(57)【要約】本開示は、抗体に増加した血清半減期を付与することができるバリアントＪ鎖及び／またはバリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を提供する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
５つの二価抗体の結合ユニットまたはそのバリアントもしくは断片及びバリアントＪ鎖またはその機能断片を含む、増強された血清半減期を有するＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体であって、
各結合ユニットが、各々が抗原結合ドメインまたはそのサブユニットと会合している２つのＩｇＭ重鎖定常領域またはその多量体化断片もしくはバリアントを含み、
前記バリアントＪ鎖またはその機能断片が、参照Ｊ鎖と比較して１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を含み、前記参照Ｊ鎖が、前記１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて前記バリアントＪ鎖と同一であり、前記バリアントＪ鎖が、前記ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の血清半減期に影響を及ぼすことができ、
前記バリアントＪ鎖における前記１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて同一でありかつ同一の動物種に同様に投与される参照ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体と比較して、前記ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体が、対象動物に投与された際に、増加した血清半減期を示す、
前記ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項２】
前記バリアントＪ鎖またはその機能断片が、前記参照Ｊ鎖と比較して１つ、２つ、３つ、または４つの単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を含む、請求項１に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項３】
前記バリアントＪ鎖またはその機能断片が、野生型ヒトＪ鎖（配列番号２）のアミノ酸Ｙ１０２に対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含む、請求項１または請求項２に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項４】
配列番号２のＹ１０２に対応するアミノ酸が、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、またはアルギニン（Ｒ）で置換されている、請求項３に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項５】
配列番号２のＹ１０２に対応するアミノ酸が、アラニン（Ａ）で置換されている、請求項４に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項６】
前記Ｊ鎖が、バリアントヒトＪ鎖であり、かつ配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項７】
配列番号２のＹ１０２に対応するアミノ酸が、セリン（Ｓ）で置換されている、請求項４に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項８】
前記Ｊ鎖が、バリアントヒトＪ鎖であり、かつ配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項９】
配列番号２のＹ１０２に対応するアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）で置換されている、請求項４に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項１０】
前記Ｊ鎖が、バリアントヒトＪ鎖であり、かつ配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項１１】
前記バリアントＪ鎖またはその機能断片が、野生型ヒトＪ鎖（配列番号２）のアミノ酸Ｔ１０３に対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含む、請求項１または請求項２に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項１２】
配列番号２のＴ１０３に対応するアミノ酸が、アラニン（Ａ）で置換されている、請求項１１に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項１３】
前記Ｊ鎖が、バリアントヒトＪ鎖であり、かつ配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項１４】
前記バリアントＪ鎖またはその機能断片が、ヒトＪ鎖（配列番号２）のアミノ酸Ｎ４９またはアミノ酸Ｓ５１に対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含み、Ｓ５１がトレオニン（Ｔ）で置換されていないか、または前記バリアントＪ鎖が、ヒトＪ鎖（配列番号２）のアミノ酸Ｎ４９及びＳ５１の両方に対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含む、請求項１または請求項２に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項１５】
配列番号２のＮ４９に対応する位置が、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換されている、請求項１４に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項１６】
配列番号２のＮ４９に対応する位置が、アラニン（Ａ）で置換されている、請求項１５に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項１７】
前記Ｊ鎖が、バリアントヒトＪ鎖であり、かつ配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項１８】
配列番号２のＳ５１に対応する位置が、アラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）で置換されている、請求項１４に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項１９】
配列番号２のＳ５１に対応する位置が、アラニン（Ａ）で置換されている、請求項１８に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項２０】
前記Ｊ鎖が、バリアントヒトＪ鎖であり、かつ配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項２１】
前記ＩｇＭ重鎖定常領域またはその多量体化断片が、参照ＩｇＭ重鎖定常領域と比較して１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を含むバリアントＩｇＭ重鎖定常領域であり、前記参照ＩｇＭ重鎖定常領域が、前記１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域と同一であり、
前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域が、前記ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の血清半減期に影響を及ぼすことができ、
前記ＩｇＭ重鎖定常領域における前記１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて同一でありかつ同一の動物種に同様に投与される参照ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体と比較して、前記ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体が、対象動物に投与された際に、更に増加した血清半減期を示す、
請求項１〜２０のいずれか一項に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項２２】
前記血清半減期の更なる増加が相加的である、請求項２１に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項２３】
５つまたは６つの二価抗体の結合ユニットまたはそのバリアントもしくは断片を含む、増強された血清半減期を有するＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体であって、
各結合ユニットが、各々が抗原結合ドメインまたはそのサブユニットと会合している２つのバリアントＩｇＭ重鎖定常領域またはその多量体化断片を含み、
前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域またはその多量体化断片が、それぞれ、参照ＩｇＭ重鎖定常領域と比較して１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を含み、前記参照ＩｇＭ重鎖定常領域が、前記１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域と同一であり、前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域が、前記ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の血清半減期に影響を及ぼすことができ、
前記ＩｇＭ重鎖定常領域における前記１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて同一でありかつ同一の動物種に同様に投与される参照ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体と比較して、前記ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体が、対象動物に投与された際に、増加した血清半減期を示す、
ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項２４】
前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域が、前記参照ＩｇＭ重鎖定常領域と比較して１つ、２つ、３つ、または４つの単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項２５】
前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域が、野生型ヒトＩｇＭ定常領域である配列番号１２のアミノ酸Ｒ３４４に対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項２６】
配列番号１２のＲ３４４に対応するアミノ酸が、アラニン（Ａ）で置換されている、請求項２５に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項２７】
前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域が、バリアントヒトＩｇＭ重鎖定常領域であり、配列番号３１のアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項２８】
前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域が、野生型ヒトＩｇＭ定常領域である配列番号１２のアミノ酸Ｅ３４５に対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項２９】
配列番号１２のＥ３４５に対応するアミノ酸が、アラニン（Ａ）で置換されている、請求項２８に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項３０】
前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域が、バリアントヒトＩｇＭ重鎖定常領域であり、配列番号３２のアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項３１】
前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域が、野生型ヒトＩｇＭ定常領域である配列番号１２のアミノ酸Ｓ４０１に対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項３２】
配列番号１２のＳ４０１に対応するアミノ酸が、アラニン（Ａ）で置換されている、請求項３１に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項３３】
前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域が、バリアントヒトＩｇＭ重鎖定常領域であり、かつ配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項３４】
前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域が、野生型ヒトＩｇＭ定常領域である配列番号１２のアミノ酸Ｅ４０２に対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項３５】
配列番号１２のＥ４０２に対応するアミノ酸が、アラニン（Ａ）で置換されている、請求項３４に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項３６】
前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域が、バリアントヒトＩｇＭ重鎖定常領域であり、かつ配列番号１４のアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項３７】
前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域が、野生型ヒトＩｇＭ定常領域である配列番号１２のアミノ酸Ｅ４０３に対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項３８】
配列番号１２のＥ４０３に対応するアミノ酸が、アラニン（Ａ）で置換されている、請求項３７に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項３９】
前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域がバリアントヒトＩｇＭ重鎖定常領域であり、かつ配列番号３４のアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項４０】
前記増加した血清半減期が、増加したアルファ半減期（ｔ１／２α）、増加したベータ半減期（ｔ１／２β）、または増加したｔ１／２α及び増加したｔ１／２βを含む、請求項１〜３９のいずれか一項に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項４１】
前記参照抗体と比較して、増加したピーク血漿濃度（Ｃｍａｘ）、増加した曲線下面積（ＡＵＣ）、改変されたクリアランス時間、またはそれらの任意の組み合わせを更に示す、請求項１〜４０のいずれか一項に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項４２】
前記ＩｇＭ重鎖定常領域またはその多量体化断片もしくはバリアントが、それぞれ、Ｃμ４ドメイン及びＩｇＭ尾部（ｔｐ）ドメインを含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項４３】
前記ＩｇＭ重鎖定常領域またはその多量体化断片もしくはバリアントが、それぞれ、Ｃμ３ドメイン、Ｃμ２ドメイン、Ｃμ１ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを更に含む、請求項４２に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項４４】
前記抗原結合ドメインが、単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）断片または単一ドメイン可変領域（ＶＨＨ）を含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項４５】
前記抗原結合ドメインのサブユニットが重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項４６】
各結合ユニットが、各々が抗原結合ドメインまたはそのサブユニットと会合している２つの軽鎖定常領域またはその断片もしくはバリアントを更に含む、請求項１〜４５のいずれか一項に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項４７】
前記軽鎖定常領域が、カッパもしくはラムダ軽鎖定常領域またはそれらの断片もしくはバリアントであり、抗原結合ドメインがＳｃＦｖ断片を含むか、または前記抗原結合ドメインのサブユニットが軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項４６に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項４８】
前記Ｊ鎖またはその機能的断片もしくはバリアントが、直接または間接的に前記Ｊ鎖またはその機能的断片もしくはバリアントに融合された１つまたはそれ以上の異種ポリペプチドを更に含む、請求項１〜４７のいずれか一項に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項４９】
前記１つまたはそれ以上の異種ポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記Ｊ鎖またはその断片に融合されている、請求項４８に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項５０】
前記ペプチドリンカーが、少なくとも５アミノ酸であるが２５アミノ酸以下を含む、請求項４９に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項５１】
前記ペプチドリンカーが、
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からなる、請求項５０に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項５２】
前記１つまたはそれ以上の異種ポリペプチドが、前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントのＮ末端に融合されているか、前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントのＣ末端に融合されているか、または異種ポリペプチドが、前記Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントのＮ末端及びＣ末端の両方に融合されており、前記異種ポリペプチドが、同一であるか、または異なり得る、請求項４８〜５１に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項５３】
少なくとも１つの異種ポリペプチドが結合ドメインを含む、請求項４８〜５２のいずれか一項に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項５４】
前記異種ポリペプチドの前記結合ドメインが、抗体またはその抗原結合断片である、請求項５３に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項５５】
前記抗原結合断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ´断片、Ｆ（ａｂ´）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項５４に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項５６】
前記抗原結合断片がｓｃＦｖ断片である、請求項５５に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項５７】
少なくとも１つの異種ポリペプチドが、ＣＤ３εに特異的に結合することができる、請求項５３〜５６のいずれか一項に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項５８】
前記Ｊ鎖が配列番号９の改変Ｊ鎖（Ｖ１５Ｊ）のバリアントである、請求項５７に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項５９】
前記改変Ｊ鎖が配列番号１０（Ｖ１５Ｊ−Ｙ１０２Ａ）のアミノ酸配列を含む、請求項５８に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項６０】
前記改変Ｊ鎖が配列番号２３（Ｖ１５Ｊ−Ｔ１０３Ａ）のアミノ酸配列を含む、請求項５８に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項６１】
前記改変Ｊ鎖が配列番号２４（Ｖ１５Ｊ−Ｎ４９Ａ）のアミノ酸配列を含む、請求項５８に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体。
【請求項６２】
請求項１〜６１のいずれか一項に記載のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体及び薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項６３】
参照Ｊ鎖と比較して１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を含むバリアントＪ鎖またはその機能断片であって、前記参照Ｊ鎖が前記１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて前記バリアントＪ鎖と同一であり、前記バリアントＪ鎖が、前記バリアントＪ鎖を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の血清半減期に影響を及ぼすことができる、前記バリアントＪ鎖またはその機能断片。
【請求項６４】
配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号２３、配列番号２４のアミノ酸配列、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項６３に記載のバリアントＪ鎖。
【請求項６５】
請求項１〜６１のいずれか一項に記載のＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体のサブユニットポリペプチドをコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記サブユニットポリペプチドが、（ａ）ＩｇＭもしくはＩｇＭ様重鎖定常領域またはそれらの多量体化断片、（ｂ）抗体軽鎖、または（ｃ）Ｊ鎖、改変Ｊ鎖、またはそれらの機能断片もしくはバリアント、または（ｄ）それらの任意の組み合わせを含む、前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項６６】
前記サブユニットポリペプチドが、ＩｇＭまたはＩｇＭ様重鎖定常領域もしくはその多量体化断片を含む、請求項６５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６７】
前記サブユニットポリペプチドが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号３１、配列番号３２、または配列番号３４のアミノ酸配列を含む、請求項６６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６８】
前記サブユニットポリペプチドが抗体軽鎖を含む、請求項６５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６９】
前記サブユニットポリペプチドが、Ｊ鎖、改変Ｊ鎖、またはそれらの任意の機能的断片もしくはバリアントを含む、請求項６５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７０】
前記サブユニットが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号２３、または配列番号２４のアミノ酸配列を含む、請求項６９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７１】
２種、３種、またはそれ以上のサブユニットポリペプチドをコードする２種、３種、またはそれ以上の核酸配列を含む、請求項６５〜７０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７２】
請求項６５〜７１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項７３】
請求項６５〜７１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項７２に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項７４】
バリアントＪ鎖を含む五量体ＩｇＭ抗体または五量体ＩｇＭ様抗体の血清半減期を増加させることができる前記バリアントＪ鎖を同定する方法であって、
（ａ）バリアントＪ鎖またはその断片を含む五量体ＩｇＭ抗体または五量体ＩｇＭ様抗体を、参照五量体ＩｇＭ抗体または五量体ＩｇＭ様抗体と比較して対象動物において増加した血清半減期について試験する工程であって、前記バリアントＪ鎖またはその断片が、既定のアミノ酸挿入、欠失、または置換を含み、前記参照五量体ＩｇＭ抗体または五量体ＩｇＭ様抗体が、前記既定のアミノ酸挿入、欠失、または置換を除いて前記バリアントＪ鎖と同一のＪ鎖またはその断片を含む、試験する工程と、
（ｂ）前記五量体ＩｇＭ抗体または五量体ＩｇＭ様抗体に、参照五量体ＩｇＭ抗体または五量体ＩｇＭ様抗体と比較して増加した血清半減期を付与するバリアントＪ鎖またはその断片を回収する工程と
を含む、前記方法。
【請求項７５】
バリアントＪ鎖を含む五量体ＩｇＭ抗体または五量体ＩｇＭ様抗体の血清半減期を増加させることができる前記バリアントＪ鎖を同定する方法であって、
（ａ）バリアントＪ鎖またはその断片を含む五量体ＩｇＭ抗体または五量体ＩｇＭ様抗体を、それらのＦｃアルファ−ミュー受容体（ＦｃαμＲ）、多量体Ｉｇ受容体（ｐＩｇＲ）、またはＦｃαμＲ及びｐＩｇＲの両方への結合レベルについて試験する工程であって、前記バリアントＪ鎖またはその断片が既定のアミノ酸挿入、欠失、または置換を含む、試験する工程と、
（ｂ）前記既定のアミノ酸挿入、欠失、または置換を除いて前記バリアントＪ鎖と同一のＪ鎖またはその断片を含む参照五量体ＩｇＭ抗体または五量体ＩｇＭ様抗体と比較して減少したＦｃαμＲ結合能、減少したｐＩｇＲ結合能、または減少したＦｃαμＲ及びｐＩｇＲ結合能を、前記五量体ＩｇＭ抗体または五量体ＩｇＭ様抗体に付与するバリアントＪ鎖またはその断片を回収する工程と
を含む、前記方法。
【請求項７６】
回収されたバリアントＪ鎖またはその断片を含む五量体ＩｇＭ抗体または五量体ＩｇＭ様抗体を、前記既定のアミノ酸挿入、欠失、または置換を除いて回収されたバリアントＪ鎖またはその断片と同一のＪ鎖またはその断片を含む参照五量体ＩｇＭ抗体または五量体ＩｇＭ様抗体と比較して対象動物において増加した血清半減期について試験する工程を更に含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の血清半減期を増加させることができる前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を同定する方法であって、
（ａ）バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を、参照５量体ＩｇＭ抗体または５量体ＩｇＭ様抗体と比較して対象動物において増加した血清半減期について試験する工程であって、前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域が、既定のアミノ酸挿入、欠失、または置換を含み、前記参照ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体が、前記既定のアミノ酸挿入、欠失、または置換を除いて前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域と同じＩｇＭ重鎖定常領域を含む、試験する工程と、
（ｂ）バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体に、前記参照ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体と比較して増加した血清半減期を付与する前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含む前記ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を回収する工程と
を含む、前記方法。
【請求項７８】
バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の血清半減期を増加させることができる前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を同定する方法であって、
（ａ）バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を、それらのＦｃアルファ−ミュー受容体（ＦｃαμＲ）、Ｆｃミュー受容体（ＦｃμＲ）、多量体Ｉｇ受容体（ｐＩｇＲ）、前記受容体の任意の２つの組み合わせ、または前記受容体の３つ全てへの結合レベルについて試験する工程であって、前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域が、既定のアミノ酸挿入、欠失、または置換を含む、試験する工程と、
（ｂ）前記既定のアミノ酸挿入、欠失、または置換を除いて前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域と同一のＩｇＭ重鎖定常領域を含む参照ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体と比較して、減少したＦｃαμＲ結合能、減少したＦｃμＲ結合能、減少したｐＩｇＲ結合能、前記受容体の任意の２つへの減少した結合能、または前記受容体の３つ全てへの減少した結合能を、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体に付与する前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含む前記ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を回収する工程と
を含む、前記方法。
【請求項７９】
前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含む回収されたＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を、前記既定のアミノ酸挿入、欠失、または置換を除いて前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域と同一のＩｇＭ重鎖定常領域を含む参照ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体と比較して対象動物において増加した血清半減期について試験する工程を更に含む、請求項７８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年３月１日に出願の米国仮特許出願番号第６２／６３７，１８６号の利益を主張し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
電子的に提出された配列表の参照
本出願と共に提出されたＡＳＣＩＩテキストファイル（名称「０９７８９−０１２ＷＯ１−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｌｉｓｔｉｎｇ」；サイズ：９８，０４８バイト；及び作成日付：２０１９年２月２８日）の電子的に提出された配列表の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
背景
ＩｇＡ及びＩｇＭ抗体などの多量体化することができる抗体及び抗体様分子は、特異性の改善、結合活性の改善、及び複数の結合標的に結合する能力を可能にし、例えば、免疫腫瘍学及び感染性疾患の分野における有望な候補薬として出現してきた。例えば、米国特許第９，９５１，１３４号及び同９，９３８，３４７号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／１４１３０３号、同ＷＯ２０１６／１５４５９３号、同ＷＯ２０１６／１６８７５８号、同ＷＯ２０１７／０５９３８７号、同ＷＯ２０１７／０５９３８０号、同ＷＯ２０１８／０１７８８８号、同ＷＯ２０１８／０１７７６３号、同ＷＯ２０１８／０１７８８９号、及び同ＷＯ２０１８／０１７７６１号（特許文献１〜１１）を参照のこと。これらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００４】
しかしながら、多価抗体の薬物動態学（ＰＫ）及び薬力学（ＰＤ）は複雑であり、モノクローナル抗体の構造及びそれが標的とする生理学的システムの両方に依存する。更に異なる抗体クラスは、通常、異なる細胞システム及び生理学的システムにより対象内で処理される。例えば、ＩｇＧ抗体クラスは２０日の血清半減期を最も有するが、ＩｇＭ及びＩｇＡ抗体の半減期は、わずか約５〜８日である。Ｂｒｅｋｋｅ，ＯＨ．，ａｎｄ  Ｉ．Ｓａｎｄｌｉｅ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２：５２−６２（２００３）（非特許文献１）。
【０００５】
抗体分子は、インビボで血中の様々な細胞または異なる組織及び臓器の種々の受容体に結合し得る。これらの受容体への結合は、治療抗体の生物学的利用能及び体内分布ならびに関心対象の標的に到達するそれらの能力に影響を与え得る。例えば、ＩｇＧアイソタイプの抗体は、リサイクルを行う新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）の結合により長いインビボ半減期を有することが公知である。しかしながら、ＩｇＡ及びＩｇＭアイソタイプ抗体は、この重要なリサイクリング受容体に結合しない。ＩｇＭアイソタイプの抗体は、Ｆｃμ受容体（ＦｃμＲ）、Ｆｃα／μ受容体（ＦｃαμＲ）、及び多量体Ｉｇ受容体（ｐＩｇＲ）に結合することが公知である。Ｊ鎖を有するＩｇＭ抗体及びＪ鎖を有さないＩｇＭ抗体はＦｃμＲに結合するが（Ｋｕｂａｇａｗａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０８：２５−４５  （２０１７）（非特許文献２））、Ｊ鎖残基は少なくともＩｇＭ抗体のＦｃαμＲへの結合に寄与し（Ｇｈｕｍｒａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３９：１１４７−１１５６（２００９）（非特許文献３））、ＩｇＭのｐＩｇＲへの結合はＪ鎖依存的である（Ｂｒａａｔｈｅｎ  Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７８：１５８９−１５９７  （２００７）（非特許文献４））。ｐＩｇＲは、ＩｇＭ及びＩｇＡの腸管腔、唾液腺、及び涙腺への輸送を担う（例えば、Ｂｒａａｔｈｅｎ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４２７５５−４２７６２（２００２）（非特許文献５）を参照のこと）。ＦｃαμＲは、Ｂ細胞及び食細胞による異物に結合した抗体の取込みを担う（Ａｋｕｌａ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０８：１−２３（２０１７）（非特許文献６））。ＦｃμＲは、Ｂ細胞発生に重要である（Ｎｇｕｙｅｎ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：３２１−３３３（２０１７）（非特許文献７））。本発明者らは、ＩｇＭのこれらの受容体のうちの１つまたはそれ以上との相互作用がＰＫ／ＰＤに影響を及ぼし得ると仮定した。
【０００６】
Ｊ鎖は１５ｋＤａの酸性ポリペプチドであり、これは、ＩｇＭのμ重鎖またはＩｇＡのα重鎖のＣ末端の１８アミノ酸の分泌型尾部（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｔａｉｌｐｉｅｃｅ、ｔｐ）における最後から２番目のシステイン残基が関与するジスルフィド結合を介して五量体ＩｇＭ及び二量体ＩｇＡと会合する。前駆ヒトＪ鎖アミノ酸配列は配列番号１として示され、成熟ヒトＪ鎖アミノ酸配列は配列番号２として示される。ＩｇＭ結合ユニットの五量体構造へのアセンブリは、ＩｇＭ定常領域のＣμ４ドメイン及び尾部ドメインを必要とすると考えられる。例えば、Ｂｒａａｔｈｅｎ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４２７５５−４２７６２（２００２）（非特許文献５）を参照のこと。
【０００７】
多量体抗体の設計においてなされた前進にもかかわらず、これらの分子の薬物動態学的特性及び薬力学的特性を操作できることが依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第９，９５１，１３４号
【特許文献２】米国特許第９，９３８，３４７号
【特許文献３】ＷＯ２０１６／１４１３０３号
【特許文献４】ＷＯ２０１６／１５４５９３号
【特許文献５】ＷＯ２０１６／１６８７５８号
【特許文献６】ＷＯ２０１７／０５９３８７号
【特許文献７】ＷＯ２０１７／０５９３８０号
【特許文献８】ＷＯ２０１８／０１７８８８号
【特許文献９】ＷＯ２０１８／０１７７６３号
【特許文献１０】ＷＯ２０１８／０１７８８９号
【特許文献１１】ＷＯ２０１８／０１７７６１号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂｒｅｋｋｅ，ＯＨ．，ａｎｄ  Ｉ．Ｓａｎｄｌｉｅ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２：５２−６２（２００３）
【非特許文献２】Ｋｕｂａｇａｗａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０８：２５−４５  （２０１７）
【非特許文献３】Ｇｈｕｍｒａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３９：１１４７−１１５６（２００９）
【非特許文献４】Ｂｒａａｔｈｅｎ  Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７８：１５８９−１５９７  （２００７）
【非特許文献５】Ｂｒａａｔｈｅｎ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４２７５５−４２７６２（２００２）
【非特許文献６】Ａｋｕｌａ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０８：１−２３（２０１７）
【非特許文献７】Ｎｇｕｙｅｎ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：３２１−３３３（２０１７）
【発明の概要】
【００１０】
概要
本開示は、増強された血清半減期を有するＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を提供し、ここで、当該抗体は、５つの二価抗体の結合ユニットまたはそのバリアントまたは断片及びバリアントＪ鎖またはその機能断片を含む。提供される抗体の各結合ユニットは、各々が抗原結合ドメインまたはそのサブユニットと会合している２つのＩｇＭ重鎖定常領域またはその多量体化断片もしくはバリアントを含む。ある種の態様では、バリアントＪ鎖またはその機能断片は、１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を、当該１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いてバリアントＪ鎖と同一の参照Ｊ鎖と比較して含む。提供されるバリアントＪ鎖は、提供されるＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の血清半減期に影響を及ぼし得る。例えば、ある種の態様では、ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体は、対象動物に投与された際に、バリアントＪ鎖における１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて同一であり、同一の動物種に同様に投与される参照ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体と比較して、増加した血清半減期を示す。ある種の態様では、バリアントＪ鎖またはその機能断片は、参照Ｊ鎖と比較して１つ、２つ、３つ、または４つの単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を含む。
【００１１】
ある種の態様では、バリアントＪ鎖またはその機能断片は、野生型ヒトＪ鎖（配列番号２）のアミノ酸Ｙ１０２に対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含む。例えば、配列番号２のＹ１０２に対応するアミノ酸は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、またはアルギニン（Ｒ）で置換され得る。ある種の態様では、配列番号２のＹ１０２に対応するアミノ酸は、アラニン（Ａ）で置換される。ある種の態様では、Ｊ鎖は、バリアントヒトＪ鎖であり、配列番号３のアミノ酸配列を含む。ある種の態様では、配列番号２のＹ１０２に対応するアミノ酸は、セリン（Ｓ）で置換される。ある種の態様では、Ｊ鎖は、バリアントヒトＪ鎖であり、配列番号４のアミノ酸配列を含む。ある種の態様では、配列番号２のＹ１０２に対応するアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）で置換される。ある種の態様では、Ｊ鎖は、バリアントヒトＪ鎖であり、配列番号５のアミノ酸配列を含む。ある種の態様では、バリアントＪ鎖またはその機能断片は、野生型ヒトＪ鎖（配列番号２）のアミノ酸Ｔ１０３に対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含む。例えば、配列番号２のＴ１０３に対応するアミノ酸は、アラニン（Ａ）で置換され得る。ある種の態様では、Ｊ鎖は、バリアントヒトＪ鎖であり、配列番号６のアミノ酸配列を含む。ある種の態様では、バリアントＪ鎖またはその機能断片は、ヒトＪ鎖（配列番号２）のアミノ酸Ｎ４９またはアミノ酸Ｓ５１に対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含み、ここで、Ｓ５１はトレオニン（Ｔ）で置換されないか、またはＪ鎖はヒトＪ鎖（配列番号２）のアミノ酸Ｎ４９及びＳ５１の両方に対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含む。例えば、配列番号２のＮ４９に対応する位置は、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換され得る。ある種の態様では、配列番号２のＮ４９に対応する位置は、アラニン（Ａ）で置換される。ある種の態様では、Ｊ鎖は、バリアントヒトＪ鎖であり、配列番号７のアミノ酸配列を含む。他の例では、配列番号２のＳ５１に対応する位置は、アラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）で置換され得、例えば、配列番号２のＳ５１に対応する位置は、アラニン（Ａ）で置換される。ある種の態様では、Ｊ鎖は、バリアントヒトＪ鎖であり、配列番号８のアミノ酸配列を含む。
【００１２】
ある種の態様では、上記で提供されたバリアントＪ鎖を含むＩｇＭ抗体もしくはＩｇＭ様抗体、それらのＩｇＭ重鎖定常領域、または多量体化断片は、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域であって、１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を、当該１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて当該バリアントＩｇＭ重鎖定常領域と同一の参照ＩｇＭ重鎖定常領域と比較して含む当該バリアントＩｇＭ重鎖定常領域であり得る。これらの態様によれば、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体が対象動物に投与された際に、ＩｇＭ重鎖定常領域における１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて同一であり、同一の動物種に同様に投与される参照ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体と比較して更に増加した血清半減期を示すように、ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の血清半減期に影響を及ぼし得る。ある種の態様では、血清半減期の更なる増加は相加的である。
【００１３】
本開示は、増強された血清半減期を有するＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を更に提供し、ここで、当該ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体は、５つまたは６つの二価抗体の結合ユニットまたはそのバリアントもしくは断片を含み、各結合ユニットは、各々が抗原結合ドメインまたはそのサブユニットと会合している２つのバリアントＩｇＭ重鎖定常領域またはその多量体化断片を含む。これらの態様によれば、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域またはその多量体化断片は、それぞれ、１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を、当該１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いてバリアントＩｇＭ重鎖定常領域と同一の参照ＩｇＭ重鎖定常領域と比較して含む。また、これらの態様によれば、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の血清半減期に影響を及ぼし得る。ある種の態様では、ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体は、対象動物に投与された際に、ＩｇＭ重鎖定常領域における１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて同一であり、同一の動物種に同様に投与される参照ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体と比較して、増加した血清半減期を示す。ある種の態様では、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、参照ＩｇＭ重鎖定常領域と比較して１つ、２つ、３つ、または４つの単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を含む。
【００１４】
ある種の態様では、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、野生型ヒトＩｇＭ定常領域である配列番号１２のアミノ酸Ｒ３４４に対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含み、例えば、配列番号１２のＲ３４４に対応するアミノ酸は、アラニン（Ａ）で置換され得る。ある種の態様では、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、バリアントヒトＩｇＭ重鎖定常領域であり、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。ある種の態様では、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、野生型ヒトＩｇＭ定常領域である配列番号１２のアミノ酸Ｅ３４５に対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含み、例えば、配列番号１２のＥ３４５に対応するアミノ酸は、アラニン（Ａ）で置換され得る。ある種の態様では、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、バリアントヒトＩｇＭ重鎖定常領域であり、配列番号３２のアミノ酸配列を含む。ある種の態様では、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、野生型ヒトＩｇＭ定常領域である配列番号１２のアミノ酸Ｓ４０１に対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含み、例えば、配列番号１２のＳ４０１に対応するアミノ酸は、アラニン（Ａ）で置換され得る。ある種の態様では、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、バリアントヒトＩｇＭ重鎖定常領域であり、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。ある種の態様では、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、野生型ヒトＩｇＭ定常領域である配列番号１２のアミノ酸Ｅ４０２に対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含み、例えば、配列番号１２のＥ４０２に対応するアミノ酸は、アラニン（Ａ）で置換され得る。ある種の態様では、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、バリアントヒトＩｇＭ重鎖定常領域であり、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。ある種の態様では、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、野生型ヒトＩｇＭ定常領域である配列番号１２のアミノ酸Ｅ４０３に対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含み、例えば、配列番号１２のＥ４０３に対応するアミノ酸は、アラニン（Ａ）で置換され得る。ある種の態様では、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、バリアントヒトＩｇＭ重鎖定常領域であり、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。
【００１５】
本明細書において提供されるようなＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体において、増加した血清半減期は、増加したアルファ半減期（ｔ１／２α）、増加したベータ半減期（ｔ１／２β）、または増加したｔ１／２α及び増加したｔ１／２βを含み得る。同様に、本明細書において提供されるようなＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体は、参照抗体と比較して増加したピーク血漿濃度（Ｃｍａｘ）、増加した曲線下面積（ＡＵＣ）、改変されたクリアランス時間、またはそれらの任意の組み合わせを更に示し得る。
【００１６】
ある種の態様では、本明細書において提供されるようなＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体のＩｇＭ重鎖定常領域またはその多量体化断片もしくはバリアントは、それぞれ１つのＣμ４ドメイン及びＩｇＭの尾部（ｔｐ）ドメインを含み、１つのＣμ３ドメイン、１つのＣμ２ドメイン、１つのＣμ１ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを更に含み得る。
【００１７】
ある種の態様では、本明細書において提供されるようなＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の抗原結合ドメインは、単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）断片または単一ドメイン可変領域（ＶＨＨ）であり得る。ある種の態様では、本明細書において提供されるようなＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の抗原結合ドメインサブユニットは、重鎖可変領域（ＶＨ）であり得る。
【００１８】
ある種の態様では、本明細書において提供されるようなＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の各結合ユニットは、各々が抗原結合ドメインまたはそのサブユニットと会合している２つの軽鎖定常領域またはその断片もしくはバリアントを更に含み得、例えば、抗原結合ドメインはｓｃＦｖ断片であり得るか、または抗原結合ドメインサブユニットはＶＬであり得る。
【００１９】
ある種の態様では、本明細書において提供されるようなＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体のＪ鎖またはその機能断片もしくはバリアントは、Ｊ鎖またはその機能断片もしくはバリアントに直接または間接的に融合された１つまたはそれ以上の異種ポリペプチドを更に含み得る。ある種の態様では、１つまたはそれ以上の異種ポリペプチドは、ペプチドリンカーを介してＪ鎖またはその断片に融合され得る。例示的なリンカーは、少なくとも５アミノ酸以上２５アミノ酸以下を含み得、
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からなり得る。ある種の態様では、１つまたはそれ以上の異種ポリペプチドは、Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントのＮ末端に融合され得るか、Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントのＣ末端に融合され得るか、またはＪ鎖またはその断片もしくはバリアントのＮ末端及びＣ末端の両方に融合され得る。２つまたはそれ以上の異種ポリペプチドがＪ鎖に融合される場合、異種ポリペプチドは同一であり得るかまたは異なり得る。ある種の態様では、少なくとも１つの異種ポリペプチドは、結合ドメイン、例えば、抗体またはその抗原結合断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ´断片、Ｆ（ａｂ´）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）断片、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。ある種の態様では、抗原結合断片はｓｃＦｖ断片である。ある種の態様では、少なくとも１つの異種ポリペプチドは、ＣＤ３εに特異的に結合し得る。ある種の態様では、Ｊ鎖は、配列番号９（Ｖ１５Ｊ）の改変Ｊ鎖のバリアント、例えば、配列番号１０（Ｖ１５Ｊ−Ｙ１０２Ａ）のアミノ酸配列、配列番号２３（Ｖ１５Ｊ−Ｔ１０３Ａ）のアミノ酸配列、または配列番号２４（Ｖ１５Ｊ−Ｎ４９Ａ）のアミノ酸配列であり得る。
【００２０】
本開示は、本明細書において提供されるようなＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体及び薬学的に許容される担体を含む組成物を更に提供する。
【００２１】
本開示は、１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を、当該１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて同一である参照Ｊ鎖と比較して含むＪ鎖またはその機能断片を更に提供し、ここで、当該バリアントＪ鎖は、当該バリアントＪ鎖を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の血清半減期に影響を及ぼし得る。ある種の態様では、バリアントＪ鎖は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号２３、配列番号２４のアミノ酸配列、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００２２】
本開示は、本明細書において提供されるようなＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体のサブユニットポリペプチドをコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチドを更に提供し、当該サブユニットポリペプチドは、（ａ）ＩｇＭもしくはＩｇＭ様重鎖定常領域またはそれらの多量体化断片、（ｂ）抗体軽鎖、または（ｃ）Ｊ鎖、改変Ｊ鎖またはそれらの機能断片もしくはバリアント、または（ｄ）それらの任意の組み合わせを含む。ある種の態様では、サブユニットポリペプチドは、ＩｇＭもしくはＩｇＭ様重鎖定常領域またはそれらの多量体化断片を含み、例えば、サブユニットポリペプチドは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号３１、配列番号３２、または配列番号３４のアミノ酸配列を含み得る。ある種の態様では、サブユニットポリペプチドは抗体軽鎖を含む。ある種の態様では、サブユニットポリペプチドは、本明細書において提供されるようなＪ鎖、改変Ｊ鎖、またはそれらの任意の機能断片もしくはバリアントを含み得、例えば、サブユニットポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号２３、または配列番号２４のアミノ酸配列を含み得る。提供されるポリヌクレオチドは、２種、３種、またはそれ以上のサブユニットポリペプチドをコードする１種、２種、３種、またはそれ以上の核酸配列を含み得る。提供されるポリヌクレオチドを含む発現ベクターが更に提供される。提供されるポリヌクレオチドまたは提供される発現ベクターを含む宿主細胞が更に提供される。
【００２３】
本開示は、バリアントＪ鎖であって、当該バリアントＪ鎖を含む五量体ＩｇＭ抗体または五量体ＩｇＭ様抗体の血清半減期を増加させることができる当該バリアントＪ鎖を同定するための方法を更に提供する。上記方法は、バリアントＪ鎖またはその断片を含む五量体ＩｇＭ抗体または五量体ＩｇＭ様抗体を、参照五量体ＩｇＭ抗体または五量体ＩｇＭ様抗体と比較した対象動物における血清半減期の増加について試験することであって、当該バリアントＪ鎖またはその断片が既定のアミノ酸挿入、欠失、または置換を含み、当該参照五量体ＩｇＭ抗体または五量体ＩｇＭ様抗体が当該既定のアミノ酸挿入、欠失、または置換を除いて当該バリアントＪ鎖と同一のＪ鎖またはその断片を含む、試験することと、当該五量体ＩｇＭ抗体または五量体ＩｇＭ様抗体に、当該参照五量体ＩｇＭ抗体または五量体ＩｇＭ様抗体と比較して増加した血清半減期を付与するバリアントＪ鎖またはその断片を回収することと、を含む。
【００２４】
本開示は、バリアントＪ鎖であって、当該バリアントＪ鎖を含む五量体ＩｇＭ抗体または五量体ＩｇＭ様抗体の血清半減期を増加させることができる当該バリアントＪ鎖を同定する方法を更に提供する。上記方法は、バリアントＪ鎖またはその断片を含む五量体ＩｇＭ抗体または五量体ＩｇＭ様抗体を、それらのＦｃアルファ−ミュー受容体（ＦｃαμＲ）、多量体Ｉｇ受容体（ｐＩｇＲ）、またはＦｃαμＲ及びｐＩｇＲの両方への結合レベルについて試験することであって、当該バリアントＪ鎖またはその断片が既定のアミノ酸挿入、欠失、または置換を含む、試験することと、五量体ＩｇＭ抗体または五量体ＩｇＭ様抗体に、当該既定のアミノ酸挿入、欠失、または置換を除いて当該バリアントＪ鎖と同一のＪ鎖またはその断片を含む参照五量体ＩｇＭ抗体または五量体ＩｇＭ様抗体と比較して減少したＦｃαμＲ結合能、減少したｐＩｇＲ結合能、または減少したＦｃαμＲ及びｐＩｇＲ結合能を付与するバリアントＪ鎖またはその断片を回収することと、を含む。上記方法は、回収されたバリアントＪ鎖またはその断片を含む五量体ＩｇＭ抗体または五量体ＩｇＭ様抗体を、既定のアミノ酸挿入、欠失、または置換を除いて回収されたバリアントＪ鎖またはその断片と同一のＪ鎖またはその断片を含む参照五量体ＩｇＭ抗体または五量体ＩｇＭ様抗体と比較した対象動物における血清半減期の増加について試験することを更に含み得る。
【００２５】
本開示は、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域であって、当該バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の血清半減期を増加させることができる当該バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を同定する方法を更に提供する。上記方法は、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を、対象動物における参照五量体ＩｇＭ抗体または五量体ＩｇＭ様抗体と比較して増加した血清半減期について試験することであって、当該バリアントＩｇＭ重鎖定常領域が、既定のアミノ酸挿入、欠失、または置換を含み、当該参照ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体が、当該既定のアミノ酸挿入、欠失、または置換を除いて当該バリアントＩｇＭ重鎖定常領域と同じＩｇＭ重鎖定常領域を含む、試験することと、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体に、参照ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体と比較して増加した血清半減期を付与する当該バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含む当該ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を回収することと、を含む。
【００２６】
本開示は、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域であって、当該バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の血清半減期を増加させることができる当該バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を同定する方法を更に提供する。上記方法は、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を、それらのＦｃアルファ−ミュー受容体（ＦｃαμＲ）、Ｆｃミュー受容体（ＦｃμＲ）、多量体Ｉｇ受容体（ｐＩｇＲ）、上記受容体の任意の２つの組み合わせ、または上記受容体の３つ全てへの結合レベルについて試験することであって、当該バリアントＩｇＭ重鎖定常領域が、既定のアミノ酸挿入、欠失、または置換を含む、試験することと、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体に、当該既定のアミノ酸挿入、欠失、または置換を除いて当該バリアントＩｇＭ重鎖定常領域と同一のＩｇＭ重鎖定常領域を含む参照ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体と比較して、減少したＦｃαμＲ結合能、減少したＦｃμＲ結合能、減少したｐＩｇＲ結合能、上記受容体の任意の２つへの減少した結合能、または上記受容体の３つ全てへの減少した結合能を付与する当該バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含む当該ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を回収すること、を含む。この方法は、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含む回収されたＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を、既定のアミノ酸挿入、欠失、または置換を除いてバリアントＩｇＭ重鎖定常領域と同一のＩｇＭ重鎖定常領域を含む参照ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体と比較して、対象動物において増加した血清半減期について試験することを更に含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】ヒトＩｇＭ重鎖定常領域アミノ酸配列（配列番号１２）の、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＣ２０７０１．１、配列番号１６）、カニクイザル（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＨＨ６２２１０．１、配列番号３０）、アカゲザル（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＤ０２４２０．１、配列番号１７）、チンパンジー（ＧｅｎＢａｎｋ：ＰＮＩ１０６２２．１、配列番号１８）、及びスマトラオランウータン（ＧｅｎＢａｎｋ：ＰＮＪ０４９６８．１、配列番号１９）のものとの配列比較を示す。配列番号１２のアミノ酸Ｒ３４５、Ｅ３４６、Ｓ４０１、Ｅ４０２、及びＥ４０３に対応するアミノ酸が枠により囲まれている。
【図１Ｂ】ヒトＩｇＭ重鎖定常領域アミノ酸配列（配列番号１２）の、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＣ２０７０１．１、配列番号１６）、カニクイザル（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＨＨ６２２１０．１、配列番号３０）、アカゲザル（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＤ０２４２０．１、配列番号１７）、チンパンジー（ＧｅｎＢａｎｋ：ＰＮＩ１０６２２．１、配列番号１８）、及びスマトラオランウータン（ＧｅｎＢａｎｋ：ＰＮＪ０４９６８．１、配列番号１９）のものとの配列比較を示す。配列番号１２のアミノ酸Ｒ３４５、Ｅ３４６、Ｓ４０１、Ｅ４０２、及びＥ４０３に対応するアミノ酸が枠により囲まれている。
【図２】ＥＬＩＳＡにより測定された、Ｊ鎖及び／またはＩｇＭ重鎖定常領域において様々な変異を含む抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性ＩＧＭへのヒト及びマウス免疫グロブリン受容体の結合を要約する表である。「ＷＴ」は、アラニン置換の導入前の、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／１４１３０３に記載されているＩｇＭ定常領域及びＶ１５Ｊ領域を有する抗ＣＤ２０  １．５．３抗体を意味する。百分率は、「ＷＴ」出発抗体と比較した受容体結合の程度を示す。百分率は、１００％に指定された、野生型ＩｇＭ重鎖定常領域（「ＩｇＭ」、（配列番号１２））及びＣＤ３に結合するｓｃＦｖがＮ末端に融合された野生型ヒトＪ鎖を含む改変Ｊ鎖（「ＶＪ」または「Ｖ１５Ｊ」（配列番号９））を含むＩｇＭ五量体と比較した受容体結合のレベルを示す。
【図３】配列番号２のアミノ酸Ｙ１０２に対応するＪ鎖における位置でのアミノ酸置換変異を有する様々な抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性ＩｇＭのｐＩｇＲへの結合を示すグラフである。各グラフは、単一の変異体を「野生型」抗ＣＤ２０  １．５．３  ＩｇＭ抗体である１．５．３ＶＪ（黒四角）と比較している。図３Ａ：Ｙ１０２Ａ変異（白四角）；図３Ｂ：Ｙ１０２Ｆ変異（黒三角）；図３Ｃ：Ｙ１０２Ｔ変異（白三角）；図３Ｄ：Ｙ１０２Ｓ変異（白ひし形）；図３Ｅ：Ｙ１０２Ｒ変異（黒ひし形）。
【図４】Ｊ鎖及び／またはＩｇＭ重鎖定常領域において様々な変異を含む抗ＣＤ３単一特異性ＩｇＭ及び抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性ＩＧＭのマウスにおける対照と比較した薬物動態データを要約する表である。「ＷＴ  ＩｇＭ」は、アラニン置換の導入前の、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／１４１３０３号に記載されているＩｇＭ定常領域を有する抗ＣＤ２０  １．５．３抗体を意味する。アラニン置換の導入前の、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／１４１３０３号に記載されている「ＷＴ  Ｊ」及び「ＷＴ  ＶＪ」及び野生型Ｊ鎖（「Ｊ」）または抗ＣＤ３改変Ｊ鎖「ＶＪ」領域。「ＶＪＨ」は、Ｃ末端に融合されたヒト血清アルブミンを更に含む「ＶＪ」抗ＣＤ３改変Ｊ鎖（配列番号１１として本明細書において掲示される）を意味する。「Ａ」は、ｔ１／２アルファ時点で測定された抗体の血清濃度である；「Ｂ」は、ｔ１／２ベータ時点で測定された抗体の血清濃度である；「ｔ１／２アルファ」は、アルファ半減期（時間単位）である；「ｔ１／２ベータ」は、時間単位で測定されたベータ半減期である；「Ｃ０」は、時刻ゼロで測定されたμｇ／ｍｌでの血清抗体濃度である；「ＡＵＣ０−ｉｎｆ」は、μｇ／ｍｌ＊ｈで測定された時刻ゼロから無限大までの曲線下面積である；「ＭＲＴ」は、時間単位で測定された抗体の血清内平均滞留時間である。
【図５】同一の抗ＣＤ２０  ＶＨ及びＶＬ結合領域を含むＩｇＧ抗体（１５３  ＩｇＧ）と比較した、単独での、またはＩｇＭ重鎖のＳ４０１ＡもしくはＥ４０１Ａ変異のいずれかとの組み合わせでのＪ鎖Ｙ１０２Ａ変異の、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３  ＩｇＭ二重特異性抗体の総合的な半減期に対する効果を示す曲線である。１５３  ＩｇＧ：白丸；ＩｇＭ  １．５．３  Ｖ１５Ｊ：黒四角；ＩｇＭ  １．５．３  Ｖ１５Ｊ−Ｙ１０２Ａ：白四角；ＩｇＭ  １．５．３  Ｓ４０１Ａ／Ｖ１５Ｊ−Ｙ１０２Ａ：白三角；ＩｇＭ  １．５．３  Ｅ４０２Ａ／Ｖ１５Ｊ−Ｙ１０２Ａ：黒逆三角。
【図６】ＩｇＭ  １．５．３  Ｖ１５Ｊ及びＩｇＭ  １．５．３  Ｖ１５Ｊ−Ｎ４９Ａの薬物動態学的パラメータを比較する表である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
詳細な説明
定義
用語「ａ」または「ａｎ」を付された物は、その物のうちの１つまたはそれ以上を指すことに留意されたい；例えば、「結合分子（ａ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、１つまたはそれ以上の結合分子を表すと理解される。従って、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたはそれ以上」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書において互換的に使用され得る。
【００２９】
更に、「及び／または」は、本明細書において使用される場合、２つの指定された特徴または成分の各々の、他方を伴うか、または伴わない具体的な開示とみなされるべきである。従って、本明細書において「Ａ及び／またはＢ」などの語句で使用される用語「及び／または」は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」などの語句において使用される用語「及び／または」は、以下の実施形態の各々を包含することを意図する：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）。
【００３０】
特に定義しない限り、本明細書において使用される技術用語及び科学用語は、本開示が関連する分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ  ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；及びＯｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓが、本開示において使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供している。
【００３１】
単位、接頭辞、及び記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）で認められた形態で表わされる。数値範囲は、その範囲を定義する数値を包括する。特に明記しない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向で、左から右へ記載される。本明細書において提供される見出しは、本明細書全体を参照することによって得られ得る様々な態様または本開示の態様を限定するものではない。従って、直下に定義される用語は、明細書全体を参照することによって、より完全に定義される。
【００３２】
本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、単一の「ポリペプチド」及び複数の「ポリペプチド」を包含することを意図し、アミド結合（ペプチド結合としても公知）によって直線状に連結されたモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２アミノ酸以上の任意の１本またはそれ以上の鎖を指し、具体的な長さの産物を指すものではない。従って、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２アミノ酸以上の１本またはそれ以上の鎖を指すために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはそれらと互換的に使用され得る。また、用語「ポリペプチド」は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、及び既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解性切断、または非天然アミノ酸による修飾を含むがこれら限定されないポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことも意図する。ポリペプチドは、生物源に由来し得るか、または組換え技術によって生成され得るが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されるものではない。これは、化学合成による手法を含む、任意の手法で生成され得る。
【００３３】
本明細書において開示されるポリペプチドは、約３もしくはそれ以上、５もしくはそれ以上、１０もしくはそれ以上、２０もしくはそれ以上、２５もしくはそれ以上、５０もしくはそれ以上、７５もしくはそれ以上、１００もしくはそれ以上、２００もしくはそれ以上、５００もしくはそれ以上、１，０００もしくはそれ以上、または２，０００もしくはそれ以上のアミノ酸のサイズであり得る。ポリペプチドは、既定の三次元構造を有し得るが、それらは、必ずしもそのような構造を有するものではない。既定の三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれている、と称され、既定の三次元構造を有さないが、むしろ、多数の異なる高次構造を採ることができるポリペプチドは、折り畳まれていない、と称される。本明細書で使用する場合、糖タンパク質という用語は、少なくとも１つの炭化水素部分にカップリングされたタンパク質を指し、当該炭化水素部分は、アミノ酸、例えば、セリンまたはアスパラギンの酸素含有または窒素含有側鎖を介して当該タンパク質に結合している。
【００３４】
「単離」ポリペプチドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、その天然環境にはないポリペプチドを意図する。特定の精製レベルは必要ない。例えば、単離ポリペプチドは、その天然または自然環境から取り出され得る。組換え生成されたポリペプチド及び宿主細胞で発現されたタンパク質は、任意の適切な技術により分離、画分、または部分的もしくは実質的に精製されている天然または組換えポリペプチドである場合、本明細書に開示のとおり、単離と判断される。
【００３５】
本明細書で使用する場合、用語「非天然ポリペプチド」またはその任意の文法的変化形は、審査官または行政もしくは司法機関により「天然」であると決定もしくは解釈されるかまたは決定もしくは解釈され得る形態のポリペプチドを明確に除外するが、それのみを除外するという、条件付き定義である。
【００３６】
本明細書において開示される他のポリペプチドは、前述のポリペプチドの断片、誘導体、類似体、またはバリアント、及びそれらの任意の組合せである。本明細書において開示される用語「断片」、「バリアント」、「誘導体」及び「類似体」は、対応する天然の抗体またはポリペプチドの特性（例えば、抗原への特異的結合）の少なくとも一部を保持する任意のポリペプチドを含む。ポリペプチドの断片には、本明細書の他の箇所で論述される特異的抗体断片に加えて、例えば、タンパク質分解性断片及び欠失断片が含まれる。例えば、ポリペプチドのバリアントには、上記のとおりの断片、更には、アミノ酸置換、欠失、または挿入によって改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。ある種の態様では、バリアントは、非天然であり得る。非天然バリアントは、当分野で公知の変異誘発技術を使用して生成され得る。バリアントポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失、または付加を含み得る。誘導体は、元のポリペプチドでは見い出されない追加の特徴を示すように改変されているポリペプチドである。例には、融合タンパク質が含まれる。バリアントポリペプチドは、本明細書において「ポリペプチド類似体」とも称され得る。本明細書で使用する場合、ポリペプチドの「誘導体」は、官能性側基の反応によって化学的に誘導体化された１つまたはそれ以上のアミノ酸を有する本ポリペプチドも指し得る。２０種の標準アミノ酸の１つまたはそれ以上の誘導体を含有するペプチドも、「誘導体」として含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンをプロリンの代わりに用いることができ；５−ヒドロキシリジンをリジンの代わりに用いることができ；３−メチルヒスチジンをヒスチジンの代わりに用いることができ；ホモセリンをセリンの代わりに用いることができ；オルニチンをリジンの代わりに用いることができる。
【００３７】
「保存的アミノ酸置換」は、１つのアミノ酸が、同様の側鎖を有する別のアミノ酸に置き換えられる置換である。塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む、同様の側鎖を有するアミノ酸のファミリーは、当該技術分野において定義されている。例えば、チロシンのフェニルアラニンとの置換は、保存的置換である。ある種の実施形態では、本開示のポリペプチド及び抗体の配列における保存的置換は、その抗体が結合する抗原への、そのアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたは抗体の結合を抑止するものではない。抗原結合性を除去しないヌクレオチド及びアミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０−１  １８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９−８８４（１９９９）；及びＢｕｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：．４１２−４１７（１９９７）を参照のこと）。
【００３８】
用語「ポリヌクレオチド」は、単一の核酸及び複数の核酸を包含することを意図し、単離核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来型のホスホジエステル結合または非従来型の結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）において見い出されるものなどのアミド結合）を含み得る。用語「核酸」または「核酸配列」は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の１つまたはそれ以上の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片を指す。
【００３９】
「単離」核酸またはポリヌクレオチドは、その天然環境から分離された任意の形態の核酸またはポリヌクレオチドを意図する。例えば、ゲル精製されたポリヌクレオチド、またはベクター中に含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、「単離」と見なされるであろう。また、クローニングのための制限部位を有するように操作されているポリヌクレオチドセグメント、例えば、ＰＣＲ産物は、「単離」と見なされる。単離ポリヌクレオチドの更なる例には、異種の宿主細胞中に維持される組換えポリヌクレオチド、または緩衝液または生理食塩水などの非天然溶液中の（部分的または実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離ＲＮＡ分子には、ポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物が含まれ、ここで、当該転写物は、天然に見い出されるものではない。単離ポリヌクレオチドまたは核酸には更に、合成で生成された分子が含まれる。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、調節エレメント、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターであり得るか、またはそれらを含み得る。
【００４０】
本明細書で使用する場合、用語「非天然ポリヌクレオチド」またはその任意の文法的変化形は、審査官または行政もしくは司法機関により「天然」であると決定もしくは解釈されるかまたは決定もしくは解釈され得る形態の核酸またはポリヌクレオチドを明確に除外するが、それのみを除外するという、条件付き定義である。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部と見なされ得る。しかし、任意の隣接配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどは、コード領域の一部ではない。２つまたはそれ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築物に、例えば、単一のベクターに、または別個のポリヌクレオチド構築物に、例えば、別個の（異なる）ベクターに存在し得る。更に、任意のベクターが、単一のコード領域を含有し得るか、または２つまたはそれ以上のコード領域を含み得、例えば、単一のベクターが、免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコードし得る。加えて、ベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、別のコード領域に融合されたか、または融合されていないかのいずれかである異種のコード領域を含み得る。異種のコード領域には、限定されるものではないが、特殊なエレメントまたはモチーフをコードするもの、例えば、分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメインが含まれる。
【００４２】
ある種の実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸は、ＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは通常、１つまたはそれ以上のコード領域と作動可能に結合されたプロモーター及び／または他の転写もしくは翻訳制御エレメントを含み得る。作動可能な結合とは、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドのためのコード領域が、遺伝子産物の発現を制御配列（複数可）の影響または制御下に置くような様式で、１つまたはそれ以上の制御配列と結合していることである。プロモーター機能の誘導が、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び２つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、発現制御配列の遺伝子産物の発現を導く能力を妨害しないか、またはＤＮＡテンプレートの転写される能力を妨害しない場合、２つのＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード領域及びそれと結合されたプロモーター）は、「作動可能に結合して」いる。従って、プロモーター領域は、当該プロモーターがポリペプチドをコードする核酸の転写をもたらすことができる場合、その核酸と作動可能に結合しているであろう。プロモーターは、所定の細胞においてＤＮＡの実質的な転写を導く細胞特異的なプロモーターであり得る。プロモーター以外の他の転写制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終止シグナルは、細胞特異的転写を導くために、ポリヌクレオチドと作動可能に結合され得る。
【００４３】
種々の転写制御領域が、当業者に公知である。これらには、限定されるものではないが、脊椎動物細胞で機能する転写制御領域、例えば、サイトメガロウイルス（イントロン−Ａと併用した前初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）由来のプロモーター及びエンハンサーセグメントが含まれるが、これらに限定されない。他の転写制御領域には、脊椎動物の遺伝子、例えば、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、及びウサギβ−グロビンに由来するもの、ならびに真核細胞において遺伝子発現を制御することができる他の配列が含まれる。追加の適切な転写制御領域には、組織特異的プロモーター及びエンハンサーならびにリンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンにより誘導可能なプロモーター）が含まれる。
【００４４】
同様に、様々な翻訳制御エレメントが、当業者に公知である。これらには、限定されるものではないが、リボソーム結合部位、翻訳開始コドン、及び終止コドン、ならびにピコルナウイルスに由来するエレメント（特に、ＣＩＴＥ配列とも称される内部リボソーム進入部位またはＩＲＥＳ）が含まれる。
【００４５】
他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり得、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、またはリボソームＲＮＡの形態のＲＮＡであり得る。
【００４６】
ポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本明細書において開示されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を導く分泌シグナルペプチドをコードする追加のコード領域と結合され得る。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質はシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有し、これは、成長中のタンパク質鎖が粗面小胞体を横断して輸送され始めると、成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、ポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有し得、これが完全または「全長」ポリペプチドから切断されて、分泌型または「成熟」型のポリペプチドを生じることを認識している。ある種の実施形態では、天然のシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖シグナルペプチド、またはその配列の機能的誘導体であって、それと作動可能に結合しているポリペプチドの分泌を導く能力を保持する機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物のシグナルペプチドまたはその機能的誘導体が使用され得る。例えば、野生型リーダー配列が、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列と置換され得る。
【００４７】
本明細書で使用する場合、用語「結合分子」は、最も広義には、受容体、例えばエピトープまたは抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。本明細書において更に記載されるように、結合分子は、１つまたはそれ以上の本明細書に記載の「抗原結合ドメイン」を含み得る。結合分子の非限定的な例は、本明細書において詳細に記載される、抗原特異的結合を保持する抗体または抗体様分子である。ある種の態様では、「結合分子」は、本明細書において詳細に記載される抗体または抗体様分子を含む。
【００４８】
本明細書で使用する場合、用語「結合ドメイン」または「抗原結合ドメイン」（互換的に使用され得る）は、結合分子、例えば、抗体または抗体様分子の、エピトープに特異的に結合するために必要かつ十分な領域を指す。例えば、「Ｆｖ」、例えば、２つの別個のポリペプチドサブユニットまたは単鎖のいずれかとしての、抗体の可変重鎖及び可変軽鎖が、「結合ドメイン」と見なされる。他の抗原結合ドメインには、限定されるものではないが、ラクダ科種に由来する抗体の可変重鎖（ＶＨＨ）、またはフィブロネクチン足場において発現される６つの免疫グロブリン相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。本明細書において記載される「結合分子」または「抗体」は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の「抗原結合ドメイン」を含み得る。
【００４９】
用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、本明細書において互換的に使用され得る。抗体（または本明細書において開示されるその断片、バリアント、もしくは誘導体）は、少なくとも重鎖の可変ドメイン（ラクダ科種について）または少なくとも重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含む。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）を参照のこと。特に明記しない限り、用語「抗体」は、抗体の小さな抗原結合断片からフルサイズ抗体までの範囲のあらゆるもの、例えば、２本の完全な重鎖及び２本の完全な軽鎖を含むＩｇＧ抗体、４本の完全な重鎖及び４本の完全な軽鎖を含み、Ｊ鎖及び／または分泌成分を任意に含むＩｇＡ抗体、または１０本もしくは１２本の完全な重鎖及び１０本もしくは１２本の完全な軽鎖を含み、Ｊ鎖またはその機能断片を任意に含むＩｇＭ抗体を包含する。
【００５０】
用語「免疫グロブリン」は、生化学的に区別され得る様々な幅広いクラスのポリペプチドを含む。当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）に分類され、それらの中に幾つかのサブクラス（例えば、γ１〜γ４またはα１〜α２）があることを認識するであろう。この鎖の性質が、抗体の「アイソタイプ」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥとして決定する。免疫グロブリンサブクラス（サブタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２などは、十分に特徴付けられており、機能的特殊化を付与することが知られている。これらの免疫グロブリンの各々の改変型は、本開示を考慮すれば当業者には容易に識別可能であり、従ってそれらは本開示の範囲内である。
【００５１】
軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかに分類される。各重鎖クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖のいずれかに結合し得る。一般的に、軽鎖及び重鎖は共有結合で相互に結合しており、免疫グロブリンが、例えば、ハイブリドーマ、Ｂ細胞、または遺伝子操作された宿主細胞によって発現される場合は、２本の重鎖の「尾」部分は、ジスルフィド共有結合または非共有結合によって相互に結合している。重鎖では、アミノ酸配列は、Ｙ字形状の分岐端にあるＮ末端から、各鎖の底部にあるＣ末端まで続いている。ある種の抗体、例えば、ＩｇＧ抗体の基本構造は、ジスルフィド結合により共有結合して、本明細書において「Ｈ２Ｌ２」構造または「結合ユニット」とも称される「Ｙ」構造を形成する、２つの重鎖サブユニット及び２つの軽鎖サブユニットを含む。
【００５２】
用語「結合ユニット」は、標準的な「Ｈ２Ｌ２」免疫グロブリン構造、すなわち、２本の重鎖またはその断片及び２本の軽鎖またはその断片に対応する結合分子、例えば、抗体、抗体様分子、それらの抗原結合断片、またはそれらの多量体化断片の部分を指すために本明細書において使用される。ある種の態様では、例えば、結合分子が二価ＩｇＧ抗体またはその抗原結合断片である場合、用語「結合分子」及び「結合ユニット」は、等価である。他の態様では、例えば、結合分子が多量体、例えば、二量体ＩｇＡ抗体もしくはＩｇＡ様抗体、五量体ＩｇＭ抗体もしくはＩｇＭ様抗体、または六量体ＩｇＭ抗体もしくはＩｇＭ様抗体である場合、結合分子は、２つまたはそれ以上の「結合ユニット」を含む。ＩｇＡ二量体の場合には２つであり、またはＩｇＭ五量体もしくは六量体の場合にはそれぞれ、５つもしくは６つである。結合ユニットは、全長の抗体重鎖及び軽鎖を含む必要はないが、典型的には二価であり、すなわち、上記に定義した２つの「抗原結合ドメイン」を含む。本明細書で使用する場合、本開示において提供されるある種の結合分子は、「二量体」であり、ＩｇＡ定常領域またはその多量体化断片を含む２つの二価結合ユニットを含む。本開示において提供されるある種の結合分子は、「五量体」または「六量体」であり、ＩｇＭ定常領域またはその多量体化断片を含む５または６つの二価結合ユニットを含む。２つまたはそれ以上、例えば、２、５、または６つの結合ユニットを含む結合分子、例えば、抗体または抗体様分子は、本明細書において「多量体」と称される。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「ＩｇＭ様抗体」は、六量体を形成する能力またはＪ鎖と共同して五量体を形成する能力を依然として保持するバリアント抗体を指す。ＩｇＭ様抗体は、通常、少なくともＩｇＭ定常領域のＣμ４−ｔｐドメインを含むが、同一の種または異なる種由来の他の抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＧ由来の重鎖定常領域ドメインを含み得る。またＩｇＭ様抗体は、当該ＩｇＭ様抗体が六量体及び／または五量体を形成できる限り、１つまたはそれ以上の定常領域が欠失している抗体断片であり得る。従って、ＩｇＭ様抗体は、ハイブリッドＩｇＭ／ＩｇＧ抗体であり得るか、またはＩｇＭ抗体の多量体化断片であり得る。
【００５４】
用語「結合価」、「二価」、「多価」及び文法的等価物は、所与の結合分子、例えば、抗体もしくは抗体様分子、または所与の結合ユニットにおける抗原結合ドメインの数を指す。従って、所与の結合分子、例えば、ＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、またはそれらの多量体化断片に関して、用語「二価」、「四価」、及び「六価」は、それぞれ２つの抗原結合ドメイン、４つの抗原結合ドメイン、及び６つの抗原結合ドメインの存在を意味する。各結合ユニットが二価である典型的なＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体は、１０または１２の結合価を有し得る。二価または多価結合分子、例えば、抗体または抗体様分子は、単一特異性であり得、すなわち、抗原結合ドメインの全てが同じであり、または二重特異性もしくは多重特異性であり得、例えばこの場合、２つまたはそれ以上の抗原結合ドメインが異なり、例えば、同一抗原上の異なるエピトープに結合するか、または完全に異なる抗原に結合する。
【００５５】
用語「エピトープ」は、抗体または抗体様分子の抗原結合ドメインに特異的に結合することができる任意の分子決定基を含む。ある種の態様では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどの、分子の化学的に活性な表面基を含み得、ある種の態様では、三次元構造特性及び／または特異的電荷特性を有し得る。エピトープは、抗体の抗原結合ドメインが結合する標的の領域である。
【００５６】
用語「標的」は、その最も広い意味で使用され、結合分子、例えば、抗体または抗体様分子が結合し得る物質を含む。標的は、例えば、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、または他の分子であり得る。更に「標的」は、例えば、結合分子、例えば、抗体または抗体様分子が結合し得るエピトープを含む細胞、器官、または生物であり得る。
【００５７】
軽鎖及び重鎖の両方は、構造的及び機能的に相同な領域に分割される。用語「定常」及び「可変」は、機能に関して使用される。これに関して、可変軽（ＶＬ）鎖及び可変重（ＶＨ）鎖部分の両方の可変ドメインは、抗原認識及び特異性を決定することが理解されよう。逆に、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖の定常ドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４）は、分泌、経胎盤移行性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの生物学的特性を付与する。慣例では、定常領域ドメインの番号付けは、それらが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠ざかるにつれて増加する。Ｎ末端部分は可変領域であり、Ｃ末端部分は定常領域である；ＣＨ３（またはＩｇＭの場合にはＣＨ４）ドメイン及びＣＬドメインは実際に、それぞれ重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端を含む。
【００５８】
「全長ＩｇＭ抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体重鎖定常ドメイン１（ＣＭ１またはＣμ１）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＭ２またはＣμ２）、抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＭ３またはＣμ３）、及び尾部を含み得る抗体重鎖定常ドメイン４（ＣＭ４またはＣμ４）を含むポリペプチドである。
【００５９】
上記のように、可変領域（複数可）は、結合分子、例えば、抗体または抗体様分子が抗原上のエピトープを選択的に認識し、それに特異的に結合することを可能にする。すなわち、結合分子、例えば、抗体または抗体様分子のＶＬドメイン及びＶＨドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが組み合わさって、抗原結合ドメインを形成する。より具体的には、抗原結合ドメインは、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖の各々の３つのＣＤＲによって規定され得る。ある種の抗体は、より大きな構造を形成する。例えば、ＩｇＡは、２つのＨ２Ｌ２結合ユニット及びジスルフィド結合により共有結合しているＪ鎖を含む分子を形成し得、これは更に分泌成分と会合し得、ＩｇＭは、５つまたは６つのＨ２Ｌ２結合ユニット及び任意にジスルフィド結合により共有結合しているＪ鎖を含む五量体または六量体分子を形成し得る。
【００６０】
抗体の抗原結合ドメインに存在する６つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗体が水性環境においてその三次元配置をとる場合に、抗原結合ドメインを形成するように特異的に配置されている、アミノ酸の短い非連続的な配列である。「フレームワーク」領域と称される、抗原結合ドメイン中のアミノ酸の残りの部分は、より小さな分子間変動性を示す。フレームワーク領域は主にβシート高次構造をとり、ＣＤＲは、βシート構造を連結し、場合によってはβシート構造の一部を形成するループを形成する。従って、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合性相互作用によってＣＤＲを正しい方向に配置することを提供する足場を形成するように作用する。配置されたＣＤＲによって形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープと相補的な表面を規定する。この相補的な表面は、抗体のその同種エピトープへの非共有結合を促進する。任意の所与の重鎖または軽鎖可変領域について、ＣＤＲ及びフレームワーク領域を構成するアミノ酸は、様々な異なる方法で定義されているため、それぞれ当業者により容易に同定され得る（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｋａｂａｔ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）；及びＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）を参照のこと）。
【００６１】
当該技術分野において使用され、及び／または受け入れられている用語の定義が２つまたはそれ以上存在する場合、本明細書において使用される当該用語の定義は、反対のことが明記されていない限り、全てのそのような意味を含むことが意図される。具体的な例は、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見出される非連続的な抗原結合部位を説明するための用語「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）の使用である。これらの特定の領域は、例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）及びＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）によって記載されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義は、相互に比較した場合のアミノ酸の重複またはサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体またはそのバリアントのＣＤＲを指すためのいずれの定義（または当業者に公知の他の定義）の適用も、特に明記しない限り、本明細書において定義及び使用される用語の範囲内であることを意図する。上記の引用参考文献の各々によって定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸を、比較として以下の表１に示す。特定のＣＤＲを包含する正確なアミノ酸番号は、ＣＤＲの配列及びサイズによって異なる。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられれば、どのアミノ酸が特定のＣＤＲを構成するかを定型的に決定することができる。
【００６２】
（表１）ＣＤＲ定義＊
2021514618.tif 000004
＊表１における全てのＣＤＲ定義の番号付けは、Ｋａｂａｔらにより記載された番号付け規則に従う（以下を参照のこと）。
【００６３】
また抗体可変ドメインは、ＣＤＲを含む可変領域セグメントを同定するために、例えば、ＩＭＧＴ情報システム（ｉｍｇｔ＿ｄｏｔ＿ｃｉｎｅｓ＿ｄｏｔ＿ｆｒ／）（ＩＭＧＴ（登録商標）／Ｖ−Ｑｕｅｓｔ）を使用して分析され得る。（例えば、Ｂｒｏｃｈｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３６：Ｗ５０３−５０８，２００８を参照のこと）。
【００６４】
またＫａｂａｔらは、任意の抗体に適用可能である可変ドメイン配列の番号付けシステムを定義した。当業者は、配列自体以外のいかなる実験データにも頼ることなく、任意の可変ドメイン配列に「Ｋａｂａｔ番号付け」というこのシステムを一義的に割り当てることができる。本明細書で使用する場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）によって記載された番号付けシステムを指す。しかしながら、Ｋａｂａｔ番号付けシステムの使用が明記されていない限り、本開示では、連続的番号付けが全てのアミノ酸配列について使用される。
【００６５】
ヒトＩｇＭ定常ドメインのためのＫａｂａｔ番号付けシステムは、Ｋａｂａｔらの“Ｔａｂｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，  Ｖ−Ｒｅｇｉｏｎｓ，  Ｃ−Ｒｅｇｉｏｎｓ，  Ｊ−Ｃｈａｉｎ，  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ，  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，  β−２  Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，  Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，  Ｔｈｙ−１，  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ，  Ｃ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，  Ｔｈｙｍｏｐｏｉｅｔｉｎ，  Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ，  Ｐｏｓｔ−ｇａｍｍａ  Ｇｌｏｂｕｌｉｎ，  α−２  Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”  Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）に見出され得る。ＩｇＭ定常領域は、連続的に（すなわち、アミノ酸＃１は定常領域の第１アミノ酸から開始する）またはＫａｂａｔ番号付けスキームを使用して番号付けられ得る。ヒトＩｇＭ定常領域の連続的番号付け（配列番号１２として本明細書において掲示される）とＫａｂａｔシステムによる番号付けとの比較を以下に示す。下線が引かれたアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔシステムでは含まれない：
ＩｇＭ重鎖の連続的番号付け（配列番号１２）／ＫＡＢＡＴ番号付けの要所
2021514618.tif 000005
【００６６】
結合分子、例えば、抗体、抗体様分子、それらの抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体、及び／またはそれらの多量体化断片には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬドメインまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成される断片が含まれるがこれらに限定されない。ＳｃＦｖ分子は当該技術分野で公知であり、例えば米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。
【００６７】
「特異的に結合する」は、一般に、結合分子、例えば、抗体、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体が、その抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、及びその結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間でいくらかの相補性を必要とすることを意味する。この定義によれば、結合分子、例えば、抗体または抗体様分子は、それが無作為の無関係なエピトープに結合するよりも容易に、その抗原結合ドメインを介してエピトープに結合する場合に、そのエピトープに「特異的に結合する」と言われる。用語「特異性」は、ある種の結合分子がある種のエピトープに結合する際の相対的親和性を表すために、本明細書において使用される。例えば、結合分子「Ａ」は、所与のエピトープに対して結合分子「Ｂ」よりも高い特異性を有すると見なされ得るか、または結合分子「Ａ」は、関連エピトープ「Ｄ」に対して有する特異性よりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言われ得る。
【００６８】
本明細書において開示される結合分子、例えば、抗体、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、５×１０−２秒−１、１０−２秒−１、５×１０−３秒−１、１０−３秒−１、５×１０−４秒−１、１０−４秒−１、５×１０−５秒−１、もしくは１０−５秒−１、５×１０−６秒−１、１０−６秒−１、５×１０−７秒−１、または１０−７秒−１以下のオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））で標的抗原に結合すると言われ得る。
【００６９】
本明細書において開示される結合分子、例えば、抗体、もしくは抗原結合断片、バリアント、または誘導体は、１０３Ｍ−１秒−１、５×１０３Ｍ−１秒−１、１０４Ｍ−１秒−１、５×１０４Ｍ−１秒−１、１０５Ｍ−１秒−１、５×１０５Ｍ−１秒−１、１０６Ｍ−１秒−１、もしくは５×１０６Ｍ−１秒−１、または１０７Ｍ−１秒−１以上のオン速度（ｋ（ｏｎ））で標的抗原に結合すると言われ得る。
【００７０】
結合分子、例えば、抗体、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、所与のエピトープへの参照抗体または抗原結合断片の結合をある程度遮断する程度まで、そのエピトープに優先的に結合するのであれば、そのエピトープへの当該参照抗体または抗原結合断片の結合を競合阻害すると言われる。競合阻害は、当該技術分野において公知の任意の方法、例えば、競合ＥＬＩＳＡアッセイによって決定され得る。結合分子は、所与のエピトープへの参照抗体または抗原結合断片の結合を、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％競合阻害すると言われ得る。
【００７１】
本明細書で使用する場合、用語「親和性」は、個々のエピトープと、例えば、免疫グロブリン分子の１つまたはそれ以上の抗原結合ドメインとの結合の強さの尺度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）の２７〜２８ページを参照のこと。本明細書で使用する場合、用語「結合活性」は、抗原結合ドメインの集団と抗原との複合体の全体的な安定性を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗの２９〜３４ページを参照のこと。結合活性は、集団内の個々の抗原結合ドメインと特定のエピトープとの親和性、更には、免疫グロブリンと抗原との結合価の両方に関連する。例えば、二価モノクローナル抗体と、重合体などの高度反復エピトープ構造を有する抗原との相互作用は、高い結合活性の１つである。二価モノクローナル抗体と、細胞表面上に高密度で存在する受容体との相互作用もまた、高い結合活性のものである。
【００７２】
また本明細書において開示される結合分子、例えば、抗体、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、それらの交差反応性に関しても記載または指定され得る。本明細書で使用する場合、用語「交差反応性」は、ある抗原に特異的な結合分子、例えば、抗体、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体が第２の抗原と反応する能力；２つの異なる抗原物質間の関連性の尺度を指す。従って、結合分子は、その形成を誘導したエピトープ以外のエピトープに結合する場合、交差反応性である。交差反応性エピトープは、一般に、誘導エピトープと同じ相補的な構造的特徴を多く含んでおり、場合によっては、元のエピトープよりも実際に良好に適合し得る。
【００７３】
また結合分子、例えば、抗体、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、抗原に対するそれらの結合親和性に関しても記載または指定され得る。例えば、結合分子は、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ以下の解離定数またはＫＤで抗原に結合し得る。
【００７４】
単鎖抗体または他の抗原結合ドメインを含む「抗原結合性抗体断片」は、単独で、または以下のうちの１つまたはそれ以上との組み合わせで存在し得る：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、もしくはＣＨ４ドメイン、Ｊ鎖、または分泌成分。可変領域（複数可）と、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、もしくはＣＨ４ドメイン、Ｊ鎖、または分泌成分のうちの１つまたはそれ以上との任意の組み合わせを含み得る抗原結合断片も含まれる。結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、鳥類及び哺乳動物を含む任意の動物起源に由来し得る。抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリ抗体であり得る。別の実施形態では、可変領域は軟骨魚類（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）起源（例えば、サメ由来）であり得る。本明細書で使用する場合、「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体、または以下及び例えばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第５，９３９，５９８号に記載される、１つまたはそれ以上のヒト免疫グロブリンに関してトランスジェニックであり、場合によっては内因性免疫グロブリンを発現することができ、場合によってはできない動物から単離された抗体が含まれる。本開示の態様によれば、本明細書において提供されるようなＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体は、当該ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体が多量体、例えば、六量体または五量体を形成することが可能である限りは、抗体の抗原結合断片、例えば、ｓｃＦｖ断片を含み得る。
【００７５】
本明細書で使用する場合、用語「重鎖サブユニット」は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含み、重鎖サブユニットを含む結合分子、例えば、抗体または抗体様分子は、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中間、及び／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、またはそれらのバリアントもしくは断片のうちの少なくとも１つを含み得る。例えば、結合分子、例えば、抗体、抗体様分子、またはそれらの断片、バリアント、もしくは誘導体は、限定されるものではないが、ＶＨドメインに加えて、ＣＨ１ドメイン；ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、及びＣＨ２ドメイン；ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン；ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、及びＣＨ３ドメイン；またはＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含み得る。ある種の態様では、結合分子、例えば、抗体、抗体様分子、またはそれらの断片、バリアント、もしくは誘導体は、ＶＨドメインに加えて、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン；またはＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、及びＪ鎖を含み得る。更に、本開示において使用するための結合分子、例えば、抗体または抗体様分子は、一定の定常領域部分、例えば、ＣＨ２ドメインの全てまたは一部を欠いていてもよい。これらのドメイン（例えば、重鎖サブユニット）は、元の免疫グロブリン分子とアミノ酸配列が異なるように改変され得ることが、当業者によって理解されるであろう。本開示の態様によれば、本明細書において提供されるようなＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体は、当該ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体の多量体、例えば、六量体または五量体の形成を可能にするのに十分な部分のＩｇＭ重鎖定常領域を含む。
【００７６】
本明細書で使用する場合、用語「軽鎖サブユニット」は、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。軽鎖サブユニットは、少なくともＶＬを含み、ＣＬ（例えば、ＣκまたはＣλ）ドメインを更に含み得る。
【００７７】
結合分子、例えば、抗体、抗体様分子、またはそれらの抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体、またはそれらの多量体化断片は、それらが認識または特異的に結合する抗原のエピトープ（複数可）または部分（複数可）に関して記載または指定され得る。抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的抗原の部分は、「エピトープ」または「抗原決定基」である。標的抗原は、単一のエピトープまたは少なくとも２つのエピトープを含み得、抗原のサイズ、高次構造、及び種類に応じて、任意の数のエピトープを含み得る。
【００７８】
前述のように、様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造及び三次元配置は周知である。本明細書で使用する場合、用語「ＶＨドメイン」は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端の可変ドメインを含み、用語「ＣＨ１ドメイン」は、免疫グロブリン重鎖の最初の（最もアミノ末端側の）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインはＶＨドメインに隣接しており、典型的なＩｇＧ重鎖分子のヒンジ領域のアミノ末端側にある。
【００７９】
本明細書で使用する場合、用語「ＣＨ２ドメイン」は、例えば、従来の番号付けスキームを使用して、ＩｇＧ抗体の例えば、約２４４位アミノ酸から３６０位アミノ酸に及ぶ重鎖分子の部分を含む（アミノ酸２４４〜３６０、Ｋａｂａｔ番号付けシステム；及びアミノ酸２３１〜３４０、ＥＵ番号付けシステム；Ｋａｂａｔ  ＥＡ  ｅｔ  ａｌ．、前掲書を参照のこと）。ＣＨ３ドメインは、ＣＨ２ドメインからＩｇＧ分子のＣ末端に及び、約１０８アミノ酸を含む。ある種の免疫グロブリンクラス、例えば、ＩｇＭはＣＨ４領域を更に含む。
【００８０】
本明細書で使用する場合、用語「ヒンジ領域」は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＤ重鎖においてＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに連結する重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域は約２５アミノ酸を含み、可動性であり、従って、２つのＮ末端の抗原結合領域は独立して動くことが可能である。
【００８１】
本明細書で使用する場合、用語「ジスルフィド結合」は、２つの硫黄原子間に形成される共有結合を含む。アミノ酸であるシステインは、第２のチオール基とジスルフィド結合または架橋を形成し得るチオール基を含む。
【００８２】
本明細書で使用する場合、用語「キメラ抗体」は、免疫反応性領域または部位が第１の種から得られているか、またはそれに由来し、かつ定常領域（インタクト、部分的、または改変型であり得る）が第２の種から得られている抗体を指す。幾つかの実施形態では、標的結合領域または部位は非ヒト供給源（例えば、マウスまたは霊長類）に由来し、定常領域はヒトである。
【００８３】
用語「多重特異性抗体」または「二重特異性抗体」は、単一の抗体分子内に、２つまたはそれ以上の異なるエピトープに対する抗原結合ドメインを有する抗体または抗体様分子を指す。標準的な抗体構造に加えて、２つの結合特異性を有する他の結合分子が構築され得る。二重特異性または多重特異性抗体によるエピトープ結合は、同時または逐次的であり得る。トリオーマ及びハイブリッドハイブリドーマは、二重特異性抗体を分泌し得る細胞系の２つの例である。また二重特異性抗体は、組換え手段によっても構築され得る（Ｓｔｒｏｈｌｅｉｎ  ａｎｄ  Ｈｅｉｓｓ，Ｆｕｔｕｒｅ  Ｏｎｃｏｌ．６：１３８７−９４（２０１０）；Ｍａｂｒｙ  ａｎｄ  Ｓｎａｖｅｌｙ，ＩＤｒｕｇｓ．１３：５４３−９（２０１０））。また二重特異性抗体は、ダイアボディであってもよい。
【００８４】
本明細書で使用する場合、用語「操作された抗体」は、重鎖及び軽鎖のいずれかまたは両方の可変ドメインが、ＣＤＲまたはフレームワーク領域のいずれかにおける１つまたはそれ以上のアミノ酸の少なくとも部分的な置換によって改変されている抗体を指す。ある種の態様では、既知の特異性の抗体に由来するＣＤＲ全体が、異種抗体のフレームワーク領域に移植され得る。代替ＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラスあるいはサブクラスの抗体に由来し得るが、ＣＤＲは、異なるクラスの抗体、例えば異なる種からの抗体にも由来し得る。既知の特異性の非ヒト抗体からの１つまたはそれ以上の「ドナー」ＣＤＲがヒト重鎖または軽鎖フレームワーク領域に移植された操作された抗体は、本明細書において「ヒト化抗体」と称される。ある種の態様では、ＣＤＲの全てが、ドナー可変領域由来の完全なＣＤＲで置き換えられるわけではないが、それでも、ドナーの抗原結合能はレシピエントの可変ドメインに導入され得る。例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、及び同第６，１８０，３７０号に記載された説明を考慮すると、定型的な実験の実行または試行錯誤の試験のいずれかによって、機能的な操作された抗体またはヒト化抗体を得ることは、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００８５】
本明細書で使用する場合、用語「操作された」は、合成手段による（例えば、組換え技術、インビトロペプチド合成、ペプチドの酵素的もしくは化学的カップリング、またはこれらの技術の幾つかの組み合わせによる）核酸またはポリペプチド分子の操作を含む。
【００８６】
本明細書で使用する場合、用語「連結された」、「融合された」、もしくは「融合」、または他の文法的等価物は、互換的に使用され得る。これらの用語は、化学的結合または組換え手段を含むどのような手段であれ、２つまたはそれ以上の要素または成分を共に連結することを指す。「インフレーム融合」は、元のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳リーディングフレームを維持する様式で、２つまたはそれ以上のポリヌクレオチドＯＲＦを連結して、連続したより長いＯＲＦを形成することを指す。従って、組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２つまたはそれ以上のセグメントを含有する単一のタンパク質である（これらのセグメントは通常、天然ではそのように連結されていない）。従って、リーディングフレームは融合セグメント全体にわたって連続しているが、これらのセグメントは、例えばフレーム内リンカー配列によって物理的または空間的に分離され得る。例えば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドは、インフレームで融合され得るが、「融合された」ＣＤＲが連続ポリペプチドの一部として同時翻訳される限り、少なくとも１つの免疫グロブリンフレームワーク領域または追加のＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドによって分離され得る。
【００８７】
ポリペプチドの文脈において、「線状配列」または「配列」は、ポリペプチドにおけるアミノ末端からカルボキシル末端方向へのアミノ酸の順序であり、配列内で相互に隣接するアミノ酸は、ポリペプチドの一次構造において連続している。ポリペプチドのある部分であって、ポリペプチドの別の部分に対して「アミノ末端側」または「Ｎ末端側」にあるポリペプチドのある部分は、連続的なポリペプチド鎖において先に来る部分である。同様に、ポリペプチドのある部分であって、ポリペプチドの別の部分に対して「カルボキシル末端側」または「Ｃ末端側」にあるポリペプチドのある部分は、連続的なポリペプチド鎖において後に来る部分である。例えば、定型抗体において、可変ドメインは定常領域の「Ｎ末端側」にあり、定常領域は可変ドメインの「Ｃ末端側」にある。
【００８８】
用語「発現」は、本明細書で使用する場合、遺伝子が生化学物質、例えば、ポリペプチドを生成するプロセスを指す。このプロセスは、遺伝子ノックダウンならびに一過性発現及び安定発現の両方を含むがこれらに限定されない、細胞内での遺伝子の機能的存在の任意の顕在化を含む。これには、遺伝子のＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写、及びそのようなｍＲＮＡのポリペプチド（複数可）への翻訳が含まれるがこれらに限定されない。所望の最終生成物が生化学物質である場合、発現は、その生化学物質及び任意の前駆体の生成を含む。遺伝子の発現によって、「遺伝子産物」が生成される。本明細書で使用する場合、遺伝子産物は、核酸、例えば遺伝子の転写によって生成されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載の遺伝子産物には更に、転写後修飾、例えばポリアデニル化を受けた核酸、または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の添加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク質分解性切断などを受けたポリペプチドが含まれる。
【００８９】
「処置すること」または「処置」または「処置するため」または「緩和すること」または「緩和するため」などの用語は、既存の診断された病理学的状態または障害を治癒する、減速させる、その症状を軽減する、及び／またはその進行を停止させるか、もしくは遅らせる治療手段を指す。「予防する」、「予防」、「回避する」、「抑止」などの用語は、未診断の標的とする病理学的状態または障害の発症を予防する予防的または防止的手段を指す。従って、「処置を必要とするもの」には、その障害を既に有するもの；その障害を有する傾向があるもの；及びその障害が予防されるべきものが含まれ得る。
【００９０】
本明細書で使用する場合、用語「血清半減期」または「血漿半減期」は、薬物、例えば、本明細書に記載されるような抗体、抗体様分子、またはそれらの断片などの結合分子の投与後の血清または血漿濃度が５０％減少するのにかかる時間（例えば、分、時間、または日）を指す。以下の２つの半減期が記載され得る：中心コンパートメント（例えば、静脈内送達の場合は血液）から末梢コンパートメント（例えば、組織または器官）への薬物の再分布プロセスに起因する、血漿濃度の低下速度であるアルファ半減期、α半減期、またはｔ１／２α、及び排泄または代謝プロセスに起因する低下速度であるベータ半減期、β半減期、またはｔ１／２β。
【００９１】
本明細書で使用する場合、用語「血漿薬物濃度−時間曲線下面積」または「ＡＵＣ」は、ある用量の薬物投与後の身体の当該薬物への実際の曝露を反映し、ｍｇ＊ｈ／Ｌで表現される。この曲線下面積は、時刻０（ｔ０）から無限大（∞）まで測定され、身体からの薬物の除去速度及び投与された用量に依存する。
【００９２】
本明細書で使用する場合、用語「平均滞留時間」または「ＭＲＴ」は、薬物が身体に残留する時間の平均的な長さを指す。
【００９３】
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後診断、または治療が望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象には、ヒト、家庭用動物、家畜、及び動物園、運動競技、または愛玩用の動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ブタ、ウシ、クマなどが含まれる。
【００９４】
本明細書で使用する場合、「治療から恩恵を受ける対象」及び「処置を必要とする動物」などの語句は、全ての予期される対象のなかから、所与の治療薬、例えば、１つまたはそれ以上の抗原結合ドメインを含む抗体などの結合分子の投与により恩恵を受けるであろう対象のサブセットを指す。例えば、疾患の診断手順及び／または処置もしくは予防のために、そのような結合分子、例えば抗体が使用され得る。
【００９５】
ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体
ＩｇＭは、抗原による刺激に応答してＢ細胞により産生される最初の免疫グロブリンであり、血清中に１．５ｍｇ／ｍｌ前後で天然に存在し、約５日の半減期を有する。ＩｇＭは五量体または六量体分子であり、従って、５つまたは６つの結合ユニットを含む。ＩｇＭ結合ユニットは、通常、２本の軽鎖及び２本の重鎖を含む。ＩｇＧ重鎖定常領域は３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を含むが、ＩｇＭの重鎖（μ）定常領域は、付加的に第４の定常ドメイン（ＣＨ４）を含み、Ｃ末端「尾部」を含む。ヒトＩｇＭ定常領域は、通常、配列番号１２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ｐｉｒ｜｜Ｓ３７７６８、ＣＡＡ４７７０８．１、及びＣＡＡ４７７１４．１と同一）のアミノ酸配列を含む。ヒトＣμ１領域は、配列番号１２の約５位アミノ酸から約１０２位アミノ酸の範囲であり、ヒトＣμ２領域は、配列番号１２の約１１４位アミノ酸から約２０５位アミノ酸の範囲であり、ヒトＣμ３領域は、配列番号１２の約２２４位アミノ酸から約３１９位アミノ酸の範囲であり、Ｃμ４領域は、配列番号１２の約３２９位アミノ酸から約４３０位アミノ酸の範囲であり、尾部は、配列番号１２の約４３１位アミノ酸から約４５３位アミノ酸の範囲である。配列番号１２を以下に掲示する。
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【００９６】
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ０１８７１．４、ＣＡＢ３７８３８．１、及びｐｉｒ｜｜ＭＨＨＵが含まれるが、これらに限定されない、軽微な配列変動を有する他の型のヒトＩｇＭ定常領域が存在する。本開示の他箇所で記載または主張される、配列番号１２に対応する位置でのアミノ酸置換、挿入、及び／または欠失が、代わりのヒトＩｇＭ配列だけでなく他の種のＩｇＭ定常領域アミノ酸配列、例えば、図１に示すものに同様に組み込まれ得る。
【００９７】
各ＩｇＭ重鎖定常領域は、抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖまたはＶＨＨ）または抗原結合ドメインのサブユニット（例えば、ＶＨ領域）と結合され得る。
【００９８】
５つのＩｇＭ結合ユニットは、追加の小さなポリペプチド鎖（Ｊ鎖）と複合体を形成して、五量体ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を形成し得る。ヒトＪ鎖の前駆体形態（配列番号１）を以下に掲示する。シグナルペプチド（下線付き）は、配列番号１の１位アミノ酸から約２２位アミノ酸に及び、成熟ヒトＪ鎖は、配列番号１の約２３位アミノ酸からアミノ酸１５９に及ぶ。成熟ヒトＪ鎖は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。
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配列番号２を以下に掲示する。
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【００９９】
Ｊ鎖がなければ、ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体は、通常、最大１２個の抗原結合ドメインを含む六量体に集合する。Ｊ鎖があれば、ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体は、通常、最大１０個の、またはＪ鎖が追加の抗原結合ドメイン（複数可）を含む異種ポリペプチドを含む改変Ｊ鎖である場合、それ以上の抗原結合ドメインを含む五量体に集合する。５つまたは６つのＩｇＭ結合ユニットの五量体または六量体のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体へのアセンブリは、Ｃμ４及び尾部ドメインを必要とすると考えられている。例えば、Ｂｒａａｔｈｅｎ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４２７５５−４２７６２（２００２）を参照のこと。従って、本開示において提供される五量体または六量体ＩｇＭ抗体は、通常、少なくともＣμ４及び／または尾部ドメイン（まとめて本明細書においてＣμ４−ｔｐとも称される）を含む。従って、ＩｇＭ重鎖定常領域の「多量体化断片」は、少なくともＣμ４−ｔｐドメインを含む。ＩｇＭ重鎖定常領域は、Ｃμ３ドメインもしくはその断片、Ｃμ２ドメインもしくはその断片、Ｃμ１ドメインもしくはその断片、及び／または他のＩｇＭ重鎖ドメインを付加的に含み得る。ある種の態様では、結合分子、例えば、本明細書において提供されるようなＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体は、完全なＩｇＭ重鎖（μ）定常ドメイン、例えば、配列番号１２、またはそのバリアント、誘導体、もしくは類似体を含み得る。
【０１００】
ある種の態様では、本開示は、５つの二価結合ユニットを含む五量体ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体を提供し、ここで、各結合ユニットは、各々が抗原結合ドメインまたはそのサブユニットと会合している２つのＩｇＭ重鎖定常領域、またはその多量体化断片、もしくはバリアントを含む。ある種の態様では、２つのＩｇＭ重鎖定常領域は、ヒト重鎖定常領域である。
【０１０１】
本明細書において提供されるＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体が五量体である場合、ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体は、通常、Ｊ鎖、またはその機能断片、もしくはバリアントを更に含む。ある種の態様では、Ｊ鎖は、本明細書の他箇所で記載される、結合された１つまたはそれ以上の異種部分を更に含む改変Ｊ鎖またはそのバリアントである。ある種の態様では、Ｊ鎖は、本明細書の他箇所で論じるように、本明細書において提供されるＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体の血清半減期に影響を及ぼす、例えば、増強するように変異され得る。
【０１０２】
ＩｇＭ重鎖定常領域は、Ｃμ１ドメインまたはその断片もしくはバリアント、Ｃμ２ドメインまたはその断片もしくはバリアント、Ｃμ３ドメインまたはその断片もしくはバリアント、及び／またはＣμ４ドメインまたはその断片もしくはバリアントのうちの１つまたはそれ以上を含み得、ただし、定常領域はＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体の所望の機能を果たし得、例えば、第２のＩｇＭ定常領域と会合して、抗原結合ドメインを形成し、かつ／または他の結合ユニット（及び五量体の場合、Ｊ鎖）と会合して、六量体または五量体を形成する。ある種の態様では、個々の結合ユニット内の２つのＩｇＭ重鎖定常領域またはその断片もしくはバリアントは、それぞれ、Ｃμ４ドメインまたはその断片もしくはバリアント、尾部（ｔｐ）またはその断片もしくはバリアント、またはＣμ４ドメイン及びＴＰまたはそれらの断片もしくはバリアントの組み合わせを含む。ある種の態様では、個々の結合ユニット内の２つのＩｇＭ重鎖定常領域またはその断片もしくはバリアントは、それぞれ、Ｃμ３ドメインまたはその断片もしくはバリアント、Ｃμ２ドメインまたはその断片もしくはバリアント、Ｃμ１ドメインまたはその断片もしくはバリアント、またはそれらの任意の組み合わせを更に含む。
【０１０３】
改変Ｊ鎖
ある種の態様では、本明細書において提供されるような五量体ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体のＪ鎖は、当該ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体のその結合標的（複数可）と集合及び結合する能力を妨害することなく、例えば、異種部分、または２つまたはそれ以上の異種部分、例えば、ポリペプチドの導入によって改変され得る。各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第９，９５１，１３４号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／０５９３８７号、及びＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／０５９３８０号を参照のこと。従って、本明細書の他箇所で記載される多重特異性ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体を含む、本明細書において提供されるようなＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体は、Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントに導入される異種部分、例えば、異種ポリペプチドを含む改変Ｊ鎖またはその機能断片もしくはバリアントを含み得る。ある種の態様では、異種部分は、Ｊ鎖にインフレームで融合されたか、またはＪ鎖に化学的にコンジュゲートされたペプチドもしくはポリペプチド配列またはそれらの断片もしくはバリアントであり得、ここで、異種ポリペプチドは、バリアントＪ鎖またはその機能断片に直接または間接的に融合される。ある種の態様では、異種ポリペプチドは、ペプチドリンカー、例えば、最少５アミノ酸以上２５アミノ酸以下からなるペプチドリンカーを介してＪ鎖またはその機能断片に融合される。ある種の態様では、ペプチドリンカーは、
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からなる。ある種の態様では、異種部分は、Ｊ鎖にコンジュゲートされた化学部分であり得る。Ｊ鎖に結合される異種部分には、限定されるものではないが、結合部分、例えば、抗体もしくはその抗原結合断片、例えば、単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子、ＩｇＭもしくはＩｇＭ様抗体の半減期を増加させ得る安定化ペプチド、または化学的部分、例えば、重合体もしくは細胞毒素が含まれ得る。
【０１０４】
幾つかの実施形態では、改変Ｊ鎖は、限定されるものではないが、標的抗原に特異的に結合することができるポリペプチド（低分子ペプチドを含む）を含み得る抗原結合ドメインを含み得る。ある種の態様では、改変Ｊ鎖と会合している抗原結合ドメインは、本明細書の他箇所で記載される抗体またはその抗原結合断片であり得る。ある種の態様では、抗原結合ドメインは、例えば、ラクダ科または軟骨魚類抗体に由来するｓｃＦｖ抗原結合ドメインまたは単鎖抗原結合ドメインであり得る。抗原結合ドメインは、Ｊ鎖の機能、または会合しているＩｇＭもしくはＩｇＡ抗体の機能を妨害することなく、当該抗原結合ドメインのその結合標的への結合を可能にする任意の位置でＪ鎖に導入され得る。挿入位置には、Ｃ末端もしくはその付近、Ｎ末端もしくはその付近、またはＪ鎖の三次元構造に基づきアクセス可能である内部位置が含まれるが、これらに限定されない。ある種の態様では、抗原結合ドメインは、配列番号２の成熟ヒトＪ鎖に、配列番号２のシステイン残基９２と１０１との間で導入され得る。更なる態様では、抗原結合ドメインは、配列番号２のヒトＪ鎖に、グリコシル化部位またはその付近で導入され得る。更なる態様では、抗原結合ドメインは、配列番号２のヒトＪ鎖に、Ｃ末端から約１０アミノ酸残基の範囲内で、またはＮ末端から約１０アミノ酸残基の範囲内で導入され得る。
【０１０５】
血清半減期を変化させるＪ鎖変異を有する五量体ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体
本開示は、増強された血清半減期を有するＩｇＭ抗体またはその多量体化断片、例えば、五量体ＩｇＭ様抗体またはその多量体化断片を提供する。ある種の態様では、本明細書において提供されるＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体は、５つの二価抗体の結合ユニットまたはそのバリアントもしくは多量体化断片及びＪ鎖のバリアントまたはその機能断片を含む。Ｊ鎖の「機能断片」は、５つのＩｇＭ結合ユニットと会合して五量体を形成するか、または２つのＩｇＡ結合ユニットと会合して二量体を形成する能力を保ち続けるＪ鎖断片（または本明細書において提供されるバリアントＪ鎖もしくは改変Ｊ鎖の断片）を意味する。提供されるＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の各結合ユニットは、２つのＩｇＭ重鎖定常領域またはその断片もしくはバリアント（ここで、当該断片またはバリアントは多量体化が可能である）を含み、ここで、各定常領域は、抗原結合ドメインまたはそのサブユニットと会合している。本明細書において提供されるように、「バリアントＪ鎖またはその機能断片」は、参照Ｊ鎖またはその機能断片と比較して１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を含み得、ここで、当該参照Ｊ鎖は、当該１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いてバリアントＪ鎖と同一である。ある種の態様では、参照Ｊ鎖は、野生型Ｊ鎖である。本明細書において提供されるようなバリアントＪ鎖またはその機能断片は、当該バリアントＪ鎖またはその機能断片を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の血清半減期に影響を及ぼし得、例えば、これを増強し得る。同様に本明細書において提供されるバリアントＪ鎖またはその機能断片は、当該バリアントＪ鎖またはその機能断片を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の同種の受容体、例えば、Ｆｃαμ受容体（ＦｃαμＲ）または多量体Ｉｇ受容体（ｐＩｇＲ）に結合する能力に影響を及ぼし得、例えば、これを阻害し得る。用語「１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、挿入、及び欠失」は、バリアントＪ鎖またはその機能断片のアミノ酸配列の各アミノ酸が、参照Ｊ鎖と比較して、個別に置換、欠失され得るか、またはそれに隣接して挿入された単一アミノ酸を有し得るが、バリアントＪ鎖またはその機能断片は、依然としてＩｇＭ重鎖またはＩｇＭ様重鎖及び抗体軽鎖と集合して、ＩｇＭ五量体またはＩｇＭ様五量体を形成する機能を果たすことが可能でなければならないことを意味する。
【０１０６】
ある種の態様では、本明細書において提供されるようなバリアントＪ鎖またはその機能断片は、単一アミノ酸置換、挿入、または欠失、２つの単一アミノ酸置換、挿入、または欠失の組み合わせ（例えば、２つの単一アミノ酸置換、または１つの単一アミノ酸置換及び１つの単一アミノ酸挿入もしくは欠失）、３つの単一アミノ酸置換、挿入、または欠失の組み合わせ、４つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、挿入、または欠失の組み合わせを有し得、ここで、当該１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、挿入、または欠失は、当該バリアントＪ鎖またはその機能断片を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の血清半減期に影響を及ぼし得、例えば、これを増強し得る。従って、提供されるＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体は、対象動物、例えば、マウスモデルに投与された際に、バリアントＪ鎖またはその機能断片における１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて、同一である参照ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体と比較して増加した血清半減期を示し得、ここで、当該提供される抗体及び当該参照抗体の両方は同一の動物種に同様に投与される。
【０１０７】
ある種の態様では、バリアントＪ鎖を含む提供されるＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体の血清半減期、例えば、α半減期（ｔ１／２α）、β半減期（ｔ１／２β）、ｔ１／２α及びｔ１／２βの両方、または総合的な半減期は、参照抗体と比較して少なくとも０．１倍、少なくとも０．５倍、少なくとも１倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍以上増加し得る。ある種の態様では、血清半減期の増加は、同一の抗原結合ドメインを含むＩｇＧ抗体の血清半減期に近づく。
【０１０８】
ある種の態様では、本明細書において提供されるようなバリアントＪ鎖を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体は、他の改変された薬物動態学的パラメータ、例えば、参照抗体と比較して、増加したピーク血漿濃度（Ｃｍａｘ）、増加したＴ０から∞までの曲線下面積（ＡＵＣ）、例えば、改変されたクリアランス時間、増加した平均滞留時間（ＭＲＴ）、またはそれらの任意の組み合わせを更に示す。ある種の態様では、ＡＵＣは、バリアントＪ鎖またはその機能断片における１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて同一である参照ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体と比較して少なくとも０．１倍、少なくとも０．５倍、少なくとも１倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍以上増加し得、ここで、当該提供される抗体及び当該参照抗体の両方は、同一の動物種に同様に投与される。
【０１０９】
ある種の態様では、本明細書において提供されるようなＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体のＪ鎖は、野生型成熟ヒトＪ鎖（配列番号２）のアミノ酸Ｙ１０２に対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含む。「野生型成熟ヒトＪ鎖のアミノ酸Ｙ１０２に対応するアミノ酸」は、ヒトＪ鎖におけるＹ１０２に相同な、任意の種のＪ鎖配列におけるアミノ酸を意味する。配列番号２のＹ１０２に対応する位置は、少なくとも４３個の他の種のＪ鎖アミノ酸配列において保存されている。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，９５１，１３４号の図４を参照のこと。実施例において実証されるように、配列番号２のＹ１０２に対応する位置での特定の変異は、特定の免疫グロブリン受容体、例えば、ヒトもしくはマウスＦｃαμ受容体、マウスＦｃμ受容体、及び／またはヒトもしくはマウス多量体Ｉｇ受容体（ｐＩｇ受容体）の変異型Ｊ鎖を含むＩｇＭ五量体への結合を阻害し得る。図２を参照のこと。ある種の態様では、配列番号２のＹ１０２に対応するアミノ酸は、任意のアミノ酸で置換され得る。ある種の態様では、配列番号２のＹ１０２に対応するアミノ酸は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、またはアルギニン（Ｒ）で置換され得る。特定の態様では、配列番号２のＹ１０２に対応するアミノ酸は、アラニンで置換され得る。特定の態様では、Ｊ鎖またはその機能的断片もしくはバリアントは、バリアントヒトＪ鎖であり、配列番号３のアミノ酸配列を含む。配列番号３を以下に掲示する。
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【０１１０】
特定の態様では、配列番号２のＹ１０２に対応するアミノ酸は、セリンで置換され得る。特定の態様では、Ｊ鎖またはその機能的断片もしくはバリアントは、バリアントヒトＪ鎖であり、配列番号４のアミノ酸配列を含む。配列番号４を以下に掲示する。
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【０１１１】
特定の態様では、配列番号２のＹ１０２に対応するアミノ酸は、アルギニンで置換され得る。特定の態様では、Ｊ鎖またはその機能的断片もしくはバリアントは、バリアントヒトＪ鎖であり、配列番号５のアミノ酸配列を含む。配列番号５を以下に掲示する。
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【０１１２】
ある種の態様では、本明細書において提供されるようなＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体のＪ鎖は、野生型成熟ヒトＪ鎖（配列番号２）のアミノ酸Ｔ１０３に対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含む。「野生型成熟ヒトＪ鎖のアミノ酸Ｔ１０３に対応するアミノ酸」は、ヒトＪ鎖におけるＴ１０３に相同な、任意の種のＪ鎖配列におけるアミノ酸を意味する。配列番号２のＴ１０３に対応する位置は、少なくとも３７個の他の種のＪ鎖アミノ酸配列において保存されている。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，９５１，１３４号の図４を参照のこと。実施例において実証されるように、配列番号２のＴ１０３に対応する位置での特定の変異は、ヒトＦｃαμ受容体の変異型Ｊ鎖を含むＩｇＭ五量体への結合を阻害し得る。図２を参照のこと。ある種の態様では、配列番号２のＴ１０３に対応するアミノ酸は、任意のアミノ酸で置換され得る。特定の態様では、配列番号２のＴ１０３に対応するアミノ酸は、アラニンで置換され得る。特定の態様では、Ｊ鎖またはその機能的断片もしくはバリアントは、バリアントヒトＪ鎖であり、配列番号６のアミノ酸配列を含む。配列番号６を以下に掲示する。
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【０１１３】
ある種の態様では、本明細書において提供されるようなＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体のバリアントＪ鎖またはその機能断片は、野生型成熟ヒトＪ鎖（配列番号２）のアミノ酸Ｎ４９またはアミノ酸Ｓ５１に対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含み、ただし、Ｓ５１は、トレオニン（Ｔ）で置換されていないか、またはＪ鎖は、野生型成熟ヒトＪ鎖（配列番号２）のアミノ酸Ｎ４９及びＳ５１の両方に対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含む。また、「野生型成熟ヒトＪ鎖の配列番号２のアミノ酸Ｎ４９に対応するアミノ酸または配列番号２のＳ５１に対応するアミノ酸」は、ヒトＪ鎖におけるＮ４９及び／またはＳ５１に相同な、任意の種のＪ鎖配列におけるアミノ酸を意味する。配列番号２のＮ４９及びＳ５１に対応する位置は、少なくとも４３個の他の種のＪ鎖アミノ酸配列において保存されている。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，９５１，１３４号の図４を参照のこと。配列番号２のＮ４９及びＳ５１に対応するアミノ酸は、配列番号２のＩ５０に対応するアミノ酸と共にＪ鎖のＮ−結合型グリコシル化モチーフを構成する。従って、Ｎ４９及び／またはＳ５１の変異（Ｓ５１での単一のトレオニン置換を除く）は、このモチーフでのグリコシル化を阻止することができる。ある種の態様では、配列番号２のＮ４９に対応する位置のアスパラギンは、任意のアミノ酸で置換され得る。ある種の態様では、配列番号２のＮ４９に対応する位置のアスパラギンは、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換され得る。特定の態様では、配列番号２のＮ４９に対応する位置は、アラニン（Ａ）で置換され得る。特定の態様では、Ｊ鎖は、バリアントヒトＪ鎖であり、配列番号７のアミノ酸配列を含む。配列番号７を以下に掲示する。
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【０１１４】
ある種の態様では、配列番号２のＳ５１に対応する位置のセリンは、トレオニンを除く任意のアミノ酸で置換され得る。ある種の態様では、配列番号２のＳ５１に対応する位置のセリンは、アラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）で置換され得る。特定の態様では、配列番号２のＳ５１に対応する位置は、アラニン（Ａ）で置換され得る。特定の態様では、バリアントＪ鎖またはその機能断片は、バリアントヒトＪ鎖であり、配列番号８のアミノ酸配列を含む。配列番号８を以下に掲示する。
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【０１１５】
ある種の態様では、本明細書において提供されるような提供されるＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体のバリアントＪ鎖またはその機能断片は、例えば、米国特許第９，９５１，１３４号において提供されるような改変Ｊ鎖である。ある種の態様では、改変Ｊ鎖は異種ポリペプチドを更に含み、ここで、当該異種ポリペプチドはバリアントＪ鎖またはその機能断片に直接または間接的に融合される。ある種の態様では、異種ポリペプチドは、ペプチドリンカー、例えば、最少５アミノ酸以上２５アミノ酸以下からなるペプチドリンカーを介してバリアントＪ鎖またはその機能断片に融合される。ある種の態様では、ペプチドリンカーは、
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からなる。異種ポリペプチドは、バリアントＪ鎖またはその機能断片のＮ末端、バリアントＪ鎖またはその機能断片のＣ末端に融合され得、異種ポリペプチドは、バリアントＪ鎖またはその機能断片のＮ末端及びＣ末端の両方に融合され得る。ある種の態様では、異種ポリペプチドは、抗原結合ドメインを含む。ある種の態様では、異種ポリペプチドの結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ´断片、Ｆ（ａｂ´）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）断片、またはそれらの任意の組み合わせである。ある種の態様では、異種ポリペプチドは、ＣＤ３εに特異的に結合し得、例えば、提供されるＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体の血清半減期を増加させ得る改変バリアントＪ鎖またはその機能断片は、改変Ｊ鎖「Ｖ１５Ｊ」（配列番号９）のバリアントであり、例えば、配列番号１０（Ｖ１５Ｊ−Ｙ１０２Ａ）または配列番号２３（Ｖ１５Ｊ−Ｔ１０３Ａ）または配列番号２４（Ｖ１５Ｊ−Ｎ４９Ａ）のアミノ酸配列を含み得る。ある種の態様では、改変Ｊ鎖は、ＣＤ３εに特異的に結合する、Ｊ鎖のＮ末端に融合された異種ポリペプチド、例えば、ｓｃＦｖ抗体断片を含み得、改変Ｊ鎖を含むＩｇＭ抗体の血清半減期に影響を及ぼす、Ｊ鎖のＣ末端に融合された追加の異種ポリペプチド、例えば、ヒト血清アルブミンを更に含み得る。特定の態様では、改変Ｊ鎖は、配列番号１１（ＶＪＨ）のアミノ酸配列または、Ｊ鎖を含む五量体ＩｇＭ抗体もしくはＩｇＭ様抗体の血清半減期に影響を及ぼし得る、例えば、配列番号２のＹ１０２もしくはＴ１０３に対応する位置での１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換、挿入、もしくは欠失を有する、配列番号１１（ＶＪＨ）のアミノ酸配列のそのバリアントを含む。
【０１１６】
ある種の態様では、本明細書において提供されるようなＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号２３、配列番号２４のアミノ酸配列、またはそれらの任意の組み合わせを含む、本明細書において提供されるようなバリアントＪ鎖またはその機能断片を含む。
【０１１７】
ある種の態様では、本明細書において提供されるようなバリアントＪ鎖を含むＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体は、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域であって、１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を、当該１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて当該バリアントＩｇＭ重鎖定常領域と同一の参照ＩｇＭ重鎖定常領域と比較して含む当該バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を更に含み、ここで、当該バリアントＩｇＭ重鎖定常領域もまた、提供されるＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の血清半減期に影響を及ぼし得る。このようなＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体は、ある種の態様では、動物に投与された際に、ＩｇＭ重鎖定常領域における１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて同一であり、同一の動物種に同様に投与される参照ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体と比較して更に増加した血清半減期を示し得る。この態様によれば、参照ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体は、本明細書において提供されるようなバリアントＪ鎖、例えば、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号２３、配列番号２４のアミノ酸配列、またはそれらの任意の組み合わせを含むバリアントＪ鎖を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体であり得る。ある種の態様では、増加した血清半減期は、相加的なもの、または相加的を超えるもの、または相加的未満のものであり得る。例示的なバリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、本明細書の他箇所で提供され、これには、限定されるものではないが、配列番号１３、配列番号１４、配列番号３１、配列番号３２、または配列番号３４のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＩｇＭ重鎖定常領域が含まれる。
【０１１８】
ある種の態様では、本明細書において提供されるようなバリアントＪ鎖及び本明細書において提供されるようなバリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含むＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体の血清半減期は、バリアントＪ鎖のみまたはバリアントＩｇＭ定常領域のみを含む参照抗体と比較した、血清半減期の個々の増加の相加的なものであるか、相加的を超えるものであるか、または相加的未満のものである血清半減期の増加を含む。
【０１１９】
ＩｇＭ血清半減期に影響を及ぼすＪ鎖バリアント
本開示は、五量体ＩｇＭ抗体または五量体ＩｇＭ様抗体の一部として、その抗体の血清半減期を増加させることができる単離バリアントＪ鎖またはその機能断片を提供する。提供されるバリアントＪ鎖またはその機能断片は、任意の種のものであり得、１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を、当該１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、挿入、または欠失を除いてバリアントＪ鎖と同一の参照Ｊ鎖と比較して含む。用語「１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、挿入、及び欠失」は、バリアントＪ鎖のアミノ酸配列の各アミノ酸が、個別に置換、欠失され得るか、またはそれに隣接して挿入された単一アミノ酸を有し得るが、バリアントＪ鎖またはその機能断片は、依然としてＩｇＭ重鎖またはＩｇＭ様重鎖及び抗体軽鎖と集合して、ＩｇＭ五量体またはＩｇＭ様五量体を形成する機能を果たすことが可能でなければならないことを意味する。ある種の態様では、本明細書において提供されるようなバリアントＪ鎖またはその機能断片は、単一アミノ酸置換、挿入、または欠失、２つの単一アミノ酸置換、挿入、または欠失の組み合わせ（例えば、２つの単一アミノ酸置換、または１つの単一アミノ酸置換及び１つの単一アミノ酸挿入もしくは欠失）、３つの単一アミノ酸置換、挿入、または欠失の組み合わせ、４つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、挿入、または欠失の組み合わせを有し得、ここで、当該１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、挿入、または欠失は、個別にまたは集合的に、当該バリアントＪ鎖またはその機能断片を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の血清半減期に影響を及ぼし得る。ある種の態様では、１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、挿入、または欠失は、バリアントＪ鎖を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の相互作用、例えば、受容体、例えば、ＦｃαμＲまたはｐＩｇＲへの結合を阻害する。
【０１２０】
ある種の態様では、本明細書において提供されるような提供されるバリアントＪ鎖またはその機能断片を含むＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体の血清半減期、例えば、α半減期、β半減期または総合的な半減期は、参照抗体と比較して少なくとも０．１倍、少なくとも０．５倍、少なくとも１倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍以上増加し得る。ある種の態様では、血清半減期の増加は、同一の抗原結合ドメインを含むＩｇＧ抗体の血清半減期に近づく。
【０１２１】
ある種の態様では、提供されるバリアントＪ鎖を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体は、他の改変された薬物動態学的パラメータ、例えば、参照抗体と比較して、増加したピーク血漿濃度（Ｃｍａｘ）、増加したＴ０から∞までの曲線下面積（ＡＵＣ）、改変されたクリアランス時間、増加した平均滞留時間（ＭＲＴ）、またはそれらの任意の組み合わせを更に示す。ある種の態様では、ＡＵＣは、バリアントＪ鎖またはその機能断片における１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて同一である参照ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体と比較して少なくとも０．１倍、少なくとも０．５倍、少なくとも１倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍以上増加し得、ここで、当該提供される抗体及び当該参照抗体の両方は、同一の動物種に同様に投与される。
【０１２２】
ある種の態様では、本明細書において提供されるような単離バリアントＪ鎖またはその機能断片は、野生型成熟ヒトＪ鎖（配列番号２）のアミノ酸Ｙ１０２に対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含む。「野生型成熟ヒトＪ鎖のアミノ酸Ｙ１０２に対応するアミノ酸」は、ヒトＪ鎖におけるＹ１０２に相同な、任意の種のＪ鎖配列におけるアミノ酸を意味する。配列番号２のＹ１０２に対応する位置は、少なくとも４３個の他の種のＪ鎖アミノ酸配列において保存されている。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，９５１，１３４号の図４を参照のこと。下記の実施例において記載されるように、配列番号２のＹ１０２に対応する位置での特定のアミノ酸置換は、バリアントＪ鎖のＦｃアルファ−ミュー（Ｆｃαμ）受容体への結合及び多量体Ｉｇ受容体（ｐＩｇ受容体またはｐＩｇＲ）への結合を阻害する。ある種の態様では、配列番号２のＹ１０２に対応するアミノ酸は、任意のアミノ酸で置換され得る。ある種の態様では、配列番号２のＹ１０２に対応するアミノ酸は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、またはアルギニン（Ｒ）で置換され得る。特定の態様では、配列番号２のＹ１０２は、アラニンで置換され得る。特定の態様では、バリアントＪ鎖またはその機能断片は、バリアントヒトＪ鎖であり、配列番号３のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、配列番号２のＹ１０２に対応するアミノ酸は、セリンで置換され得る。特定の態様では、バリアントＪ鎖またはその機能断片は、バリアントヒトＪ鎖であり、配列番号４のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、配列番号２のＹ１０２に対応するアミノ酸は、アルギニンで置換され得る。特定の態様では、バリアントＪ鎖またはその機能断片は、バリアントヒトＪ鎖であり、配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【０１２３】
ある種の態様では、本明細書において提供されるような単離バリアントＪ鎖またはその機能断片は、野生型成熟ヒトＪ鎖（配列番号２）のアミノ酸Ｔ１０３に対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含む。「野生型成熟ヒトＪ鎖のアミノ酸Ｔ１０３に対応するアミノ酸」は、ヒトＪ鎖におけるＴ１０３に相同な、任意の種のＪ鎖配列におけるアミノ酸を意味する。配列番号２のＴ１０３に対応する位置は、少なくとも３７個の他の種のＪ鎖アミノ酸配列において保存されている。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，９５１，１３４号の図４を参照のこと。下記の実施例において記載されるように、配列番号２のＴ１０３に対応する位置でのアミノ酸置換は、バリアントＪ鎖の免疫グロブリンＦｃαμ受容体への結合を阻害する。ある種の態様では、配列番号２のＴ１０３に対応するアミノ酸は、任意のアミノ酸で置換され得る。ある種の態様では、配列番号２のＴ１０３に対応するアミノ酸は、アラニン（Ａ）で置換され得る。特定の態様では、バリアントＪ鎖またはその機能断片は、バリアントヒトＪ鎖であり、配列番号６のアミノ酸配列を含む。
【０１２４】
ある種の態様では、本開示は、成熟ヒトＪ鎖（配列番号２）のアミノ酸Ｎ４９またはアミノ酸Ｓ５１に対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含む単離バリアントＪ鎖またはその機能断片を提供し、ただし、Ｓ５１は、トレオニン（Ｔ）で置換されていないか、またはＪ鎖は、野生型成熟ヒトＪ鎖（配列番号２）のアミノ酸Ｎ４９及びＳ５１の両方に対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含む。また、「野生型ヒトＪ鎖の配列番号２のアミノ酸Ｎ４９に対応するアミノ酸または配列番号２のＳ５１に対応するアミノ酸」は、ヒトＪ鎖におけるＮ４９及び／またはＳ５１に相同な、任意の種のＪ鎖配列におけるアミノ酸を意味する。配列番号２のＮ４９及びＳ５１に対応する位置は、少なくとも４３個の他の種のＪ鎖アミノ酸配列において保存されている。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，９５１，１３４号の図４を参照のこと。配列番号２のＮ４９及びＳ５１に対応するアミノ酸は、配列番号２のＩ５０に対応するアミノ酸と共にＪ鎖のＮ−結合型グリコシル化モチーフを構成し、従って、Ｎ４９及び／またはＳ５１での変異（Ｓ５１のトレオニン置換を除く）は、このモチーフで起こり得るグリコシル化を阻止することができる。ある種の態様では、配列番号２のＮ４９に対応する位置のアスパラギンは、任意のアミノ酸で置換され得る。ある種の態様では、配列番号２のＮ４９に対応する位置のアスパラギンは、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換され得る。特定の態様では、配列番号２のＮ４９に対応する位置は、アラニン（Ａ）で置換され得る。特定の態様では、バリアントＪ鎖またはその機能断片は、バリアントヒトＪ鎖であり、配列番号７のアミノ酸配列を含む。ある種の態様では、配列番号２のＳ５１に対応する位置のセリンは、任意のアミノ酸（トレオニンを除く）で置換され得る。ある種の態様では、配列番号２のＳ５１に対応する位置のセリンは、アラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）で置換され得る。特定の態様では、配列番号２のＳ５１に対応する位置は、アラニン（Ａ）で置換され得る。特定の態様では、バリアントＪ鎖またはその機能断片は、バリアントヒトＪ鎖であり、配列番号８のアミノ酸配列を含む。
【０１２５】
ある種の態様では、本明細書において提供されるようなバリアントＪ鎖またはその機能断片は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号２３、配列番号２４のアミノ酸配列、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１２６】
増加した血清半減期を付与するバリアントＩｇＭ定常領域
本開示は、増強された血清半減期を有するＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を更に提供し、ここで、当該ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体は、５つまたは６つの二価抗体の結合ユニットまたはそのバリアントもしくは断片を含み、各結合ユニットは、各々が抗原結合ドメインまたはそのサブユニットと会合している２つのバリアントＩｇＭ重鎖定常領域またはその多量体化断片を含む。提供されるバリアントＩｇＭ重鎖定常領域またはその多量体化断片は、それぞれ、１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を、当該１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて当該バリアントＩｇＭ重鎖定常領域と同一の参照ＩｇＭ重鎖定常領域と比較して含む。ある種の態様では、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、単独または本開示の他箇所で提供されるバリアントＪ鎖、バリアント改変Ｊ鎖、もしくはそれらの機能断片との組み合わせのいずれかで、提供されるＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の血清半減期に影響を及ぼし得、例えば、増加させ得る。「参照ＩｇＭ重鎖定常領域」は、１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いてバリアントＩｇＭ重鎖定常領域と同一であるＩｇＭ重鎖定常領域を意味する。ある種の態様では、バリアントＩｇＭ定常領域またはその多量体化断片は、本明細書において提供されるような五量体または六量体ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の一部として発現された場合、対象動物に投与された際に、同一の動物に同様に投与される参照ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体と比較して増加した血清半減期をＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体に付与し、ここで、当該参照ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体は、ＩｇＭ重鎖定常領域における１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて同一であり、同一の動物種に同様に投与される。ある種の態様では、バリアントＩｇＭ定常領域は、参照ＩｇＭ定常領域と比較して、例えば、Ｃμ４ドメインにおける１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失を含む。血清半減期を測定するためのアッセイは、当業者に周知であり、例示的なアッセイは、本明細書及び例えば、米国特許出願公開第ＵＳ−２０１８−０２６５５９６−Ａ１号に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２７】
ある種の態様では、本明細書において提供されるようなＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体に増加した血清半減期を付与するバリアントＩｇＭ重鎖定常領域またはその多量体化断片は、同様にＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の血清半減期を増加させるバリアントＪ鎖、例えば、本明細書の他箇所で提供されるバリアントＪ鎖を有する提供される五量体ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の血清半減期を更に増加させ得る。ある種の態様では、血清半減期の増加は相加的である。ある種の態様では、血清半減期の増加は、相加的を超えるもの、または相加的未満のものである。
【０１２８】
本明細書において提供されるように、バリアントＩｇＭ定常領域またはその多量体化断片は、当該バリアントＩｇＭ定常領域または断片を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の血清半減期に影響を及ぼす１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、または挿入を含み得る。用語「１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、挿入、及び欠失」は、バリアントＩｇＭ定常領域またはその多量体化断片の各アミノ酸が、個別に置換、欠失され得るか、またはそれに隣接して挿入された単一アミノ酸を有し得るが、バリアントＩｇＭ定常領域またはその多量体化断片は、依然としてＩｇＭまたはＩｇＭ様結合分子、例えば、抗体内でＩｇＭ五量体もしくは六量体またはＩｇＭ様五量体もしくは六量体を形成する機能を果たすことが可能でなければならないことを意味する。ある種の態様では、本明細書において提供されるようなバリアントＩｇＭ定常領域またはその多量体化断片は、単一アミノ酸置換、挿入、または欠失、２つの単一アミノ酸置換、挿入、及び／または欠失の組み合わせ（例えば、２つの単一アミノ酸置換、または１つの単一アミノ酸置換及び１つの単一アミノ酸挿入もしくは欠失）、３つの単一アミノ酸置換、挿入、及び／または欠失の組み合わせ、４つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、挿入、及び／または欠失の組み合わせを有し得、ここで、当該１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、挿入、及び／または欠失は、バリアントＩｇＭ定常領域またはその多量体化断片を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の血清半減期に影響を及ぼし得る。従って、提供されるＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体は、動物に投与された際に、バリアントＩｇＭ定常領域またはその多量体化断片における１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、欠失、及び／または挿入を除いて、同一である参照ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体と比較して増加した血清半減期を示し、ここで、当該提供される抗体及び当該参照抗体の両方は同一の動物種に同様に投与される。
【０１２９】
ある種の態様では、ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体の血清半減期、例えば、α半減期、β半減期、または総合的な半減期は、参照抗体と比較して少なくとも０．１倍、少なくとも０．５倍、少なくとも１倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍以上増加し得る。ある種の態様では、血清半減期の増加は、同一の抗原結合ドメインを含むＩｇＧ抗体の血清半減期に近づく。ある種の態様では、バリアントＩｇＭ定常領域またはその多量体化断片は、更に血清半減期を増加させるための他のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の改変と組み合わせられ得、例えば、本明細書において提供されるようなバリアントＩｇＭ定常領域またはその多量体化断片は、相加的または相加的を超える（例えば、相乗的な）血清半減期の増加を提供するために、本明細書の他箇所で記載されるアミノ酸置換、欠失、及び／または挿入を含むＪ鎖と組み合わせられ得る。
【０１３０】
ある種の態様では、本明細書において提供されるようなバリアントＩｇＭ定常領域またはその多量体化断片を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体は、他の改変された薬物動態学的パラメータ、例えば、参照抗体と比較して、増加したピーク血漿濃度（Ｃｍａｘ）、増加したＴ０から∞までの曲線下面積（ＡＵＣ）、改変されたクリアランス時間、増加した平均滞留時間（ＭＲＴ）、またはそれらの任意の組み合わせを更に示す。
【０１３１】
ある種の態様では、本明細書において提供されるようなＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体のバリアントＩｇＭ定常領域またはその多量体化断片は、野生型ヒトＩｇＭ定常領域（配列番号１２）のアミノ酸Ｓ４０１に対応し、またＫａｂａｔ番号付けシステムに従ってアミノ酸Ｓ５２４にも対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含む。「野生型ヒトＩｇＭ定常領域のアミノ酸Ｓ４０１に対応するアミノ酸」は、ヒトＩｇＭ定常領域におけるＳ４０１に相同な、任意の種のＩｇＭ定常領域配列におけるアミノ酸を意味する。配列番号１２のＳ４０１に対応する位置は、一部の種、例えば、非ヒト霊長類のＩｇＭ定常領域アミノ酸配列において保存されているが、他の種、例えば、マウスにおいては保存されていない。図１を参照のこと。ある種の態様では、配列番号１２のＳ４０１は、任意のアミノ酸で置換され得る。ある種の態様では、配列番号１２のＳ４０１は、アラニン（Ａ）で置換され得る。特定の態様では、バリアントＩｇＭ定常領域は、配列番号１３として本明細書に掲示される、Ｓ４０１Ａ変異を含むバリアントヒトＩｇＭ定常領域である。配列番号１３を、太下線内のＳ４０１Ａ変異と共に以下に掲示する：
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【０１３２】
ある種の態様では、本明細書において提供されるようなＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体のバリアントＩｇＭ定常領域またはその多量体化断片は、野生型ヒトＩｇＭ定常領域（配列番号１２）のアミノ酸Ｅ４０２に対応し、またＫａｂａｔ番号付けシステムに従ってアミノ酸Ｅ５２５にも対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含む。「野生型ヒトＩｇＭ定常領域のアミノ酸Ｅ４０２に対応するアミノ酸」は、ヒトＩｇＭ定常領域におけるＥ４０２に相同な、任意の種のＩｇＭ定常領域配列におけるアミノ酸を意味する。配列番号１２のＥ４０２に対応する位置は、一部の種、例えば、非ヒト霊長類及びマウスのＩｇＭ定常領域アミノ酸配列において保存されている。図１を参照のこと。ある種の態様では、配列番号１２のＥ４０２は、任意のアミノ酸で置換され得る。ある種の態様では、配列番号１２のＥ４０２は、アラニン（Ａ）で置換され得る。特定の態様では、バリアントＩｇＭ定常領域は、配列番号１４として本明細書に掲示される、Ｅ４０２Ａ変異を含むバリアントヒトＩｇＭ定常領域である。配列番号１４を、太下線内のＥ４０２Ａ変異と共に以下に掲示する。
2021514618.tif 000018
【０１３３】
ある種の態様では、本明細書において提供されるようなＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体のバリアントＩｇＭ定常領域またはその多量体化断片は、野生型ヒトＩｇＭ定常領域（配列番号１２）のアミノ酸Ｅ４０３に対応し、またＫａｂａｔ番号付けシステムに従ってアミノ酸Ｅ５２６にも対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含む。「野生型ヒトＩｇＭ定常領域のアミノ酸Ｅ４０３に対応するアミノ酸」は、ヒトＩｇＭ定常領域におけるＥ４０３に相同な、任意の種のＩｇＭ定常領域配列におけるアミノ酸を意味する。配列番号１２のＥ４０３に対応する位置は、一部の種、例えば、非ヒト霊長類及びマウスのＩｇＭ定常領域アミノ酸配列において保存されている。図１を参照のこと。ある種の態様では、配列番号１２のＥ４０３は、任意のアミノ酸で置換され得る。ある種の態様では、配列番号１２のＥ４０３は、アラニン（Ａ）で置換され得る。特定の態様では、バリアントＩｇＭ定常領域は、配列番号３４として本明細書に掲示される、Ｅ４０３Ａ変異を含むバリアントヒトＩｇＭ定常領域である。配列番号３４を、太下線内のＥ４０３Ａ変異と共に以下に掲示する。
2021514618.tif 000019
【０１３４】
ある種の態様では、本明細書において提供されるようなＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体のバリアントＩｇＭ定常領域またはその多量体化断片は、野生型ヒトＩｇＭ定常領域（配列番号１２）のアミノ酸Ｒ３４４に対応し、またＫａｂａｔ番号付けシステムに従ってアミノ酸Ｒ４６７にも対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含む。「野生型ヒトＩｇＭ定常領域のアミノ酸Ｒ３４４に対応するアミノ酸」は、ヒトＩｇＭ定常領域におけるＲ３４４に相同な、任意の種のＩｇＭ定常領域配列におけるアミノ酸を意味する。配列番号１２のＲ３４４に対応する位置は、一部の種、例えば、非ヒト霊長類及びマウスのＩｇＭ定常領域アミノ酸配列において保存されている。図１を参照のこと。ある種の態様では、配列番号１２のＲ３４４は、任意のアミノ酸で置換され得る。ある種の態様では、配列番号１２のＲ３４４は、アラニン（Ａ）で置換され得る。特定の態様では、バリアントＩｇＭ定常領域は、配列番号３１として本明細書に掲示される、Ｒ３４４Ａ変異を含むバリアントヒトＩｇＭ定常領域である。配列番号３１を、太下線内のＲ３４４Ａ変異と共に以下に掲示する。
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【０１３５】
ある種の態様では、本明細書において提供されるようなＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体のバリアントＩｇＭ定常領域またはその多量体化断片は、野生型ヒトＩｇＭ定常領域（配列番号１２）のアミノ酸Ｅ３４５に対応し、またＫａｂａｔ番号付けシステムに従ってアミノ酸Ｅ４６８にも対応するアミノ酸位でのアミノ酸置換を含む。「野生型ヒトＩｇＭ定常領域のアミノ酸Ｅ３４５に対応するアミノ酸」は、ヒトＩｇＭ定常領域におけるＥ３４５に相同な、任意の種のＩｇＭ定常領域配列におけるアミノ酸を意味する。配列番号１２のＥ３４５に対応する位置は、一部の種、例えば、非ヒト霊長類及びマウスのＩｇＭ定常領域アミノ酸配列において保存されている。図１を参照のこと。ある種の態様では、配列番号１２のＥ３４５は、任意のアミノ酸で置換され得る。ある種の態様では、配列番号１２のＥ３４５は、アラニン（Ａ）で置換され得る。特定の態様では、バリアントＩｇＭ定常領域は、配列番号３２として本明細書に掲示される、Ｅ３４５Ａ変異を含むバリアントヒトＩｇＭ定常領域である。配列番号３２を、太下線内のＥ３４５Ａ変異と共に以下に掲示する。
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【０１３６】
減少したＣＤＣ活性を有するバリアントヒトＩｇＭ定常領域
ある種の態様では、バリアントヒトＩｇＭ定常領域は、本明細書において提供されるようなＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の一部として発現される場合、減少したＣＤＣ活性を付与する変異を除いて同一の対応する参照ヒトＩｇＭ定常領域を有する参照ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体と比較して、細胞に対する減少した補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）活性を補体存在下で更に示し得る。これらのＣＤＣ変異は、本明細書において提供される増加した血清半減期を付与する変異のいずれかと組み合わされ得る。「対応する参照ヒトＩｇＭ定常領域」は、定常領域におけるＣＤＣ活性に影響を及ぼす１つまたは複数の改変を除いてバリアントＩｇＭ定常領域と同一な、ヒトＩｇＭ定常領域またはその一部、例えば、Ｃμ３ドメインを意味する。ある種の態様では、バリアントヒトＩｇＭ定常領域は、上記のような野生型ヒトＩｇＭ定常領域と比較して、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２６４７４号に記載のような、例えば、Ｃμ３ドメインにおける、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。ＣＤＣを測定するためのアッセイは当業者に周知であり、例示的なアッセイは、例えば、ＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２６４７４号に記載されている。
【０１３７】
ある種の態様では、減少したＣＤＣ活性を付与するバリアントヒトＩｇＭ定常領域は、配列番号１２のＰ３１１位での野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対応するアミノ酸置換を含む。他の態様では、本明細書において提供されるようなバリアントＩｇＭ定常領域は、配列番号１２のＰ３１３位での野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対応するアミノ酸置換を含む。他の態様では、本明細書において提供されるようなバリアントＩｇＭ定常領域は、配列番号１２のＰ３１１位及び配列番号１２のＰ３１３位の野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対応する置換の組み合わせを含む。配列番号１２のバリアントＩｇＭ定常領域は、アミノ酸位Ｐ３１１で、例えば、アラニン（Ｐ３１１Ａ）、セリン（Ｐ３１１Ｓ）、またはグリシン（Ｐ３１１Ｇ）に置換され得る。配列番号１２のバリアントＩｇＭ定常領域は、アミノ酸位Ｐ３１３で、例えば、アラニン（Ｐ３１３Ａ）、セリン（Ｐ３１３Ｓ）、またはグリシン（Ｐ３１３Ｇ）に置換され得る。配列番号１２のバリアントＩｇＭ定常領域は、アミノ酸位Ｐ３１１及びＰ３１３で、それぞれ、アラニン（Ｐ３１１Ａ）及びセリン（Ｐ３１３Ｓ）に、またはアラニン、セリン、及び／またはグリシンの任意の組み合わせに置換され得る（配列番号１５）。配列番号１５を、太下線内のＰ３１１Ａ及びＰ３１３Ｓ変異と共に以下に掲示する。
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【０１３８】
一態様では、Ｐ３１１及び／またはＰ３１３でのアミノ酸置換、例えば、Ｐ３１１Ａ、Ｐ３１１Ｓ、Ｐ３１１Ｇ、Ｐ３１３Ａ、Ｐ３１３Ｓ、及び／またはＰ３１３Ｇ、またはそれらの任意の組み合わせを含むバリアントヒトＩｇＭ定常領域を含む、本明細書において提供されるようなＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体は、対応する野生型ＩｇＭ定常領域を含む結合分子と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少した、用量反応アッセイにおいて達成される最大のＣＤＣを有する。
【０１３９】
ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞
本開示は、本明細書において提供されるようなＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体のポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、例えば、単離、組換え、及び／または非天然ポリヌクレオチドを更に提供する。「ポリペプチドサブユニット」は、独立して翻訳され得る、結合分子、結合ユニット、ＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、または抗原結合ドメインの一部を意味する。例には、限定されるものではないが、抗体可変ドメイン、例えば、ＶＨまたはＶＬ、Ｊ鎖、分泌成分、単鎖Ｆｖ、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖定常領域、抗体軽鎖定常領域、及び／またはそれらの任意の断片、バリアント、もしくは誘導体が含まれる。
【０１４０】
ある種の態様では、ポリペプチドサブユニットは、全てが本明細書において提供されるような、抗原結合ドメインまたはそのサブユニットに、例えば、抗原結合ドメインのＶＨ部分に、融合され得るＩｇＭ重鎖定常領域もしくはＩｇＭ様重鎖定常領域またはそれらの多量体化断片を含み得る。ある種の態様では、ポリヌクレオチドは、ヒトＩｇＭ重鎖定常領域、ヒトＩｇＭ様重鎖定常領域、またはそれらの多量体化断片、例えば、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号３１、配列番号３２、または配列番号３４を含むポリペプチドサブユニットをコードし得、これらのいずれかは、抗原結合ドメインまたはそのサブユニット、例えば、ＶＨのＣ末端に融合され得る。
【０１４１】
ある種の態様では、ポリペプチドサブユニットは、本明細書の他箇所で記載される抗原結合ドメインの抗体ＶＬ部分を含み得る。ある種の態様では、ポリペプチドサブユニットは、ＶＬのＣ末端に融合され得る、抗体軽鎖定常領域、例えば、ヒト抗体軽鎖定常領域またはその断片を含み得る。
【０１４２】
ある種の態様では、ポリペプチドサブユニットは、本明細書において提供されるようなＪ鎖、改変Ｊ鎖、またはそれらの任意の機能的断片もしくはバリアントを含み得る。ある種の態様では、ポリペプチドサブユニットは、改変Ｊ鎖を含む、ヒトＪ鎖またはその機能的断片もしくはバリアントを含み得る。ある種の態様では、Ｊ鎖は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号２３、または配列番号２４のアミノ酸配列を含み得る。
【０１４３】
ある種の態様では、本明細書において提供されるようなポリヌクレオチド、例えば、プラスミドなどの発現ベクターは、１種のポリペプチドサブユニット、例えば、ＩｇＭ重鎖もしくはＩｇＭ様重鎖、軽鎖、またはＪ鎖をコードする核酸配列を含み得るか、または本明細書において提供されるようなＩｇＭ抗体もしくはＩｇＭ様抗体の２種またはそれ以上もしくは３種全てのポリペプチドサブユニットをコードする２種またはそれ以上の核酸配列を含み得る。あるいは、３種のポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列は、別個のポリヌクレオチド、例えば、別個の発現ベクター上に存在し得る。本開示は、このような単一または複数の発現ベクターを提供する。本開示は、提供されるポリヌクレオチド（複数可）または発現ベクター（複数可）をコードする１種またはそれ以上の宿主細胞も提供する。
【０１４４】
従って、抗原結合ドメインを形成するために、抗体の可変領域をコードする核酸配列が、ＩｇＭまたはＩｇＭ様構造体用の発現ベクターテンプレート、特に、本明細書において提供されるようなバリアントＩｇＭ重鎖定常領域、例えば、配列番号１３、配列番号１４、配列番号３１、配列番号３２、または配列番号３４をコードするものに挿入され得、本明細書において提供されるＪ鎖またはその機能的断片もしくはバリアントをコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号２３、または配列番号２４をコードするポリヌクレオチド、より具体的には、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号２３、または配列番号２４のアミノ酸配列を含むバリアントＪ鎖をコードするポリヌクレオチドと更に組み合わされ得、これにより、５つまたは６つの結合ユニットを有し、本明細書の他箇所で記載されるＩｇＭ重鎖定常領域及び／またはＪ鎖における１つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換、挿入、または欠失を除いて同一構造のＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体と比較して増加した血清半減期を持つＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体が作製される。要約すると、重鎖及び軽鎖可変ドメイン配列をコードする核酸配列が、合成され得るか、または既存の分子から増幅され得、発現された際に、ベクターが所望の全長重鎖または軽鎖をもたらすように、１種またはそれ以上のベクターに適切な方向かつインフレームで挿入され得る。これらの目的に有用なベクターは、当技術分野において公知である。このようなベクターは、所望の鎖の発現を得るために必要なエンハンサー及び他の配列も含み得る。複数のベクターまたは単一ベクターが使用され得、バリアントＪ鎖またはその機能断片を更にコードし得る。このベクターまたはこれらのベクターは、宿主細胞に形質移入され得、次いで、重鎖及び／または軽鎖ならびにバリアントＪ鎖またはその機能断片が発現され、ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体がアセンブルされ、精製される。発現された際に、鎖は、増強された血清半減期を持つ完全に機能的な多量体ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体を形成する。完全にアセンブルされた多量体ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体は、次いで、標準的方法により精製され得る。発現及び精製プロセスは、必要に応じて、商業規模で実行され得る。
【０１４５】
本開示は、２種またはそれ以上のポリヌクレオチドを含む組成物を更に提供し、ここで、当該２種またはそれ以上のポリヌクレオチドは、上記のような、増強された血清半減期を有するＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体を全体としてコードし得る。ある種の態様では、組成物は、野生型またはバリアントであるＩｇＭもしくはＩｇＭ様重鎖またはそれらの多量体化断片、例えば、上記のような、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号３１、配列番号３２、または配列番号３４の定常領域アミノ酸配列を含む野生型またはバリアントヒトＩｇＭ重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み得、ここで、ＩｇＭまたはＩｇＭ様重鎖は、抗原結合ドメインまたはそのサブユニット、例えば、ＶＨドメインを更に含む。組成物は、軽鎖またはその断片、例えば、少なくとも抗原結合ドメインのＶＬを含むヒトκまたはラムダ軽鎖をコードするポリヌクレオチドを更に含み得る。提供されるポリヌクレオチド組成物は、Ｊ鎖、例えば、ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体の血清半減期を増強し得る、少なくとも１つの単一アミノ酸置換、挿入、または欠失を有するバリアントＪ鎖またはその機能断片、例えば、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号２３、または配列番号２４のアミノ酸配列を含むバリアント及び／または改変Ｊ鎖をコードするポリヌクレオチドを更に含み得る。ある種の態様では、本明細書において提供されるような組成物を構成するポリヌクレオチドは、２種、３種、またはそれ以上の別個のベクター、例えば、発現ベクター上に位置し得る。このようなベクターは、本開示により提供される。ある種の態様では、本明細書において提供されるような組成物を構成するポリヌクレオチドのうちの２種以上は、単一のベクター、例えば、発現ベクター上に位置し得る。このようなベクターは、本開示により提供される。
【０１４６】
本開示は、本明細書において提供されるようなＩｇＭもしくはＩｇＭ様抗体またはそれらの任意のサブユニットをコードする１種のポリヌクレオチドまたは２種もしくはそれ以上のポリヌクレオチド、本明細書において提供されるポリヌクレオチド組成物、または本明細書において提供されるようなＩｇＭもしくはＩｇＭ様抗体またはそれらの任意のサブユニットを全体としてコードする１種のベクターまたは２種、３種もしくはそれ以上のベクターを含む宿主細胞、例えば、原核または真核宿主細胞を更に提供する。
【０１４７】
関連する態様では、本開示は、本開示により提供されるような、増加した血清半減期を有するＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体を生成する方法を提供し、ここで、当該方法は、本明細書において提供されるような宿主細胞を培養すること、及び当該ＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体を回収することを含む。
【０１４８】
増加した血清半減期を付与することができるバリアントＪ鎖及び／またはバリアントＩｇＭ重鎖定常領域を同定する方法
本開示は、バリアント抗体サブユニットであって、当該サブユニットを含む抗体、例えば、ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の血清半減期を増加させることができる当該バリアント抗体サブユニットを同定するための様々な方法を更に提供する。これらの方法は、当業者によく知られている分子生物学の標準的方法及び部位特異的変異誘発を利用する。例示的な方法は、実施例セクションにおいて提供される。
【０１４９】
ある種の態様では、本開示は、バリアントＪ鎖であって、当該バリアントＪ鎖を含む五量体ＩｇＭ抗体、五量体ＩｇＭ様抗体、二量体ＩｇＡ抗体、及び／または二量体ＩｇＡ様抗体の血清半減期を増加させることができる当該バリアントＪ鎖を同定する方法を提供する。上記方法は、バリアントＪ鎖またはその断片を含むようにアセンブルされた、五量体ＩｇＭ抗体もしくは五量体ＩｇＭ様抗体または代替的に二量体ＩｇＡ抗体もしくは二量体ＩｇＡ様抗体を、対象動物における参照抗体と比較して増加した血清半減期について試験することを含み、ここで、当該参照抗体は、バリアントＪ鎖を除いて試験抗体と同一である。これらの態様によれば、既定のアミノ酸挿入、欠失、または置換を含む一連のバリアントＪ鎖またはその断片が構築され、参照Ｊ鎖、例えば、当該既定のアミノ酸挿入、欠失、または置換を除いて当該バリアントＪ鎖と同一のＪ鎖、改変Ｊ鎖、及び／またはその機能断片と比較して試験される。ある種の態様では、バリアントＪ鎖は、本明細書の他箇所で記載される１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の既定の単一アミノ酸置換、挿入、または欠失を含み得る。ある種の態様では、実施例１及び２においてより詳細に記載されるように、Ｊ鎖の限定された領域、例えば、特定の免疫グロブリン受容体、例えば、Ｆｃアルファ−ミュー受容体（ＦｃαμＲ）、多量体Ｉｇ受容体（ｐＩｇＲ）、Ｆｃミュー受容体（ＦｃμＲ）、上記受容体の２つまたはそれ以上、または上記受容体の３つ全てへの結合に必要であるか、または寄与する領域が、変異誘発の標的とされる。ある種の態様では、Ｊ鎖の全長が、例えば、Ｊ鎖（例えば、配列番号２）の各位置のアミノ酸を別のアミノ酸、例えば、アラニン、セリン、またはトレオニンで個別に置換することによって変異誘発に供され得る。次いで、変異型Ｊ鎖が、例えば、参照ＩｇＭ重鎖及び抗体軽鎖と共発現され得、得られた五量体ＩｇＭ抗体が、適切なアセンブリ、抗原結合性、及び任意の他の所望の機能について分析され得る。次いで、得られたＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体は、実施例にて記載されるように、対象動物、例えば、マウスモデルにおける増加した血清半減期について評価され得る。次いで、それぞれのＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体に増加した血清半減期を付与するＪ鎖が回収され、必要に応じて更に特徴付けられる。この方法は、バリアントＪ鎖であって、当該バリアントＪ鎖を含む二量体ＩｇＡ抗体またはＩｇＡ様抗体に増加した血清半減期を付与することができる当該バリアントＪ鎖を同様の方法を使用して同定するためにも適用され得る。
【０１５０】
ある種の態様では、本開示は、バリアントＪ鎖であって、当該バリアントＪ鎖を含む五量体ＩｇＭ抗体、五量体ＩｇＭ様抗体、二量体ＩｇＡ抗体、及び／または二量体ＩｇＡ様抗体の血清半減期を増加させることができる当該バリアントＪ鎖を同定する方法を提供する。上記方法は、バリアントＪ鎖またはその断片を含むようにアセンブルされた五量体ＩｇＭ抗体もしくは五量体ＩｇＭ様抗体または代替的に二量体ＩｇＡ抗体もしくは二量体ＩｇＡ様抗体を、特定の免疫グロブリン受容体、例えば、Ｆｃアルファ−ミュー受容体（ＦｃαμＲ）、多量体Ｉｇ受容体（ｐＩｇＲ）、Ｆｃミュー受容体（ＦｃμＲ）、上記受容体の２つまたはそれ以上、または上記受容体の３つ全てへの減少した結合について試験することを含む。変異誘発に供されるＪ鎖の領域は、例えば、実施例１に記載されているように、受容体結合に必要であるか、または寄与する領域を決定することによって、標的とされ得る。あるいは、Ｊ鎖の全長に沿ってアミノ酸が変異誘発に供され得、バリアントＪ鎖を含む得られた抗体が受容体結合について試験され得る。減少した受容体結合は、任意の適切なアッセイにより、例えば、実施例２において記載されるＥＬＩＳＡアッセイにより測定され得る。バリアントＪ鎖またはその断片は、上記及び本明細書の他箇所のように、既定のアミノ酸挿入、欠失、または置換を含むように構築される。次いで、抗体の１種またはそれ以上の受容体への減少した結合を付与するバリアントＪ鎖が、回収され得、必要に応じて更に特徴付けられ得る。上記方法は、回収されたバリアントＪ鎖またはその断片を含む五量体ＩｇＭ抗体もしくは五量体ＩｇＭ様抗体または二量体ＩｇＡ抗体もしくは二量体ＩｇＡ様抗体を、実施例において記載されるように、対象動物、例えば、マウスモデルにおける、バリアントＪ鎖またはその断片における既定のアミノ酸置換、欠失、または挿入を除いて同一の参照抗体と比較して増加した血清半減期について試験すること更に含み得る。この方法は、バリアントＪ鎖であって、当該バリアントＪ鎖を含む二量体ＩｇＡ抗体またはＩｇＡ様抗体に増加した血清半減期を付与することができる当該バリアントＪ鎖を同様の方法を使用して同定するためにも適用され得る。
【０１５１】
本開示は、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域（またはバリアントＩｇＡ重鎖定常領域）であって、当該バリアントＩｇＭ（またはＩｇＡ）重鎖定常領域を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体（またはＩｇＡ抗体もしくはＩｇＡ様抗体）の血清半減期を増加させることができる当該バリアントＩｇＭ重鎖定常領域（またはバリアントＩｇＡ重鎖定常領域）を同定する方法を更に提供する。ＩｇＭのための上記方法は、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を、対象動物における参照ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体と比較して増加した血清半減期について試験することを含み、ここで、当該バリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、既定のアミノ酸挿入、欠失、または置換を含み、当該参照ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体は、当該既定のアミノ酸挿入、欠失、または置換を除いて当該バリアントＩｇＭ重鎖定常領域と同じＩｇＭ重鎖定常領域を含む。上記方法は、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域であって、当該バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体に、参照ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体と比較して増加した血清半減期を付与する当該バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を回収することを更に含む。例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の既定の単一アミノ酸置換、挿入、または欠失を含む任意の数のバリアントＩｇＭまたはＩｇＭ様重鎖定常領域が試験され得る。変異誘発に供されるＩｇＭまたはＩｇＭ様重鎖定常領域の領域は、実施例において記載されるように、例えば、様々な免疫グロブリン受容体、例えば、Ｆｃアルファ−ミュー受容体（ＦｃαμＲ）、Ｆｃミュー受容体（ＦｃμＲ）、多量体Ｉｇ受容体（ｐＩｇＲ）、上記受容体の任意の２つの組み合わせ、または上記受容体の３つ全てへの結合に必要とされるか、または寄与する、例えば、Ｃμ４ドメイン内の領域を同定することによって、実験に基づいて決定され得る。あるいは、選択されたＣμドメインの全長またはＩｇＭ重鎖定常領域全体が、例えば、各位置のアミノ酸を異なるアミノ酸、例えば、アラニン、セリン、またはトレオニンで置換することにより変異誘発に供され得る。次いで、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、他の抗体サブユニット、例えば、抗体軽鎖及び任意でＪ鎖と共にアセンブルされ、適切なアセンブリ及び抗原結合性が試験される。次いで、試験抗体は、実施例において記載されるように、対象動物、例えば、マウスモデルにおける増加した血清半減期について評価され得る。この方法は、バリアントＩｇＡまたはＩｇＡ様重鎖定常領域であって、当該バリアント定常領域を含む二量体ＩｇＡ抗体またはＩｇＡ様抗体に増加した血清半減期を付与することができる当該バリアントＩｇＡまたはＩｇＡ様重鎖定常領域を同様の方法を使用して同定するためにも適用され得る。
【０１５２】
本開示は、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域（または代替的にバリアントＩｇＡ重鎖定常領域）であって、当該バリアント重鎖定常領域を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体（またはＩｇＡ抗体もしくはＩｇＡ様抗体）の血清半減期を増加させることができる当該バリアントＩｇＭ重鎖定常領域（または代替的にバリアントＩｇＡ重鎖定常領域）を同定する方法を更に提供する。ＩｇＭのための上記方法は、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を、Ｆｃアルファ−ミュー受容体（ＦｃαμＲ）、Ｆｃミュー受容体（ＦｃμＲ）、多量体Ｉｇ受容体（ｐＩｇＲ）、上記受容体の任意の２つの組み合わせ、または上記受容体の３つ全てへの、参照ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体と比較して減少した結合について試験することを含み、ここで、当該バリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、既定のアミノ酸挿入、欠失、または置換を含み、当該参照ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体は、当該既定のアミノ酸挿入、欠失、または置換を除いて当該バリアントＩｇＭ重鎖定常領域と同じＩｇＭ重鎖定常領域を含む。上記方法は、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域であって、当該バリアントＩｇＭ重鎖定常領域を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体に、参照ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体と比較して減少したＦｃαμＲ結合能、減少したＦｃμＲ結合能、減少したｐＩｇＲ結合能、上記受容体の任意の２つへの減少した結合能、または上記受容体の３つ全てへの減少した結合能を付与する当該バリアントＩｇＭ重鎖定常領域、を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を回収することを更に含む。例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の既定の単一アミノ酸置換、挿入、または欠失を含む任意の数のバリアントＩｇＭまたはＩｇＭ様重鎖定常領域が試験され得る。変異誘発に供されるＩｇＭまたはＩｇＭ様重鎖定常領域の領域は、実施例において記載されるように、例えば、様々な免疫グロブリン受容体、例えば、Ｆｃアルファ−ミュー受容体（ＦｃαμＲ）、Ｆｃミュー受容体（ＦｃμＲ）、多量体Ｉｇ受容体（ｐＩｇＲ）、上記受容体の任意の２つの組み合わせ、または上記受容体の３つ全てへの結合に必要とされるか、または寄与する、例えば、Ｃμ４ドメイン内の領域を同定することによって、実験に基づいて決定され得る。あるいは、選択されたＣμドメインの全長またはＩｇＭ重鎖定常領域全体が、例えば、各位置のアミノ酸を異なるアミノ酸、例えば、アラニン、セリン、またはトレオニンで置換することにより変異誘発に供され得る。次いで、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、他の抗体サブユニット、例えば、抗体軽鎖及び任意でＪ鎖と共にアセンブルされ、適切なアセンブリ及び抗原結合性が試験される。次いで、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、他の抗体サブユニット、例えば、抗体軽鎖及び任意でＪ鎖と共にアセンブルされ、適切なアセンブリ及び抗原結合性が試験される。減少した受容体結合は、任意の適切なアッセイにより、例えば、実施例２において記載されるＥＬＩＳＡアッセイにより測定され得る。次いで、回収されたバリアントＩｇＭまたはＩｇＭ様重鎖定常領域を含む試験抗体は、実施例において記載されるように、対象動物、例えば、マウスモデルにおける増加した血清半減期に��いて評価され得る。この方法は、バリアントＩｇＡまたはＩｇＡ様重鎖定常領域であって、当該バリアント定常領域を含む二量体ＩｇＡ抗体またはＩｇＡ様抗体に増加した血清半減期を付与することができる当該バリアントＩｇＡまたはＩｇＡ様重鎖定常領域を同様の方法を使用して同定するためにも適用され得る。
【０１５３】
使用方法
本開示は、処置を必要とする対象の疾患または障害を処置する方法であって、本明細書において提供されるようなＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体の治療上有効量を当該対象投与することを含む方法を更に提供する。「治療上有効な用量または治療上有効量」または「有効量」は、投与された場合に、対照の処置に関して、プラスの免疫療法応答をもたらすＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体の量を意図する。
【０１５４】
がんを処置するための組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、対象の生理的状態、対象がヒトであるかまたは動物であるか、投与される他の薬物、及び処置が予防的であるかまたは治療的であるかを含む、多数の異なる因子に応じて異なる。通常、対象はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物も処置され得る。安全性及び有効性を最適化するために、当業者に公知の定型的な方法を使用して、処置投与量が用量設定され得る。
【０１５５】
処置されるべき対象は、処置を必要とする任意の動物、例えば哺乳動物であり得、ある種の態様では、対象はヒト対象である。
【０１５６】
最も簡単な形態では、対象に投与されるべき調製物は、従来の剤形で投与される、本明細書において提供されるようなＩｇＭもしくはＩｇＭ様抗体、またはその多量体抗原結合断片であり、これらは、本明細書の他箇所で記載される医薬品賦形剤、担体、または希釈剤と組み合わされ得る。
【０１５７】
本開示の組成物は、任意の適切な方法によって、例えば、非経口的に、脳室内に、経口的に、吸入スプレーによって、局所的に、直腸に、経鼻的に、口腔に、経膣的に、または移植されたリザーバーを介して投与され得る。用語「非経口」は、本明細書で使用する場合、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝臓内、病巣内、及び頭蓋内への注射または注入技術を含む。
【０１５８】
医薬組成物及び投与方法
本明細書において提供されるようなＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体を調製し、それを必要とする対象に投与する方法は、当業者に公知であるか、または本開示を考慮して当業者によって容易に決定される。投与経路は、例えば、腫瘍内、経口、非経口、吸入によるもの、または局所であり得る。非経口という用語は、本明細書で使用する場合、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸内、または膣内投与を含む。これらの投与形態が適切な形態として企図される一方で、別の例の投与形態は、注射用の液剤、特に、腫瘍内、静脈内、または動脈内の注射または点滴用の液剤である。適切な医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸、リン酸、またはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、任意で安定剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含み得る。
【０１５９】
本明細書において述べるように、本明細書において提供されるようなＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体は、それを必要とする対象の処置のために薬学的有効量で投与され得る。これに関して、本開示のＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体は、投与を容易にし、活性薬剤の安定性を促進するように製剤化され得ることが理解されよう。従って、医薬組成物は、薬学的に許容される非毒性の無菌担体、例えば、生理食塩水、非毒性緩衝液、防腐剤などを含み得る。本明細書において提供されるようなＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体の薬学的有効量は、標的への効果的な結合を達成するために、及び治療効果を達成するために十分な量を意味する。適切な製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ）（２００５）に記載されている。
【０１６０】
本明細書において提供されるある種の医薬組成物は、例えば、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤、または溶剤を含む、許容される剤形で経口投与され得る。またある種の医薬組成物は、経鼻エアロゾルまたは吸入によっても投与され得る。このような組成物は、ベンジルアルコールもしくは他の適切な防腐剤、生物学的利用能を増強するための吸収促進剤、及び／または他の従来の可溶化剤もしくは分散剤を用いて、生理食塩水中の溶剤として調製され得る。
【０１６１】
単一剤形を生成するために担体材料と組み合わされ得るＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体の量は、例えば、処置される対象及び特定の投与様式に応じて異なる。組成物は、単一用量として、複数用量として、または確立された期間にわたり注入で投与され得る。また投薬計画も、最適な所望の応答（例えば、治療応答または予防応答）を提供するように調整され得る。
【０１６２】
本開示の範囲に合わせて、本明細書において提供されるようなＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体が、治療効果をもたらすのに十分な量で、治療を必要とする対象に投与され得る。本明細書において提供されるようなＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体は、公知の技法に従って、本開示の抗体、またはその多量体抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体を従来の薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせることによって調製された従来の剤形で、対象に投与され得る。薬学的に許容される担体または希釈剤の形態及び特徴は、それと組み合わされるべき活性成分の量、投与経路、及び他の周知の変数によって決定され得る。
【０１６３】
また本開示は、がんを処置する、予防する、または管理するための薬剤の製造における、本明細書において提供されるようなＩｇＭまたはＩｇＭ様抗体の使用も提供する。
【０１６４】
本開示は、特に明記しない限り、当業者の技能範囲内にある、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来技術を用いる。このような技術は、文献において詳細に説明されている。例えば、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｄ．（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ  ｅｄ．；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）；Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ，ｅｄｓ．，（１９９５）ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ），Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４；Ｇａｉｔ，ｅｄ．（１９９０）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４，６８３，１９５号；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２０１６）Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）；Ｗｏｏｄｗａｒｄ，Ｊ．，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）（１９８５）；Ｐｅｒｂａｌ（１９８８）Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；２ｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）；Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．（１９８７）Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｓ．Ｃ．Ｍａｋｒｉｄｅｓ（２００３）Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５１−１５５（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）を参照のこと。
【０１６５】
抗体工学の一般的原理は、例えば、Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｌ．Ｍ．Ｓｔｒｏｈｌ（２０１２），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｗｏｏｄｈｅａｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）に記載されている。タンパク質工学の一般的原理は、例えば、Ｐａｒｋ  ａｎｄ  Ｃｏｃｈｒａｎ，ｅｄｓ．（２００９），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ（ＣＤＣ  Ｐｒｅｓｓ）に記載されている。免疫学の一般的原理は、例えば、Ａｂｂａｓ  ａｎｄ  Ｌｉｃｈｔｍａｎ（２０１７）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）に記載されている。加えて、当該技術分野において公知の免疫学における標準的方法は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  Ｏｎｌｉｎｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ）；Ｗｉｌｄ，Ｄ．（２０１３），Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）；Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，ｅｄ．（２０１３），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）；及びＯｓｓｉｐｏｗ  ａｎｄ  Ｆｉｓｃｈｅｒ，ｅｄｓ．，（２０１４），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）における通りに従い得る。
【０１６６】
上記で引用された参考文献の全て、及び本明細書において引用される全ての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６７】
以下の実施例は、例証として提供されるものであり、限定するために提供されるものではない。
【実施例】
【０１６８】
本発明者らは、ＩｇＭとそのＩｇ受容体である、Ｆｃμ受容体（ＦｃμＲ）、Ｆｃα／μ受容体（ＦｃαμＲ）、及び／または多量体Ｉｇ受容体（ｐＩｇＲ）のうちの１つまたはそれ以上との間の相互作用が、ＩｇＭ抗体についてインビボで観察される特定の薬物動態学及び薬力学に寄与すると仮説を立てた。従って、本発明者らは、これらの受容体への結合に関与するＩｇＭの特異的領域を同定することを目指し、これらの領域の改変、例えば、アミノ酸置換が当該改変を含むＩｇＭ抗体への受容体の結合を調節、例えば、阻害することができるかどうか問うた。次いで、本発明者らは、特定のこれらの改変が、当該改変を含むＩｇＭ抗体のインビボでの血漿内利用能に影響を及ぼしたかどうかを試験した。
【０１６９】
実施例１：Ｊ鎖スクリーニング及び受容体結合についてのＦｃμペプチドアレイ
ＦｃμＲ、ＦｃαμＲ、及び／またはｐＩｇＲが結合するＩｇＭ定常領域及びＪ鎖上の領域を同定するために、本発明者らは、ペプチドアレイベースの技術（ＰＥＰｐｅｒＰＲＩＮＴ；ＷＷＷ＿ｄｏｔ＿ｐｅｐｐｅｒｐｒｉｎｔ＿ｄｏｔ＿ｃｏｍ）を使用した。ヒトＪ鎖（配列番号２）及びヒトＩｇＭのＣμ３及びＣμ４ドメイン（配列番号１２の約２２４位アミノ酸から約４３０位アミノ酸まで）アミノ酸配列に基づくペプチドの完全セットを合成し、以下の通りに固体支持体に固定化した。ペプチドの切断を回避するために、中性のＧＳＧＳＧＳＧリンカー（配列番号３３）を用いてＩｇＭのμ３鎖、μ４鎖、及びＪ鎖の配列のＮ末端及びＣ末端を延長した。延長したタンパク質配列を、それぞれ８及び１２アミノ酸のペプチド間重複を有する９及び１３アミノ酸ペプチドに翻訳した。ペプチド合成後、全てのペプチドを、Ｃ末端システイン側鎖のチオール基と適切に改変されたＮ末端との間のチオエーテル結合により環化した。得られたＩｇＭペプチドマイクロアレイは、対照ペプチドと共に二連（１，６８８個のペプチドスポット）でプリントされた８４４種の異なるペプチドを含有した。１残基の変化を有する拘束されたペプチドを、インキュベーション緩衝液（０．００５％のＴｗｅｅｎ  ２０及び１０％のＲｏｃｋｌａｎｄブロッキング緩衝液（ＭＢ−０７０）を含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４）中の１、１０、または１００μｇ／ｍＬの、各々が６×ＨＩＳタグを有する組換えヒトｐＩｇＲ（配列番号２０のアミノ酸１９〜６３８、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能）、ヒトＦｃμＲ（配列番号２１のアミノ酸１８〜２５１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから利用可能）、及びヒトＦｃαμＲ（配列番号２２のアミノ酸１７〜４５０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから利用可能）により探索し、続いて、二次抗体であるマウス抗６×Ｈｉｓエピトープタグ（ＤｙＬｉｇｈｔ６８０）により、及び対照抗体により染色し、７／７（赤色／緑色）のスキャン強度値で読み取った。
【０１７０】
スポット強度の定量化及びペプチドの注釈付けを、２４ビットのカラー化ＴＩＦＦファイルより大きなダイナミックレンジを示す、７／７のスキャン強度値での１６ビットのグレースケールＴＩＦＦファイルに基づいて行い、マイクロアレイ画像分析をＰＥＰＳＬＩＤＥ（登録商標）アナライザーにより行った。ソフトウェアアルゴリズムは、各スポットの蛍光強度を、生信号、フォアグラウンド信号、及びバックグラウンド信号に分解し（「生データ」タブを参照）、平均化フォアグラウンド中央値強度及びスポットごとの二連スポットの偏差を計算する。平均化フォアグラウンド中央値強度に基づいて、強度マップを作成した。
【０１７１】
ＩｇＭのμ３鎖のＮ末端からＩｇＭのＪ鎖のＣ末端までのタンパク質配列に対する標的タンパク質によるアッセイの平均化スポット強度をプロットして、全体のスポット強度及び信号対ノイズ比を可視化した。強度プロットを、ペプチド及び強度マップと相関させ、同様にマイクロアレイスキャンの目視検査と相関させて、標的タンパク質の主な相互作用を同定した。
【０１７２】
生データを利用して、ＰＥＰｐｅｒＰＲＩＮＴプラットフォームにおいて受容体に結合したＪ鎖及びＩｇＭ  ＨＣ定常領域の重要な領域を同定した。
【０１７３】
ヒトＦｃαμＲは、成熟Ｊ鎖（配列番号２）の以下の下線が引かれた領域に結合した。
2021514618.tif 000023
【０１７４】
従って、ヒトＦｃαμＲの結合に寄与する成熟ヒトＪ鎖の領域には、例えば、配列番号２のアミノ酸１〜１０の範囲内のアミノ酸、及び／または配列番号２のアミノ酸１〜１０と重複するアミノ酸、及び／または配列番号２のアミノ酸１〜１０を含む、からなる、もしくはから本質的になるアミノ酸、配列番号２のアミノ酸８７〜１０５の範囲内のアミノ酸、及び／または配列番号２のアミノ酸８７〜１０５と重複するアミノ酸、及び／または配列番号２のアミノ酸８７〜１０５を含む、からなる、もしくはから本質的になるアミノ酸、ならびに／または配列番号２のアミノ酸１２５〜１３７の範囲内のアミノ酸、及び／または配列番号２のアミノ酸１２５〜１３７と重複するアミノ酸、及び／または配列番号２のアミノ酸１２５〜１３７を含む、からなる、もしくはから本質的になるアミノ酸が含まれる。当業者が理解するように、（例えば、別の種由来のＪ鎖アミノ酸配列における）これらの領域の範囲内の変異、これらの領域と重複する変異、及び／またはこれらの領域に対応する変異、例えば、アミノ酸挿入、欠失、及び／または置換を有するバリアントＪ鎖を含む五量体ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を、例えば、実施例２に記載のようにＦｃαμＲ結合の阻害について、及び／または例えば、実施例３に記載のように血清半減期の増強について試験することができる。
【０１７５】
ヒトｐＩｇＲは、成熟Ｊ鎖（配列番号２）の以下の二重下線が引かれた領域に結合した。
2021514618.tif 000024
【０１７６】
従って、ヒトｐＩｇＲの結合に寄与する成熟ヒトＪ鎖の領域には、例えば、配列番号２のアミノ酸１２〜２４の範囲内のアミノ酸、及び／または配列番号２のアミノ酸１２〜２４と重複するアミノ酸、及び／または配列番号２のアミノ酸１２〜２４を含む、からなる、もしくはから本質的になるアミノ酸、ならびに／または配列番号２のアミノ酸９３〜１０５の範囲内のアミノ酸、及び／または配列番号２のアミノ酸９３〜１０５と重複するアミノ酸、及び／または配列番号２のアミノ酸９３〜１０５を含む、からなる、もしくはから本質的になるアミノ酸が含まれる。当業者が理解するように、（例えば、別の種由来のＪ鎖アミノ酸配列における）これらの領域の範囲内の変異、これらの領域と重複する変異、及び／またはこれらの領域に対応する変異、例えば、アミノ酸挿入、欠失、及び／または置換を有するバリアントＪ鎖を含む五量体ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を、例えば、実施例２に記載のようにｐＩｇＲ結合の阻害について、及び／または例えば、実施例３に記載のように血清半減期の増強について試験することができる。
【０１７７】
ヒトＦｃμＲは、成熟Ｊ鎖（配列番号２）の以下の波状下線が引かれた領域に結合した。
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【０１７８】
従って、ヒトＦｃμＲの結合に寄与する成熟ヒトＪ鎖の領域には、例えば、配列番号２のアミノ酸１〜４の範囲内のアミノ酸、及び／または配列番号２のアミノ酸１〜４と重複するアミノ酸、及び／または配列番号２のアミノ酸１〜４を含む、からなる、もしくはから本質的になるアミノ酸、配列番号２のアミノ酸８７〜１０５の範囲内のアミノ酸、及び／または配列番号２のアミノ酸８７〜１０５と重複するアミノ酸、及び／または配列番号２のアミノ酸８７〜１０５を含む、からなる、もしくはから本質的になるアミノ酸、ならびに／または配列番号２のアミノ酸１２５〜１３７の範囲内のアミノ酸、及び／または配列番号２のアミノ酸１２５〜１３７と重複するアミノ酸、及び／または配列番号２のアミノ酸１２５〜１３７を含む、からなる、もしくはから本質的になるアミノ酸が含まれる。当業者が理解するように、（例えば、別の種由来のＪ鎖アミノ酸配列における）これらの領域の範囲内の変異、これらの領域と重複する変異、及び／またはこれらの領域に対応する変異、例えば、アミノ酸挿入、欠失、及び／または置換を有するバリアントＪ鎖を含む五量体ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を、例えば、実施例２に記載のようにＦｃμＲ結合の阻害について、及び／または例えば、実施例３に記載のように血清半減期の増強について試験することができる。
【０１７９】
ヒトＦｃαμＲは、ヒトＩｇＭ定常領域（配列番号１２）のＣμ３及びＣμ４の以下の下線が引かれた領域に結合した（配列番号１２の番号付け／ＫＡＢＡＴが提供される）。
ＩｇＭ重鎖の連続的番号付け（配列番号１２）／ＫＡＢＡＴ番号付けの要所
2021514618.tif 000026
【０１８０】
従って、ヒトＦｃαμＲの結合に寄与するヒトＩｇＭ定常領域の領域には、例えば、配列番号１２のアミノ酸２４１〜２５３の範囲内のアミノ酸、及び／または配列番号１２のアミノ酸２４１〜２５３と重複するアミノ酸、及び／または配列番号１２のアミノ酸２４１〜２５３を含む、からなる、もしくはから本質的になるアミノ酸、配列番号１２のアミノ酸２８２〜２９４の範囲内のアミノ酸、及び／または配列番号１２のアミノ酸２８２〜２９４と重複するアミノ酸、及び／または配列番号１２のアミノ酸２８２〜２９４を含む、からなる、もしくはから本質的になるアミノ酸、配列番号１２のアミノ酸３４２〜３５４の範囲内のアミノ酸、及び／または配列番号１２のアミノ酸３４２〜３５４と重複するアミノ酸、及び／または配列番号１２のアミノ酸３４２〜３５４を含む、からなる、もしくはから本質的になるアミノ酸、ならびに／または配列番号１２のアミノ酸３９３〜４１５の範囲内のアミノ酸、及び／または配列番号１２のアミノ酸３９３〜４１５と重複するアミノ酸、及び／または配列番号１２のアミノ酸３９３〜４１５を含む、からなる、もしくはから本質的になるアミノ酸が含まれる。当業者が理解するように、（例えば、図１に示すものなどの別の種由来のＩｇＭ重鎖定常領域のアミノ酸配列における）これらの領域の範囲内の変異、これらの領域と重複する変異、及び／またはこれらの領域に対応する変異、例えば、アミノ酸挿入、欠失、及び／または置換を有するＩｇＭ重鎖定常領域を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を、例えば、実施例２に記載のようにＦｃαμＲ結合の阻害について、及び／または例えば、実施例３に記載のように血清半減期の増強について試験することができる。
【０１８１】
ヒトｐＩｇＲは、ヒトＩｇＭ定常領域（配列番号１２）のＣμ３及びＣμ４の以下の二重下線が引かれた領域に結合した（配列番号１２の番号付け／ＫＡＢＡＴが提供される）。
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【０１８２】
従って、ヒトｐＩｇＲの結合に寄与するヒトＩｇＭ定常領域の領域には、例えば、配列番号１２のアミノ酸２３２〜２４４の範囲内のアミノ酸、及び／または配列番号１２のアミノ酸２３２〜２４４と重複するアミノ酸、及び／または配列番号１２のアミノ酸２３２〜２４４を含む、からなる、もしくはから本質的になるアミノ酸、配列番号１２のアミノ酸２８７〜３０４の範囲内のアミノ酸、及び／または配列番号１２のアミノ酸２８７〜３０４と重複するアミノ酸、及び／または配列番号１２のアミノ酸２８７〜３０４を含む、からなる、もしくはから本質的になるアミノ酸、ならびに／または配列番号１２のアミノ酸３９７〜４１３の範囲内のアミノ酸、及び／または配列番号１２のアミノ酸３９７〜４１３と重複するアミノ酸、及び／または配列番号１２のアミノ酸３９７〜４１３を含む、からなる、もしくはから本質的になるアミノ酸が含まれる。当業者が理解するように、（例えば、図１に示すものなどの別の種由来のＩｇＭ重鎖定常領域のアミノ酸配列における）これらの領域の範囲内の変異、これらの領域と重複する変異、及び／またはこれらの領域に対応する変異、例えば、アミノ酸挿入、欠失、及び／または置換を有するＩｇＭ重鎖定常領域を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を、例えば、実施例２に記載のようにｐＩｇＲ結合の阻害について、及び／または例えば、実施例３に記載のように血清半減期の増強について試験することができる。
【０１８３】
ヒトＦｃμＲは、ヒトＩｇＭ定常領域（配列番号１２）のＣμ３及びＣμ４の以下の波状下線が引かれた領域に結合した（配列番号１２の番号付け／ＫＡＢＡＴが提供される）。
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【０１８４】
従って、ヒトＦｃμＲの結合に寄与するヒトＩｇＭ定常領域の領域には、例えば、配列番号１２のアミノ酸２８２〜３０５の範囲内のアミノ酸、及び／または配列番号１２のアミノ酸２８２〜３０５と重複するアミノ酸、及び／または配列番号１２のアミノ酸２８２〜３０５を含む、からなる、もしくはから本質的になるアミノ酸、ならびに／または配列番号１２のアミノ酸３９３〜４１７の範囲内のアミノ酸、及び／または配列番号１２のアミノ酸３９３〜４１７と重複するアミノ酸、及び／または配列番号１２のアミノ酸３９３〜４１７を含む、からなる、もしくはから本質的になるアミノ酸が含まれる。当業者が理解するように、（例えば、図１に示すものなどの別の種由来のＩｇＭ重鎖定常領域のアミノ酸配列における）これらの領域の範囲内の変異、これらの領域と重複する変異、及び／またはこれらの領域に対応する変異、例えば、アミノ酸挿入、欠失、及び／または置換を有するＩｇＭ重鎖定常領域を含むＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を、例えば、実施例２に記載のようにＦｃμＲ結合の阻害について、及び／または例えば、実施例３に記載のように血清半減期の増強について試験することができる。
【０１８５】
実施例２：アラニンスキャニングによるＩｇＭ  Ｊ鎖及びＦｃ変異体の構築ならびにＥＬＩＳＡによる受容体結合の阻害についてのスクリーニング
ＰＥＰｐｅｒＰＲＩＮＴによる分析（実施例１）により同定された特定の領域が、ＦｃαμＲ、ＦｃμＲ、及び／またはｐＩｇＲの結合を低減または阻害するように改変され得るかどうか決定するために、両方がＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／１４１３０３号において記載されている、単一特異性五量体としての単一特異性抗ＣＤ２０ＩｇＭ抗体  １．５．３（配列番号２の成熟ヒトＪ鎖を有する）、及び二重特異性五量体としての二重特異性抗ＣＤ２０ＩｇＭ抗体  １．５．３  ＩｇＭ（「Ｖ１５Ｊ」Ｊ鎖（配列番号９）を有する）のＪ鎖及びＩｇＭ定常領域を、アラニンスキャニング変異誘発に供した。試験された変異体は、配列番号２のヒト成熟Ｊ鎖のＹ１０２位及びＴ１０３位に対応する位置でのＪ鎖アラニン置換（Ｙ１０２Ａ及びＴ１０３Ａ）を含んだ。Ｙ１０２Ａ変異を含む改変「Ｖ１５Ｊ」Ｊ鎖を配列番号１０として掲示し、Ｔ１０３Ａ変異を含む改変「Ｖ１５Ｊ」Ｊ鎖を、配列番号２３として掲示する。配列番号９、配列番号１０、及び配列番号２３を以下に掲示する。
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【０１８６】
ヒトＩｇＭ定常領域に関して試験された変異体は、配列番号１２のＲ３４４、Ｅ３４５、Ｓ４０１、及びＥ４０２に対応する位置でのアラニン変異を含んだ（Ｒ３４４Ａ（配列番号３１）、Ｅ３４５Ａ（配列番号３２）、Ｓ４０１Ａ（配列番号１３）、Ｅ４０２Ａ（配列番号１４）、及びＥ４０３Ａ（配列番号３４））。２つのバリアントＩｇＭ定常領域の変異（配列番号１３及び配列番号１４）を、それらの、「野生型」Ｖ１５Ｊ  Ｊ鎖（配列番号９）と共に当該変異を含むＩｇＭ、及びＹ１０２Ａ変異（配列番号１０）を含むＶ１５Ｊ  Ｊ鎖と共に当該変異を含むＩｇＭの両方のインビボ半減期に対する効果について試験した。実施例３を参照のこと。
【０１８７】
選択された変異体の重鎖、軽鎖、及びＪ鎖をコードするＤＮＡ断片は、商業的販売業者によって合成された。ＤＮＡ構築物をコンピテント細菌に形質転換し、複数の選択抗生物質を含有するＬＢプレートに蒔いた。幾つかの細菌コロニーを採集し、標準的な分子生物学技術によりＤＮＡ調製を行った。重鎖及び軽鎖をコードする構築物を、配列決定により確認した。全て標準的な方法に従って、重鎖、軽鎖、及びＪ鎖をコードするプラスミド構築物を、ＨＥＫ２９３／Ｅｘｐｉ２９３／ＣＨＯ細胞に同時形質移入し、ＣＤ２０ＩｇＭ抗体を発現した細胞を選択した。細胞上澄み中に存在する抗体を、製造者のプロトコールに従ってＣａｐｔｕｒｅ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＩｇＭ（Ｃａｔａｌｏｇ  ２８９０．０５、ＢＡＣ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して回収した。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／１４１３０３において以前に記載されたように、抗体を非還元条件下のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で評価して、アセンブリが示された。変異体の各々は、発現及びアセンブリについて確認され、二重特異性構築物は、それらのＴ細胞媒介細胞傷害を促進する能力を保持することが確認された。
【０１８８】
特定のＩｇＭ変異体ならびに対応するＩｇＭ及びＩｇＧ対照への受容体結合を、ＥＬＩＳＡによって以下の通りに測定した。白色不透明型９６ウェルポリスチレンＥＬＩＳＡプレートに、１００μＬのＰＢＳ中１μｇ／ｍＬの多量体免疫グロブリン受容体（マウスＰＩＧＲ：Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃２８００−ＰＧ；ヒトＰＩＧＲ：Ｃａｔ＃２７１７−ＰＧ）、ヒトＦｃアルファ／ミュー受容体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃９２７８−ＦＣ−０５０）、またはヒトＦｃミュー受容体／タンパク質（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｃａｔ＃１３５５６−Ｈ０２ＨまたはＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃９４９４−ＭＵ−０５０）を４℃で一晩コーティングした。次いで、プレートを０．０５％のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５回洗浄し、２％のＢＳＡ−ＰＢＳで室温にて２時間ブロッキングした。ブロッキング及び５回の洗浄後に、１００μＬの２％ＢＳＡ−ＰＢＳ中の連続希釈したＩｇＭまたはＩｇＧタンパク質をウェルに加え、室温にて２時間インキュベートした。次いで、プレートを５回洗浄し、ＨＲＰコンジュゲートマウス抗ヒトκ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｃａｔ＃９２３０−０５、２％ＢＳＡ−ＰＢＳで１：６０００に希釈）と共に３０分間インキュベートした。二次インキュベーション後、１００μＬのＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ化学発光基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ＃３７０７０）を各ウェルに添加する前にプレートを１０回洗浄した。発光シグナルを測定し、データをプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて４パラメーターロジスティックモデルを使用して分析した。
【０１８９】
様々な変異型ＩｇＭのヒト及びマウス受容体への結合を、図２に要約する。Ｊ鎖におけるＴ１０３Ａ変異は、ヒトＦｃαμＲの結合を阻害したが、ヒトｐＩｇＲの結合もヒトＦｃμＲの結合も阻害しなかった（データ非表示）。
【０１９０】
Ｖ１５Ｊ改変Ｊ鎖において配列番号２のＹ１０２に対応するアミノ酸位で追加のアミノ酸置換を有する二重特異性抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３抗体も、ｐＩｇＲ受容体への結合に対するそれらの効果について評価した。１０２位のチロシンを、アスパラギン酸（Ｙ１０２Ｄ）、フェニルアラニン（Ｙ１０２Ｆ）、アルギニン（Ｙ１０２Ｒ）、セリン（Ｙ１０２Ｓ）、及びトレオニン（Ｙ１０２Ｔ）で置換した。変異は、上記のように抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体に組み込まれた。発現の減少を示したＹ１０２Ｄ変異を含むＩｇＭを除いて、全ての変異型ＩｇＭは予想通りに発現され、アセンブルされた。ｐＩｇＲへの結合の結果を、図３Ａ〜３Ｅに示す。Ｙ１０２Ｆ及びＹ１０２Ｔ変異は、ｐＩｇＲへの結合を許したが、Ｙ１０２Ａ変異と同様に、Ｙ１０２Ｓ及びＹ１０２Ｒ変異は、ｐＩｇＲ結合を妨害した。
【０１９１】
実施例３：受容体結合に影響を及ぼす選択された変異を含む抗ＣＤ２０抗体の薬物動態学的分析
この実施例は、五量体ＩｇＭ単一特異性または二重特異性抗体のＪ鎖またはＩｇＭ定常領域における特定のアミノ酸置換が、それらの抗体の血清半減期を増加させることができることを実証する。両方がＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／１４１３０３号において記載されている、単一特異性五量体としての単一特異性抗ＣＤ２０ＩｇＭ抗体  １．５．３（配列番号２の成熟Ｊ鎖を有する）、及び二重特異性五量体としての二重特異性抗ＣＤ２０ＩｇＭ抗体  １．５．３  ＩｇＭ（「Ｖ１５Ｊ」Ｊ鎖（配列番号９）を有する）のＪ鎖及びＩｇＭ定常領域を、アラニンスキャニング変異誘発に供し、マウスにおける薬物動態学的パラメータの変化について試験した。試験された変異体は、配列番号２のヒト成熟Ｊ鎖のＹ１０２位及びＴ１０３位に対応する位置でのＪ鎖アラニン置換（Ｙ１０２Ａ及びＴ１０３Ａ）を含んだ。Ｙ１０２Ａ変異を含む改変「Ｖ１５Ｊ」Ｊ鎖を、配列番号１０として掲示する。
【０１９２】
様々なＩｇＭ抗体の薬物動態学的パラメータを、インビボマウスモデルで以下の通りに測定した。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、静脈内注入により１００μｇの各抗体を注射した。ほぼゼロ時点及び各時点で、５００μＬの血液を終末心臓穿刺により採取し、１時点当たり３匹のマウスを用い、各抗体について合計８または１５個の時点で採取した。標準的なＥＬＩＳＡアッセイを使用して、各時点での血液中の各抗体の血清濃度を測定した。全てのＥＬＩＳＡについて品質メトリクスを確認し、Ｔ１／２−ａｌｐｈａ、Ｔ１／２−ｂｅｔａを含むＰＫパラメータ及び時刻ゼロから無限大までの濃度曲線下面積（ＡＵＣ０−∞、μｇ／ｍｌ＊ｈｒで測定）を、検量線フィッティング法（Ｗｉｎ  Ｎｏｎ  Ｌｉｎ、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して導出した。アルファ及びベータ半減期を含むＰＫ結果ならびにＡＵＣを、図４に掲示する。結果は、成熟ヒトＪ鎖（配列番号２）におけるＹ１０２に対応する変異、ならびにヒトＩｇＭ定常領域におけるＳ４０１及びＥ４０１に対応する変異が、単独または組み合わせのいずれかで、得られたＩｇＭ抗体のＰＫパラメータを改善できたことを示す。
【０１９３】
図５は、同一のＶＨ及びＶＬ領域を含むＩｇＧ抗体と比較した特定の二重特異性変異型ＩｇＭ抗体の経時的な血清濃度を示す。これらの結果が示すように、Ｊ鎖における単一のＹ１０２Ａ変異を有するＩｇＭまたはＹ１０２Ａ変異に加えてＩｇＭ重鎖における追加の変異を有するＩｇＭの血清半減期は、比較用のＩｇＧ抗体の血清半減期に近づく。
【０１９４】
実施例４：Ｎ４９ＡバリアントヒトＪ鎖を含むＩｇＭ抗体分子の半減期延長
この実施例は、ヒトＪ鎖における別の単一アミノ酸置換が、バリアントＪ鎖を含むＩｇＭ抗体の血清半減期を増加させることができることを実証する。先に記載したように、成熟ヒトＪ鎖を含み、１５アミノ酸リンカー（「Ｖ１５Ｊ」（配列番号９）、米国特許第９，９５１，１３４を参照）を介して成熟ヒトＪ鎖のＮ末端に融合された、ＣＤ３に結合する異種の抗原結合ドメインを有する改変Ｊ鎖を、野生型成熟ヒトＪ鎖（配列番号２）のＮ４９に対応する位置にアラニン置換を導入するための標準的な技術を使用して変異させて、改変Ｊ鎖「Ｖ１５Ｊ−Ｎ４９Ａ」（配列番号２４）を生成した。配列番号２４を以下に掲示する。
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【０１９５】
このＪ鎖構築物を使用して、ＣＤ２０に結合する例示的な五量体ＩｇＭ抗体である１．５．３  Ｖ１５Ｊ及び１．５．３  Ｖ１５Ｊ−Ｎ４９Ａを生成した。ＣＤ２０抗原結合ドメイン及びＩｇＭ抗体を作製する方法は、ＰＣＴ公開第ＷＯ／２０１６／１４１３０３に記載されている。上記抗体を、適切なアセンブリ、抗原結合、及びＣＤ３結合物質のＴ細胞を活性化する能力について試験した。
【０１９６】
薬物動態学的（ＰＫ）研究を、実施例３に記載したようにＢａｌｂ／ｃマウスで実施して、ＩｇＭ抗体のクリアランスを評価した。全てのＥＬＩＳＡについて品質メトリクスを確認し、Ｔ１／２アルファ、Ｔ１／２ベータを含むＰＫパラメータ及び時刻ゼロから無限大までの濃度曲線下面積（ＡＵＣ０−∞、μｇ／ｍｌ＊ｈｒで測定）を、検量線フィッティング法（Ｗｉｎ  Ｎｏｎ  Ｌｉｎ、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して導出した。
【０１９７】
結果を図６に示す。図に示されるように、ＩｇＭ  １．５．３  Ｖ１５Ｊ−Ｎ４９Ａは、Ｔ１／２アルファのほぼ５０％の増加を示し、濃度曲線下面積は１．６倍高かった。
【０１９８】
本開示の広さ及び範囲は、上記の例示的実施形態のいずれによっても限定されるべきではなく、以下の特許請求の範囲及びその等価物に従ってのみ定義されるべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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