(57)【要約】  本発明は、変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質（またはそのバリアント）、それをコードする配列、それを調製する方法、およびそれを含むウイルス様粒子に関し、ここで、当該タンパク質（またはそのバリアント）および当該ウイルス様粒子は少なくとも２つのＨＰＶ型（たとえば、ＨＰＶ６６およびＨＰＶ５６、またはＨＰＶ６６、ＨＰＶ５６、およびＨＰＶ５３）に対する中和抗体の発生を誘発でき、したがって、上記少なくとも２つのＨＰＶ型による感染および当該感染により引き起こされる疾患（子宮頚がんおよび尖圭コンジローマなど）を予防するために使用できる。本発明はさらに、上記少なくとも２つのＨＰＶ型による感染および当該感染により引き起こされる疾患（子宮頚がんおよび尖圭コンジローマなど）を予防するための医薬組成物またはワクチンの製造における上記タンパク質および上記ウイルス様粒子の使用にも関する。
2021526850.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントであって、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質との比較において、前記変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質は、以下の変異：
（１）Ｎ末端における１〜２０個のアミノ酸、たとえば１〜５、３〜８、５〜１０、９〜１３、１０〜１５、１２〜１８、もしくは１５〜２０個のアミノ酸の切断；および
（２）（ａ）前記野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の２６５〜２８３位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応位置におけるアミノ酸残基での置換；または
（ｂ）前記野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５７位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応位置におけるアミノ酸残基での置換；
を有し、
前記バリアントは、１個以上（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９個）のアミノ酸が置換（好ましくは保存的置換）、付加、または欠失されているという点でのみ、前記変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質と異なり、かつ、前記変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の機能、すなわち少なくとも２つのＨＰＶ型（たとえば、ＨＰＶ６６およびＨＰＶ５６、またはＨＰＶ６６、ＨＰＶ５６、およびＨＰＶ５３）に対する中和抗体の発生を誘発する能力を保持し；
好ましくは、前記変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質は、前記（２）（ｂ）中に定義される変異を有し、任意に、さらに以下の変異：
（３）前記野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の５１〜６０位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応位置におけるアミノ酸残基での置換、または
（４）前記野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の１１４〜１５０位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応位置におけるアミノ酸残基での置換、または
（５）前記野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の２５９〜２８３位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応位置におけるアミノ酸残基での置換；
を有し、
好ましくは、前記変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質は、前記（２）（ｂ）および（４）中に定義される変異を有し、任意に、さらに以下の変異：
（６）前記野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の１７２〜１８１位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応位置におけるアミノ酸残基での置換；
を有し、
好ましくは、前記変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質は、前記野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質との比較において、Ｎ末端の３、５、８、１０、１２、１５、または１８個のアミノ酸が切断されており；
好ましくは、前記変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質は、前記野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質との比較において、Ｎ末端の５個のアミノ酸が切断されており；
好ましくは、前記第２の型の野生型ＨＰＶは、ＨＰＶ５６であり；
好ましくは、前記（２）（ａ）中に記載される対応位置におけるアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質の２６５〜２８３位のアミノ酸残基であり；
好ましくは、前記（２）（ｂ）中に記載される対応位置におけるアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５７位のアミノ酸残基であり；
好ましくは、前記第３の型の野生型ＨＰＶは、ＨＰＶ５３であり；
好ましくは、前記（３）中に記載される対応位置におけるアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質の５１〜５９位のアミノ酸残基であり；
好ましくは、前記（４）中に記載される対応位置におけるアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質の１１３〜１４９位のアミノ酸残基であり；
好ましくは、前記（５）中に記載される対応位置におけるアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質の２５８〜２８２位のアミノ酸残基であり；
好ましくは、前記（６）中に記載される対応位置におけるアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質の１７１〜１８０位のアミノ酸残基であり；
好ましくは、前記野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質は、配列番号１または２８のアミノ酸配列を有し；
好ましくは、前記野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を有し；
好ましくは、前記野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質は、配列番号３または３１のアミノ酸配列を有し；
好ましくは、前記変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質は、配列番号７、８、９、１０、１１、および６３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、
変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアント。
【請求項２】
単離された核酸であって、請求項１に記載の変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントをコードし、
好ましくは、本発明に係る単離された核酸は、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、および６４からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、単離された核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項４】
請求項２に記載の単離された核酸および／または請求項３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５】
請求項１に記載の変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質もしくはそのバリアントを含む、またはこれからなる、ＨＰＶウイルス様粒子。
【請求項６】
請求項１に記載の変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質もしくはそのバリアント、または請求項２に記載の単離された核酸、または請求項３に記載のベクター、または請求項４に記載の宿主細胞、または請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子を含む、組成物。
【請求項７】
医薬組成物またはワクチンであって、請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子と、任意に、製薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含み、
好ましくは、前記ＨＰＶウイルス様粒子は、ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染により引き起こされる疾患を予防するのに有効な量で存在し；
好ましくは、前記ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶ型による感染（たとえば、ＨＰＶ６６感染、ＨＰＶ５６感染、および／またはＨＰＶ５３感染）であり；
好ましくは、前記ＨＰＶ感染により引き起こされる疾患は、子宮頚がんおよび尖圭コンジローマからなる群より選択される、医薬組成物またはワクチン。
【請求項８】
請求項１に記載の変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントの調製方法であって、前記変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを宿主細胞において発現させる工程と、次いで、前記宿主細胞の培養物から前記変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを回収する工程とを含み；
好ましくは、前記宿主細胞は、大腸菌であり；
好ましくは、前記方法は、前記変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを大腸菌において発現させる工程と、次いで、前記大腸菌の溶解物上清を精製することによって前記変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを得る工程；好ましくは、クロマトグラフィー（たとえば、陽イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、および／または疎水性相互作用クロマトグラフィー）によって前記大腸菌の溶解物上清から前記変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを回収する工程とを含む、方法。
【請求項９】
ワクチンの調製方法であって、請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子と、製薬学的に許容される担体および／または賦形剤と、を組み合わせる工程を含む、方法。
【請求項１０】
ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染により引き起こされる疾患の予防方法であって、請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子または請求項７に記載の医薬組成物もしくはワクチンの予防的有効量を対象に投与する工程を含み、
好ましくは、前記ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶ型による感染（たとえば、ＨＰＶ６６感染、ＨＰＶ５６感染、および／またはＨＰＶ５３感染）であり；
好ましくは、前記ＨＰＶ感染により引き起こされる疾患は、子宮頚がんおよび尖圭コンジローマからなる群より選択される、方法。
【請求項１１】
ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染により引き起こされる疾患を予防するための医薬組成物またはワクチンの製造における、請求項１に記載の変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質もしくはそのバリアント、または請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子の使用であって、
好ましくは、前記ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶ型による感染（たとえば、ＨＰＶ６６感染、ＨＰＶ５６感染、および／またはＨＰＶ５３感染）であり；
好ましくは、前記ＨＰＶ感染により引き起こされる疾患は、子宮頚がんおよび尖圭コンジローマからなる群より選択される、使用。
【請求項１２】
ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染により引き起こされる疾患を予防するための、請求項１に記載の変異ＨＰＶ３９  Ｌ１タンパク質もしくはそのバリアント、または請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子であって；
好ましくは、前記ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶ型（たとえば、ＨＰＶ３９感染、ＨＰＶ６８感染、および／またはＨＰＶ７０感染）による感染であり；
好ましくは、前記ＨＰＶ感染により引き起こされる疾患は、子宮頚がんおよび尖圭コンジローマを含むがこれらに限定されない。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２０１８年６月４日付で提出された中国出願第２０１８１０５６３５０４．２号に基づき、かつ、同出願の優先権の利益を主張する。当該出願の開示内容の全体を引用により本明細書に援用する。
【０００２】
技術分野
本発明は、分子ウイルス学および免疫学の分野に関する。特に、本発明は、変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質（またはそのバリアント）、それをコードする配列、それを調製する方法、およびそれを含むウイルス様粒子に関し、ここで、当該タンパク質（またはそのバリアント）および当該ウイルス様粒子は、少なくとも２つのＨＰＶ型（たとえば、ＨＰＶ６６およびＨＰＶ５６、またはＨＰＶ６６、ＨＰＶ５６、およびＨＰＶ５３）に対する中和抗体の発生を誘発でき、したがって、上記少なくとも２つのＨＰＶ型による感染および当該感染により引き起こされる疾患（子宮頚がんおよび尖圭コンジローマなど）を予防するために使用できるものである。本発明はさらに、上記少なくとも２つのＨＰＶ型による感染および当該感染により引き起こされる疾患（子宮頚がんおよび尖圭コンジローマなど）を予防するための医薬組成物またはワクチンの製造における上記タンパク質および上記ウイルス様粒子の使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、主として、皮膚および粘膜にいぼを生じさせる。ＨＰＶの型は、腫瘍形成との関連に依存してハイリスク型とローリスク型とに分けられる。そのうちハイリスク型ＨＰＶによる感染は女性の子宮頚がんを含む生殖器がんの主因であることが示されており、ローリスク型ＨＰＶは主として尖圭コンジローマを引き起こす。ＨＰＶ感染を予防および制御するための最も有効な方法は、ＨＰＶワクチン、特に子宮頚がんを引き起こすハイリスク型ＨＰＶに対するワクチンの接種である。
【０００４】
ＨＰＶの主要カプシドタンパク質Ｌ１は、自己集合して中空状のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成するという特徴がある。ＨＰＶ  ＶＬＰは、主要カプシドタンパク質Ｌ１の五量体が７２個集まって構成される対称二十面体構造を有する（Doorbar, J. and P.H. Gallimore. 1987. J Virol, 61(9): 2793-9）。ＨＰＶ  ＶＬＰは構造の点で天然ＨＰＶと非常によく似ており、天然のウイルスの中和エピトープの大部分を保持していて、力価の高い中和抗体の発生を誘発できる（Kirnbauer, R., F. Booy, et al. 1992 Proc Natl Acad Sci U S A 89(24): 12180-4）。
【０００５】
しかしながら、これまでの研究によると、ＨＰＶ  ＶＬＰは主に同じ型のＨＰＶに対する中和抗体の発生を誘発し、同じ型のＨＰＶに対する防御免疫をもたらし、相同性の高い少数のＨＰＶ型に対して低い交差防御効果を有するのみであることが示されている（Sara L. Bissett, Giada Mattiuzzo, et al. 2014 Vaccine. 32:6548-6555）。したがって、既存のＨＰＶワクチンの防御範囲は非常に限定されている。一般的に、１つの型のＨＰＶのＶＬＰは同じ型のＨＰＶによる感染の予防にのみ使用できる。この場合、ＨＰＶワクチンの防御範囲を広くすることが必要であれば、より多くの型のＨＰＶのＶＬＰをワクチンに添加するしかない。現在のところ、メルクのＧａｒｄａｓｉｌ（登録商標）（ＨＰＶ１６、１８、６、および１１に対する４価のワクチン）、ＧＳＫのＣｅｒｖａｒｉｘ（登録商標）（ＨＰＶ１６および１８に対する２価のワクチン）、およびメルクのＧａｒｄａｓｉｌ（登録商標）９（ＨＰＶ６、１１、１６、１８、３１、３３、４５、５２、および５８に対する９価のワクチン）を含む市販ＨＰＶワクチンは、複数のＨＰＶ型のＶＬＰを組み合わせることによって調製されている。しかしながら、このような解決策では、ＨＰＶワクチンの製造コストが大幅に増大すると考えられ、免疫量の増大による安全性の問題も生じ得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、当技術分野において、複数のＨＰＶ型による感染およびこの感染により引き起こされる疾患（子宮頚がんおよび尖圭コンジローマなど）をより経済的かつ効果的に予防するために、複数のＨＰＶ型に対する防御中和抗体の発生を誘発できるＨＰＶウイルス様粒子を開発することが急務である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の内容
本発明は、本発明者らによる以下の驚くべき発見に少なくとも一部基づく。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）６６型のＬ１タンパク質の特定セグメントを第２の型のＨＰＶ（ＨＰＶ５６など）のＬ１タンパク質の対応セグメントで置換した後、こうして得られる変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質は、生物においてＨＰＶ６６および第２の型のＨＰＶ（ＨＰＶ５６など）に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果はＨＰＶ６６  ＶＬＰと第２の型のＨＰＶのＶＬＰとの混合物の場合と同等であり、ＨＰＶ６６に対するその防御効果はＨＰＶ６６  ＶＬＰ単独の場合と同等であり、第２の型のＨＰＶ（ＨＰＶ５６など）に対するその防御効果は第２の型のＨＰＶのＶＬＰ単独の場合と同等である。
【０００８】
加えて、上述される置換をベースとし、ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の他の１つまたは２つの特定セグメントを第３の型のＨＰＶ（ＨＰＶ５３など）のＬ１タンパク質の対応セグメントでさらに置換することができ、こうして得られる二重置換を有する変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質は、ＨＰＶ６６、第２の型のＨＰＶ（ＨＰＶ５６など）、および第３の型のＨＰＶ（ＨＰＶ５３など）に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果はＨＰＶ６６  ＶＬＰ、第２の型のＨＰＶのＶＬＰ、および第３の型のＨＰＶのＶＬＰの混合物の場合と同等であり、ＨＰＶ６６に対するその防御効果はＨＰＶ６６  ＶＬＰ単独の場合と同等であり、第２の型のＨＰＶ（ＨＰＶ５６など）に対するその防御効果は第２の型のＨＰＶのＶＬＰ単独の場合と同等であり、第３の型のＨＰＶ（ＨＰＶ５３など）に対するその防御効果は第３の型のＨＰＶのＶＬＰ単独の場合と同等である。
【０００９】
したがって、一態様において、本発明は、変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを提供し、ここで、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質との比較において、変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質は、以下の変異：
（１）Ｎ末端における１〜２０個のアミノ酸、たとえば１〜２０個のアミノ酸、たとえば１〜５、３〜８、５〜１０、９〜１３、１０〜１５、１２〜１８、または１５〜２０個のアミノ酸の切断；および
（２）（ａ）野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の２６５〜２８３位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応位置におけるアミノ酸残基での置換；または
（ｂ）野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５７位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応位置におけるアミノ酸残基での置換；
を有し、
バリアントは、１個以上（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個）のアミノ酸が置換（好ましくは保存的置換）、付加、または欠失されているという点でのみ、変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質と異なり、かつ、変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の機能、すなわち少なくとも２つのＨＰＶ型（たとえば、ＨＰＶ６６およびＨＰＶ５６、またはＨＰＶ６６、ＨＰＶ５６、およびＨＰＶ５３）に対する中和抗体の発生を誘発する能力を保持する。
【００１０】
いくつかの好ましい実施形態において、変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質は、（２）（ｂ）中に定義される変異を有し、任意に、さらに以下の変異：
（３）野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の５１〜６０位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応位置におけるアミノ酸残基での置換、または
（４）野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の１１４〜１５０位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応位置におけるアミノ酸残基での置換、または
（５）野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の２５９〜２８３位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応位置におけるアミノ酸残基での置換
を有する。
【００１１】
いくつかの好ましい実施形態において、変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質は、（２）（ｂ）および（４）中に定義される変異を有し、任意に、さらに以下の変異：
（６）野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の１７２〜１８１位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応位置におけるアミノ酸残基での置換
を有する。
【００１２】
いくつかの好ましい実施形態において、変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質は、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質との比較において、Ｎ末端の３、５、８、１０、１２、１５、または１８個のアミノ酸が切断されている。
【００１３】
いくつかの好ましい実施形態において、変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質は、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質との比較において、Ｎ末端の５個のアミノ酸が切断されている。
【００１４】
いくつかの好ましい実施形態において、第２の型の野生型ＨＰＶは、ＨＰＶ５６である。いくつかの好ましい実施形態において、（２）（ａ）中に記載される対応位置におけるアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質の２６５〜２８３位のアミノ酸残基である。いくつかの好ましい実施形態において、（２）（ｂ）中に記載される対応位置におけるアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５７位のアミノ酸残基である。
【００１５】
いくつかの好ましい実施形態において、第３の型の野生型ＨＰＶは、ＨＰＶ５３である。いくつかの好ましい実施形態において、（３）中に記載される対応位置におけるアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質の５１〜５９位のアミノ酸残基である。いくつかの好ましい実施形態において、（４）中に記載される対応位置におけるアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質の１１３〜１４９位のアミノ酸残基である。いくつかの好ましい実施形態において、（５）中に記載される対応位置におけるアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質の２５８〜２８２位のアミノ酸残基である。いくつかの好ましい実施形態において、（６）中に記載される対応位置におけるアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質の１７１〜１８０位のアミノ酸残基である。
【００１６】
いくつかの好ましい実施形態において、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質は、配列番号１または２８のアミノ酸配列を有する。
【００１７】
いくつかの好ましい実施形態において、野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。
【００１８】
いくつかの好ましい実施形態において、野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質は、配列番号３または３１のアミノ酸配列を有する。
【００１９】
いくつかの好ましい実施形態において、野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５７位のアミノ酸残基は、配列番号２３の配列を有する。
【００２０】
いくつかの好ましい実施形態において、野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質の５１〜５９位のアミノ酸残基は、配列番号２４の配列を有する。
【００２１】
いくつかの好ましい実施形態において、野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質の１１３〜１４９位のアミノ酸残基は、配列番号２５の配列を有する。
【００２２】
いくつかの好ましい実施形態において、野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質の１７１〜１８０位のアミノ酸残基は、配列番号６５の配列を有する。
【００２３】
いくつかの好ましい実施形態において、野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質の２５８〜２８２位のアミノ酸残基は、配列番号２６の配列を有する。
【００２４】
いくつかの好ましい実施形態において、変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質は、配列番号７、８、９、１０、１１、および６３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【００２５】
別の一態様において、本発明は、上述される変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントをコードする単離された核酸を提供する。別の一態様において、本発明は、上記単離された核酸を含むベクターを提供する。いくつかの好ましい実施形態において、本発明に係る単離された核酸は、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、および６４からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する。
【００２６】
目的のポリヌクレオチドを挿入するのに有用なベクターは当技術分野において公知であり、これにはクローニングベクターおよび発現ベクターが含まれるが、それらに限定されない。一実施形態において、ベクターは、たとえば、プラスミド、コスミド、ファージなどである。
【００２７】
別の一態様において、本発明はさらに、上記単離された核酸またはベクターを含む宿主細胞にも関する。宿主細胞は、大腸菌細胞などの原核細胞、ならびに酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、および動物細胞（哺乳類細胞など、たとえばマウス細胞、ヒト細胞など）などの真核細胞を含むが、これらに限定されない。本発明に係る宿主細胞は、２９３Ｔ細胞などの細胞株であってもよい。
【００２８】
別の一態様において、本発明は、本発明に係る変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質もしくはそのバリアントを含む、またはこれからなる、ＨＰＶウイルス様粒子に関する。
【００２９】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質との比較においてＮ末端における１〜２０個のアミノ酸、たとえば１〜２０個のアミノ酸、たとえば１〜５、３〜８、５〜１０、９〜１３、１０〜１５、１２〜１８、または１５〜２０個のアミノ酸が切断され、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５７位のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５７位のアミノ酸残基で置換されている、変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質を含む。
【００３０】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質との比較においてＮ末端における１〜２０個のアミノ酸、たとえば１〜２０個のアミノ酸、たとえば１〜５、３〜８、５〜１０、９〜１３、１０〜１５、１２〜１８、または１５〜２０個のアミノ酸が切断され、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５７位のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５７位のアミノ酸残基で置換され、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の５１〜６０位のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質の５１〜５９位のアミノ酸残基で置換されている、変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質を含む。
【００３１】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質との比較においてＮ末端における１〜２０個のアミノ酸、たとえば１〜２０個のアミノ酸、たとえば１〜５、３〜８、５〜１０、９〜１３、１０〜１５、１２〜１８、または１５〜２０個のアミノ酸が切断され、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５７位のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５７位のアミノ酸残基で置換され、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の１１４〜１５０位のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質の１１３〜１４９位のアミノ酸残基で置換されている、変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質を含む。
【００３２】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質との比較においてＮ末端における１〜２０個のアミノ酸、たとえば１〜２０個のアミノ酸、たとえば１〜５、３〜８、５〜１０、９〜１３、１０〜１５、１２〜１８、または１５〜２０個のアミノ酸が切断され、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５７位のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５７位のアミノ酸残基で置換され、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の２５９〜２８３位のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質の２５８〜２８２位のアミノ酸残基で置換されている、変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質を含む。
【００３３】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質との比較においてＮ末端における１〜２０個のアミノ酸、たとえば１〜２０個のアミノ酸、たとえば１〜５、３〜８、５〜１０、９〜１３、１０〜１５、１２〜１８、または１５〜２０個のアミノ酸が切断され、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５７位のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５７位のアミノ酸残基で置換され、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の１１４〜１５０位のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質の１１３〜１４９位のアミノ酸残基で置換され、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の１７２〜１８１位のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質の１７１〜１８０位のアミノ酸残基で置換されている、変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質を含む。
【００３４】
特に好ましい一実施形態において、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子は、配列番号７、８、９、１０、１１、または６３の配列を有する変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質を含む。
【００３５】
別の一態様において、本発明はさらに、上記変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質もしくはそのバリアント、上記単離された核酸、上記ベクター、上記宿主細胞、または上記ＨＰＶウイルス様粒子を含む組成物にも関する。いくつかの好ましい実施形態において、組成物は、本発明に係る変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを含む。いくつかの好ましい実施形態において、組成物は、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子を含む。
【００３６】
別の一態様において、本発明はさらに、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子と、任意に、製薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む、医薬組成物またはワクチンにも関する。本発明に係る医薬組成物またはワクチンは、ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染により引き起こされる疾患（子宮頚がんおよび尖圭コンジローマなど）を予防するために使用できる。
【００３７】
いくつかの好ましい実施形態において、ＨＰＶウイルス様粒子は、ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染により引き起こされる疾患を予防するのに有効な量で存在する。いくつかの好ましい実施形態において、ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶ型による感染（たとえば、ＨＰＶ５６感染、ＨＰＶ６６感染、および／またはＨＰＶ５３感染）である。いくつかの好ましい実施形態において、ＨＰＶ感染により引き起こされる疾患は、子宮頚がんおよび尖圭コンジローマからなる群より選択される。
【００３８】
本発明に係る医薬組成物またはワクチンは、たとえば経口または注射（これらに限定されない）などの当技術分野において公知の方法によって投与されてよい。本発明において、特に好ましい投与経路は、注射である。
【００３９】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明に係る医薬組成物またはワクチンは、単位投薬量の形態で投与される。発明を限定することを意図しないが、たとえば、各単位投薬量は、ＨＰＶウイルス様粒子を５μｇ〜８０μｇ、好ましくは２０μｇ〜４０μｇ含有する。
【００４０】
別の一態様において、本発明は、上述される変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントの調製方法であって、変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを宿主細胞において発現させる工程と、次いで、宿主細胞の培養物から変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを回収する工程とを含む方法に関する。
【００４１】
いくつかの好ましい実施形態において、宿主細胞は、大腸菌である。
いくつかの好ましい実施形態において、当該方法は、変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを大腸菌において発現させる工程と、次いで、大腸菌の溶解物上清を精製することによって変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを得る工程とを含む。いくつかの好ましい実施形態において、変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントは、クロマトグラフィー（たとえば、陽イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、および／または疎水性相互作用クロマトグラフィー）によって大腸菌の溶解物上清から回収される。
【００４２】
別の一態様において、本発明は、ワクチンの調製方法であって、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子と、製薬学的に許容される担体および／または賦形剤と、を組み合わせる工程を含む方法に関する。
【００４３】
別の一態様において、本発明は、ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染により引き起こされる疾患の予防方法であって、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子または医薬組成物またはワクチンの予防的有効量を対象に投与する工程を含む方法に関する。好ましい一実施形態において、ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶ型による感染（たとえば、ＨＰＶ６６感染、ＨＰＶ５６感染、および／またはＨＰＶ５３感染）である。別の好ましい一実施形態において、ＨＰＶ感染により引き起こされる疾患は、子宮頚がんおよび尖圭コンジローマを含むが、これらに限定されない。別の好ましい一実施形態において、対象は、ヒトなどの哺乳類である。
【００４４】
別の一態様において、本発明はさらに、ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染により引き起こされる疾患を予防するための医薬組成物またはワクチンの製造における、本発明に係る変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質もしくはそのバリアントまたはＨＰＶウイルス様粒子の使用にも関する。好ましい一実施形態において、ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶ型による感染（たとえば、ＨＰＶ６６感染、ＨＰＶ５６感染、および／またはＨＰＶ５３感染）である。別の好ましい一実施形態において、ＨＰＶ感染により引き起こされる疾患は、子宮頚がんおよび尖圭コンジローマを含むがこれらに限定されない。
【００４５】
別の一態様において、本発明はさらに、ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染により引き起こされる疾患を予防するための、本発明に係る変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質もしくはそのバリアントまたはＨＰＶウイルス様粒子にも関する。好ましい一実施形態において、ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶ型による感染（たとえば、ＨＰＶ６６感染、ＨＰＶ５６感染、および／またはＨＰＶ５３感染）である。別の好ましい一実施形態において、ＨＰＶ感染により引き起こされる疾患は、子宮頚がんおよび尖圭コンジローマを含むがこれらに限定されない。
【００４６】
本発明中の用語の定義
本発明において、特記しない限り、本明細書中において使用される科学技術用語は、当業者が一般的に理解する意味を有する。また、本明細書中において使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、および免疫学の実験における操作は、対応分野において広く使用される通例的な操作である。ここで、本発明のよりよい理解を目的として、関連用語の定義および説明が以下に示される。
【００４７】
本発明において、「第２の型の野生型ＨＰＶ」という用語は、ＨＰＶ６６以外の野生型ＨＰＶ型を指す。本発明において、第２の型の野生型ＨＰＶは、好ましくは野生型ＨＰＶ５６である。
【００４８】
本発明において、「第３の型の野生型ＨＰＶ」という用語は、ＨＰＶ６６および第２の型の野生型ＨＰＶ以外の野生型ＨＰＶ型を指す。本発明において、第３の型の野生型ＨＰＶは、好ましくは野生型ＨＰＶ５３である。
【００４９】
本発明において、「対応位置」という表現は、比較対象配列を最適に並べた際、すなわち比較対象配列を同一率が最大となるように並べた際の、比較対象配列上の同等の位置を指す。
【００５０】
本発明において、「野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質」という用語は、ヒトパピローマウイルス６６型（ＨＰＶ６６）の天然の主要カプシドタンパク質Ｌ１を指す。野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の配列は当技術分野において公知であり、公開データベース中に見つかる（ＮＣＢＩデータベース中、受入番号ＡＢＯ７６８６５．１、Ｑ８０９６１．１、ＡＢＯ７６８５８．１、およびＡＬＴ５４９６１．１など）。
【００５１】
本発明において、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列に言及される場合、配列番号１の配列を参照して説明される。たとえば、「野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の５３〜５６位のアミノ酸残基」という表現は、配列番号１のポリペプチドの５３〜５６位のアミノ酸残基を指す。しかしながら、野生型ＨＰＶ６６は多様な分離株を含み得ること、多様な分離株の間でＬ１タンパク質のアミノ酸配列が異なり得ることが、当業者には理解される。さらに、Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列は異なり得るが、異なるＨＰＶ６６分離株の間の同一性は非常に高く（一般的に、９５％よりも高い、たとえば、９６％よりも高い、９７％よりも高い、９８％よりも高い、または９９％よりも高い）、実質的に同じ生物学的機能を有することが、当業者には理解される。したがって、本発明において、「野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質」という用語は、配列番号１のタンパク質だけでなく、多様なＨＰＶ６６分離株のＬ１タンパク質（ＡＢＯ７６８６５．１、Ｑ８０９６１．１、ＡＢＯ７６８５８．１、およびＡＬＴ５４９６１．１のＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質など）をも含む。また、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の配列断片が記載される場合、これは、配列番号１の配列断片だけでなく、多様なＨＰＶ６６分離株のＬ１タンパク質の対応配列断片をも含む。たとえば、「野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の５３〜５６位のアミノ酸残基」という表現は、配列番号１の５３〜５６位のアミノ酸残基、および多様なＨＰＶ６６分離株のＬ１タンパク質の対応断片を含む。
【００５２】
本発明において、「野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質」という用語は、ヒトパピローマウイルス５６型（ＨＰＶ５６）の天然の主要カプシドタンパク質Ｌ１を指す。野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質の配列は当技術分野において公知であり、公開データベース中に見つかる（ＮＣＢＩデータベース中、受入番号ＡＬＴ５４８９２．１、ＡＬＴ５４８６４．１、Ｐ３６７４３．１、およびＡＢＯ７６８３０．１など）。
【００５３】
本発明において、野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列に言及される場合、配列番号２の配列を参照して説明される。たとえば、「野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５７位のアミノ酸残基」という表現は、配列番号２のポリペプチドの３４７〜３５７位のアミノ酸残基を指す。しかしながら、野生型ＨＰＶ５６は多様な分離株を含み得ること、多様な分離株の間でＬ１タンパク質のアミノ酸配列が異なり得ることが、当業者には理解される。さらに、Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列は異なり得るが、異なるＨＰＶ５６分離株の間の同一性は非常に高く（一般的に、９５％よりも高い、たとえば、９６％よりも高い、９７％よりも高い、９８％よりも高い、または９９％よりも高い）、実質的に同じ生物学的機能を有することが、当業者には理解される。したがって、本発明において、「野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質」という用語は、配列番号２のタンパク質だけでなく、多様なＨＰＶ５６分離株のＬ１タンパク質（ＡＬＴ５４８９２．１、ＡＬＴ５４８６４．１、Ｐ３６７４３．１、およびＡＢＯ７６８３０．１のＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質など）をも含む。また、野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質の配列断片が記載される場合、これは、配列番号２の配列断片だけでなく、多様なＨＰＶ５６分離株のＬ１タンパク質の対応配列断片をも含む。たとえば、「野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５７位のアミノ酸残基」という表現は、配列番号２の３４７〜３５７位のアミノ酸残基、および多様なＨＰＶ５６分離株のＬ１タンパク質の対応断片を含む。
【００５４】
本発明において、「野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質」という用語は、ヒトパピローマウイルス５３型（ＨＰＶ５３）の天然の主要カプシドタンパク質Ｌ１を指す。野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質の配列は当技術分野において公知であり、公開データベース中に見つかる（ＮＣＢＩデータベース中、受入番号ＮＰ０４１８４８．１、ＡＮＹ２６５９６．１、ＡＢＵ５４０９０．１、およびＡＬＪ３２５０６．１など）。
【００５５】
本発明において、野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列に言及される場合、配列番号３の配列を参照して説明される。たとえば、「野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質の５１〜５９位のアミノ酸残基」という表現は、配列番号３のポリペプチドの５１〜５９位のアミノ酸残基を指す。しかしながら、野生型ＨＰＶ５３は多様な分離株を含み得ること、多様な分離株の間でＬ１タンパク質のアミノ酸配列が異なり得ることが、当業者には理解される。さらに、Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列は異なり得るが、異なるＨＰＶ５３分離株の間の同一性は非常に高く（一般的に、９５％よりも高い、たとえば、９６％よりも高い、９７％よりも高い、９８％よりも高い、または９９％よりも高い）、実質的に同じ生物学的機能を有することが、当業者には理解される。したがって、本発明において、「野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質」という用語は、配列番号３のタンパク質だけでなく、多様なＨＰＶ５３分離株のＬ１タンパク質（ＮＰ０４１８４８．１、ＡＮＹ２６５９６．１、ＡＢＵ５４０９０．１、およびＡＬＪ３２５０６．１のＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質など）をも含む。また、野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質の配列断片が記載される場合、これは、配列番号３の配列断片だけでなく、多様なＨＰＶ５３分離株のＬ１タンパク質の対応配列断片をも含む。たとえば、「野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質の５１〜５９位のアミノ酸残基」という表現は、配列番号３の５１〜５９位のアミノ酸残基、および多様なＨＰＶ５３分離株のＬ１タンパク質の対応断片を含む。
【００５６】
本発明において、「対応配列断片」または「対応断片」という表現は、比較対象配列を最適に並べた際、すなわち比較対象配列を同一率が最大となるように並べた際の、比較対象配列上の同等の位置にある断片を指す。
【００５７】
本発明において、「Ｎ末端におけるＸ個のアミノ酸の切断」または「Ｎ末端のＸ個のアミノ酸が切断されている」という表現は、タンパク質のＮ末端における１〜Ｘ位のアミノ酸残基が、開始コドンによりコードされるメチオニン残基で置換されている（タンパク質翻訳を開始させるために）ことを指す。たとえば、Ｎ末端の５個のアミノ酸が切断されているＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質とは、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質のＮ末端における１〜５位のアミノ酸残基が、開始コドンによりコードされるメチオニン残基で置換されているタンパク質を指す。
【００５８】
本発明において、「バリアント」という用語は、本発明に係る変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質（たとえば、配列番号７、８、９、１０、または１１のタンパク質）との比較において、アミノ酸配列が、１個以上（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９個）のアミノ酸の置換（好ましくは保存的置換）、付加、もしくは欠失を有し、または少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有し、かつ、本発明に係る変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の機能を保持するような、タンパク質を指す。本発明において、「変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の機能」という用語は、少なくとも２つのＨＰＶ型（たとえば、ＨＰＶ６６およびＨＰＶ５６、またはＨＰＶ６６、ＨＰＶ５６、およびＨＰＶ５３）に対する中和抗体の発生を誘発する能力を指す。「同一性」という用語は、ヌクレオチド配列同士またはアミノ酸配列同士の間の類似度についての尺度を指す。概して、マッチングが最大となるように配列を並べた。「同一性」は、当技術分野において知られる意味を有し、公開されているアルゴリズム（ＢＬＡＳＴなど）によって計算できる。
【００５９】
本発明において、「同一性」という用語は、２つのポリペプチドの間または２つの核酸の間のマッチ度を指す。比較される２つの配列が特定部位に同一の塩基またはアミノ酸のモノマーサブユニットを有する場合（たとえば、２つのＤＮＡ分子の各々が特定部位にアデニンを有する場合、または２つのポリペプチドの各々が特定部位にリシンを有する場合）、これら２つの分子は当該部位において同一である。２つの配列の間の同一率は、比較対象部位の総数に対する当該２つの配列に共通の同一部位の数（×１００）と相関する。たとえば、２つの配列において１０個の部位のうち６個が一致している場合、当該２つの配列は同一性が６０％である。たとえば、ＤＮＡ配列ＣＴＧＡＣＴとＣＡＧＧＴＴとは同一性が５０％である（６個中３個の部位が一致している）。一般的に、２つの配列の比較は、同一性が最大となるような手法で行なう。このような配列比較は、たとえばNeedlemanら（J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970）の方法に基づくＡｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ社）などのコンピュータプログラムを使用して実施できる。また、２つのアミノ酸配列の間の同一率は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたE.MeyersおよびW.Miller（Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)）のアルゴリズムを用い、PAM120 weight residue tableを使用し、gap length penaltyを１２とし、gap penaltyを４とすることによって、求めることができる。加えて、２つのアミノ酸配列の間の同一率は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comにて入手可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれたNeedlemanおよびWunsch（J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)）のアルゴリズムにより、Blossum 62 matrixまたはPAM250 matrixのいずれかを用い、gap weightを１６、１４、１２、１０、８、６、または４とし、length weightを１、２、３、４、５、または６とすることによって、求めることができる。
【００６０】
本明細書中において使用される場合、「保存的置換」という用語は、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの本質的特性に不利な影響または変化を及ぼすことのないアミノ酸置換を指す。たとえば、保存的置換は、当技術分野において知られる標準的な技術（部位特異的変異誘発、およびＰＣＲを用いた変異誘発など）によって導入されてよい。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基を、類似する側鎖を有する別のアミノ酸残基で置換すること、たとえば、当該アミノ酸残基と物理的または機能的に類似する（たとえば、サイズ、形状、電荷、共有結合または水素結合形成能力を含む化学的特性などが類似する）残基で置換することを含む。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定められている。こうしたファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、リシン、アルギニン、およびヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）、無電荷極性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、およびトリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、およびメチオニン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（トレオニン、バリン、およびイソロイシンなど）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびヒスチジン）を含む。したがって、一般的に、保存的置換は、対応するアミノ酸残基を同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置換することを指す。アミノ酸の保存的置換を特定する方法は、当技術分野において公知である（たとえば、Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999); and Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997)を参照；これらを引用により本明細書に援用する）。
【００６１】
本発明において、「大腸菌発現系」という用語は、大腸菌（株）とベクターとからなる発現系であって、当該大腸菌（株）がＥＲ２５６６、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、およびＢＬＲ（ＤＥ３）を含むがこれらに限定されない市販株に由来するものを指す。
【００６２】
本発明において、「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドを挿入できる核酸担持手段を指す。ベクターが、挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を発現させることができる場合、このベクターは発現ベクターとよばれる。このベクターは、担持している遺伝物質要素を、宿主細胞中への形質転換、形質導入、またはトランスフェクションによって宿主細胞において発現させることができる。ベクターは当業者に知られており、プラスミド、ファージ、コスミドなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００６３】
本発明において、「製薬学的に許容される担体および／または賦形剤」という用語は、対象および活性成分と薬理学的および／または生理学的に適合している担体および／または賦形剤を指し、これらは当技術分野において公知であり（たとえば、Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995を参照）、ｐＨ調製剤、界面活性剤、アジュバント、およびイオン強度エンハンサーを含むが、これらに限定されない。たとえば、ｐＨ調製剤はリン酸バッファーを含むがこれに限定されず、界面活性剤はカチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、またはたとえばＴｗｅｅｎ−８０などの非イオン性界面活性剤を含むがこれらに限定されず、アジュバントはアルミニウムアジュバント（たとえば、水酸化アルミニウム）およびフロイントアジュバント（たとえば、フロイント完全アジュバント）を含むがこれらに限定されず、イオン強度エンハンサーはＮａＣｌを含むがこれらに限定されない。
【００６４】
本発明において、「有効量」という用語は、意図される目的を効果的に達成できる量を指す。たとえば、疾患（ＨＰＶ感染など）を予防するのに有効な量とは、疾患（ＨＰＶ感染など）の発生を予防、抑制、または遅延させるのに有効な量を指す。このような有効量を決定することは、当業者の能力の範囲内である。
【００６５】
本発明において、「クロマトグラフィー」という用語は、イオン交換クロマトグラフィー（陽イオン交換クロマトグラフィーなど）、疎水性相互作用クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー（ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなど）、ゲルろ過クロマトグラフィー（ゲル排除クロマトグラフィー）、およびアフィニティクロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない。
【００６６】
本発明において、「溶解物上清」という用語は、以下の工程によって得られる溶液を指す：宿主細胞（大腸菌など）を溶解バッファー中で破壊し、次いで、破壊された宿主細胞を含有する溶解物溶液から不溶性物質を除去する。様々な溶解バッファーが当技術分野において公知であり、トリスバッファー、リン酸バッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、ＭＯＰＳバッファーなどが含まれるが、これらに限定されない。加えて、宿主細胞の破壊は、ホモジナイザーによる破壊、超音波処理、粉砕、高圧押出し、リゾチーム処理などを含むがこれらに限定されない当業者に知られる方法によって行うことができる。不溶性物質の除去方法も当業者に知られており、ろ過および遠心分離を含むが、これらに限定されない。
【発明の効果】
【００６７】
発明の有益な効果
研究によれば、ＨＰＶ６６と他のＨＰＶ型（ＨＰＶ５６およびＨＰＶ５３など）との間にはいくらか交差防御があるが、このような交差防御は非常に小さく、一般的には１パーセント未満であり、同じ型のＨＰＶのＶＬＰの防御レベルと比べて千分の一であることが示されている。したがって、ＨＰＶ６６ワクチンの接種を受けた対象は、依然として、他のＨＰＶ型（ＨＰＶ５６およびＨＰＶ５３など）に感染するリスクが高い。
【００６８】
本発明は、変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質およびこれによって形成されるＨＰＶウイルス様粒子を提供する。本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子は、ＨＰＶ６６および他のＨＰＶ型（ＨＰＶ５６およびＨＰＶ５３など）に対して著しい交差防御を提供する。特に、免疫量が同じである場合に、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子は、生物において少なくとも２つのＨＰＶ型（たとえば、ＨＰＶ６６およびＨＰＶ５６、またはＨＰＶ６６、ＨＰＶ５６、およびＨＰＶ５３）に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その効果は、複数のＨＰＶ型のＶＬＰの混合物（たとえば、ＨＰＶ６６  ＶＬＰおよびＨＰＶ５６  ＶＬＰの混合物、またはＨＰＶ６６  ＶＬＰ、ＨＰＶ５６  ＶＬＰ、およびＨＰＶ５３  ＶＬＰの混合物）の場合と同等である。したがって、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子は、少なくとも２つのＨＰＶ型（たとえば、ＨＰＶ６６およびＨＰＶ５６、またはＨＰＶ６６、ＨＰＶ５６、およびＨＰＶ５３）による感染と同時に当該感染に関連する疾患をも予防するために使用でき、非常に有益な技術的効果を有する。このことは、ＨＰＶワクチンの防御範囲を拡大してＨＰＶワクチンの製造コストを低減するという観点において特に著しい利点を有する。
【００６９】
本発明の実施形態がさらに、図面および実施例を参照して詳細に記載される。しかしながら、当業者には、以下の図面および実施例が本発明を例証することのみを意図したものであり、本発明の範囲を規定するものではないことが理解される。以下の図面および好ましい実施形態の詳細な説明から、当業者には、本発明の様々な目的および利点が明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】実施例１における精製した変異タンパク質についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。レーン１、タンパク質分子量マーカー；レーン２、ＨＰＶ６６Ｎ５（Ｎ末端の５個のアミノ酸が切断されたＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質）；レーン３、ＨＰＶ５６Ｎ０（全長ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質）；レーン４、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１；レーン５、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２；レーン６、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３；レーン７、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４；レーン８、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５；レーン９、タンパク質分子量マーカー；レーン１０、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５；レーン１１、ＨＰＶ５３Ｎ５（Ｎ末端の５個のアミノ酸が切断されたＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質）；レーン１２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１；レーン１３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２；レーン１４、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４；レーン１５、タンパク質分子量マーカー；レーン１６、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３。結果は、クロマトグラフィーによる精製後、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４タンパク質の純度が約９０％であり、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３タンパク質の純度が約７５％であったことを示した。
【図２】実施例１において調製した変異タンパク質Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４についてのウェスタンブロットの結果を示す（ＨＰＶ  Ｌ１広域スペクトル抗体４Ｂ３を使用して行なった）。レーン１、ＨＰＶ６６Ｎ５（Ｎ末端の５個のアミノ酸が切断されたＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質）；レーン２、ＨＰＶ５６Ｎ０（全長ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質）；レーン３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１；レーン４、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２；レーン５、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３；レーン６、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４；レーン７、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５；レーン８、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５；レーン９、ＨＰＶ５３Ｎ５（Ｎ末端の５個のアミノ酸が切断されたＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質）；レーン１０、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１；レーン１１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２；レーン１２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４。結果は、変異タンパク質Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４が広域スペクトル抗体４Ｂ３によって特異的に認識され得たことを示した。
【図３】タンパク質Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５、ＨＰＶ５６Ｎ０、およびＨＰＶ６６Ｎ５（Ｎ末端の５個のアミノ酸が切断されたＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質）を含む試料について、モレキュラーシーブクロマトグラフィーによって分析した結果を示す。結果は、タンパク質Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５を含む試料の第１のタンパク質ピークが、ＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰおよびＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰの場合と同等の約１３〜１４分に現れたことを示した。このことから、これらのタンパク質はいずれも集合してＶＬＰを形成できたことが示された。
【図４】タンパク質Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５、ＨＰＶ５３Ｎ５、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３を含む試料について、モレキュラーシーブクロマトグラフィーによって分析した結果を示す。結果は、タンパク質Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４を含む試料の第１のタンパク質ピークが、ＨＰＶ５３Ｎ５の場合と同等の約１３〜１４分に現れたことを示した。Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２を含む試料のタンパク質ピークは非対称であり、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１を含む試料の第１のタンパク質ピークは約１５分に現れ、このことから、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１によって形成されるＶＬＰは直径が比較的小さかったことが示され、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３によって形成されるＶＬＰはサイズが不均一であった。
【図５】Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５  ＶＬＰ、ＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ、およびＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰの沈降速度分析の結果を示す。結果は、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４  ＶＬＰ、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５  ＶＬＰの沈降係数がそれぞれ１２６Ｓ、１２５Ｓ、１２６Ｓ、１２７Ｓ、および１２８Ｓであり、ＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰおよびＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰの沈降係数がそれぞれ１３４Ｓおよび１４１Ｓであったことを示した。このことから、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５は、集合して、サイズおよび形態の観点において野生型ＶＬＰに類似するウイルス様粒子を形成できたことが示された。
【図６】Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５  ＶＬＰ、ＨＰＶ５３Ｎ５  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４  ＶＬＰ、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３の沈降速度分析の結果を示す。結果は、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５  ＶＬＰ、ＨＰＶ５３Ｎ５  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２  ＶＬＰ、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４  ＶＬＰの沈降係数がそれぞれ１２８Ｓ、１３０Ｓ、９３Ｓ、１０６Ｓ、および１１６Ｓであり、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３ＶＬＰの沈降係数が５３Ｓおよび１０７Ｓであったことを示した。このことから、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４は、集合して、サイズおよび形態の観点において野生型ＶＬＰに類似するウイルス様粒子を形成でき、一方、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３によって形成されるＶＬＰは直径が比較的小さく、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３によって形成されるＶＬＰはサイズが不均一であったことが示された。
【図７Ａ】様々なＶＬＰ試料の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を示す（倍率１００，０００倍で撮影、バー＝０．１μｍ）。図７Ａ、ＨＰＶ６６Ｎ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｂ、ＨＰＶ５６Ｎ０の集合によるＶＬＰ；図７Ｃ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１の集合によるＶＬＰ；図７Ｄ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２の集合によるＶＬＰ；図７Ｅ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３の集合によるＶＬＰ；図７Ｆ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４の集合によるＶＬＰ；図７Ｇ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｈ、ＨＰＶ５３Ｎ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｉ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１の集合によるＶＬＰ、直径が比較的小さい；図７Ｊ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２の集合によるＶＬＰ；図７Ｋ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４の集合によるＶＬＰ；図７Ｌ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３の集合によるＶＬＰ。結果は、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３はＨＰＶ５６Ｎ０、ＨＰＶ６６Ｎ５、およびＨＰＶ５３Ｎ５に類似しており、集合して半径約２５ｎｍのＶＬＰを形成できたが、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３によって形成されるＶＬＰは直径約２０ｎｍの小さな粒子を含んでおり、一方、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１は集合して半径約１０〜２０ｎｍの不揃いのＶＬＰを形成できたことを示した。
【図７Ｂ】様々なＶＬＰ試料の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を示す（倍率１００，０００倍で撮影、バー＝０．１μｍ）。図７Ａ、ＨＰＶ６６Ｎ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｂ、ＨＰＶ５６Ｎ０の集合によるＶＬＰ；図７Ｃ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１の集合によるＶＬＰ；図７Ｄ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２の集合によるＶＬＰ；図７Ｅ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３の集合によるＶＬＰ；図７Ｆ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４の集合によるＶＬＰ；図７Ｇ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｈ、ＨＰＶ５３Ｎ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｉ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１の集合によるＶＬＰ、直径が比較的小さい；図７Ｊ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２の集合によるＶＬＰ；図７Ｋ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４の集合によるＶＬＰ；図７Ｌ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３の集合によるＶＬＰ。結果は、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３はＨＰＶ５６Ｎ０、ＨＰＶ６６Ｎ５、およびＨＰＶ５３Ｎ５に類似しており、集合して半径約２５ｎｍのＶＬＰを形成できたが、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３によって形成されるＶＬＰは直径約２０ｎｍの小さな粒子を含んでおり、一方、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１は集合して半径約１０〜２０ｎｍの不揃いのＶＬＰを形成できたことを示した。
【図７Ｃ】様々なＶＬＰ試料の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を示す（倍率１００，０００倍で撮影、バー＝０．１μｍ）。図７Ａ、ＨＰＶ６６Ｎ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｂ、ＨＰＶ５６Ｎ０の集合によるＶＬＰ；図７Ｃ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１の集合によるＶＬＰ；図７Ｄ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２の集合によるＶＬＰ；図７Ｅ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３の集合によるＶＬＰ；図７Ｆ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４の集合によるＶＬＰ；図７Ｇ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｈ、ＨＰＶ５３Ｎ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｉ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１の集合によるＶＬＰ、直径が比較的小さい；図７Ｊ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２の集合によるＶＬＰ；図７Ｋ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４の集合によるＶＬＰ；図７Ｌ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３の集合によるＶＬＰ。結果は、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３はＨＰＶ５６Ｎ０、ＨＰＶ６６Ｎ５、およびＨＰＶ５３Ｎ５に類似しており、集合して半径約２５ｎｍのＶＬＰを形成できたが、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３によって形成されるＶＬＰは直径約２０ｎｍの小さな粒子を含んでおり、一方、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１は集合して半径約１０〜２０ｎｍの不揃いのＶＬＰを形成できたことを示した。
【図７Ｄ】様々なＶＬＰ試料の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を示す（倍率１００，０００倍で撮影、バー＝０．１μｍ）。図７Ａ、ＨＰＶ６６Ｎ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｂ、ＨＰＶ５６Ｎ０の集合によるＶＬＰ；図７Ｃ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１の集合によるＶＬＰ；図７Ｄ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２の集合によるＶＬＰ；図７Ｅ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３の集合によるＶＬＰ；図７Ｆ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４の集合によるＶＬＰ；図７Ｇ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｈ、ＨＰＶ５３Ｎ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｉ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１の集合によるＶＬＰ、直径が比較的小さい；図７Ｊ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２の集合によるＶＬＰ；図７Ｋ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４の集合によるＶＬＰ；図７Ｌ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３の集合によるＶＬＰ。結果は、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３はＨＰＶ５６Ｎ０、ＨＰＶ６６Ｎ５、およびＨＰＶ５３Ｎ５に類似しており、集合して半径約２５ｎｍのＶＬＰを形成できたが、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３によって形成されるＶＬＰは直径約２０ｎｍの小さな粒子を含んでおり、一方、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１は集合して半径約１０〜２０ｎｍの不揃いのＶＬＰを形成できたことを示した。
【図７Ｅ】様々なＶＬＰ試料の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を示す（倍率１００，０００倍で撮影、バー＝０．１μｍ）。図７Ａ、ＨＰＶ６６Ｎ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｂ、ＨＰＶ５６Ｎ０の集合によるＶＬＰ；図７Ｃ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１の集合によるＶＬＰ；図７Ｄ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２の集合によるＶＬＰ；図７Ｅ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３の集合によるＶＬＰ；図７Ｆ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４の集合によるＶＬＰ；図７Ｇ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｈ、ＨＰＶ５３Ｎ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｉ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１の集合によるＶＬＰ、直径が比較的小さい；図７Ｊ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２の集合によるＶＬＰ；図７Ｋ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４の集合によるＶＬＰ；図７Ｌ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３の集合によるＶＬＰ。結果は、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３はＨＰＶ５６Ｎ０、ＨＰＶ６６Ｎ５、およびＨＰＶ５３Ｎ５に類似しており、集合して半径約２５ｎｍのＶＬＰを形成できたが、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３によって形成されるＶＬＰは直径約２０ｎｍの小さな粒子を含んでおり、一方、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１は集合して半径約１０〜２０ｎｍの不揃いのＶＬＰを形成できたことを示した。
【図７Ｆ】様々なＶＬＰ試料の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を示す（倍率１００，０００倍で撮影、バー＝０．１μｍ）。図７Ａ、ＨＰＶ６６Ｎ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｂ、ＨＰＶ５６Ｎ０の集合によるＶＬＰ；図７Ｃ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１の集合によるＶＬＰ；図７Ｄ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２の集合によるＶＬＰ；図７Ｅ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３の集合によるＶＬＰ；図７Ｆ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４の集合によるＶＬＰ；図７Ｇ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｈ、ＨＰＶ５３Ｎ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｉ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１の集合によるＶＬＰ、直径が比較的小さい；図７Ｊ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２の集合によるＶＬＰ；図７Ｋ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４の集合によるＶＬＰ；図７Ｌ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３の集合によるＶＬＰ。結果は、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３はＨＰＶ５６Ｎ０、ＨＰＶ６６Ｎ５、およびＨＰＶ５３Ｎ５に類似しており、集合して半径約２５ｎｍのＶＬＰを形成できたが、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３によって形成されるＶＬＰは直径約２０ｎｍの小さな粒子を含んでおり、一方、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１は集合して半径約１０〜２０ｎｍの不揃いのＶＬＰを形成できたことを示した。
【図７Ｇ】様々なＶＬＰ試料の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を示す（倍率１００，０００倍で撮影、バー＝０．１μｍ）。図７Ａ、ＨＰＶ６６Ｎ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｂ、ＨＰＶ５６Ｎ０の集合によるＶＬＰ；図７Ｃ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１の集合によるＶＬＰ；図７Ｄ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２の集合によるＶＬＰ；図７Ｅ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３の集合によるＶＬＰ；図７Ｆ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４の集合によるＶＬＰ；図７Ｇ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｈ、ＨＰＶ５３Ｎ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｉ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１の集合によるＶＬＰ、直径が比較的小さい；図７Ｊ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２の集合によるＶＬＰ；図７Ｋ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４の集合によるＶＬＰ；図７Ｌ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３の集合によるＶＬＰ。結果は、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３はＨＰＶ５６Ｎ０、ＨＰＶ６６Ｎ５、およびＨＰＶ５３Ｎ５に類似しており、集合して半径約２５ｎｍのＶＬＰを形成できたが、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３によって形成されるＶＬＰは直径約２０ｎｍの小さな粒子を含んでおり、一方、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１は集合して半径約１０〜２０ｎｍの不揃いのＶＬＰを形成できたことを示した。
【図７Ｈ】様々なＶＬＰ試料の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を示す（倍率１００，０００倍で撮影、バー＝０．１μｍ）。図７Ａ、ＨＰＶ６６Ｎ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｂ、ＨＰＶ５６Ｎ０の集合によるＶＬＰ；図７Ｃ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１の集合によるＶＬＰ；図７Ｄ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２の集合によるＶＬＰ；図７Ｅ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３の集合によるＶＬＰ；図７Ｆ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４の集合によるＶＬＰ；図７Ｇ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｈ、ＨＰＶ５３Ｎ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｉ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１の集合によるＶＬＰ、直径が比較的小さい；図７Ｊ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２の集合によるＶＬＰ；図７Ｋ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４の集合によるＶＬＰ；図７Ｌ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３の集合によるＶＬＰ。結果は、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３はＨＰＶ５６Ｎ０、ＨＰＶ６６Ｎ５、およびＨＰＶ５３Ｎ５に類似しており、集合して半径約２５ｎｍのＶＬＰを形成できたが、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３によって形成されるＶＬＰは直径約２０ｎｍの小さな粒子を含んでおり、一方、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１は集合して半径約１０〜２０ｎｍの不揃いのＶＬＰを形成できたことを示した。
【図７Ｉ】様々なＶＬＰ試料の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を示す（倍率１００，０００倍で撮影、バー＝０．１μｍ）。図７Ａ、ＨＰＶ６６Ｎ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｂ、ＨＰＶ５６Ｎ０の集合によるＶＬＰ；図７Ｃ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１の集合によるＶＬＰ；図７Ｄ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２の集合によるＶＬＰ；図７Ｅ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３の集合によるＶＬＰ；図７Ｆ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４の集合によるＶＬＰ；図７Ｇ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｈ、ＨＰＶ５３Ｎ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｉ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１の集合によるＶＬＰ、直径が比較的小さい；図７Ｊ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２の集合によるＶＬＰ；図７Ｋ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４の集合によるＶＬＰ；図７Ｌ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３の集合によるＶＬＰ。結果は、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３はＨＰＶ５６Ｎ０、ＨＰＶ６６Ｎ５、およびＨＰＶ５３Ｎ５に類似しており、集合して半径約２５ｎｍのＶＬＰを形成できたが、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３によって形成されるＶＬＰは直径約２０ｎｍの小さな粒子を含んでおり、一方、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１は集合して半径約１０〜２０ｎｍの不揃いのＶＬＰを形成できたことを示した。
【図７Ｊ】様々なＶＬＰ試料の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を示す（倍率１００，０００倍で撮影、バー＝０．１μｍ）。図７Ａ、ＨＰＶ６６Ｎ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｂ、ＨＰＶ５６Ｎ０の集合によるＶＬＰ；図７Ｃ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１の集合によるＶＬＰ；図７Ｄ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２の集合によるＶＬＰ；図７Ｅ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３の集合によるＶＬＰ；図７Ｆ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４の集合によるＶＬＰ；図７Ｇ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｈ、ＨＰＶ５３Ｎ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｉ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１の集合によるＶＬＰ、直径が比較的小さい；図７Ｊ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２の集合によるＶＬＰ；図７Ｋ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４の集合によるＶＬＰ；図７Ｌ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３の集合によるＶＬＰ。結果は、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３はＨＰＶ５６Ｎ０、ＨＰＶ６６Ｎ５、およびＨＰＶ５３Ｎ５に類似しており、集合して半径約２５ｎｍのＶＬＰを形成できたが、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３によって形成されるＶＬＰは直径約２０ｎｍの小さな粒子を含んでおり、一方、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１は集合して半径約１０〜２０ｎｍの不揃いのＶＬＰを形成できたことを示した。
【図７Ｋ】様々なＶＬＰ試料の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を示す（倍率１００，０００倍で撮影、バー＝０．１μｍ）。図７Ａ、ＨＰＶ６６Ｎ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｂ、ＨＰＶ５６Ｎ０の集合によるＶＬＰ；図７Ｃ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１の集合によるＶＬＰ；図７Ｄ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２の集合によるＶＬＰ；図７Ｅ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３の集合によるＶＬＰ；図７Ｆ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４の集合によるＶＬＰ；図７Ｇ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｈ、ＨＰＶ５３Ｎ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｉ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１の集合によるＶＬＰ、直径が比較的小さい；図７Ｊ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２の集合によるＶＬＰ；図７Ｋ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４の集合によるＶＬＰ；図７Ｌ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３の集合によるＶＬＰ。結果は、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３はＨＰＶ５６Ｎ０、ＨＰＶ６６Ｎ５、およびＨＰＶ５３Ｎ５に類似しており、集合して半径約２５ｎｍのＶＬＰを形成できたが、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３によって形成されるＶＬＰは直径約２０ｎｍの小さな粒子を含んでおり、一方、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１は集合して半径約１０〜２０ｎｍの不揃いのＶＬＰを形成できたことを示した。
【図７Ｌ】様々なＶＬＰ試料の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を示す（倍率１００，０００倍で撮影、バー＝０．１μｍ）。図７Ａ、ＨＰＶ６６Ｎ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｂ、ＨＰＶ５６Ｎ０の集合によるＶＬＰ；図７Ｃ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１の集合によるＶＬＰ；図７Ｄ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２の集合によるＶＬＰ；図７Ｅ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３の集合によるＶＬＰ；図７Ｆ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４の集合によるＶＬＰ；図７Ｇ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｈ、ＨＰＶ５３Ｎ５の集合によるＶＬＰ；図７Ｉ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１の集合によるＶＬＰ、直径が比較的小さい；図７Ｊ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２の集合によるＶＬＰ；図７Ｋ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４の集合によるＶＬＰ；図７Ｌ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３の集合によるＶＬＰ。結果は、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３はＨＰＶ５６Ｎ０、ＨＰＶ６６Ｎ５、およびＨＰＶ５３Ｎ５に類似しており、集合して半径約２５ｎｍのＶＬＰを形成できたが、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３によって形成されるＶＬＰは直径約２０ｎｍの小さな粒子を含んでおり、一方、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１は集合して半径約１０〜２０ｎｍの不揃いのＶＬＰを形成できたことを示した。
【図８Ａ】実験群のマウスにおけるＨ６６Ｎ５−５６Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４  ＶＬＰ、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５  ＶＬＰ、ならびにコントロール群のマウスにおけるＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ、ＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ、および混合ＨＰＶ５６／ＨＰＶ６６  ＶＬＰについての、免疫防御の評価結果を示す。結果は、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４  ＶＬＰおよびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５  ＶＬＰの各々は、マウスにおいてＨＰＶ６６およびＨＰＶ５６に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、ＨＰＶ６６に対するその防御効果はＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合と同等であり、ＨＰＶ５６Ｎ０ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に高く、ＨＰＶ５６に対するその防御効果はＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合と同等であり、ＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に高かったことを示した。このことから、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４  ＶＬＰおよびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５  ＶＬＰを、ＨＰＶ６６感染およびＨＰＶ５６感染を予防するための有効なワクチンとして使用でき、ＨＰＶ６６  ＶＬＰおよびＨＰＶ５６  ＶＬＰを含む混合ワクチンの代わりに使用できることが示された。
【図８Ｂ】実験群のマウスにおけるＨ６６Ｎ５−５６Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４  ＶＬＰ、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５  ＶＬＰ、ならびにコントロール群のマウスにおけるＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ、ＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ、および混合ＨＰＶ５６／ＨＰＶ６６  ＶＬＰについての、免疫防御の評価結果を示す。結果は、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４  ＶＬＰおよびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５  ＶＬＰの各々は、マウスにおいてＨＰＶ６６およびＨＰＶ５６に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、ＨＰＶ６６に対するその防御効果はＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合と同等であり、ＨＰＶ５６Ｎ０ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に高く、ＨＰＶ５６に対するその防御効果はＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合と同等であり、ＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に高かったことを示した。このことから、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４  ＶＬＰおよびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５  ＶＬＰを、ＨＰＶ６６感染およびＨＰＶ５６感染を予防するための有効なワクチンとして使用でき、ＨＰＶ６６  ＶＬＰおよびＨＰＶ５６  ＶＬＰを含む混合ワクチンの代わりに使用できることが示された。
【図８Ｃ】実験群のマウスにおけるＨ６６Ｎ５−５６Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４  ＶＬＰ、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５  ＶＬＰ、ならびにコントロール群のマウスにおけるＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ、ＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ、および混合ＨＰＶ５６／ＨＰＶ６６  ＶＬＰについての、免疫防御の評価結果を示す。結果は、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４  ＶＬＰおよびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５  ＶＬＰの各々は、マウスにおいてＨＰＶ６６およびＨＰＶ５６に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、ＨＰＶ６６に対するその防御効果はＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合と同等であり、ＨＰＶ５６Ｎ０ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に高く、ＨＰＶ５６に対するその防御効果はＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合と同等であり、ＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に高かったことを示した。このことから、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４  ＶＬＰおよびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５  ＶＬＰを、ＨＰＶ６６感染およびＨＰＶ５６感染を予防するための有効なワクチンとして使用でき、ＨＰＶ６６  ＶＬＰおよびＨＰＶ５６  ＶＬＰを含む混合ワクチンの代わりに使用できることが示された。
【図９Ａ】実験群のマウスにおけるＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２  ＶＬＰ、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４  ＶＬＰ、ならびにコントロール群のマウスにおけるＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ、ＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ、ＨＰＶ５３Ｎ５  ＶＬＰ、および混合ＨＰＶ６６／５６／５３  ＶＬＰについての、免疫防御の評価結果を示す。結果は、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２  ＶＬＰ、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４  ＶＬＰの各々は、マウスにおいてＨＰＶ６６、ＨＰＶ５６、およびＨＰＶ５３に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、ＨＰＶ６６に対するその防御効果はＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合および混合ＨＰＶ６６／５６／５３  ＶＬＰの場合と同等であり、ＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合およびＨＰＶ５３Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に高く、ＨＰＶ５６に対するその防御効果はＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合および混合ＨＰＶ６６／５６／５３  ＶＬＰの場合と同等であり、ＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合およびＨＰＶ５３Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に高く、ＨＰＶ５３に対するその防御効果はＨＰＶ５３Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合および混合ＨＰＶ６６／５６／５３  ＶＬＰの場合と同等であり、ＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合およびＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に高かったことを示した。このことから、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２  ＶＬＰ、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４  ＶＬＰを、ＨＰＶ６６感染、ＨＰＶ５６感染、およびＨＰＶ５３感染を予防するための有効なワクチンとして使用でき、ＨＰＶ６６  ＶＬＰ、ＨＰＶ５６  ＶＬＰ、およびＨＰＶ５３  ＶＬＰを含む混合ワクチンの代わりに使用できることが示された。
【図９Ｂ】実験群のマウスにおけるＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２  ＶＬＰ、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４  ＶＬＰ、ならびにコントロール群のマウスにおけるＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ、ＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ、ＨＰＶ５３Ｎ５  ＶＬＰ、および混合ＨＰＶ６６／５６／５３  ＶＬＰについての、免疫防御の評価結果を示す。結果は、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２  ＶＬＰ、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４  ＶＬＰの各々は、マウスにおいてＨＰＶ６６、ＨＰＶ５６、およびＨＰＶ５３に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、ＨＰＶ６６に対するその防御効果はＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合および混合ＨＰＶ６６／５６／５３  ＶＬＰの場合と同等であり、ＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合およびＨＰＶ５３Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に高く、ＨＰＶ５６に対するその防御効果はＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合および混合ＨＰＶ６６／５６／５３  ＶＬＰの場合と同等であり、ＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合およびＨＰＶ５３Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に高く、ＨＰＶ５３に対するその防御効果はＨＰＶ５３Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合および混合ＨＰＶ６６／５６／５３  ＶＬＰの場合と同等であり、ＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合およびＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に高かったことを示した。このことから、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２  ＶＬＰ、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４  ＶＬＰを、ＨＰＶ６６感染、ＨＰＶ５６感染、およびＨＰＶ５３感染を予防するための有効なワクチンとして使用でき、ＨＰＶ６６  ＶＬＰ、ＨＰＶ５６  ＶＬＰ、およびＨＰＶ５３  ＶＬＰを含む混合ワクチンの代わりに使用できることが示された。
【図１０】実験群のマウスにおけるＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３  ＶＬＰ、ならびにコントロール群のマウスにおけるＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ、ＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ、ＨＰＶ５３Ｎ５  ＶＬＰ、および混合ＨＰＶ６６／５６／５３  ＶＬＰについての、免疫防御の評価結果を示す。結果は、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３  ＶＬＰは、マウスにおいてＨＰＶ６６、ＨＰＶ５６、およびＨＰＶ５３に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、ＨＰＶ６６に対するその防御効果はＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合および混合ＨＰＶ６６／５６／５３  ＶＬＰの場合と同等であり、ＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合およびＨＰＶ５３Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に高く、ＨＰＶ５６に対するその防御効果はＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合、ＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合、および混合ＨＰＶ６６／５６／５３  ＶＬＰの場合よりもわずかに弱かったが、ＨＰＶ５３Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に高く、ＨＰＶ５３に対するその防御効果はＨＰＶ５３Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合および混合ＨＰＶ６６／５６／５３  ＶＬＰの場合よりもわずかに弱かったが、ＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合およびＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に高かったことを示した。このことから、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３  ＶＬＰを、ＨＰＶ６６感染、ＨＰＶ５６感染、およびＨＰＶ５３感染を予防するための有効なワクチンとして使用でき、ＨＰＶ６６  ＶＬＰ、ＨＰＶ５６  ＶＬＰ、およびＨＰＶ５３  ＶＬＰを含む混合ワクチンの代わりに使用できることが示された。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
配列情報
本発明における関連する配列のいくつかが、以下の表１中に示される。
【００７２】
【表１】
2021526850.tif 000003
【００７３】
配列１（配列番号１）：
MAMWRPSDNKVYLPPTPVSKVVATDTYVKRTSIFYHAGSSRLLAVGHPYYSVSKSGTKTNIPKVSAYQYRVFRVRLPDPNKFGLPDPSFYNPDQERLVWACVGLEVGRGQPLGAGLSGHPLFNRLDDTEVSNLAGNNVIEDSRDNISVDCKQTQLCIVGCAPALGEHWTKGAVCKSTPGNTGDCPPLALVNTPIEDGDMVDTGFGAMDFKLLQESKAEVPLDIVQSTCKYPDYLKMSADAYGDSMWFYLRREQLFARHYFNRAGNVGEAIPTDLYWKGGNGRDPPPSSVYVATPSGSMITSEAQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQVFVTVVDTTRSTNMTINAAKSTLTKYDAREINQYLRHVEEYELQFVFQLCKITLTAEVMAYLHNMNNTLLDDWNIGLSPPVATSLEDKYRYIKSTAITCQREQPPAEKQDPLAKYKFWEVNLQDSFSADLDQFPLGRKFLMQLGPRPPRPKASVSASKRRAAPTSSSSSPAKRKK.
配列２（配列番号２）：
MATWRPSENKVYLPPTPVSKVVATDSYVKRTSIFYHAGSSRLLAVGHPYYSVTKDNTKTNIPKVSAYQYRVFRVRLPDPNKFGLPDTNIYNPDQERLVWACVGLEVGRGQPLGAGLSGHPLFNRLDDTESSNLANNNVIEDSRDNISVDGKQTQLCIVGCTPAMGEHWTKGAVCKSTQVTTGDCPPLALINTPIEDGDMIDTGFGAMDFKVLQESKAEVPLDIVQSTCKYPDYLKMSADAYGDSMWFYLRREQLFARHYFNRAGKVGETIPAELYLKGSNGREPPPSSVYVATPSGSMITSEAQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMTISTATEQLSKYDARKINQYLRHVEEYELQFVFQLCKITLSAEVMAYLHNMNANLLEDWNIGLSPPVATSLEDKYRYVRSTAITCQREQPPTEKQDPLAKYKFWDVNLQDSFSTDLDQFPLGRKFLMQLGTRSKPAVATSKKRSAPTSTSTPAKRKRR.
配列３（配列番号３）：
MAVWRPSDSKVYLPPTPVSKVITTDAYVKRTTIFYHAGSSRLLTVGHPYYPISKSGKADIPKVSAFQYRVFRVRLPDPNKFGLPDTNIFNPDQERLVWACVGLEIGRGQPLGVGVSGHPLFNRLDDTESSSIAIQDTAPDSRDNVSVDPKQTQLCIIGCAPAIGEHWTKGTACRSTPTTAGDCPPLELINSPIEDGDMVDTGFGALNFKALQESKSDVPLDIVQSTCKYPDYLKMSADAYGDSMWFYLRREQLFTRHFFNRAGVIGEEIPNDLYIKGSNGRDPPPSSVYVATPSGSMITSEAQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWNNQLFVTVVDTTRNTNMTLSATTQSMSTYNSKQIKQYVRHAEEYELQFVFQLCKISLSAEVMAYLHTMNSTLLEDWNIGLSPPVATSLEDKYRYVKSAAITCQKDQPPPEKQDPLSKYKFWEVNLQNSFSADLDQFPLGRKFLMQVGVRTKPPVSSKKRSASTTSTSAPSSKRKRK.
配列４（配列番号４）：
MPSDNKVYLPPTPVSKVVATDTYVKRTSIFYHAGSSRLLAVGHPYYSVTKDNTKTNIPKVSAYQYRVFRVRLPDPNKFGLPDPSFYNPDQERLVWACVGLEVGRGQPLGAGLSGHPLFNRLDDTEVSNLAGNNVIEDSRDNISVDCKQTQLCIVGCAPALGEHWTKGAVCKSTPGNTGDCPPLALVNTPIEDGDMVDTGFGAMDFKLLQESKAEVPLDIVQSTCKYPDYLKMSADAYGDSMWFYLRREQLFARHYFNRAGNVGEAIPTDLYWKGGNGRDPPPSSVYVATPSGSMITSEAQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQVFVTVVDTTRSTNMTINAAKSTLTKYDAREINQYLRHVEEYELQFVFQLCKITLTAEVMAYLHNMNNTLLDDWNIGLSPPVATSLEDKYRYIKSTAITCQREQPPAEKQDPLAKYKFWEVNLQDSFSADLDQFPLGRKFLMQLGPRPPRPKASVSASKRRAAPTSSSSSPAKRKK.
配列５（配列番号５）：
MPSDNKVYLPPTPVSKVVATDTYVKRTSIFYHAGSSRLLAVGHPYYSVSKSGTKTNIPKVSAYQYRVFRVRLPDPNKFGLPDPSFYNPDQERLVWACVGLEVGRGQPLGAGLSGHPLFNRLDDTESSNLANNNVIEDSRDNISVDGKQTQLCIVGCAPALGEHWTKGAVCKSTPGNTGDCPPLALVNTPIEDGDMVDTGFGAMDFKLLQESKAEVPLDIVQSTCKYPDYLKMSADAYGDSMWFYLRREQLFARHYFNRAGNVGEAIPTDLYWKGGNGRDPPPSSVYVATPSGSMITSEAQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQVFVTVVDTTRSTNMTINAAKSTLTKYDAREINQYLRHVEEYELQFVFQLCKITLTAEVMAYLHNMNNTLLDDWNIGLSPPVATSLEDKYRYIKSTAITCQREQPPAEKQDPLAKYKFWEVNLQDSFSADLDQFPLGRKFLMQLGPRPPRPKASVSASKRRAAPTSSSSSPAKRKK.
配列６（配列番号６）：
MPSDNKVYLPPTPVSKVVATDTYVKRTSIFYHAGSSRLLAVGHPYYSVSKSGTKTNIPKVSAYQYRVFRVRLPDPNKFGLPDPSFYNPDQERLVWACVGLEVGRGQPLGAGLSGHPLFNRLDDTEVSNLAGNNVIEDSRDNISVDCKQTQLCIVGCAPALGEHWTKGAVCKSTQVTTGDCPPLALVNTPIEDGDMVDTGFGAMDFKLLQESKAEVPLDIVQSTCKYPDYLKMSADAYGDSMWFYLRREQLFARHYFNRAGNVGEAIPTDLYWKGGNGRDPPPSSVYVATPSGSMITSEAQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQVFVTVVDTTRSTNMTINAAKSTLTKYDAREINQYLRHVEEYELQFVFQLCKITLTAEVMAYLHNMNNTLLDDWNIGLSPPVATSLEDKYRYIKSTAITCQREQPPAEKQDPLAKYKFWEVNLQDSFSADLDQFPLGRKFLMQLGPRPPRPKASVSASKRRAAPTSSSSSPAKRKK.
配列７（配列番号７）：
MPSDNKVYLPPTPVSKVVATDTYVKRTSIFYHAGSSRLLAVGHPYYSVSKSGTKTNIPKVSAYQYRVFRVRLPDPNKFGLPDPSFYNPDQERLVWACVGLEVGRGQPLGAGLSGHPLFNRLDDTEVSNLAGNNVIEDSRDNISVDCKQTQLCIVGCAPALGEHWTKGAVCKSTPGNTGDCPPLALVNTPIEDGDMVDTGFGAMDFKLLQESKAEVPLDIVQSTCKYPDYLKMSADAYGDSMWFYLRREQLFARHYFNRAGKVGETIPAELYLKGSNGREPPPSSVYVATPSGSMITSEAQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQVFVTVVDTTRSTNMTINAAKSTLTKYDAREINQYLRHVEEYELQFVFQLCKITLTAEVMAYLHNMNNTLLDDWNIGLSPPVATSLEDKYRYIKSTAITCQREQPPAEKQDPLAKYKFWEVNLQDSFSADLDQFPLGRKFLMQLGPRPPRPKASVSASKRRAAPTSSSSSPAKRKK.
配列８（配列番号８）：
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配列９（配列番号９）：
MPSDNKVYLPPTPVSKVVATDTYVKRTSIFYHAGSSRLLAVGHPYYPISKSGKADIPKVSAYQYRVFRVRLPDPNKFGLPDPSFYNPDQERLVWACVGLEVGRGQPLGAGLSGHPLFNRLDDTEVSNLAGNNVIEDSRDNISVDCKQTQLCIVGCAPALGEHWTKGAVCKSTPGNTGDCPPLALVNTPIEDGDMVDTGFGAMDFKLLQESKAEVPLDIVQSTCKYPDYLKMSADAYGDSMWFYLRREQLFARHYFNRAGNVGEAIPTDLYWKGGNGRDPPPSSVYVATPSGSMITSEAQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQVFVTVVDTTRSTNMTINAATEQLSKYDARKINQYLRHVEEYELQFVFQLCKITLTAEVMAYLHNMNNTLLDDWNIGLSPPVATSLEDKYRYIKSTAITCQREQPPAEKQDPLAKYKFWEVNLQDSFSADLDQFPLGRKFLMQLGPRPPRPKASVSASKRRAAPTSSSSSPAKRKK.
配列１０（配列番号１０）：
MPSDNKVYLPPTPVSKVVATDTYVKRTSIFYHAGSSRLLAVGHPYYSVSKSGTKTNIPKVSAYQYRVFRVRLPDPNKFGLPDPSFYNPDQERLVWACVGLEVGRGQPLGVGVSGHPLFNRLDDTESSSIAIQDTAPDSRDNVSVDPKQTQLCIVGCAPALGEHWTKGAVCKSTPGNTGDCPPLALVNTPIEDGDMVDTGFGAMDFKLLQESKAEVPLDIVQSTCKYPDYLKMSADAYGDSMWFYLRREQLFARHYFNRAGNVGEAIPTDLYWKGGNGRDPPPSSVYVATPSGSMITSEAQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQVFVTVVDTTRSTNMTINAATEQLSKYDARKINQYLRHVEEYELQFVFQLCKITLTAEVMAYLHNMNNTLLDDWNIGLSPPVATSLEDKYRYIKSTAITCQREQPPAEKQDPLAKYKFWEVNLQDSFSADLDQFPLGRKFLMQLGPRPPRPKASVSASKRRAAPTSSSSSPAKRKK.
配列１１（配列番号１１）：
MPSDNKVYLPPTPVSKVVATDTYVKRTSIFYHAGSSRLLAVGHPYYSVSKSGTKTNIPKVSAYQYRVFRVRLPDPNKFGLPDPSFYNPDQERLVWACVGLEVGRGQPLGAGLSGHPLFNRLDDTEVSNLAGNNVIEDSRDNISVDCKQTQLCIVGCAPALGEHWTKGAVCKSTPGNTGDCPPLALVNTPIEDGDMVDTGFGAMDFKLLQESKAEVPLDIVQSTCKYPDYLKMSADAYGDSMWFYLRREQLFARHFFNRAGVIGEEIPNDLYIKGSNGRDPPPSSVYVATPSGSMITSEAQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQVFVTVVDTTRSTNMTINAATEQLSKYDARKINQYLRHVEEYELQFVFQLCKITLTAEVMAYLHNMNNTLLDDWNIGLSPPVATSLEDKYRYIKSTAITCQREQPPAEKQDPLAKYKFWEVNLQDSFSADLDQFPLGRKFLMQLGPRPPRPKASVSASKRRAAPTSSSSSPAKRKK.
配列１２（配列番号１２）：
ATGGCCATGTGGAGGCCCAGCGACAACAAGGTGTACCTGCCCCCCACCCCCGTGAGCAAGGTGGTGGCCACCGACACCTACGTGAAGAGGACCAGCATCTTCTACCACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCCACCCCTACTACAGCGTGAGCAAGAGCGGCACCAAGACCAACATCCCCAAGGTGAGCGCCTACCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAGCTTCTACAACCCCGACCAGGAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGCCGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTTCAACAGGCTGGACGACACCGAGGTGAGCAACCTGGCCGGCAACAACGTGATCGAGGACAGCAGGGACAACATCAGCGTGGACTGCAAGCAGACCCAGCTGTGCATCGTGGGCTGCGCCCCCGCCCTGGGCGAGCACTGGACCAAGGGCGCCGTGTGCAAGAGCACCCCCGGCAACACCGGCGACTGCCCCCCCCTGGCCCTGGTGAACACCCCCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCAAGCTGCTGCAGGAGAGCAAGGCCGAGGTGCCCCTGGACATCGTGCAGAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACGCCTACGGCGACAGCATGTGGTTCTACCTGAGGAGGGAGCAGCTGTTCGCCAGGCACTACTTCAACAGGGCCGGCAACGTGGGCGAGGCCATCCCCACCGACCTGTACTGGAAGGGCGGCAACGGCAGGGACCCCCCCCCCAGCAGCGTGTACGTGGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGAGGCCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGGTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCATCAACGCCGCCAAGAGCACCCTGACCAAGTACGACGCCAGGGAGATCAACCAGTACCTGAGGCACGTGGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGGTGATGGCCTACCTGCACAACATGAACAACACCCTGCTGGACGACTGGAACATCGGCCTGAGCCCCCCCGTGGCCACCAGCCTGGAGGACAAGTACAGGTACATCAAGAGCACCGCCATCACCTGCCAGAGGGAGCAGCCCCCCGCCGAGAAGCAGGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGAGGTGAACCTGCAGGACAGCTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGATGCAGCTGGGCCCCAGGCCCCCCAGGCCCAAGGCCAGCGTGAGCGCCAGCAAGAGGAGGGCCGCCCCCACCAGCAGCAGCAGCAGCCCCGCCAAGAGGAAGAAGTAA
配列１３（配列番号１３）：
ATGGCCACCTGGCGGCCCAGCGAGAACAAGGTGTACCTGCCCCCCACCCCCGTGTCCAAGGTGGTGGCCACCGACAGCTACGTGAAGCGGACCAGCATCTTCTACCACGCCGGCAGCAGCAGACTGCTGGCCGTGGGCCACCCCTACTACAGCGTGACCAAGGACAACACCAAGACCAACATCCCCAAGGTGTCCGCCTACCAGTACCGGGTGTTCAGAGTGCGGCTGCCTGACCCTAACAAGTTCGGCCTGCCCGACACCAATATCTACAACCCCGACCAGGAACGGCTGGTCTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAAGTGGGCAGAGGCCAGCCTCTGGGAGCTGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTTCAACCGGCTGGACGACACCGAGAGCAGCAACCTGGCCAACAACAACGTGATCGAGGACAGCCGGGACAACATCAGCGTGGACGGCAAGCAGACCCAGCTGTGCATCGTGGGCTGCACACCCGCCATGGGCGAGCACTGGACCAAGGGCGCCGTGTGCAAGAGCACCCAGGTCACCACCGGCGACTGCCCCCCTCTGGCCCTGATCAACACCCCCATCGAGGACGGCGACATGATCGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCAAGGTGCTGCAGGAAAGCAAGGCCGAGGTCCCCCTGGACATCGTGCAGAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACGCCTACGGCGACAGCATGTGGTTCTACCTGCGGCGGGAGCAGCTGTTCGCCCGGCACTACTTCAACAGAGCCGGCAAAGTGGGCGAGACAATCCCCGCCGAGCTGTACCTGAAGGGCAGCAACGGACGGGAGCCTCCTCCCAGCAGCGTGTACGTGGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGAGGCCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGCGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGCTGTTCGTGACCGTCGTGGACACTACCCGGTCCACCAACATGACCATCAGCACCGCCACCGAGCAGCTGTCCAAGTACGACGCCCGGAAGATCAACCAGTACCTGCGGCACGTGGAGGAATATGAGCTGCAGTTCGTCTTTCAGCTGTGCAAGATCACCCTGAGCGCCGAAGTGATGGCCTACCTGCACAACATGAACGCCAACCTGCTGGAAGATTGGAACATCGGCCTGAGCCCCCCTGTGGCTACCTCTCTGGAAGATAAGTACAGATACGTGCGGAGCACCGCCATCACCTGCCAGAGAGAGCAGCCCCCCACCGAGAAGCAGGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGACGTGAACCTGCAGGACAGCTTCAGCACCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCCGGAAGTTCCTGATGCAGCTGGGCACCAGATCCAAGCCCGCCGTGGCCACAAGCAAGAAGCGGAGCGCCCCCACAAGCACCAGCACCCCCGCCAAGCGGAAGCGGAGATGA
配列１４（配列番号１４）：
ATGGCCGTGTGGAGGCCCAGCGACAGCAAGGTGTACCTGCCCCCCACCCCCGTGAGCAAGGTGATCACCACCGACGCCTACGTGAAGAGGACCACCATCTTCTACCACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGACCGTGGGCCACCCCTACTACCCCATCAGCAAGAGCGGCAAGGCCGACATCCCCAAGGTGAGCGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACACCAACATCTTCAACCCCGACCAGGAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCGTGAGCGGCCACCCCCTGTTCAACAGGCTGGACGACACCGAGAGCAGCAGCATCGCCATCCAGGACACCGCCCCCGACAGCAGGGACAACGTGAGCGTGGACCCCAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCGCCCCCGCCATCGGCGAGCACTGGACCAAGGGCACCGCCTGCAGGAGCACCCCCACCACCGCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGATCAACAGCCCCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCGCCCTGAACTTCAAGGCCCTGCAGGAGAGCAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCGTGCAGAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACGCCTACGGCGACAGCATGTGGTTCTACCTGAGGAGGGAGCAGCTGTTCACCAGGCACTTCTTCAACAGGGCCGGCGTGATCGGCGAGGAGATCCCCAACGACCTGTACATCAAGGGCAGCAACGGCAGGGACCCCCCCCCCAGCAGCGTGTACGTGGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGAGGCCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAACAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAACACCAACATGACCCTGAGCGCCACCACCCAGAGCATGAGCACCTACAACAGCAAGCAGATCAAGCAGTACGTGAGGCACGCCGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCAGCCTGAGCGCCGAGGTGATGGCCTACCTGCACACCATGAACAGCACCCTGCTGGAGGACTGGAACATCGGCCTGAGCCCCCCCGTGGCCACCAGCCTGGAGGACAAGTACAGGTACGTGAAGAGCGCCGCCATCACCTGCCAGAAGGACCAGCCCCCCCCCGAGAAGCAGGACCCCCTGAGCAAGTACAAGTTCTGGGAGGTGAACCTGCAGAACAGCTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGATGCAGGTGGGCGTGAGGACCAAGCCCCCCGTGAGCAGCAAGAAGAGGAGCGCCAGCACCACCAGCACCAGCGCCCCCAGCAGCAAGAGGAAGAGGAAGTAA
配列１５（配列番号１５）：
ATGCCCAGCGACAACAAGGTGTACCTGCCCCCCACCCCCGTGAGCAAGGTGGTGGCCACCGACACCTACGTGAAGAGGACCAGCATCTTCTACCACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCCACCCCTACTACAGCGTGACCAAGGACAACACCAAGACCAACATCCCCAAGGTGTCCGCCTACCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAGCTTCTACAACCCCGACCAGGAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGCCGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTTCAACAGGCTGGACGACACCGAGGTGAGCAACCTGGCCGGCAACAACGTGATCGAGGACAGCAGGGACAACATCAGCGTGGACTGCAAGCAGACCCAGCTGTGCATCGTGGGCTGCGCCCCCGCCCTGGGCGAGCACTGGACCAAGGGCGCCGTGTGCAAGAGCACCCCCGGCAACACCGGCGACTGCCCCCCCCTGGCCCTGGTGAACACCCCCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCAAGCTGCTGCAGGAGAGCAAGGCCGAGGTGCCCCTGGACATCGTGCAGAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACGCCTACGGCGACAGCATGTGGTTCTACCTGAGGAGGGAGCAGCTGTTCGCCAGGCACTACTTCAACAGGGCCGGCAACGTGGGCGAGGCCATCCCCACCGACCTGTACTGGAAGGGCGGCAACGGCAGGGACCCCCCCCCCAGCAGCGTGTACGTGGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGAGGCCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGGTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCATCAACGCCGCCAAGAGCACCCTGACCAAGTACGACGCCAGGGAGATCAACCAGTACCTGAGGCACGTGGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGGTGATGGCCTACCTGCACAACATGAACAACACCCTGCTGGACGACTGGAACATCGGCCTGAGCCCCCCCGTGGCCACCAGCCTGGAGGACAAGTACAGGTACATCAAGAGCACCGCCATCACCTGCCAGAGGGAGCAGCCCCCCGCCGAGAAGCAGGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGAGGTGAACCTGCAGGACAGCTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGATGCAGCTGGGCCCCAGGCCCCCCAGGCCCAAGGCCAGCGTGAGCGCCAGCAAGAGGAGGGCCGCCCCCACCAGCAGCAGCAGCAGCCCCGCCAAGAGGAAGAAGTAA
配列１６（配列番号１６）：
ATGCCCAGCGACAACAAGGTGTACCTGCCCCCCACCCCCGTGAGCAAGGTGGTGGCCACCGACACCTACGTGAAGAGGACCAGCATCTTCTACCACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCCACCCCTACTACAGCGTGAGCAAGAGCGGCACCAAGACCAACATCCCCAAGGTGAGCGCCTACCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAGCTTCTACAACCCCGACCAGGAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGGTGGGCAGAGGCCAGCCTCTGGGAGCTGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTTCAACCGGCTGGACGACACCGAGAGCAGCAACCTGGCCAACAACAACGTGATCGAGGACAGCCGGGACAACATCAGCGTGGACGGCAAGCAGACCCAGCTGTGCATCGTGGGCTGCGCCCCCGCCCTGGGCGAGCACTGGACCAAGGGCGCCGTGTGCAAGAGCACCCCCGGCAACACCGGCGACTGCCCCCCCCTGGCCCTGGTGAACACCCCCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCAAGCTGCTGCAGGAGAGCAAGGCCGAGGTGCCCCTGGACATCGTGCAGAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACGCCTACGGCGACAGCATGTGGTTCTACCTGAGGAGGGAGCAGCTGTTCGCCAGGCACTACTTCAACAGGGCCGGCAACGTGGGCGAGGCCATCCCCACCGACCTGTACTGGAAGGGCGGCAACGGCAGGGACCCCCCCCCCAGCAGCGTGTACGTGGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGAGGCCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGGTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCATCAACGCCGCCAAGAGCACCCTGACCAAGTACGACGCCAGGGAGATCAACCAGTACCTGAGGCACGTGGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGGTGATGGCCTACCTGCACAACATGAACAACACCCTGCTGGACGACTGGAACATCGGCCTGAGCCCCCCCGTGGCCACCAGCCTGGAGGACAAGTACAGGTACATCAAGAGCACCGCCATCACCTGCCAGAGGGAGCAGCCCCCCGCCGAGAAGCAGGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGAGGTGAACCTGCAGGACAGCTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGATGCAGCTGGGCCCCAGGCCCCCCAGGCCCAAGGCCAGCGTGAGCGCCAGCAAGAGGAGGGCCGCCCCCACCAGCAGCAGCAGCAGCCCCGCCAAGAGGAAGAAGTAA
配列１７（配列番号１７）：
ATGCCCAGCGACAACAAGGTGTACCTGCCCCCCACCCCCGTGAGCAAGGTGGTGGCCACCGACACCTACGTGAAGAGGACCAGCATCTTCTACCACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCCACCCCTACTACAGCGTGAGCAAGAGCGGCACCAAGACCAACATCCCCAAGGTGAGCGCCTACCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAGCTTCTACAACCCCGACCAGGAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGCCGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTTCAACAGGCTGGACGACACCGAGGTGAGCAACCTGGCCGGCAACAACGTGATCGAGGACAGCAGGGACAACATCAGCGTGGACTGCAAGCAGACCCAGCTGTGCATCGTGGGCTGCGCCCCCGCCCTGGGCGAGCACTGGACCAAGGGCGCCGTGTGCAAGAGCACCCAGGTCACCACCGGCGACTGCCCCCCTCTGGCCCTGGTGAACACCCCCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCAAGCTGCTGCAGGAGAGCAAGGCCGAGGTGCCCCTGGACATCGTGCAGAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACGCCTACGGCGACAGCATGTGGTTCTACCTGAGGAGGGAGCAGCTGTTCGCCAGGCACTACTTCAACAGGGCCGGCAACGTGGGCGAGGCCATCCCCACCGACCTGTACTGGAAGGGCGGCAACGGCAGGGACCCCCCCCCCAGCAGCGTGTACGTGGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGAGGCCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGGTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCATCAACGCCGCCAAGAGCACCCTGACCAAGTACGACGCCAGGGAGATCAACCAGTACCTGAGGCACGTGGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGGTGATGGCCTACCTGCACAACATGAACAACACCCTGCTGGACGACTGGAACATCGGCCTGAGCCCCCCCGTGGCCACCAGCCTGGAGGACAAGTACAGGTACATCAAGAGCACCGCCATCACCTGCCAGAGGGAGCAGCCCCCCGCCGAGAAGCAGGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGAGGTGAACCTGCAGGACAGCTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGATGCAGCTGGGCCCCAGGCCCCCCAGGCCCAAGGCCAGCGTGAGCGCCAGCAAGAGGAGGGCCGCCCCCACCAGCAGCAGCAGCAGCCCCGCCAAGAGGAAGAAGTAA
配列１８（配列番号１８）：
ATGCCCAGCGACAACAAGGTGTACCTGCCCCCCACCCCCGTGAGCAAGGTGGTGGCCACCGACACCTACGTGAAGAGGACCAGCATCTTCTACCACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCCACCCCTACTACAGCGTGAGCAAGAGCGGCACCAAGACCAACATCCCCAAGGTGAGCGCCTACCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAGCTTCTACAACCCCGACCAGGAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGCCGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTTCAACAGGCTGGACGACACCGAGGTGAGCAACCTGGCCGGCAACAACGTGATCGAGGACAGCAGGGACAACATCAGCGTGGACTGCAAGCAGACCCAGCTGTGCATCGTGGGCTGCGCCCCCGCCCTGGGCGAGCACTGGACCAAGGGCGCCGTGTGCAAGAGCACCCCCGGCAACACCGGCGACTGCCCCCCCCTGGCCCTGGTGAACACCCCCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCAAGCTGCTGCAGGAGAGCAAGGCCGAGGTGCCCCTGGACATCGTGCAGAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACGCCTACGGCGACAGCATGTGGTTCTACCTGAGGAGGGAGCAGCTGTTCGCCAGGCACTACTTCAACAGAGCCGGCAAAGTGGGCGAGACAATCCCCGCCGAGCTGTACCTGAAGGGCAGCAACGGACGGGAGCCTCCTCCCAGCAGCGTGTACGTGGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGAGGCCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGGTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCATCAACGCCGCCAAGAGCACCCTGACCAAGTACGACGCCAGGGAGATCAACCAGTACCTGAGGCACGTGGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGGTGATGGCCTACCTGCACAACATGAACAACACCCTGCTGGACGACTGGAACATCGGCCTGAGCCCCCCCGTGGCCACCAGCCTGGAGGACAAGTACAGGTACATCAAGAGCACCGCCATCACCTGCCAGAGGGAGCAGCCCCCCGCCGAGAAGCAGGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGAGGTGAACCTGCAGGACAGCTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGATGCAGCTGGGCCCCAGGCCCCCCAGGCCCAAGGCCAGCGTGAGCGCCAGCAAGAGGAGGGCCGCCCCCACCAGCAGCAGCAGCAGCCCCGCCAAGAGGAAGAAGTAA
配列１９（配列番号１９）：
ATGCCCAGCGACAACAAGGTGTACCTGCCCCCCACCCCCGTGAGCAAGGTGGTGGCCACCGACACCTACGTGAAGAGGACCAGCATCTTCTACCACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCCACCCCTACTACAGCGTGAGCAAGAGCGGCACCAAGACCAACATCCCCAAGGTGAGCGCCTACCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAGCTTCTACAACCCCGACCAGGAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGCCGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTTCAACAGGCTGGACGACACCGAGGTGAGCAACCTGGCCGGCAACAACGTGATCGAGGACAGCAGGGACAACATCAGCGTGGACTGCAAGCAGACCCAGCTGTGCATCGTGGGCTGCGCCCCCGCCCTGGGCGAGCACTGGACCAAGGGCGCCGTGTGCAAGAGCACCCCCGGCAACACCGGCGACTGCCCCCCCCTGGCCCTGGTGAACACCCCCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCAAGCTGCTGCAGGAGAGCAAGGCCGAGGTGCCCCTGGACATCGTGCAGAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACGCCTACGGCGACAGCATGTGGTTCTACCTGAGGAGGGAGCAGCTGTTCGCCAGGCACTACTTCAACAGGGCCGGCAACGTGGGCGAGGCCATCCCCACCGACCTGTACTGGAAGGGCGGCAACGGCAGGGACCCCCCCCCCAGCAGCGTGTACGTGGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGAGGCCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGGTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCATCAACGCCGCCACCGAGCAGCTGTCCAAGTACGACGCCCGGAAGATCAACCAGTACCTGAGGCACGTGGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGGTGATGGCCTACCTGCACAACATGAACAACACCCTGCTGGACGACTGGAACATCGGCCTGAGCCCCCCCGTGGCCACCAGCCTGGAGGACAAGTACAGGTACATCAAGAGCACCGCCATCACCTGCCAGAGGGAGCAGCCCCCCGCCGAGAAGCAGGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGAGGTGAACCTGCAGGACAGCTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGATGCAGCTGGGCCCCAGGCCCCCCAGGCCCAAGGCCAGCGTGAGCGCCAGCAAGAGGAGGGCCGCCCCCACCAGCAGCAGCAGCAGCCCCGCCAAGAGGAAGAAGTAA
配列２０（配列番号２０）：
ATGCCCAGCGACAACAAGGTGTACCTGCCCCCCACCCCCGTGAGCAAGGTGGTGGCCACCGACACCTACGTGAAGAGGACCAGCATCTTCTACCACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCCACCCCTACTACCCCATCAGCAAGAGCGGCAAGGCCGACATCCCCAAGGTGAGCGCCTACCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAGCTTCTACAACCCCGACCAGGAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGCCGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTTCAACAGGCTGGACGACACCGAGGTGAGCAACCTGGCCGGCAACAACGTGATCGAGGACAGCAGGGACAACATCAGCGTGGACTGCAAGCAGACCCAGCTGTGCATCGTGGGCTGCGCCCCCGCCCTGGGCGAGCACTGGACCAAGGGCGCCGTGTGCAAGAGCACCCCCGGCAACACCGGCGACTGCCCCCCCCTGGCCCTGGTGAACACCCCCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCAAGCTGCTGCAGGAGAGCAAGGCCGAGGTGCCCCTGGACATCGTGCAGAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACGCCTACGGCGACAGCATGTGGTTCTACCTGAGGAGGGAGCAGCTGTTCGCCAGGCACTACTTCAACAGGGCCGGCAACGTGGGCGAGGCCATCCCCACCGACCTGTACTGGAAGGGCGGCAACGGCAGGGACCCCCCCCCCAGCAGCGTGTACGTGGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGAGGCCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGGTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCATCAACGCCGCCACCGAGCAGCTGTCCAAGTACGACGCCCGGAAGATCAACCAGTACCTGAGGCACGTGGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGGTGATGGCCTACCTGCACAACATGAACAACACCCTGCTGGACGACTGGAACATCGGCCTGAGCCCCCCCGTGGCCACCAGCCTGGAGGACAAGTACAGGTACATCAAGAGCACCGCCATCACCTGCCAGAGGGAGCAGCCCCCCGCCGAGAAGCAGGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGAGGTGAACCTGCAGGACAGCTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGATGCAGCTGGGCCCCAGGCCCCCCAGGCCCAAGGCCAGCGTGAGCGCCAGCAAGAGGAGGGCCGCCCCCACCAGCAGCAGCAGCAGCCCCGCCAAGAGGAAGAAGTAA
配列２１（配列番号２１）：
ATGCCCAGCGACAACAAGGTGTACCTGCCCCCCACCCCCGTGAGCAAGGTGGTGGCCACCGACACCTACGTGAAGAGGACCAGCATCTTCTACCACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCCACCCCTACTACAGCGTGAGCAAGAGCGGCACCAAGACCAACATCCCCAAGGTGAGCGCCTACCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAGCTTCTACAACCCCGACCAGGAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCGTGAGCGGCCACCCCCTGTTCAACAGGCTGGACGACACCGAGAGCAGCAGCATCGCCATCCAGGACACCGCCCCCGACAGCAGGGACAACGTGAGCGTGGACCCCAAGCAGACCCAGCTGTGCATCGTGGGCTGCGCCCCCGCCCTGGGCGAGCACTGGACCAAGGGCGCCGTGTGCAAGAGCACCCCCGGCAACACCGGCGACTGCCCCCCCCTGGCCCTGGTGAACACCCCCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCAAGCTGCTGCAGGAGAGCAAGGCCGAGGTGCCCCTGGACATCGTGCAGAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACGCCTACGGCGACAGCATGTGGTTCTACCTGAGGAGGGAGCAGCTGTTCGCCAGGCACTACTTCAACAGGGCCGGCAACGTGGGCGAGGCCATCCCCACCGACCTGTACTGGAAGGGCGGCAACGGCAGGGACCCCCCCCCCAGCAGCGTGTACGTGGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGAGGCCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGGTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCATCAACGCCGCCACCGAGCAGCTGTCCAAGTACGACGCCCGGAAGATCAACCAGTACCTGAGGCACGTGGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGGTGATGGCCTACCTGCACAACATGAACAACACCCTGCTGGACGACTGGAACATCGGCCTGAGCCCCCCCGTGGCCACCAGCCTGGAGGACAAGTACAGGTACATCAAGAGCACCGCCATCACCTGCCAGAGGGAGCAGCCCCCCGCCGAGAAGCAGGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGAGGTGAACCTGCAGGACAGCTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGATGCAGCTGGGCCCCAGGCCCCCCAGGCCCAAGGCCAGCGTGAGCGCCAGCAAGAGGAGGGCCGCCCCCACCAGCAGCAGCAGCAGCCCCGCCAAGAGGAAGAAGTAA
配列２２（配列番号２２）：
ATGCCCAGCGACAACAAGGTGTACCTGCCCCCCACCCCCGTGAGCAAGGTGGTGGCCACCGACACCTACGTGAAGAGGACCAGCATCTTCTACCACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCCACCCCTACTACAGCGTGAGCAAGAGCGGCACCAAGACCAACATCCCCAAGGTGAGCGCCTACCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAGCTTCTACAACCCCGACCAGGAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGCCGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTTCAACAGGCTGGACGACACCGAGGTGAGCAACCTGGCCGGCAACAACGTGATCGAGGACAGCAGGGACAACATCAGCGTGGACTGCAAGCAGACCCAGCTGTGCATCGTGGGCTGCGCCCCCGCCCTGGGCGAGCACTGGACCAAGGGCGCCGTGTGCAAGAGCACCCCCGGCAACACCGGCGACTGCCCCCCCCTGGCCCTGGTGAACACCCCCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCAAGCTGCTGCAGGAGAGCAAGGCCGAGGTGCCCCTGGACATCGTGCAGAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACGCCTACGGCGACAGCATGTGGTTCTACCTGAGGAGGGAGCAGCTGTTCGCCAGGCACTTCTTCAACAGGGCCGGCGTGATCGGCGAGGAGATCCCCAACGACCTGTACATCAAGGGCAGCAACGGCAGGGACCCCCCCCCCAGCAGCGTGTACGTGGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGAGGCCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGGTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCATCAACGCCGCCACCGAGCAGCTGTCCAAGTACGACGCCCGGAAGATCAACCAGTACCTGAGGCACGTGGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGGTGATGGCCTACCTGCACAACATGAACAACACCCTGCTGGACGACTGGAACATCGGCCTGAGCCCCCCCGTGGCCACCAGCCTGGAGGACAAGTACAGGTACATCAAGAGCACCGCCATCACCTGCCAGAGGGAGCAGCCCCCCGCCGAGAAGCAGGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGAGGTGAACCTGCAGGACAGCTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGATGCAGCTGGGCCCCAGGCCCCCCAGGCCCAAGGCCAGCGTGAGCGCCAGCAAGAGGAGGGCCGCCCCCACCAGCAGCAGCAGCAGCCCCGCCAAGAGGAAGAAGTAA
配列２３（配列番号２３）：
TEQLSKYDARK
配列２４（配列番号２４）：
PISKSGKAD
配列２５（配列番号２５）：
VGVSGHPLFNRLDDTESSSIAIQDTAPDSRDNVSVDP
配列２６（配列番号２６）：
FFNRAGVIGEEIPNDLYIKGSNGRD
配列２７（配列番号２７）：
TKDN
配列２８（配列番号２８）：
MPSDNKVYLPPTPVSKVVATDTYVKRTSIFYHAGSSRLLAVGHPYYSVSKSGTKTNIPKVSAYQYRVFRVRLPDPNKFGLPDPSFYNPDQERLVWACVGLEVGRGQPLGAGLSGHPLFNRLDDTEVSNLAGNNVIEDSRDNISVDCKQTQLCIVGCAPALGEHWTKGAVCKSTPGNTGDCPPLALVNTPIEDGDMVDTGFGAMDFKLLQESKAEVPLDIVQSTCKYPDYLKMSADAYGDSMWFYLRREQLFARHYFNRAGNVGEAIPTDLYWKGGNGRDPPPSSVYVATPSGSMITSEAQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQVFVTVVDTTRSTNMTINAAKSTLTKYDAREINQYLRHVEEYELQFVFQLCKITLTAEVMAYLHNMNNTLLDDWNIGLSPPVATSLEDKYRYIKSTAITCQREQPPAEKQDPLAKYKFWEVNLQDSFSADLDQFPLGRKFLMQLGPRPPRPKASVSASKRRAAPTSSSSSPAKRKK
配列２９（配列番号２９）：
ATGCCCAGCGACAACAAGGTGTACCTGCCCCCCACCCCCGTGAGCAAGGTGGTGGCCACCGACACCTACGTGAAGAGGACCAGCATCTTCTACCACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCCACCCCTACTACAGCGTGAGCAAGAGCGGCACCAAGACCAACATCCCCAAGGTGAGCGCCTACCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAGCTTCTACAACCCCGACCAGGAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGCCGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTTCAACAGGCTGGACGACACCGAGGTGAGCAACCTGGCCGGCAACAACGTGATCGAGGACAGCAGGGACAACATCAGCGTGGACTGCAAGCAGACCCAGCTGTGCATCGTGGGCTGCGCCCCCGCCCTGGGCGAGCACTGGACCAAGGGCGCCGTGTGCAAGAGCACCCCCGGCAACACCGGCGACTGCCCCCCCCTGGCCCTGGTGAACACCCCCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCAAGCTGCTGCAGGAGAGCAAGGCCGAGGTGCCCCTGGACATCGTGCAGAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACGCCTACGGCGACAGCATGTGGTTCTACCTGAGGAGGGAGCAGCTGTTCGCCAGGCACTACTTCAACAGGGCCGGCAACGTGGGCGAGGCCATCCCCACCGACCTGTACTGGAAGGGCGGCAACGGCAGGGACCCCCCCCCCAGCAGCGTGTACGTGGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGAGGCCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGGTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCATCAACGCCGCCAAGAGCACCCTGACCAAGTACGACGCCAGGGAGATCAACCAGTACCTGAGGCACGTGGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGGTGATGGCCTACCTGCACAACATGAACAACACCCTGCTGGACGACTGGAACATCGGCCTGAGCCCCCCCGTGGCCACCAGCCTGGAGGACAAGTACAGGTACATCAAGAGCACCGCCATCACCTGCCAGAGGGAGCAGCCCCCCGCCGAGAAGCAGGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGAGGTGAACCTGCAGGACAGCTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGATGCAGCTGGGCCCCAGGCCCCCCAGGCCCAAGGCCAGCGTGAGCGCCAGCAAGAGGAGGGCCGCCCCCACCAGCAGCAGCAGCAGCCCCGCCAAGAGGAAGAAGTAA
配列３０（配列番号３０）：
QVT
配列３１（配列番号３１）：
MPSDSKVYLPPTPVSKVITTDAYVKRTTIFYHAGSSRLLTVGHPYYPISKSGKADIPKVSAFQYRVFRVRLPDPNKFGLPDTNIFNPDQERLVWACVGLEIGRGQPLGVGVSGHPLFNRLDDTESSSIAIQDTAPDSRDNVSVDPKQTQLCIIGCAPAIGEHWTKGTACRSTPTTAGDCPPLELINSPIEDGDMVDTGFGALNFKALQESKSDVPLDIVQSTCKYPDYLKMSADAYGDSMWFYLRREQLFTRHFFNRAGVIGEEIPNDLYIKGSNGRDPPPSSVYVATPSGSMITSEAQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWNNQLFVTVVDTTRNTNMTLSATTQSMSTYNSKQIKQYVRHAEEYELQFVFQLCKISLSAEVMAYLHTMNSTLLEDWNIGLSPPVATSLEDKYRYVKSAAITCQKDQPPPEKQDPLSKYKFWEVNLQNSFSADLDQFPLGRKFLMQVGVRTKPPVSSKKRSASTTSTSAPSSKRKRK
配列３２（配列番号３２）：
ATGCCCAGCGACAGCAAGGTGTACCTGCCCCCCACCCCCGTGAGCAAGGTGATCACCACCGACGCCTACGTGAAGAGGACCACCATCTTCTACCACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGACCGTGGGCCACCCCTACTACCCCATCAGCAAGAGCGGCAAGGCCGACATCCCCAAGGTGAGCGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACACCAACATCTTCAACCCCGACCAGGAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCGTGAGCGGCCACCCCCTGTTCAACAGGCTGGACGACACCGAGAGCAGCAGCATCGCCATCCAGGACACCGCCCCCGACAGCAGGGACAACGTGAGCGTGGACCCCAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCGCCCCCGCCATCGGCGAGCACTGGACCAAGGGCACCGCCTGCAGGAGCACCCCCACCACCGCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGATCAACAGCCCCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCGCCCTGAACTTCAAGGCCCTGCAGGAGAGCAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCGTGCAGAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACGCCTACGGCGACAGCATGTGGTTCTACCTGAGGAGGGAGCAGCTGTTCACCAGGCACTTCTTCAACAGGGCCGGCGTGATCGGCGAGGAGATCCCCAACGACCTGTACATCAAGGGCAGCAACGGCAGGGACCCCCCCCCCAGCAGCGTGTACGTGGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGAGGCCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAACAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAACACCAACATGACCCTGAGCGCCACCACCCAGAGCATGAGCACCTACAACAGCAAGCAGATCAAGCAGTACGTGAGGCACGCCGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCAGCCTGAGCGCCGAGGTGATGGCCTACCTGCACACCATGAACAGCACCCTGCTGGAGGACTGGAACATCGGCCTGAGCCCCCCCGTGGCCACCAGCCTGGAGGACAAGTACAGGTACGTGAAGAGCGCCGCCATCACCTGCCAGAAGGACCAGCCCCCCCCCGAGAAGCAGGACCCCCTGAGCAAGTACAAGTTCTGGGAGGTGAACCTGCAGAACAGCTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGATGCAGGTGGGCGTGAGGACCAAGCCCCCCGTGAGCAGCAAGAAGAGGAGCGCCAGCACCACCAGCACCAGCGCCCCCAGCAGCAAGAGGAAGAGGAAGTAA
配列３３（配列番号３３）：
SSNLANNNVIEDSRDNISVDG
配列３４（配列番号３４）：
KVGETIPAELYLKGSNGRE
配列６３（配列番号６３）：
MAMWRPSDNKVYLPPTPVSKVVATDTYVKRTSIFYHAGSSRLLAVGHPYYSVSKSGTKTNIPKVSAYQYRVFRVRLPDPNKFGLPDPSFYNPDQERLVWACVGLEVGRGQPLGVGVSGHPLFNRLDDTESSSIAIQDTAPDSRDNVSVDPKQTQLCIVGCAPALGEHWTKGTACRSTPTTAGDCPPLALVNTPIEDGDMVDTGFGAMDFKLLQESKAEVPLDIVQSTCKYPDYLKMSADAYGDSMWFYLRREQLFARHYFNRAGNVGEAIPTDLYWKGGNGRDPPPSSVYVATPSGSMITSEAQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQVFVTVVDTTRSTNMTINAATINQYLRHVEEYELQFVFQLCKITLTAEVMAYLHNMNNTLLDDWNIGLSPPVATSLEDKYRYIKSTAITCQREQPPAEKQDPLAKYKFWEVNLQDSFSADLDQFPLGRKFLMQLGPRPPRPKASVSASKRRAAPTSSSSSPAKRKK.
配列６４（配列番号６４）：
ATGGCCATGTGGAGGCCCAGCGACAACAAGGTGTACCTGCCCCCCACCCCCGTGAGCAAGGTGGTGGCCACCGACACCTACGTGAAGAGGACCAGCATCTTCTACCACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCCACCCCTACTACAGCGTGAGCAAGAGCGGCACCAAGACCAACATCCCCAAGGTGAGCGCCTACCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAGCTTCTACAACCCCGACCAGGAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCGTGAGCGGCCACCCCCTGTTCAACAGGCTGGACGACACCGAGAGCAGCAGCATCGCCATCCAGGACACCGCCCCCGACAGCAGGGACAACGTGAGCGTGGACCCCAAGCAGACCCAGCTGTGCATCGTGGGCTGCGCCCCCGCCCTGGGCGAGCACTGGACCAAGGGCACCGCCTGCAGGAGCACCCCCACCACCGCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGCCCTGGTGAACACCCCCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCAAGCTGCTGCAGGAGAGCAAGGCCGAGGTGCCCCTGGACATCGTGCAGAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACGCCTACGGCGACAGCATGTGGTTCTACCTGAGGAGGGAGCAGCTGTTCGCCAGGCACTACTTCAACAGGGCCGGCAACGTGGGCGAGGCCATCCCCACCGACCTGTACTGGAAGGGCGGCAACGGCAGGGACCCCCCCCCCAGCAGCGTGTACGTGGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGAGGCCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGGTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCATCAACGCCGCCACCGAGCAGCTGTCCAAGTACGACGCCCGGAAGATCAACCAGTACCTGAGGCACGTGGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGGTGATGGCCTACCTGCACAACATGAACAACACCCTGCTGGACGACTGGAACATCGGCCTGAGCCCCCCCGTGGCCACCAGCCTGGAGGACAAGTACAGGTACATCAAGAGCACCGCCATCACCTGCCAGAGGGAGCAGCCCCCCGCCGAGAAGCAGGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGAGGTGAACCTGCAGGACAGCTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGATGCAGCTGGGCCCCAGGCCCCCCAGGCCCAAGGCCAGCGTGAGCGCCAGCAAGAGGAGGGCCGCCCCCACCAGCAGCAGCAGCAGCCCCGCCAAGAGGAAGAAGTAA
配列６５（配列番号６５）：
TACRSTPTTA
【実施例】
【００７４】
発明を実施するための具体的な様式
実施例を参照して本発明が以下にさらに記載されるが、当該実施例は、本発明を例証するためにのみ使用されるものであり、本発明を限定するものではない。
【００７５】
特記しない限り、本発明において使用する分子生物学的実験方法および免疫学的アッセイは、実質的に、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989、およびF. M. Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995中に記載される方法に従って行ない、制限酵素は製造元推奨の条件下において使用する。当業者には、当該実施例が本発明を例証するために使用されるものであり、本発明の保護範囲の限定を意図するものではないことが理解される。
【００７６】
実施例１．変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の発現および精製
発現ベクターの構築
多部位変異誘発を目的として、ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質由来のセグメントを含む変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質をコードする発現ベクターをＰＣＲによって構築し、最初に使用した鋳型は、プラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＨＰＶ６６Ｎ５Ｃであった（Ｎ末端の５個のアミノ酸が切断されたＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質をコードする；表２中では６６Ｌ１Ｎ５と略記される）。各ＰＣＲにおける鋳型およびプライマーは表２中に示される通りであり、ＰＣＲの増幅条件は以下の通りとした：変性を９４℃において２分間；３０サイクル（変性を９８℃において１０秒間、アニーリングを所与の温度において特定時間、伸長を５８℃において６．５分間）；最終の伸長を６８℃において１０分間。アニーリングの温度および時間が表２中に示される。使用したＰＣＲプライマーの配列が表３中に示される。
【００７７】
増幅産物（５０μＬ）に、制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ（ＭＢＩ）、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＦＤ１７０４、２５００Ｕ／チューブ）２μＬを添加し、得られた混合物を３７℃において６０分間インキュベートした。消化産物１０μＬを使用して、塩化カルシウム法で調製されたコンピテント大腸菌ＥＲ２５６６（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入）４０μＬを形質転換した。形質転換した大腸菌を、カナマイシン含有（最終濃度２５μｇ／ｍＬ、以降でも同様）の固体ＬＢ培地（ＬＢ培地の成分：ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母粉末５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、以降でも同様）上に広げ、単一コロニーが明瞭に観察されるまで、３７℃において１０〜１２時間静置培養した。単一コロニーを選んで、液体ＬＢ培地（カナマイシン含有）４ｍＬを入れたチューブ中に播種し、２２０ｒｐｍで３７℃において１０時間振とう培養した後、細菌溶液１ｍｌを取り、−７０℃において保存した。大腸菌からプラスミドを抽出し、プラスミド中に挿入された目的断片のヌクレオチド配列をＴ７プライマーを使用してシーケンシングした。シーケンシング結果から、構築したプラスミド（発現ベクター）中に挿入された目的断片のヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号１５および１７であり、これらによってコードされるアミノ酸配列はそれぞれ配列番号４および６であることが示された（これらに対応するタンパク質をそれぞれＨ６６Ｎ５−５６Ｔ１およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ３と命名した）。
【００７８】
変異タンパク質Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１は、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の５３〜５６位由来のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質の５３〜５６位由来のアミノ酸残基で置換されている点で、ＨＰＶ６６Ｎ５と異なる。変異タンパク質Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３は、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の１７８〜１８０位由来のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質の１７８〜１８０位由来のアミノ酸残基で置換されている点で、ＨＰＶ６６Ｎ５と異なる。
【００７９】
Ｇｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ（Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 2009; 6:343-5. doi: 10.1038/nmeth.1318）を使用して、他の変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質をコードする発現ベクターを構築した（ここで、この変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質は、ＨＰＶ５６  Ｌ１由来の特定セグメントおよびＨＰＶ５３Ｌ１由来の特定セグメントを含む）。簡潔には、変異を含む短い断片と変異を含まない長い断片とをＰＣＲによって得て、次いでＧｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙシステムを使用してこれら２つの断片をライゲーションし、環を形成した。使用した最初の鋳型は、プラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＨＰＶ６６Ｌ１Ｎ５（Ｎ末端の５個のアミノ酸が切断されたＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質をコードする；表２中では６６Ｌ１Ｎ５と略記される）、プラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＨＰＶ５３Ｎ０（全長ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質をコードする；表２中では５６Ｌ１Ｎ０と略記される）、プラスミドｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５（変異タンパク質Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５をコードする；表２中ではＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５と略記される）、およびプラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＨＰＶ５３Ｎ５（Ｎ末端の５個のアミノ酸が切断されたＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質をコードする；表２中では５３Ｌ１Ｎ５と略記される）を含むものであった。各ＰＣＲにおける鋳型およびプライマーは表２中に示される通りであり、短い断片を増幅するためのＰＣＲの増幅条件は以下の通りとした：変性を９４℃において１０分間；２５サイクル（変性を９４℃において５０秒間、アニーリングを所与の温度において特定時間、伸長を７２℃において１分間）；最終の伸長を７２℃において１０分間。長い断片を増幅するためのＰＣＲの増幅条件は以下の通りとした：変性を９４℃において１０分間；２５サイクル（変性を９４℃において５０秒間、アニーリングを所与の温度において特定時間、伸長を７２℃において７．５分間）；最終の伸長を７２℃において１０分間。使用したＰＣＲプライマーの配列が表３中に示される。増幅産物を電気泳動に供し、次いで、ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢＥＹＯＴＩＭＥ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｄ００３３）を使用して目的断片を回収し、その濃度を求めた。増幅によって得た短い断片と長い断片とをモル比２：１で混合し（総体積３μＬ）、次いで３μＬの２  Ｘ  Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＮＥＢから購入；Ｔ５  エキソヌクレアーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ含有）を添加して、５０℃において１時間反応させた。
【００８０】
繋ぎ合わせた産物（６μＬ）を使用して、塩化カルシウム法で調製されたコンピテント大腸菌ＥＲ２５６６（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入）４０μＬを形質転換した。形質転換した大腸菌をカナマイシン含有固体ＬＢ培地上に広げ、単一コロニーが明瞭に観察されるまで３７℃で１０〜１２時間にわたって静置培養した。単一コロニーを選んで、液体ＬＢ培地（カナマイシン含有）４ｍＬを入れたチューブ中に播種し、２２０ｒｐｍで３７℃において１０時間振とう培養し、次いで細菌溶液１ｍｌを取って−７０℃において保存した。大腸菌からプラスミドを抽出し、プラスミド中に挿入された目的断片のヌクレオチド配列をＴ７プライマーを使用してシーケンシングした。シーケンシング結果から、構築したプラスミド（発現ベクター）中に挿入された目的断片のヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号１６、１８、１９、２０、２１、および２２であり、これらによってコードされるアミノ酸配列はそれぞれ配列番号５、７、８、９、１０、および１１であることが示された（これらに対応するタンパク質をそれぞれＨ６６Ｎ５−５６Ｔ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４と命名した）。
【００８１】
Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３遺伝子が、Ｓａｎｇｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（上海）社によって合成された。ＨＰＶ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３遺伝子を含む合成されたプラスミドをＮｄｅＩおよびＳａｌＩで消化した（３７℃において１２時間）。消化後、ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢＥＹＯＴＩＭＥ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｄ００３３）を使用して目的の遺伝子を回収し、消化されたＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３遺伝子をｐＴＯ−Ｔ７ベクターと１６℃において１２時間かけてライゲーションさせ、次いで、得られた産物を使用してコンピテント大腸菌ＥＲ２５６６（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入）を形質転換した。形質転換した大腸菌をカナマイシン含有固体ＬＢ培地上に広げ、単一コロニーが明瞭に観察されるまで３７℃で１０〜１２時間にわたって静置培養した。単一コロニーを選んで、液体ＬＢ培地（カナマイシン含有）４ｍＬを入れたチューブ中に播種し、２２０ｒｐｍで３７℃において１０時間振とう培養し、次いで細菌溶液１ｍｌを取って−７０℃において保存した。大腸菌からプラスミドを抽出し、プラスミド中に挿入された目的断片のヌクレオチド配列をＴ７プライマーを使用してシーケンシングした。シーケンシング結果から、構築したプラスミド（発現ベクター）中に挿入された目的断片のヌクレオチド配列は配列番号６４であり、これによってコードされるアミノ酸配列は配列番号６３であることが示された（これに対応するタンパク質をＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３と命名した）。
【００８２】
変異タンパク質Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２は、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の１３０〜１５０位由来のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質の１３０〜１５０位由来のアミノ酸残基で置換されている点で、ＨＰＶ６６Ｎ５と異なる。変異タンパク質Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４は、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の２６５〜２８３位由来のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質の２６５〜２８３位由来のアミノ酸残基で置換されている点で、ＨＰＶ６６Ｎ５と異なる。変異タンパク質Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５は、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５７位由来のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５７位由来のアミノ酸残基で置換されている点で、ＨＰＶ６６Ｎ５と異なる。
【００８３】
変異タンパク質Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１は、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５７位由来のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５７位由来のアミノ酸残基で置換されており、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の５１〜６０位由来のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質の５１〜５９位由来のアミノ酸残基で置換されている点で、ＨＰＶ６６Ｎ５と異なる。変異タンパク質Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２は、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５７位由来のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５７位由来のアミノ酸残基で置換されており、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の１１４〜１５０位由来のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質の１１３〜１４９位由来のアミノ酸残基で置換されている点で、ＨＰＶ６６Ｎ５と異なる。変異タンパク質Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４は、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５７位由来のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５７位由来のアミノ酸残基で置換されており、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の２５９〜２８３位由来のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質の２５８〜２８２位由来のアミノ酸残基で置換されている点で、ＨＰＶ６６Ｎ５と異なる。
【００８４】
変異タンパク質Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３は、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５７位由来のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５７位由来のアミノ酸残基で置換されており、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の１１４〜１５０位由来のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質の１１３〜１４９位由来のアミノ酸残基で置換されており、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の１７２〜１８１位由来のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質の１７１〜１８０位由来のアミノ酸残基で置換されている点で、ＨＰＶ６６Ｎ５と異なる。
【００８５】
【表２】
2021526850.tif 000004
【００８６】
【表３】
2021526850.tif 000005
【００８７】
大スケールでの変異タンパク質の発現
組換えプラスミドｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４、およびｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３をそれぞれ含む大腸菌溶液を−７０℃の冷蔵庫から取り出し、１００ｍＬのカナマイシン含有ＬＢ液体培地中に接種して、２００ｒｐｍにおいて３７℃で約８時間インキュベートした。次いで、培養物を５００ｍＬのカナマイシン含有ＬＢ培地に移し（細菌溶液１ｍｌを移し）、さらにインキュベートした。細菌濃度がＯＤ６００約０．６に達したら、培養温度を下げて２５℃とし、５００μＬのＩＰＴＧを各培養ボトルに添加した。インキュベーションをさらに８時間行なった。インキュベーション終了後、遠心分離によって細菌を集めた。Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３タンパク質をそれぞれ発現している細菌が得られた。
【００８８】
変異タンパク質を発現している細菌の破壊
得られた細菌を、細菌１ｇに対して溶解バッファー（２０ｍＭトリスバッファー、ｐＨ７．２、３００ｍＭ  ＮａＣｌ）１０ｍＬの比率で再懸濁した。超音波装置を使用して３０分間かけて細菌を破壊した。破壊された細菌を含有する溶解溶液を１３５００ｒｐｍ（３００００ｇ）で１５分間遠心分離して、上清（すなわち、破壊された細菌の上清）を得た。
【００８９】
クロマトグラフィーによる変異タンパク質の精製
機器：ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（すなわち、元のＡｍｅｒｓｈａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）製のＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００  分取液体クロマトグラフィーシステム
クロマトグラフィー媒体：ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）、ＣＨＴ−ＩＩ（Ｂｉｏ−ＲＡＤから購入）、およびＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）
バッファー：バッファーＡ（２０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ８．０、２０ｍＭ  ＤＴＴ）；およびバッファーＢ（２０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ８．０、２０ｍＭ  ＤＴＴ、２Ｍ  ＮａＣｌ）。以下の溶出プロトコールにおいて使用した異なる濃度のＮａＣｌを含有するバッファーは、バッファーＡとバッファーＢとを特定の比率で混合することによって調製した。
【００９０】
試料：上述されるとおりに得られた、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３をそれぞれ含有する破壊された細菌の上清。
【００９１】
溶出プロトコール：
（１）破壊された細菌の上清のＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗによる陽イオン交換精製：試料をカラムに載せ、次いで、４００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファー（８０％バッファーＡ＋２０％バッファーＢ）を用いて望ましくないタンパク質を溶出させ、続いて８００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファー（６０％バッファーＡ＋４０％バッファーＢ）を用いて目的のタンパク質を溶出させ、８００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファーを用いて、溶出させた画分を集めた。
【００９２】
（２）工程（１）で得られた溶出画分のＣＨＴＩＩ（ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）によるクロマトグラフィー精製：工程（１）で得られた溶出画分を希釈してＮａＣｌ濃度を０．５Ｍに下げ、試料をカラムに載せ、次いで、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファー（７５％バッファーＡ＋２５％バッファーＢ）を用いて望ましくないタンパク質を溶出させ、続いて１０００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファー（５０％バッファーＡ＋５０％バッファーＢ）を用いて目的のタンパク質を溶出させ、１０００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファーを用いて、溶出させた画分を集めた。
【００９３】
（３）工程（２）で得られた溶出画分のＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）によるクロマトグラフィー精製：試料をカラムに載せ、次いで、１０００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファーを用いて望ましくないタンパク質を溶出させ、続いて２００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファー（９０％バッファーＡ＋１０％バッファーＢ）を用いて目的のタンパク質を溶出させ、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファーを用いて、溶出させた画分を集めた。
【００９４】
工程（３）で得られた溶出画分１５０μＬを３０μＬの６×ローディングバッファー（その１Ｌは、３００ｍｌの１Ｍ  ＴＢ  ６．８、６００ｍｌの１００％グリセリン、１２０ｇのＳＤＳ、６ｇのブロモフェノールブルー、および５０ｍｌのβ−メルカプトエタノールを含有）に添加した。得られた溶液を十分に混合して、８０℃の水浴中で１０分間、十分にインキュベートした。次いで、得られた試料の１０μｌを、１２０Ｖにて１２０分間、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシーブリリアントブルーによって電気泳動バンドを染色した。電気泳動の結果が図１中に示される。結果は、上述される精製工程の後、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４タンパク質の純度が約９０％であり、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３の純度が約７５％であったことを示した。
【００９５】
同様の方法により、大腸菌およびプラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＨＰＶ６６Ｎ５を使用してＨＰＶ６６Ｎ５タンパク質を調製および精製し、大腸菌およびプラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＨＰＶ５６Ｌ１Ｎ０を使用してＨＰＶ５６Ｎ０タンパク質を調製および精製し、大腸菌およびプラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＨＰＶ５３Ｎ５を使用してＨＰＶ５３Ｎ５タンパク質を調製および精製した。
【００９６】
変異タンパク質のウェスタンブロットアッセイ
上述される方法によって精製したＨ６６Ｎ５−５６Ｔ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４タンパク質を、電気泳動に供した。電気泳動後、ＨＰＶ  Ｌ１タンパク質に対する広域スペクトル抗体４Ｂ３を使用してウェスタンブロットアッセイを行ない、結果を図２中に示す。結果は、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４が広域スペクトル抗体４Ｂ３によって特異的に認識され得たことを示した。
【００９７】
実施例２：ＨＰＶウイルス様粒子の集合と粒子の形態学的検出
ＨＰＶウイルス様粒子の集合
所与の体積（約２ｍｌ）のタンパク質Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４、またはＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３を、（１）２Ｌの保存バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）中、（２）２Ｌの再生バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）中、および（３）２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ中に、連続的に透析した。透析は、３種のバッファーそれぞれについて１２時間行なった。
【００９８】
同様の方法により、ＨＰＶ６６Ｎ５、ＨＰＶ５６Ｎ０、およびＨＰＶ５３Ｎ５タンパク質を集合させて、それぞれＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ、ＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ、およびＨＰＶ５３Ｎ５  ＶＬＰとした。
【００９９】
モレキュラーシーブクロマトグラフィーによる分析
透析した試料を、１１２０  Ｃｏｍｐａｃｔ  ＬＣ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたモレキュラーシーブクロマトグラフィーによる分析に供した（使用した分析カラムはＴＳＫ  Ｇｅｌ  ＰＷ５０００×ｌ  ７．８×３００ｍｍ）。分析結果が図３および図４中に示される。結果は、タンパク質Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５、またはＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４を含む試料の第１のタンパク質ピークが、ＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ、ＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ、およびＨＰＶ５３Ｎ５  ＶＬＰの場合と同等の約１３〜１４分に現れたことを示し、このことから、これらのタンパク質はいずれも集合してＶＬＰを形成できたことが示された。Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１、またはＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２を含む試料のタンパク質ピークは非対称であり、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１を含む試料の第１のタンパク質ピークは約１５分に現れ、このことから、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１によって形成されるＶＬＰは直径が比較的小さかったことが示され、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２またはＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３によって形成されるＶＬＰはサイズが不均一であった。
【０１００】
沈降速度分析
沈降速度分析に用いた装置は、光学式検査システムとＡｎ−５０ＴｉおよびＡｎ−６０Ｔｉローターとを備えるＢｅｃｋｍａｎ  ＸＬ−Ａ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅであった。Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３  ＶＬＰ、ＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ、ＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ、およびＨＰＶ５３Ｎ５  ＶＬＰの沈降係数を沈降速度法によって分析した。結果が図５および図６中に示される。結果は、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２  ＶＬＰ、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４  ＶＬＰの沈降係数がそれぞれ１２６Ｓ、１２５Ｓ、１２６Ｓ、１２７Ｓ、１２８Ｓ、９３Ｓ、１０６Ｓ、および１１６Ｓであり、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３  ＶＬＰの沈降係数が５３Ｓおよび１０７Ｓであり、ＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ、ＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ、およびＨＰＶ５３Ｎ５  ＶＬＰの沈降係数がそれぞれ１３４Ｓ、１４１Ｓ、および１３０Ｓであったことを示した。このことから、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４は、集合して、サイズおよび形態の観点において野生型ＶＬＰ（ＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ、ＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ、およびＨＰＶ５３Ｎ５  ＶＬＰ）に類似するウイルス様粒子を形成でき、一方、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２  ＶＬＰ、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３  ＶＬＰは直径が比較的小さく、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２  ＶＬＰおよびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３  ＶＬＰはサイズが不均一であったことが示された。
【０１０１】
ウイルス様粒子の形態学的試験
ＶＬＰを含む試料１００μＬを透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した。使用した装置はＪＥＯＬ社提供の１００ｋＶ透過電子顕微鏡（倍率１００，０００倍）であった。簡潔には、試料１３．５μＬを２％リンタングステン酸（ｐＨ７．０）でネガティブ染色し、炭素被覆銅グリッドに固定した後、ＴＥＭで観察した。結果が図７Ａ〜図７Ｌ中に示される。結果は、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３が集合してウイルス様粒子を形成できたことを示した。加えて、結果はまた、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４の集合による粒子は半径が約２５ｎｍでサイズが均一であったことも示し、このことから、これらの変異タンパク質はＨＰＶ６６、ＨＰＶ５６、およびＨＰＶ５３のＬ１タンパク質と類似しており、集合して均一なサイズのＶＬＰを形成できたことが示された。また、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３も集合して半径約２５ｎｍのＶＬＰを形成できたが、中には直径約２０ｎｍの小さな粒子もあり、一方、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１は集合して半径約１０〜２０ｎｍの不揃いのＶＬＰを形成できた。
【０１０２】
実施例３：ウイルス様粒子を接種したマウスの血清中における中和抗体力価の評価１
この実験において、使用したウイルス様粒子はＨ６６Ｎ５−５６Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４  ＶＬＰ、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５  ＶＬＰであった。
【０１０３】
この実験における接種スケジュールが表４中に示される。すべてのマウス（６週齢ＢａｌＢ／ｃ雌マウス）を３つの群に分けた：アルミニウムアジュバント群１（免疫量５μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）、アルミニウムアジュバント群２（免疫量１μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）、およびアルミニウムアジュバント群３（免疫量０．２μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）。各群をさらに８つの小群に分けた。コントロール小群１および２にＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ単独およびＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ単独をそれぞれ接種し、コントロール小群３に混合ＨＰＶ６６／ＨＰＶ５６  ＶＬＰ（すなわち、ＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰおよびＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰの混合物、各ＶＬＰは所与の免疫量にて）を接種した。実験小群１、２、３、４、および５にＨ６６Ｎ５−５６Ｔ１ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ２ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ３ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４ＶＬＰ、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５  ＶＬＰをそれぞれ接種した。
【０１０４】
アルミニウムアジュバント群１〜３において、１つの小群あたり５匹のマウスに、免疫量それぞれ５μｇ、１μｇ、および０．２μｇ、注射体積１ｍＬにて、腹腔内注射により接種した。すべてのマウスに対して、０週目に１回目の接種を行ない、次いで２週目および４週目の各々において追加免疫接種を行なった。６週目に血液試料を眼窩採血（orbital bleeding）によって集め、血清中のＨＰＶ６６およびＨＰＶ５６に対する抗体の力価を分析した。分析結果が図８Ａ〜図８Ｃ中に示される。結果は、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４  ＶＬＰおよびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５  ＶＬＰは、マウスにおいてＨＰＶ６６に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果は同一投与量のＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合と同等であり、同一投与量のＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れており；マウスにおいてＨＰＶ５６に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果は同一投与量のＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合と同等であり、同一投与量のＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れていたことを示した。このことから、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４  ＶＬＰおよびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５  ＶＬＰがＨＰＶ６６およびＨＰＶ５６に対して良好な交差免疫原性および交差防御を有していたことが示された。
【０１０５】
【表４】
2021526850.tif 000006
【０１０６】
実施例４：抗体陽転を誘発するウイルス様粒子のＥＤ５０の評価
この実験において、使用したウイルス様粒子は、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ４  ＶＬＰおよびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５  ＶＬＰであった。
【０１０７】
６週齢ＢａｌＢ／ｃ雌マウス（マウス８匹）に単回の腹腔内注射によってアルミニウムアジュバントを接種し、ここで、実験群にはＨ６６Ｎ５−５６Ｔ４  ＶＬＰまたはＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５  ＶＬＰを使用し、コントロール群にはＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ単独、ＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ単独、または混合ＨＰＶ６６／ＨＰＶ５６  ＶＬＰ（すなわち、ＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰおよびＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰの混合物）を使用し、免疫量は０．９００μｇ、０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ、または０．０１１μｇとし、免疫化体積は１ｍＬとした。加えて、ワクチンの希釈に使用した希釈剤をブランクコントロールとして用いた。各群のマウス８匹に接種し、接種後５週目に眼球から静脈血を集めた。血清中のＨＰＶに対する抗体を検出し、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法（Reed LJ MH. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am J Hyg. 1938; 27:493-7）によって、抗体陽転を誘発する（すなわち、マウスにおいて抗体の発生を誘発する）ＥＤ５０を各試料について計算した。結果が表５〜表９中に示される。
【０１０８】
【表５】
2021526850.tif 000007
【０１０９】
【表６】
2021526850.tif 000008
【０１１０】
【表７】
2021526850.tif 000009
【０１１１】
【表８】
2021526850.tif 000010
【０１１２】
【表９】
2021526850.tif 000011
【０１１３】
結果は、マウスに接種した後５週間で、マウスにおいてＨＰＶ６６に対する抗体の発生を誘発するＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５  ＶＬＰのＥＤ５０はＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合と同等となり、ＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れており、マウスにおいてＨＰＶ５６に対する抗体の発生を誘発するＥＤ５０はＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合よりもわずかに弱かったが、ＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れていたことを示した。このことから、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５  ＶＬＰがＨＰＶ６６およびＨＰＶ５６に対して良好な交差免疫原性および交差防御を有していたことが示された。
【０１１４】
実施例５：ウイルス様粒子を接種したマウスの血清中における中和抗体力価の評価２
この実験において、使用したウイルス様粒子は、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２  ＶＬＰ、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４  ＶＬＰであった。
【０１１５】
この実験における接種スケジュールが表１０中に示される。すべてのマウス（６週齢ＢａｌＢ／ｃ雌マウス）を２つの群に分けた：アルミニウムアジュバント群１（免疫量５μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）、およびアルミニウムアジュバント群２（免疫量１μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）。各群をさらに７つの小群に分けた。コントロール小群１、２、および３にＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ単独、ＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ単独、およびＨＰＶ５３Ｎ５  ＶＬＰ単独をそれぞれ接種し、コントロール小群４に混合ＨＰＶ６６／５６／５３  ＶＬＰ（すなわち、ＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ、ＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ、およびＨＰＶ５３Ｎ５  ＶＬＰの混合物、各ＶＬＰは所与の免疫量にて）を接種した。実験小群１、２、および３にＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２  ＶＬＰ、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４  ＶＬＰをそれぞれ接種した。
【０１１６】
アルミニウムアジュバント群１〜２において、１つの小群あたり５匹のマウスに、免疫量それぞれ５μｇおよび１μｇ、注射体積１ｍＬにて、腹腔内注射により接種した。すべてのマウスに対して、０週目に１回目の接種を行ない、次いで２週目および４週目の各々において追加免疫接種を行なった。６週目に血液試料を眼窩採血によって集め、血清中のＨＰＶ６６、ＨＰＶ５６、およびＨＰＶ５３に対する抗体の力価を分析した。分析結果が図９Ａ〜図９Ｂ中に示される。結果は、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４  ＶＬＰは、マウスにおいてＨＰＶ６６に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果は同一投与量のＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合および混合ＨＰＶ６６／５６／５３  ＶＬＰの場合よりもわずかに弱かったが、同一投与量のＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ単独またはＨＰＶ５３Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れており；マウスにおいてＨＰＶ５６に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果は同一投与量のＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合および混合ＨＰＶ６６／５６／５３  ＶＬＰの場合と同等であり、同一投与量のＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合またはＨＰＶ５３Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れており；マウスにおいてＨＰＶ５３に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果は同一投与量のＨＰＶ５３Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合および混合ＨＰＶ６６／５６／５３  ＶＬＰの場合と同等であり、同一投与量のＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合またはＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れていたことを示した。このことから、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２  ＶＬＰ、およびＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ４  ＶＬＰがＨＰＶ６６、ＨＰＶ５６、およびＨＰＶ５３に対して良好な交差免疫原性および交差防御を有していたことが示された。
【０１１７】
【表１０】
2021526850.tif 000012
【０１１８】
実施例６：ウイルス様粒子を接種したマウスの血清中における中和抗体力価の評価３
この実験において、使用したウイルス様粒子はＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３  ＶＬＰであった。
【０１１９】
この実験における接種スケジュールが表１１中に示される。すべてのマウス（６週齢ＢａｌＢ／ｃ雌マウス）を２つの群に分けた：実験群（免疫量５μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）、およびコントロール群（免疫量５μｇ、アルミニウムアジュバントを使用）。各コントロール群をさらに４つの小群に分けた。コントロール小群１、２、および３にＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ単独、ＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ単独、およびＨＰＶ５３Ｎ５  ＶＬＰ単独をそれぞれ接種し、コントロール小群４に混合ＨＰＶ６６／５６／５３  ＶＬＰ（すなわち、ＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ、ＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ、およびＨＰＶ５３Ｎ５  ＶＬＰの混合物、各ＶＬＰは所与の免疫量にて）を接種した。実験小群にＨ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３  ＶＬＰを接種した。
【０１２０】
１つの小群あたり５匹のマウスに、免疫量５μｇ、注射体積１ｍＬにて、腹腔内注射により接種した。すべてのマウスに対して、０週目に１回目の接種を行ない、次いで２週目および４週目の各々において追加免疫接種を行なった。６週目に血液試料を眼窩採血によって集め、血清中のＨＰＶ６６、ＨＰＶ５６、およびＨＰＶ５３に対する抗体の力価を分析した。分析結果が図１０中に示される。結果は、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３  ＶＬＰは、マウスにおいてＨＰＶ６６に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果は同一投与量のＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合および混合ＨＰＶ６６／５６／５３  ＶＬＰの場合と同等であり、同一投与量のＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合またはＨＰＶ５３Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れており；マウスにおいてＨＰＶ５６に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果は同一投与量のＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合、ＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合、および混合ＨＰＶ６６／５６／５３  ＶＬＰの場合よりもわずかに弱かったが、同一投与量のＨＰＶ５３Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れており；マウスにおいてＨＰＶ５３に対する高力価中和抗体の発生を誘発でき、その防御効果は同一投与量のＨＰＶ５３Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合および混合ＨＰＶ６６／５６／５３  ＶＬＰの場合よりもわずかに弱かったが、同一投与量のＨＰＶ６６Ｎ５  ＶＬＰ単独の場合またはＨＰＶ５６Ｎ０  ＶＬＰ単独の場合よりも大幅に優れていたことを示した。このことから、Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３  ＶＬＰがＨＰＶ６６、ＨＰＶ５６、およびＨＰＶ５３に対して良好な交差免疫原性および交差防御を有していたことが示された。Ｈ６６Ｎ５−５６Ｔ５−５３Ｓ２−５３Ｓ３  ＶＬＰを、ＨＰＶ６６感染、ＨＰＶ５６感染、およびＨＰＶ５３感染を予防するための有効なワクチンとして使用でき、ＨＰＶ６６  ＶＬＰ、ＨＰＶ５６  ＶＬＰ、およびＨＰＶ５３  ＶＬＰを含む混合ワクチンの代わりに使用できる。
【０１２１】
【表１１】
2021526850.tif 000013
【０１２２】
以上に、本発明の具体的な実施形態が詳細に記載されているが、当業者には、本明細書中に開示される教示内容に従えば様々な改変および変更を加えることが可能であること、このような改変および変更も本発明の範囲に含まれることが理解される。本発明の範囲は付属の請求項およびこれの同等物によってもたらされる。
【図１】
2021526850.tif 000014
【図２】
2021526850.tif 000015
【図３】
2021526850.tif 000016
【図４】
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【図５】
2021526850.tif 000018
【図６】
2021526850.tif 000019
【図７Ａ】
2021526850.tif 000020
【図７Ｂ】
2021526850.tif 000021
【図７Ｃ】
2021526850.tif 000022
【図７Ｄ】
2021526850.tif 000023
【図７Ｅ】
2021526850.tif 000024
【図７Ｆ】
2021526850.tif 000025
【図７Ｇ】
2021526850.tif 000026
【図７Ｈ】
2021526850.tif 000027
【図７Ｉ】
2021526850.tif 000028
【図７Ｊ】
2021526850.tif 000029
【図７Ｋ】
2021526850.tif 000030
【図７Ｌ】
2021526850.tif 000031
【図８Ａ】
2021526850.tif 000032
【図８Ｂ】
2021526850.tif 000033
【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【配列表】
2021526850000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年2月5日(2021.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントであって、野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質との比較において、
（Ｉ）前記変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質は、以下の変異：
（１）Ｎ末端における１〜２０個のアミノ酸の切断；および
（２）（ａ）前記野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の２６５〜２８３位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応位置におけるアミノ酸残基での置換；もしくは
（ｂ）前記野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５７位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応位置におけるアミノ酸残基での置換；
を有する、
または、
（ＩＩ）前記変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質は、前記（１）および（２）（ｂ）中に定義される変異を有し、さらに以下の変異：
（３）前記野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の５１〜６０位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応位置におけるアミノ酸残基での置換、もしくは
（４）前記野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の１１４〜１５０位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応位置におけるアミノ酸残基での置換、もしくは
（５）前記野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の２５９〜２８３位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応位置におけるアミノ酸残基での置換；を有する、
または、
（ＩＩＩ）前記変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質は、前記（１）、（２）（ｂ）、および（４）中に定義される変異を有し、さらに以下の変異：
（６）前記野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の１７２〜１８１位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応位置におけるアミノ酸残基での置換を有し、
前記バリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のアミノ酸が置換、付加、または欠失されているという点でのみ、前記変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質と異なり、かつ、前記変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質の機能、すなわち少なくとも２つのＨＰＶ型に対する中和抗体の発生を誘発する能力を保持する、
変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアント。
【請求項２】
前記変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質は、前記野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質との比較において、Ｎ末端の３、５、８、１０、１２、１５、または１８個のアミノ酸が切断されている、請求項１に記載の変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアント。
【請求項３】
前記第２の型の野生型ＨＰＶは、ＨＰＶ５６であり；
好ましくは、前記（２）（ａ）中に記載される対応位置におけるアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質の２６５〜２８３位のアミノ酸残基であり；
好ましくは、前記（２）（ｂ）中に記載される対応位置におけるアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質の３４７〜３５７位のアミノ酸残基である、
請求項１または２に記載の変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアント。
【請求項４】
前記第３の型の野生型ＨＰＶは、ＨＰＶ５３であり；
好ましくは、前記（３）中に記載される対応位置におけるアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質の５１〜５９位のアミノ酸残基であり；
好ましくは、前記（４）中に記載される対応位置におけるアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質の１１３〜１４９位のアミノ酸残基であり；
好ましくは、前記（５）中に記載される対応位置におけるアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質の２５８〜２８２位のアミノ酸残基であり；
好ましくは、前記（６）中に記載される対応位置におけるアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質の１７１〜１８０位のアミノ酸残基である、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアント。
【請求項５】
前記変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質は、下記項目：
（ｉ）前記野生型ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有する；
（ｉｉ）前記野生型ＨＰＶ５６  Ｌ１タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を有する；
（ｉｉｉ）前記野生型ＨＰＶ５３  Ｌ１タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を有する
のうちの１つ以上によって特徴づけられる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアント。
【請求項６】
前記変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質は、配列番号７、８、９、１０、１１、および６３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアント。
【請求項７】
単離された核酸であって、請求項１〜６のいずれか１項に記載の変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントをコードし、
好ましくは、本発明に係る単離された核酸は、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、および６４からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、単離された核酸。
【請求項８】
請求項７に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項９】
請求項７に記載の単離された核酸および／または請求項８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質もしくはそのバリアントを含む、またはこれからなる、ＨＰＶウイルス様粒子。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質もしくはそのバリアント、または請求項７に記載の単離された核酸、または請求項８に記載のベクター、または請求項９に記載の宿主細胞、または請求項１０に記載のＨＰＶウイルス様粒子を含む、組成物。
【請求項１２】
医薬組成物またはワクチンであって、請求項１０に記載のＨＰＶウイルス様粒子と、任意に、製薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含み、
好ましくは、前記ＨＰＶウイルス様粒子は、ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染により引き起こされる疾患を予防するのに有効な量で存在し；
好ましくは、前記ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶ型による感染であり；
好ましくは、前記ＨＰＶ感染は、ＨＰＶ６６感染、ＨＰＶ５６感染、ＨＰＶ５３感染、およびこれらの任意の組み合わせから選択され；
好ましくは、前記ＨＰＶ感染により引き起こされる疾患は、子宮頚がんおよび尖圭コンジローマからなる群より選択される、医薬組成物またはワクチン。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントの調製方法であって、前記変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを宿主細胞において発現させる工程と、次いで、前記宿主細胞の培養物から前記変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを回収する工程とを含み；
好ましくは、前記宿主細胞は、大腸菌であり；
好ましくは、前記方法は、前記変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを大腸菌において発現させる工程と、次いで、前記大腸菌の溶解物上清を精製することによって前記変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを得る工程；
好ましくは、クロマトグラフィーによって前記大腸菌の溶解物上清から前記変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質またはそのバリアントを回収する工程とを含み；
好ましくは、前記クロマトグラフィーは、陽イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびこれらの任意の組み合わせから選択される、方法。
【請求項１４】
ワクチンの調製方法であって、請求項１０に記載のＨＰＶウイルス様粒子と、製薬学的に許容される担体および／または賦形剤と、を組み合わせる工程を含む、方法。
【請求項１５】
ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染により引き起こされる疾患を予防するための組成物またはワクチンであって、請求項１〜６のいずれか１項に記載の変異ＨＰＶ６６  Ｌ１タンパク質もしくはそのバリアントまたは請求項１０に記載のＨＰＶウイルス様粒子を含み、
好ましくは、前記ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶ型による感染であり；
好ましくは、前記ＨＰＶ感染は、ＨＰＶ６６感染、ＨＰＶ５６感染、ＨＰＶ５３感染、およびこれらの任意の組み合わせから選択され；
好ましくは、前記ＨＰＶ感染により引き起こされる疾患は、子宮頚がんおよび尖圭コンジローマからなる群より選択される、組成物またはワクチン。
【国際調査報告】
2021526850.tif 000038
2021526850.tif 000039
2021526850.tif 000040
2021526850.tif 000041