(57)【要約】  本発明のいくつかの変形は、ナノセルロース結晶、ナノセルロースフィブリル、又は好ましくはそれらの組合せの形態のナノセルロースと；イオン性架橋剤の存在下でイオン性架橋が可能であるアルギネートと；水とを含む３Ｄバイオ印刷用のバイオインク組成物を提供する。ナノセルロース−アルギネートバイオインクは、押出成形ベースのバイオ印刷のために好ましい流動学的特性、膨潤特性及び生体適合性を有する。ヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞を有するナノセルロース−アルギネートバイオインクが高解像度での軟骨バイオ印刷を可能にすることが実験的に示される。開示されたナノセルロースは、細胞生存及び拡散と適合し；天然細胞外環境と類似のナノスケール及びミクロスケール構造を有し、分化及び組織形成を促進し；そして押出成形３Ｄバイオ印刷を可能にする理想的な流動学的特性を有することが証明された。結晶及びフィブリルナノセルロースのユニークなブレンドによるバイオインクは、培養中の非常に安定した構造体積を生じる。
2021514874.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３Ｄバイオ印刷用のバイオインク組成物であって、
（ａ）ナノセルロース結晶及びナノセルロースフィブリルの組合せの形態のナノセルロースと、
（ｂ）アルギン酸及び／又はアルギン酸塩の形態のアルギネートと、
（ｃ）水と
を含み、前記アルギネートがイオン性架橋剤の存在下でイオン的に架橋可能である、バイオインク組成物。
【請求項２】
３Ｄバイオ印刷用のバイオインク組成物であって、
（ａ）ナノセルロースが少なくとも２４０℃の熱分解開始温度によって特徴づけられる、ナノセルロースフィブリルの形態のナノセルロースと、
（ｂ）アルギン酸及び／又はアルギン酸塩の形態のアルギネートと、
（ｃ）水と
を含み、前記アルギネートがイオン性架橋剤の存在下でイオン的に架橋可能である、バイオインク組成物。
【請求項３】
３Ｄバイオ印刷用のバイオインク組成物であって、
（ａ）ナノセルロースが少なくとも２９０℃の熱分解開始温度によって特徴づけられる、ナノセルロース結晶の形態のナノセルロースと、
（ｂ）アルギン酸及び／又はアルギン酸塩の形態のアルギネートと、
（ｃ）水と
を含み、前記アルギネートがイオン性架橋剤の存在下でイオン的に架橋可能である、バイオインク組成物。
【請求項４】
前記ナノセルロースが、１％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）のナノセルロース濃度で存在する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のバイオインク組成物。
【請求項５】
前記ナノセルロースが、３％（ｗ／ｖ）〜６％（ｗ／ｖ）のナノセルロース濃度で存在する、請求項４に記載のバイオインク組成物。
【請求項６】
前記アルギネートが、０．１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）のアルギネート濃度で存在する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のバイオインク組成物。
【請求項７】
前記バイオインク組成物が、細胞を含まないバイオインクである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のバイオインク組成物。
【請求項８】
前記バイオインク組成物が、生存可能なヒト細胞を含有する、細胞を多く含むバイオインクであり、且つ前記生存可能なヒト細胞が、任意選択的にヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のバイオインク組成物。
【請求項９】
前記生存可能なヒト細胞が、前記バイオインク組成物１ミリリットル当たり１０５〜１０７の細胞の細胞濃度で前記バイオインク組成物中に存在する、請求項８に記載のバイオインク組成物。
【請求項１０】
前記前記ナノセルロースが、親水性ナノセルロースである、請求項１〜９のいずれか一項に記載のバイオインク組成物。
【請求項１１】
前記ナノセルロースが、少なくとも２５０℃の熱分解開始温度によって特徴づけられる、請求項１に記載のバイオインク組成物。
【請求項１２】
前記熱分解開始温度が、少なくとも２９０℃である、請求項１１に記載のバイオインク組成物。
【請求項１３】
前記熱分解開始温度が、少なくとも２７０℃である、請求項２に記載のバイオインク組成物。
【請求項１４】
前記熱分解開始温度が、少なくとも３１０℃である、請求項３に記載のバイオインク組成物。
【請求項１５】
前記ナノセルロースが、約０．０５重量％未満の硫黄を含有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のバイオインク組成物。
【請求項１６】
前記ナノセルロースが、硫酸半エステル基を含有しない、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のバイオインク組成物。
【請求項１７】
前記ナノセルロースが、少なくとも−２０ｍＶ又はそれより負のゼータ電位を有する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のバイオインク組成物。
【請求項１８】
前記ナノセルロースが、剪断減粘性である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のバイオインク組成物。
【請求項１９】
前記ナノセルロースが、セルロース、ヘミセルロース及びリグニンを生成するための二酸化硫黄及びエタノールの存在下でのリグノセルロースバイオマスの分別、それに続いて、前記ナノセルロースを生成するための前記セルロースの機械的精製から得られる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のバイオインク組成物。
【請求項２０】
前記ナノセルロースが、バクテリアナノセルロースではなく、前記ナノセルロースが、被嚢類由来ではなく、且つ前記ナノセルロースが、リグノセルロースバイオマス又はセルロースの酵素加水分解によって得られない、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のバイオインク組成物。
【請求項２１】
前記バイオインク組成物が、イオン性架橋剤をさらに含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のバイオインク組成物。
【請求項２２】
前記イオン性架橋剤が、二価金属カチオンを含む、請求項２１に記載のバイオインク組成物。
【請求項２３】
前記二価金属カチオンが、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２２に記載のバイオインク組成物。
【請求項２４】
前記バイオインク組成物が、増殖促進因子、増殖因子、ビタミン、ミネラル、酵素、タンパク質、糖、糖アルコール、酸、塩基、塩、緩衝剤、安定剤、溶存酸素及び抗生物質からなる群から選択される１つ又はそれ以上のバイオインク添加剤をさらに含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のバイオインク組成物。
【請求項２５】
前記バイオインク組成物が、ヒト細胞に対して細胞毒性ではない、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のバイオインク組成物。
【請求項２６】
３Ｄバイオ印刷用のバイオインク組成物の製造方法であって、
（ａ）（存在する場合、）ナノセルロース結晶が好ましくは少なくとも２９０℃のナノ結晶熱分解開始温度によって特徴づけられ、且つ（存在する場合、）ナノセルロースフィブリルが好ましくは少なくとも２４０℃のナノフィブリル熱分解開始温度によって特徴づけられる、ナノセルロース結晶、ナノセルロースフィブリル又はそれらの組合せの形態のナノセルロースを得ることと、
（ｂ）水溶液中で前記ナノセルロースを、アルギン酸及び／又はアルギン酸塩の形態であり、且つイオン性架橋剤の存在下でイオン的に架橋可能であるアルギネートと組み合わせることと、
（ｃ）前記水溶液を殺菌すること、又は前記水溶液を調製する前に前記ナノセルロース及び前記アルギネートを別個に殺菌することと、
（ｄ）任意選択的に、前記水溶液に複数の生存可能なヒト細胞を添加することと、
（ｅ）３Ｄバイオ印刷用のバイオインク組成物として前記水溶液を回収することと
を含む、製造方法。
【請求項２７】
前記ナノセルロースが、１％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）のナノセルロース濃度で前記バイオインク組成物中に存在する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記アルギネートが、０．１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）のアルギネート濃度で前記バイオインク組成物中に存在する、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ナノセルロースが、セルロース、ヘミセルロース及びリグニンを生成するための二酸化硫黄及びエタノールの存在下でのリグノセルロースバイオマスの分別、それに続いて、前記ナノセルロースを生成するための前記セルロースの機械的精製から得られる、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ナノセルロースは、ナノセルロース結晶及びナノセルロースフィブリルの組合せの形態である、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ステップ（ｃ）において、前記殺菌が、水蒸気殺菌、ＵＶ殺菌、エタノール殺菌及びその組合せからなる群から選択される技術を利用し、且つ前記殺菌が前記水蒸気殺菌を使用する場合、ステップ（ｃ）において、前記水溶液を調製する前に、前記ナノセルロース及び前記アルギネートが別々に殺菌され、且つ前記アルギネートがＵＶ殺菌及び／又はエタノール殺菌される、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記バイオインク組成物が、細胞を含まないバイオインクである、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記バイオインク組成物が、生存可能なヒト細胞を含有する細胞を多く含むバイオインクである、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記生存可能なヒト細胞が、ヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記生存可能なヒト細胞が、前記バイオインク組成物１ミリリットル当たり１０５〜１０７の細胞の細胞濃度で前記バイオインク組成物中に存在する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーの製造方法であって、
（ａ）（存在する場合、）ナノセルロース結晶が好ましくは少なくとも２９０℃のナノ結晶熱分解開始温度によって特徴づけられ、且つ（存在する場合、）ナノセルロースフィブリルが好ましくは少なくとも２４０℃のナノフィブリル熱分解開始温度によって特徴づけられる、ナノセルロース結晶、ナノセルロースフィブリル又はそれらの組合せの形態のナノセルロースを得ることと、
（ｂ）水溶液中で前記ナノセルロースを、アルギン酸及び／又はアルギン酸塩の形態であり、且つイオン性架橋剤の存在下でイオン的に架橋可能であるアルギネートと組み合わせることと、
（ｃ）前記水溶液を殺菌すること、又は前記水溶液を調製する前に前記ナノセルロース及び前記アルギネートを別個に殺菌することと、
（ｄ）前記水溶液に複数の生存可能なヒト細胞を添加し、細胞を多く含むバイオインクを形成することと、
（ｅ）前記細胞を多く含むバイオインクの複数の層を基材又は表面に堆積することと、
（ｆ）ステップ（ｅ）の間及び／又はステップ（ｅ）に続いて、前記細胞を多く含むバイオインクの前記複数の層をイオン性架橋剤に暴露して、前記アルギネートをイオン性架橋することと、
（ｇ）前記細胞を多く含むバイオインクの前記複数の層を含有する３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーを回収することと
を含む、製造方法。
【請求項３７】
前記ナノセルロースが、１％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）のナノセルロース濃度で、前記細胞を多く含むバイオインク中に存在する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記アルギネートが、０．１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）のアルギネート濃度で、前記バイオインク組成物中に存在する、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ナノセルロースが、セルロース、ヘミセルロース及びリグニンを生成するための二酸化硫黄及びエタノールの存在下でのリグノセルロースバイオマスの分別、それに続いて、前記ナノセルロースを生成するための前記セルロースの機械的精製から得られる、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ナノセルロースが、前記ナノセルロース結晶及び前記ナノセルロースフィブリルの組合せの形態である、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ステップ（ｃ）において、前記殺菌が、水蒸気殺菌、ＵＶ殺菌、エタノール殺菌及びその組合せからなる群から選択される技術を利用し、且つ前記殺菌が前記水蒸気殺菌を使用する場合、ステップ（ｃ）において、前記水溶液を調製する前に、前記ナノセルロース及び前記アルギネートが別々に殺菌され、且つ前記アルギネートがＵＶ殺菌及び／又はエタノール殺菌される、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記生存可能なヒト細胞が、ヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞であり、且つ前記３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーがヒト軟骨を含有する、請求項３６〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
ステップ（ｅ）の前記堆積が、押出成形を利用する、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
ステップ（ｆ）において、架橋が、前記細胞を多く含むバイオインクの前記複数の層のそれぞれの形成の間に実行される、請求項３６〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
ステップ（ｆ）において、架橋が、前記細胞を多く含むバイオインクの前記複数の層の全ての形成の後に実行される、請求項３６〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記イオン性架橋剤が二価カチオンを含み、且つ前記二価カチオンが、任意選択的に、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋及びはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３６〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
ステップ（ｆ）において、前記イオン性架橋剤のエアゾールが利用され、前記エアゾールが、連続的に、又は周期的に前記細胞を多く含むバイオインクの前記複数の層に暴露される、請求項３６〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーが、イオン性架橋された前記アルギネート中に密接に分散された相互に連結している前記ナノセルロースの小型粒子の多孔性３Ｄネットワークによって特徴づけられる、請求項３６〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーが、５０ナノメートル〜１００ミクロンの細孔径の範囲のナノセルロール細孔を有する、請求項３６〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーが、耳、鼻、軟骨性連結、気管輪、喉頭、肋軟骨又はそれらの一部分からなる群から選択される、請求項３６〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権データ
本国際特許出願は、２０１８年３月７日出願の米国仮特許出願６２／６３９，５３８号に対する優先権を主張する。上記米国仮特許出願は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
分野
本発明は、一般に、３Ｄバイオ印刷、３Ｄバイオ印刷用バイオインク組成物、バイオインク組成物の製造及び使用方法、並びに３Ｄバイオ印刷から製造された３Ｄバイオストラクチャーに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
３次元（３Ｄ）印刷又は付加製造は、特殊化された印刷機を使用して、対象がその３次元形態で作成されるプロセスである。プリンターは、３Ｄモデリングプログラムの補助によってコンピュータで作成されたデザインファイルからの指示を受け取る。次いで、印刷される対象のファイル又はデジタル青写真は、２次元（２Ｄ）表示にスライスされ、プリンターへと送られる。ファイルに含まれる情報に従って材料の層が構築され；完全な対象が印刷されるまで、層は付加され続ける。２Ｄ印刷と比較して、３Ｄ印刷のプロセスではより多くの時間が必要とされ、且つ有意な投資を伴うが、原則として、いずれの幾何構造も印刷する能力などの広範囲にわたる利点が提供される。
【０００４】
今、３Ｄ印刷技術を使用して組織及び器官を構成する産業及び学会が強く興味を持たれている。３Ｄ印刷技術を使用する、生きている細胞、組織、器官及び生体適合性スカフォードの印刷プロセスは、「３Ｄバイオ印刷」と呼ばれる。ヒト組織及び器官のバイオ印刷には、アガロース、アルギネート、キトサン、コラーゲン、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、ゼラチン、フィブリン及びヒアルロン酸などの生物学的材料を含むバイオインクが必要とされる。
【０００５】
生物学的材料の３Ｄ印刷によって多数の利点が提供される。これらの応用は、主にドラッグテスト、組織工学及び臓器移植の分野にあるが、他の生物学的応用も将来現れ得る。
【０００６】
３Ｄバイオ印刷は、機能的な生きている生体材料を伴うため、ポリマー又は金属の従来の３Ｄ印刷よりもはるかに複雑である。生きている細胞及び組織の様々な感応性によって示される問題のため、通常、使用される材料、細胞の種類並びに増殖及び分化因子の適切な選択が、バイオ印刷された組織の構造完全性を決定する。
【０００７】
押出成形及びインクジェットベースの技術は従来の３Ｄ印刷プロセスから改変されたため、デリケートなバイオ材料と一緒にこれらのシステムを使用することと関連するいくつかの適合性及び安定性の問題がある。上記技術を使用して開発されたバイオ印刷製品は、顕微鏡レベルでの構造完全性に欠ける。複数の長さスケールでの細胞構造が全体的な人工組織の機能性に影響を与え；これは完全に機能的な組織の発生に関して極めて重要であることに留意する価値がある。バイオインクが、従来の組織工学戦略の再現性及び拡大縮小可能性の問題を克服して、天然組織のミクロ構造及びマクロ構造を同時に複製することが望ましい。
【０００８】
３Ｄバイオ印刷と関連する別の一般的な観測結果は、構成された３Ｄバイオ構造は主として不安定であり、且つ経時的に形状に変形が生じると報告されているという事実である。
【０００９】
３つの主な３Ｄバイオ印刷技術：押出成形、インクジェット及びレーザー補助押出成形は最も用途が広く、高速であり、拡大縮小可能であり、且つ費用効果が高く、したがって、現在の主要技術である。押出成形バイオ印刷は、機械的（ピストン若しくはねじ駆動）又は空気圧力を使用して、ノズルを通して適切な機械的特性（粘度、弾性及び剪断減粘性）を有するバイオインクを押出成形することによる。押出成形ベースのバイオ印刷（例えば、バイオプロット又は熱溶解積層法）は、ノズル又は注射器を通して粘着性バイオインクを分配することを伴う。印刷後、構造は、物理的又は化学的のいずれかで層ごとに固体化（例えばゲル化）することが可能である。押出成形ベースのバイオ印刷の主な欠点の１つは最適材料粘度へのその依存であり、達成されない場合、漏出、及び最終の組織構造の解像度に影響を与える可能性があり、このことがバイオ構造の複雑さ（特に突出部分のあるもの）を制限する。適切なバイオインクは、剪断及び／又は高温、接着、拡散及び分化下でも細胞生存能力を示さなければならない。同様に、適切なバイオインクは、受容できる機械的な剛性を有するバイオ構造を製造することが可能であるべきである。
【００１０】
ポリアクリルアミド及びポリエチレングリコールなどの合成ポリマーバイオインクの生化学的特性を押出成形技術に適合するように仕立てることは容易であるが、これらのポリマーの生体適合性及び組織再生的電位は、天然の細胞外マトリックス環境に似ているゼラチン、アガロース、アルギネート、ヒアルロン酸及びコラーゲンなどの天然の非合成バイオインクよりも劣っている。
【００１１】
したがって、押出成形３Ｄバイオ印刷の主な課題の１つは、適切な流動学的特性並びに生体適合性を有する非合成バイオインクの識別である。多くのポリマーは適切な流動学的特性を提供するが、生体適合性ではない。他方、多くの生物学的材料は生体適合性であるが、それをバイオ印刷に有用となるようにバイオインクに適切な流動学的特性を与えない。
【００１２】
バイオ印刷された構造の高い解像度又は忠実度を保証することと、最適なバイオインクを見つけることは、複雑な生物学的構造を印刷することに関する主要な障害のままである。より高い解像度は、天然構造のより良好な複製を可能にするのみならず、細孔径及び相互接続性の制御も可能にする。これは、４００〜５００ｍｍより大きい拡散距離が酸素輸送、したがって、細胞生存能力を制限し得ることを考慮する場合、重要である。現在、ステレオリソグラフィー及びインクジェットベースの技術によって良好な解像度が提供されるが、適切な生体材料の欠如、より低い細胞生存能力及び低い機械的強度によって制限されている。レーザー補助バイオプリンターは、ミクロスケールの解像度で印刷可能であるが、堆積のための個々のリボンの調製は時間がかかり、そして費用効果が低くなる可能性がある。
【００１３】
追加的な背景情報に関しては、参照によって本明細書に組み込まれる、Jessop et al., “3D bioprinting for reconstructive surgery: Principles, applications and challenges”, Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery (2017) 70, 1155-1170を参照のこと。
【００１４】
組織工学によって実質臓器移植の生成が見込まれており、これによって、毎年何千という生命が救われ、そして慢性的健康負担が解除されるであろう。加えて、組織工学は、先天的奇形を持って生まれたか、又は外傷若しくは悪性疾患のために後天的に獲得した患者への形状及び機能を回復するという可能性を有する。
【００１５】
軟骨は、制限された自己再生特性を有する軟骨細胞を含有する無血管性組織である。軟骨自体は修復しないため、損傷を受けた軟骨組織は、組織工学などの別の方法によって置き換えられる必要がある。外傷、火傷、皮膚がん又は先天的条件からの顔面軟骨欠損の再構成は、現在、最も一般には、肋軟骨部位から、有意なドナー部位病的状態に対して自己移植片を使用することに依存する。スカフォードの非特異的細胞播種に基づく組織工学による軟骨構造は、天然組織異方性を複製することができず、したがって、特に合成生体材料が使用される場合、機械的に不安定であり、そして生体内での劣化、石灰化及び炎症の傾向がある。
【００１６】
軟骨の３Ｄバイオ印刷の最新の研究によって、フィブリン、アルギネート、ゼラチン、Engelbreth-Holm-Swarm（ＥＨＳ）ネズミ肉腫細胞によって分泌されたゼラチン状タンパク質混合物及びナノセルロースを含む、いくつかの潜在的な天然バイオインク材料が識別された。これらは、軟骨細胞又は間葉系幹細胞などの細胞成分の付加後に細胞外マトリックスの隣接する健全な組織又は堆積からの細胞ホーミングを促進するためのスカフォードとして使用されてきた。しかしながら、より一般に使用されるバイオインクの適用は、最適下限の印刷適性のため、課題となる可能性がある。純粋なアルギネート配合物は、特に、粘度が増加した場合でさえも、低い印刷後形状忠実度をもたらすと示されている。
【００１７】
平行線形多糖分子から構成され、そして植物又はバクテリアの生合成から抽出されるナノセルロースは、先進的な天然由来ナノ材料の新出現の分類である。それは、その豊富さ及び持続可能性とともに、その魅力的な物理化学的特性、極めて高い剛性（１００〜２００ＧＰａ）及び強度のため、希望を抱かせる。バクテリアナノセルロースは、その生体適合性、ナノ構造、機能付与性、保水力及びコラーゲンに対するモルフォロジーにおける類似性があり、それによって細胞担体を提供するため、組織工学的用途に対して有望である。バクテリアセルロースの高アスペクト比のためのユニークな生物機械的及び流動学的特性も、それが３Ｄバイオ印刷用のバイオインクとして潜在的な有益性を有することを意味する。しかしながら、バクテリアナノセルロースを生産するための現在の技術は、バクテリアの増殖を維持するための莫大な基材費用、製造物の低い収率、拡大縮小可能性、及び残留するバクテリアの毒素／エピトープに関する懸念によって制限されており、これらが広範囲にわたる使用を妨げている。費用のかかる酵素処理を使用して、又は濃縮酸を使用してバイオマスからナノセルロースを製造することも可能であるが、これは化学的回収が低く、臨床応用及びスケール拡大を問題化させる。
【００１８】
ヒドロゲルは、一般に生体適合性であり、低細胞毒性を示し、そして細胞外マトリックスに類似する高い含水量を有するため、バイオインク用の魅力的な材料であるとして指摘されている。３Ｄバイオ印刷に関して評価された一般的なヒドロゲルは、天然ポリマーコラーゲン、ヒアルロン酸、キトサン及びアルギネートである。３Ｄバイオ印刷に適切であるために、ヒドロゲルは、印刷の間にその形状を保持するために十分粘着性でなければならず、そしてバイオ印刷後に３Ｄ構造を維持するために架橋可能でなければならない。架橋は、温度変化、ＵＶ光重合及び／又はイオン性架橋によって引き起こされることが可能である。例えば、褐藻から単離されたアルギネートは、二価カチオンの添加によって架橋する能力を有する。純粋なアルギネートのバイオインクは、熱感受性粘度及び制御不可能な印刷適性のために劣性であることが分かっている。アルギネートの粘度は、濃度及び分子量の変化によって増加することが可能であるが、それは印刷の間に形状忠実度を達成することに関して不十分であった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
３Ｄバイオ印刷の研究に対する広範な興味にもかかわらず、真に普遍的なバイオインクはこれまで存在しなかった。一般的なバイオインクは、温度感受性、培養媒体中での印刷後の膨潤又は収縮、剪断減粘性挙動の欠如、遅いゲル化、低い解像度、印刷後の低い形状忠実度、細胞接着、生理活性及び細胞生存、組織への細胞分化、並びに細胞接着、移動、拡散及び分化に最適な環境を提供するトポグラフィーの範囲を含む、周知の課題の多くに対応するであろう。望ましいものは、印刷可能であって、複雑なマクロ構造を維持することが可能であり、そして生きている細胞が生育し、そして分化可能である環境を提供するバイオインク組成物である。そのようなバイオインクを製造及び使用する方法も求められる。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
要約
本発明のいくつかの変形は、３Ｄバイオ印刷用のバイオインク組成物であって、
（ａ）ナノセルロース結晶及びナノセルロースフィブリルの組合せの形態のナノセルロースと、
（ｂ）アルギン酸及び／又はアルギン酸塩の形態のアルギネートと、
（ｃ）水と
を含み、アルギネートがイオン性架橋剤の存在下でイオン的に架橋可能である、バイオインク組成物を提供する。
【００２１】
本発明のいくつかの変形は、３Ｄバイオ印刷用のバイオインク組成物であって、
（ａ）ナノセルロースが少なくとも２４０℃の熱分解開始温度によって特徴づけられる、ナノセルロースフィブリルの形態のナノセルロースと、
（ｂ）アルギン酸及び／又はアルギン酸塩の形態のアルギネートと、
（ｃ）水と
を含み、アルギネートがイオン性架橋剤の存在下でイオン的に架橋可能である、バイオインク組成物を提供する。
【００２２】
本発明のいくつかの変形は、３Ｄバイオ印刷用のバイオインク組成物であって、
（ａ）ナノセルロースが少なくとも２９０℃の熱分解開始温度によって特徴づけられる、ナノセルロース結晶の形態のナノセルロースと、
（ｂ）アルギン酸及び／又はアルギン酸塩の形態のアルギネートと、
（ｃ）水と
を含み、アルギネートがイオン性架橋剤の存在下でイオン的に架橋可能である、バイオインク組成物を提供する。
【００２３】
本発明のいくつかの変形は、３Ｄバイオ印刷用のバイオインク組成物であって、
（ａ）（存在する場合、）ナノセルロース結晶が好ましくは少なくとも２９０℃のナノ結晶熱分解開始温度によって特徴づけられ、且つ（存在する場合、）ナノセルロースフィブリルが好ましくは少なくとも２４０℃のナノフィブリル熱分解開始温度によって特徴づけられる、ナノセルロース結晶、ナノセルロースフィブリル又はそれらの組合せの形態のナノセルロースと、
（ｂ）アルギン酸及び／又はアルギン酸塩の形態のアルギネートと、
（ｃ）水と
を含み、アルギネートがイオン性架橋剤の存在下でイオン的に架橋可能である、バイオインク組成物を提供する。
【００２４】
いくつかの実施形態において、ナノセルロースは、１％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）のナノセルロース濃度で存在する。特定の実施形態において、ナノセルロースは、３％（ｗ／ｖ）〜６％（ｗ／ｖ）のナノセルロース濃度で存在する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、アルギネートは、０．１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）のアルギネート濃度で存在する。
【００２６】
好ましくは、ナノセルロースは、リグニンをわずかに含有するか、又は含有しない親水性ナノセルロースである。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態において、バイオインク組成物は、細胞を含まないバイオインクである。他の実施形態において、バイオインク組成物は、生存可能なヒト細胞（又は他の動物細胞）を含有する、細胞を多く含むバイオインクである。特定の実施形態において、生存可能なヒト細胞は、ヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞である。生存可能なヒト細胞は、例えば、２×１０６細胞／ｍＬなどのバイオインク組成物１ミリリットル当たり１０５〜１０７の細胞の細胞濃度でバイオインク組成物中に存在し得る。
【００２８】
好ましい実施形態において、ナノセルロースは、ナノセルロース結晶及びナノセルロースフィブリルの組合せ（ブレンド）の形態である。
【００２９】
ナノセルロース結晶及びナノセルロースフィブリルのブレンドを使用する実施形態において、ナノセルロースは、少なくとも２５０℃、２６０℃、２７０℃、２８０℃、２９０℃又は３００℃の熱分解開始温度によって特徴づけられてよい。ナノセルロースフィブリルを使用する実施形態において、ナノセルロースフィブリルは、少なくとも２５０℃、２６０℃、２７０℃、２８０℃、２９０℃、３００℃又は３１０℃の熱分解開始温度によって特徴づけられてよい。ナノセルロースの結晶を使用する実施形態において、ナノセルロースの結晶は、少なくとも２９５℃、３００℃、３１０℃、３２０℃、３３０℃又は３４０℃の熱分解開始温度によって特徴づけられてよい。
【００３０】
ナノセルロースは、好ましくは、約０．０２重量％未満の硫黄などの約０．０５重量％未満の硫黄を含有する。好ましくは、ナノセルロースは、ナノセルロース粒子の表面に付加した硫酸半エステル基を含有しない。
【００３１】
好ましい実施形態において、ナノセルロースは、セルロース、ヘミセルロース及びリグニンを生成するための二酸化硫黄及びエタノール（及び水）の存在下でのリグノセルロースバイオマスの分別、それに続いて、ナノセルロースを生成するためのセルロースの機械的精製から得られる。
【００３２】
好ましくは、ナノセルロースはバクテリアナノセルロースではなく、被嚢類由来ではなく、且つリグノセルロースバイオマス又はセルロースの酵素加水分解によって得られない。
【００３３】
ナノセルロースは、好ましくは、少なくとも−２０ｍＶ又はそれより負などの少なくとも−１０ｍＶ又はそれより負のゼータ電位を有する。
【００３４】
バイオインクが押出成形によって都合よく３Ｄ印刷されることが可能であるように、ナノセルロースは、好ましくは剪断減粘性である。
【００３５】
バイオインク組成物は、架橋が望ましい場合に典型的に後で添加されるイオン性架橋剤をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、イオン性架橋剤は、（限定されないが）Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋及びそれらの組合せからなる群から選択される二価金属カチオンなどの二価カチオンを含む。例示的なイオン性架橋剤は塩化カルシウム、ＣａＣｌ２である。
【００３６】
種々の実施形態において、バイオインク組成物は、増殖促進因子、増殖因子、ビタミン、ミネラル、酵素、タンパク質、糖、糖アルコール、酸、塩基、塩、緩衝剤、安定剤、溶存酸素及び抗生物質からなる群から選択される１つ又はそれ以上のバイオインク添加剤をさらに含む。
【００３７】
開示されたバイオインク組成物は、バイオ印刷用に選択されたヒト細胞に対して細胞毒性ではない。
【００３８】
本発明の他の変形は、３Ｄバイオ印刷用のバイオインク組成物の製造方法であって、
（ａ）（存在する場合、）ナノセルロース結晶が少なくとも２９０℃のナノ結晶熱分解開始温度によって特徴づけられ、且つ（存在する場合、）ナノセルロースフィブリルが少なくとも２４０℃のナノフィブリル熱分解開始温度によって特徴づけられる、ナノセルロース結晶、ナノセルロースフィブリル又はそれらの組合せの形態のナノセルロースを得ることと、
（ｂ）水溶液中でナノセルロースを、アルギン酸及び／又はアルギン酸塩の形態であり、且つイオン性架橋剤の存在下でイオン的に架橋可能であるアルギネートと組み合わせることと、
（ｃ）水溶液を殺菌することと、
（ｄ）任意選択的に、水溶液に複数の生存可能なヒト細胞を添加することと、
（ｅ）３Ｄバイオ印刷用のバイオインク組成物として水溶液を回収することと
を含む、製造方法を提供する。
【００３９】
いくつかの実施形態において、ナノセルロースは、１％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）のナノセルロース濃度でバイオインク組成物中に存在する。これら又は他の実施形態において、アルギネートは、０．１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）のアルギネート濃度でバイオインク組成物中に存在する。
【００４０】
好ましくは、ステップ（ａ）において、ナノセルロースは、セルロース、ヘミセルロース及びリグニンを生成するための二酸化硫黄及びエタノール（及び水）の存在下でのリグノセルロースバイオマスの分別、それに続いて、ナノセルロースを生成するためのセルロースの機械的精製から得られる。
【００４１】
いくつかの好ましい実施形態において、ナノセルロースは、ナノセルロース結晶及びナノセルロースフィブリルの組合せ（ブレンド）の形態である。
【００４２】
いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）において、殺菌は、水蒸気殺菌、ＵＶ殺菌、エタノール殺菌及びその組合せからなる群から選択される技術を利用する。水蒸気殺菌が使用される場合、ステップ（ｃ）では、水溶液を調製する前に、ナノセルロース（又はナノセルロースを含有する液体溶液）及びアルギネート（又はアルギネートを含有する液体溶液）が別々に殺菌され、そしてアルギネートは熱感応性であるため、好ましくは、アルギネートは水蒸気殺菌によって殺菌されない。アルギネートは、好ましくは、蒸気殺菌よりむしろ、ＵＶ殺菌及び／又はエタノール殺菌される。
【００４３】
製造されるバイオインク組成物は、細胞を含まないバイオインク又は細胞を多く含むバイオインクであってよい。いくつかの実施形態において、バイオインク組成物は、（限定されないが）ヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞などの生存可能なヒト細胞を含有する細胞を多く含むバイオインクである。生存可能なヒト細胞は、例えば、バイオインク組成物１ミリリットル当たり１０５〜１０７の細胞の細胞濃度でバイオインク組成物中に存在し得る。
【００４４】
他の変形は、３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーの製造方法であって、
（ａ）（存在する場合、）ナノセルロース結晶が少なくとも２９０℃のナノ結晶熱分解開始温度によって特徴づけられ、且つ（存在する場合、）ナノセルロースフィブリルが少なくとも２４０℃のナノフィブリル熱分解開始温度によって特徴づけられる、ナノセルロース結晶、ナノセルロースフィブリル又はそれらの組合せの形態のナノセルロースを得ることと、
（ｂ）水溶液中でナノセルロースを、アルギン酸及び／又はアルギン酸塩の形態であり、且つイオン性架橋剤の存在下でイオン的に架橋可能であるアルギネートと組み合わせることと、
（ｃ）水溶液を殺菌することと、
（ｄ）水溶液に複数の生存可能なヒト細胞を添加し、細胞を多く含むバイオインクを形成することと、
（ｅ）細胞を多く含むバイオインクの複数の層を基材又は表面に堆積することと、
（ｆ）ステップ（ｅ）の間及び／又はステップ（ｅ）に続いて、細胞を多く含むバイオインクの複数の層をイオン性架橋剤に暴露して、アルギネートをイオン性架橋することと、
（ｇ）細胞を多く含むバイオインクの複数の層を含有する３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーを回収することと
を含む、製造方法を提供する。
【００４５】
いくつかの実施形態において、ナノセルロースは、１％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）のナノセルロース濃度で、細胞を多く含むバイオインク中に存在する。これら又は他の実施形態において、アルギネートは、０．１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）のアルギネート濃度で、細胞を多く含むバイオインク中に存在する。
【００４６】
好ましくは、ナノセルロースは、セルロース、ヘミセルロース及びリグニンを生成するための二酸化硫黄及びエタノール（及び水）の存在下でのリグノセルロースバイオマスの分別、それに続いて、ナノセルロースを生成するためのセルロースの機械的精製から得られる。
【００４７】
いくつかの好ましい実施形態において、ナノセルロースは、ナノセルロース結晶及びナノセルロースフィブリルの組合せ（ブレンド）の形態である。
【００４８】
ステップ（ｃ）において、水蒸気殺菌、ＵＶ殺菌、エタノール殺菌及びその組合せからなる群から選択される殺菌技術が利用されてよい。水蒸気殺菌が使用される場合、ステップ（ｃ）では、水溶液を調製する前に、ナノセルロース（又はナノセルロースを含有する液体溶液）及びアルギネート（又はアルギネートを含有する液体溶液）が別々に殺菌され、そしてアルギネートは熱感応性であるため、好ましくは、アルギネートは水蒸気殺菌によって殺菌されない。アルギネートは、好ましくは、蒸気殺菌よりむしろ、ＵＶ殺菌及び／又はエタノール殺菌される。
【００４９】
いくつかの実施形態において、生存可能なヒト細胞はヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞であり、そして３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーはヒト軟骨を含有する。
【００５０】
いくつかの実施形態において、ステップ（ｅ）の堆積は、押出成形（すなわち、押出成形ベースの３Ｄバイオ印刷）を利用する。
【００５１】
いくつかの実施形態において、ステップ（ｆ）において、架橋は、細胞を多く含むバイオインクの複数の層のそれぞれの形成の間に実行される。これら又は他の実施形態において、ステップ（ｆ）において、架橋は、細胞を多く含むバイオインクの複数の層の全ての形成の後に実行される。
【００５２】
イオン性架橋剤は、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋又はそれらの組合せなどの二価カチオンを含み得る。
【００５３】
いくつかの実施形態において、ステップ（ｆ）では、イオン性架橋剤のエアゾールが利用される。エアゾールは、連続的に、又は周期的に細胞を多く含むバイオインクの複数の層に暴露される。
【００５４】
３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーは、イオン性架橋されたアルギネート中に密接に分散された相互に連結している小型のナノセルロース粒子の多孔性３Ｄネットワークによって特徴づけられてよい。好ましくは、３Ｄ印刷されたバイオストラクチャー中のナノセルロースは、約５０ナノメートル〜約１０ミクロンなどの細孔径の範囲を有する。いくつかの実施形態において、３Ｄ印刷されたバイオストラクチャー中のナノセルロースは、５５ナノメートル程度の小ささの細孔径及び１２ミクロン程度の大きさの細孔径を有する。
【００５５】
最終の３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーは、耳、鼻、軟骨性連結、気管輪、喉頭、肋軟骨又はそれらの一部分からなる群から選択されてよい。３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーは、任意の幾何学的形状であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
図面の簡単な説明
【図１】本実施例における、室温での溶解、流動、ナノセルロースブレンド（ＮＣＢ）との混合の容易さ、及び未架橋の印刷後の構造安定性に対して評価された様々なアルギネート濃度の定性分析を要約する。
【図２】本実施例における、架橋用にエアゾール化されたＣａＣｌ２を使用するアルギネート架橋時間（分）及び架橋強度の分析を要約する。
【図３】本実施例における、ナノセルロース含有バイオインクに関するバイオ印刷解像度を試験するためのグリッド厚さ分析の結果を示す。
【図４】本実施例における、複合体構造試験用に使用される形状のグラフィック形式のＧコードを示す。挿入部Ａは中空円柱であり、挿入部Ｂは円柱であり、挿入部Ｃは鼻軟骨であり、挿入部Ｄは立方体であり、挿入部Ｅは右耳であり、そして挿入部Ｆは四面ピラミッドである。
【図５】本実施例における、異なるＣａＣｌ２濃度によるアルギネート架橋最適化を要約する。
【図６】本実施例における、架橋の前及び後のナノセルロース−アルギネートバイオインクのＴＥＭイメージを示す。
【図７】本実施例における、０．１Ｍ又は０．５ＭのＣａｌＣｌ２のいずれかによって架橋された、３つの異なるバイオインク配合物（ＣＮＣ−ＡＧ、ＮＣＢ−ＡＧ及びＣＮＦ−ＡＧ）を使用してバイオ印刷された円筒状構造体積の比較を提供する。
【図８】本実施例における、２４及び７２時間における時間０に対する構造（３Ｄバイオストラクチャー）体積における変化を示す。
【図９】本実施例における、複合体形状試験用のＮＣＢ−ＡＧバイオインクを使用して印刷された幾何学的構造を示す。
【図１０】本実施例における、アルギネートを含有するが、ナノセルロースを含有しないバイオインクの流動学的特性を示す。
【図１１】本実施例における、剪断速度の関数としての純粋アルギネートのバイオインクの粘度を示す。
【図１２】本実施例における、１ヘルツにおけるナノセルロース−アルギネートバイオインクの流動学的特性を示す。
【図１３】本実施例における、１．２５％のアルギネート（ｗ／ｖ）と組み合わせた、ＣＮＣ、ＮＣＢ及びＣＮＦバイオインクに関する、剪断速度の関数としての種々のナノセルロース−アルギネートバイオインクの粘度を示す。ｘ軸記号「−ｓ」は、毎秒の単位、ｓ−１（Ｈｚ）を意味する。
【図１４】本実施例における、２．５％のアルギネート（ｗ／ｖ）と組み合わせた、ＣＮＣ、ＮＣＢ及びＣＮＦバイオインクに関する、剪断速度の関数としての種々のナノセルロース−アルギネートバイオインクの粘度を示す。ｘ軸記号「−ｓ」は、毎秒の単位、ｓ−１（Ｈｚ）を意味する。
【図１５】本実施例における、５％のアルギネート（ｗ／ｖ）と組み合わせた、ＣＮＣ、ＮＣＢ及びＣＮＦバイオインクに関する、剪断速度の関数としての種々のナノセルロース−アルギネートバイオインクの粘度を示す。ｘ軸記号「−ｓ」は、毎秒の単位、ｓ−１（Ｈｚ）を意味する。
【図１６】本実施例における、（Ａ）ナノセルロース結晶（ＣＮＣ−ＡＧ）、（Ｂ）ナノセルロースブレンド（ＮＣＢ−ＡＧ）及び（Ｃ）ナノセルロースフィブリル（ＣＮＦ−ＡＧ）バイオインク配合物に関するバイオ印刷の後のヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞の生存能力を示す。
【図１７】本実施例における、２Ｄのみの細胞培養における細胞に対して、３Ｄ細胞培養における、結晶／フィブリルブレンドナノセルロースバイオインク中のヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞生存能力を示す。
【図１８】本実施例における、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）細胞毒性分析の結果を要約し、２Ｄ培養におけるヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞の細胞毒性を、ＮＣＢ−ＡＧバイオインクによるバイオ印刷後のヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞の細胞毒性と比較する。
【図１９】本実施例における、４、１２及び２４時間におけるＮＣＢ−ＡＧバイオインク中のヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞の代謝活性を示す。
【図２０】本実施例における、バイオ印刷後のアルギネートバイオインク及びナノセルロース含有バイオインク構造の走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）イメージを示す。
【図２１】本実施例における、バイオ印刷された構造の応力−歪み曲線を示す。
【図２２】本実施例における、ナノセルロース含有バイオインクに対してアルギネートのみのバイオインクにおいて教養された鼻中隔（nasoseptal）集団個体数の相対的な遺伝子発現の定量的逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析を示す。
【図２３】本実施例における、鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞との混合から２４時間以内（左側）及び鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞との培養の２週間後（右側）のナノセルロース含有バイオインクのＳＥＭイメージ（下部から上部まで１０μｍ、２０μｍ及び５０μｍの縮尺表示）を示す。
【図２４】本実施例における、鼻中隔（nasoseptal）軟骨から得られた細胞を使用する３Ｄバイオ印刷された軟骨構造の組織学的分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
いくつかの実施形態の詳細な説明
本説明は、当業者が本発明を製造及び使用することを可能にし、且つ本発明のいくつかの実施形態、適用、変法、代替及び使用を記載する。本発明のこれら及び他の実施形態、特徴、並びに利点は、いずれかの添付の図面と一緒に、本発明の次の詳細な説明を考慮する時、当業者により明白となるであろう。
【００５８】
本明細書及び添付の請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、他に明白に示されない限り、複数形の指示対象を含む。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。パーセンテージに基づく全ての組成物数及び範囲は、他に明白に示されない限り、重量パーセントである。数又は条件の全ての範囲は、いずれかの適切な少数点に四捨五入された範囲内に含まれるいずれかの特定の値も含むように意味される。
【００５９】
他に明白に示されない限り、明細書及び請求の範囲において使用されるパラメータ、反応条件、成分の濃度などを表す全ての数は、全ての場合において、「約」という用語によって修飾されることは理解されるべきである。したがって、他に明白に示されない限り、次の明細書及び添付の請求の範囲において表される数値パラメータは、少なくとも特定の分析技術次第で変化し得る近似値である。
【００６０】
「含む」、「含有する」又は「特徴とする」と同意語である。「含む」という用語は、包括的であるか、又は非制限的であり、且つ追加の未記載の要素又は方法ステップを排除しない。「含む」は、名指された請求項要素が不可欠であるが、他の請求項要素が加えられて、且つ請求項の範囲内の構成物をなお形成し得ることを意味する、請求項言語で使用される技術用語である。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「からなる」という句は、請求項において指定されていないいずれの要素、ステップ又は成分も除外する。「からなる」という句（又はその変形）が、前置きにすぐに続いてではなく、請求項の主要部の節に現われる場合、それは、その節において明示された要素のみを限定し；他の要素は、請求項全体から除外されない。本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という句は、請求項範囲を、明示された要素又は方法ステップと、請求された対象の基本的及び新規特徴に本質的に影響を与えないものに限定する。
【００６２】
「含む」、「からなる」及び「から本質的になる」という用語に関して、これらの３つの用語の１つが本明細書中に使用される場合、本開示及び請求された対象は、他の２つの用語のいずれかの使用を含み得る。したがって、他に明示的に列挙されない、いくつかの実施形態において、「含む」のいずれの例も、「からなる」又は「から本質的になる」と置き換えられてよい。
【００６３】
本発明のいくつかの変形は、押出成形ベースの３Ｄバイオ印刷用に有利な流動学的特性を有するユニークなバイオインク組成物に基づくものである。開示されたバイオインク組成物は、組織及び器官に見られる天然細胞外マトリックスと似て、細孔径に関して広範囲の変動値及び調整可能なトポグラフィーを有するナノセルロースを含有する。開示されたバイオインク組成物は、様々な細胞の種類に広く一般に適用可能である。
【００６４】
本発明のいくつかの変形は、３Ｄバイオ印刷用のバイオインク組成物であって、
（ａ）ナノセルロース結晶及びナノセルロースフィブリルの組合せの形態のナノセルロースと、
（ｂ）アルギン酸及び／又はアルギン酸塩の形態のアルギネートと、
（ｃ）水と
を含み、アルギネートがイオン性架橋剤の存在下でイオン的に架橋可能である、バイオインク組成物を提供する。
【００６５】
本発明のいくつかの変形は、３Ｄバイオ印刷用のバイオインク組成物であって、
（ａ）ナノセルロースが少なくとも２４０℃の熱分解開始温度によって特徴づけられる、ナノセルロースフィブリルの形態のナノセルロースと、
（ｂ）アルギン酸及び／又はアルギン酸塩の形態のアルギネートと、
（ｃ）水と
を含み、アルギネートがイオン性架橋剤の存在下でイオン的に架橋可能である、バイオインク組成物を提供する。
【００６６】
本発明のいくつかの変形は、３Ｄバイオ印刷用のバイオインク組成物であって、
（ａ）ナノセルロースが少なくとも２９０℃の熱分解開始温度によって特徴づけられる、ナノセルロース結晶の形態のナノセルロースと、
（ｂ）アルギン酸及び／又はアルギン酸塩の形態のアルギネートと、
（ｃ）水と
を含み、アルギネートがイオン性架橋剤の存在下でイオン的に架橋可能である、バイオインク組成物を提供する。
【００６７】
本発明のいくつかの変形は、３Ｄバイオ印刷用のバイオインク組成物であって、
（ａ）（存在する場合、）ナノセルロース結晶が好ましくは少なくとも２９０℃のナノ結晶熱分解開始温度によって特徴づけられ、且つ（存在する場合、）ナノセルロースフィブリルが好ましくは少なくとも２４０℃のナノフィブリル熱分解開始温度によって特徴づけられる、ナノセルロース結晶、ナノセルロースフィブリル又はそれらの組合せの形態のナノセルロースと、
（ｂ）アルギン酸及び／又はアルギン酸塩の形態のアルギネートと、
（ｃ）水と
を含み、アルギネートがイオン性架橋剤の存在下でイオン的に架橋可能である、バイオインク組成物を提供する。
【００６８】
いくつかの実施形態において、ナノセルロースは、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％又は９．５％（全てｗ／ｖ）などの１％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）のナノセルロース濃度でバイオインク組成物中に存在する。特定の実施形態において、ナノセルロースは、３％（ｗ／ｖ）〜６％（ｗ／ｖ）のナノセルロース濃度で存在する。ナノセルロース分子量、ナノセルロース粒径、バイオインク中の他の成分の濃度、意図されたバイオストラクチャーなどの因子次第で、１％（ｗ／ｖ）未満又は１０％（ｗ／ｖ）より高い濃度を含む他のナノセルロース濃度が使用されてもよいことは留意すべきである。
【００６９】
アルギネートは、β−Ｄ−マンヌロン酸及びα−Ｌ−グルロン酸の線形コポリマーである。いくつかの実施形態において、アルギネートは、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％又は４．５％（全てｗ／ｖ）などの０．１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）のアルギネート濃度でバイオインク組成物中に存在する。アルギネート分子量、バイオインク中の他の成分の濃度、意図されたバイオストラクチャーにおける架橋度などの因子次第で、０．１％（ｗ／ｖ）未満又は５％（ｗ／ｖ）より高い濃度を含む他のアルギネート濃度が使用されてもよいことは留意すべきである。
【００７０】
いくつかの実施形態において、ナノセルロース及びアルギネートは、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％又は１４．５％（全てｗ／ｖ）などの１％（ｗ／ｖ）〜１５％（ｗ／ｖ）の濃度でバイオインク組成物中に総合して存在する。いくつかの実施形態において、ナノセルロース及びアルギネートは、少なくとも４％（ｗ／ｖ）、少なくとも５％（ｗ／ｖ）又は少なくとも６％（ｗ／ｖ）の濃度でバイオインク組成物中に総合して存在する。
【００７１】
バイオインク組成物中のアルギネートに対するナノセルロースの重量比は、１〜４０、例えば、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０又は３５などで変動してよい。いくつかの好ましい実施形態において、バイオインク組成物中のアルギネートに対するナノセルロースの重量比は、約４（すなわち、３．６〜４．４）又は約５（すなわち、４．６〜５．４）である。
【００７２】
ナノセルロース及びアルギネートの他に、バイオインク組成物中に水が存在する。ナノセルロース、アルギネート及び水以外の他のいずれの成分も存在しない場合、水は残部である（例えば、全てｗ／ｖ基準で、３％ナノセルロース、０．７５％アルギネート及び１００−３．７５＝９６．２５％の水）。バイオインク組成物中に添加剤が存在する場合、含水量は、ナノセルロース及びアルギネート濃度の合計を１００から差し引いた値より低いであろう。バイオインク組成物は、初期は乾燥粉末前駆体として提供され得るが、（細胞維持及び成長のための水分要求量のため）水はバイオ印刷のための必要成分であることに留意されたい。通常、バイオインク組成物は明示的に水を含む。したがって、第一に水を含むものとして見なすことができるバイオインク組成物を形成するために、（ナノセルロース＋アルギネートの）乾燥粉末前駆体に水を添加するという暗黙の指示が存在することは、バイオ印刷技術の当業者によって理解されるであろう。
【００７３】
本発明のいくつかの実施形態において、バイオインク組成物は、細胞を含まないバイオインクである。他の実施形態において、バイオインク組成物は、生存可能なヒト細胞（又は他の動物細胞）を含有する、細胞を多く含むバイオインクである。特定の実施形態において、生存可能なヒト細胞は、ヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞である。生存可能なヒト細胞は、１つの例示的な実施形態として、例えば、２×１０６細胞／ｍＬなどのバイオインク組成物１ミリリットル当たり１０５〜１０７の細胞の細胞濃度でバイオインク組成物中に存在し得る。
【００７４】
ナノセルロースは、ナノセルロース結晶及びナノセルロースフィブリルの組合せ（ブレンド）の形態であってもよい。以下により詳細に説明されるであろうように、バイオインク中でナノセルロース結晶及びナノセルロースフィブリルのブレンドが利用される場合、利点がある（実験的に観察された；実施例を参照のこと）。
【００７５】
ナノセルロース結晶及びフィブリルのブレンドは、それぞれ１％〜９９％のナノセルロース結晶及び９９％〜１％のナノセルロースフィブリルを含有し得る。種々の実施形態において、ナノセルロース結晶及びフィブリルのブレンドは、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％（全て重量パーセント）のナノセルロース結晶を含有し、ナノセルロースの残部はナノセルロースフィブリルである。
【００７６】
ナノセルロースブレンドの１つの特徴は、ナノセルロースフィブリルがナノセルロース結晶よりもはるかに大きいため、広範囲の粒径が存在することである。ナノセルロース結晶の幅は、例えば、約２ナノメートル〜約１０ナノメートル又は約３ナノメートル〜約６ナノメートルで変動し得る。ナノセルロース結晶の長さは、例えば、約５０ナノメートル〜約５００ナノメートル又は約１００ナノメートル〜約３５０ナノメートルで変動し得る。ナノセルロースフィブリルの幅は、例えば、約５ナノメートル〜約１００ナノメートル又は約１０ナノメートル〜約５０ナノメートルで変動し得る。ナノセルロースフィブリルの長さは、例えば、約２００ナノメートル〜約１０ミクロン又は約４００ナノメートル〜約３ミクロンで変動し得る。ブレンド中の平均ナノセルロース粒子幅は、約３ナノメートル〜約５０ナノメートル、例えば約５ナノメートル〜約３０ナノメートルで変動し得る。ブレンド中の平均ナノセルロース粒子長さは、約１００ナノメートル〜約２ミクロンなどの約５０ナノメートル〜約５ミクロンで変動し得る。
【００７７】
好ましくは、ナノセルロースは、リグニンをわずかに含有するか、又は含有しない親水性ナノセルロースである。リグニンがコーティングされたナノセルロースは、少なくとも部分的に疎水性であることが知られており、これは、３Ｄバイオ印刷に関して通常、望ましくない。したがって、好ましい実施形態において、ナノセルロースは、０．５重量％以下、好ましくは０．１重量％以下、より好ましくは０．０１重量％以下のリグニンを含有し、最も好ましくは、検出可能なリグニンを含有しない。（存在するとしても）これらの低濃度のリグニンのため、ナノセルロースは親水性となり、そしてより高い粘度及び保水力が与えられる。これは好ましいことである。
【００７８】
ナノセルロースの「熱分解開始温度」は、ナノセルロースの熱重量分析によって定義される。熱重量分析（thermogravimetric analysis）（ＴＧＡ）としても知られる熱重量分析（Thermal gravimetric analysis）は、試料試験片が制御雰囲気中で制御された温度プログラムを受ける時の温度又は時間の関数として物質の質量を監視する技術である。熱重量分析では、PerkinElmer STA6000 Simultaneous Thermal Analyzer（London, UK）が利用されてよい。横座標（ｘ軸）は温度であり、そして縦座標（ｙ軸）は重量パーセント（％）である。下降するＴＧＡ熱曲線は、重量損失が生じていることを示す。ＴＧＡ熱曲線から、重量損失が開始する温度を意味する、推定開始温度を算出することができる。推定開始温度は再現可能な温度計算であり、そしてそれはＴＧＡに関するＡＳＴＭ及びＩＳＯによって使用されることが指定される。推定開始は、推定ベースラインによるピークの最先端の最大勾配点で描かれた接線の交点である。有用な別の計算は、重量損失曲線の一次導関数である。一次導関数ピーク温度は、重量損失曲線上の最大変化点を示す。これは変曲点としても知られている。
【００７９】
本明細書の目的に関して、熱分解開始温度を決定するために、PerkinElmer STA6000 Simultaneous Thermal Analyzerを使用して、４０ｍL／分の流量の窒素雰囲気下１０℃／分の加熱温度において５０℃から６００℃までナノセルロース試料を加熱する。参照によって組み込まれる、Kyle et al., “Characterization of pulp derived nanocellulose hydrogels using AVAP（登録商標） technology”, Carbohydrate Polymers 198 (2018) 270-280を参照のこと。ナノセルロース質量は温度の関数として測定される。水分損失以外のナノセルロース質量損失は、ナノセルロース熱分解を示す。ＴＧＡグラフからの推定開始温度（上記を参照）は、推定熱分解開始温度である。
【００８０】
ナノセルロースフィブリルを使用するいくつかの実施形態において、ナノセルロースフィブリルは、２４５℃、２５０℃、２６０℃、２７０℃、２８０℃、２９０℃、３００℃又は３１０℃の少なくともいずれかの熱分解開始温度によって特徴づけられる。ナノセルロース結晶を使用するいくつかの実施形態において、ナノセルロースの結晶は、２９５℃、３００℃、３１０℃、３２０℃、３３０℃又は３４０℃の少なくともいずれかの熱分解開始温度によって特徴づけられてよい。ナノセルロース結晶及びナノセルロースフィブリルのブレンドを使用するいくつかの実施形態において、ナノセルロースは、２５０℃、２６０℃、２６５℃、２７０℃、２８０℃、２９０℃又は３００℃の少なくともいずれかの熱分解開始温度によって特徴づけられる。
【００８１】
推測によって制限されないが、ナノセルロース熱分解開始温度は、ナノセルロースを製造するために使用される出発リグノセルロース供給原料、並びにナノセルロースを製造するためのバイオ精製プロセス条件次第であると考えられる。本発明のナノセルロースを、ナノ結晶の硫酸加水分解又はナノフィブリルを製造するための２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシラジカル（ＴＥＭＰＯ）処理などのナノセルロースを製造するための他のプロセスと比較する場合、比較のために同一出発供給原料が使用されるべきである。ナノ結晶の場合、本明細書で提供されるナノセルロース結晶は、好ましくは、同一供給原料の硫酸加水分解と比較して、より高い熱分解開始温度を有し、そして本明細書で提供されるナノセルロースフィブリルは、好ましくは、同一供給原料のＴＥＭＰＯ処理と比較して、より高い熱分解開始温度を有する。
【００８２】
上記の通り、熱重量分析によって、「熱分解最大速度温度」も提供され、これは、熱分解の速度が最大であると測定された温度、すなわち、一次導関数ピーク温度である。
【００８３】
ナノセルロースフィブリルを利用するいくつかの実施形態において、ナノセルロースフィブリルは、２７０℃、２８０℃、２９０℃、３００℃、３１０℃、３２０℃、３３０℃、３４０℃又は３５０℃の少なくともいずれかの熱分解最大速度温度によって特徴づけられる。ナノセルロース結晶を利用するいくつかの実施形態において、ナノセルロースの結晶は、３１０℃、３２０℃、３３０℃、３４０℃、３５０℃、３６０℃、３７０℃又は３８０℃の少なくともいずれかの熱分解最大速度温度によって特徴づけられてよい。ナノセルロース結晶及びナノセルロースフィブリルのブレンドを利用するいくつかの実施形態において、ナノセルロースは、２９０℃、３００℃、３１０℃、３２０℃、３３０℃、３４０℃、３５０℃又は３６０℃の少なくともいずれかの熱分解最大速度温度によって特徴づけられる。
【００８４】
ナノセルロースは、好ましくは、検出可能な硫黄を有さないことを含めて、約０．０２重量％以下の硫黄などの０．０５重量％未満の硫黄を含有する。好ましくは、これらの基が、ナノセルロースの熱安定性を低下させることに加えて、ヒト細胞に毒性を与え得るため、ナノセルロースはナノセルロース粒子の表面に付加した硫酸半エステル基を含有しない。
【００８５】
好ましい実施形態において、ナノセルロースは、セルロース、ヘミセルロース及びリグニンを生成するための二酸化硫黄、エタノール及び水の存在下でのリグノセルロースバイオマスの分別、それに続いて、ナノセルロースを生成するためのセルロースの機械的精製から得られる。
【００８６】
好ましくは、ナノセルロースはバクテリアナノセルロースではなく、被嚢類由来ではなく、そしてリグノセルロースバイオマス又はセルロースの酵素加水分解によって得られない。
【００８７】
ナノセルロースは、好ましくは、少なくとも−１０ｍＶ若しくはそれより負又は少なくとも−２０ｍＶ若しくはそれより負（例えば、−１５ｍＶ、−１６ｍＶ、−１７ｍＶ、−１８ｍＶ、−１９ｍＶ、−２０ｍＶ、−２１ｍＶ、−２２ｍＶ、−２３ｍＶ、−２４ｍＶ又は−２５ｍＶ）のゼータ電位を有する。（表面電荷として見積もられる）ゼータ電位測定は、例えば、Zetasizer NanoZS（Malvern Instruments, UK）を使用して実行されてよい。ゼータ電位は、電界を通っての荷電粒子の移動度を測定する。少なくとも−２０ｍＶ又はそれより負のゼータ電位は、安定コロイドゲルを形成するようにナノセルロース懸濁液を補助する。
【００８８】
バイオインクが押出成形によって都合よく３Ｄ印刷されることが可能であるように、ナノセルロースは、好ましくは剪断減粘性である。レオロジーにおいて、剪断減粘性は、その粘度が剪断歪み下で減少する流体の非ニュートン性挙動である。
【００８９】
バイオインク組成物は、アルギネート架橋が望ましい場合に典型的に後で添加されるイオン性架橋剤をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、イオン性架橋剤は、（限定されないが）Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋及びそれらの組合せからなる群から選択される二価金属カチオンなどの二価カチオンを含む。カチオンは、必ずというわけではないが、典型的に、中性塩として存在し；例えば、Ｃａ２＋は、塩化カルシウム、ＣａＣｌ２として存在してよい。Ｐｂ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｄ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋及びＭｎ２＋などの他の二価金属カチオンは、アルギネートを架橋するために特異的に作用するが、これらは、毒性のためにあまり好ましくない。イオン性架橋剤は、二価有機カチオンを利用してもよい。
【００９０】
アルギネートのゲル化及び架橋は、グルロン酸からのナトリウムイオンを二価カチオンと交換することによって主に達成される。二価カチオンは、高度に共同的な様式でα−Ｌ−グルロン酸ブロックと結合し、そして共同的単位の大きさは典型的に２０モノマーより多い。それぞれのアルギネート鎖は、多くの他の鎖とともに接合を形成するように二量体化可能であり、不溶解性沈殿物ではなく、ゲルネットワークを形成する。
【００９１】
種々の実施形態において、バイオインク組成物は、増殖促進因子、増殖因子、ビタミン、ミネラル、酵素、タンパク質、糖（例えば、グルコース）、糖アルコール（例えば、マンニトール）、酸、塩基、塩（例えば、塩化ナトリウム）、緩衝剤、安定剤、溶存酸素及び抗生物質からなる群から選択される１つ又はそれ以上のバイオインク添加剤をさらに含む。存在する場合、添加剤の量は、一般に、細胞を多く含むバイオインクに含まれる細胞の種類、及び意図された３Ｄバイオストラクチャーによって規定されるであろう。酸、塩基及び緩衝剤は、約６〜約８又は約６．５〜約７．５のｐＨなどのバイオインクに関して望ましいｐＨを維持するように含まれてよい。
【００９２】
開示されたバイオインク組成物は、ヒト細胞、又はバイオ印刷するために少なくとも選択されたヒト細胞に対して細胞毒性ではない。細胞毒性のさらなる議論に関しては、本明細書中、実施例が参照される。
【００９３】
バイオインク組成物は、あらかじめ包装され、あらかじめ殺菌された形態で提供されてもよい。いくつかの実施形態において、バイオインク組成物はあらかじめ包装されているが殺菌はされておらず、後の時点で、バイオ印刷の前に（例えば蒸気オートクレーブにおいて）殺菌されるように指示を伴う。プリパッケージは小型容器、管、バイアル、ジャー、バッグ中にあってよく、そしてプリパッケージ材料はガラス、プラスチック、コーテッド紙などであってよい。特定の実施形態において、バイオインク組成物は乾燥形態で、又は少なくとも含水量が減少している状態で提供され、バイオ印刷の前に組成物に水を添加するように指示を伴う。いくつかの実施形態において、バイオインク組成物は、特定の細胞の種類及び／又は特定のバイオストラクチャーに対して調整されるバイオ印刷指示とともに、あらかじめ包装されて、あらかじめ殺菌されたバイオインクを含むキットの一部である。
【００９４】
開示されたバイオインク組成物は、バイオ印刷のために有利なレオロジーを有し、且つ相互に連結している小型の高アスペクト比のナノ粒子及び細胞潜入及び維持のために好ましい細孔径の多孔性フィブリル状ネットワークを製造する。細孔及び繊維ネットワークは組織工学的用途のために有利である。可逆性の応力緩和挙動のため、印刷後の形状忠実度を与えながら、（例えばノズルを通しての）バイオ印刷の間の剪断減粘性を可能にする。本明細書に提供されるバイオインクは印刷可能であり、複雑なマクロ構造を維持することが可能であり、且つ細胞が生育及び分化可能である環境を提供することが可能である。
【００９５】
これらのバイオインク組成物の流動学的特性は、特に、押出成形バイオ印刷に理想的である。剪断減粘性（擬似弾性）挙動によって、低い剪断速度でバイオプリンターノズルを通して流動可能となり、細胞に加えられる機械的応力を減少させる。高いゼロ−剪断粘度は、バイオ印刷後の形状忠実度を維持して、そして複雑な３Ｄバイオ印刷された構造の崩壊を防ぐ。
【００９６】
バイオインク組成物及び３Ｄバイオストラクチャーは、広範囲のトポグラフィーによって特徴づけられ得る。特に、（約１０ナノメートル〜約１００ミクロン又は約５０ナノメートル〜約１０ミクロンなどの）可変的な細孔径は、多種多様な細胞の種類に有利に作用する。広範囲のトポグラフィーは、細胞外マトリックス中の天然コラーゲン繊維の径に似ており、細胞に対する生物活性シグナルを増加させる。同じく、調整可能なトポグラフィー（ナノセルロースの種類及び量の関数として）は、特定の細胞の種類に関してバイオインクをカスタマイズする能力を提供する。
【００９７】
バイオインク組成物は、有利な膨潤特性によって特徴づけられてもよい。好ましくは、バイオインクは、印刷後の形状忠実度を維持しながら、標準的な培養条件下で細胞栄養のために十分に膨潤可能であるように、ナノセルロース及びイオン性架橋剤の適切な濃度を含有する。いったん指定された３Ｄバイオストラクチャーへとバイオ印刷されたら、結果として生じるバイオ材料は培養中で膨潤又は収縮に対して抵抗を示し、再現性のある結果を提供する。
【００９８】
バイオインク組成物は、上記のように、熱抵抗性ナノセルロースの包含のために、熱抵抗性である。この特性によって、１２１℃におけるオートクレーブ殺菌が可能となり、そして（より低い温度ではなく）室温でバイオ印刷可能であり、そして３７℃などの生物学的に最適な温度における細胞培養を可能にする。ナノセルロースは、標準的培養条件下で、そしてヒト体温で崩壊しない。
【００９９】
開示されたバイオインク組成物は、特定の細胞の種類の培養に既に使用されているヒドロゲルのためのレオロジー調整剤として有用であり、それによって、以前は印刷不可能であったヒドロゲルが印刷可能となることは留意すべきである。いくつかの実施形態は、３Ｄバイオ印刷用のバイオインク添加剤であって、
（ａ）（存在する場合、）ナノセルロース結晶が少なくとも２９０℃のナノ結晶熱分解開始温度によって特徴づけられ、且つ（存在する場合、）ナノセルロースフィブリルが少なくとも２４０℃のナノフィブリル熱分解開始温度によって特徴づけられる、ナノセルロース結晶、ナノセルロースフィブリル又はそれらの組合せの形態のナノセルロースと、
（ｂ）アルギン酸及び／又はアルギン酸塩の形態のアルギネートと、
（ｃ）任意選択的に水と
を含み、アルギネートがイオン性架橋剤の存在下でイオン的に架橋可能である、バイオインク添加剤を提供する。
【０１００】
本発明の原理は、アルギネート以外の架橋性ポリマーに適用されてもよい。例えば、アルギネートの代わりに、又はアルギネートに加えて、ゼラチン、ゲランゴム、ヒアルロン酸、フィブリノゲン、コラーゲン、キトサン又はヒドロキシアパタイトから選択される架橋性天然ポリマーがバイオインク組成物に含まれていてもよい。また、アルギネートの代わりに、又はアルギネートに加えて、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールジアクリレート又はポリウレタンから選択される架橋性合成ポリマーがバイオインク組成物に含まれていてもよい。１つ又はそれ以上の架橋性天然ポリマー及び／又は１つ又はそれ以上の架橋性合成ポリマーの組合せがバイオインク組成物に含まれていてもよい。架橋は、イオン性架橋、共有結合架橋、酵素介在架橋又はそれらの組合せであってよいことに留意されたい。共有結合架橋に関しては、架橋は、典型的にＵＶ又は可視光によって達成されてもよい（光架橋として知られている）。架橋性合成ポリマーは典型的に光架橋によって架橋されるが、架橋性天然ポリマーも光架橋性であるように変性されてもよい。例えば、メタクリル化アルギネート、ゼラチンメタクリロイル、メタクリル化ゲランゴム、メタクリル化ヒアルロン酸、メタクリル化硫酸コンドロイチン、メタクリル化キトサン又はメタクリル化デキストランから選択される変性天然ポリマーがバイオインク組成物に含まれていてもよい。
【０１０１】
本発明の他の変形は、３Ｄバイオ印刷用のバイオインク組成物の製造方法であって、
（ａ）（存在する場合、）ナノセルロース結晶が少なくとも２９０℃のナノ結晶熱分解開始温度によって特徴づけられ、且つ（存在する場合、）ナノセルロースフィブリルが少なくとも２４０℃のナノフィブリル熱分解開始温度によって特徴づけられる、ナノセルロース結晶、ナノセルロースフィブリル又はそれらの組合せの形態のナノセルロースを得ることと、
（ｂ）水溶液中でナノセルロースを、アルギン酸及び／又はアルギン酸塩の形態であり、且つイオン性架橋剤の存在下でイオン的に架橋可能であるアルギネートと組み合わせることと、
（ｃ）水溶液を殺菌することと、
（ｄ）任意選択的に、水溶液に複数の生存可能なヒト細胞を添加することと、
（ｅ）３Ｄバイオ印刷用のバイオインク組成物として水溶液を回収することと
を含む、製造方法を提供する。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、ナノセルロースは、１％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）のナノセルロース濃度でバイオインク組成物中に存在する。これら又は他の実施形態において、アルギネートは、０．１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）のアルギネート濃度でバイオインク組成物中に存在する。
【０１０３】
好ましくは、ステップ（ａ）において、ナノセルロースは、セルロース、ヘミセルロース及びリグニンを生成するための二酸化硫黄及びエタノール（及び水）の存在下でのリグノセルロースバイオマスの分別、それに続いて、ナノセルロースを生成するためのセルロースの機械的精製から得られる。
【０１０４】
いくつかの好ましい実施形態において、ナノセルロースは、ナノセルロース結晶及びナノセルロースフィブリルの組合せ（ブレンド）の形態である。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）において、殺菌は、水蒸気殺菌、ＵＶ殺菌、エタノール（又は他のアルコール）殺菌及びその組合せからなる群から選択される技術を利用する。水蒸気殺菌は、例えば３０分間、１２１℃の温度及び１００ｋＰａの圧力においてオートクレーブ中で実行されてよい。ＵＶ殺菌は、紫外線（ＵＶ−Ｃ）光を発生させる殺菌ランプから放出される、２５４ｎｍの波長のＵＶ−Ｃ殺菌光への６０分間の曝露を利用してよい。この短波紫外線光によって、ＤＮＡ塩基対に乱れが生じ、ピリミジン二量体の形成が生じ、そしてバクテリア及びウイルスの不活動化が導かれる。エタノール殺菌は、３０分間、７０体積％のエタノール中への含浸によって実行されてよい。
【０１０６】
ステップ（ｃ）において、ナノセルロース（又はナノセルロースを含有する液体溶液）及びアルギネート（又はアルギネートを含有する液体溶液）は、好ましくは、組み合わせる前に、別々に殺菌される。アルギネートは熱感応性であるため、アルギネートが水蒸気殺菌によって殺菌されることは好ましくないことに留意すべきである。アルギネートは、好ましくは、蒸気殺菌よりむしろ、ＵＶ殺菌及び／又はエタノール殺菌（又は一般にアルコール殺菌）される。いくつかの実施形態において、ナノセルロースを蒸気殺菌し、アルギネートをＵＶ殺菌させる。代わりに、又はさらに、ステップ（ｃ）において、（ナノセルロース及びアルギネートの両方を有する）水溶液全体の薄層をＵＶ殺菌することによるなど、水溶液全体が殺菌されてもよい。
【０１０７】
本開示の目的に関して、別々にナノセルロースを殺菌し、アルギネートを殺菌した後、単一水溶液中に組み合わせることによって、個々の殺菌ステップの間及び水溶液の製造時に汚染は予想されないため、殺菌された水溶液が提供される。しかしながら、殺菌によって生存可能な細胞も死滅し得るため、殺菌ステップはステップ（ｄ）の前に実行されるべきである。
【０１０８】
製造されるバイオインク組成物は、細胞を含まないバイオインク又は細胞を多く含むバイオインクであってよい。いくつかの実施形態において、バイオインク組成物は、（限定されないが）ヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞などの生存可能なヒト細胞を含有する細胞を多く含むバイオインクである。生存可能なヒト細胞は、例えば、バイオインク組成物１ミリリットル当たり１０５〜１０７の細胞の細胞濃度でバイオインク組成物中に存在し得る。
【０１０９】
ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の全ては、同一又は異なる位置で、そして同一又は異なる時間に実行されてよい。例えば、ステップ（ａ）及び（ｂ）は、殺菌されていない溶液を形成し、これは一定期間貯蔵され得る。ステップ（ｃ）は、ナノセルロース／アルギネート溶液を購入する顧客によって後で、又は潜在的に実行されてもよい。ステップ（ｄ）はステップ（ｃ）と同一時間及び位置で実行されてよいか、或いは後で及び／又は別のグループで実行されてもよい。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｅ）の全ては、３Ｄバイオ印刷を実行する別のグループに３Ｄバイオ印刷用の細胞を多く含むバイオインク組成物を販売する１つのグループによって実行される。
【０１１０】
他の変形は、３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーの製造方法であって、
（ａ）（存在する場合、）ナノセルロース結晶が少なくとも２９０℃のナノ結晶熱分解開始温度によって特徴づけられ、且つ（存在する場合、）ナノセルロースフィブリルが少なくとも２４０℃のナノフィブリル熱分解開始温度によって特徴づけられる、ナノセルロース結晶、ナノセルロースフィブリル又はそれらの組合せの形態のナノセルロースを得ることと、
（ｂ）水溶液中でナノセルロースを、アルギン酸及び／又はアルギン酸塩の形態であり、且つイオン性架橋剤の存在下でイオン的に架橋可能であるアルギネートと組み合わせることと、
（ｃ）水溶液を殺菌することと、
（ｄ）水溶液に複数の生存可能なヒト細胞を添加し、細胞を多く含むバイオインクを形成することと、
（ｅ）細胞を多く含むバイオインクの複数の層を基材又は表面に堆積することと、
（ｆ）ステップ（ｅ）の間及び／又はステップ（ｅ）に続いて、細胞を多く含むバイオインクの複数の層をイオン性架橋剤に暴露して、アルギネートをイオン性架橋することと、
（ｇ）細胞を多く含むバイオインクの複数の層を含有する３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーを回収することと
を含む、製造方法を提供する。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、ナノセルロースは、１％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）のナノセルロース濃度で、細胞を多く含むバイオインク中に存在する。これら又は他の実施形態において、アルギネートは、０．１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）のアルギネート濃度で、細胞を多く含むバイオインク中に存在する。
【０１１２】
好ましくは、ナノセルロースは、セルロース、ヘミセルロース及びリグニンを生成するための二酸化硫黄及びエタノール（及び水）の存在下でのリグノセルロースバイオマスの分別、それに続いて、ナノセルロースを生成するためのセルロースの機械的精製から得られる。
【０１１３】
いくつかの好ましい実施形態において、ナノセルロースは、ナノセルロース結晶及びナノセルロースフィブリルの組合せ（ブレンド）の形態である。
【０１１４】
ステップ（ｃ）において、水蒸気殺菌、ＵＶ殺菌、エタノール殺菌及びその組合せからなる群から選択される殺菌技術が利用されてよい。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、生存可能なヒト細胞はヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞であり、そして３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーはヒト軟骨を含有する。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、ステップ（ｅ）の堆積は、押出成形（すなわち、押出成形ベースの３Ｄバイオ印刷）を利用する。
【０１１７】
基材又は表面は、その上でバイオインクの第１の層がバイオ印刷されることが可能である材料のいずれの適切な領域でもあり得る。基材又は表面は、バイオペーパー、セルロース由来紙、不活性ポリマー、ガラス、ナノセルロースの層、又はバイオインク自体から形成される材料の層であってよい。特定の実施形態において、第１の基材が存在せず；第１のバイオインク層は、溶液中、又は空間中で、その場で第１の層を機械的に保持するための手段によって、独立層として堆積される。次いで、第１のバイオインク層は、追加の層のための基材の役割を果たす。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、ステップ（ｆ）において、架橋は、細胞を多く含むバイオインクの複数の層のそれぞれの形成の間に実行される。特定の実施形態において、架橋は、細胞を多く含むバイオインクの層の全てではないが、いくつかの形成の間に実行される。これら又は他の実施形態において、ステップ（ｆ）において、架橋は、細胞を多く含むバイオインクの複数の層の全ての形成の後に実行される。架橋のこのような最終ステップは、層ごとの架橋を置き換え得るか、又はそのような架橋を増大させ得ることに留意すべきである。
【０１１９】
イオン性架橋剤は、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋又はそれらの組合せなどの二価カチオンを含み得る。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、ステップ（ｆ）では、イオン性架橋剤のエアゾールが利用される。エアゾールは、連続的に、又は周期的に細胞を多く含むバイオインクの複数の層に暴露される。関連する実施形態において、ステップ（ｆ）は、イオン性架橋剤の加熱された蒸気を利用し、加熱された蒸気は、連続的に、又は周期的に細胞を多く含むバイオインクの複数の層に曝露される。イオン性架橋剤の揮発性次第では、イオン性架橋剤とバイオインク層との間の良好な接触を保証するために、加熱された蒸気よりもエアゾールを使用することが好ましくなる可能性がある。
【０１２１】
ステップ（ｆ）では、約２、５、１０、１５、２０、３０若しくは４５秒又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０分などの約１秒〜約１０分の架橋時を利用してよい。いくつかの実施形態において、それぞれの層による部分的な架橋があり、次いで、全ての層が堆積された後、完全な架橋がある。それらの実施形態において、それぞれの層の架橋時間は、約１〜３０秒であり得るが、（全ての層が堆積された後の）最終架橋時間は、例えば、約１〜５分であり得る。
【０１２２】
代わりに、又はさらに、ステップ（ｆ）では、１種又はそれ以上のイオン性架橋剤を含有する液体溶液中への１つ又はそれ以上のバイオインク層の浸漬が利用されてもよい。架橋のための浸漬時間は、例えば、約１分〜約１時間であってよい。
【０１２３】
３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーは、イオン性架橋されたアルギネート中に密接に分散された相互に連結している小型のナノセルロース粒子の多孔性３Ｄネットワークによって特徴づけられてよい。
【０１２４】
好ましくは、３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーは、約１００ナノメートル〜約１０ミクロンなどのナノセルロース細孔径の範囲を有する。いくつかの実施形態において、ナノセルロース構造は、５５ナノメートル程度の小ささの細孔径及び１２ミクロン程度の大きさの細孔径を有する。種々の実施形態において、ナノセルロース構造は、約５０ｎｍ、７５ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、１μｍ、１．５μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、１１μｍ、１２μｍ、１３μｍ、１４μｍ又は１５μｍから選択される少なくとも２つの細孔径を含有する。平均細孔径は、例えば約３００ナノメートル〜約３ミクロンであり得る。
【０１２５】
最終の３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーは、耳、鼻、軟骨性連結、気管輪、喉頭、肋軟骨又はそれらの一部分からなる群から選択されてよい。３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーは、任意の幾何学的形状であってもよい。
【０１２６】
３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーの製造方法のステップは、連続的に、半連続的に、バッチ式で、又は半バッチ式で実行されてよい。
【０１２７】
いくつかの変形において、３Ｄバイオ印刷プロセスは６つのインプットを利用する。
【０１２８】
第１のインプットは、コンピュータ支援設計（ＣＡＤ）ファイルであり、これは、バイオ印刷される、生きている細胞を有するバイオインクの正確な位置のための幾何学的（空間）情報を提供する、組織又は器官の青写真である。この第１のインプットは前処理として参照されてよく、且つ磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャニング、若しくは組織学的研究、及び／又は他のコンピュータ技術を利用してもよい。組織学的研究は、単独で、又はバイオイメージングと集積化されて実行されてもよい。
【０１２９】
第２のインプットは、細胞を多く含むバイオインクであり、これは、少なくともナノセルロースと、印刷される組織又は器官に関する生きている細胞とを含有する、調製された溶液である。バイオインクは、必要とされる組織又は器官の細胞へと分化することができる、幹細胞（例えば、脂肪由来幹細胞、間葉幹細胞、軟骨幹／前駆細胞など）、或いは例えば、皮膚組織を特異的に製造することのできるヒト皮膚線維芽細胞、又は軟骨を特異的に製造することのできる軟骨細胞などの特異性細胞を含んでもよい。抗生剤及び細胞増殖補助剤などの種々の他の生体適合性材料もバイオインクに添加されてよい。
【０１３０】
任意選択的な第３のインプットは、バイオペーパーである。バイオペーパーはバイオインクの担体材料であって、そしてコラーゲン、栄養、増殖因子及び他の安定剤を含有してよい。上記成分を混合した後、それがゲル様の粘稠度を達成するまで、混合物を特定の温度まで冷却してもよい。バイオペーパーは、自己集合を妨げることなく、細胞増殖及び成長を支持する環境を提供する。バイオインクは、バイオペーパー以外の別の基材又は表面（若しくはスカフォード）に堆積されてもよいことに留意すべきである。また、特定の実施形態においては、バイオペーパー自体がナノセルロースを含有することにも留意すべきである。
【０１３１】
第４のインプットはバイオプリンターであり、これは、３次元（３Ｄ）でバイオインクを印刷するために使用されるデバイスである。バイオプリンターでは、ステレオリソグラフィー、押出成形ベースの印刷、レーザー補助印刷、インクジェットベースの印刷又はナノバイオ印刷から選択される３Ｄバイオ印刷技術が利用されてもよい。好ましい実施形態において、バイオプリンターは押出成形ベースのバイオプリンターである。押出成形は、注射器様ノズル又は例えば小型押出成形器によるものであってもよい。バイオプリンターは、ＣＡＤファイルからの指示に従って、典型的に事前に装填されたバイオカートリッジからバイオインクを分配し、そして所望の組織又は器官構造を印刷する。
【０１３２】
任意選択的な第５のインプットは、１つ又はそれ以上のバイオカートリッジである。バイオカートリッジは、印刷されるバイオインクを同封する容器である。バイオカートリッジは、プラスチックなどのいずれの適切な材料からも形成されてよく、且つ円筒状バイアル又は管などのいずれかの適切な幾何構造からも形成されてよい。バイオカートリッジは、事前に殺菌されたバイオインク、又は（後で殺菌されてもよい）殺菌されていないバイオインクを含有してよい。バイオカートリッジは、細胞を含まないバイオインク又は細胞を多く含むバイオインクを含有していてもよい。いくつかの実施形態において、バイオカートリッジは細胞溶液のみを含有し、これを細胞を含まないバイオインクを含有する他のバイオカートリッジと組み合わせて、例えばバイオプリンターに供給される細胞を多く含むバイオインクを形成する。
【０１３３】
任意選択的な第６のインプットはバイオリアクターである。バイオリアクターは、組織又は器官を作成するための３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーに含有される細胞のさらなる成長及び条件付けのために適切な生物学的環境（例えば、温度、ｐＨ、増殖因子、熱及び質量輸送など）を複製又は達成するために構成される物理的装置である。化学的及び生化学的条件付けは、通常、両方ともバイオリアクターで重要である。バイオリアクター中、３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーは、それがヒトの標的領域へと移植するために十分成熟するまで維持される。バイオリアクターは、バイオインクが、細胞球体、細胞柱体又は細胞の別の適切な組織学形態を形成するまで運転されてよい。特定の実施形態において、バイオリアクターはヒトの中の生体内領域であり、すなわち、３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーを細胞の潜在的にさらなる増殖及び条件付けのための標的領域に直接的に配置することが適切である場合である。
【０１３４】
本発明のいくつかの変形において、３Ｄバイオ印刷のプロセスは、ヒト組織から細胞を単離するステップと、細胞を多く含むバイオインク中での包含のために培養液で拡張するステップとを含む。バイオインクは、中間３Ｄバイオストラクチャーを形成するための３Ｄバイオプリンターを使用して、ミクロスケール（例えば、１〜１００ミクロン）又はマクロスケール（例えば、ミリメートル又はセンチメートル）で３次元でバイオ印刷されてよい。中間３Ｄバイオストラクチャーは、組織成熟までバイオリアクターで培養されて、成熟３Ｄバイオストラクチャーを形成してもよい。
【０１３５】
中間又は成熟３Ｄバイオストラクチャーは、美容目的の試験のための皮膚として、動物試験の代替として利用されてもよい。中間又は成熟３Ｄバイオストラクチャーは、腎臓又は肝臓小器官などのバイオ印刷された小器官（小型の自己組織化された３次元の組織培養）として、動物試験の代替として利用されてもよい。成熟３Ｄバイオストラクチャーは、外傷後の欠損、がん切除又は先天的状態の外科的再構築のための軟骨又は皮膚などの外科用移植組織用に利用されてもよい。成熟３Ｄバイオストラクチャーは、ドナー器官の欠乏を克服するための、腎臓、肝臓又は心臓などの器官の外科的移植用に利用されてもよい。
【０１３６】
また本発明は、複数の層を含む３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーであって、それぞれの層が、（ｉ）ナノセルロース結晶、ナノセルロースフィブリル又はそれらの組合せの形態のナノセルロースと、（ｉｉ）（例えば、二価金属カチオンによって）イオン性架橋されたアルギネートと、（ｉｉｉ）複数の生きているヒト細胞とを含有し、３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーが、イオン性架橋されたアルギネート中に密接に分散されたナノセルロースの相互に連結している小型のナノロッドの多孔性３Ｄネットワークによって特徴づけられ、且つ生きているヒト細胞が、多孔性３Ｄネットワーク上及び／又は中に含有される、３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーを提供する。
【０１３７】
３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーにおいて、（バイオインク中の）ナノセルロースと関連する複数の長さスケール及び細孔径が存在する。上記で議論されるように、３Ｄ印刷されたバイオストラクチャー中のナノセルロースは、好ましくは、高い熱分解開始温度によって特徴づけられる。ヒト細胞は、ヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞であってよい。３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーは、ヒト軟骨を含有してよい。３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーは、耳、鼻、軟骨性連結、気管輪、喉頭、肋軟骨又はそれらの一部分からなる群から選択されてよい。３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーは、任意の幾何学的形状であってもよい。
【０１３８】
機能組織中への３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーの転移は、様々な生理学的条件及び増殖因子の組合せを使用することによって、バイオリアクターベースの培養として生体外で、又は分解のための自然な傾向に取って代わる、本来の場所での増殖を可能にする３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーの移植を通して生体内でのいずれかで実施されることができる。特定の実施形態において、３Ｄ印刷されたバイオストラクチャーはすでに機能的であり、したがって、バイオリアクターの使用は必要ではない。
【０１３９】
ナノセルロースは生体適合性であると考えられる。多くの用途において、意図は、経時的に（例えば、数日間、数週間、数カ月間又は潜在的に数年間）ナノセルロースは自然に分解し、そしていくつかの時点において、もはや存在せず、細胞マトリックス（例えば軟骨マトリックス）によって置き換えられるということである。ナノセルロースは本質的にブドウ糖の長鎖ポリマーであるため、生体内のナノセルロース加水分解は、ヒトに無毒性であるブドウ糖のみを生じることが期待されるであろうことに留意する価値がある。
【０１４０】
限定するように意図されないが、用途には、外科的及び内科的な創傷被覆材、乳房再建、顔面再建、耳再建、並びに腰又はひざと関連する軟骨再建が含まれる。細胞、組織、小器官及び器官は、本明細書の開示を使用して３Ｄバイオ印刷されてよい。３Ｄバイオストラクチャーは、情報伝達経路及び毒素に対する天然細胞の反応を調査するために利用されてもよい。小器官及び組織は、動物試験の代替として、試験薬及び化粧品に有用であり得る。移植のための組織及び器官は、ドナー部位合併症を排除し、そして臓器ドナーの欠乏を克服し得る。
【０１４１】
ナノセルロース製造及び特徴決定
ナノセルロース及び関連材料は、（以下にさらに詳細に議論される）ＡＶＡＰ（登録商標）バイオ精製プロセスと関連するプロセス条件及びステップを含む特定の条件下で製造可能である。ナノ繊維又はナノ結晶の形成の間、非晶質セルロースを加水分解するための酵素的又は別の酸処理ステップが必要とされることなく、非常に高いセルロース結晶化度が製造及び維持可能であることがわかった。高い結晶化度は、機械的に強い繊維又は良好な物理的強化特性へと翻訳されることが可能であり、これはバイオインクの流動学的特性及びバイオストラクチャーの機械的特性のために有利である。
【０１４２】
セルロースナノフィブリル（ＣＮＦ）の製造に関する有意な技術的経済的障壁は、高エネルギー消費及び高コストである。二酸化硫黄（ＳＯ２）及びエタノール（又は他の溶媒）を使用して、本明細書に開示される前処理によって、バイオマスからヘミセルロース及びリグニンのみならず、セルロースの非晶質域も効果的に除去され、それによって、ＣＮＦへの変換のために最小の機械的エネルギーを必要とするユニークな、高度に結晶質のセルロース生成物が得られる。低い機械的エネルギー必要条件は、セルロースの非晶域の除去における化学的前処理の間に形成したフィブリル化セルロース網様構造に起因する。
【０１４３】
本明細書中で意図されるように、「ナノセルロース」は、限定されないが、マイクロフィブリル化セルロース、ナノフィブリル化セルロース、マイクロ結晶セルロース、ナノ結晶セルロース及び粒子化又はフィブリル化溶解パルプを含む広範囲のセルロース材料を含むように総括的に定義される。典型的に、本明細書に提供されるナノセルロースは、ナノメートルスケールの少なくとも１つの長さ寸法（例えば、直径）を有する粒子を含むであろう。
【０１４４】
「ナノフィブリル化セルロース」又は同等に「セルロースナノフィブリル」（ＣＮＦ）又は「ナノセルロースフィブリル」は、ミクロン径の粒子又は繊維、或いはミクロン径及びナノメートル径の粒子又は繊維を含有するセルロース繊維又は領域を意味する。「ナノ結晶セルロース」又は同等に「セルロースナノ結晶」（ＣＮＣ）又は「ナノセルロース結晶」は、ナノメートル径のドメインを含有するセルロース粒子、領域又は結晶を意味する。「ミクロン径」は、１μｍ〜１００μｍを含み、且つ「ナノメートル径」は、０．１ｎｍ〜１０００ｎｍ（１μｍ）を含む。
【０１４５】
ナノセルロースの特定の径は、幅及び／又は長さにかかわらず、ナノメートルスケールからミクロンスケールまでの範囲であることが可能である。セルロースナノフィブリルは、典型的に幅約１０〜５０ｎｍ及び長さ約５００〜２０００ｎｍの寸法を有し、そしてセルロースの非晶質及び結晶質ドメインの両方を含有する。セルロースナノ結晶は、典型的に幅約３〜８ｎｍ及び長さ約１００〜３００ｎｍを有し、そして主に結晶質である。これらの範囲及び寸法が典型的であるが、（長い繊維を含めて）他の粒径が存在してもよい。粒径は、動的光散乱、原子力顕微鏡法、透過電子顕微鏡法、小角Ｘ線散乱又は他の技術によって測定されてよい。
【０１４６】
一般に、主要フラクション（セルロース、ヘミセルロース及びリグニン）を互いから効果的に分離する方法において、バイオマスを処理することは有益である。セルロースは、ナノセルロースを製造するために、さらなる処理を受けることができる。リグノセルロースの分別により、セルロースミクロフィブリルの間のリグニン及びヘミセルロースの溶解によってセルロース系繊維の放出が導かれ、そして細胞壁構造が開放される。繊維は、ナノフィブリル又はナノ結晶への転化のためにより入手可能である。ヘミセルロース糖は、エタノールなどの様々な製品へと発酵させられるか、又は他の化学物質に変換されることができる。バイオマスからのリグニンは、固形燃料として、そしてまた液体燃料、合成ガス又は水素を製造するためのエネルギー供給原料として、そして様々なポリマーコンパウンドを製造するための中間体としての価値を有する。さらに、専門的な用途のために、タンパク質又は希少糖などの微量成分を抽出及び精製することができる。
【０１４７】
次の例示的な実施形態は、請求される本発明の範囲を制限するように意図されない。ステップの順番は変更されてよく、いくつかのステップは排除されてもよく、且つ／又は他のステップが加えられてもよい。本明細書中、第１のステップ、第２のステップなどへの参照は、いくつかの実施形態を例証する目的のみのためである。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、ナノセルロースは、硬材、軟材、農業残渣、漂白されていない化学パルプ、漂白された化学パルプ、サーモメカニカルパルプ及びそれらの組合せからなる群から選択されるバイオマス源から得られる。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、ナノセルロースは、酸、リグニン用の溶媒及び水の存在下でバイオマスを精留して、セルロース豊富固体及び液相を生じることと、次いで、セルロース豊富固体を機械的に精製し、ナノセルロースを生じることから得られる。特定の実施形態において、酸は二酸化硫黄であり、そして溶媒はエタノールである。特定の実施形態において、ナノセルロースを製造するためにＡＶＡＰ（登録商標）プロセスが使用される。
【０１５０】
いくつかの変形において、ナノセルロース材料の製造方法は、
（ａ）リグノセルロースバイオマス供給原料を提供することと；
（ｂ）酸、リグニン用溶媒及び水の存在下、供給原料を分別し、セルロース豊富固体と、ヘミセルロース及びリグニンを含有する液体を生成することと；
（ｃ）セルロース豊富固体を機械的に処理して、セルロースフィブリル及び／又はセルロース結晶を形成し、それによって、少なくとも６０％の結晶化度（すなわち、セルロース結晶化度）を有するナノセルロース材料を生成することと；
（ｄ）ナノセルロース材料を回収することと
を含む。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、酸は、二酸化硫黄、亜硫酸、三酸化硫黄、硫酸、リグノスルホン酸及びその組合せからなる群から選択される。特定の実施形態において、酸は、二酸化硫黄である。
【０１５２】
バイオマス供給原料は、硬材、軟材、森林残渣、ユーカリ、産業廃棄物、パルプ及び紙廃棄物、消費者廃棄物又はその組合せから選択されてよい。いくつかの実施形態は、食用作物と関連するリグノセルロースバイオマス、一年生の草、エネルギー作物、又は他の毎年再生可能な供給原料を含む農業残査を利用する。模範的な農業残渣としては、限定されないが、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ繊維、小麦わら、サトウキビバガス、サトウキビわら、米わら、オート麦わら、大麦わら、ハチジョウススキ（ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）、エネルギーケーン（ｅｎｅｒｇｙ  ｃａｎｅ）わら／残渣又はその組合せが含まれる。本明細書に開示された方法は、供給原料融通性から利益を得；多種多様なセルロース含有供給原料に有効である。
【０１５３】
本明細書で使用される場合、「リグノセルロースバイオマス」は、セルロース及びリグニンを含有するいずれの材料も意味する。リグノセルロースバイオマスは、ヘミセルロースも含有してよい。１種又はそれ以上のバイオマスの混合物を使用することができる。いくつかの実施形態において、バイオマス供給原料は、スクロース含有成分（例えば、サトウキビ又はエネルギーケーン）及び／又はデンプン成分（例えば、トウモロコシ、小麦、米など）に加えて、（上記のものなどの）リグノセルロース成分の両方を含む。出発バイオマスとは、様々な湿分レベルが関連していてもよい。バイオマス供給原料は、そうである必要はないが、比較的乾燥していてもよい。一般に、バイオマスは、粒状又はチップの形態であるが、粒径は、本発明において重要ではない。
【０１５４】
ステップ（ｃ）における機械的処理は、限定されないが、ミリング、グラインディング、ビーティング、ソニケーティング、高圧衝突、高剪断、或いははセルロース中でナノフィブリル及び／又はナノ結晶を形成又は放出するためのいずれかの他の手段などの１つ又はそれ以上の既知の技術を利用してもよい。本質的に、繊維を物理的に分離するいずれの種類のミル又はデバイスも利用されてよい。そのようなミルは、産業において周知であり、且つ限定されないが、バレイ（Valley）ビーター、シングルディスクリファイナー、ダブルディスクリファイナー、広角及び狭角の両方を含むコニカルリファイナー、円筒リファイナー、ホモジナイザー、マイクロフルイダイザー及び他の類似のミリング若しくはグラインディング装置が含まれる。例えば、Smook, Handbook for Pulp & Paper Technologists, Tappi Press, 1992及びHubbe et al., “Cellulose Nanocomposites: A Review,” BioResources 3(3), 929-980 (2008)を参照のこと。
【０１５５】
機械的処理の範囲は、いくつかの手段のいずれかによって、プロセス間に監視されてよい。特定の光学機器は、いずれかが機械的処理ステップの終端を画定するために使用され得る、繊維長さ分布及び微細％に関連する計量値を提供することができる。時間、温度及び圧力は、機械的処理の間に変動し得る。例えば、いくつかの実施形態において、周囲温度及び圧力において、約５分〜２時間の音波処理が利用されてよい。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、セルロース豊富固体の残りの部分はフィブリル化されないが、セルロース豊富固体の一部は、ナノフィブリルに変換される。種々の実施形態において、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％で、９０％、９５％、９９％、又は実質的に全てのセルロース豊富固体が、ナノフィブリルへとフィブリル化される。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、ナノフィブリルの残りの部分はナノ結晶に変換されないが、ナノフィブリルの一部は、ナノ結晶に変換される。種々の実施形態において、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％で、９０％、９５％、９９％、又は実質的に全てのナノフィブリルが、ナノ結晶に変換される。乾燥間、少量のナノ結晶が一緒に戻り、そしてナノフィブリルを形成することは可能である。
【０１５８】
機械的処理後、ナノセルロース材料は、粒子径によって分類されてよい。材料の一部は、グルコースを生成する酵素加水分解などの、別個のプロセスを受けさせてもよい。そのような材料は、例えば、良好な結晶化度を有し得るが、望ましい粒径又は重合度を有し得ない。
【０１５９】
ステップ（ｃ）は、１種又はそれ以上の酵素、或いは１種又はそれ以上の酸によるセルロース豊富固体の処理をさらに含み得る。酸が使用される場合、それらは、二酸化硫黄、亜硫酸、リグノスルホン酸、酢酸、ギ酸及びその組合せからなる群から選択されてよい。酢酸又はウロン酸などのヘミセルロースと関連する酸は、単独で、又は他の酸と組み合わせて利用されてもよい。また、ステップ（ｃ）は、加熱によるセルロース豊富固体の処理を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）は、いずれの酵素又は酸も使用しない。
【０１６０】
ステップ（ｃ）において、酸が使用される場合、酸は、例えば、硫酸、硝酸又はリン酸などの強酸であってよい。より過酷な温度及び／又は時間において、より弱い酸が利用されてもよい。セルロースを加水分解する酵素（すなわち、セルラーゼ）及び可能であればヘミセルロースを加水分解する酵素（すなわち、ヘミセルラーゼ活性を有するもの）が、酸の代わりに、或いは酸による加水分解の前又は後に潜在的に連続的な構造で、ステップ（ｃ）において利用されてもよい。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、プロセスは、非晶質セルロースを加水分解するためにセルロース豊富固体を酵素的に処理することを含む。他の実施形態において、或いは酵素的処理の前又は後に連続的に、プロセスは非晶質セルロースを加水分解するためにセルロース豊富固体を酸処理することを含み得る。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、プロセスは、ナノ結晶セルロースを酵素的に処理することをさらに含む。他の実施形態において、或いは酵素的処理の前又は後に連続的に、プロセスは、ナノ結晶セルロースを酸処理することをさらに含む。
【０１６３】
望ましい場合、酵素的処理は、機械的処理の前、又は可能であれば同時に利用されてよい。しかしながら、望ましい実施形態において、非晶質セルロースを加水分解するか、又はナノ繊維の単離の前に繊維壁の構造を弱化するために、酵素処理は実行されない。
【０１６４】
機械的処理後、ナノセルロースは回収されてもよい。セルロースナノフィブリル及び／又はナノ結晶の分離は、ナノフィブリルの完全性を維持しながら、細胞壁の超微細構造を崩壊させることが可能な装置を使用して達成され得る。例えば、ホモジナイザーが使用されてもよい。いくつかの実施形態において、１〜１００ｎｍの範囲の成分フィブリルを有するが、フィブリルは互いに完全に分離されていないセルロース凝集体フィブリルが回収される。
【０１６５】
プロセスは、ステップ（ｃ）の前に、及び／又はステップ（ｃ）の一部として、セルロース豊富固体を漂白することをさらに含む。代わりに、或いはさらに、プロセスは、ステップ（ｃ）の間及び／又はステップ（ｃ）の後に、ナノセルロース材料を漂白することをさらに含んでもよい。酵素漂白を含む、いずれの既知の漂白技術又は配列も使用されてよい。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、スクリーンされたパルプは、標準パルプ及び紙Ｄ０ＥｐＤ１漂白シーケンス（二酸化塩素、水酸化ナトリウム及び過酸化水素、並びに二酸化塩素）を使用して漂白される。それぞれのステップは、適切なプロセス機器（保留タンク、化学薬品混合機など）を使用して、バッチ式又は連続モードで実行されてよい。ミル水で約４重量％固形分などまでパルプを希釈すること、そして遠心分離機で約１５重量％固形分まで濃縮することによって、漂白段階の間で水洗浄を実行してもよい。最終漂白段階の後、好ましくは複数の洗浄が実行される。
【０１６７】
ナノセルロース材料は、ナノフィブリル化セルロースを含み得るか、又はそれから本質的になり得る。ナノセルロース材料は、ナノ結晶セルロースを含み得るか、又はそれから本質的になり得る。いくつかの実施形態において、ナノセルロース材料は、ナノフィブリル化セルロース及びナノ結晶セルロースを含み得るか、又はそれから本質的になり得る。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、セルロース豊富固体（すなわち、ナノセルロース前駆体材料）の結晶化度は、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％又はそれ以上である。これら又は他の実施形態において、ナノセルロース材料の結晶化度は、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％又はそれ以上である。結晶化度は、いずれかの既知の技術を使用して測定されてもよい。例えば、Ｘ線回折及び固体状態１３Ｃ核磁気共鳴が利用されてよい。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、ナノセルロース材料は、約１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００又は１４００などの、約１００〜約１５００の平均重合度によって特徴づけられる。例えば、ナノセルロース材料は、約３００〜約７００、又は約１５０〜約２５０の平均重合度によって特徴づけられてもよい。ナノセルロース材料は、ナノ結晶の形態の場合、約７５、５０、２５又は１０などの１００未満の重合度を有していてもよい。材料の一部分が、約２０００、３０００、４０００又は５０００などの１５００より高い重合度を有してもよい。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、ナノセルロース材料は、単一ピークを有する重合度分布によって特徴づけられる。他の実施形態において、ナノセルロース材料は、１つは１５０〜２５０の範囲を中心とし、そして別のピークは３００〜７００の範囲を中心とするものなどの２つのピークを有する重合度分布によって特徴づけられる。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、ナノセルロース材料は、約１５、２０、２５、３５、５０、５５、６０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００又は５００などの約１０〜約１０００の粒子の平均長さ対幅のアスペクト比によって特徴づけられる。ナノフィブリルは、一般に、ナノ結晶より高いアスペクト比と関連する。例えば、ナノ結晶は、２５〜１２５のアスペクト比に翻訳される、約１００ｎｍ〜５００ｎｍの長さ範囲及び約４ｎｍの直径を有し得る。ナノフィブリルは、４０〜４００のアスペクト比に翻訳される、約２０００ｎｍの長さ及び５〜５０ｎｍの直径領域を有し得る。特定の例示的な実施形態において、ナノ結晶のアスペクト比は約５０であり、且つナノフィブリルのアスペクト比は約５５である。
【０１７２】
任意選択的に、プロセスは、ステップ（ｂ）及び／又はステップ（ｃ）において、非晶質セルロースをグルコースへと加水分解すること、グルコースを回収すること、並びにグルコースを発酵生成物へと発酵させることをさらに含む。任意選択的に、プロセスは、ヘミセルロースから誘導されるヘミセルロース糖を回収すること、発酵させること、又は処理することをさらに含む。任意選択的に、プロセスは、リグニンを回収すること、燃焼すること、又はさらに処理することをさらに含む。
【０１７３】
非晶質セルロースの加水分解から生成するグルコースは、エタノール又は別の発酵副生成物を製造する全プロセスに統合されてもよい。したがって、いくつかの実施形態において、プロセスは、ステップ（ｂ）及び／又はステップ（ｃ）において、非晶質セルロースをグルコースへと加水分解すること、並びにグルコースを回収することをさらに含む。グルコースは、精製されてから販売されてもよい。或いはグルコースは、限定されないが、エタノールなどの発酵生成物へと発酵させられてもよい。望ましい場合、グルコース又は発酵生成物は、ヘミセルロース糖加工などの前端にリサイクルされてもよい。
【０１７４】
ヘミセルロース糖が回収され、発酵される場合、それらは、モノマー又はその前駆体を製造するために発酵されてもよい。モノマーは、ポリマー−ナノセルロース複合材料（例えば、ポリ乳酸−ナノセルロース複合材料）を形成するために、次いでナノセルロース材料と組み合わされてもよいポリマーを製造するために重合されてもよい。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、ナノセルロース材料は、ステップ（ｂ）の間に、少なくともいくつかのリグニンをセルロース豊富固体の表面上に析出させることによって、少なくとも部分的に疎水性である。これら又は他の実施形態において、ナノセルロース材料は、ステップ（ｃ）又はステップ（ｄ）の間に、ナノセルロース材料の表面上への少なくともいくつかのリグニンの析出によって、少なくとも部分的に疎水性である。バイオインクのための好ましい実施形態において、ナノセルロースは親水性であり、且つ有意な濃度のリグニンを含有しない。
【０１７６】
特定の変形は、ナノセルロース材料を製造する方法において、
（ａ）リグノセルロースバイオマス供給原料を提供することと；
（ｂ）硫酸、リグニン用溶媒及び水の存在下、供給原料を分別し、セルロース豊富固体と、ヘミセルロースオリゴマー及びリグニンを含有する液体を生成し、ここで、セルロース豊富固体の結晶化度が、少なくとも７０％であり、ＳＯ２濃度が、約１０重量％〜約５０重量％であり、分別温度が、約１３０℃〜約２００℃であり、且つ分別時間が、約３０分〜約４時間であることと；
（ｃ）セルロース豊富固体を機械的に処理して、セルロースフィブリル及び／又はセルロース結晶を形成し、それによって、少なくとも７０％の結晶化度を有するナノセルロース材料を生成することと；
（ｄ）ナノセルロース材料を回収することと
を含む方法を提供する。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、ＳＯ２濃度は約１２重量％〜約３０重量％である。いくつかの実施形態において、分別温度は約１４０℃〜約１７０℃である。いくつかの実施形態において、分別時間は約１時間〜約２時間である。
【０１７８】
種々の実施形態において、ナノセルロース組成物は被嚢類、又はバクテリアセルロース由来ではない。特定の実施形態において、ナノセルロース組成物は、酵素又は酵素由来断片を含まない。
【０１７９】
また本発明は、いくつかの変形において、ナノセルロース含有製品を製造するプロセスにおいて、
（ａ）リグノセルロースバイオマス供給原料を提供することと；
（ｂ）酸、リグニン用溶媒及び水の存在下、供給原料を分別し、セルロース豊富固体と、ヘミセルロース及びリグニンを含有する液体を生成することと；
（ｃ）セルロース豊富固体を機械的に処理して、セルロースフィブリル及び／又はセルロース結晶を形成し、それによって、ナノセルロース材料を生成することと；
（ｄ）ナノセルロース材料の少なくとも一部を、ナノセルロース含有製品（例えば、ナノセルロース含有バイオインク組成物）中に組み込むことと
を含むプロセスを提供する。
【０１８０】
ナノセルロース含有製品は、ナノセルロース材料、又はその処理された形態を含む。いくつかの実施形態において、ナノセルロース含有製品は、本質的にナノセルロース材料からなる。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、ステップ（ｄ）は、ナノセルロース材料又はその誘導体を含む構造的対象（たとえばバイオ構造）を形成することを含む。
【０１８２】
ナノセルロースへの前処理後の変性がないため、表面ヒドロキシル基及び負の表面電荷による官能性化の可能性がある。理論によって拘束されることを望まないが、ナノセルロースは、細胞付着、移動、拡散及び分化を強化するために、化学活用及び静電気吸着に基づくタンパク質固定に適切であり得る。
【０１８３】
ＡＶＡＰ（登録商標）バイオ精製プロセス
ここで、ＡＶＡＰ（登録商標）バイオ精製プロセスについて、いくつかの変形で、さらに説明する。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、第１のプロセスステップは、容易な下流除去を可能にするための３種のリグノセルロース材料成分（セルロース、ヘミセルロース及びリグニン）を分別する「蒸解」（「消化」と等しい）である。特に、ヘミセルロースが溶解され、且つ５０％より多くが完全に加水分解され；セルロースが分離されるが、加水分解に対して耐性が残っており；そしてリグニンの一部が、水溶性リグノスルホネートへとスルホン化される。
【０１８５】
リグノセルロース材料は、脂肪族アルコール、水及び二酸化硫黄の溶液（蒸解液）中で加工される。蒸解液は、好ましくは、少なくとも２０重量％、３０重量％、４０重量％又は５０重量％などの少なくとも１０重量％のリグニン用溶媒を含有する。例えば、蒸解液は、約５０重量％の溶媒などの約３０〜７０重量％の溶媒を含有し得る。リグニン用の溶媒は、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、１−ペンタノール、１−ヘキサノール又はシクロヘキサノールなどの脂肪族アルコールであってよい。リグニン用の溶媒は、フェノール又はクレゾールなどの芳香族アルコールであってもよい。（限定されないが）グリセロール、メチルエチルケトン又はジエチルエーテルなどの他のリグニン溶媒が可能である。２種以上溶媒の組合せが利用されてもよい。
【０１８６】
好ましくは、出発材料に存在するリグニンを溶解するために十分な溶媒が抽出剤混合物中に含まれる。リグニン用の溶媒は、水と完全に混和性であるか、部分的に混和性であるか、又は非混和性であってよく、そのため、２つ以上の液相が存在し得る。溶媒が水と混和性である場合、及び溶媒が水と非混和性である場合、潜在的なプロセス利点が生ずる。溶媒が水混和性である場合、単一液相が形成し、リグニン及びヘミセルロース抽出の質量移動が増強し、そして下流プロセスは、１種のみの液体流で処理されなければならない。溶媒が水中に非混和性である場合、抽出剤混合物は容易に分離し、液体相を形成し、したがって、別個の分離ステップを回避できるか、又は単純化することができる。１つの液体相がほとんどのリグニンを含有し、且つ他がほとんどのヘミセルロース糖を含有する場合、ヘミセルロース糖からのリグニンの回収が容易になるため、これは有利となることが可能である。
【０１８７】
蒸解液は、好ましくは、二酸化硫黄及び／又は亜硫酸（Ｈ２ＳＯ３）を含有する。蒸解液は、好ましくは、溶解形態又は反応形態で、約９重量％、１０重量％、１１重量％、１２重量％、１３重量％、１４重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％又はそれ以上などの、少なくとも３重量％、好ましくは少なくとも６重量％、より好ましくは少なくとも８重量％の濃度でＳＯ２を含有する。蒸解液は、ＳＯ２とは別に、ｐＨを調整するために、１種又はそれ以上の種も含有し得る。蒸解液のｐＨは、典型的に、約４以下である。
【０１８８】
二酸化硫黄は、加水分解後に容易に溶液から回収可能であるため、好ましい酸触媒である。加水分解物からの大多数のＳＯ２は除去され、そして反応器に戻されて、リサイクルされ得る。回収及びリサイクルは、類似の硫酸の中和と比較して、必要とされる石灰がより少ないこと、処分される固体が少ないこと、そして分離装置が少ないことを意味する。二酸化硫黄の固有特性に起因する効率向上は、より少ない全酸又は他の触媒が必要とされ得ることを意味する。硫酸は高価であるため、これはコストにおいて利点がある。
【０１８９】
さらに、そして非常に有意に、少ない酸の使用量は、下流操作のための加水分解後のｐＨの増加のための塩基（例えば、石灰）のより低いコストを意味するであろう。さらに、少ない酸及び少ない塩基は、他の場合は処分が必要となり得る廃塩（例えば、石こう）の実質的に少ない精製も意味するであろう。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、添加剤は、セルロース粘性率を増加させるために、約０．１重量％〜１０重量％以上の量で含まれていてよい。模範的な添加剤としては、アンモニア、水酸化アンモニア、尿素、アントラキノン、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、水酸化ナトリウム及びそれらの誘導体が含まれる。
【０１９１】
蒸解は、バッチ又は連続ダイジェスターを使用して、１つ又はそれ以上の段階で実行される。固体及び液体は、同一方向又は逆方向に流動し得るか、或いは望ましい分別を達成する他のいずれかの流動パターンで流動し得る。望ましい場合、蒸解反応器は、内部で振とうされてよい。
【０１９２】
加工されるリグノセルロース材料次第で、蒸解条件は、液体相又は気相において、約６５℃〜１９０℃、例えば、７５℃、８５℃、９５℃、１０５℃、１１５℃、１２５℃、１３０℃、１３５℃、１４０℃、１４５℃、１５０℃、１５５℃、１６５℃又は１７０℃の温度及び約１気圧〜約１５気圧の対応する圧力で変動する。１又はそれ以上の段階の蒸解時間は、約３０、４５、６０、９０、１２０、１４０、１６０、１８０、２５０、３００、３６０、４５０、５５０、６００又は７００分などの約１５分〜約７２０分から選択され得る。一般に、蒸解ステップの間に使用される温度と、その成分部分へのバイオマスの良好な分別を得るために必要な時間との間に逆関係がある。
【０１９３】
蒸解液対リグノセルロース材料の比率は、約２、３、４、５又は６などの約１〜約１０から選択されてよい。いくつかの実施形態において、蒸解スペースが、水分と平衡のエタノール及び二酸化硫黄蒸気で満たされるように、バイオマスは、低い液体体積（蒸解液対リグノセルロース材料の低い比率）で加圧容器中で消化される。蒸解されたバイオマスは、リグニン及び溶解したヘミセルロースを回収するために、アルコール豊富溶液で洗浄されるが、他方、残留パルプはさらに加工される。いくつかの実施形態において、リグノセルロース材料を分別する方法は、脂肪族アルコール（又はリグニン用の他の溶媒）、水及び二酸化硫黄によるリグノセルロース材料の蒸気相蒸解を含む。例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第８，０３８，８４２号明細書及び同第８，２６８，１２５号明細書を参照のこと。
【０１９４】
二酸化硫黄の一部又は全ては、亜硫酸として抽出物液体中に存在し得る。特定の実施形態において、二酸化硫黄は、亜硫酸、亜硫酸イオン、重亜硫酸イオン、その組合せ、又は上記のいずれかの塩を導入することによって、その場で生成する。過剰量の二酸化硫黄は、加水分解後、回収され、そして再利用され得る。
【０１９５】
いくつかの実施形態において、二酸化硫黄は、第１の温度で水（又は任意選択的にアルコールとの水溶液）中に飽和され、次いで、加水分解は、第２の、一般により高い温度で実行される。いくつかの実施形態において、二酸化硫黄は、亜飽和である。いくつかの実施形態において、二酸化硫黄は、過飽和である。いくつかの実施形態において、二酸化硫黄濃度は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％又は１０の硫黄含有量％などの特定のリグニンスルホン化度を達成するよう選択される。ＳＯ２はリグニンと化学的に反応して、固体及び液体相の両方に存在し得る安定リグノスルホン酸を形成する。
【０１９６】
溶液中の二酸化硫黄、添加剤又は脂肪族アルコール（若しくは他の溶媒）の濃度、並びに蒸解の時間は、パルプ中のセルロース及びヘミセルロースの収率を制御するために変更されてよい。二酸化硫黄の濃度及び蒸解の時間は、加水分解物中のリグノスルホネートに対するリグニンの収率を制御するために変更されてよい。いくつかの実施形態において、二酸化硫黄の濃度、蒸解の温度及び時間は、発酵性糖の収率を制御するために変更されてよい。
【０１９７】
固体相からのヘミセルロース及びリグニンの両方の望ましい量の分別が達成されたら、液体及び固体相は分離される。分離のための条件は、固体相上に抽出されたリグニンの再沈殿を最小化するか、又は増強するよう選択されてよい。リグニン再沈殿を最小化することは、少なくともリグニンのガラス転移温度（約１２０℃）で分離又は洗浄を実行することによって優位となり；逆に、リグニン再沈殿を増強することは、リグニンのガラス転移温度未満で分離又は洗浄を実行することによって優位となる。
【０１９８】
物理的分離は、分離及び洗浄を実行することができるデバイスに全混合物を移送すること、又は他の相をその場に保持しながら、反応器から１つの相のみを取り出すことによって達成することができる。固体相は、液体が通過することができる適切なサイズのスクリーンによって物理的に保持されることができる。固体はスクリーン上に保持され、そして連続固体洗浄サイクルのために、そこに保持されることができる。代わりに、遠心分離、又は固体をスラリーから効率的に移送することができる力によって、液体を保持し、そして固体相を反応領域から強制的に除去してもよい。連続システムにおいて、固体及び液体の逆流動が、物理的分離を達成することができる。
【０１９９】
回収された固体は、通常、そのいくらかは洗浄によって容易に除去可能である、大量のリグニン及び糖を含むであろう。洗浄液体組成は、分別の間に使用された液体組成と同一であることも、又は異なることも可能である。有効性を増加させるために、複数回の洗浄が実行されてもよい。好ましくは、固体からの追加的なリグニンを除去するためのリグニン用の溶媒を含む組成物による１回又はそれ以上の洗浄と、それに続いて、残留溶媒及び固体からの糖と置き換えるための水での１回又はそれ以上の洗浄が実行される。固体を洗浄するために、溶媒回収操作からなどのリサイクル流を使用してもよい。
【０２００】
記載の通りの分離及び洗浄後、固体相及び少なくとも１つの液体相が得られる。固体相は、実質的に未消化のセルロースを含有する。溶媒及び水が、存在する相対比において混和性である場合、単一の液相が通常得られる。そのような場合、液体相は、溶解した形態で、出発リグノセルロース材料に元来あったほとんどのリグニン、並びに存在し得たいずれかのヘミセルロースの加水分解において形成された可能性モノマー及びオリゴマー糖を含有する。溶媒及び水が、完全に、又は部分的に非混和性である場合、複数の液体相が形成する傾向がある。リグニンは、ほとんどの溶媒を含有する液体相に含まれる傾向がある。ヘミセルロース加水分解生成物は、ほとんどの水を含有する液体相に存在する傾向がある。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、蒸解ステップからの加水分解物は、圧力減少を受ける。圧力減少は、例えば、バッチダイジェスターにおける蒸解の最後に、又は連続ダイジェスターからの抽出後に外部フラッシュタンク中で実行されてよい。圧力減少からのフラッシュ蒸気は、蒸解液補充容器中に回収されてもよい。フラッシュ蒸気は、新規蒸解液中に直接的に溶解され得る、実質的に全ての未反応の二酸化硫黄を含有する。次いで、セルロースを除去して、洗浄し、そしてさらに望む通りに処理する。
【０２０２】
プロセス洗浄ステップによって、セルロースから加水分解物が回収される。洗浄されたセルロースは、種々の目的（例えば、紙、あたはナノセルロース製造）のために使用されてよいパルプである。洗浄機からの弱い加水分解物は最終反応ステップまで続き；連続ダイジェスターにおいて、このような弱い加水分解物は、外部フラッシュタンクからの抽出された加水分解物と組み合わせられてよい。いくつかの実施形態において、加水分解物及びセルロース豊富固体の洗浄及び／又は分離は、少なくとも約１００℃、１１０℃又は１２０℃の温度で実行される。洗浄されたセルロースは、酵素又は酸によるセルロース加水分解によるグルコース製造のために使用されてもよい。
【０２０３】
別の反応ステップにおいて、加水分解物は、モノマーへとオリゴマーを加水分解するための１つ又は複数のステップにおいてさらに処理されてもよい。このステップは、溶媒及び二酸化硫黄の除去の前、間又は後に実行されてもよい。溶液は、残留溶剤（例えば、アルコール）を含有していてもよく、又は含有していなくてもよい。いくつかの実施形態において、加水分解を補助するために、このステップに二酸化硫黄が添加されるか、又は通させる。これら又は他の実施形態において、加水分解を補助するために、亜硫酸又は硫酸などの酸が導入される。いくつかの実施形態において、加水分解物は、圧力下で加熱することによって自動加水分解する。いくつかの実施形態において、追加的な酸は導入されないが、初期の蒸解の間に製造されたリグノスルホン酸が、ヘミセルロースオリゴマーからモノマーへの加水分解を触媒するために有効である。種々の実施形態において、このステップは、約０．０５重量％、０．１重量％、０．２重量％、０．５重量％、１重量％、２重量％、５重量％、１０重量％又は２０重量％などの、約０．０１重量％〜３０重量％の濃度で二酸化硫黄、亜硫酸、硫酸を利用する。このステップは、約１１０℃、１２０℃、１３０℃、１４０℃、１５０℃、１６０℃、１７０℃、１８０℃、１９０℃、２００℃で又は２１０℃などの、約１００℃〜２２０℃の温度で実行されてよい。加熱は、選択された温度に達するように、直接又は間接的であってよい。
【０２０４】
反応ステップは、発酵性糖を製造し、これは、次いで、エバポレーションによって発酵供給原料まで濃縮されることができる。エバポレーションによる濃縮は、オリゴマーを加水分解するための処理の前、間又は後に達成されてよい。最終反応段階は、任意選択的に、二酸化硫黄及びアルコールを除去及び回収するために、そして潜在的な発酵抑制副生成物の除去のために、結果として生じる加水分解物の水蒸気ストリッピングが続いてもよい。エバポレーションプロセスは、約０．１気圧、０．３気圧、０．５気圧、１．０気圧、１．５気圧、２気圧、４気圧、６気圧又は８気圧などの約−０．１気圧〜約１０気圧の真空又は圧力下であってよい。
【０２０５】
二酸化硫黄を回収及びリサイクルすることは、限定されないが、気−液遊離（例えば、フラッシング）、水蒸気ストリッピング、抽出又はその組合せ若しくは複数段階などの分離を利用してもよい。約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５以上などの様々なリサイクル比が実行されてよい。いくつかの実施形態において、最初に装てんされたＳＯ２の約９０〜９９％は、液体相からの蒸留によって容易に回収され、ＳＯ２の残りの１〜１０％（例えば、約３〜５％）は、主に、リグノスルホネートの形態で、溶解したリグニンに結合している。
【０２０６】
好ましい実施形態において、エバポレーションステップは、統合されたアルコールストリッパー及びエバポレーターを利用する。蒸発された蒸気の流れは、異なる流れにおいて異なる濃度の有機化合物を有するように分離され得る。エバポレーター凝縮液の流れは、異なる流れにおいて異なる濃度の有機化合物を有するように分離され得る。アルコールは、排出蒸気を凝縮させ、そして蒸解ステップにおける蒸解液補充容器に戻すことによって、エバポレーションプロセスから回収され得る。エバポレーションプロセスからのクリーンな凝縮物は、洗浄ステップにおいて使用されてもよい。
【０２０７】
いくつかの実施形態において、統合されたアルコールストリッパー及びエバポレーターシステムが利用され、そこで、脂肪族アルコールが蒸気ストリッピングによって除去され、結果として生じるストリッパー生成物流は、流れから水を蒸発させることによって濃縮され、そして蒸発された蒸気は、蒸気圧縮を使用して圧縮され、そして熱エネルギーを供給するために再利用される。
【０２０８】
エバポレーション及び最終反応ステップからの加水分解物は、主に発酵性糖を含有するが、全プロセス構造におけるリグニン分離の位置次第でリグニンを含有してもよい。加水分解物は、約１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％又は５５重量％の固体などの、約５重量％〜約６０重量％の固体濃度まで濃縮されてもよい。加水分解物は発酵性糖を含有する。
【０２０９】
発酵性糖は、セルロース、ガラクトグルコマンナン、グルコマンナン、アラビノグルクロノキシラン、アラビノガラクタン及びグルクロノキシランのそれぞれの短鎖オリゴマー及びモノマー生成物、すなわち、グルコース、マンノース、ガラクトース、キシロース及びアラビノースへの加水分解生成物として定義される。発酵性糖は、例えば、糖スラリー又は乾燥糖固体として、精製された形態で回収されてもよい。いずれの既知の技術も、糖スラリーを回収するため、又は溶液を乾燥させて乾燥糖固体を製造するために利用されてよい。
【０２１０】
いくつかの実施形態において、発酵性糖は、（限定されないが、）エタノール、イソプロパノール、アセトン、１−ブタノール、イソブチルアルコール、乳酸、コハク酸又は他のいずれかの発酵生成物などの生化学物質又はバイオ燃料を製造するために発酵される。発酵生成物のいくらかの量は、望ましい場合、回収され得る微生物又は酵素であり得る。
【０２１１】
発酵がクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）菌などの細菌を利用する場合、ｐＨを上昇させ、そして残留ＳＯ２及び他の発酵阻害因子を除去するため、加水分解物をさらに加工及び条件付けることは好ましい。残留ＳＯ２（すなわち、ストリッピングによるそのほとんどの除去後）は、酸化によって、残留亜硫酸イオンを硫酸イオンに変換するように触媒的に酸化され得る。この酸化は、亜硫酸イオンを硫酸イオンへと酸化させるＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏなどの酸化触媒を添加することによって達成され得る。好ましくは、残留ＳＯ２は、約１００ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、２５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、５ｐｐｍ又は１ｐｐｍ未満まで減少する。
【０２１２】
いくつかの実施形態において、プロセスは、共生成物としてリグニンを回収することをさらに含む。スルホン化リグニンも、共生成物として回収され得る。特定の実施形態において、プロセスは、スルホン化リグニンを燃焼又はガス化すること、再生利用された二酸化硫黄を含む気体流のスルホン化リグニンに含まれる硫黄を回収すること、次いで、再使用のために再生利用された二酸化硫黄をリサイクルすることをさらに含む。
【０２１３】
プロセスリグニン分離ステップは、加水分解物からリグニンの分離のためであって、そして最終反応ステップ及びエバポレーションの前又は後に位置することが可能である。後に位置する場合、次いで、アルコールがエバポレーションステップにおいて除去されているため、リグニンは加水分解物から沈殿するであろう。残留する水溶性リグノスルホネートは、例えば、アルカリ土類酸化物、好ましくは、酸化カルシウム（石灰）を使用して、加水分解物をアルカリ状態（７より高いｐＨ）に変換することによって沈殿され得る。組み合わされたリグニン及びリグノスルホネート沈殿物は、ろ過されてもよい。リグニン及びリグノスルホネートフィルターケーキは、共生成物として乾燥されるか、或いはエネルギー生成のために燃焼されるか、又はガス化されてもよい。ろ過からの加水分解物は回収され、そして濃縮糖溶液製品として販売されるか、或いは次の発酵又は他の反応ステップでさらに加工されてもよい。
【０２１４】
本来の（非スルホン化）リグニンは疎水性であるが、リグノスルホネートは親水性である。親水性リグノスルホナートは、凝集し、塊状化し、そして表面に付着する性質が少なくなり得る。濃縮及び分子量のいくらかの増加を受けるリグノスルホネートも、なお、いくらかの溶解性（親水性）を寄与するであろうＨＳＯ３基を有する。
【０２１５】
いくつかの実施形態において、溶媒がエバポレーションステップで除去された後、溶解性リグニンは加水分解物から沈殿する。いくつかの実施形態において、反応性リグノスルホネートは、脂肪族アルコールの存在下、過剰量の石灰（又はアンモニアなどの他の塩基）を使用して、加水分解物から選択的に沈殿される。いくつかの実施形態において、リグノスルホネートを沈殿させるために、消石灰が使用される。いくつかの実施形態において、リグニンの一部は反応性形態で沈殿され、そして残りのリグニンは水溶性形態でスルホン化される。
【０２１６】
プロセス発酵及び蒸留ステップは、アルコール又は有機酸などの発酵生成物の製造のために意図される。蒸解化学物質及びリグニンの除去、そしてさらなる処理（オリゴマー加水分解）後、加水分解物は、主に、いずれの発酵抑制剤も好ましくは除去又は中和されている水溶液中に発酵性糖を含有する。加水分解物は、１重量％〜２０重量％の濃度で希釈アルコール又は有機酸を製造するために発酵される。希釈生成物は、蒸留されるか、又は当該技術分野において既知であるように精製される。
【０２１７】
エタノールなどのアルコールが製造される場合、そのいくらかは、プロセス蒸解ステップにおいて蒸解液補充のために使用されてよい。また、いくつかの実施形態において、蒸留残渣などの蒸留カラム流は、エバポレーター凝縮物の有無にかかわらず、セルロースを洗浄するために再利用されてよい。いくつかの実施形態において、石灰は、生成物アルコールを脱水するために使用されてよい。副生成物は、加水分解物から除去及び回収されてよい。これらの副生成物は、最終反応ステップからのベント及び／又はエバポレーションステップからの凝縮物を加工することによって単離されてもよい。副生成物は、例えば、フルフラル、ヒドロキシメチルフルフラル（ＨＭＦ）、メタノール、酢酸及びリグニン誘導化合物を含む。
【０２１８】
グルコースは、アルコール、有機酸又は別の発酵生成物へと発酵されてもよい。グルコースは、甘味料として使用されてもよく、或いはそのフルクトース含有量を濃縮するために異性体化されてもよい。グルコースは、パン用の酵母菌を製造するために使用されてもよい。グルコースは、種々の有機酸及び他の材料へと触媒的又は熱的に変換されてもよい。
【０２１９】
ヘミセルロースが出発バイオマスに存在する場合、液体相の全体又は一部が、ヘミセルロース糖及び可溶性オリゴマーを含有する。上記のように、消化プロセスからの水、可能であれば、いくらかのリグニン用溶媒、ヘミセルロース糖及び種々のマイナー成分を含有するであろう発酵培養液を製造するために、液体からほとんどのリグニンを除去することが好ましい。この発酵培養液は、直接使用可能であるか、１つ又はそれ以上の他の発酵流と組み合わせることが可能であるか、或いはさらに処理されることが可能である。さらなる処理は、エバポレーションによる糖濃縮；グルコース又は他の糖（任意選択的に、セルロース糖化から入手されるもの）の添加；塩、ビタミン又は微量元素などの種々の栄養の添加；ｐＨ調整；並びに酢酸及びフェノール化合物などの発酵抑制剤の除去が含まれる。調整ステップの選択は、標的の生成物及び利用される微生物に特定的であるべきである。
【０２２０】
いくつかの実施形態において、ヘミセルロース糖は発酵されず、むしろ、回収及び精製されるか、貯蔵されるか、販売されるか、又は専門製品へと変換される。例えば、キシロースは、キシリトールに変換されることが可能である。
【０２２１】
リグニン生成物は、いくつかの方法の１つ又はそれ以上を使用して、容易に液体相から得ることができる。１つの単純な技術は、全ての液体を蒸発させて、固体リグニン豊富残渣を得ることである。このような技術は、リグニン用の溶媒が水非混和性である場合、特に有利であろう。別の方法は、リグニンを溶液から沈殿させることである。リグニンを沈殿させるいくつかの方法としては、（１）リグニンが可溶性でなくなるまで液体相から溶媒を選択的に蒸発させることなどによって、リグニン用溶媒を液体相から除去するが、水は除去しないこと；（２）リグニンが可溶性でなくなるまで、水で液体相を希釈すること；並びに（３）液体相の温度及び／又はｐＨを調整することが含まれる。次いで、遠心分離などの方法を利用して、リグニンを捕捉することができる。リグニンを除去するためのなお別の技術は、液体相からリグニンを選択的に除去するための液体−液体抽出と、それに続く、比較的純粋なリグニンを回収するための抽出溶剤の除去である。
【０２２２】
リグニンは、燃料として使用することができる。固体燃料として、リグニンは、エネルギー含量が石炭と類似している。リグニンは、再生可能燃料としての標準を満たしながら、オクタンを強化するために、液体燃料中の酸化成分として作用することができる。本明細書中で製造されたリグニンは、ポリマー材料として、そしてリグニン誘導体を製造するための化学前駆体としても使用することができる。スルホン化リグニンは、リグノスルホネート製品として販売されるか、又は燃料価のため燃焼されてもよい。
【実施例】
【０２２３】
実施例
ナノセルロースの結晶質、フィブリル状及びブレンド配合物のバイオ印刷適性を、解像度（格子線アッセイ）、並びに印刷後の形状忠実度及びレオロジー（弾性、粘度及び剪断減粘性特徴）を評価することによって、そしてこれらを純粋なアルギネートのバイオインクと比較することによって決定した。細胞毒性、代謝活性及びバイオストラクチャートポグラフィーを決定するために、ヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞を用いて、最適化されたナノセルロース−アルギネートバイオインクをバイオ印刷した。
【０２２４】
これらの実施例で示されるように、開示されたナノセルロース−アルギネートバイオインク組成物は、印刷後の形状忠実度に寄与する可逆性の応力緩和挙動による高度の剪断減粘性を示した。ナノセルロースの結晶及びフィブリルのブレンドを含有するバイオインクは、細胞生存及び分化のためのナノスケールの荒さ並びにミクロスケールの荒さを示し、そして培養液中で最も安定な構造体積を維持した。ヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞は、印刷後に高い代謝活性を示し、そして長期培養後に丸型軟骨形成表現型を取り入れた。
【０２２５】
これらの実施例は、Kyle et al., “Characterization of pulp derived nanocellulose hydrogels using AVAP（登録商標）technology”, Carbohydrate Polymers 198 (2018) 270-280及びJessop et al., “Printability of pulp derived crystal, fibril and blend nanocellulose-alginate bioinks for extrusion 3D bioprinting”, 2019 Biofabrication in press（https://doi.org/10.1088/1758-5090/ab0631で入手可能である）を参照することによって本発明に組み込まれる。
【０２２６】
押出成形３Ｄバイオ印刷セットアップ
注文製ＲｅｐＲａｐファームウェアを特徴とするモーター駆動ＸＹＺシステム上に可変速度調節注射器ドライバが載置された注文製押出成形バイオプリンターを使用して、ナノセルロース／アルギネートヒドロゲルバイオインクから３Ｄ構造を印刷した。バイオインクを５ｍＬの注射器（Sterile BD Plastipakスリップチップ）に装填し、そして６１０μｍ精密度ノズル（Adhesive Dispensing Ltd）を通して押出した。Ｓｌｉｃ３ｒ（オープンソース・ソフトウェア）によって、プリントヘッドの移動速度、押出成形スピード、層高さ、インフィルパターン及び密度を含めて、個々のバイオインクに適切となるように印刷設定の調整が可能であった。３Ｄモデルをスライスし、バイオプリンターを実施するためのＧコードとして輸出された。プリンター及びソフトウェアの初期校正によって、連続的で均一な印刷を可能にするために、１．７ｍｍの最小製造前層をもたらした。殺菌印刷は、６０分間の７０％エタノール及びＵＶ処理を使用して、全ての外部バイオプリンター構成要素のクリーニング後、クラスＩＩ層流フード中で達成された。
【０２２７】
バイオインク調製及び最適化
ナノセルロース粒子は、分別の時間及び温度によって制御されたモルフォロジーを伴って、エタノール、二酸化硫黄及び水を使用して、バイオマスをセルロース、ヘミセルロース及びリグニンへと分別する、特許取得済みのＡＶＡＰ（登録商標）技術を使用して、未加工の木材チップバイオマスからの水性スラリーとして製造された。最終ナノセルロース配合物は、親水性BioPlus（登録商標）セルロースナノ結晶ゲル（ＣＮＣ、水中３重量％のナノセルロース）、親水性BioPlus（登録商標）セルロースナノフィブリルゲル（ＣＮＦ、水中６重量％のナノセルロース）及び親水性BioPlus（登録商標）ブレンドゲル（ＮＣＢ、水中３重量％のナノセルロース）である。
【０２２８】
いずれの残留化学物質及びリグニン断片破片も除去するために、ＣＮＣ、ＮＣＢ及びＣＮＦを５分間、１５００ｇで遠心分離し、次いで、オートクレーブ（１００ｋＰａ、１２１℃、３０分）で蒸気殺菌した。アルギン酸ナトリウム塩（中間粘度、褐藻類由来、Sigma-Aldrich, Poole, UK）を１時間ＵＶ殺菌し、その後、殺菌培養媒体中に溶解し、０．６２５、１．２５、２．５、５、７．５及び１０％のアルギネート濃度（ｗ／ｖ）を作成した。過剰量の水を除去し、そして全く同一体積のアルギネート含有ヒドロゲルで置き換えた。１部のアルギネートを４部のナノセルロースと組み合わせ、バイオ印刷後に塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）によって架橋性であるＣＮＣ−ＡＧ、ＮＣＢ−ＡＧ及びＣＮＦ−ＡＧバイオインクを作成した。実験的なナノセルロース−アルギネートバイオインクの濃度は、０．１６％、０．３１％、０．６３％、１．２５％、１．８８％、２．５％（ｗ／ｖ）のアルギネート、並びにセルロースナノ結晶及びセルロースナノ結晶／ナノフィブリルブレンドに関しては３％（ｗ／ｖ）、セルロースナノフィブリルに関しては６％（ｗ／ｖ）であった。
【０２２９】
最適バイオインク調製を定義するために設定された４つの基準；溶解の容易さ、室温での流動の容易さ、ナノセルロースとの混合の容易さ、ナノセルロースを用いて印刷される場合の構造維持に対して、０.６２５％〜１０％（ｗ／ｖ）のアルギネート溶液を定性分析した。図１に定性分析の結果を示す。
【０２３０】
バイオインク架橋最適化
圧入力の適用時の印刷完成から構造変化の停止までの架橋時間について、異なる濃度（０．１Ｍ、０．５Ｍ及び１Ｍ）のエアゾール化されたＣａＣｌ２溶液（蒸留水に溶解した無水ＣａＣｌ２粉末、Sigma-Aldrich, Poole, UK）を試験した。全ての溶液を殺菌し、そして０．２２μｍのセルフィルター（Merck Millipore, Watford, UK）によって濾過し、そして使用前に３７℃でインキュベーター中に貯蔵した。上記の通り、重量比１：４でナノセルロースと混合された２．５％及び５％（ｗ／ｖ）のアルギネート濃度を使用して、直径２７ｍｍ及び高さ７つの単層（１１．９ｍｍ）の大きさの円筒状構造を印刷した。架橋は、バイオ印刷されたバイオインクのそれぞれの層を、エアゾール化されたＣａＣｌ２に暴露することによって実行された。図２は、架橋時間（分）の定量分析及び架橋強度の定性分析を示す。
【０２３１】
印刷適性試験：解像度
３つの異なるナノセルロースの配合物（ＣＮＣ−ＡＧ、ＣＮＦ−ＡＧ及びＮＣＢ−ＡＧ）を使用する印刷解像度は、２７％直線インフィルによって４０×４０ｍｍの正方形格子に単層高さ（１．７ｍｍ）を印刷することによって試験され、そして０．５ＭのＣａＣｌ２によって架橋された（図３）。これは、参照によって本明細書に組み込まれる、Markstedt et al.,“3D Bioprinting Human Chondrocytes with Nanocellulose-Alginate Bioink for Cartilage Tissue Engineering Applications”, Biomacromolecules 2015, 16, 1489-1496から改変されたものである。格子線厚さは、デジタルカリパスを使用して、インフィル綾目の中間点で測定された（図３の挿入部Ｂ）。３つの配合物ＣＮＣ−ＡＧ、ＣＮＦ−ＡＧ及びＮＣＢ−ＡＧを使用してバイオ印刷され、架橋された構造の形状忠実度は、７層高さ（１１．９ｍｍ）、直径２７ｍｍの円柱をバイオ印刷し、そして印刷直後、３７℃で培養媒体中での浸漬後２４時間及び７２時間で直径及び高さを測定することによって評価された。
【０２３２】
図３は、ナノセルロース含有バイオインクに対するバイオ印刷解像度を試験するための格子厚さアッセイの結果を示す。図３の挿入部Ａは、ＮＣＢ−ＡＧを使用して印刷された、架橋された格子を示し、スパチュラで撹拌した時の構造維持を明らかにする。図３の挿入部Ｂは、ＮＣＢ−ＡＧを使用して印刷されたフィラメントの電子カリパス測定を示す。図３の挿入部Ｃは、解像度試験のために構造の測定点を例示するための概略図である。図３の挿入部Ｄは、ＣＮＣ−ＡＧ、ＣＮＦ−ＡＧ及びＮＣＢ−ＡＧ配合物のフィラメントの厚さを示す。フィラメントの厚さのデータは平均として表されており、誤差バーは標準偏差を表す。統計差は一方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって算出された。ここでｐ＝０．４２４であり、４つの構造からデータを共有し、それぞれｎ＝１１であった。本特許出願において、ｐは、帰無仮説が真である場合、統計上の合計（２つの比較された群の間の試料の平均差）が実際の観察された結果以上であり、ｎが繰り返しの数であるという所与の統計上モデルに関する確率である。
【０２３３】
印刷適性試験：形状忠実度
複合体構造試験では、３Ｄ幾何学的図形、及びオンラインオープンソースリポジトリ、BodyParts3D（著作権）（The Database Center for Life Science, licensed under CC Attribution-Share Alike 2.1 Japan（http://lifesciencedb.jp/bp3d/）から得られた耳介軟骨の解剖学的ＳＴＬモデルが利用された（図４参照）。Microsoft 3D Builderソフトウェア（Microsoft Corporation, New Mexico, USA）を使用して円筒状形状を作成し、そして３Ｄバイオ印刷に関するＳＴＬファイル形式で書き出しした。Ｖ＝πＤｈを使用して、３Ｄ印刷された円筒状構造の直径（Ｄ）及び高さ（ｈ）を測定することによって体積を算出し、培養条件下で２４時間及び４８時間後の印刷後の形状忠実度を評価した。図４に、複合体構造試験のために使用される形状のグラフィック形式のＧコードを示す。図４において、挿入部Ａは中空円柱であり、挿入部Ｂは円柱であり、挿入部Ｃは鼻軟骨であり、挿入部Ｄは立方体であり、挿入部Ｅは右耳であり、そして挿入部Ｆは四面ピラミッドである。
【０２３４】
印刷適性試験：レオロジー
バイオインク混合物（それぞれ０．２５％、０．５％及び１％（ｗ／ｗ）の全アルギネート濃度を有するＣＮＣ−ＡＧ、ＮＣＢ−ＡＧ及びＣＮＦ−ＡＧバイオインクを製造するためのアルギネート１．２５％／２．５％／５％（ｗ／ｖ）並びにアルギネート１．２５％、２．５％及び５％（ｗ／ｖ）とのナノセルロース混合物）の流動学的特性は、直径４０ｍｍの平行板幾何構造を備えたAR-G2（TA instruments, UK）制御応力レオメーターを使用して測定された。試料装填前に約１５分間、回転ロッカー上で溶液を混合した。それぞれの実験の前に、レオメーター上でゼロギャップを設定し、そして回転マッピングを使用して幾何構造を測定した。
【０２３５】
スパチュラを使用して、約０．６５ｍＬの試料をレオメーターの下板の中心に慎重に装填し、そしてギャップが完全に充填されるまで、上板を試料上へと次第に低下させた（ギャップは３５０〜５００μｍの範囲であった）。幾何構造の縁部周囲のいずれの過剰量の試料もスパチュラを用いて削除した。下板で測定される法線力は最大０．１Ｎに設定され、ギャップ設定手順の間の試料へのいずれの機械的損傷も最小にされることが保証された。レオメーターの下板は２２℃の温度で制御され、そして試料蒸発を低減するために、低粘度ケイ素オイル（Fisher Scientific: Brookfield, 粘度標準０．９２０比重シリコーンオイル５ｍＰａ■ｓ）を使用して、試料の外縁を包囲した。
【０２３６】
２分の試料均衡期間後に、０．５Ｐａの定応力で周波数掃引（０．１〜１０Ｈｚ）を実行した。応力掃引（示されていないデータ）によって確認されるように、それぞれの測定は試料の線形粘弾性範囲内であった。貯蔵弾性率（Ｇ’）及び損失弾性率（Ｇ’’）の値は、利用された周波数範囲全体上で記録された。周波数掃引の完了後、１０秒間、試料を平衡化させ、その後、２分間、０．１〜１００ｓ−１の対数関数的に増加する剪断速度において剪断フローランプを実行した。周波数掃引及び剪断フローランプ実験の両方をそれぞれの試料に関して少なくとも３回繰り返した。
【０２３７】
ヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞による３Ｄバイオ印刷：細胞培養、封入及びバイオ印刷
軟骨細胞は、定常的な鼻中隔造鼻術の間のインフォームド・コンセント（IRAS ID 99202）の後に得られるヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨試料から単離された。軟骨組織は１ｍｍ３小片へと粉砕され、そして穏やかに撹拌しながら、３７℃（５％ＣＯ２）において１時間、培養培地において０．４％プロナーゼ（Roche, West Sussex, UK）によって消化され、続いて、１８時間、０．２％コラゲナーゼＩ型で消化された。溶液を４０μｍセルストレーナー（VWR, Leicestershire, UK）を通して濾過し、次いで、５分間、５００ｇで遠心分離し、酵素混合物を培養培地と置き換えた。細胞は３７℃において５％ＣＯ２中で増殖し、そして培養培地を２〜３日ごとに交換した。培養培地は、１０％牛血清（Sigma-Aldrich, Poole, UK）が補充されたブドウ糖を含まないDulbecco’s Modified Eagle Medium（Sigma-Aldrich, Poole, UK）、１００μｇ／ｍＬのペニシリン及び１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシン（Sigma-Aldrich, Poole, UK）、１ｍＭブドウ糖（Sigma-Aldrich, Poole, UK）並びに０．１％の非必須アミノ酸（Thermo Fisher Scientific, Paisley, UK）からなった。それらが８０〜９０％の培養密度に達した時、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Thermo Fisher Scientific, Paisley, UK）を使用して細胞が継代された。全体及び生存細胞の数は、Invitrogen（商標）Countess（商標）II自動細胞カウンター（Thermo Fisher Scientific, Paisley, UK）を使用して、０.４％トリパンブルー染色によって評価された。
【０２３８】
バイオインク１ｍＬあたり２×１０６の細胞を使用して、押出成形３Ｄバイオ印刷用の軟骨細胞の適切な数が得られたため、次の実験のために継代５〜７を選択した。細胞を多く含むバイオインクのバイオ印刷の直前に、細胞懸濁液を注射器中に引き上げ、そして細胞を多く含むバイオインク中での均一分布を確実にするために１分間、殺菌条件下で相互タップを使用して、ナノセルロース／アルギネート細胞フリーバイオインクの注射器と穏やかに混合した。細胞を多く含むバイオインクは、それぞれの層の間で約１０秒間の架橋時間を用いて、エアゾール化されたＣａＣｌ２を含有する雰囲気中で印刷された。印刷直後（全ての層が完了した後）、インキュベーターで培養する前に、過剰量のＣａＣｌ２を除去するために、培養媒体中で細胞バイオインク構造を洗浄した。
【０２３９】
ヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞による３Ｄバイオ印刷：生体適合性
細胞生存能力の評価のために、製造業者の指示に従って、バイオ印刷の２４及び４８時間後、LIVE/DEAD（登録商標）細胞生存能力キット（Thermo Fisher Scientific, Paisley, UK）を使用した。試料を２μＭカルセインＡＭ（緑色蛍光色素）及び１μＭエチジウムホモ二量体−１（赤色蛍光色素）によって染色した。標識化は、共焦点顕微鏡法（Zeiss LSM 710転置共焦点顕微鏡）を使用して試験された。ここで緑色標識は生細胞を表し、そして赤色標識は死滅細胞を表す。それぞれの条件に関して、３つのバイオ印刷された構造の少なくとも６つの異なる領域から画像を撮影した。生細胞及び死滅細胞の数は、NIH ImageJソフトウェアを使用して数えられ、そして細胞生存能力は、全細胞に対する生細胞数のパーセンテージとして表された。
【０２４０】
細胞代謝活性は、１０％（ｖ／ｖ）のAlamarBlue（登録商標）細胞生存能力試薬（Thermo Fisher Scientific, Paisley, UK）を使用して、バイオ印刷の４時間後、１２時間後及び２４時間後に定量された。プレートリーダー（POLARstar Omega spectrophotometer, BMG LABTECH, Ortenberg, Germany）を用いて、５３０〜５６０ｎｍ励起波長及び５９０ｎｍ放出波長において蛍光発光を測定した。培地中の細胞の一致した濃度が対照として使用された。培養中のナノセルロースに対するAlamarBlueの交叉感受性も試験された。光学密度（ＯＤ）値は、ｔ＝０における値に対して正規化された。細胞生存能力は、細胞濃度に対して蛍光発光放出強度をプロットすることによって決定された。
【０２４１】
ヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞による３Ｄバイオ印刷：細胞毒性
ＮＣＢバイオインクの細胞毒性は、乳糖脱水素酵素（ＬＤＨ）細胞毒性の分析を使用して評価した。ＮＣＢ−ＡＧと一緒の細胞（ｎ＝６）、並びに細胞のみ（ｎ＝６）、媒体のみ（ｎ＝３）及びＮＣ対照（ｎ＝３）を含有するプレートを一晩、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。次いで、それぞれの試料媒体５０μＬを９６ウェルプレートに移し、そして室温で３０分間、５０μＬの反応混合物と混合し、光から保護して、この時点で停止溶液を添加した。（４９０ｎｍ及び６８０ｎｍにおける）吸光度測定を使用してＬＤＨ活性を決定した。
【０２４２】
ヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞による３Ｄバイオ印刷：ＳＥＭ分析
培養液中で３週間成長させたバイオ印刷及び架橋された細胞構造を１０〜２０分間隔で５０ｍＭカコジル酸ナトリウム−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．２〜７．４、SPI Supplies）で３回洗浄し、過剰量の塩を除去した。試料を２％グルタルアルデヒド（Sigma Aldrich, UK）中に一晩定着させ、そして一連の等級付けられた濃度（３０％〜１００％）のエタノールを用いて脱水した。次いで、脱水した試料を換気フード中で１０分間、１００％エタノール中５０％ヘキサメチルジシラザン溶液（ＨＭＤＳ）ですすぎ、次いで、１００％ＨＭＤＳで３回すすぎ、一晩静置して乾燥させた。スパッターコーティングを使用して試料に薄層金（層厚約１５ｎｍ）をコーティングし、そして走査型電子顕微鏡法（Hitachi 4800s）を使用して画像化した。
【０２４３】
ヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞による３Ｄバイオ印刷：圧縮試験
０．５ＭのＣａＣｌ２によって５分間架橋され、そして膨潤均衡に達するまで室温で１時間リン酸緩衝食塩水（Thermo Fisher Scientific, Paisley, UK）中でインキュベートされたバイオ印刷されたＮＣＢ−ＡＧ円柱ディスク（直径５ｍｍ及び高さ４ｍｍ）上で、BOSE ElectroForce（登録商標）3200機械負荷機（Bose Corporation, ElectroForce（登録商標）Systems Group, Minnesota, USA）を使用して機械的試験を実行した。試料の圧縮強度を１Ｈｚで試験した。圧縮（ｍｍ）及び負荷（Ｎ）を記録し、そして応力／歪み曲線の線形領域の勾配としてヤング弾性率が決定された：ヤング弾性率（Ｎ／ｍ２又はＰａ）＝応力（Ｐａ）／歪み。
【０２４４】
定量的な結果は、平均±標準偏差（ＳＤ）として表され、そしてGraphPad Prism 6.0（GraphPad Software, La Jolla, CA, USA）を使用して統計分析を実行した。単独比較のための統計分析は、非ガウス分布に関してはMann-Whitney U-試験、そしてガウス分布に関してはｔ−試験を使用して実行した。複数比較は、一方向ＡＮＯＶＡによって、続いてTukeyホストホック試験によって実行した。生物学的反復数は、それぞれの図面の説明文に示される。ｐ＜０．０５の値が統計学的に有意であると考えられた。
【０２４５】
ナノセルロースバイオインク配合物及び架橋最適化
０．６２５％（ｗ／ｖ）アルギネート溶液は、溶解及び混合に関して優れた特性を示したが、印刷後、室温で急速に崩壊した。７．５％及び１０％（ｗ／ｖ）アルギネート溶液は溶解が困難であり、且つ粘着性であるため、ナノセルロースと均等に混合することができなかった。１．２５％、２．５％及び５％（ｗ／ｖ）の濃度は、適切な粘度及び混合可能性を有することが分かり、流動学的試験を行った。２．５％（ｗ／ｖ）のアルギネート濃度は、溶解及び混合の容易さと、印刷後の未架橋構造安定とのバランスを保つその能力のため、さらなる実験用に選択された（図１）。
【０２４６】
異なるＣａＣｌ２濃度を有する架橋最適化を図５に要約する。１ＭのＣａＣｌ２は最も短時間（０．５Ｍに関する２分及び０．１Ｍに関する４分と比較して、即座に）架橋し、０．５Ｍ及び０．１Ｍと比較して、より大きい機械力に抵抗することが可能である最終構造が得られた。しかしながら、１ＭのＣａＣｌ２の即座の架橋時間が、層堆積の間にフィラメントの架橋をもたらし、最終印刷構造のドラッギングを引き起こし、そして最終的に損なうことになることがわかった。図３（挿入部Ａ）は、スパチュラを使用する撹拌に抵抗する０．５ＭのＣａＣｌ２の好ましい濃度を使用する架橋された格子構造を示す。
【０２４７】
架橋、繊維絡み合い及び多孔度を評価するために、透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を利用した。それぞれの試料（２ｍｇ）を５ｍＬの脱イオン水中で分散し、そして３０分間、超音波処理した。超音波処理の直後に５０μＬの試料を採取し、凝集を防ぐために１ｍＬの脱イオン水中で分散した。レース状炭素膜でコーティングされた３００メッシュの銅格子にこの溶液（１０μＬ）を添加した。１．５％の酢酸ウラニル溶液で染色する前に格子を空気乾燥させた。染色のために、１滴の酢酸ウラニル溶液をParafilm（登録商標）ストリップ（Bemis Company, Inc., Neenah, WI, USA）上に配置し、そして格子を数秒間、液滴上に裏返した。次いで、試料を空気乾燥させた。２００ｋＶで運転されるJeol 2100 JEM上で分析を実行した。
【０２４８】
図６は、架橋の前及び後のナノセルロース−アルギネートバイオインクのＴＥＭイメージを示す。特に、パネルＡ及びＢは、それぞれ、架橋の前及び後のＣＮＣ−ＡＧバイオインクを示し；パネルＣ及びＤは、それぞれ、架橋の前及び後のＣＮＦ−ＡＧバイオインクを示し；そしてパネルＥ及びＦは、それぞれ、架橋の前及び後のＮＣＢ−ＡＧを示す。全ての実施例（すなわち、図６のパネルＢ、Ｄ及びＦ）において、架橋は、エアゾール化された０．５ＭのＣａＣｌ２を使用して達成される。
【０２４９】
凝集のため、架橋の前のＴＥＭイメージングで見られるように、全３つの配合物は、様々な程度のナノ繊維絡み合い及び大規模な多孔性ネットワークを示した（図６、パネルＡ、Ｃ及びＥ）。ＮＣＢ−ＡＧは、ナノ結晶が点在するナノフィブリルのフィブリル状絡み合いを示す（図６、パネルＥ）。推測によって制限されないが、ＣａＣｌ２による架橋において、アルギネートはナノフィブリル及びナノ結晶と一緒に作用して、材料中の空隙を減少させ、それによって、操作可能であり、且つ細胞培養条件に耐えることができる強固な構造が製造されると考えられる（図６、パネルＢ、Ｄ及びＦ）。
【０２５０】
ナノセルロース含有バイオインクを使用するマクロ構造の３Ｄバイオ印刷
図７及び８に、バイオ印刷された構造の膨潤特性を示す。図７は、０．１Ｍ又は０．５ＭのＣａｌＣｌ２によって架橋された３つの異なるバイオインク配合物（ＣＮＣ−ＡＧ、ＮＣＢ−ＡＧ及びＣＮＦ−ＡＧ）を使用してバイオ印刷された円筒状構造の体積の比較を提供する。図８は、２４及び７２時間における時間０と比較した構成物体積の変化を示す。データは平均±ＳＤとして表される（全てのグループに関してｎ＝３）。統計差は、Ｔｕｋｅｙの複数比較ポストホック試験による一方向ＡＮＯＶＡによって算出される。図８において、＊はｐ＜０．０５を意味し、＊＊はｐ＜０．０１を意味し、そして＊＊＊＊はｐ＜０．００１を意味する。
【０２５１】
ＮＣＢ−ＡＧは、ＣＮＣ−ＡＧ及びＣＮＦ−ＡＧに関して、それぞれ１．０７ｍｍ及び１．０４ｍｍと比較して、１．０１ｍｍの中間フィラメント厚さによって実証される、良好な解像度を有する（図３、挿入部Ｄ）が、これは統計学的に有意であるとは思われなかった（ｐ＝０．４２、一方向ＡＮＯＶＡ）。架橋されたＣＮＣ−ＡＧ及びＮＣＢ−ＡＧ円柱形構造は、特に低い架橋剤濃度で、（３７℃の媒体中での）培養条件下で２４時間、膨潤したが、これらの変化は統計学的に有意ではなかった（図７及び図８）。７２時間後、０．１Ｍ対０．５ＭのＣａｌＣｌ２濃度によって架橋されたＣＮＣ−ＡＧ（６９７．６ｍｍ３、ｐ＝０．００３）及びＮＣＢ−ＡＧ（５２３．９ｍｍ３、ｐ＝０．０２１）構造に関する堆積の有意な増加があったが、ＣＮＦ−ＡＧを使用して印刷された構造では体積が減少し、０．５ＭのＣａＣｌ２によって架橋された構造（４８８．３ｍｍ３）は、０．１ＭのＣａＣｌ２によって架橋された構造（１８６．８ｍｍ３）よりも、それらの原寸から大幅に体積が減少した（図８）。０．５ＭのＣａｌＣｌ２によって架橋されたＮＣＢ−ＡＧ構造は培養条件下で最も安定しており、それらの原寸から６２．３ｍｍ３の減少であった。
【０２５２】
０．５ＭのＣａＣｌ２によって架橋されたＮＣＢ−ＡＧが培養条件下で最も安定な構造体積を実証したため、中空円柱及び解剖学的耳介軟骨を含む複合体形状試験（図９）並びに生体適合性実験（図１６〜１９）に関して、この配合物が選択された。
【０２５３】
図９は、複合体形状試験のためのＮＣＢ−ＡＧバイオインクを使用して印刷された幾何学的構造を示す。図９のパネルＡにおいて、幾何学的構造は、中空円柱（上左）、円柱（上右）、ピラミッド（下左）及び立方体（下右）である。図９のパネルＢにおいて、幾何学的構造は右耳である。
【０２５４】
BioPlus（登録商標）ナノセルロースの流動学的特性はバイオ印刷を可能にする
図１０は、アルギネートを含有するが、ナノセルロースを含有しないバイオインクの流動学的特性を示す（便宜上、「純粋なアルギネート」と記載する、残りは主に水である）。図１０中、Ｇ’は様々なアルギネート濃度における貯蔵弾性率（ダークグレー）であり、且つＧ’’は損失弾性率（ライトグレー）である。データは平均±ＳＤとして表される（全てのグループに関してｎ＝５）。
【０２５５】
純粋なアルギネートバイオインクでは、周波数の増加とともにＧ’及びＧ’’が増加することが示された（図１０）。全てのアルギネート濃度（１．２５、２．５、５及び７％、ｗ／ｖ）に関して、平均損失弾性率（Ｇ”）は、首尾一貫して平均貯蔵弾性率（Ｇ’）より高く、このことは、純粋なアルギネートバイオインク中で弾性よりも粘着性が優性であることを実証する。
【０２５６】
剪断速度の増加の関数として粘度を測定することによって、バイオインクの流動特性を調査するために、せん断速度ランプを実行した。図１１は、剪断速度の関数としての純粋なアルギネートバイオインクの粘度を示す。データが平均±ＳＤとして表される（全てのグループに関してｎ＝５）。図１１は、研究された全剪断速度における非ナノセルロース含有バイオインクの５％及び７．５％（ｗ／ｖ）のアルギネート濃度における限定的な剪断減粘性挙動、並びに１．２５％及び２．５％（ｗ／ｖ）のアルギネート濃度における近似ニュートン挙動を明らかにする。
【０２５７】
それとは対照的に、全てのナノセルロース含有バイオインクの平均Ｇ’は、研究された全ての周波数上でＧ’’より高く、これは（アルギネートバイオインクとは異なり）弾性の優性を示し、そしてナノ構造の間の強い相互連結ネットワークを示す（図１２）。図１２は、１Ｈｚにおけるナノセルロース−アルギネートバイオインクの流動学的特性を示す。図１２中、Ｇ’は、様々なアルギネート及びナノセルロースの濃度における、ブレンド（ＮＣＢ）、結晶（ＣＮＣ）及びフィブリル（ＣＮＦ）ナノセルロース含有バイオインクに関しての貯蔵弾性率（ダークグレー）であり、且つＧ’’は損失弾性率（ライトグレー）である。データは平均±ＳＤとして表される（全てのグループに関してｎ＝３）。統計差は、Tukeyの複数比較ポストホック試験による一方向ＡＮＯＶＡによって算出される（＊はｐ＜０．０５を意味する）。
【０２５８】
剪断速度の増加の関数として粘度を測定することによって、ＣＮＦ−ＡＧ、ＣＮＣ−ＡＧ及びＮＣＢ−ＡＧバイオインクの流動特性を調査するために、せん断速度ランプを実行した（図１３〜１５）。図１３〜１５は、それぞれ１．２５％、２．５％及び５％のアルギネート（ｗ／ｖ）と組み合わせたＣＮＣ、ＮＣＢ及びＣＮＦバイオインクに関して、剪断速度の関数としての種々のナノセルロース−アルギネートバイオインクの粘度を示す。データが平均±ＳＤとして表される（全てのグループに関してｎ＝３）。統計差はｔ−試験を使用して算出され、そして＊はｐ＜０．０５を意味する。
【０２５９】
全てのナノセルロース含有バイオインクは、純粋なアルギネートバイオインクと比較して、より高度の非ニュートン性、剪断減粘性、擬似弾性的挙動を示した。ＣＮＦ−ＡＧ及びＮＣＢ−ＡＧ配合物は、全てのＣＮＣ配合物と比較して、より高く、且つ統計学的に異なる粘度を示した。この差異は、剪断速度＝０．１２ｓ−１で最も良く見られるが、より高い剪断速度においてもなお存在する（図１３〜１５、一番下のパネル）。推測によって制限されないが、この結果は、ＣＮＣ−ＡＧバイオインクと比較して、ＮＣＢ−ＡＧ及びＣＮＦ−ＡＧ内のナノ構造及びミクロ構造の間により強い粒子−粒子相互作用又は増加した絡み合いがあることを意味し、印刷後により良好な形状忠実度を提供する。
【０２６０】
BioPlus（登録商標）ナノセルロースはヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞と生体適合性である
図１６は、バイオ印刷の後の（Ａ）ナノセルロース結晶（ＣＮＣ−ＡＧ）、（Ｂ）ナノセルロースブレンド（ＮＣＢ−ＡＧ）及び（Ｃ）ナノセルロースフィブリル（ＣＮＦ−ＡＧ）バイオインク配合物に関するヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞の生存能力を示す。データは平均±ＳＤとして表される（全てのグループに関してｎ＝５）。統計差は、TukeyのＨＳＤ複数比較ポストホック試験による一方向ＡＮＯＶＡによって算出される（ｐ＝０．１５０２、ｎ＝５、生物学的反復３）。
【０２６１】
図１６によると、バイオ印刷の直後、細胞生存能力はＮＣＢ−ＡＧ（８３．９±１６．７％生細胞）に関して一番高く、それに続いて、ＣＮＣ−ＡＧ（８０．１±１７．４％生細胞）、そして最後にＣＮＦ−ＡＧ（７１．６±１７．４％生細胞）が高かったが、差異は統計学的に有意ではなかった（ｐ＝０．１５）。
【０２６２】
図１７は、２Ｄのみの細胞培養における細胞に対して、３Ｄ細胞培養における、結晶／フィブリルブレンドナノセルロースバイオインク中のヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞生存能力を示す。白色バーは、３Ｄ培養における２４及び４８時間後のＮＣＢ−ＡＧによるバイオ印刷後の生存能力を示すが、２４及び４８時間後の黒色バーは、２Ｄ培養における２４及び４８時間後のＮＣＢ−ＡＧによるバイオ印刷後の生存能力を示す。データは平均±ＳＤとして表される（全てのグループに関してｎ＝４）。統計差は、Mann-Whitney試験によって算出される。図１７において、＊はｐ＜０．０５を意味し、そして＊＊＊はｐ＜０．００１を意味する。
【０２６３】
ＮＣＢ−ＡＧを使用してバイオ印刷され、そして０．５ＭのＣａＣｌ２によって架橋された構造は、最大体積安定性及び好ましい細胞生存能力を示した。したがって、この配合物をさらなる生体適合性実験のために使用した。培養２４時間後のＮＣＢ−ＡＧ（９０．１±１３．８％）中の細胞生存能力は、組織培養プラスチック単独上の細胞に相当した（８５．３±３．４％）。しかしながら、驚くべきことに、４８時間まで、細胞生存能力は、プラスチック単独上で培養された細胞（９４．０％±６．４％、ｐ＝０．０３２６）と比較して、ＮＣＢ−ＡＧ中で培養された細胞（９７．３±４．５％）において有意により高かった（図１７）。
【０２６４】
図１８は、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）細胞毒性の分析の結果を要約する。２Ｄ培養におけるヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞の細胞毒性は、ＮＣＢ−ＡＧバイオインクによってバイオ印刷後のヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞の細胞毒性と比較される。データは平均±ＳＤとして表される。細胞及びＮＣＢ−ＡＧバイオインクを有する媒体間の統計差は、不対ｔ−試験（ｐ＝０．３２２、ｎ＝３〜６）によって算出された。細胞毒性の指標である中間ＬＤＨ活性は、ＮＣＢ−ＡＧにおいて３Ｄでバイオ印刷及び培養された細胞（ＬＤＨ活性＝０．０４９）に対して、プラスチック上に培養された細胞（ＬＤＨ活性＝０．０５）の間で有意な差異は見られなかった（ｐ＝０．１１３８）。
【０２６５】
図１９は、４、１２及び２４時間におけるＮＣＢ−ＡＧバイオインク中のヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞の代謝活性を示す。代謝活性は、細胞数の増加とともに、ウェル中での（媒体又は媒体及びナノセルロース値が差し引かれた）AlamarBlueの還元によって引き起こされる蛍光シグナルによって示される。データは平均±ＳＤとして表される（全てのグループに関してｎ＝５）。統計差は、Tukey HSD複数比較ポストホック試験による一方向ＡＮＯＶＡによって算出される。図１９において、＊はｐ＜０．０５を意味し、＊＊はｐ＜０．０１を意味し、＊＊＊はｐ＜０．００１を意味し、そして＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を意味する。
【０２６６】
ヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞は、試験された全ての細胞密度及び条件において培養４時間と１２時間との間で代謝活性が有意に増加した（ｐ＜０．０００１）が、１２と２４時間との間では増加しなかった（図１９）。軟骨細胞は、２×１０５細胞（それぞれ、２９３．０±１１８．１に対して１２２．２±２３．９；ｐ＝０．０００５）及び５×１０５細胞（それぞれ、４０３．０±１２０．５に対して２５７．８±２１．０；ｐ＝０．００６８）に関する蛍光強度によって測定されたように、４時間後のプラスチック上２Ｄ（細胞のみ）における培養と比較して、ＮＣＢ−ＡＧバイオインクにおける有意に増加した代謝活性を示した（図１９）。１２時間及び２４時間において、条件間の差異はもはや重要ではない。
【０２６７】
図２０は、バイオ印刷後のアルギネートバイオインク及びナノセルロース含有バイオインク構造の走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）イメージを示す。パネルＡ及びＣは、細胞を含まないアルギネートバイオインクを示す。パネルＢ及びＤは、ヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞を用いて培養液中２１日後のアルギネートバイオインクを示す。パネルＥ及びＧは、細胞を含まないＮＣＢ−ＡＧバイオインクを示す。パネルＦ及びＨは、ヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞を用いて培養液中２１日後のＮＣＢ−ＡＧバイオインクを示す。パネルＡ、Ｂ、Ｅ及びＨにおけるＳＥＭイメージの縮尺表示は５０μｍであり、そしてパネルＣ、Ｄ、Ｇ及びＨにおけるＳＥＭイメージの縮尺表示は１０μｍである。
【０２６８】
ＳＥＭイメージは、ナノセルロースブレンドバイオインクから誘導されたバイオストラクチャーの高度に多孔性の構造（パネルＥ及びＧ）と比較して、２.５％（ｗ／ｖ）アルギネートバイオインクの比較的均質な性質（パネルＡ及びＣ）を示す。ナノセルロース含有バイオストラクチャーの様々なナノ構造及びマクロ構造は、細胞接着のためのより大きい表面積を提供する。ヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞は、培養液中３週間後に純粋なアルギネート（パネルＢ及びＤ）並びにナノセルロースブレンド（パネルＦ及びＨ）の両方において丸型細胞モルフォロジーを維持する。
【０２６９】
図２１は、バイオ印刷された構造に関する応力-歪み曲線である。０．５ＭのＣａＣｌ２によって架橋された、バイオ印刷されたＮＣＢ−ＡＧ構造の一軸圧縮試験によって、５２.６ｋＰａの圧縮/ヤング弾性率が示された。
【０２７０】
BioPlus（登録商標）ナノセルロースベースのバイオインクに関する軟骨形成結果
図２２は、アルギネート対ナノセルロース含有バイオインク中で培養された鼻中隔（nasoseptal）集団の相対的な遺伝子発現の定量的な逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析を示す。ＣＤＣ、軟骨由来細胞；ＤＮＣ、分化軟骨細胞；並びにＣＳＰＣ、軟骨由来幹細胞／前駆細胞は、純粋なアルギネート及びナノセルロース−アルギネートバイオインクを使用して（ナノセルロース結晶／フィブリルブレンドを使用して）バイオ印刷された。ペレットを１４及び２１日間培養し、そしてＮＣＡＭ１、中性細胞接着分子１（パネルＡ）；ＳＯＸ９、ＳＲＹ−Ｂｏｘ９（パネルＢ）、ＡＣＡＮ、アグリカン（パネルＣ）；及びＣＯＬ２Ａ１、コラーゲンＩＩ型（パネルＤ）の発現に関して分析した。それぞれのパネル中、そして４つのバーのそれぞれのグループに関して、左から右に向かって、バーは、１４日におけるアルギネート（ミディアムライトグレー）、１４日におけるナノセルロース含有バイオインク（ライトグレー）、２１日におけるアルギネート（ミディアムダークグレー）及び２１日におけるナノセルロース含有バイオインク（ダークグレー）に対するものである。
【０２７１】
示されたデータは、リボソームタンパク質Ｌ３（ＲＰＬ３）の相乗平均にとって重要な遺伝子及びＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）ハウスキーピング遺伝子の濃度の比率である。それぞれの細胞タイプに関して１４日のアルギネートのグループが校正グループとして使用された（発現レベル１に標準化された）場合、データは平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表される。統計差は、Tukey HSD複数比較ポストホック試験による一方向ＡＮＯＶＡによって算出される。図２２において、＊はｐ＜０．０５を意味し、＊＊はｐ＜０．０１を意味し、＊＊＊はＰ＜０．００１を意味し、そして＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を意味する。
【０２７２】
遺伝子発現分析は、ＣＤＣ、ＤＮＣ及びＣＳＰＣ集団による純粋なアルギネート及びナノセルロースバイオインクを使用してバイオ印刷された構造上で、培養液中で１４日後及び２１日後に実行された（図２２）。データは、両バイオインク中の全３タイプの細胞に対して培養液中１４日後のＮＣＡＭ１発現ピークを示すが、それはアルギネート構造と比較して、ナノセルロースにおいて有意に増加する（図２２のパネルＡ）。初期の軟骨形成遺伝子ＳＯＸ９は、培養液中１４日後にアルギネート−ＣＤＣ構造と比較して、ナノセルロース−ＣＤＣにおいて有意により高い相対的な発現を有する（２．３±０．８９に対して１．０±０．０９；ｐ＜０．０００１）が、これは２１日までに２．３倍減少し、アルギネート−ＣＤＣ構造と類似のレベルに達する（ｐ＜０．０００１）（図２２のパネルＢ）。１４日におけるこのＳＯＸ９発現ピークは、ＤＮＣ及びＣＳＰＣ集団では生じない。他方、ＡＣＡＮは、１４及び２１日において、それぞれ、ＤＮＣ−ナノセルロース構造（３．０倍、ｐ＝０．０３５５）、ＣＤＣ−アルギネート（７．６倍、ｐ＜０．０００１）及びＣＤＣ−ナノセルロース構造（４．６倍、ｐ＜０．０００１）において、有意差によって、培養液中の時間を増加させることによって発現を増加させる一貫したパターンを示す（パネルＣ、図２２）。
【０２７３】
ナノセルロース構造は、アルギネート構造と比較して、増加した発現のパターンを有するように見えるが、これらの差異は、一致した時間点において有意であることは示されなかった。他方、ＣＯＬ２Ａ１発現は、２１日後にＣＤＣ−アルギネート構造と比較して、ＣＤＣ−ナノセルロースにおいて６．４倍高い発現を示し（ｐ＝０．００６）（図２２のパネルＤ）、これらのｍＲＮＡレベルが細胞外マトリックス分泌に変換される場合、軟骨形成の可能性を示した。ＤＮＣ−ナノセルロース構造は、ＤＮＣ−アルギネート構造（ｐ＜０．０００１）と比較して、１４日においてＣＯＬ２Ａ１発現における有意な劇的ピークを示したが、これは２１日（ｐ＝０．５４）まで維持されなかった。
【０２７４】
このような定量的逆転写ポリメラーゼ鎖反応データは、ＣＤＣ−ナノセルロース構造が軟骨形成のために最も有望な軟骨形成遺伝子発現プロフィールを有することを示す。
【０２７５】
ヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞は、純粋なアルギネート及びナノセルロースバイオインクを使用してバイオ印刷された。ナノセルロースによるバイオ印刷の直後に、試料上でＳＥＭ分析を実行し、細長い、繊維芽細胞様の外観を有する鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞が示された。図２３は、鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞との混合から２４時間以内（左パネル）及び鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞を有する培養液中で２週間後（右パネル）のナノセルロース含有バイオインクのＳＥＭイメージ（下から上へ１０μｍ、２０μｍ及び５０μｍの縮尺表示）を示す。図２３は、フィブロブラスチックから丸型モルフォロジーへの細胞の変化を実証し、これは軟骨形成表現型を示す。３週間の培養後、鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞は、ナノセルロース中で丸型軟骨形成表現型を推定する。
【０２７６】
図２４は、鼻中隔（nasoseptal）軟骨由来細胞を使用して３Ｄバイオ印刷された軟骨構造の組織学的分析を示す。ナノセルロース−アルギネートバイオインクを使用してバイオ印刷された、ＣＤＣ、軟骨由来細胞（パネルＣ、Ｈ及びＭ）；ＤＮＣ、分化軟骨細胞（パネルＤ、Ｉ及びＮ）；ＣＳＰＣ、軟骨由来幹細胞／前駆細胞（パネルＥ、Ｊ及びＯ）を、純粋なアルギネートバイオインク（パネルＢ、Ｇ及びＬ）によってバイオ印刷されたＣＤＣと比較する。培養液中２１日後にアルシアンブルー（パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ）、サフラニン−Ｏ（パネルＦ、Ｇ、Ｈ、Ｉ及びＪ）並びにトルイジンブルー（パネルＫ、Ｌ、Ｍ、Ｎ及びＯ）によって一部を染色した。一致するプロトコルを使用して、天然ヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨部分を染色した（パネルＡ、Ｆ及びＫ）。図２４の全てのパネルに関して、縮尺表示は２０μＬである。
【０２７７】
ＣＤＣ−ナノセルロース構造が最も多くの軟骨細胞外マトリックスを示したことは組織学的に確認された。ナノセルロースバイオインクに対して純粋なアルギネートによってバイオ印刷された構造におけるグリコサミノグリカンを、一致するプロトコルを使用して染色された天然ヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨部分と比較した（図２４）。目視可能な細胞外マトリックスモルフォロジーは、ＣＤＣ−アルギネート（パネルＢ、Ｇ及びＬ）並びにＤＮＣ−ナノセルロース構造（パネルＤ、Ｉ及びＮ）からの部分上で明白ではなかった。アルシアンブルー（パネルＡ〜Ｅ）及びトルイジンブルー（パネルＫ〜Ｏ）は、ヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨全体で硫酸プロテオグリカンを示し（パネルＡ）、そしてＣＤＣ−ナノセルロース構造において、特に同定できる欠陥を包囲する細胞周囲マトリックス領域において硫酸プロテオグリカンの集合を示す（パネルＣ及びＭ）。サフラニンＯ染色もまた、ＣＤＣ−ナノセルロース構造における強度の濃い赤色陽性の小節を示し、これは、新しい細胞外軟骨形成の領域におけるグリコサミノグリカン含有量の増加を示す（パネルＨ）。アルシアンブルー又はトルイジンブルー陽性（それぞれパネルＥ及びＯ）ではなく、それほど激しくないサフラニンＯ（パネルＪ）染色によって、ＣＳＰＣ−ナノセルロース構造中にグリコサミノグリカンを含有する、より小さい小節の証拠もあった。
【０２７８】
コラーゲンＩＩ型及びアグリカンがヒト鼻中隔（nasoseptal）硝子軟骨の細胞外マトリックスの主要成分であるとすれば、ナノセルロース中で培養された軟骨細胞によるこれらの遺伝子の持続する発現は、この材料が軟骨形成に関して適切な環境の示唆を提供していることを示す。転写データは、増加したグリコサミノグリカンの組織学的染色によって支持され、ナノセルロースによる欠陥形成を有する軟骨小節のモルフォロジー的組織化と同様、細胞外マトリックス分泌の証拠を提供する。これらの知見は、３週間後にＳＥＭで見られた丸型表現型にもかかわらず、アルギネート構造においては存在しなかった。このことは、３Ｄ細胞培養は丸型表現型を維持するが、これだけでは（アルギネート構造において）軟骨細胞分化及び細胞外マトリックス分泌には不十分であることを示す。
【０２７９】
これらの実施例の結果は、最適化された結晶、フィブリル及びブレンドナノセルロース−アルギネートバイオインク配合物が、ヒト鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞と類似の解像度、適切なレオロジー及び生体適合性を有し、軟骨バイオ印刷に関する利用を可能にすることを示す。
【０２８０】
ナノセルロースフィブリル及び結晶の両方によるナノセルロース−アルギネートバイオインクは、細胞機能性のためのナノスケール粗さ、並びにミクロスケール粗さを示すこと、並びに培養条件下で患者特有の軟骨構造の形状を確実に維持するために安定した構造体積を維持することの利点を提供する。
【０２８１】
ＴＥＭ及びＳＥＭデータは、アルギネートの添加にもかかわらず、全ての試験されたナノセルロース含有配合物が、典型的に（約５ｎｍの長さスケールで）ナノ多孔性のみである純粋なアルギネートバイオインクと異なり、ナノスケール及びミクロスケールの両方で高度に多孔性であり続けることを示す。ＮＣＢヒドロゲルは、フィブリル状ネットワーク及び相互に連結する小型ナノロッドの組合せを示し、そしてＣＮＣ単独からのものと比較して、細孔径においてより広い変動を有し（５５ｎｍ〜１２μｍ超、平均９３４ｎｍ）、このことは軟骨細胞移動を可能にし（およその軟骨細胞直径は１０μｍである）、そしてより多様な生物活性シグナルに対して調整可能なナノトポグラフィーを提供するであろう。
【０２８２】
架橋能力を可能にするアルギネートの添加は、ナノセルロースバイオインクの弾性又は剪断減粘性挙動に悪影響を与えず、それは２成分の間の比率よりもむしろ主にバイオインクの乾燥含有量に依存すると考えられる。貯蔵弾性率は、ナノセルロース−アルギネートバイオインクの全ての組合せに関して、研究した全ての周波数において、損失弾性率よりも大きく、これは、純粋なナノセルロース材料に類似の弾性優性を示した。これは、主に粘着性である純粋なアルギネートバイオインクとは対照的であった。大きいアスペクト比及び水素結合によって相互に連結するネットワーク構造を形成する能力は、ナノセルロースを規則的な（結晶質）領域のため剛性に、そしてナノ粒子の不規則的な（非晶質）領域のために軟性の両方にさせる。これらのナノセルロースネットワーク構造は、懸濁液に入れた時に流動方向に対して平行に解放及び整列することができ、そしてそれによって、高度の剪断減粘性が観察される。剪断減粘性のため、細胞に加えられる機械力を減少させて、低い剪断速度で、微細堆積ノズルを通してのバイオ印刷が可能となる。これは、印刷後の細胞生存能力を減少させる恐れのある、押出成形に関してより高い力（剪断応力）を必要とする、より高い剪断速度でも限定的な剪断減粘性のみを示す、より一般に使用される純粋なアルギネートバイオインクとは対照的である。ナノセルロースの可逆性応力緩和挙動は、印刷後、貯蔵弾性率（Ｇ’）が静的条件下で回復し、（１．２５％〜７．５％ｗ／ｖ範囲において）純粋なアルギネートバイオインクに関する貯蔵弾性率よりも高く、このことは、形状忠実度に寄与し、そして複雑な３Ｄバイオ印刷された構造の崩壊を防ぐことを意味する。ＮＣＢの剛性は、ＣＮＣより有意に高いが、ＣＮＦに類似であり、ＮＣＢに関して以前に報告された二重ネットワークヒドロゲル構造（参照によって本明細書に組み込まれる、Kyle et al., “Characterization of pulp derived nanocellulose hydrogels using AVAP（登録商標） technology”, Carbohydrate Polymers 198 (2018) 270-280）がアルギネートの添加によって乱れないことを示した。
【０２８３】
ナノセルロースは、概括的に、異物反応又は炎症を示さないバクテリアナノセルロース（ＢＮＣ）の生体内動物試験を使用して生体適合性であると考えられる。セルロース分解性酵素の欠如のため、セルロースが人体によって容易に分解されないことは周知であるが、セルロース鎖の自然発生的な非酵素的加水分解が、酸化を通して増加する可能性のある、ゆっくりと進行する分解を説明するために示唆された。ナノセルロースの加水分解は、有毒ではないブドウ糖をもたらす。完全に分解しないとしても、セルロースは生物学的に不活性であり、そして理論的にマトリックス再造形などの恒常性プロセスを妨げるべきではない。ナノセルロースのほとんどのナノ毒物学に関する報告はＢＮＣを使用し、そして遺伝、細胞及び生体内動物レベルでの損傷の証拠を示さないが、ヒトの細胞が使用された例がほとんどなく、これまで直接的にパルプベースの結晶、フィブリル及びブレンド配合物を比較したものはない。
【０２８４】
我々は、BioPlus（登録商標）のパルプベースのナノセルロースが、ＣＮＣ、ＮＣＢ及びＣＮＦによる印刷後の細胞生存能力において有意差を示すことなく、鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞に対して細胞毒素ではないことを見出した。ＮＣＢは単に２日後に培養液中で生存可能な鼻中隔（nasoseptal）軟骨細胞の割合を有意に増加させただけではなく、培養液中で３週間後に丸型軟骨形成表現型を維持しながら、印刷後の最初の４時間で、それらが新陳代謝的により活性となるように促進し、このことは、軟骨マトリックス形成のために適切な３Ｄ環境、ナノトポグラフィー及び多孔度を示す。これらの調査結果は、丸型細胞モルフォロジーの維持が明白な軟骨形成分化のための必要条件であることを示す以前の研究と一致する。ナノ細胞繊維状構造は、それによって細胞が分化するように促進する、グリコサミノグリカンと、コラーゲン、エラスチン、ラミニン及びフィブロネクチンなどの繊維状タンパク質から構成されたナノフィブリル状ネットワークでもある細胞外マトリックス成分の特性と類似することが可能である。
【０２８５】
ナノセルロースベースのバイオインクに関する軟骨形成結果は好ましかった。ナノセルロースの存在は、軟骨形成表現型を示す、フィブロブラスチックから丸型モルフォロジーまでの細胞変化を促進する。開示されたナノセルロース含有バイオインクが軟骨形成を促進することが実験的に示された。
【０２８６】
この詳細な説明において、本発明を理解し、実施することができる方法に関連する、本発明の複数の実施形態及び非限定的な実施例が参照された。本明細書に明らかにされた特徴及び利点の全てを提供するわけではない他の実施形態が、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、利用されてもよい。本発明は、本明細書に記載される方法及びシステムの定常的な実験及び最適化を含む。そのような修正及び変更は、請求項によって定義される本発明の範囲内にあると考えられる。
【０２８７】
本明細書において引用された全ての刊行物、特許及び特許出願は、それぞれの開示が、本明細書中に特に、そして個々に記載されるかのように、参照によって全体として本明細書に組み込まれる。
【０２８８】
上記の方法及びステップが、特定の順番で生じる特定の事象を示す場合、当業者は、特定のステップの順番は修正されてもよく、且つそのような修正は、本発明の変形によるものであることを認識するであろう。さらに、特定のステップは、可能である場合、平行するプロセスと同時に実行されてもよく、同様に連続的に実行されてもよい。
【０２８９】
したがって、添付の請求項において見出される本開示の精神内又は本発明の同等物である本発明の変形が存在する限りにおいて、本発明が、これらの変形も包括するであろうことが意図される。本発明は、請求項によってのみ制限されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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