(57)【要約】本発明は、ＣＤ１９抗原を認識できるｓｃＦｖアミノ酸配列およびそれをコードするヌクレオチド配列に関し、且つ、キメラ抗原受容体、それをコードする核酸、それを発現する細胞、および腫瘍を治療する医薬の調製における使用に関する。本発明のキメラ抗原受容体は、少なくとも１つの細胞外ドメイン、任意の膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含み、前記細胞外ドメインはＣＤ１９抗原認識結合ドメインを含む。本発明のキメラ抗原受容体は、ヒト化改造を経て、体内生存期間がより長くなり、患者の完全寛解期も対応して延長することができる。
2021514930.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１〜６の１つに示すような配列を有する重鎖可変領域、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を有する変異体と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７〜１２の１つに示すような配列を有する軽鎖可変領域、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を有する変異体と、
を含む、ＣＤ１９抗原を認識できるｓｃＦｖアミノ酸配列。
【請求項２】
請求項１に記載のｓｃＦｖアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチド配列。
【請求項３】
少なくとも１つの細胞外ドメイン、任意の膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含み、前記細胞外ドメインはＣＤ１９抗原認識結合ドメインを含み、
前記ＣＤ１９抗原認識結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１〜６の１つに示すような配列を有する重鎖可変領域、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を有する変異体を含み、
前記ＣＤ１９抗原認識結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７〜１２の１つに示すような配列を有する軽鎖可変領域、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を有する変異体を含む、キメラ抗原受容体。
【請求項４】
前記ＣＤ１９抗原認識結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１〜６の１つに示すような配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する変異体の重鎖可変領域を含み、
前記ＣＤ１９抗原認識結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７〜１２の１つに示すような配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する変異体の軽鎖可変領域を含む、請求項３に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項５】
前記キメラ抗原受容体の細胞外ドメインは、任意のシグナルペプチドドメインを更に含む、請求項３または４に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項６】
前記シグナルペプチドドメインは、ＧＭ−ＣＳＦシグナルペプチド、ＩＬ−２シグナルペプチド、またはＣＤ８αシグナルペプチドのうちのいずれか１種である、請求項５に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項７】
前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを更に含む、請求項３〜６のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項８】
前記細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ２８細胞内領域、ヒト４−１ＢＢ細胞内領域、ヒトＴＬＲ１細胞内領域、ヒトＴＬＲ２細胞内領域、ヒトＴＬＲ３細胞内領域、ヒトＴＬＲ４細胞内領域、ヒトＴＬＲ５細胞内領域、ヒトＴＬＲ６細胞内領域、ヒトＴＬＲ７細胞内領域、ヒトＴＬＲ８細胞内領域、ヒトＴＬＲ９細胞内領域、ヒトＴＬＲ１０細胞内領域、ヒトＤＡＰ１０細胞内領域、ヒトＣＤ２７細胞内領域、ヒトＯＸ４０細胞内領域、ヒトＣＤ３０細胞内領域、ヒトＣＤ４０細胞内領域、ヒトＰＤ−１細胞内領域、ヒトＣＴＬＡ−４細胞内領域、ヒトＴＩＭ３細胞内領域、ヒトＬＡＧ３細胞内領域、ヒトＴＧＦβ細胞内領域、ヒトＩＣＯＳ細胞内領域、ヒトリンパ球機能関連抗原１細胞内領域、ヒトＣＤ２細胞内領域、ヒトＣＤ７細胞内領域、ヒトＬＩＧＨＴ細胞内領域、ヒトＮＫＧ２Ｃ細胞内領域、ヒトＮＫＧ２Ｄ細胞内領域、ヒトＮＫｐ４６細胞内領域、ヒトＮＫｐ３０細胞内領域、ヒトＮＫｐ４４細胞内領域、ヒトＤＮＡＭ１細胞内領域、ヒトＢ７−Ｈ３細胞内領域、またはヒトＣＤ８３細胞内領域のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含み、ヒトＣＤ２８細胞内領域、ヒト４−１ＢＢ細胞内領域、ヒトＴＬＲ２細胞内領域、ヒトＤＡＰ１０細胞内領域×３、ヒトＤＡＰ１０細胞内領域×６、またはヒトＤＡＰ１０細胞内領域×９のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含むことが好ましい、請求項３〜７のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項９】
前記任意の膜貫通ドメインは、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＯＸ４０、またはＩＣＯＳのうちのいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであり、ＣＤ２８であることが好ましい、請求項３〜８のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１０】
請求項３〜９のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体をコードする、核酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸が導入された、キメラ抗原受容体発現細胞。
【請求項１２】
Ｔ細胞またはＴ細胞を含む細胞群である、請求項１１に記載のキメラ抗原受容体発現細胞。
【請求項１３】
請求項８に記載の核酸を細胞に導入するステップを含み、
好ましくは、前記細胞は、Ｔ細胞またはＴ細胞を含む細胞群である、請求項１１または１２に記載のキメラ抗原受容体発現細胞を調製する方法。
【請求項１４】
請求項１に記載のｓｃＦｖアミノ酸配列、請求項２に記載のヌクレオチド配列、請求項３〜９のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体、請求項１０に記載の核酸、あるいは請求項１１または１２に記載のキメラ抗原受容体発現細胞の、腫瘍を治療する医薬の調製における使用であって、
好ましくは、前記腫瘍は、ＣＤ１９陽性悪性腫瘍および／またはＢ細胞悪性腫瘍である、使用。
【請求項１５】
請求項１に記載のｓｃＦｖアミノ酸配列、請求項２に記載のヌクレオチド配列、請求項３〜９のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体、請求項１０に記載の核酸、あるいは請求項１１または１２に記載のキメラ抗原受容体発現細胞のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含み、
好ましくは、免疫治療医薬および／または小分子化学医薬を更に含む、腫瘍を治療する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍の細胞免疫治療の技術分野に関し、具体的には、ｓｃＦｖアミノ酸配列およびそれをコードするヌクレオチド配列に関し、更に、キメラ抗原受容体、それをコードする核酸、それを発現する細胞、および腫瘍を治療する医薬の調製における使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ、Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）のＴ細胞は、表面で特定の抗原を発現して認識し、シグナルを伝達可能なキメラ型受容体のＴ細胞である。ＣＡＲのＴ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子を発現することにより、抗腫瘍において重要な役割を果たし、ＣＡＲ分子は通常、細胞外断片、膜貫通領域および細胞内断片を含み、細胞外断片は、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが１本のペプチド断片により連結された一本鎖可変領域（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、ＳｃＦｖ）であり、細胞内断片は、各種のシグナル伝達分子の細胞内断片の嵌合体であり、ＣＤ３ｚｅｔａ、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、４−１ＢＢ等を含み、膜貫通ドメインは、他の分子（例えば、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２８およびＣＤ３ｚｅｔａ）の膜貫通ドメインに由来する。一本鎖可変断片部分の遺伝子は、例えば、標的抗原を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから分離される。ＣＡＲ分子を発現するＴ細胞は、腫瘍細胞上の主要組織適合性抗原Ｉ型の発現から独立して腫瘍細胞の表面抗原を直接認識し、且つＴ細胞を同時に活性化することにより、ＣＡＲを発現するＴ細胞は腫瘍細胞を効果的に殺傷することができる。要するに、ＣＡＲのＴ細胞は、抗原−抗体認識モードにより腫瘍細胞表面の特異的な分子を認識し、その後、その細胞内のシグナル伝達により活性化、増殖し、細胞殺傷機能を発揮する。
【０００３】
ヒト化ＣＤ１９抗体は、リンパ腫、白血病、または自己免疫疾患のようなＢ細胞疾患の治療に適用される（Ｈａｎｓｅｎ、米国特許出願公開番号ＵＳ２００５／００７０６９３を参照する）。近年、癌の治療は多く進展しているが、非ホジキンリンパ腫のＢ細胞亜型および慢性リンパ球性白血病のようなＢ細胞悪性腫瘍は、依然として主な癌に関連する死因である。そのため、Ｂ細胞悪性腫瘍を治療するための更に改良された治療プランが非常に必要となる。
【０００４】
ＣＡＲ−Ｔの中国語フルネームはキメラ抗原受容体Ｔ細胞免疫療法であり、現在流行っている新型な腫瘍治療プランであり、最も悪性腫瘍を治療する可能性がある技術の１つとも考えられる。しかし、ＣＡＲ−Ｔ治療の広範な使用も一連の難題およびボトルネックに遭遇し、ここで、宿主免疫系に含まれるＴ細胞および抗体により媒介されるＣＡＲ分子に対する免疫拒絶反応は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の体内持続性および長期治療効果を制限する重要な阻害、その使用に影響する重要な要因の１つである可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在、世界中の多くの臨床的に登録されたＣＤ１９のＣＡＲ−Ｔ細胞治療は、使用する腫瘍認識配列がマウス由来抗体に由来し、人体に投与すると、自己免疫系により異種抗原として認識されやすいため、宿主のＴ細胞または抗体により除去され、ひいてはＣＡＲ−Ｔ細胞の体内持続性に影響を及ぼし、再発率が高くなり、長期的な臨床治療効果を低減する。これに対し、本発明の目的は、キメラ抗原受容体およびその使用、具体的には、キメラ抗原受容体、それをコードする核酸、それを発現する細胞、および腫瘍を治療する医薬の調製における使用を提供することにある。本発明のキメラ抗原受容体ＣＤ１９抗体認識配列は、ヒト化改造を経て、体内生存期間がより長く、患者の完全寛解期も対応して延長することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下の技術案により、上記目的を実現する。
【０００７】
第１態様では、本発明は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１〜６の１つに示すような配列を有する重鎖可変領域、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を有する変異体と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７〜１２の１つに示すような配列を有する軽鎖可変領域、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を有する変異体と、
を含むＣＤ１９抗原を認識できるｓｃＦｖアミノ酸配列を提供する。
【０００８】
本発明のいくつかの実施例において、該ｓｃＦｖ配列の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１〜６の１つに示すようなアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％、例えば、８５％、８６％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、９９％の同一性を有し、該ｓｃＦｖ配列の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７〜１２の１つに示すようなアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％、例えば、８５％、８６％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する。
【０００９】
第２態様では、本発明は、第１態様におけるｓｃＦｖアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を提供する。
【００１０】
第３態様では、本発明は、
少なくとも１つの細胞外ドメイン、任意の膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含み、前記細胞外ドメインはＣＤ１９抗原認識結合ドメインを含み、
前記ＣＤ１９抗原認識結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１〜６の１つに示すような配列を有する重鎖可変領域、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を有する変異体を含み、
前記ＣＤ１９抗原認識結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７〜１２の１つに示すような配列を有する軽鎖可変領域、またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を有する変異体を含むキメラ抗原受容体を提供する。
【００１１】
本発明において、ヒト化ＣＤ１９の特異的一本鎖抗体配列をヒト化ＣＤ１９のＣＡＲのＴ細胞に構築することで、マウス由来ＣＤ１９のＣＡＲのＴ細胞と同様の治療効果を得ることができるが、マウス一本鎖抗体の免疫拒絶反応を回避する。本発明におけるＣＤ１９抗原認識結合ドメインは、ヒト化改造を経て、その腫瘍細胞標的抗原に対する認識能力に影響しないとともに、異種免疫拒絶の発生確率を低減する可能性があり、ＣＡＲ−Ｔ細胞の人体における持続時間を延長し、腫瘍細胞に対する免疫監視能力を強化し、腫瘍の再発率を低減し、患者の完全寛解期も対応して延長することができる。
【００１２】
本発明のいくつかの実施例において、前記ＣＤ１９抗原認識結合ドメインの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１〜６の１つに示すようなアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列であり、例えば、８５％、８６％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列であってもよく、且つＣＤ１９と結合してＴ細胞シグナル伝達を誘導する能力を有する変異体であり、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する変異体の重鎖可変領域であり、且つＣＤ１９と結合してＴ細胞シグナル伝達を誘導する能力を有する変異体であることが好ましい。
【００１３】
本発明のいくつかの実施例において、前記ＣＤ１９抗原認識結合ドメインの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７〜１２の１つに示すようなアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列であり、例えば、８５％、８６％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列であってもよく、且つＣＤ１９と結合してＴ細胞シグナル伝達を誘導する能力を有する変異体であり、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する変異体の軽鎖可変領域であり、ＣＤ１９と結合してＴ細胞シグナル伝達を誘導する能力を有する変異体であることが好ましい。
【００１４】
本発明によれば、前記ＣＤ１９抗原認識結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１〜６の１つに示すような配列を有する重鎖可変領域、またはそれと少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つＣＤ１９と結合してＴ細胞シグナル伝達を誘導する能力を有する変異体を含む。
【００１５】
本発明によれば、前記ＣＤ１９抗原認識結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７〜１２の１つに示すような配列を有する軽鎖可変領域、またはそれと少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つＣＤ１９と結合してＴ細胞シグナル伝達を誘導する能力を有する変異体を含む。
【００１６】
本発明において、発明者は、この６つの配列の重鎖と軽鎖との組み合わせを採用することにより、ハイブリドーマ抗体との親和性を更に向上させることができ、その殺傷効果も著しく高まり、具体的なＣＤ１９抗原認識結合ドメインの重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、重鎖および軽鎖のうちの１本で組み合わせることができることを見出し、具体的には以下の表１に示すとおりである。
【００１７】
【表１−１】
2021514930.tif 000003
【表１−２】
2021514930.tif 000004
【表１−３】
2021514930.tif 000005
【００１８】
本発明によれば、前記キメラ抗原受容体は、例えば、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０であるように構成され、重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１であるように構成され、または重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６で軽鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２であるように構成されてもよい。
【００１９】
本発明のいくつかの実施例において、前記ＣＤ１９抗原認識結合ドメインの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１〜６の１つに示すようなアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列であり、例えば、８５％、８６％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列であってもよく、且つＣＤ１９と結合してＴ細胞シグナル伝達を誘導する能力を有する変異体であり、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する変異体の重鎖可変領域であり、且つＣＤ１９と結合してＴ細胞シグナル伝達を誘導する能力を有する変異体であることが好ましい。
【００２０】
本発明のいくつかの実施例において、前記ＣＤ１９抗原認識結合ドメインの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７〜１２の１つに示すようなアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列であり、例えば、８５％、８６％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、９９％の同一性を有する配列であってもよく、且つＣＤ１９と結合してＴ細胞シグナル伝達を誘導する能力を有する変異体であり、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する変異体の軽鎖可変領域であり、ＣＤ１９と結合してＴ細胞シグナル伝達を誘導する能力を有する変異体であることが好ましい。
【００２１】
本発明によれば、前記キメラ抗原受容体の細胞外ドメインは、任意のシグナルペプチドドメインを更に含み、前記シグナルペプチドドメインは、ＧＭ−ＣＳＦシグナルペプチド、ＩＬ−２シグナルペプチド、またはＣＤ８αシグナルペプチドのうちのいずれか１種である。
【００２２】
本発明によれば、前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを更に含む。本発明によれば、前記細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ２８細胞内領域、ヒト４−１ＢＢ細胞内領域、ヒトＴＬＲ１細胞内領域、ヒトＴＬＲ２細胞内領域、ヒトＴＬＲ３細胞内領域、ヒトＴＬＲ４細胞内領域、ヒトＴＬＲ５細胞内領域、ヒトＴＬＲ６細胞内領域、ヒトＴＬＲ７細胞内領域、ヒトＴＬＲ８細胞内領域、ヒトＴＬＲ９細胞内領域、ヒトＴＬＲ１０細胞内領域、ヒトＤＡＰ１０細胞内領域、ヒトＣＤ２７細胞内領域、ヒトＯＸ４０細胞内領域、ヒトＣＤ３０細胞内領域、ヒトＣＤ４０細胞内領域、ヒトＰＤ−１細胞内領域、ヒトＣＴＬＡ−４細胞内領域、ヒトＴＩＭ３細胞内領域、ヒトＬＡＧ３細胞内領域、ヒトＴＧＦΒ細胞内領域、ヒトＩＣＯＳ細胞内領域、ヒトリンパ球機能関連抗原１細胞内領域、ヒトＣＤ２細胞内領域、ヒトＣＤ７細胞内領域、ヒトＬＩＧＨＴ細胞内領域、ヒトＮＫＧ２Ｃ細胞内領域、ヒトＮＫＧ２Ｄ細胞内領域、ヒトＮＫｐ４６細胞内領域、ヒトＮＫｐ３０細胞内領域、ヒトＮＫｐ４４細胞内領域、ヒトＤＮＡＭ１細胞内領域、ヒトＢ７−Ｈ３細胞内領域、またはヒトＣＤ８３細胞内領域のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含み、ヒトＣＤ２８細胞内領域、ヒト４−１ＢＢ細胞内領域、ヒトＴＬＲ２細胞内領域、またはヒトＤＡＰ１０細胞内領域×３、ヒトＤＡＰ１０細胞内領域×６、ヒトＤＡＰ１０細胞内領域×９のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせ（前記組み合わせは、例えば、ＣＤ２８−ＴＬＲ２、４１ＢＢ−ＴＬＲ２、４１ＢＢ−ＣＤ２８、４１ＢＢ−ＣＤ２８−ＴＬＲ２、４１ＢＢ−ＣＤ２８−ＤＡＰ１０×３、４１ＢＢ−ＴＬＲ２−ＤＡＰ１０×３、ＣＤ２８−ＴＬＲ２−ＤＡＰ１０×３、ＴＬＲ２−ＤＡＰ１０×３、ＣＤ２８−ＤＡＰ１０×３、４１ＢＢ−ＤＡＰ１０×３、ＴＬＲ２−ＤＡＰ１０×６、ＣＤ２８−ＤＡＰ１０×６、４１ＢＢ−ＤＡＰ１０×９、ＴＬＲ２−ＤＡＰ１０×９、ＣＤ２８−ＤＡＰ１０×９、または４１ＢＢ−ＤＡＰ１０×９）を含むことが好ましく、ヒトＣＤ２８細胞内領域、ヒト４−１ＢＢ細胞内領域、ヒトＴＬＲ２細胞内領域、およびヒトＤＡＰ１０×３細胞内領域のいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含むことが好ましい。
【００２３】
前記任意の膜貫通ドメインは、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＯＸ４０、またはＩＣＯＳのうちのいずれか１種であることが好ましく、ＣＤ２８であることが更に好ましい。
【００２４】
第４態様では、本発明は、第３態様に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸を提供する。
【００２５】
第５態様では、本発明は、第４態様に記載の核酸が導入されたキメラ抗原受容体発現細胞を提供する。
【００２６】
本発明によれば、前記細胞は、Ｔ細胞またはＴ細胞を含む細胞群である。
【００２７】
第６態様では、本発明は、第４態様に記載の核酸を細胞に導入するステップを含む第５態様に記載のキメラ抗原受容体発現細胞を調製する方法を提供する。
【００２８】
好ましくは、前記細胞は、Ｔ細胞またはＴ細胞を含む細胞群である。
【００２９】
第７態様では、本発明は、第１態様に記載のｓｃＦｖアミノ酸配列、第２態様に記載のヌクレオチド配列、第３態様に記載のキメラ抗原受容体、第４態様に記載の核酸、または第５態様に記載のキメラ抗原受容体発現細胞の腫瘍を治療する医薬の調製における使用を提供する。
【００３０】
好ましくは、前記腫瘍は、ＣＤ１９陽性悪性腫瘍および／またはＢ細胞悪性腫瘍である。
【００３１】
本発明の１つの実施形態において、前記ｓｃＦｖアミノ酸配列を用いて腫瘍の診断および治療のための抗体を調製することができる。
【００３２】
第８態様では、本発明は、
第１態様に記載のｓｃＦｖアミノ酸配列、第２態様に記載のヌクレオチド配列、第３態様に記載のキメラ抗原受容体、第４態様に記載の核酸、または第５態様に記載のキメラ抗原受容体発現細胞のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含み、
好ましくは、免疫治療医薬および／または小分子医薬を更に含む腫瘍を治療する医薬組成物を提供する。
【００３３】
本発明において、前記免疫治療医薬は、例えば、抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体、抗ＣＤ２０キメラ抗原受容体、抗ＣＤ２２キメラ抗原受容体、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、ＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼ阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤（ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体、ＣＴＬＡ−４モノクローナル、ＴＩＭ３モノクローナル抗体、ＬＡＧ３モノクローナル抗体）、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１キメラ抗原受容体、ＣＴＬＡ−４キメラ抗原受容体、ＴＩＭ３キメラ抗原受容体、またはＬＡＧ３キメラ抗原受容体のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであってもよい。
【００３４】
本発明において、前記医薬組成物は小分子化学医薬を更に含み、例えば、ビンクリスチン、ダウノルビシン、Ｌ−アスパラギナーゼ、プレドニゾン、ピラルビシン、デキサメタゾン、アスパラギナーゼ、ドキソルビシン、シタラビンまたはペガスパルガーゼ、ＭＴＯＲ阻害剤（テムシロリムス、エベロリムス、シロリムス）、プロテアソーム阻害剤（ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ）、またはヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤（ベリノスタット、ボリノスタット、パノビノスタット）のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであってもよい。
【００３５】
なお、「細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン」という用語は、細胞においてシグナルを伝送して生物学的過程の活性化または阻害を引き起こすドメインとして機能する既知の任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを指す。
【００３６】
なお、「変異体」という用語は、１つまたは複数、更に多くのアミノ酸の置換、欠失、または付加を含む任意の変異体を指し、前記変異体が基本的に元の配列が有する機能と同じ機能を保留することを条件とする。
【発明の効果】
【００３７】
従来技術と比べ、本発明は、以下のような有益な効果を有する。
【００３８】
本発明におけるＣＤ１９抗原認識結合ドメインは、ヒト化改造を経て、腫瘍細胞標的抗原に対する認識能力に影響しないとともに、異種免疫拒絶の発生確率を低減する可能性があり、ＣＡＲ−Ｔ細胞の人体における持続時間を延長し、腫瘍細胞に対する免疫監視能力を強化し、腫瘍の再発率を低減し、患者の完全寛解期も対応して延長することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ハイブリドーマ抗体とＣＤ１９−ｈｉｓとが結合した結果図であり、ここで、図１Ａは、１５Ｆ２、５５Ｇ１、２７Ｆ１１、３８Ｃ１および２２Ｈ１がハイブリドーマ抗体と結合した結果であり、図１Ｂは、３１Ａ２、６０Ｇ１０、１１Ｈ８、１４Ｇ９および３１Ｆ５がハイブリドーマ抗体と結合した結果であり、図１Ｃは、６８Ａ３、５６Ｆ４、１７Ｂ６、２８Ｃ１０、５２Ｆ９および８０Ｇ７がハイブリドーマ抗体と結合した結果であり、図１Ｄは、１１Ｈ８、１５Ｆ２、１７Ｂ６、２７Ｆ１１、３１Ａ２および５２Ｆ９がハイブリドーマ抗体と結合した結果である。
【図２】ＣＤ１９抗体エピトープ結合の結果図である。
【図３】親和性が最も優れたＣＤ１９抗体の結合分析である。
【図４】ＣＤ１９抗体と異なる抗原との親和性の分析であり、ここで、図４Ａは、１６Ｂ７、２１Ｆ１、３２Ｇ７、２１Ｇ５、２２Ａ３、１２Ｄ１、１５Ｆ２、５５Ｇ１、２７Ｆ１１、５１Ｅ９、３８Ｃ１、２２Ｈ１、３１Ａ２、２７Ｂ９および４４Ｃ１２抗原がＣＤ１９抗体と結合した結果であり、図４Ｂは、６０Ｇ１０、１１Ｈ８、１４Ｇ９、３１Ｆ５、１６Ｄ４、３１Ｇ６、３２Ｇ１１、５５Ｄ９、１６Ｇ６、８０Ｇ５、６８Ａ３、５６Ｆ４、１７Ｂ６、２８Ｃ１０、５２Ｆ９および８０Ｇ７抗原がＣＤ１９抗体と結合した結果である。
【図５】ＣＤ１９完全ヒト化抗体とＣＤ１９−ｈｉｓとが結合した結果図である。
【図６】ＣＤ１９完全ヒト化抗体とＮａｌｍ６／ＧＬとが結合した結果図である。
【図７】キメラ抗原受容体ＣＡＲの１９ＳＣＦＶの分子構造図である。
【図８】ＣＡＲ（１１Ｈ８／３１Ａ２／５２Ｆ９／ＦＭＣ６３）−４１ＢＢ−ＴＬＲ２−ＣＤ３ζのＴ細胞がＣＤ１９＋リンパ腫細胞系ＲＡＪＩを体外で標的殺傷する結果である。
【図９】ＣＡＲ（１５Ｆ２／１７Ｂ６／２７Ｆ１１／３１Ａ２／ＦＭＣ６３）−４１ＢＢ−ＴＬＲ２−ＣＤ３ζのＴ細胞がＣＤ１９＋リンパ腫細胞系ＲＡＪＩを体外で標的殺傷する結果である。
【図１０】ＣＡＲ（１１Ｈ８／３１Ａ２／５２Ｆ９／ＦＭＣ６３）−ＣＤ２８−ＴＬＲ２−ＣＤ３ζのＴ細胞がＣＤ１９＋白血病細胞系ＮＡＬＭ６を体外で標的殺傷する結果である。
【図１１】ＣＡＲ（１５Ｆ２／１７Ｂ６／２７Ｆ１１／３１Ａ２／ＦＭＣ６３）−４１ＢＢ−ＤＡＰ１０×３−ＣＤ３ζのＴ細胞がＣＤ１９＋白血病細胞系ＮＡＬＭ６を体外で標的殺傷する結果である。
【図１２】ＣＡＲ（１１Ｈ８／３１Ａ２／５２Ｆ９／ＦＭＣ６３）−４１ＢＢ−ＴＬＲ２−ＣＤ３ζのＴ細胞がＣＤ１９−急性骨髄性白血病細胞系ＡＭＬ３を体外で殺傷する結果である。
【図１３】ＣＡＲ（１５Ｆ２／１７Ｂ６／２７Ｆ１１／３１Ａ２／ＦＭＣ６３）−４１ＢＢ−ＣＤ２８−ＣＤ３ζのＴ細胞がＣＤ１９−急性骨髄性白血病細胞系ＡＭＬ３を体外で殺傷する結果である。
【図１４】ＣＡＲ（１１Ｈ８／３１Ａ２／５２Ｆ９／ＦＭＣ６３）−４１ＢＢ−ＴＬＲ２−ＣＤ３ζのＴ細胞が肺癌細胞系Ａ５４９を体外で殺傷する結果である。
【図１５】ＣＡＲ（１１Ｈ８／３１Ａ２／５２Ｆ９／ＦＭＣ６３）−ＣＤ２８−ＴＬＲ２−ＣＤ３ζのＴ細胞が肺癌細胞系Ｈ４６０を体外で殺傷する結果である。
【図１６】ＣＡＲ（１１Ｈ８／３１Ａ２／５２Ｆ９／ＦＭＣ６３）−４１ＢＢ−ＴＬＲ２−ＣＤ３ζのＴ細胞が胃癌細胞系ＭＫＮ２８を体外で殺傷する結果である。
【図１７】ＣＡＲ（１１Ｈ８／３１Ａ２／５２Ｆ９／ＦＭＣ６３）−ＣＤ２８−ＴＬＲ２−ＣＤ３ζのＴ細胞が胃癌細胞系ＳＮＵ−１を体外で殺傷する結果である。
【図１８】ＣＡＲ（１５Ｆ２／１７Ｂ６／２７Ｆ１１／３１Ａ２／ＦＭＣ６３）−４１ＢＢ−ＤＡＰ１０×３−ＣＤ３ζのＴ細胞が胃癌細胞系ＳＮＵ−１を体外で殺傷する結果である。
【図１９】ＣＡＲ（１１Ｈ８／３１Ａ２／５２Ｆ９／ＦＭＣ６３）−４１ＢＢ−ＤＡＰ１０×３−ＣＤ３ζのＴ細胞が肝癌細胞系ＳＭＭＣを体外で殺傷する結果である。
【図２０】ＣＡＲ（１５Ｆ２／１７Ｂ６／２７Ｆ１１／３１Ａ２／ＦＭＣ６３）−４１ＢＢ−ＤＡＰ１０×３−ＣＤ３ζのＴ細胞が肝癌細胞系ＨｅｐＧ２を体外で殺傷する結果である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明を理解しやすいために、本発明は以下の実施例を挙げる。当業者であれば、前記実施例が本発明を理解するためのものに過ぎず、本発明を具体的に限定するものではないことを理解すべきである。
【００４１】
ＣＡＲプラスミドの構築
以上により、ＣＡＲ分子は、細胞外領域と、膜貫通領域と、細胞内領域とを含むため、以下の実施例に用いられるＣＡＲプラスミドの構築工程は以下のステップを含む。
【００４２】
まず、遺伝子合成により、抗ＣＤ１９抗体免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域の配列、ＣＤ２８膜貫通シグナル領域の配列、ＴＬＲ１シグナル伝達領域の配列、ＴＬＲ２シグナル伝達領域の配列、ＤＡＰ１０×３シグナル伝達領域の配列、およびＣＤ３ζシグナル伝達領域の配列を含む、ＣＡＲプラスミドに必要な各遺伝子ＤＮＡを取得する。
【００４３】
次に、酵素切断、連結等のステップにより、必要な上記合成された各遺伝子配列を直列に連結し、本発明のＣＡＲ分子を取得する。
【００４４】
材料：
ｈＣＤ１９−ｆｃは、ＡＣＲＯ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｔ＃ＣＤ９−Ｈ５２５９から購入され、
ｈＣＤ１９−ｈｉｓは、ＡＣＲＯ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｔ＃ＣＤ９−Ｈ５２Ｈ２から購入される。
【具体的な実施例】
【００４５】
実施例１  ｈＣＤ１９タンパク質の調製および同定
以下のステップに従ってＨＣＤ１９タンパク質を調製し、具体的には、以下のとおりである。
【００４６】
ｈＣＤ１９−ｆｃ：ＨＥＫ２９３細胞においてヒトＣＤ１９組換えタンパク質（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＡＡＨ０６３３８）を発現した。ヒトＣＤ１９遺伝子コード領域Ｐｒｏ２０−Ｌｙｓ２９１の配列（Ｃ端をＦｃで標識する）を選択してトランスフェクションした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで精製されたタンパク質を同定した。
【００４７】
ｈＣＤ１９−ｈｉｓ：ＨＥＫ２９３細胞においてヒトＣＤ１９組換えタンパク質（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃Ｐ１５３９１−１）を発現した。ヒトＣＤ１９遺伝子コード領域Ｐｒｏ２０−Ｌｙｓ２９１の配列（Ｃ端をＨｉｓで標識する）を選択してトランスフェクションした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで精製されたタンパク質を同定した。
【００４８】
実施例２  抗体の調製
（Ｉ）抗原共役結合および免疫
（１）ｈＣＤ１９−Ｆｃ組換えタンパク質と複数種のＭａｂＳｐａｃｅ免疫増強ペプチドとを免疫共役し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによる検出により、共役タンパク質の品質管理を行った。
【００４９】
（２）以上の共役されたｈＣＤ１９−Ｆｃタンパク質に、１：１の割合でフロイント完全アジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｃａｔ＃７７１４０）を加えて乳化した後、それぞれ皮下および腹腔によりＨ２Ｌ２マウスに注射して免疫を行った。Ｈ２Ｌ２マウスはＨａｒｂｏｕｒ  ＢｉｏＭｅｄにより生産され、ヒト可変領域およびラット定常領域の遺伝子を持ち、且つ内因性マウス抗体遺伝子を含まない。ＣｐＧ（シトシン−ホスホロチオエート−グアニン）およびミョウバンを用いて更なる免疫を行い、タンパク質の天然構造を保存する。最初の免疫の後、および免疫が発生した後（少なくとも２週ごとに１回）、マウス血清を取得し、ＥＬＩＳＡ法を用いて抗血清における抗ｈＣＤ１９の力価を分析した。
【００５０】
（ＩＩ）融合
融合前の４日目に、各マウスの腹腔に共役されていないｈＣＤ１９−Ｈｉｓタンパク質のＰＢＳ溶液を注射した。融合の当日に、無菌操作でマウスの脾臓を取得し、せん断して研磨して濾過し、単細胞懸濁液にした。赤血球を分解し、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で脾臓細胞を濯いだ。生きている対数期増殖した骨髄腫瘍細胞（ＳＰ２／０）を、マウス脾臓細胞と１：４の割合で混合した。ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）と融合する前に２回洗浄した。融合後の細胞をＤＭＥＭ培地で洗浄した後、１０％のＦＢＳ＋ＨＦＣｓ（ハイドロフルオロカーボン）＋ＯＰＩ＋１×ＨＡＴ細胞増殖培地を用いて再懸濁した。９６穴細胞培養プレートに置き、各穴に２００μｌの細胞増殖培地があり、３７℃で潤い１０％の二酸化炭素のインキュベータにおいて一晩培養した。７日間培養し、２〜３日ごとにハイブリドーマ培地の上清（抗体をスクリーニングして使用に用意する）を吸い出し、新鮮な培地を交換した。
【００５１】
（ＩＩＩ）ＥＬＩＳＡによる抗体のスクリーニング
９６穴プレートに１μｇ／ｍｌのヒトＣＤ１９−Ｈｉｓを加え、各穴に１００μｌを加え、４℃で一晩インキュベートし、洗浄した後、１００μｌのハイブリドーマ培養液の上清を加え、ヒトＣＤ１９−Ｈｉｓと完全に結合し、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）により標識されたヤギ抗ラットＦｃ抗体を加え、結合されたＣＤ１９抗体を検出し、ＴＭＢ反応させてＨ２ＳＯ４で終了した後、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  ＦＣ（４５０ｎＭ）でデータを読み取った。ＥＬＩＳＡによる検出が陽性であるハイブリドーマ細胞を培養し続け、更に同定して分析し続けた。
【００５２】
実施例３  陽性ハイブリドーマ細胞サブクローンの取得および小規模抗体の生産
（Ｉ）陽性ハイブリドーマ細胞サブクローン
【００５３】
（１）９６穴プレートでＥＬＩＳＡ陽性ハイブリドーマ細胞の段階希釈を行い、理想的な親和性および遮断活性を有する細胞を選択し、７日間培養した後、細胞クローン群を形成し、上清を収集し、抗原結合能力により、実施例２における形態を用いて更にスクリーニングした。
【００５４】
（２）スクリーニング結果により、最も高い抗原親和性を有するクローンを選択し、ハイブリドーマ増殖培地で拡大培養した。７日間後に、スクリーニングされたハイブリドーマ細胞培養液の上清の抗原結合能力を再び検出し、少なくとも９０個の穴（９６穴プレート）となるまで、サブクローンスクリーニング試験を少なくとも２回以上行った。
【００５５】
（３）９０個以上の穴が陽性結合シグナルを示す場合、抗原結合活性が最も高い２つのクローンを同定し、それらを２４穴プレート培地に移し、引き続き２日間成長させることを許容した。２４穴プレートが合わせられると、細胞は６穴プレートに移された。５日間インキュベートした後、一部の細胞が凍結された。残りの細胞が１つのフラスコに移されて拡張が許容された。フラスコが合わせられると、半分の細胞が凍結されて（クローンごとに３瓶）余分なバックアップとし、他方の半分は、培地で更に拡大して抗体を生産することが許容され、標準的な方法を用いて同型を確定した。
【００５６】
（ＩＩ）モノクローナル抗体の小規模生産
（１）ハイブリドーマ細胞をローラーボトルに接種し、２００〜３００ｍｌのハイブリドーマ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で１４日間培養し、ハイブリドーマの培養からＣＤ１９モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を精製することは以下のように、全ての浄化プロセスがいずれも室温で行われ、アフィニティークロマトグラフィーを用いて各種のモノクローナル抗体を精製した。
【００５７】
（２）宿主細胞培養液（ＣＣＦ、ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｌｕｉｄ）を遠心分離して細胞残屑を除去した後、ＣＣＦ上清を濾過し、希釈した後、柱状、タンパク質Ｇの効率的（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）およびバランスの形でタンパク質Ｇクロマトグラフィー培地にローディングした。
【００５８】
（３）ローディングした後に、タンパク質Ｇカラムは、２８０ｎｍ箇所の吸光度がベースラインに戻るまで洗浄され、ＣＤ１９モノクローナル抗体をｐＨ２．５のグリシンで溶出してから、直ちに１ＭのＴｒｉｓ（１ｍＬの溶出液あたり）を加えて中和し、溶出液の２８０ｎｍの吸光度を対照とし、タンパク質を含む成分を収集し、タンパク質をプール化させた。
【００５９】
（４）精製後に、１０，０００ＭのＷＣＯ膜（Ｐｉｅｒｃｅ滑液分解器または透析管）で透析されたＣＤ１９モノクローナル抗体を、ＰＢＳを用いて配置して作製し、配置が完了した後、ＣＤ１９モノクローナル抗体を濾過した。
【００６０】
実施例４  ＥＬＩＳＡ法による精製されたＣＤ１９抗体の結合分析
実施例２に従い、ＥＬＩＳＡ法を用いて抗体をスクリーニングした。簡単に、０．５μｇ／ｍｌのｈＣＤ１９−Ｈｉｓ（ＡＣＲＯ）でコーティングをインキュベートし、精製された抗体を連続的に希釈し、インキュベートされた抗原と結合させ、ＨＲＰにより標識されたヤギ抗ラットＦｃ抗体を用いて各抗体の結合シグナルを検出することができた。
【００６１】
ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを用いてフィッティングデータを計算し、抗体ＥＣ５０をまとめて図１および表２に示す。
【００６２】
【表２】
2021514930.tif 000006
【００６３】
図１および表２から見られるように、抗体はｈＣＤ１９−Ｈｉｓとの親和性が異なるが、いずれもｈＣＤ１９−Ｈｉｓと一定の親和性を有し、これらの抗体をキメラ抗原受容体の細胞外ドメインとして選択すると、ＣＤ１９を認識する機能を実現することができた。
【００６４】
実施例５  Ｆｏｒｔｉｅｂｉｏ方法によるエピトープ結合
１つ目のＣＤ１９抗体を動力学緩衝液（ＰＢＳ）により２５０ｐｌ／穴でローディングカラムマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ）に希釈し、ｈＣＤ１９−ｈｉｓを動力学緩衝液（ＰＢＳ）により２５０ｐｌ／穴でアソシエーションカラム（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｎ）に希釈した。ＡＨＣセンサを１つ目のベースラインに配置し、１つ目のベースラインを取得した後、ローディングカラムに３００秒間配置し、１つ目のＣＤ１９抗体を捕捉し、その後、センサを２つ目のベースライン列に配置し、２つ目のベースラインを取得し、続いて、それらをアソシエーションカラムに３００秒間入れ、ＣＤ１９／１ＣＤ１９抗体を完全に関連付けさせ、センサを２つ目のＣＤ１９抗体列に３００秒間配置し、２つ目のＣＤ１９抗体と第１のＡｂとを競合する／競合しないようにさせ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（Ｏｃｔｅｔ９６）を用いてデータを分析し、結果は、図２および表３に示すように、具体的には以下のとおりである。
【００６５】
【表３】
2021514930.tif 000007
【００６６】
図２の例から見られるように、２つ目のＣＤ１９ＡｂがＣＤ１９と結合できないと、それは１つ目のＣＤ１９Ａｂと類似するエピトープを有して且つ１つ目のＣＤ１９Ａｂと競合することを示し、第２種の抗体が第１種の抗体からの影響を受けずに第１種の抗体と結合して何らかの影響を与えないと、それらのエピトープは異なり、非競合であった。この結果に基づき、競合結果に応じて抗体を２グループに分け、２グループのエピトープは異なり、結果は表３に示すように、大部分がＢｉｎ１に属し、２つの抗体のみがＢｉｎ２に属した。
【００６７】
実施例６  フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）による精製されたＣＤ１９抗体の結合分析
指数期増殖したＣＤ１９を発現する腫瘍細胞Ｎａｌｍ６を収集し、ＰＢＳで再懸濁し、細胞密度が１０５／穴、１００μｌ／穴であり、穴に希釈されたＣＤ１９抗体を加え、４℃で１時間インキュベートし、フローサイトメーター洗浄緩衝液を用いて細胞を３回洗浄し、抗ラットＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（Ａｂｅａｍ、Ｃａｔ＃ａｂ１５０１６３）を加えて４℃で１ｈインキュベートし、フローサイトメーター洗浄緩衝液を用いて細胞を３回洗浄し、フローサイトメーターでサンプルを分析し、結果は図３および表４に示すように、具体的には以下のとおりである。
【００６８】
【表４】
2021514930.tif 000008
【００６９】
表４に示すように、２７Ｆ１１、１７Ｂ６、３１Ａ２、１１Ｈ８、２７Ｂ９および１５Ｆ２は、Ｎａｌｍ６に対する結合シグナルが最も高かった。バックグラウンド（抗ラットＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７）のＭＦＩ（ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、平均蛍光強度）は約４５０であり、図３から見られるように、２つのビン（Ｂｉｎ）の抗体の結合曲線が異なり、Ｂｉｎ１の２７Ｆ１１、１７Ｂ６、３１Ａ２および１１Ｈ８の結合シグナルが高く、ＥＣ５０も高く、Ｂｉｎ２の５５Ｇ１および５２Ｆ９のシグナルが低く、ＥＣ５０が低かった。
【００７０】
実施例７  特異的結合（ＥＬＩＳＡ）
実施例４に係る方法に基づき、０．５μｇ／ｍｌのｈＣＤ１９−Ｈｉｓ、ｈＶＩＳＴＡ−ｈｉｓ、ｈＰＤ−Ｌ１、ｈＣＤ４０、ｈ４１ＢＢおよびｈＬＡＧ３をそれぞれコーティングしてインキュベートし、２μｇ／ｍｌの精製された抗体を加えてインキュベートされた抗原と結び付け、ＨＲＰにより標識されたヤギ抗ラットＦｃ抗体を用いて抗体の結合シグナルを検出することができ、結果は図４に示すとおりである。
【００７１】
図４に示すように、これらの抗体１６Ｂ７、２１Ｆ１、３２Ｇ７、２１Ｇ５、２２Ａ３、１２Ｄ１、１５Ｆ２、５５Ｇ１、２７Ｆ１１、５１Ｅ９、３８Ｃ１、２２Ｈ１、３１Ａ２、２７Ｂ９、４４Ｃ１２、６０Ｇ１０、１１Ｈ８、１４Ｇ９、３１Ｆ５、１６Ｄ４、３１Ｇ６、３２Ｇ１１、５５Ｄ９、１６Ｇ６、８０Ｇ５、６８Ａ３、５６Ｆ４、１７Ｂ６、２８Ｃ１０、５２Ｆ９および８０Ｇ７は、いずれも（ｈＣＤ１９を除く）他の抗原と交差反応せず、抗体がＣＤ１９に対して良好な特異性を有することを示した。
【００７２】
実施例８  ハイブリッド抗体の遺伝子クローンおよびシーケンシング
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の増幅によりラット抗ヒトＣＤ１９抗体の軽鎖および重鎖可変領域配列を取得した。ＲＮＡ抽出キット（ＴＡＫＡＲＡ）により、それぞれ１１Ｈ８、１７Ｂ６、３１Ａ２、２７Ｆ１１、１５Ｆ２、１９Ｄ６、５２Ｆ９を発現するハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＩＩ第一鎖ｃＤＮＡ合成キット（ＴＡＫＡＲＡ）により、ｃＤＮＡ（Ｏｌｉｇｏ  ＤＴプライマー）を合成した。縮重フォワードプライマーおよび１つのリバースプライマー（抗体アイソフォームにより決定される）でＩｇＧ遺伝子の重鎖可変領域をクローンし、ｍＫ−ＦフォワードプライマーおよびｃＫ−Ｒリバースプライマーで軽鎖可変領域をクローンした。各抗体が産生したバンドはトランス−５ａクローニングベクターにクローンされ、クローンされた十数個のＤＮＡをＤＮＡ  ｓｔａｒシーケンシング機器で測定した。
【００７３】
シーケンシング結果により、１５Ｆ２および１９Ｄ６のアミノ酸配列が同じであることが示されるため、このクローンは１５Ｆ２と命名され、配列結果は表５に示すように、具体的には以下のとおりである。
【００７４】
【表５−１】
2021514930.tif 000009
【表５−２】
2021514930.tif 000010
【００７５】
実施例９  完全ヒト化抗体の生産
シーケンシング分析および確認の後に、上記それぞれの遺伝子の可変領域を組換え発現ベクターにクローンし、例えば、軽鎖可変領域配列（ＶＬ）融合ヒト免疫グロブリンＩｇＧ  ｋａｐｐａ定常領域をｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターにクローンし、重鎖可変領域配列（ＶＨ）融合ヒトＩｇＧ１定常領域をｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターにクローンし、それぞれ抗体を生産して精製した。
【００７６】
実施例１０  組換え完全ヒト化抗体の発現および精製
組換え抗体タンパク質の発現および精製は、以下のステップを行う。
【００７７】
（１）密度（５〜６）×１０６細胞／ｍｌのＥｘｐｉＣＨＯ細胞を、ＥｘｐｉＣＨＯ発現培地を用いて培養し、その後、ＥｘｐｉＣＨＯトランスフェクションキットを用いてＥｘｐｉＣＨＯ細胞に等量の重鎖ベクターおよび軽鎖ベクターをトランスフェクションし、ベクターＤＮＡの最終濃度が１．０μｇ／ｍｌであり、トランスフェクションした細胞を、１２５ｒｐｍの振とうフラスコ、８％の二酸化炭素、３７℃のインキュベータに培養し、トランスフェクションしてから１８〜２２時間後に、ＥｘｐｉＣＨＯ培地を加えた。
【００７８】
（２）１０日目に細胞混合培養物を収集した。遠心により富化した細胞培養液（ＨＣＣＦ、Ｈａｒｖｅｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｆｌｕｉｄ）を取得した後、ＨＣＣＦをｒＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（Ｇ．Ｅ．Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に加え、ＰＢＳで洗浄した。２０ｍｍのクエン酸を含む溶液（ｐＨ３．２）でＩｇＧ抗体を溶出した。最後に、溶出された抗体をタンパク質で中和した後、−８０℃に貯蔵して長期間使用し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ、ＴＯＳＯＨ）により産生された抗体を分析し、純度を確定した。
【００７９】
実施例１１  精製されたヒト化抗体の結合特性
（Ｉ）ＥＬＩＳＡによるヒトＣＤ１９タンパク質との結合
【００８０】
実施例４に係る方法に基づき、０．５μｇ／ｍｌのｈＣＤ１９−Ｈｉｓをコーティングしてインキュベートし、連続的に段階希釈された完全ヒト化抗体を加えてインキュベートされた抗原と結合した。ＨＲＰにより標識されたヤギ抗ヒトＦｃ抗体を用いて各抗体の結合シグナルを検出することができ、結果は図５および表６に示すように、具体的には以下のとおりである。
【００８１】
【表６】
2021514930.tif 000011
図５および表６から見られるように、各抗体のＥＣ５０は約２〜８ｎｇ／ｍｌであり、抗体の結合親和性が非常に高いことを示した。
【００８２】
（ＩＩ）フローサイトメトリＦＡＣＳによる抗体とＮａｌｍ６細胞との結合の検出
実施例６に係る方法に基づき、対数増殖期にあるＮａｌｍ６細胞を収集し、遠心してＰＢＳで再懸濁して希釈し、細胞密度が１０５／１００μｌ／穴であり、希釈された完全ヒト化抗体を加えて４℃で１ｈインキュベートした。フローサイトメーター洗浄緩衝液で細胞を３回洗浄した後、抗ヒトＩｇＧ−Ｃｙ５（Ａｂｃａｍ、Ｃａｔ＃ａｂ９７１７２）を加えて４℃で１ｈインキュベートし、フローサイトメーター洗浄緩衝液で細胞を３回洗浄し、フローサイトメーターでサンプルを分析し、結果は図６および表７に示すように、具体的には以下のとおりである。
【００８３】
【表７】
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【００８４】
図６および表７から見られるように、これらの完全ヒト化抗体１１Ｈ８、１５Ｆ２、１７Ｂ６、２７Ｆ１１、３１Ａ２および５２Ｆ９は、Ｎａｌｍ６細胞が発現するＣＤ１９と用量依存的に結合し、１７Ｂ６は最も高い結合シグナルを有した。
【００８５】
実施例１２  完全ヒト化ＣＤ１９抗体の配列によるキメラ抗原受容体のＴ細胞の構築
（Ｉ）キメラ抗原受容体分子ベクターの構築
遺伝子合成、分子クローン等の手段により、抗ＣＤ１９完全ヒト化モノクローナル抗体ＳＣＦＶの配列（表１に示すような抗体の配列）をそれぞれ嵌合したｐＵＣ５７−ＣＡＲ１９ＳＣＦＶ（ここで、対照グループがＦＭＣ６３である）を取得し、ＣＡＲ分子構造は図７に示すとおりである。
【００８６】
エンドヌクレアーゼＰｍｅＩおよびＳｐｅＩにより、得られたｐＵＣ５７−ＣＡＲの１９ＳＣＦＶプラスミドを酵素切断し、ＣＡＲの１９ＳＣＦＶ遺伝子を取得した後、ＣＡＲの１９ＳＣＦＶ遺伝子をレンチウイルスベクターｐＷＰＸＬｄ（ＧＦＰ遺伝子を含む）に連結し、ｐＷＰＸＬｄ−ＣＡＲの１９ＳＣＦＶ−ＧＦＰを構築した。
【００８７】
（ＩＩ）キメラ抗原受容体のＴ細胞のトランスフェクション
ウイルスベクター形質導入法、トランスポゾン系に基づく電気的形質転換法、およびリポソームにより媒介されるプラスミドトランスフェクション等の態様により、キメラ抗原受容体分子コード遺伝子を組み込み、または免疫細胞をトランスフェクションし、その後、これらの免疫系は、ベクタープロモーターの駆動下で該遺伝子を発現し、ＣＡＲ分子受容体を免疫細胞の表面に発現させ、ここで採用するレンチウイルスによるＴ細胞を形質導入する方法は、具体的には以下のとおりである。
【００８８】
（１）１５０ｍｍのシャーレにおいて、対数増殖期にある２９３Ｔ細胞を培養し、密度が８０〜９０％に達すると（培地は、ＤＭＥＭ高グルコース培地＋１０％のＦＢＳ（ウシ胎仔血清）＋１％の二重抗体（１００×ペニシリン−ストレプトマイシンの混合溶液）である）、培地をＤＭＥＭ高グルコース培地＋１％のＦＢＳ＋１％の二重抗体に交換し、２〜６時間後に、ＰＥＩを用いてｐＷＰＸＬｄ−ＣＡＲ−ＧＦＰまたは対照プラスミドｐＷＰＸＬｄ−ＧＦＰ、ｐＭＤ２．ＧおよびｐｓＰＡＸ２という３つのプラスミドを２９３Ｔ細胞に共形質転換し、形質転換してから２４、４８および７２時間後に、培地の上清を収集し、新鮮な培地（ＤＭＥＭ高グルコース培地＋１％のＦＢＳ＋１％の二重抗体）を加え、培地の上清の収集が終了した後、０．４５ｕＭのＰＶＤＦ濾過膜で濾過し、細胞残屑を除去し、４℃の冷蔵庫に配置して使用に用意した。
【００８９】
（２）Ｔ細胞の分離精製：Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配法により、血液内の単核細胞を分離し、赤血球分離液により赤血球を分離して除去した後、また、ＭＡＣＳ  Ｐａｎ−Ｔ磁気ビーズによりＴ細胞を選別し、選別されたＴ細胞を、培地ＡＩＭ−Ｖ＋５％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンで濃度２．５×１０６個／ｍｌに希釈して使用に用意した。ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８抗体を被覆した磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）によりＴ細胞を刺激し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉにより提供されたｐｒｏｔｏｃｏｌに基づいて刺激し、すなわち、磁気ビーズとＴ細胞との割合が１：２であり、Ｔ細胞の密度が５×１０６個／ｍｌ／ｃｍ２であり、Ｔ細胞を、３７℃で５％のＣＯ２のインキュベータにおいて４８ｈ培養して刺激した。
【００９０】
（３）Ｔ細胞のレンチウイルストランスフェクション：活性化されたＴ細胞内の磁気ビーズを磁界作用により除去し、３００ｇで５ｍｉｎ遠心し、上清を除去し、新鮮な培地で再懸濁し、ＣＡＲベクターレンチウイルス、８μｇ／ｍｌのｐｏｌｙｂｒｅｎｅ、および３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２をそれぞれ加え、ウイルス添加量がＭＯＩ＝１０であった。３７℃で５％のＣＯ２のインキュベータで２４ｈ培養した後、３００ｇで５ｍｉｎ遠心し、上清を除去し、３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む新鮮な培地で再懸濁し、３７Ｃで５％のＣＯ２のインキュベータで培養した。
【００９１】
（４）ＣＡＲのＴ細胞の増殖：ＣＡＲのＴ細胞の密度を１×１０６個／ｍｌ程度に維持し、２〜３日ごとに半量の液交換を１回行った。２週間後に、Ｔ細胞数は１００倍増殖でき、ＧＦＰ陽性の細胞はトランスフェクションが成功したＣＡＲのＴ細胞であり、ＧＦＰ陽性の割合は、フローサイトメーターにより検出され、すなわち、ＣＡＲのＴ細胞または対照Ｔ細胞の割合が得られた。
【００９２】
実施例１３  完全ヒト化抗体ＣＡＲのＴ細胞が腫瘍細胞を体外で特異的殺傷する試験
（１）実施例１２で調製された抗ＣＤ１９完全ヒト化ＣＡＲＴ（異なるＳＣＦＶ配列１５Ｆ２、１７Ｂ６、２７Ｆ１１、３１Ａ２、１１Ｈ８、３１Ａ２、５２Ｆ９）、ＦＭＣ６３（マウス由来）ＣＡＲＴ、および野生型Ｔ細胞を、異なる割合で１×１０４の腫瘍細胞と混合し、９６穴Ｕ字状プレートに加え、グループごとに３つの穴を設け、且つ腫瘍細胞を単独に加えるグループを陽性対照として設け、２５０ｇで５ｍｉｎ遠心した後、３７℃で５％のＣＯ２のインキュベータに置いて１８ｈ共培養した。
（２）ルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）定量殺傷効率の検出：ＣＡＲのＴ細胞と腫瘍細胞とを共培養し、または腫瘍細胞を単独に１８時間培養した後、９６穴細胞培養プレートに１００μｌ／穴のルシフェラーゼ基質（１×）を加え、細胞を再懸濁して均一に混合し、直ちに多機能マイクロプレートリーダによりＲＬＵ（ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔ）を測定し、測定時間を１秒とした。殺傷割合の計算式は、１００％×（対照穴の読み取り値−実験穴の読み取り値）／対照穴の読み取り値（細胞が添加されないブランクグループの読み取り値を無視してもよい）であった。
【００９３】
抗ＣＤ１９完全ヒト化ＣＡＲのＴ細胞（異なるＳＣＦＶ配列のもの）、ＦＭＣ６３ＣＡＲＴ、および野生型Ｔ細胞の、ＣＤ１９抗原を発現した腫瘍細胞に対する認識殺傷機能を体外で比較する場合、腫瘍細胞はＲＡＪＩ−ＧＬ細胞系およびＮＡＬＭ６−ＧＬ（ルシフェラーゼ遺伝子Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）を選択し、結果は図８〜図１１に示すとおりである。結果により、ＧＦＰ−Ｔ野生型Ｔ細胞と比べ、１１Ｈ８、１５Ｆ２、１７Ｂ６、２７Ｆ１１、３１Ａ２のＳｃＦｖを発現したＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ１９陽性標的細胞に対して強い体外認識および殺傷能力を有し、且つ、殺傷レベルは基本的にマウス由来のＦＭＣ６３ＳｃＦｖＣＡＲ−Ｔ細胞以上であることを示した。
【００９４】
抗ＣＤ１９完全ヒト化ＣＡＲのＴ細胞（異なるＳＣＦＶ配列のもの）、ＦＭＣ６３ＣＡＲＴ、および野生型Ｔ細胞の、ＣＤ１９抗原を発現しない腫瘍細胞に対する認識殺傷機能（ＣＡＲのＴ細胞安全性試験）を体外で比較する場合、腫瘍細胞はＣＤ１９抗原を発現しない急性骨髄性白血病細胞系ＡＭＬ３、肺癌細胞系Ａ５４９−ＧＬ、Ｈ４６０−ＧＬ、胃癌細胞系ＭＫＮ２８、ＳＮＵ１、肝癌細胞系ＳＭＭＣ、およびＨｅｐＧ２を選択し、結果は図１２〜図２０に示すとおりである。結果により、ＧＦＰ−Ｔ野生型Ｔ細胞と比べ、抗ＣＤ１９完全ヒト化ＳｃＦｖを発現したＣＡＲ−Ｔ細胞は、試験されたＣＤ１９陰性標的細胞に対してほぼ特異的認識および殺傷作用を有しないことを示した。
【００９５】
以上をまとめ、本発明におけるＣＤ１９抗原認識結合ドメインは、ヒト化改造を経て、腫瘍細胞標的抗原に対する認識能力に影響しないとともに、異種免疫拒絶の発生確率を低減する可能性があり、ＣＡＲ−Ｔ細胞の人体における持続時間を延長し、腫瘍細胞に対する免疫監視能力を強化し、腫瘍の再発率を低減し、患者の完全寛解期も対応して延長することができる。
【００９６】
本発明は、上記実施例により本発明の製品、用途およびその使用形態を説明したが、本発明は上記詳細な用途および使用形態に限定されず、すなわち、本発明が上記詳細な用途および使用形態に依存しなければ実施できないことを意味するものではないことを出願人より声明する。当業者であれば、本発明に対するいかなる改良、本発明の製品の各原料に対する等価的な置換および補助成分の追加、具体的な形態の選択等は、全て本発明の保護範囲および開示範囲内に含まれることを理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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