は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、またはＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの両方を含む。一部の場合には、レンチウイルス様粒子は、機能的インテグラーゼタンパク質を含有しない。これらのウイルス様粒子は、目的の真核細胞に形質導入するのに有用である。
【０１２７】
粒子は、１つまたは複数のＡＢＰを含むウイルス性融合タンパク質を含み得る。一部の場合には、粒子は、ＮＣタンパク質、ＭＡタンパク質、または両方を含有し、ＮＣタンパク質またはＭＡタンパク質の一方または両方は、１つまたは複数の非ウイルス性ＡＢＰと融合している。一部の場合には、レンチウイルス様粒子は、少なくとも１つの非ウイルス性ＡＢＰと融合しているＮＣタンパク質を含む。一部の場合には、レンチウイルス様粒子は、少なくとも１つの非ウイルス性ＡＢＰと融合しているＭＡタンパク質を含む。一部の場合には、レンチウイルス様粒子は、ＮＣタンパク質およびＭＡタンパク質を含むことができ、ＮＣタンパク質またはＭＡタンパク質のうち一方または両方は、２つの非ウイルス性ＡＢＰタンパク質、第１の非ウイルス性ＡＢＰと、第１の非ウイルス性ＡＢＰのＣ末端に融合された第２の非ウイルス性ＡＢＰ（すなわち、タンデムの）と融合され得る。ある特定の場合には、粒子は、第１の非ウイルス性ＡＢＰおよび第２の非ウイルス性ＡＢＰと融合しているＮＣタンパク質またはＭＡタンパク質の一方または両方を含有し得る。一部の場合には、レンチウイルス様粒子は、ＶＰＲタンパク質またはＮＥＦタンパク質を含有し、ＶＰＲタンパク質またはＮＥＦタンパク質は、１つまたは複数の非ウイルス性ＡＢＰと融合している。一部の場合には、レンチウイルス様粒子は、２つの非ウイルス性ＡＢＰ、第１の非ウイルス性ＡＢＰと、第１の非ウイルス性ＡＢＰのＣ末端に融合された第２の非ウイルス性ＡＢＰ（すなわち、タンデムの）に融合されたＶＰＲタンパク質またはＮＥＦタンパク質を含有する。一部の場合には、レンチウイルス様粒子は、第１の非ウイルス性ＡＢＰおよび第２の非ウイルス性ＡＢＰに融合されたＶＰＲタンパク質またはＮＥＦタンパク質を含有する。第１の非ウイルス性ＡＢＰおよび第２の非ウイルス性ＡＢＰは両方とも、同一のＡＢＰであり得る。あるいは、第１の非ウイルス性ＡＢＰおよび第２の非ウイルス性ＡＢＰは、異なるＡＢＰであり得る。一部の場合には、レンチウイルス様粒子は、Ｃ末端に融合された少なくとも１つの第２の非ウイルス性ＡＢＰを有するＭＡタンパク質に融合された、少なくとも１つの第１の非ウイルス性ＡＢＰを有するＮＣタンパク質を含み得る。少なくとも１つの第１の非ウイルス性ＡＢＰおよび少なくとも１つの第２の非ウイルス性ＡＢＰは両方とも、同一のＡＢＰである。あるいは、少なくとも１つの第１の非ウイルス性ＡＢＰタンパク質および少なくとも１つの第２の非ウイルス性ＡＢＰは、異なるＡＢＰであり得る。第１の非ウイルス性ＡＢＰおよび第２の非ウイルス性ＡＢＰは両方とも、同一のＡＢＰであり得る。あるいは、第１の非ウイルス性ＡＢＰおよび第２の非ウイルス性ＡＢＰは、異なるＡＢＰであり得る。
【０１２８】
非ウイルス性ＡＢＰは、ＲＮＡアプタマー配列に結合するポリペプチド配列である。いくつかの非ウイルス性ＡＢＰは、本開示における使用に適している。特に、適したＡＢＰとして、ステム−ループ構造を形成するＲＮＡ配列である公知のＲＮＡアプタマー配列と特異的に結合する、バクテリオファージＲＮＡ結合タンパク質が挙げられる。例示的非ウイルス性アプタマー結合タンパク質として、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮペプチドおよびＣＯＭ（ｍｏｍの制御（Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｍｏｍ））タンパク質が挙げられる。ラムダＮペプチドは、タンパク質のＲＮＡ結合ドメインであるラムダＮタンパク質のアミノ酸１〜２２であり得る。これらのＡＢＰおよびそれらが結合するアプタマー配列に関する情報は、表１において上記で提供されている。一部の実施形態では、少なくとも１つの非ウイルス性ＡＢＰタンパク質は、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４または配列番号１６のいずれかに示される配列を有するポリペプチドである。
【０１２９】
レンチウイルス様粒子は、種々のレンチウイルスタンパク質を含み得る。しかし、一部の場合には、レンチウイルス様粒子は、天然レンチウイルスに見られるタンパク質または核酸の種類のうちすべてを含むわけではない。一部の場合には、粒子は、ＮＣ、ＭＡ、ＣＡ、ＳＰ１、ＳＰ２、Ｐ６、ＰＯＬ、ＥＮＶ、ＴＡＴ、ＲＥＶ、ＶＩＦ、ＶＰＵ、ＶＰＲおよび／またはＮＥＦタンパク質、またはいずれかのその誘導体、組合せもしくは部分を含有し得る。一部の場合には、粒子は、ＮＣ、ＭＡ、ＣＡ、ＳＰ１、ＳＰ２、Ｐ６およびＰＯＬを含有し得る。一部の場合には、レンチウイルス様粒子は、ウイルスシェル（カプシド）を形成するこれらのタンパク質のみを含み得る。一部の場合には、１つまたは複数のレンチウイルスタンパク質は、レンチウイルス様粒子から全部または一部が除外され得る。例えば、一部の場合には、レンチウイルス様粒子は、ＰＯＬタンパク質を含有しない場合もあり、ＰＯＬタンパク質の非機能的バージョン、例えば、不活性化点突然変異もしくは不活性化末端切断を有するＰＯＬタンパク質などを含む場合もある。別の例では、レンチウイルス様粒子は、インテグラーゼタンパク質を含有しない場合もあり、インテグラーゼタンパク質の非機能的バージョン、例えば、不活性化点突然変異もしくは不活性化末端切断を有するインテグラーゼタンパク質などを含む場合もある。例えば、レンチウイルス様粒子は、アミノ酸６４位でのアスパラギン酸からバリンへの突然変異（Ｄ６４Ｖ）を含む非機能的インテグラーゼタンパク質を含有し得る。別の例では、レンチウイルス様粒子は、逆転写酵素タンパク質を含有しない場合もあり、逆転写酵素タンパク質の非機能的バージョン、例えば、不活性化点突然変異もしくは不活性化末端切断を有する逆転写酵素タンパク質などを含む場合もある。
【０１３０】
一部の場合には、レンチウイルス様粒子は、少なくとも１つの非ウイルス性ＲＮＡ分子を含有する。非ウイルス性ＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム構成成分のうち少なくとも１つであるか、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム構成成分をコードする。一部の場合には、非ウイルス性ＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡであり得る。適したＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、本開示を通して論じられている。一例では、非ウイルス性ＲＮＡ分子は、Ｃａｓ９タンパク質またはその誘導体をコードするｍＲＮＡであり得る。別の例では、非ウイルス性ＲＮＡ分子は、Ｃｐｆ１タンパク質またはその誘導体をコードするｍＲＮＡであり得る。一部の場合には、非ウイルス性ＲＮＡ分子は、ｇＲＮＡを含み得る。適したｇＲＮＡの特性は、本開示を通して論じられている。ｇＲＮＡは、一般に、ＤＮＡ標的化配列およびＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと相互作用する定常領域を含む。一部の場合には、ｇＲＮＡは、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列を含み得る。例えば、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質または誘導体とともに使用されるべきであるｔｒａｃｒＲＮＡを含み得る。他の場合には、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含まない。例えば、ｇＲＮＡは、Ｃｐｆ１タンパク質または誘導体とともに使用されるべきであるｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含まない場合がある。一部の場合には、レンチウイルス様粒子は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの両方を含有する。一部の場合には、粒子は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡまたはｇＲＮＡのうち一方を含有し得る。
【０１３１】
一部の場合には、少なくとも１つの非ウイルス性ＲＮＡ分子は、その３’末端に配置される少なくとも１つのアプタマー配列を有し得る。アプタマー配列は、上記のようなウイルスタンパク質と融合しているアプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）が特異的に結合するとことが公知の配列である。上記で論じられているように、アプタマー配列は、ＡＢＰが特異的に結合する三次ループ構造を形成するＲＮＡ配列である。適したアプタマー配列は、公知のバクテリオファージアプタマー配列を含む。例示的アプタマー配列は、表１において上記で提供されている。これらのアプタマー配列は、バクテリオファージタンパク質が特異的に結合することが公知のＲＮＡ配列である。一部の状況では、少なくとも１つのアプタマー配列は、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮ  ＲＮＡ結合ドメインまたはＣＯＭタンパク質からなる群から選択されるＡＢＰが特異的に結合する。
【０１３２】
一部の場合には、非ウイルス性ＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡであり得る。一部の場合には、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡは、その３’末端に少なくとも１つのアプタマー配列を含み得る。一部の場合には、非ウイルス性ＲＮＡ分子は、ｇＲＮＡコード配列であり得る。一部の場合には、ｇＲＮＡは、少なくとも１つのアプタマー配列を含む。一部の場合には、少なくとも１つのアプタマー配列は、ｇＲＮＡの５’末端または３’末端に配置され得る。一部の場合には、少なくとも１つのアプタマー配列は、ｇＲＮＡ内の内部位置に、例えば、フォールディングされたｇＲＮＡ中に形成されるループのうち１つまたは複数などに挿入され得る。例えば、ｇＲＮＡが、ＳａＣａｓ９タンパク質のためのものである場合には、少なくとも１つのアプタマー配列は、ｇＲＮＡのテトラループ、ステムループ２または３’末端に配置され得る。一部の場合には、少なくとも１つの非ウイルス性ＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含む。一部の場合には、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの各々は、少なくとも１つのアプタマーコード配列を含み得る。一部の場合には、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡは、その３’末端に少なくとも１つのアプタマー配列を含む。一部の場合には、ｇＲＮＡは、少なくとも１つのアプタマー配列を含む。一部の場合には、１〜３０リボヌクレオチドのスペーサーが、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡまたはｇＲＮＡと、少なくとも１つのアプタマー配列との間に、または少なくとも１つのアプタマー配列に隣接して配置され得る。ある特定の場合には、少なくとも１つのアプタマー配列は、真核細胞のレンチウイルス様粒子形質導入に干渉しない。例えば、ＮＣタンパク質、ＭＡタンパク質、ＶＰＲタンパク質またはＮＥＦタンパク質のうち１つまたは複数に融合された少なくとも１つの非ウイルス性ＡＢＰは、真核細胞のレンチウイルス様粒子形質導入に干渉しない場合もある。
【０１３３】
一部の場合には、少なくとも１つの非ウイルス性ＲＮＡ分子は、１つのアプタマー配列を含む。他の場合には、少なくとも１つの非ウイルス性ＲＮＡ分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のアプタマー配列を含み得る。例えば、一部の場合には、レンチウイルス様粒子は、２つのアプタマー配列を含む少なくとも１つの非ウイルス性ＲＮＡ分子を含む。レンチウイルス様粒子がＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含む場合には、いずれかまたは両方が、１つまたは複数のアプタマー配列を含み得る。一例では、粒子がＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの両方を含む場合には、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡは、３’末端に配置される１つまたは複数のアプタマー配列を含み得る。別の例では、粒子がＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの両方を含む場合には、ｇＲＮＡは、１つまたは複数のアプタマー配列を含み得る。別の例では、粒子がＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの両方を含む場合には、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの両方が、１つまたは複数のアプタマー配列を含み得る。粒子がＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの両方を含み、両方が１つまたは複数のアプタマー配列を含む場合には、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡおよびｇＲＮＡは、同一のアプタマー配列を含む場合も、異なるアプタマーを含む場合もある。
【０１３４】
一部の場合には、レンチウイルス様粒子は、その３’末端に配置される少なくとも１つの第１のアプタマー配列を有するＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡおよび少なくとも１つの第２のアプタマー配列を含むｇＲＮＡを含有する。一例では、少なくとも１つの第１のアプタマー配列および少なくとも１つの第２のアプタマー配列は、同一のアプタマー配列である。一部の場合には、少なくとも１つの第１のアプタマー配列は、第１のＡＢＰが特異的に結合するアプタマー配列であり、少なくとも１つの第２のアプタマー配列は、第２のＡＢＰが特異的に結合するアプタマー配列であり、少なくとも１つの第１のアプタマー配列および少なくとも１つの第２のアプタマー配列は、異なる第１および第２のＡＢＰが結合する。例えば、少なくとも１つの第１のアプタマー配列および少なくとも１つの第２のアプタマー配列は、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮタンパク質ＲＮＡ結合ドメインおよびＣＯＭタンパク質からなる群から選択されるＡＢＰが特異的に結合し得る。別の例では、少なくとも１つの第１のアプタマー配列および少なくとも１つの第２のアプタマー配列は各々、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮタンパク質ＲＮＡ結合ドメインおよびＣＯＭタンパク質からなる群から選択される異なるＡＢＰが特異的に結合し得る。
【０１３５】
一部の場合には、非ウイルス性ＲＮＡ分子はまた、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡの３’末端に、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡの３’末端に、または少なくとも１つのアプタマー配列が非ウイルス性ＲＮＡ分子の３’末端に配置される場合には、少なくとも１つのアプタマー配列の後に配置されるＲＮＡ安定化配列を含み得る。ＲＮＡ安定化配列は、非ウイルス性ＲＮＡ分子の長寿命を安定化する。一例では、非ウイルス性ＲＮＡ分子は、１つまたは複数のアプタマー配列を有するＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡおよび１つまたは複数のアプタマー配列の後にＲＮＡ安定化配列を含む。別の例では、非ウイルス性ＲＮＡ分子は、ｇＲＮＡおよびｇＲＮＡの３’末端の下流に（ｇＲＮＡの３’末端に配置される任意のアプタマー配列の後に）ＲＮＡ安定化配列を含む。例示的ＲＮＡ安定化配列は、配列番号２５（ＤＮＡ）および配列番号２６（ＲＮＡ）に示されるようなヒトベータグロビン遺伝子の３’ＵＴＲの配列である。他のＲＮＡ安定化配列は、Ｈａｙａｓｈｉ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ２３９（７）：２０３４−２０４０  （２０１０）およびＮｅｗｂｕｒｙ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ４８（２）：２９７−３１０  （１９８７）に記載されている。
【０１３６】
提供されているレンチウイルス様粒子の特性として、粒子内にパッケージングできる非ウイルス性ＲＮＡ分子の量がある。天然レンチウイルスでは、ウイルスシェル（カプシド）は、一本鎖ＲＮＡゲノムの２つのコピーを含有する。例えば、野生型ＨＩＶ−１ウイルス粒子は、およそ９．７ｋｂの一本鎖ＲＮＡゲノムの２つのコピーを含有する。本開示のレンチウイルス様粒子では、ウイルスシェル内に最大１００コピーの非ウイルス性ＲＮＡ分子がパッケージングされ得る。例えば、レンチウイルス様粒子は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００の非ウイルス性ＲＮＡ分子を含有し得る。例えば、粒子は、５〜２５の非ウイルス性ＲＮＡ分子、２５〜５０の非ウイルス性ＲＮＡ分子、５０〜７５の非ウイルス性ＲＮＡ分子または７５〜１００の非ウイルス性ＲＮＡ分子を含有し得る。例えば、粒子は、およそ５０〜１００の非ウイルス性ＲＮＡ分子を含有し得る。一部の場合には、レンチウイルス様粒子は、最大１００コピーのＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡ（例えば、ＳａＣａｓ９ｍＲＮＡなど）を含有する。一部の場合には、レンチウイルス様粒子は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡ、ｇＲＮＡまたはその組合せのいくつかのコピーを含有し得る。一部の場合には、レンチウイルス様粒子は、少なくとも１つのアプタマー配列を含む非ウイルス性ＲＮＡ分子のいくつかのコピーを含む。他の場合には、レンチウイルス様粒子は、少なくとも１つのアプタマー配列を含まない非ウイルス性ＲＮＡ分子のいくつかのコピーを含む。一部の場合には、アプタマー配列は、非ウイルス性ＲＮＡ分子のいくつかのコピーを含有するレンチウイルス粒子を作製するために必要ではない。
【０１３７】
一部の場合には、レンチウイルス様粒子は、ＲＮＰ（複数可）を含有し、ＲＮＰは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡとの複合体である。一部の場合には、レンチウイルス様粒子は、ａ）ヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質またはマトリックス（ＭＡ）タンパク質を含む融合タンパク質であって、ＮＣタンパク質またはＭＡタンパク質が、少なくとも１つの非ウイルス性アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）を含む、融合タンパク質と、ｂ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを含むリボヌクレオチドタンパク質（ＲＮＰ）複合体とを含む。一部の場合には、レンチウイルス様粒子は、ウイルスタンパク質Ｒ（ＶＰＲ）タンパク質またはネガティブ調節因子（ＮＥＦ）タンパク質を含む融合タンパク質であって、ＶＰＲタンパク質またはＮＥＦタンパク質が、少なくとも１つの非ウイルス性アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）を含む、融合タンパク質と、ｂ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを含むリボヌクレオチドタンパク質（ＲＮＰ）複合体とを含む。ＲＮＰを含有するレンチウイルス様粒子では、ガイドＲＮＡは、融合タンパク質の非ウイルス性アプタマー結合タンパク質に結合するアプタマーを含む。
【０１３８】
非ウイルス性核酸配列が、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡ配列をコードし、少なくとも１つのアプタマーが、ｇＲＮＡ配列に付着されるか、またはｇＲＮＡ配列中に挿入される、非ウイルス性核酸配列を含む本明細書において記載されている哺乳動物発現プラスミドのいずれかを使用して、ＲＮＰを含有するレンチウイルス様粒子を作製できる。上記のように、本明細書において記載されているウイルス性融合タンパク質中の、ｇＲＮＡに付着またはｇＲＮＡ中に挿入されるアプタマー配列と、アプタマー結合タンパク質との相互作用は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（ＲＮＰ）と複合体形成されたｇＲＮＡのレンチウイルス粒子へのパッケージングを促進する。
ＶＩ．細胞
【０１３９】
また、本明細書において記載されている組成物を含む細胞および本明細書において記載されている組成物によって改変された細胞も提供される。本明細書において記載されている１つまたは複数の核酸構築物（プラスミド）を含む細胞または細胞の集団も提供される。例えば、上記のようなレンチウイルスパッケージングプラスミドを含む細胞が、本明細書において提供される。例えば、上記のような哺乳動物発現プラスミドを含む細胞が、本明細書において提供される。別の例では、上記のようなレンチウイルスパッケージングプラスミドおよび哺乳動物発現プラスミドの両方を含む細胞が、本明細書において提供される。この方法では、本明細書において記載されているシステムのＣＲＩＳＰＲ構成成分を含むレンチウイルス様粒子が作製され得る。別の例では、上記のようなレンチウイルス様粒子を含む細胞が、本明細書において提供される。この方法では、細胞ゲノムにおける標的ＤＮＡ配列の改変は、本明細書において記載されているシステムのＣＲＩＳＰＲ構成成分によって達成され得る。本明細書において記載されているレンチウイルスパッケージングシステムを含む細胞または細胞の集団も提供される。本明細書において記載されているレンチウイルス様粒子を含む細胞または細胞の集団も提供される。
【０１４０】
細胞は、それだけには限らないが、真核細胞、原核細胞、ヒト細胞、非ヒト動物細胞および真菌細胞を含む。必要に応じて、細胞は、細胞培養物中にある。必要に応じて、細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞である。細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏであり得る。細胞はまた、一次細胞、胚細胞、幹細胞または前駆体細胞であり得る。前駆体細胞は、例えば、多能性幹細胞または造血幹細胞であり得る。組成物の細胞への導入は、細胞周期依存性または細胞周期非依存性であり得る。細胞を同期化して、特定の相にある細胞の割合を増大する方法は、当技術分野で公知である。改変されるべき細胞の種類に応じて、当業者は、細胞周期同期化が必要であるか否かを容易に決定できる。一部の例では、細胞が対象から回収され、本明細書において記載されている方法のいずれかを使用して改変され、対象に投与される。
【０１４１】
必要に応じて、細胞は、Ｔ細胞である。Ｔ細胞は、それだけには限らないが、未処置Ｔ細胞、刺激されたＴ細胞、一次Ｔ細胞（例えば、未培養）、培養Ｔ細胞、不死化Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、それらの組合せまたはそれらの小集団を含む。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはＣＤ４＋およびＣＤ８＋であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパー細胞、例えば、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ９、ＴＨ１７またはＴＦＨ型のヘルパー細胞であり得る。Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞であり得る。Ｔ細胞は、遺伝子操作されている組換えＴ細胞、例えば、キメラ抗原受容体または組換えＴ細胞受容体を発現するＴ細胞であり得る。
ＶＩＩ．遺伝子編集方法
【０１４２】
ＤＮＡ標的を編集する、または１つもしくは複数のＤＮＡ標的の転写をモジュレートするために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて本開示で提供されているプラスミドおよびシステムを使用する方法が、本明細書において記載されている。これらの方法は、真核細胞のゲノム中の、標的ゲノム配列、例えば、遺伝子を抑制、突然変異または活性化するために使用され得る。
【０１４３】
本明細書において提供される方法では、改変されるべき目的の標的ゲノム配列を含む真核細胞は、少なくとも１つのアプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）に融合されたウイルスタンパク質を含むウイルス性融合タンパク質およびＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡを含有するレンチウイルス様粒子を用いて形質導入される。記載されている方法の特性は、真核細胞がＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを安定に発現しないということである。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、構成的に発現されず、むしろ、有限量のＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡが、レンチウイルス様粒子を介して形質導入された細胞に提供される。提供される方法の利点は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが細胞中に存在せず、そのようなものとして、長期間活性ではないために、低減されたオフターゲット遺伝子編集事象である。また、方法においてインテグラーゼ活性を欠くレンチウイルス様粒子が使用される場合には、粒子によって保持される核酸のいずれか、特に、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列の細胞ゲノムへの組込みのリスクの低減がある。一部の場合には、使用されるレンチウイルス粒子は、ウイルス複製に必須であるレンチウイルスゲノム配列の一部を欠き、そのようなものとして、継続した粒子産生のリスクを低減する。提供される構成成分の別の利点は、ウイルス性融合タンパク質が、非ウイルス性ＲＮＡ分子、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡの、レンチウイルス様粒子へのパッケージングを増大することができ、これが、ゲノム編集効率を高めるということである。一部の場合には、レンチウイルス様粒子にパッケージングされる非ウイルス性ＲＮＡ分子は、３’末端に配置される少なくとも１つのアプタマー配列を含む。
【０１４４】
一部の場合には、形質導入された真核細胞は、哺乳動物細胞である。一部の場合には、真核細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養された細胞であり得る。一部の場合には、真核細胞は、対象から得られるｅｘ  ｖｉｖｏ細胞であり得る。他の場合には、真核細胞は、対象中に存在する。全体を通して使用される、対象とは、個体を意味する。例えば、対象は、哺乳動物、例えば、霊長類、より詳しくは、ヒトである。非ヒト霊長類は、同様に対象である。対象という用語は、飼い慣らされた動物、例えば、ネコ、イヌなど、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）および実験動物（例えば、フェレット、チンチラ、マウス、ウサギ、ラット、スナネズミ、モルモットなど）を含む。したがって、獣医学的使用および医学的使用ならびに製剤が本明細書において企図される。この用語は、特定の年齢または性別を示さない。したがって、成体および新生児の対象は、雄性であろうが、雌性であろうが、対象とされるものとする。本明細書で使用される場合、患者または対象は、同義的に使用されてもよく、疾患または障害に苦しむ対象を指すことができる。本開示によって提供されるシステムのウイルス粒子は、公知の、日常的な方法に従って、対象に注射され得る。一部の場合には、システムのウイルス粒子は、静脈内に（ＩＶ）、腹腔内に（ＩＰ）、筋肉内に、または具体的な臓器中に注射される。
【０１４５】
一部の場合には、提供される方法は、目的の標的遺伝子座を改変するためのものであり、方法は、複数の真核細胞に、複数のウイルス粒子を用いて形質導入することを含み、複数のウイルス粒子は、ウイルスタンパク質Ｒ（ＶＰＲ）タンパク質またはネガティブ調節因子（ＮＥＦ）タンパク質を含む融合タンパク質であって、ＶＰＲタンパク質またはＮＥＦタンパク質は、少なくとも１つの非ウイルス性アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）を含む、融合タンパク質と、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを含むリボヌクレオチドタンパク質（ＲＮＰ）複合体とを含み、ＲＮＰは、細胞のゲノムＤＮＡ中のゲノム標的配列に結合し、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、細胞のゲノムＤＮＡを切断し、それによって、細胞ＤＮＡ修復機序を誘発し、ゲノム標的配列の改変を引き起こす。一部の場合には、複数のウイルス粒子は、ａ）ヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質またはマトリックス（ＭＡ）タンパク質を含む融合タンパク質であって、ＮＣタンパク質またはＭＡタンパク質が、少なくとも１つの非ウイルス性アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）を含む、融合タンパク質と、ｂ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを含むリボヌクレオチドタンパク質（ＲＮＰ）複合体とを含み、ＲＮＰは、細胞のゲノムＤＮＡ中のゲノム標的配列に結合し、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、細胞のゲノムＤＮＡを切断し、それによって、細胞ＤＮＡ修復機序を誘発し、ゲノム標的配列の改変を引き起こす。
【０１４６】
上記のように、ＲＮＰは、本明細書において記載されている融合タンパク質中の少なくとも１つの非ウイルス性アプタマー結合タンパク質に結合するｇＲＮＡ配列に付着するか、またはｇＲＮＡ配列中に挿入されるアプタマー配列の相互作用によって、ウイルス粒子中にパッケージングされる。ｇＲＮＡ配列は、本明細書において記載されている融合タンパク質中の少なくとも１つの非ウイルス性アプタマー結合タンパク質に結合し、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと相互作用して、複合体（ＲＮＰ）を形成する。
【０１４７】
一部の場合には、提供される方法は、目的の標的遺伝子座を改変するためのものであり、方法は、前記遺伝子座に、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよび１つまたは複数の核酸構成成分を送達することを含み、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、１つまたは複数の核酸構成成分と複合体を形成し、前記複合体の目的の遺伝子座への結合の際に、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、目的の標的遺伝子座の改変を誘導する。好ましい実施形態では、改変は、鎖切断の導入である。本開示に関連して、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡを含有するレンチウイルス様粒子を使用して、改変されるべき目的の標的遺伝子座を含有する細胞に形質導入し、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡから細胞においてＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが発現される。
【０１４８】
提供される方法では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡを含有するレンチウイルス様粒子を、編集システムのｇＲＮＡ構成成分を提供する他のウイルス粒子とともに使用してゲノム編集を達成できる。一部の場合には、複数の真核細胞は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの両方を含有するレンチウイルス様粒子を用いて形質導入される。一部の場合には、複数の真核細胞は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡを含有するレンチウイルス様粒子およびｇＲＮＡまたはｇＲＮＡコード配列を提供する第２のウイルス粒子を用いて形質導入される。第２のウイルス粒子が、ＲＮＡゲノムを含むウイルスの種類である場合には、ウイルス粒子は、ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡコード配列を含有し得る。例えば、第２のウイルス粒子は、ｇＲＮＡを含有するレンチウイルス様粒子であり得る。別の例では、第２のウイルス粒子は、ｇＲＮＡコード配列を含有するレンチウイルス粒子であり得る。第２のウイルス粒子が、ＤＮＡゲノムを含むウイルスの種類である場合には、ウイルス粒子は、ｇＲＮＡコード配列が真核細胞プロモーターに作動可能に連結しているｇＲＮＡコード配列を含有する。別の例では、第２のウイルス粒子は、真核細胞プロモーターに作動可能に連結しているｇＲＮＡコード配列を含有するアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスであり得る。
【０１４９】
一部の場合には、目的の標的遺伝子座と会合している、または目的の標的遺伝子座にある配列をゲノム編集または改変する提供される方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム構成成分を真核細胞中に導入し、それによって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム構成成分が効率的に機能して、ＤＮＡ挿入部分を真核細胞のゲノム中に組み込むことを含む。ある特定の実施形態では、ゲノムは、哺乳動物ゲノムである。一部の場合には、ＤＮＡ挿入部分の組込みは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同性組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）（ＨＤＲ）によって促進される。一部の場合には、ＤＮＡ挿入部分は、外因的に導入された標的鋳型配列、例えば、ＤＮＡ鋳型または修復鋳型である。標的鋳型配列は、真核細胞中に存在するゲノム標的配列への所望の挿入または改変を有する核酸配列を含む。標的鋳型配列はまた、ゲノム標的配列に隣接するゲノムＤＮＡに対して相同な核酸配列も含む。
【０１５０】
標的鋳型配列は、標的鋳型配列を含有するアデノウイルス粒子、アデノ随伴ウイルスまたは組み込み欠陥レンチウイルス粒子を用いて細胞に形質導入することによって、真核細胞中に導入され得る。一部の場合には、アデノウイルス粒子、アデノ随伴ウイルスまたは組み込み欠陥レンチウイルス粒子はまた、真核細胞プロモーターに作動可能に連結したｇＲＮＡコード配列を含み得る。
【０１５１】
相同組換え修復では、標的鋳型配列は、ドナー鋳型として作用し、細胞の天然ＤＮＡ修復機序は、ゲノム標的配列への所望の挿入または改変を有する核酸配列の挿入をもたらす。この方法で実施されるゲノム改変は、新規遺伝子を挿入するため、または既存遺伝子をノックアウトするために使用され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム切断のＮＨＥＪ媒介性修復は、インデルエラーを生じる傾向があるので、意図するものが、目的のゲノム標的中にヌル対立遺伝子（「ノックアウト」）を作製することである場合に有用であり得る。ＮＨＥＪによる修復の過程で生じたインデルエラーは、典型的には、小さい（１〜１０ｂｐ）が、極めて不均一である。結果として、フレームシフト突然変異を引き起こすＮＨＥＪ媒介性修復の約３分の２の機会がある。ＮＨＥＪは、インデルを義務的に導入しない。二本鎖切断の末端構造（ヌクレオチド損傷のない平滑または平滑に近い末端）を考慮すると、インデルは稀であり、一部の場合には、修復事象の５％未満を占める。しかし、正確な修復の産物は、容易に再切断されるが、インデル産物はそうではなく（もはやｇＲＮＡと対形成しない）、そのため、ゲノムＤＮＡのＣＲＩＳＰＲシステム構成成分に対する長期曝露は、後者の産物の蓄積に好都合となる。一部の場合には、数百塩基対またはそれより多くの領域に隣接するｇＲＮＡの対は、ＮＨＥＪが遠位末端を一緒に結合する場合には、染色体切断の対を同時に導入し、介在ＤＮＡの欠失（「ポップアウト」欠失）をもたらすことができる。同様に、適合するオーバーハングを含有する標的鋳型配列が使用されるという条件で、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ標的化切断（または切断の対）において、ＮＨＥＪ依存性修復（「ポップイン」挿入）によって外因性ＤＮＡ断片を直接挿入することが可能であり得る。
【０１５２】
記載されている方法は、機能のためにｓｇＲＮＡの定常領域を必要とする任意のＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとともに使用され得る。これらは、それだけには限らないが、ＲＮＡ誘導型部位特異的ヌクレアーゼを含む。例として、ＩＩ型またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをコードする任意の細菌種中に存在するヌクレアーゼが挙げられる。適したＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、本開示を通して記載されている。例えば、制限するものではないが、部位特異的ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ポリペプチドもしくはＣｐｆ１ポリペプチド、またはそれらの誘導体であり得る。
【０１５３】
一部の場合には、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、活性のＣａｓ９ポリペプチドである場合があり、その結果、ｇＲＮＡとの複合体の一部として、またはＤＮＡ鋳型との複合体の一部として標的核酸に結合している場合には、二本鎖切断が標的核酸中に誘導される。二本鎖切断は、ランダム突然変異を導入するためにＮＨＥＪによって修復されることも、または具体的な突然変異を導入するためにＨＤＲによって修復されることもある。種々のＣａｓ９ヌクレアーゼが、本明細書において記載されている方法において利用され得る。例えば、ガイドＲＮＡによって標的化される領域のすぐ３’にＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を必要とするＣａｓ９ヌクレアーゼを利用できる。このようなＣａｓ９ヌクレアーゼは、ＮＧＧ配列を含有するゲノムの任意の領域に標的化される。別の例として、直交性ＰＡＭモチーフ必要条件を有するＣａｓ９タンパク質を利用して、隣接ＮＧＧ  ＰＡＭ配列を有さない配列を標的化することができる。直交性ＰＡＭ配列特異性を有する例示的Ｃａｓ９タンパクとして、それだけには限らないが、Ｃｐｆ１タンパク質ならびにその断片および誘導体、Ｅｓｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０  （１１）：１１１６−１１２１  （２０１３）に記載されているもの、およびＺｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １６３  （３）：７５９−７７１  （２０１５）に記載されているものが挙げられる。
【０１５４】
一部の例では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ニッカーゼである改変されたＣａｓ９タンパク質であり、その結果、ｇＲＮＡとの複合体の一部として標的核酸に結合している場合には、一本鎖切断またはニックが標的核酸中に導入される。各々構造的に異なるガイドＲＮＡに結合した一対のＣａｓ９ニッカーゼは、標的ゲノム領域の２つの近位部位に標的化され、したがって、標的ゲノム領域中に一対の近位一本鎖切断を導入できる。オフターゲット効果は、一般に塩基除去修復機序による損傷を伴わずに修復される単一ニックをもたらす可能性が高いので、ニッカーゼ対は、特異性の増強を提供できる。例示的Ｃａｓ９ニッカーゼとして、Ｄ１０ＡまたはＨ８４０Ａ突然変異を有するＣａｓ９ヌクレアーゼが挙げられる。
【０１５５】
一例では、レンチウイルス様粒子が、平滑末端化二本鎖切断を生成するＣａｓ９ポリペプチドをコードする場合、修復はＮＨＥＪによって容易に進行し得るので、方法を使用して、遺伝子を無能にすることができる。別の例では、レンチウイルス様粒子が、付着末端を生成するＣｐｆ１ポリペプチドをコードする場合、方法は、遺伝子を挿入するため、またはノックインを作製するなどのために、ＤＮＡの新規配列を組み込むことにおいて役立ち得る。一部の場合には、Ｃｐｆ１タンパク質を使用して、遺伝子導入をもたらすことができる。しかし、いずれかのＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを使用して、遺伝子配列を導入する、または遺伝子を除去する（無能にする）ことができる。一部の場合には、改変されたＣａｓ９ニッカーゼを使用して、反対の鎖に互いに近い一本鎖切断を導入し、その結果、長いオーバーハングを有するＤＳＢを得ることができる。
【０１５６】
一般に、ｓｇＲＮＡは、遺伝子の、またはその付近の具体的な領域に標的化される。一部の場合には、ｓｇＲＮＡは、遺伝子の転写に影響を及ぼす領域に標的化される。例えば、ｓｇＲＮＡは、遺伝子の転写開始部位の５’（上流）の０〜７５０ｂｐの領域の、またはその付近の領域に標的化され得る。一部の例では、領域の０〜７５０ｂｐ標的化は、ｓｇＲＮＡ：非活性化ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼによって転写活性化の増大を提供し得る、または提供する。例えば、ｓｇＲＮＡは、非活性化ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、例えば、転写アクチベーターへのｄＣａｓ９ポリペプチドと複合体を形成して、複合体による遺伝子の転写活性化の増大を提供できる。別の例として、ｓｇＲＮＡは、遺伝子の転写開始部位の３’（下流）の０〜１０００ｂｐ領域の、またはその付近の領域に標的化され得る。一部の例では、この領域を標的化することは、ｓｇＲＮＡ：非活性化ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ複合体による転写抑制の増大を提供するために行われ得る。例えば、ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、例えば、転写阻害剤に連結されたｄＣａｓ９ポリペプチドと複合体を形成して、複合体による遺伝子の転写抑制の増大を提供できる。
【０１５７】
一部の例では、ｓｇＲＮＡは、ヌクレオソームを相対的に含まないと予測されるゲノム領域に標的化される。ヌクレオソームの局在および占有は、小球菌ヌクレアーゼ（ＭＮアーゼ）を用いる酵素消化の使用によって、例えば、ＭＮアーゼ−ｓｅｑ解析によってアッセイできる。したがって、一部の例では、ｓｇＲＮＡは、低ＭＮアーゼ−Ｓｅｑシグナルを有するゲノム領域に標的化される。一部の例では、ｓｇＲＮＡは、高度に転写的に活性であると予測される領域に標的化される。例えば、ｓｇＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）について相対的に高い占有を有すると予測される領域に標的化され得る。このような領域は、Ｐｏｌ  ＩＩクロマチン免疫沈降配列決定（ＣｈＩＰ−ｓｅｑ）によって同定され得る。したがって、一部の例では、ｓｇＲＮＡは、ＥＮＣＯＤＥ−ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｐｏｌ  ＩＩ  ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータベース（Ｌａｎｄｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２（９）：１８１３−１８３１  （２０１２））に開示されているような高Ｐｏｌ  ＩＩ  ＣｈＩＰ−ｓｅｑシグナルを有する領域に標的化される。別の例として、ｓｇＲＮＡは、ランオン配列決定（ｒｕｎ−ｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）またはグローバルランオン配列決定（ｇｌｏｂａｌ  ｒｕｎ−ｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＧＲＯ−ｓｅｑ）によって同定されるように、高度に転写的に活性であると予測される領域に標的化され得る。したがって、一部の例では、ｓｇＲＮＡは、公開ＧＲＯ−ｓｅｑデータ（例えば、Ｃｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００８  Ｄｅｃ  １９；３２２（５９０９）：１８４５−８；およびＨａｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ２０１３  Ａｕｇ；２３（８）：１２１０−２３）に開示されている高ＧＲＯ−ｓｅｑシグナルを有する領域に標的化される。
【０１５８】
一部の場合には、本開示に記載されているようなシステム構成成分への改変は、真核細胞への形質導入後にシステム構成成分が機能する方法を損なわない。むしろ、構成成分は、真核細胞への形質導入の際、未改変構成成分と同様にまたはより良好に機能し得る。例えば、レンチウイルス様粒子中のウイルス性融合タンパク質は、真核細胞のレンチウイルス様粒子形質導入に干渉しない場合がある。同様に、レンチウイルス様粒子にパッケージングされた非ウイルス性ＲＮＡ分子が、少なくとも１つのアプタマー配列を含む場合には、この少なくとも１つのアプタマー配列は、真核細胞のレンチウイルス様粒子形質導入に干渉しない場合がある。例えば、非ウイルス性ＲＮＡ分子がＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡである場合には、少なくとも１つのアプタマー配列の存在は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼのｍＲＮＡ分子からの発現を損なわない場合がある。別の例では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡから、そのすぐ下流の少なくとも１つのアプタマー配列とともに発現されたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、その少なくとも１つのアプタマー配列を欠くｍＲＮＡ分子から発現されるのと同程度に機能的であり得る。別の例では、少なくとも１つのアプタマー配列を含むｇＲＮＡは、任意のアプタマー配列を欠くｇＲＮＡと同程度に機能的であり得る。一部の場合には、ウイルス性融合タンパク質を含有するレンチウイルス様タンパク質は、真核細胞への形質導入の際に、ウイルス性融合タンパク質を含まないレンチウイルス様粒子に比べより大きな遺伝子編集をもたらし得る。一例では、ウイルス性融合タンパク質は、ＮＣ−ＡＢＰ融合タンパク質、例えば、ＮＣ−ＭＳ２融合タンパク質またはＮＣ−ＰＰ７融合タンパク質であり得る。一例では、ＮＣ融合タンパク質は、１つまたは２つのＡＢＰ、例えば、１つまたは２つのＭＳ２タンパク質、１つまたは２つのＰＰ７タンパク質、または１つのＭＳ２タンパク質と１つのＰＰ７タンパク質に融合される。
【０１５９】
真核細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏであり得る。一部の実施形態では、細胞は、一次細胞（対象から単離された）である。本明細書で使用される場合、一次細胞は、形質転換または不死化されていない細胞である。このような一次細胞は、限定回数（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０回培養される）培養、継代培養または継代され得る。一部の例では、一次細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件に適応される。一部の例では、一次細胞は、生物、システム、臓器または組織から単離され、必要に応じて、選別され、培養または継代培養することなく直接利用される。一部の例では、一次細胞は、刺激され、活性化され、または分化される。一部の実施形態では、細胞は、改変された細胞の集団を拡大するのに有効な条件下で培養される。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法のいずれかによって改変された細胞は、精製される。一部の例では、細胞は、対象から回収され、本明細書において記載されている方法のいずれかを使用して改変され、患者に再投与される。
【０１６０】
一部の場合には、細胞が上記のウイルス粒子を用いて形質導入されたら、細胞は、遺伝子編集が生じるのに十分な時間量の間培養され、その結果、検出可能な表現型を発現する細胞のプールを、複数の形質導入された細胞から選択できる。表現型は、例えば、細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）、生存または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）であり得る。一部の例では、表現型は、薬剤、例えば、細胞傷害剤、癌遺伝子、腫瘍サプレッサー、転写因子、キナーゼ（例えば、受容体チロシンキナーゼ）、プロモーター（例えば、異種プロモーター）の制御下の遺伝子（例えば、外因性遺伝子）、チェックポイント遺伝子または細胞周期レギュレーター、増殖因子、ホルモン、ＤＮＡ損傷剤、薬物、または化学療法薬の存在下での、細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）、生存または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）である。表現型はまた、タンパク質発現、ＲＮＡ発現、タンパク質活性、または細胞運動性、遊走もしくは浸潤性であり得る。一部の例では、細胞を表現型に基づいて選択することは、細胞の蛍光活性化細胞選別、親和性精製または細胞運動性に基づく選択を含む。
【０１６１】
一部の例では、細胞を選択することは、例えば、増幅、配列決定、ＳＮＰ解析などによる細胞のゲノムＤＮＡの解析を含む。配列決定法として、それだけには限らないが、ショットガン配列決定、ブリッジＰＣＲ、Ｓａｎｇｅｒ配列決定（マイクロ流体Ｓａｎｇｅｒ配列決定を含む）、パイロ配列決定、超並列署名配列決定、ナノポアＤＮＡ配列決定、単一分子リアルタイム配列決定（ＳＭＲＴ）（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州、メンローパーク）、イオン半導体配列決定、ライゲーション配列決定、合成による配列決定（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カリフォルニア州、サンディエゴ）、Ｐｏｌｏｎｙ配列決定、４５４配列決定、固相配列決定、ＤＮＡナノボール配列決定、ヘリスコープ（ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ）単一分子配列決定、マススペクトロスコピー配列決定、パイロ配列決定、Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｏｌｉｇｏ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ）配列決定、ＤＮＡマイクロアレイ配列決定、ＲＮＡＰ配列決定、トンネル電流ＤＮＡ配列決定および将来同定される任意の他のＤＮＡ配列決定法が挙げられる。本明細書において記載されている配列決定法のうち１つまたは複数を、ハイスループット配列決定法において使用できる。本明細書で使用される場合、「ハイスループット配列決定」という用語は、１つより多い核酸配列が所与の時間で配列決定される、核酸を配列決定することに関するすべての方法を指す。
【０１６２】
他のものは、レンチウイルス粒子を使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成成分を真核細胞に送達することの有用性を評価した。Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２３（７）：  ６２７−６３３  （２０１６）には、Ｃａｓ９コード配列が、レンチウイルスゲノム中に挿入され、その結果、Ｃａｓ９タンパク質を含有するレンチウイルス粒子が得られたシステムが記載された。そのシステムは、低いウイルス力価および低い遺伝子編集活性を有する。Ｃｈｏｉらのシステムと比較して、本明細書において記載されているシステムおよび構成成分の利点として、１）従来のレンチウイルスシステムと同様の力価のレンチウイルス様粒子の産生、２）複数のＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼｍＲＮＡ分子の、各レンチウイルス様粒子へのパッケージング、各ｍＲＮＡは複数のＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼタンパク質の翻訳に有用である、および３）レンチウイルス様粒子にパッケージングされたｍＲＮＡ分子から発現されたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、十分に活性であり、翻訳後プロセシングを必要としないことが挙げられる。例えば、Ｃｈｏｉらは、３０％のインデル率を得ること（１５０ｎｇのＰ２４を反映する粒子を使用して）を記載している。対照的に、本開示に記載されているレンチウイルス様粒子を使用する場合に、本開示の発明者らによって８０％を超えるインデル率が観察された（４５ｎｇのＰ２４；２×１０４個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞；鎌状赤血球突然変異補正を反映する粒子）。
【０１６３】
他のものは、ｍＲＮＡを真核細胞に送達するためにレンチウイルス粒子を使用することの有用性を評価した（Ｍｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ４：  ６４０９  （２０１４）およびＰｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＆  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２：  １５０３９  （２０１５））。いずれのグループも、レンチウイルス様粒子を使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム構成成分を真核細胞中に導入することの有効性を評価しなかった。Ｍｏｃｋらは、レンチウイルスゲノムを使用して、ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ分子を送達した。このシステムでは、ウイルス粒子あたりＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ分子の２コピーのみがパッケージングされた。ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡからの翻訳の程度は比較的低く、不十分な遺伝子編集活性につながった。本開示の発明者らは、ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡ分子を、遺伝子編集事象を検出するために有用なＧＦＰレポーター真核細胞に送達するためにＭｏｃｋらのシステムを試験した。ゲノム中にＳａＣａｓ９コード配列が挿入されたレンチウイルスを、不活性化された逆転写酵素をコードするパッケージングプラスミドを使用してパッケージングした。得られたレンチウイルス粒子を、ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を発現するレンチウイルスと共に用いて、実施例に記載されたＧＦＰレポーター細胞に同時形質導入した。ＧＦＰ＋レポーター細胞は検出できず、遺伝子編集が生じなかったことを示した。このように、Ｍｏｃｋらによって記載されたシステムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム遺伝子編集にとって有用ではなかった。Ｐｒｅｌらは、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでレンチウイルス粒子を使用して、Ｃｒｅ  ｍＲＮＡ分子を真核細胞中に送達した。レンチウイルス様粒子は、ＮＣタンパク質の第２のジンクフィンガードメインがＭＳ２タンパク質で置き換えられたＮＣ融合タンパク質を含有していた。Ｃｒｅ  ｍＲＮＡはまた、３’ＵＴＲに付加された１２コピーのＭＳ２アプタマー配列を有していた。そのシステムは、非効率的なウイルス粒子産生およびＣｒｅ  ｍＲＮＡ分子のウイルス粒子への低コピー数のパッケージングを有していた。Ｐｒｅｌらのシステムと比較して、本開示のシステムは、ウイルス粒子を効率的に生成し、ウイルス粒子あたり、高コピー数の非ウイルス性ＲＮＡ分子を有する。Ｐｒｅｌらは、粒子あたり、５〜６コピーのＣｒｅ  ｍＲＮＡのパッケージングを観察することを報告した。対照的に、ＮＣ−ＭＳ２融合タンパク質を発現するために作製された本開示に記載されているレンチウイルス様粒子（パッケージングプラスミドとしてのプラスミド番号１１）を使用して、本開示の発明者らは、ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡがヒトＨＢＢ  ３’ＵＴＲを用いて改変された場合（プラスミド番号３６）に、粒子あたり１００コピーのＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡを観察し、またはヒトＨＢＢ  ３’ＵＴＲが付加されなかった場合（プラスミド番号１６）に、粒子あたり３０コピーのＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡを観察した。
ＶＩＩＩ．処置の方法
【０１６４】
本明細書において記載されている方法および組成物のいずれかを使用して、対象において疾患（例えば、がん、血液障害（例えば、鎌状赤血球貧血またはベータサラセミア）、感染性疾患、自己免疫疾患、移植拒絶、移植片対宿主病または他の炎症性障害）を処置できる。
【０１６５】
一部の方法では、処置されるべきがんは、Ｂ細胞起源のがん、乳がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、神経芽細胞腫、骨肉腫、肺がん、結腸がん、慢性骨髄性がん、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）または急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ））、前立腺がん、結腸がん、腎細胞癌、肝臓がん、腎臓がん、卵巣がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、精巣がん、横紋筋肉腫およびホジキンリンパ腫から選択される。一部の実施形態では、Ｂ細胞起源のがんは、Ｂ系統急性リンパ性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病およびＢ細胞非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される。
【０１６６】
一部の方法では、対象の細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで改変される。一部の方法では、対象において疾患を処置する方法は、ａ）対象から細胞を得ること、ｂ）本明細書において提供される方法のいずれかを使用して細胞を改変すること、およびｃ）改変された細胞を対象に投与することを含む。必要に応じて、疾患は、対象におけるがん、血液障害（例えば、鎌状赤血球貧血またはベータサラセミア）、感染性疾患、自己免疫疾患、移植拒絶、移植片対宿主病または他の炎症性障害からなる群から選択される。がんを処置する一部の方法では、対象から得られた細胞が、腫瘍特異的抗原を発現するように改変される。全体を通して使用される、「腫瘍特異的抗原」という語句は、がん細胞に対して独特である、またはがん細胞において非がん性細胞においてよりも多量に発現される抗原を意味する。必要に応じて、対象から得られた細胞は、Ｔ細胞である。必要に応じて、改変された細胞は、対象への投与の前に拡大される。
【０１６７】
本開示で論じられるすべての特許、特許刊行物、特許出願、ジャーナル記事、書籍、技術参考文献などは、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６８】
本開示の図面および説明は、本開示の明確な理解に関連する要素を説明するために簡略化されていることを理解されたい。当然のことではあるが、図面は、構成図としてではなく、説明の目的で提示されている。省略された詳細および改変または代替実施形態は、当業者の範囲内である。
【０１６９】
本開示のある特定の態様では、要素または構造を提供するため、または所与の機能（単数または複数）を実行するために、単一の構成要素を複数の構成要素によって置き換えることができ、複数の構成要素を単一の構成要素によって置き換えることができることを理解されたい。そのような置換が本開示のある特定の実施形態を実施するために機能しない場合を除いて、そのような置換は、本開示の範囲内であると企図される。
【０１７０】
本明細書に提示される実施例は、本開示の潜在的かつ具体的なインプリメンテーションを説明することを意図している。実施例は、主に当業者のための本開示の説明を目的として意図されていることが理解され得る。本開示の趣旨から逸脱することなく、本明細書において記載されているこれらの図面または操作の変形形態があり得る。例えば、ある特定の場合には、方法ステップまたは操作は、異なる順序で実施または実行されることがあり、操作は、付加、欠失または改変されることがある。
【０１７１】
値の範囲が提供される場合には、文脈が明確に別段の指示をしない限り、その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の最小部分までの各介在値も具体的に開示されることが理解される。記載された範囲内の任意の記載された値または記載されていない介在値と、その記載された範囲内の任意の他の記載された値または介在する値との間の任意のより狭い範囲が包含される。これらのより小さな範囲の上限と下限は、独立して範囲に含まれるか除外される場合があり、いずれか、または両方の限界がそのより小さな範囲に含まれる、または含まれない各範囲も、記載された範囲中の任意の具体的に排除された限界の影響を受ける技術内に包含される。記載された範囲が、限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除外する範囲も含まれる。
【０１７２】
図面に表される、または上記の構成要素ならびに示されていないまたは説明されていない構成要素およびステップの異なる配置があり得る。同様に、一部の特性および部分組合せが有用であり、他の特性および部分組合せを参照することなく用いられ得る。本開示の実施形態は、制限目的ではなく例示目的で説明されているが、代替実施形態は、本特許の読者には明らかとなろう。したがって、本開示は、上記の、または図面に表される実施形態に限定されず、以下の特許請求の範囲から逸脱することなく、種々の実施形態および改変を行うことができる。
【実施例】
【０１７３】
（実施例１）
材料および方法
次世代配列決定およびデータ解析。ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、メリーランド州、ジャーマンタウン）を製造業者の使用説明書に従って用いて、細胞からゲノムＤＮＡを単離した。次世代配列決定解析のために２つのＤＮＡ領域を増幅した。配列決定の内因性ＨＢＢ標的配列を増幅するために、ウイルスベクター鋳型に由来する配列を増幅することを避けるためにネステッドＰＣＲ戦略を使用した。まず、プライマーＨＢＢ−１８４９ＦおよびＨＢＢ−５２７７Ｒ（配列番号９６および９７）を使用して、ＨＢＢ遺伝子座から３．４ｋｂの領域を増幅した。これらの２つのプライマーは、ウイルスベクター中の鋳型から配列を増幅できない。次いで、ＨＢＢ−ＭＵＴ−ＦおよびＨＢＢ−ＭＵＴ−Ｒプライマーを使用して、配列決定のために標的ＤＮＡを増幅した（表３；配列番号３４〜４０）。配列決定のために、組み込まれたＥＧＦＰレポーターからＨＢＢ標的部位を増幅するために、レポーター−ｍｕｔ−Ｆおよびレポーター−ｍｕｔ−Ｒプライマーを使用した（表３；配列番号９８〜１０２）。ＰＣＲのためにＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（マサチューセッツ州、ウィルミントン）製のプルーフリーディングＨｏｔＳｔａｒｔ（登録商標）ＲｅａｄｙＭｉｘを使用した。Ｊａｖｉｄｉ−Ｐａｒｓｉｊａｎｉ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１７；  １２（５）：  ｅ０１７７４４４によって以前に記載されているようにＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００を使用して次世代配列決定によってＰＣＲ産物を解析した。配列決定データの突然変異解析のために、Ｐａｒｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ３３（２）：２８６−２８８  （２０１７）によって記載されているＣａｓ−Ａｎａｌｙｚｅｒオンラインソフトウェアを使用した。
【０１７４】
プラスミド。ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ（Ａｄｄｇｅｎｅカタログ番号１２２５３）、ｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅカタログ番号１２２５９）、ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ（Ａｄｄｇｅｎｅカタログ番号１２２５１）、ｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅカタログ番号１２２６０）、ｐｓＰＡＸ２−Ｄ６４Ｖ（Ａｄｄｇｅｎｅカタログ番号６３５８６）、ｐＳＬ−ＭＳ２ｘ１２（Ａｄｄｇｅｎｅカタログ番号２７１１９）およびｐＸ６０１−ＡＡＶ−ＣＭＶ：：ＮＬＳ−ＳａＣａｓ９−ＮＬＳ−３ｘＨＡ−ｂＧＨｐＡ；Ｕ６：：ＢｓａＩ−ｓｇＲＮＡ（Ａｄｄｇｅｎｅカタログ番号６１５９１）。ｐＣＤＨ−ＧＦＰは、Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．から購入した（カタログ番号ＣＤ５１３Ｂ−１）。表２に記載されているプラスミドは、本開示の発明者らによって製造され、以下の実施例において使用された。以下で同定されるような合成ＤＮＡ配列は、特別注文に基づいてＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成された。以下の表３に列挙されたプライマーは、特別注文に基づいてＥｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって合成された。
表２．実施例において使用されるプラスミド
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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表３．実施例において使用されるプライマー
【表３−１】
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【表３−２】
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【０１７５】
遺伝子編集活性を評価するためのアッセイ。遺伝子編集を評価するために、鎌状赤血球症を引き起こす突然変異された配列を、編集のためのゲノム標的配列として選択した。鎌状赤血球症を引き起こす遺伝子欠陥は、ヒトベータヘモグロビン遺伝子のＡヌクレオチドのＴヌクレオチドへの点突然変異（ＧＡＧコドンをＧＵＧに変換する）であり、この結果、β−グロビンタンパク質のアミノ酸６位でグルタミン酸（Ｅ／Ｇｌｕ）が、バリン（Ｖ／Ｖａｌ）によって置換される。標的化される鎖の配列は、
【化１】
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であり、この配列の最初の６ヌクレオチド（下線が引かれている）は、プロトスペーサー隣接するモチーフに対応する。２つのアッセイを使用して、遺伝子編集活性を検出した：（１）ＧＦＰ−レポーターアッセイおよび（２）Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（登録商標）突然変異検出キット（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号７０６０２０）。
【０１７６】
ＧＦＰ−レポーターアッセイのために、Ｊａｖｉｄｉ−Ｐａｒｓｉｊａｎｉ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１７；  １２（５）：  ｅ０１７７４４４に記載されている増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）レポーター細胞（実施例を通して「ＧＦＰレポーター細胞」または「レポーター細胞」と呼ばれる）を、ＧＦＰ陽性細胞の顕微鏡観察またはフローサイトメトリー解析によるゲノム編集活性の検出のために使用した。この細胞系は、ＥＧＦＰ  ｃＤＮＡの開始コドンＡＴＧと第２のコドンとの間への１１９塩基対配列の挿入によるＥＧＦＰリーディングフレームの破壊によって、ＥＧＦＰを発現しない（挿入は、４０のインフレームコドンを作製するために１ｂｐを失っている）。１１９ｂｐ挿入は、
【化２】
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であり、５７ｂｐのＩＬ２ＲＧ標的配列（下線が引かれている）および６２ｂｐのＨＢＢ標的配列（大文字にされている）を含有する。ゲノム編集を行わなければ、ＥＧＦＰリーディングフレームを破壊する挿入の存在によってＥＧＦＰは発現されない。これは、トランスフェクトされていないレポーター細胞における、および任意のｓｇＲＮＡを有さないＳａＣａｓ９を発現するプラスミドＤＮＡをトランスフェクトされたレポーター細胞におけるＥＧＦＰ陽性細胞の不在によって確認された。挿入された配列におけるゲノム編集の際に、非相同末端結合によって二本鎖切断が修復される。挿入または欠失（インデル）を導入する可能性によって、３Ｎ＋２塩基対の欠失または３Ｎ＋１塩基対の挿入は、ＥＧＦＰリーディングフレーム、したがって、ＥＧＦＰタンパク質発現を回復させる。
【０１７７】
レポーター細胞が機能的であったか否かを試験するために、細胞にＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびＨＢＢのｓｇＲＮＡを含有するアデノ随伴ウイルス粒子（ｐＳａＣａｓ９−ＨＢＢ−ｓｇＲＮＡ１；プラスミド番号２２から作製された）を用いて形質導入した。フローサイトメトリー解析は、４．５％〜１５％の細胞が、トランスフェクションの２４時間後にＥＧＦＰ陽性であることを示した。形質導入の３日後にレポーター細胞から得たゲノムＤＮＡを精製し、レポーター領域を、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲによって増幅し、次世代配列決定によって標的領域を配列決定した。インデルを有する配列のパーセンテージを解析した。リードの６８％が、インデルを有するとわかった。一部のインデルのみが、ＥＧＦＰ発現を回復させるので、トランスフェクションの７２時間後に解析を実施し、インデル率より低いＥＧＦＰ陽性率が観察されたことは驚くべきことではない。これらのデータは、レポーター細胞が機能的であり、本開示に関連して遺伝子編集事象の解析にとって有用であることを示す。
【０１７８】
Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（登録商標）突然変異検出キットを、キットのマニュアルに従って使用して、遺伝子編集活性を検出した。キットの重要な構成成分、Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼ、ミスマッチ特異的ヌクレアーゼのＣＥＬファミリーのメンバーは、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）または小さい挿入もしくは欠失の存在に起因するミスマッチを認識し、切断する。手短には、標的配列を、ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（マサチューセッツ州、ウィルミントン）製のプルーフリーディングＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘ、高忠実度熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用して増幅して、バックグラウンドミスマッチをもたらすエラーの組み込みを最小にした。増幅されたＤＮＡを９５℃で５分間変性し、温度を室温へゆっくりと低下させることによって再生した。次いで、ＤＮＡをＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼを用いて処置して、ミスマッチを切断した。切断されたＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動によって分離し、臭化エチジウムを用いて染色し、ＵＶ光下で観察した。
【０１７９】
Ｃａｓ９  ｍＲＮＡのレンチウイルス様粒子へのパッケージング。Ｊａｖｉｄｉ−Ｐａｒｓｉｊａｎｉ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１７；  １２（５）：  ｅ０１７７４４４に記載されているようにＡｄｄｇｅｎｅ第２または第３世代パッケージングシステムを用いて、ゲノムを有するレンチウイルス様粒子を産生した。ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡをレンチウイルス様粒子中にパッケージングするために、プラスミドの所望の組合せをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションは、１：２のＤＮＡ：ＰＥＩ比（質量：質量）を使用してポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）によって媒介された。表４は、ある特定のＣａｓ９  ｍＲＮＡがパッケージングされたレンチウイルス様粒子を作製するために使用された例示的条件を提供する。細胞培養およびＤＮＡトランスフェクションは、Ｊａｖｉｄｉ−Ｐａｒｓｉｊａｎｉ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１７；  １２（５）：  ｅ０１７７４４４に記載されているとおりに実施した。ウイルス粒子は、濃縮せずに、または３つの異なる方法：１）ウイルス粒子を含有する上清を、１０ｍｌの２０％スクロースクッション上に層にし、次いで、２００００ｇ、４℃で４時間遠心分離することによる、２）Ｌｅｎｔｉ−Ｘ（商標）濃縮器を製造業者のプロトコールを使用して使用することによる（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３１２３２）、３）ＫＲ２ｉ  ＴＦＦシステム［ＫｒｏｓＦｌｏ（登録商標）Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２ｉ  Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎシステム］（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂ、カタログ番号ＳＹＲ２−Ｕ２０）のうち１つによる濃縮後のいずれかで使用した。形質導入実験によって、第３の方法によって産生されたウイルスが最良に働く（ＧＦＰレポーターアッセイにおいて生成したＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージによって判定された）ことがわかり、そのため、ほとんどのデータは、この方法によって濃縮されたウイルス粒子を用いて生成された。
表４．  ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡを負荷したレンチウイルス粒子を作製するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトするために使用されたプラスミドＤＮＡａ
【表４−１】
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【表４−２】
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ａトランスフェクションの２４時間前に１３×１０６個の細胞を１５ｃｍのディッシュに播種した。
【０１８０】
ウイルス力価検出。ウイルス力価は、ＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒ（商標）レンチウイルス力価キット（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号ＶＰＫ−１０７）を使用して酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によってｐ２４を測定することによって決定した。製造業者の使用説明書の通りに、可溶性ｐ２４タンパク質が検出されないように、ＥＬＩＳＡ解析の前にウイルス粒子を沈殿させた。
【０１８１】
ウイルスＲＮＡ単離および定量化。２つの方法を使用して、ウイルスＲＮＡを単離した。１つの方法では、ウイルス粒子を１２０，０００ｇで９０分間遠心分離し、次いで、ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）、カタログ番号２１７００４）を用いてウイルスＲＮＡを精製した。あるいは、ウイルスＲＮＡを、ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）、カタログ番号５２９０４）を用いて１４０μｌのウイルス上清から直接単離した。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標）逆転写キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてウイルスＲＮＡの逆転写を行った。定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）のために特別設計されたＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用した。定量化は、ＱＰＣＲによって、またはデジタルＰＣＲによって実施した。ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲマスター混合物（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、標準曲線法を使用する絶対ＱＰＣＲを実施した。５０、５００、５０００、５００００および５０００００コピーのｐＳａｃａｓ９−ＨＢＢ−ｓｇＲＮＡ１（ＳａＣａｓ９およびｓｇＲＮＡについて）またはｐＣＤＨ−ＧＦＰ（ＥＧＦＰについて）プラスミドＤＮＡを用いて標準曲線を準備した。標準を準備するために使用したプラスミドＤＮＡの濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）２０００（カタログ番号ＮＤ−２０００）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して決定した。ＰＣＲを、ＡＢＩ７５００機器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で実行した。ＰＣＲ産物の特異性を決定するために、増幅後に解離解析を実施した（解離曲線中に１つのピークのみが観察された場合は、増幅は特異的であった）。あるいは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）３Ｄ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、定量化のためにデジタルＰＣＲを実施した。
【０１８２】
レンチウイルス様粒子およびレンチウイルス粒子形質導入。上記のように種々の量の濃縮されたウイルス粒子（１０〜２００ｎｇのｐ２４タンパク質と等価）を、ＧＦＰ−レポーター細胞（２×１０４個）に添加し、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中、８〜１２μｇ／ｍｌのポリブレンとともに２４ウェルプレートで増殖させた。非濃縮ウイルスを含有する上清を使用して、半分の新鮮培地および半分のウイルス含有上清を用いてＧＦＰ−レポーター細胞に形質導入した。細胞を、ウイルス含有培地とともに１２時間インキュベートし、その後、培地を、１０％ＦＢＳを有する新鮮ＤＭＥＭ培地と置き換えた。
【０１８３】
ヒト細胞からのゲノムＤＮＡ抽出。ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、メリーランド州、ジャーマンタウン）を製造業者の使用説明書に従って用いて、細胞からゲノムＤＮＡを単離した。
【０１８４】
ウエスタンブロッティング。レンチウイルスまたはレンチウイルス様粒子（２００ｎｇ）を、５０μｌの１×ＳＤＳローディング緩衝剤に直接溶解し、９５℃で５分間加熱した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質を分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗ｐ１７抗体（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＰＡ１４９５４、１：１０００）を用いてＭＡ（ｐ１７）について、抗ｐ２４抗体（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号３１０８１０、１：１０００）を用いてＣＡ（ｐ２４）について、および抗ｐ１５抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ６６９５１、１：１０００）を用いてＮＣについてイムノブロットした。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）がコンジュゲートされた二次抗体および化学発光試薬は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ウエスタンブロッティング画像を獲得するためにＬＡＳ−３０００システム（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）を使用した。タンパク質バンドのデンシトメトリーは、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを用いて解析した。
（実施例２）
ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡパッケージングのためのＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）のレンチウイルスタンパク質への融合。
【０１８５】
目的は、バクテリオファージコートタンパク質と、そのそれぞれのＲＮＡアプタマーとの間の高親和性相互作用を使用して、ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡをレンチウイルス様粒子にパッケージングすることであった。アプタマー結合タンパク質は、種々のレンチウイルスタンパク質と融合していた。対応するアプタマー配列を、ＳａＣａｓ９の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に付加した（図２を参照のこと）。４種の異なるレンチウイルスタンパク質を、よく使用されるアプタマー結合タンパク質であるＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）の融合レシピエントとして試験した。これらの融合タンパク質は、ＨＩＶアクセサリータンパク質ウイルスタンパク質Ｒ（ＶＰＲ）（Ｗｕ，  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６９（６）：３３８９−３３９８  （１９９５））およびネガティブ調節因子ならびにＨＩＶ構造タンパク質ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）およびマトリックスタンパク質（ＭＡ）（それぞれ、ＭＣＰ×２−ＶＰＲ、ＮＥＦ−ＭＣＰ×２、ＮＣ−ＭＣＰ×２およびＭＡ−ＭＣＰ×２と呼ばれる）であった。ＮＥＦタンパク質は、Ｍｕｒａｔｏｒｉ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２０１０；  ６１４：  １１１−１２４に記載されているように、レンチウイルス様粒子への組込みを増大するために３つの突然変異（Ｇ３Ｃ、Ｖ１５３ＬおよびＧ１７７Ｅ）を含んでいた。公開された研究Ｗｕ，  Ｘ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９５；  ６９（６）：  ３３８９−３３９８およびＭｕｒａｔｏｒｉ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２０１０；  ６１４：  １１１−１２４に従って、ＭＣＰの２つのタンデムコピーを、ＶＰＲのＮ末端およびＮＥＦのＣ末端に融合した。ＮＣ融合タンパク質については、ＭＣＰの２コピーを、パッケージングプラスミドｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥＤ６４Ｖ（第３世代パッケージングプラスミド）およびｐｓＰＡＸ２Ｄ６４Ｖ（第２世代パッケージングプラスミド）中のＧａｇ前駆体タンパク質のＮＣジンクフィンガー２の後に挿入し、ＮＣ／Ｐ１プロテアーゼ切断部位を保存した。ＭＡ融合タンパク質については、これらのパッケージングプラスミド中のＭＡのアミノ酸４４〜１３２を、ＭＣＰの２コピーと置き換えた。ＭＡ中のこの領域を欠失することは、ウイルス粒子組み立てまたは出芽に干渉しないことが公知である（Ｊａｌａｇｕｉｅｒ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１１；  ６（１１）：  ｅ２８３１４）。ＭＣＰとＭＡまたはＮＣを融合することは、Ｇａｇ前駆体タンパク質のリーディングフレームまたはプロテアーゼプロセシング部位を破壊しなかった。
【０１８６】
レンチウイルスベクター産生の際にＭＣＰ×２−ＶＰＲまたはＮＥＦ−ＭＣＰ×２を発現させることも、ＭＣＰをＮＣまたはＭＡと融合させることも、レンチウイルス粒子産生の効率を損なわなかった。Ｐ２４  ＥＬＩＳＡは、これらの状況では、レンチウイルス産生は、ＭＣＰ融合を有さないパッケージングプラスミドによるウイルス産生と同等に効率的であることを示した（表５）。使用された対照は、ＭＣＰ融合を有さない未改変パッケージングプラスミドであった。プラスミド名は、ｐｓｐＡＸ２−Ｄ６４Ｖである。
表５．種々の融合タンパク質を有するパッケージングプラスミドのウイルス性産生効率および遺伝子編集活性
【表５】
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ａ  ＧＦＰ発現レンチウイルスベクターｐＣＤＨ−ＧＦＰをパッケージングした。融合タンパク質を有さない対照パッケージングプラスミドのウイルス性産生効率を、１００％と設定した。平均±標準誤差を示した。括弧中の数字は、各群の反復数を意味する。ＡＮＯＶＡ分析によって群間に差は認められなかった。
ｂレンチウイルス様粒子産生の際にＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２が発現された。４×１０４個のＧＦＰレポーター細胞に、２５０μｌの未濃縮レンチウイルス様粒子を、ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を発現するレンチウイルスベクターとともに用いて同時形質導入した。
＊＊＊は、ＮＣ−ＭＣＰ融合物から得たウイルス粒子が、ＭＣＰ融合を有さないパッケージングプラスミドによるウイルス粒子と比較した場合のｐ＜０．０００１を示す。
【０１８７】
次いで、これらの融合タンパク質の、遺伝子編集に対する影響を評価した。１コピーのＭＳ２アプタマーを、表２に記載されている通りに、ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡ（ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２）の停止コドンの後に付加した。レンチウイルス様粒子を作製し、実施例１に記載されているようにＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２をパッケージングした。ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２ｍＲＮＡは、４つの異なる融合タンパク質のうち任意の１種の存在下でのレンチウイルス様粒子産生の際にＨＥＫ２９３Ｔ細胞において転写された（ウイルス粒子が作製される方法については表４を参照のこと）。実施例１に記載されているように、未濃縮ウイルス様粒子（回収された培地）を、ヒトベータヘモグロビン（ＨＢＢ）ｓｇＲＮＡ１（プラスミド番号３５、ｐＦＣＫ−ＨＢＢ−ｓｇＲＮＡ１）を発現するレンチウイルスベクターと共に用いて、ＧＦＰ−レポーター細胞に同時形質導入した。これらのレポーター細胞における遺伝子編集は、ＥＧＦＰ開始コドンの後に挿入されたＨＢＢ標的配列中に挿入または欠失（インデル）をもたらし、これがＥＧＦＰリーディングフレームを回復させる。未改変パッケージングプラスミドから産生されたウイルス様粒子は、約２．５％のＧＦＰ＋レポーター細胞をもたらした。ＶＰＲ−ＭＣＰ、ＮＥＦ−ＭＣＰおよびＭＡ−ＭＣＰ融合タンパク質を発現するウイルス様粒子は、ＧＦＰ＋レポーター細胞を有意に増大しなかったが、ＮＣ−ＭＣＰ融合物は、５％を超えるＧＦＰ＋レポーター細胞を生成した（表５を参照のこと）。レポーター細胞中のインデルの３分の１だけがＥＧＦＰリーディングフレームを回復できるので、遺伝子編集事象の３分の１だけが、これらのレポーター細胞を使用して検出可能である（Ｊａｖｉｄｉ−Ｐａｒｓｉｊａｎｉ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１７；  １２（５）：  ｅ０１７７４４４を参照のこと）。したがって、ＮＣ−ＭＣＰ融合タンパク質を発現する未濃縮レンチウイルス様粒子は、レポーター細胞の１５％超において（３×５％という検出された率）インデルを作製できた。さらに、ＧＦＰ＋細胞は、レンチウイルス様粒子が、ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を発現するレンチウイルスベクターと共に用いられて同時形質導入された場合にのみ観察できた。したがって、遺伝子編集事象は、融合タンパク質レンチウイルス様粒子およびＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を保持するウイルス粒子両方によって形質導入された細胞のみに限定された。このように、システムにおいてＮＣ−ＭＣＰ融合タンパク質粒子が使用される場合に生じる遺伝子編集の率は、１５％より大きい可能性が高い。これらの結果を考慮して、ＲＮＡ結合アプタマータンパク質との融合のレシピエントタンパク質としてＮＣを使用して、さらなる実験を実施した。
【０１８８】
ＮＣに融合されたＭＣＰの１または２コピーを有するパッケージングプラスミドの性能を比較した（プラスミド番号１１および１３）。ＮＣ−ＭＣＰ×１パッケージングプラスミドによって作製されたウイルス様粒子を含有するＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２は、ＮＣ−ＭＣＰ×２パッケージングプラスミドによって作製された粒子よりも、ＧＦＰレポーターアッセイにおいて多くのＧＦＰ＋細胞を産生した（ＮＣ−ＭＣＰ×１：６．２％±０．１％、Ｎ＝４；ＮＣ−ＭＣＰ×２：４．８％±０．４％、Ｎ＝４；ｐ＜０．０５）。これらの結果を考慮して、特に断りのない限り、その後の実験においてＮＣ−ＭＣＰ×１パッケージングプラスミドを使用した。
【０１８９】
レンチウイルスＥｎｖタンパク質ＶＳＶ−Ｇは、細胞外小胞産生を促進するので（Ｒｏｌｌｓ，  Ｍ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １９９４；  ７９（３）：  ４９７−５０６）、増大したレンチウイルス様粒子へのパッケージングよりも細胞外小胞から、ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２ｍＲＮＡがレポーター細胞中に導入され得る可能性があった。これを試験するために、ＮＣ−ＭＣＰ×１を発現するレンチウイルス様粒子（ｐｓＰＡＸ２−Ｄ６４Ｖ−ＮＣ−ＭＳ２、プラスミド番号１１を使用して）またはレンチウイルスパッケージングタンパク質を全く発現しなかった、ｍＲｕｂｙを発現するプラスミド（ｐＫａｎＣＭＶ−ｍＲｕｂｙ３−１０ａａ−Ｈ２Ｂ；Ａｄｄｇｅｎｅカタログ番号７４２５８）（ｍＲｕｂｙは、赤色蛍光タンパク質である）を使用して作製された対照によって誘導される遺伝子編集率を比較する実験を実施した。ｍＲｕｂｙを発現するプラスミドは、レンチウイルスパッケージングタンパク質を全く発現せず、そのため、それから単独でレンチウイルスは産生されない。レンチウイルス様粒子ではなく細胞外小胞が、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡトランスファーを媒介する構造である場合は、ｍＲｕｂｙ  ｍＲＮＡまたはプラスミドは、細胞外小胞に同様に組み込まれるはずであり、ｍＲｕｂｙタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質と同様の効率で発現されるはずである。粒子は、実施例１に記載されているように産生され、超遠心分離によって濃縮されており、これは、レンチウイルス様粒子および細胞外小胞の両方とも沈殿させると予測された。遺伝子編集を測定するために、沈殿物を、ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を含有するレンチウイルス粒子と一緒に使用してＧＦＰレポーター細胞に形質導入した。ＮＣ−ＭＣＰ改変パッケージングプラスミドを用いて作製された粒子は、１０％を超えるＧＦＰ＋レポーター細胞を生成したのに対し、代わりにｍＲｕｂｙプラスミドを用いて作製した粒子は、１％未満のＧＦＰ＋レポーター細胞および１％未満のｍＲｕｂｙ＋レポーター細胞しか生成しなかった。ＮＣ−ＭＣＰ×１を含有するレンチウイルス様粒子を含有する沈殿物は、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡも含有し、これによって、高いＧＦＰ＋レポーター細胞率が観察された。ＮＣ−ＭＳ２パッケージングプラスミドなしでは（ｍＲｕｂｙプラスミドによって置き換えられた）、沈殿物は、細胞外小胞のみを含有し、これによって、低いＧＦＰ＋レポーター細胞率が観察された。これは、細胞外小胞が、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡまたはｍＲｕｂｙ  ｍＲＮＡをあまり有さない（ｍＲｕｂｙもまた低いパーセンテージ）ことを示した。ＶＳＶ−Ｇは両条件で発現されたので、重要な相違は、ＮＣ−ＭＣＰ改変パッケージングプラスミドが使用されたか否かであった。結果は、細胞外小胞は、このシステムにおけるＧＦＰ＋レポーター細胞の生成において重要な役割を果たさないということを示唆する。
【０１９０】
ＧＦＰ＋レポーター細胞がレンチウイルス様粒子産生から残ったプラスミドＤＮＡによって簡単に生成されるか否かを試験するために、ＮＣ−ＭＣＰ改変パッケージングプラスミド（プラスミド番号１１）を用いるレンチウイルス様粒子産生の際に、ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２ｍＲＮＡおよびＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１の両方を発現するプラスミド（プラスミド番号４０、ｐＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２−ＨＢＢ−ｓｇＲＮＡ１）をパッケージング細胞にトランスフェクトした。ｓｇＲＮＡ１は、アプタマー配列を含まない。したがって、ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２ｍＲＮＡおよびＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１の両方がプラスミドから転写されるが、ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２ｍＲＮＡのみが、検出可能な効率でレンチウイルス様粒子中にパッケージングされることができた。得られたレンチウイルス様粒子を、単独で（条件１）またはＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を含有するレンチウイルス粒子と組み合わせて（プラスミド番号３５を使用して作製された）（条件２）使用してＧＦＰレポーター細胞に形質導入した。条件２では、１０％のＧＦＰ＋レポーター細胞が観察されたが、条件１では３％未満のＧＦＰ＋細胞しか観察されなかった。ＧＦＰ−レポーター細胞にｐＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２−ＨＢＢ−ｓｇＲＮＡ１  ＤＮＡを単純にトランスフェクトすることによって、１０％を超えるＧＦＰレポーター細胞が生成した。このデータは、レンチウイルス様粒子産生の際に残ったプラスミドＤＮＡが、ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２ｍＲＮＡの主要な寄与ではないことを示唆し、ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２ｍＲＮＡはレンチウイルス様粒子中にパッケージングされるという結論を支持する。
（実施例３）
ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡ安定性に対するＭＳ２アプタマーの効果
【０１９１】
２つの可能性ある機序が、ＳａＣａｓ９０ｘＭＳ２ｍＲＮＡのレンチウイルス様粒子へのパッケージングに寄与する可能性がある。第１に、Ｒｕｌｌｉ，  Ｓ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２００７；  ８１（１２）：  ６６２３−６６３１によって記載されているように、細胞性ｍＲＮＡ（ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡを含む）は、レンチウイルス様粒子中に非特異的にパッケージングされ得る。第２に、ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡは、ＮＣ−ＭＣＰ融合タンパク質または他のレンチウイルスタンパク質が結合し得るいくつかのＲＮＡ構造を有する可能性がある。ＧＦＰ細胞レポーターアッセイによって、ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２またはＳａＣａｓ９０ｘＭＳ２のいずれかを含有する未濃縮レンチウイルス様粒子のゲノム編集活性が比較された場合、この２つによって生成したＧＦＰ＋細胞のパーセンテージは、ほとんど相違を示さなかった（９．４％±０．１％、Ｎ＝４；９．１％±０．２％、Ｎ＝４；ｐ＝０．１７）。アプタマーは、ＳａＣａ９  ｍＲＮＡがレンチウイルス様粒子にパッケージングされるのに必須ではないが、ＮＣ−ＭＣＰ融合物は、未改変パッケージングプラスミドによってパッケージングされたＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡの量と比較して、ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡのパッケージングを１０倍大幅に増強した。
【０１９２】
細胞におけるＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡレベルに対するＭＳ２アプタマーの効果を調べるために、ｍＲＮＡレベルに対するＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡの３’末端に付加された０、１、２、３および１２コピーのＭＳ２アプタマー（プラスミド番号１５〜１９）の効果を評価する実験を実施した。ＳａＣａｓ９ｎ×ＭＳ２（ｎは、０、１、２、３または１２を示す）をコードする等量のプラスミドＤＮＡを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトし、ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡの定常状態レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって比較した。ＳａＣａｓ９コード配列の後への１つのアプタマーの付加は、ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡの定常状態レベルをわずかに低下させるが、２つまたはそれより多いアプタマーの付加は、ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡの定常状態レベルを有意に低下させることがわかった（表６）。ｍＲＮＡレベル低下と一致して、ＳａＣａｓ９ｎ×ＭＳ２をコードするプラスミド（ｎは、０、１、２、３または１２を示す）（２５０ｎｇ）が、ＧＦＰレポーター細胞（２４ウェルプレート）中にＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を発現するプラスミド（２５０ｎｇ）と同時トランスフェクトされた場合に、１つのアプタマーは、観察されるＧＦＰ＋レポーター細胞のパーセンテージをわずかに低下させるが、より多くのアプタマーは、観察される数をさらに低下させる（表６）。トランスフェクションの７２時間後にフローサイトメトリーおよびｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を、ｑＲＴ−ＰＣＲのトランスフェクション効率対照として使用した。このデータは、ＭＳ２アプタマーの付加が、ＳａＣａｓ９安定性を低下させたことを示唆する。ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡは、ひとたび、レンチウイルス様粒子から放出されると、置き換え（再生）可能でないので、このｍＲＮＡ安定性低下は、ゲノム編集活性に対して測定可能な効果を有し得る。
表６．  ＳａＣａｓ９発現に対するＭＳ２アプタマーの効果
【表６】
2021522783.tif 000019
４回の反復の平均±標準誤差を示した。＃：アプタマーなしと比較してｐ＜０．０００１；＃＃、１つのアプタマーと比較してｐ＜０．０００１；＊、１つのアプタマーを２つのアプタマーと比較した場合にｐ＜０．０５；＊＊、アプタマーなしを、１つ、２つ、３つまたは１２のアプタマーと比較した場合にｐ＜０．０１。
（実施例４）
ヒトＨＢＢ遺伝子３’ＵＴＲ配列は、ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡ安定性を増大した。
【０１９３】
ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２のＭＳ２アプタマーの後へのヒトＨＢＢ遺伝子３’ＵＴＲ配列の１つまたは２つのコピーの付加が、アプタマーの存在下でＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡ安定性および翻訳可能性を増強し得るか否かを評価する実験を実施した。プラスミドｐＳａＣａｓ９１×ｍｓ２およびｐＳａＣａｓ９１×ｍｓ２−２×３’ＵＴＲを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（プラスミド番号１６および３６）にトランスフェクトした。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって細胞におけるＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡの定常状態レベルを評価した。２つのヒトＨＢＢ遺伝子３’ＵＴＲ配列の付加は、ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡレベルの定常状態レベルを、３０％増大するとわかった（１．０±０．０３対１．３±０．０８、ｎ＝４、ｐ＜０．０５）。ＧＦＰレポーター細胞に、ＳａＣａｓ９１×ＭＳ２−２×３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡを含有するレンチウイルス様粒子またはＳａＣａｓ９１×ＭＳ２ｍＲＮＡ（安定化配列なし）を含有するレンチウイルス様粒子、およびＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を含有するレンチウイルス粒子（プラスミド番号３５を使用して作製された）を用いて同時形質導入した。ＳａＣａｓ９１×ＭＳ２−２×３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡを含有するレンチウイルス様粒子を用いる形質導入は、ＳａＣａｓ９１×ＭＳ２ｍＲＮＡを含有するレンチウイルス様粒子よりも、ＧＦＰ＋レポーター細胞のパーセンテージの有意な増大をもたらした（図３を参照のこと）。したがって、２コピーのＨＢＢ  ３’ＵＴＲ配列のＳａＣａｓ９１×ＭＳ２への付加は、システムの性能を改善した。
（実施例５）
ＰＰ７コートタンパク質およびそのアプタマーに基づくＳａＣａｓ９レンチウイルス様粒子は、高いゲノム編集活性を示した。
【０１９４】
ＰＰ７コートタンパク質（ＰＣＰ）は、別のＲＮＡアプタマー結合タンパク質である（Ｌｉｍ，  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００１；  ２７６（２５）：  ２２５０７−２２５１３およびＷｕ，  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２０１２；  １０２（１２）：  ２９３６−２９４４を参照のこと）。ＭＣＰおよびそのアプタマー配列の代わりの、このシステムにおけるＰＰ７タンパク質およびその強制力を持つアプタマー配列の有用性を比較する実験を実施した。ＭＣＰがＰＣＰと置き換えられ、それによって、ＮＣ−ＰＣＰ融合物を作出するパッケージングプラスミドが産生された。また、ＭＳ２アプタマーコード配列がＰＰ７アプタマーコード配列によって置き換えられたＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡ発現プラスミド（プラスミド番号２０、ｐＳａＣａｓ９１×ＰＰ７）も構築された。これらのプラスミドを使用して、ＳａＣａｓ９１×ＰＰ７ｍＲＮＡがパッケージングされたレンチウイルス様粒子を作製した。ＳａＣａｓ９１×ＰＰ７を含有するレンチウイルス様粒子を使用して、ＧＦＰレポーター細胞にＨＢＢ標的化ｓｇＲＮＡ１を発現するレンチウイルスベクターを用いて同時形質導入すると、ＳａＣａｓ９１×ＭＳ２を含有するレンチウイルス様粒子よりも多くのＧＦＰ＋レポーター細胞が得られた（９．４％±０．１４％、Ｎ＝４；８．１％±０．０４％、Ｎ＝４、ｐ＜０．０１）。
【０１９５】
表７に要約されるように、レンチウイルス様粒子中にパッケージングされたＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡの量を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって評価した。粒子の種類は、レンチウイルス（列２）、ＡＢＰ融合物を有さないパッケージングプラスミドによって産生されたレンチウイルス様粒子（列３）、ＮＣ−ＭＣＰ融合物パッケージングプラスミドによって産生されたレンチウイルス様粒子（列４〜６）およびＮＣ−ＰＣＰ融合物パッケージングプラスミドによって産生されたレンチウイルス粒子（列７〜９）を含んでいた。ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡは、アプタマーを含有していなかった（列２、３、４および７）、１つのアプタマーを含有していた（列５および８）または１つのアプタマーおよび２コピーのＨＢＢ  ３’ＵＴＲ（列６および９）。２００ｎｇのｐ２４を含有する種々のレンチウイルスまたはレンチウイルス様粒子からＲＮＡを精製した。ＲＮＡ精製、ＲＴおよびＰＣＲを正規化するために各試料に等量のＧＦＰ−レンチウイルスを含めた。コピー数推定は、各レンチウイルス粒子が、２コピーのレンチウイルスゲノムを含有するという仮定に基づいている。同量のＳａＣａｓ９発現レンチウイルス（粒子あたり２コピーのゲノムを有することが公知）またはレンチウイルス様粒子におけるＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡレベルを比較することによって、本発明者らは、各条件における粒子あたりのＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡの平均コピー数を算出した。表７には、平均±標準誤差が示されており、括弧中の数字は、反復数である。
表７．  種々のレンチウイルス様粒子中のＳａＣａｓ９のコピー数のＱＲＴ−ＰＣＲ比較
【表７】
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【０１９６】
ＮＣに融合されたＡＢＰがなく、ＳａＣａｓ９の停止コドンの後にアプタマーがないと、レンチウイルス様粒子は、粒子あたり２未満のコピー数のＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡしか有さないとわかった。これは、ウイルス様粒子によって高度に発現された細胞性ＲＮＡが無作為にパッケージングされることの結果であり得る。ＮＣに融合されたＡＢＰ（ＭＣＰまたはＰＣＰ）を有すると、アプタマー配列がＳａＣａｓ９に付加されるか否かに関わらず、粒子あたりのＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡコピー数は、１０〜２０倍増大した。ＨＢＢ  ３’ＵＴＲの付加は、両ＡＢＰを有する場合にコピー数を３倍増大し、これは、パッケージング前後のＲＮＡ安定性の増大の結果である可能性が最も高い。１つのアプタマーをＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡに付加することは、アプタマーを有さないＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡと比較して、粒子あたりのＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡコピー数を増大させなかったが、これは、アプタマーが、ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡのＮＣ−ＡＢＰ融合タンパク質への結合を増大させるが、ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡの安定性を低下させる結果の組合せである可能性が最も高い。ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡに対するアプタマーのこれらの効果はまた、ＨＢＢ  ３’ＵＴＲがＡＢＰへの結合を増大することはできないが、ｍＲＮＡ安定性を増大するので、ＨＢＢ  ３’ＵＴＲ付加が、粒子あたりのＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡコピー数を増大するという観察結果一致する。
【０１９７】
ウイルスタンパク質ＭＡ、ＣＡおよびｐ１５の発現（ＮＣは、それからプロセシングされる）もまた、正常ＧＦＰレンチウイルスベクターにおいて、ならびにＭＣＰおよびＰＣＰベースのレンチウイルス様粒子において、ウエスタンブロッティングによって評価した。ＮＣ−ＰＣＰ融合タンパク質は、単一バンドとして移動し、約２２ｋＤａの予測サイズを有するとわかったが、ＮＣ−ＭＣＰ融合タンパク質について約１４ｋＤａのさらなる小さいバンドが観察され、これは、部分分解を示す。ＭＡおよびＣＡタンパク質は、すべての粒子から予測されるサイズで移動すると観察され、これは、ＭＣＰまたはＰＣＰのＮＣタンパク質への挿入が、他のレンチウイルスタンパク質のプロセシングに影響を及ぼさないことを示唆する。ＭＣＰ−およびＰＣＰ−ベースのレンチウイルス様粒子の電子顕微鏡解析によって、同様の粒子サイズが明らかとなった（図４を参照のこと）。
（実施例６）
レンチウイルス様粒子からのＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡの一過性発現。
【０１９８】
レンチウイルス様粒子から放出されるＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡの期間を決定するために、ＳａＣａｓ９１ｘＰＰ７ｍＲＮＡを含有するレンチウイルス様粒子（プラスミド番号２０）、ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２ｍＲＮＡを含有するレンチウイルス粒子（プラスミド番号１６）またはＳａＣａｓ９１×ＭＳ２−２×３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡを含有するレンチウイルス粒子（プラスミド番号３６）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質導入し、形質導入後２４、４８、７２および９６時間でのＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡのレベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。対照として、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ、プラスミド番号１５を使用して作製された）および組み込み欠陥レンチウイルス（ＩＤＬＶ、プラスミド番号３１を使用して作製された）から発現されたＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡレベルも評価した。逆転写の前にすべてのＤＮＡを排除し、したがって、検出されたすべてのＳａＣａｓ９核酸は、ｍＲＮＡであった。図５Ａに示されるように、ＡＡＶおよびＩＤＬＶの両方について、ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡは、形質導入の４８時間後に増大し、ＤＮＡ鋳型からの転写の開始と一致した。ＡＡＶを用いて形質導入された細胞におけるＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡのレベルは、形質導入の２４時間後よりも形質導入の９６時間後に依然として高かった。ＩＤＬＶを用いて形質導入された細胞におけるＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡレベルは、７２時間後に低下し始めたが、形質導入の９６時間後の発現は依然として、形質導入の２４時間のものの約半分であった。改変されたＳａＣａｓ９がパッケージングされたレンチウイルス様粒子を用いて形質導入された細胞では、ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡのレベルは、図５Ｂに示されるように形質導入の２４時間後に低下した。形質導入の９６時間後には、ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡのレベルは、形質導入の２４時間後のものの２５％未満であった。ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡへのＨＢＢ  ３’ＵＴＲの付加は、その分解を減速した。
（実施例７）
ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡの一過性発現からの効率的なゲノム編集活性
【０１９９】
ＳａＣａｓ９１×ＭＳ２−２×３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡを含有するレンチウイルス様粒子（プラスミド番号３６を使用して作製された）およびＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を発現するレンチウイルス粒子（プラスミド番号３５を使用して作製された）を作製し、実施例１に記載されているようにＴａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎによって濃縮した。ウイルス濃度は、ｐ２４  ＥＬＩＳＡによって決定した。実施例１に記載されているように、レンチウイルス様粒子およびレンチウイルス粒子（各３０ｎｇのｐ２４タンパク質）を用いて、２．５×１０４個のＧＦＰレポーター細胞に同時形質導入した。実施例１に記載されているように、ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１は、レポーター細胞において内因性ＨＢＢ配列と１つのヌクレオチドミスマッチを有する鎌状赤血球症を引き起こすことが公知の突然変異されたＨＢＢ配列に対して設計した。形質導入されたＧＦＰレポーター細胞においてＧＦＰコード配列の第１および第２のコドンの間に挿入されたＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１の標的配列を増幅し、次世代配列決定を実施して、インデルを検出した。配列解析によって、対立遺伝子の８６．５％がインデルを有していることがわかった。したがって、記載されているシステムは、鎌状赤血球症突然変異の編集において極めて効率的であった。インデルの位置を綿密に調べることによって、インデルのほとんどは、予測される切断部位の付近であるとわかり（ＰＡＭから３ｎｔ）（上から下に配列番号１０３〜１１２を列挙する図６を参照のこと）、これは、観察されたインデルが、ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１によってガイドされた遺伝子編集からのものであることを示唆する。
（実施例８）
レンチウイルス様粒子へのｓｇＲＮＡパッケージング。
【０２００】
ｓｇＲＮＡもコートタンパク質とそれらそれぞれのアプタマーとの間の相互作用を介してレンチウイルス様粒子にパッケージングされ得るかどうかを決定するために実験を実施した。他の研究は、アプタマー配列が、ＳｐＣａｓ９  ｓｇＲＮＡのステムループＩＩ、テトラループまたは３’末端の後に付加され得ることを見出した（Ｓｈｅｃｈｎｅｒ，  Ｄ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１５；  １２（７）：  ６６４−６７０  ａｎｄ  Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２０１５；  ５１７（７５３６）：  ５８３−５８８）。しかし、ＳａＣａｓ９  ｓｇＲＮＡにおいてアプタマー付加を許容できる位置について利用可能な情報はなかった。改変プラスミドを、ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡおよび  ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１の両方を発現するプラスミドｐＳａＣａｓ９−ＨＢＢ−ｓｇＲＮＡ１（プラスミド番号２２）のＳａＣａｓ９  ｓｇＲＮＡ中のステムループＩＩ（ＳＴ２）、テトラループ（テトラ）または、３’末端の後に１つまたは２つのＭＳ２アプタマーを付加することによって生成した。改変プラスミドＤＮＡをＧＦＰレポーター細胞にトランスフェクトした。ｓｇＲＮＡの３’末端での１つのアプタマーの付加は、ＧＦＰ＋レポーター細胞のパーセンテージにおいてほとんど減少を示さなかった（表８）。これらの結果を考慮して、アプタマーの３’付加を含むｓｇＲＮＡを続く実験において使用した。
表８．  ｓｇＲＮＡの性能へのアプタマー付加の効果
【表８】
2021522783.tif 000021
平均±ＳＥＭ（Ｎ＝３）を示す。＊は、ＡＮＯＶＡおよびチューキーの多重比較検定によって対照（アプタマー不含有）より有意に低かったことを示す（ｐ＜０．０５）。
【０２０１】
別の実験を３’ＭＳ２アプタマー改変ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１（ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１３’ＭＳ２）が、パッケージングプラスミドを使用して、ＮＣ−ＭＣＰ融合タンパク質を発現するレンチウイルス様粒子にパッケージされ得るかどうかを評価するために実施した。改変および未改変ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を発現するプラスミドＤＮＡ（アプタマーを含まないｓｇＲＮＡについてプラスミド番号２２、３’ＭＳ２アプタマーを含むｓｇＲＮＡについてプラスミド番号２４）をＭＣＰベースパッケージンプラスミド（ｐｓｐＡＸ２−Ｄ６４Ｖ−ＮＣ−ＭＣＰ；プラスミド番号１１）を使用してレンチウイルス様粒子産生の際にＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした。リアルタイムＰＣＲは、レンチウイルス様粒子インプットによって正規化した後に未改変ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡよりも３０倍多いＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ３’ＭＳ２を検出した。以前のデータと一致して、ＮＣ−ＭＣＰ×１は、ＮＣ−ＭＣＰ×２がするよりも５倍多いＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１３’ＭＳ２をパッケージした。
【０２０２】
ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびＨＢＢ  ｓｇＲＮＡがレンチウイルス粒子に同時にパッケージされ得るかどうかを検査するために、ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２およびＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ３’ＭＳ２の両方を発現するプラスミドＤＮＡ（プラスミド番号２８）を、ＭＣＰベースパッケージングプラスミド（ｐｓＰＡＸ２−Ｄ６４Ｖ−ＮＣ−ＭＳ２、プラスミド番号１１）を用いてレンチウイルス様粒子産生の際にＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした。得られたレンチウイルス様粒子（細胞２．５×１０４個に対して７０ｎｇ  ｐ２４）を用いて実施例１に記載のとおりＧＦＰレポ−ター細胞に形質導入することは、３．６％に至るＧＦＰ陽性細胞を産生した。しかし、ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１含有レンチウイルス（プラスミド番号３５を使用して作製）を用いたＧＦＰレポーター細胞の同時形質導入は、ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを１０％を超えて増加させた。これらの実験は、ｓｇＲＮＡがレンチウイルス様粒子にパッケージされ得るが、パッケージされたｓｇＲＮＡの量は低い編集効率を生じたことを示している。別の実験を３’末端に２コピーのＨＢＢ  ３’ＵＴＲ配列を有するｓｇＲＮＡを含んでパッケージされたレンチウイルス様粒子（プラスミド番号４３を使用して作製）を使用して実施した。この改変は、ｓｇＲＮＡのパッケージング／機能を改善しないことが見出された。したがって、高効率遺伝子編集のために、ｓｇＲＮＡは、レンチウイルスまたはＡＡＶから発現される必要がある可能性がある。
（実施例９）
ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡのレンチウイルス様粒子送達は、オフターゲット遺伝子編集事象のリスクを低減した。
【０２０３】
ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１をＳｉｃｋｌｅ突然変異を標的化するように設計し、野生型ＨＢＢ配列に１つのヌクレオチドミスマッチを有する。したがって、ＧＦＰレポーター細胞中の対応する野生型ＨＢＢ遺伝子配列は、ＳａＣａｓ９／ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１に対して「オフターゲット」とみなされ得る。提供されるレンチウイルス様送達システムが低いオフターゲット遺伝子編集率を示すかどうかを決定するために、実験を実施した。ＧＦＰレポーター細胞をウイルス／ウイルス様粒子の４つの異なる組合せを用いて形質導入し、ＧＦＰレポーター細胞の野生型ＨＢＢ遺伝子座のインデル率を決定し、比較した。使用したウイルスまたはレンチウイルス様粒子は、次のとおりであった：条件１：ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２ｍＲＮＡを含有するレンチウイルス様粒子（プラスミド番号１６を使用して作製）；条件２：ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡを含有するＡＡＶ（プラスミド番号１５を使用して作製、ｐＳａＣａｓ９）；条件３：組み込み欠陥レンチウイルス（プラスミド番号３１を使用して作製、ｐＣＫ００２−ＨＢＢ−ｓｇＲＮＡ、不活性インテグラーゼを含有するｐｓｐＡＸ２−Ｄ６４Ｖ（Ａｄｄｇｅｎｅカタログ番号６３５８６）を使用してパッケージされた）、ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１の両方を発現するＩＤＬＶ；ならびに条件４：組み込みコンピテントレンチウイルス（プラスミド番号３１、ｐＣＫ００２−ＨＢＢ−ｓｇＲＮＡ１、および活性インテグラーゼを含有するプラスミドｐｓｐＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅカタログ番号１２２６０）を用いてパッケージされた。条件１および２について、ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を発現するためにＧＦＰレポーター細胞に、条件１ではレンチウイルス（ｐＦＣＫ−ＨＢＢ−ｓｇＲＮＡ１、プラスミド番号３５）を、または条件２ではＡＡＶ（ｐＡＡＶ−ＨＢＢ（ｎ）−ｓｇＲＮＡ１、プラスミド番号３４）を用いて同時形質導入した。結果を表９に示す。ＧＦＰレポーター細胞のＧＦＰカセットにおけるＳｉｃｋｌｅ突然変異中のインデルの生成のために、４つすべての処置においてＧＦＰレポーター細胞の異なるパーセンテージを観察した。形質導入細胞をＧＦＰ活性化選別によって選別した。ＧＦＰ陽性細胞パーセンテージは、８９〜９５％であり、４つの条件それぞれでの大部分の細胞における機能的ＳａＣａｓ９／ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１の存在を示している。内因性ＨＢＢ遺伝子座由来のＤＮＡを増幅し、次世代配列決定によって配列決定した。条件１に記載のレンチウイルス様粒子システムは、最も低いインデル率を有し、遺伝子編集のためにレンチウイルス様粒子によってＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡを送達することが他のウイルス送達システムより安全であることを実証している。
表９．  ＧＦＰレポーター細胞の野生型ＨＢＢ遺伝子座におけるインデル率
【表９】
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表１０−配列表
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【表１０−３】
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【表１０−４】
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【表１０−５】
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【表１０−６】
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【表１０−７】
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【表１０−８】
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【表１０−９】
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【表１０−１０】
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【表１０−１１】
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【表１０−１２】
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【表１０−１３】
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【表１０−１４】
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【表１０−１５】
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【表１０−１６】
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【表１０−１７】
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【表１０−１８】
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（実施例１０）
ＬＶＬＰへのＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡのパッケージングのためのシステム
【０２０４】
ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡをＬＶＬＰに効率的にパッケージするためのシステムを本明細書に記載する。ＬＶＬＰは、一過性ＳａＣａｓ９発現および非常に効率的なゲノム編集を可能にした。それらは、ＡＡＶおよびレンチウイルス送達と比較してより低いオフターゲット率をもたらした。本明細書に記載されるＳａＣａｓ９  ＬＶＬＰは、ＲＮＰ−、ｍＲＮＡ−およびナノ粒子−送達戦略の一過性発現特性を有するが、レンチウイルスベクターの形質導入効率を保持している。このシステムは、ゲノム編集のための種々の編集タンパク質をコードするｍＲＮＡをパッケージするために使用され得る。
【０２０５】
プラスミド。ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＃１２２５３）、ｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＃１２２５９）、ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＃１２２５１）、ｐｓＰＡＸ２−Ｄ６４Ｖ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＃６３５８６）、ｐＳＬ−ＭＳ２ｘ１２（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＃２７１１９）、ｐＫａｎＣＭＶ−ｍＲｕｂｙ３−１０ａａ−Ｈ２Ｂ（ａｄｄｇｅｎｅ  ＃７４２５８）およびｐＸ６０１−ＡＡＶ−ＣＭＶ：：ＮＬＳ−ＳａＣａｓ９−ＮＬＳ−３ｘＨＡ−ｂＧＨｐＡ；Ｕ６：：ＢｓａＩ−ｓｇＲＮＡ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＃６１５９１）は、Ａｄｄｇｅｎｅから購入した。ｐＣＤＨ−ＧＦＰは、ＳＢＩ（ＣＤ５１３Ｂ−１）から購入した。その他のプラスミドは、生成した（表２を参照されたい）。遺伝子合成は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｉｎｃ．によって行われた。生成したすべての構築物は、配列を確認した。プライマー、オリゴおよび合成ＤＮＡ断片についての配列情報は、表１０にある。
【０２０６】
遺伝子編集活性についてのＧＦＰレポーターアッセイ  Ｊａｖｉｄｉ−Ｐａｒｉｓｊａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．に記載されるＥＧＦＰレポーター細胞系をＧＦＰレポーターカセットに挿入された標的配列でのＳａＣａｓ９／ヒトベータヘモグロビン（ＨＢＢ）ｓｇＲＮＡ１の遺伝子編集活性を検出するために使用した。ＧＦＰレポーター細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来）は、ＥＧＦＰコード配列の開始コドンと２番目のコドンとの間へのＨＢＢ  ｓｉｃｋｌｅ突然変異およびＩＬ２ＲＧ標的配列の挿入によるＥＧＦＰ読み枠の破壊のためにＥＧＦＰを発現しなかった。遺伝子編集後に形成されたインデルは、ＥＧＦＰの読み枠を回復でき、ＥＧＦＰ発現を生じる。ＧＦＰ陽性細胞を蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６）によって解析した。単細胞懸濁液を解析のためにＰＢＳ／０．５％ＦＢＳ中に作製した。蛍光タンパク質発現を有さない細胞を陰性対照として使用し、９９．９％の細胞がマーカーの左側になる位置にマーカーを置いた。処置試料では、マーカーの右側にある細胞を陽性とみなした。
【０２０７】
ＡＡＶ６ウイルス産生および形質導入  ＳａＣａｓ９およびＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を発現するアデノ随伴ウイルスをＡＡＶベクターｐＳａＣａｓ９（ＳａＣａｓ９を発現する）およびｐＳａＣａｓ９−ＨＢＢ−ｓｇＲＮＡ１（ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を発現し、野生型ＨＢＢ遺伝子をＳｉｃｋｌｅ突然変異に変更する相同組換えのためのドナー鋳型を含有する）からそれぞれ作製した。ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）産生および濃縮はＶｉｒｏｖｅｋ，Ｉｎｃ．（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）によって実施された。ＡＡＶ６形質導入のために、細胞を無血清培地またはＯＰＴＩ−ＭＥＭに変更し、ＡＡＶ６をウイルスゲノム１０３〜１０４個／細胞の力価で細胞に加えた。２４時間後、培地を血清含有増殖培地に変更した。
【０２０８】
レンチウイルスおよびＬＶＬＰの産生  レンチウイルスをＪａｖｉｄｉ−Ｐａｒｉｓｊａｎｉ  ｅｔ  ａｌに以前記載されたとおり第２または第３世代パッケージングシステムを用いて産生した。ＳａＣａｓ９およびＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１の両方を発現するレンチウイルスベクターｐＣＫ００２−ＨＢＢ−ｓｇＲＮＡ１を組み込みコンピテントレンチウイルス（パッケージングプラスミドｐｓｐＡＸ２またはｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥによってパッケージされた）、および組み込み欠陥レンチウイルス（ＩＤＬＶ）パッケージングプラスミドｐｓｐＡＸ２−Ｄ６４ＶまたはｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ−Ｄ６４Ｖによってパッケージされた）を産生するために使用した。ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡを含んでパッケージされたＬＶＬＰを産生するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をパッケージングプラスミド（ＮＣ−ＭＣＰまたはＮＣ−ＰＣＰ改変）、エンベローププラスミド（ｐＭＤ２．Ｇ）およびＳａＣａｓ９発現プラスミドの混合ＤＮＡを、表１１に示すＤＮＡ比で用いてトランスフェクトした。ＶＰＲまたはＮＥＦ融合タンパク質をパッケージングのために使用した場合、ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡ、プラスミドＤＮＡもそれらの発現のために含めた。トランスフェクションは、ＤＮＡ：ＰＥＩ比１：２のポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）によって媒介された。細胞培養およびＤＮＡトランスフェクションは、Ｊａｖｉｄｉ−Ｐａｒｉｓｊａｎｉ  ｅｔ  ａｌに記載のとおり実施した。トランスフェクション２４時間後、培地をＯｐｔｉ−ＭＥＭに変更し、レンチウイルスまたはＬＶＬＰを２４時間ごとに１回の回収で２回回収した。上清を下に記載のさらなる処理の前に細胞デブリを除くために１０分間、５００ｇで回転させた。
表１１．  ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡを用いてロードされたレンチウイルス粒子を作製するためにＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトするために使用したプラスミドＤＮＡａ
【表１１−１】
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【表１１−２】
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ａトランスフェクション２４時間前に細胞１３×１０６個を１５ｃｍディッシュに播種した。
【０２０９】
レンチウイルスおよびＬＶＬＰの濃縮  ３つの方法をレンチウイルスおよびＬＶＬＰを濃縮するために使用した：１）ウイルスまたはＬＶＬＰを含有する上清を１０ｍｌ  ２０％ショ糖クッション上に置き、次に２０，０００ｇ、４℃、４時間遠心分離した；２）ウイルスまたはＬＶＬＰを含有する上清をＬｅｎｔｉ−Ｘ（商標）Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号６３１２３２）と３：１（体積／体積）の比で混合し、４℃、３０分間インキュベートし、次いで４℃、１，５００×ｇ、４５分間遠心分離した；３）上清をＫＲ２ｉ  ＴＦＦ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＫｒｏｓＦｌｏ（登録商標）Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２ｉ  Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂ、カタログ番号ＳＹＲ２−Ｕ２０）を濃縮−ダイアフィルトレーション−濃縮モードで使用して濃縮した。典型的には、上清１５０〜３００ｍｌを最初に約５０ｍｌに濃縮し、５００ｍｌから１０００ｍｌ  ＰＢＳを用いてダイアフィルトレートし、最後に約８ｍｌに濃縮した。ホローファイバーフィルターモジュールを修飾ポリエーテルスルホンから、分子量カットオフ５００ｋＤａで作製した。流速および圧力限界は、フィルターモジュールＤ０２−Ｅ５００−０５−Ｎについては８０ｍｌ／分および８ｐｓｉであり、フィルターモジュールＣ０２−Ｅ５００−０５−Ｎについては１０ｍｌ／分および５ｐｓｉであった。ＴＦＦ法が最良の活性を有するレンチウイルスおよびＬＶＬＰを産生したことから、他に述べる場合を除いてデータは、ＴＦＦシステムによって濃縮したウイルスまたはＬＶＬＰを用いて得た。
【０２１０】
レンチウイルスおよびＬＶＬＰ定量  ウイルス力価をｐ２４ベースＥＬＩＳＡ（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒ（商標）Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  Ｔｉｔｅｒ  Ｋｉｔカタログ番号ＶＰＫ−１０７）によって決定した。未精製試料をアッセイする場合、可溶性ｐ２４ペプチドが検出されないようにウイルス粒子を製造者の使用説明書に従って沈殿させた。
【０２１１】
透過型電子顕微鏡  透過型電子顕微鏡をＣｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｈａｒｅｄ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  Ｗａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｂａｐｔｉｓｔ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｗｉｎｓｔｏｎ−Ｓａｌｅｍ、ＮＣ）で実施した。ネガティブ染色のために、３０ｍｌウイルス含有上清を超遠心分離を使用して約１ｍｌに濃縮した。次いで、プレーンカーボングリッド（ｐｌａｉｎ  ｃａｒｂｏｎ  ｇｒｉｄ）を２０μｌのウイルス試料に浸漬し、粒子をリンタングステン酸を用いて染色した。試料を乾燥させ、ＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ  Ｇ２  ３０  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＦＥＩ、Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ、ＯＲ）下で観察した。
【０２１２】
ウエスタンブロット解析  レンチウイルスおよびＬＶＬＰからのウイルスタンパク質を解析するために、精製レンチウイルスまたはＬＶＬＰ（２００ｎｇ  ｐ２４、ＥＬＩＳＡによって）を２０μｌの１×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液に溶解した。各試料中のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ウエスタンブロットによって解析した。使用した抗体は、ＭＡのためのＨＩＶ１  ｐ１７抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＰＡ１−４９５４、１：１０００）、ＮＣのためのＨＩＶ１  ｐ１５ポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ６６９５１、１：１０００）およびＣＡのためのｐ２４モノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号３１０８１０、１：１０００）を含んだ。
【０２１３】
ＳａＣａｓ９タンパク質を検出するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＧＦＰレポーター細胞に、ＳａＣａｓ９発現プラスミドＤＮＡを用いてトランスフェクトした、または１００ｎｇ  ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡパッケージＬＶＬＰおよび１００ｎｇ  ｐ２４のＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を発現するＩＤＬＶを用いて同時形質導入した。トランスフェクションまたは形質導入４８時間後、細胞を１００μｌの１×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液を用いて溶解させ、等体積の各試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離ならびにＨＡ−タグ化ＳａＣａｓ９を検出するための抗ＨＡ抗体（ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ、５１０６４−２−ＡＰ、１：１０００）および抗Ｃａｓ９抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａ、ＭＡＢ１３１８７２、クローン６Ｆ７、１：１０００）によるウエスタンブロット解析のためにロードした。抗ベータアクチン（Ｓｉｇｍａ、Ａ５４４１、１：５０００）をインプットの量を比較するために使用した。
【０２１４】
ＨＲＰコンジュゲート抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３１４３０、１：５０００）および抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（カタログ番号３１４６０、１：５０００）二次抗体をウエスタンブロットにおいて使用した。化学発光試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）をタンパク質シグナルを可視化するためにＬＡＳ−３０００  ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）下で使用した。
【０２１５】
レンチウイルスまたはＬＶＬＰからのＲＮＡ単離  ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮカタログ番号／ＩＤ：２１７００４）を濃縮したレンチウイルスまたはＬＶＬＰからＲＮＡを単離するために使用した。代替的にＲＮＡを、１４０μｌの粒子含有上清からＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて直接単離した。
【０２１６】
ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）をＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するために使用した。ＳａＣａｓ９、ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１およびＥＧＦＰに対して特異的なカスタム設計した加水分解プローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をｑＰＣＲにおいて、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と一緒に使用した。ＰＣＲをＡＢＩ  ７５００装置で実行した。
【０２１７】
レンチウイルスおよびＬＶＬＰ形質導入  種々の量のレンチウイルスまたはＬＶＬＰ（ｎｇ  ｐ２４タンパク質）を、８μｇ／ｍｌポリブレンを含む２４ウェルプレート中で増殖させた細胞２．５×１０４個に加えた。細胞を粒子含有培地で１２〜２４時間インキュベートし、その後、通常の培地に置き換えた。
【０２１８】
ヒト細胞での遺伝子編集  ＡＡＶ６から発現されたＣａｓ９を用いた遺伝子編集のために、ＳａＣａｓ９発現ＡＡＶ６およびＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１発現ＡＡＶ６を用いてＧＦＰレポーター細胞に形質導入した。ＳａＣａｓ９およびＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１の両方を発現するＬＶまたはＩＤＬＶ（インテグラーゼ中にＤ６４Ｖ突然変異を含有するパッケージングプラスミドを用いてパッケージされた）を用いた遺伝子編集のために、１０〜３００ｎｇ  ｐ２４と等量のウイルスを用いて２４ウェルプレート中で細胞２．５×１０４個に形質導入するために使用した。ＬＶＬＰを用いた遺伝子編集のために、種々の量のＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡ含有ＬＶＬＰを、ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を発現するＩＤＬＶと共に用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＧＦＰレポーター細胞に同時形質導入した。形質導入４８〜７２時間後、遺伝子編集活性をＧＦＰレポーターアッセイまたは次世代配列決定によって解析した。
【０２１９】
エプスタイン・バーウイルス形質転換によって不死化されたヒトリンパ芽球様細胞における遺伝子編集を検討するために、ヒトリンパ芽球様細胞系ＧＭ１６２６５をＣｏｒｒｉｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから購入した。リンパ芽球を２ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−グルタミンおよび１５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ  １６４０中、３７℃、５％二酸化炭素下で培養した。ＬＶＬＰおよびＩＤＬＶ形質導入のために、細胞２×１０５個を０．５ｍｌ  ＲＰＭＩ増殖培地に加えた。次に、１００  ｐ２４または５００  ｐ２４のＳａＣａｓ９  ＬＶＬＰおよびＩＬ２ＲＧ  ｓｇＲＮＡ  ＩＤＬＶを細胞に加えた。ポリブレンを最終濃度８μｇ／ｍｌで培地に加えた。新鮮培地を形質導入２０時間後に置き換えた。細胞を次世代配列決定によるＤＮＡ解析のために形質導入７２時間後に回収した。
【０２２０】
次世代配列決定およびデータ解析  次のＤＮＡ領域を次世代配列決定解析のために増幅した：１）内因性ＨＢＢ標的配列、２）内因性ＩＬ２ＲＧ標配列、および３）組み込まれたＧＦＰ発現カセット中のＨＢＢ標配列。配列決定のための内因性ＨＢＢ標的配列を増幅するために、ネステッドＰＣＲ戦略をウイルスベクター鋳型からの配列を増幅することを回避するために使用した。最初に、プライマーＨＢＢ−１８４９ＦおよびＨＢＢ−５２７７ＲをＨＢＢ遺伝子遺伝子座由来の３．４ｋｂ領域を増幅するために使用した。これら２つのプライマーは、ウイルスベクター中の鋳型由来の配列を増幅できない。次に、２つの内部プライマーＨＢＢ−ＭＵＴ−ＦおよびＨＢＢ−ＭＵＴ−Ｒプライマーを配列決定のための標的ＤＮＡを増幅するために使用した（表１０；配列番号３４〜４０）。内因性ＩＬ２ＲＧ標的配列を増幅するために、プライマーＩＬ２ＲＧ−１０２９ＦおよびＩＬ２ＲＧ−３３０１Ｒを処置細胞由来の標的領域を増幅するために使用した（ウイルスベクター中の鋳型から配列を増幅することはできない）、次に、配列決定のために、２つの内部プライマーＩＬ２ＲＧ−ｍｕｔ−Ｆ１およびＩＬ２ＲＧ−ｍｕｔ−Ｒ４を第１のＰＣＲ産生物由来の標的ＤＮＡを増幅するために使用した。配列決定のために、組み込まれたＥＧＦＰレポーター由来のＨＢＢ標的配列を増幅するために、レポーター−ｍｕｔ−Ｆおよびレポーター−ｍｕｔ−Ｒプライマーを使用した（表１０；配列番号９８〜１０２）。ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）からのプルーフリーディングＨｏｔＳｔａｒｔ（登録商標）ＲｅａｄｙＭｉｘをＰＣＲのために使用した。次世代配列決定の際の配列多様性を増加させるため、異なる数のスタガーヌクレオチドを異なる試料から同じ標的を増幅するために５’プライマーのバーコードの後に加えた。ＰＣＲ産生物の５’のからの単一末端読み取りデータは、Ｊａｖｉｄｉ−Ｐａｒｉｓｊａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．に記載の通りＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００を使用して次世代配列決定によって得た。低品質の読み取りデータは除いた。すべての配列をバーコードに基づいて選別した。
【０２２１】
３’リンカーおよび５’バーコード配列を除いた後に、得られた読み取りデータを突然変異解析のためにオンラインＣａｓ−Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェアに送った。参照配列を送る場合、ｓｇＲＮＡ標的から少なくとも１２ｎｔ離れていた場合はプライマー配列は除外した。そうでなければプライマー配列を参照に含めた。参照配列の５’１２ｎｔおよび３’１２ｎｔの両方を含有する読み取りデータだけをインデル解析に含めた。合計インデル率は、１と突然変異を含まない読み取りデータのパーセンテージとの間の差異であった。最も頻繁に観察された上位８〜１０個の読み取りデータを示した。
【０２２２】
ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡ劣化解析  ＩＤＬＶおよびＬＶＬＰから発現されるＳａＣａｓ９  ＲＮＡレベルを比較するために、ＨＥＫ２９３細胞２．５×１０４個に、３５ｎｇ  ｐ２４のＩＤＬＶまたはＬＶＬＰを用いて形質導入した。ＩＤＬＶ粒子はＳａＣａｓ９を発現でき、ＬＶＬＰはＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡを含んでパッケージした。形質導入２４時間後、細胞を細胞分裂を制限するために０．５％ＦＢＳを含有する培地で維持した。新鮮培地を４８時間ごとに交換した。細胞を形質導入２４、４８、７２および９６時間後に回収し、ＲＮＡ抽出およびＲＴ−ｑＰＣＲ解析が続いた。３つの加水分解プローブＳａＣａｓ９、ＧＡＰＤＨおよびＲＰＬＰ０を発現解析のために使用した。形質導入２４時間後の異なる粒子の相対的Ｃａｓ９  ｍＲＮＡレベルをＲＰＬＰ０への正規化によって決定した。新しいｍＲＮＡは、形質導入後にＬＶＬＰを含んで生成されなかったことから、ＲＮＡ劣化の解析における潜在的細胞増殖の干渉を回避するために、同じ粒子からのＣａｓ９  ｍＲＮＡのｍＲＮＡ劣化を評価する場合は、正規化は実施しなかった。しかし、ＲＰＬＰ０およびＧＡＰＤＨ発現は、試料調製が成功して、一貫していることを確認するためにすべての試料について検討した。
【０２２３】
統計解析  ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン５．０、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ）を統計解析のために使用した。ｔ検定を２つの群の平均を比較するために使用した。２群より多くからのデータを解析するために分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてチューキーの事後検定を実施した。２因子の場合は、ボンフェローニ事後検定をＡＮＯＶＡに続いて実施した。ｐ＜０．０５は統計的に有意とみなした。
【０２２４】
ヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質をＲＮＡ結合タンパク質と融合することは、レンチウイルス様粒子へのＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡの効率的なパッケージングを可能にする。特異的ＭＳ２／ＭＣＰ相互作用を介してＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡをＬＶＬＰにパッケージングするために、ＭＳ２結合タンパク質ＭＣＰをレンチウイルスタンパク質に融合し、ＭＳ２アプタマーに相互作用するＭＣＰをＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡの停止コドン後に加えた。最も効率的なｍＲＮＡパッケージングを有するＭＣＰ融合パートナーを見出すために、４つの異なるレンチウイルスタンパク質、ウイルスタンパク質Ｒ（ＶＰＲ）、ネガティブ調節因子（ＮＥＦ）、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）およびマトリックスタンパク質（ＭＡ）を、次の観察に基づいてＭＣＰのためのレシピエントタンパク質として探索した：１）突然変異体ＮＥＦ（３つの突然変異を含む：Ｇ３Ｃ、Ｖ１５３ＬおよびＧ１７７Ｅ）は、最大１１００分子／カプシドまでレンチウイルス粒子に組み込むことができ、外来タンパク質送達のためのビヒクルとして使用される；２）ＶＰＲは、ウイルスコアに最大５５０コピー／粒子まで組み込まれ、同様にタンパク質送達ビヒクルとして使用される；３）レンチウイルス粒子を形成する２５００〜５０００  Ｇａｇ前駆体のそれぞれ１つからプロセスされるＮＣは、ウイルスコアにおける主なＲＮＡ結合タンパク質である；および４）Ｇａｇタンパク質からもプロセスされるＭＡはｔＲＮＡに結合することが示されている。
【０２２５】
ＭＣＰは、重複図である図２および図７Ａに示す立体配置でＮＥＦおよびＶＰＲと融合した。ＭＣＰ−ＶＰＲおよびＮＥＦ−ＭＣＰはＬＶＬＰ産生の際に、未改変パッケージングプラスミドと同時トランスフェクトされたプラスミドＤＮＡから発現された（図７Ｂ）。ＭＣＰをＮＣと融合するために、パッケージングプラスミドをＮＣの第２の亜鉛フィンガーのコード配列の後にＭＣＰコード配列を挿入することによって改変した。ＮＣの第２の亜鉛フィンガーがビリオン産生に必要であり、このドメインを欠失させることがビリオン産生を１０分の１に低減したことから、このドメインは、ＭＣＰを用いて置き換えるのではなく保存された。ＭＣＰをＭＡに融合するために、ＭＡアミノ酸４４〜１３２についてのコード配列を、ＭＡのこの領域がウイルス産生に必要でないことから、パッケージングプラスミド中でＭＣＰのものを用いて置き換えた。Ｇａｇ前駆体タンパク質読み枠およびプロテアーゼプロセシング部位が保存されるようにパッケージングプラスミドのＮＣまたはＭＡにＭＣＰコード配列を挿入した。
【０２２６】
ＭＣＰの組み込みがビリオン産生に影響を与えるかどうかを検討するために、これらの構築物を使用してＧＦＰレンチウイルス産生効率を比較した。パッケージング細胞においてＭＣＰ−ＶＰＲまたはＮＥＦ−ＭＣＰを発現することは、元のパッケージングプラスミドを用いたＧＦＰレンチウイルス産生に影響を与えなかった。ＮＣ−ＭＣＰ改変パッケージングプラスミドは、元のパッケージングプラスミドと同様の効率でＧＦＰレンチウイルスを生成したが、ＭＡ−ＭＣＰ改変パッケージングプラスミドは、ウイルス産生効率の低減を示した（図７Ｃ）。
【０２２７】
ゲノム編集活性を比較するための簡易アッセイを得るために、ＧＦＰレポーター細胞（ＧＦＰレポーターレンチウイルスベクターを用いて形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来）を使用した。これらのＧＦＰレポーター細胞にＧＦＰ発現カセットを組み込み、ここでＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１によって標的化されるヒトベータヘモグロビン（ＨＢＢ）のＳｉｃｋｌｅ突然変異配列をＥＧＦＰ開始コドンと２番目のコドンとの間に挿入し、読み枠を破壊した。遺伝子編集から生じる標的配列中への挿入または欠失（インデル）は、ＥＧＦＰ読み枠およびＧＦＰ発現を回復できる。ＭＣＰをウイルスタンパク質に融合することが、ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡのＬＶＬＰへのパッケージングを増強できるかどうか検査するために、ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２（停止コドン後に１コピーのＭＳ２アプタマーを含むＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡ）を、元のパッケージングプラスミド（ＭＣＰ−ＶＰＲまたはＮＥＦ−ＭＣＰ発現を有するまたは有さない）による、またはＭＣＰ改変パッケージングプラスミドによるＬＶＬＰ生成の際に発現させた（図７Ｂ）。次にこれらのＬＶＬＰを、ヒトベータヘモグロビン（ＨＢＢ）のＳｉｃｋｌｅ突然変異を標的化するＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を発現する組み込み欠陥レンチウイルス（ＩＤＬＶ）ベクターと共に用いてＧＦＰレポーター細胞に同時形質導入した（３２）。ＮＣ−ＭＣＰ改変パッケージングプラスミドから作製されたＬＶＬＰは、ＭＣＰ組み込みのすべての他の戦略によって生成されたＬＶＬＰよりも有意に多いＧＦＰレポーター細胞を生成した（ｐ＜０．０１）（図７Ｄ）。したがってＮＣをさらなる実験のためのＭＣＰレシピエントタンパク質として使用した。
【０２２８】
ＭＣＰ二量体は、ＲＮＡアプタマー結合活性を有したが、モノマーまたはオリゴマーは有さなかった。ＮＣをＭＣＰの１または２コピーに融合したパッケージングプラスミドの性能を比較した場合、１コピーのＭＣＰに融合されたパッケージングプラスミドによって生成されたＬＶＬＰは、２コピーのＭＣＰに融合されたものより多いＧＦＰ＋レポーター細胞を産生した（５．７％±０．１％、Ｎ＝４、対４．４％±０．３％、Ｎ＝４；ｐ＜０．０１。したがって、１コピーのＭＣＰに融合された改変パッケージングプラスミドを続く実験において使用した。
【０２２９】
観察された遺伝子編集活性がＶＳＶ−Ｇによって促進される細胞外小胞中の核酸によって生じたかどうかを検査するために、ＮＣ−ＭＣＰ改変パッケージングプラスミドを、ｍＲｕｂｙ蛍光タンパク質を発現するが、いずれもレンチウイルスパッケージングタンパク質も発現しないプラスミドを用いて置き換えた対照を含めた。等体積の上清をＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１発現ＩＤＬＶを用いてＧＦＰレポーター細胞に同時形質導入し、パッケージングプラスミドを用いて産生された上清は、最大１５％のＧＦＰ＋レポーター細胞を生成した。一方、パッケージングプラスミドを用いずに産生された上清は、すべての条件下で０．５％未満のＧＦＰ＋レポーター細胞を生成し（図７Ｅ）、ｍＲｕｂｙ陽性率は、最も高い体積の上清を用いて処置した細胞において０．５％未満であった（図８）。ＶＳＶ−Ｇが両方の条件において存在したことから、データは、細胞外ビヒクルがＧＦＰ＋レポーター細胞の生成において主な役割を有さなかったことを示唆した。データは、残存プラスミドＤＮＡが観察された合計遺伝子編集活性にほとんど寄与しなかったことも示唆した。
【０２３０】
ＬＶＬＰ産生からの残存プラスミドＤＮＡのＧＦＰ＋レポーター細胞の生成における寄与をさらに検査するために、ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２ｍＲＮＡだけを発現する（ｐＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２）ならびにＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２ｍＲＮＡおよびＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１の両方を発現する（ｐＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２−ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１）構築物を作製した。予測されたとおり、ｐＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２−ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１プラスミドＤＮＡをＧＦＰレポーター細胞にトランスフェクトすることは、ｐＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２プラスミドＤＮＡをトランスフェクトするよりも有意に多いＧＦＰ＋レポーター細胞を生成した（図７Ｆ）。ＭＳ２アプタマーを含まないＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１がパッケージされ得ないことから、ｐＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２−ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１プラスミドＤＮＡから作製したＬＶＬＰがＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１の不十分なコピーを含有することが予測された。実際に、これらのＬＶＬＰは、単独で用いて形質導入された場合に、ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を発現するＩＤＬＶと共に用いて同時形質導入された場合よりも有意に少ないＧＦＰ＋レポーター細胞を産生した（ｐ＜０．０００１、図７Ｆ）。この実験において注目すべきことに、ＬＶＬＰ中に非特異的にパッケージされたｓｇＲＮＡもバックグラウンド活性に寄与し、なぜ高いバックグラウンド活性が図７Ｅにおいてよりも図７Ｆにおいて観察されたかを説明している。これらの観察は、ＬＶＬＰ産生の際に残存したプラスミドＤＮＡから主な寄与があるのではないことを示し、ＮＣ−ＭＣＰ  ＬＶＬＰを使用する場合のＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２ｍＲＮＡのさらに効率的なパッケージングを支持している。
【０２３１】
ヒトベータヘモグロビン（ＨＢＢ）３’非翻訳領域は、ＬＶＬＰにパッケージされたＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡのゲノム編集活性を大きく改善した。ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡのパッケージングのためのＭＳ２アプタマーの最良のコピー数を決定するために、０、１、２、３および１２コピーのＭＳ２アプタマーのＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡ発現への効果を検討した。ＳａＣａｓ９ｎｘＭＳ２（ｎは０、１、２、３または１２を示す）を発現する等量のプラスミドＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡの定常レベルをＲＴ−ｑＰＣＲによって比較した。ＳａＣａｓ９の停止コドン後への１つのアプタマーの付加は、ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡの定常レベルをわずかに減少させた一方で、１つより多いアプタマーの付加は、ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡを有意に減少させた（ｐ＜０．００１、図９Ａ）。ｍＲＮＡにおける減少と一致して、ＳａＣａｓ９ｎｘＭＳ２発現ＤＮＡをＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を発現するプラスミドと共にＧＦＰレポーター細胞に同時トランスフェクトした場合、１つのアプタマーはＧＦＰ＋レポーター細胞のパーセンテージをわずかに減少させた一方で、アプタマーが多いほどさらなる減少を生じた（図９Ｂ）。一貫して、ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２、ＳａＣａｓ９２ｘＭＳ２、ＳａＣａｓ９３ｘＭＳ２またはＳａＣａｓ９１２ｘＭＳ２含有するＬＶＬＰがＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１発現レンチウイルスとＧＦＰレポーター細胞に同時形質導入された場合、検査したすべての濃度においてＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２ＬＶＬＰは、最も多いＧＦＰ陽性細胞を生成し、ＳａＣａｓ９１２ｘＭＳ２ＬＶＬＰは最も少なく生成した（図９Ｃ）。
【０２３２】
アプタマーを含んでまたは含まずにＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡ安定性および翻訳可能性を増強するために、ヒトＨＢＢ遺伝子からの２コピーの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列をＳａＣａｓ９停止コドンの後でＭＳ２アプタマーの前に加えた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のプラスミドＤＮＡトランスフェクションは、ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２−ＨＢＢ  ３’ＵＴＲの定常状態レベルがＳａＣａｓ９０ｘＭＳ２のものの１．３倍であったことを示した（１．３±０．０８対１．０±０．０３、ｎ＝４、ｐ＜０．０５）。
【０２３３】
１つより多いＭＳ２アプタマーがＬＶＬＰの遺伝子編集活性を顕著に減少させたことから、１コピーのＭＳ２アプタマーをさらに研究した。ＭＳ２アプタマーおよびＨＢＢ  ３’ＵＴＲを含むまたは含まないＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡ（ＳａＣａｓ９０ｘＭＳ２、ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２、ＳａＣａｓ９０ｘＭＳ２−ＨＢＢ  ３’ＵＴＲ、ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２−ＨＢＢ  ３’ＵＴＲ）を含有するＬＶＬＰを作製し、それぞれの種類の粒子をＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１発現ＩＤＬＶと共に用いてＧＦＰレポーター細胞に形質導入した。フローサイトメトリー解析は、ＭＣＰを含まないと、ＬＶＬＰのＧＦＰ陽性細胞産生は非効率的になることを明らかにした（図９Ｄにおける破線）。ＭＣＰを含んで生成されたＬＶＬＰにおいて、ＭＳ２およびＨＢＢ  ３’ＵＴＲの両方の存在は、最も高いゲノム編集活性を生じた。驚くべきことに、ＭＳ２アプタマーを含まないＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡは、認識可能なＧＦＰ陽性細胞も産生できる。ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２ＬＶＬＰは、ＳａＣａｓ９０ｘＭＳ２ＬＶＬＰより低い活性を示し、ＭＳ２がＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡ安定性を減少させる以前の観察と一致する。ＨＢＢ  ３’ＵＴＲは、ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２ＬＶＬＰの性能を顕著に改善したが、ＳａＣａｓ９０ｘＭＳ２ＬＶＬＰのものは改善せず、別の観察は以前のデータと一致する。これらのデータは、１）ＭＣＰがＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡの効率的なパッケージングのために必要である；および２）ＭＳ２アプタマーはＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡ安定性を減少させるが、それらはＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡ／ＮＣ−ＭＣＰ会合を増加させることができる；ならびに３）ＨＢＢ  ３’ＵＴＲはＳａＣａ９  ｍＲＮＡ安定性を増加させ、ＭＳ２およびＨＢＢ  ３’ＵＴＲの存在はＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡ／ＮＣ−ＭＣＰ会合およびＳａＣａ９  ｍＲＮＡ安定性を改善したことを示唆している。
【０２３４】
ｓｇＲＮＡが遺伝子制御を増強するためのアプタマーを用いて改変される必要があり得るＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子制御のためのｄＣａｓ９  ｍＲＮＡのパッケージングの可能性を考慮する場合、１つより多いアプタマーが同じ実験において使用され得る。ＰＰ７／ＰＰ７コートタンパク質（ＰＣＰ）ベースパッケージングシステムもアプタマー組合せを可能にするために開発した。ＰＰ７／ＰＣＰは、ＲＮＡ研究において使用された別のＲＮＡアプタマー／ＡＢＰ対である。ＭＣＰをパッケージングプラスミドにおいてＰＣＰを用いて置き換え、ＭＳ２アプタマーはＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡ発現プラスミド（ＳａＣａｓ９１ｘＰＰ７を発現する）においてＰＰ７アプタマーによって置き換えた。ＳａＣａｓ９  ＬＶＬＰをパッケージしたＰＰ７／ＰＣＰも、ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１発現ＩＤＬＶと共にそれを用いてＧＦＰレポーター細胞に同時形質導入した場合に、ＧＦＰ＋レポーター細胞を効率的に産生できた（図９Ｄ）。驚くべきことに、ＰＣＰ改変パッケージングシステムは、ＰＰ７不含有ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡもパッケージでき、この場合、パッケージングはＰＣＰ依存性である。
【０２３５】
ＧＦＰレポーターアッセイデータは、ＬＶＬＰあたりのＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡコピー数のＲＴ−ｑＰＣＲ解析によって裏付けられた（図９Ｅ）。ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２−ＨＢＢ  ３’ＵＴＲを含有するＬＶＬＰが最も高いパーセンテージのＧＦＰ陽性細胞を生じた観察と一致して、それらは、最も高いＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡコピー数を有した（約５０倍のＲＮＡ分子が、同様のｐ２４タンパク質を含むレンチウイルスベクターに含有された）。ＳａＣａｓ９０ｘＭＳ２およびＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２ＬＶＬＰは、粒子あたりで同様のコピーのＣａｓ９  ｍＲＮＡを有するが、Ｃａｓ９１ｘＭＳ２ＬＶＬＰの遺伝子編集活性は、Ｃａｓ９０ｘＭＳ２ＬＶＬＰのものより一貫して低かった（図９Ｄ）。これは、ＭＳ２アプタマーがＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡ安定性を減少させる結果である可能性がある。
【０２３６】
ＭＣＰ／ＭＳ２およびＰＣＰ／ＰＰ７ベースシステムによってパッケージされたＬＶＬＰを比較して、ＰＣＰ／ＰＰ７パッケージＳａＣａｓ９  ＬＶＬＰは、ＨＢＢ  ３’ＵＴＲがＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡに加えられなかった場合に、ＭＣＰ／ＭＳ２パッケージＬＶＬＰのものよりもより良好な遺伝子編集活性を有した。ＨＢＢ  ３’ＵＴＲがＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡに加えられた場合は、逆になった（図９Ｄ）。ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２−ＨＢＢ  ３’ＵＴＲ  ＬＶＬＰは、複数回の反復において最良の遺伝子編集活性を一貫して示した。
【０２３７】
ＬＶＬＰによって送達されたｍＲＮＡの発現持続期間を検討し、ＩＤＬＶのものと比較した。形質導入２４時間後、ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２−ＨＢＢ  ３’ＵＴＲ  ＬＶＬＰは、最も高いＣａｓ９  ｍＲＮＡレベルを示し、それらの高いｍＲＮＡコピー数／粒子およびｍＲＮＡ安定性と一致している（図１０Ａ）。ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２ＬＶＬＰは、最も低いｍＲＮＡ発現を有し、それらの低い遺伝子編集活性と一致している。新規Ｃａｓ９  ｍＲＮＡの転写を示唆する、形質導入後４８時間でＩＤＬＶがＣａｓ９  ｍＲＮＡの発現を増加させたこととは対照的に、ＬＶＬＰによって送達されたすべてのｍＲＮＡは、異なる速度で徐々に減少した。形質導入２４時間後のそれぞれのｍＲＮＡレベルと比較して、ＳａＣａｓ９１ｘＰＰ７はＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２−ＨＢＢ  ３’ＵＴＲと同様の劣化速度を示した（図１０Ｂ）一方で、ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２は、より早い劣化速度を示した。これは、ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２−ＨＢＢ  ３’ＵＴＲおよびＳａＣａｓ９１ｘＰＰ７がＧＦＰレポーターアッセイにおいてＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２よりも成績が良好であった理由も説明できる。したがって、ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２−ＨＢＢ  ３’ＵＴＲ  ＬＶＬＰは、ＩＤＬＶウイルスベクターと比較して一過性の高い発現を達成できた。
【０２３８】
ＬＶＬＰからのタンパク質発現を検討した。Ｃａｓ９タンパク質発現は、ＳａＣａｓ９またはＨＡ（Ｃａｓ９のＣ末端のタグ）抗体のいずれかを用いて過発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＧＦＰレポーター細胞において容易に検出されたが、３００ｎｇ  ＬＶＬＰを用いて形質導入した４８時間後にＧＦＰレポーター細胞ではＣａｓ９発現をほとんど検出できなかった（図１０Ｃ）。これらの細胞は、ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１  ＩＤＬＶを用いて同時形質導入され、それらの１５％はフローサイトメトリー解析においてＧＦＰ陽性であり、ウエスタンブロットによってでは、これらの細胞においてＣａｓ９タンパク質は検出困難であったが、約４５％の細胞における成功した遺伝子編集を示唆している。データは、本発明者らが使用した方法によってはほとんど検出されなかったが、ＬＶＬＰは、効率的な遺伝子編集のために十分なＣａｓ９タンパク質を発現できたことを示している。オフターゲット率がＣａｓ９タンパク質の増加と共に増加していることから、ＬＶＬＰからの比較的低いＣａｓ９タンパク質も低いオフターゲットを確実にする。
【０２３９】
Ｇａｇ前駆体タンパク質は、異なる部位での異なる切断速度を有する連続的プロテアーゼ切断によって成熟タンパク質にプロセスされた（図１０Ｄ）。ＭＡ（ｐ１７）、ＣＡ（ｐ２４）およびｐ１５（それからＮＣがプロセスされる）に特異的な抗体を通常のＧＦＰレンチウイルスベクター、ＭＣＰ−ベースＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２ＬＶＬＰおよびＰＣＰベースＳａＣａｓ９１ｘＰＰ７ＬＶＬＰにおいてプロセスされたタンパク質のサイズを解析するために使用した。すべての粒子由来のＭＡおよびＣＡタンパク質は、同じ予測サイズを示し、解析時での適切な切断を示した（図１０Ｅ）。抗ＭＡ抗体は、弱い７５ｋＤａバンドをＭＣＰ−およびＰＣＰベースＬＶＬＰにおいて検出した。しかし、同様のバンドは、抗ＣＡまたは抗ｐ１５抗体によって検出されず、これは、プロセスされていないＧａｇ前駆体タンパク質が存在するのではないことを示している。抗ｐ１５抗体は、ＧＦＰレンチウイルスにおいて１５ｋＤａよりわずかに小さいバンドを検出した。このサイズは、解析の時点で、部位４および５での切断が検出可能なレベルで生じなかったことを示し、それらの低い速度と一致する。ｐ１５抗体は、ＰＣＰ−およびＭＣＰ−ベースＬＶＬＰにおいて２０〜２５ｋＤａの間のバンドを検出し、ＬＶＬＰにおけるＮＣ−ＰＣＰおよびＮＣ−ＭＣＰ融合タンパク質の予測されるサイズと合致する（図１０Ｄ）。ＭＣＰベースＬＶＬＰでは、追加的に小さなバンドがｐ１５抗体によって検出され、ｐ１５−ＭＣＰ融合タンパク質の部分分解を示した。これらのデータは、ＮＣにおけるＭＣＰまたはＰＣＰの挿入が部位１（ＭＡ／ＣＡ）、２（ＣＡ／ＳＰ１）および３（ＳＰ１／ＮＣ）でのＧａｇ前駆体切断にわずかに影響を有したことを示唆している。部位４（ＮＣ／ＳＰ２）および５（ＳＰ２／Ｐ６）での切断への影響は、ｐ１５抗体によって検出されたペプチドのサイズから判断して、解析の時点でこれらの部位が通常のＬＶにおいてでさえ切断されていなかったことから不明であった。ＭＣＰ−およびＰＣＰ−ベースレンチウイルス様粒子の電子顕微鏡解析は、ＧＦＰレンチウイルスと同様の粒子サイズを明らかにした（図１１）。
【０２４０】
ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡをパッケージしたＬＶＬＰは、高効率のゲノム編集を可能にする。ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡをパッケージしたＬＶＬＰの遺伝子編集活性をさらに決定するために、本発明者らは、ＳａＣａｓ９１ｘＭＳ２−ＨＢＢ  ３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡをパッケージしたＬＶＬＰ（３０ｎｇ  ｐ２４タンパク質）を６０ｎｇ  ｐ２４のＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１発現ＩＤＬＶと共に用いて、ＧＦＰレポーター細胞２．５×１０４個に同時形質導入した。形質導入４８時間後、１３％のレポーター細胞はＧＦＰ陽性になった。ＧＦＰ発現カセット中のＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１に対する標的ＤＮＡを増幅し、次世代配列決定によって配列決定した。全体で、８６．５％の対立遺伝子は、主に、ＰＡＭから３ｎｔ離れている予測された切断部位の周辺に（図１２Ｂ）インデルを有した（図１２Ａ）。データは、ＬＶＬＰによってＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡを送達することは、インデルを生成することに非常に効率的であることを実証した。
【０２４１】
内因性標的でのＳａＣａｓ９  ＬＶＬＰの活性を検査するために、その突然変異がＸ連鎖重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ−Ｘ１）を生じるヒトＩＬ２ＲＧを標的化するｓｇＲＮＡを発現するＩＤＶＬを調製した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、３０ｎｇ  ｐ２４のＳａＣａｓ９  ＬＶＬＰおよび６０ｎｇのＩＬ２ＲＧ  ｓｇＲＮＡ  ＩＤＬＶは、標的配列に１３％インデルを生成した（図１２Ｃ）。ヒトリンパ芽球（細胞２×１０５個）では、両方の種類の粒子の１００または５００ｎｇ  ｐ２４の同時形質導入は、標的配列に１１％または８７．６％インデルを生成した（図１２Ｄ）。インデル率は、異なる条件下で異なるが、最も頻繁に観察された突然変異は同じであった。データは、ＳａＣａｓ９  ＬＶＬＰが複数の細胞において異なる標的遺伝子を標的化するために使用できたことを示した。
【０２４２】
ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡをパッケージしたＬＶＬＰは、ウイルスベクターのものより低いオフターゲット率を示した。  ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１をＨＢＢ  Ｓｉｃｋｌｅ細胞突然変異を標的化するように設計し、それは野生型ＨＢＢ配列に１つのヌクレオチドミスマッチを有する（図１２Ｅ）。このようにＧＦＰレポーター細胞中の対応する野生型ＨＢＢ遺伝子配列は、ＳａＣａｓ９／ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１についての「オフターゲット」とみなされ得る。野生型ＨＢＢ遺伝子座におけるインデル率をＳａＣａｓ９がＬＶＬＰ、ＡＡＶ６、ＩＤＬＶ、またはＳａＣａｓ９発現ＬＶによって送達された場合に比較した。機能的ＳａＣａｓ９／ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を有する細胞のパーセンテージを調節するために、ＧＦＰ陽性細胞をＧＦＰ活性選別によって形質導入４８時間後に選別した。選別時（形質導入４８時間後）に、ＧＦＰ陽性率のパーセンテージは、ＬＶ、ＬＶＬＰ、ＩＤＬＶおよびＡＡＶ６（１０４ｖｇ／細胞）を用いて処置した細胞についてそれぞれ、１１．１％、２．１％、８．５％および６．５％であった。細胞はｐ２４量に基づいて同数のＬＶ、ＬＶＬＰおよびＩＤＬＶ粒子を用いて処置したが（細胞１．２５×１０６個に対して約７５０ｎｇ  ｐ２４）、組み込みコンピテントＬＶ処置細胞は、持続的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９発現のためにＩＤＬＶよりも高いＧＦＰ陽性率を既に示した。選別後、ＧＦＰ陽性率は、それぞれ９５．４％、８８．９％、９３．３％および９０．８％であり、各条件下で大部分の細胞における機能的ＳａＣａｓ９／ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１の存在を示唆している。次に内因性ＨＢＢ遺伝子座からのＤＮＡを選別した細胞から選別１週間後に増幅し、次世代配列決定に供した。ＬＶＬＰシステムは、内因性ＨＢＢ部位において最も低いインデル率を有し、ＬＶは最も高かった（図１２Ｅ）。これらのデータは、遺伝子編集のためのＬＶＬＰによるＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡ送達が他のウイルス送達システムより安全であることを実証している。
【０２４３】
上に記載される細胞において、Ｃａｓ−Ｏｆｆｉｎｄｅｒ）およびＣＲＩＳＰＯＲによって予測される９個の潜在的オフターゲット中のインデルを探索した。ＬＶ処置細胞においてでさえ９個の潜在的ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１オフターゲットの内の８個においてインデルは検出されなかった。しかし、オフターゲット８（第２０染色体、３３９８２２３０ｂｐ〜３３９８２３３７ｂｐ）では、ＬＶＬＰ形質導入細胞においてよりもわずかに多いインデルがＬＶ形質導入細胞において検出された（図１２Ｆ）。
【０２４４】
異なるパーセンテージのＧＦＰ陽性細胞を示した異なる粒子を用いて形質導入されたＧＦＰレポーター細胞があることから（図１２Ａにおいて使用された細胞、および図１２Ｅにおける未選別細胞）、これらの細胞におけるＧＦＰ陽性パーセンテージと標的配列（ＧＦＰ発現カセット中）インデル率との間の関係を解析した。インデル率は、ＧＦＰ陽性パーセンテージと共に直線的に増加することが見出された（図１３、直線回帰によりｒ２＝０．９４９７）。データから、異なる粒子種類のゲノム編集活性を比較するための本明細書に記載のＧＦＰレポーターアッセイの妥当性が検証された。
（実施例１１）
レンチウイルス様粒子へのＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰパッケージング
【０２４５】
プラスミド  ｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＃１２２５９）、ｐｓＰＡＸ２−Ｄ６４Ｖ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＃６３５８６）、ｐＣＳＩＩ−ＥＦ−ｍｉＲＦＰ７０９−ｈＣｄｔ（１／１００）（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＃８０００７）およびｐＸ６０１−ＡＡＶ−ＣＭＶ：：ＮＬＳ−ＳａＣａｓ９−ＮＬＳ−３ｘＨＡ−ｂＧＨｐＡ；Ｕ６：：ＢｓａＩ−ｓｇＲＮＡ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＃６１５９１）は、Ａｄｄｇｅｎｅから購入し、既に記載した。プラスミドは、実施例１０または表２に記載した。生成したすべての構築物は、配列を確認した。プライマー、オリゴおよび合成ＤＮＡ断片についての配列情報は、表１０にある。
【０２４６】
遺伝子編集活性についてのＧＦＰレポーターアッセイ  上に記載のＥＧＦＰレポーター細胞をＧＦＰレポーターカセット中に挿入された標的配列上のＳａＣａｓ９／ヒトベータヘモグロビン（ＨＢＢ）ｓｇＲＮＡ１またはＳａＣａｓ９／ＩＬ２ＲＧ−ｓｇＲＮＡ１の遺伝子編集活性を検出するために使用した。ＧＦＰレポーター細胞は、ＥＧＦＰコード配列の開始コドンと２番目のコドンとの間へのＨＢＢ  ｓｉｃｋｌｅ突然変異およびＩＬ２ＲＧ標的配列の挿入によるＥＧＦＰ読み枠の破壊のために、ＥＧＦＰを発現しなかった。遺伝子編集後に形成されたインデルは、ＥＧＦＰ読み枠を回復でき、ＥＧＦＰ発現を生じる。ＧＦＰ陽性細胞を上およびＬｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０１９  ｄｏｉ：  １０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｚ０９３に記載のとおり、蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６）によって解析した。
【０２４７】
ＡＡＶ６ウイルス産生および形質導入  ＳａＣａｓ９およびＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を発現するアデノ随伴ウイルスをＡＡＶベクターｐＳａＣａｓ９（ＳａＣａｓ９を発現する）およびｐＳａＣａｓ９−ＨＢＢ−ｓｇＲＮＡ１（ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を発現し、野生型ＨＢＢ遺伝子をＳｉｃｋｌｅ突然変異に変更する相同組換えのためのドナー鋳型を含有する）からそれぞれ作製した。ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）産生および定量をＶｉｒｏｖｅｋ，Ｉｎｃ．（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）によって実施された。ＡＡＶ６形質導入を無血清培地またはＯＰＴＩ−ＭＥＭでウイルスゲノム１０３〜１０４／細胞の力価で実施した。形質導入２４時間後、細胞を血清含有増殖培地に戻した。
【０２４８】
レンチウイルスおよびＬＶＬＰ産生  ＳａＣａｓ９およびＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１の両方を発現するレンチウイルスベクタープラスミドｐＣＫ００２−ＨＢＢ−ｓｇＲＮＡ１を、上に記載のとおり組み込みコンピテントレンチウイルスベクター（パッケージングプラスミドｐｓｐＡＸ２によってパッケージされた）および組み込み欠陥レンチウイルス（ＩＤＬＶ）ベクター（パッケージングプラスミドｐｓｐＡＸ２−Ｄ６４Ｖによってパッケージされた）を産生するために使用した。ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡ  ＬＶＬＰ産生も上に記載のとおりである。Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ  ＬＶＬＰを産生するために、１５ｃｍディッシュで増殖させた１３００万個の活発に分裂しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０ｍｌ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭに変更した。１６μｇのＡＢＰ改変パッケージングプラスミドｐｓｐＡＸ２−Ｄ６４Ｖ−ＮＣ−ＡＢＰ（ＡＢＰは、ＭＣＰ、ＰＣＰ、λ  Ｎ２２またはＣＯＭであってよい）、エンベローププラスミド（ｐＭＤ２．Ｇ）６μｇならびに、ＳａＣａｓ９およびアプタマー改変ｓｇＲＮＡを同時発現するプラスミドＤＮＡ１６μｇを１ｍｌ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中に混合した。７６ｕｌの１ｍｇ／ｍｌポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）を１ｍｌ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中に混合した。次に、ＤＮＡ混合物およびＰＥＩ混合物を混合し、室温、１５分間インキュベートした。次にＤＮＡ／ＰＥＩ混合物をＯｐｔｉ−ＭＥＭ中の細胞に加えた。トランスフェクション２４時間後、培地を１５ｍｌ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭに変更し、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ  ＬＶＬＰを２４時間ごとに１回の回収で２回回収した。上清を下に記載のさらなる処理の前に細胞デブリを除去するために１０分間、５００ｇで回転させた。
【０２４９】
レンチウイルスおよびＬＶＬＰの濃縮  回収し、清澄化した上清をＫＲ２ｉ  ＴＦＦ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＫｒｏｓＦｌｏ（登録商標）Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２ｉ  Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂ、カタログ番号ＳＹＲ２−Ｕ２０）を濃縮−ダイアフィルトレーション−濃縮モードで使用して濃縮した。典型的には、１５０〜３００ｍｌの上清を最初に約５０ｍｌに濃縮し、５００ｍｌから１０００ｍｌのＰＢＳでダイアフィルトレーションし、最後に約８ｍｌに濃縮した。ホローファイバーフィルターモジュールを修飾ポリエーテルスルホンから、分子量カットオフ５００ｋＤａで作製した。流速および圧力限界は、フィルターモジュールＤ０２−Ｅ５００−０５−Ｎについて８０ｍｌ／分および８ｐｓｉ、ならびにフィルターモジュールＣ０２−Ｅ５００−０５−Ｎについて１０ｍｌ／分および５ｐｓｉであった。
【０２５０】
レンチウイルスベクターおよびＬＶＬＰ定量  ウイルス力価をｐ２４ベースＥＬＩＳＡ（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ、  ＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒ（商標）Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  Ｔｉｔｅｒ  Ｋｉｔ、カタログ番号ＶＰＫ−１０７）によって決定した。未精製試料をアッセイする場合、可溶性ｐ２４タンパク質が検出されないようにウイルス粒子を製造者の使用説明書に従って沈殿させた。
【０２５１】
レンチウイルスおよびＬＶＬＰからのウイルスタンパク質のウエスタンブロット解析  精製レンチウイルスまたはＬＶＬＰ（ＥＬＩＳＡによって２００ｎｇ  ｐ２４）を２０μｌの１×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中に溶解した。各試料中のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離しウエスタンブロットによって解析した。使用した抗体は、マウスモノクローナル抗ＳａＣａｓ９抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａ、ＭＡＢ１３１８７２、クローン６Ｆ７、１：１０００）、ＭＡに対するウサギポリクローナルＨＩＶ１  ｐ１７抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＰＡ１−４９５４、１：１０００）、ＮＣに対するウサギポリクローナルＨＩＶ１  ｐ１５抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ６６９５１、１：１０００）およびＣＡに対するｐ２４マウスモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号３１０８１０、１：１０００）を含む。ＨＲＰコンジュゲート抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３１４３０、１：５０００）および抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（カタログ番号３１４６０、１：５０００）二次抗体をウエスタンブロットにおいて使用した。化学発光試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）をＬＡＳ−３０００  ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）下でタンパク質シグナルを可視化するために使用した。
【０２５２】
レンチウイルスまたはＬＶＬＰからのＲＮＡ単離およびＲＴ−ｑＰＣＲ解析  ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮカタログ番号２１７００４）を濃縮したレンチウイルスまたはＬＶＬＰからＲＮＡを単離するために使用した。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）をＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するために使用した。ｓｇＲＮＡ逆転写のために、キット中で提供されるハーフランダムプライマー（ｈａｌｆ  ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｒ）およびハーフｓｇＲＮＡ特異的プライマー（ｓｇＲＮＡ−Ｒ２）を逆転写のために使用した。ＳａＣａｓ９およびＥＧＦＰに特異的なカスタム設計加水分解プローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と一緒にｑＰＣＲにおいて使用した。ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１およびＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１テトラ−ｃｏｍ検出のために、ｓｇＲＮＡ−Ｆ１（配列番号３０）およびｓ００６７ＲＮＡ−Ｒ３をＳｙｂｒＧｒｅｅｎベースのＲＴ−ｑＰＣＲにおいてプライマーとして使用した。ＰＣＲをＡＢＩ７５００装置で実行した。
【０２５３】
ＬＶＬＰコアカプシドからの膜の除去  レンチウイルス様粒子をＷｉｅｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  １９９８，  ７２：  ２８４６−２８５４に記載のとおり０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００を用いて一過的に処置した。簡潔には、ＬＶＬＰを、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｔ−８９０ローター（２時間、１２０  ０００ｇ）を用いて０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００を含むまたは含まないＳＴＥ［１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ］中の１０％ショ糖の１ｍｌ層、およびＳＴＥ溶液中の２ｍｌ  ２０％ショ糖のクッションを含有するステップグラジエントを通して遠心分離した。ペレットにしたウイルスをウエスタンブロットまたはＲＴ−ｑＰＣＲ解析のために直接溶解した。
【０２５４】
レンチウイルスおよびＬＶＬＰ形質導入  種々の量の濃縮レンチウイルスまたはＬＶＬＰ（１０〜３００ｎｇ  ｐ２４タンパク質に相当）を８μｇ／ｍｌポリブレンを含む、２４ウェルプレートで増殖させた細胞２．５×１０４個に加えた。未濃縮ウイルス含有上清を、細胞への形質導入のために新鮮培地を用いて１：１比で希釈した。細胞を粒子含有培地を用いて１２〜２４時間インキュベートし、その後通常の培地で置き換えた。
【０２５５】
ヒト細胞における遺伝子編集  ＡＡＶ血清型６から発現されたＣａｓ９を用いた遺伝子編集のために、ＡＡＶ６を発現するＳａＣａｓ９およびＡＡＶ６を発現するＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１をＧＦＰレポーター細胞に同時形質導入した。ＳａＣａｓ９およびＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１の両方を発現するＬＶまたはＩＤＬＶ（インテグラーゼにＤ６４Ｖ突然変異を含有するパッケージングプラスミドを用いてパッケージされた）を用いた遺伝子編集のために、２４ウェルプレートで１０〜３００ｎｇ  ｐ２４に相当するウイルスを細胞２．５×１０４個に形質導入するために使用した。ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡ  ＬＶＬＰを用いた遺伝子編集のために、種々の量のＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡ  ＬＶＬＰ（ｐ２４によって定量）を、ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を発現するＩＤＬＶと共に用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＧＦＰレポーター細胞に同時形質導入した。Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ  ＬＶＬＰを用いた形質導入のために、種々の量のＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ  ＬＶＬＰを用いてヒト細胞に形質導入した。形質導入４８〜７２時間後、遺伝子編集活性をＧＦＰレポーターアッセイまたは次世代配列決定によって解析した。
【０２５６】
エプスタイン・バーウイルス形質転換によって不死化したヒトリンパ芽球様細胞における遺伝子編集を検討するために、ｓｉｃｋｌｅ細胞突然変異を有するまたは有さないヒトリンパ芽球様細胞系は、Ｃｏｒｒｉｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから購入した（ＧＭ１６２６５、Ｓｉｃｋｌｅ細胞突然変異を有する；ＩＤ０００８５、ＩＬ２ＲＧ遺伝子中に突然変異を有する）。リンパ芽球を２ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−グルタミンおよび１５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ  １６４０中で、３７℃、５％二酸化炭素下で培養した。ＬＶＬＰおよびＩＤＬＶ形質導入のために、細胞２×１０５個を０．５ｍｌ  ＲＰＭＩ増殖培地に加えた。次いでＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ  ＬＶＬＰを細胞に加えた。ポリブレンを培地に最終濃度８μｇ／ｍｌで加えた。新鮮培地に形質導入２０時間後に置き換えた。細胞を次世代配列決定によるＤＮＡ解析のために形質導入７２時間後に回収した。
【０２５７】
次世代配列決定およびデータ解析  組み込まれたＧＦＰ発現カセット中の内因性ＨＢＢ標的配列およびＩＬ２ＲＧ標的配列、ならびにＨＢＢおよびＩＬ２ＲＧ標的配列を配列決定解析のために増幅した。ネステッドＰＣＲ戦略を内因性ＨＢＢ  標的配列を増幅するために使用して、ウイルスベクター鋳型由来の配列を増幅することを回避した。最初に、プライマーＨＢＢ−１８４９ＦおよびＨＢＢ−５２７７ＲをＨＢＢ遺伝子遺伝子座由来の３．４ｋｂ領域を増幅するために使用した。これら２つのプライマーは、ウイルスベクター中の鋳型由来の配列を増幅できない。次にＨＢＢ−Ｆ１およびＨＢＢ−Ｆ２プライマーを配列決定のための標的ＤＮＡを増幅するために使用した。内因性ＩＬ２ＲＧ標的配列を増幅するために、プライマーＩＬ２ＲＧ−１０２９ＦおよびＩＬ２ＲＧ−３３０１Ｒを処置した細胞から標的領域を増幅するために使用し（ウイルスベクター中の鋳型由来の配列を増幅することはできない）、次いでプライマーＩＬ２ＲＧ−Ｆ１（配列番号９０）およびＩＬ２ＲＧ−３３０１Ｒを配列決定のために第１のＰＣＲ産生物から標的ＤＮＡを増幅するために使用した。配列決定のために、組み込まれたＥＧＦＰレポーター由来のＨＢＢ標的配列を増幅するために、レポーターＦおよびレポーターＲ１プライマーを使用した。ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）からのプルーフリーディングＨｏｔＳｔａｒｔ（登録商標）ＲｅａｄｙＭｉｘをＰＣＲのために使用した。精製したＰＣＲ産生物を次世代配列決定（Ａｍｐｌｉｃｏｎ  ＥＺ）を実施するためにＧｅｎｅｗｉｚ  Ｉｎｃ．（Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ、ＮＣ）に発送した。通常、読み取りデータ５０，０００個／アンプリコンが得られた。
【０２５８】
３’リンカーおよび５’バーコード配列を除いた後、得られた読み取りデータを突然変異解析のためにオンラインＣａｓ−Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェアに送った。参照配列を送る際に、プライマー配列は、それらがｓｇＲＮＡ標的から少なくとも１２ｎｔ離れている場合には除外した。そうでなければプライマー配列は、参照に含めた。参照配列（プライマー配列は除く）の５’１２ｎｔおよび３’１２ｎｔの両方を含有する読み取りデータだけをインデル解析に含めた。合計インデル率は、１と突然変異を含まない読み取りデータのパーセンテージとの間の差異であった。最も頻繁に観察される上位８〜１０個の読み取りデータを示した。
【０２５９】
ＧＦＰ陽性細胞出現の速度のモニタリング  ２４ウェルプレートに播種したＧＦＰレポーター細胞２．５×１０４個に、５０ｎｇ  ｐ２４のＣａｓ９／ＩＬ２ＲＧ  ｓｇＲＮＡ１テトラ−ｃｏｍＲＮＰ  ＬＶＬＰを用いて形質導入した、または１００ｎｇ  ｐ２４のＣａｓ９  ｍＲＮＡ  ＬＶＬＰおよびＩＬ２ＲＧ  ｓｇＲＮＡ１を発現する１００ｎｇ  ｐ２４のＩＤＬＶを用いて同時形質導入した。次いで時限ＧＦＰ蛍光スキャンニングのためにＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｓ３  ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）において細胞をインキュベートした。各処置から２ウェルおよび各ウェルから９スポットをスキャンした。スキャンニングは形質導入の直後に開始し、細胞を２時間ごとに１回、４８時間スキャンした。各画像のＧＦＰ陽性率を、画像中のＧＦＰ陽性面積を相面積（細胞によって占められている面積）で割ることによって算出した。
【０２６０】
統計解析  ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅを統計解析のために使用した。ｔ検定を２つの群の平均を比較するために使用した。２つより多い群からのデータを解析するために分散分析（ＡＮＯＶＡ）を実施し、チューキーの事後検定が続いた。２因子の場合はＡＮＯＶＡに続いてボンフェローニ事後検定を実施した。ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなした。
【０２６１】
ｓｇＲＮＡテトラループをアプタマーで置き換えることは、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ活性を最良に保存した。Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰのレンチウイルス様粒子へのパッケージングを検査した。戦略全体は、ＡＢＰをレンチウイルス様粒子に、上に記載のとおりＡＢＰをレンチウイルスヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）に融合することを介して組み込むことであり、Ｃａｓ９タンパク質と複合体化する対応するアプタマーをｓｇＲＮＡに加え、レンチウイルスカプシドアセンブリの際にＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰを形成する。Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰをレンチウイルスカプシドに特異的アプタマー／ＡＢＰ相互作用を介してパッケージする（図１４Ａ、右図）。エンドソームからの回避後、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰはカプシド脱コートに続いて細胞質に放出され、次いでＲＮＰ複合体は遺伝子編集を行うように核に進入する。
【０２６２】
この戦略を実行するために、アプタマー挿入を最良に許容し、Ｃａｓ９との複合体化後にヌクレアーゼ活性を保存するｓｇＲＮＡスキャフォールド中の位置を見出す必要がある。効率的なＣａｓ９  ｍＲＮＡパッケージングを媒介することから、ＭＳ２アプタマーを使用した。ステムループ２（ＳＴ２）にＭＳ２を挿入し、テトラループをＭＳ２を用いて置き換え、およびｓｇＲＮＡの３’末端の後にＭＳ２を付加して、３箇所の位置を検査した（図１４Ｂ）。ＳａＣａｓ９および、ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を標的化する改変ｓｇＲＮＡを同時発現するプラスミドＤＮＡをＧＦＰレポーター細胞にトランスフェクトした場合、ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１標的配列中のインデルは、ＧＦＰ発現を回復できる。テトラループまたはＳＴ２ループを置き換えることは、ＧＦＰ陽性レポーター細胞のパーセンテージをわずかに減少させたが、３箇所のいずれかに１つのＭＳ２を付加することは、トランスフェクション実験においてｇＲＮＡ活性を保存したことが見出された（図１４Ｃ）。２つのＭＳ２アプタマーの付加も検査した。１つのアプタマーはテトラループを置き換え、他の１つはＳＴ２ループまたは３’末端にあった。両方の場合で、ＧＦＰ陽性パーセンテージは、一貫して減少し、１コピーより多いＭＳ２がＲＮＡ安定性を減少させるという観察と一致した。したがって、１コピーのアプタマーをさらなる実験において使用した。
【０２６３】
これらのＭＳ２改変ｓｇＲＮＡがパッケージされ、ＬＶＬＰにより送達され得るかどうかも検査した。ＳａＣａｓ９タンパク質およびＭＳ２改変ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１をＬＶＬＰ調製の際に同時発現させ、ＬＶＬＰを用いて本発明者らのＧＦＰレポーター細胞に形質導入した。フローサイトメトリー解析は、テトラループにＭＳ２を有するＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を含有するＬＶＬＰ（ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１テトラ ＭＳ２）が、最も多いＧＦＰ陽性細胞をもたらし、３’末端にＭＳ２を含むＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を含有するＬＶＬＰ（ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１３’ＭＳ２）がそれに続いたことを見出した。ステムループＩＩでのＭＳ２（ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１ＳＴ２ ＭＳ２）が活性であったトランスフェクション実験とは対照的に、ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１ＳＴ２ ＭＳ２ＬＶＬＰはいかなる遺伝子編集活性もほとんど有さず（図１４Ｄ）、ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１ＳＴ２ ＭＳ２はパッケージされ得ないか、又は形質導入後工程を残存できないかのいずれかであることを示唆している。
【０２６４】
ｃｏｍ／ＣＯＭは、ｓｇＲＮＡパッケージングのためのアプタマー／ＡＢＰ対である。アプタマーを用いてテトラループを置き換えることが最良であったことを踏まえて、テトラループを置き換えるために使用できる追加的アプタマーを調査した。４つのアプタマー、ＭＳ２（２３）、ＰＰ７（２４）、ＢｏｘＢ（２５）およびｃｏｍ（２６）を標的結合目的のためのｓｇＲＮＡにおいて使用した（２２、２７〜２９）。テトラループを置き換える種々のアプタマー（ＭＳ２、ＰＰ７、ＢｏｘＢおよびｃｏｍ）を含むＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１の活性を検査した（図１５Ａ）。ＳａＣａｓ９および種々のアプタマー改変ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を同時発現するプラスミドＤＮＡをＧＦＰレポーター細胞にトランスフェクトした場合、ｃｏｍアプタマーを用いてテトラループを置き換えることは、未改変ｓｇＲＮＡと同じ率のＧＦＰ陽性細胞を生成した一方で、他の３つのアプタマーを用いてテトラループを置き換えることは、ＧＦＰ陽性率を顕著に低減した（図１５Ｂ）。
【０２６５】
異なるアプタマーを含むＬＶＬＰへのＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１のパッケージングを検査した。この目的のために、上に記載のとおりＡＢＰがヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）の第２の亜鉛フィンガードメイン後に挿入された、ＭＣＰ（ＭＳ２コートタンパク質、ＭＳ２に結合する）、ＰＣＰ（ＰＰ７コートタンパク質、ＰＰ７に結合する）、λＮ２２ペプチド（ＢｏｘＢに結合する）およびＣＯＭ（ｃｏｍに結合する）改変パッケージングプラスミドを、Ｃａｓ９が種々の改変ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１と共に複合体化したＲＮＰ含有ＬＶＬＰを作製するために使用した。これらのＬＶＬＰを用いてＧＦＰレポーター細胞に形質導入した。フローサイトメトリーは、ｃｏｍ／ＣＯＭ対によって生成されたＬＶＬＰが最も多いＧＦＰ陽性細胞を有し、ＭＳ２／ＭＣＰによって生成されたものがそれに続いたことを見出した。ＰＰ７／ＰＣＰおよびＢｏｘＢ／λＮ２２は、最も低い活性を有するＬＶＬＰを生成した（図１５Ｃ）。ＧＦＰ陽性細胞は、これらのＬＶＬＰが、ＧＦＰレポーター細胞に形質導入するために使用された場合にだけ観察されたが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では見出されず、ＧＦＰ発現ＤＮＡまたはウイルスの混入の可能性を排除している（図１６）。
【０２６６】
ｃｏｍ−ＣＯＭ組合せが最良の結果をもたらしたことから、パッケージングプラスミドのＣＯＭ改変が粒子アセンブリを損なうかどうかを検査した。未改変パッケージングプラスミドと比較して粒子アセンブ効率においてわずか１１％の減少が観察された（図１７）。このわずかな減少は、十分な粒子の産生を妨げないはずである。これらの実験を通じて、Ｃａｓ９  ＲＮＰ（またはＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡ）のレンチウイルスカプシドへの最も効率的なパッケージングのための位置（テトラループ）およびアプタマー／ＡＢＰ対（ｃｏｍ／ＣＯＭ）を同定した。
【０２６７】
ＬＶＬＰ中のＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰは観察された遺伝子編集活性の主要因であった。Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰをパッケージするために設計されたが、アプタマー不含有ＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡが未知の機構でパッケージされ得た以前の観察を考慮すると、観察された遺伝子編集活性は、同時パッケージされたＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡ由来である可能性がある。Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰまたはＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡが観察された遺伝子編集活性に寄与するかどうかを決定するために、Ｃａｓ９発現カセットをＨＨＢ  ｓｇＲＮＡ１テトラ−ｃｏｍ発現カセットから２つの異なるプラスミドに分離した。２つのプラスミドをＧＦＰレポーター細胞に同時トランスフェクトした場合、それらは、両方の発現カセットを含有する単一のプラスミドをトランスフェクトした場合と同じ効率でＧＦＰ陽性細胞を生成した（図１８Ａ）。しかし、Ｃａｓ９発現の非存在下でＨＨＢ  ｓｇＲＮＡ１テトラ−ｃｏｍをＬＶＬＰにパッケージした場合、これらのＬＶＬＰは、検証済みの機能的Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ  ＬＶＬＰと共に用いてＧＦＰレポーター細胞に同時形質導入しても、ほとんど遺伝子編集活性を有さなかった（図１８Ｂ）。
【０２６８】
Ｃａｓ９タンパク質は、細胞中でｓｇＲＮＡの安定性を保護するために必要である。これは、ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１テトラ−ｃｏｍを単独で発現すること、またはｓｇＲＮＡをＣａｓ９と同時発現することによって確認された。Ｃａｓ９を同時発現することは、ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１テトラ−ｃｏｍの発現を顕著に増加させた（図１８Ｃ）。ＤＮＡトランスフェクション後、ｓｇＲＮＡは恒常的に発現された。一方形質導入後に、ｓｇＲＮＡｓは形質導入後細胞内輸送を完了させ、新たなｓｇＲＮＡは生成されなかった。したがって、ｓｇＲＮＡへのＣａｓ９タンパク質の保護効果がさらに重要であることが予測される。これらのデータは、ｓｇＲＮＡ不安定性、特に形質導入後細胞内輸送で残存するｓｇＲＮＡの能力の欠如が、単一でパッケージされたＨＨＢ  ｓｇＲＮＡ１テトラ−ｃｏｍＬＶＬＰがＣａｓ９  ｍＲＮＡ  ＬＶＬＰとの同時形質導入後に不活性であることの理由を主に説明することを示唆している。
【０２６９】
これらの実験は、同時パッケージされたＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡに加えて、パッケージされたＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰも遺伝子編集のために使用され得ることを示している。Ｃａｓ９発現を伴ってパッケージされたＨＨＢ  ｓｇＲＮＡ１テトラ−ｃｏｍＬＶＬＰにおけるＣａｓ９タンパク質の存在を検討するために、濃縮されたＬＶＬＰのウエスタンブロット解析を実施した（図１８Ｄ）。予測されたサイズおよび量でウイルスタンパク質ＭＡ（ｐ１７）およびＣＡ（ｐ２４）が検出され、ＭＡおよびＣＡのプロセシングが影響されなかったことを示している。それからＮＣがプロセスされるｐ１５の検出は、ＧＦＰレンチウイルスにおいて（レーン１）および未改変パッケージングプラスミドを含んで生成されたＬＶＬＰにおいて（レーン３）１０ｋｄから１５ｋｄの間のバンドを示した。ＮＣ−ＭＣＰ改変パッケージングプラスミドによって生成されたＬＶＬＰ（レーン２）では、１５〜２０ｋｄの間に強いバンドが検出され、それは予測される２１．８ｋｄ  ＮＣ−ＭＣＰ融合タンパク質よりわずかに小さかった。しかし、ＮＣ−ＣＯＭ改変パッケージングプラスミドによって生成されたＬＶＬＰ（レーン４〜６）では、１５ｋｄよりわずかに小さなバンドが検出され、予測される１８．７ｋｄのＮＣ−ＣＯＭ融合タンパク質よりわずかに小さかった。抗ｐ１５は、すべての試料（ＧＦＰレンチウイルスを含む）において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥシステムによってまたはｐ１５もしくはｐ１５融合タンパク質の部分分解によって生じる可能性がある、予測されるよりもわずかに小さなバンドを検出した。
【０２７０】
驚くべきことに、Ｃａｓ９タンパク質は、ｓｇＲＮＡを含まない（レーン３、長期の曝露後に観察された）またはｓｇＲＮＡ中にテトラ−ｃｏｍアプタマーを含まない（レーン６）試料を含む、Ｃａｓ９発現を有する細胞において産生されたすべての種類のＬＶＬＰにおいて検出された。しかし、Ｃａｓ９は、ＧＦＰ発現レンチウイルスにおいて検出されなかった（図１８Ｄ、レーン１）。ＬＶＬＰにおけるＣａｓ９タンパク質の検出は、Ｃａｓ９タンパク質が観察された遺伝子編集活性に寄与できるが、Ｃａｓ９タンパク質およびｃｏｍ改変を有さないｓｇＲＮＡを含有するＬＶＬＰからの活性の欠如を説明できないことを示唆している。
【０２７１】
ｓｇＲＮＡのｃｏｍ改変は、ＬＶＬＰのコアカプシドにＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰを効率的にパッケージングするために必要であった。Ｃａｓ９タンパク質は、ｃｏｍ改変を有さないＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を含むＬＶＬＰにおいて検出された（図１８Ｄ、レーン６）。これらは、ＧＦＰレポーターアッセイにおいてわずかな遺伝子編集活性を示した（図１８Ｂ）。したがって、ｃｏｍアプタマーを含むまたは含まないＬＶＬＰ中のＣａｓ９タンパク質の相対的レベル（カプシドタンパク質ＣＡに正規化）を、粒子あたりのＣａｓ９タンパク質の量が、活性における差異を説明するかどうかを決定するために比較した。Ｃａｓ９／ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１テトラ−ｃｏｍＬＶＬＰ（ｃｏｍ＋）がＣａｓ９／ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１  ＬＶＬＰの２．９倍のＣａｓ９タンパク質を含有することが見出された（図１８Ｅ、ｃｏｍ−）。
【０２７２】
Ｃａｓ９タンパク質含有量に３倍未満の差異があったことから、Ｃａｓ９タンパク質のコンパートメント化を研究した。ＬＶＬＰがタンジェンシャルフローろ過によって濃縮されたことから、ＬＶＬＰは、エキソソームを含む膜構造を有する可能性があった。カプシドコア内のＲＮＰが、形質導入後細胞内輸送の際に最も遺伝子編集活性を保存しやすく、そのため界面活性剤耐性Ｃａｓ９タンパク質の量が重要であると想定された。カプシドコア内のＣａｓ９タンパク質を検出するために、膜小胞およびカプシドエンベロープと会合したＣａｓ９タンパク質を除去するために粒子を０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００を用いて一過的に処置した。Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００処置は、カプシドエンベロープと会合したＭＡタンパク質（ｐ１７抗体によって検出）の量を大きく減少させ、処置が機能したことを示している（図１８Ｆ）。ＣＡタンパク質は、異なる種類の粒子の異なるコアカプシド安定性を反映している可能性がある異なった程度に低減した。しかし、Ｃａｓ９タンパク質量は、未改変ｓｇＲＮＡを有するＬＶＬＰにおいて大きく低減されたが、テトラ−ｃｏｍ改変ｓｇＲＮＡを有するＬＶＬＰではわずかに低減されただけであった。Ｃａｓ９／ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１テトラ−ｃｏｍＬＶＬＰは、Ｃａｓ９／ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１  ＬＶＬＰと比較して６．８倍の界面活性剤耐性Ｃａｓ９タンパク質を有した。これらのデータは、ｓｇＲＮＡのテトラ−ｃｏｍ改変が界面活性剤耐性カプシドコアにおけるＣａｓ９タンパク質のパッケージングを促進し、コア保護Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰの量が遺伝子編集活性と相関することを示している。
【０２７３】
ｓｇＲＮＡパッケージングでのｃｏｍ−アプタマーの重要性をＬＶＬＰにおけるｓｇＲＮＡ含有量のＲＴ−ｑＰＣＲ解析によって検討した。使用したＰＣＲプライマーは、ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１およびＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１テトラ−ｃｏｍから異なるサイズのアンプリコンを産生したが、２３ｎｔ  ｃｏｍ−アプタマーの存在および非存在のために、異なる量のプラスミドＤＮＡをｑＰＣＲのための鋳型として使用した場合にプライマーは非常によく似た標準曲線を生じ（図１９）、ｃｏｍ−陽性およびｃｏｍ−陰性ｓｇＲＮＡ配列について同様の増幅効率を実証している。Ｃａｓ９タンパク質を含まないＬＶＬＰでは、ＨＨＢ  ｓｇＲＮＡ１テトラ−ｃｏｍレベルは、Ｃａｓ９タンパク質を含むＬＶＬＰより２．５倍大きかった。しかし、Ｃａｓ９およびｃｏｍ−陰性ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１を含むＬＶＬＰでは、ｓｇＲＮＡレベルは、Ｃａｓ９およびＨＨＢ  ｓｇＲＮＡ１テトラ−ｃｏｍを含むＬＶＬＰにおけるものの１／５０未満であった（図１８Ｇ）。これらのデータは、ｓｇＲＮＡのパッケージングがｃｏｍ−アプタマー依存性だがＣａｓ９タンパク質依存性ではないことを示した。Ｃａｓ９タンパク質は、パッケージされたｃｏｍ改変ｓｇＲＮＡの量をわずかに減少させた。これは、ｃｏｍ／ＣＯＭ相互作用へのＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ会合の負の効果による可能性が高い。したがってこれらのデータは、カプシドコアへのＣａｓ９タンパク質のパッケージングが、ｃｏｍ／ＣＯＭ相互作用を介してｓｇＲＮＡテトラ−ｃｏｍによって媒介されることを示した。Ｃａｓ９タンパク質は、ＬＶＬＰへのｓｇＲＮＡパッケージングのために必要ないが、形質導入の際にｓｇＲＮＡを保護するために必要である。ｃｏｍ改変を有するおよび有さないｓｇＲＮＡが比較のために使用された図１８に記載の実験を除いて、ｃｏｍ改変ｓｇＲＮＡを続くすべての実験において使用した。これ以降において、簡潔にするために、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰをＣａｓ９／ｓｇＲＮＡテトラ−ｃｏｍＲＮＰを示すために使用した。
【０２７４】
Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ  ＬＶＬＰは、効率的なゲノム編集を可能にし、オフターゲットの識別を改善した。記載のＣａｓ９  ＲＮＰ  ＬＶＬＰおよび上に記載のＣａｓ９  ｍＲＮＡ  ＬＶＬＰの遺伝子編集活性を比較した。Ｃａｓ９／ＨＨＢ  ｓｇＲＮＡ１  ＲＮＰ  ＬＶＬＰは、ＧＦＰレポーターアッセイにおいてＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡ  ＬＶＬＰと比較して同等の遺伝子編集活性を示した（図２０Ａ）。
【０２７５】
ＲＮＰ  ＬＶＬＰの遺伝子編集活性を、その突然変異がＸ連鎖重症複合免疫不全を生じる、別の標的、ＩＬ２ＲＧについて上に記載のＩＬ２ＲＧ  ｓｇＲＮＡ１を使用して次世代配列決定（ＮＧＳ）によってさらに検討した。Ｃａｓ９／ＩＬ２ＲＧ  ｓｇＲＮＡ１  ＲＮＰ  ＬＶＬＰを用いてＧＦＰレポーター細胞２．５×１０４個に形質導入した。形質導入７２時間後、内因性ＩＬ２ＲＧ領域を増幅し、ＮＧＳに供した。１５、４５および１００ｎｇ  ｐ２４のこれらの粒子は、４．１％、８．１％および２１．１％インデルを内因性ＩＬ２ＲＧ遺伝子に生じた（図２０Ｂ）。上に記載の研究において、３０ｎｇ  ｐ２４のＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡ  ＬＶＬＰおよび６０ｎｇのＩＬ２ＲＧ  ｓｇＲＮＡ  ＬＶは、１３％インデルをＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＩＬ２ＲＧにおいて生じ、したがって、これらのＲＮＰ  ＬＶＬＰは、同等のまたはさらに良好な遺伝子編集活性を示した。２００ｎｇ  ｐ２４のＩＬ２ＲＧ  ｓｇＲＮＡ１  ＲＮＰ  ＬＶＬＰを用いてＢリンパ芽球様２×１０５個に形質導入し、１８．３％インデルが検出された（図２１）。この活性は、同数のＢリンパ芽球様において１１％インデルを生じた１００ｎｇ  ｐ２４のＳａＣａｓ９  ｍＲＮＡ  ＬＶＬＰおよび１００ｎｇ  ｐ２４のＩＬ２ＲＧ  ｓｇＲＮＡ１発現ＩＤＬＶとも同等である。
【０２７６】
これらのデータはＲＮＰ  ＬＶＬＰが遺伝子編集においてＣａｓ９  ｍＲＮＡ  ＬＶＬＰと同程度に活性であったことを示した。ＲＮＰによるＣａｓ９の送達は、細胞あたりに送達されたＣａｓ９タンパク質の量のより良好な調節およびさらに一過性のＣａｓ９作用を提供するはずである。その両方が、オフターゲット率を低減することに役立つ。予測される９個の潜在的ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１オフターゲットは、すべて非常に低いインデルを有し、異なる送達方法間のオフターゲット率の比較を妨げる。しかし、鎌状赤血球症突然変異に対応する野生型ＨＢＢ配列は、ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１に１つだけのヌクレオチドミスマッチを有し（図２０Ｃ）、検出可能なオフターゲットインデルはＣａｓ９／ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１によって生成され得た。したがって、ＧＦＰレポーター細胞において、Ｃａｓ９／ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１がプラスミドトランスフェクションによって、またはＬＶ、ＩＤＬＶおよびＡＡＶによって送達された場合のオンターゲットインデル率（ＧＦＰレポーターカセット中の鎌状赤血球症突然変異において、図２０Ｃの下に示す）およびオフターゲットインデル率（ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１に１ヌクレオチドミスマッチを有する内因性野生型ＨＢＢ配列、図２０Ｃの上に示す）を研究した。結果は、Ｃａｓ９／ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１  ＲＮＰ  ＬＶＬＰがオンターゲットインデル率のオフターゲットインデル率に対する最も高い比を有し、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ／ＨＢＢ  ｓｇＲＮＡ１  ＬＶＬＰが２番目を有し、両方ともＬＶ、ＩＤＬＶおよびＡＡＶのものより高かった（図２０Ｄ）ことを示した。したがって、ＲＮＰ  ＬＶＬＰがオフターゲット効果からオンターゲット効果を最良に区別した。
【０２７７】
Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ  ＬＶＬＰは、形質導入後にＣａｓ９  ｍＲＮＡ  ＬＶＬＰより速い作用を示した。ＧＦＰレポーターアッセイをＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ  ＬＶＬＰ  およびＣａｓ９  ｍＲＮＡ  ＬＶＬＰ処置後のＧＦＰ陽性細胞出現の動態を比較するために使用した。この目的のために、ＧＦＰレポーター細胞２．５×１０４個に５０ｎｇ  ｐ２４のＣａｓ９／ＩＬ２ＲＧ  ｓｇＲＮＡ１  ＲＮＰ  ＬＶＬＰを用いて形質導入した、またはＧＦＰレポーター細胞に１００ｎｇ  ｐ２４のＣａｓ９  ｍＲＮＡ  ＬＶＬＰ、およびＩＬ２ＲＧ  ｓｇＲＮＡ１を発現する１００ｎｇ  ｐ２４のＩＤＬＶを用いて同時形質導入した。ＧＦＰ陽性細胞の出現を２時間ごとにモニターした。ＧＦＰ陽性細胞は、ＲＮＰ  ＬＶＬＰ処置細胞においてｍＲＮＡ  ＬＶＬＰ処置細胞においてよりも少なくとも６時間まで早く示した（図２０Ｅ）。形質導入３４時間後に２つの処置のＧＦＰ陽性面積率は収束した。データは、ｍＲＮＡ  ＬＶＬＰは有効に使用され得るが、ＲＮＰ  ＬＶＬＰはｍＲＮＡ  ＬＶＬＰおよびＩＤＬＶよりも早い作用を有することを示した。これは、エンドソームからのエスケープ後すぐにＲＮＰが核における機能のために利用できる一方で、ｍＲＮＡ  ＬＶＬＰおよびＩＤＬＶはＣａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮＡを発現するためにさらに時間が必要であるためであると考えられる。動態における差異も、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ  ＬＶＬＰにおける機能的構成成分がＣａｓ９  ｍＲＮＡ  ＬＶＬＰにおけるものと異なっていることを示している。
【０２７８】
ＬＶＬＰは、ドナー鋳型の存在下で効率的な相同組換えを媒介する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の１つの応用は、ドナー鋳型の存在下で相同組換えを促進することである。組み込み欠陥レンチウイルスベクターをドナー鋳型を準備するために使用した。パッケージングプラスミド中のＮＣのＣＯＭ改変は、ＧＦＰ発現レンチウイルスベクターのパッケージングをわずかに減少させたが（未改変パッケージングプラスミドについて１．０±０．１５、Ｎ＝３；ＮＣ−ＣＯＭ改変パッケージングプラスミドについて０．７３±０．１５、Ｎ＝６；ｐ＞０．０５）、これらのＣＯＭ改変ＧＦＰレンチウイルスベクターの形質導入後にＧＦＰ発現をほとんど除去した。加えて、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰのパッケージングはΨ媒介レンチウイルスゲノムパッケージングを減少させたが、差異は統計的有意性に達しなかった（ＲＮＰを有する、０．５３±０．１６、Ｎ＝３；ＲＮＰを有さない、０．９３±０．２１、Ｎ＝３；ｐ＞０．０５）。これらの観察から、ドナー鋳型は組み込み欠陥レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）によって別々に送達された。
【０２７９】
レンチウイルスベクターは、細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ改変のために広く使用されている。ＬＶＬＰを内因性ＩＬ２ＲＧプロモーターの下流への機能的ＩＬ２ＲＧ  ｃＤＮＡの挿入を促進するために使用した。このｃＤＮＡ挿入戦略は、疾患を生じる突然変異の性質に関わらずＳＣＩＤ−Ｘ１を処置するために使用できる。ドナー鋳型は、１．５ｋｂ  ５’相同アーム、１．１ｋｂ  ＩＬ２ＲＧ  ｃＤＮＡおよび３’相同アームを含有する。３’相同アームは、相同組換え後にｃＤＮＡがＩＬ２ＲＧゲノムＤＮＡの同様の長さを置き換えるように設計した。ＩＬ２ＲＧ  ｃＤＮＡは、ｃＤＮＡ媒介相同組換えの機会を低減するために元のｃＤＮＡとの差異を最大化するようにコドン最適化した。ドナー鋳型に加えて、レンチウイルスベクターもｃＤＮＡの挿入を促進するようにＩＬ２ＲＧ  ｓｇＲＮＡ１およびｓｇＲＮＡ２の発現を駆動する２つのＵ６プロモーターを含有した（図２２Ａ）。
【０２８０】
ドナー鋳型／ｓｇＲＮＡをＣａｓ９／ＩＬ２ＲＧ  ｓｇＲＮＡ１  ＲＮＰ  ＬＶＬＰを含むまたは含まないＩＤＬＶによって、リンパ芽球細胞に送達した。形質導入７２時間後、ゲノムＤＮＡを抽出し、標的領域を２ラウンドのＰＣＲ増幅によって増幅した（図２２Ａ）。最初のＰＣＲでは、１つのプライマーはドナー鋳型の外であり、したがって、相同組換えを伴わずには鋳型ＤＮＡから増幅できなかった。最初のＰＣＲの産生物をゲルから精製し、配列決定のために５’および３’接合部ＤＮＡを増幅する２回目のＰＣＲにおける鋳型として使用した。共通プライマーに加えて３個のプライマーを各ＰＣＲにおいて使用した。１つのプライマーは、ＨＲを含むＤＮＡを増幅するために挿入したｃＤＮＡ配列にマッチしており、別のプライマーは、ＨＲを含まないＤＮＡを増幅するために置き換えられるゲノムＤＮＡにマッチしていた。１００ｎｇ  ｐ２４のＬＶＬＰおよびＩＤＬＶを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞２．５×１０４個に形質導入した。５’接合部で、４６．２％の配列はＨＲを含まず（２９．６％はインデルを含まず、残りの１６．６％はインデルを含む）および５３．８％の配列はＨＲを含む（図２２Ｂ）ことが観察された。ＨＲを含む読み取りデータでは、標的配列がドナー鋳型に存在しないことからインデル率はバックグラウンドと同様であった。データは、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰが活性であり、１．１ｋｂ  ＤＮＡの標的化挿入を大きく増強したことを示した。ＰＣＲ産生物において５７％の読み取りデータがＨＲを含んだ観察は、これらのＬＶＬＰがＨＤＲを増強するためにＩＤＬＶと一緒に使用され得ることを示唆している。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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