(57)【要約】  本発明は、ビリベルジンＩＸαジエステルによる高含有量のビリルビンＩＸαの調製方法を開示している。ビリルビンＩＸαの調製に係る分野に属している。当該方法は、ビリベルジンＩＸαジエステルのアルコール溶液中に、水酸化ナトリウムのメタノール溶液を滴下し、水を加えた後に、加水分解させ、次に弱酸でｐＨを４〜５に調節し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、無機塩を水洗して除去し、真空乾燥させた後に、ビリベルジンＩＸαを得る工程と、ビリベルジンＩＸαのアルコール溶液中に、フリーラジカル捕捉剤（安定化剤）を加え、還元剤である水素化ホウ素化合物を加え、還元反応が終了した後、すぐにケトンを加えて過剰の還元剤を分解させ、次に弱酸でｐＨを４〜５に調節し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した後に、水洗し、メタノール−クロロホルムで精製した後に、含有量が９７％超であるビリルビンＩＸαを得る工程と、を含む（加水分解後還元経路）。当該方法は、クロマトグラフィー分離を必要とせず、反応条件が温和であり、コストが低く、操作が便利であり、大規模な工業化生産に適している。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ビリベルジンＩＸαジエステルのメタノール溶液中に、５〜３０℃で水酸化ナトリウムのメタノール溶液を滴下し、水を加えた後に、５〜３０℃で加水分解させ、次に弱酸でｐＨを４〜５に調節し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、無機塩を水洗して除去し、真空乾燥させた後に、ビリベルジンＩＸαを得る（室温でビリルビンＩＸαよりもはるかに安定している）加水分解反応工程と、
（２）ビリベルジンＩＸαのアルコール溶液中に、安定化剤としてのフリーラジカル捕捉剤を加え、水素化ホウ素化合物を加え、反応が終了した後、すぐにケトンを加えて過剰の還元剤を分解させ、次に弱酸溶液を滴下してｐＨを４〜５に調節し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した後に、水洗し、メタノール−クロロホルムで精製した後に、含有量が９７％超であるビリルビンＩＸαを得る還元反応工程と、
を含むことを特徴とするビリベルジンＩＸαジエステルによるビリルビンＩＸαの調製方法。
【請求項２】
工程（１）における加水分解反応の温度は、好ましくは１０〜１５℃であることを特徴とする請求項１に記載のビリベルジンＩＸαジエステルによるビリルビンＩＸαの調製方法。
【請求項３】
工程（２）におけるフリーラジカル捕捉剤は、アルキルフェノールを含むが、それに限定されず、好ましくはｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノンであることを特徴とする請求項１に記載のビリベルジンＩＸαジエステルによるビリルビンＩＸαの調製方法。
【請求項４】
工程（２）では、フリーラジカル捕捉剤の添加量は、ビリベルジンＩＸαの質量の０．０５％〜０．５％であり、好ましくは０．１％〜０．２％であることを特徴とする請求項１に記載のビリベルジンＩＸαジエステルによるビリルビンＩＸαの調製方法。
【請求項５】
工程（２）における水素化ホウ素化合物は、水素化ホウ素亜鉛、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素カリウムのうちのいずれか一種であり、好ましくは水素化ホウ素亜鉛であることを特徴とする請求項１に記載のビリベルジンＩＸαジエステルによるビリルビンＩＸαの調製方法。
【請求項６】
工程（２）におけるケトンは、アセトンを含むが、それに限定されないことを特徴とする請求項１又は３〜５に記載のビリベルジンＩＸαジエステルによるビリルビンＩＸαの調製方法。
【請求項７】
工程（２）における還元反応は、薄層クロマトグラフィー（Ｔｈｉｎ  Ｌａｙｅｒ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＴＬＣ）で監視され、ビリベルジンＩＸαの還元が完了した後、過剰な還元を回避するために、すぐにケトンを加えて過剰の還元剤を分解させることを特徴とする請求項１に記載のビリベルジンＩＸαジエステルによるビリルビンＩＸαの調製方法。
【請求項８】
工程（２）における弱酸は、酢酸を含むが、それに限定されず、好ましくは１０％酢酸であることを特徴とする請求項１に記載のビリベルジンＩＸαジエステルによるビリルビンＩＸαの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビリルビンの調製に係る分野に属しており、具体的には、ビリベルジンＩＸαジエステルから非クロマトグラフィー分離法によるビリルビンＩＸαの調製方法に関している。
【背景技術】
【０００２】
ビリルビンＩＸαは、英語名がＢｉｌｉｒｕｂｉｎ  ＩＸα（化合物１）であり、モノマー構造式の二次元模式図は、以下のとおりである。
【０００３】
【化１】
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【０００４】
ＣＡＳ番号は、６３５−６５−４であり、分子式は、Ｃ３３Ｈ３６Ｎ４Ｏ６であり、分子量は、５８４．６７である。
【０００５】
ビリルビンＩＸαの純粋製品は、オレンジ色の結晶性固体（粉末）であるが、含有量が９６％以上である純粋製品を得ることが困難であり、市販品は、濃いオレンジ色の粉末であり、室温で放置すると、徐々に赤褐色になっている。胆汁色素類（ｂｉｌｅ  ｐｉｇｍｅｎｔｓ）は、生物色素であり、特定のポルフィリン（ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）の代謝で形成される黄色、緑色、赤色又は褐色の無金属開環化合物系の一つである。獣類のほか、無脊椎動物、下等脊椎動物、特定の鳥の卵殻、紅藻及び緑色植物にも、このような色素類が含まれている。それは、動物の体の特定の部位に異なる色を与えるだけでなく、緑色植物の光周期に不可欠なものであり、紅藻の光合成作用過程における補助色素でもある。
【０００６】
ビリルビン（Ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ）は、ビリンファミリーの化合物の一種であり、ビリルビンＩＸαは、ビリルビン系化合物の一つである（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｎｏ．３，ｐａｇｅ  ３６３，１９７５）。ビリルビンＩＸαは、幅広い生理活性を有し、抗酸化機能を有し、リノール酸及びリン脂質の酸化を抑制でき、ビリルビン及びそのポルフィリン類似体は、癌の光線力学的療法において、大きな応用潜在力がある。現在、いくつかの半合成ポルフィリン薬物は、国内外で販売されており、癌の光線力学的療法に用いられたが、多少副作用があり、市販のいくつかの癌の光線力学的療法用薬物（例えば、Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ）は、安定性が悪く、成分が複雑で変化しやすい。したがって、高含有量のビリルビンの全合成及びその構造に対する改造への研究は、癌の光線力学的療法用薬物の研究方向の一つである。また、ビリルビンＩＸαは、ゴオウを体外で培養する主な原料の一つである。中国薬局方（２０１５版）には、体外で培養するゴオウ中のビリルビンＩＸαの含有量が３５．０％以上であることが規定されている。中国薬局方には、ビリルビンＩＸαの含有量の検出方法として、紫外線を用いる方法であり、ビリルビンＩＸα項目で、紫外線検出によるビリルビンＩＸαの含有量が９０％以上であることが規定されている。ビリルビンＩＸαは、室温で不安定な化合物であり（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１８，  ３１５，  １９７１）、室温で酸化、異性化、不均化、分解、重合、分子内「閉環」などの一連の複雑な反応を起こすことができ、これらの反応により生成される不純物（ビリルビンＩＩＩα及びビリルビンＸＩＩＩαを含む）は、分離が困難であり、紫外線吸収などの物性があまり明確ではない（ほとんどの不純物の分子構造は、完全に解明されていない）ので、紫外線方法によるビリルビンＩＸαの検出結果は、科学的で正確ではない。
【０００７】
ビリルビンＩＸαは、ドイツの化学者Ｆｉｓｈｅｒによって初めて全合成されており（Ｚ．  ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９４２，ｖｏｌ．２７４，ｐａｇｅ  ２３１；  １９４１，  ｖｏｌ．  ２６８，  ｐａｇｅ  １９７）（その場合に、構造が完全に解明されていないが）、最も重要な最後の二つの工程、すなわち、まずビリベルジンジメチルエステルＩＸα（図１における化合物２）をビリベルジンＩＸα（図１における化合物３）に加水分解させた工程、次に還元剤として４価や低価の硫黄（例えば、亜ジチオン酸ナトリウム）又は亜鉛粉末−酢酸系を用い、ビリルビンＩＸαに還元させる工程では、いずれも収率が低く（２５％以下）、含有量が説明されていない。Ｆａｔｉａｄｉにより、水素化ホウ素ナトリウムでビリベルジンＩＸ（化合物３）を還元すると、収率が６０％であるビリルビンＩＸαを得る（Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  １１３９，  １９７１）ことを報告したが、詳細な実験操作及び精製過程を報告しておらず、純度及び含有量も報告していない。ビリルビンＩＸαは、非常に不安定な化合物であり（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１８，  ３１５，  １９７１）、特に溶液中又は酸や塩基の存在下で、不純物が生成しやすい。８０年前にビリルビンＩＸαが抽出・合成されたが、１９７０年代になって、ビリルビンＩＸαの分子構造が基本的に明らかになった（Ｒ．Ｂｏｎｎｅｔｔ，  Ｎａｔｕｒｅ，２６２，ｐａｇｅ  ３２７，１９７６）。国外では、ビリルビンＩＸαは商業的価値がなく（市場がない）、科学研究機関での化学研究は、基本的に理論研究を主とし、その合成研究は、基本的に１〜１０ミリグラムレベルにとどまり、一次生成物を合成した後に、クロマトグラフィーで分離した。Ｓｔｕｒｒｏｃｋにより、まず５ミリグラムのビリベルジンジメチルエステルＩＸαで加水分解させ（分離せず）、すぐに過剰の水素化ホウ素ナトリウムで還元させ、次にＴＬＣ分離を行い、メタノール−クロロホルムで精製した後に、３．８ｍｇのビリルビンＩＸαを得る加水分解後還元経路を報告したが（Ｓｔｕｒｒｏｃｋ；  Ｂｕｌｌ；  Ｋｉｒｓｃｈ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  １９９４，  ｖｏｌ．  ３４，  Ｎｏ．３，  ｐａｇｅ  ２６３）、純度を報告していない（分解温度、核磁気及び紫外線のみがあり、純度、含有量が不明である）。本願発明者は、Ｓｔｕｒｒｏｃｋの実験操作を繰り返し、ＴＬＣ監視により、還元過程が比較的複雑であり、不純物スポットの制御が困難であり、再現性が悪いことを見出した。
【０００８】
現在、図１に示すとおり、ビリベルジンＩＸαジメチルエステル（化合物２）を出発原料とし、ビリルビンＩＸαを合成できる経路は２つある。ビリベルジンＩＸαジメチルエステルが還元された後にビリルビンＩＸαに加水分解されることは、文献に報告されているが（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  １５５，  ４０５−４１７，１９７６；  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，１８４，１７３−１８３，１９６９）、複雑なクロマトグラフィー分離を採用し、収率が不明である。この経路では、ビリルビンＩＸαは、加水分解の条件（室温、ｐＨ  １２以上）で安定性が悪く、一連の副反応が起こるので、純粋なビリルビンＩＸαを分離することが困難である。本願発明者は、文献における経路を繰り返したところ、還元後加水分解経路での生成物は、より複雑であり（加水分解後還元経路と比較）、ＴＬＣにより、反応混合物中に不純物スポットが多く検出されたことを見出し、還元後加水分解経路は、工業化に適していないことが示されている。水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、亜鉛粉末、亜ジチオン酸ナトリウムなどの還元剤でビリベルジンＩＸαをビリルビンＩＸαに還元させることは、文献に既に報告されているが（ミリグラムレベルの実験研究）、純度、含有量のデータが不足している。加水分解後還元経路における主な問題は、還元剤の量が制御されにくく、ビリルビンＩＸαが過剰に還元されやすくなり、すなわち、ビリルビンＩＸαが還元剤でさらに還元されることである。
【０００９】
張恒洲は、ビリルビンＩＸαを抽出し、含有量が９０％であるビリルビンＩＸα二ナトリウム塩を調製したが（ＣＮ１０５３９９６５５、２０１６）、純度が不明である。また、ヘム（豚の血液から抽出され、供給源が保証されている）を基質とし、生化学的方法によりビリルビンＩＸαを調製することは、国内の文献にも国外の文献にも報告されているが、純粋なサンプルが得られず、溶液にビリルビンＩＸαが稀に存在することが紫外線によって検出されたに過ぎない。ヘムのα位は開環しているので、生化学的方法でも化学的方法でも選択性を保証することが困難であり、それ以上の研究は不可能であり、現在、当該方法による研究は、基本的に中止されている。
【００１０】
現在市販されているビリルビンＩＸαは、全部動物（主に牛、豚）の胆嚢から（クロロホルムで）抽出して生産されたものであり、少量の高分子不純物を含む未知の不純物が多く含まれている（ＴＬＣにより原点に現れ、ＨＰＬＣによりピークが現れていない）。抽出された低含有量の（含有量が既に中国薬局方に規定される９０％に達するが）ビリルビンＩＸαをさらに精製しなければ、ゴオウを体外で培養することができない。中国では、ビリルビンＩＸαの工業化抽出は３０年以上の歴史があり、産業化は十分に成熟しているが、屠殺された動物の胆汁中のビリルビンＩＸαの分子構造は、常に変化するので、抽出されたビリルビンＩＸαの含有量を９７％以上にすることが困難である。また、胆嚢源資源が限られているので、市場の需要を満たすことは、ますます困難になっている。
【００１１】
したがって、クロマトグラフィー分離技術を用いることなく、工業化生産の潜在力を有する合成プロセス（高含有量、高純度のビリルビンＩＸαを調製する）の開発は、工業的に大きな価値があり、高含有量、高純度のビリルビンＩＸαの合成プロセスは、切実な研究課題となっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ビリベルジンＩＸαジエステルによるビリルビンＩＸαの調製方法を提供することを目的とし、加水分解後還元経路に属しており、クロマトグラフィー分離を必要としない。当該方法は、従来の合成方法において、クロマトグラフィーで分離する必要があるので、工業的に大量生産できないという技術的ボトルネックを突破するとともに、従来の工業的に抽出されたビリルビンＩＸαの含有量が低く、純度が低く、質量が不安定である（ゴオウの体外培養に影響する）という技術的難題を解決し、含有量を９７％以上にすることができる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を実現するために、本発明は、以下の技術方案を提供する。
【００１４】
以下の工程を含むビリベルジンＩＸαジエステルによるビリルビンＩＸαの調製方法。
【００１５】
（１）ビリベルジンＩＸαジエステルのメタノール溶液中に、５〜３０℃で水酸化ナトリウムのメタノール溶液を滴下し、水を加えた後に、５〜３０℃で加水分解させ、次に弱酸でｐＨを４〜５に調節し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、無機塩を水洗して除去し、真空乾燥させた後に、ビリベルジンＩＸαを得る（室温でビリルビンＩＸαよりもはるかに安定している）加水分解反応工程、
（２）ビリベルジンＩＸαのアルコール溶液中に、フリーラジカル捕捉剤、すなわち、安定化剤を加え、水素化ホウ素化合物を加え、反応が終了した後、すぐにケトンを加えて過剰の還元剤を分解させ、次に弱酸溶液を滴下してｐＨを４〜５に調節し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した後に、水洗し、メタノール−クロロホルムで精製した後に、含有量が９７％超であるビリルビンＩＸαを得る還元反応工程。
【００１６】
好適には、上記調製方法において、工程（１）における加水分解反応の温度は、好ましくは１０〜１５℃である。
【００１７】
好適には、上記調製方法において、工程（２）に加入されるフリーラジカル捕捉剤の添加量は、ビリベルジンＩＸαの質量の０．０５％〜０．５％であり、好ましくは０．１％〜０．２％である。
【００１８】
好適には、上記調製方法において、工程（２）におけるフリーラジカル捕捉剤は、アルキルフェノールを含むが、それに限定されない。
【００１９】
さらには、前記アルキルフェノールは、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノンである。
【００２０】
好適には、上記調製方法において、工程（２）における水素化ホウ素化合物は、水素化ホウ素亜鉛、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素カリウムのうちのいずれか一種である。
【００２１】
さらには、前記水素化ホウ素化合物は、水素化ホウ素亜鉛である。
【００２２】
好適には、前記調製方法において、工程（２）におけるケトンは、アセトンを含むが、それに限定されない。
【００２３】
好適には、上記調製方法において、工程（２）における還元反応は、薄層クロマトグラフィー（Ｔｈｉｎ  Ｌａｙｅｒ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＴＬＣ）で監視され、ビリベルジンＩＸαの還元が完了した後、過剰な還元を回避するために、すぐにケトンを加えて過剰の還元剤を分解させる。
【００２４】
好適には、上記調製方法において、工程（２）における弱酸は、酢酸を含むが、それに限定されず、好ましくは１０％酢酸である。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の有益な効果は、以下のとおりである。
【００２６】
還元反応に安定化剤を加え、中性（非強アルカリ性）の温和な還元剤である水素化ホウ素亜鉛を用い、還元反応が完了した後、すぐにケトンで過剰の還元剤を分解させることにより、生成されたビリルビンＩＸαの還元反応及び後処理過程での副反応を大幅に軽減し、分離が困難な不純物の生成を回避する。したがって、クロマトグラフィー分離を必要とせず、収率が高く（二つの工程の反応では、８５％と高くなる）、含有量が高く（ＨＰＬＣ外部標準法による含有量が９７％超である）、反応条件が温和であり、コストが低く、操作が便利であり、工業化に適しており、高含有量のビリルビンＩＸαの大規模な工業化生産に対して重要な理論的根拠及びプロセスパラメータを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】従来技術におけるビリルビンＩＸαの二つの合成経路である。
【図２】実施例２で調製されたビリベルジンＩＸαのＮＭＲスペクトルである。
【図３】実施例２で調製されたビリルビンＩＸαの１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）スペクトルである。
【図４】実施例２で調製されたビリルビンＩＸαの１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）スペクトルである。
【図５】実施例２で調製されたビリルビンＩＸαのＤＥＰＴ  １３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）スペクトルである。
【図６】実施例２で調製されたビリルビンＩＸαのＨＰＬＣスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の特徴及び利点は、以下の詳細な説明により、図面を参照することでより明らかになる。提供された実施例は、本発明の方法を説明するものに過ぎず、本発明に開示されている他の内容を何ら制限するものではない。
【００２９】
以下の実施例で具体的な条件が明記されていない実験方法について、一般的な方法及び条件に従う。
【００３０】
一般的な試薬：ＡＲグレード、Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ化学試薬。ＴＬＣプレート：青島海洋化工廠。
【００３１】
ＮＭＲ装置：Ｂｒｕｃｋ  ４００Ｍ、上海有機化学研究所。ＨＰＬＣ装置：Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００型番
本発明におけるビリベルジンＩＸαジメチルエステルは、Ｓｍｉｔｈ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，Ｖｏｌ．４０，  Ｎｏ．１０，  第１７４９ページ，  １９８４に記載の調製方法により調製された。
【００３２】
＜実施例１＞ビリベルジンＩＸα（化合物３）の調製
Ａ．２５０ミリリットルの三つ口フラスコ中に、０．３５０グラム（０．５７３５ｍｍｏｌ）のビリベルジンＩＸαジメチルエステルを投入し、１００ミリリットルのメタノールを加え、室温でマグネティックスターラーにより全部溶解させた後に、１０℃で５％水酸化ナトリウムのメタノール溶液（１．３８グラム、１．７２５ｍｍｏｌ）を滴下し、次に撹拌しながら５グラムの水を加え、１０℃で窒素保護下で一晩撹拌し（１５時間）、翌日ＴＬＣ（展開剤：ジクロロメタン：酢酸エチルｖ／ｖ＝５０：１）により、ジメチルエステルが完全に加水分解されたことが示されている。その後、１０％酢酸でｐＨを４〜５に調節し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、緑色固体を得た。２０ミリリットルの水を加え、１時間撹拌した後に濾過し、１０％メタノールを含む水（ｗ％）２０ミリリットルでｐＨが６となるまで洗浄した。五酸化二リンで一晩室温で真空乾燥させ、０．３３１グラムの青緑色粉末を得、収率が９９．１％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）は、図２に示される。
【００３３】
Ｂ．３０℃で窒素保護下で撹拌して加水分解させた以外、Ａと同様にし、ＴＬＣにより８時間後に原点はなくなり、得られた反応混合物（中和後）は、ＴＬＣで明らかに尾引き現象が検出されており、温度が高まると不純物が生成することが示されている。以上と同様に処理した後に、０．３３１グラムの青緑色粉末を得た。次に５０ミリリットルのメタノール−クロロホルム（メタノール：クロロホルムｖ／ｖ＝２：１）で一回精製し、０．３０５グラムの青緑色粉末を得、収率が９１．３％であった。この温度で加水分解されることにより、時間が短縮されたが、副反応が起こったので、ＴＬＣで単一の純粋な生成物（スポット）を得るために、精製する必要がある。
【００３４】
＜実施例２＞ビリルビンＩＸα（化合物１）の調製
Ａ．水素化ホウ素亜鉛を還元剤とした
５００ミリリットルの三つ口フラスコ中に、窒素保護下で、０．３００グラム（０．５１５ｍｍｏｌ）のビリベルジンＩＸαを投入し、３００ミリリットルのメタノールを加え、室温でマグネティックスターラーにより全部溶解させた後に、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン０．４５ｍｇを含むメタノール溶液１ミリリットルを加え、０℃に下げ、０．２４５グラムの水素化ホウ素亜鉛（２．５８ｍｍｏｌ）を含む調製直後のテトラヒドロフラン溶液（２０ミリリットル）を３０分間かけて滴下し（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ．１９６０，Ｖｏｌ．８２，  ｐａｇｅ  ６０７４）、反応液の色は、濃緑色から薄緑色に変化した。滴下完了後にさらに１０分間撹拌し、反応液は、薄黄緑色に変化し、ＴＬＣ（メタノール：クロロホルムｖ／ｖ＝１：５０）により、黄赤色のスポットのみが検出されており、原点（緑色）がなくなることが示されている。すぐに１０ミリリットルのアセトンを滴下し、ガスが発生し、ガスが発生しなくなるまで１５分間撹拌した後に、１０％酢酸でｐＨを４〜５に調節し、１０分間撹拌し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去してオレンジ色の固体を得た。２０ミリリットルの水を加え、１時間撹拌した後に濾過し、１０％メタノールを含む水（ｗ％）２０ミリリットルでｐＨが６になるように洗浄し、オレンジ色の粉末を得た。３０ミリリットルのメタノール−クロロホルム（ｖ／ｖ＝２：１）で室温で２時間撹拌し、１０℃まで冷却した後に濾過し、６ミリリットルのメタノール−クロロホルム（ｖ／ｖ＝２：１）で洗浄し、五酸化二リンで一晩室温で真空乾燥させ、０．２５９グラムのオレンジ色の粉末を得、収率が８６．０％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）は図３に示され、１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）は図４に示され、ＤＥＰＴ  １３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）は図５に示される。
【００３５】
含有量の測定：
クロマトグラフィー条件とシステム適合性試験：オクタデシルシラン結合シリカゲルを充填剤とし、検出波長が４５０ｎｍであり、理論段数は、ビリルビンピークで３０００以上である。
【００３６】
対照品溶液の調製：ビリルビン対照品を適量精秤し（一定重量となるまで乾燥させ、低温で保存した）、ジクロロメタンを加え、１ｍｌあたり１２μｇを含む溶液を作成した。
【００３７】
供試品溶液の調製：本製品を約１０ｍｇ精秤し、５０ｍｌのメスフラスコに入れ、適量のジクロロメタンを加えて目盛りまで溶解させ、均一に振り混ぜ、３ｍｌを精秤し、５０ｍｌのメスフラスコに入れ、ジクロロメタンを加えて目盛りまで希釈し、均一に振り混ぜ、０．４５μｍ精密ろ過膜で濾過し、次のろ液を取った。
【００３８】
測定法：対照品溶液及び供試品溶液をそれぞれ５μｌ精密に吸収し、液体クロマトグラフに注入して測定した。外部標準法で含有量を計算した。
【００３９】
乾燥品で、ビリルビンＩＸαの含有量が９７．１％であった。ＨＰＬＣスペクトルは、図６に示される。
【００４０】
Ｂ．水素化ホウ素ナトリウムを還元剤とした
水素化ホウ素亜鉛溶液の代わりに、０．５００グラムの固体水素化ホウ素ナトリウム（１３．２ｍｍｏｌ）を使用した以外、Ａと同様にし、得られた生成物について、ＴＬＣで明らかに原点（極性が大きい）不純物が検出され、さらに５０ミリリットルのメタノール−クロロホルム（ｖ／ｖ＝１：１）で一回精製し、０．２０７グラムのオレンジ色の粉末を得、ＴＬＣにより不純物が検出されず、収率が６８．７％であった。
【００４１】
Ｃ．水素化ホウ素カリウムを還元剤とした
水素化ホウ素亜鉛溶液の代わりに、０．５００グラムの固体水素化ホウ素カリウム（９．２７ｍｍｏｌ）を使用した以外、Ａと同様にし、得られた生成物について、ＴＬＣで明らかに原点（極性が大きい）不純物が検出され、さらに５０ミリリットルのメタノール−クロロホルム（ｖ／ｖ＝１：１）で一回精製し、０．１９８グラムのオレンジ色の粉末を得、ＴＬＣにより不純物が検出されず、収率が６５．８％であった。
【００４２】
Ｄ．水素化ホウ素リチウムを還元剤とした
水素化ホウ素亜鉛溶液の代わりに、１．００グラムの固体水素化ホウ素リチウム（４５．９ｍｍｏｌ）を使用し、溶媒としてメタノールの代わりにエタノールを使用した以外、Ａと同様にし、得られた生成物について、ＴＬＣで明らかに原点（極性が大きい）不純物が検出され、さらに５０ミリリットルのメタノール−クロロホルム（ｖ／ｖ＝１：１）で一回精製し、０．１８１グラムのオレンジ色の粉末を得、ＴＬＣにより不純物が検出されず、収率が６０．１％であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年5月20日(2021.5.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ビリベルジンＩＸαジエステルのメタノール溶液中に、５〜３０℃で水酸化ナトリウムのメタノール溶液を滴下し、水を加えた後に、５〜３０℃で加水分解させ、次に弱酸でｐＨを４〜５に調節し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、無機塩を水洗して除去し、真空乾燥させた後に、ビリベルジンＩＸαを得る（室温でビリルビンＩＸαよりもはるかに安定している）加水分解反応工程と、
（２）ビリベルジンＩＸαのアルコール溶液中に、安定化剤としてのフリーラジカル捕捉剤を加え、水素化ホウ素化合物を加え、反応が終了した後、すぐにケトンを加えて過剰の還元剤を分解させ、次に弱酸溶液を滴下してｐＨを４〜５に調節し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した後に、水洗し、メタノール−クロロホルムで精製した後に、含有量が９７％超であるビリルビンＩＸαを得る還元反応工程と、
を含むことを特徴とするビリベルジンＩＸαジエステルによるビリルビンＩＸαの調製方法。
【請求項２】
工程（１）における加水分解反応の温度は、１０〜１５℃であることを特徴とする請求項１に記載のビリベルジンＩＸαジエステルによるビリルビンＩＸαの調製方法。
【請求項３】
工程（２）におけるフリーラジカル捕捉剤は、アルキルフェノールを含むことを特徴とする請求項１に記載のビリベルジンＩＸαジエステルによるビリルビンＩＸαの調製方法。
【請求項４】
工程（２）におけるフリーラジカル捕捉剤は、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノンであることを特徴とする請求項３に記載のビリベルジンＩＸαジエステルによるビリルビンＩＸαの調製方法。
【請求項５】
工程（２）では、フリーラジカル捕捉剤の添加量は、ビリベルジンＩＸαの質量の０．０５％〜０．５％であることを特徴とする請求項１に記載のビリベルジンＩＸαジエステルによるビリルビンＩＸαの調製方法。
【請求項６】
工程（２）では、フリーラジカル捕捉剤の添加量は、ビリベルジンＩＸαの質量の０．１％〜０．２％であることを特徴とする請求項５に記載のビリベルジンＩＸαジエステルによるビリルビンＩＸαの調製方法。
【請求項７】
工程（２）における水素化ホウ素化合物は、水素化ホウ素亜鉛、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素カリウムのうちのいずれか一種であることを特徴とする請求項１に記載のビリベルジンＩＸαジエステルによるビリルビンＩＸαの調製方法。
【請求項８】
工程（２）における水素化ホウ素化合物は、水素化ホウ素亜鉛であることを特徴とする請求項１に記載のビリベルジンＩＸαジエステルによるビリルビンＩＸαの調製方法。
【請求項９】
工程（２）におけるケトンは、アセトンを含むことを特徴とする請求項１又は３〜８に記載のビリベルジンＩＸαジエステルによるビリルビンＩＸαの調製方法。
【請求項１０】
工程（２）における還元反応は、薄層クロマトグラフィー（Ｔｈｉｎ  Ｌａｙｅｒ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＴＬＣ）で監視され、ビリベルジンＩＸαの還元が完了した後、過剰な還元を回避するために、すぐにケトンを加えて過剰の還元剤を分解させることを特徴とする請求項１に記載のビリベルジンＩＸαジエステルによるビリルビンＩＸαの調製方法。
【請求項１１】
工程（２）における弱酸は、酢酸を含むことを特徴とする請求項１に記載のビリベルジンＩＸαジエステルによるビリルビンＩＸαの調製方法。
【請求項１２】
工程（２）における弱酸は、１０％酢酸であることを特徴とする請求項１１に記載のビリベルジンＩＸαジエステルによるビリルビンＩＸαの調製方法。
【国際調査報告】
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