(57)【要約】選択的にRNAに結合しRNAを切断する化合物が本明細書において提供される。さまざまな態様において、本開示は、リボヌクレアーゼ標的指向キメラ(RIBOTAC)として有効な化学的化合物を提供し、これは、生細胞内でRNAを選択的に切断するために内因性酵素RNアーゼLを標的とする。これらの化合物は疾患の処置、例えば、乳がんの処置において有用である。2021521831.tif 000047
2021521831.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Iの構造：
2021521831.tif 000040
を有する化合物、または薬学的に許容されるその塩:
式中、
Wは、核酸塩基であり;
Lは、リンカー部分であり;
R1、R2、R3、およびR4は、それぞれ個別にHまたはC1〜6アルキルであり;
nは、0〜9であり;
oは、1〜5であり;
pは、1〜5である。
【請求項２】
Lが、C2〜6アルキレン-O-C2〜6アルキレン-NR3-、または
2021521831.tif 000041
を含み、
各C1〜6アルキレンが、1個または2個のOHで置換されていてもよい、
請求項1記載の化合物または塩。
【請求項３】
Wが、アデニンである、請求項1または2記載の化合物または塩。
【請求項４】
Lが、C1〜6アルキレン-O-C1〜6アルキレン-NR3である、請求項2または3記載の化合物または塩。
【請求項５】
Lが、
2021521831.tif 000042
である、請求項2または3記載の化合物または塩。
【請求項６】
R1が、C1〜6アルキルである、請求項5記載の化合物または塩。
【請求項７】
R2が、C1〜6アルキルである、請求項5または6記載の化合物または塩。
【請求項８】
R3が、Hである、請求項2〜7のいずれか一項記載の化合物または塩。
【請求項９】
R3が、C1〜6アルキルである、請求項2〜7のいずれか一項記載の化合物または塩。
【請求項１０】
R4が、Hである、請求項5〜9のいずれか一項記載の化合物または塩。
【請求項１１】
Lが、
2021521831.tif 000043
である、請求項2記載の化合物または塩。
【請求項１２】
Lが、
2021521831.tif 000044
である、請求項2記載の化合物または塩。
【請求項１３】
pが、2、3、または4である、請求項1〜12のいずれか一項記載の化合物または塩。
【請求項１４】
pが、4である、請求項13記載の化合物または塩。
【請求項１５】
oが、1、2、3、または4である、請求項2〜14のいずれか一項記載の化合物または塩。
【請求項１６】
oが、1または2である、請求項15記載の化合物または塩。
【請求項１７】
oが、2である、請求項16記載の化合物または塩。
【請求項１８】
式(Ia)の構造：
2021521831.tif 000045
を有する、請求項1記載の化合物または塩。
【請求項１９】
nが、0、3、6、または9である、請求項2〜18のいずれか一項記載の化合物または塩。
【請求項２０】
nが、0である、請求項19記載の化合物または塩。
【請求項２１】
nが、3である、請求項19記載の化合物または塩。
【請求項２２】
nが、9である、請求項19記載の化合物または塩。
【請求項２３】
表Aの化合物、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項２４】
核酸を、有効量の請求項1〜23のいずれか一項記載の化合物または塩と接触させる段階
を含む、核酸を切断する方法。
【請求項２５】
核酸が、miR-96前駆体ヘアピンRNAである、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
化合物または塩が、請求項18記載の化合物または塩である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
核酸が、pre-miR-210前駆体ヘアピンRNAである、請求項24記載の方法。
【請求項２８】
化合物または塩が、請求項11記載の化合物または塩である、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
接触させる段階が細胞内で行われる、請求項24〜28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
細胞が、がん細胞である、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
がん細胞が、乳がん細胞である、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
治療的有効量の請求項1〜23のいずれか一項記載の化合物または塩を、その必要性のある患者に投与する段階
を含む、疾患または障害を処置する方法。
【請求項３３】
疾患または障害が、がんである、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
がんが、乳がんである、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
乳がんが、三種陰性乳がんである、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
化合物または塩を投与することが、アポトーシス促進性FOXO1転写因子を抑制解除する、請求項34または35記載の方法。
【請求項３７】
アポトーシス促進性FOXO1転写因子の抑制解除が、乳がん細胞においてアポトーシスを誘発する、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
化合物または塩を投与することで、プロリルヒドロキシラーゼ(PHD)に結合して低酸素誘導因子1-α(HIF1α)の過剰ヒドロキシル化を促進するGPD1Lタンパク質の抑制を解除し、プロテアソームによるHIF1α分解を媒介し、乳がん細胞においてアポトーシスを誘発する、請求項34または35記載の方法。
【請求項３９】
治療的有効量の化合物または塩が、乳がん細胞においてアポトーシスを誘発する、請求項32〜38のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
治療的有効量の化合物または塩が、健常な乳房細胞においてアポトーシスを誘発しない、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
治療的有効量の化合物または塩が、DNAに結合しない、またはRNAに結合するよりも少なくとも5倍少なくDNAに結合する、請求項32〜40のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
A2〜4-リンカー-Htの構造を有し、
式中、
Aがアデノシンであり、
リンカーが、N、OおよびSから個別に選択される1〜20個のヘテロ原子が割り込んでいてもよい、5〜150個の炭素原子を含み、かつ
HtがRNA標的指向基である、
化合物、または薬学的に許容されるその塩と、
RNAを接触させる段階
を含む、RNAを切断する方法。
【請求項４３】
Htが、
2021521831.tif 000046
を含む、請求項41記載の方法。
【請求項４４】
化合物または塩が、A4-リンカー-Htを含む、請求項41または42記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は2018年4月24日付で出願された米国仮特許出願第62/661,776号の優先権を主張し、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府支援の声明
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたGM097455の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
RNA薬物標的は、全ての細胞および本質的に全ての疾患状況の至る所にある。RNAを標的とする最も一般的な方法は、主に非構造化領域で相補配列に結合するオリゴヌクレオチドに基づくモダリティを用いることである。得られたオリゴヌクレオチド:RNAハイブリッドは、内因性リボヌクレアーゼH (RNase H (RNアーゼH))を動員し、これが次いでRNA標的を切断し生態過程に影響を与える。オリゴヌクレオチドは変革医療(transformative medicines)であった。しかしながら、それらはヒトでの血小板減少症など、末梢に送達されるとプラットフォーム固有の毒性を有する。小分子は、歴史的に主要な医薬であり、それらの化学物質は広く医学的に最適化され得るため、RNAを標的とする代替的なアプローチであり得る。しかしながら、ヒトRNAは小分子による標的指向には不応性であると考えられており、したがって新薬の開発に繋がらないと分類される。ヒトRNAを標的とする生物活性小分子を得ることは困難であるため、この複雑な分子認識の問題に対する一般的な解決策には、新しいアプローチが必要となる。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本開示は、さまざまな態様において、リボヌクレアーゼ標的指向キメラ(RIBOTAC)として有効な化合物を提供し、これは、生きている哺乳類細胞内でマイクロRNA 96 (miR-96)の一次転写産物(pri-miR-96)を選択的に切断するために、内因性酵素RNアーゼLを標的とする。pri-miR-96の破壊は、miR-96の生合成を選択的に阻害し、それによってアポトーシス促進性転写因子FOXO1 (miR-96の下流標的)の抑制を解除しうる。アポトーシス促進性FOXO1の活性化は、正常な乳房細胞と比べて三種陰性乳がん細胞において選択的にアポトーシスを誘発することができる。
【０００５】
いくつかの局面において、本開示は式Iの化合物を提供する：
2021521831.tif 000003
式中、Wは核酸塩基であり、Lはリンカー部分であり、R1、R2、R3、およびR4はそれぞれ個別にHまたはC1〜6アルキルであり、nは0〜9であり、oは1〜5であり、pは1〜5である。さまざまな態様において、Lは、構造：
2021521831.tif 000004
を有するリンカー部分である。
【０００６】
さまざまな態様において、本開示は式Iaの化合物：
2021521831.tif 000005
（式中、nは0、1、2、3、4、5、6、7、8、もしくは9である）、または薬学的に許容されるその塩を提供する。n = 0であるこの構造の化合物は、miR-96の生合成、FOXO1の抑制解除、および乳がん細胞におけるアポトーシスの誘導を阻害するうえで特に活性があることが分かった。
【０００７】
したがって、さまざまな態様において、生細胞内のmiR-96前駆体ヘアピンRNAを、有効な量または濃度の本明細書において開示される化合物と接触させる段階を含む、miR-96前駆体ヘアピンRNAを選択的に切断する方法が提供される。生細胞は乳がん細胞などのがん細胞であり得る。
【０００８】
さらに、さまざまな態様において、がん細胞を、有効な量または濃度の上記に示される化合物と、例えば、化合物2、3、または4のいずれか1つと接触させる段階を含む、アポトーシス促進性FOXO1転写因子を抑制解除し、乳がん細胞においてアポトーシスを誘発する方法が提供される。乳がん細胞においてアポトーシスを誘発するのに十分な有効な量または濃度の化合物で投与される、化合物2、3、または4のいずれかなどの、本明細書において記述される化合物の生物学的効果は、健常な乳房細胞においてアポトーシスを誘発するのには効果がなく、がん細胞に対して選択的なアポトーシス効果を提供することができる。
【０００９】
さらに、本開示は、さまざまな態様において、RIBOTACとして有効な化合物を提供し、これは、生きている哺乳類細胞内でmiR-210の前駆体またはpre-miR-210を選択的に切断するために、内因性酵素RNアーゼLを標的とする。pre-miR-210の破壊は、miR-210の生合成を選択的に阻害し、それによって、プロリルヒドロキシラーゼ(PHD)に結合して低酸素誘導因子1-α(HIF1α)の過剰ヒドロキシル化を促進するグリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ1様（GPD1L）タンパク質の抑制を解除し、プロテアソームによるHIF1α分解を媒介し、乳がん細胞においてアポトーシスを誘発しうる。GPD1Lの活性化は、正常な乳房細胞と比べて三種陰性乳がん細胞において選択的にアポトーシスを誘発することができる。
【００１０】
さまざまな態様において、本開示は、式の化合物(TGP-210-RL)または薬学的に許容されるその塩を提供する。この構造の化合物は、miR-210の生合成、GPDL1の抑制解除、および乳がん細胞におけるアポトーシスの誘導を阻害するうえで特に活性があることが分かった。
2021521831.tif 000006
【００１１】
したがって、さまざまな態様において、生細胞内のpre-miR-210 RNAを、有効な量または濃度の本明細書において開示される化合物と接触させる段階を含む、pre-miR-210を選択的に切断する方法が提供される。生細胞は乳がん細胞などのがん細胞であり得る。
【００１２】
さらに、さまざまな態様において、がん細胞を、有効な量または濃度の上記に示される化合物と、例えば、以下の表Aに記載される、本明細書において開示される化合物、例えば、1、2、3、TGP-210-2'-5' A2、TGP-210-2'-5' A3、またはTGP-210-2'-5' A4のいずれか1つと接触させる段階を含む、GPDL1を抑制解除し、乳がん細胞においてアポトーシスを誘発する方法が提供される。乳がん細胞においてアポトーシスを誘発するのに十分な有効な量または濃度の化合物で投与される、表Aに記載される、本明細書において開示される化合物、例えば、1、2、3、TGP-210-2'-5' A2、TGP-210-2'-5' A3、またはTGP-210-2'-5' A4のいずれかなどの、本明細書において記述される化合物の生物学的効果は、健常な乳房細胞においてアポトーシスを誘発するのには効果がなく、がん細胞に対して選択的なアポトーシス効果を提供することができる。
【００１３】
結果として、本開示は、さまざまな態様において、乳がんなどのがんを、それに苦しむ患者において処置する方法を提供する。より具体的には、乳がんは三種陰性乳がんであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】転写産物に選択的なRNアーゼL動員化合物のデザインおよび特徴付け。(A) 上：マイクロRNA-96の一次転写産物(pri-miR-96)の二次構造。下：化合物2によるpri-miR-96への、2'-5' Aを通じた活性なRNアーゼL動員の概略図。(B) 本研究において用いた化合物。(C) 2'-5' A4および異なるリンカー長を有するキメラ小分子によるpri-miR-96のインビトロ切断; n = 0リンカー(2)は最も高い切断能力を示した。(D) 2'-5' A4、pri-miR-96に選択的な2、または2'-5' A4を欠く1bの処理による、RNアーゼLの架橋後の単量体およびオリゴマー(活性)形態の代表的なウエスタンブロットおよび定量化。データは平均±標準誤差(s.e.m.)として表されている(n≧3)。＊p<0.05, 両側スチューデントt検定により測定された場合。
【図１Ｂ】図1Aの説明を参照のこと。
【図１Ｃ】図1Aの説明を参照のこと。
【図１Ｄ】図1Aの説明を参照のこと。
【図２】小分子によるRNアーゼL動員は、細胞内でオンターゲット効果を示す。(A) RT-qPCRにより測定された場合、2によるMDA-MB-231三種陰性乳がん細胞の処理は、Droshaプロセッシングを阻害することによりpri-miR-96のレベルを上昇させた1aと比較して、切断によりpri-miR-96の存在量を減少させた。(B) 成熟miR-96レベルに及ぼす1aおよび2の効果。(C) pri-miR-96の2を介した切断は、1aの添加により低減される。2に同じ濃度を用いた場合の、1aの効果についての相対的切断対照。(D) 200 nMでの2'-5' A4または2処理による、免疫沈降RNアーゼLタンパク質から単離されたRNAのRT-qPCR。2で処理されたRNアーゼLに結合したRNAは、β-アクチンから免疫沈降されたRNAに対して正規化された、pri-miR-96転写産物の濃縮を示す。(E) siRNAによるRNアーゼLのノックダウン時の、2によるpri-miR-96の相対的切断。(F) RNアーゼLの過剰発現は2 (20 nM)の切断活性の増加をもたらし、pri-miR-96の過剰発現は切断活性の低下をもたらした。データは平均±標準誤差(s.e.m.)として表されている(n≧3)。＊p<0.05, ＊＊p<0.01, 両側スチューデントt検定により測定された場合。
【図３Ａ】2によるpri-miR-96へのRNアーゼLの選択的動員によるアポトーシス刺激。(A) FOXO1はmiR-96によって下方制御される腫瘍抑制タンパク質である。ウエスタンブロットにより測定された場合、2による処理は、FOXO1の抑制解除を引き起こした。(B) FOXO1を標的指向すると予測されたmiRNA中で比較した、2での処理(20 nM)によるmiR-96の選択的切断。(C) 検証済みmiRNAの非仮説駆動型RT-qPCR分析により、最大の大きさおよび有意性での、2 (200 nM)によるmiR-96の阻害が示された。(D) アネキシンV/PI染色により測定された場合、2 (200 nM)による処理は、MDA-MB-231細胞をアポトーシスにさせた。「Pri-miR-96」はpri-miR-96ヘアピンのプラスミド過剰発現を示し、これにより2によって引き起こされるアポトーシスを減少させた。データは平均±標準誤差(s.e.m.)として表されている(n≧3)。＊p<0.05, 両側スチューデントt検定により測定された場合。
【図３Ｂ】図3Aの説明を参照のこと。
【図３Ｃ】図3Aの説明を参照のこと。
【図３Ｄ】図3Aの説明を参照のこと。
【図４】化合物1bの調製のための合成経路を示す。
【図５】化合物3bの調製のための合成経路を示す。
【図６】化合物4bの調製のための合成経路を示す。
【図７】化合物2の調製のための合成経路を示す。
【図８】化合物3の調製のための合成経路を示す。
【図９】化合物4の調製のための合成経路を示す。
【図１０】GPD1Lタンパク質がプロリルヒドロキシラーゼ(PHD)に結合して、低酸素誘導因子1-α(HIF1α)の過剰ヒドロキシル化を促進し、かくしてプロテアソームによるこのタンパク質のポリユビキチン化とその後の分解を媒介することを示す。
【図１１】小分子TGP-210がpre-miR-210のDicer部位を標的指向し、そのDicerプロセッシングを阻害し、かくして成熟miR-210-3p SEQ ID NO:1の生合成を減少させることを示す。
【図１２】TGP-210-RLの構造を示す。
【図１３】TGP-210-RLが最も強力な切断効果を有した一方で、二量体および三量体の2'-5 'オリゴアデニル酸が付加されたTGP-210誘導体では非常に限られた切断活性が観察されたことを示す。
【図１４】2'-5' A4ヌクレアーゼ動員モジュールを加えることの結合結果の研究を、これらの標的に対するマイクロスケール熱泳動(MST)により測定される結合親和性により、TGP-210-RLを用いて示す。
【図１５Ａ】TGP-210-RLによるインビトロRNアーゼL二量体化、結合選択性、およびpre-miR-210切断を示す。(A) 2'-5' A4、TGP-210-RL、および親化合物TGP-210による処理時のRNアーゼLの架橋後の単量体およびオリゴマー(活性)形態の代表的なウエスタンブロットおよび定量化。(B) MST分析によるTGP-210、TGP-210-RL、またはTGP-210-RLと5' Cy5末端標識miR-210ヘアピンRNAに対するRNアーゼL (50 nM)との代表的な結合等温線。緑色のボックスは、miR-210ヘアピンRNA上のTGP-210/TGP-210-RL結合部位を示す。(C) MST分析によるTGP-210、TGP-210-RL、またはTGP-210-RLと5' Cy5末端標識miR-210変異体RNAに対するRNアーゼL (50 nM)との代表的な結合等温線。橙色のボックスは、miR-210ヘアピンRNAに対応する塩基対合対照であるmiR-210変異体RNA中の変異結合部位を示す。(D) MST分析によるTGP-210、TGP-210-RL、またはTGP-210-RLと5' Cy5末端標識DNAヘアピンに対するRNアーゼL (50 nM)との代表的な結合等温線。(E) 5' 32P末端標識miR-210ヘアピン前駆体のRNアーゼLおよびTGP-210-RL処理によるインビトロマッピングゲル。「OH」は、あらゆる塩基の位置で切断されている加水分解ラダーを示す; 「T1」は、あらゆるG塩基の後ろを切断するT1エンドヌクレアーゼによる変性切断条件を示す。
【図１５Ｂ】図15Aの説明を参照のこと。
【図１５Ｃ】図15Aの説明を参照のこと。
【図１５Ｄ】図15Aの説明を参照のこと。
【図１５Ｅ】図15Aの説明を参照のこと。
【図１６】MDA-MB-231細胞における化合物の細胞取込みおよび切断を示す。(A) 左側, フローサイトメトリーにより測定された場合の、MDA-MB-231細胞における1 μMのTGP-210またはTGP-210-RLの相対的な細胞取込み。細胞取込みは、DAPI-UVレーザー(Ex: 345 nm; Em: 460 nm)による励起時の、固有の化合物蛍光を介して検出された。右側, 細胞における化合物検出の陽性数を示す代表的な重ね合わせフローサイトメトリーヒストグラム。未処理およびTGP-210処理細胞からのシグナルを、それぞれ0%および100%に正規化した。(B) SYTO 82 Orange Fluorescent Nuclear Stainで染色された、5 μM TGP-210またはTGP-210-RL処理MDA-MB-231細胞の、倍率40倍での共焦点顕微鏡検査。白色のスケールバーは20 μmを表す。(C) 異なる長さの2'-5' An (n = 2〜4)を付加したTGP-210による、低酸素MDA-MB-231細胞でのpre-miR-210の相対的切断。(D) RT-qPCR分析により測定された場合、低酸素MDA-MB-231細胞への2'-5' A4のトランスフェクションは、成熟したmiR-210-3pおよびpre-miR-210の存在量に大きな影響を与えない。＊p<0.05, ＊＊＊p<0.001, 両側スチューデントt検定により測定された場合。データは、三つ組の平均±SEMを表す。
【図１７Ａ】RNA-SeqによるTGP-210-RLの選択性、および、アポトーシスに及ぼすmiR-210を標的指向する化合物の効果を、正常酸素圧のMDA-MB-231細胞において示す。(A)処理24時間後に、媒体(DMSO)またはTGP-210-RL処理(200 nM)した低酸素MDA-MB-231細胞からの全RNAに対してRNA-Seqを実施した。サンプル間の差次的遺伝子発現を、媒体サンプルにおける遺伝子塩基あたりのスケーリングされた読み取り(x軸)、およびTGP-210-RL処理サンプルにおける遺伝子塩基あたりのスケーリングされた読み取り(y軸)の散布図としてプロットした。マッピングされた遺伝子18829個のうち、有意な影響を受けた遺伝子はなく、偽検出率は1%で、化合物のオフターゲット効果は限られていることを実証するものであった。(B) TargetScanHuman v7.2を用いて、保存された部位でのみmiR-210-3pの標的遺伝子を予測した。予測された42個の標的遺伝子のうち、37個の遺伝子がRNA-Seqデータセットにマッピングされた。相対的変化倍率(%)は、37中27個の標的遺伝子が上方制御されたことを示し、これは二項統計検定にしたがい、99%の信頼度で正のバイアスにより二項分布からの有意な不一致を示す(26%超、または70%超の上方制御された標的は、99%の信頼度で二項分布からの不一致を表す)。(C) TargetScanHuman v7.2を用いて、累積加重コンテキスト++スコアでランク付けされた、部位の保存に関係のない、miR-23-3pの上位100標的遺伝子を予測した。miR-23-3pは、miR-210-3pよりも高発現されており、低酸素関連miRNAでもあるため、対照miRNAとして用いた。予測された100個の標的遺伝子のうち、80個の遺伝子がRNA-Seqデータセットにマッピングされた。相対的変化倍率(%)は、80中46個の標的遺伝子が上方制御されたことを示し、これは二項統計検定によると、二項分布に従う(51%超、または63%超の上方制御された標的は、99%の信頼度で二項分布からの不一致を表す)。(D) TargetScanHuman v7.2を用いて、累積加重コンテキスト++スコアでランク付けされた、部位の保存に関係のない、miR-107の上位100標的遺伝子を予測した。miR-107は、miR-210-3pのレベルと同様に発現されており、低酸素関連miRNAでもあるため、対照miRNAとして用いた。予測された100個の標的遺伝子のうち、96個の遺伝子がRNA-Seqデータセットにマッピングされた。相対的変化倍率は、96中55個の標的遺伝子が上方制御されたことを示し、これは二項統計検定によると、二項分布に従う(59%超、または61%の上方制御された標的は、99%の信頼度で二項分布からの不一致を表す)。赤色の線は、二項分布に反する変化倍率分布の99%信頼区間を示す。(E) 正常酸素圧条件のMDA-MB-231細胞を、スクランブルロックド核酸(Scr-LNA)、miR-210-3p LNA (LNA-210)、TGP-210、およびTGP-210-RLで48時間処理し、アポトーシス刺激をカスパーゼ3/7活性によって測定した。あるいは、正常酸素圧のMDA-MB-231細胞に、miR-210前駆体を過剰発現するプラスミド(黄色のボックス; Pre-miR-210過剰発現)をトランスフェクションし、上記のように処理した。
【図１７Ｂ】図17Aの説明を参照のこと。
【図１７Ｃ−１】図17Aの説明を参照のこと。
【図１７Ｃ−２】図17Aの説明を参照のこと。
【図１７Ｄ−１】図17Aの説明を参照のこと。
【図１７Ｄ−２】図17Aの説明を参照のこと。
【図１７Ｅ】図17Aの説明を参照のこと。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な説明
疾患または障害を処置または予防するために、RNAに結合し、RNAを選択的に切断しうる化合物が、本明細書において提供される。これらの化合物は、がん、例えば乳がん、または三種陰性乳がんを含む、種々の疾患および障害の処置において有用である。
【００１６】
本開示の化合物
本開示は式Iの化合物および薬学的に許容されるその塩を提供する。
式I:
2021521831.tif 000007
式中、Wは核酸塩基であり; Lはリンカー部分であり、pは1〜5である。
【００１７】
いくつかの態様において、各Wはアデニンまたはグアニンである。いくつかの態様において、各Wはアデニンである。
【００１８】
いくつかの態様において、LはC2〜6アルキレン-O-C2〜6アルキレン-NR3-または
2021521831.tif 000008
を含み、各C2〜6アルキレンは1個または2個のOHで置換されていてもよく、R1、R2、R3、およびR4はそれぞれ個別にHまたはC1〜6アルキルであり; nは0〜9であり; かつoは1〜5である。
【００１９】
いくつかの態様において、LはC2〜6アルキレン-O-C2〜6アルキレン-NR3である。いくつかの態様において、LはC2〜4アルキレン-O-C2〜4アルキレン-NR3である。いくつかの態様において、LはC3アルキレン-O-C3アルキレン-NR3である。いくつかの態様において、LはC2〜6アルキレン-O-C2〜6アルキレン-NR3であり、1個のOHで置換されていてもよい。いくつかの態様において、LはC2〜4アルキレン-O-C2〜4アルキレン-NR3であり、1個のOHで置換されていてもよい。いくつかの態様において、LはC3アルキレン-O-C3アルキレン-NR3であり、1個のOHで置換されていてもよい。
【００２０】
いくつかの態様において、Lは
2021521831.tif 000009
である。
【００２１】
いくつかの態様において、R1はHである。いくつかの態様において、R1はC1〜6アルキルである。いくつかの態様において、R1はC3アルキルである。いくつかの態様において、R2はHである。いくつかの態様において、R2はC1〜6アルキルである。いくつかの態様において、R2はC3アルキルである。いくつかの態様において、R3はHである。いくつかの態様において、R3はC1〜6アルキルである。いくつかの態様において、R3はC3アルキルである。いくつかの態様において、R4はHである。いくつかの態様において、R4はC1〜6アルキルである。いくつかの態様において、R4はC3アルキルである。
【００２２】
場合によっては、各R1、R2、R3、およびR4はHまたはC3アルキルである。
【００２３】
いくつかの態様において、Lは
2021521831.tif 000010
である。いくつかの態様において、Lは
2021521831.tif 000011
である。
【００２４】
いくつかの態様において、pは2、3、または4である。いくつかの態様において、pは1である。いくつかの態様において、pは2である。いくつかの態様において、pは3である。いくつかの態様において、pは4である。
【００２５】
いくつかの態様において、oは1、2、3、または4である。いくつかの態様において、oは4である。いくつかの態様において、oは1または2である。いくつかの態様において、oは1である。いくつかの態様において、oは2である。いくつかの態様において、oは3である。いくつかの態様において、oは4である。
【００２６】
式(Ia)の化合物も本明細書において提供される。
2021521831.tif 000012
【００２７】
いくつかの態様において、nは0である。いくつかの態様において、nは1である。いくつかの態様において、nは2である。いくつかの態様において、nは3である。いくつかの態様において、nは4である。いくつかの態様において、nは5である。いくつかの態様において、nは6である。いくつかの態様において、nは7である。いくつかの態様において、nは8である。いくつかの態様において、nは9である。いくつかの態様において、nは0、3、6、または9である。
【００２８】
企図される特定の化合物は、以下の表Aに記載されるもの、およびそれらの薬学的に許容される塩を含む。
【００２９】
（表Ａ）
2021521831.tif 000013
【００３０】
定義
本明細書において用いられる場合、「核酸塩基」という用語は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの塩基部分をいう。ある種の態様において、核酸塩基は、プリン(プリニルとも呼ばれる)またはピリミジン(ピリミジニルとも呼ばれる)塩基である。ある種の態様において、核酸塩基は、アデニニル、プリニル、チミニル、シトシニル、ピリミジニル、ウラシリル、トリアゾロピリジニル、イミダゾロピリジニル、ピロロピリミジニル、トリアゾロピリミジニル、ピラゾロピリミジニル、グアニニル、アデニニル、ヒポキサンチニル、7-デアザグアニニル、7-デアザアデニニル、またはピロロトリアジニルである。ある種の態様において、核酸塩基はアデニン、グアニン、シトシン、またはチミンである。ある種の態様において、核酸塩基はアデニンである。
【００３１】
本明細書において用いられる場合、「アルキル」という用語は、1から30個の炭素原子、例えば、1から20個の炭素原子、または1から10個の炭素原子を含む直鎖および分枝飽和炭化水素基をいう。Cnという用語は、アルキル基が「n」個の炭素原子を有することを意味する。例えば、C4アルキルは、4個の炭素原子を有するアルキル基をいう。C1〜C6アルキルは、範囲全体(例えば、1から6個の炭素原子)を包含する炭素原子の数を有するアルキル基、ならびに全ての亜群(例えば、1〜6、2〜6、1〜5、3〜6、1、2、3、4、5、および6個の炭素原子)をいう。アルキル基の非限定的な例としては、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル(2-メチルプロピル)、t-ブチル(1,1-ジメチルエチル)、3,3-ジメチルペンチル、および2-エチルヘキシルが挙げられる。特に指示のない限り、アルキル基は、非置換アルキル基または置換アルキル基であることができる。
【００３２】
本明細書において用いられる「アルキレン」という用語は、2つの結合点を有するアルキル基をいう。例えば、アルキレン基は、-CH2CH2-または-CH2-であることができる。Cnという用語は、アルキレン基が「n」個の炭素原子を有することを意味する。例えば、C1〜6アルキレンは、「アルキル」基について既述されたように、範囲全体を包含する炭素原子の数を有するアルキレン基、ならびに全ての亜群をいう。特に指示のない限り、アルキレン基は、非置換アルキレン基または置換アルキレン基であることができる。
【００３３】
本明細書において用いられる場合、「置換された」という用語は、化学官能基を修飾するために用いられる場合、官能基上の少なくとも1つの水素基の置換基による置換をいう。置換基は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、オキシ、アルコキシ、ヘテロアルコキシ、エステル、チオエステル、カルボキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、アミド、アセトアミド、およびハロ(例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード)を含むことができるが、これらに限定されることはない。化学官能基が2つ以上の置換基を含む場合、置換基は、同じ炭素原子にまたは2つもしくはそれ以上の異なる炭素原子に結合することができる。「置換されてもよい」部分は、列挙された置換基を有しても有しなくてもよい。例えば、1つまたは2つのOHで置換されてもよいC2〜6アルキレンは、1つまたは2つの水素基がOHで置換されたC2、C3、C4、C5およびC6アルキレン基を含む。
【００３４】
本明細書において用いられる場合、「リンカー部分」という用語は、5から150個の炭素原子、例えば、5から100個、5から90個、10から80個、10から70個、10から60個、10から50個、10から40個の炭素原子、10から30個の炭素原子、10から20個の炭素原子、または5から50個の炭素原子を含み、1個または複数個の(例えば、1〜20個、1〜15個、1〜10個、1〜5個、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個の)ヘテロ原子(例えば、O、N、S、P、Se、およびBから選択される、またはN、O、およびSから選択される) が割り込んでいてもよい、飽和炭化水素基を含む直鎖または分枝鎖基をいう。特に指示のない限り、鎖は置換されていてもよい。置換基は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、オキソ、アルコキシ、ヘテロアルコキシ、エステル、チオエステル、カルボキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、アミド、アジド、アセトアミド、およびハロ(例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード)を含むことができるが、これらに限定されることはない。リンカー部分は重合体鎖であることができるが、重合体である必要はない。リンカー部分の非限定的な例としては、ポリアルキレン鎖(ポリエチレンまたはポリプロピレン鎖など)、ポリアルキレングリコール鎖(ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールなど)、ポリアミド鎖(ポリペプチド鎖など)などが挙げられる。リンカー部分は、アミド官能基、エステル官能基、チオール官能基、エーテル官能基、カルバメート官能基、カーボネート官能基、尿素官能基、アルケン官能基、アルキン官能基、またはヘテロアリール環(アルキンとアジドとの間のクリック化学反応を介して形成される)を介して化合物の残部に結合させることができる。
【００３５】
本明細書において用いられる場合、「RNA標的指向基」という用語は、RNAに選択的に結合する部分を含む。RNA標的指向基は、特定のRNA配列に対して選択的であることができる。RNA標的指向基は、共有結合または非共有結合のいずれかの方法でRNAに結合することができる。RNA標的指向基の非限定的な例としては、小分子、例えばtargapremirまたはtargaprimirが挙げられる。
【００３６】
本明細書において用いられる場合、「治療的有効量」という用語は、特定の疾患(例えば、がん)もしくは状態の1つもしくは複数の症状を改善、軽減もしくは除去する、または特定の疾患もしくは状態の1つもしくは複数の症状の発症を予防もしくは遅延する化合物または治療的に活性な化合物(例えば、mRNA結合化合物)の組み合わせの量を意味する。
【００３７】
本明細書において用いられる場合、「患者」という用語は、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、およびヒツジなどの動物(例えば、ヒト以外の動物)ならびにヒトを意味する。特定の患者は哺乳動物(例えば、ヒト)である。患者という用語は、男性および女性を含む。
【００３８】
本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容される」という用語は、本開示の化合物、または該化合物を含む製剤、または特定の賦形剤などの、参照物質が患者または対象への投与のために安全かつ適当であることを意味する。「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、それが投与される宿主に対して毒性がない媒体をいう。
【００３９】
本明細書において開示される化合物は、薬学的に許容される塩として存在することができる。本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、正しい医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答などなくヒトおよび下等動物の組織と接触させて用いるのに適し、かつ妥当なリスク・ベネフィット比に見合う、塩をいう。薬学的に許容される塩は当技術分野において周知である。例えば、S. M. Bergeらは薬学的に許容される塩をJ. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19において詳述しており、これは参照により本明細書に組み入れられる。本明細書において開示される化合物の薬学的に許容される塩は、適当な無機および有機の酸および塩基に由来するものを含む。薬学的に許容される無毒性の酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸および過塩素酸などの無機酸と、または酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸もしくはマロン酸などの有機酸と形成された、あるいはイオン交換などの当技術分野において用いられる他の方法を用いることによって形成されたアミノ基の塩である。他の薬学的に許容される塩は、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、2-ヒドロキシ-エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチニン酸塩、過硫酸塩、3-フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などを含む。カルボン酸または他の酸性官能基を含む化合物の塩は、適当な塩基と反応することによって調製することができる。そのような塩は、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アルミニウム塩、アンモニウム、N+(C1〜4アルキル)4塩、ならびにトリメチルアミン、トリエチルアミン、モルホリン、ピリジン、ピペリジン、ピコリン、ジシクロヘキシルアミン、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、2-ヒドロキシエチルアミン、ビス-(2-ヒドロキシエチル)アミン、トリ-(2-ヒドロキシエチル)アミン、プロカイン、ジベンジルピペリジン、デヒドロアビエチルアミン、N,N'-ビスデヒドロアビエチルアミン、グルカミン、N-メチルグルカミン、コリジン、キニン、キノリンなどの有機塩基や、リジンおよびアルギニンなどの塩基性アミノ酸の塩を含むが、これらに限定されることはない。本明細書において開示される化合物の任意の塩基性窒素含有基の四級化も想定される。そのような四級化によって水または油溶性または分散性の生成物が得られうる。代表的なアルカリまたはアルカリ��類金属塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどを含む。さらなる薬学的に許容される塩は、適切な場合、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、低級アルキルスルホン酸塩およびアリールスルホン酸塩などの対イオンを用いて形成される無毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、およびアミン陽イオンを含む。
【００４０】
本明細書において用いられる場合、「処置すること」、「処置する」または「処置」などの用語は、防止的(例えば、予防的)および対症療法的処置を含む。
【００４１】
本明細書において用いられる場合、「賦形剤」という用語は、医薬品有効成分(API)以外の、薬学的に許容される任意の添加剤、担体、希釈剤、補助剤、または他の成分を意味する。
【００４２】
本開示の化合物の合成
本明細書において開示される化合物は、当業者に公知の、または本明細書における教示に照らして、標準的な合成方法および手順を利用することにより、市販の出発物質、文献において公知の化合物を用いて、または容易に調製される中間体から、種々の方法で調製することができる。有機分子の調製ならびに官能基の変換および操作のための標準的な合成方法および手順は、関連する科学文献から、またはこの分野における標準的なテキストブックから得ることができる。いずれか1つまたはいくつかの情報源に限定されるものではないが、Smith, M. B., March, J., March' s Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 5th edition, John Wiley & Sons: New York, 2001 ; およびGreene, T.W., Wuts, P.G. M., Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd edition, John Wiley & Sons: New York, 1999などの古典的なテキストは、当業者に公知の、有用なかつ認識された有機合成の参考テキストブックである。例えば、本明細書において開示される化合物は、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 1963; 85:2149; Davis et al., Biochem. Intl. 1985; 10:394-414; Larsen et al., J. Am. Chem. Soc. 1993; 115:6247; Smith et al., J. Peptide Protein Res. 1994; 44: 183; O'Donnell et al., J. Am. Chem. Soc. 1996; 118:6070; Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis,, Freeman (1969); Finn et al., The Proteins, 3rd ed., vol. 2, pp. 105-253 (1976); およびErickson et al., The Proteins, 3rd ed., vol. 2, pp. 257-527 (1976)において記述されているものを含む固相合成技法によって合成することができる。合成方法の以下の記述は、本開示の化合物の調製のための一般的な手順を、限定するためではなく、例示するためにデザインされている。
【００４３】
本明細書にいて開示される合成プロセスは、多種多様な官能基を許容することができる; それゆえ、さまざまな置換出発材料を用いることができる。プロセスは一般に、プロセス全体の終わりまたはその近くで所望の最終化合物を提供するが、ある種の場合には、化合物を薬学的に許容されるその塩にさらに変換することが望ましい場合がある。
【００４４】
本明細書において開示される化合物を調製するための追加の合成手順は、実施例のセクションにおいて見出すことができる。
【００４５】
薬学的製剤、投薬、および投与経路
本明細書において記述される化合物(例えば、式I、式Ia、表Aの化合物、および薬学的に許容されるその塩)ならびに薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的製剤がさらに提供される。
【００４６】
本明細書において記述される化合物は、治療的有効量で(例えば、がんの症状を予防または軽減するのに十分な量で)対象に投与することができる。化合物は、単独で、または薬学的に許容される組成物もしくは製剤の一部として投与することができる。さらに、化合物は、一度に、複数回投与されてもよく、または一定期間にわたって実質的に均一に送達されてもよい。化合物の用量は、時間とともに変化しうることにも留意されたい。
【００４７】
特定の対象に対する特定の投与レジメンは、部分的には、化合物、投与される化合物の量、投与経路、ならびに任意の副作用の原因および程度に依存するであろう。本開示によって対象(例えば、ヒトなどの哺乳動物)に投与される化合物の量は、合理的な時間枠にわたって所望の応答をもたらすのに十分でなければならない。投与量は通常、投与の経路、タイミング、および頻度に依存する。したがって、臨床医は、最適な治療効果を得るために、投与量を用量設定し、投与経路を変更するものであり、従来の範囲発見技法は当業者に公知である。
【００４８】
純粋に例示として、本方法は、上記の要因に応じて、例えば、約0.1 mg/kgから約100 mg/kgまでの化合物またはそれ以上を投与する段階を含む。他の態様において、投与量は1 mg/kgから約100 mg/kgまで; または5 mg/kgから約100 mg/kgまで; または10 mg/kgから約100 mg/kgまでの範囲である。いくつかの状態は長期の処置を必要とし、それは複数回の投与にわたってより低い用量の化合物を投与することを伴うこともあり、または伴わないこともある。必要に応じて、化合物の用量は、1日を通して適切な間隔で別々に投与される2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれ以上の部分用量として、任意で、単位剤形で投与される。処置期間は、特定の状態および痛みの種類によって異なり、1日から数ヶ月続く場合がある。
【００４９】
本明細書において開示される化合物(例えば、式I、式Ia、表Aの化合物、または薬学的に許容されるその塩)を含む薬学的組成物などの、生理学的に許容される組成物を投与する適当な方法は、当技術分野において周知である。化合物を投与するために2つ以上の経路を用いることができるが、特定の経路は、別の経路よりも迅速かつ有効な反応を提供することができる。状況に応じて、化合物を含む薬学的組成物は、体腔に適用もしくは注入され、皮膚もしくは粘膜を通して吸収され、摂取され、吸入され、および/または循環血中に導入される。例えば、ある種の状況では、経口的に、静脈内、腹腔内、大脳内(実質内)、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、病変内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、尿道、膣、または直腸の手段による注射を通じて、徐放系により、または移植装置により薬剤を含む薬学的組成物を送達することが望ましいであろう。必要に応じて、化合物は、局所的に髄腔内投与、大脳内(実質内)投与、脳室内投与、または関心対象の領域に栄養を与える動脈内もしくは静脈内投与を介して投与される。あるいは、組成物は、所望の化合物が吸収またはカプセル封入された膜、スポンジ、または別の適切な材料の移植を介して局部的に投与される。移植装置が用いられる場合、装置は、1つの局面において、任意の適当な組織または器官に移植され、所望の化合物の送達は、例えば、拡散、徐放性ボーラス、または連続投与によるものである。
【００５０】
投与を容易にするために、化合物は、さまざまな局面において、担体(例えば、ビヒクル、補助剤、または希釈剤)を含む生理学的に許容される組成物に製剤化される。利用される特定の担体は、溶解性および化合物との反応性の欠如のような、化学物理的考慮事項によって、および投与経路によってのみ制限される。生理学的に許容される担体は当技術分野において周知である。注射可能な使用に適した例示的な薬学的形態は、無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製のための無菌の水溶液または分散液および無菌の粉末を含む(例えば、米国特許第5,466,468号を参照のこと)。注射可能な製剤は、例えば、Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Co., Philadelphia. Pa., Banker and Chalmers, eds., pages 238-250 (1982)、およびASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., pages 622-630 (1986))にさらに記述されている。化合物を含む薬学的組成物は、1つの局面において、そのような薬学的組成物の使用に関する使用説明を提供する包装材料とともに、容器内に配置される。一般に、そのような使用説明は、試薬濃度、ならびにある種の態様において、薬学的組成物を再構成するために必要とされうる賦形剤成分または希釈剤(例えば、水、生理食塩水またはPBS)の相対量について記述する具体的な表現を含む。
【００５１】
非経口注射に適した組成物は、生理学的に許容される無菌の水性または非水性の溶液、分散液、懸濁液、または乳濁液、および無菌の注射可能な溶液または分散液に再構成するための無菌の粉末を含みうる。適当な水性および非水性の担体、希釈剤、溶媒、またはビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール(プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロールなど)、それらの適当な混合物、植物油(オリーブ油など)およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。
【００５２】
これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などの補助剤を含みうる。微生物混入は、さまざまな抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを添加することによって防ぐことができる。等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを含めることも望ましい場合もある。注射可能な薬学的組成物の長期吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすことができる。
【００５３】
経口投与用の固体剤形は、カプセル、錠剤、粉末、および顆粒を含む。そのような固体剤形において、活性化合物は、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウムなどの少なくとも1つの不活性な通常の賦形剤(もしくは担体)、あるいは(a) 例えばデンプン、ラクトース、スクロース、マンニトールおよびケイ酸などの充填剤もしくは増量剤; (b) 例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよびアカシアゴムなどの結合剤; (c) 例えばグリセロールなどの保湿剤; (d) 例えば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプンもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種の複雑ケイ酸塩および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤; (a) 例えばパラフィンなどの溶解遅延剤; (f) 例えば第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤; (g) 例えばセチルアルコールおよびグリセロールモノステアレートなどの湿潤剤; (h) 例えばカオリンおよびベントナイトなどの吸着剤; ならびに(i) 例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、またはそれらの組み合わせなどの滑沢剤、と混合される。カプセルおよび錠剤の場合、剤形は緩衝剤も含みうる。同様のタイプの固体組成物は、ラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を用いて、軟質および硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤としても使用されうる。
【００５４】
錠剤、糖衣錠、カプセル、丸薬、および顆粒などの固体剤形は、腸溶コーティングおよび当技術分野において周知の他のものなどの、コーティングおよびシェルを用いて調製することができる。固体剤形は乳白剤も含みうる。さらに、固体剤形は、それらが腸管の特定の部分において遅れて活性化合物を放出するように、包埋組成物でありうる。使用できる包埋組成物の例は、重合体物質およびワックスである。活性化合物は、任意で1つまたは複数の賦形剤とともに、マイクロカプセル化された形態であることもできる。
【００５５】
経口投与用の液体剤形は、薬学的に許容される乳濁液、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシルを含む。活性化合物に加えて、液体剤形は、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、特に綿実油、落花生油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ種子油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールならびにソルビタンの脂肪酸エステル、またはこれらの物質の混合物などの、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤などの、当技術分野において一般的に用いられる不活性希釈剤を含みうる。
【００５６】
そのような不活性希釈剤に加えて、組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、ならびに芳香剤などの、補助剤を含むこともできる。懸濁液は、活性化合物に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム(aluminum metahydroxide)、ベントナイト、寒天、およびトラガカント、またはこれらの物質の混合物などの、懸濁化剤を含みうる。
【００５７】
直腸投与用の組成物は、好ましくは坐剤であり、これは、本開示の化合物を、通常の室温で固体であるが、体温では液体であり、それゆえ、直腸または膣腔で溶けて、活性成分を放出するカカオ脂、ポリエチレングリコールまたは坐剤ワックスなどの適当な非刺激性の腑形剤または担体と混合することによって調製することができる。
【００５８】
本明細書において開示される方法で用いられる組成物は、ミセルまたはリポソームに製剤化されうる。そのような製剤は、立体的に安定化されたミセルまたはリポソーム、および立体的に安定化された混合ミセルまたはリポソームを含む。リポソームおよびミセルの脂質二重層は細胞の原形質膜と融合し、閉じ込められた内容物を細胞内区画に送達することが知られているので、そのような製剤は細胞内送達を容易にすることができる。
【００５９】
製剤化時に、溶液は、剤形と適合性のある形で、および治療的に有効であるような量で投与されよう。製剤は、注射可能な溶液、薬物放出カプセルなどの種々の剤形で容易に投与される。例えば、水溶液中での非経口投与の場合、必要に応じて溶液を適当に緩衝化し、液体希釈剤を最初に十分な生理食塩水またはグルコースで等張にする必要がある。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。
【００６０】
投薬の頻度は薬剤の薬物動態パラメータおよび投与経路に依存するであろう。最適な薬学的製剤は、投与経路および所望の投与量に応じて当業者により決定されるであろう。例えば、参照により本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA, pages 1435-1712を参照されたい。そのような製剤は、投与された薬剤の物理的状態、安定性、インビボ放出の速度およびインビボクリアランスの速度に影響を与えうる。投与経路に応じて、体重、体表面積または臓器サイズにしたがい適当な用量が計算されうる。適切な処置用量を決定するために必要な計算のさらなる精緻化は、とりわけ本明細書において開示される投与量情報およびアッセイ法、ならびに動物またはヒトでの臨床試験で観察される薬物動態データに照らして、過度の実験なしに当業者によって日常的になされる。
【００６１】
利用される正確な投与量は、獣医学またはヒト医学のいずれにおいても、宿主、処置されている状態、例えば、疾患または障害の性質および重症度、投与方法ならびに利用される特定の活性物質を含むいくつかの要因に依存する。化合物は、任意の従来の経路によって、特に経腸的に、および1つの局面において、錠剤またはカプセルの形態で経口的に投与されうる。投与される化合物は、医薬として用いるために、特に関心対象の疾患の予防的または治癒的処置で用いるために、必要に応じて遊離形態または薬学的に許容される塩形態であることができる。これらの対策は、疾患状態の進行速度を遅くし、身体が自然な方法でプロセスの方向を反転させるのを補助する。
【００６２】
人体に対して実践される方法の特許を禁止する権限において、ヒト対象へ組成物を「投与すること」の意味は、ヒト対象が任意の技法(例えば、経口、吸入、局所適用、注射、挿入など)によって自己投与する規制物質を処方することに制限されるべきである。特許性のある事項を規定する法律または規則と一致する最も広範囲の合理的な解釈が、意図される。人体に対して実践される方法の特許を禁止しない権限において、組成物の「投与」は、人体に対して実践される方法および同様に前述の行為の両方を含む。
【００６３】
使用の方法
核酸を、本明細書において開示される有効量の化合物または塩と接触させる段階を含む、核酸を切断する方法が本明細書において開示される。場合によっては、核酸はRNAである。
【００６４】
場合によっては、核酸はmiR-96前駆体ヘアピンRNAである。場合によっては、化合物または塩は、式Iaの化合物:
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またはその塩である。
【００６５】
場合によっては、核酸はpre-miR-210前駆体ヘアピンRNAである。場合によっては、化合物または塩は式Iの化合物であり、式中、Lは
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である。
【００６６】
場合によっては、接触させる段階は細胞内で行われる。場合によっては、細胞はがん細胞である。場合によっては、がん細胞は乳がん細胞である。
【００６７】
本明細書において開示される治療的有効量の化合物または塩を、その必要性のある患者に投与する段階を含む、疾患または障害を処置する方法も提供される。場合によっては、疾患または障害はがんである。場合によっては、がんは乳がんである。場合によっては、乳がんは三種陰性乳がんである。
【００６８】
場合によっては、化合物または塩を投与することで、細胞内のアポトーシス促進性FOXO1転写因子が抑制解除される。場合によっては、アポトーシス促進性FOXO1転写因子の抑制解除は、乳がん細胞においてアポトーシスを誘発する。場合によっては、治療的有効量の化合物または塩は、乳がん細胞においてアポトーシスを誘発する。場合によっては、治療的有効量の化合物または塩は、健常な乳房細胞においてアポトーシスを誘発しない。場合によっては、治療的有効量の化合物または塩は、DNAに結合しないか、またはRNAに結合するよりも少なくとも5倍少なくDNAに結合する。場合によっては、治療的有効量の化合物または塩はDNAに結合しない。場合によっては、治療的有効量の化合物または塩は、RNAに結合するよりも少なくとも5倍少なくDNAに結合する。場合によっては、化合物は、RNAに結合するよりも少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍もしくは少なくとも10倍少なく、またはRNAに結合するよりも最大で50倍少なくDNAに結合する。
【００６９】
A2〜4-リンカー-Htの構造を有する化合物または薬学的に許容されるその塩と、RNAを接触させる段階を含む、RNAを切断する方法も本明細書において開示され、式中、Aはアデノシンであり、リンカーは、N、OおよびSから個別に選択される1〜20個のヘテロ原子が割り込んでいてもよい、5〜150個の炭素原子を含み、かつHtはRNA標的指向基である。場合によっては、Htは
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を含む。場合によっては、化合物または塩はA4-リンカー-Htを含む。
【００７０】
ENCODEプロジェクトによって、ゲノムの1〜2%しかタンパク質をコードしていないが、70〜80%はRNAに転写されることが示された。当然のことながら、非コードRNAは、タンパク質産生および遺伝子発現の調節ならびに免疫応答での機能を含めて、細胞生物学において無数の役割を果たす。細胞機能の重要な調節因子として、RNAの産生および破壊は厳密に制御されている。
【００７１】
タンパク質分解標的指向キメラ(Proteolysis targeting chimeras; PROTAC)は、小分子を用いることによる標的タンパク質分解の実証済みのアプローチである。RNA崩壊を媒介するための潜在的なアプローチは、RNAの寿命を自然に調節するリボヌクレアーゼ(RNase)を利用すること、および小分子またはリボヌクレアーゼ標的指向キメラ(RIBOTAC)を介して特定の転写産物にそれらを動員することである。抗ウイルス免疫応答の不可欠な部分であるRNアーゼLは、全ての細胞において不活性な単量体として微量に存在する。免疫系の活性化により、RNアーゼLが上方制御され、2'-5'オリゴアデニル酸[2'-5'ポリ(A)]が合成される; 2'-5'ポリ(A)の結合はRNアーゼLを二量体化かつ活性化する(図1A)。このシステムは遍在性のため、活性なRNアーゼLを特定のRNA標的にアセンブルしてそれを切断することは、アンチセンスと同様に、RNAおよび関連する活性をインビボで調節するための新しい戦略となる。
【００７２】
本発明者らは、小分子がヌクレアーゼを特定の転写産物に動員し、その破壊を誘発しうることを示す。発がん性miR-96ヘアピン前駆体に選択的に結合する小分子に、短い2'-5'ポリ(A)オリゴヌクレオチドを付加した。このコンジュゲートは、がん細胞においてmiR-96前駆体を選択的に切断した内因性の潜在性リボヌクレアーゼ(RNアーゼL)を局所的に活性化した。重要なことに、この化合物は細胞内で触媒的切断を示す。miR-96のサイレンシングにより、アポトーシス促進性FOXO1転写因子が抑制解除され、乳がんでのアポトーシスが誘発されたが、健康な乳房細胞では誘発されなかった。これらの結果は、小分子がRNAを選択的に切断するようにプログラムすることができ、広範囲にわたる影響を有することを示している。
【００７３】
計算研究によって、マイクロRNA-210ヘアピン前駆体を標的とする小分子Targapremir-210 (TGP-210)のデザインが可能とされた。マイクロRNAは、核内で一次転写産物(pri-miRNA)として最初に合成され、ヌクレアーゼDroshaにより切断されて前駆体マイクロRNAヘアピン(pre-miRNA)ができ、これは細胞質へ移行し、そこで細胞質ヌクレアーゼDicerがRNAを切断して成熟マイクロRNA (miRNA)を遊離させる(Bartel, 2004)。これらのmiRNA標的は、種々の疾患の場合で調節不全になっている。例えば、miR-210は、低酸素状態にある、または低酸素環境にある細胞において上方制御される。がん細胞が低酸素状態になると、細胞は細胞外マトリックスのリモデリングと移動性および転移性の増加に関連する挙動を示し始める。ヒトにおいて、転移性乳がんは、miR-210を介した液体細胞診によって検出することができる。
【００７４】
低酸素のがんにおいて、miR-210は、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ1様(GPD1L) mRNAを標的指向して、その翻訳を抑制することによって機能する。正常酸素圧の環境において、GPD1Lタンパク質はプロリルヒドロキシラーゼ(PHD)に結合して、低酸素誘導因子1-α(HIF1α)の過剰ヒドロキシル化を促進し、かくしてプロテアソームによるこのタンパク質のポリユビキチン化とその後の分解を媒介する(図10)。固形乳がん腫瘍におけるような、低酸素濃度で、miR-210はGPD1L mRNAを抑制し、これが次に、PHD活性を低下させ、細胞質HIF1βレベルを安定化させ、核内の低酸素誘導因子1-β(HIF1β)とのその二量体化を可能にし、活性なHIF1転写因子を形成して低酸素関連遺伝子をオンにする(図10)。miR-210はHIF1によって上方制御される遺伝子の一つであるため、過剰発現したmiR-210は正のフィードバックループを誘発して、miR-210の発現をさらに推進する。
【００７５】
小分子TGP-210は、pre-miR-210のDicer部位を標的指向し、そのDicerプロセッシングを阻害し、かくして成熟miR-210-3pの生合成を低下させる(図11)。このリード化合物は、GPD1L産生を増強してHIF1αの調節不全を引き起こすことにより、下流の低酸素プロセスを中断させ、低酸素細胞の場合のみアポトーシスを引き起こした。TGP-210化合物によって引き起こされるアポトーシスは、三種陰性乳がんマウスモデルでも腫瘍成長を阻害し、これはリード標的治療薬である。本研究において、本発明者らは、TGP-210小分子の活性を改善するために、標的指向的RNA分解アプローチを適用している(図11および12)。
【００７６】
マイクロRNA (miR)-96のDroshaエンドヌクレアーゼプロセッシング部位を標的とするRNA標的指向化合物は、Targaprimir-96 (1a)と称されることが確認された。この分子は、miR-96の生合成を選択的に阻害し、アポトーシス促進性転写因子FOXO1 (miR-96の標的)を抑制解除し、三種陰性乳がん細胞(MDA-MB-231)においてアポトーシスを選択的に誘発した。RNアーゼLを効果的に動員してmiR-96の一次転写産物(pri-miR-96)を切断できるかどうかを調べるために、1aのRNA標的指向部分と、RNアーゼL動員因子として機能する短い2'-5' A4オリゴヌクレオチドとの間の距離を変化させた(2〜4, 図1B)。インビトロの蛍光に基づくおよびゲル切断実験から、化合物がpri-miR-96の切断を誘発すること、および最短のスペーサー(2)が最も効果的であることが示された(図1C)。重要なことに、2の2'-5' A4成分の付加は、親化合物1a9 (Kd = 20 nM)と比較して、pri-miR-96のDrosha部位に対するその結合活性に有意な影響を与えず、完全に塩基対合したRNAに対して飽和結合は観察されなかった。
【００７７】
pri-miR-96レベルに及ぼす2の影響が、RNアーゼLの動員によるものであることを確認するために、一連の実験を完了した。細胞培養物に直接の、または強制的な細胞への取込み(トランスフェクション)による、2'-5' A4のみの添加は、pri-miR-96レベルに影響を与えなかった。これらの結果は、pri-miR-96の2による切断が、RNアーゼL経路の一般的な刺激とは対照的に、細胞内のpri-miR-96へのRNアーゼLの特異的な動員によるものであることを示唆している。さらに、2の添加はRNアーゼLのmRNAレベルに影響を与えなかった。pri-miR-96の同じ部位を標的とするが、RNアーゼLを動員しない、一定濃度の2および漸増濃度の化合物1aにより、細胞を同時処理した。pri-miR-96レベルに及ぼす同時処理の効果を、次いで測定した。予想通り、1aの添加は用量依存的にpri-miR-96切断レベルを低下させ(図2C)、2がRNアーゼLをpri-miR-96に向けて、その切断を誘導すること、および、動員しない化合物で競合的に効果を除く(compete off)ことができることを示した。RNアーゼL−2−pri-miR-96の三元複合体が形成されることを検証するために、RNアーゼLを、2または2'-5' A4で処理した細胞から免疫沈降させた。2'-5' A4で処理した細胞と比較して、2で処理した細胞ではpri-miR-96転写産物のおよそ2倍の増強が観察された(ともにβ-アクチンのバックグラウンドプルダウンに対して正規化された; 図2D)。実際、pri-miR-210はプルダウンされないため、2はpri-miR-96との三元複合体の形成に選択的である(2'-5' A4または2によって活性化されたRNアーゼLに結合したRNAは、RT-qPCRによって測定された場合に、pri-miR-210転写産物の濃縮を示さない。2の断片にはmiR-210ヘアピン前駆体に結合できるRNA結合モジュールが含まれているため、pri-miR-210転写産物が選択された。)。
【００７８】
次に、pri-miR-96への2によるRNアーゼLの選択的動員が細胞内で機能しているかどうかを調べた。オリゴヌクレオチドは一般に細胞透過性ではないため、2の細胞透過性をフローサイトメトリーにより測定した。2'-5' A4の結合は、1aと比較して2の透過性を50%低減させたが、それでも補助なしにかなりの量で細胞に入った。RNアーゼLの分布は主にサイトゾルであるが、核画分のRNアーゼLも観察された。
【００７９】
それゆえ、2がRNアーゼLを核内のpri-miR-96に動員する場合、pri-miR-96と成熟miR-96の両方のレベルの低減が予想される。実際、miR-96を過剰発現するMDA-MB-231細胞(図2A〜B)では両方のレベルが低減した。これらの結果は、miR-96を発現する他のがん細胞株で再現され、幅広い適用性を示唆するものであった。対照的に、1aの添加は、予想通り、pri-miR-96の量を増加させ、成熟miR-96のレベルを低減させた(図2A〜B)。これは、この化合物がDroshaエンドヌクレアーゼによる切断を阻害するためである。重要なことに、これらの結果は、標準的なプロセッシング酵素以外の酵素によるmiRNAの切断が、miRNAをRNA崩壊経路に向けることを示している。つまり、RNアーゼLによる切断は、成熟miRNAの増加をもたらす代替Droshaエンドヌクレアーゼとして作用するのではなく、pri-miRNAを分解して成熟miRNAの減少を引き起こす。
【００８０】
インビトロでの、2'-5' A4を伴う2による、RNアーゼLの動員を評価した。天然の基質である2'-5' A4と比較して、化合物2はRNアーゼLを同じ濃度で50%低いレベルでその活性オリゴマー種へとアセンブルさせた(図1D)。次に、pri-miR-96を切断するこれらの化合物の能力をインビトロで研究した。RNアーゼLの好ましい切断部位と一致して、2'-5' A4のみを付加した場合に1つの主要な切断部位が観察された(U12, Drosha部位。RNアーゼLのみでは有意な切断を引き起こさなかった。
【００８１】
興味深いことに、親化合物を添加しても、RNアーゼLによる切断量は変化しなかった。むしろ、主要な切断部位はU35になり、親化合物がデザイン通りにDrosha部位に結合することによって切断をブロックし、RNアーゼLに対する阻害活性がなかったことを示している。2を用いた類似の実験により、それがRNアーゼLを効果的に活性化し、酵素をpri-miR-96からU12、つまり2'-5' A4について観察される主要な切断部位に動員したことが明らかにされた。さらに、予想通り、親化合物(1a)の添加により、U12での切断が阻害された。2'-5' A4とは対照的に、Drosha部位のみに対する親和性をもたらす小分子は、2がRNアーゼLを他の部位、すなわち2'-5' A4の場合はU35、に動員させず、2が選択的であることを示唆していた。この所見は、漸増濃度のtRNAの存在下でのpri-miR-96の切断を研究することによってさらに強化された。実際、tRNAの添加は、2'-5' A4によるpri-miR-96の切断を、2によるpri-miR-96の切断よりも有意に阻害した。
【００８２】
次に、RNアーゼLを、siRNAを用いることによってノックダウンした。これは、2の活性を低減させるはずである。スクランブルsiRNAではなく、RNアーゼLに対するsiRNAで処理された細胞では、pri-miR-96切断活性を測定することによって決定された場合、2の活性は、処理なしで観察されたレベルまで低減した(図2E)。逆に、RNアーゼLの強制発現は2の切断活性を増強し、pri-miR-96の強制発現は切断活性を低下させた(図2F)。これらの機能獲得および機能喪失実験は、2が細胞内のRNアーゼLの動員を通じて特定のRNA転写産物を切断するという主張をさらに支持する。重要なことに、2が細胞に曝露され、2の細胞画分が単離され分析された。これらの結果は、2が細胞内で安定であることを示している。それゆえ、pri-miR-96の切断は2'-5' A4および1aの別々の効果によるのではなく、2のキメラ特性によって行われた。
【００８３】
次に、pri-miR-96への2によるRNアーゼLの選択的動員が細胞内で機能しているかどうかを決定した。オリゴヌクレオチドは一般に細胞透過性ではないため、2の細胞透過性をフローサイトメトリーにより測定した。2'-5' A4の結合は、1aと比較して2の透過性を50%低減させたが、それでも補助なしにかなりの量で細胞に入った。RNアーゼLの分布は主にサイトゾルであるが、核画分のRNアーゼLも観察された。それゆえ、2がRNアーゼLを核内のpri-miR-96に動員する場合、pri-miR-96と成熟miR-96の両方のレベルの低減が予想される。実際、miR-96を過剰発現するMDA-MB-231細胞(図2A〜B)では両方のレベルが低減した。これらの結果は、miR-96を発現する他のがん細胞株で再現され、幅広い適用性を示唆するものであった。対照的に、1aの添加は、予想通り、pri-miR-96の量を増加させ、成熟miR-96のレベルを低減させた(図2A〜B)。これは、この化合物がDroshaエンドヌクレアーゼによる切断を阻害するためである。重要なことに、これらの結果は、標準的なプロセッシング酵素以外の酵素によるmiRNAの切断が、miRNAをRNA崩壊経路に向けることを示している。つまり、RNアーゼLによる切断は、成熟miRNAの増加をもたらす代替Droshaエンドヌクレアーゼとして作用するのではなく、pri-miRNAを分解し、成熟miRNAの減少を引き起こす。
【００８４】
pri-miR-96レベルに及ぼす2の影響が、RNアーゼLの動員によるものであることを確認するために、一連の実験を完了した。細胞培養物に直接の、または強制的な細胞への取込み(トランスフェクション)による、2'-5' A4のみの添加は、pri-miR-96レベルに影響を与えなかった。これらの結果は、pri-miR-96の2による切断が、RNアーゼL経路の一般的な刺激とは対照的に、細胞内のpri-miR-96へのRNアーゼLの特異的な動員によるものであることを示唆している。さらに、2の添加はRNアーゼLのmRNAレベルに影響を与えなかった。pri-miR-96の同じ部位を標的とするが、RNアーゼLを動員しない、一定濃度の2および漸増濃度の化合物1aにより、細胞を同時処理した。pri-miR-96レベルに及ぼす同時処理の効果を次に、測定した。予想通り、1aの添加は用量依存的にpri-miR-96切断レベルを低下させ(図2C)、2がRNアーゼLをpri-miR-96に向けて、その切断を誘導すること、および、動員しない化合物で競合的に効果を除くことができることを示した。RNアーゼL−2−pri-miR-96の三元複合体が形成されることを検証するために、RNアーゼLを2または2'-5' A4で処理した細胞から免疫沈降させた。2'-5' A4で処理した細胞と比較して、2で処理した細胞ではpri-miR-96転写産物のおよそ2倍の増強が観察された(ともにβ-アクチンのバックグラウンドプルダウンに対して正規化された; 図2D)。実際、pri-miR-210はプルダウンされないため、2はpri-miR-96との三元複合体の形成に選択的である。
【００８５】
次に、RNアーゼLを、siRNAを用いることによってノックダウンした。これは、2の活性を低減するはずである。スクランブルsiRNAではなく、RNアーゼLに対するsiRNAで処理された細胞では、pri-miR-96切断活性を測定することによって決定された場合、2の活性は、処理なしで観察されたレベルまで低減した(図2E)。逆に、RNアーゼLの強制発現は2の切断活性を増強し、pri-miR-96の強制発現は切断活性を低下させた(図2F)。これらの機能獲得および機能喪失実験は、2が細胞内のRNアーゼLの動員を通じて特定のRNA転写産物を切断するという主張をさらに支持する。重要なことに、2が細胞に曝露され、2の細胞画分が単離され分析された。これらの結果は、2が細胞内で安定であることを示している。それゆえ、pri-miR-96の切断は2'-5' A4および1aの別々の効果によるのではなく、2のキメラ特性によって行われた。
【００８６】
miR-96のレベルの上昇は、アポトーシス促進性Bcl-xlタンパク質の転写に必要なアポトーシス促進性転写因子であるフォークヘッドボックスタンパク質O1 (FOXO1)の抑制により、さまざまながんの浸潤性表現型に寄与する。MDA-MB-231細胞に2 (200 nM)を添加すると、FOXO1の発現がおよそ2倍増加したが、miR-96によって調節されないタンパク質には影響しなかった(図3A)。FOXO1 mRNAはmiR-182、miR-27a、およびmiR-96によって調節されるが、以前の研究では、miR-96の阻害だけでFOXO1の発現を増強するのに十分であることが示されている。重要なことに、2はmiR-27a、miR-182、またはTargetScanによってFOXO1 mRNAを調節すると予測される他のmiRNAのレベルに影響を与えなかったこと(図3B)から、FOXO1タンパク質発現の増加がmiR-96の阻害によって媒介されることが裏付けられる。選択性をさらに研究するために、本発明者らは、MDA-MB-231細胞における全ての測定可能な成熟miRNAレベルに及ぼす2の効果を評価し、その中で最も有意に阻害されたのは、miR-96 (p<0.01)であった(図3C)。FOXO1はアポトーシス促進性であるため、miR-96の阻害によるその細胞発現の抑制解除はアポトーシスを誘発するはずである。20 nMと200 nMの両方で、2はMDA-MB-231細胞において有意なアポトーシスを誘導し、アポトーシスを誘発する2の能力は、pri-miR-96の強制発現により取り除かれる(図3D)。特に、有効濃度での、2'-5' A4単独の直接的な処理またはトランスフェクションは、RNアーゼL監視システムの全体的な活性化時に観察されるアポトーシスを有意に誘導しない(図3D)。さらに、2は健常な乳房上皮細胞(MCF10a)においてアポトーシスを誘導しなかった。したがって、2は高レベルのmiR-96を発現する細胞の生態に影響を与える精密な化学的プローブ(precision chemical probe)である。特に、2は1aと同程度に、しかし2.5倍低い用量でアポトーシスを刺激する。2が1aの半分の量で取り込まれるとすると、RNアーゼLの動員により活性が少なくとも5倍増強する。
【００８７】
細胞内のpri-miR-96を触媒的に切断する2の可能性が存在するため、この可能性を研究した。細胞のpri-miR-96の絶対レベルを、RT-qPCR定量化によって測定し、細胞内の2の量と比較した。これらの研究により、1モルの2が平均して3.1モルのpri-miR-96を切断することが示された。3.1という代謝回転は、PROTACのインビトロ触媒作用に関する以前の研究とよく一致している。
【００８８】
したがって、切断は、細胞内の標的指向された動員によって触媒的に起こりうる。
【００８９】
要約すると、内因性リボヌクレアーゼ(RIBOTAC)を動員し、アンチセンスおよびCRISPRに類似した切断を誘導することにより、RNAの寿命に影響を及ぼす能力を小分子に与えるシステムが本明細書において提供される。ヌクレアーゼをカスタム動員する能力は、実行可能な小分子標的としてのRNAの視野を広げる可能性が高く、そのような類似点は、PROTACを化学的プローブおよびリード医薬として活用する活動と類似させることができる。さらなる努力には、動員できるヌクレアーゼを広げること、また、動員部分を医学的に最適化することが含まれよう。
【００９０】
TGP-210-RL研究
以前に、RNA結合小分子への短い2'-5'結合オリゴアデニル酸ユニット(2'-5' A)の結合によって、潜在的リボヌクレアーゼ(RNアーゼL)の局所標的指向動員が可能になり、小分子が結合する、細胞内のRNAを切断することが示された。RNアーゼLはインターフェロン誘導性エンドヌクレアーゼであり、これは2'-5' Aにより活性化されると、ウイルス感染に応答してRNAを切断する。2'-5' An (n = 2〜4)のさまざまなユニットをTGP-210に結合させ、蛍光インビトロ切断アッセイ法を用いて、pre-miR-210を切断するこれらの化合物の能力を試験した(図12および13)。これらの研究により、2'-5' A4に連結されているTGP-210 (これまではTGP-210-RLと名付けられていた)が最も強力な切断効果を有することが示された(図13)。二量体および三量体の2'-5'オリゴアデニル酸が付加されたTGP-210誘導体では、非常に限られた切断活性が観察された(図13)。細胞内に不活性な単量体型で存在するRNアーゼLの活性化は、2'-5' Aに結合することによるそのオリゴマー化時にのみ行われるため、TGP-210-RLを、RNアーゼLを活性化するその能力について試験した。RNアーゼLのインビトロ架橋研究により、TGP-210-RLによるRNアーゼLの用量応答性のオリゴマー化が示されたが、TGP-210処理ではそうでなかった(図15A)。
【００９１】
親TGP-210化合物は、pre-miR-210のDicer部位に対して5倍の選択性ウィンドウでDNAに結合することが知られている(DNAに対するKdは620 nMであるが、pre-miR-210模倣体に対するKdは160 nMである) (図14および15B〜D)。2'-5' A4ヌクレアーゼ動員モジュールを加えることの結合結果を研究するために、TGP-210-RLを用いて、これらの標的に対しマイクロスケール熱泳動(MST)によって結合親和性を測定した。これらの研究において、pre-miR-210模倣体に対する親和性は、190 nMのKdを有するTGP-210と比べてやや弱い(図14および15B)。TGP-210-RLのDNAへの結合は、選択性のウィンドウが10倍にまで増加し、1200 nMのKdで行われた(図14)。TGP-210-RLは、塩基対に対してDicer部位を変異させたRNAには結合せず、選択的結合をさらに実証するものであった(図14および15C)。ヘテロ二機能性からの報告以来、PROTACは、三元複合体形成(標的:PROTAC:リガーゼ)が活性にとって重要であること、およびPROTACはその各タンパク質結合モジュールよりも高い選択性を持ちうることが示されており、pre-miR-210およびDNAに対するTGP-210-RLの結合親和性を、RNアーゼLの存在下で測定した。これらの研究により、TGP-210-RLが、pre-miR-210に対して340 nMのKdでRNAへの選択的結合を維持したが、測定可能な結合がなくDNA結合は完全に取り除かれたことが示された(図14および15D)。したがって、動員因子を加えることで、RNAを標的とした小分子のインビトロでの結合選択性が増強された。実際、TGP-210-RLの結合およびRNアーゼLの動員により、ゲルで観察されるようにpre-miR-210のインビトロ切断が可能とされた(図15E)。三元複合体の生物物理学的特性は、標的タンパク質分解因子の分析で示されているように、生物活性に影響を与えるように調整するのに極めて重要である。
【００９２】
次に、化合物TGP-210-RLを細胞透過性について試験した。この分子は自由に細胞透過性であり、フローサイトメトリーにより測定された場合、短いオリゴヌクレオチドを有するにもかかわらず、親化合物TGP-210と比べて60%の量で細胞に侵入した(図16A)。さらに、共焦点顕微鏡検査を完了したところ、親TGP-210化合物の固有の蛍光は主に核に局在化したが、TGP-210-RLからのシグナルは細胞質に局在化した(図16B)。他の短い長さの細胞透過性修飾オリゴヌクレオチドと同様に、TGP-210-RL小分子-オリゴアデニル酸コンジュゲートの有意な細胞取込みが観察された。DNAオフターゲットはもっぱら核にあるが、RNAであるpre-miR-210はもっぱら細胞質にある。さらに、RNアーゼLは集密な細胞の細胞質に主に局在化している。まとめると、結合親和性と局在化実験の両方により、RNアーゼL動員モジュールを加えることでpre-miR-210を標的とするキメラの特性が増強されたことが示唆される。
【００９３】
化合物の細胞への効果を評価するために、TGP-210、TGP-210-RLおよび2'-5 A4を、低酸素MDA-MB-231細胞におけるmiR-210レベルに影響を与えるか試験した。TGP-210とTGP-210-RLの両方が、予想通り、成熟したmiR-210のレベルを低下させた。pre-miR-210レベルの増加がTGP-210処理で観察され、これは、化合物が細胞内でのこのRNAのDicerによるプロセッシングを阻害するためと予想される。対照的に、TGP-210-RLはmiR-210とpre-miR-210の両方のレベルを低下させ、この化合物がpre-miR-210標的転写産物を能動的に切断する場合、これらの結果が予想される。4ユニットの2'-5' Aと連結されたTGP-210のみが、インビトロでの結果と同様に、細胞における切断を引き起こした(図16C)。2'-5' A4化合物を加えることでは、試験したどの濃度でもmiR-210およびpre-miR-210に及ぼす有意な効果は起こらず、以前に観察されているように、単一の化合物TGP-210-RLについてRNA結合因子とRNアーゼL動員因子とを有する場合に切断が特異的であることを示すものであった(図16D)。
【００９４】
TGP-210-RLのpre-miR-210切断能力がRNアーゼLに特異的であるかどうかを調べるために、一連の対照実験を完了した。第一に、細胞を一定濃度のTGP-210-RLおよび漸増量のTGP-210で同時に処理して、pre-miR-210標的に結合させ、ヌクレアーゼ動員因子を競合的に除いた。これらの実験では、特定の切断用キメラと親化合物とがpre-miR-210の同じ結合部位の占有をめぐって競合するため、TGP-210の添加によって、pre-miR-210の切断の減少が引き起こされた。第二に、RNアーゼLを細胞にトランスフェクションし、続いてTGP-210-RLで処理すると、化合物の切断能力が増強したが、pre-miR-210標的を過剰発現するプラスミドをトランスフェクションすると化合物の切断能力が低下した。これらの機能獲得および機能喪失実験は、TGP-210-RLによって引き起こされる切断の、RNアーゼL依存性およびpre-miR-210選択性を示している。第三に、対照siRNAではなく、RNアーゼLの標的指向siRNAによる除去は、TGP-210-RLによるpre-miR-210の切断を減少させた。これらの研究により、TGP-210-RLがRNアーゼLの標的への標的指向動員を介してpre-miR-210を特異的に切断することが実証された。
【００９５】
TGP-210-RLが物理的に相互作用し、細胞内でRNアーゼLおよびpre-miR-210と三元複合体を形成するかどうかを測定するために、抗RNアーゼL抗体を用いることにより免疫共沈降実験を完了した。これらの実験では、免疫沈降を完了し、pre-miR-210を検出するためのプライマーを用いたRT-qPCRに、プルダウンされた画分を供した。RNアーゼLプルダウン画分におけるpre-miR-210の濃縮は、TGP-210-RLを細胞に適用した場合にのみ観察されたが、高度に発現した対照マイクロRNAヘアピン前駆体転写産物pre-miR-21には濃縮が認められなかった。さらに、予想通り、2'-5' A4処理ではpre-miR-210の濃縮が観察されなかった。
【００９６】
TGP-210-RL化合物は、pre-miR-210を触媒的および準化学量論的に切断する。TGP-210-RLの固有の蛍光および定量的RT-qPCRを用いて、TGP-210-RLの分子数、およびTGP-210-RLによって切断されたpre-miR-210のコピー数を細胞内で測定した(表S1, 以下)。これらの分析は、TGP-210-RLが、細胞内で24時間の処理後、TGP-210-RLの各分子あたり9.7±1.9個の分子のpre-miR-210を準化学量論的に切断したことを実証している。
【００９７】
（表Ｓ１）24時間の処理後のTGP-210-RL触媒活性の測定。データは平均±標準偏差(s.d.)として表されている(n = 6)。
2021521831.tif 000017
「切断されたpre-miR-210」は、未処理サンプルにおける平均のpre-miR-210と、500 nMで処理されたサンプルにおける平均のpre-miR-210との差異である。
b「代謝回転」は、細胞内の「切断されたpre-miR-210 (pmol)」と「TGP-210-RL検出(pmol)」との比率であり、触媒作用を表す。
【００９８】
次に、TGP-210-RLの特異性を、qPCRプロファイリングを介して広く研究し、MBD-MB-231細胞内の全ての検出可能なmiRNAに及ぼすその効果を研究した。370種を超える検出可能なmiRNAの中で、最も有意に阻害されたのはmiR-210であり、pre-miR-210に結合し、RNアーゼLを局所的に動員する小分子が選択的であることを実証している。他の低酸素関連miRNAおよびpre-miR-210RNAアイソフォーム、またはpre-miR-210と同様の構造を有するRNAに及ぼすTGP-210-RLの有意な効果は観察されなかった。pre-miR-210は最終的にGPD1L、したがってHIF1αレベルに影響を与えるため、それらのmRNA転写産物レベルを24時間および48時間の処理後にRT-qPCRによって測定した。予想通り、TGP-210-RL処理により、GPD1L mRNAの存在量は大幅に抑制解除され、HIF1α mRNAは大幅に減少したが、ただし処理48時間後のみであった。同じ結果が、TGP-210およびmiR-210アンチセンスオリゴヌクレオチド処理によるmiR-210阻害で以前に観察された。
【００９９】
アポトーシスによる間接的な影響の測定を回避するため、低酸素状態での化合物処理24時間後に、TGP-210-RLの選択性をさらに研究するために、全RNA-Seqを実行した。全体として、トランスクリプトームへの大きな変化は観察されず、化合物の有意なオフターゲット効果がないことを示すものであった。次いで、予測されたmiR-210-3p標的の変化倍率を照会して、pre-miR-210の分解に及ぼすオンターゲット効果を研究した。miR-210-3p標的のうち、73%が媒体対照と比べて、化合物処理に応答して上方制御され、miR-210-3pを抑制する化合物のオンターゲット効果を示すものであった。比較すると、対照miRNAの予測される標的miR-23-3pおよびmiR-107は、どちらも高度に発現される低酸素関連miRNAであり、二項分布にしがたい、上方制御された標的にバイアスは観察されず、それぞれ、58%および57%の標的の上方制御を示した(図17CおよびD)。miRNAを標的とする小分子を用いた以前のRNA-Seq研究でも同様に、トランスクリプトームに及ぼす限定的なオフターゲット効果が実証されたが、劇的な下流の生物学的影響および表現型を引き起こした。
【０１００】
次に、表現型に及ぼすTGP-210-RLの効果を測定した。陽性および陰性対照として機能するために、TGP-210およびTGP-210-RLに加えて、miR-210を標的とするロックド核酸(LNA)オリゴヌクレオチド(LNA-210)およびスクランブル対照(Scr-LNA)を研究した。これらの研究により、カスパーゼ活性の増加によって測定された場合、Scr-LNAは不活性であったが、LNA-210はアポトーシス刺激を引き起こすことが示された。TGP-210とTGP-210-RLとの間のアポトーシスの効果は類似していたが、TGP-210-RLは500 nMで、LNA-210の活性に匹敵する、いっそう高い活性を示した。TGP-210-RLがTGP-210の量の約50%で細胞に入ることを考えると、ヌクレアーゼ動員は化合物の活性を少なくとも2倍増強する。しかしながら、標的指向RNA分解因子と結合因子との間の重要な概要説明の1つは、pre-miRNAが前者の場合には浸透性ではないが、後者の場合には浸透性であるということである。対照として、これらの同じ実験を、miR-210過剰発現バックグラウンドで完了し、化合物誘導性のアポトーシスがmiR-210を介して媒介されたかどうかを決定した。実際、miR-210の過剰発現により、miR-210を標的とする化合物(LNA-210、TGP-210、およびTGP-210-RL)はアポトーシスをもはや刺激せず、アポトーシスがmiR-210の阻害によるものであるという仮説をさらに支持するものであった。正常酸素圧条件の下で、miR-210は細胞内で過剰発現されず、それゆえ、正常酸素圧でのアポトーシスに及ぼす化合物の効果を測定した。細胞がより低レベルのmiR-210を発現する場合に予想される通り、正常酸素圧条件下での化合物処理ではアポトーシスの有意な増加は観察されなかった(図17E)。したがって、小分子標的分解因子は、miR-210のリード標的指向治療薬である。
【０１０１】
本明細書において記述される化合物(例えば、式I、式Iaおよび表Aの化合物、ならびに薬学的に許容されるその塩)は、核酸に結合することができる。いくつかの態様において、化合物はRNAに結合し、例えば、化合物は、遺伝子発現などのRNA媒介生物活性を、誘発または阻害する。さまざまな態様において、化合物はRNA調節因子であり、例えば、化合物は、RNAの生物活性の1つまたは複数を変化させ、阻害し、または抑止する。
【０１０２】
疾患および障害、例えば、がんを処置するための医薬の調製における、本明細書において開示される化合物の使用も、本明細書において提供される。
【０１０３】
本明細書における開示は、以下の実施例を参照することによってさらに容易に理解されるであろう。
【実施例】
【０１０４】
ハイスループット時間分解蛍光共鳴エネルギー移動(TR-FRET)スクリーニング
一般的な合成方法
化学物質
化学物質は以下の商業的供給元: 2-クロロトリチルクロリド樹脂(負荷= 1.1 meq/g)、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)およびシアノ(ヒドロキシイミノ)酢酸エチル(オキシマ(Oxyma))はChem-Impex Int’l Inc.から; 1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(HOAt)はAdvanced Chem Techから; 1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスフェート(HATU)はOakwood Chemicalから; 1-プロピルアミンはAlfa Aesarから; プロパルギルアミン、トリフルオロ酢酸(TFA)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)および2-ブロモ酢酸はSigma Aldrichから; オリゴヌクレオチド5 (リチウム塩)はChemGenesからHPLC精製あり、で; ならびにN,N-ジメチルホルムアミド(DMF, 無水)およびジメチルスルホキシド(DMSO, 無水)はEMDから調達され、さらなる精製なしで用いた。
【０１０５】
安定な銅(I)触媒、3 Ht-COOH、4 Ht-N3,4および1a2は、既報のように合成された。
【０１０６】
一般
ペプチド合成反応は、クロラニル試験によってモニタリングされた。質量分析はApplied Biosystems MALDI TOF/TOF Analyzer 4800 Plusで、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸マトリックス(1b、2a、3a、3b、4aおよび4bの陽イオンモードでは; 2、3および4の陰イオンモードでは)を用いて実施された。
【０１０７】
1b、2a、3a、3b、4aおよび4bの化合物精製および分析
分取HPLCは、Waters2487デュアル吸光度検出器システムおよびWaters Sunfire C18 OBD 5 μm, 19×150 mmカラムを備えたWaters 1525 Binary HPLCポンプを用いて実施された。吸光度は254および220 nmでモニタリングされた。小分子精製の場合、60分にわたる、0.1% TFAを有する水中、0から100%メタノールまでの流速5 mL/分による直線勾配が用いられた。純度は、Waters Symmetry C18 5 μm, 4.6×150 mmカラムを用い、流速1 mL/分、および60分にわたる、0.1% TFAを有する水中、0から100%メタノールまでの直線勾配で分析HPLCにより評価された。吸光度は254および220 nmでモニタリングされた。
【０１０８】
2、3および4の化合物精製、濃縮および分析
分取HPLCは、Waters2487デュアル吸光度検出器システムおよびWaters Symmetry C18 5 μm, 4.6×150 mmカラムを備えたWaters 1525 Binary HPLCポンプを用いて実施された。吸光度は254および345 nmでモニタリングされた。60分(2の場合)または70分(3および4の場合)にわたる、緩衝液B (水中50 mMの酢酸トリエチルアンモニウム)中、0%から100%緩衝液A [水/アセトニトリル, 50/50 (v/v)中50 mMの酢酸トリエチルアンモニウム]までの流速1 mL/分による直線勾配が用いられた。収集された画分を蒸発させ、化合物を水に溶解した。濃度は、5の分子吸光係数(260 nmで51400 M-1 cm-1)を用いて1×PBS中で決定された。純度は、Waters Symmetry C18 5 μm, 4.6×150 mmカラムを用いて分析HPLCにより評価された。小分子は、30分にわたる、緩衝液B中、0%から100%緩衝液A、その後10分間100%緩衝液Aの流速1 mL/分による直線勾配を用いて分析された。吸光度は254および345 nmでモニタリングされた。
【０１０９】
合成実験手順
1bの合成
図4を参照されたい。2-クロロトリチルクロリド樹脂(555 mg, 0.61 mmol)のジクロロメタン(DCM; 3 mL)懸濁液に、ジオキサン(1 mL)中の4 N HClを添加し、この混合物を室温で30分間振盪した。樹脂をDMF (3×3 mL)およびDCM (3×3 mL)で洗浄した。次いで樹脂に、DCM中の1 Mブロモ酢酸(3 mL)およびDIEA (519 μL, 3.0 mmol)を添加した。混合物を室温で2時間振盪し、樹脂をDCM (3×3 mL)およびDMF (3×3 mL)で洗浄した。次に、DMF 3 mLおよびプロパルギルアミン(384 μL, 6.0 mmol)を添加した。混合物を室温で1時間振盪し、樹脂をDCM (3×3 mL)およびDMF (3×3 mL)で洗浄し、続いてDMF中1 Mのブロモ酢酸(3 mL)、Oxyma (426 mg, 3.0 mmol)およびDIC (462 μL, 3.0 mmol)の添加を行った。混合物を室温で2時間振盪し、樹脂をDCM (3×3 mL)およびDMF (3×3 mL)で洗浄した。樹脂にDMF (3 mL)およびプロピルアミン(492 μL, 6.0 mmol)を添加した。この混合物を室温で1時間振盪し、樹脂をDCM (3×3 mL)およびDMF (3×3 mL)で洗浄した。このサイクルをさらに繰り返した。次いで樹脂に、Oxyma (170 mg, 1.2 mmol)、DIC (185 μL, 1.2 mmol)、DIEA (313 μL, 1.8 mmol)およびHt-COOH (450 mg, 0.88 mmol)のDMF (3 mL)混合物を添加した。この混合物を室温で2時間振盪し、樹脂をDCM (3×3 mL)およびDMF (3×3 mL)で洗浄した。DCM (2 mL)中30%のTFAの添加により化合物を樹脂から放出し、混合物を室温で30分間振盪した。混合物をろ過し、ろ液を蒸発させた。残留物にジエチルエーテル(Et2O)を添加し、沈殿物を収集した。収集した粉末を、一般的な合成方法のセクションに記述されているように逆相HPLCを用い精製して、2a (275 mg, 収率56%; C44H54N9O6 計算質量: 804.4197 (M + H) +; 実測値: 804.3752)を得た。
【０１１０】
2a (270 mg, 0.34 mmol)に安定な銅(I)触媒(12 mg, 0.020 mmol)、Ht-N3 (235 mg, 0.40 mmol)、DIEA (600 μL, 3.4 mmol)およびDMSO (2 mL)を添加した。反応混合物を60℃で2時間撹拌した。次いで反応混合物にアセトニトリル(10 mL)を添加し、沈殿物をろ過した。収集した粉末にメタノール(MeOH) 10 mLを添加し、混合物をろ紙でろ過した。ろ液を蒸発させ、残留粉末をアセトニトリルで洗浄して、1bを淡黄色粉末として得た(91 mg, 0.065 mmol, 収率22%)。一般的な合成方法のセクションに記述されているように、逆相HPLCを用いて1bの一部を精製した。C77H102N17O8計算質量: 1392.8089 (M + H) +; 実測値: 1392.7115。
【０１１１】
3bの合成
図5を参照されたい。2-クロロトリチルクロリド樹脂(200 mg, 0.22 mmol)のDCM (0.9 mL)懸濁液に、ジオキサン(0.3 mL)中の4 N HClを添加し、この混合物を室温で30分間振盪した。樹脂をDMF (3×3 mL)およびDCM (3×3 mL)で洗浄した。次いで樹脂に、DCM中の1 Mブロモ酢酸(1.1 mL)およびDIEA (190 μL, 1.1 mmol)を添加した。混合物を室温で2時間振盪し、樹脂をDCM (3×3 mL)およびDMF (3×3 mL)で洗浄した。次に、DMF 1 mLおよびプロピルアミン(180 μL, 2.2 mmol)を添加し、この混合物を室温で1時間振盪した。樹脂をDCM (3×3 mL)およびDMF (3×3 mL)で洗浄した後に、DMF中の1 Mブロモ酢酸(1.1 mL)、Oxyma (156 mg, 1.1 mmol)およびDIC (169 μL, 1.1 mmol)を樹脂に添加した。混合物を室温で2時間振盪し、樹脂をDCM (3×3 mL)およびDMF (3×3 mL)で洗浄した。このサイクルをさらに2回繰り返した。次いで樹脂にDMF 1.1 mLおよびプロパルギルアミン(141 μL, 2.2 mmol)を添加した。この混合物を室温で1時間振盪し、樹脂をDCM (3×3 mL)およびDMF (3×3 mL)で洗浄した。その後、樹脂にDMF中1 Mのブロモ酢酸(1.1 mL)、Oxyma (156 mg, 1.1 mmol)およびDIC (169 μL, 1.1 mmol)を添加した。この混合物を室温で2時間振盪し、樹脂をDCM (3×3 mL)およびDMF (3×3 mL)で洗浄した。洗浄後、DMF 1.1 mLおよびプロピルアミン(180 μL, 2.2 mmol)を添加し、この混合物を室温で1時間振盪した後、さらに洗浄(DCM, 3×3 mLおよびDMF, 3×3 mL)を行った。このサイクルをさらに繰り返した。次いで樹脂に、Oxyma (85 mg, 0.6 mmol)、DIC (93 μL, 0.6 mmol)、DIEA (156 μL, 0.9 mmol)およびHt-COOH (225 mg, 0.45 mmol)のDMF (1.1 mL)混合物を添加した。この混合物を室温で2時間振盪し、樹脂をDCM (3×3 mL)およびDMF (3×3 mL)で洗浄した。次いで樹脂に、DCM (2 mL)中30%のTFAを添加し、この混合物を室温で30分間振盪した。混合物をろ過し、ろ液を蒸発させた。残留物にEt2Oを添加し、沈殿物を収集した。収集した粉末を、一般的な合成方法のセクションに記述されているように逆相HPLCを用い精製して、3a (88 mg; 収率36%; C59H81N12O9 計算質量: 1101.6249 (M + H) +; 実測値: 1101.4913を得た。
【０１１２】
3a (80 mg, 0.072 mmol)に安定な銅(I)触媒(6 mg, 0.010 mmol)、Ht-N3 (51 mg, 0.087 mmol)、DIEA (125 μL, 0.72 mmol)およびDMSO (1 mL)を添加した。反応混合物を60℃で6時間撹拌した。次いで反応混合物にアセトニトリル(10 mL)を添加し、沈殿物をろ過した。収集した粉末にMeOHを添加し、混合物をろ紙でろ過した。ろ液を蒸発させ、残留粉末をアセトニトリルで洗浄して、3bを黄色粉末として得た(37 mg, 0.021 mmol, 収率30%)。一般的な合成方法のセクションに記述されているように、逆相HPLCを用いて3bの一部を精製した。C92H129N20O11計算質量: 1690.0150 (M + H) +; 実測値1689.9568。
【０１１３】
4bの合成
図6を参照されたい。2-クロロトリチルクロリド樹脂(200 mg, 0.22 mmol)のDCM (0.9 mL)懸濁液に、ジオキサン(0.3 mL)中の4 N HClを添加し、この混合物を室温で30分間振盪した。樹脂をDMF (3×3 mL)およびDCM (3×3 mL)で洗浄した。次いで樹脂に、DCM中の1 Mブロモ酢酸(1.1 mL)およびDIEA (190 μL, 1.1 mmol)を添加した。混合物を室温で2時間振盪し、樹脂をDCM (3×3 mL)およびDMF (3×3 mL)で洗浄した。DMF 1 mLおよびプロピルアミン(180 μL, 2.2 mmol)の添加後、この反応物を室温で1時間振盪した。樹脂をDCM (3×3 mL)およびDMF (3×3 mL)で洗浄し、その後にDMF中の1 Mブロモ酢酸(1.1 mL)、Oxyma (156 mg, 1.1 mmol)およびDIC (169 μL, 1.1 mmol)を添加した。室温で2時間振盪した後に、樹脂をDCM (3×3 mL)およびDMF (3×3 mL)で洗浄した。このサイクルをさらに8回繰り返した。次いで樹脂にDMF 1.1 mLおよびプロパルギルアミン(141 μL, 2.2 mmol)を添加した。この混合物を室温で60分間振盪し、樹脂をDCM (3×3 mL)およびDMF (3×3 mL)で洗浄した後に、1 Mブロモ酢酸(DMF中1.1 mL)、Oxyma (156 mg, 1.1 mmol)およびDIC (169 μL, 1.1 mmol)の添加を行った。この混合物を室温で2時間振盪し、樹脂をDCM (3×3 mL)およびDMF (3×3 mL)で洗浄した。次いで樹脂に、DMF 1.1 mLおよびプロピルアミン(180 μL, 2.2 mmol)を添加した。この混合物を室温で60分間振盪し、樹脂をDCM (3×3 mL)およびDMF (3×3 mL)で洗浄した。このサイクルをさらに繰り返した。次に、Oxyma (85 mg, 0.6 mmol)、DIC (93 μL, 0.6 mmol)、DIEA (156 μL, 0.9 mmol)およびHt-COOH (225 mg, 0.45 mmol)のDMF (1.1 mL)混合物。この混合物を室温で2時間振盪し、樹脂をDCM (3×3 mL)およびDMF (3×3 mL)で洗浄した。次いで樹脂に、DCM (2 mL)中30%のTFAを添加し、この混合物を室温で30分間振盪した。混合物をろ過し、ろ液を蒸発させた。残留物にEt2Oを添加し、沈殿物を収集した。収集した粉末を、一般的な合成方法のセクションに記述されているように逆相HPLCを用い精製して、4a (160 mg, 収率43%; C89H135N18O15計算質量: 1696.0354 (M + H) +; 実測値: 1695.8215)を得た。
【０１１４】
4a (100 mg, 0.059 mmol)に安定な銅(I)触媒(8 mg, 0.013 mmol)、Ht-N3 (42 mg, 0.071 mmol)、DIEA (200 μL, 1.2 mmol)およびDMSO (1 mL)を添加した。反応混合物を60℃で6時間撹拌した。次いで反応混合物にアセトニトリル(10 mL)を添加し、沈殿物をろ過した。収集した粉末にMeOHを添加し、混合物をろ紙でろ過した。ろ液を蒸発させ、残留粉末をアセトニトリルで洗浄して、4bを黄色粉末として得た(22 mg, 0.0096 mmol, 収率16%)。一般的な合成方法のセクションに記述されているように、逆相HPLCを用いて4bの一部を精製した。C122H183N26O17計算質量: 2284.4255 (M + H) +; 実測値: 2284.2666。
【０１１５】
2の合成
図7を参照されたい。10 mM HOAtおよび10 mM HATUのDMSO溶液50 μLに、DMSO中10 mMの1b (500 nmol) 50 μLを添加した。この混合物を室温で2時間振盪した。次いで混合物に106 μLの0.94 mM 5のDMSO懸濁液(100 nmol)を添加した。1時間振盪した後、DMSO中400 mMのHOAtおよび400 mMのHATU溶液を含有する溶液0.5 μLを混合物に添加した。15時間振盪した後に、DMSO中400 mMのHOAtおよび400 mMのHATUさらに0.5 μLを混合物に添加した。24時間振盪した後に、DMSO中400 mMのHOAtおよび400 mMのHATU溶液1.0 μLを混合物に添加した。24時間振盪した後に、反応混合物を、一般的な合成方法のセクションに記述されているように直接、逆相HPLCにより精製して、18 nmolの2 (収率18%; C123H162N38O37P5計算質量: 2918.0651 (M - H)-; 実測値: 2917.8376)を得た。
【０１１６】
3の合成
図8を参照されたい。DMSO中の3a (21 mM; 400 nmol) 19 μLにDMSO中400 mMのHOAtおよび400 mMのHATU 1.0 μLを添加した。この混合物を室温で30分間振盪した。次いで10 μLのDMSO中10 mMの5 (100 nmol)を添加した。15時間振盪した後、DMSO中400 mMのHOAtおよび400 mMのHATU 1.0 μLを混合物に添加した。7時間振盪した後、19 μLの21 mM 3aのDMSO溶液(400 nmol)ならびに1.0 μLの400 mM HOAtおよび400 mM HATUのDMSO溶液を混合物に添加した。16時間振盪した後、反応混合物を、一般的な合成方法のセクションに記述されているように直接、逆相HPLCにより精製して、2.4 nmolの3 (収率2.4%; C138H189N41O40P5計算質量: 3215.2704 (M - H)-; 実測値: 3214.9058)を得た。
【０１１７】
4の合成
図9を参照されたい。10 μLのDMSO中4bのアリコット(44 mM, 440 nmol)に1.0 μLの400 mM HOAtおよび400 mM HATUのDMSO溶液を添加した。この混合物を室温で10分間振盪した。次いでDMSO中5 (7.1 mM, 99 nmol) 14 μLを混合物に添加した。14時間振盪した後、4bのDMSO溶液(3.3 mM, 33 nmol) 10 μLならびに400 mM HOAtおよび400 mM HATUのDMSO溶液1.0 μLを混合物に添加した。24時間振盪した後、反応混合物を、一般的な合成方法のセクションに記述されているように直接、逆相HPLCにより精製して、2.6 nmolの4 (収率2.6%; C168H243N47O46P5計算質量: 3809.6808 (M - H)-; 実測値: 3810.0334)を得た。
【０１１８】
実験方法
RNアーゼL-GSTタンパク質の調製:
pGEX-4T-RNaseL-GSTプラスミドを既述5のように調製し、貯蔵緩衝液(Storage Buffer) (20 mM HEPES, pH 7.4, 70 mM NaCl, 2 mM MgCl2)中に保持した。
【０１１９】
インビトロでのRNアーゼLオリゴマー化:
RNアーゼL緩衝液(25 mM Tris-HCl (pH 7.4)、100 mM KClおよび10 mM MgCl2)中の12 μM RNアーゼLのアリコットに、新鮮な7 mM β-メルカプトエタノールおよび50 μMのATPを補充した。2'-5' A4、1b、または2の希釈液を、7 mM β-メルカプトエタノールおよび50 μMのATPを補充したRNアーゼL緩衝液中で調製し、RNアーゼLの溶液に総量17.4 μLで添加した。溶液を室温で5分間インキュベートし、その後、0.4 M塩酸トリエタノールアミン, pH 8.5中44 mMのスベルイミド酸ジメチル(Thomas Scientific) 1 μLを添加した。室温で2時間のインキュベーション後、6×Laemmli緩衝液(375 mM Tris-HCl, pH 6.8、0.03%ブロモフェノールブルー、0.6% β-メルカプトエタノール、12% SDS、60%グリセロール) 3.6 μLを添加した。
【０１２０】
95℃で5分間加熱した後、サンプルを1×Laemmli緩衝液中で90分の1希釈し、一部をSDS-PAGEにより分離した。PVDF膜に転写した後、5%脱脂乳を含有する1×TBST [0.1% Tween-20 (v/v)を有する1×TBS]中で膜を1時間ブロッキングした。5%脱脂粉乳を含有する1×TBST中4℃で終夜、膜をRNアーゼL抗体(5000分の1希釈; Cell Signaling Technology: D4B4J)とともにインキュベートした。膜を1×TBSTで各5分間3回洗浄し、その後、5%脱脂粉乳を含有する1×TBST中で7000分の1の抗ウサギIgG西洋ワサビペルオキシダーゼ二次抗体コンジュゲート(Cell Signaling Technology: 7074S)とともに室温で1時間インキュベートした。1×TBSTで各5分間5回洗浄した後、製造元のプロトコルにしたがってSuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce Biotechnology)を用いた化学発光によってタンパク質レベルを定量化した。ImageJソフトウェア(National Institutes of Health)を用いて、タンパク質バンドシグナルを定量化した。
【０１２１】
蛍光によるRNA切断の決定:
5'6-フルオレセインおよび3' Iowa Black(登録商標) FQで標識されたモデルRNアーゼL基質 RNA1：
2021521831.tif 000018
は、オリゴヌクレオチドのHPLC精製も行ったIntegrated DNA Technologies, Inc. (IDT)から購入された。5'6-フルオレセインおよび3'クエンチャ(IQ4, 構造は非開示)で標識されたpri-miR-96 RNAのモデル：
2021521831.tif 000019
は、Chemgenesから購入され、ChemgenesによりHPLC精製された。RNA 1またはRNA 2の溶液を70℃で5分間折り畳み、MgCl2、β-メルカプトエタノールまたはATPを有しないRNアーゼL緩衝液中で室温にまで冷却した。冷却後、RNAに10 mM MgCl2、新鮮な7 mM β-メルカプトエタノール、および50 μMのATPを補充した。2'-5' A4 + RNアーゼL (10 nM)または2 + RNアーゼL (100 nM)のサンプルを1×RNアーゼL緩衝液中で調製し、4℃で30分間インキュベートした。これらのサンプルに100 nMの折り畳まれたRNA 1またはRNA 2を添加した。サンプルをCorning非結合表面ハーフエリア96ウェル黒色プレートに移し、室温で60分間インキュベートした。蛍光強度(Ex: 485 nm, Em: 528 nm)をBioTek FLx800プレートリーダーにて測定した。相対的蛍光増強は、処理されたRNAサンプルの蛍光シグナルを未処理RNAサンプルの蛍光シグナルに対して正規化することによって計算された。RNA切断の割合は、100%として設定された最大蛍光シグナルに対してサンプル蛍光シグナルを正規化することによって計算された。tRNA競合による実験の場合、醸造用酵母由来tRNA (Roche)をフェノール-クロロホルム抽出した。折り畳まれたtRNAの希釈液をRNアーゼL緩衝液中で調製した。次に、折り畳まれたRNA 2を溶液に添加し、上記のように実験を完了した。正規化されたRNA切断は、1として設定された、最大蛍光シグナル(tRNAなしでの化合物)に対してサンプル蛍光シグナルを正規化することによって計算された。
【０１２２】
PCR増幅およびインビトロ転写:
miR-96一次転写産物RNA (pri-miR-96)のDNA鋳型：
2021521831.tif 000020
を、標準的な脱塩ありでIDTから購入し、さらに精製することなく用いた。この鋳型を50 μLの反応液中、1×PCR緩衝液(10 mM Tris, pH 9.0、50 mM KClおよび0.1% (v/v) Triton X-100)、2 μMフォワードプライマー：
2021521831.tif 000021
、2 μMリバースプライマー：
2021521831.tif 000022
、4.25 mM MgCl2、330 μM dNTPs、ならびにTaq DNAポリメラーゼ1 μL中でPCR増幅した。PCRサイクリング条件は、95℃で90秒間の初期変性、続いて25サイクル×95℃で30秒間、55℃で30秒間および72℃で60秒間であった。
【０１２３】
pri-miR-96 Drosha部位モチーフを示すRNAカセット(RNA 3)：
2021521831.tif 000023
およびpri-miR-96 Drosha部位モチーフが塩基対合されるRNAカセット(RNA 4)：
2021521831.tif 000024
のDNA鋳型を、標準的な脱塩ありでIDTから購入し、さらに精製することなく用いた。この鋳型を50 μLの反応液中、1×PCR緩衝液(10 mM Tris, pH 9.0、50 mM KClおよび0.1% (v/v) Triton X-100)、2 μMカセットフォワードプライマー：
2021521831.tif 000025
、2 μMカセットリバースプライマー：
2021521831.tif 000026
、4.25 mM MgCl2、330 μM dNTPs、ならびにTaq DNAポリメラーゼ1 μL中でPCR増幅した。PCRサイクリング条件は、95℃で90秒間の初期変性、続いて25サイクル×95℃で30秒間、50℃で30秒間および72℃で60秒間であった。
【０１２４】
PCR産物300 μLを用い、2.25 mMの各rNTPおよび5 mM MgCl2を有する1×転写緩衝液(40 mM Tris-HCl, pH 8.1、1 mMスペルミジン、0.001% (v/v) Triton X-100および10 mM DTT)中でT7 RNAポリメラーゼにより、37℃で18時間RNAをインビトロで転写した。RNAを次に、変性15%ポリアクリルアミドゲルにて精製し、既述のように単離した。Peltier温度制御ユニットを備えたBeckman Coulter DU800 UV-Vis分光光度計を用い90℃で260 nmでのUV吸光度により、RNA濃度を決定した。オリゴ吸光係数計算機を用いて、吸光係数を計算した。
【０１２５】
RNAマッピング実験:
RNAマッピングをインビトロで転写されたpri-miR-96にて実施した。既述のようにRNAを32Pで5'末端標識した。RNAを95℃で30秒間折り畳み、室温にまで冷却した。サンプルを、MgCl2、β-メルカプトエタノールまたはATPを有しないRNアーゼL緩衝液中で調製し、次いで折り畳み後に10 mM MgCl2、新鮮な7 mMβ-メルカプトエタノールおよび50 μMのATPを補充した。2'-5' A4または2のアリコットをRNアーゼL緩衝液中で希釈し、その後、およそ4000カウントの、折り畳まれた放射性標識pri-miR-96 RNAを添加した。サンプルを室温で30分間インキュベートした後に、2'-5' Ae4または2の等モル濃度でのRNアーゼLの添加を行った。サンプルを室温で60分間インキュベートし、その後、等量の2×ローディング緩衝液(8 M尿素、20 mM EDTA、2 mMトリスベース、0.01%ブロモフェノールブルーおよび0.01%キシレンシアノール)の添加によってクエンチした。1aとの競合の場合、1aの連続希釈液を一定濃度の2'-5'A4または2に加えて添加し、室温で15分間 pri-miR-96 RNAとともにインキュベートした後に適切な濃度のRNアーゼLを添加したことを除き、上記のようにサンプルを調製した。サンプルを室温で60分間インキュベートした。RNAを1×加水分解緩衝液(50 mM NaHCO3, 1 mM EDTA, pH 9.4)中95℃で1.5分間インキュベートすることにより、塩基加水分解ラダーを作製した。全てのG残基を同定するために、pri-miR-96を1×変性T1緩衝液(25 mMクエン酸ナトリウム, pH 5、7 M尿素、1 mM EDTA)中20 UのT1リボヌクレアーゼ(ThermoFisher Scientific)とともに20分間インキュベートした。RNA断片を、変性12.5%ポリアクリルアミドゲルにて分離し、phosphorimagingおよびQuantityOne (BioRad)によって定量化した。全長に対するカウント割合は、適切なバンド(全長バンド、U12バンド、またはU35バンド)を定量化するカウントを、フルレーン定量化時のカウントで除算し、100を乗じることによって計算された。
【０１２６】
結合親和性の測定:
核酸の、化合物への結合の解離定数は、溶液中での、蛍光に基づく結合アッセイ法を用いて決定された。同様の結合アッセイ法を用いて、pri-miR-96のDrosha部位に対する親化合物1aの結合親和性を評価した。このアッセイ法からの蛍光は、化合物固有の蛍光に由来する(Ex: 345 nm、Em: 460 nm)。RNAに結合すると、化合物の蛍光が増加し、適切なRNAとの結合解離曲線を生成させる。核酸を、1× Crowded Binding Buffer (8 mM Na2HPO4、190 mM NaCl、1 mM EDTAおよび20% (w/v) PEG8000中40 μg/mLのBSA)中60℃で5分間加熱することにより折り畳み、その後、室温にまで冷却した。化合物を500 nMの終濃度まで添加した。次に、500 nMの化合物を補充した1×Crowded Binding Buffer中でRNAの1:2連続希釈を実施した。溶液を30分間インキュベートし、その後、Corning非結合表面ハーフエリア96ウェル黒色プレートに移した。次いで、蛍光強度(Ex: 345 nm、Em: 460 nm)をMolecular Devices SpectraMax M5プレートリーダーにて測定した。蛍光強度の変化を、RNA濃度の関数として式1 (Eq 1)に適合した:
I = I0 + 0.5Δε(([FL]0 + [RNA]0 + Kt)-([FL]0 + [RNA]0 + Kt)2 - 4[FL]0[RNA]0)0.5) (Eq 1)
ここでIおよびI0は、それぞれ、核酸の存在下および非存在下で観察された蛍光強度であり、Δεは、無限の核酸濃度の非存在下および存在下での蛍光強度の差異であり、[FL]0および[RNA]0は、それぞれ、化合物および核酸の濃度であり、Ktは解離定数である。
【０１２７】
細胞培養:
全ての細胞は5% CO2で37℃にて維持された。L-グルタミンと、10% FBS (Sigma)および1× Antibiotic-Antimycotic (Corning)を補充した25 mM HEPES (Corning)とを有するRPMI 1640培地中でMDA-MB-231 (HTB-26, ATCC)細胞を培養した。10% FBS (Sigma)、1× Glutagro (Corning)および1× Antibiotic-Antimycotic (Corning)を補充した、4.5 g/Lグルコース(Corning)を有するDMEM培地中でA549 (CCL-185, ATCC)、HeLa (CCL-2, ATCC)およびMCF7 (HTB-22, ATCC)細胞を培養した。L-グルタミンと、10% FBS (Sigma)、20 ng/mLヒト上皮増殖因子(Pepro Tech Inc.)、0.5 mg/mLヒドロコルチゾン(Pfaltz & Bauer)、100 ng/mLコレラ毒素(Sigma-Alrich)、10 μg/mLインスリン(Sigma-Aldrich)および1× Antibiotic-Antimycotic (Corning)を補充した15 mM HEPES (Corning)とを有するDMEM/F12 50/50中でMCF10a (CRL-10317, ATCC)細胞を培養した。化合物の処理の場合、ストックを増殖培地中で希釈し、24〜72時間細胞に添加した。24ウェルまたは96ウェルプレート中でmiR-96ヘアピン前駆体(GeneCopoeia: HmiR0116-MR04)またはRNアーゼL (pcDNA3-RNaseL; R.H. Silverman, Cleveland Clinic)7のいずれかを過剰発現させるための2'-5' A4オリゴヌクレオチドおよびプラスミドDNAのトランスフェクションの場合、製造元のプロトコルにしたがってLipofectamine 2000を用いた。トランスフェクション後、培地を除去し、上記のように化合物を含有する増殖培地と交換した。対照(Santa Cruz Biotechnology: sc-37007)またはRNアーゼL標的化siRNA (Santa Cruz Biotechnology: sc-45965)のトランスフェクションの場合、製造元のプロトコルにしたがってLipofectamine RNAiMAX試薬を用いた。
【０１２８】
RNA単離およびRT-qPCR:
Quick-RNA MiniPrep (Zymo Research)を製造元のプロトコルにしたがって用いることにより、未処理細胞および処理細胞から全RNAを抽出した。製造元の推奨プロトコルにしたがってmiScript II RT Kit (Qiagen)を用いた後続の逆転写反応においては、全RNAおよそ200〜600 ngを用いた。RT-qPCRプライマーをEurofinsまたはIDTから購入し、さらに精製することなく用いた。RT-qPCRサンプルを、Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)を用いて調製し、7900HT Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems)にて完了した。RNA発現レベルを、ΔΔCt法を用いて決定し、ハウスキーピング遺伝子としてU6核内低分子RNAで正規化した。キメラ化合物2で処理すると、pri-miR-96発現に及ぼす親化合物1aの効果を制御するために、式2 (Eq. 2)にしたがって相対的切断レベルを計算した:
相対的RNA切断 = (1a処理による相対的RNA発現)/(相対的RNA発現2処理) (Eq. 2)
。
【０１２９】
RNA免疫沈降:
MDA-MB-231細胞を6ウェルプレート中でおよそ70%の集密度まで増殖させ、200 nMの2'-5' A4または200 nMの2のいずれかで48時間処理した。細胞を1×DPBSで洗浄し、アキュターゼ(Accutase) (Innovative Cell Technologies, Inc.)でプレートから取り出し、氷冷1×DPBSで洗浄した。次いで、製造元の指示にしたがい80 U RNaseOUT組み換えリボヌクレアーゼ阻害剤(Recombinant Ribonuclease Inhibitor) (Invitrogen)および1×哺乳類細胞用プロテアーゼ阻害剤カクテルIII (Protease Inhibitor Cocktail III for Mammalian Cells) (Research Products International Corp.)を補充したM-PER緩衝液100 μL中で細胞を溶解した。サンプルを13000×gで遠心分離し、上清を、β-アクチンマウス一次抗体(Cell Signaling: 8H10D10)またはRNアーゼLマウス一次抗体(Santa Cruz Biotechnology: sc-74405)のいずれかに結合されたDynabeadsプロテイン(Protein) A (Life Technologies)とともに4℃で終夜インキュベートした。インキュベーション後、ビーズを、0.02% Tween-20を有する1×DPBSで3回洗浄し、その後、製造元の指示にしたがってmiRNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いRNAを調製した。RNA沈殿を補助するためにエタノールを添加する前にグリコーゲン(20 μg)を添加した。上記のようにRT-qPCRを完了した。相対的RNA発現レベルを、ΔΔCt法によって決定し、ハウスキーピング遺伝子として18S rRNAに対し正規化した。正規化された変化倍率は、RNアーゼL免疫沈降画分から抽出されたRNAから調製されたcDNAライブラリにおける関心対象の遺伝子の相対的発現レベルを、β-アクチン免疫沈降画分から抽出されたRNAから調製されたcDNAライブラリにおける関心対象の遺伝子の相対的発現レベルで除算すること、または式3 (Eq. 3)によって計算された:
正規化された変化倍率 = (RNアーゼL画分における相対的RNA発現)/(β-アクチン画分における相対的RNA発現) (Eq. 3)
。
【０１３０】
FOXO1ウエスタンブロット:
MDA-MB-231細胞を6ウェルプレート中でおよそ60%の集密度まで増殖させた。細胞を20または200 nMの2とともに48時間インキュベートした。全タンパク質を製造元のプロトコルにしたがい1×哺乳類細胞用プロテアーゼ阻害剤カクテルIII (Research Products International Corp.)を補充したM-PER哺乳類タンパク質抽出試薬(Mammalian Protein Extraction Reagent) (Pierce Biotechnology)を用いて抽出し、Micro BCAタンパク質アッセイキット(Protein Assay Kit) (Pierce Biotechnology)を用いて定量化した。全タンパク質のアリコット30 μgを8% Bis-Tris SDSポリアクリルアミドゲルにて分離し、次いでPVDF膜に転写した。次いで、膜を1×TBSTに溶解した5% (w/v)脱脂粉乳中1時間室温でブロッキングした。次いで、膜を、5%脱脂粉乳を含有する1×TBST中1:2000のウサギmAb FOXO1一次抗体(Cell Signaling Technology: C29H4)とともに4℃で終夜インキュベートした。膜を1×TBSTで各5分間5回洗浄し、その後、5%脱脂粉乳を含有する1×TBST中1:2000の抗ウサギIgG西洋ワサビペルオキシダーゼ二次抗体コンジュゲート(Cell Signaling Technology: 7074S)とともに室温で1時間インキュベートした。1×TBSTで各5分間7回洗浄した後、製造元のプロトコルにしたがってSuperSignal West Pico化学発光基質(Chemiluminescent Substrate) (Pierce Biotechnology)を用いた化学発光によりタンパク質レベルを定量化した。膜を1×ストリッピング緩衝液(200 mMグリシン, pH 2.2, 1% Tween-20および0.1% SDS)で各5分間2回ストリッピングし、その後に1×TBST中で3回洗浄した。次いで、膜をブロッキングし、1:5000のマウスβ-アクチン一次抗体(Cell Signaling Technology: 8H10D10)を用いて上記と同じ手順にしたがいβ-アクチンについてプローブした。膜を1×TBSTで5回洗浄し、1:10000の抗マウスIgG西洋ワサビペルオキシダーゼ二次抗体コンジュゲート(Cell Signaling Technology: 7076S)とともにインキュベートした。1×TBSTで各5分間7回洗浄した後、タンパク質レベルを上記のように定量化した。ImageJソフトウェアを用いてバンド強度を定量化した。
【０１３１】
フローサイトメトリー:
細胞を6ウェルプレート中でおよそ60%の集密度まで増殖させ、その後、化合物の希釈液(1aまたは2)とともに72時間インキュベートした。あるいは、miR-96のヘアピン前駆体(GeneCopoeia: HmiR0116-MR04)を過剰発現するプラスミドを、JetPRIMEトランスフェクション試薬(Polyplusトランスフェクション)を用いて製造元のプロトコルにしたがい60%の集密度で5時間細胞にトランスフェクションし、その後、培地を交換し、上記のように化合物で処理した。細胞を、アキュターゼ(Innovative Cell Technologies, Inc.)を用いてプレートから取り出し、氷冷1×DPBSおよび1×アネキシン結合緩衝液(Annexin Binding Buffer) (50 mM HEPES, pH 7.4、700 mM NaClおよび12.5 mM CaCl2)で2回洗浄した。細胞を、アネキシンV-APC (BD Pharmigen) 5 μLを含有する1×アネキシン結合緩衝液100 μLに再懸濁した。溶液を室温で10分間インキュベートした後、1×アネキシン結合緩衝液で2回洗浄した。次に、細胞を1×アネキシン結合緩衝液300 μL中1 μg/mLのヨウ化プロピジウム(Sigma Aldrich)により室温で10分間染色した。BD LSRII機器(BD Biosciences)を用いてフローサイトメトリーを実施した。DAPI-UVレーザーによる励起時の化合物の蛍光を読み取ることにより、化合物の取込みを測定した。次に、DAPI-UVヒストグラムの平均値を取得し、未処理および1aをそれぞれ0%および100%として正規化することにより、ゲーティングされた生細胞を化合物の取込みについて分析した。少なくとも10,000事象を分析に用いた。
【０１３２】
化合物の安定性の分析:
MDA-MB-231細胞を24ウェルプレート中で80%の集密度まで増殖させ、5 μMの2で処理した。24時間のインキュベーション後、培地を除去し、細胞を1×DPBSで洗浄した。ナノ純水400 μLを添加し、-80℃で終夜凍結することにより、細胞を溶解した。融解後、サンプルを13000×gで遠心分離した。上清を取り出し、Labconco SpeedVac Concentrator中で完全に乾燥させた。アセトニトリル(200 μL)を添加し、サンプルを13000×gで遠心分離し、その後、上清を取り出し乾燥させた。サンプルを水20 μLに溶解し、C18樹脂(EMD Millipore) 0.6 μLを用いZipTipを使って10 μLを精製した。化合物を50%アセトニトリル/50%ナノ純水中に溶出させた。MALDI-TOF質量スペクトル分析による化合物検出は、一般的な合成方法のセクションに記述されているように実施された。MALDI質量分析で観察されたインタクトな化合物の総イオン数(m/z = 2919)および断片2'-5' A4の総イオン数(m/z = 1544)を収集した; 推定される代謝の主なモードは、2と2'-5' A4の間のアミド結合であるため、この比率の変化は代謝を示しうる。インタクトな化合物の比率を、2'-5' A4断片の総イオン数に対するインタクトな化合物の総イオン数の比率として計算し、ここで化合物2のストックからの比率を100%に正規化した。
【０１３３】
カスパーゼ3/7活性測定:
およそ5,000個のMDA-MB-231またはMCF10a細胞を、黒色の、細胞培養用処理済の96ウェルプレート(Corning)にプレーティングした。およそ60%の集密度で、細胞を適切な増殖培地中2の希釈液で48時間処理した。Caspase-Glo 3/7キット(Promega)を製造元のプロトコルにしたがい用いて、カスパーゼ3/7活性を測定した。バックグラウンドサンプル値を差し引いた後、処理サンプルを未処理サンプルに対して正規化することにより、カスパーゼ活性の変化倍率を計算した。
【０１３４】
触媒活性の測定:
MDA-MB-231細胞を6ウェルプレート(Corning)にプレーティングした。80%の集密度で、培地を吸引し、単層を1×DPBSで洗浄した。細胞培地中の2の希釈液を細胞に添加し、24時間インキュベートした。細胞を、アキュターゼ(Innovative Cell Technologies, Inc.)を用いてプレートから取り出し、1×DPBSで洗浄した。Quick-RNA MiniPrep (Zymo Research)のRNA溶解緩衝液200 μLを用いて細胞を溶解した。アリコット50 μLを、Corning非結合表面ハーフエリア96ウェル黒色プレートに移した。未処理の細胞溶解物の画分を組み合わせ、既知濃度の2 (50 nM、100 nM、250 nM、500 nM、1000 nM)でスパイクすることにより、2の標準曲線を作成するために用いた。次に、Molecular Devices SpectraMax M5プレートリーダーにて蛍光強度(Ex: 345 nm、Em: 460 nm)を測定した。作成された標準曲線を用いてアリコット50 μL中の2の濃度を外挿し、次いで全200 μL容量中の2の量(pmol)を計算した。
【０１３５】
次いで、サンプルからのRNAを単離し、RT-qPCRを上記のように進め、Ct値を正確に較正するためにインビトロで転写されたpri-miR-96 (10 ng、1 ng、0.1 ng、0.01 ng、0.001 ng、0.0001 ng、0 ng)を用いた標準曲線を各実行に含めた。次いで切断されたpri-miR-96の量を、未処理サンプルにおけるpri-miR-96のpmolと2処理サンプルにおけるpri-miR-96のpmolの差をとることによって計算した。次いで、サンプルにおいて切断されたpri-miR-96のpmolと2のpmolの比率をとることによって、触媒活性または代謝回転を計算した。
【０１３６】
TGP-210-RL研究
実験モデルおよび対象の詳細
L-グルタミンと、10%ウシ胎児血清(FBS) (Sigma)および1×ペニシリンストレプトマイシン溶液(Corning)を補充した25 mM HEPES (Corning)とを有するRoswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640培地中でMDA-MB-231 (HTB-26; ATCC)細胞を培養した。正常酸素条件で培養される細胞は、5% CO2を含む周囲雰囲気(およそ21% O2)中37℃で維持した。低酸素で培養される細胞は、37℃、窒素で満たされた低酸素チャンバ(Billups-Rothenberg, Inc.)中1%未満のO2、および5% CO2で維持した。細胞はATCCから直接購入されたが、認証はされなかった。
【０１３７】
化合物処理(TGP-210、TGP-210-RL、LNA-210、Scr-LNA)の場合、DMSOまたは水中の化合物ストックを増殖培地中で希釈し、細胞に24〜48時間添加した。プラスミド(miR-210過剰発現プラスミドまたはRNアーゼL過剰発現プラスミド)による細胞のトランスフェクションの場合、リポフェクタミン(Lipofectamine) 2000 (Invitrogen)を製造元のプロトコルにしたがって用いた。siRNA (対照siRNA-AもしくはRNアーゼL siRNA)または2'-5' A4による細胞のトランスフェクションの場合、Lipofectamine RNAiMAX Reagent (Invitrogen)を製造元のプロトコルにしたがって用いた。
【０１３８】
方法の詳細
インビトロでの蛍光RNA切断
5'6-フルオレセイン(6FAM)および3'ブラックホールクエンチャ(Black Hole Quencher) (IQ4)で標識されたmiR-210ヘアピン前駆体RNA：
2021521831.tif 000027
をChemgenesから、HPLC精製あり、で購入した。5' FAM/3' BHQ miR-210ヘアピン前駆体RNA (100 nM)の溶液を60℃で5分間折り畳み、MgCl2、β-メルカプトエタノールまたはATPを有しない1×RNアーゼL緩衝液(25 mM Tris-HCl, pH 7.4、100 mM KCl)中で室温にまでゆっくり冷却した。折り畳んだ後、RNAに10 mM MgCl2、新鮮な7 mM β-メルカプトエタノール、および50 μMのATPを補充した。次に、既述のように調製された50 nMのRNアーゼL、および100 nMの化合物(TGP-210-2'-5' An誘導体、ここでn = 2〜4)を1×RNアーゼL緩衝液中で調製し、RNAに添加した。次いで、サンプルをCorning非結合表面ハーフエリア96ウェル黒色プレートに移した。サンプルを室温で定義された時点(15、30、60、120、および720分)の間インキュベートし、その後、SpectraMax M5プレートリーダーを用いて蛍光強度(Ex: 485 nm、Em: 525 nm)を測定した。蛍光強度の増強がRNA切断を示した場合の蛍光強度の変化率は、未処理の蛍光シグナルに対するサンプル蛍光シグナルの変化率を計算することによって決定された。
【０１３９】
インビトロでのRNA切断マッピング
あるいは、5'-32P末端標識されたmiR-210ヘアピン前駆体を既述のようにインビトロで転写した。TGP-210-RLのアリコットをRNアーゼL緩衝液中で希釈し、その後、折り畳まれた5'-32P末端標識pre-miR-210 RNAおよそ5000カウントを加えた。サンプルを室温で30分間インキュベートした後に、TGP-210-RLの等モル濃度でのRNアーゼLの添加を行った。サンプルを室温で60分間インキュベートし、その後、等量の2×ローディング緩衝液(8 M尿素、20 mM EDTA、2 mMトリスベース、0.01%ブロモフェノールブルーおよび0.01%キシレンシアノール)の添加によってクエンチした。RNAを1×加水分解緩衝液(50 mM NaHCO3, 1 mM EDTA, pH 9.4)中95℃で5または10分間インキュベートすることにより、塩基加水分解ラダーを作製した。全てのG残基を同定するために、pre-miR-210を1×変性T1緩衝液(25 mMクエン酸ナトリウム, pH 5、7 M尿素、1 mM EDTA)中のT1リボヌクレアーゼ(ThermoFisher Scientific)希釈液とともに室温で20分間インキュベートした。RNA断片を、変性15%ポリアクリルアミドゲルにて分離し、phosphorimagingおよびQuantityOneソフトウェア(BioRad)によって画像化した。
【０１４０】
インビトロでのRNアーゼLオリゴマー化
1×RNアーゼL緩衝液中のRNアーゼL (3 μM)のアリコットに、10 mM MgCl2、新鮮な7 mM β-メルカプトエタノールおよび50 μMのATPを補充した。2'-5' A4、TGP-210、またはTGP-210-RLの希釈液を、10 mM MgCl2、新鮮な7 mM β-メルカプトエタノールおよび50 μMのATPを補充した1×RNアーゼL緩衝液中で調製し、RNアーゼLの溶液に総量17.4 μLで添加した。RNアーゼL/化合物溶液を室温で5分間インキュベートし、その後、0.4 Mトリエタノールアミン塩酸塩, pH 8.5中44 mMのスベルイミド酸ジメチル(Thomas Scientific) 1 μLを添加した。室温で2時間インキュベートした後、6×Laemmli緩衝液(375 mM Tris-HCl, pH 6.8、0.03%ブロモフェノールブルー、0.6% β-メルカプトエタノール、12% SDS、60%グリセロール) 3.6 μLを添加した。サンプルを95℃で5分間熱変性させた後、サンプルを1×Laemmli緩衝液中で1:90に希釈し、その後、SDS-PAGEによって分離した。PVDF膜に転写した後、膜を、5%脱脂乳を含有する1×TBST [0.1% Tween-20 (v/v)を有する1×TBS]中で1時間ブロッキングした。膜をRNアーゼL抗体(1:5000希釈; Cell Signaling Technology: D4B4J)とともに、5%脱脂粉乳を含有する1×TBST中4℃で終夜インキュベートした。膜を1×TBSTで各5分間3回洗浄し、その後、5%脱脂粉乳を含有する1×TBST中1:10000の抗ウサギIgG西洋ワサビペルオキシダーゼ二次抗体コンジュゲート(Cell Signaling Technology: 7074S)とともに室温で2時間インキュベートした。膜を1×TBSTで各5分間5回洗浄した後、製造元のプロトコルにしたがってSuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce Biotechnology)を用いた化学発光によりタンパク質レベルを定量化した。単量体またはオリゴマーシグナルに関連するRNアーゼLバンドを、ImageJソフトウェア(National Institutes of Health)を用いて定量化した。
【０１４１】
マイクロスケール熱泳動(MST)結合測定
MST蛍光測定は、IDTからRNase不含HPLC精製あり、で購入され、さらに精製せずに用いられた5'-Cy5標識miR-210ヘアピンRNA：
2021521831.tif 000028
、5'-Cy5 miR-210変異体RNA：
2021521831.tif 000029
、または5' Cy5 DNAヘアピン：
2021521831.tif 000030
の蛍光を用い、Monolith NT.115システム(NanoTemper Technologies)にて実施された。RNA (5 nM)を1×MST緩衝液(8 mM Na2HPO4、190 mM NaCl、1mM EDTAおよび0.05% (v/v) Tween-20)中で調製し、60℃で5分間加熱し、室温にまでゆっくり冷却することにより折り畳んだ。化合物(TGP-210またはTGP-210-RL)を1×MST緩衝液中で希釈し、その後、終濃度20 μMまで添加した後に、5 nM RNAを含有する1×MST緩衝液中1:2の希釈を行った。あるいは、化合物およびRNAに加えて、1×MST緩衝液中のRNアーゼLを終濃度50 nMまで添加した。サンプルを室温で30分間インキュベートし、その後、プレミアムコーティングされたキャピラリ(NanoTemper Technologies)中に負荷した。蛍光測定(Ex: 605-645 nm、Em: 680-685 nm)を、20% LEDおよび80% MSTパワーで実施し、レーザーオン時間30秒およびレーザーオフ時間5秒とした。データを熱泳動分析によって分析し、MST分析ソフトウェア(NanoTemper Technologies)の二次結合方程式によって適合させた。次いで、解離定数を、単一部位モデルを用いた曲線適合によって決定した。
【０１４２】
フローサイトメトリーによる細胞取込み
MDA-MB-231細胞を6ウェルプレート中でおよそ60%の集密度まで増殖させ、その後、TGP-210またはTGP-210-RLの希釈液とともに48時間インキュベートした。細胞を、アキュターゼ(Innovative Cell Technologies, Inc.)を用いてプレートから取り出し、氷冷1×DPBSで2回洗浄した。1×DPBS中でのおよそ1×106個の細胞の再懸濁時に、DAPI-UVレーザーによる励起時の化合物の蛍光を読み取ることにより、化合物の取込みを測定した。次に、DAPI-UVヒストグラムのサンプルの平均カウント値を取得し、未処理およびTGP-210サンプルをそれぞれ0%および100%として正規化することにより、ゲーティングされた生細胞を化合物の取込みについて分析した。少なくとも10,000事象を分析に用いた。
【０１４３】
共焦点顕微鏡による細胞取込み
MDA-MB-231細胞をMat-Tek 96ウェルガラス底プレートにおいて増殖培地中でおよそ80%の集密度まで増殖させた。細胞を、低酸素条件下で24時間、完全増殖培地中5000 nMのTGP-210またはTGP-210-RLで処理した。増殖培地を除去し、次いで細胞を1×DPBSで洗浄し、1×DPBS中4%のパラホルムアルデヒドにより37℃および5% CO2で10分間固定した。次いで、細胞を1×ハンクス平衡塩類溶液(HBSS)で2回洗浄し、1×HBSS中1:10000希釈のSYTO 82核染色液を添加した。室温で10分のインキュベーション後、細胞を1×HBSS中で3回洗浄し、1×HBSS 100 μLに再懸濁し、固有のTGP-210もしくはTGP-210-RL蛍光(DAPIチャネル)またはSYTO 82蛍光(TRITCチャネル)を、Olympus FluoView 1000共焦点顕微鏡を用いて40倍の倍率で画像化した。
【０１４４】
RNA単離およびRT-qPCR
MDA-MB-231細胞を、実験モデルおよび対象の詳細のセクションにおいて前述したように、正常酸素条件または低酸素条件で24〜48時間処理した。Quick-RNA MiniPrep (Zymo Research)を製造元のプロトコルにしたがって用いることにより、細胞から全RNAを抽出した。製造元の推奨プロトコルにしたがってmiScript II RT Kit (Qiagen)を用い全RNAおよそ200〜600 ngに対して後続の逆転写反応を完了した。RT-qPCRサンプルを、Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)を用いて調製し、製造元のプロトコルにしたがい7900HT Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems)にて完了した。RT-qPCRプライマーをEurofinsまたはIDTから購入し、さらに精製することなく用いた。RNA発現レベルを、ΔΔCt法を用いて決定し、ハウスキーピング遺伝子として18SリボソームRNAまたはU6核内低分子RNAを用い正規化した。qPCR miRNAプロファイリングの場合、QiagenのMHS-001Z Gene Table miRNAプロファイリングプレートに基づくmiRNAのカスタムパネルを用いた。MHS-001Z Gene Tableの調整版を用いmiScript miRNA PCR Array鋳型Version 1.1を使って下流分析を実施した。ハウスキーピング遺伝子としてSNORD44およびRNU6を用いデータを正規化した。GraphPad Prismソフトウェアでさらなるデータ分析、処理、および統計を実施した。キメラ化合物TGP-210-RLで処理すると、pre-miR-210発現に及ぼす親化合物TGP-210の効果を制御するために、式1A (Eq. 1A)にしたがって相対的切断レベルを計算した:
2021521831.tif 000031
。
【０１４５】
RNA免疫沈降
MDA-MB-231細胞を6ウェルプレート中でおよそ70%の集密度まで増殖させ、低酸素条件下で48時間、細胞培地中で希釈された200 nMの2'-5' A4または200 nMのTGP-210-RLで処理した。細胞単層を1×DPBSで洗浄し、アキュターゼ(Innovative Cell Technologies, Inc.)でプレートから取り出し、氷冷1×DPBSで洗浄した。製造元の指示にしたがい80 U RNaseOUT組み換えリボヌクレアーゼ阻害剤(Invitrogen)および1×哺乳類細胞用プロテアーゼ阻害剤カクテルIII (Research Products International Corp.)を補充したM-PER緩衝液100 μL中で細胞を溶解した。サンプルを13000×gで15分間遠心分離し、上清を除去した。上清を、β-アクチンマウス一次抗体(Cell Signaling Technologies; 3700S)またはRNアーゼLマウス一次抗体(Santa Cruz Biotechnology; sc-74405)のいずれかに結合されたDynabeadsプロテイン(Protein) A (Life Technologies)とともに4℃で終夜インキュベートした。抗体インキュベーション後、ビーズを、0.02% Tween-20を補充した1×DPBSで3回洗浄し、その後、製造元の指示にしたがってmiRNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いビーズから全RNAを抽出した。RNA沈殿を補助するためにエタノールを添加する前にグリコーゲン(20 μg)を添加した。上記のようにRT-qPCRを完了した。相対的RNA発現レベルを、ΔΔCt法によって決定し、ハウスキーピング遺伝子として18S rRNAに対し正規化した。正規化された変化倍率は、RNアーゼL免疫沈降画分から抽出されたRNAから調製されたcDNAライブラリにおける関心対象の遺伝子の相対的発現レベルを、β-アクチン免疫沈降画分から抽出されたRNAから調製されたcDNAライブラリにおける関心対象の遺伝子の相対的発現レベルで除算すること、または式2A (Eq. 2A)によって計算された:
2021521831.tif 000032
。
【０１４６】
カスパーゼ3/7活性測定
およそ5,000個のMDA-MB-231細胞を、白色の、細胞培養用処理済の96ウェルプレート(Corning)にプレーティングした。およそ60%の集密度で、細胞をLNA-210、Scr-LNA、TGP-210またはTGP-210-RLの希釈液で処理し、その後、低酸素または正常酸素条件下に置いた。48時間後、Caspase-Glo 3/7キット(Promega)を製造元のプロトコルにしたがい用いて、カスパーゼ3/7活性を測定した。あるいは、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いてpre-miR-210 (Genecopoeia; HmiR0167-MR04)を過剰発現するプラスミドをMDA-MB-231細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの5時間後に、細胞を、白色の、細胞培養用処理済の96ウェルプレート(Corning)にプレーティングし、その後、上記のように処理した。バックグラウンドサンプル値を差し引いた後、処理サンプルを未処理サンプルに対して正規化することにより、カスパーゼ活性の変化倍率を計算した。
【０１４７】
触媒活性の測定
MDA-MB-231細胞を24ウェルプレート(Corning)にプレーティングした。およそ80%の集密度で、培地を吸引し、細胞単層を1×DPBSで洗浄した。TGP-210-RL (500 nM)または媒体(DMSO)を細胞培地中で希釈し、細胞に添加し、これを低酸素条件下で24時間インキュベートした。細胞を低酸素状態から取り出し、その後、Quick-RNA MiniPrep Kit (Zymo Research)のRNA溶解緩衝液250 μLを用いて溶解した。アリコット50 μLを、黒色の、非結合表面ハーフエリア96ウェルプレート(Corning)に移した。未処理の細胞溶解物の画分を組み合わせ、既知濃度のTGP-210-RL (1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 nM)でスパイクすることにより、細胞溶解物中のTGP-210-RLの標準曲線を作成するために用いた。次に、Molecular Devices SpectraMax M5プレートリーダーにて蛍光強度(Ex: 345 nm、Em: 460 nm)を測定した。作成された標準曲線を用いて、細胞溶解物アリコット50 μL中のTGP-210-RLの濃度を外挿し、次いで全250 μL容量中pmol単位のTGP-210-RLの量を計算した。
【０１４８】
Quick-RNA MiniPrep Kit (Zymo Research)を用いて細胞溶解物からRNAを抽出し、その後にRT-qPCRを上記のように進めた。Ct値を正確に較正するためにインビトロで転写されたpre-miR-210 (10 ng、1 ng、0.1 ng、0.01 ng、0.001 ng、0.0001 ng、0 ng)を用い各実行で完了してpre-miR-210転写産物について標準曲線を作成した。miR-210前駆体ヘアピンRNAのDNA鋳型：
2021521831.tif 000033
ならびに適切なフォワードプライマー：
2021521831.tif 000034
およびリバースプライマー：
2021521831.tif 000035
を用いて、既述のようにpre-miR-210転写産物をインビトロで転写した。次いで切断されたpre-miR-210の量を、未処理サンプルにおけるpre-miR-210のpmolとTGP-210-RL処理サンプルにおけるpre-miR-210のpmolの差をとることによって計算した。サンプルにおいて切断されたpre-miR-210のpmolとTGP-210-RLのpmolの比率をとることによって、触媒活性または代謝回転を計算した。
【０１４９】
RNA-Seq
低酸素MDA-MB-231細胞を上記のようにTGP-210-RLで24時間処理し、オンカラムDNase I処理を用いmiRNeasy Mini Kit (Qiagen)を使って全RNAを抽出した。Qubit 2.0蛍光光度計(Invitrogen)およびRNAナノチップを備えたAgilent Technologies 2100 Bioanalyzerを用いて、RNAの品質を、それぞれ定量化および評価した。RNA完全性数が8.0を超えるサンプルのみを用いた。NEBNext rRNA枯渇モジュール(カタログ番号: E6310L, New England Biosciences)を用いて、製造元の指示にしたがい、全RNA 500 ngに対してrRNAを枯渇させた。NEBNext Ultra II Directional RNAキット(カタログ番号: E7760, New England Biosciences)を、製造元の指示にしたがってライブラリの調製のために用いた。次いで、RNAサンプルを化学的に断片化し、ランダムヘキサマーでプライミングし、逆転写して断片化したRNAを第1鎖cDNAに変換した。RNA鋳型を除去し、dTTPの代わりにdUTPを組み込んだ後、cDNAの第2鎖を末端修復および3'末端アデニル化によって合成した。ヘアピンループアダプターを用いてアダプターをライゲーションした。ヘアピンループアダプター上の対応するTヌクレオチドを用いて、アダプターを二本鎖cDNAにライゲーションした。次いで、ウラシル特異的切除試薬(USER)酵素を用いて、ループ内のdUTPと、第2鎖に組み込まれた他のUを除去した。最終的なライブラリは、アダプターをライゲーションしたDNAをIlluminaバーコーディングプライマーでPCR増幅することによって作製したが、ここでは最終的なPCR段階において5'と3'の両方のアダプターを有する断片が濃縮されよう。ライブラリを2 nMに正規化し、Bioanalyzer DNAチップによって検証し、均等にプールし、次いでペアードエンドケミストリ(2×40 bp)を用いNextSeq500 v2.5フローセル(1.8 pM)にて配列決定した。サンプルごとにおよそ2,000〜2,500万回の読み取りを作製し、基本品質スコアはQ30を超えた(1000 bpあたり1エラー未満)。
【０１５０】
Kallistoを用いて転写産物の存在量を定量化し、続いてRのSleuthパッケージを用いて遺伝子レベルのRNA-Seq差次的発現分析を行った。TargetScanHuman v7.2を用いて、miR-210-3p (保存された部位を有するのみ)の予測されたマイクロRNA標的ならびにmiR-23-3pおよびmiR-107の予測されたマイクロRNA標的(累積加重コンテキスト++スコアでランク付けされた部位保存に関係なく、予測された上位100標的遺伝子)を探索した。式3A (Eq. 3A)を用い、RNA-Seqデータから各マイクロRNAの標的遺伝子ごとに相対的変化倍率(%)を計算した:
2021521831.tif 000036
。
【０１５１】
次いで、GraphPad Prism 7における信頼度95%および99%で、二項検定関数を使い、標的遺伝子の上方制御および下方制御された相対的変化倍率(%)の二項分布からの有意な不一致を分析した。
【０１５２】
化学合成
略語
TGP-210, Targapremir-210; 2'-5' A, 2'-5'結合オリゴアデニル酸(Chemgenes);
HATU, (1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスフェート(Oakwood Chemical);
HOAt, 1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(Advanced Chem Tech);
DIPEA, N,N-ジイソプロピルエチルアミン(Sigma-Aldrich);
DMSO, ジメチルスルホキシド(EMD);
MALDI-TOF, マトリックス支援レーザー脱離/イオン化-飛行時間型質量分析;
HPLC, 高性能液体クロマトグラフィー;
TEAA, 酢酸トリエチルアンモニウム。
【０１５３】
2'-5'オリゴアデニル酸に結合したTargapremir-210 (TGP-210-2'-5' An; n = 2〜4)の合成
2021521831.tif 000037
1.6 mLの試験管中に、既述のように調製されたTGP-210のカルボン酸誘導体(TGP-210-COOH) (10 μL, 20 mM, 200ナノモル)、ならびにカップリング試薬HATU (2 μL, 100 mM, 200ナノモル)およびHOAt (2 μL, 100 mM, 200ナノモル)を一緒に添加した。溶液を室温で10分間インキュベートし、その後、50 nmolのオリゴアデニル酸アミン(2'-5' An-NH2、ここでn=2〜4) (Chemgenes)およびDIPEA (5 μL)を試験管に添加した。反応容量をDMSOで50 μLに調整した。次いで反応物を振盪しながら37℃でインキュベートした。Applied Biosystems MALDI-TOF/TOF Analyzer 4800 Plusを用い負イオンモードでα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸マトリックスを使ってMALDI-TOFにより反応の進行をモニタリングした。必要に応じて、8時間後に反応溶液に追加のカップリング試薬(各200 nmol)を補充した。反応が完了したら、DMSOを減圧下で除去し、混合物を逆相HPLCにより精製した。HPLC精製は、Waters 2487デュアル吸光度検出器システムとWaters Symmetry C18 5 μm, 4.6×150 mmカラムを備えたWaters 1525 Binary HPLCポンプを用い流速1 mL/分を使って実施した。0〜100%の緩衝液Aから緩衝液Bまでの60分の直線勾配法を用いたが、ここで緩衝液Bは水/アセトニトリル50/50 (v/v)中で新鮮調製された50 mM TEAA, pH 7であり、緩衝液Aは水中で新鮮調製された50 mM TEAA, pH 7である。254および345 nmで吸光度をモニタリングした。純度は、同じ機器設定を用いて、30分または60分のいずれかで同じ直線勾配法を使い分析HPLCで分析した。
【０１５４】
TGP-210-2'-5' A2: 単離された3.4 nmol (収率 = 7%); C55H68N17O20P3計算質量: 1378.3961 (M-H)-; 実測値: 1378.5798。
【０１５５】
TGP-210-2'-5' A3: 単離された18 nmol (収率 = 36%); C65H80N22O26P4計算質量: 1707.4486 (M-H)-; 実測値: 1707.6279。
【０１５６】
TGP-210-2'-5' A4: 単離された8.1 nmol (収率 = 16%); C75H92N27O32P5計算質量: 2036.5012, (M-H)-; 実測値: 2036.8623。
【０１５７】
一般的な合成方法
略語
DMF, N, N-ジメチルホルムアミド;
Hex, ヘキサン;
EtOAc, 酢酸エチル;
DMSO, ジメチルスルホキシド;
DCM, ジクロロメタン;
MeOH, メタノール;
TEA, トリエチルアミン;
TFA, トリフルオロ酢酸。
【０１５８】
化合物の付番はセクションごとに独立しているため、異なる合成セクションのなかで中間体の化合物番号を複数指定することは重要ではなく、化合物はその構造によって定義されることに留意されたい。各最終生成物の化合物番号は、各化合物に固有である。
【０１５９】
引用された文書
2021521831.tif 000038
2021521831.tif 000039
【図１Ａ】
2021521831.tif 000048
【図１Ｂ】
2021521831.tif 000049
【図１Ｃ】
2021521831.tif 000050
【図１Ｄ】
2021521831.tif 000051
【図２】
2021521831.tif 000052
【図３Ａ】
2021521831.tif 000053
【図３Ｂ】
2021521831.tif 000054
【図３Ｃ】
2021521831.tif 000055
【図３Ｄ】
2021521831.tif 000056
【図４】
2021521831.tif 000057
【図５】
2021521831.tif 000058
【図６】
2021521831.tif 000059
【図７】
2021521831.tif 000060
【図８】
2021521831.tif 000061
【図９】
2021521831.tif 000062
【図１０】
2021521831.tif 000063
【図１１】
2021521831.tif 000064
【図１２】
2021521831.tif 000065
【図１３】
2021521831.tif 000066
【図１４】
2021521831.tif 000067
【図１５Ａ】
2021521831.tif 000068
【図１５Ｂ】
2021521831.tif 000069
【図１５Ｃ】
2021521831.tif 000070
【図１５Ｄ】
2021521831.tif 000071
【図１５Ｅ】
2021521831.tif 000072
【図１６】
2021521831.tif 000073
【図１７Ａ】
2021521831.tif 000074
【図１７Ｂ】
2021521831.tif 000075
【図１７Ｃ−１】
2021521831.tif 000076
【図１７Ｃ−２】
2021521831.tif 000077
【図１７Ｄ−１】
2021521831.tif 000078
【図１７Ｄ−２】
2021521831.tif 000079
【図１７Ｅ】
2021521831.tif 000080
【配列表】
2021521831000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年1月8日(2021.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Iの構造：
2021521831.tif 000081
を有する化合物、または薬学的に許容されるその塩:
式中、
Wは、核酸塩基であり;
Lは、リンカー部分であり;
pは、1〜5である。
【請求項２】
Lが、C2〜6アルキレン-O-C2〜6アルキレン-NR3-を含み、かつ該C2〜6アルキレンの一方または両方は、1個または2個のヒドロキシル基で置換されていてもよく、またはLが、式II:
2021521831.tif 000082
を含み、
R1、R2、R3、およびR4は、それぞれ個別にHまたはC1〜6アルキルであり;
nは、0〜9であり;
oは、1〜5である、
請求項1記載の化合物または塩。
【請求項３】
Wが、アデニンである、請求項1または2記載の化合物または塩。
【請求項４】
Lが式IIであり、かつR1、R2およびR3の少なくとも1つ、並びに/またはR1、R2およびR3の全てが、C1〜6アルキルである、請求項2または3記載の化合物または塩。
【請求項５】
R3および/またはR4が、Hである、請求項2〜4のいずれか一項記載の化合物または塩。
【請求項６】
Lが、
2021521831.tif 000083
である、請求項2または3記載の化合物または塩。
【請求項７】
Lが、以下の構造の式II:
2021521831.tif 000084
である、請求項2〜6のいずれか一項記載の化合物または塩。
【請求項８】
pが、4である、請求項7記載の化合物または塩。
【請求項９】
oが、2である、請求項8記載の化合物または塩。
【請求項１０】
式(Ia)の構造：
2021521831.tif 000085
を有する、請求項1記載の化合物または塩。
【請求項１１】
nが、0、3、6、または9である、請求項2〜9のいずれか一項記載の化合物または塩。
【請求項１２】
表A:
2021521831.tif 000086
の化合物、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項１３】
がん細胞内でpri-miR-96ヘアピンRNA核酸またはpre-miR-210前駆体ヘアピンRNA核酸を切断するための薬学的組成物であって、有効量の請求項1〜12のいずれか一項記載の化合物または塩を含む、前記薬学的組成物。
【請求項１４】
がん細胞が、乳がん細胞である、請求項13記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
がん細胞内でpri-miR-96ヘアピンRNA核酸を切断するための薬学的組成物であって、有効量の請求項10記載の化合物または塩を含む、前記薬学的組成物。
【請求項１６】
細胞内でpre-miR-210ヘアピンRNA核酸を切断するための薬学的組成物であって、有効量のpが4である請求項6記載の化合物または塩を含む、前記薬学的組成物。
【請求項１７】
がん細胞が、乳がん細胞である、請求項16記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
治療的有効量の請求項1〜12のいずれか一項記載の化合物または塩を含む、患者におけるがんを含む疾患または障害を処置するための薬学的組成物。
【請求項１９】
がんが、乳がんまたは三種陰性乳がんである、請求項18記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
化合物または塩が、アポトーシス促進性FOXO1転写因子を抑制解除し、乳がん細胞または三種陰性乳がん細胞においてアポトーシスを誘発する、請求項19記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
化合物または塩が、プロリルヒドロキシラーゼ(PHD)に結合して低酸素誘導因子1-α(HIF1α)の過剰ヒドロキシル化を促進するGPD1Lタンパク質の抑制を解除し、プロテアソームによるHIF1α分解を媒介し、乳がん細胞においてアポトーシスを誘発する、請求項19記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
治療的有効量の化合物または塩が、健常な乳房細胞においてアポトーシスを誘発しない、請求項21記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
A2〜4-リンカー-Htの構造を有し、
式中、
Aがアデニンヌクレオチドであり、
リンカーが、N、OおよびSから個別に選択される1〜20個のヘテロ原子が割り込んでいてもよい、5〜150個の炭素原子を含み、かつ
HtがRNA標的指向基である、
化合物、または薬学的に許容されるその塩を含む、RNAを切断するための薬学的組成物。
【請求項２４】
Htが、
2021521831.tif 000087
を含む、請求項23記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
化合物または塩が、A4-リンカー-Htを含む、請求項24記載の薬学的組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
結果として、本開示は、さまざまな態様において、乳がんなどのがんを、それに苦しむ患者において処置する方法を提供する。より具体的には、乳がんは三種陰性乳がんであり得る。
[本発明1001]
式Iの構造：
2021521831.tif 000088
を有する化合物、または薬学的に許容されるその塩:
式中、
Wは、核酸塩基であり;
Lは、リンカー部分であり;
R1、R2、R3、およびR4は、それぞれ個別にHまたはC1〜6アルキルであり;
nは、0〜9であり;
oは、1〜5であり;
pは、1〜5である。
[本発明1002]
Lが、C2〜6アルキレン-O-C2〜6アルキレン-NR3-、または
2021521831.tif 000089
を含み、
各C1〜6アルキレンが、1個または2個のOHで置換されていてもよい、
本発明1001の化合物または塩。
[本発明1003]
Wが、アデニンである、本発明1001または1002の化合物または塩。
[本発明1004]
Lが、C1〜6アルキレン-O-C1〜6アルキレン-NR3である、本発明1002または1003の化合物または塩。
[本発明1005]
Lが、
2021521831.tif 000090
である、本発明1002または1003の化合物または塩。
[本発明1006]
R1が、C1〜6アルキルである、本発明1005の化合物または塩。
[本発明1007]
R2が、C1〜6アルキルである、本発明1005または1006の化合物または塩。
[本発明1008]
R3が、Hである、本発明1002〜1007のいずれかの化合物または塩。
[本発明1009]
R3が、C1〜6アルキルである、本発明1002〜1007のいずれかの化合物または塩。
[本発明1010]
R4が、Hである、本発明1005〜1009のいずれかの化合物または塩。
[本発明1011]
Lが、
2021521831.tif 000091
である、本発明1002の化合物または塩。
[本発明1012]
Lが、
2021521831.tif 000092
である、本発明1002の化合物または塩。
[本発明1013]
pが、2、3、または4である、本発明1001〜1012のいずれかの化合物または塩。
[本発明1014]
pが、4である、本発明1013の化合物または塩。
[本発明1015]
oが、1、2、3、または4である、本発明1002〜1014のいずれかの化合物または塩。
[本発明1016]
oが、1または2である、本発明1015の化合物または塩。
[本発明1017]
oが、2である、本発明1016の化合物または塩。
[本発明1018]
式(Ia)の構造：
2021521831.tif 000093
を有する、本発明1001の化合物または塩。
[本発明1019]
nが、0、3、6、または9である、本発明1002〜1018のいずれかの化合物または塩。
[本発明1020]
nが、0である、本発明1019の化合物または塩。
[本発明1021]
nが、3である、本発明1019の化合物または塩。
[本発明1022]
nが、9である、本発明1019の化合物または塩。
[本発明1023]
表Aの化合物、または薬学的に許容されるその塩。
[本発明1024]
核酸を、有効量の本発明1001〜1023のいずれかの化合物または塩と接触させる段階
を含む、核酸を切断する方法。
[本発明1025]
核酸が、miR-96前駆体ヘアピンRNAである、本発明1024の方法。
[本発明1026]
化合物または塩が、本発明1018の化合物または塩である、本発明1025の方法。
[本発明1027]
核酸が、pre-miR-210前駆体ヘアピンRNAである、本発明1024の方法。
[本発明1028]
化合物または塩が、本発明1011の化合物または塩である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
接触させる段階が細胞内で行われる、本発明1024〜1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
細胞が、がん細胞である、本発明1029の方法。
[本発明1031]
がん細胞が、乳がん細胞である、本発明1030の方法。
[本発明1032]
治療的有効量の本発明1001〜1023のいずれかの化合物または塩を、その必要性のある患者に投与する段階
を含む、疾患または障害を処置する方法。
[本発明1033]
疾患または障害が、がんである、本発明1032の方法。
[本発明1034]
がんが、乳がんである、本発明1033の方法。
[本発明1035]
乳がんが、三種陰性乳がんである、本発明1034の方法。
[本発明1036]
化合物または塩を投与することが、アポトーシス促進性FOXO1転写因子を抑制解除する、本発明1034または1035の方法。
[本発明1037]
アポトーシス促進性FOXO1転写因子の抑制解除が、乳がん細胞においてアポトーシスを誘発する、本発明1036の方法。
[本発明1038]
化合物または塩を投与することで、プロリルヒドロキシラーゼ(PHD)に結合して低酸素誘導因子1-α(HIF1α)の過剰ヒドロキシル化を促進するGPD1Lタンパク質の抑制を解除し、プロテアソームによるHIF1α分解を媒介し、乳がん細胞においてアポトーシスを誘発する、本発明1034または1035の方法。
[本発明1039]
治療的有効量の化合物または塩が、乳がん細胞においてアポトーシスを誘発する、本発明1032〜1038のいずれかの方法。
[本発明1040]
治療的有効量の化合物または塩が、健常な乳房細胞においてアポトーシスを誘発しない、本発明1039の方法。
[本発明1041]
治療的有効量の化合物または塩が、DNAに結合しない、またはRNAに結合するよりも少なくとも5倍少なくDNAに結合する、本発明1032〜1040のいずれかの方法。
[本発明1042]
A2〜4-リンカー-Htの構造を有し、
式中、
Aがアデノシンであり、
リンカーが、N、OおよびSから個別に選択される1〜20個のヘテロ原子が割り込んでいてもよい、5〜150個の炭素原子を含み、かつ
HtがRNA標的指向基である、
化合物、または薬学的に許容されるその塩と、
RNAを接触させる段階
を含む、RNAを切断する方法。
[本発明1043]
Htが、
2021521831.tif 000094
を含む、本発明1041の方法。
[本発明1044]
化合物または塩が、A4-リンカー-Htを含む、本発明1041または1042の方法。
【国際調査報告】
2021521831.tif 000095
2021521831.tif 000096