(57)【要約】  本発明は、標的細胞内でＡＴＸＮ２の発現を調節可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。オリゴヌクレオチドはＡＴＸＮ２  ｍＲＮＡにハイブリダイズする。本発明は更に、オリゴヌクレオチドの抱合体、ならびに、オリゴヌクレオチドを使用して、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー性前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソニズム、およびＴＤＰ−４３タンパク質症を伴う状態などの神経変性病を治療するための医薬組成物および方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１５１６、６、１５０５、１５０６、１５０７、１５０８、１５０９、１５１０、１５１１、１５１２、１５１３、１５１４、１５１５、１５１７、１５１８、１５１９、１５２０、１５２１、１５２２、１５２３、１５２４、および１５２５からなる群から選択される配列に１００％の相補性などの少なくとも９０％の相補性である、１０〜２２ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、１０〜３０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号７、１３、１４、１５、１７、１８、１０５、１５４、１６１、１６２、２３８、３８５、３８８、３９１、３９８、３９９、４０１、４０１、４２３、４６８、４７７、５３４、８４３、８４４、８４５、８４７、８４８、８４９、８５０、８５１、８５２、８５３、８５４、９０６、９７４、１００３、１００４、１０４５、１０５４、１１８０、１２４６、１２４７、１２４８、１３６１、１４０８、および１５０４からなる群から選択される配列；または、これらの少なくとも１４個の連続ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号７、１３、１４、１５、１７、１８、１０５、３８５、３８８、３９１、１２４６、１２４７、１２４８、および１５０４からなる群から選択される配列；または、これらの少なくとも１４個の連続ヌクレオチドを含む、請求項１または２のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記連続ヌクレオチド配列中の１つ以上のヌクレオシドが、２’糖修飾ヌクレオシドである、請求項１〜３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドが、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’−フルオロ−ＡＮＡ、およびＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される、請求項４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記１つ以上の修飾ヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである、請求項４〜５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記連続ヌクレオチド配列中の少なくとも１つのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記連続ヌクレオチド配列中の全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドが、ヒトＲＮａｓｅＨ１などのＲＮａｓｅＨを動員することができる、請求項１〜８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列が、式５’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−３’のギャップマーからなる、またはこれを含む、請求項９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
領域Ｇが６〜１６個のＤＮＡヌクレオシドからなる、請求項１０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
領域ＦおよびＦ’がそれぞれ、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含む、請求項１０または１１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＣＭＰ番号７＿１、１３＿１、１４＿１、１４＿２、１５＿１、１６＿１、１７＿１、１８＿１、１８＿２、１０５＿１、１５４＿１、１６１＿１、１６２＿１、２３８＿１、３８５＿１、３８８＿１、３９１＿１、３９８＿１、３９９＿１、４０１＿１、４０１＿２、４２３＿１、４６８＿１、４７７＿１、５３４＿１、８４３＿１、８４４＿１、８４５＿１、８４７＿１、８４８＿１、８４９＿１、８５０＿１、８５１＿１、８５２＿１、８５３＿１、８５４＿１、９０６＿１、９７４＿１、１００３＿１、１００４＿１、１０４５＿１、１０５４＿１、１１８０＿１、１２４６＿１、１２４７＿１、１２４８＿１、１３６１＿１、１４０８＿１、および１５０４＿１からなる群から選択される化合物である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが：
ＡＴＴＴｔａｃｔｔｔａａｃｃＴＣＣ  配列番号７  ＣＭＰ番号７＿１
ＴＣＡＣａｔｔｔｔａｃｔｔｔａａｃＣＴ  配列番号１３  ＣＭＰ番号１３＿１
ＴＣＡＣａｔｔｔｔａｃｔｔｔＡＡＣＣ  配列番号１４  ＣＭＰ番号１４＿１
ＴＣＡｃａｔｔｔｔａｃｔｔｔＡＡＣＣ  配列番号１４  ＣＭＰ番号１４＿２
ＴＣＡＣａｔｔｔｔａｃｔｔｔａａｃｃＴＣ  配列番号１５  ＣＭＰ番号１５＿１
ＴＴＣＡｃａｔｔｔｔａｃｔｔＴＡＡＣ  配列番号１７  ＣＭＰ番号１７＿１
ＴＴＣＡｃａｔｔｔｔａｃｔｔｔａＡＣＣ  配列番号１８  ＣＭＰ番号１８＿１
ＴＴＣａｃａｔｔｔｔａｃｔｔｔＡＡＣＣ  配列番号１８  ＣＭＰ番号１８＿２
ＴＣＡＣｔｔｇａｃａｃａａｃＴＴＣ  配列番号１０５  ＣＭＰ番号１０５＿１
ＡＣＴＴｔｔｔａｔａｃｃｔｃａｔＣＡ  配列番号３８５  ＣＭＰ番号３８５＿１
ＴＡＣＴｔｔｔｔａｔａｃｃｔｃＡＴＣ  配列番号３８８  ＣＭＰ番号３８８＿１
ＴＴＡｃｔｔｔｔｔａｔａｃｃＴＣＡＴ  配列番号３９１  ＣＭＰ番号３９１＿１
ＴＴＣＡｃａｔｔｔｔａｔａｃｔＴＴＡＡ  配列番号  １２４６  ＣＭＰ番号１２４６＿１
ＡＴＴＣａｃａｔｔｔｔａｔａｃｔＴＴＡＡ  配列番号１２４７  ＣＭＰ番号１２４７＿１
ＡＴＴＣａｃａｔｔｔｔａｔａｃＴＴＴＡ  配列番号１２４８  ＣＭＰ番号１２４８＿１、および
ＴＴＴＴａｔｔｔｔａｔａｔｔａｔＣＴＡＣ  配列番号１５０４  ＣＭＰ番号１５０４＿１
（大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、全てのＬＮＡ  Ｃは５−メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である）からなる群から選択される化合物である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、および、前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分を含むコンジュゲート。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または請求項１５に記載のコンジュゲート、の薬学的に許容される塩。
【請求項１７】
請求項１〜１４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または請求項１５に記載のコンジュゲート、ならびに、薬剤として許容される希釈剤、溶媒、担体、塩、および／またはアジュバントを含む、医薬組成物。
【請求項１８】
ＡＴＸＮ２を発現する標的細胞におけるＡＴＸＮ２発現を調節するためのインビボまたはインビトロ方法であって、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または請求項１５に記載のコンジュゲート、または請求項１６に記載の医薬組成物を、有効量で前記細胞に投与することを含む、方法。
【請求項１９】
病気の治療または予防方法であって、治療的または予防的有効量の、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または請求項１５に記載のコンジュゲート、または請求項１６に記載の医薬組成物を、前記病気を患う、またはそれに罹りやすい対象に投与することを含む、方法。
【請求項２０】
前記病気が、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー性前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソニズム、およびＴＤＰ−４３タンパク質症を伴う状態からなる群から選択される神経変性疾患からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
医薬で使用するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項１５に記載のコンジュゲート、または請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー性前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソニズム、およびＴＤＰ−４３タンパク質症を伴う状態からなる群から選択される病気などの神経変性疾患の治療または予防で使用するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項１５に記載のコンジュゲート、または請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー性前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソニズム、およびＴＤＰ−４３タンパク質症を伴う状態からなる群から選択される病気などの神経変性疾患の治療または予防のための医薬を調製するための、請求項１〜１４に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項１５に記載のコンジュゲート、または請求項１６に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ａｔａｘｉｎ２をコードする核酸（ＡＴＸＮ２）に相補的な、ＡＴＸＮ２の発現の低下をもたらすオリゴヌクレオチド（オリゴマー）に関する。ＡＴＸＮ２発現の低下は、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー性前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソニズム、およびＴＤＰ−４３タンパク質症を伴う状態を含む、神経変性病などの広範囲の医学的疾患に有益である。
【背景技術】
【０００２】
ＡＴＸＮ２遺伝子内の３１個以上のＣＡＧ反復により生じる、ａｔａｘｉｎ２（ＡＴＸＮ２）の拡張したグルタミン反復は、希少な神経変性疾患である脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）を引き起こす。更に、拡張したＣＡＧ反復は、ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ−４３）との、ＲＮＡに依存した相互作用による、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の遺伝性危険因子である。ＴＤＰ−４３タンパク質症に関係する他の神経変性病は、例えば、アルツハイマー性前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）およびパーキンソニズムである。近年、ＡＬＳ関係マウスモデルである、ＴＤＰ−４３導入遺伝子マウス（ＴＤＰ−４３Ｔ／Ｔｇ）は、Ａｔｘｎ２陰性マウスと交配され、寿命の有意な増加をもたらし、ＴＤＰ−４３Ｔ／Ｔｇ  Ａｔｘｎ２−／マウスの運動機能を改善した（Ｂｅｃｋｅｒら  ２０１７  Ｎａｔｕｒｅ  ５４４：３６７−３７１）。同じ記事において、ＡＴＸＮ２を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理をしたＴＤＰ−４３Ｔ／Ｔｇマウスは、生残が延び、運動性能が改善したことが示された。
【０００３】
ＡＴＸＮ２を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、米国特許第２０１７／１７５１１３号、国際公開第２０１５／１４３２４６号、および同第２０１７／１１７４９６号でも記載されており、特に国際公開第２０１７／１１７４９６号は、ＡＬＳの治療に関する。Ｓｃｏｌｅｓら  ２０１７  Ｎａｔｕｒｅ  ５４４：３６２は、小脳にてＡＴＸＮ２を低下させるアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力について評価しており、ＳＣＡ２に対する潜在的な治療法を示す、プルキンエ細胞への局在化を示した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
発明の目的
本発明は、インビボおよびインビトロの両方にてＡＴＸＮ２を制御するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより標的にされ、効果的なＡＴＸＮ２阻害をもたらすことができる、ヒトＡＴＸＮ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのイントロン９に存在する、特異的な標的配列を識別した。特に、配列番号１の位置８３１１８〜８３１４６を標的にするのが、ＡＴＸＮ２の低下という観点から有利である。本発明はまた、ＡＴＸＮ２を阻害可能な、効果的なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列および化合物、ならびに、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー性前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソニズム、およびＴＤＰ−４３タンパク質症を伴う状態を含む、神経変性病などの病気または疾患の治療における、これらの治療も提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ＡＴＸＮ２の発現を制御可能な、ＡＴＸＮ２をコードする核酸を標的にするオリゴヌクレオチド、および、ＡＴＸＮ２の機能に関係する病気を治療または予防するための、オリゴヌクレオチドの使用に関する。
【０００６】
したがって、本発明は、ヒトＡＴＸＮ２標的核酸に完全に相補性といった、少なくとも９０％相補性な１０〜３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
【０００７】
本発明は、ヒトＡＴＸＮ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ標的核酸のイントロン領域に完全に相補性といった、少なくとも９０％相補性な１０〜３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
【０００８】
本発明は、ヒトＡＴＸＮ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ標的核酸のイントロン９領域に完全に相補性といった、少なくとも９０％相補性な１０〜３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
【０００９】
本発明は、配列番号１のヌクレオチド８１４２９〜８３３１３に完全に相補性といった、少なくとも９０％相補性な１０〜３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１０】
本発明は、配列番号６のヌクレオチドに完全に相補性といった、少なくとも９０％相補性な１０〜３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１１】
オリゴヌクレオチドは、有利にはギャップマー設計を有する、アンチセンスオリゴヌクレオチドであることができる。有利には、オリゴヌクレオチドは、例えばＲＮａｓｅＨ１の動員により、標的核酸の開裂によってＡＴＸＮ２の発現を阻害することができる。
【００１２】
更なる態様において、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチド、ならびに、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、および／またはアジュバントを含む医薬組成物を提供する。
【００１３】
更なる態様において、本発明は、ＡＴＸＮ２を発現する標的細胞にてＡＴＸＮ２発現を制御するための、本発明のオリゴヌクレオチドまたは組成物を有効量で上記細胞に投与することによる、インビボまたはインビトロ法のための方法を提供する。
【００１４】
更なる態様において、本発明は、ＡＴＸＮ２のインビボ活性と関連する病気、疾患、または機能障害を治療または予防するための方法であって、治療的または予防的有効量の本発明のオリゴヌクレオチドを、上記病気、疾患、または機能障害を患う、またはこれに感染しやすい対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００１５】
更なる態様において、本発明のオリゴヌクレオチドまたは組成物は、神経変性病、例えば、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー性前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソニズム、およびＴＤＰ−４３タンパク質症を伴う状態からなる群から選択される神経変性病の治療または予防のために使用される。
【００１６】
更なる態様において、本発明のオリゴヌクレオチドまたは組成物は、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療または予防のために使用される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは薬学的に許容される塩の形態である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは薬学的に許容されるナトリウム塩の形態である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは薬学的に許容されるカリウム塩の形態である。
【００２０】
本発明は、本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチド、および、上記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分、を含むコンジュゲートを提供する。代替的に記述をすると、いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはコンジュゲート化オリゴヌクレオチドの形態である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはコンジュゲート化していない。
【００２１】
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲート、ならびに、薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩、および／またはアジュバントを含む、医薬組成物を提供する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される希釈剤、例えば滅菌リン酸緩衝生理食塩水を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５０〜３００μＭ溶液の濃度で薬学的に許容される希釈剤中で製剤化される。希釈剤はリン酸緩衝生理食塩水であることができる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１〜１００ｍｇ／ｍＬ、例えば２〜３０または２〜５０ｍｇ／ｍＬ、または例えば４〜３０ｍｇ／ｍＬの濃度にて、薬学的に許容される希釈剤の中で製剤化される。希釈剤はリン酸緩衝生理食塩水であることができる。
【００２５】
本発明は、ＡＴＸＮ２を発現する標的細胞内でＡＴＸＮ２発現を制御する方法であって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートまたは医薬組成物を、有効量で上記細胞に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法はインビトロ法である。いくつかの実施形態では、方法はインビボ法である。いくつかの実施形態では、細胞は神経細胞、例えば小脳細胞、例えばプルキンエ細胞、または毛皮質細胞である。
【００２６】
本発明は、薬剤で使用するための、本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、または医薬組成物を提供する。
【００２７】
本発明は、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー性前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソニズム、およびＴＤＰ−４３タンパク質症を伴う状態からなる群から選択される神経変性病からなる群から選択される病気の治療に使用するための、本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、または医薬組成物を提供する。
【００２８】
本発明は、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー性前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソニズム、およびＴＤＰ−４３を伴う状態からなる群から選択される病気などの、神経変性病の治療または予防のための薬剤を調製するための、本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、または医薬組成物の使用を提供する。
【００２９】
本発明は、治療的、または予防的有効量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、または医薬組成物を、病気を患う、またはこれに感染しやすい対象に投与することを含む、病気の治療または予防方法であって、上記病気が、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー性前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソニズム、およびＴＤＰ−４３タンパク質症を伴う状態からなる群から選択される神経変性病からなる群から選択される方法を提供する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、病気は脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）である。
【００３１】
いくつかの実施形態では、病気は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。
【００３２】
治療のための使用に関しては例えば、好適には、対象は、当該病気を患う、またはこれに感染しやすいヒトである。
【００３３】
更なる態様において、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチド、ならびに、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、および／またはアジュバントを含む医薬組成物を提供する。
【００３４】
更なる態様において、本発明は、ＡＴＸＮ２を発現する標的細胞にてＡＴＸＮ２発現を制御するための、本発明のオリゴヌクレオチドまたは組成物を有効量で上記細胞に投与することによる、インビボまたはインビトロ法のための方法を提供する。
【００３５】
更なる態様において、本発明は、ＡＴＸＮ２のインビボ活性と関連する病気、疾患、または機能障害を治療または予防するための方法であって、治療的または予防的有効量の本発明のオリゴヌクレオチドを、上記病気、疾患、または機能障害を患う、またはこれに感染しやすい対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００３６】
更なる態様において、本発明は、ＡＴＸＮ２のインビボ活性と関連する病気、疾患、または機能障害を治療または予防するための方法であって、治療的または予防的有効量の、ＡＴＸＮ２を標的にするオリゴヌクレオチド、またはそのコンジュゲートもしくは医薬組成物、例えば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＡＴＸＮ２を標的にするｓｉＲＮＡを、上記病気、疾患、または機能障害を患う、またはこれに感染しやすい対象に投与することを含む、方法を提供し、少なくとも、上記方法は、少なくとも２回の連続用量の、ＡＴＸＮ２を標的にするオリゴヌクレオチドを投与することを含み、少なくとも２回の連続用量の時間間隔は、少なくとも２週間、例えば少なくとも３週間、例えば少なくとも４週間、例えば少なくとも１ヶ月、例えば少なくとも６週間、例えば少なくとも８週間、例えば少なくとも２ヶ月である。投与はそれ故、例えば、毎週、隔週、１ヶ月に１回、または隔月で実施することができる。
【００３７】
更なる態様において、本発明は、神経変性病を治療または予防する方法であって、治療的または予防的有効量の、ＡＴＸＮ２を標的にするオリゴヌクレオチド、またはそのコンジュゲートもしくは医薬組成物、例えば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＡＴＸＮ２を標的にするｓｉＲＮＡを、上記神経変性病を患う、またはこれに感染しやすい対象に投与することを含む、方法を提供し、少なくとも、上記方法は、少なくとも２回の連続用量の、ＡＴＸＮ２を標的にするオリゴヌクレオチドを投与することを含み、少なくとも２回の連続用量の時間間隔は、少なくとも２週間、例えば少なくとも３週間、例えば少なくとも４週間、例えば少なくとも１ヶ月、例えば少なくとも６週間、例えば少なくとも８週間、例えば少なくとも２ヶ月である。投与はそれ故、例えば、毎週、隔週、１ヶ月に１回、または隔月で実施することができる。更なる態様において、本発明は、対象における神経変性病の治療または予防のための、ＡＴＡＸＮ２を標的にするオリゴヌクレオチドを提供し、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２回の連続投与のためのものであり、少なくとも２回の連続用量の時間間隔は、少なくとも２週間、例えば少なくとも３週間、例えば少なくとも４週間、例えば少なくとも１ヶ月、例えば少なくとも６週間、例えば少なくとも８週間、例えば少なくとも２ヶ月である。投与はそれ故、例えば、毎週、隔週、１ヶ月に１回、または隔月で実施することができる。
【００３８】
更なる態様において、本発明のオリゴヌクレオチドまたは組成物は、神経変性病、例えば、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー性前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソニズム、およびＴＤＰ−４３タンパク質症を伴う状態からなる群から選択される神経変性病の治療または予防のために使用される。
【００３９】
更なる態様において、本発明のオリゴヌクレオチドまたは組成物は、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）の治療または予防のために使用される。
【００４０】
更なる態様において、本発明のオリゴヌクレオチドまたは組成物は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療または予防のために使用される。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】化合物７＿１（ヌクレオ塩基の配列を配列番号７に示す）
【図２】化合物１３＿１（ヌクレオ塩基の配列を配列番号１３に示す）
【図３】化合物１７＿１（ヌクレオ塩基の配列を配列番号１７に示す）
【図４】化合物１８＿１（ヌクレオ塩基の配列を配列番号１８に示す）
【図５】化合物１５＿４（ヌクレオ塩基の配列を配列番号１５に示す）  図１、２、３、および４に示す化合物は、プロトン化形態で示される。ホスホロチオエート結合上のＳ原子がプロトン化されている。プロトンの存在は分子の環境の酸性度、および、（例えば、オリゴヌクレオチドが塩形態であるときの）代替のカチオンの存在によって変化することが理解されよう。プロトン化したホスホロチオエートは互変異性形態で存在する。
【図６】ヒト細胞株における、ヒトＡｔａｘｉｎ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ配列にまたがる、１５００種類を超える化合物の標的化のスクリーニング。化合物７＿１を中空の菱形として示す。
【図７】図６に従った、化合物のみを標的にするホットスポット領域の配列番号６。化合物７＿１を中空の菱形として示す。
【図８】化合物ＡＳＯ７と比較した、化合物７＿１および１５＿４のインビトロでの潜在性変化。
【図９】インビボマウス研究−１１個の選択した化合物のノックダウン（ｍＲＮＡ）の比較、３つの実験からのコンパイルデータ、研究１＝黒丸、研究２＝白丸、研究３＝白黒が半分ずつの丸。
【図１０】インビボマウス研究−タンパク質およびｍＲＮＡレベルでのノックダウン、および、毛皮質、小脳領域における化合物７＿１への暴露。毛皮質に対するタンパク質データを示す。
【図１１】インビボマウス研究−タンパク質およびｍＲＮＡレベルでのノックダウン、および、毛皮質、小脳領域における化合物１５＿４への暴露。毛皮質に対するタンパク質データを示す。
【図１２】マウスのインビボ研究、１５０μｇの化合物７＿１および化合物１５＿４をＩＣＶ投与した後の時間経過（７日目のみに測定）。
【図１３】ＮＨＰインビボＰＫ／ＰＤ研究−治療の１４日後に測定した、４、８、または２４ｍｇ（化合物７＿１）、および８ｍｇの化合物１５＿４を投与した後の、主要組織におけるｍＲＮＡおよびタンパク質発現量。
【図１４】ＮＨＰインビボＰＫ／ＰＤ研究−治療の１４日後に測定した、４、８、または２４ｍｇ（化合物７＿１）、および８ｍｇの化合物１５＿４を投与した後の、主要組織におけるｍＲＮＡおよびタンパク質発現量。データは、２つの化合物の相対的な特異的活性を示すために提示されている。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
定義
オリゴヌクレオチド
本明細書で使用する場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、当業者により一般的に理解されるように、２つ以上の共有結合ヌクレオシドを含む分子として定義される。そのような共有結合したヌクレオシドは、核酸分子またはオリゴマーと呼ばれることもあり得る。オリゴヌクレオチドは一般的に、固相化学合成、続いて精製および単離により、実験室で作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基部分の配列もしくは順序、またはその修飾が参照される。本発明のオリゴヌクレオチドは、人工であり、化学的に合成され、典型的には精製または単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば２’糖修飾ヌクレオシドなどの１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含んでもよい。
【００４３】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書で使用される用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは単鎖である。本発明の単鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの全長にわたって内部（ｉｎｔｒａ）または相互（ｉｎｔｅｒ）の自己相補性の程度が５０％未満である限り、ヘアピンまたは分子間二重鎖構造（同じオリゴヌクレオチドの２分子間の二重鎖）を形成できることが理解される。
【００４４】
有利には、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡヌクレオシド（２’−ＯＨ未修飾リボース）を含有しない。
【００４５】
有利には、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば２’糖修飾ヌクレオシドなどの１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む。更に、修飾されていないヌクレオシドがＤＮＡヌクレオシドであるのが有利である。
【００４６】
連続ヌクレオチド配列
用語「連続ヌクレオチド配列」は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書で用語「連続核酸塩基配列」および用語「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」と互換的に使用される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの全ヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列を構成する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、Ｆ−Ｇ−Ｆ’ギャップマー領域などの、連続ヌクレオチド配列を含み、任意に更なるヌクレオチド、例えば、官能基を連続ヌクレオチド配列に結合するために使用され得る、ヌクレオチドリンカー領域を含むことができる。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であっても相補的でなくてもよい。
【００４７】
ＲＮＡｉ剤
本明細書で同じ意味で用いられる、用語「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ剤」、「ｉＲＮＡ剤」、および「ＲＮＡ干渉剤」は、本明細書におけるＲＮＡヌクレオシドを含有し、ＲＮＡが誘導するサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路により、ＲＮＡ転写産物の標的開裂を媒介する、作用物質を意味する。ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）としてのプロセスを通して、ｍＲＮＡの配列特異的分解を指令する。ｉＲＮＡは、細胞、例えば、哺乳動物対象などの対象内の細胞における、標的核酸発現を制御する、例えば阻害する。ＲＮＡｉ剤は、一本鎖ＲＮＡｉ剤および二本鎖ｓｉＲＮＡ、ならびにショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む。本発明のオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列は、ＲＮＡｉ剤の形態であることができる、または、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉ剤の一部を形成することができる。本発明のいくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列は、ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡｉ剤である。
【００４８】
ｓｉＲＮＡ
用語「ｓｉＲＮＡ」は、小型の干渉性リボ核酸ＲＮＡｉ剤を意味し、二本鎖ＲＮＡ分子の一種であり、当該技術分野においては、短鎖干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡとしても知られている。ｓｉＲＮＡは典型的には、（パッセンジャー鎖とも呼ばれる）センス鎖、および（ガイド鎖とも呼ばれる）アンチセンス鎖を含み、各鎖は１７〜３０ヌクレオチド長、典型的には１９〜２５ヌクレオシド長であり、アンチセンス鎖は、標的核酸（好適には成熟ｍＲＮＡ配列）に、完全に相補性であるといった、相補性であり、センス鎖はアンチセンス鎖に相補性であるために、センス鎖とアンチセンス鎖はデュプレックスまたはデュプレックス領域を形成する。ｓｉＲＮＡ鎖は、平滑末端デュプレックスを形成することができ、または有利には、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端は、例えば１、２、または３個のヌクレオシドの３’オーバハングを形成することができる。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖の両方が、第２の３’オーバハングを有する。デュプレックス領域はそれ故、例えば、２１〜２３ヌクレオチド長などの、１７〜２５ヌクレオチド長であることができる。
【００４９】
細胞内に入ると、アンチセンス鎖は、標的核酸の標的分解または標的阻害を媒介するＲＩＳＣ複合体に組み込まれる。ｓｉＲＮＡは典型的には、ＲＮＡヌクレオシドに加えて、修飾ヌクレオシドを含む。または、いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ鎖のヌクレオチドは全て修飾されていることができる（センス）。ＬＮＡ（例えば、国際公開第２００４０８３４３０号、国際公開第２００７０８５４８５号を参照）、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、または２’−Ｏ−メトキシエチルなどの２’−糖修飾ヌクレオシドは、ｓｉＲＮＡに組み込まれることができる。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖は不連続であることができる（例えば、国際公開第２００７１０７１６２号を参照のこと）。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖のシード領域にて生じる、熱不安定化ヌクレオチドの組み込みが、ｓｉＲＮＡのオフターゲット活性の低減に有用であると、報告されている（例えば、国際公開第１８０９８３２８号を参照）。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡなどの、ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾を含む；アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾を含む、または、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全て、および、アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾を含む。更に別の実施形態では、センス鎖のヌクレオチドの全てが修飾を含む；アンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾を含む；または、センス鎖のヌクレオチドの全て、および、アンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾を含む。
【００５１】
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、
デオキシ−ヌクレオチド、３’−末端デオキシ−チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル
修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックド
ヌクレオチド、アンロックドヌクレオチド、コンフォメーション制限ヌクレオチド、制限エチル
ヌクレオチド、非塩基性ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アリル−修飾
ヌクレオチド、２’−Ｃ−アルキル−修飾ヌクレオチド、２’−ヒドロキシル−修飾ヌクレオチド、２’−メトキシエチル
修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、
ホスホロアミデート、非天然塩基含有ヌクレオチド、非結合ヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５−無水ヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基含有ヌクレオチド、メチルホスホネート基含有ヌクレオチド、５＊−ホスホネート含有ヌクレオチド、５’−ホスフェート模倣物含有ヌクレオチド、グリコール変性ヌクレオチド、および２−Ｏ−（Ｎ−メチルアセトアミド）修飾ヌクレオチド、ならびにこれらの組み合わせからなる群から独立して選択されることができる。好適なｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に、５’ホスフェート基または５’ホスフェート模倣物を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端はＲＮＡヌクレオシドである。
【００５２】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つのホスホロチオエート、または
メチルホスホネートヌクレオチド間結合を更に含む。
【００５３】
ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合は、
１つまたは両方の鎖（例えば、アンチセンス鎖；またはセンス鎖）の３’−末端にあることができる、あるいは、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合は、１つまたは両方の鎖（例えば、アンチセンス鎖；またはセンス鎖）の５’−末端にあることができる、あるいは、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオシド間結合は、１つまたは両方の鎖（例えば、アンチセンス鎖；センス鎖）の５’−および３’−末端にあることができる。いくつかの実施形態では、残りのヌクレオシド間結合はホスホジエステル結合である。
【００５４】
ｄｓＲＮＡ剤はリガンドを更に含むことができる。いくつかの実施形態では、配位子は、センス鎖の３’末端にコンジュゲート化されている。
【００５５】
生物学的分布のために、ｓｉＲＮＡは例えば、標的とするリガンドにコンジュゲート化されることができる、および／または脂質ナノ粒子内に配合されることができる。
【００５６】
本発明の別の態様は、治療的使用に好適なｓｉＲＮＡ分子などのｄｓＲＮＡを含む医薬組成物、および、本発明のｓｉＲＮＡなどのｄｓＲＮＡ分子を、例えば、本明細書で開示した様々な病状の治療のために、投与することによる、標的遺伝子の発現の阻害方法に関する。
【００５７】
ヌクレオチド
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの構成単位であり、本発明の目的のために、天然に存在するヌクレオチドおよび天然に存在しないヌクレオチドの両方を含む。本来、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分および１つ以上のリン酸基（ヌクレオシドに存在しない）を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドはまた、「単位」または「モノマー」と互換的に称されてもよい。
【００５８】
修飾ヌクレオシド
本明細書で使用される用語「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」は、等価なＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドと比較して、糖部分または（核酸）塩基部分の１つ以上の修飾の導入によって修飾されたヌクレオシドを指す。好ましい実施形態では、修飾ヌクレオシドは、修飾された糖部分を含む。用語修飾ヌクレオシドはまた、用語「ヌクレオシド類似体」または修飾「単位」または修飾「モノマー」と互換的に使用されてもよい。非修飾ＤＮＡまたはＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書でＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドと称される。ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの塩基領域における修飾を有するヌクレオシドは、それらがＷａｔｓｏｎ  Ｃｒｉｃｋ塩基対合が可能であれば、依然として一般にＤＮＡまたはＲＮＡと称される。
【００５９】
修飾ヌクレオシド間結合
用語「修飾ヌクレオシド間結合」は、２つのヌクレオシドを互いに共有結合する、ホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者により理解されるように定義される。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増加させる。天然に存在するオリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間結合は、隣接するヌクレオシド間のホスホジエステル結合を形成するリン酸基を含む。修飾ヌクレオシド間結合は、インビボ使用のためのオリゴヌクレオチドの安定化に特に有用であり、本発明のオリゴヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの領域、例えばギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域Ｇ内、ならびに領域ＦおよびＦ’などの修飾ヌクレオシドの領域におけるヌクレアーゼ切断から保護する役割を果たし得る。
【００６０】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、天然ホスホジエステルから修飾された１つ以上のヌクレオシド間結合を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％が修飾される。例えば、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、または例えば少なくとも９０％が修飾される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全てが修飾されている。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドを非ヌクレオチド官能基、例えばコンジュゲートに結合するヌクレオシドは、ホスホジエステルであり得ることが認識されるであろう。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全部がヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。
【００６１】
本発明のオリゴヌクレオチドと共に、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を使用するのが有利である。
【００６２】
ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、そのヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態および製造の容易さのために特に有用である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％がホスホロチオエートである。例えば、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、または例えば少なくとも９０％がホスホロチオエートである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全部がホスホロチオエートである。
【００６３】
有利には、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全てがホスホロチオエートである、または、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合の全てがホスホロチオエート結合である。
【００６４】
欧州特許第２  ７４２  １３５号に開示されているように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは他のヌクレオシド間結合（ホスホジエステルおよびホスホロチオエート以外）、例えば、アルキルホスホネート／メチルホスホネートヌクレオシド間を含むことができると認識されており、これは、欧州特許第２  ７４２  １３５号に従うと例えば、別様におけるＤＮＡホスホロチオエートギャップ領域内で認容性を有することができる。
【００６５】
核酸塩基
核酸塩基という用語は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドに存在するプリン（例えばアデニンおよびグアニン）およびピリミジン（例えばウラシル、チミンおよびシトシン）部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能性である修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」は、天然に存在する核酸塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチンと、天然に存在しない多様体との両方を指す。そのような多様体は、例えばＨｉｒａｏら（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｖｏｌ  ４５  ｐａｇｅ  ２０５５およびＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｕｐｐｌ．３７  １．４．１に記載されている。
【００６６】
いくつかの実施形態では、核酸塩基部分は、プリンまたはピリミジンを修飾プリンまたはピリミジン、例えば置換プリンまたは置換ピリミジン、例えばイソシトシン、シュードイソシトシン、５−メチルシトシン、５−チアゾロ−シトシン、５−プロピニル−シトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−ブロモウラシル５−チアゾロ−ウラシル、２−チオ−ウラシル、２’チオ−チミン、イノシン、ジアミノプリン、６−アミノプリン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリンおよび２−クロロ−６−アミノプリンから選択される核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅｄ）に変えることにより修飾される。
【００６７】
核酸塩基部分は、各々の対応する核酸塩基の文字コード、例えばＡ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵにより示され、各文字は、等価な機能の修飾核酸塩基を場合により含み得る。例えば、例示のオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃおよび５−メチルシトシンから選択される。場合により、ＬＮＡギャップマーについて、５−メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドが使用され得る。
【００６８】
修飾オリゴヌクレオチド
修飾オリゴヌクレオチドという用語は、１つ以上の糖−修飾ヌクレオシドおよび／または修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを記述する。キメラ”オリゴヌクレオチドという用語は、修飾ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを記述するために文献で使用されている用語である。
【００６９】
相補性
用語「相補性」は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋの塩基対合の能力を記述する。Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対は、グアニン（Ｇ）−シトシン（Ｃ）およびアデニン（Ａ）−チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでもよく、例えば５−メチルシトシンは度々シトシンの代わりに使用され、したがって相補性という用語は、非修飾および修飾核酸塩基の間のＷａｔｓｏｎ  Ｃｒｉｃｋ塩基対合を包含することが理解されるであろう（例えばＨｉｒａｏら（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｖｏｌ  ４５  ｐａｇｅ  ２０５５およびＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｕｐｐｌ．３７  １．４．１を参照されたい）。
【００７０】
本明細書で使用する場合、用語「％相補性」とは、連続ヌクレオチド配列をまたぐ、核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド）内の連続ヌクレオチド配列の、ヌクレオチドの割合（百分率）が、参照配列（例えば、標的配列または配列モチーフ）に相補性であることを意味する。相補性の百分率はそれ故、（標的配列の５’−３’と、３’から５’へのオリゴヌクレオチド配列とをアラインしたときの）２つの配列間で（Ｗａｔｓｏｎ・Ｃｒｉｃｋ塩基対にて）相補性である、アラインされたヌクレオ塩基の数を計数し、この数を、オリゴヌクレオチド内のヌクレオチドの総数で除して、１００を掛けることにより計算される。このような比較において、整列（塩基対を形成）しない核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチと称される。挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の％相補性の計算にて許容されない。相補性の測定において、Ｗａｔｓｏｎ  Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成するヌクレオ塩基の機能的能力が保持される限り、ヌクレオ塩基の化学修飾は無視されることが理解されよう（例えば、５’−メチルシトシンは、％同一性を計算する目的で、シトシンと同一であると見なされる）。
【００７１】
「完全に相補的な」という用語は、１００％の相補性を指す。
【００７２】
以下は、標的配列に完全に相補性であるオリゴヌクレオチドの例である。
【００７３】
以下は、標的配列（配列番号６）に完全に相補性であるオリゴヌクレオチド（配列番号１５）の例である。
【００７４】
５’ｔｔａａｇｇａｇｇｔｔａａａｇｔａａａａｔｇｔｇａａｔｔｔ３’（配列番号：６）
３’ｃｔｃｃａａｔｔｔｃａｔｔｔｔａｃａｃｔ５’（配列番号１５）
【００７５】
同一性
本明細書で使用される用語「同一性」は、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば配列モチーフ）に同一である、オリゴヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド）の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセントで表される）を指す。同一性の百分率はそれ故、（本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列と、参照配列との）２つの配列間で同一（マッチ）である、アラインされたヌクレオ塩基の数を計数して、この数を、オリゴヌクレオチド内のヌクレオチドの総数で除して、１００を掛けることにより計算される。したがって、同一性の百分率＝（一致×１００）／整列領域（例えば、連続ヌクレオチド配列）の長さ。挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性の百分率の計算において許容されない。同一性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がＷａｔｓｏｎ  Ｃｒｉｃｋ塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう（例えば、５−メチルシトシンは、％同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。
【００７６】
ハイブリダイゼーション
本明細書で使用される用語「ハイブリダイズしている」または「ハイブリダイズする」は、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸）が対向する鎖上の塩基対の間で水素結合を形成することにより二重鎖を形成するとして理解するべきである。２つの核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、度々、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される融解温度（Ｔｍ）によって記述される。生理学的条件では、Ｔｍは親和性に厳密に比例しない（Ｍｅｒｇｎｙ  ａｎｄ  Ｌａｃｒｏｉｘ，２００３，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １３：５１５−５３７）。標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性をより正確に表し、ΔＧ°＝−ＲＴｌｎ（Ｋｄ）によって反応の解離定数（Ｋｄ）に関連付けられ、ここでＲは気体定数であり、Ｔは絶対温度である。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映する。ΔＧ°は、水性濃度が１Ｍ、ｐＨが７、温度が３７℃の反応に関連したエネルギーである。オリゴヌクレオチドの、標的核酸へのハイブリダイゼーションは自然反応であり、自然反応に対するΔＧ°は０未満である。ΔＧ°は例えば、Ｈａｎｓｅｎら，１９６５，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．３６−３８  ａｎｄ  Ｈｏｌｄｇａｔｅら，２００５，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙに記載されているような、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）法を使用して、実験により測定することができる。当業者は、ΔＧ°測定のために市販の装置が入手可能であることを知るであろう。ΔＧ°は、Ｓｕｇｉｍｏｔｏら，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１１２１１−１１２１６  ａｎｄ  ＭｃＴｉｇｕｅら，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：５３８８−５４０５に記載されている、適切に誘導された熱力学的パラメーターを使用して、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，１９９８，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９５：１４６０−１４６５に記載されているのに最も近いモデルを使用することにより、数値的にも推定することができる。ハイブリダイゼーションによってその意図された核酸標的を調節する可能性を有するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて−１０ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションの程度または強度は、標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°により測定される。オリゴヌクレオチドは、８〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて−１０ｋｃａｌの範囲未満、例えば−１５ｋｃａｌ未満、例えば−２０ｋｃａｌ未満、および例えば−２５ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、−１０〜−６０ｋｃａｌ、例えば−１２〜−４０、例えば−１５〜−３０ｋｃａｌまたは−１６〜−２７ｋｃａｌ、例えば−１８〜−２５ｋｃａｌの推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。
【００７７】
標的核酸
本発明に従うと、標的核酸は、哺乳動物ＡＴＸＮ２をコードする核酸であり、例えば、遺伝子、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｐｒｅ−ｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡ配列であることができる。したがって、標的は、ＡＴＸＮ２標的核酸と称され得る。本発明のオリゴヌクレオチドは例えば、哺乳動物ＡＴＸＮ２の標的エクソン領域であることができる、または例えば、ＡＴＸＮ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ内の標的イントロン領域であることができる（表１を参照のこと）。
【００７８】
【表１】
2021526797.tif 000002
【００７９】
好適には、標的核酸はＡＴＸＮ２タンパク質、特に哺乳動物ＡＴＸＮ２、例えば、ヒト、サル、ラット、およびブタＡＴＸＮ２に対するｍＲＮＡおよびｐｒｅ−ｍＲＮＡ配列を付与する、ヒトＡＴＸＮ２（例えば表２および３を参照）をコードする。
【００８０】
いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号１、２、３、４、および５、またはそれらの自然に存在する多様体（例えば、哺乳動物Ａｔａｘｉｎ２タンパク質をコードする配列）からなる群から選択される。
【００８１】
本発明のオリゴヌクレオチドを研究または診断に使用する場合、標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡに由来するｃＤＮＡまたは合成核酸であり得る。
【００８２】
インビボまたはインビトロ用途に関して、本発明のオリゴヌクレオチドは、典型的には、ＡＴＸＮ２標的核酸を発現する細胞における、ＡＴＸＮ２標的核酸の発現を阻害することが可能である。本発明のオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続配列は、典型的には、オリゴヌクレオチドの長さにわたって測定して、場合により１つまたは２つのミスマッチを除いて、また場合により、オリゴヌクレオチドをコンジュゲートなどの任意の官能基に結合し得るヌクレオチドベースのリンカー領域、または他の非相補的末端ヌクレオチドを除いて、ＡＴＸＮ２標的核酸に相補的である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡ、例えば、成熟ｍＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍＲＮＡなどのメッセンジャーＲＮＡであることができる。
【００８３】
いくつかの実施形態では、標的核酸は、ヒトＡＴＸＮ２などの哺乳動物Ａｔａｘｉｎ２タンパク質、例えば、配列番号１に開示されているものなどの、ヒトＡＴＸＮ２  ｍＲＮＡ配列をコードするＲＮＡまたはＤＮＡである。例示的な標的核酸に関する更なる情報を、表２および３に提供する。
【００８４】
【表２】
2021526797.tif 000003
【００８５】
【表３】
2021526797.tif 000004
【００８６】
標的配列
本明細書で使用される用語「標的配列」は、標的核酸に存在するヌクレオチドの配列を指し、これは本発明のオリコヌクレオチドに相補的な核酸塩基配列を含む。いくつかの実施形態では、標的配列は、本発明のオリコヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に相補的な核酸塩基配列を有する標的核酸上の領域からなる。標的核酸のこの領域は、互換的に標的ヌクレオチド配列、標的配列または標的領域と称され得る。
【００８７】
いくつかの実施形態では、標的配列は、単一オリゴヌクレオチドの相補的配列よりも長く、例えば本発明のいくつかのオリゴヌクレオチドの好ましい領域を表し得る。標的核酸の好ましい領域は「ホットスポット」とも呼ぶことができ、これは、標的核酸を、対照の少なくとも５０％まで減少させるといった、１つ以上のオリゴヌクレオチドが標的核酸を効率的に減少させることができる標的ヌクレオチド配列を示す（例えば、図１を参照のこと）。ホットスポットは典型的には、オリゴヌクレオチドのスキャニングライブラリーにより識別され、オリゴヌクレオチドのライブラリーは、標的核酸の大部分をカバーするように設計されている。ホットスポットは一般的に、ホットスポットを標的にする追加のオリゴヌクレオチドライブラリーにより確認される。
【００８８】
いくつかの実施形態では、標的配列は、表４の任意の領域から選択される配列である（Ｒ＿１−Ｒ＿２４２１）。特に、標的配列は、Ｒ＿１〜Ｒ＿１３、Ｒ＿１５〜Ｒ＿８７４、Ｒ＿８７６〜Ｒ＿８９４、Ｒ＿８９６〜Ｒ＿９０２、Ｒ＿９０６〜Ｒ＿１１５１、Ｒ＿１１５３〜Ｒ＿１３３８、Ｒ＿１３４１〜Ｒ＿１４２０、Ｒ＿１４２２〜Ｒ＿１４３５、Ｒ＿１４３７〜Ｒ＿１４６５、Ｒ＿１４６８〜Ｒ＿１４９５、Ｒ＿１４９９〜Ｒ＿１５４２、Ｒ＿１５４５〜Ｒ＿１５９２、Ｒ１５９５〜Ｒ＿１６０２、Ｒ＿１６０４〜Ｒ＿１６４３、Ｒ＿１６４６〜Ｒ＿１８６９、Ｒ＿１８７３〜Ｒ＿１９０５、Ｒ＿１９０７〜Ｒ＿１９２１、Ｒ＿１９２３〜Ｒ＿１９２９、Ｒ＿１９３１〜Ｒ＿２１４５、Ｒ＿２１４７〜Ｒ＿２１５２、Ｒ＿２１５５〜Ｒ＿２２３６、Ｒ＿２２３８〜Ｒ＿２３５６、Ｒ＿２３５８〜Ｒ＿２３７０；Ｒ＿２３７３〜Ｒ＿２４０２、Ｒ＿２４０４〜Ｒ＿２４０７、Ｒ＿２４０９〜Ｒ＿２４１５、およびＲ＿２４２１からなる領域の群の中にある領域のうちの１つから選択することができる。
【００８９】
【表４】
2021526797.tif 000005
2021526797.tif 000006
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【００９０】
いくつかの実施形態では、標的配列は、表５の任意の領域から選択される配列である（Ｗ１〜Ｗ１１５）。特に、標的配列は、Ｗ１；Ｗ４；Ｗ５；Ｗ６；Ｗ７；Ｗ８；Ｗ９；Ｗ１０；Ｗ１１；Ｗ１２；Ｗ１３；Ｗ１４；Ｗ１５；Ｗ１６；Ｗ１７；Ｗ１８；Ｗ１９；Ｗ２０；Ｗ２１；Ｗ２２；Ｗ２３；Ｗ２４；Ｗ２５；Ｗ２６；Ｗ２９；Ｗ３３；Ｗ３４；Ｗ３５；Ｗ３６；Ｗ３７；Ｗ３８；Ｗ３９；Ｗ４１；Ｗ４２；Ｗ４４；Ｗ４５；Ｗ４８；Ｗ４９；Ｗ５０；Ｗ５４；Ｗ５６；Ｗ５７；Ｗ６０；Ｗ６１；Ｗ６２；Ｗ６３；Ｗ６４；Ｗ６５；Ｗ６７；Ｗ６８；Ｗ６９；Ｗ７０；Ｗ７１；Ｗ７２；Ｗ７３；Ｗ７６；Ｗ７７；Ｗ７８；Ｗ８０；Ｗ８１；Ｗ８２；Ｗ８３；Ｗ８４；Ｗ８５；Ｗ８６；Ｗ８７；Ｗ８８；Ｗ８９；Ｗ９０；Ｗ９１；Ｗ９２；Ｗ９３；Ｗ９５；Ｗ９６；Ｗ９７；Ｗ９９；Ｗ１００；Ｗ１０２；Ｗ１０４；Ｗ１０８；Ｗ１１０；Ｗ１１１；Ｗ１１４；およびＷ１１５からなる領域の群の中の領域のうちの１つから選択することができる。
【００９１】
【表５】
2021526797.tif 000026
2021526797.tif 000027
【００９２】
いくつかの実施形態では、標的配列は、表６の任意の領域から選択される配列である（Ｓ１〜Ｓ４６）。特に、標的配列は、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ９、Ｓ１０、Ｓ１１、Ｓ１２、Ｓ１４、Ｓ１５、Ｓ１６、Ｓ１９、Ｓ２１、Ｓ２２、Ｓ２５、Ｓ２６、Ｓ２７、Ｓ２８、Ｓ２９、Ｓ３０、Ｓ３１、Ｓ３３、Ｓ３６、Ｓ４１、Ｓ４３、Ｓ４５、およびＳ４６からなる領域の群の中の領域のうちの１つから選択することができる。
【００９３】
一実施形態では、標的配列は領域Ｗ５４またはＳ１９の配列である。
【００９４】
【表６】
2021526797.tif 000028
【００９５】
本発明の一実施形態では、標的配列は、
【表７】
2021526797.tif 000029
からなる群から選択される。
【００９６】
本発明の一実施形態では、標的配列は、Ｒ＿２７４、Ｒ＿８９３、Ｒ＿８９５、Ｒ＿１４９６、Ｒ＿１９９２、およびＲ＿２４２０からなる群から選択される。
【００９７】
本発明の一実施形態では、標的配列は、
【表８】
2021526797.tif 000030
からなる群から選択される。
【００９８】
本発明の一実施形態では、標的配列は、
【表９】
2021526797.tif 000031
からなる群から選択される。
【００９９】
いくつかの実施形態では、標的配列は、イントロン１、３、９、または１８からのものといった、ヒトＡＴＸＮ２  ｍＲＮＡイントロン１、３、５、９、１０、１１、１、１８、２０、または２１（上記表１を参照のこと）から選択される配列である。
【０１００】
いくつかの実施形態では、標的配列は、エクソン２５からのものなどの、ヒトＡＴＸＮ２  ｍＲＮＡエクソン４、５、または２５（上記表１を参照）から選択される配列である。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、標的配列は、イントロン４／エクソン５、またはエクソン９／イントロン１０の、ヒトＡＴＸＮ２  ｍＲＮＡエクソン／イントロン拡大領域から選択される配列である。
【０１０２】
本発明の一実施形態では、標的配列は配列番号６である。
【０１０３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸、例えば本明細書に記載される標的配列に相補的またはハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列を含む。
【０１０４】
オリゴヌクレオチドが相補的またはハイブリダイズする標的配列は、一般に、少なくとも１０ヌクレオチドの連続核酸塩基配列を含む。連続ヌクレオチド配列は、１０〜４００ヌクレオチド、例えば１０〜１５０、例えば１０〜１００、例えば１０〜６０、例えば１０〜５０ヌクレオチド、例えば１２〜４０ヌクレオチド、例えば１２〜３０、例えば１４〜３０ヌクレオチド、例えば１４〜２５、例えば１５〜２５ヌクレオチド、例えば１５〜１８連続ヌクレオチドである。
【０１０５】
標的細胞
本明細書で使用される用語「標的細胞」は、標的核酸を発現している細胞を指す。いくつかの実施形態では、標的細胞は、インビボまたはインビトロであり得る。いくつかの実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、例えばげっ歯類細胞、例えばマウス細胞もしくはラット細胞、または霊長類細胞、例えばサル細胞もしくはヒト細胞である。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、標的細胞は、プルキンエ細胞などのプルキンエニューロンであることができる。他の関係する標的細胞は、上位運動ニューロンおよび下位運動ニューロンなどの、運動ニューロンである。
【０１０７】
インビトロ評価のために、標的細胞を、Ａ４３１またはＵ２−ＯＳ細胞などの、確立された細胞株であることができる。あるいは、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＣＳ）に由来する運動ニューロン（例えば、Ｓａｎｃｅｓら  ２０１６  Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９（４）：５４２−５５３を参照のこと）、または、ｉＰＣＳ由来のプルキンエ細胞（Ｗａｎｇら  ２０１５  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５：９２３２）を、インビトロスクリーニングのために使用することができる。
【０１０８】
好ましい実施形態において、標的細胞は、ＡＴＸＮ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡまたはＡＴＸＮ２成熟ｍＲＮＡなどの、ＡＴＸＮ２  ｍＲＮＡを発現する。ＡＴＸＮ２  ｍＲＮＡのポリＡテールは、典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチド標的化では無視される。
【０１０９】
天然に存在する多様体
用語「天然に存在する多様体」は、標的核酸と同じ遺伝子座に由来するが、例えば、同じアミノ酸をコードする多数のコドンを引き起こす遺伝コードの縮重のために、またはｐｒｅ−ｍＲＮＡの選択的スプライシング、または多型、例えば単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の存在に起因して異なり得るＡＴＸＮ２遺伝子または転写産物の多様体、および対立遺伝子多様体を指す。オリゴヌクレオチドに対する十分な相補的な配列の存在に基づいて、本発明のオリゴヌクレオチドは、したがって、標的核酸およびその天然に存在する多様体を標的とし得る。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、天然に存在する多様体は、哺乳動物ＡＴＸＮ２標的核酸、例えば配列番号１、２、３、４、および５からなる群から選択される標的核酸に対して少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％または少なくとも９９％相同性を有する。いくつかの実施形態では、天然に存在する変異体は、配列番号１のヒトＡＴＸＮ２標的核酸に対して少なくとも９９％相同性を有する。
【０１１１】
発現の調節
本明細書で使用される用語「発現の調節」は、オリゴヌクレオチドの投与前のＡＴＸＮ２の量と比較したときに、ＡＴＸＮ２の量を変更するオリゴヌクレオチドの能力の総称として理解されるべきである。あるいは、発現の調節は、対照実験を参照することによって決定され得る。対照は、生理食塩水組成物で処理された個体もしくは標的細胞、または非標的化オリゴヌクレオチド（モック）で処理された個体もしくは標的細胞であると一般的に理解されている。
【０１１２】
調節の１つのタイプは、例えばｍＲＮＡの分解または転写の遮断による、ＡＴＸＮ２の発現を阻害、ダウンレギュレート、低減、抑制、除去、停止、遮断、防止、減少、低下、回避または終了するオリゴヌクレオチドの能力である。別のタイプの調節は、例えばスプライス部位の修復またはスプライシングの防止、またはマイクロＲＮＡ抑制などの阻害メカニズムの除去もしくは遮断による、ＡＴＸＮ２の発現を回復、増加または増強するオリゴヌクレオチドの能力である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは有利に、ヒトＡＴＸＮ２などの哺乳動物ＡＴＸＮ２の発現を阻害することができる。
【０１１３】
高親和性修飾ヌクレオシド
高親和性修飾ヌクレオシドは、修飾されたヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドに組み込まれると、例えば、融解温度（Ｔｍ）によって測定されるように、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、修飾ヌクレオシドあたり＋０．５〜＋１２℃、より好ましくは＋１．５〜＋１０℃、最も好ましくは＋３〜＋８℃の融解温度の上昇をもたらす。多数の高親和性修飾ヌクレオシドが当技術分野にて既知であり、例えば、多くの２’置換ヌクレオシドおよびロックド核酸（ＬＮＡ）が含まれる（例えば、Ｆｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９−４４４３  ａｎｄ  Ｕｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３−２１３を参照されたい）。
【０１１４】
糖修飾
本発明のオリゴマーは、修飾された糖部分、即ち、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較した場合の糖部分の修飾を有する１つ以上のヌクレオシドを含み得る。
【０１１５】
リボース糖部分の修飾を有する多数のヌクレオシドが、親和性および／またはヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドの特定の特性を改善することを主な目的として作製されている。
【０１１６】
そのような修飾には、例えばヘキソース環（ＨＮＡ）または二環式環（典型的には、リボース環（ＬＮＡ）のＣ２とＣ４炭素の間にバイラジカル架橋を有する）、または典型的にはＣ２とＣ３炭素の間の結合を欠く非結合リボース環（例えば、ＵＮＡ）で置き換えることにより、リボース環構造が修飾されているものが含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えばビシクロヘキソース核酸（国際公開第２０１１／０１７５２１号）または三環式核酸（国際公開第２０１３／１５４７９８号）が含まれる。修飾ヌクレオシドには、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）の場合には、糖部分が非糖部分で置き換えられているヌクレオシド、またはモルホリノ核酸も含まれる。
【０１１７】
糖修飾には、リボース環上の置換基を水素以外の基、またはＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオシドに天然に存在する２’−ＯＨ基に変更することによる修飾も含まれる。置換基は、例えば２’、３’、４’または５’位で導入され得る。
【０１１８】
２’糖修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨまたは−ＯＨ以外の置換基を有し（２’置換ヌクレオシド）、または２’炭素とリボース環の第２の炭素との間に架橋を形成できる２’結合バイラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’−４’バイラジカル架橋）である。
【０１１９】
実際、２’置換ヌクレオシドの開発には多くの注目が集まっており、多くの２’糖置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに組み込まれた際に有益な特性を有することが見出されている。例えば、２’修飾ヌクレオシドは、向上された結合親和性、および／または増大されたヌクレアーゼ耐性をオリゴヌクレオチドに提供することができる。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡおよび２’−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシドである。更なる例については、例えばＦｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９−４４４３およびＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３−２１３、およびＤｅｌｅａｖｅｙ  ａｎｄ  Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１２，１９，９３７を参照。以下は、いくつかの２’置換修飾ヌクレオシドの説明である。
【化１】
2021526797.tif 000032
【０１２０】
本発明に関連して、２’置換糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡのように、２’架橋ヌクレオシドを含まない。
【０１２１】
ロックド核酸ヌクレオシド（ＬＮＡヌクレオシド）
「ＬＮＡヌクレオシド」は、前記ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’を結合するバイラジカル（「２’−４’架橋」とも称される）を含む２’修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環の立体配座を制限または固定する。これらのヌクレオシドは、文献にて架橋核酸または二環式核酸（ＢＮＡ）とも称されている。リボースのコンフォメーションの固定は、ＬＮＡが相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子のオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の向上（二重鎖安定化）に関連している。これはオリゴヌクレオチド／補完二重鎖の融解温度を測定することにより日常的に決定され得る。
【０１２２】
非限定的な、例示的なＬＮＡヌクレオシドは、国際公開９９／０１４２２６号、同第００／６６６０４号、同第９８／０３９３５２号、同第２００４／０４６１６０号、同第００／０４７５９９号、同第２００７／１３４１８１号、同第２０１０／０７７５７８号、同第２０１０／０３６６９８号、同第２００７／０９００７１号、同第２００９／００６４７８号、同第２０１１／１５６２０２号、同第２００８／１５４４０１号、同第２００９／０６７６４７号、同第２００８／１５０７２９、Ｍｏｒｉｔａら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２，７３−７６，Ｓｅｔｈら．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０，Ｖｏｌ  ７５（５）ｐｐ．１５６９−８１，ａｎｄ  Ｍｉｔｓｕｏｋａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００９，３７（４），１２２５−１２３８，ａｎｄ  Ｗａｎ  ａｎｄ  Ｓｅｔｈ，Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１６，５９，９６４５−９６６７に開示されている。
【０１２３】
更なる非限定的な、例示的なＬＮＡヌクレオシドは、スキーム１に開示されている。
【０１２４】
スキーム１：
【化２】
2021526797.tif 000033
【０１２５】
特定のＬＮＡヌクレオシドは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、６’−メチル−β−Ｄ−オキシＬＮＡ、例えば（Ｓ）−６’−メチル−β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ（ＳｃＥＴ）およびＥＮＡである。
【０１２６】
特定の有利なＬＮＡは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである。
【０１２７】
本明細書に記載される化合物は、数個の不斉中心を含むことができ、光学的に純粋なエナンチオマー、例えばラセミ体などのエナンチオマーの混合物、ジアステレオ異性体の混合物、ジアステレオ異性体ラセミ体またはジアステレオ異性体ラセミ体の混合物として存在することができる。
【０１２８】
用語「不斉炭素原子」は、４つの異なる置換基を有する炭素原子を意味する。Ｃａｈｎ−Ｉｎｇｏｌｄ−Ｐｒｅｌｏｇ則によれば、不斉炭素原子は、「Ｒ」または「Ｓ」立体配置のものであり得る。
【０１２９】
薬学的に許容される塩
用語「薬学的に許容される塩」は、生物学的にまたは別様に望ましくないものではない、遊離塩基または遊離酸の生物学的有効性および特性を保持する塩を指す。塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、特に塩酸、および酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、Ｎ−アセチルシステインなどの有機酸と共に形成される。加えて、これらの塩は、無機塩基または有機塩基を遊離酸に加えることにより調製され得る。無機塩基から誘導される塩には、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム塩が含まれるがこれらに限定されない。有機塩基から誘導される塩には、第１級、第２級、および第３級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環式アミンおよび塩基性イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リシン、アルギニン、Ｎ−エチルピペリジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂の塩が含まれるがこれらに限定されない。式（Ｉ）の化合物は、双性イオンの形態で存在することもできる。特に好ましくは、式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容される塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸およびメタンスルホン酸の塩である。
【０１３０】
保護基
用語「保護基」は、単独または組み合わせで、化学反応が他の非保護の反応性部位で選択的に行われ得るように、多官能化合物の反応性部位を選択的に遮断する基を意味する。保護基は、除去することができる。例示的な保護基は、アミノ保護基、カルボキシ保護基またはヒドロキシ保護基である。
【０１３１】
ヌクレアーゼ媒介分解
ヌクレアーゼ媒介分解は、相補的なヌクレオチド配列と二重鎖を形成するときに、そのような配列の分解を媒介することができるオリゴヌクレオチドを指す。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的核酸のヌクレアーゼ媒介分解により機能することができ、ここで、本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ、特に、およびエンドヌクレアーゼ、好ましくはＲＮａｓｅＨなどのエンドリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）を動員することができる。ヌクレアーゼ媒介メカニズムにより作用するオリゴヌクレオチドデザインの例は、典型的には、少なくとも５または６個の連続したＤＮＡヌクレオシドの領域を含み、一端または両端に、親和性向上ヌクレオシド、例えばギャップマー、ヘッドマー、およびテイルマーが隣接している、オリゴヌクレオチドである。
【０１３３】
ＲＮａｓｅＨ活性および動員
アンチセンスアンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅＨ活性は、相補的ＲＮＡ分子と二重鎖を形成するときにＲＮａｓｅＨを動員するその能力を指す。国際公開第０１／２３６１３号は、ＲＮａｓｅＨ活性を決定するインビトロ方法を提供し、これはＲＮａｓｅＨを動員する能力の決定に使用され得る。典型的には、オリゴヌクレオチドは、相補的な標的核酸が提供された場合、ｐｍｏｌ／ｌ／分で測定して、試験されている修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、ＤＮＡモノマーのみを含み、オリゴヌクレオチドの全モノマー間にホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドを使用し、また国際公開第０１／２３６１３号（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例９１〜９５により提供される方法論を使用したときに決定された初期率の少なくとも５％、例えば少なくとも１０％または２０％超を有する場合に、ＲＮａｓｅＨを動員することができると見なされる。ＲＨａｓｅＨ活性の測定に使用するために、組換えヒトＲＮａｓｅＨ１がＬｕｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨ，Ｌｕｃｅｒｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手可能である。
【０１３４】
ギャップマー
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列は、ギャップマーオリゴヌクレオチドまたはギャップマーデザインとも呼ばれる、ギャップマーであることができる。アンチセンスギャップマーは、通常、ＲＮａｓｅ媒介分解を介して標的核酸を阻害するのに使用される。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つの区別される構造領域、５’−フランク、ギャップおよび３’−フランク、Ｆ−Ｇ−Ｆ’を５’−＞３’配向で含む。「ギャップ」領域（Ｇ）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ  Ｈを動員することを可能にする連続ＤＮＡヌクレオチドのストレッチを含む。ギャップ領域には、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む５’フランク領域（Ｆ）、および、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む３’フランク領域（Ｆ’）が隣接している。領域ＦおよびＦ’の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増強する（即ち、これは親和性増強糖修飾ヌクレオシドである）。いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、２’糖修飾ヌクレオシド、例えばＬＮＡおよび２’−ＭＯＥから独立して選択される、例えば高親和性２’糖修飾である。
【０１３５】
ギャップマー設計において、ギャップ領域の最も５’および３’のヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドであり、各々、５’（Ｆ）または３’（Ｆ’）の糖修飾ヌクレオシドに隣接して配置されている。フランクは更に、ギャップ領域から最も遠い端、即ち５’フランクの５’末端および３’フランクの３’末端に少なくとも１つの糖修飾ヌクレオシドを有することによって定義されてもよい。
【０１３６】
領域Ｆ−Ｇ−Ｆ’は、連続ヌクレオチド配列を形成する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列は、式Ｆ−Ｇ−Ｆ’のギャップマー領域を含んでもよい。
【０１３７】
ギャップマー設計Ｆ−Ｇ−Ｆ’の全長は、例えば１２〜３２ヌクレオシド、例えば１３〜２４、例えば１４〜２２ヌクレオシド、例えば１４〜１７、例えば１６〜１８ヌクレオシドであってもよい。
【０１３８】
例として、本発明のギャップマーオリゴヌクレオチドは、以下の式により表すことができる：
Ｆ１〜８−Ｇ６〜１６−Ｆ’１〜８、例えば
Ｆ１〜８−Ｇ８〜１６−Ｆ’２〜８
ただし、ギャップマー領域の全長は、少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長であることを条件とする。
【０１３９】
本発明の一態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列は、式５’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−３’のギャップマーからなり、またはこれを含み、領域ＦおよびＦ’は独立して、１〜８個、例えば２〜６個、例えば３〜４個の２’糖修飾ヌクレオシドを含み、またはこれからなり、（領域ＧのＤＮＡヌクレオシドに隣接した）領域Ｆの３’末端に位置する、少なくとも１つの２’糖修飾ヌクレオシドが存在し、（領域ＧのＤＮＡヌクレオシドに隣接して位置する）領域Ｆ’の５’末端に位置する、少なくとも１つの２’糖修飾ヌクレオシドが存在し、Ｇは、６〜１６個のＤＮＡヌクレオシド、例えば１０〜１５個の連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば、１０〜１４個の連続ＤＮＡヌクレオチド、例えば１１〜１５個の連続ＤＮＡヌクレオチド、例えば１３〜１５個の連続ＤＮＡヌクレオチドの領域などの、ＲＮａｓｅＨを動員可能な、６〜１６個のヌクレオシドの領域である。
【０１４０】
ＬＮＡギャップマー
ＬＮＡギャップマーは、領域ＦおよびＦ’の一方または両方のいずれかが、ＬＮＡヌクレオシドを含み、またはそれからなるギャップマーである。β−Ｄ−オキシギャップマーは、領域ＦおよびＦ’の一方または両方のいずれかが、β−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを含み、またはそれからなるギャップマーである。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、ＬＮＡギャップマーは、式：［ＬＮＡ］１−〜５−［領域Ｇ］−［ＬＮＡ］１〜５のものであり、領域Ｇはギャップマー領域Ｇの定義に定義したとおりである。
【０１４２】
ＭＯＥギャップマー
ＭＯＥギャップマーは、領域ＦおよびＦ’がＭＯＥヌクレオシドからなるギャップマーである。いくつかの実施形態では、ＭＯＥギャップマーは、設計［ＭＯＥ］１〜８−［領域Ｇ］−［ＭＯＥ］１〜８、例えば［ＭＯＥ］２〜７−［領域Ｇ］５〜１６−［ＭＯＥ］２〜７、例えば［ＭＯＥ］３〜６−［領域Ｇ］−［ＭＯＥ］３〜６のものであり領域Ｇはギャップマーの定義に定義したとおりである。５−１０−５設計（ＭＯＥ−ＤＮＡ−ＭＯＥ）を有するＭＯＥギャップマーは、当技術分野で広く使用されている。
【０１４３】
混合ウイングギャップマー
混合ウイングギャップマーは、領域ＦおよびＦ’の一方または両方が、２’置換ヌクレオシド、例えば２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位および２’−フルオロ−ＡＮＡ単位から独立して選択される２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドを含むＬＮＡギャップマーである。領域ＦおよびＦ’の少なくとも一方、または領域ＦおよびＦ’の両方が少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の残りのヌクレオシドは、ＭＯＥおよびＬＮＡからなる群から独立して選択される。領域ＦおよびＦ’の少なくとも一方、または領域ＦおよびＦ’の両方が少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の残りのヌクレオシドは、ＭＯＥおよびＬＮＡからなる群から独立して選択される。いくつかの混合ウイング実施形態では、領域ＦおよびＦ’の一方または両方が、１つ以上のＤＮＡヌクレオシドを更に含んでもよい。
【０１４４】
混合ウイングギャップマーデザインは、国際公開第２００８／０４９０８５号、および同第２０１２／１０９３９５号に開示されている。
【０１４５】
交互フランクギャップマー
フランク領域は、ＬＮＡとＤＮＡヌクレオシドの両方を含むことができ、ＬＮＡ−ＤＮＡ−ＬＮＡヌクレオシドの交互モチーフを含むため、「交互フランク」と呼ばれる。このような交互フランクを含むギャップマーは、「交互フランクギャップマー」と呼ばれる。「交互フランクギャップマー」はそれ故、ＬＮＡギャップマーオリコヌクレオチドであり、フランクの少なくとも一方（ＦまたはＦ’）が、ＬＮＡヌクレオシドに加えてＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、領域ＦもしくはＦ’、または両領域ＦおよびＦ’は、ＬＮＡヌクレオシドおよびＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。そのような実施形態では、隣接領域ＦもしくはＦ’、またはＦおよびＦ’の両方は、少なくとも３つのヌクレオシドを含み、Ｆおよび／またはＦ’領域の最も５’および３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。
【０１４６】
交互フランク領域、最大で３個のＤＮＡヌクレオシド、例えば、１〜２個、または１個、または２個、または３個の連続ＤＮＡヌクレオシドを含むことができる。
【０１４７】
オリゴヌクレオチドにおける領域Ｄ’またはＤ”
本発明のオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマーＦ−Ｇ−Ｆ’、ならびに更に５’および／または３’ヌクレオシドを含み、またはそれからなり得る。更なる５’および／または３’ヌクレオシドは、標的核酸に完全に相補的であってもよく、または完全に相補的でなくてもよい。このような更なる５’および／または３’ヌクレオシドは、本明細書で領域Ｄ’およびＤ”と称され得る。
【０１４８】
領域Ｄ’またはＤ”の追加は、連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマーをコンジュゲート部分または他の官能基に連結することを目的として用いられ得る。連続ヌクレオチド配列をコンジュゲート部分に連結するのに使用される場合、生体切断可能なリンカーとしての役割を果たし得る。あるいは、それはエキソヌクレアーゼ保護を提供するために、または合成もしくは製造を容易にするために使用され得る。
領域Ｄ’およびＤ”は、各々、領域Ｆの５’末端または領域Ｆ’の３’末端に結合されて、以下の式Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’、Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ”または
【０１４９】
Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ”の設計を生成することができる。この場合、Ｆ−Ｇ−Ｆ’はオリゴヌクレオチドのギャップマー部分であり、領域Ｄ’またはＤ”は、オリゴヌクレオチドの別個の部分を構成する。
【０１５０】
領域Ｄ’またはＤ”は、独立して、１、２、３、４または５個の追加のヌクレオチドを含み、またはそれからなり、標的核酸に相補的であっても、または相補的でなくてもよい。ＦまたはＦ’領域に隣接するヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオチドではなく、例えばＤＮＡまたはＲＮＡまたはこれらの塩基修飾バージョンである。Ｄ’およびＤ”領域は、ヌクレアーゼ感受性の生体切断可能なリンカーとしての役割を果たし得る（リンカーの定義を参照されたい）。いくつかの実施形態では、追加の５’および／または３’末端ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で連結され、ＤＮＡまたはＲＮＡである。領域Ｄ’およびＤ”としての使用に好適なヌクレオチドベースの生体切断可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号に開示されており、これは例としてホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドを含む。ポリオリゴヌクレオチド構築物における生体切断可能なリンカーの使用は、国際公開第２０１５／１１３９２２号に開示されており、それらは複数のアンチセンス構築物（例えば、ギャップマー領域）を単一のオリゴヌクレオチド内で結合するのに使用されている。
【０１５１】
一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマーを構成する連続ヌクレオチド配列に加えて、領域Ｄ’および／またはＤ”を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の式により表すことができる：
Ｆ−Ｇ−Ｆ’；特にＦ１〜８−Ｇ６〜１６−Ｆ’２〜８
Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’、特にＤ’１〜３−Ｆ１〜８−Ｇ６〜１６−Ｆ’２〜８
Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ”、特にＦ１〜８−Ｇ６〜１６−Ｆ’２〜８−Ｄ”１〜３
Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ’’、特にＤ’１〜３−Ｆ１〜８−Ｇ６〜１６−Ｆ’２〜８−Ｄ”１〜３
【０１５２】
いくつかの実施形態では、領域Ｄ’と領域Ｆの間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’と領域Ｄ”の間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。
【０１５３】
コンジュゲート
本明細書で使用されるコンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分に共有結合したオリゴヌクレオチドを指す（コンジュゲート部分または領域Ｃまたは第３の領域）。
【０１５４】
１つ以上の非ヌクレオチド部分に対する本発明のオリゴヌクレオチドのコンジュゲート化は、例えば、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞取り込み、または安定性に影響を及ぼすことにより、オリゴヌクレオチドの薬理学を改善することができる。いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの細胞分布、バイオアベイラビリティ、代謝、排泄、浸透性、および／または細胞取り込みを改善することにより、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を調節または向上させる。特に、コンジュゲートは、オリゴヌクレオチドを特定の器官、組織または細胞型に標的化し、それにより、その器官、組織または細胞型におけるオリゴヌクレオチドの有効性を増強し得る。同時に、コンジュゲートは、非標的細胞型、組織または器官内のオリゴヌクレオチドの活性を低下させるのに役立ち得る（例えば、非標的細胞型、組織または器官内のオフ標的活性または活性）。
【０１５５】
一実施形態では、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）は、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、キャプシド）またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／１４３３７９号に開示されているような、トランスフェリン受容体に対して特異的親和性を有する抗体または抗体断片である。いくつかの実施形態では、非ヌクレオチド部分は、抗体または抗体断片、例えば脳血液関門を通過する送達を促進する抗体または抗体断片、特にトランスフェリン受容体を標的とする抗体または抗体断片である。
【０１５７】
リンカー
リンケージまたはリンカーは、１つ以上の共有結合を介して、対象の化学基またはセグメントを別の化学基またはセグメントに連結する２つの原子間の接続である。コンジュゲート部分は、直接または連結部分（例えば、リンカーまたはテザー）を介してオリゴヌクレオチドに付着させることができる。リンカーは、第３の領域、例えばコンジュゲート部分（領域Ｃ）を、第１の領域、例えば、標的核酸（領域Ａ）に相補性であるオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列に共有結合する役割を持つ。
【０１５８】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のコンジュゲートまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、場合により、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列（領域Ａまたは第１の領域）の間に位置するリンカー領域（第２の領域または領域Ｂおよび／または領域Ｙ）と、コンジュゲート部分（領域Ｃまたは第３の領域）とを含み得る。
【０１５９】
領域Ｂは、哺乳動物の体内で通常遭遇するまたは遭遇するものに類似した条件下で切断可能である生理学的に不安定な結合を含み、またはそれからなる生体切断可能なリンカーを指す。生理学的に不安定なリンカーが化学的変換（例えば、切断）を受ける条件には、ｐＨ、温度、酸化のしくは還元条件または薬剤などの化学条件、および哺乳動物細胞で見られるまたは遭遇するものに類似した塩濃度が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解酵素または加水分解酵素またはヌクレアーゼなどの哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。一実施形態では、生体切断可能なリンカーは、Ｓ１ヌクレアーゼ切断の影響を受けやすい。好ましい実施形態において、ヌクレアーゼの影響を受けやすいリンカーは、少なくとも２個の連続ホスホジエステル結合、例えば、少なくとも３個または４個または５個の、連続ホスホジエステル結合を含む、１〜１０個のヌクレオシド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオシド、より好ましくは２〜６個のヌクレオシド、および最も好ましくは、２〜４個の結合ヌクレオシドを含む。ヌクレオシドはＤＮＡまたはＲＮＡであるのが好ましい。ホスホジエステルを含む生体切断可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号（参照により本明細書に組み込まれる）により詳細に記載されている−本明細書の領域Ｄ’またはＤ”も参照されたい。
【０１６０】
領域Ｙは、必ずしも生体切断可能ではないが、主にコンジュゲート部分（領域Ｃまたは第３の領域）をオリゴヌクレオチド（領域Ａまたは第１の領域）に共有結合させるのに役立つリンカーを指す。領域Ｙリンカーは、エチレングリコール、アミノ酸単位またはアミノアルキル基などの反復単位の鎖構造またはオリゴマーを含み得る。本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、以下の局所要素Ａ−Ｃ、Ａ−Ｂ−Ｃ、Ａ−Ｂ−Ｙ−Ｃ、Ａ−Ｙ−Ｂ−ＣまたはＡ−Ｙ−Ｃから構築することができる。いくつかの実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、例えばＣ６〜Ｃ１２アミノアルキル基を含むＣ２〜Ｃ３６アミノアルキル基などのアミノアルキルである。好ましい実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、Ｃ６アミノアルキル基である。
【０１６１】
治療
本明細書で使用される用語「治療」は、既存の疾患（例えば、本明細書で言及される疾患または障害）の治療、または疾患の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、即ち予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）の両方を指す。したがって、本明細書で言及される治療は、いくつかの実施形態では、予防的であり得ることが認識されるであろう。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、治療は、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー性前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソニズム、およびＴＤＰ−４３タンパク質症を伴う状態を含む神経変性病からなる群から選択される神経疾患といった、神経疾患を患うと診断されている患者にて実施される。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療で使用するためのものである。
【０１６４】
発明を実施するための形態
発明の詳細な説明
本発明のオリゴヌクレオチド
本発明は、ＡＴＸＮ２を阻害する（ダウンレギュレートする）といった、ＡＴＸＮ２の発現を制御することができるオリゴヌクレオチドに関する。制御は、Ａｔａｘｉｎ２をコードする標的核酸にハイブリダイズすることで達成される。標的核酸は、配列番号１、２、３、４、および５からなる群から選択される配列といった、哺乳動物ＡＴＸＮ２配列であることができる。
【０１６５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＡＴＸＮ２を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドが、表４〜６に列挙する領域のうちの１つから選択される標的配列に相補性である場合、有利である。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、Ｒ１〜Ｒ２４２１（表４）から選択される標的配列に完全に相補性であるといった、少なくも９０％相補性である。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、Ｗ１〜Ｗ１１５（表５）から選択される標的配列に完全に相補性であるといった、少なくも９０％相補性である。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、Ｓ１〜Ｓ４６（表６）から選択される標的配列に完全に相補性であるといった、少なくも９０％相補性である。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号１（表１）のｉ１〜ｉ２４から選択される標的配列といった、ＡＴＡＸＮ２標的核酸配列のイントロン領域に完全に相補性であるといった、少なくとも９０％相補性である。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号１（表１）のｉ１、ｉ３、ｉ９、またはｉ１８などの、ヒトＡＴＡＸＮ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのイントロン１、３、５、９、１０、１１、１４、１８、２０、または２１に完全に相補性であるといった、少なくとも９０％相補性である。
【０１６８】
実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号１（表１）のｅ２５などの、ヒトＡＴＡＸＮ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのエクソン４、５、または２５に完全に相補性であるといった、少なくとも９０％相補性である。
【０１６９】
実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号１におけるような、ヒトＡＴＡＸＮ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡの、イントロン４／エクソン５、またはエクソン９／イントロン１０のエクソン／イントロン拡大領域に完全に相補性であるといった、少なくとも９０％相補性である。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的の発現を阻害またはダウンレギュレートすることにより、それを調節することができる。好ましくは、そのような調節は、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも２０％、より好ましくは、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の阻害をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、２５μＭのオリゴヌクレオチドをＡ４３１、またはＵ２−ＯＳ細胞に適用した後で、インビトロで、少なくとも６０％または７０％の、ＡＴＸＮ２  ｍＲＮＡの発現量を阻害することができ得る。いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、５μＭのオリゴヌクレオチドをＡ４３１またはＵ２−ＯＳ細胞に用いることで、インビトロで少なくとも５０％、ＡＴＸＮ２タンパク質の発現量を阻害することができ得る。好適には、実施例は、ＡＴＸＮ２  ｍＲＮＡまたはタンパク質阻害を測定するために使用可能なアッセイを提供する（例えば、実施例１および２）。標的調節は、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列と標的核酸との間のハイブリダイゼーションによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間のミスマッチを含む。ミスマッチにもかかわらず、標的核酸へのハイブリダイゼーションは、ＡＴＸＮ２発現の所望の調節を示すのに尚十分であり得る。ミスマッチから生じる結合親和性の低下は、オリゴヌクレオチド内のヌクレオチド数の増加、および／または、標的への結合親和性を増加させることができる修飾ヌクレオシド、例えばオリゴヌクレオチド配列内に存在する、ＬＮＡを含む２’糖修飾ヌクレオシドの数の増加により有利に補償され得る。
【０１７１】
本出願にて記載した一態様は、配列番号１に１００％相補性であるといった、少なくとも９０％の相補性を有する、１０〜３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、１０〜３０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。連続ヌクレオチド配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ長さであるか、これより短いと、一般に理解される。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド配列または連続ヌクレオチド配列は、配列番号１および配列番号２に存在する、対応する標的核酸領域に１００％相補性である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド配列または連続ヌクレオチド配列は、配列番号１および配列番号５に存在する、対応する標的核酸領域に１００％相補性である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド配列、連続ヌクレオチド配列は、配列番号１、２、および３に存在する、対応する標的核酸領域に１００％相補性である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド配列、連続ヌクレオチド配列は、配列番号１、３、および５に存在する、対応する標的核酸領域に１００％相補性である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド配列、連続ヌクレオチド配列は、配列番号１、２、３、４、および５に存在する、対応する標的核酸領域に１００％相補性である。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、表４の任意の領域（Ｒ＿１〜Ｒ＿２４２１）から選択される、対応する標的配列に１００％相補性であるといった、少なくとも９０％相補性である、１０〜３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。特に、標的配列は、Ｒ＿１〜Ｒ＿１３、Ｒ＿１５〜Ｒ＿８７４、Ｒ＿８７６〜Ｒ＿８９４、Ｒ＿８９６〜Ｒ＿９０２、Ｒ＿９０６〜Ｒ＿１１５１、Ｒ＿１１５３〜Ｒ＿１３３８、Ｒ＿１３４１〜Ｒ＿１４２０、Ｒ＿１４２２〜Ｒ＿１４３５、Ｒ＿１４３７〜Ｒ＿１４６５、Ｒ＿１４６８〜Ｒ＿１４９５、Ｒ＿１４９９〜Ｒ＿１５４２、Ｒ＿１５４５〜Ｒ＿１５９２、Ｒ１５９５〜Ｒ＿１６０２、Ｒ＿１６０４〜Ｒ＿１６４３、Ｒ＿１６４６〜Ｒ＿１８６９、Ｒ＿１８７３〜Ｒ＿１９０５、Ｒ＿１９０７〜Ｒ＿１９２１、Ｒ＿１９２３〜Ｒ＿１９２９、Ｒ＿１９３１〜Ｒ＿２１４５、Ｒ＿２１４７〜Ｒ＿２１５２、Ｒ＿２１５５〜Ｒ＿２２３６、Ｒ＿２２３８〜Ｒ＿２３５６、Ｒ＿２３５８〜Ｒ＿２３７０；Ｒ＿２３７３〜Ｒ＿２４０２、Ｒ＿２４０４〜Ｒ＿２４０７、Ｒ＿２４０９〜Ｒ＿２４１５、およびＲ＿２４２１からなる領域の群の中にある領域のうちの１つから選択することができる。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、表４の任意の領域（Ｒ＿１〜Ｒ＿２４２１）から選択される、対応する標的配列に１００％相補性であるといった、少なくとも９０％相補性である、１０〜３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。特に、標的配列は、Ｒ＿２７４、Ｒ＿５６０、Ｒ＿５９６、Ｒ＿７１６、Ｒ＿８９３、Ｒ＿８９５、Ｒ＿９０３、Ｒ＿９０５、Ｒ＿１０３３、Ｒ＿１４２１、Ｒ＿１４６７、Ｒ＿１４９６、Ｒ＿１４９８、Ｒ＿１５３７、Ｒ＿１５５４、Ｒ＿１６９０、Ｒ＿１９９２、Ｒ＿２１８５、およびＲ＿２４２０からなる領域の群の中の領域のうちの１つから選択することができる。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、表４の任意の領域（Ｒ＿１〜Ｒ＿２４２１）から選択される、対応する標的配列に１００％相補性であるといった、少なくとも９０％相補性である、１０〜３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。特に、標的配列は、Ｒ＿２７４、Ｒ＿８９３、Ｒ＿８９５、Ｒ＿１４９６、Ｒ＿１９９２、およびＲ＿２４２０からなる領域の群の中の領域のうちの１つから選択することができる。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、対応する標的配列に１００％相補性であるといった、少なくとも９０％相補性である、１０〜３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。標的配列は、表５の任意の領域（Ｗ１〜Ｗ１１５）から選択される配列である。特に、標的配列は、Ｗ１；Ｗ４；Ｗ５；Ｗ６；Ｗ７；Ｗ８；Ｗ９；Ｗ１０；Ｗ１１；Ｗ１２；Ｗ１３；Ｗ１４；Ｗ１５；Ｗ１６；Ｗ１７；Ｗ１８；Ｗ１９；Ｗ２０；Ｗ２１；Ｗ２２；Ｗ２３；Ｗ２４；Ｗ２５；Ｗ２６；Ｗ２９；Ｗ３３；Ｗ３４；Ｗ３５；Ｗ３６；Ｗ３７；Ｗ３８；Ｗ３９；Ｗ４１；Ｗ４２；Ｗ４４；Ｗ４５；Ｗ４８；Ｗ４９；Ｗ５０；Ｗ５４；Ｗ５６；Ｗ５７；Ｗ６０；Ｗ６１；Ｗ６２；Ｗ６３；Ｗ６４；Ｗ６５；Ｗ６７；Ｗ６８；Ｗ６９；Ｗ７０；Ｗ７１；Ｗ７２；Ｗ７３；Ｗ７６；Ｗ７７；Ｗ７８；Ｗ８０；Ｗ８１；Ｗ８２；Ｗ８３；Ｗ８４；Ｗ８５；Ｗ８６；Ｗ８７；Ｗ８８；Ｗ８９；Ｗ９０；Ｗ９１；Ｗ９２；Ｗ９３；Ｗ９５；Ｗ９６；Ｗ９７；Ｗ９９；Ｗ１００；Ｗ１０２；Ｗ１０４；Ｗ１０８；Ｗ１１０；Ｗ１１１；Ｗ１１４；およびＷ１１５からなる領域の群の中の領域のうちの１つから選択することができる。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、対応する標的配列に１００％相補性であるといった、少なくとも９０％相補性である、１０〜３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。標的配列は、表５の任意の領域（Ｓ１〜Ｓ４６）から選択される配列である。特に、標的配列は、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ９、Ｓ１０、Ｓ１１、Ｓ１２、Ｓ１４、Ｓ１５、Ｓ１６、Ｓ１９、Ｓ２１、Ｓ２２、Ｓ２５、Ｓ２６、Ｓ２７、Ｓ２８、Ｓ２９、Ｓ３０、Ｓ３１、Ｓ３３、Ｓ３６、Ｓ４１、Ｓ４３、Ｓ４５、およびＳ４６からなる領域の群の中の領域のうちの１つから選択することができる。
【０１７８】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、領域Ｓ１９の標的配列に１００％相補性であるといった、少なくとも９０％相補性である１０〜２２ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、またはこれからなる。
【０１７９】
本発明の一態様は、配列番号６、１５０５、１５０６、１５０７、１５０８、１５０９、１５１０、１５１１、１５１２、１５１３、１５１４、１５１５、１５１６、１５１７、１５１８、１５１９、１５２０、１５２１、１５２２、１５２３、１５２４、および１５２５に１００％相補性であるといった、少なくとも９０％相補性である１０〜２２ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、１０〜３０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号６、１５０５、１５０６、１５０７、１５０８、１５０９、１５１０、１５１１、１５１２、１５１３、１５１４、１５１５、１５１６、１５１７、１５１８、１５１９、１５２０、１５２１、１５２２、１５２３、１５２４、および１５２５からなる群から選択される標的核酸または標的配列の領域と、少なくとも９０％相補性である、例えば、少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または１００％相補性である、１０〜３０、例えば１０〜２２ヌクレオチド長の連続配列を含む。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１５０５、１５０９、１５１０、１５１６、１５２２、および１５２５からなる群から選択される標的核酸または標的配列の領域と、少なくとも９０％相補性である、例えば、少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または１００％相補性である、１０〜３０、例えば１０〜２２ヌクレオチド長の連続配列を含む。
【０１８２】
本発明のオリゴヌクレオチド、もしくはその連続ヌクレオチド配列が、標的配列に完全に相補性（１００％相補性）である、または、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間に、１つまたは２つのミスマッチを含み得る場合、有利である。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１の位置８３１１８〜８３１４６、例えば、配列番号１の８３１２２〜８３１４３の標的核酸領域に完全に（即ち、１００％）相補性であるといった、少なくとも９０％相補性である、１０〜２２ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０〜３０ヌクレオチド長、例えば、１１〜２８，例えば１０〜２２、例えば１２〜２２、例えば１４〜２０、例えば１５〜２０、例えば１６〜１８、例えば１７〜２０、または１８〜２０連続ヌクレオチド長を含む、またはこれからなる。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１７〜２０ヌクレオチド長を含む、またはこれからなる。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、２４個以下のヌクレオチド、例えば２２個以下のヌクレオチド、例えば２０個以下のヌクレオチド、例えば１７、１８、１９、または２０個以下のヌクレオチドを含む、またはこれからなる。本明細書で提供されるいずれの範囲も、範囲の終点を含むことを理解するべきである。したがって、オリゴヌクレオチドが１０〜３０ヌクレオチドを含むと記される場合、１０ヌクレオチドおよび３０ヌクレオチドの両方が含まれる。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０連続ヌクレオチド長を含み、またはそれからなる。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド長を含む、またはこれからなる。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列は、表７から選択される配列を含む、またはこれからなる。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列は、配列番号７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；３０；３１；３２；３３；および３４（表７：材料および方法セクション）からなる群から選択される配列を含む、またはこれからなる。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列は、配列番号７、１３、１４、１５、１７、１８、１０５、１５４、１６１、１６２、２３８、３８５、３８８、３９１、３９８、３９９、４０１、４０１、４２３、４６８、４７７、５３４、８４３、８４４、８４５、８４７、８４８、８４９、８５０、８５１、８５２、８５３、８５４、９０６、９７４、１００３、１００４、１０４５、１０５４、１１８０、１２４６、１２４７、１２４８、１３６１、１４０８、および１５０４からなるから選択される配列に対して、少なくとも９０％相補性、好ましくは１００％相補性を有する、１０〜３０、例えば１０〜２２ヌクレオチド長を含む、またはこれからなる。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列は、配列番号７、１３、１４、１５、１７、１８、１０５、３８５、３８８、３９１、１２４６、１２４７、１２４８、および１５０４からなる群から選択される配列に、少なくとも９０％同一性、好ましくは１００％同一性を有する、１０〜３０、例えば１０〜２２ヌクレオチド長を含む、またはこれからなる。
【０１９１】
連続核酸塩基配列（モチーフ配列）は、例えばヌクレアーゼ耐性および／または標的核酸に対する親和性を増大させるために修飾され得ることが理解される。
【０１９２】
修飾ヌクレオシド（高親和性修飾ヌクレオシドなど）がオリゴヌクレオチド配列に組み込まれるパターンは、一般にオリゴヌクレオチド設計と称される。
【０１９３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシドおよびＤＮＡヌクレオシドを用いて設計される。高親和性修飾ヌクレオシドを用いることが有利である。
【０１９４】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５または少なくとも１６個の修飾ヌクレオシドを含む。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１〜１０個の修飾ヌクレオシド、例えば２〜９個の修飾ヌクレオシド、例えば３〜８個の修飾ヌクレオシド、例えば４〜７個の修飾ヌクレオシド、例えば６または７個の修飾ヌクレオシドを含む。適切な修飾は、「修飾ヌクレオシド」、「高親和性修飾ヌクレオシド」、「糖修飾」、「２’糖修飾」およびロックド核酸（ＬＮＡ）の「定義」セクションに記載されている。
【０１９５】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、例えば２’糖修飾ヌクレオシドを含む。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’−フルオロ−ＡＮＡおよびＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドを含む。修飾ヌクレオシドの１つ以上がロックド核酸（ＬＮＡ）である場合、有利である。
【０１９６】
更なる実施形態において、オリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合、例えば、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。適切なヌクレオシド間結合は、「修飾ヌクレオシド間結合」の「定義」セクションに記載されている。連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の、少なくとも７５％、例えば全てがホスホロチオエートヌクレオシド間結合である場合、有利である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの連続配列中の全ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、例えば１、２、３、４、５、６、７または８個のＬＮＡヌクレオシド、例えば２〜６個のＬＮＡヌクレオシド、例えば３〜７個のＬＮＡヌクレオシド、４〜８個のＬＮＡヌクレオシド、または３、４、５、６、７もしくは８個のＬＮＡヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの修飾ヌクレオシドの少なくとも７５％、例えば修飾ヌクレオシドの８０％、例えば８５％、例えば９０％がＬＮＡヌクレオシドである。尚更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドの全修飾ヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、および以下のＬＮＡヌクレオシドの１つ以上：β−Ｄまたはα−Ｌ立体構造のいずれかのチオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、ｏｘｙ−ＬＮＡ、ＳｃＥＴおよび／またはＥＮＡ、またはそれらの組み合わせの両方を含んでもよい。更なる実施形態では、全ＬＮＡシトシン単位は、５−メチル−シトシンである。オリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列のヌクレアーゼ安定性にとって、ヌクレオチド配列の５’末端に少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドと３’末端に少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドがあることが有利である。
【０１９８】
本発明の一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ヒトＲＮａｓｅＨ１などのＲＮａｓｅＨを動員することができる。
【０１９９】
本発明において、有利な構造設計は、例えば、「ギャップマー」、「ＬＮＡギャップマー」、「ＭＯＥギャップマー」および「混合ウイングギャップマー」「交互フランクギャップマー」の「定義」セクションに記載されているギャップマー設計である。ギャップマー設計には、均一フランク、混合ウイングフランク、交互フランク、およびギャップブレーカー設計のギャップマーが含まれる。本発明において、本発明のオリゴヌクレオチドが、Ｆ−Ｇ−Ｆ’デザインを有し、領域ＦおよびＦ’が独立して１〜８個のヌクレオシド（これらのうち１〜５個が２’糖修飾されている）を含み、ＦおよびＦ’領域の５’および３’末端を画定し、Ｇが、ＲＮａｓｅＨを動員可能な６〜１６個のヌクレオシドの領域である、ギャップマーである場合、有利である。一実施形態では、Ｇ領域は、６〜１６個の連続ＤＮＡヌクレオシドからなる。更なる実施形態において、領域ＦおよびＦ’はそれぞれ、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含む。
【０２００】
表７（材料および方法セクション）は、各モチーフ配列の好ましいデザインを列挙する。
【０２０１】
全ての場合において、Ｆ−Ｇ−Ｆ’デザインは、「オリゴヌクレオチドの領域Ｄ’またはＤ’’」の下の「定義」に記載されている、領域「Ｄ’および／またはＤ’’」を更に含むことができる。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマー領域の５’または３’末端にて、ＤＮＡ単位などの、１、２、または３個のホスホジエステル結合ヌクレオシド単位を有する。
【０２０２】
本発明のいくつか実施形態に関して、オリゴヌクレオチドは、ＣＭＰ番号：７＿１；８＿１；９＿１；１０＿１；１１＿１；１２＿１；１３＿１；１４＿１；１５＿１；１６＿１；１７＿１；１８＿１；１９＿１；２０＿１；２１＿１；２２＿１；２３＿１；２４＿１；２５＿１；２６＿１；２７＿１；２８＿１；２９＿１；３０＿１；３１＿１；３２＿１；３３＿１；および３４＿１（材料および方法セクションにおける表７を参照）を有するオリゴヌクレオチド化合物からなる群から選択される。
【０２０３】
本発明の特定の実施形態に関して、オリゴヌクレオチドは、ＣＭＰ番号：７＿１、１３＿１、１４＿１、１４＿２、１５＿１、１６＿１、１７＿１、１８＿１、１８＿２、１０５＿１、１５４＿１、１６１＿１、１６２＿１、２３８＿１、３８５＿１、３８８＿１、３９１＿１、３９８＿１、３９９＿１、４０１＿１、４０１＿２、４２３＿１、４６８＿１、４７７＿１、５３４＿１、８４３＿１、８４４＿１、８４５＿１、８４７＿１、８４８＿１、８４９＿１、８５０＿１、８５１＿１、８５２＿１、８５３＿１、８５４＿１、９０６＿１、９７４＿１、１００３＿１、１００４＿１、１０４５＿１、１０５４＿１、１１８０＿１、１２４６＿１、１２４７＿１、１２４８＿１、１３６１＿１、１４０８＿１、および１５０４＿１（表７を参照）を有するオリゴヌクレオチド化合物からなる群から選択される。
【０２０４】
本発明の文脈において特に有利なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下からなる群から選択される化合物である。
【表１０】
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大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、全てのＬＮＡ  Ｃは５−メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【０２０５】
本発明は、本発明によるオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含むコンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分は、トランスフェリン受容体を標的とする抗体または抗体断片など、血液脳関門を通過する送達を促進するコンジュゲートである。
【０２０６】
製造方法
更なる態様では、本発明は、ヌクレオチド単位を反応させ、それによってオリゴヌクレオチドからなる共有結合された連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、本発明のオリゴヌクレオチドを製造する方法を提供する。好ましくは、この方法は、ホスホロアミダイト化学を使用する（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１５４，ｐａｇｅｓ  ２８７−３１３を参照のこと）。更なる実施形態では、この方法は、連続ヌクレオチド配列をコンジュゲート化部分（リガンド）と反応させて、コンジュゲート部分をオリゴヌクレオチドに共有結合させることを更に含む。更なる態様では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは結合オリゴヌクレオチドを薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩および／またはアジュバントと混合することを含む、本発明の組成物を製造する方法が提供される。
【０２０７】
薬学的塩
本発明による化合物は、それらの薬学的に許容される塩の形態で存在し得る。「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の生物学的有効性および特性を保持し、適切な非毒性の有機もしくは無機酸または有機もしくは無機塩基から形成される従来の酸付加塩または塩基付加塩を指す。酸付加塩には、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸および硝酸などの無機酸に由来するもの、ならびにｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸などの有機酸に由来するものが含まれる。塩基付加塩には、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、および第四級アンモニウム水酸化物、例えばテトラメチルアンモニウム水酸化物から誘導されるものが含まれる。医薬化合物の塩への化学修飾は、化合物の物理的および化学的安定性、吸湿性、流動性、および溶解性を向上させるために、薬剤師によく知られている手法である。これは例えば、Ｂａｓｔｉｎ，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２０００，４，４２７−４３５  ｏｒ  ｉｎ  Ａｎｓｅｌ，Ｉｎ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，６ｔｈ  ｅｄ．（１９９５），ｐｐ．１９６  ａｎｄ  １４５６−１４５７に記載されている。例えば、本明細書で提供される化合物の薬学的に許容される塩は、ナトリウム塩であり得る。
【０２０８】
更なる態様では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートの薬学的に許容される塩を提供する。好ましい実施形態では、薬学的に許容される塩は、ナトリウムまたはカリウム塩である。
【０２０９】
医薬組成物
更なる態様では、本発明は、前述のオリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその塩のいずれかと、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩および／またはアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容される希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれ、薬学的に許容される塩には、ナトリウム塩およびカリウム塩が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される希釈剤は、無菌リン酸緩衝生理食塩水である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５０〜３００μＭ溶液の濃度で薬学的に許容される希釈剤中で使用される。
【０２１０】
本発明での使用に適した製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ  ｅｄ．，１９８５に見られる。薬物送達の方法の簡単なレビューについては、例えば、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３，１９９０）を参照のこと。国際公開第２００７／０３１０９１号は、薬学的に許容される希釈剤、担体およびアジュバントの更に適切で好ましい例を提供する（参照により本明細書に組み込まれる）。適切な用量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療薬との組み合わせ、プロドラッグ製剤もまた、国際公開第２００７／０３１０９１号に提供されている。
【０２１１】
本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、医薬組成物または製剤の調製のために、薬学的に許容される活性または不活性物質と混合されてもよい。医薬組成物の調製のための組成物および方法は、限定されるものではないが、投与経路、疾患の程度、または投与される用量を含む多くの基準に依存する。
【０２１２】
これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌され得るか、または滅菌濾過され得る。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装するか、または凍結乾燥することができ、凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。調製物のｐＨは、典型的には３〜１１、より好ましくは５〜９または６〜８、最も好ましくは７〜８、例えば７〜７．５であろう。得られた固体形態の組成物は、錠剤またはカプセルの密封パッケージなどのように、各々が上記の薬剤または薬剤群の固定量を含む複数の単回用量単位で包装することができる。固体形態の組成物はまた、局所適用可能なクリームまたは軟膏用に設計された絞り出し可能なチューブなどの柔軟な量の容器に包装することもできる。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートはプロドラッグである。特にオリゴヌクレオチドコンジュゲートに関して、プロドラッグが作用部位、例えば標的細胞に送達されると、コンジュゲート部分はオリゴヌクレオチドから切断される。
【０２１４】
用途
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、診断、治療および予防のための研究試薬として利用され得る。
【０２１５】
研究では、そのようなオリゴヌクレオチドを使用して、細胞（例えば、インビトロ細胞培養物）および実験動物におけるＡｔａｘｉｎ２タンパク質の合成を特異的に調節し、それによって標的の機能分析または治療的介入の標的としてのその有用性の評価を促進することができる。典型的には、標的調節は、タンパク質を生成するｍＲＮＡを分解または阻害し、それによりタンパク質形成を防止することによって、またはタンパク質を生成する遺伝子もしくはｍＲＮＡのモジュレーターを分解もしくは阻害することによって達成される。
【０２１６】
本発明のオリゴヌクレオチドを研究または診断に使用する場合、標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡに由来するｃＤＮＡまたは合成核酸であり得る。
【０２１７】
本発明は、ＡＴＸＮ２を発現している標的細胞におけるＡＴＸＮ２発現を調節するためのインビボまたはインビトロ方法を提供し、前記方法は、本発明のオリゴヌクレオチドを前記細胞に有効量で投与することを含む。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞である。標的細胞は、哺乳動物の組織の一部を形成するインビトロ細胞培養物またはインビボ細胞であってよい。好ましい実施形態では、標的細胞は、脳幹および脊髄を含む、脳または中枢神経系に存在する。特に、小脳内の細胞は、特に、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）の影響を受けた個体において、関係する標的細胞、例えばプルキンエニューロンまたはプルキンエ細胞である。
【０２１９】
他の関係する標的細胞は、脳の毛皮質、および脊髄中に位置する運動ニューロンである。運動毛皮質内の上位運動ニューロン、ならびに、脳幹および脊髄内の下位運動ニューロンは、本発明の標的細胞である。特に、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の影響を受ける個体の運動ニューロンは、関係する標的細胞である。
【０２２０】
診断では、オリゴヌクレオチドを使用して、ノーザンブロッティング、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたは同様の技術により、細胞および組織におけるＡＴＸＮ２発現を検出および定量することができる。
【０２２１】
治療のために、オリゴヌクレオチドは、ＡＴＸＮ２の発現を調節することによって治療することができる病気または疾患を有することが疑われる動物またはヒトに投与することができる。
【０２２２】
本発明は、治療的または予防的に有効な量の本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または医薬組成物を、疾患に苦しむまたは感染しやすい対象に投与することを含む、疾患の治療または予防方法を提供する。
【０２２３】
本発明はまた、医薬として使用するための、本明細書で定義されるオリゴヌクレオチド、組成物またはコンジュゲートに関する。
【０２２４】
本発明によるオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物は、典型的には有効量で投与される。
【０２２５】
本発明はまた、本明細書で言及される疾患の治療のための医薬の製造のため、または本明細書で言及される疾患の治療の方法のために記載される本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用を提供する。
【０２２６】
本明細書で言及される病気または疾患は、ＡＴＸＮ２の発現に関連している。いくつかの実施形態では、病気または疾患は、伸長ＣＡＧ反復領域などの、ＡＴＸＮ２遺伝子内での変異と関連している場合がある。病気または疾患は、タンパク質生成物がＡＴＸＮ２と関連している、または相互作用する遺伝子と、関連している場合がある。特に、ＴＤＰ−４３タンパク質症と関連する病気において、ＡＴＸＮ２の低減は、例えば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー性前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、およびパーキンソニズムにおいて、有益な効果を有し得る。
【０２２７】
本発明の方法は、好ましくは、ＡＴＸＮ２の異常なレベルおよび／または活性によって引き起こされる病気の治療または予防のために使用される。
【０２２８】
本発明は更に、ＡＴＸＮ２の異常なレベルおよび／または活性を治療するための医薬を製造するための、本明細書で定義されるオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物の使用に関する。
【０２２９】
一実施形態において、本発明は、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソニズム、およびＴＤＰ−４３タンパク質症を伴う状態を含む、神経変性病から選択される病気または疾患の治療で使用するための、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または医薬組成物に関する。特に、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療における、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または医薬組成物の使用が有利である。
【０２３０】
投与
本発明のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、非経口（静脈内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、眼内、または髄腔内投与など）を介して投与することができる。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、投与は、髄腔内投与を介する。
【０２３２】
有利には、例えば神経学的疾患の治療のために、本発明のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、髄腔内または頭蓋内に、例えば脳内または脳室内投与を介して投与される。
【０２３３】
本発明はまた、皮下投与用の剤形である医薬の製造のための、本発明の薬学的塩または組成物などのオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートの使用を提供する。
【０２３４】
本発明はまた、髄腔内投与用の剤形である医薬の製造のための、本発明の薬学的塩または組成物などの、本発明のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートの使用を提供する。
【０２３５】
本発明は、薬剤が髄腔内投与のための剤形となっている、薬剤の製造のための、記載したとおりの、本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用もまた提供する。
【０２３６】
併用療法
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物は、別の治療剤との併用治療で使用するためのものである。治療剤は、例えば、上記の病気または疾患の標準的な治療であり得る。
【０２３７】
実施形態
本発明の以下の実施形態を、本明細書で記載される任意の他の実施形態と組み合わせて使用することができる。
【０２３８】
１．表４の任意の標的配列（Ｒ＿１〜Ｒ＿２４２１）に１００％相補性といった、少なくとも９０％相補性である、１０〜３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、１０〜５０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【０２３９】
２．標的配列が、群Ｒ＿１〜Ｒ＿１３、Ｒ＿１５〜Ｒ＿８７４、Ｒ＿８７６〜Ｒ＿８９４、Ｒ＿８９６〜Ｒ＿９０２、Ｒ＿９０６〜Ｒ＿１１５１、Ｒ＿１１５３〜Ｒ＿１３３８、Ｒ＿１３４１〜Ｒ＿１４２０、Ｒ＿１４２２〜Ｒ＿１４３５、Ｒ＿１４３７〜Ｒ＿１４６５、Ｒ＿１４６８〜Ｒ＿１４９５、Ｒ＿１４９９〜Ｒ＿１５４２、Ｒ＿１５４５〜Ｒ＿１５９２、Ｒ１５９５〜Ｒ＿１６０２、Ｒ＿１６０４〜Ｒ＿１６４３、Ｒ＿１６４６〜Ｒ＿１８６９、Ｒ＿１８７３〜Ｒ＿１９０５、Ｒ＿１９０７〜Ｒ＿１９２１、Ｒ＿１９２３〜Ｒ＿１９２９、Ｒ＿１９３１〜Ｒ＿２１４５、Ｒ＿２１４７〜Ｒ＿２１５２、Ｒ＿２１５５〜Ｒ＿２２３６、Ｒ＿２２３８〜Ｒ＿２３５６、Ｒ＿２３５８〜Ｒ＿２３７０；Ｒ＿２３７３〜Ｒ＿２４０２、Ｒ＿２４０４〜Ｒ＿２４０７、Ｒ＿２４０９〜Ｒ＿２４１５、およびＲ＿２４２１内の領域のうちの１つから選択される、実施形態１に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２４０】
３．標的配列が、群Ｒ＿２７４、Ｒ＿５６０、Ｒ＿５９６、Ｒ＿７１６、Ｒ＿８９３、Ｒ＿８９５、Ｒ＿９０３、Ｒ＿９０５、Ｒ＿１０３３、Ｒ＿１４２１、Ｒ＿１４６７、Ｒ＿１４９６、Ｒ＿１４９８、Ｒ＿１５３７、Ｒ＿１５５４、Ｒ＿１６９０、Ｒ＿１９９２、Ｒ＿２１８５、およびＲ＿２４２０内の領域のうちの１つから選択される、実施形態１に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２４１】
４．標的配列が、群Ｒ＿２７４、Ｒ＿８９３、Ｒ＿８９５、Ｒ＿１４９６、Ｒ＿１９９２、およびＲ＿２４２０内の領域のうちの１つから選択される、実施形態１に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２４２】
５．標的配列が、群Ｗ１；Ｗ４；Ｗ５；Ｗ６；Ｗ７；Ｗ８；Ｗ９；Ｗ１０；Ｗ１１；Ｗ１２；Ｗ１３；Ｗ１４；Ｗ１５；Ｗ１６；Ｗ１７；Ｗ１８；Ｗ１９；Ｗ２０；Ｗ２１；Ｗ２２；Ｗ２３；Ｗ２４；Ｗ２５；Ｗ２６；Ｗ２９；Ｗ３３；Ｗ３４；Ｗ３５；Ｗ３６；Ｗ３７；Ｗ３８；Ｗ３９；Ｗ４１；Ｗ４２；Ｗ４４；Ｗ４５；Ｗ４８；Ｗ４９；Ｗ５０；Ｗ５４；Ｗ５６；Ｗ５７；Ｗ６０；Ｗ６１；Ｗ６２；Ｗ６３；Ｗ６４；Ｗ６５；Ｗ６７；Ｗ６８；Ｗ６９；Ｗ７０；Ｗ７１；Ｗ７２；Ｗ７３；Ｗ７６；Ｗ７７；Ｗ７８；Ｗ８０；Ｗ８１；Ｗ８２；Ｗ８３；Ｗ８４；Ｗ８５；Ｗ８６；Ｗ８７；Ｗ８８；Ｗ８９；Ｗ９０；Ｗ９１；Ｗ９２；Ｗ９３；Ｗ９５；Ｗ９６；Ｗ９７；Ｗ９９；Ｗ１００；Ｗ１０２；Ｗ１０４；Ｗ１０８；Ｗ１１０；Ｗ１１１；Ｗ１１４；およびＷ１１５内の領域のうちの１つから選択される、実施形態１に記載のオリゴヌクレオチド（表５を参照）。
【０２４３】
６．標的配列が、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ９、Ｓ１０、Ｓ１１、Ｓ１２、Ｓ１４、Ｓ１５、Ｓ１６、Ｓ１９、Ｓ２１、Ｓ２２、Ｓ２５、Ｓ２６、Ｓ２７、Ｓ２８、Ｓ２９、Ｓ３０、Ｓ３１、Ｓ３３、Ｓ３６、Ｓ４１、Ｓ４３、Ｓ４５、およびＳ４６（表６を参照）からなる群内の領域のうちの１つから選択される、実施形態１に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２４４】
７．連続ヌクレオチド配列が、配列番号１５２６、１５２７、１５２８、１５２９、１５３０、１５３１、１５３２、１５３３、１５３４、１５３５、１５３６、１５３７、１５３８、１５３９、１５４０、１５４１、１５４２、１５４３、および１５４４からなる群から選択される標的配列に相補性である、実施形態１〜６に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２４５】
８．連続ヌクレオチド配列が、配列番号１５２６、１５３０、１５３１、１５３７、１５４２、および１５４４からなる群から選択される標的配列に相補性である、実施形態１〜６に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２４６】
９．連続ヌクレオチド配列が、配列番号６、１５０５、１５０６、１５０７、１５０８、１５０９、１５１０、１５１１、１５１２、１５１３、１５１４、１５１５、１５１６、１５１７、１５１８、１５１９、１５２０、１５２１、１５２２、１５２３、１５２４、および、１５２５からなる群から選択される標的配列に相補性である、実施形態１〜６に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２４７】
１０．連続ヌクレオチド配列が、配列番号６、１５０５、１５０９、１５１０、１５１６、１５２２、および１５２５からなる群から選択される標的配列に相補性である、実施形態１〜６に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２４８】
１１．連続ヌクレオチド配列が、配列番号１の位置８３１１８〜８３１５１に相補性である、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【０２４９】
１２．連続ヌクレオチド配列が配列番号６の標的配列に相補性である、実施形態１〜６に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２５０】
１３．連続ヌクレオチド配列が、配列番号１の位置８３１２２〜８３１４３に相補性である、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【０２５１】
１４．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＡＴＸＮ２の発現を低減するといった、ＡＴＸＮ２の発現を制御することができる、実施形態１〜１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２５２】
１５．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、−１０ｋｃａｌ未満のΔＧ°を有する標的配列とハイブリダイズすることができる、実施形態１〜１４に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２５３】
１６．標的配列が位置する標的核酸がＲＮＡである、実施形態１〜１５に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２５４】
１７．ＲＮＡがｍＲＮＡである、実施形態１６に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２５５】
１８．ｍＲＮＡがｐｒｅ−ＲＮＡまたは成熟ＲＮＡである、実施形態１７に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２５６】
１９．ｐｒｅ−ｍＲＮＡが配列番号１、２、３、４、または５から選択される、実施形態１８に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２５７】
２０．連続ヌクレオチド配列が、少なくとも１０個の連続ヌクレオチド、具体的には、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９個の連続ヌクレオチドを含む、またはこれからなる、実施形態１〜１９に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２５８】
２１．連続ヌクレオチド配列が、１０〜２２個のヌクレオチドを含む、またはこれからなる、実施形態１〜２０に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２５９】
２２．連続ヌクレオチド配列が、１２〜２２個のヌクレオチドを含む、またはこれからなる、実施形態２１に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２６０】
２３．連続ヌクレオチド配列が、１４〜２０個のヌクレオチドを含む、またはこれからなる、実施形態２１に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２６１】
２４．オリゴヌクレオチドが１０〜３０ヌクレオチド長を含む、またはこれからなる、実施形態１〜２３に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２６２】
２５．オリゴヌクレオチドが１２〜２２ヌクレオチド長を含む、またはこれからなる、実施形態２４に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２６３】
２６．オリゴヌクレオチドが１４〜２０ヌクレオチド長を含む、またはこれからなる、実施形態２４または２５に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２６４】
２７．オリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列が一本鎖である、実施形態１〜２６に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２６５】
２８．オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡではなく、自己相補性でもない、実施形態１〜２７に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２６６】
２９．連続ヌクレオチド配列が、表７から選択される配列を含む、またはこれからなる、実施形態１〜２８に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２６７】
３０．連続ヌクレオチド配列が、配列番号７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；３０；３１；３２；３３；または３４から選択される配列を含む、またはこれからなる、実施形態１〜２９に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２６８】
３１．連続ヌクレオチド配列が、７、１３、１４、１５、１７、１８、１０５、１５４、１６１、１６２、２３８、３８５、３８８、３９１、３９８、３９９、４０１、４０１、４２３、４６８、４７７、５３４、８４３、８４４、８４５、８４７、８４８、８４９、８５０、８５１、８５２、８５３、８５４、９０６、９７４、１００３、１００４、１０４５、１０５４、１１８０、１２４６、１２４７、１２４８、１３６１、１４０８、および１５０４から選択される配列を含む、またはこれからなる、実施形態１〜２８に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２６９】
３２．連続ヌクレオチド配列が、相補性である標的核酸と比較して、０〜３個のミスマッチを有する、実施形態１〜２９に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２７０】
３３．連続ヌクレオチド配列が、標的核酸と比較して１つのミスマッチを有する、実施形態３２に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２７１】
３４．連続ヌクレオチド配列が、標的核酸と比較して２つのミスマッチを有する、実施形態３２に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２７２】
３５．連続ヌクレオチド配列が、標的核酸配列に完全に相補性である、実施形態３２に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２７３】
３６．１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む、実施形態１〜３５に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２７４】
３７．１つ以上の修飾ヌクレオシドが高親和性修飾ヌクレオシドである、実施形態３６に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２７５】
３８．１つ以上の修飾ヌクレオシドが２’糖修飾ヌクレオシドである、実施形態３６または３７に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２７６】
３９．１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドが、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＡＮＡ、およびＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される、実施形態３８に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２７７】
４０．１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである、実施形態３８または３９に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２７８】
４１．修飾ＬＮＡヌクレオシドが、オキシ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、チオ−ＬＮＡ、ｃＥＴ、およびＥＮＡから選択される、実施形態４０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【０２７９】
４２．修飾ＬＮＡヌクレオシドが、以下の２’−４’架橋−Ｏ−ＣＨ２−を有するオキシ−ＬＮＡである、実施形態４０または４１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【０２８０】
４３．オキシ−ＬＮＡがβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである、実施形態４２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【０２８１】
４４．修飾ＬＮＡヌクレオシドが、以下の２’−４’架橋−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−を有するｃＥＴである、実施形態４０または４１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【０２８２】
４５．ｃＥＴが（Ｓ）ｃＥＴ、即ち、６’（Ｓ）メチル−β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである、実施形態４４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【０２８３】
４６．ＬＮＡが、以下の２’−４’架橋−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−を有するＥＮＡである、実施形態４０または４１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【０２８４】
４７．オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、実施形態１〜４６のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
【０２８５】
４８．修飾ヌクレオシド間結合がヌクレアーゼ耐性を有する、実施形態４７に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２８６】
４９．連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、ヌクレオシド間結合である、実施形態４７または４８に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２８７】
５０．連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の全てがホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態４７または４８に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２８８】
５１．オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅＨを動員することができる、実施形態１〜５０に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２８９】
５２．オリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列がギャップマーである、実施形態５１に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２９０】
５３．ギャップマーが、式５’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−３’を有し、ＦおよびＦ’ウイング領域は独立して、１〜８個の２’糖修飾ヌクレオシドを含み、またはこれからなり、Ｇは、ＲＮａｓｅＨを動員することができる、６〜１６ヌクレオシドの領域である、実施形態５２に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２９１】
５４．領域ＦおよびＦ’が、同一のＬＮＡヌクレオシドからなる、実施形態５３に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２９２】
５５．領域ＦおよびＦ’内の２’糖修飾ヌクレオシドが全て、オキシ−ＬＮＡヌクレオシドである、実施形態５３または５４に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２９３】
５６．領域ＦまたはＦ’の少なくとも１つが、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、および２’−フルオロ−ＤＮＡからなる群から独立して選択される少なくとも１つの２’修飾ヌクレオシドを更に含む、実施形態５３に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２９４】
５７．領域Ｇ内のＲＮａｓｅＨ動員ヌクレオシドが、ＤＮＡ、α−Ｌ−ＬＮＡ、Ｃ４’アルキル化ＤＮＡ、ＡＮＡ、ならびに２’Ｆ−ＡＮＡおよびＵＮＡから独立して選択される、実施形態５３〜５６に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２９５】
５８．領域Ｇ内のヌクレオシドが、ＤＮＡおよび／またはα−Ｌ−ＬＮＡヌクレオシドである、実施形態５７に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２９６】
５９．領域Ｇが、少なくとも７５％のＤＮＡヌクレオシドからなる、実施形態５７または５８に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２９７】
６０．領域Ｇが６〜１６個のＤＮＡヌクレオシドからなる、実施形態５７〜５９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【０２９８】
６１．オリゴヌクレオチドが、ＣＭＰ番号７＿１；８＿１；９＿１；１０＿１；１１＿１；１２＿１；１３＿１；１４＿１；１５＿１；１６＿１；１７＿１；１８＿１；１９＿１；２０＿１；２１＿１；２２＿１；２３＿１；２４＿１；２５＿１；２６＿１；２７＿１；２８＿１；２９＿１；３０＿１；３１＿１；３２＿１；３３＿１；または３４＿１から選択される、実施形態１〜６０に記載のオリゴヌクレオチド。
【０２９９】
６２．オリゴヌクレオチドが、ＣＭＰ番号７＿１、１３＿１、１４＿１、１４＿２、１５＿１、１６＿１、１７＿１、１８＿１、１８＿２、１０５＿１、１５４＿１、１６１＿１、１６２＿１、２３８＿１、３８５＿１、３８８＿１、３９１＿１、３９８＿１、３９９＿１、４０１＿１、４０１＿２、４２３＿１、４６８＿１、４７７＿１、５３４＿１、８４３＿１、８４４＿１、８４５＿１、８４７＿１、８４８＿１、８４９＿１、８５０＿１、８５１＿１、８５２＿１、８５３＿１、８５４＿１、９０６＿１、９７４＿１、１００３＿１、１００４＿１、１０４５＿１、１０５４＿１、１１８０＿１、１２４６＿１、１２４７＿１、１２４８＿１、１３６１＿１、１４０８＿１、または１５０４＿１から選択される、実施形態１〜６０に記載のオリゴヌクレオチド。
【０３００】
６３．オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドが、以下からなる群から選択される化合物である、実施形態１〜６０のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
【表１１】
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大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、全てのＬＮＡ  Ｃは５−メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【０３０１】
６４．実施形態１〜６３のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド、および、上記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分、を含むコンジュゲート。
【０３０２】
６５．コンジュゲート部分が、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素、ビタミン、ウイルスタンパク質またはそれらの組み合わせから選択される、実施形態６４に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【０３０３】
６６．コンジュゲートが、脳血液関門を通過する送達を促進する、実施形態６４または６５に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【０３０４】
６７．コンジュゲートが、トランスフェリン受容体を標的にする抗体または抗体断片である、実施形態６６に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【０３０５】
６８．実施形態１〜６３に記載のオリゴヌクレオチド、または実施形態６４〜６７に記載のコンジュゲート、ならびに、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、および／またはアジュバントを含む医薬組成物。
【０３０６】
６９．ヌクレオチド単位を反応させることで、オリゴヌクレオチド内に含まれる、共有結合した連続ヌクレオチドを形成することを含む、実施形態１〜６３に記載のオリゴヌクレオチドの作製方法。
【０３０７】
７０．連続ヌクレオチド配列を非ヌクレオチドコンジュゲート化部分と反応させることを更に含む、実施形態６９に記載の方法。
【０３０８】
７１．オリゴヌクレオチドを、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、および／またはアジュバントと混合することを含む、実施形態６８に記載の組成物の作製方法。
【０３０９】
７２．ＡＴＸＮ２を発現する標的細胞におけるＡＴＸＮ２発現を調節するためのインビボまたはインビトロ法であって、実施形態１〜６３に記載のオリゴヌクレオチド、または実施形態６４〜６７に記載のコンジュゲート、または、実施形態６８に記載の医薬組成物を、有効量で上記細胞に投与することを含む、方法。
【０３１０】
７３．病気の治療または予防方法であって、治療的、または予防的有効量の、実施形態１〜６３に記載のオリゴヌクレオチド、または実施形態６４〜６７に記載のコンジュゲート、または実施形態６８に記載の医薬組成物を、上記病気を患う、またはこれに感染しやすい対象に投与することを含む、方法。
【０３１１】
７４．対象における病気の治療または予防用の薬剤として使用するための、実施形態１〜６３に記載のオリゴヌクレオチド、または実施形態６４〜６７に記載のコンジュゲート、または実施形態６８に記載の医薬組成物。
【０３１２】
７５．対象における病気の治療または予防用の薬剤を調製するための、実施形態１〜６３に記載のオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、または実施形態６４〜６７に記載のコンジュゲートの使用。
【０３１３】
７６．病気が、ＡＴＸＮ２のインビボ活性と関連している、実施形態７３〜７５に記載の方法、オリゴヌクレオチド、または使用。
【０３１４】
７７．病気が、ＡＴＸＮ２の過剰発現、および／または異常量のＡＴＸＮ２と関連している、実施形態７３〜７６に記載の方法、オリゴヌクレオチド、または使用。
【０３１５】
７８．実施形態１〜６３に記載のオリゴヌクレオチド、または実施形態６４〜６７に記載のコンジュゲート、または実施形態６８に記載の医薬組成物なしでの発現と比較して、ＡＴＸＮ２が少なくとも３０％、または少なくともまたは少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％減少する、実施形態７７に記載の方法、オリゴヌクレオチド、または使用。
【０３１６】
７９．病気が、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー性前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソニズム、およびＴＤＰ−４３タンパク質症を伴う状態から選択される、実施形態７３〜７７に記載の方法、オリゴヌクレオチド、または使用。
【０３１７】
８０．対象が哺乳動物である、実施形態７３〜７９に記載の方法、オリゴヌクレオチド、または使用。
【０３１８】
８１．哺乳動物がヒトである、実施形態８０に記載の方法、オリゴヌクレオチド、または使用。
【実施例】
【０３１９】
材料および方法
オリゴヌクレオチドモチーフ配列およびオリゴヌクレオチド化合物
【０３２０】
【表１２】
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2021526797.tif 000037
2021526797.tif 000038
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【０３２１】
モチーフ配列は、オリゴヌクレオチドに存在する核酸塩基の連続配列を表す。
【０３２２】
設計とは、ギャップマー設計の「Ｆ−Ｇ−Ｆ’」を意味し、各数字は、連続した修飾ヌクレオシド、例えば２’修飾ヌクレオシドの数を表し（最初の数＝５’隣接）、それにＤＮＡヌクレオシドの数が続き（２つ目の数＝ギャップ領域）、それに修飾ヌクレオシド、例えば２’修飾ヌクレオシドの数が続き（３つ目の数＝３’隣接）、任意に、ＤＮＡおよびＬＮＡの更なる繰り返し領域が先行する、または後に続き、これらは必ずしも、標的核酸に相補的な連続ヌクレオチド配列の一部ではない。
【０３２３】
オリゴヌクレオチド化合物は、モチーフ配列の特定の設計を表す。大文字は、β−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、ＬＮＡのＣは全て５−メチルシトシンであり、５−メチルＤＮＡのシトシンは全て「ｅ」で表され、ヌクレオシド間結合は全て、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【０３２４】
オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチド合成は、当技術分野で一般に知られている。以下は、適用できるプロトコルである。本発明のオリゴヌクレオチドは、使用する装置、支持体および濃度に関してわずかに異なる方法によって生成されている場合がある。
【０３２５】
オリゴヌクレオチドは、Ｏｌｉｇｏｍａｋｅｒ  ４８のホスホロアミダイトアプローチを１μｍｏｌスケールで使用して、ウリジンユニバーサル支持体上で合成される。合成の最後に、水性アンモニアを使用して６０℃で５〜１６時間、オリゴヌクレオチドを固相支持体から切断する。オリゴヌクレオチドは逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）または固相抽出によって精製され、ＵＰＬＣによって特徴付けられ、分子量は更にＥＳＩ−ＭＳによって確認される。
【０３２６】
オリゴヌクレオチドの伸長：
β−シアノエチル−ホスホロアミダイトのカップリング（ＤＮＡ−Ａ（Ｂｚ）、ＤＮＡ−Ｇ（ｉｂｕ）、ＤＮＡ−Ｃ（Ｂｚ）、ＤＮＡ−Ｔ、ＬＮＡ−５−メチル−Ｃ（Ｂｚ）、ＬＮＡ−Ａ（Ｂｚ）、ＬＮＡ−Ｇ（ｄｍｆ）、またはＬＮＡ−Ｔ）は、アセトニトリル中の０．１Ｍの５’−Ｏ−ＤＭＴ保護アミダイトおよびアセトニトリル（０．２５Ｍ）中のＤＣＩ（４，５−ジシアノイミダゾール）の溶液を使用して行われる。最終サイクルでは、所望の修飾を有するホスホロアミダイト、例えばコンジュゲート基を結合するためのＣ６リンカー、またはそのようなコンジュゲート基を使用できる。ホスホロチオエート結合を導入するためのチオール化は、水素化キサンタン（アセトニトリル／ピリジン９：１中０．０１Ｍ）を使用することにより行われる。ホスホジエステル結合は、ＴＨＦ／ピリジン／水７：２：１中の０．０２Ｍヨウ素を使用して導入できる。残りの試薬は、オリゴヌクレオチド合成に通常使用される試薬である。
【０３２７】
固相合成後のコンジュゲート化では、固相合成の最後のサイクルで市販のＣ６アミノリンカーホルフォラミダイトを使用でき、脱保護および固相支持体からの切断後、アミノ結合脱保護オリゴヌクレオチドが分離される。コンジュゲートは、標準的な合成方法を使用した官能基の活性化によって導入される。
【０３２８】
ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製：
粗化合物は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８  １０μ  １５０ｘ１０ｍｍカラムでの取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製される。０．１Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ８およびアセトニトリルを５ｍＬ／分の流速でバッファーとして使用する。収集された画分は凍結乾燥されて、精製された化合物が典型的には白色固体として得られる。
【０３２９】
略記：
ＤＣＩ  ４，５−ジシアノイミダゾール
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＴ：４，４’−ジメトキシトリチル
ＴＨＦ  テトラヒドロフラン
Ｂｚ：ベンゾイル
Ｉｂｕ：イソブチリル
ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィー
【０３３０】
Ｔｍアッセイ
オリゴヌクレオチドとＲＮＡ標的（リン酸結合、ＰＯ）二重鎖は、５００ｍｌのＲＮａｓｅフリー水で３ｍＭに希釈され、５００ｍｌの２ｘＴｍバッファー（２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭリン酸、ｐＨ７．０）と混合される。この溶液を９５℃で３分間加熱した後、室温で３０分間アニールする。デュプレックス融解温度（Ｔｍ）は、ＰＥ  Ｔｅｍｐｌａｂソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、Ｐｅｌｔｉｅｒ温度プログラマーＰＴＰ６を装着した、Ｌａｍｂｄａ  ４０  ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計にて測定される。温度を２０℃から９５℃に上昇させ、次いで２５℃に低下させ、２６０ｎｍで吸収を記録する。一次導関数と、融解およびアニーリングの両方の極大値を使用して、二重鎖Ｔｍを評価する。
【０３３１】
細胞株
【０３３２】
【表１３】
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【０３３３】
実施例１  ２５および５μＭにおける、Ａ４３１、ＮＣＩ−Ｈ２３、およびＡＲＰＥ１９細胞株での、ＬＮＡオリゴヌクレオチドのインビトロ有効性の試験
配列番号１の位置８３１２１〜８３１４４の領域を標的にする、表７のＬＮＡオリゴヌクレオチド（ＣＭＰ番号７〜３５＿１）を使用して、３つのヒト細胞株にてオリゴヌクレオチドスクリーンを行った。ヒト細胞株のＡ３４１、ＮＣＩ−Ｈ２３、およびＡＲＰＥ１９を、表８に列挙する販売者から購入し、５％ＣＯ２で３７℃にて、加湿したインキュベーター内で、供給元により推奨される方法で維持した。スクリーニングアッセイのために、細胞を、供給元により推奨される培地内で９６マルチウェルプレートに播種した（材料および方法セクションの、表８を参照のこと）。１ウェル当たりの細胞数は、各細胞株に対して最適化されている（材料および方法セクションの、表８を参照のこと）。
【０３３４】
オリゴヌクレオチドの添加前に、（ＰＢＳに溶解させた）５または２５μｍの濃度にて、細胞を０〜２４時間の間でインキュベートした。オリゴヌクレオチドを添加した３〜４日後に、細胞を回収した（各細胞株に対するインキュベーション時間は、材料および方法セクションにおける表８にて、示されている）。
【０３３５】
メーカーの指示に従い、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  ９６キット（７４１８２）を使用して、ＲＮＡを抽出した。ｑＳｃｒｉｐｔ  ＸＬＴワンステップＲＴ−ｑＰＣＲ  ＴｏｕｇｈＭｉｘ  Ｌｏｗ  ＲＯＸ、９５１３４−１００（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ｃＤＮＡ合成およびｑＰＣＲを実施した。ＶＩＣ標識したＧＵＳＢ対照と共に、複数の反応において、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＦＡＭ標識ＴａｑＭａｎアッセイを使用して、標的転写量を定量化した。対象のＡＴＸＮ２（Ｈｓ０１００２８３３＿ｍ１（ＦＡＭ−ＭＧＢ））、およびハウスキーピング遺伝子ＧＵＳＢ（４３２６３２０Ｅ  ＶＩＣ−ＭＧＢプローブ）の標的転写物に対する、ＴａｑＭａｎプライマーアッセイ。技術的なデュプレックスセットアップを使用した（ｎ＝１、生物学的複製）。
【０３３６】
相対的なＡＴＸＮ２  ｍＲＮＡ発現レベルを表９に、対照（ＰＢＳ処理細胞）の割合として示す。即ち、値が小さいほど、阻害は大きい。
【０３３７】
【表１４】
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【０３３８】
実施例２：Ａ４３１、ＮＣＩ−Ｈ２３、Ｕ２５１、およびＵ２−ＯＳ細胞株における、実施例１から選択した化合物のインビトロＥＣ５０および有効性の試験。
以下のオリゴヌクレオチド濃度：５０、１５．８１、５．００、１．５８、０．５０、０．１６、０．０５、および０．０１６μＭ（半対数希釈、５０μＭから８箇所）、およびｎ＝１〜２の生物学的複製にて、実施例１に記載するアッセイを使用して、５μＭにおいて、ＮＣＩ−Ｈ２３細胞で２０％未満の残留ＡＴＸＮ２  ｍＲＮＡを示す実施例１のオリゴヌクレオチドの、ＥＣ５０および有効性（ＫＤ）を測定した。
【０３３９】
材料および方法セクションの表８に、２つの更なる細胞株に関する条件を示し、細胞株Ｕ２−ＯＳに使用したＴａｑＭａｎプライマーアッセイは、ＡＴＸＮ２、Ｈｓ００２６８０７７＿ｍ１（ＦＡＭ−ＭＧＢ）、ハウスキーピングＧＡＰＤＨ、４３２６１３７Ｅ（ＶＩＣ−ＭＧＢ）である。実施例１で使用した細胞株に対するＴａｑＭａｎプライマーは、この実施例でも同一であった。
【０３４０】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６を使用してＥＣ５０値を計算し、５０μＭにおけるＡＴＸＮ２  ｍＲＮＡの最大低減（Ｍａｘ  ＫＤ）を表に、対照（ＰＢＳ処理細胞）の割合として示す。表１０〜１３に、各細胞株に対する結果を示す。
【０３４１】
【表１５】
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【０３４２】
【表１６】
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【０３４３】
【表１７】
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【０３４４】
【表１８】
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【０３４５】
実施例３  ０．５μＭにおける、Ａ４３１およびＵ２−ＯＳ細胞株でのＬＮＡオリゴヌクレオチドのインビトロ有効性の試験
スキャニングライブラリーを作製し、２つのヒト細胞株における有効性を試験した。使用したオリゴヌクレオチドを表７に示す。実施例１で試験したオリゴヌクレオチドのいくつかを、本実施例でも含めた。ヒト細胞株のＡ３４１およびＵ２−ＯＳを、表８に列挙する供給元から購入し、５％ＣＯ２で３７℃にて、加湿したインキュベーター内で、供給元により推奨される方法で維持した。スクリーニングアッセイのために、細胞を、供給元により推奨される培地内で９６マルチウェルプレートに播種した（材料および方法セクションの、表８を参照のこと）。１ウェル当たりの細胞数は、各細胞株に対して最適化されている（材料および方法セクションの、表８を参照のこと）。
【０３４６】
（ＰＢＳに溶解した）０．５μＭの濃度のオリゴヌクレオチドを添加する直前に、細胞を播種した（これは、表８に記載した２４時間から変更されている）。オリゴヌクレオチドを添加した３日後に、細胞を回収した。
【０３４７】
メーカーの指示に従い、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  ９６キット（７４１８２）を使用して、ＲＮＡを抽出した。ｑＳｃｒｉｐｔ  ＸＬＴワンステップＲＴ−ｑＰＣＲ  ＴｏｕｇｈＭｉｘ  Ｌｏｗ  ＲＯＸ、９５１３４−１００（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ｃＤＮＡ合成およびｑＰＣＲを実施した。ＶＩＣ標識したハウスキーピング遺伝子対照と共に、複数の反応において、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＦＡＭ標識ＴａｑＭａｎアッセイを使用して、標的転写量を定量化した。使用したＴａｑＭａｎプライマーアッセイは、以下のとおりであった。
【表１９】
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【０３４８】
技術的なデュプレックスセットアップを使用した（ｎ＝１、生物学的複製）。
【０３４９】
相対的なＡＴＸＮ２  ｍＲＮＡ発現量を表１４に、対照（ＰＢＳ処理細胞）の割合として示す。即ち、値が小さいほど、阻害は大きい。
【０３５０】
【表２０】
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表１４のデータを、図１Ａ（Ａ４３１細胞）およびＢ（Ｕ２−ＯＳ細胞）に示す。図２は、２つの細胞株のスクリーニング結果どうしの良好な相関関係を示す。
【０３５１】
実施例４  ０．５μＭのオリゴヌクレオチドで処理した後の、Ａ４３１およびＵ２ＯＳ細胞株におけるＡＴＸＮ２  ｍＲＮＡ量の測定値からの、ホットスポット領域の識別
表７に列挙する、１４８３種類のオリゴヌクレオチドのそれぞれで処理した後のＡ４３１およびＵ２ＯＳ細胞株内でのＡＴＸＮ２  ｍＲＮＡの量を使用して、ＡＴＸＮ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ上でのホットスポット領域を、以下のとおりに識別した。
【０３５２】
まず、Ａ４３１およびＵ２ＯＳ細胞株の一方または両方の、５０％を超える減少をもたらすオリゴヌクレオチドヒットを識別し、４８種類のオリゴヌクレオチドを得た。
【０３５３】
次に、これらの４８種類のヒットのそれぞれについて、ヒットから１０ｎｔｓ以内に開始位置がある、任意の追加のオリゴヌクレオチドを、そのヒットと共にグループ分けする。同じオリゴヌクレオチドの１つまたはそれ以上を含有する任意の群を、１つのグループにまとめる。これにより、２１種類の異なるオリゴヌクレオチドの群が得られる。各群は、少なくとも５０％、ＡＴＸＮ２  ｍＲＮＡを減少させることができる１種以上のオリゴヌクレオチドを含む。
【０３５４】
２１種類の群のそれぞれについて、ホットスポット領域を、群の中の全てのオリゴヌクレオチドにより覆われたＡＴＸＮ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ上の領域として識別し、下表１５に示す。
【０３５５】
【表２１】
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【０３５６】
図１Ｃは、ＡＴＸＮ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ上での、灰色の点としてのホットスポットの位置を示す。ホットスポットの大部分は、標的転写物（配列番号１）のイントロン領域に位置していることが確認できる。
【０３５７】
実施例５  Ａ４３１およびＵ２−ＯＳ細胞株における、実施例３から選択した化合物のインビトロＥＣ５０および有効性の試験
以下のオリゴヌクレオチド濃度：１０、３．２、１．０、０．３２、０．１０、０．３２、０．０１０、および０．０３２μＭ（半対数希釈、１０μＭから８カ所）、およびｎ＝２の生物学的複製にて、実施例３に記載するアッセイを使用して、実施例３から選択したオリゴヌクレオチドのＥＣ５０および有効性（ＫＤ、１０μＭにおける残留ｍＲＮＡの量）を測定した。
【０３５８】
具体的には、４パラメーターロジスティックモデルをデータに、最小二乗法で適合させることにより、ＥＣ５０値を推定した。高濃度での最小漸近線が０を上回る、または０に等しくなるように、モデル適合を制限した。１０μＭにおける残留ＡＴＸＮ２  ｍＲＮＡを表１６に、対照（ＰＢＳ処理細胞）の％として示す。
【０３５９】
【表２２】
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【０３６０】
実施例６  「領域１２」を標的にする化合物と、ヒトＡＸＴＮ２にまたがり標的にする化合物の比較
ＡＴＸＮ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ配列（配列番号１）にまたがり、１５００個を超えるＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドを設計し、０．５μＭの低用量におけるそれらのインビトロ潜在性を、Ａ４３１およびＵ２ＯＳ細胞で評価した。結果を図６にまとめている。実線円として表されるホットスポット領域（配列番号６）が、潜在性の高い化合物を提供することが、データから確認される。図７は、選択したホットスポット領域化合物のみを示す。
【０３６１】
実施例７  ０．５μＭにおける、Ｕ２ＯＳおよびＡ４３１細胞株での、ＬＮＡオリゴヌクレオチドのインビトロ有効性の試験
配列番号１の位置８３１２１〜８３１４４の領域もまた標的にする、表１７のＬＮＡオリゴヌクレオチドを使用して、３つのヒト細胞株にてオリゴヌクレオチドスクリーンを行った。上記実施例に記載のとおりである。相対的なＡＴＸＮ２  ｍＲＮＡ発現レベルを表１７に、対照（ＰＢＳ処理細胞）の割合として示す。即ち、値が小さいほど、阻害は大きい。
【０３６２】
【表２３】
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【０３６３】
化合物に関して、大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、全てのＬＮＡ  Ｃは５−メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【０３６４】
実施例８：選択した化合物のインビトロＥＣ５０および有効性の試験
実施例２に記載の方法論を使用し、開始濃度として１０ｍＭを使用して、実施例３で試験した化合物のＥＣ５０を測定した。ＥＣ５０値を以下のとおりに計算した：
【０３６５】
【表２４】
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【０３６６】
実施例９：マウス一次皮質ニューロン細胞における、先行技術の化合物ＡＳＯ７と比較した、選択した化合物７＿１および１５＿４の評価。
化合物ＡＳＯ７＝ｇｔｇｇｇａｔａｃａａａｔｔｃｔａｇｇｃ（配列番号Ｍ）、下線付き太文字は２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドを表し、太字でない文字はＤＮＡヌクレオシドであり、ヌクレオシド間結合は全てホスホロチオエートである（Ｓｃｈｏｌｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ｖｏｌｕｍｅ  ５４４，ｐａｇｅｓ  ３６２−３６６（２０  Ａｐｒｉｌ  ２０１７）に開示しているとおり）。
【０３６７】
マウス一次皮質ニューロン細胞培養の調製
標準的な手順に従い、１５日齢のマウスの胚脳から、一次皮質ニューロン培養物を調製した。手短に言うと、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で２〜３時間、培養皿をポリ−Ｌ−リジン（５０μｇ／ｍｌポリ−Ｌ−リジン、１０ｍＭ  Ｎａテトラボレート、ｐＨ８の緩衝液）でコーティングした。皿を、使用前に１×ＰＢＳで洗浄した。回収したマウス胚脳をかみそりの刃で切開して均質化し、３８ｍｌの切開培地（ＨＢＳＳ、０．０１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、ペニシリン／ストレプトマイシン）に浸した。２ｍｌのトリプシンを添加して、細胞を３０分間、３７℃にてインキュベートした。インキュベーション後、４ｍｌのトリプシン停止剤を添加して、細胞を遠心分離にかけた。
【０３６８】
細胞を２０ｍｌ  ＤＭＥＭ（＋１０％  ＦＢＳ）に分散させて、更なる均質化のために、１３ｇの針を備えた注射器に通した。この後、５００ｒｐｍで１５分間遠心分離をした。上清を取り除き、細胞をＤＭＥＭ（＋１０％  ＦＢＳ）に分散させて９６ウェルプレート（１００μｌ中に、０．１×１０＾６細胞／ウェル）に播種した。神経細胞細胞培養物は、播種後直接使用する準備ができていた。
【０３６９】
マウス一次皮質ニューロン細胞培養物におけるオリゴヌクレオチドのスクリーニング
翌日、培地を、９６ウェルプレート中の増殖培地（Ｇｉｂｃｏ  Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、Ｂ２７上清、Ｇｌｕｔａｍａｘ、ペニシリン−ストレプトマイシン）および５μＭ  ＦｄＵに変更し、所望濃度にて６日間、オリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。ＲＮＡを全て細胞から分離し、ノックダウン有効性をｑＰＣＲ分析により測定した。ワンステップｑＰＣＲ（ｃＤＮＡ合成およびｑＰＣＲ）のために、ＲＰＬ４、Ｍｍ．ＰＴ．５８．１７６０９２１８、またはＲＰＳ２９、Ｍｍ．ＰＴ．５８．２１５７７５７７のいずれかのデュプレックスで実施する、１つのＡＴＸＮ２プローブセット（ＩＤＴ，Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）（ＡＴＸＮ２＿ａｓｓａｙ１、Ｍｍ．ＰＴ．５８．７１７８３４１）と共に、各サンプルを二連で実行した。各反応物に、以前に希釈した４μＬのＲＮＡ、０．５μＬの水、および５．５μＬのＴａｑＭａｎ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘを添加した。プレートを遠心分離し、９０℃にて４０秒間熱閉鎖させた後、氷上で短いインキュベーションを行い、その後、ｑＰＣＲを使用してサンプルを分析した（５０℃にて１５分間、および９０℃にて３分間、続いて４０サイクル、９５℃にて５秒間、および６０℃にて４５秒間の、インキュベーション）。
【０３７０】
相対検量線法を使用してデータを分析し、各サンプルをまず、２つのハウスキーピング遺伝子（ＲＰＬ４およびＲＰＳ２９）の幾何平均に正規化した後、未処理の対照動物の割合として表現した。
使用した化合物：７＿１、１５＿４、およびＡＳＯ７
【０３７１】
結果を図８に示す。
【０３７２】
実施例１０：インビボＩＣＶマウス研究
動物のケア
カゴ１つ当たり５〜６匹を収容したＣ５７ＢＬ／６ＪＢｏｍＴａｃメスマウス（１６−２３ｇ、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅｊｂｙ、Ｄｅｎｍａｒｋ）にて、化合物のインビボ活性および忍容性を試験した。動物を、一定温度（２２±２℃）および湿度（５５±１０％）、および１日あたり１２時間照明を付けた（６時に照明を付ける）にて維持したコロニー部屋にて維持した。動物は全て、研究を通して、自由に食料と水にアクセスできた。マウスの手順は全て、Ｄａｎｉｓｈ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｅｔｈｉｃｓ  ｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓにより認可されていた。
【０３７３】
投与経路−脳室内注射
化合物を、脳室内（ＩＣＶ）注射によりマウスに投与した。ＩＣＶ投与の前に、マウスの体重を量り、イソフルランまたはプロポフォール（３０ｍｇ／ｋｇ）で安楽死させた。スタンドを調整して、皮膚および頭蓋から正しい距離（３．９ｍｍ）で、右側脳室まで貫通する、２３ゲージ針が固定されて適合した、ＦＥＰカテーテルを備えたＨａｍｉｌｔｏｎマイクロ注射針を使用して脳室内注射を行った。片手の親指人差し指で、注射されるマウスの首の襟首を保持した。優しく、かつしっかりと圧力を加えて、頭部を上方に持ち上げて、正中線（中外側）の右１〜２ｍｍ、かつ目の向こう１〜２ｍｍの頭蓋に針を刺した。試験化合物またはビヒクルのボーラスを、以前に測定した注入速度にて、３０秒間注射した。逆流を避けるため、マウスをこの位置に更に５秒間保持した後、下方へ慎重に引き下げ、針を離した。この手順に、手術または切開は必要ではなかった。手順から回復するまで、動物を熱ランプの下に置いた。脳組織（毛皮質および小脳）、ならびに肝臓および腎臓皮質を、投与の２または４週間後に、薬剤濃度分析、ならびにＡＴＸＮ２  ｍＲＮＡおよびタンパク質分析のために、ドライアイス上で収集した。
【０３７４】
３つの独立実験を、下表（表１９）に示すとおりに、異なる化合物の群で実施した。
化合物９０６＿１＝ＴＣＣａｔｔａａｃｔａｃｔＣＴＴＴ（大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、全てのＬＮＡ  Ｃは５−メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。）
【０３７５】
【表２５】
2021526797.tif 000105
【０３７６】
忍容性の結果：
国際公開第２０１６／１２６９９５号に記載されているとおりに動物の挙動を監視することで、急性の毒性を測定した（国際公開’９９５の実施例９を参照のこと）。慢性毒性を、実験の時間経過中の、各動物の体重を監視することで測定し、５％を超える体重減少は、慢性毒性を示す。毒性の兆候を示した顕著な動物を安楽死させ、場合によっては実験を早く終えた（高い割合で動物が毒性の兆候を示す場合、全ての動物を安楽死させた）。
【０３７７】
実験１
化合物７＿１：いずれの動物も、急性の毒性の兆候は示さなかった。１匹のマウスが、実験中（２７日間）に体重減少を示した。
【０３７８】
化合物１４＿１：１０匹の動物のうち２匹が急性の毒性を示し、投与の１日後に安楽死させる必要があった。残りの８匹の動物のうち５匹が、実験中（８日目に終了）に体重減少を示した。
【０３７９】
化合物１５＿１：１０匹の動物のうち１匹が急性の毒性を示し、投与の１日後に安楽死させる必要があった。残りの８匹の動物の全てのうち、５匹が実験中（８日目に終了）に体重減少を示した。
【０３８０】
実験２
化合物ＡＳＯ７は１０匹の動物全てにおいて急性の毒性であり、投与後３０分以内に深刻な痙攣を伴い、投与の１時間後に安楽死させる必要があった。
【０３８１】
化合物９０６＿１：１０匹の動物のうち３匹が急性の毒性を示し、投与後の１日後に安楽死させる必要があった。残りの７匹の動物のうち４匹が、実験中（１２日目に終了）に体重減少を示した。
【０３８２】
化合物１７＿１：いずれの動物も、急性の毒性の兆候は示さなかった。１０匹の動物のうち２匹が、実験中（２９日間）に体重減少を示した。
【０３８３】
化合物１８＿１：１０匹の動物のうち１匹が急性の毒性を示し、安楽死させた。残りの９匹の動物のうち３匹が、実験中（２９日間）に体重減少を示した。
【０３８４】
実験３
化合物１５＿３：６匹の動物のうち２匹が急性の毒性を示し、投与後の１日後に安楽死させる必要があった。残りの４匹のうち、２匹が、実験中（１５日目に終了）に体重減少した。
【０３８５】
化合物１５＿４：６匹の動物のうち２匹が急性の毒性を示し、投与後の１日後に安楽死させる必要があった。残りの４匹の動物はいずれも、実験中（１４日で終了）に体重減少を示さなかった。
【０３８６】
化合物１４＿３：６匹の動物のうち１匹が急性の毒性を示し、投与の１日後に安楽死させる必要があった。残りの５匹のうち、３匹が、実験中（９日目に終了）に体重減少した。
【０３８７】
化合物１４＿２：６匹の動物のうち２匹が急性の毒性を示し、投与の１日後に安楽死させる必要があった。残りの４匹のうち、３匹が、実験中（１５日目に終了）に体重減少した。
【０３８８】
化合物１５＿２：６匹の動物のうち２匹が急性の毒性を示し、投与の１日後に安楽死させる必要があった。残りの４匹のうち、３匹が、実験中（１０日目に終了）に体重減少した。
【０３８９】
化合物１５＿５：６匹の動物は全て急性の毒性を示し、投与の１日後に安楽死させる必要があった。
【０３９０】
オリゴ含有量およびＡＴＸＮ２  ｍＲＮＡ分析のための、組織の均質化
Ｑｉａｇｅｎ  ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ  ＩＩを使用して、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ＬＣ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）にて、マウスの脳、肝臓、および腎臓サンプルを均質化した。ホモジェネートを完全に細胞溶解させるために、３０分間室温でインキュベートした。細胞溶解後、ホモジェネートを３分間、１３０００ｒｐｍにて遠心分離し、上清を分析に使用した。半分を生物学的分析のために取っておき、もう半分に関して、ＲＮＡ抽出を直接継続した。
【０３９１】
オリゴ含有量分析
生物学的分析に関して、サンプルを、オリゴ含有量測定のために、ハイブリダイゼーションＥＬＩＳＡ法を用いて、１０〜５０倍に希釈した。ビオチン化ＬＮＡ捕捉プローブ、およびジゴキシゲニンコンジュゲート化ＬＮＡ検出プローブ（５ｘＳＳＣＴにて両方３５ｎＭ、それぞれ、検出されるＬＮＡオリゴヌクレオチドの一端に相補性である）を、希釈したホモジェネート、または関係する規格で希釈し、３０分間室温にてインキュベートし、ストレプトアビジンでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに加えた（Ｎｕｎｃカタログ番号４３６０１４）。
【０３９２】
プレートを１時間室温にてインキュベートし、２ｘＳＳＣＴ（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、および０．０５％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ  ７．０）で洗浄した。アルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号１１０９３２７４９１０）およびアルカリホスファターゼ基質系（Ｂｌｕｅ  Ｐｈｏｓ基質、ＫＰＬプロダクトコード：５０−８８−００）とコンジュゲート化した抗ＤＩＧ抗体を使用して、捕捉したＬＮＡデュプレックスを検出した。オリゴ複合体の量を、Ｂｉｏｔｅｋリーダーにて６１５ｎｍにおける吸光度として、測定した。
【０３９３】
データを組織重量に対して正規化し、オリゴのｎＭとして表現した。
【０３９４】
ＡＴＸＮ２  ｍＲＮＡの減少
キットであるＣｅｌｌｕｌａｒ  ＲＮＡ  Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ９６機器を使用して、３５０μＬの上清からＲＮＡ精製した。ＲＮＡサンプルを、ＲＮａｓｅ非含有水中で２ｎｇ／μＬに正規化し、更なる使用まで、−２０℃にて保存した。
【０３９５】
ワンステップｑＰＣＲ（ｃＤＮＡ合成およびｑＰＣＲ）のために、デュプレックス（ＲＰＬ４、Ｍｍ．ＰＴ．５８．１７６０９２１８とデュプレックスのＡＴＸＮ２＿ａｓｓａｙ１、Ｍｍ．ＰＴ．５８．７１７８３４１、および、ＲＰＳ２９、Ｍｍ．ＰＴ．５８．２１５７７５７７とデュプレックスのＡＴＸＮ２＿ａｓｓａｙ２、Ｍｍ．ＰＴ．５８．１１６７３１２３）にて実施する、４種類のプローブセット（ＩＤＴ，Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて、各サンプルを二連で実行した。各反応物に、以前に希釈した４μＬのＲＮＡ、０．５μＬの水、および５．５μＬのＴａｑＭａｎ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘを添加した。プレートを遠心分離し、９０℃にて４０秒間熱閉鎖させた後、氷上で短いインキュベーションを行い、その後、ｑＰＣＲを使用してサンプルを分析した（５０℃にて１５分間、および９０℃にて３分間、続いて４０サイクル、９５℃にて５秒間、および６０℃にて４５秒間の、インキュベーション）。
【０３９６】
相対検量線法を使用してデータを分析し、各サンプル（２つのＡＴＸＮ２アッセイの幾何平均）をまず、２つのハウスキーピング遺伝子（ＲＰＬ４およびＲＰＳ２９）の幾何平均に正規化した後、未処理の対照動物の割合として表現した。
【０３９７】
ＡＴＸＮ２タンパク質分析のための、組織の均質化
Ｑｉａｇｅｎ  ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ  ＩＩを使用して、１％  Ｈａｌｔ（商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、ＲＩＰＡ緩衝液中にてマウスの脳サンプルを均質化した。ホモジェネートを完全に細胞溶解させるために、３０分間４℃でインキュベートした。細胞溶解後、ホモジェネートを１０分間、１４０００ｒｃｆにて遠心分離にかけ、上清を小さな体積にアリコートして、更に使用するまで−２０℃にて保存した。
【０３９８】
ＡＴＸＮ２タンパク質の減少
ＢＣＡ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した全てのタンパク質に基づき、サンプルを０．０５ｍｇ／ｍｌに正規化した。ＡＴＸＮ２タンパク質の減少をデュプレックス（一次抗体：Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ａｔａｘｉｎ−２、１：５０、＃６１１３７８、ＢＤ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅおよびＡｎｔｉ−ＨＰＲＴ、１：１００、＃ａｂ１０９０２１、Ａｂｃａｍ：二次抗体：抗マウスおよび抗ウサギ二次抗体、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で測定し、メーカーの標準的な手順に従い、キャピラリーウェスタン免疫アッセイＷＥＳ機器（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ）で分析した。
【０３９９】
相対量でデータを分析した。各サンプルに対するＡＴＸＮ２の発現をまず、ハウスキーピングタンパク質（ＨＰＲＴ）に対して正規化した後で、未処理の対照動物の割合として表現した。
【０４００】
図９〜１１に結果を示す。
【０４０１】
図９：１１個の選択した化合物のノックダウン（ｍＲＮＡ）の比較、３つの実験からのコンパイルデータ、研究１＝黒丸、研究２＝白丸、研究３＝白黒が半分ずつの丸。
【０４０２】
図１０：タンパク質およびｍＲＮＡレベルでのノックダウン、および、毛皮質、小脳領域における化合物７＿１への暴露。毛皮質に対するタンパク質データを示す。
【０４０３】
図１１：タンパク質およびｍＲＮＡレベルでのノックダウン、および、毛皮質、小脳領域における化合物１５＿４への暴露。毛皮質に対するタンパク質データを示す。
【０４０４】
実施例１１：インビボでのＩＣＶマウス研究−作用期間
化合物７＿１の作用期間を調査するために、新しい研究を立ち上げた。１５＿４を、１箇所の時点のみ（７日間）に含めた。手順は、以下のプロトコルを使用する、実施例７に記載されているとおりである。
【０４０５】
【表２６】
2021526797.tif 000106
【０４０６】
ｍＲＮＡノックダウンの結果を図１２に示す。これは、毛皮質、および特に小脳組織の両方において、少なくとも５６日間の、ＡＴＸＮ２  ｍＲＮＡのロバストで潜在的なノックダウンを示している（有効性の最大レベルは７〜５６日間維持され、このことは、作用の有効期間は５６日間よりも相当長いことを示している）。治療がさほど効果的でない数匹のマウスが存在するようであり、これは、同じ個体と関連しているため、時間経過にわたり、マウスには、手順が関係している可能性がある。
【０４０７】
実施例１２：インビボでのカニクイザル研究
対象
対象は、投与開始時に体重が２〜４ｋｇの、オスおよびメスカニクイザルであった。それぞれの、腰の髄腔内空間に、ポリウレタンカテーテルを埋め込んだ。カテーテルの近位端を、皮下アクセスポートに接続して、髄腔内空間への注射、およびＣＳＦサンプルの引き出しを可能にした。
【０４０８】
カニクイザルに、生理食塩水、化合物番号７＿１、または化合物番号１５＿４（１．０ｍｌの体積で、続いて１．５ｍｌのａＣＳＦで、０．３３ｍｌ／分にて生理食塩水に溶解したもの）のいずれかを投与した。注入の総時間は４．５分であった。用量、期間、群のサイズ、および組織についての情報は、表２１を参照のこと。
【表２７】
2021526797.tif 000107
【０４０９】
サンプル当たり、自然流下から、最大０．８ｍｌのＣＳＦにより、ＣＳＦを腰のアクセスポートから収集した。ＣＳＦを遠心分離にかけて、上清を、分析するまで−８０℃にて保持した。利用可能な静脈から入手した血漿を、分析するまで−８０℃にて保持した。
【０４１０】
適切な体積の、市販されている安楽死溶液をカニクイザルに投与しながら、ケタミンおよびイソフルランで安楽死させた。剖検組織をその直後に入手し、切開のために、脳を冷却した表面に移した。薬剤濃度分析およびＡＴＸＮ２  ｍＲＮＡ分析のために、きれいな除去技術を使用してサンプルを全て収集し、重量を量ってドライアイス上で冷凍した。
【０４１１】
忍容性
生活相の間に、臨床的副作用は報告されなかった。組織病理学的には、試験量において、いずれの化合物に対しても懸念は示されなかった。
【０４１２】
オリゴ含有量およびＡＴＸＮ２  ｍＲＮＡ分析のための、組織の均質化
実施例７を参照のこと−同じ手順を用いた。
【０４１３】
オリゴ含有量分析
生物学的分析に関して、サンプルを、オリゴ含有量測定のために、ハイブリダイゼーションＥＬＩＳＡ法を用いて、５０〜１００倍に希釈した。ビオチン化ＬＮＡ捕捉プローブ、およびジゴキシゲニンコンジュゲート化ＬＮＡ検出プローブ（５ｘＳＳＣＴにて両方３５ｎＭ、それぞれ、検出されるＬＮＡオリゴヌクレオチドの一端に相補性である）を、希釈したホモジェネート、または関係する規格で希釈し、３０分間室温にてインキュベートし、ストレプトアビジンでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに加えた（Ｎｕｎｃカタログ番号４３６０１４）。
【０４１４】
プレートを１時間室温にてインキュベートし、２ｘＳＳＣＴ（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、および０．０５％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ  ７．０）で洗浄した。アルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号１１０９３２７４９１０）およびアルカリホスファターゼ基質系（Ｂｌｕｅ  Ｐｈｏｓ基質、ＫＰＬプロダクトコード：５０−８８−００）とコンジュゲート化した抗ＤＩＧ抗体を使用して、捕捉したＬＮＡデュプレックスを検出した。オリゴ複合体の量を、Ｂｉｏｔｅｋリーダーにて６１５ｎｍにおける吸光度として、測定した。
【０４１５】
データを組織重量に対して正規化し、オリゴのｎＭとして表現した。
【０４１６】
ＡＴＸＮ２  ｍＲＮＡの減少
キットであるＣｅｌｌｕｌａｒ  ＲＮＡ  Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ９６機器を使用して、３５０μＬの上清からＲＮＡ精製した。ＲＮＡサンプルを、ＲＮａｓｅ非含有水中で２ｎｇ／μＬに正規化し、更なる使用まで、−２０℃にて保存した。
【０４１７】
ワンステップｑＰＣＲ（ｃＤＮＡ合成およびｑＰＣＲ）のために、各サンプルを、シングルプレックスで実施する、ＡＴＸＮ２（表２２を参照）に対する４つのプローブセット（ＩＤＴ，Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、ならびに、異なるハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ、Ｍｆ０４３９２５４６＿ｇ１、ＰＯＬＲ３Ｆ、Ｍｆ０２８６０９３９＿ｍ１、ＹＷＨＡＺ、Ｍｆ０２９２０４１０＿ｍ１およびＵＢＣ、Ｍｆ０２７９８３６８＿ｍ１）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に対する４つのプローブセットを用い、二連で実施した。
【０４１８】
【表２８】
2021526797.tif 000108
【０４１９】
各反応物に、以前に希釈した４μＬのＲＮＡ、０．５μＬの水、および５．５μＬのＴａｑＭａｎ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘを添加した。プレートを遠心分離し、９０℃にて４０秒間熱閉鎖させた後、氷上で短いインキュベーションを行い、その後、ｑＰＣＲを使用してサンプルを分析した（５０℃にて１５分間、および９０℃にて３分間、続いて４０サイクル、９５℃にて５秒間、および６０℃にて４５秒間の、インキュベーション）。
【０４２０】
相対検量線法を使用してデータを分析した。各サンプル（４つのＡＴＸＮ２アッセイの平均）をまず、Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅら，２００２，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００２，３（７）：ｒｅｓｅａｒｃｈ  ００３４．１−００３４．１１に記載されているｇｅＮＯＲＭ分析により測定した、３つの最良なパフォーマンスを示す各組織のハウスキーピング遺伝子の平均に正規化し、その後、未処理の対照動物の割合として表現する（図１３を参照）。
【０４２１】
ＡＴＸＮ２タンパク質分析のための、組織の均質化
マウス研究と同じ
ＡＴＸＮ２タンパク質の減少
ＢＣＡ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した全タンパク質に基づき、小脳および毛皮質サンプルサンプルを０．２ｍｇ／ｍｌに正規化した。ＡＴＸＮ２タンパク質の減少をデュプレックス（一次抗体：Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ａｔａｘｉｎ−２、１：５０、＃６１１３７８、ＢＤ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅおよびＡｎｔｉ−ＨＰＲＴ、１：５０、＃ａｂ１０９０２１、Ａｂｃａｍ：二次抗体：抗マウスおよび抗ウサギ二次抗体、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で測定し、メーカーの標準的な手順に従い、キャピラリーウェスタン免疫アッセイＷＥＳ機器（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ）で分析した。
【０４２２】
相対量でデータを分析した。各サンプルに対するＡＴＸＮ２の発現をまず、ハウスキーピングタンパク質（ＨＰＲＴ）に対して正規化した後で、未処理の対照動物の割合として表現した。
【０４２３】
結果を図１３および１４に示す。
【図１】
2021526797.tif 000109
【図２】
2021526797.tif 000110
【図３】
2021526797.tif 000111
【図４】
2021526797.tif 000112
【図５】
2021526797.tif 000113
【図６】
2021526797.tif 000114
【図７】
2021526797.tif 000115
【図８】
2021526797.tif 000116
【図９】
2021526797.tif 000117
【図１０】
2021526797.tif 000118
【図１１】
2021526797.tif 000119
【図１２】
2021526797.tif 000120
【図１３】
2021526797.tif 000121
【図１４】
2021526797.tif 000122
【配列表】
2021526797000001.app
【国際調査報告】
2021526797.tif 000123
2021526797.tif 000124
2021526797.tif 000125
2021526797.tif 000126
2021526797.tif 000127
2021526797.tif 000128