(57)【要約】  Beclin-1とBcl-2のタンパク質間相互作用の破壊物質として機能する低分子は、オートファジーを誘導することから、がん、感染症（ジカウイルス感染症を含む）、免疫、神経変性、寿命などの、オートファジーの刺激（誘導）が治療上有用な様々な徴候の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オートファジーを選択的に誘導する方法であって、
以下の構造Ｉで示される化合物もしくはその塩、水和物もしくは立体異性体、または本明細書に開示されている化合物を含む医薬組成物を使用して、オートファジーの選択的な誘導を必要とするヒトを処置することを含む方法。
【化１】
2021527067.tif 000042
（式中、
Ｒ１は、置換されていてもよいＣ５またはＣ６のアリールまたはヘテロアリールであるか、
Ｒ１は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１〜３個のヘテロ原子を有し、置換されていてもよいＣ５またはＣ６のアリールまたはヘテロアリールであるか、
Ｒ１は、置換されていてもよい、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、トリアゾール、フラザン、オキサジアゾール、チアジアゾール、ジオキサゾール、ジチアゾール、ピリジン、ピラン、チオピラン、ジアジン、オキサジン、チアジン、ジオキシン、ジチインまたはトリアゾンであるか、
Ｒ１は、置換されていてもよい、２−フラニル、３−フラニル、フェニル、２−ピリジン、３−ピリジンまたは４−ピリジンであり；
Ｒ２は、置換されていてもよいヘテロ原子、および置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルから独立して選択される０〜５個の置換基であるか、
Ｒ２は、ハロゲン、アミド、アミン、イミン、イミド、ニトロ、ニトロソ、ニトラート、ニトリット、シアノ、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルおよびスルホニルから独立して選択される０〜５個の置換基であるか、
Ｒ２は、それぞれフッ素化されていてもよい、ハロゲン、ＮＯ２、Ｎ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルおよびＣ１〜Ｃ４スルホニルから選択される０〜５個の置換基であるか、
Ｒ２は、それぞれフッ素化されていてもよい、ハロゲン、ＮＯ２、Ｎ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルおよびＣ１〜Ｃ４スルホニルから選択される１個のパラ置換基であり、好ましくはメチルまたはフッ素化メチルであり；
Ｒ３は、置換されていてもよいヘテロ原子、および置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルから独立して選択される０〜４個の置換基であるか、
Ｒ３は、ハロゲン、アミド、アミン、イミン、イミド、ニトロ、ニトロソ、ニトラート、ニトリット、シアノ、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルおよびスルホニルから独立して選択される０〜４個の置換基であるか、
Ｒ３は、それぞれフッ素化されていてもよい、ハロゲン、ＮＯ２、Ｎ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルおよびＣ１〜Ｃ４スルホニルから選択される０〜４個の置換基であるか、
Ｒ３は、０個の置換基であり；
Ｒ４は、Ｈ、置換されていてもよいヘテロ原子、または置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルであるか、
Ｒ４は、Ｈ、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルまたはスルホニルであるか、
Ｒ４は、Ｈ、またはそれぞれフッ素化されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルもしくはＣ１〜Ｃ４スルホニルであるか、
Ｒ４はＨであり；
Ｒ５は、置換されていてもよいヘテロ原子、または置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルであるか、
Ｒ５は、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルまたはスルホニルであるか、
Ｒ５は、それぞれフッ素化されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルまたはＣ１〜Ｃ４スルホニルであるか、
Ｒ５は、フッ素化されていてもよい、スルホニル、エステル、ＳＯ２ＲまたはＣＯ２Ｒであり（ここでＲはＣ１〜Ｃ４アルキルである）；
Ｒ４およびＲ５は、一緒になって複素環を形成してもよい。）
【請求項２】
Ｒ１が、置換されていてもよいＣ５またはＣ６のアリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ２が、置換されていてもよいヘテロ原子、および置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルから独立して選択される０〜５個の置換基であり；
Ｒ３が、置換されていてもよいヘテロ原子、および置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルから独立して選択される０〜４個の置換基であり；
Ｒ４が、Ｈ、置換されていてもよいヘテロ原子、または置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルであり；
Ｒ５が、置換されていてもよいヘテロ原子、または置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルである、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ１が、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１〜３個のヘテロ原子を有し、置換されていてもよいＣ５またはＣ６のアリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ２が、ハロゲン、アミド、アミン、イミン、イミド、ニトロ、ニトロソ、ニトラート、ニトリット、シアノ、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルおよびスルホニルから独立して選択される０〜５個の置換基であり；
Ｒ３が、ハロゲン、アミド、アミン、イミン、イミド、ニトロ、ニトロソ、ニトラート、ニトリット、シアノ、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルおよびスルホニルから独立して選択される０〜４個の置換基であり；
Ｒ４が、Ｈ、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルまたはスルホニルであり；
Ｒ５が、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルまたはスルホニルである、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ１が、置換されていてもよい、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、トリアゾール、フラザン、オキサジアゾール、チアジアゾール、ジオキサゾール、ジチアゾール、ピリジン、ピラン、チオピラン、ジアジン、オキサジン、チアジン、ジオキシン、ジチインまたはトリアゾンであり；
Ｒ２が、それぞれフッ素化されていてもよい、ハロゲン、ＮＯ２、Ｎ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルおよびＣ１〜Ｃ４スルホニルから選択される０〜５個の置換基であり；
Ｒ３が、それぞれフッ素化されていてもよい、ハロゲン、ＮＯ２、Ｎ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルおよびＣ１〜Ｃ４スルホニルから選択される０〜４個の置換基であり；
Ｒ４が、Ｈ、またはそれぞれフッ素化されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルもしくはＣ１〜Ｃ４スルホニルであり；
Ｒ５が、それぞれフッ素化されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルまたはＣ１〜Ｃ４スルホニルである、
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ１が、置換されていてもよい、２−フラニル、３−フラニル、フェニル、２−ピリジン、３−ピリジンまたは４−ピリジンであり；
Ｒ２が、それぞれフッ素化されていてもよい、ハロゲン、ＮＯ２、Ｎ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルおよびＣ１〜Ｃ４スルホニルから選択される１個のパラ置換基であり、好ましくはメチルまたはフッ素化メチルであり；
Ｒ３が、０個の置換基であり；
Ｒ４が、Ｈであり；
Ｒ５が、フッ素化されていてもよい、スルホニル、エステル、ＳＯ２ＲまたはＣＯ２Ｒである（ここでＲはＣ１〜Ｃ４アルキルである）、
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
抗アポトーシス性のBcl-2のBH3ドメインへのアポトーシス促進性のBaxのBH3ドメインまたはアポトーシス促進性のBim BH3タンパク質の結合を抑制することなく、抗アポトーシス性のBcl-2のBH3ドメインへのBeclin 1のBH3ドメインの結合を選択的に抑制する方法であって、
以下の構造Ｉで示される化合物もしくはその塩、水和物もしくは立体異性体、または本明細書に開示されている化合物を含む医薬組成物を使用して、Bcl-2のBH3ドメインへのBeclin 1のBH3ドメインの結合の選択的抑制を必要とするヒトを処置することを含む方法。
【化２】
2021527067.tif 000043
（式中、
Ｒ１は、置換されていてもよいＣ５またはＣ６のアリールまたはヘテロアリールであるか、
Ｒ１は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１〜３個のヘテロ原子を有し、置換されていてもよいＣ５またはＣ６のアリールまたはヘテロアリールであるか、
Ｒ１は、置換されていてもよい、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、トリアゾール、フラザン、オキサジアゾール、チアジアゾール、ジオキサゾール、ジチアゾール、ピリジン、ピラン、チオピラン、ジアジン、オキサジン、チアジン、ジオキシン、ジチインまたはトリアゾンであるか、
Ｒ１は、置換されていてもよい、２−フラニル、３−フラニル、フェニル、２−ピリジン、３−ピリジンまたは４−ピリジンであり；
Ｒ２は、置換されていてもよいヘテロ原子、および置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルから独立して選択される０〜５個の置換基であるか、
Ｒ２は、ハロゲン、アミド、アミン、イミン、イミド、ニトロ、ニトロソ、ニトラート、ニトリット、シアノ、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルおよびスルホニルから独立して選択される０〜５個の置換基であるか、
Ｒ２は、それぞれフッ素化されていてもよい、ハロゲン、ＮＯ２、Ｎ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルおよびＣ１〜Ｃ４スルホニルから選択される０〜５個の置換基であるか、
Ｒ２は、それぞれフッ素化されていてもよい、ハロゲン、ＮＯ２、Ｎ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルおよびＣ１〜Ｃ４スルホニルから選択される１個のパラ置換基であり、好ましくはメチルまたはフッ素化メチルであり；
Ｒ３は、置換されていてもよいヘテロ原子、および置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルから独立して選択される０〜４個の置換基であるか、
Ｒ３は、ハロゲン、アミド、アミン、イミン、イミド、ニトロ、ニトロソ、ニトラート、ニトリット、シアノ、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルおよびスルホニルから独立して選択される０〜４個の置換基であるか、
Ｒ３は、それぞれフッ素化されていてもよい、ハロゲン、ＮＯ２、Ｎ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルおよびＣ１〜Ｃ４スルホニルから選択される０〜４個の置換基であるか、
Ｒ３は、０個の置換基であり；
Ｒ４は、Ｈ、置換されていてもよいヘテロ原子、または置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルであるか、
Ｒ４は、Ｈ、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルまたはスルホニルであるか、
Ｒ４は、Ｈ、またはそれぞれフッ素化されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルもしくはＣ１〜Ｃ４スルホニルであるか、
Ｒ４はＨであり；
Ｒ５は、置換されていてもよいヘテロ原子、または置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルであるか、
Ｒ５は、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルまたはスルホニルであるか、
Ｒ５は、それぞれフッ素化されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルまたはＣ１〜Ｃ４スルホニルであるか、
Ｒ５は、フッ素化されていてもよい、スルホニル、エステル、ＳＯ２ＲまたはＣＯ２Ｒであり（ここでＲはＣ１〜Ｃ４アルキルである）；
Ｒ４およびＲ５は、一緒になって複素環を形成してもよい。）
【請求項７】
Ｒ１が、置換されていてもよいＣ５またはＣ６のアリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ２が、置換されていてもよいヘテロ原子、および置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルから独立して選択される０〜５個の置換基であり；
Ｒ３が、置換されていてもよいヘテロ原子、および置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルから独立して選択される０〜４個の置換基であり；
Ｒ４が、Ｈ、置換されていてもよいヘテロ原子、または置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルであり；
Ｒ５が、置換されていてもよいヘテロ原子、または置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルである、
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｒ１が、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１〜３個のヘテロ原子を有し、置換されていてもよいＣ５またはＣ６のアリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ２が、ハロゲン、アミド、アミン、イミン、イミド、ニトロ、ニトロソ、ニトラート、ニトリット、シアノ、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルおよびスルホニルから独立して選択される０〜５個の置換基であり；
Ｒ３が、ハロゲン、アミド、アミン、イミン、イミド、ニトロ、ニトロソ、ニトラート、ニトリット、シアノ、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルおよびスルホニルから独立して選択される０〜４個の置換基であり；
Ｒ４が、Ｈ、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルまたはスルホニルであり；
Ｒ５が、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルまたはスルホニルである、
請求項６に記載の方法。
【請求項９】
Ｒ１が、置換されていてもよい、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、トリアゾール、フラザン、オキサジアゾール、チアジアゾール、ジオキサゾール、ジチアゾール、ピリジン、ピラン、チオピラン、ジアジン、オキサジン、チアジン、ジオキシン、ジチインまたはトリアゾンであり；
Ｒ２が、それぞれフッ素化されていてもよい、ハロゲン、ＮＯ２、Ｎ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルおよびＣ１〜Ｃ４スルホニルから選択される０〜５個の置換基であり；
Ｒ３が、それぞれフッ素化されていてもよい、ハロゲン、ＮＯ２、Ｎ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルおよびＣ１〜Ｃ４スルホニルから選択される０〜４個の置換基であり；
Ｒ４が、Ｈ、またはそれぞれフッ素化されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルもしくはＣ１〜Ｃ４スルホニルであり；
Ｒ５が、それぞれフッ素化されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルまたはＣ１〜Ｃ４スルホニルである、
請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
Ｒ１が、置換されていてもよい、２−フラニル、３−フラニル、フェニル、２−ピリジン、３−ピリジンまたは４−ピリジンであり；
Ｒ２が、それぞれフッ素化されていてもよい、ハロゲン、ＮＯ２、Ｎ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルおよびＣ１〜Ｃ４スルホニルから選択される１個のパラ置換基であり、好ましくはメチルまたはフッ素化メチルであり；
Ｒ３が、０個の置換基であり；
Ｒ４が、Ｈであり；
Ｒ５が、フッ素化されていてもよい、スルホニル、エステル、ＳＯ２ＲまたはＣＯ２Ｒである（ここでＲはＣ１〜Ｃ４アルキルである）、
請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
医薬組成物の投与を必要とするヒトへの投与用に製剤化された医薬組成物であって、以下の構造Ｉに示される化合物もしくはその塩、水和物もしくは立体異性体、または本明細書に開示されている化合物を含む組成物。
【化３】
2021527067.tif 000044
（式中、
Ｒ１は、置換されていてもよいＣ５またはＣ６のアリールまたはヘテロアリールであるか、
Ｒ１は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１〜３個のヘテロ原子を有し、置換されていてもよいＣ５またはＣ６のアリールまたはヘテロアリールであるか、
Ｒ１は、置換されていてもよい、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、トリアゾール、フラザン、オキサジアゾール、チアジアゾール、ジオキサゾール、ジチアゾール、ピリジン、ピラン、チオピラン、ジアジン、オキサジン、チアジン、ジオキシン、ジチインまたはトリアゾンであるか、
Ｒ１は、置換されていてもよい、２−フラニル、３−フラニル、フェニル、２−ピリジン、３−ピリジンまたは４−ピリジンであり；
Ｒ２は、置換されていてもよいヘテロ原子、および置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルから独立して選択される０〜５個の置換基であるか、
Ｒ２は、ハロゲン、アミド、アミン、イミン、イミド、ニトロ、ニトロソ、ニトラート、ニトリット、シアノ、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルおよびスルホニルから独立して選択される０〜５個の置換基であるか、
Ｒ２は、それぞれフッ素化されていてもよい、ハロゲン、ＮＯ２、Ｎ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルおよびＣ１〜Ｃ４スルホニルから選択される０〜５個の置換基であるか、
Ｒ２は、それぞれフッ素化されていてもよい、ハロゲン、ＮＯ２、Ｎ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルおよびＣ１〜Ｃ４スルホニルから選択される１個のパラ置換基であり、好ましくはメチルまたはフッ素化メチルであり；
Ｒ３は、置換されていてもよいヘテロ原子、および置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルから独立して選択される０〜４個の置換基であるか、
Ｒ３は、ハロゲン、アミド、アミン、イミン、イミド、ニトロ、ニトロソ、ニトラート、ニトリット、シアノ、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルおよびスルホニルから独立して選択される０〜４個の置換基であるか、
Ｒ３は、それぞれフッ素化されていてもよい、ハロゲン、ＮＯ２、Ｎ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルおよびＣ１〜Ｃ４スルホニルから選択される０〜４個の置換基であるか、
Ｒ３は、０個の置換基であり；
Ｒ４は、Ｈ、置換されていてもよいヘテロ原子、または置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルであるか、
Ｒ４は、Ｈ、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルまたはスルホニルであるか、
Ｒ４は、Ｈ、またはそれぞれフッ素化されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルもしくはＣ１〜Ｃ４スルホニルであるか、
Ｒ４はＨであり；
Ｒ５は、置換されていてもよいヘテロ原子、または置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルであるか、
Ｒ５は、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルまたはスルホニルであるか、
Ｒ５は、それぞれフッ素化されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルまたはＣ１〜Ｃ４スルホニルであるか、
Ｒ５は、フッ素化されていてもよい、スルホニル、エステル、ＳＯ２ＲまたはＣＯ２Ｒであり（ここでＲはＣ１〜Ｃ４アルキルである）；
Ｒ４およびＲ５は、一緒になって複素環を形成してもよい。）
【請求項１２】
Ｒ１が、置換されていてもよいＣ５またはＣ６のアリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ２が、置換されていてもよいヘテロ原子、および置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルから独立して選択される０〜５個の置換基であり；
Ｒ３が、置換されていてもよいヘテロ原子、および置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルから独立して選択される０〜４個の置換基であり；
Ｒ４が、Ｈ、置換されていてもよいヘテロ原子、または置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルであり；
Ｒ５が、置換されていてもよいヘテロ原子、または置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルである、
請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
Ｒ１が、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１〜３個のヘテロ原子を有し、置換されていてもよいＣ５またはＣ６のアリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ２が、ハロゲン、アミド、アミン、イミン、イミド、ニトロ、ニトロソ、ニトラート、ニトリット、シアノ、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルおよびスルホニルから独立して選択される０〜５個の置換基であり；
Ｒ３が、ハロゲン、アミド、アミン、イミン、イミド、ニトロ、ニトロソ、ニトラート、ニトリット、シアノ、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルおよびスルホニルから独立して選択される０〜４個の置換基であり；
Ｒ４が、Ｈ、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルまたはスルホニルであり；
Ｒ５が、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルまたはスルホニルである、
請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
Ｒ１が、置換されていてもよい、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、トリアゾール、フラザン、オキサジアゾール、チアジアゾール、ジオキサゾール、ジチアゾール、ピリジン、ピラン、チオピラン、ジアジン、オキサジン、チアジン、ジオキシン、ジチインまたはトリアゾンであり；
Ｒ２が、それぞれフッ素化されていてもよい、ハロゲン、ＮＯ２、Ｎ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルおよびＣ１〜Ｃ４スルホニルから選択される０〜５個の置換基であり；
Ｒ３が、それぞれフッ素化されていてもよい、ハロゲン、ＮＯ２、Ｎ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルおよびＣ１〜Ｃ４スルホニルから選択される０〜４個の置換基であり；
Ｒ４が、Ｈ、またはそれぞれフッ素化されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルもしくはＣ１〜Ｃ４スルホニルであり；
Ｒ５が、それぞれフッ素化されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルまたはＣ１〜Ｃ４スルホニルである、
請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
Ｒ１が、置換されていてもよい、２−フラニル、３−フラニル、フェニル、２−ピリジン、３−ピリジンまたは４−ピリジンであり；
Ｒ２が、それぞれフッ素化されていてもよい、ハロゲン、ＮＯ２、Ｎ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルおよびＣ１〜Ｃ４スルホニルから選択される１個のパラ置換基であり、好ましくはメチルまたはフッ素化メチルであり；
Ｒ３が、０個の置換基であり；
Ｒ４が、Ｈであり；
Ｒ５が、フッ素化されていてもよい、スルホニル、エステル、ＳＯ２ＲまたはＣＯ２Ｒである（ここでＲはＣ１〜Ｃ４アルキルである）、
請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
ライブラリー化合物であるSW076956を除く、以下の構造Ｉで示される化合物もしくはその塩、水和物もしくは立体異性体、または本明細書に開示されている化合物。
【化４】
2021527067.tif 000045
（式中、
Ｒ１は、置換されていてもよいＣ５またはＣ６のアリールまたはヘテロアリールであるか、
Ｒ１は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１〜３個のヘテロ原子を有し、置換されていてもよいＣ５またはＣ６のアリールまたはヘテロアリールであるか、
Ｒ１は、置換されていてもよい、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、トリアゾール、フラザン、オキサジアゾール、チアジアゾール、ジオキサゾール、ジチアゾール、ピリジン、ピラン、チオピラン、ジアジン、オキサジン、チアジン、ジオキシン、ジチインまたはトリアゾンであるか、
Ｒ１は、置換されていてもよい、２−フラニル、３−フラニル、フェニル、２−ピリジン、３−ピリジンまたは４−ピリジンであり；
Ｒ２は、置換されていてもよいヘテロ原子、および置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルから独立して選択される０〜５個の置換基であるか、
Ｒ２は、ハロゲン、アミド、アミン、イミン、イミド、ニトロ、ニトロソ、ニトラート、ニトリット、シアノ、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルおよびスルホニルから独立して選択される０〜５個の置換基であるか、
Ｒ２は、それぞれフッ素化されていてもよい、ハロゲン、ＮＯ２、Ｎ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルおよびＣ１〜Ｃ４スルホニルから選択される０〜５個の置換基であるか、
Ｒ２は、それぞれフッ素化されていてもよい、ハロゲン、ＮＯ２、Ｎ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルおよびＣ１〜Ｃ４スルホニルから選択される１個のパラ置換基であり、好ましくはメチルまたはフッ素化メチルであり；
Ｒ３は、置換されていてもよいヘテロ原子、および置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルから独立して選択される０〜４個の置換基であるか、
Ｒ３は、ハロゲン、アミド、アミン、イミン、イミド、ニトロ、ニトロソ、ニトラート、ニトリット、シアノ、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルおよびスルホニルから独立して選択される０〜４個の置換基であるか、
Ｒ３は、それぞれフッ素化されていてもよい、ハロゲン、ＮＯ２、Ｎ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルおよびＣ１〜Ｃ４スルホニルから選択される０〜４個の置換基であるか、
Ｒ３は、０個の置換基であり；
Ｒ４は、Ｈ、置換されていてもよいヘテロ原子、または置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルであるか、
Ｒ４は、Ｈ、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルまたはスルホニルであるか、
Ｒ４は、Ｈ、またはそれぞれフッ素化されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルもしくはＣ１〜Ｃ４スルホニルであるか、
Ｒ４はＨであり；
Ｒ５は、置換されていてもよいヘテロ原子、または置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルであるか、
Ｒ５は、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルまたはスルホニルであるか、
Ｒ５は、それぞれフッ素化されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルまたはＣ１〜Ｃ４スルホニルであるか、
Ｒ５は、フッ素化されていてもよい、スルホニル、エステル、ＳＯ２ＲまたはＣＯ２Ｒであり（ここでＲはＣ１〜Ｃ４アルキルである）；
Ｒ４およびＲ５は、一緒になって複素環を形成してもよい。）
【請求項１７】
Ｒ１が、置換されていてもよいＣ５またはＣ６のアリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ２が、置換されていてもよいヘテロ原子、および置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルから独立して選択される０〜５個の置換基であり；
Ｒ３が、置換されていてもよいヘテロ原子、および置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルから独立して選択される０〜４個の置換基であり；
Ｒ４が、Ｈ、置換されていてもよいヘテロ原子、または置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルであり；
Ｒ５が、置換されていてもよいヘテロ原子、または置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルである、
請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ１が、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１〜３個のヘテロ原子を有し、置換されていてもよいＣ５またはＣ６のアリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ２が、ハロゲン、アミド、アミン、イミン、イミド、ニトロ、ニトロソ、ニトラート、ニトリット、シアノ、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルおよびスルホニルから独立して選択される０〜５個の置換基であり；
Ｒ３が、ハロゲン、アミド、アミン、イミン、イミド、ニトロ、ニトロソ、ニトラート、ニトリット、シアノ、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルおよびスルホニルから独立して選択される０〜４個の置換基であり；
Ｒ４が、Ｈ、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルまたはスルホニルであり；
Ｒ５が、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルまたはスルホニルである、
請求項１６に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ１が、置換されていてもよい、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、トリアゾール、フラザン、オキサジアゾール、チアジアゾール、ジオキサゾール、ジチアゾール、ピリジン、ピラン、チオピラン、ジアジン、オキサジン、チアジン、ジオキシン、ジチインまたはトリアゾンであり；
Ｒ２が、それぞれフッ素化されていてもよい、ハロゲン、ＮＯ２、Ｎ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルおよびＣ１〜Ｃ４スルホニルから選択される０〜５個の置換基であり；
Ｒ３が、それぞれフッ素化されていてもよい、ハロゲン、ＮＯ２、Ｎ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルおよびＣ１〜Ｃ４スルホニルから選択される０〜４個の置換基であり；
Ｒ４が、Ｈ、またはそれぞれフッ素化されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルもしくはＣ１〜Ｃ４スルホニルであり；
Ｒ５が、それぞれフッ素化されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルまたはＣ１〜Ｃ４スルホニルである、
請求項１６に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ１が、置換されていてもよい、２−フラニル、３−フラニル、フェニル、２−ピリジン、３−ピリジンまたは４−ピリジンであり；
Ｒ２が、それぞれフッ素化されていてもよい、ハロゲン、ＮＯ２、Ｎ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルおよびＣ１〜Ｃ４スルホニルから選択される１個のパラ置換基であり、好ましくはメチルまたはフッ素化メチルであり；
Ｒ３が、０個の置換基であり；
Ｒ４が、Ｈであり；
Ｒ５が、フッ素化されていてもよい、スルホニル、エステル、ＳＯ２ＲまたはＣＯ２Ｒである（ここでＲはＣ１〜Ｃ４アルキルである）、
請求項１６に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国国立衛生研究所（NIH）によって付与された助成金番号U19-AI109725による政府支援を受けてなされたものである。米国政府は、本発明に関し一定の権利を保有する。
【背景技術】
【０００２】
マクロオートファジー（以下、オートファジーと呼ぶ）は、望ましくないまたは損傷を受けた細胞タンパク質または細胞小器官が、オートファゴソームと呼ばれる二重膜構造を介して細胞により隔離される異化代謝経路である。このプロセスは、進化的に保存された一連の遺伝子であるオートファジー関連遺伝子（autophagy-related genes（ATG））によって仲介され1,2、このATG遺伝子は、オートファゴソーム膜の核形成、オートファジー膜の伸長、細胞質構成成分の隔離、二重膜の閉鎖、リソソームとの融合、および隔離した内容物の分解において機能する。
【０００３】
オートファジーは、細胞の生存およびストレス適応3、代謝4、発達5,6、免疫7、タンパク質および細胞小器官の恒常性8、ならびに加齢に対する保護9において重要な生理学的役割を果たしている。さらに、糖尿病、感染症、がん、神経変性疾患、加齢などの哺乳動物疾患とオートファジーの関連性を示すいくつかの一連の証拠がある3,9,10。マウスにおいてオートファジー遺伝子を全身あるいは組織特異的に破壊すると、組織異常、異常な炎症、免疫障害、神経変性、腫瘍発生に対する易感受性などの様々な病変が発生する11。ヒトでは、オートファジー遺伝子の変異または多型は、感染症に対する易感受性、がん、炎症性疾患、喘息、脳性麻痺、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ハンチントン病およびパーキンソン病に関連している11~14。さらに、マウスにおけるオートファジー遺伝子の機能獲得型変異または発現の増強は、代謝および組織機能の改善、寿命の延長、神経保護、腫瘍発生の減少などの有益な効果がある11,15~19。したがって、オートファジー誘導剤を開発することにより、臨床医療において特定の疾患を予防および／または治療するための治療アプローチを提供することができる11,20~22。
【０００４】
現在臨床試験中の薬剤または臨床適用されている薬剤のうちのいくつかは、オートファジーを誘導することが知られているが11,23、これらの薬剤の効果は多面的であり、オートファジー経路以外にも作用する。具体的には、上流のシグナル伝達経路の調節（mTORの抑制、AMPKの活性化、カルシウムチャネルの抑制、cAMPのシグナル伝達など）によりオートファジーを増強する薬剤が数多く存在するが、これらの薬剤は下流の様々な生物学的機能も制御し、その結果、オートファジーに関連しない効果がもたらされ、臨床的有用性が制限されることがある21。したがって、利点を最大限に高め、毒性を最小限に抑えるためには、上流のシグナル伝達ではなく、オートファジーの実行の律速段階を選択的な標的とするオートファジー誘導剤が早急に必要とされている。
【０００５】
オートファジーの開始を制御する重要な機構の１つとして、Beclin 1へのBcl-2の結合がある。Beclin 1は、クラスIIIホスファチジルイノシトール３キナーゼであるVPS34とBeclin 1からなる複合体の活性に必須の決定因子として機能する足場タンパク質である24,25。オートファジーレベルは、基底状態では、Bcl-2（またはこれに関連するファミリーメンバーであるBcl-xL）がBeclin 1に結合することによって抑制されている。インビトロでは、ストレス刺激（栄養飢餓24,26、JNKの活性化26、セラミド27、免疫学的シグナル伝達28など）に応答して、Beclin 1とBcl-2からなる複合体が破壊され、オートファジーがアップレギュレートされる。この破壊は、Bcl-2の非構造ループの複数の部位におけるリン酸化26、Bcl-2に対するBeclin 1の親和性を低下させるBeclin 1のBH3ドメイン（両親媒性のαヘリックス）のリン酸化調節29,30、またはBeclin 1とBcl-2の結合を競合的に破壊するBH3オンリータンパク質31によっても仲介されうる。Beclin 1とBcl-2の結合の破壊に必要なBcl-2のリン酸化部位に変異を有する遺伝子組換えマウスでは、インビボにおける飢餓誘発性オートファジーおよび運動誘発性オートファジーが欠損しており、長期的な運動トレーニングによる有益な代謝効果は認められない32。
【０００６】
これとは逆に、インビトロにおいてBcl-2およびBcl-xLに対するBeclin 1の結合親和性を低下させる点変異（ヒトタンパク質ではF123A、マウスタンパク質ではF121A）をBeclin 1にノックインしたマウスでは、脳、心臓、筋肉、肝臓、乳腺、腎臓などの複数の組織において構成的オートファジーが増加する17~19。このマウスは、寿命の延長と、加齢に関連した表現型の減少を示し、特に、加齢に関連した腎臓および心臓の病理変化および加齢に関連した腫瘍の自然発生が減少する。さらに、Beclin 1へのこのノックイン変異は、アルツハイマー様疾患のマウスモデルにおいて、アミロイドオリゴマーの蓄積を減少させるとともに、認知機能と生存率を改善し18、HER2誘導性腫瘍発生マウスモデルにおいて乳がんの発生率を低下させる19。
【０００７】
このように、Beclin 1とBcl-2の相互作用が、インビボにおいてオートファジーを誘導する重要なチェックポイントとして機能しているという説得力のある遺伝学的証拠がある。さらに重要なことには、この複合体の長期的な破壊は、マウスにおいて安全なだけではなく、健康期間を延長し、寿命を延長し、神経変性疾患およびがんを予防する。これらのインビボでの知見と、インビトロでのオートファジーの制御におけるBeclin 1とBcl-2の相互作用の役割に関する広範なデータから25,30、Beclin 1とBcl-2の結合を標的とした新規なオートファジー誘導戦略を開発することの強い論理的根拠が示されている。
【０００８】
しかし、このアプローチでは、オートファジータンパク質であるBeclin 1のBH3ドメインと、アポトーシス促進性タンパク質のBH3ドメインがいずれも、Bcl-2またはBcl-xLの保存された疎水性溝に結合するという様式の重複があるという重大な問題点がある33,34。BH3ミメティック（たとえば、ABT-737、ABT-263、ABT-199など）は、Bcl-2（および／またはBcl-xL）へのBeclin 1の結合を破壊すること（かつ、これによりオートファジーを誘導すること）を目的として開発されたが31,35、これらのBH3ミメティックは、抗アポトーシス性のBcl-2ファミリーのメンバーとアポトーシス促進性のBH3ドメインの結合も破壊する（その結果、アポトーシスが誘導される）36。これらのBH3ミメティックは、アポトーシス誘導活性が最適化され、がん化学療法剤の候補薬として使用できるように最適化されたものである。しかしながら、感染症および神経変性を治療し、加齢を予防する（さらに、オートファジーのアップレギュレーションが有益でありうるその他の病態生理学的状態を治療および予防する）という観点からは、Bcl-2ファミリーのメンバーとアポトーシス促進性ファミリーのメンバーの結合を破壊することなく、Beclin 1とBcl-2の結合を選択的に破壊し、それによって、アポトーシスを誘導することなくオートファジー（生存促進経路）を選択的に誘導する薬剤を開発することが望ましいと考えられる。これは技術的に実現可能であると考えられ、この理由として、Beclin 1のBH3ドメインのBcl-xLに対する結合親和性は、アポトーシス促進性BH3ファミリーメンバーのBcl-xLに対する結合親和性よりも大幅に低いことから34,37,38、Bcl-2および／またはBcl-xLに対するBeclin 1の結合を選択的に破壊できる治療域を得られる可能性があることが挙げられる。さらに、Bcl-2ファミリーのメンバーに対するBH3ペプチドの結合の詳細な生化学的分析および生物物理学的分析を実施したところ、様々なBH3ドメインの厳密な結合様式には差異が存在し、これを治療に利用できる可能性が示された33,34,39。これを踏まえ、本発明者らは、アポトーシス促進性のBH3ドメインを含む分子へのBcl-2の結合を乱すことなく、Beclin 1とBcl-2の相互作用を標的とする新規なオートファジー誘導薬の同定に尽力を重ねた。
【０００９】
細胞ベースのスプリットルシフェラーゼアッセイまたはインビトロのAlphaLISAアッセイを使用したハイスループットスクリーニング（HTS）プラットフォームを採用して、新規なBeclin 1/Bcl-2結合阻害剤を同定した。UT Southwestern Medical CenterとMITおよびハーバード大学のブロード研究所から得た約300,000種の化合物を含む化合物ライブラリーを使用することにより、細胞ベースのスプリットルシフェラーゼアッセイにおいてBeclin 1とBcl-2の相互作用を破壊し、かつインビトロのAlphaLISAアッセイにおいてμＭレベルのIC50値でBeclin 1とBcl-2の相互作用を直接抑制する３種の低分子化合物を同定した。これらの３種の化合物は、細胞の生存能力を低下させない濃度において、細胞にオートファジーフラックスを誘導する。本発明者らが得た生化学的データから、これらの化合物は、アポトーシス促進性タンパク質であるBaxのBH3ドメインとBcl-2の間の相互作用や、BH3オンリータンパク質であるBimとBcl-2の間の相互作用に影響を与えることなく、Beclin 1のBH3ドメインとBcl-2の間の相互作用を抑制することが示され、このことから、これらの化合物が、Beclin 1とBcl-2の相互作用の選択的阻害剤であることが示された。全体的な結果として、このスクリーニングプログラムにより、Beclin 1とBcl-2の相互作用を選択的に破壊する化合物が同定された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
オートファジーは、細胞の恒常性、発達、免疫、腫瘍の抑制、代謝、神経変性の予防および寿命の延長に重要な役割を果たしている。したがって、オートファジーを薬理学的に刺激することによって、特定のヒト疾患および／または加齢の予防または治療に有効なアプローチを提供することができる。スプリットルシフェラーゼアッセイおよびAlphaLISAアッセイを使用し、構造活性相関（SAR）を利用した開発を行うことによって、（アポトーシスを誘導しうるその他のBH3ドメイン含有タンパク質とBcl-2の間のタンパク質間相互作用を抑制することなく）Beclin 1とBcl-2のタンパク質間相互作用を選択的に抑制する低分子を開発した。Beclin-1とBcl-2のタンパク質間相互作用の破壊物質として機能するこれらの低分子は、オートファジーを誘導することから、がん、感染症（ジカウイルス感染症を含む）、免疫、神経変性、寿命などの、オートファジーの刺激（誘導）が治療上有用な様々な徴候の治療に有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は様々な態様において以下のものを提供する。
【００１２】
オートファジーを選択的に誘導する方法であって、以下の構造Ｉで示される化合物を含む医薬組成物を使用して、オートファジーの選択的な誘導を必要とするヒトを処置することを含む方法。
【００１３】
抗アポトーシス性のBcl-2のBH3ドメインへのアポトーシス促進性のBaxのBH3ドメインまたはアポトーシス促進性のBim BH3タンパク質の結合を抑制することなく、抗アポトーシス性のBcl-2のBH3ドメインへのBeclin 1のBH3ドメインの結合を選択的に抑制する方法であって、以下の構造Ｉで示される化合物を含む医薬組成物を使用して、Bcl-2のBH3ドメインへのBeclin 1のBH3ドメインの結合の選択的抑制を必要とするヒトを処置することを含む方法。
【００１４】
医薬組成物の投与を必要とするヒトへの投与用に製剤化された医薬組成物であって、以下の構造Ｉに示される化合物を含む組成物。
【００１５】
ライブラリー化合物であるSW076956を除く、以下の構造Ｉで示される化合物またはその塩、水和物もしくは立体異性体。
【化１】
2021527067.tif 000002
（式中、
Ｒ１は、置換されていてもよいＣ５またはＣ６のアリールまたはヘテロアリールであるか、
Ｒ１は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１〜３個のヘテロ原子を有し、置換されていてもよいＣ５またはＣ６のアリールまたはヘテロアリールであるか、
Ｒ１は、置換されていてもよい、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、トリアゾール、フラザン、オキサジアゾール、チアジアゾール、ジオキサゾール、ジチアゾール、ピリジン、ピラン、チオピラン、ジアジン、オキサジン、チアジン、ジオキシン、ジチインまたはトリアゾンであるか、
Ｒ１は、置換されていてもよい、２−フラニル、３−フラニル、フェニル、２−ピリジン、３−ピリジンまたは４−ピリジンであり；
Ｒ２は、置換されていてもよいヘテロ原子、および置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルから独立して選択される０〜５個の置換基であるか、
Ｒ２は、ハロゲン、アミド、アミン、イミン、イミド、ニトロ、ニトロソ、ニトラート、ニトリット、シアノ、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルおよびスルホニルから独立して選択される０〜５個の置換基であるか、
Ｒ２は、それぞれフッ素化されていてもよい、ハロゲン、ＮＯ２、Ｎ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルおよびＣ１〜Ｃ４スルホニルから選択される０〜５個の置換基であるか、
Ｒ２は、それぞれフッ素化されていてもよい、ハロゲン、ＮＯ２、Ｎ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルおよびＣ１〜Ｃ４スルホニルから選択される１個のパラ置換基であり；
Ｒ３は、置換されていてもよいヘテロ原子、および置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルから独立して選択される０〜４個の置換基であるか、
Ｒ３は、ハロゲン、アミド、アミン、イミン、イミド、ニトロ、ニトロソ、ニトラート、ニトリット、シアノ、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルおよびスルホニルから独立して選択される０〜４個の置換基であるか、
Ｒ３は、それぞれフッ素化されていてもよい、ハロゲン、ＮＯ２、Ｎ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルおよびＣ１〜Ｃ４スルホニルから選択される０〜４個の置換基であるか、
Ｒ３は、０個の置換基であり；
Ｒ４は、Ｈ、置換されていてもよいヘテロ原子、または置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルであるか、
Ｒ４は、Ｈ、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルまたはスルホニルであるか、
Ｒ４は、Ｈ、またはそれぞれフッ素化されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルもしくはＣ１〜Ｃ４スルホニルであるか、
Ｒ４はＨであり；
Ｒ５は、置換されていてもよいヘテロ原子、または置換されていてもよく、ヘテロ原子を含んでいてもよく、環状であってもよいＣ１〜Ｃ１０ヒドロカルビルであるか、
Ｒ５は、ヒドロキシル、ヒドロカルビルオキシ、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、エーテル、エステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、スルフィニルまたはスルホニルであるか、
Ｒ５は、それぞれフッ素化されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、シクロプロピル、イソプロピル、シクロブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４シアノ、Ｃ１〜Ｃ４スルフィニルまたはＣ１〜Ｃ４スルホニルであるか、
Ｒ５は、フッ素化されていてもよい、スルホニル、エステル、ＳＯ２ＲまたはＣＯ２Ｒであり（ここでＲはＣ１〜Ｃ４アルキルである）；
Ｒ４およびＲ５は、一緒になって複素環を形成してもよい。）
【００１６】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態のあらゆる組み合わせが、あたかも労力を伴って記載されているように、これらの組み合わせを包含する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
「アルキル」は、炭素数１〜１８、炭素数１〜１２または炭素数１〜６の直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素基から選択される炭化水素基を指す。アルキル基の例としては、メチル、エチル、１−プロピルまたはｎ−プロピル（「ｎ−Ｐｒ」）、２−プロピルまたはイソプロピル（「ｉ−Ｐｒ」）、１−ブチルまたはｎ−ブチル（「ｎ−Ｂｕ」）、２−メチル−１−プロピルまたはイソブチル（「ｉ−Ｂｕ」）、１−メチルプロピルまたはｓ−ブチル（「ｓ−Ｂｕ」）、および１，１−ジメチルエチルまたはｔ−ブチル（「ｔ−Ｂｕ」）が挙げられる。アルキル基のその他の例としては、１−ペンチル基、２−ペンチル基、３−ペンチル基、２−メチル−２−ブチル基、３−メチル−２−ブチル基、３−メチル−１−ブチル基、２−メチル−１−ブチル基、１−ヘキシル基、２−ヘキシル基、３−ヘキシル基、２−メチル−２−ペンチル基、３−メチル−２−ペンチル基、４−メチル−２−ペンチル基、３−メチル−３−ペンチル基、２−メチル−３−ペンチル基、２，３−ジメチル−２−ブチル基および３，３−ジメチル−２−ブチル基が挙げられる。
【００１８】
低級アルキルは、炭素数が１〜８、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜４であることを意味する。低級アルケニルまたは低級アルキニルは、炭素数が２〜８、２〜６または２〜４であることを意味する。
【００１９】
「アルケニル」は、少なくとも１つのＣ＝Ｃ二重結合を含み、かつ炭素数２〜１８、炭素数２〜１２または炭素数２〜６の直鎖または分岐鎖の炭化水素基から選択される炭化水素基を指す。アルケニル基の例は、エテニル基またはビニル基、プロパ−１−エニル基、プロパ−２−エニル基、２−メチルプロパ−１−エニル基、ブタ−１−エニル基、ブタ−２−エニル基、ブタ−３−エニル基、ブタ−１，３−ジエニル基、２−メチルブタ−１，３−ジエン基、ヘキサ−１−エニル基、ヘキサ−２−エニル基、ヘキサ−３−エニル基、ヘキサ−４−エニル基、およびヘキサ−１，３−ジエニル基から選択してもよい。
【００２０】
「アルキニル」は、少なくとも１つのＣ≡Ｃ三重結合を含み、かつ炭素数２〜１８、炭素数２〜１２、または炭素数２〜６の直鎖または分岐鎖の炭化水素基から選択される炭化水素基を指す。アルキニル基の例としては、エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル（プロパルギル）基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、および３−ブチニル基が挙げられる。
【００２１】
「シクロアルキル」は、単環基および多環基（たとえば二環基および三環基）を含む、飽和環式炭化水素基および部分不飽和環式炭化水素基から選択される炭化水素基を指す。たとえば、シクロアルキル基の炭素数は、３〜１２、３〜８または３〜６であってもよい。また、たとえば、シクロアルキル基は、炭素数３〜１２、炭素数３〜８または炭素数３〜６の単環基であってもよい。単環式シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、１−シクロペンタ−１−エニル基、１−シクロペンタ−２−エニル基、１−シクロペンタ−３−エニル基、シクロヘキシル基、１−シクロヘキサ−１−エニル基、１−シクロヘキサ−２−エニル基、１−シクロヘキサ−３−エニル基、シクロヘキサジエニル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基、シクロウンデシル基、およびシクロドデシル基が挙げられる。二環式シクロアルキル基の例としては、［４，４］環系、［４，５］環系、［５，５］環系、［５，６］環系および［６，６］環系から選択される二環基として７〜１２個の環原子が配置された基、ならびにビシクロ［２．２．１］ヘプタン、ビシクロ［２．２．２］オクタンおよびビシクロ［３．２．２］ノナンから選択される架橋二環基として７〜１２個の環原子が配置された基が挙げられる。これらの環は、飽和していてもよく、少なくとも１つの二重結合を有していてもよい（すなわち部分的に不飽和であってもよい）が、完全には共役しておらず、本明細書で定義されるような芳香環ではない。
【００２２】
本明細書において「アリール」は、５員または６員の炭素環式芳香環（たとえばフェニルなど）；少なくとも１つの環が炭素環式芳香族である二環系（７〜１２員の二環系など）（たとえば、ナフタレン、インダンおよび１，２，３，４−テトラヒドロキノリンから選択される二環系など）；ならびに少なくとも１つの環が炭素環式芳香族である三環系（１０〜１５員の三環系など）（たとえばフルオレンなど）から選択される基を指す。
【００２３】
たとえば、アリール基は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含んでいてもよい５〜７員のシクロアルキルまたは複素環と縮合した５員または６員の炭素環式芳香環から選択され、炭素環式芳香環が複素環と縮合している場合、結合点は炭素環式芳香環にあり、炭素環式芳香環がシクロアルキル基と縮合している場合、結合点は、炭素環式芳香環にあってもよく、シクロアルキル基にあってもよい。置換ベンゼン誘導体から形成され、環原子に自由原子価を有する二価基は、置換フェニレン基と呼ばれる。名称が「イル」で終わる一価の多環式炭化水素基において、自由原子価を有する炭素原子から１つの水素原子を除去することにより得られる二価の基は、それに対応する一価の基の名称に「イデン」を付けて命名され、たとえば、２つの結合点を有するナフチル基は、ナフチリデンと呼ばれる。一方、アリールは、ヘテロアリールを包含したり、ヘテロアリールと重複したりすることなく、以下で述べるように別に定義される。したがって、１つ以上の炭素環式芳香環が複素環式芳香環と縮合した場合、本明細書で定義するように、生成する環系はヘテロアリールであり、アリールではない。
【００２４】
「ハロゲン」または「ハロ」は、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを指す。
【００２５】
「ヘテロアルキル」は、少なくとも１個のヘテロ原子を含むアルキルを指す。
【００２６】
「ヘテロアリール」は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個、２個、３個または４個のヘテロ原子を含み、残りの環原子が炭素である５〜７員の芳香族単環基；Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個、２個、３個または４個のヘテロ原子を含み、残りの環原子が炭素である８〜１２員の二環基であって、少なくとも一方の環が芳香環であり、少なくとも１個のヘテロ原子が該芳香環に存在する二環基；ならびに、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個、２個、３個または４個のヘテロ原子を含み、残りの環原子が炭素である１１〜１４員の三環基であって、少なくとも１つの環が芳香環であり、少なくとも１個のヘテロ原子が芳香環に存在する三環基から選択される基を指す。
【００２７】
たとえば、ヘテロアリール基には、５〜７員のシクロアルキル環と縮合した５〜７員の複素環式芳香環が含まれる。このような、１つの環のみに少なくとも１個のヘテロ原子が含まれる縮合二環式ヘテロアリール環系では、結合点は、複素環式芳香環にあってもよく、シクロアルキル環にあってもよい。
【００２８】
ヘテロアリール基において、Ｓ原子とＯ原子の総数が１を超える場合、これらのヘテロ原子は互いに隣接していない。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール基におけるＳ原子とＯ原子の総数は２以下である。いくつかの実施形態において、芳香族複素環におけるＳ原子とＯ原子の総数は１以下である。
【００２９】
ヘテロアリール基の例としては、（結合位置を１位として番号を付けた場合）ピリジル（たとえば、２−ピリジル、３−ピリジルまたは４−ピリジル）、シンノリニル、ピラジニル、２，４−ピリミジニル、３，５−ピリミジニル、２，４−イミダゾリル、イミダゾピリジニル、イソキサゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、テトラゾリル、チエニル、トリアジニル、ベンゾチエニル、フリル、ベンゾフリル、ベンゾイミダゾリル、インドリル、イソインドリル、インドリニル、フタラジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピロリル、トリアゾリル、キノリニル、イソキノリニル、ピラゾリル、ピロロピリジニル（たとえば１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）、ピラゾロピリジニル（たとえば１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−イル）、ベンゾオキサゾリル（たとえばベンゾ［ｄ］オキサゾール−６−イル）、プテリジニル、プリニル、１−オキサ−２，３−ジアゾリル、１−オキサ−２，４−ジアゾリル、１−オキサ−２，５−ジアゾリル、１−オキサ−３，４−ジアゾリル、１−チア−２，３−ジアゾリル、１−チア−２，４−ジアゾリル、１−チア−２，５−ジアゾリル、１−チア−３，４−ジアゾリル、フラザニル、ベンゾフラザニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、フロピリジニル、ベンゾチアゾリル（たとえばベンゾ［ｄ］チアゾール−６−イル）、インダゾリル（たとえば１Ｈ−インダゾール−５−イル）および５，６，７，８−テトラヒドロイソキノリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
「複素環式」、「複素環」または「ヘテロシクリル」は、酸素、硫黄および窒素から選択される１個、２個、３個または４個のヘテロ原子に加えて、少なくとも１個の炭素原子を含む４〜１２員の単環式、二環式または三環式の飽和環または部分不飽和環から選択される環を指す。また、「複素環」は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む５〜７員の複素環が、５員、６員および／または７員のシクロアルキル、炭素環式芳香環または複素環式芳香環と縮合した基も指し、該複素環が炭素環式芳香環または複素環式芳香環と縮合している場合、結合点は該複素環にあり、該複素環がシクロアルキルと縮合している場合、結合点は、シクロアルキルにあってもよく、該複素環にあってもよい。
【００３１】
さらに、「複素環」は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む脂肪族スピロ環も指すが、この場合、結合点は複素環にある。これらの環は、飽和していてもよく、少なくとも１つの二重結合を有していてもよい（すなわち部分的に不飽和であってもよい）。複素環はオキソで置換されていてもよい。結合点は、複素環の炭素にあってもよく、複素環のヘテロ原子にあってもよい。複素環は、本明細書で定義されるヘテロアリールではない。
【００３２】
複素環の例としては、（結合位置を１位として番号を付けた場合）１−ピロリジニル、２−ピロリジニル、２，４−イミダゾリジニル、２，３−ピラゾリジニル、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−ピペリジニル、２，５−ピペラジニル、ピラニル、２−モルホリニル、３−モルホリニル、オキシラニル、アジリジニル、チイラニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、１，２−ジチエタニル、１，３−ジチエタニル、ジヒドロピリジニル、テトラヒドロピリジニル、チオモルホリニル、チオキサニル、ピペラジニル、ホモピペラジニル、ホモピペリジニル、アゼパニル、オキセパニル、チエパニル、１，４−オキサチアニル、１，４−ジオキセパニル、１，４−オキサチエパニル、１，４−オキサアゼパニル、１，４−ジチエパニル、１，４−チアゼパニル、１，４−ジアゼパン、１，４−ジチアニル、１，４−アザチアニル、オキサゼピニル、ジアゼピニル、チアゼピニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロピラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、１−ピロリニル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、インドリニル、２Ｈ−ピラニル、４Ｈ−ピラニル、１，４−ジオキサニル、１，３−ジオキソラニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、ジチアニル、ジチオラニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、ピリミジノニル、１，１−ジオキソ−チオモルホリニル、３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサニル、３−アザビシクロ［４．１．０］ヘプタニルおよびアザビシクロ［２．２．２］ヘキサニルが挙げられるが、これらに限定されない。置換複素環には、１つ以上のオキソ部分で置換された環系、たとえば、ピペリジニルＮ−オキシド、モルホリニル−Ｎ−オキシド、１−オキソ−１−チオモルホリニルおよび１，１−ジオキソ−１−チオモルホリニルなども含まれる。
【００３３】
置換基は、ハロゲン、−Ｒ’、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’−ＳＯ２ＮＲ’’’、−ＮＲ’’ＣＯ２Ｒ’、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＲ’Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−ＳＯ２Ｒ’、−ＳＯ２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’ＳＯ２Ｒ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、パーフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシおよびパーフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから選択され、置換基の数は０〜３個であり、０個、１個または２個の置換基を有する基が特に好ましい。Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は、それぞれ独立して、水素、置換されていない（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、置換されていない（Ｃ１〜Ｃ８）ヘテロアルキル、置換されていないアリール、１〜３個のハロゲンで置換されたアリール、置換されていないアルキル基、置換されていないアルコキシ基、置換されていないチオアルコキシ基、またはアリール−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基を指す。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に結合している場合、Ｒ’およびＲ’’はこの窒素原子と一緒になって５員環、６員環または７員環を形成することができる。したがって、−ＮＲ’Ｒ’’は、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含み、「アルキル」は、トリハロアルキル（たとえば−ＣＦ３や−ＣＨ２ＣＦ３）などの基を含み、アリール基が１，２，３，４−テトラヒドロナフタレンである場合、このアリール基は、置換されたまたは置換されていない（Ｃ３〜Ｃ７）スピロシクロアルキル基で置換されていてもよい。この（Ｃ３〜Ｃ７）スピロシクロアルキル基は、本明細書で定義される「シクロアルキル」と同様に置換されていてもよい。
【００３４】
好ましい置換基は、ハロゲン、−Ｒ’、−ＯＲ’、＝Ｏ、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’’ＣＯ２Ｒ’、−ＮＲ’−ＳＯ２ＮＲ’’Ｒ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−ＳＯ２Ｒ’、−ＳＯ２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’ＳＯ２Ｒ、−ＣＮ、−ＮＯ２、パーフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシおよびパーフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから選択される（ここで、Ｒ’およびＲ’’は上記で定義した通りである）。
【００３５】
本明細書において「縮合環」は、２つの環が２個の環原子と１本の結合のみを共有する多環系（たとえば二環系または三環系）を指す。縮合環の例として、前述した［４，４］環系、［４，５］環系、［５，５］環系、［５，６］環系および［６，６］環系から選択される二環基として７〜１２個の環原子が配置された基などの、縮合二環式シクロアルキル環；前述した７〜１２員の二環式アリール環系などの縮合二環式アリール環；前述した１０〜１５員の三環式アリール環系などの縮合三環式アリール環；前述した８〜１２員の二環式ヘテロアリール環などの縮合二環式ヘテロアリール環；前述した１１〜１４員の三環式ヘテロアリール環などの縮合三環式ヘテロアリール環；ならびに前述した縮合二環式ヘテロシクリル環および縮合三環式ヘテロシクリル環を挙げることができる。
【００３６】
本発明の化合物は不斉中心を有していてもよく、したがって、エナンチオマーとして存在していてもよい。本発明の化合物が２つ以上の不斉中心を有する場合、さらにジアステレオマーとして存在していてもよい。エナンチオマーおよびジアステレオマーは、より広い意味での立体異性体に含まれるものとする。実質的に純粋に分割されたエナンチオマー、そのラセミ体混合物、ジアステレオマーの混合物などの、存在しうるあらゆる立体異性体が本発明に含まれるものとする。また、本発明の化合物のあらゆる立体異性体および／またはその薬学的に許容される塩が本発明に含まれるものとする。本明細書に特に記載がない限り、１種の異性体に対する言及は、存在しうるあらゆる異性体にも適用されるものとする。異性体組成物が特定されていない場合、存在しうるあらゆる異性体が含まれるものとする。
【００３７】
本発明の化合物は、重水素などの同位体原子を自然界では見られない割合で構成原子の１個以上に含んでいてもよく、たとえば、メチルの代わりに−ＣＤ３、ＣＤ２ＨまたはＣＤＨ２を含んでいてもよい。たとえば、本発明の化合物は、たとえばトリチウム（３Ｈ）、ヨウ素１２５（１２５Ｉ）、炭素１４（１４Ｃ）などの放射性同位体で放射性標識されていてもよい。同位体を含む本発明の化合物は、放射性であるか非放射性であるかにかかわらず、本発明の範囲内に包含されるものとする。
【００３８】
「実質的に純粋」とは、目的の立体異性体が、その他の立体異性体を、３５重量％以下、たとえば３０重量％以下、さらにたとえば２５重量％以下、さらにたとえば２０重量％以下しか含んでいないことを意味する。いくつかの実施形態において、「実質的に純粋」とは、目的の立体異性体が、その他の立体異性体を、１０重量％以下、たとえば５重量％以下、たとえば１重量％以下しか含んでいないことを意味する。
【００３９】
本明細書に具体的な記載がない限り、本発明の化合物がオレフィン二重結合を有する場合、このような二重結合は、Ｅ幾何異性体とＺ幾何異性体の両方が含まれることを意味する。
【００４０】
本発明の化合物のいくつかは、水素の結合点が異なっていてもよく、このような化合物を互変異性体と呼ぶ。たとえば、カルボニル基（−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−）を有する化合物（ケト型）は、互変異性によりヒドロキシル基（−ＣＨ＝Ｃ（ＯＨ）−）（エノール型）を形成することがある。適切であれば、ケト型とエノール型の両方、ケト型とエノール型のいずれか、およびケト型とエノール型の混合物が含まれるものとする。
【００４１】
様々な反応生成物を互いに分離したり、かつ／または出発原料から反応生成物を分離すると有利な場合がある。各工程または一連の工程で得られる所望の生成物を、当技術分野で一般的な技術により分離および／または精製（以下、「分離」と呼ぶ）して、所望の均質性とする。通常、このような分離には、多相抽出、溶媒または溶媒混合物からの結晶化、蒸留、昇華またはクロマトグラフィーが含まれる。クロマトグラフィーには様々な方法が含まれ、たとえば、逆相クロマトグラフィーおよび順相クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー；高圧、中圧および低圧での液体クロマトグラフ法およびクロマトグラフ装置；少量分析クロマトグラフィー；疑似移動床（「ＳＭＢ」）クロマトグラフィー、分取薄層クロマトグラフィー、分取厚層クロマトグラフィー；少量薄層クロマトグラフィー技術、ならびにフラッシュクロマトグラフィー技術が挙げられる。当業者であれば、所望の分離を最も達成できそうな技術を適用することができるであろう。
【００４２】
ジアステレオマー混合物は、クロマトグラフィーおよび／または分別結晶化などの当業者に公知の方法を使用して、物理化学的差異に基づいて各ジアステレオマーに分離することができる。エナンチオマー混合物は、適切な光学活性化合物（たとえば、キラルアルコールやモッシャー酸塩化物などのキラル補助剤）と反応させてジアステレオマー混合物に変換した後、ジアステレオマーを分離し、得られた各ジアステレオマーを、それぞれに対応する純粋なエナンチオマーに変換（たとえば加水分解）することによって、エナンチオマーを分離することができる。エナンチオマーは、キラルＨＰＬＣカラムを使用して分離することもできる。
【００４３】
単一の立体異性体（たとえば、実質的に純粋なエナンチオマー）は、光学活性な分割試薬を使用してジアステレオマーを形成する方法などを利用してラセミ混合物を分割することによって得てもよい（Eliel, E. and Wilen, S. Stereochemistry of Organic Compounds. New York: John Wiley & Sons, Inc., 1994; Lochmuller, C. H., et al. “Chromatographic resolution of enantiomers: Selective review.” J. Chromatogr., 113(3) (1975): pp. 283-302）。本発明のキラル化合物からなるラセミ混合物は、適切な方法によって分離および単離することができ、たとえば（１）キラル化合物を作用させてイオン性ジアステレオマー塩を形成させ、分別結晶化などの方法で分離する方法、（２）キラル誘導体化試薬を使用してジアステレオマー化合物を形成させ、ジアステレオマーを分離し、純粋な立体異性体に変換する方法、および（３）キラル条件下で、実質的に純粋な立体異性体または純度の高い立体異性体を直接分離する方法によって分離および単離することができる。Wainer, Irving W., Ed. Drug Stereochemistry: Analytical Methods and Pharmacology. New York: Marcel Dekker, Inc., 1993を参照されたい。
【００４４】
「薬学的に許容される塩」として、たとえば、塩酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、スルフィン酸塩、硝酸塩などから選択される無機酸塩、およびたとえば、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、２−ヒドロキシエチルスルホン酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、アルカン酸塩（酢酸塩など）、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ（ｎは０〜４から選択される）との塩などから選択される有機酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。同様に、薬学的に許容されるカチオンの例として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム、リチウムおよびアンモニウムが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
さらに、化合物が酸付加塩として得られた場合、この酸付加塩の溶液を塩基性にすることによって遊離塩基を得ることができる。これとは逆に、得られた生成物が遊離塩基である場合、塩基性化合物から酸付加塩を調製する従来の方法に従って、遊離塩基を適切な有機溶媒に溶解し、得られた溶液を酸で処理することによって付加塩（薬学的に許容される付加塩など）を得てもよい。当業者であれば、過度の実験を行うことなく使用可能な様々な合成方法を使用して、薬学的に許容される無毒な付加塩を調製することができることを認識するであろう。
【００４６】
「治療すること」、「治療する」または「治療」は、少なくとも１種の化合物、少なくとも１種のその立体異性体、および／または少なくとも１種のそれらの薬学的に許容される塩を、これらの投与が必要であると認められた対象に投与することを指す。
【００４７】
「有効量」は、対象における疾患または障害の「治療」に有効であり、たとえば投与した場合などに、組織、系、動物またはヒトにおいて所望の生物学的反応または医学的反応をある程度有意な程度で誘導し、治療の対象となる病態または障害の１つ以上の症状の発症を阻止したり、これらの症状をある程度まで緩和したりするのに十分な量の少なくとも１種の化合物、少なくとも１種のその立体異性体および／または少なくとも１種のそれらの薬学的に許容される塩を指す。治療有効量は、化合物、疾患およびその重症度、ならびに治療を受ける哺乳動物の年齢や体重などに応じて異なる。
【００４８】
「少なくとも１つの置換基」は、たとえば１〜４つの置換基、たとえば１〜３つの置換基、さらにたとえば１つまたは２つの置換基を含む。たとえば、本明細書において「少なくとも１つの置換基Ｒ」は、本明細書に記載のＲの一覧から選択される１〜４つの置換基、たとえば１〜３つの置換基、さらにたとえば１つまたは２つの置換基を含む。
【００４９】
本発明の化合物、その立体異性体およびそれらの薬学的に許容される塩を単独で使用して治療を行ってもよく、あるいは本発明の化合物、その立体異性体およびそれらの薬学的に許容される塩を少なくとも１種の別の治療剤と併用して治療を行ってもよい。いくつかの実施形態において、本発明の化合物、その立体異性体およびそれらの薬学的に許容される塩は、少なくとも１種のさらなる治療剤と併用することができる。本明細書で開示される化合物および／または１種の薬学的に許容される塩は、少なくとも１種の別の治療剤と一緒に単位剤形または別個の剤形で投与してもよい。別個の剤形として投与する場合、少なくとも１種の別の治療剤は、本明細書で開示される化合物および／または１種の薬学的に許容される塩の投与前、それと同時、またはその後に投与してもよい。
【００５０】
さらに、本発明の化合物、その立体異性体またはそれらの薬学的に許容される塩と、少なくとも１種の薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。
【００５１】
本発明の化合物、その立体異性体またはそれらの薬学的に許容される塩を含む組成物は、経口投与、局所投与、直腸投与、非経口投与、吸入スプレーによる投与、埋め込みリザーバーからの投与などの様々な公知の方法で投与することができるが、いずれの場合でも、最も適切な経路は、特定のレシピエント、ならびに有効成分の投与を受ける状態の特性および重症度に左右される。本明細書において「非経口」は、皮下注射、皮内注射、静脈内注射、筋肉内注射、関節内注射、動脈内注射、滑液包内注射、胸骨内注射、髄腔内注射、病巣内注射、頭蓋内注射または輸注を包含する。本明細書で開示される組成物は、簡便に単位剤形として提供してもよく、当技術分野でよく知られている方法であれば、どのような方法で調製してもよい。
【００５２】
本発明の化合物、その立体異性体およびそれらの薬学的に許容される塩は、カプセル剤、錠剤、トローチ剤、糖衣錠、顆粒剤、散剤などの固形剤形で、あるいはエリキシル剤、シロップ剤、乳剤、分散剤、懸濁剤などの液体剤形で経口投与することができる。また、本明細書で開示される本発明の化合物、その立体異性体およびそれらの薬学的に許容される塩は、分散剤、懸濁剤、液剤などの無菌液体剤形で非経口投与することもできる。本明細書で開示される本発明の化合物、その立体異性体およびそれらの薬学的に許容される塩は、その他の剤形を使用して投与することもでき、局所投与用の軟膏剤、クリーム剤、点滴剤、経皮パッチまたは散剤として投与することもでき、眼投与用の眼科用液剤または眼科用懸濁剤（すなわち点眼剤）として投与することもでき、吸入用または鼻腔内投与用のエアゾールスプレーまたはエアゾールパウダー組成物として投与することもでき、直腸投与用または膣内投与用のクリーム剤、軟膏剤、スプレー剤または坐剤として投与することもできる。
【００５３】
本明細書で開示される化合物および／または少なくとも１種のその薬学的に許容される塩と、乳糖、デンプン、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などの粉末担体とを含むゼラチンカプセル剤を使用することもできる。同様の希釈剤を使用して圧縮錠剤を製造することもできる。錠剤およびカプセル剤は、一定時間にわたって薬剤を連続放出するための徐放製剤として製造することもできる。圧縮錠剤を糖類でコーティングしたり、フィルムでコーティングしたりすることにより、不快な味をマスクしたり、錠剤を大気から保護したりすることができ、あるいは腸溶コーティングを施すことにより、消化管において選択的に崩壊させることもできる。
【００５４】
経口投与用の液体剤形は、患者が服用しやすいように、着色剤および香料から選択される少なくとも１種の添加剤をさらに含むことができる。
【００５５】
通常、非経口溶液用の適切な担体の例として、水、適切な油剤、生理食塩水、デキストロース（グルコース）水溶液、関連する糖溶液、およびグリコール類（プロピレングリコールやポリエチレングリコールなど）を挙げることができる。非経口投与用の溶液は、本明細書に記載の少なくとも１種の化合物の水溶性塩、少なくとも１種の適切な安定化剤、および必要であれば少なくとも１種の緩衝物質を含んでいてもよい。適切な安定化剤の例として、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、またはアスコルビン酸などの抗酸化剤を挙げることができ、これらを単独または組み合わせて使用することができる。また、適切な安定化剤の例として、クエン酸もしくはその塩、またはＥＤＴＡナトリウムを使用することもできる。さらに、非経口溶液は、たとえば塩化ベンザルコニウム、メチルパラベン、プロピルパラベンおよびクロロブタノールから選択される少なくとも１種の保存剤を含んでいてもよい。
【００５６】
薬学的に許容される担体は、たとえば、組成物中の有効成分と適合性があり（いくつかの実施形態においては、有効成分を安定化でき）、治療を受ける対象に対して有害ではない担体から選択される。たとえば、シクロデキストリン（シクロデキストリンは、本明細書で開示される少なくとも１種の化合物および／または少なくとも１種の薬学的に許容される塩と溶解性の高い特定の錯体を形成可能である）などの可溶化剤を、有効成分の送達用の医薬賦形剤として使用することができる。その他の担体の例としては、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウムおよび顔料（D&C Yellow#10など）が挙げられる。薬学的に許容される適切な担体は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, A. Osolおよび当技術分野のその他の参考文献に記載されている。
【００５７】
吸入投与する場合、本発明の化合物、その立体異性体およびそれらの薬学的に許容される塩は、簡便に、加圧容器または吸入器からエアロゾルスプレーの形態で送達してもよい。また、本発明の化合物、その立体異性体およびそれらの薬学的に許容される塩は、製剤化されていてもよい散剤として送達してもよく、このような粉末組成物は、吹送用粉末吸入器を使用して吸入してもよい。吸入用の送達系の一例として、定量吸入（ＭＤＩ）エアロゾルを挙げることができ、このような定量吸入（ＭＤＩ）エアロゾルは、たとえばフルオロカーボンや炭化水素などから選択される少なくとも１種の適切な噴射剤中に、本明細書で開示される本発明の化合物、その立体異性体またはそれらの薬学的に許容される塩を含む懸濁液または溶液として製剤化されていてもよい。
【００５８】
眼投与する場合、本発明の化合物、その立体異性体またはそれらの薬学的に許容される塩を適切な眼科用溶媒中に適切な重量パーセントで含む溶液または懸濁液として眼科用製剤を製剤化してもよく、これによって、本発明の化合物、その立体異性体または少なくとも１種のそれらの薬学的に許容される塩が角膜および眼の内部に浸透するのに十分な時間にわたって、本発明の化合物、その立体異性体またはそれらの薬学的に許容される塩と眼の表面との接触を維持させる。
【００５９】
本明細書で開示される本発明の化合物、その立体異性体およびそれらの薬学的に許容される塩の投与に有用な医薬品剤形として、硬ゼラチンカプセル剤、軟ゼラチンカプセル剤、錠剤、非経口注射剤および経口懸濁液が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
投与量は、レシピエントの年齢、健康状態および体重、疾患の程度、併用療法を実施している場合はその種類、治療の頻度、所望の作用の特性などの要因に左右される。通常、有効成分の１日投与量は様々であり、たとえば１日あたり０．１〜２０００ｍｇであってもよい。たとえば、１０〜５００ｍｇを１日１回または複数回投与すると、所望の結果を得るのに有効である場合がある。
【００６１】
いくつかの実施形態において、たとえば、本明細書で開示される粉末状の本発明の化合物、その立体異性体またはそれらの薬学的に許容される塩１００ｍｇ、乳糖１５０ｍｇ、セルロース５０ｍｇおよびステアリン酸マグネシウム６ｍｇを、２つのシェルからなる標準的な硬ゼラチンカプセルに充填することによって、多数の単位カプセル剤を調製することができる。
【００６２】
いくつかの実施形態において、本発明の化合物、その立体異性体またはそれらの薬学的に許容される塩と、大豆油、綿実油、オリーブ油などの消化性の油との混合物を調製し、容積式ポンプを使用してゼラチンに注入することによって、１００ｍｇの有効成分を含む軟ゼラチンカプセル剤を調製することができる。得られたカプセルは、洗浄後、乾燥する。
【００６３】
いくつかの実施形態において、たとえば、本発明の化合物、その立体異性体またはそれらの薬学的に許容される塩１００ｍｇ、コロイド状二酸化ケイ素０．２ｍｇ、ステアリン酸マグネシウム５ｍｇ、微結晶性セルロース２７５ｍｇ、デンプン１１ｍｇおよび乳糖９８．８ｍｇが各錠剤に含まれるように、従来の方法で多数の錠剤を調製することができる。味をよくしたり、吸収を遅らせたりするために、適切なコーティングを施してもよい。
【００６４】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される化合物および／または少なくとも１種のそのエナンチオマー、ジアステレオマーもしくは薬学的に許容される塩１．５重量％を、プロピレングリコール１０体積％中に加えて撹拌することによって、注射での投与に適切な非経口組成物を調製することができる。得られた溶液は、注射用水で所望の量とし、滅菌する。
【００６５】
いくつかの実施形態において、経口投与用の水性懸濁液を調製することができる。たとえば、微粉化した本発明の化合物、その立体異性体またはそれらの薬学的に許容される塩１００ｍｇ、カルボキシメチルセルロースナトリウム１００ｍｇ、安息香酸ナトリウム５ｍｇ、ソルビトール溶液（米国薬局方）１．０ｇおよびバニリン０．０２５ｍｌを含む水性懸濁液５ｍｌを各投与に使用することができる。
【００６６】
本発明の化合物、その立体異性体またはそれらの薬学的に許容される塩を段階的に投与したり、少なくとも１種の別の治療剤とともに投与する場合、通常、同じ剤形を使用することができる。薬剤を物理的に組み合わせて投与する場合、組み合わせる薬剤同士の適合性に応じて剤形および投与経路を選択すべきである。したがって、「同時投与」は、少なくとも２種の薬剤の同時投与または連続投与を含み、あるいは少なくとも２種の有効成分の多剤混合薬としての投与を含むと理解される。
【００６７】
本明細書で開示される化合物、その立体異性体またはそれらの薬学的に許容される塩は、単一の有効成分として投与することができ、あるいは少なくとも１種の第２の有効成分と組み合わせて投与することができる。
【００６８】
本発明の化合物は、医薬組成物または医薬製剤に組み込まれる。医薬組成物は、薬学的に許容される希釈剤および／または担体を含み、すなわち、生理学的に適合性があり、実質的に病原性不純物を含まない希釈剤または担体を含む。適切な賦形剤または担体、および投与可能な組成物を調製する方法は、当業者に公知または明らかであり、Remington’s Pharmaceutical Science, Mack Publishing Co, NJ (1991)などの刊行物にさらに詳細に説明されている。医薬組成物は、当技術分野において公知の放出制御組成物または徐放性組成物の形態であってもよい。様々な用途において、本発明の化合物は朝／昼間に投与され、夜間は休薬時間とする。
【００６９】
本発明の化合物は、そのまま使用してもよく、あるいは塩酸塩、臭化水素酸塩、酢酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、トリフルオロ酢酸塩などの薬学的に許容される塩の形態で使用してもよい。本発明の化合物が比較的酸性の官能基を有している場合、無溶媒あるいは適切な不活性溶媒中で所望の塩基を添加することにより塩を得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、有機アミノ塩、マグネシウム塩などが挙げられる。本発明の化合物が比較的塩基性の官能基を有している場合、無溶媒あるいは適切な不活性溶媒中で所望の酸を添加することにより塩を得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、硫酸塩、硫酸水素塩、ヨウ化水素酸塩、亜リン酸塩などの無機酸由来の塩、および酢酸塩、プロピオン酸塩、イソ酪酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、マンデル酸塩、フタル酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トリルスルホン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩などの、比較的毒性のない有機酸由来の塩が挙げられる。アルギニン酸塩などのアミノ酸塩、およびグルクロン酸塩またはガラクツロン酸塩などの有機酸塩も含まれる（たとえば、Berge et al, “Pharmaceutical Salts”, Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19を参照されたい）。
【００７０】
従来の方法により、前記塩を塩基または酸と接触させ、親化合物を単離することによって、中性の化合物を再生してもよい。親化合物は、極性溶媒への溶解度などの物理的特性の点で様々な塩の形態と異なるが、本発明の目的に対してその他の点では、塩は親化合物と同等である。
【００７１】
本発明は、塩の形態に加えて、プロドラッグの形態の化合物を提供する。本明細書に記載の化合物のプロドラッグは、生理学的条件下において容易に化学変化を起こし、本発明の化合物へと変換される化合物である。さらに、プロドラッグは、エクスビボ環境での化学的方法または生化学的方法によって本発明の化合物へと変換することができる。たとえば、プロドラッグは、適切な酵素または化学試薬とともに経皮パッチのリザーバー内に封入すると、本発明の化合物に徐々に変換することができる。いくつかの状況下では、プロドラッグは親薬物よりも投与が容易であるため、有用である場合が多い。たとえば、プロドラッグは、経口投与によるバイオアベイラビリティが親薬物よりも良好である場合がある。また、プロドラッグは、薬理学的組成物中での溶解度が親薬物よりも高い場合がある。様々なプロドラッグ誘導体が当技術分野で公知であり、たとえば、加水分解または酸化的活性化に依存したプロドラッグなどが知られている。プロドラッグの例として、エステル（「プロドラッグ」）として投与され、代謝的に加水分解されて活性体であるカルボン酸に変換される本発明の化合物を挙げることができるが、これに限定されない。
【００７２】
本発明の特定の化合物は、溶媒和されていない形態で存在していてもよく、水和形態を含む溶媒和された形態で存在していてもよい。通常、溶媒和形態は、溶媒和されていない形態と同じであり、本発明の範囲内に含まれるものとする。本発明の特定の化合物は、様々な結晶形態で存在していてもよく、アモルファス形態で存在していてもよい。通常、本発明で意図する使用に対して、あらゆる物理的形態を等しく用いることができ、あらゆる物理的形態が本発明の範囲内に含まれるものとする。
【００７３】
本発明の化合物のうちのいくつかは、不斉炭素原子（光学中心）または二重結合を有し、本発明の化合物のラセミ体、ジアステレオマー、幾何異性体および個々の異性体はいずれも本発明の範囲内に含まれるものとする。
【００７４】
本発明の化合物は、通常、「治療有効量」で投与され、すなわち、組織、系、動物またはヒトにおいて、研究者、獣医、医師またはその他の臨床医が探求する生物学的反応または医学的反応を誘導することが可能な量の本発明の化合物が投与される。「治療有効量」は、本発明の化合物を投与した場合に、治療の対象となる病態または障害の１つ以上の症状の発症を阻止したり、これらの症状をある程度まで緩和したりするのに十分な量の化合物を包含する。治療有効量は、化合物、疾患およびその重症度、ならびに治療を受ける哺乳動物の年齢や体重などに応じて異なる。
【００７５】
前記接触は、通常、前述の様々な実施形態を包含し、一般式Ｉ（前記参照）を有する１種以上の化合物の有効量を対象に投与することによって達成される。通常、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇの治療投与量となるように調整して投与が行われるが、最適な投与量は化合物に応じて異なり、通常、実験を行うことにより化合物ごとに決定される。
【００７６】
「単位剤形」は、ヒト対象およびその他の哺乳動物に対する１回の投与に適切な、物理的に分かれた単位を指し、各単位は、所望の治療効果がもたらされるように計算された所定量の活性物質と、適切な医薬賦形剤とを含む。典型的な単位剤形として、あらかじめ計量した液体組成物を充填したアンプルまたはシリンジが挙げられ、固形組成物の場合は、丸剤、錠剤、カプセル剤、トローチ剤などが挙げられる。このような組成物において、ミメティックは、通常、（約０．１〜約５０重量％、または好ましくは約１〜約４０重量％の）微量成分として含まれ、所望の投与形態の形成を容易にするための加工助剤および様々な溶媒または担体が残りを占める。単位剤形製剤は、単位あたり約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約２５ｍｇ、約５０ｍｇ、約１００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約５００ｍｇまたは約１，０００ｍｇであることが好ましい。特定の一実施形態において、単位剤形は、連続使用に適したマルチパック包装に包装されており、たとえば、少なくとも６個、９個または１２個の単位剤形を含むシートを含むブリスター包装に包装されている。
【００７７】
本明細書に記載の実施例および実施形態は、説明のみを目的としたものであり、本発明を限定するものではない。当業者であれば、重要ではない様々なパラメーターを変更または修正して、実質的に同様の結果を得ることができるということを容易に理解でき、このような修正は、本願の要旨および範囲ならびに添付の請求項の範囲に含まれる。本明細書に引用された刊行物、特許および特許出願は、いずれも参照によりその全体があらゆる目的で本明細書に援用される。
【実施例】
【００７８】
一般的な実験試薬および実験条件：
【化２】
2021527067.tif 000003
ａ）ＫＯＨ、ＭｅＯＨ、Ｈ２Ｏ、室温；ｂ）Ｈ２ＮＮＨ２、ＭｅＯＨ、室温；ｃ）ピリジン、ＣＨ２Ｃｌ２、室温。
【００７９】
【化３】
2021527067.tif 000004
メチルアリールケトン化合物（１当量）およびＫＯＨ（３当量）の水−メタノール混合溶媒溶液（水：メタノール＝１：３）に、アリールカルボキサルデヒド化合物（１．０５当量）を室温で加えた。得られた溶液を室温で１０時間攪拌し、水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。有機抽出物を合わせて生理食塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、勾配溶出、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン＝１：５）で残渣を精製し、所望の生成物としてα，β−不飽和ケトンを得た。
【００８０】
【化４】
2021527067.tif 000005
α，β−不飽和ケトン化合物（１当量）のＭｅＯＨ溶液に、ヒドラジン（３当量）を室温で加えた。得られた溶液を室温で１０時間攪拌し、減圧下で濃縮した。残渣を水で洗浄後、乾燥し、所望のピラゾール生成物を得て、それ以上精製せずに次の工程に使用した。
【００８１】
【化５】
2021527067.tif 000006
ピラゾール化合物（１当量）のジクロロメタン溶液に、所望の生成物に対応する酸塩化物（１．１当量）およびピリジン（１．２当量）を室温で加えた。得られた溶液を室温で６時間攪拌し、酢酸エチルで希釈し、生理食塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、勾配溶出、ＥｔＯＡｃ：ＣＨ２Ｃｌ２＝１：１５）で残渣を精製し、所望の生成物を得た。
【００８２】
後掲の表に示す代表的な化合物に例示するように、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の各範囲を含む、化学式の実施形態の開示された範囲全体において活性が保持されている。
【００８３】
Beclin 1とBcl-2の結合の破壊により機能するオートファジー誘導物質を同定するためのハイスループットスクリーニング
リソソーム分解経路であるオートファジーは、細胞の恒常性、発達、免疫、腫瘍の抑制、代謝、神経変性の予防および寿命の延長に重要な役割を果たしている。したがって、オートファジーの薬理学的刺激は、特定のヒト疾患および／または加齢の予防または治療に有効なアプローチとなりうる。本発明者らは、オートファジーを特異的に誘導する新規化合物の開発方法の確立に尽力を重ねた。これを達成するため、オートファジーの誘導において重要な制御ノードを標的とする化合物、より具体的には、Beclin 1（オートファジーの開始において機能するBeclin 1−VPS34脂質キナーゼ複合体のアロステリックモジュレーター）へのBcl-2（オートファジーの負の制御因子）の結合を標的とする化合物を同定するために２種のアッセイを開発した。これらのアッセイは、細胞においてBeclin 1とBcl-2の結合を測定するスプリットルシフェラーゼアッセイ、またはインビトロにおいてBeclin 1とBcl-2の直接的な結合を直接測定するAlphaLISAアッセイを使用したものである。Beclin 1とBcl-2の結合を破壊し、オートファジーを誘導する低分子を同定するため、約300,000種の化合物を含む２種の化合物ライブラリーをスクリーニングした。μＭレベルのIC50でBeclin 1とBcl-2の相互作用を直接抑制し、オートファジーフラックスを増加させる３種の新規化合物が同定された。これらの化合物は、有意な細胞傷害性を示さず、Bcl-2ファミリーのアポトーシス促進性メンバー（BaxおよびBim）のBH3ドメインへのBcl-2の結合よりも、Beclin 1のBH3ドメインへのBcl-2の結合を選択的に破壊する。
【００８４】
Beclin 1/Bcl-2スプリットルシフェラーゼアッセイの開発
Beclin 1とBcl-2の相互作用を破壊する新規化合物を同定するため、（１）細胞透過活性を有し、かつ細胞ベースのアッセイにおいてBeclin 1とBcl-2の相互作用を破壊する機能を有する化合物の同定と、（２）インビトロでBeclin 1とBcl-2の結合を破壊することから、前記細胞ベースのアッセイにおいてオンターゲットに機能することが確認される化合物の同定とを並行して実施できるように設計した２種の新規ハイスループットスクリーニング（HTS）アッセイを開発した。
【００８５】
最初のHTSでは、細胞ベースのスプリットルシフェラーゼアッセイを使用した。このアッセイは、酵素同士が近接することに基づく酵素相補型レポーターシステムである。スプリットルシフェラーゼ法は、融合パートナーとして目的のタンパク質において発現されるホタルルシフェラーゼの２つの断片、すなわち、NLuc（2〜416番目のアミノ酸）およびCLuc（398〜550番目のアミノ酸）が再構築されることに依存している。相互作用パートナー同士が結合すると、ルシフェラーゼの機能を持たない２つの断片が近接し、活性なルシフェラーゼタンパク質を形成する。スプリットルシフェラーゼアッセイを使用してBeclin 1とBcl-2の相互作用を測定するため、スプリットルシフェラーゼレポーターとして、Ｎ末端にNLucタグを付加したBeclin 1（NLuc-Beclin 1）とCLucタグを付加したBcl-2（CLuc-Bcl-2）を発現するHeLa細胞株を作製した。これらのレポーターはいずれも、Beclin 1またはBcl-2の構成的な過剰発現によって生じうる毒性またはクローンの適応を回避するため、テトラサイクリン誘導型プロモーターの制御下で発現させた。内部コントロールとして、ウミシイタケルシフェラーゼを構成的に発現させた。Beclin 1とBcl-2の相互作用は、相対発光量（RLU）として測定し、この相対発光量（RLU）は、スプリットルシフェラーゼシグナルとウミシイタケルシフェラーゼシグナルの比率として算出した。
【数１】
2021527067.tif 000007
【００８６】
HeLa細胞においてBeclin 1スプリットルシフェラーゼレポーターおよびBcl-2スプリットルシフェラーゼレポーターを発現させると、測定可能なルミネッセンス活性が得られ、この活性は、陽性コントロール化合物として使用した強力なBH3ミメティックであるABT-73740によって用量依存的に抑制された。さらに、測定されたスプリットルシフェラーゼ活性にBeclin 1とBcl-2の結合が必要であることを確認するため、Beclin 1のBcl-2結合ドメインに欠失を有するNLuc-Beclin 1レポーター（81〜151番目のアミノ酸の欠失；「Beclin 1ΔBcl-2BD」と呼ぶ）とCLuc-Bcl-2レポーターを発現する細胞株を作製した。Beclin 1ΔBcl-2BDスプリットルシフェラーゼレポーターとBcl-2スプリットルシフェラーゼレポーターを発現させると、ルミネッセンス活性が10分の１〜20分の１になり、Beclin 1ΔBcl-2BDスプリットルシフェラーゼレポーターとBcl-2スプリットルシフェラーゼレポーターのベースライン活性は、ABT-737による影響を受けなかった。したがって、Beclin 1/Bcl-2スプリットルシフェラーゼの全長の活性は、ルシフェラーゼ断片同士の自発的な再会合ではなく、Beclin 1のBH3ドメインとBcl-2の間の特異的な相互作用を示していると見られた。全体的な結果として、これらのデータから、HeLa細胞におけるBeclin 1/Bcl-2スプリットルシフェラーゼアッセイは、ロバストかつ高感度であり、Beclin 1とBcl-2の相互作用を広いダイナミックレンジで測定可能であることが示された。
【００８７】
ハイスループットスクリーニング（HTS）を目的として、Ｚ’ファクター検定によりBeclin 1/Bcl-2スプリットルシフェラーゼアッセイを検証した。384ウェルフォーマットのHTSにおけるBeclin 1/Bcl-2スプリットルシフェラーゼアッセイの均一性を試験した。中性コントロールとしてDMSO（240ウェル）を使用し、陽性コントロールとしてABT-737（16ウェル）を使用した。算出したＺ’値は0.7444であり、Beclin 1/Bcl-2スプリットルシフェラーゼアッセイがHTSによく適していることが示された。
【００８８】
Beclin 1/Bcl-2 AlphaLISAアッセイの開発
さらに、インビトロにおけるBeclin 1とBcl-2の間の相互作用を直接測定するため、ハイスループットBeclin 1/Bcl-2 AlphaLISAアッセイを開発した。AlphaLISAは、均質な溶液中でタンパク質間相互作用を測定することができるビーズベースの近接アッセイである41。Alphaドナービーズに680nmの光を照射すると一重項酸素分子が生成し、近傍するアクセプタービーズに移動する。一重項酸素はドナービーズを励起し、615nmでルミネッセンスを発光する。一重項酸素分子の半減期は極めて短く、効率的なエネルギー移動は半径200nm以内のみでしか起こらない。したがって、測定可能なAlphaルミネッセンスシグナルを得るためには、ドナービーズとアクセプタービーズの間での化学エネルギーの伝達が必要であり、相互作用分子ペアがビーズ上に固相化されていることから、ビーズ同士の会合が安定化されて、測定可能なAlphaシグナルが得られる。
【００８９】
AlphaLISAアッセイを行うため、精製された組換えBeclin 1タンパク質および精製された組換えBcl-2タンパク質を使用した。これらのタンパク質は、溶解性および発現が向上するように最適化したものであった。ヒトBeclin 1は、Ｎ末端にStrepII-SUMOを付加した融合タンパク質として発現させ、溶解性およびタンパク質の安定性を向上させるため、Beclin 1の芳香族フィンガー上の３つの残基を変異させた（F359D/F360D/W361D）42。これらの変異はBARAドメインにあり、Bcl-2によって認識されるBH3モチーフからは離れた位置にあった。陰性コントロールとして、Bcl-2との結合を欠損させた組換えBeclin 1変異体（StrepII-SUMO-Beclin 1ΔBcl-2BD）を使用した。Bcl-2コンストラクトは１〜218番目のアミノ酸から構成し、膜貫通ドメインを切断して、Ｃ末端に6×Hisタグを付加した（Bcl-2-6×His）。標準化コントロールとして、（Ｎ末端にStrepIIタグを付加し、Ｃ末端に6×Hisタグを付加した）精製SUMOタンパク質を使用したAlphaLISAアッセイを並行して実施した。標準化コントロールは、Beclin 1とBcl-2の相互作用とは無関係にAlphaLISAアッセイに干渉することによってルミネッセンスシグナルを低下させるインナーフィルター（偽陽性）ヒットを排除することを目的として含めた。標準化コントロールを使用したBeclin 1とBcl-2の相互作用は次式で測定した。
【数２】
2021527067.tif 000008
【００９０】
AlphaLISAビーズとともに、StrepII-SUMO-Beclin 1とBcl-2-6×Hisをインキュベートすることによって、強力なAlphaシグナルが発生した。Beclin 1のBcl-2結合ドメインを欠失させたことによって、Alphaシグナルがほぼ完全に消失したことから、AlphaシグナルがBeclin 1とBcl-2の相互作用に特異的であることが示された。さらに、Beclin 1とBcl-2の相互作用による強力なAlphaシグナルは、陽性コントロールとしてスクリーニングに使用したBH3ミメティックABT-737によって用量依存的に抑制されたが、Beclin 1ΔBcl-2BDとBcl-2の相互作用による弱いシグナルはABT-737によって抑制されなかった。
【００９１】
これらのデータから、このアッセイが、インビトロにおけるBeclin 1とBcl-2の結合に対する薬理学的抑制の測定に適していることが示された。Beclin 1/Bcl-2 AlphaLISAアッセイをHTSプラットフォームとしてさらに評価するため、384ウェルプレートフォーマットを使用してＺ’ファクター検定を行った。中性コントロールとしてDMSO（240ウェル）を使用し、陽性コントロールとしてABT-737（16ウェル）を使用した。得られたＺ’値は0.7237であり、Beclin 1/Bcl-2 AlphaLISAアッセイがロバストなHTSアッセイであることが示された。
【００９２】
Beclin 1とBcl-2の結合に対する破壊物質の１次スクリーニングおよび２次スクリーニング
Beclin 1/Bcl-2スプリットルシフェラーゼアッセイを使用して、UT Southwestern Medical Center（UTSW）から得た約200,000種の化合物と、MITおよびハーバードのブロード研究所の多様性指向型合成（DOS）ライブラリーから得た100,000種の化合物を含む化学ライブラリーの一次HTSを行った43。UTSWの化学ライブラリーは、ChemBridge Corporationから購入した75,000種の化合物、Chemical Diversity Labsから購入した100,000種の化合物、ComGenex社から購入した22,000種の化合物、TimTek社から購入した1200種の化合物、Prestwick社から購入した1100種の化合物、およびNIH clinical collection社から購入した450種の薬剤から構成されている。TimTek社から購入した化合物は、「天然物様」の合成化合物であり、Prestwick社の化合物は特許切れの薬剤である。NIH clinical collection社から購入した薬剤は、第Ｉ相臨床試験で試験された化合物から構成されている。UTSWの化学ライブラリーは、John MacMillan博士（カリフォルニア大学サンタクルーズ校）によってユニークな海洋細菌から単離された約30,000種の天然物も含んでいる。このライブラリーに含まれる化合物は、そのうちの99%が、550g/mol未満の分子量（平均で250〜300g/mol）を有しており、Lipinskiによる大まかな法則を満たしていた。すべてのライブラリー化合物は、384ウェルプレートフォーマットのHTSにおいて５μMの濃度でスクリーニングした。スクリーニングの過程において、ライブラリー化合物の多くは、ウミシイタケルシフェラーゼの活性を強力に増強したが、スプリットルシフェラーゼの活性には影響を与えなかったことが認められた。したがって、このような偽陽性ヒットを排除するため、スプリットルシフェラーゼ活性および標準化した活性（RLU）の両方において、ｚスコア＝−3.0をカットオフとした。UTSWライブラリーから1027ヒットを同定し、ブロード研究所ライブラリーから193ヒットを同定した後、HTSアッセイを再度行うことにより、UTSWライブラリーの233ヒットおよびブロード研究所ライブラリーの55ヒットを確認した。
【００９３】
Beclin 1とBcl-2の相互作用を直接抑制する化合物を同定するため、チェリーピッキングにより選択した化合物（UTSWライブラリーから同定した1027種の化合物およびブロード研究所ライブラリーから同定した55種の化合物）を、Beclin 1/Bcl-2 AlphLISAアッセイを使用した２次スクリーニングに供した。２次HTSスクリーニングでは、ｚスコア≦−3.0において、20％を超える抑制（UTSWライブラリー）または40％を超える抑制（ブロード研究所ライブラリー）を示した35種の化合物（UTSWライブラリー）および１種の化合物（ブロード研究所ライブラリー）を同定した。19種の化合物を再度追加して、用量反応AlphaLISAアッセイをさらに実施した（天然物画分および天然化合物が入手不可能であったものは除外した）。再度追加した化合物のうちの６種は、インビトロにおいてBeclin 1とBcl-2の相互作用を用量依存的に抑制することが分かった。pan-assay interference（PAINS）44化合物を除外した後、UTSWライブラリーから２種の化合物（SW063058およびSW076956）ならびにブロード研究所ライブラリーから１種の化合物（BRD1991）を選択し、ヒットの検証および生物学的調査研究をさらに行った。
【００９４】
ヒットの検証および選択性の評価
AlphaLISAアッセイを使用することにより、これらの３種の候補化合物が、μＭレベルのIC50でBeclin 1とBcl-2の結合を用量依存的に抑制したことを確認した。Bcl-2ファミリーのアポトーシス促進性メンバーとBcl-2の結合の破壊と比較することにより、Beclin 1のBH3ドメインとBcl-2の結合の破壊の選択性を評価するため、Beclin 1のBH3ドメイン（105〜130番目のアミノ酸）またはBaxのBH3ドメイン（49〜84番目のアミノ酸）からなるペプチドと、精製した組換えBcl-2とを使用したAlphaLISAアッセイを実施した。その結果、３種の候補分子はいずれも、Bcl-2に対するBeclin 1のBH3ドメインの結合を低下させたが、Bcl-2に対するBaxのBH3ドメインの結合では低下は認められなかった。一方、ABT-737は、ｎＭレベルの効率で、Bcl-2に対するBeclin 1のBH3ドメインの結合もBaxのBH3ドメインの結合も抑制した。SW063058、SW076956およびBRD1991をより高い濃度（＞20μM）で使用することによって、Baxまたはその他のアポトーシス促進性のBH3ドメイン含有分子へのBcl-2の結合を破壊することも可能であると考えられるが、前述のデータからは、Beclin 1とBcl-2の相互作用を選択的に抑制できる治療域が明確に示された。
【００９５】
前述の２種の化合物（SW063058およびSW076956）は、ラージスケールの組織培養実験の実施に十分な量で入手できたことから、Beclin 1、BaxまたはBimとBcl-2とを使用した共免疫沈降法におけるこれらの化合物の効果を試験した。過去に報告されているMycタグ付加Bcl-2を安定に発現するHeLa細胞26を、SW063058またはSW076956で12時間処理したところ、Beclin 1とMyc-Bcl-2の相互作用の低下が観察されたが、BaxとMyc-Bcl-2の相互作用の低下やBimとMyc-Bcl-2の相互作用の低下は認められなかった。細胞におけるこの共免疫沈降実験でも、インビトロにおけるAlphaLISA結合実験と同じ傾向が示され、SW076956は、SW063058よりも活発にBeclin 1とBcl-2の相互作用を破壊し（しかし、BH3ミメティックであるABT-737ほどには活発ではない）、SW063058およびSW076956は、BaxとBcl-2の結合よりもBeclin 1とBcl-2の結合を選択的に破壊したが、ABT-737ではこのような選択的な破壊は認められなかった。さらに、ABT-737では、Bcl-2とBH3オンリータンパク質Bimの間の共免疫沈降の破壊が認められたが、SW063058およびSW076956では、このような破壊は認められなかった。
【００９６】
Beclin 1とBcl-2の結合の破壊物質の機能アッセイ
SW063058、SW076956およびBRD1991が、（BaxとBcl-2の結合よりも）Beclin 1とBcl-2の結合を破壊するという選択的活性を有することから、これらの化合物が、細胞死を引き起こすことなくオートファジーを誘導しうることが示された。十分に確立されたアッセイ45として、（ｉ）リソソーム阻害剤であるバフィロマイシンＡ１（Baf A1）の存在下および非存在下における（オートファゴソームを標識する）GFP-LC3斑点の定量、および（ii）Baf A1の存在下および非存在下においてLC3-Iから脂質化オートファゴソーム関連タンパク質LC3-IIへの転換を評価するウエスタンブロット分析を使用して、これらの化合物のオートファジー活性を評価した。GFP-LC3を安定に発現するHeLa細胞を、20μMのSW063058、SW076956またはBRD1991で24時間処理したところ、DMSOコントロールと比較してGFP-LC3斑点の数が増加した。化合物の濃度を低くし（10μM）、処理時間を短くしても同様の結果が得られた。GFP-LC3斑点の数はBaf A1の存在下でさらに増加したことから、これらの化合物は、オートファゴソームの成熟を阻害するのではなく、完全なオートファジーフラックスを誘導することが示された。これらの知見を支持するものとして、これらの化合物はLC3-IIの増加を誘導し、このLC3-IIはBaf A1の存在下でさらに増加することが見出されたことから、オートファジーフラックスの増加が確認された。したがって、これらの化合物は、HeLa細胞においてオートファジーフラックスを誘導する。
【００９７】
さらに、HeLa細胞においてsiRNAを使用してBeclin 1またはBcl-2をノックダウンすることによって、SW063058およびSW076956によるオートファジーの誘導にBeclin 1およびBcl-2が必要であるかどうかを評価した。Beclin 1がオートファジーに必須のタンパク質としての役割を果たしていることと一致して、Beclin 1のノックダウンにより、ベースライン条件において（GFP-LC3斑点の数によって示される）オートファゴソームの数が減少し、SW063058、SW076956またはABT-737で処理したところ、コントロールsiRNAで処理した細胞とは異なり、GFP-LC3斑点の数はそれ以上増加しなかった。また、Bcl-2がオートファジー阻害剤としての役割を果たしていることと一致して、Bcl-2のノックダウンにより、ベースライン条件においてGFP-LC3斑点の数が増加し、SW063058、SW076956またはABT-737で処理したところ、コントロールsiRNAで処理した細胞とは異なり、GFP-LC3斑点の数はそれ以上増加しなかった。Beclin 1をノックダウンした細胞においてオートファジー基質であるp62のレベルが増加したことから、Beclin 1のノックダウンによりオートファジーフラックスが減少したことが確認され、Bcl-2をノックダウンした細胞においてオートファジー基質であるp62のレベルが減少したことから、Bcl-2のノックダウンによりオートファジーフラックスが増加したことが確認された。コントロールsiRNAで処理した細胞とは異なり、SW063058、SW076956またはABT-737は、Beclin 1またはBcl-2をノックダウンした細胞において、p62レベルに影響を及ぼさなかった。以上のデータから、Beclin 1およびBcl-2はいずれも、SW063058、SW076956およびABT-737によるオートファジー誘導効果に必要であることが示された。
【００９８】
GFP-LC3アッセイにおいて測定したのと同じオートファジーフラックス誘導濃度（10μMおよび20μM）において、SW063058およびSW076956は、HeLa細胞に対して細胞傷害性を示さなかったが、BRD1991およびABT-737は、CellTiter-Gloアッセイで測定したところ、20μMにおいて軽度の細胞傷害性を示した。Bcl-2が過剰発現されると、ABT-737誘導性アポトーシスに対する細胞の感受性が増強するという過去の報告と一致して46、ABT-737による処理を行うと、Bcl-2を過剰発現するHeLa細胞の細胞死が用量依存的により顕著に増加したが、このような細胞死の増加は、SW063058、SW076956およびBRD1991では認められなかった。アポトーシス死の検出にさらに特異的なアッセイ（カスパーゼ３の基質であるPARPの切断47）を使用して、CellTiter-Gloアッセイの結果を確認した。10μMまたは20μMの濃度のABT-737で処理したところ、切断されたPARPが検出され、ABT-737処理によるPARPの切断の用量依存的な増加が観察された。SW063058、SW076956およびBRD1991は、同じ濃度においてPARPの切断を誘導しなかった。以上のデータを合わせると、本発明者らによって新たに同定されたBeclin 1とBcl-2の結合に対する破壊物質は、アポトーシスやその他の形態の細胞死を惹起することなく、オートファジーを誘導することができる治療域を有することが示された。
【００９９】
薬物動態特性
これらのヒット化合物が、特異的なオートファジー誘導物質を開発するためのさらなる構造活性相関（SAR）の出発点として使用可能であることから、細胞透過性を分析および定量し、いくつかの代謝的安定性を測定した。１μMのSW063058、SW076956またはBRD1991とHeLa細胞をインキュベーションした後、質量分析によりHeLa細胞における細胞内薬物濃度を様々な時点で測定した。これらの３種の候補化合物はいずれも１時間以内に細胞に進入し、SW076956およびBRD1991は時間の経過とともに徐々に細胞内に蓄積した。これらのヒット化合物のインビトロにおけるADME特性の測定において、マイクロスケールでの熱力学的溶解度では、これらのヒット化合物が、PBS中で0.72μM〜30μMの溶解度を有し、AlphaLISAバッファー中で43.3μM〜202μMの溶解度を有することが示された。血漿中での安定性は、マウスおよびヒトの血漿中において90%を超えていた。マウスおよびヒトのミクロソーム中での安定性では、親化合物であるSW063058をヒトミクロソーム抽出物に１時間暴露させると、36%が代謝されずに残ったが、その他の化合物の組み合わせを、マウスまたはヒトのミクロソームに１時間暴露させると、親化合物よりも２%低い濃度となることが示された。精査するために選択した足場に応じて、化合物系の検討を進める際には、これらの特性を考慮に入れる必要がある。
【０１００】
NMRによる化学シフト摂動分析
SW063058、SW076956およびBRD1991がBcl-2の疎水性ポケットに収容されるのかどうか調べるため、化学シフト摂動分析を行なった。精製したBcl-2/-xLキメラタンパク質（Bcl-2の非構造ループをBcl-xLの短いループで置換したキメラタンパク質）48を、これらの候補分子とインキュベートしたところ、いくつかの残基で化学シフト変化が認められ、これらの候補分子がBcl-2と結合することが示された。特に、Bcl-2の疎水性結合ポケットP2の内側に位置するF153において化学シフト変化が観察され、これらの候補化合物がBH3ポケット内に結合できることが示された。その他の残基の化学シフト変化（G141、V162およびD171）は、P2ポケットの周辺に位置していなかったことから、リガンドの結合によってBcl-2/-xLキメラタンパク質がアロステリックな構造変化を引き起こしたことが示された。全体的な結果として、SW063058、SW076956およびBRD1991の化学シフトプロファイルは類似していたが、ABT-737、ABT-199、ABT-263などの公知のBH3ミメティックと比較していくつかの異なる特徴を示した。たとえば、SW063058、SW076956およびBRD1991のいずれでも、（BH3ミメティックと同様に）疎水性溝の内部に位置するF153に化学シフトが認められたが、疎水性溝に位置するその他の残基（F104やE136など）では化学シフトは認められなかった。さらに、SW063058、SW076956およびBRD1991では、Beclin 1に対するBcl-2の結合に必須の残基であるG15549において化学シフトが認められたが、ATB-737およびその他のBH3ミメティックでは、この残基における化学シフトは認められなかった。これらのデータから、本発明者らによって新たに同定されたBeclin 1とBcl-2の結合を破壊する物質がBcl-2に結合する際の構造決定因子は、公知のBH3ミメティックの結合の構造決定因子とは異なることが示された。
【０１０１】
Beclin 1とBcl-2の相互作用を破壊する化合物を同定するための２種の新規なHTSアプローチを開発した。これらのスクリーニングツールによって、BaxとBcl-2の結合やBimとBcl-2の結合よりもBeclin 1とBcl-2の結合を選択的に破壊し、細胞傷害性が最小限に抑えられた濃度においてオートファジーフラックスを誘導することができる３種の検証されたヒット化合物（SW063058、SW076956およびBRD1991）が同定された。さらに、NMRの化学シフト摂動データから、新たに同定されたこれらの化合物が、現在入手可能なBH3ミメティックとは異なる様式でBcl-2のP2ポケットに結合できることが示された。
【０１０２】
過去のスクリーニングでは、今回のスクリーニングよりも少ない数の化合物から、Beclin 1 BH3ミメティックとして機能し、オートファジーおよびアポトーシスの両方を誘導する低分子が同定されたことが最近報告された50。これに対して、本発明者らの目的は、Bcl-2へのBaxのBH3ドメインの結合を破壊せずに、Bcl-2へのBeclin 1のBH3ドメインの結合を選択的に破壊することによってオートファジーのみを誘導する化合物を同定することであった。本発明者らは、これらの基準を満たす初期のツール化合物を３種同定した。これらの化合物は、μＭレベルにおいて生物学的に活性であるが、本研究で同定された特性、特に、（公知のBH3ミメティックと比較した際の）Bcl-2とBeclin 1のBH3モチーフとの間の相互作用の破壊の選択性、細胞傷害性を起こさずにオートファジーを誘導する能力、およびNMRでのユニークな化学シフト摂動プロファイルから、これらのヒット化合物が、効力が増強され、Beclin 1とBax（またはその他のアポトーシス促進性BH3含有タンパク質）の相互作用と比較してBeclin 1とBcl-2の相互作用の破壊の選択性が増強され、かつADME特性が最適化された類似体の設計に有望であることが分かった。前述の細胞ベースのBeclin 1/Bcl-2結合アッセイおよびインビトロのBeclin 1/Bcl-2結合アッセイはいずれも、このような類似体の迅速評価／最適化に有用である。
【０１０３】
本発明者らは、有効なBeclin 1/Bcl-2選択的阻害剤の開発の出発点としてこれらの化合物を使用し、構造活性相関分析により、本明細書で詳細に説明されているオートファジーモジュレーターを得ることができた。
【０１０４】
細胞株
HeLa/GFP-LC3細胞51およびHeLa/Myc-Bcl-2細胞26は、本発明者らの研究室で過去に報告したものを使用した。NLuc-Beclin 1（またはBeclin 1ΔBcl-2BD変異体）を発現するテトラサイクリン誘導性プラスミドpTRE2purベクターおよびCLuc-Bcl-2を発現するpTRE2-RLuc-hyg3ベクターをHeLa tet-on細胞（クロンテック）に安定にトランスフェクトすることによって、Beclin 1/Bcl-2スプリットルシフェラーゼ細胞を作製した。選択培地（10%Tetシステム仕様FBS、1mMグルタミン、100μg/mL G418、200μg/mLハイグロマイシンおよび0.5μg/mLピューロマイシンを添加したDMEM）において安定なクローンを選択した。過去に報告されているBeclin 1ΔBcl-2BD変異体24,49は、Bcl-2への結合に関わる88〜150番目のアミノ酸からなるBeclin 1のBH3ドメインに欠失を含んでいる。
【０１０５】
組換えタンパク質および組換えペプチド
ヒトbeclin 1遺伝子は、Ｎ末端にStrepIIタグおよびSUMOタンパク質を付加した融合タンパク質としてppSUMO-Strep発現ベクターにクローニングした。タンパク質の溶解性を向上させるため、ヒトBeclin 1の「芳香族フィンガー」42に存在する３つの芳香族残基をアスパラギン酸に変異させた（F359D/F360D/W361D）。StrepII-SUMO-Beclin 1発現プラスミド、StrepII-SUMO-Beclin 1ΔBcl-2BD発現プラスミドまたはStrepII-SUMO-6×His発現プラスミドを含むBL21 Star (DE3) pLysS大腸菌を37℃で対数期まで増殖させ、0.1mM IPTGを加えて16℃で一晩インキュベートした。StrepTactinセファロース（IBA Biosciences）を使用して、可溶性のStrepII-SUMO-Beclin 1タンパク質または可溶性のStrepII-SUMO-Beclin 1ΔBcl-2BDタンパク質をアフィニティー精製し、改変バッファーＷ（100mM Tris-HCl、pH 8.0、300mM NaCl、5%グリセロール、0.1%CHAPSおよび1mM DTT）で平衡化したHiLoad 16/60 Superdex 200カラム（GEヘルスケア）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーでさらに精製した。
【０１０６】
Bcl-2の精製では、膜貫通ドメインを欠失し、Ｃ末端に6×Hisタグが付加された（１〜218番目のアミノ酸からなる）ヒトBcl-2をコードするpET21c-Bcl-2発現プラスミドを使用した。この発現プラスミドを導入したBL21 Star (DE3) pLysS大腸菌を37℃で対数期まで増殖させ、0.1mMの最終濃度でIPTGを加え、16℃で一晩インキュベートした。溶解バッファー（50mMリン酸塩、pH8.0、300mM NaCl、0.1% CHAPSおよび5%グリセロール）を使用したNi-NTAアガロース（キアゲン）上で、可溶性のBcl-2-6×Hisタンパク質をアフィニティー精製した。10mMのイミダゾールを結合に使用し、20mMのイミダゾールを洗浄に使用し、250mMのイミダゾールを溶出に使用した。アフィニティー精製したBcl-2-6×Hisを、改変バッファーＷで平衡化したHiLoad 16/60 Superdex 200カラムによるサイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製した。
【０１０７】
NMR実験は、２Ｄスペクトルを向上させるため、Bcl-xLループで置換したBcl-2のキメラバージョン（Bcl-2/-xL）を使用して行った48。DNAは、大腸菌における発現のために最適化し（GeneArt、ライフテクノロジーズ）、過剰発現を促すため、Ｎ末端にHis6-MBPタグを付加したpET28aベクターにクローニングした。MBPタグを除去するため、MBPタグとBcl-2/-xLタンパク質の間にTEV切断部位を組み込んだ。このタンパク質を発現させ、過去の報告に従って標識し52、過去の報告に従ってタンパク質を精製した53。タンパク質の純度は、ImageJによる画像分析を使用したSDS-PAGEにより95%以上であると推定され、ε280=43,430M-1cm-1を使用して定量した。タンパク質の一部を100μM以上の濃度に濃縮し、必要時まで−80℃で凍結保存した。
【０１０８】
Beclin 1 BH3ペプチドは、Ｎ末端に連結されたビオチン、YGGGGSリンカー、およびヒトBeclin 1に由来する16個のアミノ酸（105〜130番目のアミノ酸）からなる。Bax BH3ペプチドは、Ｎ末端に連結されたビオチン、YGGGGSリンカー、およびヒトBaxに由来する36個のアミノ酸（49〜84番目のアミノ酸）からなる。ビオチン−6×Hisコントロールペプチドは、Ｎ末端に連結されたビオチン、YGGGGSリンカー、およびＣ末端の6×Hisタグからなる。
【０１０９】
Beclin 1/Bcl-2スプリットルシフェラーゼによるスクリーニング
Beclin 1/Bcl-2スプリットルシフェラーゼ細胞を誘導培地（Tet仕様FBS、1mMグルタミン、100単位/mLペニシリン／ストレプトマイシンおよび1μg/mLドキシサイクリンを添加したDMEM）に懸濁し、1.2×104個／ウェルの密度で384ウェルプレート（コーニング#3570）に播種し、37℃で一晩インキュベートした。
【０１１０】
DMSO（中性コントロール）、ABT-737（陽性コントロール）またはライブラリー化合物を５μMの最終濃度で加え、37℃でインキュベートした。ライブラリー化合物は、UTSWの化合物ライブラリー（200,000種）またはMITおよびハーバード大学のブロード研究所の多様性指向型合成コレクション（100,000種）（Stuart Schreiber氏のご厚意により提供されたもの）から入手した。５時間インキュベーション後、遠心分離して培地を除去し、Dual-Glo（登録商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ）を使用してBeclin 1/Bcl-2スプリットルシフェラーゼレポーターの活性を測定した。まず、１×FLバッファー（ルシフェラーゼ試薬をPBSで１：１希釈したもの）20μlを各ウェルに加え、室温で10分間インキュベートし、ホタルルシフェラーゼの発光量をEnvisionプレートリーダー（パーキンエルマー）で測定した。次に、１×RLバッファー（Stop&Glo試薬）10μlを試料に加え、室温で10分間試料をインキュベートし、ウミシイタケルシフェラーゼの活性を測定した。Beclin 1とBcl-2の相互作用は、スプリットルシフェラーゼシグナルとウミシイタケルシフェラーゼシグナルの比率として算出した相対発光量（RLU）として測定した。
【０１１１】
スクリーニングは384ウェルフォーマットで行った。各アッセイプレートは、３〜22列目に320種のライブラリー化合物を含んでいた。中性コントロールとして２列目および23列目にDMSOを入れ、陽性コントロールとして１列目にABT-737を入れた。１次スクリーニングデータを分析するため、EnVisionプレートリーダーから得られた読み取り値の品質管理を行い、Genedata Screener（登録商標）SuiteのAssay Analyzerモジュールを使用して読み取り値を加工した。エッジ効果やプレート効果などの全体的な変動バイアスを取り除くため、Assay Analyzerソフトウェアに含まれている特許取得済みのパターン検出アルゴリズムを使用して、標準化した値（RLU）を補正した54。各化合物のｚスコアは、スプリットルシフェラーゼ活性および補正した標準化活性（RLU）から算出した54。試験濃度における化合物の活性（％）は、次式で定義される。
【数３】
2021527067.tif 000009
【０１１２】
スプリットルシフェラーゼ活性および補正した標準化活性（RLU）において−3.0未満のｚスコアを有する化合物を、次の確認アッセイでの試験に使用した。
【０１１３】
UTSWライブラリーから得た化合物の確認アッセイは、化合物の濃度を５μMとして三連で行った。ブロード研究所のライブラリーから得た化合物の確認アッセイは、５μMの濃度から２倍の８段階希釈を行って実施した。次に、Genedata Screenerにおいて「Robust Condensing」法を使用することにより、三連で測定した各化合物の活性値（％）を単一の値に集約して、三連での測定値を代表する単一の値である「集約活性（condensed activity）」とした。通例、三連の測定値は、次式により一対の値（ＸおよびＹ）にあらかじめ集約した。
【数４】
2021527067.tif 000010
【数５】
2021527067.tif 000011
【０１１４】
｜Ｘ−Ｙ｜値が小さいほど、データ品質がより良好である。｜Ｘ−Ｙ｜値が３０％以下のデータポイントでは、ＸおよびＹの中央値を集約活性として使用し、これは三連の測定値の中央値でもあった。これ以外の場合は、集約関数の最大値（Ｘ，Ｙ）を使用して集約活性を推定した。次に、以下の方程式を使用して、各化合物のロバストｚスコアを算出した。
【数６】
2021527067.tif 000012
【０１１５】
ｚスコアが−3.0未満であった化合物（UTSWライブラリー）、またはスプリットルシフェラーゼ活性を用量反応性に抑制した化合物（ブロード研究所ライブラリー）を確認された化合物とした。
【０１１６】
Beclin 1/Bcl-2 AlphaLISAアッセイによるスクリーニング
AlphaLISAアッセイはすべて、BBバッファー（0.5%BSAおよび1mM DTTを添加したリン酸緩衝生理食塩水）を使用した384ウェルフォーマットにおいて三連で行った。Beclin 1/Bcl-2 AlphaLISAアッセイでは、精製したStrepII-SUMO-Beclin 1を、300nMまたは60nMのBcl-2-6×Hisタンパク質とインキュベートした。内部コントロールAlphaLISAアッセイでは、StrepII-SUMO-6×Hisタンパク質（内部コントロール）を20nMの濃度で使用した。Beclin 1/Bcl-2タンパク質またはSUMOタンパク質を含む試料は、Multidropを使用してAlphaPlate-384（パーキンエルマー#6005350）に加え、DMSO（中性コントロール）、ABT-737（陽性コントロール）、または５μMのライブラリー化合物（UTSWライブラリー）もしくは10μMのライブラリー化合物（ブロード研究所ライブラリー）とともに室温で３時間インキュベートし、タンパク質間相互作用を誘導した。初回のインキュベーション後、Strep-Tactin Alphaドナービーズ（AS106D）と抗6×His AlphaLISAアクセプタービーズ（AL128M）をそれぞれ40μg/mLの最終濃度で加え、室温の暗所でさらに１時間にインキュベートした。試料はすべて三連で評価した。Alphaシグナルは、Envisionプレートリーダー（パーキンエルマー）で測定した。Beclin 1とBcl-2の結合によるAlphaシグナルは、内部コントロールのAlphaシグナルで標準化した。この標準化した値は、Beclin 1とBcl-2の結合活性を示す。化合物の活性（％）は次式により算出した。
【数７】
2021527067.tif 000013
【０１１７】
三連で測定した各化合物の活性値（％）を集約活性に変換し、先の節で説明したようにロバストｚスコアを算出した。ｚスコアが−3.0未満であり、かつ活性が20%を超えるか（UTSWライブラリー）、あるいは40%を超える（ブロード研究所ライブラリー）化合物を選択して用量反応実験でさらに確認を行った。
【０１１８】
AlphaLISA用量反応実験では、各化合物をDMSOで段階希釈し（２倍、７段階）、精製組換えタンパク質またはビオチン標識ペプチドを含むBBバッファー中に10μM〜156nMの最終濃度で加えた。AlphaLISA用量反応実験において使用したタンパク質またはペプチドの濃度は、以下のとおりであった。
Beclin 1/Bcl-2：300nM/60nM；
SUMO（Beclin 1/Bcl-2 AlphaLISAの内部コントロール）：20nM；
Beclin 1 BH3/Bcl-2：1000nM/60nM；
Bax BH3/Bcl-2：100nM/20nM；
ビオチン−6×His（BH3/Bcl-2 AlphaLISAの内部コントロール）：10
【０１１９】
分析アッセイ
溶解度は、ブロード研究所の分析班によりPBSバッファー中で測定するか、UT Southwestern Medical CenterのPreclinical Pharmacology Core LaboratoryによりAlphaLISA反応バッファー中で測定した。PBSバッファー中における溶解度の測定では、100%DMSO中または１%DMSO含有PBS中で各化合物を100μMの濃度に三連で調製した。750rpmのボルテックスシェーカー上にて室温で18時間振盪することによって化合物を平衡化した。平衡化後、シングル四重極質量分析計を使用したUPLC-MS（Waters、マサチューセッツ州ミルフォード）によりSIRモードで各化合物を検出することによって試料を分析した。DMSO中の試料を使用して２点検量線を作成し、PBS中での用量反応をフィットさせた。また、AlphaLISA反応バッファー中での溶解度を測定するため、ガラスバイアルにおいて、0.5%BSAおよび1mM DTTを含むPBS中で各化合物を１mMの濃度に三連で調製した。オービタルシェーカー上で各バイアルを18時間激しく（250rpm）振盪した。各試料をテフロン製のエッペンドルフチューブに入れ、16,100×ｇで10分間遠心分離した。上清を回収し、Qtrap 3200 LC-MS/MSシステムで分析した。
【０１２０】
血漿中での安定性は、ヒト血漿またはマウス血漿中にて37℃で５時間インキュベートすることにより測定した。pH7.4のPBS（0.95%アセトニトリル、0.05%DMSO）で50/50(v/v)希釈した血漿中で各化合物を５μMの濃度に二連で調製した。350rpmのオービタルシェーカー上で振盪しながら各化合物を37℃で５時間インキュベートし、０時間と５時間の時点で測定した。シングル四重極質量分析計を使用したUPLC-MS（Waters、マサチューセッツ州ミルフォード）によりSIRモードで各化合物を検出することによって試料を分析した。
【０１２１】
ミクロソーム中での安定性は、ヒトのミクロソームまたはマウスのミクロソーム中において37℃で60分間インキュベートすることにより測定した。pH7.4のPBS（１%DMSO）中の0.3mg/mLミクロソーム溶液中で各化合物を１μMの濃度に二連で調製した。350rpmのオービタルシェーカー上で振盪しながら各化合物を37℃で60分間インキュベートし、０分および60分の時点で測定した。シングル四重極質量分析計を使用したUPLC-MS（Waters、マサチューセッツ州ミルフォード）によりSIRモードで各化合物を検出することによって試料を分析した。
【０１２２】
NMRスペクトル実験
NMRデータは、ブロード研究所において、低温QCIクライオプローブを備えたBruker社製 Avance III HDスペクトロメーター（600MHz）を使用して取得した。2D 15N-1H HSQCスペクトルおよびTROSYスペクトルは、化合物の非存在下または存在下において25℃で収集した。NMR試料は、25mM HEPES中90%H2O/10%D2O（pH7.5）、150mM NaClおよび0.5mM TCEPで構成されていた。ABT-737、ABT-199、ABT-263、SW063058、SW076956およびBRD1991の化学シフト摂動実験では、15Nで標識したBcl-2/-xL中に分割試料を滴定し、2D 15N-1H HSQCスペクトルおよびTROSYスペクトルを25℃で収集した。Bcl-2/-xLへの化学シフトの割り当ては、過去の報告に従って行った48。NMRデータはすべてSPARKYソフトウェアを使用して分析した。
【０１２３】
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【０１２４】
【表１】
2021527067.tif 000014
2021527067.tif 000015
2021527067.tif 000016
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【０１２５】
【表２】
2021527067.tif 000034
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【０１２６】
【表３】
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【０１２７】
【表４】
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【国際調査報告】
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