(57)【要約】  フェニルケトン尿症に罹患している対象の、アミノ酸、神経伝達物質、及び神経伝達物質代謝物のレベルを正常化することにより、フェニルケトン尿症を治療する方法が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)AAV 5'逆方向末端反復(ITR)配列;
(b)プロモーター;
(c)ヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼ(hPAH)をコードする、コドン最適化配列;
(d)AAV 3'ITR
を含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターゲノム。
【請求項２】
前記コドン最適化PAH配列は配列番号7である、請求項1記載のrAAVベクター。
【請求項３】
前記プロモーターは、hAATプロモーターの部分及びHCRエンハンサー/ApoEエンハンサーの部分を含む合成プロモーター配列である、請求項1又は2記載のrAAVベクター。
【請求項４】
前記プロモーター配列は、配列番号6である、請求項1〜3のいずれか一項記載のrAAVベクター。
【請求項５】
前記AAV 5'ITR及び/又はAAV 3'ITRは、AAV2由来である、請求項1〜4のいずれか一項記載のrAAVベクター。
【請求項６】
前記ベクターゲノムは、更にポリアデニル化シグナル配列を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載のrAAVベクター。
【請求項７】
前記ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモン(bGH)ポリアデニル化シグナルである、請求項6記載のrAAVベクター。
【請求項８】
前記ベクターゲノムは、更にイントロンを含む、請求項1〜7のいずれか一項記載のrAAVベクター。
【請求項９】
前記イントロンは、複合型のグロビン/AIATイントロン配列である、請求項8記載のrAAVベクター。
【請求項１０】
前記イントロン配列は配列番号14である、請求項8又は9記載のrAAVベクター。
【請求項１１】
前記ベクターゲノムは、約2kb〜約3kb、約3kb〜約4kb、又は約4kb〜約5kbのサイズである、請求項1〜10のいずれか一項記載のrAAVベクター。
【請求項１２】
前記ベクターゲノム配列は配列番号18である、請求項1〜11のいずれか一項記載のrAAVベクター。
【請求項１３】
AAVカプシド及び請求項1〜12のいずれか一項記載のベクターゲノムを含む、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子。
【請求項１４】
前記AAVカプシドはAAV5カプシドである、請求項13記載のrAAV粒子。
【請求項１５】
前記rAAV粒子はApoE-HCR-hAAT.cG-AIATI.hPAHcol.bGHである、請求項13又は14記載のrAAV粒子。
【請求項１６】
配列番号7のヌクレオチド配列と少なくとも80%相同性を有し、かつ機能的PAHをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項１７】
低下したCpGジヌクレオチド含量を有する、コドン最適化PAH核酸。
【請求項１８】
前記CpGジヌクレオチド含量は25未満である、請求項17記載の核酸。
【請求項１９】
請求項1〜12のいずれか一項記載のベクターゲノム、又は請求項13〜15のいずれか一項記載のrAAV粒子、及び医薬として許容し得るキャリアを含む、医薬組成物。
【請求項２０】
請求項1〜12のいずれか一項記載のベクターゲノム、又は請求項13〜15のいずれか一項記載のrAAV粒子、及び医薬として許容し得るキャリアを含む、免疫原性組成物。
【請求項２１】
請求項1〜12のいずれか一項記載のベクターゲノム、又は請求項13〜15のいずれか一項記載のrAAV粒子、及び医薬として許容し得るキャリアを含む処置。
【請求項２２】
対象内でタンパク質を発現させる方法であって、対象へ請求項1〜13のいずれか一項記載のrAAV粒子を含む組成物を投与し、その結果、該対象の肝臓内で、コードされていたPAHタンパク質を発現させることを含む、前記方法。
【請求項２３】
患者のPKUを治療する方法であって、該方法は、患者へ請求項1〜12のいずれか一項記載のrAAVベクターゲノム、請求項13〜15のいずれか一項記載のrAAV粒子、請求項19記載の医薬組成物、請求項20記載の免疫原性組成物、又は請求項21記載の処置を施すことを含む、前記方法。
【請求項２４】
前記rAAV粒子は、約1×1012〜約1×1015vg/kgの水性懸濁液中で送達される、請求項22又は23記載の方法。
【請求項２５】
対象のPKUを治療するための、請求項1〜12のいずれか一項記載のrAAVベクターゲノム、請求項13〜15のいずれか一項記載のrAAV粒子、請求項19記載の医薬組成物、請求項20記載の免疫原性組成物、又は請求項21記載の処置の使用。
【請求項２６】
フェニルケトン尿症(PKU)に罹患している対象の治療方法であって:
有効量のPKU治療薬を該対象へ投与することを含み、有効量の該PKU治療薬は、該対象の生物学的試料中の1以上の神経伝達物質又は神経伝達物質代謝物のレベルを変化させるものである、前記方法。
【請求項２７】
PKU患者におけるフェニルケトン尿症(PKU)の認知神経的症状を改善する方法であって:
有効量のPKU治療薬を該対象へ投与することを含み、有効量の該PKU治療薬は、該対象の生物学的試料中の1以上の神経伝達物質又は神経伝達物質代謝物のレベルを変化させるものである、前記方法。
【請求項２８】
更に、前記有効量のPKU治療薬の投与後に前記対象から得られた、生物学的試料中の1以上の神経伝達物質のレベルを測定することを含み、有効量の該PKU治療薬は、対象の1以上の神経伝達物質のレベルを変化させるものである、請求項26又は27記載の方法。
【請求項２９】
前記1以上の神経伝達物質又は神経伝達物質代謝物は、フェネチルアミン、フェニルエタノールアミン、チラミン、ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、トリプタミン、ヒドロキシトリプタミン、フェニル酢酸、フェニルアセチルグルタミン、マンデル酸、ヒドロキシフェニル酢酸、DOPAC、ホモバニリン酸、DOMA、MOPEG、バニリルマンデル酸、インドールアクティックアシッド(indoleactic acid)、及び5-ヒドロキシインドール酢酸からなる群から選択される、請求項26〜28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
前記対象の生物学的試料は、血液、血清、血漿、脳脊髄液(CSF)、及び尿からなる群から選択される、請求項26〜29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
前記対象の生物学的試料は血液である、請求項26〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
前記対象の生物学的試料は血清である、請求項26〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
前記対象の生物学的試料は血漿である、請求項26〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
前記対象の生物学的試料はCSFである、請求項26〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
前記対象の生物学的試料は尿である、請求項26〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
前記PKU治療薬は、サプロプテリン、pegvaliase-pqpz、及びPKU遺伝子療法からなる群から選択される、請求項26〜35のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
前記PKU遺伝子療法は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)を含む導入遺伝子を発現するアデノ随伴ウイルス性(AAV)ベクターを含む、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
有効量の前記PKU遺伝子療法は、1E12vg/kg(前記対象の体重)を超える、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
前記1以上の神経伝達物質又は神経伝達物質代謝物のレベルは、前記PKU治療薬投与の少なくとも1か月後に測定される、請求項26〜38のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
前記1以上の神経伝達物質又は神経伝達物質代謝物のレベルは、前記PKU治療薬投与の少なくとも3か月後に測定される、請求項26〜39のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
前記1以上の神経伝達物質又は神経伝達物質代謝物のレベルは、前記PKU治療薬投与の少なくとも6か月後に測定される、請求項26〜40のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
前記1以上の神経伝達物質の変化したレベルは、該1以上の神経伝達物質の対照レベルの5%以内であって、該対照レベルは少なくとも10の、神経学的に定型な対象から得られた1以上の神経伝達物質のレベルの平均として得られる、請求項26〜41のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
前記1以上の神経伝達物質の変化したレベルは、該1以上の神経伝達物質の対照レベルの10%以内であって、該対照レベルは少なくとも10の、神経学的に定型な対象から得られた1以上の神経伝達物質のレベルの平均として得られる、請求項26〜42のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
前記1以上の神経伝達物質の変化したレベルは、該1以上の神経伝達物質の対照レベルの20%以内であって、該対照レベルは少なくとも10の、神経学的に定型な対象から得られた1以上の神経伝達物質のレベルの平均として得られる、請求項26〜43のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
前記対象はヒトである、請求項26〜44のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６】
前記認知神経的症状は、低下したIQ、注意欠陥、並びに、戦略的計画、抑制制御、作業記憶及び認知的柔軟性を含む実行機能の欠陥、からなる群から選択される請求項27記載の方法。
【請求項４７】
対象からの生物学的試料中の神経伝達物質又は神経伝達物質代謝物のレベルを測定する方法であって:
該対象から該生物学的試料を取得すること;
該試料を、重標識内部標準を含む冷アセトニトリルで沈殿させること;
該試料を遠心分離によりペレット化すること;
その上清を新しい容器へ移すこと;
炭酸ナトリウム及び塩化ベンゾイル、又はクロロギ酸エチル及びピリジンを該上清へ添加すること;
それが炭酸ナトリウム及び塩化ベンゾイル、又はクロロギ酸エチル及びピリジンと反応した後の該上清へギ酸を添加すること;並びに
得られた反応物の上清をLC/MSで分析し、それによって該神経伝達物質又は神経伝達物質代謝物のレベルを検出して測定すること、を含む前記方法。
【請求項４８】
前記神経伝達物質又は神経伝達物質代謝物のレベルは、請求項21記載の方法によって測定される、請求項26〜47のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(1.  分野)
本明細書で提供されるのは、有効用量のPKU治療薬を最適化するための、フェニルケトン尿症(PKU)患者のアミノ酸、神経伝達物質、及び神経伝達物質代謝物レベルの使用である。同様に提供されるのは、有効量のPKU治療薬を投与することを含む、PKU患者の治療方法であって、その有効量は、その対象のアミノ酸、神経伝達物質、及び神経伝達物質代謝物のレベルを正常化するものである。同様に、本明細書で提供されるのは、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)の最適化されたコード化配列であり、その配列は、対象の肝臓内でフェニルアラニンの代謝に関与する酵素であるPAHの長期発現を達成するための、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターのようなベクターとして使用されることができる。同様に提供されるのは、遺伝子置換アプローチにおいてそのベクターを使用する処置方法である。
【背景技術】
【０００２】
(2.  背景)
フェニルケトン尿症(PKU)は、フェニルアラニンの代謝に関与する酵素である、肝臓のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)の活性が損傷した結果である、アミノ酸代謝の先天性異常である。PKU及び高フェニルアラニン血症(HPA)を発症するPAH突然変異を有する患者は、フェニルアラニンレベルの上昇、神経生理学的な機能障害、及び低下した認知発達を示す。重度のPKU患者では、食事制限を行ってフェニルアラニンレベルを低レベルに維持しない限り、不可逆的な精神遅滞を起こす可能性がある。PKUの神経学的な症状は、PKU患者内でのPAH欠乏に起因する多数の神経伝達物質の産生異常により引き起こされ、そのPAHは、多数の神経伝達物質の合成に必要な前駆体代謝物へフェニルアラニンを変換するために必須のものである。
【０００３】
現在のPKU治療法には、アミノ酸フェニルアラニンが少ない食事を生涯続けることが含まれる。この食事療法は維持することが困難であり、かつフェニルアラニンレベルの上昇により引き起こされる可能性のある神経学的に有害な作用を常に排除するわけではない。妊娠中の理想的とは言えない食事管理は先天性欠損症をもたらす可能性がある。更に、PKU/HPA患者にとって、制限された食事療法を続けながら通常の生活を送ることは非常に困難であるし、食事療法は幾つかの栄養素の欠乏を伴う可能性があり、そのうちの幾つかは脳の発達に害を及ぼすおそれがある。ほとんどの低フェニルアラニンダイエット製品は、この療法を遵守することが難しいほど充分に、不満足な官能特性を有する。従って、治療用処置の開発は、現在の食事管理処置に取って代わるか、それを補完するものであり、特に最も重症な疾患患者のために、PKUを患う個人が受ける神経的損傷を防ぐものである。しかし、最適なPKU治療薬は、不充分なPAH活性の結果としてそのレベルが変更されていた、アミノ酸、神経伝達物質、及び神経伝達物質代謝物のレベルを正常化するものであろう。従って、有効量で送達された場合に、PKU患者の特別なアミノ酸、神経伝達物質、及び神経伝達物質代謝物のレベルを正常化できるPKU治療薬が、臨床的に求められている。
【０００４】
遺伝子療法は、ベクター単回投与の後に起こる継続的な内因性PAHの産生を通した治癒の可能性を提供する。これは、効果的な治療法の無い他の先天的な障害へも著しい影響を及ぼす主要な臨床的進歩を表すであろう。アデノ随伴ウイルス(AAV)は、ヒト及び他の幾つかの霊長目種に感染する、小型で、複製欠損した非エンベロープ型の動物ウイルスである。AAVの幾つかの特徴により、このウイルスは遺伝子療法における治療用タンパク質の送達のための魅力的なビヒクルとなっており、その特徴には、例えば、AAVがヒト疾患を引き起こすことが知られておらず、軽度の免疫応答しか誘発しないこと、並びにAAVベクターは、宿主細胞ゲノム内への組み込み無しに分裂細胞及び休止細胞の両方へ感染可能であることが含まれる。AAVを用いる遺伝子療法ベクターは、幾つかの臨床試験で、例えば、血友病B治療のために、成人肝臓へのヒト第IX因子(FIX)の送達に使用されて成功している。
【０００５】
それらの好ましい特徴にも拘らず、AAV遺伝子療法ベクターには幾つかの欠点がある。特に、AAVベクターのクローニング能力が、このウイルスのDNAパッケージング容量のために限定されている。野生型AAVの一本鎖DNAゲノムは、約4.7キロ塩基(kb)である。実際には、最大約5.0kbのAAVゲノムは、AAVウイルス粒子内に完全に(即ち、完全長で)パッケージングされていることを示している。AAVベクター内の核酸ゲノムは、約145塩基の2つのAAV逆方向末端反復(ITR)を持たなくてはならない制限のため、AAVベクターのDNAパッケージング容量は、最大約4.4kbのタンパク質コード化配列がカプシド形成できるようなものである。
【０００６】
PKUは、PAH cDNAのサイズ及びPAHタンパク質発現効率に関するPAHの明確な分子的及び生化学的特性、並びに、細胞局在化、活性の制御及び変異PAHとのヘテロ二量体化能力等の、その酵素の独特な機能特性に起因する、幾つかの新しい課題を提起する。ベクターを介したPAH発現の幾つかの試みがマウスで行われている。例えば、Hardingらの文献、Complete correction of hyperphenylalaninemia following liver-directed, recombinant AAV2/8 vector mediated gene therapy in murine phenylketonuria Gene Ther. 2006 Mar; 13(5):457-6及びViecelliらの文献、Treatment of Phenylketonuria Using Minicircle-Based Naked-DNA Gene Transfer to Murine Liver Hepatology. 2014 Sep; 60(3): 1035-1043(同様にWO2018126112を参照)を参照のこと。しかし、送達効率、免疫刺激、長期間の発現安定性及び安全性の評価は、なされていないか最適ではないかのいずれかである。従って、PKU治療のために、更に有効なAAV.hPAHベクターが求められている。
【発明の概要】
【０００７】
(3.  概略)
本明細書に記載された実施態様は、機能性ヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)を、それを必要とする対象へ送達するためのAAV遺伝子療法ベクターに関する。
【０００８】
一の態様では、PKUと診断された患者(ヒト対象)の肝細胞へヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)遺伝子を送達するための、複製欠損アデノ随伴ウイルス(AAV)の使用が提供される。hPAH遺伝子(「rAAV.hPAH」又は「AAV-PAH」)送達のために使用される組換えAAVベクター(rAAV)は、肝臓への屈性を有する必要があり(例えば、AAV5カプシドを有するrAAV)、かつhPAH導入遺伝子は、肝臓特異的な発現調節エレメントによって調節される必要がある。一の実施態様では、この発現調節エレメントは、1以上の下記:エンハンサー;プロモーター;イントロン;及びポリAシグナルを含む。これらエレメントは、更に本明細書で説明される。
【０００９】
一の実施態様では、hPAH導入遺伝子は組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターゲノム内に含まれ、そのベクターゲノムは、(a)AAV 5'逆方向末端反復(ITR)配列;(b)プロモーター;(c)ヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼ(hPAH)をコードする、コドン最適化配列;及び(d)AAV 3'ITRを含むものである。特定の実施態様では、コドン最適化PAH配列は配列番号7である。プロモーターは、hAATプロモーター、肝臓の制御領域(HCR)エンハンサー、及びApoEエンハンサーの部分を含む合成プロモーター配列でもよい。特定の実施態様では、プロモーター配列は、配列番号6である。AAV 5'ITR及び/又はAAV 3'ITRは、異種のAAV偽型由来でもよい。特定の実施態様では、ITR配列は、AAV2由来である、別の実施態様では、ベクターゲノムは、更にポリアデニル化シグナル配列を含み、それはウシ成長ホルモン(bGH)ポリアデニル化シグナルでもよい。更なる別の実施態様では、ベクターゲノムは、更にイントロンを含む。特定の実施態様では、イントロンは、複合型のグロビン/AIATイントロン配列である。特定の実施態様では、イントロン配列は配列番号14である。ベクターゲノムは、約4kb〜約5kbのサイズでもよい。特定の実施態様では、ベクターゲノム配列は配列番号18である。
【００１０】
別の態様で本明細書で提供されるのは、AAVカプシド及び、本明細書の1以上の実施態様に記載されたベクターゲノムを含む、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子である。一の実施態様では、AAVカプシドはAAV5カプシドである。別の実施態様では、rAAV粒子はApoE-HCR-hAAT.cG-AIATI.hPAHcol.bGHである。別の実施態様では、rAAV粒子は医薬組成物で提供される。
【００１１】
別の態様で本明細書で提供されるのは、配列番号7のヌクレオチド配列と少なくとも80%相同性を有し、かつ機能的PAHをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子である。一の実施態様では、機能的PAHはヒトPAHである。hPAHのコード化配列は、一の実施態様では、ヒトでの発現用にコドン最適化されている。このような配列は、天然hPAHコード化配列(配列番号1)と80%未満の相同性を共有してもよい。一の実施態様では、hPAHコード化配列は配列番号7に示されるものである。別の実施態様では、コドン最適化PAH核酸は、低下したCpGジヌクレオチド含量を含む。特定の実施態様では、CpGジヌクレオチド含量は25未満である。
【００１２】
別の態様で本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されたベクターゲノム、又は本明細書に記載されたrAAV粒子、及び医薬として許容し得るキャリアを含む、医薬組成物である。別の態様で本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されたベクターゲノム、又は本明細書に記載されたrAAV粒子、及び医薬として許容し得るキャリアを含む、免疫原性組成物である。別の態様で本明細書で提供されるのは、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されたベクターゲノム、又は本明細書に記載されたrAAV粒子、及び医薬として許容し得るキャリアを含む、ワクチンである。
【００１３】
本明細書で提供される更なる態様は、対象内でタンパク質を発現させる方法であって、該対象へ本明細書に記載されたrAAV粒子を含む組成物を投与し、その結果、該対象の肝臓内で、コードされていたPAHタンパク質を発現させることを含む、前記方法である。
【００１４】
更に別の態様では、フェニルケトン尿症患者を治療する方法が提供され、該方法は、本明細書に記載されたrAAVベクターゲノム、本明細書に記載されたrAAV粒子、本明細書に記載された医薬組成物、本明細書に記載された免疫原性組成物(composisiton)、又は本明細書に記載されたワクチンを投与することを含む。一の実施態様では、rAAV粒子は、水性懸濁液中約1×1012〜約1×1015μg/kgで送達される。本明細書で提供される別の実施態様は、対象のPKUを治療するための、本明細書に記載されたrAAVベクターゲノム、本明細書に記載されたrAAV粒子、本明細書に記載された医薬組成物、本明細書に記載された免疫原性組成物(composisiton)、又は本明細書に記載されたワクチンの使用である。
【００１５】
本明細書で提供されるのは、フェニルケトン尿症(PKU)に罹患している対象の治療方法であって:有効量のPKU治療薬を該対象へ投与するステップを含み、該有効量のPKU治療薬は、該対象の1以上のアミノ酸、神経伝達物質又は神経伝達物質代謝物のレベルを変化させるものである、前記方法である。
【００１６】
一の実施態様では、方法は、有効量のPKU治療薬の投与後に対象から得られた、生物学的試料中の1以上のアミノ酸、神経伝達物質、又は神経伝達物質代謝物のレベルを測定するステップを含み、該有効量のPKU治療薬は、該対象の1以上の神経伝達物質又は神経伝達物質代謝物のレベルを変化させるものである。別の実施態様では、方法はPKU患者におけるフェニルケトン尿症(PKU)の認知神経的症状を改善する結果を生じる。特定の実施態様では、認知神経的症状は、低下したIQ、注意欠陥、並びに、戦略的計画、抑制制御、作業記憶及び認知的柔軟性を含む実行機能の欠陥、を含むものである。別の実施態様では、1以上のアミノ酸、神経伝達物質、又は神経伝達物質代謝物は、フェニルエサリ(ethaly)アミン、フェニルエタノールアミン、チラミン、ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、トリプタミン、ヒドロキシトリプタミン、フェニル酢酸、フェニルアセチルグルタミン、マンデル酸、ヒドロキシフェニル酢酸、3,4-ジヒドロキシフェニル酢酸(DOPAC)、3,4-ジヒドロマンデル酸(DOMA)、ホモバニリン酸、バニリルマンデル酸、ジヒドロキシフェニルエチレングリコール(DOPEG)、メチルフェニルエチレングリコール(MOPEG)、インドール酢酸、及び5-ヒドロキシインドール酢酸を含む。
【００１７】
別の実施態様では、対象から得られた試料は、血液、血清、血漿、脳脊髄液(CSF)、及び尿を含む。ある実施態様では、試料はCSFである。一の実施態様では、試料は血漿である。
【００１８】
別の実施態様では、PKU治療は、KUVAN(登録商標)(サプロプテリン二塩酸塩)、PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)、及び/又はPKU遺伝子療法を含む。更なる実施態様では、PKU治療は、PKU細胞療法(例えば、Harding, C.の文献、Clin Genet., Aug; 74(2) pages 97-104 (2008)を参照のこと)、並びに/又は、PAHタンパク質安定性を保ち、ミスフォールドされたPAHを補助し、及び/若しくは酵素活性を上昇させる薬理学的シャペロンを含む(例えば、Santos-Sierraらの文献、Human Molecular Genetics, Volume 21, Issue 8, 15 April 2012, Pages 1877-1887; Angelらの文献、J Clin Invest. 2008 Aug 1; 118(8): 2858-2867を参照のこと)。
【００１９】
別の実施態様では、PKU遺伝子療法は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)又はpegvaliaseを含む導入遺伝子を発現するアデノ随伴ウイルス性(AAV)ベクターを含む。別の実施態様では、有効量のPKU遺伝子療法は、1E12vg/kg(対象の体重)を超える。別の実施態様では、有効量のPKU遺伝子療法は、1E11vg/kg(対象の体重)を超える。別の実施態様では、有効量のPKU遺伝子療法は、1E10g/kg(対象の体重)を超える。
【００２０】
別の実施態様では、PKU治療薬は、KUVAN(登録商標)ではないものから選択される。別の実施態様では、PKU治療薬は、PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz) ではないものから選択される。更なる実施態様では、PKU治療薬は、AAVベクターがAAV8でもAAVHSC15でもないものから選択される。
【００２１】
別の実施態様では、1以上のアミノ酸、神経伝達物質又は神経伝達物質代謝物のレベルは、PKU治療薬投与の少なくとも1か月後に測定される。別の実施態様では、1以上のアミノ酸、神経伝達物質又は神経伝達物質代謝物のレベルは、PKU治療薬投与の少なくとも3か月後に測定される。更に別の実施態様では、1以上のアミノ酸、神経伝達物質又は神経伝達物質代謝物のレベルは、PKU治療薬投与の少なくとも6か月後に測定される。
【００２２】
別の実施態様では、1以上のアミノ酸、神経伝達物質、又は神経伝達物質代謝物の変化したレベルは、該1以上のアミノ酸、神経伝達物質、又は神経伝達物質代謝物の対照レベルの5%以内であって、該対照レベルは神経学的に定型な対象(例えば、少なくとも5、10、15又はそれ以上の神経学的に定型な対象)から得られた1以上のアミノ酸、神経伝達物質、又は神経伝達物質代謝物のレベルの平均として得られる。更に他の実施態様では、1以上のアミノ酸、神経伝達物質、又は神経伝達物質代謝物の変化したレベルは、該1以上のアミノ酸、神経伝達物質、又は神経伝達物質代謝物の対照レベルの10%以内であって、該対照レベルは神経学的に定型な対象(例えば、少なくとも5、10、15又はそれ以上の神経学的に定型な対象)から得られた1以上のアミノ酸、神経伝達物質、又は神経伝達物質代謝物のレベルの平均として得られる。更なる実施態様では、1以上のアミノ酸、神経伝達物質、又は神経伝達物質代謝物の変化したレベルは、該1以上のアミノ酸、神経伝達物質、又は神経伝達物質代謝物の対照レベルの20%以内であって、該対照レベルは神経学的に定型な対象(例えば、少なくとも5、10、15又はそれ以上の神経学的に定型な対象)から得られた1以上のアミノ酸、神経伝達物質、又は神経伝達物質代謝物のレベルの平均として得られる。
【００２３】
別の実施態様で提供されるのは、対象からの生物学的試料中のアミノ酸、神経伝達物質又は神経伝達物質代謝物のレベルを測定する方法であって、該対象から該生物学的試料を取得するステップ;該試料を、重(heavy)標識内部標準を含む冷アセトニトリルで沈殿させるステップ;試料を遠心分離によりペレット化するステップ;その上清を新しい容器へ移すステップ;炭酸ナトリウム及び塩化ベンゾイル、又はクロロギ酸エチル及びピリジンを該上清へ添加するステップ;それが炭酸ナトリウム及び塩化ベンゾイル、又はクロロギ酸エチル及びピリジンと反応した後の該上清へギ酸を添加するステップ;並びに、得られた反応物の上清をLC/MSで分析し、それによって該神経伝達物質又は神経伝達物質代謝物のレベルを検出して測定するステップを含む。特定の実施態様では、アミノ酸、神経伝達物質、及び神経伝達物質代謝物のレベルは、該試料と、塩化ベンゾイル、又はクロロギ酸エチル及びピリジンとの反応から得られる結果を測定する方法を使用して決定される。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「AAVベクター」とは、一本鎖又は二本鎖いずれかの核酸であって、AAV 5'逆方向末端反復(ITR)配列、並びにAAV 3'ITRに隣接したタンパク質コード化配列(一の実施態様では、機能的な治療用タンパク質コード化配列、例えばPAH)であって、AAVウイルス性ゲノムとは異種の転写制御エレメント、即ち、1以上のプロモーター及び/又はエンハンサー、に機能的に連結したタンパク質コード化配列、並びに、任意で、ポリアデニル化配列、及び/又は、前記タンパク質コード化配列のエクソン間に挿入された1以上のイントロン、を有する核酸を指す。一本鎖AAVベクターは、AAVウイルス粒子のゲノム内に存在する核酸であって、本明細書に記載された核酸配列のセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかでもよい核酸を指す。このような一本鎖核酸のサイズは、塩基単位で提供される。二本鎖AAVベクターは、AAVベクター核酸を発現又は遺伝子導入するために使用される、プラスミド(例えば、pUC19)のDNA内、又は二本鎖ウイルス(例えば、バキュロウイルス)のゲノム内に存在する核酸を指す。このような二本鎖核酸のサイズは塩基対(bp)単位で提供される。
【００２５】
用語「逆方向末端反復(ITR)」とは、本明細書で使用される場合、DNA複製の開始点として、及びウイルス性ゲノムのパッケージングシグナルとしてシスに機能する、AAVゲノムの5'末端及び3'末端に存在する、当分野において認知されている領域を指す。AAV ITRは、AAV repコード領域と一緒になって、宿主細胞ゲノムからの切り出し及びレスキュー、並びに宿主細胞ゲノムへの2つ(5'又は3')の隣接するITR間に挿入されたヌクレオチド配列の組込みを効率的に提供する。ある種のAAV関連ITRの配列は、Yanらの文献、J. Virol. (2005) vol. 79, pp. 364-379により開示されており、その全体が引用により本明細書に組み込まれている。本明細書に使用が認められるITR配列は、完全長の野生型AAV ITR又は、機能性能を保持するその断片でもよく、又は複製起点としてシスに機能できる、完全長の野生型AAV ITRの配列バリアントでもよい。本明細書で提供される実施態様の組換えAAV PAHベクター内で有用なAAV ITRは、任意の公知のAAV血清型に由来してもよく、特定の実施態様では、AAV2又はAAV5血清型から由来してもよい。
【００２６】
「転写制御エレメント」は、遺伝子転写の制御に関与する遺伝子のヌクレオチド配列を指し、プロモーター、plus応答エレメント、転写因子が結合してRNAポリメラーゼの結合を助けて発現を促進するためのアクチベーター及びエンハンサー配列、並びにリプレッサータンパク質が結合することでRNAポリメラーゼの付加を阻止して発現を妨げるオペレーター又はサイレンサー配列が含まれる。用語「肝臓特異的転写制御エレメント」は、肝臓組織内で特異的に遺伝子発現を調節する制御エレメントを指す。肝臓特異的制御エレメントの例には、限定するものではないが、マウストランスサイレチンプロモーター(mTTR)、内因性ヒト第VIII因子プロモーター(F8)、ヒトα-1-アンチトリプシンプロモーター(hAAT)及びその活性断片、ヒトアルブミン最小プロモーター、並びにマウスアルブミンプロモーターが含まれる。プロモーターは、又、CBA等の遺伝子性プロモーター又はCMV等のウイルス性プロモーターを含むことができる。Enh1と共に、EBP、DBP、HNF1、HNF3、HNF4、HNF6等の、肝臓特異的転写因子結合部位に由来するエンハンサーも又、考えられる。
【００２７】
一の実施態様では、AAVベクターは、機能的に活性なフェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)タンパク質をコードする核酸を含む。PAHをコードする配列は、野生型、コドンを最適化したもの、又はバリアントでもよい(例えば、Fangらの文献、Gene Ther., vol. 1, pages 247-254 (1994); Eisensmithらの文献、J. Inherit. Metab. Dis., vol. 19, pages 412-423 (1996); Nagasakiらの文献、Pediatr. Res., vol. 45, pages 465-473 (1999); Laipisらの文献、Mol. Ther., vol. 7, pages S391-S392 (2003); Knappskog PM及びMartinez A.の文献、FEBS Lett., vol. 409, pages 7-11 (1997); Khanらの文献、J Biol Chem., vol. 12, pages 4359-4367 (2019); Wang GAらの文献、Proc Natl Acad Sci U S A., vol. 98, pages 1537-42 (2001)を参照のこと)。
【００２８】
本明細書で使用される野生型PAHは、次のアミノ酸配列を有する:
【化１】
2021522811.tif 000003
【００２９】
別の実施態様では、組換えAAVベクターは、AAV2 5'逆方向末端反復(ITR)(当分野で公知の通りに改変されても、改変されなくてもよい)、肝臓特異的転写制御領域、コドン最適化治療用タンパク質コード領域、任意で1以上のイントロン、ポリアデニル化配列、及びAAV2 3'ITR(当分野で公知の通りに改変されても、改変されなくてもよい)を含む核酸を含む。特定の実施態様では、治療用タンパク質は、ヒトPAH又はそのバリアントである。別の実施態様では、肝臓特異的転写制御領域は、短縮型ApoEエンハンサー配列; 42塩基の5'非翻訳領域(UTR)を含む、186塩基ヒトα抗トリプシン(hAAT)近位プロモーター;1以上のエンハンサーであって、(i)34塩基ヒトApoE/C1エンハンサー、(ii)32塩基ヒトAATプロモーター遠位X領域、及び(iii)追加的な80塩基ヒトAAT近位プロモーターの遠位エレメント、からなる群から選択されるエンハンサー;並びに、ヒトPAHをコードする核酸を含む。別の実施態様では、肝臓特異的転写制御領域は、α-ミクログロブリンエンハンサー配列及び186塩基ヒトα抗トリプシン(AAT)近位プロモーターを含む。
【００３０】
本明細書で提供される他の実施態様は、機能的PAHポリペプチドをコードするベクター構築物に関し、該構築物は、1以上の異なる方向性を有する、上記構築物の1以上の個々のエレメント及びそれらの組み合わせを含む。本明細書で提供される別の実施態様は、逆方向性である上記構築物に関する。別の実施態様で提供されるのは、本明細書に記載されたAAV PAHベクターを含む組換えAAVウイルス粒子、及び対象のPKUを治療するためのそれらの使用である。一の実施態様では、対象は、若年性対象である。
【００３１】
本明細書で提供される一本鎖型AAVベクターは、約7.0kb長未満、又は6.5kb長未満、又は6.4kb長未満、又は6.3kb長未満、又は6.2kb長未満、又は6.0kb長未満、又は5.8kb長未満、又は5.6kb長未満、又は5.5kb長未満、又は5.4kb長未満、又は5.3kb長未満、又は5.2kb長未満又は5.0kb長未満、又は4.8kb長未満、又は4.6kb長未満、又は4.5kb長未満、又は4.4kb長未満、又は4.3kb長未満、又は4.2kb長未満、又は4.1kb長未満、又は4.0kb長未満、又は3.9kb長未満、又は3.8kb長未満、又は3.7kb長未満、又は3.6kb長未満、又は3.5kb長未満、又は3.4kb長未満、又は3.3kb長未満、又は3.2kb長未満、又は3.1kb長未満、又は3.0kb長未満、又は2.9kb長未満、又は2.8kb長未満、又は2.7kb長未満、又は2.6kb長未満である。本明細書で提供される一本鎖型AAVベクターは、約5.0kb〜約6.5kb長の範囲、又は約4.8kb〜約5.2k長の範囲、又は4.8kb〜5.3kb長、又は約4.9kb〜約5.5kb長の範囲、又は約4.8kb〜約6.0kb長、又は約5.0kb〜6.2kb長若しくは約5.1kb〜約6.3kb長、又は約5.2kb〜約6.4kb長、又は約5.5kb〜約6.5kb長若しくは約4.0kb〜約5.0kb長の範囲、又は約3.8kb〜約4.8k長の範囲、又は3.6kb〜4.6kb長、又は約3.4kb〜約4.4kb長の範囲、又は約3.2kb〜約4.2kb長の範囲、又は約3.0kb〜4.0kb長の範囲、又は約3.0kb〜約4.0kb長の範囲、又は約2.8kb〜約3.8kb長の範囲、又は約2.6kb〜約3.6kb長の範囲、又は約5.0kb〜約4.5kb長の範囲、又は約4.5kb〜約4.0kb長の範囲、又は約3.5kb〜約4.0kb長の範囲、又は、又は約3.0kb〜約3.5kb長の範囲、又は2.5kb〜3.0kb長の範囲である。
【００３２】
別の実施態様では、本明細書で提供されるAAVベクターのいずれかを含む組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子を生成する方法を提供する。この方法は、本明細書で提供される(様々なAAV cap及びrep遺伝子を伴う)AAVベクターのいずれかをトランスフェクトした細胞を培養するステップ、及びトランスフェクトした細胞の上清から組換え治療用AAVウイルス粒子を回収するステップを含む。
【００３３】
本明細書で提供される組換えAAV生成に有用な細胞は、バキュロウイルスに感染しやすい全ての細胞型であり、例えば、High Five、Sf9、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf9、Sf900＋、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、BM-N、Ha2302、Hz2E5、及びAo38等の昆虫細胞が含まれる。別の実施態様では、例えば、HEK293、HeLa、CHO、NSO、SP2/0、PER.C6、Vero、RD、BHK、HT1080、A549、Cos-7、ARPE-19、及びMRC-5等の哺乳類細胞が使用できる。
【００３４】
同様に、本明細書で提供されるのは、本明細書で提供されるAAVベクターのいずれかを含む組換えウイルス性粒子、又は前記方法に従い生成した全てのウイルス性粒子である。
【００３５】
「AAVウイルス粒子(AAV virion)」又は「AAVウイルス性粒子(AAV viral particle)」又は「AAVベクター粒子」又は「AAVウイルス」とは、本明細書に記載されたように、少なくとも1つのAAVカプシドタンパク質及びカプシド形成されたポリヌクレオチドAAVベクターから構成されるウイルス性粒子を指す。この粒子が、異種ポリヌクレオチド(即ち、哺乳類細胞に送達するための導入遺伝子等の、野生型AAVゲノム以外のポリヌクレオチド)を含む場合、通常、「AAVベクター粒子」又は単に「AAVベクター」と称される。従って、ベクターはAAVベクター粒子内に含有されることから、AAVベクター粒子の生成には必然的にAAVベクターの生成が含まれる。
【００３６】
本明細書で使用される「治療用AAVウイルス」とは、治療用タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含む、AAVウイルス粒子、AAVウイルス性粒子、AAVベクター粒子、又はAAVウイルスを指す。
【００３７】
本明細書で使用される「治療用タンパク質」は、内因性タンパク質の活性の喪失又は低下を代替又は代償する生物学的活性を有するポリペプチドを指す。例えば、機能的なフェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)は、フェニルケトン尿症(PKU)の治療用タンパク質である。
【００３８】
別の実施態様で本明細書で提供されるのは、PKU罹患対象の治療用医薬品を調製するための有効量の組換えAAV PAHウイルスの使用である。一の実施態様では、PKU罹患対象はヒトである。一の実施態様では、医薬品は静脈内(IV)投与により投与される。別の実施態様では、医薬品の投与は、対象の神経伝達物質代謝物又は神経伝達物質レベルを変化させるのに充分な、対象の血流内でのPAHタンパク質の発現を生じる。特定の実施態様では、医薬品は又、AAV PAHウイルスの投与に関係するいずれかの肝毒性の防止及び/又は処置のための予防用及び/又は治療用コルチコステロイドを含む。予防又は治療用コルチコステロイド治療薬を含む医薬品は、コルチコステロイドを少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60mg/日又はそれ以上で、含むことができる。特定の実施態様では、予防用又は治療用コルチコステロイドを含む医薬品は、少なくとも約3、4、5、6、7、8、9、10週、又はそれ以上の継続的期間をかけて投与されてもよい。別の実施態様では、本明細書で提供されるPKU療法は、任意でチロシンサプルメントを含むことができる。
【００３９】
他の実施態様は、本明細書を読む当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
(4.  図面の説明)
【図１】図1は、クロロギ酸エチル及びピリジンとの反応後の、フェニルアラニン由来のアミノ酸、神経伝達物質、及び神経伝達物質代謝物の液体クロマトグラフィー/質量分析法(LC/MS)クロマトグラムである。
【００４１】
【図２】図2A〜Iは、野生型及びEnu2マウスの脳内で測定された様々なアミノ酸、神経伝達物質、及び神経伝達物質代謝物のレベルを比較する一連のグラフである。グラフに見られるように、フェニルアラニンは野生型マウスと比較してEnu2マウスで上昇している一方、他のすべての測定したアミノ酸、神経伝達物質、及び神経伝達物質代謝物は、野生型マウスと比較してEnu2マウスで減少した。
【００４２】
【図３】図3A〜Iは、ビヒクル、2E13vg/kg又は2E14vg/kgのAAV-PAHで処置した野生型及びEnu2マウスの脳内で測定された様々なアミノ酸、神経伝達物質、及び神経伝達物質代謝物のレベルを比較する一連のグラフである。AAV-PAHの2E14vg/kg用量は、測定されたアミノ酸(野生型のレベルまで減少したフェニルアラニンを除く)、神経伝達物質、及び神経伝達物質代謝物のレベルを、野生型マウスで測定されたレベルまで上昇させた。反対に、AAV-PAHの2E13vg/kg用量は、測定されたアミノ酸、神経伝達物質、及び神経伝達物質代謝物のレベルを完全には回復しなかった。
【００４３】
【図４】図4は、脳フェニルアラニンレベル及び血漿フェニルアラニンレベルの間の相関関係を示すプロットである。フェニルアラニンレベルを、ビヒクルで処置した野生型マウス、並びにビヒクル又は2E13vg/kgAAV-PAH若しくは2E14vg/kgAAV-PAHで処置したEnu2マウスの、脳内及び血漿内両方で測定した。プロットは、処置状態に関係なく、試験された各動物の脳及び血漿のフェニルアラニンの間に相関関係があることを示す。
【００４４】
【図５】図5A〜Dは、野生型及びEnu2マウスの血漿中のアミノ酸(フェニルアラニン(A)及びチロシン(B))並びに神経伝達物質代謝物(DOPAC(C)及びホモバニリン酸(D))のレベルを示す一連のグラフである。Enu2マウスは、野生型マウスと比較して、その血漿中の神経伝達物質代謝物のレベルが低い。各被検物質の質量分析測定は、検出シグナルの毎分カウント(cpm)から得られたピーク面積として提供される。
【００４５】
【図６】図6A〜Dは、野生型及びEnu2マウスの脳及び血漿中のフェニルアラニン(A)、チロシン(B)、DOPAC(C)、及びホモバニリン酸(D)それぞれの相関関係を示す一連のグラフである。
【００４６】
【図７】図7A〜Iは、ビヒクルで処置した野生型マウス、並びにビヒクル又は2E13vg/kg若しくは2E14vg/kgで処置したEnu2マウスの、血漿内で測定した様々なアミノ酸、神経伝達物質、及び神経伝達物質代謝物のレベルを比較する一連のグラフである。AAV-PAHの2E14vg/kg用量は、測定されたアミノ酸(野生型のレベルまで減少したフェニルアラニンを除く)、神経伝達物質、及び神経伝達物質代謝物のレベルを、野生型マウスで見られたレベルまで上昇させた。反対に、AAV-PAHの2E13vg/kg用量は、測定されたアミノ酸、神経伝達物質、及び神経伝達物質代謝物のレベルを完全には回復しなかった。
【００４７】
【図８】図8A〜Cは、ビヒクルで処置した野生型マウス、並びにビヒクル、2E13vg/kg又は2E14vg/kgAAV-PAHで処置したEnu2マウスの脳及び血漿の、フェニルアラニン(A)、DOPAC(B)、及びホモバニリン酸(C)のレベル間の相関関係を示す一連のグラフである。
【００４８】
【図９】図9A〜Dは、ビヒクルで処置した野生型マウス、並びにビヒクル、2E13vg/kg又は2E14vg/kgAAV-PAHで処置したEnu2マウスの、血漿及び脳フェニルアラニンレベル、並びにDOPAC(A、B)及びホモバニリン酸(C、D)のレベルの間の負の相関関係を示す一連のグラフである。
【００４９】
【図１０】図10A〜Cは、化学構造(A)、並びにビヒクルで処置した野生型マウス、及びビヒクル、2E13vg/kg又は2E14vg/kgAAV-PAHで処置したEnu2マウスの、脳内のドーパミン(B)及びノルエピネフリン(C)レベルを示す一連のグラフを示す。
【００５０】
【図１１】図11A〜Cは、化学構造(A)、並びにビヒクルで処置した野生型マウス、及びビヒクル、2E13vg/kg又は2E14vg/kgAAV-PAHで処置したEnu2マウスの、脳内のドーパミン(B)及びDOPAC(C)レベルを示す一連のグラフを示す。
【００５１】
【図１２】図12A〜Bは、ビヒクルで処置した野生型マウス、並びにビヒクル、2E13vg/kg又は2E14vg/kgAAV-PAHで処置したEnu2マウスの、血漿内のDOPAC(A)及びホモバニリン酸(B)レベルを示す一連のグラフである。
【００５２】
【図１３】図13A〜Dは、ビヒクルで処置した野生型マウス、並びにビヒクル、2E13vg/kg又は2E14vg/kgAAV-PAHで処置したEnu2マウスの、脳内及び血漿内両方のDOPAC(A、B)及びホモバニリン酸(C、D)レベルの間の相関関係を示す。このデータは、DOPAC及びホモバニリン酸の血漿レベルは、脳内のこれら神経伝達物質代謝物のレベルの代用物マーカーとして作用可能であることを示す。
【００５３】
【図１４】図14A〜Fは、3日間、ビヒクルで処置したEnu2マウス、並びにPeg-PAL(PegPal-10k)で処置したEnu2マウスの、脳及び血漿フェニルアラニン(A、D)、チロシン(B、E)、及びトリプトファン(C、F)レベルを示す一連のグラフである。
【００５４】
【図１５】図15A〜Cは、3日間、ビヒクルで処置したEnu2マウス並びにPeg-PAL(PegPal-10k)で処置したEnu2マウスの脳内神経伝達物質、ドーパミン(A)、ノルエピネフリン(B)、及びセロトニン(C)レベルを示す一連のグラフである。
【００５５】
【図１６】図16A〜Fは、3日間、ビヒクルで処置したEnu2マウス並びにPeg-PAL(PegPal-10k)で処置したEnu2マウスの、脳及び血漿内のDOPAC(A、D)、ホモバニリン酸(B、E)、及び5-ヒドロキシインドール酢酸(C、F)レベルを示す一連のグラフである。
【００５６】
【図１７】図17A〜Cは、ビヒクル又はPALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)の単回投与のいずれかで処置してから72時間後のEnu2マウスの血漿内の、フェニルアラニン(A)、チロシン(B)、及びトリプトファン(C)のレベルを示す一連のグラフである。
【００５７】
【図１８】図18A〜Fは、ビヒクル又はPALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)の単回投与のいずれかで処置してから72時間後のEnu2マウスの脳内の、フェニルアラニン(A)、チロシン(B)、及びトリプトファン(C)のレベル、並びに、Enu2マウス(D〜F)でのPALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)処置後の、表示されたマーカー間の相関関係を示す一連のグラフである。
【００５８】
【図１９】図19A〜Hは、ビヒクル又はPALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)の単回投与のいずれかで処置してから72時間後のEnu2マウスの血漿及び脳内の、フェネチルアミン(A)、ドーパミン(B)、ノルエピネフリン(C)、及びセロトニン(D)のレベル、並びに、Enu2マウス(E〜H)でのPALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)処置後の、表示されたマーカーの間の相関関係を示す一連のグラフである。
【００５９】
【図２０】図20A〜Hは、ビヒクル又はPALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)の単回投与のいずれかで処置してから72時間後のEnu2マウスの血漿内の、フェニルアセチルグリシン(A)、ホモバニリン酸(B)、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール(C)、及び5-ヒドロキシインドール酢酸(D)のレベル、並びに、Enu2マウス(E〜H)でのPALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)処置後の、表示されたマーカーの間の相関関係を示す一連のグラフである。
【００６０】
【図２１】図21A〜21Cは、ビヒクル又はPALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)の単回投与のいずれかで処置してから72時間後のEnu2マウスの脳内の、ホモバニリン酸(HVA)(A)、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール(MOPEG)(B)、及び5-ヒドロキシインドール酢酸(5HIAA)(C)のレベルを示す
【００６１】
【図２２】図22A〜Fは、PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)処置と組み合わせたチロシン(Tyr)補充は、PAHEnu2マウスの脳ノルエピネフリンレベルを上昇させることを示す。ビヒクル又はPALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)のいずれかで処置の後のPAHWTマウス。Tyrの血漿レベル(C)、並びに、Tyr(D)、ドーパミン(E)及びノルエピネフリン(F)の脳レベルを、PAHEnu2及びPAHWTマウスで測定した。A〜FでTyr、チロシンの有意性を決定するために、調整したp値を用いたTukeyの多重比較試験を使用した(****=p＜0.0001、***=p＜0.001、**=p＜0.01、*=p＜0.05)。
【００６２】
【図２３】図23A〜Tは、重要な神経伝達物質代謝物の血漿レベルは、PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)の12か月後のフェニルアラニンの低下によって影響されたことを示す。全データは、フェニルアラニンレベルが＜360μM(第1群)又は＞900μM(第2群)のいずれかにより達成された対象群のサブセットからの試料に関する。(A〜D)全ての神経伝達物質代謝物は12か月までに対照値に向かう傾向を見せた。(E〜H)血漿神経伝達物質代謝物及び血漿フェニルアラニンの相関関係。A〜Dでの有意性を決定するために、調整したp値を用いたTukeyの多重比較試験を使用した(****=p＜0.0001、***=p＜0.001、**=p＜0.01、*=p＜0.05)。E〜Hでは、r値、p値、及び95%信頼区間は、対数変換したデータへ線形適合させることにより計算した。E〜Lでは、ベースライン、第6月及び第12月での利用可能なデータが含まれる。網掛け領域は、対照とした対象群の上限及び下限を表す。PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)処置の12月後に、ほとんどのPKU罹患対象群での血漿フェニルアラニン低下は、PKU罹患対象群では＞900μM群(M〜P)での他の神経伝達物質代謝物の変化を生じ、＜360μM群(Q〜T)では更に大きな傾向を示した。5-ヒドロキシインドール酢酸(5HIAA);対照(Ctrl);ホモバニリン酸(HVA);3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール(MOPEG);フェニルアセチルグリシン(PAG);フェニルアラニン(Phe)。
【００６３】
【図２４】図24A〜Dは、ベースラインでのADHDiスコアが≧9を示す対象群のサブセットのためのADHDi下位尺度が、MOPEGの増加と逆相関したことを示す。ADHDi下位尺度の変化と、ベースラインでのADHDiスコアが＞9(n=17)(A)若しくは＜9(n=7)(B)の時の血漿HVAの変化との相関関係、又はベースラインでのADHDiスコアが＞9(C)若しくは＜9(D)の時のMOPEGの変化との相関関係;スコア＞9は不注意(inattention)症状を示す。青及び赤の点は、それぞれ＜360及び＞900μMの対象群を示す。各データセットのr値及びp値は、各データセットに線形回帰を適用した後に決定した。5HIAA、5-ヒドロキシインドール酢酸;ADHD-RS IV、注意欠陥多動障害(ADHD)評価尺度(RS)の不注意下位尺度ドメイン;3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール(MOPEG);フェニルアセチルグリシン(PAG);フェニルアラニン(Phe);フェニルケトン尿症(PKU)。
【００６４】
【図２５】図25は神経伝達物質生合成経路を示す。Phe並びにTyr及びTrpに由来する他の神経伝達物質の代謝物は、脳代謝の代用物として血漿内で検出できる。青は血漿内で発生する分子を表し、赤は脳又は消化管内で主に発生する代謝物を表す(例えば、Lambertらの文献、Life Sci., volume 57 pages255-67 (1995); Ruddellらの文献、J Hepatol., vol. 48 pages 666-675 (2008)(Ruddell図1及び凡例を参照)参照のこと)。5-HIAA、5-ヒドロキシインドール酢酸;AADC、アミノ酸デカルボキシラーゼ;ALDH2、アルデヒドデヒドロゲナーゼ;AR、アルデヒドレダクターゼ;COMT、カテコ(catecho)-O-メチルトランスフェラーゼ;DBH、ドーパミンβヒドロキシラーゼ;DOPAC、3,4-ジヒドロキシフェイル(pheyl)-酢酸;DOPEG、3,4-ジヒドロキシ-フェニルエチレングリコール;HVA、ホモバニリン酸;IAA、インドール酢酸;LAT1、大型(L型)中性アミノ酸トランスポーター1;MA、マンデル酸;MAO、モノアミンオキシダーゼ;MOPEG、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール;PAA、フェニル酢酸;PAG、フェニルアセチルグリシン;PAH,フェニルアラニンヒドロキシラーゼ;PEA、フェニルエチルアミン;TH、チロシンヒドロキシラーゼ;TPH、トリプトファンヒドロキシラーゼ。
【００６５】
【図２６】図26は、ApoE-HCR-hAAT.GI.hPAH.bGH遺伝子療法ベクター(同様に、ベクター1又はWT-hPAHベクターともいう)の概略的な表示である。
【００６６】
【図２７】図27A〜Bは、ApoE-HCR-hAAT.GI.hPAH.bGH遺伝子療法ベクターによる制限酵素消化を示し、制限マップの概略図(A)、及び制限消化したベクターのゲル電気泳動分析(B)を含む。
【００６７】
【図２８】図28A〜Bは、ApoE-HCR-hAAT.GI.hPAH.bGH遺伝子療法ベクターのddPCR分析を示し、ddPCR反応のゲル電気泳動分析(A)、及び増幅されたDNA領域の定量結果と共に遺伝子療法ベクターの概略図(B)を示す。
【００６８】
【図２９】図29A〜Bは、ビヒクル、2E13vg/kg又は2E14vg/kgAAV-PAH(A)又は6E13vg/kgAAV-PAH(B)で処置した野生型及びEnu2マウスで測定された血漿フェニルアラニンレベルを比較する。
【００６９】
【図３０】図30は、AAV5-PAHで処置したENU2マウスは体重増加率が上昇することを示す。
【００７０】
【図３１】図31は、ENU2マウスの外被色は、AAV5-PAHで処置すると野生型の色へ戻ることを示す。
【００７１】
【図３２】図32A〜Eは、高用量のAAV-PAHは、ENU2マウスの脳アミノ酸Phe(A)及びTyr(B)、並びに神経伝達物質レベル(C-D)を野生型のレベルへ正常化することを示す。化学的経路も又、記載する(E)。
【００７２】
【図３３】図33は、ApoE-HCR-hAAT.GI.muPAH.bGHベクターで処置したENU2マウスは、60週間フェニルアラニンレベルが低下することを示す。
【００７３】
【図３４】図34は、ApoE-HCR-hAAT.GI.hPAH.bGHベクター又はApoE-HCR-hAAT.GI.muPAH.bGHベクターで処置した野生型マウスは、PAHタンパク質が上昇してもPheレベル変化は最小にとどまることを示す。
【００７４】
【図３５】図35は、図34で処置したマウスは、Pheレベル変化が最小であるにもかかわらず、PAHタンパク質レベルは上昇していたことを示すウエスタンブロットである。
【００７５】
【図３６】図36A〜Bは、染色の定量化(A)及び染色(B)を示し、それは2E13又は2E14vg/kgのAAV5-hPAHで処置し、投与後第12週の動物の肝臓では有意なTUNEL染色は見られないことを示す。
【００７６】
【図３７】図37は、ApoE-HCR-hAAT.hPAH-tI2.bGHベクターの概略図表示である。
【００７７】
【図３８】図38は、ApoE-HCR-hAAT.hPAH-tI2.bGHベクターを投与したマウスでは、血漿フェニルアラニンレベルは、用量に依存して低下したことを示すグラフである。
【００７８】
【図３９】図39A〜Dは、高用量のApoE-HCR-hAAT.hPAH-tI2.bGHベクターは、脳内の(A〜C)アミノ酸レベル及び(D)神経伝達物質レベルを修正することを示すグラフである。
【００７９】
【図４０】図40は、ApoE-HCR-hAAT.cG-AIATI.hPAH.bGHベクターの概略図表示である。
【００８０】
【図４１】図41は、codop-hPAH DNA配列の配列アラインメントを示す。
【００８１】
【図４２】図42A〜Cは、配列同一性パーセント(A)、分岐図関係(B)、及びGC含量(C)を比較する図表を用いてcodop-hPAH配列を分析している。
【００８２】
【図４３】図43A〜Bは、AAV5-PAHベクター設計及びDNA構造を示す。
【００８３】
【図４４】図44A〜Bは、HEPG2肝細胞の形質導入又はトランスフェクションによる、コドン最適化hPAHバージョンの比較である。
【００８４】
【図４５】図45A〜Bは、AML12の形質導入によるコドン最適化hPAHバージョンの比較である。
【００８５】
【図４６】図46A〜Bは、AAV-codop PAH構築物で処置したEnu2マウスの血漿フェニルアラニンレベルを示し、それは、第2週(A)及び6週間の間(B)、血漿フェニルアラニンレベルが変化したことを示す。
【００８６】
【図４７】図47は、AAV-codop PAH構築物で処置したENU2マウスで測定された、体重の増加変化及びPheパーセントの低下変化の間の相関関係を示す。
【００８７】
【図４８】図48A〜Bは、V1(ApoE-HCR-hAAT.GI.hPAHco1.bGH)、V1＋LGイントロン(ApoE-HCR-hAAT.cG-AIATI.hPAH.bGH)、GENEius 1(ApoE-HCR-hAAT.GI.hPAHco1.bGH)及び本明細書ではHepG2トランスフェクションを経た「ベクター2」と称するベクター(ApoE-HCR-hAAT.cG-AIATI.hPAHco1.bGH)を比較する。
【００８８】
【図４９】図49A〜Cは、Geneius-1、又は大型イントロン(A)で改変されたAAV5-PAHの用量応答曲線を示す。このAAV5-PAHバリアントを様々な用量でENU2マウスに投与し、血漿フェニルアラニンを第2週(B)及び第4週(C)時に測定した。
【００８９】
【図５０】図50A〜Cは、GENEius-1(GENE-1)及び大型イントロン(LG INT)AAV-PAH構築物の用量応答(A)及びPAH体内分布(B、C)を示す。
【００９０】
【図５１】図51A〜Bは、AAV5-PAHバリアントの、雄及び雌ENU2マウスでの5週間の間の用量応答を示す(A)。投与されたENU2マウスのAAV5-PAHバリアントの用量応答を第2週の時点で検査し、異なる用量でのベクター2投与の有効性の相違をより明確に特定した(B)。
【００９１】
【図５２】図52は、ベクター2の濃度を増加させて処置した場合の、ENU2マウスのフェニルアラニンレベルのグラフを示す。
【００９２】
【図５３】図53は、2e13vg/kgのベクター候補で処置した雄ENU2マウスの第2週でのPheレベルを比較する。
【００９３】
【図５４】図54A〜Bは、処置前採血(A)、又は、ベクター2、Codop、及びLgイントロン構築物のいずれかで処置後第2週(B)の、ENU2マウスの血漿ALTレベルを示す。
【００９４】
【図５５】図55は、Codop又はLgイントロンAAV-PAH構築物で処置したENU2マウスの肝臓組織の、TUNEL染色の定量化グラフ及び染色を示す。
【００９５】
【図５６】図56A〜Bは、Codop又はLgイントロンAAV-PAH構築物で処置したENU2マウスの肝臓組織の、IBA染色した定量化グラフ(A)、及びIBA染色(B)を示し、これらはIBA-1陽性(＋)凝集体(foci)の数において統計的に関連する差異を示さないことを示す。
【００９６】
【図５７】図57A〜Cは、ビヒクル(A)、Codop AAV-PAH構築物(B)、又はLgイントロンAAV-PAH構築物(C)で処置したENU2マウスの、肝臓組織のH&E(ヘマトキシリン及びエオシン)染色を、正常な野生型マウス組織と比較して示す。
【００９７】
【図５８】図58A〜Cは、AAV5-muPAHで処置したENU2マウスの血漿フェニルアラニンは野生型レベルまで回復し(A)、一方ALTレベルは群間で同じままである(B)ことを示す。AAV5-muPAHで処置したENU2マウスは、外被色が野生型と類似の黄褐色に変化した(C)。
【００９８】
【図５９】図59A〜Bは、AAV5-muPAHで処置したENU2マウスでは、脳アミノ酸(A)及び神経伝達物質(B)のレベルは、野生型レベルまで回復することを示す。
【００９９】
【図６０】図60A〜Bは、AAV5-hPAHで処置した野生型マウスがこの研究実験の間正常なフェニルアラニンレベル(A)を保つ一方、ビヒクル処置した野生型マウスと比較して2倍に増加したPAHタンパク質発現を発現する(B)ことを示す。
【０１００】
【図６１】図61A〜Cは、AAV-hPAH-処置したENU2マウスの染色した肝細胞中のhPAH DNA(A)及びタンパク質(B)、並びに定量化(C)を示す。
【０１０１】
【図６２】図62A〜Cは、ENU2マウスのWTにAAV5-hPAHを投与した後の炎症性マーカーの評価を示す。(A)IBA1及び(B)CD68(M1/M2活性化された)マクロファージを、マウス肝臓組織内で測定した。炎症誘発性マクロファージマーカーであるiNOS(M1活性化された)は、群間で増大を示さなかった(C)。染色の定量化グラフ(D)。
【０１０２】
【図６３】図63は、AAV-hPAHで処置したENU2マウス又は野生型マウスの肝臓組織のTUNEL染色を示す。染色は、対照マウスと比較して、遺伝子療法処置した群ではアポトーシス性(apopototic)細胞死の有意な増大を示さない。
【０１０３】
【図６４】図64は、カニクイザル(cynomolus)への静脈注射で、2つの異なる用量レベルで送達されたベクター2の体内分布を示す。結果は、肝臓から抽出されたゲノム性ベクターDNAのパーセントとして示される。
【０１０４】
【図６５】図65A〜Bは、高用量又は低用量ベクター2のいずれかで30日間処置したカニクイザルの血漿フェニルアラニン(A)及び血漿チロシン(B)レベルを示す。
【０１０５】
【図６６】図66A〜Cは、ENU2マウスへのベクター2の投与は、脳ホモジネート内のアミノ酸レベルの修正を生じたことを示す。
【０１０６】
【図６７】図67A〜Dは、ENU2マウスへのベクター2の投与は、脳ホモジネート内の神経伝達物質レベルの修正を生じたことを示す。
【０１０７】
【図６８】図68A〜Cは、神経伝達物質代謝物の修正が、高用量のベクター2で観察されたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１０８】
(5.  詳細な説明)
一の実施態様で本明細書で提供されるのは、有効用量のPKU治療薬を最適化するための、フェニルケトン尿症(PKU)患者におけるアミノ酸、神経伝達物質、及び神経伝達物質代謝物レベルの使用である。別の実施態様で提供されるのは、PKU罹患対象の治療方法であって、有効量のPKU治療薬を投与することを含み、該有効量は対象のアミノ酸、神経伝達物質代謝物、及び神経伝達物質のレベルを正常化するものである、前記方法である。
【０１０９】
一の実施態様で本明細書で提供されるのは、機能的に活性な治療用タンパク質をコードするAAVベクター(例えば、完全にパッケージされたAAV PAHベクター、AAV PAHベクター、及び、配列番号1のヌクレオチド配列と実質的に相同であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子)である。別の実施態様では、組換えAAV治療用タンパク質ベクターは、導入遺伝子発現が改良され、かつAAVウイルス生成収率も改良され、精製が簡易化されている。特定の実施態様では、1以上のイントロンを治療用タンパク質コード領域に導入することによりコドンが最適化され、及び/又はエンハンサーの数及び位置付けを再設定することによっても発現が増強される。
【０１１０】
他に明記しない限り、本明細書で使用される技術的及び科学的用語は、本開示が属する分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。例えば、Singletonらの文献、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994); Sambrookらの文献、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, N.Y. 1989)を参照のこと。本開示の目的のために、次の用語を下記に定義する。
【０１１１】
本明細書の遺伝子送達の文脈で使用される用語「ベクター」又は「遺伝子送達ベクター」は、遺伝子送達ビヒクルとして機能し、例えばエンベロープ又はカプシド内にパッケージされた、核酸(即ち、ベクターゲノム)を含む粒子を指し得る。遺伝子送達ベクターは、ウイルス性遺伝子送達ベクター又は非ウイルス性遺伝子送達ベクターでもよい。或いは、幾つかの場合には、用語「ベクター」は、ベクターゲノムのみを指すために使用され得る。本明細書での使用に適したウイルス性ベクターは、パルボウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、又は単純ヘルペスウイルスでもよい。パルボウイルスは、アデノウイルス随伴ウイルス(AAV)でもよい。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、「AAVベクター」とは、一本鎖又は二本鎖いずれかの核酸であって、AAV 5'逆方向末端反復(ITR)配列、並びにAAV 3'ITRに隣接したタンパク質コード化配列(一の実施態様では、機能的な治療用タンパク質コード化配列、例えばPAH)であって、AAVウイルス性ゲノムとは異種の転写制御エレメント、即ち、1以上のプロモーター及び/又はエンハンサー、に機能的に連結したタンパク質コード化配列、ポリアデニル化配列、及び/又は、前記タンパク質コード化配列のエクソン間に挿入された1以上のイントロン、を有する核酸を指す。一本鎖AAVベクターは、AAVウイルス粒子のゲノム内に存在する核酸であって、本明細書に記載された核酸配列のセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかでもよい核酸を指す。このような一本鎖核酸のサイズは、塩基単位で提供される。二本鎖AAVベクターは、AAVベクター核酸を発現又は遺伝子導入するために使用される、プラスミド(例えば、pUC19)のDNA内、又は二本鎖ウイルス(例えば、バキュロウイルス)のゲノム内に存在する核酸を指す。このような二本鎖核酸のサイズは塩基対(bp)単位で提供される。
【０１１３】
用語「逆方向末端反復(ITR)」とは、本明細書で使用される場合、DNA複製の開始点として、及びウイルス性ゲノムのパッケージングシグナルとしてシスに機能する、AAVゲノムの5'末端及び3'末端に存在する、当分野において認知されている領域を指す。AAV ITRは、AAV repコード領域と一緒になって、宿主細胞ゲノムからの切り出し及びレスキュー、並びに宿主細胞ゲノムへの2つ(5'又は3')の隣接するITR間に挿入されたヌクレオチド配列の組込みを効率的に提供する。ある種のAAV関連ITRの配列は、Yanらの文献、J. Virol. (2005) vol. 79, pp. 364-379により開示されており、その全体が引用により本明細書に組み込まれている。本明細書に使用が認められるITR配列は、完全長の野生型AAV ITR又は、機能性能を保持するその断片でもよく、又は複製起点としてシスに機能できる、完全長の野生型AAV ITRの配列バリアントでもよい。本明細書で提供される実施態様の組換えAAV PAHベクター内で有用なAAV ITRは、任意の公知のAAV血清型に由来してもよく、特定の実施態様では、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、又はAAV9血清型から由来してもよい。
【０１１４】
用語「調節配列」とは、特定の宿主有機的組織体において機能的に連結したコード化配列の発現に必要なDNA配列を指す。原核生物に適した調節配列は、例えばプロモーター、任意でオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞が、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することは公知である。
【０１１５】
「転写制御エレメント」は、遺伝子転写の制御に関与する遺伝子のヌクレオチド配列を指し、プロモーター、plus応答エレメント、転写因子が結合してRNAポリメラーゼの結合を助けて発現を促進するためのアクチベーター及びエンハンサー配列、並びにリプレッサータンパク質が結合することでRNAポリメラーゼの付加を阻止して発現を妨げるオペレーター又はサイレンサー配列が含まれる。用語「肝臓特異的転写制御エレメント」は、肝臓組織内で特異的に遺伝子発現を調節する制御エレメントを指す。肝臓特異的制御エレメントの例には、限定するものではないが、マウスサイレチンプロモーター(mTTR)、内因性ヒト第VIII因子プロモーター(F8)、ヒトα-1-アンチトリプシンプロモーター(hAAT)及びその活性断片、ヒトアルブミン最小プロモーター、並びにマウスアルブミンプロモーターが含まれる。Enh1と共に、EBP、DBP、HNF1、HNF3、HNF4、HNF6等の、肝臓特異的転写因子結合部位に由来するエンハンサーも又、考えられる。
【０１１６】
本明細書で使用される用語「機能的に連結した」は、制御エレメント及び遺伝子又はそのコード領域との間の接続を説明するために使用される。通常は、遺伝子発現は、1以上の制御エレメント、例えば、限定するものではないが、構成型又は誘導型プロモーター、組織特異的制御エレメント、及びエンハンサーの制御下に置かれる。遺伝子又はコード領域は、制御エレメントへ「機能的に連結する」又は「作動可能に連結する」又は「機能的に関係する」と言われ、これはその遺伝子又はコード領域が制御エレメントにより、調節される又は影響を受けることを意味する。例えば、あるプロモーターがコード化配列の転写又は発現に影響を与える場合、そのプロモーターは機能的にコード化配列と連結している。
【０１１７】
一の実施態様では、AAVベクターは、機能的に活性なフェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)タンパク質をコードする核酸を含む。PAHコード化配列は、野生型、コドンを最適化したもの、又はバリアントでもよい(例えば、Fangらの文献、Gene Ther., vol. 1, pages 247-254 (1994); Eisensmithらの文献、J. Inherit. Metab. Dis., vol. 19, pages 412-423 (1996); Nagasakiらの文献、Pediatr. Res., vol. 45, pages 465-473 (1999); 及びLaipisらの文献、Mol. Ther., vol. 7, pages S391-S392 (2003)を参照のこと)。
【０１１８】
本明細書で使用される野生型PAHは、次の核酸配列を有する:
【０１１９】
【化２】
2021522811.tif 000004
【０１２０】
本明細書で使用される野生型PAHは、次のアミノ酸配列を有する:
【０１２１】
【化３】
2021522811.tif 000005
【０１２２】
本開示の第一態様によると、配列番号1のヌクレオチド配列と実質的な相同性を有し、かつ機能的PAHをコードするヌクレオチド配列を含む、AAVベクターが提供される。用語「実質的な相同性」は、相同性パーセント(%)を使って更に特定可能である。これについては、更に詳細に本明細書で説明する。
【０１２３】
用語「単離された」は、本開示の核酸分子に関して使用される場合、通常は、それがその天然出所において通常関係する少なくとも1つの汚染核酸から判別され分離された核酸配列を指す。単離された核酸は、それが天然で見られるものとは異なる形態又は設定で存在し得る。従って、単離された核酸分子は、天然細胞に存在する核酸分子とは区別される。
【０１２４】
本明細書で使用される用語「バリアント」とは、参照(基準)対照のポリヌクレオチド(又はポリペプチド)と実質的に類似の配列を有するポリヌクレオチド(又はポリペプチド)を指す。ポリヌクレオチド、タンパク質又はポリペプチド内の、ヌクレオチド及びアミノ酸を変化させるための手順は、当業者に公知である(例えばSambrookらの文献(1989)を参照のこと)。ポリヌクレオチドの場合、バリアントは、参照(基準)対照ポリヌクレオチドと比較して、5'末端、3'末端、及び/又は1以上の内部部位に1以上のヌクレオチドの欠失、置換、付加を有することができる。バリアント及び参照(基準)対照ポリヌクレオチドとの間の配列の類似性及び/又は差異は、当分野で公知の従来技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)及びハイブリダイゼーション技術を使用して検出できる。バリアントポリヌクレオチドには又、例えば部位特異的突然変異誘発技術を使用することによって生成されたもの等、合成的な由来のポリヌクレオチドも含まれる。一般的に、ポリヌクレオチドのバリアントは、DNAを含み、限定するものではないが、当業者に公知の配列アラインメントプログラムにより決定される、参照(基準)対照ポリヌクレオチドとの配列同一性が、少なくとも約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%又はそれ以上であってもよい。ポリペプチドの場合、バリアントは、参照(基準)対照ポリペプチドと比較して、1以上のアミノ酸の欠失、置換、付加を有してもよい。バリアント及び参照(基準)対照ポリペプチド間の配列の類似性及び/又は差異は、当分野で公知の従来技術、例えばウエスタンブロットを使用して検出できる。一般的に、ポリペプチドのバリアントは、当業者に公知の配列アラインメントプログラムにより決定される、参照(基準)対照ポリペプチドとの配列同一性は、少なくとも約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%又はそれ以上であってもよい。
【０１２５】
用語「同一性」、「相同性」及びそれらの文法的変形とは、それらが「整列した」配列である場合、2以上の参照した実体が同じであることを意味する。従って、例示として、2つのポリペプチド配列が同一である場合、それらは、少なくとも参照した領域又は部分内では、同じアミノ酸配列を有する。2つのポリヌクレオチド配列が同一である場合、それらは、少なくとも参照した領域又は部分内では、同じポリヌクレオチド配列を有する。同一性は、その配列で特定されたエリア(領域又はドメイン)にわたって成立できる。同一性の「エリア」又は「領域」とは、2以上の参照した実体の同一である部分を指す。従って、2つのタンパク質又は核酸配列が1以上の配列エリア又は領域にわたって同一である場合、それらはその領域内で同一性を共有する。「整列した」配列とは、複数のポリヌクレオチド又はタンパク質(アミノ酸)配列を指し、参照(基準)対照配列と比較すると、しばしば欠落の修正又は追加の塩基若しくはアミノ酸(ギャップ)を含む。「実質的な相同性」とは、分子が構造的又は機能的に保存されており、その分子が、参照(基準)対照分子の、1以上の構造又は機能(例えば、生物学的機能若しくは活性)の少なくとも部分的な構造又は機能を有するか、若しくは有すると予測される、又は、相同性を共有する参照(基準)対照分子の関連/対応する領域又は部分を有するか、若しくは有すると予測されることを意味する。
【０１２６】
「核酸配列同一性パーセント(%)」は、最大の配列同一性パーセントを達成するために、それぞれの配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後に、参照(基準)対照配列と同一である候補配列のヌクレオチドのパーセンテージとして定義される。核酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメント(整列)は、当業者の技量の範囲内で様々な方法、例えばALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウェア等の公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して達成できる。当業者は、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定でき、それには比較する配列の全長にわたって最大限のアラインメントを達成するために必要な全てのアルゴリズムも含まれる。
【０１２７】
本明細書で特定されるPAHアミノ酸配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント(%)」は、最大の配列同一性パーセントを達成するためでありかつ配列同一性の一部としての保存的置換は全く考慮することなく、それぞれの配列を整列させて必要に応じてギャップを導入した後の、PAHポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である候補配列内のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメント(整列)は、当業者の技量の範囲内で様々な方法、例えばALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウェア等の公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して達成できる。当業者は、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定でき、それには比較する配列の全長にわたって最大限のアラインメントを達成するために必要な全てのアルゴリズムも含まれる。
【０１２８】
「コドン最適化」又は「コドン最適化された」とは、非コドン最適化配列と比較して相対的に高いレベルで発現する可能性が高いように、ヌクレオチド配列に加えられた変更を指す。各コドンがコードするアミノ酸は変化しない。
【０１２９】
本明細書で使用される「イントロン」は、RNAスプライシングによって除去可能なヌクレオチド配列として広く定義される。「RNAスプライシング」とは、プレmRNAからイントロンを切り出して成熟mRNAを形成することを意味する。発現された配列へのイントロンの挿入は、当分野で公知のいずれかの方法で達成できる。イントロンが挿入される場合の唯一の制限は、AAVウイルス粒子のパッケージング制限(約5kbp)を考慮することである。
【０１３０】
「AAVウイルス粒子(AAV virion)」又は「AAVウイルス性粒子(AAV viral particle)」又は「AAVベクター粒子」又は「AAVウイルス」とは、本明細書に記載されたように、少なくとも1つのAAVカプシドタンパク質及びカプシド形成されたポリヌクレオチドAAVベクターから構成されるウイルス性粒子を指す。この粒子が、異種ポリヌクレオチド(即ち、哺乳類細胞に送達するための導入遺伝子等の、野生型AAVゲノム以外のポリヌクレオチド)を含む場合、通常、「AAVベクター粒子」又は単に「AAVベクター」と称される。従って、ベクターはAAVベクター粒子内に含有されることから、AAVベクター粒子の生成には必然的にAAVベクターの生成が含まれる。
【０１３１】
本明細書で使用される「治療用AAVウイルス」とは、治療用タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含む、AAVウイルス粒子、AAVウイルス性粒子、AAVベクター粒子、又はAAVウイルスを指す。本明細書で使用される「AAVベクター」とは、複数のAAV末端反復配列(ITR)に隣接し、かつ1以上の発現調節エレメントと機能的に連結している、1以上の目的のポリヌクレオチド(又は導入遺伝子)を含むベクターを指す。このようなAAVベクターは、rep及びcap遺伝子産物をコードして発現するベクターでトランスフェクトされた宿主細胞内に存在する場合、複製され、感染性ウイルス性粒子内にパッケージされることができる
【０１３２】
本明細書で使用される「治療用タンパク質」は、内因性タンパク質の活性の喪失又は低下を代替又は代償する生物学的活性を有するポリペプチドを指す。例えば、機能的なフェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)は、フェニルケトン尿症(PKU)の治療用タンパク質である。
【０１３３】
本明細書で使用される「神経伝達物質」とは、神経細胞から放出され、それによって神経細胞から別の神経、筋肉、臓器、又は他の組織に刺激を伝達する化学物質を指す。神経伝達物質は、ある細胞から別の細胞へ伝わる神経性情報のメッセンジャーである。特定の実施態様では、神経伝達物質は、フェネチルアミン、チラミン、ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、トリプタミン、及びセロトニンを含む。本明細書で使用される「神経伝達物質代謝物」とは、神経伝達物質の分解後の、1又は2の酵素ステップ下流の産物を指す。神経伝達物質代謝物の非限定例は、フェニル酢酸、フェニルアセチルグリシン、フェニルアセチルグルタミン、DOPAC、ホモバニリン酸、ジヒドロキシフェニルエチレングリコール(DOPEG)、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール(MHPG、MOPEG)、インドール酢酸及び5-ヒドロキシインドール酢酸を含む。神経伝達物質及び代謝物の非限定例は、図24にも示される。
【０１３４】
本明細書で使用される「フェニルケトン尿症(PKU)」とは、酵素フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)の欠乏によって引き起こされる遺伝性代謝性疾患を指す。この疾患は、フェニルアラニン(Phe)レベルの上昇、並びに、神経伝達物質及び神経伝達物質代謝物レベルの低下を生じ、それにより脳機能に影響を及ぼし、重度の知的身体障害、行動異常、言語の遅れ、発作を引き起こす。
【０１３５】
本明細書で使用される「処置」又は「治療」は、病気、即ちPKUの徴候又は症状を示す対象へ、それら徴候又は症状を軽減又は排除する目的で施す処置を示す、治療的処置を指す。この徴候又は症状は、生化学的、細胞的、組織学的、機能的、主観的又は客観的であってもよい。「処置」又は「治療」とは、フェニルアラニンレベルの上昇に関係する疾患(又はその関連症状)(例えば、PKU)の進行、重症度、及び/又は罹病期間の低減又は改善を指す。
【０１３６】
本明細書で使用される「改善する」とは、症状の重症度、疾患の進行又は罹病期間を軽減する作用を指す。
【０１３７】
本明細書で使用される「安定して処置する」又は「安定した治療」とは、治療用AAVウイルスを対象へ投与するために使用して、対象は治療用AAVウイルスによって発現された治療用タンパク質を安定して発現することを指す。安定して発現する治療用タンパク質とは、そのタンパク質が臨床的に有意な期間、発現することを意味する。本明細書で使用される「臨床的に有意な時間」とは、治療上効果的なレベルにおいて、対象の生活の質に有意義な影響を与える時間の長さの表現を意味する。ある実施態様において、生活の質への有意義な影響は、静脈内又は皮下で別の療法を施す必要性の欠如によって示される。ある実施態様において、臨床的に有意な期間は、少なくとも6ヶ月、少なくとも8か月、少なくとも1年、少なくとも2年、少なくとも3年、少なくとも4年、少なくとも5年、少なくとも6年、少なくとも7年、少なくとも8年、少なくとも9年、少なくとも10年、又は対象の生涯を表現する。
【０１３８】
本明細書で使用される用語「有効量」とは、有益な又は望ましい生物学的な及び/若しくは臨床的な結果をもたらすのに充分な量を指す。
【０１３９】
本明細書で使用される「対象」とは、治療、観察又は実験の対象体である動物を指す。「動物」は、魚、甲殻類、爬虫類、及び特に哺乳動物等の、冷血及び温血の脊椎動物並びに無脊椎動物を含む。本明細書で使用される「哺乳動物」とは、哺乳綱に属する個体を指し、限定するものではないが、ヒト、家庭内及び農場の家畜、動物園の動物、スポーツ用及び愛玩用動物が含まれる。哺乳動物の非限定例は、マウス;ラット;ウサギ;モルモット;イヌ;ネコ;ヒツジ;ヤギ;ウシ;ウマ;サル、チンパンジー及び類人猿等の霊長類、並びに、特にヒトを含む。幾つかの実施態様では、哺乳動物はヒトである。しかしながら、幾つかの実施態様では、哺乳動物はヒトではない。
【０１４０】
一般的に、「医薬として許容し得るキャリア」は、細胞に対して毒ではないか、又は過度に有害ではないものである。例示的な医薬として許容し得るキャリアには、無菌のパイロジェンフリー水及び無菌のパイロジェンフリーのリン酸緩衝食塩水が含まれる。医薬として許容し得るキャリアには、生理学的に許容し得るキャリアが含まれる。用語「医薬として許容し得るキャリア」は、生理学的適合性のある、いずれの全ての溶媒、分散液媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等を含む。
【０１４１】
「医薬として許容し得る」によって、生物学的さもなければ望ましくないことのない材料を意味し、即ち、この材料は対象へ、どんな望ましくない生物学的効果も生じないで投与できる。従って、そのような医薬組成物は、例えば、エクスビボでの細胞のトランスフェクションにおいて、又はウイルス性粒子若しくは細胞を、対象へ直接投与する際に使用できる。
【０１４２】
キャリアは、静脈内、腹腔内又は筋肉内投与を含む非経口投与に適していてもよい。あるいは、キャリアは、舌下又は経口投与に適していてもよい。医薬として許容し得るキャリアには、無菌の注射可能な溶液又は分散液の用時調製のための、無菌の水溶液若しくは分散液、及び無菌の粉末が含まれる。医薬的に活性な物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当分野で公知である。従来の媒体又は薬剤が本活性化合物と不適合な場合を除いて、本明細書で提供される医薬組成物におけるそれらの使用が考慮される。
【０１４３】
本明細書で使用される「神経学的に定型な」又は「神経学的に定型な対象」とは、神経学的な又は認知神経的な疾患若しくは病状に罹患しておらず、それらの症状を示さない対象又は対象群を指す。特定の実施態様では、神経学的に定型な対象は、定型発達の対象は、健康なヒトの正常範囲内、又は正常なヒト群の平均レベルから定められた正常範囲内にある、神経伝達物質及び神経伝達物質代謝物レベルのレベルを有する。マウス等の動物対象に適用する場合、神経学的に定型な神経伝達物質及び神経伝達物質代謝物レベルは、野生型対照動物で測定されるものである。
【０１４４】
KUVAN(登録商標)(サプロプテリン二塩酸塩)は、テトラヒドロビオプテリン(BH4-)応答性PKUによる高フェニルアラニン血症(HPA)の患者の血液Pheレベルを低下させるための、最初で唯一のPKU用FDA承認薬である。KUVAN(登録商標)は、PAH酵素の天然補因子であるBH4の医薬製剤であり、残留PAH酵素の活性を刺激してPheをチロシンに代謝する。KUVAN(登録商標)は、米国特許第7,732,599、8,003,126、7,566,462、及び8,178,670号に記載されており、これらのそれぞれ全体は引用により本明細書に組み込まれる。
【０１４５】
PALYNZIQ(登録商標)(ペグバリアーゼ-pqpz)(ペグ化組換えフェニルアラニンアンモニアリアーゼ又は「PEG-PAL」)は、フェニルケトン尿症(PKU)の治療のための治験の酵素代用療法である。PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)は、米国特許第7,531,341、7,534,595、7,537,923、7,790,433、7,560,263、9,557,34号に記載されており、これらのそれぞれ全体は引用により本明細書に組み込まれる。
【０１４６】
本明細書で使用される「PKU療法」とは、PKU患者への、PKU症状を改善するか又は血清フェニルアラニンのレベルを低下させる、どのような治療的介入をも指す。本明細書で使用される「PKU遺伝子療法」とは、対象の細胞への1以上の核酸分子の送達を介したフェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性の置換又は回復を含む、PKU患者へのどのような治療的介入をも指し、それは、生物学的に活性なフェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素活性の発現を置換又は回復するものである。特定の実施態様では、PKU遺伝子療法は、ヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼを発現するアデノ随伴ウイルス性(AAV)ベクターを含む遺伝子治療を指す。
【０１４７】
本明細書で使用される「認知神経的症状」とは、フェニルケトン尿症に罹患している対象が伴う、特有の神経学的、行動的、及び認知的症状を指す。特に、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性の喪失は、フェニルケトン尿症の罹患対象において、充分な神経伝達物質レベルを生成する能力の欠如をもたらす。充分な神経伝達物質を生成する能力の欠如は、直接的に、多くの神経学的、認知的、及び行動的症状を生じる。一の実施態様では、認知神経的症状は、低下したIQ、注意欠陥、並びに、戦略的計画、抑制制御、作業記憶、及び認知的柔軟性を含む実行機能の欠陥、を含む。
【０１４８】
Enu2マウスは、Shedlovsky Aらの文献(Mouse models of human phenylketonuria, (1993), Genetics, vol. 134, pages 1205-1210)に記載されている。これらのマウスは、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子のエクソン7にT835Cミスセンス突然変異を持っており、それはこの酵素のアミノ酸263(F263S)でフェニルアラニンからセリンへの置換を引き起こす。ホモ接合型変異Enu2マウスは、重度の高フェニルアラニン血症を示す。それらは、低フェニルアラニン食での飼育を維持しない限り、色素脱失する。雌は繁殖力があるが、標準的なマウス食餌で飼育する場合、子は育たない。バックグラウンド系統であるBTBR＋T tf/tfの外被色は黒色及び黄褐色(at/at)である。この系統は又、遺伝子タフテッド(tufted)(tf/tf)についてホモ接合型であり、マウスの外被に様々な換毛パターンを生じる。これらの影響はマウス外被に限定されており、マウスの外観が悪くなる可能性がある。
【０１４９】
(5.1  AAVベクター)
本明細書で使用される用語「AAV」は、アデノ随伴ウイルスの一般的な略語である。アデノ随伴ウイルスは、ある特定の機能が同時感染しているヘルパーウイルスによって与えられ、細胞内でのみ増殖する一本鎖DNAパルボウイルスである。現在、特徴付けられているAAVの血清型は13種存在する。AAVの概説及び総説は、例えば、Carterの文献、1989, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pp. 169-228;及びBernsの文献、1990, Virology, pp. 1743-1764, Raven Press, (New York)に見出すことができる。しかし、様々な血清型は、遺伝子レベルにおいてでさえ、構造及び機能の両方の面で、極めて密接に関連していることは周知であるため、これらと同一の原理が追加的なAAV血清型に適用可能であることは充分に予想できる。(例えば、Blackloweの文献、1988, pp. 165-174 of Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison編;及びRose, Comprehensive Virology 3:1-61 (1974)を参照)。例えば、全てのAAV血清型は、明らかに、相同rep遺伝子を介して生じる非常に類似する複製特性を示し;かつ、全てが3つの関連カプシドタンパク質を有している。関連性の度合いは、ゲノム長の全体にわたる血清型間の広範なクロスハイブリダイゼーションを明らかにするヘテロ二本鎖解析;及び「逆方向末端反復配列」(ITR)に相当する末端での類似のセルフアニーリングセグメントの存在によって更に示される。類似の感染性パターンも又、各血清型での複製機能が類似の制御管理下にあることを示す。
【０１５０】
一の実施態様では、AAVベクターは、rep及びcap遺伝子産物をコード及び発現するベクターでトランスフェクトした宿主細胞内に存在する場合に、複製及び感染性ウイルス性粒子内へのパッケージングが可能である。
【０１５１】
幾つかの実施態様では、ウイルス性ベクターは、AAVの5'の逆方向末端反復(ITR)及び3' AAV ITR、プロモーター、PAHをコードするポリヌクレオチド、並びに転写後制御エレメントを含み、該プロモーター、PAHをコードするポリヌクレオチド及び転写後制御エレメントは、5' AAV ITRの下流かつ3' AAV ITRの上流に位置する。ウイルス性ベクターは、例えば治療目的のために対象内で高レベルPAHを生成するために使用できる。
【０１５２】
特定の実施態様では、組換えAAVベクターは、AAV2 5'逆方向末端反復(ITR)(当分野で公知の通りに改変されても、改変されなくてもよい)、肝臓特異的転写制御領域、コドン最適化治療用タンパク質コード領域、任意で1以上のイントロン、ポリアデニル化配列、及びAAV2 3'ITR(当分野で公知の通りに改変されても、改変されなくてもよい)を含む核酸を含む。特定の実施態様では、治療用タンパク質は、ヒトPAH又はそのバリアントである。別の実施態様では、肝臓特異的転写制御領域は、短縮型ApoEエンハンサー配列; 42塩基の5'非翻訳領域(UTR)を含む、186塩基ヒトα抗トリプシン(hAAT)近位プロモーター;1以上のエンハンサーであって、(i)34塩基ヒトApoE/C1エンハンサー、(ii)32塩基ヒトAATプロモーター遠位X領域、及び(iii)追加的な80塩基ヒトAAT近位プロモーターの遠位エレメント、からなる群から選択されるエンハンサー;並びに、ヒトPAHをコードする核酸を含む。別の実施態様では、肝臓特異的転写調節領域は、α-ミクログロブリンエンハンサー配列及び186塩基ヒトα抗トリプシン(AAT)近位プロモーターを含む。
【０１５３】
本明細書で提供される他の実施態様は、機能的PAHポリペプチドをコードするベクター構築物に関し、該構築物は、1以上の異なる方向性を備えた、上記構築物の1以上の個々のエレメント及びそれらの組み合わせを含む。本明細書で提供される別の実施態様は、逆方向性である上記構築物に関する。別の実施態様で提供されるのは、本明細書に記載されたAAV PAHベクターを含む組換えAAVウイルス粒子、及び対象のPKUを治療するためのそれらの使用である。一の実施態様では、対象は、若年性対象である。
【０１５４】
本明細書で提供される一本鎖型AAVベクターは、約7.0kb長未満、又は6.5kb長未満、又は6.4kb長未満、又は6.3kb長未満、又は6.2kb長未満、又は6.0kb長未満、又は5.8kb長未満、又は5.6kb長未満、又は5.5kb長未満、又は5.4kb長未満、又は5.3kb長未満、又は5.2kb長未満又は5.0kb長未満である。本明細書で提供される一本鎖型AAVベクターは、約5.0kb〜約6.5kb長の範囲、又は約4.8kb〜約5.2k長の範囲、又は4.8kb〜5.3kb長、又は約4.9kb〜約5.5kb長の範囲、又は約4.8kb〜約6.0kb長の範囲、又は約5.0kb〜6.2kb長又は約5.1kb〜約6.3kb長、又は約5.2kb〜約6.4kb長、又は約5.5kb〜約6.5kb長である。
【０１５５】
ウイルス性ベクターの作成は、当分野で周知で適切ないずれかの遺伝子操作技術を使用して達成でき、限定するものではないが、その技術には、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、及びDNAシーケンシングの標準的技術が含まれ、例えばSambrookらの文献(Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989))に記載されているとおりである。
【０１５６】
ウイルス性ベクターは公知のいずれの有機的組織体のゲノムからの配列も組み込むことができる。配列は、その天然型で組み込むことも、求められる活性を得るためにいずれかの方法で改変することもできる。例えば、配列は挿入、欠失又は置換を含むことができる。
【０１５７】
(5.1.1  プロモーター)
様々なプロモーターは、本明細書で開示されるウイルス性ベクター内で、目的タンパク質のコード領域を含む核酸と機能的に連結できる。幾つかの実施態様では、プロモーターは、標的細胞等の、ウイルス性ベクター由来のウイルスに感染した細胞内で、目的タンパク質の発現を駆動することができる。プロモーターは、天然由来型又は非天然型であることができる。幾つかの実施態様では、プロモーターは合成プロモーターである。一の実施態様では、合成プロモーターは、自然界には存在せず、かつ機能的に連結した遺伝子の活性を制御するように操作した配列を含む。別の実施態様では、合成プロモーターは、天然プロモーターの断片を含み、それは自然界には存在しない新規な一連のDNA配列を形成する。合成プロモーターは、通常、強化された組織特異的発現を生成するように操作され、制御エレメント、プロモーター、エンハンサー、イントロン、スプライスドナー及びアクセプターで構成されている。プロモーターの例には、限定するものではないが、ウイルス性プロモーター、植物プロモーター、及び哺乳類プロモーターが含まれる。別の実施態様では、プロモーターは肝臓特異的プロモーターである。肝臓特異的プロモーターの特別な例には、LP1、HLP、HCR-hAAT、ApoE-hAAT、LSP、TBG及びTTRが含まれる。これらのプロモーターについては、次の参考文献で更に詳細に説明されている:LP1: Nathwani A.らの文献、Blood. 2006 April 1; 107(7): 2653-2661;ハイブリッド肝臓特異的プロモーター(HLP): McIntosh J.らの文献、Blood. 2013 Apr 25; 121(17): 3335-3344; HCR-hAAT: Miao CHらの文献、Mol Ther. 2000;1: 522-532; ApoE-hAAT:Okuyama Tらの文献、Human Gene Therapy, 7, 637-645 (1996); LSP: Wang Lらの文献、Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 March 30; 96(7): 3906-3910, チロキシン結合グロブリン(TBG)プロモーター: Yanらの文献、Gene 506:289-294 (2012)、及びトランスサイレチン(TTR)プロモーター:Costaらの文献、Mol. Cell. Biol. 8:81-90 (1988)。
【０１５８】
幾つかの実施態様では、プロモーターは、ヒトα1アンチトリプシン(hAAT)プロモーター複合体を含む。幾つかの実施態様では、プロモーターは、少なくともhAATプロモーターの一部分を含む。hAATプロモーターの一部分は、配列番号3に対して、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%又はそれ以上の配列同一性を有する核酸配列を含むことができる。
【０１５９】
幾つかの実施態様では、プロモーターは、肝臓特異的エンハンサーを含む。幾つかの実施態様では、プロモーターは、肝臓の制御領域(HCR)エンハンサーを含む。幾つかの実施態様では、プロモーターは、HCRエンハンサーの少なくとも一部分を含む。例えば、HCRエンハンサーは、配列番号4に対して、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%又はそれ以上の配列同一性を有する核酸配列を含むことができる。
【０１６０】
幾つかの実施態様では、プロモーターは、肝臓特異的アポリポタンパク質E(ApoE)エンハンサーを含む。幾つかの実施態様では、プロモーターは、ApoEエンハンサーの少なくとも一部分を含む。例えば、ApoEエンハンサーは、配列番号4に対して、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%又はそれ以上の配列同一性を有する核酸配列を含むことができる。
【０１６１】
幾つかの実施態様では、プロモーターは、hAATプロモーターの少なくとも一部分、HCRエンハンサーの少なくとも一部分、及びApoEエンハンサーの少なくとも一部分を含む合成プロモーターである。幾つかの実施態様では、プロモーターは、配列番号6に対して、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%又はそれ以上の配列同一性を有する核酸配列を含むことができる。
【０１６２】
幾つかの実施態様では、プロモーターは、上記で定義された1以上のエンハンサーの複数のコピーを含む。幾つかの実施態様では、プロモーター構築物は、1以上の異なる方向性を備えた、1以上の個々の上記エンハンサーエレメント及びそれらの組み合わせを含む。
【０１６３】
幾つかの実施態様では、プロモーターは、1以上の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドと機能的に連結する。幾つかの実施態様では、プロモーターは、PAHタンパク質をコードするポリヌクレオチドと機能的に連結する。
【０１６４】
プロモーターのサイズは変動可能である。AAVのパッケージング容量の制限のために、小型サイズであるが同時に、目的タンパク質の宿主細胞内での高レベル産生が可能なプロモーターの使用が好ましい。例えば、幾つかの実施態様において、プロモーターは、最大約1.5kb、最大約1.4kb、最大約1.35kb、最大約1.3kb、最大約1.25kb、最大約1.2kb、最大約1.15kb、最大約1.1kb、最大約1.05kb、最大約1kb、最大約800塩基対、最大約600塩基対、最大約400塩基対、最大約200塩基対、又は最大約100塩基対である。
【０１６５】
(5.1.2  制御エレメント)
様々な追加的な制御エレメントがウイルス性ベクターに使用でき、例えば、宿主細胞内の目的タンパク質の発現レベルを更に増大させるためのエンハンサー、ポリアデニル化シグナル、リボソーム結合配列、及び/若しくはコンセンサススプライスアクセプター、又はスプライスドナー部位等である。幾つかの実施態様では、制御エレメントは、宿主細胞内の染色体外での組換えDNA分子の維持を促進し、及び/又はベクターの効能(例えば、足場/マトリックス結合領域(S/MAR))を改良することができる。そのような制御エレメントは、当分野で周知である。
【０１６６】
本明細書で開示されるウイルス性ベクターは、転写開始領域及び/又は転写終結領域等の制御エレメントを含み得る。転写終結領域の例には、限定するものではないが、ポリアデニル化シグナル配列が含まれる。ポリアデニル化シグナル配列の例には、限定するものではないが、ウシ成長ホルモン(bGH)ポリ(A)、SV40後期ポリ(A)、ウサギβグロビン(rBG)ポリ(A)、チミジンキナーゼ(TK)ポリ(A)配列、及びそのいずれかのバリアントが含まれる。幾つかの実施態様では、転写終結領域は、転写後調節エレメントの下流に位置する。幾つかの実施態様では、転写終結領域はポリアデニル化シグナル配列である。幾つかの実施態様では、転写終結領域はbGHポリ(A)配列である。
【０１６７】
幾つかの実施態様では、ウイルス性ベクターは、当分野で公知の、追加的な転写及び翻訳開始配列、並びに/又は追加的な転写及び翻訳ターミネーターを含むことができる。
【０１６８】
(5.1.3  目的タンパク質)
本明細書で使用される「目的タンパク質」は、天然発生型及び、その非天然型バリアントを含むいずれのPAHタンパク質でもよい。幾つかの実施態様では、1以上のPAH目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、本明細書で開示されるウイルス性ベクターへ挿入可能であり、該ポリヌクレオチドはプロモーターと機能的に連結する。幾つかの例では、プロモーターは宿主細胞(例えば、ヒト肝細胞)内で目的タンパク質の発現を駆動することができる。
【０１６９】
第一の態様では、本開示は、配列番号1のヌクレオチド配列と相同なヌクレオチド配列を含み、それは機能的な野生型フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)をコードする単離された核酸分子(配列番号:2)を提供する。
【０１７０】
本明細書に記載されたように、PAHタンパク質をコードするヌクレオチドは、タンパク質の発現効率を改良するために改変されてもよい。本明細書の遺伝子の転写及び/又は翻訳を改良するために使用できる方法は、特に制限されない。例えば、ヌクレオチド配列は、宿主(例えば、哺乳動物)内で、遺伝子発現(例えば、タンパク質産生)を増大させるために、宿主コドンの使用をよりよく反映するように改変され得る。改変の別の非限定的な例として、目的タンパク質のヌクレオチド配列内のスプライスドナー及び/又はスプライスアクセプターのうちの1以上が、無関係なスプライシングの可能性を低下させるように改変される。改変の別の非限定的な例として、1以上のイントロンを、目的タンパク質のヌクレオチド配列内、又は隣接して挿入して、AAVベクターパッケージングを最適化し、発現を増強することができる。
【０１７１】
特定の実施態様では、核酸分子は、配列番号1のヌクレオチド配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%相同性、又は少なくとも98%相同性を有する。一の実施態様では、核酸分子は、機能的PAHタンパク質をコードする、即ち、それは、発現すると野生型PAHの機能を有するPAHをコードする。特定の実施態様では、核酸分子は、適切な系内(例えば、宿主細胞内)で発現する時に、機能的PAHタンパク質を、比較的高レベルで産生する。産生されたPAHは機能的なので、野生型PAHの少なくとも一部分と同一な立体構造を持つであろう。特定の実施態様では、本明細書に記載されるように産生される機能的PAHタンパク質は、PKU罹患対象で生じるPheレベルを少なくともいくらか低下させることを可能にする。
【０１７２】
別の実施態様では、機能的PAHをコードするヌクレオチド配列は、対応する非コドン最適化配列をコードする天然型ヌクレオチド配列と比較して、ヒト細胞において改善されたコドン使用の偏重(bias)を有する。機能的PAHをコードするヌクレオチド配列のヒト細胞でのコドン使用の適応性は、コドン適応指数(CAI)として表され得る。本明細書では、コドン適応指数は、高度に発現したヒト遺伝子のコドン使用に対する遺伝子のコドン使用の相対的適応度の測定値として定義される。各コドンの相対適応度(w)は、同じアミノ酸のための最も豊富なコドンの使用に対する、各コドンの使用の比率である。CAIは、これら相対的適応度の値の幾何平均として定義される。非同義コドン及び終結コドン(遺伝暗号に依存する)は除外される。CAI値の範囲は0〜1であり、その値が高いほど、最も豊富なコドンの割合が高いことを示す(Sharp及びLiの文献、1987, Nucleic Acids Research 15: 1281-1295参照;同様に、下記参照のこと: Kimらの文献、Gene. 1997, 199:293-301;zur Megede らの文献、Journal of Virology, 2000, 74: 2628-2635)。特定の実施態様では、PAHをコードする核酸分子は、少なくとも0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、又は0.99のCAIを有する。
【０１７３】
配列番号:7のヌクレオチド配列は、GENEius 1(hPAHco1)としても言及され、野生型ヒトPAHヌクレオチド配列(配列番号:1)の配列に基づく、コドン最適化ヒトPAH核酸配列である。配列番号:7のヌクレオチド配列は、CpGジヌクレオチド含量を手動で低下させ、かつ、センス及びアンチセンス方向の余分なORFをすべて除去すると共に、Operon/Eurofins Genomicsコドン最適化ソフトウェアを使用してコドンを最適化したPAH配列である。CpGジヌクレオチド含量は樹状細胞内のTLR9を活性化し、潜在的な免疫活性化及びCTL応答をもたらすことが示された。我々のAAVベクターゲノム産物はssDNAであるためCpG含量が低下しており、そのために肝臓の炎症及びALTが減少するだろう。
【０１７４】
一の実施態様では、核酸分子は、配列番号7のヌクレオチド配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%相同性、又は98%相同性を有する。別の実施態様では、ヌクレオチド配列は、配列番号7内の(対応する位置の)コドンと同一である、機能的PAHをコードする全コドンの、少なくとも約335、少なくとも約360、少なくとも約380、少なくとも約405、少なくとも約425、少なくとも約440を有し得る。別の実施態様では、核酸分子は、野生型PAHコード化配列と比較して約218コドン変化を有し、そのCAIは約0.96である。
【０１７５】
一の実施態様では、配列番号:7及び、これと類似の配列、即ち、比較的高レベルの相同性を有する配列はすべて、驚くべきことに高レベルの機能的なタンパク質の発現を示す。これに関して、配列番号:7、8、9、10、11、12及び13は、コドン最適化PAH核酸配列であり、その%相同性は配列番号1と比較して、それぞれ80.7%、80.6%、96.5%、96.6%、77.0%、80.5%及び76.7%である。
【０１７６】
一の実施態様では、核酸分子は、配列番号8のヌクレオチド配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%相同性、又は98%相同性を有する。一の実施態様では、ヌクレオチド配列は又、配列番号8内の(対応する位置の)コドンと同一である、機能的PAHをコードする全コドンの、少なくとも約335、少なくとも約360、少なくとも約380、少なくとも約405、少なくとも約425、少なくとも約440を有し得る。別の実施態様では、核酸分子は、野生型PAHコード化配列と比較して約219コドン変化を有し、そのCAIは約0.96である。
【０１７７】
配列番号8のヌクレオチド配列は、GENEius 2(hPAHco2)としても言及され、野生型ヒトPAHヌクレオチド配列(配列番号:1)の配列に基づく、コドン最適化PAH核酸配列である。配列番号:8のヌクレオチド配列は、CpGジヌクレオチド含量を手動で低下させ、かつ、センス及びアンチセンス方向の余分なORFをすべて除去すると共に、Operon/Eurofins Genomicsコドン最適化ソフトウェアを使用してコドンを最適化したPAH配列である。
【０１７８】
一の実施態様では、核酸分子は、配列番号9のヌクレオチド配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%相同性、又は98%相同性を有する。別の実施態様では、ヌクレオチド配列は又、配列番号9内の(対応する位置の)コドンと同一である、機能的PAHをコードする全コドンの、少なくとも約335、少なくとも約360、少なくとも約380、少なくとも約405、少なくとも約425、少なくとも約440を有し得る。別の実施態様では、核酸分子は、野生型PAHコード化配列と比較して約37コドン変化を有し、そのCAIは約0.79である。
【０１７９】
配列番号9のヌクレオチド配列は、Nathwani (NW2-Cop、hPAHco3)としても言及され、野生型ヒトPAHヌクレオチド配列(配列番号:1)の配列に基づく、コドン最適化PAH核酸配列である。配列番号:9のヌクレオチド配列は、Amit Nathwaniが第VIII因子コドン最適化のために使用したコドン使用表を使用して、コドンを最適化したヒトPAH配列である。
【０１８０】
一の実施態様では、核酸分子は、配列番号10のヌクレオチド配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%相同性、又は98%相同性を有する。別の実施態様では、ヌクレオチド配列は又、配列番号10内の(対応する位置の)コドンと同一である、機能的PAHをコードする全コドンの、少なくとも約335、少なくとも約360、少なくとも約380、少なくとも約405、少なくとも約425、少なくとも約440を有し得る。別の実施態様では、核酸分子は、野生型PAHコード化配列と比較して約34コドン変化を有し、そのCAIは約0.79である。
【０１８１】
配列番号10のヌクレオチド配列は、Nathwani-RCG(NW-RCG、hPAHco4)としても言及され、野生型ヒトPAHヌクレオチド配列(配列番号:1)の配列に基づく、コドン最適化PAH核酸配列である。配列番号:10のヌクレオチド配列は、CpGジヌクレオチド含量を手動で低下させ、かつ、センス及びアンチセンス方向の余分なORFをすべて除去すると共に、Amit Nathwaniが第VIII因子コドン最適化のために使用したコドン使用表を使用して、コドンを最適化したヒトPAH配列である。
【０１８２】
特定の実施態様では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号11のヌクレオチド配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%相同性、又は98%相同性を有する。特定の実施態様では、本明細書で提供されるヌクレオチド配列は又、配列番号11内の(対応する位置の)コドンと同一である、機能的PAHをコードする全コドンの、少なくとも約335、少なくとも約360、少なくとも約380、少なくとも約405、少なくとも約425、少なくとも約440を有し得る。別の実施態様で本明細書で提供されるのは、野生型PAHコード化配列と比較して約228コドン変化を有し、そのCAIは約0.84である核酸分子である。
【０１８３】
配列番号11のヌクレオチド配列は、ATUM(DNA2.0-op/D20-P、hPAHco5)としても言及され、野生型ヒトPAHヌクレオチド配列(配列番号:1)の配列に基づく、コドン最適化PAH核酸配列である。配列番号:11のヌクレオチド配列は、DNA2.0コドン最適化アルゴリズムを使用してコドンを最適化したヒトPAH配列である。
【０１８４】
特定の実施態様では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号12のヌクレオチド配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%相同性、又は98%相同性を有する。特定の実施態様では、ヌクレオチド配列は又、配列番号12内の(対応する位置の)コドンと同一である、機能的PAHをコードする全コドンの、少なくとも約335、少なくとも約360、少なくとも約380、少なくとも約405、少なくとも約425、少なくとも約440を有し得る。別の実施態様で本明細書で提供されるのは、野生型PAHコード化配列と比較して約228コドン変化を有し、そのCAIは約0.85である核酸分子である。
【０１８５】
配列番号12のヌクレオチド配列は、ATUM-RCG(DNA2.0-Cop1、hPAHco6)としても言及され、野生型ヒトPAHヌクレオチド配列(配列番号:1)の配列に基づく、コドン最適化PAH核酸配列である。配列番号:12のヌクレオチド配列は、CpGジヌクレオチド含量を手動で低下させ、かつ、センス及びアンチセンス方向の余分なORFをすべて除去すると共に、DNA2.0コドン最適化アルゴリズムを使用してコドンを最適化したヒトPAH配列である。
【０１８６】
特定の実施態様では、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号13のヌクレオチド配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%相同性、又は98%相同性を有する。特定の実施態様では、ヌクレオチド配列は又、配列番号13内の(対応する位置の)コドンと同一である、機能的PAHをコードする全コドンの、少なくとも約335、少なくとも約360、少なくとも約380、少なくとも約405、少なくとも約425、少なくとも約440を有し得る。別の実施態様で本明細書で提供されるのは、野生型PAHコード化配列と比較して約238コドン変化を有し、そのCAIは約0.95である核酸分子である。
【０１８７】
配列番号13のヌクレオチド配列は、JCAT(hPAHco7)としても言及され、野生型ヒトPAHヌクレオチド配列(配列番号:1)の配列に基づく、コドン最適化PAH核酸配列である。配列番号:13のヌクレオチド配列は、CpGジヌクレオチド含量を手動で低下させ、かつ、センス及びアンチセンス方向の余分なORFをすべて除去すると共に、Javaコドン適応ツール(www.jcat.de; Grote et al., Nucleic Acids Res. 2005 Jul 1; 33)を使用してコドンを最適化したヒトPAH配列である。
【０１８８】
一般的に、コドンの最適化は、各コドンがコードするアミノ酸を変更しない。それは単にヌクレオチド配列を変更するだけで、非コドン最適化配列と比較して比較的高レベルで発現する可能性を高くする。これは、本明細書で提供される核酸のヌクレオチド配列、例えば、配列番号7(又は配列番号8〜13)は異なるものであるかもしれないが、それらが翻訳される場合に生成されるタンパク質のアミノ酸配列は同一であることを意味する。
【０１８９】
しかし、一の実施態様では、核酸分子は、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12又は配列番号13のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質に対して、0〜350の間、0〜300の間、0〜250の間、0〜200の間、0〜150の間、0〜100の間、0〜50の間、0〜30の間、0〜20の間、0〜15の間、0〜10の間、又は0〜5の間のアミノ酸変化を有するタンパク質をコードし得る。タンパク質をコードする核酸分子がいずれかのアミノ酸への変化を有する配列を含む場合でも、そのタンパク質はやはり、機能的なタンパク質でなくてはならない。当業者は、タンパク質の機能に悪影響を与えることなく、タンパク質の幾つかのアミノ酸に小さな変更を加えることができることを理解するであろう。
【０１９０】
幾つかの実施態様では、コドン最適化hPAH核酸分子は、25未満、20未満、15未満、又は10未満のCpGジヌクレオチド含量を有する。別の実施態様では、コドン最適化hPAH核酸分子は、65%未満、60%未満、又は58%未満のGC含量を有する。
【０１９１】
本明細書で提供される核酸分子を生成することは、当業者の能力の範囲内であろう。これは、例えば、所与の配列の化学的合成を利用して行うことができる。更に、本明細書に記載された核酸が機能的なタンパク質を発現するかどうかを決定するための適切な方法は、当業者には明らかであろう。例えば、一の適切なインビトロ法は、核酸をAAVベクター等のベクターに挿入し、そのベクターで293T又はHeLa細胞等の宿主細胞へ形質導入し、PAH活性についてアッセイすることを含む。或いは、適切なインビボ法は、核酸を含むベクターをPKUマウスに形質導入し、マウスの血漿中の機能的PAHについてアッセイすることを含む。適切な方法は、下記で更に詳細に記載する。
【０１９２】
幾つかの実施態様では、ベクターは1以上のイントロンを含む。イントロンは、哺乳類の宿主細胞内でRNA転写産物のプロセシングを促進して、目的タンパク質の発現を増加させ、及び/又はベクターのAAV粒子内へのパッケージングを最適化する可能性がある。このようなイントロンの非限定例は、β-グロビンイントロン、AIATイントロン及び/又はhPAHイントロンである。幾つかの実施態様では、イントロンは合成イントロンである。合成イントロンは、例えば、配列番号14との配列同一性が、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%又はそれ以上であるヌクレオチド配列を含むことができる。ベクター中のイントロンの位置及びサイズは変化し得る。幾つかの実施態様では、イントロンは、プロモーターと目的タンパク質コード化配列との間に位置する。幾つかの実施態様では、イントロンはプロモーター内に位置する。幾つかの実施態様では、イントロンはエンハンサーエレメントを含む。幾つかの実施態様では、イントロンは目的タンパク質のコード化配列内、好ましくは目的タンパク質のコード化配列のエクソン間に位置する。幾つかの実施態様では、イントロンは目的タンパク質のコード化配列内に天然に存在するイントロンの全部又は一部を含み得る。幾つかの実施態様では、イントロンは、第二PAHイントロンである。或いは、イントロンは、hPAH第二イントロンの2116bp短縮型である。別の実施態様では、このイントロンの配列は、複合型のβグロビン/AIATイントロンである。
【０１９３】
イントロンエレメントの包含は、イントロンエレメントの非存在下での発現と比較して発現を増強し得る(例えば、Kurachiらの文献、1995, J Biol Chem. 1995 Mar 10;270(10):5276-81を参照のこと)。AAVベクターは、通常は一般的に約4kb〜約5.2kb、又はそれよりわずかに多い限定されたサイズ範囲を有するDNAの挿入を許容する。しかし、パッケージングの最小サイズ限定は存在せず、小型ベクターゲノムなら非常に効率良くパッケージングされる。イントロン及びイントロン断片(例えば、PAHのイントロン2の一部)は、この要件を満たし、かつ発現をも増強する。従って、本開示は、AAVベクター内にPAHイントロン2配列を含むことに限定されるものではなく、PAHイントロン2の部分の代わりに他のイントロン又は他のDNA配列を含む。更に、核酸の他の5'及び3'非翻訳領域を、ヒトPAHのために挙げられているものの代わりに使用することもできる。
【０１９４】
本明細書で使用される「PAHイントロン2の部分」は、約0.1kb〜約2.1kbのヌクレオチド長を有するPAHイントロン2領域であって、プラスミド又はウイルス性ベクターテンプレート上でのPAHの発現を、PAHイントロン2の一部が非存在下でのPAHの発現と比較すると、通常は約1.5倍又はそれ以上増強する領域を意味する。更に特異的な部分は、2116bpのPAHイントロン2の部分である。
【０１９５】
改変体を含むポリヌクレオチド及びポリペプチドは、当業者に公知の様々な標準的な、クローニング、組換えDNA技術、細胞発現経由若しくはインビトロ翻訳、及び化学的合成技術を使用して作成できる(Sambrookらの文献、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版)。
【０１９６】
(5.1.4  遺伝子送達法)
同様に提供されるのは、本開示の核酸分子を含むベクターである。一の実施態様では、ベクターは、遺伝子送達ベクターでもよい。このような遺伝子送達ベクターは、ウイルス性遺伝子送達ベクター又は非ウイルス性遺伝子送達ベクターでもよい。ウイルス性ベクターは、レンチ-、アデノ-、ヘルペスウイルス性ベクターを含む。好ましくは、組換えアデノ随伴ウイルス性(rAAV)ベクターである。或いは、非ウイルス性系も使用でき、それは裸の(naked)DNA(クロマチン付着領域の有無にかかわらない)の使用又は接合型(conjugated)DNAの使用、即ち、脂質による若しくはエレクトロポレーションによる等の様々なトランスフェクション法によって細胞に導入することも含まれる。
【０１９７】
AAVベクター配列の非限定例は、配列番号:15〜23で提供される。例えば、ApoE-HCR-hAATプロモーター、β-グロビンイントロン、野生型ヒトPAHコード化配列、及びbGHポリ(A)配列を含むAAVベクターのヌクレオチド配列は、配列番号15(ベクター1)、ApoE-HCR-hAAT.GI.hPAH.bGHに明記されており;ApoE-hAATプロモーター、βグロビンイントロン、コドン最適化ヒトPAH配列(hPAH-Genius1)、及びbGHポリ(A)配列を含むAAVベクターのヌクレオチド配列は、配列番号16(ApoE-HCR-hAAT.GI.hPAHco1.bGH)に明記されており;ApoE-hAATプロモーター、それと共に複合型のグロビン/AIATイントロン、野生型ヒトPAHコード化配列、及びbGHポリ(A)配列を含むAAVベクターのヌクレオチド配列は、配列番号17((V1-LG-イントロン)、ApoE-HCR-hAAT.cG-AIATI.hPAH.bGH)に明記されており;ApoE-hAATプロモーター、それと共に複合型のグロビン/AIATイントロン、コドン最適化ヒトPAH配列、及びbGHポリ(A)配列を含むAAVベクターのヌクレオチド配列は、配列番号18((LGI-hPAH-Geneius1)、ApoE-HCR-hAAT.cG-AIATI.hPAHco1.bGH)に明記されており;ApoE-hAATプロモーター、野生型ヒトPAHコード化配列、それと共に挿入された切断型第二イントロン、及びbGHポリ(A)配列を含むAAVベクターのヌクレオチド配列は、配列番号19((hPAH＋切断型第二イントロン)、ApoE-HCR-hAAT.hPAH-tI2.bGH)に明記されており;ApoE-hAATプロモーター、βグロビンイントロン、コドン最適化ヒトPAH配列(hPAH-Genius2)、及びbGHポリ(A)配列を含むAAVベクターのヌクレオチド配列は、配列番号20((pFB-ApoE-hAAT-hPAH-Genius2)、ApoE-HCR-hAAT.GI.hPAHco2.bGH)に明記されており;ApoE-hAATプロモーター、βグロビンイントロン、コドン最適化ヒトPAH配列(hPAH-JCAT)、及びbGHポリ(A)配列を含むAAVベクターのヌクレオチド配列は、配列番号21((pFB-ApoE-hAAT-hPAH-JCAT)、ApoE-HCR-hAAT.GI.hPAHco3.bGH)に明記されており;2つのマクログロブリン部位を有するTBGプロモーター、βグロビンイントロン、野生型ヒトPAHコード化配列、及びbGHポリ(A)配列を含むAAVベクターのヌクレオチド配列は、配列番号22((pFB-hPAHV1-TBG2uGlob)、TBG.GI.hPAH.bGH)に明記されており;並びに、TTRプロモーター、βグロビンイントロン、野生型ヒトPAHコード化配列、及びbGHポリ(A)配列を含むAAVベクターのヌクレオチド配列は、配列番号23((pFB-hPAHV1-TTR)、TTR.GI.hPAH.bGH)に明記されている。
【０１９８】
幾つかの実施態様では、AAVベクターは、配列番号:15〜23との配列同一性が少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%又はそれ以上であるヌクレオチド配列を含む。幾つかの実施態様では、AAVベクターは、配列番号18との配列同一性が少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%又はそれ以上であるヌクレオチド配列を含む。
【０１９９】
(5.1.5  非ウイルス性遺伝子送達)
非ウイルス性遺伝子送達は、非ウイルス性トランスフェクションの最も簡便な方法である、裸のDNAを使用して行われ得る。例えば、裸のプラスミドDNAを使用して、本明細書で提供される核酸を投与することも可能である。或いは、エレクトロポレーション、ソノポレーション、又は、DNAコーティングされた金粒子を細胞に、例えば高圧ガス若しくは倒立型22口径銃を利用して発射する「遺伝子銃」(Helios(登録商標)Gene Gunシステム(BIO-RAD))の使用等の方法を採用することもできる。
【０２００】
核酸の細胞内への送達を改良するため、それを損傷から保護し、かつその細胞内への侵入を促進することが必要であろう。この目的のために、リポプレックス及びポリプレックスを使用することができ、それらはトランスフェクションプロセス中の望ましくない分解から核酸を保護する能力を有する。
【０２０１】
プラスミドDNAは、ミセル又はリポソーム等の組織化された構造の脂質でコーティングされ得る。組織化された構造がDNAと複合化する場合、それはリポプレックスと呼ばれる。アニオン性及び中性の脂質は、合成ベクター用のリポプレックスの構築に使用することができる。一の実施態様では、カチオン性脂質を、それらの正電荷のために負に帯電したDNA分子を凝縮するのに使用して、リポソームへのDNAのカプセル化を促進してもよい。リポプレックスを形成するために、ヘルパー脂質(通常はDOPE等の電気的に中性の脂質)をカチオン性脂質に添加する必要があるかもしれない(Dabkowskaらの文献、J R Soc Interface. 2012 Mar 7; 9(68): 548-561)。
【０２０２】
特定の実施態様では、ポリプレックスと呼ばれる、ポリマーとDNAとの複合体を使用して、核酸を送達することができる。ほとんどのポリプレックスは、カチオン性ポリマーで構成されており、その生成はイオン性相互作用によって制御されている。ポリプレックスは通常、担持しているDNAを細胞質内に放出できない。従って、不活化アデノウイルス等のエンドソーム溶解性薬剤(エンドサイトーシス中にエンドソーム溶解を行い、そのプロセスによりポリプレックスが細胞に侵入する)との同時トランスフェクションが必要になる場合がある(Akincらの文献、The Journal of Gene Medicine. 7 (5): 657-63)。
【０２０３】
特定の実施態様では、2つ以上の技術を組み合わせたハイブリッド法を、核酸送達に使用することができる。ビロソームはその一例であり;それらはリポソームを不活化されたHIV又はインフルエンザウイルスと組み合わせる。別の実施態様では、他の方法は、他のウイルス性ベクターをカチオン性脂質と混合するか、又はウイルスをハイブリダイズすることを含み、核酸を送達するために使用できる(Khan、Firdos Alamの文献、Biotechnology Fundamentals, CRC Press, Nov 18, 2015, p. 395)。
【０２０４】
特定の実施態様では、デンドリマー、特にカチオン性デンドリマー、即ち正の表面電荷を有するものを、核酸を送達するために使用できる。遺伝子性材料がDNA又はRNAとして存在する場合、電荷の相補性が、核酸とカチオン性デンドリマーとの一時的な会合を引き起こす。その目的場所に到達すると、デンドリマー-核酸複合体はエンドサイトーシスを介して細胞内に移送される(Amijiの文献、Mansoor M.編、Polymeric Gene Delivery: Principles and Applications, CRC Press, Sep 29, 2004, p. 142)。
【０２０５】
(5.1.6  ウイルス性粒子)
一の実施態様では、適切なウイルス性遺伝子送達ベクターが、核酸を送達するために使用できる。特定の実施態様では、本明細書での使用に適したウイルス性ベクターは、パルボウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、又は単純ヘルペスウイルスでもよい。パルボウイルスは、アデノ随伴ウイルス(AAV)でもよい。
【０２０６】
従って、本開示は、動物パルボウイルス、特に感染性ヒト又はシミアンAAV等のディペンドウイルス属、及びそれらの構成要素(例えば、動物パルボウイルスゲノム)をベースとし、哺乳類細胞内の第VIII因子ポリペプチドの導入及び/又は発現のためのベクターとして使用するための、遺伝子送達ベクター(本明細書で提供される核酸を含む)を提供する。従って、本明細書で使用される用語「パルボウイルス性」は、全てのAAV種のようなディペンドウイルス属を包含する。
【０２０７】
パルボウイルス科ファミリーのウイルスは、小型DNA動物ウイルスである。パルボウイルス科ファミリーは、2つの亜科:脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科と昆虫に感染するデンソウイルス亜科、に分けられるだろう。パルボウイルス亜科サブファミリーのメンバーは、本明細書ではパルボウイルスと呼ばれ、ディペンドウイルス属を含む。それらの属の名前から推測されるかもしれないが、ディペンドウイルス属のメンバーは、通常、アデノウイルス又はヘルペスウイルス等のヘルパーウイルスとの同時感染を、細胞培養における産生的感染のために必要とするという点で独特である。ディペンドウイルス属は、通常はヒトに感染するAAV(例えば、血清型1、2、3A、3B、4、5及び6)、霊長目(例えば、血清型1及び4)、並びに他の温血動物(例えば、ウシ、イヌ、ウマ、マウス、ラット、及びヒツジのアデノ随伴ウイルス)並びに鳥類及び爬虫類に感染する関連ウイルスを含む。パルボウイルス及びパルボウイルス科の他のメンバーの更なる情報については、Kenneth I.Bernsの文献、"Parvoviridae: The Viruses and Their Replication," Chapter 69 in Fields Virology (第3版、1996)に記載されている。便宜上、本開示は、AAVを参照することにより、本明細書で更に例示及び説明される。しかしながら、本開示は、AAVに限定されるものではなく、他のパルボウイルスにも同様に適用され得ることが理解される。
【０２０８】
AAVの「rep」遺伝子及び「cap」遺伝子は、それぞれ複製タンパク質及びカプシド形成タンパク質をコードする遺伝子である。AAVのrep遺伝子及びcap遺伝子は、現在までに調べられた全てのAAV血清型において見出されており、本明細書及び引用した参考文献にも記載されている。野生型AAVでは、rep遺伝子及びcap遺伝子は通常、ウイルス性ゲノム内で互いに隣接して見出され(即ち、これらは隣接又は重複する転写単位として共に「連結」している)、これらは通常、AAV血清型の間で保存されている。又、AAVのrep遺伝子及びcap遺伝子は、個々に、及び集合的に、「AAVパッケージング遺伝子」とも称される。本明細書で使用するためのAAV cap遺伝子はCapタンパク質をコードし、それはrep及びアデノヘルパー機能の存在下でAAVベクターをパッケージングすることが可能であり、かつ標的細胞受容体と結合することが可能なものである。幾つかの実施態様では、AAV cap遺伝子は、特定のAAV血清型に由来するアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質をコードする。
【０２０９】
AAVの生成に使用されるAAV配列は、いかなるAAV血清型のゲノムに由来していてもよい。通常、AAV血清型は、アミノ酸レベル及び核酸レベルで有意に相同的なゲノム配列を有し、類似の一連の遺伝的機能を提供し、本質的に物理的かつ機能的に等価なウイルス粒子を生成し、実際上ほぼ同一の機構により複製及び構築を行う。AAV血清型のゲノム配列及びゲノム類似性の考察について。(例えば、GenBank寄託番号U89790;GenBank寄託番号J01901;GenBank寄託番号AF043303;GenBank寄託番号AF085716;Chioriniらの文献、J. Vir. (1997) vol. 71, pp. 6823-6833; Srivastavaらの文献、J. Vir. (1983) vol. 45, pp. 555-564; Chioriniらの文献、J. Vir. (1999) vol. 73, pp. 1309-1319; Rutledgeらの文献、J. Vir. (1998) vol. 72, pp. 309-319;及びWuらの文献、J. Vir. (2000) vol. 74, pp. 8635-8647を参照のこと)。
【０２１０】
全ての公知のAAV血清型のゲノム構成は非常に似ている。AAVのゲノムは、約5,000ヌクレオチド(nt)長未満の直鎖状一本鎖DNA分子である。逆方向末端反復(ITR)は、構造に関係しない複製(Rep)タンパク質及び構造(VP)タンパク質のユニークなコード化ヌクレオチド配列と隣接している。VPタンパク質はカプシドを形成する。末端の145ntは自己相補的であり、T字形ヘアピンを形成するエネルギー的に安定な分子内二本鎖が形成され得るように構成されている。これらのヘアピン構造は、ウイルス性DNA複製の開始点として機能し、細胞性DNAポリメラーゼ複合体のプライマーとして働く。Rep遺伝子は、Repタンパク質、Rep78、Rep68、Rep52、及びRep40をコードする。Rep78及びRep68はp5プロモーターから転写され、Rep52及びRep40はp19プロモーターから転写される。cap遺伝子は、VPタンパク質、VP1、VP2、及びVP3をコードする。cap遺伝子はp40プロモーターから転写される。本実施態様のベクターで採用されるITRは、関係するcap遺伝子と同じ血清型に対応しても、違う血清型に対応してもよい。一の実施態様では、本明細書で採用されるITRはAAV2血清型に対応し、cap遺伝子はAAV5血清型に対応する。
【０２１１】
AAV VPタンパク質は、AAVウイルス粒子の細胞トロピシティ(tropicity)を決定することが公知である。VPタンパク質コード化配列は、異なるAAV血清型間でRepタンパク質及び遺伝子に比べ有意に低く保存されている。Rep及びITR配列が他の血清型の対応する配列とクロス相互補完する能力を備えているために、ある血清型(例えば、AAV1、5又は8)のカプシドタンパク質及び別のAAV血清型(例えば、AAV2)のRep及び/又はITR配列を含む偽型AAV粒子の生成が可能である。そのような偽型rAAV粒子は本発明の一部である。
【０２１２】
一の実施態様では、本開示の文脈で使用されるAAV ITR配列は、AAV1、AAV2、AAV4及び/又はAAV6に由来する。同様に、Rep(Rep78及びRep52)コード化配列は、一の実施態様では、AAV1、AAV2、AAV4及び/又はAAV6に由来する。しかしながら、本開示の文脈で使用される、VP1、VP2、及びVP3カプシドタンパク質をコードする配列は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAVS、AAV6、AAV7、AAV8若しくはAAV9等の公知の42個の血清型のいずれかから、又は、例えば、カプシドシャフリング技術及びAAVカプシドライブラリから得られた新開発のAAV類似粒子等から取得され得る。
【０２１３】
改変された「AAV」配列も又、例えばAAV遺伝子療法ベクターの生成のために、本開示の文脈で使用できる。そのような改変された配列は、例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8又はAAV9のITR、Rep、又はVPと少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%若しくはそれ以上のヌクレオチド配列及び/又はアミノ酸配列同一性を有する配列(たとえば、約75〜99%ヌクレオチド配列同一性を有する配列)を含み、野生型AAV ITR、Rep、又はVP配列の代わりに使用することができる。
【０２１４】
幾つかの実施態様では、AAVカプシドタンパク質をコードする核酸配列は、Sf9細胞又はHEK細胞等の特定の細胞型における発現のための発現調節配列に機能的に連結している。昆虫宿主細胞又は哺乳類宿主細胞内で異種遺伝子を発現するための、当業者に公知の技術が、本実施態様を実施するために使用できる。昆虫細胞内でのポリペプチドの分子エンジニアリング及び発現のための方法論は、例えば、Summers及びSmithの文献、(1986) A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bull. No. 7555, College Station, Tex.; Luckowの文献(1991)Prokopら著の文献中、Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors' Recombinant DNA Technology and Applications, 97-152; King, L. A.及びR. D. Posseeの文献、(1992) The baculovirus expression system, Chapman and Hall, United Kingdom; O'Reilly, D. R., L. K. Miller, V. A. Luckowの文献(1992) Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York; W.H. Freeman及びRichardsonの文献、C. D. (1995) Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, volume 39;米国特許番号第4,745,051号;米国出願公開番号第2003148506号;並びに国際公開番号WO03/074714号に記載されており、これら全てはその全体が引用により組み込まれている。AAVカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写に特に適したプロモーターは、例えば、多角体プロモーターである。しかし、昆虫細胞において活性な他のプロモーター、例えば、p10、p35又はIE-1プロモーターも当分野で公知であり、更に、上記の参考文献に記載されたプロモーターも又考慮される。
【０２１５】
異種タンパク質の発現のための昆虫細胞の使用は、ベクター、例えば昆虫細胞適合性ベクター等の核酸を、そのような細胞に導入する方法、及びそのような細胞を培養液中で維持する方法のように、文書により充分に裏付けられている。(例えば、METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Richard編、Humana Press, N J (1995); O'Reillyらの文献、BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS, A LABORATORY MANUAL, Oxford Univ. Press (1994); Samulskiらの文献、J. Vir. (1989) vol. 63, pp.3822-3828; Kajigayaらの文献、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA (1991) vol. 88, pp. 4646-4650; Ruffingらの文献、J. Vir. (1992) vol. 66, pp. 6922-6930; Kirnbauerらの文献、Vir. (1996) vol. 219, pp. 37-44; Zhaoらの文献、Vir. (2000) vol. 272, pp. 382-393;及び米国特許番号6,204,059号を参照のこと)。幾つかの実施態様では、昆虫細胞におけるAAVをコードする核酸構築物は、昆虫細胞適合性のあるベクターである。本明細書で使用される「昆虫細胞適合性のあるベクター」又は「ベクター」は、昆虫又は昆虫細胞の増殖性形質転換又はトランスフェクションが可能である核酸分子を指す。例示的な生物学的ベクターには、プラスミド、直鎖状核酸分子、及び組換えウイルスが含まれる。昆虫細胞適合性があればいかなるベクターも使用可能である。ベクターは昆虫細胞ゲノム内に組み込まれ得るが、ベクターの昆虫細胞内での存在は永続的である必要はなく、一過性のエピソーム性ベクターも又含まれる。ベクターは、全ての既知の手段によって、例えば、細胞の化学的処理、エレクトロポレーション、又は感染によって、導入できる。幾つかの実施態様では、ベクターは、バキュロウイルス、ウイルス性ベクター、又はプラスミドである。一の実施態様では、ベクターはバキュロウイルスであり、即ち、構築物がバキュロウイルス性ベクターである。バキュロウイルス性ベクター及びそれらの使用法は、昆虫細胞の分子工学に関する上記の参考文献に記載されている。
【０２１６】
(5.2  組換えAAVの生成方法)
本開示は、昆虫細胞又は哺乳類細胞内で組換えAAVを生成するための材料及び方法を提供する。幾つかの実施態様では、ウイルス性構築物は、1以上の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの挿入を可能にするための、プロモーター及び該プロモーターの下流の制限部位を更に含み、該プロモーター及び該制限部位は、5' AAV ITRの下流かつ3' AAV ITRの上流に位置する。幾つかの実施態様では、ウイルス性構築物は、更に、制限部位の下流かつ3' AAV ITRの上流の転写後制御エレメントを含む。幾つかの実施態様では、ウイルス性構築物は、更に、制限部位に挿入され、プロモーターと機能的に連結されたポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドは目的タンパク質のコード領域を含む。当業者に理解されるように、本出願で開示されるAAVベクターのどれ1つでも、組換えAAVを生成するためのウイルス性構築物として方法で使用できる。
【０２１７】
幾つかの実施態様では、ヘルパー機能は、アデノウイルス性又はバキュロウイルス性ヘルパー遺伝子を含む1以上のヘルパープラスミド又はヘルパーウイルスによって提供される。アデノウイルス性又はバキュロウイルス性ヘルパー遺伝子の非限定例としては、限定するものではないが、E1A、E1B、E2A、E4及びVAが挙げられ、これらは、AAVパッケージングにヘルパー機能を提供できる。
【０２１８】
AAVのヘルパーウイルスは、当分野において公知であり、例えば、アデノウイルス科ファミリー及びヘルペスウイルス科ファミリーに由来するウイルスが含まれる。AAVのヘルパーウイルスの例には、限定するものではないが、米国出願公開第20110201088号(この開示は引用により本明細書中に組み込まれる)に記載されるSAdV-13ヘルパーウイルス及びSAdV-13類似ヘルパーウイルス、ヘルパーベクターpHELP(Applied Viromics)が含まれる。適切なヘルパー機能をAAVに与えることのできる、いかなるAAVのヘルパーウイルス又はヘルパープラスミドも、本明細書で使用可能であることは、当業者に理解される。
【０２１９】
幾つかの実施態様では、AAV cap遺伝子はプラスミド内に存在する。プラスミドは更に、cap遺伝子のものと同一の血清型に対応しても、対応しなくてもよいAAV rep遺伝子を含むことができる。いかなるAAV血清型(限定するものではないが、AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13及びその全てのバリアントを含む)に由来するcap遺伝子及び/又はrep遺伝子が、組換えAAVを生成するために本明細書で使用できる。幾つかの実施態様では、AAV cap遺伝子は、血清型1、血清型2、血清型4、血清型5、血清型6、血清型7、血清型8、血清型9、血清型10、血清型11、血清型12、血清型13又はそのバリアントに由来するカプシドをコードする。
【０２２０】
幾つかの実施態様では、昆虫細胞又は哺乳類細胞は、ヘルパープラスミド又はヘルパーウイルス、ウイルス性構築物及びAAV cap遺伝子をコードするプラスミドでトランスフェクトすることができ;組換えAAVウイルスは、同時トランスフェクション後の様々な時点において採取できる。例えば、組換えAAVウイルスは、同時トランスフェクションの約12時間後、約24時間後、約36時間後、約48時間後、約72時間後、約96時間後、約120時間後、又はこれらいずれか2つの時点の間の時間に、採取できる。
【０２２１】
組換えAAVも又、感染性組換えAAVを生成するために適切な、当分野で公知のいかなる従来法を用いても生成できる。幾つかの例では、組換えAAVは、AAV粒子生成に必要な構成要素の幾つかを安定に発現する昆虫細胞又は哺乳類細胞を用いて生成できる。例えば、AAV rep遺伝子及びAAV cap遺伝子、並びにネオマイシン耐性遺伝子等の選択マーカーを含むプラスミド(又は複数のプラスミド)が、細胞のゲノム内に組み込まれ得る。昆虫細胞又は哺乳類細胞は次に、ヘルパーウイルス(例えば、ヘルパー機能を与えるアデノウイルス又はバキュロウイルス)、並びに5' AAV ITR及び3' AAV ITR(及び、必要であれば、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列)を含むウイルス性ベクターに同時感染され得る。この方法の利点は、細胞が選択可能であること、及び組換えAAVの大規模生産に適していることである。別の非限定的例として、プラスミドではなく、アデノウイルス又はバキュロウイルスが、rep遺伝子及びcap遺伝子をパッケージング細胞に導入するために使用できる。
更に別の非限定的例として、5'及び3' AAV LTRを含有するウイルスベクター並びにrep-cap遺伝子の両方がプロデューサー細胞のDNAに安定に組み込まれ得、ヘルパー機能が野生型アデノウイルスによって提供されて組換えAAVを生成できる。
【０２２２】
一の実施態様では、AAV遺伝子送達ベクターの生成方法が提供され、該方法は下記:
(a)下記を含む1以上の核酸構築物を含む昆虫細胞を提供するステップ:
(i)本明細書で提供され、少なくとも1つのAAV逆方向末端反復ヌクレオチド配列に隣接する核酸分子;
(ii)1以上のAAV Repタンパク質をコードし、昆虫細胞内でRepタンパク質の発現を駆動できるプロモーターと機能的に結合している、ヌクレオチド配列を含む第1発現カセット;
(iii)1以上のAAVカプシドタンパク質をコードし、昆虫細胞内でカプシドタンパク質の発現を駆動できるプロモーターと機能的に結合している、ヌクレオチド配列を含む第2発現カセット;
(iv)及び、任意でVP2/3mRNA内に含まれるAAP及びMAAP、
(b)(a)で定義された昆虫細胞を、Repタンパク質及びカプシドタンパク質の発現を助長する条件下で培養するステップ;並びに、任意で、
(c)AAV遺伝子送達ベクターを回収するステップを含む。
【０２２３】
次に、通常、本明細書で提供されるAAV遺伝子送達ベクターを生成するための方法は、AAV複製を許容する細胞に対して、(a)本開示のベクターゲノムを生成するためのテンプレートをコードするヌクレオチド配列(本明細書で詳細に説明されている);ベクターゲノムをAAVカプシド内に複製及びパッケージングするのに充分な条件下で;(b)ベクターゲノムを生成するためのテンプレートの複製に充分なヌクレオチド配列(上記で定義された第1発現カセット);(c)ベクターゲノムがAAVカプシド内にパッケージングされるのに充分なヌクレオチド配列(上記で定義された第2発現カセット)を提供することを含み、それによりAAVカプシド内でカプシドで包まれた状態のベクターゲノムを含むAAV粒子がその細胞内に生成する、方法である。
【０２２４】
本明細書で提供される方法は、抗AAV抗体、一の実施態様では固定化された抗体、を使用した組換えパルボウイルス性(rAAV)ベクター(を含むウイルス粒子)のアフィニティ精製のステップを含み得る。別の実施態様では、抗AAV抗体はモノクロナール抗体である。本明細書で使用するための1の抗体は、例えば、ラクダ又はラマから得られる一本鎖ラクダ類抗体又はその断片である(例えば、Muyldermansの文献、2001,Biotechnol.74:277-302を参照のこと)。rAAVのアフィニティ精製のための抗体は、AAVカプシドタンパク質上のエピトープに特異的に結合する抗体であり、そのため一の実施態様では、エピトープは、複数のAAV血清型のカプシドタンパク質上に存在するエピトープである。例えば、抗体は、AAV2カプシドへの特異的結合に基づいて、生成しても選択してもよいが、同時に抗体は又、AAV1、AAV3、AAV5、AAV6、AAV8又はAAV9カプシドに特異的に結合してもよい。
【０２２５】
(5.3  AAV生成で使用される細胞型)
本実施態様のAAVベクターを含むウイルス性粒子は、AAV又は生物学的産物の生成を可能にし、培養で維持することができる、いかなる無脊椎動物細胞型を用いても生成し得る。例えば、使用される昆虫細胞株は、SF9、SF21、SF900＋等のヨトウガ(Spodoptera frugiperda)由来細胞、ショウジョウバエ細胞株、ヒトスジシマカ(Aedes albopictus)由来細胞株等の蚊細胞株、カイコガ(Bombyx mori)細胞株等の家蚕細胞株、High Five細胞等のイラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)細胞株、又は、アスカラパ・オドラタ(Ascalapha odorata)細胞株等の鱗翅目細胞株でもよい。一の実施態様では、昆虫細胞は、High Five、Sf9、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf9、Sf900＋、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、BM-N、Ha2302、Hz2E5及びAo38を含む、バキュロウイルスに感染し易い昆虫種由来の細胞である。
【０２２６】
バキュロウイルスは、節足動物のエンベロープ型DNAウイルスであり、そのうちの2つのメンバーは細胞培養液中で組換えタンパク質を生成するための周知の発現ベクターである。バキュロウイルスは、特定の細胞への巨大なゲノム内容物の送達を可能にするように遺伝子操作可能な、環状二本鎖ゲノム(80〜200kbp)を有する。ベクターとして使用されるウイルスは、一般的には、オートグラファ・カリフォルニカ多カプシド核多角体病ウイルス(AcMNPV)又はカイコガ核多角体病ウイルス(BmNPV)である(Katoらの文献、(2010), Applied Microbiology and Biotechnology, vol. 85, Issue 3, pp 459-470)。
【０２２７】
バキュロウイルスは、通常、組換えタンパク質の発現のための昆虫細胞の感染に使用される。特に、昆虫における異種遺伝子の発現は、例えば、米国特許番号第4,745,051号;欧州特許番号EP127,839号;EP155,476号;Vlakらの文献、(1988), Journal of General Virology, vol. 68, pp 765-776; Millerらの文献、(1988), Annual Review of Microbiology, vol. 42, pp 177-179; Carbonellらの文献、(1998), Gene, vol. 73, Issue 2, pp 409-418; Maedaらの文献、(1985), Nature, vol. 315, pp 592-594; Lebacq-Veheydenらの文献、(1988), Molecular and Cellular Biology, vol. 8, no. 8, pp 3129-3135; Smithらの文献、(1985), PNAS, vol. 82, pp 8404-8408;及びMiyajimaらの文献、(1987), Gene, vol. 58, pp 273-281に記載されているように達成できる。タンパク質産生に使用できる、多数のバキュロウイルス株及びバリアント並びに対応する許容できる昆虫宿主細胞がLuckowらの文献、(1988), Nature Biotechnology, vol. 6, pp 47-55; Maedaらの文献、(1985), Nature, vol. 315, pp 592-594;及びMcKennaらの文献、(1998), Journal of Invertebrate Pathology, vol. 71, Issue 1, pp 82-90に記載されている。
【０２２８】
別の実施態様では、本明細書で提供される方法は、AAVの複製又は生物学的産物の生成を可能にし、培養中に維持可能な、全ての哺乳類細胞型を用いて実行される。一の実施態様では、使用される哺乳類細胞は、HEK293、HeLa、CHO、NSO、SP2/0、PER.C6、Vero、RD、BHK、HT1080、A549、Cos-7、ARPE-19、及びMRC-5細胞でもよい。
【０２２９】
(5.3.1  宿主有機的組織体及び/又は細胞)
更なる実施態様では、上記ベクターを含む宿主が提供される。一の実施態様では、ベクターは、本明細書で提供される核酸分子を宿主内で発現することができる。宿主は、いずれの適切な宿主でもよい。別の実施態様では、PKU治療はPKU細胞療法を含む(例えば、Harding、C.、Clin Genet.、Aug;74(2)pages97-104(2008を参照のこと)。
【０２３０】
本明細書で使用される、用語「宿主」は、本開示の核酸分子又はベクターを宿す有機的組織体及び/又は細胞、並びに組換え遺伝子又はタンパク質の発現に使用するのに適した有機的組織体及び/又は細胞を指す。本開示は、特定の細胞型又は有機的組織体に限定されることを意図するものではない。実際、いずれの適切な有機的組織体及び/又は細胞も、本明細書で宿主としての使用が認められると考慮されている。宿主細胞は、単一細胞の形態、類似又は異なる細胞の集団、例えば、培養物(液体培養物又は固体基質での培養物等)、有機的組織体又はその一部の形態でもよい。一の実施態様では、宿主細胞は、本明細書で提供される核酸分子の発現を可能にし得る。従って、宿主細胞は、例えば、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞でもよい。
【０２３１】
別の実施態様で提供されるのは、本明細書で提供される核酸を、分裂細胞及び非分裂細胞を含む広範な範囲の細胞へ送達するための手段である。本開示は、本明細書で提供される核酸を、細胞へインビトロで送達するために、例えば、核酸分子等によりコード化されているポリペプチドをインビトロで生成するため、又は生体外での遺伝子療法のために、利用され得る。
【０２３２】
本開示の核酸分子、ベクター、細胞及び方法/使用は、追加的に、本明細書で提供される核酸を宿主、典型的にはPKU罹患宿主へ送達する方法において有用である。
【０２３３】
本開示は、獣医学的及び医学的両方の応用に使用できることが判明した。本明細書に記載されたような遺伝子送達方法のための適切な対象は、鳥類及び哺乳動物の両方を含み、哺乳動物が好ましい。本明細書で使用される用語「鳥類」は、限定するものではないが、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、七面鳥及びキジが含まれる。本明細書で使用される用語「哺乳動物」は、限定するものではないが、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ類等が含まれる。ヒト対象は、新生児、幼児、青少年、及び成人を含む。
【０２３４】
(5.4  医薬製剤)
一の実施態様で提供されるのは、本明細書で提供される核酸又はベクター並びに医薬として許容し得るキャリア及び/又は他の薬効のある薬剤、医薬薬剤又はアジュバント等を含む医薬組成物である。
【０２３５】
別の実施態様で本明細書で提供されるのは、遺伝的障害を有する対象への投与に有用な、治療用タンパク質を発現するAAVベクター/ウイルス粒子の医薬製剤である。特定の実施態様では、本明細書で提示される医薬製剤は、本明細書で開示されるベクターから生成する組換え治療用タンパク質を発現するAAVウイルス粒子を含む液体製剤であり、ここで、製剤中の組換えAAVウイルス粒子の濃度は、広く変化し得る。特定の実施態様では、製剤中の組換えAAVウイルス粒子の濃度は、1E12vg/ml〜2E16vg/mlの範囲でもよい。一の実施態様では、製剤中の組換えAAVウイルス粒子の濃度は、約2E13vg/mlである。
【０２３６】
別の実施態様では、本明細書で提供されるAAV医薬製剤は、1以上の医薬として許容し得る賦形剤を含み、その賦形剤は、貯蔵及び/又は遺伝的障害の治療のための対象への投与のために有利な特性を備えた製剤を提供する。特定の実施態様では、本明細書で提供される医薬製剤は、-65℃で、少なくとも2週間、一の実施態様では、少なくとも4週間、別の実施態様では、少なくとも6週間及び更に別の実施態様では少なくとも約8週間は、検出可能な安定性の変化なしに貯蔵できる。この点に関して、用語「安定」は、製剤中に存在する組換えAAVウイルスが、貯蔵中にその物理的安定性、化学的安定性及び/又は生物学的活性を本質的に保持することを意味する。特定の実施態様では、製剤中に存在する組換えAAVウイルスは、-65℃での定められた期間の貯蔵中に、ヒト患者におけるその生物学的活性の少なくとも約80%、他の実施態様では、ヒト対象におけるその生物学的活性の少なくとも約85%、90%、95%、98%又は99%を保持する。一の実施態様では、対象は、若年性のヒト対象である。
【０２３７】
ある態様では、組換えAAVウイルス粒子を含む製剤は、更に1以上の緩衝剤を含む。例えば、様々な実施態様では、本明細書で提供される製剤は、リン酸水素二ナトリウムを約0.1mg/ml〜約3mg/ml、約0.5mg/ml〜約2.5mg/ml、約1mg/ml〜約2mg/ml、又は約1.4mg/ml〜約1.6mg/ml濃度で含む。一の実施態様では、本明細書で提供されるAAV製剤は、約1.42mg/mlのリン酸水素二ナトリウム(無水)を含む。本明細書で提供される組換えAAV製剤で使用され得る別の緩衝剤は、リン酸二水素ナトリウム一水和物であり、幾つかの実施態様では、約0.1mg/ml〜約3mg/ml、約0.5mg/ml〜約2.5mg/ml、約1mg/ml〜約2mg/ml、又は約1.3mg/ml〜約1.5mg/mlの濃度での使用が認められる。一の実施態様では、本実施態様のAAV製剤は、約1.38mg/mlのリン酸二水素ナトリウム一水和物を含む。別の実施態様では、本明細書で提供される組換えAAV製剤は、約1.42mg/mlのリン酸水素二ナトリウム及び約1.38mg/mlのリン酸二水素ナトリウム一水和物を含む。
【０２３８】
別の実施態様では、本明細書で提供される組換えAAV製剤は、塩化ナトリウム等の1以上の等張化剤を、一の実施態様では、約1mg/ml〜約20mg/ml、例えば、約1mg/ml〜約10mg/ml、約5mg/ml〜約15mg/ml、又は約8mg/ml〜約20mg/mlの濃度で含み得る。別の実施態様では、本明細書で提供される製剤は約8.18mg/mlの塩化ナトリウムを含む。当分野で公知の他の緩衝剤及び等張化剤も適切であり、本明細書で提供される製剤で使用するために、日常的に使用できる。
【０２３９】
別の実施態様では、本明細書で提供される組換えAAV製剤は、1以上の増量剤を含み得る。例示的な増量剤には、限定するものではないがマンニトール、スクロース(ショ糖)、デキストラン、ラクトース、トレハロース、及びポビドン(PVP K24)が含まれる。特定の実施態様では、本明細書で提供される製剤はマンニトールを含み、それは約5mg/ml〜約40mg/ml、又は約10mg/ml〜約30mg/ml、又は約15mg/ml〜約25mg/mlの量で存在し得る。別の実施態様では、マンニトールは約20mg/mlの濃度で存在する。
【０２４０】
更なる別の実施態様では、本明細書で提供される組換えAAV製剤は、1以上の界面活性剤を含むことができ、それは非イオン性界面活性剤でもよい。例示的な界面活性剤には、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、及びそれらの組み合わせが含まれる。例えば、界面活性剤は、限定するものではないが、TWEEN 80(ポリソルベート80、又はその化学的名称ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートとしても知られる)、ナトリウムドデシル硫酸塩、ステアリン酸ナトリウム、アンモニウムラウリル硫酸、TRITON AG98(Rhone-Poulenc)、poloxamer 407、poloxamer 188等、及びそれらの組み合わせでもよい。一の実施態様では、本実施態様の製剤は、poloxamer 188を含み、それは約0.1mg/ml〜約4mg/ml、又は約0.5mg/ml〜約3mg/ml、約1mg/ml〜約3mg/ml、約1.5mg/ml〜約2.5mg/ml、又は約1.8mg/ml〜約2.2mg/mlの濃度で存在し得る。別の実施態様では、poloxamer 188は約2.0mg/mlの濃度で存在する。
【０２４１】
本明細書で提供される、組換え治療用タンパク質を発現するAAVウイルス含有製剤は、安定しており、品質、効能、又は純度の非許容な変化無しに長期間貯蔵可能である。一の態様では、製剤は、約5℃(例えば、2℃〜8℃)の温度で、少なくとも1か月、例えば、少なくとも1か月、少なくとも3か月、少なくとも6か月、少なくとも12か月、少なくとも18か月、少なくとも24か月、又はそれ以上、安定である。別の実施態様では、製剤は、約-20℃以下の温度で、少なくとも6か月、例えば、少なくとも6か月、少なくとも12か月、少なくとも18か月、少なくとも24か月、少なくとも36か月、又はそれ以上、安定である。別の実施態様では、製剤は、約-40℃以下の温度で、少なくとも6か月、例えば、少なくとも6か月、少なくとも12か月、少なくとも18か月、少なくとも24か月、少なくとも36か月、又はそれ以上、安定である。別の実施態様では、製剤は、約-60℃以下の温度で、少なくとも6か月、例えば、少なくとも6か月、少なくとも12か月、少なくとも18か月、少なくとも24か月、少なくとも36か月、又はそれ以上、安定である。
【０２４２】
医薬組成物は、通常は無菌であり、製造及び貯蔵の条件では安定している。医薬組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高薬物濃度に対応するのに適切な他の指定された構造として製剤化し得る。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等)、及びその適切な混合物を含む溶媒又は分散液媒体でもよい。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティング使用により維持でき、分散液の場合に必要な粒子サイズの保持により、及び界面活性剤の使用により、維持できる。幾つかの実施態様では、等張化剤、例えば、糖類、例えばマンニトール、ソルビトール等のポリアルコール、又は塩化ナトリウムが組成物に含まれる。注射可能な組成物の長期間の吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチン、を組成物に含ませることにより達成できる。特定の実施態様では、本明細書で提供される核酸又はベクターは、一度に投与されてもよく、又は、例えば徐放性ポリマーを含む組成物等の放出制御製剤で、若しくはインプラント及びマイクロカプセル化送達系を含む迅速な放出から化合物を保護する他のキャリアで、投与されてもよい。生分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸及びポリ乳酸・ポリグリコール性共重合体(copolymners)(PLG)等、を使用してもよい。
【０２４３】
特定の実施態様では、本明細書で提供されるAAVベクターを含む医薬組成物は、細胞への遺伝子性材料の遺伝子導入に使用できる。このような遺伝子導入は、インビトロ、生体外又はインビボで行える。従って、一の実施態様では、ヌクレオチド配列を細胞へ送達する方法を提供し、該方法は、核酸、ベクター、又は医薬組成物を、本明細書で提供される核酸又はベクターが細胞に侵入するような条件下で、本明細書に記載されたように接触させることを含む。細胞は、インビトロ細胞、生体外細胞、又はインビボ細胞でもよい。
【０２４４】
(5.5  治療方法)
特定の実施態様で本明細書で提供されるのは、遺伝的障害を有する対象を治療する方法であり、該対象へ治療的な有効量の、治療用タンパク質を発現するAAVベクター又はそれと同じものを含む医薬組成物を投与することを含む方法である。この場合に、「治療的な有効量」は、投与後に、遺伝的障害の症状を少なくとも部分的に、かつ好ましくは完全に改善するのに充分なレベルで治療用タンパク質の発現をもたらすAAVベクターの量である。
【０２４５】
一の実施態様では、本明細書で提供されるのは、治療的な有効量の、本明細書で提供される核酸、タンパク質、ベクター若しくは細胞、又は医薬組成物を、PKU罹患患者に投与することを含む、PKUの治療方法である。一の実施態様では、患者はヒトである。一の実施態様では、対象患者集団は中等度から重度の高フェニルアラニン血症を有する患者であり、PKU、バリアントPKU又は非PKU高フェニルアラニン血症を有するものを含む。一の実施態様では、AAVベクター治療の最終目標は、重度のPKU患者を中等度又は軽度いずれかのPKUに変換することであり、したがって、厳しく制限されたフェニルアラニン食に関連する負担を軽減することである。
【０２４６】
一の実施態様で本明細書で提供されるのは、それを必要とする対象における循環性(circulating)PAHタンパク質レベルを増加させるための方法であり、該方法は、本明細書で提供されるAAVベクター、若しくは本明細書で提供されるウイルス性粒子、又は本明細書で提供される方法により生成されるウイルス性粒子のいずれかであってPAHタンパク質を発現させるものを、対象に投与することを含む。一の実施態様では、このベクター用量は、血漿フェニルアラニンレベルを160μM未満に低下させる結果を生じるPAHを送達する。
【０２４７】
別の実施態様で本明細書で提供されるのは、PKU罹患対象の治療用医薬品を調製するための有効量の組換えAAV PAHウイルスの使用である。一の実施態様では、PKU罹患対象はヒトである。一の実施態様では、医薬品は静脈内(IV)投与により投与される。別の実施態様では、医薬品の投与は、対象の神経伝達物質代謝物又は神経伝達物質レベルを変化させるのに充分な、対象の血流内でのPAHタンパク質の発現を生じる。特定の実施態様では、医薬品は又、AAV PAHウイルスの投与に関係するいずれかの肝毒性の防止及び/又は処置のための予防用及び/又は治療用コルチコステロイドを含む。予防又は治療用コルチコステロイド治療薬を含む医薬品は、コルチコステロイドを少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60mg/日又はそれ以上で、含むことができる。特定の実施態様では、予防用又は治療用コルチコステロイドを含む医薬品は、少なくとも約3、4、5、6、7、8、9、10週、又はそれ以上の継続的期間をかけて投与されてもよい。別の実施態様では、本明細書で提供されるPKU療法は、任意でチロシンサプルメントを含む。
【０２４８】
本明細書に記載された治療目的のための、AAVベクター若しくはウイルス又はそれと同じものを含む医薬組成物の「治療的な有効量」は、定められている経験的かつ日常的様式で決定できる。しかし、特定の実施態様では、組換えAAVウイルスの「治療的な有効量」は、約1E12vg/kg体重〜約1E14vg/kg体重、一の実施態様では、約6E12vg/kg体重〜約6E13vg/kg体重の範囲である。別の実施態様では、組換えAAVウイルスの治療的な有効量は、約2E13vg/kg体重である。別の実施態様では、組換えAAVウイルスの治療的な有効量は、約6E13vg/kg体重である。
【０２４９】
一の実施態様では、本明細書で提供される組換えAAVベクター/ウイルスは、対象へ、一の実施態様では、哺乳類の対象へ、又はヒト対象へ、様々な公知の投与技術を介して投与されてもよい。別の実施態様では、組換えAAV遺伝子療法ウイルスは静脈内投与により、単回ボーラスで投与されるか、それとも少なくとも約1、5、10、15、30、45、60、75、90、120、150、180、210若しくは240分、又はそれ以上でもよい長期間にわたって投与される。他の実施態様では、投与された組換えAAVウイルスは、PAHを発現する。
【０２５０】
対象におけるPKUを治療するためにPAHを発現するAAVベクターを含む、ある実施態様では、AAVベクターの有効性は、治療した対象の血中のフェニルアラニンレベルを測定することによってモニターできる。循環しているフェニルアラニンのレベルを決定するための正確な定量化アッセイは当分野で公知であり、蛍光定量アッセイ(McCaman,M.W.及びRobins,E.の文献、(1962) J. Lab. Clin. Med., vol. 59, pp. 885-890を参照のこと); 薄層クロマトグラフィーベースのアッセイ(Tsukerman,G.L.の文献、 (1985) Laboratornoe delo, vol. 6, pp. 326-327を参照のこと);酵素アッセイ(La Du, B. N.らの文献、(1963) Pediatrics, vol. 31, pp. 39-46;及びPeterson, K.らの文献、(1988) Biochem. Med. Metab. Biol., vol. 39, pp. 98-104を参照のこと);高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用する方法(Rudy, J. L.らの文献、(1987) Clin. Chem., vol. 33, pp. 1152-1154を参照のこと);及びハイスループット自動化技術(Hill, J. B.らの文献、(1985) Clin. Chem., vol. 5, pp. 541-546を参照のこと)が含まれる。
【０２５１】
本開示のAAVウイルスの投与は、場合によっては、観察可能な程度の肝毒性をもたらす可能性がある。肝毒性は、周知で日常的に使用されている様々な技術によって測定でき、例えば、対象の血流中の所定の肝臓関連酵素(例えば、アラニントランスアミナーゼ、ALT)の濃度をAAV投与前(即ち、ベースライン)及びAAV投与後の両方で測定する。(投与前と比較して)AAV投与後のALT濃度の観察可能な増加は、薬物誘発性肝毒性を示す。特定の実施態様では、治療的な有効量のAAVウイルスの投与に加えて、対象は、予防用及び/若しくは治療のいずれか又はその両方のためにコルチコステロイドで治療されて、AAVウイルスの投与に関係するいずれかの肝毒性を防止及び/又は処置することができる。
【０２５２】
「予防的」コルチコステロイド処置は、対象における肝毒性を防止し及び/又は測定されるALTレベルの増加を防止するための、コルチコステロイドの投与を指す。「治療的」コルチコステロイド処置は、AVVウイルスの投与により引き起こされた肝毒性を低下させるための、及び/又は、AAVウイルスの投与により引き起こされた対象の血流内の、上昇したALT濃度を低下させるための、コルチコステロイドの投与を指す。特定の実施態様では、予防的又は治療的コルチコステロイド処置は、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60mg/日又はそれ以上のコルチコステロイドの対象への投与を含むことができる。特定の実施態様では、対象の予防用又は治療用コルチコステロイド処置は、少なくとも約3、4、5、6、7、8、9、10週、又はそれ以上の継続的期間をかけて行われてもよい。本明細書に記載された方法において使用されるコルチコステロイドは、公知の又は日常的に使用されるいずれのコルチコステロイドも含み、例えば、デキサメサゾン、プレドニゾン、フルドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン等を含む。
【０２５３】
(5.6  抗AAV抗体の検出)
全身的なAAVを介した治療的遺伝子導入による肝臓形質導入成功の可能性を最大化するために、上記のようなヒト患者治療処方計画におけるAAVベクターの投与前に、治療予定患者は、細胞の形質導入を阻止するか、そうでなければ治療処方計画の全体効率を低下させる可能性のある抗AAVカプシド抗体の存在について評価されてもよい。そのような抗体は、予定患者の血清中に存在する可能性があり、いずれかの血清型のAAVカプシドに対する抗体である可能性がある。一の実施態様では、既存の抗体が対抗する血清型はAAV5である。
【０２５４】
既存のAAV免疫を検出する方法は周知であり、当分野で日常的に使用されており、細胞ベースのインビトロ形質導入阻害(TI)アッセイ、インビボ(例えば、マウス内)TIアッセイ、及びELISAベースの全抗カプシド抗体(TAb)検出が含まれる(例えば、Masatらの文献、Discov. Med., vol. 15, pp. 379-389及びBoutinらの文献、(2010) Hum. Gene Ther., vol. 21, pp. 704-712を参照のこと。)。TIアッセイでは、AAV誘導性レポーターベクターを予め導入した宿主細胞を使用してもよい。このレポーターベクターは、GFP等の誘導性レポーター遺伝子を含むことができ、その遺伝子の発現は、宿主細胞がAAVウイルスにより形質導入されると誘導される。ヒト血清中の、宿主細胞の形質導入を防止/低下可能な抗AAVカプシド抗体は、それにより、系内でのレポーター遺伝子の発現全体を低下させるであろう。したがって、そのようなアッセイは、治療用AAV PAHウイルスによる細胞形質導入を防止/低下可能な、ヒト血清中の抗AAVカプシド抗体の存在を検出するために使用できる。
【０２５５】
抗AAVカプシド抗体を検出するためのTAbアッセイは、その上をヒト血清が通過する「捕捉剤」として固相結合AAVカプシドを使用し、それにより、血清中に存在する抗カプシド抗体が固相結合カプシド「捕捉剤」に結合することを可能にできる。非特異的結合を除去するために洗浄した後は、「検出剤」を使用して、捕捉剤に結合した抗カプシド抗体の存在を検出できる。検出剤は、抗体、AAVカプシド等でもよく、結合した抗カプシド抗体の検出及び定量化を補助するために検出可能に標識されてもよい。一の実施態様では、検出剤は、電気化学発光技術及び装置を使用して検出することができるルテニウム又はルテニウム錯体で標識される。
【０２５６】
上記と同じ方法論を使用して、目的の治療用AAVウイルスで以前に処置した患者における抗AAVカプシド免疫応答の発生を評価及び検出できる。このように、これらの技術は、治療用AAVウイルスでの処置前に抗AAVカプシド抗体の存在を評価するために使用できるだけでなく、投与後に、投与された治療用AAVウイルスに対する免疫応答の誘導を評価及び測定するためにも使用できる。このように、本明細書で考慮されるのは、ヒト血清中の抗AAVカプシド抗体を検出するための技術と、PKUの治療のための治療用AAVウイルスの投与のための技術とを組み合わせた方法であり、そのヒト血清中の抗AAVカプシド抗体を検出するための技術は、治療用AAVウイルスの投与前又は投与後いずれかで実行され得る。
【０２５７】
本開示の他の態様及び利点は、以下の例示的な例を検討することで理解されるであろう。
【実施例】
【０２５８】
(6.  実施例)
(6.1  実施例1:フェニルアラニン代謝経路及びアッセイの方法論)
スキーム1に示すように、PAHを介しての、フェニルアラニンからチロシンへの変換は、多数の神経伝達物質の生成の前駆体反応として働く。
スキーム 1:
【化４】
2021522811.tif 000006
【０２５９】
PKU患者でのPAH活性の喪失は、フェニルアラニンの蓄積をもたらし、それは血漿フェニルアラニンレベルの増加により示される。しかし、PKUの認知神経的な効果は、主に、多数の神経伝達物質及び代謝物の生成につながる前駆体代謝ステップの喪失によって引き起こされる。
【０２６０】
質量分析連結型高感度液体クロマトグラフィー(LC/MS)ベースのアッセイを、様々なアミノ酸、神経伝達物質、及び神経伝達物質代謝物のレベルを測定するために使用した。簡単に言えば、アミノ酸、神経伝達物質代謝物、及び神経伝達物質をクロロギ酸エチル及びピリジン、又は、塩化ベンゾイル及び炭酸ナトリウムと反応させると、定義済の増加分子量を有する反応生成物が生成し、それはLC/MSを使用した同定及び定量化を可能にする。この反応プロセスは、153.08Daドーパミンが369.14Daドーパミン-ECFに変換される神経伝達物質ドーパミンのスキーム2に詳細に示される。
スキーム 2:
【化５】
2021522811.tif 000007
【０２６１】
クロロギ酸エチル及びピリジンとの反応生成物、並びにそれらの測定精密質量(exact mass)が、フェニルアラニンPAH酵素反応の下流で生成するアミノ酸、神経伝達物質、神経伝達物質代謝物として示され、それらはスキーム３に示される。
スキーム 3:
【化６】
2021522811.tif 000008
2021522811.tif 000009
【０２６２】
図1は、クロロギ酸エチル及びピリジン、又は、塩化ベンゾイル及び炭酸ナトリウムとの反応後の、フェニルアラニン由来のアミノ酸、神経伝達物質、及び神経伝達物質代謝物の液体クロマトグラフィー/質量分析法(LC/MS)クロマトグラムの具体例を示す。図1に見られるように、反応生成物のそれぞれは明確に特定して定量できる。
【０２６３】
(6.2  実施例2:神経伝達物質レベルは、野生型マウス試料と比較してEnu2マウス試料では一貫して低い。)
上記実施例1記載のアッセイを、Enu2及び野生型マウスから得られた生物学的試料のアミノ酸、神経伝達物質、及び神経伝達物質代謝物のレベル測定に使用して、神経伝達物質産生におけるPAH喪失の効果を決定した。図2に示すように、Enu2マウスは、野生型マウスと比較して、脳試料内で低レベルの神経伝達物質及び神経伝達物質代謝物を一貫して示した。Enu2マウスは、野生型マウスの脳内で検出されるレベルと比較して、その脳内でより低いレベルのチロシン、ドーパミン、3-メトキシチラミン(3-MT)、DOPAC、ホモバニリン酸、ノルエピネフリン、トリプトファン、及びセロトニンを有していた。これらのデータは、PAH活性の喪失は、多数の重要な神経伝達物質の低下を生じることを示す。
【０２６４】
(6.3  実施例3:神経伝達物質レベルは、PKU治療薬の有効用量を特定するための代用物マーカーとして働く。)
Enu2マウスを、2つの用量(2E13vg/kg及び2E14vg/kg)の、ヒトPAH(AAV-PAH)を発現するアデノ随伴ウイルスベクターで処置した。AAVは、AAV2血清型のITR及びAAV5血清型のカプシド遺伝子で構築した。又、Enu2及び野生型マウスを、対照としてのビヒクルで処置した。ウイルス投与後第12週で、動物各群から採取した脳試料内のアミノ酸、神経伝達物質、及び神経伝達物質代謝物のレベルを測定した。図3に示すように、ビヒクル処置したEnu2マウスでは、ビヒクル処置した野生型マウス内で測定されたレベルと比較して、フェニルアラニンレベルが上昇し、チロシン、ドーパミン、DOPAC、ホモバニリン酸、ノルエピネフリン、トリプトファン、及びセロトニンのレベルが低下した。高用量のAAV-PAH(2E14vg/kg)をEnu2マウスへ投与すると、低用量(2E13vg/kg)と異なり、フェニルアラニン、チロシン、ドーパミン、DOPAC、ホモバニリン酸、ノルエピネフリン、トリプトファン、及びセロトニンのレベルは、ビヒクル処置した野生型対照で観察されるレベルまで回復した。これらデータは、ある種のアミノ酸、神経伝達物質、及び神経伝達物質代謝物の脳内レベルは、神経伝達物質代謝経路が野生型対照で見られるものまで回復するために必要な、PKU治療薬の有効用量を決定するために使用できることを示す。
【０２６５】
(6.4  実施例4:血漿フェニルアラニンレベルは、脳内で検出されるレベルと相関する。)
尿、血液、血清、及び血漿のフェニルアラニンレベルは、PKU診断及び疾患管理モニタリングのための公知のバイオマーカーである。血漿及び脳フェニルアラニンレベルを測定し、ビヒクル処置した野生型及びEnu2マウス、並びに、2E13vg/kg及び2E14vg/kgAAV-PAHで治療したEnu2マウスと比較した。図4に示すように、個々の動物の血漿及び脳フェニルアラニン間には直線的な強い相関関係がある。更に、この相関関係は、PAHの状態やAAV-PAHの治療用量に関係なく成立する。これらデータは更に、脳のフェニルアラニンレベルが、生成された神経伝達物質のレベルを決定づけるだろうから、認知神経的なPKU症状の代用物バイオマーカーとしての血漿フェニルアラニンの価値を裏付ける。
【０２６６】
(6.5  実施例5:ENU2及び野生型マウスの血漿内の神経伝達物質及び神経伝達物質代謝物レベル)
野生型及びEnu2マウス内の神経伝達物質代謝物、DOPAC及びホモバニリン酸レベルを測定した。図5に示すように、Enu2マウスは野生型マウスと比較して、低レベルの神経伝達物質代謝物をその血漿内に有する。更に、これら代謝物の血漿レベルは脳内で検出されたレベルと関連する(図6及び8)。これらデータは、血漿DOPAC及びホモバニリン酸は、これら脳内代謝物のレベルを理解するための代用物として機能できること、比較的容易に得られる認知神経的症状のバイオマーカーとして役立てることができることを示す。
【０２６７】
血漿及び脳のフェニルアラニン、チロシン、ドーパミン、DOPAC、3MT、ホモバニリン酸、ノルエピネフリン、トリプトファン、及びセロトニンレベルを、ビヒクル処置した野生型マウス及びEnu2マウス、並びに2E13vg/kg及び2E14vg/kgAAV-PAHで治療したEnu2マウスで測定した。図7に示すように、2E14vg/kg用量のAAV-PAHは、測定されたアミノ酸(野生型レベルへ低下したフェニルアラニンを除く)、神経伝達物質、及び神経伝達物質代謝物の血漿レベルを、野生型マウスで観察されるものまで増加させた。反対に、2E13vg/kg用量のAAV-PAHは、測定されたアミノ酸、神経伝達物質代謝物、及び神経伝達物質のレベルを完全には回復させなかった。更に、フェニルアラニンレベル及び神経伝達物質代謝物DOPAC及びホモバニリン酸のレベルの間には、逆の相関関係がある(図9)。これは、PAH活性の喪失は、PKUの認知神経的症状の根拠となる、代謝物の著しい低下をもたらすという考えと一致する。従って、これら神経伝達物質又はそれらから生じる代謝物の血漿又は脳レベルは、PKUの認知神経的症状を治療又は改善するために必要なPKU治療薬の有効用量を決定するためのコンパニオン診断として役立てることができる。これは、非限定的な実例として、図10及び11に示される。この場合、ドーパミン、ノルエピネフリン、及びDOPACの脳レベルを、ビヒクル処置した野生型及びEnu2マウス、並びに2E13vg/kg及び2E14vg/kgAAV-PAHで治療したEnu2マウスで測定した。図10及び11に示すように、低用量の2E13vg/kgは、ドーパミンレベルを回復させるには充分だったが、DOPAC及びノルエピネフリンレベルを回復させるのには不充分であった。反対に、高用量の2E14vg/kgは、Enu2動物のドーパミン、DOPAC、及びノルエピネフリンレベルを、野生型対照で観察されるレベルまで完全に回復させた。この一連の代用物マーカーは、2E14vg/kg用量が、これらの認知神経的な経路の回復に有効であるのに対し、低用量はそうではないことを決定するのに充分であった。
【０２６８】
追加的例として、神経伝達物質代謝物の血漿レベルの、効果的な用量の代用物マーカーとしての使用を、図12及び13に示す。ここでは、DOPAC及びホモバニリン酸の血漿レベルを、ビヒクル処置した野生型及びEnu2マウス、並びに2E13vg/kg及び2E14vg/kgAAV-PAHで治療したEnu2マウスで測定した。図12に示すように、高用量の2E14vg/kgは、DOPAC及びホモバニリン酸の血漿レベルを野生型で観察されるレベルまで回復させることができたが、低用量の2E13vg/kgはできなかった。更に又、図13に示すように、これらマーカーの血漿及び脳レベルは、それらのアミノ酸前駆体であるフェニルアラニンの血漿及び脳レベルと逆の相関関係があった。
【０２６９】
(6.6  実施例6:PALYNZIQ(登録商標)(PEGVALIASE-PQPZ)の有効量は、神経伝達物質レベルを回復する。)
Enu2マウスをPKU治療薬、PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)、又はビヒクルで処置した。PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)投薬3日後、マウスを安楽死させ、血液及び脳を採取し、選択した神経伝達物質及び神経伝達物質代謝物の存在を検査した。図14、15、及び16に示すように、PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)処置したEnu2マウスは、ビヒクルで処置したものと比較して、血漿及び脳両方の神経伝達物質及び神経伝達物質代謝物レベルの増加を示した。PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)処置後第3日には、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンの脳レベルは野生型で観察されるものへ回復し、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンの血漿レベルは、対応する脳レベルのおおよその代用物として働いた (図14)。更に、PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)第3日には又、ドーパミン、ノルエピネフリン、及びセロトニンの脳レベルを正常化することができた(図15)。PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)処置も又、DOPAC、ホモバニリン酸、及び5-ヒドロキシルインドール酢酸の脳を、正常なマウス脳で観察されるレベルまで回復させ、3つ全ての代謝物の血漿レベルは、脳で観察されるレベルの代用物として働いた。これらデータは更に、神経伝達物質及び代謝物の血漿レベルを、有効用量のPKU治療薬を特定するための代用物マーカーとして使用する価値を示す。
【０２７０】
様々な用量レベルのPALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)(10〜80mg/kg)又はビヒクル(トリス緩衝食塩水/2mMトランス桂皮酸エステル;4ml/kg))を、雄C57BL6-Pahenu2マウス(n=7)へ皮下(SQ)注射で第0日に投与した。加熱ランプの下でマウスを短時間温めて血管拡張を誘導した後、投与前及び投与24時間後に、無菌外科用ブレードを使用して尾の皮膚に長さ約0.1cmの横方向の切り込みを入れて、各動物から血液試料を採取した。その血液を1本のリチウムヘパリン処理毛細管に収集し、それを直ちに遠心分離して血漿を得た。血漿を清浄な、ラベル付き試験管にデカントし、-80℃で貯蔵した。PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)投与72時間後に、各動物をノーズコーンを介して送達したイソフルランで強く麻酔した(誘導用4%、維持用1.5%濃度)。心臓穿刺により末端血液試料を採取し、リチウムヘパリンの入っている試験管に入れた。次に、動物を失血させ、開胸術を実施し、心臓を介して〜10分間 PBSで全身灌流し、続いて頸椎脱臼を行って安楽死させた。次に、各マウスの脳を切除し、矢状に半分にし、急速凍結し、ラベル付き試験管に-80℃で貯蔵した。血液試料を遠心分離して血漿を得て、これを清浄な、ラベル付き試験管にデカントし、-80℃で貯蔵した。
【０２７１】
実施例12及び13記載のアッセイを使用して、アミノ酸、神経伝達物質、及び神経伝達物質代謝物のレベルを測定した。図17〜18に示すように、PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)を40mg/kg又は80mg/kgで単回投与してから72時間後、脳及び血漿の両方のフェニルアラニンレベルと脳内のトリプトファンレベルは野生型マウスで観察されるレベルまで正常化された。図19は、PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)の40mg/kg又は80mg/kgでの単回投与により、フェネチルアミン、ドーパミン、及びセロトニンのレベルが正常化され、投与72時間後にノルエピネフリンレベルが上昇したことを示す。血漿中のフェネチルアミン及びセロトニン代謝物のレベルも又、図20に見られるように、野生型レベルへ正常化された。脳内の神経伝達物質代謝物のすべてのレベルは、ビヒクル処置したEnu2マウスと比較して、PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)処置では増加した(図21A〜C)。
【０２７２】
(6.7  実施例7:ENUマウスで関連するマーカーレベル)
(6.7.1  Enuマウスでは、脳内のアミノ酸レベルは、血漿フェニルアラニン低下と関連する。)
ビヒクル又はPALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)処置をして72時間後のPAHEnu2及びPAHWTマウスからの、血漿及び脳ホモジネート中のアミノ酸レベルを定量化した(図17及び18A)。10mg/kgを超えるPALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)は、PAHEnu2マウスの血漿Pheレベルを、1999.0±85.0μM(平均±SEM)から＜1.0μM(PAHWT=60.4±4.4μM)へ低下させた(図17左)。血漿とは反対に、脳のPheレベルは、PAHWTに関してPALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)処置で正常化され、743.7±37.4μMから107.7＋6.6μM(PAHWT=108.8±6.7μM)へ低下させた(図18A左)。
【０２７３】
脳Pheレベルは、血漿Pheで観察されるように、PAHWT未満には低下しなかったが、強い相関関係が、r値0.89(95%信頼区間(CI)0.81〜0.94、p＜0.0001)での2つの区画間で測定された(図18B左)。
【０２７４】
血漿Tyrは、PAHWTと比較して全てのPAHEnu2群で低いままであったが(図17中央)、PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)処置したPAHEnu2マウスでの脳Tyrは、68.8±2.9μMから85.1±6.1μMへ増加した(PAHWT=99.0±2.6μM)(図18A中央)。脳Tyrは、400μM未満での脳Pheの低下と相関した(図18B中央)。
【０２７５】
血漿Trpレベルは、全処置群において正常なままだった(図17右)。興味深いことに、PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)処置したPAHEnu2マウスの脳Trpは、PAHWTに関して正常化され、20.4±1.1μMから30.5±0.8μMへ増加した(PAHWT=29.2±0.7μM)(図18A右)。脳Trpレベルは、脳Pheが400μM未満へ低下した時に正常化された(図18B右)。
【０２７６】
(6.7.2  マウス脳内での神経伝達物質レベルは、アミノ酸修正と関連する。)
全ての神経伝達物質レベルは、PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)処置においてPAHWTに関して正常化され;血漿PEAは、53.6±1.8nMから2.7±0.8nMへ低下し(PAHWT=3.7±1.0nM)、脳ドーパミンは、1115±78.6nMから1506±96.5nMへ増加し(PAHWT=1492±138.4nM)、脳ノルエピネフリンは、1335±54.0nMから1855±78.0nMへ増加し(PAHWT=2247±54.9nM)、かつ脳セロトニンも166±12.5から583.8±45.6へ増加した(PAHWT=502±47.6nM)(図19A)。
【０２７７】
血漿PEA及び脳Pheの間の強い正の相関関係が、r値0.95(95% CI 0.89-0.97、p＜0.0001)で観察された。脳ドーパミン、ノルエピネフリン、及びセロトニンは、それぞれのr値-0.61(95% CI -0.79〜-0.34、p=0.0002)、-0.63(95% CI -0.80〜-0.35、p=0.0001)、及び-0.92(95% CI -0.96〜-0.84、p＜0.0001)で、脳Pheと逆相関した(図19B)。
【０２７８】
(6.7.3  マウスでの神経伝達物質代謝物レベルは神経伝達物質レベルと関連する。)
脳内の全ての神経伝達物質代謝物レベルは、PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)処置により、ビヒクル処置したPAHEnu2と比較して増加し;脳HVAは869±41.01nMから1073±67.5nMへ増加し、脳MOPEGは640.5±55.22nMから746±40.7nMへ増加し、かつ脳5HIAAは280.2±20.2nMから1318.0±37.4nMへ増加した(図21)。
【０２７９】
血漿PAGlyレベルは、PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)処置により、PAHWTに関して正常化され、205.7±24.8nMから14.69±2.2nMへ低下した(PAHWT=11.9±0.7nM)(図20A左)。血漿HVA及びMOPEGレベルは、それらの対応する脳レベルと類似し;ほとんどのPAHEnu2マウスは血漿PAHWTレベルへ達しなかった(図20A中央)。血漿5HIAAレベルは、高用量及びPAHWT群の両方で400nMの平坦域に達するまで脳5HIAAレベルと類似した(図20A右)。
【０２８０】
血漿PAGlyは、r値0.93(95% CI 0.86-0.96、p＜0.0001)での血漿PEAと直接的に相関し、このことは、代謝物との直接的な関係を示唆する(図20B左)。血漿HVA、MOPEG、及び5HIAAは、それぞれのr値0.62(95% CI 0.37-0.78、p＜0.0001)、0.556(95% CI 0.29-0.74、p=0.0003)、及び0.66(95% CI 0.40-0.79、p＜0.0001)で、対応する脳神経伝達物質代謝物レベルと相関した(図20B中央及び右)。
【０２８１】
(6.8  実施例8:PALYNZIQ(登録商標)(PEGVALIASE-PQPZ)処置と組み合わせたチロシン補充は、PAHEnu2マウスの脳ノルエピネフリンレベルを増加させる。)
別の研究実験では、雄C57BL6-PAHEnu2マウスへ、PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)、40mg/kg又はビヒクルのSQ投与の１日前に、リン酸緩衝食塩水(PBS)中に懸濁したチロシン60mg/kg又はビヒクル対照を経口経管栄養によって１日３回補充を開始し、それを毎日、PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)用量投与4日後まで継続した。血液試料をTyr用量投与開始前、並びにPALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)投与24及び96時間後に採取した。脳は、PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)用量投与の96時間後及び、最終的なTyr用量投与の1時間後に採取した。
【０２８２】
切片化した脳を秤量し、PBS(4:1(v/w)で1%NP-40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム及び0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを含む)中で、FastPrep-24 5G装置(MP Biomedicals 116005500)の標準プロトコルを使用してホモジナイズした。脳ホモジネートを21,000gで15分間、4℃で遠心分離して上清を調製し、次に-80℃でアリコートで貯蔵した。
【０２８３】
チロシン補充(180mg/kg/日)は、ビヒクル及びPALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)処置したPAHEnu2マウスの血漿Tyrレベルを増加した(図22C)。Tyr補充は、ビヒクル処置したPAHEnu2マウスの脳Tyrレベルを僅かに増加させたが、PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)処置したPAHEnu2マウスでは効果を示さなかった(図22D)。脳ドーパミンは、PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)処置したPAHEnu2マウスではTyr補充に関係なくPAHWTレベルへ達した(図22E)。最も驚くべきことに、PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)処置したPAHEnu2マウスへTyr補充すると、脳ノルエピネフリンがPBS補充(p=0.0002)を超えて1481±34.8 nMから1818±62.7nMまで増加した(図22F)。
【０２８４】
(6.9  実施例9:神経伝達物質代謝物レベルは、PKU罹患対象において血漿Pheの低下と共に増加する)
PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)処置をしたPAHEnu2マウスのデータは、血漿Pheの低下は、脳内神経伝達物質をPAHWTレベルへ回復させ、血漿の神経伝達物質代謝物も類似の傾向を示すことを示唆する。これらの所見をPKU罹患ヒト対象へ適用できるかどうかを決定するために、神経伝達物質代謝物レベルを、PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)の第III相臨床試験の、処置前の血中Pheレベルが＞900μMである対象群のサブセットからの血漿試料で評価した。第III相PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)臨床試験(PRISM-1、NCT01819727又はPRISM-2、NCT01889862)に参加したことのある23人の対象からの血漿試料を評価した。全ての対象は、告知に基づく同意書面を提出した。成人対照血漿試料をDiscovery Life Sciences(Los Osos、CA)から入手し、年齢と性別で統計的な差はなかった。BMIは対照に利用できなかった。対照試料は、PKUとは関係ない診断手順から残されて匿名化された余りの試料であった。PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)臨床試験における血漿Phe及びADHD-RS IVの評価方法は、先に説明されている(Thomasらの文献)。
【０２８５】
対象を2つの小群、12か月処置後の血漿Pheレベルが＞900μMの群、又は12か月処置後の血漿Pheレベルが＜360μMの群に分けた。血漿Phe＜360μMは、ACMG PKU治療ガイドライン(Vockleyらの文献、2014)で推奨されている目標Phe範囲の上限である一方、血漿フェニルアラニン＞900μMは、ACMG及びEU PKU治療ガイドライン(Vockleyらの文献、2014;van Spronsenらの文献、2018)の両方を実質的に超えるPheレベルである。ベースライン特性は、年齢、性別、ADHD-RS IV、及び血漿Pheに基づく2つの小群で一致し、下記表1に記載されている。
(表1.ベースライン対象の特性：)
【表１】
2021522811.tif 000010
【０２８６】
PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)処置した患者の血漿Pheレベルを、PKUに罹患していない対照群からの試料と比較した。実施例10及び11に記載のアッセイを使用して、処置の第0月、第6月、及び第12月での、全ての血漿試料の神経伝達物質代謝物レベルのレベルを評価した。
【０２８７】
PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)処置の12か月後、＞900μMのPhe群の血漿フェニルアセチルグルタミン(PAG)は、4177±446.3nM〜3565±481.9nMで変化の無いままであり;＜360μMのPhe群のPAGレベルは、対照に関して正常化されて3133±452.2nMから1133±317.3nMへ低下した(対照=1167±150.0nM)(図23A)。血漿HVAは＞900μM群では変化無しのまま(27.6±3.2nM〜24.35±1.72nM)、対照群(42.1±2.45nM)よりも低く;血漿HVAは＜360μM群では、対照群に関して正常化されて、30.6±3.9nMから44.8±5.6nMへ増加した(図23B)。血漿MOPEGは＞900μM群では、38.2±2.9nMから50.9±5.3nMへ増加し;血漿MOPEGは＜360μM群では、対照群に関して正常化されて、49±6.4nMから70±5.4nMへ増加した(対照=61.0±4.1nM)(図23C)。最後に、血漿5HIAAは＞900μM群では変化無しのままで(13.4±0.8nM〜15.9±1.22nM)、対照未満であり(43.1±2.5nM);一方、血漿5HIAAは＜360μM群では対照レベルへ近づき、18.1±3.6nMから34.9±2.8nMへ増加した(p=0.0017)(図23D)。
【０２８８】
(6.10  実施例10:PKU罹患対象の神経伝達物質レベルは、血漿PHEレベルと関連する。)
＞900μM群(r=0.68;95% CI 0.48-0.72;p＜0.0001)及び＜360μM群(r=0.72;95% CI 0.52-0.84;p＜0.0001;図23E)において、血漿PAGが血漿Pheと相関することは、全濃度において血漿Pheの低下は、脳Pheの低下及び、それに続くPAGの低下へと導くことを示唆する。PAHEnu2マウスと同様に、血漿Pheレベル＜30uMの対象は、対照と同じ範囲のPAGレベルを維持した。
【０２８９】
＜360μM群(HVA:r=-0.42;95% CI -0.64--0.12;p=0.0075;MOPEG:r=-0.35;95% CI -0.60--0.049;p=0.0246)において、血漿HVA及びMOPEGのみが、血漿Pheと相関することは、ドーパミン及びノルエピネフリン代謝物レベルに対して明確な影響を与えるためには、より低い血漿Pheレベルが必要であることを示唆する。血漿5-HIAAは、＞900μM (r=-0.38;95% CI -0.61〜-0.088;p=0.0126)群及び＜360μM(r=-0.72;95% CI -0.84〜-0.53;p＜0.0001)群の両方において、血漿Phe低下と相関する(図23E〜L)。5-HIAAレベルが対照試料の範囲に達した場合は、＜360μM群において血漿5-HIAAは、より強く血漿Pheと相関する。
【０２９０】
各神経伝達物質代謝物及びPheの対象レベルの軌跡を、アッセイした12か月の試料へのベースラインについて分析した。＞900μM群では、PAG及び5-HIAAのPheに関する対象レベルの軌跡の大きさは中程度であり、少数の対象でのみ観察され、この群のHVA又はMOPEGでは軌跡の一貫した傾向は観察されなかった(図23M〜P)。Phe変化に関する神経伝達物質代謝物レベルの最大かつ最も一貫した変化は、＜360μM群で観察された。更に驚くべきことに、＜360μM群では、個々の対象の軌跡の大きさの傾向がより大きく、かつ1人を除くすべての対象が血漿Pheの低下と共にPAGの低下を経験した(図23Q)。HVAの場合、軌道に正の傾向が観察され;3人を除くすべての対象がPheの低下と共にHVAの増加を経験した(図23R)。同様に、MOPEGの場合、3人を除くすべての対象が血漿Pheの低下と共にMOPEGの増加を経験した(図23S)。5HIAAの場合、1人を除くすべての対象が12か月後に血漿Pheの低下と共に5HIAAの増加を経験した(図23T)。
【０２９１】
幾つかの実施態様では、対象からの2以上のアミノ酸、神経伝達物質、及び神経伝達物質代謝物の組み合わせを、PKUの診断及び/又は管理のために測定することができる。非限定的な例として、Phe及びＰAＧを、PKUの診断及び/又は管理のために測定することができる。
【０２９２】
(6.11  実施例11:PKU罹患対象における不注意スコアの改良は、血漿MOPEGレベルと関連する。)
注意欠陥多動障害評価尺度IV(ADHD RS-IVIA)の不注意下位尺度ドメインを使用して、PALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)処置したPKU罹患対象の臨床的な研究実験における、不注意の神経心理学的症状を評価した。平均不注意下位尺度スコアの改良は、長期間のPALYNZIQ(登録商標)(pegvaliase-pqpz)処置を継続している対象の平均血漿Pheの低下と関係していた。この関連性は、ADHD RS-IVIAスコアが≧9であることにより示されたベースラインでの不注意症状が報告されている対象において特に明白であった(Thomasらの文献、2018)。
【０２９３】
ノルエピネフリン及びドーパミンレベルの低下は、ADHD症状と関係があり、ノルエピネフリンの低下は、不注意症状と強く関係している兆候がある。従って、実施例10及び11記載のアッセイを使用して、ADHD RS-IVIAスコア並びに、ドーパミン及びノルエピネフリンの神経伝達物質代謝物であるHVA及びMOPEGそれぞれの変化の関係を探求した(図24)。ベースラインADHD RS-IVIAスコア≧9又は＜9を示す対象では、HVAとADHD RS-IVIAの変化の間に相関関係は認められなかった(図24A〜B)。ベースラインADHD RS-IVIAスコア≧9(r=-0.5434、p=0.0242)を示す対象では、MOPEG変化とADHD RS-IVIA変化との間に相関関係が認められた。(＞900μM及び＜360μM群の双方で)MOPEGレベルが上昇する場合のADHD RS-IVIAスコアの変化はネガティブであり、スコアの改良を示した。ベースラインADHD RS-IVIAスコア＜9を示す対象では、HVA又はMOPEGと、ADHD RS-IVIAスコアの変化との間の相関関係は認められなかった(図24C〜D)。
【０２９４】
幾つかの実施態様では、一人の対象からの2以上のアミノ酸、神経伝達物質、及び神経伝達物質代謝物の組み合わせを、ADHDの診断及び/又は管理のために測定することができる。非限定的な例として、ドーパミン/HVA、ノルエピネフリン/MOPEG、及び/又はセロトニン/5HIAAを、ADHDの診断及び/又は管理のために測定することができる。
【０２９５】
(6.12  実施例12:血漿又は脳ホモジネートの誘導体化)
96ウェルプレート中で、20μLの脳ホモジネート又は血漿を、内部標準を含む80μLの氷冷アセトニトリルで沈殿させた。遠心分離後、20μLの上清を10μLの100mM炭酸ナトリウム及び10μLのBzCl(6%(v/v)アセトニトリル溶液)を入れた新しいプレート内で誘導体化した。反応物を、60μLのギ酸(0.16%(v/v)水溶液)でクエンチした。
【０２９６】
(6.13  実施例13:LC/MSによる神経伝達物質の分析)
実施例12に記載した誘導体化された試料を、Sciex 6500 Q-Trap質量分光計に連結している、Acquity UPLC(Waters H-Class)でLC/MSにより、ポジティブ、スケジュール化されたMRMモードを使用して分析した。10μLをAcquity HSS C18カラム(2.1mm×150mm、1.8μM、100AポアサイズWaters 186003534)へ注入し、0.15%ギ酸(MPA)を含む10mMギ酸アンモニウム及びアセトニトリル(MPB)のグラジエントを使用して、流速0.5mL/分で、8分間で溶出した。
【０２９７】
各被検物質の設定を表2に示す。ピーク積分はMultiQuantソフトウェアを使用して行った。Quadrupole mass analyzer 1(Q1)及びQ3マスフィルター、溶出時間、デクラスタリング電位(DP)、エントランス電位(EP)、衝突エネルギー(CE)、及び衝突セルイグジット電位(CXP)は、各被検物質に対して最適化した。5HIAA、5-ヒドロキシインドール酢酸;DOPEG、3,4-ジヒドロキシ-フェニルエチレングリコール;HVA、ホモバニリン酸;MOPEG、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール;PAGlu、フェニルアセチルグルタミン酸;PAGly、フェニルアセチルグリシン;PEA-IS、フェニルエチルアミン同位体;PHE、フェニルアラニン;SRO、セロトニン;TYR-IS、チロシンヒドロキシラーゼ;TRP-IS、トリプトファンヒドロキシラーゼ。
(表2：各被検物質用のLC/MS設定)
【表２】
2021522811.tif 000011
【０２９８】
実施例12及び13に記載のアッセイを、実施例6〜11に記載の生物学的試料内のアミノ酸、神経伝達物質、及び神経伝達物質代謝物のレベルを測定するために使用した。
【０２９９】
(6.14  実施例14:RAAVベクターへ導入したPAH発現カセットの評価)
(6.14.1  野生型ヒト又はマウスPAHを発現するベクターの作成)
最初の研究実験は、野生型PAH cDNA(ベクター1;ApoE-HCR-hAAT.GI.hPAH.bGH;配列番号:15)を含む組換えAAV遺伝子療法ベクターで行った。マウス(muPAH)配列又はヒトPAH(hPAH)配列のいずれかをベクターへ挿入した。ベクターゲノムは、逆方向末端反復(ITR)由来のAAV血清型2(AAV2)に隣接し、PAHの発現は、ハイブリッドヒトアポリポタンパク質E(ApoE)/HCRエンハンサー/ヒトα抗トリプシン(AAT)プロモーターによって駆動された。ベクターゲノムには又、βグロビンイントロン配列(GI)及びウシ成長ホルモン(bGH)ポリアデニル化シグナルも含まれていた(図26)。配列番号15に示されるヒトPAH cDNAの2800bp長ベクターゲノム配列。ベクターは、例えば、Gibsonらの文献、(2009)"Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases". Nature Methods. 6 (5): 343-345、及びGibson DG.の文献、(2011)."Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments". Methods in Enzymology. 498: 349-361に記載のような従来のクローニング技術を使用して作成した。なお、これら文献は、引用により本明細書中に組み込まれている。
【０３００】
(6.14.2  AAV-PAHベクターの発現及び活性を試験するためのアッセイ)
本明細書で提供される組換えAAV PAHベクターを試験するためのアッセイには、例えば、(1)インビトロで、ヒト肝臓由来細胞株であるHepG2細胞へ、AAVベクター核酸を含む二本鎖DNAプラスミドの一過性トランスフェクションを行い、肝臓特異的なmRNA発現及びスプライシング、並びにPAHタンパク質産生及び分泌を確認する;(2)293細胞及びバキュロウイルスに感染した昆虫細胞内で、AAV PAHベクターを含むAAVウイルス粒子を生成させる;(3)アルカリ性ゲル分析及び複製アッセイによりAAVベクター核酸を評価する;及び(4)ENU2マウスにおけるPAH発現、PAH活性、及びPheレベルを評価する、ことが含まれる。
【０３０１】
(6.14.3  一過性トランスフェクションアッセイ)
予備的インビトロアッセイを、本実施態様のAAV PAHベクターからのPAH発現及び活性を比較するために行った。一の実施態様では、AAV PAHベクターのプラスミドは、ヒト肝細胞株のHepG2へ一過的にトランスフェクトする。トランスフェクション後、例えば24又は48又は72時間後、細胞内のPAH発現を測定する。このアッセイを使用すると、ApoE-HCR-hAAT.GI.hPAH.bGHベクターは、一過的にトランスフェクトしたHepG2細胞内でPAHタンパク質の発現が可能であることが示され(例えば、図47を参照のこと)、図51では定量化も提供された(WT-hPAHとして特定されたベクター)。
【０３０２】
(6.14.4  293細胞及びバキュロウイルスに感染した昆虫細胞内での、AAV PAHウイルス粒子生成)
本実施態様の組換えAAV PAHベクターが実際にPAHをコードする核酸をパッケージすることを示すために、上記で生成した二本鎖型AAV PAHベクター(例えば、配列番号:15〜23)を、AAVウイルス粒子を生成可能な細胞内に導入する。第一のAAVウイルス産生システムでは、二本鎖型AAV PAHベクター核酸を含むプラスミドが、AAV Cap及びRepタンパク質を発現するプラスミド並びにAAVウイルス粒子産生に必要なアデノウイルスヘルパー機能を発現するプラスミドと共に、293細胞に同時トランスフェクトされる。第二のAAVウイルス産生システムでは、バキュロウイルス構築物が生成され、AAV PAHベクター核酸及びAAV Cap及びRepタンパク質を発現し、更に次に昆虫Sf9細胞に同時感染する。一過的にトランスフェクトした293細胞又はバキュロウイルスに感染したSf9細胞内で生成されて得られるAAVウイルス粒子は、当分野で公知の標準的な方法により、精製されて分析される。
【０３０３】
(6.14.5  アルカリ性ゲルによる評価及び複製アッセイ)
アルカリ性ゲル電気泳動アッセイを使用して、パッケージされた核酸のサイズを決定する。複製センターアッセイ(replication center assay)を使用して、両方のパッケージング方法でどちらのAAV PAHベクターが無傷の形でパッケージングされているかを決定する。プライマー伸長アッセイを使用して、完全な末端を有する、即ち、AAV2 5'ITR(センス鎖)又は3'ITR(アンチセンス鎖)内のヘアピンループの5'末端で終結する、AAV PAHベクター核酸の量を定量する。或いは、PCRアッセイを使用して、AAV PAHベクター核酸が完全な末端を有する、即ち、AAV2 5'ITR(センス鎖)又は3'ITR(アンチセンス鎖)内のヘアピンループの5'末端で終結するかどうかを決定する。
【０３０４】
図27及び28に示すように、この特性評価が、アルカリ性ゲル電気泳動によって最初のAAV-PAHベクター(ApoE-HCR-hAAT.GI.hPAH.bGH)に実施されると、複数のバンドが観察された。ApoE-HCR-hAAT.GI.hPAH.bGHベクターは、hPAH-sc-AAV-DNA(図27)又はAAV-hPAHv1(図28)のいずれかとして同定される。プライマー伸長及びPCRアッセイを実施して、この二つの集団が自己相補的かつ一本鎖であることを確認した。hPAHに隣接するバキュロウイルス領域は、hPAH VG力価よりも約100〜300倍低いことが観察された。従って、〜4.2kbバンドの追加的な配列は、近くのバキュロウイルスDNAに由来するものではない。
【０３０５】
(6.14.6  PKU罹患マウスにおけるAAV-PAHの効果)
C57BL6-ENU2又はBTBRenu2マウスは、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子(PAH)遺伝子座におけるホモ接合型変異体であり、その結果、重度の高フェニルアラニン血症を有する動物である。高い血漿フェニルアラニン(Phe)レベルは、この動物を、血漿Pheを低下させるAAV-PAHの能力を評価し、同様に、血漿Tyr、成長速度、脳アミノ酸及び神経伝達物質等の他のパラメーター、並びに血漿ALT及び肝臓組織病理学等の、安全性バイオマーカーを評価するための、適切なモデルとしている。
【０３０６】
様々な用量レベルの(2e12vg/kg〜6e14vg/kg)ベクター又はビヒクル(リン酸緩衝食塩水;4ml/kg)を、雄又は雌C57BL6-Pahenu2マウス又はC57Bl6対照マウス(n=7〜10/群)へ、尾静脈を介して静脈内注射により第0日に投与した。投与前及び投与後２週間ごとに、各マウスの体重を測定して記録した。同じ時点で、各動物から血液を採取した。最終時点(投与後第5週又は第12週)で、血液及び組織試料を採取した。
【０３０７】
(6.14.7  血漿のPheレベル及びTyrレベル)
Enu2マウスを、マウスPAH(muPAH)又はヒトPAH(hPAH)いずれかを発現するアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)を2つの用量(2E13vg/kg及び2E14vg/kg)で処置した。AAV-PAHは、ApoE-HCR-hAAT.GI.mu/hPAH.bGHベクターで記載したように、AAV2血清型のITR及びAAV5血清型のカプシド遺伝子で構築した。Enu2マウス及び野生型マウスを同様に、対照としてのビヒクルで処置した。ウイルス投与後の様々な時点で、動物の各群から採取した血液試料内の血漿フェニルアラニン(Phe)レベル及びチロシン(Tyr)レベルを、QTRAP 4500質量分光計を備えたLC-MS/MSを使用して測定した。図29Aに示すように、ビヒクル処置したEnu2マウスは、ビヒクル処置した野生型マウスで測定されたレベルに対してフェニルアラニンレベルが増加した。
【０３０８】
高用量のAAV-PAH(2E14vg/kg)のEnu2マウスへの投与は、低用量(2E13vg/kg)とは異なり、フェニルアラニンレベルをビヒクル処置した野生型対照で観察されるレベルまで回復させた。これらデータは、血漿Pheレベルは、神経伝達物質代謝経路を野生型対照で見られるものへ回復させるために必要であるPKU治療薬の有効用量を決定するために、使用できることを示す。追加的な用量レベルの研究実験では、AAV5-PAH≧6e13vg/kgも又、血漿Pheレベルの正常化近くまで導くことを示した(図29B)。このように、2e13vg/kg及び6e13vg/kgは、ベクター操作によって効能を改良するためのベンチマークとして設定される。
【０３０９】
(6.14.8  成長速度)
成長速度も又、血漿試料回収前の体重測定に基づいて、対照としてのビヒクルで処置した未治療のEnu2及び野生型マウスで測定し、AAV-PAH治療したEnu2マウスと比較した(図30)。試験された両方の用量でのAAV-PAHでの治療は、体重増加率を有意に増加させた。
【０３１０】
(6.14.9  外被色)
Enu2マウスの高フェニルアラニン血症は、外被色の相対的な色素脱失と関係する。この効果は、フェニルアラニンによるメラノサイト中のチロシナーゼ酵素の競合的阻害のためらしい(Miyamoto M, Fitzpatrick T. Competitive inhibition of mammalian tyrosinase by phenylalanine and its relationship to hair pigmentation in phenylketonuria. Nature. 1957;179:199-200)。AAV-PAHの投与及び血清Pheレベルの正常化に続き、試験された両方の用量(2E13vg/kg及び2E14vg/kg)で、処置したマウスの外被色は徐々に暗くなった(図31)。この効果の出現は注射後の早い段階で認識できたが、8週には完全に明らかになった。
【０３１１】
(6.14.10  脳アミノ酸及び脳神経伝達物質)
フェニルアラニンのチロシンへのPAHを介した転換は、図32に示すように、多数の神経伝達物質の生成のための前駆体反応として働く。PKU患者におけるPAH活性の喪失は、血漿フェニルアラニンレベルの増加により示されるように、フェニルアラニンの蓄積を生じる。しかし、PKUの認知神経的な効果は、主に、多数の神経伝達物質及び代謝物の産生へ続く前駆体代謝性段階の喪失により引き起こされる。
【０３１２】
質量分析連結型高感度液体クロマトグラフィー(LC/MS)ベースのアッセイを使用して、様々なアミノ酸、神経伝達物質、及び神経伝達物質代謝物のレベルを測定した。簡単に言えば、アミノ酸、神経伝達物質代謝物、及び神経伝達物質をクロロギ酸エチル及びピリジン、又は、塩化ベンゾイル及び炭酸ナトリウムと反応させると、定義済の増加分子量を有する反応生成物が生成し、それはLC/MSを使用した同定及び定量化を可能にする。このアッセイは、未処置のEnu2マウス、野生型対照マウス、及び2つの用量(2E13vg/kg及び2E14vg/kg)の、ヒトPAH(AAV-PAH)を発現するアデノ随伴ウイルスベクターで処置したEnu2マウスから得られた生物学的試料の、アミノ酸、神経伝達物質、及び神経伝達物質代謝物のレベルを測定し、神経伝達物質生成に対するPAH喪失の効果を決定するために使用した。AAVは、ApoE-HCR-hAAT.GI.mu/hPAH.bGHベクター及びAAV5血清型のカプシド遺伝子で構築した。
【０３１３】
図32に示すように、脳試料内では、未処置のEnu2マウスは、野生型マウスと比較して一貫して低レベルの神経伝達物質及び神経伝達物質代謝物を示した。Enu2マウスは、野生型マウス脳内で見られるレベルと比較して、その脳内で、低レベルのチロシン、ドーパミン、及びノルエピネフリンを有した。これらのデータは、PAH活性の喪失は多くの重要な神経伝達物質の低下をもたらすことを確認す。高用量のAAV-PAH(2E14vg/kg)をEnu2マウスへ投与すると、低用量(2E13vg/kg)と異なり、フェニルアラニン、チロシン、ドーパミン、及びノルエピネフリンのレベルは、ビヒクル処置した野生型対照で観察されるレベルまで回復した。これらデータは、ある種のアミノ酸、神経伝達物質、及び神経伝達物質代謝物の脳内レベルは、神経伝達物質代謝経路が野生型対照で見られるものまで回復するために必要なPKU治療薬の有効用量を決定するために使用できることを示す。
【０３１４】
(6.14.11  有効性持続期間)
AAV5-muPAH(ApoE-HCR-hAAT.GI.muPAH.bGHベクター)がENU2マウスへ投与されてからの薬効が有効な期間を決定するために、血漿PheレベルをAAVベクター投与後2週間ごとにモニターした。60週後(研究実験進行中)、最適ではない用量2e13vg/kgで有効性の低下が見られたが、2e14vg/kg用量では薬効は維持されていた(図33)。
【０３１５】
(6.14.12  予備的な安全性データ)
予備的な安全性の研究実験を2E13又は2E14vg/kgのAAV5-hPAHで処置した野生型動物で行ったところ、処置されたマウスにおけるPAHタンパク質のレベルは増加したことがウエスタンブロットによって測定されたにもかかわらず(図35)、肝酵素アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)の増加はなく(データは示さず)、WTと比較したPheレベルの変化は最小であり(図34)、肝細胞損傷又は細胞死の組織学的証拠はなかった(例えば、TUNEL染色で確認されず)(図36)。
【０３１６】
(6.15  実施例15:イントロン配列を組み込んだAAV-PAH構築物の作成)
追加的な組換えAAVベクターを作成するために、バキュロ産生システムにより、異質な異成分から成るプロセシングを回避し、かつ、機能的PAHの発現を増加させるようなAAVパッケージング容量に近づけるように操作し、構築物を代替的イントロン配列で作成した。幾つかの実施態様では、構築物は、hPAH第二イントロンの切断型バージョンを含んでいた。別の実施態様では、構築物は、複合型のグロビン/AIATイントロン(配列番号14で提供されている)又はその切断型バージョンを含んでいた。これら構築物は、前記実施例1の通り、標準的なDNAクローニング技術を使用して作成し、その代表的配列を、それぞれ配列番号:19及び17に示す。
【０３１７】
ApoE-HCR-hAAT.GI.hPAH.bGHベクター中のhPAH配列の発現を増加させる最初の試みでは、2116塩基対(bp)切断型hPAH第二イントロンを、hPAHコード化配列(ApoE-HCR-hAAT.hPAH-tI2.bGH)中のエクソン2及び3間に挿入した(図37)。イントロンの挿入は、例えば、インターフェロン遺伝子等のイントロンのない遺伝子において、mRNA発現のレベルを増加させる可能性があることが知られている。しかし、この場合、肝臓内で活性なプロモーターを含むことが知られているため、イントロン1は使用しなかった。又、切断型hPAH第二イントロンは、ESEファインダーによって切断ジャンクションで検出されるエクソン性スプライシングエンハンサーを持たない。このベクターは又、AAVパッケージング容量に近づけるように操作された。
【０３１８】
(6.15.1  ApoE-HCR-hAAT.hPAH-tI2.bGHベクターで処置したENU2マウスの血漿Pheレベルの測定)
マウスへ様々な濃度のApoE-HCR-hAAT.hPAH-tI2.bGHベクターを注射し、血液試料を毎週採取し、血漿フェニルアラニン濃度を評価した(図38)。同腹仔対照と比較して、高レベルのフェニルアラニンが、注射前のPAH KO/Enu2マウス内で検出され、ベクター注射後第2日に、血漿フェニルアラニンレベルは、2E14vg/kg用量を与えたマウスで低下し、6E13及び2E13vg/kg群でもより少ない範囲で低下した一方、対照は安定したままだった。この結果は、ApoE-HCR-hAAT.hPAH-tI2.bGHベクターの2E14vg/kg用量での単回注射は、欠乏しているPAHをレスキューし、血中のフェニルアラニンの病理学的な蓄積を減少させることを示す。しかし、ApoE-HCR-hAAT.hPAH-tI2.bGHベクターは、血漿Pheレベルの低下に関しては、6E13vg/kg用量で第2日の時点で野生型レベルまでのPhe低下を達成したApoE-HCR-hAAT.GI.hPAH.bGHベクターほど効果的ではなかった(図29B参照)。
【０３１９】
(6.15.2  ApoE-HCR-hAAT.hPAH-tI2.bGHベクターで治療したENU2マウス脳内のアミノ酸及び神経伝達物質レベル)
上記実施例14に記載の神経伝達物質アッセイを使用して、アミノ酸、神経伝達物質、及び神経伝達物質代謝物のレベルも又、ApoE-HCR-hAAT.hPAH-tI2.bGHベクターで処置したマウスで測定した。図39に示すように、2つの最高用量(2E14vg/kg及び6E13vg/kg)のApoE-HCR-hAAT.hPAH-tI2.bGHベクターで処置したEnu2マウスでは、低用量(≦2E13vg/kg)と異なり、アミノ酸であるフェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンのレベル(図39A)、並びに神経伝達物質ノルエピネフリンのレベル(図39B)は、ビヒクル処置した野生型対照で観察されるところまで回復した。
【０３２０】
(6.15.3  大型イントロン-ベクター1(ApoE-HCR-hAAT.cG-AIATI.hPAH.bGH))
次の試みとして、1815bp複合型のグロビン/AIATイントロン(配列番号:14)を、hPAHコード化配列(ApoE-HCR-hAAT.cG-AIATI.hPAH.bGH)の前に挿入した(図40)。このイントロンも又ベクターの全サイズをAAVパッケージング容量に近づけるように操作した。このヌクレオチド配列は、ApoE-hAATプロモーター、それと共に複合型のグロビン/AIATイントロン、野生型ヒトPAHコード化配列、及びbGHポリ(A)配列を含み、配列番号17に示される。
【０３２１】
このベクターのインビトロ及びインビボ評価は、コドン最適化ベクターとの比較と共に実施例17に含まれる。
【０３２２】
(6.16  実施例16コドン最適化AAV-PAH構築物の作成)
ApoE-HCR-hAAT.GI.hPAH.bGHベクターにおいてhPAHの発現を更に増加させるための別の試みでは、追加的な組換えAAVベクターを、コドン最適化PAHコード化配列で作成した(配列番号:7〜13参照)。上記のように、これら構築物は、標準的なDNAクローニング技術を使用して作成され、コドン最適化配列番号7配列を含む代表的ベクター配列は、配列番号:16に示される。
【０３２３】
(6.16.1  コドン最適化PAHの作成)
本発明者らは、cDNAにおいてまれにしか使用されないコドンを、哺乳類遺伝子においてより一般的に見られるものに置き換える(「コドン最適化」)ことは、遺伝子導入に引き続くhPAH発現の増加を生じるであろう、という仮説を試験するために、代替的なhPAH構築物(codop-PAH)を設計した。凝固因子VII、VIII及びIXに関する類似の試行も、野生型の同族と比較した場合に最大10倍まで発現を改良した(例えば、米国特許番号第9,393,323号を参照のこと)。codop-hPAHの操作戦略には、hPAHアミノ酸配列を、高度に発現される哺乳類の遺伝子内に最も頻繁に見られる一連のコドンで逆翻訳することも含まれた。次に、この改変された配列を注意深くスキャンし、コドンを更に改変して、mRNA安定性を改良し、過剰なCpGジヌクレオチドや潜在的なスプライス部位等の望ましくない配列を削除した。
【０３２４】
本発明者らは、上記のような６つの異なるコドン最適化の方法であり、下記を含む方法を採用した:
【０３２５】
GENEius 1/2(Operon １)-CpGジヌクレオチド含量を手動で低下させ、かつ、センス及びアンチセンス方向の余分なORFを除去することと組み合わせた、Operon/Eurofins Genomincsコドン最適化ソフトウェア、
【０３２６】
Nathwani (NW2-Cop)-Amit Nathwaniが第VIII因子コドン最適化に使用したコドン使用頻度表を使用してコドンを最適化した、
【０３２７】
Nathwani-RCG(NW-RCG)-CpGジヌクレオチド含量を手動で低下させ、かつ、センス及びアンチセンス方向の余分なORFを除去すると共に、Amit Nathwaniが第VIII因子コドン最適化に使用したコドン使用頻度表を使用してコドンを最適化した、
【０３２８】
ATUM(DNA2.0-op/D20-P)-DNA2.0コドン最適化アルゴリズムを使用してコドンを最適化した、
【０３２９】
ATUM-RCG(DNA2.0-Cop1)-CpGジヌクレオチド含量を手動で低下させ、かつ、センス及びアンチセンス方向の余分なORFを除去すると共に、DNA2.0コドン最適化アルゴリズムを使用してコドンを最適化した、
【０３３０】
JCAT(JCAT)-CpGジヌクレオチド含量を手動で低下させ、かつ、センス及びアンチセンス方向の余分なORFを除去すると共に、Javaコドン適応ツール(www.jcat.de)を使用してコドンを最適化した。
【０３３１】
codop-hPAH配列の配列アラインメントを図41に提供し、配列同一性パーセント、GC含量を比較する図表及び分岐図関係を有する図42と共に示す。
【０３３２】
(6.16.2  コドン最適化hPAHベクター操作)
最終的な遺伝子操作したcodop-hPAH配列は、野生型hPAH配列からの46〜316の単一bp変化をどこにでも含み、野生型配列のG＋C含量47%に対して、G＋C含量は通常47〜57%である。本発明者らは、様々な構成で、ApoE/hAATプロモーター下でcodop PAHバリアントを、その標準的なrAAVベクター(Nathwani A.らの文献、Blood. 2007 February 15; 109(4): 1414-1421)にクローン化した(図43参照)。好ましい実施態様では、codop-PAHは、ApoE-hAATプロモーター、それと共に複合型のグロビン/AIATイントロン、ヒトPAHのコドン最適化配列、及びbGHポリ(A)配列を含むベクターにクローン化した。好ましい複合型のグロビン/AIATイントロンは、配列番号14の配列を有する。
【０３３３】
(6.16.3  コドン最適化hPAH AAVベクターでのHepG2形質導入)
HepG2肝細胞株でのこれらコドン最適化hPAH AAVベクターの評価(図44)は、GENEius 1、GENEius 2 及びJCATが、WT-hPAHよりも有意に発現増強を示したことを示した。まとめると、従って、これらデータは、本発明者らのcodop-PAH分子がWT-hPAHよりも強力であることを示唆する。とりわけ、GENEius 1(ApoE-HCR-hAAT.GI.hPAHco1.bGH)及びGENEius 2(ApoE-HCR-hAAT.GI.hPAHco2.bGH)ベクタープラスミドは、一貫してrAAV-WT-hPAHよりも50〜100%高いベクター収量を生じる。
【０３３４】
第0日に、HepG2細胞を、12ウェルプレートに5E5細胞/ウェルで播種した。第1日に、細胞を1.25E5から1E6の範囲のMOI及び20uMエトポシド条件で形質導入した。第2日に培地を交換した。第4日に、培地を除去してTrypLEで剥離して細胞を収集し、続いて血清含有培地(media)で中和し、DPBSで細胞を洗浄し、細胞ペレットを凍結した。発現分析を、TPER＋4mM BMeでの細胞溶解、不溶性細胞破片の除去、A280によるタンパク質濃度の測定、20ugのタンパク質ロードでのSDS-PAGE、並びに、抗PAHマウスモノクローナル一次Ab及びウサギ抗マウスHRP接合型二次Abを使用したWBにより行った。
【０３３５】
(6.16.4  AML12AAV-codophPAHベクターでの形質導入)
AML12細胞は、マウス肝細胞由来の細胞である。第0日に、細胞を、12ウェルプレートに5E5細胞/ウェルで播種した。第1日に、細胞を、1E6のMOI及び20uMエトポシド条件で形質導入した。第2日に培地を交換した。第4日に、培地を除去してTrypLEで剥離して細胞を収集し、続いて血清含有培地で中和し、DPBSで細胞を洗浄し、細胞ペレットを凍結した。発現分析を、TPER＋4mM BMeでの細胞溶解、不溶性細胞破片の除去、A280によるタンパク質濃度の測定、80ugのタンパク質ロードでのSDS-PAGE、並びに、抗PAHマウスモノクローナル一次Ab及びウサギ抗マウスHRP接合型二次Abを使用したWBにより行った。図45に示した結果は、第1〜4日の血清含有培地及び血清フリーの培地(SFM)の使用比較を示し、後者の場合は、以前、肝細胞類似の転写制御を誘導することが開示されていた。コドン最適化hPAHの発現パターンを比較すると、SFM中で維持された細胞は、マウスのインビボ実験と同様に、HepG2細胞での我々の結果と一致した。
【０３３６】
(6.16.5  コドン最適化AAV-PAHベクターで処置したENU2マウスの血漿Pheレベルの測定)
Enu2マウスへ、2E13vg/kgの各コドン最適化AAV-PAHベクター、ビヒクル又は、野生型PAH配列を有するAAVベクターを注射した。血液試料を毎週採取して、血漿フェニルアラニン濃度を評価した(図46A〜B)。同腹仔対照と比較して、高レベルのフェニルアラニンが、注射前のENU2マウス内で検出された。ベクター注射後第6週で、ENU2マウスの血漿フェニルアラニンレベルは低下した一方、対照は安定したままだった。この結果は、PAH KO/ENU2マウスへのコドン最適化AAV-PAHの単回注射は、欠乏しているPAHをレスキューし、血中のフェニルアラニンの病理学的な蓄積を減少させることを示す。
【０３３７】
AAV-codop PAH構築物での処置の効果を、異なる構築物間での体重対Phe低下関係として更に評価した(図47)。GENEius 1(ApoE-HCR-hAAT.GI.hPAHco1.bGH),GENEius 2(ApoE-HCR-hAAT.GI.hPAHco2.bGH)及びJCAT(ApoE-HCR-hAAT.GI.hPAHco3.bGH)構築物は、Pheレベル低下に最も効果を有することが証明され、それは又、より体重%での大きな増加とも相関した。
【０３３８】
(6.17  実施例17コドン最適化AAV-PAH構築物とイントロン挿入との比較)
一連の実験を実施して、更に、先導的(lead)コドン最適化ベクター(ApoE-HCR-hAAT.GI.hPAHco1.bGH)と先導的イントロンを挿入したベクター(ApoE-HCR-hAAT.cG-AIATI.hPAH.bGH)とで、機能性及び有効性を比較した。
【０３３９】
(6.17.1  HepG2一過性トランスフェクション)
第0日に、HepG2細胞を、12ウェルプレートに5E5細胞/ウェルで播種した。第1日に、細胞を、1ug DNA/ウェルで、FuGene HD:DNA混合比4.5：1で用いてトランスフェクトした。第2日に培地を交換した。第4日に、培地を除去してTrypLEで剥離して細胞を収集し、続いて血清含有培地で中和し、DPBSで細胞を洗浄し、細胞ペレットを凍結した。発現分析を、TPER＋4mM BMeでの細胞溶解、不溶性細胞破片の除去、A280によるタンパク質濃度の測定、20ugのタンパク質ロードでのSDS-PAGE、並びに、抗PAHマウスモノクローナル一次Ab及びウサギ抗マウスHRP接合型二次Abを使用したWBにより行った。図48A〜Bのデータは、V1(ApoE-HCR-hAAT.GI.hPAHco1.bGH)、V1＋LGイントロン(ApoE-HCR-hAAT.cG-AIATI.hPAH.bGH)、Geneius 1(ApoE-HCR-hAAT.GI.hPAHco1.bGH)及びベクター2(ApoE-HCR-hAAT.cG-AIATI.hPAHco1.bGH)の比較を提供する。結果は、LGイントロンがV1に含まれる利点、及びGeneius 1＋LGイントロンベクターは少なくともGeneius 1単独と同じくらい強力であることを示す。
【０３４０】
(6.17.2  改良された効能を有するベクターでの投薬応答)
増量した用量のApoE-HCR-hAAT.GI.hPAHco1.bGH又はApoE-HCR-hAAT.cG-AIATI.hPAH.bGHをENU2マウスへ送達し、Pheレベルを低下させる効率を決定した。AAV5-PAHベクターをコドン最適化PAH遺伝子、大型イントロンを含むように改変し、これらの改変の効果をENU2/PKUマウスモデルで試験した。
【０３４１】
GENEius-1、又は大型イントロンで改変したAAV5-PAHの用量応答曲線を図49Aに示す。AAV5-PAHバリアントを、グラフに示されているvg/kg用量でENU2マウスへ投与し、血漿Pheを測定した。図49Bは、AAV投与後第2週での用量応答を示し(ENU2マウスはプロットしていない)、図49Cは、AAV投与後第4週での用量応答を示すが、用量応答変化を強調するためにｙ軸を狭めている(ENU2マウスはプロットしていない)。
【０３４２】
(6.17.3  GENEius-1及び大型イントロンのAAV-PAH構築物間のPAH体内分布の比較)
図50は、AAV-PAH処置における肝臓組織内のPAH生体内分布の変化特性を表す。AAV5-PAHベクターを、コドン最適化PAH遺伝子、大型イントロンを含むように改変し、肝臓肝細胞におけるPAHタンパク質の発現を、標準的技術を使用してIHCによって決定した。PAHタンパク質を、標準的なＩＨＣ技術を使用して染色し、陽性細胞の%を決定し、AAV5-PAH用量(vg/kg)に対してプロットした(図50A)。大型イントロン又はGENEius-1の構築物いずれかの用量を増やすと、PAHを発現する肝細胞の割合が増大することが観察された。しかし、各用量でのGENEius-1構築物と大型イントロン構築物との間ではPAH陽性肝細胞の%に有意差はなかった。これらAAV5-PAHベクターを2e13vg/kg(図50B)及び1e14vg/kg(図50C)で投与したENU2マウスから得られた肝臓のIHC画像は、両方のケースにおいてPAHの大部分は中心静脈の周りのエリアに限られ、かつ門脈周辺エリアに最小分布が見られた。従って、PAHタンパク質発現は、全ての用量レベルで、中心静脈の周囲の肝細胞で観察されることが明らかである。
【０３４３】
(6.18  実施例18コドン最適化及びイントロン挿入を組み合わせたAAV-PAH構築物の作成)
(6.18.1  ENU2マウスへのベクター2の投薬応答)
用量応答の動力学を評価するために、血漿Pheを肝臓におけるPAH活性の代理マーカーとして使用する。ENU2/PKUマウスモデルへAAV5-PAHバリアントを投与後、AAV投与後2週間以内に血漿Pheの低下が観察された。この応答は、5週間までは安定したままであったし、他の研究実験に基づいて延長した期間中も安定したままだった(図51A)。ENU2マウスに投与されたAAV5-PAHバリアントの用量応答も又、第2週の時点でグラフ化され、異なる用量の有効性の違いをより明確に示した(図51B)。Gene 1(Geneius-1バリアント)及びLgイントロン(大型イントロンバリアント)を、4e13vg/kgで参照(基準)対照として使用した。ベクター2を、雄及び雌ENU2マウスに異なる用量で投与し、有効性を他のAAV5-PAHバリアントと比較した。
【０３４４】
ベクター2の用量と雄及び雌ENU2マウスにおける有効性との間の相関関係は、図52に更に例示するが、雄及び雌ENU2マウス間でベクター2の有効性にわずかな違いが観察されただけであった。
【０３４５】
AAV5-PAHバリアント(GENEius-１及び大型イントロン)とベクター２との間の用量応答の比較を図53に示す。2e13vg/kgで投与した場合、第2週でのENU2マウスの血漿Phe低下におけるベクターの応答をプロットする。グラフは、他のAAV5-PAHバリアントと比較した場合、ベクター2が2e13vg/kgで血漿Pheを低下させる効果が高いことを示す。
【０３４６】
(6.19  実施例19AAV-PAH構築物の安全性分析)
(6.19.1  血漿ALTレベル)
血漿中のアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)活性は、肝細胞の健康状態の指標として使用でき、高レベルのALTは肝細胞毒性を示す。血漿試料は、AAV5-PAHの投与前(図54A)及び投与後第2週(図54B)にマウスから採取され、血漿ALTは市販のキット(Sigma)を使用して測定した。グラフは、異なる用量でのAAV5-PAHの投与は、ALTレベルの感知可能な変化をもたらさなかったことを示す。
【０３４７】
(6.19.2  毒性測定に使用したTUNEL染色)
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニックエンドラベリング(TUNEL)は、アポトーシスシグナル伝達カスケードからの細胞死の結果としてのDNA断片化を検出するために使用される酵素アッセイである。AAV5-PAHバリアントで処置したマウスからの肝臓切片のTUNEL陽性細胞を評価し、異なる用量でのAAV5-PAH投与後でもTUNEL陽性細胞は最小変化であることを観察した(図55)。
【０３４８】
(6.19.3  炎症レベルを決定するために使用したIBA及びH&E染色)
肝臓の健康状態を更に測定するために、IBA及びH&E染色法を使用してAAV-hPAHを投与した動物のマクロファージ浸潤を検出した。イオン化カルシウム結合性アダプター分子1(IBA1)としても知られる同種移植片炎症性因子1(AIF-1)は、活性化されたマクロファージ内で観察される。活性化されたマクロファージは、炎症のある組織内で見いだされる(図56A)。AAV5-PAHバリアントで処置したマウスから得た肝臓切片の、IBA1陽性細胞/凝集体(foci)を評価し、AAV5-PAH投与後の炎症及びマクロファージ浸潤の程度を決定した(図56B)。異なる用量でのAAV5-PAH投与後でも、IBA1陽性凝集体細胞は最小変化であることが観察された。
【０３４９】
肝臓組織のH&E(ヘマトキシリン及びエオシン)染色を、AAV5-PAHバリアントで処置したマウスに行い、野生型マウスの染色パターンと比較した。染色パターンは、野生型マウスとAAV5-PAHバリアントで処置したマウスとの間では、組織学的に最小限の差異が示された(図57A〜C)。
【０３５０】
上記より、使用されたAAV5-PAHベクター及び用量は、有意な肝臓病理組織が欠如しているので、ENU2マウスにおいて無発病性である可能性が高い。
【０３５１】
(6.20  実施例20:改良されたプロモーター/エンハンサー配列を有する構築物の作成)
機能的PAHの発現を増加させる強力なプロモーターを有する組換えAAVベクターを追加的に作成するために、改変されたエンハンサー及び/又はプロモーター配列を有する構築物を作成した。具体的には、構築物は、チロキシン結合グロブリン(TBG)プロモーター又はトランスサイレチン(TTR)プロモーター(例えば、配列番号:22及び23を参照のこと。)等の代替的肝臓特異的プロモーターを使った標準的なDNAクローニング技術を使用して構築した。他の適切なプロモーターには、ヒトアルブミン(Miyatakeらの文献、J. Virol, 71 :5124 32 (1997))、humAlb;肝臓特異的プロモーター(LSP)、及び肝炎Bウイルスコアプロモーター(Sandigらの文献、Gene Ther., 3: 1002 9 (1996) が含まれる。例えば、肝臓特異的遺伝子プロモーターデータベース、Cold Spring Harbor, rulai .schl .edifLSPDを参照のこと。求められる程度は低いが、ウイルス性プロモーター、合成プロモーター、構成型プロモーター、調節可能プロモーター(例えば、国際公開番号WO2011/126808及びWO2013/04943号を参照)、又は生理学的合図に応答するプロモーター等の他のプロモーターも、本明細書に記載されたベクター内で使用することができる。
【０３５２】
(6.21  実施例21:遺伝子療法は、ENU2マウスのPAH活性を回復させる)
(6.21.1  AAV5-PAHベクター操作)
ヒトPAH(hPAH)又はマウスPAH(muPAH)遺伝子の、アデノ随伴ウイルス血清型5(AAV5)を介した (肝臓特異的プロモーターによる)送達を、本研究実験で使用した。
【０３５３】
(6.21.2  インビボ研究実験)
全ての研究実験は、カリフォルニア州Buck Institute、Novato所在の動物施設内の、BioMarin’s Translational Biology Departmentが行った。動物の飼育及び実験のプロトコルは、Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)によって承認された。雄ENU2マウス(C57BL/6-Pahenu2)及び野生型(WT)対照マウス(C57BL/6J)は、Jackson Laboratoryから受領した。
【０３５４】
８週齢のENU2マウスへ、AAV5-muPAH又はビヒクル対照を尾への静脈注射で投与した。野生型マウスをビヒクルで処置した。血液試料を、投与後2週間ごとに尾静脈切り込みによって採取した。研究実験の終了時に、心臓穿刺により血液を採取し、組織(脳及び肝臓)をリン酸緩衝食塩水で灌流してから採取した。
【０３５５】
マウスの血漿Phe及びTyrレベルをLC-MS/MSによって測定し、血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)を、製造者の指示に従ったイムノアッセイ(Sigma Aldrich)によって測定した。図58Aに見られるように、AAV5-muPAHで処置したENU2マウスの血漿Pheレベルは、投与後第2週にはWTレベルに回復した。この効果は、研究実験の存続期間(80週間)を通じて持続した。80週間の研究実験期間を通して、野生型マウス、ビヒクルで処置したENU2、及びAAV5-muPAHで処置したENU2の間でALTレベルに統計的差異は観察されなかった(図58B)。ビヒクル投与したENU2マウスは薄茶色のままであった一方、AAV5-muPAHで処置したENU2マウスは外被色が、WT対照が示す外被色と同様の暗褐色に変化した(図58C)。これらのデータは、WTレベル近くまでの血漿Pheの持続的な低下が、単回投与遺伝子治療によって達成されたことを示す。
【０３５６】
脳アミノ酸及び神経伝達物質代謝物へのヒトPAHの効果を検査するために、ENU2マウスをAAV5-hPAHで処置した。12週間後、凍結させた大脳半球をホモジナイズし、得られたライゼートを、Phe、Tyr、トリプトファン、5-ヒドロキシインドール酢酸(5-HIAA)、ホモバニリン酸(HVA)、及び3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール(MOPEG)のLC-MS/MS測定用に処理した。図59に見られるように、AAV5-hPAHによる処置は、脳アミノ酸(Phe、Tyr、及びトリプトファン)レベルを正常化し(図59A)、セロトニン、ドーパミン及びノルエピネフリンにそれぞれ由来する脳神経伝達物質代謝物である、5-ヒドロキシインドール酢酸(5-HIAA)、ホモバニリン酸(HVA)及び3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール(MOPEG)レベルも同様であった(図59B)。
【０３５７】
肝臓PAHタンパク質の発現へのヒトPAHの効果を検査するために、AAV5-hPAHで処置した野生型マウスを、12週にわたって低フェニルアラニン(症)での証拠のために検査した。図60Aは、AAV5-hPAHで処置した野生型マウスが、研究実験の期間を通して正常なPheレベルを有したことを示す。12週間の研究実験の終了では、凍結させた肝臓切片をホモジナイズし、得られたライゼートを還元し、アキレートし(akylated)、トリプシン(Promega)で消化した。PAHレベルを、マウス及びヒト両方のPAHに共通するペプチドを使用してLC-MS/MSによって測定した。AAV5-hPAHで処置した野生型マウスは、図60Bに示すように、PAHタンパク質レベルが２倍に増加した。
【０３５８】
これらのデータは、WTレベル近くへの血漿Pheの持続的な低下が、単回投与の遺伝子療法によって達成できることを示す。更に、脳アミノ酸及び神経伝達物質代謝物も又、処置によりWTレベルに正常化し、AAV5-hPAHで処置したWT動物ではPheレベルが参照基準範囲を下回らなかった。要約すると、これらの実験は、PAH活性の回復に基づく遺伝子療法は、PKU治療のための利用可能な治療アプローチであるという証拠を提供する。
【０３５９】
(6.22  実施例22:PAHEnu2マウスにおけるAAV5-HPAH遺伝子療法後のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)肝臓分布及び特性評価)
(6.22.1ヒトPAH導入遺伝子の体内分布)
ENU2マウスへ、単回用量のAAV5-hPAHを、尾への静脈注射で投与した。動物をベクター投与後第12週で安楽死させ、食塩水で灌流し、次に肝臓を採取した。全ての中葉肝臓試料を4%パラホルムアルデヒドで48時間固定し、受領後1か月以内にパラフィン包埋のための日常的な処理をした。
【０３６０】
マウス肝臓を切片化し、Roche Ventana Autostainerを使用して製造者の指示に従って(AＣＤ)インサイチュハイブリダイゼーションを実施した。動物ごとに10枚の40倍画像を撮影し、肝細胞をDABシグナルに対して陰性又は陽性のいずれかでスコア付けした。図61は、PKUのマウスモデルにおける肝臓組織内の、AAV5-hPAHベクターゲノム及び導入遺伝子由来のPAHタンパク質の生体内分布を示す。hPAH DNA及びタンパク質の両方に対して陽性に染色される肝細胞数の用量依存的な増加が、ENU2マウス肝臓内で検出された(図61A〜C)。門脈周囲領域と比較した場合、肝小葉の中心領域周辺にはベクターDNA及びタンパク質の両方がより豊富に存在していた。
【０３６１】
(6.22.2  AAV5-hPAH投与後の炎症及びアポトーシスの評価)
上記の通り、ENU2マウスへ単回用量のAAV5-hPAHを投与し、ベクター投与後第12週で肝臓を採取した。AAV5-PAH遺伝子療法及び導入遺伝子由来のPAHタンパク質の、肝臓の安全性に対する効果を評価するために、肝臓をFFPE及び免疫組織化学(IHC)のために処理して、炎症誘発性マーカーを検出した。図62A〜Cは、AAV5-hPAHの投与時に検出されたIBA1(合計)及びCD68(M1/M2活性化)マクロファージの数がわずかに増加したこと、炎症誘発性マクロファージマーカーであるiNOS(M1活性化)には有意な染色が検出されなかったことを示す。更に、肝細胞壊死、クッパー細胞過形成、及び門脈三管の炎症又は線維症等の免疫組織学的特徴は観察されず、このことはAAV5-hPAH投与後に肝臓の健康状態は維持されることを示唆する。図62Dは、染色された切片の定量化を示す。
【０３６２】
FFPE肝臓の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニックエンドラベリング(TUNEL)染色は、ビヒクル処置した野生型マウス又はビヒクル処置したENU2マウスと比較した場合、遺伝子療法処置群のいずれにおいてもアポトーシス性細胞死の有意な増加を示さなかった。図63は、画像化されたTUNEL染色肝臓切片を示し、画像分析は、ImageJを使用して実行した。動物あたり約14,000〜17,000個の核が数えられた。これらのデータは、AAV5-hPAHベクター投与後の細胞死の増加の病理組織学的な証拠が観察されなかったことを示し、炎症を示す兆候も存在しなかった(図62〜63)。これらのデータは、hPAHのAAV5を介した遺伝子送達が、有望なPKU罹患患者の治療アプローチとして実行可能な選択肢であろうことを裏付ける。
【０３６３】
(6.23  実施例23:ベクター2の効果)
実施例17(図48)及び実施例18(図51〜53)に記載のベクター2を、更なる研究実験のために選択した。
【０３６４】
(6.23.1  カニクイザルにおけるベクター2 DNAの体内分布)
ベクター2を、静脈注射によって2つの用量レベル(高及び低)で送達した。雄及び雌カニクイザルを、投与後第4週に安楽死させた。リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)アッセイを使用して、カニクイザルの血液及び組織から抽出されたゲノムDNA(gDNA)中のベクター2のベクターDNA量を定量化した。図64は、このIVベクター2投与後のベクター2 DNAの体内分布が、肝臓を主要標的臓器とした場合に、AAV5カプシドに関して公表された研究文献と一致することを示す。他の組織で検出されたDNAの量を、肝臓で観察されたDNAのパーセンテージとして表してある。脾臓は肝臓の次に最も多いベクターDNAの量を有し(黒四角)、精巣と卵巣は肝臓に比べて最も少ない量を表す(黒丸)。
【０３６５】
(6.23.2  カニクイザルにおけるフェニルアラニン及びチロシンに対するベクター2の効果)
ベクター2を、上記ように、2つの用量レベル(高及び低)で静脈注射によって送達した。雄及び雌カニクイザルから、投与後4週間ごとに、定期的に血漿を採取した。アセトニトリル沈殿及びHPLC/MS/MS(C18 HPLCカラムと、それに続く三連四重極質量分光計)を使用して、カニクイザルのリチウムヘパリン血漿中のフェニルアラニン及びチロシン濃度を決定した。
【０３６６】
血漿フェニルアラニン及びチロシンは、研究実験の期間(４週間)を通して一貫していた(図65)。内因性PAHはアロステリックに制御されることが知られており、これらのデータは、遺伝子療法を介して送達されるPAHも又アロステリック制御の対象であることを示す。この制御は、低フェニルアラニン血症(hypo-phenylalanininemia)のリスクを最小化するものである。
【０３６７】
(6.23.3  ENU2マウスへのベクター2の投与は、脳ホモジネート中のアミノ酸レベルの修正を生じた)
雌及び雄ENU2マウスへ、様々な用量のベクター2を投与した。12週間後、マウスを犠牲にし、脳ホモジネートを分析して特定のアミノ酸のレベルを決定した。図66に示すように、雄及び雌両方のマウスは、ベクター2の投与において、Pheの明確に用量依存的なWTレベルへの減少を示した。脳Pheの完全な修正が、ベクター2を6E13vg/kg用量で雄マウスへ、2E14vg/kg用量で雌マウスへ投与すると見られた(図66A)。ENU2雄への2E13vg/kg用量、ENU2雌への6E13vg/kg用量のベクター2は、脳TyrをWTレベルまで増加させた(図66B)。ENU2雄へ2E13vg/kg用量、ENU2雌へ2E14vg/k用量のベクター2は、脳TrpをWTレベル近くまで増加させた(図66C)。
【０３６８】
(6.23.4  ENU2マウスへのベクター2の投与は、脳ホモジネート内の神経伝達物質レベルの修正をもたらした)
上記の通り、雌及び雄ENU2マウスへ、様々な用量のベクター2を投与し、12週間後、マウスを犠牲にし、脳ホモジネートを分析して神経伝達物質のレベルを決定した。Tyrに由来する脳ドーパミン及び脳ノルエピネフリン、並びにTrpに由来する脳セロトニンは、ENU2雄は2E13vg/kg用量及びENU2雌は6E13vg/kg用量で、WTレベルまで増加した(図67A〜C)。更に、ENU2マウスへ6E13vg/kg(雄)又は2E14vg/kg(雌)のベクター2を投与した時、Pheに由来するPEAレベルは、野生型マウスで観察されるレベルまで低下した(図67D)。
【０３６９】
(6.23.5  高用量のベクター2で観察された神経伝達物質代謝物の修正)
上記のようにベクター2で処置後のENU2マウスの脳ホモジネート内の、神経伝達物質代謝物を測定した。代謝物HVA、MOPEG、及び5-HIAAは全て、ベクター2が2E13vg/kg用量でENU2雄マウスへ、6E13又は2E14用量でENU2雌マウスへ投与された時に、WTレベルまで修正された(図68A〜C)。
【０３７０】
本明細書に記載された実施態様は、単に例示的であることが意図されており、当業者は、特定の化合物、材料、及び手順の多数の均等物を認識するであろうし、日常的な実験を超えないものを使用して確認することができるはずである。そのような均等物はすべて、本開示の範囲内にあると見なされる。
【０３７１】
本明細書で参照されるすべての特許、特許出願及び文献は、それらの全体が引用により本明細書に組み込まれる。本出願におけるいずれの参考文献の引用又は特定も、そのような参考文献が本出願の先行技術として利用可能であることを認めるものではない。本開示の全範囲は、添付の特許請求の範囲を参照することにより、よりよく理解される。
(7.  配列)
配列番号:1-野生型ヒトPAH核酸配列
【化７】
2021522811.tif 000012
配列番号:2-野生型ヒトPAHアミノ酸配列
【化８】
2021522811.tif 000013
配列番号:3-hAATプロモーター配列
【化９】
2021522811.tif 000014
配列番号:4-HCRエンハンサー又はApoEエンハンサー配列
【化１０】
2021522811.tif 000015
配列番号:6-合成プロモーター配列(hAATプロモーター、HCRエンハンサー/ApoEエンハンサー)
【化１１】
2021522811.tif 000016
配列番号:7-コドン最適化ヒトPAH核酸配列(GENEius 1/Operon1)
【化１２】
2021522811.tif 000017
配列番号:8-コドン最適化ヒトPAH核酸配列(GENEius 2/Operon2)
【化１３】
2021522811.tif 000018
配列番号:9-コドン最適化ヒトPAH核酸配列(Nathwani/NW2-Cop)
【化１４】
2021522811.tif 000019
配列番号:10-コドン最適化ヒトPAH核酸配列(Nathwani-RCG/NW-RCG)
【化１５】
2021522811.tif 000020
配列番号:11-コドン最適化ヒトPAH核酸配列(ATUM(DNA2.0-op/D20-P))
【化１６】
2021522811.tif 000021
配列番号:12-コドン最適化ヒトPAH核酸配列(ATUM-RCG(DNA2.0-Cop1))
【化１７】
2021522811.tif 000022
配列番号:13-コドン最適化ヒトPAH核酸配列(JCAT(JCAT))
【化１８】
2021522811.tif 000023
配列番号:14-複合型のグロビン/AIATイントロン核酸配列
【化１９】
2021522811.tif 000024
配列番号:15-ベクター1(ApoE-HCR-hAAT.GI.hPAH.bGH)核酸配列
【化２０】
2021522811.tif 000025
配列番号:16-GENEius1(ApoE-HCR-hAAT.GI.hPAHco1.bGH)核酸配列
【化２１】
2021522811.tif 000026
配列番号:17-大型イントロン-ベクター1(ApoE-HCR-hAAT.cG-AIATI.hPAH.bGH)核酸配列
【化２２】
2021522811.tif 000027
2021522811.tif 000028
2021522811.tif 000029
配列番号:18-大型イントロン-GENEius 1(ApoE-HCR-hAAT.cG-AIATI.hPAHco1.bGH)核酸配列
【化２３】
2021522811.tif 000030
2021522811.tif 000031
2021522811.tif 000032
配列番号:19-hPAH+切断型第二イントロン(ApoE-HCR-hAAT.hPAH-tI2.bGH)核酸配列
【化２４】
2021522811.tif 000033
2021522811.tif 000034
2021522811.tif 000035
配列番号:20-pFB-ApoE-hAAT-hPAH-Genius 2-ベクター配列
【化２５】
2021522811.tif 000036
配列番号:21-pFB-ApoE-hAAT-hPAH-JCAT-ベクター配列
【化２６】
2021522811.tif 000037
配列番号:22-pFB-hPAHV1-TBG2uGlob-ベクター配列
【化２７】
2021522811.tif 000038
配列番号:23--pFB-hPAHV1-TTR-ベクター配列
【化２８】
2021522811.tif 000039
【図１】
2021522811.tif 000040
【図２】
2021522811.tif 000041
【図３】
2021522811.tif 000042
【図４】
2021522811.tif 000043
【図５】
2021522811.tif 000044
【図６】
2021522811.tif 000045
【図７】
2021522811.tif 000046
【図８】
2021522811.tif 000047
【図９】
2021522811.tif 000048
【図１０】
2021522811.tif 000049
【図１１】
2021522811.tif 000050
【図１２】
2021522811.tif 000051
【図１３】
2021522811.tif 000052
【図１４】
2021522811.tif 000053
【図１５】
2021522811.tif 000054
【図１６】
2021522811.tif 000055
【図１７】
2021522811.tif 000056
【図１８】
2021522811.tif 000057
【図１９】
2021522811.tif 000058
【図２０】
2021522811.tif 000059
【図２１】
2021522811.tif 000060
【図２２】
2021522811.tif 000061
【図２３Ａ】
2021522811.tif 000062
【図２３Ｂ】
2021522811.tif 000063
【図２３Ｃ】
2021522811.tif 000064
【図２３Ｄ】
2021522811.tif 000065
【図２３Ｅ】
2021522811.tif 000066
【図２３Ｆ】
2021522811.tif 000067
【図２３Ｇ】
2021522811.tif 000068
【図２３Ｈ】
2021522811.tif 000069
【図２３Ｉ】
2021522811.tif 000070
【図２３Ｊ】
2021522811.tif 000071
【図２３Ｋ】
2021522811.tif 000072
【図２３Ｌ】
2021522811.tif 000073
【図２３Ｍ】
2021522811.tif 000074
【図２３Ｎ】
2021522811.tif 000075
【図２３Ｏ】
2021522811.tif 000076
【図２３Ｐ】
2021522811.tif 000077
【図２３Ｑ】
2021522811.tif 000078
【図２３Ｒ】
2021522811.tif 000079
【図２３Ｓ】
2021522811.tif 000080
【図２３Ｔ】
2021522811.tif 000081
【図２４】
2021522811.tif 000082
【図２５】
2021522811.tif 000083
【図２６】
2021522811.tif 000084
【図２７】
2021522811.tif 000085
【図２８】
2021522811.tif 000086
【図２９】
2021522811.tif 000087
【図３０】
2021522811.tif 000088
【図３１】
2021522811.tif 000089
【図３２】
2021522811.tif 000090
【図３３】
2021522811.tif 000091
【図３４】
2021522811.tif 000092
【図３５】
2021522811.tif 000093
【図３６】
2021522811.tif 000094
【図３７】
2021522811.tif 000095
【図３８】
2021522811.tif 000096
【図３９】
2021522811.tif 000097
【図４０】
2021522811.tif 000098
【図４１】
2021522811.tif 000099
【図４１−１】
2021522811.tif 000100
【図４１−２】
2021522811.tif 000101
【図４１−３】
2021522811.tif 000102
【図４１−４】
2021522811.tif 000103
【図４１−５】
2021522811.tif 000104
【図４２】
2021522811.tif 000105
【図４３】
2021522811.tif 000106
【図４４】
2021522811.tif 000107
【図４５】
2021522811.tif 000108
【図４６】
2021522811.tif 000109
【図４７】
2021522811.tif 000110
【図４８】
2021522811.tif 000111
【図４９】
2021522811.tif 000112
【図５０】
2021522811.tif 000113
【図５１】
2021522811.tif 000114
【図５２】
2021522811.tif 000115
【図５３】
2021522811.tif 000116
【図５４】
2021522811.tif 000117
【図５５】
2021522811.tif 000118
【図５６】
2021522811.tif 000119
【図５７】
2021522811.tif 000120
【図５８】
2021522811.tif 000121
【図５９】
2021522811.tif 000122
【図６０】
2021522811.tif 000123
【図６１】
2021522811.tif 000124
【図６２】
2021522811.tif 000125
【図６３】
2021522811.tif 000126
【図６４】
2021522811.tif 000127
【図６５】
2021522811.tif 000128
【図６６】
2021522811.tif 000129
【図６７】
2021522811.tif 000130
【図６８】
2021522811.tif 000131
【手続補正書】
【提出日】令和3年3月4日(2021.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021522811000001.app
【国際調査報告】
2021522811.tif 000132
2021522811.tif 000133
2021522811.tif 000134
2021522811.tif 000135
2021522811.tif 000136
2021522811.tif 000137
2021522811.tif 000138