(57)【要約】  本発明は、抗体−薬物コンジュゲートであって、抗体が、ＴｆＲ、トランスフェリン受容体と特異的に結合し、薬物が、好ましくは、細胞毒性薬から選択される、抗体−薬物コンジュゲートに関する。そのような抗体−薬物コンジュゲートは、特に、リンパ腫または白血病などのがんを含む増殖性疾患を処置するのに、有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：Ａｂ−Ｌ−Ｚ−Ｘ−Ｄの抗体−薬物コンジュゲートであって、式中：
−  Ａｂが、抗ＴｆＲ抗体であり、
−  Ｌが、前記抗体と結合したリンカー分子であり、前記リンカー分子が式（ＩＩ）：
【化１】
2021521181.tif 000019
であり、式中、ｎが２から２０の間に含まれる整数である、
−  Ｚが、Ｌと結合したバリン−シトルリンのジペプチドであり、
−  Ｘが、Ｚと結合したアミノベンジルエステル自壊性基であり、
−  Ｄが、Ｘと結合した薬物である、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２】
薬物が、細胞毒性薬、特にモノメチルオーリスタチンＥである、請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項３】
Ｘが、Ｚと共有結合したパラアミノベンジルエステル基であり、前記Ｘが、以下の式（ＩＩＩ）：
【化２】
2021521181.tif 000020
であり、式中、ＪがＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨＣＯＣＨ３、Ｎ（ＣＨ３）２、ＮＨＣＯＣＦ３、アルキル、およびハロアルキルから選択される任意の置換基であり、ｍが、０、１、２、３、および４の整数であり、前記Ｘが、好ましくは、ｍが０であるパラアミノベンジルエステルである、請求項１または２に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項４】
Ｌが、前記抗体の１つまたは複数のチオール残基と共有結合し、好ましくは、前記Ｌが、式（ＩＶ）：
【化３】
2021521181.tif 000021
のリンカー分子に対応する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項５】
前記抗体が、完全長抗体、または抗原結合部分を含有する抗体断片を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項６】
前記抗体が、配列番号１６のトランスフェリン受容体と特異的に結合する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項７】
前記抗体が、１０ｎＭ以下のＫＤ、好ましくは１ｎＭ以下のＫＤでトランスフェリン受容体と結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項８】
前記抗体がモノクローナル抗体および／またはヒト化抗体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項９】
−  前記抗体が、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ定常領域または変異型もしくは化学修飾型定常領域を含み、前記変異型または化学修飾型定常領域が、野生型ＩｇＧ４アイソタイプ定常領域を有する対応抗体と比較して、ＡＤＣＣ活性の喪失または減少を前記抗体に与え、または
−  前記抗体が、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ定常領域または変異型もしくは化学修飾型定常領域を含み、前記変異型または化学修飾型定常領域が、野生型ＩｇＧ１アイソタイプ定常領域を有する対応抗体と比較して、ＡＤＣＣ活性の増加を前記抗体に与える、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１０】
前記抗ＴｆＲ抗体が以下：
（ａ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、配列番号３のＨＣＤＲ３を含む可変重鎖ポリペプチド、ならびに配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｂ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、配列番号３のＨＣＤＲ３を含む可変重鎖ポリペプチド、ならびに配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号８のＬＣＤＲ２、および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１１のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチドおよび配列番号１３のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｄ）配列番号１１のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチドおよび配列番号１４のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｅ）配列番号１１のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチドおよび配列番号１５のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｆ）配列番号１２のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチドおよび配列番号１３のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｇ）配列番号１２のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチドおよび配列番号１４のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｈ）配列番号１２のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチドおよび配列番号１５のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド
のいずれかを含み、好ましくは、前記抗体が、配列番号１８の重鎖および配列番号１７の軽鎖を含むｍＡｂ１である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１１】
医薬品としての使用のための、好ましくは、腫瘍、例えば、固形腫瘍または血液腫瘍、より具体的には、リンパ腫または白血病の処置における使用のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１２】
１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体と組み合わせて、任意で他の活性成分を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートを含む薬学的組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、６．５のｐＨを有し、ヒスチジン、ならびに任意で、スクロースおよびポリソルベート８０をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートを含む組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートを含む、凍結乾燥製剤、プレフィルドシリンジ、またはバイアル。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートを得るための方法であって、
−  請求項１〜１０のいずれか一項に定義される抗体をコードする核酸の発現に適した条件下で宿主細胞を培養するステップ、
−  抗体を単離するステップ、
−  式（Ｖ）：
【化４】
2021521181.tif 000022
のリンカーＬ−Ｚ−Ｘと結合したモノメチルオーリスタチンＥを合成するステップ、
−  式（Ｖ）のリンカーＬ−Ｚ−Ｘと結合したモノメチルオーリスタチンＥに前記抗体をコンジュゲートするステップ
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
抗体−薬物コンジュゲートであって、抗体が、ＴｆＲ、トランスフェリン受容体と特異的に結合し、薬物が、好ましくは、細胞毒性薬から選択される、抗体−薬物コンジュゲートが以下に開示される。そのような抗体−薬物コンジュゲートは、特に、リンパ腫または白血病などのがんを含む増殖性疾患を処置するのに、有用である。
【背景技術】
【０００２】
抗体−薬物コンジュゲート（以下、「ＡＤＣ」と呼ばれる）は、治療学、とりわけ、がん治療学の新しいクラスである。そのようなＡＤＣは、少なくとも抗体およびペイロード（例えば、細胞毒性薬）を含み、両方がリンカーによって結合されている。したがって、ＡＤＣは、抗体標的の特異性をペイロード（例えば、化学療法剤の細胞毒性）の効率と組み合わせるようにデザインされる。効率的なＡＤＣは、高い特異性および低い毒性を示すはずである。
【０００３】
毒性という関連の中では、ＡＤＣの抗体は、それの抗原と正確かつ効率的に結合する必要があり、つまり、その適切な標的抗原が標的細胞上に優先的にまたは独占的に発現しているということである。
【０００４】
ＵＳ６２１４３４５、ＷＯ０３／０２６５７７、ＷＯ０３／０４３５８３、ＷＯ２００４／０１０９５７、ＷＯ２００５／０８２０２３、およびＷＯ２０１５／００１１１７などのいくつかの特許または特許出願が、ＡＤＣを作製するために用いることができるリンカーを開示している。細胞毒または薬物を抗体にコンジュゲートするために用いられているリンカーの型の例には、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィド、およびペプチド含有リンカーが挙げられるが、それらに限定されない。リンカーは、例えば、リソソームコンパートメント内の低ｐＨによる切断に対して感受性が高く、または腫瘍組織において優先的に発現するプロテアーゼ、例えば、カテプシン（例えば、カテプシンＢ、Ｃ、Ｄ）などのプロテアーゼによる切断に対して感受性が高いものから選択される。効率的なリンカーは、ペイロードの正確かつタイムリーな放出を保証することができる。毒性という関連の中ではまた、リンカーの安定性が、たとえ、そのリンカー自体が毒性を駆動するようには思われないとしても、ペイロードにより発揮される毒性に影響し得ると思われる。実際、安定なリンカーは、標的特異的様式でペイロードを放出することができるが、安定ではないリンカーは、ペイロードの（例えば、非特異的切断による）不正確な放出を起こして、非特異的毒性をもたらす可能性がより高い。
【０００５】
ＡＤＣに用いられるペイロードは、ピコモルの範囲において、非常に強力で、多くの場合、細胞毒性のある、薬物である。一般的なペイロードは、例えば、微小管阻害剤（例えば、メイタンシン誘導体（ＤＭ１／ＤＭ４）またはオーリスタチン（ＭＭＡＥ／ＭＭＡＦ））、ＤＮＡ合成阻害剤（例えば、カリチアマイシン、ドキソルビシン、ピロロベンゾジアゼピン、インドリノベンゾジアゼピン、またはデュオカルマイシン誘導体）、またはトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、ＳＮ−３８））である。
【０００６】
ＡＤＣは、有望な治療薬であるように思われるが、いくつかのＡＤＣは、あまりにも毒性が強くあり過ぎ、そのことは、これらの化合物の治療濃度域を制限し、またはさらなる臨床開発を妨げる。
【０００７】
したがって、高い特異性、最大の効率、および低い毒性を示す効率的なＡＤＣは、それのコンポーネントの適切な組合せを必要とする。
トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）（以下、「ＴｆＲ」と呼ばれる）は、それぞれがおよそ９０ｋＤａの２つの７６０アミノ酸モノマーからなるジスルフィド連結されたホモダイマー膜貫通糖タンパク質である。ＴｆＲは、鉄取り込みおよび細胞成長の制御において極めて重要な役割を果たす（Ｇｉｌｌら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．、３３２、１７４４〜１７４８、１９９５；Ｈｅｒｍｉｎｅら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．、３３２、１７４９〜１７５１、１９９５）。二鉄トランスフェリンが、それの細胞表面受容体と結合した時、それは、クラスリン被覆ピットを介して酸性小胞へ内部移行し、そこで、鉄−トランスフェリン複合体は解離する。放出後、受容体およびアポトランスフェリンは、細胞表面へ戻ってリサイクルする。
【０００８】
ＴｆＲは、骨髄における血液細胞の前駆体、肝臓における肝実質細胞、表皮におけるケラチノサイト、および腸上皮の陰窩における腸細胞などの、常に再生される組織の細胞膜で構成的に発現している。
【０００９】
いくつかの研究により、ＴｆＲが、悪性組織において、それらの健康な対応物においてより、豊富に発現していることが示されている（Ｇａｔｔｅｒら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．、３６、５３９〜５４５、１９８３；Ｆａｕｌｋら、Ｌａｎｃｅｔ．、２、３９０〜３９２、１９８０；Ｓｈｉｎｄｅｌｍａｎら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、２７、３２９〜３３４、１９８１）。幾人かの著者らにより、悪性細胞を殺害するために、薬物にコンジュゲートされた抗ＴｆＲ抗体またはトランスフェリンそれ自体を用いるというこの考えに基づいた治療的アプローチが報告されている。トランスフェリンとＴｆＲの間の相互作用をブロックするために抗ＴｆＲ抗体を用い、その結果として、鉄取り込みを阻止し、鉄欠乏および細胞成長の負制御をもたらすこともまた提案されている。しかしながら、多くの刊行物が、抗ＴｆＲ抗体の調製を記載しているが、抗増殖活性を有する抗ＴｆＲモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の報告は非常に少ない。
【００１０】
以前の刊行物（Ｍｏｕｒａら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、１９４、４１７〜４２５、２００１）において、その著者らは、ヒトＴｆＲと結合する、Ａ２４と名づけられた、マウスモノクローナルＩｇＧ（ＩｇＧ２カッパ）を報告している。
【００１１】
ＷＯ２００５／１１１０８２は、Ｔ細胞増殖をブロックすることができるマウス抗体である、Ａ２４抗体を開示し、その抗体は、Ｔ細胞の増殖を阻害することにおいて、以前記載されたｍＡｂ  ４２／６より効率的であるように思われた。Ａ２４はまた、細胞表面でＴｆＲ発現を低下させ、ＴｆＲリサイクリングを障害した。Ａ２４はまた、急性型と慢性型の両方のＡＴＬ由来の悪性Ｔ細胞のエクスビボ増殖をブロックすることもできる（Ｍｏｕｒａら、Ｂｌｏｏｄ、１０３、５、１８３８〜４５、２００４年３月１日、Ｃａｌｌｅｎｓら、２０１０；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２０７巻、４号、ｐｐ７３１〜７５０）。この抗体はまた、インビトロとインビボの両方で、マントル細胞リンパ腫の腫瘍発生を阻止することができると記載されている（Ｌｅｐｅｌｌｅｔｉｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００７；６７：１１４５〜１１５４；Ｃａｌｌｅｎｓら、２００８、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２２、４２〜４８）。
【００１２】
ＷＯ２０１７／０１３２３０はさらに、Ａ２４抗体のヒト化バージョン、および増殖性障害を処置することにおけるそれらの使用を開示する。それはまた、細胞毒または薬物などの治療用部分にコンジュゲートされた抗ＴｆＲ抗体を開示する。しかしながら、ＷＯ２０１７／０１３２３０において、特異的なＡＤＣは開示されていない。
【００１３】
それゆえに、高い特異性および低い毒性を有する、効率的である抗ＴｆＲ抗体を含むＡＤＣの必要性が存在する。
したがって、本発明者らは、そのようなＡＤＣを開発している。本発明は、実に、本発明のＡＤＣ（すなわち、特定のリンカーおよび薬物と組み合わされた特異的抗ＴｆＲ抗体を含むＡＤＣ）が以下の利点を有することを示す予期せぬ結果に依存する：
−  Ａ２４およびＡＤＣは、ＴｆＲを発現する細胞へ類似した結合効力を有する；
−  ＡＤＣは、ＣＤ７１陽性細胞のみのアポトーシスを誘導する；
−  ＡＤＣは、複数の細胞株において効率的である；
−  ＡＤＣは、インビトロで、およびまたインビボでも効率的である；
−  ＡＤＣは、インビボで、オフターゲット効果も（例えば、炎症促進性サイトカインを放出しない）毒性効果も引き起こさない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって、本開示は、式（Ｉ）：Ａｂ−Ｌ−Ｚ−Ｘ−ＤのＡＤＣであって、式中：
−  Ａｂが、抗ＴｆＲ抗体であり、
−  Ｌが、前記抗体と結合したリンカー分子であり、前記リンカー分子が式（ＩＩ）：
【００１５】
【化１】
2021521181.tif 000002
【００１６】
であり、式中、ｎが２から２０の間に含まれる整数である、
−  Ｚが、Ｌと結合したバリン−シトルリンのジペプチドであり、
−  Ｘが、Ｚと結合したアミノベンジルエステル自壊性基であり、
−  Ｄが、Ｘと結合した薬物である、
ＡＤＣに関する。
【００１７】
他の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態において、Ｄは細胞毒性薬である。好ましくは、そのようなＤは、モノメチルオーリスタチンＥ（以下、「ＭＭＡＥ」と呼ばれる）という薬物である。
【００１８】
他の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態において、Ｘは、Ｚと共有結合したパラアミノベンジルエステル基であり、前記Ｘが、以下の式（ＩＩＩ）：
【００１９】
【化２】
2021521181.tif 000003
【００２０】
であり、式中、ＪがＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨＣＯＣＨ３、Ｎ（ＣＨ３）２、ＮＨＣＯＣＦ３、アルキル、およびハロアルキルから選択される任意の置換基であり、ｍが、０、１、２、３、および４の整数である。好ましくは、Ｘは、ｍが０であるパラアミノベンジルエステルである。
【００２１】
他の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態において、Ｌは、前記抗体の１つまたは複数のチオール残基と共有結合している。好ましくは、Ｌは、式（ＩＶ）：
【００２２】
【化３】
2021521181.tif 000004
【００２３】
のリンカー分子に対応する。
他の実施形態と組み合わせることができる別の特定の実施形態において、前記抗体は、完全長抗体、または抗原結合部分を含有する抗体断片を含む。
【００２４】
他の実施形態と組み合わせることができる別の特定の実施形態において、前記抗体は、配列番号１６のトランスフェリン受容体と特異的に結合する。
他の実施形態と組み合わせることができる別の特定の実施形態において、前記抗体は、１０ｎＭ以下のＫＤ、好ましくは１ｎＭ以下のＫＤでトランスフェリン受容体と結合する。
【００２５】
他の実施形態と組み合わせることができる別の特定の実施形態において、前記抗体は、配列番号９のＶＨおよび配列番号１０のＶＬを有する親のマウス可変領域を含む対応キメラ抗体に関して測定された誘導レベルと同等またはそれより優れたレベルで、ＨＬ−６０細胞株のアポトーシスを誘導する。
【００２６】
他の実施形態と組み合わせることができる別の特定の実施形態において、前記抗体はモノクローナル抗体である。
他の実施形態と組み合わせることができる別の特定の実施形態において、前記抗体はヒト化抗体である。
【００２７】
他の実施形態と組み合わせることができる別の特定の実施形態において、前記抗体は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ定常領域または変異型もしくは化学修飾型定常領域を含み、前記変異型または化学修飾型定常領域が、野生型ＩｇＧ４アイソタイプ定常領域を有する対応抗体と比較して、ＡＤＣＣ活性の喪失または減少を前記抗体に与える。あるいは、前記抗体は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ定常領域または変異型もしくは化学修飾型定常領域を含み、前記変異型または化学修飾型定常領域が、野生型ＩｇＧ１アイソタイプ定常領域を有する対応抗体と比較して、ＡＤＣＣ活性の増加を前記抗体に与える。
【００２８】
他の実施形態と組み合わせることができる別の特定の好ましい実施形態において、前記抗ＴｆＲ抗体はＩｇＧ４アイソタイプのモノクローナルのヒト化抗体である。
他の実施形態と組み合わせることができる別の特定の好ましい実施形態において、前記抗ＴｆＲ抗体は以下：
（ａ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、配列番号３のＨＣＤＲ３を含む可変重鎖ポリペプチド、ならびに配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｂ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、配列番号３のＨＣＤＲ３を含む可変重鎖ポリペプチド、ならびに配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号８のＬＣＤＲ２、および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１１のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチドおよび配列番号１３のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｄ）配列番号１１のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチドおよび配列番号１４のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｅ）配列番号１１のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチドおよび配列番号１５のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｆ）配列番号１２のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチドおよび配列番号１３のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｇ）配列番号１２のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチドおよび配列番号１４のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｈ）配列番号１２のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチドおよび配列番号１５のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド
のいずれかを含む。
【００２９】
本発明のＡＤＣに用いることができる抗体の例には、下に、特に表１に記載されているようなヒト化抗ＴｆＲ抗体ｍＡｂ１〜ｍＡｂ１６が挙げられる。好ましくは、前記抗体は、配列番号１８の重鎖および配列番号１７の軽鎖を含むｍＡｂ１である。
【００３０】
医薬品としての使用のための、とりわけ、がんの処置における使用のための、上記で定義されているようなＡＤＣもまた、本明細書で開示される。前記がんは、好ましくは、血液腫瘍、より具体的には、リンパ腫または白血病である。あるいは、前記ＡＤＣはまた、固形腫瘍の処置において用いられ得る。
【００３１】
本開示はさらに、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体と組み合わせて、任意で他の活性成分を含む、上記で定義されているようなＡＤＣを含む薬学的組成物に関する。
【００３２】
本開示はさらに、ヒスチジンをさらに含み、６．５のｐＨを有する、上記で定義されているようなＡＤＣを含む組成物に関する。そのような組成物はまた、スクロースおよびポリソルベート８０を含み得る。
【００３３】
特定の実施形態において、前記組成物は凍結乾燥製剤であり、または前記ＡＤＣが、治療的に許容される量で、プレフィルドシリンジまたはプレフィルドバイアル中に含まれる。
【００３４】
本開示はさらに、上記で定義されているようなＡＤＣを得るための方法に関し、その方法が以下のステップを含む：
−  上記で定義されているような抗体をコードする核酸の発現に適した条件下で宿主細胞を培養するステップ、
−  抗体を単離するステップ、
−  式（Ｖ）：
【００３５】
【化４】
2021521181.tif 000005
【００３６】
のリンカーＬ−Ｚ−Ｘと結合したモノメチルオーリスタチンＥを合成するステップ、
−  式（Ｖ）のリンカーＬ−Ｚ−Ｘと結合したモノメチルオーリスタチンＥに前記抗体をコンジュゲートするステップ。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】「ＩＮＡ０１−ＳＤＶ１」または「ＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１」と呼ばれるＡＤＣの概略図である。ＩＮＡ０１はＡｂに対応し、ＡＰＮはＬに対応し、ＶＣ−ＰＡＢは、それぞれ、Ｚ−Ｘに対応し、ＭＭＡＥはＤに対応する。
【図２】造血細胞株上でのＩＮＡ０１−ＳＤＶ１およびＡ２４の比較結合を示す図である。図２Ａは、ＴＨＰ−１細胞株に関する結果を示し、図２ＢはＭＥＣ−１細胞株に関する結果を示す。
【図３】ヒトＣＤ７１をトランスフェクションされた、またはトランスフェクションされていないＣＨＯ細胞におけるプログラム細胞死（アポトーシス）の誘導を示す図である。図３Ａは、ＣＤ７１陰性細胞に関する結果を示し、図３ＢはＣＤ７１陽性細胞に関する結果を示す。
【図４】複数の細胞株におけるＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１の増殖の低下によるインビトロ効力を示す図である。図４Ａは、Ｒａｍｏｓ細胞株に関する結果を示し、図４ＢはＴＨＰ−１細胞株に関する結果を示す。
【図５】ＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１のインビボ効力を示す図である。図５は、処置後の、ＴＨＰ−１細胞株を異種移植された、腫瘍なしマウスのパーセンテージのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを示す。処置は、ＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１と呼ばれるＡＤＣの１回のみの投与からなる。処置は、腫瘍サイズがおよそ１００ｍｍ３になった時、腹腔内（ＩＰ）に注射される。２つの投薬量（５ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇ）が試験された。ｎはマウスの数である。
【図６】３ｍｇ／ｋｇで腹腔内に投与された、野生型Ｂ６（ＷＴ）マウスおよびＣＤ７１／トランスフェリン二重ノッキングマウス（ＴｆＲ／Ｔｆ  ２Ｋｉ）におけるＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１の毒性学分析を示す図である。４日ごとに５回の注射（ｑ４ｄｘ５）。図６Ａは、ＷＴにおける肉眼での器官分析を示し、図６Ｂは、ＴｆＲ／Ｔｆ  ２Ｋｉマウスにおける肉眼での器官分析を示す。図６Ａおよび６Ｂに描かれた各器官の組織学的検査は、表７で言及されている。
【図７】０．０２ｕｇ／ｍＬから１０ｕｇ／ｍＬまでの範囲の１０個の濃度のＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１と呼ばれるＡＤＣと共に３７℃で７２時間、インキュベートされた、ＨＬ−６０急性骨髄性白血病細胞株の細胞増殖を示す図である。適合曲線を用いて、ＩＣ５０を計算した（０．０８ｕｇ／ｍＬ）。
【図８】３つの異なる条件：高コーティング化（風乾）、低コーティング化（湿潤コーティング化）、または溶液中（水性）下における、ＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１と呼ばれるＡＤＣとのＰＢＭＣ（末梢血単核球）のインキュベーション後のＴＮＦ−α産生（ｐｇ／ｍＬ）を示す図である。ＡＤＣの以下の３つの異なる濃度が試験された：０．１ｕｇ／ｍＬ、１ｕｇ／ｍＬ、および１０ｕｇ／ｍＬ。
【図９】ＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１のインビボ効力を示す図である。図９は、処置後の、ＴＨＰ−１細胞株を異種移植された、腫瘍なしマウスのパーセンテージのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを示す。処置は、ＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１と呼ばれるＡＤＣの４日ごとの４回の投与からなる。処置は、腫瘍サイズがおよそ１００ｍｍ３になった時、腹腔内（ＩＰ）に注射される。２つの投薬量（１ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇ）が試験された。ｎはマウスの数である。ｐ値は、ログ順位検定を用いて決定された。＊Ｐ＝０．０２５。
【図１０】ＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１のインビボ効力を示す図である。図１０は、処置後の、ＴＨＰ−１細胞株を異種移植された、腫瘍なしマウスのパーセンテージのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを示す。処置は、ＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１と呼ばれるＡＤＣの４日ごとの４回の投与からなる。処置は、腫瘍サイズがおよそ１００ｍｍ３になった時、静脈内（ＩＶ）に注射される。２つの投薬量（３ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇ）が試験された。ｎはマウスの数である。ｐ値は、ログ順位検定を用いて決定された。＊＊Ｐ＝０．００１５。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
定義
本開示がより容易に理解され得るように、まず、ある特定の用語が定義される。追加の定義は、詳細な説明を通して示される。
【００３９】
用語「ＣＤ７１」または「トランスフェリン受容体」または「ＴｆＲ」は、他に記載がない限り、配列番号１６に定義されるヒトＴｆＲを指す。この配列は、トランスフェリン受容体タンパク質１アイソフォーム１（ホモサピエンス）（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００３２２５．２）に対応する。
【００４０】
本明細書で言及される場合、用語「抗体」は、抗体全体、およびその任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）または一本鎖を含む。天然に存在する「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略される）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と名づけられた、より高度に保存されている領域と共に散在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と名づけられた、超可変性の領域へさらに細区画することができる。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へ配置された、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む、宿主組織または因子との免疫グロブリンの結合を媒介し得る。本明細書で用いられる場合、抗体の「抗原結合部分」（または、単純に「抗原部分」）という用語は、抗原（例えば、ＴｆＲの一部分）と特異的に結合する能力を保持する、抗体の完全長または１つもしくは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実施され得ることは示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される結合断片の例には、Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片；Ｆ（ａｂ）２断片；ヒンジ領域でのジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；ヒンジ領域での改変されたＩｇＧ重鎖、例えば、ＩｇＧ４を有する単一アームからなるＵｎｉＢｏｄｙ、ドメイン抗体断片（Ｗａｒｄら、１９８９  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４〜５４６）、もしくはＶＨドメインからなるナノボディ断片；ならびに、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；またはそのような抗原結合部分を含む任意の融合タンパク質が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、ＶＬとＶＨ領域がペア形成して、一価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている）を形成する一本鎖タンパク質として生成されるのを可能にする合成リンカーにより、組換え方法を用いて、連結することができる；例えば、Ｂｉｒｄら、１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６；およびＨｕｓｔｏｎら、１９８８  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ８５：５８７９〜５８８３参照。そのような一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含されることが意図される。これらの抗体断片は、当業者に知られた通常の技術を用いて得られ、その断片は、無傷抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングされる。本明細書で用いられる場合、「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体（例えば、ＴｆＲと特異的に結合し、ＴｆＲより他の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない、単離された抗体）を指す。しかしながら、ＴｆＲと特異的に結合する単離された抗体は、他の種由来のＴｆＲ分子などの他の抗原との交差反応性を有する場合がある。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含み得ない。句「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」は、用語「抗原と特異的に結合する抗体」と本明細書で交換可能に用いられる。
【００４１】
本明細書で用いられる場合、用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、単一の分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。
【００４２】
本明細書で用いられる場合、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によって与えられる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４などのＩｇＧ）を指す。
【００４３】
本明細書で用いられる場合、「抗原と特異的に結合する」、例えば、「ＴｆＲと特異的に結合する」抗体またはタンパク質は、前記抗原（例えば、配列番号１６のヒトＴｆＲ）と、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、または１ｎＭ以下のＫＤで結合する抗体またはタンパク質を指すことを意図される。
【００４４】
本明細書で用いられる場合、用語「ＫＤ」は、Ｋａに対するＫｄの比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される、解離定数を指すことを意図される。抗体のＫＤ値は、当技術分野において十分確立された方法を用いて決定することができる。抗体のＫＤを決定するための方法は、表面プラズモン共鳴を用いること、またはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを用いることによる。
【００４５】
本明細書で用いられる場合、用語「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」は、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指すことを意図され、一方、本明細書で用いられる場合、用語「Ｋｄｉｓ」または「Ｋｄ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指すことを意図される。
【００４６】
本明細書で用いられる場合、用語「親和性」は、抗体と抗原の間の単一抗原部位における相互作用の強度を指す。各抗原部位内において、抗体「アーム」の可変領域が、多数の部位において、抗原と弱い非共有結合性力を通して相互作用する；相互作用が大きければ大きいほど、親和性は強い。
【００４７】
本明細書で用いられる場合、用語「ＨＬ−６０細胞株」は、Ｃｏｌｌｉｎｓら（ＰＮＡＳ  １９７８、７５：２４５８〜１４６２）により導き出された前骨髄球細胞株であり、Ｇａｌｌａｇｈｅｒら（Ｂｌｏｏｄ、１９７９、５４：７１３〜７３３）にも記載され、例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）コレクションのカタログ番号ＣＣＬ−２４０（商標）において入手できる。
【００４８】
本明細書で用いられる場合、用語「宿主細胞」は、原核細胞または真核細胞を指す。真核細胞、例えば、哺乳類、酵母、または糸状菌の宿主細胞が好ましく、特に哺乳類細胞が好ましく、それらが、正しく折り畳まれ、免疫学的活性のある抗体を構築および分泌する可能性が、原核細胞より高いからである。
【００４９】
本明細書で用いられる場合、抗体「Ａ２４」は、ＷＯ２００５／１１１０８２に開示されているような抗体を指す。
本明細書で用いられる場合、用語「ＡＤＣＣ」または「抗体依存性細胞毒性」活性は、細胞枯渇活性を指す。ＡＤＣＣ活性は、市販されているＡＤＣＣアッセイ、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａの参照番号Ｇ７０１５により商品化されているようなＡＤＣＣ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｂｉｏａｓｓａｙにより測定することができる。
【００５０】
本明細書で用いられる場合、用語「アポトーシス」は、プログラム細胞死を指す。アポトーシスについての詳細な情報は、「Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ」、Ｓｕｓａｎ  Ｅｌｍｏｒｅ、Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ．２００７；３５（４）：４９５〜５１６に見出すことができる。
【００５１】
本明細書で用いられる場合、用語「ＥＣ５０」は、ベースラインと特定の曝露時間後の最大値との中間の応答を誘導するための抗体の濃度を指す。例えば、そのような濃度は、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアにより決定することができる。
【００５２】
本明細書で用いられる場合、用語「対象」は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。用語「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳類および非哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。用語「対象」はまた、用語「患者」も包含する。
【００５３】
本明細書で用いられる場合、用語「薬物」はまた、「ペイロード」、すなわち、抗体（または断片）にコンジュゲートされる部分を指す。Ｄは、古典的な化学療法剤に限定されると解釈されるべきではない。例えば、Ｄは、所望の生物活性を有するタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを包含し得る。好ましくは、それは、細胞毒などの治療用部分を指す。「細胞毒」または「細胞毒性剤」は、細胞にとって有害である（例えば、細胞を殺す）任意の作用物質を含む。
【００５４】
本明細書で用いられる場合、用語「リンカー分子」は、式（ＩＩ）または（ＩＶ）の化合物を指す。そのようなリンカー分子は、抗体などのチオール部分を含む化合物と連結されるのに適している。
【００５５】
本明細書で用いられる場合、用語「バリン−シトルリンのジペプチド」（以下、「ジペプチドＶＣ」と呼ばれる）は、２個のアミノ酸、バリンとシトルリンからなるリンカーを表す。このジペプチドは、とりわけ、式（ＶＩ）：
【００５６】
【化５】
2021521181.tif 000006
【００５７】
である。
本明細書で用いられる場合、用語「アミノベンジルエステル自壊性基」は、自壊性基として機能するアミノベンジルエステル基を指す。そのような基は、式（ＩＩＩ）の化合物により表される。「自壊性基」は、（ｉ）少なくとも２つの他の化学的部分を安定な分子へと一緒に共有結合性に連結する能力があり、（ｉｉ）酵素切断を用いて、その分子由来の、間隔を空けて配置された化学的部分の１つから放出され得、および（ｉｉｉ）酵素切断後、その分子の残りから自発的に切断して、間隔を空けて配置された化学的部分の他方を放出することができる、二官能性化学的部分として定義され得る。
【００５８】
本明細書で用いられる場合、用語「アルキル」は、（直鎖または分岐鎖を有する）一価飽和炭化水素鎖を指す。例えば、アルキルは、Ｃ１〜Ｃ２０アルキルを指す。好ましくは、アルキルは、「低級アルキル」、すなわち、１個、２個、３個、４個、５個、または６個の炭素を有するアルキル基（直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキル基）である。例えば、これには、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルなどが挙げられる。
【００５９】
本明細書で用いられる場合、用語「ハロアルキル」は、１個または複数の水素原子が１個または複数のハロゲン原子によって置き換えられているアルキルを指す。好ましくは、ハロアルキルは、「低級ハロアルキル」、すなわち、１個、２個、３個、４個、５個、または６個の炭素を有するハロアルキル基（直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル基）である。例えば、これには、ＣＦ３、ＣＦ２Ｂｒ、ＣＨ２Ｆ、ＣＨＦＣＨ３、ＣＦ３ＣＨ２、ＣＦ３ＣＦ２、ＣＨＦ２ＣＦ２、ＣＨ２Ｃｌ、またはＣＨ２ＣＨ２Ｃｌが挙げられる。
【００６０】
本明細書で用いられる場合、用語「結合した」は、連結を指す。この連結はまた、式（Ｉ）において、ダッシュ記号「−」により表される。連結は、共有結合、または静電力によるなどの非共有結合性相互作用であり得る。好ましくは、結合は共有結合である。本明細書で用いられる場合、式における「波線」は、本開示のＡＤＣの各パート（Ａｂ、Ｌ、Ｚ、Ｘ、およびＤ）間の付着部位を表す。
【００６１】
本明細書で用いられる場合、「治療的に許容される量」は、所望の結果（例えば、腫瘍サイズの低下、腫瘍成長の阻害、転移の防止、アポトーシスの誘導など）をもたらすのに十分な量を指す。
【００６２】
組換え抗体
本開示の抗体は、抗ＴｆＲ抗体である。好ましくは、そのような抗体には、単離され、下記の表１に記載されているように可変重鎖および軽鎖アミノ酸配列ならびにヒト定常アイソタイプによって構造的に特徴づけられた、ヒト化組換え抗体ｍＡｂ１〜ｍＡｂ１６が挙げられる。
【００６３】
【表１】
2021521181.tif 000007
【００６４】
ｍＡｂ１〜ｍＡｂ１６を作製するために用いられるＩｇＧ４、ＩｇＧ１、ならびにそれらの変異バージョンＩｇＧ１  ＡＡおよびＩｇＧ１  Ｎ２９７Ａの定常アイソタイプ領域の対応するアミノ酸配列およびヌクレオチドコード配列は、当技術分野においてよく知られている。ｍＡｂ１の完全長軽鎖および重鎖ならびに対応するコード配列は、下記の表２に示されている。
【００６５】
【表２】
2021521181.tif 000008
【００６６】
本開示によるいくつかの抗体のＶＨ  ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１とも呼ばれる）、ＶＨ  ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２とも呼ばれる）、ＶＨ  ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ１とも呼ばれる）、ＶＬ  ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１とも呼ばれる）、ＶＬ  ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２とも呼ばれる）、ＶＬ  ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３とも呼ばれる）のアミノ酸配列の例が表３に示されている。
【００６７】
表３において、本開示のいくつかの抗体のＣＤＲ領域は、Ｃｈｏｔｈｉａシステム（Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ、Ｌｅｓｋ  ＡＭ．１９８７、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６、９０１〜９１７）を用いて描写されている。読みやすさのために、ＣＤＲ領域は、以下、それぞれ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３と呼ばれる。
【００６８】
【表３】
2021521181.tif 000009
【００６９】
表４、５、および６は、ＡＤＣの抗体に関連して有用なアミノ酸およびヌクレオチド配列を記載する。
【００７０】
【表４】
2021521181.tif 000010
【００７１】
【表５−１】
2021521181.tif 000011
【００７２】
【表５−２】
2021521181.tif 000012
【００７３】
【表５−３】
2021521181.tif 000013
【００７４】
【表６】
2021521181.tif 000014
【００７５】
一実施形態において、単離された組換え抗体は、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５または８のＬＣＤＲ２、および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を有し、前記抗体が配列番号１６のトランスフェリン受容体と特異的に結合する。
【００７６】
特定の実施形態において、本開示による単離された組換え抗体は以下：
（ａ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、配列番号３のＨＣＤＲ３を含む可変重鎖ポリペプチド、ならびに配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２、および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｂ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、配列番号３のＨＣＤＲ３を含む可変重鎖ポリペプチド、ならびに配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号８のＬＣＤＲ２、および配列番号６のＬＣＤＲ３を含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１１のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチドおよび配列番号１３のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｄ）配列番号１１のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチドおよび配列番号１４のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｅ）配列番号１１のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチドおよび配列番号１５のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｆ）配列番号１２のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチドおよび配列番号１３のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｇ）配列番号１２のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチドおよび配列番号１４のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド；
（ｈ）配列番号１２のＶＨを含む可変重鎖ポリペプチドおよび配列番号１５のＶＬを含む可変軽鎖ポリペプチド
のいずれかを含む。
【００７７】
特定の実施形態において、上記で定義されているような前記組換え抗ＴｆＲ抗体は、以下の性質の１つまたは複数を有する：
（ｉ）それは、ＳＰＲによって測定される場合、１０ｎＭ以下のＫＤ、好ましくは１ｎＭ以下のＫＤでトランスフェリン受容体と結合する；
（ｉｉ）それは、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定される場合、０．１μｇ／ｍｌ以下、好ましくは０．０５μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０でトランスフェリン受容体と結合する（詳細な情報についてＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０６７４６５参照）；
（ｉｉｉ）それは、例えば、ＨＬ−６０アポトーシス誘導アッセイを用いて測定される場合、配列番号９のＶＨおよび配列番号１０のＶＬを有する親のマウス可変領域を有する対応参照キメラ抗体に関して測定された誘導レベルと同等またはそれより優れたレベルで、ＨＬ−６０細胞株のアポトーシスを誘導する。典型的には、本開示の組換え抗体の１０μｇ／ｍｌの量が、ＨＬ−６０細胞株のアポトーシスの誘導について、配列番号９のＶＨおよび配列番号１０のＶＬを含むＡ２４の親マウス可変領域を有する参照キメラ抗体の同量と比較して、アッセイされ得る。試験された抗体のＨＬ−６０アポトーシス誘導アッセイにおけるアポトーシスの誘導は、その試験された抗体に関して測定された場合の陽性細胞のパーセンテージが、参照抗体に関して測定された場合の陽性細胞のパーセンテージより有意に低いわけではないならば、参照抗体と同等である。
【００７８】
本明細書で用いられる場合、「対応」参照キメラ抗体は、特定の性質、例えば、アポトーシスの誘導について試験されるべき抗体のアイソタイプ定常領域と１００％同一のアイソタイプ定常領域を有する参照抗体を指す。
【００７９】
前の実施形態と組み合わせられ得る、ある特定の実施形態において、本明細書に提供された抗体は、上記で定義された抗体の抗体断片である。抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＵｎｉＢｏｄｙ、およびｓｃＦｖ断片、ダイアボディ、単一ドメインまたはナノボディ、ならびに他の断片が挙げられるが、それらに限定されない。用語「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片であって、その断片が、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）に含む、抗体断片を指す。同じ鎖上の２つのドメインの間でのペア形成を可能にするには短過ぎるリンカーを用いることにより、それらのドメインは、別の鎖の相補性ドメインとペア形成せざるを得ず、２つの抗原結合部位を生じる。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部分、または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部分を含む抗体断片である。ある特定の実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号参照）。抗体断片は様々な技術により作製することができ、その技術には、無傷抗体のタンパク質消化、および本明細書に記載されているような組換え宿主細胞による産生が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８０】
ある特定の実施形態において、本開示の抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親の非ヒト抗体の少なくとも同じ親和性（または優れた親和性）を有すると同時に、ヒトに対する免疫原性を低下させるためにヒト化される。好ましい実施形態において、本開示の抗体は、親抗体Ａ２４のヒト化抗体である。一般的に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ（またはその部分）が非ヒト抗体、例えば、マウスＡ２４抗体に由来し、ＦＲ（またはその部分）がヒト抗体配列に由来する、１つまたは複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部分を含む。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体におけるいくつかのＦＲ残基は、例えば抗体特異性または親和性を回復または向上させるために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来しているＡ２４抗体）由来の対応する残基で置換される。いくつかの特定の実施形態において、ヒト化抗体におけるいくつかのＣＤＲ残基もまた、例えば抗体特異性または親和性を回復または向上させるために、置換される。ヒト化抗体およびそれらを作製する方法は、例えば、ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９〜１６３３（２００８）に概説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９〜１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、第７，５２７，７９１号、第６，９８２，３２１号、および第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２５〜３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフティングを記載する）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２８：４８９〜４９８（１９９１）（「表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」を記載する）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：４３〜６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載する）；ならびにＯｓｂｏｕｒｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：６１〜６８（２００５）およびＫｌｉｍｋａら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、８３：２５２〜２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングへの「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」アプローチを記載する）にさらに記載されている。好ましくは、本開示による組換え抗体は、ヒト化サイレント抗体、好ましくは、ヒト化サイレントＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体である。
【００８１】
本明細書で用いられる場合、用語「サイレント」抗体は、ＡＤＣＣ活性アッセイにおいて測定された場合、ＡＤＣＣ活性なしまたは低いＡＤＣＣ活性を示す抗体を指す。
一実施形態において、用語「ＡＤＣＣ活性なしまたは低いＡＤＣＣ活性」は、サイレント抗体が、野生型ヒトＩｇＧ１アイソタイプを有する対応抗体に関して観察されるＡＤＣＣ活性の少なくとも１０％未満、例えば、５０％未満であるＡＤＣＣ活性を示すことを意味する。
【００８２】
エフェクター機能のサイレンシングは、抗体のＦｃ定常パートにおける変異によって得ることができ、Ａｒｔ：Ｓｔｒｏｈｌ  ２００９（ＡＡ＆Ｎ２９７Ａ）；Ｂａｕｄｉｎｏ  ２００８、Ｄ２６５Ａ（Ｂａｕｄｉｎｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８１（２００８）：６６６４〜６９、Ｓｔｒｏｈｌ、ＣＯ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０（２００９）：６８５〜９１）に記載されている。サイレントＩｇＧ１抗体の例は、ＩｇＧ１  Ｆｃアミノ酸配列におけるＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ変異を含むいわゆるＡＡ変異体を含む。別のサイレントＩｇＧ１抗体は、Ｎ２９７Ａ変異を含み、それは、結果として、アグリコシル化または非グリコシル化抗体を生じる。
【００８３】
変異アミノ酸配列を有する抗体は、コード核酸分子の変異誘発（例えば、部位特異的またはＰＣＲ媒介性変異誘発）、その後、本明細書に記載された機能アッセイを用いて、そのコード化改変抗体の保持された機能（すなわち、上記で示された機能）について試験することにより得ることができる。
【００８４】
保存的改変を有する抗体
ある特定の実施形態において、本開示の抗体（またはその抗原結合部分を含む結合タンパク質）は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を有し、これらのＣＤＲ配列の１つまたは複数が、本明細書に記載されたｍＡｂ１〜ｍＡｂ１６抗体またはそれらの保存的改変に基づいた特定のアミノ酸配列を有し、抗体またはタンパク質が、本開示の抗ＴｆＲ抗体の所望の機能的性質を保持する。
【００８５】
抗ＴｆＲ抗体の所望の機能的性質には、非限定的に、以下が挙げられる：
（ｉ）それは、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）を用いる、ＳＰＲアッセイによって測定される場合、１０ｎＭ以下のＫＤ、好ましくは１ｎＭ以下のＫＤでトランスフェリン受容体と結合する；
（ｉｉ）それは、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定される場合、０．１μｇ／ｍｌ以下、好ましくは０．０５μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０でトランスフェリン受容体と結合する（詳細な情報についてＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０６７４６５参照）；
（ｉｉｉ）それは、例えば、ＨＬ−６０アポトーシス誘導アッセイを用いて測定される場合、配列番号９のＶＨおよび配列番号１０のＶＬを有する親のマウス可変領域を有する対応参照キメラ抗体に関して測定された誘導レベルと同等またはそれより優れたレベルで、ＨＬ−６０細胞株のアポトーシスを誘導する。典型的には、本開示の組換え抗体の１０μｇ／ｍｌの量が、ＨＬ−６０細胞株のアポトーシスの誘導について、配列番号９のＶＨおよび配列番号１０のＶＬを含むＡ２４の親マウス可変領域を有する参照キメラ抗体の同量と比較して、アッセイされ得る。試験された抗体のＨＬ−６０アポトーシス誘導アッセイにおけるアポトーシスの誘導は、その試験された抗体に関して測定された場合の陽性細胞のパーセンテージが、参照抗体に関して測定された場合の陽性細胞のパーセンテージより有意に低いわけではないならば、参照抗体と同等である。
【００８６】
本明細書で用いられる場合、用語「保存的配列改変」は、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる、アミノ酸置換を指すことを意図される。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、無極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐型側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。したがって、本開示の抗体のＣＤＲ領域内の１個または複数のアミノ酸残基が、同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基で置き換えられ得、その変化した抗体は、本明細書に記載された機能アッセイを用いて、保持された機能について試験され得る。
【００８７】
改変は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介性変異誘発などの当技術分野において知られた標準技術により、本開示の抗体へ改変が導入され得る。
フレームワークまたはＦｃ操作
本開示の操作化抗体には、例えば抗体の性質を向上させるために、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に改変が施されている抗体が挙げられる。典型的には、そのようなフレームワーク改変は、抗体の免疫原性を減少させるために施される。例えば、１つのアプローチは、１つまたは複数のフレームワーク残基を対応生殖系配列へ「復帰変異させる」ことである。より具体的には、体細胞変異を起こしている抗体は、その抗体が由来する生殖系配列とは異なるフレームワーク残基を含有し得る。そのような残基は、その抗体が由来する生殖系配列とその抗体フレームワーク配列を比較することにより同定することができる。フレームワーク領域配列をそれらの生殖系構成へ戻すために、体細胞変異は、例えば、部位特異的変異誘発またはＰＣＲ媒介性変異誘発により、生殖系配列へ「復帰変異し」得る。そのような「復帰変異した」抗体もまた、本発明により包含されることを意図される。
【００８８】
別の型のフレームワーク改変は、Ｔ細胞エピトープを除去して、それにより抗体の潜在的免疫原性を低下させるように、フレームワーク領域内またはさらに１つもしくは複数のＣＤＲ領域内の１個または複数の残基を変異させることを含む。
【００８９】
特に、Ａｎｔｉｔｏｐｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＵＫ）という会社は、免疫原性を評価および除去するための様々な専有技術を開発しており、それらは、治療用抗体およびタンパク質においてＴ細胞エピトープの位置を同定することに基づいている。これらのテクノロジーは下記に要約される：
−  ｉＴｏｐｅ（商標）  −  ヒトＭＨＣクラスＩＩアレルと結合するペプチドの予測のためのインシリコテクノロジー（Ｐｅｒｒｙら  ２００８  Ｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｒ＆Ｄ、９（６）：３８５〜３９６）
−  ＴＣＥＤ（商標）  −  特に抗体Ｖ領域の、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔ細胞エピトープマッピングアッセイを用いた研究において同定された既知のＴ細胞エピトープのデータベース（Ｂｒｙｓｏｎら  ２０１０  Ｂｉｏｄｒｕｇｓ  ２４（１）：１〜８）。データベースは、ＢＬＡＳＴ検索により問い合わせて、共通のモチーフを同定することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら  １９９７  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９７）２５：３３８９〜３４０２）。
【００９０】
フレームワークまたはＣＤＲ領域内に施された改変に加えて、またはそれの代わりに、本開示の抗体は、典型的には抗体の１つまたは複数の機能的性質、例えば、血清中半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、および／または抗原依存性細胞毒性を変化させるために、Ｆｃ領域内に改変を含むように操作され得る。
【００９１】
さらに、本開示の抗体は、この場合もやはり、抗体の１つまたは複数の機能的性質を変化させるために、化学修飾され（例えば、１つまたは複数の化学的部分が抗体に付着させられ得る）、またはそれのグリコシル化を変化させるように改変され得る。これらの実施形態のそれぞれは、下でさらに詳細に記載される。
【００９２】
本明細書で用いられる場合、用語「アイソタイプ定常領域」または「Ｆｃ領域」は、交換可能に用いられて、天然配列Ｆｃ領域およびバリアントＦｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義する。ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、一般的に、ＩｇＧ抗体の、位置Ｃ２２６またはＰ２３０からカルボキシル末端までのアミノ酸残基を含むと定義される。Ｆｃ領域における残基のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスのナンバリングである。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（残基Ｋ４４７）は、例えば、抗体の産生または精製中に、除去され得る。したがって、本開示の抗体の組成物は、全てのＫ４４７残基が除去されている抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、およびＫ４４７残基を含む抗体と含まない抗体の混合物を有する抗体集団を含み得る。
【００９３】
一つの特定の実施形態において、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数が変化する、例えば、増加または減少するように改変される。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒらによる米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、例えば、軽鎖と重鎖の構築を促進するために、または抗体の安定性を増加もしくは減少させるために変更される。
【００９４】
別の実施形態において、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を減少させるように変異される。より具体的には、抗体が天然のＦｃヒンジドメインブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）結合と比べて損なわれたＳｐＡ結合を有するように、Ｆｃヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域へ１つまたは複数のアミノ酸変異が導入される。このアプローチは、Ｗａｒｄらによる米国特許第６，１６５，７４５号にさらに詳細に記載されている。
【００９５】
別の実施形態において、抗体は、それの生物学的半減期を増加させるように改変される。様々なアプローチが可能である。例えば、Ｗａｒｄの米国特許第６，２７７，３７５号に記載されているように、以下の変異の１つまたは複数が導入され得る：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。あるいは、生物学的半減期を増加させるために、抗体は、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５，８６９，０４６号および第６，１２１，０２２号に記載されているように、ＣＨ１またはＣＬ領域内で、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取り出されたサルベージ受容体結合エピトープを含有するように変化させられ得る。
【００９６】
さらに他の実施形態において、抗体のエフェクター機能を変化させるために、Ｆｃ領域は、少なくとも１個のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と置き換えることにより変更される。例えば、抗体が、エフェクターリガンドに対する親和性が変化しているが、親抗体の抗原結合能力を保持するように、１個または複数のアミノ酸が、異なるアミノ酸残基と置き換えられ得る。親和性が変化するエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であり得る。このアプローチは、Ｗｉｎｔｅｒらによる米国特許第５，６２４，８２１号と第５，６４８，２６０号の両方にさらに詳細に記載されている。
【００９７】
別の実施形態において、抗体が、Ｃ１ｑ結合の変化および／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）の低下もしくは消失を有するように、アミノ酸残基から選択された１個または複数のアミノ酸が、異なるアミノ酸残基と置き換えられ得る。このアプローチは、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらによる米国特許第６，１９４，５５１号にさらに詳細に記載されている。
【００９８】
別の実施形態において、１個または複数のアミノ酸残基が変化して、それにより、抗体の補体を結合する能力を変化させる。このアプローチは、ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴ公報第ＷＯ９４／２９３５１号にさらに記載されている。
【００９９】
さらに別の実施形態において、Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増加させるように、および／またはＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増加させるように、１個または複数のアミノ酸を改変することにより改変される。このアプローチは、ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公報第ＷＯ００／４２０７２号にさらに記載されている。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位がマッピングされており、結合が向上しているバリアントが記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら、２００１  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７６：６５９１〜６６０４参照）。
【０１００】
他の実施形態において、Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を減少させるように、および／またはＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を減少させるように、１個または複数のアミノ酸を改変することにより改変される。エフェクター機能が減少した、特にＡＤＣＣが減少した、そのような抗体には、サイレント抗体が挙げられる。
【０１０１】
ある特定の実施形態において、ＩｇＧ１アイソタイプのＦｃドメインが用いられる。いくつかの特定の実施形態において、ＩｇＧ１  Ｆｃ断片の変異バリアント、例えば、その融合ポリペプチドの、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介し、および／またはＦｃγ受容体と結合する能力を低下させ、または排除するサイレントＩｇＧ１  Ｆｃが用いられる。ＩｇＧ１アイソタイプサイレント変異体の例は、ＨｅｚａｒｅｈらによるＪ．Ｖｉｒｏｌ  ２００１年１２月；７５（２４）：１２１６１〜８に記載されているように、アミノ酸位置２３４および２３５において、ロイシンがアラニンによって置き換えられている、ＩｇＧ１である。
【０１０２】
ある特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの位置２９７におけるグリコシル化を阻止するサイレントＦｃ変異体である。例えば、Ｆｃドメインは、位置２９７におけるアスパラギンのアミノ酸置換を含有する。そのようなアミノ酸置換の例は、Ｎ２９７のグリシンまたはアラニンによる置き換えである。
【０１０３】
さらに別の実施形態において、抗体のグリコシル化が改変される。例えば、アグリコシル化抗体が作製され得る（すなわち、その抗体はグリコシル化を欠く）。グリコシル化は、例えば、抗体の抗原に対する親和性を増加させるために変化させることができる。そのような糖鎖改変は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１つまたは複数の部位を変化させることにより、達成することができる。例えば、１つまたは複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位の排除を生じて、それにより、その部位におけるグリコシル化を排除する、１つまたは複数のアミノ酸置換が行われ得る。そのようなアグリコシル化は、抗体の抗原に対する親和性を増加させ得る。そのようなアプローチは、Ｃｏらによる米国特許第５，７１４，３５０号および第６，３５０，８６１号にさらに詳細に記載されている。
【０１０４】
追加としてまたは代替として、フコシル残基の量が低下している低フコシル化抗体、またはバイセクトＧｌｃＮａｃ構造が増加している抗体などの、グリコシル化の型の変化を有する抗体が作製され得る。そのようなグリコシル化パターンの変化は、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが実証されている。そのような糖鎖改変は、例えば、グリコシル化機構が変化した宿主細胞において抗体を発現することにより、達成することができる。グリコシル化機構が変化した細胞は、当技術分野において記載されており、本開示の組換え抗体を発現して、それにより、グリコシル化が変化した抗体を産生するための宿主細胞として用いることができる。例えば、ＨａｎｇらによるＥＰ１１７６１９５は、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子（フコシルトランスフェラーゼをコードする）を有する細胞株であって、その結果として、そのような細胞株において発現した抗体が低フコシル化を示す、細胞株を記載する。したがって、一実施形態において、本開示の抗体は、低フコシル化パターンを示す細胞株、例えば、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子の発現欠損を有する哺乳類細胞株における組換え発現により産生される。ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公報第ＷＯ０３／０３５８３５号は、Ａｓｎ（２９７）連結糖鎖へフコースを付着させる能力が低下し、同様にその結果として、その宿主細胞において発現した抗体の低フコシル化を生じる、バリアントＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃｌ３細胞を記載する（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら、２００２  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７７：２６７３３〜２６７４０も参照）。ＵｍａｎａらによるＰＣＴ公報第ＷＯ９９／５４３４２号は、糖タンパク質を改変するグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞株であって、その結果、その操作された細胞株において発現した抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増加を生じるバイセクトＧｌｃＮａｃ構造の増加を示す、細胞株を記載する（Ｕｍａｎａら、１９９９  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １７：１７６〜１８０も参照）。
【０１０５】
本開示によって企図される本明細書における抗体の別の改変は、ＰＥＧ化もしくはＨＥＳ化（ｈｅｓｙｌａｔｉｏｎ）または関連テクノロジーである。抗体は、例えば、抗体の生物学的（例えば、血清中）半減期を増加させるためにＰＥＧ化することができる。抗体をＰＥＧ化するために、抗体またはその断片を、典型的には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と、１つまたは複数のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に付着する条件下で、反応させる。ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）でのアシル化反応またはアルキル化反応によって行うことができる。本明細書で用いられる場合、用語「ポリエチレングリコール」は、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−もしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなどの、他のタンパク質を誘導体化するために用いられているＰＥＧの形のいずれも包含することを意図される。ある特定の実施形態において、ＰＥＧ化され得る抗体は、アグリコシル化抗体である。タンパク質をＰＥＧ化するための方法は当技術分野において知られており、本開示の抗体に適用することができる。例えば、ＮｉｓｈｉｍｕｒａらによるＥＰ０１５４３１６およびＩｓｈｉｋａｗａらによるＥＰ０４０１３８４を参照されたい。
【０１０６】
本開示により企図される抗体の別の改変は、生じた分子の半減期を増加させるための、本開示の抗体の少なくとも抗原結合領域の、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンまたはその断片へのコンジュゲートまたはタンパク質融合である。そのようなアプローチは、例えば、Ｂａｌｌａｎｃｅら、ＥＰ０３２２０９４に記載されている。
【０１０７】
別の可能性は、生じた分子の半減期を増加させるための、本開示の抗体の少なくとも抗原結合領域の、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質と結合する能力があるタンパク質との融合である。そのようなアプローチは、例えば、Ｎｙｇｒｅｎら、ＥＰ０４８６５２５に記載されている。
【０１０８】
一つの特定の実施形態において、本開示による抗体のエフェクター機能または補体活性化機能は、同じアイソタイプの野生型抗体に対して低下しまたは排除されている。一態様において、エフェクター機能は、抗体のグリコシル化の低下、抗体アイソタイプの、天然でエフェクター機能が低下しまたは排除されているアイソタイプへの改変、およびＦｃ領域の改変から選択される方法により、低下しまたは排除される。特定の関連実施形態において、エフェクター機能が低下しまたは排除されている前記アイソタイプは、ＩｇＧ４アイソタイプである。
【０１０９】
本開示の抗体の産生
本開示の抗体は、当業者に知られた通常の技術を用いて得ることができる。本開示の抗体をコードする核酸、およびこれらの抗体を産生するトランスフェクトーマの作製についての詳細な情報について、当業者はまた、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０６７４６５号を参照することができる。
【０１１０】
リンカー
本開示のＡＤＣは、３つの異なるリンカー：Ｌ、Ｚ、およびＸを含有する。一緒に連結されるこれらの３つのリンカーの一般式は式（Ｖ）により表される。リンカーは、抗体と薬物の間の連結を可能にする。好ましくは、連結は共有結合性である。したがって、本発明のある実施形態において、ＤがＸと共有結合し、および／またはＸがＺと共有結合し、および／またはＺがＬと共有結合し、および／またはＬがＡｂと共有結合する。より好ましくは、ＤがＸと共有結合し、およびＸがＺと共有結合し、およびＺがＬと共有結合し、およびＬがＡｂと共有結合する。
【０１１１】
Ｌは式（ＩＩ）または（ＩＶ）のリンカー分子であり、式中、ｎが２から２０の間に含まれる整数である。Ｌは、「ＡＰＮ」とも呼ばれる、ＰＥＧ−アリールプロピオロニトリルである。本明細書に開示されているように、その時、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０を包含する。Ｌは、幅広い条件においてＡＤＣの安定性を与える。Ｌについての詳細な情報は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０６４３８７に開示されている。
【０１１２】
他の実施形態と組み合わせることができる、ある実施形態において、Ｌは、抗体と、少なくとも１つのチオール部分（抗体のシステイン由来）を介して連結される。ある実施形態において、Ｌと抗体の間の連結は、式（ＩＩ）または（ＩＶ）における二重結合Ｃ＝Ｃ側である。
【０１１３】
Ｚは、Ｌと結合したバリン−シトルリンのジペプチドである。Ｚは、Ｌにおけるカルボニル基（すなわち、カルボニル官能基）側でＬと連結する。ある実施形態において、ＬとＺの間の連結は、Ｌのカルボニル基とＺのアミノ官能基（例えば、バリンのアミノ官能基）の間で起こる。ジペプチドＶＣは切断可能リンカーである。切断可能リンカーは、血流における条件と標的細胞（とりわけ、がん細胞）内の細胞質内条件の間の違いを利用する。ジペプチドＶＣは、リソソーム内の酸性環境において、カテプシンＢなどのリソソームプロテアーゼにより切断される。標的細胞におけるＡＤＣの内部移行後、ＺとＸの間のカテプシンＢによる細胞内切断機構がある（例えば、シトルリンとアミノベンジルエステル自壊性基の間のアミン官能基側での切断）。式（ＶＩＩ）：
【０１１４】
【化７】
2021521181.tif 000015
【０１１５】
における
【０１１６】
【化６】
2021521181.tif 000016
【０１１７】
を参照。
結果として生じたＸ−薬物は、安定な中間体ではなく、自発的に排除を起こし、生成物として薬物を残す（すなわち、１，６−排除（自壊））。カテプシンＢによる細胞内切断機構としてのバリン−シトルリンのジペプチドについての詳細な情報について、例えば、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ＧＭ、Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅ  ＲＡ、Ｐａｄｉｌｌａ  Ｌ、Ｗｉｌｌｎｅｒ  Ｄ、Ｈｏｆｓｔｅａｄ  ＳＪ、Ｍｏｓｕｒｅ  Ｋら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．  ２００２；１３：８５５〜６９を参照。
【０１１８】
Ｘは、式（ＩＩＩ）のＺと結合したアミノベンジルエステル自壊性基である。Ｘは、Ｚのカルボキシル基（すなわち、カルボニル官能基）側でＺと連結される。ある実施形態において、ＺとＸの間の連結は、Ｚのカルボニル基とＸのアミノ官能基の間で起こる。アミノベンジルエステル自壊性基についての詳細な情報について、ＷＯ０３／０２６５７７またはＷＯ２００４／０１０９５７を参照されたい。したがって、本明細書で開示されているように、Ｘは、二官能性化学的部分のスペーサーであり、それは、（ｉ）少なくとも２つの他の化学的部分（特に、ＤおよびＺ）を一緒に安定な分子へと共有結合性に連結する能力があり、（ｉｉ）酵素切断によって、その分子由来の間隔を空けた化学的部分の１つから放出され得（カテプシンＢによる切断後、Ｘ−Ｄが放出される）、および（ｉｉｉ）酵素切断後、その分子の残りから自発的に切断して、間隔を空けた化学的部分の他方を放出することができる（最終的に、Ｄが放出される）。
【０１１９】
ペイロード
一実施形態において、本開示のＤは、Ｘのカルボニル官能基側でＸと連結されるペイロードである。ある実施形態において、ＸとＤの間の連結は、Ｘのカルボニル官能基とＤのアミノ基の間で起こる。
【０１２０】
特定の実施形態において、本開示のＡＤＣにおいて、Ｄは細胞毒性薬である。
ある実施形態において、細胞毒性薬は、タキサン（ｔａｘｏｎ）、サイトカラシンＢ、オーリスタチン、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそれらの類似体または相同体からなる群から選択される。これにはまた、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、ダカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、削摩剤（ａｂｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）（例えば、メクロレタミン、チオテパ（ｔｈｉｏｅｐａ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｘｎｂｕｃｉｌ）、メルファラン（ｍｅｉｐｈａｌａｎ）、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前は、ダウノマイシン）、およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前は、アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）も挙げられる。好ましくは、薬物は、モノメチルオーリスタチンＥである。
【０１２１】
本開示のＡＤＣ
ある実施形態において、本開示は、抗ＴｆＲ抗体が薬物（特にＭＭＡＥ）と連結されているＡＤＣを提供する。リンカーは、上記で定義されているような分子Ｌ、Ｚ、およびＸである。好ましくは、そのようなＡＤＣは、有効用量のＭＭＡＥを、ＴｆＲを発現する腫瘍組織へ選択的に送達することができる。
【０１２２】
ある実施形態において、本開示は、上記で定義されているような式（Ｉ）のＡＤＣを提供する。
より好ましい実施形態において、本開示のＡＤＣは以下の通りである：
−  Ａｂは、抗ＴｆＲ抗体、特に、上記で定義されているようなｍＡｂ１である、
−  Ｌは、前記抗体と結合したリンカー分子であり、前記リンカー分子が式（ＩＶ）である、
−  Ｚは、Ｌと結合したバリン−シトルリンのジペプチドである、
−  Ｘは、Ｚと結合しており、ｍが０である式（ＩＩＩ）のパラアミノベンジルエステル自壊性基である、
−  Ｄは、Ｘと結合した薬物、特に、ＭＭＡＥである。
【０１２３】
別のより好ましい実施形態において、「ＩＮＡ０１−ＳＤＶ１」と呼ばれる本開示のＡＤＣは以下の通りである：
−  Ａｂは、配列番号１８により表された重鎖および配列番号１７により表された軽鎖によって特徴づけられる抗ＴｆＲ抗体ｍＡｂ１である、
−  Ｌは、前記抗体と結合したリンカー分子であり、前記リンカー分子が式（ＩＶ）である、
−  Ｚは、Ｌと結合したバリン−シトルリンのジペプチドである、
−  Ｘは、Ｚと結合しており、ｍが０である式（ＩＩＩ）のパラアミノベンジルエステル自壊性基である、
−  Ｄは、ＭＭＡＥである。
【０１２４】
図１は、「ＩＮＡ０１−ＳＤＶ１」または「ＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１」と名づけられた、本開示の好ましいＡＤＣの１つの概略図を表す。ヒト化抗体ＩＮＡ０１（Ａｂ）へ、そのシステイン残基を通して、リンカーＡＰＮ（Ｌ）、酵素カテプシンＢにより切断可能なジペプチド配列バリン−シトルリン（Ｚ）、ｍが０である式（ＩＩＩ）のパラアミノベンジルエステル（Ｘ）、および細胞毒性モノメチルオーリスタチンＥ「ＭＭＡＥ」（Ｄ）が付着している。
【０１２５】
薬物対抗体比は、特定のＡＤＣについて正確な値を有するが、その値が、多くのＡＤＣを含有する試料を記載するために用いられる場合、典型的にはコンジュゲーションステップに関連したある程度の不均質性によって、平均値である場合が多いことは理解されている。ＡＤＣの試料についての平均負荷は、薬物対抗体比または「ＤＡＲ」と本明細書で呼ばれる。いくつかの実施形態において、ＤＡＲは、約１から約８の間（すなわち、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、および８）、好ましくは、平均で４前後である。
【０１２６】
薬学的組成物  −  製剤
別の態様において、本開示は、薬学的に許容される担体と共に一緒に製剤化される、本明細書に開示されたＡＤＣ（例えば、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ１６、特にｍＡｂ１であって、それが式（ＩＶ）のリンカー分子と結合し、そのリンカー分子自体がＺと結合し、そのＺ自体が、ｍが０である式（ＩＩＩ）のパラアミノベンジルエステル自壊性基であるＸと結合し、そのＸ自体がＭＭＡＥなどの薬物と結合している、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ１６からなる群から選択される１つのＡＤＣ）の１つまたは組合せを含有する組成物、例えば、薬学的組成物を提供する。
【０１２７】
好ましい実施形態において、本開示の組成物（例えば、製剤）は、（ｉ）本明細書に開示されたＡＤＣ（例えば、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ１６、特にｍＡｂ１であって、それが式（ＩＶ）のリンカー分子と結合し、そのリンカー分子自体がＺと結合し、そのＺ自体が、ｍが０である式（ＩＩＩ）のパラアミノベンジルエステル自壊性基であるＸと結合し、そのＸ自体がＭＭＡＥなどの薬物と結合している、ｍＡｂ１〜ｍＡｂ１６からなる群から選択される１つのＡＤＣ）の１つまたは組合せ、（ｉｉ）ヒスチジン、および任意で（ｉｉｉ）薬学的に許容される担体を含有し、前記組成物のｐＨが６．５である。別の実施形態において、本開示の組成物（例えば、製剤）は、（ｉ）本明細書に開示されたＡＤＣの１つまたは組合せ、（ｉｉ）ヒスチジン、（ｉｉｉ）スクロース、（ｉｖ）ポリソルベート８０を含有し、前記組成物のｐＨは６．５である。好ましくは、ヒスチジンのモル濃度は２０ｍＭである。別の実施形態において、本開示の組成物（例えば、製剤）は、（ｉ）本明細書に開示されたＡＤＣの１つまたは組合せ、（ｉｉ）２０ｍＭ  ヒスチジン、（ｉｉｉ）６％スクロース（バッファー１００ｍＬにつき６ｇ）、（ｉｖ）０．０２％ポリソルベート８０を含有し、前記組成物のｐＨは、６．５である。好ましくは、そのような組成物は、４０℃で安定であり、ＡＤＣの平均ＤＡＲが４から４．５の間に維持されることを意味する。ｐＨは、当業者に知られた任意の技術により決定することができる。
【０１２８】
本明細書に開示された薬学的組成物はまた、併用療法において、すなわち、他の作用物質と併用して、投与することができる。例えば、併用療法は、少なくとも１つの抗ウイルス剤、抗炎症剤、または別の抗増殖性剤と併用された、本開示のＡＤＣを含み得る。併用療法において用いることができる治療剤の例は、下記の本開示のＡＤＣの使用に関するセクションにおいてより詳細に記載されている。
【０１２９】
本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容される担体」には、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに生理的に適合性である同類のものが挙げられる。担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、または表皮の投与（例えば、注射または注入による）に適しているべきである。一実施形態において、担体は、皮下経路に適しているべきである。投与経路に依存して、活性化合物、すなわち、ＡＤＣは、酸の作用、およびその化合物を不活性化し得る他の自然条件からその化合物を保護し得る材料でコーティングされ得る。無菌リン酸緩衝食塩水は、薬学的に許容される担体の一例である。他の適切な担体は、当業者に周知である（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（編）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、第１９版、１９９５）参照）。製剤はさらに、１つまたは複数の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面上でのタンパク質損失を防止するためのアルブミンなどを含み得る。
【０１３０】
薬学的組成物の形態、投与経路、投薬量、およびレジメンは、処置されるべき状態、病気の重症度、患者の年齢、体重、および性別などに当然ながら、依存する。
本開示の薬学的組成物は、局所的、経口、非経口、腹腔内、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、または眼内の投与など、好ましくは、腹腔内または静脈内の投与のために製剤化することができる。
【０１３１】
好ましくは、薬学的組成物は、注射され得る製剤として、薬学的に許容される媒体を含有する。これらは、特に、等張性、無菌性の食塩溶液（リン酸一ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、もしくは塩化マグネシウムなど、またはそのような塩の混合物）、または乾燥、特に凍結乾燥組成物（場合に応じて、滅菌水または生理食塩水の添加により、注射用溶液の構成を可能にする）であり得る。
【０１３２】
投与に用いられる用量は、様々なパラメータの関数、特に、用いられる投与様式、関連病態、あるいは、処置の望ましい持続期間の関数として、適応し得る。
薬学的組成物を調製するために、有効量のＡＤＣが、薬学的に許容される担体または水性媒体中に溶解または分散され得る。
【０１３３】
注射用に適した薬学的形態には、無菌水溶液または分散体；ゴマ油、ピーナッツ油、または水性プロピレングリコールを含む製剤；および無菌注射用溶液または分散体の即時調製のための無菌粉末または凍結乾燥物が挙げられる。全ての場合において、形態は、無菌でなければならず、易注射性（ｅａｓｙ  ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流動性でなければならない。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染行為から守られなければならない。
【０１３４】
遊離塩基または薬学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。分散体もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中、ならびに油中で調製することができる。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための保存剤を含有する。
【０１３５】
本開示のＡＤＣは、中性または塩の形をとった組成物へ製剤化することができる。薬学的に許容される塩には、（タンパク質の遊離アミノ基と共に形成された）酸付加塩が挙げられ、それは、無機酸、例えば、塩化水素酸もしくはリン酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸と共に形成される。遊離カルボキシル基と共に形成された塩もまた、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から導き出すことができる。
【０１３６】
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動度は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用により、分散体の場合、必要とされる粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物の行為の防止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続性吸収は、吸収を遅らせる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの、組成物における使用により、もたらされ得る。
【０１３７】
無菌注射用溶液は、上記で列挙された様々な他の成分と共に適切な溶媒中に必要とされる量で活性化合物を組み入れ、必要に応じて、その後、濾過滅菌することにより、調製される。一般的に、分散体は、塩基性分散媒、および上記で列挙されたものからの必要とされる他の成分を含有する無菌媒体へ様々な滅菌活性成分を組み入れることにより調製される。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、活性成分プラス任意の追加の望ましい成分の、それらのあらかじめ滅菌濾過された溶液から粉末を生じる、真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０１３８】
直接的注射のためのより高く、または高度に濃縮された溶液の調製もまた企図され、その場合、溶媒としてのＤＭＳＯの使用が、結果として、極めて迅速な浸透を生じて、高濃度の活性物質の小さい腫瘍領域へ送達することが構想される。
【０１３９】
製剤に関して、溶液は、投与製剤と適合した様式で、治療的有効であるような量で、投与される。製剤は、様々な剤形、例えば、上で記載された注射用溶液型で、容易に投与されるが、薬物放出カプセルなどもまた用いることができる。
【０１４０】
例えば水溶液における非経口投与について、溶液は、必要ならば、適切に緩衝されるべきであり、液体希釈剤がまず、十分な食塩水またはグルコースで等張性を与えられるべきである。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内の投与に適している。この関連において、用いることができる無菌水性媒体は、本開示を鑑みれば、当業者にはわかるだろう。例えば、１投薬量が、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液中に溶解され、１０００ｍｌの皮下注入液に加えられるか、または注入の提案された部位に注射されるかのいずれかであり得る（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１５版、１０３５〜１０３８ページおよび１５７０〜１５８０ページ参照）。投薬量のいくつかのバリエーションは、必然的に、処置されることになっている対象の状態に依存して生じる。投与に関して責任がある人は、とにかく、個々の対象についての適切な用量を決定するだろう。
【０１４１】
本開示のＡＤＣは、用量あたり約０．０００１〜１．０ミリグラム、または約０．００１〜０．１ミリグラム、または約０．１〜１．０ミリグラム、またはさらに１．０〜約１０ミリグラムを含むように、治療用混合物内に製剤化され得る。複数の用量もまた投与され得る。
【０１４２】
静脈内または筋肉内注射などの非経口投与のために製剤化された化合物に加えて、他の薬学的に許容される形態には、例えば、経口投与のための錠剤または他の固体；徐放性カプセル；および現在用いられている、任意の他の形態が挙げられる。
【０１４３】
ある特定の実施形態において、リポソームおよび／またはナノ粒子の使用が企図され得る。リポソームおよび／またはナノ粒子の形成および使用は、当業者に知られている。
ナノカプセルは、一般的に、安定でかつ再現可能であるように、化合物を封入することができる。細胞内ポリマー過負荷（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｏｖｅｒｌｏａｄｉｎｇ）による副作用を避けるために、そのような超微細粒子（サイズが約０．１μｍ）は、一般的に、インビボで分解することができるポリマーを用いてデザインされる。これらの必要条件に合う生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子が、本開示における使用として企図され、そのような粒子は、容易に作製され得る。
【０１４４】
リポソームは、水性媒体中に分散されるリン脂質から形成され、自発的に、多重膜同心円状二分子層ベシクル（多重膜ベシクル（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を形成する。ＭＬＶは、一般的に、２５ｎｍから４μｍまでの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、２００〜５００Åの範囲での直径を有し、コアに水溶液を含有する、小さい単層膜ベシクル（ＳＵＶ）の形成を生じる。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度、および二価陽イオンの存在に依存する。
【０１４５】
本開示のＡＤＣの使用および方法
本開示のＡＤＣは、インビトロおよびインビボでの診断的および治療的有用性を有する。例えば、これらの分子は、様々な障害を処置し、予防し、または診断するために、培養中の細胞に、例えばインビトロもしくはインビボで、または、対象において、例えばインビボで、投与することができる。
【０１４６】
本開示のＡＤＣは、細胞増殖を阻害するだけでなく、活性化Ｔ細胞などの高増殖性細胞のアポトーシスを誘導することができる。
医薬品として、特に、細胞増殖性障害、例えば、高レベルのＴｆＲを発現する腫瘍、より具体的には、リンパ腫、特に、ＡＴＬ、ＭＣＬ、ホジキン病、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、急性白血病（骨髄性およびリンパ性）などの血液腫瘍、加えて、固形腫瘍、例えば、腎癌、肺がん（小細胞性）、乳がんなどを処置し、予防し、または診断することにおける使用のために、本開示のＡＤＣを用いることが本明細書で企図される。
【０１４７】
固形腫瘍の処置における使用のために本開示のＡＤＣを用いることがさらに開示される。
上記で開示されているような使用のためのＡＤＣは、例えば、上記で言及された疾患の処置または予防のために、唯一の活性成分として、または、他の薬物、例えば、抗ウイルス剤、抗炎症剤、もしくは細胞毒性剤、抗増殖性剤、化学療法剤もしくは抗腫瘍剤と共に、例えば、それらの補助剤としてもしくはそれらと併用して、投与され得る。例えば、上記で開示されているような使用のためのＡＤＣは、ＡＺＴ、ＩＦＮ−アルファ、抗ＣＤ２０  ｍＡｂ、抗ＣＤ２５  ｍＡｂ、抗ＰＤ１  ｍＡｂ、抗ＰＤＬ−１  ｍＡｂ、化学療法剤と併用して用いられ得る。適切な抗悪性腫瘍剤には、非限定的に、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）、テモゾロミド）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、バルルビシン）、タキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル）、エポチロン、トポイソメラーゼＩの阻害剤（例えば、イリノテカンまたはトポテカン）、トポイソメラーゼＩＩの阻害剤（例えば、エトポシド、テニポシド、またはタフルポシド）、ヌクレオチド類似体および前駆類似体（例えば、アザシチジン、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メルカプトプリン、メトトレキサート、またはチオグアニン）、ペプチド抗生物質（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、およびオキサリプラチン）、レチノイド（例えば、トレチノイン、アリトレチノイン、ベキサロテン）、ビンカアルカロイドおよび誘導体（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン）、キナーゼ阻害剤などの標的療法（例えば、イブルチニブ、イデラリシブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ベムラフェニブ、ビスモデギブ）、プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ）、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えば、ボリノスタットまたはロミデプシン）が挙げられ得る。
【０１４８】
前述により、本開示は、なおさらなる態様において、治療的有効量の本開示のＡＤＣの投与を含む方法を提供する。
前述により、本開示は、なおさらなる態様において、治療的有効量の本開示のＡＤＣおよび少なくとも１つの第２の原薬の、例えば同時または順々での、共投与を含む方法であって、前記第２の原薬が、例えば上記で示されているような、抗ウイルス剤または抗増殖性剤である、方法を提供する。
【０１４９】
本明細書に開示された（例えば、ＡＤＣを含む）組成物および使用についての使用説明書からなるキットもまた、本開示の範囲内である。キットはさらに、少なくとも１つの追加の試薬、または１つもしくは複数の追加の抗体もしくはタンパク質（例えば、第１の抗体とは異なる、標的抗原上のエピトープと結合する補完的な活性を有する抗体）を含有し得る。キットは、典型的には、キットの内容物の意図された使用を示すラベルを含む。ラベルという用語は、キット上にもしくはキットと共に供給された、または別の方法でキットに伴う、任意の書面または記録された材料を含む。キットはさらに、患者が、上記で定義されているような、ＡＤＣ処置に応答するだろうグループに属するかどうかを診断するためのツールを含み得る。
【０１５０】
本開示のＡＤＣを作製する方法
本開示の抗体は、当技術分野において知られた任意の技術により、少なくとも１つの薬物に、リンカーＬ−Ｚ−Ｘにより、コンジュゲートされ得る。そのような技術は、例えば、ＵＳ７，８１１，５７２；ＵＳ７，３６８，５６５；ＵＳ２０１１／０００３９６９；ＵＳ２０１１／０１６６３１９；ＵＳ２０１２／０２５３０２１、およびＵＳ２０１２／０２５９１００に記載されている。治療剤を抗体にコンジュゲートするための方法に関連した詳細な情報について、抗体薬コンジュゲートに関する概説として、Ｐａｎｏｗｋｓｉ  Ｓら  ２０１４年１月１日；６（１）：３４〜４５も参照されたい。
【０１５１】
ある実施形態において、本開示のＡＤＣを得るための方法は以下のステップを含む：
−  上記で定義されているような抗体をコードする核酸の発現に適した条件下で宿主細胞を培養するステップ、
−  抗体を単離するステップ、
−  式（Ｖ）のリンカーＬ−Ｚ−Ｘと結合したモノメチルオーリスタチンＥを合成するステップ、
−  式（Ｖ）のリンカーＬ−Ｚ−Ｘと結合したモノメチルオーリスタチンＥに前記抗体をコンジュゲートするステップ。
【０１５２】
抗体は、上記で説明されているように、得ることができる。抗体は、潜在的コンジュゲーション部位として用いることができる４つの鎖間ジスルフィド結合を含有する。４つの鎖間ジスルフィド結合は、例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）またはジチオスレイトール（ＤＴＴ）によって還元され得、それは、結果として、コンジュゲーションに利用できる８個のチオール基を生じる。
【０１５３】
リンカーＬは、ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０６４３８７に開示されているように、得ることができる。リンカーＸは、ＷＯ０３／０２６５７７またはＷＯ２００４／０１０９５７に開示されているように、得ることができる。リンカーＺもまた、それを得る方法を知る当業者によりよく知られている。
【０１５４】
完全に記載されている本発明は、今、以下の実施例によりさらに例証され、その実施例は、例証となるのみであり、さらに限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１５５】
実施例１
造血細胞株上でのＡ２４とＩＮＡ０１−ＳＤＶ１の結合比較
両方のビオチン化抗体（抗体Ａ２４およびＡＤＣの抗体ＩＮＡ０１−ＳＤＶ１）の段階希釈（５〜０．０５ｕｇ／ｍＬ）を行い、ＴＨＰ−１およびＭＥＣ−１細胞株上でインキュベートした。希釈された抗体の結合を、ストレプトアビジンＡｌｅｘａ  Ｆ４８８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃで入手可能）を用いてフローサイトメトリーにより検出した。
【０１５６】
Ａ２４とＩＮＡ０１−ＳＤＶ１の両方は、ＣＤ７１＋細胞株に対して同一の親和性を示す（図２Ａおよび２Ｂ）。
実施例２
アポトーシス
ＣＨＯ細胞に、ヒトＣＤ７１をトランスフェクションし、クローンをＦＡＣＳにより選択した。天然ＣＨＯ細胞（ヒトＣＤ７１が陰性）およびｈＣＤ７１陽性細胞を、いくつかの濃度のＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１と、完全培地中、３７℃で９６時間、インキュベートした。４日目、細胞を、Ａｎｎｅｘｉｎ  ＶおよびＴｏｐｒｏ  ３とインキュベートした。アポトーシス細胞を、二重陽性Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ／Ｔｏｐｒｏ  ３細胞として、ＦＡＣＳにより決定した。
【０１５７】
結果は、図３Ａおよび３Ｂに提示されている。棒はアポトーシス細胞のパーセンテージを表す。
実施例３
複数の細胞株へのＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１のインビトロ効力
細胞増殖の阻害を、Ｐｒｏｍｅｇａによる細胞生存率アッセイＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）を製造会社のプロトコールに従って用いることにより測定した。簡単に述べれば、細胞を、４８ウェルプレートにプレーティングし、増加性濃度のＩＮＡ０１−ＳＤＶ１（０μｇ／ｍｌから２０μｇ／ｍｌまで）の存在下または非存在下で９６時間、インキュベートした。
【０１５８】
結果は、図４Ａおよび４Ｂに提示されている。細胞生存率は、Ｒａｍｏｓ細胞株とＴＨＰ−１細胞株の両方において損なわれた。
実施例４
ＩＮＡ０１−ＳＤＶ１のインビボ効力
ＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１のインビボ効力を評価するために、ヌードマウスに、５×１０６個のＴＨＰ−１細胞を皮下に注射した。腫瘍が１００ｍｍ３に達した時、マウスに、腹腔内５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、またはＰＢＳのいずれかを治療様式で注射した。腫瘍成長を、毎日モニターし、腫瘍が１０００ｍｍ３に達した時、マウスを屠殺した。
【０１５９】
図５のデータは、ＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１の単回注射後の日数におけるマウスの生存率を表す。
実施例５
毒性学的分析
ＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１の毒性学分析を、野生型Ｂ６（ＷＴ）マウスおよびＣＤ７１／トランスフェリン二重ノッキングマウス（ＴｆＲ／Ｔｆ  ２Ｋｉ）において評価した。マウスに、３ｍｇ／ｋｇでのＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１の５回の注射を４日ごとにＩＰ注射し、最後の注射から２日後、屠殺した。
【０１６０】
図６は、ＷＴマウス（図６Ａ）およびＴｆＲ／Ｔｆ  ２Ｋｉマウス（図６Ｂ）における肉眼での器官分析を表す。下記の表７は、図６Ａおよび６Ｂに描かれた各器官の非依存的病理学的分析を表す。
【０１６１】
【表７】
2021521181.tif 000017
【０１６２】
実施例６
製剤
４つの異なる製剤を比較している。製剤１および２は、それらのｐＨだけが異なり、製剤３および４も同様である。製剤は、ＡＤＣ、２０ｍＭ  ヒスチジンまたは２０ｍＭ  クエン酸塩、６％  スクロース（バッファー１００ｍＬにつき６ｇ）、および０．０２％  ポリソルベート８０を含有する。
【０１６３】
製剤１は、本開示によるＡＤＣ、特にＩＮＡ０１、およびヒスチジンを含有し、この製剤のｐＨは５．５である。製剤２は、本開示によるＡＤＣ、特にＩＮＡ０１、およびヒスチジンを含有し、この製剤のｐＨは６．５である。製剤３は、本開示によるＡＤＣ、特にＩＮＡ０１、およびクエン酸塩を含有し、この製剤のｐＨは５．５である。製剤４は、本開示によるＡＤＣ、特にＩＮＡ０１、およびクエン酸塩を含有し、この製剤のｐＨは６．５である。
【０１６４】
結果は下記の表８に描かれている。それらは、５℃／４０℃でのＴ＝０およびＴ＝２週間の保存、ならびに５℃／２５℃でのＴ＝４週間保存における製剤１〜４についてのＤＡＲ（薬物抗体比）値を示す。４０℃で、ＤＡＲ値の全体的減少が、製剤２を除いて、測定されている。これらの結果は、製剤２が、製剤１、３、および４との比較により安定であることを示す。
【０１６５】
【表８】
2021521181.tif 000018
【０１６６】
実施例７
ＩＣ５０の決定
ＨＬ−６０急性骨髄性白血病細胞株（すなわち、ＣＤ７１を発現する細胞）を、０．０２ｕｇ／ｍＬから１０ｕｇ／ｍＬまでの範囲の１０個の濃度のＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１と３７℃でインキュベートした。ＡＤＣの細胞増殖への効果は図７に示されている。適合曲線を用いて、ＩＣ５０を計算した。したがって、ＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１の計算されたＩＣ５０は、０．０８ｕｇ／ｍＬである。
【０１６７】
実施例８
ＴＮＦ−αの分泌
ＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１が患者においてサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を誘発し得るかどうかを評価するために、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）によるＴＮＦ−α分泌を試験した。ＡＤＣの異なる濃度を表す３つの異なる条件：高度のコーティング化（風乾）、より低度のコーティング化（湿潤コーティング化）、または溶液中（水性）におけるＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１とのＰＢＭＣのインキュベーション後、ＴＮＦ−α産生を試験した。
【０１６８】
材料および方法
以前、いくつかの活性化手順について報告されているように（Ｆｉｎｄｌａｙ  Ｌら  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ  ２００８；Ｓｔｅｂｂｉｎｇｓ  Ｒら  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００７）、ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌにより分離し、０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、または１０μｇ／ｍｌにおける風乾された、湿潤コーティングされた、または水性のＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１と共に培地中に懸濁した。３７℃で２４時間のインキュベーション後、ＴＮＦ−αを、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により評価した。天然および組換えヒトＴＮＦ−アルファを測定するためにサンドイッチＥＬＩＳＡの発色に必要とされる基本的コンポーネントを含有するＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ発色キットを用いた。
【０１６９】
ＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１コーティング
ＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１は、３つの異なるプロトコール：風乾、湿潤コーティング化、または水性でＰＢＭＣへ提示される。
【０１７０】
−  風乾：ＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１を、（０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、および１０μｇ／ｍｌの最終濃度として）５０ｕｌ中５×作用濃度で加えた。プレートを、フード下に一晩、保ち、その後、２回、洗浄した。
【０１７１】
−  湿潤コーティング化：ＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１を、（０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、および１０μｇ／ｍｌの最終濃度として）２００ｕｌ中５×作用濃度で加えた。乾燥を避けるためにウェルをテーピングし、その後、２回、洗浄した。
【０１７２】
−  水性：ＰＢＭＣおよびＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１を一緒に、培地中で培養した。
結果
結果は図８にあり、ＴＮＦ−αが、ＰＢＭＣ上で、全てのＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１インキュベーション条件において放出されなかったことを示している。しかしながら、１ｎｇ／ｍｌのＬＰＳとの２４時間のインキュベーションが、ＴＮＦ−αの強い放出を生じた。
【０１７３】
実施例９
ＩＰ投与後のＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１のインビボ効力
ＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１のインビボ効力を評価するために、ヌードマウスに、５×１０６個のＴＨＰ−１細胞を皮下に注射した。腫瘍が１００ｍｍ３に達した時、マウスに、腹腔内１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、またはＰＢＳのいずれかを治療様式で４日ごとに４回の投与で、注射した。腫瘍成長を、毎日モニターし、腫瘍が１０００ｍｍ３に達した時、マウスを屠殺した。
【０１７４】
図９のデータは、ＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１の腹腔内での４回の注射後の日数におけるマウスの生存率を表す。
実施例１０
ＩＶ投与後のＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１のインビボ効力
ＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１のインビボ効力を評価するために、ヌードマウスに、５×１０６個のＴＨＰ−１細胞を皮下に注射した。腫瘍が１００ｍｍ３に達した時、マウスに、静脈内３ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、またはＰＢＳのいずれかを治療様式で４日ごとに４回の投与で、注射した。腫瘍成長を、毎日モニターし、腫瘍が１０００ｍｍ３に達した時、マウスを屠殺した。
【０１７５】
図１０のデータは、ＩＮＡ０１−ＳＤＶ＃１の静脈内での４回の注射後の日数におけるマウスの生存率を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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