(57)【要約】  ｐ５３遺伝子内の１つ又は複数の点変異を標的とするための核酸配列が本明細書に開示される。特に、ｐ５３における点変異の部位は、Ｒ２４９、Ｒ２４８、Ｒ２７３、及びＲ１７５からなる群から選択される。また、対象の癌を処置するための方法が本明細書に開示され、この方法は、本明細書に開示される１つ又は複数の核酸配列を対象に投与することを含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子内の単一点変異を標的とするための核酸配列であって、前記標的遺伝子が１つ又は複数の腫瘍抑制遺伝子であり；前記腫瘍抑制遺伝子はｐ５３であり、前記点変異の部位は、Ｒ２４９（ｐ５３）、Ｒ２４８（ｐ５３）、Ｒ２７３（ｐ５３）、及びＲ１７５（ｐ５３）からなる群から選択される、核酸配列。
【請求項２】
前記点変異が、Ｒ２４９Ｓ（ｐ５３）、Ｒ２４９Ｇ（ｐ５３）、Ｒ２４９Ｍ（ｐ５３）、Ｒ２４８Ｗ（ｐ５３）、Ｒ２４８Ｑ（ｐ５３）、Ｒ２７３Ｈ（ｐ５３）、Ｒ２７３Ｌ（ｐ５３）、及びＲ１７５Ｈ（ｐ５３）からなる群から選択される、請求項１に記載の核酸配列。
【請求項３】
細胞死、依存の抑止、標的遺伝子のいずれか１つ又は複数の活性化、ドミナントネガティブ効果の軽減、１つ又は複数の抗癌剤に対する感受性の増加、及び腫瘍成長の遅延又は停止からなる群から選択される効果のいずれか１つ又は複数をもたらす、請求項１又は２に記載の核酸配列。
【請求項４】
変異腫瘍抑制遺伝子の対立遺伝子を実質的にサイレンシングすることができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸配列。
【請求項５】
前記点変異が置換変異である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸配列。
【請求項６】
ＲＮＡ配列である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸配列。
【請求項７】
前記ＲＮＡ配列が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）配列又は低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）配列である、請求項６に記載の核酸配列。
【請求項８】
前記ｓｉＲＮＡ配列が１５〜１５０塩基対である、請求項７に記載の核酸配列。
【請求項９】
前記ｓｈＲＮＡ配列が、１５〜３０塩基対の長さのステムを含む、請求項７に記載の核酸配列。
【請求項１０】
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号４４、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号４５、配列番号４６、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号４７、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２４／４０／４１、配列番号２５／４２／４３、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、及び配列番号３３からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸配列。
【請求項１１】
配列番号９、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号２１からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸配列。
【請求項１２】
対象の癌を処置する方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の１つ又は複数の核酸配列を前記対象に投与することを含み、前記核酸配列が、標的遺伝子内の１つ又は複数の点変異部位を標的とし、前記標的遺伝子が腫瘍抑制遺伝子である、方法。
【請求項１３】
前記癌が、食道、上気道、皮膚、上皮、中枢神経系、卵巣、乳房、胃−腸、大腸、小腸、結腸直腸、肝臓、腺癌、副腎腺癌、甲状腺、肺、膵臓、腎臓、子宮内膜、造血、筋肉、結合組織（腱又は軟骨など）、骨、軟部組織、リンパ組織、リンパ系、及び免疫系からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記癌が、黒色腫、骨髄腫、癌腫、肉腫、リンパ腫、芽細胞腫、及び胚細胞腫瘍からなる群から選択される、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記癌が、肺癌、悪性黒色腫、結腸癌、乳癌、子宮内膜腺癌、横紋筋肉腫、腎腺癌、結腸腺癌、肝細胞癌、気管支扁平上皮癌、卵巣癌、及び膵臓腺癌からなる群から選択される、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記癌が腫瘍抑制遺伝子に依存し、前記腫瘍抑制遺伝子がｐ５３である、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記点変異部位が、Ｒ２４９（ｐ５３）、Ｒ２４８（ｐ５３）、Ｒ２７３（ｐ５３）、及びＲ１７５（ｐ５３）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記点変異が、Ｒ２４９Ｓ（ｐ５３）、Ｒ２４９Ｇ（ｐ５３）、Ｒ２４９Ｍ（ｐ５３）、Ｒ２４８Ｗ（ｐ５３）、Ｒ２４８Ｑ（ｐ５３）、Ｒ２７３Ｈ（ｐ５３）、Ｒ２７３Ｌ（ｐ５３）、及びＲ１７５Ｈ（ｐ５３）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸配列の１つ又は複数の投与が、細胞死、依存の抑止、標的遺伝子のいずれか１つ又は複数の活性化、ドミナントネガティブ効果の軽減、１つ又は複数の抗癌剤に対する感受性の増加、及び腫瘍成長の遅延又は停止からなる群から選択される効果のいずれか１つ又は複数をもたらす、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
治療薬の投与を含む、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記治療薬が抗癌剤である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
処置の影響を受けやすい対象を識別する方法であって、
ｉ）標的遺伝子内の１つ又は複数の単一点変異を同定するステップであって、前記標的遺伝子が１つ又は複数の腫瘍抑制遺伝子であり；前記腫瘍抑制遺伝子はｐ５３であり、前記１つ又は複数の点変異の部位が、Ｒ２４９（ｐ５３）、Ｒ２４８（ｐ５３）、Ｒ２７３（ｐ５３）、及びＲ１７５（ｐ５３）からなる群から選択される、ステップ；
ｉｉ）請求項１〜１１のいずれか一項に記載の１つ又は複数の核酸配列を前記対象に投与するステップであって、前記核酸配列が、前記標的遺伝子内の１つ又は複数の点変異部位を標的とする、ステップを含み、
前記標的遺伝子内の１つ又は複数の点変異の存在が、前記対象が処置の影響を受けやすいことを示す、方法。
【請求項２３】
前記点変異が、Ｒ２４９Ｓ（ｐ５３）、Ｒ２４９Ｇ（ｐ５３）、Ｒ２４９Ｍ（ｐ５３）、Ｒ２４８Ｗ（ｐ５３）、Ｒ２４８Ｑ（ｐ５３）、Ｒ２７３Ｈ（ｐ５３）、Ｒ２７３Ｌ（ｐ５３）、及びＲ１７５Ｈ（ｐ５３）からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容がすべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、２０１８年２月２１日出願のシンガポール仮特許出願第１０２０１８０１４３２Ｓ号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、一般に、分子生物学の分野に関する。特に、本発明は、検出及び診断用のバイオマーカー、並びに癌の処置用のｓｉＲＮＡの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
全癌ゲノム配列決定の取り組みにより、ほとんどすべての癌型にわたって多数のゲノム変化が同定されている。これにより、これらの変異の多くが、癌の発生に偶然関与している潜在的なドライバーとして同定され、関連付けられた。癌遺伝子の同定された変化のいくつかは、これらの変異を有する癌の処置において当初は大きな成功を収め、腫瘍学における精密医療の基礎をなしている、阻害分子又は遮断抗体の開発によって標的治療に供されてきた。しかしながら、標的治療用の阻害剤又は遮断抗体を使用するこのようなアプローチの１つの課題は、これらがタンパク質の変異型に対して完全には特異的ではなく、むしろその野生型（ＷＴ）の対応物で変異タンパク質の活性又は発現が高いため、変異タンパク質発現細胞ではるかに効果的である。結果として、これは、ＷＴタンパク質を発現する複数の細胞型に対して望ましくない副作用をもたらす可能性がある。
【０００４】
従って、変異タンパク質に対する理想的な薬物は、ＷＴ型に影響を全く与えることなく、変異型の機能のみに影響を与える薬物であろう。しかしながら、これまでに、そのような高い特異性を有し得る生成された薬物又は分子は存在しない。それにもかかわらず、「変異体のみ」に特異的な試薬を生成するための常用の技術は現在まで得られていない。
【０００５】
精密医療の時代は、タンパク質の非常に活性な変異型に特異的な多数の薬物の開発を促してきた。当初は素晴らしい結果が得られたが、特異性に関する２つの主要な問題が残っている。まず、特定のタンパク質（多くの場合キナーゼ）に対して生成された薬物は、ほとんどの場合、他の細胞標的に影響を与える。さらに、ｃ−Ｋｉｔで示されているように、これらの薬物の多くは、タンパク質の変異型及び活性型に非常に効果的であるが、野生型の対応物にも大きな影響を与える。従って、効果的ではあるが、これらの阻害剤の野生型形態又は他の密接に関連する標的に対する影響は、望ましくない副作用を弱まらずに引き起こし、これらの試薬の有望性を低下させる。
【０００６】
従って、過剰増殖性疾患の処置に使用するための野生型形態に対する交差反応性がほとんど又はまったくない、タンパク質の変異型に非常に特異的な試薬が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、本発明は、標的遺伝子内の単一点変異を標的とするための核酸配列に関し、この標的遺伝子は、１つ又は複数の腫瘍抑制遺伝子であり；腫瘍抑制遺伝子はｐ５３であり、点変異の部位は、Ｒ２４９（ｐ５３）、Ｒ２４８（ｐ５３）、Ｒ２７３（ｐ５３）、及びＲ１７５（ｐ５３）からなる群から選択される。
【０００８】
別の態様では、本発明は、対象の癌を処置する方法に関し、この方法は、本明細書に開示される１つ又は複数の核酸配列を対象に投与することを含み、この核酸配列は、標的遺伝子における１つ又は複数の点変異部位を標的とし、この標的遺伝子は腫瘍抑制遺伝子である。
【０００９】
さらに別の態様では、本発明は、処置の影響を受けやすい対象を識別する方法に関し、この方法は、ｉ）標的遺伝子内の１つ又は複数の単一点変異を同定するステップであって、標的遺伝子は１つ又は複数の腫瘍抑制遺伝子であり；腫瘍抑制遺伝子はｐ５３であり、１つ又は複数の点変異の部位は、Ｒ２４９（ｐ５３）、Ｒ２４８（ｐ５３）、Ｒ２７３（ｐ５３）、及びＲ１７５（ｐ５３）からなる群から選択される、ステップ；ｉｉ）本明細書に開示される１つ又は複数の核酸配列を対象に投与するステップであって、核酸配列は、標的遺伝子における１つ又は複数の点変異部位を標的とし、標的遺伝子における１つ又は複数の点変異の存在は、対象が処置の影響を受けやすいことを示す、ステップを含む。
【００１０】
本発明は、非限定的な例と添付の図面を併せて考慮すると詳細な説明の参照でより良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、様々なｐ５３ホットスポット変異を特異的に標的とするためにｓｉＲＮＡ歩行（ｓｉＲＮＡ  ｗａｌｋ）によって選択されたｓｉＲＮＡ配列を示すデータを示す。（Ａ）は、野生型（ＷＴ）のヌクレオチド配列を示し、いずれの場合も、それぞれのｐ５３変異体（即ち、Ｒ１７５Ｈ；Ｒ２４８Ｗ；Ｒ２４９Ｓ、及びＲ２７３Ｈ）を示し、その後に各変異を標的とするために候補に挙げられたｐ５３対立遺伝子特異的ｓｉＲＮＡ配列を示す。ＷＴ及び変異ヌクレオチド残基の両方を太字で強調表示している。ｐａｎ−ｐ５３  ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ｐ５３）及びスクランブル（ｓｃｒ）ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ｓｃｒ）配列を下部に表示している。（Ｂ）は、（Ａ）に示されている各ｓｉＲＮＡについて行われた免疫ブロットの画像を示す。各ｓｉＲＮＡを、示されたｐ５３変異体を安定して発現する同質遺伝子Ｈ１２９９細胞株にトランスフェクトした。次いで、細胞溶解物を、トランスフェクションの７２時間後に、抗ｐ５３抗体（ＤＯ−１）を使用して免疫ブロット法によってｐ５３発現について分析した。温度感受性（ＴＳ）ＷＴ  ｐ５３発現細胞をＷＴ対照として使用した。特異的で改善されたノックダウン活性を示した変異特異的ｓｉＲＮＡは、アスタリスク（「＊」）で示している。少なくとも３つの独立した実験のうちの１つの代表的なブロットを示す。アクチンはローディング対照として示し、（−）は、まったくｓｉＲＮＡトランスフェクトされていない細胞のみを表す。各試料について、アクチンバンド強度に対するｐ５３の比率を計算し、ｓｉ−ｓｃｒ対照の比率に対して正規化した。値は、正規化した倍数変化を表す。
【図２】図２は、内因性変異ｐ５３に対する変異特異的ｓｉＲＮＡのサイレンシング効果を示す免疫ブロットデータを示す。パネル（Ａ）〜（Ｄ）はそれぞれ、Ｒ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、及びＲ２７３Ｈに対するｓｉＲＮＡの免疫ブロットの結果を示す。変異ｓｉＲＮＡを、ＷＴ  ｐ５３の発現を伴う３つの細胞株、及び示されたｐ５３変異体を発現する３つの細胞株にトランスフェクトした。上記のように、サイレンシングの有効性を免疫ブロット法によって評価した。少なくとも３つの独立した実験のうちの１つの代表的なブロットを示す。細胞株の変異ｐ５３の状態は、ブロットの下に強調表示し、表１に記載している。
【図３】図３は、変異ｐ５３発現の対立遺伝子特異的サイレンシングが細胞死をもたらすことを示すフローサイトメトリーのグラフを示す。細胞内のｓｕｂ−Ｇ１  ＤＮＡ含量（アポトーシスを示す）のフローサイトメトリー分析により、示された細胞株で示されたｓｉＲＮＡのトランスフェクションの７２時間後に定量した。少なくとも３つの独立した繰り返しのうちの１つの実験からの代表的なヒストグラムを示す。ｓｕｂ−Ｇ１細胞のパーセンテージをヒストグラム（Ｍ１）で示す。
【図４】図４は、変異ｐ５３特異的サイレンシングが、変異ｐ５３発現細胞においてｐ５３標準標的遺伝子の活性化をもたらすことを例示するヒストグラムを示す。（Ａ）は、ＷＴ  ｐ５３を発現するＨＣＴ１１６細胞が、４つのホットスポットｐ５３変異体を標的とするｓｉＲＮＡ又は対照スクランブルｓｉＲＮＡ又はｐ５３特異的ｓｉＲＮＡで一過性にトランスフェクトされたことを示す。定量的リアルタイムＰＣＲによる示された標的遺伝子のｍＲＮＡ分析のために、細胞を７２時間後に収集した。（Ｂ）は、示されたｐ５３変異体を発現するＡＵ５６５細胞株、７８６−Ｏ細胞株、ＢＴ５４９細胞株、及びＡＳＰＣ１細胞株を同様にトランスフェクトし、分析したことを示す。標的遺伝子の相対発現を示す。すべての実験は、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、３連で行った。棒グラフは、３つの独立した実験の平均±標準偏差を示す。＊は＜０．０５のｐ値を示し、＊＊は＜０．００５のｐ値を示し；＊＊＊は＜０．００１のｐ値を示し、ｎ＝３試料／群である。
【図５】図５は、変異ｐ５３特異的ｓｈＲＮＡの増殖抑制効果を示すデータを示す。（Ａ）は、ｓｈＲＮＡ発現ｐａｎ−ｐ５３（ｓｈ−ｐ５３）ｓｈＲＮＡ、スクランブル対照、それぞれの変異特異的ｓｈＲＮＡ、又は空ベクター（−）でトランスフェクトされた、示された細胞株の免疫ブロットを示す。４８時間後に細胞を採取し、免疫ブロット法によりサイレンシングの効率を分析した。（Ｂ）は、ｓｈＲＮＡトランスフェクションの５日後にクリスタルバイオレット溶液で染色し、視覚化された細胞コロニーの並行培養の画像を示す。少なくとも３つの独立した実験（ｂ）のうちの１つの実験からの代表的な画像が示され、定量される。
【図６】図６は、変異ｐ５３特異的サイレンシングによる変異ｐ５３のドミナントネガティブ効果の軽減を示すデータを表す。（Ａ）は、対照、ｐａｎ−ｐ５３（ｓｈ−ｐ５３）、又はＲ２４８Ｗ特異的ｓｈＲＮＡ（ｓｈ−４）をトランスフェクトした、サイレンシングの有効性について上記のように分析したＲＫＯ＋／−細胞及びＲＫＯ＋／２４８Ｗ細胞の免疫ブロットを示す。コロニーの成長に関するデータをパネル（Ｂ）に示し、ｐ５３標的遺伝子発現分析の結果をパネル（Ｃ）に示す。シスプラチン（ＣＤＤＰ）処理を用いて（パネルＥ）又は用いずに（パネルＤ）細胞死を分析した。ｓｕｂ−Ｇ１細胞のパーセンテージ（％）をヒストグラムで示す（Ｍ１で表されている）。３つの独立した実験からの代表的なデータを示す。棒グラフは、３つの独立した実験の平均±標準偏差を示す。＊＊は＜０．００５のｐ値を示し；＊＊＊は＜０．００１のｐ値を示し、ｎ＝３試料／群である。
【図７】図７は、変異ｐ５３特異的サイレンシングがインビボで腫瘍成長を遅延させることを示すデータを提示する。変異ｐ５３特異的サイレンシングは、インビボでの腫瘍成長を遅延させる。（Ａ）及び（Ｂ）ＲＤ、ＰＬＣ−ＰＲＦ５、及びＨ１９７５細胞株にスクランブルｓｈＲＮＡ又は示された変異ｐ５３特異的ｓｈＲＮＡを形質導入し、３日後に収集し、細胞［ＲＤ（４×ｌ０６）、ＰＬＣ−ＰＲＦ５（３×１０６）及びＨ１９７５（５×１０６）］をＰＢＳ中、７５μｌの細胞と７５μｌのマトリゲルの混合物としてＳＣＩＤマウスの側腹部に注射し、腫瘍成長を定期的に監視した。腫瘍のサイズをグラフに示す（Ａ）。いずれの場合もエンドポイントで採取した腫瘍を、ＲＤ腫瘍のＨ＆Ｅ又は抗ｐ５３染色に使用した（Ｂ）。値は平均＋ＳＤを表す。ｎ＝４（ＲＤ細胞及びＨ１９７５細胞の場合は群あたり）及びｎ＝５（ＰＬＣ細胞の場合）。＊＊＊は＜０．００１のｐ値を示す。
【図８】図８は、内因性変異ｐ５３発現に対する変異特異的ｓｉＲＮＡのサイレンシングの有効性に関する免疫ブロットデータを示す。Ｒ１７５Ｈ（ｓｉ−１及び２）、Ｒ２４８Ｗ（ｓｉ−３及び４）、Ｒ２４９Ｓ（ｓｉ−５及び６）、及びＲ２７３Ｈ（ｓｉ−７及び８）に対するｓｉＲＮＡを、示されたｐ５３変異体を発現する示された細胞株にトランスフェクトし、サイレンシングの有効性を、記載されているように免疫ブロット法によって評価した。少なくとも２つの独立した実験のうちの１つの代表的なブロットを示す。細胞株の変異ｐ５３の状態は、ブロットの下に強調表示し、表１に記載している。各試料について、アクチンバンド強度に対するｐ５３の比率を計算し、ｓｉ−ｓｃｒ対照の比率に対して正規化した。値は、正規化した倍数変化を表す。
【図９】図９は、様々な変異ｐ５３発現細胞株における細胞死に対する変異特異的ｓｉＲＮＡの効果の評価のさらなるフローサイトメトリーの結果を示す。細胞内のｓｕｂ−Ｇ１  ＤＮＡ含量（アポトーシスを示す）のフローサイトメトリー分析により、示された細胞株における示されたｓｉＲＮＡ（本明細書に記載）のトランスフェクションの７２時間後に定量した。代表的なヒストグラムを示す。ｓｕｂ−Ｇ１細胞のパーセンテージをヒストグラムで示す（ＨＣＣ１３９５細胞はＭ１、他のすべての細胞株はＭ２）。
【図１０】図１０は、シスプラチン処理が、変異ｐ５３サイレンシング時に細胞死を促進することに関するさらなるフローサイトメトリーデータを示す。ｓｕｂ−Ｇ１  ＤＮＡ含量（アポトーシスを示す）のフローサイトメトリー分析を、ＨＣＴ１１６細胞、ＡＵ５６５細胞、７８６−Ｏ細胞、ＢＴ５４９細胞、及びＨ１９７５細胞で行った。これらの細胞は、示されたｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後、さらに２４時間後にシスプラチンで処理した。少なくとも３つの独立した繰り返しのうちの１つの実験からの代表的なヒストグラムを示す。ｓｕｂ−Ｇ１細胞のパーセンテージ（％）をヒストグラム（Ｍ１）で示す。
【図１１】図１１は、変異対立遺伝子発現の喪失がｐ５３転写標的の活性化をもたらすことに関するリアルタイムＰＣＲデータを示すヒストグラムを示す。本明細書に記載されるように、ｐ２１、Ｍｄｍ２、及びＮｏｘａなどのｐ５３標的遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲを、様々なｓｉＲＮＡでトランスフェクトされ、続いてシスプラチン（ＣＤＤＰ）を用いずに又はシスプラチンを用いて処理された、示された細胞株に対して行った。すべての実験は、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、３連で行い、標的遺伝子の相対発現を示す。棒グラフは、３つの独立した実験の平均±標準偏差を示す。＊は＜０．０５のｐ値を示し；＊＊は＜０．００５のｐ値を示し；＊＊＊は＜０．００１のｐ値を示し、ｎ＝３試料／群である。
【図１２】図１２は、対立遺伝子特異的変異ｐ５３特異的ｓｈＲＮＡが細胞死を誘導し、同じ残基での様々な変異ヌクレオチドに対して有効であることを示すデータを示す。（Ａ）は、トランスフェクションの７２時間後に行われた、示されたｓｈＲＮＡでトランスフェクトされた、示された細胞株におけるｓｕｂ−Ｇ１  ＤＮＡ含量（アポトーシスを示す）のフローサイトメトリー分析の結果のヒストグラムを示す。代表的なヒストグラムは、３つの独立した実験の平均±標準偏差を示す。（Ｂ）〜（Ｄ）は、示されたｓｈＲＮＡでトランスフェクトされ、変異ｐ５３発現（Ｂ）、コロニーの成長（Ｃ）、及びＣＤＤＰ処理の非存在下又は存在下でのアポトーシス（Ｄ）について分析された、Ｒ２４８Ｑ変異ｐ５３を発現するＨＥＣ１Ａ細胞からのデータを示す。３つの独立した実験のうちの１つからの代表的な結果を示す。棒グラフは、３つの独立した実験の平均±標準偏差を示す。ｓｈ−４は、Ｒ２４８特異的ｓｉＲＮＡである。
【図１３】図１３は、変異ｐ５３特異的サイレンシングによる変異ｐ５３のドミナントネガティブ効果の軽減を例示するデータを示す。ＨＣＴ１１６＋／−細胞及びＨＣＴ１１６＋／Ｒ２４８Ｗ細胞に、対照、ｐａｎ−ｐ５３（ｓｈ−ｐ５３）、又はＲ２４８Ｗ特異的ｓｈＲＮＡ（ｓｈ−４）をトランスフェクトし、サイレンシングの有効性（Ａ）、コロニーの成長（Ｂ）、及びｐ５３標的遺伝子発現（Ｃ）について説明したように分析した。シスプラチン（ＣＤＤＰ）処理を用いて（パネルＥ）又は用いずに（パネルＤ）細胞死を分析した。ｓｕｂ−Ｇ１細胞のパーセンテージ（％）をヒストグラムで示す（Ｍ１で表される）。３つの独立した実験からの代表的なデータを示す。棒グラフは、３つの独立した実験の平均±標準偏差を示す。＊は＜０．０５のｐ値を示し；＊＊は＜０．００５のｐ値を示し；＊＊＊は＜０．００１のｐ値を示し、ｎ＝３試料／群である。
【図１４】図１４は、様々なＲ２４９変異に対するｓｉＲＮＡ−６の有効性を表すデータを示す。（Ａ）は、ヒトの癌のｐ５３のＲ２４９の位置に見られる様々な可能な変異、及び可能な各アミノ酸のヌクレオチド配列を示す表を示す。従って、Ｒ２４９は、Ｒ２４９Ｓ、Ｒ２４９Ｇ、及びＲ２４９Ｍに変異させることができる。（Ｂ）は、変異の数として、ヒトの癌における様々なＲ２４９変異の頻度を示す様々なヒストグラムを示す。（Ｃ）は、免疫ブロット分析の結果を示す。ｓｉ−６及び対照ｓｉｐ５３及びｓｉ−ｓｃｒ  ｓｉＲＮＡを、Ｈ１２９９細胞株にトランスフェクトし、このＨ１２９９細胞株は、２４時間後に様々なＲ２４９変異ｃＤＮＡ構築物又はＷＴ  ｐ５３構築物で同時トランスフェクトした。次いで、細胞溶解物を、抗ｐ５３抗体（ＤＯ−１）を使用して、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの７２時間後に免疫ブロット法によってｐ５３発現について分析した。少なくとも２つの独立した実験のうちの１つの代表的なブロットを示す。アクチンはローディング対照として示し、（−）は、まったくｓｉＲＮＡトランスフェクトされていない細胞のみを表す。
【図１５】図１５は、様々なＲ２７３変異に対するｓｉＲＮＡ−８の有効性を表すデータを示す。（Ａ）は、ヒトの癌におけるｐ５３のＲ２７３の位置に見られる様々な可能な変異、及び可能な各アミノ酸のヌクレオチド配列を示す表である。従って、Ｒ２７３は、Ｒ２７３Ｈ及びＲ２７３Ｌに変異させることができる。（Ｂ）は、変異の数として、ヒトの癌における様々なＲ２７３変異の頻度を示す様々なヒストグラムを示す。（Ｃ）は、免疫ブロット分析の結果を示す。ｓｉ−８及び対照ｓｉｐ５３及びｓｉ−ｓｃｒ  ｓｉＲＮＡをＨ１２９９細胞株にトランスフェクトし、このＨ１２９９細胞株は、２４時間後に様々なＲ２７３変異ｃＤＮＡ構築物又はＷＴ  ｐ５３構築物で同時トランスフェクトした。次いで、細胞溶解物を、抗ｐ５３抗体（ＤＯ−１）を使用して、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの７２時間後に免疫ブロット法によってｐ５３発現について分析した。少なくとも２つの独立した実験のうちの１つの代表的なブロットを示す。アクチンはローディング対照として示し、（−）は、まったくｓｉＲＮＡトランスフェクトされていない細胞のみを表す。
【図１６】図１６は、変異ｐ５３特異的サイレンシングが、変異ｐ５３発現細胞におけるｐ５３標準標的遺伝子の活性化をもたらすことを例示するヒストグラムを提供する。（Ａ）は、ｓｉ−８及び対照スクランブルｓｉＲＮＡ又はｐ５３特異的ｓｉＲＮＡ対照ｓｉＲＮＡのトランスフェクションの２４時間後にＲ２７３Ｌ及びＲ２７３Ｈ  ｐ５３変異ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＨ１２９９細胞のヒストグラムを示す。定量的リアルタイムＰＣＲによる示された標的遺伝子のｍＲＮＡ分析のために、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの７２時間後に細胞を収集した。（Ｂ）は、同様に、ｓｉ−６及び対照スクランブルｓｉＲＮＡ又はｐ５３特異的ｓｉＲＮＡ対照ｓｉＲＮＡと共にＲ２４９Ｇ、Ｒ２４９Ｍ、又はＲ２４９Ｓ  ｐ５３変異ｃＤＮＡをトランスフェクトしたＨ１２９９細胞のヒストグラムを示す。定量的リアルタイムＰＣＲによる示された標的遺伝子のｍＲＮＡ分析のために、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの７２時間後に細胞を収集した。（Ｃ）は、ｓｉ−２、ｓｉ−４、ｓｉ−６、ｓｉ−８、及び対照スクランブルｓｉＲＮＡ又はｐ５３特異的ｓｉＲＮＡと共にＷＴ  ｐ５３  ｃＤＮＡをトランスフェクトしたＨ１２９９細胞のヒストグラムを示す。定量的リアルタイムＰＣＲによる示された標的遺伝子のｍＲＮＡ分析のために、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの７２時間後に細胞を収集した。標的遺伝子の相対発現を示す。すべての実験は、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、３連で行った。
【図１７】図１７は、同じアミノ酸内の変異に対する変異ｐ５３特異的ｓｉＲＮＡの有効性をまとめた表を示す。Ｙはｙｅｓを表す（言い換えると、ｓｉＲＮＡは列記された変異を標的とするのに効果的である）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
Ｔｐ５３の変異は、機能的野生型対立遺伝子に対するドミナントネガティブ効果；又は癌細胞が依存することになる変異ｐ５３によってもたらされる生存上の利点の結果として、のいずれかによって治療反応を低下させる。従って、変異ｐ５３を標的とすることは、すべての癌の半分を超える効果的な標的治療を表す。ｐ５３ホットスポット変異を標的とすることができる一連の低分子干渉ＲＮＡが生成された。これらの変異ｐ５３特異的ｓｉＲＮＡ（ＭｕｐＳｉ）は、野生型ｐ５３に影響を与えることなく、目的の変異の発現を抑制するのに非常に特異的である。理論に拘束されることなく、これらのＭｕｐＳｉは、機能的に、変異ｐ５３への依存及びドミナントネガティブ効果の両方を無効にすることによって細胞死を誘発し；治療環境で投与した場合、異種移植片における腫瘍成長を遅延させると考えられている。
【００１３】
従って、一例では、標的遺伝子内の単一点変異を標的とするための核酸配列が開示される。別の例では、標的遺伝子は、１つ又は複数の腫瘍抑制遺伝子である。さらに別の例では、腫瘍抑制遺伝子はｐ５３である。
【００１４】
機能的に、そして理論に束縛されることなく、これらの変異ｐ５３特異的ｓｉＲＮＡは、変異ｐ５３への依存及びドミナントネガティブ効果の両方を抑止することによって細胞死を誘発し；治療環境で投与した場合、異種移植片における腫瘍成長を遅らせ、変異特異的ｓｉＲＮＡを生成して、治療反応を改善するために効果的に使用できる、広く適用可能であり得る戦略を実証している。
【００１５】
一例では、核酸配列は、限定されるものではないが、細胞死、依存の抑止、標的遺伝子のいずれか１つ又は複数の活性化、ドミナントネガティブ効果の軽減、１つ又は複数の抗癌剤に対する感受性の増加、及び腫瘍成長の遅延又は停止のいずれか１つ又は複数をもたらす。別の例では、核酸配列は、変異腫瘍抑制遺伝子の対立遺伝子を実質的に抑制することができる。別の例では、本明細書に開示される核酸配列は、変異抑制遺伝子の対立遺伝子を抑制する。さらに別の例では、本明細書に開示される核酸配列は、対応する野生型対立遺伝子に影響を与えることなく、変異抑制遺伝子の対立遺伝子を抑制する。
【００１６】
本明細書で使用される「変異」又は「変異した」又は「遺伝子変化」という用語は、任意の生物、ウイルス、又は染色体外遺伝因子のゲノム又は核酸配列の一部の天然又は人工的な改変又は遺伝子変化を指す。この変異は、限定されるものではないが、化学物質及び放射線を使用して人工的に誘導することができるが、細胞分裂における核酸複製中に自然に生じ得る。変異は、生物の観察可能な特性（表現型）に識別可能な変化をもたらすこともあるし、もたらさないこともある。知られている様々な種類の変異があり、これらは小規模な変異又は大規模な変異のいずれかであり得る。小規模な変異の例としては、限定されるものではないが、置換変異、サイレント変異、ミスセンス変異、ナンセンス変異、挿入、及び欠失が挙げられる。大規模変異の例としては、限定されるものではないが、増幅、欠失、染色体転座、中間部欠失、染色体逆位、及びヘテロ接合性の消失をもたらす変異が挙げられる。変異は、結果として生じる産物の機能に対するそれらの影響によって分類することもできる。これらには、限定されるものではないが、機能喪失（不活性化）変異、機能獲得（活性化）変異、ドミナントネガティブ（アンチモルフ）変異、致死変異、及び復帰変異（ｂａｃｋ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）又は復帰変異（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）が含まれる。例えば、単一塩基修飾としても知られている点変異は、遺伝物質、ＤＮＡ、又はＲＮＡの単一ヌクレオチド塩基の置換、挿入、又は欠失を引き起こすタイプの変異である。「フレームシフト変異」という用語は、塩基対の付加又は欠失を指す。
【００１７】
本明細書で使用される「ホットスポット変異」という用語は、統計的に高い変異する傾向を示すＤＮＡ配列内の領域又は部位を指す。このような非常に頻繁な変異は、例えば、すべての癌の種類におけるｐ５３遺伝子で確認することができる。一例として、ｐ５３遺伝子内には６つの部位が見られる。これらのホットスポット変異部位には、Ｒ１７５、Ｒ２４８、Ｒ２４９、及びＲ２７３が含まれる。一例では、点変異の部位は、限定されるものではないが、Ｒ２４９（ｐ５３）、Ｒ２４８（ｐ５３）、Ｒ２７３（ｐ５３）、及びＲ１７５（ｐ５３）である。
【００１８】
従って、一例では、変異は点変異である。別の例では、点変異は置換変異である。さらに別の例では、変異はホットスポット変異である。
【００１９】
別の例では、点変異は、限定されるものではないが、Ｒ１７５Ｈ（ｐ５３）、Ｒ２４８Ｗ（ｐ５３）、Ｒ２７３Ｈ（ｐ５３）、Ｒ２４９Ｓ（ｐ５３）、及びそれらの組み合わせである。別の例では、点変異は、限定されるものではないが、Ｒ２４９Ｓ（ｐ５３）、Ｒ２４９Ｇ（ｐ５３）、Ｒ２４９Ｍ（ｐ５３）、Ｒ２４８Ｗ（ｐ５３）、Ｒ２４８Ｑ（ｐ５３）、Ｒ２７３Ｈ（ｐ５３）、Ｒ２７３Ｌ（ｐ５３）、及びＲ１７５Ｈ（ｐ５３）である。
【００２０】
癌における変異遺伝子の中で、腫瘍抑制遺伝子Ｔｐ５３（以下、ｐ５３と呼ぶ）の変異は、最も高い頻度で起こり、癌が発生するにはその機能を無効にしなければならない重要なゲートキーパー遺伝子としての地位を固めている。ｐ５３の変異は、その３９３残基のほぼすべてで発生する可能性があり、これらの変異は、複数の方法で腫瘍発生に影響を与える。まず、生殖細胞系のｐ５３の変異は、Ｌｉ−Ｆｒａｕｍｅｎｉ症候群及び多数のモデル生物で例証されているように癌の素因をもたらす。さらに、ｐ５３の変異は、変異型の発現を低下させることによって改善することができる、残りの野生型タンパク質に対する変異タンパク質のドミナントネガティブ（ＤＮ）効果に起因する場合が多い、療法に対する反応の悪さに関連している。最後に、癌細胞は、生存及び転移のために変異ｐ５３の存在に依存している場合が多く、変異ｐ５３の後天性機能獲得（ＧＯＦ）の多くを抑止すると、依存及び転移を減少させることができ、これによりインビボで腫瘍細胞死及び腫瘍負荷を誘発する。しかしながら、ＧＯＦ自体はすべてのｐ５３変異体の中で普遍的な現象ではないようである。
【００２１】
従って、治療の観点から、変異ｐ５３は、癌を処置するための主要な標的であると期待されるであろう。しかしながら、変異ｐ５３を標的とする試薬を開発することに関心がないのは、ｐ５３が「アンドラッガブル（創薬不可能な）」転写因子であると考えられているという事実に由来する。この考えは、ｐ５３標的剤の開発の進展を妨げてきた。さらに、最近、すべての変異が形態及び機能が等しいわけではないこと、並びに変異ｐ５３を標的とするには、様々なｐ５３変異体を選択的に標的とすることができる単剤とは対照的に、大量の分子が必要になるであろうことが示された。さらに、効果的であるためには、これらの分子のすべてが野生型形態の機能に影響を与えてはならない。従って、創薬に使用されている現在の技術は、適用されておらず、変異ｐ５３を標的とすることにも成功していない。
【００２２】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、それらの発現をうまく抑制するために多数の標的用に開発されており、本明細書に示されるように、様々な変異ｐ５３を標的とするための手段と見なすことができる。しかしながら、単一ヌクレオチドの変化を認識できるｓｉＲＮＡが、意図した標的の野生型の対応物に影響を与えることなく、主に単一ヌクレオチドの変化を標的とする特異性を達成できないことが原因で日常的に生成されていない。これらの技術は、同じ遺伝子の複数の遺伝子変化のための試薬を生成する際に日常的には利用されていない。従って、例えばｐ５３の６つのホットスポット変異に特異的なｓｉＲＮＡを生成する可能性が検討されている。本明細書で提供されるデータは、そのような変異ｐ５３特異的ｓｉＲＮＡ（ＭｕｐＳｉと呼ばれる）の生成を実証し、他の変異体又は野生型タンパク質に対する交差反応なしに、目的の変異ｐ５３型の発現を選択的にサイレンシングする際のそれらの有用性を実証する。さらに、これらのｓｉＲＮＡは、変異ｐ５３のドミナントネガティブ（ＤＮ）活性が野生型よりも改善されることを実証するために使用されており、これにより腫瘍細胞を治療処置に対して敏感にさせる。さらに、これらのｓｉＲＮＡはまた、生存のために変異ｐ５３への癌細胞の依存を抑止し、変異ｐ５３を発現する腫瘍細胞の細胞死をもたらす。最後に、ｓｉＲＮＡは治療薬として使用することができ、副作用も臓器毒性も有することなく、インビボで腫瘍成長を遅延させることができることが示されている（データは示していない）。このような変異ｐ５３特異的ｓｉＲＮＡ（ＭｕｐＳｉと呼ばれる）の生成が本明細書に示されている。さらに、目的の変異ｐ５３型の発現を選択的にサイレンシングする能力が、他の変異体又は野生型タンパク質に対する交差反応なしに実証される。さらに、これらのＲＮＡは、変異ｐ５３のドミナントネガティブ（ＤＮ）活性を野生型よりも改善し、これにより変異腫瘍細胞が治療処置に敏感になることが示されている。さらに、これらのＲＮＡはまた、生存のための変異ｐ５３への癌細胞の依存を抑止し、変異ｐ５３を発現している腫瘍細胞の細胞死をもたらすことも示されている。最後に、これらのＲＮＡは治療薬として使用することができ、いかなる副作用も臓器毒性ももたらすことなく、インビボで腫瘍成長を遅延させることができることが示されている。まとめると、このデータは、変異特異的ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡを日常的に生成できること、及びこれらの変異特異的ｓｉＲＮＡが癌の処置に有効であることを実証している。
【００２３】
「ＲＮＡｉ」という用語は、ＲＮＡ分子が遺伝子機能を阻害するプロセスであるＲＮＡ干渉を指す。この干渉は、対応する塩基配列を有する遺伝子の発現を干渉又は抑制する二本鎖ＲＮＡの能力に基づいている。例えば、２種類の低分子リボ核酸（ＲＮＡ）分子−マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉にとって重要である。ＲＮＡ分子（又はＲＮＡ）は、遺伝子の直接の産物であり、これらの低分子ＲＮＡは、例えば他の特定のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に結合することができ、それにより、例えばｍＲＮＡがタンパク質を産生するのを防止することによって、それらの活性を高めるか又は弱める。
【００２４】
本明細書で使用される「ＲＮＡ」、即ち「リボ核酸」という用語は、糖がリボース（又はその変形）であり、塩基がアデニン、シトシン、グアニン、及びウラシルである長いヌクレオチド鎖からなる有機分子を指す。本開示では、「ｓｉＲＮＡ」及び「ｓｈＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の概念を使用して機能する二本鎖ＲＮＡ分子のクラスを指す。ｓｉＲＮＡとｓｈＲＮＡの違いは２次構造にある。なぜなら、ｓｈＲＮＡが、その２次構造に急なヘアピンターンが存在するためにそのように呼ばれているからである。
【００２５】
従って、一例では、本明細書に開示される核酸配列は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）配列又は低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）配列である。別の例では、核酸配列はｓｉＲＮＡである。さらに別の例では、核酸配列はｓｈＲＮＡである。
【００２６】
一例では、ｓｉＲＮＡ配列は、１５〜１５０塩基対、６０〜１００塩基対、７０〜１２０塩基対、約６０塩基対、約６５塩基対、約７０塩基対、約７５塩基対、約８０塩基対、約８５塩基対、約９０塩基対、約９５塩基対、約１００塩基対、約１０５塩基対、又は約１１０塩基対の長さである。別の例では、ｓｉＲＮＡ配列は、少なくとも１５塩基対、少なくとも２０塩基対、少なくとも２５塩基対、少なくとも３０塩基対、少なくとも３５塩基対、少なくとも４０塩基対、少なくとも４５塩基対、又は少なくとも５０塩基対の長さである。
【００２７】
別の例では、ｓｈＲＮＡ配列は、１５〜３０塩基対、１９〜２９塩基対、１５〜２０塩基対、２０〜３０塩基対、約１８塩基対、約１９塩基対、約２０塩基対、約２１塩基対、約２２塩基対、約２３塩基対、約２４塩基対、約２５塩基対、約２６塩基対、約２７塩基対、約２８塩基対、約２９塩基対、又は約３０塩基対の長さのステムを含む。
【００２８】
さらに別の例では、開示される核酸配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号４４、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号４５、配列番号４６、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号４７、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、又は配列番号３３の配列のうちの１つを含む。
【００２９】
まとめると、本明細書、例えば本明細書に開示される図２Ａ〜図２Ｄに示されるデータは、広範なスクリーニングにより、単一ヌクレオチド変化に対して非常に特異的且つ選択的であるｓｉＲＮＡを再現可能に生成することが可能であることを示す。従って、一例では、本明細書に開示される核酸配列は、配列番号９、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１７、又は配列番号２１の配列のうちの１つを含む。
【００３０】
一例では、本明細書に開示される核酸配列は、配列番号８（Ｒ１７５Ｈ  Ｓｉ−１−Ｒ１７５Ｈ）、配列番号９（Ｒ１７５Ｈ  Ｓｉ−２−Ｒ１７５Ｈ）、配列番号１２（Ｒ２４８Ｗ／Ｑ  Ｓｉ−３−Ｒ２４８Ｗ／Ｒ２４８Ｑ）、配列番号１３（Ｒ２４８Ｗ／Ｑ  Ｓｉ−４−Ｒ２４８Ｗ／Ｒ２４８Ｑ）、配列番号１６（Ｒ２４９Ｓ／Ｍ／Ｇ  Ｓｉ−５−Ｒ２４９Ｓ／Ｒ２４９Ｍ／Ｒ２４９Ｇ）、配列番号１７（Ｒ２４９Ｓ／Ｍ／Ｇ  Ｓｉ−６−Ｒ２４９Ｓ／Ｒ２４９Ｍ／Ｒ２４９Ｇ）、配列番号２０（Ｒ２７３Ｈ／Ｌ  Ｓｉ−７−Ｒ２７３Ｈ／Ｒ２７３Ｌ）、又は配列番号２１（Ｒ２７３Ｈ／Ｌ  Ｓｉ−８−Ｒ２７３Ｈ／Ｒ２７３Ｌ）の配列のうちの１つを含む。
【００３１】
さらに別の例では、本明細書に開示される核酸配列は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、又は配列番号３３の配列のうちの１つを含む。
【００３２】
別の例では、本明細書に開示される核酸配列は、配列番号２６及び配列番号２７；配列番号２８及び配列番号２９；配列番号３０及び配列番号３１；又は配列番号３２及び配列番号３３の配列対の１つを含む。
【００３３】
さらなる例では、一例では、本明細書に開示される核酸配列は、配列番号９、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１７、又は配列番号２１の配列のうちの１つを含む。
【００３４】
一例では、核酸配列は配列番号２である。別の例では、核酸配列は配列番号３である。一例では、核酸配列は配列番号４である。一例では、核酸配列は配列番号５である。一例では、核酸配列は配列番号３６である。一例では、核酸配列は配列番号３７である。一例では、核酸配列は配列番号３８である。一例では、核酸配列は配列番号３９である。一例では、核酸配列は配列番号７である。一例では、核酸配列は配列番号８である。一例では、核酸配列は配列番号９である。一例では、核酸配列は配列番号１１である。一例では、核酸配列は配列番号４４である。一例では、核酸配列は配列番号１２である。一例では、核酸配列は配列番号１３である。一例では、核酸配列は配列番号１５である。一例では、核酸配列は配列番号４５である。一例では、核酸配列は配列番号４６である。一例では、核酸配列は配列番号１６である。一例では、核酸配列は配列番号１７である。一例では、核酸配列は配列番号１９である。一例では、核酸配列は配列番号４７である。一例では、核酸配列は配列番号２０である。一例では、核酸配列は配列番号２１である。一例では、核酸配列は配列番号２６である。一例では、核酸配列は配列番号２７である。一例では、核酸配列は配列番号２８である。一例では、核酸配列は配列番号２９である。一例では、核酸配列は配列番号３０である。一例では、核酸配列は配列番号３１である。一例では、核酸配列は配列番号３２である。一例では、核酸配列は配列番号３３である。
【００３５】
一例では、核酸配列は、配列番号２４（ＡＡＧＣＴＴＴ）、配列番号４０（ＴＴＣＡＡＧＡＧＡ）、及び配列番号４１（ＴＴＴＴＴＴＡ）を含み、これにより、この核酸配列は次の構造を有する：５’−ＡＡＧＣＴＴＴＮ（１９−２９）（センス配列）ＴＴＣＡＡＧＡＧＡＮ（１９−２９）（アンチセンス配列）ＴＴＴＴＴＴＡ−３’。これは、例示的なｓｈＲＮＡ上部オリゴヌクレオチドであり、各オリゴヌクレオチドの前及び末端に示される（Ｎ（１９−２９）と呼ばれるｓｉＲＮＡ配列以外の）ヌクレオチドは制限酵素切断部位用である。中央配列（この例では、ＴＴＣＡＡＧＡＧＡ）は、ステムループの形成用である。
【００３６】
別の例では、核酸配列は、配列番号２５（ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡ）、配列番号４２（ＴＣＴＣＴＴＧＡＡ）、及び配列番号４３（ＧＧＧ）を含み、これにより、この核酸配列は次の構造を有する：５’−ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＮ（１９−２９）（センス配列）ＴＣＴＣＴＴＧＡＡＮ（１９−２９）（アンチセンス配列）ＧＧＧ−３’。これは、例示的なｓｈＲＮＡ下部オリゴヌクレオチドであり、各オリゴヌクレオチドの前及び末端に示される（Ｎ（１９−２９）と呼ばれるｓｉＲＮＡ配列以外の）ヌクレオチドは制限酵素切断部位用である。中央配列（この例では、ＴＣＴＣＴＴＧＡＡ）は、ステムループの形成用である。
【００３７】
本明細書で提示される結果は、非常に特異的であり、且つ１つのヌクレオチド変化を区別することができるｓｉＲＮＡを実際に定期的に生成することができることを実証し、４つのｐ５３ホットスポット変異を標的とする際にそれらの有用性を明らかにしている。これらの４つのｐ５３変異体は、癌に見られるすべてのｐ５３変異体の約２０％を占め、従って、すべての癌の約１０％を標的にする可能性を表している。変異ｐ５３を標的にすると、ヘテロ接合性細胞の野生型ｐ５３タンパク質に影響を及ぼさず、この野生型ｐ５３タンパク質が細胞死を誘導するように機能することが可能になるため化学感受性が改善される。さらに、変異ｐ５３のみを発現する癌細胞における変異ｐ５３発現の抑止は、ヘテロ接合性の喪失により野生型ｐ５３対立遺伝子が失われる癌の後期段階でしばしば見られ、単剤療法として使用した場合でも、インビボでの腫瘍成長を遅らせた。このデータは、これらのｐ５３変異特異的ｓｉＲＮＡの治療的使用を明らかにしており、その効果は、他の化学療法剤や放射線療法と組み合わせてさらに強化できるであろう。従って、これらのデータは、臨床的利益のために変異ｐ５３を直接標的とする弾みを与え、これは、すぐに臨床の場に取り入れられるであろう。
【００３８】
変異ｐ５３は、すべての癌で最も変異した遺伝子であり、重要なことに、すべての変異が同様に振る舞うわけではなく、従って、変異のそれぞれを標的とする選択的薬剤を必要とするため、ヌクレオチド特異的ｓｉＲＮＡを実証するためにこの変異ｐ５３を選択した。さらに、変異ｐ５３を標的とすることは、腫瘍細胞の増殖及び転移を遅延させ、一般的な細胞毒性薬に対する感受性を向上させるための巨大な未開拓の経路を意味するため、ほとんどの癌型に対して適用性が見出されるであろう。同様に、変異ｐ５３と共に特異的ｓｉＲＮＡで他のドライバー癌遺伝子を標的とすることは、治療効果を高めると考えられるため、各癌型の主要な遺伝子変化に対するｓｉＲＮＡのカクテルの使用は、臨床現場でも可能である。
【００３９】
従って、一例では、対象の癌を処置する方法が開示される。別の例では、方法は、本出願に記載される１つ又は複数の核酸配列を対象に投与することを含む。さらに別の例では、核酸配列は、標的遺伝子内の１つ又は複数の点変異を標的とする。別の例では、標的遺伝子は、１つ又は複数の腫瘍抑制遺伝子である。さらに別の例では、方法は、本明細書に開示される１つ又は複数の核酸配列を対象に投与することを含み、この核酸配列は、標的遺伝子内の１つ又は複数の点変異を標的とし、この標的遺伝子は腫瘍抑制遺伝子である。また、対象の癌を処置するための薬剤の製造における、本明細書に開示される１つ又は複数の核酸配列の使用も本明細書に開示される。さらに、治療における本明細書に開示される核酸配列の１つ又は複数の使用も本明細書に開示される。別の例では、本明細書に開示される核酸配列は治療で使用するためのものである。
【００４０】
本明細書で使用される「処置する」若しくは「処置」という用語は、弱った状態及び／若しくは不健康な状態の発症を防止するために予防的に作用するのに十分な、薬学的有効量若しくは治療有効量の、例えば、核酸、タンパク質、若しくはそのそれぞれの医薬組成物若しくは薬剤を提供すること；並びに／又は疾患状態及び／若しくは疾患状態の症状、弱った状態及び／若しくは不健康な状態を緩和又は解消するのに十分な量の医薬組成物若しくはその薬剤を対象に提供することを指すものとする。当技術分野で知られているように、所与の組成物の薬学的有効量は、投与経路にも依存するであろう。一般に、必要な量は、投与が、例えば、胃腸管を介する場合（例えば、坐剤による、直腸、又は胃内プローブによる場合）はより高く、投与経路が非経口的、例えば、静脈内である場合はより低くなるであろう。
【００４１】
ヒトの癌で高度に現れる様々なｐ５３変異体に非常に特異的であるｓｉＲＮＡの生成及び特徴付けが示されている。このデータは、適切な送達メカニズムによる臨床評価のために直接変換される。
【００４２】
一例では、核酸配列の１つ又は複数の投与は、限定されるものではないが、細胞死、標的遺伝子のいずれか１つ又は複数への依存の抑止、ドミナントネガティブ効果、１つ又は複数の抗癌剤に対する感受性の増加、及び腫瘍成長の遅延又は停止を含む、１つ又は複数の効果をもたらす。別の例では、開示された核酸配列は、治療薬と共に投与される。
【００４３】
本明細書で使用される「治療薬」という用語は、対象に適切に投与された場合に所望の治療効果を誘発することができる化学化合物又は組成物を指す。例えば、糖尿病治療薬は、例えば、対象の糖尿病を処置するために投与されるという点で、治療薬と見なされる。従って、一例では、本明細書に開示される方法は、治療薬の投与を含む。別の例では、治療薬は、抗癌剤である。別の例では、抗癌剤は、１０−ヒドロキシカンプトテシン、アブラキサン、アセジアスルホン、アクラルビシン、塩酸アクラビン、アンバゾン、アムサクリン、アミノグルテチミド、アナストロゾール、塩酸アンシタビン、Ｌ−アスパラギナーゼ、アザチオプリン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、ホリナートカルシウム、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐ  ｌａｔｉｎ）、カルペシタビン、カルムスチン、セレコキシブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダプソン、ダウノルビシン、ジブロムプロパミジン、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エメチン、エンジイン、エピルビシン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、エストラムシンリン酸（ｅｓｔｒａｍｕｃｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、エストロゲン、エチニルエストラジオール、エトポシド、エピルビシン塩酸塩、フェソロデックス、フラボピリドール、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、フォスフェストロール、フラゾリドン、ガンボギン酸アミド、ガンボギン酸、ゲムシタビン、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体、ハーセプチン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシカルバミド、ヒドロキシメチルニトロフラントイン、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イドクスウリジン、イホスファミド、インターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）、イリノテカン、イマチニブ、イリノテカン、レトロゾール、ロイプロリド、ロムスチン、ルルトテカン、硫酸マフェニドオラミド、メクロレタミン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メガストロール（ｍｅｇａｓｔｒｏｌａｃｅｔａｔｅ）、メルファラン、メパクリン、メルカプトプリン、メトトレキセート、メトロニダゾール、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン塩酸塩、ミトポドジド、ミトタン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、ナリジクス酸、ニフラテル、ニフロキサジド、ニフララジン、ニフルチモックス、ニムスチン、ニノラゾール、ニトロフラントイン、ナイトロジェンマスタード、オレオムシン（ｏｌｅｏｍｕｃｉｎ）、オキソリン酸、オキサリプラチン、ウアバイン、ペンタミジン、ペントスタチン、フェナゾピリジン、フタリルスルファチアゾール、酢酸フェニル水銀、ピクロポドフィロトキシン、ピポブロマン、プレドニムスチン、プレドニゾン、プレウシン、プリスチメリン、プロカルバジン、ピリメタミン、キナクリン塩酸塩、ラルチトレキセド、ラパマイシン、ロテノン、ロフェコキシブ、ロシグリタゾン、ラロキシフェン、サラゾスルファピリジン、塩化スクリフラビニウム（ｓｃｒｉｆｌａｖｉｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、セムスチンストレプトゾシン、��ルファカルバミド、スルファセタミド、スルファクロピリダジン、スルファジアジン、スルファジクラミド、スルファジメトキシン、スルファエチドール、スルファフラゾール、スルファグアニジン、スルファグアノール、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、コトリモキサゾール、スルファメトキシジアジン、スルファメトキシピリダジン、スルファモキソール、スルファニルアミド、スルファペリン、スルファフェナゾール、スルファチアゾール、スルフィソミジン、スタウロスポリン、タモキシフェン、タキソール、テモゾリミド、テニポシド、テルチポシド、テストラクトン、プロピオン酸テストステロン、チメロサール、チオグアニン、チオテパ、イミダゾール、トポテカン、トラスツズマブ、トリアジクオン、トレオスルファン、トリメトプリム、トロホスファミド、ＵＣＮ−０１、ビンブラスチン、ビンブラスチン硫酸塩、ビンクリスチン、ビンクリスチン硫酸塩、ビンデシン、ビノレルビン、及びゾルビシン、又はそれらの各誘導体又は類似体からなる群から選択される。一例では、化学療法剤は、限定されるものではないが、シスプラチン、エトポシド、アブラキサン、トラスツズマブ、ゲムシタビン、イマチニブ、イリノテカン、オキサリプラチン、ボルテゾミブ、メトトレキセート、クロラムブシル、ドキソルビシン、ダカルバジン、シクロホスファミド、パクリタキセル、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、ビンクリスチン、ドセタキセル、ビノレルビン、エポチロンＢ、ゲフィチニブ、及びそれらの組み合わせである。別の例では、抗癌剤は、限定されるものではないが、シスプラチン、エトポシド、アブラキサン、トラスツズマブ、ゲムシタビン、イマチニブ、イリノテカン、オキサリプラチン、ボルテゾミブ、メトトレキセート、クロラムブシル、ドキソルビシン、ダカルバジン、シクロホスファミド、パクリタキセル、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、ビンクリスチン、ドセタキセル、ビノレルビン、ゲフィチニブ、エポチロンＢ、及びそれらの組み合わせである。
【００４４】
従って、本明細書に開示される方法は、過剰増殖性疾患、例えば癌を処置するために使用することができる。一例では、癌は、限定されるものではないが、食道、上気道、皮膚、上皮、中枢神経系、卵巣、乳房、胃−腸、大腸、小腸、結腸直腸、肝臓、腺癌、副腎腺癌、甲状腺、肺、膵臓、腎臓、子宮内膜、造血、筋肉、結合組織（腱又は軟骨など）、骨、軟組織、リンパ組織、リンパ系、及び免疫系を含む哺乳動物の体の臓器及び部位にある、又はそれらを起源とすることが分かっている。別の例では、癌の種類は、限定されるものではないが、黒色腫、骨髄腫、癌腫、肉腫、リンパ腫、芽細胞腫、及び胚細胞腫瘍である。別の例では、癌は、限定されるものではないが、肺癌、悪性黒色腫、結腸癌、乳癌、子宮内膜腺癌、横紋筋肉腫、腎腺癌、結腸腺癌、肝細胞癌、気管支扁平上皮癌、卵巣癌、及び膵臓腺癌である。
【００４５】
別の例では、癌は、限定されるものではないが、Ａ５４９、Ａ３７５、ＨＣＴ１１６、ＲＫＯ、ＡＵ５６５、ＳＫＢＲ３、ＨＣＣ１３９５、ＨＥＣ  １Ａ、ＲＤ、７８６−Ｏ、ＣＯＬＯ−３２０ＤＭ、ＰＬＣ−ＰＲＦ／５、ＫＮＳ−６２、ＢＴ５４９、ＡＳＰＣ１、ＷｉＤＲ１、及びＨ１９７５を含む癌細胞株である。別の例では、癌は、腫瘍抑制遺伝子の１つ又は複数に依存している。さらに別の例では、腫瘍抑制遺伝子はｐ５３である。さらなる例では、癌は、腫瘍抑制遺伝子に依存し、この腫瘍抑制遺伝子はｐ５３である。
【００４６】
本明細書に提示される結果は、特異的であり、１つのヌクレオチド変化を区別することができるｓｉＲＮＡは、実際に定期的に生成できることを実証し、４つのｐ５３ホットスポット変異を標的とする際のそれらの有用性を明らかにしている。本明細書に開示される４つのｐ５３変異体は、癌に見られるすべてのｐ５３変異体の約２０％を占め、それらを標的とすることは、すべての癌の約１０％を標的とする可能性を表している。変異ｐ５３を標的とすると、ヘテロ接合性細胞の野生型ｐ５３タンパク質にほとんど又はまったく影響を及ぼさず、この野生型ｐ５３タンパク質が細胞死を誘導するように機能することが可能になるため化学感受性が改善される。さらに、変異ｐ５３のみを発現する癌細胞における変異ｐ５３発現の抑止は、ヘテロ接合性の喪失により野生型ｐ５３対立遺伝子が失われる癌の後期段階でしばしば見られ、単剤療法として使用した場合でも、インビボでの腫瘍成長を遅らせた。このデータは、本明細書に開示されるＲＮＡ構築物によって提供される治療の可能性を明らかにしており、その効果は、他の化学療法剤又は放射線療法と組み合わせてさらに増強することができるであろう。従って、本明細書に示されるデータはまた、変異ｐ５３を標的とすることが臨床的利益を直接有し、これが臨床の場に取り入れられるであろうことも実証している。
【００４７】
ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡは、遺伝子発現をサイレンシングするための生成に成功しており、研究で広く使用されており、臨床の場にも取り入れられている。これらのｓｉＲＮＡのほとんどは、他の関連遺伝子との交差反応なしに、遺伝子全体（タンパク質）を標的にする。しかしながら、疾患の状態で見られる単一ヌクレオチドの変化を見分けることができるｓｉＲＮＡの生成については、数例しか存在しない。単一のヌクレオチドに対していくつかの特異性を有するように生成されたｓｉＲＮＡは、Ｒ２４８Ｗ変異ｐ５３に対するｓｉＲＮＡを含む。これらは、レポーターアッセイ及び過剰発現系において比較的特異的であることが示されているが、野生型タンパク質とのあるレベルの交差反応がしばしば指摘されている。さらに、ｓｉＲＮＡの多くは、それらの特異性を明確に立証するべく多数の細胞株で試験されていない。これらの因子は、ヌクレオチドレベルで特異性を示し、ｐ５３のように通常の生理機能の多数のプロセスに影響を与える重要な遺伝子に使用できるｓｉＲＮＡを得る際の大きな課題を明らかにしている。本明細書に示されているデータは、特にｓｉＲＮＡ配列におけるいくつかのヌクレオチドの加算又は減算の影響により大きな違いが生じ得るため、非常に特異的なｓｉＲＮＡを得る前に、ｓｉＲＮＡの大きなライブラリーを試験する必要があることを明らかにした。ｓｉＲＮＡの配列の非常にとらえにくい変化は、特異性に大きく影響し、選択性に顕著な違いをもたらす可能性があり、様々な配列の影響を直感的に予測できないことを明らかにする。ヌクレオチド特異的であると思われるｓｉＲＮＡを得ることは比較的可能であるが、特に１つ又は２つの細胞株に対してアッセイする場合、又はトランスフェクション系を使用する場合、それらが特異的であることを確認するために、細胞系の大きなパネルに対する分析が不可欠である。これは、これらのｓｉＲＮＡが臨床の場での使用を目的としている場合は非常に重要である。本明細書に提示された一連のｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ配列は、ｐ５３に変異を有するすべての癌のほぼ２０％を特異的に標的とすることができるユニークな一連のＲＮＡを表し、十分なスクリーニングにより、ヌクレオチド特異的ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡを生成し、臨床試験で評価できるという見解を支持する。
【００４８】
変異ｐ５３は、すべての癌で最も変異した遺伝子であるため、ヌクレオチド特異的ｓｉＲＮＡを生成する能力を実証するためにこの変異ｐ５３を選択した。重要なことに、すべてのｐ５３変異体が同じように振る舞うわけではないため、変異ｐ５３を標的とするには、それらのそれぞれを個別に標的とするために選択剤が必要である。さらに、変異ｐ５３を標的とすることは、腫瘍細胞の増殖及び転移を遅延させ、一般的な細胞毒性剤に対する感受性を向上させるための未開拓の経路を意味するため、ほとんどの癌型に対して適用性が見出されるであろう。すでに明らかにしたように、変異ｐ５３は、腫瘍形成の初期段階で野生型対立遺伝子と共に存在し得る、又は後期段階でＬＯＨによる野生型対立遺伝子の消失後にそれ自体で存在し得る。初期段階では、変異ｐ５３はドミナントネガティブ（ＤＮ）効果によってＷＴタンパク質を阻害し、後期段階では、変異は、野生型対立遺伝子とは無関係に生存の利点を提供する。本明細書に示されるデータは、変異ｐ５３特異的ｓｉＲＮＡが、ドミナントネガティブ（ＤＮ）効果、及び癌細胞の変異ｐ５３への依存の両方を緩和することができ、従って、変異が腫瘍に存在する限り広く使用できることを実証している。同様に、変異ｐ５３と共に特異的ｓｉＲＮＡで他のドライバー癌遺伝子を標的とすることは、治療効果を高めると理解されており、各癌型の主要な遺伝子変化に対するｓｉＲＮＡのカクテル（又は標的遺伝子の発現をサイレンシングできる他のＲＮＡ）は、交差反応を最小限に抑え、従って今日の抗癌剤の多くに関連する副作用を軽減するため、臨床的に有益であると考えられている。
【００４９】
本明細書に例示的に記載される本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の１つ又は複数の要素、任意の１つ又は複数の限定がなくても適切に実施することができる。従って、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、限定ではなく拡大して読まれるべきである。さらに、本明細書で使用されている用語及び表現は、限定ではなく説明の用語として使用されており、そのような用語及び表現の使用では、示され説明された特徴又はその一部の任意の同等物を除外する意図はないが、請求された本発明の範囲内で様々な変更が可能であることを認識されたい。従って、本発明は、好ましい実施形態及び任意選択の特徴によって具体的に開示されたが、本明細書で開示され本明細書で実施される発明の修正及び変形は、当業者に依存することができること、並びにそのような修正及び変形が、本発明の範囲内であると見なされることを理解されたい。
【００５０】
本出願で使用される単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈がそうでないことを明確に指示しない限り、複数の参照を含む。例えば、「遺伝子マーカー」という用語は、それらの混合物及び組み合わせを含む、複数の遺伝子マーカーを含む。
【００５１】
本明細書で使用される「約」という用語は、製剤の成分の濃度の文脈では、典型的には、表示値の＋／−５％、より典型的には表示値の＋／−４％、より典型的には表示値の＋／−３％、より典型的には表示値の＋／−２％、より一層典型的には表示値の＋／−１％、より一層典型的には表示値の＋／−０．５％を意味する。
【００５２】
本開示全体を通して、特定の実施形態は、範囲の形で開示することができる。範囲の形での説明は、単に便宜及び簡潔さのためであり、開示される範囲のスコープに対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。従って、範囲の説明は、すべての可能な部分範囲及びその範囲内の個々の数値が具体的に開示されたと考えるべきである。例えば、１〜６などの範囲の説明は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの具体的に開示された部分範囲、及びその範囲内の個々の数値、例えば、１、２、３、４、５、６を有すると考えるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【００５３】
特定の実施形態はまた、本明細書では広く一般的に説明することができる。一般的な開示に含まれるより狭い種及び亜属の分類のそれぞれも、開示の一部を形成する。これには、切除された材料が本明細書に具体的に記載されているか否かにかかわらず、属から任意の対象物を排除するという条件又は負の制限を伴う実施形態の一般的な説明が含まれる。
【００５４】
本発明は、本明細書で広く一般的に説明してきた。一般的な開示に含まれるより狭い種及び亜属の分類のそれぞれも、本発明の一部を形成する。これには、切除された材料が本明細書に具体的に記載されているか否かにかかわらず、属から任意の対象物を排除するという条件又は負の制限を伴う発明の一般的な説明が含まれる。
【００５５】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲及び非限定的な例の範囲内である。さらに、本発明の特徴又は態様がマーカッシュグループに関して説明される場合、当業者であれば、本発明が、それによりマーカッシュグループの任意の個々のメンバー又はメンバーのサブグループに関しても説明されることを認識するであろう。
【実施例】
【００５６】
実験セクション
材料及び方法
細胞培養
細胞株をＡＴＣＣ及びＪＣＲＢから入手し、標準的な条件下（３７℃、５％ＣＯ２）で、以下の培地で培養した：Ｈ１２９９、ＲＫＯ、ＨＣＴ１１６、Ａ５４９、Ａ３７５、ＳＫＢＲ３、ＲＤ、ＰＬＣ−ＰＲＦ−５、ＫＮＳ−６２、及びＨＥＣ１Ａ細胞株の場合は、４．５ｇ／Ｌのグルコースを含むＤＭＥＭ及び１０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）；ＡＵ５６５、ＨＣＣ１３９５、ＣＯＬＯ−３２０ＤＭ、７８６−Ｏ、ＡＳＰＣ−１、ＷｉＤＲ、及びＨ１９７５の場合は、ＲＰＭＩ−１６４０及び１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）；ＢＴ−５４９；ＲＫＯ  ｐ５３＋／−及び＋／Ｒ２４８Ｗ及びＨＣＴ  ｐ５３＋／−及び＋／Ｒ２４８Ｗの場合は、０．０２３ＩＵ／ｍｌのインスリンを含むＲＰＭＩ−１６４０及び１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）。
【００５７】
ｓｉＲＮＡの設計
ｓｉＲＮＡの大規模なライブラリーを、ｐ５３ホットスポット変異（Ｒ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、及びＲ２７３Ｈ）を標的とするように設計し、これらから、さらなる特徴付けのために４つの変異について８つが候補に挙がった（ｓｉ−１−８）。本発明者らのスクリーニングで生成されたすべてのｐ５３対立遺伝子に対するｓｉＲＮＡを、ｐａｎ−ｐ５３を標的とするための陽性対照として使用した。対照スクランブルｓｉＲＮＡは、ヒトゲノムにおけるバイオインフォマティックに予測された配列標的であり、これを陰性対照として使用した。
【００５８】
ｐ５３  ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡのトランスフェクション、並びにＲＮＡ及びタンパク質の分析
トランスフェクションの２４時間前に、ウェルあたり２．５×１０５個の細胞を６ウェルプレートに播種した。製造者の説明に従って、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、細胞を８０ｎＭ  ｓｉＲＮＡ又は１μｇのｐＲｅｔｒｏＳｕｐｅｒ−ｓｈＲＮＡでトランスフェクトした。各トランスフェクションを３連で行い、トランスフェクションの７２時間後に細胞を１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で回収した。ｐ５３  ｃＤＮＡとの同時トランスフェクションでは、ｐ５３  ｃＤＮＡを、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの２４時間後にトランスフェクトし、ｃＤＮＡトランスフェクションの４８時間後（即ち、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの７２時間後）に細胞を分析した。
【００５９】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの標準的なプロトコルを使用して全ＲＮＡの単離を行い、ｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して調製した。定量的及び半定量的逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ分析を、記載されているように次のｐ５３標的遺伝子：ｐ２１、ｐｉｇ３、ｍｄｍ２、ｎｏｘａ、及びｇａｐｄｈに対して行った。
【００６０】
細胞抽出物を溶解緩衝液（０．７％ＮＰ４０；Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、ｐＨ７．４；７０ｍＭ  ＥＤＴＡ；２００ｎＭ  ＮａＣｌ、氷上で１０分間）で調製した。タンパク質の定量後、３０〜５０μｇの溶解物をＳＤＳ−ポリアクリルアミド（ｐｏｌｙｃｒｙｌａｍｉｄｅ）ゲル（１２％）電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけ、分離されたタンパク質を電気泳動によりポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｒｅｄａ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に移した。タンパク質の検出は、ＥＣＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｗａｕｋｅｓｈａ，ＷＩ，ＵＳＡ）で行った。ｐ５３を、マウス抗ｐ５３モノクローナル抗体（ＤＯ−１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから、＃ＳＣ１２６）で検出し、アクチンを、ウサギ抗アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ、＃８２０６１）で検出した。最初の抗体からのバックグラウンドが高い場合、平行ゲルを等量の溶解物と共に泳動させて、様々な抗体で別々に調べた。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、レーンプロッティング（ｌａｎｅ  ｐｌｏｔｔｉｎｇ）及びピールラベリング（ｐｅａｌ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ）（信号強度の定量）によってウエスタンブロットの定量を行った。各試料について、アクチンバンド強度に対するｐ５３の比率を計算し、ｓｉ−ｓｃｒ／ｓｈ−ｓｃｒ対照の比率に対して正規化した。値は、正規化された倍数変化を表す。
【００６１】
細胞死アッセイ
細胞を８０ｎＭ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、培地中での細胞浮遊を含むトランスフェクションの７２時間後に回収した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、７０％エタノールで一晩固定し、ＲＮａｓｅで２０分間処理した後、５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の添加及びフローサイトメトリー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ）によるフローサイトメトリー分析によってアポトーシスを測定した（ｓｕｂ−Ｇ１  ＤＮＡ含量）。
【００６２】
ｓｈＲＮＡ鋳型オリゴヌクレオチドの設計及びプラスミドの構築
ｓｈＲＮＡ標的配列を、前述のｓｉＲＮＡ配列と相同となるように設計した。ｐＲｅｔｒｏ−Ｓｕｐｅｒベクターには、ｓｈＲＮＡ発現用のヒトＨ１ポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ−ＩＩＩ）プロモーターが含まれている。各ｓｈＲＮＡインサートを、制限酵素（ＲＥ）消化によって作製されたものと同一のオーバーハング末端を有する合成二重鎖として設計した（５’にＢａｍＨＩ及び３’にＨｉｎｄＩＩＩ）。各ヘアピンのコード領域は、単一のオリゴヌクレオチド（上部オリゴヌクレオチド：５’−ＡＡＧＣＴＴＴＮ（１９−２９）（センス配列）ＴＴＣＡＡＧＡＧＡＮ（１９−２９）（アンチセンス配列）ＴＴＴＴＴＴＡ−３’）及びその相補等価物（下部オリゴヌクレオチド：５’−ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＮ（１９−２９）（センス配列）ＴＣＴＣＴＴＧＡＡＮ（１９−２９）（アンチセンス配列）ＧＧＧ−３’）内にネストされている。これらのサイズは、（１９〜２９ｂｐのステムを有するヘアピンのために）６０〜１００塩基の範囲であった。各二重鎖には、転写開始塩基、ｓｈＲＮＡコード領域（センスステム、ループ配列、アンチセンスステム）、終止スペーサー、及び少なくとも４つの「Ｔ」の連続からなるｐｏｌ−ＩＩＩ終結シグナルが含まれていた。転写開始塩基は、「Ａ」又は「Ｇ」（効率的なｐｏｌ−ＩＩＩ転写開始に必要）であり、ヘアピンステムの最初の塩基がプリンでない場合にのみ含まれていた。終止スペーサーは、「Ｔ」以外の任意の塩基であり、「Ｔ」の初期の連続による早期終了を防止するために、アンチセンスステムの最後の塩基が「Ｔ」の場合にのみ含まれていた。オリゴヌクレオチドは、最小限の合成及び精製規模で注文した（０．０５μＭ及び脱塩、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。各オリゴヌクレオチドを１００μＭの濃度で水に再懸濁し、それぞれからの１０μｌを２０μｌの２×アニーリング緩衝液（２００ｍＭ  酢酸カリウム、６０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ＫＯＨ  ｐＨ７．４、４ｍＭ  酢酸マグネシウム）に加え、９５℃で１０分間加熱し、ゆっくりと室温に平衡化し、連結のために１：１０００倍に希釈した。インサートとベクターを連結し、ＴＯＰ１０又はＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。ｓｈＲＮＡインサートを含むクローンを選択し、トランスフェクションの前に精製した。
【００６３】
コロニー形成アッセイ
示された細胞株を、様々な変異ｐ５３をサイレンシングするためのオリゴヌクレオチド配列を含む示されたｓｈＲＮＡプラスミドでトランスフェクトし、１５μｇ／ｍｌのブラスチシジン（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）で２週間にわたり選択した。記載されているように、コロニーをクリスタルバイオレット溶液（Ｍｅｒｃｋ）で染色した。
【００６４】
インビボでの腫瘍成長の分析のためのｓｈＲＮＡ発現細胞株の作製
ｐ５３変異特異的ｓｈＲＮＡ用のウイルスを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｐＣＬ−Ａｍｐｈｏ両種性ウイルスパッケージングプラスミドを使用して作製した。簡単に述べると、リポフェクタミン２０００（商標）を使用して、１．５μｇの適切なｓｈＲＮＡ及び１．０μｇのパッケージングプラスミドでＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトすることによってレトロウイルスを調製した。レトロウイルス上清を、トランスフェクションの２４時間後に回収し、０．４５μＭ  シリンジフィルターでろ過し、等分して急速冷凍した。３．５ｍｌのレトロウイルス上清を使用して、６ｃｍ皿に３連の８μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ）の存在下で、１０ｃｍ皿に５×１０５個の細胞を形質導入した。翌日、２回目の形質導入を行った。２回目の形質導入の４８時間後に、１０μｇ／ｍｌのブラストサイジンを使用して細胞を選択し、インビボ異種移植試験用に採取した。並行培養物を免疫ブロット分析に使用して、ｐ５３ノックダウンの効率を評価した。
【００６５】
それぞれのｓｈＲＮＡを発現する細胞株を収集し、氷上で５０％マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）基底膜マトリックス）（Ｓｉｇｍａ）と混合し、Ｃ．Ｂ−１７  ＳＣＩＤ雌マウス（６〜８週齢）の右側腹部に皮下注射し、スクランブルｓｈＲＮＡで形質導入した細胞を各マウスの左側腹部に注射した。腫瘍体積を週に２回キャリパーで評価し、腫瘍が触知可能になるとすぐに値を記録した。腫瘍体積の計算は、Ｖ＝１／２×（長さ×幅２）に従って行った。値を標準偏差と共に平均値としてプロットする。成長曲線間の統計学的差異を、対応のない（両側）ｔ検定を使用して、ＰＲＩＳＭソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で計算した。各郡において、４〜５匹のマウスを各処置に使用した。
【００６６】
マウスを屠殺してから、腫瘍組織を切除し、１０％ホルマリンで一晩固定し、脱水し、パラフィンに包埋し、そして５μｍの切片に調製した。ｐ５３  １Ｃ１２マウスモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃２５２４）を１：１５００の濃度で使用して、抗ｐ５３染色を行った。Ｄａｋｏ  ＲＥＡＬ（商標）ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）検出システム、ペルオキシダーゼ／ＤＡＢ＋、ウサギ／マウス（＃５００７）を使用して、染色シグナルを発現させた。動物実験はすべて、施設の動物保護及び倫理委員会の承認を得て実施した。
【００６７】
結果
ホットスポットｐ５３変異体の対立遺伝子特異的ｓｉＲＮＡの設計及び選択
ｓｉＲＮＡの生成の出発点は、これらのｓｉＲＮＡが、ＷＴ  ｐ５３発現に影響を与えることなく、変異ｐ５３対立遺伝子のみをサイレンシングすることができるであろうということであった。この目的のために、多数のｓｉＲＮＡのライブラリーを、変異体ヌクレオチドの位置がｓｉＲＮＡ鎖全体に対して異なるように配列歩行（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗａｌｋ）を実行することによって構築した。すべてのｓｉＲＮＡを、様々なｐ５３変異体又は温度感受性（ＴＳ）ＷＴ  ｐ５３を安定して発現する一連のＨ１２９９ベースの同質遺伝子細胞株にトランスフェクトし、４つのホットスポット変異体：Ｒ１７５Ｈ、Ｒ２４８Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、及びＲ２７３Ｈに対して特異的活性を示す代表的なｓｉＲＮＡからのデータを示す（図１Ａ）。これらは、それぞれのｐ５３変異体に対して特異的な活性を有する数少ない候補ｓｉＲＮＡであった。示されたすべてのｓｉＲＮＡを、すべての同質遺伝子細胞株に一過性にトランスフェクトし、免疫ブロット法により、２４時間後にｐ５３タンパク質発現を分析するために採取した。図１Ｂに示されているように、すべてのｐ５３を無差別に標的とするｓｉ−ｐ５３は、スクランブルｓｉＲＮＡ又はトランスフェクトされなかった細胞（ゲル画像の右側の最後の３レーン）と比較して、すべての細胞株におけるｐ５３の発現を低下させることができた。変異特異的ｓｉＲＮＡのほとんどは、特異性を示し、他の変異体又はＷＴ  ｐ５３への影響を最小限から無視できる程度で目的の変異体を識別できた：例えば、Ｒ１７５Ｈ変異ｐ５３に特異的なｓｉ−１及びｓｉ−２は、Ｒ１７５Ｈの発現を低下させることができたが、他のｐ５３変異体及びＷＴ  ｐ５３への影響は最小限であった。同様に、Ｒ２４８Ｗ変異ｐ５３に特異的なｓｉ−３及びｓｉ−４は、他の変異体に影響を与えることなく、Ｒ２４８Ｗ変異体の発現を顕著に低下させることができた。しかしながら、他方で、同様にＲ２４８Ｗ変異体を標的とするｓｉ−３は、その意図した変異の発現を減少させることはできるが、ＷＴ  ｐ５３の発現の減少ももたらした。同様に、Ｒ２７３Ｈを標的とするｓｉ−８は、非常に特異的であったが、ｓｉ−７は、同様にＷＴ  ｐ５３変異体及びＲ２４９Ｓ変異体の両方にいくらかの影響を及ぼした。このデータは、複数の細胞系で同じ変異に対して生成された複数のｓｉＲＮＡの評価が、非常に変異特異的な試薬を得るために重要であることを示している。
【００６８】
内因性変異ｐ５３発現の変異特異的ｓｉＲＮＡ媒介サイレンシング
選択されたｓｉＲＮＡの有効性及び特異性を、ＷＴ又は様々な変異ｐ５３のいずれかを発現する１７の異なる癌細胞株のパネルで評価した（表１）。Ｈ１２９９同質遺伝子細胞株と同様に、これらの細胞を、ＷＴ及び変異ｐ５３の両方の発現を無差別に抑制する特異的ｓｉＲＮＡ又は陽性対照ｓｉ−ｐ５３でトランスフェクトした（図２Ａ〜図２Ｄ）。既にＨ１２９９同質遺伝子細胞環境で述べたように、ｓｉ−２は、３つの細胞株（即ち、ＨＣＴ１１６、Ａ５４９、及びＡ３７５）のＷＴ  ｐ５３の発現に影響を与えることなく、この変異体（即ち、ＨＣＣ１３９５、ＳＫＢＲ３、及びＡＵ５６５）を発現する細胞におけるＲ１７５Ｈ変異体の発現を特異的にダウンレギュレートすることができた（図２Ａ）。同様に、Ｒ２４８Ｗ変異ｐ５３に特異的なｓｉ−４は、他の細胞株でのＷＴ  ｐ５３発現に明らかな影響を与えることなく、Ｒ２４８Ｗ変異体を発現するＣＯＬＯ−３２０ＤＭ細胞、７８６−Ｏ細胞、及びＲＤ細胞でのｐ５３発現を効率的に阻害した（図２Ｂ）。同様の結果が、（ＢＴ５４９細胞、ＫＮＳ−６２細胞、ＰＬＣ−ＰＲＦ５細胞における）Ｒ２４９Ｓ変異体に選択的であるｓｉ−６、並びにＲ２７３Ｈを発現するＡＳＰＣ１細胞、Ｈ１９７５細胞、及びＷＩＤＲ細胞のＲ２７３Ｈに特異的なｓｉ−８で得られた（図２Ｃ及び図２Ｄ）。特定の変異体に対する他のｓｉＲＮＡ、ｓｉ−１、ｓｉ−３、ｓｉ−５、及びｓｉ−７もまた、目的の変異体に特異的であり、時にはＷＴ  ｐ５３にわずかな影響を示すこともあった。従って、変異ｐ５３特異的ｓｉＲＮＡのそれぞれの特異性を、様々な他の変異ｐ５３発現細胞でも評価した。図８に示されているように、ｓｉ−２、ｓｉ−４、ｓｉ−６、及びｓｉ−８は、非常に特異的であり、試験したすべての細胞株で他の変異ｐ５３の発現に影響を与えなかった。しかしながら、Ｈ１２９９同質遺伝子細胞系について前述したように、ｓｉ−１、ｓｉ−３、ｓｉ−５、及びｓｉ−７は、一部の細胞株の他の変異体に時折影響を与えた。Ｒ２４８Ｗに対するｓｉ−３は、この特異的変異を標的とするための公表されたｓｉＲＮＡに類似していることに注目されたい（Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｌ．Ａ．，Ｎａｇｕｉｂｎｅｖａ，Ｉ．，Ｌｅｈｒｍａｎｎ，Ｈ．，Ｖｅｒｖｉｓｃｈ，Ａ．，Ｔｃｈｅｎｉｏ，Ｔ．，Ｌｏｚａｎｏ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｈａｒｅｌ−Ｂｅｌｌａｎ，Ａ．（２００２）．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ＲＮＡｓ：ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｏｏｌｓ  ｔｏ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｔｏｒｅ  ｐ５３  ｐａｔｈｗａｙｓ．ＰＮＡＳ；  ９９；  １４８４９−１４８５４）。しかしながら、広範な分析は、Ｍａｒｔｉｎｅｚらで公表されたｓｉＲＮＡが実際にＲ２４８Ｗを標的とし、また、一部の細胞株では、ＷＴ及びＲ１７５Ｈ変異体に対してある程度の非特異的活性を有する。これは、ｓｉＲＮＡの配列における非常に微妙な変化が特異性に著しく影響を与え、異なる配列間の特異性に顕著な違いをもたらすことを実証し、様々な配列の効果を直感的に予測できないことを明らかにしている。まとめると、これらの結果は、広範なスクリーニングにより、単一ヌクレオチドの変化に対して非常に特異的で選択的なｓｉＲＮＡを再現可能に生成できることを示している。これらの分析に基づいて、ｓｉ−２（Ｒ１７５Ｈ変異体の場合）；ｓｉ−４（Ｒ２４８Ｗ変異体の場合）；ｓｉ−５及びｓｉ−６（Ｒ２４９Ｓ変異体の場合）、並びにｓｉ−８（Ｒ２７３Ｈ変異体の場合）が、さらに詳細な特性評価のために候補に挙げられた。従って、一例では、本明細書に開示される核酸配列は、配列番号９、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１７、又は配列番号２１の配列の１つを含む。
【００６９】
変異ｐ５３発現の対立遺伝子特異的ノックダウンはアポトーシスを促進し、ｐ５３標的遺伝子発現を誘導する
変異ｐ５３を発現する腫瘍細胞は、生存がその存在に依存していることが示されているため、変異特異的ｓｉＲＮＡがこの現象を緩和し、それぞれの変異発現癌細胞株で細胞死を誘導できるか否かを最初に評価した。ｓｕｂ−Ｇ１集団のパーセンテージによって決定されるように、それぞれの変異ｐ５３発現細胞株における特異的ｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、一般的にアポトーシスの増加をもたらした（図３）。非トランスフェクト細胞及びスクランブルｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞は基礎死をもたらしたが、ｐａｎ−ｐ５３  ｓｉＲＮＡ又は特異的な変異ｐ５３  ｓｉＲＮＡのいずれかのトランスフェクションは、それぞれの変異ｐ５３を発現する細胞株で細胞死の増加をもたらした（ｓｉ−ｓｃｒ対ｓｉ−ｐ５３対ｓｉ−変異ｐ５３のｓｕｂ−Ｇ１集団のパーセンテージ→ＡＵ５６５：２６．７対３９．６対３６．６；７８６−Ｏ：１８．０対３７．２対３１．７；ＢＴ５４９：１０．４対３９．６対３２．９；Ｈ１９７５：１１．５対２５．８対２８．５）（図３Ａ）。重要なことに、ｓｉ−ｐ５３は、ＷＴ  ｐ５３を発現するＨＣＴ１１６細胞の細胞死を減少させ（ｓｉ−ｓｃｒ対ｓｉ−ｐ５３：７．６対２．１）、一般的なｐ５３  ｓｉＲＮＡ又は変異特異的ｓｉＲＮＡによる変異ｐ５３発現のサイレンシングが変異ｐ５３発現癌細胞株でのみ細胞死の促進をもたらすことを確認した。他のｐ５３変異体を発現する癌細胞に対するｓｉＲＮＡの相互評価でも、目的の変異体のみをサイレンシングし、他はサイレンシングしないそれらの特異性を確認した（図９）。化学療法剤シスプラチン（ＣＤＤＰ）によるこれらの細胞の同時処理は、変異ｐ５３を発現する癌細胞株でのみ変異特異的ｓｉＲＮＡによって誘導される細胞死を促進したが、ＷＴ  ｐ５３を発現するＨＣＴ１１６細胞では促進しなかった（図１０）。まとめると、これらのデータは、変異ｐ５３のサイレンシングによって誘導される細胞死が細胞毒性薬による処置とのさらなる相乗効果をもたらすことを示している。
【００７０】
変異ｐ５３発現細胞株における変異ｐ５３のサイレンシングが、生存のための変異ｐ５３への依存の低下と同時に、標準的なｐ５３標的遺伝子の発現の誘導をもたらすことが既に示されている。従って、この現象が、変異ｐ５３特異的ｓｉＲＮＡ処理の状況でも発生するか否かを評価した。この目的のために、ｐ２１、Ｍｄｍ２、Ｎｏｘａ、及びＰｉｇ３などのいくつかのｐ５３標的遺伝子に対して定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行った（図４）。試験したすべてのｐ５３標的遺伝子のｍＲＮＡの発現は、予想どおり、ＷＴ  ｐ５３発現ＨＣＴ１１６細胞でのｐ５３ダウンレギュレーションに続いて有意にダウンレギュレートされたが、これらの細胞の変異特異的ｓｉＲＮＡによる変更は最小限であった（図４Ａ）。対照的に、変異特異的ｓｉＲＮＡ（即ち、ｓｉ−２、ｓｉ−４、ｓｉ−６、及びｓｉ−８）又は変異ｐ５３発現細胞株の一般的なｐ５３  ｓｉＲＮＡは、試験したほとんどすべての標的遺伝子の有意なアップレギュレーションをもたらした（図４Ｂ）。同様の結果が、変異特異的ｓｉＲＮＡを使用して、対応する変異体を発現する異なる一連の細胞株で得られた（図１１）。さらに、細胞生存率実験で述べたように、変異ｐ５３特異的ｓｉＲＮＡとＣＤＤＰとでの細胞の同時処理により、ｐ５３標的遺伝子の誘導が促進され、相乗効果が明らかにされた。さらに、ＣＤＤＰで処理されたＷＴ  ｐ５３発現細胞におけるｐ５３発現の阻害は、標的遺伝子発現の予想された減少をもたらし、変異ｐ５３発現細胞株に対する変異ｐ５３  ｓｉＲＮＡの効果の特異性を示している。
【００７１】
変異ｐ５３特異的ｓｈＲＮＡ発現ベクターを用いた変異ｐ５３発現の阻害
変異ｐ５３特異的サイレンシングの長期の効果を評価するために、ｓｉ−２、ｓｉ−４、ｓｉ−６、及びｓｉ−８  ｓｉＲＮＡから変異ｐ５３特異的配列を発現する低分子ヘアピンＲＮＡ、並びに一般的なｐ５３特異的ｓｉＲＮＡを、ｐＳｕｐｅｒベクターを使用して生成した。特異的変異ｐ５３の発現のサイレンシングにおけるそれらの効果を評価する最初の試験を、プラスミドの一過性トランスフェクション後に、それぞれの変異ｐ５３発現細胞株で行った。免疫ブロット分析により、変異ｐ５３特異的ｓｈＲＮＡが、対照スクランブルｓｈＲＮＡとは異なり、それぞれの細胞株における目的の変異ｐ５３の発現の抑制において同等に効果があることが示された（図５Ａ）。これに基づいて、長期的なコロニーの成長に対する変異ｐ５３の発現を抑制する効果を評価したところ、それぞれの変異ｐ５３をサイレンシングすることによって細胞の成長が有意に阻害されることがここでも同様に確認された（図５Ｂ）。同様の結果が短期アポトーシスアッセイでも得られ（図１２Ａ）、ｓｈＲＮＡベースの変異ｐ５３サイレンシングが、変異ｐ５３発現癌細胞の細胞死を促進するのに同等に効果的であることを示している。
【００７２】
変異特異的ｓｈＲＮＡが、ｐ５３上の同じヌクレオチド位置で生じる様々な変異体をサイレンシングできるか否かも評価した。この仮説を検証するために、Ｒ２４８Ｑ変異を発現するＨＥＣ−１Ａ癌細胞株を利用し、Ｒ２４８Ｗ変異に対して最初に生成されたｓｈ−４をトランスフェクトした。図１２Ｂ〜図１２Ｄに示されているように、ｓｈ−４は、Ｒ２４８Ｑ  ｐ５３変異体の発現をサイレンシングすることができ、これは、同時に短期及び長期のアッセイでの細胞死の増加をもたらした。このデータは、特定の変異ヌクレオチド残基に対する変異特異的ｓｉ／ｓｈＲＮＡがその位置の残基に特異的であることを示唆しているが、必ずしも置換された残基を識別する必要はなく、従って、一例では、特に変異ｐ５３の場合、特定のヌクレオチド位置に見られる多くの変異に広く使用することができる。
【００７３】
変異ｐ５３のドミナントネガティブ効果の軽減及び変異ｐ５３サイレンシング時の細胞死の促進
変異ｐ５３のみの発現は、癌細胞の生存のための変異体タンパク質への依存をもたらすが、ヘテロ接合状態におけるＷＴ及び変異ｐ５３の両方の同時発現は、ＷＴタンパク質に対する変異体タンパク質のドミナントネガティブ（ＤＮ）効果をもたらし、標的遺伝子の活性化及びアポトーシス誘導におけるＷＴタンパク質の機能の改善につながる。このヘテロ接合の状況において変異ｐ５３レベルを低下させると、ＷＴ  ｐ５３機能が回復し、化学療法剤及び放射線照射に対する細胞の感受性を高めることが既に示されていた。従って、変異ｐ５３特異的ｓｈＲＮＡは、変異ヘテロ接合細胞の変異ｐ５３レベルを低下させて治療反応を改善するための使用について評価した。この目的のために、ｐ５３にヘテロ接合性（ｐ５３＋／−）であるか又は変異ｐ５３にヘテロ接合性（ｐ５３＋／Ｒ２４８Ｗ）である２組の同質遺伝子結腸直腸細胞株（ＲＫＯ及びＨＣＴ１１６）を利用した。Ｒ２４８Ｗ変異体に特異的なｓｈ−４のトランスフェクションは、ｐ５３＋／−Ｒ２４８Ｗ細胞では全ｐ５３の有意な減少をもたらしたが、ｐ５３＋／−ＨＣＴ細胞及びＲＫＯ細胞ではそうではなく、特異性を示している（図６Ａ及び図１３Ａ）。長期生存の同時分析により、ｓｈ−４トランスフェクトｐ５３＋／Ｒ２４８Ｗ細胞が、ｐ５３＋／−細胞と比較して成長が阻害されやすいことが明らかになった（図６Ｂ及び図１３Ｂ）。さらに、ｐ５３標的遺伝子の誘導は、ｓｈ−４をトランスフェクトした場合のｐ５３＋／−細胞と比較して、ｐ５３＋／Ｒ２４８Ｗ細胞でのみ有意に誘導され（図６Ｃ及び図１３Ｃ）、まとめると、変異ｐ５３の抑制がＤＮ効果を軽減し、変異ｐ５３発現細胞の細胞死の上昇をもたらすことを示している。
【００７４】
シスプラチン（ＣＤＤＰ）処理時の細胞死に対するこれらのｓｉＲＮＡの効果も分析し、これにより、変異ｐ５３の存在が細胞死を減少させたことが示され（ＲＫＯ  ｐ５３＋／−細胞対ｐ５３＋／Ｒ２４８Ｗ細胞での非トランスフェクトｓｈＲＮＡとトランスフェクトされたスクランブルｓｈＲＮＡのｓｕｂ−Ｇ１細胞のパーセンテージ：５０．９と５０．３対１４．９と１１．３；ＨＣＴ細胞では：６１．１と５１．２対３２．１と２８．６）、ＤＮ効果を明らかにしている（図６Ｄ及び図６Ｅ並びに図１３Ｄ及び図１３Ｅ）。対照的に、変異特異的ｓｈ−４のトランスフェクションは、ｐ５３＋／−細胞と比較して、特にｐ５３＋／Ｒ２４８Ｗ細胞での細胞死の有意な増加をもたらした（非トランスフェクトｓｈＲＮＡ対ｓｈ−４  ｓｈＲＮＡのＲＫＯ  ｐ５３＋／−細胞でのｓｕｂ−Ｇ１細胞のパーセンテージ：５０．９対４９．７；ＲＫＯ  ｐ５３＋／Ｒ２４８Ｗ細胞では：１４．９対８６．１；ＨＣＴ  ｐ５３＋／−細胞では：６１．１対６８．８；ＨＣＴ  ｐ５３＋／Ｒ２４８Ｗ細胞では：３２．１対６６．９；図１３Ｅ）。このデータは、まとめると、ＷＴ  ｐ５３の発現に影響を与えることなく変異ｐ５３を特異的にサイレンシングすることにより、ＤＮ効果が軽減され、変異−ｐ５３発現細胞の感受性を高めて死に至らしめ、これが化学療法剤処置によって促進されることを示している。
【００７５】
変異ｐ５３を標的とする治療によりインビボでの腫瘍成長を遅延させる
最後に、細胞ベースの異種移植片モデルを使用して、スクランブルｓｈＲＮＡ又はそれぞれの変異特異的ｓｈＲＮＡを発現する癌細胞株（ＲＤ、ＰＬＣ−ＰＲ５、及びＨ１９７５）の増殖を監視することにより、変異ｐ５３特異的ｓｉ／ｓｈＲＮＡがインビボで腫瘍成長を遅延させるのに有効であるか否かを評価した。様々なｐ５３変異体を発現する、スクランブルｓｈＲＮＡを発現するウイルス粒子に一過性に感染した癌細胞は、時間の経過と共に大量に増殖したが、それぞれの変異ｐ５３特異的ｓｈＲＮＡを発現する細胞は、インビボでの増殖が顕著に遅延した（図７Ａ）。屠殺時の腫瘍の組織学的分析により、変異特異的ｓｈＲＮＡを発現する腫瘍がｐ５３染色を有意に減少させたことが明らかになり、特異的なｓｈＲＮＡが、腫瘍成長中にインビボでそれぞれの変異ｐ５３の発現をサイレンシングするのに効果的であることを示している（図７Ｂ）。このデータは、変異ｐ５３特異的ｓｉＲＮＡがインビボでの腫瘍細胞の増殖の遅延に効果的であることを立証している。
【００７６】
さらに、患者由来のトリプルネガティブ乳癌異種移植腫瘍（ＰＤＸ）を発現するＲ２４９Ｓ変異体の増殖が、治療処置プロトコルで利用されるｓｉＲＮＡによって影響され得るか否かを調べた。本質的に、ＰＤＸ腫瘍は、同所性に成長し、このＰＤＸ腫瘍が１７０ｍｍ３に達したら、マウスを、ナノリポソームで静脈内に送達されるスクランブルｓｉＲＮＡ又は変異ｐ５３特異的ｓｉＲＮＡで週に２回処置し、腫瘍に効果的に送達されていることが示された。（Ｒ２４９Ｓに対する）ｓｉ−６での週２回の処置により、スクランブルｓｉＲＮＡ処置マウスと比較して腫瘍成長が遅延し、この腫瘍は、処置の２９日後までに完全な腫瘍に成長した（データは示していない）。ｐ５３の免疫組織化学的染色は、変異ｐ５３の発現がｓｉ−６処置腫瘍で有意に減少したことを示した（データは示していない）。ｓｉＲＮＡ処理マウスの屠殺時の複数の臓器のさらなる分析では、この処置計画によるあらゆる副作用を除いて、いかなる異常も示されなかった（データは示していない）。まとめると、このデータは、変異ｐ５３特異的ｓｉＲＮＡを治療的に使用してインビボでの腫瘍成長を遅延させることができることを立証している。
【００７７】
表
【００７８】
【表１】
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【００７９】
配列
野生型ｐ５３ポリペプチドは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ０４６３７（Ｐ５３＿ＨＵＭＡＮ）のアミノ酸配列：ＭＥＥＰＱＳＤＰＳＶＥＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬＰＥＮＮＶＬＳＰＬＰＳＱＡＭＤＤＬＭＬＳＰＤＤＩＥＱＷＦＴＥＤＰＧＰＤＥＡＰＲＭＰＥＡＡＰＰＶＡＰＡＰＡＡＰＴＰＡＡＰＡＰＡＰＳＷＰＬＳＳＳＶＰＳＱＫＴＹＱＧＳＹＧＦＲＬＧＦＬＨＳＧＴＡＫＳＶＴＣＴＹＳＰＡＬＮＫＭＦＣＱＬＡＫＴＣＰＶＱＬＷＶＤＳＴＰＰＰＧＴＲＶＲＡＭＡＩＹＫＱＳＱＨＭＴＥＶＶＲＲＣＰＨＨＥＲＣＳＤＳＤＧＬＡＰＰＱＨＬＩＲＶＥＧＮＬＲＶＥＹＬＤＤＲＮＴＦＲＨＳＶＶＶＰＹＥＰＰＥＶＧＳＤＣＴＴＩＨＹＮＹＭＣＮＳＳＣＭＧＧＭＮＲＲＰＩＬＴＩＩＴＬＥＤＳＳＧＮＬＬＧＲＮＳＦＥＶＲＶＣＡＣＰＧＲＤＲＲＴＥＥＥＮＬＲＫＫＧＥＰＨＨＥＬＰＰＧＳＴＫＲＡＬＰＮＮＴＳＳＳＰＱＰＫＫＫＰＬＤＧＥＹＦＴＬＱＩＲＧＲＥＲＦＥＭＦＲＥＬＮＥＡＬＥＬＫＤＡＱＡＧＫＥＰＧＧＳＲＡＨＳＳＨＬＫＳＫＫＧＱＳＴＳＲＨＫＫＬＭＦＫＴＥＧＰＤＳＤ（配列番号１）を含んでもよいし、又はこれから構成されてもよい。
【００８０】
【表２】
2021514195.tif 000004
【００８１】
【表３】
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【００８２】
【表４】
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【００８３】
【表５】
2021514195.tif 000007
【００８４】
【表６】
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【００８５】
【表７】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２ＡＢ】
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【図２ＣＤ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ＡＢＣ】
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【図６ＤＥ】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ＡＢ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３ＤＥ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５ＡＢ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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