(57)【要約】【課題】生体液から線溶タンパク質を除去するための体外装置及びマトリックス、その方法及び使用等に関する。【解決手段】本明細書に開示される主題は、生体液から線溶剤を枯渇させるための特別な組成物、コンジュゲート、装置、キット及びシステムを提供する。本明細書に開示される主題は更に、結果として得られる線溶活性を欠いている生体液製剤、その治療的方法及び使用に関する。このコンジュゲートは、粒子と、少なくとも１つのリンカーと、４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸（トラネキサム酸）、ε−アミノカプロン酸、リジン、シクロヘキサンカルボン酸及び４−メチルシクロヘキサンカルボン酸のうちの少なくとも１つである少なくとも１つのアミノ酸、その誘導体又はその類似体とを含む。複数の異なるコンジュゲート（例えば、粒径（partcile size）又はリンカーの種類が異なる）が使用されてもよい。【選択図】図４
2021515189.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のコンジュゲート又は前記複数のコンジュゲートを含む任意の組成物であって、各コンジュゲートが粒子と少なくとも１つのリンカーと少なくとも１つのアミノ酸、その誘導体又はその類似体とを含み、前記複数のコンジュゲートが少なくとも２つの異なるコンジュゲートを含み、及び前記アミノ酸、その誘導体又はその類似体が、４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸（トラネキサム酸）、ε−アミノカプロン酸  リジン、シクロヘキサンカルボン酸及び４−メチルシクロヘキサンカルボン酸のうちの少なくとも１つである、複数のコンジュゲート又は組成物。
【請求項２】
前記少なくとも２つの異なるコンジュゲートの前記粒子及び／又は前記リンカーが異なる、請求項１に記載の複数のコンジュゲート又は組成物。
【請求項３】
前記粒子が約９０μｍ〜約１５０μｍの平均粒径を有する、請求項１又は２に記載の複数のコンジュゲート又は組成物。
【請求項４】
前記リンカーが１原子〜４０原子の直鎖を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の複数のコンジュゲート又は組成物。
【請求項５】
前記粒子と前記粒子の表面の前記リンカー被覆率との間の比が約９〜２３μｍｏｌビーズ／ｍｌ液抜き後媒体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の複数のコンジュゲート又は組成物。
【請求項６】
前記リンカーが、孤立電子対を有する原子を少なくとも１個含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の複数のコンジュゲート又は組成物。
【請求項７】
前記粒子が、多糖ビーズ、ガラスビーズ、綿ビーズ、プラスチックビーズ、ナイロンビーズ、ラテックスビーズ、磁性ビーズ、常磁性ビーズ、超常磁性ビーズ、デンプンビーズなど、シリコンビーズ、ＰＴＦＥビーズ、ポリスチレンビーズ、ガリウムヒ素ビーズ、金ビーズ、又は銀ビーズのうちの少なくとも１つである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複数のコンジュゲート又は組成物。
【請求項８】
前記粒子がアガロースビーズ又はセファロースビーズである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の複数のコンジュゲート又は組成物。
【請求項９】
前記アミノ酸又はその任意の誘導体又はその類似体がトラネキサム酸（ＴＸＡ）である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の複数のコンジュゲート又は組成物。
【請求項１０】
前記リンカーが二官能性リンカーを含み、前記二官能性リンカーが、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、ＤＡＴＡ、ＣＮＢｒ、エポキシ、ジアミノジプロピルアミン（ＤＡＤＰＡ）、１，６ジアミノヘキサン、コハク酸、１，３ジアミノ−２−プロパノール、エチレンジアミン（ethylendiamine）（ＥＤＡ）、ＴＮＢ、ピリジルジスルフィド、ヨードアセトアミドのうちの少なくとも１つの断片を含むか、又はそのような少なくとも１つの断片である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の複数のコンジュゲート又は組成物。
【請求項１１】
【化１】
2021515189.tif 000044
（式中、
【化２】
2021515189.tif 000045
は粒子を表す）である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の複数のコンジュゲート又は組成物。
【請求項１２】
【化３】
2021515189.tif 000046
（式中、
【化４】
2021515189.tif 000047
は粒子を表す）である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の複数のコンジュゲート又は組成物。
【請求項１３】
【化５】
2021515189.tif 000048
（式中、
【化６】
2021515189.tif 000049
は粒子を表す）である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の複数のコンジュゲート又は組成物。
【請求項１４】
粒子と少なくとも１つのリンカーと少なくとも１つのアミノ酸、その誘導体又はその類似体とを含むコンジュゲートであって、
【化７】
2021515189.tif 000050
（式中、
【化８】
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は粒子を表す）のうちのいずれか１つである、コンジュゲート。
【請求項１５】
前記粒子がアガロースビーズ又はセファロースビーズであり、約９０μｍ〜約１５０μｍの平均粒径を有する、請求項１４に記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
１つ又は複数の哺乳類体液から少なくとも１つの線溶タンパク質を枯渇させる装置であって、
−  少なくとも１つの流体入口ポートと、少なくとも１つの流体出口ポートとを有するハウジング
を含み；
−  前記ハウジングが少なくとも１つのチャンバを備え、前記少なくとも１つのチャンバが、前記少なくとも１つの流体入口ポート及び前記少なくとも１つの流体出口ポートと流体連通している制御容積を画成し；
−  前記制御容積が、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の複数のコンジュゲート又は組成物及び請求項１４又は１５に記載のコンジュゲートのうちの少なくとも一方を収容する、装置。
【請求項１７】
１つ又は複数の哺乳類体液から少なくとも１つの線溶タンパク質を枯渇させる装置であって、
−  少なくとも１つの流体入口ポートと、少なくとも１つの流体出口ポートとを有するハウジング
を含み；
−  前記ハウジングが少なくとも１つのチャンバを備え、前記少なくとも１つのチャンバが、前記少なくとも１つの流体入口ポート及び前記少なくとも１つの流体出口ポートと流体連通している制御容積を画成し：
−  前記制御容積が、第１の粒子の第１の集合と第２の粒子の第２の集合とを少なくとも含む複数の粒子集合を収容し；
−  前記第１の粒子は前記第２の粒子と寸法が異なり；
−  前記第１の粒子及び前記第２の粒子のうちの少なくとも一方は、アミノ酸、その誘導体又はその類似体にコンジュゲートされているコンジュゲート粒子であり、前記アミノ酸、その誘導体又はその類似体が、４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸（トラネキサム酸）、ε−アミノカプロン酸、リジン、シクロヘキサンカルボン酸及び４−メチルシクロヘキサンカルボン酸のうちの少なくとも１つである、装置。
【請求項１８】
前記第１の粒子及び前記第２の粒子がコンジュゲート粒子であり、各コンジュゲート粒子がアミノ酸、その誘導体又はその類似体にコンジュゲートされており、各前記アミノ酸、その誘導体又はその類似体が、４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸（トラネキサム酸）、ε−アミノカプロン酸、リジン、シクロヘキサンカルボン酸及び４−メチルシクロヘキサンカルボン酸のうちの少なくとも１つである、請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
前記第１の粒子及び前記第２の粒子がＴＸＡコンジュゲート粒子である、請求項１７又は１８に記載の装置。
【請求項２０】
前記コンジュゲート粒子が、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の複数のコンジュゲート又は組成物、又は請求項１４又は１５に記載のコンジュゲートによって定義される、請求項１７又は１８に記載の装置。
【請求項２１】
前記ハウジングが長手方向軸を含み、且つ本体部分と、前記少なくとも１つの流体入口ポートを有する入口端部キャップ、及び前記少なくとも１つの流体出口ポートを有する出口端部キャップを含む一対の端部キャップとを含む、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２２】
前記制御容積が、前記本体部分の長手方向両端に提供される対応するバリア部材によって画成される、請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
前記バリア部材が、前記制御容積から前記粒子が抜け出ることを防止するように構成される、請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
前記バリア部材が、前記制御容積を通じた前記１つ又は複数の哺乳類体液の貫流を同時に許容するように構成される、請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
前記バリア部材が、前記制御容積を通じた前記１つ又は複数の哺乳類体液の貫流を同時に許容するように構成され、ここで前記装置の使用において、前記１つ又は複数の哺乳類体液が前記入口端部キャップ及び前記流体入口ポートを通って前記制御容積に入り、前記制御容積を出た後、前記出口端部キャップ及び前記流体出口ポートを通って流れる、請求項２３に記載の装置。
【請求項２６】
前記バリア部材が、各々、それを通じた前記１つ又は複数の哺乳類体液の貫流を可能にする複数の開口であって、前記粒子より小さいサイズの開口を含む、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２７】
複数の装置を含む、１つ又は複数の哺乳類体液から少なくとも１つの線溶タンパク質を枯渇させることに用いられる装置一式であって、各装置が、請求項１６〜２６のいずれか一項に記載のとおりであり、前記複数の装置のうちの前記装置が、前記複数の装置のそれぞれの前記制御容積間に流体連通を提供するようにして相互接続されている、装置一式。
【請求項２８】
前記複数の装置のうちの少なくとも一部が直列に相互接続され、前記直列に相互接続された前記装置のうちの各対について、前記対のうちの一方の前記装置のそれぞれの前記流体入口ポートが、前記対のうちのもう一方の前記装置のそれぞれの前記流体出口ポートに接続され且つそれと流体連通している、請求項２７に記載の装置一式。
【請求項２９】
前記複数の装置のうちの少なくとも一部が並列に相互接続され、前記並列に相互接続された前記装置について、それぞれの前記流体入口ポートが互いに相互接続され且つ流体連通し、及びそれぞれの前記流体出口ポートが互いに相互接続され且つ流体連通している、請求項２７に記載の装置一式。
【請求項３０】
前記複数の装置のうちの少なくとも一部が並列に相互接続され、前記並列に相互接続された前記装置について、それぞれの前記流体入口ポートが少なくとも１つの供血側血漿リザーバに接続され且つそれと流体連通し、及び前記それぞれの前記流体出口ポートが少なくとも１つの受血側血漿リザーバに接続され且つそれと流体連通している、請求項２７に記載の装置一式。
【請求項３１】
１つ又は複数の哺乳類体液から少なくとも１つの線溶タンパク質を枯渇させるためのキットであって、
−  請求項１６〜２６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの装置、
−  前記少なくとも１つの入口ポートと選択的に流体連通している生理食塩水リザーバ；
−  受血側血漿リザーバ及び洗浄廃液リザーバであって、前記少なくとも１つの流体出口ポートと選択的且つ非同時的に流体連通している受血側血漿リザーバ及び洗浄廃液リザーバ
を含むキット。
【請求項３２】
１つ又は複数の哺乳類体液から少なくとも１つの線溶タンパク質を枯渇させるシステムであって、
−  請求項１６〜２６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの装置、
−  生理食塩水リザーバ及び供血側リザーバであって、前記少なくとも１つの流体入口ポートと選択的且つ非同時的に流体連通している生理食塩水リザーバ及び供血側リザーバ；
受血側血漿リザーバ及び洗浄廃液リザーバであって、前記少なくとも１つの流体出口ポートと選択的且つ非同時的に流体連通している受血側血漿リザーバ及び洗浄廃液リザーバ
を含むシステム。
【請求項３３】
１つ又は複数の哺乳類体液又はその任意の製剤から少なくとも１つの線溶タンパク質を枯渇させる方法であって、前記方法が、
（ｉ）前記１つ又は複数の体液を前記少なくとも１つの線溶タンパク質に特異的なアフィニティー枯渇手順に供するステップ；及び
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で得られた前記少なくとも１つの線溶タンパク質が枯渇した体液を回収するステップ
を含み；
前記アフィニティー枯渇手順が、前記体液を有効量の複数のコンジュゲート又は前記複数のコンジュゲートを含む組成物と接触させること、又は前記複数のコンジュゲート又は組成物を含む装置、装置一式、キット又はシステムに前記体液を適用することを含み、各コンジュゲートが粒子と少なくとも１つのリンカーと少なくとも１つのアミノ酸、その誘導体又はその類似体とを含み、前記複数のコンジュゲートが少なくとも２つの異なるコンジュゲートを含み、及び前記アミノ酸、その誘導体又はその類似体が、４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸（トラネキサム酸）、ε−アミノカプロン酸、リジン、シクロヘキサンカルボン酸及び４−メチルシクロヘキサンカルボン酸のうちの少なくとも１つである、方法。
【請求項３４】
前記複数のコンジュゲート又は組成物が請求項１〜１３のいずれか一項に記載のとおりであり、前記コンジュゲートが請求項１４又は１５に記載のとおりであり、前記装置が請求項１６〜２６のいずれか一項に記載のとおりであり、前記装置一式が請求項２７〜３０のいずれか一項に記載のとおりであり、前記キットが請求項３１に記載のとおりであり、及び前記システムが請求項３２に記載のとおりである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記体液が、少なくとも１つの凝固因子を含む全血、血漿又は血液由来製剤のうちの少なくとも１つである、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記血液由来製剤が、全血、血漿、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）、多血小板血漿（ＰＲＰ）及びクリオプレシピテートのうちの少なくとも１つである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記線溶タンパク質が、プラスミノーゲン及び組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）のうちの少なくとも１つである、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記方法が、前記線溶タンパク質枯渇体液における凝固時間及び総凝血塊溶解時間のうちの少なくとも一方を決定することにより、ステップ（ｉｉ）で回収された前記線溶タンパク質枯渇体液中のプラスミノーゲンの量を測定するステップを更に含む、請求項３３〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
線溶活性が低下している少なくとも１つの血液及び／又は血液由来製剤の調製における使用のための、請求項３３〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
それを必要としている対象の１つ又は複数の体液から少なくとも１つの線溶タンパク質を枯渇させるための、請求項３３〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
それを必要としている対象の１つ又は複数の体液から少なくとも１つの線溶タンパク質を体外手技によって枯渇させる方法であって、前記方法が、
（ｉ）前記対象の体液を体外機器へと移送するステップ；
（ｉｉ）前記体液を少なくとも１つの線溶タンパク質に特異的なアフィニティー枯渇手順に供するステップであって、前記枯渇が、前記機器への及びそこからの血液の移送前、移送中又は移送後に実施され、それにより少なくとも１つの線溶タンパク質が枯渇した前記対象の体外体液が入手されるステップ：及び
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で入手した前記体液を前記対象に再導入又は返還するステップ
を含み；
前記アフィニティー枯渇手順が、前記体外機器内、又は前記体外機器に接続した装置、装置一式、キット若しくはシステム内に含まれる有効量の複数のコンジュゲート又はその組成物に前記体液を接触させることを含み、各コンジュゲートが粒子と少なくとも１つのリンカーと少なくとも１つのアミノ酸、その誘導体又はその類似体とを含み、前記複数のコンジュゲートが少なくとも２つの異なるコンジュゲートを含み、及び前記アミノ酸、その誘導体又はその類似体が、４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸（トラネキサム酸）、ε−アミノカプロン酸、リジン、シクロヘキサンカルボン酸及び４−メチルシクロヘキサンカルボン酸のうちの少なくとも１つである、方法。
【請求項４２】
前記複数のコンジュゲート又は組成物が請求項１〜１３のいずれか一項に記載のとおりであり、前記コンジュゲートが請求項１４又は１５に記載のとおりであり、前記装置が請求項１６〜２６のいずれか一項に記載のとおりであり、前記装置一式が請求項２７〜３０のいずれか一項に記載のとおりであり、前記キットが請求項３１に記載のとおりであり、及び前記システムが請求項３２に記載のとおりである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記体液が、全血及び血漿のうちの少なくとも一方である、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記少なくとも１つの線溶タンパク質が、プラスミノーゲン及びｔＰＡのうちの少なくとも一方である、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記方法が、前記複数のコンジュゲート若しくは組成物又はコンジュゲートからプラスミノーゲン及びｔＰＡのうちの少なくとも一方を回収するステップを更に含む、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
それを必要としている対象の出血性、止血障害及びそれに関連する任意の出血性又は病的状態を治療、防止、予防、改善、抑制する方法であって、前記方法が、低下した線溶活性を有する少なくとも１つの血液及び／又は血液由来製剤の治療有効量を前記対象に投与するステップを含み、前記製剤が、請求項３３〜３８のいずれか一項に記載の方法によって調製される、方法。
【請求項４７】
前記止血障害が遺伝性又は後天性出血性障害である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記遺伝性止血障害が、少なくとも１つの凝固因子の欠乏及び未確定の出血傾向のうち少なくとも一方が原因で生じる障害である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記少なくとも１つの凝固因子の欠乏が、第ＸＩ因子、第Ｘ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＩ因子（プロトロンビン）及び第Ｉ因子（フィブリノーゲン）のうちの少なくとも１つの欠乏である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記後天性止血障害が、手術によって引き起こされる出血、外傷によって引き起こされる出血、急性消化管出血、熱傷に関連する出血、出血性脳卒中、気腫及びＣＯＰＤに起因する肺傷害、分娩に関連する出血及び線溶療法又は血栓溶解療法が原因で生じる出血のうちの少なくとも１つである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記手術によって引き起こされる出血が、小手術又は大手術によって引き起こされる出血である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記大手術が、直視下心臓手術又は肝移植術のうちの少なくとも一方である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記後天性止血障害が、線溶療法又は血栓溶解療法が原因で生じる出血である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
前記投与が体外機器を使用して実施される、請求項４６〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
それを必要としている対象の出血性、止血障害及びそれに関連する任意の出血性又は病的状態を治療、防止、予防、改善、抑制する方法における使用のための、低下した線溶活性を有する治療有効量の少なくとも１つの血液及び／又は血液由来製剤であって、前記製剤が請求項３３〜３８のいずれか一項に記載の方法によって調製される、血液及び／又は血液由来製剤。
【請求項５６】
前記止血障害が遺伝性又は後天性出血性障害である、請求項５５に記載の血液及び／又は血液由来製剤。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、凝固及び輸血医学の分野に関する。より具体的には、本発明は、生体液から線溶剤を枯渇させるための特別な装置及びマトリックス、結果として得られる線溶活性を欠いている生体液製剤、その方法及び使用を提供する。
【０００２】
背景技術
本明細書に開示される主題に背景として関連すると考えられる参考文献を以下に挙げる。
Selighson U et al. Classification, Clinical Manifestations & Evaluation of Disorders of Hemostasis. In: Williams Hematology, 8th ed, 2010, pp2322-2330
Abdel-Wahab OI et al. Effect of fresh-frozen plasma transfusion on prothrombin time and bleeding in patients with mild coagulation abnormalities. Transfusion 2006; 46: 1279-1285
Holland LL et al. Toward rational fresh frozen plasma transfusion: The effect of plasma transfusion on coagulation test results. Am J Clin Pathol 2006; 126: 133-139
Meheux CJ et al. Efficacy of Intra-articular Platelet-Rich Plasma Injections in Knee Osteoarthritis: A Systematic Review. Arthroscopy, 2016, 32, 495-505
Pap G et al. Expression of stromelysin and urokinase type plasminogen activator protein in resection specimens and biopsies at different stages of osteoarthritis of the knee. Pathol. Res. Pract. 2000, 196: 219-226
米国特許第７，１２５，５６９号
米国特許第３，９９８，９４６号
【０００３】
本明細書に上記の参考文献を認めることをもって、それらの参考文献が何らかの形で本明細書に開示される主題の特許性に関連することを意味すると推論されてはならない。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
正常な止血は、極めて繊細な均衡の上に成り立っているシステムである。それがあるべきとおりに機能しているとき、血液は血管系内で流体状態に維持され、しかし傷害を塞ぐ必要が生じると速やかに凝血する。１９６０年代に２つのグループが凝血塊形成モデルを提案しており、これは一つの凝血（凝固）因子の活性化が別の因子の活性化につながり、最終的に凝血塊形成につながる一連の逐次的な段階を想定したものであった。これらの凝固因子が逐次的活性化により凝血塊の形成を生じさせると、線溶系と呼ばれる対応するシステムが更に活性化され、凝血塊の融解（溶解）の原因となる。この線溶系は抗凝血タンパク質（プラスミノーゲン活性化因子、プラスミノーゲン及びプラスミン）を含み、これが逐次的活性化を受けて凝血塊の溶解につながる（Selighson U et al.）。
【０００５】
凝固因子の欠乏に起因する止血機能不全は、凝血塊形成の障害（又は欠如）を引き起こす。同様に、過剰な線溶活性の結果、形成された凝血塊の急速且つ不必要な融解が生じる。他方で、凝固カスケードが過度に刺激され又は線溶系が抑制されれば、病的凝血塊の形成が引き起こされ得る。従って、上記システムの各々が不全となる帰結は、出血又は凝固傾向の増大である可能性がある。
【０００６】
補充療法は出血性障害の治療に有効であるが、しかしながら、この治療は十分でないこともある。出血患者又は凝固検査に延長が認められる患者には、それが止血を改善し、出血を修正及び／又は防止するであろうという想定のもとに、高頻度で新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）が輸血される。マサチューセッツ総合病院（Massachusetts General Hospital）にて実施された前向き監査（prospective audit）において、プロトロンビン時間（ＰＴ）及び国際標準化比（ＩＮＲ）などの凝固パラメータに対するＦＦＰの効果が調査された（Abdel-Wahab OI et al.）。データは、このセッティングでのＦＦＰ輸血が９９％の患者でＰＴを修正できず、僅か１５％の患者においてＩＮＲが正常値の少なくとも半分に修正されたに過ぎなかったことを示した。同様に、Holland et al.は、ＦＦＰでは時間が経つにつれＩＮＲが変化しなくなったことを報告した。この研究者らは、ＦＦＰがＩＮＲを修正できないのは、注入されたＦＦＰ中に存在する凝固因子が被輸血者の血漿によって希釈されたことが原因であるとの仮説を立てた。ＦＦＰは凝固系及び線溶系の全ての成分（タンパク質）を含有し、従って理論的には遺伝性又は後天性凝固因子欠乏症患者の出血の治療に好適である。加えて、この製剤は、凝固障害を伴う対象の手術手技前、手技中及び手技後の出血を防止するはずである。しかしながら、こうした血漿由来製剤は凝固因子に加えて線溶タンパク質を含有するため、製剤の凝固因子の補充中及び補充後に形成された止血凝血塊の望ましくない溶解（融解）を引き起こす可能性がある。
【０００７】
従って、現在に至るまで、過剰出血の治療には限られた解決法しかないように見える。米国では毎年１９万２千人を超える患者が、傷害に関連した失血が原因で死亡している（National trauma instituteによる）。大量の失血は、外傷手術、分娩、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＧ）、消化管出血等に付随して起こる。これらの例では、いずれにおいても出血を止める効率的な血漿輸血が必要である。しかしながら、最近の研究によれば、血漿輸血では大量出血を食い止めることができず、一方で他の治療は低い有効性及び死亡リスクの増加を示すことが明らかになっている。大多数の治療選択肢は凝固の増強に重点が置かれるが、しかしながらそうした大量出血治療によっては不十分な転帰しか得られず、場合によっては死亡に至る。対照的に、同様に大量出血に寄与する線溶亢進に対しては、治療が幾つかある。線溶亢進は、潜在的に線溶活性がフィブリン形成より速く、凝血塊の完全性が脅かされるようになると起こる。現在、外傷患者の５７％及び肝硬変患者の６０％が線溶亢進を呈し、従って凝固増強によるこれらの患者の転帰は不良であるものの、別の治療選択肢はない。本明細書に開示される主題は、線溶亢進の原因となる血漿タンパク質を有効且つ特異的に抽出及び除去する革新的な体外装置を生み出すために開発された。本明細書に開示される主題の医療装置を使用すると、医師は輸血用血漿を改善し、止血を線溶亢進から凝固へとシフトさせ、ひいては大量出血を防止することができる。
【０００８】
米国特許第３，９９８，９４６号は、フィブリンへの重合化なしにフィブリノーゲンを除去し、プラスミノーゲン及びプラスミン並びに他の化合物を除去するが、凝固第ＩＩ因子は保持するヒュームドコロイドシリカによる血漿の処理方法又は関連製剤を開示している。フィブリノーゲンを欠いているため、得られる製剤は凝血塊形成を支持することができず、そのため出血性及び止血障害の治療には使用することができない。
【０００９】
米国特許第７，１２５，５６９号、並びにその対応する出願及び特許は、１つ又は複数のタンパク質混合物からプラスミン（プラスミノーゲン）のみを除去するための極めて特殊な樹脂を用いた特異的方法を開示している。得られる製剤は、生体用接着剤として用いられるプラスミン（プラスミノーゲン）不含フィブリノーゲンを調製する目的で作製された。しかしながら、得られる混合物はなおも組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）を含有し、そのため明らかに線溶活性を呈する。より具体的には、この製剤中のｔＰＡが治療部位でプラスミノーゲンを活性化したため、それが新しく形成されたフィブリン網の切断につながった。プラスミノーゲンは通常は血中に高濃度で存在し（約２μＭ）、従って何らかの手術介入中に何らかの血液漏出があると、血管外部位のプラスミノーゲン濃度が上昇する。更に、手術介入中にかかる接着剤が傷害血管に塗布される場合、生体用接着剤中に存在するｔＰＡが血中に存在するプラスミノーゲンに接触し、それによって線溶カスケードが活性化し得る。従って、米国特許第７，１２５，５６９号に開示されるプラスミノーゲン不含製剤は、生体用接着剤としての局所適用にのみ使用されてもよく、輸血における全身使用又は線溶療法若しくは血栓溶解療法に関連する出血の治療には不適切である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、当該技術分野では、哺乳類体液、具体的には血液、血漿及びその任意の製剤から線溶タンパク質を枯渇させる有効な装置及びコンジュゲートが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の概要
第１の態様において、本開示は、各コンジュゲートが粒子と少なくとも１つのリンカーと少なくとも１つのアミノ酸、その誘導体又はその類似体とを含む複数のコンジュゲート又は複数のコンジュゲートを含む組成物を提供し、ここで複数のコンジュゲートは少なくとも２つの異なるコンジュゲートを含む。アミノ酸又はその類似体は、４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸（トラネキサム酸）、ε−アミノカプロン酸（本明細書ではアミノカプロン酸とも称される）及びリジンのうちの少なくとも１つ又はこれらの任意の組み合わせであってもよく、ここでアミノ酸誘導体は、シクロヘキサンカルボン酸、４−メチルシクロヘキサンカルボン酸のうちの少なくとも１つ又はこれらの任意の組み合わせであってもよい。
【００１２】
一部の更なる態様において、本開示は、少なくとも１つの粒子と少なくとも１つのリンカーと少なくとも１つのアミノ酸、その誘導体又はその類似体とを含むコンジュゲートを提供する。一部の具体的な実施形態において、本明細書に開示される主題のコンジュゲートは、
【化１】
2021515189.tif 000003
（式中、
【化２】
2021515189.tif 000004
は粒子を表す）のうちのいずれか１つであってもよい。
【００１３】
なおも別の態様において、本明細書に開示される主題は、１つ又は複数の哺乳類体液から少なくとも１つの線溶タンパク質を枯渇させる装置を提供し、この装置は、
−  少なくとも１つの流体入口ポートと、少なくとも１つの流体出口ポートとを有するハウジング
を含み；
−  このハウジングは少なくとも１つのチャンバを備え、前記少なくとも１つのチャンバは、少なくとも１つの流体入口ポート及び少なくとも１つの流体出口ポートと流体連通している制御容積を画成し；
−  前記制御容積は、本明細書に開示される主題により定義されるとおりの複数のコンジュゲート又は複数のコンジュゲートを含む組成物及び本明細書において上記に定義されるとおりのコンジュゲートのうちの少なくとも一方を収容する。
【００１４】
本明細書に開示される主題の別の態様によれば、１つ又は複数の哺乳類体液から少なくとも１つの線溶タンパク質を枯渇させる装置が提供され、この装置は、
−  少なくとも１つの流体入口ポートと、少なくとも１つの流体出口ポートとを有するハウジング
を含み；
−  このハウジングは少なくとも１つのチャンバを備え、前記少なくとも１つのチャンバは、少なくとも１つの流体入口ポート及び少なくとも１つの流体出口ポートと流体連通している制御容積を画成し；
−  前記制御容積は、第１の粒子の第１の集合と第２の粒子の第２の集合とを少なくとも含む複数の粒子集合を収容し；
−  ここで前記第１の粒子は前記第２の粒子と寸法が異なり；
−  ここで前記第１の粒子及び前記第２の粒子のうちの少なくとも一方は、アミノ酸、その誘導体又はその類似体とコンジュゲートしたコンジュゲート粒子であり、ここで前記アミノ酸又はその類似体は、４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸（トラネキサム酸）、ε−アミノカプロン酸及びリジンのうちの少なくとも１つであり、及び前記そのアミノ酸誘導体は、シクロヘキサンカルボン酸、４−メチルシクロヘキサンカルボン酸又はこれらの任意の組み合わせである。
【００１５】
例えば、前記第１の粒子及び前記第２の粒子はコンジュゲート粒子であり、各コンジュゲート粒子がアミノ酸、その誘導体又はその類似体とコンジュゲートしており、ここで各前記アミノ酸又はその類似体は、４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸（トラネキサム酸）、ε−アミノカプロン酸及びリジンのうちの少なくとも１つであり、及び前記そのアミノ酸誘導体は、シクロヘキサンカルボン酸、４−メチルシクロヘキサンカルボン酸又はこれらの任意の組み合わせである。
【００１６】
加えて、及び／又は代わりに、例えば、前記第１の粒子及び前記第２の粒子はＴＸＡコンジュゲート粒子、具体的には、シクロヘキサンカルボン酸コンジュゲート粒子、４−メチルシクロヘキサンカルボン酸コンジュゲート粒子又はこれらの任意の組み合わせである。なおも加えて、例えば、前記第１の粒子及び前記第２の粒子はＴＸＡコンジュゲート粒子である。
【００１７】
本明細書で使用されるとき、用語のコンジュゲート粒子とは、アミノ酸、その誘導体又はその類似体にリンカーを介してコンジュゲートした粒子を指す。
【００１８】
加えて、又は代わりに、例えば、前記コンジュゲート粒子は、本明細書において上記に定義される複数のコンジュゲート又は組成物によって定義される。
【００１９】
加えて、又は代わりに、例えば、前記ハウジングは長手方向軸を含み、及び本体部分と、前記少なくとも１つの流体入口ポートを有する入口端部キャップ、及び前記少なくとも１つの流体出口ポートを有する出口端部キャップを含む一対の端部キャップとを含む。
【００２０】
例えば、前記制御容積は、本体部分の長手方向両端に提供される対応するバリア部材によって画成される。
【００２１】
例えば、前記バリア部材は、前記制御容積から前記粒子が抜け出ることを防止するように構成される。
【００２２】
例えば、前記バリア部材は、制御容積を通じた１つ又は複数の哺乳類体液の貫流を同時的に許容するように構成されるか、又は前記バリア部材は、制御容積を通じた１つ又は複数の哺乳類体液の貫流を同時的に許容するように構成され、ここで装置の使用時、１つ又は複数の哺乳類体液は入口端部キャップ及び流体入口ポートを通って制御容積に入り、制御容積を出た後、出口端部キャップ及び流体出口ポートを通って流れる。
【００２３】
加えて、又は代わりに、例えば、前記バリア部材は各々が、それを通じた１つ又は複数の哺乳類体液の貫流を可能にする複数の開口であって、前記粒子より小さいサイズの開口を含む。
【００２４】
更なる態様において、本明細書に開示される主題は、複数の装置を含む、１つ又は複数の哺乳類体液から少なくとも１つの線溶タンパク質を枯渇させることに用いられる装置一式（ｂａｔｔｅｒｙ）に関し、ここで各装置は本明細書に開示される主題により定義されるとおりである。複数の装置のうちの装置は、前記複数の装置のそれぞれの前記制御容積間に流体連通を提供するようにして相互接続されている。
【００２５】
本明細書に開示される主題の別の態様は、１つ又は複数の哺乳類体液から少なくとも１つの線溶タンパク質を枯渇させるためのキットに関し、このキットは、
−  本明細書に開示される主題により定義されるとおりの少なくとも１つの装置、
−  前記少なくとも１つの入口ポートと選択的に流体連通している生理食塩水リザーバ；
−  受血側血漿リザーバ及び洗浄廃液リザーバであって、前記少なくとも１つの流体出口ポートと選択的且つ非同時的に流体連通している受血側血漿リザーバ及び洗浄廃液リザーバ
を含む。
【００２６】
なおも別の態様において、本明細書に開示される主題は、１つ又は複数の哺乳類体液から少なくとも１つの線溶タンパク質を枯渇させるシステムを提供し、このシステムは、
−  本明細書に開示される主題により定義されるとおりの少なくとも１つの装置、
−  生理食塩水リザーバ及び供血側リザーバであって、前記少なくとも１つの流体入口ポートと選択的且つ非同時的に流体連通している生理食塩水リザーバ及び供血側リザーバ；
受血側血漿リザーバ及び洗浄廃液リザーバであって、前記少なくとも１つの流体出口ポートと選択的且つ非同時的に流体連通している受血側血漿リザーバ及び洗浄廃液リザーバ
を含む。
【００２７】
従って、なおも別の態様において、本明細書に開示される主題は、１つ又は複数の哺乳類体液又はその任意の製剤から少なくとも１つの線溶タンパク質を枯渇させる方法に関する。より具体的には、この方法は、（ｉ）前記１つ又は複数の体液を少なくとも１つの線溶タンパク質に特異的なアフィニティー枯渇手順に供するステップ；及び（ｉｉ）ステップ（ｉ）で得られた少なくとも１つの線溶タンパク質が枯渇した体液を回収するステップを含む。アフィニティー枯渇手順は、有効量の複数のコンジュゲート又は複数のコンジュゲートを含む少なくとも１つの組成物と体液を接触させることを含み得る点に留意すべきである。或いは、体液は、複数のコンジュゲート又はその任意の組成物を含む装置、装置一式、キット又はシステムに適用されてもよい。一部の実施形態において、各コンジュゲートは少なくとも１つの粒子と少なくとも１つのリンカーと少なくとも１つのアミノ酸、その誘導体又はその類似体とを含む。一部の具体的な実施形態において、複数のコンジュゲートは少なくとも２つの異なるコンジュゲートを含み、及びここで前記アミノ酸、その誘導体又はその類似体は、４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸（トラネキサム酸）、ε−アミノカプロン酸  リジン、シクロヘキサンカルボン酸及び４−メチルシクロヘキサンカルボン酸のうちの少なくとも１つである。一部の更なる具体的な実施形態において、複数のコンジュゲートは少なくとも２つの異なるコンジュゲートを含み、及びここで前記アミノ酸、その誘導体又はその類似体は、４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸（トラネキサム酸）、ε−アミノカプロン酸及びリジンのうちの少なくとも１つである。
【００２８】
なおも別の態様において、本明細書に開示される主題は、それを必要としている対象の出血性、止血障害及びそれに関連する任意の出血性又は病的状態の治療、防止、予防、改善、抑制方法を提供する。より具体的には、本方法は、線溶活性が低下した治療有効量の少なくとも１つの血液及び／又は血液由来製剤を治療下の対象に投与するステップを含み得る。一部の実施形態において、製剤は本明細書に記載されるとおりの方法により調製されてもよい。
【００２９】
図面の簡単な説明
本明細書に開示される主題の更なる理解のため、及びそれが実際にどのように行われ得るかを例示するため、ここで実施形態について、添付の図面を参照しながら、あくまでも非限定的な例として説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１：コンジュゲート２コンジュゲート２の調製についての化学反応の概略図。
【図２】図２：プラスミノーゲン（ＰＬＧ）検量線ＰＬＧ濃度計算用の検量線を表すグラフ。
【図３】図３：プラスミノーゲン枯渇クリオプレシピテート未処理のクリオプレシピテートとClearPlasmaを使用してろ過したクリオプレシピテートとのプラスミノーゲン濃度を表すグラフ。
【図４】図４：コンジュゲート１（「［アガロース４％ビーズにコンジュゲートしたＴＸＡ］」）を有するClearPlasmaによる血漿ろ過血液の流れ及び血漿と赤血球の分離を示す概略図。加えて、この模式図は、ｔＰＡレベルが低下したプラスミノーゲン枯渇血漿を生成するClearPlasmaの使用を示す。
【図５】図５：ClearPlasmaを使用するとブタの肝傷害における失血が減少するヒストグラムは、肝裂傷後３０分間に見られたとおりの失血量を示す。統計量はスチューデントｔ検定（両側分布等分散）を用いて計算した。データは平均値±ＳＤとして表す。Ｐ＜０．０５の値を有意と見なした。
【図６】図６Ａ〜６Ｌ：コンジュゲート１（「アガロース４％SuperflowビーズにコンジュゲートしたＴＸＡ」）を有するClearPlasmaは線溶活性を消失させるブタが血漿アフェレーシスを受け、血漿はClearPlasmaを用いて処理するか、又は未処理とした。結果として得られるブタ全血の凝固及び線溶をＴＥＧにより判定した。
【図６Ａ】図６Ａ：麻酔前に対照ブタから入手した血液の凝固。
【図６Ｂ】図６Ｂ：麻酔前の０．０８３μＭ  Ｗｔ−ｔＰＡでの対照ブタからの血液
【図６Ｃ】図６Ｃ：麻酔後の対照ブタの血液。
【図６Ｄ】図６Ｄ：麻酔後の０．０８３μＭ  Ｗｔ−ｔＰＡでの対照ブタの血液。
【図６Ｅ】図６Ｅ：血漿アフェレーシス及びプラスミノーゲン枯渇前の対照ブタの血液。
【図６Ｆ】図６Ｆ：０．０８３μＭ  Ｗｔ−ｔＰＡでの血漿アフェレーシス及びプラスミノーゲン枯渇前のブタの血液。
【図６Ｇ】図６Ｇ：血漿アフェレーシス前のブタの血液。
【図６Ｈ】図６Ｈ：０．０８３μＭ  Ｗｔ−ｔＰＡでの血漿アフェレーシス前のブタの血液。
【図６Ｉ】図６Ｉ：血漿アフェレーシス及びプラスミノーゲン枯渇後の対照ブタの血液。
【図６Ｊ】図６Ｊ：０．０８３μＭ  Ｗｔ−ｔＰＡでの血漿アフェレーシス及びプラスミノーゲン枯渇後のブタの血液
【図６Ｋ】図６Ｋ：血漿アフェレーシス制御後のブタの血液。
【図６Ｌ】図６Ｌ：０．０８３μＭ  Ｗｔ−ｔＰＡでの血漿アフェレーシス後のブタの血液
【図７】図７Ａ〜７Ｆ：ＴＥＧ分析−ClearPlasmaはヒト血漿中の線溶活性を消失させるClearPlasmaを通って流れる新鮮凍結血漿（ＰＤＰと称される）の凝固及び線溶を未処理血漿（ＦＦＰと称されるとおり）の凝固及び線溶とトロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）によって比較した。
【図７Ａ】図７Ａ：ＦＦＰは更なる処理なしに凝血塊形成を実証する。
【図７Ｂ】図７Ｂ：組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ−１．８５ｎＭ）を加えると凝血塊分解が生じる。
【図７Ｃ】図７Ｃ：図７Ａ及び図７Ｂのオーバーレイ。
【図７Ｄ】図７Ｄ：プラスミノーゲン枯渇血漿（ＰＤＰ）は更なる処理なしに凝血塊形成を実証する。
【図７Ｅ】図７Ｅ：組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ−１．８５ｎＭ）を加えても凝血塊分解は生じなかった。
【図７Ｆ】図７Ｆ：図７Ｄ及び図７Ｅのオーバーレイ。このデータは（３つの独立した実験からの）代表的な実験を示している。
【図８】図８：マウスにおける尾切断後の出血時間ClearPlasma、血漿又は生理食塩水のいずれかで治療した尾切断後の個々のマウス（１〜８番の番号を付与）の出血時間を示すグラフ。
【図９】図９：各マウスのペレットサイズ結果（２４時間時点）ClearPlasma、血漿又は生理食塩水のいずれかで治療した尾切断後の個々のマウス（１〜８番の番号を付与）のペレットサイズを示すグラフ。
【図１０】図１０：マウスにおける尾切断後の出血試験結果：出血試験からの血液細胞ペレットを遠心し、上清を吸引した。次に定規を用いてペレットサイズを測定した。ペレットサイズ測定値の統計的分析は、一元配置ＡＮＯＶＡと、続く事後ＬＳＤ／ＳＣＨＥＬＦ（ｐ＜０．０５を有意と見なす）を用いて実施した。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｂ：ClearPlasmaはブタにおいてプラスミノーゲン及びｔＰＡタンパク質の両方のレベルを低下させる雌ブタが麻酔下でHaemonetics mcs+システムを使用した血漿アフェレーシスを受けた。いずれの手順も同様に行った（血液ろ過量、治療される抗凝血物質、血漿採取時間及び量）。
【図１１Ａ】図１１Ａ：未ろ過対照血漿との比較におけるClearPlasmaでろ過したブタからの血漿試料（ＰＤＰと称される）中のプラスミノーゲン枯渇を表すグラフ。
【図１１Ｂ】図１１Ｂ：未ろ過対照血漿との比較におけるClearPlasmaでろ過したブタからの血漿試料（ＰＤＰと称される）中のｔＰＡ枯渇を表すグラフ。４つの独立した実験からの代表的な結果。
【図１２】図１２：本装置本明細書に開示される主題の第１の例に係る装置を横断面側面図で示す。
【図１２Ａ】図１２Ａ：図１２の例の代替的変形例に係る装置を分解等角図で示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂ：図１２の例の代替的変形例に係る装置の一部を断面詳細側面図で示す。
【図１３】図１３：図１３Ａ〜図１３Ｄ：本装置
【図１３Ａ】図１３Ａ：図１２の例に係る装置の本体部分を上面図で示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂ：図１３Ａの例に係る装置の本体部分を側面図で示す。
【図１３Ｃ】図１３Ｃ：図１３Ｂの例に係る装置の本体部分をＡ−Ａに沿った断面側面図で示す。
【図１３Ｄ】図１３Ｄ：図１３Ｃの例に係る装置の「Ｇ」における一部を断面詳細側面図で示す。
【図１４】図１４：図１４Ａ〜図１４Ｄ：本装置の端部キャップ
【図１４Ａ】図１４Ａ：図１２の例に係る装置の端部キャップを上面図で示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂ：図１４Ａの例に係る装置の端部キャップを側面図で示す。
【図１４Ｃ】図１４Ｃ：図１４Ｂの例に係る装置の端部キャップをＡ−Ａに沿った断面側面図で示す。
【図１４Ｄ】図１４Ｄ：図１４Ｃの例に係る装置の「Ｇ」における一部を断面詳細側面図で示す。
【図１５】図１５：本システム本明細書に開示される主題の例に係るシステムを概略的に図示し、このシステムは洗浄構成にある。
【図１６】図１６：本システム図１５の例に係るシステムを概略的に図示し、このシステムは治療構成にある。
【図１７】図１７：本キット図１５の例に係るシステムに対応するキットを概略的に図示する。
【図１８】図１８：本システム本明細書に開示される主題の別の例に係るシステムを概略的に図示し、このシステムは装置の装置一式を含んでいる。
【図１９】図１９：本システム本明細書に開示される主題の別の例に係るシステムを概略的に図示し、このシステムは装置の装置一式を含んでいる。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
発明の詳細な説明
本開示は、その最も広義の態様によれば、複数のコンジュゲート又は複数のコンジュゲートを含む組成物を提供し、各コンジュゲートは一般式（Ｉ）
Ｘ−Ｙ−Ｚ（Ｉ）
のものであり、
式中：
Ｘは、固体支持体部分、例えば粒子であり；
Ｙは、部分Ｘ及びＺを連結する化学反応性部分であり；
Ｚは、アミノ酸、その誘導体又はその類似体のうちの少なくとも１つを含む部分であり；及び
式中、各「−」は、相互作用／会合、例えばスペーサーとして働くか又は選択性を導く部分として働く１つ又は複数の介在原子を任意選択で含む化学結合を意味する。
【００３２】
用語のアミノ酸とは、本明細書で使用されるとき、アミン（−ＮＨ２）基及びカルボキシル（−ＣＯＯＨ）基を含有する化合物（例えば、有機化合物）を指し、本明細書に詳述されるとおりの、その任意の誘導体又はその任意の類似体を包含する。本開示との関連において用語「部分」は、本明細書に記載されるとおり機能する原子、原子団及び分子の任意の機能的断片を指し得る。部分はまた、カプセル、スフェア、ナノ粒子、リポソーム等、本明細書に記載されるとおり機能する少なくとも１つの材料の（即ち単一の原子又は複数の原子の）物理的要素の形態であってもよい。
【００３３】
「アミノ酸類似体」は、天然に存在するアミノ酸と同じ化学構造、即ち、カルボキシル基及びアミノ基、又はＲ基を有する化合物（本明細書では構造的類似体とも称される）である。例としては、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムが挙げられる。なおも一部の更なる実施形態において、用語のアミノ酸類似体はまた、機能的類似体、具体的には同じ生物学的機能を果たす分子も包含する。あるアミノ酸、例えばリジンのかかる機能的類似体の非限定的な例はトラネキサム酸（ＴＸＡ）であり、これはリジンに対する機能的類似体として働き、そのためプラスミノーゲン上の４〜５個のリジン受容体部位と可逆的に結合することによって抗線溶剤として機能する。
【００３４】
「アミノ酸誘導体」は、本明細書で使用されるとき、アミノ酸又はその任意の類似体（構造的及び／又は機能的）の断片（一部、部分）、例えば少なくともアミノ基を欠く断片を少なくとも含む類似体化合物である。具体的な例では、アミノ酸誘導体は、アミノ酸又はその類似体のシクロヘキサンカルボン酸断片、即ちアミノ基を欠く断片を含む。
【００３５】
アミノ酸、その誘導体又はその類似体は、一部の実施形態において、４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸（トラネキサム酸）、ε−アミノカプロン酸、リジン、シクロヘキサンカルボン酸、４−メチルシクロヘキサンカルボン酸のうちの少なくとも１つ又はこれらの任意の組み合わせであってもよい。
【００３６】
第１の態様において、本開示は、各コンジュゲートが粒子と少なくとも１つのリンカーと少なくとも１つのアミノ酸、その誘導体又はその類似体とを含む複数のコンジュゲート又は複数のコンジュゲートを含む組成物を提供する。一部の実施形態において、複数のコンジュゲートは少なくとも２つの異なるコンジュゲートを含む。なおも更に、一部の実施形態において、アミノ酸、その誘導体又はその類似体は、４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸（トラネキサム酸）、ε−アミノカプロン酸、リジン、シクロヘキサンカルボン酸及び４−メチルシクロヘキサンカルボン酸のうちの少なくとも１つ又はこれらの任意の組み合わせであってもよい。なおも更に、一部の実施形態において、アミノ酸、その誘導体又はその類似体は、４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸（トラネキサム酸）、ε−アミノカプロン酸及びリジンのうちの少なくとも１つ、又はこれらの任意の組み合わせであってもよい。なお一部の実施形態において、アミノ酸、その誘導体又はその類似体はトラネキサム酸（ＴＸＡ）であってもよい。
【００３７】
コンジュゲートとは、本明細書で使用されるとき、少なくとも１つの粒子、少なくとも１つのリンカー及び少なくとも１つのアミノ酸、その誘導体又はその類似体を含めた幾つかの要素（成分）で構成され、それらが全てそこに会合している化合物を指す。本願では「少なくとも１つの粒子」と表現されるが、特許請求される複数のコンジュゲートに適用可能な任意の固体支持体が本明細書に包含されることに留意しなければならない。
【００３８】
本明細書に開示される主題のコンジュゲート又はその任意の組成物のうちのいずれか１つはまた、物質の組成物（composition of matter）とも称され得る。ほとんどの一般的用語において、「物質の組成物」は「コンジュゲート」と同様に（両者とも同義的に使用される）、少なくとも１つの粒子と少なくとも１つのリンカーと少なくとも１つのアミノ酸、その誘導体又はその類似体との会合であって、以下に詳述するとおり、全体としてのその物質の組成物（又はコンジュゲート）に帰され得る且つその個別の状態ではコンジュゲート（conjugae）の成分のうちのいずれの１つにも帰されないものであり得る特性を生み出す会合を指す。
【００３９】
一部の実施形態において、本明細書に開示される主題のコンジュゲートのうちのいずれか１つは、少なくとも１つの粒子とリンカーである少なくとも１つの化学反応性部分との会合及び少なくとも１つのリンカーと少なくとも１つのアミノ酸、その誘導体又はその類似体との会合（assocaition）であって、リンカーが粒子とアミノ酸、その誘導体又はその類似体との間に位置し、従って一方の末端で（一方のアームで）粒子に会合し、もう一方の末端で（第２の異なるアームで）アミノ酸、その誘導体又はその類似体に会合しているような会合を包含する。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、用語「会合」又はその任意の語学上の変化形は、２つの実体（例えば粒子とリンカー）を一体に保持する化学的力又は物理的力を指す。かかる力は、当業者に公知のいかなる種類の化学的又は物理的結合相互作用であってもよい。かかる会合相互作用の非限定的な例は、共有結合、イオン結合、配位結合、錯体化、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性−親水性相互作用等である。従って、リンカーと少なくとも１つの粒子の、及びリンカーとアミノ酸の会合／コンジュゲーションは、共有結合、静電相互作用、酸塩基相互作用、ファンデルワールス相互作用等を含めた任意の化学結合によるものであってよい。理解されるとおり、粒子及びリンカーの会合と、リンカーとアミノ酸、その誘導体又はその類似体の会合とは同じであってもよく、又は以下に更に詳述するとおり異なってもよい。
【００４１】
例えば及び以下に詳述するとおり、シクロヘキサンカルボン酸又は４−メチルシクロヘキサンカルボン酸である（即ちアミノ酸類似体の少なくともＮＨ２基（アミノ基）を欠いている）アミノ酸誘導体について、リンカーは、アミノ基（単独での、又はメチレン基に結合した、即ち−ＮＨ２−ＣＨ２−である（「−」は共有結合である））を含んでもよい。代替的な例では、アミノ酸又はその類似体（即ちアミノ酸のＮＨ２基（アミノ基）を含む）について、リンカーはアミノ基（単独での、又はメチレン基に結合した、即ち−ＮＨ２−ＣＨ２−である（「−」は共有結合である））を含まなくてもよい。
【００４２】
上記に指摘したとおり、複数のコンジュゲートは、本明細書に開示される主題によって組成物で提供されてもよい。本明細書で使用されるとおりの組成物は、少なくとも２つの異なるコンジュゲートを含む複数のコンジュゲートを含む。異なるコンジュゲートとは、少なくとも１つのパラメータが異なると理解されるべきであり、より具体的には、コンジュゲート成分のうちの少なくとも１つ、例えば粒子、リンカー、アミノ酸、その誘導体又はその類似体、時にコンジュゲート成分のうちの少なくとも２つ及び時にコンジュゲート成分のうちの少なくとも３つの少なくとも１つのパラメータ又は特性の点で異なる種々のコンジュゲートであると理解されるべきである。従って、複数のコンジュゲート又はその組成物のうちの少なくとも２つの異なるコンジュゲートが、異なる粒子及び／又は異なるリンカー及び／又は異なるアミノ酸、その誘導体又はその類似体を含み得る。換言すれば、本明細書で「異なるコンジュゲート」と称されるコンジュゲートは、少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つ全ての成分が同一でない（例えば異なる）ようなコンジュゲート成分、例えば粒子、リンカー、アミノ酸を含む。
【００４３】
一部の実施形態において、少なくとも２つの異なるコンジュゲートは異なる粒子を含む。
【００４４】
一部の実施形態において、少なくとも２つの異なるコンジュゲートは異なるリンカーを含む。
【００４５】
一部の実施形態において、少なくとも２つの異なるコンジュゲートは異なるアミノ酸、その誘導体又はその類似体を含む。
【００４６】
一部の実施形態において、少なくとも２つの異なるコンジュゲートは、同一の粒子、同一のリンカー及び異なるアミノ酸、その誘導体又はその類似体を含む。
【００４７】
一部の他の実施形態において、少なくとも２つの異なるコンジュゲートは、同一の粒子、異なるリンカー及び同一のアミノ酸、その誘導体又はその類似体を含む。
【００４８】
一部の他の実施形態において、少なくとも２つの異なるコンジュゲートは、異なる粒子、同一のリンカー及び同一のアミノ酸、その誘導体又はその類似体を含み得る。
【００４９】
一部の実施形態において、少なくとも２つの異なるコンジュゲートは、異なる粒子及び異なるリンカーを含む。一部の実施形態において、少なくとも２つの異なるコンジュゲートは、異なる粒子、異なるリンカー及び同一のアミノ酸、その誘導体又はその類似体を含む。
【００５０】
一部の実施形態において、少なくとも２つの異なるコンジュゲートは、異なる粒子及び異なるアミノ酸、その誘導体又はその類似体を含む。一部の実施形態において、少なくとも２つの異なるコンジュゲートは、異なる粒子、異なるアミノ酸、その誘導体又はその類似体及び同一のリンカーを含む。
【００５１】
一部の実施形態において、少なくとも２つの異なるコンジュゲートは、異なるリンカー及び異なるアミノ酸、その誘導体又はその類似体を含む。一部の実施形態において、少なくとも２つの異なるコンジュゲートは、異なるリンカー、異なるアミノ酸、その誘導体又はその類似体及び同一の粒子を含む。
【００５２】
一部の実施形態において、少なくとも２つの異なるコンジュゲートは、異なる粒子、異なるリンカー及び異なるアミノ酸、その誘導体又はその類似体を含む。
【００５３】
用語の異なるリンカーとは、異なる点がリンカーの化学式などのリンカー特性であり得るというように理解されなければならない。
【００５４】
上述のとおり、本明細書に開示される主題によって提供されるとおりの複数のコンジュゲート又はその任意の組成物は、少なくとも２つの異なるコンジュゲート、少なくとも３つの異なるコンジュゲート、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７  少なくとも８、少なくとも１０の異なるコンジュゲート、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又はそれ以上の異なるコンジュゲートを含み得る。
【００５５】
なおも更に、異なるコンジュゲートと言うとき、それは、異なる点が、コンジュゲート又はその任意の成分（例えば、粒子、リンカー及びアミノ酸）の少なくとも１つの特徴（特性、パラメータ）、例えば、サイズ、化学組成、形状、構造、密度、伝導率、溶解度、材料等であり得るというように理解されなければならない。例えば、サイズ及び／又は異なる組成及び／又は異なる形状及び／又は異なる構造のうちの少なくとも１つの点で異なる粒子、リンカー又はアミノ酸のうちの少なくとも１つは、異なる粒子と見なされる。
【００５６】
意外にも、本明細書に記載されるとおりの少なくとも２つの異なるコンジュゲートを含む複数のコンジュゲート又は少なくとも２つの異なるコンジュゲートを含む組成物が、体液、具体的には血液、血漿及び任意の血液製剤からのプラスミノーゲン、プラスミン及び／又はｔＰＡなどの線溶タンパク質の枯渇において有効であることが分かった。
【００５７】
一部の実施形態において、複数のコンジュゲートは、約１０μｍ以下〜約５００μｍ以上の間の平均粒径を有する粒子を含む。具体的には、μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、１２０μｍ、１３０μｍ、１４０μｍ、１５０μｍ、１６０μｍ、１７０μｍ、１８０μｍ、１９０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、３５０μｍ、４００μｍ、４５０μｍ、５００μｍ又はそれ以上。一部の具体的な実施形態において、複数のコンジュゲートは、少なくとも７０μｍ以下、時に少なくとも８０μｍ、時に少なくとも９０μｍ、時に少なくとも１００μｍ、時に少なくとも１１０μｍ、時に少なくとも１２０μｍ、時に少なくとも１３０μｍ、時に少なくとも１４０μｍ、時に少なくとも１５０μｍの平均粒径を有する粒子を含む。一部の実施形態において、複数のコンジュゲートは約９０μｍ〜約１５０μｍ以上の間の平均粒径を有する。
【００５８】
用語「平均径（average size）」又は「平均直径（average diameter）」又は「径平均値（mean size）」は、直径測定値の算術平均値を指し、ここで直径は平均値の±２５％の範囲である。粒子の径平均値は、当該技術分野において公知の任意の方法によって測定することができる。
【００５９】
一部の実施形態において、複数のコンジュゲートは、平均径が異なる少なくとも２つの異なる粒子を含む。理論によって拘束されるものではないが、２つ以上の異なるサイズの粒子（例えばビーズ）を使用すると、表面積の最大化という利点が得られ、そのため体液、例えば血漿が主にビーズの表面上を流れ、死空間がほとんどなくなることに留意しなければならない。異なるサイズのビーズが多くあると、樹脂床における自由空間が少なくなる。
【００６０】
他方で、樹脂を緊密に充填すると、血漿が流れるところがほとんどなくなり、つまり流量が下がることになる。
【００６１】
より具体的には、本発明者らは、意外にも、異なるサイズの粒子の混合物がマイクロ流体力学的流動性を改善し、同じ流量を維持しながらも、より多くの血漿をコンジュゲート（樹脂）に曝露し得ることを見出した。更に、少なくとも２つの粒径のコンジュゲートを混合するとビーズの量が減少し、従って使用するコンジュゲートのコストが最小限となり得る。一部の実施形態において、本明細書に開示される主題のコンジュゲートは、異なるサイズの少なくとも２つの粒子集合を使用したコンジュゲートを含む樹脂を形成し得る。一部の詳細な実施形態において、粒子は、約０．００１：１〜約１：１００００、より具体的には、約０．０１：１〜１：１００００、約１：１〜１：１０００の比で存在してもよい。なおも一部の更なる実施形態において、この比は、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００であってもよい。より具体的には、本明細書に開示される主題に係る複数のコンジュゲート又はその組成物の粒子は、一部の実施形態において約１：１〜１：１０、具体的には１：４の比を呈する少なくとも２つの異なるサイズであってもよい。一部の実施形態において、本明細書では本明細書に開示される主題の樹脂とも称される、本明細書に開示される主題の複数のコンジュゲートは、平均径が約９０μｍ以下の粒子と、平均径が１５０μｍ以上の粒子との異なるコンジュゲートの混合物を含み得る。なおも一部の更なる具体的な実施形態において、本明細書に開示される主題の複数のコンジュゲート又は組成物は、平均径が９０μｍの粒子と平均径が１５０μｍの粒子との４：１の比のコンジュゲートを含み得る。
【００６２】
用語の粒子は、本明細書で使用されるとき、共有結合又は非共有結合のいずれかによって取り付けられてもよい、化学的又は生物学的化合物、小分子又は大分子に取り付けることのできる表面を有する物質の一部分を指す。粒子は多孔質材料を含み得る。粒子は、「球状」（概して、実質的に（ほぼ）丸いボールの幾何学的形状を指す）、又は「非球状」、例えば、（「細長い」形状で、定義付けられた長軸及び短軸を有する）であってもよい。粒子の非限定的な例としては、多糖ビーズ、ガラスビーズ、綿ビーズ、プラスチックビーズ、ナイロンビーズ、ラテックスビーズ、磁性ビーズ、常磁性ビーズ、超常磁性ビーズ、デンプンビーズなど、シリコンビーズ、ＰＴＦＥビーズ、ポリスチレンビーズ、ガリウムヒ素ビーズ、金ビーズ、又は銀ビーズのうちの少なくとも１つなどのビーズが挙げられる。一部の実施形態において、粒子は、任意選択で異なる架橋度、異なる材料（アガロース）％の、アガロースビーズを含むビーズである。
【００６３】
このように、アガロースビーズは、様々な架橋度のアガロースを含むビーズ、例えばセファロースビーズと呼ばれるビーズを包含する。一部の実施形態において、ビーズはアガロースビーズを含む。一部の実施形態において、ビーズはセファロースビーズを含む。一部の実施形態において、複数のコンジュゲートは、アガロースビーズとセファロースビーズとを含む粒子の組み合わせを含む。本開示において、アガロースビーズ及びセファロースビーズのいずれかである粒子は、異なる粒子を有する２つの異なるコンジュゲートと見なされることに留意しなければならない。
【００６４】
セファロースは、海藻から抽出された多糖ポリマー材料であるアガロースが架橋されてビーズ状になった形態のものの商標名である。その商品名は、セパレーション−ファルマシア−アガロース（Separation-Pharmacia-Agarose）に由来する。セファロースは、GE Healthcare（旧Pharmacia、Pharmacia LKB Biotechnology、Pharmacia Biotech、Amersham Pharmacia Biotech、及びAmersham Biosciences）の登録商標である。様々なグレード及びケミストリーのセファロースが利用可能である。
【００６５】
本明細書に記載されるとおり、複数のコンジュゲートは、異なるサイズ、異なる形状、異なる組成及び異なる材料など、異なる特性の粒子を任意選択で有する少なくとも２つの異なるコンジュゲートを含んでもよい。一部の実施形態において、複数のコンジュゲートは、平均径が約９０μｍのアガロースビーズを含んでもよい。一部の実施形態において、複数のコンジュゲートは、平均径が約１５０μｍのアガロースビーズを含んでもよい。一部の実施形態において、複数のコンジュゲートは、平均径が約９０μｍのセファロースビーズを含んでもよい。一部の実施形態において、複数のコンジュゲートは、平均径が約１５０μｍのセファロースビーズを含んでもよい。本開示において、平均径が約９０μｍのセファロースビーズ及び平均径が約１５０μｍのセファロースビーズのいずれかである粒子は、異なる粒子を有する２つの異なるコンジュゲートと見なされることに留意しなければならない。
【００６６】
本明細書に記載されるとおりの粒子、具体的にはビーズは、本明細書でリンカーと呼ばれる化学反応性部分に会合されてもよい。リンカーは、本明細書で使用されるとき、任意の長さのオリゴマー鎖及びポリマー鎖を含め、任意の原子集合で構成される任意の化学的実体であってよく、これは一部の実施形態によれば、一方の末端が粒子への、及び他方の末端が少なくとも１つのアミノ酸、その誘導体又はその類似体への結合能を有するものである。更に、本発明者らにより、粒子表面のリンカー被覆率は約９〜約２３μｍｏｌビーズ／ｍｌ液抜き後媒体の範囲であり得ることが見出された。より具体的には、一部の実施形態において、液抜き後媒体とは、本明細書では乾燥ビーズを指すことに留意しなければならない。
【００６７】
本明細書に記載されるとおり、リンカーは一端が粒子への、及び第２の端部がアミノ酸、その誘導体又はその類似体への結合能を有し、従ってリンカーは両側に官能性末端を有する。換言すれば、リンカーは二官能性リンカーであり得る。一部の実施形態において、リンカーは二官能性架橋剤であり、粒子は、この二官能性架橋剤に結合するビーズである。本明細書で使用されるとき、用語「架橋剤」は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質又は他の分子上にある特異的官能基（例えば、第一級アミン、カルボキシル、スルフヒドリル等）と化学的に結び付く能力を有する反応性末端を２つ以上含む試薬を指す。
【００６８】
一部の実施形態において、リンカー（又は架橋剤）は二官能性リンカーであってもよく、又は二官能性リンカーの一部／断片を含んでもよい。
【００６９】
理解されるとおり、リンカーは様々な実験要件に応じて異なる長さを有し得る。長さとは、架橋剤の分子スパン、即ち、コンジュゲートした成分間、例えば粒子とアミノ酸との間の距離を指す。一部の実施形態において、架橋剤は切断可能である（即ち、必要に応じて連結を逆戻りさせる又は壊すことができるかどうか、例えばＥＤＣ）。一部の実施形態において、架橋剤はゼロ長さの架橋剤である。一部の実施形態において、架橋剤は、最終的な架橋共有結合の一部となることなく直接的なコンジュゲーションを生じさせる。架橋剤はホモ二官能性架橋剤又はヘテロ二官能性架橋剤であってもよい。ホモ二官能性架橋剤は、両末端に同じ種類の反応基を有する試薬である。アミン架橋剤（即ちアミン反応基に結合する）が、例えば、グルタルアルデヒド、ビス（イミドエステル）類又はビス（スクシンイミジルエステル）類（ＮＨＳエステルとしても知られる）から選択されてもよい。一部の実施形態によれば、限定はされないが、ピメルイミド酸ジメチル（ＤＭＰ）又はグルタルアルデヒドなどのホモ二官能性架橋剤は、磁性ビーズ上のＮＨ２基（主要な基）と、トラネキサム酸のＮＨ２基とに結合することができる。スルフヒドリル架橋剤が、例えばマレイミド類又はピリジルジチオール類から選択されてもよい。
【００７０】
一部の実施形態において、リンカーはヘテロ二官能性架橋剤である。ヘテロ二官能性架橋剤は、両末端に異なる種類の反応基を有する試薬、例えば限定はされないが、アミン対スルフヒドリル又はアミン対カルボキシルである。
【００７１】
アミン対スルフヒドリル架橋剤は各末端にＮＨＳエステル類及びマレイミド類を有し、又は各末端にＮＨＳエステル類及びピリジルジチオール類を有し得る。アミン基及びスルフヒドリル基を結合し得るヘテロ二官能性架橋剤の例は、限定はされないが、Ｎ−スクシンイミジル３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、又はスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）から選択される。
【００７２】
アミン対カルボキシル架橋剤はカルボジイミドを有し得る。第一級アミン類との反応が自然に起こるようにカルボキシル基を活性化する、かかるカルボジイミド架橋剤。こうした架橋剤は、カルボキシル基（グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、Ｃ末端）を第一級アミン類（リジン、Ｎ末端）及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）にコンジュゲートし得る。アミン基及びカルボキシル基を結合し得るヘテロ二官能性架橋剤の例は、限定はされないが、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）及び（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、塩酸塩（ＥＤＡＣ）から選択される。これらの架橋剤は、アミンコンジュゲーション用のカルボン酸塩の安定活性化のためカルボキシル基（グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、Ｃ末端）を第一級アミン類（リジン、Ｎ−末端）及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）にコンジュゲートするために使用される。
【００７３】
一部の実施形態において、リンカーは芳香族系である。非限定的な例としては、安息香酸又は置換安息香酸、ベンゼンスルホニルクロリド、ベンズアルデヒド、クロロメチルベンゼンが挙げられる。
【００７４】
一部の具体的な実施形態において、使用されるリンカーは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）である。
【００７５】
本明細書において上記に詳述されるとおり、アミノ酸誘導体、例えばシクロヘキサンカルボン酸又は４−メチルシクロヘキサンカルボン酸を含むコンジュゲート（即ちアミノ酸のＮＨ２基（アミノ基）を欠いている）について、リンカーはアミノ基（単独での、又はメチレン基に結合した、即ち−ＮＨ２−ＣＨ２−である（「−」は共有結合である））を含んでもよい。従って、一部の実施形態において、本明細書に記載されるリンカーは、少なくとも追加のアミノ基又はメチレン基に結合したアミノ基を含み得ることに留意しなければならない。従って、かかる実施形態において、アミノ酸誘導体に結合するリンカー末端は、リンカーのアミノ基又はリンカーのメチレン基である。換言すれば、リンカーの一端とアミノ酸誘導体との間の会合は、シクロヘキサン環とアミノ基又はメチレン基との共有結合を含む。かかる会合は、当業者に公知の任意の公知の合成方法によることができる。
【００７６】
一部の実施形態において、ビーズは、ビーズ上に存在するスペーサー又はコーティングを介してリンカーに会合されてもよい。このように、ビーズは初めにスペーサー／コーティングとの会合によって活性化され（「活性化ビーズ」）、次にリンカーと反応する。時に、スペーサー／コーティングが少なくとも１つのアミノ酸に直接結合する場合、リンカーはそれ以上不要であり得ることに留意しなければならない。時に、リンカーへの結合能のある官能基がビーズになく、スペーサー又はコーティングが使用されてもよい。
【００７７】
活性化ビーズは、ビーズへの結合及びリンカー及び／又はアミノ酸への結合を可能にする活性部分を有する好適な材料でビーズをプレコーティングすることにより入手される。換言すれば、ビーズは、リンカー又はアミノ酸のいずれかへの共有結合性の結合を可能にする反応基を含むようにプレコーティングされる。
【００７８】
一部の実施形態において、ビーズは、例えば任意のコーティング材料でプレコーティングすることにより活性化されてもよい。かかる材料の非限定的な例としては、例えば、アミノ酸、タンパク質、エポキシ、トシル、カルボン酸、カルボキシル化ポリビニルアルコールが挙げられる。「プレコーティング」と言うとき、それは、結果としてビーズが活性材料でコーティングされ、ひいては活性材料によってトラネキサム酸との（即ち直接）又は少なくとも１つのリンカーを介したビーズの共有結合性の結合が可能となる予備的ステップと理解されなければならない。一部の実施形態において、ビーズは、アミノ酸、ペプチド又はその任意の誘導体でプレコーティングされる。プレコーティングされた磁性ビーズは、例えば活性基として、第一級アミン（−ＮＨ２）、カルボキシル（−ＣＯＯＨ）、スルフヒドリル（−ＳＨ）又はカルボニル（−ＣＨＯ）を含み得る。一部の実施形態において、ビーズは、第一級又は第二級アミノ基と反応し得る部分を含むようにプレコーティングされる。一部の他の実施形態において、磁性ビーズはポリリジンでコーティングされる。
【００７９】
本明細書で使用されるとき、用語「リンカー」は、ビーズ上に存在する任意のスペーサー又はプレコーティングを包含する。
【００８０】
一部の実施形態において、リンカーは、原子鎖、例えば直鎖を含むか、又はそれである。一部の実施形態において、リンカーは、少なくとも１原子、少なくとも４原子、時に５原子、時に１０原子、時に２０原子、時に３０原子、時に４０原子を含む。一部の実施形態において、リンカーは１〜４０原子の直鎖であるか、又はそれを含む。一部の実施形態において、リンカーは１原子の直鎖であるか、又はそれを含む。一部の実施形態において、リンカーは５原子を含む直鎖である。一部の実施形態において、リンカーは１５原子を含む直鎖である。
【００８１】
一部の実施形態において、リンカーは３１原子を含む直鎖である。一部の実施形態において、リンカーは、２６−（２−ヒドロキシ−３−メトキシプロピルアミノ）−ヘキサコサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イルエステルの断片である。一部の実施形態において、リンカーは、４−オキソペンタン酸メチルエステルの断片である。一部の実施形態において、リンカーはメチレンである。
【００８２】
本明細書に記載されるとおり、アミノ酸誘導体について、リンカーは一端（シクロヘキサン環との反応性のある末端）にアミノ基又はメチレン（−ＣＨ２−）基を含む。
【００８３】
理解されるとおり、リンカーがアミノ酸、その誘導体又はその類似体に会合すると、リンカーはその会合に起因して修飾され、一部の実施形態では、リンカーの断片を含む。
【００８４】
リンカー特性はリンカー内の原子の性質に依存する。酸素、窒素又は硫黄など、少なくとも１つの孤立電子対を有する原子を少なくとも１つ含むリンカーが分かった。一部の実施形態において、リンカーは少なくとも１つの酸素原子を含む。
【００８５】
一部の他の実施形態において、リンカーから少なくとも１つのアミノ酸、その誘導体又はその類似体への間の会合は共有結合であってもよい。一部の更なる実施形態において、リンカーから少なくとも１つのアミノ酸への間の会合は、アミノ酸の窒素（Ｎ）原子とリンカーの炭素（Ｃ）原子との結合によってもよい。理解されるとおり、会合及び化学結合の形成時、アミノ基（−ＮＨ２−）は１個の水素原子を失い−ＮＨ−となる。一部の実施形態において、共有結合性の会合は、アミン、イミン又はアミド結合を介したものである。一部の実施形態において、アミノ酸はトラネキサム酸（ＴＸＡ）である。本明細書に詳述されるとおり、一部の実施形態において、アミノ酸誘導体はシクロヘキサンカルボン酸であり、シクロヘキサンカルボン酸とリンカーの会合／相互作用はシクロヘキサン環及びリンカーのメチレン基を介したものである。以下の実施例１．１に詳述するとおり、複数のコンジュゲートの少なくとも一部において、ビーズは２６−（２−ヒドロキシ−３−メトキシプロピルアミノ）−ヘキサコサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イルエステルでプレコーティングされてもよい。従って、２６−（２−ヒドロキシ−３−メトキシプロピルアミノ）−ヘキサコサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イルエステルと会合したアガロースビーズが、少なくとも１つのアミノ酸又はその類似体との会合に供される。コンジュゲート中のリンカーは、２６−（２−ヒドロキシ−３−メトキシプロピルアミノ）−ヘキサコサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イルエステルの断片、具体的には２６−（２−ヒドロキシ−３−メトキシプロピルアミノ）−ヘキサコサナールである。理解されるとおり、２６−（２−ヒドロキシ−３−メトキシプロピルアミノ）−ヘキサコサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イルエステルとアミノ酸又はその類似体との間の会合に起因して、リンカーは、２６−（２−ヒドロキシ−３−メトキシプロピルアミノ）−ヘキサコサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イルエステルの断片、具体的には２６−（２−ヒドロキシ−３−メトキシプロピルアミノ）−ヘキサコサナールである。
【００８６】
以下の実施例１．２に詳述するとおり、複数のコンジュゲートの少なくとも一部において、ビーズは水酸化物でプレコーティングされてもよく、無水コハク酸及びピリジンと反応し、続いてＮ−ヒドロキシルコハク酸アミド（N-Hydroxylsuccinamide）（ＮＨＳ）及びＥＤＣと反応し得る。従って、４−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）−４−オキソ酪酸メチルエステルと会合したアガロースビーズが、少なくとも１つのアミノ酸又はその類似体との会合に供される。コンジュゲート中のリンカーは、４−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）−４−オキソ酪酸メチルエステルの断片、具体的には４−オキソ酪酸メチルエステルである。
【００８７】
一部の実施形態において、コンジュゲートは、平均径が９０μｍのアガロースビーズを含む。一部の実施形態において、リンカーは２６−（２−ヒドロキシ−３−メトキシプロピルアミノ）−ヘキサコサナールを含む。一部の実施形態において、コンジュゲートは、構造（本明細書では「コンジュゲート１」と称される）：
【化３】
2021515189.tif 000005
（式中
【化４】
2021515189.tif 000006
は粒子、例えばアガロースビーズ、具体的には平均径が９０μｍの４％アガロースビーズを表す）を有し得る。
【００８８】
一部の実施形態において、アミノ酸はＴＸＡであり、粒子は平均径が９０μｍのアガロースビーズであり、及びリンカーは２６−（２−ヒドロキシ−３−メトキシプロピルアミノ）−ヘキサコサナールを含み、及びコンジュゲートは、本明細書においてコンジュゲート１と称される構造を有する。アミノ酸誘導体がシクロヘキサンカルボン酸である一部の実施形態において、粒子は平均径が９０μｍのアガロースビーズであり、及びリンカーは２６−（２−ヒドロキシ−３−メトキシプロピルアミノ）−ヘキサコサン酸メチルアミドを含み、及びコンジュゲートは、本明細書においてコンジュゲート１と称される構造を有する。
【００８９】
一部の実施形態において、本明細書に開示される主題のコンジュゲートは、平均径が１５０μｍのセファロースビーズを含む。一部の実施形態において、リンカーは４−オキソ酪酸メチルエステルを含む。一部の実施形態において、コンジュゲートは、構造（本明細書において「コンジュゲート２」と称される）：
【化５】
2021515189.tif 000007
（式中
【化６】
2021515189.tif 000008
は粒子、例えば平均径が１５０μｍのセファロースビーズを表す）を有し得る。
【００９０】
一部の実施形態において、アミノ酸はＴＸＡであり、粒子は平均径が１５０μｍのセファロースビーズであり、及びリンカーは４−オキソ酪酸メチルエステルを含み、及びコンジュゲートは、本明細書においてコンジュゲート２と称される構造を有する。
【００９１】
アミノ酸誘導体がシクロヘキサンカルボン酸である一部の実施形態において、粒子は平均径が１５０μｍのセファロースビーズであり、及びリンカーはＮ−メチル−スクシンアミド酸メチルエステルを含み、及びコンジュゲートは、本明細書においてコンジュゲート２と称される構造を有する。
【００９２】
一部の実施形態において、コンジュゲートは、平均径が１５０μｍのアガロースビーズを含む。一部の実施形態において、リンカーはメチレンを含む。一部の実施形態において、コンジュゲートは、構造（本明細書では「コンジュゲート３」と称される）：
【化７】
2021515189.tif 000009
（式中
【化８】
2021515189.tif 000010
は粒子、例えば平均径が１５０μｍのアガロースビーズを表す）を有し得る。
【００９３】
一部の実施形態において、アミノ酸はＴＸＡであり、粒子は平均径が１５０μｍのアガロースビーズであり、及びリンカーはメチレンを含み、及びコンジュゲートは、本明細書においてコンジュゲート３と称される構造を有する。
【００９４】
アミノ酸誘導体がシクロヘキサンカルボン酸である一部の実施形態において、粒子は平均径が１５０μｍのアガロースビーズであり、及びリンカーはジメチルアミンを含み、及びコンジュゲートは、本明細書においてコンジュゲート３と称される構造を有する。
【００９５】
一部の実施形態において、コンジュゲートはアガロースビーズを含む。一部の実施形態において、リンカーは１５原子の炭素鎖を含む。一部の実施形態において、リンカーはヘキサデカナールである。一部の実施形態において、コンジュゲートは、構造（コンジュゲート４）：
【化９】
2021515189.tif 000011
（式中
【化１０】
2021515189.tif 000012
は粒子を表す）を有し得る。
【００９６】
一部の実施形態において、コンジュゲートはアガロースビーズを含む。一部の実施形態において、リンカーは１５原子の炭素鎖を含む。一部の実施形態において、リンカーはヘキサデカン酸メチルアミドである。一部の実施形態において、コンジュゲートは、構造（コンジュゲート４）を有し得る：
【００９７】
一部の更なる態様において、本開示は、少なくとも１つの粒子と少なくとも１つのリンカーと少なくとも１つのアミノ酸、その誘導体又はその類似体とを含む少なくとも１つのコンジュゲートを提供する。一部の実施形態において、本明細書に開示される主題のコンジュゲートは、以下のコンジュゲートのうちのいずれか１つ又はこれらの任意の組み合わせであってもよい。より具体的には、
【化１１】
2021515189.tif 000013
（式中
【化１２】
2021515189.tif 000014
は粒子を表す）のうちの少なくとも１つ。
【００９８】
一部の実施形態において、粒子はアガロースビーズ又はセファロースビーズである。一部の他の実施形態において、粒子は、具体的には上記に定義されるとおり、約１０μｍ以下〜約５００μｍ以上の間の平均粒径を有する。より具体的には、約９０μｍ〜約１５０μｍの間。一部の実施形態において、本明細書に開示される主題のコンジュゲートは少なくとも１つの線溶タンパク質に結合してもよく、より具体的には、前記線溶タンパク質は組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）及び任意選択で、プラスミノーゲンであってもよい。
【００９９】
図１２〜図１９を参照すると、本明細書に開示される主題の第１の例に係る、哺乳類体液、詳細には血漿又は全血を処理する装置が参照符号１００で略指示され、これは、ハウジング３００と、第１の粒子又はビーズ２１０の第１の集合１１０及び第２の粒子又はビーズ２２０の第２の集合１２０を少なくとも含む粒子、具体的にはビーズの複数の集合とを含む。
【０１００】
この例及び他の例に係る装置は、ヒト血漿（human blood plasma）（本明細書ではまた「ヒト血漿（human plasma）」と同義的に使用される）及び／又はヒト全血（本明細書ではまた「ヒト血液」と同義的に使用される）、及び／又はその任意の製剤との特定の使用が見出されるが、これはまた、他の哺乳類だが非ヒトの血漿又は哺乳類だが非ヒトの全血、又は実に、例えば少なくとも一部の種類の非哺乳類血漿又は非哺乳類全血を含めた、少なくとも一部の種類の動物血漿又は動物全血の処理にも使用することができる。
【０１０１】
本明細書において明らかになるであろうとおり、本装置は、哺乳類体液を処理する一例として、哺乳類体液（例えばヒト血漿及び／又はヒト全血及び／又は他の哺乳類血漿及び／又は他の哺乳類全血）から少なくとも１つの線溶タンパク質（例えばｔＰＡ及び／又はプラスミノーゲン）を枯渇させるように構成される。
【０１０２】
ハウジング３００は長手方向軸ＡＡを画成し、本体部分３５０と、流体入口ポート３３０を有する入口端部キャップ３１０、及び流体出口ポート３４０を有する出口端部キャップ３２０を含む一対の端部キャップとを含む。この例の代替的変形例において、ハウジングは、２つ以上の本体部分、及び／又は各本体部分につき２つ以上の入口ポート、及び／又は１つ又は２つ以上の入口ポート、及び／又は各本体部分につき２つ以上の出口ポート、及び／又は１つ又は２つ以上の出口ポートを含むことができる。
【０１０３】
入口端部キャップ３１０及び出口端部キャップ３２０の各々は、それぞれの円錐台状内表面３７０とそれぞれの円錐台状外表面３８０とを有する略円錐台状基部３６０を有する。この例及び少なくとも一部の他の例において、円錐台状内表面３７０及び円錐台状外表面３８０は高度に研磨されている。この例の代替的変形例において、円錐台状内表面３７０及び／又は円錐台状外表面３８０は研磨されていない。
【０１０４】
例えば、流体入口ポート３３０、及び流体出口ポート３４０は、各々がそれぞれの円錐台状基部３６０から遠方に突出し、各々に好適なそれぞれの防漏性コネクタ部分３３５が装着されていてもよい。例えば、かかる防漏性コネクタ部分３３５は、そこへの導管（例えば医療グレードのチューブ類）の接続を促進するルアーロックの形態であってもよい。或いは、流体入口ポート３３０、及び流体出口ポート３４０は、各々に、そこへの導管（例えば医療グレードのチューブ類）の接続を促進する任意の他のタイプの好適な防漏性コネクタ部分３３５が装着されてもよい。
【０１０５】
少なくともこの例では、及び図１４Ａ〜図１４Ｄもまた参照すると、各円錐台状基部３６０は、そのそれぞれの小端３１２、３２２からそれぞれの大端３１４、３２４まで増加する横断面面積（長手方向軸ＡＡと直交する）を有する。少なくともこの例では、各円錐台状基部３６０は複数のウェブ部材３０１を備え、これらはそれぞれの入口端部キャップ３１０又は出口端部キャップ３２０の内表面から内側に半径方向且つ軸方向に突出している。しかしながら、この例の少なくとも一部の代替的変形例及び他の例において、ウェブ部材は省略されてもよい。理論によって拘束されるものではないが、ウェブ部材３０１は装置１００の全体的剛性を増強することができ、及び／又は装置１００に出入りする、詳細には長手方向軸ＡＡに略沿ってチャンバ４００に入る未処理体液の流れを整える助けとなることができる。
【０１０６】
更に理論によって拘束されるものではないが、ウェブ部材３０１は、バリア部材３５２、３５４をそれぞれ長手方向端部Ｅ１、Ｅ２において所定位置に保持し、又は他の方法で維持するのに役立ち、及びより詳細には、以下で更に明確になるであろうとおり、バリア部材３５２、３５４をハウジング３００においてそれぞれの入口端部キャップ３１０又は出口端部キャップ３２０と本体部分３５０との間に締め付けるのに役立ち得る。
【０１０７】
ウェブ部材３０１は、各々が、組み立てられた装置１００においてそれぞれのバリア部材３５２、３５４に面する自由端３０６を有する。図１４Ｂ及び図１４Ｃで最も良く分かるとおり、自由端３０６はそれぞれの円錐台状内表面３７０から遠方に、長手方向軸ＡＡと平行な長手方向にそれぞれの大端３１４、３２４を越えて突出している。
【０１０８】
少なくともこの例では、流体入口ポート３３０は入口端部キャップ３１０の小端３１２につなぎ合わされ、流体出口ポート３４０は出口端部キャップ３２０の小端３２２につなぎ合わされている。この例の代替的変形例において、流体入口ポート３３０は任意の他の好適な位置で入口端部キャップ３１０と接続されてもよく、及び／又は流体出口ポート３４０は任意の他の好適な位置で出口端部キャップ３２０と接続されてもよい。
【０１０９】
この例において、及び図１３Ａ〜図１３Ｄもまた参照すると、本体部分３５０は、略円筒壁３５５を含み（即ち本装置の長手方向軸ＡＡを横断して円形断面を有する）、及び長手方向に対向する端部３５６、３５８を有する。
【０１１０】
この例においてハウジング３００、詳細には円筒壁３５５を備える本体部分３５０は、比較的剛性である。比較的剛性とは、本体部分３５０が、その自重下で又は装置の動作時に複数の粒子集合並びに装置を流れる血漿又は他の体液のフローを収容しているとき著しい変形なしに（例えば訓練されていない観察者の肉眼で見える変形なしに）その形状を維持することを意味する。
【０１１１】
この例の代替的変形例において、本体部分は、半可撓性、又は完全に可撓性（例えば可撓性バッグの形態）であってもよく、及び／又は本体部分は非円筒横断面を有し、例えば楕円、多角形などであってもよい。
【０１１２】
この例及び他の例では、本体部分３５０の横断面は、装置の長手方向軸ＡＡに沿って略均一である。この例の代替的変形例において、本体部分３５０の横断面は、代わりに装置の長手方向軸ＡＡに沿って不均一であってもよい−例えば、長手方向軸ＡＡに沿って横断面の形状が変化してもよく、及び／又は横断面のサイズが変化してもよい。例えば本体部分は円錐台形で、長手方向軸ＡＡに沿って本体部分の円形横断面のサイズが増加し、又は代わりにサイズが減少してもよい；例えばかかる円錐台形は、約０．５°又は約１°の半頂角を例えば有するほぼ円筒形であってもよい（図１３Ｃを参照）。
【０１１３】
ハウジング３００、詳細には本体部分３５０及び入口端部キャップ３１０及び出口端部キャップ３２０は、各々が、任意の好適な医療上適合性のある材料で作られていてもよい。例えば、かかる材料には、医療グレードプラスチック、例えば以下：Covestro、USAが供給するＰＣ（Makrolon 2458）、Apec（登録商標）1745ポリカーボネート；ポリプロピレン；ポリスルホン；ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）のうちのいずれか１つが含まれ得る。
【０１１４】
少なくともこの例では、ハウジング３００、詳細には本体部分３５０、入口端部キャップ３１０及び出口端部キャップ３２０は透明であり、即ち、透明材料で作られている。しかしながら、この例の代替的変形例において、ハウジング３００、詳細には本体部分３５０及び／又は入口端部キャップ３１０及び／又は出口端部キャップ３２０は透明でなく、例えば半透明若しくは不透明であり、又は透明部分、半透明部分若しくは不透明部分の任意の組み合わせである。
【０１１５】
ハウジング３００、詳細には本体部分３５０は、制御容積Ｖを画成する内部チャンバ４００を含む。この例において、制御容積Ｖは、この例では円筒状内表面である本体部分３５０の内表面によって画成されるその横断外周囲Ｐと、本体部分３５０の長手方向両端にある長手方向端部Ｅ１及びＥ２とによって画成される。
【０１１６】
制御容積Ｖの長手方向端部Ｅ１及びＥ２は、本体部分３５０の長手方向両端に提供された、それぞれ対応するバリア部材３５２、３５４によって画成される。本明細書において更に明確になるであろうとおり、バリア部材３５２、３５４は、第１の粒子２１０及び第２の粒子２２０が本体部分３５０から抜け出ること、詳細には制御容積Ｖから、特に入口端部キャップ３１０及び流体入口ポート３３０を通って、又は出口端部キャップ及び流体出口ポート３４０を通って抜け出ることを防止するように構成される。バリア部材３５２、３５４はまた、本体部分３５０を通じた、詳細には制御容積Ｖを通じた体液、詳細には液体、より詳細には血漿、及びより詳細にはヒト血漿の貫流を同時に可能にするようにも構成され、特に、１つ又は複数の哺乳類体液は入口端部キャップ３１０及び流体入口ポート３３０を通って制御容積Ｖに入り、制御容積Ｖを出た後、出口端部キャップ及び流体出口ポート３４０を通って流れる。
【０１１７】
少なくともこの例では、バリア部材３５２、３５４は互いに同様又は同一であり、それぞれフィルタディスク３５２Ａ、３５４Ａの形態であり、各々が、それぞれのフィルタディスク３５２Ａ、３５４Ａの厚さだけ隔てられたそれぞれの上流表面及びそれぞれの下流表面を有する。バリア部材３５２、３５４、詳細にはフィルタディスク３５２Ａ、３５４Ａは、流体、詳細には液体、より詳細には体液、及びより詳細にはヒト血漿又はヒト全血（又は代わりに、任意の哺乳類又は非哺乳類血漿又は全血）の細孔を通じた貫流を可能にするための複数の細孔又は他の開口を含み、これらの細孔は、（ａ）第１の粒子２１０の平均径又はメジアン径又は（ｂ）第２の粒子２２０の平均径又はメジアン径のうちの小さい方より小さいサイズである。例えば、第１の粒子２１０又は第２の粒子２２０のうちの小さい方の粒子が約９０μｍの有効（平均又はメジアン）直径を有する（例えば大きい方の粒子が約１５０μｍの有効（平均又はメジアン）直径を有する）例では、細孔は、９０μｍ未満、例えば８０μｍ；７０μｍ；６０μｍ；５０μｍ；４０μｍ、又は４０μｍ未満のうちのいずれか１つの有効（平均又はメジアン）直径を有する。このような粒子直径の例では、細孔は範囲４５μｍ〜５０μｍ以内の有効（平均又はメジアン）直径を有することができ、例えば、又は代わりに細孔は、以下の範囲：２０μｍ〜８０μｍ；３０μｍ〜７０μｍ；４０μｍ〜５５ｐｍ；４０μｍ〜５０μｍ；４０μｍ〜６０μｍ；４０μｍ〜７０μｍ；４０μｍ〜８０μｍのうちのいずれか１つ以内の有効（平均又はメジアン）直径を有することができる。
【０１１８】
バリア部材３５２、３５４がフィルタディスク３５２Ａ、３５４Ａの形態である少なくとも一部の例の特徴は、フィルタディスク３５２Ａ、３５４Ａを迅速に製造できることである。
【０１１９】
本装置の少なくとも一部の例の別の特徴は、装置１００を通るフローを制御できることである。例えば制御容積Ｖに多量の粒子（即ち第１の粒子２１０及び第２の粒子２２０）を選択すると、装置１００を通る体液の体積流量が低下する傾向があり、一方で制御容積Ｖ中の粒子量を減少させることを選択すると、粒子が体液から線溶タンパク質を枯渇させる能力及び有効性が低下することになる。従って、事実上、本装置の体積流量は、制御容積Ｖ中の粒子の（即ち第１の粒子２１０及び第２の粒子２２０の）量と、この量の粒子を制御容積Ｖに収容したとき制御容積Ｖに収容することのできる体液の体積との比に依存し得る。
【０１２０】
この例及び他の例の代替的変形例において、バリア部材は、例えば、繊維又はプラスチック基質を含むフィルタであって、リガンドがコンジュゲートされるところである繊維又はプラスチック基質にリガンドがコンジュゲートされるフィルタ、又は例えば好適な膜、例えばそこを通る体液の一方向のフローは許容するが、膜を通る反対方向のフローは許容しない一方向膜を備えてもよい。
【０１２１】
この例及び他の例において、フィルタディスク３５２Ａ、３５４Ａとしては、Spectrum、USAが供給するSpectra Mesh（登録商標）織布フィルタ（例えば、ナイロン、ＰＥＥＫ、ポリプロピレン、ポリエステル、ステンレス鋼を含む）、又はYair Technologies、Israelが供給するMS（登録商標）ナイロンメッシュフィルタのうちのいずれか１つを挙げることができる。
【０１２２】
少なくともこの例では、バリア部材３５２、３５４、詳細にはフィルタディスク３５２Ａ、３５４Ａは、ハウジング３００に対して、詳細には本体部分３５０に対して、及び任意選択でまた入口端部キャップ３１０及び出口端部キャップ３２０に対しても、制御容積Ｖの完全性が維持されるように装着される。換言すれば、バリア部材３５２、３５４、詳細にはフィルタディスク３５２Ａ、３５４Ａとハウジング３００、詳細には本体部分３５０との間の接続は、この接続からの第１の粒子２１０又は第２の粒子２２０のいかなる漏出も最小限に抑え又はそれを回避する一方、装置１００を通過する体液に対するバリア部材３５２、３５４、詳細にはフィルタディスク３５２Ａ、３５４Ａの露出面積を最大化するようなものである。更に、バリア部材３５２、３５４、詳細にはフィルタディスク３５２Ａ、３５４Ａは、ハウジング３００に対して、詳細には本体部分３５０に対して、及び任意選択でまた入口端部キャップ３１０及び出口端部キャップ３２０に対しても、２つのバリア部材３５２、３５４、詳細には２つのフィルタディスク３５２Ａ、３５４Ａの類似のそれぞれの上流表面が上流方向に向く一方で、そのそれぞれの下流表面が下流方向に向くように装着される。
【０１２３】
少なくともこの例では、特に図１３Ｄ及び図１４Ｄを参照すると、本体部分３５０の端部３５６、３５８の各々は、それぞれの端部３５６、３５８の内縁３４４（例えば図１２Ｂ、図１３Ｃを参照）から半径方向にずれた、それぞれの内側レッジ３５７及び外側レッジ３５３を画成する隆起した環状ショルダ３５９を含む。バリア部材３５２、３５４、詳細にはフィルタディスク３５２Ａ、３５４Ａの各々は、それぞれの内縁３４４の外径より大きく、それぞれの環状ショルダ３５９の内径より小さい外径を有し、従ってそれぞれの内側レッジ３５７に着座する。それぞれの入口端部キャップ３１０及び出口端部キャップ３２０は、各々が、円錐台状基部３６０のそれぞれの大端３１４、３２４にそれぞれの環状縁３５１を有し、それがそれぞれの入口端部キャップ３１０及び出口端部キャップ３２０をそれぞれ端部３５６、３５８に封止固定する。例えば、それぞれの環状縁３５１は、それぞれの外側レッジ３５３に接着されるか、熱溶接されるか、超音波溶接されるか、又は他の方法で封止固定されてもよい。
【０１２４】
この例において、それぞれの端部３５６、３５８の各々の環状ショルダ３５９は、略三角形の横断面を有する突出リップ３５９Ａを含み、その三角形の頂点がそれぞれの端部３５６、３５８から遠ざかる方に向き、略三角形の横断面は頂点に向かって本体部分３５０から遠ざかる長手方向軸ＡＡと略平行の方向に収束する。それぞれの環状縁３５１は、各々が、入口端部キャップ３１０、本体部分３５０及び出口端部キャップ３２０を長手方向軸ＡＡに対して同時に整列させたとき突出リップ３５９Ａと正しく合わさる環状凹部３５１Ａを含む。
【０１２５】
ウェブ部材３０１は、それぞれの入口端部キャップ３１０又は出口端部キャップ３２０が本体部分３５０に封止固定されたとき、それぞれのバリア部材３５２、３５４、詳細にはフィルタディスク３５２Ａ、３５４Ａがハウジング３００に対して動かなくなり、それぞれのウェブ部材３０１とそれぞれの内側レッジ３５７との間が当接した、且つ任意選択で締め付けられている関係となるように、長手方向軸ＡＡと平行に寸法Ｄ（図１４Ｃ）を有することに留意すべきである。
【０１２６】
熱溶接又は超音波溶接の過程で、例えば、それぞれのリップ３５９Ａが変形してそれぞれの環状凹部３５１Ａと封止接続をなし、それによりそれぞれの入口端部キャップ３１０又は出口端部キャップ３２０が本体部分３５０に封止固定される。
【０１２７】
図１３Ａ〜図１４Ｄの例の代替的変形例において、及びかかる一例として図１２Ｂを参照すると、それぞれの端部３５６、３５８の各々の環状ショルダ３５９が、円錐台状内表面３７０と略平行の傾斜面３５９Ｂを（突出リップ３５９Ａの代わりに）有する。他方で、この例において、それぞれの環状縁３５１は各々が（環状凹部３５１Ａの代わりに）、入口端部キャップ３１０、本体部分３５０及び出口端部キャップ３２０が長手方向軸ＡＡに対して同時に整列したとき外側レッジ３５３と正しく合わさる突出リップ３５１Ｂを含む。突出リップ３５１Ｂは略三角形の横断面を有し、三角形の頂点がそれぞれの端部３５６、３５８の方に向き、略三角形の横断面は、頂点に向かって長手方向軸ＡＡと平行な方向に、即ち本体部分３５０に向かって収束する。熱溶接又は超音波溶接の過程で、それぞれのリップ３５１Ｂが変形してそれぞれの環状外側レッジ３５３と封止接続をなす。
【０１２８】
非限定的な例として、図１３Ａ〜図１３Ｄは、この例の一実施態様に係る、本体部分３５０の様々な部分の寸法データ（ｍｍ単位）を提供する（公差は例えば±０．０５）。この例の代替的な実施態様において、寸法データは比例して変化させることができ、例えば注釈が付されている寸法全てを同じ比率で増加又は減少させることができ、例えば５０％、１００％、１５０％、２００％などだけ増加させるか、又は１０％、２５％、５０％などだけ減少させることができる。
【０１２９】
同様に非限定的な例として、図１４Ａ〜図１４Ｄは、この例の一実施態様に係る、入口端部キャップ３１０の様々な部分の寸法データ（ｍｍ単位）を提供し（公差は例えば±０．０５）、同様の寸法データが適宜修正して出口端部キャップ３２０に適用される。この例の代替的な実施態様において、寸法データは比例して変化させることができ、例えば注釈が付されている寸法全てを同じ比率で増加又は減少させることができ、例えば５０％、１００％、１５０％、２００％などだけ増加させるか、又は１０％、２５％、５０％などだけ減少させることができる。図１２及び図１３Ａ〜図１４Ｄの例に関して、本体部分３５０は本体部分３５０の内径とほぼ同じサイズの長手方向寸法（長手方向軸ＡＡと平行）を有することに留意すべきである。この例の代替的変形例において、例えば図１２Ａを参照すると、長手方向寸法は本体部分３５０の内径より大きくてもよい。この例の更に他の代替的変形例において、長手方向寸法は本体部分３５０の内径より小さくてもよい。
【０１３０】
この例の代替的変形例において、ハウジング３００は一体に形成されてもよく、長手方向端部Ｅ１及びＥ２の各々に横断方向スロットを提供することにより、それぞれのバリア部材３５２、３５４、詳細にはフィルタディスク３５２Ａ、３５４Ａを横断方向に挿入してハウジング３００に対して封止することを可能にしてもよい。
【０１３１】
少なくともこの例では、ハウジング３００、詳細には本体部分３５０は、円筒壁３５５に提供された粒子入口ポート３９０を含み、第１の粒子２１０の第１の集合１１０及び第２の粒子２２０の第２の集合１２０を少なくとも含む前記複数の粒子集合を粒子入口ポート３９０から制御容積Ｖに充填可能であるように構成される。粒子入口ポート３９０は、制御容積Ｖへの前記複数の粒子集合の充填後に粒子入口ポート３９０を可逆的又は永久的に封止するための封止キャップ３９２を含む。例えば、かかる封止キャップ３９２は、粒子入口ポート３９０の相補的なテーパ状の内壁３９４に当接するテーパ状の高度に研磨されたステム部分３９３と、粒子入口ポート３９０の口部に提供される環状フランジ３９９を変形可能に係合するヘッド部分３９５とを有する。
【０１３２】
或いは粒子入口ポート３９０は、制御容積Ｖへの前記複数の粒子集合の充填後に、別の方法で可逆的又は永久的に封止されてもよい。
【０１３３】
装置１００は、初めにバリア部材３５２、３５４、詳細にはフィルタディスク３５２Ａ、３５４Ａをハウジング３００の端部３５６、３５８と正しく合わさるように置き、次に入口端部キャップ３１０及び出口端部キャップ３２０を本体部分３５０に封止固定して、それによりバリア部材３５２、３５４、詳細にはフィルタディスク３５２Ａ、３５４Ａをハウジング３００に対して係合させることにより組み立てられる。組立体の完全性は、粒子入口ポート３９０を圧力源（例えば１バールゲージ圧に設定する）に結合する一方で、入口ポート３３０及び出口ポート３４０を可逆的に封止し、漏出があるかどうかを、例えばハウジング３００を例えば水などの液体に沈めて確かめることにより試験してもよく、漏出があるかは、ハウジング３００から漏れ出る気泡を観察することにより検出し得る。例えばハウジング３００は、ハウジング３００から漏れ出る気泡が３０秒毎に１つ以下である漏出を観察できた場合、十分に封止されていると見なすことができる。
【０１３４】
装置１００の上記の例の少なくとも一部の適用において、最終使用者への供給前に、装置１００に前記複数の粒子集合が予め充填される。そのような場合、前記複数の粒子集合に保存剤が使用されてもよい。例えば、かかる保存剤は２０％エタノールであってもよい。
【０１３５】
装置１００の上記の例の他の代替的な適用において、装置１００には前記複数の粒子集合が最終使用者によって充填される。少なくともこの例では、制御容積Ｖのサイズは２０ｍｌ〜約３５ｍｌである。
【０１３６】
この例の代替的変形例において、及び他の例において、制御容積Ｖのサイズは異なってもよく、例えば３５ｍｌ未満又は３５ｍｌ超であってもよい。例えば、本装置のサイズ、ひいては制御容積Ｖのサイズは、例えば線形縮尺倍率によって拡大縮小されてもよい。例えば、線形縮尺倍率は、以下の値：２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、又は５０超のうちのいずれか１つであってもよい。或いは、例えば線形倍率は、制御容積Ｖのサイズが現在の例の「ｎ」倍の大きさである（ここでｎは、以下の値：２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０又は１５０超のうちのいずれか１つである）というようなものであってよく；対応して又は代わりに、制御容積Ｖが７０ｍｌ、１００ｍｌ、１５０ｍｌ、１７５ｍｌ、２００ｍｌ、２５０ｍｌ、５００ｍｌ、１リットル、１．５リットル、２リットル、２．５リットル、３リットル、４リットル、５リットル又は５リットル超に拡大されてもよい。
【０１３７】
この例において、第１の粒子２１０及び／又は第２の粒子２２０はコンジュゲート粒子（本明細書において「コンジュゲート」と称される）であってもよく、各々が、任意選択で、例えば本明細書に開示されるとおりの、コンジュゲート粒子のうちのいずれか１つ、又は少なくとも２つ以上の異なるコンジュゲートを含み得るその組成物を含み得る。
【０１３８】
これらの例の少なくとも一部の代替的変形例において、第１の集合１１０及び第２の集合１２０のうちの一方の集合のみがコンジュゲート粒子を含み、一方、第１の集合１１０及び第２の集合１２０のうちの他方は非コンジュゲート粒子を含む。これらの例の更に他の代替的変形例において、第１の集合１１０及び第２の集合１２０は両方ともに同じコンジュゲート粒子を含み、従って事実上単一の、組み合わされたコンジュゲート粒子集合のみが存在する。
【０１３９】
少なくともこの例では、第１の粒子２１０及び／又は第２の粒子２２０はコンジュゲート粒子であり、ここで第１の粒子は第２の粒子と寸法が異なる。詳細には、第１のコンジュゲート粒子２１０及び第２のコンジュゲート粒子２２０は第２の粒子と寸法が異なる。少なくとも一部のかかる例において、第１のコンジュゲート粒子は第２の粒子の平均径と異なる平均径を有する。なおも一部の更なる実施形態において、第１の粒子、具体的にはコンジュゲートは、第２のコンジュゲートと化学的に異なってもよい。
【０１４０】
理論によって拘束されるものではないが、本発明者らは、第１のコンジュゲート粒子が第２の粒子の平均径と異なる平均径を有する少なくとも２つの粒子集合を含めると、粒子間に間隔が付与されることになり得るため、全ての粒子が同じサイズ又は同様のサイズである類似の並び方ほど実質的に稠密でない並び方がもたらされると考える。ひいては、低い稠密度というこの特徴により、同じ又は同様のサイズの粒子による類似の並び方よりも大きい露出面積が粒子の各々にもたらされる。ひいては露出面積が大きくなったことにより、コンジュゲート粒子と体液との間の（かかる体液が装置１００を通じて流されるときの）より高い相互作用が可能となり、そのため粒子が体液から少なくとも１つの線溶タンパク質を枯渇させる有効性が増加する。従って、体液から少なくとも１つの線溶タンパク質を枯渇させる点で、比較的少ない総量である寸法の異なる第１のコンジュゲート粒子及び第２のコンジュゲート粒子が、寸法が同様である比較的多い総量の第１のコンジュゲート粒子及び第２のコンジュゲート粒子と同程度に有効となることができ、これには経済的効果があり得る。
【０１４１】
単一のコンジュゲート粒子集合を用いてどの程度プラスミノーゲンを吸収し得るかを計算する一つの方法は、以下のとおりである：
樹脂容量計算
−  標準新鮮凍結血漿単位から開始する−
・  各単位が２５０ｍＬ血漿を有する
・  血漿中のプラスミノーゲン濃度は１６０μｇ／ｍＬである
・  従って、１単位のＦＦＰ中におけるプラスミノーゲンの総量は４０ｍｇである
・  プラスミノーゲンの分子質量は９２ｋＤａである
・  計算の目的上、１ダルトン単位は数値的に１ｇ／ｍｏｌと等価と考える。
・  従って９２０００Ｄａは９２０００ｇ／ｍｏｌ又は９２０００μｇ／μｍｏｌ又は９２ｍｇ／μｍｏｌである
・  １ＦＦＰ単位中４０ｍｇにおけるモル数を計算すると−
４０ｍｇ÷９２ｍｇ／μｍｏｌ＝０．４３５μｍｏｌ
−  １６〜２３μｍｏｌビーズ／ｍＬ液抜き後樹脂に働く２５原子リンカーを有するSepharose 4 Fast Flowは１．３１７グラムのプラスミノーゲンを減少させることができ、これは１血漿単位中の３３倍の多さである。
【０１４２】
図１５及び図１６を参照すると、本明細書に開示される主題の一例に係る、参照符号１０００で略指示される、１つ又は複数の哺乳類体液から少なくとも１つの線溶タンパク質を枯渇させるシステムは、装置１００、生理食塩水リザーバ１１００、供血側リザーバ１２００、受血側血漿リザーバ１３００及び洗浄廃液リザーバ１４００を含む。
【０１４３】
生理食塩水リザーバ１１００及び供血側リザーバ１２００は、流体入口ポート３３０と第１の三方弁７０を介して選択的且つ非同時的に流体連通している。
【０１４４】
受血側血漿リザーバ１３００及び洗浄廃液リザーバ１４００は、流体出口ポート３４０と第２の三方弁９０を介して選択的且つ非同時的に流体連通している。
【０１４５】
導管８２、８４が、それぞれ生理食塩水リザーバ１１００及び供血側リザーバ１２００を第１の三方弁７０のそれぞれのポート７２、７４に接続し、もう一つの導管７６が第１の三方弁７０の第３のポート７６を装置１００の入口ポート３３０に接続する。
【０１４６】
導管６２、６４が、それぞれ受血側血漿リザーバ１３００及び洗浄廃液リザーバ１４００を第２の三方弁９０のそれぞれのポート９２、９４に接続し、もう一つの導管６６が第２の三方弁９０の第３のポート９６を装置１００の出口ポート３４０に接続する。
【０１４７】
少なくともこの例では、装置１００は、本明細書におけるその例、又はそれらの例の代替的変形例に開示されるとおりである。いずれの場合にも、制御容積Ｖが、第１の粒子の第１の集合及び第２の粒子の第２の集合を少なくとも含む前述の複数の粒子集合を収容する。
【０１４８】
生理食塩水リザーバ１１００は、好適な分量の生理食塩水が入った任意の好適なリザーバを含んでもよく、この分量は典型的には制御容積Ｖのサイズの数倍である。この例では生理食塩水リザーバ１１００はシリンジの形態であるが、この例の代替的変形例において生理食塩水リザーバ１１００は他の形態をとることができ、例えば圧迫することにより生理食塩水を導管８２を通じてバッグから押し出すことのできる非剛性のバッグであってもよい。
【０１４９】
供血側リザーバ１２００は、装置１００によって処理されることになる哺乳類体液が入ったバッグ又は他のリザーバを含んでもよい。例えば、供血側リザーバ１２００には、ヒト血漿及び／又はヒト全血及び／又は他の哺乳類血漿及び／又は他の哺乳類全血が入っていてもよい。或いは、代わりに供血側リザーバ１２００は、血液が（導管８４に接続された又はその一部である）カテーテルを通じて装置１００に直接流れるか、又は装置１００への送達前に全血から血漿を分離する好適な血液製剤分離装置を介して間接的に流れることが可能な方法でその血管に血液カテーテルが挿入されている生体ドナー、例えばヒトを含んでもよい。
【０１５０】
受血側血漿リザーバ１３００は、装置１００による処理後に処理済みの哺乳類体液を受け取るためのバッグ又は他のリザーバを含んでもよい。例えば、血漿リザーバ１３００には、少なくとも１つの線溶タンパク質が完全に又は部分的に枯渇したヒト血漿及び／又はヒト全血及び／又は他の哺乳類血漿及び／又は他の哺乳類全血が入っていてもよい。或いは、代わりに受血側血漿リザーバ１３００は、装置１００から（導管６２に接続された又はその一部である）カテーテルを通じて処理済みの哺乳類体液が流れることが可能な方法でその血管に血液カテーテルが挿入されている生体患者、例えばヒトを含んでもよい。
【０１５１】
洗浄廃液リザーバ１４００は、生理食塩水リザーバ１１００から装置を通過した後の生理食塩水を入れることが可能なバッグ又は他のリザーバを含んでもよい。
【０１５２】
図１７を参照すると、本明細書に開示されるとおりの装置１００は、生理食塩水リザーバ１１００、受血側血漿リザーバ１３００及び洗浄廃液リザーバ１４００と共に、キット８００として提供されてもよいことに留意すべきである。キット８００は、第１の三方弁７０、並びに生理食塩水リザーバ１１００に接続し且つポート７２を介して第１の三方弁７０に接続する導管８２、及び第１の三方弁７０に接続し且つ装置１００の入口ポート３３０に接続する導管８６を更に含んでもよい。キット８００は、第２の三方弁９０、並びにそれぞれ受血側血漿リザーバ１３００及び洗浄廃液リザーバ１４００に接続し且つそれぞれのポート９２、９４を介して第２の三方弁９０に接続する導管６２、６４、及び第２の三方弁９０の第３のポート９６に接続し且つ装置１００の出口ポート３４０に接続する導管６６を更に含んでもよい。キット８００は、ポート７４を介して第１の三方弁７０に接続する導管８４を更に含んでもよく、ここで導管８４のもう一方の端部は供血側リザーバ１２００に接続可能である。
【０１５３】
システム１０００は、例えば以下のとおり使用することができる。
【０１５４】
キット８００はその無菌包装から開梱され、様々な構成要素を点検して全ての構成要素の完全性が確認されてもよい。
【０１５５】
図１５を参照すると、第１の三方弁７０がポート７４を遮断しつつポート７２と７６との間に流体連通を提供するように設定され、及び第２の三方弁９０がポート９２を遮断しつつポート９４と９６との間に流体連通を提供するように設定されていることを確実にすることにより、洗浄構成がセットアップされる。次に装置１００が、生理食塩水を生理食塩水リザーバ１１００から第１の三方弁７０を介して装置１００に通し、第２の三方弁９０を介して洗浄廃液リザーバ１４００まで流すことによりプライミングされる（生理食塩水で洗浄される）。
【０１５６】
供血側リザーバ１２００がキット８００に接続され、システム１０００が提供される。供血側リザーバが、装置１００によって処理されることになる哺乳類体液が入ったバッグ又は他のリザーバの形態である例では、供血側リザーバ１２００は導管８４に融着されてもよい。次に供血側リザーバ１２００は、例えばＩＶポールから吊り下げられてもよく、又は蠕動ポンプに接続されてもよく、以下で更に明確になるであろうとおり、装置１００によって処理されることになる哺乳類体液がそこに選択的に流れることが可能となり得る。
【０１５７】
供血側リザーバ１２００が生体ドナー、例えばヒトである例では、生体ドナーの血管に血液カテーテルが挿入され、そのカテーテルが導管８４に接続されるか、又はその一部である。
【０１５８】
図１６を参照すると、洗浄構成が完成し、装置１００が生理食塩水で（図１５の構成を用いて）プライミングされた後、処理構成がセットアップされる。処理構成は、第１の三方弁７０がポート７２を遮断しつつポート７４と７６との間に流体連通を提供するように設定され、及び第２の三方弁９０がポート９４を遮断しつつポート９２と９６との間に流体連通を提供するように設定されていることを確実にすることによりセットアップされる。次に、詳細には未処理の哺乳類体液を供血側リザーバ１２００から第１の三方弁７０を介して装置１００に通し、第２の三方弁９０を介して受血側血漿リザーバ１３００まで流すことによって少なくとも１つの線溶タンパク質を哺乳類体液から枯渇させることにより、未処理の哺乳類体液が処理される。
【０１５９】
図１８を参照すると、本明細書に開示される主題に係る、参照符号２０００で略指示される、１つ又は複数の哺乳類体液から少なくとも１つの線溶タンパク質を枯渇させるシステムの別の例は、複数の装置１００を含む装置一式２５００を含む。図１８の示される例では、装置一式２５００は４つの装置１００を含み、この例の代替的変形例では、代わりに装置一式２５００は２つ、３つ又は４つより多い装置１００を適宜修正して含んでもよい。
【０１６０】
システム２５００はまた、図１５及び図１６に示されるシステム１０００について本明細書に開示されるとおり、生理食塩水リザーバ１１００、供血側リザーバ１２００、受血側血漿リザーバ１３００及び洗浄廃液リザーバ１４００、並びに第１の三方弁７０及び第２の三方弁９０も適宜修正して含む。この例において、装置一式２５００は、複数の装置１００のそれぞれの制御容積Ｖ間に流体連通を提供するようにして相互接続されている複数の装置１００を含む。
【０１６１】
少なくともこの例では、（装置一式２５００の）各装置１００は、本明細書におけるその例、又はそれらの例の代替的変形例に開示されるとおりである。いずれの場合にも、装置一式２５００の各装置１００の制御容積Ｖは、第１の粒子の第１の集合及び第２の粒子の第２の集合を少なくとも含むそれぞれの前記複数の粒子集合を収容する。
【０１６２】
少なくともこの例では、装置一式２５００の複数の装置１００は直列に相互接続され、ここで直列に（隣接して）相互接続された装置１００の各対について、対のうちの一方の装置１００のそれぞれの流体入口ポート３３０が対のうちの他方の装置１００のそれぞれの流体出口ポート３４０に接続され且つそれと流体連通している。装置一式２５００の最も上流の装置１００（図１８では装置１００Ａとも指示される）は、図１５及び図１６に示されるシステム１０００の装置１００と同様の方法で、適宜修正して、第１の三方弁７０を介して生理食塩水リザーバ１１００及び供血側リザーバ１２００に接続する。装置一式２５００の最も下流の装置１００（図１８では装置１００Ｂとも指示される）は、図１５及び図１６に示されるシステム１０００の装置１００と同様の方法で、適宜修正して、第２の三方弁９０を介して受血側血漿リザーバ１３００及び洗浄廃液リザーバ１４００に接続する。
【０１６３】
この例において、生理食塩水リザーバ１１００は、装置一式２５００内の全ての装置１００を洗浄し及びプライミングするのに十分な生理食塩水を有する。
【０１６４】
本明細書に開示されるとおりの装置１００の装置一式２５００は、生理食塩水リザーバ１１００、受血側血漿リザーバ１３００及び洗浄廃液リザーバ１４００と共に（及びそれぞれの供血側リザーバ１２００は除いて）、キット２８００として提供されてもよいことに留意すべきである。キット２８００は、第１の三方弁７０、並びに生理食塩水リザーバ１１００に接続し且つポート７２を介して第１の三方弁７０に接続する導管８２、及び第１の三方弁７０に接続し且つ最も上流の装置１００Ａの入口ポート３３０に接続する導管８６を更に含んでもよい。キット２８００は、第２の三方弁９０、並びにそれぞれ受血側血漿リザーバ１３００及び洗浄廃液リザーバ１４００に接続し且つそれぞれのポート９２、９４を介して第２の三方弁９０に接続する導管６２、６４、及び第２の三方弁９０の第３のポート９６に接続し且つ最も下流の装置１００Ｂの出口ポート３４０に接続する導管６６を更に含んでもよい。キット２８００は、ポート７４を介して第１の三方弁７０に接続する導管８４を更に含んでもよく、ここで導管８４のもう一方の端部は供血側リザーバ１２００に接続可能である。
【０１６５】
システム２０００は、本明細書にシステム１０００について開示されるとおりの洗浄構成及び処理構成と同様に、詳細にはそれぞれの洗浄構成から開始した後それぞれの処理構成が続くシステム１０００と同様の方法で、適宜修正して使用することができる。
【０１６６】
システム２０００の特徴は、装置一式２５００内での連続的な供血側リザーバ１２００から各装置１００への哺乳類体液であって、それにより高品質の処理済み哺乳類体液の提供が可能となることであり、即ち、装置一式２５００内で一つの装置１００から次の装置１００へと処理されて枯渇していく哺乳類体液が送られるにつれ、哺乳類体液中の少なくとも１つの線溶タンパク質のレベルは連続的にますます枯渇していく。
【０１６７】
他方で、直列接続の複数の装置１００はシステム２０００に背圧をセットアップし得ることが可能であってもよく、この背圧により、システム２０００を通じた哺乳類体液の流量が例えばシステム１０００内と比べて低くなり得る。
【０１６８】
図１９を参照すると、本明細書に開示される主題に係る、参照符号３０００で略指示される、１つ又は複数の哺乳類体液から少なくとも１つの線溶タンパク質を枯渇させるシステムの別の例は、複数の装置１００を含む装置一式３５００を含む。図１９の示される例では、装置一式３５００は４つの装置１００を含み、この例の代替的変形例では、代わりに装置一式３５００は２つ、３つ又は４つより多い装置１００を適宜修正して含んでもよい。
【０１６９】
システム３５００はまた、図１５及び図１６に示されるシステム１０００について本明細書に開示されるとおり、生理食塩水リザーバ１１００、供血側リザーバ１２００、受血側血漿リザーバ１３００及び洗浄廃液リザーバ１４００、並びに第１の三方弁７０及び第２の三方弁９０も適宜修正して含む。この例において、装置一式３５００は、複数の装置１００のそれぞれの制御容積Ｖ間に流体連通を提供するようにして相互接続されている複数の装置１００を含む。
【０１７０】
少なくともこの例では、（装置一式３５００の）各装置１００は、本明細書におけるその例、又はそれらの例の代替的変形例に開示されるとおりである。いずれの場合にも、装置一式３５００の各装置１００の制御容積Ｖは、第１の粒子の第１の集合及び第２の粒子の第２の集合を少なくとも含むそれぞれの前記複数の粒子集合を収容する。
【０１７１】
少なくともこの例では、装置一式３５００の複数の装置１００は並列に相互接続され、装置１００のそれぞれの流体入口ポート３３０が入口マニホルド３３３０を介して互いに相互接続され且つ流体連通している。更に、装置１００のそれぞれの流体出口ポート３４０が出口マニホルド３３４０を介して互いに相互接続され且つ流体連通している。装置一式３５００の入口マニホルド３３３０は、図１５及び図１６に示されるシステム１０００の装置１００と同様に、第１の三方弁７０を介して生理食塩水リザーバ１１００且つ供血側リザーバ１２００に適宜修正して接続する。装置一式３５００の出口マニホルド３３４０は、図１５及び図１６に示されるシステム１０００の装置１００と同様に、第２の三方弁９０を介して受血側血漿リザーバ１３００及び洗浄廃液リザーバ１４００に適宜修正して接続する。
【０１７２】
この例において、生理食塩水リザーバ１１００は、装置一式３５００内の全ての装置１００を洗浄し及びプライミングするのに十分な生理食塩水を有する。
【０１７３】
本明細書に開示されるとおりの装置１００の装置一式３５００は、生理食塩水リザーバ１１００、受血側血漿リザーバ１３００及び洗浄廃液リザーバ１４００、入口マニホルド３３３０及び出口マニホルド３３４０と共に（及びそれぞれの供血側リザーバ１２００は除いて）、キット３８００として提供されてもよいことに留意すべきである。キット３８００は、第１の三方弁７０、並びに生理食塩水リザーバ１１００に接続し且つポート７２を介して第１の三方弁７０に接続する導管８２、及び第１の三方弁７０に接続し且つ入口マニホルド３３３０に接続する導管８６を更に含んでもよい。キット３８００は、第２の三方弁９０、並びにそれぞれ受血側血漿リザーバ１３００及び洗浄廃液リザーバ１４００に接続し且つそれぞれのポート９２、９４を介して第２の三方弁９０に接続する導管６２、６４、及び第２の三方弁９０の第３のポート９６に接続し且つ出口マニホルド３３４０に接続する導管６６を更に含んでもよい。キット３８００は、ポート７４を介して第１の三方弁７０に接続する導管８４を更に含んでもよく、ここで導管８４のもう一方の端部は供血側リザーバ１２００に接続可能である。システム３０００は、本明細書にシステム１０００について開示されるとおりの洗浄構成及び処理構成と同様に、詳細にはそれぞれの洗浄構成から開始した後それぞれの処理構成が続くシステム１０００と同様の方法で、適宜修正して使用することができる。
【０１７４】
システム３０００の特徴は、哺乳類体液を装置一式３５００内の複数の装置１００の間で分割し、装置１００において哺乳類体液を同時に処理することにより、供血側リザーバ１２００からの哺乳類体液の比較的高い体積フロー及び／又は体積流量を処理できることである。
【０１７５】
他方で、複数の装置はシステム２０００に背圧をセットアップすることが可能であり、この背圧により、システム２０００を通じた哺乳類体液の流量が例えばシステム１０００内と比べて低くなり得る。
【０１７６】
システム３０００の代替的変形例において、装置一式３５００内の複数の装置１００の流体入口ポート３３０は、それぞれの供血側血漿リザーバに直接接続され且つそれと流体連通していてもよく、及び／又は流体出口ポート３４０の各々は、それぞれの受血側血漿リザーバに直接接続され、且つそれと選択的に流体連通していてもよい。
【０１７７】
システム３０００の別の代替的変形例において、各装置１００は、例えば装置一式２５００に対応する直列接続の装置１００の装置一式に適宜修正して置き換えられてもよい。
【０１７８】
提案される生理学的細胞ベースの止血モデルは、活性化第ＶＩＩ因子（ＶＩＩａ）が組織因子担持細胞に結合すると惹起され、第ＩＸ因子及び第Ｘ因子の更なる活性化につながり、ひいてはこれが第ＩＩ因子（プロトロンビン）を切断（活性化）してトロンビン（ＩＩａ）が形成される。トロンビンは第ＸＩ因子を活性化させ、ひいてはこれが他の因子を活性化して、より多くのトロンビンが生成される。次にトロンビンが更にフィブリノーゲンを切断して予備的なフィブリン塊が形成され、次にこれが第ＸＩＩＩ因子の架橋作用によって安定化して堅い止血凝血塊となる。
【０１７９】
血管外傷に応答して凝固系が上記のとおり活性化されると、組織及び血管における架橋フィブリンの沈着につながり、ひいては血流が損なわれる。従って、フィブリン塊を適切に融解することのできる、それにより凝血塊が生理学的必要性を超えて更に成長することを防ぎ、凝血塊がそれ以上必要でなくなると凝血塊溶解を惹起する更なるシステムが必要である。このシステムは線溶タンパク質を含むものであり、次にはそれらが活性化されて、セリンプロテアーゼ、プラスミンの作用を通じてフィブリンをその可溶性分解産物に変換する。生理的条件下では、線溶は、活性化因子、抑制因子及び補因子の正確に測られた関与によって厳密に調節される。
【０１８０】
線溶系の主要な構成要素であるプラスミノーゲンは、主に肝臓で合成される。５６０〜５６１位の単一のＡｒｇ−Ｖａｌペプチド結合でプラスミノーゲンが切断（活性化）されると、活性のセリンプロテアーゼ、プラスミンが生じ、ひいてはこれがフィブリン塊を融解する。プラスミノーゲンの切断はプラスミノーゲン活性化因子によって媒介される。
【０１８１】
主要な内因性プラスミノーゲン活性化因子は組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）である。機能的には、ｔ−ＰＡそれ自体は、プラスミノーゲンの弱い活性化因子である。しかしながら、フィブリンの存在下では、ｔＰＡ依存性プラスミノーゲン活性化の触媒効率が５００倍増加する。超過したプラスミン活性はまた凝固因子も切断し、それにより新たな凝血塊の形成を妨げ得る。
【０１８２】
第２の内因性プラスミノーゲン活性化因子は単鎖ｕ−ＰＡ又はプロウロキナーゼである。ｕ−ＰＡは、フィブリンに対する親和性がｔＰＡと比べてはるかに低い。ｕＰＡはフィブリンの存在下又は非存在下で有効なプラスミノーゲン活性化因子であるが、そのプラスミノーゲン活性化活性はフィブリンによって大きく刺激される。ｕ−ＰＡは、活性化内皮細胞、マクロファージ、腎上皮細胞、及び一部の腫瘍細胞を含め、幾つかの細胞に発現する。
【０１８３】
線溶系は、線溶タンパク質の活性化因子（上記に詳述したとおり）及び抑制因子の作用によって実に均衡がとれている。プラスミンの主要な抑制因子はα２抗プラスミン−主に肝臓で合成され、血漿中に比較的高濃度（２μＭ）で循環する単鎖糖タンパク質である。血流中又は凝血塊の近傍に放出されたプラスミンは、α２抗プラスミンとの不可逆的な１：１の化学量論的複合体の形成を受けて直ちに中和される。
【０１８４】
プラスミノーゲン活性化因子の抑制因子の中でも、プラスミノーゲン活性化因子抑制因子−１（ＰＡＩ−１）は最も遍在性が高い。これは、内皮細胞、単球、マクロファージ、ヘパトサイト、脂肪細胞、及び血小板によって放出される。ＰＡＩ−１は、ｔＰＡ及びｕ−ＰＡの両方に対する最も重要性の高い即効性の生理学的抑制因子である。
【０１８５】
プラスミノーゲン活性化因子抑制因子２（ＰＡＩ  ２）は、ヒト胎盤によって合成される。主に妊娠中、ヒト血漿に高レベルのＰＡＩ  ２が認められる。
【０１８６】
最後に、トロンビン活性化可能線溶抑制因子（ＴＡＦＩ）は、カルボキシ末端アルギニン及びリジン残基に特異性のある、強力な線溶抑制因子として作用する血漿カルボキシペプチダーゼである。
【０１８７】
様々な凝固異常を有する患者の治療は、特発性出血エピソード、外傷の間、及び手術手技全体を通じて不可欠である。多くのかかる状況下で血液／血漿由来製剤（例えば標準血漿又は新鮮凍結血漿−ＦＦＰ）が使用される。これらの製剤は凝固因子及び線溶タンパク質を含有し、従って、止血凝血塊の形成を誘導することにより出血を止め、及び欠損している又は障害された凝固異常を修正するとされている。一般に、任意の凝固因子の欠如又は異常は、安定した止血凝血塊を作り出す能力が不十分であるため、出血傾向に至り得る。いかなる理論によっても拘束されないが、本発明者らは、線溶タンパク質の存在が止血凝血塊の溶解に関与し、凝血塊の融解及び出血現象の悪化を招き得ると想定した。
【０１８８】
従って、利用可能な１つ又は複数の血液／血漿由来製剤による欠損凝固因子の補充後に止血凝血塊が形成された後、必要に応じて線溶系による凝血塊融解が達成される。しかしながら、凝血塊の融解が望ましくなく、例えば出血状況での止血凝血塊の確保、又はより多くの凝血塊の生成のために実に逆の活性が求められる場合には、凝固因子で構成されるが線溶因子が枯渇している体液、具体的には血液又は血漿及び任意の由来製剤による治療が望ましい解決法であり得る。
【０１８９】
本明細書において指摘するとおり、本明細書に開示される本主題は、体液、具体的には血液、血漿及びその製剤から線溶タンパク質を枯渇させるためのコンジュゲート、複数のコンジュゲート又はその任意の組成物、並びに装置、キット及びシステムを提供し、従って更にはこれらの製剤を使用した方法を提供する。
【０１９０】
従って、更に別の態様において、本明細書に開示される主題は、１つ又は複数の哺乳類体液又はその任意の製剤から少なくとも１つの線溶タンパク質を枯渇させる方法に関する。より具体的には、本方法は、第１のステップ（ｉ）において、１つ又は複数の体液又はその任意の調製物を少なくとも１つの線溶タンパク質に特異的なアフィニティー枯渇手順に供するステップを含む。次のステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉ）で得られた少なくとも１つの線溶タンパク質が枯渇した体液を回収するステップを伴う。
【０１９１】
アフィニティー枯渇手順は、本明細書に開示される主題により開示されるとおり、本明細書に開示される主題に係る複数のコンジュゲートの有効量又は複数のコンジュゲートを含む少なくとも１つの組成物に体液を接触させることを含む点に留意すべきである。或いは、アフィニティー枯渇手順は、本明細書に開示される主題において、本明細書に開示される主題のコンジュゲート、任意の複数のコンジュゲート又は複数のコンジュゲートを含む任意の組成物を含む装置、装置一式、キット又はシステムに体液を適用することにより実施されてもよい。
【０１９２】
一部の実施形態において、各コンジュゲートは少なくとも１つの粒子と少なくとも１つのリンカーと少なくとも１つのアミノ酸、その誘導体又はその類似体とを含むことに留意しなければならない。一部の具体的な実施形態において、複数のコンジュゲートは少なくとも２つの異なるコンジュゲートを含み、ここで前記アミノ酸、その誘導体又はその類似体は、４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸（トラネキサム酸）、ε−アミノカプロン酸、リジン、シクロヘキサンカルボン酸及び４−メチルシクロヘキサンカルボン酸のうちの少なくとも１つである。一部の更なる具体的な実施形態において、複数のコンジュゲートは少なくとも２つの異なるコンジュゲートを含み、ここで前記アミノ酸、その誘導体又はその類似体は、４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸（トラネキサム酸）、ε−アミノカプロン酸及びリジンのうちの少なくとも１つである。
【０１９３】
一部の実施形態において、本明細書に開示される主題の方法において有用なコンジュゲート粒子は、本明細書において上記に本明細書に開示される主題により定義されるとおりであってよいことに留意しなければならない。なおも一部の更なる実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、本明細書において上記に定義するとおりの本明細書に開示される主題によって提供される装置、装置一式、キット又はシステムのうちのいずれかを使用し得る。
【０１９４】
一部の実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、少なくとも１つの凝固因子を含む全血、血漿又は血液由来製剤のうちの少なくとも１つであってよい体液から線溶タンパク質を枯渇させることに適用可能であり得る。
【０１９５】
一部の具体的な実施形態において、かかる血液由来製剤は、全血、血漿、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）、多血小板血漿（ＰＲＰ）及びクリオプレシピテートのうちの少なくとも１つであってもよい。
【０１９６】
一部の実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、エキソビボ又はインビトロで、より具体的には、もはや人体の一部でない体液において実施されてもよいことが理解されなければならない。
【０１９７】
輸血は、なおも救命に最も不可欠な要素である。現代の貯蔵血液療法では、全血よりむしろ血液成分が輸血される。
【０１９８】
血液成分療法とは、血液を各成分に分離して特定の所望の成分のみを患者に輸血することを可能にし、そのようにして不要な成分の使用を回避することを指す。血液成分を使用することにより、数人の患者を１人の供血者からの血液で治療することができる。
【０１９９】
用語「新鮮凍結血漿」（ＦＦＰ）は、本明細書で使用されるとき、供血後に凍結及び保存されている、且つ輸血に使用されることになる主要な血液成分、即ちヒト血液の無細胞液体画分を指す。供血後、１単位のヒト血液が遠心され、血液の細胞含有物が分離され、残りの血漿が採取から８時間以内に−１８Ｃ（０Ｆ）以下で凍結される。
【０２００】
ＦＦＰは、凝固系、線溶系及び補体系のあらゆる成分（因子／タンパク質）を含有する。単一又は複数の凝固欠乏、並びに外傷又は手術で起こるとおりの既存の又は予想される出血におけるＦＦＰの使用については、明確に定義された適応症例が存在する。
【０２０１】
「クリオプレシピテート」は、本明細書で使用されるとき、採取から６〜８時間以内の急速凍結（ＦＦＰについて行われるとおり）及び４℃での急速解凍によって１単位の新鮮血漿から得られる血漿の沈降タンパク質に関する。クリオプレシピテートは、第ＶＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子及びフィブリノーゲンが豊富である。従って、この成分は、上述の凝固タンパク質の欠如又は障害に関連する遺伝性又は後天性病態における出血の治療又は防止に好適である。
【０２０２】
「多血小板血漿」（ＰＲＰ）血液成分は、１単位の新鮮（供血）血液から遠心又はアフェレーシス手技によって調製される。
【０２０３】
標準単位の全血から調製されることに加えて、血液成分はアフェレーシス手技によって入手されてもよい。アフェレーシスは、半自動血液分離器具であるフェレーシス機器／機械を用いて行われる。この手技では、供血に血漿が使用されると計画される場合、供血者の抗凝固処理された全血が機器に通され、そこで血液が赤血球、血漿、及び白血球／血小板画分に分離され、次にそれらが対象に返血される。分離した血漿のみが対象に返血されず、しかし更に供血に使用される。
【０２０４】
血小板、顆粒球、血液幹細胞、単核球、及び血漿の採取に幾つかの半自動血液細胞分離器具が利用可能である。これらの器具はいずれも、遠心を用いて血液成分を分離する。一部のアフェレーシス手技は、供血者からの連続血流を血液細胞分離器に通しながらの２回の静脈穿刺を含む；他の手順は、単回の静脈穿刺及び断続的な血液採取及び返血によって達成することができる。
【０２０５】
なおも一部の更なる具体的な実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、プラスミノーゲン及び組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）のうちの少なくとも一方であってよい線溶タンパク質の枯渇に用いられ得る。
【０２０６】
より具体的には、プラスミノーゲン（別名ＰＥＧ、酵素エントリＥＣ：３．４．２１．７）は、本明細書で使用されるとき、線溶系の主要な構成要素であり、主に肝臓で合成される。ヒトにはプラスミノーゲンの２つの主要なグリコフォームが存在する−２個のグリコシル化部分（Ｎ２８９へのＮ結合型及びＴ３４６へのＯ結合型）を含有するＩ型プラスミノーゲン、一方、ＩＩ型プラスミノーゲンは単一のＯ結合型糖のみ（Ｔ３４６へのＯ結合型）を含有する。ＩＩ型プラスミノーゲンはＩ型グリコフォームと比べて細胞表面に優先的に動員される。逆に、Ｉ型プラスミノーゲンは凝血塊に一層容易に動員されるように見える。循環中では、プラスミノーゲンは閉じた活性化抵抗性のコンホメーションをとる。凝血塊との結合時、又は細胞表面との結合時、プラスミノーゲンは開いた形態をとり、これは、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、カリクレイン、及び第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）を含めた種々の酵素によって活性プラスミンに変換されることができる。より具体的には、５６０〜５６１位の単一のＡｒｇ−Ｖａｌペプチド結合でプラスミノーゲンが切断（活性化）されると、活性のセリンプロテアーゼ、プラスミンが生じ、ひいてはこれがフィブリン塊を融解する。
【０２０７】
完全長プラスミノーゲンは７ドメインを含む。Ｃ末端キモトリプシン様セリンプロテアーゼドメインに加えて、プラスミノーゲンはＮ末端Pan Appleドメイン（ＰＡｐ）を５個のクリングルドメイン（ＫＲ１〜５）と共に含有する。Pan-Appleドメインは、プラスミノーゲンが閉じた形態を維持するのに重要な決定基を含有し、クリングルドメインは、受容体及び基質に存在するリジン残基への結合に関与する。
【０２０８】
一部の実施形態において、本明細書に開示される主題が言及するプラスミノーゲンはヒトプラスミノーゲンであってもよい。かかる実施形態において、プラスミノーゲン遺伝子（GenBank：ＡＹ１９２１６１．１、ｃｈｒ６ｑ２６にマッピングされる）は約５２．５ｋｂのＤＮＡにわたり、１９エクソンを含有する（ＯＭＩＭ番号１７３３５０）。一部の実施形態において、プラスミノーゲンは、本明細書で使用されるとき、配列番号１によって示されるとおりの配列を含む核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むヒトプラスミノーゲンを指すことに留意しなければならない。一部の更なる実施形態において、ヒトプラスミノーゲンは、配列番号１によって示されるとおりの配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性を有する配列を含む核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含んでもよい。なおも一部の更なる実施形態において、かかるヒトプラスミノーゲン分子は、配列番号２によって示されるとおりのアミノ酸配列を含んでもよい。なおも一部の他の実施形態において、かかるヒトプラスミノーゲン分子は、配列番号２によって示されるとおりの配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【０２０９】
「プラスミノーゲン欠乏体液」又は「プラスミノーゲン不含体液」は、本明細書で使用されるとき、本明細書に開示される主題の製剤（一部の実施形態によれば、血液、血漿又は血液製剤などの体液を線溶タンパク質結合剤、具体的にはプラスミノーゲン結合剤で処理することにより調製されたもの）が、未処理の血液又は血液製剤と比較したときプラスミノーゲン量の約１００％〜５０％の低下、減少、減弱を呈することを意味する。より具体的には、体液、具体的には血液又は血液製剤に通常存在するプラスミノーゲンの少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％が、具体的には未処理の血液又は血液製剤と比較したとき、本明細書に開示される主題の製剤から除去される。換言すれば、本明細書に開示される主題の製剤は、他の製剤又は未処理の血液若しくは血液製剤中のプラスミノーゲンの量の約０．０１％〜約５０％の量のプラスミノーゲンを含んでもよい。具体的には、未処理の血液又は血液製剤と比較したときプラスミノーゲンの量の約０．０１％以下、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％又はそれ未満。
【０２１０】
プラスミノーゲンは、活性化されて活性プラスミン酵素を形成すると、タンパク質分解活性、具体的にはタンパク質から小型のポリペプチド又はアミノ酸への切断又は分解を呈する。これに関連して、本明細書に開示される主題の方法によって処理される体液は、プラスミノーゲン又はプラスミンタンパク質分解活性を欠いている。一部の具体的な実施形態において、プラスミン及びプラスミノーゲンのタンパク質分解活性はフィブリンの切断を伴い、従ってフィブリン塊を融解する。用語「プラスミン及びプラスミノーゲン活性を欠いている」は、本明細書に開示される主題の方法によって処理される体液がプラスミン及びプラスミノーゲンのタンパク質分解性活性を完全に欠損しているか、又は少なくとも、血液、血漿又は血液製剤などの体液、具体的には未処理血液又は血液製剤における活性プラスミン又はプラスミノーゲンのタンパク質分解活性と比較したとき約１％〜９９．９％のうちのいずれか１つ、具体的には、約１％〜約５％、約５％〜１０％、約１０％〜１５％、約１５％〜２０％、約２０％〜２５％、約２５％〜３０％、約３０％〜３５％、約３５％〜４０％、約４０％〜４５％、約４５％〜５０％、約５０％〜５５％、約５５％〜６０％、約６０％〜６５％、約６５％〜７０％、約７５％〜８０％、約８０％〜８５％  約８５％〜９０％、約９０％〜９５％、約９５％〜９９％、又は約９９％〜９９．９％又は１００％だけ「低下した」、「減少した」「緩和された」、「抑制された」又は「減弱された」タンパク質分解性活性を呈することを意味すると理解されなければならない。
【０２１１】
なおも更に、一部の実施形態において、本明細書に開示される主題の方法によって処理される体液は、ｔＰＡを欠いている。本明細書に開示される主題の方法、コンジュゲート及び装置を用いたｔＰＡの枯渇は、図９によって明確に実証されている。
【０２１２】
組織プラスミノーゲン活性化因子（別名ＰＬＡＴ；酵素エントリＥＣ３．４．２１．６８．）に関して本明細書で使用される用語ｔＰＡは、プロ酵素プラスミノーゲンを強力な線溶酵素プラスミンに変換して活性化する分泌型セリンプロテアーゼに関することが理解されなければならない。ｔＰＡは血管内皮細胞において単一のポリペプチド鎖として合成され、これが中心に位置するアルギニン−イソロイシン結合でプラスミン又はトリプシンによるタンパク質分解切断を受けると、Ｎ末端に由来する重鎖とＣ末端軽鎖とで構成される２本鎖のジスルフィド結合した形態になる。ｔＰＡ遺伝子（ＤＮＡ受託番号ＮＴ＿１６７１８７．１、８ｐ１１．２１にマッピングされる）は、２つのクリングル領域（Ｋ１及びＫ２）及び成長因子と類似の領域を含む重鎖ドメインと、セリンプロテアーゼ触媒部位を含む軽鎖ドメインとをコードする１４個のエクソンを含有する。ｔＰＡ遺伝子が選択的にスプライシングされると、線溶は別として、細胞遊走及び組織リモデリングなど、複数の生物学的過程に関与する異なるアイソフォームをコードする複数の転写変異体が生じる。ｔＰＡ活性の増加は、過剰出血として現れる線溶亢進を引き起こす；ｔＰＡ活性の低下は、血栓症又は塞栓症を招き得る線溶低下につながる。ｔＰＡと関連付けられる表現型には、家族性線溶亢進（ｔＰＡ放出の増加に起因する）及び家族性血栓形成傾向（ｔＰＡ放出の低下に起因する（ＯＭＩＭ番号６１２３４８））が含まれる。一部の実施形態において、ｔＰＡは、本明細書で使用されるとき、配列番号３によって示されるとおりの配列を含む核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むヒトｔＰＡを指すことに留意しなければならない。一部の更なる実施形態において、ヒトｔＰＡは、配列番号３によって示されるとおりの配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性を有する配列を含む核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含んでもよい。なおも一部の更なる実施形態において、かかるヒトｔＰＡ分子は、配列番号４によって示されるとおりのアミノ酸配列を含んでもよい。なおも一部の他の実施形態において、ヒトｔＰＡは、配列番号４によって示されるとおりの配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【０２１３】
「ｔＰＡ欠乏体液」又は「ｔＰＡ不含体液」は、本明細書で使用されるとき、本明細書に開示される主題の方法によって処理される体液（一部の実施形態によれば、血液、血漿又は血液製剤などの体液を本明細書に開示される主題のコンジュゲートで処理することにより調製されたもの）が、未処理の血液又は血液製剤と比較したとき、通常存在するｔＰＡ量の約１００％〜５０％の低下、減少、減弱を呈することを意味する。より具体的には、体液から、具体的には未処理の血液、血漿又は血液製剤と比較したとき少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のｔＰＡが除去される。換言すれば、本明細書に開示される主題の方法によって処理される体液は、他の製剤中又は未処理の血液若しくは血液製剤中におけるｔＰＡ量の約０．０１％〜約５０％の量のｔＰＡを含み得る。具体的には、未処理の体液、例えば血液、血漿又は血液製剤などと比較したときｔＰＡ量の約０．０１％以下、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％以下、更には６０％又は７０％。
【０２１４】
なおも一部の更なる実施形態において、本明細書に開示される主題の方法によって調製される体液又は具体的には血液、血漿若しくは血液由来の製剤は、プラスミノーゲン及びｔＰＡを欠いていてもよく、そのため、上記に特定したとおりの任意の線溶活性を欠いていてもよい。なおも一部の更なる実施形態において、本明細書に開示される主題の方法によって調製される体液又は製剤はまた、任意の他の線溶剤、例えばウロキナーゼ（ｕＰＡ）を欠いていてもよい。なおも更に、一部の実施形態において、本明細書に開示される主題の方法によって調製される体液製剤に追加的な抗線溶剤が加えられてもよいことが理解されなければならない。
【０２１５】
一部の任意選択の実施形態において、本方法は、ステップ（ｉｉ）で回収された線溶タンパク質枯渇体液中のプラスミノーゲンの量を、前記線溶タンパク質枯渇体液における凝固時間及び総凝血塊溶解時間のうちの少なくとも一方を決定することにより測定するステップを更に含んでもよい。
【０２１６】
一部の実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、線溶活性が低下している少なくとも１つの血液及び／又は血液由来製剤の調製において用いられてもよい。
【０２１７】
線溶活性は、本明細書で使用されるとき、血液及び血液由来製剤中の一部のタンパク質分解酵素がフィブリン及び凝血塊を融解させる能力を指す。フィブリンを切断する主要なタンパク質分解酵素はプラスミンである。プラスミンは、プラスミノーゲンがｔＰＡ及び／又はｕＰＡによって活性化されることにより形成される。プラスミンがフィブリンを分解すると、フィブリン分解産物（ＦＤＰ）が形成される。ＦＤＰはトロンビンと競合し、従ってフィブリノーゲンからフィブリンへの変換を妨げることにより凝血塊形成を減速させる。この効果はトロンビン凝固時間（ＴＣＴ）試験で見ることができ、活性な線溶を有する人ではこれが延長する。ＦＤＰ、及び特異的ＦＤＰ、Ｄ−ダイマーは、抗体−抗原技術を用いて測定することができる。これはＴＣＴよりも特異的であり、線溶が起こっていることを確認する。従ってこれは、深部静脈血栓症、肺塞栓症、ＤＩＣ及び急性心筋梗塞における治療の有効性の指標を得るために用いられる。或いは、全血中のトロンボエラストメトリー（ＴＥＭ）によれば、ヘパリン下の患者であっても、線溶活性、特に線溶亢進のより迅速な検出が可能である。このアッセイでは、線溶阻害薬アプロチニンの非存在下又は存在下でのＴＥＭプロファイルを比較することにより、線溶の増加が評価される。なおも更に、全体的な線溶の検査を真性グロブリン溶解時間（ＥＬＴ）アッセイによって測定することができる。ＥＬＴは、血漿から真性グロブリン画分（主に、重要な線溶因子フィブリノーゲン、ＰＡＩ−１、ｔＰＡ、α２−抗プラスミン、及びプラスミノーゲン）を凝血させ、次に凝血塊融解に必要な時間を観察することにより線溶を測定する。溶解時間が短くなることが、線溶亢進状態及び出血リスクを示す。
【０２１８】
上記に指摘したとおり、本明細書に開示される主題の方法によって処理される体液、血液、血漿又は血液製剤は、低下した、又は減少した線溶活性を呈する。用語「低下した」、「減少した」「緩和された」、「抑制された」又は「減弱した」は、本明細書において参照されるとき、ｔＰＡ及び／又はプラスミノーゲンを含む血液、血漿又は血液製剤などの体液との比較、本明細書に開示される主題のコンジュゲートによって処理されなかった血液又は血液製剤との比較、通常の血液又は血液製剤との比較、又は市販の血液製剤との比較で、ある過程、具体的には線溶活性の約１％〜９９．９％のうちのいずれか１つ、具体的には、約１％〜約５％、約５％〜１０％、約１０％〜１５％、約１５％〜２０％、約２０％〜２５％、約２５％〜３０％、約３０％〜３５％、約３５％〜４０％、約４０％〜４５％、約４５％〜５０％、約５０％〜５５％、約５５％〜６０％、約６０％〜６５％、約６５％〜７０％、約７５％〜８０％、約８０％〜８５％  約８５％〜９０％、約９０％〜９５％、約９５％〜９９％、又は約９９％〜９９．９％、又は更には１００％の遅延、制限、減少又は低下を指すことが理解されなければならない。換言すれば、これらの製剤は線溶活性を呈しないか、又は高々、最小限の低下した線溶活性、具体的には、未処理の血液又は血液製剤の線溶活性と比較したとき約０．０１％以下、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％以下の線溶活性を呈する。一部の実施形態において、上記に定義されるとおり低下した線溶活性を呈する又は線溶活性を呈しない、本明細書に開示される主題によって提供される方法、コンジュゲート、組成物、並びに装置、装置一式、キット又はシステムによって処理される体液、血液、血漿又は血液製剤は、本明細書で後に考察するとおり、本明細書に開示される主題によって開示される任意の治療適用に用いられてもよい。
【０２１９】
更に一部の他の具体的な実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、それを必要としている対象の及び／又はそうした対象にある少なくとも１つの線溶タンパク質体液を枯渇させるためインビボ／エキソビボで用いられてもよい。
【０２２０】
従って、その別の態様において、本明細書に開示される主題は、それを必要としている対象の１つ又は複数の体液から少なくとも１つの線溶タンパク質を体外手技によって枯渇させる方法を提供する。より具体的には、本方法は以下のステップを含む：
第１のステップ（ｉ）において、前記対象の体液を体外機器へと移送するステップ。一部の実施形態において、本明細書に開示される主題により提供される装置、装置一式、キット又はシステムが、かかる体外機器と見なされてもよい。
【０２２１】
第２のステップ（ｉｉ）は、体液を少なくとも１つの線溶タンパク質に特異的なアフィニティー枯渇手順に供するステップを含む。かかる枯渇は、前記機器への及びそこからの血液の移送前、移送中又は移送後に実施されてもよいことに留意しなければならない。このようにして、対象の体外体液が入手される。この体外体液は少なくとも１つの線溶タンパク質が枯渇している。
【０２２２】
次のステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉｉ）で入手された、少なくとも１つの線溶タンパク質が枯渇している体液を対象に返還する、又は再導入するステップを含む。
【０２２３】
アフィニティー枯渇手順は、対象の体液を有効量の複数のコンジュゲート又はその任意の組成物と具体的にはエキソビボで接触させることを含む点に留意しなければならない。なおも更に、前記体外機器内、又は本明細書に開示される主題により定義されるとおりの、かかる体外機器に接続した装置、装置一式、キット又はシステム内に、本明細書に開示される主題のコンジュゲート又はその任意の組成物が含まれてもよい。上述のとおり、本明細書で考察される各コンジュゲートは、一部の実施形態において、少なくとも１つの粒子と少なくとも１つのリンカーと少なくとも１つのアミノ酸、その誘導体又はその類似体とを含んでもよい。なおも一部の更なる実施形態において、複数のコンジュゲートは少なくとも２つの異なるコンジュゲートを含む。一部の更なる実施形態において、アミノ酸、その誘導体又はその類似体は、４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸（トラネキサム酸）、ε−アミノカプロン酸、リジン、シクロヘキサンカルボン酸及び４−メチルシクロヘキサンカルボン酸のうちの少なくとも１つであってもよい。なおも一部の更なる実施形態において、アミノ酸、その誘導体又はその類似体は、４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸（トラネキサム酸）、ε−アミノカプロン酸及びリジンのうちの少なくとも１つである。更に一部の実施形態において、アミノ酸、その誘導体又はその類似体はトラネキサム酸（ＴＸＡ）であってもよい。
【０２２４】
一部の実施形態において、体外機器は心肺バイパス機（ＣＰＢ）であり、及びここで体外機器は血漿アフェレーシス機械である。
【０２２５】
用語「体外」は、体外で行われる医療手技を指す。例えば、かかる体外手技は、循環手技、即ち、患者の循環から血液が取り出され、それに対してある処理が適用された後、それが循環に返還される手技に関し得る。血液を体外に運び出す機器は全て、体外循環と呼ばれる。かかる循環手技には、例えば限定はされないが、アフェレーシス、自己血輸血、血液透析、血液ろ過、血漿アフェレーシス、体外二酸化炭素除去、体外心肺蘇生、体外式膜型人工肺（ＥＣＭＯ）及び直視下心臓手術中の心肺バイパスが含まれる。
【０２２６】
心肺バイパス（ＣＰＢ）は、手術時に心肺機能を一時的に代わって担い、患者の体の血液循環及び酸素含量を維持する技法である。ＣＰＢポンプそれ自体は、人工心肺又は「ポンプ」と称されることが多い。心肺バイパスポンプは血液潅流技師によって操作される。ＣＰＢは体外循環の一形態である。体外式膜型人工肺は、概して長期治療に使用される。
【０２２７】
アフェレーシス機は、患者又は供血者の体から取り出された血液を受け取り、それをその様々な成分：血漿、血小板、白血球及び赤血球に分離する装置である。
【０２２８】
一部の実施形態において、本明細書に開示される主題の方法において有用なコンジュゲート粒子は、本明細書に開示される主題により定義されるとおりであってよいことに留意しなければならない。なおも一部の更なる実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、本明細書において上記に定義するとおりの装置、装置一式、キット又はシステムを使用してもよい。
【０２２９】
一部の実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、少なくとも１つの凝固因子を含む全血、血漿又は血液由来製剤のうちの少なくとも１つであってよい少なくとも１つの線溶タンパク質を体液から枯渇させることに適用可能であり得る。
【０２３０】
一部の具体的な実施形態において、かかる血液由来製剤は、全血、血漿、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）、多血小板血漿（ＰＲＰ）及びクリオプレシピテートのうちの少なくとも１つであってもよい。
【０２３１】
なおも一部の更なる具体的な実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、プラスミノーゲン及びｔＰＡのうちの少なくとも１つであってよい線溶タンパク質の枯渇に用いられてもよい。一部の具体的な実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、ｔＰＡの枯渇に用いられてもよい。なおも一部の更なる実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、プラスミノーゲンの枯渇に用いられてもよい。なおも更に、特定の実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、プラスミノーゲン及びｔＰＡの枯渇に用いられてもよい。
【０２３２】
なおも一部の更なる実施形態において、本方法は、本明細書に開示される主題のコンジュゲート、複数のコンジュゲート又はその任意の組成物、又は具体的にはＴＸＡコンジュゲート粒子からプラスミノーゲン及びｔＰＡのうちの少なくとも一方を回収するステップを更に含んでもよい。本明細書に開示される主題の方法によって体液から取り出される枯渇させる線溶タンパク質は、他の目的に用いられてもよいことが理解されなければならない。一部の具体的な実施形態において、本明細書に開示される主題の機器又はコンジュゲートからプラスミノーゲン及び／又はｔＰＡを回収することは、前記機器上で、有効量のコンジュゲート、その組成物又は具体的にはＴＸＡ、その誘導体又はその任意の類似体を、前記プラスミノーゲン及び／又はｔＰＡに結合した組成物、コンジュゲート又は具体的にはＴＸＡコンジュゲート粒子に適用することにより実施されてもよい。なおも一部の更なる実施形態において、回収されたプラスミノーゲンは、線溶が必要な場合に前記対象の治療に用いられ得る。
【０２３３】
なおも更に、本開示は、それを必要としている対象の１つ又は複数の体液から少なくとも１つの線溶タンパク質を体外手技によって枯渇させる方法における使用のための体外機器を更に提供することが理解されなければならない。より具体的には、本方法は以下のステップ：第１のステップ（ｉ）において、前記対象の体液を〜に（into）移送するステップを含む。一部の実施形態において、本明細書に開示される主題により提供される装置、装置一式、キット又はシステムが、かかる体外機器と見なされてもよい。第２のステップ（ｉｉ）は、体液を少なくとも１つの線溶タンパク質に特異的なアフィニティー枯渇手順に供するステップを含む。かかる枯渇は、前記機器への及びそこからの血液の移送前、移送中又は移送後に実施されてもよいことに留意しなければならない。このようにして、対象の体外体液が入手される。この体外体液は少なくとも１つの線溶タンパク質が枯渇している。次のステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉｉ）で入手された、少なくとも１つの線溶タンパク質が枯渇している体液を対象に返還する、又は再導入するステップを含む。
【０２３４】
更に別の態様において、本明細書に開示される主題は、それを必要としている対象の出血性、止血障害及びそれに関連する任意の出血性又は病的状態を治療、防止、予防、改善、抑制する方法を提供する。より具体的には、本方法は、線溶活性が低下した治療有効量の少なくとも１つの血液及び／又は血液由来製剤を治療下の対象に投与するステップを含んでもよい。一部の実施形態において、製剤は、本明細書に記載されるとおりの方法により調製されてもよい。
【０２３５】
一部の実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、遺伝性又は後天性出血性障害であってもよい止血障害に適用可能であり得る。
【０２３６】
止血障害は、遺伝性又は後天性のいずれかに分類される出血性障害である。後天性出血性障害は、本明細書で以下に考察するとおり、外傷、手術又は線溶治療など、外因（後天的原因）によって出血が引き起こされる障害である。
【０２３７】
１つ以上の凝固因子の遺伝的欠乏によって起こる出血性障害は、世界中に分布するまれな障害である。これらの欠乏に関与する突然変異遺伝子のホモ接合体又は複合ヘテロ接合体は、様々な重症度の、通常は特定の凝固因子の活性低下の程度に関係する出血徴候を呈する。
【０２３８】
更に別の実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、遺伝性止血障害に関連する出血及び未確定の出血傾向の治療、予防、改善、抑制又は遅延に適用可能である。
【０２３９】
「遺伝性止血障害」は、本明細書で使用されるとき、少なくとも１つの凝固因子の遺伝的欠乏に関する。より具体的には、凝固第Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、Ｘ及びＸＩ因子をコードする遺伝子に、前記因子のうちの少なくとも１つの欠乏又はその活性低下につながる多数の突然変異が同定されている。これらの突然変異のホモ接合体は、特発性又は外傷／手術後のいずれかに出血傾向を呈する。様々な欠乏のヘテロ接合体は、出血傾向を示すことはまれである。
【０２４０】
未確定の出血傾向とは、本明細書で使用されるとき、その状態の正確な診断は確立することができないが、出血傾向にある状態に関する。
【０２４１】
軽度出血症状の評価に回される一部の患者は、手術又は分娩など、出血を生じさせる攻撃的イベントが起こるまで認識されていなかった可能性のある診断未確定の出血傾向を有する。かかる個体には、出血徴候に関して臨床的なばらつきがよく見られ、環境因子及び他の遺伝因子が出血リスクを改善し得ることが示唆される。軽度出血問題は、重大な止血チャレンジ（手術、抜歯、大外傷、初経又は分娩）に直面するまで明らかにならないこともあるが、こうした個体について、予測的な術後出血リスクは確立されていない。性別は出血徴候に影響を及ぼす。女性は、月経及び／又は分娩に伴う厄介な出血があるため、評価に回されることが多くなる。加えて、抜歯後２４時間以上持続する又は問題となる出血については、出血性障害の可能性が浮上する。軽度の皮膚粘膜出血を有する患者の診断を確立できないことは、実際にはよく見られる問題である。
【０２４２】
未確定の出血傾向の診断の証となるのは、通常の臨床検査である。診断を確立できないことは、手術を受ける又は分娩を行う必要のある患者にとって問題となり得る。
【０２４３】
未確定の出血性障害を有する患者の軽度出血症状には、歯科及び口腔外科手術についてε−アミノカプロン酸又はトラネキサム酸による線溶阻害薬療法が用いられてもよく、これは他の手術手技に伴う出血を減少させ得る。しかしながら、例えば手術又は分娩時に重度の出血が起こる場合、血液又は血液由来成分が必要となる。
【０２４４】
より具体的な実施形態において、遺伝性止血障害は、少なくとも１つの凝固因子の欠乏及び未確定の出血傾向のうちの少なくとも一方に起因する障害であり得る。
【０２４５】
なおも一部の更なる実施形態において、少なくとも１つの凝固因子の欠乏は、第ＸＩ因子、第Ｘ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＩ因子（プロトロンビン）及び第Ｉ因子（フィブリノーゲン）のうちの少なくとも１つの欠乏であり得る。従って、一部の実施形態において、本明細書に開示される主題により記載される方法は、本明細書に開示されるとおりの第ＸＩ因子、第Ｘ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＩ因子（プロトロンビン）及び第Ｉ因子（フィブリノーゲン）のうちの少なくとも１つの欠乏によって引き起こされる遺伝性止血障害に付随する任意の形態の出血に適用可能であり得る。
【０２４６】
なおも一部の更なる実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、凝固第Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、Ｘ及びＸＩ因子の遺伝的欠乏によって特徴付けられる障害であって、それに関連する出血傾向のうちの少なくとも１つ又は任意の出血傾向を含む障害の治療に適用可能であり得る。凝固第Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、Ｘ及びＸＩ因子の遺伝的欠乏は、大多数の集団において記載されている常染色体劣性出血性障害である。その相対頻度は、一部には近交系集団で特定の突然変異遺伝子が高頻度である結果として集団間で様々である。幾つかの集団調査が示すところによれば、これらの出血性障害には第ＸＩ因子及び第ＶＩＩ因子の欠乏がよく見られ、あまり見られない障害は、第Ｖ因子及び第Ｘ因子の欠乏並びに無フィブリノーゲン血症であり、及び最もまれな障害は第ＩＩ因子（プロトロンビン）及び第ＸＩＩＩ因子の欠乏である。突然変異遺伝子に関してホモ接合又は複合ヘテロ接合である罹患患者における出血徴候の重症度は様々であり、通常は欠乏の程度に関係する。一部の患者は軽い青あざを有するのみで、又は外傷後にのみ過剰出血を呈する。通常は正常な第ＶＩＩ、ＸＩＩＩ、又はＸ因子活性の１パーセント未満である他の患者は、重症血友病患者と同様の頭蓋内出血及び関節血症を呈し得る。
【０２４７】
一部の具体的な実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、遺伝性第ＸＩ因子欠乏症に関連する出血、又は第ＩＸ因子欠乏症に罹患している患者の任意の後天性出血又は止血病態の治療、防止、低減、減弱、又は抑制に適用可能であり得る。
【０２４８】
遺伝性第ＸＩ因子欠乏症は、常染色体劣性形質として遺伝する。この障害は、ホモ接合体又は複合ヘテロ接合体において、主に傷害関連である軽度から中等度の出血傾向として示される。多くの集団において罹患対象が記載されているが、ユダヤ人、特にアシュケナージ系ユダヤ人に、この障害が多く見られる。
【０２４９】
機能不全タンパク質の結果としての第ＸＩ因子欠乏症はまれであり、患者の大多数は第ＸＩ因子タンパク質レベルが低下している。様々な血統の非ユダヤ人及びユダヤ人患者に合わせて１５０を上回る突然変異が報告されており、そのほとんどがミスセンス突然変異である。
【０２５０】
ホモ接合体及び複合ヘテロ接合体での多くの出血徴候は、傷害関連である。過剰出血が傷害時に起こり、又は外傷後数時間若しくは数日で始まり得る。出血傾向は、止血チャレンジ及び様々な傷害部位に応じて異なる。線溶活性が高い組織（尿路、扁桃腺、鼻、歯槽）が関わる手術手技は、重度の第ＸＩ因子欠乏症患者では遺伝子型に関係なく高頻度で過剰出血を伴う。現在では、凝血塊溶解の防止における第ＸＩ因子の実証されている機能を踏まえると、部位関連の出血傾向を理解することができる。第ＸＩ因子欠乏症は、それ自体は線溶の増加を伴い、従って、こうした患者における線溶に富む部位での手術の更なる出血リスクにより、出血傾向は更に一層増加し得る。
【０２５１】
第ＸＩ因子欠乏症を有する出血患者の現在の治療はＦＦＰに基づく。手術手技を受けなければならない重度第ＸＩ因子欠乏症患者は、慎重に評価され、細心の注意を払って手術準備が行われなければならない。局所線溶活性が高い部位の手術を受ける患者においては、抗線溶剤の使用が検討されなければならない。従って、一部の実施形態において、本明細書に開示される主題により提供されるｔＰＡ及び／又はプラスミノーゲン欠乏ＦＦＰは、第ＸＩ因子欠乏症患者、より具体的には上記で考察した病態のいずれかに罹患している対象の治療に特に関連性が高いものであり得る。
【０２５２】
他の実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、遺伝性第ＶＩＩ因子欠乏症に関連する出血、又は第ＶＩＩ因子欠乏症に罹患している患者の任意の後天性出血若しくは止血病態の治療、防止、低減、減弱、抑制に適用可能であり得る。
【０２５３】
第ＶＩＩ因子の遺伝的欠乏は、多くの集団に観察されているまれな常染色体劣性障害である。第ＶＩＩ因子欠乏症は、凝固時間検査プロトロンビン時間（ＰＴ）の延長を生じる唯一の血液凝固障害であるため、推定診断は容易に行うことができる。第ＶＩＩ因子欠乏症を引き起こす多くの突然変異がミスセンス突然変異となっている。
【０２５４】
第ＶＩＩ因子欠乏に関するホモ接合体及び複合ヘテロ接合体で出血徴候が起こる。第ＶＩＩ因子活性が正常値の１パーセント未満である患者は、重度の関節症につながる関節血症及び致命的な脳内出血など、重度の出血徴候を高頻度で示す。
【０２５５】
やや高いレベルの第ＶＩＩ因子（正常値の５パーセント以上の第ＶＩＩ因子活性）を有する患者は、鼻出血、歯肉出血、月経過多、及び青あざができ易いことによって特徴付けられる、はるかに軽度の疾患を有する。抜歯、扁桃摘出術、及び泌尿生殖器管が関わる手技など、一部の手術手技は、手技前に前療法が導入されない場合、高頻度で出血を伴う。対照的に、開腹術、ヘルニア縫合術、付録切除術、及び子宮摘出術などの手術手技は問題なく行われている。この明らかな相違は、それぞれの外傷組織が呈する局所線溶の程度の差によって説明することができる。
【０２５６】
ＦＦＰによる補充療法は、関節血症又は脳内出血など、重度の出血を示す患者に不可欠である。抜歯、扁桃摘出術、鼻の手術、及び泌尿器科介入は局所線溶に起因して出血を伴う可能性が高いため、手術を要する場合には手術部位を考慮しなければならない。従って、一部の実施形態において、本明細書に開示される主題により提供されるｔＰＡ及びプラスミノーゲン欠乏ＦＦＰは、第ＶＩＩ因子欠乏症、具体的には上記で考察した病態のいずれかを有する患者の治療に特に関連性が高いものであり得る。
【０２５７】
更に別の実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、遺伝性第Ｘ因子欠乏症に関連する出血、又は第Ｘ因子欠乏症に罹患している患者における任意の後天性出血若しくは止血病態の治療、防止、低減、減弱、抑制に適用可能であり得る。
【０２５８】
中等度から重度の出血傾向である遺伝性第Ｘ因子欠乏症は、常染色体劣性障害である。現在記載されている第Ｘ因子欠乏症を引き起こす９５個の突然変異には、大型欠失、小型フレームシフト欠失、ナンセンス突然変異、及びミスセンス突然変異が含まれる。第Ｘ因子欠乏症の臨床徴候は第Ｘ因子の機能レベルに関係する。重度の第Ｘ因子欠乏症を有し及び機能性第Ｘ因子レベルが正常出血値の１パーセント未満である個体は、特発的に及び外傷後に出血する。出血は主に関節及び軟部組織に起こるが、しかしながら、月経過多など、粘膜からの出血が女性で特に問題となり得る。更に異例の出血は、脳内出血、腸壁内出血（急性腹症のような症状が生じ得る）、尿路出血、及び軟部組織出血であって、出血性仮性嚢胞又は偽腫瘍の発育を伴うものである。軽度の第Ｘ因子欠乏症を有する個体では、出血はあまり見られず、通常は外傷後又は術中若しくは術後にのみ起こる。第Ｘ因子欠乏症患者は新鮮凍結血漿を使用して治療される。従って、一部の実施形態において、本明細書に開示される主題により提供されるｔＰＡ及び／又はプラスミノーゲン欠乏ＦＦＰ（又は任意の他の血液製剤）は、第Ｘ因子欠乏症患者、具体的には上記で考察した病態のいずれかに罹患している患者の治療に特に関連性が高いものであり得る。
【０２５９】
なおも一部の他の実施形態において、本明細書に開示される主題は、遺伝性第Ｖ因子欠乏症に関連する出血、又は第Ｖ因子欠乏症に罹患している患者における任意の後天性出血若しくは止血病態の治療、防止、低減、減弱、及び抑制に適用可能であり得る。
【０２６０】
遺伝性第Ｖ因子欠乏症は、あまり見られない遺伝性出血性障害の中の一つであり、ホモ接合体又は複合ヘテロ接合体において中等度の出血傾向として現れる。第Ｖ因子欠乏症は常染色体劣性形質として遺伝する。血漿第Ｖ因子活性が正常値の２５〜６０パーセントの範囲であるヘテロ接合体は、通常は無症候性である。第Ｖ因子タンパク質アッセイによれば、多くのホモ接合体及び複合ヘテロ接合体が、機能不全タンパク質よりむしろ、真の欠乏を有することが指摘される。全体で８０を上回る個別的な突然変異が同定されており、そのうち４分の１がミスセンスである。第Ｖ因子レベルが正常値の１〜１０パーセント未満の範囲であるホモ接合又は複合ヘテロ接合患者は、生涯にわたって出血傾向を呈する。多く見られる徴候には、斑状出血、鼻出血、歯肉出血、軽微な裂傷後の出血、及び月経過多が含まれる。重度の第Ｖ因子欠乏症を有する患者では、５０パーセントを超える妊娠で分娩後出血が起こる。他の部位からの出血はあまり見られない。外傷、抜歯、及び手術は、高い過剰出血リスクをもたらす。重度の特発性出血が起こる場合、又は手術が実施される場合、新鮮凍結血漿補充が行われなければならない。血漿補充療法を計画する際には、泌尿生殖器管、口腔、及び鼻など、局所線溶活性が高い部位での手術手技について考慮することが、こうした部位での手術は過剰出血を招くことになり、及び分娩後出血が多く見られるため、重要である。従って、一部の実施形態において、本明細書に開示される主題により提供されるｔＰＡ及びプラスミノーゲン欠乏製剤は、第Ｖ因子欠乏症、具体的には上記で考察した病態のいずれかを有する患者の治療に特に関連性が高いものであり得る。
【０２６１】
特定の実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、遺伝性第ＩＩ因子欠乏症に関連する出血、又は第ＩＩ因子欠乏症に罹患している患者における任意の後天性出血若しくは止血病態の治療、防止、低減、減弱、抑制に特に適用可能であり得る。
【０２６２】
遺伝性第ＩＩ因子（プロトロンビン）欠乏症は、最もまれな凝固因子欠乏症の一つである。これは２つの形態：真の欠乏であるＩ型（低プロトロンビン血症）、及び機能不全のプロトロンビンが産生されるＩＩ型（プロトロンビン異常症）を呈する。これらの常染色体劣性障害は遺伝的に異質であり、軽度から中等度の出血傾向によって特徴付けられる。
【０２６３】
プロトロンビンの異常は常染色体劣性様式で遺伝する。Ｉ型欠乏症の個体の中では、ヘテロ接合体が正常値の約５０パーセントのプロトロンビンレベルを呈し、一方、ホモ接合体が典型的には正常値の１０パーセント未満のレベルを示す。プロトロンビン欠乏症を引き起こす５０を上回る突然変異が同定されており、そのほとんどがミスセンス突然変異である。
【０２６４】
遺伝性Ｉ型及びＩＩ型欠乏症は、通常は機能性プロトロンビンの欠乏程度と相関する軽度から中等度の皮膚粘膜及び軟部組織出血によって特徴付けられる。プロトロンビンレベルが正常値の約１パーセントであれば、特発的に又は外傷後に出血が起こり得る。手術による出血は重篤となり得る。月経過多、鼻出血、歯肉出血、青あざができ易い、及び皮下血腫が起こり得る。
【０２６５】
先天性プロトロンビン欠乏症患者の補充療法はＦＦＰの投与からなる。従って、一部の実施形態において、本明細書に開示される主題により提供されるｔＰＡ及びプラスミノーゲン欠乏ＦＦＰは、第ＩＩ因子欠乏症、具体的には上記で考察した病態のいずれかを有する患者の治療に特に関連性が高いものであり得る。
【０２６６】
なおも一部の他の実施形態において、本明細書に開示される主題は、遺伝性フィブリノーゲン欠乏症に関連する出血又は遺伝性フィブリノーゲン欠乏症に罹患している患者における任意の後天性出血若しくは止血病態の治療、防止、低減、減弱、抑制に適用可能であり得る。
【０２６７】
「フィブリノーゲン（第Ｉ因子）欠乏症」は、本明細書で使用されるとき遺伝性フィブリノーゲン異常に関し、無フィブリノーゲン血症（フィブリノーゲンの完全な欠如）、異常フィブリノーゲン血症及び低異常フィブリノーゲン血症を含む。遺伝性のフィブリノーゲン障害はまれであり、Ｉ型及びＩＩ型障害に細分することができる。Ｉ型障害（無フィブリノーゲン血症及び低フィブリノーゲン血症）は循環中のフィブリノーゲンの量に影響を及ぼす。ＩＩ型障害（異常フィブリノーゲン血症及び低異常フィブリノーゲン血症）は、循環フィブリノーゲンの質に影響を及ぼす。最も重症型のフィブリノーゲン欠乏症である無フィブリノーゲン血症は、常染色体劣性遺伝及び血漿中におけるフィブリノーゲンの完全な欠如によって特徴付けられる。
【０２６８】
異常フィブリノーゲン血症は、正常レベルの機能的に異常な血漿フィブリノーゲンの存在によって定義される。低異常フィブリノーゲン血症は、低レベルの機能不全タンパク質によって定義される。これらは、３つのフィブリノーゲンコード遺伝子における多くの異なる突然変異によって引き起こされる異質性障害である。異常フィブリノーゲン血症及び低異常フィブリノーゲン血症は常染色体優性障害である。最も罹り易い患者は、これらの３つのフィブリノーゲン遺伝子のうちの１つのコード領域におけるミスセンス突然変異に関してヘテロ接合である。分泌型フィブリノーゲン六量体は、これらの３つのフィブリノーゲン鎖の各々のコピーを２つ含み、結果として生じるフィブリン網がこの分子の複数のコピーを含むため、１つの突然変異アレルに関するヘテロ接合性が、フィブリン塊の構造及び機能を損なうのに十分である。
【０２６９】
無フィブリノーゲン血症に起因する出血は、通常は新生児期に現れ、症例の８５パーセントが臍帯出血を示し、しかし発症年齢が遅くなることも珍しくない。出血は皮膚、消化管、尿生殖路、又は中枢神経系に起こることもあり、頭蓋内出血が主な死亡原因である。無フィブリノーゲン血症患者には、興味深い特発性脾破裂への易罹患性がある。月経期の女性は機能性子宮出血を経験し得る。加えて、無フィブリノーゲン血症女性では、妊娠第一期における流産が通常である。こうした患者はまた、分娩前及び分娩後出血も有し得る。黄体破裂後の腹腔内出血もまた認められている。
【０２７０】
フィブリノーゲンを含有する市販の製剤による補充療法が、先天性フィブリノーゲン欠乏症患者の唯一の治療選択肢である。従って、一部の実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、フィブリノーゲン欠乏症、具体的には上記で考察した病態のいずれかを有する患者の治療に特に関連性が高いものであり得る。特に、一部の実施形態において、ここでは本明細書に開示される主題のコンジュゲート及び方法によって調製される線溶タンパク質枯渇体液にフィブリノーゲンが補足される。
【０２７１】
遺伝性凝固因子欠乏症の治療に使用される血液由来製剤の市販の調製物と対照的に、本明細書に開示される主題のコンジュゲート、組成物及び方法によって調製される線溶タンパク質枯渇体液は、欠損している因子を提供すること（凝固促進品質）に加えて、製剤からのｔ−ＰＡ及びプラスミノーゲンの除去により、出血の場合に更なる凝血塊溶解の防止に不可欠な抗線溶品質となるため、実質的な利点を有する。
【０２７２】
一部の実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、後天性止血障害の治療に適用可能であり得る。後天性止血障害は、手術によって引き起こされる出血、外傷によって引き起こされる出血、急性消化管出血、熱傷に関連する出血、出血性脳卒中、気腫及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に関連する肺傷害、分娩に関連する出血、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、及び線溶療法又は血栓溶解療法によって起こる出血のうちの少なくとも１つであってもよい。一部の具体的な実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、手術手技、具体的には小手術又は大手術手技に関連する出血の治療、防止、低減、減弱、及び抑制に適用可能であり得る。
【０２７３】
手術手技は、特に線溶タンパク質に富む場所（例えば、組織、臓器）で手術が実施されるとき、止血系に対する大きなチャレンジである。出血性障害を有しない又はそれが軽度から中等度である患者であっても、手術後は過剰に出血し得る。手術による外傷の程度に加えて、手術部位における線溶活性の大きさを考慮しなければならない。
【０２７４】
手術手技が待機的である、予定されている、又は緊急でない場合（例えば、帝王切開術、又は術前の準備に十分な時間を取る任意の他の大手術）、本明細書に開示される主題の製剤が、手術介入時の過剰出血の防止又は低減を促進するための術前治療に用いられてもよいことが理解されなければならない。従って、一部の実施形態において、本明細書に開示される主題は、遺伝性障害を有する患者、線溶亢進に罹患している患者及び／又は手術が予定されている患者に特に有用な予防的方法を提供し得る。
【０２７５】
一部の更なる具体的な実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、外傷によって引き起こされる出血（外傷性出血）の治療に好適である。
【０２７６】
外傷性出血は、任意の種類の傷害、例えば、労働災害及び自動車事故、戦闘又は落下によって引き起こされる任意の傷害によって引き起こされ得る。出血を引き起こし得る外傷性創傷には様々な種類がある。一般に、外傷は血管に損傷を引き起こし、そのため血液が体外へと外部に流れ出るか、又は脳、肺、肝臓、腎臓、脾臓などの生体器官若しくは胸部及び腹部などの生体腔へと内部に流れ込む。
【０２７７】
出血を止める物理的処置に加えて、通常、血液凝固を惹起するため血液及び血液由来成分が投与され、それが最終的には出血の停止をもたらすことになる。
【０２７８】
本明細書に開示される主題のｔＰＡ及び／又はプラスミノーゲン欠乏血液及び血液由来製剤は、更なる抗線溶品質を提供し、そのため形成された凝血塊の融解が防止されることになり、これは迅速な出血停止に不可欠であり得るため、市販の血液由来製剤と比べて利点を示す。
【０２７９】
一部の具体的な実施形態において、本明細書に開示される主題のコンジュゲート及び方法によって調製される線溶タンパク質枯渇体液は、急性又は慢性消化管出血の治療に好適であり得る。
【０２８０】
「消化管（ＧＩ）出血」、別名、胃腸出血は、本明細書で使用されるとき、口から直腸までの消化管におけるあらゆる形態の出血に関する。「急性消化管出血」は、短期間に大量の失血があり、急性失血及び出血性ショックが引き起こされることを意味する。症状には、赤色の血又は黒色の血（「コーヒー残渣」とも称される消化された血液が原因）のいずれかの嘔吐（吐血（（hemathemesis））、血便、又は黒色便（下血と呼ばれる消化された血液）が含まれ得る。対照的に、慢性消化管出血は、長期間にわたる少量の血液の出血である。この場合、症状は鉄欠乏性貧血である。ＧＩ出血は、典型的には２つの主な種類：上部消化管出血及び下部消化管出血に分けられる。上部ＧＩ出血の原因としては、とりわけ、消化性潰瘍疾患、食道静脈瘤（一部の実施形態では、肝硬変及び癌に起因して起こり得る）が挙げられる。下部ＧＩ出血の原因としては、とりわけ、痔核、癌、及び炎症性腸疾患が挙げられる。上部及び下部消化管の内視鏡検査で出血部位を特定し得る。明確でない場合には、医用イメージングが有用となり得る。
【０２８１】
急性上部ＧＩ出血は、下部ＧＩ出血よりも多く見られる。上部ＧＩ出血は、毎年１０万人当たり５０〜１５０人の成人に起こる。下部ＧＩ出血は、毎年１０万人当たり２０〜３０人に起こると推定される。その結果、米国では１年に約３０万人が入院している。ＧＩ出血による死亡リスクは５％〜３０％である。出血リスクは男性でより多く見られ、年齢と共に上昇する。
【０２８２】
上部消化管出血の最も多く見られる発生源は消化性潰瘍である。食道炎及びびらん性疾患が、次に多く見られる原因である。肝硬変患者では、出血の５０〜６０％が食道静脈瘤に起因する。消化性潰瘍患者のほぼ半分がヘリコバクター・ピロリ感染症を有する。他の原因としては、胃潰瘍又は十二指腸潰瘍、マロリー・ワイス裂傷、癌、及び血管異形成が挙げられる。幾つもの医薬が上部ＧＩ出血を引き起こすことが分かっている：ＮＳＡＩＤｓ、ＣＯＸ−２阻害薬、ＳＳＲＩｓ、コルチコステロイド類、及び抗凝固薬。
【０２８３】
下部消化管出血は、典型的には結腸、直腸又は肛門からである。下部消化管出血のよく見られる原因としては、痔核、癌、血管異形成、潰瘍性大腸炎、クローン病、及び大動脈腸管瘻が挙げられる。
【０２８４】
急性消化管出血治療の初期の焦点は蘇生に置かれ、気道確保並びに静脈内輸液及び血液を用いた輸液蘇生から開始される。
【０２８５】
下部ＧＩ出血の診断及び治療には、結腸鏡検査法が有用である。クリップ法、焼灼法、及び硬化療法を含め、幾つもの技法が用いられてもよい。手術は、上部ＧＩ出血の治療にはほとんど用いられないが、問題を引き起こしている腸の一部を切り取ることによる下部ＧＩ出血の管理には未だによく用いられる。血管造影による塞栓術は、上部及び下部ＧＩ出血の両方に用いることができる。
【０２８６】
なおも更に、本明細書に開示される主題のコンジュゲート及び機器を用いて、本明細書に開示される主題の方法により調製されるプラスミノーゲン及び／又はｔＰＡ枯渇血液製剤は、出血性脳卒中の治療に用いられてもよい。
【０２８７】
「出血性脳卒中」は、本明細書で使用されるとき、脳実質に直接起こる出血に関する。通常の機構は、慢性高血圧によって損傷を受けた脳内小動脈からの漏出と考えられる。脳内出血患者は、虚血性脳卒中患者と比べて、頭痛、精神状態の変化、発作、悪心嘔吐、及び／又は著しい血圧上昇を有する可能性がより高い。とは言え、これらの所見のいずれも、出血性脳卒中と虚血性脳卒中とを確実に区別するものではない。特異的症状は局所神経障害から生じ得る。この種の障害は脳病変部に依存する。優位半球（通常は左半球）に病変がある場合、以下からなる症候群が生じ得る：右不全片麻痺、右片側感覚消失、左注視優先、右視野欠損及び失語症。非優位半球（通常は右半球）に病変がある場合、以下からなる症候群が生じ得る：左不全片麻痺、左片側感覚消失、右注視優先及び左視野欠損。
【０２８８】
脳イメージングは、疑わしい出血性脳卒中の判定において極めて重要なステップであり、緊急時対応で入手されなければならない。脳イメージングは出血の診断に役立ち、脳室内出血、脳浮腫、又は水頭症などの合併症を同定し得る。非造影コンピュータ断層撮影法（ＮＣＣＴ）スキャニング又は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）のいずれも最適なモダリティである。
【０２８９】
出血性脳卒中に対して血液製剤による治療が適応となる場合、血液バンクから入手された血液、ＦＦＰ及び血小板が使用される。本明細書に開示される主題のコンジュゲート及び方法によって調製される線溶タンパク質枯渇体液の血栓形成促進（prothromboyic）品質及び線溶品質を考慮すると、これは出血性脳卒中に罹患している患者において従来の血液製剤よりも適切な出血停止であるように思われる。
【０２９０】
一部の具体的な実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、気腫及びＣＯＰＤに関連する肺傷害の治療に好適であり得る。より具体的な実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、本明細書に開示される主題のコンジュゲート及び方法によって調製される線溶タンパク質枯渇体液の治療有効量を治療下の対象に投与するステップを含んでもよく、そのα１−アンチトリプシンの高濃度化に起因して、その使用は気腫及びＣＯＰＤを有する対象の治療に一層適切となる。これらの疾患では、白血球プロテアーゼが肺の弾性を破壊するため肺不全（lung fuller）となり、結果として肺気腫及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を発症する。従って、本明細書に開示される主題のコンジュゲート及び方法によって調製される線溶タンパク質枯渇体液中のα１−アンチトリプシンが白血球プロテアーゼの活性を阻害し、それによって肺組織の弾性を回復させ得る。
【０２９１】
気腫は、慢性（長期）肺疾患の一形態である。気腫のある人は限定的にしか空気を吐き出すことができないため呼吸困難を有する。気腫の原因は複数あるが、喫煙が圧倒的に多く見られる。
【０２９２】
気腫は、主な種類の慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のうちの一つである。気腫のある人は、何かが空気の流れを塞いでいるかのように息を吐き出すため、これは「閉塞性」と呼ばれる。ＣＯＰＤの他の形態は慢性気管支炎であり、これもまた喫煙によって引き起こされ得る。
【０２９３】
気腫は、肺の空気嚢の繊細な内膜が修復不可能な損傷を受けると起こる。最も一般的には、タバコの煙中にある毒素が損傷を生じさせる。気腫の肺変化は、空気嚢間の脆弱な組織が破壊され、肺にエアポケットが発達するにつれ、何年にもわたってゆっくりと進行する。損傷を受けた肺組織のそれらの空間に空気が閉じ込められるようになる。肺がゆっくりと拡大し、呼吸に更に多くの労力を要する。
【０２９４】
気腫のこの問題は、気流制限と呼ばれる。肺機能検査時、気腫を有する人は、気腫を有しない人と比べてその肺を空にするのにはるかに長い時間がかかる。
【０２９５】
喫煙に加えて、気腫の主な原因として他に知られているのは、α１−アンチトリプシン欠乏症である。しかしながら、これは喫煙と比べると重要な原因ではない。α１−アンチトリプシンは、ヒト血中に循環する天然タンパク質である。その主な機能は、白血球が正常組織に損傷を与えるのを防ぐことである。従って、α１−アンチトリプシンを高濃度化した本明細書に開示される主題のコンジュゲート及び方法によって調製される線溶タンパク質枯渇体液による気腫を有する対象の治療は、プロテアーゼの活性を阻害し、それにより肺組織の弾性を回復させ得る。
【０２９６】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、長期にわたる気流低下によって特徴付けられる閉塞性肺疾患の一種である。主な症状には、息切れ及び痰の喀出を伴う咳が含まれる。ＣＯＰＤは、典型的には時間と共に悪化する。最終的には階段を上ったり又は物を運んだりすることが困難になる。慢性気管支炎及び気腫は、異なる種類のＣＯＰＤに用いられる旧来の用語である。用語「慢性気管支炎」は、２年にわたって毎年少なくとも３ヵ月間存在する湿性咳嗽を定義付けるため未だに用いられている。
【０２９７】
ＣＯＰＤは、慢性の不完全に可逆的な気流低下（気流制限）及び完全に息を吐き出すことができないこと（空気とらえこみ現象）が存在する閉塞性肺疾患の一種である。気流低下は、肺組織の破綻（気腫として知られる）及び末梢気道病変（閉塞性細気管支炎として知られる）の結果である。これらの２つの要因の相対的な寄与は人によって様々である。末梢気道の重篤な破壊は、肺組織を置き換えるブラとして知られる大型エアポケットの形成につながり得る。この形態の疾患は、嚢胞性肺気腫と呼ばれる。
【０２９８】
喫煙は、ＣＯＰＤの最も多く見られる原因であり、大気汚染及び遺伝学などの幾つもの他の要因がより小さい役割を果たしている。発展途上国世界では、一般的な大気汚染源の一つは、不十分な換気下での暖房及び調理用の火である。こうした刺激源に長期間曝露すると、肺に炎症反応が引き起こされ、末梢気道の狭小化及び肺組織の破綻が起こる。診断は、肺機能検査によって測定したときの気流低下に基づく。喘息と対照的に、気流減少は気管支拡張薬の使用によってもあまり改善しない。
【０２９９】
ＣＯＰＤの最も多く見られる症状は、喀痰喀出、息切れ、及び湿性咳嗽である。これらの症状は長期間存在し、典型的には時間と共に悪化する。異なる種類のＣＯＰＤが存在するかどうかは不明である。先に気腫と慢性気管支炎とに分けられたが、気腫は、疾患それ自体というよりむしろ、あくまでも肺変化を記述するものであり、慢性気管支炎は単に、ＣＯＰＤに伴い起こることも又は起こらないこともある症状を記述するものである。
【０３００】
進行したＣＯＰＤは高い肺動脈圧につながり、それにより右心室が歪み、右心不全（right hear failure）となる。この状況は肺性心と称され、下肢腫脹及び頸静脈膨隆の症状につながる。ＣＯＰＤは、肺性心の原因として他のいずれの肺疾患よりも多く見られる。酸素補給の使用以来、肺性心はあまり見られなくなっている。
【０３０１】
結果的に、本明細書に開示される主題のコンジュゲート及び方法によって調製された線溶タンパク質枯渇体液は、その高濃度化されたα−１抗プラスミンが白血球のプロテアーゼを阻害し、それにより損傷を受けた肺組織の弾性品質を修復するため、ＣＯＰＤの補完治療として有益であり得る。
【０３０２】
なおも更に、本明細書に開示される主題のコンジュゲート及び機器を使用した、本明細書に開示される主題の方法によって調製されるプラスミノーゲン及び／又はｔＰＡ枯渇血液製剤は、熱傷及びそれに関連する任意の出血の治療に用いられてもよい。用語「熱傷」は、本明細書で使用されるとき、皮膚及び場合によっては皮膚の下層組織への損傷を伴う組織の傷害を指す。熱傷は、熱、炎、化学薬品、電気、又は放射線との接触によって引き起こされ得る。
【０３０３】
熱傷は主に事故によって引き起こされ、原因に応じて高温熱傷、電気熱傷、化学熱傷、放射線熱傷に分類することができる。熱傷の重症度は、熱傷の幅及び深さ、熱傷を引き起こす物体の温度との接触時間、及び皮膚の状態に応じて第１度、第２度、第３度及び第４度熱傷に分けられる。第２度以上の熱傷では、やけど跡が残ることもあり、病院での治療が必要である。
【０３０４】
第１度熱傷は皮膚の発赤及びそう痒を伴う疼痛を引き起こす。これは、皮膚層の最外層である表皮の損傷、並びに疼痛及び発赤を伴う腫脹を引き起こす。症状は数日で消失するが、表皮落屑及び色素沈着が残り得る。回復後、瘢痕（やけど跡）は残らない。日焼けは、最もよく見られる第１度熱傷の例である。
【０３０５】
第２度熱傷は表皮及び真皮を冒し、事故後２４時間で発赤、疼痛、腫脹、及び水疱が生じる。第２度熱傷は汗腺又は汗孔を冒し得る。重度の灼熱感及び激痛が起こる。水疱が破裂すると、蝕まれた範囲が残り、分泌物が多量に放出される。熱傷範囲が体表面積の約１５パーセント以上になる場合、特別な注意を払わなければならない。第２度熱傷は数週間で治癒するが、多くの場合に色素沈着又は色素脱失が残る。二次感染が起こる場合、一部の症状が重篤化し、治るまでに更に時間がかかる。
【０３０６】
第３度熱傷は表皮、真皮、及び更には皮下脂肪までも冒し、皮膚の色が濃くなるか又は薄くなり、皮膚表面直下の血管が凝固する。熱傷領域は無感覚になり得るが、患者は極度の激痛を感じ、皮膚組織及び構造の死滅があり、治療に多くの時間を要するとともに、やけど跡が後に残る。事故後２週間で痂皮が脱落し、潰瘍化した表面が現れる。多量の体液が分泌され、出血が起こる可能性が高いが、徐々に新しい組織が形成されると、表皮の再生につながり、第３度熱傷は治癒するとともに、瘢痕が後に残る。深部の皮膚壊死が生じると、又は二次感染が起こると、治癒は遅れ、凸凹の瘢痕表面が生じるためケロイドが形成され又は変形し、又は運動障害が生じる。熱傷範囲が体表面積の１０パーセント以上になる場合、特別な注意が必要となる。
【０３０７】
第４度熱傷は、熱傷領域の炭化して黒ずんだ組織を伴い、皮膚層に広がって、脂肪層、靱帯、筋膜、筋肉、及び更には骨組織にまでも傷害を与える。第４度熱傷には主に高電圧電気熱傷が含まれ、場合によっては、ウイルス感染が起こると真皮深層第２〜３度熱傷が第４度熱傷へと展開し得る。熱傷範囲が２０パーセント以上の範囲である場合、全身に反応が起こり得る；体液が過度に失われるため低血圧症、ショック、急性腎機能障害が起こり得るとともに、後に創傷感染又は肺炎、敗血症、及び多臓器不全症候群が起こり得る。
【０３０８】
４４℃（１１１°Ｆ）より高い温度では、タンパク質はその三次元形状を失い始め、分解し始める。これにより細胞及び組織損傷が生じる。熱傷の直接的な健康への影響の多くは皮膚の正常機能の破壊に続発する。これには、皮膚の感覚、蒸発による水分損失を防ぐ能力、及び体温を調節する能力の破壊が含まれる。細胞膜が破壊されると、細胞から細胞外の空間へとカリウムが失われ、水及びナトリウムが取り込まれる。
【０３０９】
広範囲の（総体表面積の３０％を超える）熱傷では、顕著な炎症反応がある。これにより毛細血管からの体液漏出が増加し、続いて組織浮腫が生じる。これが全体的な血液量損失を引き起こすとともに、残りの血液が深刻な血漿損失を被るため、血液が更に濃縮される。腎臓及び消化管などの臓器への血流が低下するため、腎不全及び胃潰瘍が生じ得る。
【０３１０】
なおも一部の更なる実施形態において、手術によって引き起こされる出血は、小手術又は大手術によって引き起こされる出血であり得る。大手術は、麻酔又は呼吸補助を伴う任意の手術手技として定義される。大手術中の出血の場合、治療には、市販のＦＰ、ＦＦＰ又はクリオプレシピテートによる欠損している又は非機能性の凝固因子の補充が含まれる。
【０３１１】
本明細書において上記に詳述したとおり、麻酔又は呼吸補助を伴う任意の手術手技に関する大手術と対照的に、小手術は、生体において損傷を修復し又は疾患を止めるために実施される、器具による切開を伴う医療手技である。小手術は、人体の任意の一部を鋭利な刃で突き刺す又は開く行為である切開又は切除を含むため、出血傾向のある対象では、この手技は重大な出血を引き起こし得る。
【０３１２】
一部の実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、任意の歯科治療又は手技を含み得る小手術に適用可能であり得ることに留意しなければならない。用語「歯科治療」は、顎（下顎骨）、口腔、顎顔面領域並びに人体の隣接及び関連構造の軟組織及び硬組織の疾患、障害及び病態の防止及び／又は治癒を目指す任意の治療を指す。かかる治療は、明らかに、歯科学、歯科矯正学、歯周病学、口腔内科学及び口腔外科学に関するが、また、一般に口腔の健康に関わり得る歯科学及び医薬実践の他の分野に関してもよい。
【０３１３】
なおも更に、大手術は直視下心臓手術又は肝移植術であってもよい。
【０３１４】
大手術は、麻酔又は呼吸補助を伴う任意の手術手技として定義される。大手術時の出血の場合、治療には、市販のＦＰ、ＦＦＰ又はクリオプレシピテートによる欠損している又は非機能性の凝固因子の補充が含まれる。しかしながら、上記製剤中のｔＰＡ及びプラスミノーゲンの存在が手術の傷害部位で線溶活性を媒介する結果、出血を止める又は防ぐために形成された凝血塊の融解が促進され得るため、この補充は十分でないこともある。従って、大幅に低下した線溶活性を示す本明細書に開示される主題のｔ−ＰＡ及びプラスミノーゲン欠乏製剤の投与は、市販の製剤と比べてより良好且つより効率的な治療選択肢であり、なぜなら、本明細書に開示される主題の製剤による凝固因子の補給に加えて、その抗線溶活性が（実施例によって実証されるとおり）、市販の製剤中に存在する線溶タンパク質によって引き起こされる凝血塊溶解が寄与する出血を減少させ又は防止し得るためである。
【０３１５】
詳細な実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、直視下心臓手術に適用可能である。一部の手術手技は、直視下心臓手術など、重度の出血を引き起こすことを予想し得る。そうした手術では、体外循環（心肺バイパス−ＣＰＢ）が用いられる。
【０３１６】
心血管手術（直視下心臓手術）は、心臓外科医によって実施される心臓又は大血管の手術である。高頻度でこれは、虚血性心疾患の合併症を治療し（例えば、冠動脈バイパス移植術）、先天性心疾患を修正し、又は心内膜炎、リウマチ性心疾患及びアテローム性動脈硬化症を含めた様々な原因による心臓弁膜症を治療するために行われる。これにはまた、心臓移植も含まれる。
【０３１７】
直視下心臓手術時、心臓は一時的に停止させる。直視下心臓手術を受けている患者は心肺バイパス下に置かれ、つまり、機械が患者のためにその血液及び酸素をポンプで送るということである。機械が正常な心肺と同じ機能を果たすことは決してなく、従って、多くの手術手技と同様に、この機械にかける時間は最小限に抑えられる。この人工的方法はバイパスを提供し、心肺機能に関する患者の必要性を一時的に解消する。
【０３１８】
これらの手術で起こる出血現象は、手術時に使用される、意図的に凝固欠乏を生じさせる抗凝固に起因する。加えて、血液が体外循環を通過することにより生じる血小板機能異常症が、出血傾向に寄与する。
【０３１９】
本明細書に開示される主題の方法は、ＣＰＢによる直視下心臓手術を受ける対象に特に適用可能であり得ることが理解されなければならない。本明細書に開示される主題の製剤、組成物及び方法は、そうした患者に以下のとおりの二重の有益な効果を付与し得る：
【０３２０】
１．直視下心臓手術時、血液は、人工心肺（ＣＰＢ機械）に加えられたチューブを通って流れることになり、一方でチューブは、血液からｔ−ＰＡ及び／又はプラスミノーゲンを枯渇させるためトラネキサム酸でコーティングされる（実験手順に詳述するとおり）。ポンプが血流をＣＰＢ機械から患者へと送ることになる。このチューブを通って流れる間、ｔ−ＰＡ及びプラスミノーゲンが枯渇した血液が患者の循環に返血される。
【０３２１】
このようにして返血された血液は線溶活性が乏しく、且つ抗線溶活性が高濃度化しており、従って出血傾向からの保護が提供される。
【０３２２】
２．上述の理由によって出血が起こる場合、次に患者は、本明細書に開示される主題のコンジュゲート及び方法によって調製される線溶タンパク質枯渇体液で出血を止めるため治療されてもよく、この体液は、その抗線溶品質に起因して、出血を停止させる効力がより高いと予想される。
【０３２３】
更なる実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、肝移植術に関連する出血の治療における実施に好適である。
【０３２４】
肝臓は、止血及び血栓症において中心的な役割を果たす。肝実質細胞は、多くの凝固因子の合成部位、生理学的凝固抑制因子、及び線溶系の必須成分である。肝臓はまた、活性化した凝固因子及び酵素阻害因子複合体を循環からクリアランスすることにより止血及び線溶も調節する。従って、肝疾患を有する患者に肝機能障害が起こると、複雑な止血の乱れが後に続き、それが出血につながり得る。
【０３２５】
肝移植の最初の段階、病的肝臓の除去（肝外段階）においては、大幅な止血変化が起こり得る。活性化した凝固因子が循環から除去されないため、その消費が血小板消費及び二次線溶亢進と共に増大し得る。更に、不完全なｔＰＡクリアランスの結果として一次線溶亢進もまた起こる。肝移植中の最も重大な止血変化は、ドナー肝の再灌流後に起こる。移植片に血小板が取り込まれることにより血小板減少症の増悪が生じ、内皮細胞アポトーシスの誘導によって移植片に損傷が引き起こされる。再灌流された移植片からの組織因子及びｔＰＡの放出が、更に線溶を引き起こす。従って、線溶亢進は、肝外相及び再灌流相における止血障害に大きく寄与すると考えられる。更に、移植片は、凝固を抑制し得るヘパリン様物質を放出する。加えて、この相では低体温症、代謝性アシドーシス、及び血液希釈などの他の要因が止血に悪影響を与える。肝移植は長時間にわたる手技であり、側副静脈の流通可能性を含む手術創表面が広範囲に及ぶ。手術技法の向上及び麻酔学的ケアにより、肝移植中の失血は著しく減少している。無制御の出血が起こる場合、濃縮赤血球、血小板、及び新鮮凍結血漿を輸血することができる。トラネキサム酸（リジン類似体）及びアプロチニン（セリンプロテアーゼ阻害薬）などの合成抗線溶剤の使用が、よく行われている方法である。
【０３２６】
従って、本明細書に開示される主題の製剤、本明細書に開示される主題により記載されるコンジュゲート、組成物、及び方法は、その抗線溶品質のおかげで、肝移植術によって引き起こされる線溶亢進状態に関連する出血の停止に特に適用可能であり得ることが理解されなければならない。
【０３２７】
本明細書に開示される主題の方法は、任意の臓器又は組織移植、例えば、肝臓、腎臓、肺、心臓、膵臓、皮膚、血管などが関わる任意の手術に適用可能であり得ることが理解されなければならない。
【０３２８】
なおも一部の更なる実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、線溶療法又は血栓溶解療法の結果として生じる出血であり得る後天性止血障害に適用可能であり得る。
【０３２９】
線溶療法／血栓溶解療法は、主として急性心筋梗塞（急性冠状動脈血栓症）を有する患者又は急性脳卒中（急性大脳動脈血栓症）を有する患者において投与される。線溶療法／血栓溶解療法の目標は、血栓の線溶タンパク質分解を加速させることによって実現する閉塞血管の血流の速やかな回復である。線溶療法では典型的には、プラスミノーゲン活性化が血栓に限定されないため、線溶状態となる。これらの効果は複合的であり、フィブリノーゲンレベルの低下、フィブリノーゲン分解産物の増加、及び凝固因子の減少が含まれる。線溶療法の合併症は出血である。出血性合併症は抗凝固薬療法よりも線溶療法でより頻度が高く、迅速な診断及び管理が必要である。過度の出血には２つの問題が寄与する。第一に、線溶効果は血栓症部位に限定されず、通常は全身性である。従って、治療に必要なカテーテルによって生じるか、又は脳、消化管、若しくは他の場所の病変内に生じるかのいずれかである血管外傷部位の出血を防止するために必要な任意の止血血栓もまた融解を受け易い。最も重度の合併症は頭蓋内出血であり、これは約１％の患者に起こり、高い死亡率及び生存者における重度の身体障害を伴う。最も多く見られる出血性合併症は、動脈及び静脈内カテーテルの留置など、侵襲的血管手技に関する。これらの部位における何らかの出血は高頻度にあり、局所圧迫又は他の単純な処置で管理できるならば、それが療法を中断する理由となってはならない。この問題は、静脈及び動脈穿刺の制限並びに局所的処置の早期導入によって最小限に抑えることができる。大量出血はまた、胃腸潰瘍又は泌尿生殖器病変など、既存の病変によっても生じ得る。
【０３３０】
線溶／血栓溶解後の出血性合併症の治療は、局所部位を対象とした処置を伴い、全身性凝固性低下状態の修正は、全身性プラスミン血症によって引き起こされる止血異常を修正するための補充療法を含む。多くの場合にフィブリノーゲン補充が必要であり、これはクリオプレシピテートの投与によって達成することができ、及び新鮮凍結血漿を使用して他の止血タンパク質を補充することができる。
【０３３１】
線溶療法／血栓溶解療法は抗凝固薬又は抗凝固剤の使用を伴うことに留意しなければならない。本明細書で使用されるとき、用語「抗凝固薬剤」は、血液の凝血を妨げる任意の薬剤を意味することが意図される。クマリン誘導体ビスヒドロキシクマリン（ジクマロール）及びワルファリン（クマジン（Coumadin））などの一部の抗凝固薬は、凝血塊形成物質であるプロトロンビン、及び他の凝血因子の合成を阻害する。抗凝固薬としては、限定はされないが、β２アドレナリン受容体拮抗薬、神経ペプチドＶ２拮抗薬、プロスタサイクリン類似体、トロンボキサンシンターゼ阻害薬、カルシウム作動薬、クマリン誘導体、エラスターゼ阻害薬、非ステロイド系抗炎症薬、トロンビン阻害薬、リポキシゲナーゼ阻害薬、第Ｖｉｌａ因子阻害薬、第Ｘａ因子阻害薬、ホスホジエステラーゼＩＩＩ阻害薬、ヘパリン、及びフィブリノーゲン糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ拮抗薬として作用する化合物を挙げることができる。
【０３３２】
クマリンは、ビタミンＫ拮抗薬である。このクラスの著名なメンバーはワルファリン（クマジン（Coumadin））である。これらの抗凝固薬は、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、肺塞栓症（ＰＥ）を有する患者の治療、並びに心房細動（ＡＦ）、及び機械的人工心臓弁を有する患者における塞栓の防止に用いられる。他の例は、アセノクマロール、フェンプロクモン、アトロメンチン、及びフェニンジオンである。
【０３３３】
ヘパリンは、通常はブタ腸から作られる生物学的物質である。これは、トロンビンによる凝血を阻止するアンチトロンビンＩＩＩを活性化することによって働く。より高度に処理された製剤である低分子量ヘパリンは、例えばエノキサパリン（クレキサン）のようにＡＰＴＴ凝固パラメータをモニタする必要がなく、且つ副作用が少ないため有用である。
【０３３４】
フォンダパリヌクスは、アンチトロンビンに結合するヘパリン中の５つの糖（五糖）で構成される合成糖であり、第Ｘａ因子の阻害薬である。これは低分子量ヘパリンよりも小さい分子である。別の例はイドラパリヌクスナトリウムであり、これはフォンダパリヌクスと同様の化学構造及び作用方法を有する。
【０３３５】
リバーロキサバン、アピキサバン及びエドキサバンなどの薬物は、第Ｘａ因子を直接阻害することによって働く（アンチトロンビン活性化を通じて働くヘパリン及びフォンダパリヌクスとは異なる）。
【０３３６】
更なる例としては、限定はされないが、Portola Pharmaceuticalsのベトリキサバン、Astellasのダレキサバン（YM150）、並びに最近ではTakedaのレタキサバン（TAK-442）及びPfizerのエリバキサバン（PD0348292）が挙げられる。
【０３３７】
別の種類の抗凝固薬は、直接トロンビン阻害薬である。このクラスの現在のメンバーとしては、限定はされないが、二価の薬物であるヒルジン、レピルジン、及びビバリルジン；及び一価の薬物であるアルガトロバン及びダビガトランが挙げられる。
【０３３８】
アンチトロンビンタンパク質それ自体が、ヒト血漿から精製し得るか又は組換え産生し得るタンパク質療法用抗凝固薬剤として使用される（例えば、Atryn、これは遺伝子修飾されたヤギの乳で産生されるものである）。
【０３３９】
上記に指摘したとおり、抗凝固薬投与、例えばヘパリンは、急性静脈血栓症、術後（特に整形外科）及び寝たきり患者の血栓症予防、及び開存性を維持するための静脈ラインのフラッシングに適応のある標準的な抗血栓療法である。しかしながら、その効力に起因して、ヘパリン及びＬＭＷＨは欠点を被る。単純な運動ストレス及び付随する物理的物体との接触の結果としての又は手術部位における制御されない出血が、主要な合併症である。加えて、ヘパリンで治療された患者の約５％（最高３０％までの範囲）、及び未分画ヘパリン（ＵＦＨ）の投与を受けている患者の約２％が免疫介在性血小板減少症（ＨＩＴ）を発症し、これは、出血（血小板数が減少する結果としての）又は血管内血小板凝集に起因した動脈及び静脈血栓症のいずれかによって複雑化し得る。本明細書に開示される主題の製剤及び方法は、これらの抗凝固剤のかかる望ましくない効果を防止し得る。
【０３４０】
より具体的には、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＧ）は、全身にわたって微小血管内で凝血塊形成が生じる凝血カスケードの広範な活性化によって特徴付けられる病的過程である。これは組織血流障害につながり、最終的には多臓器損傷につながり得る。加えて、凝固過程で凝固因子及び血小板が消費されるため、正常な凝血が妨げられ、様々な部位から重度の出血が起こり得る。
【０３４１】
なおも一部の更なる実施形態において、本明細書に開示される主題は、分娩又は妊娠に関連する任意の出血、例えば分娩後出血（ＰＰＨ）の治療、防止、予防、改善、抑制に適用可能な方法を提供する。分娩後出血（postpartum bleeding）又は分娩後出血（postpartum hemorrhage：ＰＰＨ）は、分娩後最初の２４時間以内における５００ｍｌ又は１，０００ｍｌより多い血液の喪失として定義されることが多い。徴候及び症状には、当初は、心拍数の上昇、起立時の立ちくらみ感、及び呼吸数の増加が含まれ得る。この病態は、出産後最長６週間まで起こり得る。最も多く見られる原因は、分娩後の子宮収縮の低下、全ての胎盤が娩出されなかったこと、子宮裂傷、又は凝血不良である。
【０３４２】
分娩後出血の原因は、一般に「４つのＴ」と称される、子宮弛緩、外傷、胎盤遺残、及び凝固障害である：
緊張（Tone）：子宮弛緩とは、子宮が収縮できないことであり、持続的出血につながり得る。遺残胎盤組織及び感染症が子宮弛緩の一因であり得る。子宮弛緩は、分娩後出血の最も多く見られる原因である。
外傷（Trauma）：子宮、子宮頸部、腟及び会陰を含む産道の傷害、これは出産が適切にモニタされたとしても起こり得る。これらの器官は全て、妊娠中に血管化が進むため、出血は相当量となる。
組織（Tissue）：胎盤又は胎児からの組織の遺残は出血につながり得る。
トロンビン（Thrombin）：凝固障害として知られる疾患を有するなど、凝血不全があると、出血性障害が起こる。
【０３４３】
一部の実施形態において、本明細書に開示される主題のｔＰＡ及び／又はプラスミノーゲン不含製剤及びそれを使用した任意の方法は、上記で考察したとおりのＰＰＨの治療及び防止に適用可能であり得ることが理解されなければならない。
【０３４４】
なおも一部の更なる実施形態において、本明細書に開示される主題の方法はまた、ＧＰＳの治療にも適用可能であり得る。グッドパスチャー症候群（ＧＰＳ）は、まれな自己免疫疾患であり、抗体が肺及び腎臓の基底膜を攻撃するため、肺からの出血及び腎不全につながる。前記患者の治療に通常使用される血液製剤などの体液から、本明細書に開示される主題のコンジュゲート及び方法を用いてｔＰＡ及び／又はプラスミノーゲンなどの線溶タンパク質を枯渇させると、治療が向上し得る。
【０３４５】
なおも一部の更なる実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、血管破裂によって引き起こされる出血の治療に適用可能であり得る。
【０３４６】
一部の具体的な実施形態において、変形性膝関節症（ＯＡ）の患者の治療に血漿又は多血小板血漿の関節内注射が用いられる。膝へのＰＲＰ注射は、有意な臨床的改善をもたらすことが示されている（Meheux CJ et al.）。他方で、コラーゲン及びアグレカンコアタンパク質などの種々の細胞外マトリックス成分を分解するウロキナーゼ型のプラスミノーゲン活性化因子（ＰＡ）の発現は、ＯＡの発症において特に重要と思われる（Pap G et al.）。膝骨関節炎の種々の段階での切除標本及び生検におけるストロメライシン及びウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子タンパク質の発現（Pap G. et al.）。従って、本明細書に開示される主題のコンジュゲート及び方法によって調製される線溶タンパク質枯渇体液の注射であれば、有害な効果が防止され、転帰が向上し得る。
【０３４７】
なおも更に、手術手技は、遺伝性止血障害の患者において重度の出血を引き起こすことが予想され得る。こうした患者は、術中又は術後に過剰に出血し得る。遺伝性止血障害の患者に関して、手術による外傷の程度に加え、手術部位の線溶活性の大きさが考慮されなければならないことが理解されるべきである。従って、口腔、鼻咽頭腔、並びに泌尿生殖器系、特に前立腺床など、線溶活性に富む部位の手術手技は、遺伝性止血障害患者では最後的に過剰出血となり得る。従って、一部の実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、かかる出血にも同様に具体的に適用可能であり得る。
【０３４８】
上述のとおり、本明細書に開示される主題の方法は、本明細書に開示される主題のコンジュゲート又は本明細書に開示される主題により開示される任意の組成物、装置、装置一式、キット又はシステムを使用して、本明細書で上記に考察される方法によって得られる線溶活性が低下した又は全くない体液又はその製剤の投与又は再導入を伴う。
【０３４９】
一部の詳細な実施形態において、投与は体外機器を使用して実施されてもよい。なおも一部の更なる実施形態において、線溶活性不含製剤は、本明細書で考察するとおりの任意の装置、装置一式、キット又はシステムを使用して対象に投与されてもよい。
【０３５０】
一部の実施形態において、上記で考察したとおりの線溶活性が低下した製剤は、同種異系対象から入手された体液から調製されてもよいことが理解されなければならない。なおも一部の更なる実施形態において、特に待機的手技（例えば、計画されている手術）の場合、対象は自己供給源の体液製剤によって治療されてもよい。
【０３５１】
「自己」供血は、本明細書で使用されるとき、血液の必要性を予想し且つ供血計画を作成できる場合に、被輸血者が自己使用のため供血し得る概念である。最も一般的には、この状況は待機的手術で起こる。輸血用の自己血は、術前の供血によって入手することができる。用語「同種血」は、本明細書で使用されるとき、同じ種の無関係の供血者から採取された血液に関する。より具体的には、一部の実施形態において、本明細書に開示される主題の血液又は血液製剤が少なくとも１人又はそれ以上のヒト対象から入手される場合、同種異系供給源とは、結果として得られる製剤が他の１人又は複数のヒト個体に用いられ得ることを意味する。
【０３５２】
上記に指摘したとおり、本明細書に開示される主題は、出血性、止血障害及びそれに関連する任意の病態の治療方法を提供する。本明細書で使用されるとき、「疾患」、「障害」、「病態」などは、それらが対象の健康に関するとき、同義的に使用され、かかる用語の各々及び全てに帰される意味を有する。
【０３５３】
本明細書において病的状態に言及するときの、同義的に使用される用語「関連する」及び「関係する」は、因果関係を共有する、偶然より高い頻度で共存する、又は少なくとも１つの疾患、障害、病態又は病的状態が第２の疾患、障害、病態又は病的状態を引き起こす場合、のうちの少なくとも１つである疾患、障害、病態、又は任意の病的状態を意味することが理解される。
【０３５４】
上述のとおり、本明細書に開示される主題は、上記に指定したとおりの障害の治療方法を提供する。用語「治療」は、本明細書で使用されるとき、疾患に関連する望ましくない症状を改善すること、かかる症状の発現をそれが起こる前に防止すること、疾患の進行を減速させること、症状の悪化を減速させること、寛解期の開始を促すこと、疾患の進行慢性期に引き起こされる不可逆的な損傷を減速させること、前記進行期の開始を遅延させること、重症度を低下させるか又は疾患を治癒すること、生存率を改善すること又はより速い回復、又は疾患が起こるのを防止すること、又は上記のうちの２つ以上の組み合わせに有効な、本明細書に開示される主題の組成物の治療量を投与することを指す。治療は、最初に止血病態が発症したときに行われてもよく、又は上記に挙げた治療効果を実現するため、例えば１日１回超、１日毎〜７日毎、７日毎〜１５日毎、１５日毎〜３０日毎、毎月〜２ヵ月毎、２ヵ月毎〜６ヵ月毎、又は更にそれ以上投与することによる連続投与であってもよい。
【０３５５】
用語「予防」は、生物学的又は医学的事象の発生リスク、具体的には、組織、系、動物又はヒトにおいて研究者、獣医師、医師又は他の臨床医が防止しようとする出血に関連する障害の発生又は再発リスクの防止又は低減を指し、及び用語「予防有効量」は、この目標を実現するであろう医薬組成物の量を意味することが意図される。従って、詳細な実施形態において、本明細書に開示される主題の方法は、出血性障害に関連する病態の予防、即ち防止において特に有効である。従って、前記組成物を投与される対象は、前記出血性障害に関連する症状が出る可能性が低く、その症状が過去に既に出たことのある対象においてそれが再発する可能性もまた低い。
【０３５６】
用語「改善」は、本明細書において参照されるとき、本明細書に開示される主題に係る組成物及び方法によってもたらされる症状の低下、及び対象の状態の向上を指し、ここで前記向上は、本明細書に記載される出血性障害に関連する病的過程の阻害、その大きさの大幅な低下、又は罹患対象の生理学的状態の向上という形で現れ得る。
【０３５７】
用語「阻害する」及びこの用語のあらゆる変化形は、病的症状の進行及び増悪又は病的過程進行であって、関連する病的過程症状又は過程の制限又は阻止を包含することが意図される。
【０３５８】
用語「消失させる」は、任意選択で、以下に記載される本明細書に開示される主題の方法に係る、病的症状及び場合によっては病的原因の実質的な根絶又は除去に関する。
【０３５９】
用語「遅延させる」、「発症を遅延させること」、「遅らせる」及びそのあらゆる変化形は、本明細書に開示される主題に係る治療の非存在下よりも後に出現するように、タンパク質ミスフォールディング又はタンパク質凝集に関連する障害、具体的には、出血性障害及びその症状の進行及び／又は増悪を減速させること、その進行、更なる増悪又は展開を減速させることを包含することが意図される。
【０３６０】
上述のとおり、治療又は防止には、疾患の発症の防止又は延期、症状の発症の防止又は延期及び／又は発症するであろう又は発症すると予想されるかかる症状の重症度の低下が含まれる。これには更に、既存の症状を改善すること、更なる症状を防止すること、及び症状の根底にある代謝的原因を改善又は防止することが含まれる。用語「抑制」、「緩和」、「低減」又は「減弱」は、本明細書において参照されるとき、ある過程、具体的には出血性障害の、約１％〜９９．９％のうちのいずれか１つ、具体的には、約１％〜約５％、約５％〜１０％、約１０％〜１５％、約１５％〜２０％、約２０％〜２５％、約２５％〜３０％、約３０％〜３５％、約３５％〜４０％、約４０％〜４５％、約４５％〜５０％、約５０％〜５５％、約５５％〜６０％、約６０％〜６５％、約６５％〜７０％、約７５％〜８０％、約８０％〜８５％  約８５％〜９０％、約９０％〜９５％、約９５％〜９９％、又は約９９％〜９９．９％の遅延、制限又は低減に関することが理解されなければならない。
【０３６１】
毎日、毎週又は毎月のスケジュールでの単回又は複数回投与が行われてもよく、用量レベル及びパターンは治療担当医師によって選択される。より具体的な実施形態は、典型的には２〜３用量／週の使用に関する。
【０３６２】
本明細書に開示される主題は、それを必要としている対象、又は患者の治療に関する。「患者」又は「必要としている対象」とは、ヒト、家畜及び非家畜哺乳類、例えばイヌ及びネコ対象、ウシ、サル、ウマ及びマウス対象、げっ歯類、家禽類、水産養殖魚類及び外来観賞魚類を含めた、上述の病原体に感染していてもよい任意の生物であって、それに対して本明細書に記載される防御的及び予防的製剤、１つ又は複数のキット及び方法が所望される生物を意味する。治療対象はまた、任意の爬虫類又は動物園動物であってもよいことが理解されなければならない。
【０３６３】
「哺乳類対象」とは、ヒト、ウマ、イヌ、及びネコ対象、より具体的にはヒトを含めた、提案される療法が所望される任意の哺乳類が意味される。具体的に非ヒト対象の場合、本明細書に開示される主題の方法は注射（静脈内（ＩＶ）、動脈内（ＩＡ）、筋肉内（ＩＭ）又は皮下（ＳＣ））、飲用水、飼料、噴霧、経口洗浄による投与及びそれを必要としている対象の消化管への直接投与を用いて実施されてもよいことに留意しなければならない。
【０３６４】
本明細書に開示される主題は、その更なる態様において、線溶活性の減少を示す、且つ本明細書に開示される主題の方法のいずれかによって調製された任意の体液製剤を提供することが理解されなければならない。従って、本明細書に開示される主題は、その一部の実施形態において、少なくとも１つの線溶タンパク質、具体的には、ｔＰＡ、及び／又はプラスミノーゲンのうちの少なくとも一方が欠如している又はその量が低下している任意の哺乳類体液製剤を包含する。一部の実施形態において、本明細書に開示される主題の方法によって製造される製剤は、ｔＰＡが欠如している。なおも一部の更なる実施形態において、本明細書に開示される主題の方法によって作製される製剤は、ｔＰＡ及びプラスミノーゲンが欠如している。上記に指摘したとおり、本明細書に開示される主題の方法によって作製されるかかる製剤は、本明細書に記載される手順、コンジュゲート、組成物、装置及びシステムのいずれかに供された任意の体液、具体的には、哺乳類の血液、血漿又は任意の血液製剤であってもよい。
【０３６５】
更に別の態様において、本明細書に開示される主題は、それを必要としている対象における出血性、止血障害及びそれに関連する任意の出血性又は病的状態の治療、防止、予防、改善、抑制方法における使用のための線溶活性が低下した治療有効量の少なくとも１つの血液及び／又は血液由来製剤を提供する。かかる体液製剤は、本明細書に開示される主題の方法によって調製されることが理解されなければならない。なおも一部の更なる実施形態において、かかる体液製剤は、本明細書に開示される主題のコンジュゲートのいずれか、その任意の組成物又は本明細書に定義するとおりの本明細書に開示される主題の複数のコンジュゲートを含む任意の装置、装置一式、キット若しくはシステムによって調製されてもよい。
【０３６６】
なおも一部の更なる実施形態において、本明細書に開示される主題によって使用される血液及び／又は血液由来製剤は、具体的には、本明細書で上記に開示されるとおりの本明細書に開示される主題により定義されるとおり、任意の止血障害、具体的には遺伝性又は後天性出血性障害の治療に適用可能であり得る。
【０３６７】
本明細書に開示される主題の他の態様との関連における、本明細書に開示される主題によって記載されるコンジュゲートのいずれか、その任意の組成物、及び本明細書に開示される主題によって記載される任意の装置、装置一式、キット又はシステムは、この態様にも同様に適用可能であり得ることが理解されなければならない。なおも更に、本明細書に開示される主題は、本明細書で上記に開示される病態又は障害のいずれかに対する本明細書に記載される治療法又は任意の他の方法のいずれかによる使用のための本明細書に開示される血液及び／又は血液由来製剤のいずれかを更に包含することが理解されなければならない。
【０３６８】
本明細書で使用される全ての科学技術用語は、特記しない限り、当該技術分野で一般的に使用される意味を有する。本明細書に提供される定義は、本明細書で頻繁に使用される特定の用語の理解を促進するものであり、本開示の範囲を限定するよう意図するものではない。
【０３６９】
本明細書において定義及び使用されるとおりの全ての定義は、辞書的定義、参照によって援用される文献中の定義、及び／又は定義される用語の通常の意味に優先すると理解されなければならない。
【０３７０】
用語「約」は、本明細書で使用されるとき、言及される値よりも最大１％、より具体的には５％、より具体的には１０％、より具体的には１５％、及びある場合には最大２０％上下に偏差していてもよい値を示し、この偏差範囲は整数値を含み、且つ該当する場合には非整数値も同様に含んで、連続する範囲を成す。本明細書で使用されるとき、用語「約」は±１０％を指す。
【０３７１】
不定冠詞「a」及び「an」は、ここで本明細書及び特許請求の範囲において使用されるとき、明確にそうでない旨が指示されない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解されなければならない。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「a」、「an」及び「the」は、内容上特に明確に指示されない限り複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。
【０３７２】
語句「及び／又は」は、ここで本明細書及び特許請求の範囲において使用されるとき、そのように接続された要素、即ちある場合には等位接続で存在し、他の場合には離接接続で存在する要素の「いずれか一方又は両方」を意味するものと理解されなければならない。「及び／又は」を伴い挙げられる複数の要素も同様に、即ち、そのように接続された要素の「１つ以上」と解釈されなければならない。任意選択で、「及び／又は」節によって具体的に特定される要素以外の他の要素が、具体的に特定されるそれらの要素に関係があるか否かに関わらず存在してもよい。従って、非限定的な例として、「Ａ及び／又はＢ」という表現は、「〜を含む（comprising）」などの非制限的文言と併せて使用されるとき、一実施形態ではＡのみ（任意選択でＢ以外の要素を含む）を指し；別の実施形態ではＢのみ（任意選択でＡ以外の要素を含む）を指し；更に別の実施形態ではＡ及びＢの両方（任意選択で他の要素を含む）を指すなどとなる。
【０３７３】
ここで本明細書及び特許請求の範囲において使用されるとき、「又は」は、上記に定義されるとおりの「及び／又は」と同じ意味を有するものと理解されなければならない。例えば、リスト中の項目を分けるとき、「又は」又は「及び／又は」は包含的である、即ち、数ある要素又は列挙されている要素のうちの少なくとも１つの包含だが、２つ以上もまた包含し、且つ任意選択で、追加的な列挙されていない項目を包含すると解釈されるものとする。「〜のうちの１つのみ」又は「〜のうちの正確に１つ」など、明確にそうでない旨が指示される用語のみが、又は特許請求の範囲で使用される場合には「〜からなる（consisting of）」が、数ある要素又は列挙されている要素のうちの正確に１つの要素の包含を指すことになる。一般に、用語「又は」は、本明細書で使用されるとき、「いずれか」、「〜のうちの１つ」、「〜のうちの１つのみ」、又は「〜のうちの正確に１つ」などの排他性の用語が前に付く場合には排他的選択肢（即ち、「いずれか一方であるが、両方ではない」）を指示するとのみ解釈されるものとする。「〜から本質的になる（consisting essentially of）」は、特許請求の範囲で使用されるとき、特許法の分野で使用されるとおりのその通常の意味を有するものとする。
【０３７４】
ここで本明細書及び特許請求の範囲において使用されるとき、１つ以上の要素のリストを参照した語句「少なくとも１つ」は、要素リスト中にある要素の任意の１つ以上から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、必ずしも要素リスト中に具体的に挙げられるあらゆる要素のうちの少なくとも１つを含むものでなく、要素リスト中の要素の任意の組み合わせを除外しないものと理解されなければならない。この定義はまた、語句「少なくとも１つ」が参照する要素リスト中に具体的に特定される要素以外の要素が、具体的に特定される要素と関係があるか否かに関わらず、任意選択で存在し得ることも許容する。従って、非限定的な例として、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」（又は、同等に「Ａ又はＢのうちの少なくとも１つ」、又は、同等に「Ａ及び／又はＢのうちの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、少なくとも１つの、任意選択で２つ以上を含むＡであって、Ｂは存在しないこと（及び任意選択でＢ以外の要素を含む）を指すことができ；別の実施形態では、少なくとも１つの、任意選択で２つ以上を含むＢであって、Ａは存在しないこと（及び任意選択でＡ以外の要素を含む）を指すことができ；更に別の実施形態では、少なくとも１つの、任意選択で２つ以上を含むＡ、及び少なくとも１つの、任意選択で２つ以上を含むＢ（及び任意選択で他の要素を含む）を指すことができるなどとなる。
【０３７５】
また、明確にそうでない旨が指示されない限り、２つ以上のステップ又は動作を含む本明細書に特許請求される任意の方法において、方法のステップ又は動作の順序は、必ずしも方法のステップ又は動作が記載されている順序に限定されないことも理解されなければならない。
【０３７６】
本明細書並びに以下の実施例及び特許請求の範囲全体を通じて、文脈上特に必須でない限り、「〜を含む（comprising）」、「〜を包含する（including）」、「〜を持つ（carrying）」、「〜を有する（having）」、「〜を含有する（containing）」、「〜が関わる（involving）」、「〜を保持する（holding）」、「〜で構成される（composed of）」などの移行句は全て、オープンエンド形式である、即ち、〜を含むが限定はされないことを意味するものと理解されるべきである。米国特許庁特許審査手順マニュアル（United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures）に示されているとおり、移行句「〜からなる（consisting of）」及び「〜から本質的になる（consisting essentially of）」のみが、それぞれ、クローズド又はセミクローズド移行句であるものとする。より具体的には、用語「〜を含む（comprises）」、「〜を含んでいる（comprising）」、「〜を包含する（includes）」、「〜を包含している（including）」、「〜を有している（having）」及びこれらの活用形は、「〜を包含しているが、限定はされない」を意味する。用語「〜からなる（consisting of）」は「〜を包含し、且つそれに限定される」を意味する。用語「〜から本質的になる（consisting essentially of）」は、組成物、方法又は構造が追加の成分、ステップ及び／又は部分を包含し得るが、但し、その追加の成分、ステップ及び／又は部分が、特許請求される組成物、方法又は構造の基本的な新規の特徴を実質的に変えない場合に限ることを意味する。
【０３７７】
この本明細書に開示される主題の様々な実施形態は、範囲形式で提供され得ることに留意しなければならない。範囲形式での記述は単に便宜上で、簡潔にするためであることが理解されなければならず、本明細書に開示される主題の範囲に関する柔軟性のない限定と解釈されてはならない。従って、範囲の記述は、具体的に開示される全ての可能な部分範囲並びに当該範囲内にある個々の数値を有するものと見なされなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記述は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等の具体的に開示される部分範囲、並びに当該範囲内にある個々の数、例えば、１、２、３、４、５、及び６を有すると見なされなければならない。これは範囲の広さに関わらず適用される。本明細書において数値範囲が指示される場合は常に、指示される範囲内にある任意の引用される数字（分数又は整数）を包含することが意図される。第１の指示数字と第２の指示数字と「の間の範囲にわたっている／範囲である」及び第１の指示数字「から」第２の指示数字「までの範囲にわたっている／範囲である」という語句は、本明細書では同義的に使用され、第１及び第２の指示数字並びにそれらの間にある全ての分数及び整数を包含することが意図される。
【０３７８】
本明細書で使用されるとき、用語「方法」は、限定はされないが、化学、薬理学、生物学、生化学及び医学分野の当業者に公知であるか、又はそうした当業者によって公知の様式、手段、技法及び手順から容易に開発されるかのいずれかである様式、手段、技法及び手順を含め、所与の課題を遂行するための様式、手段、技法及び手順を指す。
【０３７９】
明確にするため個別の実施形態との関連で記載されている本明細書に開示される主題の特定の特徴がまた、単一の実施形態に組み合わせて提供されてもよいことが理解される。逆に、簡略にするため単一の実施形態との関連で記載されている本明細書に開示される主題の様々な特徴がまた、個別に又は任意の好適な部分的組み合わせで又は本明細書に開示される主題の任意の他の記載される実施形態において好適なとおり提供されてもよい。様々な実施形態との関連で記載される特定の特徴は、それらの要素なしには実施形態が動作不能な場合を除いて、それらの実施形態の必須の特徴であると見なされてはならない。
【０３８０】
本明細書において上記に描出されるとおりの及び以下の特許請求の範囲の部分に特許請求されるとおりの本明細書に開示される主題の様々な実施形態及び態様は、以下の実施例に実験的裏付けが見出される。
【０３８１】
開示され及び記載される、この本明細書に開示される主題が、本明細書に開示される詳細な例、方法ステップ、及び組成に限定されず、従って方法ステップ及び組成は幾らか異なってもよいことが理解されるべきである。また、本明細書に開示される主題の範囲は添付の特許請求の範囲及びその均等物によってのみ限定されることになるため、本明細書で使用される用語は詳細な実施形態を説明する目的で用いられているに過ぎず、限定する意図はないことも理解されるべきである。
【０３８２】
以下の例は、本明細書に開示される主題の態様を実行する際に本発明者らが用いた技法を代表するものである。これらの技法は、本明細書に開示される主題の実施に好ましい実施形態を例示するものであるが、当業者であれば、本開示を踏まえて、本明細書に開示される主題の趣旨及び意図される範囲から逸脱することなく多数の変形例を作成し得ると認識するであろうことが理解されなければならない。
【実施例】
【０３８３】
実施例
実験手順
試薬：
セファロース4B200（Sigma Aldrich）
ヒト血漿  −  健常供血者の血漿はMDA Bloodから入手した
及び／又はヒトクリオプレシピテート  −  クリオプレシピテートはHadassah Blood Bankから入手した
【０３８４】
方法
ビーズ回収（方法＃１）
１．ビーズをＲＴにおいて３００×ｇで２分、１００ｍＭリジン  ＰＨ＝９．０及び１Ｍ  ＮａＣｌによって３回洗浄した。
２．ビーズを室温（ＲＴ）において３００×ｇで２分間、３Ｍ  ＮａＣｌによって３回洗浄した。
３．ビーズをＲＴにおいて３００×ｇで２分間、Ｈ２Ｏによって３回（×３）洗浄した。
４．ビーズをＲＴにおいて３００×ｇで２分間、０．５ＭのＮａＯＨによって３回洗浄した。３回目の洗浄でビーズをＮａＯＨと共に３０分間インキュベートする。
５．ビーズをＲＴにおいて３００×ｇで２分間、Ｈ２Ｏによって３回洗浄した。
６．ビーズをＲＴにおいて３００×ｇで２分間、０．５Ｍクエン酸ナトリウムによって３回洗浄した
７．ビーズをＲＴにおいて３００×ｇで２分間、ａ−  １０ｍＭクエン酸ナトリウム  ＰＨ＝６．８、ｂ−  １２０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｃ−  １２０ｍＭグリシンによって３回洗浄した。８．ビーズをＲＴ℃において３００×ｇで２分間、Ｈ２Ｏによって３回洗浄した。
９．ビーズを２０％エタノール＋１Ｍ  ＮａＣｌによって３回洗浄した＊。３回目の洗浄後、２０％エタノール＋１Ｍ  ＮａＣｌを加えると７０％スラリーが得られ、穏やかに反転させることにより再懸濁し、４℃で保存した。
【０３８５】
蠕動（peristalic）ポンプによるビーズ回収（方法＃２）
１−  フィルタを蠕動ポンプに接続した。
２−  １５０ｍｌの各溶液をフィルタに１５分間流した：
ａ−  １００ｍＭリジン  ＰＨ＝９．０及び１Ｍ  ＮａＣｌ
ｂ−  ３Ｍ  ＮａＣｌ
ｃ−  Ｈ２Ｏ
ｄ−  ０．５Ｍ  ＮａＯＨ（フィルタをＮａＯＨと３０分間インキュベートする）
ｅ−  Ｈ２Ｏ
ｆ−  ０．５Ｍクエン酸ナトリウム
ｇ−  １０ｍＭクエン酸ナトリウム  ＰＨ＝６．８
１２０ｍＭ  ＮａＣｌ
１２０ｍＭグリシン
ｈ−  Ｈ２Ｏ
ｉ−  ２０％エタノール＋１Ｍ  ＮａＣｌ
ＮａＯＨを除いて緩衝液は全てオートクレーブで滅菌した
【０３８６】
ＰＬＧ検出
実施例７のＰＬＧ検出は、キット：ab196262 PLG human simple step ELISA KITを使用して実施した。
【０３８７】
【表１】
2021515189.tif 000015
【０３８８】
試薬調製：
試薬は全て、使用前に室温にする。
使用する試薬の調製（３６ウェル用）：
１×洗浄緩衝液ＰＴ（３６ｍＬ）：３．６ｍＬの１０×洗浄緩衝液ＰＴ＋３２．４ｍＬの脱イオン水
抗体カクテル（１．８ｍＬ）：１８０μＬの１０×捕捉抗体＋１８０μＬの１０×検出抗体＋１４４０μＬの抗体希釈剤ＣＰＩ
【０３８９】
試料調製：
血漿を段階希釈で試料希釈剤ＮＳ中に１０５倍希釈した：
１：１００血漿＝１０μＬ血漿＋９９０μｌ試料希釈剤ＮＳ
１：１０５血漿＝１μＬ血漿＋９９９μｌ試料希釈剤ＮＳ
【０３９０】
標準調製：
１−  ストック標準溶液（１２０ｎｇ／ｍＬ）：ピペットで２００μＬの水を加えることによるＰＥＧタンパク質標準試料の再構成。１０分間室温に保ち、穏やかに混合する。
２−  ８本の１．５ｍＬチューブに標準１〜８の表示を付す。
チューブ１には、２２５μＬの試料希釈剤ＮＳを加えた。
チューブ２〜８には、１５０μＬの試料希釈剤ＮＳを加えた。
７５μＬのストック標準溶液をチューブ１に加えた。
１５０μＬの標準を次のチューブ（チューブ２〜７）に加えた。
標準＃８はタンパク質を含まず、ブランク対照である。
【０３９１】
アッセイ手順：
余分なマイクロプレートストリップをプレートフレームから取り外し、それらを乾燥剤パックの入ったフォイル袋に戻し、密閉し直し、４℃の保管場所に戻す。
１−  ５０μＬの全ての試料又は標準を適切なウェルに加えた。
２−  各ウェルに５０μＬの抗体カクテルを加えた。
３−  プレートを密閉し、４００ｒｐｍに設定したプレートシェーカー上において室温で１時間インキュベートした。
４−  各ウェルを３×３５０μＬ  １×洗浄緩衝液ＰＴによって洗浄した（ウェルからの吸引又はデカントによって洗浄し、次に各ウェルに３５０μＬ  １×洗浄緩衝液ＰＴを分注する）
５−  各ウェルに１００μＬのＴＭＢ基質を加え、４００ｒｐｍに設定したプレートシェーカー上において暗所下で１０分間インキュベートした。
６−  各ウェルに１００μＬの停止液を加えた。プレートをプレートシェーカー上において１分間振盪することにより混合した。
７−  ＯＤ吸光度を４５０ｎｍで読み取った。
【０３９２】
トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）
ＴＥＧ器具TEG 5000機（６０）（Haemonetics、Braintree, MA）（２０１９年１０月３１日まで有効）
使い捨てカップ及びピン［HAE-07-052］
【０３９３】
ＴＥＧ用試薬：
１．ＷＴ−ｔＰＡ  １ｍｇ／ｍｌ（Acytilyse  ５０ｍｇ）［Acytilyse  ５０ｍｇ、Boehringer Ingelheim；１バイアルの２，３３３ｍｇ粉末は５０ｍｇの活性アルテプラーゼを含有する（ＷＴ−ｔＰＡ）］
２．塩化カルシウム０．２Ｍ［Haemonetics、カタログ番号7003  ロット番号：150597BA］
３．新鮮凍結ヒトクエン酸塩加血漿
４．FVII Valin（１ｍｇ／ｍｌストック）DPD-V304-037 Bulk B
５．Level I対照［Haemonetics、カタログ番号8001、ロット番号：HMO3199  有効期限：２０１８年１０月］
６．Level II対照［Haemonetics、カタログ番号8002、ロット番号：HMO3178  有効期限：２０１８年１０月］
７．ＰＢＳ×１０、Biological Industries  ロット番号：1626505
８．TEG Hemostasis system希釈水  ロット番号：0110-1404
【０３９４】
アッセイは、「トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）によってモニタする凝血塊溶解（Clot lysis monitored by thromboelastography (TEG)）」プロトコルに従い実施した。ＴＥＧの使用前に、level I及びlevel II対照を使用することによりキャリブレーションを行い、各対照を両方のチャンネルで試験した（プロトコルに記載されるとおり）。ＷＴ−ｔＰＡ試薬は、ＰＢＳ×１  ５μｌ  Ｗｔ−ｔＰＡ（１６．６６μＭ）＋５９５μｌ  ＰＢＳ×１＝ワーキング濃度０．１８５μＭ（試料中の最終濃度は１．８５ｎＭである）に１：９０希釈した。
【０３９５】
外出血モデル（マウスにおける尾切断）
動物及び条件：
種／系統：マウス、ｃ５７ブラック
性別／匹数／年齢：雄、２４匹、８週齢
供給元：Harlan Laboratories、イスラエル
体重：体重は研究開始時に２０〜２５ｇであった。この群の最低及び最高体重は群平均体重の±１０％の範囲内であった。
馴化期間：７日。
識別情報：油性マーカー（２４時間以下の実験）及びケージ札。
動物のハンドリングは、国立衛生研究所（National Institute of Health：ＮＩＨ）及び実験動物管理評価認定協会（Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care：ＡＡＡＬＡＣ）に従い行った。動物は、ポリスルホン（ＰＳＵ）ケージ（４〜６匹のマウス／ケージ）、ステンレス鋼製格子天板付き、ペレット飼料及び透明のポリカーボネートボトルに入った飲用水用の設備を有するもので飼育した；寝わら：蒸気滅菌した清浄な稲の籾殻を使用した。寝わら材料はケージと共に少なくとも週２回交換した。
食餌：動物には市販のげっ歯類用の餌を不断給餌した。動物には、公営水道から得たオートクレーブ処理した飲用水を自由に摂取させた。
混入物：供給される飼料及び水の中に予想される混入物のいずれも、本研究の結果に影響を与える可能性はない。
環境条件：動物は、十分な新鮮空気の供給を伴う標準的な実験室条件下で飼育する。動物は、温湿度が制御された環境で飼った。温度範囲は２０〜２４℃であったとともに、ＲＨは３０〜７０％であり、１２時間明期及び１２時間暗期サイクルとする。
獣医学的ケア：本研究に適合させるため、動物は入荷時に検査した。これは２４時間実験であったため、研究開始後に獣医学的フォローアップは不要であった。
倫理委員会：本研究は、「イスラエル動物実験委員会（Israel Board for Animal Experiments）」による承認後に、「イスラエル動物福祉法（Israel Animal Welfare Act）」に準拠して実施した。
責任者：
１．施設管理者、動物の健康及び馴致のあらゆる側面を監督する。及び全ての動物プログラム要員の支援を受けた。
２．研究責任者が、全ての研究及び技術スタッフが十分に訓練を受けた者であることを確認にした。スタッフは要求される手順の実施経験がある。
【０３９６】
試験モデルの樹立
動物をその体重に従いケタミンとキシラジンとの混合物（それぞれ１００及び１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。動物を静脈内注射による種々の治療：２００μＬの生理食塩水、２００μＬの血漿及び２００μＬのプラスミノーゲン枯渇血漿で治療した。これに続き、動物を腹臥位に置いた。尾の遠位７ｍｍ部分をメスで切断した。この尾を直ちに、予め水浴で３７℃に温めておいた等張生理食塩水が入った５０ｍＬファルコンチューブに浸した。尾の向きは垂直とし、先端を体の水平面の約２ｃｍ下に位置させた。出血が止まった場合であっても各動物を６０分間モニタして、再出血があるか検出した。ストップウォッチを使用して出血時間を決定した。出血オン／オフサイクルが起こった場合、６０分の時間の中での出血時間の合計を記録した。施設内動物倫理委員会の規定に従い６０分後に実験を終了して、実験中の死亡を回避した。尾の切れ端を含めた体重を再び記録し、体重の減少から実験期間中の失血量を推定した。チューブの遠心後にペレット状の血液を推定した。実験の終了時、麻酔の過量投与によって動物を犠牲にした。
【０３９７】
選択したげっ歯類種は、よく使用される実験室系統のｃ５７ブラック健常若齢成体動物である。このマウスモデルは、過剰出血の治療に対するプラスミノーゲン枯渇血漿の有効性に関して初期情報を提供する第一歩である。
【０３９８】
３群にわたる合計２４匹のマウスを利用した。各群に８匹の動物が含まれた。対照群は生理食塩水のみの投与を受け、２番目の群は未処理血漿の投与を受け、３番目の群はプラスミノーゲン枯渇血漿（ＰＤＰ）の投与を受けた。動物を各群に無作為に分けた。各群から１匹の動物が血漿又は対照治療のいずれかを受け、これは単回２００μＬ用量として静脈内適用された。動物の総数は、動物が失った血液量に関して有意な情報を生み出す１群当たりの動物の数として、これが最小限であることを実証する先行研究に基づいている。治療は静脈内注射によって投与した。
【０３９９】
clear plasmaを使用したプラスミノーゲン枯渇クリオプレシピテート：
１−  ClearPlasmaアセンブリ：
・  フィルタに樹脂を充填する。
・  充填入口をロックする
・  流量調整弁をオフに設定する。
・  延長チューブ（流量調整弁付き）にクランプを取り付ける。
・  クランプを閉じる
・  フィルタに延長チューブを取り付ける
・  収集バッグにクランプを取り付ける
・  クランプを閉じる
・  収集バッグをフィルタと取り付ける。
１  ClearPlasmaに１８ｍｌ樹脂：ＴＸＡコンジュゲートＴＸＡ及び／又はシクロヘキサンカルボン酸（９０〜１００μｍ  superflow樹脂を充填する−コンジュゲート１。
２  ６０ｍｌの水で樹脂を洗浄する。
３  ６０ｍｌの生理食塩水で樹脂を洗浄する。
４  クリオプレシピテートバッグをClearPlasmaに接続する
５  １６ｍｌのクリオプレシピテートをフィルタに２２分間流す。
６  上清を新しいチューブに−プラスミノーゲンが枯渇したクリオプレシピテート。
【０４００】
２−  ＰＬＧ検出
・  E-80PMG−ヒトプラスミノーゲンＥＬＩＳＡキット、ロット番号10−（ICL, Inc.）
・  使用説明書はキット添付文書からのものである。（１）
【０４０１】
【表２】
2021515189.tif 000016
【０４０２】
試料の希釈：
試料の１／５，０００希釈液を段階希釈で調製する：
１：１００クリオプレシピテート（１：１００＝５μＬクリオプレシピテート（１：１００＋４９５μｌ  １×希釈液）。
１：５０００クリオプレシピテート（１：５０＝１０μＬの希釈クリオプレシピテート（１：１００）＋４９０μｌ  １×希釈液）。
各段階で十分に混合する。
【０４０３】
アッセイ手順：
１  使用前に全ての試薬を室温にする。
２  １００μＬの試料（デュプリケート）を予め指定しておいたウェルにピペッティングする。
３  マイクロタイタープレートを室温で６０分間インキュベートする。インキュベーション中、プレートはカバーをしたまま水平に保つ。
４  インキュベーション後、ウェルの内容物を吸引する。
５  ウェルに洗浄緩衝液を完全に充填し、プレートを反転させ、次に内容物を廃棄物容器に流し込む／振り落とす。これに続いて吸収紙上でウェルを強く叩くことにより残留緩衝液を取り除く。３回繰り返して合計４回の洗浄とする。
６  １００μＬの適切に希釈した酵素抗体コンジュゲートを各ウェルにピペッティングする。室温で６０分間インキュベートする。インキュベーション中、プレートは暗所下でカバーをしたまま水平に保つ。
７  ステップ５／６に記載されるとおりウェルを洗浄し、吸い取る。
８  １００μＬのＴＭＢ基質溶液を各ウェルにピペッティングする。
９  暗所下室温で正確に１０分間インキュベートする。
１０  １０分後、各ウェルに１００μＬの停止液を加える。
１１  各ウェルの内容物の吸光度（４５０ｎｍ）を決定する。
【０４０４】
実施例１
樹脂の合成
実施例１．１−コンジュゲート１の合成
【化１３】
2021515189.tif 000017
樹脂作製及びフィルタ充填−スケールアップ
このプロセスは、ＮＨＳ活性化セファロースFast Flow（GE Healthcare  カタログ番号17-0906-02）製品説明書に従い実施した。
【０４０５】
このプロセスは、製造者から適切な文書と共に受領したナイーブビーズの新しい清浄なバッチで開始した。
【０４０６】
このプロトコルに使用した樹脂容積は、８×５０ｍＬチューブ内にある１１２ｍＬの液抜き後樹脂（８×１４ｍＬ）であった（当初は７０％樹脂スラリー；チューブ１本当たり１４ｍＬの液抜き後樹脂）。このプロトコルでは３つの完全なClearPlasmaフィルタのバッチが生じる。調製、カップリング及びカップリング後洗浄を可能な限り清浄に行った。エンドトキシン洗浄及び充填段階は清浄環境で行った。
【０４０７】
使用した実験器具
０．２μｍフィルタ（例えばSteritop）、３×１Ｌボトル（１ｍＭ  ＨＣｌ；０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５；０．１Ｍ酢酸塩緩衝液、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）、２×０．５Ｌボトル（カップリング緩衝液；４Ｍ尿素）、４×１Ｌボトル（７０％ＥｔＯＨ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、パイロジェンフリー水中、２０％ＥｔＯＨ）、有機性廃棄物容器、オートクレーブ処理したへら、ビーカー、メスシリンダ、清浄なプラスチックピペット、チューブローラ／ローテータ、５０ｍＬカテーテル先端シリンジ、滅菌ClearPlasmaフィルタケーシング
【０４０８】
使用した試薬
重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）、塩化ナトリウム、トラネキサム酸、３７％ＨＣｌ、ＮａＯＨ、トリス−ＨＣｌ、酢酸、酢酸ナトリウム、エタノール、尿素、Ｄｄｗ（再蒸留水）、パイロジェンフリー水
【０４０９】
溶液
最終的な緩衝液及び溶液は全て、使用前に０．２μｍフィルタでろ過した。
【０４１０】
カップリング緩衝液−１００ｍＬ  ０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．３。１．６８ｇの量の重炭酸ナトリウムを秤量し、７０ｍＬ  ｄｄｗに溶解した。ｐＨを（１Ｍ  ＮａＯＨ又は１Ｍ  ＨＣｌ）で８．３に調整した。２．９２ｇの量の塩化ナトリウムを秤量し、重炭酸ナトリウム溶液に溶解した。容積をＤＤＷで１００ｍＬに調整した。
【０４１１】
リガンド溶液−８５ｍＬ  ２５ｍＭ（１当量）又は５０ｍＭ（２当量）又は１２５ｍＭ（５当量）又は２５０ｍＭ（１０当量）トラネキサム酸、カップリング緩衝液中、ｐＨは６〜９に調整。所望の量のトラネキサム酸を８５ｍＬ  ０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．３に溶解した。ｐＨを所望のレベルに調整した。この溶液を０．２μでろ過した
【０４１２】
樹脂一次洗浄液−１．５Ｌ  １ｍＭ  ＨＣｌ。５０ｍＬチューブの中に４４ｍＬの量のＤＤＷを加えた。１ｍＬ  ＨＣＬを加え（約３７％、１２Ｍ）、０．２５Ｍ  ＨＣｌとした。２Ｌボトルの中に１４００ｍＬ  ＤＤＷを加えた。６ｍＬ  ０．２５Ｍ  ＨＣｌを加えた。容積を１５００ｍＬに調整した。この溶液を０．２μでろ過した。
【０４１３】
樹脂ブロッキング液−２５０ｍＬ  ０．３Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５。１１．８２ｇの量のトリス−ＨＣｌを２００ｍＬ  ＤＤＷに溶解した。ｐＨを１Ｍ  ＮａＯＨ又は１Ｍ  ＨＣｌで８．５に調整した。容積をｄｄｗで２５０ｍＬに調整した。この溶液を０．２μでろ過した。
【０４１４】
塩基性洗浄液−１．５Ｌ  ０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５。２３．６４ｇの量のトリス−ＨＣｌを１３００ｍＬ  ＤＤＷに溶解した。ｐＨを１Ｍ  ＮａＯＨ又は１Ｍ  ＨＣｌで８．５に調整した。容積をｄｄｗで１５００ｍＬに調整した。この溶液を０．２μでろ過した。
【０４１５】
樹脂酸性洗浄液−１．５Ｌ  ０．１Ｍ酢酸塩緩衝液、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５。１２．３ｇの量の酢酸ナトリウムを１３００ｍＬ  ＤＤＷに溶解した。ｐＨを１Ｍ  ＮａＯＨ又は０．１Ｍ酢酸（１．１５ｍＬ氷酢酸をｄｄｗで合計２００ｍＬにしたもの）で４．５に調整した。４３．８３ｇの量の塩化ナトリウム及び溶解した。容積を１５００ｍＬに調整した。この溶液を０．２μでろ過した。
【０４１６】
エンドトキシン洗浄液（ＥＷ）１−６００ｍＬ  ７０％ＥｔＯＨ。４２０ｍＬ高品質エタノールを１８０ｍＬ  ＤＤＷと共に混合する。
【０４１７】
ＥＷ２−６００ｍＬ  ５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５。３．６３ｇの量のトリス−ＨＣｌを５００ｍＬ  ＤＤＷに溶解した。ｐＨを１Ｍ  ＨＣｌで７．５に調整した。容積をＤＤＷで６００ｍＬに調整した。
【０４１８】
ＥＷ３−パイロジェンフリー水中３００ｍＬ  ４Ｍ尿素。７２ｇの量の尿素を２００ｍＬ灌注用ＤＤＷに溶解した。容積を灌注用水で３００ｍＬに調整した。
【０４１９】
ＥＷ４−パイロジェンフリー水中６００ｍＬ  ５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５。３．６３ｇの量のトリス−ＨＣｌを５００ｍＬ灌注用ＤＤＷに溶解した。ｐＨを１Ｍ  ＨＣｌで７．５に調整した。３．５１ｇの量の塩化ナトリウムを緩衝液に溶解した。容積を灌注用水で６００ｍＬに調整した。
【０４２０】
エンドトキシンフリー保存液（ＥＦＳ）−パイロジェンフリー水中５５０ｍＬ  ２０％ＥｔＯＨ。１１０ｍＬの容積の高品質エタノールを４４０ｍＬ灌注用水と共に混合した。
【０４２１】
１Ｍ  ＨＣｌ−ｐＨ調整。４．１７ｍＬ  ３７％塩酸をＤＤＷで５０ｍＬに希釈した。
【０４２２】
１Ｍ  ＮａＯＨ−ｐＨ調整。２ｇ  ＮａＯＨを５０ｍＬ  ＤＤＷ中に希釈した。
【０４２３】
エンドトキシンフリー溶液のｐＨ調整には、灌注用水で作製した溶液を使用した。
【０４２４】
調製
−  樹脂を再懸濁し（ＮＨＳ活性化セファロースビーズ、１００％イソプロパノール中７０％スラリー）、８×１４ｍＬを８×５０ｍＬ  ＰＰチューブに移した。
−  チューブを４００ｇで３分間スピンダウンした。
−  保存溶媒を吸引した。
−  チューブに１ｍＭ  ＨＣｌを４５ｍＬまで充填し、樹脂を再懸濁した。
−  チューブを４００ｇで３分間スピンダウンし、吸引した。
−  洗浄を更に４回繰り返した（合計５回の洗浄）。
【０４２５】
カップリング
−  各チューブに７ｍＬの樹脂を加えた。
−  ｐＨを７．５〜８に調整した（必要に応じて）。
−  チューブを２〜４時間（室温）／一晩（４℃）穏やかに連続回転させた。
−  樹脂をスピンダウンし、吸引し、回転させながら２５ｍＬ（各チューブ）０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５で２〜４時間ブロックした。
【０４２６】
洗浄
樹脂をスピンダウンし、吸引した。
３０ｍＬ  ０．１Ｍトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８〜９を加えて再懸濁し、スピンダウンし、吸引した。
３０ｍＬ  ０．１Ｍ酢酸塩緩衝液、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４〜５を加えて再懸濁し、スピンダウンし、吸引した。
これらの洗浄（トリスから酢酸塩まで）を５回繰り返した。
このプロセスが：
・  更なる時間続くとき−洗浄ステップ（添加、スピンダウン、吸引）を３０ｍＬ  ２０％ＥｔＯＨで２回実施し、５０％スラリーとして２０％ＥｔＯＨ中に保存した。
・  直接エンドトキシン洗浄へと続くとき−３０ｍＬ  ７０％ＥｔＯＨ（ＥＷ１）を加えた。
【０４２７】
エンドトキシン洗浄
樹脂が２０％ＥｔＯＨ中に保存されている場合、それをスピンダウンし、吸引し、及び３０ｍＬ  ７０％ＥｔＯＨ（ＥＷ１）を加えた。
樹脂を７０％ＥｔＯＨ中で３０分間（回転させながら）インキュベートした。
樹脂を洗浄し、３０ｍＬ  ５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５（ＥＷ２）を加えた。
樹脂を洗浄し、３０ｍＬ  ５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５を加え、この樹脂を３０分間（回転させながら）インキュベートした。
樹脂を洗浄し、１５ｍＬ  ４Ｍ尿素（ＥＷ３）を加えた。
樹脂を洗浄し、１５ｍＬ  ４Ｍ尿素を加え、この樹脂を３０分間（回転させながら）インキュベートした。
樹脂を洗浄し、３０ｍＬ  ５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（ＥＷ４）を加えた。
樹脂を洗浄し、３０ｍＬ  ５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５を加え、この樹脂を３０分間（回転させながら）インキュベートした。
樹脂を洗浄し、３０ｍＬ  ２０％ＥｔＯＨ（ＥＦＳ）を加えた。
洗浄を繰り返した。
樹脂は充填時まで７０％スラリーとして２０％ＥｔＯＨ（ＥＦＳ）中に保存した。
【０４２８】
充填
チューブからの樹脂を全て１つの容器にプールした。
ビーズが沈降している場合、容器を穏やかに回転させて均一な懸濁液にした。
−  滅菌５０ｍＬカテーテル先端シリンジに懸濁液を充填した。
−  ケーシングに懸濁液を穏やかに充填した。継ぎ足しが必要な場合、上記と同じ方法を用いた。
−  フィルタが満杯に近付いたところで、出口ルアーロックカバーを開けて、過剰な保存溶液容積をフィルタから流出させた。樹脂区画が充満した後、出口を閉じた。
充填した製品は製品仕様に従い保存した。
【０４２９】
実施例１．２−コンジュゲート２の合成
【化１４】
2021515189.tif 000018
コンジュゲート２の調製のための反応を図１に概略的に示す。
【０４３０】
より具体的には、以下の手順を用いた：
１．４．２ｍｌの量のセファロース4B200（Sigma Aldrich）をシェーカーを使用してガラス漏斗フィルタに通してアセトンで洗浄した。セファロースは１ｍｌの反応性官能基を含有し、従って４．２ｍｌは４．２ｍｍｏｌを含有するものと見なした。
２．無水コハク酸（０．４２、４ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（３ｍｌ）中のビーズのスラリーに加え、続いてピリジン（０．３３９ｍｌ）を加えた。この混合物を一晩振盪した（shacked）。
３．ビーズをろ過し（filets）、アセトンで洗浄した。
４．ビーズをＣＨ２Ｃｌ２に懸濁し、Ｎ−ヒドロキシルコハク酸アミド（N-Hydroxylsuccinamide）ＮＨＳ（０．４８３ｇ）を加えた後、続いてＥＤＣ（０．８ｇ）を加えた。この混合物を一晩振盪し、次にろ過した。
５．この生成物をＤＭＦ（３ｍｌ）に懸濁し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．５４ｇ）及び４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸（０．６６ｇ）を加えた。この混合物を一晩振盪した。この生成物をアセトンで洗浄し、更なる試験に回した。
【０４３１】
実施例１．３−コンジュゲート３の合成（「ＴＸＡ−グリオキサールアガロース樹脂」）
【化１５】
2021515189.tif 000019
手順
１．グリオキサールアガロースビーズをガラスフィルタを使用して蒸留水で洗浄する。
２．リガンド溶液を調製し、活性及び／又は２８０ｎｍでの吸光度を試験する。
３．１ｍｌグリオキサールアガロースビーズをｐＨ１０．０５の緩衝液中の９ｍｌ  ＴＸＡ溶液に加える。
４．穏やかに撹拌し、頻繁にｐＨを確認する。懸濁液のアリコートを抜き取り、活性又は２８０ｎｍでの吸光度に関してアッセイする。
５．穏やかな撹拌を数時間続けるか、又は活性測定値が一定のままとなるまで続ける（これは完全な固定化を示す）。マグネチックスターラは避ける。注記：固定化時間が長くなるほど、強力な生体分子／ビーズ反応及び安定性に有利に働くが、好ましくない歪みが生じることもある。
６．活性／吸光度が一定になったところで、懸濁液に１０ｍｇ固体水素化ホウ素ナトリウムを加え、蓋のない容器内において室温で３０分間撹拌して水素を逃がす。このステップを火気の近くで実施しないこと。可能であれば換気扇の近くで行う。
７．真空フィルタを使用して懸濁液を２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で洗浄することにより、過剰なホウ化水素を取り除く。続いて、懸濁液を蒸留水で十分に洗浄し、ろ過乾固する。
８．リガンドがカップリングしたグリオキサールアガロースビーズは、保存剤を含有する水中２０％エタノールに４〜１０℃で保存しなければならない。
【０４３２】
実施例１．４−コンジュゲート４の合成（「ＴＸＡ−ＥＣＨアガロース樹脂」）
【化１６】
2021515189.tif 000020
トラネキサム酸（ＴＸＡ）とＥＣＨ−アガロースビーズ（G-Biosciences、#786-1223）とのコンジュゲーション
１．リガンド溶液を調製する−ｄｄｗ中５０ｍＭ  ＴＸＡ、ｐＨをＨＣｌで５．２に調整。
２．２ｍＬ樹脂を１０ｍＬ  ｄｄｗで洗浄する。遠心３分間×５００ｇによってスピンダウンする。
３．樹脂を１６０ｍＬ  ０．５Ｍ  ＮａＣｌで洗浄する。
４．液抜き後の樹脂に４ｍＬリガンド溶液を加える。
５．最終反応物において１００ｍＭが得られるようにＥＤＣ（カップリング剤）を加える。
６．１時間回転させて、ｐＨをＨＣｌで５．０に調整する。回転を一晩続ける。
７．樹脂をスピンダウンし、デカントする。
８．樹脂を３サイクルの交互の溶液で洗浄する：
ａ．０．１Ｍ酢酸塩、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０
ｂ．０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０
９．ｄｄｗで２回洗浄する。
１０．１回洗浄し、次に２０％ＥｔＯＨに２〜８℃で保存する。
【０４３３】
実施例１．５−コンジュゲート５の合成
【化１７】
2021515189.tif 000021
反応物−シアノ水素化ホウ素ナトリウム
【化１８】
2021515189.tif 000022
第一段階ではシッフ塩基（Schieff base）が調製され、次にこれがシアノ水素化ホウ素ナトリウム（sodium cyanoborhydride）（ＮａＣＮＢＨ３）又は好ましくは水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）で還元されると、最終的な材料が得られる。シッフ塩基（Schieff base）中の二重結合は、１５９０〜１６９０ｃｍ−１の赤外吸光度が特徴的である。アルデヒド中のカルボニルは、２７００〜２９００ｃｍ−１の赤外吸光度が特徴的なその出発物質である。最終的な材料には、トラネキサム酸（tannzamic acid）もまた必要になる。
【０４３４】
より具体的には、以下の手順を用いた：
１．グリオキサールアガロースビーズをガラスフィルタを使用して蒸留水で洗浄した。
２．リガンド溶液を調製し、活性及び／又は２８０ｎｍでの吸光度を試験した。
３．ｐＨ１０．０５の緩衝液中の９ｍｌリガンド溶液に１ｍｌの量のグリオキサールアガロースビーズを加えた。リガンドが室温で不安定な場合、以下のステップは低温室で実行した。
４．穏やかな撹拌を実施し、頻繁にｐＨを確認した。懸濁液のアリコートを抜き取り、活性又は２８０ｎｍでの吸光度に関するアッセイを実施した。
５．穏やかな撹拌を数時間維持するか、又は活性測定値が一定のままとなるまで維持した（これは完全な固定化を示す）。マグネチックスターラは避けた。
注記：固定化時間が長くなるほど、強力な生体分子／ビーズ反応及び安定性に有利に働くが、好ましくない歪みが生じることもある。
６．活性／吸光度が一定になったところで、懸濁液に１０ｍｇ固体水素化ホウ素ナトリウムを加え、蓋のない容器内において室温で３０分間撹拌して水素を逃がした。このステップが火気の近くで実施されることはなく、むしろ可能な限り換気扇の近くで行った。
７．真空フィルタを使用して懸濁液を２５ｍＭリン酸緩衝液  ｐＨ７．０で洗浄することにより、過剰なホウ化水素を取り除いた。続いて、懸濁液を蒸留水で十分に洗浄し、ろ過乾固した。
８．リガンドがカップリングしたグリオキサールアガロースビーズは、保存剤を含有する水中２０％エタノールに４〜１０℃で保存した。
【０４３５】
実施例１．６−コンジュゲート６  ＴＸＡ−セファロース樹脂の合成
【化１９】
2021515189.tif 000023
１．４．２ｍｌの量のセファロースビーズをシェーカーを使用してガラス漏斗フィルタに通してアセトンで洗浄した。Ｉ
２．無水コハク酸（０．４２、４ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（３ｍｌ）中のビーズのスラリーに加え、続いてピリジン（０．３３９ｍｌ）を加えた。この混合物を一晩振盪した（shacked）。
３．ビーズをろ過し（filets）、アセトンで洗浄した。
４．ビーズをＣＨ２Ｃｌ２に懸濁し、Ｎ−ヒドロキシルコハク酸アミド（N-Hydroxylsuccinamide）ＮＨＳ（０．４８３ｇ）を加えた後、続いてＥＤＣ（０．８ｇ）を加えた。この混合物を一晩振盪し、次にろ過した。
５．この生成物をＤＭＦ（３ｍｌ）に懸濁し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．５４ｇ）及び４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸（０．６６ｇ）を加えた。この混合物を一晩振盪した。
最終的なビーズをアセトンで２回洗浄し、更にエタノール７０％で洗浄し、遠心し、２０％エタノールに懸濁した。
【０４３６】
実施例２
新規に合成されたＴＸＡコンジュゲートＥＣＨ−アガロースビーズ、Sterogene Superflow及びグリオキサールアガロースビーズ−コンジュゲート１の活性の判定
材料：
・血漿：MDA Blood Bankから健常供血者の血漿を入手した。使用した血漿はＲｈ陰性であるとともに、種々のウイルス抗原（例えば、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＴＬＶ、ＨＩＶ）に対しても陰性である。
・ビーズ：
１．実施例１（コンジュゲート１の調製）に記載される手順により合成されたＴＸＡコンジュゲートグリオキサールアガロースビーズ
２．ＴＸＡコンジュゲートＥＣＨ−アガロースビーズ（新規ビーズ）、Daren laboratories
３．Sterogene Superflow sterogeneビーズ）
・器具：
シェーカー：KRS-3016（MRC）
ＥＬＩＳＡリーダー：800TS（BioTek）
実験は非無菌環境で行った。
・溶液調製：
結合緩衝液（３０ｍｌ）：
クエン酸ナトリウム（１０ｍＭ）−０．３ｍｌ
ＮａＣｌ（１２０ｍＭ；調製日：２０１７年９月２５日）−１．２ｍｌ
ＤＤＷ＝２８．５ｍｌ
【０４３７】
プラスミノーゲン枯渇
１．ビーズは既に２０％エタノール及び７０％樹脂中に保存されていた。１ｍｌの量のビーズを１５ｍｌチューブに移した。
２．チューブに水を充填し、及び
３．チューブを室温において３００×ｇで２分間遠心した。
４．上清を取り除いた。
５．これらのステップを３回繰り返した。
６．ビーズを結合緩衝液に懸濁する＊：
ａ−１０ｍＭクエン酸ナトリウム  ＰＨ＝７．１６
ｂ−１２０ｍＭ塩化ナトリウム
７．遠心ステップを第３節にあるとおり実施した。
８．上清を取り除いた。
９．これらのステップを２回繰り返した
１０．ビーズに１ｍｌの量の７４Ｅ血漿を加えた。
１１．この混合物を穏やかに反転させることにより十分に混合し、室温で２時間インキュベートした（プレートシェーカー−８０ｒｐｍで振盪した場合）。
１２．遠心ステップを第３節にあるとおり実施し、血漿枯渇プラスミノーゲンが入った新しいチューブに上清を移した。
１３．ＥＬＩＳＡアッセイを用いて血漿枯渇を試験した。
１４．残りの血漿（未枯渇及び枯渇済みを含む）を−２０℃でインキュベートした。
【０４３８】
ＰＬＧ検出
キットAb108893ヒトプラスミノーゲンＥＬＩＳＡキット（abacam（登録商標））を製造者の指示に従い使用した。
【０４３９】
プレートは表３にある以下のとおり調製した（１：２０，０００血漿希釈）：
【０４４０】
【表３】
2021515189.tif 000024
【０４４１】
試薬調製
試薬は全て、使用前に室温（１８〜２５℃）に平衡化させた。使用直前に新鮮な試薬を調製した。
１−  １×Diluent M：１．５ｍｌの１０×Diluent M濃縮物についての１５ｍｌの試薬グレード水による１：１０希釈液。穏やかに且つ十分に混合する。
２−  １×洗浄緩衝液：２ｍｌの２０×洗浄緩衝液、濃縮物についての３８ｍｌの試薬グレード水による１：２０希釈液。穏やかに且つ十分に混合する。
３−  １×ビオチン化プラスミノーゲン検出抗体：最初に５０×ビオチン化プラスミノーゲン抗体バイアルをスピンして底の内容物を収集する。１２μｌの５０×ストックビオチン化プラスミノーゲン抗体を５８８μｌの１×Diluent Mに加える。穏やかに且つ十分に混合する。
４−  １×ＳＰコンジュゲート：１００×ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲート（ＳＰコンジュゲート）を短時間スピンダウンし、６μｌのコンジュゲートを５９４μｌの１×Diluent Mで１：１００希釈する。
【０４４２】
標準調製：
１−  標準物質を室温に平衡化させた。
２−  ７本のチューブに＃２〜８の表示を付した
３−  チューブ＃２〜８に１２０μＬの１×Diluent Mを加える。
４−  標準＃２を調製し、１２０μＬの標準１番をチューブ＃２に加え、穏やかに混合する。
５−  標準＃３を調製し、１２０μＬの標準２番をチューブ＃３に加え、穏やかに混合する。
６−  以下の表を指針として用いて、後続の段階希釈液を調製する。
７−  １×Diluent Mはゼロ標準、０ｎｇ／ｍＬ（チューブ＃８）として働く。
【０４４３】
試料調製
試料は段階希釈で１×Diluent Mにより１：２０，０００希釈する：
ａ−  １：１００血漿＝５μＬの血漿＋４９５μｌ  １×Diluent M
ｂ−  １：２０，０００血漿＝５μＬの希釈血漿＋９９５μＬ  １×Diluent M
【０４４４】
以下の手順を用いた：
１−  全ての試薬、ワーキング標準物質及び試料は、指示どおり調製した。アッセイは室温（１８〜２５℃）で実施する。
２−  余分なマイクロプレートストリップはプレートフレームから取り外し、中に乾燥剤が入ったフォイル袋に直ちに戻した。水蒸気への曝露を最小限に抑えるためポーチをしっかりと密閉し直し、減圧デシケータに保存した。
３−  各ウェルに５０μＬの量のプラスミノーゲン標準物質又は試料を加えた。ウェルをシールテープで覆い、１時間インキュベートした。タイマーは最後の試料を加えた後に開始した。
４−  ２００μＬの１×洗浄緩衝液による手作業の洗浄ステップを５回実施した。毎回プレートを反転させ、内容物をデカントした（吸水性のペーパータオル上で１４回軽く叩くことにより液体を完全に取り除いた）
５−  各ウェルに５０μＬの量の１×ビオチン化プラスミノーゲン抗体を加え、１時間インキュベートした。
６−  マイクロプレートを上記に記載されるとおり洗浄した。
７−  各ウェルに５０μＬの量の１×ＳＰコンジュゲートを加え、３０分間インキュベートした。マイクロプレートリーダーをオンにし、予めプログラムをセットアップした。
８−  マイクロプレートを上記に記載されるとおり洗浄した。
９−  各ウェルにつき５０μＬの量の発色基質を加え、約１２分間又は最適な青色濃度が生じるまでインキュベートした（プレートを穏やかに叩いて十分な混合を確実にし、及びピペット先端でウェル内の気泡をつぶす）
１０−  各ウェルに５０μＬの量の停止液を加えた。色が青色から黄色に変化した。
１１−  直ちにマイクロプレートリーダーにおいて４５０ｎｍの波長で吸光度を読み取った。以下の結果が観察された。
【０４４５】
・  ＰＬＧ濃度：
検量線結果＊を表４にまとめ、及び図３に示す。
【０４４６】
【表４】
2021515189.tif 000025
【０４４７】
表５に示す式が得られた。それに応じて、試料の濃度及び枯渇パーセンテージを計算した。表６に示す。
【０４４８】
【表５】
2021515189.tif 000026
【０４４９】
【表６】
2021515189.tif 000027
【０４５０】
未枯渇血漿中のＰＬＧ濃度はヒト血漿中のプラスミノーゲン濃度の正常範囲（１５３．１〜１７４．９μｇ／ｍｌ、キット取扱説明書による）と比べて僅かに高いように見える。プラスミノーゲンレベルはTXA Superflow回復後ビーズとのインキュベーション後に９２％超が枯渇し、YA2-2ビーズとのインキュベーション後に９０％超、及びＴＸＡコンジュゲートＥＣＨアガロースビーズとのインキュベーション後に３８％の枯渇であった。回復後はTXA Superflowビーズ及びY2-2ビーズ（ＴＸＡコンジュゲートグリオキサールアガロースビーズ）は血漿からのプラスミノーゲン除去に高い効率を示したが、ＴＸＡコンジュゲートＥＣＨアガロースビーズは低い効率を示した。
【０４５１】
実施例３
新規コンジュゲートＧＥビーズ、Sterogene Superflowビーズの活性の判定
材料：
・  血漿：MDA Blood Bankから健常供血者の血漿を入手した（付録１を参照）
・  ビーズ：
１−  コンジュゲート１（「ＴＸＡコンジュゲートＧＥビーズ」）−ｐＨ６．５、７．５、８．５。合成プロトコルについては実施例１を参照のこと。
２−  「Sterogene回復後TXA Superflowビーズ」［コンジュゲート−６］］
・  方法＃１：ビーズをブタ実験に使用し、回復させた。器具：
１−  シェーカー：KRS-3016（MRC）
２−  ＥＬＩＳＡリーダー：800TS（BioTek）。
・  実験は非無菌環境で行った。
【０４５２】
プラスミノーゲン枯渇
１．ａ．Sterogene TXA Superflowビーズは既に２０％エタノール及び７０％樹脂中にあった。１ｍｌの量のビーズを１５ｍｌチューブに移した。
ｂ．既に２０％エタノール及び７０％樹脂中にあるＴＸＡコンジュゲートＧＥビーズの各反応物１ｍｌ
２．チューブに水を充填した。
３．ＲＴにおいて３００×ｇで２分間遠心する
４．上清を取り除いた。
５．３回繰り返す
６．ビーズを結合緩衝液に懸濁した＊：
ａ−  １０ｍＭクエン酸ナトリウム  ＰＨ＝７．１６
ｂ−  １２０ｍＭ塩化ナトリウム
７．第３節のとおり遠心する
８．上清を取り除いた。
９．２回繰り返す
１０．ビーズに１ｍｌの２７Ｋ血漿を加えた。
１１．チューブを穏やかに反転させることにより十分に混合し、室温で２時間インキュベートした（プレートシェーカー−８０ｒｐｍにおいて振盪するため）。
１２．第３節のとおり遠心し、上清を新しいチューブに移した−血漿枯渇プラスミノーゲン
１３．ＥＬＩＳＡアッセイを用いて血漿枯渇を試験した。
１４．残りの血漿（未枯渇及び枯渇済み）は−２０℃でインキュベートした。
【０４５３】
ＰＬＧ検出
キットAb108893ヒトプラスミノーゲンＥＬＩＳＡキット（abacam（登録商標））を製造者の指示に従い使用した。
【０４５４】
プレートは以下のとおり調製した（１：２０，０００血漿希釈）。
【０４５５】
【表７】
2021515189.tif 000028
【０４５６】
試薬調製：
試薬は全て、使用前に室温（１８〜２５℃）に平衡化させる。使用直前に新鮮な試薬。
１×Diluent M：２ｍｌの１０×Diluent M濃縮物を１８ｍｌの試薬グレード水と１：１０希釈した。穏やかに且つ十分に混合する。
１×洗浄緩衝液：４ｍｌの２０×洗浄緩衝液濃縮物を７６ｍｌの試薬グレード水と１：２０希釈した。穏やかに且つ十分に混合する。
１×ビオチン化プラスミノーゲン検出抗体：５０×ビオチン化プラスミノーゲン抗体バイアルをスピンして底の内容物を収集した。１８μｌの５０×ストックビオチン化プラスミノーゲン抗体を８８２μｌの１×Diluent Mに加える。穏やかに且つ十分に混合する。
１×ＳＰコンジュゲート：１００×ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲート（ＳＰコンジュゲート）を短時間スピンダウンし、９μｌのコンジュゲートを８９１μｌの１×Diluent Mと１：１００希釈した。
実施例２に詳述するとおり標準物質を調製した。検量線結果を表４にまとめ、及び図２に示す。表５に示す式が得られた。
【０４５７】
試料調製：
試料を１×Diluent Mと段階希釈で１：２０，０００希釈した：
ａ−  １：１００血漿＝５μＬの血漿＋４９５μｌ  １×Diluent M
ｂ−  １：２０，０００血漿＝５μＬの希釈血漿＋９９５μＬ  １×Diluent M
【０４５８】
アッセイ手順：
１２−  全ての試薬、ワーキング標準物質及び試料は、指示どおり調製した。試薬は使用前に室温に平衡化した。アッセイは室温（１８〜２５℃）で実施した。
１３−  余分なマイクロプレートストリップはプレートフレームから取り外し、中に乾燥剤が入ったフォイル袋に直ちに戻した。水蒸気への曝露を最小限に抑えるためポーチをしっかりと密閉し直し、減圧デシケータに保存した。
１４−  各ウェルにつき５０μＬのプラスミノーゲン標準物質又は試料を加えた。ウェルをシールテープで覆い、１時間インキュベートした。タイマーは最後の試料を加えた後に開始した。
１５−  ２００μＬの１×洗浄緩衝液による手作業での５回の洗浄。毎回プレートを反転させ、内容物をデカントした（プレートを吸水性のペーパータオル上で４回軽く叩く（taping）ことにより液体を完全に取り除く）。
１６−  各ウェルに５０μＬの１×ビオチン化プラスミノーゲン抗体を加え、１時間インキュベートした。
１７−  マイクロプレートを上記に記載されるとおり洗浄。
１８−  各ウェルに５０μＬの１×ＳＰコンジュゲートを加え、３０分間インキュベートした。マイクロプレートリーダーをオンにし、予めプログラムをセットアップした。
１９−  マイクロプレートを上記に記載されるとおり洗浄。
２０−  各ウェルにつき５０μＬの発色基質を加え、約１２分間又は最適な青色濃度が生じるまでインキュベートした（プレートを穏やかに叩いて十分な混合を確実にし、及びピペット先端でウェル内の気泡をつぶす）。
２１−  各ウェルに５０μＬの停止液を加えた。色が青色から黄色に変化した。
２２−  直ちにマイクロプレートリーダーにおいて４５０ｎｍの波長で吸光度を読み取った。
【０４５９】
・  ＰＬＧ濃度：
表５に詳述される式により試料の濃度及び枯渇パーセンテージを計算した。表８に示す。
【０４６０】
【表８】
2021515189.tif 000029
【０４６１】
未枯渇血漿中のＰＬＧ濃度はヒト血漿中のプラスミノーゲン濃度の正常範囲より僅かに高いように見える。方法＃１を用いて回復させたTXA Superflowビーズとの血漿のインキュベーション後に約２４％、方法＃２を用いて回復させたビーズとのインキュベーション後には９３％超のプラスミノーゲンが枯渇した。従って、２４％の枯渇のビーズは再び回復させなければならず、９３％のビーズはブタ実験に再び使用することができる。ＰＨ＝６．５又はＰＨ＝７．５で合成したＴＸＡコンジュゲートＧＥビーズは６０％超のＰＬＧ枯渇を示したが、ＰＨ＝８．５で合成したものは５４％の枯渇を示した。この実験は、反応がＰＨ＝６．５でより効率的であることを実証している。今後の実験は、一晩行うか、又は異なるリガンド濃度の反応液で行う。
【０４６２】
実施例４
ClearPlasmaによる血漿ろ過
・  TXA superflow、コンジュゲート１
フィルタ調製：
１−フィルタに２５ｍｌの樹脂を充填した。
２−１００ｍｌの７０％エタノールをフィルタに流し、３０分間インキュベートした。
３−７０％エタノールで２回洗浄した。
４−２０％エタノールで３回洗浄した
５−４℃で保存した。
【０４６３】
樹脂活性化：
樹脂をＤＤＷで３回、及び結合緩衝液）１０ｍＭクエン酸ナトリウム＋１２０ｍＭ塩化ナトリウム）で２回洗浄した。
【０４６４】
血漿ろ過：
ヒト血漿バッグをフィルタに接続し、１時間にわたって全容積（２００ｍｌ）をフィルタに通して受容バッグに入れた。
【０４６５】
結果は以下の表９に示す。
【０４６６】
【表９】
2021515189.tif 000030
【０４６７】
表９に示されるとおり、血漿をろ過すると、プラスミノーゲンが有効に枯渇した。
【０４６８】
・  ClearPlasma（商標）装置  ＴＸＡコンジュゲートビーズ及び／又はシクロヘキサンカルボン酸アガロースビーズ＝コンジュゲート１。
材料：
−血漿：健常供血者からの血漿は、Magen David Adorn（MDA）血液バンクから入手した
−ClearPlasma（商標）装置：３ｍｌパスツールピペットを使用してカートリッジにコンジュゲートシクロヘキサンカルボン酸＝コンジュゲート２アガロースビーズを充填した；この樹脂を１５０ｍｌの生理食塩水で洗浄し、２〜８℃で保存した。
−器具：ＥＬＩＳＡリーダー：800TS（BioTek）
【０４６９】
ルアーロックを使用して２５０ｍｌの量の血漿を装置に接続し、装置に２滴／秒の速度で約３０分間流した。枯渇させた血漿は滅菌キャップに収集した。未処理血漿及び枯渇済み血漿からの試料を分析用に取り、残りを−２０℃で凍結した。E-80PMG−ヒトプラスミノーゲンＥＬＩＳＡキット、ロット番号9（ICL, Inc.）を用いてプラスミノーゲン濃度を決定した。
【０４７０】
【表１０】
2021515189.tif 000031
【０４７１】
上述のClearPlasma（商標）装置によるろ過後に、血漿から９６％超のＰＥＧが除去されたように見える。
【０４７２】
実施例５
ClearPlasmaを使用することによるクリオプレシピテートからのプラスミノーゲンレベルの枯渇におけるClear Plasma有効性の判定
クリオプレシピテートは、一般には出血及び詳細には大量出血の治療に用いられる重要な血液製剤である。従って、ClearPlasma装置がクリオプレシピテートからプラスミノーゲンを枯渇させる能力を判定した。
【０４７３】
材料：
ａ．ClearPlasma：プラスチックフィルタ（Pentracor Inc.）、ＴＸＡコンジュゲートSuperflow樹脂（Sterogene；ロット：1608:88）、流量調整弁付き延長ライン（Qosina；ロット：159299）、採血バッグ（Fresenius；ロット：FA17H30126）。
ｂ．備品：
ｉ．シェーカー：カタログ番号KRS-3016；製造番号：SH30000003；製造者：MRC。
ｉｉ．ＥＬＩＳＡリーダー：カタログ番号800TS；製造番号：1709201B；製造者：BioTek
ｉｉｉ．遠心機：カタログ番号Z383K；製造番号：31030005；製造者：HERMLE.a.
ｃ．クリオプレシピテート：クリオプレシピテートは、Hadassah血液バンクから入手した（付録１にクリオプレシピテートの詳細）。（Ｙ  ２００２  １８  １７０００７  Ｏ  Ｒｈ陽性）
【０４７４】
この実験は、実験手順の記載に従い行った。データは、ClearPlasmaを通じたクリオプレシピテート単位（２９ｍｌ）のシングルパスにより、凝固因子には何ら効果を及ぼすことなく、クリオプレシピテートのプラスミノーゲン濃度が１５５．８７から２．７μｇ／ｍｌへと減少し、即ち約９８％の減少であったことを示す（図３を参照）。従ってClearPlasma装置は、クリオプレシピテートからプラスミノーゲンを枯渇させるための使用に好適である。クリオプレシピテートからプラスミノーゲンを枯渇させると、出血病態の治療能力が向上した新規製剤が提供される。
【０４７５】
実施例６
インビボでの活性プラスミノーゲン濃度の判定
簡潔に言えば、健常ボランティアから新鮮血を採取した。５０μｌのｔＰＡ（６μＭ）又は通常生理食塩水（ＮＳ）を１．８ｍｌの新鮮血に加え、Hemochron 401機器を使用して凝固時間を決定した。並行実験では、５０μｌのｔＰＡ（６μＭ）又はＮＳを１．８ｍｌプラスミノーゲンフリー血漿に加えた。
【０４７６】
本明細書に開示される主題のコンジュゲートの効果を判定するため、２つのパラメータを評価した。凝固時間、及び全凝血塊溶解時間。
【０４７７】
凝固時間
凝固時間は活性プラスミノーゲン濃度に反比例した。
【０４７８】
対照血液では、凝固時間は１１３±２７秒（ｎ＝７）であり、ここでｔＰＡと共に処理した血液では、これは２５５±４１秒（ｎ＝８）であった。プラスミノーゲン枯渇血液では、ｔＰＡの非存在下での凝固時間は１１０±１６（ｎ＝６）であり、ここでｔＰＡの存在下ではこれは１１８＋１８（ｎ＝７）であった。
【０４７９】
全凝血塊溶解時間
単純な観察によって、及び凝血塊を含むチューブを機械に再挿入することにより、凝血塊の存在を決定した。
【０４８０】
１４±５．２分後（ｎ＝６）、ｔＰＡで処理した対照血液からは凝血塊が消失した。対照的に、ＮＳで処理した対照血液では、完全な凝血塊形成後２時間の時点で凝血塊はインタクトであった。
【０４８１】
ｔＰＡ含有又は不含のプラスミノーゲン枯渇血液では、完全な凝血塊形成後２時間の時点で凝血塊はインタクトであった。これらの結果は、本明細書に開示される主題のコンジュゲートの有効性を明確に実証している。
【０４８２】
実施例７
肝裂傷ブタモデルにおける血漿アフェレーシスの有効性の評価
この研究は、ClearPlasma（商標）の使用及び通常の血漿と比較したときプラスミノーゲンが減少した血漿の有益性を調べることを目標とした。本研究は、Biotechfarm Ltd.（イスラエル）で実施された。
【０４８３】
目的
目的は、ブタ肝裂傷モデルにおいて失血に対するＰＤＰ投与の有効性を評価することであった。
【０４８４】
研究エンドポイント
４ｃｍの肝裂傷後３０分で失血を測定し、以下に提示するグレード評価スキームにより判定した。
【０４８５】
【表１１】
2021515189.tif 000032
【０４８６】
研究期間
各ブタにつき８〜９時間
【０４８７】
研究デザイン
１４匹の雌の飼育ブタを４群に割り付けた（対照、通常の血漿、ClearPlasma（商標）及びＴＸＡ）
【０４８８】
各群を以下のとおり治療した。
【０４８９】
対照群１：
１．全身麻酔の導入
２．９０分間にわたる血漿採取
３．血漿採取の終了後３０分における肝裂傷の導入
４．肝裂傷の導入後３０分における腹壁及び皮膚の縫合
【０４９０】
対照群２：
１．全身麻酔の導入
２．血漿採取の終了後３０分における肝裂傷の導入
３．肝裂傷の導入後３０分における腹壁及び皮膚の縫合
【０４９１】
対照群３：
１．全身麻酔の導入
２．ＴＸＡによる治療
３．血漿採取の終了後３０分における肝裂傷の導入
４．肝裂傷の導入後３０分における腹壁及び皮膚の縫合
【０４９２】
試験群：
１．全身麻酔の導入
２．９０分間にわたる血漿採取−ClearPlasma（商標）によるろ過（試験装置群）
３．血漿採取の終了後３０分における肝裂傷の導入
４．肝裂傷の導入後３０分における腹壁及び皮膚の縫合
【０４９３】
【表１２】
2021515189.tif 000033
【０４９４】
研究手順
１．麻酔の導入前にブプレノルフィンを投与した。
２．麻酔−動物をケタミン、キシラジン及びアトロピンで鎮静させ、次に気管内チューブを挿管した；酸素中のイソフルランで麻酔を維持した。
３．血管アクセスのためアクセス可能な耳静脈にカテーテルを留置した。
４．血漿採取適用のため各頸静脈に中心静脈カニューレ（ＣＶＣ）を導入した。
５．血漿を９０分の間採取した。その後、ClearPlasma（商標）有り又は無しでの血漿輸血を実施した。
６．血漿採取の３０分後、以下のとおり肝裂傷モデルを導入した：
−  ブタを仰臥位に置いた。
−  腹部領域の刈毛及びスクラブ洗浄を実施した。
−  正中切開を設けた。
−  肝右葉を露出させて体外に出し、十分な作業域を確保した後、生理食塩水でリンスした。
−  ４ｃｍ（長さ）、１ｃｍ間隔及び０．５ｃｍ深さの格子パターンの裂傷を設けた（肝臓片を秤量した）。
７．乾燥したスポンジとモデル導入後の血の付いたスポンジとの重量差を決定することにより、失血を測定した。重量差は、グラム単位の失血として表した。
８．適用可能な場合、止血までの時間（ＴＴＨ）を測定した。
９．裂傷の導入から３０分後、腹壁及び皮膚を縫合した。
【０４９５】
生理学的パラメータのモニタリング
血漿採取適用前（ベースライン）、採取適用の直後、肝裂傷の導入直前、出血中及び皮膚縫合直後：
−  食道温度、
−  平均動脈圧、
−  心拍数、
−  酸素飽和度、
−  活性化凝固時間、
−  ＣＢＣ用血液試料、
−  プロトロンビン時間（ＰＴ）及び部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）を含めた、血液学、生化学及び凝固パラメータ。
血漿採取適用前（ベースライン）、肝裂傷の導入後３０分（縫合直前）及び研究終了時（縫合後５時間）：
−  臨床徴候の詳細：麻酔からの回復後
血漿アフェレーシス適用前：
−  体重
【０４９６】
支持療法
回復中、動物は皮膚を温めるブランケットに置いた。
【０４９７】
安楽死
動物は縫合後５時間で犠牲にした。注記：肝裂傷の導入から６０分後（即ち、縫合直前）に出血が続く２匹の動物は、人道的見地から安楽死させた。
【０４９８】
臨床観察方法
行動的属性としては、限定はされないが、以下が挙げられる：
１．血液、尿及び糞便の排出、尿の変色（該当する場合）、下痢、糞便がないこと（便秘）。
２．病気又は傷害の徴候、嗜眠、嘔吐、唾液分泌過剰、姿勢異常、疼痛、跛行、不快感、動こうとしないこと又は動けないこと。
３．神経学的重症度スコア（ＮＳＳ）
４．臨床観察に基づき必要な場合は常に、更なる評価を実施した。
【０４９９】
備品
Haemonetics MCS（登録商標）+、シリンジ、針及び手術用ガラス備品、血圧計、酸素計。装置又は非経口注射アセンブリの洗浄及びリンス用の希釈剤及び溶液は全て、それらの無菌性、パイロジェンフリー及び汚染からの保護が確実となる方法で処理した。
【０５００】
結果
全ての実験において、ブタはHaemonetics MCS（登録商標）+システムを使用した血漿採取を受けた。図４に記載されるとおり、全血を採取し、遠心し、直ちに赤血球をブタに返血し、及び最高７００ｍｌの血漿を採取し、ClearPlasma（商標）を使用してろ過するか（試験群について）、又はろ過しなかった（対照群について）。ブタは麻酔下に置き、及び静脈からの血液を採取して血漿アフェレーシスシステムに導入した。次に赤血球を動物に返血し、試験群動物ではClearPlasma（商標）によって血漿をろ過し、動物に返血した。各ブタから得られた詳細な結果を表１３に詳述する。
【０５０１】
【表１３】
2021515189.tif 000034
【０５０２】
【表１４】
2021515189.tif 000035
【０５０３】
実験１：ブタ１４４からの血漿はClearPlasma（商標）を使用してろ過し、ブタ１４４に返血した。ブタ１４３からの血漿はモックろ過後にブタ１４３に輸血した。次に４ｃｍ肝臓切断を実施し、血液量及び出血時間を記録した。この実験は、プラスミノーゲンレベルを枯渇させると出血量が減少することを示している。対照ブタでは肝臓切断サイズがより小さかったことはあるにしても、出血はＰＤＰを受けたブタの方が多かった。加えて、臨床判定が向上し、対照ブタの脈拍は、ＰＤＰを受けたブタと比較したときより高く、不安定であった。
【０５０４】
実験２：通常の血漿及びＴＸＡと比較したときのＰＤＰの効果。３匹のブタを以下のとおり試験した：ブタ１４５は通常の血漿で治療し、ブタ１４６はプラスミノーゲン枯渇血漿で治療し、及びブタ１４７はトラネキサム酸（ＴＸＡ）で治療した。結果は、通常の血漿と比較したときＰＤＰが出血量を減少させることを実証している。加えて、通常の血漿と比較したときＴＸＡとの間で出血量に僅かな差があった。
【０５０５】
実験３：通常の血漿及びＴＸＡと比較したときのＰＤＰの効果。結果は、通常の血漿と比較したときＰＤＰが出血量を減少させることを実証している。
【０５０６】
実験４：通常の血漿及びＴＸＡと比較したときのＰＤＰの効果。結果は、通常の血漿と比較したときＰＤＰが出血量を減少させることを実証している。
【０５０７】
実験５：ＰＤＰを投与したブタにおける肝臓切断後の出血の減少。材料及び方法の節に記載されるとおりブタを麻酔し、血漿を採取した。ブタを通常の血漿、ＰＤＰ、ＴＸＡ１６ｍｇ／ｋｇで治療するか、又は未治療とした。次に、材料及び方法の節に記載されるとおり、メスを使用して４ｃｍ肝臓切断を行った。結果は、通常の血漿と比較したときＰＤＰが出血量を減少させることを実証している。
【０５０８】
図５は、肝裂傷後３０分の間に見られたとおりの失血量を示す。図５を見ると分かるとおり、ClearPlasmaを使用すると、通常の血漿の投与を受けたブタとの比較で出血量が約５０％超減少する。
【０５０９】
プラスミノーゲン及びｔＰＡなどの線溶タンパク質活性の低下を検証するため、トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）を実施した（図６Ａ〜図６Ｌを参照）。（ＴＥＧ）は、血液凝固効率を試験する方法である。ブタに番号を付した：１６９番−対照、１７２番−血漿アフェレーシス及びプラスミノーゲン枯渇；１７３番−血漿アフェレーシスのみ。図６Ｊを見ると分かるとおり、ブタ１７２番においてのみ、ｔＰＡ投与後に線溶反応がなかった。この結果は、プラスミノーゲン及びｔＰＡなどの線溶タンパク質の有意な減少を実証している。
【０５１０】
結論として、全ての実験でClearPlasma（商標）の使用により、通常の血漿輸血を受けたブタと比較したとき臨床アウトカムが有意に改善し、ブタが失う血液の量が減少した。
【０５１１】
実施例８
ブタ肝裂傷モデルにおけるクレキサン治療下の動物の失血に対するプラスミノーゲン枯渇血漿の投与の安全性評価
本研究は、Biotechfarm Ltd.（イスラエル）で実施された。
【０５１２】
目的
ブタ肝裂傷モデルにおける失血に対するプラスミノーゲン枯渇血漿の投与の安全性評価。抗凝固薬による治療下の動物におけるプラスミノーゲン枯渇の効果を調べること。血液希釈剤療法（クレキサン）を受けている患者において血栓塞栓性合併症の発症リスクがないことを提供すること。
【０５１３】
研究エンドポイント
４ＣＭ肝裂傷後３０分で失血を測定した。
【０５１４】
研究デザイン
本研究では、クレキサン治療下の動物において線溶タンパク質が減少した血漿と通常の血漿とを比較することにより、ＰＤＰによる治療が深部静脈血栓症（ＤＶＴ）の発症につながらないことを確認した。
種及び性別：飼育雌ブタ、試験開始時４０〜５０ｋｇ
群の数：４群（３つの対照群及び１つの試験装置群）
群サイズ：対照群についてｎ＝５匹（雌）；試験装置群についてｎ＝５匹（雌）
動物の総数：２０匹
【０５１５】
群及び投与の構成：
対照群１：１．未治療の対照：全身麻酔の導入  ２．９０分間にわたる血漿採取。３．血漿採取の終了後３０分における肝裂傷の導入  ４．肝裂傷の導入後３０分における腹壁及び皮膚の縫合。
【０５１６】
対照群２：１．４０００単位のクレキサン：手術の１０時間前にブタに４０００単位のクレキサンを注射した。２  全身麻酔の導入  ３．血漿採取の終了後３０分における肝裂傷の導入  ４．肝裂傷の導入後３０分における腹壁及び皮膚の縫合。
【０５１７】
対照群３：１．新鮮血漿及び４０００単位のクレキサン：手術の１０時間前にブタに４０００単位のクレキサンを注射した。２．全身麻酔の導入  ３．ＴＸＡによる治療  ４．血漿採取の終了後３０分における肝裂傷の導入  ５．肝裂傷の導入後３０分における腹壁及び皮膚の縫合。
【０５１８】
試験群：１．プラスミノーゲン枯渇血漿及び４０００単位のクレキサン：手術の１０時間前にブタに４０００単位のクレキサンを注射した。２  全身麻酔の導入  ３．９０分間にわたる血漿採取−ClearPlasma（商標）によるろ過（試験装置群）。４．血漿採取の終了後３０分における肝裂傷の導入。５．肝裂傷の導入後３０分における腹壁及び皮膚の縫合
【０５１９】
研究手順
ＰＤＰ又は通常の血漿による治療の１０時間前に、クレキサン（Clexane（登録商標））シリンジ、プレフィルドシリンジ中の注射用４，０００ＩＵ（４０ｍｇ）／０．４ｍｌ溶液をブタに静脈内（ＩＶ）注射した。鎮痛：ブプレノルフィン；麻酔：動物をケタミン、キシラジン及びアトロピンで鎮静させ、次に気管内チューブを挿管し、酸素中のイソフルランによって麻酔を維持した。
【０５２０】
アクセス可能な耳静脈に血管アクセス用のカテーテルを留置した。血漿採取適用のため各頸静脈に中心静脈カニューレ（ＣＶＣ）を導入した。
【０５２１】
９０分の期間中に採取される血漿。この血漿をClearPlasma（商標）による処理後又は処理なしで輸血した。
【０５２２】
血漿採取の適用から３０分後、以下のとおり肝裂傷を導入した：
−ブタを仰臥位に置いた、
−腹部領域の刈毛及びスクラブ洗浄、
−正中切開を設けた、
−肝右葉を露出させて体外に出し、十分な作業域を確保し、生理食塩水でリンスした、
−４ｃｍ（長さ）、１ｃｍ間隔及び０．５ｃｍ深さの格子パターンの裂傷を設け、肝臓片を秤量した、
モデル導入後に乾燥したスポンジと血の付いたスポンジとの重量差を決定することにより、失血を測定した。重量差はグラム単位の失血として表した。該当する場合、止血までの時間（ＴＴＨ）を測定した。
裂傷の導入から３０分後、腹部を縫合し、次に皮膚を縫合した。
【０５２３】
生理学的パラメータのモニタリング：
血漿採取適用前：
ベースライン、採取適用直後、肝裂傷の導入直前、出血中及び皮膚の縫合直後
食道温度、平均動脈圧、心拍数、酸素飽和度、活性化凝固時間  ＣＢＣに関する血液試料
プロトロンビン時間（ＰＴ）及び部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）を含めた、血液学、生化学及び凝固パラメータ：血漿採取適用前−ベースライン、肝裂傷導入後３０分（縫合直前）及び研究終了時、縫合後５時間
臨床徴候の詳細：麻酔からの回復後
体重：１回、血漿アフェレーシス適用前
【０５２４】
支持療法：麻酔の導入前にブプレノルフィンを投与した。回復中、動物は皮膚を温めるブランケットに置いた。
【０５２５】
終末調査：動物は縫合後５時間で犠牲にした。注記：肝裂傷の導入後（即ち、縫合直前）６０分を超える持続的出血のある動物はいずれも、人道的見地から安楽死させた
【０５２６】
研究期間：各ブタにつき８〜９時間
【０５２７】
臨床観察方法：行動的属性としては、限定はされないが、以下が挙げられる：１．血液、尿及び糞便の排出、尿の変色（該当する場合）、下痢、糞便がないこと（便秘）。２．病気又は傷害の徴候、嗜眠、嘔吐、唾液分泌過剰、姿勢異常、疼痛、跛行、不快感、動こうとしないこと又は動けないこと．３．神経学的重症度スコア（ＮＳＳ）４．臨床観察に基づき必要な場合は常に、更なる評価を実施した。
【０５２８】
機器：Haemonetics MCS（登録商標）+、シリンジ、針及び手術用ガラス備品、血圧計、酸素計。装置又は非経口注射アセンブリの洗浄及びリンス用の希釈剤及び溶液は全て、それらの無菌性及びパイロジェンフリーが確実となる方法で処理した。全ての試液が汚染から保護されることを確実にする。
【０５２９】
全ての実験において、ブタはHaemonetics MCS（登録商標）+システムを使用した血漿採取を受けた。図５に記載されるとおり、全血を採取し、遠心し、直ちに赤血球をブタに返血し、及び最高７００ｍｌの血漿を採取してろ過するか、又はClearPlasma（商標）を使用しなかった。ブタは麻酔下に置き、静脈からの血液を採取して血漿アフェレーシスシステムに導入した。これに続き、赤血球を動物に返血し、ClearPlasma（商標）によって血漿をろ過し、最後に動物に返血した。
【０５３０】
結果：
【０５３１】
【表１５】
2021515189.tif 000036
【０５３２】
【表１６】
2021515189.tif 000037
【０５３３】
【表１７】
2021515189.tif 000038
【０５３４】
予想どおり、動物をクレキサンで治療すると、溢血（extraverted blood）の量が１８７ｃｃから２７４ｃｃへと大幅に増加した。データはまた、動物の１単位の新鮮血漿（ＦＰ）を投与すると、出血が２７４ｃｃから５９６ｃｃへと増加したことも示している。更に、そのＦＰからプラスミノーゲンを枯渇させると、５９６ｃｃから１２８．７ｃｃへと出血規模が低下した。
【０５３５】
死後データは、ＰＤＰで治療した動物が血栓性又は血栓塞栓性イベントを生じないことを示している。ＰＤＰで治療した動物の肺、心臓又は脾臓に凝血塊は認められなかった。血栓塞栓性イベントがないことに関する結論は、ＰＤＰで治療された動物にＤ−ダイマーがないことによって更に裏付けられる。
【０５３６】
このデータは、クレキサンによる治療下の動物であってもプラスミノーゲン枯渇血漿が有効な抗出血治療であることを示している。このデータはまた、クレキサンによる治療下の動物であってもプラスミノーゲンＰＤＰが有効であることも示している。従って、抗凝固薬による治療下にあって緊急手術を受ける必要のある患者において、ＰＤＰは良好な解決法となり得る。このデータはまた、ＰＤＰによる治療下の患者を出血が増加するリスクなしにクレキサンで治療し得ることも示唆している；かかる結論は、術後期にＤＶＴを防止又は治療するため抗凝固薬で治療する必要がある患者に適切である。このデータはまた、患者をクレキサンとＰＤＰとによって同時治療し、それにより出血イベントと血栓イベントとを同時に防止可能であることも示している。
【０５３７】
実施例９
ＦＦＰと比較したプラスミノーゲン枯渇血漿（ＰＤＰ）インビトロ特性
プラスミノーゲン枯渇血漿（ＰＤＰ）及び新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）の凝固パラメータを実験手順に従い計算し、表１７に詳述するとおり比較した。２１５ｍｌの容積の新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）をClearPlasmaに流した（表１７においてＰＤＰと表示される；未処理血漿に関するＦＦＰと対照となす）。ＰＰＤ中最大８０％のＰＬＧが枯渇したように見える。
【０５３８】
【表１８】
2021515189.tif 000039
【０５３９】
実験は全てトリプリケートで行った。統計量はスチューデントｔ検定（両側分布等分散）を用いて計算した。
【０５４０】
加えて、特定の血液成分に関する複数の試験を実施して、処理済み及び未処理血漿の凝固及び生化学的状態を決定した（栄養素及びタンパク質含量（contact）の検査）。この試験は、Bnay-zionの血液学及び生化学研究所において実施された。結果を表１８に示す。ＦＦＰとＰＤＰとの間に生化学的パラメータの有意な差はなく、従ってClearPlasmaは栄養素及び／又はレベルタンパク質含量に影響を及ぼさなかったように見える。
【０５４１】
【表１９】
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【０５４２】
実験は全てトリプリケートで行った。統計量はスチューデントｔ検定（両側分布等分散）を用いて計算した
【０５４３】
凝血塊に加え、実験手順の節に詳述するとおり、ＰＰＤ及びＦＦＤの両方における溶解をトロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）によってモニタした。結果を図７に示す。ＰＤＰはヒト血漿中の線溶活性を消失させたように見える。
【０５４４】
実施例１０
マウス安全性実験−尾出血アッセイにおける抗線溶技術の判定
本研究はBiocell Ltd.（イスラエル）において実施された。
【０５４５】
目的
この実験の目的は、マウスにおけるプラスミノーゲン不含血漿の静脈内注射の安全性を調べることである。
【０５４６】
研究エンドポイント
血液マーカー（血球数、生化学）及び臨床観察（皮膚、毛、眼／粘膜の検査、神経系、身体活動及び一般行動）によってプラスミノーゲン枯渇血漿の安全性を判定した。これらのパラメータは、注射前、注射後４８時間及び注射後７日に測定した。
【０５４７】
動物
１２匹の動物
種／系統：マウス：Ｃ５７ブラック
性別／匹数／年齢：雄１０〜１２週齢
供給元：Harlan Laboratories、イスラエル
【０５４８】
倫理委員会
本研究は、「イスラエル動物実験委員会（Israel Board for Animal Experiments）」による承認後に、「イスラエル動物福祉法（Israel Animal Welfare Act）」に準拠して実施した。
【０５４９】
研究デザイン
この実験では、各マウスに治療のうちの１つの２００μｌを注射した。
１．  健常な１２週齢Ｃ５７ブラックマウスをケタミンとキシラジンとの混合物（それぞれ１００及び１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、その体重を測定した。
２．  マウスを３つの異なる群（各群４匹のマウス）に無作為に分け、２００μｌの以下を注射した：
１．生理食塩水−群１
２．通常の血漿−群２
３．プラスミノーゲン不含血漿−群３（Ｃ５７ブラックマウス由来の、ClearPlasma（商標）によってろ過した血漿）。
３．  注射の４８時間後、各群から２匹のマウスを犠牲にし、この注射の安全性を判定した；採血のためEDTA K3チューブに血液を採取し、血液検査に回した（４℃）。
４．  ７日後、各群から２匹のマウスを犠牲にし、この注射の安全性を判定した；採血のためEDTA K3チューブに血液を採取し、血液検査に回した（４℃）。
５．  血球数（ＣＢＣ）、ＬＤＨ、ＡＧＴ、ＡＬＴ及び完全生化学分析に関してマウス血液を検査した。
【０５５０】
生理学的マーカーは、プラスミノーゲン枯渇血漿の静脈内注射がマウス生理学に影響を及ぼさなかったことを実証している。全血球計算（ＣＢＣ）、血液生化学、体重、形態学的外観及び動物行動を調べ、全ての群で正常であることが分かった。従って、この実験の結果によれば、プラスミノーゲン枯渇血漿の使用は安全であるように見える。
【０５５１】
マウスにおける出血試験
プラスミノーゲン枯渇もまたマウスにおいて実施した：Ｃ５７ブラックマウス由来の血漿をClearPlasmaに供した（対照血漿は処理しなかった）。次にプラスミノーゲンレベルをＥｌｉｚａ［キット：ab198511−Plasminogen Total（ＰＬＧ）マウスＥＬＩＳＡキット］によって判定しており、９７％のプラスミノーゲンの枯渇を示す（以下の表に示すとおり）。
【０５５２】
【表２０】
2021515189.tif 000041
【０５５３】
マウスにおける尾切断後の出血試験は、実験手順の節に記載される手順に従い実施した。この非ＧＬＰ研究は、ClearPlama（商標）装置の使用及び通常の血漿と比較したときの、プラスミノーゲンが減少した血漿の有益性を調べることを目標とした。本研究はBiocell Ltd.（イスラエル）において実施された。
【０５５４】
目的
ＰＤＰがマウスの出血速度に及ぼす効果を試験すること。
【０５５５】
研究エンドポイント
以下の標準的なグレード評価スキームを用いて失われた血液の量をグレード評価した：
【０５５６】
【表２１】
2021515189.tif 000042
【０５５７】
簡潔に言えば、マウスに生理食塩水又は未処理血漿（ＦＦＰ）又はプラスミノーゲンを欠いている血漿（処理済み血漿又はＰＤＰ）を注射した。動物を腹臥位に置いた。尾の遠位１０ｍｍ部分をメスで切断した。この尾は、水浴で３７℃に予め温めた等張生理食塩水が入った５０ｍＬチューブに直ちに浸した。尾の向きは垂直とし、先端を体の水平面の約２ｃｍ下に位置させた。各動物を２０分間モニタした（出血が止まった場合であっても、可能性のある再出血イベントを検出するため）。
【０５５８】
出血時間
参加マウスの尾を７ｍｍのところで切り取り、出血が止まるまでの時間を測定した。この試験は、反復毎に各治療群から１匹のマウスとして３群で行った。結果は、２番を除くこの試験の反復全てにおいて、ＰＤＰマウスが最も短い出血時間であったことを示している。
【０５５９】
出血量
マウスの尾を７ｍｍのところで切り取り、出血が止まるまでの時間を測定した。この試験は、反復毎に各治療群から１匹のマウスとして３群で行った。血液を採取し、遠心し、定規を使用してサイズを測定した。結果は、２番を除くこの試験の反復全てにおいて、ＰＤＰマウスが最も少ない出血量であったことを示している（図８を参照）。
【０５６０】
出血試験後２４時間における血液細胞ペレットサイズ
出血試験からの血液細胞ペレットを遠心し、上清を吸引した。次に定規を用いてペレットサイズを測定した。統計量は、一元配置ＡＮＯＶＡの後に事後ＬＳＤ／ＳＣＨＥＬＦ（ｐ＜０．０５を有意と見なす）を用いて計算した。図９は、各マウスからのペレットサイズ結果を示す。図１０は、ペレットサイズ測定値の統計的分析を要約する。ＰＤＰはマウスにおいて出血を４０％超減少させるように見える。これらの結果は、ＰＤＰ（ClearPlasma（商標））が、それで治療されたマウスにおいて、対照群と比較したとき出血時間及び失血量を減らすことを実証している。
【０５６１】
実施例１１
ClearPlasmaはブタにおいてプラスミノーゲン及びｔＰＡタンパク質の両方のレベルを低下させる
雌ブタが麻酔下でHaemonetlcs mcs+システムを用いた血漿アフェレーシスを受けた。２群のブタ：対照群及び試験群を調べた。試験群では、ブタの血漿をClearPlasmaでろ過した。両群に同様の手順を行い、即ち、ろ過した血液の量：７００ｍｌ、抗凝固薬による治療［抗凝固薬クエン酸塩デキストロース溶液配合ａ］、時間：約１００分及び２５００の量の血液を進めた（ｍｌ）：約７００の血漿が採取された。これらの手順後、血漿を動物に返血した。
【０５６２】
プラスミノーゲン枯渇（ＥＬＩＳＡキット：ab108893ヒトプラスミノーゲン、実験手順の節に詳述するとおり）及びｔＰＡ枯渇（野生型ｔＰＡサンドイッチＥＬＩＳＡ＃  Technozym T-PA AG EDTA Elisa Kit 96 TC12007）に関して各群の血漿試料を分析した。図１１Ａ〜図１１Ｂに示すとおり、ClearPlasmaでろ過した血漿の試料はプラスミノーゲン及びｔＰＡの両方が枯渇したように見える。
【０５６３】
実施例１２
血漿ｐＨ及び伝導率
目的
ＰＤＰと供血血漿とのｐＨ及び伝導率を比較すること。
【０５６４】
材料
血漿：健常供血者からの血漿
最終滅菌したClearPlasma（商標）装置
器具：ｐＨ計、導電率計
【０５６５】
ヒト血漿が入ったバッグをClearPlasma（商標）装置に接続し、１時間にわたって全容積（２００ｍｌ）を装置に通して受容バッグに入れた。ＰＤＰ及び血漿のｐＨ及び伝導率を測定した。表２１に詳述するとおり、血漿をClearPlasma（商標）装置で処理した後に、ｐＨ値及び伝導率値の僅かな変化が認められた。
【０５６６】
【表２２】
2021515189.tif 000043
【０５６７】
実施例１３
安全性関連分析
・  血液適合性
最終滅菌したClearPlasma（商標）装置（ポリカーボネートハウジングに入った多糖ポリマーの粒子）はインビトロ溶血試験：全血ヘモグロビン濃度測定（シアンメトヘモグロビン法）で試験されている。この試験はEnvigo（イスラエル）によって実施された。本研究は、ＯＥＣＤ優良試験所基準（ＧＬＰ）原則（１９９７年に改訂されたとおり）、ＥＮＶ／ＭＣ／ＣＨＥＭ（９８）１７に準拠して行った。
【０５６８】
インビトロ溶血試験はシアンメトヘモグロビン法を用いて全血ヘモグロビン濃度を測定する。３匹のウサギからのプール血液を陰性対照（ガラスバイアル、バッチ：１６４９１）及び陽性対照（ニトリル検査グローブ、バッチ：４１０１０１０４）並びに供試品（ClearPlasma（商標））と共にインキュベートした。３７±１℃で３時間インキュベートした後、血漿中のヘモグロビン含有量を測定し、溶血を決定した。
【０５６９】
陰性対照（ガラスバイアル、バッチ：１６４９１）の％溶血は−０．５％であり、従ってグレードは非溶血性と評価された。
【０５７０】
陽性対照（ニトリル検査グローブ、バッチ：４１０１０１０４）の％溶血は９１．１％であり、従ってグレードは溶血性と評価された。
【０５７１】
陰性及び陽性対照が適合判定基準を満たしたため、従ってこの試験の妥当性が確認された。
【０５７２】
供試品ClearPlasma（商標）（バッチ番号：18-0001）の％溶血指標は−０．３％及び−０．１％であったとともに、非溶血性と見なされる。
【０５７３】
この研究の条件下では、ヘモグロビン含有量の計算値によれば、供試品ClearPlasma（商標）（バッチ番号：18-0001）のパートＡ及びパートＢは非溶血性と見なされる。
【０５７４】
・  材料媒介性発熱原性試験
この研究の目的は、プラスミノーゲン枯渇血漿の材料媒介性発熱原性の検出に関する一般的な情報を提供することであった。
【０５７５】
この試験はAmerican Preclinical Services, LLC（MN, USA）によって行われた。
【０５７６】
本研究は、
・  米国薬局方（ＵＳＰ）＜１５１＞発熱性物質試験規制基準（Pyrogen Test Regulatory Standards）、
・  ＩＳＯ  １０９９３−１１：２０１７医療機器の生物学的評価（Biological Evaluation of Medical Devices）第１１部：全身毒性試験（Tests for Systemic Toxicity）
に準拠して行った。
【０５７７】
合計３匹の動物を使用した。各動物について注射前の３０分以内にベースライン対照体温を確定した。被験物質（プラスミノーゲン枯渇血漿、ロット番号001）を３７±２℃に温め、各動物の外側耳静脈に１０ｍｌ／ｋｇで１０分以内に静脈内注射した。各動物の体温を注射後１〜３時間の間に３０分間隔で記録した。この研究の結果に基づくと、被験物質はウサギにおいて材料媒介性発熱原性のエビデンスを示さなかった。
【０５７８】
・  細菌性エンドトキシン試験
この研究の目的は、最終滅菌ClearPlasma（商標）装置及びビーズで調製した水抽出物中の細菌性エンドトキシン（発熱物質）の濃度を推定することであった。
【０５７９】
この試験はMilouda ＆ Migal Laboratories（イスラエル）によって行われた。
【０５８０】
装置及びビーズは別々に試験した。
【０５８１】
ビーズのない装置を、１試料につき５０ｍｌ  ＬＡＬ試薬水と共に１時間インキュベートした。ＬＡＬ試薬水は試験前に３７℃に加熱してあった。次にカイネティック比濁ＬＡＬ試験法を用いて試料からの抽出物を細菌性エンドトキシンに関して試験した。
【０５８２】
２つの試験した試料の結果は、０．００８６０ＥＵ／ｍｌ及び０．０１３８０ＥＵ／ｍｌであった。
【０５８３】
次に、３バイアルの３０％エタノール中ビーズを以下のとおり試験した：各試料をＬＡＬ試薬水で１：１０希釈し、１５〜３０℃で１時間インキュベートした。試料を５，０００ＲＰＭで１０分間遠心した。カイネティック比濁ＬＡＬ試験法を用いて上清（希釈度１：１０）を細菌性エンドトキシンに関して試験した。結果は、各試験について＜０．０５ＥＵ／ｍｌであった。
【０５８４】
［装置＋ビーズ］についての最大限の要約結果は、ＵＳＰ＜１６１＞によって確立された限界値（２０ＥＵ／装置）以下であった：
［０．０１３８０ＥＵ／ｍｌ×５０ｍｌ］＋［＜０．０５ＥＵ／ｍｌ×２７ｍｌ（装置を充填するため）］＝０．６９ＥＵ／装置＋［＜１．３５］ＥＵ／装置＝＜２．０４ＥＵ／装置
【０５８５】
ＬＡＬ試験は出荷試験の一環として製品バッチ毎に行われる。
【０５８６】
以下の方法クレームにおいて、クレームステップを指示して用いられる英数字及びローマ数字は便宜上提供されるに過ぎず、いかなる特定のステップ実施順序も含意しない。
【０５８７】
最後に、語句「〜を含んでいる（comprising）」は、添付の特許請求の範囲全体を通じて使用されるとき、「〜を含むが、限定はされない」を意味すると解釈されるべきであることに留意しなければならない。
【０５８８】
本明細書に開示される主題に係る例が示され、開示されているが、本明細書に開示される主題の趣旨から逸脱することなくそれらに多くの変更を行い得ることが理解されるであろう。
【０５８９】
実施例１４
急性上部消化管出血を有する患者におけるClearPlasma（商標）の有効性及び安全性を判定する臨床試験
無作為化二重盲検対照試験を行い、急性上部消化管出血を呈する患者におけるClearPlasma（商標）装置によってろ過したＰＤＰの安全性及び有効性を判定する。これは非劣性研究である。主要アウトカムは安全性：血栓塞栓性イベント（静脈又は動脈）である。本研究は、以下のパラメータを判定することを目標とした：
１）血漿輸血後の総失血量［時間フレーム：術後最初の４８時間］。失血は、輸血されたＲＢＣ血液単位［時間フレーム：２週間］、輸血された血漿単位［時間フレーム：２週間］、ヘモグロビン降下−ベースラインとの比較、輸血された血小板単位［時間フレーム：２週間］及び２週間のフォローアップの間における再出血エピソードによって判定する；
２）入院期間［時間フレーム：２週間のフォローアップの間］；
３）血漿輸血に関連する死亡率。
【０５９０】
本研究は、数ヵ所の施設（多施設）において第１／２相で総実施期間１２ヵ月（各患者の研究実施期間は２週間である）にわたって行われる。本研究は２アームを含む：
ａ）２５０〜５００ｍｌのＰＤＰの輸血、＋必要に応じて通常の血漿；
ｂ）通常の血漿の輸血。
【０５９１】
患者集団は、下血／胃洗浄液中の血液の存在／吐血によって診断される急性上部消化管出血（ＵＧＩＢ）を有する患者に関する。標本サイズは３０例の患者（各群１５例）である。標本サイズの計算は、同様の適応疾患及び臨床計画における医学論文のレビューに基づき、記述的分析を伴う。
【０５９２】
患者は、組入れ基準及び除外基準の評価によって研究への適格性に関してスクリーニングする。スクリーニング手順には、人口統計学的データ、病歴、理学的検査及びバイタルサインの収集が含まれる。
【０５９３】
本研究に組み入れるには、患者は年齢１８歳以上であり、医師の診断を受けた急性上部消化管出血（２４時間未満）を有し、書面によるインフォームドコンセントを提出しなければならない。インフォームドコンセントのプロセスは、ＩＳＯ  １４１５５：２０１１の推奨に従う。
【０５９４】
以下のパラメータにより患者は本研究から除外される：妊娠、前月における血漿注入の投与、既知の腎不全クレアチニンクリアランス３０ｍｌ／分未満、直近３ヵ月における動脈又は静脈血栓症、血漿に対するアレルギー反応歴、別の臨床試験への参加、及びワルファリン、アピキサバン、リバーロキサバン、ダビガトラン、低分子量ヘパリンなどの抗凝固薬治療。
【０５９５】
ビジット／評価スケジュールは、ベースライン、輸血の８〜１２時間後（血液試料を含む）、翌朝（２日目）、７２時間後及び１４日後である。ベースライン判定は、血圧、脈拍、血液検査であって、全ＣＢＣ、ＰＴ、ＩＮＲ、ＰＴＴ、生化学を含むものを含む。治療スケジュールは一回限りの輸血であり、フォローアップスケジュールは、輸血後１２時間、２４時間、７２時間及び２週間である。
【０５９６】
ClearPlasma（商標）の投与はＡＢＯ血液型適合性に基づかなければならない。緊急時には、ClearPlasma（商標）血液型ＡＢを万能血漿と見なすことができる。ClearPlasma（商標）は、フィルタを備えた注入セットを用いて解凍後に静脈内注入によって投与されなければならない。注入全体を通じて無菌法が用いられなければならない。
【０５９７】
予想される有害作用は、アレルギー反応及び発熱である。患者は、治療の変更を余儀なくさせる重篤有害事象の発生、同意の撤回、又は治験責任医師の判断を受けて離脱することができる。
【０５９８】
本研究のデータは、臨床研究データの系統的な取込み、レビュー、管理、保存、分析及び報告が可能となるように米国連邦規則集に従い症例報告書（ＣＲＦ）に記録される。
【０５９９】
以下の研究サイトがモニタリングされる：
ａ）研究の開始前（即ち、研究開始ビジット）；
ｂ）最初の患者登録及びｃｒｆの記入が済んだ後の研究初期；
ｃ）研究経過中に１０〜１５人の患者が登録された後；
ｄ）最後の患者が登録された後（即ち、研究終了ビジット）。
【０６００】
ＣＲＦ報告の不備、データ品質の不足又は過剰な数の患者の離脱又は偏りに起因して、更なるオンサイトモニタリングビジットが行われることもある。
【０６０１】
本研究は治験依頼者又はその被指名人による監査、並びに適切な規制当局による調査を受けることもある。治験責任医師は研究関連記録の監査又は調査に同意しなければならず、データ保護及び医療上の機密性を十分に考慮した上で原資料を直接取り扱うことを許可しなければならない。
【０６０２】
研究データは、最終的に承認されたプロトコルに従い全ての変数を含めてＣＲＦに取り込まれる。データは、ＩＣＨ−ＧＣＰ（医薬品の臨床試験の実施基準（Good Clinical Practices））、ＩＳＯ  １４１５５：２０１１  ヒトを対象とする医療機器の臨床試験−医薬品の臨床試験の実施基準（Clinical investigation of medical devices for human subjects - Good Clinical Practice）、及び米国連邦規則集第２１編第１１部の要求事項などのＦＤＡ規格に従い収集、記入、整理、及び報告される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2021515189.tif 000058
【図６Ｃ】
2021515189.tif 000059
【図６Ｄ】
2021515189.tif 000060
【図６Ｅ】
2021515189.tif 000061
【図６Ｆ】
2021515189.tif 000062
【図６Ｇ】
2021515189.tif 000063
【図６Ｈ】
2021515189.tif 000064
【図６Ｉ】
2021515189.tif 000065
【図６Ｊ】
2021515189.tif 000066
【図６Ｋ】
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【図６Ｌ】
2021515189.tif 000068
【図７Ａ】
2021515189.tif 000069
【図７Ｂ】
2021515189.tif 000070
【図７Ｃ】
2021515189.tif 000071
【図７Ｄ】
2021515189.tif 000072
【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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