(57)【要約】  ニモジピン注射用組成物及びその調製方法であって、前記ニモジピン注射用組成物は、ニモジピンを０．０２−０．２３質量濃度％、注射用油を２−３０質量濃度％、乳化剤を０．８−３質量濃度％、錯化剤０−０．１質量濃度％、安定化剤０−０．３質量濃度％、及び浸透圧調節剤を１−３質量濃度％含む。該組成物は、可溶化剤であるエタノール、Ｔｗｅｅｎ  ８０等の共乳化剤、ベンジルアルコールなどの共溶媒を含まない。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニモジピン０．０２−０．２３質量濃度％、注射用油２−３０質量濃度％、乳化剤０．８−３質量濃度％、錯化剤０−０．１質量濃度％、安定剤０−０．３質量濃度％、及び浸透圧調節剤１−３質量濃度％を含むことを特徴とする、ニモジピン注射用組成物。
【請求項２】
好ましくは、ニモジピン０．０４−０．２０％、注射用油３−２０％、乳化剤１−２．５％、錯化剤０−０．０５％、安定剤０−０．２％、浸透圧調節剤２−３％を含み、より好ましくは、ニモジピン０．０８−０．１８％、注射用油８−１２％、乳化剤１−２％、錯化剤０−０．０１％、安定剤０−０．１％、及び浸透圧調節剤２−２．５％を含むことを特徴とする、請求項１に記載の注射用組成物。
【請求項３】
ｐＨが６．０−８．５、好ましくはｐＨが６．５−８．０、更に好ましくはｐＨが７．０−７．５であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の注射用組成物。
【請求項４】
前記ニモジピンは、α結晶形態又はβ結晶形態から選択され、好ましくは、融点が１１４−１１６℃のα結晶形態であることを特徴とする、請求項１−４のいずれか１項に記載の注射用組成物。
【請求項５】
前記乳化剤は、大豆リン脂質又は卵黄リン脂質から選択されることを特徴とする、請求項１−４のいずれか１項に記載の注射用組成物。
【請求項６】
前記大豆リン脂質又は卵黄リン脂質中に６０−９０％のホスファチジルコリン（ＰＣ）及び２−２０％のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含み、好ましくは、前記大豆リン脂質又は卵黄リン脂質中に７０−８５％のホスファチジルコリン（ＰＣ）及び５−１８％のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むことを特徴とする、請求項１−４のいずれか１項に記載の注射用組成物。
【請求項７】
前記錯化剤は、エデト酸カルシウムナトリウム、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸塩から選択される１種又はそれ以上であり、好ましくは、前記錯化剤は、エデト酸二ナトリウムであることを特徴とする、請求項１−４のいずれか１項に記載の注射用組成物。
【請求項８】
前記注射用油は、注射用大豆油、注射用中鎖トリグリセリド、又はこれらの混合物であり、好ましくは注射用大豆油及び注射用中鎖トリグリセリドの混合物であり、質量比が好ましくは２：８−５：５、より好ましくは４：６−５：５、最も好ましくは４：６であることを特徴とする、請求項１−４のいずれか１項に記載の注射用組成物。
【請求項９】
前記安定剤が、好ましくはオレイン酸又はオレイン酸ナトリウムであることを特徴とする、請求項１−４のいずれか１項に記載の注射用組成物。
【請求項１０】
浸透圧調節剤はグリセリンであることを特徴とする、請求項１−４のいずれか１項に記載の注射用組成物。
【請求項１１】
平均粒径が１００−６００ｎｍ、好ましくは平均粒径が１２０−４００ｎｍ、より好ましくは平均粒径が１４０−３００ｎｍであることを特徴とする、請求項１−１０のいずれか１項に記載の注射用組成物。
【請求項１２】
くも膜下出血後の脳血管攣縮、脳血管疾患からの回復期の血行改善を行う際に使用されることを特徴とする、請求項１−１０に記載の本発明の組成物。
【請求項１３】
ニモジピン注射用組成物の調製方法であって、
（１）注射用水に対して、ｐＨを調節し、錯化剤及び安定剤を加え、次に浸透圧調節剤を加え、均一に混合するまで撹拌し、水温を５０−７０℃に制御した水相を調製するステップであって、前記錯化剤は、エデト酸カルシウムナトリウム、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸塩からなる群から選択される１種又はそれ以上であり、好ましくは、前記錯化剤は、エデト酸二ナトリウムであり、好ましくは、浸透圧調節剤はグリセリンである、ステップと、
（２）注射用油に対して、乳化剤、安定剤を所定量の４０％添加してせん断し、均一に混合し、水浴で５０−７０℃に加熱し、ニモジピンを添加して撹拌しながら溶解させて油相を調製するステップであって、
前記ニモジピンは、α結晶形態又はβ結晶形態から選択され、好ましくは、融点が１１４−１１６℃のα結晶形態であり、比率は、ニモジピンが０．０２−０．２３％、ニモジピンが０．０４−０．２０％、ニモジピンが０．０８−０．１８％であり、
前記注射用油は、注射用大豆油若しくは注射用中鎖トリグリセリド又はこれらの混合物であり、好ましくは注射用大豆油及び注射用中鎖トリグリセリドの混合物であり、質量比が好ましくは２：８−５：５、より好ましくは４：６−５：５、最も好ましくは４：６である、ステップと、
（３）安定剤としてオレイン酸ナトリウムを選択した場合には、水相（１）にオレイン酸ナトリウムを添加し、オレイン酸を選択した場合には、油相（２）にオレイン酸を添加するステップと、
（４）所定量の６０％の乳化剤に対して、水相に添加し、窒素保護下で乳化剤が均一に分散するまでせん断するステップであって、
前記乳化剤は、大豆リン脂質又は卵黄リン脂質から選択され、大豆リン脂質又は卵黄リン脂質中に６０−９０％のホスファチジルコリン（ＰＣ）及び２−２０％のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含み、好ましくは、前記大豆リン脂質又は卵黄リン脂質中に７０−８５％のホスファチジルコリン（ＰＣ）及び５−１８％のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含む、ステップと、
（５）油相を水相にゆっくりと加え、せん断して初期乳化物を作るステップと、
（６）初期乳化物を均質化し、乳剤粒子径が基準を満たすまで循環させるステップと、
（７）サンプルに対して、ｐＨ、乳剤粒子径を測定し、窒素で充填し、容器に封入し、滅菌するステップと、
を含むことを特徴とするニモジピン注射用組成物の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬技術の分野に属し、本発明の組成物の注射液、その調製方法及び非臨床安全性に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニモジピン（Ｎｉｍｏｄｉｐｉｎｅ，Ｎｉｍ）は、ニモトップ（Ｎｉｍｏｔｏｐ）とも呼ばれる第二世代のピリジン系カルシウム拮抗薬であり、ニモジピン注射剤は１９８５年４月にドイツのバイエル社（Ｂａｙｅｒ）より開発・販売され、現在、中国で１００社以上のメーカーで生産されている。ニモジピンは、高い親油性を有するため、血液脳関門を容易に通過することができ、脳血管を選択的に拡張し、脳底動脈や前脊髄動脈の痙攣を有意に逆転させる効果があり、高血圧症、脳卒中、片頭痛、くも膜下出血などの脳出血性疾患の治療に広く使用されており、現在、脳血管疾患の第一選択薬と位置づけられて、特にアルツハイマー病には高い臨床応用価値がある。
【０００３】
現在の技術において、臨床的に一般的に使用されるニモジピン製剤は、錠剤、カプセル剤、及び注射剤がある。ニモジピンは水難溶性で溶解性が低く、肝臓の初回通過効果が強いため、経口バイオアベイラビリティーは健常者で５−１３％、くも膜下出血患者で３−２８％と低いことになる。本剤は生物学的半減期が短く（約１．５−２ｈ）、１日３−４回の頻回投与が必要であり、使用しにくいだけでなく、血中濃度の「ピーク値トラフ値変動」現象を引き起こし、副作用を引き起こす可能性があり、ニモジピンは水不溶性であるため、臨床的に使用されるニモジピン注射剤には溶解性を高めるために高濃度のエタノールが含まれており、皮膚や血管への刺激性が高い。ニモジピンは、忍容できない副作用の発生を防ぐため、１−２ｍｇ／ｈの速度でゆっくりと注入する必要があり、すなわち１０ｍｇの薬剤に必要な注入時間は通常５時間以上かかるため、使用時にはグルコース又は生理食塩水と混合するか、又は特製の三方活栓を使用してグルコース又は生理食塩水と同時に注入し、混合物を患者に直接投与する必要がある。数多くの臨床医は、ニモジピン注射を輸液バイアルに注入し、混合して使用している。ニモジピンはエタノールに可溶で水に不溶であるため、ニモジピン輸液はエタノールを含む非水溶性製剤であり、他の注射液と併用すると、いずれも結晶を析出させるため、含有量が減少し、薬効の低下を引き起こし、患者にある程度のリスクを与えることになる。
【０００４】
ニモジピンは、α型とβ型の異なる結晶形態が存在する。異なる結晶形態は、異なる溶媒に対する溶解度が異なり、文献によると、β結晶形態は、融点１２４−１２５℃で、水に対する溶解度が良好（３．６μｇ／ｍｌ）であり、α結晶形態は、融点１１４−１１６℃で、水に対する溶解度が２．５μｇ／ｍｌであり、油相に対する溶解度は報告されておらず、本発明は、市販のニモジピン（β結晶形態、新華製薬）と自家製ニモジピン（α結晶形態）の異なる油に対する溶解度を比較したところ、ニモジピンの油に対する溶解度は水に対する溶解度よりもはるかに高く、α結晶型の中鎖脂肪酸油に対する溶解度や大豆油と中鎖脂肪酸油の混合物に対する溶解度はβ結晶型の溶解度よりもはるかに高いことがわかり（下表参照）、したがって、α結晶型のニモジピンを油に溶解して静注用脂肪乳剤とすることで、ニモジピン水性注射剤及び先行技術によるニモジピン静注用脂肪乳剤の負荷の低さ、安全性、安定性の問題を解決することが期待される。
【０００５】
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【０００６】
大豆油、中鎖脂肪酸油、及び大豆油と中鎖脂肪酸油の混合物などを主成分とする静注用脂肪乳剤は、溶媒特性を有し、毒性がほとんどなく、脂溶性薬物を乳剤粒子の核の脂質部分に導入・溶解し、脂質油滴とともに代謝・ゆっくりと放出し、それにより有効な血中濃度を維持し、薬物による起こりうる副作用を低減し、さらに本発明の組成物の注射液には多くの利点がある。本発明の組成物の注射液は、ニモジピンの薬物の溶解度を高めることができ、これにより、薬物負荷を改善し、薬物の加水分解を低減し、安定性を高め、毒性を低減することができ、臨床応用の見通しが良い。
【０００７】
現在、ニモジピン脂肪乳に関する文献や特許出願は多く存在するが、様々な不足点があり、例えば登録済みの中国特許出願番号２００９１００２１０９１．６では、Ｔｗｅｅｎ  ８０を処方に使用している。現在、Ｔｗｅｅｎ  ８０を含有する静脈注射剤には、溶血反応、急性過敏反応、末梢神経毒性、Ｐ−糖タンパク質活性阻害、内在性抗腫瘍作用、肝毒性などの臨床的有害事象が多く報告されているため、Ｔｗｅｅｎ  ８０含有製剤の静脈内注射には注意が必要であり、登録済みの中国特許出願番号２００５１００８１６６８．４では、処方に共溶媒ベンジルアルコールを添加する。ベンジルアルコールには、消毒・防腐作用、局所麻酔作用があり、抗菌剤、鎮痛剤として注射に使用され、溶血作用がある。小児にベンジルアルコールが含まれている注射剤を筋肉内注射すると、臀筋拘縮症を引き起こす可能性がある。静脈注射剤への静菌剤の添加は、『中華人民共和国薬典』（２０１５年版）付録の「注射剤」項目の下で厳しく制限されており、推奨されていない。同時に、すべてのニモジピン乳剤は結晶形態の問題を考慮していなく、他の結晶形態は低溶解度で、製剤の薬物負荷が小さく、保管中に結晶が析出しやすく、安定性が望ましくない。上記のニモジピン組成物における安定性及び安全性の懸念を考慮すると、臨床ニーズに対応した新規なニモジピン乳剤組成物の開発が求められている。
【０００８】
発明内容
本発明の目的の１つは、ニモジピン、注射用油、乳化剤、錯化剤、安定化剤、及び浸透圧調節剤を含むことを特徴とするニモジピン注射用組成物を提供することにある。
【０００９】
前記注射用組成物はニモジピン０．０２−０．２３％、注射用油２−３０％、乳化剤０．８−３％、錯化剤０−０．１％、安定化剤０−０．３％、及び浸透圧調節剤１−３％を含む。好ましい比率は、ニモジピン０．０４−０．２０％、注射用油３−２０％、乳化剤１−２．５％、錯化剤０−０．０５％、安定剤０−０．２％、浸透圧調節剤２−３％であり、より好ましい比率は、ニモジピン０．０８−０．１８％、注射用油８−１２％、乳化剤１−２％、錯化剤０−０．０１％、安定剤０−０．１％、及び浸透圧調節剤２−２．５％である。配合されたニモジピン注射用組成物はｐＨが６．０−８．５、より好ましくはｐＨが６．５−８．０、更に好ましくはｐＨが７．０−７．５である。配合されたニモジピン注射用組成物は、平均粒径が１００−６００ｎｍ、好ましくは平均粒径が１２０−４００ｎｍ、より好ましくは平均粒径が１４０−３００ｎｍである。
【００１０】
前記ニモジピンは、α結晶形態又はβ結晶形態から選択され、好ましくは、融点が１１４−１１６℃のα結晶形態である。
【００１１】
前記注射用組成物中の乳化剤は、大豆リン脂質又は卵黄リン脂質から選択される。
【００１２】
前記注射用組成物は、大豆リン脂質又は卵黄リン脂質中に６０−９０％のホスファチジルコリン（ＰＣ）及び２−２０％のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含み、好ましくは、前記大豆リン脂質又は卵黄リン脂質中に７０−８５％のホスファチジルコリン（ＰＣ）及び５−１８％のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含む。
【００１３】
前記注射用組成物中の錯化剤は、エデト酸カルシウムナトリウム、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸から選択される１種又はそれ以上の組成物、好ましくは、前記錯化剤は、エデト酸二ナトリウムである。
【００１４】
前記注射用組成物中の注射用油は、注射用大豆油又は注射用中鎖トリグリセリド、又はこれらの混合物であり、好ましくは注射用大豆油及び注射用中鎖トリグリセリドの混合物であり、質量比が好ましくは２：８−５：５、より好ましくは４：６−５：５、最も好ましくは４：６である。
【００１５】
前記注射用組成物中の安定剤は、好ましくはオレイン酸又はオレイン酸ナトリウムである。
【００１６】
前記注射用組成物中の浸透圧調節剤はグリセリンである。
【００１７】
本発明は、ニモジピン注射用組成物の調製方法を提供し、本発明の利点は、本発明の組成物の注射液が可溶化剤エタノールを含まず、皮膚や血管への刺激を回避することである。ニモジピン注射剤における乳化及び可溶化の問題は、Ｔｗｅｅｎ−８０等の共乳化剤やベンジルアルコールなどの共溶媒を添加することなく解決された。大豆油と中鎖トリグリセリドの異なる比率とニモジピンの異なる結晶形態の研究を通じて、ニモジピン原薬の最大負荷を実現すると共に中鎖トリグリセリドの過剰な量に起因する油水分離を回避できる比率と結晶形態を決める。具体的には、以下のような課題を解決した。
【００１８】
１．安定性の課題を解決した。乳化剤に対するスクリーニングにより、特定の含有量範囲のホスファチジルコリン（含有率７０−８５％）とホスファチジルエタノールアミン（含有率５−１８％）を含む卵黄リン脂質又は大豆リン脂質を乳化剤として選定し、共乳化剤としてＴｗｅｅｅｎ−８０を添加しなくても安定性の問題を解決することができ、臨床応用時のアレルギー、過敏反応、溶血反応のリスクを低減することができる。
【００１９】
２．乳化剤を油相と水相に別々に添加して研究した結果、好ましくは、一部の乳化剤を油相に添加し、一部を水相に添加することで、より良好な乳化効果が得られ、乳剤粒子の均一性及び乳化剤の安定性を向上させることができる。
【００２０】
３．溶解性の問題と、工業的な均質化回数が過剰になるという問題を解決した。注射用油は好ましく４：６の質量比を有する注射用大豆油、注射用中鎖トリグリセリドを使用し、α結晶型ニモジピン原料の融点が好ましくは１１４−１１６℃である場合、油水分離現象を回避しつつ、最大の薬剤装填量を達成することができる。
【００２１】
４．ベンジルアルコールなどの共溶媒を添加する必要がないため、ベンジルアルコール等の共溶媒を添加することによる臨床使用上の有害事象を避けることができる。
【００２２】
５．中鎖トリグリセリドの添加により、油相がより乳化分散しやすくなり、均質化の回数を減らすことができ、工業生産に有利である。
【００２３】
６．錯化剤を使用することで、抗酸化作用が得られるだけでなく、製剤中のメトキシアニリン値を大幅に低減し、製剤の安全性を向上させることができる。
【００２４】
７．アレルギー、刺激性、溶血、ラットなどの非臨床安全性試験研究により、下記の結果が得られた。
（１）ラットを用いた受身皮膚アナフィラキシー反応試験では、本発明の組成物の注射液は感作ラットに対して受身皮膚アナフィラキシー反応を示さず、先行技術のニモジピン乳剤は感作ラットに対して受身皮膚アナフィラキシー反応を示し、モルモットを用いた能動的全身性アナフィラキシーショック反応試験では、本発明の組成物の注射液の高用量群では直ちに（約１分間）腹這い姿勢、その後に死亡など同様のアレルギー反応を示し、死亡率は１００％であり、モルモットの低用量群では明らかな異常反応は認められないことがわかった。一方、先行技術のニモジピン乳剤では、高用量群、低用量群ともに腹這い姿勢、その後に死亡などの類似のアレルギー反応が認められ、高用量群で１００％の死亡率、低用量群で４０％の死亡率が認められた。
（２）先行技術のニモジピン乳剤には溶血・凝集作用があるが、本発明の組成物の注射液には溶血・凝集作用はない。
（３）ウサギの血管刺激性試験では、本発明の組成物の注射液も先行技術のニモジピン乳剤も、ウサギの耳縁静脈（血管）に対して有意な刺激作用が認められなかった。
（４）ウサギを使った筋肉内注射による局所刺激性試験では、本発明の組成物の注射液も先行技術のニモジピン乳剤も、ウサギの大腿四頭筋に対して有意な刺激効果が認められなかった。
【００２５】
本発明の組成物の注射液をゼブラフィッシュに注射して誘発した心血管毒性実験の結果、ニモジピン原薬、ニモジピン水性注射剤、先行技術のニモジピン乳剤、及び本発明の組成物の注射液は、ゼブラフィッシュに心拍数低下、心房停止、心膜浮腫、及び循環障害を誘発し、４剤とも心血管毒性を有していた。ニモジピン原薬・ニモジピン水性注射剤の最大非致死濃度は２．５μｇ／ｍｌ、先行技術のニモジピン乳剤の最大非致死濃度は５．０μｇ／ｍｌであり、本発明の組成物の注射液の最大非致死濃度は１０μｇ／ｍｌであり、これはニモジピン原薬・ニモジピン水性注射剤の４倍、先行技術のニモジピン乳剤の２倍であり、本発明の組成物の注射液が、ニモジピン原薬、ニモジピン水性注射剤、及び先行技術のニモジピン乳剤よりもゼブラフィッシュに対する毒性がはるかに弱いことがわかった。
【００２６】
ラットへの投与では、ニモジピン水性注射剤の高用量群で有意な副作用が認められ、注射剤投与中に複数の死亡例が認められた。ニモジピン水性注射剤を複数回投与した後、複数の動物が著しい静脈炎及び尾部潰瘍を発症した。本発明の組成物の注射液のいずれの投与群においても、投与時に死亡等の明らかな有害反応は認められなかった。
【００２７】
本発明で使用される技術的解決手段は以下のとおりである。
【００２８】
ニモジピン注射用組成物であって、ニモジピン０．０２−０．２３質量濃度％、注射用油２−３０質量濃度％、乳化剤０．８−３質量濃度％、錯化剤０−０．１質量濃度％、安定化剤０−０．３質量濃度％、及び浸透圧調節剤１−３質量濃度％を含む。好ましい比率は、ニモジピン０．０４−０．２０％、注射用油３−２０％、乳化剤１−２．５％、錯化剤０−０．０５％、安定剤０−０．２％、浸透圧調節剤２−３％であり、より好ましい比率は、ニモジピン０．０８−０．１８％、注射用油８−１２％、乳化剤１−２％、錯化剤０−０．０１％、安定剤０−０．１％、及び浸透圧調節剤２−２．５％である。調製されたニモジピン注射用組成物は、好ましくはｐＨが６．０−８．５、より好ましくはｐＨが６．５−８．０、更に好ましくはｐＨが７．０−７．５である。調製されたニモジピン注射用組成物は、平均粒径が１００−６００ｎｍ、好ましくは平均粒径が１２０−４００ｎｍ、より好ましくは平均粒径が１４０−３００ｎｍである。
【００２９】
前記ニモジピンは、α結晶形態又はβ結晶形態から選択され、好ましくは、融点が１１４−１１６℃のα結晶形態である。
【００３０】
前記ニモジピン注射用組成物中の前記乳化剤は、大豆リン脂質、卵黄リン脂質、水素添加大豆リン脂質、水素添加卵黄リン脂質から選択される１種又はそれ以上の組成物である。
【００３１】
前記ニモジピン注射用組成物中の前記錯化剤は、エデト酸カルシウムナトリウム、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸から選択される１種又はそれ以上の組成物である。
【００３２】
前記ニモジピン注射用組成物中の安定剤は、好ましくはオレイン酸又はオレイン酸ナトリウムである。
【００３３】
前記ニモジピン注射用組成物中の前記浸透圧調節剤はグリセリンである。
【００３４】
前記ニモジピン注射用組成物は、好ましくはｐＨが６．０−８．５、より好ましくはｐＨが６．５−８．０、更に好ましくはｐＨが７．０−７．５である。
【００３５】
前記ニモジピン注射用組成物は、平均粒径が１００−６００ｎｍ、好ましくは平均粒径が１２０−４００ｎｍ、より好ましくは平均粒径が１４０−３００ｎｍである。
【００３６】
本発明は、ニモジピン注射用組成物の調製方法をさらに提供し、以下のステップを含む。
（１）注射用水に対して、ｐＨを調節し、錯化剤及び安定剤を加え、次に浸透圧調節剤を加え、均一に混合するまで撹拌し、水温を５０−７０℃に制御した水相を調製する。
前記錯化剤は、エデト酸カルシウムナトリウム、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸から選択される１種又はそれ以上の組成物、好ましくは、前記錯化剤は、エデト酸二ナトリウムである。好ましくは、浸透圧調節剤はグリセリンである。
（２）注射用油に対して、乳化剤、安定剤を所定量の４０％添加してせん断し、均一に混合し、水浴で５０−７０℃に加熱し、ニモジピンを添加して撹拌しながら溶解させて油相を調製する。前記ニモジピンは、α結晶形態又はβ結晶形態から選択され、好ましくは、融点が１１４−１１６℃のα結晶形態にする。
前記注射用油は、注射用大豆油又は注射用中鎖トリグリセリド、又はこれらの混合物であり、好ましくは注射用大豆油及び注射用中鎖トリグリセリドの混合物にし、質量比が好ましくは２：８−５：５、より好ましくは４：６−５：５、最も好ましくは４：６である。
（３）安定剤としてオレイン酸ナトリウムを選択した場合には、水相（１）にオレイン酸ナトリウムを添加し、オレイン酸を選択した場合、油相（２）にオレイン酸を添加する。
（４）所定量の６０％の乳化剤に対して、水相に添加し、窒素保護下で乳化剤が均一に分散するまでせん断する。
前記乳化剤は、大豆リン脂質又は卵黄リン脂質から選択され、大豆リン脂質又は卵黄リン脂質中に６０−９０％のホスファチジルコリン（ＰＣ）及び２−２０％のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含む。好ましくには、前記大豆リン脂質又は卵黄リン脂質中に７０−８５％のホスファチジルコリン（ＰＣ）及び５−１８％のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含む。
（５）油相を水相にゆっくりと加え、せん断して初期乳化物を作る。
（６）初期乳化物を均質化し、乳剤粒子径が基準を満たすまで循環させる。
（７）サンプルに対して、ｐＨ、乳剤粒子径を測定し、窒素で充填し、容器に封入し、滅菌する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、本発明の組成物の高用量群９番ラットにおける脳血流の変化を示す図であり、点線の曲線は頭蓋全体部位、菱形の曲線は矢状縫合部位である。
【図２】図２は、ニモジピン水性注射剤の高用量群１６番ラットにおける脳血流の変化を示す図であり、点線の曲線は頭蓋全体部位、菱形の曲線は矢状縫合部位である。
【図３】図３は、ニモジピン水性注射剤と本発明の組成物の血中濃度時間曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下の実施形態をふまえて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではない。
【００３９】
実施例１
ニモジピン１ｇ、大豆油４０ｇ、中鎖トリグリセリド６０ｇ、卵黄リン脂質１２ｇ、エデト酸二ナトリウム０．０５ｇ、オレイン酸０．３ｇ、グリセリン２２．５ｇ、適量のｐＨ調節剤、注射用水を１０００ｍｌとする。調製方法は以下のとおりである。
（１）所定量の注射用水を取り、２％水酸化ナトリウム溶液でｐＨを調節し、エデト酸二ナトリウムを加えて撹拌しながら溶解させ、グリセリンを加えて撹拌しながら均一に混合する。水温を５０−７０℃に制御する。
（２）所定量の大豆油と中鎖トリグリセリドを混合し、所定量４０％の卵黄リン脂質とオレイン酸を加えてせん断し均一に混合し、水浴で５０−７０℃に加熱し、所定量のニモジピンを加えて撹拌して溶解させる。
（３）所定量６０％の卵黄リン脂質を秤量し、水相に添加し、窒素保護下で乳化剤が均一に分散するまでせん断する。
（４）油相を水相にゆっくりと加え、せん断して初期乳化物を作る。
（５）初期乳化物を均質化し、乳剤の粒子径が基準を満たすまで循環させる。
（６）サンプルに対して、ｐＨ及び粒子径が基準を満たすことを検出した後、メンブレンィルターで濾過し、窒素を充填し、容器に封入する。
（７）滅菌は１２１℃で１２分間行う。
（８）ｐＨ値は７．３、平均粒子径は１５５ｎｍである。
【００４０】
実施例２
ニモジピン１．５ｇ、大豆油４０ｇ、中鎖トリグリセリド６０ｇ、卵黄リン脂質１２ｇ、エデト酸二ナトリウム０．０５ｇ、オレイン酸０．３ｇ、グリセリン２２．５ｇ、適量のｐＨ調節剤、注射用水を１０００ｍｌとする。調製方法は以下のとおりである。
（１）所定量の注射用水をとり、２％水酸化ナトリウム溶液でｐＨを調節し、エデト酸二ナトリウムを加えて撹拌しながら溶解させ、グリセリンを加えて撹拌しながら均一に混合する。水温を５０−７０℃に制御する。
（２）所定量の大豆油と中鎖トリグリセリドを混合し、所定量４０％の卵黄リン脂質とオレイン酸を加えてせん断し均一に混合し、水浴で５０−７０℃に加熱し、所定量のニモジピンを加えて撹拌して溶解させる。
（３）所定量６０％の卵黄リン脂質を秤量し、水相に添加し、窒素保護下で乳化剤が均一に分散するまでせん断する。
（４）油相を水相にゆっくりと加え、せん断して初期乳化物を作る。
（５）初期乳化物を均質化し、乳剤の粒子径が基準を満たすまで循環させる。
（６）サンプルに対して、ｐＨ及び粒子径が基準を満たすことを検出した後、メンブレンィルターで濾過し、窒素を充填し、容器に封入する。
（７）滅菌は１２１℃で１２分間行う。
（８）ｐＨ値は６．９、平均粒子径は１６２ｎｍである。
【００４１】
実施例３
ニモジピン０．２ｇ、大豆油５０ｇ、卵黄リン脂質８ｇ、エデト酸二ナトリウム０ｇ、オレイン酸ナトリウム０．２ｇ、グリセリン２５ｇ、適量のｐＨ調節剤、注射用水を１０００ｍｌとする。調製方法は以下のとおりである。
（１）所定量の注射用水を取り、ｐＨを調節し、オレイン酸ナトリウムを加えて撹拌しながら溶解し、グリセリンを加えて撹拌しながら均一に混合する。水温を５０−７０℃に制御する。
（２）所定量の大豆油を取り、水浴で５０−７０℃に加熱し、所定量４０％の卵黄リン脂質とオレイン酸を加えてせん断・混合し、所定量のニモジピンを加えて撹拌して溶解させる。
（３）所定量６０％の卵黄リン脂質を秤量し、水相に添加し、窒素保護下で乳化剤が十分に分散するまでせん断する。
（４）油相を水相にゆっくりと加え、せん断して初期乳化物を作る。
（５）初期乳化物を均質化し、乳剤の粒子径が基準を満たすまで循環させる。
（６）サンプルに対して、ｐＨ及び平均粒子径が基準を満たすことを検出した後、メンブレンィルターで濾過し、窒素を充填し、容器に封入する。
（７）滅菌は１２１℃で１２分間う。
（８）ｐＨ値は７．４、平均粒子径は１５０ｎｍである。
【００４２】
実施例４
ニモジピン２．３ｇ、大豆油８０ｇ、中鎖トリグリセリド１２０ｇ、卵黄リン脂質１５ｇ、エデト酸二ナトリウム０．１ｇ、オレイン酸１ｇ、グリセリン２０ｇ、適量のｐＨ調節剤、注射用水を１０００ｍｌとする。
調製方法：実施例１と同様。
ｐＨ値は７．２、平均粒子径は２９６ｎｍである。
【００４３】
実施例５
ニモジピン０．４ｇ、大豆油４０ｇ、中鎖トリグリセリド６０ｇ、卵黄リン脂質８ｇ、エデト酸二ナトリウム０．０３ｇ、オレイン酸０．３ｇ、グリセリン２２．５ｇ、適量のｐＨ調節剤、注射用水を１０００ｍｌとする。
調製方法：実施例１と同様。
ｐＨ値は７．９、平均粒子径は６００ｎｍである。
【００４４】
実施例６
ニモジピン０．８ｇ、大豆油３０ｇ、中鎖トリグリセリド７０ｇ、卵黄リン脂質３０ｇ、エデト酸二ナトリウム０．０ｇ、オレイン酸０．０ｇ、グリセリン２２．５ｇ、適量のｐＨ調節剤、注射用水を１０００ｍｌとする。
調製方法：実施例１と同様。
ｐＨ値は６．８、平均粒子径は１４６ｎｍである。
【００４５】
実施例７
ニモジピン１．２ｇ、大豆油１２０ｇ、中鎖トリグリセリド１８０ｇ、卵黄リン脂質３０ｇ、エデト酸二ナトリウム０．０ｇ、オレイン酸０．３ｇ、グリセリン２０ｇ、適量のｐＨ調節剤、注射用水を１０００ｍｌとする。
調製方法：実施例１と同様。
ｐＨ値は６．５、平均粒子径は３５２ｎｍである。
【００４６】
実施例８
ニモジピン１．２ｇ、大豆油５０ｇ、中鎖トリグリセリド５０ｇ、卵黄リン脂質３０ｇ、エデト酸二ナトリウム０．０ｇ、オレイン酸０．０ｇ、グリセリン２２．５ｇ、適量のｐＨ調節剤、注射用水を１０００ｍｌとする。
調製方法：実施例１と同様。
ｐＨ値は８．５、平均粒子径は２４６ｎｍである。
【００４７】
本発明者らは、本発明における共溶媒なしの最大薬物負荷量、及び共乳化剤なしの最適な処方及び最適なプロセスを決定するために、広範な試験と検討を行い、以下の結果が得られた。
【００４８】
１．大豆油と中鎖トリグリセリドの比率の異なった最適薬物負荷試験。
大豆油と中鎖トリグリセリドは、ニモジピンに対する溶解度が異なるため、配合比率が異なると、異なる薬物負荷量になる可能性がある。また、中鎖トリグリセリドを過剰に含有すると、乳剤の油化を引き起こす可能性がある。実施例１の処方に基づいて、異なる油相の比率で最適な薬物負荷試験を行った。
2021535932.tif 000003
結論：大豆油：中鎖トリグリセリドは４：６で処方するのがベストである。
【００４９】
２．乳剤安定性に対するリン脂質中のホスファチジルコリン（ＰＣ）及びホスファチジルエタノールアミンの異なる含有量の影響を、実施例１の処方に基づいて考察した。
2021535932.tif 000004
結論：大豆リン脂質又は卵黄リン脂質中に７０−８５％のホスファチジルコリン（ＰＣ）及び５−１８％のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリン脂質の乳化能が最も高いである。
【００５０】
３．本発明の組成物の注射液に対するリン脂質に水相又は油相を添加する影響を、実施例１の処方に基づいて考察した。
2021535932.tif 000005
結論：水相又は油相にリン脂質を添加することにより、本発明の組成物は、より高いδ-電位を有し、より優れた安定性を有する。
【００５１】
４．本発明の組成物の注射液のメトキシアニリン価に対する錯化剤の影響を実施例６に関して検討した。
2021535932.tif 000006
結論：金属イオン錯化剤を使用することにより、抗酸化を達成することができるとともに、製剤中のメトキシアニリン値を大幅に低下させることができ、製剤の安全性を向上させることができ、他の抗酸化剤を添加しても本発明の組成物の注射液のメトキシアニリン値を低下させることはできない。
【００５２】
本発明の調製プロセスの安定性を確認するために、実施例１に準じてパイロット試験を行い、希釈安定性試験及び長期安定性試験を行った。
【００５３】
本発明の組成物の注射液３０ｍｌを２５０ｍｌの計量瓶に入れ、０．９％塩化ナトリウム注射液、５％グルコース注射液でそれぞれ目盛りまで希釈し、よく振盪して配合実験液を得る。上記溶液のｐＨ値、乳剤粒子径、関連物質、含有量をそれぞれ０ｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、８ｈ、１２ｈに測定した。実験結果は以下の表のとおりである。
2021535932.tif 000007
2021535932.tif 000008
【００５４】
希釈した試料から測定した主要項目の結果、１２時間以内のｐＨ、乳剤粒子径、関連物質、含有量のいずれの希釈試料においても、有意な変化は認められなかった。本発明の組成物の注射液は、グルコース注射又は塩化ナトリウム注射で希釈して１２時間以内に使用すれば、臨床的に安全で信頼性の高いものと見なされる。
【００５５】
本発明の組成物の注射液を２５±２℃の温度で日陰に置き、０、３、６、９、１２、及び１８ヶ月にそれぞれ１回サンプリングし、安定性重点試験項目に従って試験したところ、０ヶ月の場合と比較した。
2021535932.tif 000009
【００５６】
試験結果から、本発明の組成物の注射液を２５±２℃で１８ヶ月間の長期安定性を調べたところ、全ての指標が規定に適合しており、本発明の組成物の注射液の品質が２℃から２５℃までの保存条件で安定していることがわかる。
【００５７】
本発明の組成物の注射液の非臨床安全効果を検証するために、本発明の実施例１で調製した組成物注射剤について、アレルゲン性、溶血及び局所（血管、皮膚、粘膜、筋肉等）刺激性の特別な安全性試験、ゼブラフィッシュ試験、ラットくも膜下出血モデルに対する薬力学試験等を実施し、その実験結果を以下に示す。
【００５８】
一、本発明の組成物の注射液について、アレルゲン性、溶血性、局所（血管、皮膚、粘膜、筋肉等）刺激性などの特別な安全性試験を行った。
１、アレルギー反応試験
１．１  ラットの受身皮膚アナフィラキシー反応試験
対応する抗血清０．１ｍｌの皮内注射による健康なクリーングレードＳＤラットの受動的感作の４８ｈ後、各群に、本発明の組成物の注射液の８、４ｍｇ／ｋｇ投与量で静脈注射し、先行技術特許プロセス（出願番号：２００９１００２１０９１．６  処方にＴｗｅｅｎ  ８０を含む。）を使って調製したニモジピン乳剤の８、４ｍｇ／ｋｇ投与量、ウシ血清アルブミンの１００ｍｇ／ｋｇと０．９％ＮａＣｌ注射液１０ｍｌ／ｋｇ投与量、１％エバンスブルー溶液１ｍｌ／匹で励起する。３０分間後の剖検結果では、本発明の組成物の注射液８、４ｍｇ／ｋｇ投与群、０．９％ＮａＣｌ注射液の陰性対照群のいずれにおいても、ラットの背部の皮膚内層に青斑は認められなかった。これに対して、特許を使って調製したニモジピン乳剤８、４ｍｇ／ｋｇ投与量、ウシ血清アルブミン陽性対照群のラットは、いずれも背中の皮膚の内層に明らかな青斑（いずれも直径５ｍｍ超過）を示し、青斑反応が陽性であった。この試験の用量条件では、先行技術のニモジピン乳剤は感作ラットに対して受身皮膚アナフィラキシー反応を示し、本発明の組成物の注射液は感作ラットに対して受身皮膚アナフィラキシー反応を示さなかった。
2021535932.tif 000010
【００５９】
１．２  モルモットの能動的全身性アナフィラキシーショック反応試験
健康な白色モルモットに、本発明の組成物の注射液４及び２ｍｇ／ｋｇの用量を１日おきに１回、３回連続で腹腔内注射することにより感作した。最終感作後１３日目に、本発明の組成物の注射液の感作用量を単回静脈内注射して励起し、先行技術のニモジピン乳剤の感作・刺激試験を上記のように行った。本発明の組成物の注射液の高用量群では直ちに（約１分）腹這い姿勢、その後に死亡など同様のアレルギー反応を示し、死亡率は１００％であり、モルモットの低用量群では明らかな異常反応は認められなかったことがわかった。一方、先行技術のニモジピン乳剤では、高用量群、低用量群ともに腹這い姿勢、その後に死亡などの類似のアレルギー反応が認められ、高用量群で１００％の死亡率、低用量群で４０％の死亡率であった。本発明の組成物の注射液の高用量群と低用量群、先行技術のニモジピン乳剤、ウシ血清アルブミンの陽性対照群のモルモットは、感作時に有意な異常反応を示さず、最初の感作時、最後の感作時及び励起時の平均体重は、対応する時刻の０．９％ＮａＣｌ注射液の陰性対照群と同様であった（Ｐ＞０．０５）。ウシ血清アルブミン陽性対照群のすべてのモルモットは、励起後に明らかなアレルギー反応の徴候を示し、主に不穏、立毛、身震い、鼻掻き、くしゃみ、咳、頻呼吸、排尿、流涙、呼吸困難、異常歩行、喘鳴、跳び上り、痙攣、さらには死に至るまで、アレルギー反応の強さは＋＋~＋＋＋＋、死に至るまでの時間は投与後約５分間であった。アナフィラキシー反応を起こした生き残ったモルモットは、投与後３０分間以内に徐々に正常に戻り、発生率１００％、死亡率５０％であった。本試験条件では、２ｍｇ／ｋｇの用量での先行技術のニモジピン乳剤はモルモットでアレルギー反応を示し、２ｍｇ／ｋｇの用量での本発明の組成物の注射液はモルモットでアレルギー反応を示さなかった。
【００６０】
２．溶血性研究
従来の薬物の溶血試験法によると、３時間以内に本発明の組成物の注射液０．１−０．５ｍｌの各チューブは、０．９％ＮａＣｌ注射剤の陰性対照チューブと同様に、溶血・凝集は観察されなかった。先行技術のニモジピン乳剤と蒸留水陽性対照チューブは、観察されたすべての時点で完全な溶血を示した。本試験において、先行技術のニモジピン乳剤には溶血・凝集作用があるが、本発明の組成物の注射液には溶血・凝集作用はない。
【００６１】
３．ウサギの血管刺激性試験
ウサギの耳縁静脈（血管）に、本発明の組成物の注射液と先行技術ニモジピン乳剤をそれぞれ１日１回１ｍｇ（１０ｍｌ）／（ｋｇ・ｄ）の用量で７日間連続でゆっくりと注射し、投与中止後９６時間後に解剖したところ、肉眼的には明らかな先行技術ニモジピン乳剤の異常は認められず、病理組織学的検査では、２匹のウサギの注射部位の付近の耳縁静脈の血管に内皮細胞の濁った腫れが認められ、周囲間質軽度の浮腫、いずれも血栓症、塞栓症、広範囲の出血、浮腫、壊死などの重篤な刺激性病変を認めず、０．９％ＮａＣｌ注射対照群と比較して有意差は認められなかった。総合判定は、血管刺激試験の採点基準によると、「＜１」であった。この試験の用量条件では、本発明の組成物の注射液も先行技術のニモジピン乳剤も、「血管刺激の強さ判断」によると、ウサギ耳縁静脈（血管）に対して有意な刺激効果を有していなかった。
【００６２】
４．ウサギを使った筋肉内注射による局所刺激性試験
ウサギの左右の大腿四頭筋に、本発明の組成物の注射液と先行技術のニモジピン乳剤をそれぞれ０．１ｍｇ（１ｍｌ）／（ｋｇ．ｄ）の投与量で１日１回７日間連続で注射し、投与中止後４８時間後に肉眼的検査を行ったところ、８匹のウサギの片側の大腿四頭筋の注射部位に０．５×１．０ｃｍ以下のうっ血の局所病変が認められたのに対し、残りのウサギの注射部位には、うっ血、腫脹、壊死の顕著な病変は認められなかった。すべての大腿四頭筋反応レベルの合計は４で、６未満であり、投与部位である局所大腿四頭筋の病理組織学的検査では、主に小さな焦点性又は微小焦点性の間質性過形成と単核細胞浸潤を示し、一部の病変では筋線維の濁った腫脹又は好塩基性変化を示したが、程度は軽度であり、同時に０．９％ＮａＣｌ注射液対照群と比較して、病変はやや重度であったが、全体的な病変は範囲が限定されており、いずれも明らかな大規模な筋線維の変性、壊死、間質性炎症浸潤、うっ血、出血、浮腫などの重篤な刺激性病変は認められなかった。この試験の用量条件では、本発明の組成物の注射液も、先行技術のニモジピン乳剤も、筋肉刺激反応の評定基準で判断されるように、ウサギの大腿四頭筋に有意な刺激反応を示さなかった。
【００６３】
５．まとめ：
（１）ラットを用いた受身皮膚アナフィラキシー反応試験では、本発明の組成物の注射液は感作ラットに対して受身皮膚アナフィラキシー反応を示さず、先行技術のニモジピン乳剤は感作ラットに対して受身皮膚アナフィラキシー反応を示し、モルモットを用いた能動的全身性アナフィラキシーショック反応試験では、本発明の組成物の注射液の高用量群では直ちに（約１分）腹這い姿勢、その後に死亡など同様のアレルギー反応を示し、死亡率は１００％であり、モルモットの低用量群では明らかな異常反応は認められないことがわかった。一方、先行技術のニモジピン乳剤では、高用量群、低用量群ともに腹這い姿勢、その後に死亡などの類似のアレルギー反応が認められ、高用量群で１００％の死亡率、低用量群で４０％の死亡率であった。
（２）先行技術のニモジピン乳剤には溶血・凝集作用があるが、本発明の組成物の注射液には溶血・凝集作用はない。
（３）ウサギの血管刺激性試験では、本発明の組成物の注射液も先行技術のニモジピン乳剤も、ウサギの耳縁静脈（血管）に対して有意な刺激作用は認められなかった。
（４）ウサギを使った筋肉内注射による局所刺激性試験では、本発明の組成物の注射液も先行技術のニモジピン乳剤も、ウサギの大腿四頭筋に対して有意な刺激効果を示さなかった。
【００６４】
二、本発明の組成物の注射液のゼブラフィッシュモデルを用いた心血管毒性試験を以下のように行った。
１．魚飼育用水に混ぜて投与する
１．１  薬品
被験薬は、ニモジピン原薬、ニモジピン水性注射剤（ニモトップ、バイエル社製）、本発明の組成物の注射液（実施例１に従って調製）、ブランク乳剤、及び先行技術特許プロセス（出願番号：２００９１００２１０９１．６  処方中にＴｗｅｅｎ  ８０を含有する。）より調製されたニモジピン乳剤である。すべて浙江省九旭製薬有限公司が提供した。
【００６５】
１．２  実験装置及び試薬
解剖顕微鏡（ＳＭＺ６４５、日本ニコン）、精密電子天秤（ＣＰ２１４、ＯＨＡＵＳ）、６ウェルプレート（Ｎｅｓｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）。
【００６６】
ゼブラフィッシュ及び魚飼育用水
実験で観察されたゼブラフィッシュの幼虫は、受胎能力実験で生産された胚から自然に孵化したものである。魚飼育用水の水質：逆浸透水１Ｌあたり２００ｍｇの即溶海塩、導電率４８０〜５１０μＳ／ｃｍ、ｐＨ６．９〜７．２、硬度５３．７〜７１．６ｍｇ／ＬＣａＣＯ３。実験終了後、すべての発生段階のゼブラフィッシュに麻酔をかけ、０．２５ｍｇ／ｍｌのトリカインメタンスルホナートを投与して死なせた。麻酔の手順は、動物の麻酔実行に関する米国獣医師会（ＡＶＭＡ）のガイドラインの要件を満たしている。
【００６７】
１．３  試験方法
一定の段階にある野生型ＡＢラインゼブラフィッシュの幼虫を、２４時間被験薬で処理し、初期アッセイ濃度は０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌの５つのレベルを設定し、ブランク対照群を設定し、各濃度で３０匹のゼブラフィッシュを処理した。薬物処理の終了時に、各実験群におけるゼブラフィッシュの死亡数をカウントし、次の実験濃度設計の基礎とした。被験薬の検出濃度範囲は、上限１０００μｇ／ｍｌ（最大溶解度が１０００μｇ／ｍｌ未満の場合は最高溶解度とする）、下限０．００１μｇ／ｍｌである。
【００６８】
１．４  ゼブラフィッシュの致死率の比較
ニモジピン原薬とニモジピン水性注射剤の最大非致死濃度は２．５μｇ／ｍｌ、先行技術のニモジピン乳剤の最大非致死濃度は５．０μｇ／ｍｌであり、本発明の組成物の注射液の最大非致死濃度は１０μｇ／ｍｌであり、これはニモジピン原薬・ニモジピン水性注射剤の４倍、先行技術のニモジピン乳剤の２倍であり、本発明の組成物の注射液が、ニモジピン原薬、ニモジピン水性注射剤、及び先行技術のニモジピン乳剤よりもゼブラフィッシュに対する毒性がはるかに弱いことがわかった。
2021535932.tif 000011
【００６９】
１．５  ゼブラフィッシュの心拍数低下の比較
薬剤濃度が高くなると、ゼブラフィッシュの心拍数は遅くなる。ここで、ニモジピン原薬、ニモジピン水性注射剤、先行技術のニモジピン乳剤は、薬物濃度の増加に伴ってゼブラフィッシュ心拍数の速度低下をより大きく誘導したが、本発明の組成物の注射液は、薬物濃度の増加に伴ってゼブラフィッシュ心拍数の速度低下をより小さく誘導した。
2021535932.tif 000012
【００７０】
１．６  ゼブラフィッシュにおける心房停止の発生率の比較
ニモジピン原薬、ニモジピン水性注射剤及び先行技術のニモジピン乳剤は、２．５μｇ／ｍｌでゼブラフィッシュに部分的な心房停止を誘導し、５．０μｇ／ｍｌでは、ニモジピン原薬、ニモジピン水性注射剤及び先行技術のニモジピン乳剤で誘導されたゼブラフィッシュの心房停止の発生率は、それぞれ９０％、１００％及び７０％に達したが、本発明の組成物の注射液は、２０μｇ／ｍｌの濃度で一部のゼブラフィッシュで、４０μｇ／ｍｌの濃度で１００％のゼブラフィッシュの心房拍動停止を誘導し、すべてニモジピン原薬、ニモジピン水性注射剤、及び先行技術のニモジピン乳剤よりも有意に高い濃度で発生した。
2021535932.tif 000013
【００７１】
１．７  ゼブラフィッシュにおける心膜浮腫の発生率の比較
４種類の薬剤で誘発されたゼブラフィッシュの心膜浮腫の発生率は、薬剤濃度の増加に伴って増加した。そのうち、ニモジピン水性注射剤によって誘導されたゼブラフィッシュの心膜浮腫の発生率は、濃度の増加とともに最も速く増加し、２．５μｇ／ｍｌですべてのゼブラフィッシュの心膜浮腫を誘導し、ニモジピン原薬は２番目に、５．０μｇ／ｍｌですべてのゼブラフィッシュの心膜浮腫を誘導し、先行技術のニモジピン乳剤は３番目に、１０．０μｇ／ｍｌですべてのゼブラフィッシュの心膜浮腫を誘導した。一方、本発明の組成物の注射液によって誘発されたゼブラフィッシュの心膜浮腫の発生率は、薬剤の濃度の増加とともに最もゆっくりと増加し、２０μｇ／ｍｌまでの濃度でのみ、すべてのゼブラフィッシュにおいて心膜浮腫を誘発した。
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【００７２】
１．８  まとめ
実験結果により、ニモジピン原薬、ニモジピン水性注射剤、先行技術のニモジピン乳剤、及び本発明の組成物の注射液は、ゼブラフィッシュに心拍数低下、心房停止、心膜浮腫、及び循環障害を誘発し、４剤とも心血管毒性を有する。ニモジピン原薬とニモジピン水性注射剤の最大非致死濃度は２．５μｇ／ｍｌ、先行技術のニモジピン乳剤の最大非致死濃度は５．０μｇ／ｍｌであり、本発明の組成物の注射液の最大非致死濃度は１０μｇ／ｍｌであり、これはニモジピン原薬・ニモジピン水性注射剤の４倍、先行技術のニモジピン乳剤の２倍であり、本発明の組成物の注射液が、ニモジピン原薬、ニモジピン水性注射剤、及び先行技術のニモジピン乳剤よりもゼブラフィッシュに対する毒性がはるかに弱いことがわかった。
【００７３】
２．卵黄嚢注射による投与
２．１  実験デザイン
投与方法は、最大投与量４０ｎｌの卵黄嚢注射を用い、被験薬を野生型ＡＢラインゼブラフィッシュ幼虫で２４時間処理し、初期アッセイ濃度は０．１ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、５００ｍｇ／ｍｌの５つのレベルとし、ブランク対照群を設定し、各濃度で３０匹のゼブラフィッシュを処理した。薬物処理の終了時に、各実験群におけるゼブラフィッシュの死亡数をカウントし、次の実験濃度設計の基礎とした。被験薬の検出濃度範囲は、上限５００ｍｇ／ｍｌ（最大溶解度が５００ｍｇ／ｍｌ未満の場合は最高溶解度とする）、下限０．００１ｍｇ／ｍｌである。
【００７４】
２．２  ゼブラフィッシュの心血管に及ぼすニモジピン原薬の影響。
２．２．１  １０ｎＬを卵黄嚢注射により投与した。一定時間処理後、ゼブラフィッシュ１０匹を無作為に選び、心拍数をカウントし、比較のために相対心拍数を算出したところ、濃度が３２ｍｇ／ｍｌに達すると心拍数の低下が起こり、それ以外の薬剤処理群は正常であることがわかった。その結果を表１３に示した。
2021535932.tif 000015
【００７５】
２．２．２  実験終了時に死亡率統計を行い、４．０ｍｇ／ｍｌ以上の用量群では濃度が高くなるにつれて致死率が上昇した。その結果を表１４に示した。
2021535932.tif 000016
【００７６】
２．２．３  各群のゼブラフィッシュ１０匹を無作為に選び、解剖顕微鏡で観察した結果、処理群では濃度の増加に伴って心膜浮腫の発生率が増加し、最高濃度の３２ｍｇ／ｍｌ群ではゼブラフィッシュの血行不良を伴い心膜浮腫の発生率が１００％に達した。その結果を表１５に示した。
2021535932.tif 000017
【００７７】
２．３  ゼブラフィッシュの心血管に及ぼすニモジピン水性注射剤（ニモトップ）の影響
２．３．１  ニモジピン水性注射剤の最高濃度は０．２ｍｇ／ｍｌのみで、かつその溶媒を調製することができないため、最高濃度で異なる容積を投与する方法を採用した。溶媒の含有率において最も多いのは２３．７％エタノールであったが、このエタノール濃度が実験に影響を与えないことを示すために、溶媒対照群として２４％エタノール溶液を調製した。一定時間処理後、ゼブラフィッシュ１０匹を無作為に選び、心拍数をカウントし、比較のために相対心拍数を算出したところ、陽性対照（テルフェナジン錠）を除いて全ての群で異常は認められなかった。その結果を表１６に示した。
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【００７８】
２．３．２  実験終了時に死亡率統計を実施したが、死亡個体は見られなかった。その結果を表１７に示した。
2021535932.tif 000019
【００７９】
２．３．３  各群のゼブラフィッシュ１０匹を無作為に選び、解剖顕微鏡で観察した結果、陽性対照群（テルフェナジン錠）を除いて、４０ｎｌ群のみの個体の４０％に循環不全と血流速度低下を伴う心膜浮腫が発生していた。その結果を表１８に示した。
2021535932.tif 000020
【００８０】
２．４  ゼブラフィッシュに対する本発明の組成物の注射液の心血管効果
３つの正式な実験濃度を設定した。一定時間処理後、ゼブラフィッシュ１０匹を無作為に選び、心拍数をカウントし、比較のために相対心拍数を算出したところ、陽性対照（テルフェナジン錠）を除いて全ての群で異常は認められなかった。実験終了時には、死亡個体は見られず、陽性対照群を除く全ての群で異常は見られなかった。その結果を表１９に示した。
2021535932.tif 000021
【００８１】
２．５  まとめ
卵黄嚢注射投与実験におけるニモジピン原薬４．０ｍｇ／ｍｌ以上の用量群のゼブラフィッシュにおける致死率は、濃度の増加に伴って増加し、また心嚢水腫や循環障害を誘発した。ニモジピン原薬を２．０ｍｇ／ｍｌ（６７ｍｇ／ｋｇ）の濃度で投与した場合、３０％の個体に心膜浮腫が誘発され、最大投与量４０ｎｌ（２６．７ｍｇ／ｋｇ）のニモジピン水性注射剤を投与した場合、４０％の個体に心膜浮腫が誘発されたが、本発明の組成物の注射液の最大投与量（１０６．７ｍｇ／ｋｇ）では心血管系毒性は認められず、本発明の組成物の注射液は、ニモジピン水性注射剤及びニモジピン原薬をゼブラフィッシュに投与した場合よりも心血管毒性が低かった。
【００８２】
三、ラットくも膜下出血モデルにおける本発明の組成物の注射液の薬力学試験。
３．１  薬力学試験方法
３．１．１  モデリング方法
体重が１６０−２００ｇの雄ＳＤラットに対して、頭蓋骨を露出させるために麻酔をかけ、約１ｍｍの骨ドリルで頭蓋骨（ラムダ縫合の後ろにある頭頂骨）に穴をほり、ただし、硬膜を穿孔しない。同時に眼底の血管叢から採血し、１ｍＬのシリンジで自己血５００μＬを採取し、その後、骨穴に沿って３−４ｍｍの深さまで頭蓋骨内に挿入し、生体用粘着シールを貼って漏れないようにし、ゆっくりと血を注入して観察した。続いて、Ｐｅｒｉｃａｍ  ＰＳＩ型レーザー微小循環血流撮像装置を用いてラットの脳血流を測定した。
【００８３】
３．１．２  割り付けと投与
実験動物は、頭蓋骨を曝露するだけで血液を注射しない対照群、ニモジピン水性注射剤高、中、低用量群、本発明の組成物の注射液の高、中、低用量群、生理食塩水を注射したモデル群の８群に無作為に分けた。１群あたり１０匹以上がモデリング後まで生存した。各群の投与方法及び投与量は以下のとおりである。
【００８４】
ニモジピン水性注射群：体重によって高用量群２ｍｇ／ｋｇ、中用量群１ｍｇ／ｋｇ、低用量群０．５ｍｇ／ｋｇであり、薬物濃度は１ｍｇ／５ｍＬである。
【００８５】
本発明の組成物の注射液投与群：使用前に生理食塩水で１ｍｇ／５ｍＬの濃度に希釈し、体重によって高用量群２ｍｇ／ｋｇ、中用量群１ｍｇ／ｋｇ、低用量群０．５ｍｇ／ｋｇである。
【００８６】
モデル群：尾静脈注射より生理食塩水１ｍＬ／１００ｇを体重によって投与する。
【００８７】
投与量及び投与方法：体重によって高用量群１ｍＬ／１００ｇ、中用量群０．５ｍＬ／１００ｇ、低用量群０．２５ｍＬ／１００ｇである。モデリング後、それぞれ約３０ｍｉｎ、４８ｈ、９６ｈ後に上記の用量で尾静脈注射により投与した。
【００８８】
３．２  試験結果
３．２．１  脳血流測定の結果
各群のモデリング後投与前の脳血流測定結果を表２０に示した。
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【００８９】
モデリング後各群ともモデル群と比較してＰ＜０．０５≪、Ｐ＜０．０１≪≪、Ｐ＜０．００１≪≪≪。
モデリング後各群とも正常群と比較してＰ＜０．０５p、Ｐ＜０．０１pp、Ｐ＜０．００１ppp。
モデリング後、正常群と比較して、各群で頭蓋全体部位の血流と矢状縫合部位（脳底動脈）の血流に高い有意差が認められた。これは、このモデルが成功したことを示しており、各群で脳灌流量が実質的に低下していたことを示している。
【００９０】
本発明の組成物の各群において、モデル群と比較して、頭蓋全体部位の血流と矢状縫合部位（脳底動脈）の血流に有意な差は認められなかった。ニモジピン水性注射剤中用量群ではモデル群と比較して矢状縫合部位（脳底動脈）の血流に有意差があったに対し、残りの群は有意差がなく、ニモジピン水性注射剤中用量群ではモデル群と比較してモデリング後の基底動脈の血流に有意差があることが示された。
【００９１】
投与後の脳血流を測定し、時間を計り、投与後３０ｍｉｎ後に再度、頭蓋全体部位と矢状縫合部位の血流量を測定した。一元配置分散分析をＥＸＣＥＬソフトウェアで実施し、その結果を以下の表２１及び表２２に示した。
2021535932.tif 000023
各群投与前後の比較でＰ＜０．０５≪、Ｐ＜０．０１≪≪、Ｐ＜０．００１≪≪≪。
【００９２】
表２１に示すように、投与前と比較して、投与後３０ｍｉｎ後には各群で脳血流がある程度改善された。ニモジピン水性注射剤の各投与群と本発明の組成物の各投与群では、投与前後の脳血流改善効果に有意な差は認められなかった。
【００９３】
2021535932.tif 000024
各群ともモデル群と比較してＰ＜０．０５≪、Ｐ＜０．０１≪≪、Ｐ＜０．００１≪≪≪。
【００９４】
表２２に示すように、投与後の群間では、脳血流に有意な差は認められなかった。また、本発明の組成物の投与群を同じ用量のニモジピン水性注射剤群と比較しても、有意差は認められなかった。
【００９５】
モデリング１０ｄ後、ニモジピン水性注射剤の高用量群（３匹）と本発明の組成物高用量群（４匹）の全脳及び中脳の血流をレーザー微小循環血流撮像装置により測定した。一元配置分散分析をＥＸＣＥＬソフトウェアで実施し、その結果を以下の表２３に示した。
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【００９６】
表２３に見られるように、ニモジピン水性注射剤と本発明の組成物高用量群（３回投与）において、１０ｄ後頭蓋全体部位の血流と矢状縫合部位（脳底動脈）の血流は、有意な差がなく、基本的に同じであった。
【００９７】
ニモジピン水性注射剤の高用量群と本発明の組成物高用量群におけるモデリング前後及び投与前後の脳血流値を表２４に示し、脳血流の変化を添付の図１及び図２に示した。
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【００９８】
その結果、ニモジピン水性注射剤と本発明の組成物高用量群において、動物の頭蓋全体部位の血流と矢状縫合部位（脳底動脈）の脳血流値は、モデリング後に有意に減少し、投与後には両者ともにある程度増加したことがわかった。本発明の組成物は、同じ用量のニモジピン水性注射剤よりも若干良好な改善効果を示したが、両群は実質的に同じであり、有意差は認められなかった。
【００９９】
３．２．２  脳血管攣縮の測定結果
脳組織を脱水し、パラフィンで包埋し、脳底動脈を含む脳幹組織の切片を採取し、ＨＥで染色し、密封して顕微鏡観察を行い、画像解析装置を用いて脳底動脈の血管周長と面積を測定することにより、脳内の血管痙攣の程度を求めた。結果は以下の表２５のとおりである。
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各群ともモデル群と比較してＰ＜０．０５≪、Ｐ＜０．０１≪≪、Ｐ＜０．００１≪≪≪。
【０１００】
上記の表から明らかなように、モデル群では正常群に比べて脳底動脈の周長と面積の減少が大きく、ラットでは頭蓋内血液注入により脳底動脈が収縮していることが示唆された。脳底動脈断面周長については、モデル群と比較して、ニモジピン水性注射剤の高用量、中用量、低用量で有意な改善が認められ、ニモジピン水性注射剤の高用量では非常に有意な改善が認められ、本発明の組成物の低用量、中用量、高用量でも有意な改善が認められた。
【０１０１】
群内のＳＤが増加したのは、切片の作成後期に血管が変形しやすく、一部の動物で血管の断面積のばらつきが大きくなったためである。モデル群と比較して、ニモジピン水性注射剤高用量群と本発明の組成物高用量群でのみ、脳底動脈血管断面積が有意に改善された。
【０１０２】
同一投与量での全投与群間の比較では有意差はなかったが、用量反応関係が認められた。投与量の増加に伴い、脳底動脈の周長と面積が増加した。
【０１０３】
各群の脳血管攣縮の程度（脳底動脈周長、脳底動脈面積）の改善度をもとに、効果のある順に、ニモジピン水性高用量≒本発明の組成物高用量＞本発明の組成物中用量≒ニモジピン水性注射剤中用量≒ニモジピン水性注射剤低用量＞本発明の組成物低用量。
【０１０４】
３．２．３  行動指標の測定結果
実験動物には、投与後２４ｈ、７２ｈ、５ｄの回転棒耐久性試験を実施した。その結果を表２６に示した。
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各群ともモデル群と比較してＰ＜０．０５≪、Ｐ＜０．０１≪≪、Ｐ＜０．００１≪≪≪
【０１０５】
回転棒耐久性試験の結果から明らかなように、モデル群の回転棒耐久性は、モデリング後、正常群に比べて著しく低下し、時間の経過とともに徐々に回復する傾向が見られた。
【０１０６】
初回投与の２４ｈ後、モデル群と比較して、投与した全ての群で若干の回復が見られた。ここで、ニモジピン水性注射剤中用量群及び高用量群、本発明の組成物の中用量群及び高用量群では、有意な改善が認められた。異なる用量間には有意な用量反応関係が認められた。
【０１０７】
また、２回投与後（７２ｈ後）には、モデル群と比較して、投与した全ての群で若干の回復が見られた。ここで、ニモジピン水性注射剤高用量群、本発明の組成物の中用量群及び高用量群では、有意な改善が認められた。異なる用量間にはある程度の用量反応関係が認められた。
【０１０８】
また、３回投与後（５ｄ後）には、モデル群と比較して、投与した全ての群で若干の回復が見られた。ここで、本発明の組成物の高用量群では、有意な改善が認められた。異なる用量間にはある程度の用量反応関係が認められた。
【０１０９】
実験動物には、薬物投与後２４ｈ、７２ｈ、５ｄのオープンフィールドテストを行い、ビデオモニタリングシステムを使用して、５ｍｉｎ以内のラットの活動距離と活動時間を記録した。その結果を表２７及び表２８に示した。
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各群ともモデル群と比較してＰ＜０．０５≪、Ｐ＜０．０１≪≪、Ｐ＜０．００１≪≪≪
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各群ともモデル群と比較してＰ＜０．０５≪、Ｐ＜０．０１≪≪、Ｐ＜０．００１≪≪≪
【０１１０】
表２７及び表２８の結果から、モデル群では、５ｍｉｎ以内の活動距離及び活動時間が正常群に比べて有意に減少しており、活動能力の経時的な傾向の変化は認められなかった。
投与後は活動距離と活動時間が改善され、全体的な活動能力が向上し、投与回数の増加に伴って若干改善された。モデル群と比較して、投与５ｄ後に本発明組成物の高用量群で活動距離が有意に改善され、ニモジピン水性注射剤高用量群及び本発明の組成物の中用量群でも活動時間の改善が認められたが、有意差は認められなかった。
【０１１１】
３．３  薬力学試験における有害反応
ニモジピン水性注射剤には高濃度のエタノールが含まれており、静脈内に注射すると強い「麻醉」効果があり、ラットは注射後、回復するのに約１０−３０ｍｉｎがかかる。ここで、ニモジピン水性注射剤の高用量群で有意な副作用が認められ、注射剤投与中に複数の死亡例が認められた。ニモジピン水性注射剤を複数回投与した後、複数の動物が著しい静脈炎及び尾部潰瘍を発症した。本発明の組成物の注射液のいずれの投与群においても、投与時に死亡等の明らかな有害反応は認められなかった。
【０１１２】
以上のように、同一の用量の本発明の組成物の注射液とニモジピン水性注射剤の有効性は、基本的には同等であり、有意な差はない。しかし、本発明の組成物の注射液には、毒性のある副作用や他の明らかな有害反応は認められなかった。したがって、本発明の組成物の注射液は、市販のニモジピン注射剤や先行技術のニモジピン乳剤注射剤と同等の有効性を有しているが、より高い安全性を有している。
【０１１３】
四、本発明の組成物の注射液の血漿中薬物濃度の測定。
雄性ＳＤラットを順化後２日間飼育し、上記と同量の腹腔内注射により５％抱水クロラール（生理食塩水で調製）で麻酔し、麻酔後、番号を付けて本発明の組成物群とニモジピン水性注射剤群に分け、尾静脈注射により体重に従い２ｍｇ／ｋｇの投与量で投与した。本剤投与後１０ｍｉｎ後、３０ｍｉｎ後、９０ｍｉｎ後、１２０ｍｉｎ後にヘパリン採血管を使ってラットの内眼角の眼底静脈から０．３ｍｌを採血し、４０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上層の血漿を−８０℃で保存した。
【０１１４】
ニモジピン血漿試料は、ＵＰＬＣ−ＰＤＡ分析法により測定した。血漿試料を１つずつ処理して分析し、血漿中のニモジピン濃度を算出し、その結果を表２９に示した。時間（ｍｉｎ）に対して血中濃度（ｎｇ／ｍｌ）をプロットし、血中濃度時間曲線をプロットし、その結果を添付の図３に示した。
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【０１１５】
表２９及び添付の図３で示されるように、本発明の組成物投与群とニモジピン水性注射剤投与群の血漿中薬物濃度は基本的に同等であり、薬物濃度時間曲線も基本的に同じであった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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2021535932.tif 000036
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