(57)【要約】  慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）を含むＢ型肝炎感染症を処置するための組成物および方法が本明細書に開示される。
2021522864.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域を含むヘパドナウイルスエンベロープＨＢｓＡｇ−Ｓ融合タンパク質を含む組換えウイルス様粒子抗原（ＶＬＰ−Ａｇ）であって、前記抗原エピトープリピート領域が、ＨＢｓＡｇ−Ｓドメインのループ１およびループ２領域において発現される抗原エピトープからなる群から選択される、組換えウイルス様粒子抗原（ＶＬＰ−Ａｇ）。
【請求項２】
ループ１において発現される前記１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域が、アミノ酸配列ＣＸ1ＴＣＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＧＸ6ＳＭＸ7ＰＣ（配列中、Ｘ1はＫまたはＲであり、Ｘ2はＴまたはＭであり、Ｘ3はＴまたはＩであり、Ｘ4はＰ、ＴまたはＬであり、Ｘ5はＡまたはＶであり、Ｘ6はＮまたはＴであり、Ｘ7はＦまたはＹである）によって規定されるか、または前記１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域が、アミノ酸配列ＰＣＸ8ＴＣＸ9Ｘ10Ｘ11（配列中、Ｘ8はＫまたはＲであり、Ｘ9はＴまたはＭであり、Ｘ10はＴ、ＩまたはＳであり、Ｘ11はＰ、ＴまたはＬである）によって規定される、請求項１に記載の組換えＶＬＰ−Ａｇ。
【請求項３】
ループ２において発現される前記１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域が、コンセンサスアミノ酸配列ＣＣＣＴＫＰＸ12ＤＧＮＣＸ13（配列中、Ｘ12はＴまたはＳであり、Ｘ13はＴまたはＳである）によって規定される、請求項１に記載の組換えＶＬＰ−Ａｇ。
【請求項４】
前記１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域が、ＰＣＫＴＣＴＴＰ、ＰＣＲＴＣＴＴＰ、ＣＴＫＰＴＤＧＮＣ、ＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳ、ＣＴＫＰ（Ｔ／Ｓ）ＴＤＧＮＣ、ＰＣ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）ＴＰ、Ｃ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）Ｔ（Ｐ／Ｔ）ＡＱＧ（Ｎ／Ｔ）ＳＭ（Ｆ／Ｙ）ＰＳ、ＰＣＲＴＣＭＴＴＡＱＧＴＳＭＹＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣ、およびＰＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＴＤＧＮＣからなる群から選択される、請求項１に記載の組換えＶＬＰ−Ａｇ。
【請求項５】
前記ヘパドナウイルスエンベロープ融合タンパク質が、前記抗原エピトープリピート領域と前記エンベロープタンパク質との間にスペーサードメインを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＶＬＰ−Ａｇ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＶＬＰ−Ａｇをコードする核酸。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＶＬＰ−Ａｇおよび薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項９】
それを必要とする対象におけるＢ型肝炎感染症を処置する方法であって、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域を含むヘパドナウイルスエンベロープＨＢｓＡｇ−Ｓ融合タンパク質を含む組換えウイルス様粒子抗原（ＶＬＰ−Ａｇ）を前記対象に投与するステップであって、前記抗原エピトープリピート領域が、ＨＢｓＡｇ−Ｓドメインのループ１およびループ２領域において発現される抗原エピトープからなる群から選択される、ステップを含む方法。
【請求項１０】
ループ１において発現される前記１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域が、アミノ酸配列ＣＸ1ＴＣＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＧＸ6ＳＭＸ7ＰＣ（配列中、Ｘ1はＫまたはＲであり、Ｘ2はＴまたはＭであり、Ｘ3はＴまたはＩであり、Ｘ4はＰ、ＴまたはＬであり、Ｘ5はＡまたはＶであり、Ｘ6はＮまたはＴであり、Ｘ7はＦまたはＹである）によって規定されるか、または前記１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域が、アミノ酸配列ＰＣＸ8ＴＣＸ9Ｘ10Ｘ11（配列中、Ｘ8はＫまたはＲであり、Ｘ9はＴまたはＭであり、Ｘ10はＴ、ＩまたはＳであり、Ｘ11はＰ、ＴまたはＬである）によって規定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ループ２において発現される前記１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域が、コンセンサスアミノ酸配列ＣＣＣＴＫＰＸ12ＤＧＮＣＸ13（配列中、Ｘ12はＴまたはＳであり、Ｘ13はＴまたはＳである）によって規定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域が、ＰＣＫＴＣＴＴＰ、ＰＣＲＴＣＴＴＰ、ＣＴＫＰＴＤＧＮＣ、ＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳ、ＣＴＫＰ（Ｔ／Ｓ）ＴＤＧＮＣ、ＰＣ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）ＴＰ、Ｃ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）Ｔ（Ｐ／Ｔ）ＡＱＧ（Ｎ／Ｔ）ＳＭ（Ｆ／Ｙ）ＰＳ、ＰＣＲＴＣＭＴＴＡＱＧＴＳＭＹＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣ、およびＰＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＴＤＧＮＣからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヘパドナウイルスエンベロープ融合タンパク質が、前記抗原エピトープリピート領域と前記エンベロープタンパク質との間にスペーサードメインを含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
それを必要とする対象におけるＢ型肝炎感染症を処置するための医薬の製造における組換えウイルス様粒子抗原（ＶＬＰ−Ａｇ）の使用であって、前記ＶＬＰ−Ａｇが、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域を含むヘパドナウイルスエンベロープＨＢｓＡｇ−Ｓ融合タンパク質を含み、前記抗原エピトープリピート領域が、ＨＢｓＡｇ−Ｓドメインのループ１およびループ２領域において発現される抗原エピトープからなる群から選択される、使用。
【請求項１５】
ループ１において発現される前記１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域が、アミノ酸配列ＣＸ1ＴＣＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＧＸ6ＳＭＸ7ＰＣ（配列中、Ｘ1はＫまたはＲであり、Ｘ2はＴまたはＭであり、Ｘ3はＴまたはＩであり、Ｘ4はＰ、ＴまたはＬであり、Ｘ5はＡまたはＶであり、Ｘ6はＮまたはＴであり、Ｘ7はＦまたはＹである）によって規定されるか、または前記１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域が、アミノ酸配列ＰＣＸ8ＴＣＸ9Ｘ10Ｘ11（配列中、Ｘ8はＫまたはＲであり、Ｘ9はＴまたはＭであり、Ｘ10はＴ、ＩまたはＳであり、Ｘ11はＰ、ＴまたはＬである）によって規定される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
ループ２において発現される前記１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域が、コンセンサスアミノ酸配列ＣＣＣＴＫＰＸ12ＤＧＮＣＸ13（配列中、Ｘ12はＴまたはＳであり、Ｘ13はＴまたはＳである）によって規定される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１７】
前記１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域が、ＰＣＫＴＣＴＴＰ、ＰＣＲＴＣＴＴＰ、ＣＴＫＰＴＤＧＮＣ、ＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳ、ＣＴＫＰ（Ｔ／Ｓ）ＴＤＧＮＣ、ＰＣ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）ＴＰ、Ｃ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）Ｔ（Ｐ／Ｔ）ＡＱＧ（Ｎ／Ｔ）ＳＭ（Ｆ／Ｙ）ＰＳ、ＰＣＲＴＣＭＴＴＡＱＧＴＳＭＹＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣ、およびＰＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＴＤＧＮＣからなる群から選択される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１８】
前記ヘパドナウイルスエンベロープ融合タンパク質が、前記抗原エピトープリピート領域と前記エンベロープタンパク質との間にスペーサードメインを含む、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
対象におけるＢ型肝炎ウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域を含むヘパドナウイルスエンベロープＨＢｓＡｇ−Ｓ融合タンパク質を含む組換えウイルス様粒子抗原（ＶＬＰ−Ａｇ）を前記対象に投与するステップであって、前記抗原エピトープリピート領域が、ＨＢｓＡｇ−Ｓドメインのループ１およびループ２領域において発現される抗原エピトープからなる群から選択される、ステップを含む方法。
【請求項２０】
ループ１において発現される前記１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域が、アミノ酸配列ＣＸ1ＴＣＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＧＸ6ＳＭＸ7ＰＣ（配列中、Ｘ1はＫまたはＲであり、Ｘ2はＴまたはＭであり、Ｘ3はＴまたはＩであり、Ｘ4はＰ、ＴまたはＬであり、Ｘ5はＡまたはＶであり、Ｘ6はＮまたはＴであり、Ｘ7はＦまたはＹである）によって規定されるか、または前記１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域が、アミノ酸配列ＰＣＸ8ＴＣＸ9Ｘ10Ｘ11（配列中、Ｘ8はＫまたはＲであり、Ｘ9はＴまたはＭであり、Ｘ10はＴ、ＩまたはＳであり、Ｘ11はＰ、ＴまたはＬである）によって規定される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ループ２において発現される前記１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域が、コンセンサスアミノ酸配列ＣＣＣＴＫＰＸ12ＤＧＮＣＸ13（配列中、Ｘ12はＴまたはＳであり、Ｘ13はＴまたはＳである）によって規定される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域が、ＰＣＫＴＣＴＴＰ、ＰＣＲＴＣＴＴＰ、ＣＴＫＰＴＤＧＮＣ、ＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳ、ＣＴＫＰ（Ｔ／Ｓ）ＴＤＧＮＣ、ＰＣ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）ＴＰ、Ｃ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）Ｔ（Ｐ／Ｔ）ＡＱＧ（Ｎ／Ｔ）ＳＭ（Ｆ／Ｙ）ＰＳ、ＰＣＲＴＣＭＴＴＡＱＧＴＳＭＹＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣ、およびＰＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＴＤＧＮＣからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記ヘパドナウイルスエンベロープ融合タンパク質が、前記抗原エピトープリピート領域と前記エンベロープタンパク質との間にスペーサードメインを含む、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
Ｂ型肝炎に対する免疫応答を誘導するための組成物の製造における組換えウイルス様粒子抗原（ＶＬＰ−Ａｇ）の使用であって、前記ＶＬＰ−Ａｇが、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域を含むヘパドナウイルスエンベロープＨＢｓＡｇ−Ｓ融合タンパク質を含み、前記抗原エピトープリピート領域が、ＨＢｓＡｇ−Ｓドメインのループ１およびループ２領域において発現される抗原エピトープからなる群から選択される、使用。
【請求項２５】
ループ１において発現される前記１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域が、アミノ酸配列ＣＸ1ＴＣＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＧＸ6ＳＭＸ7ＰＣ（配列中、Ｘ1はＫまたはＲであり、Ｘ2はＴまたはＭであり、Ｘ3はＴまたはＩであり、Ｘ4はＰ、ＴまたはＬであり、Ｘ5はＡまたはＶであり、Ｘ6はＮまたはＴであり、Ｘ7はＦまたはＹである）によって規定されるか、または前記１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域が、アミノ酸配列ＰＣＸ8ＴＣＸ9Ｘ10Ｘ11（配列中、Ｘ8はＫまたはＲであり、Ｘ9はＴまたはＭであり、Ｘ10はＴ、ＩまたはＳであり、Ｘ11はＰ、ＴまたはＬである）によって規定される、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
ループ２において発現される前記１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域が、コンセンサスアミノ酸配列ＣＣＣＴＫＰＸ12ＤＧＮＣＸ13（配列中、Ｘ12はＴまたはＳであり、Ｘ13はＴまたはＳである）によって規定される、請求項２４に記載の使用。
【請求項２７】
前記１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域が、ＰＣＫＴＣＴＴＰ、ＰＣＲＴＣＴＴＰ、ＣＴＫＰＴＤＧＮＣ、ＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳ、ＣＴＫＰ（Ｔ／Ｓ）ＴＤＧＮＣ、ＰＣ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）ＴＰ、Ｃ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）Ｔ（Ｐ／Ｔ）ＡＱＧ（Ｎ／Ｔ）ＳＭ（Ｆ／Ｙ）ＰＳ、ＰＣＲＴＣＭＴＴＡＱＧＴＳＭＹＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣ、およびＰＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＴＤＧＮＣからなる群から選択される、請求項２４に記載の使用。
【請求項２８】
前記ヘパドナウイルスエンベロープ融合タンパク質が、前記抗原エピトープリピート領域と前記エンベロープタンパク質との間にスペーサードメインを含む、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２９】
組換えウイルス様粒子抗原（ＶＬＰ−Ａｇ）を含む、それを必要とする対象におけるＢ型肝炎感染症を処置するためのキットであって、前記ＶＬＰ−Ａｇが、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域を含むヘパドナウイルスエンベロープＨＢｓＡｇ−Ｓ融合タンパク質を含み、前記抗原エピトープリピート領域が、ＨＢｓＡｇ−Ｓドメインのループ１およびループ２領域において発現される抗原エピトープからなる群から選択される、キット。
【請求項３０】
ループ１において発現される前記１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域が、アミノ酸配列ＣＸ1ＴＣＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＧＸ6ＳＭＸ7ＰＣ（配列中、Ｘ1はＫまたはＲであり、Ｘ2はＴまたはＭであり、Ｘ3はＴまたはＩであり、Ｘ4はＰ、ＴまたはＬであり、Ｘ5はＡまたはＶであり、Ｘ6はＮまたはＴであり、Ｘ7はＦまたはＹである）によって規定されるか、または前記１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域が、アミノ酸配列ＰＣＸ8ＴＣＸ9Ｘ10Ｘ11（配列中、Ｘ8はＫまたはＲであり、Ｘ9はＴまたはＭであり、Ｘ10はＴ、ＩまたはＳであり、Ｘ11はＰ、ＴまたはＬである）によって規定される、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
ループ２において発現される前記１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域が、コンセンサスアミノ酸配列ＣＣＣＴＫＰＸ12ＤＧＮＣＸ13（配列中、Ｘ12はＴまたはＳであり、Ｘ13はＴまたはＳである）によって規定される、請求項２９に記載のキット。
【請求項３２】
前記１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域が、ＰＣＫＴＣＴＴＰ、ＰＣＲＴＣＴＴＰ、ＣＴＫＰＴＤＧＮＣ、ＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳ、ＣＴＫＰ（Ｔ／Ｓ）ＴＤＧＮＣ、ＰＣ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）ＴＰ、Ｃ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）Ｔ（Ｐ／Ｔ）ＡＱＧ（Ｎ／Ｔ）ＳＭ（Ｆ／Ｙ）ＰＳ、ＰＣＲＴＣＭＴＴＡＱＧＴＳＭＹＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣ、およびＰＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＴＤＧＮＣからなる群から選択される、請求項２９に記載のキット。
【請求項３３】
前記ヘパドナウイルスエンベロープ融合タンパク質が、前記抗原エピトープリピート領域と前記エンベロープタンパク質との間にスペーサードメインを含む、請求項２９〜３２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３４】
１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域を含むヘパドナウイルスエンベロープＨＢｓＡｇ−Ｓ融合タンパク質をコードする組換えｍＲＮＡであって、前記抗原エピトープリピート領域が、ＨＢｓＡｇ−Ｓドメインのループ１およびループ２領域において発現される抗原エピトープからなる群から選択される、組換えｍＲＮＡ。
【請求項３５】
ループ１において発現される前記１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域が、アミノ酸配列ＣＸ1ＴＣＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＧＸ6ＳＭＸ7ＰＣ（配列中、Ｘ1はＫまたはＲであり、Ｘ2はＴまたはＭであり、Ｘ3はＴまたはＩであり、Ｘ4はＰ、ＴまたはＬであり、Ｘ5はＡまたはＶであり、Ｘ6はＮまたはＴであり、Ｘ7はＦまたはＹである）によって規定されるか、または前記１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域が、アミノ酸配列ＰＣＸ8ＴＣＸ9Ｘ10Ｘ11（配列中、Ｘ8はＫまたはＲであり、Ｘ9はＴまたはＭであり、Ｘ10はＴ、ＩまたはＳであり、Ｘ11はＰ、ＴまたはＬである）によって規定される、請求項３４に記載の組換えｍＲＮＡ。
【請求項３６】
ループ２において発現される前記１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域が、コンセンサスアミノ酸配列ＣＣＣＴＫＰＸ12ＤＧＮＣＸ13（配列中、Ｘ12はＴまたはＳであり、Ｘ13はＴまたはＳである）によって規定される、請求項３４に記載の組換えｍＲＮＡ。
【請求項３７】
前記１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域が、ＰＣＫＴＣＴＴＰ、ＰＣＲＴＣＴＴＰ、ＣＴＫＰＴＤＧＮＣ、ＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳ、ＣＴＫＰ（Ｔ／Ｓ）ＴＤＧＮＣ、ＰＣ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）ＴＰ、Ｃ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）Ｔ（Ｐ／Ｔ）ＡＱＧ（Ｎ／Ｔ）ＳＭ（Ｆ／Ｙ）ＰＳ、ＰＣＲＴＣＭＴＴＡＱＧＴＳＭＹＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣ、およびＰＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＴＤＧＮＣからなる群から選択される、請求項３４に記載の組換えｍＲＮＡ。
【請求項３８】
修飾された前記ヘパドナウイルスエンベロープ融合タンパク質が、前記抗原エピトープリピート領域と前記エンベロープタンパク質との間にスペーサードメインを含む、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の組換えｍＲＮＡ。
【請求項３９】
請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の組換えｍＲＮＡを含む発現ベクター。
【請求項４０】
請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の組換えｍＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項４１】
それを必要とする対象におけるＢ型肝炎感染症を処置する方法であって、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域を含むヘパドナウイルスエンベロープＨＢｓＡｇ−Ｓ融合タンパク質をコードする組換えｍＲＮＡを前記対象に投与するステップであって、前記抗原エピトープリピート領域が、ＨＢｓＡｇ−Ｓドメインのループ１およびループ２領域において発現される抗原エピトープからなる群から選択される、ステップを含む方法。
【請求項４２】
ループ１において発現される前記１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域が、アミノ酸配列ＣＸ1ＴＣＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＧＸ6ＳＭＸ7ＰＣ（配列中、Ｘ1はＫまたはＲであり、Ｘ2はＴまたはＭであり、Ｘ3はＴまたはＩであり、Ｘ4はＰ、ＴまたはＬであり、Ｘ5はＡまたはＶであり、Ｘ6はＮまたはＴであり、Ｘ7はＦまたはＹである）によって規定されるか、または前記１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域が、アミノ酸配列ＰＣＸ8ＴＣＸ9Ｘ10Ｘ11（配列中、Ｘ8はＫまたはＲであり、Ｘ9はＴまたはＭであり、Ｘ10はＴ、ＩまたはＳであり、Ｘ11はＰ、ＴまたはＬである）によって規定される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ループ２において発現される前記１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域が、コンセンサスアミノ酸配列ＣＣＣＴＫＰＸ12ＤＧＮＣＸ13（配列中、Ｘ12はＴまたはＳであり、Ｘ13はＴまたはＳである）によって規定される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域が、ＰＣＫＴＣＴＴＰ、ＰＣＲＴＣＴＴＰ、ＣＴＫＰＴＤＧＮＣ、ＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳ、ＣＴＫＰ（Ｔ／Ｓ）ＴＤＧＮＣ、ＰＣ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）ＴＰ、Ｃ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）Ｔ（Ｐ／Ｔ）ＡＱＧ（Ｎ／Ｔ）ＳＭ（Ｆ／Ｙ）ＰＳ、ＰＣＲＴＣＭＴＴＡＱＧＴＳＭＹＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣ、およびＰＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＴＤＧＮＣからなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
修飾された前記ヘパドナウイルスエンベロープ融合タンパク質が、前記抗原エピトープリピート領域と前記エンベロープタンパク質との間にスペーサードメインを含む、請求項４１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
それを必要とする対象におけるＢ型肝炎感染症を処置するための医薬の製造における組換えｍＲＮＡの使用であって、前記組換えｍＲＮＡが、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域を含むヘパドナウイルスエンベロープＨＢｓＡｇ−Ｓ融合タンパク質をコードし、前記抗原エピトープリピート領域が、ＨＢｓＡｇ−Ｓドメインのループ１およびループ２領域において発現される抗原エピトープからなる群から選択される、使用。
【請求項４７】
ループ１において発現される前記１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域が、アミノ酸配列ＣＸ1ＴＣＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＧＸ6ＳＭＸ7ＰＣ（配列中、Ｘ1はＫまたはＲであり、Ｘ2はＴまたはＭであり、Ｘ3はＴまたはＩであり、Ｘ4はＰ、ＴまたはＬであり、Ｘ5はＡまたはＶであり、Ｘ6はＮまたはＴであり、Ｘ7はＦまたはＹである）によって規定されるか、または前記１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域が、アミノ酸配列ＰＣＸ8ＴＣＸ9Ｘ10Ｘ11（配列中、Ｘ8はＫまたはＲであり、Ｘ9はＴまたはＭであり、Ｘ10はＴ、ＩまたはＳであり、Ｘ11はＰ、ＴまたはＬである）によって規定される、請求項４６に記載の使用。
【請求項４８】
ループ２において発現される前記１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域が、コンセンサスアミノ酸配列ＣＣＣＴＫＰＸ12ＤＧＮＣＸ13（配列中、Ｘ12はＴまたはＳであり、Ｘ13はＴまたはＳである）によって規定される、請求項４６に記載の使用。
【請求項４９】
前記１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域が、ＰＣＫＴＣＴＴＰ、ＰＣＲＴＣＴＴＰ、ＣＴＫＰＴＤＧＮＣ、ＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳ、ＣＴＫＰ（Ｔ／Ｓ）ＴＤＧＮＣ、ＰＣ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）ＴＰ、Ｃ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）Ｔ（Ｐ／Ｔ）ＡＱＧ（Ｎ／Ｔ）ＳＭ（Ｆ／Ｙ）ＰＳ、ＰＣＲＴＣＭＴＴＡＱＧＴＳＭＹＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣ、およびＰＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＴＤＧＮＣからなる群から選択される、請求項４６に記載の使用。
【請求項５０】
前記ヘパドナウイルスエンベロープ融合タンパク質が、前記抗原エピトープリピート領域と前記エンベロープタンパク質との間にスペーサードメインを含む、請求項４６〜４９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５１】
対象におけるＢ型肝炎ウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域を含む修飾されたヘパドナウイルスエンベロープＨＢｓＡｇ−Ｓ融合タンパク質をコードする組換えｍＲＮＡを前記対象に投与するステップであって、前記抗原エピトープリピート領域が、ＨＢｓＡｇ−Ｓドメインのループ１およびループ２領域において発現される抗原エピトープからなる群から選択されるステップを含む方法。
【請求項５２】
ループ１において発現される前記１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域が、アミノ酸配列ＣＸ1ＴＣＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＧＸ6ＳＭＸ7ＰＣ（配列中、Ｘ1はＫまたはＲであり、Ｘ2はＴまたはＭであり、Ｘ3はＴまたはＩであり、Ｘ4はＰ、ＴまたはＬであり、Ｘ5はＡまたはＶであり、Ｘ6はＮまたはＴであり、Ｘ7はＦまたはＹである）によって規定されるか、または前記１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域が、アミノ酸配列ＰＣＸ8ＴＣＸ9Ｘ10Ｘ11（配列中、Ｘ8はＫまたはＲであり、Ｘ9はＴまたはＭであり、Ｘ10はＴ、ＩまたはＳであり、Ｘ11はＰ、ＴまたはＬである）によって規定される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ループ２において発現される前記１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域が、コンセンサスアミノ酸配列ＣＣＣＴＫＰＸ12ＤＧＮＣＸ13（配列中、Ｘ12はＴまたはＳであり、Ｘ13はＴまたはＳである）によって規定される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域が、ＰＣＫＴＣＴＴＰ、ＰＣＲＴＣＴＴＰ、ＣＴＫＰＴＤＧＮＣ、ＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳ、ＣＴＫＰ（Ｔ／Ｓ）ＴＤＧＮＣ、ＰＣ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）ＴＰ、Ｃ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）Ｔ（Ｐ／Ｔ）ＡＱＧ（Ｎ／Ｔ）ＳＭ（Ｆ／Ｙ）ＰＳ、ＰＣＲＴＣＭＴＴＡＱＧＴＳＭＹＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣ、およびＰＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＴＤＧＮＣからなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
修飾された前記ヘパドナウイルスエンベロープ融合タンパク質が、前記抗原エピトープリピート領域と前記エンベロープタンパク質との間にスペーサードメインを含む、請求項５１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
Ｂ型肝炎に対する免疫応答を誘導するための組成物の製造における組換えｍＲＮＡの使用であって、前記組換えｍＲＮＡが、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域を含むヘパドナウイルスエンベロープＨＢｓＡｇ−Ｓ融合タンパク質をコードし、前記抗原エピトープリピート領域が、ＨＢｓＡｇ−Ｓドメインのループ１およびループ２領域において発現される抗原エピトープからなる群から選択される、使用。
【請求項５７】
ループ１において発現される前記１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域が、アミノ酸配列ＣＸ1ＴＣＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＧＸ6ＳＭＸ7ＰＣ（配列中、Ｘ1はＫまたはＲであり、Ｘ2はＴまたはＭであり、Ｘ3はＴまたはＩであり、Ｘ4はＰ、ＴまたはＬであり、Ｘ5はＡまたはＶであり、Ｘ6はＮまたはＴであり、Ｘ7はＦまたはＹである）によって規定されるか、または前記１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域が、アミノ酸配列ＰＣＸ8ＴＣＸ9Ｘ10Ｘ11（配列中、Ｘ8はＫまたはＲであり、Ｘ9はＴまたはＭであり、Ｘ10はＴ、ＩまたはＳであり、Ｘ11はＰ、ＴまたはＬである）によって規定される、請求項５６に記載の使用。
【請求項５８】
ループ２において発現される前記１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域が、コンセンサスアミノ酸配列ＣＣＣＴＫＰＸ12ＤＧＮＣＸ13（配列中、Ｘ12はＴまたはＳであり、Ｘ13はＴまたはＳである）によって規定される、請求項５６に記載の使用。
【請求項５９】
前記１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域が、ＰＣＫＴＣＴＴＰ、ＰＣＲＴＣＴＴＰ、ＣＴＫＰＴＤＧＮＣ、ＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳ、ＣＴＫＰ（Ｔ／Ｓ）ＴＤＧＮＣ、ＰＣ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）ＴＰ、Ｃ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）Ｔ（Ｐ／Ｔ）ＡＱＧ（Ｎ／Ｔ）ＳＭ（Ｆ／Ｙ）ＰＳ、ＰＣＲＴＣＭＴＴＡＱＧＴＳＭＹＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣ、およびＰＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＴＤＧＮＣからなる群から選択される、請求項５６に記載の使用。
【請求項６０】
修飾された前記ヘパドナウイルスエンベロープ融合タンパク質が、前記抗原エピトープリピート領域と前記エンベロープタンパク質との間にスペーサードメインを含む、請求項５６〜５９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６１】
組換えｍＲＮＡを含む、それを必要とする対象におけるＢ型肝炎感染症を処置するためのキットであって、前記組換えｍＲＮＡが、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域を含むヘパドナウイルスエンベロープＨＢｓＡＧ−Ｓ融合タンパク質をコードし、前記抗原エピトープリピート領域が、ＨＢｓＡｇ−Ｓドメインのループ１およびループ２領域において発現される抗原エピトープからなる群から選択される、キット。
【請求項６２】
ループ１において発現される前記１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域が、アミノ酸配列ＣＸ1ＴＣＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＧＸ6ＳＭＸ7ＰＣ（配列中、Ｘ1はＫまたはＲであり、Ｘ2はＴまたはＭであり、Ｘ3はＴまたはＩであり、Ｘ4はＰ、ＴまたはＬであり、Ｘ5はＡまたはＶであり、Ｘ6はＮまたはＴであり、Ｘ7はＦまたはＹである）によって規定されるか、または前記１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域が、アミノ酸配列ＰＣＸ8ＴＣＸ9Ｘ10Ｘ11（配列中、Ｘ8はＫまたはＲであり、Ｘ9はＴまたはＭであり、Ｘ10はＴ、ＩまたはＳであり、Ｘ11はＰ、ＴまたはＬである）によって規定される、請求項６１に記載のキット。
【請求項６３】
ループ２において発現される前記１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域が、コンセンサスアミノ酸配列ＣＣＣＴＫＰＸ12ＤＧＮＣＸ13（配列中、Ｘ12はＴまたはＳであり、Ｘ13はＴまたはＳである）によって規定される、請求項６１に記載のキット。
【請求項６４】
前記１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域が、ＰＣＫＴＣＴＴＰ、ＰＣＲＴＣＴＴＰ、ＣＴＫＰＴＤＧＮＣ、ＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳ、ＣＴＫＰ（Ｔ／Ｓ）ＴＤＧＮＣ、ＰＣ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）ＴＰ、Ｃ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）Ｔ（Ｐ／Ｔ）ＡＱＧ（Ｎ／Ｔ）ＳＭ（Ｆ／Ｙ）ＰＳ、ＰＣＲＴＣＭＴＴＡＱＧＴＳＭＹＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣ、およびＰＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＴＤＧＮＣからなる群から選択される、請求項６１に記載のキット。
【請求項６５】
修飾された前記ヘパドナウイルスエンベロープ融合タンパク質が、前記抗原エピトープリピート領域と前記エンベロープタンパク質との間にスペーサードメインを含む、請求項６１〜６４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６６】
ＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣ（配列番号１７）、ＴＣＴＩＰＡＱＧＴＳＭＦＰＳＣ（配列番号１８）、ＴＣＴＴＰＡＱＧＴＳＭＦＰＳＣ（配列番号１９）、ＣＴＫＰＴＤＧＮＣＴ（配列番号２０）、およびＣＴＫＰＳＤＧＮＣＴ（配列番号２１）からなる群から選択される１つまたは複数のペプチドを含む組成物。
【請求項６７】
前記１つまたは複数のペプチドが担体タンパク質とコンジュゲートしている、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
前記担体タンパク質がキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）である、請求項６７に記載の組成物。
【請求項６９】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項６６に記載の組成物。
【請求項７０】
前記１つまたは複数のペプチドが環状である、請求項６６に記載の組成物。
【請求項７１】
それを必要とする対象におけるＢ型肝炎感染症を処置する方法であって、ＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣ（配列番号１７）、ＴＣＴＩＰＡＱＧＴＳＭＦＰＳＣ（配列番号１８）、ＴＣＴＴＰＡＱＧＴＳＭＦＰＳＣ（配列番号１９）、ＣＴＫＰＴＤＧＮＣＴ（配列番号２０）、およびＣＴＫＰＳＤＧＮＣＴ（配列番号２１）からなる群から選択される１つまたは複数のペプチドを前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項７２】
前記１つまたは複数のペプチドが担体タンパク質とコンジュゲートしている、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記担体タンパク質がキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記１つまたは複数のペプチドが環状である、請求項７１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年５月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／６６９，６６３号に対する優先権の利益を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
本技術は、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）を含む、Ｂ型肝炎感染症を処置するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
あらゆる以前の刊行物（またはそれから派生した情報）、または公知であるあらゆる事柄に対する本明細書における参考文献は、以前の刊行物（またはそれから派生した情報）、または公知の事柄が、本明細書が関連する試みの分野における共通の一般知識の一部を形成するという認識または承認またはなんらかの形態の示唆として解釈されず、また、解釈されるべきではない。
Ｂ型肝炎は最も一般的なウイルス性肝炎であり、生命を脅かす可能性があり、長期合併症を伴い、世界中の主要な公衆衛生の課題の１つである。現在、ワクチンはＢ型肝炎感染症に対して最も効果的な手段である。ワクチンが入手可能になったことにより新たなＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症の数は減少したが、既にウイルスに慢性的に感染している２億５７００万人の人々には恩恵がない（ＷＨＯファクトシート２０１８年７月１８日）。２０１５年から２０３０年の間に、累積して６３００万人の慢性ＨＢＶ感染症の新たな症例および１７００万人のＨＢＶ関連の死が発生すると推定される（Nayagam et al. Lancet Infectious Dis 2016 16:1399-1408）。
【０００３】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）による慢性感染症は、肝硬変および肝細胞癌（ＨＣＣ）を含む、肝疾患の臨床転帰につながる。３０年以上前の予防的Ｂ型肝炎ワクチンの導入にもかかわらず、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）感染症は依然として世界的な健康問題のままであり（Lozano R, et al. Lancet 2012; 380(9859):2095-128）、世界の肝がん負荷の５０％超の原因となっている。慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）を有する個体の約３分の１は、未処置のまま放置すると、肝硬変、肝細胞癌（ＨＣＣ）、および肝不全などの、重篤な肝疾患により死亡する。数字別にみると、世界中でこのウイルスに感染している人々は２億６０００万人〜３億５０００万人であり、肝硬変および肝がんを含むＨＢＶ関連肝疾患により死亡する人々は毎年７８０，０００人超であると推定される（Lozano R, et al. Lancet. 2012; 380(9859):2095-128）。ＣＨＢに対する現在のヌクレオシド（ヌクレオチド）類似体（ＮＡ）療法はウイルスＤＮＡ抑制（検出できないＨＢＶ  ＤＮＡ）を効果的に標的としているが、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のクリアランスは標的としておらず、その発現の継続はＨＣＣ発症についての進行中のリスクと関連している（Fattovich G, et al. Am J Gastroenterol. 1998;93(6):896-900; Yuen MF et al. Gastroenterology 2008; 135(4):1192-1199）。Ｂ型肝炎の完全治癒はウイルスおよびその全ての複製中間体の根絶によって定義され（Revill P, et al. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology, 2016, 13(4):239-248）、これは非現実的な転帰であると現在考えられている。ＨＢｓＡｇ消失および／または抗ＨＢｓへのセロコンバージョンの臨床エンドポイントがＣＨＢ療法の現在の目標であるが、達成されることはまれである。このクリアランスについての基礎は、おそらく効果的な宿主抗ウイルス（抗体駆動）応答の選択圧である。しかしながら、ＣＨＢを有する患者における自然免疫応答および適応免疫応答は損なわれており、最適以下の抗原提示、抗原特異的Ｔ細胞の枯渇および不十分な抗体産生を特徴とすることが示されている（Wang L, et al. World J Hepatol. 2015, 7(30):2980-91）。したがって、ＣＨＢに対するさらなる治療アプローチを開発する必要がある。
【０００４】
現在、好ましい一次治療選択肢は、それらの優れた抗ウイルス効果および／または高抵抗性バリアに基づく、ペグ化インターフェロンアルファ−２ａ（ｐｅｇＩＦＮ−α）、エンテカビル、およびテノホビルである。しかしながら、一次治療選択肢を用いても、ｐｅｇＩＦＮ−αは、ＨＢｅＡｇ陽性の３０％およびＨＢｅＡｇ陰性の４０％の症例のみにおいて持続性ウイルス学的著効の達成に効果的であり、通常は、重度の副作用と関連する。他方で、ヌクレオシド（ヌクレオチド）類似体は良好な耐容性を示し、処置患者の大多数においてＨＢＶ複製を強力に抑制する。しかしながら、最も強力なヌクレオシド（ヌクレオチド）類似体でさえ、感染の完全かつ持続的な制御を伴うＨＢＶに対する成功した免疫学的応答の顕著な特徴である、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）セロコンバージョン、または「機能的治癒」を誘導することはまれである。したがって、長期かつ場合により、生涯にわたるＮＡ治療がＨＢＶ複製を継続的に抑制するのに必要であり、これは大きなコスト負担と関連することがあり、薬物関連毒性によって制限されることがある。したがって、機能的治癒を達成するのに安全かつ効果的である治療レジメンの導入に対する差し迫った必要性が存在する。
【０００５】
感染性ＨＢＶビリオンは、ウイルスＤＮＡゲノムがパッケージングされている正二十面体ヌクレオカプシドと、ＨＢｓＡｇ大型（ＨＢｓＡｇ−Ｌ）、ＨＢｓＡｇ中型（ＨＢｓＡｇ−Ｍ）およびＨＢｓＡｇ小型（ＨＢｓＡｇ−Ｓ）と称される３つの関連する膜貫通タンパク質（ＨＢｓＡｇ）を含有するリポタンパク質エンベロープとからなる直径４２ｎｍの球状粒子である。エンベロープタンパク質の合成は３つの異なるインフレーム翻訳開始部位において開始される。その結果、エンベロープタンパク質はＳ−ドメインとして知られる共有領域を有する。ＨＢｓＡｇ−Ｓは２２６アミノ酸（ａａ）からなるＳドメインのみから構成されており、ＨＢｓＡｇ−ＭはさらなるＮ末端伸長である５５アミノ酸のプレＳ２ドメインを含有し、ＨＢｓＡｇ−ＬはプレＳ２ドメインおよびプレＳ１ドメインと呼ばれるさらなる１０８または１１９アミノ酸（遺伝子型依存性）のＮ末端伸長を含有する。
小胞体（ＥＲ）において脂質の存在下で自己集合するＨＢｓＡｇ−Ｓの能力により、分泌可能な（ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）サブウイルス粒子（ＶＬＰ）が形成され、これは他のＨＢＶウイルス成分を全く含有しない。ＨＢｓＡｇ−Ｓ  ＶＬＰは直径２２〜２５ナノメートル（ｎｍ）であり、非常にコンパクトであり、１つの粒子が約１００個のＨＢｓＡｇ−Ｓ分子を含有すると推定される。また、ＨＢｓＡｇ−Ｍは分泌可能なＶＬＰも形成する。また、ＨＢｓＡｇ−Ｌは完全に分泌可能でないことがあるＶＬＰも形成する。
【０００６】
ＨＢｓＡｇ粒子形成は複雑なプロセスである。粒子形成における最初の段階は、短い管腔露出Ｎ末端配列、５７ａａの細胞質ループによって分離された２つの膜貫通領域、および主要なＢ細胞エピトープ（「ａ」決定基）を含有する管腔外部７０ａａドメインを有するＥＲ膜へのタンパク質の同時翻訳挿入である。ＨＢｓＡｇ−Ｓ  ＶＬＰは、個々のサブユニット内および個々のサブユニット間の多数の分子内および分子間ジスルフィド結合に起因して非常にコンパクトな構造を表す。
ＶＬＰは先進的で革新的なバイオナノテクノロジーベクターおよびワクチン開発の手段であり、それらは従来のワクチンよりも多くの利点を有する。ＶＬＰはウイルス遺伝物質を含有せず、Ｂ細胞および／またはＴ細胞応答のための免疫系の重要な部分を効率的に誘発するウイルス構造タンパク質を高密度でディスプレイしている（Buonaguro L. et al., (2011), Expert Rev Vaccines 10:1569-1583; Jennings GT and Bachmann MF. (2009) Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2009, 49:303-326; Pushko P, et al., Intervirology 2013, 56:141-165）。
例えば、ＨＢＶ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のカプシドタンパク質に基づくキメラＶＬＰ、およびＱβファージは、それぞれ、禁煙のためにニコチンおよびアンジオテンシンＩＩなどの非病原体関連抗原を含む外来抗原配列を発現し、高血圧を克服するように設計されている（Ambuhl PM et al. J. Hypertension. 2007, 25:63-72; Buonaguro L. et al. Exp. Rev. Vaccines 2011, 10:1569-1583; Cornuz J. et al. PlosOne 2008, 3:e2547）。タンパク質サブユニットのみから構成されるカプシドＶＬＰとは対照的に、ＨＢＶベースのＨＢｓＡｇ−Ｓ  ＶＬＰはエンベロープタンパク質および脂質から構成され、ＥＲは集合のために細胞内に位置している。免疫系に対する抗原配列の提示のために、ＨＢｓＡｇ−Ｓ  ＶＬＰは外来エピトープを保有するように修飾されている（Delpeyroux F. et al. Science 1986, 233:472-475; Eckhart L., et al. J. Gen. Virology 1996, 77:2001-2008; Fomsgaard A. et al. Scand. J. Immunol. 1998, 47:289-295; Phogat S. et al. Virology 2008, 373:72-84; Netter HJ et al. J. Virology 2001, 75:2130-2141）。ＨＢｓＡｇ−Ｌから構成されるＶＬＰが、ヒト肝細胞への遺伝子および薬物のための送達システムとして開発された（Yamada T et al. Nature Biotechnology 2003, 21:885-890）。アヒルのＢ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質および他のヘパドナウイルスエンベロープタンパク質は、ＶＬＰの一部として目的の抗原を発現するように修飾されている。
【０００７】
ＨＢＶに由来する小エンベロープタンパク質（ＨＢｓＡｇ−Ｓ）から構成されるＶＬＰは成功した予防ワクチンの抗原成分である（Jilg W et al. Lancet ii 1984, 1174-1175; Zuckerman JN. J Med Virology 2006, 78:169-177）。しかし、ワクチンが入手できるにもかかわらず、Ｂ型肝炎は依然として非常に大きな健康上の問題となっている。
ワクチン開発における重要な問題は、加齢による免疫系の減少した能力および高齢者における減少したワクチンの有効性と関連している免疫老化である（Derhovanessian E and Pawelec G. Microbial Biotechnology 2012, 5:226-232; Pera A et al. Maturitas 2015, 82: 50-55）。
【０００８】
血清中の検出できないレベルのＨＢＶ  ＤＮＡと組み合わせた抗ＨＢｓへのセロコンバージョンの非存在下または存在下におけるＨＢｓＡｇ消失のエンドポイントは、ＣＨＢ療法に対する現在の目標であるが、達成されることはまれである。このクリアランスについての基礎は、おそらく、効果的な宿主抗ウイルス（抗体駆動）応答の選択圧である。しかしながら、ＣＨＢを有する患者における自然免疫応答および適応免疫応答は損なわれており、最適以下の抗原提示、抗原特異的Ｔ細胞の枯渇および不十分な抗体産生を特徴とすることが示されている（Wang L, et al. World J Hepatology 2015, 7(30):2980-2991）。
ＣＨＢの処置のための効果的なＢ細胞ワクチンを開発する必要性が存在している。特に、機能的治癒を達成することを可能にする治療プロトコールを開発する必要性が存在している。
【発明の概要】
【０００９】
一態様では、本開示は、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域を含むヘパドナウイルスエンベロープＨＢｓＡｇ−Ｓ融合タンパク質を含む組換えウイルス様粒子抗原（ＶＬＰ−Ａｇ）であって、前記抗原エピトープリピート領域が、ＨＢｓＡｇ−Ｓドメインのループ１およびループ２領域において発現される抗原エピトープからなる群から選択される、組換えウイルス様粒子抗原（ＶＬＰ−Ａｇ）を提供する。
一部の実施形態では、ループ１において発現される１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域は、アミノ酸配列ＣＸ1ＴＣＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＧＸ6ＳＭＸ7ＰＣ（配列中、Ｘ1はＫまたはＲであり、Ｘ2はＴまたはＭであり、Ｘ3はＴまたはＩであり、Ｘ4はＰ、ＴまたはＬであり、Ｘ5はＡまたはＶであり、Ｘ6はＮまたはＴであり、Ｘ7はＦまたはＹである）によって規定されるか、または１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域は、アミノ酸配列ＰＣＸ8ＴＣＸ9Ｘ10Ｘ11（配列中、Ｘ8はＫまたはＲであり、Ｘ9はＴまたはＭであり、Ｘ10はＴ、ＩまたはＳであり、Ｘ11はＰ、ＴまたはＬである）によって規定される。
一部の実施形態では、ループ２において発現される１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域は、コンセンサスアミノ酸配列ＣＣＣＴＫＰＸ12ＤＧＮＣＸ13（配列中、Ｘ12はＴまたはＳであり、Ｘ13はＴまたはＳである）によって規定される。
【００１０】
一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域は、ＰＣＫＴＣＴＴＰ、ＰＣＲＴＣＴＴＰ、ＣＴＫＰＴＤＧＮＣ、ＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳ、ＣＴＫＰ（Ｔ／Ｓ）ＴＤＧＮＣ、ＰＣ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）ＴＰ、Ｃ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）Ｔ（Ｐ／Ｔ）ＡＱＧ（Ｎ／Ｔ）ＳＭ（Ｆ／Ｙ）ＰＳ、ＰＣＲＴＣＭＴＴＡＱＧＴＳＭＹＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣ、およびＰＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＴＤＧＮＣからなる群から選択される。
一部の実施形態では、ヘパドナウイルスエンベロープ融合タンパク質は、抗原エピトープリピート領域とエンベロープタンパク質との間にスペーサードメインを含む。
一態様では、本開示は、本技術のＶＬＰ−Ａｇをコードする核酸を提供する。一態様では、本開示は、核酸を含む発現ベクターを提供する。
一態様では、本開示は、本技術のＶＬＰ−Ａｇおよび薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
【００１１】
一態様では、本開示は、それを必要とする対象におけるＢ型肝炎感染症を処置する方法であって、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域を含むヘパドナウイルスエンベロープＨＢｓＡｇ−Ｓ融合タンパク質を含む組換えＶＬＰ−Ａｇを対象に投与するステップであって、前記抗原エピトープリピート領域が、ＨＢｓＡｇ−Ｓドメインのループ１およびループ２領域において発現される抗原エピトープからなる群から選択される、ステップを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、ループ１において発現される１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域は、アミノ酸配列ＣＸ1ＴＣＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＧＸ6ＳＭＸ7ＰＣ（配列中、Ｘ1はＫまたはＲであり、Ｘ2はＴまたはＭであり、Ｘ3はＴまたはＩであり、Ｘ4はＰ、ＴまたはＬであり、Ｘ5はＡまたはＶであり、Ｘ6はＮまたはＴであり、Ｘ7はＦまたはＹである）によって規定されるか、または１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域は、アミノ酸配列ＰＣＸ8ＴＣＸ9Ｘ10Ｘ11（配列中、Ｘ8はＫまたはＲであり、Ｘ9はＴまたはＭであり、Ｘ10はＴ、ＩまたはＳであり、Ｘ11はＰ、ＴまたはＬである）によって規定される。
【００１２】
一部の実施形態では、ループ２において発現される１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域は、コンセンサスアミノ酸配列ＣＣＣＴＫＰＸ12ＤＧＮＣＸ13（配列中、Ｘ12はＴまたはＳであり、Ｘ13はＴまたはＳである）によって規定される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域は、ＰＣＫＴＣＴＴＰ、ＰＣＲＴＣＴＴＰ、ＣＴＫＰＴＤＧＮＣ、ＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳ、ＣＴＫＰ（Ｔ／Ｓ）ＴＤＧＮＣ、ＰＣ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）ＴＰ、Ｃ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）Ｔ（Ｐ／Ｔ）ＡＱＧ（Ｎ／Ｔ）ＳＭ（Ｆ／Ｙ）ＰＳ、ＰＣＲＴＣＭＴＴＡＱＧＴＳＭＹＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣ、およびＰＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＴＤＧＮＣからなる群から選択される。
一部の実施形態では、ヘパドナウイルスエンベロープ融合タンパク質は、抗原エピトープリピート領域とエンベロープタンパク質との間にスペーサードメインを含む。
一態様では、本開示は、それを必要とする対象におけるＢ型肝炎感染症を処置するための医薬の製造における組換えＶＬＰ−Ａｇの使用であって、ＶＬＰ−Ａｇが、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域を含むヘパドナウイルスエンベロープＨＢｓＡｇ−Ｓ融合タンパク質を含み、前記抗原エピトープリピート領域が、ＨＢｓＡｇ−Ｓドメインのループ１およびループ２領域において発現される抗原エピトープからなる群から選択される、使用を提供する。
一部の実施形態では、ループ１において発現される１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域は、アミノ酸配列ＣＸ1ＴＣＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＧＸ6ＳＭＸ7ＰＣ（配列中、Ｘ1はＫまたはＲであり、Ｘ2はＴまたはＭであり、Ｘ3はＴまたはＩであり、Ｘ4はＰ、ＴまたはＬであり、Ｘ5はＡまたはＶであり、Ｘ6はＮまたはＴであり、Ｘ7はＦまたはＹである）によって規定されるか、または１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域は、アミノ酸配列ＰＣＸ8ＴＣＸ9Ｘ10Ｘ11（配列中、Ｘ8はＫまたはＲであり、Ｘ9はＴまたはＭであり、Ｘ10はＴ、ＩまたはＳであり、Ｘ11はＰ、ＴまたはＬである）によって規定される。
【００１３】
一部の実施形態では、ループ２において発現される１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域は、コンセンサスアミノ酸配列ＣＣＣＴＫＰＸ12ＤＧＮＣＸ13（配列中、Ｘ12はＴまたはＳであり、Ｘ13はＴまたはＳである）によって規定される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域は、ＰＣＫＴＣＴＴＰ、ＰＣＲＴＣＴＴＰ、ＣＴＫＰＴＤＧＮＣ、ＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳ、ＣＴＫＰ（Ｔ／Ｓ）ＴＤＧＮＣ、ＰＣ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）ＴＰ、Ｃ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）Ｔ（Ｐ／Ｔ）ＡＱＧ（Ｎ／Ｔ）ＳＭ（Ｆ／Ｙ）ＰＳ、ＰＣＲＴＣＭＴＴＡＱＧＴＳＭＹＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣ、およびＰＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＴＤＧＮＣからなる群から選択される。
一部の実施形態では、ヘパドナウイルスエンベロープ融合タンパク質は、抗原エピトープリピート領域とエンベロープタンパク質との間にスペーサードメインを含む。
一態様では、本開示は、対象におけるＢ型肝炎ウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域を含むヘパドナウイルスエンベロープＨＢｓＡｇ−Ｓ融合タンパク質を含む組換えＶＬＰ−Ａｇを対象に投与するステップであって、前記抗原エピトープリピート領域が、ＨＢｓＡｇ−Ｓドメインのループ１およびループ２領域において発現される抗原エピトープからなる群から選択される、ステップを含む方法を提供する。
【００１４】
一部の実施形態では、ループ１において発現される１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域は、アミノ酸配列ＣＸ1ＴＣＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＧＸ6ＳＭＸ7ＰＣ（配列中、Ｘ1はＫまたはＲであり、Ｘ2はＴまたはＭであり、Ｘ3はＴまたはＩであり、Ｘ4はＰ、ＴまたはＬであり、Ｘ5はＡまたはＶであり、Ｘ6はＮまたはＴであり、Ｘ7はＦまたはＹである）によって規定されるか、または１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域は、アミノ酸配列ＰＣＸ8ＴＣＸ9Ｘ10Ｘ11（配列中、Ｘ8はＫまたはＲであり、Ｘ9はＴまたはＭであり、Ｘ10はＴ、ＩまたはＳであり、Ｘ11はＰ、ＴまたはＬである）によって規定される。
一部の実施形態では、ループ２において発現される１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域は、コンセンサスアミノ酸配列ＣＣＣＴＫＰＸ12ＤＧＮＣＸ13（配列中、Ｘ12はＴまたはＳであり、Ｘ13はＴまたはＳである）によって規定される。
【００１５】
一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域は、ＰＣＫＴＣＴＴＰ、ＰＣＲＴＣＴＴＰ、ＣＴＫＰＴＤＧＮＣ、ＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳ、ＣＴＫＰ（Ｔ／Ｓ）ＴＤＧＮＣ、ＰＣ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）ＴＰ、Ｃ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）Ｔ（Ｐ／Ｔ）ＡＱＧ（Ｎ／Ｔ）ＳＭ（Ｆ／Ｙ）ＰＳ、ＰＣＲＴＣＭＴＴＡＱＧＴＳＭＹＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣ、およびＰＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＴＤＧＮＣからなる群から選択される。
一部の実施形態では、ヘパドナウイルスエンベロープ融合タンパク質は、抗原エピトープリピート領域とエンベロープタンパク質との間にスペーサードメインを含む。
一態様では、本開示は、Ｂ型肝炎に対する免疫応答を誘導するための組成物の製造における組換えＶＬＰ−Ａｇの使用であって、ＶＬＰ−Ａｇが、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域を含むヘパドナウイルスエンベロープＨＢｓＡｇ−Ｓ融合タンパク質を含み、前記抗原エピトープリピート領域が、ＨＢｓＡｇ−Ｓドメインのループ１およびループ２領域において発現される抗原エピトープからなる群から選択される、使用を提供する。
【００１６】
一部の実施形態では、ループ１において発現される１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域は、アミノ酸配列ＣＸ1ＴＣＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＧＸ6ＳＭＸ7ＰＣ（配列中、Ｘ1はＫまたはＲであり、Ｘ2はＴまたはＭであり、Ｘ3はＴまたはＩであり、Ｘ4はＰ、ＴまたはＬであり、Ｘ5はＡまたはＶであり、Ｘ6はＮまたはＴであり、Ｘ7はＦまたはＹである）によって規定されるか、または１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域は、アミノ酸配列ＰＣＸ8ＴＣＸ9Ｘ10Ｘ11（配列中、Ｘ8はＫまたはＲであり、Ｘ9はＴまたはＭであり、Ｘ10はＴ、ＩまたはＳであり、Ｘ11はＰ、ＴまたはＬである）によって規定される。
一部の実施形態では、ループ２において発現される１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域は、コンセンサスアミノ酸配列ＣＣＣＴＫＰＸ12ＤＧＮＣＸ13（配列中、Ｘ12はＴまたはＳであり、Ｘ13はＴまたはＳである）によって規定される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域は、ＰＣＫＴＣＴＴＰ、ＰＣＲＴＣＴＴＰ、ＣＴＫＰＴＤＧＮＣ、ＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳ、ＣＴＫＰ（Ｔ／Ｓ）ＴＤＧＮＣ、ＰＣ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）ＴＰ、Ｃ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）Ｔ（Ｐ／Ｔ）ＡＱＧ（Ｎ／Ｔ）ＳＭ（Ｆ／Ｙ）ＰＳ、ＰＣＲＴＣＭＴＴＡＱＧＴＳＭＹＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣ、およびＰＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＴＤＧＮＣからなる群から選択される。
【００１７】
一部の実施形態では、ヘパドナウイルスエンベロープ融合タンパク質は、抗原エピトープリピート領域とエンベロープタンパク質との間にスペーサードメインを含む。
一態様では、本開示は、組換えＶＬＰ−Ａｇを含む、それを必要とする対象におけるＢ型肝炎感染症を処置するためのキットであって、ＶＬＰ−Ａｇが、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域を含むヘパドナウイルスエンベロープＨＢｓＡｇ−Ｓ融合タンパク質を含み、前記抗原エピトープリピート領域が、ＨＢｓＡｇ−Ｓドメインのループ１およびループ２領域において発現される抗原エピトープからなる群から選択される、キットを提供する。
一部の実施形態では、ループ１において発現される１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域は、アミノ酸配列ＣＸ1ＴＣＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＧＸ6ＳＭＸ7ＰＣ（配列中、Ｘ1はＫまたはＲであり、Ｘ2はＴまたはＭであり、Ｘ3はＴまたはＩであり、Ｘ4はＰ、ＴまたはＬであり、Ｘ5はＡまたはＶであり、Ｘ6はＮまたはＴであり、Ｘ7はＦまたはＹである）によって規定されるか、または１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域は、アミノ酸配列ＰＣＸ8ＴＣＸ9Ｘ10Ｘ11（配列中、Ｘ8はＫまたはＲであり、Ｘ9はＴまたはＭであり、Ｘ10はＴ、ＩまたはＳであり、Ｘ11はＰ、ＴまたはＬである）によって規定される。
【００１８】
一部の実施形態では、ループ２において発現される１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域は、コンセンサスアミノ酸配列ＣＣＣＴＫＰＸ12ＤＧＮＣＸ13（配列中、Ｘ12はＴまたはＳであり、Ｘ13はＴまたはＳである）によって規定される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域は、ＰＣＫＴＣＴＴＰ、ＰＣＲＴＣＴＴＰ、ＣＴＫＰＴＤＧＮＣ、ＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳ、ＣＴＫＰ（Ｔ／Ｓ）ＴＤＧＮＣ、ＰＣ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）ＴＰ、Ｃ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）Ｔ（Ｐ／Ｔ）ＡＱＧ（Ｎ／Ｔ）ＳＭ（Ｆ／Ｙ）ＰＳ、ＰＣＲＴＣＭＴＴＡＱＧＴＳＭＹＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣ、およびＰＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＴＤＧＮＣからなる群から選択される。
一部の実施形態では、ヘパドナウイルスエンベロープ融合タンパク質は、抗原エピトープリピート領域とエンベロープタンパク質との間にスペーサードメインを含む。
一態様では、本開示は、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域を含むヘパドナウイルスエンベロープＨＢｓＡｇ−Ｓ融合タンパク質をコードする組換えｍＲＮＡであって、前記抗原エピトープリピート領域が、ＨＢｓＡｇ−Ｓドメインのループ１およびループ２領域において発現される抗原エピトープからなる群から選択される、組換えｍＲＮＡを提供する。
【００１９】
一部の実施形態では、ループ１において発現される１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域は、アミノ酸配列ＣＸ1ＴＣＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＧＸ6ＳＭＸ7ＰＣ（配列中、Ｘ1はＫまたはＲであり、Ｘ2はＴまたはＭであり、Ｘ3はＴまたはＩであり、Ｘ4はＰ、ＴまたはＬであり、Ｘ5はＡまたはＶであり、Ｘ6はＮまたはＴであり、Ｘ7はＦまたはＹである）によって規定されるか、または１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域は、アミノ酸配列ＰＣＸ8ＴＣＸ9Ｘ10Ｘ11（配列中、Ｘ8はＫまたはＲであり、Ｘ9はＴまたはＭであり、Ｘ10はＴ、ＩまたはＳであり、Ｘ11はＰ、ＴまたはＬである）によって規定される。
一部の実施形態では、ループ２において発現される１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域は、コンセンサスアミノ酸配列ＣＣＣＴＫＰＸ12ＤＧＮＣＸ13（配列中、Ｘ12はＴまたはＳであり、Ｘ13はＴまたはＳである）によって規定される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域は、ＰＣＫＴＣＴＴＰ、ＰＣＲＴＣＴＴＰ、ＣＴＫＰＴＤＧＮＣ、ＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳ、ＣＴＫＰ（Ｔ／Ｓ）ＴＤＧＮＣ、ＰＣ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）ＴＰ、Ｃ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）Ｔ（Ｐ／Ｔ）ＡＱＧ（Ｎ／Ｔ）ＳＭ（Ｆ／Ｙ）ＰＳ、ＰＣＲＴＣＭＴＴＡＱＧＴＳＭＹＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣ、およびＰＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＴＤＧＮＣからなる群から選択される。
【００２０】
一部の実施形態では、修飾されたヘパドナウイルスエンベロープ融合タンパク質は、抗原エピトープリピート領域とエンベロープタンパク質との間にスペーサードメインを含む。
一態様では、本開示は、本技術の組換えｍＲＮＡを含む発現ベクターを提供する。一態様では、本開示は、組換えｍＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
一態様では、本開示は、それを必要とする対象におけるＢ型肝炎感染症を処置する方法であって、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域を含むヘパドナウイルスエンベロープＨＢｓＡｇ−Ｓ融合タンパク質をコードする組換えｍＲＮＡを対象に投与するステップであって、前記抗原エピトープリピート領域が、ＨＢｓＡｇ−Ｓドメインのループ１およびループ２領域において発現される抗原エピトープからなる群から選択される、ステップを含む方法を提供する。
【００２１】
一部の実施形態では、ループ１において発現される１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域は、アミノ酸配列ＣＸ1ＴＣＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＧＸ6ＳＭＸ7ＰＣ（配列中、Ｘ1はＫまたはＲであり、Ｘ2はＴまたはＭであり、Ｘ3はＴまたはＩであり、Ｘ4はＰ、ＴまたはＬであり、Ｘ5はＡまたはＶであり、Ｘ6はＮまたはＴであり、Ｘ7はＦまたはＹである）によって規定されるか、または１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域は、アミノ酸配列ＰＣＸ8ＴＣＸ9Ｘ10Ｘ11（配列中、Ｘ8はＫまたはＲであり、Ｘ9はＴまたはＭであり、Ｘ10はＴ、ＩまたはＳであり、Ｘ11はＰ、ＴまたはＬである）によって規定される。
一部の実施形態では、ループ２において発現される１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域は、コンセンサスアミノ酸配列ＣＣＣＴＫＰＸ12ＤＧＮＣＸ13（配列中、Ｘ12はＴまたはＳであり、Ｘ13はＴまたはＳである）によって規定される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域は、ＰＣＫＴＣＴＴＰ、ＰＣＲＴＣＴＴＰ、ＣＴＫＰＴＤＧＮＣ、ＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳ、ＣＴＫＰ（Ｔ／Ｓ）ＴＤＧＮＣ、ＰＣ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）ＴＰ、Ｃ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）Ｔ（Ｐ／Ｔ）ＡＱＧ（Ｎ／Ｔ）ＳＭ（Ｆ／Ｙ）ＰＳ、ＰＣＲＴＣＭＴＴＡＱＧＴＳＭＹＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣ、およびＰＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＴＤＧＮＣからなる群から選択される。
【００２２】
一部の実施形態では、修飾されたヘパドナウイルスエンベロープ融合タンパク質は、抗原エピトープリピート領域とエンベロープタンパク質との間にスペーサードメインを含む。
一態様では、本開示は、それを必要とする対象におけるＢ型肝炎感染症を処置するための医薬の製造における組換えｍＲＮＡの使用であって、組換えｍＲＮＡが、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域を含むヘパドナウイルスエンベロープＨＢｓＡｇ−Ｓ融合タンパク質をコードし、前記抗原エピトープリピート領域が、ＨＢｓＡｇ−Ｓドメインのループ１およびループ２領域において発現される抗原エピトープからなる群から選択される、使用を提供する。
一部の実施形態では、ループ１において発現される１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域は、アミノ酸配列ＣＸ1ＴＣＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＧＸ6ＳＭＸ7ＰＣ（配列中、Ｘ1はＫまたはＲであり、Ｘ2はＴまたはＭであり、Ｘ3はＴまたはＩであり、Ｘ4はＰ、ＴまたはＬであり、Ｘ5はＡまたはＶであり、Ｘ6はＮまたはＴであり、Ｘ7はＦまたはＹである）によって規定されるか、または１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域は、アミノ酸配列ＰＣＸ8ＴＣＸ9Ｘ10Ｘ11（配列中、Ｘ8はＫまたはＲであり、Ｘ9はＴまたはＭであり、Ｘ10はＴ、ＩまたはＳであり、Ｘ11はＰ、ＴまたはＬである）によって規定される。
【００２３】
一部の実施形態では、ループ２において発現される１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域は、コンセンサスアミノ酸配列ＣＣＣＴＫＰＸ12ＤＧＮＣＸ13（配列中、Ｘ12はＴまたはＳであり、Ｘ13はＴまたはＳである）によって規定される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域は、ＰＣＫＴＣＴＴＰ、ＰＣＲＴＣＴＴＰ、ＣＴＫＰＴＤＧＮＣ、ＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳ、ＣＴＫＰ（Ｔ／Ｓ）ＴＤＧＮＣ、ＰＣ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）ＴＰ、Ｃ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）Ｔ（Ｐ／Ｔ）ＡＱＧ（Ｎ／Ｔ）ＳＭ（Ｆ／Ｙ）ＰＳ、ＰＣＲＴＣＭＴＴＡＱＧＴＳＭＹＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣ、およびＰＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＴＤＧＮＣからなる群から選択される。
一部の実施形態では、ヘパドナウイルスエンベロープ融合タンパク質は、抗原エピトープリピート領域とエンベロープタンパク質との間にスペーサードメインを含む。
【００２４】
一態様では、本開示は、対象におけるＢ型肝炎ウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域を含む修飾されたヘパドナウイルスエンベロープＨＢｓＡｇ−Ｓ融合タンパク質をコードする組換えｍＲＮＡを対象に投与するステップであって、前記抗原エピトープリピート領域が、ＨＢｓＡｇ−Ｓドメインのループ１およびループ２領域において発現される抗原エピトープからなる群から選択されるステップを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、ループ１において発現される１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域は、アミノ酸配列ＣＸ1ＴＣＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＧＸ6ＳＭＸ7ＰＣ（配列中、Ｘ1はＫまたはＲであり、Ｘ2はＴまたはＭであり、Ｘ3はＴまたはＩであり、Ｘ4はＰ、ＴまたはＬであり、Ｘ5はＡまたはＶであり、Ｘ6はＮまたはＴであり、Ｘ7はＦまたはＹである）によって規定されるか、または１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域は、アミノ酸配列ＰＣＸ8ＴＣＸ9Ｘ10Ｘ11（配列中、Ｘ8はＫまたはＲであり、Ｘ9はＴまたはＭであり、Ｘ10はＴ、ＩまたはＳであり、Ｘ11はＰ、ＴまたはＬである）によって規定される。
一部の実施形態では、ループ２において発現される１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域は、コンセンサスアミノ酸配列ＣＣＣＴＫＰＸ12ＤＧＮＣＸ13（配列中、Ｘ12はＴまたはＳであり、Ｘ13はＴまたはＳである）によって規定される。
【００２５】
一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域は、ＰＣＫＴＣＴＴＰ、ＰＣＲＴＣＴＴＰ、ＣＴＫＰＴＤＧＮＣ、ＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳ、ＣＴＫＰ（Ｔ／Ｓ）ＴＤＧＮＣ、ＰＣ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）ＴＰ、Ｃ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）Ｔ（Ｐ／Ｔ）ＡＱＧ（Ｎ／Ｔ）ＳＭ（Ｆ／Ｙ）ＰＳ、ＰＣＲＴＣＭＴＴＡＱＧＴＳＭＹＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣ、およびＰＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＴＤＧＮＣからなる群から選択される。
一部の実施形態では、修飾されたヘパドナウイルスエンベロープ融合タンパク質は、抗原エピトープリピート領域とエンベロープタンパク質との間にスペーサードメインを含む。
一態様では、本開示は、Ｂ型肝炎に対する免疫応答を誘導するための組成物の製造における組換えｍＲＮＡの使用であって、組換えｍＲＮＡが、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域を含むヘパドナウイルスエンベロープＨＢｓＡｇ−Ｓ融合タンパク質をコードし、前記抗原エピトープリピート領域が、ＨＢｓＡｇ−Ｓドメインのループ１およびループ２領域において発現される抗原エピトープからなる群から選択される、使用を提供する。
【００２６】
一部の実施形態では、ループ１において発現される１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域は、アミノ酸配列ＣＸ1ＴＣＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＧＸ6ＳＭＸ7ＰＣ（配列中、Ｘ1はＫまたはＲであり、Ｘ2はＴまたはＭであり、Ｘ3はＴまたはＩであり、Ｘ4はＰ、ＴまたはＬであり、Ｘ5はＡまたはＶであり、Ｘ6はＮまたはＴであり、Ｘ7はＦまたはＹである）によって規定されるか、または１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域は、アミノ酸配列ＰＣＸ8ＴＣＸ9Ｘ10Ｘ11（配列中、Ｘ8はＫまたはＲであり、Ｘ9はＴまたはＭであり、Ｘ10はＴ、ＩまたはＳであり、Ｘ11はＰ、ＴまたはＬである）によって規定される。
一部の実施形態では、ループ２において発現される１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域は、コンセンサスアミノ酸配列ＣＣＣＴＫＰＸ12ＤＧＮＣＸ13（配列中、Ｘ12はＴまたはＳであり、Ｘ13はＴまたはＳである）によって規定される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域は、ＰＣＫＴＣＴＴＰ、ＰＣＲＴＣＴＴＰ、ＣＴＫＰＴＤＧＮＣ、ＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳ、ＣＴＫＰ（Ｔ／Ｓ）ＴＤＧＮＣ、ＰＣ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）ＴＰ、Ｃ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）Ｔ（Ｐ／Ｔ）ＡＱＧ（Ｎ／Ｔ）ＳＭ（Ｆ／Ｙ）ＰＳ、ＰＣＲＴＣＭＴＴＡＱＧＴＳＭＹＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣ、およびＰＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＴＤＧＮＣからなる群から選択される。
【００２７】
一部の実施形態では、修飾されたヘパドナウイルスエンベロープ融合タンパク質は、抗原エピトープリピート領域とエンベロープタンパク質との間にスペーサードメインを含む。
一態様では、本開示は、組換えｍＲＮＡを含む、それを必要とする対象におけるＢ型肝炎感染症を処置するためのキットであって、組換えｍＲＮＡが、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域を含むヘパドナウイルスエンベロープＨＢｓＡＧ−Ｓ融合タンパク質をコードし、前記抗原エピトープリピート領域が、ＨＢｓＡｇ−Ｓドメインのループ１およびループ２領域において発現される抗原エピトープからなる群から選択される、キットを提供する。
一部の実施形態では、ループ１において発現される１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域は、アミノ酸配列ＣＸ1ＴＣＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＧＸ6ＳＭＸ7ＰＣ（配列中、Ｘ1はＫまたはＲであり、Ｘ2はＴまたはＭであり、Ｘ3はＴまたはＩであり、Ｘ4はＰ、ＴまたはＬであり、Ｘ5はＡまたはＶであり、Ｘ6はＮまたはＴであり、Ｘ7はＦまたはＹである）によって規定されるか、または１つもしくは複数の抗原エピトープリピート領域は、アミノ酸配列ＰＣＸ8ＴＣＸ9Ｘ10Ｘ11（配列中、Ｘ8はＫまたはＲであり、Ｘ9はＴまたはＭであり、Ｘ10はＴ、ＩまたはＳであり、Ｘ11はＰ、ＴまたはＬである）によって規定される。
【００２８】
一部の実施形態では、ループ２において発現される１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域は、コンセンサスアミノ酸配列ＣＣＣＴＫＰＸ12ＤＧＮＣＸ13（配列中、Ｘ12はＴまたはＳであり、Ｘ13はＴまたはＳである）によって規定される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の抗原エピトープリピート領域は、ＰＣＫＴＣＴＴＰ、ＰＣＲＴＣＴＴＰ、ＣＴＫＰＴＤＧＮＣ、ＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳ、ＣＴＫＰ（Ｔ／Ｓ）ＴＤＧＮＣ、ＰＣ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）ＴＰ、Ｃ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）Ｔ（Ｐ／Ｔ）ＡＱＧ（Ｎ／Ｔ）ＳＭ（Ｆ／Ｙ）ＰＳ、ＰＣＲＴＣＭＴＴＡＱＧＴＳＭＹＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣ、およびＰＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＴＤＧＮＣからなる群から選択される。
一部の実施形態では、修飾されたヘパドナウイルスエンベロープ融合タンパク質は、抗原エピトープリピート領域とエンベロープタンパク質との間にスペーサードメインを含む。
一態様では、本開示は、ＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣ（配列番号１７）、ＴＣＴＩＰＡＱＧＴＳＭＦＰＳＣ（配列番号１８）、ＴＣＴＴＰＡＱＧＴＳＭＦＰＳＣ（配列番号１９）、ＣＴＫＰＴＤＧＮＣＴ（配列番号２０）、およびＣＴＫＰＳＤＧＮＣＴ（配列番号２１）からなる群から選択される１つまたは複数のペプチドを含む組成物を提供する。
【００２９】
一部の実施形態では、１つまたは複数のペプチドは担体タンパク質とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、担体タンパク質はキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のペプチドは環状である。一部の実施形態では、組成物は薬学的に許容される担体をさらに含む。
一態様では、本開示は、それを必要とする対象におけるＢ型肝炎感染症を処置する方法であって、ＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣ（配列番号１７）、ＴＣＴＩＰＡＱＧＴＳＭＦＰＳＣ（配列番号１８）、ＴＣＴＴＰＡＱＧＴＳＭＦＰＳＣ（配列番号１９）、ＣＴＫＰＴＤＧＮＣＴ（配列番号２０）、およびＣＴＫＰＳＤＧＮＣＴ（配列番号２１）からなる群から選択される１つまたは複数のペプチドを対象に投与するステップを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、１つまたは複数のペプチドは担体タンパク質とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、担体タンパク質はキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のペプチドは環状である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＨＢｓＡｇエピトープ占有アッセイを示す概略図である。１．磁気ビーズ；２．捕捉Ａｂ：ＨＢｓＡｇ外部領域に対するマウス抗ＨＢｓモノクローナルＡｂ（ｍＡｂ）；３．参照ＨＢｓＡｇ試料。Ａｇのみ対抗ＨＢｓ試料と結合したＡｇ；４．レポーターＡｂ：ＰＥコンジュゲートポリクローナル抗ＨＢｓ。ＮＣＰ：非クリアランスプロファイル；ＣＰ：クリアランスプロファイル。
【図２】機能的ＣＨＢ治癒（アッセイ１）および免疫Ａｂ応答活性（アッセイ２）の予測バイオマーカーの概略図である。アッセイ１（上パネル）：１．磁気ビーズ；２．捕捉Ａｂ：ＨＢｓＡｇ「外部領域」に対するマルチプレックスマウス抗ＨＢｓｍＡｂ；３．患者ＨＢｓＡｇ試料；４．レポーターＡｂ：ＰＥコンジュゲートポリクローナル抗ＨＢｓ。アッセイ２（下パネル）：１．磁気ビーズ；２．捕捉Ａｂ：ＨＢｓＡｇ「外部領域」に対する２プレックスマウス抗ＨＢｓｍＡｂ；３．患者試料：複合抗ＨＢｓ（ＨＢｓＡｇを有する）；４．レポーターＡｂ：ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメイン。
【図３】ＨＢｓＡｇクリアランスプロファイル（ＣＰ）を示すＣＨＢ治癒患者を示す概略図である。ＣＨＢ：慢性Ｂ型肝炎。
【図４】ＨＢｓＡｇ非クリアランスプロファイル（ＮＣＰ）を示す非治癒／非応答患者を示す概略図である。ＲＦＵ：相対蛍光単位。
【図５】小さなＢ型肝炎表面（エンベロープ）抗原（ＨＢｓＡｇ−Ｓ）、２２６アミノ酸長およびサブタイプａｙｗ（遺伝子型Ｄ）の提案された構造の概要を示す概略図である。ＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸１００から１６０の間の外部抗原ループ領域は拡大されている：各アミノ酸は灰色の円で表され、システイン残基は黒色の円として示され、潜在的な−Ｓ−Ｓ−ジスルフィド結合は強調されている。１４６位におけるグリコシル化部位（アスパラギン）は白色で示され、グリカン構造が示されている。外来配列を挿入するために使用される位置はアミノ酸１２７および１２８に存在する。
【図６】ＢＮＰ１、２、３、および４について、２２６アミノ酸長のＨＢｓＡｇ−Ｓタンパク質の提案された折り畳みを示す概略図である。ＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸１００から１６０の間の外部抗原ループ領域は拡大されている：各アミノ酸は灰色の円で表され、システイン残基は黒色の円として示され、潜在的な−Ｓ−Ｓ−ジスルフィド結合は強調されている。１４６位におけるグリコシル化部位（アスパラギン）は白色で示され、グリカン構造が示されている。外来配列を挿入するために使用される位置はアミノ酸１２７および１２８に存在し、ＨＢｓＡｇ−Ｓ配列サブタイプａｙｗが親鋳型として使用される。さらなるＨＢｓＡｇ−Ｓ由来抗原配列は親鋳型内の１２７位および１２８位に挿入される。右パネルはＢＮＰ１、２、３および４についての治癒関連ループ配列（出現順に配列番号４１〜４４）を示し、ＨＢｓＡｇ−Ｓ特異的抗原配列は太字であり、「ＧＳＧＳ」リンカーはイタリック体であり、下線が引かれている。ＢＮＰ−１は三量体ＰＣＫＴＣＴＴＰ（配列番号２８）挿入物（ループ１、遺伝子型Ａ特異的、血清型ａｄｗ）を有する「ａｙｗ」親鋳型であり；ＢＮＰ−２は三量体ＰＣＲＴＣＴＴＰ（配列番号３３）挿入物（ループ１、遺伝子型Ｂ／Ｃ、血清型ａｙｗ）を有する「ａｙｗ」親鋳型であり；ＢＮＰ−３はループ２配列ＣＴＫＰＴＤＧＮＣ（配列番号３４）（血清型「ａｄｗ」に由来する）の三量体挿入物を有する「ａｙｗ」親鋳型であり；ＢＮＰ−４は伸長ループ１配列ＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳ（配列番号３５）（血清型「ａｄｗ」）の挿入物（二量体）を有する「ａｙｗ」親鋳型である。
【図７】ＢＮＰ５について、２２６アミノ酸長のＨＢｓＡｇ−Ｓタンパク質の提案された折り畳みを示す概略図である。ＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸１００から１６０の間の外部抗原ループ領域は拡大されている：各アミノ酸は灰色の円で表され、システイン残基は黒色の円として示され、潜在的な−Ｓ−Ｓ−ジスルフィド結合は強調され、「ＧＳＧＳ」リンカーは縞模様のある円で表されている。１４６位におけるグリコシル化部位（アスパラギン）は白色で示され、グリカン構造が示されている。２つのさらなるループ２配列が野生型ループに付加されて反復構造を生じる。ループ２ＣＴＫＰ（Ｔ／Ｓ）ＴＤＧＮＣ（配列番号３６）配列リピートは四角で囲まれている。右パネルは配列（配列番号４５）を示し、ＨＢｓＡｇ−Ｓ特異的抗原配列は太字であり、「ＧＳＧＳ」リンカーはイタリック体であり、下線が引かれている。ＢＮＰ−５は三量体ループ２領域を有する親「ａｙｗ」親鋳型である。「ａｙｗ」ループ２配列は２つのさらなる「ａｄｗ」ループ２配列によって伸長されている。
【図８】ＢＮＰ６について、２２６アミノ酸長のＨＢｓＡｇ−Ｓタンパク質の提案された折り畳みを示す概略図である。ＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸１００から１６０の間の外部抗原ループ領域は拡大されている：各アミノ酸は灰色の円で表され、システイン残基は黒色の円として示され、潜在的な−Ｓ−Ｓ−ジスルフィド結合は強調され、「ＧＳＧＳ」リンカーは縞模様のある円で表されている。１４６位におけるグリコシル化部位（アスパラギン）は白色で示され、グリカン構造が示されている。２つのさらなるループ１ＰＣ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）ＴＰ（配列番号３７）およびループ２ＣＴＫＰ（Ｔ／Ｓ）ＴＤＧＮＣ（配列番号３６）配列が、対応するループ配列内に付加されている。ループ１およびループ２配列リピートは四角で囲まれている。右パネルは伸長配列（出現順に配列番号４６および４７）を示し、ＨＢｓＡｇ−Ｓ特異的抗原配列は太字であり、「ＧＳＧＳ」リンカーはイタリック体であり、下線が引かれている。２つのさらなるループ１配列（血清型ａｄｗ）が挿入され、その後に親鋳型（血清型ａｙｗ）の元のループ１配列が続く。元のループ２配列（親血清型ａｙｗ）の後に２つの挿入ループ２配列、血清型ａｄｗが続く。
【図９】ＢＮＰ７について、２２６アミノ酸長のＨＢｓＡｇ−Ｓタンパク質の提案された折り畳みを示す概略図である。ＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸１００から１６０の間の外部抗原ループ領域は拡大されている：各アミノ酸は灰色の円で表され、システイン残基は黒色の円として示され、潜在的な−Ｓ−Ｓ−ジスルフィド結合は強調され、「ＧＳＧＳ」リンカーは縞模様のある円で表されている。１４６位におけるグリコシル化部位（アスパラギン）は白色で示され、グリカン構造が示されている。２つのさらなるループ１Ｃ（Ｋ／Ｒ）ＴＣ（Ｔ／Ｍ）Ｔ（Ｐ／Ｔ）ＡＱＧ（Ｎ／Ｔ）ＳＭ（Ｆ／Ｙ）ＰＳ（配列番号３８）配列がループ１配列内に付加されている。ループ１リピートは四角で囲まれている。野生型ＨＢｓＡｇ−Ｓ配列についての元のアミノ酸位置は変化せず、さらなるアミノ酸は、‘および‘‘でマークされている。右パネルは伸長配列（出現順に配列番号５２、４８、および４９）を示し、ＨＢｓＡｇ−Ｓ特異的抗原配列は太字であり、「ＧＳＧＳ」リンカーはイタリック体であり、下線が引かれている。２つの伸長ループ１配列（血清型ａｄｗ）、アミノ酸配列１２１〜１３６が挿入され、その後に元のループ１配列（血清型ａｙｗ）が続く。
【図１０】ＢＮＰ８について、２２６アミノ酸長のＨＢｓＡｇ−Ｓタンパク質の提案された折り畳みを示す概略図である。ＨＢｓＡｇ−Ｓのアミノ酸１００から１６０の間の外部抗原ループ領域は拡大されている：各アミノ酸は灰色の円で表され、システイン残基は黒色の円として示され、潜在的な−Ｓ−Ｓ−ジスルフィド結合は強調され、「ＧＳＧＳ」リンカーは縞模様のある円で表されている。１４６位におけるグリコシル化部位（アスパラギン）は白色で示され、グリカン構造が示されている。ループ１およびループ２領域は複製された。野生型ＨＢｓＡｇ−Ｓ配列についての元のアミノ酸位置は変化せず、反復されるループ１およびループ２のさらなるアミノ酸は‘でマークされている。ＢＮＰ−８は元のループ１およびループ２領域（「ａｙｗ」、アミノ酸（ａａ）１２０〜１４７）を含有し、続いてさらなるループ１およびループ２「ａｄｗ」配列（ａａ１２０〜１４７）を含有する。
【図１１】ＣＰ−ＢＮＰ１、２、３、および４の調製物ならびにＣＰ−ＢＮＰ１＋３、１＋３＋４、および３＋４の製剤のＨＢｓＡｇエピトーププロファイル（ｂｉｏｐｌｅｘプラットフォーム）分析を示すグラフである。ＣＰ−ＢＮＰは、免疫化後に標的化された「クリアリング（ｃｌｅａｒｉｎｇ）」抗ＨＢｓ抗体応答を誘導するためにディスプレイされたループ１（ＣＰ−ＢＮＰ１、２、４）またはループ２（ＣＰ−ＢＮＰ３）特異的「クリアリング」エピトープ挿入物を組み込んでいる。ＨＢｓＡｇエピトーププロファイル分析は、ループ１およびループ２の両方にわたるエピトープが、全ての試験したＣＰ−ＢＮＰ調製物および製剤において保持（＋／−０．５倍の正常範囲内）および／または増強される（＞０．５倍）ことを示し、標的「クリアリング」エピトープについての抗原性が、ＢＮＰ製剤において達成される最も強力／最も広範なエピトープ保持を伴って、正確にかつインタクトでディスプレイされることを示す。
【図１２】環状ペプチドについての、生成され、導出され、精製されたモノクローナル抗体分析を示すグラフである。このグラフは、ループ１またはループ２の汎遺伝子型／血清型環化ペプチド製剤による免疫化後の、選択され、生成されたモノクローナル抗体の抗ＨＢｓ抗体により誘導されたＣＰプロファイル（ｂｉｏｐｌｅｘプラットフォーム）分析を示す。生成されたモノクローナル抗ＨＢｓ抗体ｎ＝８が、参照ＶＬＰ抗原とのプレインキュベーション時のＩｎｄＣＰの誘導（例えば、ループ１およびループ２の両方のエピトープでのエピトープ認識の消失）について分析され、「クリアリング」またはＣＰ関連抗ＨＢｓプロファイルを示した。
【図１３Ａ−Ｄ】ＣＰ−ＢＮＰ抗原免疫化後の抗ＨＢｓ抗体反応性分析を示すグラフである。血清の標準的な酵素免疫測定法（ＥＩＡ）分析を、ＣＰ−ＢＮＰ１＋３、１＋３＋４、および３＋４の製剤のＣＰ−ＢＮＰ１、２、３、および４の調製物によるｎ＝３の免疫化後に、動物の出血（出血１〜４、または全出血にわたって平均した）について実施した。誘導した抗体応答を、組換えＷＴ  ＨＢｓＡｇ（ＶＬＰ）（図１３Ａ）；ＨＢｓＡｇループ１特異的環化ペプチド（図１３Ｂ）；およびＨＢｓＡｇループ２特異的環化ペプチド（図１３Ｃ）に対する特異性について分析した。図１３Ｄは、ＷＴ−ＢＮＰ、ループ１ペプチドおよびループ２ペプチド抗原に対する抗Ｈｂｓ反応性を報告している。最も強く、最も迅速で最も広範な、または最も保存された（ＶＬＰならびにループ１およびループ２の両方のペプチドに対して）抗ＨＢｓ抗体免疫原性応答が、ループ１およびループ２の両方に対する標的「クリアリング」エピトープを送達したＣＰ−ＢＮＰ製剤１＋３＋４、１＋４＋５、５＋７および５について観察された（囲んでいる）。
【図１４】ＣＰ−ＢＮＰ１、３、４、５、および７の調製物の単一または組合せによる免疫化後の、選択した血清応答の抗ＨＢｓ抗体により誘導されたＣＰプロファイル（ｂｉｏｐｌｅｘプラットフォーム）分析を示すグラフである。ＣＰ−ＢＮＰの調製物および製剤によるｎ＝３の免疫化スケジュール後の最終的な出血血清を、抗ＨＢｓ抗体プロファイルについて分析した。免疫原性研究由来の抗ＨＢｓ陽性個体マウス血清との参照ＶＬＰ抗原＋／−プレインキュベーションのＨＢｓＡｇエピトーププロファイルを、血清中の「クリアリング」またはＣＰ関連抗ＨＢｓに起因するＣＰの誘導について評価した。この標的化した「クリアリング」エピトープ抗ＨＢｓ発生は、ＣＰ−ＢＮＰ１＋４＋５、１＋３＋４、５、または５＋７の製剤免疫化を受けたマウス（９−５、１３−２、１６−５および１７−３）において最も一貫して観察された。
【図１５Ａ−１５Ｃ】ＣＨＢ感染のネズミモデルにおける種々のＣＰ−ＢＮＰ組合せの治療ワクチン接種後のベースライン（Ｗ１０）からのＨＢＶ  ＤＮＡ（ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍＬ）レベルの変化を示すグラフである。０．５μｇ用量におけるＣＰ−ＢＮＰ１＋４＋５は、同用量におけるプラセボまたはＷＴ−ＢＮＰのいずれかと比較して、ＨＢＶ  ＤＮＡの最も迅速かつ絶対的な持続的減少を示した。ＣＰ−ＢＮＰの他の組合せもまた、ＨＢＶ  ＤＮＡレベルが減少したが、ＣＰ−ＢＮＰ１＋４＋５と比較して、より遅い速度かつより少ない絶対的な減少であった。
【図１６Ａ−１６Ｃ】ＣＨＢ感染のネズミモデルにおける種々のＣＰ−ＢＮＰ組合せの治療ワクチン接種後のベースライン（Ｗ１０）からのＨＢｓＡｇ（ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍＬ）レベルの変化を示すグラフである。０．５μｇ用量におけるＣＰ−ＢＮＰ１＋４＋５は、同用量におけるプラセボまたはＷＴ−ＢＮＰのいずれかと比較して、ＨＢｓＡｇの最も迅速かつ絶対的な持続的減少を示した。ＣＰ−ＢＮＰの他の組合せもまた、ＨＢｓＡｇレベルが減少したが、ＣＰ−ＢＮＰ１＋４＋５と比較して、より遅い速度かつより少ない絶対的な減少であった。
【図１７】ＨＥＫ２９３Ｔ（図１７Ａ）およびＨｕｈ７（図１７Ｂ）細胞株へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写およびトランスフェクション後の、ＲＮＡ由来のＷＴ−ＢＮＰおよびＣＰ−ＢＮＰ４のＨＢｓＡｇ  ＢＮＰ発現のウェスタン分析を示す画像である。抗ＨＢｓＡｇ抗体を使用して、両方の細胞株への適切なｍＲＮＡのトランスフェクション後に生成したＨＢｓＡｇバンド（＋／−グリコシル化、約５０％）が、ＷＴ−ＢＮＰ（２４または２７ｋＤａ）およびＣＰ−ＢＮＰ４（２９または３２ｋＤａ）の両方において検出された。未処理および試薬アッセイ対照トランスフェクションはＨＢｓＡｇに対して陰性であった。対照は、精製したＨＢｓＡｇ（Ｆｌａｇタグ、２５または２８ｋＤを有する）およびＷＴ−ＢＮＰ  ＤＮＡのトランスフェクション後からの試料（フラグタグ、２５または２８ｋＤを有する）を含んだ。ｍＲＮＡ転写産物は、Ｆｌａｇタグの非存在下でＷＴ−ＢＮＰまたはＢＮＰ４特異的ＨＢｓＡｇサブユニットをコードする。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本技術の実質的な理解を提供するために、本技術の特定の態様、様式、実施形態、変形形態、および特徴が、様々なレベルの詳細で以下に記載されることを理解されたい。本明細書において使用される特定の用語の定義は以下に提供される。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は一般に、本技術が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００３２】
Ｉ．一般
機能的Ｂ型肝炎治癒は、血清ＨＢＶ  ＤＮＡの検出不能性を維持しながら、抗ＨＢｓＡｇ抗体（「抗ＨＢｓ」）へのセロコンバージョンを伴うまたは伴わないＨＢｓＡｇ消失として定義される（Revill P, et al. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 2016, 13(4):239-248)）。クリアランスプロファイル（ＣＰ）の選択圧を模倣し、ＨＢｓＡｇクリアランスに対する効果的かつ特異的なＢ細胞抗ＨＢｓ免疫応答を促進するために、ＣＰ関連エピトープの増強された抗原ディスプレイを組み込んでいるＨＢｓＡｇバイオナノ粒子（ＢＮＰ）が本明細書に記載されている。ＣＨＢの新しく開発され、検証されたＣＢＡ  Ｃａｒｔｅｒ  Ｊ（ＣＢＡ／ＣａＪ）ネズミモデルにおいて、ＨＢｓＡｇクリアランスおよびセロコンバージョンを駆動するための治療ワクチン接種転帰を評価する前に、ＢＮＰの免疫原性が正常なＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて最初に検証される（例えば、Chen HH, et al. PNAS 112(7):2175-2180 (2015)を参照のこと）。一部の実施形態では、ＣＰ発現ＢＮＰ治療ワクチンの目的は、ＣＨＢを有する患者に送達される場合、機能的Ｂ型肝炎治癒を加速させ、駆動することである。一部の実施形態では、ＣＰ発現ＢＮＰの治療機能は、Ｂ細胞応答を増強し、加速させ、ＨＢｓＡｇセロコンバージョンを促進するための過剰グリコシル化（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）修飾、および／またはＣＨＢ患者における、潜在的に既に存在し、中和性であるが、クリアリングをもたらさない循環抗ＨＢｓ抗体に対してＢＮＰの「ステルス」状態を誘導するためのＢＮＰ送達骨格の修飾によってさらに増強され得る。
【００３３】
ＩＩ．定義
以下の用語が本明細書で使用され、それらの定義は指針のために提供される。
対象の明細書で使用される場合、単数形「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の態様を含む。したがって、例えば、「プロファイル」への言及は単一のプロファイル、および２つ以上のプロファイルを含み、「エピトープ」への言及は単一のエピトープ、および２つ以上のエピトープを含み、「抗体」は単一の抗体、および２つ以上の抗体を含み、「本開示」への言及は、本開示によって教示される単一および複数の態様を含む、などである。
「約」という用語および範囲の使用は一般に、約という用語によって限定されるか否かに関わらず、包含される数が本明細書に示される正確な数に限定されないことを意味し、本技術の範囲から逸脱せずに実質的に引用される範囲内である範囲を指すことを意図する。本明細書で使用される場合、「約」は当業者によって理解され、使用される文脈上である程度変動する。その用語が使用される文脈を前提として、当業者にとって明確ではない用語の使用がある場合、「約」は特定の用語のプラスまたはマイナス１０％までを意味する。
【００３４】
「抗原」という用語は、その最も広い意味において、免疫応答において反応し、および／または免疫応答を誘導することができる物質を指すために本明細書で使用される。「抗原」への言及は、抗原決定基またはエピトープを含む。
「抗原決定基」または「エピトープ」とは、特定の免疫応答が指向される抗原分子の部分を意味し、ハプテンを含む。典型的に、動物において、抗原はいくつかまたはさらに多くの抗原決定基を同時に提示する。「ハプテン」は抗体と特異性を組み合わせることができるが、担体と結合しない限り免疫応答を誘導することができないか、またはほとんど誘導することができない物質である。ハプテンは典型的に単一の抗原決定基またはエピトープを含む。
本明細書で使用される場合、「バイオナノ粒子」または「ＢＮＰ」という用語は、１つまたは複数の標的挿入エピトープを含むかまたはディスプレイするように修飾されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）を指す。本開示の目的のために、「バイオナノ粒子」または「ＢＮＰ」という用語はまた、「組換えウイルス様粒子抗原」または「ＶＬＰ−Ａｇ」を指す。
本明細書で使用される場合、「有効量」または「治療有効量」または「薬学的有効量」という用語は、所望の生物学的、治療的、および／または予防的効果を達成するのに十分な量、例えば、疾患、その状態および／または症状の予防を生じる量を指す。治療的または予防的適用の文脈において、対象に投与される組成物の量は、疾患の種類および重症度ならびに全体的な健康、年齢、性別、体重および組成物薬物に対する耐性などの個体の特徴に依存する。また、疾患または状態の程度、重症度および種類にも依存する。当業者はこれらおよび他の要因に応じて適切な投薬量を決定することができる。一部の実施形態では、複数回用量が投与される。さらにまたは代替として、一部の実施形態では、複数の治療用組成物または化合物（例えば、ワクチンなどの免疫原性組成物）が投与される。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「機能的治癒」という用語は、ＣＨＢの機能的治癒を指し、天然に存在するか、または導入された抗ＨＢｓＡｇ抗体（本明細書では「抗ＨＢｓ抗体」または「抗ＨＢｓ」とも称される）の存在の有無にかかわらず、検出可能なＨＢｓＡｇの消失によって定義され、その抗ＨＢｓＡｇ抗体はＨＢｓＡｇ上のエピトープを選択するように選択的に結合する抗体の集団を含み、抗ＨＢｓ抗体によって占有される場合、ＨＢｓＡｇおよび最終的にＨＢＶのクリアランスを生じる。ＨＢＶは完全に治癒した対象において検出できない。
「免疫原性組成物」という用語は、組成物に曝露された哺乳動物において免疫応答を誘発する組成物を指すために本明細書で使用される。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、８つのＣＰ−ＢＮＰ（例えば、ＢＮＰ１、２、３、４、５、６、７、８）および／またはＣＰエピトープ環状ペプチドのうちの少なくとも１つを含む。
【００３６】
一部の実施形態では、本明細書に記載される免疫原性組成物は多くの形態で投与するために製剤化され得る。例えば、一部の実施形態では、免疫原性組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、経口、経鼻、または局所投与のために調製される。組成物はまた、特定の投薬形態のために製剤化され得る。例えば、一部の実施形態では、免疫原性組成物は、液体、ゲル、エアロゾル、軟膏、クリーム、凍結乾燥製剤、粉末、ケーキ、錠剤、またはカプセルとして製剤化され得る。他の実施形態では、免疫原性組成物は、制御放出製剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、パルス放出製剤、および混合即時放出製剤として製剤化される。一部の実施形態では、免疫原性組成物は液体として提供される。他の実施形態では、免疫原性組成物は凍結乾燥形態で提供される。
本明細書で使用される場合、「感染した」という用語は、疾患または病原体、例えば、ウイルスを保有することを指す。感染は、ウイルスもしくは病原体の投与による（例えば、ワクチン接種による）ように意図的であってもよく、またはある生物から他の生物への病原体の自然的な移入、もしくは汚染された表面から生物への自然的な移入によるように意図的でなくてもよい。一部の実施形態では、感染は、水圧注入アプローチを使用した複製可能なＤＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクションによってモデル生物（例えば、ネズミモデル）において誘導される。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」は交換可能に使用され、動物、例えば、任意の脊椎動物種のメンバーを指す。一部の実施形態では、対象はヒトである。
本明細書で使用される場合、「処置する」または「処置」または「軽減」という用語は治療的処置を指し、その目的は、標的とする病的状態もしくは障害の進行もしくは進展を低減させるか、軽減するか、もしくは遅延させるか、および／または標的とする病的状態もしくは障害の進行を好転させることである。例えば、対象は、本明細書に記載される方法に従って、本技術の組成物の治療量を受けた後に、対象が、ＨＢｓＡｇをクリアリングする抗体の観察可能および／もしくは測定可能な誘導、ならびに／または検出可能なＨＢｓＡｇの消失、ならびに／またはＨＢｓＡｇおよび／もしくはＨＢＶ  ＤＮＡの低減したレベルを示す場合、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）感染症を含む、現存するＢ型肝炎感染症および／または持続性Ｂ型肝炎感染症について成功裏に「処置」されている。
「ワクチン」という用語は、特定の疾患に対する免疫を生じさせるか、または増大させるために対象に投与される組成物を指すために本明細書で使用される。一部の実施形態では、ワクチンは、薬学的に許容されるアジュバントおよび／または薬学的に許容される担体を含む。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「ＢＮＰ１」または「ＣＰ−ＢＮＰ１」とは、配列番号１、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、例えば配列番号９に示されるヌクレオチド配列、配列番号１を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）もしくはバイオナノ粒子（ＢＮＰ）、配列番号１を含む免疫原性組成物、または配列番号１を含むワクチンを指す。
本明細書で使用される場合、「ＢＮＰ２」または「ＣＰ−ＢＮＰ２」とは、配列番号２、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、例えば配列番号１０に示されるヌクレオチド配列、配列番号２を含むＶＬＰもしくはＢＮＰ、配列番号２を含む免疫原性組成物、または配列番号２を含むワクチンを指す。
本明細書で使用される場合、「ＢＮＰ３」または「ＣＰ−ＢＮＰ３」とは、配列番号３、配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、例えば配列番号１１に示されるヌクレオチド配列、配列番号３を含むＶＬＰもしくはＢＮＰ、配列番号３を含む免疫原性組成物、または配列番号３を含むワクチンを指す。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「ＢＮＰ４」または「ＣＰ−ＢＮＰ４」とは、配列番号４、配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、例えば配列番号１２に示されるヌクレオチド配列、配列番号４を含むＶＬＰもしくはＢＮＰ、配列番号４を含む免疫原性組成物、または配列番号４を含むワクチンを指す。
本明細書で使用される場合、「ＢＮＰ５」または「ＣＰ−ＢＮＰ５」とは、配列番号５、配列番号５に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、例えば配列番号１３に示されるヌクレオチド配列、配列番号５を含むＶＬＰもしくはＢＮＰ、配列番号５を含む免疫原性組成物、または配列番号５を含むワクチンを指す。
本明細書で使用される場合、「ＢＮＰ６」または「ＣＰ−ＢＮＰ６」とは、配列番号６、配列番号６に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、例えば配列番号１４に示されるヌクレオチド配列、配列番号６を含むＶＬＰもしくはＢＮＰ、配列番号６を含む免疫原性組成物、または配列番号６を含むワクチンを指す。
本明細書で使用される場合、「ＢＮＰ７」または「ＣＰ−ＢＮＰ７」とは、配列番号７、配列番号７に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、例えば配列番号１５に示されるヌクレオチド配列、配列番号７を含むＶＬＰもしくはＢＮＰ、配列番号７を含む免疫原性組成物、または配列番号７を含むワクチンを指す。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「ＢＮＰ８」または「ＣＰ−ＢＮＰ８」とは、配列番号８、配列番号８に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、例えば配列番号１６に示されるヌクレオチド配列、配列番号８を含むＶＬＰもしくはＢＮＰ、配列番号８を含む免疫原性組成物、または配列番号８を含むワクチンを指す。
本明細書で使用される場合、「クリアランスプロファイル（ＣＰ）エピトープ環状ペプチド１」とは配列番号１７を指す。本明細書で使用される場合、「ＣＰエピトープ環状ペプチド２」とは配列番号１８を指す。本明細書で使用される場合、「ＣＰエピトープ環状ペプチド３」とは配列番号１９を指す。本明細書で使用される場合、「ＣＰエピトープ環状ペプチド４」とは配列番号２０を指す。本明細書で使用される場合、「ＣＰエピトープ環状ペプチド５」とは配列番号２１を指す。
本明細書で使用される場合、機能的治癒をもたらす抗ＨＢｓ応答内の抗体は、「クリアランス抗体」と称される。これらの抗体は、特異的ＨＢｓＡｇエピトープを標的とし、最終的にＨＢｓＡｇのクリアランスおよび機能的治癒をもたらす抗体の「クリアランスプロファイル」を規定する。エピトープは、宿主対象において抗体によって占有されると、対象に機能的治癒をもたらすか、またはもたらす可能性があることを意味する「クリアランスエピトープ」と称される。したがって、「クリアランスプロファイル」は、ＨＢｓＡｇ上の利用できないエピトープのフィンガープリントまたはこれらのエピトープを占有する個々の抗体の一式もしくは集団を指すことができ、これらの抗体が占有する場合、エピトープは達成される機能的治癒の予測となる。ＨＢｓＡｇ上の抗体またはエピトープのクリアランスプロファイルは、処置中の対象が機能的治癒を達成する見込みまたは可能性のバイオマーカーを表す。機能的治癒の「可能性」への言及は、一般に、可能性が１００％であること、すなわち、抗体のクリアランスプロファイルが検出されると、対象が機能的治癒の状態に達すること、または循環ＨＢｓＡｇの非存在下で対象が機能的治癒を達成することを意味する。しかしながら、いずれの生体系においても同様だが、変動が起こり得る。したがって、本技術の目的のために、機能的治癒の「可能性」への言及は、抗体のクリアランスプロファイルを有する対象が機能的治癒を達成する少なくとも８０％の確率を意味する。「少なくとも８０％」とは、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％を意味する。
【００４１】
ＨＢｓＡｇ上の「エピトープのクリアランスプロファイル」または「エピトープのＣＰ」は、クリアランス抗体によって占有される見込みを有するＨＢｓＡｇ上の利用可能または利用可能ではないエピトープの存在である。ＨＢｓＡｇ上のエピトープのクリアランスプロファイルが結合のために利用可能なエピトープを含まない場合、エピトープは「利用不可能」とみなされ、これは、エピトープが抗体によって占有され、機能的治癒が起こる可能性が高いことを意味する。あるいは、ＨＢｓＡｇが検出されないか、または循環ＨＢＶ  ＤＮＡが全く検出されない場合、機能的治癒が達成され、抗体のクリアランスプロファイルのみが存在する（またはＨＢＶへの曝露後の免疫応答において誘導され得る）。
【００４２】
また、「標準化された」という用語は、ＨＢｓＡｇまたはＨＢｓＡｇ−Ａｂ複合体のレベルの「正規化」を包含し、アッセイのためのＨＢｓＡｇまたはＨＢｓＡｇ−Ａｂ複合体の最適レベルを表す。「血液由来の試料」は血清を含む。
【００４３】
ＩＩＩ．慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）機能的治癒
検出できない血清ＨＢＶ  ＤＮＡを伴う、血清ＨＢｓＡｇのクリアランスおよび／または抗ＨＢｓへのセロコンバージョンは、ＣＨＢに対する機能的治癒であるとみなされる。なぜならこれは治療の停止を可能にするだけでなく、肝硬変の速度および肝細胞がん（ＨＣＣ）の発生の有意な低下、ならびに生存率の全体の増加とも関連するからである（Fattovich G, et al. Am J Gastroenterol. 1998; 93(6):896-900; Yuen MF, et al. Gastroenterology 2008, 135(4):1192-1199; Simonetti J, et al. Hepatology 2010, 51: 1531-1537）。急性Ｂ型肝炎感染症の自然消散の間、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞とＢ細胞の協調的相互作用により、感染した肝細胞が取り除かれ、非細胞溶解性経路を介してウイルス複製が抑制され、ウイルス特異的抗体（抗ＨＢｓ）の産生を介してビリオンが中和される。慢性感染症はＨＢＶ複製を制御する宿主免疫応答の失敗を表し、ＨＢｓＡｇの自然発生的クリアランスはまれであり、患者の１〜２％においてのみ発生することが見出されている。この割合は現在の抗ウイルス療法では増強されないが、この自然消失に関連する重要な要因は１００ＩＵ／ｍｌ未満のＨＢｓＡｇの低い血清レベルであり（Tseng TC, et al. Gastroenterology 2011, 141(2):517-525, 25 e1-2）、このようなレベルを達成するように設計されたストラテジーは治療手段（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｒｍａｍｅｎｔａｒｉｕｍ）の一部を形成する。ＨＢｓＡｇ消失および／またはセロコンバージョンに関連する機構は不明であるが、ＨＢＶ再活性化と関連するＢ細胞枯渇療法（例えば、リツキシマブ、抗ＣＤ２０）は肝不全および死をもたらすことから、有効なＢ細胞応答が機能的Ｂ型肝炎治癒を維持するために必須であることが示されている（Shouval D. Semin Liver Dis. 2013; 33(2):167-177）。臨床的および診断的観察により、相同ＨＢｓＡｇに対して低い親和性を有する抗ＨＢｓをコードするＢ細胞クローンが、ＣＨＢを有する患者において存在することが示唆されている（Gerlich WH. Clin Infect Dis. 2007; 44(9):1170-1172）。ＣＨＢを有するＨＢｓＡｇ陽性患者において同時に発現した抗ＨＢｓは、抗ＨＢｓ応答が慢性感染症を克服するには量的および／または質的に不十分または不適切（弱い）であるが、特異的抗体産生が完全に阻害されていないことを示すことをさらに示唆している（Zhang JM, et al. Clin Infect Dis. 2007; 44(9):1161-1169）。
【００４４】
ＩＶ．慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）疾患
慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）は５つの認識可能で別の相に及ぶ感染性疾患である：第１相は、感染および慢性感染症の確立から活動性疾患の最初の徴候までの時間に及ぶ免疫寛容（ＩＴ）相である。これは典型的に無症候性であり（重大な肝疾患はない）、これらの個体は出生時またはその直後に感染を獲得し、それらはＨＢｅＡｇ陽性である。第２相または免疫クリアランス（ＩＣ）相は、ヒトの肝疾患において著しい進行を伴う疾患活動期である。これらの患者はまた、ＨＢｅＡｇ陽性でもある。第３相または非複製相（ＮＲ）では、活動性肝疾患の証拠はほとんどないか、全くなく、ウイルスは低レベルで同定でき、ヒトはＨＢｅＡｇ陰性である。第４相は肝疾患活動およびウイルス複製の再発または再燃であり、この相はＨＢｅＡｇ陰性疾患としても知られている。この相は最終的にそれ自体で立ち消え、次いで患者は多くの場合、肝硬変になる傾向がある。最後の相の第５相は、ＨＢｓＡｇ消失および抗ＨＢｓセロコンバージョンとして同定される。これはまた、機能的治癒（ＦＣ）相としても認識される。
【００４５】
ＣＨＢは、ＨＢＶ遺伝子型に基づいて少なくとも４つの異なる疾患を含む。したがって、ＣＨＢは、アジアＣＨＢ（遺伝子型ＢおよびＣ）、ヨーロッパＣＨＢ（遺伝子型Ａ−２およびＤ）、アフリカＣＨＢ（遺伝子型Ａ−１およびＥ）およびラテンアメリカＣＨＢ（遺伝子型ＦおよびＨ）に分けて考えることができ、これら４群の各々は、それぞれ、異なる民族（アジア対ヨーロッパ／コーカサス対アフリカ対ラテン系）、獲得年齢（周産期対幼児期対成人早期）および伝播様式（母子間、子供間、文化的スカリフィケーション、医原性／非経口および性的）を有する。異なる遺伝子型（例えば、ＡとＤ、またはＢとＣ）の間の組換えは珍しくない。ＣＨＢは、ＨＢｅＡｇおよび疾患状態；肝疾患の有無にかかわらず、ＨＢｅＡｇ陽性またはＨＢｅＡｇ陰性のいずれかに基づいてさらに階層化することができる。
ＦＣ−ＰはＦＣと関連し、ｍＡｂ５、６、７、および８を使用する場合、ＨＢｓＡｇの「ａ」決定基を含む、外部ループ領域内のループ１およびループ２におけるエピトープ認識の消失によって実証される（図１および２を参照のこと）。治癒転帰後の抗ＨＢｓ応答は、参照ＨＢｓＡｇ試料に対してＦＣ−Ｐを「誘導する」。本明細書に記載される一部の実施形態では、ＦＣ−Ｐ関連エピトープ（ループ１＋ループ２）を含むＢＮＰプラットフォームを使用するワクチン接種は、治癒の可能性を増強するＦＣ−Ｐと関連する抗ＨＢｓ応答を生じる。
【００４６】
Ｖ．ＨＢｓＡｇ、抗ＨＢｓ、およびＣＰ／Ｆ−ＣＰ
患者の血液中で循環するＨＢＶのエンベロープタンパク質（ＨＢｓＡｇ）のエピトーププロファイルの測定はウイルスの直接的な測定であり、それは患者の血液中に見出される外来抗原の検出を含む。ＣＰにおいて開発された論理または論証は、感染したヒトがウイルスに対する免疫応答を開始し、ウイルスに対するその免疫応答選択圧の効果を測定することができることである。この効果は、そのヒトにおけるウイルスのエンベロープに対するＨＢｓＡｇエピトープの変化として実証され得る。ＣＰはマルチプレックス報告パネルにわたって測定される（図２）。ＦＣ−Ｐは、Ｓｔ．Ｖｉｎｃｅｎｔ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅで実施された自然歴コホートに適用された４プレックスパネルに対する反応性に対して報告されており、このコホート内では患者はＨＢｅＡｇ陰性であり、第４相において疾患活動性は最小限であるか、または全くなく、第５相に移行しており、感染遺伝子型は制限されていなかった（すなわち、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤ）。対照的に、患者によって作られた抗体の測定はウイルスに対する宿主の応答の直接的な測定であり、患者の血液中を循環していることも見出される。ＦＣ−Ｐにおいて開発された論理または論証は、これらのＣＨＢを治癒したヒトが抗体反応を首尾良く開始し、その効果を測定できることである。この効果はＨＢＶのパネルの外部から供給されたＨＢｓＡｇ上にエピトープ変化を誘導するその抗体の能力によって実証され得る；すなわち、患者の抗体は、供給された外因性抗原上でエピトーププロファイル応答を「誘導」する。「誘導された」ＦＣ−Ｐは、第４／５相の自然歴コホート、ＨＢｅＡｇ陰性、制限されていない遺伝子型、ＣＨＢ患者に適用され、これは４プレックス報告パネルに基づく。
【００４７】
ＶＩ．ＨＢｓＡｇ、ＶＬＰ、およびＢＮＰ
ＨＢＶはウイルスエンベロープを形成する３つのＨＢｓＡｇタンパク質；小型（Ｓ）、中型（Ｍ）および大型（Ｌ）をコードする（Carman WF, et al. J Hepatol. 1999; 31(2):195-201; Seeger C, et al. Hepadnaviruses. 2013）。いずれも、共通の２２６残基ＨＢｓＡｇ−Ｓドメインを共有し（Seeger C, et al. Hepadnaviruses. In “Fields Virology”, 2013, 6th edition. pp. 2180-2221）、一方、ＭおよびＬのＮ末端伸長はそれぞれプレＳ２およびプレＳ１ドメインをコードする。ＨＢｓＡｇエンベロープタンパク質は重要なウイルス抗原であり；感染の間、Ｓ、Ｍ、およびＬが発現され、宿主細胞のＥＲ膜を介して共にパッケージングされて、感染性ＨＢＶ粒子のエンベロープを形成する。Ｓタンパク質は、主に外部ループ領域の主要な抗原「ａ」決定基（残基９９〜１６９）に対する防御抗体を誘導することができるＢ型肝炎ワクチンの唯一の抗原成分である。Ｓタンパク質は脂質関連ＶＬＰに容易に自己集合し、酵母で作られ、グリコシル化されていない、現在の組換えワクチンの基礎を形成する。Ｓタンパク質は結晶化されていないが、主要抗原「ａ」決定基内に別個のループドメイン（ループ１：ａａ１０７〜１３５；ループ２：ａａ１３９〜１４９）を形成すると予測される、多数のシステインおよびプロリン残基を含有する立体構造的に動的なタンパク質と考えられる（Stirk HJ, et al. Intervirology. 1992, 33(3):148-158）。Ｓタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を配列番号２２に示す。ＡｇｅＩ制限部位およびＦＬＡＧタグを有するＳタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を配列番号２３に示す。「ａ」決定基内の変更（バリアントおよび抗体占有）はＨＢｓＡｇトポロジーを修飾することができ、ＨＢＶ中和表現型に直接影響を及ぼすことができる（Carman WF, et al. J Hepatol. 1999; 31(2):195-201）。
【００４８】
配列番号５０のアミノ酸配列を有するＨＢｓＡｇ−Ｓタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を配列番号２２に示す。配列番号５１のアミノ酸配列を有するＳタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を配列番号２３に示す。ＨＢｓＡｇ−Ｓ  ｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を以下の表Ａに提供する。
【００４９】
【表１】
2021522864.tif 000003
2021522864.tif 000004
【００５０】
ＨＢｓＡｇ  ＶＬＰは、個々のサブユニット内および間の多数の分子内および分子間ジスルフィド結合に起因して非常にコンパクトであり（Seeger C, et al. Hepadnaviruses. . In “Fields Virology”, 2013, 6th edition. pp. 2180-2221; Mangold CM, et al. Arch Virol. 1997, 142(11):2257-2267）、臨床試験が、挿入された外来抗原配列およびバイオナノ粒子（ＢＮＰ）送達プラットフォームとして医学的に妥当な配列をディスプレイするように首尾良く修飾することができるように確立された（Beaumont E, et al. Vaccine. 2015, 33(8):973-976; Buonaguro L, et al. Expert Rev Vaccines. 2011, 10(11):1569-1583; Cheong WS, et al. Antiviral Res. 2009, 81(2):113-122; Moffat JM et al. Vaccine. 2013, 31(18):2310-2316; Netter HJ, et al. J Virology 2001;75(5):2130-2141; Phogat S et al. Virology. 2008, 373(1):72-84）。
【００５１】
ＶＩＩ．ＨＢｓＡｇループ１およびループ２のクリアランスエピトープ
ＨＢｓＡｇ上のクリアランスエピトープは、対象における抗体によって占有される場合、起こり得る結果が機能的治癒であるものである。エピトープはＨＢｓＡｇ−Ｓのループ１およびループ２の各々に位置する。アッセイに関連して、ＨＢｓＡｇ−Ｓ上の様々なエピトープを標的とするマルチプレックスアッセイにおいて使用するためにモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が選択される。ｍＡｂ５および６と指定した１セットのｍＡｂはループ１のエピトープを標的とする。以下のコンセンサスアミノ酸配列によって規定される２つのループ１のエピトープがスクリーニングされる：
ＣＸ1ＴＣＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＧＸ6ＳＭＸ7ＰＣ（配列番号２４）、配列中：
Ｘ1はｓＫ１２２（遺伝子型Ａ１、Ａ２、Ａ６、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ６、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ）またはｓＲ１２２（遺伝子型Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ９、Ｃ２、Ｃ４、Ｄ、Ｅ）であり；
Ｘ2はｓＴ１２５（遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ）またはｓＭ１２５（遺伝子型Ｄ３、Ｄ５）であり；
Ｘ3はｓＴ１２６（遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ）またはｓＩ１２６（遺伝子型Ｃ）であり；
Ｘ4はｓＰ１２７（遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｉ）またはｓＴ１２７（遺伝子型Ｃ４、Ｄ２、Ｄ５）またはｓＬ１２７（遺伝子型Ｅ、Ｆ、Ｈ）であり；
Ｘ5はｓＡ１２８（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ）またはｓＶ１２８（Ｄ２）であり；
Ｘ6はｓＮ１３１（遺伝子型Ａ、Ｇ、Ｉ）またはｓＴ１３１（遺伝子型Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ）であり；
Ｘ7はｓＦ１３４（遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｈ）またはｓＹ１３４（遺伝子型Ｄ、Ｇ、Ｉ）である；
およびｍＡｂ１０が結合するコンセンサスアミノ酸配列ＰＣＸ8ＴＣＸ9Ｘ１０Ｘ11（配列番号２５）、配列中：
Ｘ8はｓＫ１２２（遺伝子型Ａ１、Ａ２、Ａ６、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ６、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ）またはｓＲ１２２（遺伝子型Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ９、Ｃ２、Ｃ４、Ｄ、Ｅ）であり；
Ｘ9はｓＴ１２５（遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ）またはｓＭ１２５（遺伝子型Ｄ３、Ｄ５）であり；
Ｘ10はｓＴ１２６（遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ）またはｓＩ１２６（遺伝子型Ｃ）またはｓＳ１２６またはｓＡ１２６（共通のバリアント）であり；
Ｘ11はｓＰ１２７（遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｉ）またはｓＴ１２７（遺伝子型Ｃ４、Ｄ２、Ｄ５）またはｓＬ１２７（遺伝子型Ｅ、Ｆ、Ｈ）である。
【００５２】
別のセットのｍＡｂ（ｍＡｂ、７、８、１１、１２、１６、および１７と指定される）は、以下のコンセンサスアミノ酸配列によって規定されるループ２上のエピトープを標的とする：
ＣＣＣＴＫＰＸ12ＤＧＮＣＸ13（配列番号２６）
配列中：
Ｘ12はｓＴ１４０（遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ）またはｓＳ１４０（遺伝子型ＥまたはＦ）であり；
Ｘ13はｓＴ１４３（遺伝子型Ａ、Ｂ）またはｓＳ１４３（遺伝子型Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ）である。
【００５３】
理論によって束縛されることを望まないが、ループ１におけるいずれかのエピトープが占有される場合、ループ２におけるエピトープが占有される場合、またはループ１におけるいずれかのエピトープがループ２におけるエピトープと一緒に占有される場合、抗体のクリアランスプロファイルが達成され、機能的クリアランスを生じることが本明細書で提案される。
一実施形態では、占有されるエピトープは、ＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣ（配列番号２７）；および／またはＰＣＫＴＣＴＴＰ（配列番号２８）；およびＣＣＣＴＫＰＴＤＧＮＣＴ（配列番号２９）である。
一実施形態では、占有されるエピトープは、ＣＫＴＣＴＩＰＡＱＧＴＳＭＦＰＳＣ（配列番号３０）；および／またはＰＣＫＴＣＴＴＰ（配列番号２８）；およびＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣＴ（配列番号３１）である。
一実施形態では、占有されるエピトープは、ＣＲＴＣＴＴＰＡＱＧＴＳＭＦＰＳＣ（配列番号３２）；および／またはＰＣＫＴＣＴＴＰ（配列番号２８）；およびＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣＴ（配列番号３１）である。
【００５４】
ＶＩＩＩ．クリアランスプロファイル−バイオナノ粒子（ＣＰ−ＢＮＰ）治療ワクチン製剤
本技術の開示は、対照野生型（ＷＴ）ＢＮＰと共に、汎遺伝子型／血清型ループ１およびループ２のＨＢｓＡｇ標的エピトープを包含する８個のＣＰ−ＢＮＰ（配列番号１〜８）の開発に関する。ＢＮＰ骨格は、ＨＢｓＡｇ−Ｓエンベロープタンパク質非感染性サブウイルス粒子（完全ウイルスの成分を全て含有しないウイルス様粒子、またはＶＬＰ）からなる。一部の実施形態では、ＨＢＶ遺伝子型は、遺伝子型Ａ、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ｂ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ９、Ｃ、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ４、Ｄ、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ５、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、またはＩである。一部の実施形態では、ＨＢＶ遺伝子型は遺伝子型Ｄである。一部の実施形態では、血清型はａｙｗまたはａｄｗである。一部の実施形態では、血清型はａｙｗである。標的挿入エピトープを送達するためのバイオナノ粒子（ＢＮＰ）としてのＶＬＰの修飾は活性アプローチを表し、これは、持続性Ｂ型肝炎ウイルス感染症を処置または治癒（クリアリング）できる応答を誘導するように免疫系を刺激する。現存するＢ型肝炎感染症および持続性Ｂ型肝炎感染症の治癒を誘導することができる抗体が生成される。ＣＰエピトープ標的（挿入）配列を以下の表１に列挙する。ＢＮＰが産生され、精製され（エンドフリー）、個々にならびにループ１およびループ２の標的エピトープの組合せを考慮した製剤中で免疫原性について評価される。分析する製剤を以下の表２に列挙する。
【００５５】
【表２】
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【００５６】
【表３】
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【００５７】
８個のＣＰ−ＢＮＰ構築物のアミノ酸配列、構築物１（ＢＮＰ１）（配列番号１）、構築物２（ＢＮＰ２）（配列番号２）、構築物３（ＢＮＰ３）（配列番号３）、構築物４（ＢＮＰ４）（配列番号４）、構築物５（ＢＮＰ５）（配列番号５）、構築物６（ＢＮＰ６）（配列番号６）、構築物７（ＢＮＰ７）（配列番号７）、および構築物８（ＢＮＰ８）（配列番号８）、を表３に提供する。
【００５８】
【表４】
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【００５９】
８個のＣＰ−ＢＮＰアミノ酸構築物をコードする例示的なヌクレオチド配列を表４に提供する。
【表５】
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【００６０】
ＩＸ．ＣＰ−ペプチド治療ワクチン
ＣＰ−ＢＮＰ治療ワクチンに組み込まれた、表１に記載しているＨＢｓＡｇ  ＣＰエピトープに基づいて、汎遺伝子型／血清型環状ペプチドワクチンとしてのこれらのエピトープワクチンの代替の送達も開発した。本技術のＣＰエピトープ環状ペプチドを表５に列挙する。
【表６】
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免疫原性研究により、リード環状ペプチドワクチンが、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）とコンジュゲートしている、環状ペプチドＣＴＫＰＴＤＧＮＣＴ（配列番号２０）およびＣＴＫＰＳＤＧＮＣＴ（配列番号２１）の等モル製剤であることが示された。このワクチンのマウスへの投与は抗原性であり、ＣＰと一致する抗ＨＢｓ  Ａｂ応答を引き起こし、抗ＨＢｓ  Ａｂの「クリアリング」を示す。分析には、ＥＬＩＳＡ（免疫ペプチド、対照ペプチド、ＶＬＰ抗原に対する）、誘導ＣＰ分析、免疫沈降、およびウェスタンブロットが含まれた。
【００６１】
Ｘ．ｍＲＮＡワクチン
一部の実施形態では、本開示は、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）を含む、現存するＢ型肝炎および／または持続性Ｂ型肝炎において免疫応答を誘発するためのｍＲＮＡ構築物の使用に関する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＨＢｓＡｇ−Ｓドメインのループ１およびループ２領域において発現される抗原性エピトープ由来の抗原性エピトープリピート領域をコードする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＢＮＰ１、２、３、４、５、６、７、または８をコードする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、表５に提供されているものなどの、ＣＰエピトープ環状ペプチドをコードする。
【００６２】
ＸＩ．投与様式および有効投薬量
本明細書に開示されるような免疫原性組成物（例えば、ワクチン）は、ワクチンのために慣用的に使用されるか、または推奨される経路のいずれか（例えば、非経口経路）によって投与されてもよく、種々の形態（例えば、注射可能な液体）であってもよい。ワクチンは、注射器によって、または筋肉内、皮下、もしくは皮内注射のための無針注射器によって投与されてもよい。
【００６３】
本技術によれば、免疫原性組成物の「有効量」は、所望の生物学的効果を達成するのに十分な量である。一部の実施形態では、有効投薬量は、受容者の年齢、性別、健康、および体重、もしあれば、併用処置の種類、処置の頻度、ならびに望まれる効果の性質に依存することは理解される。以下に提供される有効用量の範囲は、限定することを意図するものではなく、例示的な用量範囲を表す。したがって、一部の実施形態では、投薬量は、当業者によって理解され、決定できるように、個々の対象に合わせて調整される。哺乳動物（例えば、ヒト）の成体に対するＣＰ−ＢＮＰ、ＣＰエピトープ環状ペプチド、またはｍＲＮＡワクチンの投薬量は、０．０１μｇ〜１０，０００μｇ、またはこれらの間の任意の範囲もしくは値であり得る。一部の実施形態では、投薬量は、０．１０μｇ〜１０，０００μｇ、またはこれらの間の任意の範囲もしくは値であり得る。一部の実施形態では、投薬量は、１μｇ〜１０，０００μｇ、またはこれらの間の任意の範囲もしくは値であり得る。一部の実施形態では、投薬量は、２μｇ〜１０，０００μｇ、またはこれらの間の任意の範囲もしくは値であり得る。一部の実施形態では、投薬量は、３μｇ〜１０，０００μｇ、またはこれらの間の任意の範囲もしくは値であり得る。一部の実施形態では、投薬量は、４μｇ〜１０，０００μｇ、またはこれらの間の任意の範囲もしくは値であり得る。一部の実施形態では、投薬量は、５μｇ〜１０，０００μｇ、またはこれらの間の任意の範囲もしくは値であり得る。一部の実施形態では、投薬量は、１０μｇ〜１０，０００μｇ、またはこれらの間の任意の範囲もしくは値であり得る。一部の実施形態では、投薬量は、１５μｇ〜１０，０００μｇ、またはこれらの間の任意の範囲もしくは値であり得る。一部の実施形態では、投薬量は、２０μｇ〜１０，０００μｇ、またはこれらの間の任意の範囲もしくは値であり得る。一部の実施形態では、投薬量は、２５μｇ〜１０，０００μｇ、またはこれらの間の任意の範囲もしくは値であり得る。一部の実施形態では、投薬量は、５０μｇ〜１０，０００μｇ、またはこれらの間の任意の範囲もしくは値であり得る。一部の実施形態では、投薬量は、１００μｇ〜１０，０００μｇ、またはこれらの間の任意の範囲もしくは値であり得る。一部の実施形態では、投薬量は、５００μｇ〜１０，０００μｇ、またはこれらの間の任意の範囲もしくは値であり得る。一部の実施形態では、投薬量は、１，０００μｇ〜１０，０００μｇ、またはこれらの間の任意の範囲もしくは値であり得る。一部の実施形態では、投薬量は、５，０００μｇ〜１０，０００μｇ、またはこれらの間の任意の範囲もしくは値であり得る。
【００６４】
ＸＩＩ．治療方法
以下の論述は、例としてのみ提示され、限定することを意図しない。
本技術の一態様は、Ｂ型肝炎感染症を有すると診断された、またはＢ型肝炎感染症を有すると疑われる対象において、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）を含む、現存するＢ型肝炎および／または持続性Ｂ型肝炎を処置する方法を含む。治療的適用において、本技術のＣＰ−ＢＮＰ、ＣＰエピトープ環状ペプチド、および／またはｍＲＮＡ構築物を含む組成物または医薬は、疾患の症状を治癒するか、または少なくとも部分的に停止するのに十分な量で、Ｂ型肝炎感染症が疑われるか、またはＢ型肝炎感染症に既に罹患している対象に投与される。
【００６５】
ＸＩＩＩ．本技術のＣＰ−ＢＮＰ、ＣＰエピトープ環状ペプチド、またはｍＲＮＡの生物学的効果の決定
本明細書に記載されるＨＢｓＡｇイムノアッセイの結果に基づいて機能的治癒が達成されたか、または達成される場合、臨床医は、次いで、処置を中止することを決定することができる。したがって、本明細書に記載されるＨＢｓＡｇイムノアッセイは、個体が機能的治癒を達成するかどうかを決定するため、個体が機能的治癒を達成したかどうかを決定するため、および個体が自然防御機構を介して治癒を達成したかどうかを決定するために処置をモニターすることができる。
プロトコールは、本技術の本質から逸脱することなく変更することができる。重要なエンドポイントは、個体の抗体応答によって占有されたＨＢｓＡｇ上のエピトープのフィンガープリントの決定である。ループ１およびループ２におけるエピトープのフィンガープリントが占有されている場合、機能的治癒が予想され得る。このフィンガープリントに結合する能力を有する抗体が存在するか、またはＨＢＶへの曝露の際に示されるが、ＨＢｓＡｇが検出できない場合、機能的治癒が達成されている。その時点で、処置を中止することができる。
【実施例】
【００６６】
以下の実施例は、例示のためだけに提供され、限定のためではない。当業者は、本質的に同じまたは類似の結果をもたらすように変更または修飾することができる様々な重要でないパラメーターを容易に認識する。実施例は、添付の特許請求の範囲によって定義されるように、本技術の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。
【００６７】
（実施例１）
クリアランスプロファイルアッセイの開発
ＨＢｓＡｇエピトープアッセイを開発し、ＨＢｓＡｇエピトープのクリアランスプロファイルを構成するエピトープのＨＢｓＡｇプロファイルを確立し、マッピングするために、マルチプレックス（「Ｂｉｏｐｌｅｘ」）ビーズベースのフローサイトメトリープラットフォームを使用する（図２を参照のこと）。「エピトープのクリアランスプロファイル」は、個体の抗体が標的とするエピトープのプロファイルである。全てのエピトープが、個体によって生成される抗体の結合を受ける場合、ＨＢｓＡｇのクリアランスが予想され得る。このアッセイは、Lim et al. (2014) Hepatology 60 (1) supplement:1623, 980Aによるアッセイに由来する。簡潔に述べると、ＨＢｓＡｇマルチプレックスイムノアッセイは、ＨＢｓＡｇと結合する異なる抗ＨＢｓ抗体と各々コンジュゲートしている蛍光により同定されたビーズ、続いてポリクローナルフィコエリトリン（ＰＥ）がコンジュゲートしている検出抗体のパネルを含む。ＨＢｓＡｇマルチプレックスパネルは、「ａ」決定基を含むＨＢｓＡｇ外部ループ領域に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、およびＨＢｓＡｇの残基９９〜２２６に及ぶＣ末端ドメインエピトープを含む。ＨＢｓＡｇエピトープは、以下のドメイン（これらのドメインと結合するモノクローナル抗体を有する）：Ｎ末端（ｍＡｂ１）；ループ１（ｍＡｂ５、６、１０）；ループ２（ｍＡｂ７、８、１１、１２、１６、１７、１９）；ループ１／２組合せ（ｍＡｂ１３、１４、１５）；Ｃ末端（ｍＡｂ２、３、４）；および立体構造（ｍＡｂ９、１８）に分類される。各ビーズに関連するＰＥの強度は、試料内の特異的ＨＢｓＡｇエピトープの抗体認識の高感度の測定を提供する。一致したＨＢＶ株骨格と比較したＨＢｓＡｇ上のエピトーププロファイルを、バイオインフォマティクスデータ分析後の抗体結合またはエピトープ認識の変化倍率として表した。参照骨格からのエピトープ認識の変動の正常範囲についての９５％ＣＩは、＋／−０．５倍の変化として確立されている。エピトープ認識の獲得は正の変化倍率（＞０．５倍）に対応し、負の変化倍率（＞−０．５倍）はエピトープ結合の消失または低下に対応する。アッセイの描写を図１に示す。
【００６８】
（実施例２）
ｍＡｂの選択
ＨＢｓＡｇマルチプレックスアッセイ（図２の上パネル）において利用される抗ＨＢｓｍＡｂを、連続および不連続エピトープの両方、ならびに高変動性およびまた、保存された認識の両方に対するエピトープ領域対象に及ぶ、ＨＢｓＡｇ抗原ドメインおよびＣ末端ドメイン（残基９９〜２２６）に対する反応性を有する広範囲のエピトープを提供するように選択し、調達した。ｍＡｂによって提供される高レベルのエピトープカバレージ（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｃｏｖｅｒａｇｅ）により、マッピングされたエピトープ利用可能性に従ったＨＢｓＡｇプロファイルの分析が可能となり、エピトープ領域：Ｎ末端（ｍＡｂ１）；ループ１（ｍＡｂ５、６、１０）；ループ２（ｍＡｂ７、８、１１、１２、１６、１７、１９）；ループ１／２組合せ（ｍＡｂ１３、１４、１５）；Ｃ末端（ｍＡｂ２、３、４）；および立体構造（ｍＡｂ９、１８）に従って報告した。ＨＢＶ株（遺伝子型Ａ〜Ｇ）の調査により、保存されたエピトープ認識パターン（すなわち、遺伝子型および血清型にわたって保存されたＨＢｓＡｇフィンガープリントを示す）を示す抗ＨＢｓｍＡｂが同定され、これらはｍＡｂ３および４（Ｃ末端）、ｍＡｂ１５（ループ１／２組合せ）、およびｍＡｂ１８（立体構造）であった。残りの抗ＨＢｓｍＡｂは、遺伝子型Ａ２、血清型ａｄｗ２ワクチン株と比較して、ＨＢＶ株間のエピトープ認識パターンの変化によって同定されるＨＢｓＡｇプロファイルの変動に敏感であった。
【００６９】
（実施例３）
アッセイ／動力学の最適化
大多数の一般的なＨＢＶワクチンの共通基盤を形成し、したがってＨＢｓＡｇエピトープ認識の比較のための妥当なベースラインまたは骨格を表す、ＨＢＶ  Ａ２  ａｄｗ２株ＨＢｓＡｇを使用してＨＢｓＡｇプロファイルアッセイを開発し、最適化した。ＨＢｓＡｇ源は主にＨＢｓＡｇ患者血清であり、細胞培養上清由来の組換え野生型Ａ２  ａｄｗ２  ＨＢｓＡｇを使用した確認である、野生型Ａ２  ａｄｗ２（コンセンサス配列と比較した）としてＨＢＶ配列決定によって確認した。最初のアッセイ開発は、ｍＡｂ１０（ループ１）および１８（立体構造）である、ＨＢｓＡｇに対する反応性について実験室（ウェスタンブロッティング、Ｅｌｉｓａ、および蛍光を含む）において十分に特徴付けられた抗ＨＢｓｍＡｂのうちの２つに基づいた。一連の濃度のｍＡｂにより標識した調製したビーズセットを、一連の濃度のＨＢｓＡｇに対してインキュベートする。これらの濃度はＨＢｓＡｇの標準化を表す。ビーズ／ｍＡｂ−ＨＢｓＡｇ複合体の過負荷および凝集を引き起こすことなく、十分な蛍光読み取り（１００００〜２００００ＲＦＵの範囲内）に対応する条件を同定した。ＨＢｓＡｇのアッセイ濃度を約１６ＩＵ／ウェル（標準化レベル）であると決定し、ＨＢｓＡｇの検出は最低１ＩＵ／ウェルから最大１００ＩＵ／ウェルであった。ＨＢｓＡｇについての試料希釈系列を、ＨＢｓＡｇ濃度の診断決定においてあらゆるわずかな不正確さも考慮するために、８、１６、および３２ＩＵ／ウェルのアッセイに組み込んだ。ビーズに対する標識した抗ＨＢｓｍＡｂの最適濃度を、機器のダイナミックレンジ（１５０００〜１８０００ＲＦＵ）との蛍光反応性をもたらすｍＡｂ濃度として最適化し、これを各ｍＡｂについて特異的／実験的に決定した。このアッセイの多重化を、ビーズとコンジュゲートした個々の抗ＨＢｓｍＡｂｓを連続的に添加することによって構築し、これによりｍＡｂによる部分的に共有されたエピトープに起因するエピトープ競合の同定が可能になった。ｍＡｂ間のエピトープ競合の測定を回避するために（すなわち、ＨＢｓＡｇエピトーププロファイルを正確に記録するために）、４プレックス、５プレックス、および１０プレックスとして、３セットのマルチプレックス抗ＨＢｓビーズ／ｍＡｂを確立した。ＨＢｓＡｇ試料を、これらのプレックスを用いて並行して（同じプレート上で）分析し、得られたデータを組み合わせて、ＨＢｓＡｇプロファイルの多重読み取りを達成した（図２の上パネル）。
【００７０】
（実施例４）
ＨＢＶ株にわたるアッセイ検証／ＨＢｓＡｇプロファイル
ＨＢＶの共通のワクチン株に対応し、したがってアッセイにおける多重化抗ＨＢｓｍＡｂに対するエピトープ認識のＨＢｓＡｇプロファイルを反映する、ＨＢｓＡｇ  Ａ２  ａｄｗ２に対してこのアッセイを開発した。このアッセイは、野生型ｅｘ  ｖｉｖｏ血清ＨＢｓＡｇ由来のＨＢｓＡｇ  Ａ２  ａｄｗ２およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物由来の組換えＨＢｓＡｇの両方について検証して、Ａ２  ａｄｗ２についてのＨＢｓＡｇプロファイルを確認し、このＡ２  ａｄｗ２は、一致しないワクチンである場合があり、報告されたＨＢｓＡｇバリアントについてワクチンエスケープ（例えば、ｓＧ１４５Ｒ／Ａ、ｓＰ１２０Ｔ／Ｌ、ｓＤ１４４Ｅ／Ａ）の可能性がある、他のＨＢＶ株（遺伝子型および血清型）の比較のためのワクチン株バックグラウンドを形成した。このアッセイを、患者血清および組換え上清の両方から調達した、異なる遺伝子型（Ａ〜Ｇ）および血清型のＨＢｓＡｇに対してさらに検証し、これにより、ワクチン株（Ａ２  ａｄｗ２）バックグラウンドと比較して各株のＨＢｓＡｇプロファイルを確立した。各ＨＢＶ株を代表する血清の参照パネルを、研究コホートにおける対照データ点としてアッセイに継続的に組み入れるために確立した。共通の遺伝子型（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）間のＨＢｓＡｇプロファイルにおける遺伝子型特異的変動は、ループ１（ｍＡｂ６）およびループ２（ｍＡｂ８）エピトープで明らかであり、一方、血清型はループ２（ｍＡｂ７）エピトープで明らかである。ワクチン株（Ｃ４、ＥおよびＦ）から多く分岐しているＨＢＶ株は、エピトープ認識のそれらのＨＢｓＡｇプロファイルにおいてワクチン株から、より増大された変動を示す。
【００７１】
（実施例５）
「クリアリング」抗ＨＢｓ応答と関連するクリアランスプロファイルの特徴付け
図１は、機能的治癒をもたらす抗体に関連するクリアランスプロファイル（ＣＰ）を特徴付けるための実施例１に記載されるアッセイの適用を示す。このアッセイは、ｍＡｂパネルを使用してＨＢｓＡｇエピトープ占有を決定し、ここでｍＡｂ５および６は以下のループ１におけるコンセンサス配列を標的とする：
ＣＸ1ＴＣＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＱＧＸ6ＳＭＸ7ＰＣ（配列番号２４）
配列中、
Ｘ1はＫまたはＲであり；
Ｘ2はＴまたはＭであり；
Ｘ3はＴまたはＩであり；
Ｘ4はＰ、ＴまたはＬであり；
Ｘ5はＡまたはＶであり；
Ｘ6はＮまたはＴであり；
Ｘ7はＦまたはＹである。
【００７２】
ｍＡｂ１０は以下のコンセンサス配列のアミノ酸１２０〜１２７内の別のエピトープループ１と結合する：
ＰＣＸ8ＴＣＸ9Ｘ10Ｘ11（配列番号２５）
配列中、
Ｘ8はＫまたはＲであり；
Ｘ9はＴまたはＭであり；
Ｘ10はＴ、ＩまたはＳであり；
Ｘ11はＰ、ＴまたはＬである。
ｍＡｂ７、８、１１、１２、１６および１７は、ループ２におけるコンセンサス配列の配列番号２６のアミノ酸１３７〜１４７内のエピトープと結合し、ここでコンセンサス配列は、
ＣＣＣＴＫＰＸ12ＤＧＮＣＸ13（配列番号２６）
配列中、
Ｘ12はＴまたはＳであり、
Ｘ13はＴまたはＳである。
配列番号２４および／または配列番号２５の両方を占有し、また、配列番号２６も占有する抗体の集団は、機能的治癒を示す抗体のクリアランスプロファイルを表すことが提案される。
【００７３】
（実施例６）
機能的ＣＨＢ治癒の予測バイオマーカー
図２は、占有されたエピトープを有するＨＢｓＡｇを検出するアッセイ（上パネル）および抗ＨＢｓ抗体と複合体化したＨＢｓＡｇを検出するアッセイ（下パネル）を記載している。このアッセイは、ループ１（コンセンサス配列の配列番号２４および２５）およびループ２（コンセンサス配列の配列番号２６）におけるエピトープの占有を検出するマルチプレックスイムノアッセイを利用する。
【００７４】
（実施例７）
ＣＨＢ治癒におけるＨＢｓＡｇクリアランスプロファイル
図３および図４は、ＣＨＢ治癒におけるＨＢｓＡｇクリアランスプロファイル（ＣＰ）を示す概略図である。図３において、機能的治癒患者は感染をクリアリングする抗体応答を発生する。図４において、非治癒／非応答患者は占有されたＨＢｓＡｇエピトープを保有しない。ＨＢｓＡｇＣＰという用語は、ＨＢｓＡｇエピトープのクリアランスプロファイルを意味する。ＨＢｓＡｇ非クリアランスプロファイルは、ＨＢｓＡｇ−ＮＣＰと称される。
【００７５】
（実施例８）
ＣＨＢ治癒におけるＨＢｓＡｇクリアランスプロファイル
ＨＢｓＡｇエピトープについての各アッセイｍＡｂによる認識は、認識の変化倍率；ＨＢｓＡｇエピトープの認識の増強または改善に関連する正の変化倍率、未変化または正常範囲のエピトープ認識（＋／−０．５倍以内）、および負の変化倍率によって示される低下したＨＢｓＡｇエピトープ認識として記録される。ＨＢｓＡｇ  ＣＰは、ループ１およびループ２の両方のＨＢｓＡｇエピトープにおける低下したＨＢｓＡｇエピトープ認識（例えば、エピトープ占有に起因する）によって示される。
【００７６】
（実施例９）
予測クリアランスプロファイルバイオマーカーの同定
ＨＢｓＡｇプロファイルアッセイ。ｂｉｏｐｌｅｘ上のマルチプレックス抗ＨＢｓパネルアッセイ（図２、上パネル）を、ＨＢｓＡｇ変化についてＣＨＢ患者の診断モニタリングの概念を用いて最初に開発した。例えば、ＨＢＶ  ＤＮＡが検出できないが、ＨＢｓＡｇが陽性のままであるヌクレオチド類似体（ＮＡ）療法中の患者に、および処置耐性変異、またはワクチンエスケープバリアントの発生を調べる際に、このアッセイを使用することができる。さらに、このアッセイは、ＨＢｓＡｇプロファイルおよびＣＨＢ疾患期の間に生じる変化、すなわち、ＣＨＢ疾患についての予測バイオマーカーを理解しようとするのに有用である。ＣＨＢの機能的治癒を達成した患者のコホート（自然歴コホート由来）はＣＰバイオマーカーを同定するのに妥当であり、以下でさらに詳述する。
ＨＢｓＡｇプロファイルアッセイからの結果は、ＣＰバイオマーカー（すなわち、アッセイにおける抗ＨＢｓＡｂのサブセットによるＨＢｓＡｇの認識）の開発につながった。これらのアッセイからの結果は、（ａ）機能的治癒が抗ＨＢｓ応答に関連する；（ｂ）「クリアリング」抗ＨＢｓ応答が、アッセイにおいてループ１およびループ２特異的抗ＨＢｓＡｂの／内のエピトープを特異的に標的化する；（ｃ）患者は多くの異なる抗ＨＢｓＡｂを有するが、これらのループ１およびループ２の両方のエピトープ（ＣＰエピトープ）を標的化するもののみが機能的治癒の達成に関連する；ならびに（ｄ）これらのＣＰ関連エピトープの増強され、標的化されたディスプレイはＣＰ関連「クリアリング」抗ＨＢｓＡｂの産生を駆動するという理解を提供した。
【００７７】
自然歴／機能的治癒コホート：抗ＨＢｓ分析を実施した。この研究は、機能的治癒（ＦＣ）の症例定義を満たした、Ｓｔ  Ｖｉｎｃｅｎｔの研究（自然歴コホート）において同定したＣＨＢを有する６人の患者を含んだ。６人の患者全てが抗ウイルス療法を停止し、ＨＢｓＡｇが検出できなくなり、抗ＨＢｓによるセロコンバージョンに成功した。６人の自然歴コホート患者は全て、それらの血清試料（セロコンバージョン後）中で抗ＨＢｓ陽性であり、次いで参照ＨＢｓＡｇ（図１を参照のこと）とインキュベートした場合に、その抗ＨＢｓ状態がＦＣ−Ｐ（機能的治癒クリアランスプロファイル；機能的治癒患者の抗ＨＢｓ分析および４プレックスアッセイパネルに基づく）を「誘導する」能力について分析した。ＦＣ−Ｐは、４つのｍＡｂ：ｍＡｂ５、ｍＡｂ６、ｍＡｂ７、およびｍＡｂ８：（ｍＡｂ５およびｍＡｂ６はループ１におけるエピトープを認識し；ｍＡｂ７およびｍＡｂ８はループ２におけるエピトープを認識する）を使用して場合の、ＨＢｓＡｇの「ａ」決定基を含む外部ループ領域におけるループ１およびループ２の両方でのエピトープ結合の消失として定義した（図２、上パネルを参照のこと）。６人の自然歴患者のうちの１人は、依然としてＨＢｓＡｇ陽性であった、以前に入手可能な血清試料を有した。Ｂｉｏｐｌｅｘプラットフォーム上の４プレックス抗ＨＢｓＡｂを使用して、ＨＢｓＡｇ陽性試料をエピトープマッピングし、ＦＣプロファイル（ＦＣ−Ｐ）の症例定義を満たした。
【００７８】
４プレックスループ１またはループ２抗ＨＢｓＡｂ（表１に詳述している）によって認識された導出されたＨＢｓＡｇエピトープを複数のリピートとしてＨＢｓＡｇ  ＶＬＰワクチン送達プラットフォームに挿入してＢＮＰ／ＦＣ−Ｐ（ＣＰ−ＢＮＰ）を生成した。これらのＢＮＰ／ＦＣ−Ｐワクチンは、単一のエピトープ送達フォーマットとして、またはマウスに対する免疫化として投与された複数のエピトープ混合物として調製した。得られた抗ＨＢｓ応答を、参照ＨＢｓＡｇとインキュベートした場合にＦＣ−Ｐを誘導するそれらの能力について分析し、ＦＣ−Ｐを、ループ１およびループ２の両方のエピトープを包含するＢＮＰ免疫化混合物について同定した。これらのＢＮＰ／ＦＣ−Ｐ免疫化製剤は、表２に詳述した構築物を含んだ。今日までに試験されたこれらのワクチンはループ１およびループ２の両方のエピトープを含み、ＦＣ−Ｐ関連抗体の生成をもたらした。
【００７９】
（実施例１０）
ＶＬＰ／ＢＮＰ産生
哺乳動物細胞株におけるタンパク質産生ならびに超遠心分離による精製、アフィニティーおよびゲル濾過精製のための方法は標準的なプロトコールであり、以下、およびHyakumura, et al., Journal of Virology 2015, 89 (22): 11312-11322 (2015)に記載される。
【００８０】
簡潔に述べると、ＶＬＰまたはＢＮＰの産生のために、ＧｌｕｔａＭａｘ−１（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中で成長させたＨＥＫ２９３−Ｔ細胞に、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＵＳＡ）またはＦｅｃｔｏＰＲＯ（ＰｏｌｙＰｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ＵＳＡ）を使用して発現構築物をトランスフェクトした。トランスフェクションの５〜８日後にＶＬＰ／ＢＮＰを細胞培養上清から回収した。Ｎ末端Ｆｌａｇタグを含むＶＬＰ／ＢＮＰを、収集した組織培養上清から、抗Ｆｌａｇアフィニティー樹脂カラム（ＣＳＩＲＯ、オーストラリア）でアフィニティー精製した。融合タンパク質を、ＰＢＳ中の組換えＦｌａｇペプチド（０．４ｍｇｍｌ；ＣＳＩＲＯ、オーストラリア）を用いて抗Ｆｌａｇアフィニティーカラムからいずれかで競合的に溶出した。次いでＰＢＳ中のアフィニティー精製したＶＬＰ／ＢＮＰ調製物を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００またはＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６ゲル濾過カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でのサイズ排除によってピーク精製した。最終ＶＬＰ／ＢＮＰ精製調製物をエンドトキシンについて試験し（Ｅｎｄｏｓａｆｅ  Ｔｅｓｔ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、ＵＳＡ）、Ａｍｉｃｏｎ  ５０ｋＤａカットオフ遠心濃縮装置を使用して１ｍｌ未満までスピン濃縮した。あるいは、卓上遠心分離機を使用したスピン清澄化によって、収集した組織培養上清からＶＬＰ／ＢＮＰを精製し、次いで上清を超遠心分離管に移し、２０％スクロースクッションを下に敷き、超遠心分離によって粒子をペレット化した。上清を捨て、ペレット化したＶＬＰをワクチン接種目的のためにＳＴＥ緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁した。ＶＬＰ／ＢＮＰ調製物の収率純度を、ｉ）３７．２６の計算したＶＬＰ吸光係数を使用したＡ２６０／２８０スペクトルプロファイル；ｉｉ）定量的ＨＢｓＡｇ血清学（Ｅｌｅｃｓｙｓ  ＨＢｓＡＧ  ＩＩキット；Ｒｏｃｈｅ）；ｉｉｉ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて抗ＨＢｓおよび抗Ｆｌａｇ検出抗体の両方を用いるクマシー染色およびウェスタンブロッティング（ＷＢ）；ｉｖ）Ｂｉｏｐｌｅｘプラットフォーム上でのＨＢｓＡｇエピトーププロファイルアッセイ分析（インハウスアッセイ）；ならびにｖ）抗ＨＢｓ抗体による検出を伴う標準的なＥＬＩＳＡ技術（インハウスアッセイ）によって評価した。
【００８１】
（実施例１１）
ＣＰ−ＢＮＰエピトープ保持
ＢＮＰ産生および精製、ならびにＢＮＰ調製物の収率および純度についての品質保証分析に続いて、ＣＰ−ＢＮＰを、個々のＢＮＰ調製物として、ならびにまた、ＢＮＰ製剤としてＨＢｓＡｇエピトーププロファイル（Ｂｉｏｐｌｅｘプラットフォーム）について分析して、送達時の抗原性に対して適切であるようにループ１およびループ２エピトープ提示保持（すなわち、ループ１およびループ２エピトープがディスプレイされるか、または提示される）を評価した。図１１に示すように、ＣＰ−ＢＮＰ製剤は本技術のエピトープ挿入物を保持する。
【００８２】
（実施例１２）
ＣＰエピトープ環状ペプチド産生
環化ＣＰエピトープペプチド。環化ペプチドを、ＣＰ−ＢＮＰ中に送達したＣＰエピトープ挿入物と同様に、ＨＢｓＡｇ内の同定したループ１およびループ２標的「クリアリング」エピトープを模倣するように設計した。これらのエピトープ内の配列変化は、天然に存在するＨＢＶ遺伝子型およびＨＢｓＡｇ血清型変化に依存して存在し、複数の環状ペプチドをこの考慮に基づいて設計し、ＣＰ関連「クリアリング」抗ＨＢｓ抗体の開発のための免疫原性研究において免疫化抗原としての送達のためのループ１またはループ２ＣＰエピトープ環化ペプチドの汎遺伝子型／汎血清型等モル製剤を生成した。設計したペプチドを、天然配列システイン残基においてジスルフィド結合によって環化された、Ｎ末端遊離アミン、Ｃ末端遊離酸を有するＭｉｍｏｔｏｐｅｓ（オーストラリア）による産生のために注文した。産生物はＨＰＬＣにより８５％超の純度であり、質量分析プロファイル解析により決定した。環化ペプチドを、免疫化のためにＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）またはスクリーニングアッセイのためにＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）のいずれかにグルタルアルデヒドリンカーを介して結合させた。本技術の例示的な環状ペプチドは上記の表５に列挙されている。
【００８３】
ＣＰ関連抗ＨＢｓを生成するための免疫原性研究は、各ペプチド製剤についてｎ＝２のＢＡＬＢ／ｃおよびｎ＝２のＣ５７／Ｂ６マウスに投与するループ１ミックス環状ペプチドまたはループ２ミックス環状ペプチド製剤による免疫化を含んだ。マウスを３×２ｕｇ用量のペプチドミックスにより免疫化した。
回収した融合前血清を、組換えＨＢｓＡｇ（ＶＬＰ）およびＨＢｓＡｇループ１またはループ２ペプチド環化ペプチド（個々のペプチドおよびプールしたペプチド製剤の製剤）に特異的な抗体応答について、標準的なＥＬＩＳＡプロトコールによってスクリーニングした。血清をまた、Ｂｉｏｐｌｅｘプラットフォーム上での抗ＨＢｓ抗体誘導ＣＰプロファイルアッセイ分析（インハウスアッセイ）の創出について分析した。このデータを使用して、モノクローナル抗ＨＢｓ特異的抗体を開発するために、どのマウスを脾臓採取および融合のために選択すべきかを通知した。
融合後の上清を、組換えＨＢｓＡｇ（ＶＬＰ）ならびにループ１およびループ２の環化ペプチド（個々のペプチドおよびプールされたペプチド製剤の製剤）に特異的な抗体応答について、標準的なＥＬＩＳＡプロトコールによって最初にスクリーニングした。クローン上清を、線状エピトープに対する親和性を決定するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット後のＨＢｓＡｇの検出についてさらに分析した。クローン上清を、プレインキュベーション汎遺伝子型／血清型ＨＢｓＡｇと比較して、Ｂｉｏｐｌｅｘプラットフォーム上での抗ＨＢｓ抗体誘導ＣＰプロファイルアッセイ分析（インハウスアッセイ）の創出について分析した。このデータを使用して、各ラウンドでクローン上清の分析を行い、最終的に選択したモノクローナル抗ＨＢｓ抗体の分析を含めて、モノクローナル抗体開発のさらなるラウンドのためにどのクローンを選択すべきかを決定した（表６；図１２）。
【００８４】
【表７】
2021522864.tif 000016
【００８５】
（実施例１３）
ＣＰ−ＢＮＰおよびＣＰエピトープ環状ペプチド免疫原性研究
この実施例は、本技術のＣＰ−ＢＮＰおよびＣＰエピトープ環状ペプチドの免疫原性を実証する。標的ループ１、ループ２、またはループ１および２の「クリアランス」エピトープをディスプレイするＣＰ−ＢＮＰおよびＣＰ−ＢＮＰ製剤（上記の表２を参照のこと）の免疫原性を、ＢＡＬＢ／ｃ系統マウスの免疫化によって評価した。ＣＰ−ＢＮＰ１〜４およびその製剤（ＷＴ−ＢＮＰバックグラウンド対照と比較した）を、第１ラウンドのＢＮＰ免疫原性研究において評価した。これらを、第２の免疫原性研究においてＣＰ−ＢＮＰ５〜８およびその製剤の評価と共に再評価する。
【００８６】
免疫原性研究＃１は、ＣＰ−ＢＮＰ１〜４および表２に示した製剤（ＷＴ−ＢＮＰおよびＰＢＳプラセボ対照と比較した）を組み入れたが、免疫原性研究ＩＭＭ００１は最初の研究において実施した評価を反復し、ＣＰ−ＢＮＰ５〜８ならびに製剤１＋３＋４および５＋７の性能をさらに評価した。６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（治療群あたり最大５匹）を、隔週で３×２ｕｇ用量の精製したＣＰ−ＢＮＰ抗原により免疫化した。各抗原投与の前に出血を採取し、次いで５週間、週１回の間隔で免疫化の後に採取した。最終時点でマウスを屠殺し、最後の出血を収集した。各出血時点から回収した血清を分析して、ｉ）診断用血清学的検査（Ｅｌｅｃｓｙｓ抗ＨＢｓキット、Ｒｏｃｈｅ）を使用した抗ＨＢｓ抗体力価（ＩＵ／Ｌ）；ｉｉ）ＷＴ−ＶＬＰまたはＨＢｓＡｇループ１もしくはループ２ペプチドの検出のための標準的なＥＬＩＳＡ法；およびｉｉｉ）Ｂｉｏｐｌｅｘプラットフォーム上での抗ＨＢｓ抗体誘導ＣＰプロファイルアッセイ分析（インハウスアッセイ）によってＣＰ−ＢＮＰ免疫化に対する抗ＨＢｓ抗体応答を調査した。この表で報告したループ１およびループ２反応性は、クリアランス（すなわち、「クリアリング」抗ＨＢｓ応答の標的エピトープ）に関連すると同定したＨＢｓＡｇＣＰエピトープ（複数も含む）の保持されたディスプレイを決定するための、ＨＢｓＡｇプロファイルアッセイによるＣＰ−ＢＮＰまたは製剤の分析を報告している。
図１３Ａは、ＣＰ−ＢＮＰ調製物および製剤に対する抗ＨＢｓ抗体免疫原性応答を示す。図１３Ｂおよび図１３Ｃは、ＣＰエピトープ環状ペプチドに対する、それぞれループ１およびループ２の抗ＨＢｓ抗体免疫原性応答を示す。図１３Ｄは、ＷＴ−ＢＮＰ、ループ１ペプチドおよびループ２ペプチド抗原に対する抗Ｈｂｓ反応性を報告する。まとめると、これらの結果は、本技術のＣＰ−ＢＮＰおよびＣＰエピトープ環状ペプチドがＨＢＶ特異的免疫応答を誘発し、抗ＨＢｓの産生を誘導する方法において有用であることを示す。
【００８７】
（実施例１４）
ＣＰ−ＢＮＰはＣＨＢクリアランスプロファイルを誘導する
この実施例は、本技術のＣＰ−ＢＮＰが免疫化した対象においてクリアランスプロファイルを誘導することができることを実証する。
ＣＰ−ＢＮＰ調製物（ＣＰ−ＢＮＰ１〜８）および製剤（ＣＰ−ＢＮＰ１＋３、１＋３＋４、１＋４、ＷＴ＋４、５＋７または１＋４＋５）を用いて、ｎ＝３の免疫化スケジュール後の最終出血血清を抗ＨＢｓ抗体プロファイルについて分析した。図１４に示される結果は、本技術のＣＰ−ＢＮＰがクリアランスプロファイル（例えば、ループ１およびループ２の両方のエピトープにおけるエピトープ認識の消失）を誘導することを実証する。したがって、これらの結果は、本技術のＣＰ−ＢＮＰを含む組成物が慢性Ｂ型肝炎を処置する方法において有用であることを実証する。
【００８８】
（実施例１５）
ＣＰ−ＢＮＰおよびＣＰエピトープ環状ペプチドをコードするｍＲＮＡはＣＨＢクリアランスプロファイルを誘導する
この実施例は、本技術のＣＰ−ＢＮＰおよびＣＰエピトープ環状ペプチドをコードするｍＲＮＡが免疫化した対象においてクリアランスプロファイルを誘導することができることを実証する。
６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（治療群あたり５匹）を、隔週でＣＰ−ＢＮＰまたはＣＰエピトープ環状ペプチドをコードする精製したｍＲＮＡの３×２ｕｇ用量により免疫化する。各抗原投与の前に出血を採取し、次いで５週間、週１回の間隔で免疫化の後に採取する。最終時点でマウスを屠殺し、最後の出血を収集する。各出血時点から回収した血清を分析して、ｉ）診断用血清学的検査（Ｅｌｅｃｓｙｓ抗ＨＢｓキット、Ｒｏｃｈｅ）を使用した抗ＨＢｓ抗体力価（ＩＵ／Ｌ）；ｉｉ）ＷＴ−ＶＬＰまたはＨＢｓＡｇループ１もしくはループ２ペプチドの検出のための標準的なＥＬＩＳＡ法；およびｉｉｉ）Ｂｉｏｐｌｅｘプラットフォーム上での抗ＨＢｓ抗体誘導ＣＰプロファイルアッセイ分析（インハウスアッセイ）によってＣＰ−ＢＮＰ免疫化に対する抗ＨＢｓ抗体応答を調査する。
この結果は、本技術のｍＲＮＡ構築物が、免疫化マウスにおいてクリアランスプロファイル（例えば、ループ１およびループ２の両方のエピトープにおけるエピトープ認識の消失）を誘導することを示す。したがって、これらの結果は、本技術のｍＲＮＡ構築物を含む組成物が慢性Ｂ型肝炎を処置する方法において有用であることを実証する。
【００８９】
（実施例１６）
ＣＰ−ＢＮＰは慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）ネズミモデルにおいてＨＢＶ  ＤＮＡおよびＨＢｓＡｇレベルを低下させる
ネズミＣＨＢモデルにおいて試験するための試験ワクチン候補（ＣＰ−ＢＮＰ１、３、４、５、７）の製造のための材料および方法。ＨＢｓＡｇＳ特異的ｃＤＮＡ挿入物（ＷＴまたは表３および表４に記載される種々の挿入物）を含有するプラスミドをｐＣＡＧＧＳ（Ｎ末端ＦＬＡＧタグを有する）にクローニングし、以前に記載されているようにポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトするために使用した（Longo, 2013）。さらなる配列が挿入されたキメラＨＢｓＡｇＳタンパク質を含む機能的ＨＢｓＡｇＳタンパク質により、分泌可能なウイルス様粒子、バイオナノ粒子（ＢＮＰ）を構築する。トランスフェクションの５日後、細胞培養培地を回収し、遠心分離して細胞残屑を除去した。細胞培養培地を、２０％スクロースクッション上で高速（超遠心分離）で遠心分離してペレット化し、ＢＮＰを部分的に精製し、次いで塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）−Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＳＴＥ）緩衝液に再懸濁した。ＳＴＥ中のスクロース（２０〜５０％）の勾配を使用した超遠心分離によってＢＮＰのさらなる精製を実施した。ＶＬＰを含有する画分を収集し、プールし（必要に応じて）、緩衝液交換し、ＰＢＳ中で濃縮し（Hyakumura, 2015; Cheong, 2009; Patzer, 1986）、使用するまで−８０℃で保存した。ＨＢｓＡｇ  ＶＬＰは、以前に記載されているようにＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットによって確認した。
【００９０】
ネズミＣＨＢモデル。ＣＢＡ／ｃａＪ  ＣＨＢマウスモデルを、尾静脈への静脈注射を通して肝細胞へのＤＮＡの送達を可能にする、ＨＢＶレプリコン（ｐＡＡＶ／ＨＢＶ１．２）の水圧注入（ＨＤＩ）によって開発した（Kim, 2013; Yang, 2002; Huang, 2006）。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）はマウスに自然感染しないので、このｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクションの様式が必要であった。複製可能なＨＢＶ  ＤＮＡを含有するプラスミドの単一のＨＤＩは、使用したマウス系統に依存して安定なＨＢＶを誘導した（ＣＢＡマウスについては肝特異的ＨＢＶウイルスマーカー産生で６カ月超持続した（最大３２週間））。キャリアマウスにおけるＨＢＶの長期発現は肝障害を引き起こさず、これは肝障害についての指標（アラニンアミノトランスフェラーゼ、ＡＬＴ）の正常レベルによって証明される。ＨＤＩ後、ＨＢＶ  ＤＮＡをマウス血清中で測定して、ＨＢＶ持続性が確立されていることを確認した。次いで持続性ＨＢＶを有するマウスを免疫化研究のために使用して、クリアランスプロファイル特異的エピトープリピート（ＣＰ−ＢＮＰ）を有するキメラＢＮＰが、肝臓からＨＢＶを妨害および／またはクリアリングすることができる治療免疫応答を誘導する能力について試験した。
【００９１】
慢性Ｂ型肝炎の確立（約１０週間）後、６〜８匹のＣＢＡ／ｃａＪマウスの群を、プラセボ（アジュバント対照）、対照粒子（Ｅｎｇｅｒｉｘ  Ｂ（酵母細胞中で製造された市販のＨＢＶワクチン）、野生型ＢＮＰ（ＷＴ−ＢＮＰ］））または試験ワクチン候補（図１５Ａ〜１５Ｃおよび１６Ａ〜１６Ｃに列挙した最終濃度で等モル比の種々の組合せでのＣＰ−ＢＮＰ１〜７）を用いて処置した。処置スケジュールは、水酸化アルミニウムでアジュバント化した異なるキメラＢＮＰの混合物を含んだ。ワクチンの３回の用量を、用量の間に２週間あけて皮下投与した。ＨＤＩ後２６週まで２週間毎に顎下腺出血を行い、血清ＨＢＶ  ＤＮＡ負荷（Sitnik, 2010）およびＨＢｓＡｇレベル（製造業者の推奨プロトコールに従う；ｑＨＢｓＡｇ  Ｅｌｅｃｓｙｓ）を決定するために試験した。
【００９２】
ネズミＣＨＢモデルの結果−ＨＢＶ  ＤＮＡレベル。以下に記載するＨＢＶ  ＤＮＡレベルの結果を図１５Ａ〜１５Ｃに示す。プラセボ（治療群１）は研究期間を通じてＨＢＶ  ＤＮＡレベルを有意に変化させなかった。ＷＴ−ＢＮＰを、０．０５（治療群２）、０．１（治療群３）または０．５（治療群４および１２）μｇで投与した。０．０５μｇ（治療群２）用量のＷＴ−ＢＮＰはＨＢＶ  ＤＮＡレベルに対して効果がなかったが、０．１（治療群３）または０．５（治療群４および１２）μｇ用量はＨＢＶ  ＤＮＡレベルの用量依存的減少を示した。０．５μｇでのＣＰ−ＢＮＰ１＋４＋５の組合せ（治療群８および１３）は、ＨＢＶ  ＤＮＡの最も速いおよび最も急激な減少を示し、Ｗ１２（初回投与の２週間後）から開始して研究終了時（Ｗ２６）まで効果を持続した。最大の減少は０．５μｇのＣＰ−ＢＮＰ１＋４＋５で観察され、Ｗ１０でのベースラインと比較してＨＢＶ  ＤＮＡの３ｌｏｇの低下、また、Ｗ１２から開始して同じ用量でＷＴ−ＢＮＰと比較してＨＢＶ  ＤＮＡの少なくとも２ｌｏｇの低下を示し、最大の減少がＷ１４で開始して観察された（３ｌｏｇ超の低下）。０．５μｇ未満の用量を使用すると、ＣＰ−ＢＮＰ１＋４＋５はまた、ＨＢＶ  ＤＮＡの用量依存的減少を示したが、より低い用量の０．０５（治療群６）または０．１（治療群７）μｇは、同じ用量のＷＴ−ＢＮＰと比較して、より高いＨＢＶ  ＤＮＡを示した。ＣＰ−ＢＮＰの他の組合せもまた、このモデルにおいて試験し、ＣＰ−ＢＮＰ１＋４＋５よりも低い有効性が見出された。例えば、０．５μｇでのＣＰ−ＢＮＰ１＋３＋４の組合せおよび低下した組合せ（ＣＰ−ＢＮＰ３＋４（治療群９）、ＣＰ−ＢＮＰ４＋５（治療群１０）、ＣＰ−ＢＮＰ５＋７（治療群１１））もまた、ＨＢＶ  ＤＮＡレベルが減少したが、より遅い速度で減少し、より少ない絶対的減少であり、１ｌｏｇ超の低下がＷ１２で開始して達成され、研究期間を通じて維持された。図１５Ａ〜１５Ｃに表されるデータはまた、それぞれ表７、８、および９において、個々、平均およびベースラインからの平均変化として表形式で示される。
【００９３】
【表８】
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【００９４】
【表９】
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【００９５】
【表１０】
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【００９６】
ネズミＣＨＢモデルの結果−ＨＢｓＡｇレベル。以下に記載するＨＢｓＡｇレベルの結果を図１６Ａ〜１６Ｃに示す。プラセボ（治療群１）は研究期間を通じてＨＢｓＡｇレベルを有意に変化させなかった。ＷＴ−ＢＮＰを、０．０５（治療群２）、０．１（治療群３）または０．５（治療群４および１２）μｇで投与した。ＷＴ−ＢＮＰ０．０５μｇ（治療群２）用量はＨＢｓＡｇレベルに対して効果がなかったが、０．１（治療群３）または０．５（治療群４および１２）ｕｇの用量はＨＢｓＡｇレベルの用量依存的減少を示した。０．５μｇでのＣＰ−ＢＮＰ１＋４＋５の組合せ（治療群８および１３）は、ＨＢｓＡｇの最も速いおよび最も急激な減少を示し、Ｗ１２（初回投与の２週間後）から開始して研究終了時（Ｗ２６）まで効果を持続した。最大の減少は０．５μｇのＣＰ−ＢＮＰ１＋４＋５で観察され、Ｗ１０でのベースラインと比較してＨＢｓＡｇの３ｌｏｇの低下、また、Ｗ１２から開始して同じ用量でＷＴ−ＢＮＰと比較してＨＢｓＡｇの１ｌｏｇ超の低下を示し、最大の減少がＷ１４で開始して観察された。０．５μｇ未満の用量を使用すると、ＣＰ−ＢＮＰ１＋４＋５はまた、ＨＢｓＡｇの用量依存的減少を示したが、より低い用量の０．０５μｇ（治療群６）は同じ用量でのＷＴ−ＢＮＰと同様であったか、または０．１μｇ（治療群７）は、同じ用量のＷＴ−ＢＮＰと比較して、より高いＨＢｓＡｇを示した。ＣＰ−ＢＮＰの他の組合せもまた、このモデルにおいて試験し、ＣＰ−ＢＮＰ１＋４＋５よりも低い有効性が見出された。例えば、０．５μｇでのＣＰ−ＢＮＰ１＋３＋４の組合せおよび低下した組合せ（ＣＰ−ＢＮＰ３＋４（治療群９）、ＣＰ−ＢＮＰ４＋５（治療群１０）、ＣＰ−ＢＮＰ５＋７（治療群１１））もまた、ＨＢｓＡｇレベルが減少したが、より遅い速度で減少し、より少ない絶対的減少であり、０．５ｌｏｇ超の低下がＷ１２で開始して達成され、研究期間を通じて維持された。
図１６Ａ〜１６Ｃに表されるデータはまた、それぞれ表１０、１１、および１２において、個々、平均およびベースラインからの平均変化として表形式で示される。
【００９７】
【表１１】
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【００９８】
【表１２】
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【００９９】
【表１３】
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【０１００】
図１５Ａ〜１５Ｃおよび１６Ａ〜１６Ｃに示される結果は、本技術のＣＰ−ＢＮＰが、ＣＨＢのモデルにおいてＨＢＶ  ＤＮＡウイルス負荷およびＨＢｓＡｇレベルを低下させるのに有効であることを実証する。したがって、これらの結果は、本技術のＣＰ−ＢＮＰを含む組成物が慢性Ｂ型肝炎を処置する方法において有用であることを実証する。
【０１０１】
（実施例１７）
ｍＲＮＡからの候補ワクチンの製造および哺乳動物細胞へのＢＮＰコード核酸のトランスフェクション後のタンパク質発現
ｍＲＮＡからのＷＴおよびＣＰ−ＢＮＰ４候補ワクチンの製造。ＷＴまたはＢＮＰ４コード配列を含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）プラスミドをＥｃｏＲＶ−ＨＦ制限酵素により線状化し、精製し、標準的な分子生物学的技術によって確認した。線状化プラスミドを、製造業者の推奨（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従ってｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写キットを使用してｍＲＮＡ産生のための鋳型として使用し、次いで精製した（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。得られた転写産物を、使用の準備ができるまで−８０℃で保存した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、５日間、ＨＥＫ２９３ＴまたはＨｕｈ７細胞へのトランスフェクションを実施した。次いで、培地を収集し、上記のスクロース超遠心分離法を使用して処理した。あるいは、ＮＰ−４０溶解緩衝液を使用して細胞溶解物を処理し、細胞残屑をペレット化した。以前に記載されているようにウェスタンブロットによって試料を評価した。
【０１０２】
哺乳動物細胞株へのＢＮＰコード核酸（ｍＲＮＡおよびＤＮＡ）のトランスフェクション後のタンパク質発現の結果。ｍＲＮＡのトランスフェクションからのＨＢｓＡｇ  ＢＮＰ発現は、抗ＨＢｓＡｇ抗体を使用したウェスタンブロット分析によって測定すると、２つの異なる細胞株（ＨＥＫ２９３ＴおよびＨｕｈ７）において首尾良く達成された（図１７Ａ〜１７Ｂ）。ウェスタンブロットは、モノマーの予想されるサイズ（ＷＴ−ＢＮＰ、２４ｋＤ；ＣＰ−ＢＮＰ４、２９ｋＤ）およびグリコシル化バリアント（ＷＴ−ＢＮＰ、２７ｋＤ；ＣＰ−ＢＮＰ４、３２ｋＤ）を含む、複数のバンドを同定した。さらに、ＷＴ−ＢＮＰ（フラグタグ１５および２８ｋＤａを有する）を発現するＤＮＡ構築物によるトランスフェクション後にＨＢｓＡｇを検出した。
これらの結果は、本技術のｍＲＮＡ構築物が、ＢＮＰ製剤についての指標である、細胞培養上清物へ分泌するそれらの能力によって実証されるように、機能的ＨＢｓＡｇ−Ｓサブユニットを発現することができることを実証する。ＲＮＡトランスフェクションによって生成される、本技術のＣＰ−ＢＮＰは、慢性Ｂ型肝炎の処置のための組成物において有用であり得る。
【０１０３】
均等物
本技術は、本出願に記載される特定の実施形態に関して限定されるべきではなく、本技術の個々の態様の単一の例示として意図される。当業者に明らかなように、本技術の精神および範囲から逸脱することなく、本技術の多くの修飾および変更を行うことができる。本明細書に列挙されたものに加えて、本技術の範囲内の機能的に等価な方法および装置は、前述の説明から当業者には明らかであろう。そのような修飾および変更は添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。本技術は、そのような特許請求の範囲が権利を与えられる均等物の全範囲と共に、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定される。本技術は、特定の方法、試薬、化合物組成物、または生物学的システムに限定されず、当然ながら、これらは変更することができることが理解されるべきである。同様に、本明細書で使用される専門用語は特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。
【０１０４】
加えて、本開示の特徴または態様がマーカッシュグループによって説明されている場合、これにより、本開示は、マーカッシュグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループによっても説明されることを当業者は認識するだろう。
当業者に理解されるように、特に文書として記述するという観点のあらゆる目的のために、本明細書で開示されている全ての範囲は、あらゆる可能な部分範囲およびこれらの部分範囲の組合せも包含する。列挙されているあらゆる範囲を、少なくとも２等分、３等分、４等分、５等分、１０等分等に分解される同じ範囲を十分に説明して可能にすると容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で論じる各範囲を、下３分の１、中３分の１および上３分の１等に容易に分解することができる。当業者にも理解されるように、「以下」、「少なくとも」、「超」、「未満」等の全ての言葉は、列挙される数を含み、上記で論じたように後に部分的範囲に分解され得る範囲を指す。最後に、当業者に理解されるように、範囲は個々の各メンバーを含む。したがって、例えば、１〜３個の細胞を有する群は、１個、２個または３個の細胞を有する群を指す。同様に、１〜５個の細胞を有する群は、１個、２個、３個、４個または５個の細胞を有する群を指し、以下同様である。
【０１０５】
全ての図および表を含む、本明細書で参照されているか、または引用されている全ての特許、特許出願、仮出願、および刊行物は、それらが、本明細書の明確な教示と矛盾しない範囲で、それらの全体が参照として組み込まれる。
他の実施形態は以下の特許請求の範囲において示される。
【０１０６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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