(57)【要約】本発明の発現ベクターを含むマイコバクテリウム属の株を含む医薬組成物を、対象の膀胱に投与することによって、対象におけるがんを治療する又は予防するための組成物及び方法を記載する。前記医薬組成物を、カテーテルを含む任意の好適な手段によって投与することがある。【選択図】図１１
2021521798.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
STINGアゴニストを作るタンパク質又はその機能的部分を発現する核酸配列を含むベクター。
【請求項２】
請求項１に記載のベクター、ここで、前記STINGアゴニストが、3'-5' c-di-AMP(c-di-AMPとしても知られる)；3'-5' c-di-GMP(c-di-GMPとしても知られる)；3'-3'cGAMP；2'-3'cGAMP及びそれらの組み合わせからなる群、より選択される。
【請求項３】
Rv1354cタンパク質又はその機能的部分をコードする第1の核酸配列；3'-3'サイクリックGMP-AMP合成酵素(DncV)タンパク質又はその機能的部分をコードする第2の核酸配列；2'-3'サイクリックGMP-AMP合成酵素(cGAS)タンパク質又はその機能的部分をコードする第3の核酸配列；DNAインテグリティ・スキャニング(DNA integrity scanning)(disA)タンパク質又はその機能的部分をコードする第4の核酸配列、及びそれらの組み合わせからなる群、より選択される核酸配列を含む、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
PanC及びPanDタンパク質又はそれらの機能的部分をコードする第5の核酸配列を更に含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクター、ここで、前記ベクターが抗生物質耐性遺伝子を含まない。
【請求項６】
請求項１に記載のベクター、ここで、前記ベクターが、バクテリアのゲノムに安定的に組み込まれるベクター、バクテリア内で多数のコピーとしてエピソーム的に安定的に複製するベクター、及び／又はそれらの組み合わせからなる群、より選択される。
【請求項７】
マイコバクテリウム属のホスホジエステラーゼ遺伝子又はホスホジエステラーゼ・ドメインの発現をノックアウトするタンパク質又は核酸配列をコードする第5の核酸配列を更に含む、請求項３に記載のベクター。
【請求項８】
請求項３に記載のベクター、ここで、前記第3の核酸配列がサイクリックGMP-AMP合成酵素(cGAS)タンパク質のシクラーゼ・ドメインを過剰発現する。
【請求項９】
請求項３に記載のベクター、ここで、前記第3の核酸配列が、非機能的である、調節性DNA認識能力を有するサイクリックGMP-AMP合成酵素(cGAS)タンパク質を発現する。
【請求項１０】
STINGアゴニストを作るタンパク質又はその機能的部分を含むベクターを含むマイコバクテリウム属の株。
【請求項１１】
請求項１０に記載の株、ここで、前記STINGアゴニストが、3'-5' c-di-AMP(c-di-AMPとしても知られる)；3'-5' c-di-GMP(c-di-GMPとしても知られる)；3'-3' cGAMP；2'-3' cGAMP及びそれらの組み合わせからなる群、より選択される。
【請求項１２】
Rv1354cタンパク質又はその機能的部分をコードする第1の核酸配列；3'-3'サイクリックGMP-AMP合成酵素(DncV)タンパク質又はその機能的部分をコードする第2の核酸配列；2'-3'サイクリックGMP-AMP合成酵素(cGAS)タンパク質又はその機能的部分をコードする第3の核酸配列；DNAインテグリティ・スキャニング(DNA integrity scanning)(DisA)タンパク質又はその機能的部分をコードする第4の核酸配列、及びそれらの組み合わせからなる群、より選択される核酸配列を含む、請求項１０に記載の株。
【請求項１３】
請求項１２に記載の株、ここで、前記マイコバクテリウム属の株が、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、ウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)、又はそれらの組み合わせである。
【請求項１４】
請求項１３に記載の株、ここで、前記マイコバクテリウム属の株が、マイコバクテリウム属カルメット・ゲラン菌(bacillus Calmette Guerin)(BCG)である。
【請求項１５】
請求項１４に記載の株、ここで、前記株が、BCGのパントテン酸(panCD突然変異体)栄養要求株である、並びに前記ベクターが、PanCタンパク質又はその機能的部分をコードする核酸及びPanDタンパク質又はその機能的部分をコードする核酸配列、であるpanCDを含む。
【請求項１６】
請求項１６に記載の株、ここで、前記株が、ゲノムに抗生物質耐性遺伝子を含まない。
【請求項１７】
請求項１６に記載の株、ここで、前記ベクターが、抗生物質耐性遺伝子を含まない。
【請求項１８】
請求項１０に記載の株、ここで、前記ベクターが、前記マイコバクテリウム属の染色体に組み込まれるベクター、前記マイコバクテリウム属で多数のコピーとしてエピソーム的に安定的に複製するベクター、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【請求項１９】
請求項１０に記載の株、ここで、前記株が、抗生物質耐性遺伝子を含まない。
【請求項２０】
請求項１０−１９のマイコバクテリウム属の株の何れか1種、及び(ii)薬学的に許容可能な担体、を含む、医薬組成物。
【請求項２１】
以下の工程を含む、対象において、I型インターフェロン応答を誘発する、向-炎症性サイトカインの発現を増強する、及び／又は免疫力を強化する方法：
請求項１０−１９のマイコバクテリウム属の株の何れか1種を含む医薬組成物を投与すること；及び、
前記対象において、I型インターフェロン応答を誘発すること、向-炎症性サイトカインの発現を増強すること、及び／又は免疫力を強化すること。
【請求項２２】
前記医薬組成物を、カテーテルにより前記対象の膀胱に投与する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
以下の工程を含む、対象において、がんを治療する又は予防するSTINGアゴニストを作るタンパク質を発現するベクターを含むマイコバクテリウム属の株を使用する方法：
がんを有する対象に、STINGアゴニストを作るタンパク質又はその機能的部分を発現するベクターを含むマイコバクテリウム属の株を含む医薬組成物を投与すること；並びに、
前記対象において、がんを治療すること、又は予防すること。
【請求項２４】
請求項２３に記載のベクター、ここで、前記STINGアゴニストが、3'-5' c-di-AMP(c-di-AMPとしても知られる)；3'-5' c-di-GMP(c-di-GMPとしても知られる)；3'-3' cGAMP；2'-3' cGAMP及びそれらの組み合わせからなる群、より選択される。
【請求項２５】
Rv1354cタンパク質又はその機能的部分をコードする第1の核酸配列；3'-3'サイクリックGMP-AMP合成酵素(DncV)タンパク質又はその機能的部分をコードする第2の核酸配列；2'-3'サイクリックGMP-AMP合成酵素(cGAS)タンパク質又はその機能的部分をコードする第3の核酸配列；DNAインテグリティ・スキャニング(DNA integrity scanning)(DisA)タンパク質又はその機能的部分をコードする第4の核酸配列、及びそれらの組み合わせからなる群、より選択される核酸配列を含む、請求項２４に記載のベクター。
【請求項２６】
請求項２３に記載の方法、ここで、前記がんが、上皮がん、乳がん、筋層非浸潤性膀胱がん、及びそれらの組み合わせからなる群、より選択される。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法、ここで、前記がんが、筋層非浸潤性膀胱がんである、及びBCG非応答性の筋層非浸潤性膀胱がん(BCG非応答性NMIBC)である、並びに前記医薬組成物を膀胱内注入によって投与する。
【請求項２８】
請求項２６に記載の方法、ここで、前記がんが、筋層非浸潤性膀胱がんである、及びBCGナイーブな筋層非浸潤性膀胱がん(BCGナイーブNMIBC)である、並びに前記医薬組成物を膀胱内注入によって投与する。
【請求項２９】
請求項２６に記載の方法、ここで、前記上皮がんが、結腸がん、子宮がん(uterine cancer)、子宮頸がん、膣がん(vaginal cancer)、食道がん(esophageal cancer)、鼻咽腔がん(nasopharyngeal cancer)、気管支内がん(endobronchial cancer)及びそれらの組み合わせからなる群、より選択される、並びに、前記医薬組成物を、前記上皮がんの管腔表面に投与する。
【請求項３０】
請求項２３に記載の方法、ここで、前記がんが、固形腫瘍、液性腫瘍から選択される。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法、ここで、前記医薬組成物を腫瘍内注射によって投与する。
【請求項３２】
請求項３０に記載の方法、ここで、前記医薬組成物を全身投与によって投与する。
【請求項３３】
チェックポイント阻害剤を投与する工程を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法、ここで、前記チェックポイント阻害剤が、イピリムマブ(抗CTLA-4)、ニボルマブ(抗PD-1)、ペムブロリズマブ(抗PD-1)、セミプリマブ(抗PD-1)、アテゾリズマブ(抗PD-L1)、アベルマブ(抗PD-L1)、デュルバルマブ(抗PD-L1)及びそれらの組み合わせからなる群、より選択される。
【請求項３５】
請求項２３に記載の方法、ここで、前記がんが膀胱がんである、及びカテーテルにより前記医薬組成物を投与する。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
［政府の利益に関する記載］
本発明は、米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)のAI036973、AI037856の提供資金に基づいて、米国政府のサポートにより成された。米国政府は、本発明においてある種の権利を有する。
【０００２】
膀胱の尿路上皮がんは、北米、南米、欧州、アジアで最も良く見られるタイプの膀胱がんである。筋層非浸潤性膀胱がん(NMIBC)は、再発率が高いこと、膀胱内治療が頻回になること、進行したステージに進展するリスクがあること、及び全てのがんの中で生涯にわたる治療となることが最も高いこと、と関連している。膀胱内BCG(カルメット・ゲラン菌(bacillus Calmette Guerin))注入は、30年の間、NMIBCの標準治療であり続けてきた。それは、60-70%の患者に有効である。BCGは、抗原を送達するための非常に効果的な媒体であることが示されている。I型インターフェロン及びTh1誘導性で介した免疫応答に沿った基礎的な免疫応答の多くの研究が、有望であることを裏付けている。NMIBCのための組換えBCG(rBCG)株を作製する努力は、これらの抗腫瘍免疫応答を増強する株の開発に焦点を当ててきた。今日まで、このような努力によって、従来のBCGを上回るはっきりとした向上はもたらされていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明のある実施形態は、例えば、STINGアゴニスト（例えば、c-di-AMP(3'-5' c-di-AMPとしても知られる)；c-di-GMP(3'-5' c-di-GMPとしても知られる)；3'-3' cGAMP(3’-5’, 3’-5’ cGAMPとしても知られる、コレラ菌(Vibrio cholerae)のDncVタンパク質の産物)；2'-3'cGAMP(2’-5’、3'-5'cGAMPとしても知られる、ヒトcGASタンパク質の産物)及びそれらの組み合わせ等を含む）を作るタンパク質又はその機能的部分を発現する核酸配列を含むベクターである。いくつかの本発明のベクターは、Rv1354cタンパク質又はその機能的部分をコードする第1の核酸配列；3'-3'サイクリックGMP-AMP合成酵素(DncV)タンパク質又はその機能的部分をコードする第2の核酸配列；2'-3'サイクリックGMP-AMP合成酵素(cGAS)タンパク質又はその機能的部分をコードする第3の核酸配列；DNAインテグリティ・スキャニング(DNA integrity scanning)(disA)タンパク質又はその機能的部分をコードする第4の核酸配列、及びそれらの組み合わせからなる群、より選択される核酸配列を含む。これらの核酸配列の各々は、本明細書の定義のセクションに記載されるように、1種以上のSTINGアゴニストを作るタンパク質を発現する。いくつかの本発明のベクターは、上記に列挙した配列のうちの1種以上に加えて、PanCタンパク質及びPanDタンパク質又はそれらの機能的部分をコードする第5の核酸配列を含む。PanCタンパク質及びPanDタンパク質又はそれらの機能的部分をコードする核酸配列を含むベクターは、典型的には抗生物質耐性遺伝子を含まない。本発明で使用する好適なベクターとしては、多数のコピーとしてエピソーム的に複製するベクター、又は単一コピーとしてバクテリアの染色体に組み込まれる、若しくはそうでない場合、バクテリア細胞中に存在するベクター、が挙げられる。本発明のベクターは、バクテリアのゲノムに安定的に組み込まれることがある、又は、本発明のベクターは、エピソーム・プラスミドとして安定的に複製されることがある。好適な第3の核酸配列としては、サイクリックGMP-AMP合成酵素(cGAS)タンパク質のシクラーゼ・ドメインを過剰発現するもの、が挙げられる。他の好適な第3の核酸配列は、非機能的である、調節性DNA認識能力を有するサイクリックGMP-AMP合成酵素(cGAS)タンパク質を発現することがある。本発明のベクターはまた、本発明において使用するマイコバクテリウム属の株のPDE遺伝子の発現をノックアウトする配列又はタンパク質をコードする核酸配列を含むこともある。
【０００４】
本発明の別の実施形態は、STINGアゴニストを作るタンパク質又はその機能的部分を含むベクターを含む、本発明のベクターのいずれか1種を含むマイコバクテリウム属の株である。上述のように、例えば、STINGアゴニストの例としては、c-di-AMP(3'-5'c-di-AMPとしても知られる)；c-di-GMP(3'-5'c-di-GMPとしても知られる)；3'-3'cGAMP(3’-5’, 3’-5’ cGAMPとしても知られる、コレラ菌(Vibrio cholerae)のDncVタンパク質の産物)；2'-3'cGAMP(2’-5’、3'-5'cGAMPとしても知られる、ヒトcGASタンパク質の産物)及びそれらの組み合わせ、が挙げられる。好適な核酸配列の例としては、Rv1354cタンパク質又はその機能的部分をコードする第1の核酸配列；3'-3'サイクリックGMP-AMP合成酵素(DncV)タンパク質又はその機能的部分をコードする第2の核酸配列；2'-3'サイクリックGMP-AMP合成酵素(cGAS)タンパク質又はその機能的部分をコードする第3の核酸配列；DNAインテグリティ・スキャニング(DNA integrity scanning)(disA)タンパク質又はその機能的部分をコードする第4の核酸配列、及びそれらの組み合わせからなる群、より選択される核酸配列、が挙げられる。本発明で使用される好適なマイコバクテリウム属の株の例としては、例えば、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、ウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)、又はそれらの組み合わせが挙げられる。本発明で使用される別の株は、マイコバクテリウム属カルメット・ゲラン菌(bacillus Calmette Guerin)(BCG)である。本発明で使用されるマイコバクテリウム属の株は、おそらく、そのpanCD遺伝子オペロンを欠いたBCGのパントテネート(pantothenate)栄養要求株であろう。panCD 栄養要求株は、機能的なPanC及び／又はPanDタンパク質をコードすることができるゲノム配列を欠いている。いくつかの実施形態では、パントテネート(pantothenate)栄養要求株であるマイコバクテリウム属の株は、PanC及びPanDタンパク質又はその機能的部分をコードするpanCD核酸を含む、本発明のベクターを含む。panCD核酸配列を含む本発明のベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子又は抗生物質耐性を提供する機能的タンパク質をコードする核酸配列を含まない。本発明のパントテネート(pantothenate)栄養要求株であるマイコバクテリウムは、好ましくはゲノムに抗生物質耐性遺伝子を含まない、又は抗生物質耐性を提供する機能的タンパク質をコードすることができない。
【０００５】
本発明の別の実施形態は、本発明のマイコバクテリウム属の株のいずれか1種、及び(ii)薬学的に許容可能な担体、を含む、医薬組成物である。
【０００６】
本発明の別の実施形態は、以下の工程を含む、対象において、I型インターフェロン応答を誘発する、向-炎症性サイトカインの発現を増強する、及び／又は免疫力を強化する方法、である：対象に、本発明の株の何れか1種を含む医薬組成物を投与すること；対象において、I型インターフェロン応答を誘発すること、向-炎症性サイトカインの発現を増強すること、及び／又は免疫力を強化すること。ある実施形態では、前記医薬組成物を、カテーテルにより前記対象の膀胱に投与する。
【０００７】
別の実施形態は、対象におけるがんを治療する又は予防するために、本発明のマイコバクテリウム属の株を使用する方法である。前記方法は、以下の工程を含む：がんを有する対象に、STINGアゴニストを作るタンパク質又はその機能的部分を発現するベクターを含むマイコバクテリウム属の株を含む医薬組成物を投与すること；及び、前記対象におけるがんを治療すること、又は予防すること。本発明を使用して、がん（例えば、上皮がん、乳がん、筋層非浸潤性膀胱がん等を含む）を治療する、又は予防する、ことがある。いくつかの実施形態では、前記がんが、筋層非浸潤性膀胱がんである、及びBCG非応答性の筋層非浸潤性膀胱がん(BCG非応答性NMIBC)である、並びに前記医薬組成物を膀胱内注入によって投与する。いくつかの実施形態では、前記がんが、BCGナイーブな筋層非浸潤性膀胱がん(BCGナイーブNMIBC)である、及び前記医薬組成物を膀胱内注入によって投与する。他の実施例では、前記がんが、結腸がん、子宮がん(uterine cancer)、子宮頸がん、膣がん(vaginal cancer)、食道がん(esophageal cancer)、鼻咽腔がん(nasopharyngeal cancer)、気管支内がん(endobronchial cancer)及びそれらの組み合わせからなる群、より選択される、並びに、前記医薬組成物を、前記上皮がんの管腔表面に投与する。いくつかの実施形態では、前記がんが、固形腫瘍、液性腫瘍から選択される、並びに前記医薬組成物を腫瘍内注射によって、及び／又は全身投与によって、投与する。本発明の方法は、例えば、チェックポイント阻害剤（例えば、抗-PD1、抗-PDL1、それらの組み合わせ）を投与する工程を含むことがある。別の実施形態では、前記がんは膀胱がんである、及びカテーテルにより前記医薬組成物を投与する。
【０００８】
本発明のある実施形態は、Rv1354cタンパク質若しくはその機能的部分をコードする第1の核酸配列；サイクリックGMP-AMP合成酵素(DncV)タンパク質若しくはその機能的部分をコードする第2の核酸配列；サイクリックGMP-AMP合成酵素(cGAS)タンパク質若しくはその機能的部分をコードする第3の核酸配列；ジアデニレート・シクラーゼとして機能するDNAインテグリティ・スキャニング(DNA integrity scanning)(disA)タンパク質若しくはその機能的部分をコードする第4の核酸配列、又はそれらの組み合わせ、を含む発現ベクターである。いくつかの本発明の発現ベクターは、天然のRv1354cの発現を対照として比較した場合に、Rv1354cタンパク質のシクラーゼ・ドメインを過剰発現する第1の核酸配列を有する。いくつかの本発明の発現ベクターは、天然のDncVタンパク質の発現と比較した場合、サイクリックGMP-AMP合成酵素(DncV)タンパク質を過剰発現する第2の核酸配列を有する。いくつかの本発明の発現ベクターは、天然のcGASタンパク質の発現と比較した場合に、サイクリックGMP-AMP合成酵素(cGAS)タンパク質のシクラーゼ・ドメインを過剰発現する第3の核酸配列を有する。本発明で使用する好適なRv1354タンパク質としては、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)Rv1354タンパク質が挙げられる。本発明で使用する好適なDncVタンパク質としては、コレラ菌(Vibrio cholerae)DncVタンパク質が挙げられる。本発明で使用する好適なcGASタンパク質としては、ホモ・サピエンスcGASタンパク質が挙げられる。本発明で使用する好適なDisAタンパク質としては、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)disAタンパク質が挙げられる。
【０００９】
本発明の別の実施形態は、cdnP遺伝子、Rv1354c遺伝子、Rv1357c遺伝子、又はそれらの組み合わせを含むBCG株を含む、ここで、前記cdnP遺伝子は、機能的なサイクリック・ジ-ヌクレオチド・ホスホジエステラーゼ(CdnP)タンパク質を発現することができない、前記Rv1354c遺伝子は、機能的なRv1354cタンパク質を発現することができない、及び／又は前記Rv1357c遺伝子は、機能的なRv1357タンパク質を発現することができない。いくつかの本発明のBCG株は、非機能的なEALドメインを含むRv1354c遺伝子を有することがある。本発明のBCG株は、本発明の発現ベクターのいずれかを含むことがある。
【００１０】
本発明の別の実施形態は、以下の工程を含む、膀胱がんを治療する又は予防する方法である：本発明の発現ベクターを含むBCG株を含む医薬組成物を、対象の膀胱に投与する工程；及び、前記対象における膀胱がんを、前記医薬組成物を投与していない対照の対象と比較した場合に、治療する又は予防する工程。前記医薬組成物を、カテーテルを含む任意の好適な手段によって、投与することがある。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、以下の工程を含む、対象における、I型インターフェロン応答を誘発する方法である：本発明の発現ベクターを含むBCG株を含む医薬組成物を、前記対象(例えば、前記対象の膀胱)に投与すること；及び、前記対象におけるI型インターフェロン応答を、前記医薬組成物を投与していない対照の対象と比較した場合に、増強すること。
【００１２】
本発明の別の実施形態は、以下の工程を含む、対象における、がんを治療する又は予防する方法である：本発明の発現ベクターを含むBCG株を含む医薬組成物を、がんを有する対象の腫瘍に投与すること；及び、前記対象におけるがんを、前記医薬組成物を投与していない対照の対象と比較した場合に、治療する又は予防すること。前記医薬組成物を、腫瘍内への注入を含む任意の好適な手段によって投与することがある。本方法により治療する又は予防することがあるがんとしては、限定されるものではないが、乳がん、及び／又は筋層非浸潤性膀胱がんが挙げられる。
【００１３】
本発明で使用するマイコバクテリウムの例としては、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、ウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)、ウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)カルメット・ゲラン菌(Bacillus Calmette Guerin)(BCGと呼ばれる)、マイコバクテリウム・スメグマチス(Mycobacterium smegmatis)、トリ型結核菌(Mycobacterium avium)複合体、及び他の非結核性マイコバクテリア(non-tuberculous mycobacteria)(NTM)が挙げられる。本発明で使用するBCG株（STINGアゴニストを過剰発現するものを含む）の例としては、BCGパスツール(BCG Pasteur)、BCG-パスツール-アエラス(BCG-Pasteur-Aeras)、BCG-タイス(BCG-Tice)(BCGシカゴとしても知られる)、BCG-コンノート (BCG-Connaught)(BCGトロントとしても知られる)、BCGデンマーク、BCG-プラハ(BCG チェコスロヴァキアとしても知られる)、BCGロシア(BCGモスクワとしても知られる)、BCGモロー(BCGブラジルとしても知られる)、BCG日本(BCG東京としても知られる)、BCGスウェーデン(BCGイェーテボリとしても知られる)、BCGビルクハウグ(BCG Birkhaug)、BCGグラクソ、BCGフラピエ(BCG Frappier)(BCGモントリオールとしても知られる)、BCGフィップス、又は他の利用可能なBCG株が挙げられる。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、以下の工程を含む、糖尿病の治療方法である：糖尿病を有する対象に、STINGアゴニストを作るタンパク質又はその機能的部分を発現するベクターを含むマイコバクテリウム属の株を含む医薬組成物を投与すること；及び、免疫力を強化することにより、前記対象における糖尿病を治療すること、又は予防すること。免疫力を強化することは、抗原非依存的である、ヘテロなCD4及びCD8メモリーを活性化させることに基づく、サイトカインを介する、並びにエピジェネティックな変化及び代謝的な変化と関連している。本方法によって、免疫力を強化することによって媒介される解糖のアップレギュレーションがもたらされる。上記解糖のアップレギュレーションは、I型及びII型糖尿病の予防すること及び治療することに有益である。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、以下の工程を含む、対象における、免疫力を強化することを刺激する方法である：対象に、STINGアゴニストを作るタンパク質又はその機能的部分を発現するベクターを含むマイコバクテリウム属の株を含む医薬組成物を投与すること；及び、前記対象において、免疫力を強化することを刺激すること。ここで、前記方法は、前記対象において解糖をアップレギュレーションし、及び／又は前記対象において免疫力を強化することを媒介する、前記対象におけるヒストン・メチル化のエピソーム変化を刺激する。
【００１６】
本発明の別の実施形態は、以下の工程を含む、対象における、ウイルス感染を治療する又は予防する方法である：対象に、STINGアゴニストを作るタンパク質又はその機能的部分を発現するベクターを含むマイコバクテリウム属の株を含む医薬組成物を投与すること；及び、前記対象におけるウイルス感染を治療すること、又は予防すること。前記方法は、前記対象における、免疫力を強化することを刺激し、前記対象において、前記ウイルス感染を治療する又は予防する。ここで、前記方法は、前記対象において解糖をアップレギュレーションし、及び／又は前記対象において免疫力を強化することを媒介する、前記対象におけるヒストン・メチル化のエピソーム変化を刺激する。
【００１７】
本発明の別の実施形態は、以下の工程を含む、対象における、バクテリア感染又は薬剤耐性のバクテリア感染を治療する又は予防する方法である：対象に、STINGアゴニストを作るタンパク質又はその機能的部分を発現するベクターを含むマイコバクテリウム属の株を含む医薬組成物を投与すること；及び、前記対象におけるバクテリア感染又は薬剤耐性のバクテリア感染を治療すること、又は予防すること。前記方法は、前記対象における、免疫力を強化することを刺激し、前記対象において、前記バクテリア感染を治療する又は予防する。ここで、前記方法は、前記対象において解糖をアップレギュレーションし、及び／又は前記対象において免疫力を強化することを媒介する、前記対象におけるヒストン・メチル化のエピソーム変化を刺激する。本発明の方法は、1種以上の本発明のベクター又は本発明のベクターを含む1種以上のバクテリアの株を使用することがある。
【００１８】
別段の定義がない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。以下の参考文献は本発明で使用する用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); 及び Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書中で使用する場合、以下の用語は、別段に明記しない限り、それらに帰する意味を有する。
【００１９】
「薬剤」とは、任意の低分子化学化合物、抗体、核酸分子、若しくはポリぺプチド、又はそれらのフラグメントを意味する。
【００２０】
「変わること(alteration)」とは、本明細書中に記載されるものような標準的な技術の公知の方法によって検出されるような、遺伝子又はポリペプチドの発現レベル又は活性の変化(増加又は減少)を意味する。本明細書中で使用する場合、変わることには、発現レベルの10%の変化、好ましくは25%の変化、より好ましくは40%の変化、そして最も好ましくは発現レベルの50%以上の変化、が含まれる。
【００２１】
「改善する」とは、疾患の発生又は進行を減少、抑制、減弱、緩和、停止、又は安定化することを意味する。
【００２２】
「類似体(analog)」とは同一ではないが、類似の機能的又は構造的特徴を有する分子を意味する。例えば、ポリペプチド類似体は、対応する天然に存在するポリペプチドの生物学的活性を保持するが、天然に存在するポリペプチドと比較して類似体の機能を増強する、特定の生化学的な改変を有する。このような生化学的な改変は、例えば、リガンド結合を変えることなく、類似体のプロテアーゼ耐性、膜透過性、又は半減期を増加させることがある。類似体は、別の実施例において、非天然アミノ酸を含むことがある。
【００２３】
「cdnP」とは、1)サイクリック・ジ-ヌクレオチド・ホスホジエステラーゼ(cdnP)タンパク質をコードするcdnP遺伝子若しくは核酸配列、又は2)サイクリック・ジ-ヌクレオチド・ホスホジエステラーゼ・タンパク質、のいずれかを意味する。例としては、H37Rv中のヒト型結核菌(M. tuberculosis) cdnP遺伝子、NCBI遺伝子ID 888920であるRv2837c、及びUniProtKB/Swiss-Prot P71615.2のcdnPタンパク質、が挙げられる。
【００２４】
「cGAS」とは、1)サイクリックGMP-AMP合成酵素(cGas)タンパク質をコードするcGAS遺伝子若しくは核酸配列、又は2)サイクリックGMP-AMP合成酵素タンパク質、のいずれかを意味する。cGasの例としては、ホモ・サピエンス(H.sapiens) cGAS遺伝子(NCBI遺伝子ID: 115004)、及びこの遺伝子によってコードされるタンパク質(UniProtKB/Swiss-Prot: Q8N884.2)が挙げられる。cGasタンパク質は、2'3'cGMPを作るヒト由来のサイクリックGMP-AMP合成酵素である。2'3'cGMPは、ヒトにおけるSTINGアゴニストである。
【００２５】
「シクラーゼ・ドメイン」とは、cGASのものを意味し、例えば、Kranzuschら(Cell Reports 2013; 3:1362-1368 PMID 23707061)に記載される522アミノ酸のヒトcGASタンパク質の一部である。シクラーゼ・ドメインは、アミノ酸160-330の中にNTaseのコアを有する、及びアミノ酸330-522の中にC-ドメインである調節性センサー・ドメインを有する、として記載されることがある。前記NTaseコア配列の変異及び前記調節性センサー・ドメインの変異を用いて、DNA結合による活性化という通常は必要とされることが無くても、高いレベルのcGAMPを産生するように設計されたcGAMPに関する構成的に活性な変異型を作製することがある。シクラーゼ・ドメインの別の例としては、NCBI遺伝子ID: 887485の623アミノ酸のヒト型結核菌(M. tuberculosis) Rv1354c、及びこの遺伝子によってコードされるタンパク質(UniProtKB/Swiss-Prot: P9WM13)が挙げられ、これはc-di-GMP(サイクリック・ジグアニレート又はサイクリックdi-GMP)を合成すること(そのGGDEFドメイン、アミノ酸201-400を介する)及び分解すること(そのEALドメイン、アミノ酸401-623を介する)の両方が可能なタンパク質をコードする。前記GAFドメイン(アミノ酸1-200)は調節性ドメインである。前記GGDEFドメイン、並びに前記EALドメイン(ホスホジエステラーゼ活性)を除去するために一部を切断した調節性センサーGAFドメイン及びポリペプチドの変異を使用して、高いレベルのc-di-GMPを産生するように設計した、Rv1354cの構成的に活性化した変異型を生成することがある。
【００２６】
「DisA」又は「disA」とは、1)DNAインテグリティ・スキャニング(DNA integrity scanning)(DisA)タンパク質をコードするDis A遺伝子若しくは核酸配列、又は2)DNAインテグリティ・スキャニング(DNA integrity scanning)タンパク質、のいずれかを意味する。例えば、NCBI遺伝子ID: 887485の358アミノ酸のヒト型結核菌(M. tuberculosis) disA遺伝子Rv3586が挙げられる、及びこの遺伝子によってコードされるタンパク質は、UniProtKB/Swiss-Prot: P9WNW5.1である。前記タンパク質は、Dey & Bishai et al.  Nature Medicine 2015;21:401-6. PMID: 25730264に記載されるジアデニレート・シクラーゼである。DisAタンパク質はc-di-AMPを作るジアデニレート・シクラーゼである。c-di-AMPはSTINGアゴニストである。
【００２７】
「疾患」とは、細胞、組織、又は臓器の正常な機能を損傷又は妨害する、あらゆる症状又は障害を意味する。疾患の例としては、限定されるものではないが、膀胱がんが挙げられる。
【００２８】
「dncV」とは、GTP及びATPから3'3'-サイクリックGMP-AMP(3'3'-cGAMP) （細胞シグナル伝達のセカンド・メッセンジャー）を合成することを触媒する、サイクリックGMP-AMP合成酵素をコードする遺伝子を意味する。dncV は、ATP及びGTPからそれぞれc-di-AMP及びc-di-GMPを産生することも可能である；しかし、真核生物が産生する2'3'-cGAMPとは逆に、3'3'-cGAMPがin vivoでDncVによって産生される主要な分子である。dncV は、効率的なコレラ菌(Vibrio cholerae)腸内コロニー形成に必要であり、コロニー形成に影響する走化性の過程をダウンレギュレーションする。dncV は、dATP、TTP、UTP、及びCTPには活性ではない。前記DncVタンパク質はコレラ菌(Vibrio cholerae)由来のサイクリックGMP-AMP合成酵素で、3'3'cGAMPを作る。3'3'cGAMPはSTINGアゴニストである。
【００２９】
「EALドメイン」は、様々なバクテリア・シグナル伝達タンパク質に見出される保存されたタンパク質ドメインを意味する。前記EALドメインは、ジグアニレート・ホスホジエステラーゼとして機能することがある、及びセカンド・メッセンジャー（サイクリックdi-GMP）の分解を刺激することが示されている。非機能的EALドメインは、これらの機能の1種以上を持たないであろう。EALドメインの例には、NCBI遺伝子ID: 886815の307アミノ酸のヒト型結核菌(M. tuberculosis) Rv1357c遺伝子が挙げられ、この遺伝子によってコードされるタンパク質は、c-di-GMPホスホジエステラーゼ(PDE)をコードし、単一のEALドメインからなるUniProtKB/Swiss-Prot: P9WM07である。この酵素の活性は、c-di-GMPホスホジエステラーゼとして働き、サイクリック・ジ-ヌクレオチド(シグナル伝達活性を有する)を2つのGMP分子(シグナル伝達活性を欠く)に切断することである。このことは、“A full-length bifunctional protein involved in c-di-GMP turnover is required for long-term survival under nutrient starvation in Mycobacterium smegmatis,” Bharati BK, Sharma IM, Kasetty S, Kumar M, Mukherjee R, Chatterji D.  Microbiology. 2012 Jun;158(Pt 6):1415-27. doi: 10.1099/mic.0.053892-0. Epub 2012 Feb 16.PMID: 22343354の論文に記載されている。EALドメインの別の例としては、H37Rv(Rv2837c)中の336アミノ酸のヒト型結核菌(M. tuberculosis) cdnP遺伝子、ヒト2'-3'cGAMP(ヒトcGAS酵素の産物)を加水分解する能力を有するEALドメインを含むc-di-AMPホスホジエステラーゼ、が挙げられる。このことは、Jain-Dey Bishai et al. Nat Chem Biol. 2017;13:210-217 PMID 28106876に記載されている。前記EALドメイン(サイクリック・ジヌクレオチド・ホスホジエステラーゼ活性)の構造特性及びGGDEFドメイン(サイクリック・ジ-ヌクレオチド環化生合成活性)は公知であり、詳しく記載されている(例えば、Schirmer T, Jenal U. Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signaling. Nat Rev Microbiol. 2009;7:724-35. PMID: 19756011)。
【００３０】
「有効量」とは、治療を受けていない患者と比較して、疾患の症候を改善するのに必要な量を意味する。疾患を治療的処置のために本発明を実施するために使用する活性化合物の有効量は、投与の様式、対象の年齢、体重、及び一般的な健康に依存して変化する。最終的に、主治医又は獣医は、適切な量及び投薬レジメンを決定する。このような量を「有効」量と呼ぶ。
【００３１】
「dncV」とは、1)サイクリックGMP-AMP合成酵素(DncV)タンパク質をコードするdncV遺伝子若しくは核酸配列、又は2)サイクリックGMP-AMP合成酵素タンパク質、のいずれかを意味する。例えば、限定されるものではないが、NCBI遺伝子ID: 2614190のコレラ菌(Vibrio cholerae)dncV遺伝子が挙げられ、この遺伝子によってコードされるタンパク質はUniProtKB/Swiss-Prot: Q9KVG7.1である。
【００３２】
「フラグメント」とは、ポリペプチド又は核酸分子の一部分を意味する。この部分は、好ましくは、対照核酸分子又はポリペプチドの全長の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%を含有する。フラグメントは、例えば、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、又は1000個のヌクレオチド又はアミノ酸を含むことがある。
【００３３】
「遺伝子欠失」とは、当業者に周知の対立遺伝子交換方法を使用して、BCGの染色体から目的の遺伝子の完全な遺伝子コーディング領域(coding region)を欠失させることを意味する。抗生物質耐性カセットのような選択マーカーによる遺伝子置換は、対立遺伝子交換の一形態であり、実施することがある。遺伝子が完全に欠失しており、且つその代わりに選択マーカーが導入されない、目印のない欠失(選択マーカー無し)を生成するための技術も利用可能である。
【００３４】
「遺伝子ドメイン欠失」とは、上記の対立遺伝子交換方法を使用して、特定のドメイン (本発明の場合、多機能性ポリペプチドのCDNホスホジエステラーゼ・ドメインをコードするRv1354cのEALドメイン) をコードする遺伝子の一部を、そのポリペプチドの他の部分をインタクトでフレームが合ったままで残しながら、除去すること、を意味する。
【００３５】
「ホモ・サピエンス(H.sapiens)」とは、ホモ・サピエンス(Homo sapiens)を意味する。
【００３６】
「取得する」又は「薬剤を取得する」とは、前記薬剤を合成すること、購入すること、又はそれ以外の獲得すること、を意味する。
【００３７】
「過剰発現」とは、一般的な意味では、遺伝子が、野生型又は対照遺伝子よりも大量にその対応するタンパク質を発現することを意味する。本発明において、タンパク質を過剰発現する遺伝子を作製する例としては、目的の遺伝子をコードするDNAを、BCG中の強力なプロモーター(例えば、Phsp60)、又は強力な条件的に活性化するプロモーター(例えば、PtetOFF)に、融合させること、が挙げられる。PtetOFFでは、テトラサイクリン、アンヒドロテトラサイクリン、又はドキシサイクリンの存在下で、遺伝子発現はオフになる；しかし、ヒト又は動物モデルにおける免疫療法として、組換えBCGを投与すると、目的の遺伝子がオンになる。この条件的に活性化させる方策によって、BCGが増殖している間に、サイクリック・ジ-ヌクレオチド産生酵素の強い過剰発現が、BCG生物体の生存率又は増殖速度に対して及ぼす可能性のある、如何なる有害な影響を防止する利点が得られ、BCG免疫療法を哺乳動物宿主に対する治療として与えた場合にのみ、強い発現(「過剰発現」)が可能になる。
【００３８】
「Mtb」とは、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)を意味する。
【００３９】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために、本明細書中で互換的に使用する。前記用語は、1つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の類似体又は模倣体であるところのアミノ酸ポリマー、並びに天然に存在するアミノ酸ポリマー、に適用される。ポリペプチドを、例えば、糖タンパク質を形成するために炭水化物残基を付加することによって、改変することがある。前記用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」には、糖タンパク質、並びに非-糖タンパク質が含まれる。
【００４０】
「減少させる(reduces)」又は「減少する(decreases)」とは、例えば、少なくとも約10%、25%、50%、75%、若しくは100%、又はその間の任意のパーセンテージで負に変わることを意味する。
【００４１】
「増加する(increases)」とは、例えば、少なくとも約10%、25%、50%、75%、若しくは100%、又はその間の任意のパーセンテージで正に変わることを意味する。
【００４２】
「対照」とは、標準又はコントロールの条件を意味する。
【００４３】
「参照配列」は、配列比較の基礎として使用する定義された配列を意味する。参照配列は特定の配列のサブセット又は全体；例えば、完全長cDNA又は遺伝子の配列のセグメント、又は完全なcDNA又は遺伝子の配列、であることがある。ポリペプチドについては、対照ポリペプチド配列の長さは一般に、少なくとも約16アミノ酸、好ましくは少なくとも約20アミノ酸、より好ましくは少なくとも約25アミノ酸、及び更に好ましくは約35アミノ酸、約50アミノ酸、又は約100アミノ酸であろう。核酸については、対照核酸配列の長さは一般に、少なくとも約50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約60ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約75ヌクレオチド、更により好ましくは約100ヌクレオチド若しくは約300ヌクレオチド、又はその周辺若しくはその間の任意の整数である。
【００４４】
「対照BCG株」とは、例えば、本発明の発現ベクター及び／又は内因性遺伝子を含まず、cdnP機能性タンパク質、Rv1354c機能性タンパク質、Rv1357c機能性タンパク質、又はそれらの組み合わせを発現することができない、従来のBCG株を意味する。
【００４５】
「調節性DNA認識能力」とは、DNAを検出する又は結合する、タンパク質の作用能を意味する。例えば、cGASタンパク質は、細胞質のDNAのようなDNAと結合し、GTPとATPとの反応を引き起こしてサイクリックGMP-AMP(cGAMP)を形成すること、が知られている。cGAMPは、TBK1を介してIRF3のリン酸化を引き起こすインターフェロン遺伝子刺激因子(Stimulator Interferon Genes (STING))に結合する。
【００４６】
「Rv1354c」とは、1)Rv1354cタンパク質をコードするRv1354c遺伝子若しくは核酸配列、又は2)Rv1354cタンパク質、のどちらかを意味する(例えば、Gupta, Kumar, and Chatterji; PLoS ONE (November, 2010); Vol. 5; Issue 11; 並びに Bhariati, Sharma, Kasetty, Kumar, Mukherjee, and Chatterji; Microbiology (2012), 158, 1415-1427)。前記Rv1354cタンパク質は、c-di-GMPを作るジグアニレート・シクラーゼである。C-di-GMPはSTINGアゴニストである。
【００４７】
「Rv1357c」とは、1)サイクリックdi-GMPホスホジエステラーゼ・タンパク質(Rv1357)タンパク質をコードするRv1357遺伝子若しくは核酸配列、又は2)サイクリックdi-GMPホスホジエステラーゼ・タンパク質、のどちらかを意味する(例えば、Gupta, Kumar, and Chatterji; PLoS ONE (November, 2010); Vol. 5; Issue 11; 並びに Bhariati, Sharma, Kasetty, Kumar, Mukherjee, and Chatterji; Microbiology(2012), 158, 1415-1427)。前記Rv1357cタンパク質は、c-di-GMPを作るジグアニレート・シクラーゼである。C-di-GMPはSTINGアゴニストである。
【００４８】
「STINGアゴニスト」とは、STING(インターフェロン遺伝子刺激因子(Stimulator Interferon Genes)、又はTMEM173)に結合し、それを活性化し、IRF3-TBK1経路の活性化を引き起こし、I型インターフェロン及び他の遺伝子の転写を増加させる分子を意味する。
【００４９】
「CDN」とは、3'-5' c-di-AMP、3'-5' c-di-GMP、3'-3' cGAMP(コレラ菌(Vibrio cholerae)DncVタンパク質の産物である3'-5', 3'-5' cGAMPとしても知られる)、又は2'-3' cGAMP(ヒトcGASタンパク質の産物である2’-5’, 3’-5’  cGAMPとしても知られる)などのサイクリック・ジヌクレオチドを意味する。
【００５０】
「PAMP」とは、病原体関連分子パターン(pathogen associated molecular pattern)を意味する。PAMPは、自然免疫センサーによって認識される低分子を含む微生物産物である。PAMPの例は3'-5' c-di-AMP、3'-5' c-di-GMP、3'-3' cGAMPである。
【００５１】
「DAMP」は危険関連分子パターン(danger associated molecular pattern)を意味する。DAMPは宿主由来(すなわち、ヒト、マウス、又は他の哺乳動物の疾患モデル)の分子であり、感染又は正常な生理機能に関する他の障害のような危険をシグナル伝達するために産生される。DAMPの一例は2'-3' cGAMPであり、これは宿主のセンサー酵素cGASによって、ウイルス又はある種の細胞内バクテリア感染の間に起こるように、細胞質中で二本鎖DNAを検出したときに産生される。
【００５２】
「panCD」とは、バクテリア又は他の種由来の遺伝子オペロンを意味し、生合成遺伝子panC(パントエート(pantoate)--ベータ-アラニン・リガーゼ酵素活性を有するPanCタンパク質をコードする)及び生合成遺伝子panD(アスパルテート1-デカルボキシラーゼ酵素活性を有するPanDタンパク質をコードする)をコードする。前記PanC及びPanDタンパク質は、ビタミンB5(Bビタミン)とも呼ばれるパントテン酸(pantothenic acid)又はパントテネート(pantothenate)の生合成に必要である。水溶性ビタミンであるパントテン酸は、バクテリア及びBCGを含む全てのマイコバクテリウムにとって必須の栄養素である。パントテン酸は、補酵素-A(CoA)を合成するために、並びにタンパク質、炭水化物、及び脂質を合成及び代謝するために必要である。
【００５３】
「特異的に結合する」とは、例えば、ポリペプチド又は核酸配列を認識する、及び結合するが、サンプル中の他の分子を実質的に認識しない、及び結合しない、化合物、核酸、ペプチド、タンパク質、又は抗体を意味する。
【００５４】
「実質的に同一」とは、対照アミノ酸配列(例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか1種)又は核酸配列(例えば、本明細書に記載の核酸配列のいずれか1種)と、少なくとも50%の同一性を示すポリペプチド又は核酸分子を意味する。好ましくは、このような配列が、比較のために使用される配列に対して、アミノ酸レベル又は核酸において、少なくとも60%、より好ましくは80%又は85%、より好ましくは90%、95%、又は更には99%同一である。配列同一性を、典型的には、配列解析ソフトウエア(例えば、遺伝学コンピュータグループ(Genetics Computer Group)の配列解析ソフトウェアパッケージ、ウィスコンシン大学バイオテクノロジー・センター、1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, BLAST, BESTFIT, GAP, 又はPILEUP/PRETTYBOX プログラム)を用いて測定する。このようなソフトウェアは、相同性の程度を種々の置換、欠失、及び／又は他の改変に割り当てることによって、同一又は類似の配列を対応させる。保存的置換としては、典型的には、以下のグループ内での置換が挙げられる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定するための例示的なアプローチでは、BLASTプログラムを使用することがあり、e-3とe-100の間の確率スコアを、密接に関連する配列として示す。
【００５５】
「対象」とは、限定されるものではないが、ヒト又は非ヒト哺乳動物(例えば、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、又はネコ)等を含む哺乳動物を意味する。
【００５６】
「感受性(sensitivity)」とは、特定の疾患を有する対象の割合を意味する。
【００５７】
「特異性(specificity)」とは、特定の疾患に罹患していると正しく同定された対象、即ち、正常又は健常な対象、の割合を意味する。例えば、前記特異性を、非がん対象(例えば、正常な健常対象)と比較した、特定の疾患に罹患している対象の数として、計算する。
【００５８】
「免疫力を強化する(trained immunity)」とは、ある抗原刺激が後に投与された第2の異なる抗原に対してより強力な免疫応答を誘発する作用能を意味する。免疫力を強化することは、抗原非依存的である、ヘテロなCD4及びCD8メモリーを活性化させることに基づく、サイトカインを介する、並びにエピジェネティックな変化及び代謝的な変化と関連している。
【００５９】
「Phsp60」又は「Phsp65」とは、ハンセン菌(Mycobacterium leprae) Hsp65 5'UTRに由来する強力なマイコバクテリウム属のプロモーターを意味する。
【００６０】
「5'UTR」とは、遺伝子の5' 非翻訳領域を意味する。
【００６１】
「3'UTR」とは、遺伝子の3' 非翻訳領域を意味する。
【００６２】
「WT」とは、野生型を意味する。
【００６３】
「BCG-WT」とは、ウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)カルメット・ゲラン菌(bacillus Calmette Guerin)の野生型株を意味する。
【００６４】
本明細書中で使用する場合、本明細書中に提供される範囲は、その範囲内の全ての値についてを簡潔に表現したものであると理解される。例えば、1から50までの範囲には、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、又は50からなる群に由来する、任意の数、数の組み合わせ。又は部分的な範囲、が含まれるものと理解される。
【００６５】
本明細書中で使用する場合、用語「治療／処置する(treat)」、「治療／処置すること(treating)」、「治療／処置(treatment)」などは、それに関連する障害及び／又は症状を減少させる又は改善させることをいう。障害又は症状を治療することには、例外が無いわけではないが、それに関連する障害、症状(condition)又は症状(symptoms)が完全に取り除かれることを必要としないことが認識されるであろう。
【００６６】
本明細書中で使用する用語「又は(or)」は、特に明記しない限り、又は文脈から明らかでない限り、包含的であると理解される。特に明記しない限り、又は文脈から明らかでない限り、本明細書中で使用する用語「a」、「an」、及び「the」は、単数又は複数であると理解される。
【００６７】
本明細書中で使用する場合、特に明記しない限り、又は文脈から明らかでない限り、用語「約」は当技術分野における通常の許容範囲内、例えば、平均値の2標準偏差内と理解される。約は、記載された値の10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、又は0.01%以内と理解することがある。文脈から特に明確でない限り、本明細書で提供される全ての数値は、用語「約」によって修飾される。
【００６８】
本明細書中で使用する場合、「含む(comprises)」、「含む(comprising)」、「有する(containing)」及び「有する(having)」などは、米国特許法においてそれらに与えられる意味を有することがあり、「含む(includes)」、「含む／挙げられる(including)」などを意味することがあり；「から本質的になる(consisting essentially of)」又は「本質的になる(consists essentially)」などは同様に、米国特許法において与えられる意味を有し、前記用語は、オープン・エンド(open-ended)であり、記載されるものの基本的又は新規な特徴が、記載されるものより多くの存在によって変更されない限り、記載されるものより多くの存在を許容する、しかし、先行技術の実施形態を除外する。
【００６９】
本明細書中に提供される任意の組成物又は方法は、本明細書中に提供される他の組成物及び方法のいずれかの1種以上と組み合わせることがある。
【００７０】
本明細書中で使用する場合、用語「予防する(prevent)」、「予防すること(preventing)」、「予防(prevention)」「予防的治療(prophylactic treatment)」等とは、障害又は症状が無いものの、発生するリスクがある、又は感受性がある対象において、障害又は症状が発生する確率を減少させること、を意味する。
【００７１】
このような治療／処置(外科手術及び／又は化学療法)を、膀胱がん若しくは疾患、障害、又はその症状に罹患している、有している、感受性がある、又はそのリスクがある対象（特にヒト）に適切に施す。これらの対象に「リスクがある」ことの判定を、診断試験、又は対象若しくは医療提供者の意見(例えば、遺伝子試験、酵素又はタンパク質マーカー、マーカー(本明細書中で定義されるよう)、家族歴など)による任意の客観的な又は主観的な判定によって、行うことがある。特定の実施形態では、前記マーカーのうちの少なくとも1種に関するレベルを測定することによって、膵臓がんに感受性があるか、又はそれに罹患している対象の決定を判定する。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１Ａ−１Ｂ  pSD5B Phsp60::disAプラスミド構築物からdisAを過剰発現するマイコバクテリウムは、大量のc-di-AMPをマクロファージの細胞質に放出し、高いレベルのdisA mRNAを転写する。Ａ．  pSD5B Phsp60::disAプラスミドを有するM.tb又は野生型M.tb(CDC1551)に、1:20のMOIで感染させたJ774マクロファージ。マクロファージ内のc-di-AMPのレベルを、感染24時間後に、LC-MS/MSにより測定した。見ての通り、M.tb-disA-OE株は、野生型M.tb(CDC1551)よりも約15倍多くのc-di-AMPを産生する。前記BCG-disA-OEは、同様に高いレベルのc-di-AMPを示すと予想される。(データは、Dey B, Dey RJ, Cheung LS, Pokkali S, Guo H, Lee JH, Bishai WR. A bacterial cyclic dinucleotide activates the cytosolic surveillance pathway and mediates innate resistance to tuberculosis. Nat Med. 2015;21:401-6. PMID: 25730264.からである)。Ｂ．  BpSD5B Phsp60:: disAプラスミドを有するBCG-Pasteur、又はBCG-Pasteur-WTを、対数増殖期にまで増殖させた。バクテリアを溶解し、mRNAを調製した。disA mRNAのレベルを、定量的RT-PCRにより測定した。BCG-disA-OE株は、BCG-Pasteur-WTよりも約50倍多くのdisA mRNAを産生する。
【図２】図２  disAを過剰発現するBCGは、向-炎症性サイトカインを増強する。BCG-Pasteurの野生型及びdisA過剰発現株を抗原負荷したマウスBMDMにおける、向-炎症性サイトカイン及びIFN-βの遺伝子発現プロファイリング(qPCR)。
【図３】図３．  disAを過剰発現するBCGは、IRF3のシグナル伝達を増強させる。IRF-SEAP QUANTI Blueレポーター・アッセイによって測定されるIRF経路の活性化に対するdisA過剰発現の効果。感染させたRAW-Blue ISG細胞の培養上清を、IRF活性化についてアッセイした。IRF活性化のグラフの下の画像は、QUANTI Blueアッセイのプレート及びサンプル・ウェルを表す；ウェルの列についての処置のパラメータは、そのウェルと整列した上記の棒グラフの棒について定義されたものに対応する。この図におけるBCG-disA-OEは、BCG Pasteurに由来する。
【図４】図４Ａ−４Ｃ．  disAの過剰発現に応答した向-炎症性サイトカインの増加。BCG-Pasteurの野生型及びdisA過剰発現株を抗原負荷したマウスBMDMにおける、TNF-α(A)、IL-6(B)及びIL-1β(C)の発現の違い。培養上清を、種々のサイトカインについてELISAによってアッセイした。
【図５】図５．  disAを過剰発現するBCGは、ヒト膀胱がん細胞(RT4)において種々の免疫応答を誘導する。野生型 BCG-Pasteur、野生型BCG-Tice株、及びBCG-Pasteur-disA-OEを抗原負荷した、ヒトRT4膀胱がん細胞における、遺伝子発現の違い。mRNAの発現レベルを、SYBRグリーンをベースとした定量リアル-タイムPCRを用いて測定した。
【図６】図６.  野生型及びBCG-disA-OE株の相対的な治療効果を試験するための模式的なワークフロー。
【図７】図７．  無処置又はWT BCG又はdisAを過剰発現するrBCG(rBCG = BCG-Pasteur-disA-OE；wtBCG = BCG-Pasteur)で処置した担腫瘍ラットの腫瘍浸潤指数（tumor involvement index）。
【図８】図８．  種々のBCG株を用いた膀胱内注入療法に応答した、MNU誘発性フィッシャー・ラットの膀胱腫瘍の免疫プロファイリング。ウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)BCG-Pasteurの野生型及びdisA過剰発現株による治療後のラット膀胱腫瘍細胞における遺伝子発現の違い。mRNAの発現レベルは、TaqManをベースとした定量リアル-タイムPCRを用いて測定した。この図において、BCG-WTはBCG Pasteurであり、BCG-disA-OEはBCG Pasteurに由来した。
【図９】図９．  無処置又はWT又はrBCG過剰発現disAで処置したMNU担腫瘍ラットの膀胱の遺伝子発現プロファイリング。
【図１０】図１０．  様々な細胞又は組織におけるBCG-disA-OE対BCG-WTの相対的な遺伝子発現のまとめ。マウス骨髄由来マクロファージ(BMDM)、ヒト不死化膀胱がん細胞株RT4及び5637、並びにラット不死化膀胱がん細胞株をBCG-disA-OE及びBCG-WTに24時間感染させ、細胞からmRNAを調製した。ラットを8週間にわたり膀胱内注入によりMNUに曝露させ、その後8週間膀胱内注入によりBCG-disA-OE又はBCG-WTのいずれかで処置した。16週目の剖検時に膀胱を取り出し、mRNAを調製した。サイトカイン又はケモカイン遺伝子の定量的RT-PCRを行った。示された変化は、BCG-disA-OEで観察された誘発の又は減少の倍数をBCG-WTで観察されたものに正規化したものである。BCG-WTはBCG Pasteurであり、BCG-disA-OEはこの図のBCG Pasteurに由来した。
【図１１】図１１．  disAを過剰発現するBCGに関する提案する作用機序。
【図１２】図１２．  STINGアゴニストであるCDN PAMP及びDAMP分子のレベルを増大させるBCGに対する分子遺伝学的な改変。PAMP：病原体関連分子パターン(pathogen associated molecular pattern) (バクテリアによって作られる)：  c-di-AMP(disA)、c-di-GMP(Rv1354c)、3'3'-cGAMP(dncV)。DAMP：危険関連分子パターン(danger associated molecular pattern) (宿主によって作られる)：2'-3'-cGAMP。OE：過剰発現。KO：ノックアウト(遺伝子置換)。
【図１３】図１３．  BCG中に存在する2種のサイクリック・ジヌクレオチド・シクラーゼ及びホスホジエステラーゼ・タンパク質の図：  BCG_RS07340及びBCG_AHM07112。BCG_RS07340は、CDNシクラーゼ及びCDN PDE活性の両方を有する二機能性タンパク質である。BCG_AHM07112は、CDN PDEである。そのドメインは、GAF(調節性)、GGDEF(ジグアニレート・シクラーゼ)、及びEALジグアニレート・ホスホジエステラーゼである。
【図１４】図１４．  pSD5B Phsp60::disAプラスミドを有するヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）(M.tb-disA-OE又はMtb-OE)は、野生型M.tb(Mtb-CDC1551)と比較して、マウスでは、病原性が有意に減弱している。6-7週齢のメスのBALB/cマウス(n = 10/群)を、上記のように、~3.5 log10 CFUで、エアロゾル感染により感染させた。投与1日目のCFU計数を各群3例のマウスについて実施し、3.5 log10 CFU単位の埋植を確認した。マウスを死ぬまで保持した。見ての通り、野生型ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）感染についての死亡するまでの期間の中央値は、150.5日であった。対照的に、M.tb-disA-OE(Mtb-OE)の同じ接種物に感染させたマウスは、死亡するまでの期間の中央値が321.5日であった(p <0.001)。前記BCG-disA-OEは、BCG-WTと比較して、マウスにおいて同様の病原性の消失を示すことが予想される(データは、Dey B, Dey RJ, Cheung LS, Pokkali S, Guo H, Lee JH, and Bishai WR. A bacterial cyclic dinucleotide activates the cytosolic surveillance pathway and mediates innate resistance to tuberculosis. Nat Med. 2015; 21: 401-6. PMID: 25730264.から)。
【図１５】図１５Ａ−１５Ｂ．  他のBCG株も活性がある：  disAを過剰発現するBCG Tice株もまた、disAを過剰発現するBCG Pasteurと同様の向炎症性サイトカインの誘導を示す。骨髄由来マクロファージに、BCG Pasteur株及びBCG Tice株の両方の野生型及びdisA過剰発現株を、1:20 のM.O.Iで、15時間、抗原負荷した。培養上清を回収し、ELISAを用いてサイトカインについて調べた。2つの異なった系統のBCGを抗原負荷したマウスBMDMにおけるTNF-α(A)とIL-6(B)の発現パターンの違い。前記BCG-Tice株は、市販のOnco-Tice製品由来であった。
【図１６】図１６．  BCG-disA-OEに応答するマクロファージにおけるI型インターフェロン応答は、STING依存的である。STINGを欠失させた(KO)及びコントロールのマウス由来の骨髄由来マクロファージにBCG Pasteurの野生型及びdisA OE株を、24時間、抗原負荷した。培養上清を、ELISAを用いてIFN-βレベルについて調べた。
【図１７】図１７は、BCG-disA-OEを膀胱内注入すると、筋層非浸潤性膀胱がん(NIMBC)のMNU発がん物質モデルにおいて、最大の抗腫瘍効果(病理学における統計的に有意な向上)が示されることを示す。ラット群に、MNUによる4回の膀胱内処置を、最初の8週間(2週間ごとに1回の処置)にわたって、与え、NIMBCを誘発させた。その後8週間にわたって、そのラット群に、PBS(無処置)、BCG-WT、又はBCG-disA-OEのいずれかによる膀胱内処置を4回与えた(2週間ごとに1回処置)。16週間の実験の終わりに、ラットを屠殺し、それらの膀胱を摘出した。膀胱の一部を固定し、H&E染色に供し、次いで、委員会が認定した泌尿器病理学者が、盲検様式で、評価した。腫瘍浸潤スコア(tumor involvement score)とがんステージ(T2-3, T1、CIS+ 乳頭状病変、CIS 単独、又は正常-異形成)を評価して、示した。見ての通り、BCG-disA-OEを注入すると、PBS(無処置)よりも統計的に有意で且つ低い腫瘍浸潤指数（tumor involvement index）がもたらされたが、BCG-WTは、PBSよりも統計的に有意に優れているわけではなかった。この16週間の実験を2回行った。図７のデータは、実験1の結果を表す。この図(図１７)は、実験1+実験2を併せたデータを表している。実験1が終わった後の剖検時の膀胱組織を用いて、図８及び図９に示すqPCRデータを得た。
【図１８】図１８は、BCG-disA-OEが、マウス同系膀胱がん腫瘍におけるTregs(CD4+ CD25+ Foxp3+)を減少させることを示す。マウスの側腹に5×106個のBBN975マウス膀胱がん腫瘍細胞を移植した。直径が1.5cmになったとき、マウスに、PBS(コントロール)、BCG-WT、又はBCG-disA-OEのいずれかを、3回腫瘍内注射した(2日ごとに1回の処置)。最後に腫瘍内処置した2日後に、マウスを屠殺し、その脾臓及び腫瘍を摘出した。腫瘍細胞を分散させた後、その細胞調製物を染色し、フロー・サイトメトリーに供した。見ての通り、BCG-disA-OEによって、腫瘍CD4+ Tregは減少し、腫瘍CD8+ Tregは減少し、及び脾臓CD4+ Tregは減少した。
【図１９】図１９は、2種のマウス・モデルにおいてBCG-disA-OEがBCG-WTより安全であることを示す。パネルＡでは、BALB/cマウス(免疫能がある(immunocompetent))の群を、Glas-Colエアロゾル化チャンバーを用いて、1×103 CFU (マウスの群を屠殺し、1日目の肺CFU数を測定することによって確認した)のBCG-WT又はBCG-disA-OEのいずれかに曝露させた。4週間後、それぞれの群の前記マウスを屠殺し、それらの肺を摘出し、ホモジナイズし、7H11寒天プレート上に播種した。図は、BCG-WT及びBCG-disA-OEを感染させたマウス肺の、平均CFU数を示す。見ての通り、BCG-disA-OEでは、BCG-WTと比較して、肺で負荷したCFU量が統計的に有意に低いことが観察された。パネルＢでは、SCIDマウス(免疫が抑制されている)の群を、Glas-Colエアロゾル化チャンバーを用いて、1×102 CFU (マウスの群を屠殺し、1日目の肺CFU数を測定することによって確認した)のBCG-WT又はBCG-disA-OEのいずれかに曝露させた。第3群は非感染とした。本図は、マウス群のKaplan-Meier生存曲線を示している。見ての通り、BCG-disA-OEを感染させたマウスは、BCG-WTを感染させたマウスより、統計的に有意に長い生存期間を有していた。
【図２０】図２０は、BCG-disA-OEが、CD14+ヒト単球において、BCG-WTよりも統計的に有意に高いレベルの「強化された免疫力の免疫学的な及びエピジェネティックな目印」を誘発することを示す。「免疫力を強化する(trained immunity)」とは、第1の免疫学的刺激が、その後、第2の抗原的に異なる刺激に対する免疫応答が増加することを、誘発する作用能のことを言う。この試験では、CD14+ヒト単球を、アフェレーシスにより採取したLeukoPaksから調製した。0日目に、BCG-WT又はBCG-disA-OEのいずれかに、5:1のMOIで、3時間、感染させた。第3群の細胞は、感染させなかった。感染後、細胞を複数回(2日毎に)洗浄した。6日間の休止期の後、前記単球をTLR1/2アゴニストPAM3CSK4で、2時間、再刺激した。細胞を繰り返し洗浄し、続いて24時間、インキュベートした。分泌したIL-1βのTh量を、培養上清中でELISAによって測定した。見ての通り、BCG-WT自体が、非感染細胞と比較して、統計的に有意に高いレベルの第2の刺激に対する免疫応答を誘発した一方で、BCG-disA-OEは、BCG-WT又は非感染細胞のいずれよりも統計的に有意に高いレベルの応答を誘発した。
【図２１】図２１は、BCG-disA-OEが、BCG-WTよりもIL6及びTNF遺伝子プロモーター領域において、より大きなヒストン活性化の目印(H3K4-トリメチル化)を誘発することを示す。「免疫力を強化する(trained immunity)」とは、第1の免疫学的刺激が、その後、第2の抗原的に異なる刺激に対する免疫応答が増加することを、誘発する作用能のことを言う。免疫力を強化することは、サイトカイン及び他の免疫メディエーターのプロモーター領域における、ヒストン・メチル化などのエピジェネティックな修飾と関連している。TLR1/2アゴニストPAM3CSK4(略称PAM3)による第2の刺激の後、細胞を回収し、固定し、クロマチンを架橋し、H3K4-me3ヒストン・メチル化の目印に特異的な抗体を用いてクロマチン免疫沈降解析(ChIP)をするためにDNAを回収したことを除いて、図２０に記載したのと全く同じ細胞セット及び方法で、図２１で示した実験を行った。H3K4-me3は、遺伝子活性化の目印であることが知られている。本グラフは、IL6及びTNF遺伝子プロモーター領域のプライマーを用いた定量PCRにより測定した場合の、免疫沈降したDNAの存在量に関する相対的な倍数変化を示す。見ての通り、BCG-Pasteur-disA-OE及びBCG-Tice-disA-OEの両方は、その対応するBCG-WT株よりも、2回目の刺激、PAM3CSK4による抗原負荷後に、IL6及びTNFプロモーター領域において、H3K4ヒストン・トリメチル化を有意に高いレベルにした。
【図２２】図２２は、BCG-Tice-disA-OEがうまく構築されたことを示す。本発明者らの以前の研究は、BCG-Pasteurを利用して、BCG-Pasteur-disA-OEを構築した。この株を、1995年にDr.Frank Collinsが、本発明者の1人に提供した。それは、BCG-Pasteur-Aerasとして知られている株と同じである。BCG-Ticeは、Merckが製造販売しており、米国で入手可能な唯一の米国食品医薬品局が承認したBCGである。本発明者らはBCG-Ticeを購入し、エレクトロコンピテント(electrocompetent) BCG-Ticeを調製し、及びpSD5-hsp60-MT3692プラスミドをBCG-Ticeの中にエレクトロポレーションした。本図は、5種のカナマイシン耐性の形質転換されたBCG-Ticeの候補クローンについてのコロニーPCRの結果を示し、pSD5-hsp65-MT3692プラスミドをBCG-Ticeの中にエレクトロポレーションすることによって、BCG-Tice-disA-OEがうまく調製されたことを確認する。なお、命名法について、本発明者らは以前に、この同じプラスミドをpSD5-hsp60-MT3692と呼んだ。しかし、この株の実際のプロモーターはハンセン菌(Mycobacterium leprae)のhsp65遺伝子のプロモーターである。従って、本発明者らは、本プラスミドをpSD5-hsp65-MT3692と、より正確に言及する。
【図２３】図２３は、図２２に示した形質転換実験から得られたBCG-Tice-disA-OEのクローン2が、disA遺伝子を強く発現していることを示す。リアル-タイムPCRを用いて、4種の異なったBCG-Tice-disA-OEクローンにおけるdisA発現の違いを示した。遺伝子発現を、対数増殖期の培養物を用いて、SYBRグリーンに基づく定量リアル-タイムPCRを用いて、後期対数増殖期の培養物から単離した全RNAにおいて、測定した。本グラフのデータ・ポイントは、3回の独立した実験の平均±標準誤差平均(SEM)を表す。内部コントロールとして、ヒト型結核菌(M. tuberculosis) sigA(Rv2703)を使用した。2-ΔΔCT法を用いてデータ解析を行った。スチューデントt検定に続いてウェルチ補正をした(Welch correction)(*** P<0.001；** P<0.01)。本発明者らはBCG-Tice-disA-OEクローン2のシードロット(seedlot)を作製し、このクローンを、後に続く全ての研究において、単に「BCG-Tice-disA-OE」と呼ぶ。
【図２４】図２４は、BCG-Pasteur-WTと比較して、BCG-Pasteur-disA-OEに感染させたマウス骨髄由来マクロファージにおいて、IRF3の誘導が、強く、統計的に有意に増強されたことを示す。マウス(C57BL/6)骨髄由来マクロファージを、BCG Pasteurの野生型及びdisA過剰発現株に(20 MOI)、3時間、感染させた。細胞を温めたDPBSで洗浄して、内部に取込まれなかった桿菌を除去し、続いて更に3時間インキュベートした。IRF3の発現は、細胞溶解物から単離した全RNAにおいて、SYBRグリーンに基づいた定量リアル-タイムPCRを用いて測定した。本グラフのデータ・ポイントは、3回の独立した実験の平均±標準誤差平均(SEM)を表す。マウスのベーター・アクチンを内部コントロールとして使用した。2-ΔΔCT法を用いてデータ解析を行った。スチューデントt検定に続いてウェルチ補正をした(Welch correction)(*** P<0.001；** P<0.01)。
【図２５】図２５は、STINGが、BCG-WT及びBCG-disA-OEに応答して、I型IFN(IFN-β)誘導が増強されるのに必要であることを示す。STINGを欠失させた(STING-KO)野生型動物由来のマウス(C57BL/6)骨髄由来マクロファージを、種々の株のBCGに(MOI=1:20)、3時間、感染させた。細胞を温めたDPBSを用いて洗浄して、内部に取込まれなかった桿菌を除去し、続いて更に24時間インキュベートした後、培養上清を回収した。IFN-βのELISAを、製造業者の指示に従って培養上清中において実施した。データ・ポイントは、3回の独立した生物学的実験の平均±標準誤差平均(S.E.M.)を表す。スチューデントt検定に続いてウェルチ補正をした(Welch correction) (** P<0.01)。
【図２６】図２６は、インターフェロン-βが、マウスBMDM、BMDC及びJ774.1マクロファージにおいて、disAを過剰発現するBCG株への曝露時に、誘導され、並びにそのIFN-β応答が、BCG-Pasteur-disA-OE及びBCG-Tice-disA-OEについての方が、対応するBCG-WT株についてよりも、統計的に有意に大きいことを示す。マウス(C57BL/6)骨髄由来マクロファージ(BMDM)、及びJ774.1マクロファージを、種々のBCG株に(MOI: 20)、3時間、感染させた。内部に取込まれなかった桿菌を温めたDPBSを用いて洗浄し、細胞を更に24時間インキュベートした。IFN-βのレベルを、製造業者の指示に従って、ELISAを用いて、培養上清中で、定量した。データ・ポイントは、3回の独立した生物学的実験±標準誤差平均(S.E.M.)を表す。データ解析を、対応の無いt検定を用いて行った(*** P<0.001；** P<0.01；*P<0.05)。
【図２７】図２７は、IL-6が、マウスのBMDM、BMDC及びJ774.1マクロファージにおいて、disAを過剰発現するBCG株への曝露に応答して、誘導され、並びにそのIL-6応答が、BCG-Pasteur-disA-OE及びBCG-Tice-disA-OEについての方が、対応するBCG-WT株についてよりも、統計的に有意に大きいことを示す。マウス(C57BL/6)骨髄由来マクロファージ(BMDM)、及びJ774.1マクロファージを、種々のBCG株に(MOI: 20)、3時間、感染させた。内部に取込まれなかった桿菌を温めたDPBSを用いて洗浄し、細胞を更に24時間インキュベートした。IL-6のレベルを、製造業者の指示に従って、ELISAを用いて、培養上清中で、定量した。データ・ポイントは、3回の独立した生物学的実験±標準誤差平均(S.E.M.)を表す。データ解析を、対応の無いt検定を用いて行った(*** P<0.001；** P<0.01；*P<0.05)。
【図２８】図２８は、TNFが、マウスのBMDM、BMDC及びJ774.1マクロファージにおいて、disAを過剰発現するBCG株への曝露に応答して、誘導され、並びにその応答が、BCG-Pasteur-disA-OE及びBCG-Tice-disA-OEについての方が、対応するBCG-WT株についてよりも、統計的に有意に大きいことを示す。マウス(C57BL/6)骨髄由来マクロファージ(BMDM)、及びJ774.1マクロファージを、種々のBCG株に(MOI: 20)、3時間、感染させた。内部に取込まれなかった桿菌を温めたDPBSを用いて洗浄し、細胞を更に24時間インキュベートした。TNFのレベルを、製造業者の指示に従って、ELISAを用いて、培養上清中で、定量した。データ・ポイントは、3回の独立した生物学的実験±標準誤差平均(S.E.M.)を表す。データ解析を、対応の無いt検定を用いて行った(*** P<0.001；** P<0.01；*P<0.05)。
【図２９】図２９は、TNF及びIFN-γが、ラット膀胱がんNBT-II細胞株において、disAを過剰発現するBCG株への曝露に応答して、誘導され、並びにその2つの応答が、BCG-Pasteur-disA-OE及びBCG-Tice-disA-OEについての方が、対応するBCG-WT株についてよりも、統計的に有意に大きいことを示す。NBT-II細胞を、野生型及び組換えのBCG株に、3時間、感染させた。内部に取込まれなかった桿菌を温めたDPBSを用いて繰り返し洗浄し、細胞を更に24時間インキュベートした。培養上清を用いて、TNF及びIFN-γを、定量した。データ・ポイントは、3回の独立した生物学的実験±標準誤差平均(S.E.M.)を表す。データ解析を、対応の無いt検定を用いて行った(*** P<0.0001；** P<0.001；*P<0.05)。
【図３０】図３０は、IFN-β、IFN-γ、TNF及びIL-1βが、移行上皮パピローマ(transitional cell papilloma)RT4膀胱がん細胞株において、disAを過剰発現するBCG株への曝露に応答して、誘導され、並びにその2つの応答が、BCG-Pasteur-disA-OE及びBCG-Tice-disA-OEについての方が、対応するBCG-WT株についてよりも、統計的に有意に大きいことを示す。RT4細胞を、野生型及び組換えのBCG株に、3時間、感染させた。内部に取込まれなかった桿菌を温めたDPBSを用いて繰り返し洗浄し、細胞を更に24時間インキュベートした。培養上清を、製造業者の指示に従って用いて、サイトカインを定量した。データ・ポイントは、2回の独立した生物学的実験±標準誤差平均(S.E.M.)を表す。データ解析を、対応の無いt検定を用いて行った(*** P<0.001；** P<0.01；*P<0.05)。
【図３１】図３１は、BCG-disA-OEが、BCG-WTよりも、複数の膀胱がん細胞株において、IFN-βのレベルの増加を大きく刺激することを示す。本図は、BCG-WT、BCG-disA-OE、及びLPSに曝露させた後の、IFN-β mRNAのレベル(2-ΔΔCT法による相対的な発現)を示す。5637細胞はヒト筋層浸潤膀胱がん細胞であり、RT4細胞はヒト移行上皮パピローマ(transitional cell papilloma)膀胱がん細胞、及びNBT-II細胞はN-ブチル-N-(-4-ヒドロキシブチル)ニトロソアミンにより誘発したラット膀胱がん細胞である。
【図３２】図３２は、エアロゾル感染後の様々な時点における、BCG-WT及びBCG-disA-OEが感染したマウス肺における、IFN-β、IFN-γ、IL-6、及びTNFに関するサイトカイン応答を示す。本図から、ほとんどの時点で、ほとんどのサイトカインに関して、前記応答は、BCG-Pasteur-disA-OE及びBCG-Tice-disA-OEについての方が、対応するBCG-WT株についてよりも、大きいことが明らかである。BALB/cマウスを、図１９に記載したように、エアロゾル経路によって感染させた。感染後2、4、及び6週目に、マウス群を屠殺した。肺のホモジネートを調製し、サイトカインのレベルを、製造業者のプロトコールに従って、ELISAを使用して定量した(n=4動物/処置群± S.E.M.)。データ解析を、対応の無いt検定を用いて行った(*** P<0.001；** P<0.01；*P<0.05)。
【図３３】図３３は、エアロゾル感染から4週間後の、BCG-WT及びBCG-disA-OEが感染したマウス脾臓における、IFN-β、IFN-γ、IL-6、及びTNFに関するサイトカイン応答を示す。本図から、ほとんどのサイトカインに関して、前記応答は、BCG-Pasteur-disA-OE及びBCG-Tice-disA-OEについての方が、対応するBCG-WT株についてよりも、大きいことが明らかである。BALB/cマウスを、図１９に記載したように、エアロゾル経路によって感染させた。感染後4週目に、マウス群を屠殺した。脾臓のホモジネートを調製し、サイトカインのレベルを、製造業者のプロトコールに従って、ELISAを使用して定量した(n=4動物/処置群± S.E.M.)。データ解析を、対応の無いt検定を用いて行った(*** P<0.001；** P<0.01；*P<0.05)。
【図３４】図３４は、STING-アゴニストを過剰発現する抗生物質耐性遺伝子を持たない組換えBCGを生成する方法を示す。この実施例では、遺伝子組換えで、抗生物質耐性遺伝子を持たないBCGを作製し、BCG disA遺伝子を過剰発現させ、及び余剰c-di-AMP(既知のSTINGアゴニスト)を放出させる。しかしながら、同じ方策を用いて、Rv1354c(別の既知のSTINGアゴニストであるc-di-GMPを作るジグアニレート・シクラーゼ)、DncV（別の既知のSTINGアゴニストである3'-3'-cGAMPを作る、コレラ菌(Vibrio cholerae)由来のサイクリックGMP-AMP合成酵素)、cGAS(別の既知のSTINGアゴニストである2'-3'cGAMPを作る、ヒト由来のサイクリックGMP-AMP合成酵素)、又はSTINGアゴニストを生成する別の類似の酵素遺伝子を過剰に発現させることがある。  工程1において、BCG-WT株を、プラスミドpJV53(配列番号(SEQ ID NO): 32)をエレクトロポレーションし、及びカナマイシン含有7H11寒天プレート上で選択することによって形質転換する。pJV53には、それぞれRecE及びRecTのホモログをコードするマイコバクテリオファージChe9cのgp60及びgp61遺伝子がある。Che9cのgp60及びgp61は、それぞれエキソヌクレアーゼ活性及びDNA結合活性をコードし、これらのタンパク質が発現すると、マイコバクテリウム属の相同組換え能力が実質的に上昇する。工程1によって、本図に示すように、「組換え能の高いBCG」が生じる。形質転換体を確認した後、その陽性クローンをカナマイシンの存在下で増殖させ、これを用いてエレクトロコンピテント細胞を作る。これらのエレクトロコンピテント細胞を調製するために、バクテリアを、中期対数増殖期にまで増殖させ、24時間、0.2 %アセトアミドで誘導して(Che9c gp60及びChe9c gp61組換え遺伝子の発現がアップレギュレーションする) 、エレクトロコンピテントにする。  工程2において、配列番号(SEQ ID NO): 33に対応する線状化した対立遺伝子交換基質(allelic exchange substrate (AES))の構築物を生成する。前記AES(配列番号(SEQ ID NO): 33)は、一方の側にpanCDオペロンの5'UTRの500bp、他方の側にpanCDオペロンの3'UTRの500bpが隣接する、dif-Hyg-difカセット(配列番号(SEQ ID NO): 34)配列を含む。前記AES(配列番号(SEQ ID NO): 33)を、panCDオペロンの5'UTRの500bp及びpanCDオペロンの3'UTRの500bpを、pUC-Hygプラスミド(配列番号(SEQ ID NO): 35)中にクローニングすることによって構築し、プラスミドpUC-Hyg-panCD-KO(配列番号(SEQ ID NO): 36)が生じる。pUC-Hyg-panCD-KO(配列番号(SEQ ID NO): 36)を、NruI及びNcoIでの消化によって切断して、配列番号(SEQ ID NO): 33に対応する線状AESを得る。或いは、プライマー配列番号(SEQ ID NO): 28及び配列番号(SEQ ID NO): 29を使用して、線状のAES(配列番号(SEQ ID NO): 33)を増幅する。次いで、配列番号(SEQ ID NO): 33に対応する線状化対立遺伝子交換基質(allelic exchange substrate (AES))の構築物を、「組換え能の高いBCG」中にエレクトロポレーションし、クローンをハイグロマイシン及びカナマイシン含有7H11寒天プレート上で選択する。この工程により、前記AES(配列番号(SEQ ID NO): 33)が相同組換えによって染色体のpanCDオペロン中に組み込まれた「panCD KOカセットを有するBCG」が得られる。  工程3において、「panCD KOカセットを有するBCG」の数百個のコロニーを、(i)カナマイシン含有7H11寒天プレート及び(ii) パントテネート(pantothenate) (24 μg/ml)を補充したカナマイシン含有7H11寒天の両方に、レプリカで播種する。Kan耐性のパントテネート(pantothenate)栄養要求性クローンは、パントテネート(pantothenate) (24 μg/ml)を補充したカナマイシン含有7H11寒天上でのみ増殖し、パントテネート(pantothenate)を欠くカナマイシン含有7H11寒天プレート上では増殖しないクローンとして選択される。この工程の過程で、dif部位を認識し、及び組換えを起こすマイコバクテリウム属のXerリコンビナーゼの天然の作用より、ハイグロマイシン・カセットが切り出されて消失し、図のように「pJV53を有するパントテネート(pantothenate)栄養要求株」であるクローンが生じる。  工程4において、「pJV53を有するパントテネート(pantothenate)栄養要求株」を、スクロースを含む7H11寒天プレートに播種し、sacB遺伝子(スクロースの存在下で致死性を与える)を保有するpJV53を喪失したクローンを選択する。スクロース耐性クローンを選択し、カナマイシン感受性であることを確認する。これによって、「pJV53を含まないパントテネート(pantothenate)栄養要求株」のクローンを得る。  工程5において、エレクトロコンピテントな「pJV53を含まないパントテネート(pantothenate)栄養要求株」を調製する。前記プラスミド「pSD5.phsp65-disA.panCD-No Kan」（配列番号(SEQ ID NO): 31）を、図３６に記載するように作製する。配列番号(SEQ ID NO): 31)を「pJV53を含まないパントテネート(pantothenate)栄養要求株」にエレクトロポレーションし、そしてクローンを、パントテネート(pantothenate)を含まない7H11寒天上に播種して、所望の「disA-OEプラスミドを有するパントテネート(pantothenate)栄養要求株」を得る。候補クローンを、関連する遺伝子のPCR及び全ゲノム・シークエンシングによって確認する。
【図３５】図３５は、配列番号(SEQ ID NO): 33であるpanCD対立遺伝子交換基質(allelic exchange substrate (AES))を含むDNAフラグメントの分子構造を示す。
【図３６】図３６は、「pSD5.hsp65-disA.panCD--No Kan」(配列番号(SEQ ID NO): 31)を生成するために使用する方策を示す。このスキームは、Kanカセット「pSD5.hsp65-disA.Kan」(配列番号(SEQ ID NO):30)をpanCDオペロンで置換して、「pSD5.hsp65-disA.panCD--No Kan」(配列番号(SEQ ID NO): 31)を生成する。
【図３７】図３７は、配列番号(SEQ ID NO): 32である組換えプラスミドである、pJV53の分子構造を示す。
【図３８】図３８は、配列番号(SEQ ID NO): 35であるHygカセットに隣接するdif部位を有するプラスミドである、pUC-Hygの分子構造を示す。pUC-Hygを使用して、プラスミド「pUC-Hyg-panCD-KO」(配列番号(SEQ ID NO): 36)を作製する。
【図３９】図３９は、配列番号(SEQ ID NO): 36であるプラスミド「pUC-Hyg-panCD-KO」の分子構造を示す。「pUC-Hyg-panCD-KO」を、Hygカセットの一方に隣接してpanCD 5'UTRの500bpをクローニングし、他方に隣接してpanCD 3'UTRの500bpをクローニングすることによって、生成する。
【図４０】図４０は、配列番号(SEQ ID NO): 30であるプラスミド「pSD5.hsp65-disA.Kan」の分子構造を示す。
【図４１】図４１は、配列番号(SEQ ID NO): 31であるプラスミド「pSD5.hsp65-disA.panCD-No Kan」の分子構造を示す。このプラスミドは、図３６に例示したスキームを使用して生成される。
【図４２】図４２は、本発明において使用した核酸及びタンパク質配列のいくつかを示す。
【図４３】図４３は、本発明において使用した核酸及びタンパク質配列の説明を示す。
【図４４】図４４は、陽性検体の数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
［発明の詳細な説明］
いくつかの実施形態において、本発明は、組換えBCG(以下、「rBCG」)株を生成する、ウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)のBCG(以下、「BCG」)の遺伝子改変に関する。これらの株は、(i)結核のワクチン及び／又は(ii)筋層非浸潤性膀胱がん(NMIBC)の免疫療法として、より強い効力を有する。本発明のいくつかの実施形態は、マクロファージ、樹状細胞などのヒト食細胞から重要な免疫調節応答を誘発することが知られている、サイクリック・ジ-ヌクレオチド(CDN)を高いレベルで合成する、及び分泌するBCG株に関する。本発明の別の実施形態は、BCGの遺伝子改変を組み合わせて、新規なCDN合成遺伝子物質の付加及び／又はCDNの蓄積及び放出を増強する内因性BCGホスホジエステラーゼ遺伝子又は遺伝子ドメインの変異を含む、多価のCDN過剰発現改変体を生成することである。
【００７４】
BCG
BCG(カルメット・ゲラン菌(bacillus Calmette Guerin))は、1921年にフランスの微生物学者カルメットとゲランが、病原性ウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)を13年間連続継代することによって作製された、ウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)の突然変異体である。1921年から1960年の間に、BCGは、多数の世界の研究所で連続継代され、規定されるシードロット(seedlot)が確立され、参照研究所(reference laboratories)に寄託された。そのようなものとして、BCGパスツール(BCG Pasteur)、BCGタイス(BCG Tice)、BCG東京、BCGデンマーク、BCGモントリオールなどのBCGの多くの変異型が世界中に存在する。現在では、既存のBCG株の大部分は、全ゲノム・シークエンシングによって定義されている。病原性ウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)と各種BCG株との主な相違点としては、病原性結核菌と比較して、BCGでは、ゲノム欠失を含む少なくとも15領域の欠失の相違が含まれる。BCGを開発する中で生じた主要領域の違いは、RD1(Esx-1分泌系の喪失につながる、並びに抗原ESAT-6及びCFP-10が放出されなくなる、9.5kbの欠失)及びRD3(9.2kbの欠失)であった。病原性結核菌と比較して、全てのBCG株では、RD4-RD11の領域の違いは認められない。
【００７５】
1920年代以降、BCGは、結核(TB)を予防するためのワクチンとして使用されてきている。2004年には、BCGは、約1億人の子どもたちに接種されたと推定されており、それゆえ、その導入以来、BCGは、約50億人のヒトに接種されてきており、そのようなものとして歴史的に、最も広く利用されているワクチンである。最も一般的には、出生時に皮内投与され、現在まで、米国、カナダ、及びヨーロッパの一部を除くほとんどの国で依然として投与されている。BCGは、小児期の播種性結核の発生率を低下させることが示されているが、BCG接種者を結核のリスクから完全には防御していない。
【００７６】
1977年以来、BCGは、筋層非浸潤性膀胱がん(NMIBC)のがん免疫療法としても広く使用されてきている。6週間の間、毎週、膀胱内に投与し、高リスク疾患などの場合は、初回治療後、3、6、12、18、24、30、及び36ヵ月目に、維持療法として、週1回3週間投与する。膀胱内投与のBCGは、(i)主にCD4 T細胞及びマクロファージからなる単核細胞の浸潤を誘導し、(ii)膀胱におけるインターフェロン・ガンマ(IFNγ)の発現を増大させ、(iii)IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IFNγ、及びTNFαの尿中サイトカイン・レベルを増大させる、ことが示されている。
【００７７】
(i)結核に対するワクチン、及び(ii)NMIBCに対する免疫療法、としてBCGが世界的に広く使用されているにもかかわらず、その有効性にはかなりの改善の余地がある。結核に対しては、BCGは、主に小児期の播種性結核を部分的に防御するにしかすぎない。NMIBCについては、患者の約30%にBCG抵抗性疾患が認められる。これらの患者には、全身化学療法による、よりリスクの高い治療が必要であり、より侵襲性の高い膀胱がんへと進行する確率が高い。
【００７８】
尿路上皮がん
膀胱の尿路上皮がんは、尿路の最も一般的な悪性腫瘍である。男性では4番目に多く、女性では11番目に多くみられるがんである。米国では、2017年に、新たに約79,000例の膀胱がんが診断され、19,870例の死亡と関係している、と推定されている。膀胱がん患者の推定5年生存率は78%であるが、局所進行性の又は転移病変を有する患者ではこの割合が劇的に低下する。膀胱がん患者の約75%は、筋層非浸潤性膀胱がん(NMIBC)として知られる、粘膜(ステージTa、上皮内がん(carcinoma in situ))又は粘膜下層(ステージT1)に限局する疾患を呈する。NMIBCに対しては、経尿道的切除術(transurethral resection)が初期治療として選択される。筋線浸潤性膀胱がん(MIBC；T2以上)の患者場合、ファースト-ラインの治療選択肢は、白金製剤を含む化学療法とその後の膀胱摘出である。膀胱内注入療法に反応しないNMIBC患者では、MIBCへの進行リスクが高い。このように、再発率が高く、進行するリスクが大きいため、追加治療を実施することが必須である。従って、高リスクNMIBC患者の臨床転帰を改善するには、新規な治療法を開発することが必要である。
【００７９】
NMIBCのために1970年代に開発された、カルメット・ゲラン菌(Bacillus-Calmette Guerin) (BCG)の膀胱内投与は、できあがった固形がんに対する、最初に成功した免疫療法であり、NMIBC患者の標準治療であり続けている（Askeland EJ, Newton MR, O'Donnell MA, Luo Y. Bladder Cancer Immunotherapy: BCG and Beyond. Adv Urol. 2012;2012:181987. PMID: 22778725、Morales A. BCG: A throwback from the stone age of vaccines opened the path for bladder cancer immunotherapy. Can J Urol. 2017;24:8788-8793. PMID:  28646932）。ウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)の弱毒株であるBCGの抗腫瘍作用の正確な機序は、不明なままであるが、フィブロネクチン及びインテグリンα5β1を介して尿路上皮に結合した後、Th1反応を主とする、強力な免疫細胞性及び体液性免疫応答が調整されること、と考えられている(Redelman-Sidi G, Glickman MS, Bochner BH. The mechanism of action of BCG therapy for bladder cancer--a current perspective. Nat Rev Urol. 2014;11:153-62. PMID: 24492433)。しかしながら、BCG治療に対する典型的な完全奏効率は、乳頭状腫瘍で55-65%、上皮内がん(carcinoma in situ (CIS))で70-75%である（Askeland EJ, Newton MR, O'Donnell MA, Luo Y. Bladder Cancer Immunotherapy: BCG and Beyond. Adv Urol. 2012;2012:181987. PMID: 22778725、Morales A. BCG: A throwback from the stone age of vaccines opened the path for bladder cancer immunotherapy. Can J Urol. 2017;24:8788-8793. PMID:  28646932）。従って、BCG無反応性及び再発性疾患の患者に対する負担、並びに治療に不忍容の患者に対する負担により、NMIBCに対するBCGの有効性を更に改善する必要性が増している。
【００８０】
CDNは、TB及びNMIBCに対して重要な免疫応答を生み出す重要なPAMPやDAMPである。
バクテリア性病原体関連分子パターン(pathogen associated molecular pattern) (PAMP)。ヒト細胞は、細胞質監視プログラム(cytosolic surveillance program (CSP))として知られる自然免疫監視システムを利用して、細胞質中のサイクリック・ジヌクレオチド等の核酸を検出する。CSPは、元々は、ウイルス防御システムとして特性が明らかにされたが、現在では、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、リステリア菌、サルモネラ菌種などの細胞内バクテリアに対する抗バクテリア防御において重要であることが示されている。STING、cGAS、DDX41及び他の多くのものを含む細胞質パターン認識レセプター(pattern recognition receptor (PRR))は、それらを活性化する細胞質のCDN及び核酸に結合することが可能である。重要なシグナル伝達の事象は、TBK1及びIRF3の活性化並びにその後のI型インターフェロン発現のアップレギュレーションを導くSTINGの活性化である。サイクリック・ジヌクレオチドによりSTINGが活性化すると、TBK1-IRF3経路とは独立して、CCL2及びCCL20などのケモカインを誘導するSTAT6も誘導される。STINGが活性化すると、また、IκBキナーゼ(IKK)が活性化することを介して、転写因子NFκBを活性化するとも考えられている。
【００８１】
ヒト危険関連分子パターン(danger associated molecular pattern) (DAMP)。サイクリックcGAMP(cGAS)合成酵素は、細胞質DNAを認識する細胞質PRRである。DNAに結合すると、それは、2'3' cGAMPの形成を触媒する、そのコア酵素活性を活性化するコンホメーションに変化する。2'3' cGAMPは、次に、STING-TBK1-IRF3軸を活性化する強力なDAMPであり、STAT6活性化及びIKK活性化と同様にI型インターフェロン発現の増加をもたらす。
【００８２】
CDN誘発性免疫応答のSTINGを介したメカニズム。I型IFN（腫瘍環境内の自然免疫細胞及び腫瘍細胞自身によって産生される）は、いくつかの悪性腫瘍に対して抗腫瘍作用を媒介することが知られているが、これは、I型IFNが全てのフェーズのがん免疫編集に介入できるためである(Zitvogel L, Galluzzi L, Kepp O, Smyth MJ, Kroemer G. Type I interferons in anticancer immunity. Nat Rev Immunol. 2015;15:405-14. PMID: 26027717)。STING (インターフェロン遺伝子の刺激因子(stimulator of interferon genes))は、センサー・サイクリックGMP-AMP合成酵素(cGAS)が細胞質DNAを認識した後の、病原体に対するI型IFN自然免疫応答の主要な調節因子である。cGASは、サイクリックGMP-AMP(cGAMP)の合成を触媒し、cGAMPは、次にSTINGに結合して活性化するセカンド・メッセンジャーとして機能する(Zhao GN, Jiang DS, Li H. Interferon regulatory factors: at the crossroads of immunity, metabolism, and disease. Biochim Biophys Acta. 2015;1852:365-78. PMID:24807060)。それ故に、組換えI型IFN、I型IFNをコードするベクター、I型IFN発現細胞、及びSTINGアゴニストに基づく新規な抗がん免疫療法が、新規腫瘍免疫療法として現在開発されている。
【００８３】
PAMP免疫調節剤、3'-5' c-di-AMPの過剰発現。3'-5' c-di-AMPは、STING-TBK1-IRF3軸の強力なインデューサーである。それは、BCGを含むマイコバクテリウム属により、DisAタンパク質(BCG中のBCGタンパク質WP_010950916.1、結核菌タンパク質Rv3586又はP9WNW5.1)をコードするdisA遺伝子で産生される。ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)(M.tb)は、c-di-AMPを合成及び分泌し、これにより、STINGシグナル伝達及びcGASを介して、インターフェロン調節因子(IRF)経路及びI型IFN応答が活性化される(Ahmed D, Cassol E. Role of cellular metabolism in regulating type I interferon responses: Implications for tumour immunology and treatment. Cancer Lett. 2017;409:20-29. PMID: 28888999.)。c-di-AMPを過剰発現するM.tbは、マウス・モデルにおいて、結核を緩和した。粘膜アジュバントとして、c-di-AMPは、免疫刺激作用を発揮し、樹状細胞の成熟、共刺激分子のアップレギュレーション及び向-炎症性サイトカインの産生、並びに病原体に対する強いTh1、Th17及びCD8 T細胞応答、を引き起こす。c-di-AMPを過剰発現するBCG株(rBCG-disA又はBCG-disA-OE)が構築されており、それによって、驚くべきことに、BCG自体よりも有意に高いIRF及びIFN-β応答が生成されることが、見出され、バクテリア由来のc-di-AMPが、ESX-1タンパク質分泌系が無いにも関わらず、宿主細胞の細胞質に接近できるようになることを示している(Ahmed D, Cassol E. Role of cellular metabolism in regulating type I interferon responses: Implications for tumour immunology and treatment. Cancer Lett. 2017;409:20-29. PMID: 28888999.)。これらの発見は、c-di-AMPを過剰発現するように改変したrBCG株が、BCG自体よりも、膀胱がんに対するより優れた保護的な免疫を誘発する可能性があることを示唆している。
【００８４】
M.tb disA (MT3692)を過剰発現するBCGに応答したマウス骨髄由来マクロファージ(BMDM)における向-炎症性Th1サイトカインの誘導：  M.tbゲノムは、ATP又はADPからc-di-AMPを合成するジ-アデニレート・シクラーゼ酵素(DisA、DacAとも呼ばれ、UniProtKB/Swiss-ProtデータベースのP9WNW5.1)をコードする。BCGタンパク質WP_010950916.1(NCBI参照番号)は、ヒト型結核菌(M. tuberculosis)のDisAと100%同一である。disAを過剰発現するM.tb株は、c-di-AMP（STING依存的なIFN-β産生を活性化するユニークなバクテリアPAMP）を過剰に放出することによって、マクロファージを毒する(Ahmed D, Cassol E. Role of cellular metabolism in regulating type I interferon responses: Implications for tumour immunology and treatment. Cancer Lett. 2017;409:20-29. PMID: 28888999.)。非病原性ワクチン株の抗原レパートリーを拡大するために、強力なマイコバクテリウム属のプロモーターであるPhsp60に連結した、M.tb由来のdisA遺伝子(ヒト型結核菌(M. tuberculosis) Rv3586又はMT3692) (Mtb及びBCG disA遺伝子は100%同一)を有する、カナマイシン耐性(Kan-R)を付与するプラスミドを使って、BCG Pasteurを形質転換した。このプラスミドをBCG-Pasteurに加えると、disA mRNAのレベルが50倍に増加した(図１ｂ)。近縁のM.tb-disA-OE株は、野生型M.tbよりも15倍多くのc-di-AMPをマクロファージの細胞質に放出する(図１ａ)。従って、BCG-disA-OEも、宿主の細胞質中に、より多くのc-di-AMPを放出することが予想される。これらのdisA過剰発現組換え体(rBCG又はBCG-disA-OE)は、親株と比較して、STING依存的IFN-βに関する、より良好なインデューサーであった。最も重要なことは、2016年2月10日に出願されたPCT/US2016/017248に記載されているように、rBCGでワクチン接種したモルモットは、病原性M.tbによるエアロゾル感染に対して、有意により良好に保護されており、現存するBCG株よりも保護効果が改善されていることが示唆される。
【００８５】
図２に示すように、BCG-Pasteur disA-OEによって誘発される免疫応答を、in vitroのマクロファージ感染モデルにおいて試験した。BCG-Pasteur disA-OEに感染したC57BL/6マウス由来のBMDMは、非感染の又は野生型BCGに感染のマクロファージに比べて、IFN-β、TNF-α、IL-6及びIL-2が有意にアップレギュレーションした。
【００８６】
図３に示すように、増大したc-di-AMPベースのSTING活性化が、RAWBlue ISGマクロファージにおいて確認された。RAWBlueマクロファージは、BCG-Pasteur disA-OEに感染させた場合、親株のコントロールと比較して、IRF3レベルが増加した。
【００８７】
図４に示すように、BCG-Pasteur-disA-OEを感染させたマウスBMDMの培養上清において、向-炎症性サイトカイン(TNF-α、IL-6及びIL-1β)の分泌が有意に上昇することが、認められた。これらの発見は、抗原レパートリーが増加したBCG-Pasteur-disA-OEは、STINGアゴニストのように作用し、それ故に、STING依存的なI型IFNの強力なインデューサーであることを示す。更に、BCG-Pasteur disA-OEに応答したマクロファージの免疫応答は、Th1寄りに偏っていて、この表現型によって、BCG免疫療法はNMIBCをコントロールすることができる。
【００８８】
図５に示すように、BCG-disA-OEは、ヒト膀胱がん(RT4)細胞において、抗腫瘍免疫応答を誘発する。BCG-Pasteur-disA-OEを評価して、WT株BCG-Pasteur及びOncoTICE(現行の免疫療法のBCG株)と比較して、膀胱がん(BC)細胞において、同様の免疫応答を誘発するかどうかを調べた。ヒトNMIBC腫瘍由来のヒトRT4 BC細胞に、野生型(Pasteur及びTICEの両方)並びに組換えBCG Pasteur disA-OE株を、1:20(RT4 :: BCG)で、3時間、抗原負荷し、非感染細胞と比較して、遺伝子発現プロファイルの違いを測定した。単球走化性タンパク質1(monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1))/CCL2、IFN-β及びIL-1βなどの主要な免疫メディエーターは、野生型株に対する応答と比較して、BCG-Pasteur-disA-OEに曝露した膀胱がん細胞において、有意に増加することが認められた。
【００８９】
図６に示すように、NMIBCのMNU発がん物質モデルにおいて、膀胱内BCG-disA-OE免疫療法が、Th1応答の増強及び抗腫瘍効果につながるかどうかを試験するための実験系を設定した。RT4細胞を用いた前述の実験の結果から、本発明者らは、ビバラクア(Bivalacqua)研究室で最初に開発された、in vivoラットNMIBCモデルにおいて（Kates M, Nirschl T, Sopko NA, Matsui H, Kochel CM, Reis LO, Netto GJ, Hoque MO, Hahn NM, McConkey DJ, Baras AS, Drake CG, Bivalacqua TJ. Intravesical BCG Induces CD4(+) T-Cell Expansion in an Immune Competent Model of Bladder Cancer. Cancer Immunol Res. 2017;5:594-603. PMID: 28588015）、BCG-Pasteur disA OEの相対的な治療効果を評価することにした。このモデルでは、発がん性のアルキル化剤であるN-メチル-N-ニトロソ尿素(MNU)を用いて、メスのフィッシャー・ラットにおいて、尿路上皮がんを誘導する。
【００９０】
図７に示すように、BCG-disA-OEは、ラット膀胱がんモデルにおける、顕著な免疫療法効果を有する。尿路上皮異形成が、MNUを注入した後8週間以内に発症し、初回注入後16週目までに、全てのラットが上皮内がん(carcinoma in situ)、乳頭状Ta、又はより高いグレードT1尿路上皮がんを呈し、組織病理学的及び免疫表現型的特徴は、ヒト尿路上皮がんで観察されるものと類似している。このモデルを用いて、ビバラクア(Bivalacqua)研究室は、膀胱内BCG免疫療法によって、尿路上皮において、CD4+ T細胞集団が大きく一過性に増加することを示した（Kates M, Nirschl T, Sopko NA, Matsui H, Kochel CM, Reis LO, Netto GJ, Hoque MO, Hahn NM, McConkey DJ, Baras AS, Drake CG, Bivalacqua TJ. Intravesical BCG Induces CD4(+) T-Cell Expansion in an Immune Competent Model of Bladder Cancer. Cancer Immunol Res. 2017;5:594-603. PMID: 28588015）。BCG-disA-OE株の膀胱内注入をMNU処置ラットで実施し、腫瘍が観察された場合、MNU誘導8週間後から、6週間にわたり毎週連続して投与した。膀胱腫瘍を、WHO-ISUP分類に従って、記載された基準に従って各群毎に算出した腫瘍浸潤パーセント(Ta、T1及びCISの合計)を使って、GU病理医によってステージ分類した（Kates M, Nirschl T, Sopko NA, Matsui H, Kochel CM, Reis LO, Netto GJ, Hoque MO, Hahn NM, McConkey DJ, Baras AS, Drake CG, Bivalacqua TJ. Intravesical BCG Induces CD4(+) T-Cell Expansion in an Immune Competent Model of Bladder Cancer. Cancer Immunol Res. 2017;5:594-603. PMID: 28588015）。BCG-Pasteur disA-OEで処置したラットでは、無処置の又はBCG-Pasteurで処置したラットの膀胱と比較して、腫瘍浸潤指数（tumor involvement index）の有意な低下が認められた。
【００９１】
図８に示すように、BCG-disA-OEは、免疫療法を受けているラット膀胱において、特徴的なサイトカイン及びケモカインのシグナチャー（signature）を誘導する。BCG-disA-OEで処置したラットのラット膀胱は、無処置の又はBCG-Pasteurで処置したラットと比較して、IFN-α/β、IFN-γ、IL-1β、TNF-α、TGF-β、iNOS、IP-10、MCP-1及びMIP-1αが有意に誘導された。
【００９２】
図９に示すように、BCG-Pasteur-disA-OEで処置したラットの膀胱では、CCL2+ マクロファージ、Nos2+ 及びIL-1β+ M1マクロファージの浸潤が増加し、IL-6及びIFNの発現が増加することの証拠が見出された。興味深いことに、IP-10レベルの増加が認められ、これはIFN-γの増加とともに、感染部位及び炎症部位にT細胞を強力に集めることを促進することが知られている。
【００９３】
図１０は、初代細胞、がん細胞株、及びラット膀胱がん組織において、BCG-disA-OE対BCG-WTで観察されたサイトカイン発現レベルの変化のまとめを示す。見ての通り、Th1 T細胞及びM1マクロファージの増殖に関連するサイトカイン、2種類のI型インターフェロン、並びに3種類の向-炎症性ケモカインは、これらの細胞、細胞株及び組織にわたり、BCG-WTと比較して、BCG-disA-OEによって有意にアップレギュレーションした(2倍~30倍)。対照的に、Th2 T細胞及びM2マクロファージの増殖に関連するサイトカインは、BCG-WTと比較して、BCG-disA-OEによって、概してダウンレギュレーションした(1倍~10倍)。
【００９４】
図１１に示すように、BCG免疫療法は、3つの免疫メカニズムを介して効果を発揮することがある：(i)腫瘍特異的な細胞傷害性CD8 T細胞の生成が増加すること、(ii)腫瘍抗原に対するマクロファージを介したCD4細胞活性化を促進するサイトカイン環境、及び(iii)殺腫瘍活性を促進するマクロファージM1シフト。本明細書で報告された知見は、c-di-AMPを過剰発現するBCGが、膀胱腫瘍細胞、及び腫瘍微小環境に常在する又は集められた骨髄性細胞に取り込まれること、並びに宿主の免疫応答（STING及びI型IFN応答、並びにサイトカイン及びケモカインの分泌、マクロファージを集めること及びアポトーシスのメカニズムを促進するNF-κBシグナル伝達の活性化等（これらは全て総合的に腫瘍進行を低下させる）を含む）を誘導すること、を強く示す。
【００９５】
図１２に示されるように、PAMP分子c-di-AMPのレベルを増加させるdisAの過剰発現に加えて、更にBCGを組換えDNA改変して、それにより他のPAMP及びDAMP分子の産生を増強させることがある。図１２に示すように、他のCDNシクラーゼ--(i)BCG_RS07340タンパク質又はヒト型結核菌(M. tuberculosis)Rv1354cタンパク質のGGDEFドメイン(互いに100%同一)、(ii)2'-5'c-GAMP合成酵素であり、Swiss-ProtではQ9KVG7である、コレラ菌(Vibrio cholerae)DncVタンパク質、及び(iii)2'-3' cGAMP合成酵素であり、Swiss-ProtではQ8N884である、ヒトcGASタンパク質--に対する遺伝子をBCGに加えることがある。これらの加えたCDNシクラーゼ遺伝子は、単独で、又は併用して加えることがある。このような併用は、多価CDNを過剰発現するBCGを表す。また、図１３に示すように、BCGは、いくつかのCDNホスホジエステラーゼ遺伝子又はホスホジエステラーゼ・ドメインを含む遺伝子を有している。これらの内因性ホスホジエステラーゼ遺伝子及び遺伝子内ホスホジエステラーゼ・ドメイン：(i) ヒト型結核菌(M. tuberculosis)Rv2837cと100%同一であるBCG中のCDN PDEをコードする、BCG WP_003414507遺伝子(CdnP又はCnpBとも呼ばれる)、(ii)既知のCDN PDE であるヒト型結核菌(M. tuberculosis) Rv1354cタンパク質と100%同一であるタンパク質BCG_RS07340(以前はBCG_1416c)のEALドメインをコードするDNA、及び(iii)既知のCDN PDE ヒト型結核菌(M. tuberculosis)  Rv1357cと相同であるBCG AHM07112をコードする遺伝子、を除去するための組換え技術の方法。これらのPDEをコードする遺伝子を除去することは、本明細書中に開示されるrBCG株が産生するCDN PAMP及びDAMP分子のレベルを更に増加させるのに役立つ。
【００９６】
配列番号(SEQ ID NO):1
BCG及び他の関連したマイコバクテリウム属由来のジアデニレート・シクラーゼDisA、アミノ酸配列(358アミノ酸；BCGタンパク質AOQ92_RS18745；NCBI参照配列: NZ_CUWL01000001.1)。同一の配列はBCGの他の株に存在する（例えば、タンパク質Rv3586又はMT3692としてヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、及びタンパク質Mb3617としてウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)）。
【００９７】
【化１】
2021521798.tif 000003
【００９８】
配列番号(SEQ ID NO):2
BCG及び他の関連したマイコバクテリウム属由来のジアデニレート・シクラーゼdisA、DNA配列(1077ヌクレオチド[358コドン、1終止コドン]；BCG遺伝子AOQ92_RS18745をコードする；NCBI参照配列: NZ_CUWL01000001.1)。同一の配列はBCGの他の株に存在する（例えば、遺伝子Rv3586又はMT3692としてヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、遺伝子Mb3617としてウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)）。
【００９９】
【化２】
2021521798.tif 000004
【０１００】
配列番号(SEQ ID NO):3.
プラスミドpSD5B-Phsp60::disAは、Phsp60 プロモーターからBCG disA遺伝子を過剰発現させる、エピソーム的に複製する大腸菌-マイコバクテリウム属のシャトル・プラスミドである。DNA配列(7742ヌクレオチド；ハンセン菌(Mycobacterium leprae) hsp65遺伝子ヌクレオチドの一部を含むプロモーター Phsp60DNA である13~180に下線を付し；disAコーディング配列ヌクレオチド242~1318；ATG開始コドン及びTAA終止コドンを太字、下線で示す)。
【０１０１】
【化３】
2021521798.tif 000005
【化４】
2021521798.tif 000006
【化５】
2021521798.tif 000007
【化６】
2021521798.tif 000008
【化７】
2021521798.tif 000009
【化８】
2021521798.tif 000010
【化９】
2021521798.tif 000011
【０１０２】
disAを過剰発現しているマイコバクテリウム属は、病原性について弱毒化している。図１４に示すように、pSD5B Phsp60::disAプラスミドを保有するヒト型結核菌(M. tuberculosis) (M.tb-disA-OE若しくはMtb-OE)、又は野生型ヒト型結核菌(M. tuberculosis) (Mtb-CDC1551)のいずれかを、エアロゾル経路によって3.5 log10単位で、マウスに感染させた場合、その動物が死亡するまでの期間の中央値(median time to death (MTD))には大きな差がある。見ての通り、野生型ヒト型結核菌(M. tuberculosis) (Mtb-CDC1551)は、150.5日のMTDであったが、pSD5B Phsp60::disAプラスミドを保有するヒト型結核菌(M. tuberculosis) (M.tb-disA-OE又はMtb-OE)は、321.5日のMTDであり、有意により弱い病原体であった。BCG-WTと比較して、BCG-disA-OEでは、病原性が同程度に低下していることが期待される。従って、BCG-disA-OEをがん免疫療法として用いるべきであると考えられ、BCG-WTと比較して、血流による播種の割合の低下、排尿障害の軽減、尿意切迫感(urgency)の軽減及び不快感の軽減、が予想される。
【０１０３】
disA以外の、rBCGへのCDNシクラーゼの付加
タンパク質BCG_RS07340のGGDEFドメインを過剰発現させることによる、PAMP免疫調節物質、3'-5' c-di-GMPの過剰発現。  3'-5' c-di-GMPは、STING-TBK1-IRF3軸の強力なインデューサーである。それを、BCGを含むマイコバクテリウム属は、タンパク質BCG_RS07340(以前はBCG_1416c)のGGDEFドメイン及びヒト型結核菌(M. tuberculosis) Rv1354c遺伝子によって産生する。BCG_RS07340タンパク質(ヒト型結核菌(M. tuberculosis)Rv1354cタンパク質と100%同一)は、二機能性のジグアニレート・シクラーゼ／ジグアニレート・ホスホジエステラーゼをコードする。従って、ジグアニレート・シクラーゼとして機能する部位は、BCGにおける内因性のCDN産生酵素である。全長BCG_RS07340ポリペプチドは623アミノ酸長であり、そのドメイン構成は、図11に示すように、N末端-GAF-GGDEF-EAL-C末端、である。前記GAFドメイン(大体アミノ酸1-190辺り)は、他のドメインの活性に影響を及ぼす調節性ドメインである。前記GGDEFドメイン(大体アミノ酸190-350辺り)は、2 GTP → c-di-GMP + 2ピロリン酸、の反応を触媒するジグアニレート・シクラーゼである。前記EALドメイン(大体アミノ350-623辺り)は、c-di-GMP → 2 GMP、の反応を触媒するジグアニレート・ホスホジエステラーゼである。C末端EALドメインをコードするDNA配列を遺伝子的に除去することにより、GGDEFドメインをコードするDNAを用いて、ジグアニレート・シクラーゼ活性を過剰発現する組換えBCGを作製することができる。これはまた、調節性センサーGAFドメインをコードするDNAを欠失させること、及び／又は前記GAFドメインをコードするDNAに変異を入れること、によって、それが有することがある、あらゆるシクラーゼ阻害活性を減弱させて、実現させることもできる。BCG_RS07340タンパク質の構成的に活性のある組換え型を作製するこのような技術によって、組換えBCG中に高いレベルのc-di-GMPが産生されるであろう。
【０１０４】
配列番号(SEQ ID NO):4
BCG及び他の関連したマイコバクテリウム属由来の二機能性のジグアニレート・シクラーゼ／ホスホジエステラーゼBCG_RS07340、アミノ酸配列(623アミノ酸；BCGタンパク質BCG_RS07340；NCBI参照配列: NC_008769.1；タンパク質ID WP 003898837.1；旧遺伝子座タグBCG_1416c)。同一の配列はBCGの他の株に存在する（例えば、タンパク質Rv1354c又はMT1397としてヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、及びタンパク質Mb1389cとしてウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)）。前記EALドメインはアミノ酸354-623であり、下線を引いている。
【０１０５】
【化１０】
2021521798.tif 000012
【０１０６】
配列番号(SEQ ID NO):5
BCG及び他の関連したマイコバクテリウム属由来の二機能性のジグアニレート・シクラーゼ／ホスホジエステラーゼBCG_RS07340、DNA配列(1872ヌクレオチド[623コドン+1終止コドン]；BCGタンパク質BCG_RS07340をコードする；NCBI参照配列：  NC_008769.1；タンパク質ID WP 003898837.1；旧遺伝子座タグBCG_1416c；NC_008769.1:c1548390-1546519ウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)BCG Pasteur 1173P2由来のDNA)。同一の配列はBCGの他の株に存在する（例えば、タンパク質Rv1354c又はMT1397としてヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、及びタンパク質Mb1389cとしてウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)）。EALドメインはヌクレオチド1060-1872にコードされ、下線を引いている。
【０１０７】
【化１１】
2021521798.tif 000013
【０１０８】
配列番号(SEQ ID NO):6
BCG及び他の関連したマイコバクテリウム属由来の、改変した二機能性のジグアニレート・シクラーゼ／ホスホジエステラーゼであって、そのEALドメインが欠失していて、一機能性のジグアニレート・シクラーゼ、として働く、アミノ酸配列(353アミノ酸；BCGタンパク質BCG_RS07340のフラグメント；NCBI参照配列: NC_008769.1；タンパク質ID WP 003898837.1；旧遺伝子座タグBCG_1416c)。同一の配列フラグメントはBCGの他の株に存在する（例えば、タンパク質Rv1354c又はMT1397としてヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、及びタンパク質Mb1389cとしてウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)）。
【０１０９】
【化１２】
2021521798.tif 000014
【０１１０】
配列番号(SEQ ID NO):7
BCG及び他の関連したマイコバクテリウム属由来の、改変した二機能性のジグアニレート・シクラーゼ／ホスホジエステラーゼであって、そのEALドメインをコードしている配列が欠失していて、一機能性のジグアニレート・シクラーゼをコードしている、DNA配列(1059ヌクレオチド[353コドン+0終止コドン]；BCGタンパク質BCG_RS07340のフラグメントをコードする；NCBI参照配列: NC_008769.1；タンパク質ID WP 003898837.1；旧遺伝子座タグBCG_1416c；NC_008769.1:c1548390-1546519ウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)BCG Pasteur 1173P2由来のDNA)。同一の配列はBCGの他の株に存在する（例えば、遺伝子Rv1354c又はMT1397のフラグメントとしてヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、及び遺伝子Mb1389cのフラグメントとしてウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)）。
【０１１１】
【化１３】
2021521798.tif 000015
【０１１２】
PAMP免疫調節因子、2'-5'c-GAMP合成酵素：Q9KVG7(Swiss-Prot)、の過剰発現。  2'-5' c-GAMPはSTING-TBK1-IRF3軸の強力なインデューサーである。dncV遺伝子によってコードされる、コレラ菌(Vibrio cholerae)Q9KVG7タンパク質(436アミノ酸)は、既知の2’-5’c-GAMP合成酵素である。BCG用にコドン最適化された組換えdncV遺伝子を作製することが可能である。コドンを最適化した構造の遺伝子を、強力なプロモーター(例えば、Phsp60など)、又は条件的に活性化する強力なプロモーター(例えば、PTET-offなど)と連結させて、BCGにおいて、過剰発現させることがある。構成的に活性のある組換え型のQ9KVG7タンパク質を作製するこのような技術によって、組換えBCG中に高いレベルの2'-5' c-GAMPが産生されるであろう。
【０１１３】
配列番号(SEQ ID No):8
サイクリックGMP-AMP合成酵素、DncV、コレラ菌(Vibrio cholerae)由来、アミノ酸配列(436アミノ酸；UniProtKB/Swiss-Protタンパク質ID Q9KVG7.1)。
【０１１４】
【化１４】
2021521798.tif 000016
【０１１５】
配列番号(SEQ ID No):9
サイクリックGMP-AMP合成酵素、DncV、コレラ菌(Vibrio cholerae)由来、DNA配列(1311ヌクレオチド[436コドン+1終止コドン])；UniProtKB/Swiss-Protタンパク質ID Q9KVG7.1をコードする；NCBI参照配列： NC_002505.1：コレラ菌(Vibrio cholerae) O1 次亜種 El Tor 株N16961、 第1染色体、完全な配列、及びヌクレオチド180419-181729)。
【０１１６】
【化１５】
2021521798.tif 000017
【０１１７】
DAMP免疫調節因子、2'-3' cGAMP合成酵素：Q8N884(Swiss-Prot)の過剰発現。  2'-3' cGAMPはSTING-TBK1-IRF3軸の強力なインデューサーである。cGASタンパク質は、細胞質DNAを感知し、2'-3' cGAMP合成酵素として機能する、522アミノ酸のポリペプチドを生じるヒトcGAS遺伝子によって産生される。cGASの合成酵素又はシクラーゼのドメインは、cGASがDNAに結合すると活性化する。シクラーゼ・ドメインだけをもち、それ故に構成的に活性のある組換えcGAS遺伝子を作ることができる。この組換え遺伝子は、BCGのコドンに最適化してあることもある。コドンを最適化した構造遺伝子を、強力なプロモーター(例えば、Phsp60など)、又は条件的に活性化する強力なプロモーター(例えば、PTET-offなど)と連結させて、BCGにおいて、過剰発現させることがある。構成的に活性のある組換え型のcGASタンパク質を作製するこのような技術によって、組換えBCG中に高いレベルの2'-3' c-GAMPが産生されるであろう。
【０１１８】
配列番号(SEQ ID No):10
サイクリック2'3'-GMP-AMP合成酵素、cGAS、ホモ・サピエンス由来、アミノ酸配列(522アミノ酸、UniProtKB/Swiss-Protタンパク質ID Q8N884.2)。
【０１１９】
【化１６】
2021521798.tif 000018
【０１２０】
配列番号(SEQ ID No):11
サイクリック2'3'-GMP-AMP合成酵素、cGAS、ホモ・サピエンス由来、ヌクレオチドUの代わりにヌクレオチドTを使用したmRNAのDNA配列(1802ヌクレオチド；UniProtKB/Swiss-Protタンパク質ID Q8N884.2をコードする；NCBI参照配列:  NM_138441.2。コーディング配列は1569ヌクレオチド[522コドン、1終止コドン]、ヌクレオチド140の開始コドンATG［太字で下線付き］；ヌクレオチド1706の終止コドンTGA(太字、下線付き)。
【０１２１】
【化１７】
2021521798.tif 000019
【０１２２】
配列番号(SEQ ID NO):12
サイクリック2'3'-GMP-AMP合成酵素、c-GAS、ホモ・サピエンス由来、マイコバクテリウム属のコドンに最適化している、DNA配列。(1569 ヌクレオチド[522コドン、1終止コドン]；UniProtKB/Swiss-Protタンパク質ID Q8N884.2)をコードする。
【０１２３】
【化１８】
2021521798.tif 000020
【０１２４】
配列番号(SEQ ID NO):13
プラスミドpMH94H-Phsp60::disA::hcGASco::mCherryは、Phsp60 プロモーターからBCG disA遺伝子、ヒトcGAS遺伝子(マイコバクテリウム属のコドンに最適化している)、及びmCherryを過剰発現させる、大腸菌-マイコバクテリウム属のシャトル・プラスミドである、DNA配列。BCG、ヒト型結核菌(M. tuberculosis)、ウシ（型）結核菌（Mycobacterium bovis）又は非常に関連した株に導入すると、このプラスミドはマイコバクテリウムの染色体に1コピーとして組み込まれる(10842ヌクレオチド；ハンセン菌(Mycobacterium leprae)のhsp65遺伝子の一部からなるプロモーターPhsp60 DNAヌクレオチド901-1068を下線で示す；disAをコードする配列は、ヌクレオチド1069-2145である；マイコバクテリウム・コドン最適化配列を有するヒトcGASは、ヌクレオチド2158-3726である；ATG開始コドン及びTAA又はTGA終止コドンは太字、下線で示す)。
【０１２５】
【化１９】
2021521798.tif 000021
【化２０】
2021521798.tif 000022
【化２１】
2021521798.tif 000023
【化２２】
2021521798.tif 000024
【化２３】
2021521798.tif 000025
【０１２６】
CDN PAMP及びDAMPレベルを上昇させるために、内因性BCGホスホジエステラーゼ遺伝子及びホスホジエステラーゼ・ドメインをコードする遺伝子内セグメントをノックアウトする
内因性BCGホスホジエステラーゼ：WP_003414507をノックアウトすることによるCDNの過剰発現  BCG AHM 08589.1タンパク質は、C末端316アミノ酸にわたり、ヒト型結核菌(M. tuberculosis) Rv2837Cと100%同一である、BCGにおける316アミノ酸の内因性二機能性のc-di-AMP及びcGAMPホスホジエステラーゼをコードする（CdnP、CnpB、3'-to-5'オリゴリボヌクレアーゼA、二機能性オリゴリボヌクレアーゼ、又はPAPホスファターゼNrnAとも呼ばれる）。ヒト型結核菌(M. tuberculosis)Rv2837cタンパク質は、3'-5' c-di-AMP(バクテリアPAMP分子)及び2'-3'cGAMP(宿主DAMP分子)の両方を加水分解することが知られている。BCGタンパク質はC末端315アミノ酸にわたり100%同一であるため、BCG AHM08589.1タンパク質のノックアウト(遺伝子置換)は、組換えBCGにおいて、CDN(3'-5' c-di-AMP及び2'-3'cGAMP)のレベルを増加させるであろう。
【０１２７】
配列番号(SEQ ID No):14
二機能性のc-di-AMP及びcGAMPホスホジエステラーゼCdnP(CnpB、3'-to-5'オリゴリボヌクレアーゼA、二機能性オリゴリボヌクレアーゼ、PAPホスファターゼNrnAとも呼ばれる)はBCG由来である、アミノ酸配列(316アミノ酸；BCGタンパク質AHM08589.1；NCBI参照DNA配列：BCG株ATCC 35743由来のCP003494.1；NCBI参照タンパク質識別子WP_003414507)。類似の配列は、タンパク質Rv2837c又はMT2903としてヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、及びタンパク質Mb2862cとしてウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)）に存在する。
【０１２８】
【化２４】
2021521798.tif 000026
【０１２９】
配列番号(SEQ ID No):15
二機能性のc-di-AMP及びcGAMPホスホジエステラーゼ遺伝子、cdnP(cnpB又は3'-to-5'オリゴリボヌクレアーゼA、二機能性オリゴリボヌクレアーゼ、又はPAPホスファターゼNrnAの遺伝子とも呼ばれる)はBCG由来である、DNA配列(951ヌクレオチド[316コドン及び1終止コドン]；BCGタンパク質AHM08589.1をコードする；NCBI参照配列：BCG株ATCC 35743由来のCP003494.1)。類似の配列は、タンパク質Rv2837c又はMT2903としてヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、及びタンパク質Mb2862cとしてウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)）に存在する。
【０１３０】
【化２５】
2021521798.tif 000027
【０１３１】
配列番号(SEQ ID No):16
二機能性のc-di-AMP及びcGAMPホスホジエステラーゼCdnP(CnpB、Rv2837c、又はMT2903、3'to-5' オリゴリボヌクレアーゼA、二機能性オリゴリボヌクレアーゼ、PAPホスファターゼNrnAとも呼ばれる)は、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)由来である、アミノ酸配列(336アミノ酸；ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)タンパク質WP_003905944.1；NCBI/Genbank参照配列: ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)株H37Rv由来のAL123456)。BCGタンパク質(配列番号(SEQ ID No): 14)と比較して、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)タンパク質は、そのN末端に20個の更なるアミノ酸を有し、これに下線及び太字を付す。
【０１３２】
【化２６】
2021521798.tif 000028
【０１３３】
内因性のBCGホスホジエステラーゼ・ドメインをノックアウトすることによるCDNの過剰発現：タンパク質BCG_RS07340(旧BCG_1416c)のEALドメイン。  BCG_RS07340タンパク質(配列番号(SEQ ID No): 4)は、配列番号(SEQ ID No): 5に示すDNA配列によってコードされる。BCG_RS07340タンパク質は、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)Rv1354cタンパク質と100% 同一であり、BCGにおける内因性のCDN PDEである。全長ポリペプチドは623アミノ酸長であり、及びそれは、二機能性のジグアニレート・シクラーゼ／ジグアニレート・ホスホジエステラーゼをコードする。そのドメイン構成は、図１１に示すように、N末端-GAF-GGDEF-EAL-C末端、である。前記GAFドメイン(大体アミノ酸1-190辺り)は、他のドメインの活性に影響を及ぼす調節性ドメインである。前記GGDEFドメイン(大体アミノ酸190-350辺り)は、2 GTP → c-di-GMP + 2ピロリン酸、の反応を触媒するジグアニレート・シクラーゼである。前記EALドメイン(アミノ酸354-623、配列番号(SEQ ID No): 4中で強調)は、c-di-GMP → 2 GMP、の反応を触媒するジグアニレート・ホスホジエステラーゼである。このタンパク質のEALドメインは3'-5' c-di-GMPを切断することが知られているので、この内因性サイクリック・ジヌクレオチド・ホスホジエステラーゼ・ドメインをノックアウトすると、BCGによって産生されるc-di-GMPのレベルが増加するであろう。前記EALドメインをターゲッティングしたノックアウトは、全長WT BCG_RS07340遺伝子を、適当な終止コドン及び転写終結配列等を含み、アミノ酸1-353だけをコードする遺伝子（（GAF-GGDEFドメイン)即ち、前記遺伝子のコーディング配列を短く切断して、アミノ酸354-623(配列番号(SEQ ID No): 5では下線を引いたDNA配列として示した)をコードする配列を除外した）、と遺伝子置換することによって達成することができることがある。BCG_RS07340のEALドメインを欠く組換えBCGは、CDN PAMP c-di-GMPのレベルの増加させるであろう。  
【０１３４】
内因性のBCGホスホジエステラーゼ：BCG AHM07112をノックアウトすることによるCDNの過剰発現。  BCG_AHM07112タンパク質は、BCG中の内因性ジグアニレート・ホスホジエステラーゼである(307アミノ酸のヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)Rv1357cタンパク質と相同)。BCGのいくつかの株はBCG_AHM07112を完全に欠くが、BCG Ticeのような他の株はBCG_AHM07112を保有する。このポリぺプチドを有するBCG株の中で、このタンパク質は、288アミノ酸長(例えば、BCG ATCC 35743において)、又は307アミノ酸長(例えば、BCG Pasteur 1173 P2において)であることがある。BCG ATCC 35743由来のBCG_AHM07112タンパク質は288アミノ酸長であり、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)Rv1357cタンパク質と、そのC末端287アミノ酸にわたって、100%同一である。BCG_AHM07112のドメイン構成は、単一のEALドメインの構成である(図１１)。ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)Rv1357cタンパク質は、3'-5' c-di-GMPを切断することが知られているので、前記BCGタンパク質も同様の反応をする可能性が高い。BCGにおいて、この内因性サイクリック・ジヌクレオチド・ホスホジエステラーゼをノックアウトすると、BCGによって産生されるc-di-GMPのレベルが増加すると予想される。前記EALドメインをターゲティングしたノックアウトを、全長WT BCG_AHM07112遺伝子を遺伝子置換し、及びその後に目印が無いように欠失させることで、達成することがある。
【０１３５】
配列番号(SEQ ID No):17
BCG及び他の関連したマイコバクテリウム属由来のジグアニレート・ホスホジエステラーゼAHM07112.1、アミノ酸配列(288アミノ酸；GenBank 参照配列： CP003494.1；BCG株ATCC 35743由来)。AHM07112.1は、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)タンパク質Rv1357c又はMT1400及びタンパク質Mb1392cとしてのウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)のジグアニレート・ホスホジエステラーゼのC末端287アミノ酸と100%同一である。
【０１３６】
【化２７】
2021521798.tif 000029
【０１３７】
配列番号(SEQ ID No):18
BCG及び他の関連したマイコバクテリウム属由来のジグアニレート・ホスホジエステラーゼAHM07112.1、DNA配列(867ヌクレオチド[288コドン、1終止コドン]；GenBank参照配列： CP003494.1；BCG株ATCC 35743由来)。AHM07112.1は、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)タンパク質Rv1357c又はMT1400及びタンパク質Mb1392cとしてのウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)のジグアニレート・ホスホジエステラーゼのC末端287アミノ酸と100%同一である。
【０１３８】
【化２８】
2021521798.tif 000030
【０１３９】
配列番号(SEQ ID No):19
ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)及びBCG Pasteur 1173 P2由来のジグアニレート・ホスホジエステラーゼRv1357c又はMT1400、アミノ酸配列(307アミノ酸、NCBI/GenBank参照配列：ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)株H37Rv由来のAL123456)。ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis) 及びBCG Pasteur株1173 P2には、N末端が19アミノ酸延びて存在しているが、これは、他のいくつかのBCG株には存在しない。N末端が19アミノ酸延びている部分に下線を付し、太字とした。ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)Rv1357cのC末端287アミノ酸は、BCGジグアニレート・ホスホジエステラーゼAHM07112.1と100%同一である。
【０１４０】
【化２９】
2021521798.tif 000031
【０１４１】
本出願において参照される配列を、以下の表１に要約する。
【０１４２】
【表１】
2021521798.tif 000032
【０１４３】
いくつかの実施形態では、本発明は、Rv1354cタンパク質若しくはその機能的部分をコードする核酸配列；サイクリックGMP-AMP合成酵素(DncV)タンパク質若しくはその機能的部分をコードする核酸配列；サイクリックGMP-AMP合成酵素(cGAS)タンパク質若しくはその機能的部分をコードする核酸配列；又はその組み合わせ、を含む発現カセット又は発現ベクターに関する。いくつかの実施形態では、前記発現ベクター又は発現カセットは、ジアデニレート・シクラーゼとして機能するDNAインテグリティ・スキャニング(DNA integrity scanning)(disA)タンパク質又はその機能的部分をコードする核酸配列を更に含む。いくつかの実施形態では、Rv1354cタンパク質をコードする核酸配列は、ホスホジエステラーゼ遺伝子又はホスホジエステラーゼ・ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、前記発現ベクター又は発現カセットは、ホスホジエステラーゼ遺伝子又はホスホジエステラーゼ・ドメインを含まない。
【０１４４】
発現ベクター及び発現カセットを作製し、マイコバクテリウムを形質転換し、それらを単離する方法が記載されている。いくつかの実施形態では、本発明の発現ベクター又は発現カセットは、1種以上の調節配列（例えば、核酸の転写を制御する又は核酸の転写に影響を与える、本発明の核酸に作動可能的に連結した、プロモーター・エレメント及び／又はエンハンサー・エレメント）を含む。いくつかの実施形態では、本発明の発現ベクター又は発現カセットは、転写の終結、転写後切断、及び／又はポリアデニル化を指示する、本発明の核酸に作動可能的に連結した、1種以上の配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の発現ベクター又は発現カセットは、本発明の核酸に作動可能的に連結した、可変長の介在配列及び／又は選択マーカー遺伝子を含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の本発明の発現ベクター又は発現カセットを含むマイコバクテリウム属の株に関する。いくつかの実施形態では、前記マイコバクテリウム属の株は、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、ウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、前記マイコバクテリウム属の株はBCGである。いくつかの実施形態では、前記株は、配列番号(SEQ ID NO):13のプラスミドを含む。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、本発明は、ジアデニレート・シクラーゼを発現若しくは過剰発現する、及び／又は1種以上の他のシクラーゼ遺伝子若しくはドメイン(例えば、本明細書中に記載されるもの)を発現若しくは過剰発現する、マイコバクテリウム属の株に関する。いくつかの実施形態では、前記発現又は過剰発現は、1種以上のSTINGアゴニスト(例えば、c-di-AMP、c-di-GMP、2'-3' cGAMP、及び／又は3'-3' cGAMP)の放出を生じさせる。いくつかの実施形態では、本発明は、ジアデニレート・シクラーゼを発現若しくは過剰発現する、及び／又はSTINGアゴニストを加水分解するホスホジエステラーゼ(PDE)を発現しない(例えば、STINGアゴニストを加水分解するPDE遺伝子の欠失を含む)、マイコバクテリウム属株に関する。例えば、図１２を参照のこと。いくつかの実施形態では、前記マイコバクテリウム属の株は、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、ウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、前記マイコバクテリウム属の株はBCGである。
【０１４７】
ラットMNU膀胱がんモデルにおける、BCG-disA-OEによる統計的に有意な抗腫瘍作用
ラットMNU膀胱がんモデルは、膀胱内BCGの投与が治療的であることを示すことができる膀胱がんの検証されたモデルである(図６及びKatesら、PMID 28588015)。本発明者らは、図７に示した、BCG-disA-OE対BCG-WTの治療効果に関する先行する知見を発展させた。本発明者らは、ここで、16週ラットMNUモデルを2回行った。図７は実験1に基づいており、BCG-disA-OEがBCG-WTよりも良好な転帰に向かう傾向を示すことを示している。実験2を実施し、そのデータを実験1と組み合わせることにより、本発明者は、ここで、BCG-disA-OEが無処置よりも統計的に有意に優れている(p = 0.048)のに対し、BCG-WTは無処置よりも統計的に有意に優れているわけではないことを示す(図１７に示すデータ)。
【０１４８】
マウス同系膀胱がん腫瘍モデルにおけるBCG-disA-OEによる腫瘍抑制性Treg細胞の減少。
MNUラット膀胱がんモデルでは、16週間の実験終了時の膀胱組織の量が、フロー・サイトメトリーを行うには不十分である。BCG-disA-OEによって誘発される細胞集団の変化を検討するために、本発明者らは、BBN975細胞を用いてマウス同系膀胱がん腫瘍モデルを開発した。前記モデルによって、大型腫瘍(直径1.5 cmより大きい)をマウス側腹に作ることができるようになる。マウスを、腫瘍内注射によりBCG-disA-OEとBCG-WTで処置した。図１８に示すように、BCG-disA-OEを使用すると、腫瘍関連CD4+ Treg細胞、腫瘍関連CD8+ Treg細胞、及び脾臓CD4+ Treg細胞のレベルが低下した。
【０１４９】
BCG-disA-OEは、細胞内のコンパートメントから持続的にSTINGアゴニストを送達する。
膀胱におけるBCGの持続性。
Bowyerら(The persistence of bacilli Calmette-Guerin in the bladder after intravesical treatment for bladder cancer.  Brit J Urol.   1995; 75: 188-192.  PMID 7850324)は、膀胱内BCGを受けた、1986-1992の、125例の膀胱がん患者を評価した。患者に月1回の尿サンプルの提供を依頼し、その後、その尿サンプルを送付してもらい、マイコバクテリウムの培養をした。90例の患者が生存し、月1回の尿中サンプルを遵守していた。90例中4例の患者(4.4%)では、尿中にBCGが持続して存在し、1例では最長16.5か月間持続した。5例目の患者は、膀胱内BCG治療が終了した7週間後に、膀胱摘出術が必要であり、顕微鏡検査により、その膀胱内に抗酸菌に関する顕微鏡的証拠があることが見つかった。
【０１５０】
Durekら(The fate of bacillus Calmette-Guerin after intravesical instillation.   J Urol. 2001; 165: 1765-1768.  PMID 11342972)は、BCG膀胱内注入後に、連続して尿培養を行った49例の患者を調べた。BCGは、尿中に、2時間後には、検体の96.4%で検出され、注入24時間後には、67.9%で検出された。陽性検体の数は、減少し、次に注入する直前の7日目には27.1%であった(図４４)。この研究者らはまた、6回目の注入後1週間以内に、マイコバクテリウムDNAについてPCRによって、膀胱生検を評価した(毎月注入した)。44例のうち14例の膀胱生検(31.8%)で、マイコバクテリウムのリボソームDNAが認められた。加えて、マイコバクテリウムDNAに関して陽性のPCRは、調査した生検の4.2%から37.5%の間で、24か月まで、はっきりと見られた。
【０１５１】
BCGが膀胱組織に残存することがわかったという事実は、がんにおいてSTINGアゴニストを送達するためのBCG-disA-OEの方策に関する重要な利点を表している。多くの技術が低分子STINGアゴニストを創成することに焦点を当てているが、そのような薬剤は、比較的短い曝露時間になる。対照的に、細胞内微生物として、またBowyer及びDurekの研究で示されたように、BCGは、細胞及び組織中で何週間も持続して存在する。組織において、BCG-disA-OEが持続して存在することによって、腫瘍微小環境においては、STINGアゴニストが、持続的に、長期的に、送達される。
【０１５２】
2種の別々のマウス・モデルにおいて、BCG-disA-OEは、BCG-WTよりも安全である
ヒトにおけるBCG膀胱内注入療法は、治療を受けた患者において、排尿障害、倦怠感、及び不快感と関連している。更により深刻な有害作用は、BCGによる持続性の膀胱炎及び播種性のBCGosisである。BCGに関する患者の安全性は、O'Donnellらにおいて広範にレビューされている(Up-to-date、2019)。膀胱内注入後の血流中へのBCGの播種の発生率は、1/15,000例と推定されている。
【０１５３】
BCG-disA-OEの安全性をBCG-WTと比較するために、本発明者らは、免疫能があるBABL/cマウス又は免疫が抑制されたSCIDマウスの肺内に、BCG株をエアロゾル化させて入れるという、BCG感染の2種のマウスモデルを用いた。図１９に示すように、BCG-disA-OEは、BCG-WTよりも免疫能があるマウス肺で増殖能が低く、免疫が抑制されたマウスにおける死亡するまでの期間のアッセイでは致死性が低かった。
【０１５４】
BCGは、固形及び液性腫瘍並びに糖尿病に対する治療上の有益性と関連している免疫力を強化すること、を誘発することが示されている。STINGアゴニストを過剰発現するBCG株は、BCG-WTよりも強力に、免疫力を強化する変化を誘発する。
【０１５５】
免疫力を強化すること。免疫力を強化することとは、ある抗原刺激の、第2の異なる抗原に対してより強力な免疫応答を誘発する、作用能を指す。免疫力を強化することは、抗原非依存的である、ヘテロなCD4及びCD8メモリーを活性化させることに基づく、サイトカインを介する、並びにエピジェネティックな変化及び代謝的な変化と関連している。BCGは、最初の抗原刺激としての強力なツールであり、腫瘍、ウイルス感染、又は薬剤耐性バクテリア感染などのその後の抗原刺激に対して、免疫力を強化することを誘発する (Netea et al. Trained immunity:  a program of innate immune memory in health and disease.  Science 2016.  PMID 27102489；及びArts et al.  BCG vaccination protects against experimental viral infection in humans through the induction of cytokines associated with trained immunity.  Cell Host Microbe 2018.  PMID 29324233)。
【０１５６】
固形及び液性腫瘍用のBCG。BCGには、ヒトにおける固形及び液性腫瘍の両方に対する免疫療法として、治療上の有益性に関する長い歴史がある(Hersh et al.  BCG as adjuvant immunotherapy for neoplasia.  Annu Rev Med 1977.  PMID 324372)。BCGは、メラノーマ、非小細胞肺がん(NSCLC)、及び急性リンパ芽球性白血病(ALL)を含む悪性腫瘍に対して、全身的に及び腫瘍内的にの両方で使用されてきている。近年、BCGとチェックポイント阻害剤を併用した膀胱がんの臨床試験が行われている。
【０１５７】
糖尿病に対するBCG。BCGワクチン接種に、I型糖尿病等を含む各種糖尿病に対する糖管理において治療上の有益性があることが、最近、示されてきている(Stienstra and Netea.  Firing up glycolysis:  BCG vaccination effects on Type 1 diabetes mellitus.   Trends Endoc Metab 2018.  PMID:  30327169)。この効果には、BCGによる免疫力を強化する効果が介していると考えられており、BCGは、向-炎症性サイトカイン発現、並びに代謝酵素（例えば、glycolosisのための代謝酵素）の発現、を促進するエピジェネティックな修飾を引き起こすということが示されている。
【０１５８】
BCG-disA-OE及び免疫力を強化すること。STINGアゴニストを過剰発現するBCG株の、免疫力を強化することを刺激する作用能、を検討するために、本発明者らは、BCG株に曝露した6日後に、休止状態にあるヒト単球において、別の抗原刺激の増強を誘発するBCG-WTの作用能を、対BCG-disA-OEで評価した。第1の抗原は0日目のBCG株であり、6日間の休止後、関連性の無いTLR-1/2抗原PAM3CSK4を第2の抗原とした。図２０に見られるように、第2の刺激を受けたときに、評価した免疫応答(IL-1βの分泌)は、BCG-WT及びBCG-disA-OEの両方によって増強されたが、BCG-disA-OEによる刺激の程度は、BCGの初回刺激無し又は最初の刺激としてBCG-WTのいずれかの刺激の程度よりも統計的に有意に大きかった。このことから、BCG-disA-OEなどのSTINGを過剰発現するBCG株が、BCG-WTよりも強力な、免疫力を強化することに関する刺激因子であることは、明らかである。
【０１５９】
関連実験において、本発明者らは、BC-第1刺激／6日休止／PAM3CSK4を用いたTLR-1、2の第2の抗原刺激、という同じ実験を、ヒト単球を用いて、行った。本実験の終了時に、細胞DNAを採取し、H3K4のヒストン・メチル化の目印に対する抗体を用いて、クロマチン免疫沈降(ChIP)を行った。このH3K4の目印は、既知の転写活性化の目印である。免疫沈降させたDNAに関して、IL-6プロモーター領域を定量PCRで増幅させると、その結果は、BCG-Pasteur-disA-OE及びBCG-Tice-disA-OEは、それぞれのBCG-WT株よりも、IL-6プロモーター(IL-6は向-炎症性サイトカインである)中のH3K4目印を誘発させることにおいて、統計的に有意により強力であること、を示した。これらの結果は、BCG-disA-OEのようなSTINGを過剰発現するBCG株が、BCG-WTよりも、免疫力を強化することに関連するエピジェネティックな変化に関するより強力な刺激因子であること、を示す。
【０１６０】
BCG-Tice-disA-OEは、BCG-WTよりもはるかに高いレベルのdisA遺伝子を発現する
図２３に見られるように、BCG-Tice-disA-OEクローン2(シード-ロット(seed-lot)の調製及び保存のために選択した)の相対的な発現は、比較に関する2-ΔΔCT 法を用いたところ、300:1であった。このことは、disAが、多コピーのプラスミド上に存在することによって強く過剰発現し、pSD5-hsp65-MT3692プラスミド中のハンセン菌(Mycobacterium leprae) hsp65プロモーターによって駆動されることを示している。この強い過剰発現によって、STINGアゴニスト（c-di-AMP）の放出が、はるかにより高いレベルになる。
【０１６１】
STINGアゴニストを過剰発現するBCG株（例えば、BCG-disA-OE等）は、複数のモデル系において、シグナル伝達経路及びサイトカイン分泌プロファイルでの向-炎症性の変化を誘発する。
本発明者らは、STINGアゴニストを過剰発現する株（例えば、BCG-disA-OE等）を試験して、BCG-WTと比較して、複数のモデル系において、向-炎症性サイトカインの変化を誘発するその相対的な能力を評価した。BCG-disA-OEは、それらの試験の大半において、BCG-WTよりも統計的に有意に優れていた。また、その比較が統計的に有意でない場合は、2つの応答のうち、BCG-disA-OEの方が、より強かった。図２５はまた、BCG-disA-OE及びBCG-WTの両方において、I型IFN分泌物の上昇が、STING依存的であることを示している。まとめると、BCG-disA-OEは、BCG-WTよりも、向-炎症性サイトカイン発現の、及び向-炎症性経路誘導の、より強力な刺激因子である
【０１６２】
【表２】
2021521798.tif 000033
【０１６３】
STINGアゴニスト生合成遺伝子を過剰発現する抗生物質遺伝子カセットを持たない組換えBCGを作製する方法。
disAを過剰発現するプラスミドpSD5-hsp65-MT3692は、抗生物質カナマイシンに対する耐性を付与するKan耐性遺伝子カセットを有する。本発明者らは、STINGアゴニスト生合成遺伝子を過剰発現する抗生物質遺伝子カセットを持たない組換えBCGを作製する方法を開示する。
【０１６４】
マイコバクテリウムの遺伝子オペロンpanCDは、生合成遺伝子panC(パントエート(pantoate)--ベータ-アラニン・リガーゼ遺伝子)とpanD(アスパルテート1-デカルボキシラーゼ遺伝子)をコードする。その遺伝子産物PanC及びPanDは、ビタミンB5(Bビタミン)とも呼ばれるパントテン酸の生合成に必要である。水溶性ビタミンであるパントテン酸は、BCGなどのマイコバクテリウムにとって必須の栄養素である。動物は、補酵素A(CoA)を合成する、並びに、タンパク質、炭水化物、及び脂質を合成する、及び代謝するために、パントテン酸を必要とする。そのアニオンはパントテネート(pantothenate)と呼ばれる。
【０１６５】
マイコバクテリウムにおいてpanCDを遺伝的に欠失させると、添加したパントテネート(pantothenate)の存在下でのみ増殖可能な突然変異株を生じることが示されている。そのようなものとして、それらはパントテネート(pantothenate)の栄養要求株である。ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)のΔpanCD変異体は、その変異体にとってパントテネート(pantothenate)を利用できない哺乳動物の組織中では増殖できないため、動物に感染すると非常に弱毒化し、急速にクリアランスされることが示されている。
【０１６６】
本発明者らは、目印の無い(抗生物質遺伝子カセット無し)のBCGのΔpanCD欠失変異体を作製するための詳細な方法を開示する。この変異体は、パントテネート(pantothenate)の存在下でのみ増殖可能であるので、感染中に生存したり、又はSTINGアゴニストを発現させるための効果的な送達ベクターであるとは考えられない。
【０１６７】
本発明者らは、マイコバクテリウムpanCD遺伝子を有するシャトル・プラスミド、並びに、STINGアゴニストを生合成するための過剰発現構築物(例えば、disA遺伝子を過剰発現し、STINGアゴニスト（c-di-AMP）を過剰放出するPhsp65::disA構築物等)を作製するための詳細な方法を開示する。前記シャトル・プラスミドは、大腸菌又はマイコバクテリウム中で複製可能である。このシャトル・プラスミドには、希少切断制限酵素による切断によって容易に除去でき、且つ再びライゲーションが可能である抗生物質カセットが入っている。或いは、前記シャトル・プラスミドを、末端にユニークな制限酵素部位を生成する、抗生物質耐性カセットを除いたプラスミドの骨格をPCR増幅することによって、及び末端に同じユニークな制限酵素部位を有する、増幅されたpanCDオペロンからなるPCR産物中にライゲーションすることによって、生成することがある。いずれの様式においても、抗生物質耐性遺伝子を持たないシャトル・プラスミド(ライゲーション産物)を、BCG又は大腸菌の栄養要求株の中にエレクトロポレーションすることがあり、及びパントテネート(pantothenate)を含まない寒天プレート上で選択することがある。
【０１６８】
本発明に関して最後に明らかにしたことでは、本発明者らは、マイコバクテリウムpanCD遺伝子、並びにSTINGアゴニストを生合成するための過剰発現構築物(例えば、Phsp65::disA構築物)を有する抗生物質カセットを持たないプラスミドを、目印の無いBCG ΔpanCD変異体に導入する方法を示す。本最終的な結果は、抗生物質耐性遺伝子を持たず、及びSTINGアゴニスト生合成遺伝子を強く過剰発現する、BCG株である。哺乳動物の宿主又はヒトの中では、そのようなBCG株は、前記プラスミドからpanCDが相補されることを必要とするために、前記プラスミドを保持することへの強い選択圧の下にある。
【０１６９】
本発明に関して明らかにしたもう一つ別のことでは、前記panCDカセット及びSTINGアゴニストを生合成するための構築物(例えば、Phsp65::disA構築物)を、染色体組み込みベクター(例えば、pH94)の中に導入することがある。同様の方法を用いて、前記抗生物質カセットをpMH94から除去することがある。この染色体組み込みプラスミドを、目印の無いBCG ΔpanCD変異体の中に導入することによっても、抗生物質耐性遺伝子をもたず、STINGアゴニスト生合成遺伝子を強く過剰発現する、BCG株が得られる。この方策の欠点は、過剰発現構築物がプラスミド上に複数のコピーで存在するのではなく、バクテリア染色体上に単一コピーとして存在することであり、これにより、STINGアゴニスト放出のレベルが、より低下することがある。
【０１７０】
BCG-Tice (ATCC 35743)は、天然のパントテネート(pantothenate)栄養要求株である。
本発明者らは、ウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)BCG Tice株(ATCC 35743)が、天然のパントテネート(pantothenate)栄養要求株であることを開示する。この株は、そのpanC遺伝子中に、739-743塩基対で、5bpのDNA挿入を保有している。この挿入変異の変化によって、PanCの246番目のアミノ酸の後が、フレームシフト変異となる(野生型PanCは309アミノ酸長)。5 bpの挿入変異の結果として、ウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)BCG Tice株(ATCC 35743)における変異PanCポリペプチドは、そのN末端では246アミノ酸の野生型PanC配列のからなり、そのC末端では478アミノ酸のナンセンス・ポリペプチドが続く。この変異体PanCポリペプチドが、機能的なパントエート(pantoate)--ベータ-アラニン・リガーゼ活性(PanCの正常な酵素機能)を保持する可能性は非常に低い。更に、BCG Tice(ATCC 35743)中のPanDポリペプチドは、panC遺伝子の終止コドン(野生型配列中のpanD翻訳開始のためのATGと重複する)がフレームから外れているので、翻訳される可能性が非常に低い。野生型panCDオペロンにおいて、PanCの翻訳をリボソームが終結することは、PanDの翻訳をリボソームが開始することと共役している。panDの開始コドンのすぐ上流で、リボソームが終結することがないので、panD遺伝子の翻訳をリボソームが開始する可能性は非常に低い。
【０１７１】
本発明者らは、この天然の栄養要求性によって、STINGアゴニスト生合成遺伝子を過剰発現する、抗生物質遺伝子カセットを持たない組換えBCGを、より迅速に構築できるようになることを開示する。
【０１７２】
本発明者らは、マイコバクテリウムpanCD遺伝子を有する抗生物質カセットを持たないプラスミド、並びにSTINGアゴニストを生合成するための過剰発現構築物(例えば、Phsp65::disA構築物)をBCG-Tice(ATCC 35743)の中に、直接的に、導入するための方法を開示する。
【０１７３】
なお、pSD5-hsp60-MT3692はpSD5-hsp65-MT3692と同じである。本発明者らは以前に、この同じプラスミドをpSD5-hsp60-MT3692と呼んでいた。しかし、この株の実際のプロモーターはハンセン菌(Mycobacterium leprae)のhsp65遺伝子のプロモーターである。従って、本発明者らは、プラスミドpSD-hsp60-MT3692をpSD5-hsp65-MT3692と呼ぶことがある。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の本発明の発現ベクター、発現カセット、又は株、及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物に関する。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の発現ベクター、発現カセット、株又は医薬組成物を対象に投与することを含む、がんを治療する、及び／又は予防するための方法及び／又は組成物に関する。いくつかの実施形態では、前記がんは、膀胱がん(例えば、筋層非浸潤性膀胱がん(NMIBC))、乳がん、又は固形腫瘍である。本発明の更なる実施形態は、I型インターフェロン(IFN)応答の変調が直接的に又は間接的に関連する膀胱がんを、治療する及び／又は予防するための、方法及び／又は組成物に関する。ある特定の実施形態では、NMIBCのような膀胱がんを有する個体は、I型インターフェロン応答のモジュレーターを使って治療を受ける、及び具体的な実施形態において、膀胱がんを有する個体は、I型インターフェロン発現の発現モジュレーター（例えば、その発現のインデューサー等）が与えられる。
【０１７６】
ある特定の実施形態では、I型インターフェロン発現のインデューサーがI型インターフェロンの発現を増加させるレベルは、それが非筋肉侵襲性膀胱がん(NMIBC)等を含む膀胱がんの少なくとも1種の症状を改善する限り、任意のレベルであって良い。I型インターフェロンの発現レベルは、少なくともいくつかの場合において、標準における発現レベルと比較して、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、1000倍、又はそれ以上の倍数の発現に、増加することがある。個体は、例えば、ノーザン・アッセイ又は定量PCRのような、当技術分野における標準的な方法を使用して、I型インターフェロンの発現レベルをモニターすることがある。
【０１７７】
膀胱がんを有することが知られている個体、膀胱がんを有することが疑われる個体、又は膀胱がんを有するリスクがある個体に、有効量のI型インターフェロン発現のインデューサー（本発明の発現ベクターを含む本発明のBCG株等）を投与することがある。前記発現ベクターは、RV1354cタンパク質若しくはその機能的部分；サイクリックGMP-AMP合成酵素(DncV)タンパク質若しくはその機能的部分；サイクリックGMP-AMP合成酵素(cGAS)タンパク質若しくはその機能的部分；デニレート・シクラーゼとして機能するDNAインテグリティ・スキャニング(DNA integrity scanning)(disA)タンパク質若しくはその機能的部分；又はそれらの組み合わせ、を発現する。好ましくは、本発明の発現ベクターを含む本発明のBCG株を対象の膀胱に投与する、及びその発現したタンパク質が膀胱におけるI型インターフェロン発現を増強する。膀胱がんのリスクがある個体は、例えば、1種以上の遺伝的要因を有する個体であることがある、加齢が進んでいることがある、及び／又は家族歴を有していることがある。
【０１７８】
本発明の特定の実施形態において、個体には、本発明のI型インターフェロンの1種以上のインデューサーに加えて、膀胱がん治療のための薬剤が与えられる。そのような追加的な治療としては、例えば、マイトマイシンC、シクロホスファミド、又はそれらの組み合わせなどの膀胱内化学療法、を挙げることができる。I型インターフェロンの1種以上のインデューサー（例えば、以下のタンパク質の1種以上を発現するBCG株：RV1354cタンパク質若しくはその機能的部分；サイクリックGMP-AMP合成酵素(DncV)タンパク質若しくはその機能的部分；サイクリックGMP-AMP合成酵素(cGAS)タンパク質若しくはその機能的部分；デニレート・シクラーゼとして機能するDNAインテグリティ・スキャニング(DNA integrity scanning)(disA)タンパク質若しくはその機能的部分）との併用療法を用いる場合、前記追加的な治療は、I型インターフェロンのインデューサーの前に、I型インターフェロンのインデューサーと同時に、及び／又はI型インターフェロンのインデューサーの後に、実施することがある。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される本発明の発現ベクター、発現カセット、株、医薬組成物、及び／又は方法は、非組換えBCGと比較して、安全性が増大する、忍容性が増大する(例えば、排尿障害、尿意切迫感(urgency)、又は不快感が減少する)、及び／又は血流中における感染又は播種性の血流感染を引き起こす可能性が減少する。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書中に記載される本発明の発現ベクター、発現カセット、株、及び／又は医薬組成物を対象に投与することを含む、がんを治療する及び／又は予防する方法に関する、ここで、前記投与は、非組換えBCGと比較して、安全性プロファイルが増大する、忍容性が増大する(例えば、排尿障害、尿意切迫感(urgency)、又は不快感が減少する)、及び／又は血流中における感染又は播種性の血流感染の可能性が減少する。いくつかの実施形態では、前記がんは、例えば、膀胱がん(例えば、非筋肉浸潤性膀胱がん(NMIBC))、乳がん、又は固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、前記固形腫瘍は、例えば、肉腫、上皮がん、又はリンパ腫である。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載される本発明の発現ベクター、発現カセット、株、及び／又は医薬組成物を対象に投与することを含む、非組換えBCGと比較して、安全性を増大させる、忍容性を増大させる(例えば、排尿障害、尿意切迫感(urgency)、又は不快感を減少させる)、及び／又は血流中における感染又は播種性の血流感染を引き起こす可能性を減少させる、方法に関する。
【０１８２】
医薬品調製
本発明の医薬組成物は、有効量のI型インターフェロンの1種以上のインデューサー（例えば、以下のタンパク質の1種以上を発現するBCG株：RV1354cタンパク質若しくはその機能的部分；サイクリックGMP-AMP合成酵素(DncV)タンパク質若しくはその機能的部分；サイクリックGMP-AMP合成酵素(cGAS)タンパク質若しくはその機能的部分；デニレート・シクラーゼとして機能するDNAインテグリティ・スキャニング(DNA integrity scanning)(disA)タンパク質若しくはその機能的部分）を、薬学的に許容される担体中に溶解して、又は分散して、含む。語句「薬学的又は薬理学的に許容される」とは、動物(例えば、適宜、ヒト)に投与した場合に、有害な、アレルギー性の、又は他の不都合な応答を生じない分子的な実体(molecular entities)及び組成物をいう。I型インターフェロンの発現の少なくとも1種のインデューサー又は追加の活性成分を含む医薬組成物の調製は、本発明に照らして当業者に公知である（Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed. Lippincott Williams and Wilkins, 2005に例示される、参照により本明細書に取り込まれる）。更に、動物(例えば、ヒト)に投与するために、調製は、米国食品医薬品局の生物学的基準(FDA Office of Biological Standards)によって要求されるように、無菌性、発熱性、一般的安全性及び純度に関する基準を満たすべきであることが理解される。
【０１８３】
本明細書中で使用する場合、「薬学的に許容可能な担体」には、当業者のうちのある者に公知であるような、任意の及び全ての、溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤(例えば、抗菌薬(antibacterials)剤、抗真菌剤)、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬剤、薬剤安定化剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香料、色素、等の材料及びそれらの組み合わせ、が挙げられる（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329、を参照、本明細書に参照により取り込まれる）。任意の従来の担体が活性成分と不適合である場合を除いて、それを医薬組成物において使用することが企図される。
【０１８４】
I型インターフェロンの発現インデューサー（例えば、以下のタンパク質の1種以上を発現するBCG株：RV1354cタンパク質若しくはその機能的部分；サイクリックGMP-AMP合成酵素(DncV)タンパク質若しくはその機能的部分；サイクリックGMP-AMP合成酵素(cGAS)タンパク質若しくはその機能的部分；デニレート・シクラーゼとして機能するDNAインテグリティ・スキャニング(DNA integrity scanning)(disA)タンパク質若しくはその機能的部分）は、それを固体、液体、又はエアロゾルのいずれの形式で投与するか、及び注入などの投与経路を理由としてそれを無菌化する必要があるか、によって、種々のタイプの担体を含むことがある。いくつかの実施形態において、本発明(例えば、発現ベクター、株、又は医薬組成物)を、静脈内、皮内、経皮、髄腔内、動脈内、腹腔内、鼻腔内、膣内、直腸内、膀胱内（例えば、膀胱内に直接投与する、例えば、注射によって、または膀胱内注入によって）、腫瘍内、局所、筋肉内、皮下、粘膜内、口腔内、局所、限局的、吸入（例えば、エアロゾル吸入）、注射、点滴、連続点滴、ターゲット細胞を直接浸す局所灌流、カテーテルを介して、洗浄(lavage)を介して、クリー ム中で、脂質組成物中（例えば、リポソーム）中で、又は当業者のうちのある者には知られているであろう他の方法若しくは前記の任意の組み合わせによって、投与することがある（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, 及び Francica et al. TNFα and radio-resistant stromal cells are essential for therapeutic efficacy of cyclic dinucleotide STING agonists in non-immunogenic tumors. Cancer Immunol Res. 2018 Feb 22. PMID: 29472271を参照、参照により本明細書に取り込まれる）。
【０１８５】
薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（例えば、タンパク質組成物の遊離アミノ基で形成されるもの、又は無機酸（例えば、塩酸若しくはリン酸）、若しくは有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸）で形成されるもの）が挙げられる。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた、無機塩基(例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム若しくは水酸化第二鉄)；又は有機塩基(例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン若しくはプロカイン)から誘導されることもある。処方に際して、溶液を、投薬処方に適合した様式で、かつ治療的に効果的であるような量で、投与するであろう。前記処方を、非経口投与用に処方化する（例えば、注射溶液、若しくは肺に送達するためのエアロゾル）又は消化管投与(alimentary administration)用に処方化する（例えば、薬物放出カプセルなど）など、様々な投薬形態で容易に投与する。
【０１８６】
更に、本発明によれば、投与に適した本発明の組成物を、不活性な希釈剤と一緒に又は無しで、薬学的に許容可能な担体中に入れる。前記担体は、同化可能であるべきであり、液体、半固体（即ち、ペースト）、又は固体の担体が挙げられる。任意の従来の媒体、薬剤、希釈剤又は担体が、レシピエントにとって、又はその中に含まれる組成物の治療有効性にとって、有害である場合を除いて、それを、本発明の方法を実施する際に使用するための投与可能な組成物において、使用することが適切である。担体又は希釈剤の例としては、脂肪、油、水、生理食塩水溶液、脂質、リポソーム、樹脂、結合剤、充填剤など、又はそれらの組み合わせが挙げられる。前記組成物はまた、1種以上の成分が酸化することを遅らせるために、種々の抗酸化剤を含むことがある。更に、微生物の作用の予防を、種々の抗菌薬(antibacterials)及び抗真菌剤などの防腐剤（例えば、限定されるものではないが、パラベン(例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン)、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、又はこれらの組み合わせ）によって行うことがある。
【０１８７】
本発明によれば、該組成物を、任意の好都合かつ実用的な様式で（即ち、溶液、懸濁、乳化、混合、カプセル化、吸着などによって）、担体と組み合わせる。このような手順は、当業者にとって、普通にしていることである。
【０１８８】
本発明の具体的な実施形態では、前記組成物を半固体又は固体の担体と完全に組み合わせる又は混合する。前記混合を、粉砕のような任意の好都合な方法で行うことがある。安定化剤をまた、治療活性が失われる（即ち、胃の中で変性する）ことから前記組成物を保護するために、前記混合の工程において、添加することもある。前記組成物に用いる安定化剤の例としては、バッファー、グリシン、リジン等のアミノ酸、デキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マンニトール等の炭水化物、が挙げられる。
【０１８９】
更なる実施形態では、本発明は、I型インターフェロン発現のインデューサー、1種以上の脂質、及び水系の溶媒を含む医薬脂質媒体組成物の使用を含む。本明細書中で使用する場合、用語「脂質」は、水に不溶である特徴を持ち、有機溶媒で抽出可能な、任意の広範囲な物質を含む。この広範なクラスの化合物は、当業者に周知であり、本明細書中で使用する「脂質」という用語は、特定の構造に限定されない。例としては、長鎖脂肪族炭化水素及びそれらの誘導体を含有する化合物が挙げられる。脂質は、天然に存在するか、又は合成される(すなわち、ヒトによって設計される又は生産される)ことがある。しかしながら、脂質は、通常、生物学的な物質である。生物学的な脂質は、当該技術分野において周知であり、例えば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質、スフィンゴ糖脂質、糖脂質、スルファチド、エーテル及びエステル結合脂肪酸を有する脂質並びに重合性脂質、並びにそれらの組み合わせ、を挙げられる。もちろん、脂質として当業者のうちのある者によって理解される、本明細書中に具体的に記載される化合物以外の化合物もまた、本発明の組成物及び方法は包含する。
【０１９０】
当業者のうちのある者は、組成物を脂質媒体中に分散させるために用いることができる一連の技術に精通しているであろう。例えば、本発明のI型インターフェロン発現のインデューサーを、当業者に公知の任意の手段によって、脂質を含む溶液中に分散させる、脂質と共に溶解させる、脂質と共に乳化させる、脂質と一緒に混合させる、脂質に結合させる、脂質に共有結合させる、脂質中に懸濁物として含ませる、ミセル若しくはリポソームと一緒に含有させる、若しくは複合体化させる、又はそれ以外に、脂質若しくは脂質構造と相互作用させる、ことがある。分散させることにより、リポソームが形成されることもある、又はされないこともある。
【０１９１】
動物の患者に投与する本発明の組成物の実際の投薬量を、体重、症状の重篤度、治療する疾患のタイプ、前の又は同時の治療介入、患者の特発性、及び投与経路などの身体的及び生理学的要因によって決定することがある。前記投薬量及び前記投与経路に応じて、好ましい投薬量及び／又は有効量を投与する回数は、対象の応答性に従って変わることがある。投与を担当する医師が、如何なる場合でも、組成物中の活性成分の濃度及び個々の対象に対する適切な用量を決定する。
【０１９２】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、少なくとも約0.1%の活性化合物を含むことがある。他の実施形態では、前記活性化合物は、単位の重量の約2%~約75%、又は例えば約25%~約60%、及びその中から導き出すことができる任意の範囲を含むことがある。当然のことながら、各治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、前記化合物の任意の所与の単位用量において、好適な投薬量が得られるような方法で、調製することがある。溶解性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品保存寿命、並びに他の薬理学的な考慮事項のような要因を、そのような医薬製剤を調製する当業者は熟慮し、そのようなものとして、種々の投薬量及び処置レジメンが望ましいものとなることがある。
【０１９３】
他の非限定的な例において、用量はまた、投与当たり、約1マイクログラム/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重、約10マイクログラム/kg/体重、約50マイクログラム/kg/体重、約100マイクログラム/kg/体重、約200マイクログラム/kg/体重、約350マイクログラム/kg/体重、約500マイクログラム/kg/体重、約1ミリグラム/kg/体重、約5ミリグラム/kg/体重、約10ミリグラム/kg/体重、約50ミリグラム/kg/体重、約100ミリグラム/kg/体重、約200ミリグラム/kg/体重、約350ミリグラム/kg/体重、約500ミリグラム/kg/体重、から、約1000mg/kg/体重又はそれ以上まで、及びその中から導き出すことができる任意の範囲で、含むこともある。本明細書に列挙される数から導き出すことができる範囲の非限定的な例において、約5 mg/kg/体重~約100 mg/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重~約500ミリグラム/kg/体重などの範囲を、上記の数に基づいて投与することがある。
【０１９４】
Ａ．  消化管の組成物及び処方(Alimentary Compositions and Formulations)
本発明のある実施形態において、本発明のI型インターフェロン発現のインデューサー発現のインデューサーは、消化管経路を介して投与されるように処方される。消化管経路には、前記組成物が消化管と直接接触する全ての可能な投与経路が含まれる。具体的には、本明細書に開示される医薬組成物を、経口、口腔、直腸、又は舌下に投与することがある。そのようなものとして、これらの組成物を、不活性な希釈剤若しくは同化可能な食用の担体と一緒に処方することがある、又はこれらの組成物を、ハード-シェル若しくはソフト-シェル・ゼラチン・カプセルの中に封入することがある、又はこれらの組成物を、タブレットに圧縮することがある、又はこれらの組成物を、食餌の食物と一緒に直接的に組み込むことがある。
【０１９５】
ある特定の実施形態において、前記活性化合物を、賦形剤と一緒に組み込むことがある、及び摂取可能なタブレット、口腔タブレット、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェハなどの形態で使用することがある（Mathiowitz E, Jacob JS, Jong YS, Carino GP, Chickering DE, Chaturvedi P, Santos CA, Vijayaraghavan K, Montgomery S, Bassett M, Morrell C. Biologically erodable microspheres as potential oral drug delivery systems. Nature. 1997;386:410-4. PMID: 9121559; Hwang MJ, Ni X, Waldman M, Ewig CS, Hagler AT. Derivation of class II force fields. VI. Carbohydrate compounds and anomeric effects. Biopolymers. 1998;45:435-68. PMID: 9538697; Hwang JS, Chae SY, Lee MK, Bae YH. Synthesis of sulfonylurea conjugated copolymer via PEO spacer and its in vitro short-term bioactivity in insulin secretion from islets of Langerhans. Biomaterials. 1998;19:1189-95. PMID: 9720902;  Hwang SJ, Park H, Park K. Gastric retentive drug-delivery systems. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1998;15:243-84. PMID: 9699081; 米国特許 5,641,515; 5,580,579; 及び 5,792, 451、各々は、その全体が参照により本明細書に明確に取り込まれる）。前記タブレット、トローチ、ピル、カプセルなどはまた、以下を含むこともある：結合剤（例えば、トラガント・ゴム、アラビアゴム、コーン・スターチ、ゼラチン、又はそれらの組み合わせなど）；賦形剤（例えば、リン酸二カルシウム、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、又はそれらの組み合わせなど；崩壊剤（例えば、コーン・スターチ、ポテト・スターチ、アルギン酸、又はそれらの組み合わせなど）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）；甘味剤（例えば、スクロース、ラクトース、サッカリン、又はそれらの組み合わせなど）；香料（例えば、ペパーミント、ウィンターグリーンのオイル、チェリー・フレーバー、オレンジ・フレーバーなど）。投薬単位の形態がカプセルである場合、それは、上記の種類の物質に加えて、液体の担体を含むことがある。種々の他の物質が、コーティングとして、存在することがある、又は前記投薬単位の物理的な形態をそれ以外に改変するために存在することがある。例えば、タブレット、ピル又はカプセルを、シェラック、糖又は両方でコーティングすることがある。前記投薬形態がカプセルである場合、それは、上記の種類の物質に加えて、液体担体などの担体を含有することがある。ゼラチン・カプセル、タブレット、又はピルを、腸溶コーティングすることがある。腸溶コーティングは、pHが酸性である胃又は上腸において、前記組成物が変性することを防止する。例えば、米国特許5,629,001を参照のこと。小腸に到達すると、その中の塩基性pHによって前記コーティングは溶解する、並びに前記組成物は放出され、及び特殊化した細胞（例えば、上皮腸細胞及びパイエル板M細胞）によって吸収されるようになる。エリキシルのシロップは、活性化合物、スクロースを甘味剤として、メチル及びプロピルパラベンを防腐剤として、色素及び香料(例えば、チェリー又はオレンジ香料)を含むことがある。もちろん、任意の投薬単位の形態を調製する際に使用する任意の物質は、薬学的に純粋である、及び使用する量において実質的に無毒であるべきである。更に、前記活性化合物は、徐放性調製物及び製剤の中に組み込まれることがある。
【０１９６】
経口投与のために、本発明の組成物を、代わりに、口腔洗浄剤、歯磨き剤、口腔タブレット、経口スプレー剤、又は舌下経口投与製剤の形態に、1種以上の賦形剤と一緒に組み込むことがある。例えば、ホウ酸ナトリウム溶液(Dobell's 溶液)のような好適な溶媒中に必要量の活性成分を組み込ませた口腔洗浄剤を調製することがある。あるいは、前記活性成分を、経口溶液（例えば、ホウ酸ナトリウム、グリセリン及び重炭酸カリウムを含有する経口溶液など）中に組み込ませる、歯磨き剤中に分散させる、又は水、結合剤、研磨剤、香料、発泡剤、及び保湿剤を含むことがある組成物に、治療有効量で添加することがある。あるいは、前記組成物を、舌の下に置く、さもなければ口の中で溶解することがある、タブレット又は溶液の形態に、形成させることがある。
【０１９７】
他の消化管投与の様式に適した、更なる処方には、座薬剤が挙げられる。座薬剤は、直腸に挿入するための、通常薬用であり、種々の重量及び形状の固体の投薬形態である。挿入後、座薬剤は、腔の液において、柔らかくなる、融解する、又は溶解する。一般的に、座薬剤については、従来の担体として、例えば、ポリアルキレン・グリコール、トリグリセリド、又はそれらの組み合わせを挙げることができる。ある特定の実施形態において、座薬剤を、例えば、約0.5%~約10%、及び好ましくは約1%~約2%の範囲で前記活性成分を含む、混合物から形成することができる。
【０１９８】
Ｂ．  非経口の組成物及び処方
更なる実施形態において、本発明のI型インターフェロン発現のインデューサーを、非経口経路を介して投与することがある。本明細書中で使用する場合、用語「非経口」は、消化管をバイパスする経路を含む。具体的には、本明細書に開示される医薬組成物を、例えば、静脈内、皮内、筋肉内、動脈内、髄腔内、皮下、又は腹腔内に投与することがある。例えば、米国特許6,7537,514; 6,613,308; 5,466,468; 5,543,158; 5,641,515; 及び 5,399,363 を参照のこと(各々は、その全体が参照により本明細書に明確に取り込まれる)。
【０１９９】
遊離塩基又は薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤を好適に混合した水中で調製することがある。グリセロール、液状ポリエチレン・グリコール、及びその混合物中で、並びに油中で、分散液を調製することもある。保存する及び使用する通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐために防腐剤を含む。注射可能な使用に適した医薬形態としては、無菌の水溶液又は分散液、及び無菌の注射可能溶液又は分散液を即時に調製するための無菌の粉末が挙げられる(米国特許第5,466,468号、その全体が参照により本明細書に明確に取り込まれる)。全ての場合において、前記形態は、無菌でなければならず、そして容易に注射可能である程度に流動性が高くなければならない。それは、製造する及び保存する条件下で安定でなければならず、バクテリア及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。その担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(即ち、グリセリン、プロピレン・グリコール、及び液状ポリエチレン・グリコールなど)、それらの好適な混合物、及び／又は植物油、を含む溶媒又は分散媒体であることがある。適切な流動性を、例えば、レシチンのようなコーティングを使用することにより、分散液の場合に必要とされる粒径を維持することにより、及び界面活性剤を使用することにより、維持することがある。微生物の作用を予防することは、種々の抗菌薬(antibacterials)及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど、によって、行うことがある。多くの場合、等張化剤、例えば、糖又は塩化ナトリウム、を含むことが好ましい。注射可能な組成物の吸収を遅延させることは、前記組成物中に、例えば、ステアリン酸アルミニウムやゼラチンのような吸収遅延剤を使用することにより、行うことがある。
【０２００】
水溶液での非経口投与に関しては、例えば、前記溶液を必要であれば好適に緩衝化する、及び前記希釈液を十分な生理食塩水又はグルコースでまず等張にする。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用することができる無菌の水性媒体は、本開示に照らして当業者に周知であろう。例えば、ある投薬量を、等張なNaCl溶液に溶解することがあり、そして皮下注射液に添加する、又は提示された注射部位に注射することがある(例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 及び 1570-1580、を参照のこと)。治療する対象の症状に依存して、投薬量をある程度変えることが必然的に生じることがある。投与を担当する者が、如何なる場合でも、個々の対象に適した用量を決定する。更に、ヒトに投与するために、調製物は、米国食品医薬品局の生物学的基準(FDA Office of Biological Standards)によって要求されるように、無菌性、発熱性、並びに一般的な安全性及び純度に関する基準を満たさなければならない。
【０２０１】
無菌の注射可能な溶液を、必要量の活性化合物を好適な溶媒中に、上記に列挙した他の成分のいくつかと一緒に組み込み、必要に応じて、続いて濾過滅菌することによって、調製する。一般に、分散液は、塩基性分散媒体及び上記に列挙したもののうちから必要とされる他の成分、を含有する無菌媒体中に、種々の滅菌した活性成分を組み込ませることによって、調製する。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌粉末の場合、調製することに関する好ましい方法は、前記活性成分+任意の更なる所望の成分の粉末を、前に滅菌濾過したその溶液から生じさせる、真空乾燥及び凍結乾燥技術である。粉末化した組成物を、安定化剤と一緒に又は無しで、液体担体（例えば、水又は生理食塩水等）と混合する。
【０２０２】
Ｃ．  その他の医薬組成物及び処方
本発明の他の好ましい実施形態において、本発明のI型インターフェロン発現の活性化合物インデューサーを、種々のその他の経路(例えば、局所(即ち、経皮)投与、粘膜投与(鼻腔内、膣など)及び／又は吸入)を介して投与するために、製剤化することがある。局所投与用の医薬組成物としては、軟膏、ペースト、クリーム又は粉末のような医薬用途のために製剤化した活性化合物を挙げることができる。軟膏としては、局所適用のための全ての油性、吸収性、乳化及び水溶性ベースの組成物が挙げられるが、一方で、クリーム及びローションとしては、乳化ベースのみを含む組成物が挙げられる。局所的に投与する薬物は、皮膚を通って前記活性成分が吸収されることを促進するための浸透増強剤を含むことがある。適切な浸透増強剤としては、グリセリン、アルコール、アルキル・メチル・スルホキシド、ピロリドン及びルアロカプラムが挙げられる。局所に適用するための組成物のための可能な基剤としては、ポリエチレン・グリコール、ラノリン、コールド・クリーム及びワセリン(petrolatum)、並びに任意の他の適切な吸収剤、エマルジョン又は水溶性軟膏基剤、が挙げられる。局所製剤はまた、前記活性成分を保存するために、及び均質な配合物を提供するために、乳化剤、ゲル化剤、及び抗菌(antimicrobial)の防腐剤、を含むことがある。本発明の経皮投与はまた、「パッチ」の使用を含むこともある。例えば、前記パッチは、所定の速度で、そして固定した期間にわたって連続的な様式で、1種以上の活性物質を供給することがある。
【０２０３】
ある特定の実施形態において、前記医薬組成物を、点眼剤、鼻腔内スプレー、吸入、及び／又は他のエアロゾル送達媒体によって送達することがある。経鼻エアロゾル・スプレーを介して、組成物を肺に直接的に送達するための方法は、例えば、米国特許5,756,353 及び5,804,212(各々は、その全体が参照により本明細書に明確に取り込まれる)に記載されている。同様に、鼻腔内微粒子樹脂を用いた薬物の送達（Takenaga M, Serizawa Y, Azechi Y, Ochiai A, Kosaka Y, Igarashi R, Mizushima Y.  Microparticle resins as a potential nasal drug delivery system for insulin. J Control Release. 1998;52:81-7. PMID: 9685938）及びリゾホスファチジル-グリセロール化合物(米国特許第5,725,871、その全体が参照により本明細書に明確に取り込まれる)もまた、医薬技術分野において周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持体マトリックスの形態での経粘膜薬物送達は、米国特許5,780,045に記載されている(その全体が参照により本明細書に明確に取り込まれる)。用語「エアロゾル」は、液化又は加圧ガス推進剤中に分散させた液体粒子の微細に分割した固形物のコロイド系を指す。吸入のための本発明の典型的なエアロゾルは、液体推進剤中の活性成分の懸濁液、又は液体推進剤と好適な溶媒との混合物からなる。好適な推進剤としては、炭化水素及び炭化水素エーテルが挙げられる。好適な容器は、前記推進剤の圧力要件に応じて変化する。前記エアロゾルの投与は、対象の年齢、体重、並びに症状の重篤度及び応答性によって変化する。
【０２０４】
本発明のキット
本明細書中に記載される組成物のいずれも、キットに含まれることがある。非制限的な例では、本発明のI型インターフェロン発現のインデューサー（例えば、以下のタンパク質の1種以上を発現するBCG株：RV1354cタンパク質若しくはその機能的部分；サイクリックGMP-AMP合成酵素(DncV)タンパク質若しくはその機能的部分；サイクリックGMP-AMP合成酵素(cGAS)タンパク質若しくはその機能的部分；デニレート・シクラーゼとして機能するDNAインテグリティ・スキャニング(DNA integrity scanning)(disA)タンパク質若しくはその機能的部分）が、キットに含まれることがある。
【０２０５】
前記キットは、好適にアリコートした本発明のI型インターフェロン発現のインデューサー、及び、ある場合において、1種以上の更なる薬剤、を含むことがある。前記キットの構成成分は、水性媒体又は凍結乾燥形態のいずれかでパッケージ化されていることがある。前記キットの容器手段としては、一般的に、少なくとも1種のバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ又は他の容器手段が挙げられ、その中に、成分を入れることがあり、好ましくは、好適にアリコートされていることがある。前記キット中に2種以上の構成成分が存在する場合、前記キットはまた、一般的に、第2、第3、又は他の追加的な容器を含み、その中に追加的な構成成分を別々に入れることがある。しかし、構成成分を種々に組み合わせたものを、 1つのバイアル中に含めることがある。本発明のキットはまた、典型的には、商業的販売のために密閉した、本発明のI型インターフェロン発現のインデューサーを収容する方法及び任意の他の試薬容器、を含む。そのような容器としては、所望のバイアルを内部に備えたインジェクション(injection)又は中空成形のプラスチック容器が挙げられる。
【０２０６】
前記キットの構成成分を、1種及び／又はそれ以上の液体溶液として提供する場合、前記液体溶液は水溶液であることがあり、無菌水溶液であることが特に好ましい。本発明のI型インターフェロン発現のインデューサーの組成物を、注射可能な組成物の中に処方することがある。この場合では、容器手段がそれ自体、シリンジ、ピペット、及び／又は他のそのような装置であってもよく、それから、その処方物を、体内の感染領域に投与し、動物中に注射し、及び／又はキットの他の成分と一緒に投与し、及び／又は混合することがある。
【０２０７】
しかしながら、前記キットの構成成分を、乾燥粉末として提供してもよい。試薬及び／又は構成成分を乾燥粉末として提供する場合には、前記粉末を、好適な溶媒を添加することによって再構成することがある。前記溶媒を別の容器手段で提供することも想定される。
【０２０８】
上記の実施例を、本開示の主題の代表的な実施形態を実施するための、当業者のある者に対するガイダンスを提供するために挙げてきた。本開示及び当業者の一般的なレベルに照らして、当業者は、上記の実施例が例示に過ぎず、本発明の主題の範囲から逸脱することなく、多数の変更、改変、及び修正を採用することができるということ、を理解することができる。上記の実施例は、例示として提供され、限定として提供されるものではない。
【０２０９】
本明細書中に引用される刊行物、特許出願及び特許等を含む全ての文献は、各文献を個々に具体的に示し、参照により取り込まれるのと、並びに、その内容の全てを本明細書で述べるのと、同じ程度で、本明細書中に参照により取り込まれる。
【０２１０】
本明細書中で値の範囲を記載することは、本明細書中に別段の指示がない限り、単に、前記範囲内に入る各別個の値を個々に言及する簡潔な方法として役立つことを意図し、各別個の値はあたかもそれが本明細書中に個々に記載されたかのように、本明細書中に取り込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書中に別段の指示がない限り、又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書中で使用する任意の及び全ての実施例、又は例示的な言い回し(例えば、「など」)は、特に主張しない限り、単に本発明をよりよく説明することだけを意図し、本発明の範囲に対する限定を設けるものではない。本明細書中の如何なる言い回しも、本発明の実施に不可欠なこととして、請求項に記載されていない要素を示すものとは解釈されないものとする。
【０２１１】
本発明の好ましい実施形態を、発明者らが知っている本発明を実施するための最良の形態を含めて、本明細書で記載している。これらの好ましい実施態様の変形は、上述の記載を読めば当業者には明らかとなり得る。本発明者は当業者が適宜このような変形を適用することを予想しており、本明細書中で具体的に説明される以外の方法で発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、準拠法で許されているように、本明細書に添付された請求項に記載の内容の改変及び均等物を全て含む。更に、上述の要素を、全ての可能な変形で任意に組み合わせたものが、本明細書中に別段の指示がない限り、又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【国際調査報告】
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