(57)【要約】本発明は、特異的なオリゴヌクレオチドプライマー及びコントローラーヌクレオチドを使用して改善された特異性を有する核酸を増幅する方法に関し、第１の増幅において、該コントローラーオリゴヌクレオチドは、配列特異的な様式で増幅産物の鎖開口を可能にする。本発明はさらに、本発明による方法を実施するための対応するキットに関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を増幅する方法であって（図５６）：
・  第１の標的配列Ｍ１［及びＭ１に（逆）相補的な配列Ｍ１’］を含み、５’−３’方向においてＭは配列セグメントＭ１．５、Ｍ１．４、Ｍ１．３、Ｍ１．２及びＭ１．１を直近に連続して含む、第１の核酸ポリマーを含有する試料を、第１の増幅ステップにおいて、以下の成分：
・  第１の鋳型依存性核酸ポリメラーゼ、特にＤＮＡポリメラーゼ、並びに鋳型依存性核酸ポリメラーゼの基質（特にリボヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸）及び適切な補因子、特にマグネシウムイオン、
・  ５’−３’方向に配列セグメントＰ１．１．２及びＰ１．１．１を直近に連続して含む第１（右）のオリゴヌクレオチドプライマーＰ１．１であって、Ｐ１．１．１が、［本質的に配列特異的に結合できる］Ｍ１．１に相補的な［ハイブリダイズする］配列を有し、かつ配列セグメントＰ１．１．２はＭ１［又は配列Ｍ１に関して３’方向にあるＭ１．１の直後の配列］に結合できない、及び
Ｐ１．１（特にセグメントＰ１．１．２において）は、修飾ヌクレオチドビルディングブロックを含み、それにより、Ｐ１．１．２が第１の鋳型依存性核酸ポリメラーゼを活性化するための鋳型として機能できない；及び
・  Ｍ１．５と（本質的に）同一である［かつＭ１の反対側の鎖上のＭ１．５の逆相補配列又はＰ１．１の伸長産物、Ｐ１．１−Ｅｘｔ（Ｐ１．１Ｅ１と呼ばれる）に配列特異的に結合できる］第２（左）のオリゴヌクレオチドプライマーＰ２．１；
・  ５’−３’方向に配列セグメントＣ１．２．３、Ｃ１．２．２及びＣ１．２．１を直近に連続して含むコントローラーオリゴヌクレオチドＣ１．２であって、Ｃ１．２．３はＭ１．１の５’方向に位置するＭ１のセグメントＭ１．２と同一であり［かつＰ１．１のポリメラーゼの開始時に最初に読み取られ、Ｃ１．２．３はプライマーの重合産物Ｐ１．１−Ｅｘｔに結合でき］、Ｃ１．２．２はＰ１．１．１に相補的であり（及びＭ１．１と同一であり）、かつＣ１．２．１はＰ１．１．２に相補的である、
及び、Ｃ１．２は、Ｃ１．２．１で修飾されたヌクレオチドビルディングブロックを含み、それにより、Ｃ１．２．１が、鋳型依存性核酸ポリメラーゼを活性化するための鋳型として機能できない、
と接触し、
及び、前記試料を、第２の増幅ステップにおいて、以下の成分：
ａ）  ３’末端に配列セグメント３．１．１を含み［又は本質的に３．１．１からなり］、Ｍ１のＭ１．１に（逆）相補的である［Ｐ２．１−Ｅｘｔに相補的に結合できる］、第３（右）のオリゴヌクレオチドプライマーＰ３．１、
ｂ）  Ｍ１のＭ１．５と同一及び／又は本質的に同一である［Ｐ１．１−Ｅｘｔへ相補的に結合できる］、３’末端に配列セグメント４．１．１を含む［又は本質的に４．１．１からなる］第４（左）のオリゴヌクレオチドプライマーＰ４．１、
ｃ）  第２の鋳型依存性核酸ポリメラーゼ、特にＤＮＡポリメラーゼ、及び任意に鋳型依存性核酸ポリメラーゼの基質（特にリボヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸）及び適切な補因子、
と接触する、
前記方法。
【請求項２】
第１のプライマー伸長産物Ｐ１．１−Ｅｘｔは、配列領域Ｐ１．１．２及びＰ１．１．１に加えて、配列セグメントＰ１．１Ｅ４、Ｐ１．１Ｅ３、Ｐ１．１Ｅ２及びＰ１．１Ｅ１を５’−３’方向に含む合成領域を５’−３’方向に含む、前記第１のプライマー伸長産物Ｐ１．１−Ｅｘｔが得られ、Ｐ１．１Ｅ４、Ｐ１．１Ｅ３、Ｐ１．１Ｅ２及びＰ１．１Ｅ１は、それぞれ標的配列Ｍ１の配列セグメントＭ１．２、Ｍ１．３、Ｍ１．４及びＭ１．５に本質的に相補的であり、かつ第２のプライマー伸長産物Ｐ２．１ーＥｘｔは、配列領域Ｐ２．１．１に加えて、３’方向でＭ１．５に隣接する領域における標的配列Ｍ１と本質的に同一である合成領域Ｐ２．１−Ｅｘｔを含む、前記第２のプライマー伸長産物Ｐ２．１ーＥｘｔが得られ、
かつ、
Ｐ１．１−ＥｘｔがＭ１又はＰ２．１−Ｅｘｔと二本鎖を形成でき、かつＰ１．１−ＥｘｔがＣ１．２と二本鎖を形成でき、かつＰ２．１−Ｅｘｔを有するＰ１．１−Ｅｘｔの二本鎖の形成よりも、Ｃ１．２を有するＰ１．１−Ｅｘｔの二本鎖の形成が優先されるように、
−  第１の増幅ステップの反応条件が選択される、及び／又は
−  Ｐ１．１．２、及び該当する場合はＭ１．４、Ｍ１．３、Ｍ１．２及びＭ１．１の長さ及び／又は溶融温度が選択される、
請求項１に記載の核酸を増幅する方法。
【請求項３】
コントローラーオリゴヌクレオチドＣ１．２が不在の場合、第１のプライマー伸長産物Ｐ１．１−Ｅｘｔは、全く分離しない、又は第２のプライマー伸長産物Ｐ２．１−Ｅｘｔから本質的に分離しないように、
−  第１の増幅ステップの反応条件が選択される、及び／又は
−  Ｐ１．１．２、及び該当する場合は、Ｍ１．４、Ｍ１．３、Ｍ１．２、及びＭ１．１の長さ及び／又は溶融温度が選択される、
請求項２に記載の核酸を増幅する方法。
【請求項４】
修飾ヌクレオチドビルディングブロックは、２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオシドビルディングブロック、特に２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドビルディングブロックを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
第１の増幅ステップは、特に２０℃〜５０℃の間の範囲の温度で、本質的に等温的に実施される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
Ｐ１．１−Ｅｘｔが１０〜１ｅ１２、特に１００〜１ｅ１０、特に１０００〜１ｅ８の範囲のコピー数で存在するまで、第１の増幅ステップが実施される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
Ｐ３．１及びＰ４．１は、領域Ｐ３．１．１及びＰ４．１．１の５’末端にそれぞれ隣接する、第２の領域Ｐ３．１．２及びＰ４．１．２をそれぞれ含み、第２の領域は、それぞれＰ１．１−Ｅｘｔ及びＰ２．１−Ｅｘｔに相補的ではない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
第２の増幅ステップ中に、特に低温としての２０℃〜７５℃の間の範囲の温度と、８５℃〜１０５℃の間の範囲の温度との間で、反応温度を周期的に増加及び減少する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
第１のポリメラーゼ及び第２のポリメラーゼが同一であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
−  Ｐ１．１及びＰ３．１は本質的に同一であること、及び／又は
−  Ｐ２．１及びＰ４．１は本質的に同一であること、
を特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
第１の増幅及び第２の増幅は、同じ反応バッチで実施されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
第２のポリメラーゼ、第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．１）及び／又は第４のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ４．１）が活性化されることが可能であり、及び／又はコントローラーオリゴヌクレオチド（Ｃ１．１）が非活性化されることが可能であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
第１の増幅は、第１の反応バッチで実施され、かつ第２の増幅は第２の反応バッチで実施されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
第１の反応バッチのアリコート又は全ての第１の反応バッチは、第２の反応バッチに添加されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
コントローラーオリゴヌクレオチド（Ｃ１．１）は、第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．２）に配列特異的に結合することができる第４の領域を含むことを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）は、第２領域に、特に第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１の領域の直後に、第２の領域で、第１のポリメラーゼを停止する１つ以上の修飾を含むことを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ａ．配列セグメントが、
ｉ．配列セグメントＭ１．２、Ｍ１．３、及びＭ１．４に位置するＭ１の配列と同一である；又は
ｉｉ．  配列セグメントＭ１．３及びＭ１．４に位置するＭ１の配列に相補的である、
前記配列セグメントを含み、
ｂ．蛍光色素が、
ｉｉｉ．  第１のプローブオリゴヌクレオチドに連結される第２のプローブオリゴヌクレオチドを有するドナー−クエンチャー対又はＦＲＥＴ対を形成する；又は
ｉｖ．  第１のプローブオリゴヌクレオチドの結合部位に十分近接して結合できる第２のプローブオリゴヌクレオチドに連結される蛍光色素を有するドナー−クエンチャー対又はＦＲＥＴ対を形成する、
前記蛍光色素に結合する、第１のプローブオリゴヌクレオチドと、
試料をさらに接触する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
核酸を増幅する方法であって：
ａ）  第１の標的配列Ｍ１を含む第１の核酸ポリマーを含有する試料であって、５’−３’方向においてＭ１は、配列セグメントＭ１．５、Ｍ１．４、Ｍ１．３、Ｍ１．２及びＭ１．１を直近に連続して含む、前記試料を、第１の増幅ステップにおいて、次の成分：
ｂ）  第１の鋳型依存性核酸ポリメラーゼ、特にＤＮＡポリメラーゼ、及び鋳型依存性核酸ポリメラーゼの基質、
ｃ）  ５’−３’方向に配列セグメントＰ１．１．２及びＰ１．１．１を直近に連続して含む第１（右）のオリゴヌクレオチドプライマーＰ１．１であって、Ｐ１．１．１はＭ１．１に相補的である［ハイブリダイズする］配列を有し、かつ配列セグメントＰ１．１．２はＭ１に結合できない、及び
Ｐ１．１（特にセグメントＰ１．１．２において）は、修飾ヌクレオチドビルディングブロックを含み、それにより、Ｐ１．１．２が第１の鋳型依存性核酸ポリメラーゼを活性化するための鋳型として機能できない、前記第１（右）のオリゴヌクレオチドプライマーＰ１．１；及び
ｄ）  Ｍ１．５と（本質的に）同一である、第２（左）のオリゴヌクレオチドプライマーＰ２．１；
ｅ）  ５’−３’方向に配列セグメントＣ１．２．３、Ｃ１．２．２及びＣ１．２．１を直近に連続して含むコントローラーオリゴヌクレオチドＣ１．２であって、Ｃ１．２．３は、Ｍ１．１の５’方向に位置するＭ１のセグメントＭ１．２と同一であり、Ｃ１．２．２はＰ１．１．１に相補的であり（かつＭ１．１と同一であり）、かつＣ１．２．１はＰ１．１．２と相補的である、
及び、Ｃ１．２は、Ｃ１．２．１で修飾されたヌクレオチドビルディングブロックを含み、それにより、Ｃ１．２．１が、鋳型依存性核酸ポリメラーゼを活性化するための鋳型として機能できない、前記コントローラーオリゴヌクレオチドＣ１．２、
と接触し、
該試料を、さらに
ａ．配列セグメントが、
ｉ．配列セグメントＭ１．２、Ｍ１．３、及びＭ１．４に位置するＭ１の配列と同一である；又は
ｉｉ．  配列セグメントＭ１．３及びＭ１．４に位置するＭ１配列に相補的である、
前記配列セグメントを含み、
ｂ．蛍光色素が、
ｉ．第１のプローブオリゴヌクレオチドに連結された第２のプローブオリゴヌクレオチドを有するドナークエンチャー対又はＦＲＥＴ対を形成する；又は
ｉｉ．  第１のプローブオリゴヌクレオチドの結合部位に十分近接して結合できる第２のプローブオリゴヌクレオチドに連結される蛍光色素を有するドナー−クエンチャー対又はＦＲＥＴ対を形成する
前記蛍光色素に結合する、第１のプローブオリゴヌクレオチド
に接触する、
前記方法。
【請求項１９】
第１のプローブオリゴヌクレオチドの配列セグメントは、第２の増幅ステップの反応条件下で、Ｐ１．１、Ｐ２．１、Ｐ３．１及びＰ４．１とも、又はＣ１．２ともハイブリダイズしない、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、
ａ）５’−３’方向に配列セグメントＰ１．１．２及びＰ１．１．１を直近に連続して含む、第１（右）のオリゴヌクレオチドプライマーＰ１．１であって、Ｐ１．１．１は、真核生物又は病原性細菌、特に哺乳動物、特にヒト標的配列のゲノム配列Ｍ１のプライマー結合部位Ｍ１．１に結合し、５’−３’方向においてＭ１は、直近に連続して、配列セグメントＭ１．５、Ｍ１．４、Ｍ１．３、Ｍ１．２及びＭ１．１を含み、かつ配列セグメントＰ１．１．２は、Ｍ１［又は３’における配列Ｍ１に関してＭ１．１の直後の配列］に結合できない、及び
Ｐ１．１（特にセグメントＰ１．１．２）は、Ｐ１．１．２が第１の鋳型依存性核酸ポリメラーゼを活性化するための鋳型として機能できないように、修飾ヌクレオチドビルディングブロックを含む、前記第１（右）のオリゴヌクレオチドプライマーＰ１．１；及び
ｂ）  Ｍ１．５と（本質的に）同一である［かつＭ１の反対側の鎖上のＭ１．５の逆相補配列又はＰ１．１の伸長産物、Ｐ１．１−Ｅｘｔ（Ｐ１．１Ｅ１と呼ばれる）に配列特異的に結合できる］第２（左）のオリゴヌクレオチドプライマーＰ２．１；
ｃ）  ５’−３’方向に配列セグメントＣ１．２．３、Ｃ１．２．２、及びＣ１．２．１を直近に連続して含むコントローラーオリゴヌクレオチドＣ１．２であって、Ｃ１．２．３はＭ１．１の５’に位置する［及びＰ１．１のポリメラーゼの開始時に最初に読み取られ、したがってＣ１．２．３はプライマーの重合産物Ｐ１．１−Ｅｘｔに結合することができる］Ｍ１のセグメントＭ１．２と同一であり、Ｃ１．２．２はＰ１．１．１に相補的（及びＭ１．１と同一）であり、及びＣ１．２．１はＰ１．１．２に相補的である、
Ｃ１．２は、Ｃ１．２．１が、第一の鋳型依存性核酸ポリメラーゼを活性化するための鋳型として機能できないように、Ｃ１．２．１で修飾されたヌクレオチドビルディングブロックを含む、
及び
ｄ）  ３’末端に配列セグメント３．１．１を含み［又は本質的に３．１．１からなり］、Ｍ１のＭ１．１に（逆）相補的である［Ｐ２．１−Ｅｘｔに相補的に結合できる］、第３（右）のオリゴヌクレオチドプライマーＰ３．１、
ｅ）  ３’末端に、Ｍ１のＭ１．５と同一及び／又は本質的に同一である［Ｐ１．１−Ｅｘｔに相補的に結合できる］、配列セグメント４．１．１を含む［又は本質的に４．１．１からなる］第４（左）のオリゴヌクレオチドプライマーＰ４．１、
及び任意に、第２の鋳型依存性核酸ポリメラーゼ、特にＤＮＡポリメラーゼ、及び任意に鋳型依存性核酸ポリメラーゼの基質（特にリボヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸）及び適切な補因子、特に好熱性鋳型依存性ポリメラーゼ、特に５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する好熱性鋳型依存性ポリメラーゼ；
を含み、
及び／又は
ａ．配列セグメントが、
ｉ．  配列セグメント  Ｍ１．２、Ｍ１．３、及びＭ１．４に位置するＭ１の配列と同一である；又は
ｉｉ．  配列セグメントＭ１．３及びＭ１．４に位置するＭ１の配列に相補的である
前記配列セグメントを含み、
かつ
ｂ．蛍光色素が、
ｉ．  第１のプローブオリゴヌクレオチドに連結された第２のプローブオリゴヌクレオチドを有するドナークエンチャー対又はＦＲＥＴ対を形成する；又は
ｉｉ．  第１のプローブオリゴヌクレオチドの結合部位に十分近接して結合できる第２のプローブオリゴヌクレオチドに連結される蛍光色素を有するドナークエンチャー対又はＦＲＥＴ対を形成する、
前記蛍光色素に結合する、第１のプローブオリゴヌクレオチドを含む、前記キット。
【請求項２１】
第１の鋳型依存性核酸ポリメラーゼ、特にＤＮＡポリメラーゼ、及び任意にＤＮＡポリメラーゼの基質（特にリボヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸）及び適切な補因子、特に中温性鋳型依存性ポリメラーゼ、特に５’−３’エキソヌクレアーゼ活性のない中温性鋳型依存性ポリメラーゼをさらに含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
修飾ヌクレオチドビルディングブロックは、２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオシドビルディングブロック、特に２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドビルディングブロックを含む、請求項２０又は２１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特異性を改善した核酸を増幅する方法に関する。
【０００２】
本出願は、以下の出願の優先権を主張する：ヨーロッパ特許出願、ＥＰ１８１５８７２２．１（２０１８年２月２６日）、ＥＰ１８１９５３１２．６（２０１８年９月１８日）、ＥＰ１８１５９３３７．７（２０１８年２月２８日）；ドイツ特許出願１０  ２０１８  ００１５８６．７（２０１８年２月２８日）。本明細書で言及されるこれら及び他のすべての特許文書は、参照により本明細書に組み込まれる（参照として組み込まれる）と見なされるものとする。
【背景技術】
【０００３】
核酸鎖の合成は、今日のバイオテクノロジーにおいて中心的な役割を果たしている。ＰＣＲなどの方法は、診断や食品業界など、研究の展望及び応用工業分野の両方を大幅に進歩させてきた。ＰＣＲと、シーケンシング、リアルタイム検出、マイクロアレイ技術、マイクロ流体管理などの技術の組み合わせは、技術開発に貢献し、元のＰＣＲの欠点を部分的に克服してきた。等温増幅技術などの他の増幅方法も開発されている。それらの使用は、特にＰＯＣＴ（ポイントオブケアテスト）を目的としていた。この分野での大きな進歩にもかかわらず、ＰＣＲは中心的な役割を果たしており、そのためその応用に対する個々の技術的障壁を決定している。
【０００４】
増幅手順の間、ＰＣＲでは、プライマーの間にある増幅される配列セグメントの制御は行われない。ＰＣＲ法の最適化の焦点はプライマー結合である。ＰＣＲの開始時とその過程とで、主な生成物の合成と副生成物の合成が、例えば、プライマーの非特異的な結合又は伸長により継続的に開始される。逆方向合成反応が発生した場合、非特異的に伸長したプライマーが鋳型として読み取られ、通常は完全なプライマー結合部位が形成することになる。したがって、不完全な配列情報が１つの合成サイクルから次の合成サイクルに転送され、これにより、全体として、初期の形成だけでなく、何よりも副産物の指数関数的な増加につながる。
【０００５】
このような副反応は、主反応（標的配列の増幅）を干渉する断片の指数関数的な増加をもたらし、分析の次のステップでそれぞれ干渉をもたらし得る。そのような副産物は、通常、左右のプライマー配列を含み、そのために、それらの増幅は、主反応と並行して起こり得る。しかしながら、標的配列の代わりに、そのような副産物は別の核酸標的配列を含む。
【０００６】
主に、ＰＣＲ増幅の特異性は、標的配列へのプライマーの結合を最適化することによって達成される。例えば、プライマーに部分的に結合し、したがって他の核酸鎖へのプライマー結合に競合的に関与することができる追加のオリゴヌクレオチドを使用することができる。
【０００７】
そのようなプローブは、一般に、プライマーの配列セグメントに結合し、一本鎖配列セグメントを占有せず、そのため前記セグメントを有するプライマーは、標的核酸に結合して、合成反応を開始することができる。プライマーの鋳型の不一致は、このようなオリゴヌクレオチドによって競合的に置き換えられ、開始の特異性が向上する。そのような追加のオリゴヌクレオチドは、両方のプライマー間の部位で増幅される核酸鎖と相互作用しない。ただし、プライマーのモル過剰により、増幅中にプライマーと鋳型の非特異的相互作用が発生し、副産物の相補鎖の合成の結果として、完全に機能するプライマー結合部位が形成される。副産物中にそのような完全に機能するプライマー結合部位が存在すると、プライマー結合に対するそのような追加のオリゴヌクレオチドの競合効果の低下につながる。したがって、そのようなオリゴヌクレオチドによって鋳型に結合するプライマーの特異性を制御しても、副反応の開始は起こりにくくするだけで、副産物が一度形成されると、その指数関数的増幅にほとんど影響を与えることができない。
【０００８】
ＰＣＲの副反応は、実行される合成サイクルの数とともに増加し、多くの場合、最大４０回のＰＣＲサイクルが実行される。ＰＣＲ増幅後、他の方法が関わり、例えば、検出、ライブラリー生成、クローニング、配列決定（シーケンシング）などである。前記方法は、ＰＣＲ増幅中にある範囲で生成される副産物又は配列の相違に耐容することのみが可能である。一般に、このような方法の特異性は、ＰＣＲ中の副反応の問題によってもまた影響される。
【０００９】
副産物の出現及び共増幅の減少を伴う増幅法の合成の特異性の改善は、診断法の改善に寄与する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、核酸鎖の酵素的増幅の特異性を改善する方法及び手段を提供することである。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、増幅方法とＰＣＲ増幅との組み合わせを提供することであり、標的配列のシグナル取得（それぞれモニタリング又は検出）又は増幅は、最初に、コントローラーオリゴヌクレオチド及び対応する特異的プライマーセットを使用する制御された増幅によって行われ、そして特にＰＣＲ特異的プライマーを使用して、ＰＣＲによって継続される。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、十分な量のＰＣＲ生成物を得るために必要なＰＣＲ合成サイクルの数を減らすことである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、核酸鎖の合成及び核酸鎖の増幅のための新しい酵素的方法及び成分を提供することであり、連続的な（オンライン）シグナル取得が提供され、シグナル取得（モニタリング／検出）は、配列特異的なプローブオリゴヌクレオチドによって媒介又は支持される。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記目的は、独立請求項による方法及びキットによって解決される。本発明のさらに有利な実施形態は、従属請求項及び以下の説明に列挙されている。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、不均一形式における本発明による増幅方法の特定の実施形態の成分を図式的に示す。Ａ）第１の増幅系；Ｂ）第２の増幅系。
【図２】図２は、第１の増幅系の特定の実施形態の成分を図式的に示す。
【図３】図３は、不均一形式における本発明による方法の特定の実施形態の温度プロファイルを示す。
【図４】図４は、不均一形式における本発明による方法の特定の実施形態の温度プロファイルを示す。
【図５】図５は、均一形式における本発明による増幅方法の特定の実施形態の成分を示す。Ａ）第１の増幅系；Ｂ）第２の増幅系。
【図６】図６〜１１は、本発明による方法の実施形態の温度プロファイルを示す。
【図７】図６〜１１は、本発明による方法の実施形態の温度プロファイルを示す。
【図８】図６〜１１は、本発明による方法の実施形態の温度プロファイルを示す。
【図９】図６〜１１は、本発明による方法の実施形態の温度プロファイルを示す。
【図１０】図６〜１１は、本発明による方法の実施形態の温度プロファイルを示す。
【図１１】図６〜１１は、本発明による方法の実施形態の温度プロファイルを示す。
【図１２】図１２は、（Ａ）第１のオリゴヌクレオチドプライマーの構造、（Ｂ）増幅される核酸鎖への第１のプライマーの相補的な結合、（Ｃ）増幅される核酸鎖への第１のプライマーの相補的な結合、及びプライマーの伸長を図式的に示す。
【図１３】図１３は、（Ａ）第１のプライマー伸長産物の合成時の個々の成分間の関係、（Ｂ）第１のプライマー伸長産物の合成（１＝第１の増幅における増幅される核酸、２＝コントローラーオリゴヌクレオチド、３＝第１のオリゴヌクレオチドプライマー、４＝第１のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物）を図式的に示す。
【図１４】図１４は、第２のプライマー伸長産物の合成を図式的に示す。図１３のとおり、マーク１〜４を参照；５＝第２のオリゴヌクレオチドプライマー；６＝第２のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物。
【図１５】図１５は、第３及び第４のプライマー伸長産物の合成を図式的に示す；Ｐ３．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ１＝鋳型としてＰ２．１−Ｅｘｔで合成されたＰ３．１の伸長産物（中間産物）、Ｐ４．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ１＝鋳型としてｐ１．１−Ｅｘｔで合成されたＰ４．１の伸長産物（中間産物）、Ｐ３．１−Ｅｘｔ＝鋳型としてＰ４．１−Ｅｘｔ−ｐａｒｔ１又はＰ４．１−Ｅｘｔを使用して合成されたＰ３．１の伸長産物、Ｐ４．１−Ｅｘｔ＝鋳型としてＰ３．１−Ｅｘｔ−ｐａｒｔ１を使用して又はＰ３．１−Ｅｘｔで合成されたＰ４．１の伸長産物。
【図１６】図１６は、部分的な第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ１）の合成を図式的に示す；７＝第２のプライマーの伸長産物（Ｐ２．１−Ｅｘｔ）に相補的なＰ３．１のセグメント；８＝第２のプライマーの伸長産物（Ｐ２．１−Ｅｘｔ）に相補的ではないＰ３．１のセグメント、Ｐ３．１−Ｅｘｔ−ｐａｒｔ１＝鋳型としてＰ２．１ーＥｘｔを使用して合成された第３のプライマー（Ｐ３．１）の伸長産物。
【図１７】図１７は、完全な第４のプライマー伸長産物の合成を図式的に示す；Ｐ２．１−Ｅｘｔ＝セグメント５及び６；Ｐ３．１−Ｅｘｔ−ｐａｒｔ１＝鋳型としてＰ２．１−Ｅｘｔで合成されたＰ３．１の伸長産物；Ｐ４．１＝第４のプライマー；９＝Ｐ３．１−Ｅｘｔ−ｐａｒｔ１に相補的に結合できるＰ４．１のセグメント；１０＝Ｐ３．１−Ｅｘｔ−ｐａｒｔ１に相補的に結合できないＰ４．１のセグメント；Ｐ４．１−Ｅｘｔ＝鋳型としてＰ３．１−Ｅｘｔ−ｐａｒｔ１で合成されたＰ４．１の伸長産物。
【図１８】図１８は、第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１−Ｅｘｔ）を使用した第３のプライマー伸長産物の中間産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ−ｐａｒｔ１）の合成（Ａ）を図式的に示す。（Ｂ）鋳型としてＰ４．１−Ｅｘｔを使用した完全な第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ）；Ｐ４．１−Ｅｘｔ＝鋳型としてＰ３．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ１で合成されたＰ４．１の伸長産物；Ｐ３．１−Ｅｘｔ＝鋳型としてＰ４．１−Ｅｘｔで合成されたＰ３．１の伸長産物。
【図１９】図１９〜２６は、第１のプライマー伸長産物及び第３のＰＣＲプライマーの合成中の個々の成分間の関係を図式的に示す；１＝第１の増幅におけるＰ２．１の伸長；２＝コントローラーオリゴヌクレオチド；３＝第１のオリゴヌクレオチドプライマー；４＝プライマー３．１。
【図２０】図１９〜２６は、第１のプライマー伸長産物及び第３のＰＣＲプライマーの合成中の個々の成分間の関係を図式的に示す；１＝第１の増幅におけるＰ２．１の伸長；２＝コントローラーオリゴヌクレオチド；３＝第１のオリゴヌクレオチドプライマー；４＝プライマー３．１。
【図２１】図１９〜２６は、第１のプライマー伸長産物及び第３のＰＣＲプライマーの合成中の個々の成分間の関係を図式的に示す；１＝第１の増幅におけるＰ２．１の伸長；２＝コントローラーオリゴヌクレオチド；３＝第１のオリゴヌクレオチドプライマー；４＝プライマー３．１。
【図２２】図１９〜２６は、第１のプライマー伸長産物及び第３のＰＣＲプライマーの合成中の個々の成分間の関係を図式的に示す；１＝第１の増幅におけるＰ２．１の伸長；２＝コントローラーオリゴヌクレオチド；３＝第１のオリゴヌクレオチドプライマー；４＝プライマー３．１。
【図２３】図１９〜２６は、第１のプライマー伸長産物及び第３のＰＣＲプライマーの合成中の個々の成分間の関係を図式的に示す；１＝第１の増幅におけるＰ２．１の伸長；２＝コントローラーオリゴヌクレオチド；３＝第１のオリゴヌクレオチドプライマー；４＝プライマー３．１。
【図２４】図１９〜２６は、第１のプライマー伸長産物及び第３のＰＣＲプライマーの合成中の個々の成分間の関係を図式的に示す；１＝第１の増幅におけるＰ２．１の伸長；２＝コントローラーオリゴヌクレオチド；３＝第１のオリゴヌクレオチドプライマー；４＝プライマー３．１。
【図２５】図１９〜２６は、第１のプライマー伸長産物及び第３のＰＣＲプライマーの合成中の個々の成分間の関係を図式的に示す；１＝第１の増幅におけるＰ２．１の伸長；２＝コントローラーオリゴヌクレオチド；３＝第１のオリゴヌクレオチドプライマー；４＝プライマー３．１。
【図２６】図１９〜２６は、第１のプライマー伸長産物及び第３のＰＣＲプライマーの合成中の個々の成分間の関係を図式的に示す；１＝第１の増幅におけるＰ２．１の伸長；２＝コントローラーオリゴヌクレオチド；３＝第１のオリゴヌクレオチドプライマー；４＝プライマー３．１。
【図２７】図２７〜３１は、第１の増幅系の異なる実施形態の成分を図式的に示す；（Ａ）第１の増幅系の成分；（Ｂ）第２の増幅系の成分。図２７〜２９：第４のプライマーは第２のプライマーと同一であり、第３のプライマーは第１のプライマーとは異なる。その結合は、第１のオリゴヌクレオチドプライマーと比較してシフトされ得る。
【図２８】図２７〜３１は、第１の増幅系の異なる実施形態の成分を図式的に示す；（Ａ）第１の増幅系の成分；（Ｂ）第２の増幅系の成分。図２７〜２９：第４のプライマーは第２のプライマーと同一であり、第３のプライマーは第１のプライマーとは異なる。その結合は、第１のオリゴヌクレオチドプライマーと比較してシフトされ得る。
【図２９】図２７〜３１は、第１の増幅系の異なる実施形態の成分を図式的に示す；（Ａ）第１の増幅系の成分；（Ｂ）第２の増幅系の成分。図２７〜２９：第４のプライマーは第２のプライマーと同一であり、第３のプライマーは第１のプライマーとは異なる。その結合は、第１のオリゴヌクレオチドプライマーと比較してシフトされ得る。
【図３０】図３０は、第４のプライマーは第２のオリゴヌクレオチドプライマーとは異なる。第４のプライマーの３’末端は、第２のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端に対してシフトされ得る。第４のプライマーは、標的配列に相補的でない、又はＰ１．１−Ｅｘｔに結合しないコピー可能な配列セグメントを含む。
【図３１】図３１は、第３のオリゴヌクレオチドプライマーは、標的配列に相補的でない、又はＰ２．１−Ｅｘｔに結合しないコピー可能な配列セグメントを含む。
【図３２】図３２は、（Ａ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー及び（Ｂ）増幅される核酸（Ｐ１．１−Ｅｘｔ及びＰ２．１−Ｅｘｔ）を図式的に示す。
【図３３】図３３は、コントローラーオリゴヌクレオチドによる鎖置換を図式的に示す。
【図３４】図３４は、本発明による方法の反応における成分間の相互作用を図式的に示し、第２のプライマー伸長産物を、第１のプライマー伸長産物とコントローラーオリゴヌクレオチドを含む二重鎖を有する複合体から分離する中間ステップを視覚化したものである。
【図３５】図３５は、２本鎖の同時合成による増幅及び合成された増幅断片の分離を図式的に示す。
【図３６】図３６〜４９は、試料の実験の結果を示す。
【図３７】図３６〜４９は、試料の実験の結果を示す。
【図３８】図３６〜４９は、試料の実験の結果を示す。
【図３９】図３６〜４９は、試料の実験の結果を示す。
【図４０】図３６〜４９は、試料の実験の結果を示す。
【図４１】図３６〜４９は、試料の実験の結果を示す。
【図４２】図３６〜４９は、試料の実験の結果を示す。
【図４３】図３６〜４９は、試料の実験の結果を示す。
【図４４】図３６〜４９は、試料の実験の結果を示す。
【図４５】図３６〜４９は、試料の実験の結果を示す。
【図４６】図３６〜４９は、試料の実験の結果を示す。
【図４７】図３６〜４９は、試料の実験の結果を示す。
【図４８】図３６〜４９は、試料の実験の結果を示す。
【図４９】図３６〜４９は、試料の実験の結果を示す。
【図５０】図５０及び５１は、ゲノムＤＮＡからの開始核酸鎖の特定の種類の調製を図式的に示す。
【図５１】図５０及び５１は、ゲノムＤＮＡからの開始核酸鎖の特定の種類の調製を図式的に示す。
【図５２】図５２〜５４は、本発明に基づく増幅の特定の実施形態を図式的に示す。
【図５３】図５２〜５４は、本発明に基づく増幅の特定の実施形態を図式的に示す。
【図５４】図５２〜５４は、本発明に基づく増幅の特定の実施形態を図式的に示す。
【図５５】図５５〜５７は、第１の増幅系及び第２の増幅系の成分のトポグラフィーの特定の実施形態を図式的に示す。
【図５６】図５５〜５７は、第１の増幅系及び第２の増幅系の成分のトポグラフィーの特定の実施形態を図式的に示す。
【図５７】図５５〜５７は、第１の増幅系及び第２の増幅系の成分のトポグラフィーの特定の実施形態を図式的に示す。
【図５８】図５８〜５９は、プローブオリゴヌクレオチドの可能な局在領域の特定の実施形態を図式的に示す。
【図５９】図５８〜５９は、プローブオリゴヌクレオチドの可能な局在領域の特定の実施形態を図式的に示す。
【図６０】図６０は、第３の（及び場合により第１の）プライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ及びＰ１．１−Ｅｘｔ）に相補的様式で主に結合することができる、プローブセグメントの局在の特定の実施形態を図式的に示す。
【図６１】図６１は、第４の（及び場合により第２の）プライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ及びＰ２．１−Ｅｘｔ）に相補的に主に結合することができる、プローブセグメントの局在の特定の実施形態を図式的に示す。
【図６２】図６２〜６７は、プローブの特定の実施形態を図式的に示す。
【図６３】図６２〜６７は、プローブの特定の実施形態を図式的に示す。
【図６４】図６２〜６７は、プローブの特定の実施形態を図式的に示す。
【図６５】図６２〜６７は、プローブの特定の実施形態を図式的に示す。
【図６６】図６２〜６７は、プローブの特定の実施形態を図式的に示す。
【図６７】図６２〜６７は、プローブの特定の実施形態を図式的に示す。
【図６８】図６８〜７１は、開始核酸１．１、増幅断片１．１（Ｐ１．１−Ｅｘｔ及びＰ２．１−Ｅｘｔ）、及び第２の増幅断片２．１（Ｐ３．１−Ｅｘｔ及びＰ４．１−Ｅｘｔ）における標的配列１〜３の局在の特定の実施形態を図式的に示す。
【図６９】図６８〜７１は、開始核酸１．１、増幅断片１．１（Ｐ１．１−Ｅｘｔ及びＰ２．１−Ｅｘｔ）、及び第２の増幅断片２．１（Ｐ３．１−Ｅｘｔ及びＰ４．１−Ｅｘｔ）における標的配列１〜３の局在の特定の実施形態を図式的に示す。
【図７０】図６８〜７１は、開始核酸１．１、増幅断片１．１（Ｐ１．１−Ｅｘｔ及びＰ２．１−Ｅｘｔ）、及び第２の増幅断片２．１（Ｐ３．１−Ｅｘｔ及びＰ４．１−Ｅｘｔ）における標的配列１〜３の局在の特定の実施形態を図式的に示す。
【図７１】図６８〜７１は、開始核酸１．１、増幅断片１．１（Ｐ１．１−Ｅｘｔ及びＰ２．１−Ｅｘｔ）、及び第２の増幅断片２．１（Ｐ３．１−Ｅｘｔ及びＰ４．１−Ｅｘｔ）における標的配列１〜３の局在の特定の実施形態を図式的に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の概要
本発明の第１の態様は、核酸を増幅するための方法に関し、該方法は以下のステップを含む：
ａ）第１の増幅のステップであり、次のステップを含む：
−  第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）を、標的配列を含む増幅される核酸にハイブリダイズさせるステップであり、第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）は以下の領域を含む：
・  増幅される核酸の領域が、少なくとも標的配列の５’末端を含む、又は標的配列の５’方向に位置する、増幅される核酸の領域に配列特異的に結合できる第１の領域（Ｐ１．１．１）；
・  第２領域が、コントローラーオリゴヌクレオチドによって結合されることができ、選択した反応条件下で使用されるポリメラーゼによって本質的にコピーされないままである、第１領域の５’末端に隣接する、又はリンカーを介して接続される第２領域（Ｐ１．１．２）；
−  第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）に加えて増幅される核酸又は標的配列に本質的に相補的である合成領域を含む、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）を得るための第１のポリメラーゼによる第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）の伸長のステップであり、第１のプライマー伸長産物及び増幅される核酸が、二本鎖として存在する；
−  第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）へのコントローラーオリゴヌクレオチド（Ｃ１．１）の結合のステップであり、コントローラーオリゴヌクレオチド（Ｃ１．１）は以下の領域を含む；
・  第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）の第２の領域（オーバーハング）に結合できる第１の領域（Ｃ１．１．１）、
・  第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）の第１の領域に本質的に相補的である第２の領域（Ｃ１．１．２）、及び
・  第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）の合成領域の少なくとも一部に本質的に相補的な第３の領域（Ｃ１．１．３）；そして
ここで、コントローラーオリゴヌクレオチド（Ｃ１．１）は、第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）のプライマー伸長の鋳型として機能せず、かつ第１のコントローラーオリゴヌクレオチド（Ｃ１．１）は、増幅される核酸（第１及び第２の領域に相補的な領域）を置き換えながら、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）の第１及び第２の領域に結合する；
−  第２のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ２．１）を第１のプライマー伸長産物にハイブリダイズするステップであり、第２のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ２．１）は、標的配列の５’末端に少なくとも相補的である、又はその３’方向に位置する、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）の合成領域に配列特異的に結合できる領域（Ｐ２．１．１）を含む；
−  第２のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ．２．１）に加えて増幅される核酸又は標的配列に本質的に同一である合成領域を含む、第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１−Ｅｘｔ）を得るための第１のポリメラーゼによる第２のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ２．１）の伸長のステップであり、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）及び第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１）が、第１の二本鎖増幅生成物を形成する；
ｂ）第２の増幅のステップであり、次のステップを有する：
−  第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．１；Ｐ３．２）を第１の増幅産物の第２プライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）にハイブリダイズするステップであって、第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．１；Ｐ３．２）が、第２のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）の領域に配列特異的に結合でき、標的配列の５’末端を少なくとも含む、又はその５’方向に位置する、第１の領域（Ｐ３．１．１）を有する；
−  第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．１；Ｐ３．２）に加えて、第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１−Ｅｘｔ）又は標的配列に本質的に相補的である合成領域を含む第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１／２−Ｅｘｔ）を得るための第２のポリメラーゼによる第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．１；Ｐ３．２）の伸長のステップであって、第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１）及び第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１）が二本鎖として存在する；
−  第４のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ４．１；Ｐ４．２）を第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）にハイブリダイズするステップであって、第４のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ４．１；Ｐ４．２）は、標的配列の５’末端に少なくとも相補的である、又はその３’方向に位置する、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）の合成領域に配列特異的に結合できる第１の領域（Ｐ４．１．１）を有する；
−  第４のオリゴヌクレオチドプライマーに加えて、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）に本質的に相補的である、又は標的配列と同一である合成領域を含む、第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．１／２−Ｅｘｔ）を得るための、第２のポリメラーゼによる第４のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ４．１；Ｐ４．２）の伸長のステップであって、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）及び第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．１／２−Ｅｘｔ）は二本鎖として存在する；
−  第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）及び第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．１／  ２−Ｅｘｔ）からの二本鎖と、第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１）及び第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１）からの二本鎖の分離のステップ；
−  第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．２）を第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．２−Ｅｘｔ）にハイブリダイズし、第２のポリメラーゼによって第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．２）を伸長するステップ；及び
−  第４のオリゴヌクレオチドプライマーを第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．２−Ｅｘｔ）にハイブリダイズし、第２のポリメラーゼによって第４のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ４．１；Ｐ４．２）を伸長するステップ。
【００１７】
あるいは、本発明の態様はまた、核酸を増幅する方法として構成することもでき（図１、５５〜５６）、第１の標的配列Ｍ１［及びＭ１に相補的な配列Ｍ１’］を含む第１の核酸ポリマーを含む試料であって、５’−３’方向においてＭは、配列セグメントＭ１．５、Ｍ１．４、Ｍ１．３、Ｍ１．２、及びＭ１．１を直後に連続して含む前記試料を、第１の増幅ステップにおいて、以下の成分と接触する：
ｉ．  第１の鋳型依存性核酸ポリメラーゼ、特にＤＮＡポリメラーゼ、及び鋳型依存性核酸ポリメラーゼの基質（特にリボヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸）及びＭｇ塩などの適切な補因子、
ｉｉ．  ５’−３’方向に配列セグメントＰ１．１．２及びＰ１．１．１を直近に連続して含む第１の（右）オリゴヌクレオチドプライマーＰ１．１であって、Ｐ１．１．１が、［本質的に配列特異的に結合できる］Ｍ１．１に相補的に［ハイブリダイズする］配列を有し、及び配列セグメントＰ１．１．２がＭ１［又は配列Ｍ１に関して３’のＭ１．１の直後の配列］に結合できない、そして
ここで、Ｐ１．１（特にセグメントＰ１．１．２において）は、Ｐ１．１．２が第１の鋳型依存性核酸ポリメラーゼを活性化するための鋳型として機能できないように、修飾ヌクレオチドビルディングブロックを含む；及び
ｉｉｉ．  Ｍ１．５と（本質的に）同一である［及びＭ１の反対側の鎖上のＭ１．５の逆相補配列又はＰ１．１の伸長産物、Ｐ１．１−Ｅｘｔ（Ｐ１．１Ｅ１と呼ばれる）に配列特異的に結合できる］第２（左）のオリゴヌクレオチドプライマーＰ２．１；
ｉｖ．  ５’−３’方向において配列セグメントＣ１．２．３、Ｃ１．２．２、Ｃ１．２．１が直近に連続して含むコントローラーオリゴヌクレオチドＣ１．２であって、Ｃ１．２．３は、Ｍ１のセグメントＭ１．２と同一であり、これは、Ｍ１．１の５’方向に位置し［及びＰ１．１のポリメラーゼの開始時に最初に読み取られ、したがってＣ１．２．３はプライマーＰ１．１−Ｅｘｔの重合産物に結合できる］、Ｃ１．２．２はＰ１．１．１と相補的であり（及びＭ１．１に同一である）及びＣ１．２．１はＰ１．１．２に相補的であり、
そしてここで、Ｃ１．２は、Ｃ１．２．１で修飾されたヌクレオチドビルディングブロックを含み、それにより、Ｃ１．２．１が鋳型依存性核酸ポリメラーゼを活性化するための鋳型として機能できない、
及び、該試料を、第２の増幅ステップにおいて、以下の成分と接触する：
ｖ．  Ｍ１のＭ１．１に（逆）相補的である［Ｐ２．１−Ｅｘｔに相補的に結合できる］、３’末端に配列セグメント３．１．１を含み、［又は本質的に３．１．１からなる］、第３（右）のオリゴヌクレオチドプライマーＰ３．１、
ｖｉ．  Ｍ１のＭ１．５と同一及び／又は本質的に同一である［Ｐ１．１−Ｅｘｔへ相補的に結合できる］、３’末端に配列セグメント４．１．１を含む［又は本質的に４．１．１からなる］第４（左）のオリゴヌクレオチドプライマーＰ４．１、
ｖｉｉ．  第２の鋳型依存性核酸ポリメラーゼ、特にＤＮＡポリメラーゼ、及び任意に鋳型依存性核酸ポリメラーゼの基質（特にリボヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸）及び適切な補因子。
【００１８】
第１の増幅ステップでは、第１のプライマー伸長産物Ｐ１．１−Ｅｘｔが得られ、これは、配列領域Ｐ１．１．２及びＰ１．１．１に加えて、５’−３’方向で配列セグメントＰ１．１Ｅ４、Ｐ１．１Ｅ３、Ｐ１．１Ｅ２、及びＰ１．１Ｅ１を含む合成領域を５’−３’方向で含み、Ｐ１．１Ｅ４は、本質的に標的配列Ｍ１の配列セクションＭ１．２に相補的であり、Ｐ１．１Ｅ３は本質的にＭ１．３に相補的であり、Ｐ１．１Ｅ２は本質的にＭ１．４に相補的であり、Ｐ１．１Ｅ１は本質的にＭ１．５に相補的である。同様に、配列領域Ｐ２．１．１に加えて、合成領域Ｐ２．１−Ｅｘｔを含む第２のプライマー伸長産物Ｐ２．１−Ｅｘｔが得られ、これは、３’のＭ１．５に続く領域の標的配列Ｍ１と本質的に同一である。第１の増幅ステップのＰ１．１．２及び任意にＭ１．４、Ｍ１．３、Ｍ１．２及びＭ１．１の反応条件及び／又は長さ又は融解温度は、Ｍ１と、又はＰ２．１−ＥｘｔとＰ１．１−Ｅｘｔは二本鎖を形成でき、Ｐ１．１−ＥｘｔはＣ１．２と二本鎖を形成でき、そしてＣ１．２とのＰ１．１−Ｅｘｔの二本鎖の形成がＰ１．１−ＥｘｔとＰ２．１−Ｅｘｔとの二本鎖の形成より優先するように、選択される。
【００１９】
より一般的な形態では、本発明はまた、核酸を増幅するための方法として構成することができ、第１の標的配列Ｍ１を含む第１の核酸ポリマーを含む試料を、第１の増幅ステップにおいて以下の成分と接触する：
ａ．  第１の鋳型依存性核酸ポリメラーゼ、特に第１のＤＮＡポリメラーゼ、及び鋳型依存性核酸ポリメラーゼの基質（特にリボヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸）及び適切な補因子、
ｂ．  ５’−３’方向に、配列セグメントＰ１．１．２とＰ１．１．１が直近に連続して含まれる第１（右）のオリゴヌクレオチドプライマーＰ１．１であって、Ｐ１．１．１の少なくとも３’セグメントは（本質的に）配列特異的に、Ｍ１のセグメントに結合でき、配列セグメントＰ１．１．２はＭ１に結合できない、そして
ここで、Ｐ１．１（特にセグメントＰ１．１．２において）は、Ｐ１．１．２が第１の鋳型依存性核酸ポリメラーゼを活性化するための鋳型として機能できないように、修飾ヌクレオチドビルディングブロックを含む；及び
ｃ．  Ｐ１．１の結合部位の５’方向に位置するＭ１の配列セグメントと（本質的に）同一である、又はＭ１の反対鎖上の逆相補配列又はＰ１．１の伸長産物（Ｐ１．１Ｅ１として、Ｐ１．１−Ｅｘｔと呼ばれる）を結合することができる少なくとも１つの３’セグメントを含む第２（左）のオリゴヌクレオチドプライマーＰ２．１；
ｄ．  ５’−３’方向に配列セグメントＣ１．２．３、Ｃ１．２．２及びＣ１．２．１を直近に連続して含むコントローラーオリゴヌクレオチドＣ１．２：
ｉ．  増幅反応中に形成される第１のプライマーの伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）の合成領域の少なくとも一部に本質的に相補的なコントローラーオリゴヌクレオチドの第３の領域（Ｃ１．２．３）であって、言い換えれば第３の領域は、読み取られる鎖の極性に関して第１のプライマーの結合部位の５’方向にあるＭ１のセグメントと同一である［及びＰ１．１のポリメラーゼの開始時に最初に読み取られ、したがって、コントローラーの第３の領域は、第１のプライマーの重合産物に結合したオリゴヌクレオチド［Ｐ１．１−Ｅｘｔ］の少なくとも一部に結合することができる、
ｉｉ．  第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）の第１の領域に本質的に相補的な（及び少なくとも部分的に標的配列Ｍ１上の第１のプライマーの結合部位と同一）コントローラーオリゴヌクレオチドの第２の領域（Ｃ１．２．２）及び
ｉｉｉ．  第１のプライマーの配列セグメントＰ１．１．２又は増幅反応中に形成された第１のプライマーの伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）の５’末端領域に結合できるコントローラーオリゴヌクレオチドの第１の領域（Ｃ１．２．１）であって、そして
ここで、Ｃ１．２は、Ｃ１．２．１が鋳型依存性核酸ポリメラーゼを活性化するための鋳型として機能できないように、少なくともＣ１．２．１  Ｃ１．２．３で修飾されたヌクレオチドビルディングブロックを含む；
第１の増幅を可能にする条件下で、該試料は、上記の成分とインキュベートされ、第１のオリゴヌクレオチドプライマーのプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）及び第２オリゴヌクレオチドプライマーのプライマー伸長産物（Ｐ２．１−Ｅｘｔ）を含む増幅産物が形成され、これは、標的配列Ｍ又は少なくともそれらの部分及び対応する相補的配列を含む；そして、該試料を、その後に又は同時に、第２の増幅ステップにおいて以下の成分と接触する：
ｅ．  第１の増幅ステップで形成された増幅産物に（逆）相補的である、言い換えれば、これは配列特異的であり、第１の増幅反応で形成された第２のプライマーの伸長産物の３’末端領域に結合することができる、３’末端に配列セグメント３．１．１を含む［又は本質的に３．１．１からなる］第３（右）のオリゴヌクレオチドプライマーＰ３．１、
ｆ．  第１の増幅ステップで形成された増幅産物に（逆）相補的に結合できる、言い換えれば、これは第１の増幅反応で形成された第１のプライマーの伸長産物の３’末端領域に特異的に結合することができる、３’末端に配列セグメント４．１．１を含む［又は本質的に４．１．１からなる］第４（左）のオリゴヌクレオチドプライマーＰ４．１、
ｇ．  第２の鋳型依存性核酸ポリメラーゼ、特にＤＮＡポリメラーゼ、及び任意に鋳型依存性核酸ポリメラーゼの基質（特にリボヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸）及び適切な補因子。
【００２０】
試料は、第２の増幅を可能にする条件下で上記の成分とインキュベートされ、第３のオリゴヌクレオチドプライマーのプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ）及び第４のオリゴヌクレオチドプライマーのプライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ）を含む増幅産物が形成され、これは、標的配列Ｍ又は少なくともそれらの部分及び対応する相補的配列を含む。
【００２１】
しかしながら、本発明は、図５０から５６に示されるトポロジーに必ずしも限定されない。
【００２２】
発明のさらなる態様は、次の成分を含むキットに関する：
ａ．  ５’−３’方向に２つの配列セグメントＰ１．１．２及びＰ１．１．１を直近に連続して含む第１（右）のオリゴヌクレオチドプライマーＰ１．１であって、
ｉ．  Ｐ１．１．１は、増幅される配列［Ｍ１．１］に相補的に［ハイブリダイズ］する任意の配列セグメントであり、及び
ｉｉ．  配列セグメントＰ１．１．２は、増幅される配列［又は増幅される配列に関して３’の直後の配列］に結合できない；及び
ｉｉｉ．  Ｐ１．１．２は、Ｐ１．１．２が鋳型依存性核酸ポリメラーゼの活性に鋳型として機能することができないように修飾ヌクレオチドビルディングブロックを含む；及び
ｂ．  配列特異的な様式で第１のオリゴヌクレオチドプライマーが結合した配列の対向鎖上の配列に結合できる第２（左）のオリゴヌクレオチドプライマーＰ２．１；
ｃ．  配列セグメントＣ１．２．３、Ｃ１．２．２及びＣ１．２．１を５’−３’方向に直近に連続して含むコントローラーオリゴヌクレオチドＣ１．２であって、
ｉ．  Ｃ１．２．３は、増幅される配列［Ｍ１］のセグメントＭ１．２と同一であり、［Ｍ１．１の］Ｐ１．１．１の結合部位の５’に位置し［及びＰ１．１のポリメラーゼの開始時に最初に読み取られ、したがって、Ｃ１．２．３は、オリゴヌクレオチドプライマーの重合産物Ｐ１．１−Ｅｘｔに結合することができる］、
ｉｉ．  Ｃ１．２．２はＰ１．１．１に相補的であり（及びＭ１．１と同一）、及び
ｉｉｉ．  Ｃ１．２．１はｐ１．１．２に相補的であり、
そして、Ｃ１．２は、Ｃ１．２．１が、鋳型依存性核酸ポリメラーゼを活性化するための鋳型として機能できないように、Ｃ１．２．１で修飾されたヌクレオチドビルディングブロックを含む；
ｄ．  第１の鋳型依存性核酸ポリメラーゼ、特にＤＮＡポリメラーゼ、及び任意に鋳型依存性核酸ポリメラーゼの基質（特にリボヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸）及びＭｇ塩のような適切な補因子；
ｅ．  第１のオリゴヌクレオチドプライマーＰ１．１とは異なり、特にセクションＰ１．１．２を持たず、かつ標的配列［Ｍ１］の［セクションＭ１．１］に（逆）相補的である、３’末端に配列セグメント３．１．１を含む［又は本質的に３．１．１からなる］第３（右）のオリゴヌクレオチドプライマーＰ３．１；
ｆ．  第３のオリゴヌクレオチドプライマーが結合された配列の反対鎖の配列に配列特異的に結合できる、３’末端に配列セグメント４．１．１を含む［又は本質的に４．１．１からなる］第４（左）のオリゴヌクレオチドプライマーＰ４．１；
ｇ．  第２の鋳型依存性核酸ポリメラーゼ、特にＤＮＡポリメラーゼ、及び任意に鋳型依存性核酸ポリメラーゼの基質（特にリボヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸）及び適切な補因子。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、核酸を増幅するための方法に関し、第１の標的配列Ｍ１を含む核酸を含有する試料であって、５’−３’方向に配列セグメントＭ１．５、Ｍ１．４、Ｍ１．３、Ｍ１．２、及びＭ１．１を直後に連続して含む前記試料を、第１の増幅ステップにおいて、以下の成分と接触する；
−  第１の鋳型依存性核酸ポリメラーゼ、特にＤＮＡポリメラーゼ、及び鋳型依存性核酸ポリメラーゼの基質、
−  ５’−３’方向に配列セグメントＰ１．１．２及びＰ１．１．１を直近に連続して含む第１の（右）オリゴヌクレオチドプライマーＰ１．１であって、Ｐ１．１．１はＭ１．１に相補的に［ハイブリダイズ］する配列を有し、及び配列セグメントＰ１．１．２はＭ１に結合できない、及び
ここで、Ｐ１．１（特に部位Ｐ１．１．２において）は、Ｐ１．１．２が第１の鋳型依存性核酸ポリメラーゼを活性化するための鋳型として機能できないように、修飾ヌクレオチドビルディングブロックを含む；及び
−  （本質的に）Ｍ１．５と同一である、第２（左）のオリゴヌクレオチドプライマーＰ２．１、
−  ５’−３’方向に配列セグメントＣ１．２．３、Ｃ１．２．２、Ｃ１．２．１が直後に連続して含まれるコントローラーオリゴヌクレオチドＣ１．２であって、Ｃ１．２．３は、Ｍ１．１の５’方向に位置するＭ１のセグメントＭ１．２と同一であり、Ｃ１．２．２はＰ１．１．１と相補的であり（及びＭ１．１と同一であり）、及びＣ１．２．１はＰ１．１．２と相補的であり、
そしてここで、Ｃ１．２は、Ｃ１．２．１が、鋳型依存性核酸ポリメラーゼを活性化するための鋳型として機能できないように、Ｃ１．２．１で修飾されたヌクレオチドビルディングブロックを含み、
そして、該試料を、第１のプローブオリゴヌクレオチドにさらに接触し、該第１のプローブオリゴヌクレオチドは：
ａ．  配列セグメントを含み、該配列セグメントは
ｉ．  配列セグメント  Ｍ１．２、Ｍ１．３、及びＭ１．４に位置するＭ１の配列と同一である；又は
ｉｉ．  配列セグメントＭ１．３及びＭ１．４に位置するＭ１配列に相補的である、
ｂ．  蛍光色素に結合し、該蛍光色素は、
ｉ．  第１のプローブオリゴヌクレオチドに連結された第２のプローブオリゴヌクレオチドを持つドナークエンチャー対又はＦＲＥＴ対を形成する；又は
ｉｉ．  第１のプローブオリゴヌクレオチドの結合部位に十分近接して結合できる第２のプローブオリゴヌクレオチドに連結される蛍光色素を持つドナークエンチャー対又はＦＲＥＴ対を形成する。
【００２４】
さらに、本発明の態様は、次のステップを含む方法として構成することができる：
Ａ）（第１の標的配列）を含む核酸断片（以下、開始核酸鎖とも呼ばれる）を提供するステップ。
Ｂ）第１のオリゴヌクレオチドプライマー、第２のオリゴヌクレオチドプライマー、コントローラーオリゴヌクレオチド、第１のＤＮＡポリメラーゼ、及び第１のポリメラーゼの基質（ｄＮＴＰ）、適切な緩衝溶液を含む第１の増幅系（増幅システム）を提供するステップ。
Ｃ）第３のオリゴヌクレオチドプライマー、第４のオリゴヌクレオチドプライマー、第２の熱安定性ポリメラーゼ及び第２のポリメラーゼの基質（ｄＮＴＰ）、及び適切な緩衝溶液を含む第２の増幅系を提供するステップ。
任意に、本発明の目的が、特にプローブを用いて、第１及び／又は第２の増幅系によって増幅された核酸断片の検出も含む限り、検出系がさらに提供される。
Ｄ）第１の標的配列を含み、相補的二重鎖を形成できる第１のプライマー伸長産物及び第２のプライマー伸長産物を含む、第１の増幅断片１．１を得るために、最初の鋳型鎖として開始増幅鎖を使用し、第１の増幅を実行するステップであって、第１のプライマー伸長産物は、鋳型としての開始核酸鎖及び／又は第２のプライマー伸長産物を使用するポリメラーゼによる第１のプライマーの鋳型依存性伸長から生じる、及び第２のプライマー伸長産物は、第１のプライマー伸長産物を鋳型として使用するポリメラーゼによる第２のプライマーの鋳型依存性伸長から生じ、ここで前記第１及び第２のプライマー伸長産物は、それぞれのプライマー伸長の鋳型として相互に機能し、そして第１の増幅産物１．１の両方の相補鎖は、新たなプライマーが合成されたプライマー伸長産物のそれぞれの相補的セグメントに結合することが可能であるように、コントローラーオリゴヌクレオチドの協調により、少なくとも部分的に一本鎖形態に変換することができる。
第１の増幅に使用される反応条件は、第１の増幅系の両方のプライマーのハイブリダイズ及び鋳型依存プライマー伸長を可能にする少なくとも１つの温度ステップ、及び第１のプライマー伸長産物がコントローラーオリゴヌクレオチドの関与により、第２のプライマー伸長産物から分離される少なくとも１つの温度ステップを含む。使用される反応条件は、コントローラーオリゴヌクレオチドの非存在下での第２のプライマー伸長産物からの第１のプライマー伸長産物の自然分離を可能にしない。第１の増幅は、第１の増幅生成物１．１の所望の量が合成されるまで実施される。
Ｅ）相補的な二本鎖を形成できる、第３のプライマー伸長産物及び第４のプライマー伸長産物を含む第２の増幅断片２．１を得るために、最初の鋳型鎖としての第１の増幅断片１．１の２つの鎖の少なくとも一つを使用し、かつ第２の増幅系を使用し、第２の増幅を実行するステップであって、増殖断片２．１の両鎖は、プライマー伸長中に相互に鋳型として機能することができ、第２の増幅で使用される反応条件により、少なくとも１つの温度ステップにおいて相補的領域に結合する、第２の増幅系の２つのプライマーのハイブリダイズ及び第２の増幅系のプライマーの鋳型依存プライマー伸長を可能にし、かつ第３のプライマー伸長産物及び第４のプライマー伸長産物を含む、少なくとも１つのさらなる温度ステップにおいて二本鎖の分離を可能にし、第３及び第４のプライマー伸長産物が、再プライマー結合及び伸長が行われるように、一本鎖に変換される。第２の増幅は、第２の増幅産物２．１の所望の量が合成されるまで行われる。
【００２５】
詳細には、それぞれの増幅系の成分の特性、第１の標的配列を含む核酸断片の特性、及び使用される反応条件の特性は、２つの増幅反応の過程を決定する。
【００２６】
一般的に、第１の増幅はコントローラーオリゴヌクレオチドの関与によって行われる。２つの合成プライマー伸長産物の分離は、少なくとも第１のプライマー伸長産物の配列、及びコントローラーオリゴヌクレオチドの配列に対するその相補性に部分的に依存する。
【００２７】
第２の増幅中では、コントローラーオリゴヌクレオチドを関与させることなく、第２の増幅断片が本質的に増幅される。
【００２８】
どちらの増幅反応の過程も、目的の増幅産物（増幅断片  １．１及び増幅断片  ２．１）及びそれらの中間体（中間体産物）の両方を形成することができる。
【００２９】
中間体の組成は、提供される第１及び第２の増幅系の成分に本質的に依存する。
【００３０】
発明の詳細な説明
初めに述べた本発明の目的は、特に２つの連続する増幅の組み合わせによって解決され、ＰＣＲ増幅が最終ステップである。
【００３１】
本発明の他の目的は、特定の態様及び実施形態において以下に説明されるプローブ系を使用することによって解決される。
【００３２】
以下では、いくつかの分子プロセスとその得られる産物、及びそれらの可能な中間の段階について、例示的かつ概略的な方法で説明する。本発明の態様１によれば、増幅の方法が提供される。この方法は次のステップを含む：
１）次のステップを含む第１の増幅のステップ
１．Ａ）標的配列を含む、増幅される第１の核酸の鋳型（鋳型鎖、開始核酸鎖）として機能する核酸断片の３’セグメントに第１オリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズするステップであって、第１のオリゴヌクレオチドプライマーは以下の領域を含む：
−  増幅される第１の核酸の鋳型鎖の３’セグメントに配列特異的に結合でき、かつ標的配列の少なくとも一部に相補的な第１の領域；
−  第２領域が、コントローラーオリゴヌクレオチドによって結合されることができ、選択した反応条件下で第１の増幅に使用されるポリメラーゼによって本質的にコピーされないままである、第１の領域の５’末端に隣接する、又はリンカーを介して接続される第２領域；
１．Ｂ）  第１のオリゴヌクレオチドプライマーに加えて、標的配列の鋳型鎖に本質的に相補的である、ポリメラーゼによって合成される領域を含む第１のプライマー伸長産物を得るために、第１の鋳型依存性ポリメラーゼによって増幅される第１の核酸の相補的セグメントにハイブリダイズした場合の、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長のステップであって、第１プライマー伸長産物及び増幅される第１核酸の鋳型鎖は、第１の増幅で使用される反応条件下で本質的に二本鎖として存在する；
１．Ｃ）  第１のプライマー伸長産物へのコントローラーオリゴヌクレオチドの結合のステップであり、コントローラーオリゴヌクレオチドは以下の領域を含む；
・  第１オリゴヌクレオチドプライマー及び／又は第１のプライマー伸長産物の第２の領域に結合できる第１の領域；
・  第１のオリゴヌクレオチドプライマー及び／又は第１のプライマー伸長産物の第１領域に本質的に相補的又は完全に相補的な第２領域、及び
・  ポリメラーゼによって合成されるプライマー伸長産物の領域に少なくとも部分的に相補的又は本質的に相補的である第３の領域；
ここで、コントローラーオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドプライマーのプライマー伸長のための鋳型として機能しない、及び
コントローラーオリゴヌクレオチドは、鋳型鎖（標的配列）の一方の鎖と同一又は本質的に同一である配列セグメントを含む、及び
コントローラーオリゴヌクレオチドは、第１のプライマー伸長産物の第１の領域に結合する、及び  
コントローラーオリゴヌクレオチドは、第１のプライマー伸長産物の第２の領域、及び第１のプライマー伸長産物の合成領域に少なくとも部分的に結合し、それにより、増幅される第１の核酸の鋳型鎖の相補的部分を置換する；ここで、第２のオリゴヌクレオチドプライマーに相補的な第１のプライマー伸長産物のセグメントを含む、第１のプライマー伸長産物のポリメラーゼ合成領域は、反応条件下で一本鎖になる；
１．Ｄ）  第２のオリゴヌクレオチドプライマーを、第１のプライマー伸長産物の一本鎖相補的セグメントにハイブリダイズするステップであり、第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、第１のプライマー伸長産物の合成領域に配列特異的にハイブリダイズできる領域を含み、標的配列の少なくとも一部を含む；
１．Ｅ）  第２のオリゴヌクレオチドプライマーに加えて、第１の標的配列の少なくとも一部を含むポリメラーゼ合成領域を含む第２のプライマー伸長産物を得るために、鋳型として第１のプライマー伸長産物を使用する、第１のポリメラーゼによる第２のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長のステップであって、第１のプライマー伸長産物及び第２のプライマー伸長産物は、第１の増幅の反応条件下で第１の二本鎖増幅産物を形成する、及び
１．Ｆ）  必要に応じて、複数の繰り返しを含む第１の増幅のステップを繰り返すステップ。
２）  次のステップを含む第２の増幅のステップ（図１５）：
２．Ａ）  第３のオリゴヌクレオチドプライマーを第１の増幅産物の第２のプライマー伸長産物にハイブリダイズするステップであって、第３のオリゴヌクレオチドプライマーは、第２のプライマー伸長産物のセグメントに本質的に配列特異的に結合できる第１の領域を含む；
２．Ｂ）  第３オリゴヌクレオチドプライマーに加えて、第２オリゴヌクレオチドプライマー又は増幅される核酸又は標的配列の一部に本質的に相補的な配列セグメントを含むポリメラーゼによって合成される領域を含む第３プライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ１）を得るために、第２のプライマー伸長産物を鋳型として使用する第２のポリメラーゼによる第３オリゴヌクレオチドプライマーの伸長のステップであって、第２オリゴヌクレオチドプライマー及び第３プライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ１）は二本鎖である；
２．Ｃ）第４オリゴヌクレオチドプライマーを、第１の増幅産物の第１プライマー伸長産物にハイブリダイズするステップであって、第４オリゴヌクレオチドプライマーは、第１のプライマー伸長産物のポリメラーゼ合成領域に本質的に配列特異的に結合できる第１の領域を含む；
２．Ｄ）  第４オリゴヌクレオチドプライマーに加えて、第１のオリゴヌクレオチドプライマーに本質的に相補的であり、かつ標的配列の部分を含む、ポリメラーゼによって合成される領域を含む、第４プライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ１）を得るために、第１プライマー伸長産物を鋳型として使用する第２ポリメラーゼによる第４のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長のステップであって、第１のプライマー伸長産物及び第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ１）は、二本鎖として存在する；
２．Ｅ）  第１のプライマー伸長産物と第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ１）から二本鎖を分離し、第２のプライマー伸長産物と第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ１）から二本鎖を分離するステップ；
２．Ｆ）  第３のオリゴヌクレオチドプライマーを、第４のプライマー伸長産物（ステップ２．Ｄで取得、Ｐ４．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ１）にハイブリダイズするステップであって、第３のオリゴヌクレオチドプライマーは、本質的に配列特異的に第４のプライマー伸長産物のセグメント（Ｐ４．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ１）に結合できる第１の領域を含む；
２．Ｇ）  完全な第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ）を得るための、第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ１）を鋳型として使用する第２のポリメラーゼによる第３のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長のステップであって、第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ）及び第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ１）は、二本鎖として存在する；
２．Ｈ）  第４のオリゴヌクレオチドプライマーを、第３のプライマー伸長産物（ステップ２Ｂで取得、Ｐ３．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ１）にハイブリダイズするステップであって、第４のオリゴヌクレオチドプライマーは、第３のプライマー伸長産物のポリメラーゼ合成領域に配列特異的に本質的に結合することができる第１の領域を含む；
２．Ｉ）  完全な第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ）を得るための、第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ１）を鋳型として使用する、第２のポリメラーゼによる第４のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長のステップであって、第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ１）及び第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ）が、二本鎖として存在する；
２．Ｊ）  第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ１）及び完全な第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ）による二本鎖を分離する、及び第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ１）及び完全な第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ）による二本鎖を分離するステップ；
２．Ｋ）  第３のオリゴヌクレオチドプライマーを、完全な第４のプライマー伸長産物（ステップ２Ｉで取得、Ｐ４．１−Ｅｘｔ）にハイブリダイズするステップであって、第３のオリゴヌクレオチドプライマーは、本質的に配列特異的に第４のプライマー伸長産物のセグメント（Ｐ４．１−Ｅｘｔ）に結合できる第１の領域を含む；
２．Ｌ）  完全な第３プライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ）を得るための、完全な第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ）を鋳型として使用する、第２のポリメラーゼによる第３のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長のステップであって、完全な第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ）及び完全な第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ）は、二本鎖として存在する；
２．Ｍ）  第４のオリゴヌクレオチドプライマーを、完全な第３のプライマー伸長産物（ステップ２Ｇで取得、Ｐ３．１−Ｅｘｔ）にハイブリダイズするステップであって、第４のオリゴヌクレオチドプライマーは、完全な第３のプライマー伸長産物のポリメラーゼ合成領域に配列特異的に本質的に結合することができる第１の領域を含む；
２．Ｎ）  完全な第４プライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ）を得るための、完全な第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ）を鋳型として使用する、第２のポリメラーゼによる第４のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長のステップであって、第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ）及び完全な第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ）は、二本鎖として存在する；
２．Ｏ）  完全な第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ）及び完全な第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ）で構成されるステップ２．Ｌ及び２．Ｎで形成される二本鎖を分離するステップ；
２．Ｐ）  任意に、必要に応じて、第２の増幅のステップを繰り返し、完全な第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ）及び完全な第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ）を増加させ、任意に数回繰り返すステップ。
【００３３】
特にプローブを有する得られる増幅産物の検出に関する態様及び実施形態では、反応混合物に検出系を追加することが目的とされ得る。
【００３４】
あるいは、本発明の前記態様はまた、核酸を増幅する方法として構成され得る（図１、５）：
１）標的配列を含む第１の増幅断片１．１の増殖の伝播ための第１の増幅を実行することであって、第１の増幅は以下のステップを含む：
ａ）  第１のオリゴヌクレオチドプライマーを、増幅される核酸鎖の鎖の３’セグメントにハイブリダイズするステップであって、増幅される核酸鎖は標的配列を含み、
第１のオリゴヌクレオチドプライマーは以下の領域を含む：
・  増幅される核酸鎖の鎖に配列特異的に結合できる第１のオリゴヌクレオチドプライマーの３’セグメントの第１のプライマー領域
・  コントローラーオリゴヌクレオチドを結合すること、及びコントローラーオリゴヌクレオチドによる鎖置換（ステップｃ）を支持することに適したポリヌクレオチドテールを含む、直接又はリンカーを介して第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１のプライマー領域の５’末端に結合される第２の領域であって、ポリメラーゼのポリヌクレオチドテールは、選択された反応条件下で本質的にコピーされないままである。
ｂ）  増幅される核酸鎖の標的配列（ａ）に相補的な配列を含む第１のプライマー伸長産物を形成するためのポリメラーゼによる第１のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長のステップ、
ｃ）  コントローラーオリゴヌクレオチドを、第１の伸長オリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域のポリヌクレオチドテールに結合するステップであって、コントローラーオリゴヌクレオチドは以下の領域を含む：
・  第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域のポリヌクレオチドテールに結合できる第１の一本鎖領域、
・  第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１の領域に本質的に相補的であり、それに結合できる第２の一本鎖領域、
・  第１のプライマー伸長産物のポリメラーゼ合成伸長産物の少なくとも１つのセグメントに本質的に相補的な第３の一本鎖領域、
ここで、コントローラーオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドプライマーのプライマー伸長のための鋳型として機能しない、
ｄ）  第１の伸長オリゴヌクレオチドプライマーの第１のプライマー領域へのコントローラーオリゴヌクレオチドを結合し、それにより増幅された核酸鎖の前記第１のプライマー領域へ相補鎖を置換するステップ、
ｅ）  第１の伸長オリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物の相補的セグメントへのコントローラーオリゴヌクレオチドを結合し、それにより前記伸長産物に相補的な増幅された核酸鎖の鎖を置換するステップであって、第１のプライマー伸長産物の３’セグメントが一本鎖になる、
ｆ）  第２のオリゴヌクレオチドプライマーを、第１のプライマー伸長産物にハイブリダイズするステップであって、第２のオリゴヌクレオチドプライマーの３’セグメントは、第１のプライマー伸長産物にハイブリダイズできる配列を含む、及び
ｇ）  第２のプライマー伸長産物を形成するために、第２のオリゴヌクレオチドプライマーをポリメラーゼで伸長するステップであって、伸長は、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１のプライマー領域を含み、前記第１のプライマー領域はポリメラーゼによってコピーされ、第２の領域のポリヌクレオチドテールはコピーされないままである、
（ｈ）  望ましいレベルの増幅が達成されるまで、ステップ（ａ）〜（ｇ）を繰り返すステップ。
２）第１の増幅反応で得られる第１の増幅断片１．１を鋳型として使用し、第３プライマー及び第４プライマー及び第２ポリメラーゼ、及び適切な補因子を使用して、標的配列又は標的配列の少なくともセグメント（又はその相補配列）を含む第２の増幅断片２．１の増加につながる第２の増幅を実行するステップであって、ここで
・  第３のオリゴヌクレオチドプライマーは、第２のプライマー伸長産物及び／又は第４のプライマー伸長産物に本質的に配列特異的な様式で結合でき、第２のポリメラーゼによって伸長できる、
・  第４のオリゴヌクレオチドプライマーは、第１のプライマー伸長産物及び／又は第３のプライマー伸長産物に本質的に配列特異的な様式で結合でき、第２のポリメラーゼによって伸長できる、
かつ第３及び第４のプライマーから得られるプライマー伸長産物は、第２の増幅断片２．１の指数関数的増幅のための鋳型として機能することができる。
【００３５】
さらに、前述の態様のいずれかによる方法は、第２の増幅がＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲ増幅とも呼ばれる）であり、標的配列を含む第２の増幅断片２．１の増幅を可能にする条件下で行われることを特徴とし得る。
【００３６】
さらに、前述の態様のいずれか１つによる方法は、少なくとも第２の増幅が、プローブオリゴヌクレオチドを含む検出系の存在下で行われるＰＣＲ増幅であることを特徴とし得る。
【００３７】
さらに、前述の態様のいずれか１つによる方法は、第２の増幅がＰＣＲ増幅であり、プライマーがポリメラーゼによってハイブリダイズ及び／又は伸長される少なくとも１つのステップ、及び得られるプライマー伸長産物が一本鎖形態に変換（変性）される少なくとも１つのステップを含む条件下で行われることを特徴とし得る。
【００３８】
さらに、前述の態様のいずれか１つによる方法は、第２の増幅がＰＣＲ増幅であり、所望の量の増幅断片２．１が合成されるまで行われることを特徴とし得る。
【００３９】
さらに、前述の態様のいずれか１つによる方法は、第２の増幅の第３のオリゴヌクレオチドプライマーが、第２のプライマー伸長産物の３’セグメント及び／又は第４のプライマー伸長産物の３’セグメントに結合でき，ポリメラーゼによって伸長することができることを特徴とし得る。
【００４０】
さらに、前述の態様のいずれか１つによる方法は、第２の増幅の第４のオリゴヌクレオチドプライマーが、第１のプライマー伸長産物の３’セグメント及び／又は第３のプライマー伸長産物の３’セグメントに結合でき、ポリメラーゼによって伸長することができることを特徴とし得る。
【００４１】
さらに、前述の態様のいずれか１つによる方法は、第２の増幅の第３のオリゴヌクレオチドプライマーが、その３’セグメントで第２のプライマー伸長産物及び／又は第４のプライマー伸長産物に結合でき、ポリメラーゼによって伸長することができることを特徴とし得る。
【００４２】
さらに、前述の態様のいずれか１つによる方法は、第２の増幅の第４のオリゴヌクレオチドプライマーが、その３’セグメントで第１のプライマー伸長産物及び／又は第３のプライマー伸長産物に結合でき、ポリメラーゼによって伸長することができることを特徴とすることができる。
【００４３】
さらに、前述の態様のいずれか１つによる方法は、第２の増幅の第３のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物及び／又は第４のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物が、標的配列の少なくとも１つのセグメント又はその相補的な配列を含むことを特徴とし得る。
【００４４】
前述の態様のいずれか１つによる方法は、コントローラーオリゴヌクレオチドの第３の一本鎖領域が、ポリメラーゼによって合成される第１のプライマー伸長産物の伸長産物のセグメント（第１のプライマー領域の直後に隣接する）に本質的に相補的であることを特徴とする。
【００４５】
さらに、前述の態様のいずれか１つによる方法は、第１のプライマー伸長産物に相補的な増幅される核酸の鎖の置換が、増幅される核酸の前記相補的な鎖が第１のプライマー伸長産物から離脱するまで行われることを特徴とすることができる。
【００４６】
さらに、前述の態様のいずれか１つによる方法は、方法のステップ（ｆ）が、第２のオリゴヌクレオチドプライマーの第１のプライマー伸長産物へのハイブリダイゼーションを含む点で改変され、第１の伸長産物との結合からのコントローラーオリゴヌクレオチドの少なくとも部分的な置換は、鎖置換によって同時に達成されることを特徴とすることができる。
【００４７】
さらに、前述の態様のいずれか１つによる方法は、方法のステップ（ｇ）が、ポリメラーゼの制御下で、コントローラーオリゴヌクレオチドの、第１のプライマー伸長産物との結合からの置換を含むように改変されることを特徴とすることができる。
【００４８】
さらに、前述の態様のいずれか１つによる方法は、方法のステップ（ｈ）が、コントローラーオリゴヌクレオチドが、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１の特異的伸長産物のセグメントと同時に相補的な二本鎖を形成しながら、第１の伸長オリゴヌクレオチドプライマーのコピーされていないポリヌクレオチドテールへのコントローラーオリゴヌクレオチドの結合、及び第１のプライマー伸長産物への結合からの第２のプライマー伸長産物の置換を含むように改変されることを特徴とし得る。
【００４９】
さらに、前述の態様のいずれか１つによる方法は、ステップ（ａ）から（ｇ）の繰り返しを可能にする条件下でステップの繰り返しが実行されることを特徴とすることができる。
【００５０】
さらに、前述の態様のいずれか１つによる方法は、第１及び第２のオリゴヌクレオチドプライマー及びコントローラーオリゴヌクレオチドを使用する指数反応における第１及び第２のプライマー伸長産物の同時増幅を含むことを特徴とし得、プライマー伸長産物は相互合成の鋳型として機能する。
【００５１】
個々の産物及び中間体の収率は、いくつかの要因に依存する。例えば、個々のオリゴヌクレオチドプライマーの濃度が高いほど、一般的に産物／中間体の収量が高くなる。さらに、産物／中間体の形成は、反応温度の選択、及び個々の反応物の相互への結合親和性（鋳型鎖内の相補的プライマー結合部位への個々のプライマーの結合の親和性）によって影響を受けることが可能であり：例えば、より長いオリゴヌクレオチドは一般に、より高い温度でより短いオリゴヌクレオチドよりも良好に結合し、ＣＧレベルも相補的な配列セグメントで役割を果たすことができる：ＣＧが豊富な配列はまた、ＡＴが豊富な配列よりも高温で強く結合する。さらに、ＭＧＢ又は２−アミノ−ｄＡ又はＬＮＡなどの修飾は、プライマーのそれぞれの相補的セグメントへの結合強度を高めることができ、これによりまた、高温でオリゴヌクレオチドプライマーが優先的に結合する。
【００５２】
したがって、個々のプライマー配列の配列セグメントを設計することにより、特定の産物／中間産物の収量に影響を与え、したがって増幅中のそれらの富化に影響を与えることができると推定することができる。
【００５３】
さらに、本発明による核酸の増幅方法（図１、５、５５〜５７）は、以下のステップの結果として構成することができる：
ａ）次のステップを含む第１の増幅のステップ：
−  標的配列を含む開始核酸１．１の提供のステップ
−  第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）を標的配列（開始核酸１．１又はＰ２．１−Ｅｘｔのいずれか）を有する増幅される核酸にハイブリダイズさせるステップであり、第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）は以下の領域を含む：
・  増幅するべき核酸の領域（Ｐ２．１Ｅ１）に配列特異的に結合できる第１の領域（Ｐ１．１．１）、  
・  第１領域の５’末端に隣接する、又はリンカーを介して接続される第２領域（Ｐ１．１．２）であり、第２領域が、コントローラーオリゴヌクレオチドによって結合されることができ、選択した反応条件下で使用されるポリメラーゼによって本質的にコピーされないままである；
−  第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）に加えて、増幅される核酸又は標的配列に本質的に相補的である合成領域（Ｐ１．１Ｅ１からＰ１．１Ｅ４）を含む、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）を得るための、第１のポリメラーゼによる第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）の伸長のステップであり、第１のプライマー伸長産物及び増幅される核酸が、二本鎖として存在する；
−  第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）へのコントローラーオリゴヌクレオチド（Ｃ１．２）の結合のステップであり、コントローラーオリゴヌクレオチド（Ｃ１．２）は以下の領域を含む；
・  第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１Ｅ６）の第２の領域（オーバーハング）に結合できる第１の領域（Ｃ１．２．１）、
・  第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１．１）の第１の領域に相補的である第２の領域（Ｃ１．２．２）、及び
・  第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１Ｅ４）の合成領域の少なくとも一部に本質的に相補的な第３の領域（Ｃ１．２．３）；及び
ここで、コントローラーオリゴヌクレオチド（Ｃ１．１）は、第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）のプライマー伸長の鋳型として機能せず、かつコントローラーオリゴヌクレオチド（Ｃ１．１）は、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１Ｅ６，Ｐ１．１Ｅ５，Ｐ１．１Ｅ４）に結合し、それにより、増幅される核酸の相補的領域（Ｐ２．１Ｅ１，Ｐ２．１Ｅ２）を置き換える；
−  第２のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）を第１のプライマー伸長産物にハイブリダイズするステップであり、第２のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ２．１）は、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１Ｅ１）の合成領域に配列特異的に結合できる領域（Ｐ２．１．１）を含む、  
−  第２のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ２．１）に加えて増幅される核酸又は標的配列に本質的に同一である合成領域（Ｐ２．１Ｅ４からＰ２．１Ｅ１）を含む、第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１−Ｅｘｔ）を得るための第１のポリメラーゼによる第２のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ２．１）の伸長のステップであり、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）及び第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１）が、第１の二本鎖増幅産物を形成する；及び
−  所望の量の第１の増幅産物が合成されるまで、第１の増幅のステップが繰り返される。
ｂ）次のステップを含む第２の増幅のステップ：
−  第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．２）を第２のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）にハイブリダイズするステップであり、第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．２）は、第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１Ｅ１）の領域に配列特異的に結合できる第１の領域（Ｐ３．１．１）を含む、
−  第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．２）に加えて、第２のプライマー伸張産物（Ｐ２．１−Ｅｘｔ）又は標的配列に本質的に相補的である合成領域（Ｐ３．１Ｅ５からＰ３．１Ｅ２又はＰ３．１Ｅ５からＰ３．１Ｅ１）を有する第３のプライマー伸張産物（Ｐ３．２−Ｅｘｔ）を得るための第２のポリメラーゼによる第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．２）の伸長のステップであって、第２のプライマー伸張産物（Ｐ２．１）及び第３のプライマー伸張産物（Ｐ３．１）が二本鎖として存在する；
−  第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）及び／又は第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ）に第４のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ４．２）をハイブリダイズするステップであって、第４のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ４．２）は、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１Ｅ１）及び第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１Ｅ２）の合成領域に配列特異的に結合できる第１の領域（Ｐ４．１．１）を含む、
−  第４のオリゴヌクレオチドプライマーに加えて、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）に本質的に相補的である、又は標的配列と本質的に同一である合成領域（Ｐ４．１Ｅ５からＰ４．１Ｅ２又はＰ４．１Ｅ５からＰ４．１Ｅ１）を含有する第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．２−Ｅｘｔ）を得るための、第２のポリメラーゼによる第４のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ４．２）の伸長のステップであり、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）及び第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ）は二本鎖として存在する；
−  第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）及び第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．２−Ｅｘｔ）による二本鎖を分離し、第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１−Ｅｘｔ）及び第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ）による二本鎖を分離し、及び第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ）及び第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ）による二本鎖を分離するステップ；
−  第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．２）を、第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．２−Ｅｘｔ）にハイブリダイズし、第２のポリメラーゼによって第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．２）を伸長するステップ；及び
−  第４のオリゴヌクレオチドプライマーを、第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．２−Ｅｘｔ）にハイブリダイズし、第２のポリメラーゼによって第４のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ４．２）を伸長するステップ。
【００５４】
さらに、本発明は次の態様を含む：
【００５５】
核酸断片が一本鎖形態の標的配列を含む、態様１に記載の方法。
【００５６】
態様１による方法であって、標的配列を含む核酸断片が二本鎖形態で提供され（第１の標的配列、開始核酸鎖、及びそれに相補的な核酸断片を含む）、及び前記二本鎖核酸断片は、第１の増幅の前に一本鎖形態に変換される。
【００５７】
態様１による方法であって、第２の増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）として第３及び第４のプライマーを使用して行われる。
【００５８】
態様１による方法であって、第１の増幅中の合成された鎖の分離が、主にコントローラーオリゴヌクレオチドの関与を伴い配列特異的である。
【００５９】
態様１による方法であって、第２の増幅中の合成された鎖の分離が、合成された鎖の分離を引き起こし得る温度を使用して実行される。例えば、そのような温度は、８０℃〜１０５℃の温度範囲を含む。
【００６０】
態様１による方法であって、第２の増幅中のハイブリダイゼーション及びプライマー伸長が、合成された鎖の相補的配列セグメントへのプライマーの主に相補的な結合、及び第２のポリメラーゼによるプライマー伸長を可能にする温度で行われる。例えば、そのような温度は、２０℃〜約８０℃の温度範囲を含む。
【００６１】
態様１による方法であって、第２の増幅の前に、第１の増幅中に合成された第１及び第２のプライマー伸長産物の分離が行われ、両方のプライマー伸長産物が一本鎖になる。
【００６２】
態様１による方法であって、第１のオリゴヌクレオチドプライマーが、その第１の領域に、その３’セグメントの第１の標的配列に相補的に結合することができる配列セグメントを含む。
【００６３】
態様１による方法であって、第２のオリゴヌクレオチドプライマーがその３’領域に、第１の標的配列の一部と本質的に同一である配列セグメントを含み、前記部分が標的配列の５’セグメントに位置する。
【００６４】
態様１による方法であって、コントローラーオリゴヌクレオチドが、その第２及び第３の領域に、標的配列の一部と本質的に同一である配列セグメントを含む。
【００６５】
態様１による方法であって、第１の標的配列及び前記第１の標的配列に相補的な鎖が、第１のオリゴヌクレオチドプライマー及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマー対の両側に含まれる。
【００６６】
態様１による方法であって、第３のオリゴヌクレオチドプライマーがその３’領域に、第１の増幅断片１．１の第２のプライマー伸長産物に本質的に相補的に結合できる配列セグメントを含む。
【００６７】
態様１による方法であって、第３オリゴヌクレオチドプライマーが、その３’領域に第１の増幅断片１．１の第２のプライマー伸長産物に本質的に相補的に結合できる配列セグメントを含み、さらに前記３’領域が第１の標的配列に相補的なセグメントを含む。
【００６８】
態様１による方法であって、第４のオリゴヌクレオチドプライマーがその３’領域に、第１の増幅断片１．１の第１のプライマー伸長産物に本質的に相補的に結合できる配列セグメントを含む。
【００６９】
態様１による方法であって、第４のオリゴヌクレオチドプライマーが、その３’領域に、第１の増幅断片１．１の第１のプライマー伸長産物に本質的に相補的に結合できる配列セグメントを含み、さらに前記３’領域が、本質的に第１の標的配列の部分と同一であるセグメントを含み、前記部分は標的配列の５’領域にある。
【００７０】
態様１による方法であって、第１の標的配列及び前記標的配列に相補的な鎖が、第３のオリゴヌクレオチドプライマー及び第４のオリゴヌクレオチドプライマーによって形成されるプライマー対の両側に少なくとも部分的に含まれる。
【００７１】
態様１による方法であって、第１のオリゴヌクレオチドプライマー及び第３のオリゴヌクレオチドプライマーが同一である。
【００７２】
態様１による方法であって、第１のオリゴヌクレオチドプライマー及び第３のオリゴヌクレオチドプライマーが同一であり、第２の増幅中に生じるプライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ１）及び（Ｐ４．１−Ｅｘｔ）が同一である。
【００７３】
態様１による方法であって、第１のオリゴヌクレオチドプライマー及び第３のオリゴヌクレオチドプライマーは同一であるが、第２及び第４のプライマーは異なる。
【００７４】
態様１による方法であって、第１のオリゴヌクレオチドプライマー及び第３のオリゴヌクレオチドプライマーが同一であり、第２の増幅中に生じるプライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ１）及び（Ｐ４．１−Ｅｘｔ）が同一であるが、第２及び第４のプライマーのプライマー伸長産物は異なる。
【００７５】
態様１による方法であって、第２のオリゴヌクレオチドプライマー及び第４のオリゴヌクレオチドプライマーが同一である。
【００７６】
態様１による方法であって、第２のオリゴヌクレオチドプライマー及び第４のオリゴヌクレオチドプライマーが同一であり、第２の増幅中に生じるプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ１）及び（Ｐ３．１−Ｅｘｔ）が同一である。
【００７７】
態様１による方法であって、第２のオリゴヌクレオチドプライマー及び第４のオリゴヌクレオチドプライマーは同一であるが、第１及び第３のオリゴヌクレオチドプライマーは異なる。
【００７８】
態様１による方法であって、第２のオリゴヌクレオチドプライマー及び第４のオリゴヌクレオチドプライマーが同一であり、第２の増幅中に生じるプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ１）及び（Ｐ３．１−Ｅｘｔ）が同一であるが、第１及び第３のオリゴヌクレオチドプライマーのプライマー伸長産物は異なる。
【００７９】
態様１による方法であって、第１のオリゴヌクレオチドプライマー及び第３のオリゴヌクレオチドプライマー、並びに第２及び第４のオリゴヌクレオチドプライマーが同一である。
【００８０】
態様１による方法であって、第１のオリゴヌクレオチドプライマー及び第３のオリゴヌクレオチドプライマー、並びに第２及び第４のオリゴヌクレオチドプライマーが同一であり、第２の増幅中に得られるプライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ１）及び（Ｐ４．１−Ｅｘｔ）は同一であり、得られるプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ１）と（Ｐ３．１−Ｅｘｔ）は同一である。
【００８１】
態様１による方法であって、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域が、第１の標的配列に結合しないポリヌクレオチドテールを含む。
【００８２】
態様１に関する前述の実施形態は、互いに組み合わせることができる。
【００８３】
第１の増幅で増幅される核酸は、第１の標的配列を含む。第１の増幅を開始する前に、標的配列を含み、第１の増幅断片の合成の鋳型として機能する少なくとも１つの開始核酸鎖１．１が反応に付加される。
【００８４】
第１の増幅（第１の増幅断片１．１）の合成プライマー伸長産物は、標的配列を含む。前記第１の増幅断片１．１は、第２の増幅のための鋳型機能を有する開始核酸鎖２．１として機能することができる。
【００８５】
第２の増幅（第２の増幅断片２．１）で合成されるプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ及びＰ４．１−Ｅｘｔ）は、第１の標的配列の少なくとも一部を含む。
【００８６】
本開示の文脈における「本質的に相補的」という用語は、２つの核酸、特にそれらの相互に相補的な領域が、互いの不一致が５、４、３、２、又は１を超えないことを意味する。
【００８７】
本発明による方法の特定の実施形態では、第１の増幅のステップは、第１の増幅断片（１．１）が１０から１Ｅ１２、特に１００から１０Ｅ９、特に１，０００から１０Ｅ９（１０Ｅ９＝１，０００，０００，０００）の範囲のコピー数で存在するまで繰り返されることが提供される。
【００８８】
本発明による方法の特定の実施形態では、第１の増幅のステップが少なくとも２回繰り返されることが提供される。
【００８９】
本発明による方法の特定の実施形態において、第２の増幅は、第１の増幅断片（１．１）が１０から１Ｅ１２、特に１００から１Ｅ１０、特に１０Ｅ３から１０Ｅ９の範囲のコピー数から開始されることが提供される。
【００９０】
本発明による方法の特定の実施形態では、第２の増幅のステップは、増幅断片（２．１）が１０Ｅ５から１Ｅ１６、特に１０Ｅ５から１Ｅ１４、特に１０Ｅ６から１Ｅ１４の範囲のコピー数で存在するまで繰り返されることが提供される。
【００９１】
本発明による方法の特定の実施形態では第２の増幅のステップが少なくとも２回繰り返されることが提供される。
【００９２】
さらなる実施形態では、検出系は、蛍光レポーターで標識された少なくとも１つのプローブオリゴヌクレオチドを含む。
【００９３】
さらなる実施形態では、検出系は、蛍光レポーター及び蛍光クエンチャーで標識された少なくとも１つのプローブオリゴヌクレオチドを含む。
【００９４】
さらなる実施形態では、検出系は、蛍光レポーターとＦＲＥＴ対を形成することができるドナー蛍光色素分子で標識された少なくとも１つのプローブオリゴヌクレオチドを含む。
【００９５】
さらなる実施形態では、プローブオリゴヌクレオチドは、形成されるプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ、Ｐ２．１−Ｅｘｔ、Ｐ３．１−Ｅｘｔ、Ｐ４．１−Ｅｘｔ）の少なくとも１つに本質的に相補的な配列セグメントを含み、これは、形成されたプライマー伸長産物の少なくとも１つに適切な条件下（ハイブリダイゼーション条件）でハイブリダイズできる。
【００９６】
さらなる実施形態では、前記配列セグメントは、第１及び／又は第３のプライマー伸長産物に相補的である。
【００９７】
さらなる実施形態では、前記配列セグメントは、第１及び／又は第３のプライマー伸長産物に相補的であり、プローブオリゴヌクレオチドは、コントローラーオリゴヌクレオチドにより相補的に結合されないそれぞれのプライマー伸長産物の３’セグメントで相補的に結合できる。
【００９８】
さらなる実施形態では、前記配列セグメントは、第２及び／又は第４のプライマー伸長産物に相補的である。
【００９９】
さらなる実施形態では、プローブオリゴヌクレオチドの前記配列セグメントは、１０ヌクレオチド〜５０、特に１５〜４０、特に１５〜３０のヌクレオチドの範囲の長さを含む。
【０１００】
さらなる実施形態では、プローブオリゴヌクレオチドの前記配列セグメントは、コントローラーオリゴヌクレオチドに本質的に相補的である配列セグメントを含まない。
【０１０１】
さらなる実施形態では、プローブオリゴヌクレオチドの前記配列セグメントは、コントローラーオリゴヌクレオチドに本質的に相補的な配列セグメントを含み、前記セグメントの長さは、２０ヌクレオチド未満であり、特に１５ヌクレオチド未満を含み、特に１０ヌクレオチド未満を含む。
【０１０２】
さらなる実施形態では、プローブオリゴヌクレオチドの前記配列セグメントは、オリゴヌクレオチドプライマーの１つに本質的に相補的である配列セグメントを含まない。
【０１０３】
さらなる実施形態では、プローブオリゴヌクレオチドの前記配列セグメントは、オリゴヌクレオチドプライマーの１つに本質的に相補的な配列領域を含み、前記セグメントの長さは、２０ヌクレオチド未満であり、特に１５ヌクレオチド未満，特に１０ヌクレオチド未満、特に５ヌクレオチド未満を含む。
【０１０４】
さらなる実施形態では、プローブオリゴヌクレオチドの前記配列セグメントは、コントローラーオリゴヌクレオチドの第３の領域の配列と本質的に同一である配列領域を含まない。
【０１０５】
さらなる実施形態では、プローブオリゴヌクレオチドの前記配列セグメントは、コントローラーオリゴヌクレオチドの第３の領域の配列と本質的に同一である配列領域を含み、前記セグメントの長さは、２０ヌクレオチド未満であり、特に１５ヌクレオチド未満、特に１０ヌクレオチド未満を含む。
【０１０６】
一実施形態では、コントローラーオリゴヌクレオチドは、以下の成分（蛍光レポーター及び／又は蛍光クエンチャー及び／又はドナー蛍光色素分子）の１つを含み、前記成分の少なくとも１つは、コントローラーオリゴヌクレオチドの第３の領域に位置する。
【０１０７】
一実施形態では、プローブオリゴヌクレオチドは、５’−３’ヌクレアーゼによって少なくとも部分的に切断可能である。
【０１０８】
さらなる実施形態では、プローブオリゴヌクレオチドは、増幅産物の１つにより含まれる標的配列又はその部分に本質的に相補的な配列セグメントを含み、前記セグメントの長さは５〜５０ヌクレオチド、特に１０〜４０ヌクレオチド、特に１５〜３０ヌクレオチドの範囲である。
【０１０９】
さらなる実施形態では、プローブオリゴヌクレオチドは、標的配列又はその相補鎖に本質的に相補的な配列セグメントを含まない。
【０１１０】
さらなる実施形態では、プローブオリゴヌクレオチドは、標的配列又はその相補鎖に本質的に相補的でない配列セグメントを含む。
【０１１１】
適切なハイブリダイゼーション条件下で形成されたプライマー伸長産物のそれぞれの相補的セグメントへのプローブオリゴヌクレオチドの結合は、二本鎖の形成をもたらす。ハイブリダイゼーション条件は、方法の間に存在する。
【０１１２】
方法の間の適切な時点で、反応を適切な波長の光で照射して、蛍光シグナルを生成し、蛍光シグナルを蛍光レポーターで検出し、蛍光シグナルの強度が測定される。
【０１１３】
蛍光シグナルの検出は、蛍光シグナルの増加又は蛍光シグナルの減少が測定される適切な光学的／物理的手段によって行われる。適切なセンサーを使用して、適切なキャリブレーションの後に、反応混合物中に所望の標的配列が存在するかどうかを決定することが可能である測定値に、蛍光シグナルの強度が変換され得る。
【０１１４】
蛍光検出系の重要な態様は、レポーターとクエンチャーの対である。クエンチャーがレポーターに近接している場合、励起光にさらされてもシグナルは発せられない。レポーター分子とクエンチャー分子が相補的なステム配列により近接している場合、照明下でも蛍光シグナルは発生しない。ただし、レポーターとクエンチャーの間にあるヌクレオチド配列が標的配列とハイブリダイズできるように蛍光系が変更される場合、反応混合物が励起光源で照射されると、レポーター分子が蛍光放射線を放出するレポーター分子からクエンチャーが遠く離れるように、レポーターとクエンチャーとが空間的距離へもたらされる。レポーターとクエンチャーとの距離は、使用する分子によって異なる。通常、クエンチャーとレポーターの間隔が２５ヌクレオチド未満の場合、蛍光レポーターの照射後の光の放出は減少する、又はほぼ完全になくなる。この距離は、ヌクレオチド配列、又はリンカーやスペーサーなどの距離をもたらす特定の分子によってのいずれかによりもたらすことができる。
【０１１５】
さらなる実施形態では、蛍光レポーターは、吸収されたエネルギーを蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）によって蛍光レポーターに転移することができるドナー蛍光色素分子と特定のレポーター−ドナー対（ＦＲＥＴ対）を形成することができる。
【０１１６】
蛍光レポーター及び一致するドナー蛍光色素分子を含み、かつ蛍光共鳴エネルギー転移対を形成するレポーター−ドナー対は、そのようなＦＲＥＴ対のパートナーの１つだけがプローブオリゴヌクレオチドに結合され、他のパートナーがコントローラーオリゴヌクレオチドに結合されるようになり得る。蛍光レポーター及びドナー蛍光色素分子の両方は、プローブオリゴヌクレオチドの非ハイブリダイズ状態において、ドナー蛍光色素分子が吸収されたエネルギーを蛍光レポーターに転移できない程度でそれぞれのオリゴヌクレオチドに結合される。
【０１１７】
一実施形態では、コントローラーオリゴヌクレオチドは、検出系の構成成分であり、蛍光レポーター及び／又は蛍光クエンチャー及び／又はドナー蛍光色素分子を含む。コントローラーオリゴヌクレオチドを合成された第１又は第３のプライマー伸長産物に同時にハイブリダイズし、プローブオリゴヌクレオチドを同じ第１及び／又は第３プライマー伸長産物の３’セグメントに同時にハイブリダイズさせることにより、結合が、第１及び／又は第３のプライマー伸長産物の隣接配列位置で発生し、ドナー蛍光色素分子及び蛍光レポーターが空間的に近接することになる。これにより、ドナー蛍光色素分子から蛍光レポーターにＦＲＥＴが実行される程度に、蛍光レポーターとドナー蛍光色素分子との間の距離が短くなる。これは、蛍光レポーターの蛍光シグナルの生成につながり、蛍光レポーターの蛍光シグナルの検出可能な増加をもたらす。
【０１１８】
ハイブリダイズ後のドナー蛍光色素分子と蛍光レポーターとの間の距離は、２５ヌクレオチド未満、特に１５ヌクレオチド未満、特に５ヌクレオチド未満である必要がある。励起時の光の波長は、ドナー蛍光色素分子によって吸収され、レポーターに送達され、これにより、検出可能な光が放出される。増幅産物における検出系の配置に関する限りは、以下の実施形態が好ましく、蛍光レポーター又は蛍光クエンチャー又はドナー蛍光色素分子のいずれかが、コントローラーオリゴヌクレオチド、特にコントローラーオリゴヌクレオチドの第３の領域に結合される：
−  コントローラーオリゴヌクレオチドでの結合は、好ましくは、コントローラーオリゴヌクレオチドの第３の領域で行われる、
−  コントローラーオリゴヌクレオチドでの結合は、好ましくは、５’末端又は第３の領域又はその近傍で、例えば第３の領域の５’末端から２〜約１０ヌクレオチドで行われる、
−  プローブオリゴヌクレオチドへの結合は、好ましくはプローブオリゴヌクレオチドの中央領域で行われる、  
−  プローブオリゴヌクレオチドへの結合は、好ましくは、プローブオリゴヌクレオチドの３’セグメントで行われる。
【０１１９】
本発明の出願において、以下の実施形態が特に有利であることが判明している：
−  第１のプライマー伸長産物にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドのハイブリダイズの状態でのＦＲＥＴ対の２つの要素間の距離は、約３０ヌクレオチド未満である、
−  プライマー伸長産物の１つに相補的な３’セグメントを含むプローブオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼが前記３’末端を伸長できないように修飾される、
−  プローブオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼが前記３’末端を伸長できるように、プライマー伸長産物の１つに相補的な３’セグメントを含み、プローブオリゴヌクレオチドはＰＣＲプライマーとして機能する。
−  ２つ以上の核酸鎖が増幅される増幅を検出する方法であって、増幅される各核酸鎖に対して特定の検出系が使用される。
−  増幅される２つ以上の核酸鎖を増幅する増幅の検出方法であって、増幅される２つ以上の核酸鎖の増幅の検出が、均一な検出系によって行われる。
−  増幅には、プライマー伸長産物の１つの非対称増幅を含む。
−  蛍光レポーターの励起及び蛍光レポーターの蛍光シグナルの測定は、増幅中に行われる。
−  ドナー蛍光色素分子の励起及び蛍光レポーターの蛍光シグナルの測定は、増幅中に行われる。
−  蛍光レポーターの励起及び蛍光レポーターの蛍光シグナルの測定は、増幅後に行われる。
−  ドナー蛍光色素分子の励起及び蛍光レポーターの蛍光シグナルの測定は、増幅後に行われる。
−  プローブオリゴヌクレオチドはＤＮＡオリゴヌクレオチドである。
−  プローブオリゴヌクレオチドはＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、ポリメラーゼは伸長できないように、３’末端はブロックされる。
−  プローブオリゴヌクレオチドは、第１及び／又は第３のプライマー伸長産物に対する相補的配列セグメントを含み、前記配列セグメントは８〜約６０ヌクレオチドの長さを含む。
−  プローブオリゴヌクレオチドは、第１及び／又は第３プライマー伸長産物の３’セグメントに相補的な配列セグメントを含み、相補的配列セグメントはコントローラーオリゴヌクレオチドによって結合されず、前記セグメントは８〜約４０ヌクレオチドの長さを含む。
【０１２０】
プローブオリゴヌクレオチドは、次の群：リンカー（ＨＥＧ、Ｃ３、Ｃ６など）、リン酸糖骨格修飾（ＰＴＯ、２’−Ｏ−Ｍｅ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ修飾など）から選択される少なくとも１つの追加修飾を含む。
【０１２１】
本発明による方法の特定の実施形態において、第３のオリゴヌクレオチドプライマー及び／又は第４のオリゴヌクレオチドプライマーは、第１の領域の５’末端に隣接する、又はリンカーを介して接続される第２の領域を有し、第１のプライマー伸長産物又は第２のプライマー伸長産物に相補的に結合することはできないことが提供される。
【０１２２】
本発明による方法の特定の実施形態では、第３及び／又は第４のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域は、第３及び／又は第４のオリゴヌクレオチドプライマーの第１の領域の５’方向に位置することが提供される。
【０１２３】
本発明による方法の特定の実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドプライマー及び／又は第４のオリゴヌクレオチドプライマーがバーコード配列を含むことが提供される。
【０１２４】
本発明による方法の特定の実施形態では、第１のプライマー伸長産物及び第４のプライマー伸長産物からの二本鎖の分離、並びに第２のプライマー伸長産物及び第３のプライマー伸長産物からの二本鎖の分離が、特に８５℃〜１０５℃の範囲の温度で熱変性によって行われることが提供される。
【０１２５】
本発明による方法の特定の実施形態では、第１のポリメラーゼが合成中に鎖置換が可能であることが提供される。
【０１２６】
本発明による方法の特定の実施形態では、第２のポリメラーゼが熱安定性ポリメラーゼであることが提供される。
【０１２７】
本発明による方法の特定の実施形態では、第１のポリメラーゼ及び第２のポリメラーゼが同一であることが提供される。
【０１２８】
本発明による方法の特定の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプライマー及び第３のオリゴヌクレオチドプライマーが本質的に同一であることが提供される。
【０１２９】
本発明による方法の特定の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ２．１）及び第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ４．２）が本質的に同一であることが提供される。
【０１３０】
本開示の文脈における「本質的に同一」という用語は、特に、２つの核酸配列が互いに５、４、３、２、又は１個を超える不一致がないことを意味する。
【０１３１】
本発明による方法の特定の実施形態では、第１の増幅の反応条件は、第１の増幅産物の自然解離が起こり得ないように選択されることが提供される。
【０１３２】
本発明による方法の特定の実施形態では、第２の増幅が２つ又は複数の温度で実行され、第１の温度で、第３及び／又は第４のオリゴヌクレオチドプライマーの第１及び／又は第２及び／又は第３及び／又は第４のオリゴヌクレオチドプライマー伸長産物へのハイブリダイゼーション及び伸長が起こり、第２の温度で、得られた二本鎖の分離が起こることが提供される。
【０１３３】
本発明による方法の特定の実施形態では、第２の増幅が３つ以上の温度で行われ、第１の温度では第３及び／又は第４のオリゴヌクレオチドプライマーの第１及び／又は第２及び／又は第３及び／又は第４のオリゴヌクレオチドプライマー伸長産物へのハイブリダイゼーションが起こり、第２の温度では、第３及び／又は第４のプライマーの伸長が起こり、そして第３の温度では、得られた二本鎖の分離が起こることが提供される。
【０１３４】
本発明による方法の特定の実施形態では、第１の増幅及び第２の増幅が同じ反応バッチで実施されることが提供される。
【０１３５】
本発明による方法の特定の実施形態では、第２のポリメラーゼ、第３のオリゴヌクレオチドプライマー及び／又は第４のオリゴヌクレオチドプライマーが活性化されることが可能であり、及び／又はコントローラーオリゴヌクレオチドが不活性化されることが可能であることが提供される。
【０１３６】
活性化可能なポリメラーゼは、例えば、熱安定性ポリメラーゼ（ホットスタートポリメラーゼ）又は抗体又は化学的修飾により可逆的に不活性化されるポリメラーゼなどの可逆的不活性化ポリメラーゼであり得る。
【０１３７】
活性化可能プライマーは、可逆的不活性化プライマー、例えば保護された３’−ＯＨ基を有するオリゴヌクレオチドであり得、保護基は、特に５’−エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによって除去され得る。ここで、第１の増幅において５’−エキソヌクレアーゼ活性のないポリメラーゼを使用することは有利であろう。
【０１３８】
コントローラーオリゴヌクレオチドは、例えば、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによって不活性化又は切断され得る。あるいは、コントローラーオリゴヌクレオチドはまた、第２の増幅の前に他の酵素的又は化学的方法によって切断され得、そしてしたがって、除去され得る。
【０１３９】
本発明による方法の特定の実施形態では、第２の増幅が行われる前に第１のポリメラーゼが不活性化されることが提供される。これは、例えば、第１のポリメラーゼが非耐熱性ポリメラーゼである場合、熱変性によって達成することができる。
【０１４０】
本発明による方法の特定の実施形態では、第１の増幅は第１の反応バッチで行われ、第２の増幅は第２の反応バッチで行われることが意図されている。
【０１４１】
本発明による方法の特定の実施形態において、第１の反応混合物のアリコートが第２の反応混合物に添加されることが意図される。
【０１４２】
本発明による方法の特定の実施形態において、完全な第１の反応混合物が第２の反応混合物に添加されることが意図される。
【０１４３】
本発明による方法の特定の実施形態において、コントローラーオリゴヌクレオチドの第３の領域は、第１のオリゴヌクレオチド伸長産物のオリゴヌクレオチドプライマー部分に直後に隣接する第１のプライマー伸長産物の合成領域のその部分に本質的に相補的であることが提供される。これは、増幅される核酸の配列特異的置換を改善するという利点を有する。
【０１４４】
本発明による方法の特定の実施形態において、コントローラーオリゴヌクレオチドは、第３のオリゴヌクレオチドプライマーの３’領域に配列特異的に本質的に結合することができる第４の領域を含むことが意図される。第４の領域は、コントローラーオリゴヌクレオチドの第２の領域及び／又は第３の領域内に位置することができ、又は第２及び／又は第３の領域の配列セグメントを含むことができ、第４の領域は、特に９〜３０ヌクレオチド、特に１０〜２０ヌクレオチド、又は１２〜１６ヌクレオチドの長さを有する。
【０１４５】
本明細書の文脈における「本質的に配列特異的」という用語は、互いに本質的に相補的である、増幅されるオリゴヌクレオチドプライマー及び核酸の領域が、５、４、３、２又は１つを超える不一致を含まないことを意味する。
【０１４６】
本発明の特定の実施形態では、コントローラーオリゴヌクレオチドが、コントローラーオリゴヌクレオチドに結合したプライマーの伸長を防ぐように適合された１つ又は複数のヌクレオチド修飾を含むことが提供される。例えば、複数の２’−Ｏ−アルキル修飾は、そのような伸長を阻止又は防止することができる。特に、複数のヌクレオチド修飾は、コントローラーオリゴヌクレオチドの第２及び／又は第３の領域に位置する。特に、コントローラーオリゴヌクレオチドは、そのような修飾の少なくとも５つ、より良好には少なくとも１０個の修飾を含む。
【０１４７】
特定の実施形態では、コントローラーオリゴヌクレオチドは、完全にヌクレオチド修飾からなる。
【０１４８】
本発明による方法の特定の実施形態において、コントローラーヌクレオチドの第３の領域に本質的に相補的である、ポリメラーゼによって合成される第１のプライマー伸長産物の領域の部分は、５ヌクレオチド〜７０ヌクレオチドの範囲の長さを有する。
【０１４９】
特定の実施形態において、コントローラーオリゴヌクレオチドの第３の一本鎖領域は、第１のプライマー伸長産物の５’セグメントに完全に相補的であり、前記相補的配列セグメントの長さは、次の長さ：少なくとも３〜７０ヌクレオチド、又は少なくとも５〜５０ヌクレオチド、特に５〜４０ヌクレオチド、５〜３０ヌクレオチド、特に５〜２０ヌクレオチドを有し得る。
【０１５０】
本発明による方法の特定の実施形態では、第１の増幅が本質的に等温で行われることが意図されている。
【０１５１】
本発明による方法の特定の実施形態では、第２の増幅が３つの温度で行われ、第１の温度では、第３又は第４のオリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイズ及び任意に該プライマーの初期伸長が行われ、そして第２の温度では、該プライマーの完全な伸長が行われ、第３の温度では、形成されたプライマー伸長産物のそれらのそれぞれの鋳型鎖からの分離が行われることが提供される。特に、第１の温度は２５℃〜６５℃の範囲で、第２の温度は６５℃〜８０℃の範囲で、第３の温度は８５℃〜１０５℃の範囲である。
【０１５２】
本発明による方法の特定の実施形態では、増幅される核酸は、２０ヌクレオチド〜３００ヌクレオチドの範囲の長さを有することが提供される。
【０１５３】
本発明による方法の特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーの第１のセグメントは、１５ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドの範囲の長さを有することが提供される。
【０１５４】
本発明による方法の特定の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドプライマーが１５ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドの範囲の長さを有することが提供される。
【０１５５】
本発明による方法の特定の実施形態において、コントローラーオリゴヌクレオチドは、２０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドの範囲の長さを有することが提供される。
【０１５６】
本発明による方法の特定の実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドプライマーは、１５ヌクレオチド〜６０ヌクレオチドの範囲の長さを有することが提供される。
【０１５７】
本発明による方法の特定の実施形態では、第４のオリゴヌクレオチドプライマーは、１５ヌクレオチド〜６０ヌクレオチドの範囲の長さを有することが提供される。
【０１５８】
本発明による方法の特定の実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドプライマーが少なくとも１つのヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド修飾、例えば、ＰＴＯ（ホスホチオエート）又は２’−Ｏ−アルキル修飾を有することが提供される。
【０１５９】
本発明による方法の特定の実施形態では、第４のオリゴヌクレオチドプライマーが少なくとも１つのヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド修飾、例えば、ＰＴＯ又は２’−Ｏ−アルキル修飾を有することが提供される。
【０１６０】
本発明による方法の特定の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプライマーが第２の領域、特に第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１の領域の直後に、使用されるポリメラーゼの第２の領域のコピーを停止／防止する１つ以上の修飾を有することが提供される。第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１の領域のみがコピーされることが有利である。
【０１６１】
これは、特定の実施形態では、第１のプライマー伸長産物と相補的な結合を形成することができるヌクレオチド修飾を使用することによって達成することができ、ヌクレオチド修飾は、ポリメラーゼによって鋳型として許容されない。そのようなヌクレオチド修飾の例は、例えば、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡ修飾（２’−ＯＭｅなど）、ＬＮＡ修飾又はモルホリノ修飾など、修飾されたリン酸−糖骨格部分を有するヌクレオチド化合物である。一般に、鎖にそのような修飾が存在すると、ＤＮＡ依存性ポリメラーゼがそのような鎖を転写することを防止する。そのような修飾の数は変動し得、通常、いくつかの修飾（１から２０の間）で、ポリメラーゼがこのような鎖を読み取るのを防ぐのに十分である。そのようなヌクレオチド修飾は、例えば、コントローラーオリゴヌクレオチドへの第１のオリゴヌクレオチドプライマーの結合部位で又はその周辺で、及び／又は第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域の構成成分として使用できる。
【０１６２】
そのような修飾の使用のおかげで、使用される構造の特定のセグメントがポリメラーゼによってコピーされず、主に一本鎖のままであるように、ポリメラーゼ機能は局所的に妨げられる。前記一本鎖形態では、それらはさらなる反応成分に結合することができ、したがってそれらの機能を実行することができる。
【０１６３】
本発明による方法の個々の特徴が特定の実施形態に存在するものとして上述されている限り、当業者は、前記特徴がより具体的な実施形態に組み合わされ得ることを承知している。これは、それらの組み合わせが無意味である（例えば、相互に排他的なパラメーターの重複の場合など）ことが明らかでない限り、本説明の文脈で議論されたすべての特徴に適用される。
【０１６４】
本発明の別の態様によれば、上述の態様又はそれらの具体的な実施形態もしくは代替物による、本発明による方法を実行するためのキットが提供される。本発明によるキットは以下を含む：
−  第１のオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の領域を含む：
・  増幅するべき核酸の領域に配列特異的に結合できる第１の領域、
・  第１の領域の５’末端に近接する、又はリンカーを介して接続される第２領域であり、第２領域が、第１のコントローラーオリゴヌクレオチドによって結合されることができ、選択した反応条件下で増幅に使用されるポリメラーゼによって本質的にコピーされないままである；
ここで、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、合成領域及び第１のオリゴヌクレオチドプライマーを含む第１のプライマー伸長産物へポリメラーゼによって伸長されることができる；
−  第２のオリゴヌクレオチドプライマーであって、第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、第１のプライマー伸長産物の合成領域に配列特異的に結合でき、第２のオリゴヌクレオチドプライマーに加えて、ポリメラーゼにより、合成領域を含む第２のプライマー伸長産物に伸長できる領域を含む、
−  コントローラーオリゴヌクレオチドであって、以下の領域を含む：
・  第１のプライマー伸長産物の第２の領域に結合できる第１の領域、
・  第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１の領域に本質的に又は完全に相補的である第２の領域；及び
・  プライマー伸長産物の合成領域の少なくとも一部に本質的に相補的又は完全に相補的である第３の領域；
ここで、コントローラーオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドプライマーのプライマー伸長のための鋳型として機能せず、かつコントローラーオリゴヌクレオチドは、第２のプライマー伸長産物の相補的領域を置換しながらプライマー伸長産物に結合することができる、
−  第３のオリゴヌクレオチドプライマーであって、前記第３のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記第２のプライマー伸長産物のセグメントに配列特異的に結合でき、ポリメラーゼによって、合成領域及び第３のオリゴヌクレオチドプライマーを含む第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ）に伸長可能な第１の領域を含む；及び
−  第４のオリゴヌクレオチドプライマーであって、第４のオリゴヌクレオチドプライマーは、第１のプライマー伸長産物の合成領域に配列特異的に結合でき、ポリメラーゼにより、合成領域及び第４のオリゴヌクレオチドプライマーを含む第４のプライマー伸長産物へ伸長されることができる第１の領域を含む。
【０１６５】
本発明によるキットの特定の実施形態では、キットは少なくとも１つのポリメラーゼをさらに含む。
【０１６６】
本発明のキットの特定の実施形態において、キットは、第１及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーを伸長することが意図される第１のポリメラーゼ並びに第３及び第４のプライマーを伸長することが意図される第２のポリメラーゼを含む。
【０１６７】
本発明によるキットの特定の実施形態では、第１のポリメラーゼは５’エキソヌクレアーゼ活性を有さず、かつ第２のポリメラーゼは５’エキソヌクレアーゼ活性を有さない。特に、第２のポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼであり得る。
【０１６８】
本発明によるキットの特定の実施形態では、第２のポリメラーゼ、第３のオリゴヌクレオチドプライマー及び／又は第４のオリゴヌクレオチドプライマーが活性化されることが可能であり、及び／又はコントローラーオリゴヌクレオチドが不活性化されることが可能であることが提供される。
【０１６９】
本発明の別の態様によれば、上記の態様によるキットの使用は、上記の態様又はそれらの具体的な実施形態又は代替物による、本発明による方法を実施するために提供される。
【０１７０】
本発明のさらなる詳細及び利点は、図及び選択された実施形態の詳細な説明によって非限定的に説明されるものとする。
【０１７１】
本発明による組み合わせは、次々に実行される２つの増幅方法を含む。第１の部分増幅（第１の増幅方法）中に、標的配列を含む核酸鎖が増幅される。これにより、増幅された核酸鎖が得られ、これはその後、第２の部分増幅（第２の増幅方法）で鋳型として使用される。前記第２の部分増幅は、多くの場合、従来のＰＣＲである。第２の部分増幅の間、第１の部分増幅で増幅された標的核酸又は標的核酸を含む核酸から増幅が継続される。ＰＣＲ断片は増幅される。前記ＰＣＲ断片は、特に標的配列又は標的配列の部分を含む。さらに、第２の増幅手順中に、増幅可能な核酸鎖に特定の変更を加えることができる。例えば、標的配列は、バーコーディングプライマー又は検出特異的オリゴヌクレオチドプライマーの使用により隣接され得る。ＰＣＲプローブ（いわゆるＴａｑｍａｎプローブなど）を使用した検出も検出できる。さらに、ＰＣＲ段階の間、固定化オリゴヌクレオチドプライマーを使用する標的配列の固相への固定化が使用され得、その結果、ＰＣＲは、固相ＰＣＲとして実行される。
【０１７２】
本発明による第１の増幅方法により、規定された配列組成を有する核酸鎖を合成又は増幅することが可能であるべきであり、生成された産物は、後続のＰＣＲのための鋳型機能を有する開始核酸鎖として働き得、ＰＣＲ増幅が少なくとも１つの特定のＰＣＲプライマーを使用して行われる。
【０１７３】
本発明の目的は、第１の増幅方法（第１の部分増幅）及びその実行のための対応する手段を提供することによってさらに解決される。前記第１の増幅手順の実行は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７１１０１１及び欧州出願１６１８５６２４．０にすでに記載されている。増幅の実行の詳細については、前記出願が参照される。
【０１７４】
第２の増幅方法（第２の部分増幅）は、特にＰＣＲとして行うことができ、使用されるプライマーの少なくとも１つは、第１の増幅方法で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーとは異なる組成及び／又は構造を有する。これは、特異的な標的配列又はその部分を含む少なくとも１つの核酸鎖の増幅をもたらす。
【０１７５】
ＰＣＲ増幅自体は通常、初期鋳型の約１，０００コピー以上、より良くは、約１００，０００コピー以上から、十分に特徴付けが可能な増幅産物を生成すること、又はリアルタイムモードで特定のシグナルを生成することが可能である。コピー数が１０００未満（１００又は１０コピーなど）に減少した場合、ＰＣＲはより多くの合成サイクルを含む必要があり、増幅産物又はシグナルの欠陥が増加することが可能である。これは、ＰＣＲがバッチに少量存在する配列異形（例えば、配列の突然変異又は対立遺伝子異形）を増幅する必要があり、大量の別の配列異形（例えば、野生型配列又は対立遺伝子異形）の存在下でＰＣＲ増幅が実行される場合に特に当てはまる。ＰＣＲの特異性を改善するために多くの方法がすでに開発されているが、増幅依存検出法は、例えば液体生検の分野で、増幅方法の特異性をさらに向上させることで恩恵を受けることができる。特に臨床診断では、測定方法の特異性を改善する必要性がある。
【０１７６】
ＰＣＲ技術が広く使用されているため、分子生物学の多くの分野で使用されている、前記技術又は本質的なＰＣＲ法の拡張に多くの改変がなされている。別の第１の増幅方法の上流接続により、例えば、シグナル特異性又はＰＣＲ産物特異性は、前記適用において改善され得る。
【０１７７】
本発明は、前述の非常に特異的な増幅方法と下流ＰＣＲとの組み合わせを説明する。この組み合わせにより、第１の増幅方法の選択性の高い増幅条件下で、目的の量まで核酸鎖の初期コピー数を増幅し、次いで必要に応じて、ＰＣＲ増幅の特異性の低い条件下でさらに増幅することができる。このように、第１の増幅方法（第１の部分増幅）は、特異性の高い第１の増幅の機能を有する。第１のセグメントにおける合成されるコピー量は、例えば、約１０コピー〜約１Ｅ１１コピー、より良好には約１００コピー〜約１．０Ｅ１０コピー、好ましくは約１０００〜約１０Ｅ８コピーの範囲を含む。標的配列の量は、第１の増幅によって増加する。前記増幅（バッチ中の標的配列の初期量に基づく）は、例えば、以下の範囲であり、約２倍〜約１Ｅ１０倍、より良好には約１０倍〜約１０Ｅ９倍、さらに良好には約１０倍〜約１０Ｅ８倍、好ましくは約１０倍〜約１０Ｅ７倍、特に好ましくは約１００倍〜１０Ｅ６倍である。反応の容量に基づいて、次の濃度範囲が達成される：約１０ａｍｏｌ／ｌ〜約１０ｎｍｏｌ／ｌ、より良好には約１ｆｍｏｌ／ｌ〜約１ｎｍｏｌ／ｌ、さらに良好には約１０ｆｍｏｌ／ｌ〜約０．１ｎｍｏｌ／ｌ、特に約１０ｆｍｏｌ／ｌ〜約１０ｐｍｏｌ／ｌ。
【０１７８】
第２の増幅方法（第２の部分増幅、ＰＣＲ方法又はその改変型として使用される）は第２の増幅として機能し、第１の増幅の特定の産物と組み合わせにおけるＮＧＳライブラリー調製又は固相ＰＣＲでのプローブ挿入又はバーコーディング又は配列コーディングなどの既存のＰＣＲに基づく方法を使用できる。
【０１７９】
前記組み合わせの利点は、一方で、最終産物の所望の量まで増幅を行うために必要なＰＣＲサイクルの数の減少である。これにより、ＰＣＲによる欠陥産物の合成の確率又は程度が減少する。したがって、合成結果は、ＰＣＲ増幅単独の場合よりも高い特異性を持つことができる。
【０１８０】
特定の実施形態において、第１の増幅系の必要な成分を用いた第１の増幅は、第１の増幅反応の間、同じ反応バッチにおいて第２の増幅系の必須の成分の少なくとも１つの不在下で最初に実行される。例えば、ＰＣＲプライマー又は熱安定性ポリメラーゼは、ＰＣＲ増幅の前にのみ添加される。
【０１８１】
第１の増幅反応の完了後、反応混合物を、第２の増幅系の構成成分と接触し、ＰＣＲ増幅が行われる。
【０１８２】
特定の実施形態において、特定の増幅系の反応成分は、増幅が始まる前に、別個の反応バッチ及び／又は別個の反応容器中に存在する。
【０１８３】
例えば、第１の増幅反応は１つの反応容器内で行われ、次いで前記反応の合成物が（完全に又は部分的に）第２の反応容器に移され、次に第２の増幅が行われる。
【０１８４】
さらなる実施形態では、最初に、第１の増幅系の成分が添加され、第１の増幅反応が実行されるように、反応成分は順次添加される。次に、第２の増幅を行うことができるように、第２の増幅系の構成成分が添加される。さらなる実施形態において、第２の増幅系の成分は、反応が本質的に同じ反応容器内で行われるように、第１の増幅系に添加される。したがって、両方の増幅方法の配列は、個々の成分の添加の時間的順序によって測定される。
【０１８５】
汚染の可能性を減らすために、両方の反応は特に閉鎖系で行うことができる。そのような系は、例えば、少なくとも２つの別個の反応容器を含むことができる。ある反応容器から他の反応容器へのバッチの移送もまた、特定の実施形態では、閉鎖系を使用して行われる。閉鎖反応容器系における２つの反応のそのような分離は、例えば、カートリッジ系、又はアレイ系、又はマイクロ流体系を形成するために組み合わされる別個の反応容器として公知である。
【０１８６】
特定の実施形態では、第１の増幅の増幅された核酸を含む第１の増幅アプローチは、第１のアプローチを分割することなく第２の増幅に使用される。したがって、第１のバッチは、本質的に完全に第２の増幅反応に移される。第１の増幅手順から合成されたコピーの量は、それとともに第２の増幅系に移され、例えば、約１０コピー〜約１Ｅ１１コピー、より良好には約１００コピー〜約１Ｅ１０コピー、好ましくは約１０００〜約１０Ｅ９コピーの範囲を含む。それにより、標的配列の量は、第１の増幅によって増加する。前記増加（バッチ中の標的配列の初期量と比較して）は、例えば、以下の範囲であり、約２倍〜約１Ｅ１１倍、より良好には約１０倍〜約１，０００，０００，０００倍、さらに良好には約１０倍〜約１，００，０００，０００倍、好ましくは約１０倍〜約１，０００，０００，０００倍、特に好ましくは約１００倍〜１，０００，０００倍である。次の濃度範囲は、反応の容量に関連して達成できる：約１０ａｍｏｌ／ｌ〜約１０ｎｍｏｌ／ｌ、より良好には約１ｆｍｏｌ／ｌ〜約１ｎｍｏｌ／ｌ、さらに良好には約１０ｆｍｏｌ／ｌ〜約０．１ｎｍｏｌ／ｌ、好ましくは約１０ｆｍｏｌ／ｌ〜約１０ｐｍｏｌ／ｌ。
【０１８７】
さらなる特定の実施形態において、第１の増幅バッチの一部（アリコート又は部分的な量）のみが、好ましくは、第２の増幅反応において使用される。第１の増幅系による増幅により、少なくとも１つの標的配列を含む核酸鎖の量の増加が起こる。第２の増幅反応では、前記量の一部を出発物質として使用することができる。前記部分は、例えば、第２の反応バッチに移す、又は加えることができる。この部分は、例えば、比較的小さく、所望の用途の要件に本質的に依存することが可能である。ＰＣＲの増幅効果により、第２の増幅は、特に第１の増幅手順で配列特異的に増幅された核酸鎖の約１０００コピーを超える数から開始できる。
【０１８８】
したがって、第１の増幅手順で十分な量の増幅された核酸鎖が合成された場合に、ＰＣＲ増幅は開始することができる。前記合成された核酸鎖の量は、以下の範囲を含むことができる：例えば、約１０，０００コピー〜約１Ｅ１１コピー、より良好には約１０，０００コピー〜約１Ｅ１０コピー、特に約１０，０００〜約１Ｅ９コピーの範囲である。標的配列の量は、前記第１の増幅によって所望のとおり増加される。前記増幅（バッチ中の標的配列の初期量と比較して）は、初期量のＮ倍として測定することができ、例えば、以下の範囲内：約２倍〜約１Ｅ１１倍、より良好には約１０倍〜約１Ｅ１０倍、さらにより良好には約１０倍〜約１Ｅ９倍、特に約１０倍〜約１Ｅ８倍、特に約１００倍〜約１Ｅ６倍である。反応の容量に基づいて、次の濃度範囲が達成される：約１０ａｍｏｌ／ｌ〜約１０ｎｍｏｌ／ｌ、より良好には約１ｆｍｏｌ／ｌ〜約１ｎｍｏｌ／ｌ、さらに良好には約１０ｆｍｏｌ／ｌ〜約０．１ｎｍｏｌ／ｌ、特に約１０ｆｍｏｌ／ｌ〜約１０ｐｍｏｌ／ｌ。
【０１８９】
標的配列を含む特定の核酸鎖の１０００コピーを超える数が第１の増幅反応で生成できるため、前記量の画分（又はアリコート又は部分）を第２の増幅反応に使用できる。
【０１９０】
例えば、ＰＣＲは、以下の範囲を含む量から開始することができる：例えば、約１００コピー〜約１Ｅ１１コピー、より良好には約１，０００コピー〜約１Ｅ１０コピー、特に約１，０００〜約１Ｅ９コピー。前記量は、第１の増幅によって増幅された標的配列を含む合成された核酸鎖のサブ量として理解することができる。
【０１９１】
第１の増幅の増幅された合成産物の提供は、反応の量に関して以下の濃度範囲を含む：約１０ａｍｏｌ／ｌ〜約１００ｎｍｏｌ／ｌ、より良好には約１ｆｍｏｌ／ｌ〜約１０ｎｍｏｌ／ｌ、さらにより良好には約１０ｆｍｏｌ／ｌ〜約１ｎｍｏｌ／ｌ、特に約１０ｆｍｏｌ／ｌ〜約１０ｐｍｏｌ／ｌ。ＰＣＲ増幅は、第１の増幅の合成産物の前記濃度から開始することができる。ＰＣＲ増幅の過程で、産物のさらなる増幅が行われ、ＰＣＲ断片の最終濃度は、０．０１ｎｍｏｌ／ｌ〜５μｍｏｌ／ｌ、より良好には１ｎｍｏｌ／ｌ〜１μｍｏｌ／ｌの範囲の濃度が含まれる。
【０１９２】
また、第２の増幅方法では、第１の増幅方法で特異的に合成された核酸鎖の画分のみ使用することができる。特定の実施形態では、したがって、第１の増幅は、ＰＣＲの開始材料として必要又は所望されるコピーの必要な量に関して相対的な余剰を示すコピー量を提供する。
【０１９３】
前記第１の増幅反応から、一部は第２の増幅反応に移され、そこに含まれる合成された核酸鎖は、ＰＣＲ反応を開始するための鋳型として働く。
【０１９４】
例えば、第１の反応バッチの一部は、第１の反応バッチを希釈し、合成された核酸鎖を含む特定の容量部分を第２の反応に移すことによって作製することができる。それによって移される、特異的に合成された核酸鎖の量の一部は、ＰＣＲ断片を生成するための鋳型として機能し、それにより以下の範囲を含むことができる（第１の増幅ステップでの合成産物の総量で計算）：約１Ｅ−７％〜約９０％、より良好には約１Ｅ−６％〜約９０％、さらに良好には約０．０００１％〜約５０％、特に約０．００１％〜約５０％、又は約０．０１％〜約５０％、特に０．１％〜約２０％。
【０１９５】
これは、標的配列を含む合成された核酸鎖の希釈をもたらすだけでなく、第１の増幅系の構成成分、例えばプライマー及びコントローラーオリゴヌクレオチドの希釈ももたらす。生成された可能性のあるいずれの副産物も希釈される。第１の増幅系の成分の濃度の結果として生じる減少は許容され、ＰＣＲの性能にプラスの効果を与えることさえある。例えば、プライマー及びコントローラーオリゴヌクレオチドの希釈は、ＰＣＲ反応中に使用されるオリゴヌクレオチドプライマー又はオリゴヌクレオチドプローブが、第１の増幅系の移されたオリゴヌクレオチドプライマーよりも高い濃度で存在することをもたらし得る。これにより、ＰＣＲ反応を促進し、増幅手順への干渉を最小限にすることができる。
【０１９６】
さらに、前記コントローラーオリゴヌクレオチドは第２の増幅反応中にバッチに存在するが、第２の増幅中に濃度が低下し、合成生成物又は反応成分へのその結合が十分に遅くなる、又は相補的配列セグメントとの相互作用が減少する、又は不十分に起こり、したがって、全体的な反応配列に対するその効果が前記希釈効果によって減少するように、コントローラーオリゴヌクレオチドの希釈は、ＰＣＲ反応にプラスの影響を与えることが可能である。
【０１９７】
したがって、第２の増幅のための核酸鎖を提供する場合、第１の増幅系の反応成分の希釈も、一般に、提供される特定の核酸鎖の希釈と並行して行うことができる。第２の増幅反応に移された第１の増幅系の成分の相対量は、一部分として示すことができる。前記部分は、第１の増幅反応で使用される成分の量（１００％）を指す。第２の増幅反応における第１の増幅系の成分の移された部分は、例えば、以下の範囲を含む：約１Ｅ−７％〜約５０％、より良好には約１Ｅ−６％〜約３０％、さらに良好約０．０００１％〜約２０％、特に約０．００１％〜約１０％、特に好ましくは約０．１％〜約１０％。したがって、第１の増幅系の成分の濃度は、第２の増幅ステップにおけるそれらの効果が低減されるか又は無視できるように大幅に低減される。
【０１９８】
第１の反応バッチの移された部分は、例えば、使用される濃度又は体積部分を指し得る。例えば、第１の増幅系を含むバッチの１マイクロリットル（１μｌ）を（増幅の完了後）第２の増幅系を含むバッチの４９μｌに移すと、２％（ｖ／ｖ）の希釈又は１：５０の希釈にすることができる。希釈系列を使用すると、より高い希釈レベルを達成できる。
【０１９９】
例えば、第１の増幅系におけるコントローラーオリゴヌクレオチドの濃度は、１：１０００の希釈での約１０μｍｏｌ／ｌから約１０ｎｍｏｌ／ｌに減少させることができる。したがって、移された部分はわずか０．０１％である。そのような希釈では、標的配列を含む同じ割合の合成された核酸鎖を同時に移すことができる。例えば、第１の増幅反応では、約１０，０００，０００コピーの量が増幅され、１：１０００の希釈でＰＣＲ反応に移された生成物の量は、約１０，０００コピーの部分的な量になる。前記初期コピー量は、通常、ＰＣＲが安定し十分に特異的な増幅反応を行うために十分な量である。
【０２００】
干渉する可能性がある核酸鎖（例えば、野生型分子又は対立遺伝子変異体）の希釈の場合も同様に有利である。配列特異的な第１の増幅の間、主に標的分子の特異的な増幅が行われる。他の核酸鎖は増幅されない、又は著しく増幅されていない。
【０２０１】
希釈する場合、希釈効果は、ＰＣＲ反応を干渉する可能性のある前記配列にも適用される。例えば、野生型配列の量は１００，０００から約１００に削減される。これは、ＰＣＲ反応の特異性にプラスの効果を与えることができる。
【０２０２】
特定の実施形態では、特に両方の方法が１つのアプローチで（「均一アッセイ」として）実行される。前記目的のために、両方の増幅系の成分は、第１の増幅の開始時に１つのバッチで利用可能である必要がある。したがって、両方の増幅系に必要な成分は、第１の増幅が始まる前に反応バッチに添加される。
【０２０３】
特定の実施形態において、第１の増幅系の必要な成分を用いた第１の増幅は、第１の増幅反応の間、同じ反応バッチにおいて第２の増幅系の必須の成分の少なくとも１つの在下で最初に実行される。
【０２０４】
１つの反応バッチで両方の増幅系を統合するには、個々の成分又は濃度及び反応条件の調整が必要になり得る。
【０２０５】
第２の増幅系の成分の存在は、第１の増幅反応を妨げるべきではない。
【０２０６】
特定の実施形態では、コントローラーオリゴヌクレオチドと相補的結合を形成することができる、第３のオリゴヌクレオチドプライマーの３’セグメントの長さは、前記セグメントがコントローラーオリゴヌクレオチドによる鎖置換を妨げないように選択される。これは、コントローラーオリゴヌクレオチドによる鎖置換の反応条件下（例えば、第１の増幅中の６５℃ステップ）で、コントローラーオリゴヌクレオチドと第３のプライマーの３’セグメントの２本鎖複合体の安定性は、第３プライマーのコントローラーオリゴヌクレオチドへの結合がただ一時的なものであり、鎖置換を妨げないほど十分に低いということによって本質的に達成される。これは、例えば、コントローラーオリゴヌクレオチドとのそのような複合体を形成することができ得る第３のプライマーの３’セグメントの長さによって影響を受けることが可能である。例えば、前記複合体の長さは、８〜２０ヌクレオチドである。さらに、第３のプライマーの３’セグメントは、対応するセグメントのコントローラーオリゴヌクレオチドの配列組成と１つ以上の不一致を有し得、その結果、前記複合体が不安定化し得る。特に、１から３の不一致は、第３のプライマーの３’末端ヌクレオチドに対して−１０から−２０の位置に配置されている。これは、第３のプライマーのプライマー機能に大きな影響を与えることはないが、コントローラーオリゴヌクレオチドとの複合体の安定性を低下させる。
【０２０７】
さらに、第２の増幅系のポリメラーゼ及び両方のプライマーのコントローラーオリゴヌクレオチドは、鋳型として使用されるべきではない。コントローラーオリゴヌクレオチドに相補的に結合できる配列セグメントを含むため、これは、第３のオリゴヌクレオチドプライマーにとって特に重要である。したがって、第３のオリゴヌクレオチドプライマーへのその可能な相補的結合のセグメントにおけるコントローラーオリゴヌクレオチドの構造は、第１のセットの第１のプライマーと類似して設計することができる。特定の実施形態において、第３のオリゴヌクレオチドプライマーのプライマー伸長は、ポリメラーゼがコントローラーオリゴヌクレオチドに結合した第３のプライマーを伸長するのを防ぐためにヌクレオチド修飾を使用するコントローラーオリゴヌクレオチドによって防がれる。例えば、いくつかの２’−Ｏ−アルキル修飾は、そのようなブロッキング効果を媒介することができる。
【０２０８】
２つの増幅系間の不要な干渉を回避するために、第１の部分増幅において、第２の増幅系の成分を完全又は部分的に「不活性」又は「非活性化」又は「可逆的に非活性化」又は「非反応性」状態に保つことも有利であり得る。第２の増幅の実施のためにのみ、そのような成分は活性な、すなわち機能的状態に移行され必要がある。
【０２０９】
特定の実施形態では、前記成分は第１の増幅反応に関与しない、又はその関与は重要ではないように、前記ＰＣＲ成分の少なくとも１つは、第１の増幅中に可逆的に不活性化された形態で存在する。不活性化が取り除かれ、成分は第２の増幅反応において活性形態で存在し、したがって増幅においてそれらの役割を果たすことができるように、第１の増幅の完了後、前記可逆的に不活性化された成分は次いで最初に活性化される。
【０２１０】
例えば、可逆的に不活化されたＰＣＲプライマー又は可逆的に不活化された熱安定性ポリメラーゼ（いわゆるホットスタートポリメラーゼ）が使用される。例えば、第１の増幅から第２の増幅への変換ステップは、前記不活性形態の成分の活性化を可能にする反応条件を使用する。他の実施形態では、成分の活性化は、ＰＣＲ条件下で連続的に行われる。
【０２１１】
可逆的に不活性化されたプライマーのいくつかの例は当業者に知られている（例えば、ＣｌｅａｎＡｍｐプライマー（Ｔｒｉｌｉｎｋ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と呼ばれる熱不安定性プライマー）。そのようなプライマーは、ポリメラーゼが前記プライマーから合成を開始できるように、加熱することにより活性化することができる。可逆的に不活性化されたプライマーの他の例には、修飾糖残基を含む３’末端ヌクレオチドを有するプライマーが含まれ、例えば、ブロックされた３’−ＯＨ基（例えば、３’位のＣ３リンカー又は末端ジデオキシヌクレオチドを有するプライマー、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＮＡＲ  １９９８  ｐ．３０７３）である。
【０２１２】
特定の実施形態では、そのようなプライマーは、鋳型に対して３’末端不一致を示す。このようなプライマーを使用する場合、特に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示さないポリメラーゼ（例えば、Ｂｓｔポリメラーゼ又はその修飾体）が第１の増幅に使用される。したがって、そのようなプライマーは、第一段階の間、不活性化状態のままである。したがって、ＰＣＲ段階でそのようなプライマーを使用する場合は、それらを活性化する必要がある。活性化は通常、修飾された糖残基と一緒に３’末端ヌクレオチドを酵素的に切断することによって行われる。上記の理由により、そのようなプライマーを、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含む熱安定性ポリメラーゼ（いわゆるプルーフリーディングポリメラーゼ）と組み合わせて使用することが有利である。３’末端不一致を有するプライマーを含む特定の実施形態では、そのような末端不一致は、ポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼの機能を促進する。ＰＣＲ増幅の開始後、そのような「非活性化」プライマーは、鋳型上の相補的な位置に結合する。鋳型に結合した後、（ポリメラーゼに伴い）エキソヌクレアーゼ活性により、ブロッキング基を含む末端ヌクレオチドを除去することができる。これにより、ポリメラーゼによって伸長できる遊離３’−ＯＨ基及び相補的結合オリゴヌクレオチドプライマーが得られる。そのような「活性化された」プライマーは、これより、それぞれの鋳型に相補的な鎖を合成することができるように、ポリメラーゼによって伸長されることができる。ＰＣＲ条件下でこのようなプライマーを活性化できるポリメラーゼには、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、及びＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを含む。それぞれの鋳型に対して３’末端の（又は、例えば、３’末端のヌクレオチドに対して−１又は−２の位置に）不一致があるＰＣＲプライマーを設計することにより、そのようなプライマーの活性化を通常加速できる（例えば、Ｐｆｕポリメラーゼ又はＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ）。他の熱安定性ポリメラーゼは、鋳型に相補的であっても、ブロックされた３’−ＯＨ基を有する修飾末端ヌクレオチドを切断することもできる（例えば、Ｖｅｎｔポリメラーゼ又はＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔポリメラーゼ）。ＰＣＲプライマーに対するポリメラーゼの分解効果を制限するために、そのようなプライマーは、３’−５’ヌクレアーゼ非切断可能結合、例えば、１つ以上のホスホロチオエート（ＰＴＯ）修飾（例えば「マイナス２」又は「マイナス３」の位置、又は「マイナス２」から「マイナス７」の位置）を含み得る。これにより、プライマーの過度の分解を防ぐ。
【０２１３】
可逆的活性化ポリメラーゼには、例えば、抗体によって可逆的に不活性化される、又は化学的修飾によって可逆的に不活性化されるものが含まれる（ＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ）。いくつかの商用的供給会社は、ＰＣＲ用にこのような「ホットスタート」ポリメラーゼを開発している（Ｑｉａｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｒｏｃｈｅ）。特に、Ｔａｑポリメラーゼとその修飾体は、いわゆるホットスタートＴａｑポリメラーゼとして、さまざまな可逆的に不活性化された状態で提供されてきた。特に好ましくは、例えば、調製物を９５℃に１分間〜１０分間最初に加熱することによって活性型に変換されるホットスタートポリメラーゼである。抗体はポリメラーゼのさまざまなエピトープを遮蔽できるため、ポリメラーゼのさまざまな活性をさまざまな程度に可逆的に不活化できる（Ｓｃａｌｉｃｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９４、ｐ．１４７−、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ  ｅｔら、ＰＮＡＳ、１９９９、ｐ．６１４３）。
【０２１４】
均一形式の特定の種類の増幅では、第１の増幅反応で増幅される核酸鎖の指数関数的増幅を行ったポリメラーゼは、第２の増幅の開始前に加熱することによって不活性化される。前記不活性化は、例えば、調製物を８０℃を超えるまで、好ましくは９０℃を超えるまで、特に９５℃へ、１〜１０分間加熱することによって達成することができる。このようにして、中温性ポリメラーゼ（Ｂｓｔポリメラーゼ又はＢｓｍポリメラーゼ、又はＧｓｔポリメラーゼなど）を不活性化できる。このような不活性化は、第１の増幅反応のプロセスから第２の増幅反応への移行を促進する。このような温度ステップは、第１の増幅反応のポリメラーゼの不活性化及び第２の増幅反応のポリメラーゼの活性化が同時に起こることを可能にする。
【０２１５】
第１のポリメラーゼのそのような熱的不活性化のために、第１のポリメラーゼはもはや同じ程度にプライマー又は鋳型に結合することができない。したがって、第２の増幅反応の間、プライマー−鋳型複合体は、特に、第２の増幅ステップで合成を行うポリメラーゼによって使用される。
【０２１６】
このように一方のポリメラーゼから別のポリメラーゼへの切り替えにより、Ｂｓｔポリメラーゼによる鎖置換など、ポリメラーゼに関する他の活性を「切り替えオフにする」、又はＴａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を「切り替えオンにする」ことも可能である。
【０２１７】
特定の実施形態では、第１のプライマー伸長産物にハイブリダイズしたコントローラーオリゴヌクレオチドの５’セグメントは、第２の増幅中に、ポリメラーゼの５’−３ヌクレアーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ）によって切断されることができる。前記プロセスはよく知られており、プローブ分解及びＰＣＲ反応のリアルタイムモニタリングに使用されることが多い（米国特許第５，２１０，０１５号）。ここで、ポリメラーゼは、第３のプライマー伸長産物を使用して適切な反応条件下でヌクレオチドを組み込むことにより、第４のＰＣＲプライマーを相補的に伸長でき、同時に、ポリメラーゼは、第３のプライマー伸長産物にハイブリダイズした第３の領域のその５’セグメントでコントローラーオリゴヌクレオチドを酵素的に切断できる。合成中に、使用される反応条件下でＴａｑポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性を認識できる構造が形成され、前記構造は切断されることができるように、ポリメラーゼによって伸長された鎖は、少なくとも１つの３’末端ヌクレオチドによってコントローラーオリゴヌクレオチドと特に重複を形成する。５’−３’−エキソヌクレアーゼ活性により、コントローラーオリゴヌクレオチドの第３の領域のヌクレオチド間のホスホジエステル結合が切断されることになる。５’−３’−エキソヌクレアーゼ誘導切断は、特にＤＮＡ鎖で起こるが、２’−ＯＭｅリボヌクレオチド又はＰＴＯ修飾又はＰＮＡなどのいくつかの糖リン酸骨格修飾は、前記切断を遅延又は、さらに防止する。上記の理由により、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を含むポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）とコントローラーオリゴヌクレオチドとの組み合わせは、特に前記実施形態で特に使用され、第３の領域のその５’セグメントのコントローラーオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼによって切断可能なヌクレオチド又はそれらの類似体（例えば、ＤＮＡ）を主に含む。コントローラーオリゴヌクレオチドの前記５’セグメントの長さは、例えば、５〜５０、特に１０〜３０ヌクレオチドを含む。
【０２１８】
第１のプライマー伸長産物に結合したコントローラーオリゴヌクレオチドを分解することにより、ポリメラーゼは、鎖置換特性がなくても第２のプライマーを伸長させ、よって第２のプライマー伸長産物を合成することができる。
【０２１９】
特定の実施形態において、第１の増幅中の第２の増幅系の成分の存在は、以下のように考慮に入れられる：
【０２２０】
１つには、第２の増幅系の成分の効果は、第１の増幅の前のそれらの可逆的な不活性化によって低減することができる。一方、個々の配列要素は、第１の増幅中にプライマー伸長のための非特異的なマトリックスとして出現するべきではない。上記の理由により、第１及び第２の増幅系のプライマーは、プライマー二量体の形成を回避するために自己相補的構造の存在について確認されるべきである。
【０２２１】
第３のＰＣＲプライマーは通常、その３’セグメントに配列セグメントを含み、それはコントローラーオリゴヌクレオチドに相補的な領域を含む。これにより、第３のＰＣＲプライマーがコントローラーオリゴヌクレオチドに相補的に結合することを可能にする。第１の増幅を実行するために、第３のＰＣＲプライマーは、第１の増幅中にコントローラーオリゴヌクレオチドによる鎖置換を防ぐべきではない。この目的のために、第３のＰＣＲプライマーの３’セグメントの配列長又は配列組成は、鎖置換ステップの反応条件下（６５℃など）でコントローラーオリゴヌクレオチドに本質的に結合しないように調整される。これは、例えば、コントローラーオリゴヌクレオチド及び第３のオリゴヌクレオチドプライマーの３’セグメントからなる複合体の融解温度が、鎖置換ステップの反応温度、例えば、４５°〜６０℃の間を本質的に下回る。そのような第３のＰＣＲプライマーは、その３’セグメントがその鋳型になお結合することができ、プライマー伸長反応を開始できる。これは、達成することができ、例えば、コントローラーオリゴヌクレオチドに相補的に結合することができる第３のＰＣＲプライマーの３’セグメントが、長さ９〜３０ヌクレオチドの間、より良好には１２〜２０ヌクレオチドの間、特に１２〜１６ヌクレオチドの間である領域を含む。第３のＰＣＲプライマーの前記３’セグメントは、結合強度は減少し続けるように、コントローラーオリゴヌクレオチドの対応する位置との１つ又は複数の不一致を含み得る。
【０２２２】
第３のＰＣＲプライマーに本質的に相補的であるコントローラーオリゴヌクレオチドの配列セグメントは、コントローラーオリゴヌクレオチドの第４の領域を指す。コントローラーオリゴヌクレオチドの前記第４の領域は、第２の領域及び／又は第３の領域の配列セグメントを含み得る。
【０２２３】
コントローラーオリゴヌクレオチドの第４の領域は、９〜３０ヌクレオチド、より良くは１２〜２０ヌクレオチド、特に１２〜１６ヌクレオチドの間である長さの領域を含む。コントローラーオリゴヌクレオチドの第４の領域は、第３のＰＣＲプライマーの３’セグメントとの１つ以上の不一致を含むことができる。特に、前記第４の領域は、コントローラーオリゴヌクレオチドを鋳型として使用して、第３のＰＣＲプライマーが第１及び／又は第２の増幅系のポリメラーゼによって伸長されることを防ぐヌクレオチド修飾を含む。そのような修飾は、第１のプライマーとコントローラーオリゴヌクレオチドとの組み合わせについて既に記載されている。それらは、例えば、２’−Ｏ−アルキル修飾を有する配列セグメントを含み、前記セグメントの長さは６〜３０修飾であり得、第３のＰＣＲプライマーの３’末端ヌクレオチドに対するコントローラーオリゴヌクレオチドの相補的ヌクレオチドは、特にそのような修飾自体を含み、さらにそのような修飾を有する少なくとも３つのヌクレオチドが両側に隣接される。これにより、第３及び第４のプライマーのコントローラーオリゴヌクレオチド及び第２の増幅系のポリメラーゼが鋳型として使用されないことを確実にする。
【０２２４】
規定された長さを有する第１及び第２のプライマー伸長産物の生成は、コントローラーオリゴヌクレオチドを用いた前記２つの産物の分離において役割を果たす。したがって、第１の増幅反応中の鋳型としての第２の増幅系の第３又は第４のプライマーによる（それぞれ第１及び第２のプライマー伸長産物の）３’末端の可能な時期尚早の伸長を防ぐことに有利である。
【０２２５】
鋳型として第４のＰＣＲプライマーを使用する第１のプライマー伸長産物の３’末端の望ましくない過剰な伸長の低減又は防止は、さまざまな方法で実現できる。特定の実施形態では、これは、第４のＰＣＲプライマーが、第１のプライマー伸長産物の３’セグメントに結合する場合に、前記合成された第１のプライマー伸長産物の３’末端ヌクレオチドと完全に一致する相補的結合を形成することができないことによって達成される。これは、第１のプライマー伸長産物の３’末端ヌクレオチドの過剰な伸長を防止又は少なくとも低減するはずである。
【０２２６】
特定の実施形態では、これは、第４のＰＣＲプライマーが、第１のプライマー伸長産物の３’セグメントに結合したときに、前記合成された第１の末端ヌクレオチドの少なくとも１つと完全に一致する相補的結合を形成できないという事実によって達成される。得られる少なくとも１つの不一致の位置は、第１のプライマー伸長産物の末端ヌクレオチドに対して特に−１〜−５の位置にある。
【０２２７】
第３のＰＣＲプライマーを鋳型として使用して、第２のプライマー伸長産物の３’末端の望ましくない過剰な伸長を低減又は防止するには、さまざまな方法で達成することができる。特定の実施形態では、これは、第３のＰＣＲプライマーが、第２のオリゴヌクレオチド伸長産物の３’セグメントに結合する場合に、前記合成された第１のプライマー伸長産物の３’末端ヌクレオチドと完全に一致する相補的結合を形成できないという事実によって達成される。これは、第２のプライマー伸長産物の３’末端ヌクレオチドの過剰な伸長を防止又は少なくとも低減するはずである。
【０２２８】
特定の実施形態では、これは、第３のＰＣＲプライマーが、第２のプライマー伸長産物の３’セグメントに結合する場合に、前記合成された第２の末端ヌクレオチドの少なくとも１つと完全に一致する相補的結合を形成することができないことによって達成される。得られる少なくとも１つの不一致の位置は、第２のプライマー伸長産物の末端ヌクレオチドに対して特に−１〜−５の位置にある。
【０２２９】
第２の増幅中の第１の増幅系の成分の存在は、次のように考慮される：
１つには、第２の増幅の前にそれらを希釈することにより、第１の増幅系の成分の効果を低減することができる。一方、個々の要素は、第２の増幅中にプライマー伸長の非特異的な鋳型として現れるべきではない。上記の理由により、第１及び第２の増幅系のプライマーは、プライマー二量体の形成を回避するために自己相補的構造の存在について確認されるべきである。
【０２３０】
特定の実施形態では、第２の増幅は、第１の増幅系のコントローラーオリゴヌクレオチドの存在下で行われる。上記の理由により、コントローラーオリゴヌクレオチドの設計、第２のセットのプライマー及び反応条件は、第２増幅反応がコントローラーオリゴヌクレオチドの存在によって著しく妨害されないように適合されなければならない。
【０２３１】
まず、第２の増幅系のポリメラーゼ及び両方のプライマーのコントローラーオリゴヌクレオチドは、鋳型として使用されるべきではない。これは、第４の領域のコントローラーオリゴヌクレオチドに相補的に結合できる配列セグメントを含むため、第３のオリゴヌクレオチドプライマーにとって特に重要である。第４の領域におけるコントローラーオリゴヌクレオチドの構造は、可能なプライマー伸長を防ぐ修飾を特に含む。例えば、いくつかの２’−Ｏ−アルキル修飾は、そのような合成阻害効果を媒介することができる。
【０２３２】
コントローラーオリゴヌクレオチドは、第２の増幅中に第３のプライマー伸長産物に結合することができ、したがって、第３のプライマー伸長産物と相補鎖を形成することができる。このような二本鎖断片は、特定の状況下で、第３のプライマー伸長産物の５’セグメントをコピーすることを含めて、第４のＰＣＲプライマーから始まるポリメラーゼが完全に相補鎖を合成することを防ぎ得る。したがって、ポリメラーゼ及び反応条件の選択は、コントローラーオリゴヌクレオチドの結合が第４のプライマー伸長産物の合成を防止しないようなものでなければならない。
【０２３３】
コントローラーオリゴヌクレオチドに相補的に結合することができる第３のプライマー伸長産物のセグメントの長さは、例えば、第３のプライマーの配置によって決定される。特に、第３のプライマーは、コントローラーオリゴヌクレオチドに対して期待される第３のプライマー伸長産物の得られる完全に相補的な部分の長さが特に以下の範囲：約１５ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、又は約２０ヌクレオチド〜約４０ヌクレオチド、特に約２０ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチドにあるように配置される。
【０２３４】
特定の実施形態では、特に、第２の増幅反応において熱安定性ポリメラーゼが選択され、それは鎖置換活性を含み、例えば、ベントエキソマイナスポリメラーゼ又はパイロファージポリメラーゼのような熱安定性ポリメラーゼを使用することができる。これにより、第２の増幅中にコントローラーオリゴヌクレオチドを第３のプライマー伸長産物から分離し、第４のプライマー伸長産物を完全長で合成することを可能にする。
【０２３５】
特定の実施形態では、特に、ポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によりコントローラーオリゴヌクレオチドを切断することができるポリメラーゼが第２の増幅反応において選択され、同時プライマー伸長が起こる（上記参照）。少なくとも５’セグメントで５’−３’エキソヌクレアーゼによって切断できるコントローラーオリゴヌクレオチドが使用される。分解により、第３のプライマー伸長産物にハイブリダイズしたコントローラーオリゴヌクレオチドが段階的に短縮され、これは、適切な反応条件下（例えば、約６５℃〜７５℃の温度）で、この結合を不安定化させ、最終的に第３のプライマー伸長産物への結合の分離を導く。したがって、第４のプライマー伸長産物を完全長で合成することができる。
【０２３６】
特定の実施形態において、コントローラーオリゴヌクレオチドの濃度及び第２のプライマーセットの第４のプライマーの濃度は、選択された反応条件下での第３のプライマー伸長産物へのコントローラーオリゴヌクレオチドの結合よりもプライマー結合及びプライマー伸長が速くなるように選択される。例えば、０．０１μｍｏｌ／ｌ〜０．３μｍｏｌ／ｌの範囲のコントローラーオリゴヌクレオチドの濃度が使用される。同時に、約０．５μｍｏｌ／Ｌ〜２μｍｏｌ／Ｌの範囲である第４のオリゴヌクレオチドプライマーの濃度が使用される。特に、高度な処理能力を備えたポリメラーゼ（例えば、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ）は、第２の増幅反応で使用される。プライマーの結合とその伸長は、プライマー伸長反応が速度論的な利点を有するように、通常、コントローラーのオリゴヌクレオチドの結合よりも速い。
【０２３７】
特定の実施形態では、プライマー伸長反応は、第２の増幅反応において２つ以上の温度で行われる。最初は、一般的に低い温度であり、例えば４５℃〜６５℃の範囲であり、第３のプライマー伸長産物の３’セグメントにおいて第４のプライマーとその相補セグメントへの相補的結合、及びポリメラーゼによる最初の伸長が起こる。これは、第２の範囲の温度、例えば、約７０℃〜約８０℃の値まで上昇させた後、部分的に伸長された第３のプライマー伸長産物がポリメラーゼによって伸長されるように、第３のプライマー伸長産物と十分に安定である部分的に伸長されたプライマー伸長産物を生成する。前記温度で、コントローラーオリゴヌクレオチドは、第３のプライマー伸長産物との結合から自然に解離することができ、その結果、ポリメラーゼは、第３のプライマー伸長産物の５’セグメントを含んでポリメラーゼによってコピーされるまで、第４のプライマー伸長産物の合成を続けることができる。特に、高度な処理能力を持つポリメラーゼ（例えば、ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ）は、第２の増幅反応で使用される。
【０２３８】
「均一な形態」において反応混合物の組成を用いて機能する方法は、例えば、「マイクロ又はナノ液滴反応」など、第１の反応バッチの分割が実用的又は技術的に非常に複雑でない場合に特に適する（デジタルＰＣＲとも呼ばれる）。
【０２３９】
さらなる要素、例えば、形成された産物の特異的結合に適し、及び／又は固定化プライマーとしても生じるオリゴヌクレオチドを含む固相が増幅のために加えることもでき、その結果、固相ＰＣＲが実行され得、プライマー伸長産物は固相に固定化される。特定のオリゴヌクレオチドを含む固相との接触は、第１の増幅の前、間又は後に行うことができる。
【０２４０】
第１の増幅反応の開始前に、反応バッチを多数の反応容量に分割でき（パーティション）、その結果、反応バッチの増幅は同時に約１００又は１０００以上の等容量のパーティションに分割される。前記パーティションは、液滴の形態で（例えば、エマルションとして）行うことができる。増幅の実行は、前記多数の液滴において（例えば、デジタルＰＣＲとして）並行して行うことができる。
【０２４１】
増幅反応の順序（第１の配列特異的増幅、その後にのみ行われるＰＣＲ）が重要な役割を果たす：コントローラーオリゴヌクレオチドを使用した配列特異的増幅（第１の増幅）は、特にＰＣＲ増幅の前に行われる。これは、第１の増幅の前に、標的配列のＰＣＲに基づく変形及び副反応を回避することを目的としている。上記の理由により、ＰＣＲに基づく増幅は第２のステップとしてのみ行われる。
【０２４２】
したがって、特定の実施形態では、ＰＣＲ又は任意の他の増幅方法によって生成されたＤＮＡ断片は、第１の増幅反応の開始核酸鎖として使用されない。
【０２４３】
以下では、第１の増幅方法（第１の部分増幅）及び第１の増幅系の必要な成分が概略的に説明され、続いて第２の増幅方法（第２の部分増幅）及び第２の増幅系の成分の説明が続く。次に、第１及び第２の増幅方法の組み合わせが説明され、有利な実施形態が提示される。第１の増幅の後に、第２の増幅手順（ＰＣＲとも呼ばれる）が続く。
【０２４４】
特に、第１の増幅は指数関数的増幅として実行され、両方のプライマーの新たに合成された産物（プライマー伸長産物）が、さらなる合成ステップの鋳型として使用される。したがって、プライマー配列は、相補的プライマー結合部位が形成されるように少なくとも部分的にコピーされ、それらは、合成の直後に二本鎖の配列セグメントとして存在する。第１の増幅方法では、両方の鎖の合成ステップと、新しく合成された配列セグメントの二本鎖開口ステップが交互に実行される。合成後の十分な二本鎖分離は、さらなる合成のための重要な前提条件である。全体として、このような合成と二本鎖の分離ステップとを交互に行うことは、指数関数的な増幅を導き得る。
【０２４５】
本発明による第１の増幅方法では、増幅（標的配列を含む核酸鎖の増幅）の主産物の二本鎖開口には、とりわけ、コントローラーオリゴヌクレオチドと呼ばれるオリゴヌクレオチドによる。コントローラーオリゴヌクレオチドは、特に、標的配列に対応する配列セグメントを含む。
【０２４６】
詳細には、本発明による鎖の分離は、両方の特異的なプライマー伸長産物からなる新しく合成された二本鎖を配列依存性核酸媒介鎖分離によって特に分離するそれぞれの所定の配列を有するコントローラーオリゴヌクレオチドを使用することによって達成される。プライマー伸長産物の得られた一本鎖セグメントは、増幅される核酸鎖の指数関数的増幅が達成されるように、標的配列、並びにさらなるオリゴヌクレオチドプライマーの結合部位として機能し得る対応するプライマー結合部位を含む。本質的には、プライマー伸長反応及び鎖置換反応は、同時に起こることが好ましい。増幅は特に、両方の特定の合成されたプライマー伸長産物の自然分離を可能にしない反応条件下で行われる。
【０２４７】
標的配列含有核酸鎖の特定の指数関数的第１の増幅は、核酸鎖の増殖の必須の前提条件として、合成ステップ及び二本鎖開口ステップ（プライマー結合部位の活性化ステップ）の繰り返しを含む。
【０２４８】
合成された二本鎖の開口は、コントローラーオリゴヌクレオチドによって配列特異的に影響を受ける反応ステップとして実行される。前記開口は、両方の相補的プライマー伸長産物の解離まで完全に行うことができ、又は部分的に行うこともできる。
【０２４９】
本発明によれば、コントローラーオリゴヌクレオチドは、標的配列と相互作用することができる配列セグメントと、それぞれ前記相互作用を引き起こす、許容する、又は良好にするさらなる配列セグメントとを含む。コントローラーオリゴヌクレオチドとの相互作用の過程で、合成されたプライマー伸長産物の二本鎖部位は、配列特異的な鎖置換によって一本鎖の形態に変換される。前記プロセスは、配列依存性である：合成された二本鎖の配列が、コントローラーオリゴヌクレオチドの対応する配列と一定量の相補性を有する場合のみ、十分な二本鎖開口が生じ、その結果、合成を続けるために不可欠な配列セグメントは、例えばプライマー結合部位は、「活性状態」に対応する一本鎖型に変換される。したがって、コントローラーオリゴヌクレオチドは、さらなる合成ステップのために、標的配列を含む新しく合成されたプライマー伸長産物を特異的に「活性化」する。
【０２５０】
対照的に、標的配列を含まない配列セグメントは、一本鎖状態に変換されず、二本鎖のままであり、これは「不活性」状態に対応する。そのような二本鎖の可能なプライマー結合部位は、新しいプライマーとの相互作用が不利である、又は完全に妨げられ、その結果、そのような「非活性化」鎖でのさらなる合成ステップは一般に起こらない。合成ステップ後の合成された核酸鎖の活性化（すなわち、一本鎖状態への変換）の前記欠如又は減少は、その後の合成ステップにおいて、減少した量のプライマーのみが成功してプライマー伸長反応に参加できるという事実をもたらす。
【０２５１】
主産物（標的配列を含む増幅される核酸鎖）の指数関数的な第１の増幅により、いくつかの合成ステップと活性化ステップ（２本鎖開裂ステップ）が１つの増幅方法で組み合わされ、それぞれ目的の量の特定の核酸鎖が提供されるまで、実行又は繰り返される。
【０２５２】
第１の増幅方法の過程における反応条件（例えば、温度）は、コントローラーオリゴヌクレオチドの非存在下での相補的プライマー伸長産物の自発的分離が起こりそうにない、又は著しく減速されるように設計される。
【０２５３】
したがって、増幅の特異性の増加は、標的配列を含む相補的プライマー伸長産物の分離の配列依存性に起因する：コントローラーオリゴヌクレオチドは、その配列セグメントのプライマー伸長産物の所定の配列セグメントとの一致の結果として、前記二本鎖分離を可能にする、又は有利に働く。前記一致は、コントローラーオリゴヌクレオチドによって各合成サイクル後に検証される。指数関数的増幅は、コントローラーオリゴヌクレオチドによる合成プロセス及び配列特異的鎖置換からの良好な反復の結果をもたらし、すなわち、新たに合成されたプライマー伸長産物の「活性化」（対応するプライマー結合部位の一本鎖形態をもたらす二本鎖開口／二本鎖分離／鎖置換プロセス）をもたらす。
【０２５４】
したがって、事前所定のコントローラーオリゴヌクレオチドを使用することで、指数関数的な増幅中に個々の合成ステップ間でプライマー伸長産物の内容の配列依存的検証を可能にし、後続の合成ステップで配列の選択又は選別を得ることができる。ここでは、コントローラーオリゴヌクレオチドとの相互作用が成功した結果としての新たに合成された特異的なプライマー伸長産物の「活性」な一本鎖状態と、コントローラーオリゴヌクレオチドとの相互作用の欠陥及び／又は不十分及び／又は減少及び／又は減速の結果としての新しく合成された非特異的なプライマー伸長産物の「不活性」な二本鎖状態とを区別することが可能となる。
【０２５５】
指数関数的な増幅には、次のような効果をもたらす。
非変性の条件下では、特異的に合成された鎖の分離は、コントローラーオリゴヌクレオチドの協調により行われる。
【０２５６】
標的配列含有核酸鎖の指数関数的増幅は、配列制御される（主反応）。前記配列制御は、各合成ステップの後に行われ、プライマー間に存在しかつ標的配列を含む配列セグメントを含む。成功した各合成ステップ後の合成結果の確認は、さらなる特異的な合成ステップの前提条件である、両方の特異的なプライマー伸長産物の分離が起こることである。
【０２５７】
第１の増幅中、非特異的プライマー伸長産物の最初の生成は本質的に除外できない（副産物）。鋳型依存性のため、このような非特異的プライマー伸長産物は一般に、合成直後に二本鎖の形態で存在する。しかしながら、コントローラーオリゴヌクレオチドとの相互作用は完全に失敗する、又は制限されることのいずれかであり、結果として、主反応にわたって、鎖の分離はない、又は鎖の分離は減速される。したがって、１つの合成サイクルから次の合成サイクルへの誤った配列情報の移送はない。
【０２５８】
したがって、反応条件の選択及びコントローラーオリゴヌクレオチドの設計により、増幅方法中の単一の合成ステップの間の正しい核酸鎖鋳型の再生の効率に特異的に影響を与えることが可能である。一般に、合成された産物の分離及び１つの合成ステップから次のステップへの正しい鋳型の再生がより成功するほど、コントローラーオリゴヌクレオチドの所与の配列と合成された配列との間の一致の度合いが高くなる。一方、副産物の配列の相違により、鋳型鎖の再生が不十分になり、したがって、合成の開始が遅延し、後続の各サイクルでの収率が低下することになる。副産物の指数関数的増幅の全体は、よりゆっくりと進行する、又はまったく発生しない、及び／又は検出不能なレベルのままのいずれかである。
【０２５９】
したがって、この方法は、リアルタイムで、すなわち反応を停止することなく、合成された配列の検証を可能にし、したがって、アッセイのすべての成分が反応の始めに反応混合物中にすでに存在する均一なアッセイの発展に可能性を示す。
【０２６０】
第１の部分増幅の結果として、十分な量の高度に特異的な増幅断片が提供され、これは、第２の部分増幅（ＰＣＲ）の鋳型として機能する。
【０２６１】
十分な反応時間又はサイクル数の後、次いで第１の増幅方法を終了する、又は反応条件を変更して、その結果、第２の増幅方法（ＰＣＲ）を開始できる。第２の増幅方法では、第１の増幅方法で生成された核酸鎖及び少なくとも１つのさらなるＰＣＲ特異的成分（例えば、オリゴヌクレオチドプライマー及び／又はＰＣＲポリメラーゼ）を使用して標的配列が増幅される。特定の核酸鎖の数は、第２の増幅の開始時にすでに十分に多いため、ＰＣＲプロセスでは、目的の総量の産物が得られるまでの必要なサイクルが少なくなる。これにより、全体的にエラーの少ないＰＣＲ産物が生成される。
【０２６２】
増幅の開始時の非常に特異的な第１の増幅方法及びその後のみのＰＣＲを順次切り替えることにより、生成されたＰＣＲ産物の全体的な特異性は、開始からＰＣＲ条件下で機能する従来のＰＣＲ方法と比較して改善することができる。
【０２６３】
特に、両方の増幅方法の成分は、増幅手順の開始時にすでに利用可能である。
【０２６４】
特定の実施形態では、第１の増幅系の成分は、第２の増幅系（ＰＣＲ）の成分とは異なる。
【０２６５】
特定の実施形態において、第１の増幅系の成分は、第２の増幅系の成分とは異なり、（第２の増幅系の）ＰＣＲ成分は、第１の増幅方法の反応条件下で、少なくとも部分的に非活性形態（例えば、ホットスタートポリメラーゼとして）である。したがって、第１の増幅から第２の増幅への変化は、ＰＣＲ成分（例えば、ポリメラーゼ）の追加の活性化ステップを必要とする。
【０２６６】
特定の実施形態では、第１の増幅系のポリメラーゼは、第１の増幅の完了後に不活性化され、その結果、異なるポリメラーゼが第２の増幅（ＰＣＲ）に使用される。
【０２６７】
特定の実施形態において、第１の増幅系の成分はまた、第２の増幅系によって部分的に使用され、第１の増幅系の一部ではない、少なくとも１つのさらなるＰＣＲ特異的成分（例えば、さらなるオリゴヌクレオチドプライマー又はポリメラーゼ）が使用される。
【０２６８】
本発明は、両方の増幅方法を実施するために有利である、両方の方法のいくつかの実施形態、オリゴヌクレオチドプライマーの配置を記載する。標的配列を含む核酸鎖上の第１及び第２の増幅系の個々の要素の適切な配置によって、より高い全体的な特異性を有する均一なアッセイを組み立てることができる。
【０２６９】
用語と定義
特に明記しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、平均的な専門家によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。分子生物学的又は生化学的方法には標準的な手法が使用される（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ、及びＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９９）第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．）
【０２７０】
説明に示される配列及び配列表に示される配列が互いに異なる場合、疑わしいときは本説明に示されている配列が適用される。
【０２７１】
本発明の文脈において、使用される用語は以下の意味を有する：
プライマー、コントローラーオリゴヌクレオチド、プローブ、増幅される核酸鎖に関して本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上、好ましくは３つを超えるデオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチド及び／又はヌクレオチド修飾及び／又は非ヌクレオチド修飾を含む分子として定義される。その長さは、例えば、３〜３００ヌクレオチドユニット又はそのアナログの間の領域、特に５〜２００ヌクレオチドユニット又はそのアナログの間の領域を含む。その正確なサイズは、オリゴヌクレオチドの最終的な機能又は使用に依存するいくつかの要因に依存する。
【０２７２】
本明細書で使用される「プライマー」という用語は、オリゴヌクレオチドに関し、それが天然に生じるかどうか、例えば、精製された制限切断、又は合成的に生成されるかどうかに関係がない。プライマーは、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下で、すなわちヌクレオチド及び誘導剤、例えば、適切な温度及び適切なｐＨ値でのＤＮＡポリメラーゼなどの存在下で使用される場合、合成の開始点として機能することができる。好ましくは、プライマーは、増幅における最大の効力のために一本鎖である。プライマーは、誘導剤の存在下で伸長産物の合成を開始するために十分に長い必要がある。プライマーの正確な長さは、反応温度、プライマー源、方法の適用など、いくつかの要因に依存する。例えば、診断適用におけるオリゴヌクレオチドプライマーの長さは、標的配列の複雑さに応じて、５〜１００ヌクレオチド、好ましくは６〜４０ヌクレオチド、特に好ましくは７〜３０ヌクレオチドの間である。短いプライマー分子は一般に、鋳型と十分に安定な複合体を形成するためのプライマー機能を実行するためにより低い反応温度が必要であり、又は形成されるプライマー鋳型複合体を十分に長くできるように、ＤＮＡポリメラーゼなどの他の反応成分の濃度をより高くする必要がある。
【０２７３】
ここで使用されるプライマーは、増幅される各特異的配列のさまざまな鎖に「本質的に」相補的であるように選択される。これは、プライマーがそれぞれの鎖とハイブリダイズし、プライマー伸長反応を開始するのに十分に相補的である必要があることを意味する。したがって、例えば、プライマー配列は、標的配列の正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチド断片をプライマーの５’末端に結合させることができ、残りのプライマー配列は鎖に相補的である。別の実施形態では、単一の非相補的塩基又はより長い非相補的配列をプライマーに挿入することができ、ただし、プライマー配列が、それとハイブリダイズするために、増幅される鎖の配列と十分に大きな相補性を有する場合、伸長産物の合成が可能なプライマー鋳型複合体を生成する。
【０２７４】
鋳型に相補的な鎖の酵素的合成の過程で、鋳型鎖に完全に相補的であるプライマー伸長産物が生成される。
【０２７５】
Ｔｍ−融解温度
相補的又は部分的に相補的な二本鎖の融解温度は、一般に、鎖の約半分が二本鎖として存在し、残りの半分は一本鎖として存在する反応温度の測定値であると理解されている。この系（鎖の結合及び解離）は平衡状態である。
【０２７６】
二本鎖のＴｍに影響を与える可能性のあるいくつかの要因（例えば、配列の長さ、配列のＣＧレベル、緩衝液条件、２価金属カチオンの濃度など）により、増幅される核酸のＴｍは目的の増幅反応と同じ条件下で測定される。
【０２７７】
測定可能な融解温度は、複数の反応パラメーター、例えば、それぞれの緩衝液条件及び反応相手のそれぞれの濃度に依存するため、融解温度は、指数関数的増幅と同じ反応緩衝液において、二本鎖の両方の相補的成分の濃度が、約０．１μｍｏｌ／ｌ〜約１０μｍｏｌ／ｌ、好ましくは約０．３μｍｏｌ／〜約３μｍｏｌ／ｌの濃度、好ましくは約１μｍｏｌ／ｌの濃度で測定された値であることが意図される。融解温度の各値は、対応する二本鎖の安定性に相関するガイド値である。
【０２７８】
デオキシリボヌクレオシド三リン酸塩
デオキシリボヌクレオシド三リン酸塩（ｄＮＴＰ）ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びＴＴＰ（又はｄＵＴＰ、又はｄＵＴＰ／ＴＴＰ混合物）が適切な量で合成混合物に添加される。特定の実施形態では、ｄＮＴＰに加えて、少なくとも１つのさらなる種類のｄＮＴＰ類似体を合成混合物に加えることができる。特定の実施形態では、前記ｄＮＴＰ類似体は、例えば、核酸鎖に組み込むことができる特徴的な標識（例えば、ビオチン又は蛍光色素）を含む。別の実施形態では、前記ｄＮＴＰ類似体は、ヌクレオチドの糖リン酸比率の少なくとも１つの修飾、例えば、アルファ−ホスホロチオエート−２’−デオキシリボヌクレオシド三リン酸（又は核酸鎖にヌクレアーゼ耐性を付与する他の修飾）、２’，３’−ジデオキシ−リボヌクレオシド三リン酸、アシクロ−ヌクレオシド三リン酸（又は合成の停止をもたらす他の修飾）を含む。特定の実施形態では、前記ｄＮＴＰ類似体は、核酸塩基の少なくとも１つの修飾、例えば、イソシトシン、イソグアノシン（又は伸長遺伝的アルファベットの核酸塩基の他の修飾も含む）、２−アミノアデノシン、２−チオウリジンを含む。イノシン、７−デアザ−アデノシン、７−デアザ−グアノシン、５−ｍｅ−シトシン、５−プロピル−ウリジン、５−プロピル−シトシン（又は、天然の核酸塩基と比較して、ポリメラーゼによって組み込むことができる核酸塩基の他の修飾もまた含み、鎖の安定性に変化をもたらす）を含む。特定の実施形態では、ｄＮＴＰ類似体は、核酸塩基の修飾及び糖リン酸比率の修飾の両方を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つのさらなる種類のｄＮＴＰ類似体が、少なくとも１つの天然のｄＮＴＰ基質の代わりに合成混合物に添加される。
【０２７９】
核酸合成誘導剤は、結果としてプライマー伸長産物の合成が引き起こされるように作用する酵素又は系であり得る。
【０２８０】
前記目的のための第１の増幅に適した酵素は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＢｓｔポリメラーゼ及びその修飾体、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、及び特に正しい様式でのヌクレオチドの組み込みを可能にする熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されなく、合成された各核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物が形成される。通常、合成は各プライマーの３’末端で開始され、次いで合成が完了する、又は中断されるまで、鋳型鎖に沿って５’方向に進行する。
【０２８１】
特に、鎖置換可能な鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼが第１の増幅で使用される。これには、Ｂｓｔポリメラーゼの大きな断片又はその修飾体（例えば、Ｂｓｔ  ２．０  ＤＮＡポリメラーゼ）、クレノウ断片、ベントエキソマイナスポリメラーゼ、ディープベントエキソマイナスＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼの大きな断片、及びＢｓｍ  ＤＮＡポリメラーゼの大きな断片を含む。
【０２８２】
特定の実施形態では、特に、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性又は５’−３’ＦＥＮ活性を示さないポリメラーゼが使用される。
【０２８３】
第２の増幅には、特に熱安定性鋳型依存ＤＮＡポリメラーゼが使用される。例えば、Ｔａｑポリメラーゼ又はその修飾体（Ａｍｐｌｉ−Ｔａｑなど）、又は校正機能を備えたポリメラーゼ：Ｐｆｕとその修飾体、又はＶｅｎｔポリメラーゼとその修飾体である。処理能力を高めるために別のタンパク質と融合したポリメラーゼ、例えば、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを使用できる。多数のポリメラーゼが市販されている。
【０２８４】
ポリメラーゼの組み合わせも使用でき，例えばＯｎｅＴａｑ−ポリメラーゼ（ＮＥＢ）は、Ｔａｑポリメラーゼとｖｅｎｔポリメラーゼの組み合わせである。ポリメラーゼのそのような組み合わせは、第２の増幅におけるより高い合成精度に寄与することができる。
【０２８５】
特定の実施形態では、少なくとも２つの異なるポリメラーゼが使用され、例えば、鎖置換が可能なポリメラーゼ及び３’−５’プルーフリーディング活性を有するポリメラーゼが使用される。
【０２８６】
特定の実施形態では、ホットスタート機能を備えたポリメラーゼが使用され、特定の温度に達したときにのみ機能を発揮することができる。
【０２８７】
第１の増幅系は、特定の第１の増幅を実行するために必要な成分：第１のオリゴヌクレオチドプライマー、第２のオリゴヌクレオチドプライマー、コントローラーオリゴヌクレオチド及び第１のポリメラーゼを含む。
【０２８８】
さらに、特異的な第１の増幅を実行するために必要である範囲で、ヌクレオチド混合物及び緩衝液系もまた含むことができる（例えば、第１のポリメラーゼのための特異的な緩衝液系）。
【０２８９】
第１の増幅系は、第１の増幅（第１の部分増幅とも呼ばれる）中の第１の増幅断片１．１（又は第１の増幅産物１．１、増幅される第１の増幅の核酸鎖とも呼ばれる）の合成をサポートする。
【０２９０】
第２の増幅系は、特異的な第２の増幅を実行するために必要な成分：第３のオリゴヌクレオチドプライマー、第４のオリゴヌクレオチドプライマー及び第２のポリメラーゼを含む。          
【０２９１】
さらに、ヌクレオチド混合物及び緩衝液系もまた、それらが特異的な第２の増幅の実行に必要である限り、含まれ得る（例えば、第２のポリメラーゼのための特定の緩衝液系）。
【０２９２】
第２の増幅系は、第２の増幅（第２の部分増幅とも呼ばれる）中の第２の増幅断片２．１（又は第２の増幅産物２．１）の合成をサポートする。
【０２９３】
第１のオリゴヌクレオチドプライマー：（第１の増幅系の成分）
第１のオリゴヌクレオチドプライマー（図１２〜１６）は、第１のプライマー領域及び第２の領域を含む。第１のプライマー領域は、増幅される核酸又はその同等物内の本質的に相補的な配列に結合し、プライマー伸長反応を開始することができる。第２の領域は、コントローラーオリゴヌクレオチドを結合することができ、それによってコントローラーオリゴヌクレオチドと第一のプライマー伸長産物の他の部分との間に十分な近接を引き起こし、コントローラーオリゴヌクレオチドによる鎖置換を開始することができるポリヌクレオチドテールを含む。第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域は、ポリメラーゼ依存性合成の継続を阻害することによってポリメラーゼがポリヌクレオチドテールをコピーするのを防ぐ少なくとも１つの修飾（ヌクレオチド修飾又は非ヌクレオチド修飾）をさらに含む。前記修飾は、例えば、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１の領域と第２の領域との間の移行部に位置する。その結果、オリゴヌクレオチドプライマーの第１のプライマー領域は、ポリメラーゼによりコピーされ得、その結果、前記領域に対する相補的配列は、第２のプライマー伸長産物の合成中にポリメラーゼにより生成され得る（以下に詳細に説明）。第１オリゴヌクレオチドプライマーの第２領域のポリヌクレオチドテールは、特にこのポリメラーゼによってコピーされない。特定の実施形態では、これは、ポリヌクレオチドテールの前にポリメラーゼを停止させる第２のセグメントの修飾によって達成される。特定の実施形態において、これは、第２の領域におけるヌクレオチド修飾によって達成され、ポリヌクレオチドテール全体は、そのようなヌクレオチド修飾から本質的になり、したがって、このポリメラーゼにはコピー不可である。
【０２９４】
特定の実施形態では、各第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、増幅される１つの核酸に特異的である。
【０２９５】
特定の実施形態では、各第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、それぞれ本質的に異なる配列を含む、増幅される少なくとも２つの核酸に特異的である。
【０２９６】
特定の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、特徴的な標識、例えば、蛍光色素（例えば、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５）又はアフィニティーマーカー（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン）又は追加の配列断片（例えば、検出又は固定化のための、又はバーコード標識化のための特異的なオリゴヌクレオチドプローブの結合のために）で標識化される。
【０２９７】
第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、第１の増幅においてプライマーとして特に使用される。
【０２９８】
特定の実施形態において、それは、第１及び第２の増幅の両方においてプライマーとして使用され得る。
【０２９９】
第２のオリゴヌクレオチドプライマー：（第１の増幅系の成分）
３’セグメントを有するオリゴヌクレオチドは、増幅される核酸又はその同等物内の本質的に相補的な配列に結合し、特異的な第２のプライマー伸長反応を開始することができる。したがって、前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１の特異的プライマー伸長産物の３’セグメントに結合し、第２のプライマー伸長産物のポリメラーゼ依存性合成を開始することができる。
【０３００】
第２のオリゴヌクレオチドプライマーの長さは、１５〜１００ヌクレオチド、特に２０〜６０ヌクレオチド、特に３０〜５０ヌクレオチドの間であり得る。
【０３０１】
特定の実施形態では、各第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、それぞれ増幅される１つの核酸に特異的である。
【０３０２】
特定の実施形態では、各第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、それぞれ本質的に異なる配列を含む増幅される少なくとも２つの核酸に特異的である。
【０３０３】
特定の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、特徴的な標識、例えば、蛍光色素（例えば、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５）又はアフィニティー標識（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン）又は追加の配列断片（例えば、検出又は固定化のための、又はバーコード標識化のための特異的なオリゴヌクレオチドプローブの結合のために）で標識化される。
【０３０４】
第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、第１の増幅でプライマーとして特に使用される。特定の実施形態において、それは、第１及び第２の増幅の両方においてプライマーとして使用され得る。
【０３０５】
プライマー伸長産物
プライマー伸長産物（プライマー伸長産物とも呼ぶ）は、ポリメラーゼによって触媒される鋳型依存合成の結果として、オリゴヌクレオチドプライマーの酵素（ポリメラーゼ依存）伸長によって形成される。
【０３０６】
プライマー伸長産物は、５’セグメントのオリゴヌクレオチドプライマーの配列及び鋳型依存型のポリメラーゼによって合成された伸長産物の配列（伸長産物とも呼ぶ）を含む。ポリメラーゼによって合成された伸長産物は、それが合成された鋳型鎖に相補的である。
【０３０７】
第１の増幅（主産物）の特異的なプライマー伸長産物（例えば、Ｐ１．１−Ｅｘｔ及びＰ２．１−Ｅｘｔ）は、増幅される核酸鎖の配列を含む。これは、特異的に増幅される核酸鎖が鋳型として機能する意図されたプライマー伸長反応の特異的合成又は正確な実行の結果である。特定の実施形態では、合成されたプライマー伸長産物の配列は、増幅される核酸の期待の配列と完全に一致する。別の実施形態では、理論的に期待される配列からの得られた配列の相違は耐性があり得る。特定の実施形態では、増幅の理論的に期待される核酸の配列との増幅の結果として得られる配列の一致の程度は、例えば、９０％〜１００％の間であり、特に一致の程度は９５％を超え、理想的には９８％を超える一致である（合成された塩基の比率で測定）。
【０３０８】
特異的なプライマー伸長産物の伸長産物の長さは、１０〜３００ヌクレオチド、特に１０〜１８０ヌクレオチド、特に２０〜１２０ヌクレオチド、特に３０〜８０ヌクレオチドの間であり得る。
【０３０９】
例えば、第２の増幅では、第３及び第４のプライマーの特異的な鋳型依存プライマー伸長反応の産物が主産物及びそれぞれの中間産物：部分的第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ１、図１５〜１８）、又は完全なプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ、図１５〜１８）、部分的第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ１、図１５〜１８）、又は完全なプライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ、図１５〜１８）を表す。前記産物は、特定の実施形態において、標的配列又はその同等物を含む。別の実施形態では、第２のプライマー伸長産物は標的配列を含み、第１のプライマー伸長産物は標的配列の同等物、すなわち相補鎖を含む。特定の実施形態では、第４のプライマー伸長産物は標的配列を含み、第３のプライマー伸長産物は標的配列の同等物、すなわち相補鎖を含む。特定の実施形態では、第４のプライマー伸長産物は標的配列の部分を含み、第３のプライマー伸長産物は標的配列の前記部分の同等物、すなわち相補鎖を含む。
【０３１０】
第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）及び第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１−Ｅｘｔ）は、第１の増幅の第１の増幅断片１．１（増幅産物１．１とも呼ばれる）を共に表す（図１）。
【０３１１】
第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ）及び第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ）は共に、第２の増幅の第２の増幅断片２．１（第２の増幅産物２．１とも呼ばれる）を表す（図１）。
【０３１２】
第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ）は、完全な第３のプライマー伸長産物と呼ぶこともできる。前記産物は、第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ）を鋳型として使用することにより得られる。第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ）は、完全な第４のプライマー伸長産物と呼ぶこともできる。前記産物は、第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ）を鋳型として使用することによって生成される（図１５〜１８）。
【０３１３】
対照的に、部分的第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ−ｐａｒｔ１）は、第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１−Ｅｘｔ）を鋳型として使用して中間産物として生成される。部分的第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ−ｐａｒｔ１）は、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）を鋳型として使用して中間産物として生成される（図１５〜１８）。
【０３１４】
非特異的プライマー伸長産物（副産物）は、例えば、非特異的又は不正確又は意図しないプライマー伸長反応の結果である配列を含む。これらには、例えば、不正確な開始事象（誤ったプライミング）又は他の副反応（塩基置換、欠失などのポリメラーゼ依存性配列変化など）の結果であるプライマー伸長産物を含む。非特異的プライマー伸長産物の配列の相違の程度は、一般に、そのような二本鎖副産物を鋳型から成功して置換するコントローラーオリゴヌクレオチドの能力を超え、その結果、そのような副産物の増幅は遅くなる、又は完全になくなる。相違の許容度又は耐性度は、例えば、反応温度及び配列相違の種類と方法に依存する。非特異的プライマー伸長産物の例は、増幅される核酸に対応しないプライマー二量体又は配列変異体であり、例えば標的配列を含まない配列である。
【０３１５】
増幅の十分な特異性の評価は、目下の課題に関連していることが多い。多くの増幅方法において、所望の結果が達成され得る限り、増幅反応のある程度の非特異性は耐性があり得る。特定の実施形態では、反応の総結果において増幅される核酸鎖の割合は、新たに合成された鎖の総量において測定して、１％を超え、特に１０％を超え、特に３０％を超える。
【０３１６】
増幅される核酸（第１の増幅の期待される結果）
増幅される核酸は、プライマー及びコントローラーオリゴヌクレオチドを使用する第１の増幅において、ポリメラーゼによって配列特異的又は少なくとも主に配列特異的に増幅される核酸鎖を表す。増幅される核酸は、第１の増幅断片１．１（第１の増幅産物１．１とも呼ばれる）の両方の鎖を含む（図１）。これは、開始核酸鎖２．１として使用でき、その鎖の少なくとも１つを使用して、第２の増幅を開始できる。
【０３１７】
増幅される核酸の長さは、２０〜３００ヌクレオチド、特に３０〜２００ヌクレオチド、特に４０〜１５０ヌクレオチド、特に５０〜１００ヌクレオチドであり得る。
【０３１８】
増幅される核酸鎖は、１つ以上の標的配列又はそれらの同等物を含み得る。さらに、増幅される核酸は、標的配列に本質的に相補的な配列を含み得、それは、増幅反応において標的配列と同様の効率で増幅され、標的配列又はそのセグメントを含む。標的配列に加えて、増幅される核酸は、さらなる配列セグメント、例えば、プライマー配列、プライマー結合部位を有する配列及び／又は検出プローブの結合のための配列セグメント、及び／又はバーコード配列により鎖をコードする配列の配列セグメント及び／又は固相に結合するための配列セグメントを含み得る。オリゴヌクレオチドプライマー配列又はそれらの配列部分、並びにプライマー結合部位又はそれらの配列部分は、例えば、標的配列の配列セグメントに属することができる。
【０３１９】
特定の実施形態では、増幅される核酸は、標的配列に対応する。
【０３２０】
別の実施形態では、標的配列は、第１の増幅の増幅される核酸鎖の配列の一部を形成する。そのような標的配列は、さらなる配列の３’側及び／又は５’側に隣接することができる。前記さらなる配列は、例えば、オリゴヌクレオチドプライマー又はそれらの部分の結合部位を含み得、及び／又はプライマー配列又はそれらの部分を含み得、及び／又は検出プローブの結合部位を含み得、及び／又は固相（例えば、マイクロアレイ又はビーズに基づく分析の文脈において）への相補的結合のためのアダプター配列を含み得、及び／又はデジタルシグネチャーのバーコード配列を含み得る。
【０３２１】
増幅を開始するためには、反応の開始時に反応混合物に核酸鎖を追加する必要があり、これは、増幅される核酸鎖の合成の初期鋳型として機能する。前記核酸鎖は、開始核酸鎖と呼ばれる。前記開始核酸鎖は、増幅される核酸鎖の形成／合成／指数関数的増幅に重要である個々の配列要素の配置を定義する。
【０３２２】
特定の実施形態では、開始時に増幅反応に供給される、又は反応混合物に添加される初期鋳型（開始核酸鎖）は、増幅される核酸鎖の配列組成に対応している。
【０３２３】
増幅反応の初期段階及びその後の過程で、それぞれのプライマーは開始核酸鎖の対応する結合部位に結合し、特異的なプライマー伸長産物の合成を開始する。そのような特異的なプライマー伸長産物は、増幅中に指数関数的に蓄積し、指数関数的増幅における相補的プライマー伸長産物の合成のための鋳型の役割を次第に引き継ぐ。
【０３２４】
したがって、指数関数的増幅における反復鋳型依存合成プロセスは、増幅される核酸鎖を形成する。
【０３２５】
増幅反応の終わりに向かって、反応の主産物（増幅される核酸）は、主に一本鎖であり得る、又は主に相補的な二本鎖を形成し得る。これは、例えば、両方のオリゴヌクレオチドプライマーの相対濃度及び対応する反応条件によって決定することができる。
【０３２６】
増幅される核酸の同等物は、本質的に同一の情報内容を有する核酸を含む。例えば、増幅される核酸の相補鎖は、同一の情報内容を有し、同等と呼ぶことができる。
【０３２７】
標的配列
特定の実施形態において、標的配列は、増幅される核酸の特徴的な配列として機能することができる増幅される核酸鎖のセグメントである。前記標的配列は、別の核酸の存在の有無のマーカーとして機能し得る。したがって、前記他の核酸は、標的配列の供給源として機能し、例えば、ゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡ又はゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡの一部（例えば、ｍＲＮＡ）、又は生物のゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡの同等物（例えば、ｃＤＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡなどの修飾ＲＮＡ）であり得、又は、生物のゲノムＤＮＡ又はＲＮＡの規定の変化、例えば遺伝子変異（例えば、欠失、挿入、置換、付加、配列伝播、例えばマイクロサテライト不安定性の文脈での繰り返し伝播など）、スプライス変異、再配置変異（例えば、Ｔ細胞受容体変異など）を含む。個々の標的配列が抗生物質耐性又は予後情報などの表現型特性を表し得、したがって診断アッセイ／検査に関与する。標的配列の供給源／起源として、そのような核酸は、例えば、その鎖の配列要素として標的配列を含み得る。したがって、標的配列は、別の核酸の特異的な配列内容についての特徴的なマーカーとして機能し得る。
【０３２８】
標的配列は、一本鎖又は二本鎖であり得る。それは、第１の増幅の増幅される核酸と本質的に同一であり得る、又は増幅される核酸の一部のみを表し得る。
【０３２９】
標的配列の同等物は、本質的に同一の情報内容を有する核酸を含む。例えば、標的配列の相補鎖は同一の情報内容を有し、同等物と呼ぶことができ、配列のＲＮＡ及びＤＮＡ変異体も同等の情報内容の例である。
【０３３０】
増幅反応の前の材料調製中に、そのような標的配列は、その元の配列環境から単離され、増幅反応のために調製され得る。
【０３３１】
特定の実施形態では、増幅される核酸は標的配列を含む。特定の実施形態では、標的配列は、増幅される核酸に相当する。別の特定の実施形態では、開始核酸鎖１．１は標的配列を含む。特定の実施形態では、標的配列は、開始核酸鎖１．１に相当する。
【０３３２】
標的配列は、第１の増幅中、第１の増幅断片１．１の一部として完全に又は部分的に含まれ得る。例えば、第２のプライマー伸長産物は標的配列又はその一部を含み、したがって第２のプライマー伸長産物は前記標的配列に相補的な鎖を含む。この鎖は同等の情報内容を有する。
【０３３３】
標的配列は、第２の増幅中、第２の増幅断片２．１の一部として完全に又は部分的に含まれ得る。例えば、第４のプライマー伸長産物は標的配列又はその部分を含み、したがって第３のプライマー伸長産物は前記標的配列に相補的な鎖を含む。この鎖は同等の情報内容を有する。
【０３３４】
開始核酸鎖
第１の増幅を開始するためには、反応の開始時に反応混合物に核酸鎖を追加する必要があり、これは、増幅される核酸鎖の合成の初期鋳型として機能する（図１）。前記核酸鎖は、第１の増幅の開始核酸鎖（開始核酸鎖１．１）と呼ばれる。前記開始核酸鎖は、増幅される核酸鎖の形成／合成／指数関数的増幅に重要である個々の配列要素の配置を特定する。
【０３３５】
そのような開始核酸鎖は、反応の開始時に一本鎖又は二本鎖であり得る。開始核酸鎖の相補鎖が互いに分離されている場合、核酸が元々二本鎖であるか一本鎖であるかに関係なく、鎖は特異的な相補的プライマー伸長産物の合成のための鋳型として機能することができる。
【０３３６】
特定の実施形態では、開始核酸鎖１．１は標的配列を含む。
【０３３７】
開始核酸鎖は、増幅系のプライマーの少なくとも１つがその３’セグメントと主に相補的に結合することができる少なくとも１つの主に一本鎖の配列セグメントをさらに含み、その結果、開始核酸鎖にハイブリダイズした場合、ｄＮＴＰを組み込むことで鋳型特異的に、使用されるポリメラーゼはそのようなプライマーを伸長することができる。
【０３３８】
開始核酸鎖はまた、標的配列ではないがオリゴヌクレオチドプライマーに結合できるセグメントを含み得る。
【０３３９】
第２の増幅を開始するには、第２の増幅反応の開始時に、第２の増幅断片の合成の初期鋳型として機能する核酸鎖が反応混合物に存在する、又は核酸鎖がそれに添加されている必要がある（図。１）。
【０３４０】
前記開始核酸鎖２．１は、増幅される核酸鎖の形成／合成／指数関数的増幅に重要である個々の配列要素の配置を特定する。
【０３４１】
ここで、第１の増幅中に生成された第１の増幅断片１．１（増幅される核酸鎖とも呼ばれる）は、第２の増幅の開始核酸鎖２．１として機能する。したがって、前記開始核酸鎖２．１は、第１の増幅で生成された第１のプライマー伸長産物を含む、又はそれからなる。特定の実施形態では、開始核酸鎖２．１は標的配列を含む。
【０３４２】
ＰＣＲ増幅（第２の増幅とも呼ばれる）
ＰＣＲは、ＤＮＡ断片の増幅に一般的に使用されるポリメラーゼ連鎖反応である。ＰＣＲ反応の多くの変異体がこの分野で知られている。とりわけ、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、ジェノタイピングＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、固相ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ（パーティショニング／マイクロドロップレットＰＣＲ）、マルチプレックスＰＣＲ、プローブ又は挿入色素を使用したリアルタイムＰＣＲ（例えば、分子ビーコン又は５’−３’エキソヌクレアーゼ又はＦＲＥＴ対を備えた２つのオリゴヌクレオチドプローブ）、ブロッキングプローブを使用したクランプイングＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲなどである。当業者は、個々のＰＣＲ法を説明する多数の評価を参照している。
【０３４３】
一般に、オリゴヌクレオチドプライマーの位置によって規定される核酸断片は、ＰＣＲ中に増幅される。一般に、少なくとも２つの温度範囲：主にそれらの特異的配列セグメントにプライマーを結合し、それらを拡張して相補鎖を形成するための低温範囲と、新たに合成されたプライマー伸長産物鎖が鋳型から分離されるように、主に配列非選択的分離によって分離される少なくとも１つの温度範囲が使用される。
【０３４４】
ＰＣＲの経過に影響を与えるために、多くの技術が開発されており、例えば、ホットスタートポリメラーゼ、ホットスタートオリゴヌクレオチド、活性化可能プライマー（例えば、ポリメラーゼの３’−５’プルーフリーディング活性による）である。
【０３４５】
ＰＣＲは、ＰＣＲ試験チューブ／マイクロタイタープレートを使用して液相で、又は固相で、又はマイクロ流体系で、又はその場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）で実行され得る。
【０３４６】
ＰＣＲプライマー対（第３及び第４のオリゴヌクレオチドプライマー）
（第２の増幅の成分）
通常、ＰＣＲプライマー対は、ＰＣＲ法による核酸断片の増幅をサポートすることができる２つのオリゴヌクレオチドを含む。
【０３４７】
一般に、ＰＣＲプライマー対は、第３及び第４のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。そのようなオリゴヌクレオチドプライマーは科学界ではよく知られている。
【０３４８】
明確にするために、ＰＣＲプライマーはここでは、一般にＰ３及びＰ４と呼ばれる（コントローラー依存性増幅Ｐ１及びＰ２に対して）。
【０３４９】
ＰＣＲプライマーの多くの変異体が当業者に知られている。通常、それらは約１５〜約６０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであり、少なくとも３’セグメントには、標的配列の相補セグメントに結合することができ、鋳型として前記標的配列を使用しポリメラーゼによって鋳型依存性合成を開始することができる配列を含む。
【０３５０】
色素標識（例えば、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ５）又はクエンチング（例えばＢＨＱ１）、親和性標識（例えばビオチン、ジゴキシゲニン）、又はさらなる配列、例えば、配列バーコーディング（特異的タグ配列の使用）又はライブラリー作成のための配列の使用などについては、当業者に知られている。ＰＣＲプライマーは、溶液で使用する、又は固相（例えば、ビーズ、マイクロタイタープレート）に結合することができる。前記変異体はまた、当業者によく知られている。
【０３５１】
コントローラーオリゴヌクレオチド：
コントローラーオリゴヌクレオチド（図１、Ｃ１．１）は、増幅される核酸の増幅中（第１の増幅）に特異的に生成される第１のプライマー伸長産物のセグメントの事前定義された本質的に相補的な配列を含む一本鎖核酸鎖である。これは、コントローラーオリゴヌクレオチドが、本質的に相補的な様式で、第１のオリゴヌクレオチドプライマーに、少なくとも第１のオリゴヌクレオチドプライマーの特異的な伸長産物の５’セグメントに結合することを可能にする。特定の実施形態において、コントローラーオリゴヌクレオチドは、その内部配列セグメントにヌクレオチド修飾を含み、それは、第１及び／又は第３オリゴヌクレオチドプライマーがコントローラーオリゴヌクレオチドに相補的に結合される場合に、ポリメラーゼが鋳型としてコントローラーオリゴヌクレオチドを使用して相補鎖を合成するのを防ぐ。特定の実施形態では、コントローラーオリゴヌクレオチドが、鋳型機能を遮断する修飾ヌクレオチドから全体としてなる場合が有利である。特定の実施形態では、コントローラーオリゴヌクレオチドが、鋳型機能を遮断する修飾ヌクレオチドの一部のみからなる場合が有利である。コントローラーオリゴヌクレオチドはさらに、選択された反応条件下での鎖置換を介して、第２の特異的プライマー伸長産物を第１の特異的プライマー伸長産物への結合から完全に又は部分的に置き換えることができる。それにより、その相補的領域を有するコントローラーオリゴヌクレオチドは、それ自体を第１の特異的プライマー伸長産物に結合する。コントローラーオリゴヌクレオチドと第１の特異的プライマー伸長産物の間の結合が成功した場合、これは、第１のオリゴヌクレオチドプライマーを結合するのに適した、第２の特異的プライマー伸長産物の３’を含むセグメントの一本鎖状態の回復をもたらし、その結果、新しいプライマー伸長反応が起こることができる。第２のプライマー伸長産物の合成中、コントローラーオリゴヌクレオチドは、例えば、ポリメラーゼによる及び／又は第２のオリゴヌクレオチドプライマーによる鎖置き換えにより、第１のプライマー伸長産物への結合から分離され得る。
【０３５２】
検出−系（システム）：
検出系（検出システム）は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブ及び少なくとも１つの蛍光レポーター（蛍光色素分子）を含む。検出系は、第１及び／又は第２及び／又は第３及び／又は第４のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ、Ｐ２．１−Ｅｘｔ、Ｐ３．１−Ｅｘｔ、Ｐ４．１−Ｅｘｔ）の合成を検出することができる必要がある。これは、それぞれのプライマー伸長産物に結合することができ、それによって特異的シグナルを生成する、又はシグナルの変化を引き起こすことができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって行われる。前記変化は、蛍光強度の増加又は減少であり得る。検出系はまた、追加の成分を含み得る。そのような成分には、特に蛍光クエンチャー及び／又はドナー蛍光色素分子を含む。さらに、検出系はまた、コントローラーオリゴヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドプローブ上、又はオリゴヌクレオチドプローブを含む対上のドナー蛍光色素分子、蛍光レポーター、蛍光クエンチャー及びとコントローラーオリゴヌクレオチドの配置により、第１のプライマー伸長産物への結合事象を検出できる。
【０３５３】
蛍光レポーター
蛍光色素分子は、電磁放射によって励起されると、電磁放射（光）（発光）を放出することができる化学物質又は分子である。蛍光色素分子によって放出された前記放射（発光）は、適切な技術的手段によって蛍光シグナルとして検出することができる。そのようなレポーターは、オリゴヌクレオチドに共有結合することができる。オリゴヌクレオチドに結合することができる多くの蛍光色素分子が知られている（例えば、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＨＥＸ、ＲＯＸ、Ｃｙ色素、Ａｌｅｘａ色素）。
【０３５４】
蛍光クエンチャー
クエンチャーとは、直接接触（接触クエンチング）又はエネルギー移動（例えば、ＦＲＥＴとして）によって蛍光色素分子の発光を削減することができる化学化合物／分子である。原則として、前記シグナルの減少を有意にするために、クエンチャーを蛍光色素分子に近接して配置する必要がある。
【０３５５】
クエンチャーによる蛍光レポーターの有意なシグナル削減に有利なのは、レポーターとクエンチャーの間の距離が２５ヌクレオチド未満、特に１５ヌクレオチド未満、特に５ヌクレオチド未満であることである。
【０３５６】
クエンチャーによる蛍光レポーターのシグナル減少を克服するために、前記成分間の距離がそれに応じて増加させる必要がある。レポーターとクエンチャーとの間の距離が、１５ヌクレオチドを超える、特に２０ヌクレオチドを超える、特に４０ヌクレオチドを超えて増加する場合、それは有利である。この場合、ヌクレオチド配列によって引き起こされる距離は、伸長したヌクレオチド配列に起因する必要がある。例えば、ヘアピン構造が形成されると、空間距離がもはや存在しなくなり得る。
【０３５７】
特にＦＲＥＴに基づくクエンチャーでは、蛍光色素分子の発光スペクトルとクエンチャーの吸収スペクトル間の十分なスペクトル重複が有益である。したがって、２５％を超えるスペクトルの重複がある蛍光色素分子クエンチャーの対が好ましい（例えば、ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ）。
【０３５８】
ドナー蛍光色素分子
蛍光色素分子は、電磁放射線を吸収し、エネルギー伝達（例えば、ＦＲＥＴとして）によってそれを別の蛍光色素分子（アクセプター）に、前記蛍光色素分子が励起され、その結果、それ自体が発光を生成するように伝達できる化学化合物／分子である。発光中に蛍光シグナルが生成される。通常、ドナーとアクセプターとは、蛍光共鳴エネルギー伝達対（ＦＲＥＴ対）を形成する。原則として、前記シグナル生成を有意な程度に発生させるためには、ドナーをアクセプター（蛍光色素分子）に近接して配置する必要がある。
【０３５９】
ドナー蛍光色素分子からのＦＲＥＴの結果としての蛍光レポーターのシグナル生成に有益なのは、レポーターとドナー間の距離が、２５ヌクレオチド未満、特に１５ヌクレオチド未満、特に５ヌクレオチド未満である。
【０３６０】
ドナーからアクセプターへのＦＲＥＴ効果の排除には、通常、ＦＲＥＴ対の二者の間の距離を増やすことによって達成される。レポーターとドナーとの間の距離が１５ヌクレオチドを超えて、特に２０ヌクレオチドを超えて、特に４０ヌクレオチドを超えて増加する場合、有益である。
【０３６１】
さらに、ドナーの放出スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルとの間の十分なスペクトル重複は通常有利である。したがって、２５％を超えるスペクトル重複（例えば、ＦＡＭ／Ｃｙ３）を持つＦＲＥＴ対が好ましい。
【０３６２】
本発明によれば、個々の構成成分の間の空間距離は、特に、２つの構成成分が、標的配列の特定の部分とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を介して接続されるという事実によりもたらされる。
【０３６３】
鎖置換：
適切な手段の作用により、第１の二本鎖（例えば、Ａ１鎖及びＢ１鎖からなる）の完全な又は部分的な分離、及び新しい第２の二本鎖の同時／並列形成をもたらすプロセスであって、鎖（Ａ１又はＢ１）の少なくとも１つは、前記の新しい第２の鎖の形成に関与している。ここでは、鎖置換の２つの形態の間に区別が形成され得る。
【０３６４】
鎖置換の第１の形態では、既存の相補鎖を使用して新しい第２の二本鎖を形成でき、これは、通常、反応の開始時に一本鎖の形態である。この場合、鎖置換の手段（例えば、鎖Ａ１に相補的な配列を持つ事前に形成された一本鎖の鎖Ｃ１）は、最初にすでに形成された二本鎖（Ａ１及びＢ１）に作用し、鎖Ａ１との相補的結合に入り込み、それにより、鎖Ｂ１は、鎖Ａ１との結合から置き換えられる。Ｂ１の置換が完了すると、Ｃ１の効果の結果として、新しい二本鎖（Ａ１：Ｃ１）と一本鎖Ｂ１が生成される。Ｂ１の置換が不完全な場合、結果はいくつかの要因に依存する。例えば、部分的二本鎖のＡ１：Ｂ１及びＡ１：Ｃ１の複合体が中間産物として存在する場合がある。
【０３６５】
鎖置換の第２の形態では、新しい第２の二本鎖の形成は、相補鎖の同時酵素合成の下で起こり得、第１の事前形成された二本鎖の一方の鎖は、ポリメラーゼによる合成の鋳型として作用する。それにより、鎖置換剤（例えば、鎖置換能力を持つポリメラーゼ）は、最初に既に形成された二本鎖（Ａ１及びＢ１）に作用し、新しい相補鎖Ｄ１を鎖Ａ１に合成し、鎖Ｂ１は同時に、鎖Ａ１との結合から置換される。
【０３６６】
「核酸媒介性鎖置換」という用語は、互いに平衡状態にあり、最初にあらかじめ形成された二本鎖（相補鎖Ａ１及びＢ１から成る）の一時的又は恒久的な開口をもたらし、そして新しい第２の二重鎖（相補鎖Ａ１及びＣ１からなる）の形成をもたらす中間ステップの総和／一連を説明するために使用され、Ａ１及びＣ１は互いに相補的である。
【０３６７】
鎖置換を開始するための必須の構造条件は、二重鎖末端（Ａ１とＢ１との事前に形成された第１の二重鎖）と、鎖置換を開始する一本鎖の鎖（Ｃ１）間の空間的近接の確立であることが知られている（Ａ１とＣ１は相補鎖を形成する）。このような近接は、特に一本鎖オーバーハング（短いオーバーハングの例は「ｔｏｅｈｏｌｄ」と呼ばれる文献で知られる、上記の文献を参照）によって達成でき、それは、相補的な様式において一時的又は永久的に一本鎖の鎖（Ｃ１）に結合し、したがって、鎖Ｂ１の置換が成功して開始されるように鎖Ｃ１とＡ１の相補的なセグメントが十分に近接するようにさせる。核酸媒介性鎖置換を開始する効率は、一般に、鎖Ａ１及びＣ１の相補的セグメントが互いに近くに配置されるほど高くなる。
【０３６８】
内側のセグメントで核酸媒介性鎖置換を効率的に継続するためのもう１つの重要な構造的前提条件は、新しい二重鎖を形成するべき鎖間の高度な相補性（Ａ１とＣ１の間など）である。例えば、単一のヌクレオチド変異（Ｃ１内）は、（例えば、分岐移動として記載される）鎖置換の中断につながることが可能である。
【０３６９】
本発明は、相補的核酸の配列依存性核酸媒介性鎖置換を形成する能力を使用する。
【０３７０】
本発明の特定の実施形態は、図及び実施例においてさらに説明される。
【０３７１】
個々の実施形態
第１の増幅の反応条件
反応条件は、とりわけ、緩衝液条件、温度条件、反応時間、及びそれぞれの反応成分の濃度を含む。
【０３７２】
反応中、増幅されるべき特異的に生成される核酸の量は指数関数的様式で蓄積する。伸長産物の合成を含む反応は、必要な限り、所望の量の特異的な核酸配列を生成するために行うことができる。本発明による方法は、特に連続的に行われる。好ましい実施形態では、増幅反応は同じ反応温度で進行し、温度は特に５０℃〜７０℃の間である。別の実施形態では、増幅の単一のステップは、それぞれ異なる温度で進行するように、反応温度はまた可変的に制御され得る。
【０３７３】
指数関数的増幅に必要な試薬は、特に、同じバッチの反応の開始時にすでに存在する。別の実施形態では、該方法の後の段階で試薬を加えることもできる。
【０３７４】
特に、増幅される核酸の新しく合成された二本鎖の分離のために反応混合物にてヘリカーゼ又はリコンビナーゼは使用されない。
【０３７５】
特定の実施形態では、反応混合物は、ＡＴＰなどの生化学的エネルギー付与化合物を含有しない。
【０３７６】
反応の開始時に存在する増幅される核酸の量は、数コピー〜数十億コピーの間で１つのバッチに存在し得る。診断用途の場合は、増幅される核酸鎖の量は未知であり得る。
【０３７７】
反応において、増幅される対象ではないさらなる核酸もまた存在し得る。前記核酸は、天然のＤＮＡ又はＲＮＡ又はそれらの同等物に由来し得る。特定の実施形態において、制御配列は、増幅される核酸と並行して増幅される必要のある同じバッチ中に存在する。
【０３７８】
特に、使用されるプライマー及びコントローラーオリゴヌクレオチドが約１０３：１〜約１０１５：１（プライマー：鋳型の比）のモル過剰で、増幅される核酸鎖の合成のための鋳型鎖を含む反応混合物に加えられる。
【０３７９】
本発明による方法が診断用途に使用される場合、標的核酸の量は未知であり得、そのため相補鎖に対するプライマー及びコントローラーオリゴヌクレオチドの相対量を確実に決定することはできない。増幅されるべき配列が複雑な長鎖核酸鎖の混合物に含有される場合、添加されるプライマーの量は、一般に、相補鎖（鋳型）の量に対してモル過剰で存在する。方法の効率を改善するために、多量の過剰モルが好ましい。
【０３８０】
使用するプライマー１、プライマー２及びコントローラーオリゴヌクレオチドの濃度は、例えば０．０１μｍｏｌ／ｌ〜１００μｍｏｌ／ｌの間、特に０．１μｍｏｌ／ｌ〜１００μｍｏｌ／ｌの間、特に０．１μｍｏｌ／ｌ〜５０μｍｏｌ／ｌ、特に０．１μｍｏｌ／ｌ〜２０μｍｏｌ／ｌの間の範囲である。成分の濃度が高いと、増幅率が増加することが可能である。個々の成分のそれぞれの濃度は、所望の反応結果を達成するために独立して変えることができる。
【０３８１】
ポリメラーゼの濃度は、０．００１μｍｏｌ／ｌ〜５０μｍｏｌ／ｌの間の範囲、好ましくは０．０１μｍｏｌ／ｌ〜２０μｍｏｌ／ｌ、特に０．１μｍｏｌ／ｌ〜１０μｍｏｌ／ｌの間の範囲である。
【０３８２】
個々のｄＮＴＰ基質の濃度は、１０μｍｏｌ／ｌ〜１０ｍｍｏｌ／ｌの間の範囲、特に５０μｍｏｌ／ｌ〜２ｍｍｏｌ／ｌの間の範囲であり、良好には１００μｍｏｌ／ｌ〜１ｍｍｏｌ／ｌの間の範囲である。ｄＮＴＰの濃度は、２価金属カチオンの濃度に作用することが可能である。任意に、これは相応して調整される。
【０３８３】
二価の金属カチオンとして、例えばＭｇ２＋が使用される。対応するアニオンＣｌとしては、例えば、酢酸塩、硫酸塩、グルタミン酸塩等が使用できる。
【０３８４】
二価の金属カチオンの濃度は、例えば対応するポリメラーゼに最適な範囲に適合され、０．１ｍｍｏｌ／ｌ〜５０ｍｍｏｌ／ｌの間の範囲、より良好には０．５ｍｍｏｌ／ｌ〜２０ｍｍｏｌ／ｌの間の範囲、好ましくは１ｍｍｏｌ／ｌ〜１５ｍｍｏｌ／ｌの間の範囲を含む。
【０３８５】
一般に、酵素合成は緩衝水溶液で行われる。緩衝液としては、トリスＨＣｌ、トリス酢酸、グルタミン酸カリウム、ＨＥＰＥＳ緩衝液、一般的な濃度のグルタミン酸ナトリウムなどの溶解された従来の緩衝物質が使用できる。前記溶液のｐＨ値は、通常、７〜９．５、好ましくは約８〜８．５の間である。緩衝液条件は、例えば、使用するポリメラーゼの製造業者の推奨に従って適用され得る。
【０３８６】
いわゆるＴｍ降下剤（ＤＭＳＯ、ベタイン、ＴＰＡＣなど）などの他の物質を緩衝液に添加することができる。そのような物質は、二本鎖の融解温度（「Ｔｍ降下剤」）を低下させ、したがって二本鎖の開口にプラスの影響を有し得る。Ｔｗｅｅｎ２０又はＴｒｉｔｏｎ１００などのポリメラーゼ安定化成分も通常の量で緩衝液に添加できる。ＥＤＴＡ又はＥＧＴＡを従来の量で添加して、重金属を複合することができる。トレハロース又はＰＥＧ６０００などのポリメラーゼ安定化物質も反応混合物に加えることができる。
【０３８７】
特に、反応混合物は、鎖置換反応のいずれの阻害剤を含有せず、ポリメラーゼ依存性プライマー伸長の阻害剤も含有しない。
【０３８８】
特定の実施形態では、反応混合物は、ＤＮＡ結合色素、特にＥｖａＧｒｅｅｎ又はＳｙｂｒＧｒｅｅｎなどの挿入色素を含有する。そのような色素は、新しい核酸鎖の形成の検出を可能にし得る。
【０３８９】
反応混合物はまた、例えば、元の材料に由来し、増幅に影響を及ぼさないタンパク質又は他の物質を含有し得る。
【０３９０】
反応条件の特定の実施形態
温度は二本鎖の安定性に大きな影響を与える。
【０３９１】
特定の実施形態では、増幅反応の間、コントローラーオリゴヌクレオチドの非存在下で増幅される核酸の二本鎖の分離を本質的に導く温度条件は使用されない。これは、増幅される核酸鎖の二本鎖の分離が、増幅手順全体を通じてコントローラーオリゴヌクレオチドの存在に依存することを確認するものである。
【０３９２】
増幅される核酸の測定された融解温度（Ｔｍ）とほぼ等しい温度で、増幅される核酸の両方の鎖の自発的な分離が生じ、それにより、合成された鎖の分離に対するコントローラーオリゴヌクレオチドの影響が、したがって増幅の配列特異性に対するコントローラーオリゴヌクレオチドの影響が最小限になり限定される。
【０３９３】
配列特異性が低い必要がある（つまり、コントローラーオリゴヌクレオチド依存性が低い）指数的増幅の場合、反応温度は、増幅される核酸の融解温度（すなわち、Ｔｍプラス／マイナス３°〜５℃）付近であり得る。そのような温度で、コントローラーオリゴヌクレオチドと合成されたプライマー伸長産物との間の配列の差異は、一般的に、鎖置換反応において十分に耐性があり得る。
【０３９４】
約（Ｔｍマイナス３℃）から約（Ｔｍマイナス１０℃）の温度範囲でも、合成されたプライマー伸長産物の自発的な鎖の分離はなお生じるが、効率は低下する。増幅される核酸の配列特異性に対するコントローラーオリゴヌクレオチドの影響は、増幅される核酸鎖の融解温度（Ｔｍ）付近の温度条件ではより高い。
【０３９５】
鎖の分離は反応温度の低下に伴って行われるが、主に新しく合成された二本鎖とコントローラーオリゴヌクレオチドとの相互作用による。しかしながら、伸長温度でのプライマーの二本鎖はまた、上記の条件下で、すなわち、コントローラーオリゴヌクレオチドによる配列依存性鎖置換なしに、自発的に分解することもできる。例えば、減少した配列特異的増幅の反応温度は、約（Ｔｍマイナス３℃）〜約（Ｔｍマイナス１０℃）、特に約（Ｔｍマイナス５℃）〜約（Ｔｍマイナス１０℃）の間の範囲である。このような温度では、コントローラーオリゴヌクレオチドと合成されたプライマー伸長産物との間の配列の差異は、鎖置換反応において耐容可能性が低い。
【０３９６】
増幅される核酸の新しく合成された鎖が反応条件下で自然に一本鎖に解離できない場合、この方法の増幅の高い配列特異性が主に実現される。そのような場合、コントローラーオリゴヌクレオチドによる配列特異的鎖置換は、配列特異的鎖分離において決定的な役割を果たし、増幅反応の配列特異性に大きく関与する。これは一般に、反応温度が増幅される核酸の両方の鎖の融解温度を大幅に下回り、鎖分離に他の成分が使用されない場合、例えばヘリカーゼ又はリコンビナーゼがない場合に実現できる。例えば、配列特異的増幅では、反応温度はおよそ（Ｔｍマイナス１０℃）〜およそ（Ｔｍマイナス５０℃）の間、特におよそ（Ｔｍマイナス１５℃）〜およそ（Ｔｍマイナス４０℃）の間、特におよそ（Ｔｍマイナス１５℃）〜およそ（Ｔｍマイナス３０℃）の間の範囲である。
【０３９７】
増幅の特定の実施形態では、最大反応温度は、全増幅反応の間に増幅される核酸鎖の融解温度を超えて上昇しない。
【０３９８】
増幅の特定の実施形態では、反応温度は、増幅される核酸鎖の融解温度を少なくとも１回超えて上昇させることができる。例えば、増幅反応の開始時に温度が上昇され、ゲノムＤＮＡの二本鎖が変性をもたらすことができる。そのようなステップの間、コントローラーオリゴヌクレオチドの作用に対する二本鎖分離の依存性が排除される、又は少なくとも著しく減少することに留意すべきである。
【０３９９】
増幅反応の個々のステップの反応温度は、約１５℃〜約８５℃の範囲、良好には、約１５℃〜約７５℃の範囲、特に約２５℃〜約７０℃の範囲であり得る。
【０４００】
下記の実施例２及び３では、増幅反応に６５℃の反応温度が使用され、増幅される核酸のＴｍは約７５℃〜約８０℃の間であった。したがって、増幅される核酸の二本鎖は反応条件下で安定であり、増幅反応は配列特異的であった。
【０４０１】
一般に、反応温度は、個々の反応ステップごとに最適に調整できるため、そのような温度は、各反応ステップごとに実現できる。したがって、増幅反応には、周期的に繰り返される温度の繰り返し変化を含む。プロセスの有利な実施形態では、いくつかの反応ステップの反応条件は、温度ステップの数が反応ステップの数よりも少なくなるように標準化される。本発明のそのような特定の実施形態では、増幅のステップの少なくとも１つは、増幅の他のステップの反応温度とは異なる反応温度で行われる。したがって、反応は等温で進行せず、反応温度は周期的に変化される。
【０４０２】
例えば、増幅中、交互に誘導される少なくとも２つの温度範囲が使用される（個々の温度範囲間の温度の周期的変化）。特定の実施形態において、より低い温度範囲は、例えば、２５℃〜６０℃の間、特に３５℃〜６０℃の間、特に５０℃〜６０℃の間の温度を含み、かつ上限温度範囲は、例えば、６０℃〜７５℃の間、特に６０℃〜７０℃の間の温度を含む。
【０４０３】
特定の実施形態では、より低い温度範囲は、例えば１５℃〜５０℃の間、特に２５℃〜５０℃の間、特に３０℃〜５０℃の間の温度を含み、上限温度範囲は、例えば５０℃〜７５℃、特に５０℃〜６５℃の間の温度を含む。
【０４０４】
特定の実施形態において、より低い温度範囲は、例えば、１５℃〜４０℃の間、特に２５℃〜４０℃の間、特に３０℃〜４０℃の間の温度を含み、そして上限温度範囲は、例えば、４０℃〜７５℃の間、特に４０℃〜６５℃の間の温度を含む。
【０４０５】
温度はそれぞれの範囲で一定に保つこと、又は温度勾配（下降又は上昇）として変化させることができる。
【０４０６】
温度設定のさらなる説明は、実施形態の以下のセクションで詳細に記載される。
【０４０７】
誘導された各温度は特定の時間、維持され得、よってインキュベーションステップをもたらすことができる。したがって、反応混合物は、選択された温度での増幅の間、特定の時間インキュベートすることが可能である。前記時間は、各インキュベーションステップで異なることが可能であり、所与の温度でのそれぞれの反応の進行によることが可能である（例えば、プライマー伸長又は鎖置換など）。インキュベーションステップの時間は、以下の範囲：０．１秒〜１０，０００秒、特に０．１秒〜１０００秒、特に１秒〜３００秒、特に１秒〜１００秒の間の範囲を含むことができる。
【０４０８】
上記のように温度を変化させることにより、特に選択された温度で、個々の反応ステップを実施することができる。このようにして、それぞれの反応ステップからの収率を改善することができる。合成サイクル内では、必要に応じて、温度変化又は個々の範囲間の温度切り替えを数回行うことができる。したがって、合成サイクルは、少なくとも１つの温度変化を含むことができる。そのような温度変化は、例えば、時間プログラムとしてＰＣＲ装置／温度サイクラーで定期的に実行することができる。
【０４０９】
特定の実施形態では、鎖置換を含むステップの少なくとも１つ、及びプライマー伸長反応を含むステップの少なくとも１つが、同時に又は並行して、同じ反応条件下で行われる増幅方法が好ましい。そのような実施形態では、例えば、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、第１のオリゴヌクレオチドプライマー）のプライマー伸長反応は、特に、より低い温度範囲の温度条件下で実行することができる。対照的に、鎖置換は、コントローラーオリゴヌクレオチドの協力により行われ、（例えば、第２のオリゴヌクレオチドプライマーの）さらなるプライマー伸長反応が、特に上限温度範囲の反応ステップで起こる。
【０４１０】
特定の実施形態では、コントローラーオリゴヌクレオチドによる鎖置換を含むステップの少なくとも１つ、及びプライマー伸長反応を含むステップの少なくとも１つが、異なる温度で行われる増幅方法が好ましい。そのような実施形態では、例えば、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、第１のオリゴヌクレオチド及び／又は第２のオリゴヌクレオチドプライマー）のプライマー伸長反応は、特に、より低い温度範囲の温度条件下で行うことができる。一方、コントローラーオリゴヌクレオチドが関与する鎖置換は、特に上限温度範囲の反応ステップで起こる。
【０４１１】
別の特定の実施形態では、増幅反応のすべてのステップは、同じ反応条件下で行われる。
【０４１２】
そのような実施形態では、増幅手順は、等温条件下で実行することができ、すなわち、プロセスを実行するために温度変化は必要とされない。本発明のそのような特定の実施形態では、増幅反応全体が一定の温度下で行われる、すなわち、反応は等温である。そのような反応の時間は、例えば以下の範囲：１００秒〜３０，０００秒、特に１００秒〜１０，０００秒、特に１００秒〜１０００秒の間の範囲を含む。
【０４１３】
「実施例」のセクションでは、等温反応が可能になるように、個々の反応成分及び対応する反応ステップの構造を一致させることが可能であることを示す。
【０４１４】
増幅される核酸鎖の量を２倍にするすべての方法ステップの総和は、合成サイクルと呼ばれる。このようなサイクルは、等温であり得、又はその過程での温度変化によって特徴付けられ得る。温度変化はサイクルごとに繰り返され、同一であることが可能である。
【０４１５】
コントローラーオリゴヌクレオチドの第３の領域の５個を超えるヌクレオチドが第１のプライマー伸長産物との相補的結合に入ることができる場合、特に１０を超える場合、特にコントローラーオリゴヌクレオチドの２０を超えるヌクレオチドが第１のオリゴヌクレオチド伸長産物との結合に入る場合、最大達成温度がコントローラーオリゴヌクレオチドの関与を伴う鎖分離のみを可能にする増幅方法は、特に有利である。一般に、合成された鎖が反応条件下で分離する前に、コントローラーオリゴヌクレオチドと第１のプライマー伸長産物の相補鎖の間の必要な結合が長いほど、増幅反応はより特異的である。詳細には、所望の特異性の程度は、コントローラーオリゴヌクレオチドの第３の部分を伸長又は短縮することによって決定することができる。
【０４１６】
プロセスのステップは、プロセスの全期間にわたって一定の温度で、又は異なる温度で繰り返すことができる。
【０４１７】
個々の方法のステップは、個々の成分を追加することにより、次々に実行できる。特定の実施形態では、増幅手順に必要なすべての反応成分は、増幅手順の開始時に反応混合物中に存在する。
【０４１８】
増幅反応の開始は、成分を添加すること、例えば、標的配列を含む核酸鎖（例えば、開始核酸鎖）、又はポリメラーゼもしくは二価金属イオンを添加することにより、又は増幅に必要な反応条件を誘導することにより、例えば、１つ以上のプロセスのステップに必要な反応温度を設定することにより、行うことができる。
【０４１９】
増幅は、増幅される核酸が所望の量に達するまで行うことができる。別の実施形態では、増幅反応は、増幅されるべき十分な量の核酸を得るのに十分である時間の間行われる。別の実施形態において、増幅反応は、増幅されるべき十分な量の核酸を得るのに十分であると思われる十分な数の合成サイクル（倍加時間）にわたって行われる。
【０４２０】
反応は、さまざまな介入によって停止できる。例えば、温度を変化させることにより（例えば、ポリメラーゼの機能が妨害される冷却又は加熱）、又はポリメラーゼ反応を停止する物質、例えば、ＥＤＴＡ又はホルムアミドを添加することによる。
【０４２１】
増幅後、増幅された核酸鎖は、さらなる分析に使用できる。合成された核酸鎖は、さまざまな検出方法で分析できる。例えば、蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブが使用され得、又は配列決定方法（サンガーシーケンシング又は次世代シーケンシング）、マイクロアレイ又はビーズアレイ分析などの固相分析などが使用され得る。合成された核酸鎖は、基質／鋳型として、さらなるオリゴヌクレオチド伸長反応に使用できる。
【０４２２】
特定の実施形態において、合成反応の進行は、反応中にモニタリングされる。これは、例えば、Ｓｙｂｒｇｒｅｅｎ又はＥｖａｇｒｅｅｎなどの挿入色素を使用することにより、又は標識プライマー（例えば、Ｌｕｘ−オリゴヌクレオチドプライマー又はＳｃｏｒｐｉｏｎ−オリゴヌクレオチドプライマーなど）を使用することにより、又は蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを使用することにより行うことができる。
【０４２３】
増幅中の蛍光変化の検出は、この手順の検出ステップで実行される。前記ステップの温度及び持続時間は、オリゴヌクレオチドプローブのそれぞれの要件に適合させることができる。例えば、検出ステップの温度は、２０℃〜７５℃、特に４０〜７０℃、特に５５〜７０℃の間を含む。
【０４２４】
検出ステップの間、反応は、検出系（ドナー又は蛍光レポーター）で使用される蛍光色素分子を励起できる波長の光で照射される。シグナル取得は通常、励起と並行して実行され、特異的な蛍光シグナルが検出され、その強度が定量化される。
【０４２５】
増幅方法は、診断手順の一部として、生物学的材料又は診断的材料における標的核酸鎖の存在を確認するために使用することができる。
【０４２６】
第２の増幅の反応条件の特定の実施形態
ＰＣＲの反応条件は、当業者に十分に知られている。
【０４２７】
したがって、いくつかの特定の実施形態は、例示的な手段によって本明細書に提示される。
【０４２８】
特定の実施形態において、図３〜１１に示される温度は、以下の範囲を含む：
Ｔ１＝５５℃（＋／−５℃）
Ｔ２＝６５℃（＋／−５℃）
Ｔ３＝９５℃（＋／−５℃）
Ｔ４＝４５℃（＋／−５℃）
Ｔ５＝７０℃（＋／−５℃）
【０４２９】
特定の実施形態では、図３〜１１に示される温度は、以下の範囲を含む：
Ｔ１＝５５℃（＋／−１０℃）
Ｔ２＝６５℃（＋／−１０℃）
Ｔ３＝９５℃（＋／−１０℃）
Ｔ４＝４５℃（＋／−１０℃）
Ｔ５＝７０℃（＋／−１０℃）
【０４３０】
特定の実施形態では、図３〜１１に示される温度は、以下の範囲を含む：
Ｔ１＝５５℃（＋／−１５℃）
Ｔ２＝６５℃（＋／−１０℃）
Ｔ３＝９５℃（＋／−１０℃）
Ｔ４＝４５℃（＋／−２０℃）
Ｔ５＝７０℃（＋／−１０℃）
【０４３１】
特定の実施形態では、図３〜１１に示される温度は、以下の範囲を含む：
Ｔ１＝５５℃（＋／−５℃）
Ｔ２＝６５℃（＋／−３℃）
Ｔ３＝９５℃（＋／−１０℃）
Ｔ４＝４５℃（＋／−５℃）
Ｔ５＝７０℃（＋／−３℃）
【０４３２】
単一の温度ステップ中のインキュベーション時間は、いくつかの実行において０．１秒〜６０分の間、特に１秒〜１０分の間、特に１秒〜５分の間であり得る。
【０４３３】
周期的な温度変化は、ＰＣＲサイクルと呼ばれることが多い。例えば、ＰＣＲサイクルには、Ｔ１、Ｔ２からＴ３への温度の完全な変化を含む。
【０４３４】
使用される温度範囲は、主に第２の増幅の次のステップをサポートすることを目的とする：
Ｔ１、Ｔ２、Ｔ４、及びＴ５の温度：第３及び第４のプライマーの、それぞれの鋳型鎖の相補セグメントへのハイブリダイゼーション、及び第３及び第４のプライマー伸長産物の伸長。
【０４３５】
Ｔ３温度は、プライマー伸長産物の少なくとも１つを含む二本鎖を分離するために使用される。二本鎖として存在するすべての核酸鎖（例えば、二本鎖標的配列、第１の増幅断片１．１、第２の増幅断片２．１、並びにＰ１．１−Ｅｘｔ及びＰ４．１−Ｅｘｔ−ｐａｒｔ１又はＰ２．１−Ｅｘｔ及びＰ３．１−Ｅｘｔ−ｐａｒｔ１を含む中間産物）は、温度の作用により一本鎖の形態に変換される。
【０４３６】
さらに、Ｔ３温度は、（例えば、抗体によって不活性化された）第２のポリメラーゼのホットスタート形態を活性化する、又は第１のポリメラーゼを不活性化するのに機能し得る。さらに、熱不安定性コントローラーオリゴヌクレオチドは、前記温度（Ｔ３）によって切断され得る。さらに、熱活性化可能オリゴヌクレオチドプライマー３及び４が活性化することができる。
【０４３７】
したがって、反応制御に異なる温度を使用できる。
【０４３８】
さらに、それぞれのＰＣＲプライマー（第２の増幅の第３及び第４のプライマー）との組み合わせでの反応温度の選択は、第２の増幅中の産物の生成／中間体の形成に影響を与えることが可能である。
【０４３９】
個々の産物及び中間体の収率の程度は、いくつかの要因に依存する。例えば、個々のプライマーの濃度が高いほど、一般に産物／中間収の収量に有利である。さらに、産物／中間体の形成は、反応温度、及び個々の反応物の相互への結合／親和性（鋳型鎖内の相補的プライマー結合部位への個々のプライマーの結合の親和性）によって影響を受けることが可能であり：一般に、例えば、より長いオリゴヌクレオチドは、より高い温度でより短いオリゴヌクレオチドよりも良好に結合し、ＣＧのレベルも相補的な配列セグメントで役割を果たすことができる：ＣＧが豊富な配列はまた、ＡＴが豊富な配列よりも高温でより強く結合する。さらに、ＭＧＢ又は２−アミノ−ｄＡ又はＬＮＡなどの修飾は、それぞれの相補的セグメントへのプライマーの結合強度を高めることができ、これにより、高温でオリゴヌクレオチドプライマーが優先的に結合する。
【０４４０】
例えば、相補的なセグメントとのＴｍが比較的高い（例えば、６０〜７０℃）、より長いオリゴヌクレオチドプライマーがＰＣＲに使用される（例えば、２５〜６０の間のヌクレオチド、ＣＧのレベルが４０％を超える）。これにより、より高い温度（Ｔ２又はＴ５など）で実行する第２の増幅のハイブリダイゼーションステップ及びプライマー伸長ステップを許容できる。したがって、（第１の増幅からの）比較的短い第１及び第２のプライマーの組み合わせにおいて、プライマー伸長産物Ｐ４．１−Ｅｘｔ及びＰ３．１−Ｅｘｔが優先的に形成され、ＰＣＲ増幅中のＰ１．１及びＰ２．１から始まるプライマー伸長産物の共増幅が大幅に抑制できるように、反応が制御されることが可能である。
【０４４１】
例えば、前記標的配列又はその同等物に結合することができる短い３’セグメントのみを含む（例えば、前記セグメントは６〜１５の間のヌクレオチド長である）第３及び第４のプライマーを使用する場合、低温で数サイクルを最初に実施することが有利であり得る（図１０Ａ及びＢ、Ａ２．１の段階）。同様の状況は、例えば、本質的に相補的な第１の増幅断片１．１のみの不一致を含むＰＣＲプライマーにも適用できる。
【０４４２】
比較的低温の前記段階（Ｔ１及びＴ４）の間に、第３及び／又は第４のプライマーの第１の増幅断片の相補セグメントへのプライマー結合が起こり、その結果、短い長さの相補セグメント及び／又は既存の不一致にもかかわらず、第１の増幅断片の個々の鎖にハイブリダイズされた前記プライマーから開始するポリメラーゼが、鋳型依存性プライマー伸長を実行でき、第３及び第４のオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマー伸長産物を合成できる。
【０４４３】
前記ＰＣＲサイクルは、相補鎖も合成できるように、少なくとも２回繰り返される。サイクルが繰り返されると、第３及び第４のプライマー自体も鋳型としてコピーされ、結果として第３及び／又は第４のオリゴヌクレオチドプライマーの完全なプライマー結合部位が形成される。
【０４４４】
次いで、第３及び第４のプライマーがより高温で完全に形成されたプライマー結合部位に結合できるように、温度を上昇することができる（Ａ２．２の段階）
【０４４５】
より高い温度（Ｔ２及びＴ５）の使用は、例えば、均一なアッセイ（両方の増幅系が同じ反応バッチ内にある場合）で有利である。これは、例えば、第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ又はＰ３．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ）の標的配列の相補的領域へのコントローラーオリゴヌクレオチドの結合の影響を低減するために使用され得る。
【０４４６】
酵素合成はまた、一般的に、第２の増幅において緩衝水溶液中で行われる。緩衝液としては、トリス−ＨＣｌ、トリス酢酸、グルタミン酸カリウム、ＨＥＰＥＳ緩衝液、一般的な濃度のグルタミン酸ナトリウムなどの溶解された従来の緩衝物質が使用できる。前記溶液のｐＨ値は、通常、７〜９．５、特に約８〜８．５の間である。緩衝液条件は、例えば、使用するポリメラーゼの製造業者の推奨に従って適用され得る。
【０４４７】
いわゆるＴｍ降下剤（ＤＭＳＯ、ベタイン、ＴＰＡＣなど）などのさらなる物質を緩衝液に添加することができる。そのような物質は、二本鎖の融解温度（「Ｔｍ降下剤」）を低下させ、したがって二本鎖の開口にプラスの影響を有し得る。また、Ｔｗｅｅｎ２０又はＴｒｉｔｏｎ１００などのポリメラーゼ安定化成分も通常の量で緩衝液に添加できる。ＥＤＴＡ又はＥＧＴＡを従来の量で添加して、重金属を複合することができる。トレハロース又はＰＥＧ６０００などのポリメラーゼ安定化物質も反応混合物に加えることができる。
【０４４８】
開始核酸鎖の特定の実施形態：第１の増幅用
増幅反応の開始時に使用された、又は使用されるべき核酸鎖は、開始核酸鎖と呼ぶことができる（図１）。
【０４４９】
その機能は、プライマー、両方のプライマー間の合成セグメント、並びに結合プロセス及び伸長プロセスの開始の正しい配置を可能にする初期鋳型を表すという点で理解することができる。特定の実施形態では、開始核酸鎖は標的配列を含む。
【０４５０】
プライマーをそれぞれのプライマー結合部位（ＰＢＳ１及びＰＢＳ２）に結合し、適切なプライマー伸長反応を開始することにより、第１のプライマー伸長産物が生成される。これらは、反応の開始時に存在する核酸鎖の特異的コピーとして合成される。
【０４５１】
特定の実施形態では、増幅反応の開始前に反応混合物中で使用されるこの核酸鎖（開始核酸鎖）は、増幅される核酸鎖と同一であり得る。増幅反応により、そのような核酸鎖の量のみが増加する。
【０４５２】
特定の実施形態では、増幅される核酸及び開始核酸鎖は、開始核酸鎖が増幅される核酸鎖の個々の配列要素の配置を規定するが、開始核酸鎖の配列組成は、増幅される核酸鎖の配列と異なり得る点で異なる。例えば、増幅中のプライマー結合及び伸長の観点から、（開始核酸鎖に関する）新しい配列内容は、増幅される核酸鎖に組み込むことができる。さらに、増幅される核酸鎖の配列要素は、それらの配列組成（例えば、プライマー結合部位又はプライマー配列）において、開始核酸鎖のそのような配列要素とは異なり得る。開始核酸は、増幅される核酸鎖の特異的な合成のための初期鋳型としてのみ機能する。前記初期鋳型は、増幅の終了まで反応混合物中に留まることができる。しかしながら、増幅の指数関数的な特性に起因して、増幅反応の終わりにて増幅される核酸鎖の量は、反応に加えられた開始核酸鎖の量を上回る。
【０４５３】
特定の実施形態では、開始核酸鎖は、増幅されない少なくとも１つの配列部分を含むことができる。したがって、そのような開始核酸鎖は、増幅されるべき配列と同一ではない。増幅されないそのようなセグメントは、例えば、それぞれ、配列準備ステップの結果又は前の配列操作ステップの結果としての開始核酸鎖の配列セグメントを示すことができる。
【０４５４】
特定の実施形態では、反応の開始前に反応混合物に添加される開始核酸鎖は、少なくとも１つの標的配列を含む。
【０４５５】
特定の実施形態では、そのような開始核酸鎖は、少なくとも１つの標的配列及びなお非標的配列であるさらなる配列を含む。増幅中、標的配列を含む配列セグメントは指数関数的に増加し、それにより、他の配列セグメントは全く指数関数的に増加しない、又は部分的にのみ増加することいずれかである。
【０４５６】
開始核酸鎖の構造（第１の増幅用）
そのような開始核酸鎖の例は、標的配列を含み、並びに配列断片Ａを含み、配列断片Ｂを含む核酸鎖である。
【０４５７】
開始核酸鎖の配列断片Ａは、この増幅に使用される両方のプライマーの一方の配列と有意な相同性を有する、又は一方のプライマーの３’セグメントのコピー可能な部分と本質的に同一である配列を含む。このセグメントに対する相補鎖の合成において、それぞれのプライマー結合部位を表す相補配列が生成される。
【０４５８】
開始核酸鎖の配列断片Ｂは、対応するさらなるプライマー又はその３’セグメントを相補的に結合して伸長可能なプライマー鋳型複合体を形成するのに適した配列を含み、配列断片Ａと配列断片Ｂは、互いに主に／特に非相補的である。
【０４５９】
特定の実施形態において、開始核酸鎖は、以下の特性を有する増幅方法の反応混合物に加えられる：
特に、配列断片Ａは、開始核酸鎖の５’セグメントにある。特に、前記配列断片Ａは、該核酸鎖の５’方向に制限を形成する。
【０４６０】
特に、配列断片Ｂは、配列断片Ａから、第１のプライマーの結合部位に対して及び第１のプライマーの極性に対して（「下流」）３’方向に位置する。
【０４６１】
特定の実施形態では、前記配列断片Ｂは、３’方向において核酸鎖の制限を形成する。特定の実施形態では、前記配列断片Ｂは、３’方向において核酸鎖の制限を表さないが、３’側からさらなる配列が隣接している。特に、前記配列は標的配列ではなく、指数関数的増幅には関与しない。
【０４６２】
特定の実施形態では、標的配列は、両方の配列断片Ａ又はＢの少なくとも一方を含む。特定の実施形態では、標的配列は、配列断片Ａと配列断片Ｂの間にある。
【０４６３】
特定の実施形態（図５０）では、そのような開始核酸鎖は、第１のプライマー伸長産物の合成の鋳型として機能することができる。ここで、例えば、第２のオリゴヌクレオチドプライマーを使用したプライマー伸長反応中の開始核酸鎖は、指数関数的増幅の前の調製的ステップの間、より長い開始核酸鎖の配列セグメントとして提供され得、一本鎖形態に変換され得る。例えば、開始核酸鎖はゲノムＤＮＡ又はＲＮＡであり得、それは標的配列の供給源として機能する。核酸鎖の５’セグメントの開始核酸鎖は、第２のオリゴヌクレオチドプライマーの配列セグメントを含みかつ５’方向において制限を表すセグメント１、標的配列又はその一部を含むセグメント２、第１のオリゴヌクレオチドプライマーのプライマー結合部位を含むセグメント３、及び開始核酸鎖の３’セグメントに局在し、よって３’側のセグメント３に隣接する非標的配列を含むセグメント４を含む。
【０４６４】
増幅の開始時に、第１の領域の少なくとも３’セグメントを持つ第１のプライマーは、セグメント３においてそのような開始核酸鎖に結合し、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの存在下で適切に伸長できる。それにより、開始核酸鎖の鋳型鎖に相補的であり、その長さが制限されている第１のプライマー伸長産物が生成される。増幅反応中、そのようなプライマー伸長産物は、コントローラーオリゴヌクレオチドを介して鋳型鎖から配列特異的に引き離され、その結果、これから合成される第１のプライマー伸長産物の３’セグメントに対応する配列セグメントが第２のオリゴヌクレオチドプライマーの結合部位として利用できる。
【０４６５】
したがって、特定の実施形態では、開始核酸鎖は、以下の配列断片を含む（図５０）：
・  配列セグメント１（セグメント１と呼ばれる）であって、これは、第２のプライマーの配列と有意な相同性を持つ配列である、又は第２のプライマーの３’セグメントのコピー可能な部分と本質的に同一の配列を含む。前記配列セグメント１は、開始核酸鎖の５’セグメントにあり、特に前記配列セグメント１は、５’方向において核酸鎖の制限を形成する。
・  配列セグメント３（セグメント３と呼ばれる）であって、これは、第１のプライマーの第１の領域又はその３’セグメントに相補的に結合して、伸長可能なプライマー鋳型複合体を形成するのに適した配列を含む。特に、前記配列セグメント３は、配列セグメント１の３方向（「上流」）にある。
・  部分的又は全体的にセグメント１とセグメント３の間にある標的配列（標的配列のこの部分はセグメント２と呼ばれる）。特定の実施形態では、標的配列は、セグメント２並びにセグメント１及び／又はセグメント３の少なくとも１つを含む。
・  任意に、３’セグメントの開始核酸鎖は、増幅されない隣接配列セグメント（セグメント４と呼ばれる）を含む。
【０４６６】
特定の実施形態（図５１）では、開始核酸鎖は、第２のプライマー伸長産物の合成の鋳型として機能することができる。
【０４６７】
ここで、例えば、第１のオリゴヌクレオチドプライマーを使用したプライマー伸長反応中の開始核酸鎖は、指数関数的増幅の前の準備ステップの間、より長い開始核酸鎖の配列セグメントとして提供され得、一本鎖形態に変換され得る。例えば、開始核酸鎖はゲノムＤＮＡ又はＲＮＡであり得、それは標的配列の供給源として機能する（二本鎖として図示）。核酸鎖の５’セグメントの開始核酸鎖は、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの配列セグメントを含み、かつ５’方向において制限を表すセグメント５、標的配列又はその一部を含むセグメント６、第２のオリゴヌクレオチドプライマーのプライマー結合部位を含むセグメント７、及び開始核酸鎖の３’セグメントに局在し、したがって３’側のセグメント７に隣接する非標的配列を含むセグメント８を含む。
【０４６８】
増幅の開始の間、少なくともその第１の領域の３’セグメントを持つ第１のプライマーは、セグメント７のそのような開始核酸鎖に結合でき、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの存在下で、適切に第１のオリゴヌクレオチドプライマーの停止セクションまで延長できる。それにより、開始核酸鎖の鋳型鎖に相補的であり、その長さが制限されている第２のプライマー伸長産物が生成される。増幅反応中、そのようなプライマー伸長産物は、コントローラーオリゴヌクレオチドを介して鋳型鎖から配列特異的に分離され、その結果、これから合成される第２のプライマー伸長産物の３’セグメントに対応する配列セグメントが第１のオリゴヌクレオチドプライマーの結合部位として利用できる。
【０４６９】
前記特定の実施形態では、開始核酸鎖は、以下の配列断片を含む：
・  配列セグメント５（セグメント５と呼ばれる）であって、これは、第１のプライマーのこの領域の配列と有意な相同性を持つ、又は第１のプライマーの第１の領域のコピー可能な部分と本質的に同一の配列を含む。前記配列セグメント５は、開始核酸鎖の５’セグメントにあり、（第１のオリゴヌクレオチドプライマーに対してアナログに）コピー不可能なオリゴヌクレオチドテールにより隣接され、特に前記セグメント５は、５’方向にコピー可能な核酸鎖の制限を形成する。
・  配列セグメント７（セグメント７と呼ばれる）であって、これは、第２のプライマー又はその３’セグメントに相補的に結合して、伸長可能なプライマー鋳型複合体を形成するのに適した配列を含む。特に、セグメント７は、配列セグメント５の３’方向（「上流」）にある。
・  部分的又は全体的にセグメント５とセグメント７の間にある標的配列（図２３において、標的配列のこの部分はセグメント６と呼ばれる）。特定の実施形態では、標的配列は、セグメント６及び少なくとも１つのセグメント５及び／又はセグメント７を含む。
・  任意に、３’セグメントの開始核酸鎖は、増幅されない隣接配列セグメント（セグメント８と呼ばれる）を含む。
【０４７０】
第１の増幅反応のための開始核酸鎖の機能モード
増幅反応の開始時に、開始核酸鎖は、それぞれのプライマー伸長産物を最初に生成するための鋳型として機能する。したがって、それは、増幅される核酸鎖の出発鋳型を表す。開始核酸鎖は、増幅される核酸鎖と必ずしも同一である必要はない。増幅反応中に両方のプライマーを結合及び伸長することにより、本質的に両方のプライマーが、増幅される核酸鎖の両方の末端セグメント上のどの配列が増幅中に生成されるかを規定する。
【０４７１】
この方法の特定の実施形態では、二本鎖を変性させない反応条件は、指数関数的増幅手順の間維持される。したがって、開始核酸鎖が５’配列セグメントにポリメラーゼによって伸長可能な制限を有し、その結果、それぞれのプライマーの酵素的伸長が停止する場合、有利である。したがって、反応条件下で生成されるプライマー伸長断片の長さが制限される。これは、コントローラーオリゴヌクレオチドによる鎖置換に有益な効果をもたらし、それぞれの鎖の解離をもたらすことができ、その結果、プライマー結合部位は一本鎖段階に変換され、したがって、プライマーの新しい結合に到達できるようになる。
【０４７２】
第１のオリゴヌクレオチドプライマー（プライマー１）の特定の実施形態
第１のオリゴヌクレオチドプライマー（プライマー１）は、少なくとも以下の領域を含む核酸鎖である（図１２〜１４）：
・  増幅される核酸鎖の鎖に本質的に配列特異的に結合できる第１のオリゴヌクレオチドプライマーの３’セグメントの第１のプライマー領域  
・  コントローラーオリゴヌクレオチドを結合し、コントローラーオリゴヌクレオチドによる鎖置換（ステップｃ）をサポートするのに適したポリヌクレオチドテールを含む、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１のプライマー領域の５’末端に、直接又はリンカーを介して結合された第２の領域であって、ポリヌクレオチドテールは、反応条件下で本質的に一本鎖のままであり、すなわち、安定したヘアピン構造又はｄｓ構造を形成せず、本質的にポリメラーゼによってコピーされない。
【０４７３】
第１のオリゴヌクレオチドプライマーの全長は、１０〜８０ヌクレオチドの間、特に１５〜５０ヌクレオチドの間、より良くは２０〜３０ヌクレオチドの間又はその同等物（例えば、ヌクレオチド修飾体）である。第１のオリゴヌクレオチドプライマーの構造は、選択された反応条件下でコントローラーオリゴヌクレオチドに可逆的に結合できるように適合されている。さらに、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの構造は、そのプライマー機能に適合している。さらに、この構造は、コントローラーオリゴヌクレオチドによる鎖置換が実行できるように適合されている。全体として、第１及び第２の領域の構造は、指数関数的増幅を行うことができるように適合されている。
【０４７４】
本発明の有利な実施形態では、プライマーの第１及び第２の領域は、従来の５’−３’配置で結合される。本発明の特定の実施形態では、両方のセクションの結合は５’−５’結合を介して行われるため、第２の領域は第１の領域と反対の方向を有する。
【０４７５】
互いの間／相互間の領域の結合は、特に共有結合的に行われる。特定の実施形態では、第１の領域と第２の領域との間の結合は、ＤＮＡにとって従来の５’−３’ホスホジエステル結合（カップリング）である。特定の実施形態では、それは５’−５’ホスホジエステル結合である。特定の実施形態では、それは５’−３’ホスホジエステル結合であり、隣接する末端ヌクレオチド又は両領域のヌクレオチド修飾の間で、少なくとも１つのリンカー（例えば、Ｃ３、Ｃ６、Ｃ１２、又はＨＥＧリンカー又は無塩基修飾）が、配置される。
【０４７６】
個々の領域には、異なるヌクレオチド修飾を含むことができる。ここでは、ヌクレオチドの個々の要素を修飾できる：核酸塩基及び骨格（糖含有量及び／又はリン酸含有量）。さらに、標準的なヌクレオチドビルディングブロックの少なくとも１つの成分を欠く、又は修飾される（例えば、ＰＮＡ）修飾体が使用され得る。
【０４７７】
特定の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域は、コントローラーオリゴヌクレオチドに結合しないさらなる配列を含む。これらの配列は、他の目的、例えば固相への結合に使用できる。これらの配列は、ポリヌクレオチドテールの５’末端に特に局在している。
【０４７８】
特定の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、特徴的な標識を含み得る。そのような標識の例は、色素（例えば、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ４８８など）又はビオチン、又は例えばジゴキシゲニンなどの特異的に結合することができる他の群である。
【０４７９】
第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１のプライマー領域
配列の長さは約３〜３０ヌクレオチド、特に５〜２０ヌクレオチドの間であり、この配列は、増幅される核酸鎖の鎖の３’セグメントに主に相補的である。詳細には、前記プライマー領域は、第２のプライマー伸長産物の相補的な３’セグメントに特異的に結合できなければならない。前記第１の領域は、逆方向合成でコピー可能であり、また第２の鎖の鋳型としても機能する。特に、ヌクレオチドビルディングブロックは、共通の５’−３’ホスホジエステル結合又はホスホチオエステル結合を介して相互の間で結合される。
【０４８０】
第１のプライマー領域は、特に、ポリメラーゼの機能に影響を及ぼさない、又はほんのわずかに影響を与えるヌクレオチドモノマーを含み、これらは、例えば以下である：
・  天然のヌクレオチド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＣ、ｄＧなど）又は塩基対の変更なしのその修飾体
・  修飾ヌクレオチド、２−アミノ−ｄＡ、２−チオ−ｄＴ、又は相違塩基対を伴うその他のヌクレオチド修飾体。
【０４８１】
特定の実施形態では、前記領域の３’−ＯＨ末端は、特に修飾されておらず、ポリメラーゼによって認識され得る機能的な３’−ＯＨ基を有する。第１のプライマー領域は、増幅における第１のプライマー伸長産物の合成の開始剤として機能する。さらなる特定の実施形態では、第１の領域は、少なくとも１つのホスホロチオエート化合物を含み、そのため、ポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性によるプライマーの３’末端の分解は起こり得ない。
【０４８２】
第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１の領域の配列及びコントローラーオリゴヌクレオチドの第２の領域の配列は、互いに特に相補的である。
【０４８３】
特定の実施形態では、第１のプライマー領域又はその３’セグメントは、標的配列の配列セグメントに結合することができる。
【０４８４】
第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域
第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域は、特に、合成反応中にポリメラーゼによって特にコピーされないままであり、コントローラーオリゴヌクレオチドの第１の領域に結合できる少なくとも１つのポリヌクレオチドテールを含む核酸配列である。主にコントローラーオリゴヌクレオチドに結合する第２の領域のセグメントは、ポリヌクレオチドテールと呼ばれ得る。
【０４８５】
さらに、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域は、反応条件下でコントローラーオリゴヌクレオチドを特異的に結合する必要があるだけでなく、コントローラーオリゴヌクレオチドによる鎖置換のプロセスにも関与する必要もある。したがって、第２領域の構造は、コントローラーオリゴヌクレオチドと対応する二本鎖末端（詳細には、第２プライマー伸長産物の３’末端）の間に空間的近接を引き起こすのに適している必要がある。
【０４８６】
第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域の構造の構成は、いくつかの実施形態で詳細に示されている。ここでは、ポリメラーゼ触媒合成の停止につながるようにオリゴヌクレオチドセグメントの配置及び使用される修飾が考慮される。
【０４８７】
第２の領域の長さは、３〜６０ヌクレオチド、特に５〜４０ヌクレオチド、特に６〜１５ヌクレオチドの間又はその同等物である。
【０４８８】
第２の領域の配列は、任意に選択され得る。特に、この配列は、増幅される核酸及び／又は第２のオリゴヌクレオチドプライマー及び／又は第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１の領域に対して非相補的である。さらに、それは、特にヘアピンやステムループなどのいずれの自己相補的なセグメントを含有しない。
【０４８９】
第２の領域の配列は、両方の配列が反応条件下で結合することができるために、コントローラーオリゴヌクレオチドの第１の領域の配列に特に適合される。特定の実施形態では、前記結合は、反応条件下で可逆的である：したがって、互いに結合した成分と結合していない成分との間に平衡がある。
【０４９０】
第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域の配列は、コントローラーオリゴヌクレオチドの第１の領域に結合できる相補的塩基の数が１〜４０、より良好には３〜２０、特に６〜１５であるように特に選択される。
【０４９１】
とりわけ第２の領域の機能は、コントローラーオリゴヌクレオチドを結合することである。特定の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域は、特異的なコントローラーオリゴヌクレオチドに結合することができるように、特に前記結合は特異的である。別の実施形態では、第２の領域は、反応条件下で２つ以上のコントローラーオリゴヌクレオチドに結合することができる。
【０４９２】
一般に、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域とこのコントローラーオリゴヌクレオチドの第１の領域との間の配列において完全に一致する必要はない。第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域とこのコントローラーオリゴヌクレオチドの第１の領域との間の相補性の程度は、２０％〜１００％、より良好には５０％〜１００％、特に８０％〜１００％の間であり得る。それぞれ相補的な領域は、互いに直接隣接して配置され得る、又はそれらの間に非相補的な配列セグメントも含み得る。
【０４９３】
特定の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域は、少なくとも１つのＴｍ修飾を含み得る。そのような修飾を組み込むことにより、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域とコントローラーオリゴヌクレオチドの第１の領域との間の結合の安定性を修飾することができる。例えば、ＬＮＡヌクレオチド、２アミノアデノシン又はＭＧＢ修飾などのＴｍ上昇修飾（ヌクレオチド修飾又は非ヌクレオチド修飾）を使用することができる。一方、例えばイノシンヌクレオチドのようなＴｍ下降修飾も使用することもできる。第２の領域の構造において、リンカー（例えば、Ｃ３、Ｃ６、ＨＥＧリンカー）も組み込むことができる。
【０４９４】
鎖置換のために、コントローラーオリゴヌクレオチドは、増幅される核酸の二本鎖末端に空間的に近接させる必要がある。前記二本鎖末端は、第１のプライマー伸長産物の第１のプライマー領域のセグメント及び第２のプライマー伸長産物の対応する相補的な３’セグメントからなる。
【０４９５】
ポリヌクレオチドテールは、主に反応条件下でコントローラーオリゴヌクレオチドに相補的に結合し、したがってコントローラーオリゴヌクレオチドの第２領域と伸長されたプライマー伸長産物の第１の領域との一時的な近接を引き起こし、その結果、前記要素間の相補的結合が、鎖置換プロセス中に開始する。
【０４９６】
特定の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプライマーのポリヌクレオチドテールへのコントローラーオリゴヌクレオチドの結合は、そのような接触を直接導く。これは、ポリヌクレオチドテール及び第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１のプライマー領域が互いに直接に結合される必要があることを意味する。このような配置のため、コントローラーオリゴヌクレオチドがその第１の領域に結合した後、コントローラーオリゴヌクレオチドの第２の領域の相補的塩基と第１プライマー領域の対応する塩基との間に直接的接触があり得、それにより、鎖置換が開始され得る。
【０４９７】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドテールの構造と第１のプライマー領域の構造との間に、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域の他の構造が存在する。したがって、コントローラーオリゴヌクレオチドがポリヌクレオチドテールに結合した後、これは、第１のプライマー領域に直接配置されず、それから一定の距離に配置される。コピー不可能なポリヌクレオチドテールとオリゴヌクレオチドプライマーのコピー可能な第１のプライマー領域との間の構造は、そのような距離を生成することができる。前記距離は、０．１〜２０ｎｍの間、特に０．１〜５ｎｍの間、特に０．１〜１ｎｍの間の値を有する。
【０４９８】
そのような構造は、例えば、リンカー（例えば、Ｃ３又はＣ６又はＨＥＧリンカー）又はコントローラーオリゴヌクレオチドに相補的でないセグメント（例えば、非相補的、コピー不可能なヌクレオチド修飾の形態において）を表す。これらの構造の長さは、通常、鎖原子で測定可能である。前記長さは、１〜２００原子、特に１〜５０鎖原子、特に１〜１０鎖原子の間である。
【０４９９】
増幅条件下でコピーできないポリメラーゼのポリヌクレオチドテールを保つために、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域は、通常、ポリメラーゼが第１のプライマー領域を成功してコピーした後に、第２のプライマー伸長産物の合成でポリメラーゼの停止を導く、配列アラインメント又は構造をそれぞれ含む。前記構造は、第２の領域のポリヌクレオチドテールがコピーされるのを防ぐためのものである。したがって、ポリヌクレオチドテールは、特にポリメラーゼによってコピーされないままである。
【０５００】
特定の実施形態では、そのような構造は、第１のプライマー領域とポリヌクレオチドテールとの間にある。
【０５０１】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドテールの配列は、ポリメラーゼの停止をもたらすヌクレオチド修飾を含み得る。このようにして、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域の配列セグメントは、両方の機能を含むことができる：それは、ポリヌクレオチドテール及びポリメラーゼの停止をもたらすヌクレオチド修飾の配列の両方である。
【０５０２】
合成停止をもたらし、したがって、この適用において、ポリヌクレオチドテールをコピーせずに残す、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域における修飾は、「第１のブロッキングユニット又は停止領域」という用語の下に組み合わせされる。
【０５０３】
以下では、第２の鎖の合成の停止をもたらし得る構造のさらなる実施形態が示される。
【０５０４】
オリゴヌクレオチド合成におけるいくつかのビルディングブロックは、ポリメラーゼが鋳型を読み取るのを妨害し、ポリメラーゼ合成の終結を導くことが知られている。例えば、コピー不可能なヌクレオチド修飾又は非ヌクレオチド修飾が知られている。ポリメラーゼの停止を導くオリゴヌクレオチド内のヌクレオチドモノマーの合成の種類／アラインメントもまた存在する（例えば、５’−５アラインメント又は３’−３’アラインメント）。コピー不可能なポリヌクレオチドテールを有するオリゴヌクレオチドプライマーもまた先行技術で知られている（例えば、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ−プライマー構造又は固相に結合するためのプライマー）。両方のプライマー変異体は、鎖の合成を開始できるオリゴヌクレオチドプライマー構造を示しているため、プライマー伸長反応を行うことができる。その結果は、プライマー構造をプライマー伸長産物のテールと統合する第１の鎖である。第１のプライマー伸長産物に対する相補鎖の合成において、例えば、ＰＣＲ反応中に、第２の鎖は、プライマー構造の「ブロッキングユニット／停止構造」まで伸長される。示される両方のプライマー構造は、オリゴヌクレオチドプライマーの５’部分が一本鎖のままであり、ポリメラーゼによってコピーされないように設計される。
【０５０５】
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域は、全長が５’から３’の従来のアラインメントを有し、コピー不可能なヌクレオチド修飾を含むポリヌクレオチドテールを含む。そのようなコピー不可能なヌクレオチド修飾は、例えば、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡ修飾、ＰＮＡ、モルホリノである。前記修飾は、第２のプライマー領域において別々に分布され得る。
【０５０６】
ポリヌクレオチドテールにおけるコピー不可能なヌクレオチド修飾の部分は、ヌクレオチドビルディングブロックの２０％〜１００％、特に５０％を超え得る。特に、これらのヌクレオチド修飾は第２の領域の３’セグメントにあり、したがって第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１の領域に隣接する。
【０５０７】
特定の実施形態では、コピー不可能なヌクレオチド修飾の配列は、鋳型鎖の配列に少なくとも部分的に相補的であり、その結果、鋳型へのプライマーの結合は、前記ヌクレオチド修飾の少なくとも一部を含むことによって行われる。特定の実施形態では、コピー不可能なヌクレオチド修飾の配列は、鋳型鎖中の配列に非相補的である。
【０５０８】
コピー不可能なヌクレオチド修飾は、特に互いに共有結合され、したがって第２の領域の配列セグメントを表す。このセグメントの長さは、１〜４０、特に１〜２０ヌクレオチド修飾、特に３〜１０ヌクレオチド修飾を含む。
【０５０９】
特定の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域は、全長が５’−３’の従来のアラインメントを有し、コピー不可能なヌクレオチド修飾（例えば、２’−Ｏ−アルキル修飾）及び少なくとも１つの非ヌクレオチドリンカー（例えば、Ｃ３、Ｃ６、ＨＥＧリンカー）を含むポリヌクレオチドテールを含む。非ヌクレオチドリンカーの機能は、隣接するヌクレオチド又はヌクレオチド修飾を共有接続すると同時に、ポリメラーゼの合成機能を部位特異的に中断することである。
【０５１０】
そのような非ヌクレオチドリンカーは、ポリヌクレオチドテールの構造及び第１のプライマー領域の構造を互いに離れて配置するものではない。むしろ、ポリヌクレオチドテールは、第１のプライマー領域に空間的に近接している。非ヌクレオチドリンカーは、長さが２００鎖原子以下、さらに有利には５０鎖原子以下、特に好ましくは１０鎖原子以下の修飾を含む。そのようなリンカーの最小の長さは、１つの原子にすることができる。そのような非ヌクレオチドリンカーの例は、少なくとも１個の炭素原子、特に少なくとも２〜３０個、より特に４〜１８個を含むアルキル鎖を有する直鎖又は分岐鎖アルキルリンカーである。そのようなリンカーは、オリゴヌクレオチド化学において十分に知られており（例えば、Ｃ３、Ｃ６又はＣ１２リンカー）、ポリヌクレオチドテールの配列と第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１の領域の配列との間のオリゴヌクレオチドの固相合成中に組み込むことができる。そのような非ヌクレオチドリンカーの他の例は、直鎖又は分岐ポリエチレングリコール誘導体である。オリゴヌクレオチド化学における既知の例は、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）である。そのような非ヌクレオチドリンカーのさらなる例は、脱塩基修飾（例えば、ｄＲｉｂｏｓｅのアナログとしてのＴＨＦ修飾）である。
【０５１１】
１つ以上のそのような修飾が第２の領域に統合されている場合、それらは第２のプライマー伸長産物の合成中にポリメラーゼのコピー機能を効果的に干渉することができ、そのため、そのような修飾後に３’方向においてセグメントがコピーされないままになる。第２の領域におけるそのような修飾の数は、１〜１００の間、特に１〜１０の間、特に１〜３の間であり得る。
【０５１２】
このような非ヌクレオチドリンカーの位置は、第２の領域の３’末端にあることが可能であり、したがって、オリゴヌクレオチドプライマーの第１の領域及び第２の領域への移行部を示す。
【０５１３】
また、第２の領域の中央セグメントにおける非ヌクレオチドリンカーの配置が使用され得る。したがって、ポリヌクレオチドテールは、少なくとも２つのセグメントに分割される。この実施形態では、ポリヌクレオチドテールの３’セグメントは、少なくとも１つ、より特に、例えば、２〜２０の間、特に２〜１０の間のコピー不可能なヌクレオチド修飾を含む。これらのコピー不可能なヌクレオチド修飾は、特にオリゴヌクレオチドプライマーの第１の領域と第２の領域の間の移行部に存在する。
【０５１４】
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域は、全長が５’から３’へのアラインメントを有し、３’から５’への「逆」アラインメントの少なくとも１つのヌクレオチドモノマーを含むポリヌクレオチドテールを含み、それは第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１の領域と第２の領域との間の移行部に配置されている。
【０５１５】
特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域は、ポリヌクレオチドテールを含み、そのようなポリヌクレオチドテールは、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１の領域に逆アラインメントで直接隣接するヌクレオチドから完全に構成され、その結果、第１及び第２の領域の結合は５’−５’位置によって達成される。そのようなアラインメントの利点は、第１の領域をコピーした後のポリメラーゼがヌクレオチドの「逆」アラインメントに遭遇することであり、これは通常、この部位での合成の停止につながる。
【０５１６】
ポリヌクレオチドテールの全長におけるヌクレオチドの「逆」アラインメントでは、特にポリヌクレオチドテールの３’末端ヌクレオチドは、副反応を防ぐために３’−ＯＨ末端でブロックされるべきである。あるいは、３’ＯＨ基を全く持たない末端ヌクレオチド、例えばジデオキシヌクレオチドを使用することもできる。
【０５１７】
そのような実施形態では、もちろん、コントローラーオリゴヌクレオチド内の対応するヌクレオチドアラインメントも適合されるべきである。このような場合、コントローラーオリゴヌクレオチドの第１の領域及び第２の領域は、３’−３’アラインメントで結合される必要がある。
【０５１８】
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域は、全長が５’から３’の従来のアラインメントを持ち、合成が天然のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、又はｄＵＴＰ）で排他的に実行される場合に、ポリメラーゼに相補的な核酸塩基を表さない少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含むポリヌクレオチドテールを含む。
【０５１９】
例えば、Ｉｓｏ−ｄＧ又はＩｓｏ−ｄＣヌクレオチド修飾は、単一の、しかし特にいくつか（少なくとも２〜２０）のヌクレオチド修飾として、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域に組み込むことができる。核酸塩基修飾のさらなる例は、伸長された遺伝的アルファベットのさまざまな修飾である。そのようなヌクレオチド修飾は、特に天然のヌクレオチドとの相補的な塩基対合をサポートせず、そのため、ポリメラーゼは（少なくとも理論的には）一連のヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、又はｄＵＴＰ）を挿入しない。ただし、実際には、特に高濃度のｄＮＴＰ基質及び長時間のインキュベーション時間（例えば６０分以上）では、本質的な挿入が行われることもある。したがって、特に隣接する部位に位置するそのようなヌクレオチド修飾のいくつかが使用されるべきである。ポリメラーゼ合成の停止は、これらの修飾の適切な相補的基質の欠如によって作用される。Ｉｓｏ−ｄＣ又はＩｓｏ−ｄＧを有するオリゴヌクレオチドは、標準的な方法で合成でき、いくつかの商業的供給者（例えば、Ｔｒｉｌｉｎｋ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、Ｂｉｏｍｅｒｓ  ＧｍｂＨ）から入手できる。あるいは、コントローラーオリゴヌクレオチドの第１の領域の配列も、そのような第２のプライマー領域の配列に適合させることができる。ここで、伸長された遺伝的アルファベットの相補的核酸塩基は、それに応じて、化学合成中にコントローラーオリゴヌクレオチドの第１の領域に統合されることが可能である。例えば、Ｉｓｏ−ｄＧは第１のプライマーヌクレオチドの第２の領域に組み込むことができ、その相補的ヌクレオチド（Ｉｓｏ−ｄＣ−５−Ｍｅ）は、コントローラーオリゴヌクレオチドの第１の領域の適切な部位に配置することができる。
【０５２０】
要約すると、第２の領域におけるポリメラーゼの合成の停止は、異なる様式で達成され得る。しかしながら、この遮断は、好ましくは、ポリメラーゼが第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１の領域をコピーしたときにのみ起こる。このようにして、第２のプライマー伸長産物が３’セグメントに適切なプライマー結合部位を持つことが確認される。このプライマー結合部位は、鎖置換中に露出され、したがって、さらなる第１のオリゴヌクレオチドプライマーの新たな結合に利用できる。
【０５２１】
第１のプライマー伸長産物に対する相補鎖の合成では、プライマー伸長反応は、ポリヌクレオチドテールの前で停止する。このようにして、このポリヌクレオチドテールはコントローラーオリゴヌクレオチドとの相互作用のために一本鎖のままであり、したがって結合に利用でき、コントローラーオリゴヌクレオチドの対応する相補セグメントを適切な二本鎖の端に近接させることにより、コントローラーオリゴヌクレオチドによる鎖置換反応の開始をサポートする。このようにして、コントローラーオリゴヌクレオチドの相補的部分（第２の領域）と伸長されたオリゴヌクレオチドプライマーの相補的部分（第１の領域）との間の距離が最小に減少する。そのような空間的近接は、鎖置換の開始を促進する。
【０５２２】
核酸媒介性鎖置換反応の概略図に照らし、コントローラーオリゴヌクレオチドの相補的配列は、適切な二重鎖末端の近接にある。これは、コントローラーオリゴヌクレオチドの鎖とプライマーに相補的な鋳型鎖との間の第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１の領域への結合に競合をもたらす。プライマー領域とコントローラーオリゴヌクレオチドの相補的セグメント（コントローラーヌクレオチドの第２の領域）又は鋳型鎖の相補的セグメントの間の塩基対を繰り返し近接し形成することにより、それぞれ、核酸媒介鎖置換プロセスの開始が起こる。
【０５２３】
一般に、鎖置換の開始の収率は、コントローラーオリゴヌクレオチドの対応する相補的配列部分がプライマー領域の相補的セグメントに近づくほど高くなる。しかしながら、この距離が増加すると、鎖置換の開始の収率は減少する。
【０５２４】
本発明の文脈において、鎖置換の開始が最大収率で機能することは必須ではない。したがって、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域のポリヌクレオチドテールに結合される場合の、鋳型の相補鎖に結合して相補二重鎖を形成する第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１のプライマー領域の５’セグメントと、コントローラーオリゴヌクレオチドの対応する相補配列部分の間の距離は、以下の範囲：０．１〜２０ｎｍ、特に０．１〜５ｎｍ、特に０．１〜１ｎｍの間であり得る。特定の場合では、前記距離は１ｎｍ未満である。他の単位で表すと、前記距離は、２００原子未満、特に５０原子未満、特に１０原子未満の飛跡に対応する。特定の場合では、前記距離は１原子である。距離情報は配向のみのためであり、これらの構造間の距離は短い方が好ましいことを示している。多くの場合、前記距離は、オリゴヌクレオチドの正確な構造を分析し、配列距離又はリンカー長の測定を評価することによってのみ測定できる。
【０５２５】
第１のプライマーはまた、コントローラーオリゴヌクレオチド又は鋳型鎖との相互作用に必要とされないさらなる配列セグメントを含み得る。そのような配列セグメントは、例えば、固相への結合において検出プローブ又は固定化相手として使用されるさらなるオリゴヌクレオチドに結合することができる。
【０５２６】
第１のオリゴヌクレオチドプライマーのプライマー機能
第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、いくつかの個別のステップで使用され得る。第一に、それは増幅においてプライマー機能を発揮する。これにより、第２のプライマー伸長産物を鋳型として使用しプライマー伸長反応が行われる。特定の実施形態では、増幅反応の開始時の第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、開始核酸鎖を鋳型として使用することができる。特定の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、開始核酸鎖を設計／提供することに使用され得る。増幅中、第１のプライマーは、第２のプライマー伸長産物を鋳型として使用して、第１のプライマー伸長産物の合成の開始剤として機能する。第１のプライマーの３’セグメントは、第２のプライマー伸長産物に主に相補的に結合できる配列を含む。第２のプライマー伸長産物を鋳型として使用する第１のオリゴヌクレオチドプライマーの酵素的伸長は、第１のプライマー伸長産物の形成をもたらす。そのような第１のプライマー伸長産物は、標的配列又はその配列部分を含む。第２のプライマー伸長産物の合成の過程で、第１のオリゴヌクレオチドプライマーのコピー可能な部分の配列がポリメラーゼによって鋳型として認識され、対応する相補配列が合成され、それゆえ、それぞれのプライマー結合部位が第１のオリゴヌクレオチドプライマーのために生じる。第１のプライマー伸長産物の合成は、第２のオリゴヌクレオチドプライマーの５’セグメントまで実行される及び含む。第１のプライマー伸長産物の合成直後に、この産物は第２のプライマー伸長産物に結合し、二本鎖複合体を形成する。第２のプライマー伸長産物は、コントローラーオリゴヌクレオチドによって前記複合体から配列特異的に置換される。それにより、コントローラーオリゴヌクレオチドは第１のプライマー伸長産物に結合する。コントローラーオリゴヌクレオチドによる成功した鎖置換の後、第２のプライマー伸長産物は、次いで第１のプライマー伸長産物の合成のための鋳型自体として機能することができる。第１のプライマー伸長産物の３’セグメントがここで自由になったことで、さらなる第２のオリゴヌクレオチドプライマーを結合でき、それゆえ、第２のプライマー伸長産物の新しい合成を開始できる。
【０５２７】
さらに、第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、増幅の開始時に開始核酸鎖から始まる第１のプライマー伸長産物の合成の開始剤として機能することができる。特定の実施形態では、第１のプライマーの配列は、開始核酸鎖の対応する配列セグメントに完全に相補的である。特定の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの配列は、開始核酸鎖の対応する配列セグメントに部分的にのみ相補的である。しかしながら、上記の相違相補性は、第１のオリゴヌクレオチドプライマーが主に配列特異的なプライマー伸長反応を開始することを妨げるものではない。開始核酸鎖のそれぞれの位置に対する第１のオリゴヌクレオチドプライマーの相補性のそれぞれの違いは、特に第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１の領域の５’セグメントにあり、それゆえ、３’セグメントでは主に相補的な塩基の対合及び合成の開始が可能である。合成の開始のために、例えば、特に３’セグメントの最初の４〜１０の位置は、鋳型（開始核酸鎖）に完全に相補的である必要がある。残りのヌクレオチド位置は、完全な相補性とは相違し得る。したがって、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１の領域の残りの５’セグメントにおける完全な相補性の程度は、塩基組成物の５０％〜１００％、特に８０％〜１００％の間の範囲を含み得る。第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１の領域の長さによれば、配列の相違は、１〜多くとも１５の位置、特に１〜多くとも５の位置である。したがって、第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、開始核酸鎖の合成を開始することができる。第２のプライマー伸長産物の後続の合成では、第１のオリゴヌクレオチドプライマーのコピー可能な配列セグメントがポリメラーゼによってコピーされ、それにより、次いで後続の合成サイクルでは、完全に相補的なプライマー結合部位が第１のオリゴヌクレオチドプライマーの結合のために第２のプライマー伸長産物内に形成され、後続の合成サイクルで利用可能となる。
【０５２８】
特定の実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、開始核酸鎖の調製において使用され得る。それにより、そのような第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、主に／特に配列特異的に核酸（例えば、標的配列を含む一本鎖ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡ又はその同等物）に結合し、ポリメラーゼの存在下で鋳型依存プライマー伸長反応を開始することができる。結合位置は、プライマー伸長産物が所望の標的配列を含むように選択される。第１のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長は、鋳型に相補的な配列を有する核酸鎖をもたらす。そのような鎖は、鋳型から分離することができ（例えば、熱又はアルカリによって）、したがって、一本鎖の形態に変換することができる。そのような一本鎖核酸鎖は、増幅の開始時に開始核酸鎖として機能することができる。５’セグメントにおいてそのような開始核酸鎖は、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの配列部分を含み、さらにそれは、標的配列又はその同等物及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーのためのプライマー結合部位を含む。詳細な手順については、「核酸鎖の開始」のセクションで説明する。
【０５２９】
第１のプライマー伸長産物の合成はプライマー伸長反応であり、増幅の個々のステップを形成する。このステップの間の反応条件は、それに応じて調整される。反応温度及び反応時間は、反応が連続的に起ることができるように選択される。このステップにおける好ましい温度は、使用するポリメラーゼ及びそれぞれの第一のオリゴヌクレオチドプライマーのそのプライマー結合部位への結合強度に依存し、例えば、１５℃〜７５℃、特に２０〜６５℃、特に２５℃〜６５℃の範囲を含む。第１のオリゴヌクレオチドプライマーの濃度は、０．０１μｍｏｌ／ｌ〜５０μｍｏｌ／ｌ、特に０．１μｍｏｌ／ｌ〜２０μｍｏｌ／ｌ、特に０．１μｍｏｌ／ｌ〜１０μｍｏｌ／ｌの範囲を含む。
【０５３０】
特定の実施形態では、増幅のすべてのステップは、非特異的産物／副産物の形成を防止又は遅延させるストリンジェントな条件下で進行する。そのような条件は、例えばより高い温度、特に５０℃を上回る。
【０５３１】
２つ以上の特異的な核酸鎖が１つのバッチで増幅される場合、特定の実施形態では、特に配列特異的なオリゴヌクレオチドプライマーが、対応する標的配列の増幅に使用される。
【０５３２】
特に、第１のオリゴヌクレオチドプライマー、第２のオリゴヌクレオチドプライマー及びコントローラーオリゴヌクレオチドの配列は、副反応、例えば、プライマー二量体形成が最小化されるように互いに適合される。そのため、例えば、第１及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーの配列は、両方のオリゴヌクレオチドプライマーが適切な鋳型及び／又は標的配列及び／又は開始核酸鎖の不在下でそれぞれ増幅反応を開始又はサポートできないように互いに適合される。これは、例えば、第２のオリゴヌクレオチドプライマーが第１のオリゴヌクレオチドプライマーのプライマー結合部位を含まず、第１のオリゴヌクレオチドプライマーが第２のオリゴヌクレオチドプライマーのプライマー結合部位を含まないことで達成できる。さらに、プライマー配列が拡張された伸長される自己相補的構造（自己相補的）を含むことが避けられるべきである。
【０５３３】
特定の実施形態では、第１及び第２のプライマー伸長産物の合成は、同じ温度で進行する。特定の実施形態では、第１及び第２のプライマー伸長産物の合成は、異なる温度で進行する。特定の実施形態では、第１のプライマー伸長産物の合成及びコントローラーオリゴヌクレオチドによる鎖置換は、同じ温度で進行する。特定の実施形態では、第１のプライマー伸長産物の合成及びコントローラーオリゴヌクレオチドによる鎖置換は、異なる温度で進行する。
【０５３４】
コントローラーオリゴヌクレオチドの特定の実施形態
コントローラーオリゴヌクレオチド（図１９〜２６）は以下を含む：
・  第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域のポリヌクレオチドテールに結合できる第１の一本鎖領域、
・  第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１の領域に本質的に相補的に結合できる第２の一本鎖領域、
・  第１のプライマー伸長産物の伸長産物の少なくとも１つのセグメントに本質的に相補的な第３の一本鎖領域、
及び、コントローラーオリゴヌクレオチドは、第１又は第２のオリゴヌクレオチドプライマーのプライマー伸長のための鋳型として機能しない。
【０５３５】
一般に、コントローラーオリゴヌクレオチドの第３の領域の配列は、増幅される核酸の配列に適合され、これは、第１のプライマーの伸長産物におけるヌクレオチドの順序の鋳型として関連するためである。コントローラーオリゴヌクレオチドの第２の領域の配列は、第１のプライマー領域の配列に適合される。コントローラーオリゴヌクレオチドの第１の領域の構造は、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域の配列、特にポリヌクレオチドテールの性質に適合されている。
【０５３６】
コントローラーオリゴヌクレオチドはまた、第１、第２又は第３の領域に属さないさらなる配列セグメントを含み得る。これらの配列は、例えば３’及び５’末端に隣接する配列として結合することができる。特に、これらの配列セグメントは、コントローラーオリゴヌクレオチドの機能を妨害しない。
【０５３７】
コントローラーオリゴヌクレオチドの構造には、特に次の特性がある：
個々の領域は、互いに共有結合している。例えば、結合は従来の５’−３’結合を介して行うことができる。例えば、ホスホジエステル結合又はヌクレアーゼ耐性ホスホチオエステル結合が使用され得る。
【０５３８】
コントローラーオリゴヌクレオチドは、その第１の領域によって第１のオリゴヌクレオチドプライマーのポリヌクレオチドテールに結合することができ、結合は主に相補的塩基のハイブリダイズによって媒介される。前記第１の領域の長さは、３〜８０ヌクレオチド、特に４〜４０ヌクレオチド、特に好ましくは６〜２０ヌクレオチドである。コントローラーオリゴヌクレオチドの第１の領域の配列と第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域の配列との間の配列一致の程度は、２０％〜１００％、特に５０％〜１００％、特に８０％〜１００％の間であり得る。コントローラーオリゴヌクレオチドの第１の領域の結合は、特に、反応条件下で第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域に特異的であるべきである。
【０５３９】
コントローラーオリゴヌクレオチドの第１の領域の配列は、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域に相補的に結合できる相補的塩基の数が１〜４０、特に３〜２０、特に６〜１５となるように特に選択される。
【０５４０】
コントローラーオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼの鋳型を示さないため、塩基修飾及び／又は糖リン酸骨格修飾の両方であり得るポリメラーゼ機能をサポートしないヌクレオチド修飾を含み得る。第１の領域のコントローラーオリゴヌクレオチドには、次の一覧から選択されたヌクレオチド及び／又はヌクレオチド修飾を含む：ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ（糖残基に２’−４’架橋型結合を持つ「ロックされた核酸」のアナログ）、ＵＮＡ（糖残基の２’−３’原子間の結合のない「ロックされていない核酸」）、ＰＮＡ（「ペプチド核酸」アナログ）、ＰＴＯ（ホスホロチオエート）、モルホリノアナログ、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡ修飾（２’−ＯＭｅ、２’−Ｏプロパルギル、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）、２’−Ｏ−プロピル−アミンなど）、２’−ハロＲＮＡ、２’−アミノＲＮＡなど。これらのヌクレオチド又はヌクレオチド修飾は、例えば従来の５’−３’結合又は５’−２’結合によって互いに結合される。例えば、ホスホジエステル結合又はヌクレアーゼ耐性ホスホチオエステル結合が使用され得る。
【０５４１】
第１の領域のコントローラーオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド及び／又はヌクレオチド修飾を含むことができ、核酸塩基は、以下の一覧から選択される：アデニン及びそのアナログ、グアニン及びそのアナログ、シトシン及びそのアナログ、ウラシル及びそのアナログ、チミン及びそのアナログ、イノシン又は他のユニバーサル塩基（例えば、ニトロインドール）、２−アミノ−アデニン及びそのアナログ、イソシトシン及びそのアナログ、イソグアニン及びそのアナログ。
【０５４２】
第１の領域のコントローラーオリゴヌクレオチドには、次の一覧から選択される非ヌクレオチド化合物を含むことができる：コントローラーオリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチドプライマーの間の結合強度に影響を与える可能性のあるインターカレート物質（ＭＧＢ、ナフタレンなど）。同じ要素がまた第１のプライマーの第２の領域でも使用できる。
【０５４３】
第１の領域のコントローラーオリゴヌクレオチドは、非ヌクレオチド化合物、例えば、第１の領域の個々のセグメントを互いに連結することができるＣ３、Ｃ６、ＨＥＧリンカーなどのリンカーを含むことができる。
【０５４４】
コントローラーオリゴヌクレオチドは、その第２の領域によって第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１のプライマー領域に結合することができ、結合は本質的に相補的塩基のハイブリダイゼーションによって媒介される。
【０５４５】
コントローラーオリゴヌクレオチドの第２の領域の長さは、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１の領域の長さに適合され、特にそれに対応する。それは約３〜３０ヌクレオチド、特に５〜２０ヌクレオチドの間である。コントローラーオリゴヌクレオチドの第２の領域の配列は、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１の領域に特に相補的である。相補性の一致の程度は、８０％〜１００％、特に９５％〜１００％、特に１００％である。コントローラーオリゴヌクレオチドの第２の領域には、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長においてポリメラーゼを妨げるヌクレオチド修飾を特に含むが、相補的な二本鎖の形成を阻止又は本質的に防止せず、例えば、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡアナログ（例えば、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−プロパルギルヌクレオチド修飾）、ＬＮＡ、ＰＮＡ、又はモルホリノヌクレオチド修飾である。個々のヌクレオチドモノマーは特に５’−３’結合を介して連結されるが、ヌクレオチドモノマー間の５’−２’結合も使用できる。
【０５４６】
コントローラーオリゴヌクレオチドの第１及び第２の領域の配列長及びその性質は、少なくとも方法の１つの反応ステップにおける反応条件下での第１のオリゴヌクレオチドプライマーへの前記領域の結合が可逆的であるように特に選択される。つまり、コントローラーオリゴヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチドプライマーは確実に互いに特異的に結合できるが、この結合によって、反応条件下で永続的に安定な両方の要素の複合体の形成をもたらすわけではない。
【０５４７】
むしろ、コントローラーオリゴヌクレオチド及び第１のオリゴヌクレオチドプライマーの結合複合体形態と、個々の成分の遊離形態との間の平衡は、少なくとも１つの反応ステップでの反応条件下で意図される又は可能であるべきである。このようにして、反応条件下での第１のオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも一部が遊離形態で存在し、鋳型と相互作用してプライマー伸長反応を開始できることが保証される。一方、このようにして、コントローラーオリゴヌクレオチドのそれぞれの配列領域が伸長オリゴヌクレオチドプライマーとの結合に利用できることが保証される。
【０５４８】
反応中の温度を選択することにより、遊離の一本鎖の部分、したがって反応性成分の部分が温度を下げることにより作用され得、第１のオリゴヌクレオチドプライマーがコントローラーオリゴヌクレオチドに結合し、それにより、両方の関与物が相補的な二本鎖複合体を結合する。このようにして、個々の成分の一本鎖形態の濃度は低減され得る。温度が上昇すると、両方の成分が一本鎖の形態に解離することをもたらすことができる。複合体（コントローラーオリゴヌクレオチド／第１のオリゴヌクレオチドプライマー）の融解温度の範囲では、成分の約５０％が一本鎖の形態で存在し、約５０％が二本鎖複合体として存在する。したがって、適切な温度を使用することにより、反応混合物中の一本鎖形態の濃度が影響を受け得る。
【０５４９】
個々の反応ステップ間の温度変化を含む増幅方法の実施形態では、それぞれの反応ステップ中に所望の反応条件が達成され得る。例えば、コントローラーオリゴヌクレオチド／第１のオリゴヌクレオチドプライマー複合体のおよその融解温度の温度範囲を使用することにより、個々の成分の遊離形態の部分が影響を受けることが可能である。ここで、使用される温度により、コントローラーオリゴヌクレオチド／第１のオリゴヌクレオチドプライマーを含む複合体が不安定になり、それにより、この反応ステップ中に、個々の複合体成分が少なくとも一時的に一本鎖になり、したがって他の反応相手と相互作用できるようになる。例えば、コントローラーオリゴヌクレオチドの第１の配列領域は、非伸長の第１のプライマーを有する二本鎖複合体から放出され得、したがって、伸長された第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第２の配列領域と相互作用し、したがって、鎖置換を開始することができる。一方、コントローラーオリゴヌクレオチド／第１のオリゴヌクレオチドプライマーを含む複合体からの第１の非伸長オリゴヌクレオチドプライマーの放出により、第１のプライマー領域が一本鎖になり、したがって鋳型と相互作用でき、それにより、プライマーがポリメラーゼによる伸長を開始することができる。
【０５５０】
使用する温度は、コントローラーオリゴヌクレオチド／第１のオリゴヌクレオチドプライマーの複合体の融解温度に正確に対応する必要はない。１つの反応ステップにおける温度は、およその融解温度の範囲内で使用されれば十分である。例えば、反応ステップの１つにおける温度は、コントローラーオリゴヌクレオチド／第１のオリゴヌクレオチドプライマーの複合体のＴｍ±１０℃、特にＴｍ±５℃、特にＴｍ±３℃の範囲を含む。
【０５５１】
このような温度は、例えば、コントローラーオリゴヌクレオチドによる配列特異的鎖置換を含む反応ステップ中に調節できる。
【０５５２】
個々の反応ステップ間の温度変化を含まず、等温条件下で増幅が進行する増幅方法の実施形態では、反応条件は、コントローラーオリゴヌクレオチド及び第１のオリゴヌクレオチドプライマーの複合形態と、個々の成分の遊離形との間の平衡が可能である。
【０５５３】
コントローラーオリゴヌクレオチド及び第１のオリゴヌクレオチドプライマーの複合体形態と、個々の成分の遊離形態の間の比率は、反応条件（例えば、温度及びＭｇ２＋濃度）及び個々の成分の構造と濃度の両方に影響され得る。
【０５５４】
特定の実施形態におけるコントローラーオリゴヌクレオチドの第１及び第２領域の配列長及びその性質は、所与の反応条件下（例えば、コントローラーオリゴヌクレオチドによる鎖置換の反応ステップにおいて）で、第１のオリゴヌクレオチドプライマーとの複合体中の遊離コントローラーオリゴヌクレオチドの部分及びコントローラーオリゴヌクレオチドの部分の間の比率が、以下の範囲：１：１００〜１００：１、特に１：３０〜３０：１、特に１：１０〜１０：１を含むように選択される。コントローラーオリゴヌクレオチドとの複合体における遊離の第１のオリゴヌクレオチドプライマーの部分と第１のオリゴヌクレオチドプライマーの部分との間の比率は、１：１００〜１００：１、特に１：３０〜３０：１、特に１：１０〜１０：１の範囲を含む。
【０５５５】
特定の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの濃度は、コントローラーオリゴヌクレオチドの濃度よりも高い。このようにして、反応中に過剰な第１のプライマーが存在し、コントローラーオリゴヌクレオチドが、その効果のために、適切な反応温度を選択することにより、第１のプライマーとの結合から解放されなければならない。一般に、これは、コントローラーオリゴヌクレオチドの遊離形態の十分な濃度が存在するまで温度を上げることによって行われる。
【０５５６】
特定の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの濃度は、コントローラーオリゴヌクレオチドの濃度よりも低い。このようにして、過剰なコントローラーオリゴヌクレオチドが存在し、第１のオリゴヌクレオチドプライマーが、その効果のために、適切な反応温度を選択することにより、コントローラーオリゴヌクレオチドとの結合から切り離されなければならない。一般に、これは、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの遊離形態の十分な濃度が存在するまで温度を上げることによって行われる。
【０５５７】
等温条件では平衡が存在し、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの特定の部分とコントローラーオリゴヌクレオチドの特定の部分は互いに結合するが、その他は反応において一本鎖の形態で存在する。
【０５５８】
コントローラーオリゴヌクレオチドは、その第３の領域によって、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの特異的に合成された伸長産物の少なくとも１つのセグメントに結合することができる（図１３〜３５）。結合は特に、コントローラーオリゴヌクレオチドとポリメラーゼによって合成された伸長産物との間の相補的塩基のハイブリダイゼーションによって行われる。
【０５５９】
鎖置換反応をサポートするために、第３の領域の配列は、特に、伸長産物に対して高い相補性を有する必要がある。特定の実施形態では、第３の領域の配列の１００％が伸長産物に相補的である。
【０５６０】
特に、第３の領域は、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１の領域の直後の伸長産物のセグメントに結合する。したがって、伸長産物のセグメントは、特に、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの全伸長産物の５’セグメントにある。
【０５６１】
特に、コントローラーオリゴヌクレオチドの第３の領域は、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物の全長にわたって結合されない。特に、伸長産物の３’末端の１つのセグメントは結合されないままである。前記３’末端セグメントは、第２のオリゴヌクレオチドプライマーの結合に必要である。
【０５６２】
第３の領域の長さは、第３の領域が伸長産物の５’位セグメントに結合するが、伸長産物の３’位セグメントに結合しないように、それに応じて適合される。
【０５６３】
コントローラーオリゴヌクレオチドの第３の領域の全長は、２〜１００、特に６〜６０、特に好ましくは１０〜４０ヌクレオチド又はその同等物である。コントローラーオリゴヌクレオチドは、この長さにわたって伸長産物のセグメントに相補的に結合することができ、したがって、伸長産物の前記５’位セグメントを、その相補的鋳型鎖との結合から置換する。
【０５６４】
コントローラーオリゴヌクレオチドによって結合されない伸長産物の３’位セグメントの長さは、例えば、５〜６０ヌクレオチド、特に１０〜４０、特に１５〜３０ヌクレオチドの範囲を含む。
【０５６５】
伸長産物の前記３’位セグメントは、コントローラーオリゴヌクレオチドによって鋳型鎖への結合から置換されない。また、伸長産物の相補的セグメントへのコントローラーオリゴヌクレオチドの完全に結合された第３の領域により、第１のプライマー伸長産物は、その３’位セグメントを介して鋳型鎖に結合したまま残ることができる。前記複合体の結合強度は、例えば反応条件下で自然に解離することができるように特に選択される（ステップｅ）。これは、例えば、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物の３’位セグメントと、その鋳型鎖との前記複合体の融解温度が、それぞれの反応ステップ（反応ステップｅ）において、おおよその反応温度の範囲内又は反応温度未満である場合に達成され得る。伸長産物の３’セグメントにおける前記複合体の安定性が低い場合、伸長産物の５’位セグメントへのコントローラーオリゴヌクレオチドの第３の領域の完全な結合は、第１のプライマー伸長産物のその鋳型鎖からの急速な解離をもたらす。
【０５６６】
コントローラーオリゴヌクレオチドは、その機能を発揮するための適切な構造を、それぞれの反応条件下で完全に備え、伸長した第１のオリゴヌクレオチドプライマーを鋳型鎖との結合から配列特異的に置換し、それによって鋳型鎖が一本鎖形態に変換されることができ、したがって、ポリメラーゼによる新しい第１のオリゴヌクレオチドプライマーとのさらなる結合及びその標的配列特異的伸長に利用できる。
【０５６７】
鎖置換の機能を果たすために、コントローラーオリゴヌクレオチドの領域１、２及び３は、反応条件下で主に一本鎖の形で存在することになる。したがって、これらの領域の二本鎖自己相補的構造（例えば、ヘアピン）は、それらがコントローラーオリゴヌクレオチドの機能性を低下させることが可能であるため、可能であれば回避されるべきである。
【０５６８】
本発明による方法では、コントローラーオリゴヌクレオチドは鋳型として存在するべきではなく、したがって、反応条件下でコントローラーオリゴヌクレオチドに結合されるとき、第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、ポリメラーゼによって伸長されるべきではない。
【０５６９】
これは、ポリメラーゼが鎖をコピーするのを防ぐヌクレオチド修飾の使用によって特に達成される。特に、第１のオリゴヌクレオチドプライマーが反応条件下でコントローラーオリゴヌクレオチドに結合する場合、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端は伸長されないまま残る。
【０５７０】
反応の遮断／妨害／減速／複雑化の程度は、この特性の完全な発現（例えば、所定の反応条件下で１００％の遮断）とこの特性の部分的な発現（例えば、所定の反応条件下で３０〜９０％の遮断）の間であり得る。７０％を超えて、特に９０％を超えて、より特に９５％を超えて、及び特に１００％の第１のプライマーの伸長を防止できる単独で又は連続で（例えば、修飾ヌクレオチドからなる配列断片として）結合されたヌクレオチド修飾が好ましい。
【０５７１】
ヌクレオチド修飾は、塩基修飾及び／又は糖リン酸残基修飾を含み得る。従来の核酸塩基との組み合わせにより、コントローラーオリゴヌクレオチドの任意の相補的配列を配置することができるため、糖リン酸修飾が好ましい。ポリメラーゼの合成のそれぞれ妨害又は遮断をもたらし得る糖リン酸残基に修飾を有するヌクレオチドは、例えば、以下を含む：２’−Ｏ−アルキル修飾（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−プロパルギルヌクレオチド修飾）、２’−アミノ−２’−デオキシヌクレオチド修飾、２’−アミノ−アルキル−２’−デオキシヌクレオチド修飾、ＰＮＡ、モルホリノ修飾など。
【０５７２】
遮断は、単一のヌクレオチド修飾によっての両方で、又は連続で結合された数個のヌクレオチド修飾によってのみで（例えば、修飾ヌクレオチドからなる配列断片として）達成することができる。例えば、少なくとも２個、特に少なくとも５個、特に少なくとも１０個のそのようなヌクレオチド修飾を、コントローラーオリゴヌクレオチド中で互いに隣接して結合させることができる。
【０５７３】
コントローラーオリゴヌクレオチドは、均一な種類のヌクレオチド修飾を有する、又は少なくとも２つの異なる種類のヌクレオチド修飾を含むことができる。
【０５７４】
コントローラーオリゴヌクレオチドにおけるこのようなヌクレオチド修飾の位置は、特に、ポリメラーゼがコントローラーオリゴヌクレオチドに結合した第１のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を伸長するのを防ぐためである。
【０５７５】
特定の実施形態では、そのようなヌクレオチド修飾は、コントローラーオリゴヌクレオチドの第２の領域に位置する。特定の実施形態では、そのようなヌクレオチド修飾は、コントローラーオリゴヌクレオチドの第３の領域に位置する。特定の実施形態では、そのようなヌクレオチド修飾は、コントローラーオリゴヌクレオチドの第２及び第３の領域に位置する。
【０５７６】
例えば、コントローラーオリゴヌクレオチドの第２の領域の位置の少なくとも２０％、特に少なくとも５０％は、そのようなヌクレオチド修飾からなる。
【０５７７】
例えば、コントローラーオリゴヌクレオチドの第３の領域は、そのようなヌクレオチド修飾の位置の少なくとも２０％、特に少なくとも５０％、特に少なくとも９０％からなる。特定の実施形態において、第３の領域全体は、ポリメラーゼが、鋳型としてコントローラーオリゴヌクレオチドを使用して、そのような領域に結合されたプライマーを伸長することを妨げるヌクレオチド修飾を含む。特定の実施形態では、第３及び第２の領域全体がそのようなヌクレオチド修飾を含む。特定の実施形態では、第１、第２及び第３の領域全体がそのようなヌクレオチド修飾を含む。したがって、このコントローラーオリゴヌクレオチドは、完全にそのようなヌクレオチド修飾からなることができる。このような修飾コントローラーオリゴヌクレオチドは、例えば、追加のオリゴヌクレオチドプライマーが使用される多重分析において使用され得る。これは、１つ以上のコントローラーオリゴヌクレオチドでの意図しないプライマー伸長反応を防ぐためである。
【０５７８】
これらのヌクレオチド修飾の核酸塩基の配列は、それぞれの領域の配列に対する要求に適合される。
【０５７９】
残りの部分は、例えば、ポリメラーゼ機能を全く又はごくわずかに妨害しない天然のヌクレオチド又はヌクレオチド修飾、例えば、ＤＮＡヌクレオチド、ＰＴＯヌクレオチド、ＬＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチドである。ここで、さらなる修飾、例えば、２−アミノ−アデノシン、２−アミノプリン、５−メチル−シトシン、イノシン、５−ニトロインドール、７ーデアザ−アデノシン、７−デアザ−グアノシン、５−プロピル−シトシン、５−プロピル−ウリジンなどの塩基修飾、又は染料などの非ヌクレオチド修飾、又はＭＧＢ修飾などを、例えば、コントローラーオリゴヌクレオチドの個々の領域の結合強度を調整するために使用することができる。個々のヌクレオチドモノマーは、従来の５’−３’結合を介して、又は５’−２’結合を介して互いに結合できる。
【０５８０】
ポリメラーゼによってコントローラーオリゴヌクレオチドに結合した第１のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端の伸長を妨げるヌクレオチド修飾を含むコントローラーオリゴヌクレオチドのセグメントは、「第２のブロッキングユニット」と呼ばれる。前記セグメントの長さは、１〜５０ヌクレオチド修飾、特に４〜３０ヌクレオチド修飾を含むことができる。前記セグメントは、例えば、結合した第１のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端がこのセグメントにあるように、コントローラーオリゴヌクレオチドに配置することができる。したがって、このセグメントは領域２と３に広がることができる。
【０５８１】
特定の実施形態では、特に、コントローラーオリゴヌクレオチドに結合した第１のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端の伸長を防ぐために、Ｃ３、Ｃ６、ＨＥＧリンカーなどのリンカー構造又はスペーサー構造は使用されない。
【０５８２】
特定の実施形態では、コントローラーオリゴヌクレオチドは、その第３の領域に、検出系の少なくとも１つの成分（例えば、蛍光レポーター又は蛍光クエンチャー又はドナー蛍光色素分子）を含む。特定の実施形態では、この成分の位置は、コントローラーオリゴヌクレオチドの５’末端にある。別の実施形態では、この成分は、第３の領域の内部配列セグメントに位置する。ここで、コントローラーオリゴヌクレオチドの５’末端までの距離は、２〜５０ヌクレオチド、特に２〜２０ヌクレオチド、特に２〜１０ヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドプローブ及びコントローラーオリゴヌクレオチドが同じ第１のプライマー伸長産物に同時に結合する場合、検出系のこの２つの成分は近接して存在するであろう（例えば、オリゴヌクレオチドプローブの蛍光レポーターとコントローラーオリゴヌクレオチドのドナー蛍光色素分子の間）。
【０５８３】
コントローラーオリゴヌクレオチドは、領域１、２、及び３に加えて、例えば、コントローラーオリゴヌクレオチドの５’セグメント又は３’セグメントにおいて、上記の領域に隣接するさらなる配列セグメントを含むこともできる。このような配列要素は、例えば、プローブとの相互作用、固相への結合などのさらなる機能のために、例えば使用することができる。このような領域は、特に、領域１〜３の機能を妨害しない。これらの隣接配列の長さは、例えば、１〜５０ヌクレオチドであり得る。さらに、コントローラーオリゴヌクレオチドは、固相への固定化のための少なくとも１つの要素、例えばビオチン残基を含むことができる。さらに、コントローラーオリゴヌクレオチドは、検出のための少なくとも１つの要素、例えば、蛍光色素を含むことができる。
【０５８４】
コントローラーオリゴヌクレオチドの存在下で、新たに合成された配列は、コントローラーオリゴヌクレオチドとの相互作用によってそれらの配列内容を考慮して試験される。
・  コントローラーオリゴヌクレオチド鎖置換の所定の配列内容と正しい一致が生じる場合であって、鋳型鎖が新しく合成された鎖に置き換わる。それにより、プライマー結合部位は一本鎖状態に変換され、プライマーとの新たな相互作用に利用でき、したがってさらなる合成に利用できる。このようにして、両方のプライマー伸長産物の系が活性状態になる。したがって、コントローラーオリゴヌクレオチドは、この系に活性化作用を有する。
・  コントローラーオリゴヌクレオチドの所与の配列内容と一致しない場合、新しく合成された鎖の鋳型鎖の鎖置換が影響を受ける。鎖置換及び／又は分離は、量的に低減される、又は完全に中止される。したがって、プライマー結合部位は、一本鎖状態に変換されることは全くない、又は頻度が少ない。したがって、プライマーとの新しい相互作用に利用できるプライマー結合部位はまったくない、又は量的に少ない。したがって、両方のプライマー伸長産物の系が活性状態になる頻度が低くなる、又は活性状態がまったく達成されない。
【０５８５】
各単一合成ステップ後の新しく合成されたプライマー伸長産物の二本鎖開口の効率性は、後続のサイクルで得られる可能な収量に影響を与える：より少ない遊離／一本鎖のプライマー結合部位が増幅される核酸鎖に提供されれば、このステップで増幅される核酸鎖の新しく合成された鎖の数は少なくなる。言い換えると：合成サイクルの収量は、対応する相補的プライマーとの相互作用に利用できるプライマー結合部位の量に比例する。まとめると、このように制御ループを実現できる。
【０５８６】
前記制御ループは、合成された断片のリアルタイム制御（リアルタイム／オンライン）に対応し、配列制御は、増幅が行われている間に反応混合物中で行われる。前記配列制御は、所与のパターンに従って行われ、オリゴヌクレオチド系は（コントローラーオリゴヌクレオチドの鎖開裂効果による）外部介入なしに「正しい」状態と「誤った」状態を区別することができる。正しい状態では配列の合成が続行され、誤った状態では合成が減速する又は完全に防止される。各ステップ後の「正しい」及び「誤った」配列の収量における得られる差異は、いくつかのそのようなステップを含む増幅全体に影響を与える。
【０５８７】
指数関数的増幅では、前記依存性は指数関数的であり、それにより、配列の相違による１つの単一の合成サイクルでの有効性のわずかな相違でも、増幅全体の時間に大幅な遅延が発生する、又は所定の時間枠で検出可能な増幅が完全に失われる。
【０５８８】
新しく合成された核酸鎖のリアルタイム制御のこの作用は、コントローラーオリゴヌクレオチドの使用に関連しており、したがって増幅という文脈でのコントローラーオリゴヌクレオチドの作用は、オリゴヌクレオチドプライマーの長さを含む領域をはるかに超えて伸長する。
【０５８９】
鎖置換反応の反応条件
コントローラーオリゴヌクレオチドによる配列依存性鎖置換による、第１のプライマー伸長産物との結合からの第２のプライマー伸長産物の置換は、増幅における個々のステップを形成する。前記ステップの間の反応条件は、それに応じて調整される。反応温度及び反応時間は、反応が成功して起こり得るように選択される。
【０５９０】
特定の実施形態では、コントローラーオリゴヌクレオチドによる鎖置換は、第１のプライマー伸長産物との結合からの第２のプライマー伸長産物の脱離／解離まで行われる。第２のプライマー伸長産物の相補部分の第１のプライマー伸長産物の３’セグメントのこのような解離は、両方のプライマー伸長産物の温度依存性／温度関連分離の間に自然発生し得る。そのような解離は、増幅反応の速度論に有利な作用を及ぼし、例えば温度条件などの反応条件の選択によって影響を受け得る。したがって、温度条件は、コントローラーオリゴヌクレオチドの相補的結合による鎖置換の成功が、第１のプライマー伸長産物の３’セグメントからの第２のプライマー伸長産物の解離に有利になるように選択される。
【０５９１】
前記実施形態は、「古典的な」ＰＣＲを表さないが、３’セグメントの熱的な誘発解離は、古典的なＰＣＲの＞９０℃の一般的な鎖分離を誘発する反応をかなり下回る温度範囲で進行する。
【０５９２】
さらなる特定の実施形態では、コントローラーオリゴヌクレオチドによる鎖置換は、第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１−Ｅｘｔ）の３’セグメントが第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）との相補的結合から分離／解離するまで進行し、この第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１−Ｅｘｔ）の３’セグメントは、第１のプライマーに相補的な少なくとも１つのセグメント及び第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）に相補的な１つのセグメントを含み、これは酵素合成中にのみ形成される。これにより、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）、第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１−Ｅｘｔ）及びコントローラーオリゴヌクレオチド（Ｃ１．１）を含む複合体（Ｃ１．１／Ｐ１．１−Ｅｘｔ／Ｐ２．１−Ｅｘｔ）（図２Ｂ）の形成をもたらす。このような複合体では、コントローラーオリゴヌクレオチドによって第１のプライマー伸長産物との結合が置き換えられることが可能であるため、第２のプライマー伸長産物の３’セグメントは少なくとも一時的に一本鎖形態で存在する。第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）の３’セグメントは、第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１−Ｅｘｔ）にハイブリダイズしたそのような複合体で存在する（図２Ｂ）。
【０５９３】
第１のオリゴヌクレオチドプライマーの部分的に開いたプライマー結合部位（第２のプライマー伸長産物の３’セグメント）により、新しいオリゴヌクレオチドプライマーは、反応条件下でなお複合体であるもの（Ｐ２．１−Ｅｘｔ）のこの一本鎖配列セグメントのプライマー結合部位に結合でき、従ってポリメラーゼによる新しい第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．２−Ｅｘｔ）の合成を開始する。原則として、Ｐ２．１−Ｅｘｔの３’セグメントは永続的に一本鎖ではなく、コントローラーオリゴヌクレオチドと競合的に振る舞い、したがってＰ１．１−Ｅｘｔへの結合により、一本鎖と二本鎖が交互に現れるため、この反応は減速して進行する。
【０５９４】
鋳型として第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１−Ｅｘｔ）を使用してこの新しく開始されたＰ１．２−Ｅｘｔの合成を継続すると、ポリメラーゼ関連鎖置換による複合体（Ｃ１．１／Ｐ１．１−Ｅｘｔ／Ｐ２．１−Ｅｘｔ）の解離もまたもたらすことができる。ここでは、コントローラーオリゴヌクレオチド、温度依存性二本鎖不安定化、及びポリメラーゼによる鎖置換が相乗的かつ相補的に働く。これにより、第１プライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）の３’セグメントが、第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１−Ｅｘｔ）の相補的部分から解離することになる。
【０５９５】
そのような解離は、増幅反応の速度論に好ましい作用を及ぼし、反応条件の選択、例えば、温度条件によって。影響を受け得る。Ｐ１．１−Ｅｘｔ及びＰ２．１−Ｅｘｔの解離における、ポリメラーゼ媒介合成依存性鎖置換の関与は、鎖分離に好ましい作用を与える。
【０５９６】
前記工程における温度は、例えば、１５℃〜７５℃、特に３０℃〜７０℃、特に５０℃〜７０℃の範囲を含む。
【０５９７】
コントローラーオリゴヌクレオチドの第１の領域及び第１オリゴヌクレオチドプライマーの第２の領域の所与の長さで（例えば、３〜２５ヌクレオチドモノマー、特に５〜１５ヌクレオチドモノマーの範囲を含む）、一般的に、鎖置換反応が成功して開始できる。コントローラーオリゴヌクレオチドが第１のプライマー伸長産物のそれぞれの部分に完全に相補的である場合、コントローラーオリゴヌクレオチドは、第１のプライマー伸長産物の３’セグメントを除いて、第１のプライマー伸長産物に結合し、第２のプライマー伸長産物を置換することができる。したがって、第２のプライマー伸長産物は、第１のプライマー伸長産物の３’セグメントに接続されたまま残る。前記接続の強さは、温度に応じて影響を受けることが可能である。臨界温度に達する場合、この接続が崩壊し、両方のプライマー伸長産物が解離し得る。３’セグメントの配列が短いほど、接続が不安定になり、かつ自然解離を引き起こす温度が低くなる。
【０５９８】
自然解離は、例えば、およその融解温度である温度範囲で達成することができる。特定の実施形態では、コントローラーオリゴヌクレオチドによる鎖置換のステップの温度は、コントローラーオリゴヌクレオチドによって結合されない第１のプライマー伸長産物の３’セグメント、及び第２のオリゴヌクレオチドプライマー又は第２のプライマー伸長産物それぞれを含む複合体のおよその融解温度（Ｔｍ±３℃）である。
【０５９９】
特定の実施形態では、コントローラーオリゴヌクレオチドによる鎖置換のステップの温度は、コントローラーオリゴヌクレオチドによって結合されない第１のプライマー伸長産物の３’セグメント及び第２のオリゴヌクレオチドプライマー又は第２のプライマー伸長産物それぞれを含む複合体のほぼ融解温度（Ｔｍ±５℃）である。
【０６００】
特定の実施形態では、コントローラーオリゴヌクレオチドによる鎖置換のステップの温度は、コントローラーオリゴヌクレオチドによって結合されない第１のプライマー伸長産物の３’セグメント、及び第２のオリゴヌクレオチドプライマー又は第２のプライマー伸長産物それぞれを含む複合体の融解温度を超える。そのような温度は、約Ｔｍ＋５℃〜Ｔｍ＋２０℃、より良くはＴｍ＋５℃〜Ｔｍ＋１０℃の温度範囲を含む。より高い温度を使用することにより、前記反応ステップにおける平衡は、解離に向かってシフトすることができる。これにより、反応の速度論に好ましい影響を与えることができる。コントローラーオリゴヌクレオチドによる鎖置換のステップで低すぎる温度を使用すると、増幅が大幅に減速することにつながることが可能である。
【０６０１】
特定の実施形態では、第１のプライマー伸長産物は、コントローラーオリゴヌクレオチドによって結合されず、そして４〜６、より良くは７〜８、特に約１８ヌクレオチドの配列長を含む３’セグメントを含む。前記実施形態では、自発的解離は、通常、４０℃〜６５℃の間の温度範囲で既に達成されている。より高い温度も解離につながる。
【０６０２】
特定の実施形態では、第１のプライマー伸長産物は、コントローラーオリゴヌクレオチドによって結合されず、１５〜約２５ヌクレオチドの配列長を含む３’セグメントを含む。この実施形態では、自発的解離は、通常、５０℃〜７０℃の間の温度で既に達成されている。より高い温度も解離につながる。
【０６０３】
特定の実施形態では、第１のプライマー伸長産物は、コントローラーオリゴヌクレオチドによって結合されず、２０〜約４０ヌクレオチドの配列長を含む３’−セグメントを含む。この実施形態では、自発的解離は、通常、５０℃〜７５℃の間の温度範囲で既に達成されている。より高い温度も解離につながる。
【０６０４】
第１のプライマー伸長産物の３’セグメントの組成及び、任意に追加の融解温度影響性オリゴヌクレオチド修飾（ＭＧＢなど）又は反応条件（ＴＰＡＣ、ベタインなど）は、温度の選択に影響を与えることが可能である。したがって、対応する調整が行われ得る。
【０６０５】
特定の実施形態では、増幅のすべてのステップは、非特異的産物／副産物の形成を防止又は減速するストリンジェントな条件下で進行する。そのような条件は、例えばより高い温度、例えば５０℃を上回る。
【０６０６】
特定の実施形態では、コントローラーオリゴヌクレオチドによる鎖置換の個々のステップは、第１及び第２のプライマー伸長産物の合成と同じ温度で進行する。さらなる実施形態では、コントローラーオリゴヌクレオチドによる鎖置換の個々のステップは、第１及び第２のプライマー伸長産物のそれぞれの合成の温度とは異なる温度で進行する。更なる実施形態では、第１のプライマー伸長産物の合成及びコントローラーオリゴヌクレオチドによる鎖置換は、同じ温度で進行する。更なる実施形態では、第２のプライマー伸長産物の合成及びコントローラーオリゴヌクレオチドによる鎖置換は、同じ温度で進行する。
【０６０７】
コントローラーオリゴヌクレオチドの濃度は、０．０１μｍｏｌ／ｌ〜５０μｍｏｌ／ｌの範囲、より良くは０．１μｍｏｌ／ｌ〜２０μｍｏｌ／ｌの範囲、好ましくは０．１μｍｏｌ／ｌ〜１０μｍｏｌ／ｌの範囲を含む。
【０６０８】
第２のオリゴヌクレオチドプライマー（プライマー２）の特定の実施形態：
３’セグメントを持つオリゴヌクレオチドは、増幅される核酸又はその同等物内の本質的に相補的な配列に結合し、特異的な第２のプライマー伸長反応を開始することができる（図１４、２７〜２９、５５、６８〜７１）。したがって、この第２オリゴヌクレオチドプライマーは、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１の特異的プライマー伸長産物の３’セグメントに結合することができ、第２のプライマー伸長産物のポリメラーゼ依存性合成を開始することができる。特定の実施形態では、各第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、増幅されるべき１つの核酸に特異的である。
【０６０９】
第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、逆方向合成時にコピー可能であるべきであり、第１のプライマー伸長産物の合成中に鋳型自体としても機能する。
【０６１０】
第２のオリゴヌクレオチドプライマーの長さは、１５〜１００ヌクレオチド、特に２０〜６０ヌクレオチド、特に好ましくは３０〜５０ヌクレオチドの間であり得る。特に、ヌクレオチドビルディングブロックは、共通の５’−３’ホスホジエステル結合又はホスホチオエステル結合を介して相互の間で連結される。このようなオリゴヌクレオチドプライマーは、所望の様式で化学的に合成することができる。
【０６１１】
特定の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、ポリメラーゼの機能に影響を及ぼさない、又はほんのわずかに影響を与えるヌクレオチドモノマーを含むことができ、これらは例えば以下で存在する：
・  天然のヌクレオチド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＣ、ｄＧなど）又は塩基対の変更なしのその修飾体  
・  修飾されたヌクレオチド、２−アミノ−ｄＡ、２−チオ−ｄＴ、又は相違塩基対（例えば、イノシン５ーニトロインドールなどのユニバーサル塩基対）を持つその他のヌクレオチド修飾体。
【０６１２】
特定の実施形態では、この領域の３’−ＯＨ末端は特に修飾されておらず、ポリメラーゼによって認識され、鋳型に応じて伸長することができる機能的な３’−ＯＨ基を有する。さらなる特定の実施形態では、第２のプライマーの３’セグメントは、少なくとも１つのホスホロチオエート化合物を含み、それにより、プライマーの３’末端は、ポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性によって分解されることができない。
【０６１３】
第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、いくつかの個別のステップで使用できる。第一に、それは増幅においてプライマー機能を発揮する。これにより、第１のプライマー伸長産物を鋳型として使用しプライマー伸長反応が行われる。特定の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、増幅反応の開始時に鋳型として開始核酸鎖を使用することができる。特定の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、開始核酸鎖を設計／提供することに使用できる。
【０６１４】
増幅の範囲内で、第２のプライマーは、第１のプライマー伸長産物を鋳型として使用して、第２のプライマー伸長産物の合成の開始剤として機能する。第２のプライマーの３’セグメントは、第１のプライマー伸長産物に主に相補的に結合できる配列を含む。第１のプライマー伸長産物を鋳型として使用する第２のオリゴヌクレオチドプライマーの酵素的伸長は、第２のプライマー伸長産物の形成をもたらす。そのような合成は、一般的には、第１のプライマー伸長産物との結合からのコントローラーオリゴヌクレオチドの置換と並行して行われる。前記置換は、主にポリメラーゼによって達成され、部分的に第２のオリゴヌクレオチドプライマーによって行うことができる。そのような第２の伸長産物は、標的配列又はそのセグメントを含む。第２のプライマー伸長産物の合成の過程で、第１のオリゴヌクレオチドプライマーのコピー可能な部分の配列は、鋳型としてポリメラーゼにより認識され、それぞれの相補的配列が合成される。前記配列は、第２のプライマー伸長産物の３’セグメントにあり、第１のオリゴヌクレオチドプライマーのプライマー結合部位を含む。第２のプライマー伸長産物の合成は、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの停止位置まで行われる。第２のプライマー伸長産物の合成直後に、この産物は第１のプライマー伸長産物に結合し、二本鎖複合体を形成する。第２のプライマー伸長産物は、コントローラーオリゴヌクレオチドによって前記複合体から配列特異的に置換される。コントローラーオリゴヌクレオチドによる成功した鎖置換の後、第２のプライマー伸長産物自体は、次いで第１のプライマー伸長産物の合成のための鋳型として機能することができる。
【０６１５】
さらに、第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、増幅の開始時に開始核酸鎖から始まる第２のプライマー伸長産物の合成の開始剤として機能することができる。特定の実施形態では、第２のプライマーの配列は、開始核酸鎖の対応する配列セグメントに完全に相補的である。特定の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドプライマーの配列は、開始核酸鎖の対応する配列セグメントに部分的にのみ相補的である。しかしながら、前記相違相補性は、第２のオリゴヌクレオチドプライマーが主に配列特異的なプライマー伸長反応を開始することを妨げるものではない。開始核酸鎖のそれぞれの位置に対する第２のオリゴヌクレオチドプライマーの相補性のそれぞれの相違は、３’セグメントでは主に相補的な塩基の対合及び合成の開始が可能であるように、特に第２のオリゴヌクレオチドプライマーの５’セグメントにある。合成の開始のために、例えば、特に３’セグメントの最初の４〜１０の位置は、鋳型（開始核酸鎖）に完全に相補的である必要がある。残りのヌクレオチド位置は、完全な相補性とは異なり得る。したがって、５’セグメントにおける完全な相補性の程度は、塩基組成物の１０％〜１００％、特に３０％〜１００％の間の範囲を含み得る。第２のオリゴヌクレオチドプライマーの長さに応じて、５’セグメントの完全な相補性からのこれらの相違は、１〜４０、特に１〜２０ヌクレオチドの位置を含む。特定の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、その３’セグメントのみで開始核酸鎖に結合するが、その５’セグメントでは結合しない。開始核酸鎖に完全に相補的である第２のオリゴヌクレオチドプライマーのそのような３’セグメントの長さは、６〜４０ヌクレオチド、特に６〜３０ヌクレオチド、特に６〜２０ヌクレオチドの間の範囲を含む。開始核酸鎖に非相補的である第２のオリゴヌクレオチドプライマーの対応する５’セグメントの長さは、５〜６０ヌクレオチド、特に１０〜４０ヌクレオチドの間の範囲を含む。したがって、第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、開始核酸鎖の合成を開始することができる。第１のプライマー伸長産物の後続の合成では、第２のオリゴヌクレオチドプライマーの第１のプライマー伸長産物配列セグメントがポリメラーゼによってコピーされ、それにより、次いで後続の合成サイクルでは、完全に相補的なプライマー結合部位が第２のオリゴヌクレオチドを結合する第１のプライマー伸長産物内に形成され、後続の合成サイクルで利用可能となる。
【０６１６】
特定の実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、開始核酸鎖の調製において使用され得る。ここで、そのような第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、主に／好ましくは配列特異的に核酸（例えば、標的配列を含む一本鎖ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡ又はその同等物）に結合し、ポリメラーゼの存在下で鋳型依存プライマー伸長反応を開始することができる。結合位置は、プライマー伸長産物が所望の標的配列を含むように選択される。第２のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長は、鋳型に相補的な配列を有する鎖をもたらす。そのような鎖は、鋳型により分離することができ（例えば、熱又はアルカリによって）、したがって、一本鎖の形態に変換することができる。そのような一本鎖核酸鎖は、増幅の開始時に開始核酸鎖として機能することができる。５’セグメントにおいてそのような開始核酸鎖は、第２のオリゴヌクレオチドプライマーの配列部分を含み、さらにそれは、標的配列又はその同等物及び第１のオリゴヌクレオチドプライマーのためのプライマー結合部位を含む。更なるステップについては、「核酸鎖の開始」のセクションで説明する。
【０６１７】
特定の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、少なくともその３’セグメントにおいて、標的配列の配列セグメントに相補的かつ配列特異的に結合し、ポリメラーゼによる正常なプライマー伸長反応を開始／支持することができる配列部分を含む。そのような配列セグメントの長さは、６〜４０ヌクレオチド、特に８〜３０ヌクレオチド、特に１０〜２５ヌクレオチドの範囲を含む。
【０６１８】
特定の実施形態では、３’及び５’セグメントに第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、第１のプライマー伸長産物の合成においてポリメラーゼによってコピーされるコピー可能な配列セグメントを含む。したがって、第２のプライマーのすべての配列セグメントは、ポリメラーゼによってコピーされる。これにより、第１のプライマー伸長産物の３’セグメントにプライマー結合部位が形成される。
【０６１９】
特定の実施形態では、その長さにおいて、コピー可能な部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、コントローラーオリゴヌクレオチドによって結合されない第１のプライマー伸長産物の３’セグメントに対応する。第２のオリゴヌクレオチドプライマーと第１のプライマー伸長産物とを含む複合体において、そのような第２のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端は、第１のプライマー伸長産物に結合するコントローラーオリゴヌクレオチドに隣接する。このようなプライマーの伸長は、第１のプライマー伸長産物を鋳型として使用して行われる。このようなプライマーの伸長において、第１のプライマー伸長産物との結合からのコントローラーオリゴヌクレオチドの置換は、ポリメラーゼ依存性鎖置換によって行われる。
【０６２０】
特定の実施形態では、そのコピー可能な配列部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、コントローラーオリゴヌクレオチドによって結合されない第１のプライマー伸長産物の３’セグメントよりも短い。第２のオリゴヌクレオチドプライマーと第１のプライマー伸長産物とを含む複合体では、そのようなプライマーの３’末端と第１のプライマー伸長産物に結合したコントローラーオリゴヌクレオチドの間に、第１のプライマー伸長産物の一本鎖部位が存在する。このようなプライマーの伸長は、第１のプライマー伸長産物を鋳型として使用して行われる。このようなプライマーの伸長において、第１のプライマー伸長産物との結合からのコントローラーオリゴヌクレオチドの置換は、ポリメラーゼ依存性鎖置換によって行われる。
【０６２１】
特定の実施形態では、そのコピー可能な部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、コントローラーオリゴヌクレオチドによって結合されない第１のプライマー伸長産物の３’セグメントよりも長い。第２のオリゴヌクレオチドプライマーと第１のプライマー伸長産物との複合体では、第２のプライマーの３’セグメント及びコントローラーオリゴヌクレオチドの５’セグメントが、第１のプライマー伸長産物への結合をめぐって競合する。合成の開始に必要な第１のプライマー伸長産物への第２のプライマーの３’セグメントの結合は、コントローラーオリゴヌクレオチドの５’セグメントの部分的な置換と同時に行われる。
【０６２２】
ポリメラーゼによる合成の開始後、第１のプライマー伸長産物を鋳型として使用することにより、そのようなプライマーの置換が起こる。このようなプライマーの伸長において、第１のプライマー伸長産物との結合からのコントローラーオリゴヌクレオチドの置換は、ポリメラーゼ依存性鎖置換によって行われる。コントローラーオリゴヌクレオチドの５’セグメントを置き換える第２のオリゴヌクレオチドプライマーの３’セグメントの配列長は、次の範囲を含む：１〜５０ヌクレオチド、特に３〜３０ヌクレオチド、特に５〜２０ヌクレオチド。第１のプライマー伸長産物の３’セグメントの長さを超える、より長い第２のオリゴヌクレオチドプライマーを使用することは、例えば、いくつかの実施形態において有利である。そのような実施形態は、例えば、５〜４０ヌクレオチド、特に１０〜３０ヌクレオチドの長さである、コントローラーオリゴヌクレオチドによって結合されない３’セグメントを有する第１のプライマー伸長産物を含む。特に、より短い３’セグメントを有する、より長い第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、合成開始時の配列特異性の向上を与える。
【０６２３】
第２のオリゴヌクレオチドプライマーのそのプライマー結合部位への結合強度は、プライマーの長さに依存する。一般に、より長い第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、より高い反応温度で使用することができる。
【０６２４】
特に、第１及び第２のオリゴヌクレオチドプライマー、及びコントローラーオリゴヌクレオチドの配列は、副反応、例えば、プライマー二量体形成が最小化されるように互いに適合される。そのため、例えば第１及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーの配列は、両方のオリゴヌクレオチドプライマーが適切な鋳型及び／又は標的配列及び／又は開始核酸鎖の非在下でそれぞれ増幅反応を開始できないように互いに適合される。これは、例えば、第２のオリゴヌクレオチドプライマーが第１のオリゴヌクレオチドプライマーのプライマー結合部位を含まず、第１のオリゴヌクレオチドプライマーが第２のオリゴヌクレオチドプライマーのプライマー結合部位を含まないことで達成できる。さらに、プライマー配列が伸長される自己相補的構造（自己相補的）を含むことが避けられるべきである。
【０６２５】
第２のプライマー伸長産物の合成はプライマー伸長反応であり、第１の増幅の個々のステップを形成する。このステップの間の反応条件は、それに応じて調整される。反応温度及び反応時間は、反応が成功して起こり得るように選択される。このステップにおけるそれぞれの好ましい温度は、使用するポリメラーゼ及びそれぞれの第２のオリゴヌクレオチドプライマーのそのプライマー結合部位への結合強度に依存し、例えば、１５℃〜７５℃、特に２０〜６５℃、特に２５℃〜６５℃の範囲を含む。第２のオリゴヌクレオチドプライマーの濃度は、０．０１μｍｏｌ／ｌ〜５０μｍｏｌ／ｌ、特に０．１μｍｏｌ／ｌ〜２０μｍｏｌ／ｌ、特に０．１μｍｏｌ／ｌ〜１０μｍｏｌ／ｌの範囲を含む。
【０６２６】
特定の実施形態では、増幅のすべてのステップは、非特異的産物／副産物の形成を防止又は減速するストリンジェントな条件下で進行する。そのような条件は、例えばより高い温度、例えば５０℃を上回る。
【０６２７】
２つ以上の特異的な核酸鎖が１つのバッチで増幅される場合、特定の実施形態では、それぞれの配列特異的なオリゴヌクレオチドプライマーが、好ましくは、それぞれ対応する標的配列の増幅のために使用される。
【０６２８】
特定の実施形態では、第１及び第２のプライマー伸長産物の合成は、同じ温度で進行する。特定の実施形態では、第１及び第２のプライマー伸長産物の合成は、異なる温度で進行する。特定の実施形態では、第２のプライマー伸長産物の合成及びコントローラーオリゴヌクレオチドによる鎖置換は、同じ温度で進行する。更なる実施形態では、第２のプライマー伸長産物の合成及びコントローラーオリゴヌクレオチドによる鎖置換は、異なる温度で進行する。
【０６２９】
ポリメラーゼ：
好ましくは、鎖置換が可能な鋳型依存性ポリメラーゼが使用される。
【０６３０】
一実施形態では、Ｂｓｔポリメラーゼ又はその修飾体（例えば、Ｂｓｔ２．０  ＤＮＡポリメラーゼ）の大きな断片を使用することができる。さらに、Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｖｅｎｔ  ｅｘｏ  ｍｉｎｕｓポリメラーゼ、Ｄｅｅｐｖｅｎｔ  ｅｘｏ  ｍｉｎｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼの大きな断片、Ｂｓｍ  ＤＮＡポリメラーゼの大きな断片が使用され得る。Ｖｅｎｔ  ｅｘｏ  ｍｉｎｕｓポリメラーゼ、Ｄｅｅｐｖｅｎｔ  ｅｘｏ  ｍｉｎｕｓ  ＤＮＡ（ＮＥＢ製）及びＬｕｃｉｇｅｎ製のＰｙｒｏＰｈａｇｅポリメラーゼは、鎖置換活性を持つ熱安定性酵素である。
【０６３１】
一実施形態では、室温で活性を示さないポリメラーゼ、いわゆるホットスタートポリメラーゼ又はウォームスタートポリメラーゼが使用される。ＢＳＴ  ２．０ポリメラーゼウォームスタート（ＮＥＢ製）は、この例である。
【０６３２】
第３のオリゴヌクレオチドプライマーの特定の実施形態
（第２の増幅系の成分）
一実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドプライマーは、第１の増幅系の第１のオリゴヌクレオチドプライマーと同一である。
【０６３３】
特定の実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドプライマーは、第１の増幅系の第１のオリゴヌクレオチドプライマーと同一ではない。
【０６３４】
第３のオリゴヌクレオチドプライマーの長さは、１５〜１００ヌクレオチド、特に２０〜６０ヌクレオチド、特に３０〜５０ヌクレオチドの間であり得る。例えば、ＣＧのレベルは２０〜８０％、特に３０〜７９％の間である。ヌクレオチドビルディングブロックは、通常の５’−３’ホスホジエステル結合又はホスホチオエステル結合を介して特に相互に連結される。このようなオリゴヌクレオチドプライマーは、所望の形態で化学的に合成することができる。
【０６３５】
特定の実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドプライマーは、以下のような、ポリメラーゼの機能にほとんど又は全く影響を与えないヌクレオチドモノマーを含むことができる。
・  天然のヌクレオチド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＣ、ｄＧなど）又は塩基対の変更なしのその修飾体
・  修飾ヌクレオチド、ヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエート化合物（ＰＴＯ）修飾体、ＬＮＡ修飾体、２−アミノ−ｄＡ、２−チオ−ｄＴ、又は異なる塩基対（例えば、イノシン５−ニトロインドールなどのユニバーサル塩基対）を持つ他のヌクレオチド修飾体。
【０６３６】
特定の実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドプライマーの３’−ＯＨ末端は、特に修飾がなく、ポリメラーゼによって認識され、鋳型依存的に伸長することができる機能的な３’−ＯＨ基を有する。さらなる特定の実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドプライマーの３’セグメントは、少なくとも１つのホスホロチオエート化合物を含み、そのため、ポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性によるプライマーの３’末端の分解は起こり得ない。
【０６３７】
特定の実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端はブロックされている。例えば、３’−リン酸基又はＣ３リンカーを有する。前記実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドプライマーの３’セグメントは、例えば、第２のポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を使用して、第２の増幅まで活性化されない。
【０６３８】
特に、第３のオリゴヌクレオチドプライマーは、コントローラーオリゴヌクレオチドの第１のセグメントと相補的に結合することができるいかなる配列セグメントも含まない。
【０６３９】
第３のオリゴヌクレオチドプライマー（図１５〜３１）は、第１の増幅断片１．１（標的配列を含む第１の増幅産物１．１）に対して異なる配置で配置することができる。
【０６４０】
鋳型として第１の増幅断片１．１を使用して第２の増幅反応を開始できるようにするには（開始核酸鎖２．１）、第３及び第４のプライマーは第１の増幅断片によって事前に決定された配列内に結合し、ポリメラーゼによって伸長される必要がある。
【０６４１】
特定の実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドプライマーは、第１の増幅断片１．１の１つの鎖に結合することができる。特に、第３のオリゴヌクレオチドプライマーは、第２のプライマー伸長産物に結合し、適切なポリメラーゼ及び反応条件を使用してプライマー伸長を開始することができる。
【０６４２】
特定の実施形態において、第３のオリゴヌクレオチドプライマーのこの結合は、好ましくは、第２のプライマー伸長産物の３’セグメントにおいて起こる。
【０６４３】
第３のオリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは、使用される反応条件下で第２のプライマー伸長産物に相補的又は主に相補的に結合できる３’セグメントに配列セグメントを含み、それにより、ポリメラーゼは第３のプライマー伸長産物の合成を開始することができる。
【０６４４】
このセグメントの長さは、特に６〜３０ヌクレオチド、特に８〜２５ヌクレオチド、特に１０〜２０ヌクレオチド、特に１０〜１５ヌクレオチドの間の範囲を含む。特定の実施形態では、このセグメントは、第２のプライマー伸長産物の対応するセグメントに完全に相補的である。特定の実施形態では、前記セグメントは、プライマー伸長産物に対する少なくとも１つの不一致を含む。特に、この不一致の位置は、第３のプライマーの３’末端に対して−４位置より近くはない、特に−５より近くない、特に−６より近くない、特に第３のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端に対して−８位置より近くはない。第３のオリゴヌクレオチドプライマーもこの３’セグメントでコントローラーオリゴヌクレオチドに結合できるため、このような不一致はこのセグメントのコントローラーオリゴヌクレオチドへの結合を弱める。したがって、不一致の長さ及び数を選択する場合、３’セグメントが第２のプライマー伸長産物に結合し、プライマー伸長反応を開始する必要があることを考慮するが、同時に前記セグメントが使用した反応条件下でコントローラーオリゴヌクレオチドに不可逆的に結合せず、したがってそれを不活性化することを考慮する。
【０６４５】
したがって、位置及び長さの選択では、第３のオリゴヌクレオチドプライマー及びコントローラー、並びに第２のプライマー伸長産物の間の相互作用を考慮する。
【０６４６】
前記セグメントの第２のプライマー伸長産物への結合の位置は、様々な方法で選択することができる（図２７〜３１、５７）。
【０６４７】
例えば、第３のオリゴヌクレオチドプライマーは、主に相補的な方法で第１のオリゴヌクレオチドプライマーと同じ配列セグメントに結合することができる。第３のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端の位置は、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端の位置に対応する。したがって、第３のオリゴヌクレオチドプライマーは、少なくとも部分的に（その３’セグメントを用いて）、標的配列の一部に相補的様式で結合することができる。したがって、第３のプライマーの３’末端は、コントローラーオリゴヌクレオチドの第２のブロッキングユニット内に配置され、コントローラーを鋳型として使用してポリメラーゼによって伸長することはできない（図２０）。
【０６４８】
特定の実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドプライマーは、第２のプライマー伸長産物に主に相補的に結合し、その３’末端は、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端に対してシフトされる。特定の実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端は、第２のプライマー伸長産物の３’方向に少なくとも１つのヌクレオチドでシフトされている。したがって、第３のオリゴヌクレオチドプライマーが主に相補的に結合することができる第２のプライマー伸長産物のセグメントは、３’方向にシフトされている（図１９）。
【０６４９】
特定の実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端は、第２のプライマー伸長産物の５’方向に少なくとも１つのヌクレオチドだけシフトされている。したがって、第３のオリゴヌクレオチドプライマーが主に相補的に結合することができる第２のプライマー伸長産物のセグメントは、５’方向にシフトしている（図２１）。
【０６５０】
特定の実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドプライマーの結合位置は、第３のオリゴヌクレオチドプライマーが第１の増幅系の第１のオリゴヌクレオチドプライマーの結合位置と重複しないように、第２のプライマー伸長産物の５’方向にシフトされる。したがって、第３のオリゴヌクレオチドプライマーが主に相補的に結合できる第２のプライマー伸長産物のセグメントは、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの結合位置に対して５’方向にシフトしている（図２２）。
【０６５１】
したがって、第３のオリゴヌクレオチドプライマーは、コントローラーオリゴヌクレオチドに相補的に結合することができる配列セグメントを含む。第３のオリゴヌクレオチドプライマーに相補的に結合することができるコントローラーオリゴヌクレオチドのセグメントは、コントローラーオリゴヌクレオチドの第４のセグメントと呼ばれる。コントローラーにおける第３のオリゴヌクレオチドプライマーの望ましくないプライマー伸長を防ぐために、少なくとも第３のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端の周りに位置するコントローラーオリゴヌクレオチドの位置が修飾される。例えば、これは、第２のブロッキングユニットの修飾と同様の方法で行うことができる。そのような修飾（第３のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長を防ぐ）を含むコントローラーのセグメントは、第４のブロッキングユニットと呼ばれる（図１９〜２２）。その位置は、コントローラー内の第３のオリゴヌクレオチドプライマーの可能な結合位置によって決定される。
【０６５２】
第３のオリゴヌクレオチドプライマーは、逆合成中にコピーできる必要があり、第４のプライマー伸長産物の合成のための鋳型自体としても機能する。
【０６５３】
特定の実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドプライマーは、その３’領域に少なくとも１つの配列セグメントを含み、これは第１の標的配列に主に相補的に結合することができる。このセグメントは、（前記標的配列の対応するセグメントを含む）第２のプライマー伸長産物に主に相補的に結合することができ、ポリメラーゼはプライマー伸長反応を行うことができる。
【０６５４】
第３のオリゴヌクレオチドプライマーは、一実施形態では、標的配列に相補的ではない５’セグメントに少なくとも１つのセグメントを含む。例えば、前記セグメントは、１〜６０ヌクレオチドを含み得、バーコード化、クローニング、固定化、プローブ結合などの他の目的のために使用され得る。この５’セグメントの配列組成は、第２の増幅に干渉しないように調整される。
【０６５５】
第３のオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、蛍光色素（例えば、ＦＡＭ、Ｃｙ５など）、蛍光クエンチャー（例えば、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２など）、親和性マーカー（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニンなど）を含み得る。一実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’セグメントがポリメラーゼによってコピーされないように、リンカー（例えば、Ｃ３又はＨＥＧリンカー）を含み得る。
【０６５６】
特定の実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドプライマーは、第２の増幅反応の前に固相上に固定化される。したがって、この第３のオリゴヌクレオチドプライマーのプライマー伸長は、第３のプライマー伸長産物全体の固定化をもたらす。
【０６５７】
第３のオリゴヌクレオチドプライマーの使用濃度は、０．０１μｍｏｌ／ｌ〜約１０μｍｏｌ／ｌ、特に０．１μｍｏｌ／ｌ〜約２μｍｏｌ／ｌの間の範囲を含み得る。
【０６５８】
第４のオリゴヌクレオチドプライマーの特定の実施形態（第２の増幅系の成分）
一実施形態では、第４のオリゴヌクレオチドプライマーは、第１の増幅系の第２のオリゴヌクレオチドプライマーと同一である。
【０６５９】
特定の実施形態では、第４のオリゴヌクレオチドプライマーは、第１の増幅系の第２のオリゴヌクレオチドプライマーと同一ではない。
【０６６０】
第４のオリゴヌクレオチドプライマーの長さは、１５〜１００ヌクレオチド、特に２０〜６０ヌクレオチド、特に３０〜５０ヌクレオチドの間であり得る。例えば、ＣＧのレベルは２０〜８０％、特に３０〜７９％の間である。ヌクレオチドビルディングブロックは、通常の５’−３’ホスホジエステル結合又はホスホチオエステル結合を介して特に相互に連結される。このようなオリゴヌクレオチドプライマーは、所望の形態で化学的に合成することができる。
【０６６１】
特定の実施形態では、第４のオリゴヌクレオチドプライマーは、以下のような、ポリメラーゼの機能にほとんど又は全く影響を与えないヌクレオチドモノマーを含むことができる。
・  天然のヌクレオチド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＣ、ｄＧなど）又は塩基対の変更なしのその修飾体
・  修飾ヌクレオチド、ヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエート化合物（ＰＴＯ）修飾体、ＬＮＡ修飾体、２−アミノ−ｄＡ、２−チオ−ｄＴ、又は異なる塩基対合（例えば、イノシン５−ニトロインドールなどのユニバーサル塩基対）を持つ他のヌクレオチド修飾体。
特定の実施形態では、第４のオリゴヌクレオチドプライマーの３’−ＯＨ末端は、特に修飾がなく、ポリメラーゼによって認識され、鋳型依存的に伸長することができる機能的な３’−ＯＨ基を有する。さらなる特定の実施形態では、第４のオリゴヌクレオチドプライマーの３’セグメントは、少なくとも１つのホスホロチオエート化合物を含み、そのため、ポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性によるプライマーの３’末端の分解は起こり得ない。
【０６６２】
特定の実施形態では、第４のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端はブロックされている。例えば、３’−リン酸基又はＣ３リンカーを有する。これらの実施形態では、第４のオリゴヌクレオチドプライマーの３’セグメントの活性は、例えば、第２のポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を使用して、第２の増幅まで生じない。
【０６６３】
特に、第４のオリゴヌクレオチドプライマーは、コントローラーオリゴヌクレオチドの第１のセグメントと相補的に結合することができるいかなる配列セグメントも含まない。
【０６６４】
第４のオリゴヌクレオチドプライマー（図１５〜３１）は、第１の増幅断片１．１（標的配列を含む第１の増幅産物１．１）に対して異なる配置で配置することができる。
【０６６５】
鋳型として第１の増幅断片１．１を使用して第２の増幅反応を開始するには（開始核酸鎖２．１）、第３及び第４のプライマーは第１の増幅断片によって事前に決定された配列内に結合し、ポリメラーゼによって伸長される必要がある。
【０６６６】
特定の実施形態では、第４のオリゴヌクレオチドプライマーは、第１の増幅断片１．１の１つの鎖に結合することができる。好ましくは、第４のオリゴヌクレオチドプライマーは、第１のプライマー伸長産物に結合し、適切なポリメラーゼ及び反応条件を使用してプライマー伸長を開始することができる。
【０６６７】
特定の実施形態において、第４のオリゴヌクレオチドプライマーのこの結合は、好ましくは、第１のプライマー伸長産物の３’セグメントにおいて起こる。
【０６６８】
第４のオリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは、使用される反応条件下で第１のプライマー伸長産物に相補的又は主に相補的に結合できる３’セグメントに配列セグメントを含み、それにより、ポリメラーゼは第４のプライマー伸長産物の合成を開始することができる。
【０６６９】
前記セグメントの長さは、特に６〜４０ヌクレオチド、特に８〜３０ヌクレオチド、特に１０〜２５ヌクレオチド、特に１０〜２０ヌクレオチドの間の範囲を含む。特定の実施形態では、このセグメントは、第１のプライマー伸長産物の対応するセグメントに完全に相補的である。特定の実施形態では、前記セグメントは、第１のプライマー伸長産物に対する少なくとも１つの不一致を含む。特に、この不一致の位置は、第４のプライマーの３’末端に対して−４位置より近くはない、特に−５より近くはない、特に−６より近くはない、特に第４のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端に対して−８位置より近くはない。
【０６７０】
前記セグメントの第１のプライマー伸長産物への結合の位置は、様々に選択することができる（図２３〜３１、５７）。
【０６７１】
例えば、第４のオリゴヌクレオチドプライマーは、第２のオリゴヌクレオチドプライマーと主に相補的に同じ配列セグメントに結合することができる。第４のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端の位置は、第２のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端の位置に対応する。したがって、第４のオリゴヌクレオチドプライマーは、少なくとも部分的に（その３’セグメントを用いて）、標的配列の一部を含む。
【０６７２】
特定の実施形態では、第４のオリゴヌクレオチドプライマーは、第１のプライマー伸長産物に主に相補的に結合し、その３’末端は、第２のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端に対してシフトされる。特定の実施形態では、第４のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端は、第１のプライマー伸長産物の３’方向に少なくとも１つのヌクレオチドでシフトされている。したがって、第４のオリゴヌクレオチドプライマーが主に相補的に結合することができる第１のプライマー伸長産物のセグメントは、３’方向にシフトしている（図１）。
【０６７３】
特定の実施形態では、第４のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端は、第１のプライマー伸長産物の５’方向に少なくとも１つのヌクレオチドでシフトされている。したがって、第４のオリゴヌクレオチドプライマーが主に相補的に結合することができる第１のプライマー伸長産物のセグメントは、５’方向にシフトしている。
【０６７４】
特に、第４のオリゴヌクレオチドプライマーは、コントローラーオリゴヌクレオチドへ相補的に結合することができるいかなる配列セグメントも含まない。
【０６７５】
第４のオリゴヌクレオチドプライマーは、逆方向合成中にコピー可能でなければならず、それ自体が合成中に第３のプライマー伸長産物の鋳型としても機能する。
【０６７６】
特定の実施形態では、第４のオリゴヌクレオチドプライマーは、第１の標的配列の一部を含み、したがって標的配列に相補的な鎖に結合することができる少なくとも１つの配列セグメントを３’セグメントに含む。前記セグメントは、（この標的配列の対応するセグメントを含む）第１のプライマー伸長産物に主に相補的に結合することができ、ポリメラーゼはプライマー伸長反応を行うことができる。
【０６７７】
特定の実施形態では、第４のオリゴヌクレオチドプライマーは、第１の標的配列の配列セグメントを含まない、少なくとも１つの配列セグメントを５’セグメントに含む。例えば、前記セグメントは、１〜６０ヌクレオチドを含み得、バーコード化、クローニング、固定化、プローブ結合などの他の目的のために使用され得る。この５’セグメントの配列組成は、第２の増幅に干渉しないように調整される。
【０６７８】
第４のオリゴヌクレオチドプライマーは、さらなる修飾、例えば、蛍光色素（例えば、ＦＡＭ、Ｃｙ５等）、蛍光クエンチャー（例えば、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２等）、親和性マーカー（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン等）を含み得る。一実施形態では、第４のオリゴヌクレオチドプライマーは、リンカー（例えば、Ｃ３又はＨＥＧリンカー）を含み得、それにより、５’セグメントがポリメラーゼによってコピーされないままになる。
【０６７９】
特定の実施形態では、第４のオリゴヌクレオチドプライマーは、第２の増幅反応の前に固相上に固定化される。したがって、このような第４のオリゴヌクレオチドプライマーのプライマー伸長は、第４のプライマー伸長産物全体の固定化をもたらす。
【０６８０】
第４のオリゴヌクレオチドプライマーの使用濃度は、０．０１μｍｏｌ／ｌ〜約１０μｍｏｌ／ｌ、特に０．１μｍｏｌ／ｌ〜約２μｍｏｌ／ｌの間の範囲を含み得る。
【０６８１】
第２の増幅系のポリメラーゼ：
ＰＣＲを行うための多くのポリメラーゼが知られている。
【０６８２】
特定の実施形態では、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼが使用される。
【０６８３】
特定の実施形態では、Ｔａｑポリメラーゼ及び／又はその製剤及び／又は修飾体（例えば、Ａｍｐｌｉ−Ｔａｑ）を使用して、第２の増幅を行う。
【０６８４】
特定の実施形態では、鎖置換活性を有する熱安定性鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼが使用される。例えば、Ｖｅｎｔ  Ｅｘｏマイナス（ＮＥＢ製）、ＰｙｒｏＰｈａｇｅポリメラーゼ（Ｌｕｃｉｇｅｎｅ製）、ＳＤポリメラーゼ（Ｂｉｏｒｏｎ製）である。
【０６８５】
特定の実施形態では３’−５プルーフリーディング活性を有する熱安定性鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼが使用される。例えば、Ｖｅｎｔ  ｅｘｏ  ｐｌｕｓ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ｅｘｏ  ｐｌｕｓ（ＮＥＢ製）、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（ＮＥＢ）である。
【０６８６】
特定の実施形態では、例えば、ポリメラーゼのプロセス活性を増大させるために、別のタンパク質とコンジュゲートされる熱安定性鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼが使用される。例えば、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（ＮＥＢ）である。
【０６８７】
追加の配列セグメントを含むオリゴヌクレオチドプライマー：
第１のプライマー及び第２のプライマーの上記の構造は、それぞれいわゆる「プライマーの基本構造」及び「プライマーの最小構造」とみなすことができる。
【０６８８】
プライマー機能を有するオリゴヌクレオチドのそのような基本構造（例えば、第１のオリゴヌクレオチドプライマー、第２のオリゴヌクレオチドプライマー、任意に第３のオリゴヌクレオチドプライマー、任意に第４のオリゴヌクレオチドプライマーなど）は、増幅手順を実施するのに有利な配列セグメント、例えば第１のプライマーの第１及び第２のセグメントを含む。
【０６８９】
オリゴヌクレオチドプライマーのそのような基本構造は、さらに追加の配列セグメントによって伸長することができる。そのような追加の配列セグメントは、増幅手順の実行に必要ではないが、他の仕事に有用であり得る構造を含む。
【０６９０】
そのような追加の配列セグメントは、任意にオリゴヌクレオチドプライマーに導入され、さらなる機能又は反応のために使用され得る。このようにして、（例えば、第１及び／又は第２のプライマーから始まる）ポリメラーゼによって合成されたプライマー伸長産物は、そのような配列セグメントに連結され得る。これは、そのような追加の配列セグメント及びプライマー伸長産物の分子構造への統合を可能にする。そのような統合は、特定の実施形態において有利であり得る。追加の配列セグメントを有するオリゴヌクレオチドプライマー配列の様々な用途が当業者に知られている。
【０６９１】
オリゴヌクレオチドプライマーの追加の配列セグメントによってサポートされるいくつかの機能が当業者に知られている。
【０６９２】
例えば、追加の構造の導入は、分子間又は分子内の結合を媒介する手段として使用することができる。そのような構造のいくつかの例は、当業者に知られている。例えば、プローブは、例えばＳｃｏｒｐｉｏｎ−プライマーにおいて分子内結合のそのような原理に従って設計され得る。例えば、配列セグメントは、さらなるオリゴヌクレオチドを結合するために依然として使用され得る。ストリンジェントな条件を使用することで、配列特異的な分子間結合を実現できる。そのような相互作用は、例えば、固定化されたオリゴヌクレオチドへの相補的結合によって増幅産物を固相に結合するために使用することができる。
【０６９３】
別の例は、いわゆるアダプター配列の導入、及び／又はプライマー及び得られるプライマー伸長産物の固有のコード化又は配列特異的標識化のためのさらなるセグメントの使用である（いわゆるプライマーバーコーディング）。これは、例えばＮＧＳライブラリーの調整に使用される（Ｓｔａｈｌｂｅｒｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２０１６年６月２０日、４４（１１）：ｅ１０５）。プライマー伸長産物の配列分析では、このような標識を後の配列の割り当てのために使用することができる。
【０６９４】
さらなる例は、例えば、制限酵素などの特定のタンパク質の結合を有する特異的配列を導入するための追加の配列セグメントの使用を提供する。
【０６９５】
別の例は、特異的な相互作用相手に結合することを目的とせず、むしろ隣接する配列間の距離を増加させるスペーサー配列を導入するためのさらなるセグメントの使用を提供する。
【０６９６】
そのような追加の配列は、プライマーのコピー可能な部分に配置する、又はオリゴヌクレオチドプライマーのコピー不可能な部分に付加することのいずれかができる。配列セグメントをコピーするかどうかを決定することにおいて、いくつかの要因が働く。例えば、それぞれのオリゴヌクレオチドにおける配列セグメントの配置、使用されるヌクレオチド修飾（例えば、Ｃ３、ＨＥＧ、２’−Ｏｍｅなど）は、配列セグメントがプロセスステップ中に鋳型として使用されるか否かを決定することができる。
【０６９７】
一実施形態では、追加の配列セグメントが、プライマーのコピー可能な領域に、例えば、第２のプライマーのコピー可能な部分の５’セグメントにて導入され、それにより、例えば、標的配列の合成プロセス中にプライマー配列が読み取られると、追加の配列セグメントもまたポリメラーゼによって読み取られる。そのような追加の配列セグメントの長さは、３〜５０ヌクレオチドの範囲を含む。これらの配列セグメントの組成により、この種類の実施形態では、ポリメラーゼによる合成が可能になり、したがって、前記セグメントは、ポリメラーゼ依存性合成の鋳型として機能する。そのようなセグメントでは、例えば、天然ヌクレオチド、例えば、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、ｄＴが使用される。
【０６９８】
さらなる実施形態では、追加の配列セグメントは、例えば、標的配列を含む特異的な増幅断片の合成中にコピーされるべきではないオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端に配置され得る。これは、例えば、ポリメラーゼが相補鎖を合成するのを妨げる１つ以上の修飾又は化学基（例えば、ＨＥＧ、Ｃ３、２’−Ｏｍｅ修飾を含む４〜１０ヌクレオチドを含むセグメントなど）を配置することによって達成できる。そのような修飾は、例えば、第２のプライマーのコピー可能な部分の５’末端に配置され、合成の継続を妨げ得る。例えば、第２のプライマーのコピー可能なセグメントの５’末端にＨＥＧ基を導入することができ、次いで、その後、追加の配列セグメントを導入することができる。
【０６９９】
さらに、追加の配列セグメントを、第１のプライマーの第２の領域の５’末端に配置することができる。追加の配列セグメントのそのような局在は、標的配列を含む特異的な増幅産物の通常の合成中の相補鎖の合成を妨げる。
【０７００】
そのような追加の配列セグメントの長さは、３〜５０ヌクレオチドの範囲を含む。塩基組成は、例えば、天然の核酸塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ、イノシン）又はヌクレオチドの異なる位置での修飾（例えば、２−アミノアデニン、イソ−グアニン、イソ−シトシン、５−プロパルギル−ウリジン、５−プロパルギル−シトシンなどの塩基で、又はＬＮＡ、２’−Ｏｍｅ、２’−ハロゲンなどの糖リン酸骨格での）を含み得る。一実施形態では、第１のプライマー及び追加の配列セグメントが組み合わされて、オリゴヌクレオチドプライマーを形成する。特定の実施形態では、第２のプライマー及び追加の配列セグメントが組み合わされて、オリゴヌクレオチドを形成する。
【０７０１】
そのような追加の配列セグメントでは、それらが標的配列の増幅を妨げないような方法で、オリゴヌクレオチドが設計される。これは、例えば、プロセスに不可欠なプライマー又はコントローラーの構造との阻害的相互作用を回避又は低減することによって達成される。特定の実施形態では、追加の構造は、選択された反応条件下で他のプライマー領域と相補的な二本鎖セグメントを形成することができる。しかしながら、特にそのような二本鎖セグメントは、標的配列の特異的な増幅を妨げない。特定の実施形態では、そのような追加の配列セグメントは、第１のプライマーの第１又は第２のプライマー領域と相互作用しない、又は結合しない。特定の実施形態では、そのような追加のセグメントは、コントローラーオリゴヌクレオチドと相互作用しない。特定の実施形態では、そのような追加の配列セグメントは、反応において他のプライマーと相互作用しない。特定の実施形態では、そのような追加の配列セグメントは、Ｐ１．１−Ｅｘｔ又はＰ２．１−Ｅｘｔ又は標的配列を含む他の増幅断片と相互作用しない。特定の実施形態では、そのような追加の配列セグメントは、第１又は第２の領域が機能することを完全に妨げる第１のプライマーの第１又は第２の領域と安定な二本鎖セグメントを反応条件下で形成しない。
【０７０２】
特定の実施形態では、そのような追加のセグメントは、第２のプライマーと相互作用しない、又は結合しない。特定の実施形態では、そのような追加の配列セグメントは、特に、第２のプライマーの３’セグメントと相互作用しない。
【０７０３】
特定の実施形態では、第１のプライマーは、第２の領域の５’末端に第１のプライマーの追加の配列セグメント（追加の配列変異体Ｐ１）を含む。前記セグメントは、標的配列の増幅手順を妨害しない（例えば、プライマーで二次構造を形成しない）１０〜５０ヌクレオチドの配列を任意に含む。さらに、前記セグメントは、第１のプライマーのコピー可能な第１のセグメントの約５〜１５ヌクレオチドの配列を任意に含む。追加の配列変異体Ｐ１は、モノマー（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）として天然ヌクレオチドを含み、ポリメラーゼの鋳型として可能に機能することができる。
【０７０４】
特定の実施形態では、第２のプライマーは、その５’末端に第２のプライマーの追加のセグメント（追加の配列変異体Ｐ２）を含む。任意に、前記セグメントは、標的配列の増幅手順を妨害しない（例えば、プライマーと二次構造を形成しない）１０〜５０ヌクレオチドの配列を含む。さらに、前記セグメントは、第２のプライマーのコピー可能な領域の約５〜１５ヌクレオチドの配列を任意に含む。追加の配列変異体Ｐ２は、モノマー（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）として天然ヌクレオチドを含み、ポリメラーゼの鋳型として可能に機能することができる。
【０７０５】
そのような第１のプライマー及び追加の配列変異体Ｐ１を含むオリゴヌクレオチド又は第２のプライマー及び追加の配列変異体Ｐ２を含むオリゴヌクレオチドは、第１のプライマーのみを含むオリゴヌクレオチド又は第２のプライマーのみを含むオリゴヌクレオチドよりも副反応を受けにくいことが観察された。特定の実施形態では、例えば、非特異的プライマー二量体構造の生成及び／又は増幅を遅延させることができる。したがって、そのような副反応において、標的配列を含まない副産物の形成は、任意に減少又は遅延させることができる。このようにして、例えば、プライマーの早期の消費を低減又は遅延させることができる。そのようなオリゴヌクレオチドの使用は、例えば、第１のプライマーを含むプライマー二量体（ＰＤ  Ｐ１）又は第２のプライマーを含むプライマー二量体（ＰＤ  Ｐ２）が副反応によって生成され、反応中のプライマーの早期消費につながる場合に有利である。そのような追加の構造を有するプライマー（追加の配列変異体Ｐ１を有する第１のプライマー及び／又は追加の配列変異体Ｐ２を有する第２のプライマー）の使用は、増幅反応において非特異的反応が観察される場合、特定の実施形態において有利である。このような副反応は、次を含むいくつかの要因によって促進される：
・  反応時間が長い（例えば、１時間〜１００時間の範囲）
・  プライマーが高濃度で使用される（例えば、１μｍｏｌ／ｌ〜１ｍｍｏｌ／ｌの間の範囲）
・  ポリメラーゼが高濃度で使用される（例えば、１０ユニット／１０μｌを超える範囲）
・  複数反応（例えば、１つの反応アプローチで１０を超える異なる標的配列の増幅）。
・  反応混合物中の高濃度の複合核酸鎖（例えば、５０μｌ中に１μｇ  ｈｇＤＮＡを超える濃度）
単独、又は他の因子と組み合わせの要因が、副反応を促進し得る。
【０７０６】
一般に、副反応（例えば、非特異的なプライマー−ダイマー形成）は、反応成分及び／又は反応条件を最適化することで、例えば、個々の成分の濃度を減らす、反応時間を短縮する、プライマー配列の配列設計を行う、よりストリンジェンドな反応条件を選択することで防止できる。有利な実施形態に記載されている追加の配列セグメント（第１のプライマー及び追加の配列変異体Ｐ１を含むオリゴヌクレオチド又は第２のプライマー及び追加の配列変異体Ｐ２を含むオリゴヌクレオチド）は、特定の副反応を遅らせるさらなる可能性を示す。
【０７０７】
実施例では、追加の配列セグメントを有するオリゴヌクレオチドプライマーが示されている。前記実施形態では、標的配列の特異的増幅に関与せず、副反応の遅延に寄与する追加の配列セグメントが使用される。したがって、第１のプライマー及び追加の配列変異体Ｐ１を含むオリゴヌクレオチド、並びに第２のプライマー及び追加の配列変異体Ｐ２を含むオリゴヌクレオチドが使用される。
【０７０８】
当業者は、オリゴヌクレオチドが、標的配列の特異的増幅に有利であるプライマー構造（この構造はまた、「基本構造」又は「最小構造」と呼ばれる）に加えて、さらなる追加の配列セグメント（例えば、追加の配列変異体Ｐ１又は追加の配列変異体Ｐ２）も含み得ることを認識するであろう。そのような追加の配列セグメントは、他の様々な有利性又は有用な特性又は機能を提供することができる。
【０７０９】
検出系の特定の実施形態
検出系は、増幅中に形成されるプライマー伸長産物の少なくとも１つにハイブリダイズすることができる少なくとも１つの蛍光レポーター（レポーター）及び少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを含む。さらに、検出系は、蛍光レポーターに適合する蛍光消光剤（クエンチャーと呼ばれる）を含むことができ、それにより、このクエンチャーは、特定の状況下で蛍光レポーターの蛍光シグナルを低減する、又はシグナル強度を低減することができる。さらに、検出系は、蛍光レポーターと適合するドナー蛍光色素分子を含むことができ、それにより、このドナー蛍光色素分子は、特定の状況下でエネルギー伝達により蛍光レポーターの蛍光シグナルを可能にすることができる。さらに、検出系は、コントローラーオリゴヌクレオチドを含むことができ、そのようなコントローラーオリゴヌクレオチドは、蛍光レポーター又はドナー蛍光色素分子又は蛍光クエンチャーのいずれかを含む。
【０７１０】
オリゴヌクレオチドプローブ及び／又はコントローラーオリゴヌクレオチド上の個々の要素（蛍光レポーター、蛍光クエンチャー、ドナー蛍光色素分子）の配置により、それぞれ相補的な複合体を形成するプライマー伸長産物の存在において蛍光レポーターからの蛍光シグナルの変化がもたらされる必要がある。
【０７１１】
当業者は、リアルタイムＰＣＲのセグメントにおいて過去２０年間に開発された多数のレポーター系を理解している。これらには、自己相補的なセグメントを持つプローブ、例えば、分子ビーコン、エキソヌクレアーゼ分解に基づくプローブ（いわゆるＴａｑｍａｎプローブ、これはＴａｑポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性を使用して特異的に切断される）、シグナルを生成するためにＦＲＥＴ対で標識化され、１つの鎖に結合することができる２つのオリゴヌクレオチドを備えたプローブ系シグナル、プライマーに基づくプローブ（例えば、ＬＵＸプライマー、これは自己相補的構造が逆合成中に展開される場合にシグナルの強度を変化させる）、「Ｓｃｏｒｐｉｏｎ−プライマー」（プライマーで合成された鎖に相補的なセグメントを有する）などを含む。いくつかのプローブは、シグナル取得間の終点測定として使用できる（例えば、分子ビーコン）。いくつかのプローブは、ＰＣＲの反応速度を検出するために使用され、例えば、５’−３’ヌクレアーゼプローブがある。プローブ及び蛍光レポーター、蛍光クエンチャー、及びドナー蛍光色素分子の多くの異なる配置が文献で知られている。多くの蛍光レポータークエンチャー及び蛍光レポーター−ドナー蛍光色素分子（ドナー−アクセプター対又はＦＲＥＴ対とも呼ばれる）も知られている（「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ」Ｄｉｄｅｎｋｏ編，２００６，例えばＣｈａｐｔｅｒ１及び２；Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ「Ｆｌｕｒｅｓｃｅｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ」，Ｇｅｎｅ  Ｌｉｎｋ  Ｉｎｃより出版）。ほとんどのプローブは、ＰＣＲに基づく方法用に開発され、プライマー、プローブ、及び使用するポリメラーゼ、例えば、３’−エキソヌクレアーゼ（ＦＥＮ）の特異的な配置が使用されている。
【０７１２】
一般に、そのようなプローブは、増幅中に生成されたＤＮＡ断片に多かれ少なかれ特異的に結合でき、シグナルは、単独又は他の事象と組み合わせのそのような結合（例えば、ヌクレアーゼ分解又は隣接するセグメントへの別のオリゴヌクレオチドの結合）の結果として変化する。この変化は検出及び定量化可能である。
【０７１３】
したがって、第２の増幅におけるＰＣＲの使用により、そのような既知の技術及びプローブも使用することができる。オリゴヌクレオチドプローブの配列は、反応中に生成される増幅産物に適合される。
【０７１４】
プローブの選択は、例えば、標的配列の特定の変異体を標的配列特異的プローブによって検出する必要があるかどうか、又は（増幅の兆候として）プライマーの消費のみを記録するかにも依存する。したがって、仕事に応じて異なるプローブ形式を選択できる。
【０７１５】
したがって、以下では、いくつかの実施形態に対するそのような適合の詳細について説明する。
【０７１６】
不均一形式
両方の増幅系の成分は第１の増幅の開始時に分離され、それにより、第１の増幅反応に対するオリゴヌクレオチドプローブ又はＰＣＲプライマーの影響が起こることができない。逆に、第１の増幅の完了後、アリコートは第１の増幅から第２の増幅に移される。得られる第１の増幅系の反応成分の希釈液は、ＰＣＲ反応で知られているプローブ構造の使用に有利である。例えば、１００ｎｍｏｌ／ｌ未満、特に１０ｎｍｏｌ／ｌ未満、特に１ｎｍｏｌ／ｌ未満、特に０．０１ｎｍｏｌ／ｌ未満の濃度のコントローラーオリゴヌクレオチドの存在下では、形成されるプライマー伸長断片の相補的セグメントに結合するプローブは、ＰＣＲ条件下でほとんど影響を受けないため、当業者に知られているプローブに基づく検出方法が使用可能である。
【０７１７】
オリゴヌクレオチドプローブは、形成されるプライマー伸長産物の１つ（例えば、第３及び第４のプライマー伸長産物）に結合でき、この結合事象は、さまざまな手法（例えば、Ｔａｑｍａｎプローブ及びＴａｑポリメラーゼを使用する、又は「分子ビーコン」を「対応するプライマー伸長産物の相補的セグメントに結合すること）によって検出できる。
【０７１８】
均一形式
均一形式では、両方の増幅系の成分は、第１の増幅の開始時に同じバッチ内にあり、それにより、他の成分と相互作用し、特定のプロセスに介入することができる。特に、コントローラーオリゴヌクレオチドの有効濃度（例えば、０．０１μｍｏｌ／ｌ〜１０μｍｏｌ／ｌの間）及びオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、０．０１μｍｏｌ／ｌ〜１０μｍｏｌ／ｌの間）の存在は、これらの成分間の相互作用を引き起こし、サブステップ又はこれらのステップの結果に影響を及ぼす。このため、とりわけ以下の態様を考慮する必要がある：
・  コントローラーオリゴヌクレオチドの存在は、形成されるプライマー伸長産物へのオリゴヌクレオチドプローブの結合に影響を与えることができる。これは、例えば、プローブ及びコントローラーがプライマー伸長産物に相補的なセグメントに有意な重複を含む場合である（例えば、コントローラーの第３のセグメントとオリゴヌクレオチドプローブとが第１及び／又は第３のプライマー伸長産物の同じセグメントに部分的にハイブリダイズし得る）このため、そのような重複の程度を制限することが有利である。例えば、重複を最小限に抑えることができるようにコントローラー及びプローブのセグメントの長さを調整することができる。好ましくは、形成されたプライマー伸長産物に相補的に結合する場合、配列セグメントは重複しない。
・  オリゴヌクレオチドプローブは、鎖置換が発生する場合に、必要に応じてコントローラーオリゴヌクレオチドに結合し、影響を与えることができる。これは、例えば、コントローラーオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドプローブがそれぞれセグメントを含む場合に起こり得、これはコントローラーとプローブとの間の二本鎖複合体の形成をもたらす。このため、そのような相補的なセグメントの程度を制限することは有利である。例えば、可能な限り相補性を少なくすることができるように、コントローラー及びプローブのセグメントの長さを調整することができる。好ましくは、コントローラー及びプローブは、相補的配列セグメントを含まない。
【０７１９】
このような理由から、例えば、第１又は第３のプライマー伸長産物の３’セグメントに選択的にハイブリダイズするように、均一形式ではオリゴヌクレオチドプローブを設計することが有利である。これらのセグメントは、コントローラーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされない。
【０７２０】
本発明の別の本質的な態様は、第１の増幅から第２の増幅に切り替える場合の可能なポリメラーゼの変化である：第１のポリメラーゼは不活性化でき、第２のポリメラーゼは活性化できる。これは、例えば、第２の増幅中に５’−３ヌクレアーゼ感受性プローブ（「Ｔａｑｍａｎプローブ」）の使用を可能にする：第１の増幅では、例えば、Ｂｓｔポリメラーゼの大きな断片が好ましい。この断片はＴａｑｍａｎプローブを切断できない。第２の増幅の開始時に、Ｂｓｔポリメラーゼの大きな断片が不活性化され、Ｔａｑポリメラーゼ（例えば、ホットスタートポリメラーゼとして使用される）が活性化される。これは、５’−３’ヌクレアーゼ感受性プローブの使用を可能にする。
【０７２１】
蛍光レポーター及び／又はドナー蛍光色素分子及び／又は蛍光クエンチャーの間で選択される一群に応じて、この変化は、蛍光レポーターのシグナル強度の増加又は減少を導くことができる。この変化は、反応中又は満了後に、既知の適切な手段（例えば、ＳｔｅｐＯｎｅ−ＰＣＲ又はＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ又はＲｏｔｏｒｇｅｎｅなどのリアルタイムＰＣＲ装置で、製造元の指示を参照して）で検出できる。シグナル変化を検出することで、反応の経過、例えば、シグナルの振幅、速度論、時間又はシグナル出現の濃度依存性について引き出される結論を出すことができる。複数の標的配列が使用される場合、複数の反応を並行して観察できるように、マルチプレックス分析は異なるスペクトルプロパティによって適宜コード化できる。
【０７２２】
本発明は、反応の進行の検出に特に有利なオリゴヌクレオチドプローブの様々な実施形態を記載する。
【０７２３】
オリゴヌクレオチドプローブは、好ましくはＤＮＡヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドである。ＤＮＡ以外の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、他のヌクレオチドモノマー、例えば、ＲＮＡ又はヌクレオチド修飾体（例えば、ＰＴＯ、ＬＮＡ、２’−Ｏ−Ｍｅなどの糖リン酸骨格修飾を有する）から構成され得る。別の実施形態では、このオリゴヌクレオチド試料は、ＤＮＡ及び非ＤＮＡ要素（例えば、ＲＮＡ、ＰＴＯ  ＬＮＡ）の両方を含む混合ポリマーである。前記オリゴヌクレオチドプローブは、他のオリゴヌクレオチド修飾、例えば、リンカー又はスペーサー（Ｃ３、ＨＥＧ、脱塩基モノマー、例えばＴＨＦ修飾など）を含み得る。
【０７２４】
オリゴヌクレオチドプローブの塩基組成は、ハイブリダイゼーション条件下で天然の核酸塩基（Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ）と相補的な結合を形成できる塩基を含むことが好ましい。さらなる実施形態では、このプローブはまた、例えば、ユニバーサル塩基（例えば、イノシン、５−ニトロ−インドール）を含む修飾を含む。このプローブは、オリゴヌクレオチドの結合挙動に影響を与えるさらなる修飾、例えば、ＭＧＢ修飾を含むことができる。
【０７２５】
オリゴヌクレオチドプローブの長さは、好ましくは８〜８０ヌクレオチド、特に１２〜８０ヌクレオチド、特に１２〜５０ヌクレオチド、特に１２〜３５ヌクレオチドの間である。オリゴヌクレオチドプローブは通常、形成された生成物の少なくとも１つに相補的に結合できるセグメントを含む。一実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、形成されたプライマー伸長産物の１つに相補的に結合することができない少なくとも１つのさらなるセグメントを含む。
【０７２６】
プローブは、増幅系の他の成分との関係で異なって配置することができる。それにより、特定の実施形態が好ましい。
【０７２７】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、形成されるプライマー伸長産物の少なくとも１つ（Ｐ１．１−Ｅｘｔ、Ｐ２．１−Ｅｘｔ、Ｐ３．１−Ｅｘｔ、Ｐ４．１−Ｅｘｔ）に本質的に相補的な配列セグメントを含み、これは、適切な条件下で、形成されたプライマー伸長産物の少なくとも１つにハイブリダイズすることができる（ハイブリダイゼーション条件）。さらなる実施形態では、配列セグメントは、第１及び／又は第３のプライマー伸長産物に相補的である。さらなる実施形態では、この配列セグメントは、第１及び／又は第３のプライマー伸長産物に相補的であり、オリゴヌクレオチドプローブは、コントローラーオリゴヌクレオチドにより相補的に結合されないそれぞれのプライマー伸長産物の３’セグメントに相補的に結合できる。さらなる実施形態では、この配列セグメントは、第２及び／又は第４のプライマー伸長産物に相補的である。さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブのこの配列セグメントは、１０ヌクレオチド〜５０ヌクレオチド、特に１５〜４０、特に１５〜３０のヌクレオチドの間の範囲の長さを含む。さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブのこの配列セグメントは、コントローラーオリゴヌクレオチドに本質的に相補的である配列領域を含まない。さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブ配列の前記セグメントは、コントローラーオリゴヌクレオチドに本質的に相補的な配列領域を含み、前記セグメントの長さは、２０ヌクレオチド未満、特に１５ヌクレオチド未満、特に１０ヌクレオチド未満、特に５ヌクレオチド未満である。
【０７２８】
さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブのこの配列セグメントは、オリゴヌクレオチドプライマーの１つに本質的に相補的な配列領域を含まない。さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブ配列の前記セグメントは、オリゴヌクレオチドプライマーの１つに本質的に相補的な配列領域を含み、前記セグメントの長さは、２０ヌクレオチド未満、特に１５ヌクレオチド未満、特に１０ヌクレオチド未満、特に５ヌクレオチド未満である。
【０７２９】
さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブのこの配列セグメントは、コントローラーオリゴヌクレオチドの第３の領域の配列と本質的に同一である配列領域を含まない。さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブ配列の前記領域は、コントローラーオリゴヌクレオチドの第３の領域の配列と本質的に同一である配列領域を含み、前記セグメントの長さは、２０ヌクレオチド未満、特に１５ヌクレオチド未満、特に１０ヌクレオチド未満、特に５ヌクレオチド未満である。
【０７３０】
一実施形態では、コントローラーオリゴヌクレオチドは、以下の成分（蛍光レポーター及び／又は蛍光クエンチャー及び／又はドナー蛍光色素分子）の１つを含み、これらの成分の少なくとも１つは、コントローラーオリゴヌクレオチドの第３の領域に位置する。
【０７３１】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、５’−３’ヌクレアーゼによって少なくとも部分的に切断可能である。一実施形態では、コントローラーオリゴヌクレオチドは、少なくともその５’セグメント（コントローラの第３の領域）において５’−３’ヌクレアーゼによって切断可能である。
【０７３２】
さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、標的配列に本質的に相補的な配列セグメント又は増幅産物の１つに含まれるそのセグメントを含み、前記セグメントの長さは、５〜５０ヌクレオチド、特に１０〜４０ヌクレオチド、特に１５〜３０ヌクレオチドの間の範囲である。
【０７３３】
さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、標的配列又はその相補鎖に本質的に相補的な配列セグメントを含まない。例えば、次のことがあり得る：
【０７３４】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブの３’末端は、修飾、例えば、蛍光色素分子又はクエンチャー又はドナーにより、又はポリメラーゼがプライマーとしてオリゴヌクレオチドを使用するのを妨げる別の修飾（例えば、リン酸残基又はＣ３リンカー又はジデオキシヌクレオチド修飾）によりブロックされる。
【０７３５】
さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブの３’末端は自由であり、第１のプライマー伸長産物と相補的に結合でき、ポリメラーゼによる合成を開始することができる。これは、オリゴヌクレオチドプローブがプライマーのように伸長されることを可能にし、プローブ伸長産物の形成をもたらす。
【０７３６】
一実施形態では、プローブの配列組成は、プライマーの配列組成に対応する。
【０７３７】
蛍光レポーター、蛍光クエンチャー又はドナー蛍光色素分子の位置は、オリゴヌクレオチドプローブの実施形態に応じて異なり得る。前記要素は、オリゴヌクレオチドプローブのそれぞれの末端のいずれか１つ又は中央領域のいずれかに共有結合することができる。多くのそのような修飾は当業者に知られており、例えば、ヌクレオチドの３’末端又は５’末端へのＦＡＭレポーターの結合、又はプローブの中央又は内側の配列セグメントにおけるプローブの結合のためのｄＴ−ＢＨＱ１又はｄＴ−ＦＡＭ又はｄＴ−ＴＭＲ修飾の使用である。そのような修飾オリゴヌクレオチドプローブは、商業的供給業者（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ、ＩＤＴ、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から入手できる。
【０７３８】
例えば、オリゴヌクレオチドプローブは、検出ステップの適切な反応条件下での増幅中に形成される第３又は第４のプライマー伸長産物に本質的に相補的に結合できる少なくとも１つの配列セグメントを含む。このプロセスでは、オリゴヌクレオチドプローブは、例えば、合成された第３のプライマー伸長産物の一本鎖３’セグメント又は合成された第４のプライマー伸長産物の５’セグメントに相補的に結合される。そのようなプローブは、コントローラーと同一である、又はコントローラーに相補的であるいずれの配列セグメントも含まない。したがって、プライマー伸長産物及びオリゴヌクレオチドプローブを含む複合体が生成される。合成された第３のプライマー伸長産物へのオリゴヌクレオチドプローブ及びコントローラーオリゴヌクレオチドの結合は、好ましくは配列特異的である。第１のプライマー伸長産物の３’セグメントに相補的なこの配列セグメントの長さは、例えば、８〜８０ヌクレオチド、特に１２〜８０ヌクレオチド、特に１２〜５０ヌクレオチド、特に１２〜３５ヌクレオチド、特に１５〜２５ヌクレオチドの間の範囲である。
【０７３９】
オリゴヌクレオチドプローブ又はコントローラーオリゴヌクレオチドのいずれかに結合した少なくとも１つの蛍光レポーターを含む検出系は、オリゴヌクレオチドプローブの相補配列への結合に応じて、蛍光レポーターのシグナル生成又はシグナル強度を変化させることができる。検出系の実施形態に応じて、この変化は、シグナルの生成又は増加又は減少をもたらし得る。
【０７４０】
増幅中、第３及び第４のプライマー伸長産物は、第３のプライマー伸長産物の３セグメント及び第４のプライマー伸長産物の対応する断片が一本鎖の形で存在するように分離される。オリゴヌクレオチドプローブは、第３のプライマー伸長産物の３’セグメント又は第４のプライマー伸長産物の５’セグメントに、反応中又はその完了後にのみ結合できる。
【０７４１】
結合は本質的に配列特異的であるが、完全な相補性からの相違に耐性であることも可能である。
【０７４２】
オリゴヌクレオチドプローブの結合は、好ましくは増幅を妨げない。プローブの濃度及びその長さは、十分な量のプライマーがプライマー伸長産物の合成を開始できるように調整される。
【０７４３】
反応が進むと、十分な量のプライマー伸長産物が形成され、オリゴヌクレオチドプローブも十分に結合して、検出可能なシグナル変化をもたらすことができる。
【０７４４】
少なくとも１つの蛍光レポーターを含む適切な検出系は、一実施形態では、蛍光レポーターと合致する少なくとも１つの蛍光クエンチャーをさらに含む。これにより、蛍光クエンチャー（クエンチャーとしても知られている）は、接触クエンチャー又はＦＲＥＴクエンチャーとしての機能を果たすことができる。適切な例は文献（「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ」Ｄｉｄｅｎｋｏ編，２００６，例えばＣｈａｐｔｅｒ１及び２；Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ「Ｆｌｕｒｅｓｃｅｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ」，Ｇｅｎｅ  Ｌｉｎｋ  Ｉｎｃにより出版）で知られる。例えば、蛍光レポーターはフルオレセイン（ＦＡＭ）であり得、適切な蛍光クエンチャーはＢＨＱ−１又はＢＨＱ−２又はＴＡＭＲＡであり得る。一実施形態では、グアノシン核酸塩基は、（例えば、レポーターとしてのＦＡＭと組み合わせて）クエンチャーとして作用することができる。蛍光レポーターが適切な光波長で励起されると、クエンチャーの不在下では蛍光シグナルが発せられる。ただし、蛍光レポーターと適切なクエンチャーとが近接している場合、蛍光レポーターの強度は低下する。蛍光レポーターとクエンチャーとの距離／分離が大きくなると、シグナル強度が増加する。
【０７４５】
少なくとも１つの蛍光レポーターを含むさらなる適切な検出系は、一実施形態では、ＦＲＥＴ対が形成されるように蛍光レポーターと合致する少なくとも１つのドナー蛍光色素分子（ドナーとも呼ばれる）をさらに含む。適切な例は文献（「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ」Ｄｉｄｅｎｋｏ編，２００６，例えばＣｈａｐｔｅｒ１及び２；Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ「Ｆｌｕｒｅｓｃｅｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ」，Ｇｅｎｅ  Ｌｉｎｋ  Ｉｎｃにより出版）で知られる。ＦＲＥＴ対は通常、ドナーとアクセプターとを含む（通常、レポーターはアクセプターとして機能する）。例えば、蛍光レポーターはテトラメチルロダミン（ＴＡＭＲＡ）であり得、ＦＲＥＴ対の適切な相手はＦＡＭ（ドナー）であり得、別の例はＦＡＭ（ドナー）及びＣｙ３（アクセプター又はレポーターとして）であり得る。空間的に近接している場合、ドナー（ＦＡＭなど）の励起によりエネルギーがレポーター（ＴＡＭＲＡ又はＣｙ３）へ転移されることを引き起こし、そのため、レポーター自体が電磁放射（検出可能な光シグナル又は蛍光シグナル）としてエネルギーを放出できるようになる。レポーターのこの蛍光シグナルは、適切な手段で検出することができる。レポーターとドナー蛍光色素分子との空間的分離が増加すると、シグナルは徐々に減少し、通常は５０ヌクレオチド（２本鎖の５０ヌクレオチドとして測定）を超える距離からもはや測定可能に検出できなくなる。
【０７４６】
オリゴヌクレオチドプローブ及び／又はコントローラーオリゴヌクレオチド上で検出系の個々の要素を適切に配置することにより、シグナルの増加又はシグナルの減少により、これらの成分の第１のプライマー伸長産物への結合事象を検出することが可能である。
【０７４７】
そのような検出は、増幅中に（例えば、オンライン検出として）、又は適切な時間間隔で、又は反応の終わりのみのいずれかで行うことができる。
【０７４８】
蛍光シグナルは、１つの検出ステップで取得される。この方法の検出ステップでは、オリゴヌクレオチドプローブが第１のプライマー伸長産物（Ｐ１−Ｅｘｔ）の３’セグメントに相補的に結合しているか否かを確認する必要がある。したがって、検出ステップでは、プローブが本質的に相補的な様式で第１のプライマー伸長産物の３’セグメントに結合できるように、反応温度が調整される。前記温度は、増幅中の温度のうちの１つに対応することができる、又は増幅の温度ステップとは別のステップを表すことができる。
【０７４９】
前記ステップの間、反応は、適切な波長の光を使用する光源によって励起することができる。検出系の設計に応じて、波長は蛍光レポーター又はドナー蛍光色素分子の吸収スペクトルに適合される。オリゴヌクレオチドプローブが合成された第１のプライマー伸長産物の３’末端に結合できる場合、蛍光レポーターからのシグナルが期待され得る。前記シグナルは、波長の固有のスペクトルを有し、適切な検出系によって検出及び定量化することができる。現在のリアルタイムＰＣＲデバイスは通常、励起用の光源とレポーターの蛍光を検出するための検出系の両方、及び反応バッチ用の温度制御コンテナーを含む。ＳｔｅｐＯｎｅ、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ、ＲｏｔｏｒＧｅｎｅなどのリアルタイムＰＣＲデバイスが良い例である。
【０７５０】
この検出は、反応中に存在する１つ又は複数の開始核酸鎖を定量化するために使用され得る。さらに、この検出を使用して、反応の開始時の開始核酸鎖の利用性を検出することができる。さらに、検出系は、内部増幅対照と組み合わせて使用できる。
【０７５１】
さらなる実施形態では、２つ以上の核酸鎖は、増幅バッチにおいて特異的に増幅され得る。例えば、特異的な第１のプライマー及び／又は特異的なコントローラーオリゴヌクレオチド及び／又は特異的な第２のプライマーの組み合わせを使用することができる。例えば、標的配列及び内部増幅対照は１つのバッチで増幅される。したがって、個々の核酸鎖の検出を、それらの増幅中に別々にかつ独立して行うことが有利である。
【０７５２】
一実施形態では、特異的な検出系がそれぞれの場合に使用され、それにより、核酸鎖の増幅のモニタリングは、それぞれの場合に特異的な検出系によって実行される。蛍光レポーターからの特異的なシグナルは同時に検出され得る。好ましくは、蛍光レポーターのスペクトル特性は、特徴的な波長でそれぞれの蛍光シグナルを検出することによって行うことができる程度で異なる。例えば、２つ又は３つ又は４つの蛍光レポーターを使用することができる。蛍光シグナルのそれぞれの特異的な波長は、好ましくは、蛍光スペクトルの最大強度（蛍光ピーク）で測定して、約１０ｎｍ超、特に約２０ｎｍ超、特に約３０ｎｍ超である。このような組み合わせが知られている。例えば、ＦＡＭ及び／又はＣｙ３及び／又はＣｙ５又はＦＡＭ及び／又はＨＥＸ及び／又はＲＯＸを含む組み合わせが適切である。それぞれのクエンチャーは、好ましくは、クエンチャーによるシグナル減少が高い効率を有するように、各蛍光レポーターに対して特異的に選択される。例えば、ＦＡＭ／ＢＨＱ−１及びＨＥＸ／ＢＨＱ−２又はＦＡＭ／ＢＨＱ−１及びＣｙ５／ＢＨＱ−２の組み合わせが使用される。
【０７５３】
さらなる実施形態では、異なる核酸鎖の群の増幅のモニタリングを可能にする検出系を使用することができる。前記群は、増幅される２つ以上の核酸鎖を含むことができる。検出系の成分はそれに応じて調整される。一実施形態では、増幅されるべき異なる核酸鎖のそのような群は、例えば、検出ステップの反応条件下でオリゴヌクレオチドプローブの相補的結合に使用されるオリゴヌクレオチドプローブに特異的な少なくとも１つの均一な配列セグメントを含む。さらなる実施形態では、増幅されるべき異なる核酸鎖のそのような群は、例えば、オリゴヌクレオチドプローブの主に相補的な結合のための少なくとも１つの配列セグメントを含み、この配列セグメントの配列組成は、この群内で異なる。これらの差異は、１〜１０ヌクレオチド、好ましくは１〜３ヌクレオチドを含み得る。
【０７５４】
さらなる態様及び実施形態は、本発明を限定することなく本発明を説明する以下の項目に見出される：
項目１：  核酸を増幅する方法であって、
ａ）  第１の標的配列Ｍ［及びＭに（逆）相補的な配列Ｍ’］を含む第１の核酸ポリマーを含む試料であって、Ｍは、配列セグメントＭＰＬ、ＭＳ及びＭＰＲを５’−３’方向に直近の配列に含む、前記試料を、第１の増幅ステップで次の成分：
ｂ）  第１の鋳型依存性核酸ポリメラーゼ、特にＤＮＡポリメラーゼ、並びに鋳型依存性核酸ポリメラーゼの基質（特にリボヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸）及び適切な補因子；
ｃ）  ＭＰＬと（本質的に）同一である第１の左のオリゴヌクレオチドプライマーＰＬ１；
ｄ）  ５’−３’方向に配列セグメントＰＣＲ及びＰＭＲを直近に連続して含む、第１の右のオリゴヌクレオチドプライマーＰＲ１であって、ＰＭＲは、ＭＰＲに相補的な［ハイブリダイズ］配列を有し、配列セグメントＰＣＲはＭに、［又は３’の配列Ｍに関してＭＰＲの直後の配列に］結合できない、前記第１の右のオリゴヌクレオチドプライマーＰＲ１、及び
ここで、ＰＲ１（特にＰＣＲ部位）は、ＰＣＲが第１の鋳型依存性核酸ポリメラーゼを活性化するための鋳型として機能できないように、修飾されたヌクレオチドビルディングブロックを含む；及び
ｅ）  ５’−３’方向に配列セグメントＣＳＲ、ＣＰＲ及びＣＣＲが直近に連続して含まれる、コントローラーオリゴヌクレオチドＣＲであって、ＣＳＲはＭＰＲの５’にあるＭＳのセグメントと同一であり［及びＰＲのポリメラーゼの開始で最初に読み取られる、すなわちＣＳＲはプライマーＰＲ１の重合産物に結合できる］、ＣＰＲはＰＭＲに相補的であり（かつＭＰＲと同一であり）、かつＣＣＲはＰＣＲに相補的である、前記コントローラーオリゴヌクレオチドＣＲ、
及び、ここで、ＣＲは、ＣＳＲが、鋳型依存性核酸ポリメラーゼを活性化するための鋳型として機能できないように、ＣＳＲに修飾されたヌクレオチドビルディングブロックを含む；
と接触する、前記核酸を増幅する方法。
項目２：  配列領域ＰＣＲ及びＰＭＲに加えて、５’においてＭＰＲに隣接する領域にて、標的配列Ｍに本質的に相補的な合成領域ＰＳＲを５’−３’方向に含む、第１のプライマー伸長産物ＰＲ１’が得られ、そして配列領域ＭＰＬに加えて、３’において隣接する領域の標的配列Ｍに本質的に同一の合成領域ＰＳＬを含む、第２のプライマー伸長産物ＰＬ１’が得られ、
そして、
−  いずれかの第１の増幅ステップの反応条件が選択され、及び／又は
−  ＰＣＲ及びＭＳの長さ及び融解温度が、適用可能であれば、選択され、
その結果として、ＰＲ１’はＭと二本鎖を形成でき、［ＰＬ１’はＭ’と二本鎖を形成できる］、［ＰＲ１’はＰＬ１’と二本鎖を形成できる］、かつＰＲ１’はＣと二本鎖を形成でき、かつＰＲ１’及びＣの二本鎖の形成は、ＭとのＰＲ１’の二本鎖の形成よりも（少なくともＭＰＲ領域で）優先される、
項目１に記載の核酸を増幅する方法。
項目３：
−  いずれかの第１の増幅ステップの反応条件が選択され、及び／又は
−  適切に、ＰＣＲの長さ及び融解温度、及びＭＳ及び／又はＭＰＬ及びＭＰＲの位置が選択され、
その結果として、コントローラーオリゴヌクレオチドＣＲがない場合、第１のプライマー伸長産物ＰＲ１’は、第２のプライマー伸長産物ＰＬ１’から分離しない、
項目２に記載の核酸を増幅する方法。
項目４：  第２の増幅ステップにおいて、試料を、以下の成分：
ａ）  第１の２次プライマー結合領域ＭＰＬ２と同一である、第２の左のオリゴヌクレオチドプライマーＰＬ２、
ｂ）  領域ＭＰＲ２に相補的である、第２の右オリゴヌクレオチドプライマーＰＲ２、
ここで、ＭＰＬ２及びＭＰＲ２はＭに含まれ、かつＭＰＬ２の３’末端［少なくとも２０位置］は、ＭＰＲ２の５’末端の５’に位置する（特に、ＭＰＬ２はＭＰＬと同一である及び／又はＭＰＲ２はＭＰＲと同一である）、
と接触する、
項目１〜３のいずれか一項に記載の核酸を増幅する方法。
項目５：  ＰＬ２及び／又はＰＲ２が、それぞれＭＰＬ２と同一又はＭＰＲ２に相補的な配列部分の５’に、配列部分ＰＣＬ２又はＰＣＲ２を［直接］含む、項目４に記載の方法。
項目６：  第２の鋳型依存性核酸ポリメラーゼ、特にＤＮＡポリメラーゼ、並びに任意に鋳型依存性核酸ポリメラーゼの基質（特にリボヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸及び適切な補因子）が、第２の増幅ステップで試料と接触する、項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
項目７：  修飾ヌクレオチドビルディングブロックが２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオシドビルディングブロック、特に２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドビルディングブロックを含むことを特徴とする、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
項目８：  第１の増幅ステップが本質的に等温で行われることを特徴とする、項目１〜７のいずれか一項に記載の方法。
項目９：  ＭＳが、２０ヌクレオチド〜２００ヌクレオチドの長さを有することを特徴とする、項目１〜８のいずれか一項に記載の方法。
項目１０：  ＰＲ１が、１５ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドの範囲の長さを有することを特徴とする、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
項目１１：  ＰＣＲが、５ヌクレオチド〜８５ヌクレオチドの範囲の長さを有すること、特にＰＣＲが、配列セグメントＰＭＲの長さの５０％〜３００％の間を有することを特徴とする、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
項目１２：  ＣＲ（コントローラーオリゴヌクレオチド）が、２０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドの範囲の長さを有することを特徴とする、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
項目１３：  第１の増幅及び第２の増幅が同じ反応バッチで行われることを特徴とする、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
項目１４：  第２の鋳型依存性核酸ポリメラーゼが、熱安定性ポリメラーゼ、特に熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする、項目１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
項目１５：  第１の鋳型依存性核酸ポリメラーゼが、熱的に不活性化可能であること、特に第１の鋳型依存性核酸ポリメラーゼが、中温性ポリメラーゼであることを特徴とする、項目１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
項目１６：  第２の鋳型依存性核酸ポリメラーゼ、第２の右のオリゴヌクレオチドプライマーＰＲ２及び／又は第２の左のオリゴヌクレオチドプライマーＰＬ２が、活性化されることが可能であり、かつ／又はコントローラーオリゴヌクレオチドＣＲが、非活性化されることが可能であることを特徴とする、項目１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
項目１７：  第１の増幅ステップが実施された後、第２の増幅ステップの成分が試料と接触することを特徴とする、項目１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
項目１８：ＣＳＲ及びＣＰＲにおいてＣＲが、第２の右のオリゴヌクレオチドプライマーＰＲ２に配列を特異的に結合することができる配列領域を含むことを特徴とする、項目１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
項目１９：  選択された反応条件、特に第１の増幅ステップの反応条件が、２５℃〜８０℃、特に５０〜７０℃の範囲の反応温度を含むことを特徴とする、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
項目２０：  項目１〜１９のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、
−  ５’−３’方向に配列セグメントＰＣＲ及びＰＭＲを直近に連続して含む、第１の右のオリゴヌクレオチドプライマーＰＲ１であって、ＰＭＲは、真核生物又は病原性細菌、特に哺乳動物、特にヒトの標的配列のゲノム配列Ｍのプライマー結合部位ＭＰＲに結合することができ、５’−３’方向においてＭは、配列セグメントＭＰＬ、ＭＳ及びＭＰＲを直近に連続して含み、配列セグメントＰＣＲは、ＭＰＲの３’に直接に位置する配列に結合できない、そして
ＰＲ１（特にＰＣＲ部位）は、ＰＣＲが第１の鋳型依存性核酸ポリメラーゼを活性化するための鋳型として機能できないように、修飾されたヌクレオチドビルディングブロックを含む、前記第１の右のオリゴヌクレオチドプライマーＰＲ１；及び
−  ＭＰＬと（本質的に）同一である、第１の左のオリゴヌクレオチドプライマーＰＬ１
−  ５’−３’方向に配列セグメントＣＳＲ、ＣＰＲ及びＣＣＲを直近に連続して含む、コントローラーオリゴヌクレオチドＣＲであって、ＣＳＲはＭＰＲの５’にあるＭＳのセグメントと同一であり［かつＰＲのポリメラーゼの開始時に最初に読み取られる、したがってＣＳＲはプライマーＰＲ１の重合産物に結合でき］、ＣＰＲはＰＭＲに相補的であり（かつＭＰＲと同一であり）、かつＣＣＲはＰＣＲに相補的である、及び
ここで、ＣＳＲにおいてＣＲは、ＣＳＲが、鋳型依存性核酸ポリメラーゼを活性化するための鋳型として機能できないような方法で修飾されたヌクレオチドビルディングブロックを含む、前記コントローラーオリゴヌクレオチドＣＲ；
−  第１の２次プライマー結合領域ＭＰＬ２と同一である、第２の左のオリゴヌクレオチドプライマーＰＬ２、及び
−  領域ＭＰＲ２に相補的である、第２の右のオリゴヌクレオチドプライマーＰＲ２であって、
ここで、ＭＰＬ２及びＭＰＲ２は、Ｍに含まれ、かつＭＰＬ２の３’末端［少なくとも２０位置］は、ＭＰＲ２の５’末端の５’に位置する（特に、ＭＰＬ２はＭＰＬと同一である及び／又はＭＰＲ２はＭＰＲと同一である）、前記第２の右のオリゴヌクレオチドプライマーＰＲ２、
を含む、前記キット。
項目２１：  第２の鋳型依存性核酸ポリメラーゼ、特にＤＮＡポリメラーゼ、及び任意にＤＮＡポリメラーゼの基質（特にリボヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸）及び適切な補因子、特に中温性鋳型依存性ポリメラーゼ、特に５’−３’エキソヌクレアーゼ活性のない中温性鋳型依存性ポリメラーゼをさらに含む、項目２０に記載のキット。
項目２２：  第２の鋳型依存性核酸ポリメラーゼ、特にＤＮＡポリメラーゼ、及び任意に鋳型依存性核酸ポリメラーゼの基質（特にリボヌクレオシド三リン酸又はデオキシリボヌクレオシド三リン酸）、及び適切な補因子、特に好熱性鋳型依存性ポリメラーゼ、特に５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する好熱性鋳型依存性ポリメラーゼをさらに含む、項目２０及び２１のいずれか一項に記載のキット。
項目２３：  核酸を増幅する方法であって、次のステップ：
ａ）  第１の増幅のステップであり、次のステップ：
−  第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）を、標的配列を含む増幅される核酸にハイブリダイズさせるステップであり、該第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）は以下の領域：
・  増幅される核酸の領域に配列特異的に結合できる第１の領域であり、増幅される核酸の領域が、標的配列の少なくとも５’末端を含む、又は標的配列の５’方向に配置される、前記第１の領域；
・  第１の領域の５’末端に隣接する、又はリンカーを介して接続される第２の領域であり、第２の領域が、コントローラーオリゴヌクレオチドによって結合されることができ、選択した反応条件下で使用されるポリメラーゼによって本質的にコピーされないままである、第２の領域
を含む、前記ステップ；、
−  第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）に加えて増幅される核酸又は標的配列に本質的に相補的である合成領域を含む、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）を得るための第１のポリメラーゼによる第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）の伸長のステップであり、第１のプライマー伸長産物及び増幅される核酸が、二本鎖として存在する、前記ステップ；
−  第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）へのコントローラーオリゴヌクレオチド（Ｃ１．１）の結合のステップであり、コントローラーオリゴヌクレオチド（Ｃ１．１）は以下の領域：
・  第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）の第２の領域（オーバーハング）に結合できる第１の領域、
・  第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）の第１の領域に本質的に相補的である第２の領域、及び
・  プライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）の第１のセグメントの合成領域の少なくとも一部に本質的に相補的な第３の領域；及び
ここで、コントローラーオリゴヌクレオチド（Ｃ１．１）は、第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）のプライマー伸長の鋳型として機能せず、かつ第１のコントローラーオリゴヌクレオチド（Ｃ１．１）は、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）の第１及び第２の領域に結合するのと同時に、第１及び第２の領域に相補的に、増幅される核酸の領域を置換する；
を含む、前記ステップ、
−  第２のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ２．１）を第１のプライマー伸長産物にハイブリダイズするステップであり、第２のプライマー（Ｐ２．１）は、標的配列の少なくとも５’末端に相補的である、又はその３’方向に配置される、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）の合成領域に配列特異的に結合できる領域を含む、前記ステップ；
−  第２のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ２．１）に加えて、増幅される核酸又は標的配列に本質的に同一である合成領域を含む、第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１−Ｅｘｔ）を得るための第１のポリメラーゼによる第２のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ２．１）の伸長のステップであり、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）及び第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１）が、第１の二本鎖増幅生成物を形成する、前記ステップ；
を含む、前記第１の増幅のステップ、及び
（ｂ）  第２の増幅のステップであり、次のステップ：
−第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．２）を第１の増幅産物の第２のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）にハイブリダイズするステップであり、第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．２）が、標的配列の５’末端を少なくとも含む、又はその５’方向に配置される、第２のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）のセグメントに配列特異的に結合できる第１の領域を含む、前記ステップ；
−  第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．２）に加えて、第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１−Ｅｘｔ）又は標的配列に本質的に相補的である合成領域を含む第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．２−Ｅｘｔ）を得るための第２のポリメラーゼによる第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．２）の伸長のステップであって、第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１）及び第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１）が二本鎖として存在する、前記ステップ；
−  第４のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ４．２）を第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）にハイブリダイズするステップであり、第４のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ４．２）は、標的配列の少なくとも５’末端に相補的である、又はその３’方向に配置される、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）の合成領域に配列特異的に結合できる第１の領域を含む、前記ステップ；
−  第４のオリゴヌクレオチドプライマーに加えて、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）に本質的に相補的である、又は標的配列と同一である合成領域を含む第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．２−Ｅｘｔ）を得るための、第２のポリメラーゼによる第４のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ４．２）の伸長のステップであり、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）及び第４プライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ）は二本鎖として存在する、前記ステップ；
−  第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）及び第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．２−Ｅｘｔ）からの二本鎖、並びに第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１）及び第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１）からの二本鎖を分離するステップ；
−  第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．２）を第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．２−Ｅｘｔ）にハイブリダイズし、第２のポリメラーゼによって第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．２）を伸長するステップ；及び
−  第４のオリゴヌクレオチドプライマーを、第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．２−Ｅｘｔ）にハイブリダイズし、第２のポリメラーゼによって第４のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ４．２）を伸長するステップ、
を有する前記第２の増幅のステップ、
を含む、前記方法。
項目２４：  第１の増幅のステップは、第１の増幅産物が１０〜１００，０００，０００，００００、特に１００〜１０００，０００，０００、特に１０００〜１００，０００，０００の範囲のコピー数で存在するまで繰り返されることを特徴とする、項目２３に記載の方法。
項目２５：第３のオリゴヌクレオチドプライマー及び／又は第４のオリゴヌクレオチドプライマーが、第１の領域の５’末端に隣接する、又はリンカーを介して接続される第２の領域を有し、第２の領域が、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）又は第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１−Ｅｘｔ）に相補的に結合できないことを特徴とする、項目２３又は２４に記載の方法。
項目２６：第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）及び第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．２−Ｅｘｔ）の二本鎖の分離、並びに第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１）及び第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１）の二本鎖の分離は、熱変性によって、特に８５℃〜１０５℃の範囲の温度で実施されることを特徴とする、項目２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
項目２７：  第１のポリメラーゼ及び第２のポリメラーゼが同一であることを特徴とする、項目２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
項目２８：
−  第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）及び第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．２）は、本質的に同一であること；及び／又は
−  第２のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ２．１）及び第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ４．２）は、本質的に同一であること、
を特徴とする、項目２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
項目２９：  第１の増幅及び第２の増幅が、同じ反応バッチで行われることを特徴とする、項目２３〜２８のいずれか一項に記載の方法。
項目３０：  第２のポリメラーゼ、第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．１）及び／又は第４のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ４．１）が活性化されることが可能であり、かつ／又はコントローラーオリゴヌクレオチド（Ｃ１．１）が非活性化されることが可能であることを特徴とする、項目２９に記載の方法。
項目３１：  第１の増幅が第１の反応バッチで行われ、そして第２の増幅が第２の反応バッチで行われることを特徴とする、項目２３〜２８のいずれか一項に記載の方法。
項目３２：  第１の反応バッチのアリコート又は完全な第１の反応バッチが、第２の反応バッチに添加されることを特徴とする、項目３１に記載の方法。
項目３３：  コントローラーオリゴヌクレオチド（Ｃ１．１）が、第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．２）に配列特異的に結合することができる第４の領域を含むことを特徴とする、項目２３〜３２のいずれか一項に記載の方法。
項目３４：  第１の増幅が本質的に等温で行われることを特徴とする、項目２３〜３３のいずれか一項に記載の方法。
項目３５：第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）が、第２の領域に、特に第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１の領域の直後に１つ以上の修飾を含み、これにより、第２の領域で、第１のポリメラーゼを停止することを特徴とする、項目２３〜２４のいずれか一項に記載の方法。
項目３６：  項目２３〜３５のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、
−  第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）であり、以下の領域：
・  増幅される核酸の領域に配列特異的に結合できる第１の領域であり、増幅される核酸の領域が、少なくとも標的配列の５’末端を含む、又はそれ自体が標的配列の５’方向に配置される、前記第１の領域；
・  第１の領域の５’末端に近接する、又はリンカーを介して接続される第２の領域であり、第２の領域が、第１のコントローラーオリゴヌクレオチドにより結合されることができ、選択した反応条件下で増幅に使用されるポリメラーゼによって本質的にコピーされないままである、前記第２の領域；
ここで、第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）は、第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）に加えて、合成領域を含む第１のプライマー伸長産物へポリメラーゼによって伸長されることが可能である；
を有する前記第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）、
−  第２のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ２．１）であって、第２のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ２．１）は、標的配列の５’末端に少なくとも相補的である、又はその３’方向に配置される第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）の合成セグメントに配列特異的に結合できる領域を含み、そしてオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ２．１）に加えて合成セグメントを含む第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１−Ｅｘｔ）へポリメラーゼによって伸長されることが可能である、前記第２のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ２．１）、
−  コントローラーオリゴヌクレオチド（Ｃ１．１）であって、以下の領域：
・  第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）の第２の領域に結合できる第１の領域、
・  第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）の第１の領域に本質的に相補的である第２の領域、及び
・  プライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）の第１の領域の合成領域の少なくとも一部に本質的に相補的な第３の領域；
を含み、
ここで、コントローラーオリゴヌクレオチド（Ｃ１．１）は、第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）のプライマー伸長の鋳型として機能せず、かつ該コントローラーオリゴヌクレオチド（Ｃ１．１）は、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）の第１及び第２の領域に結合すると同時に、第１及び第２の領域に相補的に増幅される核酸の領域を置換する、前記コントローラーオリゴヌクレオチド（Ｃ１．１）；
−  第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．２）であって、第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．２）は、標的配列の少なくとも５’末端を含む、又はその５’方向に配置される第２のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）の領域に、配列特異的に結合することができ、そして第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．２）に加えて合成領域を含む第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．２−Ｅｘｔ）にポリメラーゼによって伸長することができる第１の領域を含む、前記第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．２）；及び
−  第４のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ４．２）であって、第４のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ４．２）は、標的配列の５’末端に少なくとも相補的である、又はその３’方向に配置される第１のプライマー伸長産物（Ｐ１−Ｅｘｔ）の合成領域に配列特異的に結合でき、そしてオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ４．２）に加えて合成領域を含む第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．２−Ｅｘｔ）にポリメラーゼによって伸長されることが可能である第１の領域を含む、前記第４のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ４．２）、
を含む、前記キット。
項目３７：  項目２３〜３５のいずれか一項に記載の方法を実施するための項目３６に記載のキットの使用。
項目３８：  核酸を増幅する方法であって、次のステップ：
ａ）第１の増幅のステップであり、次のステップ：
−  標的配列を含む開始核酸１．１の提供のステップ、
−  第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）を標的配列（開始核酸１．１又はＰ２．１−Ｅｘｔのいずれか）を有する増幅させる核酸にハイブリダイズさせるステップであり、第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）は以下の領域：
・  増幅させる核酸の領域（Ｐ２．１Ｅ１）に配列特異的に結合できる第１の領域（Ｐ１．１．１）、
・  第１の領域の５’末端に隣接する、又はリンカーを介して接続される第２の領域（Ｐ１．１．２）であり、第２の領域が、コントローラーオリゴヌクレオチドにより結合されることができ、選択した反応条件下で使用されるポリメラーゼによって本質的にコピーされないままである、前記第２の領域（Ｐ１．１．２）；
を含む、前記ステップ
−  第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）に加えて、増幅される核酸又は標的配列に本質的に相補的である合成セグメント（Ｐ１．１Ｅ１からＰ１．１Ｅ４）を含む、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）を得るための、第１のポリメラーゼによる第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）の伸長のステップであり、第１のプライマー伸長産物及び増幅される核酸が、二本鎖として存在する、前記ステップ；
−  第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）へのコントローラーオリゴヌクレオチド（Ｃ１．２）の結合のステップであり、コントローラーオリゴヌクレオチド（Ｃ１．２）は以下の領域；
・  第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１Ｅ６）の第２の領域（オーバーハング）に結合できる第１の領域（Ｃ１．２．１）、
・  第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１．１）の第１の領域に相補的である第２の領域（Ｃ１．２．２）、及び
・  第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１Ｅ４）の合成領域の少なくとも一部に本質的に相補的な第３の領域（Ｃ１．２．３）；を含み、及び
ここで、コントローラーオリゴヌクレオチド（Ｃ１．１）は、第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）のプライマー伸長の鋳型として機能せず、かつ第１のコントローラーオリゴヌクレオチド（Ｃ１．１）は、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１Ｅ６、Ｐ１．１Ｅ５、Ｐ１．１Ｅ４）に結合すると同時に、前記領域に増幅される核酸の相補的領域（Ｐ２．１Ｅ１，Ｐ２．１Ｅ２）を置換する、前記ステップ；
−  第２のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）を第１のプライマー伸長産物にハイブリダイズするステップであり、第２のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ２．１）は、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１Ｅ１）の合成領域に配列特異的に結合できる領域（Ｐ２．１．１）を含む、前記ステップ、
−  第２のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ２．１）に加えて増幅される核酸又は標的配列に本質的に同一である合成領域（Ｐ２．１Ｅ４からＰ２．１Ｅ１）を含む、第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１−Ｅｘｔ）を得るための第１のポリメラーゼによる第２のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ２．１）の伸長のステップであり、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）及び第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１）が、第１の二本鎖増幅生成物を形成する、前記ステップ；及び
−  所望の量の第１の増幅産物が合成されるまで、第１の増幅のステップが繰り返される必要があるステップ、
を含む、前記第１の増幅のステップ、
ｂ）第２の増幅のステップであり、次のステップ：
−  第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．２）を第２及び／又は第４のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ又はＰ４．１−Ｅｘｔ）にハイブリダイズするステップであり、第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．２）は、第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１Ｅ１）及び第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．１Ｅ２）の領域に配列を特異的に結合できる第１の領域（Ｐ３．１．１）を含む、前記ステップ、
−  第３のプライマー伸張産物に加えて、第２のプライマー伸張産物（Ｐ２．１−Ｅｘｔ）又は標的配列に本質的に相補的である合成領域（Ｐ３．１Ｅ５からＰ３．１Ｅ２又はＰ３．１Ｅ５からＰ３．１Ｅ１）を有する第３のオリゴヌクレオチドプライマー伸長産物（Ｐ３．２−Ｅｘｔ）を得るための第２のポリメラーゼによる第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．２）の伸長のステップであって、第２のプライマー伸張産物（Ｐ２．１）及び第３のプライマー伸張産物（Ｐ３．１）が二本鎖として存在する、前記ステップ；
−  第４のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ４．２）を第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）及び／又は第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ）にハイブリダイズするステップであり、第４のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ４．２）は、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１Ｅ１）及び第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１Ｅ２）の合成領域に配列特異的に結合できる第１のセグメント（Ｐ４．１．１）を含む、前記ステップ、
−  第４のオリゴヌクレオチドプライマーに加えて、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）に本質的に相補的である、又は標的配列と本質的に同一である合成領域（Ｐ４．１Ｅ５からＰ４．１Ｅ２又はＰ４．１Ｅ５からＰ４．１Ｅ１）を含有する第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．２−Ｅｘｔ）を得るための、第２のポリメラーゼによる第４のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ４．２）の伸長のステップであり、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）及び第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ）は二本鎖として存在する、前記ステップ；
−  第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）及び第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．２−Ｅｘｔ）の二本鎖を分離し、及び第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１−Ｅｘｔ）及び第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ）の二本鎖を分離し、及び第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ）及び第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ）の二本鎖を分離するステップ；
−  第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．２）を第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．２−Ｅｘｔ）にハイブリダイズし、第２のポリメラーゼによって第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．２）を伸長するステップ；及び
−  第４のオリゴヌクレオチドプライマーを、第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．２−Ｅｘｔ）にハイブリダイズし、第２のポリメラーゼによって第４のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ４．２）を伸長するステップ、
を含む、前記第２の増幅のステップ、
を含む、前記方法。
項目３９：  第１の増幅のステップは、第１の増幅産物が１０〜１００，０００，０００，００００、特に１００〜１０００，０００，０００、特に１０００〜１００，０００，０００の範囲のコピー数で存在するまで繰り返されることを特徴とする、項目３８に記載の方法。
項目４０：  第３のオリゴヌクレオチドプライマー及び／又は第４のオリゴヌクレオチドプライマーが、第１の領域の５’末端に隣接する第２の領域（それぞれＰ３．１．２又はＰ４．１．２）を有し、第２の領域は、第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）又は第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１−Ｅｘｔ）に相補的に結合できないことを特徴とする、項目３８又は３９に記載の方法。
項目４１：  第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）及び第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．２−Ｅｘｔ）の二本鎖の分離、及び第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１−Ｅｘｔ）及び第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ）の二本鎖の分離、及び第４のプライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ）及び第３のプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ）の二本鎖の分離は、特に８５℃〜１０５℃の範囲の温度での熱変性によって実現されることを特徴とする、項目３８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
項目４２：  第１のポリメラーゼ及び第２のポリメラーゼが同一であることを特徴とする、項目３８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
項目４３：
・  第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）及び第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．２）は、本質的に同一であること；及び／又は
・  第２のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ２．１）及び第４のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ４．２）は、本質的に同一であること、
を特徴とする、項目３８〜４２のいずれか一項に記載の方法。
項目４４：  第１の増幅及び第２の増幅が、同じ反応バッチで行われることを特徴とする、項目３８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
項目４５：  第２のポリメラーゼ、第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．１）及び／又は第４のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ４．１）が活性化されることが可能であり、及び／又はコントローラーオリゴヌクレオチド（Ｃ１．１）が非活性化されることが可能であることを特徴とする、項目４４に記載の方法。
項目４６：蛍光色素で標識された第１のオリゴヌクレオチドプローブが、第３のプライマー伸長産物に相補的に結合でき、蛍光色素のシグナルが検出されることを特徴とする、項目３８〜４５のいずれか一項に記載の方法。
項目４７：  蛍光色素で標識された第１のオリゴヌクレオチドプローブが、第４のプライマー伸長産物に相補的に結合でき、蛍光色素のシグナルが検出されることを特徴とする、項目３８〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【実施例】
【０７５５】
材料及び方法：
試薬は、以下の業者から購入した：
【０７５６】
未修飾及び修飾のオリゴヌクレオチド（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、Ｂｉｏｍｅｒｓ、Ｔｒｉｌｉｎｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＩＢＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ポリメラーゼＮＥＢ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）；ｄＮＴＰ’ｓ：Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；挿入ＥｖａＧｒｅｅｎ色素：Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；緩衝物質及びその他の化学物質：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；プラスチック製品：Ｓａｒｓｔｅｄｔ
【０７５７】
溶液１（増幅反応溶液１）：
グルタミン酸カリウム、５０ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ  ８．０；酢酸マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／ｌ；ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ）、それぞれ２００μｍｏｌ／ｌ；ポリメラーゼ（Ｂｓｔ２．０ＷａｒｍＳｔａｒｔ、１２０．０００Ｕ／ｍｌ  ＮＥＢ）、１２ユニット／１０μｌ；ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％（ｖ／ｖ）；ＥＤＴＡ、０．１ｍｍｏｌ／ｌ；ＴＰＡＣ（塩化テトラプロピルアンモニウム）、５０ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ  ８．０；ＥｖａＧｒｅｅｎ色素（色素は、メーカーの指示に従って１：５０の希釈で使用した）。
【０７５８】
溶液２（増幅反応溶液２）：
１ｘ等温緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）；単一濃度でこの緩衝液には次を含む：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４；５０ｍＭ  ＫＣｌ；２ｍＭ  ＭｇＳＯ４；０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０；ｐＨ  ８．８、２５℃にて）；ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ）、各２００μｍｏｌ／ｌ；
ＥｖａＧｒｅｅｎ色素（色素は、メーカーの指示に従って１：５０の希釈で使用した）
【０７５９】
溶液４（増幅反応溶液４）；１ｘ等温緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）上記参照。
すべての濃度は、反応における最終濃度である。標準反応からの偏差は、それに応じて示される。
【０７６０】
関与する成分の融解温度（Ｔｍ）は、溶液１中の各成分の濃度が１μｍｏｌ／ｌで測定される。偏差パラメーターは、それぞれの場合に与えられる。
【０７６１】
反応に関する一般情報（第１の増幅）
Ｂｓｔ  ２．０ポリメラーゼウォームスタートは、温度感受性オリゴヌクレオチド（メーカーの仕様に従う）により低温での機能が大幅に抑制されるため、反応溶液を反応温度に加熱することによって、反応を開始した。ポリメラーゼは４５℃を超える温度でますます活性になる。６５℃の温度では、ポリメラーゼＢｓｔ２．０及びＢｓｔ２．０ウォームスタートの間に違いは検出することができなかった。反応の調整段階中に大量の副産物（プライマーダイマーなど）が形成されるのを防ぐために、ポリメラーゼＢｓｔ２．０ウォームスタートを使用した。これによる偏差は具体的に示される。
【０７６２】
反応溶液を、８０℃を超えて（例えば、９５℃で１０分）加熱することにより反応を停止させた。この温度では、ポリメラーゼＢｓｔ２．０は不可逆的に変性し、合成反応の結果を後で変更することはできない。
【０７６３】
反応は、蛍光測定デバイスを備えたサーモスタットで行われた。この目的のために、市販のリアルタイムＰＣＲデバイスであるＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒから供給）を使用した。標準反応容量は１０μｌであった。これによる偏差は示される。
【０７６４】
終点の決定及び速度論的観察の両方が行われた。終点の決定において、シグナルは、例えば、核酸に結合された色素により、例えば、ＴＭＲ（テトラメチルローダミン、ＴＡＭＲＡとも呼ばれる）又はＦＡＭ（フルオレセイン）により記録された。ＦＡＭ及びＴＭＲの蛍光シグナルの励起及び測定用の波長は、ＳｔｅｐＯｎｅ  ＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲデバイスにデフォルト設定として保存されている。また、挿入染料（ＥｖａＧｒｅｅｎ）を終点測定（例えば、融解曲線の測定）に使用した。ＥｖａＧｒｅｅｎは挿入色素であり、頻繁に使用される色素Ｓｙｂｒｇｒｅｅｎのアナログであるが、ポリメラーゼの阻害はわずかに低くなっている。ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ及びＥｖａＧｒｅｅｎの蛍光シグナルの励起と測定用の波長は同一であり、工場設定としてＳｔｅｐＯｎｅ  ＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲデバイスに保存されている。蛍光は、内蔵の検出器によって連続的に、つまり「オンライン」又は「リアルタイム」で検出できる。ポリメラーゼはその合成中に二本鎖を合成するため、この手法は反応の速度論的測定（リアルタイムモニタリング）に使用できた。ＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓデバイスのカラーチャンネル間の特定の混信により、１μｍｏｌ／Ｌ（例えば、１０μｍｏｌ／Ｌ）を超える濃度のＴＭＲ標識プライマーを使用した測定で、基礎シグナル強度の増加が観察されることがあった。Ｓｙｂｒ−ＧｒｅｅｎチャネルのＴＭＲシグナルが基礎シグナル強度の増加をもたらすことが観察された。前記の高められた基礎値を計算に考慮した。
【０７６５】
反応過程の速度論的観察は、フルオレセイン（ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡフレット対）又は挿入色素（ＥｖａＧｒｅｅｎ）からの蛍光シグナルを使用して定期的に記録した。シグナルの時間依存性を記録した（ＳｔｅｐＯｎｅ  ｐｌｕｓＰＣＲデバイスを用いるリアルタイムのシグナル取得）。対照反応と比較した反応中のシグナルの増加は、バッチの構造に応じて解釈した。例えば、Ｅｖａｇｒｅｅｎ色素を使用した場合のシグナルの増加は、反応中の二本鎖核酸鎖の量の増加を示すものと解釈し、したがってＤＮＡポリメラーゼによる合成の結果として解釈した。
【０７６６】
いくつかの反応では、反応後に融解曲線測定を行った。このような測定により、例えば、挿入色素を吸収し、したがって、色素のシグナル強度を大幅に増幅できる二本鎖が存在すると結論を出すことが可能である。温度が上昇すると、二本鎖の割合が減少し、シグナル強度も減少する。シグナルは、核酸鎖の長さ及び配列組成に依存する。前記技術は、当業者に十分に知られている。
【０７６７】
かなりの量の修飾された核酸鎖（例えば、コントローラーオリゴヌクレオチド又はプライマー）を含有する反応に関連して融解曲線分析を使用する場合、ＥｖａＧｒｅｅｎ色素からのシグナルは、例えば、ＤＮＡのＢ型と修飾された核酸鎖のＡ型との間で異なった挙動を示すことができることがわかった。例えば、二本鎖核酸鎖（通常は古典的なＤＮＡセクションで想定される）のＢ型において、（例えば、ヌクレオチドのいくつかの２’−Ｏ−Ｍｅ修飾による）Ａ型に類似の形態と推測することができる核酸塩基の同じ配列を有する二本鎖核酸鎖よりも高いシグナル強度が観察された。この観察は、挿入色素を使用する場合に考慮された。
【０７６８】
必要に応じて、反応をキャピラリー電気泳動で分析し、形成された断片の長さを標準と比較した。キャピラリー電気泳動の調製として、標識された核酸の濃度が約２０ｎｍｏｌ／ｌであるような範囲に、反応混合物を緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ  ８．０、及びＥＤＴＡ、２０ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ  ８．０）で希釈した。キャピラリー電気泳動を、ＧＡＴＣ−Ｂｉｏｔｅｃｈ（コンスタンス、ドイツ）が契約サービスとして実施した。この供給者によれば、キャピラリー電気泳動は、ＰＯＰ７ゲルマトリックスを使用したサンガーシーケンシングの標準的な条件下で、約５０℃、定電圧（約１０ｋＶ）で、ＡＢＩ３７３０キャピラリーシーケンサーで行われた。使用された条件は、二本鎖の変性をもたらし、その結果、キャピラリー電気泳動では、一本鎖形態が核酸鎖から分離された。電気泳動は遺伝子分析における標準的な技術である。今日、自動化キャピラリー電気泳動がサンガーシーケンシングに通常、使用されている。蛍光シグナルは、キャピラリー電気泳動（通常は仮想フィルターを使用）中に継続的に記録され、その結果、シグナル強度が電気泳動の継続時間に相関する電気泳動図が得られる。短い断片、例えば、未使用のプライマーの場合、より早いシグナルピークが観察され、より長い断片の場合、伸長セグメントの長さに比例するシグナルのタイムシフトが存在する。伸長断片の長さは、既知の長さの対照を使用して測定することができる。この技術は当業者に知られており、断片長多型のための標準としても使用されている。
【０７６９】
特定のシーケンスに関して別段の定義がない限り、大文字及び小文字のａｇｃｔとＡＧＣＴの両方は、ＤＮＡのデオキシリボヌクレオチドビルディングブロック、又は対応するリボヌクレオチド又は塩基アナログを示す。いくつかの実施例では、ウラシル核酸塩基を修飾された配列セグメントで使用し、それにより、２’−ＯＭｅ修飾を糖として使用した（２’−Ｏ−メチル修飾を有するリボース）。他の２’−Ｏ−アルキル修飾も可能である。ｄＵＴＰを伴うバッチ（特に第１の増幅反応）では、（汚染に対する保護として）ｄＵＭＰを含む増幅断片が生成される。しかしながら、一般に、ウラシル塩基は、リボースと同様に２’−デオキシリボースを有して使用することができる。当業者は、古典的なＤＮＡ骨格、ＲＮＡ、又は塩基アナログをどの点で有効に適用できるかを決定するために、新たな事実から、本明細書で使用される配列のそれぞれの配列セグメントに関連する全体の教示として応用する。
【０７７０】
実施例１（図３６）
標的配列の供給源としてのヒトゲノムＤＮＡの使用
この実施例は、標的配列の供給源としてのヒトゲノムＤＮＡ（ｈｇＤＮＡ）の使用を示す。第Ｖ因子ライデン遺伝子（ホモサピエンス凝固第Ｖ因子（Ｆ５）、ｍＲＮＡ、ここではＦＶＬ遺伝子と呼ぶ）の配列セグメントを標的配列として選択した。
【０７７１】
第１の増幅のみを実行した。この実施例は、コントローラー依存性の第１の増幅を実行できることを示す。この実施例では、第２の増幅を行わなかった。
【０７７２】
標的配列：
【化１】
2021514637.tif 000003
【０７７３】
第１のオリゴヌクレオチドプライマーの結合配列には下線が引かれている。第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、その３’セグメントで二重下線付き配列の逆相補配列に結合する。
【０７７４】
第１のプライマー、第２のプライマー、及びコントローラーオリゴヌクレオチドを、遺伝子のＦＶＬ変異の変異体のために設計及び合成した。
【０７７５】
第１のオリゴヌクレオチドプライマー：  Ｐ１Ｆ５−２００−ＡＥ２０５３
【化２】
2021514637.tif 000004
【０７７６】
反応でプライマーとして使用されるセグメントには下線が引かれている。
【０７７７】
Ａ＝２’−デオキシアデノシン；Ｃ＝２’−デオキシシトシン；Ｇ＝２’−デオキシグアノシン；Ｔ＝２’−デオキシチミジン（チミジン）
【０７７８】
このオリゴヌクレオチドは以下の修飾を含む：
１＝Ｃ３リンカーを使用して、第２のプライマー伸長産物の合成を停止した。
【０７７９】
角括弧内のプライマー［ＣＵＣＵ  ＧＡＵＧＣＵＵＣ］のセグメントは、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含み、コントローラーオリゴヌクレオチドの第１の領域に結合する第２のプライマー領域として機能した。
Ａ＝（２’−Ｏ−メチルアデノシン）；Ｇ＝（２’−Ｏ−メチルグアノシン）；Ｃ＝（２’−Ｏ−メチルシトシン）；Ｕ＝（２’−Ｏ−メチルウリジン）
【０７８０】
このオリゴヌクレオチドプライマーは、第１の領域（３’末端から１〜１２の位置）、第２の領域（Ｃ３リンカー、及び３’末端から１３〜２４の位置）、及び追加の配列変異体Ｐ１を持つセグメント（３’末端から２５〜５７の位置）を含む。第１の領域及び第２の領域は、特異的な増幅を行うために必要であり、「第１のプライマーの基本構造」又は「第１のプライマーの最小構造」として概要することができる。追加の配列変異体Ｐ１は、第１のオリゴヌクレオチドプライマーに組み込むことができる追加のセグメントの例を提供する。１〜１２の位置は、第２のプライマー伸長産物の合成用の鋳型として機能する。Ｃ３修飾及び第２の領域は、第２のプライマー伸長産物の合成中に２５〜５７の位置での合成の継続を妨げる。
【０７８１】
プライマー２：  Ｐ２Ｇ３−５２７０−７０６３  
【０７８２】
【化３】
2021514637.tif 000005
【０７８３】
反応でプライマーとして使用されるセグメントには下線が引かれている。
【０７８４】
このオリゴヌクレオチドは以下の修飾を含む：
６  ＝  ＨＥＧリンカー
Ａ＝２’−デオキシアデノシン；Ｃ＝２’−デオキシシトシン；Ｇ＝２’−デオキシグアノシン；Ｔ＝２’−デオキシチミジン（チミジン）
【０７８５】
このオリゴヌクレオチドプライマーは、コピー可能な領域とコピー不可能な領域とを含む。コピー可能な領域は、（ｈｇＤＮＡ内のＦＶＬ遺伝子の配列に相補的に結合できる３’末端から１〜１３の位置と、ＦＶＬ遺伝子の配列に相補的に結合しないが、増幅中に第１のプライマー伸長産物に結合できる１４〜３５の位置）を含む。コピー可能な領域は、「第２プライマーの基本構造」又は「第２プライマーの最小構造」として要約できる。
【０７８６】
コピー不可能な領域（ＦＶＬ遺伝子の配列に相補的に結合しない３’末端から３６〜７０の位置）は、ＨＥＧ修飾によってコピー可能な領域から分離され、これにより、第１のプライマー伸長産物の合成中の３６〜７０の位置での合成の継続を妨げる。コピー不可能なセグメントは、第２のオリゴヌクレオチドプライマーに組み込むことができる、追加の配列変異体Ｐ２の例である。
【０７８７】
以下のコントローラーオリゴヌクレオチドを使用した：  ＡＤ−Ｆ５−１００１−５０３
【化４】
2021514637.tif 000006
Ａ＝２’−デオキシアデノシン；Ｃ＝２’−デオキシシトシン；Ｇ＝２’−デオキシグアノシン；Ｔ＝２’−デオキシチミジン（チミジン）
【０７８８】
角括弧のオリゴヌクレオチドの５’セグメント［ＵＡＡＵＣＵＧＵＡＡ  ＧＡＧＣＡＧＡＵＣＣ  ＣＵＧＧＡＣＡＧＧＣ  ＡＡ  ＧＧＡＡＵＡＣ］は、２’−Ｏ−Ｍｅヌクレオチド修飾を含んだ：
修飾：Ａ＝（２’−Ｏ−メチルアデノシン）；Ｇ＝（２’−Ｏ−メチルグアノシン）；Ｃ＝（２’−Ｏ−メチルシトシン）；Ｕ＝（２’−Ｏ−メチルウリジン）
Ｘ＝ポリメラーゼによる可能な伸長をブロックする３’−リン酸基。
【０７８９】
ヌクレオチド及びヌクレオチド修飾体は、ホスホジエステル結合によって互いに連結される。コントローラーオリゴヌクレオチドの３’末端は、ポリメラーゼによる可能な伸長を防ぐためにリン酸基でブロックされる。
【０７９０】
第１のプライマーは、その第１の領域に、ゲノムＤＮＡ内の第Ｖ因子ライデン遺伝子の配列に特異的に結合することができる配列を含み、その結果、ポリメラーゼによって合成を開始することができる。第１のプライマーの第２の領域は、ＦＶＬ遺伝子の配列に特異的にハイブリダイズしない配列を含む。さらに、第１のプライマーは、第２の領域の５’末端に連結されるさらなる配列セグメントを含む（追加の配列変異体Ｐ１）。前記セグメントは、第５因子ライデンセグメントの特異的な増幅には関与しない。前記セグメントの機能は主に副反応の遅延に見られる。
【０７９１】
第２のプライマーは、その３’セグメントに、ゲノムＤＮＡに特異的に結合して、その結果、ポリメラーゼによって合成を開始できるセグメントを含む。第２のプライマーの５’セグメントは、ＦＶＬ遺伝子の配列に特異的にハイブリダイズしない配列を含む。後方の合成中に、この配列セグメントをコピーできる。第２のプライマーは、コントローラーオリゴヌクレオチド、第１のプライマー又は第２のプライマーに特異的にハイブリダイズできないさらなる配列セグメントを含む。前記セグメントは、第２のプライマーの５’末端に配置され、ＨＥＧリンカー（追加の配列変異体Ｐ２）によってプライマーの５’末端から分離される。前記セグメントは、特異的な増幅には関与しない。前記セグメントの機能には、主に副反応の遅延が見られる。
【０７９２】
コントローラーオリゴヌクレオチドは、ＦＶＬ遺伝子の結果の第Ｖ因子ライデン変異の配列と完全に一致するように構築されている。コントローラーオリゴヌクレオチドは、第１、第２及び第３の領域を含む。
【０７９３】
ＦＶＬ変異のＷＨＯ標準をゲノムＤＮＡとして使用した。反応に使用する前に、ＤＮＡを加熱（９５℃で５分）により変性させ、二本鎖状態から一本鎖状態に移した。この一本鎖ｈｇＤＮＡを使用して、開始核酸鎖をプライマー伸長によって最初に作成した。続いて、この開始核酸鎖から開始して指数関数的増幅を行った。増幅の特異性は、融解曲線分析及びシーケンシングプライマーによるサンガーシーケンシングによって決定された。
【０７９４】
すべての反応は増幅溶液１で行った。
使用したｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＵＴＰ（ｄＴＴＰの代わり）を含んだ。
ＮＥＢ製のＢｓｔ２．０ウォームスタートポリメラーゼをポリメラーゼとして使用した。
【０７９５】
開始核酸鎖を次のように作成した：
約５０，０００半数体ゲノム同等物（ＨＧＥ）、１５０ｎｇ  ｈｇＤＮＡを、第２のプライマー（０．５μｍｏｌ／ｌ）及びＢｓｔ−２．０ウォームスタートポリメラーゼ（約１ユニット）、並びにｄＮＴＰ（約２５０μｍｏｌ／ｌ）と、ハイブリダイゼーション条件下（増幅溶液１、温度約６０℃）で、５０μｌの反応容量において接触させ、そして約１０分間インキュベートした。この段階の間、第２のプライマーが伸長され、ゲノムＤＮＡが鋳型として機能する。その結果、開始核酸として使用できるプライマー伸長産物が得られる。この反応の完了後、反応混合物を約１０分間９５℃に加熱して、この開始核酸鎖を分離した。この反応混合物を凍結し、必要に応じて開始核酸鎖の供給源として使用した。
【０７９６】
ＦＶＬ遺伝子の標的配列の特異的増幅は、開始核酸鎖（約５０００  ＨＧＥに対応）を伴う５μｌの反応混合物を使用して実行した。
【０７９７】
その他の反応成分（第１のプライマー、第２のプライマー、コントローラーオリゴヌクレオチド、Ｅｖａ−Ｇｒｅｅｎ色素、ポリメラーゼＢｓｔ．２．０ウォームスタート、ｄＮＴＰ）を添加し、約１０μｌの反応終了容量を得た。成分の最終濃度は次のとおりである：第１のプライマー：５μｍｏｌ／ｌ、第２のプライマー：２μｍｏｌ／ｌ、コントローラーオリゴヌクレオチド：１μｍｏｌ／ｌ、Ｅｖａ−Ｇｒｅｅｎ色素（１：５０）、ポリメラーゼＢｓｔ．２．０ウォームスタート（約８ユニット）、ｄＮＴＰ：約２５０μｍｏｌ／ｌ。
【０７９８】
対照バッチにはｈｇＤＮＡを添加しなかった。
【０７９９】
反応は、Ｓｔｅｐ−Ｏｎｅ  Ｐｌｕｓデバイス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で行った。
【０８００】
反応温度は、６５℃（５分間、検出ステップを含む）と５５℃（１分間）の間の周期的な変更（３０サイクル）によって、初期に変更され、次いで、６５℃で１時間（２分ごとの検出ステップ）一定に維持した。反応の過程の後に、ＥｖａＧｒｅｅｎ色素のシグナル検出を行った。反応の完了後、反応混合物を１０分間、９５℃に最初にもたらし、次に形成された生成物の融解曲線を測定した。
【０８０１】
最初に、開始核酸鎖が確立され（図５０）、続いて、コントローラーオリゴヌクレオチドを使用して、第１のプライマー及び第２のプライマーを伸長することにより指数関数的増幅を行った。
【０８０２】
増幅の結果は、増幅断片の堆積である。増幅の検出結果を図３６に示す。蛍光における可視的な増加は、反応の約２時間後に発生することがわかる（３６Ａ）。後続の融解曲線分析は、８４℃のＴｍを持つ特異的な融解曲線を示した（図３６Ｂ）。
【０８０３】
配列チェック（図３６Ｃ）：
配列検証は、シーケンシングプライマーを使用して実行した：
５’−  ＡＡＧ  ＣＴＣＧＡＣＡＡＡＡＧＡＡＣ  ＴＣＡＧ    ＡＧ  ＴＧＴＧ  ＣＴＣＧＡＣ  ＡＣ  ｔａｃｃｔｇｔａｔｔｃｃ  ｔｔｇｃｃ    ３’  （配列番号００５）
Ａ＝２’−デオキシアデノシン；Ｃ＝２’−デオキシシトシン；Ｇ＝２’−デオキシグアノシン；Ｔ＝２’−デオキシチミジン（チミジン）
【０８０４】
配列を検証するために、反応混合物（融解曲線の測定後）を水で希釈し（約１：１０〜約１：１００）、得られたアリコートをシーケンシングプライマーと混合した（２μｍｏｌ／ｌの濃度で添加）。この混合物は、商用の配列決定業者（ＧＡＴＣ−Ｂｉｏｔｅｃ）によって出荷され、契約した配列決定法としてサンガーシーケンシングを使用して配列決定された。得られた電気泳動図を、ＦＶＬ配列遺伝子との一致についてチェックした。反応の結果、ＦＶＬ遺伝子の配列を同定した。
【０８０５】
実施例２（図３７）：
標的配列の配列変異体の選択的増幅反応。
この実施例では、鋳型における配列変更の増幅への影響を調査した。第１のオリゴヌクレオチドプライマーが伸長される場合、鋳型に相補的な配列を有し、したがってこれらの配列変異を含む相補鎖が形成される。目的は、得られた第１のプライマー伸長産物とコントローラーオリゴヌクレオチドの間のそのような不一致が増幅に及ぼす影響を評価することであった。不一致の位置は第１のプライマーの３’方向にあり、それにより、プライマーではなくコントローラーのオリゴヌクレオチドによって評価される。
【０８０６】
したがって、標的配列の個々の配列変異体の間の識別は、均一な第１及び第２のプライマーを使用するコントローラーオリゴヌクレオチドによって行われる。
【０８０７】
第１の増幅のみを実行した。この実施例は、２つの標的配列変異体の間を識別を用いて、コントローラー依存性の第１の増幅を実行できることを示す。この実施例では、第２の増幅は行われなかった。
【０８０８】
次の鋳型を使用した：
コントローラーオリゴヌクレオチドと完全に一致する第１のプライマー伸長産物をもたらす配列組成を有する鋳型：Ｍ２ＳＦ５−Ｍ００１−２００
【化５】
2021514637.tif 000007
Ａ＝２’−デオキシアデノシン；Ｃ＝２’−デオキシシトシン；Ｇ＝２’−デオキシグアノシン；Ｔ＝２’−デオキシチミジン（チミジン）
【０８０９】
第１のオリゴヌクレオチドプライマーの結合配列には下線が引かれている。第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、二重下線付き配列の逆相補に結合する（５’末端の３５の位置）。
【０８１０】
単一の塩基位置（太字）でコントローラーオリゴヌクレオチドとの不一致を形成する第１のプライマー伸長産物をもたらす配列組成を有する鋳型（配列番号７）：
【化６】
2021514637.tif 000008
Ａ＝２’−デオキシアデノシン；Ｃ＝２’−デオキシシトシン；Ｇ＝２’−デオキシグアノシン；Ｔ＝２’−デオキシチミジン（チミジン）
【０８１１】
第１のオリゴヌクレオチドプライマーの結合配列には下線が引かれている。第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、二重下線付きの配列の逆相補に結合する。
【０８１２】
次の鋳型を使用した。
第１のオリゴヌクレオチドプライマー：
Ｐ１Ｆ５−２００−ＡＥ２０５３
【化７】
2021514637.tif 000009
【０８１３】
反応でプライマーとして使用されるセグメントには下線が引かれている。
Ａ＝２’−デオキシアデノシン；Ｃ＝２’−デオキシシトシン；Ｇ＝２’−デオキシグアノシン；Ｔ＝２’−デオキシチミジン（チミジン）
【０８１４】
このオリゴヌクレオチドは以下の修飾を含む：
１＝Ｃ３リンカーを使用して、第２のプライマー伸長産物の合成を停止した。
プライマーのセグメント［ＣＵＣＵ  ＧＡＵＧＣＵＵＣ］は、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含み、コントローラーオリゴヌクレオチドの第１の領域に結合する第２のプライマー領域として機能した。
Ａ＝（２’−Ｏ−メチルアデノシン）；Ｇ＝（２’−Ｏ−メチルグアノシン）；Ｃ＝（２’−Ｏ−メチルシトシン）；Ｕ＝（２’−Ｏ−メチルウリジン）
【０８１５】
プライマー２：Ｐ２Ｇ３−５２７０−７０６３
【化８】
2021514637.tif 000010
【０８１６】
反応でプライマーとして使用されるセグメントには下線が引かれている。
このオリゴヌクレオチドは以下の修飾を含む：
６  ＝ＨＥＧリンカー
Ａ＝２’−デオキシアデノシン；Ｃ＝２’−デオキシシトシン；Ｇ＝２’−デオキシグアノシン；Ｔ＝２’−デオキシチミジン（チミジン）
【０８１７】
以下のコントローラーオリゴヌクレオチドを使用した：
ＡＤ−Ｆ５−１００１−５０３
【化９】
2021514637.tif 000011
Ａ＝２’−デオキシ−アデノシン；Ｃ＝２’−デオキシ−シトシン；Ｇ＝２’−デオキシ−グアノシン；Ｔ＝２’−デオキシ−チミジン（チミジン）
角括弧のオリゴヌクレオチドの５’セグメント［ＵＡＡＵＣＵＧＵＡＡ  ＧＡＧＣＡＧＡＵＣＣ  ＣＵＧＧＡＣＡＧＧＣ  ＡＡ  ＧＧＡＡＵＡＣ］は、２’Ｏ−Ｍｅヌクレオチド修飾を含んだ：
【０８１８】
修飾：
Ａ＝（２’−Ｏ−メチルアデノシン）；Ｇ＝（２’−Ｏ−メチルグアノシン）；Ｃ＝（２’−Ｏ−メチルシトシン）；Ｕ＝（２’−Ｏ−メチルウリジン）
Ｘ＝ポリメラーゼによる可能な伸長をブロックする３’−リン酸基。
【０８１９】
ヌクレオチド及びヌクレオチド修飾体は、ホスホジエステル結合によって互いに連結される。コントローラーオリゴヌクレオチドの３’末端は、ポリメラーゼによる可能な伸長を防ぐためにリン酸基でブロックされる。
【０８２０】
４つのバッチを調製した：
バッチ１は、開始核酸鎖として鋳型Ｍ２ＳＦ５−Ｍ００１−２００（完全一致状況）が３００ｆｍｏｌ／ｌの濃度（約２ｘ１０６コピー／バッチに相当）で含有する。
【０８２１】
バッチ２は、開始核酸鎖として鋳型Ｍ２ＳＦ５−Ｍ００１−２００（完全一致の状況）が３００ａｍｏｌ／ｌの濃度（約２ｘ１０３コピー／バッチに相当）で含有する。
【０８２２】
バッチ３は、鋳型が含まれていないため、コントロールを形成する。
【０８２３】
バッチ４は、開始核酸鎖として鋳型Ｍ２ＳＦ５−ＷＴ０１−２００（単一不一致の状況）が３００ｐｍｏｌ／ｌの濃度で含有する（バッチあたり約２ｘ１０９コピー）。
【０８２４】
プライマー１は５μｍｏｌ／ｌで使用し、コントローラーオリゴヌクレオチドは２μｍｏｌ／ｌで使用し、プライマー２は１μｍｏｌ／ｌで使用した。
【０８２５】
さらなる反応条件は次のとおりである：増幅液２。
【０８２６】
アッセイでゲノムＤＮＡの存在を模倣するために、１００ｎｇの新たに変性した魚ＤＮＡ（サーモンＤＮＡ）を反応ごとに加えた。
【０８２７】
熱反応条件は、周期的に変化する温度変化であり、５５℃での２分間の間隔の後に６５℃での５分間の間隔を続けた。増幅は１００サイクルにわたってモニターした。ＥｖａＧｒｅｅｎ蛍光シグナルの検出は６５℃で行った。
【０８２８】
増幅の成功を、ＥｖａＧｒｅｅｎ蛍光シグナルの経時的な増加によって測定した。
【０８２９】
温度変化及びリアルタイムモニタリングは、ＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒのＳｔｅｐＰｎｅ  ＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲデバイスを使用して実行した。
【０８３０】
図３７は、ＥｖａＧｒｅｅｎシグナルの典型的な曲線を示す。Ｙ軸は蛍光シグナルの増加（Ｄｅｌｔａ  Ｒｎ）を示し、Ｘ軸は反応時間（サイクル数として）を示す。矢印は個々の反応調製物を示す。記された位置は次のバッチに属する：
【０８３１】
矢印１：  ３００ｆｍｏｌ／ｌの完全一致鋳型（約２ｘ１０６コピー／バッチ）
【０８３２】
矢印２：  ３００ｆｍｏｌ／ｌの完全一致鋳型（約２ｘ１０３コピー／バッチ）
【０８３３】
矢印３：  鋳型なし
【０８３４】
矢印４：  ３００ｐｍｏｌ／ｌの不一致鋳型（バッチあたり約２ｘ１０９コピー）。
【０８３５】
鋳型の完全一致及び不一致変異の両方で蛍光シグナルの増加を確認でき、不一致の変異（４）のシグナルは、１００倍の過剰にもかかわらず、後に出現する。不一致の増幅シグナルは、完全一致増幅シグナルと比較して大幅に遅延していることがわかる。単一の不一致に対して約１５サイクルの遅延が観察される。時間遅延（＝サイクル数）は、増幅における識別の即時測定である。増幅における識別のさらなる定量は、完全一致増幅下での鋳型濃度系列で比較することによって得ることができる。
【０８３６】
完全一致鋳型を使用する場合、プライマー伸長産物の相補鎖が合成される。この伸長産物は、完全一致の鋳型及び使用されるコントローラーオリゴヌクレオチドの両方に相補的である。
【０８３７】
対照的に、不一致配列が使用される場合、プライマー伸長産物の第１のセグメントの合成は、不一致鋳型に完全に相補的である伸長産物の相補鎖の生成をもたらすが、それによりオリゴヌクレオチドコントローラーの第３の領域との相補性から相違する。この相違は、コントローラーオリゴヌクレオチドと反応して、鎖置換プロセスを進行させることを許容するはずである、伸長産物の５’−鎖セグメントで起こる。この例に示すように、不一致はコントローラーオリゴヌクレオチドによる鎖置換により干渉する。
【０８３８】
完全一致鋳型を使用した制御反応（矢印１及び２）は、増幅の濃度依存性を示した。濃度が低下すると、シグナルがベースラインレベルを超えて増幅される核酸を増幅するための十分な量が合成するための反応時間はより長かった。
【０８３９】
この結果は、コントローラーオリゴヌクレオチドの塩基組成の重要性を示す：コントローラーオリゴヌクレオチドとプライマー伸長産物の間の相補性からの相違は、増幅を遅くする、又はさらには中断し得る。
【０８４０】
この実施例では、完全一致の鋳型と不一致の鋳型との配列末端は完全に同一であり、したがって両方のオリゴヌクレオチドプライマーの結合の可能性は同じであったが、両方の反応は完全に異なることがわかった：コントローラーオリゴヌクレオチドと、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物の５’セグメントとの間に完全な相補性がある場合、増幅は計画通りに行われた。配列の相違（この場合は不一致による）による鎖置換の中断は、増幅の抑制をもたらした。
【０８４１】
実施例３（図３８〜４２）：
２つの増幅の使用：第１の増幅、その後の第２の増幅
この実施例は、第１の増幅の増幅産物（第１の増幅）が、その後の古典的なＰＣＲ（第２の増幅）によって開始核酸鎖として使用できることを示している。したがって、合計２つの別個の増幅反応が行われた：最初に第１の増幅、次いで第２の増幅。
【０８４２】
第１の増幅
最初に、第１の増幅を、第１の増幅系を使用して、標的配列を含む一本鎖核酸鎖（ここでは一本鎖の開始核酸鎖１．１として）を使用して行った。使用する反応条件（温度５５℃及び６５℃）では、コントローラーオリゴヌクレオチドの非存在における、第１のプライマー伸長産物及び第２のプライマー伸長産物を含む、反応中に形成される２本鎖の自然分離を起こすことを許容しない。
【０８４３】
第１の増幅系は、次の成分を含んだ：
・  第１のオリゴヌクレオチドプライマー、
・  第２のオリゴヌクレオチドプライマー、
・  コントローラーオリゴヌクレオチド及び
・  鎖置換特性を有するポリメラーゼ（ＢＳＴ２．０ウォームスタートポリメラーゼ）、
・  並びに、ポリメラーゼに必要な基質（ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）及び適切な緩衝系（反応は等温緩衝液１倍（ＮＥＢ）で実行した）。
【０８４４】
反応の進行はＥｖａＧｒｅｅｎによって６５℃で検出した。
【０８４５】
第１のオリゴヌクレオチドプライマー（５μｍｏｌ／ｌ）と、使用されるコントローラーオリゴヌクレオチド（２μｍｏｌ／ｌ）との濃度比では、第１のプライマーはコントローラーオリゴヌクレオチドに対して相対的に過剰である。第１のオリゴヌクレオチドプライマー及びコントローラーオリゴヌクレオチドを含む複合体の融解温度は、約６３℃（Ｔｍ）であり、同じ反応溶液で測定した。
【０８４６】
第１の増幅反応では、２つの温度範囲を使用した：
５５℃（２分）及び６５℃（２分）。５５℃の温度ステップでは、コントローラーオリゴヌクレオチドは第１のオリゴヌクレオチドプライマーと完全に複合化した。これは、コントローラーオリゴヌクレオチドが第１のプライマー伸長産物に結合するのを妨げた。第２の温度ステップ（６５℃）では、この複合体は少なくとも部分的に複合体から解離することが可能であり、その結果、遊離の一本鎖コントローラーオリゴヌクレオチドがバッチで利用可能になった。このような遊離のコントローラーオリゴヌクレオチドは、新しい第１のオリゴヌクレオチドプライマーと複合体を形成する、又は第１のプライマー伸長産物にアニーリングすることのいずれかが可能である。第１のプライマー伸長産物との接触は、ポリメラーゼによってコピーされない、プライマーの第２の領域の対応する配列セグメントへコントローラーオリゴヌクレオチドの第１の領域の配列セグメントが相補的に結合することによって始まる。
【０８４７】
個々の合成方法及び鎖分離方法は、本質的に次のプロセスからなる：
第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、提供された核酸鎖の３’セグメント（開始核酸鎖１．１）に主に特異的に結合でき、ポリメラーゼによって伸長できる（この反応は主に５５℃で行われる）。合成は、鋳型鎖の末端へ進む（開始核酸鎖の５’領域）。これは第１のプライマー伸長産物をもたらした。コントローラーオリゴヌクレオチドは、相補的塩基対形成によって前記第１のプライマー伸長産物に結合でき、相補的塩基対形成によって鋳型鎖（ここでは第１の開始核酸鎖）を置換する（この反応は主に６５℃で行われる）。６５℃で、第１のプライマー伸長産物の３’セグメント（コントローラーによって結合されなかった）は、主に温度のために、鋳型鎖との複合体から分離した（前記３’セグメントのＴｍは６５℃未満であった）。したがって、第１のプライマー伸長産物の３’セグメントは一本鎖になった。したがって、第１のプライマー伸長産物は、コントローラーオリゴヌクレオチドと複合化して存在した。
【０８４８】
第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、第１のプライマー伸長産物の前記セグメントに結合することがこれより可能であり、ポリメラーゼによる第２のプライマー伸長産物の合成を開始した（このステップは、５５℃及び６５℃で実行できる）。合成を実行するのと同時に、コントローラーオリゴヌクレオチドを第１のプライマー伸長産物への結合から同時置換した。第１のプライマー伸長反応で使用されるポリメラーゼ（Ｂｓｔ２．０ウォームスタート）は、鎖置換特性を有する。第２のプライマー伸長産物の合成は、ポリメラーゼによってコピーされた第１のプライマーの第１の領域まで、及び該第１の領域を含み実行された。第２のプライマー伸長産物の合成は、第１のプライマー伸長産物のＣ３リンカーによって停止し、それにより、第１のプライマー伸長産物の第２の領域は、ポリメラーゼによってコピーされなかった。これにより、第１のプライマー伸長産物と二本鎖を形成する第２のプライマー伸長産物が得られた（この二本鎖のＴｍ＝第１の増幅産物は約７９℃であった）。反応混合物を６５℃に繰り返し加熱すると、コントローラーオリゴヌクレオチドの第１のプライマー伸長産物への再結合をもたらし、それにより、第２のプライマー伸長産物が第１のプライマー伸長産物への結合から解放された。
【０８４９】
第２のプライマー伸長産物の解放の結果として、この産物は鋳型としてこれより機能することができ、第２のプライマー伸長産物は、３’セグメントに、第１のプライマーの第１の領域に相補的な配列を含み、したがって新しいオリゴヌクレオチドプライマーを結合することができ、ポリメラーゼによって合成を開始することができる。
【０８５０】
その結果、繰り返される合成及び鎖分離のプロセスが実行され、合成された両方のプライマー伸長産物が後続のサイクルで鋳型として機能することができた。
【０８５１】
第１の増幅産物は、提供されたプライマーを使用して開始核酸鎖（１．１）から開始して、提供されたコントローラーオリゴヌクレオチドの助けにより、目的のコピー数が達成されるまで合成できた（ここで、第１の増幅産物１．１の濃度は、第１の増幅の終わりに向けて約０．８〜１μｍｏｌ／ｌ、これは１０μｌの反応バッチで約１，０００，０００，０００コピーに相当する）。コピーの数は、説明のために濃度から見積もった。
【０８５２】
９５℃へ１０分間加熱することにより反応を停止させ、第１のポリメラーゼを変性させた。次に、短い融合分析を行って、特異的な増幅を確認した。反応バッチを凍結し、必要に応じて第２の増幅で使用した。
【０８５３】
第２の増幅（ＰＣＲ）
第１の増幅の完了後、第１の反応バッチの一部を第２の増幅に加えた。第１の増幅中に合成された第１の増幅断片（１．１）は、第２の増幅の第２の開始核酸鎖（２．１）として機能した。
【０８５４】
第１に完了したバッチのいくつかの希釈ステップが第２の増幅反応に追加され、１つの希釈系列が得られた。
【０８５５】
形成された第１の増幅断片（１．１）の精製は行われず、希釈のみが行われたことに注意すべきである。したがって、第１の増幅系のすべての未使用の成分は、希釈された形態ではあるが、第２の増幅ステップにも存在した。
【０８５６】
ＰＣＲ反応条件（５５℃（１分）及び７２℃（３分）及び９５℃（２０秒）の３つの温度範囲）を使用して、標準ＰＣＲ（第２の増幅）を実行した。
【０８５７】
第２の増幅系は、それぞれ次の成分を含む：
・  第３のオリゴヌクレオチドプライマー、
・  第４のオリゴヌクレオチドプライマー、
・  熱安定性ポリメラーゼであるポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）
・  及び、ポリメラーゼのための基質（ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）及び適切な緩衝液系。
【０８５８】
ＰＣＲでは、個々の成分の一般的な濃度を使用した：最終濃度が各０．５μｍｏｌ／ｌのＰＣＲプライマー、及び濃度（１，１００希釈、約１ユニット／反応に相当）のＴａｑポリメラーゼ及び濃度約２００μｍｏｌ／ｌのｄＮＴＰ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）。この反応は、等温緩衝液１倍（ＮＥＢ）において実施した。
【０８５９】
第２の増幅は、この第１の増幅断片を開始核酸鎖（２．１）として使用し、第２の増幅系を使用して実行した。合成の進行は、７２℃でＥｖａＧｒｅｅｎによって検出した。第２の増幅系で鋳型としても使用できるＮＴＣ及び開始核酸鎖１．１は、対照反応として使用した。
【０８６０】
特異的なシグナルが増加するまでの第２の増幅に必要なサイクル数を測定し、参照値と比較した。検出可能な増幅に必要なサイクル数の比較から、ＰＣＲでの第１の増幅断片（１．１）の使用の成功が結論付けられた。
【０８６１】
詳細には、以下を実行した：
コントローラーオリゴヌクレオチドに基づく第１の増幅反応の第１の増幅産物を、希釈し、一般的なＰＣＲ条件下で鋳型（インプット）として増幅した。この実施例では、後続のＰＣＲでの検出は、挿入色素ＥｖａＧｒｅｅｎを使用して実行する。多数の異なる制御アプローチと比較することにより、本発明者らは、コントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅反応が成功した場合にのみ、後続のＰＣＲでシグナルが生成されることを示している。このため、その後の従来のＰＣＲは検出ＰＣＲとも呼ぶ。
【０８６２】
コントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅反応の増幅産物を、実施例２に記載されるように本質的に生成した。
【０８６３】
以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した：
第１のオリゴヌクレオチドプライマー：  Ｐ１Ｆ５−２００−ＡＥ２０５
【化１０】
2021514637.tif 000012
反応でプライマーとして使用されるセグメントには下線が引かれている。
Ａ＝２’−デオキシアデノシン；Ｃ＝２’−デオキシシトシン；Ｇ＝２’−デオキシグアノシン；Ｔ＝２’−デオキシチミジン（チミジン）
このオリゴヌクレオチドは以下の修飾を含む：
１＝Ｃ３リンカーを使用して、第２のプライマー伸長産物の合成を停止した。
２＝２’−デオキシイノシン
【０８６４】
プライマーのセグメント［ＣＵＣＵ  ＧＡＵＧＣＵＵＣ］は、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含み、コントローラーオリゴヌクレオチドの第１の領域に結合する第２のプライマー領域として機能した。
Ａ＝（２’−Ｏ−メチルアデノシン）；Ｇ＝（２’−Ｏ−メチルグアノシン）；Ｃ＝（２’−Ｏ−メチルシトシン）；Ｕ＝（２’−Ｏ−メチルウリジン）
第２のオリゴヌクレオチドプライマー：  Ｐ２Ｇ３−５２７０−７０６３
【化１１】
2021514637.tif 000013
反応でプライマーとして使用されるセグメントには下線が引かれている。
このオリゴヌクレオチドは以下の修飾を含む：
６＝ＨＥＧリンカー
Ａ＝２’−デオキシアデノシン；Ｃ＝２’−デオキシシトシン；Ｇ＝２’−デオキシグアノシン；Ｔ＝２’−デオキシチミジン（チミジン）
以下のコントローラーオリゴヌクレオチド（配列番号４）を使用した：
ＡＤ−Ｆ５−１００１−５０３
【化１２】
2021514637.tif 000014
Ａ＝２’−デオキシアデノシン；Ｃ＝２’−デオキシシトシン；Ｇ＝２’−デオキシグアノシン；Ｔ＝２’−デオキシチミジン（チミジン）
【０８６５】
角括弧のオリゴヌクレオチドの５’セグメント［ＵＡＡＵＣＵＧＵＡＡ  ＧＡＧＣＡＧＡＵＣＣ  ＣＵＧＧＡＣＡＧＧＣ  ＡＡ  ＧＧＡＡＵＡＣ］は、２’−Ｏ−Ｍｅヌクレオチド修飾を含んだ：
Ａ＝（２’−Ｏ−メチルアデノシン）；Ｇ＝（２’−Ｏ−メチルグアノシン）；Ｃ＝（２’−Ｏ−メチルシトシン）；Ｕ＝（２’−Ｏ−メチルウリジン）
Ｘ＝ポリメラーゼによる可能な伸長をブロックする３’−リン酸基
【０８６６】
ヌクレオチド及びヌクレオチド修飾体は、ホスホジエステル結合によって互いに連結される。コントローラーオリゴヌクレオチドの３’末端は、ポリメラーゼによる可能な伸長を防ぐためにリン酸基でブロックされる。
【０８６７】
コントローラーと完全一致を有する開始核酸鎖（１．１）。
Ｍ２ＳＦ５−Ｍ００１−２００
５’  ＧＣＴ  ＣＡＴＡ  ＣＴＡＣＡＡＴＧＴＣＡ  ＣＴ  ＴＡ  ＣＴＧＴＡＡ  ＧＡＧＣＡＧＡＴＣＣ  ＣＴＧＧＡＣＡＧＧＣ  ＡＡ  ＧＧＡＡＴＡＣＡＧＧＴＡ  ＡＡＡＡＡ  ３’  （配列番号００６）
開始核酸鎖は約１ｐＭの濃度で使用した。
【０８６８】
その結果、増幅断片は、次の配列を持つ第２のプライマー伸長産物を生成することが期待できる：
５’  ＧＣＴ  ＣＡＴＡ  ＣＴＡＣＡＡＴＧＴＣＡ  ＣＴ  ＴＡ  ＣＴＧＴＡＡ  ＧＡＧＣＡＧＡＴＣＣ  ＣＴＧＧＡＣＡＧＧＣ  ＡＡ  ＧＧＡＡＴＡＣＡＧＧＴＡ    ３’  （配列番号１０）
（コピーできない第２のプライマーの配列セグメントはここには示さない）
【０８６９】
ＰＣＲは、３つの異なるプライマー対で実行した。このプライマーは、増幅産物の異なる配列領域をカバーする。理解を深めるために、鋳型鎖（＝増幅産物）のプライマー結合部位にも、各プライマー対のマークが付けられている。
【０８７０】
ＰＣＲに使用したもの：
第３のオリゴヌクレオチドプライマーＳｅｑＰ１Ｆ５  ３００−３５ｘ（配列番号８）及び第４のオリゴヌクレオチドプライマーＰ２−４４０１−６０１  ＴＭＲ（配列番号９）からなるＰＣＲプライマー対１：
【０８７１】
第３のオリゴヌクレオチドプライマー  ＳｅｑＰ１Ｆ５  ３００−３５ｘ
５’  ＡＣＧＡＡＧＣＴＣＧＣＡＡＧＡＡＣＴＣＡＧＡＧＴＧＴＧＣＴＣＧＡＣＡＣＴＡＣＣＴＧＴＡＴＴＣＣ  ３’  （配列番号８）
第４のオリゴヌクレオチドプライマーＰ２−４４０１−６０１
ＴＭＲ  ５’  ＧＣＴＣＡＴＡＣＴＡＣＡＡＴＧＴＣＡＣＴＴＡＣ  ３’（配列番号９）
Ａ＝２’−デオキシアデノシン；Ｃ＝２’−デオキシシトシン；Ｇ＝２’−デオキシグアノシン；Ｔ＝２’−デオキシチミジン（チミジン）：をそれぞれ有する。
ＴＭＲ＝この鎖の５’末端に接続したテトラメチルローダミン（Ｐ２−４４０１−６０１  ＴＭＲ）
【０８７２】
前記２つのプライマーは、以下の様式で鋳型鎖に結合する（ここでは、第１の増幅の第２のプライマー伸長産物として示される）：
【化１３】
2021514637.tif 000015
【０８７３】
制御アプローチでは、このプライマー対のプライマーは、次のように開始核酸鎖１．１にも結合できる。
Ｍ２ＳＦ５−Ｍ００１−２００  （配列番号００６）：
【化１４】
2021514637.tif 000016
【０８７４】
第１のオリゴヌクレオチドプライマーの結合配列には下線が引かれている。
【０８７５】
第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、二重下線付きの配列の逆相補に結合する。
【０８７６】
第３のオリゴヌクレオチドプライマーＰ３Ｆ５Ｄ−６００−２０３（配列番号ＸＹ）及び第４のオリゴヌクレオチドプライマーＰ２−４４０１−６０１  ＴＭＲからなるＰＣＲプライマー対２：
【０８７７】
第３のオリゴヌクレオチドプライマー：  
Ｐ３Ｆ５Ｄ−６００−２０３
−  ５’  ＴＭＲ  ＧＴＡＣＣＧＡＡＧＣ  ＴＣＧＣＡＧＧＡＡＣ  ＴＣＡＧＡＧＴＧＴＧ  ＧＡＧＡＧＧＡＣＧＡ  ＡＡＡＴＧＴＣＣＡＧ  ＧＧＡ  ３’  （配列番号１１）
【０８７８】
第４のオリゴヌクレオチドプライマーＰ２−４４０１−６０１
ＴＭＲ  ＴＭＲ  −  ５’  ＧＣＴＣＡＴＡＣＴＡＣＡＡＴＧＴＣＡＣＴＴＡＣ  ３’  （配列番号９）
Ａ＝２’−デオキシアデノシン；Ｃ＝２’−デオキシシトシン；Ｇ＝２’−デオキシグアノシン；Ｔ＝２’−デオキシチミジン（チミジン）：をそれぞれ有する。
【０８７９】
修飾：
ＴＭＲ＝鎖の５’末端（Ｐ３Ｆ５Ｄ−６００−２０３）及びＰ２−４４０１−６０１  ＴＭＲに接続したテトラメチルローダミン
【０８８０】
前記２つのプライマーは、以下の様式で鋳型鎖に結合する（ここでは、第１の増幅の第２のプライマー伸長産物として示される）：
【化１５】
2021514637.tif 000017
【０８８１】
制御バッチでは、このプライマー対のプライマーは、次のように開始核酸鎖１．１にも結合できる。
【０８８２】
Ｍ２ＳＦ５−Ｍ００１−２００
【化１６】
2021514637.tif 000018
第１のオリゴヌクレオチドプライマーの結合配列には下線が引かれている。
第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、二重下線付きの配列の逆相補に結合する。
【０８８３】
第３のオリゴヌクレオチドプライマー  ＳｅｑＰ１Ｆ５−３５−Ｘ０２及び第４のオリゴヌクレオチドプライマーＰ２−４４０１−６０１  ＴＭＲからなるＰＣＲプライマー対３：
第３のオリゴヌクレオチドプライマーＳｅｑＰ１Ｆ５−３５−Ｘ０２
５’  ＡＡＧＣＴＣＧＡＣＡＡＡＡＧＡＡＣＴＣＡＧＡＧＴＧＴＧＣＴＣＧＡＣＡＣＴＡＣＣＴＧＴＡＴＴＣＣＴＴＧ  ３’  （配列番号０１２）
【０８８４】
第４  のオリゴヌクレオチドプライマーＰ２−４４０１−６０１  ＴＭＲ
ＴＭＲ  −  ５’  ＧＣＴＣＡＴＡＣＴＡＣＡＡＴＧＴＣＡＣＴＴＡＣ  ３’  （配列番号００９）
Ａ＝２’−デオキシアデノシン；Ｃ＝２’−デオキシシトシン；Ｇ＝２’−デオキシグアノシン；Ｔ＝２’−デオキシチミジン（チミジン）：をそれぞれ有する。
ＴＭＲ＝この鎖の５’末端（Ｐ２−４４０１−６０１  ＴＭＲ）に接続したテトラメチルローダミン
【０８８５】
前記２つのプライマーは、以下の様式で鋳型鎖に結合する（ここでは、第１の増幅の第２のプライマー伸長産物として示される）：
【化１７】
2021514637.tif 000019
【０８８６】
制御バッチでは、このプライマー対のプライマーは、次のように開始核酸鎖１．１にも結合できる。
Ｍ２ＳＦ５−Ｍ００１−２００：
【化１８】
2021514637.tif 000020
第１のオリゴヌクレオチドプライマーの結合配列には下線が引かれている。
第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、二重下線付きの配列の逆相補に結合する。
【０８８７】
ヌクレオチド及びヌクレオチド修飾体は、ホスホジエステル結合によって互いに連結される。
【０８８８】
Ｔａｑポリメラーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２７３Ｓ）をＰＣＲで使用した。反応ごとに１：１００のポリメラーゼ希釈を使用した。
【０８８９】
コントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅反応（第１の増幅）からの増幅産物は、１：５，０００〜１：５００，０００，０００の希釈でＰＣＲに使用した。
【０８９０】
対照として、増幅用の鋳型を含まない反応混合物も調査した（ＮＴＣ＝鋳型なしの対照＝陰性対照）。
【０８９１】
さらに、コントローラーオリゴヌクレオチドがＰＣＲプライマーの鋳型として機能するかどうかを確認するために、さらなる制御アプローチを使用した。この目的のために、前にコントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅中に使用されていたコントローラーオリゴヌクレオチド（配列番号４＝ここでは「コントローラー５０３」と呼ぶ）を１μｍｏｌ／ｌ〜１ｐｍｏｌ／ｌの濃度でＰＣＲでの増幅に提供した。
【０８９２】
さらなる対照において、規定量の鋳型Ｍ２ＳＦ５−Ｍ００１−２００をＰＣＲでの増幅のために提供した（陽性対照）。前記対照は、（理想的な条件下で）ＰＣＲ−プライマー対の機能を実証した。さらに、受け取ったＣｔ値を陽性対照の標準希釈系列と比較することにより、第１の増幅後に試料を定量化できた。鋳型Ｍ２ＳＦ５−Ｍ００１−２００は、１ｎｍｏｌ／ｌ〜１ｆｍｏｌ／ｌの濃度で試験した。
【０８９３】
第３及び第４のオリゴヌクレオチドプライマーは、それぞれ０．５μｍｏｌ／ｌの濃度で使用した。
【０８９４】
さらなる反応条件は次のとおりである：
１倍等温緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）；単一濃度では、緩衝液には以下を含有する：２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４；５０ｍＭのＫＣｌ；２ｍＭのＭｇＳＯ４；０．１％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０；２５℃にてｐＨ８．８）；ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ）、各２００μｍｏｌ／ｌ；
ＥｖａＧｒｅｅｎ色素（色素は、メーカーの指示に従って１：５０の希釈で使用した）
【０８９５】
熱反応条件は次のように選択した：
・  ２０秒９５℃、系をアクティブ化する
・  ３０サイクル、それぞれが、次の温度−時間プロファイルを有する
ｏ  １分５５℃
ｏ  ３分７２℃
ｏ  ２０秒９５℃
・  増幅産物の標準化のために１０分７２℃
・  融解曲線分析
【０８９６】
増幅は通常、３０サイクル、つまり、３０ｘ（１分５５℃＋３分７２℃＋２０秒９５℃）＝約３０ｘ２６０秒＝１３０分にわたってモニターした。増幅の成功は、経時的なＥｖａＧｒｅｅｎ蛍光シグナルの増加によって測定した。
【０８９７】
検出ＰＣＲの分析
以下の手法を使用して、検出ＰＣＲを分析し、得られた増幅産物を評価した。
・  挿入色素（ＥｖａＧｒｅｅｎ）の蛍光シグナル
・  得られた増幅産物の融解曲線分析
ＰＣＲを分析する場合、Ｔａｑポリメラーゼの１：１００希釈で得られたデータについてのみ説明する。
【０８９８】
鋳型（Ｍ２ＳＦ５−Ｍ００１−２００）での制御実験では、選択した３つすべてのＰＣＲプライマー対が、使用したＰＣＲ条件下で特異的なＰＣＲ産物を生成できたことを確認できた。また、３つすべてのプライマー対が、コントローラーオリゴヌクレオチドから開始する産物を形成できなかったことも確認できた。使用されたすべての「第３の」プライマーは、コントローラーオリゴヌクレオチドの修飾された部分に結合するため、これは期待された結果であった。
【０８９９】
図３８Ａは、プライマー対１による希釈されたコントローラーオリゴヌクレオチド増幅アプローチの増幅中に得られたＥｖａＧｒｅｅｎ蛍光シグナルの典型的な時間経過を示す。Ｙ軸はＥｖａＧｒｅｅｎ色素の蛍光シグナルを示し、Ｘ軸は反応時間を示す（サイクル数として）。矢印は、さまざまな増幅アプローチを示す。矢印は、次のバッチを示す：
【０９００】
【表１】
2021514637.tif 000021
【０９０１】
矢印６は、鋳型を含まないため、実験中に増幅シグナルを生成しない陰性対照バッチを示す。
【０９０２】
コントローラーオリゴヌクレオチド増幅バッチの選択された希釈に応じて、時間遅延した増幅シグナルが観察される。ＰＣＲプライマー対１の場合、１：５，０００〜１：５０，０００，０００の希釈は、選択した条件下で十分に分解可能である。１：５０，０００，０００の希釈は、陰性対照とわずかに異なる増幅シグナルを生成する（矢印５を参照）。
【０９０３】
図３８Ｂは、反応１〜５の関連する融解曲線分析を示し、特異的な増幅産物が形成されたことを明らかにする（Ｔｍ＝８２．７℃）。
【０９０４】
図３８Ｂは、図３８Ａからのプライマー対１の増幅産物の融解曲線を示す。Ｙ軸、温度に対する蛍光シグナルの導関数を示し、Ｘ軸は、温度を示す。矢印１でマークされた均一なピークを検出した。融点が８２．７℃に近い位置１のピークは、プライマー対１の増幅産物に属する。融解曲線分析は特異的な増幅を示す。
【０９０５】
図３９Ａは、ＰＣＲプライマー対２による、希釈されたコントローラーオリゴヌクレオチド増幅アプローチの増幅から得られたＥｖａＧｒｅｅｎ蛍光シグナルの一般的な時間曲線を示す。Ｙ軸はＥｖａＧｒｅｅｎ色素の蛍光シグナルであり、Ｘ軸は反応時間（サイクル数として）である。矢印は、さまざまな増幅アプローチを示す。矢印は、次のバッチを示す：
【０９０６】
【表２】
2021514637.tif 000022
【０９０７】
矢印５は、鋳型を含まないため、実験中に増幅シグナルを生成しない陰性対照バッチを示す。
【０９０８】
コントローラーオリゴヌクレオチド増幅バッチの選択された希釈に応じて、時間遅延した増幅シグナルが観察される。ＰＣＲプライマー対２の場合、１：５，０００〜１：５，０００，０００の希釈は、選択した条件下で十分に分解可能である。１：５，０００，０００の希釈は、陰性対照から際だった増幅シグナルを生成する（矢印４を参照）。
【０９０９】
図３９Ｂは、反応１〜４についての関連する融解曲線分析を示し、特異的な増幅産物が形成されたことを明らかにしている。
【０９１０】
図３９Ｂは、図３９ＡからのＰＣＲプライマー対２の増幅産物の融解曲線を示す。Ｙ軸は、温度に対する蛍光シグナルの導関数を示し、Ｘ軸は、温度を示す。矢印１でマークされた均一なピークを検出した。融点が８１．９℃に近い位置１のピークは、プライマー対２のＰＣＲ増幅産物に属する。融解曲線分析は特異的な増幅を示す。
【０９１１】
図４０Ａは、ＰＣＲプライマー対３による、希釈されたコントローラーオリゴヌクレオチド増幅アプローチの増幅から得られたＥｖａＧｒｅｅｎ蛍光シグナルの一般的な時間曲線を示す。Ｙ軸はＥｖａＧｒｅｅｎ色素の蛍光シグナルであり、Ｘ軸は反応時間（サイクル数として）である。矢印は、さまざまな増幅アプローチを示す。矢印は、次のバッチを示す：
【０９１２】
【表３】
2021514637.tif 000023
【０９１３】
矢印７は、鋳型を含まないため、実験中に増幅シグナルを生成しない陰性対照バッチを示す。
【０９１４】
コントローラーオリゴヌクレオチド増幅アプローチの選択された希釈に応じて、時間遅延した増幅シグナルが観察される。プライマー対３の場合、１：５，０００〜１：５００，０００，０００の希釈は、選択した条件下で十分に分解可能である。１：５００，０００，０００の希釈は、陰性対照から際立った増幅シグナルを生成する（矢印６及び７を参照）。
【０９１５】
図４０Ｂは、反応１〜６についての関連する融解曲線分析を示し、特異的な増幅産物が形成されたことを明らかにしている。
【０９１６】
図４０Ｂは、図４０ＡからのＰＣＲプライマー対３の増幅産物の融解曲線を示す。Ｙ軸は、温度に対する蛍光シグナルの導関数を示し、Ｘ軸は、温度を示す。矢印１でマークされた均一なピークを検出した。融点が８１．２℃に近い位置１のピークは、プライマー対３のＰＣＲ増幅産物に属する。融解曲線分析は特異的な増幅を示す。
【０９１７】
増幅の過程での蛍光シグナルの分析（増幅プロット）及び増幅の終わりでの融解曲線分析により、ＰＣＲプライマーの対１〜３はそれぞれ、第１の増幅反応から得られた希釈増幅産物を鋳型として使用できることを示した。
【０９１８】
選択した希釈に応じて、時間遅延した増幅シグナルが生成され、これは、希釈系列に一般的である。ここで選択したＰＣＲ条件で、５，０００，０００倍に希釈された増幅産物を検出できる。プライマー対３は最も感度が高く、５００，０００，０００倍の希釈で増幅産物をなお検出することができる。
【０９１９】
図４１は、１ｎｍｏｌ／ｌ（矢印１）及び１０ｐｍｏｌ／ｌ（矢印２）で使用された鋳型（Ｍ２ＳＦ５−Ｍ００１−２００）、及びＮＴＣ対照（矢印３）による対照実験を示す。
【０９２０】
図４１Ａは、ＰＣＲプライマー対１の結果を示す。
図４１Ｂは、ＰＣＲプライマー対２の結果を示す。
図４１Ｃは、ＰＣＲプライマー対３の結果を示す。
【０９２１】
対照実験（鋳型）と第１の増幅断片から実行された第２の増幅との間の蛍光シグナルの立ち上がり時間の比較は、第１の増幅が第２の増幅で鋳型として使用できる増幅断片の増加を引き起こしたことを示す。
【０９２２】
図４２は、第１の増幅の過程を示す（ＰＣＲ前）。
【０９２３】
シグナルの増加が見られ、これを第１の増幅でのコピー数の増加として解釈した。矢印１は、開始核酸鎖１．１を有するバッチに対応した。矢印２＝ＮＴＣ対照。
【０９２４】
実施例４（図４３〜４７）：
同一のバッチでの第１の増幅及び第２の増幅の組み合わせ（均一アッセイ）
この実施例では、本発明者らは、コントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅反応が、均一アッセイ形式で後続の古典的なＰＣＲとどのように組み合わせることができるかを実証する。ここで、本発明者らは、増幅の初期段階で高選択性のコントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅反応を使用し、その後、増幅及び増幅産物の検出のために古典的ＰＣＲに切り替える。実施例３（＝不均一アッセイ形式）とは対照的に、この実施例における組み合わせは、均一アッセイ形式で行われる。すべてのアッセイの成分は、反応の開始時にすでに利用可能である。コントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅と従来のＰＣＲとの切り替えは、反応の過程で温度制御を変更することで行われる。
【０９２５】
最初に、第１の増幅産物１．１は、１５〜３０サイクルのコントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅反応を使用して、一本鎖開始核酸鎖（１．１）から開始して増幅され、その後３０サイクルの古典的なＰＣＲでさらに増幅して前増幅産物を検出した。この例では、挿入色素ＥｖａＧｒｅｅｎを検出に使用する。
【０９２６】
第１の増幅系は、次の成分を含んだ：
・  第１のオリゴヌクレオチドプライマー、
・  第２のオリゴヌクレオチドプライマー、
・  コントローラーオリゴヌクレオチド及び
・  鎖置換特性を有するポリメラーゼ（ＢＳＴ２．０ウォームスタートポリメラーゼ）、
・  並びに、ポリメラーゼに必要な基質（ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）及び適切な緩衝液系（反応は等温緩衝液１倍（ＮＥＢ）で実行した）。
【０９２７】
第２の増幅系は、次の成分を含んだ：
・  第３のオリゴヌクレオチドプライマー、
・  第４のオリゴヌクレオチドプライマー、
・  熱安定性ポリメラーゼであるポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）
・  及び、ポリメラーゼに必要な基質（ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）及び適切な緩衝液系。
【０９２８】
両方の増幅系は、第１の増幅が始まる前に一緒に利用できた。
【０９２９】
この例では、第２のオリゴヌクレオチドプライマーを両方の増幅に使用した。したがって、第４のオリゴヌクレオチドプライマーは、第２のオリゴヌクレオチドプライマーと同一である。
【０９３０】
第３のオリゴヌクレオチドプライマーは変更した。
【０９３１】
この実施例では、発明者らは４つの異なるプライマーを提示し、そのそれぞれは、「第３のオリゴヌクレオチドプライマー」としてバッチごとに個別に使用した。
【０９３２】
それぞれの第３のオリゴヌクレオチドプライマーは、第１のオリゴヌクレオチドプライマーとは異なる。したがって、各反応バッチは、３つのプライマー、すなわち、第１のオリゴヌクレオチドプライマー及び第２のオリゴヌクレオチドプライマー（第１の増幅系の成分として）及び第２の増幅系の特異的なプライマーとして使用された第３のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。第４のプライマーの役割は、後続のＰＣＲ反応にも適する、第１の増幅系の第２のプライマーによって引き継がれた。よりよく理解するために、各プライマーの組み合わせのプライマー結合部位は、鋳型鎖（＝増幅産物）上にマークされている。
【０９３３】
次の開始核酸鎖（１．１）を一本鎖鋳型として使用した：
【０９３４】
コントローラーオリゴヌクレオチドと完全に一致する第１のプライマー伸長産物をもたらす配列組成を持つ鋳型（配列番号６）：
Ｍ２ＳＦ５−Ｍ００１−２００：
【化１９】
2021514637.tif 000024
第１のオリゴヌクレオチドプライマーの結合配列には下線が引かれている。
【０９３５】
第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、二重下線の配列の逆相補に結合する。第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３Ｆ５Ｄ−６００−２０３）の結合配列は、太字のイタリック体で示される。
【０９３６】
第１の増幅系：
第１のオリゴヌクレオチドプライマー：Ｐ１Ｆ５−２００−ＡＥ２０５
【化２０】
2021514637.tif 000025
【０９３７】
反応でプライマーとして使用されるセグメントには下線が引かれている。
Ａ＝２’−デオキシアデノシン；Ｃ＝２’−デオキシシトシン；Ｇ＝２’−デオキシグアノシン；Ｔ＝２’−デオキシチミジン（チミジン）
【０９３８】
このオリゴヌクレオチドは以下の修飾を含む：
１＝Ｃ３リンカーを使用して、第２のプライマー伸長産物の合成を停止した。
２＝２’−デオキシイノシン
【０９３９】
プライマーの１つのセグメント［ＣＵＣＵ  ＧＡＵＧＣＵＵＣ］は、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含み、コントローラーオリゴヌクレオチドの第１の領域に結合する第２のプライマー領域として機能した。
Ａ＝（２’−Ｏ−メチルアデノシン）；Ｇ＝（２’−Ｏ−メチルグアノシン）；Ｃ＝（２’−Ｏ−メチルシトシン）；Ｕ＝（２’−Ｏ−メチルウリジン）
【０９４０】
第２のオリゴヌクレオチドプライマー：  Ｐ２Ｇ３−５２７０−７０６３
【化２１】
2021514637.tif 000026
【０９４１】
反応でプライマーとして使用されるセグメントには下線が引かれている。
【０９４２】
このオリゴヌクレオチドは以下の修飾を含む：
６  ＝ＨＥＧリンカー
Ａ＝２’−デオキシアデノシン；Ｃ＝２’−デオキシシトシン；Ｇ＝２’−デオキシグアノシン；Ｔ＝２’−デオキシチミジン（チミジン）
【０９４３】
以下のコントローラーオリゴヌクレオチドを使用した：
ＡＤ−Ｆ５−１００１−５０３
【化２２】
2021514637.tif 000027
Ａ＝２’−デオキシアデノシン；Ｃ＝２’−デオキシシトシン；Ｇ＝２’−デオキシグアノシン；Ｔ＝２’−デオキシチミジン（チミジン）
【０９４４】
角括弧のオリゴヌクレオチドの５’セグメント［ＵＡＡＵＣＵＧＵＡＡ  ＧＡＧＣＡＧＡＵＣＣ  ＣＵＧＧＡＣＡＧＧＣ  ＡＡ  ＧＧＡＡＵＡＣ］は、２’−Ｏ−Ｍｅヌクレオチド修飾を含んだ：
修飾：
Ａ＝（２’−Ｏ−メチルアデノシン）；Ｇ＝（２’−Ｏ−メチルグアノシン）；Ｃ＝（２’−Ｏ−メチルシトシン）；Ｕ＝（２’−Ｏ−メチルウリジン）
Ｘ＝ポリメラーゼによる可能な伸長をブロックする３’リン酸基
【０９４５】
ヌクレオチド及びヌクレオチド修飾体は、ホスホジエステル結合によって互いに連結される。コントローラーオリゴヌクレオチドの３’末端は、ポリメラーゼによる可能な伸長を防ぐためにリン酸基でブロックされる。
【０９４６】
第２の増幅系は、以下の一覧から第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３プライマー）を特に含む：
・  第３のオリゴヌクレオチドプライマー：  Ｐ３Ｆ５Ｄ−６００−２０１
ＴＭＲ  ５’  ＧＴＡＣＣＧＡＡＧＣ  ＴＣＧＣＡＧＧＡＡＣ  ＴＣＡＧＡＧＴＧＴＧ  ＧＡＧＡＧＧＡＣＧＡ  ＡＡＡ  ＣＴＧＴＣＣＡＧＧＧＡＴＣ  ３’  （配列番号１４）
Ａ＝２’−デオキシアデノシン；Ｃ＝２’−デオキシシトシン；Ｇ＝２’−デオキシグアノシン；Ｔ＝２’−デオキシチミジン（チミジン）
修飾：
５’位置におけるＴＭＲ（＝テトラメチルローダミン）
・  第３のオリゴヌクレオチドプライマー：  Ｐ３Ｆ５Ｄ−６００−２０２
ＴＭＲ  ５’ＧＴＡＣＣＧＡＡＧＣ  ＴＣＧＣＡＧＧＡＡＣ  ＴＣＡＧＡＧＴＧＴＧ  ＧＡＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＡ  ＣＣＡＧＧＧＡＴ  ３’  （配列番号１５）
Ａ＝２’−デオキシアデノシン；Ｃ＝２’−デオキシシトシン；Ｇ＝２’−デオキシグアノシン；Ｔ＝２’−デオキシチミジン（チミジン）
修飾：
５’位置におけるＴＭＲ（＝テトラメチルローダミン）
・  第３のオリゴヌクレオチドプライマーＰ３Ｆ５Ｄ−６００−２０３
ＴＭＲ  ５’  ＧＴＡＣＣＧＡＡＧＣＴＣＧＣＡＧＧＡＡＣＴＣＡＧＡＧＴＧＴＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＡ  ＴＧＴＣＣＡＧＧＧＡ  ３’  （配列番号１１）：
Ａ＝２’−デオキシアデノシン；Ｃ＝２’−デオキシシトシン；Ｇ＝２’−デオキシグアノシン；Ｔ＝２’−デオキシチミジン（チミジン）
修飾：
５’位置におけるＴＭＲ（＝テトラメチルローダミン）
・  第３のオリゴヌクレオチドプライマー：  Ｐ３Ｆ５Ｄ−６００−２０４
ＴＭＲ  ５’  ＧＴＡＣＣＧＡＡＧＣＴＣＧＣＡＧＧＡＡＣＴＣＡＧＡＧＴＧＴＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＡ  ＣＴＧＴＣＣＡＧ  ３’  （配列番号１６）
Ａ＝２’−デオキシアデノシン；Ｃ＝２’−デオキシシトシン；Ｇ＝２’−デオキシグアノシン；Ｔ＝２’−デオキシチミジン（チミジン）
修飾：
５’位置におけるＴＭＲ（＝テトラメチルローダミン）
【０９４７】
ヌクレオチド及びヌクレオチド修飾体は、ホスホジエステル結合によって一緒に連結される。この３’末端は、ポリメラーゼによる可能な伸長を防ぐためにリン酸基でブロックされる。
【０９４８】
開始核酸鎖１．１（鋳型）は１ｐｍｏｌ／ｌの濃度で使用した。プライマー１は５μｍｏｌ／ｌ、コントローラーオリゴヌクレオチドは２μｍｏｌ／ｌ、プライマー２は１μｍｏｌ／ｌ、プライマー３は０．５μｍｏｌ／ｌで使用した。増幅には、２つのポリメラーゼが１：１００の希釈でバッチにおいてＴａｑポリメラーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２７３Ｓ？）で存在し、及び１：２００の希釈でＢｓｔ２．０ウォームスタートポリメラーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０５３８Ｓ？）で存在した。
【０９４９】
対照反応では、Ｐ３プライマーは使用しなかった。さらなる制御反応では、ＢＳＴポリメラーゼのみを使用し、Ｔａｑポリメラーゼは使用しなかった。
【０９５０】
さらなる反応条件は次のとおりである：
１倍等温緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）；単一の濃度では、緩衝液には以下を含有する：２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４；５０ｍＭのＫＣｌ；２ｍＭのＭｇＳＯ４；０．１％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０；２５℃にてｐＨ  ８．８）；ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ）、各２００μｍｏｌ／ｌ；
ＥｖａＧｒｅｅｎ色素（色素は、メーカーの指示に従って１：５０の希釈で使用した）
熱反応条件は次のプロファイルに従い選択した：
・  ２分６５℃、系を活性化するため
・  次の温度−時間プロファイルで１５サイクル又は３０サイクル（コントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅反応）
ｏ  ２分５５℃
ｏ  ２分６５℃
・  ２０秒９５℃、系を活性化するため
・  次の温度−時間プロファイルで３０サイクル（ＰＣＲ）
ｏ  １分５５℃
ｏ  ３分７２℃
ｏ  ２０秒９５℃
・  １０分７２℃、増幅産物の標準化のため
・  融解曲線分析
【０９５１】
総増幅を通常、４５〜６０サイクルにわたり実行した、すなわち、
第１の増幅：（１５又は３０）ｘ（２分５５℃＋２分６５℃）＝（１５〜３０）ｘ４分＝６０〜１２０分
第２の増幅（ＰＣＲ）：３０ｘ（１分５５℃＋３分７２℃＋２０秒９５℃）＝３０ｘ２６０秒＝１３０分（モニターした）。これは、１９０〜２５０分の合計時間に相当する。
【０９５２】
増幅の成功は、経時的なＥｖａＧｒｅｅｎ蛍光シグナルの増加によって測定することが可能であった。
【０９５３】
コントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅反応と検出ＰＣＲとの組み合わせの分析。
次の手法を使用して、得られた増幅産物を分析及び評価した。
・  挿入色素（ＥｖａＧｒｅｅｎ）の蛍光シグナル
・  得られた増幅産物の融解曲線分析
【０９５４】
第１の部分増幅（１５サイクル又は３０サイクルによる）により、核酸鎖（第１の増幅断片１．１）の富化をもたらし、後続のＰＣＲで鋳型として使用できる。これは、ＰＣＲが検出可能な量のＰＣＲ産物を生成するために必要なサイクルが少ないことを意味する。２つの増幅段階のサイクル数を選択することにより、２つの増幅反応の全増幅の増幅率を調整できる。
【０９５５】
これをいくつかの異なる制御アプローチと比較することにより、本発明者らは、第１の増幅を使用することにより、検出可能なシグナルが生成されるまで（Ｃｔ）、第２の増幅（ＰＣＲ）のサイクル数を減らすことができることを示している。このＰＣＲサイクル数の減少は、第１の増幅（コントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅反応）が成功した場合にのみ発生した。次に、第１の増幅産物から検出まで、第２の増幅を実施した。このため、後続の従来のＰＣＲは検出ＰＣＲとも呼ぶ。
【０９５６】
さらに、本発明者らは、１つのバッチで第１及び第２の増幅系を組み合わせることが可能であり、それより、均一なアッセイ形式を実行できることを示している。
【０９５７】
個々の反応バッチの結果を以下に示す。
図４３Ａは、プライマーＰ３Ｆ５Ｄ−６００−２０１を用いた鋳型Ｍ２ＳＦ５−Ｍ００１−２００の組み合わせ増幅中のＥｖａＧｒｅｅｎ蛍光シグナルの一般的な経過を示す。Ｙ軸はＥｖａＧｒｅｅｎ色素の蛍光シグナルを示し、Ｘ軸は反応時間を示す（サイクル数として）。サイクル１〜１５では、コントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅反応を使用する。サイクル１５〜サイクル４５までは、従来のＰＣＲ（検出ＰＣＲ）を使用する。切り替え時間（サイクル１５の終わり）は、矢印１でマークされている。
【０９５８】
矢印２は、鋳型Ｍ２ＳＦ５−Ｍ００１−２００が１ｐｍｏｌ／ｌの開始濃度から開始するＢＳＴポリメラーゼ及びＴａｑポリメラーゼにより増幅される増幅アプローチを示す。
【０９５９】
矢印３は、ＢＳＴポリメラーゼのみを含有する対照の実行を示す。熱感受性ＢＳＴポリメラーゼは、検出ＰＣＲの温度プロファイルによってサイクル１６以降で変性するため、増幅は省かれる。コントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅反応から既に形成された増幅産物は、ＥＧの検出閾値を下回り隠れたままである。
【０９６０】
矢印４は、プライマーＰ３Ｆ５Ｄ−６００−２０１の追加を省いた別の制御アプローチを示す。検出ＰＣＲでの指数関数的増幅は第３のプライマーなしでは不可能であるため、増幅シグナルはもはや観察されない。コントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅反応からすでに生成された増幅産物は、ＥＧの検出閾値を下回り隠れたままである。
【０９６１】
図４３Ｂは、プライマーＰ３Ｆ５Ｄ−６００−２０２との鋳型Ｍ２ＳＦ５−Ｍ００１−２００の組み合わせ増幅中のＥｖａＧｒｅｅｎ蛍光シグナルの一般的な経過を示す。Ｙ軸はＥｖａＧｒｅｅｎ色素の蛍光シグナルを示し、Ｘ軸は反応時間を示す（サイクル数として）。サイクル１〜１５では、コントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅反応を使用する。サイクル１５〜サイクル４５までは、従来のＰＣＲ（検出ＰＣＲ）を使用する。切り替え時間（サイクル１５の終わり）は、矢印１でマークされている。
【０９６２】
矢印２は、鋳型Ｍ２ＳＦ５−Ｍ００１−２００が１ｐｍｏｌ／ｌの開始濃度から開始するＢＳＴ及びＴａｑポリメラーゼにより増幅される増幅アプローチを示す。
【０９６３】
矢印３は、ＢＳＴポリメラーゼのみを含有する対照の実行を示す。熱感受性ＢＳＴポリメラーゼは、検出ＰＣＲの温度プロファイルによってサイクル１６以降で変性するため、増幅は省かれる。コントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅反応から既に形成された増幅産物は、ＥＧの検出閾値を下回り隠れたままである。
【０９６４】
矢印４は、プライマーＰ３Ｆ５Ｄ−６００−２０２を追加しなかった別の制御アプローチを示す。検出ＰＣＲでの指数関数的増幅は第３のプライマーなしでは不可能であるため、増幅シグナルはもはや観察されない。コントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅反応からすでに生成された増幅産物は、ＥＧの検出閾値を下回り隠れたままである。
【０９６５】
図４４Ａは、プライマーＰ３Ｆ５Ｄ−６００−２０３との鋳型Ｍ２ＳＦ５−Ｍ００１−２００の組み合わせ増幅中のＥｖａＧｒｅｅｎ蛍光シグナルの一般的な経過を示す。Ｙ軸はＥｖａＧｒｅｅｎ色素の蛍光シグナルを示し、Ｘ軸は反応時間を示す（サイクル数として）。サイクル１〜１５では、コントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅反応を使用する。サイクル１５〜サイクル４５までは、従来のＰＣＲ（検出ＰＣＲ）を使用する。切り替え時間（サイクル１５の終わり）は、矢印１でマークされている。
【０９６６】
矢印２は、鋳型Ｍ２ＳＦ５−Ｍ００１−２００が１ｐｍｏｌ／ｌの開始濃度から開始してＢＳＴポリメラーゼ及びＴａｑポリメラーゼにより増幅される増幅アプローチを示す。
【０９６７】
矢印３は、ＢＳＴポリメラーゼのみを含有する対照の実行を示す。熱感受性ＢＳＴポリメラーゼは、検出ＰＣＲの温度プロファイルによってサイクル１６以降で変性するため、増幅は省かれる。コントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅反応から既に形成された増幅産物は、ＥＧの検出閾値を下回り隠れたままである。
【０９６８】
矢印４は、プライマーＰ３Ｆ５Ｄ−６００−２０３を追加しなかった別の制御アプローチを示す。検出ＰＣＲでの指数関数的増幅は第３のプライマーなしでは不可能であるため、増幅シグナルはもはや観察されない。コントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅反応からすでに生成された増幅産物は、ＥＧの検出閾値を下回り隠れたままである。
【０９６９】
図４４Ｂは、プライマーＰ３Ｆ５Ｄ−６００−２０４との鋳型Ｍ２ＳＦ５−Ｍ００１−２００の組み合わせ増幅中のＥｖａＧｒｅｅｎ蛍光シグナルの一般的な経過を示す。Ｙ軸はＥｖａＧｒｅｅｎ色素の蛍光シグナルを示し、Ｘ軸は反応時間を示す（サイクル数として）。サイクル１〜１５では、コントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅反応を使用する。サイクル１５〜サイクル４５までは、従来のＰＣＲ（検出ＰＣＲ）を使用する。切り替え時間（サイクル１５の終わり）は、矢印１でマークされている。
【０９７０】
矢印２は、鋳型Ｍ２ＳＦ５−Ｍ００１−２００が１ｐｍｏｌ／ｌの開始濃度から開始してＢＳＴポリメラーゼ及びＴａｑポリメラーゼにより増幅される増幅アプローチを示す。
【０９７１】
矢印３は、ＢＳＴポリメラーゼのみを含有する対照の実行を示す。熱感受性ＢＳＴポリメラーゼは、検出ＰＣＲの温度プロファイルによってサイクル１６以降で変性するため、増幅は省かれる。コントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅反応から既に形成された増幅産物は、ＥＧの検出閾値を下回り隠れたままである。
【０９７２】
矢印４は、プライマーＰ３Ｆ５Ｄ−６００−２０４を追加しなかった別の制御アプローチを示す。検出ＰＣＲでの指数関数的増幅は第３のプライマーなしでは不可能であるため、増幅シグナルはもはや観察されない。コントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅反応からすでに生成された増幅産物は、ＥＧの検出閾値を下回り隠れたままである。
【０９７３】
均一アッセイ形式でのコントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅反応と、４つのプライマー３の変異体（Ｐ３Ｆ５Ｄ−６００−２０１〜Ｐ３Ｆ５Ｄ−６００−２０４）のいずれかを有する（従来の）検出ＰＣＲとの組み合わせが成功していることがわかる。ＢＳＴ及びＴａｑポリメラーゼの併用は重要である。同様に重要なのは、第３のプライマーであり、これがないと、増幅シグナルを検出できなかった。プライマー３の変異体は非常に個別に動作し、これは、増幅シグナルがベースラインから目立ち始めた時点のさまざまな点から確認できる。検出ＰＣＲで増幅シグナルが早く検出されるほど、以前に生成されたコントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅産物の検出において、それぞれのプライマー３の変異体がより効果的になる。
【０９７４】
初期増幅段階でのコントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅反応のサイクル数を２倍にすると、定性的に非常に類似した結果が得られることを以降に示す。
【０９７５】
図４５Ａは、プライマーＰ３Ｆ５Ｄ−６００−２０１との鋳型Ｍ２ＳＦ５−Ｍ００１−２００の組み合わせ増幅中のＥｖａＧｒｅｅｎ蛍光シグナルの一般的な経過を示す。Ｙ軸はＥｖａＧｒｅｅｎ色素の蛍光シグナルを示し、Ｘ軸は反応時間を示す（サイクル数として）。コントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅反応は、サイクル１〜３０で使用する。サイクル３１〜サイクル６０までは従来のＰＣＲ（検出ＰＣＲ）を使用する。切り替え時間（サイクル３０の終わり）は、矢印１でマークされている。
【０９７６】
矢印２は、鋳型Ｍ２ＳＦ５−Ｍ００１−２００が１ｐｍｏｌ／ｌの開始濃度から開始してＢＳＴポリメラーゼ及びＴａｑポリメラーゼにより増幅される増幅アプローチを示す。
【０９７７】
矢印３は、ＢＳＴポリメラーゼのみを含有する対照の実行を示す。熱感受性ＢＳＴポリメラーゼは、検出ＰＣＲの温度プロファイルによってサイクル１６以降で変性するため、増幅は省かれる。コントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅反応から既に形成された増幅産物は、ＥＧの検出閾値を下回り隠れたままである。
【０９７８】
矢印４は、プライマーＰ３Ｆ５Ｄ−６００−２０１の追加を省いた別の制御アプローチを示す。検出ＰＣＲでの指数関数的増幅は第３のプライマーなしでは不可能であるため、増幅シグナルはもはや観察されない。コントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅反応からすでに生成された増幅産物は、ＥＧの検出閾値を下回り隠れたままである。
【０９７９】
図４５Ｂは、プライマーＰ３Ｆ５Ｄ−６００−２０３との鋳型Ｍ２ＳＦ５−Ｍ００１−２００の組み合わせ増幅中のＥｖａＧｒｅｅｎ蛍光シグナルの一般的な経過を示す。Ｙ軸はＥｖａＧｒｅｅｎ色素の蛍光シグナルを示し、Ｘ軸は反応時間を示す（サイクル数として）。コントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅反応は、サイクル１〜３０で使用する。サイクル３１〜サイクル６０までは従来のＰＣＲ（検出ＰＣＲ）を使用する。切り替え時間（サイクル３０の終わり）は、矢印１でマークされている。
【０９８０】
矢印２は、鋳型Ｍ２ＳＦ５−Ｍ００１−２００が１ｐｍｏｌ／ｌの開始濃度から開始してＢＳＴポリメラーゼ及びＴａｑポリメラーゼにより増幅される増幅バッチを示す。
【０９８１】
矢印３は、ＢＳＴポリメラーゼのみを含有する対照の実行を示す。熱感受性ＢＳＴポリメラーゼは、検出ＰＣＲの温度プロファイルによってサイクル１６以降で変性するため、増幅は省かれる。コントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅反応から既に形成された増幅産物は、ＥＧの検出閾値を下回り隠れたままである。
【０９８２】
矢印４は、プライマーＰ３Ｆ５Ｄ−６００−２０３を追加しなかった別の制御アプローチを示す。検出ＰＣＲでの指数関数的増幅は第３のプライマーなしでは不可能であるため、増幅シグナルはもはや観察されない。コントローラーオリゴヌクレオチドに基づく増幅反応からすでに生成された増幅産物は、ＥＧの検出閾値を下回り隠れたままである。
【０９８３】
図４６は、組み合わせ増幅（第１及び第２の増幅を含む）とＰＣＲ単独（第２の増幅のみ）の時間間隔の比較を示す。
第１の増幅は上記のとおり実施した。第２の反応では、第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３Ｆ５Ｄ−６００−２０３）を使用した。バッチをピペットで取り、反応を上記のとおり実施した。上に示すとおり、コントローラー依存増幅は、最初に組み合わせバッチ（ここでは１５サイクル）で実行し、次にＰＣＲに切り替えた（矢印１）。時間間隔１と２とを比較した。
【０９８４】
矢印２は、組み合わせ増幅の経過を示す（Ｂｓｔポリメラーゼ及びＴａｑポリメラーゼは両方ともバッチ内に存在した）。第１の増幅が始まる前に、バッチには１ｐｍｏｌ／ｌの開始核酸鎖（鋳型）を含有した。蛍光シグナルの増加は、時間間隔１の後に発生している。
【０９８５】
矢印３は、Ｂｓｔが省かれ、その結果、第１の増幅反応が「停止」した制御バッチの経過を示す（第１の増幅系のすべての成分はバッチ内にあるが、正しいポリメラーゼ、この場合Ｂｓｔ２．０は不在であった）。このバッチは、第１の増幅の開始前に、１ｐｍｏｌ／ｌの開始核酸鎖（鋳型）を含有した。蛍光シグナルの増加は、時間間隔２の後に発生している。Ｔａｑポリメラーゼは同じ鋳型から産物を合成することもできるが、ＰＣＲだけでこれを行うにはさらにサイクルが必要である。
【０９８６】
矢印４は、開始核酸鎖１．１なし（鋳型なし＝ＮＴＣ対照）の組み合わせバッチの経過を示す。
【０９８７】
総じて、ＰＣＲで次いで開始核酸鎖２．１（鋳型）として機能することができる、増幅断片１．１の数を第１の増幅中に増やすことにより、バッチ２での反応のＰＣＲ断片の生成が全体として速くなることがわかる：検出可能な量の第２の増幅産物（２．１）が生成されるまで、必要なＰＣＲのサイクル数は少ない。時間間隔１は時間間隔２より短い。
【０９８８】
図４７は、組み合わせ増幅（第１及び第２の増幅を含む）とＰＣＲ単独（第２の増幅のみ）の時間間隔の比較を示す。
第１の増幅は上記のとおり実施した。第２の反応では、第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３Ｆ５Ｄ−６００−２０３）を使用した。バッチをピペットで取り、反応を上記のとおり実施した。上に示すとおり、コントローラー依存増幅は、最初に組み合わせバッチ（ここでは３０サイクル）で実行し、次にＰＣＲに切り替えた（矢印１）。時間間隔３と４とを比較した。
【０９８９】
矢印２は、組み合わせ増幅の経過を示す（Ｂｓｔポリメラーゼ及びＴａｑポリメラーゼは両方ともバッチ内に存在した）。第１の増幅が始まる前に、バッチには１ｐｍｏｌ／ｌの開始核酸鎖（鋳型）を含有した。蛍光シグナルの増加は、時間間隔３の後に発生している。
【０９９０】
矢印３は、Ｂｓｔが省かれ、その結果、第１の増幅反応が「停止」した制御バッチの経過を示す（第１の増幅系のすべての成分はバッチ内にあるが、正しいポリメラーゼ、この場合はＢｓｔ２．０がなかった）。このバッチは、第１の増幅の開始前に、１ｐｍｏｌ／ｌの開始核酸鎖（鋳型）を含有した。蛍光シグナルの増加は、時間間隔４の後に発生している。Ｔａｑポリメラーゼは同じ鋳型から産物を合成することもできるが、ＰＣＲ単独でこれを行うにはさらにサイクルが必要である。
【０９９１】
矢印４は、開始核酸鎖１．１なし（鋳型なし＝ＮＴＣ対照）の組み合わせバッチの経過を示す。
【０９９２】
総じて、ＰＣＲで次いで開始核酸鎖２．１（鋳型）として機能し得る、増幅断片１．１の数を第１の増幅中に増加することにより、ＰＣＲ断片の生成がバッチ２での反応を全体として速くさせることがわかる：検出可能な量の第２の増幅産物（２．１）が生成されるまで、必要なＰＣＲのサイクル数は少ない。時間間隔３は時間間隔４より短い。
【０９９３】
実施例５（図４８〜４９、７１）：野生型配列変異体を有するヒトゲノムＤＮＡの存在下で変異を伴うヒトＦＶＬ標的配列の増幅
この実施例は、２つの配列変異体（変異型又は野生型）を含む多型遺伝子座を含む標的配列（凝固第Ｖ因子ライデン遺伝子、ＦＶＬ遺伝子のＳＮＰ変異体）の選択的増幅を示す。
【０９９４】
第１の増幅系の成分（第１のプライマー、第２のプライマー、コントローラー、ポリメラーゼ）及び反応条件は、増幅される核酸（両方のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ及びＰ２．１−Ｅｘｔ）を含む増幅断片１．１）は、ＦＶＬ遺伝子に変異がある配列変異体を好ましくは含むように選択した。野生型配列変異体（ＷＴ配列）は、第１の増幅動作中に大幅に増幅されるべきではない。第１の増幅は、一本鎖ヒトｇＤＮＡ（標的配列を含む鋳型）を使用してプライマー伸長産物として得られた開始核酸１．１から開始した。増幅は、所望のレベルの増幅断片が達成されるまで実施した。第１の増幅で生成された産物（増幅断片１．１）は、第２の増幅（ＰＣＲ）の鋳型（開始核酸２．１）として機能することができた。
【０９９５】
標的配列の両方の変異体を増幅できるように、第２の増幅系の成分（第３のプライマー、第４のプライマー、ポリメラーゼ）及び反応条件（ＰＣＲ増幅）を選択した。第２の増幅（ＰＣＲ）は、第１の増幅に続く別のステップで実行した。
【０９９６】
第１の増幅系及び第２の増幅系の概略的なトポグラフィーを図７１に示す。第２の増幅系のプライマーは、第１の増幅系のプライマーに対して「ネスト形式」であった。
【０９９７】
第１の増幅の得られた産物（増幅断片１．１）及び第２の増幅の得られた産物（増幅断片２．１）を、異なる方法によって検出及び分析した。検出方法の１つは、挿入色素（Ｅｖａ−Ｇｒｅｅｎ色素）によるリアルタイム検出からなり、別の検出方法は、配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ（Ｔａｑｍａｎプローブ）によるリアルタイム検出からなり（これらのプローブにより、配列変異体に応じた識別が可能になる：突然変異体と野生型変異体）、別の分析方法は、増幅で得られた増幅断片のサンガーシーケンシングからなった。
【０９９８】
配列特異的な増幅の実施は、いくつかの方法で達成した。第一に、標的配列の増幅は突然変異体を含んでいた（第１の増幅単独によるか、又は第１及び第２の増幅の組み合わせによる）。第二に、野生型変異体を伴う約３０，０００コピーのヒトｇＤＮＡの存在下で、１つの突然変異体（１００又は１０コピー）を含む標的配列の増幅を達成した。さらに、選択された条件下では、野生型変異体（５０００コピー）による標的配列の測定可能な増幅が起こらなかったことが示された。
【０９９９】
材料及び方法：
標的配列：
以下の変異体を、多型遺伝子座を持つ標的配列として選択した。
突然変異を伴うＦＶＬ配列変異体：
【化２３】
2021514637.tif 000028
【１０００】
野生型配列変異体：
【化２４】
2021514637.tif 000029
【１００１】
どちらの配列も、ＮＣＢＩから入手可能な情報に基づいて誘導した：
ホモサピエンス染色体１、ＧＲＣｈ３８．ｐ１２一次アセンブリ、配列番号：ＮＣ＿０００００１．１１
ＳＮＰ１６９１Ｇ＞Ａ（置換）を伴う凝固第Ｖ因子、コドン５０６において。
【１００２】
開始核酸１．１の調製のためのバッチ内の成分
【１００３】
ヒトｇＤＮＡ：ＦＶＬ遺伝子のためのヒトｇＤＮＡのＷＨＯ標準０４／２２４
・  ヒトｇＤＮＡの突然変異を保有する変異体（０３／２６０第Ｖ因子ライデンホモ接合体）（ＦＶＬ変異）
・  ヒトｇＤＮＡの変異を保有する野生型（０３／２５４野生型第Ｖ因子）（ＷＴ配列）
・  オリゴヌクレオチドプライマー
Ｐ１Ｆ５Ｇ２−２００１−２０３  （配列番号１９）
【化２５】
2021514637.tif 000030
１＝Ｃ３
下線の配列は、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド（２’−Ｏ−メチルヌクレオチド）からなり、第１のプライマーの第２の領域に相当する。
【１００４】
−  Ｂｓｔ２．０ウォームスタートＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ  １２０，０００ユニット／ｍｌ）（１：１０００希釈の反応で使用された）（さらには「Ｂｓｔポリメラーゼ」と呼ばれる）
【１００５】
第１の増幅系
・  第１のオリゴヌクレオチドプライマーＰ１Ｆ５Ｇ２−１００１−１０３
【化２６】
2021514637.tif 000031
１＝Ｃ３
【１００６】
下線の配列は２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドからなり、第１のプライマーの第２の領域に相当する。
・  ブロックオリゴヌクレオチド：  Ｂ１−Ｐ１Ｆ５Ｇ２−３５０１−３０４
【化２７】
2021514637.tif 000032
２＝ＨＥＧ
Ｘ＝３’−リン酸基
【１００７】
括弧内の下線の配列は、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドからなる。
・  コントローラーオリゴヌクレオチド：ＣＦ５Ｇ２−１００２−４０１（配列番号２２）
５’    ［Ａｇｇａｃｕａｃｕｕ  ｃｕａａｕｃｕｇｕａ  ａｇａｇｃａｇａｕｃ  ｃｃｕｇｇａｃａｇｇ  ｃａａｇｇａａｕａｃ  ａｇｇｕａｕｕ］  ｔｔｇＡＣａｇａｇｃａｔ  ｃａｇａｇａｇ  Ｘ
Ｘ＝３’−リン酸基
【１００８】
括弧内の配列は、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドからなる。
・  第２のオリゴヌクレオチドプライマー
Ｐ２−ＨＡＦ５−０８１−１０５１  （配列番号２３）
ＣＡｃａａＴＣＡＴＣＡＡＴＡＣｔａａｔａｇｇａｃ  ６  ｃｔｃｔｇｇｇｃｔａａｔａｇｇａｃｔａｃｔｔｃｔａａｔｃｔｇｔａａｇａｇｃａ
６＝ＨＥＧ
・  ＢＳＴ２．０ウォームスタートＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ  １２０，０００ユニット／ｍｌ）、さらには「ＢＳＴポリメラーゼ」とも呼ばれる
【１００９】
個々の成分に以下の濃度を使用した：
・  第１のオリゴヌクレオチドプライマー      ０．３  μｍｏｌ／ｌ  
・  ブロックオリゴヌクレオチド      ５  μｍｏｌ／ｌ
・  コントローラーオリゴヌクレオチド      ２  μｍｏｌ／ｌ
・  第２のオリゴヌクレオチドプライマー      ０．２  μｍｏｌ／ｌ
・  ＢＳＴ  ポリメラーゼ      １：１０００希釈において反応に使用した
ヒトｇＤＮＡ（「ヒト男性」、Ｐｒｏｍｅｇａ製）をバッチあたり（１２μｌ）約１００ｎｇの濃度で一本鎖の形で第１の増幅のバッチに添加した。これは、複合的な遺伝的背景を持つ試験系をシミュレーションした。ヒトｇＤＮＡはプールされた試料を含む（バッチあたり約３０，０００コピー）。
【１０１０】
第２の増幅系（ＥｖａＧｒｅｅｎ検出）
・  第３のオリゴヌクレオチドプライマー  Ｐ３Ｆ５Ｇ２−１００１−３０１
５’−  ＣＴＣＧＡＣＡＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＡＡＡＴａｃｃｔｇｔａｔｔｃｃ    （配列番号２４）  （０，５μｍｏｌ／ｌで使用）
・  第４のオリゴヌクレオチドプライマー：  Ｐ４Ｆ５Ｇ２−１００１−４０１
５’−  ｃｔｃ  ｔｇｇｇｃｔａａｔａ  ｇｇａｃｔａｃｔｔｃ  ｔａａｔａｔｇｔａａ  ｇａｇｃａ  ｇａｔ    （配列番号２５）  （０，５μｍｏｌ／ｌで使用）
・  Ｔａｑポリメラーゼホットスタート（ＮＥＢ  ５，０００ユニット／ｍｌ）（１：１００希釈で反応において使用）
・  ＥｖａＧｒｅｅｎ色素を使用した検出（Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｓｔｏｃｋ  １：５０）
【１０１１】
第３及び第４のプライマーは、それぞれ第１及び第２のプライマーに対し「ネスト形式」で設計した。
【１０１２】
第２の増幅でＦＶＬ系を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ：
第２の増幅系（プローブ検出）
・  第３のオリゴヌクレオチドプライマー：  Ｐ３Ｆ５Ｇ３−１００１−３３０３−４
５’−  ＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＡＡＡＴａｃｃｔｇｔ  ａｔｔ （配列番号２６）（０，５μｍｏｌ／ｌで使用）
・  第４のオリゴヌクレオチドプライマー：  Ｐ４Ｆ５Ｇ３−１００１−３４０４−２
５’−   ＡＴＡＴＧＴＡＡ  ＧＡＧＣＡ  ＧＡＴ  ＣＣＣ  （配列番号２７）  （０，５μｍｏｌ／ｌで使用）
・  Ｔａｑポリメラーゼホットスタート（ＮＥＢ  ５，０００ユニット／ｍｌ）（１：１００希釈で反応において使用）
・  オリゴヌクレオチドプローブによる検出
【１０１３】
第３及び第４のプライマーは、それぞれ第１及び第２のプライマーに対し「ネスト形式」で設計した。
・  ＦＶＬ変異の特異的検出のためのプローブオリゴヌクレオチドＳ１Ｐ４−ＦＶＬ−１００７
【化２８】
2021514637.tif 000033
（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ製）（０，２μｍｏｌ／ｌで使用）
・  ＷＴ特異的検出のためのプローブオリゴヌクレオチド：  Ｓ１Ｐ４−ＦＶＬ−１００３−１
【化２９】
2021514637.tif 000034
（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ製）（０，６μｍｏｌ／ｌで使用）
識別塩基には下線が引かれている。
ＮＦＱ＝非蛍光クエンチャー（ＢｌａｃｋＨｏｌｅシリーズのクエンチャー）
これらのプローブは、蛍光レポーターと蛍光クエンチャーとを備えた「Ｔａｑｍａｎプローブ」の例である。
【１０１４】
緩衝液：
すべての反応は同じ緩衝液で行った。１倍緩衝液成分（ＮＥＢ）２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４
５０ｍＭ  ＫＣｌ
２ｍＭ  ＭｇＳＯ４
０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０
２５℃でｐＨ  ８．８
・  任意に、Ｅｖａ−Ｇｒｅｅｎ色素（Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（１：５０希釈において反応に使用した）。
・  Ｂｓｔポリメラーゼ用ｄＮＴＰミックス：ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ  各２００μｍｏｌ／Ｌ、ｄＵＴＰ  ４００μｍｏｌ／ｌ
・  Ｔａｑポリメラーゼ用ｄＮＴＰミックス：ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ  各２００μｍｏｌ／Ｌ
【１０１５】
方法の手順：
第１の増幅のための開始核酸の調製
最初に、一本鎖ヒトゲノムＤＮＡ（ＦＶＬ及びＷＴ配列変異体のＷＨＯ標準）から開始する標的配列を含む開始核酸１．１を、プライマー（Ｐ１Ｆ５Ｇ２−２００１−２０３、０．２μｍｏｌ／ｌで挿入）を使用して、Ｂｓｔポリメラーゼによるプライマー伸長（５０℃で１０分）により合成し、次いで、９５℃（５分）での熱変性により鋳型鎖から分離した。ＦＶＬ変異及び野生型変異を有する標的配列の配列変異体の開始核酸１．１の生成は、別々のバッチで実施した。バッチあたり約１００，０００コピーのヒトｇＤＮＡを使用した。これに使用したプライマーは、第１のオリゴヌクレオチドプライマーＰ１Ｆ５Ｇ２−１００１−１０３と構造が類似していた。
【１０１６】
プライマー伸長後、標的核酸に相補的な配列セグメント及び５’末端にオーバーハングを有するプライマー伸長産物を含む開始核酸１．１が得られた。第１の増幅では、そのような開始核酸が鋳型として機能し、第２のプライマーは、そのような開始核酸１．１に特異的に配列を結合し、ポリメラーゼによって伸長することができる。コントローラーオリゴヌクレオチドは、その第１の領域でオーバーハングに結合できる。
【１０１７】
第１の増幅及び検出の実行：
開始核酸１．１（ＦＶＬ変異及び／又はＷＴ配列を有する）を増幅バッチにさまざまな希釈度で添加した（１００コピー、ＦＶＬ変異には１０コピー、及びＷＴ配列には５０００コピー）。反応は、５０℃〜６５℃の間の周期的な温度変化の下で実施した。前記温度では、特異的な増幅の課題である自然減衰は発生しなかった。１サイクルは、５０℃（２分）及び６５℃（４分）でのインキュベーションを含んだ。このバッチを異なる時間（最大約１５時間）インキュベートした。挿入色素Ｅｖａ  Ｇｒｅｅｎからのシグナルが反応中に検出された。反応の完了後、融解曲線を決定した。増幅は、挿入色素を保存することができる二本鎖ＤＮＡ（増幅断片１．１）の量の増加をもたらし、ＥｖａＧｒｅｅｎのシグナルが増加する結果となった。
【１０１８】
この反応中に合成された増幅断片１．１は、第２の増幅又はサンガーシーケンス分析の鋳型として使用可能であった。
【１０１９】
第２の増幅及び検出の実行（ＥｖａＧｒｅｅｎ）：
第２の増幅で使用する前に、第１の増幅の産物を１：６０００に希釈した。前記希釈されたバッチに存在する増幅断片は、ＰＣＲ反応のための開始核酸２．１として機能した。ＰＣＲ反応は４０サイクルで行った。１つのサイクルには次を含んだ：５５℃１分、６８℃３分、９５℃２０秒。検出はＥｖａ−Ｇｒｅｅｎ色素を用いて実施した。シグナルの増加（Ｃｔ値）を観察することで、反応の開始時に添加される鋳型の相対量を推定することが可能であった。第２の増幅で合成された増幅断片２．１は、サンガーシーケンシングに使用することができた。
【１０２０】
第２の増幅及び検出の実行（プローブオリゴヌクレオチド）：
第２の増幅で使用する前に、第１の増幅の産物を１：６０００に希釈した。前記希釈されたバッチに存在する増幅断片は、ＰＣＲ反応のための開始核酸２．１として機能した。ＰＣＲ反応は４０サイクルで行った。１つのサイクルには次を含んだ：５７℃１分、９５℃２０秒。検出は、配列特異的なオリゴヌクレオチドプローブ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ製の蛍光レポーター及びＭＧＢを備えたＴａｑｍａｎプローブ）を使用して実施した。シグナルの増加（Ｃｔ値）を観察することにより、反応の開始時に添加された鋳型の相対量は、合成産物の関連配列セグメントの配列組成と同様に推定することが可能であった。
【１０２１】
結果及び評価：
第１の増幅では、（ＥｖａＧｒｅｅｎ色素の）シグナルの増加が、開始核酸１．１（ＦＶＬ変異配列変異体を持つ標的配列）から開始するバッチにおいて、バッチあたり約１００及び１０コピーの初期濃度で検出可能であった（図４８、矢印１及び２、Ａ）増幅中のシグナル曲線、Ｂ）融解曲線）。初期濃度がバッチあたり約５０００コピーのＷＴ変異体の標的配列を有するバッチでは、シグナルの増加は検出されなかった（図４８、矢印３）。このシグナルは、開始核酸のないバッチのレベルであった。第１の増幅の完了後、アリコートを取り、希釈して、第２の増幅に加えた。
【１０２２】
第２の増幅は、完了した第１の増幅からのバッチの希釈に基づいた（最終希釈１：６０００）。第２の増幅では、第３及び第４のプライマーを使用し、これは第１及び第２のプライマーへネスト化した。第２の増幅は、ＦＶＬ変異変異体の標的配列を備えた開始核酸１．１に由来する増幅断片を有する、第１の増幅のすべてのバッチで特異的なシグナルの増加を示した（図４９矢印２、Ａ）増幅中のシグナルの進行を示す、Ｂ）融解曲線を示す）。シグナルの増加はＰＣＲの過程において初期に発生し（Ｃｔ値は約５又は８）、第１の増幅からの増幅断片の高い濃度を示す。野生型変異体の標的配列を有する開始核酸１．１から開始するバッチでは、開始核酸のないバッチのレベル（図４９、矢印４、Ｃｔ値約２５）にあるシグナルが観察された（図４９、矢印３、Ｃｔ値約２５）。これらのバッチでのシグナル増加の時点（Ｃｔ値）の比較では、第１の増幅の終わりにＦＶＬ変異を持つ増幅断片の量が、野生型ＤＮＡを持つ増幅断片の量よりも有意に多いことを示している。第１の増幅で使用された開始核酸（ＦＶＬ配列変異体の１０コピー、対、野生型ＤＮＡの５０００コピー）を考慮すると、ＦＶＬ配列変異体の増幅が野生型変異体よりも明らかに優先であることが観察できた。個々の反応の増幅産物（ＦＶＬ配列）の組成を、サンガー分析及びプローブに基づく検出によってさらに確認した。
【１０２３】
この結果は、第１の増幅中の前記標的配列の特異的な増幅を表す。第１の増幅で合成された増幅断片は、第２の増幅の鋳型として使用することができた。
【１０２４】
第１の増幅中の標的配列の２つの変異体の違いは、突然変異を伴う標的配列に相補的であるように設計されたコントローラーオリゴヌクレオチドの影響によってなされた。したがって、このコントローラーオリゴヌクレオチドは、１つのヌクレオチド位置にて、前記標的配列の野生型変異体に対する不一致を含む。コントローラーオリゴヌクレオチドを、標的配列の多型遺伝子座がコントローラーオリゴヌクレオチドの第３の領域に位置するように設計した。したがって、この多型遺伝子座は、第１のプライマーの３’及び第２のプライマーの３’である、標的配列の配列セグメントに位置した。単独で使用されるプライマーは、標的配列の多型遺伝子座における個々の配列変異体を区別することができなかったであろう。
【１０２５】
第１の増幅中に、主にこのコントローラーの第３の領域に完全に相補的な配列（突然変異を含むＦＶＬ標的配列）を有する産物の選択的増幅を実施した。この実施例では、一方でプライマー濃度がコントローラーオリゴヌクレオチドの濃度よりも低く、他方で周期的な温度変化（５０℃から６５℃の間）を使用する、反応条件の有利な実施形態を選択した。
【１０２６】
使用されるオリゴヌクレオチドにおいて、オリゴヌクレオチドプライマーは、対応するコントローラーオリゴヌクレオチドと相互作用対を形成する（例えば、第１のオリゴヌクレオチドプライマー及び第１のコントローラーオリゴヌクレオチド）。前記相互作用対は、増幅反応条件下で約６３℃の融解温度を有した（増幅緩衝液条件下で両方の成分の約１μｍｏｌ／ｌの濃度で測定）。オリゴヌクレオチドプライマーの第１の領域は、約５０℃の融解温度で鋳型の相補配列部分と複合体を形成した（例えば、第１のプライマーの第１のセグメントと第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１−Ｅｘｔ）とは、この増幅の緩衝液条件下での両方の成分の濃度は約１μｍｏｌ／ｌで測定した）。
【１０２７】
実施形態に応じて、プライマー及びコントローラーオリゴヌクレオチドを異なる比率で使用することができる。
【１０２８】
有利な実施形態では、プライマーの濃度がコントローラーの濃度よりも高いプライマーとコントローラーの組み合わせを使用した（例えば、第１のプライマー５μｍｏｌ／ｌ及びコントローラー２μｍｏｌ／ｌ、実施例１〜３を参照）。前記実施形態では、過剰なプライマーが存在し、それにより、５０℃の温度でのプライマー伸長ステップは、オリゴヌクレオチドプライマーのコントローラーオリゴヌクレオチドの部分的結合にもかかわらず、良好な収率をもたらした。
【１０２９】
さらに有利な実施形態（実施例５）では、プライマーの濃度がコントローラーオリゴヌクレオチドの濃度よりも低いプライマー及び対応するコントローラーオリゴヌクレオチドの混合物を使用した（例えば、プライマー０．５μｍｏｌ／ｌ及びコントローラー２μｍｏｌ／ｌ）。したがって、コントローラーオリゴヌクレオチドは過剰であった。前記実施形態では、反応温度を５０℃に下げることにより、オリゴヌクレオチドプライマーのコントローラーオリゴヌクレオチドへの迅速な結合がもたらされた。これにより、５０℃でのプライマー伸長ステップの収量が減少し、増幅速度が低下した。低温でも十分なプライマー濃度を維持し、したがってプライマー伸長ステップでの収量を増やすために、いわゆるブロックオリゴヌクレオチドを使用した。そのようなブロックオリゴヌクレオチドは、コントローラーオリゴヌクレオチドへの結合に関してオリゴヌクレオチドプライマーと競合したが、ポリメラーゼ自体によって伸長することができなかった。
【１０３０】
ブロックオリゴヌクレオチドを使用することにより、いくつかの濃度範囲でオリゴヌクレオチドプライマーとコントローラーオリゴヌクレオチドとの組み合わせを使用し、それらを周期的な温度変化と組み合わせることが可能であった。これにより、反応速度が向上した。
【１０３１】
ブロックオリゴヌクレオチドの構造は、本質的にオリゴヌクレオチドプライマーの構造に類似するが、次の点が異なる：
−  ブロックオリゴヌクレオチドはポリメラーゼによって伸長されない。これは、例えば、３’−末端を修飾（例えば、３’−リン酸、３’−Ｃ３、ジデオキシヌクレオチド）でブロックすることにより、及び／又はブロックオリゴヌクレオチドの３’−末端に末端不一致を導入することにより達成できる。
−  ブロックオリゴヌクレオチドは、対応するプライマーとは配列組成が異なり得る。配列不一致の数は、１ヌクレオチド〜２０ヌクレオチドまで変化可能である。
【１０３２】
ブロックオリゴヌクレオチドを設計する場合、ブロックオリゴヌクレオチドのＴｍを、オリゴヌクレオチドプライマー及びコントローラーオリゴヌクレオチドのＴｍと同様の範囲のコントローラーオリゴヌクレオチドに保つことが有利である。結果として、ブロックオリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドプライマーとは、同様のレベル（例：プライマー−コントローラー複合体のＴｍプラス／マイナス３℃）でコントローラーオリゴヌクレオチドへの結合をめぐって競合する。オリゴヌクレオチドプライマーよりも高濃度のブロックオリゴヌクレオチドを使用することにより、結合比に有利に影響を与えることができる。
【１０３３】
本発明の実施形態のさらなる実施例
図１は、第１の増幅系及び第２の増幅系の成分を使用する、第１の増幅（図１Ａ）（第１の部分増幅）、及び次いで第２の増幅（図１Ｂ）（第２の部分増幅）を含む増幅の遊離物及び産物を概略的に示す。反応は、標的配列を含み、第１の部分増幅を開始するための鋳型として使用される開始核酸１．１で開始する。
【１０３４】
第１の増幅系の成分は、特に：第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）、第２のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ２．１）、コントローラーオリゴヌクレオチド（Ｃ１．１）及び第１のポリメラーゼ（Ｐｏｌ１．１）、ｄＮＴＰである。
第１の部分増幅（Ａ１．１）中に、第１の増幅断片１．１の特異的な増幅（第１のプライマー伸長産物Ｐ１．１−Ｅｘｔ及び第２のプライマー伸長産物Ｐ２．１−Ｅｘｔを含む）が行われる。プライマー伸長産物Ｐ１．１−Ｅｘｔは、第１の部分増幅の反応条件下で、ポリメラーゼによるＰ１．１の鋳型依存伸長として実現される。プライマー伸長産物２．１−Ｅｘｔは、第１の部分増幅の反応条件下でのＰ２．１の鋳型依存伸長からもたらされる。プライマーＰ１．１及びＰ２．１は両方とも、標的配列又はその相補的配列セグメントに相補的に結合することができる配列セグメントを含み、その結果、プライマーは標的配列の両端に配置される。
【１０３５】
第１の部分増幅中に形成された増幅産物１．１は、第２の部分増幅（Ａ２．１）の開始核酸２．１として使用できる。第２の部分増幅中に、第３のプライマー伸長産物Ｐ３．１−Ｅｘｔ及び第４のプライマー伸長産物Ｐ４．１−Ｅｘｔを含む第２の増幅断片２．１が増幅され、プライマー伸長産物Ｐ３．１−Ｅｘｔは、Ｐ３．１の鋳型依存伸長としてかつポリメラーゼによって形成され、プライマー伸長産物４．１−Ｅｘｔは、第２の部分増幅の反応条件下でのＰ４．１の鋳型依存性伸長から生じる。プライマーＰ３．１及びＰ４．１の両方は、標的配列又はその相補的配列セグメントに相補的に結合することができる配列セグメントを含む。Ｐ１．１及びＰ３．１は、それらの３’セグメントで相補的にコントローラーオリゴヌクレオチドに結合できるが、コントローラーオリゴヌクレオチドの修飾により、それらは使用されるポリメラーゼによって伸長されない。
【１０３６】
図２は、第１の部分増幅の遊離物及び産物を概略的に示す。第１の部分的な増幅の間、第１の増幅断片１．１の特異的な増幅（第１のプライマー伸長産物Ｐ１．１−Ｅｘｔ及び第２のプライマー伸長産物Ｐ２．１−Ｅｘｔを含む）。プライマー伸長産物Ｐ１．１−Ｅｘｔは、Ｐ１．１の鋳型依存性伸長として実現され、プライマー伸長産物２．１−Ｅｘｔは、Ｐ２．１の鋳型依存性伸長から生じる。
【１０３７】
この反応中に形成された合成産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ及びＰ２．１−Ｅｘｔ）は、それらの間で、及びコントローラーオリゴヌクレオチドと異なる複合体を形成できる（濃度比と反応条件に応じて）詳細には、これらの形態は、Ｐ１．１−Ｅｘｔ／Ｃ１．１及び／又はＰ１．１−Ｅｘｔ及び／又はＰ１．１−Ｅｘｔ／Ｃ１．１／Ｐ２．１−Ｅｘｔの複合体を含むことができる。
【１０３８】
Ｐ１−Ｅｘｔは、第２の部分増幅の反応条件下でＰ４．１プライマーに本質的に相補的に結合できる配列部分を含む３’セグメントを含む。Ｐ２−Ｅｘｔは、第２の部分増幅の反応条件下でＰ３．１プライマーに本質的に相補的に結合できる配列部分を含む３’セグメントを含む。
【１０３９】
図３は、２回の部分増幅の温度プロファイル（図３Ａ）を示し、第１及び第２の部分増幅中の産物の蓄積（時間依存性様式でのコピー数の増加として）の概略図を示す（図３Ｂ）。
【１０４０】
第１の部分増幅セクションＡ１．１は、特異的なコントローラーオリゴヌクレオチドの非存在下で非特異的な自発的な鎖分離を許さない温度条件下で実行する。本質的に、この反応は温度Ｔ１とＴ２との間で起こる。より低い温度（Ｔ１）では、特に第１の増幅系の少なくとも１つのプライマーのハイブリダイゼーション及びポリメラーゼによるその伸長が起こり、第２の温度（Ｔ２）では、特にＰ１−Ｅｘｔ及びＰ２−Ｅｘｔの分離が、コントローラーオリゴヌクレオチドが関与して起こる。反応は、反応温度の周期的変化として進行し、必要なサイクル数を選択でき、増幅の程度に影響を与えることができる。ここでは、約１０コピー〜約１０８コピーへの概略的な増加を示す（図３Ｂ）。さらに、第１の部分増幅が完了した後、形成された産物の一部（増幅生成物１．１）がアリコートとして第２の部分増幅に移され、第２の部分増幅の開始核酸鎖として機能できることをここに概略的に示す。したがって、このバッチが第１の部分反応の後に希釈される場合、第１の反応で形成されたコピーの部分的な量だけが第２の反応に移される。第１の増幅系の成分も希釈され、その結果、第２の増幅系へのそれらの作用は、結果として得られる低濃度に起因して低減される。
【１０４１】
図３Ａは、第２の部分増幅（Ａ２．１）の配列をさらに概略的に示し、使用される温度条件は、温度（Ｔ３）で得られる増幅産物の分離が、合成された相補的プライマー伸長産物の両方の鎖の間の結合の熱不安定化により、かつコントローラーオリゴヌクレオチドの本質的な関与がなく主に非特異的であるように選択される。Ｔ１でのプライマーの結合及び伸長は、第１の部分増幅の場合と同様である。反応は本質的にＰＣＲのように進行し、必要なコピー数を生成するために必要な数のＰＣＲサイクルが実行される。反応は、鋳型へのプライマーの結合、対応するプライマー伸長産物の形成までのそれらの伸長、及び形成された鎖の温度による分離を含む。ＰＣＲは、約１０５の標的配列を含む第１の増幅産物１．１の初期コピー数で始まり、約１０１０のコピー数まで標的配列を含む増幅産物２．１を増幅する。
【１０４２】
第１の部分増幅は、コントローラーオリゴヌクレオチドの関与により、合成された鎖の配列依存性分離を引き起こす条件下で進行する。第２の部分増幅はＰＣＲとして進行し、鎖分離は主に配列非特異的である。
【１０４３】
図４は、２回の部分増幅の温度プロファイル（図４Ａ）を概略的に示し、第１及び第２の部分増幅中の産物の蓄積（時間依存性様式でのコピー数の増加として）の概略図を示す（図４Ｂ）。反応は図３に示すように進行するが、第１の部分増幅を伴うバッチに第２の増幅系の成分が追加され、それにより、形成される第１の増幅断片１．１のコピー数は、第２の部分増幅の開始核酸２．１を構成し、第１の増幅系の成分の有意な希釈は起こらないという違いがある。
【１０４４】
図５は、第１の増幅系及び第２の増幅系の成分を使用する、第１の部分増幅（図５Ａ）及びその後の第２の部分増幅（図５Ｂ）を含む増幅の出発物質及び産物を概略的に示す。反応は本質的に図１に示すように進行するが、第２の部分増幅中には、プライマーＰ３．２及びＰ４．２が使用され、これらはそれぞれＰ１．１−Ｅｘｔ及びＰ２．１−Ｅｘｔの３’末端セグメントに本質的に相補的な配列セグメントを含まないという違いがある。したがって、３’末端を有するＰ１．１−Ｅｘｔ及びＰ２．１−Ｅｘｔ産物は、ポリメラーゼ（例えば、Ｐｏｌ１．１又はＰｏｌ２．１）によって伸長される、プライマーＰ３．２及びＰ４．２それぞれに相補的な結合を形成できない。これは、プライマーＰ３．２及びＰ４．２が第１の部分増幅の反応条件下で使用された場合に、Ｐ１．１−Ｅｘｔ及びＰ２．１−Ｅｘｔが過度に伸長することを防ぐ。第２の部分的な増幅中に、完全なＰ３．１−Ｅｘｔ及びＰ４．１−Ｅｘｔ産物が、周期的合成プロセス及びその伝播の間に形成される。このようなプライマーの組み合わせ（Ｐ１．１及びＰ２．１を含むセット１及びＰ３．１及びＰ４．１を含むセット２）を使用すると、両方のプライマーセットが増幅の最初に同じ反応バッチで提供される均一反応の設計が可能になる。
【１０４５】
図６は、両方の部分増幅の温度プロファイル（図６Ａ）を概略的に示し、第１及び第２の部分増幅中の産物の蓄積（時間依存性様式でのコピー数の増加として）の概略図を示す（図６Ｂ）。
【１０４６】
この図は、両方の部分増幅が互いに直後に実行される温度プロファイルを概略的に示す（両方のプライマーセットが反応の開始時にバッチに存在する）。第１の増幅中に、増幅産物１．１のコピー数が約１０〜約１０４に増加することが概略的に示されている。これらの産物は標的配列を含み、第２の増幅のための開始核酸２．１として機能する。第２の増幅中に、増幅された標的配列の数は、約１０４の増幅産物１．１から約１０１０の得られる増幅産物２．２にさらに増加する。
【１０４７】
図７Ａは、２つの部分増幅の温度プロファイルを概略的に示す。図７Ａの一連の温度変化は、図３で説明したものに対応している：第１の部分増幅セグメントＡ１．１は、特異的なコントローラーオリゴヌクレオチドの非存在下で非特異的な自発的な鎖分離を許さない温度条件下で進行する。本質的に、この反応は温度Ｔ１とＴ２との間で起こる。より低い温度（Ｔ１）では、特に第１の増幅系の少なくとも１つのプライマーのハイブリダイゼーション及びポリメラーゼによるその伸長が進行し、第２の温度（Ｔ２）では、特にＰ１−Ｅｘｔ及びＰ２−Ｅｘｔの分離が、コントローラーオリゴヌクレオチドの関与により進行する。反応の過程で、第１の増幅産物１．１の増幅が起こり、これは、第２の部分増幅における開始核酸２．１として使用することができる。反応は、反応温度の周期的変化として進行し、必要なサイクル数を選択でき、増幅の程度に影響を与えることができる。図７Ａはまた、第１の部分増幅の直後に進行する第２の部分増幅（Ａ２．１）の経過も概略的に示し、使用される温度条件は、温度（Ｔ３）で得られる増幅産物の分離が、合成された相補的プライマー伸長産物の２つの鎖の間の結合が熱的に不安定になるため、かつコントローラーオリゴヌクレオチドの実質的な関与がなく主に非特異的であるように使用される。Ｔ１でのプライマーの結合及び伸長は、第１の部分増幅の場合と同様である。反応は本質的にＰＣＲのように進行し、必要なコピー数を生成するために必要な数のＰＣＲサイクルが実行される。反応は、鋳型へのプライマーの結合、対応するプライマー伸長産物の形成までのそれらの伸長、及び形成された鎖の温度による分離を含む。第１の部分増幅は、コントローラーオリゴヌクレオチドの関与により、合成された鎖の配列依存性分離を引き起こす条件下で実施される。第２の部分増幅はＰＣＲとして行われ、鎖の分離は主に配列非特異的である。
【１０４８】
図７Ｂは、図７Ａのような第１及び第２の増幅を示す。両方の反応は、ここでは「温度切り替えステップ」と呼ばれるさらなる温度ステップによって分離され、これは、一定時間、温度を約Ｔ３に上げることを含む。前記ステップの間、例えば、第１の部分増幅のポリメラーゼの不活性化及び／又は第２の部分増幅のポリメラーゼの活性化及び／又は熱不安定性プライマーの活性化が起こり得る。したがって、このようなステップにより、増幅系の個々の成分の活性の変化も進行する。
【１０４９】
図８は、両方の部分増幅の温度プロファイルを概略的に示す。第１の部分増幅の配列は、図７Ａに記載されたものに対応する。第２の部分増幅は２つの段階に分割される。第１の段階（Ａ２．１段階１）では、Ｔ１とＴ３の間で温度変化が起こる。Ｔ１の間、第２の増幅系の少なくとも１つのプライマーは、増幅産物１．１の対応する相補的な位置に結合でき、そして伸長できる。より低い温度を使用することにより、比較的短い３’セグメントを持つプライマーを使用でき、これは相補的に結合できる（図５を参照）。段階１は数サイクルを含み、初期の増幅産物２．１が形成され、これは、より長い相補的セグメントを含み、したがってより高い温度でプライマーを結合することができる。これにより、段階２でのプライマー結合及びプライマー伸長ステップに高い温度を使用できる（ここではＴ２とＴ３との間の周期的伸長として示す）。例えば、温度を上げることにより、副反応の発生を防ぐことができる。
【１０５０】
図８Ｂでは、例えば、セット２のプライマーが結合できるように、Ａ２．１の段階１の間に温度がさらに温度Ｔ４に低下することが概略的に示される。段階１での温度Ｔ４の使用は、第１の増幅産物の相補的配列セグメントに対する少なくとも１つの不一致を含むセット２の少なくとも１つのプライマーの使用のためであり得る。低温（Ｔ４）は、Ｐ３．１及び／又はＰ４．１から始まるプライマー伸長産物の初期生成をサポートすることを目的としている。この初期生成後、完全に相補的なプライマー結合部位がそのとき存在するようになるため、プライマー結合及びプライマー伸長を伴うステップの温度を上げることができる（段階２）。
【１０５１】
図９Ａは、２つの部分増幅の温度プロファイルを概略的に示す。第１の部分増幅は、均一な温度、ここではＴ２で進行する。第１の部分増幅のすべての必要なステップは、この温度で実行される。これに、（図７Ｂで説明したように）例えば、温度上昇（温度切り替えステップ）が続くことができる。この後、第２の部分増幅としてＰＣＲ反応が行われる。
【１０５２】
第１の部分的な増幅は均一な温度で進行し、コントローラーオリゴヌクレオチドを使用して配列依存性鎖分離を促進する。
【１０５３】
図９Ｂは、（開始時の）等温段階及び後の周期的段階の両方を含む、第１の部分増幅のさらなる温度曲線を概略的に示す。ここでは、また、第１の部分増幅は、コントローラーオリゴヌクレオチドが関与する配列依存性鎖分離を促進する温度で進行する。
【１０５４】
図１０Ａは、２つの部分増幅の温度プロファイルを概略的に示す。段階２の第２の部分増幅は、Ｔ２より高い、更なる温度Ｔ５の使用を含む。前記温度は、約６８℃〜８２℃の間である。温度Ｔ５を使用すると、コントローラーオリゴヌクレオチドのＰ３．１  Ｅｘｔへの結合を弱めることができ、したがって、Ｐ４．１の伸長に対するこの結合の影響を減らすことができ、それにより、Ｐ４．１の伸長がより効果的であり得る。
【１０５５】
図１０Ｂは、両方の部分増幅の温度プロファイルを概略的に示す。第２の部分増幅セグメントの間、第２の増幅産物の最初の生成は段階１で進行する。より高温（Ｔ５）で相補的な位置に結合でき、ポリメラーゼによって伸長できるプライマー３．１及び４．１を使用して、第２段階の温度をＴ５とＴ３の間で変更することができる。反応条件の選択により、中間産物又は最終産物の形成に影響を与えることができる。例えば、より長いＰ３．１及びＰ４．１（例えば、３０〜４０ヌクレオチド長）を、第２の部分増幅におけるプライマー結合ステップ及びプライマー伸長ステップにおけるより高い温度と組み合わせて使用することにより（例えば、Ｔ２及び／又はＴ５での）、Ｐ３．１−Ｅｘｔ及びＰ４．１−Ｅｘｔは、好ましくは蓄積される。
【１０５６】
図１１は、両方の部分増幅の温度プロファイルを概略的に示す。２つの部分増幅間の移行段階は、異なる方法で設計できる。図１１Ａは、第１の部分増幅の終わりに向う温度の連続的上昇を示す。図１１Ｂでは、温度の周期的な低下が第１の部分増幅の終わりに示されている。したがって、部分増幅の両方のセグメントは、反応プロセスにおいて部分的な重複を有することができる。
【１０５７】
図１２〜１８は、第１の増幅系の個々の成分の間の関係（図１４まで）及び第１の増幅系及び第２の増幅系の成分の間の関係を示す。図１５Ａは、開始核酸１．１から開始する第１の増幅断片（Ｐ１．１−Ｅｘｔ及びＰ２．１−Ｅｘｔを含む）の生成を概略的に示す（ここでは増幅される核酸として反応に概略的に追加される）。図１５Ｂは、第１の部分増幅のプライマーＰ３．１及びＰ４．１並びにＰ１．１−Ｅｘｔ及びＰ２．１−Ｅｘｔを鋳型として使用して生成される中間体の生成を概略的に示す（Ｐ３．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ１及びＰ４．１−Ｅｘｔ  Ｐａｒｔ１）。これらの中間体は、Ｐ３．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ１及びＰ４．１−Ｅｘｔ  ｐａｒｔ１を鋳型として使用して再プライマー結合及び伸長により、後続のサイクルで完全なＰ３．１−Ｅｘｔ及びＰ４．１−Ｅｘｔに変換され得る。反応条件の選択は、中間産物又は最終産物の形成に影響を与えることができる。例えば、より長いＰ３．１及びＰ４．１（例えば、３０〜４０ヌクレオチド長）を、第２の部分増幅でのプライマー結合ステップ及びプライマー伸長ステップでの高温と組み合わせて使用することによって（例えば、Ｔ２及び／又はＴ５）Ｐ３．１−Ｅｘｔ及びＰ４．１−Ｅｘｔは、好ましく蓄積される。
【１０５８】
図１９〜２６は、コントローラーオリゴヌクレオチド（Ｃ１．１）、第１のプライマー（Ｐ１．１）及び第３のプライマー（Ｐ３．１）並びに第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１−Ｅｘｔ）の配列セグメントの配置の例を概略的に示す。Ｐ２．１−Ｅｘｔは３’セグメントにおいてＰ１．１に相補的な配列を含み、第１の部分増幅でＰ１．１−Ｅｘｔを生成するための鋳型として機能する。さらに、Ｐ２．１−Ｅｘｔは、Ｐ２．１−Ｅｘｔに結合し、ポリメラーゼによって伸長されるＰ３．１の３’セグメントのためのさらなる相補的セグメントを含み、その結果、Ｐ３．１−Ｅｘｔは第２の部分増幅で生成されることができる。
【１０５９】
図１６〜２６は、コントローラーオリゴヌクレオチド及びＰ１．１及びＰ３．１におけるセグメントの配置の例を要約する。Ｐ３．１は、３’セグメントと相補的な様式でコントローラーオリゴヌクレオチドに結合できる。この結合は、ここでは第４の領域と呼ばれる、コントローラーオリゴヌクレオチドの配列セグメントで生じる。Ｐ３．１がどのように詳細に配置されているかに応じて、この第４の領域は、領域１、２、又は３に関して異なる配置を持つことができる。特定の実施形態では、第４の領域は第２の領域内に位置し（図１９、２０）、別の実施形態では、第４の領域は領域２と３との間の移行部に位置し（図２１）、別の実施形態では、第４の領域はコントローラーオリゴヌクレオチドの第３の領域に位置する（図２２）。特に、コントローラーオリゴヌクレオチドの存在は、意図しない副産物の形成につながるべきではない。とりわけ、コントローラーオリゴヌクレオチドに結合するプライマーは、ポリメラーゼがコントローラーオリゴヌクレオチドを使用してＰ１．１伸長又はＰ３．１伸長を触媒することをもたらすべきではない。これは一般に、コントローラーオリゴヌクレオチドにヌクレオチド修飾を使用することにより、例えば、２’−Ｏ−アルキル修飾を使用することにより達成される。このような修飾は、それぞれのプライマーの少なくとも３’セグメントに相補的な配列を含むコントローラーオリゴヌクレオチドの配列セグメントで特に使用される。さらに、そのような修飾は、プライマーに相補的な配列セグメントを超えて伸長でき、例えば、これらの配列セグメントは、約マイナス１０〜約プラス１０ヌクレオチドの位置又はそれぞれのプライマーの３’末端の位置を含むことができる。そのようなヌクレオチド修飾を有する配列セグメントは、本明細書では「第２のブロッキングユニット」と呼ばれ、第１のプライマー（Ｐ１．１）に相補的な配列セグメントを含む（図１及び２）、又は「第４のブロッキングユニット」とよばれ、第３のプライマー（Ｐ３．１）に相補的な配列セグメントを含む（図１９−２２）。コントローラーオリゴヌクレオチドのそのような修飾は、プライマーがコントローラーオリゴヌクレオチドに結合するとき、ポリメラーゼが鋳型依存性プライマー伸長を開始することを防ぐ。ヌクレオチド修飾の組成は、第２及び第４のブロッキングユニットにおいて同じであっても異なっていてもよい。組み合わされて第２又は第４のブロッキングユニットを形成するそれぞれの配列セグメントの長さはまた、それぞれのブロッキングユニットについて同じであり得る、又は異なり得る。それぞれのブロッキングユニットの位置は、コントローラーオリゴヌクレオチド上のプライマーのそれぞれの可能な結合部位の位置に依存する（図１９〜２２）。第１のプライマーのための第２のブロッキングユニットの可能な組成が詳細に示されている。第４のブロッキングユニットの成分は、第２のブロッキングユニットの成分と同様であり得る。特定の実施形態では、コントローラーオリゴヌクレオチドの第３の領域は、完全にヌクレオチドの２’−Ｏ−アルキル修飾からなる。さらなる特定の実施形態において、その３’セグメントにおけるコントローラーオリゴヌクレオチドの第３の領域（例えば、コントローラーオリゴヌクレオチドの第２の領域に隣接する１〜２０のヌクレオチド位置）は、ヌクレオチドの２’−Ｏ−アルキル修飾から完全に構成される。別の特定の実施形態では、コントローラーオリゴヌクレオチドの第２の領域は、完全にヌクレオチドの２’−Ｏ−アルキル修飾からなる。さらなる特定の実施形態において、その３’セグメントにおけるコントローラーオリゴヌクレオチドの第２の領域及びコントローラーオリゴヌクレオチドの第３の領域（第２の領域に続く１〜２０位値）は、完全にヌクレオチドの２’−Ｏ−アルキル修飾からなる。従って、修飾を有する個々のセグメントを別々に提供することは全く必要ではなく、コントローラーオリゴヌクレオチドの完全な配列セグメントは、例えば、２’−Ｏ−アルキル修飾を有する相補的ヌクレオチドによって提供されることが可能である。
【１０６０】
（鋳型依存的な様式でのポリメラーゼの酵素活性の結果として生成される）プライマー伸長産物の相補的配列セグメントに修飾がないため、ポリメラーゼによりこのような配列セグメントに相補的に結合する場合、プライマーは認識され及び伸長され得る。
【１０６１】
図２７〜３１は、プライマーセット１（Ｐ１．１及びＰ２．１）及びプライマーセット２（Ｐ３．１及びＰ４．１）を含む配置及び可能な組み合わせの例を概略的に示す。プライマーセット１のプライマーの１つは、セット２のプライマーの１つと同一であり得る（例えば、図２７〜２８においてＰ４．１は、Ｐ２．１に相当する）。特に、第１の部分増幅後に反応混合物の希釈液を使用し、第１の部分増幅後に第２の増幅系の成分を添加する場合、第２のプライマーセットのプライマーはプライマーセット１と長さが異なり得る（図３０）。好ましくは、その３’セグメントにのみコントローラーオリゴヌクレオチドに相補的な配列を含むプライマー３の構造が使用される。第３のプライマーの５’セグメントの組成は、特に、コントローラーオリゴヌクレオチドへの相補的配列セグメントを含まない（図３１）。
【１０６２】
図３２〜３５は、第１の部分増幅における成分の相互作用を概略的に示す。
【１０６３】
図３２は、図３３〜３５に示される構造の成分を記載する。
【１０６４】
図３３は、鎖置換メカニズムを概略的に示す。
【１０６５】
図３４は、鎖置換中の構造の相互作用を概略的に示す。
【１０６６】
図３５は、第１のオリゴヌクレオチドプライマー及び第２のオリゴヌクレオチドプライマーの一方における増幅による第１の核酸増幅の間の構造の相互作用、及びさらにコントローラーオリゴヌクレオチドの作用及び得られる鎖置換を概略的に示す。
【１０６７】
図３６は、実施例１の結果を示す。図３７は実施例２の結果を示す。図３８〜４０は、実施例３の結果を示す。図４１〜４７は実施例４の結果を示し、図４８〜４９は実施例５の結果を示す。
【１０６８】
図５０〜５１は、開始核酸鎖１．１の調製を概略的に示す。
【１０６９】
図５２〜５４は、増幅方法の特定の実施形態を概略的に示す。
【１０７０】
第１の増幅を開始するために、第１の標的配列Ｍ［及びＭに（逆）相補的な配列Ｍ’］を含む第１の核酸ポリマーが提供され、５’−３’方向においてＭは、配列セグメントＭＰＬ、ＭＳ及びＭＰＲを直近に連続して含む。
【１０７１】
一実施形態では、第１の核酸ポリマーは、開始核酸鎖を含む。別の実施形態では、第１の核酸ポリマーは、増幅される第１の増幅核酸鎖を含む。別の実施形態では、第１の核酸ポリマーは、第２の増幅による増幅される核酸鎖を含む。
【１０７２】
前記実施形態では、５’−３’方向において標的配列Ｍ［及びＭに（逆）相補的な配列Ｍ’］は、配列セグメントＭＰＬ、ＭＳ及びＭＰＲを直近に連続して含む。一実施形態では、第１の核酸ポリマーはそのような標的配列Ｍを含む。さらなる実施形態では、開始核酸鎖はそのような標的配列Ｍを含む。さらなる実施形態では、第１の増幅で増幅される核酸鎖は、そのような標的配列Ｍを含む。さらなる実施形態では、第１の増幅の増幅断片１．１は、そのような標的配列Ｍを含む。さらなる実施形態では、第２の増幅の増幅される核酸鎖は、そのような標的配列Ｍを含む。さらなる実施形態では、第２の増幅の増幅断片２．１は、そのような標的配列Ｍを含む。
【１０７３】
ここに示されている第１の左のオリゴヌクレオチドプライマーＰＬ１は、（本質的に）標的配列ＭのＭＰＬと同一である。そのようなＰＬ１は、第２のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ２．１）の特定の実施形態である。
【１０７４】
ここに示す第１の右のオリゴヌクレオチドプライマーＰＲ１は、第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１．１）の特定の実施形態である。ＰＲ１は、配列セグメントＰＣＲ及びＰＭＲをすぐに連続して５’−３’方向に含み、ＰＭＲ（この実施形態では、増幅される核酸に含まれる前記標的配列Ｍの第１の領域に対応する）は、本質的に相補的な［ハイブリダイズする］配列であり［本質的に配列特異的に結合でき］、かつ配列セグメントＰＣＲ（前記実施形態では、前記セグメントは第１のプライマーの第２の領域に対応する）が標的配列Ｍ［又は、例えば第１の開始核酸の、３’において配列Ｍに対してＭＰＲに直近に隣接する配列］に結合しない、かつＰＲ１（特にＰＣＲ部位では）は、ＰＣＲが第１の鋳型依存性核酸ポリメラーゼの活性のための鋳型として機能できないように、修飾ヌクレオチドビルディングブロックを含む。
【１０７５】
ここに示されているコントローラーオリゴヌクレオチドＣＲは、５’−３’方向に、配列セグメントＣＳＲ、ＣＰＲ及びＣＣＲを直近に連続して含む。配列セグメントＣＳＲは、コントローラーオリゴヌクレオチドの第３の領域に相当する。配列セグメントＣＰＲは、コントローラーオリゴヌクレオチドの第２の領域に相当する。配列セグメントＣＣＲは、コントローラーオリゴヌクレオチドの第１のセグメントに相当する。
【１０７６】
一実施形態では、配列セグメントＣＳＲは、ＭＰＲの５’に位置する標的配列のＭＳのセグメントと同一である［かつＰＲ１のポリメラーゼの開始時に最初に読み取られる、すなわち、ＣＳＲは、プライマーＰＲ１の重合産物（第１のプライマーの伸長産物）に結合できる］。
【１０７７】
一実施形態では、配列セグメントＣＰＲは、第１のプライマーのＰＭＲに相補的である（かつ標的配列ＭのＭＰＲと同一である）。
【１０７８】
一実施形態では、配列セグメントＣＣＲ（コントローラーオリゴヌクレオチドの第１のセグメント）は、第１のプライマーのＰＣＲ（第２の領域）に相補的である。
【１０７９】
一実施形態では、コントローラーオリゴヌクレオチド（ＣＲ）は、その第３のセグメント（ＣＳＲ）に修飾ヌクレオチドビルディングブロックを含み、その結果、ＣＳＲは、鋳型依存性核酸ポリメラーゼ活性のための鋳型として機能することができない。
【１０８０】
第１のプライマー伸長産物（ＰＲ１’）：この第１のプライマー伸長産物は、（第１のオリゴヌクレオチドプライマーの）配列領域ＰＣＲ及びＰＭＲに加えて、５’においてＭＰＲに隣接する領域において標的配列Ｍに本質的に相補的な合成領域ＰＳＲを５’−３’方向に含む。
【１０８１】
第２のプライマー伸長産物（ＰＬ１’）：配列領域ＭＰＬに加えて、このプライマー伸長産物は、３’においてＭＰＬに隣接する領域において標的配列Ｍと本質的に同一の合成領域ＰＳＬを含む。
【１０８２】
ＰＲ１’及びＰＬ１’は一緒に増幅断片１．１を形成し、第２の増幅のための鋳型（開始核酸２．１）として機能する。
【１０８３】
第２の左のオリゴヌクレオチドプライマーＰＬ２：そのようなＰＬ２は、第４のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ４．１）の特定の実施形態である。一実施形態では、前記ＰＬ２は、第１の二次プライマー結合領域ＭＰＬ２と同一である。この種類の実施形態におけるこのＭＰＬ２は、第２の増幅断片２．１のＰ４．１  Ｅｘｔに含まれる。別の実施形態では、ＭＰＬ２は、第２のプライマー伸長産物に含まれ得る。さらなる実施形態では、ＭＰＬ２は、標的配列Ｍに含まれ得る。
【１０８４】
第２の右のオリゴヌクレオチドプライマーＰＲ２：ＰＲ２は、一実施形態では領域ＭＰＲ２に相補的である第３のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ３．１）の特定の実施形態である。前記ＭＰＲ２は、第２のプライマー伸長産物の実施形態に含まれ得る。これ以外の実施形態では、ＭＰＲ２は、第４のプライマー伸長産物に含まれ得る。さらなる実施形態において、ＭＰＲ２は、標的配列Ｍに含まれ得る。
【１０８５】
ＰＬ２及びＰＲ２の配置は異なり得る。一実施形態では、ＭＰＬ２及びＭＰＲ２は、標的配列Ｍから構成されるであろう。一実施形態では、ＭＰＬ２の３’末端［少なくとも２０位置］は、ＭＰＲ２の５’末端の５’に配置される。さらなる実施形態では、特に、ＭＰＬ２は、ＭＰＬと同一であり、及び／又はＭＰＲ２は、ＭＰＲと同一である。
【１０８６】
さらなる実施形態では、第３（ＰＲ２）及び第４（ＰＬ２）のオリゴヌクレオチドプライマーは、さらなる配列セグメント（ＰＣＬ２又はＰＣＲ２）を含み得る。
【１０８７】
第２の増幅では、第３（ＰＲ２）及び第４（ＰＬ２）のオリゴヌクレオチドプライマーが第１の増幅断片の対応する相補的部位に結合でき、それにより、これらのプライマーは第２の増幅で第２のポリメラーゼによって伸長される。第２の増幅の結果、第３及び第４のプライマーのプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ及びＰ４．１−Ｅｘｔ）が増加する。この結果は、第２の増幅断片２．１である。
【１０８８】
図５５は、第１の増幅系の成分のトポグラフィーの特定の実施形態を概略的に示す。
【１０８９】
開始核酸１．１は、次のセグメントを（５’−３’方向に）含む：Ｍ１Ｙ、Ｍ１．５、Ｍ１．４、Ｍ１．３、Ｍ１．２、Ｍ１．１、Ｍ１．Ｘ。
【１０９０】
第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、（５’−３’の方向に）次のセグメントを含む：第１のセグメント（ｐ１．１．１）及び第２の領域（ｐ１．１．２）。
【１０９１】
コントローラーオリゴヌクレオチド（Ｃ１．１）は（５’−３’方向に）次のセグメントを含む：第３の領域（Ｃ１．１．３）、第２の領域（Ｃ１．１．２）、第１の領域（Ｃ．１．１．１）。
【１０９２】
コントローラーオリゴヌクレオチド（Ｃ１．２）は（５’−３’方向に）次のセグメントを含む：第３のセグメント（Ｃ１．２．３）、第２の領域（Ｃ１．２．２）、第１の領域（Ｃ．１．２．１）。
【１０９３】
第２のプライマーＰ２．１は、次のセグメントを（５’−３’方向に）含む：Ｐ２．１．１。
【１０９４】
第２のプライマーＰ２．２は、次のセグメントを（５’−３’方向に）含む：Ｐ２．２．１。
【１０９５】
第２のプライマーＰ２．３は、次のセグメントを（５’−３’方向に）含む：Ｐ２．３．１。
【１０９６】
第１のプライマー伸長産物（Ｐ１．１−Ｅｘｔ）は、次のセグメントを（５’−３’方向に）含む：Ｐ１．１Ｅ６、Ｐ１．１Ｅ５、Ｐ１．１Ｅ４、Ｐ１．１Ｅ３、Ｐ１．１Ｅ２、Ｐ１．１Ｅ１。
【１０９７】
第２のプライマー伸長産物（Ｐ２．１−Ｅｘｔ）は、次のセグメントを（５’−３’方向に）含む：Ｐ２．１Ｅ５、Ｐ２．１Ｅ４、Ｐ２．１Ｅ３、Ｐ２．１Ｅ２、Ｐ２．１Ｅ１。
【１０９８】
第１の増幅中に好ましくは得られるプライマー伸長産物Ｐ１．１−Ｅｘｔ及びＰ２．１−Ｅｘｔは、相補的な二重鎖を形成でき、一緒に第２の増幅断片１．１を表し、これは第２の増幅の開始核酸２．１として機能することができる。
【１０９９】
Ｐ１．１．１は主にＭ１．１に相補的に結合でき、ポリメラーゼによって伸長されることができる。Ｐ２．１．１はＰ１．１Ｅ１と相補的に結合でき、ポリメラーゼによって伸長されることが可能である。Ｐ１．１−Ｅｘｔ及びＰ２．１−Ｅｘｔは、第２の増幅の開始核酸２．１として機能する、増幅される核酸を表す。Ｐ２．１、Ｐ２．２及びＰ２．３は第２のプライマーの変異体を表し、同一の増幅断片をもたらす。
【１１００】
図５６〜５７は、第１及び第２の増幅系のトポグラフィーの特定の実施形態を概略的に示す：
【１１０１】
第３のオリゴヌクレオチドプライマーは、次のセグメントを（５’−３’方向に）含む：Ｐ３．１．２、Ｐ３．１．１、ここでＰ３．１．２は、開始核酸１．１又はＰ２．１−Ｅｘｔに相補的ではない。Ｐ３．１．１はＰ２．１−ＥｘｔのＰ２．１Ｅ１に本質的に相補的である。
【１１０２】
第４のオリゴヌクレオチドプライマーは、次のセグメントを（５’−３’方向に）含む：Ｐ４．１．２、Ｐ４．１．１、ここでＰ４．１．２は、開始核酸１．１の相補鎖又はＰ１．１−Ｅｘｔに相補的ではない。Ｐ４．１．１はＰ１．１−ＥｘｔのＰ１．１Ｅ１に本質的に相補的である。
【１１０３】
好ましくは第２の増幅中に得られるプライマー伸長産物Ｐ３．１−Ｅｘｔ及びＰ４．１−Ｅｘｔは、相補的な二重鎖を形成することができ、共に第２の増幅断片２．１を表す。
【１１０４】
Ｐ３．１−Ｅｘｔは、次のセグメントを（５’−３’方向に）含む：Ｐ３．１Ｅ７、Ｐ３．１Ｅ６、Ｐ３．１Ｅ５、Ｐ３．１Ｅ４、Ｐ３．１Ｅ３、Ｐ３．１Ｅ２、Ｐ３．１Ｅ１。セグメントＰ３．１．Ｅ５からＰ３．１Ｅ３は、Ｐ１．１Ｅ４からＰ１．１Ｅ２の配列と同一である。
【１１０５】
Ｐ４．１−Ｅｘｔは、次のセグメントを（５’−３’方向に）含む：Ｐ４．１Ｅ７、Ｐ４．１Ｅ６、Ｐ４３．１Ｅ５、Ｐ４．１Ｅ４、Ｐ４．１Ｅ３、Ｐ４３．１Ｅ２、Ｐ４．１Ｅ１。セグメントＰ４．１．Ｅ５からＰ４．１Ｅ３は、Ｐ２．１Ｅ４からＰ２．１Ｅ２の配列と同一である。
【１１０６】
図５７は、第３のプライマー（Ｐ３．１、Ｐ３．２、Ｐ３．３）及び第４のプライマー（Ｐ４．１、Ｐ４．２、Ｐ４．３）の特定の実施形態を概略的に示し、それぞれのプライマーの３’セグメントは、互いに対してシフトされ得る。
【１１０７】
図５８〜５９は、オリゴヌクレオチドプローブの局在領域の特定の実施形態を概略的に示す：
Ｄ１−はＰ４．１Ｅｘｔの５’末端に配置される。したがって、プローブ機能を持つプライマーを使用でき、例えば、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマー、Ｌｕｘプライマーである。プライマーはＰ４．１と同様に３’セグメントに構築される。
【１１０８】
Ｄ４−は、Ｐ３．１−Ｅｘｔの５’末端に配置される。したがって、プローブ機能を持つプライマーを使用でき、例えば、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマー、Ｌｕｘプライマーである。プライマーはＰ３．１と同様に３’セグメントに構築される。
【１１０９】
領域Ｄ２及びＤ３は、それぞれＰ３．１−Ｅｘｔ及びＰ４．１−Ｅｘｔの中央のセグメントに配置される。したがって、ハイブリダイゼーションプローブ（例えば、分子ビーコン、Ｔａｑｍａｎプローブ（５’−３’ヌクレアーゼ切断可能プローブ、又はＦＲＥＴ対を備えた２−オリゴヌクレオチドプローブ）は、ここでは位置特定されることが可能である。
【１１１０】
Ｄ２領域はコントローラーオリゴヌクレオチドと重複しないため、（Ｐ３．１−Ｅｘｔ又はＰ４．１−Ｅｘｔにおいて）可能なプローブの局在に特に適する。したがって、プローブは、特に均一アッセイの前記領域で使用することができる。前記領域は、第３のプライマー伸長産物の３’セグメントを含む。領域Ｄ３のプローブは、Ｐ３．１−ＥｘｔとＰ４．１−Ｅｘｔの両方に提供することもできる。ただし、Ｃ１．２の濃度が比較的高い場合（コントローラー、例えば、０．５ｍｏｌ／ｌ〜５μｍｏｌ／ｌ、例えば、均一系アッセイ）、そのようなプローブがコントローラーと相互作用し得る、又はコントローラによって置換され得るように考慮しなければならない。コントローラーの濃度が比較的低い場合（例えば、１ｎｍｏｌ／ｌ未満のセグメントでは）、コントローラーとのこの相互作用は無視できる（例えば、第１の増幅を第２の増幅の前に希釈する場合）。
【１１１１】
図６０は、第３（及びおそらくは第１）のプライマー伸長産物（Ｐ３．１−Ｅｘｔ及びＰ１．１−Ｅｘｔ）に主に相補的に結合できるプローブセグメントの局在の特定の実施形態を概略的に示す。可能なプローブの局在にはいくつかの可能性があることを示す。
【１１１２】
図６１は、第４（及びおそらくは第２）のプライマー伸長産物（Ｐ４．１−Ｅｘｔ及びＰ２．１−Ｅｘｔ）に主に相補的に結合できるプローブセグメントの局在の特定の実施形態を概略的に示す。可能なプローブの局在にはいくつかの可能性があることを示す。
【１１１３】
図６２〜６３は、プローブの特定の実施形態を図式的に示す：
【１１１４】
Ｄ１に局在化されたプローブ：Ｓ３．１、Ｓ３．２、Ｓ３．３のプローブは、蛍光レポーター（Ｒ）／蛍光クエンチャー（Ｑ）対を含み、これは、プライマー伸長産物の対応するセグメントにハイブリダイズする場合、シグナルの増加をもたらす（レポーター／クエンチャーの空間的分離）。プローブＳ３．１及びＳ３．３はプライマーとして伸長でき、プローブ機能を備えたプライマーに基づくプライマー伸長産物が得られる（図６３におけるＳ３．１−Ｅｘｔ及びＳ３．３．Ｅｘｔ）。
【１１１５】
図６４〜６７は、オリゴヌクレオチドプローブ及びそれらのプローブがどれだけ広がるかの特定の実施形態を概略的に示す：Ｓ３．４は、５’−３’ヌクレアーゼ分裂可能プローブ（「Ｔａｑｍａｎプローブ」）を表す。このプローブは、Ｐ３．１Ｅｘｔへのハイブリダイゼーション後にＴａｑポリメラーゼによって切断され、Ｐ４．１伸長が同時に起こる。
【１１１６】
プローブＳ３．６は、２つのオリゴヌクレオチドがＰ３．１Ｅｘｔに結合できる、又は結合する必要があるプローブ系を表す。これにより、一方のオリゴヌクレオチドは蛍光レポーター（Ｒ）を備えたプローブＳ３．６であり、もう一方のプローブは、５’領域にドナー蛍光色素分子を含むコントローラーオリゴヌクレオチドＣ１．２である。両方のオリゴヌクレオチドが同時にＰ３．１−Ｅｘｔに結合する場合、ＦＲＥＴが発生するのに十分な空間的近接性（２５ＮＴ未満）があり、これはシグナルをもたらす。
【１１１７】
プローブＳ３．７は、自己相補的なパーツ（「分子ビーコン」）を備えたプローブを概略的に表す。非結合状態では、蛍光レポーター（Ｒ）からのシグナルは、選択された反応条件下で蛍光クエンチャー（Ｑ）によって優先的に消光される。相補的結合は構造のデコンボリューションをもたらし、結果としてＱからＲを空間的に分離し、これは通常、シグナルの増加をもたらす。
【１１１８】
図６８〜７１は、開始核酸１．１、増幅断片１．１（Ｐ１．１−Ｅｘｔ及びＰ２．１−Ｅｘｔ）、及び第２の増幅断片２．１（Ｐ３．１−Ｅｘｔ及びＰ４．１−Ｅｘｔ）における標的配列１〜３の局在の特定の実施形態を概略的に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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