(57)【要約】  本発明は、敗血症性胆汁うっ滞の治療における使用のためのＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤に関し、ここで、阻害剤は、選択的ナノ構造送達システムによって肝臓内に標的化され、ここで、選択的ナノ構造送達システムは、少なくとも１つのポリメチン色素及び少なくとも１つのポリマー及び／又は少なくとも１つの脂質及び／又は少なくとも１つのウイルス様粒子を含み、ここで、少なくとも１つのポリメチン色素は、対称又は非対称ポリメチンである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
敗血症性胆汁うっ滞の治療における使用のためのＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤であって、該阻害剤が、選択的ナノ構造送達システムによって肝臓内に標的化され、ここで、選択的ナノ構造送達システムが、少なくとも１つのポリメチン色素及び少なくとも１つのポリマー及び／又は少なくとも１つの脂質及び／又は少なくとも１つのウイルス様粒子を含み、ここで、少なくとも１つのポリメチン色素が、一般構造Ｉ又はＩＩの対称又は非対称ポリメチンであり：
2021535148.tif 000007
式中、
ａ．ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の数値を表し、
ｂ．Ｒ１−Ｒ１７は同じであっても異なっていてもよく、水素又は重水素、１つ又は複数のアルキル、ｔｅｒｔ−アルキル、シクロアルキル−（「アルキル」及び「シクロアルキル」ラジカルはまた、オレフィン構造も含む）又はアリール、カルボキシアリール、ジカルボキシアリール、ヘテロアリール又はヘテロ脂環式ラジカル、アルキルオキシ、アルキルメルカプト、アリールオキシ（ａｒｌｙｏｘｙ）、アリールメルカプト、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールメルカプト基、ヒドロキシル、ハロゲン、ニトロ又はシアノ基、アルキル置換又は環状アミン官能基であってもよく、かつ／又は２つのオルト位ラジカルは一緒になって、追加の芳香族、ヘテロ芳香族、脂肪族又はヘテロ脂肪族環を形成してもよく、
ｃ．Ｒ１−Ｒ１７置換基の少なくとも１つは、これらのポリメチン色素の親水特性を決定する、ＳＯ３−、（−ＳＯ３Ｈ）、ＰＯ３２−、ＣＯＯＨ、ＯＨ又はＮＲ３＋、シクロデキストリン又は糖などの可溶化及び／又はイオン化可能又はイオン化置換基を有し、ここで、この置換基はまた、スペーサー基によってポリメチン色素に結合されてもよく、
ｄ．Ｒ１−Ｒ１７置換基の少なくとも１つは、イソシアネート、イソチオシアネート、ヒドラジン、アミン、モノ−及びジクロロ−又はモノ−及びジブロモトリアジン、アジリジン、エポキシド、ハロゲン化スルホニル、酸ハロゲン化物、カルボン酸無水物、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル、イミドエステル、カルボン酸、グリオキサール、アルデヒド、マレイミド又はヨードアセトアミド及びホスホラミダイト誘導体又はアジド、アルキン又はオレフィンなどの反応性基（リンカー）を有し、ここで、この置換基はまた、スペーサー基によってポリメチン色素に結合されてもよく、
ｅ．芳香族、ヘテロ芳香族、脂肪族又はヘテロ脂肪族のスペーサー基は、［（ＣＨ２）ａ−Ｙ−（ＣＨ２）ｂ］ｃ又は［（Ｃ６Ｈ４）ａ−Ｙ−（Ｃ６Ｈ４）ｂ］などの構造要素からなり、ここで、Ｙは同じであっても異なっていてもよく、ＣＲ２−、Ｏ−、Ｓ−、−ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨ−、ＮＲ−、ＣＯＯ−、又はＣＯＮＲ官能基を含み、ここで、それはＲ１ーＲ１７置換基の１つに結合しており、ａ．）及びｂ．）は同じであっても異なっていてもよく、かつ０−１８の数値を有し、ｃの数値は０−１８であり、
ｆ．対応するｎ＝２、３、４又は５を有するＲ８及びＲ９置換基はまた、２回、３回、４回又は５回存在してもよく、これらは同じであっても異なっていてもよい、
ＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤。
【請求項２】
少なくとも１つのポリメチン色素がＩＣＧ誘導体である、請求項１に記載の、使用のためのＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤。
【請求項３】
少なくとも１つのポリメチン色素が、標的組織の細胞へのナノ構造送達システムの取り込みを誘発する、少なくとも１つの組織特異的輸送体を有する、請求項１又は２に記載の、使用のためのＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤。
【請求項４】
少なくとも１つの組織特異的輸送体が、ＯＡＴＰ１Ｂ１、ＯＡＴＰ−Ｃ、ＯＡＴＰ２、ＬＳＴ−１、ＯＡＴＰ１Ｂ３、ＯＡＴＰ８、ＯＡＴＰ２Ｂ１、ＯＡＴＰ１Ａ２、ＮａＤＣ３、ＳＤＣＴ２、ＮＴＣＰ、ＯＣＴ１、ＯＣＴ３、ＯＡＴ２、ＯＡＴ１、ＯＡＴ３、ＰＧＴ、ＯＣＴ２、ＯＡＴ１、ＯＡＴＰ４Ａ１、ＯＡＴＰ４Ｃ１からなる群から選択される、請求項３に記載の、使用のためのＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤。
【請求項５】
阻害剤が、ＰＫＣ阻害剤、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＭＡＰＫ阻害剤、ＰＬＣ阻害剤、ＤＡＧレベル低減剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、修飾オリゴ類似体、アンチセンス構築物、及びＲＮＡｓｅ  Ｈからなる群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の、使用のためのＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤。
【請求項６】
阻害剤が、ビスインドリルマレイミド、スタウロスポリン、ミドスタウリン、ＵＣＮ−０１、ソトラスタウリン、エンザスタウリン、ルボキシスタウリン、チバンチニブ、エンザスタウリン、Ｇｏ６９８３、Ｋ２５２ａ、ＡＮＡ−１２、レスタウルチニブ、スタウプリミド、ＣＥＰ−７０１、アルシリアフラビンＡ、及びビスインドリルマレイミドＩ−ＸＩＩ、別名ＢＩＭ  Ｉ−ＸＩＩからなる群から選択されるＰＫＣ阻害剤である、請求項５に記載の、使用のためのＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤。
【請求項７】
阻害剤が、コパンリシブ、イデラリシブ、ワートマニン誘導体、ブリオスタチン（ｂｒｙｏｓｔａｉｎ）誘導体、タセリシブ、オミパリシブ、ＡＳ６０５２４０、ＧＳＫ１０５９６１５、ブパリシブ、アルペリシブ、ピクチリシブ、セラビリシブ、ダクトリシブ、ジヒドロスフィンゴシン、カルホスチンＣ及びメリチンからなる群から選択されるＰＩ３キナーゼ阻害剤である、請求項５に記載の、使用のためのＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤。
【請求項８】
阻害剤が、ＰＫＣ又はＰＫＣサブタイプの活性を直接的又は間接的に阻害又は低減する、請求項１から７のいずれか一項に記載の、使用のためのＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤。
【請求項９】
少なくとも１つのポリマーが、ポリエステル、ポリアクリレート、ポリスチレン誘導体、ポリアミド、ポリウレタン、ポリアクリロニトリル、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、シリカ粒子、酸化セリウム（ｃｅｒｉｕｍ  ｏｘｉｄ）、酸化アルミニウム又はアパタイト粒子、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド及びポリオキサゾリン、並びにそれらのコポリマーであって、好ましくは、ランダム、グラジエント、交互、ブロック、グラフト又は星型コポリマーなどの様々な組成のコポリマーからなる群から選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載の、使用のためのＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤。
【請求項１０】
少なくとも１つのポリマーが、有機、無機、疎水性、親水性、両親媒性、アニオン性及び／又はカチオン性ポリマーである、請求項９に記載の、使用のためのＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤。
【請求項１１】
少なくとも１つのポリマーが、ＰＬＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬ、ＰＧＡ、ＰＤＭＡＥＭＡ、ＰＭＭＡ、ＰＭＡＡ、ＰＥＩ、ＰＥｔＯｘ、ＰＥＧ、ＨＰＭＡ、ＡＰＭＡ、ＰＶＰ、加水分解ＰＶＰ、及び多糖類からなる群から選択される、請求項９又は１０に記載の、使用のためのＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤。
【請求項１２】
少なくとも１つの脂質が、飽和及び不飽和脂肪酸、コレステロール誘導体、リン脂質、スフィンゴ脂質、リポタンパク質並びに糖脂質からなる群から選択される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の、使用のためのＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤。
【請求項１３】
少なくとも１つのウイルス様粒子が、バクテリオファージＭＳ２、バクテリオファージＱβ、腸内細菌ファージＰ２２、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）、ササゲクロロティックモトルウイルス（ＣＣＭＶ）、Ｂ型肝炎ウイルスキャリー（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｃａｒｒｉｅｓ）（ＨＢＶｃ）、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）からなる群から選択されるウイルスに由来する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の、使用のためのＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
胆汁うっ滞
胆汁うっ滞とは、胆汁形成と流れの障害、及びその後のビリルビンと胆汁酸の滞留を指す。胆汁うっ滞には２つの形態が知られている：例えば、胆石、膵臓癌などの腫瘍、胆管嚢胞、胆管狭窄又は寄生虫から発生する可能性がある、管系の機械的閉塞と胆道の変位によって引き起こされる閉塞性型の胆汁うっ滞である、肝外胆汁うっ滞、及び、胆汁のうっ血の原因が肝臓の内部にある肝内胆汁うっ滞（非閉塞性胆汁うっ滞）。肝内胆汁うっ滞は、遺伝的欠陥が原因で発生する可能性があり、又は例えば、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、降圧薬、抗糖尿病薬、抗けいれん薬、脂質低下薬、アナボリックステロイド、向精神薬、及び様々な抗生物質などの多くの薬物の副作用として後天的に発症される可能性がある。さらに、胆汁うっ滞は、ウイルス性又はアルコール性肝炎、肝細胞癌、肉芽腫性肝疾患、又は肝硬変の結果としても発生する可能性がある。しかし、第２の最も一般的な原因は、肝外感染症（敗血症）である。また、非経口栄養中、妊娠中、肝移植後も発生する可能性がある。ビリルビン排泄の低減の結果として、胆汁うっ滞の患者は黄疸の症状を示す。原因によっては、胆汁うっ滞はかゆみ（そう痒症）、白色便、暗色尿、吐き気、嘔吐、痛みなどの消化器の症状を伴う場合がある。胆汁うっ滞性肝疾患は、血清アルカリホスファターゼ及びビリルビンの顕著な上昇によって診断されるが、血清ビリルビンは疾患の後期まで正常である場合がある。明らかな肝内胆汁うっ滞はまれであるが、敗血症の典型的な症状である。ドイツでは、例えば、約３００００人が敗血症に関連する臓器不全を発症し、そのうちの３−６％が、黄疸の追加の症状を特徴とする、敗血症性胆汁うっ滞又は敗血症誘発性胆汁うっ滞と呼ばれる状態を発症する。診断後の最初の１２か月間の死亡率は９２％であり、他の敗血症関連臓器不全よりもはるかに高い（Jaeger et al. Jaundice Increases the Rate if Complications and One-Year Mortality in Patients with Hypoxic Hepatitis, Hepatology 2012, 56(6), 2297）。
【０００２】
敗血症
敗血症は、病原体による感染症への調節不全宿主応答によって引き起こされる生命を脅かす臓器機能不全として定義されるべきであり、２０１１年の米国の総病院経費の２００億ドル以上を占める主要な公衆衛生上の懸念である。敗血症は、世界的に死亡率と重症疾患の主な原因であると想定され得る。さらに、敗血症を生き延びた患者は、多くの場合、かなりの健康管理と社会への影響を伴う長期の身体的、心理的及び認知的障害を有する。敗血症は、様々な起源を有する可能性があり、細菌、ウイルス、真菌、又は原虫の感染症から生じる可能性がある。敗血症は、全身性炎症によって定義されるだけでなく、より重要なのは、この感染症に対する患者の調節不全の応答であり、これは臓器機能不全を引き起こし、この状態の全体的な重症度を強調する。敗血症はまた、炎症誘発性及び抗炎症性反応、心血管、神経、自律神経、ホルモン、生体エネルギー、代謝過程及び凝固の変化を伴う。最後に、臓器不全又は機能不全は、敗血症に関連する高い死亡率の原因である。そのため、敗血症の重症度を判定するために、いわゆる「逐次臓器不全評価」（ＳＯＦＡ）のスコアリング率が開発された。それらは、Ｐａｏ２／Ｆｉｏ２、血小板数、ビリルビン、クレアチニン、尿量、患者の精神状態などの臨床パラメータによって定義することができる。根底にある感染症の早期の抗生物質による根絶が、患者の生存のために最も重要であることを示すことができた。追加の治療上の考慮事項には、非経口栄養の回避、肝毒性薬の回避、血糖値のモニタリング、及び必要に応じて適切な供給、体外式肝臓サポート（すなわち、アルブミン透析）が含まれる。例えば、臓器移植、がん治療又は自己免疫疾患の治療後の免疫不全患者は、一般的な病原体による感染症のリスクが増加しているだけでなく、免疫システムが損なわれていない患者にはほとんど心配のない毒性の低い微生物による日和見感染症のリスクも増加する。したがって、この高度に高まる感染症のリスクは、そのような個体が敗血症及び敗血症性ショックのリスクを増加させる素因となることは明らかである。
【０００３】
敗血症では、全身性感染症に対する調節不全宿主応答は、しばしば、胆汁排泄の連続的な障害を伴う膜輸送プロセスの肝細胞機能不全につながる（Zollner G., Trauner M.; Mechanism of cholestasis, Clin Liver Dis 2008; 12: 1-26）。結果として、敗血症の患者では、肝内（非閉塞性）胆汁うっ滞の結果として黄疸が観察され得る。課題は、胆汁うっ滞の敗血症に関連する原因と他の敗血症に関連しない原因をタイムリーに識別することである（上記を参照）。通常、敗血症性胆汁うっ滞の発症前には、敗血症の症状が臨床像を支配している。制御されていない感染症は、重要な肝細胞輸送タンパク質の機能及び発現の低減をもたらし、ビリルビン排泄の低減及び黄疸をもたらす可能性がある（Zollner G., Trauner M., I.c.）。敗血症性胆汁うっ滞は肝不全を伴い、９２％を超える死亡率を有する。
【０００４】
敗血症誘発性胆汁うっ滞
敗血症誘発性胆汁うっ滞は、肝臓の特殊な種類の排泄機能障害である。肝臓の排泄機能障害は、様々な原因を有し得る：癌腫、胆管中の嚢胞、肝臓の炎症（肝炎など）、線維症又は肝硬変、脂肪肝（アルコール性又は非アルコール性）、特定の薬（例えば、アナボリック薬、抗精神病薬、特定の抗生物質）の副作用など。敗血症性胆汁うっ滞の場合、根底にある全身性感染症が免疫系全体の障害を引き起こし、肝臓の分泌機能障害を誘発する。したがって、敗血症誘発性胆汁うっ滞は、全身性感染症の合併症を表している。現在、敗血症性胆汁うっ滞の唯一の効果的な治療法は、感染症の抗生物質療法による根底にある敗血症の治療であり、これはできるだけ早く開始されるべきものである。介入を成功させるための機会は短く、感染症の診断と抗生物質療法の初期化の遅れは、患者の予後と生存可能性を著しく悪化させる（Fuchs M., Sanyal AJ.; Sepsis and cholestasis, Clin Liver Dis 2008; 12: 151-72）。細菌感染を迅速かつ効率的に根絶するために、通常、異なる広域抗生物質の組み合わせの最大許容用量が治療に使用されるが、その理由は、原因となる病原体の診断（血液培養）が、ほとんどの場合、許容できる時間枠内では不可能であるからである。
【０００５】
全身性感染症の抗生物質療法は既知の問題にも関連しており、確かに感染症に対する調節不全の応答に起因する臓器不全の治療法ではない。さらに、いくつかの抗生物質は胆汁排泄を妨げ、遮断し、したがって胆汁うっ滞を誘発する可能性がある（上記を参照）。最も顕著な例としては、アモキシシリン及びエリスロマイシンが挙げられる。高用量の広域抗生物質療法は、抗生物質耐性を有する病原体の新たな発生を引き起こし、将来の療法の成功を妨げる。さらに、アレルギー、食品や他の医薬との相互作用など、いくつかの抗生物質の潜在的な望ましくない（毒性の）副作用のため、及び／又は特に臓器機能が損なわれている場合、主要な臓器、主に腎臓及び肝臓への直接的な損傷のために、根底にある感染症が真菌、ウイルス又は原虫である場合、抗生物質療法は無意味であるか、逆効果でさえあることを考慮しなければならない。
【０００６】
敗血症の抗生物質療法に加えて、キナーゼ阻害剤を用いた敗血症のさらなる治療アプローチが記載されている。１９９１年に出願されたＵＳＨ１１６８Ｈは、脂質類似体からなる群から選択されたＰＫＣ阻害剤を注入することを含む、炎症を軽減し、組織及び臓器の灌流を改善する敗血症性ショックの治療法を記載している。これは、ＰＫＣ阻害剤の全身投与を意味する。１９９６年に出願された米国特許第５６１６５７７号（対応する国際公開第９３／１６７０３号）は、ＰＫＣ阻害が指示される、状態の治療及び予防を記載している。これらの状態は、心血管障害及び腎障害、炎症、中枢神経系障害、免疫抑制、及び敗血症性ショックとして記載されている。米国特許出願公開第２０１１／０１３０４１５号は、ＰＫＣ阻害による、敗血症性ショックを含む様々な炎症性疾患の治療について記載している。
【０００７】
胆汁うっ滞に対するキナーゼ阻害剤、特にＰＫＣ阻害の効果が記載されているが（Anwer M.S.; Role of protein kinase C isoforms in bile formation and cholestasis, Hepatology 2014; 60(3): 1090-1097）、キナーゼ阻害剤の使用による敗血症の治療は逆効果であり、「キナーゼ阻害剤と敗血症」の段落で概説されている理由により、生命を脅かす副作用を引き起こす可能性がある（下記を参照）。最初に、胆汁うっ滞に対するキナーゼ阻害剤の役割がさらに詳細に説明される。
【０００８】
キナーゼ阻害剤及び胆汁うっ滞
肝内胆汁うっ滞の場合、肝細胞からの胆汁自体の形成が損なわれる。胆汁形成は、多くの異なる経肝溶質輸送体が関与する複雑なプロセスであり、最も顕著なのは、基底外側部位で、Ｎａ−タウロコール酸共輸送ポリペプチド（ＮＴＣＰ）、頂端側肝細胞膜で、胆汁酸塩排出輸送体（ＢＳＥＰ）及び多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）である（Anwer M.S., l.c）。これらの輸送体の原形質膜局在化は非常に動的なプロセスであり、これは翻訳後イベントによって、特に、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）及びマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）などのキナーゼによって調節される。ＰＫＣ阻害剤又はＰＩ３キナーゼ阻害剤は、胆汁うっ滞の治療のために有用な前臨床ツールであることが、様々な実験で示されている。（Anwer M.S., l.c.; Toledo et al. Arch Toxicol. 2017, 91 :2391-2403；及びLi et al Pharm. Res. 2017, 125, 105-113）。これらのキナーゼ阻害剤は、細胞増殖と免疫細胞のシグナル伝達に大きく影響し、免疫抑制剤として作用する。
【０００９】
キナーゼ阻害剤及び敗血症
上で概説されるように、敗血症は、感染症によって誘発される深刻で複雑な全身性免疫反応である。体はこの感染症に対抗するために、免疫系に依存している。ＰＫＣ及びＰＩ３キナーゼ阻害剤などのキナーゼ阻害剤は、炎症の場合に免疫応答を抑制することができることが当技術分野で知られている。したがって、過剰な炎症反応は、敗血症の場合にも、このような化合物で治療できることが示唆されている（例えば、ＵＳＨ１１６８Ｈ、米国特許第５５５８９６９号、国際公開第９３／１６７０３号、上記を参照のこと）。しかしながら、一方では、根底にある感染症自体がそのような提案された治療によって治療されていないことは確かであり、他方では、感染症に関連する状態については、体の免疫系を抑制することは確かに望ましくないことを認識しなければならない。すでに述べたように、免疫不全患者は一般的な病原体による感染症のリスクが増加しており、この高度に発達した感染症のリスクが患者に敗血症及び敗血症性ショックのリスクを増加させる素因となることは明らかである。ＰＫＣ及びＰＩ３キナーゼ阻害剤などのキナーゼ阻害剤は、それらの免疫抑制特性に起因して、様々な（追加の）感染症の発生率を高めることも知られている。これらの理由から、様々な病原体の状態、特定の種類のがんの治療における使用のための市販のキナーゼ阻害剤の製造業者は、免疫抑制効果を示し、患者に感染症又は炎症が存在する場合におけるこれらの阻害剤の全身投与に対して明示的に警告している。例えば、以下を参照：
・  ２００７年５月２４日のＥＭＥＡレポートＥＭＥＡ／Ｈ／Ｃ／７５３（Ｄｏｃ．Ｒｅｆ．ＥＭＥＡ／１５０９６４／２００７）、１３ページ、ＰＫＣ阻害剤ルボキシスタウリン（薬物名Ａｒｘｘａｎｔ；糖尿病性網膜症に適応される）に関する；
・  医療専門家向けのＭｅｄｓｃａｐｅサイトでは、ＰＩ３Ｋ阻害剤であるコパンリシブ（薬物名Ａｌｉｑｏｐａ、再発性濾胞性リンパ腫に適応される）について、感染症の場合は治療を差し控える必要があると記載されている；感染症（敗血症自体であっても）のリスクの増加は、Kim et al. BJC, 2018, 118, 462-470によって詳細に記載されている。
・  Medscape (l.c.)は、感染症の場合にＰＩ３Ｋ阻害剤イデラリシブ：（薬物名Ｚｙｄｅｌｉｇ；リンパ腫の３つのクラスに適応される）による治療の差し控えを規定しており、特に敗血症；規制：「感染症が回復するまでイデラリシブを中断する」と言及している。これはまた、Zelenetz et al. Lancet Oncol. 2017, 18:297-311にも記載されている。彼らは、プラセボと比較して、イデラリシブ投与中の有害作用として敗血症を発症するリスクが５倍高いことを記載している。
・  Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ  ＧｍｂＨ  （２０１７）：Ｒｙｄａｐｔ（登録商標）２５ｍｇ  Ｗｅｉｃｈｋａｐｓｅｌｎ、Ｆａｃｈｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（専門情報）、ステータス２０１７年９月は、ＰＫＣ阻害剤ミドスタウリン（薬物名ＲＹＤＡＰＴ；ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）に適応される）に関する処方情報のハイライトを提供している。１ページの右の列と５ページの表２は、ミドスタウリンの有害反応を示している；６ページの最後の段落には、「５％以上（≧５％）で報告されたグレード３以上（≧３）の有害反応は、疲労、敗血症、胃腸出血、肺炎、下痢、発熱性好中球減少症．．．．（表４）」であったことが明記されている。７ページには、次のように明記されている：「有害反応に起因する治療の中止が、患者の２１％で発生した。治療中止を引き起こす最も頻度の高い有害反応には感染症が含まれていた。．．．．重篤な有害反応は患者の６８％で報告され、最も一般的には（≧２０％）感染症と胃腸障害によるものであった」、及び「根底にある悪性腫瘍とは関係のない治療中の死亡が１６人の患者（１１％）で発生し、最も一般的には感染症（敗血症又は肺炎）から、続いて心臓イベントから発生した。疾患の進行による治療中の死亡のうち、４人は感染によるものであった」。８ページには、敗血症を患っている患者の９％以上（≧９％）で発生する有害反応が概説されている。
【００１０】
前述のことから、敗血症が存在する場合、キナーゼ阻害剤を全身投与してはならないことが明らかになった。これは教示であり、結果的に、当業者は、敗血症のような全身性感染症の間に、胆汁うっ滞を治療するためにキナーゼ阻害剤を投与することを考慮しないであろう。
【００１１】
要約すれば：上に概説されるように、敗血症性胆汁うっ滞（別名：敗血症誘発性又は敗血症関連胆汁うっ滞）の現在知られている治療法は、根底にある全身性感染症の治療法である。根底にある全身性感染症を伴う状態の場合、全身投与された免疫抑制キナーゼ阻害剤で炎症反応を抑制することは望ましくなく、その理由は特にそのような薬物が全身投与されるとき、免疫調節の有害作用が生命を脅かす状態をもたらす可能性があるためである。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、有害な副作用を回避することによって、少なくとも最小限に抑えることによって、敗血症性胆汁うっ滞の効果的な治療を提供することである。さらに、本発明の目的は、敗血症性胆汁うっ滞自体の直接治療を提供することである。
【００１３】
この目的は、本発明によって、及び胆汁形成に関与する輸送体を最終的に調節するプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性を低下させるか又は阻害する化合物で敗血症性胆汁うっ滞を治療することによって解決された。これらの化合物は、特有かつ選択的送達システムによって肝臓内へ標的化される。
【００１４】
本発明は、その第１の態様において、敗血症性胆汁うっ滞の治療における使用のためのＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤に関し、ここで、阻害剤は、選択的ナノ構造送達システムによって肝臓内に標的化され、ここで、選択的ナノ構造送達システムは、少なくとも１つのポリメチン色素及び少なくとも１つのポリマー及び／又は少なくとも１つの脂質及び／又は少なくとも１つのウイルス様粒子を含み、ここで、少なくとも１つのポリメチン色素は、一般構造Ｉ又はＩＩの対称又は非対称ポリメチンであり：
2021535148.tif 000002
式中、
ａ．ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の数値を表し、
ｂ．Ｒ１−Ｒ１７は同じであっても異なっていてもよく、水素又は重水素、１つ又は複数のアルキル、ｔｅｒｔ−アルキル、シクロアルキル−（「アルキル」及び「シクロアルキル」ラジカルはまた、オレフィン構造も含む）又はアリール、カルボキシアリール、ジカルボキシアリール、ヘテロアリール又はヘテロ脂環式ラジカル、アルキルオキシ、アルキルメルカプト、アリールオキシ（ａｒｌｙｏｘｙ）、アリールメルカプト、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールメルカプト基、ヒドロキシル、ハロゲン、ニトロ又はシアノ基、アルキル置換又は環状アミン官能基であってもよく、かつ／又は２つのオルト位ラジカル、例えば、Ｒ３及びＲ４、Ｒ１３及びＲ１４、並びに／又はＲ１及びＲ２並びにＲ１１及びＲ１２並びに／又はＲ７及びＲ９は、一緒になって、追加の芳香族、ヘテロ芳香族、脂肪族又はヘテロ脂肪族環を形成してもよく、
ｃ．Ｒ１−Ｒ１７置換基の少なくとも１つは、これらのポリメチン色素の親水特性を決定する、ＳＯ３−、（−ＳＯ３Ｈ）、ＰＯ３２−、ＣＯＯＨ、ＯＨ又はＮＲ３＋、シクロデキストリン又は糖などの可溶化及び／又はイオン化可能又はイオン化置換基を有し、ここで、この置換基はまた、スペーサー基によってポリメチン色素に結合されてもよく、
ｄ．Ｒ１−Ｒ１７置換基の少なくとも１つは、イソシアネート、イソチオシアネート、ヒドラジン、アミン、モノ−及びジクロロ−又はモノ−及びジブロモトリアジン、アジリジン、エポキシド、ハロゲン化スルホニル、酸ハロゲン化物、カルボン酸無水物、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル、イミドエステル、カルボン酸、グリオキサール、アルデヒド、マレイミド又はヨードアセトアミド及びホスホラミダイト誘導体又はアジド、アルキン又はオレフィンなどの反応性基（リンカー）を有し、ここで、この置換基はまた、スペーサー基によってポリメチン色素に結合されてもよく、
ｅ．芳香族、ヘテロ芳香族、脂肪族又はヘテロ脂肪族のスペーサー基は、［（ＣＨ２）ａ−Ｙ−（ＣＨ２）ｂ］ｃ又は［（Ｃ６Ｈ４）ａ−Ｙ−（Ｃ６Ｈ４）ｂ］などの構造要素からなり、ここで、Ｙは同じであっても異なっていてもよく、ＣＲ２−、Ｏ−、Ｓ−、−ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨ−、ＮＲ−、ＣＯＯ−、又はＣＯＮＲ官能基を含み、ここで、それはＲ１ーＲ１７置換基の１つに結合しており、ａ．）及びｂ．）は同じであっても異なっていてもよく、かつ０−１８の数値を有し、ｃの数値は０−１８であり、
ｆ．対応するｎ＝２、３、４又は５を有するＲ８及びＲ９置換基はまた、２回、３回、４回又は５回存在してもよく、これらは同じであっても異なっていてもよい。
【００１５】
本発明の好ましい実施態様では、少なくとも１つのポリメチン色素はＩＣＧ誘導体である。
【００１６】
したがって、本発明の好ましい実施態様は、敗血症性胆汁うっ滞の治療における使用のためのＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤に関し、ここで、阻害剤は、選択的ナノ構造送達システムによって肝臓内に標的化され、ここで、選択的ナノ構造送達システムは、少なくとも１つのＩＣＧ誘導体、及び少なくとも１つのポリマー及び／又は少なくとも１つの脂質及び／又は少なくとも１つのウイルス様粒子を含み、ここで、少なくとも１つのＩＣＧ誘導体又はＩＣＧ様ポリメチン色素は、本明細書に開示される（上記及び特許請求の範囲に示され、さらに定義される）一般構造Ｉ又はＩＩの対称又は非対称ポリメチンである。
【００１７】
用語「ＩＣＧ誘導体」は、構造Ｉ及びＩＩによる２つのインドール部分を有する任意のポリメチン色素を意味し、ここで、少なくとも１つの残基はカップリング反応に使用することができ、カップリング後の正味電荷は−１又は＋／−０である。
【００１８】
したがって、本発明によるＩＣＧ誘導体、ＩＣＧ様ポリメチン色素、ＩＣＧベースのポリメチン色素は、本明細書に開示されるような一般構造Ｉ又はＩＩに該当する対称又は非対称のポリメチン色素に関する。
【００１９】
用語「ＩＣＧ誘導体」、「ＩＣＧ様ポリメチン色素」及び「ＩＣＧベースのポリメチン色素」は、同じ意味を有する同義語として使用される。
【００２０】
本発明によれば、阻害剤は、好ましくは、本発明の選択的ナノ構造送達システムによって肝臓の実質細胞内に送達される。
【００２１】
胆汁形成は、多くの異なる経肝溶質輸送体が関与する複雑なプロセスであり、最も顕著なのは、Ｎａ−タウロコール酸共輸送ポリペプチド（ＮＴＣＰ）、胆汁酸塩排出輸送体（ＢＳＥＰ）及び多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）である（Anwer, l.c.）。これらの輸送体は、肝細胞の基底部位にある。
【００２２】
これらの輸送体の原形質膜局在化は非常に動的なプロセスであり、これは翻訳後イベントによって、特に、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）及びマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）などのプロテインキナーゼのようなキナーゼによって調節される。ＰＫＣ又はＰＩ３Ｋ阻害剤は、胆汁うっ滞の治療のために有用な前臨床ツールであることが様々な実験で示されている。（Anwer, l.c.; Toledo et al., l.c.; Li et al., l.c.）。これらのキナーゼ阻害剤は、細胞増殖と免疫細胞のシグナル伝達に大きく影響し、免疫抑制剤として作用する。
【００２３】
シグナル伝達経路によると、ＰＫＣの活性は、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）及びカルシウム（Ｃａ２＋）などの調節分子の濃度に大きく依存し、例えば、
・  ＤＡＧ濃度は、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）などの酵素によって媒介され、これは様々なＧαｑ共役ＧＰＣＲ、ＡＫＴ及びＭＡＰキナーゼ、成長因子、並びにカンナビノイド受容体の活性化によって高度に制御される。
・  ＰＬＣ活性は、ＰＩＰ２をＰＩＰ３にリン酸化するＰＩ３キナーゼによって主に制御される。
・  活性化されたＰＬＣは、ＰＩＰ２をＩＰ３とＤＡＧに切断する。ＩＰ３は、小胞体（ＥＲ）へのＣａ放出を誘発し、これは次にＰＫＣを活性化する。また、分子ＤＡＧ自体もＰＫＣの活性化に寄与している。
・  したがって、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＰＬＣ阻害剤、ＤＡＧレベル低減剤、又はＰＫＣの低減に最終的に寄与する任意の薬剤は、敗血症性胆汁うっ滞を治療するための有用なツールである。
【００２４】
生化学的観点から、ＰＩ３キナーゼはシグナル伝達物質であるジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を生成し、これが他のプロテインキナーゼ（例えばＰＫＣ）を活性化する。したがって、ＰＩ３キナーゼ阻害剤は基本的にＤＡＧレベルを低減させ、したがって下流のＰＫＣも阻害する。このような理由から、それ以外のＤＡＧレベルを低減させることができる薬剤は、敗血症性胆汁うっ滞の治療においても有用である。
【００２５】
したがって、本発明の用語「ＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤」は、生体内及び細胞内のＰＫＣ媒介シグナルの伝達（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）及び／又は伝達（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）に影響を与える任意の物質に関する。そのような阻害剤は、特に、ＰＫＣシグナル伝達経路に関与するキナーゼの阻害剤を含む。
【００２６】
用語「ＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤」はさらに、ＰＫＣ経路の上流の調節分子を介して、ＰＫＣの活性及び／又は発現及び／又はタンパク質フォールディングに直接的又は間接的に影響を与える、好ましくは低減又は阻害する任意の物質を意味する。好ましい実施態様では、ＰＫＣ自体、ＰＩ３キナーゼ、ＤＡＧ、ＰＬＣ、ＡＭＰＫ、ＭＡＰＫ、ＡＫＴの活性及び／又は発現及び／又はタンパク質フォールディングは、本発明の「ＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤」によって低減される。ＰＫＣシグナル伝達経路の本発明の阻害剤は、ＰＫＣ活性低減剤として理解することができる。本発明によれば、用語「ＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤」、「ＰＫＣ活性低減剤」及び「ＰＫＣ活性の阻害剤」、「ＰＫＣ発現の阻害剤」及び「ＰＫＣフォールディングの阻害剤」は同義語として使用される。
【００２７】
そのような「ＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤」は、例えば以下によって、上記のタンパク質／シグナル伝達分子を直接阻害するように作用することができる。
・  ミドスタウリン、スタウロスポリン、ＢＩＭ−１及び他の薬物などのＰＫＣ阻害剤によるＰＫＣの直接阻害；又は
・  ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、修飾オリゴ類似体又はアンチセンス構築物によるＰＫＣ又はそれぞれのタンパク質／シグナル伝達分子のタンパク質生合成のサイレンシング；並びにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドなど、当技術分野で知られている他の分子生物学的方法を使用することによって。
【００２８】
結果として、好ましい実施態様では、敗血症性胆汁うっ滞の治療における使用のためのＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤は、ＰＫＣ又は任意のＰＫＣサブタイプの活性を直接的又は間接的に阻害又は低減する。
【００２９】
本発明によるＰＫＣの活性の直接阻害又は低減は、好ましくはＲＮＡｉを介して、それぞれの遺伝子を発現停止する核酸構築物を含むＰＫＣ阻害剤によって活性に影響を与えることを意味する。これは、一般的に知られている方法、好ましくは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｓｅ  Ｈ、モルホリノなどの修飾オリゴマーなどの構築物を使用する方法によって達成することができる。既知の生化学的アプローチによれば、それぞれの核酸構築物が設計され、共有結合によって、又はポリメチンベースの標的指向化部分を有するナノ担体へのカプセル化によって、ポリメチンベースの標的指向化部分に直接結合される。
【００３０】
本発明によるＰＫＣの活性の間接的な阻害又は低減は、好ましくは、ＰＫＣ活性に必要な経路及び／又はシグナル伝達分子の阻害又は低減によって達成される。ＰＫＣ活性は、様々な要因によって促進される。ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＰＬＣ阻害剤、ＤＡＧレベル低減剤、又はＰＫＣの低減に最終的に寄与する任意の薬剤は、敗血症性胆汁うっ滞を治療するための有用なツールである。したがって、ＰＫＣ活性を低減させることによってＰＫＣシグナル伝達経路に影響を与えることができる全ての種類の薬剤（例えば、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＰＬＣ阻害剤）は、本発明による阻害剤であり、敗血症性胆汁うっ滞の治療のための有用なツールである。これもまた、本明細書に記載のＰＩ３キナーゼ阻害剤などの小分子阻害剤、及び／又はＵ−７３１２２、Ｄ６０９、マノアリド（ｍａｎａｌｉｄｅ）、エデルフォシン（ｅｄｅｌｆｏｓｉｎ）若しくはそれぞれの核酸構築物などのＰＬＣ阻害剤のいずれかによって達成することができる。
【００３１】
本発明によるＰＫＣ活性の直接的及び間接的な阻害又は低減もまた理解されなければならず、ＰＫＣサブタイプ遺伝子を含むＰＫＣ遺伝子の発現、それらの転写及び／又は翻訳及び／又はタンパク質フォールディングへの任意の影響を含み、遺伝子産物及び／又はＰＫＣタンパク質を減少させ、かつ／又は生じない結果をもたらす。そのような影響は、ＰＫＣ発現、したがってＰＫＣ活性を減少（低減）又は防止、遮断、スイッチオフ（阻害）するとして理解されなければならない。
【００３２】
現在、ＰＫＣ阻害剤は主にがん治療及び自己免疫疾患の治療に使用されている。現在、試験された薬剤として２つのＰＫＣ阻害剤、すなわちＲｙｄａｐｔ（登録商標）（ミドスタウリン）とＡｒｘｘａｎｔ（登録商標）（ルボキシスタウリン）が利用可能である。
【００３３】
さらに知られている薬物は、イデラリシブ及びコパンリシブに関連している。両方の化合物について、専門家のための情報サイトでは（Ｍｅｄｓｃａｐｅリファレンス：参照／上記）、それらの免疫抑制特性のために、敗血症を含む重篤な感染症の場合には厳密に禁忌であり、その間は治療を中止することが推奨される。
【００３４】
これまで、診療所において敗血症性胆汁うっ滞の特異的治療法は利用できず、根底にある敗血症の間の脆弱な免疫状態と、敗血症性胆汁うっ滞に対するプラスの効果を引き出すために必要な肝臓中での治療用量とに起因して、全身投与される上記の薬剤のいずれかによる治療は危険が多すぎるであろう。
【００３５】
したがって、本発明は、患者の身体に対する危険な全身性免疫抑制作用を回避、少なくとも軽減することによる、敗血症性胆汁うっ滞そのものの特異的治療法を初めて提供するものである。これは、本発明によれば、作用側、すなわち肝実質細胞への治療剤の選択的標的指向化によって達成される。本発明のナノ構造送達システムは、敗血症性胆汁うっ滞を治療するための能動的肝細胞標的指向化を提供し、これは、肝臓組織に存在する特殊なレクチンによって選択的に認識されるポリメチン色素由来の標的指向化部分によって達成される。本発明によれば、これらの治療活性剤の全身循環及び必要な治療用量も、病的状態の治療におけるＰＫＣ阻害剤の全身投与と比較して大幅に低減することができる。
【００３６】
本発明によれば、敗血症性胆汁うっ滞を治療するために、阻害剤は、例えば注射によって投与され、本発明のナノ構造送達システムによって、それらの作用部位、すなわち肝臓に選択的に送達される。このようにして、阻害剤を所望の作用側に送達することなく、上述のキナーゼ阻害剤を用いた感染症の全身治療に付随する副作用（免疫抑制）が低減され、好ましくは回避される。さらに、ナノ構造送達システムを有する阻害剤の必要な用量は、肝臓を標的としたナノ構造送達システムを有しない阻害剤の用量と比較して大幅に低減される。本発明は、敗血症性胆汁うっ滞自体の治療を初めて提供する。
【００３７】
根底にある全身性感染症、すなわち敗血症を伴う状態としての敗血症性胆汁うっ滞を治療するために、免疫系を抑制することは望ましくない。したがって、本発明は、無視できるほどの全身性免疫抑制効果を伴う、ＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤の肝臓内への標的化輸送のためのポリメチン色素駆動型選択的送達システムを記載する。その理由はそれらが肝臓で選択的に作用し、胆汁排泄のみを特異的に修飾し、胆汁うっ滞を回復することができるからである。このようにして、本発明の薬剤、すなわち、ＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤／  ＰＫＣ活性の阻害剤は、標的化されていない対応物と比較してはるかに低い用量で投与され、作用の場所に対してのみ輸送され、したがって、敗血症性胆汁うっ滞の治療に適している。したがって、本発明は、敗血症性胆汁うっ滞を治療するための非常に効果的な方法を表し、ここで、キナーゼ阻害剤が最先端の感染症の治療において投与されるときに一般に生じる全身性の有害作用が大幅に低減される。
【００３８】
本発明による用語「薬剤」又は「治療剤」は、ＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤を意味し；さらに、用語「薬剤」又は「薬剤（ａｇｅｎｔｓ）」は、用語「抗胆汁うっ滞剤」及び「胆汁うっ滞剤」並びに「薬物」又は「薬物（ｄｒｕｇｓ）」と同義語として使用される。さらに、用語「薬剤」及び「薬物」は、本発明に従って同義語として使用される。
【００３９】
本発明によるナノ構造送達システムが少なくとも１つのポリマーを含む場合、それは本明細書では「ナノ粒子」と呼ばれ；それが少なくとも１つの脂質を含む場合、それは本明細書では「リポソーム」と呼ばれる。本発明によるナノ構造送達システムがポリマー及び脂質の両方を含む場合、それは本明細書では「ナノ粒子」又は「リポソーム」とも呼ばれる。本発明によるナノ構造送達システムが、少なくとも１つのポリマー及び少なくとも１つの核酸構築物を含む場合、それは、本明細書では「ポリプレックス」とも呼ばれる。本発明によれば、ナノ粒子、リポソーム、ウイルス様粒子、並びにポリプレックス、リポプレックス及びペプトプレックスは、ナノ構造送達システムに関する。
【００４０】
ナノ粒子は、複数の分子から構築され得る。これらのナノ粒子は、特定のユニット（モノマー）が反復ユニットであるという事実によってこれらのポリマーが特徴づけられるポリマーからなり得る。ポリマーは、これらのモノマーの化学反応（重合）によって互いに共有結合している。これらのポリマーの一部が疎水性を有する場合、それらは水性環境においてナノスケール構造（例えば、ナノ粒子、ミセル、ベシクル）を形成し得る。それらの疎水性のため、脂質はまた、ナノ粒子（ミセル、リポソーム）を形成するために使用され得る。
【００４１】
本発明によるナノ構造送達システムが、負に帯電した遺伝物質と複合体を形成する少なくとも１つの正に帯電したポリマーを含む場合、それは本明細書では「ポリプレックス」と呼ばれ；それが少なくとも１つの正に帯電した脂質、及び負に帯電した遺伝物質を含む場合、それは本明細書では「リポプレックス」と呼ばれ、それが少なくとも１つの正に帯電したペプチド、及び負に帯電した遺伝物質を含む場合、それは本明細書では「ペプトプレックス」と呼ばれる。
【００４２】
ポリメチン色素又はインドシアニングリーン（ＩＣＧ）のようなポリメチン様色素は、主に肝臓に存在するいくつかの有機アニオン輸送ポリペプチド（ＯＡＴＰ）と相互作用することが知られている。そのため、ＩＣＧは肝臓の機能検査に広く使用されている。いわゆるインドシアニングリーン血漿消失率は、胆汁排泄率の能力を反映しており、診療所において標準的な方法として使用されている。
【００４３】
さらに、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）のようないくつかのポリメチン色素又はポリメチンベースの色素は、これらの化合物が光によって励起されると一重項酸素及びフリーラジカルを発生するため、がん治療における光増感剤として使用することができることが知られている。したがって、そのような色素は、診断のためだけでなく、がんの光線力学的治療のモデル化合物のためにしばしば記載される。
【００４４】
ほとんど全ての色素が、それらの構造に関係なく、自発的に形成された色素−リポソームコンジュゲートのいわゆる「増強された透過性及び保持」又はＥＰＲ効果のために、がん組織に蓄積することは好都合である（Ngoune et al., Accumulating nanoparticles by EPR: A route of no return, J. Contr. Rel. 2016）。
【００４５】
ＥＰＲ効果は、腫瘍組織が通常、増強された血管新生、及びナノ粒子又はアルブミン粒子の侵入を促進する漏出性血管構造を特徴とすることを意味する。さらに、リンパの流れは通常、腫瘍組織において大きく減少する。これら２つの因子は最終的に、リポソーム及びアルブミン又はリポタンパク質コンジュゲート小分子のような粒子の蓄積に関与する。このような粒子が腫瘍組織に蓄積する場合、能動的担体システム又は輸送システムが関与しないため、このプロセスは「受動的標的指向化」と称される。ＥＰＲ効果は、がん治療と診断において広く利用されている：
・  診断上の理由のために、色素（例えば、エバンスブルー、ＩＣＧ、トルイジンブルー、フルオレセイン）
・  腫瘍の光線力学治療のために、リポタンパク質又はアルブミンと複合体を形成するいくつかのＮＩＲ色素が使用される。
・  強化された腫瘍治療のために、薬物はリポソーム又は粒子内にカプセル化され、腫瘍組織への蓄積を強化する。例えば、承認された薬物のＤｏｘｅｌ（登録商標）。
【００４６】
ＥＰＲ効果を念頭に置くと、この種類の標的指向化は能動的プロセスではなく、これらの色素を含む粒子が腫瘍内に蓄積したとしても、上記の色素を能動的腫瘍標的指向化のために使用できないことは明らかである。
【００４７】
しかし、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）のような一部のポリメチンベースの色素は、ＯＡＴＰを介したエンドサイトーシスによって肝臓中に能動的かつ迅速に取り込まれ、この特性を能動的な肝細胞／肝臓標的指向化に利用することが考えられ得る。しかし、化学的手段によっては、能動的肝臓／肝細胞標的化ナノ構造送達システムを操作するためにＩＣＧをポリマー又は脂質に結合させることはできない。なぜなら、アルキル鎖の末端は、化学修飾又はカップリングの「終端」を表す２つのスルホネート残基を含むからである。
【００４８】
したがって、既知のカップリング反応法を用いて、他の化学的部位（すなわち、ポリマー、タンパク質、小分子）に接続できる修飾ＩＣＧ様足場を有するポリメチン色素を設計し、合成することは、本発明の重要な工程である。さらに、色素は、カップリング後の正味電荷が−１又は±０になるように設計されている。
【００４９】
発明者らは、ＩＣＧ又はＩＣＧ様ポリメチン色素の肝細胞標的指向化は、生理学的条件下での分子の正味電荷の比率と分子の表面又は形状に大きく依存すること；及び足場だけではないことを見出した。ＩＣＧ様ポリメチン色素が官能基を有するポリマー又は脂質又は担体に結合されると、カップリング反応中に未結合官能基の正味電荷が失われる。したがって、色素分子での正味電荷の比率は、カップリング中に変化し、肝細胞の標的指向化が低減又は失われる。
【００５０】
ポリマー又は脂質又は担体に共有結合しているＩＣＧ又はＩＣＧ様ポリメチン色素の設計のために、したがって、カップリング反応に帯電基が使用される場合、電荷に寄与しないカップリング位置を使用するか、又は追加の荷電基を導入する必要がある。生理学的条件下で負の正味電荷を生成する官能基は、好ましくは、スルフェート（ｓｕｌｆａｔｅ）、スルホネート（ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、スルホンアミド（ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）、ホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ホスホネート（ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）、ボレート（ｂｏｒａｔｅ）、ボロナート（ｂｏｒｏｎａｔｅ）、ＢＲ４、パークロレート（ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ）、又はカルボン酸、強いＣＨ−、ＯＨ−、若しくはＮＨ−酸性基である。生理学的条件下で正の正味電荷を生成する官能基は、好ましくは、アミン、四級塩、グアニジン、アミジン及びそれらのそれぞれの四級塩、オキソニウムイオン、ピリジニウム塩、ピリジンである。これらのグループは全て、環状構造の一部である可能性もある（例えば、インドリニウムイオン、テトラゾリウム又は環状オキソニウムイオン、ピリリウム塩）。金属塩錯体を使用して永久電荷を生成することも適用できる可能性もある（例えば、錯化亜鉛）。
【００５１】
肝細胞のＯＡＴＰ媒介標的指向化について、本発明者らは、結合した構築物の全体的な電荷がゼロ又は−１であるべきであることを見出した。化合物の化学的性質は、本来、インドール窒素に１つの永久的な正電荷をもたらすので、これは、スルホネート又はホスホネート残基のような永久的に帯電した残基によって補償され得る。リン酸水素エステル又は硫酸水素エステルも可能であるが、安定性は低い。図２に示され、特許請求の範囲に含まれる一般的な構造Ｉ及びＩＩは、２つのインドール部分を有するポリメチン色素の構造を示す。
【００５２】
本発明のポリメチン色素の細胞選択性は、ナノ粒子又はリポソーム又はウイルス様粒子に結合され、肝臓特異的流入輸送体によって検出されるポリメチン色素の特異的相互作用を通じて得られる。本発明によるポリメチン色素のための流入輸送体は、肝細胞について定義されている。
【００５３】
肝細胞の基底外側膜の流入輸送体によって特異的に取り込まれる本発明によるポリメチン色素は、ナノ粒子を肝細胞に特異的なものにする。現在の情報及びＦＤＡによれば、以下の例示的に記載された輸送体は、肝細胞の流入輸送体の分類に入る。
2021535148.tif 000003
【００５４】
結果として、本発明の好ましい実施態様は、敗血症性胆汁うっ滞の治療における使用のためのＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤に関し、ここで、少なくとも１つのポリメチン色素は、標的組織の細胞へのナノ構造送達システムの取り込みを誘発する、少なくとも１つの組織特異的輸送体を有する。本発明のさらに好ましい実施態様によれば、前記少なくとも１つの組織特異的輸送体は、ＯＡＴＰ１Ｂ１、ＯＡＴＰ−Ｃ、ＯＡＴＰ２、ＬＳＴ−１、ＯＡＴＰ１Ｂ３、ＯＡＴＰ８、ＯＡＴＰ２Ｂ１、ＯＡＴＰ１Ａ２、ＮａＤＣ３、ＳＤＣＴ２、ＮＴＣＰ、ＯＣＴ１、ＯＣＴ３、ＯＡＴ２、ＯＡＴ１、ＯＡＴ３、ＰＧＴ、ＯＣＴ２、ＯＡＴ１、ＯＡＴＰ４Ａ１、ＯＡＴＰ４Ｃ１からなる群から選択される。
【００５５】
本発明によるポリメチン色素又はポリメチン標的指向化部分（ＰＴＭ）は、特殊な表面分子（ＯＡＴＰ）、好ましくはＯＡＴＰ１Ｂ２又はＯＡＴＰ１Ｂ３、ＯＡＴＯ２Ｂ１及びＮＴＣＰによって認識される、化学的ポリメチン（トリメチン、ペンタメチン又はヘプタメチン構造（図１及び２を参照））に関する。認識されると、ナノ構造送達システムは、ＰＴＭと一緒に、好ましくはクラスリン媒介メカニズムによって、内部移行又はエンドサイトーシスされるようになる。
【００５６】
本発明によれば、用語「ポリメチン色素」は、用語「ポリメチン標的指向化部分（ＰＴＭ）」と同義語として使用される。さらに同義語として使用される用語は、「ポリメチン色素標的指向化部分」、「ポリメチンベースの標的指向化部分」、「ポリメチン様標的指向化部分」である。これらの用語は全て同じ意味を有する。
【００５７】
用語「組織特異的輸送体」、「輸送体」及び「流入輸送体」は、本発明に従って同義語として使用される。
【００５８】
ポリメチン標的指向化部分（ＰＴＭ）をナノ構造化送達システムに、又はＰＫＣ低減剤、構築物又はポリマーに接続するために、図３に示される既知の標準的な方法を使用することができる。ＰＫＣ低減剤、構築物、又はポリマーの接続点を変更するために、標準的な方法を適用できる。最も一般的な標準的な方法が図４に示され、これは、カルボン酸からアミン、アルコールからカルボン酸、又はマレイミドへの相互変換について記載している。カルボン酸誘導体をアミン又はマレイミドに相互変換するための詳細な例示された手順は、実施例２に記載され、図６に示される。個別の適用のために、最も効率的で合成的に実現可能な標的指向化は、例えば、チップベースのマイクロ流体モデル（実施例７に例示）のような組織エンドサイトーシスのための適切なモデルにおいて調べられるべきである。
【００５９】
特に好ましい実施態様では、敗血症性胆汁うっ滞の治療における使用のためのＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤は、ＰＫＣ阻害剤、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＭＡＰＫ阻害剤、ＰＬＣ阻害剤、ＤＡＧレベル低減剤、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、修飾オリゴ類似体（例えば、モルホリノ）、アンチセンス構築物及びＲＮＡｓｅ  Ｈからなる群から選択される。
【００６０】
本発明による阻害剤ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、修飾オリゴ類似体（例えば、モルホリノ）、アンチセンス構築物及びＲＮＡｓｅ  Ｈは、当技術分野で周知の遺伝子サイレンシング技術によって構築することができるそれぞれの遺伝子を発現停止（例えば、ＰＫＣ遺伝子、ＰＩ３キナーゼ遺伝子、ＭＡＰＫ遺伝子、ＰＬＣ遺伝子の発現停止）することができるオリゴヌクレオチド構築物に関する。これらの阻害剤は、ＰＫＣ  ｓｉＲＮＡ、ＰＫＣ  ｓｈＲＮＡ、ＰＫＣ  ｍｉＲＮＡ、ＰＩ３キナーゼｓｉＲＮＡ、ＰＩ３キナーゼｓｈＲＮＡ、ＰＩ３キナーゼｍｉＲＮＡとして指定することもできる。
【００６１】
本発明によれば、ＰＫＣ活性の阻害はまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼのような適切な遺伝子編集方法を用いて達成することができる。
【００６２】
好ましい実施態様では、敗血症性胆汁うっ滞の治療における使用のためのＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤は、ビスインドリルマレイミド、スタウロスポリン、ミドスタウリン、ＵＣＮ−０１、ソトラスタウリン、エンザスタウリン、ルボキシスタウリン、チバンチニブ、エンザスタウリン、Ｇｏ  ６９８３、Ｋ２５２ａ、ＡＮＡ−１２、レスタウルチニブ、スタウプリミド、ＣＥＰ−７０１、アルシリアフラビンＡ、ケレリトリンクロリド、及びビスインドリルマレイミドＩ−ＸＩＩ、別名ＢＩＭ  Ｉ−ＸＩＩからなる群から選択されるＰＫＣ阻害剤である。
【００６３】
好ましい実施態様では、敗血症性胆汁うっ滞の治療における使用のためのＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤は、コパンリシブ、イデラリシブ、ワートマニン誘導体、ブリオスタチン（ｂｒｙｏｓｔａｉｎ）誘導体、タセリシブ、オミパリシブ、ＡＳ６０５２４０、ＧＳＫ１０５９６１５、ブパリシブ、アルペリシブ、ピクチリシブ、セラビリシブ、ダクトリシブ、ジヒドロスフィンゴシン、カルホスチンＣ及びメリチンからなる群から選択されるＰＩ３キナーゼ阻害剤である。本発明の好ましい阻害剤はまた、ＰＩ３キナーゼ阻害効果を示す新規の研究化合物を含む。
【００６４】
本発明の薬剤、すなわちＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、芳香族、ヘテロ芳香族、線状、分岐若しくは環状の原子集合体、及び／又はポリメチン標的指向化部分を含むスペーサー若しくはリンカーに直接結合され得るか、あるいはこれらの薬剤がカプセル化され又は閉じ込められるナノ粒子、リポソーム若しくはウイルス様粒子などの適切な担体に結合され得る（例えば、図１を参照）。
【００６５】
選択的肝臓標的指向化部分としての本発明のポリメチン標的指向化部分は、当技術分野で周知の通常の化学カップリング反応により、好ましくは活性化カルボン酸誘導体（例えば、無水物、ハロゲン化アシル、活性エステル）により、本発明の薬剤に（すなわち、直接阻害剤に又は適切な担体に）付着させることができ、その後、光誘起チオール−エンクリック反応により、マイケル付加（１，４−付加）、環状付加反応、Ｈｕｉｓｇｅｎ反応（例えば、アルキンのアジドへの１，３−環状付加）、ディールス・アルダー反応（例えば、テトラジン誘導体へのトランス−シクロオクテンカップリング）、モノー又はジーハロゲン化トリアジン、アジリジン、エポキシド、ハロゲン化スルホニル、イミドエステル、ホスホラミダイト、マレイミド−チオール反応、イソシアネート−、イソチオシアネートカップリング、カルボジイミドカップリング、ハロ−アセトアミドカップリングにより、アミンへカップリングさせることができる。あるいは、反応性カルボニル化合物、好ましくは、対応するアミンに還元することができるシッフ塩基を形成するアミンとともにケトン、アルデヒドアセタール又はヘミアセタールを、本発明に従って使用することができる（例えば、図３を参照のこと）。
【００６６】
本発明による用語「ナノ構造送達システム」は、治療剤、すなわち本発明の阻害剤を標的組織内に送達する、少なくとも１つのポリメチン標的指向化部分（ＰＴＭ）及び少なくとも１つのポリマー及び／又は少なくとも１つの脂質及び／又は少なくとも１つのウイルス様粒子によって特徴づけられ、標的組織を前記ナノ構造送達システムと接触させることを含む。
【００６７】
標的指向化ユニットとしての少なくとも１つのポリメチン標的指向化部分（ＰＴＭ）は、標的組織内へのナノ構造送達システムの能動的かつ選択的な輸送を誘発する。
【００６８】
少なくとも１つのポリメチン標的指向化部分（ＰＴＭ）は、細胞表面と相互作用し、細胞表面上にナノ構造送達システムを蓄積することによって、標的組織の細胞内へのナノ構造送達システムの取り込みをさらに誘発する。
【００６９】
本発明による用語「ナノ構造送達システム」は、ポリプレックスにも関係し、これは、正に帯電したポリマーに連結された負に帯電した核酸構築物との間の複合体として理解されなければならない。用語「ナノ構造担体システム」及び「ナノ構造送達システム」は、本発明に従って同義語として使用される。
【００７０】
本発明のナノ構造送達システムは、ナノ構造担体とポリメチン標的指向化部分との組み合わせを含む。ナノ構造担体システムは、少なくとも１つのポリマー及び／又は少なくとも１つの脂質又はウイルス様粒子を含み、有効成分−本発明によれば、ビヒクルのようなＰＫＣ活性阻害剤又は低減剤（ＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤）を運ぶことができる。これらのナノ構造システムは、ＤＬＳ、ＡＵＣ、ＡＦ４、ＤＳＣ、ＩＴＣ、ＸＲＤ、ＳＡＮＳ、ＳＡＸＳなどの当技術分野で知られている方法、又はＳＥＭ、ＳＴＥＭ、又はクライオＴＥＭ、ＡＦＭなどの特殊な顕微鏡法によって検出され、特徴づけることができる。その形状は、好ましくは、球形、楕円形、棒状、樽状、円盤状、又は多面体のいずれかであり得るが、これらに限定されない。サイズは、好ましくは１ｎｍから８００ｎｍまで変化する。
【００７１】
好ましい実施態様では、少なくとも１つのポリマー、脂質、ウイルス様粒子及び／又は活性剤は、化学修飾及びポリメチン標的指向化部分（ＰＴＭ）の付着を可能にする官能基を含む（例えば、図４を参照）。ポリマーは有機又は無機であり得、ビヒクルのように治療剤を固定する。無機粒子は、酸化物にアミン官能基を導入する、アミノプロピルトリメチルシラン（ＡＰＴＥＳ）のような官能化シランでシラン化することによって官能化される可能性がある。
【００７２】
本発明の好ましい実施態様では、少なくとも１つのポリマーは、ポリエステル、ポリアクリレート、ポリスチレン誘導体、ポリアミド、ポリウレタン、ポリアクリロニトリル、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、シリカ粒子、酸化セリウム、酸化アルミニウム又はアパタイト粒子、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド及びポリオキサゾリン、並びにそれらのコポリマーであって、好ましくは、ランダム、グラジエント、交互、ブロック、グラフト又は星型コポリマーなどの様々な組成のコポリマーからなる群から選択される。より好ましくは、少なくとも１つのポリマーは、有機、無機、疎水性、親水性、両親媒性、アニオン性及び／又はカチオン性ポリマーである。
【００７３】
ポリマーは、ＰＬＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬ、ＰＧＡ、ＰＤＭＡＥＭＡ、ＰＭＭＡ、ＰＭＡＡ、ＰＥＩ、ＰＥｔＯｘ、ＰＥＧ、ＨＰＭＡ、ＡＰＭＡ、ＰＶＰ、加水分解ＰＶＰ、多糖類、例えば、アラビノガラクタン、キトサン、プルラン、アルギン酸塩、セルロース又はデンプン誘導体などからなる群からさらにより好ましくは選択される。本発明によるポリマーはまた、有効成分を捕捉／カプセル化することができる、多孔質粒子を形成することができ、好ましくは、シリカベース、アルミナベース、酸化チタンベース、酸化セリウムベース、炭素ベース、ゼオライトベース、又はアパタイトベースである無機ポリマーを含む。
【００７４】
本発明の好ましい実施態様では、少なくとも１つの脂質は、飽和及び不飽和脂肪酸、コレステロール誘導体、リン脂質、スフィンゴ脂質、リポタンパク質並びに糖脂質からなる群から選択される。
【００７５】
本発明による少なくとも１つのポリマー及び／又は少なくとも１つの脂質は、好ましくは、生体適合性ポリマー及び／又は脂質である。
【００７６】
ナノ構造送達システムは、好ましくは、ウイルス様粒子、例えば、タンパク質又はタンパク質シェルを含む。そのようなウイルス様粒子は、好ましくは、しかし限定されないが、以下のウイルスに由来する、タンパク質シェルを好ましくは含む：バクテリオファージＭＳ２、バクテリオファージＱβ、腸内細菌ファージＰ２２、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）、ササゲクロロティックモトルウイルス（ＣＣＭＶ）、Ｂ型肝炎ウイルスキャリー（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｃａｒｒｉｅｓ）（ＨＢＶｃ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。タンパク質は、当技術分野で周知の方法により、それぞれのウイルス遺伝物質をサッカロマイセス・セレビシエのような適切な発現系の中にトランスフェクトすることによって得られる。
【００７７】
その結果、本発明の好ましい実施態様では、少なくとも１つのウイルス様粒子は、バクテリオファージＭＳ２、バクテリオファージＱβ、腸内細菌ファージＰ２２、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）、ササゲクロロティックモトルウイルス（ＣＣＭＶ）、Ｂ型肝炎ウイルスキャリー（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｃａｒｒｉｅｓ）（ＨＢＶｃ）、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）からなる群から選択されるウイルスに由来する。
【００７８】
本発明は、図を参照してより詳細に説明されるが、これらは、本発明の範囲を制限するために理解される必要はない。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１Ａ】図１は、敗血症性胆汁うっ滞の治療のために有用な、様々な異なるナノ構造送達システムを生成／調製するための例示的なビルディングブロックを示す。図１Ａは、ＰＫＣ活性を低減させる様々な潜在的な化合物を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、いくつかの代表的なポリメチン色素標的指向化部分（ＰＴＭ）を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、標的化ナノ構造送達システムの例を示す。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは、好ましくはポリメチンベースの標的指向化部分（ＰＴＭ）として有用である、特許請求されたポリメチン色素のマーカッシュ式を示す。
【図３−１】図３は、肝細胞標的指向化のために有用なポリメチン標的指向化部分（ＰＴＭ）の例を示し、式中「Ｒ」は、担体システム（ポリマー、ウイルス様粒子、脂質、又は遺伝子構築物）の可能な接続点を表す。図３は、薬剤、薬剤構築物、担体ポリマー、ウイルス様粒子又はリンカーへのポリメチン標的指向化部分（ＰＴＭ）の合成／付着のための一般的な合成アプローチをさらに示す。
【図３−２】図３は、肝細胞標的指向化のために有用なポリメチン標的指向化部分（ＰＴＭ）の例を示し、式中「Ｒ」は、担体システム（ポリマー、ウイルス様粒子、脂質、又は遺伝子構築物）の可能な接続点を表す。図３は、薬剤、薬剤構築物、担体ポリマー、ウイルス様粒子又はリンカーへのポリメチン標的指向化部分（ＰＴＭ）の合成／付着のための一般的な合成アプローチをさらに示す。
【図４】図４は、薬剤／薬剤構築物、ポリマー、及び標的指向化部分の付着のための官能基を導入及び／又は変更するための例示的な方法を示す。
【図５】図５は、肝臓標的指向化のためのナノ構造送達システムに結合するのに適した２つの代表的なＰＴＭ（ＰＴＭ１及びＰＴＭ２）を合成するスキームを示す。詳細なプロトコルは、実施例１ａ及び１ｂに示される。同様の手順を様々なＰＴＭの合成に採用することができる。
【図６】図６は、ＣＯＯＨ官能化ＰＴＭが、それぞれのアミン−（７ａ）又はマレイミド官能化（１３ａ）ＰＴＭに変換され得る方法の例を示す。詳細な手順が実施例２に与えられる。
【図７】図７は、ＰＬＧＡからの末端カルボン酸へのアミノ末端ＰＴＭ（７ａ）のカップリングを示す。詳細な手順が実施例３に与えられる。
【図８】図８は、マレイミド官能化ＰＴＭ（１３ｂ）への核酸物質の直接カップリングのための戦略を示す。図８Ａ：主にＤＮＡ様構築物のための３’末端標識戦略；図８Ｂ：ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は修飾ヌクレオチドのための５’末端標識戦略。詳細な手順が実施例４に与えられる。
【図９】図９は、エマルジョン、二重エマルジョン、及びナノ沈殿によるナノ粒子の調製方法を示す。図９Ａ：ダブルエマルジョン、図９Ｂ：エマルジョン；図９Ｃ：ナノ沈殿（滴下）。
【図１０】図１０は、ＨｅｐＧ２細胞における標的化ナノ粒子と遊離薬物（ＢＩＭ−１）の毒性を示す。
【図１１】図１１は、２つの異なる便のバッチを使用した腹膜汚染及び感染症（ＰＣＩ）モデルにおけるマウスの生存を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ−Ｓｃｈａｔｚｅｒプロットを示す。
【図１２】図１２は、ＰＫＣ活性低下化合物で治療されたマウスの生存率をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ−Ｓｃｈａｔｚｅｒプロットで示す。これらの図は、健康な動物（偽）及びＰＣＩを有する動物に対する薬物及び標的化ナノ構造粒子の効果を示す。
【図１３】図１３は、ＰＫＣ活性低下化合物で治療されたマウスの生存率をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ−Ｓｃｈａｔｚｅｒプロットで示す。これらの図は、健康な動物（偽）及びＰＣＩを有する動物に対する薬物及び標的化ナノ構造粒子の効果を示す。
【図１４】図１４は、ＰＫＣ活性低下化合物で治療されたマウスの生存率をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ−Ｓｃｈａｔｚｅｒプロットで示す。これらの図は、健康な動物（偽）及びＰＣＩを有する動物に対する薬物及び標的化ナノ構造粒子の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
図１Ａ−Ｃは、敗血症性胆汁うっ滞の本発明の治療のために有用である、本発明による様々な異なるナノ構造送達システムを調製するための例示的なビルディングブロックを示す。図１Ａは、ビルディングブロックにおいて使用される可能性のある異なるＰＫＣ活性低減剤を示す。これらのＰＫＣ活性低減剤、並びに小分子及び核酸構築物を、本発明に従って使用することができる。図１Ｂは、本発明に従って使用することができる異なる好ましいポリメチン標的指向化部分（ＰＴＭ）を示す。青い点は、薬剤／薬剤構築物又はポリマーへの接続点を表す。可能な化学的結合が図３に示される。図１Ｃは、ポリメチン標的指向化部分（星印として示されている）を運ぶ異なる担体システムを示す。上には、標的化薬物送達のためのビヒクルとして作用することができるポリマー（有機又は無機）、脂質、ウイルス様粒子が示されている。基本的に、ＰＴＭは、小分子、核酸構築物、及び核酸構築物と正に帯電したポリマーとの間のポリプレックスに連結することができる。そのような正に帯電したポリマーはまた、本発明のポリメチン標的指向化部分（ＰＴＭ）で標識することができ、それゆえに、核酸構築物へのライゲーションの後に、それ自体で標的化ナノ構造送達システムを形成することもできる。そのような標的化ナノ構造送達システムは、ＰＴＭがＰＫＣシグナル伝達経路の本発明の阻害剤（好ましくは核酸構築物）に直接結合し、これらの構築物がナノ構造送達システムを（ヘルパーポリマーの有無にかかわらず）形成する場合、好ましく形成される。
【００８１】
ポリメチン色素ベースの標的指向化部分は、特定の認識ユニット、好ましくはＯＡＴＰ又は溶質担体輸送体タンパク質によって認識される化学部分を含む。認識のためには、分子の釣り合った電荷が重要である。好ましい実施態様では、最終構築物／担体に結合した後、ＰＴＭの正味電荷は＋／−０又は−１である。図１Ｂには、いくつかの代表的なポリメチン標的指向化部分（ＰＴＭ）が示されている。
【００８２】
図２及び３は、２つのインドール部分を有する本発明のポリメチン色素の構造を示す。図２は、本発明による対称又は非対称ポリメチンの一般構造Ｉ又はＩＩを示し、ここで、
ａ．）ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の数値を表し、
ｂ．）Ｒ１−Ｒ１７は同じであっても異なっていてもよく、水素又は重水素、１つ又は複数のアルキル、ｔｅｒｔ−アルキル、シクロアルキル−（「アルキル」及び「シクロアルキル」ラジカルはまた、オレフィン構造も含む）又はアリール、カルボキシアリール、ジカルボキシアリール、ヘテロアリール又はヘテロ脂環式ラジカル、アルキルオキシ、アルキルメルカプト、アリールオキシ（ａｒｌｙｏｘｙ）、アリールメルカプト、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールメルカプト基、ヒドロキシル、ハロゲン、ニトロ又はシアノ基、アルキル置換又は環状アミン官能基であってもよく、かつ／又は２つのオルト位ラジカル、例えば、Ｒ３及びＲ４、Ｒ１３及びＲ１４、並びに／又はＲ１及びＲ２並びにＲ１１及びＲ１２並びに／又はＲ７及びＲ９は、一緒になって、追加の芳香族、ヘテロ芳香族、脂肪族又はヘテロ脂肪族環を形成してもよく、
ｃ．）Ｒ１−Ｒ１７置換基の少なくとも１つは、これらのポリメチン色素の親水特性を決定する、ＳＯ３−、（−ＳＯ３Ｈ）、ＰＯ３２−、ＣＯＯＨ、ＯＨ又はＮＲ３＋、シクロデキストリン又は糖などの可溶化及び／又はイオン化可能又はイオン化置換基を有し、ここで、この置換基はまた、スペーサー基によってポリメチン色素に結合されてもよく、
ｄ．）Ｒ１−Ｒ１７置換基の少なくとも１つは、イソシアネート、イソチオシアネート、ヒドラジン、アミン、モノ−及びジクロロ−又はモノ−及びジブロモトリアジン、アジリジン、エポキシド、ハロゲン化スルホニル、酸ハロゲン化物、カルボン酸無水物、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル、イミドエステル、カルボン酸、グリオキサール、アルデヒド、マレイミド又はヨードアセトアミド及びホスホラミダイト誘導体又はアジド、アルキン又はオレフィンなどの反応性基（リンカー）を有し、ここで、この置換基はまた、スペーサー基によってポリメチン色素に結合されてもよく、
ｅ．）芳香族、ヘテロ芳香族、脂肪族又はヘテロ脂肪族のスペーサー基は、［（ＣＨ２）ａ−Ｙ−（ＣＨ２）ｂ］ｃ又は［（Ｃ６Ｈ４）ａ−Ｙ−（Ｃ６Ｈ４）ｂ］などの構造要素からなり、ここで、Ｙは同じであっても異なっていてもよく、ＣＲ２−、Ｏ−、Ｓ−、−ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨ−、ＮＲ−、ＣＯＯ−、又はＣＯＮＲ官能基を含み、ここで、それはＲ１ーＲ１７置換基の１つに結合しており、ａ．）及びｂ．）は同じであっても異なっていてもよく、かつ０−１８の数値を有し、ｃの数値は０−１８であり、
ｆ．）対応するｎ＝２、３、４又は５を有するＲ８及びＲ９置換基はまた、２ｘ、３ｘ、４ｘ又は５ｘ存在してもよく、これらは同じであっても異なっていてもよい。
【００８３】
図３は、本発明によるポリマー又は標的指向化部分との薬剤／薬剤構築物の結合戦略の例を示す。本発明のポリメチン駆動型標的指向化部分選択的肝臓標的指向化部分は、上記で言及したような通常の化学カップリング反応によって、本発明の薬剤又は薬剤構築物に付着させることができる。カップリング反応については、当業者、すなわち化学者によく知られている全ての反応を適用することができる。好ましい実施態様では、図３に示すように、反応性カルボニル化合物、好ましくは、対応するアミンに還元することができるシッフ塩基を形成するアミンとともに、ケトン、アルデヒドアセタール又はヘミアセタールを使用することができる。
【００８４】
本発明によるポリメチン部分誘発性エンドサイトーシスは、薬剤自体の組織特異的輸送のために採用することができる。このために、目的の薬剤は、活性な肝細胞／肝臓標的指向化のためのポリメチン色素を含む、カップリング反応に適した部分と結合される。本発明によれば、ＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤は、直接、又は図３に示されるようなポリメチン色素若しくはリガンド構築物を含むスペーサーを用いて、ポリマー又はナノ構造送達システム（すなわち、ポリマー粒子）に結合される。
【００８５】
本発明のポリメチン色素は、薬剤、すなわち阻害剤、薬剤構築物又は担体の標的化送達及び細胞／組織／臓器特異性のための重要な本発明のツールである。図１Ｂ、２、及び３に概説されるように、このような認識リガンドはＩＣＧの誘導体として見ることができる。それらは、肝細胞標的指向化のために有用である。
【００８６】
ポリメチン色素標的指向化部分を薬物（薬剤）、薬物構築物（薬剤構築物）又は担体に結合させるために、異なるアプローチを適用することができる。それぞれの薬物、薬物構築物又は本発明のナノ構造送達システム、及びそれぞれの認識リガンドに存在する官能基に応じて、最も適切な方法を評価しなければならない。
適切な接続点の欠如に起因して直接カップリングが難しい場合、適切な官能基が、好ましくは、薬剤／薬剤構築物、又はナノ構造送達システムをポリメチン標的指向化部位に連結させるために、図４に示すように一般的に知られている官能基相互変換法に従って導入される。図４は、カルボン酸からアミン、アルコールからカルボン酸、アルコールからマレイミドへの相互変換を示す。カルボン酸はアミンとのカップリングに適しており、その逆も同様であり、一方マレイミドはチオールに結合することができる。
【００８７】
標的指向化部分と薬剤／薬剤構築物、ポリマー及び／又は担体システムとの間の距離を増加させるために、ポリメチン標的指向化部分を、直接、又は追加のスペーサーを介して付着させることができる。ナノ担体として有用なＤｙｅ−ＰＬＧＡの合成について、例示的な合成が図７に示される。さらなる開示が実施例３に与えられる。ポリメチン色素標識ＰＬＧＡ（図７及び実施例３）は、好ましくは、図９に示され、実施例５に記載されるようなナノ沈殿、エマルジョン又は二重エマルジョンによるＰＫＣ阻害剤のカプセル化に有用である。
【００８８】
あるいは、ポリメチン標的指向化部分は、本発明の阻害剤のカプセル化後に最終粒子（ナノ構造送達システム）に結合することができる。この場合、ＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤は、それに応じてカプセル化される。ナノ粒子の調製後、ポリマー中の官能基が活性化され、図３に示すようにカップリングと同様にＰＴＭに結合される。ポリマー上の官能基と使用される薬物に応じて、異なるカップリング戦略を適用することができる。そのようなカップリング戦略は当技術分野でよく知られており、本発明に従って好ましい有用なカップリング戦略を図４に示す。
【００８９】
このアプローチは、小分子、ｓｉ−ＲＮＡのような核酸構築物、又は有機若しくは無機のリポソーム若しくはナノ粒子などの本発明の担体に採用することができる。
【００９０】
本発明によるポリメチン標的指向化部分（ＰＴＭ）は、好ましくは、ナノ構造送達システムのポリマー部分（ポリマー又はウイルス様粒子）に付着しているが、ナノ構造送達システムの形成の前に、ＰＫＣシグナル伝達経路の阻害剤に直接付着させることもできる。例えば、マレイミド官能基を含むポリメチン標的指向化部分（ＰＴＭ）は、３’又は５’ＥｎｄＴＡＧＴＭのような既知の標識方法によって核酸構築物に付着される。いずれの方法においても、ＰＴＭでの好ましい官能基はマレイミドであり、図４に示すように生成することができる。核酸構築物をポリメチン標的指向化部分（ＰＴＭ）に選択的に結合させるための２つのＥｎｄＴＡＧカップリング戦略を図４に示し、図６に例示する。ＰＴＭへの核酸物質のカップリングのための戦略を、図８に示す。図８Ａは、主にＤＮＡ様構築物に対する３’末端標識戦略を示し；図８Ｂは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は修飾ヌクレオチドの５’末端標識戦略を示す。ナノ構造送達システムを生成するために、標的核酸構築物を使用して、ポリマー（有機又は無機）とのポリプレックスを形成することができる。
【００９１】
敗血症性胆汁うっ滞を模倣するために、確立された腹膜汚染及び感染症（ＰＣＩ）モデルを使用して全身性炎症が誘導された。このモデルでは、人間の糞便懸濁液が腹腔内に（ｉ．ｐ．）適用され、肝機能障害を伴う敗血症を急速に誘発する。
【００９２】
ヒトの便の各バッチについて、２週間以内に生存率が０％から２０％になるように、用量は注意深く滴定される。
【００９３】
便の適切な用量を見つけるために、異なる用量が試験された。便の腹腔内（ｉ．ｐ．）適用の６時間後、８−１２週齢のＣ５７／ＢＬ６マウス又はＦＶＢ／Ｎマウスを、それぞれナノ粒子又は遊離薬物で治療した。図１１は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ−Ｓｃｈａｔｚｅｒプロットにおいて使用された２つの異なるバッチを用いたマウスの生存を示す。
【００９４】
図１２、１３、及び１４は、ＰＫＣ活性低下化合物で治療されたマウスの生存率をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ−Ｓｃｈａｔｚｅｒプロットで示す。これらの図は、健康な動物（偽）及びＰＣＩを有する動物に対する薬物及び標的化ナノ構造粒子の効果を示す。図１２は、ＰＫＣ阻害剤ＢＩＭ−１の遊離薬物としての、及び標的化ナノ粒子製剤の積荷としての効果を示す。
【００９５】
図１３は、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤ＡＳ６０５２４０の遊離薬物としての、及び標的化ナノ粒子製剤の積荷としての効果を示す。
【００９６】
図１４は、ＰＫＣ阻害剤ミドスタウリンの遊離薬物としての、及び標的化ナノ粒子製剤の積荷としての効果を示す。
【００９７】
本発明は、実施例に基づいて以下にさらに示されるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００９８】
実施例
実施例１Ａ及びＢ：肝細胞標的指向化に有用なポリメチン標的指向化部分（ＰＴＭ）の合成。
合成スキームを図５Ａ及びＢに示す。
ＰＴＭ１（７）の合成スキームが、図５Ａに概説される。
工程１：１．６ｇ（１０ｍｍｏｌ）のトリメチルインドレイン（１）を４０ｍＬのアセトニトリルに溶解し、１０ｍＬアセトニトリル中の２．５３ｇ（１１ｍｍｏｌ）のトシルエチレングリコールメチルエーテル（２）の溶液を加えた。反応混合物を、アルゴン底下で室温で４日間撹拌した。１−（２−メトキシエチル）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール−１−イウム（３）を溶液から沈殿させ、濾別し、アセトニトリルとジエチルエーテルの混合物で洗浄し、乾燥させて２．１８ｇを得る（７３％）。
工程２及び３：５ｍＬの氷酢酸と０．５ｍＬの無水酢酸の混合物中で、１１１ｍｇ（５ｍｍｏｌ）のマロンアルデヒドジアニル塩酸塩（ｍａｌｏｎａｌｄｅｈｙｄｅｄｉａｎｉｌｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（４）と１１０ｍｇ（５ｍｍｏｌ）の１−（２−メトキシエチル）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール−１−イウム（３）の混合物を１２０℃に２．５時間加熱することにより、中間体５を紫色の溶液として得た。溶液を約７０℃に冷却し、１７７ｍｇの１−（５−カルボキシペンチル）−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール−１−イウム−５−スルホネート（６）及び３５０ｍｇのＫＯＡｃを加えた。添加後、反応混合物を再び１２０℃に３時間加熱した。反応をＴＬＣによってモニターした。冷却した混合物を５０ｍＬのＥｔＯＡｃに注ぎ、粗ポリメチン色素７を濃青色固体として沈殿させた。固体をＥｔＯＡｃ（３×３０ｍＬ）で洗浄し、真空中で乾燥させた。（収率：８３％）。
アセトニトリルと０．１％ギ酸を用いた分取Ｃ１８−ＲＰ−ＨＰＬＣにより、さらなる精製を行った。
Ｃ３５Ｈ４３Ｏ６Ｎ２ＳのＭａｓｓ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ，［Ｍ＋１］＋，計算値：６０７．２８３６、実測値：６０８．２８３３
【００９９】
ＰＴＭ２（１３）の合成スキームを、図５Ｂに示す。
工程１：９ｍｍｏｌの１，４−ブタンスルホン（２）中の３ｍｍｏｌの２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール（１）の溶液を１２０℃で２時間加熱する。冷却後、残留物をアセトン（３×５０ｍｌ）で洗浄し、濾過し、乾燥し、７５％の収率で９を得る。
工程２：４ｍＬの無水酢酸及び１ｍＬの氷酢酸中の（９）（０．９ｍｍｏｌ）及びＮ−［（３−（アニリノメチレン）−２−クロロ−１−シクロヘキセン−１−イル）メチレン］アニリン一塩酸塩（３−ｃｈｌｏｒｏ−２，４−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｅｎｅｎｇｌｕｔａｃｏｎｄｉａｎｉｌｘＨＣｌ）（１０）（１ｍｍｏｌ）（Ｓｉｇｍａから）の混合物を１００℃で２時間加熱する。冷却後、溶液をジエチルエーテル中で注意深く沈殿させ、粗生成物を濾別する。さらなる精製のために、粗生成物を３ｍＬのＤＣＭに溶解し、ジエチルエーテル中で再び沈殿させる。紫色の固体を濾過し、水で洗浄し、乾燥させ、次の工程のために十分な純度を有する１１を得る。収率：７２％。
工程３：２０ｍＬのピリジンと２ｍＬの酢酸の混合物中、３ｍｍｏｌの化合物１１及び３．３ｍｍｏｌの市販の６−（２，３，３−トリメチルインドール−１−イル）−ヘキサン酸ブロミド（１２）（ＡＫｏｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の溶液を、５０℃で４時間加熱する。冷却後、（１３）をジエチルエーテルから沈殿させ、ピリジンに再溶解し、ジエチルエーテルで沈殿させる。
粗生成物をＤＣＭに溶解し、０．１ＭのＨＣｌ及びブラインで洗浄し、蒸発乾固させた。
アセトニトリルと０．１％ギ酸を用いた分取Ｃ１８−ＲＰ−ＨＰＬＣにより、さらなる精製を行った。
Ｃ４０Ｈ４９Ｏ５Ｎ２ＣｌＳのＭａｓｓ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ，［Ｍ＋１］＋，計算値：７０５．３４５４，実測値：７０５．３４４９
【０１００】
実施例２：ＰＴＭでの官能基の相互変換
工程４：（図６にも示される）カルボン酸色素７のアミン官能化のために、１ｍｍｏｌを１０ｍＬのＤＣＭに溶解する。この溶液に、１．２ｍｍｏｌのＨＢＴＵ、１ｍｍｏｌのヒューニッヒ塩基及び１．５ｍｍｏｌのエチレンジアミン（遊離塩基）を連続的に加え、混合物を室温で１２時間撹拌する。最終生成物を、ジエチルエーテルからの沈殿、ジエチルエーテル中のＤＭＦからの２回目の沈殿、最後にＣ１８ＲＰカラムクロマトグラフィー（アセトニトリル／ギ酸）により精製し、濃青色固体として収率６８％の７ａを得る。
工程４ａ（図６にも示される）カルボン酸色素４のマレイミド官能化のために、１ｍｍｏｌを１０ｍＬのＤＣＭに溶解する。この溶液に、１．２ｍｍｏｌのＨＢＴＵ、１．５ｍｍｏｌのヒューニッヒ塩基及び１．５ｍｍｏｌのアミノエチルマレイミドｘＴＦＡを連続的に加え、混合物を室温で１２時間撹拌する。最終生成物を、ジエチルエーテルからの沈殿、ジエチルエーテル中のＤＭＦからの２回目の沈殿、最後にＣ１８ＲＰカラムクロマトグラフィー（アセトニトリル／ギ酸）により精製し、濃緑色固体として収率７７％の１３ａを得る。
【０１０１】
実施例３：ＰＴＭ１のＰＬＧＡへのカップリング
１ｇのＰＬＧＡ（Ｒｅｓｏｍｅｒ  ＲＧ  ５０２  Ｈ）ＭＷ：１２．０００を５ｍＬのＣＨＣｌ３、及び１ｍＬのクロロホルムに事前溶解した８ｍｇのＥＤＣｘＨＣｌに溶解し、１ｍＬのＤＭＦ中の４．８ｍｇのＮＨＳを加える。活性化混合物を４時間撹拌し、次いでアミン官能化色素（７ａ）の溶液１ｍＬ（ＤＭＦ中１ｍｇ／ｍＬ）及び８０μＬのトリメチルアミンを不活性雰囲気下で加える。混合物を室温で１８時間撹拌した後、５８μＬの氷酢酸を加え、溶媒を強真空下で除去する。得られた粘着性油を５０ｍＬの水で５回、５０ｍＬのメタノールで２回洗浄する。遊離色素を取り除くために、残留物を３５０ｍＬのアセトニトリルに溶解し、１０ｇの新たに洗浄したアンバーライトＩＲ１２０Ｈ（５ｘ水洗浄、次いで３ｘアセトニトリル洗浄）を加える。フラスコをロータリーエバポレーターで４０分間、真空又は加熱なしで回転させる。溶液を濾別し、減圧下で蒸発させる。残留物を再び６ｍＬのアセトニトリルに溶解し、１００ｍＬの冷水（０℃）中で沈殿させる。沈殿したポリマーを濾別し、凍結乾燥させる。この色素標識ＰＬＧＡは、適切な薬剤のカプセル化のための標準的なナノ沈降手順又はエマルジョン手順に従ってインビボ実験に記載された、ナノ粒子の調製に使用された。熟練者にとっては、標準的なプロトコルに従った通常のプロセスは、問題なく実施することができる。
【０１０２】
実施例４：ＰＴＭの遺伝物質へのカップリング
マレイミド官能化ポリメチン標的指向化部分（ＥｎｄＴａｑ（登録商標））への遺伝物質ベースの阻害剤の直接カップリング
ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ（登録商標）によると、１μｇのＰＫＣ−ｓｉＲＮＡ（ＪｅｎａＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅによる特注）を反応緩衝液中でＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ及びＡＴＰγＳとともに３７℃で３０分間インキュベートする。反応物をＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒＲＮＡ精製キットを用いて精製し、ＲＮＡに必要であるため、注意深く保存する。（低温、無菌、ＲＮＡｓｅフリー！）。次いで、活性化されたｓｉＲＮＡを５０μＬのＰＢＳ緩衝液に懸濁し、１μｇのマレイミド官能化ＰＴＭ（１３ｂ）を加え、６５℃で３０分間振盪する。最終構築物を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒＲＮＡ精製キットを用いて無菌条件下で再び精製する。
【０１０３】
実施例５：ナノ粒子の調製
ポリメチン標的指向化部分によるポリマーの官能化後（実施例３を参照）、界面活性剤としてポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を使用するナノ沈殿によってナノ粒子を生成した。ＰＴＭ１標識ポリマー及びＰＫＣ阻害剤ＢＩＭ−１及びミドスタウリン又はＰＩ３Ｋ阻害剤ＡＳ６０５２４０をＤＭＳＯに溶解し、その溶液を勢いよく撹拌した０．３％のＰＶＡ水溶液にゆっくりと滴下した。形成されたナノ粒子は、ＰＴＭ標識ＰＧＬＡにカプセル化された、３ｗｔ％のＢＩＭ−１、６ｗｔ％のミドスタウリン、又は１２ｗｔ％のＡＳ６０５２４０を含む。溶液を精製し、クロスフロー濾過（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）により濃縮する。エマルジョン、ダブルエマルジョン及びナノ沈殿による本発明のナノ粒子の調製方法は、図９にさらに例示的に示される。
【０１０４】
肝細胞標的指向化の評価及び視覚化は、国際公開第２０１５／０３５９７４号に記載の生体顕微鏡法に従って実施され、その公開の開示は本明細書において完全に参照され、組み込まれる。
【０１０５】
実施例６：本発明のナノ粒子の特徴づけ
ＰＴＭ１−ＰＬＧＡ（実施例３）のナノ粒子を一定のパラメータを用いて生成し、以下のプロトコルに従って再現した。
−  サイズ：動的光散乱法（例えば、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＧｍｂＨ））又は電子顕微鏡写真による、脱イオン水に溶解した様々なナノ構造送達システムのサイズの測定。
形状：電子顕微鏡写真による形状の決定。
−  電荷：電気泳動信号（ゼータ電位、表面電荷）を測定することによる、ゼータサイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＧｍｂＨ）を使用した、脱イオン水に溶解された様々なナノ構造送達システムの測定。
−  エンドトキシン：エンドトキシン含有量を、D. E. Guilfoyle, et al., Evaluation of a chromogenic procedure for use with the Limulus lysate assay of bacterial endotoxins drug products, J Parenter Sci Technol, 1985, 39(6): pp. 233-6によるＬＡＬ発色アッセイに基づくＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ試験キットを用いて決定した。
−  溶血：生理的緩衝液中で粒子と１時間インキュベートされた赤血球のヘモグロビン濃度の測定。赤血球膜に損傷がある場合、上清中の測定可能なヘモグロビン濃度が増加する。
−  凝集：生理学的緩衝液中でポリマーとともにインキュベートされた赤血球の吸収の測定。細胞凝集体を含む試料は、均一に分布した非凝集細胞よりも低い吸収を示す。
【０１０６】
表１：結果：
Ａ：２．５％のカプセル化された中性脂質オレンジを含む非標的化ナノ粒子（ＰＬＧＡ／ＰＶＡ）
Ｂ：４％のＢＩＭ−１（ＰＫＣ阻害剤）を含む実施例５からのＰＴＭ１標的化ナノ粒子
Ｃ：１２％のＡＳ６０５２３０（ＰＩ３キナーゼ阻害剤）を含む実施例５からのＰＴＭ１標的化ナノ粒子
Ｄ：６％のミドスタウリン（ＰＫＣ阻害剤）を含む実施例５からのＰＴＭ１標的化ナノ粒子
2021535148.tif 000004
【０１０７】
実施例７：肝細胞標的指向化及びマクロファージとの相互作用のための静的マクロファージアッセイ及び動的チップベースのマイクロ流体モデル
マクロファージアッセイを使用して、マクロファージによるナノ粒子の不必要な取り込み及び／又は効果が生じるかどうかを調べた。ＮＰとマクロファージとの間の相互作用は、ＮＰの有効性を著しく低減させる可能性がある。さらに、相互作用はマクロファージの活性化をもたらす可能性があり、それによって、全ての宿主の後に、周囲の組織に害を及ぼす可能性がある。したがって、ＮＰとマクロファージとの間の相互作用を最初に証明する必要がある。粒子サイズ、形状、コーティング、及び表面電荷は重要な決定因子である。２つのアッセイを、静的条件下で行った。
【０１０８】
Ａ．ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）培養及びマクロファージ分化ＰＢＭＣを、健康なボランティアからドナー血液を採取した直後に新たに単離した。ドナーは研究の目的について通知され、書面によるインフォームドコンセントを与えた。血液試料量を、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と２ｍＭのＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ；単離緩衝液）を含むカルシウムとマグネシウムを含まないＰＢＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で１：１の比率に希釈し、Ｂｉｏｃｏｌｌ分離溶液（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の上に注意深く置いた。ＰＢＭＣを、密度勾配遠心分離から得た。続いて、細胞を単離緩衝液中で数回洗浄し、最後に４０μｍの分子メッシュ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって濾過した。単球濃縮のために、ウェル（９，６ｃｍ２）あたり１０７個のＰＢＭＣを、１０％自己血清、１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充した２ｍＬのＸ−ＶＩＶＯ１５（Ｌｏｎｚａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で、６ウェルプレートに（又は同等の細胞密度でより小さなウェルに）蒔いた。３時間のインキュベーション後、細胞を単純なＸ−ＶＩＶＯ  １５培地で洗浄し、補充を含む新鮮な培地（上記）を加えた。ナノ粒子実験の準備時間を含めて、マクロファージ（Ｍｆ）の分化を５日間行った。
【０１０９】
Ａ１．マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７の培養及び分化
ＲＡＷ２６４．７マクロファージ（ＣＬＳ，Ｅｐｐｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、加湿した５％ＣＯ２／９５％空気雰囲気中３７℃で、７５ｃｍ２の細胞培養フラスコ中、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０％ウシ胎児血清、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。培地交換は、２ー４日後に行った（細胞の培養密度に依存する）。実験のために、マクロファージをアキュターゼ処理によって剥離し、播種し、２４時間培養し、次いで粒子、すなわち中性脂質オレンジをロードしたＮＰをフェノールレッドを含まない培地中で個々の期間インキュベートした。インキュベーション後、マクロファージを回収及び／又は溶解し、次いで個別の分析（すなわち、蛍光検出システムを備えたマイクロプレートリーダーによる）を行った。タンパク質含有量は、ＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を使用して分析した。
【０１１０】
静置単細胞培養と比較してより意味のあるデータを得るために、いくつかのスケーラブルな共培養モデルを使用した。それらは、静置単細胞培養よりもインビボでの状況によく似ている。
【０１１１】
Ａ２．内皮細胞とマクロファージの共培養
Rinkenauer AC et al., Comparison of the uptake of methacrylate-based nanoparticles in static and dynamic in vitro systems as well as in vivo, J Control Release. 2015; 216:158-68に従って、ナノ粒子（ＮＰ）を、内皮細胞とマクロファージの共培養モデルにおいて、生理学的せん断応力条件下で試験した。簡潔には、単球を、４ｍｇ  ｍＬ−１のリドカイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及び５ｍＭのＥＤＴＡで処理することにより単離の２４時間後に回収した。コンフルエントなＨＵＶＥＣをトリプシンを使用して剥離した。単球を、無血清Ｘ−ＶＩＶＯ  １５中で１μＭのＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  ｇｒｅｅｎ  ＣＭＦＤＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で４５分間染色した。続いて、単球及びＨＵＶＥＣを、１０％自己血清、１０ｎｇ  ｍＬ−１のＧＭ−ＣＳＦ及び１００ＵｍＬ−１ペニシリン及び１００μｇｍＬ−１ストレプトマイシンを補充した内皮増殖培地ＭＶ中に１：３でプールし、１．３ｘ１０５個のＨＵＶＥＣ  ｃｍ−２及び０．４３ｘ１０５個の単球ｃｍ２の密度で菱形チャンバーチップ内に播種した。培地は毎日交換した。Ｍｆの分化は、ＧＭ−ＣＳＦの存在下、静置培養条件下で７２時間行った。ＨＵＶＥＣを、蠕動ポンプ（Ｉｓｍａｔｅｃ  ＲＥＧＬＯ  ｄｉｇｉｔａｌ  ＭＳ−ＣＡ−４／１２−１００，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して灌流した。菱形チャンバーチップ内のせん断応力は、以前に記載されるように計算した（Raasch et al., Microfluidically supported biochip design for culture of endothelial cell layers with improved perfusion conditions, Biofabrication, 2015, 7(1 ):015013）。０．７、３．０、６．０、及び１０．０ｄｙｎ  ｃｍ−２のせん断応力を、２００μｇｍＬ−１の濃度で６０分間ナノ粒子を取り込んだ後に２４時間適用した。ナイルレッドを含む負に帯電したナノ粒子を、添加剤を含まない内皮細胞増殖培地ＭＶ中に溶解した。
【０１１２】
Ｂ．Ｄｖｎａｍｉｃ４２  Ｓｉｎｕｓｏｉｄ−Ｃｈｉｐベースのマイクロ流体モデル
細胞の特異性と標的指向化を、マクロファージ、肝細胞、星細胞、及び内皮細胞からなるチップベースのマイクロ流体的にサポートされた多細胞培養システムにおいて決定する。Rennert K. et al, A microfluidically perfused three-dimensional human liver model, Biomaterials 2015; 71 :119-131に従って、Ｄｙｎａｍｉｃ４２  Ｓｉｎｕｓｏｉｄモデルの細胞培養とアセンブリングを行った。
【０１１３】
Ｄｙｎａｍｉｃ４２  ＳｉｎｕｓｏｉｄモデルのためのＨｅｐａＲＧ及び内皮細胞の調製
ＨｅｐａＲＧ細胞を２．７ｘ１０４個の細胞／ｃｍ２の密度で播種し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、５μｇ／ｍｌインスリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、２ｍＭグルタミン（ＧＩＢＣＯ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、５０μＭヒドロコルチゾン−ヘミコハク酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン混合物（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）（ＧＩＢＣＯ）を含むウィリアム培地  Ｅ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で培養した。細胞を、分化の前に５％ＣＯ２、３７℃で１４日間、加湿した細胞インキュベーター中で培養した。培地は３−４日ごとに新しくした。細胞分化が誘導され、細胞は４週間まで使用された。
【０１１４】
内皮細胞：ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、ヒト臍帯静脈から単離した。ドナーは研究の目的について説明され、書面による同意を与えた。ＨＵＶＥＣ細胞を２．５  １０４個の細胞／ｃｍ２の密度で播種し、内皮細胞培地（ＥＣＭ）（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で継代４まで培養した。
【０１１５】
Ｄｙｎａｍｉｃ４２  ＳｉｎｕｓｏｉｄモデルのためのＬＸ−２星細胞及びマクロファージの調製
ＬＸ−２星細胞（米国ニューヨーク州ニューヨーク市マウントサイナイ医科大学肝臓病部門のＳｃｏｔｔ  Ｌ．Ｆｒｉｅｄｍａｎ氏のご厚意により提供）を２．０ｘ１０４個の細胞／ｃｍ２の密度で播種し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＧＩＢＣＯ）、及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したダルベッコの最小必須培地（ＤＭＥＭ）（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）中で培養した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコール密度勾配遠心分離によって分離し、１０％（ｖ／ｖ）自己ヒト血清、１０ｎｇ／ｍｌヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＸ−ＶＩＶＯ  １５培地（Ｌｏｎｚａ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に１．０ｘ１０６個の細胞／ｃｍ２の密度で播種した。５％ＣＯ２及び３７℃で加湿した細胞インキュベーター中で３時間のインキュベーション後、細胞をＸ−ＶＩＶＯ１５培地で２回洗浄した。付着した単球をＸ−ＶＩＶＯ１５培地中で２４時間培養し、肝類洞内に播種した。
【０１１６】
Ｄｖｎａｍｉｃ４２  Ｓｉｎｕｓｏｉｄのアセンブリ
肝類洞モデルを、血管及び肝細胞層の交互の播種によってアセンブルした。各滅菌バイオチップにおいて、２．７ｘ１０５個のＨＵＶＥＣ／ｃｍ２（合計３．０  １０５個の細胞）と０．９ｘ１０５個／ｃｍ２の単球（合計１ｘ１０５個の細胞）を混合し、上部チャンバーの膜の上に播種した。ＨＵＶＥＣ／単球を、１０ｎｇ／ｍｌ上皮成長因子、９０ｍｇ／ｍｌヘパリン、２．８ｍＭヒドロコルチゾン、内皮細胞増殖補助剤、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、マクロファージ分化を誘導するための１０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン及び１０％（ｖ／ｖ）自己ヒト血清Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充した内皮細胞培養培地（ＥＣＭ）中で毎日培地交換しながら、少なくとも３日間共培養した。続いて、２．７ｘ１０５個／ｃｍ２の分化したＨｅｐａＲＧ（合計３ｘ１０５個の細胞）と０．９ｘ１０４個／ｃｍ２のＬＸ−２（合計１ｘ１０４個の細胞）をＨＵＶＥＣ細胞の反対側の膜に播種し、実験使用前に、５０μＭヒドロコルチゾン、５μｇ／ｍｌインスリンを含む１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、及び１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＳＯフリーのウィリアム培地Ｅ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）肝細胞増殖培地中で、２４時間培養した。
【０１１７】
表２：類洞チップの寸法
2021535148.tif 000005
【０１１８】
表３：類洞チップ内の流速
2021535148.tif 000006
【０１１９】
肝洞モデルは、７２時間まで流速５０μｌ／ｍｉｎでの灌流により、７日間静置培養した後に平衡化した。続いて、薬物構築物及び対照（少なくとも三通り）を、可変動的条件下で肝類洞モデルにおいて個々の期間インキュベートした。その後、肝類洞をパラホルムアルデヒド又はメタノール、あるいはその両方で固定し、免疫蛍光染色で分析した。異なる細胞層を蛍光顕微鏡で調べ、異なる細胞型における、又は異なる細胞型上での構築物の濃縮度を分析した。さらに、血管細胞層と肝細胞層を別々に溶解し、蛍光検出システムを備えたマイクロプレートリーダーによって細胞特異的に取り込まれたナノ粒子を測定することが可能である。
【０１２０】
実施例８：細胞傷害性の決定
細胞傷害性試験を、ＩＳ０１０９９３−５により推奨されているようにＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝がん細胞株）を用いて行った。細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ）中で、９６ウェルプレートにウェルあたり１０４個の細胞で播種し、加湿した５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２雰囲気中で３７℃で２４時間インキュベートした。示された濃度（０．５μｇ／ｍＬから５０μｇ／ｍＬ）の試験物質（ポリマー）を細胞に加え、プレートをさらに２４時間インキュベートした。対照細胞を新鮮な培地でインキュベートした。その後、培地を、製造者の指示に従って調製した新鮮な培地とアラマーブルー溶液（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の混合物によって置き換えた。４時間のさらなるインキュベーション後、陰性対照として同じウェルプレート上の未処理の細胞を用いて、蛍光を、Ｅｘ  ５７０／Ｅｍ  ６１０ｎｍで測定した。陰性対照は、代謝阻害の０％として標準化され、１００％の生存率とされた。７０％未満の細胞生存率は、細胞傷害性を示すと考えられた。データは、３回の測定の平均±Ｓ．Ｄ．として表される。図１０は、カプセル化された薬物が、遊離薬物（ＢＩＭ−１）と比較して高濃度で毒性が低いことを示している。
【０１２１】
実施例９：敗血症性条件下での胆汁うっ滞モデルにおける生存率「腹膜汚染及び感染症（ＰＣＩ）」
実験の設定：
ＰＣＩモデルを使用することにより、雄のＣ５７／ＢＬ６マウスにおいて全身性感染症／臓器不全を伴う敗血症を誘導した。この目的のために、ヒトの糞便懸濁液（それぞれ、便バッチ１では２．５μｌ／ｇ  ＢＷ、便バッチ２では６μｌ／ｇ）を、体重を適応させて腹腔内（麻酔なし）注射し、その結果それに続く全身性感染症を伴う腹膜炎を誘発した。動物への負担や死亡を避けるため、感染後６時間で１日２回、広域抗生物質メロペネムを皮下投与する（２．５μｇ／ｇ体重）。動物を入念にモニターし、タイムリーにするために感染症の兆候について６時間ごとにスコアを付けた。便バッチ１では、２．５μｇ／ｇの用量でマウスの７０％が最初の２日以内に死亡し、残りの３０％が７日目まで死亡した（図１１、左パネル）。評価用量の６μｌ／ｇ  ＢＷの便及び追加の抗生物質療法では、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ−Ｓｃｈａｔｚｅｒ図（図１１、右パネル）に示されるように、全てのマウスは３日以内に死亡した。実験データは、一部はバッチ１の実験に依存し、一部はバッチ２の実験に依存している。詳細は図１１に記載される。
【０１２２】
用量決定のために、製剤ごとに３つの薬物濃度を小グループにおいて試験し、生存率の変化を文書記録した。遊離薬物を用量評価のために使用し（データ非表示）、有効用量の１／８を標的化ナノ粒子において使用した。ＰＩ３Ｋ阻害剤ＡＳ６０５２４０及びＰＫＣ阻害剤ＢＩＭ−１単独では、４ｍｇ／ｋｇ体重で活性であった。ナノ粒子において、我々は０．５ｍｇ／ｋｇを使用し、全ての場合においてさらに顕著な効果が得られた。ミドスタウリンについては、６ｍｇ／ｋｇの遊離薬物と０．７５ｍｇ／ｋｇがナノ粒子製剤において使用された。
【０１２３】
感染の６時間後（ＰＣＩモデル）、ＰＫＣの活性を低減させることができる異なる薬物（ＰＫＣ阻害剤としてのＢＩＭ−１とミドスタウリン及びＰＩ３キナーゼ阻害剤としてのＡＳ６０５２４０）又は対照製剤（１日１回、腹腔内又は静脈内）及び量と抗生物質療法の併用（１日２回、皮下）を用いて治療を行う。薬物による治療は、５日間予定されている。量／抗生物質療法は７日間（薬物療法より２日長い）にわたって行われる。最初の５日間の観察は、１日２４時間、３時間間隔で行う。その後、１４日目（１日２回）まで動物の観察が続く。
【０１２４】
９ａ）積荷としての典型的なＰＫＣ阻害剤としてＢＩＭ−１を用いたＰＴＭ１標的化ＰＬＧＡナノ粒子：
我々は、合成されたＰＴＭ１−ＰＬＧＡ、界面活性剤としてのＰＶＡ、及びＢＩＭ−１を以下の濃度／負荷効率で用いて、実施例５において記載されるようにナノ粒子を調製した。
ＰＴＭ−ＰＬＧＡ：６６％
ＰＶＡ：３１％
ＢＩＭ−１：４％
サイズ／ゼータ電位：９３ｎｍ／−１８
【０１２５】
粒子懸濁液を４５％グルコース溶液で希釈し、最終グルコース濃度を５％にした。
【０１２６】
１０匹のマウスを標的化ナノ粒子で治療し、健康なマウスにおけるナノ粒子の忍容性を試験するために、２匹の偽のマウスを用いて評価した。結果を図１２に示し、７日以内に生存率が１０％から８０％に増加したことを示している。
【０１２７】
９ｂ）積荷としての実験的なＰｉ３Ｋ阻害剤としてＡＳ６０５２４０を用いたＰＴＭ標的化ＰＬＧＡナノ粒子：
粒子は、わずかに修正されたパラメータを用いて実施例５と同様に調製された：我々は、合成されたＰＴＭ−ＰＬＧＡ、界面活性剤としてのＰＶＡ、及びＡＳ６０５２４０を以下の濃度／負荷効率で用いて、上に記載されるようにナノ粒子を調製した。
ＰＴＭ−ＰＬＧＡ：５８％
ＰＶＡ：３０％
ＡＳ６０５２４０：１２％
サイズ／ゼータ電位：１６６ｎｍ／−１５
【０１２８】
粒子懸濁液を４５％グルコース溶液で希釈し、最終グルコース濃度を５％にした。
【０１２９】
６匹のマウスを標的化ナノ粒子で治療し、健康なマウスにおけるナノ粒子の忍容性を試験するために、２匹の偽のマウスを用いて評価した。結果を図１３に示し、７日以内に生存率が０％から４０％に増加したことを示している。
【０１３０】
９ｃ）積荷としての顕著なＰＫＣ阻害を有する承認されたキナーゼ阻害剤としてミドスタウリンを用いたＰＴＭ１標的化ＰＬＧＡナノ粒子：
粒子は、わずかに修正されたパラメータを用いて実施例５と同様に調製された：我々は、合成されたＰＴＭ−ＰＬＧＡ、界面活性剤としてのＰＶＡ、及び以下の濃度／負荷効率のミドスタウリンを用いて、上に記載されるようにナノ粒子を調製した。
ＰＴＭ−ＰＬＧＡ：６９％
ＰＶＡ：２５％
ミドスタウリン：６％
サイズ／ゼータ電位：１０１ｎｍ／−２５
【０１３１】
粒子懸濁液を４５％グルコース溶液で希釈し、最終グルコース濃度を５％にした。
【０１３２】
５匹のマウスを標的化ナノ粒子で治療し、健康なマウスにおけるナノ粒子の忍容性を試験するために、２匹の偽のマウスを用いて評価した。
【０１３３】
結果を図１４に示し、７日以内に生存率が１０％から６０％に増加したことを示している。
【図１Ａ】
2021535148.tif 000008
【図１Ｂ】
2021535148.tif 000009
【図１Ｃ】
2021535148.tif 000010
【図２】
2021535148.tif 000011
【図３−１】
2021535148.tif 000012
【図３−２】
2021535148.tif 000013
【図４】
2021535148.tif 000014
【図５】
2021535148.tif 000015
【図６】
2021535148.tif 000016
【図７】
2021535148.tif 000017
【図８】
2021535148.tif 000018
【図９】
2021535148.tif 000019
【図１０】
2021535148.tif 000020
【図１１】
2021535148.tif 000021
【図１２】
2021535148.tif 000022
【図１３】
2021535148.tif 000023
2021535148.tif 000024
【図１４】
2021535148.tif 000025
【国際調査報告】
2021535148.tif 000026
2021535148.tif 000027
2021535148.tif 000028