(57)【要約】本発明は、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子又はＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子のモジュレータを用いて、哺乳動物、特にヒト対象における疾患を治療又は予防するための新規な治療アプローチに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物対象を治療するのに使用するための、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子又はＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子のモジュレータ。
【請求項２】
哺乳動物対象における免疫応答を調節するのに使用するための、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子又はＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子のモジュレータ。
【請求項３】
前記ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、ｇＣ１ｑＲのリガンドである、請求項１又は２に記載の補因子又はモジュレータ。
【請求項４】
前記ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、表１又は２のタンパク質から選択されるタンパク質又は該タンパク質のｇＣ１ｑＲ結合要素である、請求項１又は２に記載の補因子又はモジュレータ。
【請求項５】
前記ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、病原体又は栄養素の成分、好ましくは病原体由来のタンパク質又はペプチドである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の補因子又はモジュレータ。
【請求項６】
前記ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、ウイルス、細菌、真菌又は寄生虫のタンパク質若しくはペプチドである、請求項５に記載の補因子又はモジュレータ。
【請求項７】
前記ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、ＨＣＶコアタンパク質、ブドウ球菌プロテインＡ又はそれらのいずれかの断片若しくはミモトープである、請求項６に記載の補因子又はモジュレータ。
【請求項８】
前記ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子のモジュレータは、該ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子の阻害剤である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の補因子又はモジュレータ。
【請求項９】
前記阻害剤は、前記補因子のｇＣ１ｑＲへの結合を阻害する、請求項８に記載の補因子又はモジュレータ。
【請求項１０】
前記阻害剤は、前記補因子の発現を阻害する、請求項８に記載の補因子又はモジュレータ。
【請求項１１】
前記阻害剤は、ｇＣ１ｑＲ又は前記補因子に結合してｇＣ１ｑＲの機能を阻害する化合物である、請求項９に記載の補因子又はモジュレータ。
【請求項１２】
前記阻害剤は、ｇＣ１ｑＲ媒介エキソサイトーシスを阻害する、請求項１１に記載の補因子又はモジュレータ。
【請求項１３】
前記阻害剤は、抗体又はその変異体若しくは断片である、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の補因子又はモジュレータ。
【請求項１４】
前記阻害剤は、ｇＣ１ｑＲ又は表１又は２から選択されるタンパク質に結合して好ましくは該タンパク質のｇＣ１ｑＲへの結合を阻害する抗体又はその変異体若しくは断片である、請求項１３に記載の補因子又はモジュレータ。
【請求項１５】
前記阻害剤は、ペプチド又はリポペプチドである、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の補因子又はモジュレータ。
【請求項１６】
前記阻害剤は、ｇＣ１ｑＲに結合して表１又は２から選択されるタンパク質のｇＣ１ｑＲへの結合を阻害するペプチドである、請求項１５に記載の補因子又はモジュレータ。
【請求項１７】
前記阻害剤は核酸である、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の補因子又はモジュレータ。
【請求項１８】
前記阻害剤は炭水化物である、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の補因子又はモジュレータ。
【請求項１９】
前記ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子のモジュレータは、前記補因子に抗体を誘導可能な前記ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子の免疫原である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の補因子又はモジュレータ。
【請求項２０】
前記対象は、病原体、好ましくは感染性病原体によって引き起こされる疾患を有する、請求項８〜１９のいずれか１項に記載の補因子又はモジュレータ。
【請求項２１】
前記感染性病原体は、ウイルス、細菌、真菌又は寄生虫である、請求項２０に記載の補因子又はモジュレータ。
【請求項２２】
前記対象は、免疫抑制によって引き起こされる、免疫抑制に関連する又は免疫抑制を誘発する疾患を有する、請求項８〜１９のいずれか１項に記載の補因子又はモジュレータ。
【請求項２３】
前記補因子又はモジュレータは、別の薬剤又は治療と組み合わせて投与される、請求項８〜２２のいずれか１項に記載の補因子又はモジュレータ。
【請求項２４】
前記対象の病原菌によって引き起こされる疾患を治療するためにＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子の阻害剤を該対象に投与することを含む、請求項１に記載の補因子又はモジュレータ。
【請求項２５】
前記対象のウイルスによって引き起こされる疾患を治療するためにＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子の阻害剤を該対象に投与することを含む、請求項１に記載の補因子又はモジュレータ。
【請求項２６】
前記対象の肝炎ウイルス又はＨＩＶによって引き起こされる疾患を治療するためにＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子の阻害剤を対象に投与することを含む、請求項２５に記載の補因子又はモジュレータ。
【請求項２７】
前記ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子のモジュレータは、該ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子の活性剤、アゴニスト又はミモトープである、請求項１又は２に記載の補因子又はモジュレータ。
【請求項２８】
前記対象は、免疫抑制療法又は免疫刺激療法を必要とする状態を有する、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の補因子又はモジュレータ。
【請求項２９】
Ｔ細胞に対するＰＬＡ２−ＧＩＢの効果を増大させることによって免疫抑制の誘発を必要とする対象の免疫抑制を誘発するために使用する、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子又はそのアゴニスト若しくはミモトープ。
【請求項３０】
前記対象は、哺乳動物、好ましくはヒトである、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の補因子又はモジュレータ。
【請求項３１】
病原体によって引き起こされる障害を治療するための併用療法又は治療レジメンであって、
（ｉ）病原体に対して効果的な薬剤と、
（ｉｉ）ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子のモジュレータと、
（ｉｉｉ）ＰＬＡ２−ＧＩＢのモジュレータとから選択される少なくとも２つの活性剤の組み合わせを含み、
前記薬剤及び前記モジュレータは、組み合わせて、別々に又は連続して投与される、併用療法又は治療レジメン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物、特にヒト対象における疾患を治療又は予防するための新規な治療アプローチに関する。本発明は、哺乳動物において様々な病原体が作用する新規なメカニズムの阻害に基づく治療方法を提供する。本発明は、ウイルス又は細菌等の様々な病原体によって引き起こされる疾患に対して、単独で又は他の治療と組み合わせて、予防的又は治療的アプローチで使用されてもよい。
【背景技術】
【０００２】
発明者は、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢがＨＩＶ感染患者におけるＣＤ４Ｔ細胞の不活性化に関与していることを報告している（国際公開第２０１５／０９７１４０号を参照）。したがって、本発明者は、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢモジュレータが哺乳動物の疾患、例えば免疫不全関連障害を治療するのに効果的であることを提案し、報告した。
【０００３】
彼らの研究を続けて、出願人は、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢの効果が罹患した対象に存在する補因子によって媒介及び／又は増幅されてそのような補因子がｇＣ１ｑ受容体を介してＴ細胞の表面で作用し得ることを発見した。特に、本発明者らは、病原体がｇＣ１ｑＲに結合する補因子を産生又は活性化し、非常に低用量のＰＬＡ２−ＧＩＢによる不活性化に対するＣＤ４Ｔ細胞の感作をもたらすことを示した。そのような病原体に感染した患者では、ＣＤ４Ｔ細胞は生理的量のｓＰＬＡ２−ＧＩＢによる不活性化に対して敏感になり、非感染対象では、ＣＤ４Ｔ細胞はそのような生理的濃度のｓＰＬＡ２−ＧＩＢによる不活性化に対して耐性を保つ。本発明者らは、ＨＩＶ、ＨＣＶ又は黄色ブドウ球菌等のウイルス又は細菌を含む様々な病原体からのｇＣ１ｑＲ結合補因子を同定した。出願人はまた、補因子がＣＤ４Ｔ細胞をｓＰＬＡ２−ＧＩＢによる不活性化に対して感作し得、インビボでそのような補因子の遮断がｓＰＬＡ２−ＧＩＢによる不活性化に対するＣＤ４Ｔ細胞の耐性を回復又は維持し得ることを確認した。したがって、出願人は、多くの病原体が哺乳動物における疾患又は病態を誘発することによって、すなわちＰＬＡ２−ＧＩＢによる不活性化に対するＣＤ４Ｔ細胞の感作を誘発することによって、一般的な新規メカニズムを特定した。そのような予想外の発見により、出願人は遮断又は阻害等の補因子の調節に基づく新規な治療アプローチを提供し、それにより多くの病原体の病原作用を防止、回避、又は少なくとも低減することができる。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の目的は、哺乳動物対象にＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子、又はＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子のモジュレータを投与することを含む、該対象を治療する方法を提供することである。
【０００５】
本発明の別の目的は、哺乳動物対象にＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子、又はＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子のモジュレータを投与することを含む、該対象における免疫応答を調節する方法に関する。
【０００６】
本発明の別の目的は、哺乳動物対象を治療するために使用するＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子、又はＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子のモジュレータである。
【０００７】
本発明はまた、哺乳動物対象における免疫応答を調節するために使用するＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子、又はＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子のモジュレータに関する。
【０００８】
ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、病原体又は栄養素の成分、好ましくは病原体からの又は病原体によって活性化されるタンパク質又はペプチドでもよい。特定の実施形態ではＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、ウイルス、細菌、真菌又は寄生虫のタンパク質若しくはペプチドである。
【０００９】
ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子のモジュレータは、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子の阻害剤、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子の免疫原、又はＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子の活性剤、アゴニスト若しくはミモトープでもよい。薬剤又はモジュレータの種類に応じて、本発明は、例えば、免疫抑制又は免疫刺激療法を必要とする状態を有する対象を治療するために使用されてもよい。
【００１０】
本発明はまた、（ｉ）病原体に対して効果的な薬剤と、（ｉｉ）ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子のモジュレータと、（ｉｉｉ）ＰＬＡ２−ＧＩＢのモジュレータとから選択される少なくとも２つの活性剤の組み合わせを含む、病原体によって引き起こされる障害を治療するための併用療法又は治療レジメンに関し、薬剤及びモジュレータは、組み合わせて、別々に又は連続して投与される。
【００１１】
本発明はまた、Ｔ細胞に対するＰＬＡ２−ＧＩＢの効果を増加させることによって、免疫抑制の誘発を必要とする対象の免疫抑制を誘発する薬剤の製造にＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子、又はそのアゴニスト又はミモトープを使用することに関する。
【００１２】
本発明はまた、通常、Ｔ細胞に対するＰＬＡ２−ＧＩＢの効果を調節することによって、免疫応答の調節を必要とする対象の免疫応答を調節するために使用するＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子のモジュレータに関する。
【００１３】
本発明はまた、免疫応答の刺激を必要とする対象の免疫応答を刺激する薬剤の製造にＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子の阻害剤を使用することに関する。
【００１４】
さらなる様態では、本発明は、候補分子がＣＤ４Ｔ細胞のｇＣ１ｑＲを介した感作を阻害し得るかどうかを試験することを含む、免疫刺激分子を選択する方法に関する。
【００１５】
本発明は、任意の哺乳動物、特にヒト対象において使用されてもよい。ＣＤ４Ｔ細胞の刺激又は回復が有益である疾患、例えば感染性病原体又は望ましくない細胞増殖（例えば、癌）によって引き起こされる疾患の治療に適している。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ウイルス血症血漿は、ＰＬＡ２−ＧＩＢ活性に対してＣＤ４Ｔ細胞の感受性を引き起こす補因子を含む。図１Ａは、４人の健康なドナーから精製されたＣＤ４Ｔ細胞をＰＢＳ  ＢＳＡ１％緩衝液（緩衝液）、又は抗ＰＬＡ２−ＧＩＢ抗体で予め枯渇させたＣＤ４Ｔ細胞の内因性ＰＬＡ２−ＧＩＢ活性を除去した１％の健康なドナー血漿（ｐＨＤ）若しくはウイルス血症患者の血漿（ｐＶＰ）中の５ｎＭ又は７５ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢに、又はＰＬＡ２−ＧＩＢなし（ＧＩＢなし）に３０分間曝露した。その後、細胞をＩＬ−７で１５分間処理し、ｐＳＴＡＴ５核移行（ｐＳＴＡＴ５  ＮＴ）を共焦点顕微鏡で評価した。結果は、緩衝液中のＩＬ−７に応答してｐＳＴＡＴ５  ＮＴで正規化されたｐＳＴＡＴ５  ＮＴの割合を示した。５ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢに対するウイルス血症患者の血漿の効果の統計分析を、対応のないｔ検定を用いて健康なドナーの血漿と比較した。図１Ｂは、精製ＣＤ４Ｔ細胞を抗ＰＬＡ２−ＧＩＢ抗体で予め枯渇させた１％の健康なドナー血漿（ｐＨＤ）又はウイルス血症患者の血漿（ｐＶＰ）に曝露し、分子量を３０ｋＤａ超過若しくは未満、及び１０ｋＤａ超過若しくは以下、又は１０ｋＤａ〜３０ｋＤａに分離し分画した。
【図２】ＡＴ−２−不活性化ＨＩＶ−１粒子は、ＰＬＡ２−ＧＩＢ活性に対してＣＤ４Ｔ細胞の感受性を引き起こす。精製ＣＤ４Ｔ細胞をＰＢＳ  ＢＳＡ１％緩衝液、ＨＩＶ−１  ＡＴ−２不活性化粒子又はモック対照の同様の希釈で１５分間前処理した。ＨＩＶ−１粒子を５０００、５００、５０及び５ｐｇのｐ２４／１０ｅ６細胞で使用し、それぞれ１、０．１、０．０１及び０．００１の多重感染度（ＭＯＩ）を表す。次に、ＰＬＡ２−ＧＩＢ阻害条件の対照として、細胞を３０分間ＰＢＳ  ＢＳＡ１％中の５ｎＭ、７５ｎＭ又は２５０ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢで処理するか、又はＨＩＶ−１粒子又はモックを含む５ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢ又はそれなしで処理した。その後、細胞をＩＬ−７で１５分間処理し、ｐＳＴＡＴ５核移行（ｐＳＴＡＴ５  ＮＴ）を共焦点顕微鏡で評価した。結果は、３つ以上の独立したフィールドで計算されたＳＥＭ変動を含むＩＬ−７に応答するｐＳＴＡＴ５  ＮＴの割合である。ＰＬＡ２−ＧＩＢを含まないＩＬ−７処置と比較したＧＩＢの条件間は、＊＊ｐ＜０．０１と＊＊＊ｐ＜０．００１である。５ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢを用いてＨＩＶ−１粒子の量が増加する条件間は、＃ｐ＜０．０５、＃＃＃ｐ＜０．００１である。統計分析は、ウェルチの修正を加えた対応のないｔ検定を用いて実行された。
【図３】組換えｇｐ４１タンパク質が、ＩＬ−７に応答するｐＳＴＡＴ５  ＮＴのＰＬＡ２−ＧＩＢ阻害活性に対してＣＤ４Ｔ細胞の感受性を引き起こす。図３Ａは、ＩＬ−７へのｐＳＴＡＴ５  ＮＴ応答に対するＰＬＡ２−ＧＩＢ活性における組換えｇｐ４１タンパク質の用量効果を示す。健康なドナーから精製されたＣＤ４Ｔ細胞をいくつかの量のｇｐ４１又は緩衝液（ＰＢＳ  ＢＳＡ１％）で１５分間前処理し、５ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢ（ＧＩＢ）で又はそれを含まない（ＧＩＢなし）で３０分間インキュベートし、ＩＬ−７で１５分間刺激した。その後、ｐＳＴＡＴ５  ＮＴを共焦点顕微鏡で分析した。図３Ｂは、０．５μｇ／ｍｌのｇｐ４１で１５分間、５ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢ（ＧＩＢ）で又はそれを含まない（ＧＩＢなし）で３０分間処理し、ＩＬ−７で１５分間刺激した３人の独立した健康なドナーのＣＤ４Ｔ細胞に関する実験の概要を示す。図３Ａ及びＢの結果は、緩衝液中のＩＬ−７に応答するｐＳＴＡＴ５  ＮＴで正規化されたｐＳＴＡＴ５  ＮＴの阻害率を示した。ＰＬＡ２−ＧＩＢを含まないｇｐ４１単独による阻害率と比較して、ｇｐ４１及び５ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢによる阻害率の差を対応のないｔ検定で統計分析し、＊＊はｐ＜０．０１を意味する。
【図４】抗ｇｐ４１抗体を含むウイルス血症患者の血漿の免疫枯渇は、ＣＤ４Ｔ細胞中のｐＳＴＡＴ５  ＮＴに対するＰＬＡ２−ＧＩＢの阻害活性を無効にする（すなわち、ＰＬＡ２−ＧＩＢによる不活性化に対するＣＤ４Ｔ細胞の耐性を回復する）。３つの独立した実験において、３人の独立した健康なドナーから精製されたＣＤ４Ｔ細胞をＰＬＡ２−ＧＩＢ単独で、又はＰＬＡ２−ＧＩＢに対する感受性の陽性対照として抗ｇｐ４１ポリクローナル（ｐＡｂ抗ｇｐ４１）若しくは対照ポリクローナル抗体（対照ｐＡｂ）で予め枯渇した健康なドナー（ＨＤ）血漿又はウイルス血症患者（ＶＰ）血漿で３０分間処理し、又は抗体なしで処理（のみ）し、ＩＬ−７で１５分間刺激した。結果は、ＰＬＡ２−ＧＩＢの緩衝液中のＩＬ−７に応答してｐＳＴＡＴ５  ＮＴで正規化された、又はウイルス血症患者の血漿処理サンプルでは健康なドナー血漿と同じ割合で正規化された、ｐＳＴＡＴ５  ＮＴの阻害率を示した。＊＊＊は、ｐＡｂ抗ｇｐ４１で処理したウイルス血症血漿と比較して、対照ｐＡｂ抗体によるｐＳＴＡＴ５  ＮＴ阻害の差について、対応のないｔ検定でｐ＜０．００１であることを意味する。
【図５】ＰＥＰ３ペプチドは、ＩＬ−７で刺激されたＣＤ４Ｔ細胞のｐＳＴＡＴ５  ＮＴにおけるＰＬＡ２−ＧＩＢ阻害活性に対する感受性を誘発する。図５Ａは、ＰＥＰ３及び対照（ＣＴＬ）ペプチドのアミノ酸配列を調べた。図５Ｂは、ＩＬ−７へのｐＳＴＡＴ５  ＮＴ応答の阻害率におけるＰＬＡ２−ＧＩＢ活性に対するＰＥＰ３及びＣＴＬペプチドの用量効果を示す。健康なドナーから精製されたＣＤ４Ｔ細胞をいくつかの量のＰＥＰ３、ＣＴＬペプチド又は緩衝液（ＰＢＳ  ＢＳＡ１％）で１５分間前処理し、５ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢ（５ｎＭ  Ｇ１Ｂ）で又はそれを含まないで（Ｇ１Ｂなし）３０分間インキュベートし、ＩＬ−７で１５分間刺激した。ｐＳＴＡＴ５  ＮＴを共焦点顕微鏡で分析した。図５Ｃは、５ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢを含む（Ｇ１Ｂ  ５ｎＭ）又はそれを含まない（Ｇ１Ｂなし）０．５μｇ／ｍｌのＰＥＰ３で４５分間処理し、ＩＬ−７で１５分間刺激した３人の独立した健康なドナーのＣＤ４Ｔ細胞に関する実験の概要を示す。図５Ｂ及びＣは、緩衝液中のＩＬ−７に応答してｐＳＴＡＴ５  ＮＴで正規化されたｐＳＴＡＴ５  ＮＴの阻害率を示した。対応のないｔ検定でＰＬＡ２−ＧＩＢを含まないＰＥＰ３単独と比較して、ＰＥＰ３と５ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢによる阻害率の差を統計分析し、＊はｐ＜０．０５を意味する。
【図６】ｇＣ１ｑＲは、ＰＬＡ２−ＧＩＢに対するＣ１ｑ及びＰＥＰ３の補因子活性に重要な役割を果たし、ウイルス血症患者の血漿抑制活性に関与する。図６Ａは、Ｃ１ｑがＰＬＡ２−ＧＩＢ及び６０．１１に対する補因子活性を持ち、ｇＣ１ｑＲに対する７４．５．２抗体はＣＤ４Ｔ細胞に対するＣ１ｑＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子活性を阻害することを示す。精製ＣＤ４Ｔ細胞を６０．１１、７４．５．２、マウス対照ＩｇＧ１（対照ＩｇＧ１）又は抗体なし（Ａｂなし）でプレインキュベートし、５ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢを含む（Ｇ１Ｂ  ５ｎＭ）又はそれを含まない１０μｇ／ｍｌのＣ１ｑで処理し、ＩＬ−７へのｐＳＴＡＴ５  ＮＴ応答を分析した。図６Ｂは、６０．１１抗体ではなく、抗ｇＣ１ｑＲ  ７４．５．２抗体がＣＤ４Ｔ細胞に対するＰＥＰ３ペプチドＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子活性を遮断することを示す。図６Ａと同様に、細胞を５ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢを含む（Ｇ１Ｂ  ５ｎＭ）又はそれを含まない０．５μｇ／ｍｌのＰＥＰ３で処理した。図６Ｃは、６０．１１抗体ではなく、抗ｇＣ１ｑＲ  ７４．５．２抗体がＩＬ−７で刺激されたＣＤ４Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５  ＮＴの阻害を減少させることを示す。図６Ａと同様に、細胞を抗ｇＣ１ｑＲ又は対照抗体で前処理し、１％若しくは３％のウイルス血症患者（ｐＶＰ）又は健康なドナー（ｐＨＤ）の血漿で４５分間処理し、ＩＬ−７へのｐＳＴＡＴ５  ＮＴ応答を分析した。代表的な一実験において、図６Ａ、Ｂ及びＣの結果は、図６ＡのＣ１ｑ又は図６ＢのＰＥＰ３を含む対照ＩｇＧ１と５ｎＭのＧ１Ｂ、及び図６Ｃの１％又は３％のウイルス血症患者の血漿を含む対照ＩｇＧ１による阻害率でそれぞれ正規化された、ｐＳＴＡＴ５  ＮＴの阻害率±ＳＥＭとして示される。統計分析は、条件ごとに少なくとも３つの独立したフィールドでウェルチの補正を行った対応のないｔ検定の結果である。＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１及び＃＃＃ｐ＜０．００１は、図Ａ及びＢでＰＬＡ２−ＧＩＢを含む場合とＰＬＡ２−ＧＩＢを含まない場合、又は図Ｃでウイルス血症患者血漿の各パーセンテージと健康なドナー血漿と同じパーセンテージの各実験条件である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１は、対照ＩｇＧ１抗体で処理した細胞と比較した各実験条件である。
【図７】ｇｐ４１は、ＣＤ４Ｔ細胞膜に対するＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性を増加させる。［３Ｈ］アラキドン酸で標識した精製ＣＤ４Ｔ細胞を、いくつかの濃度の組換えｇｐ４１に単独で又は６３ｎＭ、２００ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢとともに、又はｇｐ４１を含まないＰＬＡ２−ＧＩＢ（培地のみ）とともに曝露した。結果は、各ｇｐ４１濃度について、培地単独でのＰＬＡ２−ＧＩＢマイナス活性による［３Ｈ］アラキドン酸放出による３回の刺激の平均ｃｐｍ／ｍｌ±ＳＥＭとして示され、同様の結果を持つ４つの独立した実験のうちの代表的な実験の１つである。統計分析は、対応のないｔ検定によってｇｐ４１とＰＬＡ２−ＧＩＢとＰＬＡ２−ＧＩＢのみを使用した実験条件の間で＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【図８】ＨＣＶコアタンパク質は、ＣＤ４Ｔ細胞膜に対するＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性を増加させる。図８Ａは、［３Ｈ］アラキドン酸放出及びＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性に対するＨＣＶコアタンパク質の用量効果を示す。［３Ｈ］アラキドン酸で標識した精製ＣＤ４Ｔ細胞を、いくつかの濃度のＨＣＶコアタンパク質に単独（ＨＣＶコアのみ）で、又は６３ｎＭ及び２００ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢとともに、又はＨＣＶコアを含まないＰＬＡ２−ＧＩＢ（緩衝液のみ）とともに曝露した。結果は、一つの実験の各タンパク質濃度について、緩衝液のみの培地中のＰＬＡ２−ＧＩＢマイナス活性による［３Ｈ］アラキドン酸放出による２回の刺激の平均ｃｐｍ／ｍｌとして示される。図８Ｂは、ＨＣＶコアタンパク質がＰＬＡ２−ＧＩＢ活性を増加させることを示す。［３Ｈ］アラキドン酸で標識した精製ＣＤ４Ｔ細胞を、１０μｇ／ｍｌのＨＣＶコアタンパク質に単独で（０ｎＭ）、６３ｎＭ及び２００ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢとともに、又はＨＣＶコアを含まないＰＬＡ２−ＧＩＢ（ｅｑ緩衝液１０μｇ／ｍｌ）とともに曝露した。結果は、１０μｇ／ｍｌのＨＣＶコアタンパク質に相当する緩衝液のみを含む培地中のＰＬＡ２−ＧＩＢマイナスの活性による［３Ｈ］アラキドン酸放出による刺激の３回を含む３つの独立した実験の平均ｃｐｍ／ｍｌ±ＳＥＭとして表される。統計分析は対応のないｔ検定を用い、ＨＣＶコアタンパク質のみ、又はＰＬＡ２−ＧＩＢと培地のみ、又は緩衝液中のＰＬＡ２−ＧＩＢをそれぞれ使用した実験条件の間で＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【図９】黄色ブドウ球菌プロテインＡ（ＳＡプロテインＡ）は、ＣＤ４Ｔ細胞膜にＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性を増加させる。［３Ｈ］アラキドン酸で標識した精製ＣＤ４Ｔ細胞を、いくつかの濃度のＳＡプロテインＡ単独で（Ｇ１Ｂなし）、６３ｎＭ及び２００ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢとともに、又はＳＡプロテインＡを含まないＰＬＡ２−ＧＩＢとともに曝露した。図９Ａは、ＳＡプロテインＡが［３Ｈ］アラキドン酸の基礎及びＰＬＡ２−ＧＩＢ誘発放出を増加させることを示す。結果は、ＳＡプロテインＡ単独又はＰＬＡ２−ＧＩＢを含むＳＡプロテインＡによる［３Ｈ］アラキドン酸放出に起因する３回の刺激を含む３つの独立した実験からの平均ｃｐｍ／ｍｌ±ＳＥＭとして表される。統計分析は対応のないｔ検定によって、ＳＡプロテインＡのみと培地のみとを使用した実験条件の間で＃＃ｐ＜０．０１及び＃＃＃ｐ＜０．００１であり、ＰＬＡ２−ＧＩＢを含むＳＡプロテインＡとＰＬＡ２−ＧＩＢのみを使用した実験条件の間で＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１である。図９Ｂは、ＳＡプロテインＡがＣＤ４Ｔ細胞に対するＰＬＡ２−ＧＩＢ活性を増加させることを示す。結果は、ＳＡプロテインＡとＰＬＡ２−ＧＩＢによる３回の刺激からＳＡプロテインＡ単独による又は培地中の３回の刺激を差し引いたものを含む３つの独立した実験で得られたＰＬＡ２−ＧＩＢ活性による平均ｃｐｍ／ｍｌ±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１は、ＳＡプロテインＡとＰＬＡ２−ＧＩＢを併用した場合とＰＬＡ２−ＧＩＢ単独を使用した場合の実験条件間である。
【図１０】ＣＤ４Ｔ細胞膜のＰＬＡ２−ＧＩＢ活性に対するｇｐ４１及びその他の補因子効果の簡略化モデルを示す。ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子のＨＩＶ−１粒子、ｇｐ４１、ＰＥＰ３、Ｃ１ｑ、ＨＣＶコア又はＳＡプロテインＡ等のｇＣ１ｑＲへの結合は、細胞内小胞のエキソサイトーシスを引き起こす。これらの小胞と原形質膜の融合は、脂質組成を変化させ、ＣＤ４Ｔ細胞膜にＰＬＡ２−ＧＩＢ活性を引き起こす。ＰＬＡ２−ＧＩＢ活性の結果として、膜の流動性が増加し、サイトカイン受容体が異常な膜ドメインに凝集してサイトカインシグナル伝達とＣＤ４Ｔ細胞のアネルギーが劇的に低下する。
【図１１】ＰＥＰ３がＰＬＡ２−ＧＩＢに対する補因子効果を持つことを示す。
【図１２】ＰＥＰ３がｇＣ１ｑＲと結合することを示す。
【図１３】ｇＣ１ｑＲがＰＥＰ３補因子効果に関与することを示す。
【図１４】ＨＣＶコアタンパク質がＪｕｒｋａｔ  Ｅ６．１  Ｔ細胞膜をＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性に感作させることを示す。
【図１５】ポルフィロモナス・ジンジバリスがＰＬＡ２−ＧＩＢに対して補因子効果を持つことを示す。
【図１６】膵臓癌患者の血漿がＰＬＡ２−ＧＩＢに対して補因子効果を持つことを示す。
【００１７】
表１は、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子として作用し得る潜在的なｇＣ１ｑＲ結合要素を含むタンパク質を示す。
表２は、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子として作用し得るｇＣ１ｑＲの表である。
表３は、ポテンシャルｇＣ１ｑＲ結合要素を含むヒト病原体のタンパク質を示す。この表は表１から派生したもので、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子として作用し得るヒト病原体のタンパク質とペプチド、及び関連疾患を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、一般にＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子を調節する治療を施すことを含む、治療の調節を必要とする哺乳動物対象を治療するための新規な治療組成物及び方法に関する。治療は、補因子自体、又は補因子の活性剤、アゴニスト若しくはミモトープ、又は補因子の阻害剤若しくは免疫原を投与することを含んでもよい。そのような治療は、好ましくは、通常、対象においてＰＬＡ２−ＧＩＢによる不活性化に対するＣＤ４Ｔ細胞の耐性を維持又は回復し得る、又は対象においてＰＬＡ２−ＧＩＢによる不活性化に対するＣＤ４Ｔ細胞の感作を引き起こす方法で、ＣＤ４Ｔ細胞に対するＰＬＡ２−ＧＩＢの効果を直接的又は間接的に調節する方法で行われる（そして、その治療は好ましくはある量で投与される）。
【００１９】
（定義）
本明細書において、「ＰＬＡ２−ＧＩＢ」（又は「ＰＬＡ２−Ｇ１Ｂ」）という用語は、グループＩＢの膵臓ホスホリパーゼＡ２を指す。ＰＬＡ２−ＧＩＢは、様々な哺乳動物種から同定され、且つクローン化されてきた。ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質は、例えば、Ｌａｍｂｅａｕ及びＧｅｌｂ（２００８）によって開示されている。配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＮＰ＿０００９１９で入手できる。
【００２０】
ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢのアミノ酸配列の一例を以下に示す（配列番号１）。
ＭＫＬＬＶＬＡＶＬＬ  ＴＶＡＡＡＤＳＧＩＳ  ＰＲＡＶＷＱＦＲＫＭ  ＩＫＣＶＩＰＧＳＤＰ  ＦＬＥＹＮＮＹＧＣＹ  ＣＧＬＧＧＳＧＴＰＶ  ＤＥＬＤＫＣＣＱＴＨ  ＤＮＣＹＤＱＡＫＫＬ  ＤＳＣＫＦＬＬＤＮＰ  ＹＴＨＴＹＳＹＳＣＳ  ＧＳＡＩＴＣＳＳＫＮ  ＫＥＣＥＡＦＩＣＮＣ  ＤＲＮＡＡＩＣＦＳＫ  ＡＰＹＮＫＡＨＫＮＬ  ＤＴＫＫＹＣＱＳ
【００２１】
配列番号１のアミノ酸１〜１５はシグナル配列であり、配列番号１のアミノ酸１６〜２２はプロペプチド配列である。
【００２２】
本発明の文脈内で、「ＰＬＡ２−ＧＩＢ」という用語は、好ましくは、ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢを指す。
【００２３】
ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢタンパク質は、２つの異なる形態、すなわちプロペプチドのタンパク質分解開裂によって活性化され、成熟した分泌型（ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ）になるプロ型（ｐｒｏ−ｓＰＬＡ２−ＧＩＢ）で存在してもよい。ＰＬＡ２−ＧＩＢという用語は、プロ型及び／又は成熟型等のタンパク質の任意の形態を含む。通常、成熟分泌型は、配列番号１のアミノ酸残基２３〜１４８、又はそれらの任意の天然変異体の配列を含む。
【００２４】
タンパク質の天然変異体は、例えば、多型又はスプライシングから生じる変異体を含む。天然変異体はまた、１つ以上のアミノ酸置換、付加、及び／又は１個以上（通常は１、２又は３個）のアミノ酸残基の欠失を伴い、配列番号１の配列又は配列番号１のアミノ酸残基２３〜１４８の配列を含む任意のタンパク質を含んでもよい。変異体は、例えば、配列番号１に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する天然に存在する変異体を含む。特定の変異体は、配列番号１と比較して、１０以下のアミノ酸置換、付加、及び／又は１つ以上（通常１、２又は３）のアミノ酸残基の欠失を含む。代表的な天然に存在する変異体は、ＰＬＡ２−ＧＩＢの生物活性を維持する。この点に関して、いくつかの実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢは、健康な対象のＣＤ４Ｔ細胞における膜マイクロドメイン（ＭＭＤ）の形成を誘導すること、又は健康な対象のＣＤ４Ｔ細胞をＩＬ−２シグナル伝達への不応、ＩＬ−７シグナル伝達への不応若しくはＩＬ−４シグナル伝達への不応等インターロイキンシグナル伝達に不応にさせることから選択される少なくとも１つの活性を有する。いくつかの実施形態では、健康な対象のＣＤ４Ｔ細胞をインターロイキン−７シグナル伝達に不応にさせることは、細胞中のＳＴＡＴ５Ａ及び／又はＢリン酸化を少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％減少させることを含む。いくつかの実施形態では、健康な対象のＣＤ４Ｔ細胞をインターロイキン−７シグナル伝達に不応にさせることは、リン酸化ＳＴＡＴ５Ａ及び／又はリン酸化ＳＴＡＴ５Ｂの核移行率を少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％又は少なくとも約５０％低下させることを含む。
【００２５】
核酸又はタンパク質配列に適用される「配列同一性」という用語は、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアライメント（Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  １４７：１９５−１９７）、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２２：４６７３−４６８０）、又はＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら編、（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５：３３８９−３４０２））等の標準化アルゴリズムを用いてアライメントされた少なくとも２つの配列同士の間で一致するヌクレオチド又はアミノ酸残基の定量化（通常、パーセンテージ）に関する。ＢＬＡＳＴ２は、アライメントを最適化し且つそれらの間のさらに意義深い比較をおこなう目的で、配列のうちの１つに間隙を挿入する、標準化され且つ再現性のある方法で用いられてもよい。
【００２６】
ＣＤ４Ｔ細胞に関して「不活性化」という用語は、そのような細胞が効果的な免疫応答の発達に寄与する能力の少なくとも一部を失うことを示す。不活性化は、部分的又は完全、一時的又は永続的でもよい。不活性化は、好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又はそれ以上のＣＤ４Ｔ細胞の機能、特にｐＳＴＡＴ５核移行及び／又はＣＤ４Ｔ細胞の免疫刺激活性の低下を示す。通常、不活性ＣＤ４Ｔ細胞は効果的なｐＳＴＡＴ５核移行をしない。特定の実施形態では、不活性ＣＤ４Ｔ細胞は、アネルギー性ＣＤ４Ｔ細胞である。
【００２７】
本発明の文脈内で、ｓＰＬＡ２−ＧＩＢによる不活性化に対するＣＤ４Ｔ細胞の「耐性」（又は「非感受性」）という用語は、５ｎＭのｓＰＬＡ２−ＧＩＢの存在下でインキュベートされた場合、ＣＤ４Ｔ細胞がインビトロで本質的に不活性化されないことを示す。耐性は、例えば、５ｎＭのｓＰＬＡ２−ＧＩＢ及びインターロイキン−７の存在下で、ＣＤ４Ｔ細胞がインビトロでインキュベートされた場合にｐＳＴＡＴ５の活発な核移行を維持することを示す。ＣＤ４Ｔ細胞のｓＰＬＡ２−ＧＩＢに対する耐性（又は非感受性）は、５ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢとインビトロでインキュベートしたＣＤ４Ｔ細胞が免疫学的に機能し続けること、例えば、アネルギー性にならないことを示してもよい。
【００２８】
（補因子効果）
本発明者らは、多くの病原体がＣＤ４Ｔ細胞をＰＬＡ２−ＧＩＢによる不活性化に対して感受性にすることによって作用することを見出した。このようなメカニズムは、ＣＤ４Ｔ細胞の表面でのｇＣ１ｑＲへの病原体の（又はそれによって誘発された）分子の結合を含み、生理的濃度のＰＬＡ２−ＧＩＢによる不活性化に対するＣＤ４Ｔ細胞の感作を引き起こすと考えられている。特に、ＰＬＡ２−ＧＩＢによるＣＤ４Ｔ細胞の不活性化のメカニズムを分析することによって、本発明者らはｇＣ１ｑＲのアゴニストがＣＤ４Ｔ細胞を低用量のＰＬＡ２−ＧＩＢに対して感受性にすることを発見した。その結果、ＣＤ４Ｔ細胞は、そのような補因子と生理的量のＰＬＡ２−ＧＩＢの存在下では不活性（例えば、アネルギー性）になるが、生理的量のＰＬＡ２−ＧＩＢのみの存在下では活性を維持する。本発明者らは、ｇＣ１ｑＲの天然リガンドであるｇＣ１ｑがそのような補因子効果を示すこと、及び抗ｇＣ１ｑ抗体がそのような補因子効果を遮断し得ることを確認した。本発明者らはまた、驚くべきことに、ウイルス及び細胞を含む多くの病原体がｓＰＬＡ２−ＧＩＢによる不活性化に対するＣＤ４Ｔ細胞の感作をもたらす補因子を実際に含む又は産生する又は活性化することを見出した。特に、本発明者らは、（ｉ）ＨＣＶコアタンパク質がｇＣ１ｑＲに結合してｓＰＬＡ２−ＧＩＢによる不活性化に対するＣＤ４Ｔ細胞の感作を引き起こし得ることと、（ｉｉ）ブドウ球菌プロテインＡがｇＣ１ｑＲに結合してｓＰＬＡ２−ＧＩＢによる不活性化に対するＣＤ４Ｔ細胞の感作を引き起こし得ることと、（ｉｉｉ）ＨＩＶ  ｇｐ４１がｇＣ１ｑＲに結合してｓＰＬＡ２−ＧＩＢによる不活性化に対するＣＤ４Ｔ細胞の感作を引き起こし得ることと、（ｉｖ）癌患者からの血漿がｓＰＬＡ２−ＧＩＢによる不活性化に対するＣＤ４Ｔ細胞の感作を引き起こし得ることとを示している。
【００２９】
したがって、出願人は、多くの病原体が疾患、病態又は（少なくとも一時的に）哺乳動物の免疫不全を誘発することによって、すなわちＰＬＡ２−ＧＩＢによる不活性化に対するＣＤ４Ｔ細胞の感作を誘発する補因子を産生又は活性化することによって、一般的な新規メカニズムを特定した。本発明者らは、特にＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子が癌にあることを発見し、そのようなメカニズムが癌の発生及び発達にも関与していることを実証した。そのような予想外の発見により、出願人はメカニズムの調節（例えば、遮断、阻害又は刺激）に基づく新規な治療アプローチを提供することができ、それにより、多くの病原体の病原性効果を防止、回避又は少なくとも低減し、又は免疫抑制を誘発する。
【００３０】
したがって、本発明の目的は、哺乳動物対象にＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子又はＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子のモジュレータを投与することを含む、該対象を治療するための方法及び組成物を提供することである。
【００３１】
本発明の別の目的は、哺乳動物対象にＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子又はＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子のモジュレータを投与することを含む、該対象における免疫応答を調節するための方法及び組成物を提供することである。
【００３２】
本発明の別の目的は、哺乳動物対象における免疫応答を調節するために使用するＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子又はＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子のモジュレータに関する。
【００３３】
本発明の別の目的は、治療を必要とする対象、特に免疫抑制療法又は免疫刺激療法を必要とする疾患又は状態を有する対象を治療するために使用するＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子又はＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子のモジュレータに関する。
【００３４】
本発明のさらなる目的は、哺乳動物におけるＰＬＡ２−ＧＩＢによる不活性化に対するＣＤ４Ｔ細胞の耐性を回復／維持するための方法及び組成物を提供することである。
【００３５】
本発明はまた、治療を必要とする対象、特に免疫抑制療法又は免疫刺激療法を必要とする状態を有する対象を治療するための、より具体的には、その治療を必要とする対象における免疫応答を調節するための、薬剤を製造するＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子又はＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子のモジュレータの使用に関する。
【００３６】
（ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子）
本発明者らは、驚くべきことに、多くの異なる種類の病原体がＰＬＡ２−ＧＩＢと組み合わせてＣＤ４Ｔ細胞の不活性化をもたらすＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子として作用（又は産生又は活性化）することを発見している。特に、図８に示すように、ＨＣＶコアタンパク質は、低濃度のｓＰＬＡ２−ＧＩＢによる不活性化に対するＣＤ４Ｔ細胞の感作を引き起こしている。同様に、図９に示すように、ブドウ球菌プロテインＡは、低濃度のｓＰＬＡ２−ＧＩＢによる不活性化に対するＣＤ４Ｔ細胞の感作を引き起こし、図３〜７に示すように、ＨＩＶ  ｇｐ４１は、低濃度のｓＰＬＡ２−ＧＩＢによる不活性化に対するＣＤ４Ｔ細胞の感作を引き起こしている。図１５は、ポルフィロモナス・ジンジバリスからのペプチドがＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子効果を持つことを示しており、さらに図１６は癌患者からの血漿がＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子効果を持つことを実証している。本発明者らはさらに、これらの補因子分子がｇＣ１ｑＲのリガンドであり、ｇＣ１ｑＲへのそれらの結合を阻害することもまた、補因子効果を阻害することを発見した（図６Ｂ及び６Ｃ）。
【００３７】
したがって、本発明者らは、様々な分子がｇＣ１ｑＲに結合してｓＰＬＡ２−ＧＩＢの補因子として作用し得る病原体によって、及び／又は病態において産生されることを明らかにした。
【００３８】
したがって、本発明の文脈内でＰＬＡ２−ＧＩＢの「補因子」という用語は、ＰＬＡ２−ＧＩＢの効果、特にＣＤ４Ｔ細胞に対するＰＬＡ２−ＧＩＢの効果を増強、増幅又は媒介する任意の分子又は薬剤を指す。好ましい補因子は、ＣＤ４Ｔ細胞を低濃度のＰＬＡ２−ＧＩＢによる不活性化に対し感作し得る分子である。
【００３９】
本発明の特定の実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子はｇＣ１ｑＲのリガンドである。本発明者らは、ＣＤ４Ｔ細胞の表面でのｇＣ１ｑＲのリガンドがＰＬＡ２−ＧＩＢの補因子として作用して細胞をＰＬＡ２−ＧＩＢによる不活性化に対してより感作させることを実際に実証した。より具体的には、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子はｇＣ１ｑＲのアゴニストであり、例えばｇＣ１ｑＲを介してシグナル伝達を誘導し得、より具体的にはｇＣ１ｑＲを介したエキソサイトーシスを誘導し得る。
【００４０】
この点において、本発明者らは、表１〜３に列挙されるようにＰＬＡ２−ＧＩＢの補因子として作用し得る様々なタンパク質を同定した。本発明の特定の実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、表１又は２のタンパク質から選択されるタンパク質、又はそのようなタンパク質のｇＣ１ｑＲ結合要素である。より具体的には、補因子は、配列番号２〜４４のいずれかを含む又は配列番号４５〜７１のタンパク質から選択される任意のタンパク質であってもよく、より好ましくは配列番号３、４３、４４及び配列番号４５〜６１のいずれかから選択される任意のタンパク質であり、さらにより好ましくは、配列番号３、４３、４４及び４５〜５５のいずれか、又はそれらの任意の断片若しくはミモトープから選択される任意のタンパク質であってもよい。
【００４１】
そのような補因子に関して、「断片」という用語は、好ましくはそのようなタンパク質のｇＣ１ｑＲ結合要素を含む断片、及び／又はｇＣ１ｑＲに結合する能力を保持する断片を指す。好ましい断片は、少なくとも５個の連続したアミノ酸残基、通常、５〜１００を含む。
【００４２】
さらなる特定の実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、病原体又は栄養素の成分であり、好ましくは病原体由来のタンパク質又はペプチドである。より具体的な実施形態ではＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、ウイルス、細菌、真菌又は寄生虫のタンパク質若しくはペプチドである。そのような補因子の好ましい例は、表２及び３に記載されている。
【００４３】
特定の実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、ＨＣＶコアタンパク質、又はその断片又はミモトープである。特定の実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、配列番号４３を含む又はそれからなるタンパク質若しくはペプチド、又はミモトープ又はその断片である。
配列番号：４３
ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＲＱ１９０１３．１
ＭＳＴＮＰＫＰＱＲＫＴＫＲＮＴＩＲＲＰＱＤＶＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫＴＳＥＲＳＱＰＲＧＲＲＱＰＩＰＫＡＲＲＰＥＧＲＴＷＡＱＰＧＹＰＷＰＬＹＧＮＥＧＭＧＷＡＧＷＬＬＳＰＲＧＳＲＰＳＷＧＰＴＤＰＲＲＲＳＲＮＬＧＫＶＩＤＴＬＴＣＧＦＡＤＬＭＧＹＶＰＬＶＧＡＰＬＧＧＡＡＲＡＬＡＨＧＶＲＡＬＥＤＧＶＮＹＡＴＧＮＬＰＧＣＳＦＳＩＳＬＷＸＬＬＳＣＬＴＩＰＡＳＡ
【００４４】
別の特定の実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、ブドウ球菌プロテインＡ、又はその断片又はミモトープである。特定の実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、配列番号４４を含む又はそれからなるタンパク質又はペプチド、又はミモトープ又はその断片である。
配列番号：４４
ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿４９８６７０．１
ＭＫＫＫＮＩＹＳＩＲＫＬＧＶＧＩＡＳＶＴＬＧＴＬＬＩＳＧＧＶＴＰＡＡＮＡＡＱＨＤＥＡＱＱＮＡＦＹＱＶＬＮＭＰＮＬＮＡＤＱＲＮＧＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＶＬＧＥＡＱＫＬＮＤＳＱＡＰＫＡＤＡＱＱＮＮＦＮＫＤＱＱＳＡＦＹＥＩＬＮＭＰＮＬＮＥＡＱＲＮＧＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＴＮＶＬＧＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫＡＤＮＮＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＮＭＰＮＬＮＥＥＱＲＮＧＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＳＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫＡＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＧＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫＡＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＥＱＲＮＧＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫＥＥＤＮＮＫＰＧＫＥＤＮＮＫＰＧＫＥＤＮＮＫＰＧＫＥＤＮＮＫＰＧＫＥＤＮＮＫＰＧＫＥＤＧＮＫＰＧＫＥＤＮＫＫＰＧＫＥＤＧＮＫＰＧＫＥＤＮＫＫＰＧＫＥＤＧＮＫＰＧＫＥＤＧＮＫＰＧＫＥＤＧＮＧＶＨＶＶＫＰＧＤＴＶＮＤＩＡＫＡＮＧＴＴＡＤＫＩＡＡＤＮＫＬＡＤＫＮＭＩＫＰＧＱＥＬＶＶＤＫＫＱＰＡＮＨＡＤＡＮＫＡＱＡＬＰＥＴＧＥＥＮＰＦＩＧＴＴＶＦＧＧＬＳＬＡＬＧＡＡＬＬＡＧＲＲＲＥＬ  
【００４５】
別の特定の実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、ＨＩＶ  ｇｐ４１、ＨＩＶ  ｒｅｖ、又はその断片若しくはミモトープである。特定の実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、配列番号３又は配列番号５１を含む又はそれらからなるタンパク質又はペプチド、又はその断片又はミモトープである。そのような補因子は、特にＨＩＶ感染症に関連している。
配列番号：３
ＧｅｎＢａｎｋ参照  ＡＡＣ３１８１７．１
ＡＡＩＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＡＳＶＴＬＴＶＱＡＲＬＬＬＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＳＱＱＨＭＬＲＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＶＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＦＷＧＣＳＧＫＬＩＣＴＴＴＶＰＷＮＡＳＷＳＮＫＳＬＤＤＩＷＮＮＭＴＷＭＱＷＥＲＥＩＤＮＹＴＳＬＩＹＳＬＬＥＫＳＱＴＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦＤＩＴＮＷＬＷＹＩＫＩＦＩＭＩＶＧＧＬＶＧＬＲＩＶＦＡＶＬＳＩＶＮＲＶＲＱＧＹＳＰＬＳＬＱＴＲＰＰＶＰＲＧＰＤＲＰＥＧＩＥＥＥＧＧＥＲＤＲＤＴＳＧＲＬＶＨＧＦＬＡＩＩＷＶＤＬＲＳＬＦＬＬＳＹＨＨＬＲＤＬＬＬＩＡＡＲＩＶＥＬＬＧＲＲＧＷＥＶＬＫＹＷＷＮＬＬＱＹＷＳＱＥＬＫＳＳＡＶＳＬＬＮＡＡＡＩＡＶＡＥＧＴＤＲＶＩＥＶＬＱＲＡＧＲＡＩＬＨＩＰＴＲＩＲＱＧＬＥＲＡＬＬ
【００４６】
別の特定の実施形態ではＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、配列番号４５を含む又はそれからなるタンパク質又はペプチド、又はその断片又はミモトープである。そのような補因子は、特にＥＢＶ感染症に関連している。
【００４７】
別の特定の実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、配列番号４６を含む又はそれからなるタンパク質又はペプチド、又はその断片又はミモトープである。そのような補因子は、特にアデノウイルス感染症に関連している。
【００４８】
別の特定の実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、配列番号４７を含む又はそれからなるタンパク質又はペプチド、又はその断片又はミモトープである。そのような補因子は、特にハンタウイルス感染症に関連している。
【００４９】
別の特定の実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、配列番号４８を含む又はそれからなるタンパク質又はペプチド、又はその断片又はミモトープである。そのような補因子は、特にＨＳＶ感染症に関連している。
【００５０】
別の特定の実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、配列番号４９又は５０を含む又はそれからなるタンパク質又はペプチド、又はその断片又はミモトープである。そのような補因子は、特に風疹ウイルス感染症に関連している。
【００５１】
別の特定の実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、配列番号５２を含む又はそれからなるタンパク質又はペプチド、又はその断片又はミモトープである。そのような補因子は、特にリステリア・モノサイトゲネス感染症に関連している。
【００５２】
別の特定の実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、配列番号５３を含む又はそれからなるタンパク質又はペプチド、又はその断片又はミモトープである。そのような補因子は、特に肺炎球菌感染症に関連している。
【００５３】
別の特定の実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、配列番号５４を含む又はそれからなるタンパク質又はペプチド、又はその断片又はミモトープである。そのような補因子は、特にセレウス菌感染症に関連している。
【００５４】
別の特定の実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、配列番号５５を含む又はそれからなるタンパク質又はペプチド、又はその断片又はミモトープである。そのような補因子は、特に熱帯熱マラリア原虫感染症に関連している。
【００５５】
別の特定の実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、配列番号７又は８を含むタンパク質又はペプチド、又はその断片又はミモトープである。そのような補因子は、特にポルフィロモナス・ジンジバリスに関連している。
【００５６】
別の特定の実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、配列番号１４を含むタンパク質又はペプチド、又はその断片又はミモトープである。そのような補因子は、特にプロテウス・ミラビリスに関連している。
【００５７】
別の特定の実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、配列番号１８を含むタンパク質又はペプチド、又はその断片又はミモトープである。そのような補因子は、特にレピストラ・ウェイリと関連している。
【００５８】
別の特定の実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、配列番号２８を含むタンパク質又はペプチド、又はその断片又はミモトープである。そのような補因子は、特にテリスポロバクター・グリコリカスに関連している。
【００５９】
別の特定の実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、配列番号２９又は３０を含むタンパク質又はペプチド、又はその断片又はミモトープである。そのような補因子は、特にバクテロイデス・フラジリスに関連している。
【００６０】
別の特定の実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、配列番号３３を含むタンパク質又はペプチド、又はその断片又はミモトープである。そのような補因子は、特にカンジダ・グラブラタに関連している。
【００６１】
別の特定の実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、配列番号３８を含むタンパク質又はペプチド、又はその断片又はミモトープである。そのような補因子は、特にアグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンスに関連している。
【００６２】
別の特定の実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、配列番号４１を含むタンパク質又はペプチド、又はその断片又はミモトープである。そのような補因子は、特にポルフィロモナス・ソメラエに関連している。
【００６３】
別の特定の実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子は、配列番号４２を含むタンパク質又はペプチド、又はその断片又はミモトープである。そのような補因子は、特にアグリゲイティバクター・アフロフィルスに関連している。
【００６４】
補因子のさらなる例示的な例は、癌患者の血漿中の分子又は薬剤、又はその変異体若しくは誘導体であり、ＰＬＡ２−ＧＩＢに補因子効果を発揮し得る。
【００６５】
（補因子効果を調節する治療）
本発明は、このような補因子効果を調節することにより、罹患した対象を治療すること、及び／又は該対象におけるＣＤ４Ｔ細胞活性を回復／増強することを提案する。したがって、本発明はＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子又はＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子のモジュレータを用いて、罹患した対象を治療するための、及び／又は該対象におけるＣＤ４Ｔ細胞活性を回復／増強するための方法及び組成物を提供する。
【００６６】
本発明の文脈内で、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子の「モジュレータ」という用語は、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子の発現又は活性を直接的又は間接的に調整し得る任意の分子を指す。したがって、モジュレータは、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子の阻害剤又は（抗補因子抗体を誘発する）ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子の免疫原、又はＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子の活性化剤、アゴニスト又はミモトープであってもよい。
【００６７】
（補因子阻害剤）
補因子の「阻害剤」という用語は、補因子の発現又は機能の阻害、例えば、ｇＣ１ｑＲへの補因子結合又はＰＬＡ２−ＧＩＢに対してＣＤ４Ｔ細胞を感作する補因子能力を（直接的又は間接的に）引き起こす任意の分子又は治療を指す。補因子を阻害することは、補因子の発現又は機能を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又はそれ以上減少させること、及び該発現又は機能を完全にブロック又は抑制することを意味する。状況に応じて、阻害は一時的、持続的又は永続的であってもよい。
【００６８】
特定の実施形態では、補因子の阻害剤は、ｇＣ１ｑＲ阻害剤である。実際、補因子はｇＣ１ｑＲを標的受容体として結合する。ｇＣ１ｑＲ阻害剤を用いて補因子のｇＣ１ｑＲへの結合をブロック、低減又は防止することは、補因子効果に影響を与え得る。「ｇＣ１ｑＲ阻害剤」という用語は、ｇＣ１ｑＲ、例えば、ｇＣ１ｑＲ媒介エキソサイトーシスの機能の阻害を（直接的又は間接的に）引き起こす任意の分子又は治療を指す。
【００６９】
ｇＣ１ｑＲは、細胞、特にＣＤ４Ｔ細胞、特にヒト型の受容体の表面にある補体Ｃ１ｑの受容体を示す。ｇＣ１ｑＲはまた、Ｃ１ｑ結合タンパク質（Ｃ１ＱＢＰ）、ＡＳＦ／ＳＦ２関連タンパク質ｐ３２（ＳＦ２Ｐ３２）、糖タンパク質ｇＣ１ｑＢＰ、ヒアルロン酸結合タンパク質１（ＨＡＢＰ１）、ミトコンドリアマトリックスタンパク質ｐ３２、ｇＣ１ｑ−Ｒタンパク質、ｐ３３、Ｃ１ｑＢＰ及びＧＣ１ＱＢＰとしても知られている。受容体のアミノ酸配列は、当該技術分野で開示されている。ヒトｇＣ１ｑＲの例示的なアミノ酸配列を以下に複製する（配列番号２）：
ＭＬＰＬＬＲＣＶＰＲＶＬＧＳＳＶＡＧＬＲＡＡＡＰＡＳＰＦＲＱＬＬＱＰＡＰＲＬＣＴＲＰＦＧＬＬＳＶＲＡＧＳＥＲＲＰＧＬＬＲＰＲＧＰＣＡＣＧＣＧＣＧＳＬＨＴＤＧＤＫＡＦＶＤＦＬＳＤＥＩＫＥＥＲＫＩＱＫＨＫＴＬＰＫＭＳＧＧＷＥＬＥＬＮＧＴＥＡＫＬＶＲＫＶＡＧＥＫＩＴＶＴＦＮＩＮＮＳＩＰＰＴＦＤＧＥＥＥＰＳＱＧＱＫＶＥＥＱＥＰＥＬＴＳＴＰＮＦＶＶＥＶＩＫＮＤＤＧＫＫＡＬＶＬＤＣＨＹＰＥＤＥＶＧＱＥＤＥＡＥＳＤＩＦＳＩＲＥＶＳＦＱＳＴＧＥＳＥＷＫＤＴＮＹＴＬＮＴＤＳＬＤＷＡＬＹＤＨＬＭＤＦＬＡＤＲＧＶＤＮＴＦＡＤＥＬＶＥＬＳＴＡＬＥＨＱＥＹＩＴＦＬＥＤＬＫＳＦＶＫＳＱ
【００７０】
ｇＣ１ｑＲという用語は、上記の配列番号２の任意の受容体（アクセッション番号ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｑ０７０２１．１）、及びその処理された形態及び変異体を指す。変異体は、例えば、配列番号２に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する天然に存在する変異体を含む。
【００７１】
補因子が結合すると、ｇＣ１ｑＲはシグナル伝達経路を誘発し、細胞内小胞のエキソサイトーシスを引き起こす。理論に縛られることなく、これらの小胞と細胞膜との融合は、脂質組成を変化させてＣＤ４Ｔ細胞膜にｓＰＬＡ２−ＧＩＢ活性を増加させ得、その結果、リン酸化ＳＴＡＴ５シグナル伝達が阻害される（図１０を参照）と考えられている。特に、これらの小胞と細胞膜の融合は、脂質組成を変化させてＣＤ４Ｔ細胞膜にｓＰＬＡ２−ＧＩＢ活性を引き起こさせ得る。その結果、膜流動性が増加し、サイトカイン受容体が異常な膜ドメインに凝集され、サイトカインシグナル伝達とＣＤ４Ｔ細胞のアネルギーとが劇的に低下する。
【００７２】
したがって、ｇＣ１ｑＲ阻害剤という用語は、ｇＣ１ｑＲ又はｇＣ１ｑＲのパートナーに結合し、ｇＣ１ｑＲ媒介エキソサイトーシス等のｇＣ１ｑＲの機能を阻害する任意の分子を含む。
【００７３】
別の実施形態では、補因子阻害剤は、補因子の活性を直接阻害する、例えば、補因子に結合する、及び／又はその受容体への補因子の結合を阻害する分子である。
【００７４】
補因子阻害剤の好ましい例は、例えば、抗体及びその変異体、合成特異的リガンド、ペプチド、低分子薬剤又は阻害性核酸を含む。
【００７５】
（抗体）
第１の実施形態では、補因子阻害剤は、本質的に同じ抗原特異性を有する抗体又は抗体変異体／断片、又はそのような抗体又は変異体／断片をコードする核酸である。抗体は、補因子、ｇＣ１ｑＲ、ｇＣ１ｑＲのパートナー又はそのｇＣ１ｑＲ結合要素に結合してもよく、好ましくは、同族抗原（例えば、ｇＣ１ｑＲ又は補因子）の機能を阻害する。
【００７６】
抗体は、合成、モノクローナル又はポリクローナルであり得、当該技術分野において既知の技術で作製され得る。
【００７７】
「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆ（ａｂ’）２及びＦａｂ断片等の断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体断片（ＶＨＨ又はナノボディ）、二価抗体断片（二重特異性抗体）、並びに組換え及び合成により生成された結合パートナー、ヒト抗体又はヒト化抗体を含むことを意味する。
【００７８】
抗体は、好ましくは約１０７Ｍ−１以上のＫａで同族抗原に結合する場合、特異的に結合すると定義される。抗体の親和性は、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．，５１：６６０（１９４９年）によって記載されるもの等の従来技術を用いて容易に測定され得る。
【００７９】
ポリクローナル抗体は、当該技術分野で周知の手段を用いて、様々な供給源、例えば、ウマ、ウシ、ロバ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス、ハムスタ−又はラットから容易に作製され得る。一般に、精製された免疫原は、任意に適切に結合され、通常非経口注射により宿主動物に投与される。免疫原の免疫原性は、例えばフロイント完全又は不完全アジュバント等のアジュバントを使用することにより増強され得る。追加免疫の後に、血清の少量のサンプルが収集され、抗原ポリペプチドに対する反応性について試験される。そのような測定に有用な様々なアッセイの例としては、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８に記載されたもの、及び向流免疫電気泳動（ＣＩＥＰ）、ラジオイムノアッセイ、放射免疫沈降法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイ、サンドイッチアッセイ等の手段を含む。米国特許第４，３７６，１１０号及び第４，４８６，５３０号明細書を参照する。
【００８０】
モノクローナル抗体は、よく知られた手順を用いて容易に調製され得る。例えば、米国特許第３２，０１１号、４，９０２，６１４号、４，５４３，４３９号及び４，４１１，９９３号明細書、及びＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｋｅｎｎｅｔｔ、ＭｃＫｅａｍ及びＢｅｃｈｔｏｌ（編）、１９８０年に記載されている手段を参照する。例えば、マウス等の宿主動物は、単離及び精製された免疫原を約３週間間隔で少なくとも１回、好ましくは少なくとも２回腹腔内に、任意的にアジュバントの存在下で注射され得る。そして、マウス血清は、どの動物が融合に適するかを決定するために、従来のドットブロット技術又は抗体キャプチャ（ＡＢＣ）によって分析される。約２〜３週間後に、マウスにはタンパク質又はペプチドの静脈内追加が行われる。マウスは後に犠牲となり、確立されたプロトコルに従って脾臓細胞がＡｇ８．６５３（ＡＴＣＣ）等の市販で入手可能な骨髄腫細胞と融合される。短時間で、骨髄腫細胞は培地内で数回洗浄され、１つの骨髄腫細胞に対して約３つの脾臓細胞の割合でマウス脾臓細胞と融合される。融合剤は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の当該技術分野で使用される任意の適切な薬剤であり得る。融合物は、融合細胞の選択的成長を可能にする培地を含むプレートに配置される。そして、融合細胞は約８日間成長させられ得る。得られたハイブリドーマからの上清を収集し、ヤギ抗マウスＩｇで最初にコ−ティングされたプレートに添加する。洗浄後、各ウェルに標識を添加し、インキュベートする。その後、陽性ウェルが検出され得る。バルク培地において陽性クロ−ンが成長し得、その後、上清がプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）で精製される。モノクローナル抗体は、参照により本明細書に組み込まれる、Ａｌｔｉｎｇ−ｍｅｅｓらによる「モノクローナル抗体発現ライブラリ：ハイブリドーマの高速な代替物」、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：１−９（１９９０年）に記載されているような代替的技術を用いても産生され得る。同様に、結合パートナーは、特異的結合抗体をコードする遺伝子の可変ドメインを組み込むように組換えＤＮＡ技術を用いて構築され得る。そのような技術は、Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、７：３９４（１９８９年）に記載される。
【００８１】
また、従来技術によって産生され得る抗体の抗原結合断片も本発明に包含される。そのような断片の例は、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片を含むが、これらに限定はされない。遺伝子工学技術によって産生され得る抗体断片及び誘導体も提供される。
【００８２】
本発明のモノクローナル抗体はまた、例えばヒト化型のマウスモノクローナル抗体であるキメラ抗体を含む。そのようなヒト化抗体は、既知の技術によって調製され得、抗体がヒトに投与されるときに免疫原性を低下するという有利性がある。一実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス抗体の可変領域（又は単にその抗原結合部位）及びヒト抗体由来の定常領域を含む。代替的に、ヒト化抗体断片は、マウスモノクローナル抗体の抗原結合部位及びヒト抗体由来の（抗原結合部位がない）可変領域断片を含み得る。キメラ及びさらに操作されたモノクローナル抗体の産生の手法は、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３、１９８８年）、Ｌｉｕら（ＰＮＡＳ  ８４：３４３９、１９８７年）、Ｌａｒｒｉｃｋら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：９３４、１９８９年）、及びＷｉｎｔｅｒとＨａｒｒｉｓ（ＴＩＰＳ  １４：１３９、１９９３年５月）によって記載されたものを含む。遺伝子組換えで抗体を生成するための手順は、英国特許第２，２７２，４４０号明細書、米国特許第５，５６９，８２５号及び第５，５４５，８０６号明細書に見受けられる。標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製され得る、ヒト部分及び非ヒト部分の両方を含むキメラ及びヒト化モノクローナル抗体等、遺伝子工学的方法によって産生された抗体を使用し得る。そのようなキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎらによる国際公開第８７／０２６７１号；Ａｋｉｒａらによる欧州特許第０１８４１８７号明細書；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．による欧州特許第０１７１４９６号明細書；Ｍｏｒｒｉｓｏｎらによる欧州特許第０１７３４９４号明細書；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒらによる国際公開第８６／０１５３３号明細書；Ｃａｂｉｌｌｙらによる米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｃａｂｉｌｌｙらによる欧州特許第０１２５０２３号明細書；Ｂｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１  １０４３，１９８８年；Ｌｉｕら、ＰＮＡＳ  ８４：３４３９  ３４４３，１９８７年；Ｌｉｕら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１  ３５２６，１９８７年；Ｓｕｎら、ＰＮＡＳ  ８４：２１４  ２１８、１９８７年；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９  １００５、１９８７年；Ｗｏｏｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６  ４４９、１９８５年、Ｓｈａｗら；Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３  １５５９、１９８８年）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓ．Ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２  １２０７、１９８５年；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４、１９８６年；Ｗｉｎｔｅｒによる米国特許第５，２２５，５３９号明細書；Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２  ５２５，１９８６年；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４、１９８８年及びＢｅｉｄｌｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３  ４０６０、１９８８年に記載される方法等、当該技術分野において既知である標準的なＤＮＡ技術を用いる遺伝子工学によって産生され得る。
【００８３】
合成及び半合成抗体について、そのような用語は、抗体断片、アイソタイプスイッチ抗体、ヒト化抗体（例えば、マウス−ヒト、ヒト−マウス）、ハイブリッド、複数の特異性を有する抗体及び完全に合成された抗体様分子を包含することが意図されるが、これらに限定はされない。
【００８４】
ヒトモノクローナル抗体はまた、対象のリンパ球由来のｍＲＮＡから調製された免疫グロブリン軽鎖及び重鎖ｃＤＮＡを用いて、Ｆａｂファージディスプレイライブラリ又はｓｃＦｖファージディスプレイライブラリ等のコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリを構築することでも調製され得る。例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらによる国際公開第９２／０１０４７号、Ｍａｒｋｓら（１９９１年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１  ５９７及びＧｒｉｆｆｔｈｓら（１９９３年）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５  ７３４が参照される。さらに、抗体の可変領域のコンビナトリアルライブラリは、既知のヒト抗体を変異することで作製し得る。例えば、ｇＣ１ｑＲと結合することが知られているヒト抗体の可変領域は、ｇＣ１ｑＲに結合するためにスクリーニングされ得る変異可変領域のライブラリを作製するために、例えばランダムに変化させた変異オリゴヌクレオチドを用いて変異され得る。免疫グロブリン重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲ領域内にランダム突然変異誘発を誘導する方法、ランダム化された重鎖と軽鎖を交差させてペアを形成する方法、及びスクリーニング方法は、例えば、Ｂａｒｂａｓらによる国際公開第９６／０７７５４号、Ｂａｒｂａｓら（１９９２年）によるＮａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４４５７  ４４６１に見受けられる。
【００８５】
本発明の抗体は、ｇＣ１ｑＲ、ｇＣ１ｑＲリガンド又はＣ１ｑＲパートナーに対して向けられてもよく、ｇＣ１ｑＲによって媒介されるシグナル伝達の阻害を引き起こしてもよい。本発明の抗体を調製するために、ｇＣ１ｑＲ、ｇＣ１ｑＲリガンド、ｇＣ１ｑＲパートナー又はそれらの断片、変異体若しくは融合分子を含む免疫原を用いてもよい。
【００８６】
（ｇＣ１ｑＲへの抗体）
本発明の特定の抗体は、ｇＣ１ｑＲエピトープに結合し、及び／又は成熟したｇＣ１ｑＲタンパク質又は少なくとも８個の連続したアミノ酸残基を含む該ｇＣ１ｑＲの断片から選択される、ｇＣ１ｑＲエピトープを含むポリペプチドでの免疫によって生成された。本発明の好ましい抗ｇＣ１ｑＲ抗体は、ｇＣ１ｑＲ内のリガンド結合部位のエピトープに結合し、それによってリガンドの結合を妨害する。特定の実施形態では、抗体は、ｇＣ１ｑＲリガンド結合部位を含む配列番号２のアミノ酸残基７６〜２８２の間に含まれるエピトープに結合する。ｇＣ１ｑＲに結合するＣ１ｑには、ｇＣ１ｑＲの少なくとも３つの異なるモチーフ、すなわちアミノ酸残基７５〜９６、１９０〜２０２及び１４４〜１６２（配列番号２を参照）が関与し得る。ｇＣ１ｑＲに結合するＨＣＶコアタンパク質には、ｇＣ１ｑＲの少なくとも２つの異なるモチーフ、すなわちアミノ酸残基１４４〜１４８及び１９６〜２０２（配列番号２を参照）が関与し得る。ｇＣ１ｑＲに結合するＨＩＶ  ｇｐ４１には、ｇＣ１ｑＲの少なくともアミノ酸残基１７４〜１８０（配列番号２を参照）が関与し得る。
【００８７】
したがって、前記エピトープの１つに含まれる又は前記エピトープの１つに近い少なくとも１個のアミノ酸残基を含むエピトープに結合する抗体（又はその変異体）を使用することが好ましい。そのような抗体としては、ｇＣ１ｑＲの残基７５〜９６に結合する抗体６０．１１、及び残基２０４〜２１８を含むエピトープに結合する抗体７４．５．２を含む。
【００８８】
したがって、好ましいｇＣ１ｑＲ阻害剤は、ｇＣ１ｑＲに対する、より好ましくはタンパク質のアミノ酸残基７６〜２８２（配列番号２を参照）内に位置するｇＣ１ｑＲのエピトープに対する、さらにより好ましくはアミノ酸７５〜９６、１４４〜１６２、１７４〜１８０及び１９０〜２１０から選択されるアミノ酸残基を含むエピトープに対するモノクローナル抗体である。好ましい抗体は、中和（又はアンタゴニスト）抗体であり、すなわち、それらは天然リガンドの受容体への結合及び／又は受容体を介したシグナル伝達を防止、阻害又は低減する。
【００８９】
（ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子に対する抗体）
本発明の他の特定の阻害剤は、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子に結合する、及び／又はＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子又はその断片での免疫により生成される抗体であり、好ましくはそのような補因子の活性、好ましくはそのような補因子のｇＣ１ｑＲへの結合を少なくとも部分的に阻害する抗体である。
【００９０】
本発明の特定の抗体は、表１及び２に列挙されたタンパク質から選択されるタンパク質に結合して該タンパク質のｇＣ１ｑＲへの結合を少なくとも部分的に阻害する、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又はそれらの変異体である。本発明の好ましい抗体は、表２及び３に列挙されたタンパク質から選択されるタンパク質に結合して該タンパク質のｇＣ１ｑＲへの結合を少なくとも部分的に阻害する、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又はそれらの変異体であり、さらに具体的には、表２に列挙されたタンパク質から選択されるタンパク質であり、該タンパク質のｇＣ１ｑＲへの結合を少なくとも部分的に阻害する。
【００９１】
特定の実施形態では、Ｃ１ｑＲ阻害剤は、配列番号２〜４４及び配列番号４５〜７１から、より好ましくは配列番号２、３、４３、４４及び配列番号４５〜６１から、さらにより好ましくは配列番号３、８、４３、４４及び配列番号４５〜５５から選択されるタンパク質に結合する抗体又はその変異体であり、ｇＣ１ｑＲへのタンパク質の結合を少なくとも部分的に阻害する。
【００９２】
本発明の特定の抗体又は変異体は、ｇＣ１ｑＲ結合要素又はリガンドドメインに含まれる（又は重複する）Ｃ１ｑＲリガンド内のエピトープに結合し、通常、少なくとも１個のリガンドのｇＣ１ｑＲへの結合に関与するリガンドの少なくとも１個のアミノ酸残基を含む。
【００９３】
特定の実施形態では、阻害剤は、配列番号７又は８を含むタンパク質又はペプチドに結合する抗体又はその変異体である。そのような阻害剤は、膵臓癌、慢性歯周病、リウマチ性多発性関節炎、又はアルツハイマー病等のポルフィロモナス・ジンジバリスに関連する障害の治療に特に有用である。好ましくは、そのような抗体は、標的受容体又は細胞、特にｇＣ１ｑＲへのタンパク質の結合を阻害する。
【００９４】
別の特定の実施形態では、阻害剤は、配列番号１４を含むタンパク質又はペプチドに結合する抗体又はその変異体である。そのような阻害剤は、尿路感染症又はＨＩＶ患者における骨髄炎等のプロテウス・ミラビリスに関連した障害の治療に特に有用である。好ましくは、そのような抗体は、標的受容体又は細胞、特にｇＣ１ｑＲへのタンパク質の結合を阻害する。
【００９５】
別の特定の実施形態では、阻害剤は、配列番号１８を含むタンパク質又はペプチドに結合する抗体又はその変異体である。そのような阻害剤は、レプトスピラ症等のレプトスピラ・ウェイリイに関連する障害の治療に特に有用である。好ましくは、そのような抗体は、標的受容体又は細胞、特にｇＣ１ｑＲへのタンパク質の結合を阻害する。
【００９６】
特定の実施形態では、阻害剤は、配列番号２８を含むタンパク質又はペプチドに結合する抗体又はその変異体である。そのような阻害剤は、創傷感染症等のテリスポロバクター・グリコリカスに関連する障害の治療に特に有用である。好ましくは、そのような抗体は、標的受容体又は細胞、特にｇＣ１ｑＲへの前記タンパク質の結合を阻害する。
【００９７】
特定の実施形態では、阻害剤は、配列番号２９又は３０を含むタンパク質又はペプチドに結合する抗体又はその変異体である。そのような阻害剤は、腹膜感染症、菌血症、皮下膿瘍又は火傷等のバクテロイデス・フラジリスに関連する障害の治療に特に有用である。好ましくは、そのような抗体は、標的受容体又は細胞、特にｇＣ１ｑＲへのタンパク質の結合を阻害する。
【００９８】
特定の実施形態では、阻害剤は、配列番号３３を含むタンパク質又はペプチドに結合する抗体又はその変異体である。そのような阻害剤は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、癌及び臓器移植の皮膚カンジダ症等のカンジダ・グラブラタに関連する障害の治療に特に有用である。好ましくは、そのような抗体は、標的受容体又は細胞、特にｇＣ１ｑＲへのタンパク質の結合を阻害する。
【００９９】
特定の実施形態では、阻害剤は、配列番号３８を含むタンパク質又はペプチドに結合する抗体又はその変異体である。そのような阻害剤は、侵襲性歯周炎、細菌性膣炎、心内膜炎、放線菌症又は関節リウマチ等のアグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンスに関連する障害の治療に特に有用である。好ましくは、そのような抗体は、標的受容体又は細胞、特にｇＣ１ｑＲへのタンパク質の結合を阻害する。
【０１００】
特定の実施形態では、阻害剤は、配列番号４１を含むタンパク質又はペプチドに結合する抗体又はその変異体である。そのような阻害剤は、慢性皮膚、軟組織及び骨感染症等のポルフィロモナス・ソメラエに関連する障害の治療に特に有用である。好ましくは、そのような抗体は、標的受容体又は細胞、特にｇＣ１ｑＲへのタンパク質の結合を阻害する。
【０１０１】
特定の実施形態では、阻害剤は、配列番号４２を含むタンパク質又はペプチドに結合する抗体又はその変異体である。そのような阻害剤は、心内膜炎、脳膿瘍、化膿性脊椎炎及び菌血症等のアグリゲイティバクター・アフロフィルスに関連する障害の治療に特に有用である。好ましくは、そのような抗体は、標的受容体又は細胞、特にｇＣ１ｑＲへのタンパク質の結合を阻害する。
【０１０２】
特定の実施形態では、阻害剤は、配列番号３又は４５を含む又はそれからなるタンパク質又はペプチドに結合する抗体又はその変異体である。そのような阻害剤は、ＨＩＶ感染症の治療に特に有用である。好ましくは、そのような抗体は、標的受容体又は細胞、特にｇＣ１ｑＲへのタンパク質の結合を阻害する。
【０１０３】
特定の実施形態では、阻害剤は、配列番号４３を含む又はそれからなるタンパク質又はペプチドに結合する抗体又はその変異体である。そのような阻害剤は、ＨＣＶ感染症を治療するのに特に有用である。好ましくは、そのような抗体は、標的受容体又は細胞、特にｇＣ１ｑＲへのタンパク質の結合を阻害する。
【０１０４】
特定の実施形態では、阻害剤は、配列番号５１を含む又はそれからなるタンパク質又はペプチドに結合する抗体又はその変異体である。そのような阻害剤は、ＥＢＶ感染症の治療に特に有用である。好ましくは、そのような抗体は、標的受容体又は細胞、特にｇＣ１ｑＲへのタンパク質の結合を阻害する。
【０１０５】
特定の実施形態では、阻害剤は、配列番号４６を含む又はそれからなるタンパク質又はペプチドに結合する抗体又はその変異体である。そのような阻害剤は、アデノウイルス感染症の治療に特に有用である。好ましくは、そのような抗体は、標的受容体又は細胞、特にｇＣ１ｑＲへのタンパク質の結合を阻害する。
【０１０６】
特定の実施形態では、阻害剤は、配列番号４７を含む又はそれからなるタンパク質又はペプチドに結合する抗体又はその変異体である。そのような阻害剤は、ＨＴＮＶ感染症の治療に特に有用である。好ましくは、そのような抗体は、標的受容体又は細胞、特にｇＣ１ｑＲへのタンパク質の結合を阻害する。
【０１０７】
特定の実施形態では、阻害剤は、配列番号４８を含む又はそれからなるタンパク質又はペプチドに結合する抗体又はその変異体である。そのような阻害剤は、ＨＳＶ感染症の治療に特に有用である。好ましくは、そのような抗体は、標的受容体又は細胞、特にｇＣ１ｑＲへのタンパク質の結合を阻害する。
【０１０８】
特定の実施形態では、阻害剤は、配列番号４９又は５０を含む又はそれからなるタンパク質又はペプチドに結合する抗体又はその変異体である。そのような阻害剤は、風疹ウイルス感染症の治療に特に有用である。好ましくは、そのような抗体は、標的受容体又は細胞、特にｇＣ１ｑＲへのタンパク質の結合を阻害する。
【０１０９】
特定の実施形態では、阻害剤は、配列番号４４を含む又はそれからなるタンパク質又はペプチドに結合する抗体又はその変異体である。そのような阻害剤は、黄色ブドウ球菌感染症の治療に特に有用である。好ましくは、そのような抗体は、標的受容体又は細胞、特にｇＣ１ｑＲへのタンパク質の結合を阻害する。
【０１１０】
特定の実施形態では、阻害剤は、配列番号５２を含む又はそれからなるタンパク質又はペプチドに結合する抗体又はその変異体である。そのような阻害剤は、リステリア・モノサイトゲネス感染症の治療に特に有用である。好ましくは、そのような抗体は、標的受容体又は細胞、特にｇＣ１ｑＲへのタンパク質の結合を阻害する。
【０１１１】
特定の実施形態では、阻害剤は、配列番号５３を含む又はそれからなるタンパク質又はペプチドに結合する抗体又はその変異体である。そのような阻害剤は、肺炎球菌感染症の治療に特に有用である。好ましくは、そのような抗体は、標的受容体又は細胞、特にｇＣ１ｑＲへのタンパク質の結合を阻害する。
【０１１２】
特定の実施形態では、阻害剤は、配列番号５４を含む又はそれからなるタンパク質又はペプチドに結合する抗体又はその変異体である。そのような阻害剤は、セレウス菌感染症の治療に特に有用である。好ましくは、そのような抗体は、標的受容体又は細胞、特にｇＣ１ｑＲへのタンパク質の結合を阻害する。
【０１１３】
特定の実施形態では、阻害剤は、配列番号５５を含む又はそれからなるタンパク質又はペプチドに結合する抗体又はその変異体である。そのような阻害剤は、熱帯熱マラリア原虫感染症の治療に特に有用である。好ましくは、そのような抗体は、標的受容体又は細胞、特にｇＣ１ｑＲへのタンパク質の結合を阻害する。
【０１１４】
（阻害性核酸）
代替的実施形態では、補因子阻害剤は阻害性核酸である。好ましい阻害性核酸は、補因子、ｇＣ１ｑＲ、又はｇＣ１ｑＲのパートナーに結合してその機能を阻害するように設計されたアプタマーを含む。
【０１１５】
他の核酸は、上記で定義された抗体をコードする核酸である。
【０１１６】
（ペプチド）
代替的実施形態では、補因子阻害剤は、補因子の機能を阻害するペプチドである。ペプチドは、通常、補因子、ｇＣ１ｑＲ又はｇＣ１ｑＲのパートナーを選択的に結合する分子である。
【０１１７】
ペプチドは、好ましくは４〜３０個のアミノ酸残基を含んでおり、それらの配列はｇＣ１ｑＲのドメイン又は補因子（餌ペプチド）のドメインと同一であってもよく、又はそれらの配列はｇＣ１ｑＲのドメイン又は補因子（ペプチドアンタゴニスト）のドメインの配列と比較して変動を含んでもよい。
【０１１８】
本発明の好ましいペプチドは、配列番号２（ｇＣ１ｑＲ）又は配列番号３〜７１のいずれかから選択される補因子の４〜３０個の連続したアミノ酸残基を含み、少なくとも１つの修飾を含んでもよい。
【０１１９】
修飾は、アミノ酸置換からなっていてもよい。そのような置換の例は、アラニン等のより中性の残基による荷電又は反応性アミノ酸残基の置換、又はその逆を含むが、限定はされない。修飾はまた（又はさらに）、ペプチドの一端（又は両端）又はその側鎖、又はペプチド結合への化学基の付加等の化学修飾からなっていてもよい。これに関して、本発明のペプチドは、ペプチド、非ペプチド及び／又は修飾ペプチド結合を含み得る。特定の実施形態では、ペプチドは、メチレン（−ＣＨ２−）又はリン酸（−ＰＯ２−）基、第二級アミン（−ＮＨ−）又は酸素（−Ｏ−）、アルファ−アザペプチド、アルファ−アルキルペプチド、Ｎ−アルキルペプチド、ホスホナミデート、デプシペプチド、ヒドロキシメチレン、ヒドロキシエチレン、ジヒドロキシエチレン、ヒドロキシエチルアミン、レトロ−インベルソペプチド、メチレンオキシ、セトメチレン、エステル、ホスフィン酸塩、ホスフィン酸、又はホスホンアミドのインターカレーションから選択される少なくとも１つのペプチド模倣結合を含む。また、ペプチドは、例えばアシル化及び／又はアミド化及び／又はエステル化によって、保護されたＮ−ｔｅｒ及び／又はＣ−ｔｅｒ機能を含んでもよい。
【０１２０】
このようなペプチドの例としては、例えば、配列番号２（ｇＣ１ｑＲ）のアミノ酸残基１４４〜１６２を備えたペプチド、及び配列番号２（ｇＣ１ｑＲ）のアミノ酸残基２０４〜２１８を含む。
【０１２１】
本発明のこのようなペプチドのさらなる例としては、１つのアミノ酸置換、より好ましくはアラニンで置換されたＷ、Ｉ又はＫから選択される少なくとも１つのアミノ酸を備えた、配列番号７、８、１４、１８、２８〜３０、３３、３８、４１又は４２のいずれかの配列を含むペプチドを含む。
【０１２２】
本発明のこのようなペプチドのさらなる例としては、中心のアミノ酸が１つ削除された、配列番号７、８、１４、１８、２８〜３０、３３、３８、４１又は４２のいずれかの配列を含むペプチドを含む。
【０１２３】
本発明のペプチドのさらなる例としては、Ｅ３Ａ、Ｗ６Ａ、Ｓ１０Ａ、Ｉ１４Ａ（明確にするために、Ｅ３Ａは３番目のアミノ酸Ｅがアミノ酸Ａで置換されていることを意味する）の修飾のうち少なくとも１つを備えた、配列番号８のアミノ酸配列を含むペプチドを含む。
【０１２４】
本発明のペプチドのさらなる例としては、Ｓ１Ａ、Ｋ４Ａ、Ｗ６Ａ、Ｓ１０Ａ、Ｉ１４Ａ（明確にするために、Ｓ１Ａは１番目のアミノ酸Ｓがアミノ酸Ａで置換されていることを意味する）の修飾のうち少なくとも１つを備えた、配列番号７のアミノ酸配列を含むペプチドを含む。
【０１２５】
本発明のペプチドは、化学的、生物学的及び／又は遺伝子的合成等の当該技術分野で既知の技術によって産生されてもよい。
【０１２６】
これらのペプチドはそれぞれ、単離された形態で、本発明の特定の目的を表す。本明細書で用いられる「単離された」という用語は、それらの自然環境の成分から除去され、単離又は分離され、それらが自然に関連する他の成分を少なくとも６０％、好ましくは７５％、最も好ましくは９０％含まない分子（例えば、核酸又はアミノ酸）に関する。「単離された」ポリペプチド（又はタンパク質）は、例えば、その自然環境の成分から分離され、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィ（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）移動等によって測定されるときに好ましくは９０％又は９５％以上の純度に精製されたポリペプチドである。「単離された」核酸は、その自然環境の成分から分離されるか、及び／又は異なる構築物（例えば、ベクター、発現カセット、組換え宿主等）において構築される核酸分子に関する。
【０１２７】
（低分子薬剤）
他の阻害剤は、ｇＣ１ｑＲ又は補因子に選択的に結合する炭化水素化合物等の低分子薬剤阻害剤である。
【０１２８】
低分子薬剤は、好ましくは（ｉ）ｇＣ１ｑＲを発現する細胞と試験化合物を接触させることと、（ｉｉ）ｇＣ１ｑＲに結合する試験化合物を選択することと、（ｉｉｉ）ｇＣ１ｑＲの活性を阻害する（ｉｉ）の化合物を選択することとを含む方法によって得ることができる。そのような方法は、本発明の特定の目的を示す。
【０１２９】
（ｇＣ１ｑＲ可溶性受容体）
代替的実施形態では、補因子阻害剤はｇＣ１ｑＲの可溶型である。
【０１３０】
（細胞増殖抑制剤又は細胞毒性剤）
別の実施形態では、モジュレータは、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子に対する、又は原核細胞若しくは真核細胞若しくはＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子を発現させるウイルスに対する細胞増殖抑制剤又は細胞毒性剤である。
【０１３１】
補因子が細菌である、又はその一部である、又はそれによって製造される場合、阻害剤は該細菌に対する抗生物質であってもよい。細菌の死滅によって、補因子の生成が回避される。抗生物質は、任意の広域抗生物質、又は標的とする細菌に対して特定のスペクトルを備えた抗生物質であってもよい。抗生物質の例としては、アモキシシリン、クラリスロマイシン、セフロキシム、セファレキシンシプロフロキサシン、クリンダマイシン、ドキシサイクリン、メトロニダゾール、テルビナフィン、レボフロキサシン、ニトロフラントイン、テトラサイクリン、ペニシリン及びアジスロマイシンを含むが、これらに限定はされない。
【０１３２】
補因子が真核細胞である、又はその一部である、又はそれによって製造される場合、阻害剤は該細胞に対する細胞毒性剤であってもよい。細胞の死滅によって、補因子の生成が回避される。
【０１３３】
補因子が真菌類である、又はその一部である、又はそれによって製造される場合、阻害剤は該真菌類に対する抗真菌剤であってもよい。真菌類の死滅によって、補因子の生成が回避される。抗真菌剤の例としては、クロトリマゾール、ブテナフィン、ブトコナゾール、シクロピロクス、クリオキノール、エコナゾール、フルコナゾール、フルシトシン、グリセオフルビン、ハロプロジン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、ナフチフィン、ナイスタチン、オキシコナゾール、スルコナゾール、テルビナフィン、テルコナゾール、チオコナゾール及びトルナフテートを含むが、これらに限定はされない。
【０１３４】
補因子がウイルスである、又はその一部である、又はそれによって産生される場合、阻害剤は該ウイルスに対する細胞毒性剤又は抗ウイルス剤であってもよい。ウイルスの死滅によって、補因子の生成が回避される。抗ウイルス剤の例としては、ジドブジン、ジダノシン、ザルシタビン、スタブジン、ラミブジン、アバカビル、テノホビル、ネビラピン、デラビルジン、エファビレンツ、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル及びロピナビルを含むが、これらに限定はされない。
【０１３５】
別の実施形態では、補因子のモジュレータは、マイクロバイオームのモジュレータである。マイクロバイオームの組成／多様性の調節は、補因子の生成を低減、調節又は増加させるために使用され得る。
【０１３６】
（免疫原）
代替的（又は累積的）実施形態では、対象における補因子の阻害は、補因子の免疫原を使用する（例えば、対象にワクチン接種又は免疫する）ことによって得られる。その結果、対象は補因子を阻害する抗体（又は細胞）を産生する。特に、補因子免疫原（例えば、補因子の任意の免疫原性部分）を投与することで、治療された対象に抗体を生成し得る。これらの抗体は、免疫療法又はワクチン予防として補因子効果を阻害するであろう。
【０１３７】
したがって、本発明の目的はＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子の免疫原を対象に投与することを含む、該対象にワクチン接種する方法にある。
【０１３８】
本発明のさらなる目的は、ワクチン接種を必要とする対象にワクチン接種するために使用するＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子の免疫原に関する。
【０１３９】
特定の実施形態では、ワクチン接種に使用されるＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子抗原の免疫原は、対象の補因子に対する免疫応答を誘発する不活性化免疫原性分子である。不活性化は、例えば、補因子を化学的又は物理的に改変することによって、又はタンパク質を変異又は切断することによって、又はその両方によって得られてもよい。免疫原性は、不活性化の結果として及び／又はタンパク質を適切な担体又はハプテン、例えばＫＬＨ、ＨＳＡ、ポリリジン、ウイルスアナトキシン又はそれに類するものにさらにコンジュゲートすることによって、及び／又は重合又はそれに類するものによって得られてもよい。したがって、免疫原は、例えばその免疫原性を向上させるために、化学的又は物理的に修飾されてもよい。
【０１４０】
好ましい実施形態では、本発明のＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子の免疫原は、全ての補因子を含む。
【０１４１】
代替的実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子の免疫原は、少なくとも６個の連続したアミノ酸残基を含み、免疫原性エピトープを含む補因子の断片を含む。好ましい実施形態では、免疫原は少なくとも６〜２０個のアミノ酸残基を含む。本発明の好ましい免疫原は、配列番号２〜４４及び配列番号４５〜７１（又は天然変異体に対応する配列）のいずれかから選択されるタンパク質の４〜３０個の連続したアミノ酸残基を含む又はそれらからなる。
【０１４２】
免疫原は、遊離形態である、重合化される、化学的又は物理的に修飾されるか、及び／又は担体分子とカップリングされる（すなわち連結）等、様々な形態であってもよい。担体とのカップリングは、免疫原性を高め、（さらに）免疫原の生物活性を抑制してもよい。これに関して、担体分子は、免疫学において従来から用いられる任意の担体分子又はタンパク質であってよく、例えば、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）、オボアルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイドＢコレラ毒素、ジフテリア毒素ＣＲＭ１９７等のウイルス若しくは細菌アナトキシン、それらの変異体、外膜小胞タンパク質、ポリリジン分子又はウイルス様粒子（ＶＬＰ）であってもよい。好ましい実施形態では、担体はＫＬＨ、ＣＲＭ１９７又はＶＬＰである。
【０１４３】
免疫原の担体へのカップリングは、例えばグルタルアルデヒド、ビオチン等の連結化学基又は反応を用いて共有結合化学によって行われてもよい。好ましくは、複合体又は免疫原は、補因子を完全に不活性化させるためにホルムアルデヒドで処理される。
【０１４４】
免疫原の免疫原性は、ヒト免疫細胞を移植された非ヒト動物の免疫化、それに続く抗体の存在の検証、又はヒト若しくはヒト化抗体を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡ等の様々な方法によって試験されてもよい。生物活性の欠如は、本願に記載されている任意の活性試験によって検証されてもよい。
【０１４５】
特定の実施形態では、本発明は不活性化された免疫原性ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子に関する。
【０１４６】
さらなる特定の実施形態では、本発明は担体分子、好ましくはＫＬＨにコンジュゲートされるＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子タンパク質又はその断片に関する。
【０１４７】
さらなる様態において、本発明はＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子の免疫原、適切な賦形剤及び任意で適切なアジュバントを含むワクチンに関する。
【０１４８】
本発明のさらなる目的は、それを必要とする対象においてＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子の活性を中和する抗体の産生を誘発する方法に関することであって、この方法は、上記で定義された免疫原又はワクチンの有効量を該対象に投与することを含む。
【０１４９】
本発明の免疫原又はワクチンの投与は、注射等による任意の適切な経路によってであってもよく、好ましくは筋肉内、皮下、経皮、静脈内又は動脈内、経鼻、経口、粘膜又は直腸投与等である。
【０１５０】
（活性剤、アゴニスト及びミモトープ）
本発明の文脈内で、補因子「アゴニスト」という用語は、ＰＬＡ２−ＧＩＢに対してＣＤ４Ｔ細胞を感作する能力等の補因子の活性を有する任意の物質を包含する。補因子のアゴニストは、ｇＣ１ｑＲのアゴニストを含んでもよい。アゴニストの例は、補因子自体である。
【０１５１】
本発明の文脈内で、補因子の「活性剤」という用語は、補因子の発現又は活性を媒介又は上方制御する任意の物質、例えば、ペプチド、ポリペプチド、組換えタンパク質、コンジュゲート、天然又は人工のリガンド、分解生成物、ホモログ、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー等又はそれらの組み合わせを指すが、これらに限定はされない。
【０１５２】
ミモトープは、補因子の活性を再現し得る任意の合成分子を含む。
【０１５３】
補因子の活性剤は、マイクロバイオームのモジュレータでもあり得る。マイクロバイオームの組成／多様性の調節を用いて、補因子の生成を増加させ得る。
【０１５４】
これに関して、本発明はまた、マイクロバイオーム中のＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子の存在、非存在又は活性を検出又は測定することを含む、マイクロバイオームを分析する方法を提供する。この方法は、マイクロバイオームを監視するために、又は治療の有効性若しくは疾患の進行を決定するために使用されてもよい。
【０１５５】
特定の実施形態では、本発明は、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子、例えば補因子自体、又は補因子をコードする核酸のアゴニスト又は活性剤又はミモトープを対象に投与することを含む、該対象における免疫応答を阻害する方法に関する。
【０１５６】
（組成及び治療方法）
本発明はまた、上記で定義された補因子又はモジュレータ、好ましくは薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤又は担体を含む組成物に関する。
【０１５７】
「医薬組成物」とは、本発明の化合物の製剤（活性成分）及び生物活性化合物を対象に送達するために当該技術分野において通常許容される媒体に関する。そのような担体には、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、媒体又は支持体がすべて含まれる。従来からの医薬実務は、適切な製剤又は組成物を対象に提供するために、例えば単位剤形において用いられてもよい。
【０１５８】
本発明に係る化合物又は組成物は、軟膏、ゲル、ペースト、液体溶液、懸濁液、錠剤、ゼラチンカプセル、カプセル、坐剤、粉末、点鼻薬、又はエアロゾルの形態、好ましくは注射可能な溶液又は懸濁液の形態であってもよい。注射の場合、化合物は、一般に、液体懸濁液の形態で包装されており、例えば、シリンジ又は灌流を介して注射されてもよい。この点に関し、化合物は、一般に、薬学的使用と互換性がありかつ当業者に既知である、生理食塩水、生理溶液、等張液又は緩衝液に溶解される。したがって、組成物は、分散剤、可溶化剤、安定剤及び防腐剤等から選択される１つ以上の薬剤又は賦形剤を含んでいてもよい。液体及び／又は注射可能な製剤に使用され得る薬剤又は賦形剤は、特にメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリソルベート８０、マンニトール、ゼラチン、ラクトース、植物油、アカシア等である。担体はまた、例えばメチル−β−シクロデキストリン、アクリル酸のポリマー（カーボポール等）、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールの混合物、モノエタノールアミン及びヒドロキシメチルセルロースから選択され得る。
【０１５９】
組成物は一般に、本発明の化合物の有効量、例えば、ＣＤ４Ｔ細胞に対するＰＬＡ２−ＧＩＢの効果を直接的又は間接的に調節するのに効果的な量を含む。阻害剤は、通常ＰＬＡ２−ＧＩＢによる不活性化に対するＣＤ４Ｔ細胞の耐性を維持／回復するのに効果的な量で使用される。一般に、本発明に係る組成物は、約１μｇ〜１０００ｍｇの補因子又はモジュレータを含み、これは０．００１〜０．０１、０．０１〜０．１、０．０５〜１００、０．０５〜１０、０．０５〜５、０．０５〜１、０．１〜１００、０．１〜１．０、０．１〜５、１．０〜１０、５〜１０、１０〜２０、２０〜５０及び５０〜１００ｍｇ等であり、例えば０．０５〜１００ｍｇ、好ましくは０．０５〜５ｍｇ、例えば０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４又は５ｍｇである。用量は、薬剤及び疾患に応じて当業者により調整されてもよい。
【０１６０】
本発明の組成物は、別々に、同時に又は連続して使用するために、１つ以上の追加の活性化合物をさらに含み得る。追加の活性化合物の例としては、化学療法剤、抗生物質、抗寄生虫剤、抗真菌剤又は抗ウイルス剤を含むが、これらに限定はされない。
【０１６１】
特定の実施形態では、阻害剤は化学療法又はホルモン療法と組み合わせて使用される。
【０１６２】
別の特定の実施形態では、阻害剤は、放射線療法、超音波療法又はナノ粒子療法と組み合わせて使用される。
【０１６３】
別の特定の実施形態では、阻害剤は、チェックポイント阻害剤、免疫療法又は抗癌ワクチンと組み合わせて使用される。
【０１６４】
別の特定の実施形態では、阻害剤は、ＰＬＡ２−ＧＩＢのモジュレータと組み合わせて使用される。
【０１６５】
ＰＬＡ２−ＧＩＢモジュレータの例としては、例えば国際公開第２０１５／０９７１４０号、第２０１７／０３７０４１号又は第２０１７／０６０４０５号に開示されており、それらは参照により本明細書に組み入れられる。特定の実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢモジュレータは、ＰＬＡ２−ＧＩＢに対する抗体、特にＰＬＡ２−ＧＩＢに対するモノクローナル抗体、又はＳｃＦｖ、ナノボディ、Ｆａｂ、二重特異性抗体等の誘導体又は断片である。抗体、誘導体又は断片は、ヒト又はヒト化であってもよい。
【０１６６】
特定の実施形態において、本発明の方法又は組成物は、（ｉ）ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子の阻害剤と、（ｉｉ）ＰＬＡ２−ＧＩＢに対する抗体（又はその誘導体若しくは断片）との組み合わせを使用する。さらなる特定の実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子の阻害剤は、補因子に対する抗体、抗生物質、抗真菌剤又は抗ウイルス剤である。
【０１６７】
別の特定の実施形態では、本発明の方法及び組成物は、（ｉ）ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子の阻害剤と、（ｉｉ）ＰＬＡ２−ＧＩＢのインドール系阻害剤（例えば、３−（２−アミノ−１，２−ジオキソエチル）−２−エチル−１−（フェニルメチル）−１Ｈ−インドール−４−イル）オキシ）酢酸又はそのナトリウム塩（バレスプラジブ）等）の薬学的に許容可能な塩、水和物、又はプロドラッグ等との組み合わせを使用する。さらなる特定の実施形態では、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子の阻害剤は、補因子に対する抗体、抗生物質、抗真菌剤又は抗ウイルス剤である。
【０１６８】
別の特定の実施形態では、本発明の方法及び組成物は、（ｉ）ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子の阻害剤と、（ｉｉ）ＰＬＡ２−ＧＩＢのペンタペプチド阻害剤（例えば、ＦＬＳＹＫ、ＦＬＳＹＲ及び（２ＮａｐＡ）ＬＳ（２ＮａｐＡ）Ｒから選択される環状ペプチド）との組み合わせを使用する。さらなる特定の実施形態ではＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子の阻害剤は、補因子に対する抗体、抗生物質、抗真菌剤又は抗ウイルス剤である。
【０１６９】
本発明はまた、上述のような補因子又はモジュレータと薬学的に許容可能な希釈剤又は賦形剤とを混合すること、及び組成物を任意の適切な形態又は容器（シリンジ、アンプル、フラスコ、ボトル及びパウチ等）に処方することを含む、医薬組成物を調製する方法に関する。
【０１７０】
本発明はまた、（ｉ）上述のような補因子又はモジュレータを含む組成物と、（ｉｉ）少なくとも１つの容器と、任意で（ｉｉｉ）キットの使用説明書とを含むキットに関する。
【０１７１】
本発明の化合物及び組成物は、感染症や不適切な（例えば、欠陥がある又は不適当な）免疫応答、特に不適切なＣＤ４Ｔ細胞活性に関連する疾患等の様々な疾患、及び向上した免疫性が対象状態を改善する可能性がある疾患を治療するために使用されてもよい。これらの疾患は、本願において「免疫性障害」と呼ばれることもある。これには、（例えば、ウイルス感染、病原性感染及び癌等によって引き起こされる）免疫不全の状態、自己免疫疾患、移植片、糖尿病、炎症性疾患、癌、アレルギー、喘息、乾癬、じんま疹、湿疹及びそれに類するもの等が含まれる。
【０１７２】
特定の実施形態では、本発明は、補因子阻害剤又は免疫原を、免疫応答の刺激を必要とする対象に投与することを含む、該対象の免疫応答を刺激するための方法に関する。
【０１７３】
別の特定の実施形態では、本発明は、補助因子阻害剤又は免疫原を、免疫不全又は関連障害の治療を必要とする対象に好ましくはＰＬＡ２−ＧＩＢによる不活性化に対するＣＤ４Ｔ細胞の耐性を維持／回復するのに効果的な量で投与することを含む、該対象の免疫不全又は関連障害を治療する方法に関する。
【０１７４】
免疫不全及び関連障害は、対象における免疫機能又は免疫応答の低下を特徴とする、及び／又はそれによって引き起こされる任意の状態又は病態を指す。免疫不全は、例えば、ウイルス性感染（例えば、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎等）、細菌感染、癌、又は他の病的状態によって引き起こされてもよい。したがって、「免疫不全関連障害」という用語は、免疫不全によって引き起こされる、又はそれに関連する任意の疾患を指す。本発明は、ＣＤ４Ｔ細胞に関連する免疫不全及び関連疾患の治療に特に適している。
【０１７５】
本発明は特に、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子を阻害する化合物を対象に投与することを含む、該対象の癌を治療する方法に関する。本発明者らは、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子が、癌を有する患者の血漿中に存在し、ＰＬＡ２−ＧＩＢとともに免疫細胞の不活性化を誘発することを示した。
【０１７６】
特定の実施形態では、本発明はＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子を阻害する化合物を、癌又は腫瘍の治療を必要とする対象に投与することを含む、該対象の癌又は腫瘍を治療する方法に関する。
【０１７７】
本発明はまた、癌又は腫瘍の治療をするためにその治療を必要とする対象に使用するＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子を阻害する化合物に関する。
【０１７８】
特定の実施形態では、本発明の方法は、腫瘍又は癌等のリスクがある対象における癌の予防又は癌発生率の低減のためのものである。これに関して、本発明は、癌の危険因子を治療するために使用され、それによって癌の発生リスク／発生率を回避又は低減する。そのような危険因子としては、口炎、胃炎、及び／又は腸炎及び膵炎等の感染症を含むが、これらに限定はされない。
【０１７９】
本発明はまた、癌の予防又は癌発生率低下のためにそれを必要とする対象に使用するＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子を阻害する化合物に関する。
【０１８０】
別の特定の実施形態では、本発明の方法は、癌を有する対象における癌の進行度を低下させるためのものである。
【０１８１】
別の特定の実施形態では、本発明は、癌を有する対象における癌の進行度を低下させるために使用する、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子を阻害する化合物に関する。
【０１８２】
別の特定の実施形態では、本発明の方法は、癌を有する対象における癌転移を低減、予防又は治療するため、又は癌細胞を死滅させるためのものである。
【０１８３】
別の特定の実施形態では、本発明は、癌を有する対象における癌転移を低減、予防又は治療するため、又は癌細胞を死滅させるために使用する、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子を阻害する化合物に関する。
【０１８４】
本発明は、任意の癌を治療するために使用されてもよい。
【０１８５】
特定の実施形態では、癌は固形癌である。
【０１８６】
特定の実施形態では、方法は、癌を有しＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子を発現させる対象を治療するために使用される。好ましい実施形態では、方法は、対象の癌を治療するために使用され、該対象にはＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子、原核細胞、真核細胞又はＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子を発現させるウイルスが存在する。
【０１８７】
別の特定の実施形態では、方法は、癌を有する患者を治療するために使用され、癌微小環境又は血液中にＰＬＡ２−ＧＩＢ又はＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子が存在する。
【０１８８】
本発明はまた、ＰＬＡ２−ＧＩＢ関連のＣＤ４Ｔ細胞欠損症を有する患者の癌又は腫瘍を治療するのに適している。
【０１８９】
本発明は、任意の発達のステージで癌を治療するのに使用されてもよい。これに関し、固形癌の多くは４つのステージによって発達する。ステージＩは通常、近くの組織に深く成長していない小さな癌又は腫瘍である。また、リンパ節や体の他の部分にも広がっていない。早期癌と呼ばれる場合もある。ステージＩＩ及びステージＩＩＩは、一般により大きな癌又は腫瘍が近くの組織により深く成長していることを示す。また、リンパ節に広がっていても、体の他の部分には広がっていない場合もある。ステージＩＶは、癌が他の臓器や体の一部に転移していることを意味する。また、進行癌又は転移癌とも呼ばれる。
【０１９０】
一部の癌にはステージ０の癌も含まれる。ステージ０の癌は、まだ始まった場所にあり、近くの組織に広がっていない。このステージの癌は、通常、腫瘍全体を手術で除去することにより、治癒の確率が高い。
【０１９１】
本発明は、ステージ０、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶでの腫瘍又は癌を治療するために使用されてもよい。
【０１９２】
本発明は、ステージ０、Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩでの癌転移を予防、低減又は治療するために使用されてもよい。
【０１９３】
本発明は、ステージ０、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶでの癌の進行度を低減させるために使用されてもよい。
【０１９４】
本発明は、膵臓癌、メラノ−マ、肺癌、食道癌、咽頭癌、網膜芽細胞腫、肝臓、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、胃癌、十二指腸癌、子宮癌、子宮頸癌、甲状腺癌、膀胱癌、前立腺癌、骨癌、脳癌又は大腸癌から選択される固形癌を治療するために特に使用されてもよい。
【０１９５】
特定の実施形態では、本発明の方法は、膵臓癌を治療するためのものである。膵臓癌は、膵臓のどの部分、すなわち消化物質が外分泌癌を引き起こす部分、インスリンや他のホルモンが内分泌癌を引き起こす部分が影響を受けるかに応じて分類される。膵臓癌にはいくつかの異なる種類があるが、９５％の症例が外分泌癌である膵管腺癌（ＰＤＡＣ）によるものである。
【０１９６】
ＰＤＡＣは、癌による主な死因の中で４番目である。ＰＤＡＣは、２０３０年までに米国で２番目に多い癌関連死因になると研究者に予測されている。発生率は３０年で２倍以上になり、現在は年間５％増加している。５年間の相対生存率は約５％で、ＰＤＡＣの治療には外科手術が最も効果的な選択肢である。診断アプローチの限られた利用可能性、及び診断患者のわずか１０％の生存率を伴う唯一の既存治癒の選択肢としての手術は、この疾患の恐ろしさを増加させる。病気の予後不良は、積極的な行動と現在利用可能な化学療法への耐性とともに、スクリーニングと早期発見に効果的なバイオマーカーがないことで説明され得る。
【０１９７】
本発明はＰＬＡ２−ＧＩＢ阻害剤が膵臓癌を治療するのに使用され得ることを示す。本発明は、膵臓癌の進行及び転移を予防する方法を指す。本発明は、任意の種類／ステージの膵臓癌、例えば膵管腺癌、神経内分泌腫瘍、膵管内乳頭粘液性腫瘍、粘液性嚢胞腫瘍及び重篤な嚢胞性腫瘍に使用されてもよい。本発明は、任意のステージでの膵管腺癌を治療するのに特に適している。
【０１９８】
本発明はまた、大腸癌、肺癌及び増殖の速い癌を治療するのに特に適している。大腸癌は、全ての性別で最も一般的な癌の一つである。全てのステージで、５年生存率は約５５％である（Ｂｏｓｓａｒｄ  Ｎ、２００７）。実際、フランス、日本、米国、ドイツ、イタリア、スペイン、イギリスでは、直腸癌の１８万人以上の新規症例が２０１０年に診断された。大腸癌は４つのステージに分類される。ステージＩは、最も進行度が遅く主に外科手術で管理され、ステージＩＩ及びＩＩＩは、患者が放射線化学療法（ＲＣＴ）を組み合わせて受け、ステージＩＶは非常に進行し転移している段階である。患者が局所的に進行した（ステージＩＩ又はＩＩＩ）大腸癌と診断された場合、患者は通常、外科的切除の前にＲＣＴで治療される。本発明は、ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶの大腸癌の治療に適している。本発明は、特にステージＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶの大腸癌の治療に適している。
【０１９９】
本発明はまた、胃腸や代謝の病態を誘発する癌の治療に適している。
【０２００】
本発明で使用するために、ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子阻害剤は、任意の適した経路によって投与されてもよい。好ましくは、投与は、例えば、筋肉、静脈、動脈内、皮下、腫瘍内等の全身若しくは非経口注射又は灌流等の注射によるものである。投与は、通常、繰り返されるか又は連続的である。特定の実施形態では、腫瘍又は体液中のＰＬＡ２−ＧＩＢ又はＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子のレベルは、治療レジメンを導くために治療過程中に測定される。
【０２０１】
ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子阻害剤は、単独で又はさらなる癌治療と組み合わせて使用されてもよい。
【０２０２】
特定の実施形態では、本発明は化学療法又はホルモン療法と組み合わせて、癌を有する対象にＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子を阻害する化合物を投与することを含む、癌を治療する方法に関する。
【０２０３】
別の特定の実施形態では、本発明は放射線療法、超音波療法又はナノ粒子療法と組み合わせて、癌を有する対象にＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子を阻害する化合物を投与することを含む、癌を治療する方法に関する。
【０２０４】
別の特定の実施形態では、本発明は、チェックポイント阻害剤、免疫療法又は抗癌ワクチンと組み合わせて、癌を有する対象にＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子を阻害する化合物を投与することを含む、癌を治療する方法に関する。
【０２０５】
別の特定の実施形態では、本発明はＰＬＡ２−ＧＩＢ阻害剤と組み合わせて、癌を有する対象にＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子を阻害する化合物を投与することを含む、癌を治療する方法に関するＰＬＡ２−ＧＩＢ阻害剤は、そのアンタゴニスト又はそのＰＬＡ２−ＧＩＢに対するワクチンであってもよい。
【０２０６】
「併用」療法では、活性剤は同時に、連続して、一緒に又は交互に使用されてもよい。各活性剤は、特定のスケジュ−ルに従って使用されてもよい。他の例では、すべての活性薬剤は、灌流等で一緒に処方及び／又は投与されてもよい。
【０２０７】
さらなる実施形態では、化合物は手術前、手術中又は手術後に投与される（腫瘍の切除又は除去）。
【０２０８】
本明細書では、「治療」又は「処置」という用語は、治療される個体の自然経過を変化させようとする臨床介入を指し、予防又は治癒のいずれかの目的で行われ得る。治療の望ましい効果は、疾患の発生又は再発の予防、症状の緩和、疾患の何らかの直接的又は間接的な病的な帰結の減少、転移の予防、疾患進行度の低下、疾患状態の改善又は緩和、及び緩解又は予後改善を含むが、これらに限定はされない。いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、疾患若しくは障害の発達を遅らせるために、又は疾患若しくは障害の進行を遅らせるために使用される。
【０２０９】
本発明の化合物又は組成物の投与の期間、用量及び頻度は、対象及び疾患に応じて適合されてもよい。治療は単独で、又は他の活性成分と組み合わせて同時に、別々に、又は連続して使用されてもよい。
【０２１０】
本発明の化合物又は組成物は、限定はされないが、例えば全身注射、筋肉、静脈、腹腔内、皮膚、皮下、真皮、経皮、髄腔内、眼球（例えば角膜の）若しくは直腸の経路、又は炎症部位における局所投与等の様々な方法及び経路で、好ましくは筋肉内注射又は静脈内注射で投与されてもよい。
【０２１１】
代表的なレジメンは、有効量の補因子又はモジュレータを、単回又は繰り返して１日又は数日、最長１年間で、１週間〜約６か月を含む期間に亘って投与することを含む。インビボで投与される本発明の医薬的化合物又は組成物の用量は、受容者（対象）の年齢、健康、性別及び体重、並行する治療の種類、必要であれば、治療の頻度並びに所望の医薬的効果の特性に応じているものと理解される。本明細書で提供される有効量の範囲は、限定を意図するものではなく、好ましい用量範囲を示している。しかしながら、最も好ましい用量は、当業者に理解されて決定できる個々の対象に適合される。（例えば、Ｂｅｒｋｏｗｅｔら編、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ、１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｒａｈｗａｙ、Ｎ．Ｊ．、１９９２年、Ｇｏｏｄｍａｎｅｔｎａ編、Ｇｏｏｄｍａｎ及びＣｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、ＰｅｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｅｌｍｓｆｏｒｄ，Ｎ．Ｙ．（２００１年）を参照）。
【０２１２】
（ウイルス性疾患）
本発明は、哺乳動物におけるウイルス性疾患又はウイルス性感染症を治療するのに使用されてもよい。
【０２１３】
本明細書で提供される方法で治療され得るウイルスの例としては、例えば、レトロウイルス科（例えば、ＨＩＶ（ＨＩＶ１及びＨＩＶ２等）、ＭＬＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型及び２型、ＸＭＲＶ及びコルチウイルス（ＣＴＦＶ又はバンナウイルス等））、トガウイルス科（例えば、アルファウイルス（ロスリバーウイルス、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、オニョンニョンウイルス、チクングニアウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス）又は風疹ウイルス）、フラビウイルス科（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス（西ナイルウイルス又は日本脳炎ウイルス等）、黄熱ウイルス）、コロナウイルス科（例えば、ＳＡＲＳウイルスやトロウイルス等のコロナウイルス）、ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルスや狂犬病ウイルス）、パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、センダイウイルス及びメタニューモウイルス）、オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）、ブニヤウイルス科（例えば、ハンタウイルス、ブニヤウイルス（ラクロスウイルス等）、フレボウイルス及びナイロウイルス）、ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）、ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型及びＨＳＶ−２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＨＨＶ−８、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７及び仮性狂犬病ウイルス）、フィロウイルス科（エボラウイルスやマールブルグウイルスを含むフィロウイルス）及びポックスウイルス科（天然痘ウイルス、ワクチニアウイルス、ポックスウイルス（天然痘ウイルス、サル痘ウイルス及び伝染性軟属腫ウイルス等）、ヤタボックスウイルス（タナポックス及びヤバポックス等））等のウイルスファミリーのメンバーであるエンベロープウイルスを含むが、これらに限定はされない。非エンベロープウイルスもまた、以下に示すファミリーのメンバー等、本明細書で提供される方法で治療され得る。カリシウイルス科（胃腸炎を引き起こす株等）、アレナウイルス科（ＬＣＭＶ、ラッサウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス等の出血熱ウイルス）、レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルス及びロタウイルス）、ビルナウイルス科、パルボウイルス科（ヒトボカウイルスアデノ随伴ウイルス等のパルボウイルス）、パピローマウイルス科（パピローマウイルス等）、パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）、アデノウイルス科（アデノウイルス）、ピコルナウイルス科（エンテロウイルス、腸内ウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、肝炎ウイルス、カルジオウイルス、アプトウイルス、エコーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、口蹄疫ウイルス及びライノウイルス）及びイリドウイルス科（アフリカ豚コレラウイルス等）。本明細書で提供される方法を用いて治療さ得る他のウイルスとしては、分類されていないウイルス（例えば、海綿状脳症の病因物質、Ｄ型肝炎の物質（Ｂ型肝炎ウイルスの欠陥のある付随体であると考えられる）、非Ａ型肝炎、非Ｂ型肝炎（例えばＣ型肝炎等）、カリシウイルス（ノロウイルス、ノーウォークウイルス及び関連ウイルス等）、ヘペウイルス属（Ｅ型肝炎、ＪＣ、ＢＫウイルス等）及びアストロウイルス）を含む。
【０２１４】
特定の実施形態では、本発明は、補因子阻害剤を、任意でｓＰＬＡ２−ＧＩＢ阻害剤と組み合わせて対象に投与することにより、対象のＨＩＶ感染症を治療する方法に関する。いくつかの実施形態では、対象は初期のＨＩＶ患者であり、本方法により患者がＨＩＶコントローラである可能性を増大する。いくつかの実施形態では、対象は抗レトロウイルス性治療後に低い免疫再構成を有する、及び／又は重篤な突発性のＣＤ４Ｔリンパ球減少（ＩＣＬ）を有する患者である。本発明はまた、ＨＩＶ感染対象においてｓＰＬＡ２−ＧＩＢ及び補因子を阻害することによって、好ましくはｓＰＬＡ２−ＧＩＢ阻害剤及び補因子阻害剤を該対象に投与することによって、該対象におけるＣＤ４Ｔ細胞活性を増加させる方法に関する。
【０２１５】
ＨＩＶ感染症を治療するために、好ましい補因子阻害剤は、（ｉ）抗体、その変異体又はｇＣ１ｑＲ若しくは配列番号３のポリペプチドに結合する核酸と、（ｉｉ）配列番号３の断片を含むペプチドとから選択される。
【０２１６】
別の特定の実施形態では、本発明は補因子阻害剤を、任意でｓＰＬＡ２−ＧＩＢ阻害剤と組み合わせて対象に投与することにより、該対象におけるＨＣＶ感染症を治療する方法に関する。
【０２１７】
ＨＣＶ感染症を治療するために、好ましい阻害剤は、（ｉ）抗体、その変異体又はｇＣ１ｑＲ若しくは配列番号４３のポリペプチドに結合する核酸と、（ｉｉ）配列番号４３の断片を含むペプチドとから選択される。
【０２１８】
（細菌／真菌病）
本明細書で提供される方法で治療され得る感染細菌の例としては、任意の種類のグラム陽性菌（レンサ球菌、ブドウ球菌、コリネバクテリウム、リステリア、バチルス及びクローストリジウム等）又はグラム陰性菌（ポルフィロモナス、サルモネラ菌、赤痢菌、腸内細菌、シュードモナス菌、モラクセラ菌、ヘリコバクター菌、ステノトロホモナス菌、酢酸菌、アルファプロテオバクテリア綱、大腸菌、淋菌、髄膜炎菌、モラクセラ・カタラーリス、インフルエンザ菌、肺炎桿菌、レジオネラ・ニューモフィラ、緑膿菌、プロテウス・ミラビリス、エンテロバクター・クロアカ及びセラチア菌等）を含むが、これらに限定はされない。感染細菌の例としては、ポルフィロモナス・ジンジバリス、ポルフィロモナス・ソメラエ、テリスポロバクター・グリコリカス、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス、アグリゲイティバクター・アフロフィラス、バクテロイデス・フラジリス、ヘリコバクター・ピロリ、ボレリア・ブルグドルフェリ、レジオネラ・ニューモフィラ、マイコバクテリウム属（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・カンサシイ、マイコバクテリウム・ゴードナエ等）、黄色ブドウ球菌、淋菌、髄膜炎菌、リステリア・モノサイトゲネス、化膿レンサ球菌(Ａ群レンサ菌）、ストレプトコッカス・アガラクティアエ（（Ｂ群レンサ菌）、レンサ球菌（ビリダンス群）、エンテロコッカス・フェカーリス、ストレプトコッカス・ボビス、レンサ球菌（嫌気性属）、肺炎レンサ球菌、病原性カンピロバクター属、エンテロコッカス属、インフルエンザ菌、炭疽菌、ジフテリア菌、コリネバクテリウム属、豚丹毒菌、ウェルシュ菌、破傷風菌、エンテロバクター・アエロゲネス、肺炎桿菌、パスツレラ・ムルトシダ、バクテロイデス属、フソバクテリウム・ヌクレアタム、ストレプトバチルス・モニリフォルミス、梅毒トレポネーマ、トレポネーマ・ペルテヌエ、レプトスピラ及びアクチノミセス・イスラエリイを含むが、これらに限定はされない。
【０２１９】
本明細書で提供される方法で治療され得る感染性真菌の例としては、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスレータム、コクシジオイデス・イミティス、ブラストミセス・デルマチチジス、クラミジア・トラコマチス、カンジダ・アルビカンス及びカンジダ・グラブラタを含むが、これらに限定はされない。
【０２２０】
特定の実施形態では、本発明は、補因子阻害剤又は免疫原を、任意でｓＰＬＡ２−ＧＩＢ阻害剤と組み合わせて対象に投与することにより、該対象におけるブドウ球菌感染症、特に黄色ブドウ球菌感染症を治療する方法に関する。
【０２２１】
対象のブドウ球菌感染症、特に黄色ブドウ球菌感染症を治療するために、好ましい阻害剤は、（ｉ）抗体、その変異体又はｇＣ１ｑＲ若しくは配列番号４４のポリペプチドに結合する核酸と、（ｉｉ）配列番号４４の断片を含むペプチドとから選択される。
【０２２２】
特定の実施形態では、本発明は、ｇＣ１ｑＲ阻害剤を、任意でｓＰＬＡ２−ＧＩＢ阻害剤と組み合わせて対象に投与することにより、該対象におけるリステリア感染症、特にリステリア・モノサイトゲネス感染症を治療する方法に関する。
【０２２３】
対象のリステリア感染症、特にリステリア・モノサイトゲネス感染症を治療するために、好ましい阻害剤は、（ｉ）抗体、その変異体又はｇＣ１ｑＲ若しくは配列番号５２のポリペプチドに結合する核酸と、（ｉｉ）配列番号５２の断片を含むペプチドとから選択される。
【０２２４】
特定の実施形態では、本発明は、補因子阻害剤を、任意でｓＰＬＡ２−ＧＩＢ阻害剤と組み合わせて対象に投与することにより、該対象におけるレンサ球菌感染症、特に肺炎レンサ球菌感染症を治療する方法に関する。
【０２２５】
対象のレンサ球菌感染症、特に肺炎レンサ球菌感染症を治療するために、好ましい阻害剤は、（ｉ）抗体、その変異体又はｇＣ１ｑＲ若しくは配列番号５３のポリペプチドに結合する核酸と、（ｉｉ）配列番号５３の断片を含むペプチドとから選択される。
【０２２６】
特定の実施形態では、本発明は、ｇＣ１ｑＲ阻害剤を、任意でｓＰＬＡ２−ＧＩＢ阻害剤と組み合わせて対象に投与することにより、該対象における細菌感染症、特にセレウス菌感染症を治療する方法に関する。
【０２２７】
対象の細菌感染症、特にセレウス菌感染症を治療するために、好ましい阻害剤は、（ｉ）抗体、その変異体又はｇＣ１ｑＲ若しくは配列番号５４のポリペプチドに結合する核酸と、（ｉｉ）配列番号５４の断片を含むペプチドとから選択される。
【０２２８】
（寄生虫症）
本明細書で提供される方法で治療され得る感染性寄生虫の例としては、熱帯熱マラリア原虫及びトキソプラズマを含むが、これらに限定はされない。
【０２２９】
特定の実施形態では、本発明は補因子阻害剤を、任意でｓＰＬＡ２−ＧＩＢ阻害剤と組み合わせて対象に投与することにより、該対象における熱帯熱マラリア原虫感染症を治療する方法に関する。
【０２３０】
対象の熱帯熱マラリア原虫感染症を治療するために、好ましい阻害剤は、（ｉ）抗体、その変異体又はｇＣ１ｑＲ若しくは配列番号５５のポリペプチドに結合する核酸と、（ｉｉ）配列番号５５の断片を含むペプチドとから選択される。
【０２３１】
（その他の障害）
本発明は、免疫系の改善を必要とする任意の哺乳動物における免疫系を改善するために使用されてもよい。例えば、薬物、毒素、汚染物質、殺虫剤等の医原性効果等の望ましくない効果を補正するのに適している。
【０２３２】
本発明は、任意の哺乳動物、特に任意のヒトに使用されてもよい。
【０２３３】
本発明のさらなる様態及び利点について、以下の実験の項で開示する。
【実施例】
【０２３４】
材料及び方法
（組換えタンパク質及びペプチド）
ヒトＰＬＡ２−ＧＩＢは、大腸菌（Ｇｅｒａｒｄ  Ｌａｍｂｅａｕ寄贈、純度＞９８％）又はＣＨＯ−Ｓ（純度＞９８％）で作製された。ＨＩＶ−１  ｇｐ４１  ＭＮ組換えタンパク質は、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｎｌｉｎｅs（ｇｐ４１  ＭＮ（５６５−７７１Ｄｅｌｔａ６４２−７２５），ＡＢＩＮ２１２９７０３，ｌｏｔ９３−４８２，純度＞９５％）から入手し、ＰＥＰ３ペプチドＮＨ２−ＰＷＮＡＳＷＳＮＫＳＬＤＤＩＷ−ＣＯＯＨ及び対照ペプチド（ＣＴＬ）ＮＨ２−ＰＷＮＡＴＷＴＱＲＴＬＤＤＩＷ−ＣＯＯＨは、Ｃｏｖａｌａｂ（純度＞９８％）から注文した。ＨＰ  Ｐｇペプチド８（配列番号８のペプチド）ＮＨ２−ＳＧＥＧＧＷＳＮＧＳＬＶＤＩＭ−ＣＯＯＨ及びスクランブルＰＥＰ３  ＮＨ２−ＷＮＷＤＳＫＩＬＳＤＰＡＷＮＳ−ＣＯＯＨペプチドは、Ｃｏｖａｌａｂ（純度＞９８％）から注文した。ヒト血清からの補体成分Ｃ１ｑは、Ｓｉｇｍａ社（Ｃ１７４０、純度＞９５％）から入手した。ＨＣＶコアタンパク質は、０．００２％ＳＤＳを含むＰＢＳ緩衝液中のＰｒｏｓｐｅｃ社（ＨＣＶ−０１１、純度＞９５％）から入手し、ＨＣＶコアタンパク質による効果の特異性は、ＰＢＳ  ＳＤＳ（０．００２％）の同様の希釈との比較によって評価された。黄色ブドウ球菌プロテインＡは、Ｓｉｇｍａ社（Ｐ６０３１）から入手した。
【０２３５】
（ｇＣ１ｑＲ  ＫＯ  ＪｕｒｋａｔＥ６．１Ｔ細胞の生成）
Ｃ１ＱＢＰを奪われたＪｕｒｋａｔ細胞の開発のためのグロ−バル戦略は、相同組換えを介したＣ１ＱＢＰ遺伝子の二対立遺伝子不活性化を可能にする標的ベクターの設計に基づいている。ＪｕｒｋａｔＥ６．１Ｔ細胞株（ＥＣＡＣＣ  ８８０４２８０３）と同系のヒトＣ１ＱＢＰ相同領域が使用されている。標的ベクターは、Ｇｅｎｅｗｉｚによって合成されてｐＵＣ５７−Ａｍｐベクターにクローン化される。ヒトＣ１ＱＢＰ遺伝子の３番目のエクソンは、ネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）選択カセットを導入することで標的とされ、これにより、Ｃ１ＱＢＰオープンリーディングフレームが中断される。ＮｅｏＲカセットは、ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ制限部位を用いてクローン化された。標的ベクターは、選択された制限酵素（ＡＰａＬ１、Ｄｒｄ１、Ｐｖｕ１、Ｐｖｕ２、ＢａｍＨ１／ＮｏｔＩ、Ｎｏｔ１／ＮｃｏＩ、ＮＥＢ）によるＤＮＡ制限消化切断及び対象領域の配列によって検証されている。Ｃ１ＱＢＰ  ｓｇＲＮＡ（１８２８−Ｃｒｉｓｐｒ＿１Ａ：ＣＡＣＣ−ＧＡＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＴＴＣＴＡＡＡＡ及び１８２８−Ｃｒｉｓｐｒ＿１Ｂ：ＡＡＡＣ−ＴＴＴＴＡＧＡＡＴＣＡＣＧＧＴＣＡＣＴＴＣ）に対応するＤＮＡプライマーをハイブリダイズし、ＢｂｓＩ制限部位（ＮＥＢ）を用いてｐＸ３３０プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ、４２２３０；Ｆｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ  ＭＩＴ）にクローン化した（Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｓｅ−Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＮＥＢ）。
【０２３６】
Ｊｕｒｋａｔ細胞（５×１０６）を１００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に再懸濁し、７μｇのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミド及び２．５μｇの標的ベクターを加えた。細胞をＮｅｐａ２１エレクトロポレータでエレクトロポレーションした。Ｇ４１８選択培地中で細胞を選択した後、Ｊｕｒｋａｔ細胞クローンをＰＣＲジェノタイピングによりプレスクリーニングした。Ｃ１ＱＢＰ遺伝子がノックアウトされた独立した細胞クローンが増幅され、ＰＣＲジェノタイピングと対象領域シークエンシングとによって検証された。Ｃ１ＱＢＰ遺伝子を欠く独立したＪｕｒｋａｔ細胞クローンの検証パイプラインは、ＰＣＲジェノタイピングで構成された。遺伝子編集されたＪｕｒｋａｔ細胞のゲノムＤＮＡは、プロテイナーゼＫ処理及びフェノール精製によって単離された。Ｃ１ＱＢＰ遺伝子の二対立遺伝子不活性化を備えた各細胞クローンは、ＰＣＲジェノタイピング及び対象領域シークエンシングによって確認された。ＰＣＲ増幅は、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＨｉＦｉ  Ｔａｑ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、５０℃で２分間、プライマー１８２８＿ＲＨ５＿Ｆ：ＴＡＣＴＡＣＡＧＣＣＣＴＴＧＴＴＣＴＴ及び１８２８＿ＲＨ３＿Ｒ：ＡＧＣＡＣＴＴＣＣＴＧＡＡＡＴＧＴＴで行った。プライマーは、Ｃ１ＱＢＰヒト遺伝子座で、相同な腕から設計される。野生型と変異型対立遺伝子は、同じＰＣＲ反応で区別される。野生型と変異型対立遺伝子は、それぞれ１１４６−ｂｐと２３６２−ｂｐの増幅産物を与える。このＰＣＲジェノタイピングプロトコルにより、Ｃ１ＱＢＰ遺伝子の両方の対立遺伝子がノックアウトされたホモ接合型Ｊｕｒｋａｔ細胞クローンの同定が可能になる。Ｊｕｒｋａｔ細胞株における遺伝子破壊は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いて達成された。Ｃ１ＱＢＰ遺伝子を欠く３つの独立したホモ接合型Ｊｕｒｋａｔ細胞クローンが得られ、ＰＣＲジェノタイピングと対象領域シークエンシングによって検証された。
【０２３７】
（Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６．１Ｔ細胞におけるｇＣ１ｑＲのイムノブロット検出）
ＷＴ及びｇＣ１ｑＲ  ＫＯ  Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６．１Ｔ細胞ライセート中のｇＣ１ｑＲタンパク質発現をウエスタンブロット分析した。細胞を哺乳動物のタンパク質抽出試薬（Ｍ−ＰＥＲ、１１８８４１１１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）緩衝液で溶解し、タンパク質含有量をＢＣＡタンパク質アッセイキットを用いて透明な上清（２３２２７、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量化した。ＷＴとｇＣ１ｑＲ  ＫＯ  Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６．１Ｔ細胞（４０μｇ）に等量の総タンパク質をロードしてミニプロティアンＴＧＸ  Ｓｔａｉｎ  Ｆｒｅｅゲル８〜１６％（４５６８１０４、ＢＩＯＲＡＤ）でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、さらに電気泳動転写した。そして、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ０．０５％  ＢＳＡ  ５％中のｇＣ１ｑＲ（１：５０で６０．１１  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、１：１０００で７４．５．２  Ａｂｃａｍ）又はβ−アクチン（ＡＣ−７４、１：２０００でＳｉｇｍａ）に対する特異的抗体を用いて室温で２時間、ＰＢＳ  ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ０．０５％  ＢＳＡ  ５％中のヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（１：２００００、３１４３０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて１時間、イムノブロッティングでプローブした。結合した抗体は、ＥＣＬイムノブロッティング検出システム（ＮＥＬ１０３００１ＥＡ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて検出された。
【０２３８】
（ｇＣ１ｑＲ−ペプチド結合アッセイ）
１００μｌのペプチドＰＥＰ３、スクランブルＰＥＰ３又はＣＴＬを１００μｇ／ｍｌの炭酸緩衝液ｐＨ９．６（１５ｍＭのＮａ２ＣＯ３及び３５ｍＭのＮａＨＣＯ３）で希釈し、Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ平底マイクロプレート（４４−２４０４−２１、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に４℃で一晩コーティングした。未結合のタンパク質を除去し、ウェルをＴＢＳＴ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０）で２回洗浄して、未反応の部位をＴＢＳＴ中の３００μｌの３％ＢＳＡでインキュベート（３０分、室温）してブロックした。洗浄後（ＴＢＳＴで２回）、マイクロタイタープレートに結合したペプチドを、０〜３μｇ／ｗｅｌｌの範囲の異なる量のＨｉｓタグｇＣ１ｑＲを用いて３回繰り返してインキュベートした（２時間、室温）。洗浄後（ＴＢＳＴで５回）、ＴＢＳＴ中の３％ＢＳＡ中の１００μｌの抗ＨｉｓタグＨＲＰ抗体（１：１０００；７１８４０−３、Ｍｅｒｃｋ）をウェルごとに添加し、室温で２時間インキュベートした。次に、マイクロプレートのウェルを洗浄し（ＴＢＳＴで５回）、１００μｌのＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ基質標準溶液（ＵＰ６６４７８１、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）をウェルごとに添加した。０．１６ＭのＨ２ＳＯ４溶液をウェルあたり１００μｌで反応を停止し、マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００  Ｐｒｏ）で４５０ｎＭのＯＤを測定した。
【０２３９】
（ウイルス血症患者及び健康なドナーの血漿のｇｐ４１免疫枯渇）
１ｍｌのウイルス血症患者の血漿又は健康なドナーの血漿を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブで１００μｇのヤギ抗ｇｐ４１ポリクローナル抗体（ＰＡ２１７１９、Ｆｉｓｈｅｒ）又は対照ヤギポリクローナル抗体（免疫前、ＡＢ１０８−Ｃ、Ｒ＆Ｄ）を用いてローター上で４℃にて一晩インキュベートした。次に、２００μｌのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ｂｅａｄｓ（１７−０６１８−０１、ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）をＰＢＳ  ＢＳＡ１％で３回洗浄し、ローター上で各サンプルを４℃にて３時間加えた。ビーズを除去するために、サンプルを最初に４℃にて４００ｘｇで２分間遠心分離し、上清を収集後、４℃にて１６，１００ｘｇで１５分間遠心分離した。対照ヤギポリクローナル抗体は、当初アジ化ナトリウムを含んでいたため、免疫枯渇に進む前に１０ｋＤａのＡｍｉｃｏｎでＰＢＳを用いて５回洗浄し、アジ化ナトリウムを除去した。
【０２４０】
（ＡＴ−２不活性化ＨＩＶ−１粒子）
ＨＩＶ粒子の構造的及び機能的完全性を維持するために、２，２−ジチオジピリジン（ＡＴ−２；４３７９１、Ｓｉｇｍａ）を用いてＨＩＶ−１  ＮＤＫ（Ｔ−ｔｒｏｐｉｃ）粒子上で不活性化し、ＲｏｓｓｉｏらによるＪ  Ｖｉｒｏｌ．１９９８に記載されているように、ＰＨＡ刺激ＰＢＭＣで調製した。２，２−ジチオジピリジン（アルドリチオール−２；ＡＴ−２）は、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）のヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質の必須ジンクフィンガーを共有結合で修飾する。３７℃の水浴中に１時間、ＨＩＶ−１粒子を３００μＭのＡＴ−２で２回不活性化し、その後氷上で２時間不活性化した。
【０２４１】
並行して、ＰＨＡ刺激ＰＢＭＣの上清をＨＩＶ−１  ＮＤＫ感染細胞の上清として処理し、モック対照（ＨＩＶ−１粒子なし）として機能させた。ＨＩＶ粒子の不活性化は、感染性アッセイで検出不能なＴＣＩＤ５０によって確認された。
【０２４２】
ＨＩＶ粒子濃度は、抗ＨＩＶ−１  ｇａｇ  ｐ２４  ＥＬＩＳＡアッセイ（ＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ｐ２４  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット、ＤＨＰ２４０、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｅ）によって決定された。ＨＩＶ−１粒子は、５０００、５００、５０及び５ｐｇのｐ２４／１０ｅ６細胞で使用された。５０００ｐｇのｐ２４／１０ｅ６細胞（１７５４ｐｇのｐ２４／３．５×１０ｅ５細胞）は、細胞では１粒子（多重感染度、ＭＯＩ  １）に相当する。
【０２４３】
（ヒトＣＤ４Ｔリンパ球の精製）
静脈血は、ＥＦＳ（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ  Ｆｒａｎｃａｉｓ  ｄｕ  Ｓａｎｇ、Ｃｅｎｔｅｒ  Ｎｅｃｋｅｒ−Ｃａｂａｎｅｌ、Ｐａｒｉｓ）を通じて健康なボランティアから得た。ＣＤ４Ｔ細胞は、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、１５０６２）を用いて、全血から精製された。このカクテルは、プロテインＡ又はプロテインＧセファロースを用いてアフィニティークロマトグラフィーによって、マウス腹水又はハイブリドーマ培養上清から精製された、マウス及びラットのモノクローナル抗体を含む。これらの抗体は、ヒト造血幹細胞の細胞表面抗原（ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂ、ＴＣＲγ／δ）と赤血球のグリコフォリンＡに対する二重特異性四量体抗体複合体に結合している。ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ抗体カクテルは、ヒト全血中の不要な細胞を複数の赤血球に架橋させ、免疫ロゼットを形成する。これにより、不要な細胞の密度が増加し、リンパ球分離培地（Ｅｕｒｏｂｉｏ、ＣＭＳＭＳＬ０１−０１）等の浮遊密度培地で遠心分離すると、遊離赤血球と一緒にペレット化する。
【０２４４】
全血を５０μｌ／ｍｌのＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｃｏｃｋｔａｉｌとともに室温で穏やかに振とうしながら（１００ｒｐｍ）２０分間インキュベートし、等容量のＰＢＳ＋２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で希釈して穏やかに混合した。希釈したサンプルをリンパ球分離培地にて１２００ｘｇで２０分間遠心分離した。次に、濃縮された細胞を血漿界面で密度培地から収集し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄した。その後、５％ＦＢＳ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及びファンギゾン（完全培地）を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｌｏｎｚａ）に細胞を再懸濁し、ミニ自動細胞カウンターＭｏｘｉ  Ｚ（ＯＲＦＬＯ、ＭＸＺ０００）でカウントした。細胞懸濁液を７×１０６細胞／ｍｌに調整し、３７℃、５％ＣＯ２加湿雰囲気で少なくとも２時間平衡化した。
【０２４５】
濃縮されたＣＤ４Ｔ細胞集団は、ＣｙｔｏＦＬＥＸ（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ  ｃｏｕｌｔｅｒ）のフローサイトメトリーによって制御された。回復したＣＤ４Ｔ細胞の静止は、ＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）の低レベルによって制御された。ＣＤ４Ｔ細胞は、抗ヒトＣＤ３  ｅＦｌｕｏｒ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＵＣＨＴ１、４７−００３８−４２）、抗ヒトＣＤ２５−ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＢＣ９６、３０２６０５）及び抗ヒトＣＤ４−ＰｅｒＣＰ（ＢＤ、クローンＳＫ３、３４５７７０）で標識された。濃縮されたＣＤ４Ｔ細胞集団は、９５％超過のＣＤ３＋ＣＤ４＋及び８％以下のＣＤ２５＋を含む。
【０２４６】
（ＣＤ４Ｔ細胞のＰＬＡ２−ＧＩＢバイオアッセイ及び光学顕微鏡用の特定のタンパク質の標識）
平衡化された精製ＣＤ４Ｔ細胞を、３７℃で温度調節された水中の２４ウェルポリスチレンプレートにポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ、Ｐ８９２０）でコーティングされた円形カバーガラス（直径１４ｍｍ、Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ）にロードし（３．５×１０５細胞／５０μｌ完全培地）、ペプチド、組換えたんぱく質を組換えＰＬＡ２−ＧＩＢと一緒に、又は含まず、又はウイルス血症患者の血漿（１％又は３％）又は健康なドナー血漿を含むＰＢＳ  ＢＳＡ１％中の５０μｌの懸濁液と混合した。細胞懸濁液を、４０μｌのペプチド、組換えタンパク質、ＨＩＶ−１  ＮＤＫ粒子又はＰＢＳ  ＢＳＡ１％のモック希釈で１５分間前処理した後に１０μｌのＰＬＡ２−ＧＩＢ（最終的に５ｎＭ）を３０分間加えるか、又はＰＬＡ２−ＧＩＢ（最終的に５ｎＭ）とともにペプチド又は組換えタンパク質を含むＰＢＳ  ＢＳＡ１％中の５０μｌの希釈で４５分間直接処理した。細胞を２ｎＭの組換えグリコシル化ヒトＩＬ−７（Ａｃｃｒｏｂｉｏ  Ｓｙｓｔｅｍ）で１５分間活性化した。細胞上清を除去し、ＰＢＳ（Ｆｉｓｈｅｒ、ＰＦＡ  ３２％ＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１５７１４）中の４％パラホルムアルデヒド溶液５００μｌを１５分間３７℃で加えて細胞を固定し、その後、５００μｌの氷冷９０％メタノール／水溶液で２０分間透過処理した。
【０２４７】
次に、細胞をＰＢＳ＋５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）に１５分間再水和し、標識した。したがって、ＰＢＳでのメタノール処理後にスライドを２回洗浄し、室温で５％ＦＢＳを補充したＰＢＳに１５分間再水和した。スライドを６０μｌのＰＢＳ５％ＦＢＳ中の一次抗体（１／１２０）で１時間標識し、ＰＢＳ緩衝液で１５回、ＰＢＳ／ＦＢＳ緩衝液で５回洗浄した後、二次抗体（１／３００）で１時間染色した。スライドをＰＢＳ５％ＦＢＳ緩衝液で５回洗浄し、ＰＢＳで１５回リンスし、その後共焦点顕微鏡用の新鮮なＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐ３６９３０）封入剤に固定した。使用した一次抗体は、ウサギ抗ｐＳＴＡＴ５（ｐＹ６９４、９３５９、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）及びマウス抗ＣＤ４（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５５３４４）からなり、二次抗体はロバ抗マウスＩｇＧ−ＡＦ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２１２０２）及びロバ抗ウサギでＩｇＧ−ＡＦ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ３１５７２）からなる。
【０２４８】
（抗ｇＣ１ｑＲ抗体６０．１１及び７４．５．２によるｇＣ１ｑＲのブロッキング）
平衡化された精製ＣＤ４Ｔ細胞を、抗ｇＣ１ｑＲ  ６０．１１（エピトープ７５−９６、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−２３８８４）、７４．５．２（エピトープ２０４−２１８、Ａｂｃａｍ、ａｂ１２５１３２）（Ｇｈｅｂｒｅｈｉｗｅｔ  Ｂら、Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．、２０１３）又は対照ＩｇＧ１（マウスＩｇＧ１対照アイソタイプ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ／Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、１６−４７１４）を用いて３０分間プレインキュベートし、３７℃で温度調節された水中の２４ウェルポリスチレンプレートにポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ、Ｐ８９２０）でコーティングされた円形カバーガラス（直径１４ｍｍ、Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ）にロードした（３．５×１０５細胞／５０μｌ完全培地）。細胞をさらにＣ１ｑ（Ｓｉｇｍａ  Ｃ１７４０、純度＞９５％、１０μｇ／ｍｌ）、５ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢを含む若しくは含まないＰＥＰ３ペプチド（０．５μｇ／ｍｌ）又は１００μｌの最終容量中のウイルス血症患者の血漿１％若しくは３％で４５分間処理した。そして、細胞をＩＬ−７で刺激し、上記のように処理して共焦点顕微鏡でｐＳＴＡＴ５  ＮＴを分析した。
【０２４９】
（共焦点顕微鏡）
画像は、ＰＦＡ固定細胞用の油浸プランアポクロマート６３ｘ／１．４ＮＡ対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ）を備えた倒立共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＬＳＭ７００、Ｚｅｉｓｓ）の回折限界を超えて取得された。画像は、ＺＥＮソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）で取得され分析された。
【０２５０】
（［３Ｈ］アラキドン酸標識ＣＤ４Ｔ細胞又はＪｕｒｋａｔ  Ｅ６．１  Ｔ細胞のＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素アッセイ）
２×１０６細胞／ｍｌの精製ＣＤ４Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及びファンギゾンを６ウェルプレートに２ｍｌ／ウェルで補充したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｌｏｎｚａ）中の１μＣｉ／ｍｌのアラキドン酸［５，６，８，９，１１，１４，１５−３Ｈ（Ｎ）］（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社、ＮＥＴ２９８Ｚ２５０ＵＣ）を用いて３７℃、５％ＣＯ２加湿雰囲気で１６時間インキュベートした。細胞を、室温にて５８０ｘｇで１０分間遠心分離することにより、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩで細胞を２回洗浄し、−８０℃、１０７細胞／ｍｌ／バイアルにて９０％ＦＢＳ１０％ＤＭＳＯで凍結した。ＣＤ４Ｔ細胞の［３Ｈ］アラキドン酸の割合は、上清及び細胞中の［３Ｈ］アラキドン酸の合計（ｃｐｍ／ｍｌ）に対する、細胞なしのＣＤ４Ｔ細胞の上清中の［３Ｈ］アラキドン酸のマイナス比（ｃｐｍ／ｍｌ）である。
【０２５１】
５×１０５細胞／ｍｌのＪｕｒｋａｔ  Ｅ６．１Ｔ細胞（ＥＣＡＣＣ  ８８０４２８０３）又はｇＣ１ｑＲ  ＫＯ  Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６．１Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及びファンギゾンを６ウェルプレートに２ｍｌ／ウェルで補充したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｌｏｎｚａ）中の１μＣｉ／ｍｌのアラキドン酸［５，６，８，９，１１，１４，１５−３Ｈ（Ｎ）］（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社、ＮＥＴ２９８Ｚ２５０ＵＣ）を用いて３７℃、５％ＣＯ２加湿雰囲気で１７時間インキュベートした。細胞を、室温にて３００ｘｇで１０分間遠心分離することにより、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩで２回洗浄し、その後、−８０℃にて１０７細胞／ｍｌバイアルで９０％ＦＢＳ  １０％ＤＭＳＯで凍結した。ＣＤ４Ｔ細胞中の［３Ｈ］アラキドン酸の割合は、上清と細胞の［３Ｈ］アラキドン酸の合計（ｃｐｍ／ｍｌ）に対する、細胞を含まないＣＤ４Ｔ細胞の上清の［３Ｈ］アラキドン酸のマイナス比である（ｃｐｍ／ｍｌ）。
【０２５２】
［３Ｈ］アラキドン酸標識ＣＤ４Ｔリンパ球に対するＰＬＡ２−ＧＩＢ活性を試験するために、細胞を室温にて５８０ｘｇで１０分間遠心分離することにより、３７℃に予熱した１０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩで解凍し、２．５％ＦＢＳ  ＲＰＭＩで２回洗浄した。そして、３７℃、５％ＣＯ２加湿雰囲気で２４ウェルポリスチレンプレートに２×１０５ＣＤ４Ｔ細胞／４００μｌ／ウェルで１時間３０分間平衡化した。次に、１００μｌの組換えタンパク質（ｇｐ４１  ＭＮ（５６５−７７１Ｄｅｌｔａ６４２−７２５）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｎｌｉｎｅ、ＡＢＩＮ２１２９７０３、ＨＣＶコアタンパク質、ＨＣＶ−０１１、Ｐｒｏｓｐｅｃ）又は２．５％ＦＢＳ  ＲＰＭＩのビヒクル希釈液を各ウェルに２時間加えた。細胞と上清をエッペンドルフチューブに収集し、室温にて５８０ｘｇで１０分間遠心分離した。細胞上清中に放出された［３Ｈ］アラキドン酸は、カウンター（ｔｒｉ−Ｃａｒｂ  ２８００  ＴＲ  ｌｉｑｕｉｄ  ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）上の低拡散バイアル（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社、６０００４７７）中の１６ｍｌのＵｌｔｉｍａ  ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社、６０１３３２９）を用いて３００μｌで定量された。
【０２５３】
［３Ｈ］アラキドン酸標識Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６．１Ｔリンパ球に対するＰＬＡ２−ＧＩＢ活性を試験するために、細胞を３００ｘｇで１０分間遠心分離することによって３７℃に予熱した１０％のＦＢＳ  ＲＰＭＩで解凍し、２．５％のＦＢＳ  ＲＰＭＩで２回洗浄した。そして、３７℃、５％ＣＯ２加湿雰囲気で２４ウェルポリスチレンプレートに５×１０４又は１０５  Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６．１Ｔ細胞／４００μｌ／ウェルで１時間３０分平衡化した。次に、５．９５μＭの２．５％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ中のＨＣＶコア溶液又はビヒクル希釈液を、６３０ｎＭ又は２μＭの２．５％ＦＢＳ  ＲＰＭＩの等量のＰＬＡ２−ＧＩＢ溶液と混合し、同時にウェルあたり１００μｌを２時間添加した。ペプチド処理の場合、図に示すように、２．５％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ中の１１０μＭ又は５５μＭでウェルあたり５０μｌのペプチド溶液を用いて、細胞を２時間、４時間又は２１時間前処理した。次に、６３０ｎＭ又は２μＭの２．５％ＦＢＳ  ＲＰＭＩでウェルあたり５０μｌのＰＬＡ２−ＧＩＢ又は培地のみを２時間添加した。細胞と上清をエッペンドルフチューブに収集し、室温にて５８０ｘｇで１０分間遠心分離した。細胞上清に放出された［３Ｈ］アラキドン酸は、カウンター（ｔｒｉ−Ｃａｒｂ  ２８００  ＴＲ  ｌｉｑｕｉｄ  ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ）の低拡散バイアル（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社、６０００４７７）に１６ｍｌのＵｌｔｉｍａ  ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社、６０１３３２９）を入れて３００μｌで定量された。
【０２５４】
結果は、ＰＬＡ２−ＧＩＢ活性（ｃｐｍ／ｍｌ中のＰＬＡ２−ＧＩＢを含まないペプチド又は緩衝液のみの細胞による［３Ｈ］アラキドン酸の自然放出を差し引いたＰＬＡ２−ＧＩＢとともに、ペプチド又はＨＣＶコアで処理された細胞の上清中の［３Ｈ］アラキドン酸の放出）、又はペプチドによるＰＬＡ２−ＧＩＢ活性からスクランブルＰＥＰ３による活性を差し引いたもの（ペプチドで処理した細胞の上清中の［３Ｈ］アラキドン酸の放出からｃｐｍ／ｍｌ中のスクランブルＰＥＰ３で処理した細胞による［３Ｈ］アラキドン酸の放出を差し引いたもの）である。
【０２５５】
結果及び考察
（１．ウイルス血症患者の血漿がＣＤ４Ｔ細胞に対するＰＬＡ２−ＧＩＢ活性を増加させる）
５ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢによる処置は、ＩＬ−７への応答に影響を与えない一方で、７５ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢ単独によるＣＤ４Ｔ細胞の処置は、ＩＬ−７誘導リン酸化ＳＴＡＴ５核移行（ｐＳＴＡＴ５  ＮＴ）を著しく減少させることを以前示した（緩衝液、図１Ａ）。内因性ＰＬＡ２−ＧＩＢが枯渇したウイルス血症の血漿は、ＩＬ−７に応答してリン酸化ＳＴＡＴ５移行に影響を与えない。特に、１％の内因性ＰＬＡ２−ＧＩＢが枯渇したウイルス血症の血漿中に５ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢを加えると、４０％のｐＳＴＡＴ５  ＮＴ阻害率が得られるが、同様に処置された健康なドナー血漿には効果がない（ｎ＝４独立ドナー、ｐ＜０．０００１、図１Ａ）。これらの結果は、ウイルス血症血漿がＣＤ４Ｔ細胞をＰＬＡ２−ＧＩＢによる阻害に感作させる補因子を含むことを示している。
【０２５６】
このウイルス血症の血漿補因子の分子量を同定するために、３０ｋＤａ及び１０ｋＤａカットオフのフィルタでウイルス血症血漿を分画した。図１Ｂに示すように、１０ｋＤａ超過３０ｋＤａ未満の生成物を含む内因性ＰＬＡ２−ＧＩＢが枯渇した血漿の画分は、ＣＤ４Ｔ細胞のＰＬＡ２−ＧＩＢ活性を増加させるが、健康なドナー血漿からの同じ画分は増加させない。３０ｋＤａ超過の生成物を含む内因性ＰＬＡ２−ＧＩＢ枯渇ウイルス血症血漿の画分と１０ｋＤａ未満の生成物を含む画分とは、ＰＬＡ２−ＧＩＢ活性に影響を与えない。したがって、ウイルス血症の血漿患者は、１０ｋＤａ〜３０ｋＤａの分子量を持つ補因子を含み、ＰＬＡ２−ＧＩＢ濃度だけではＩＬ−７に応答してｐＳＴＡＴ５  ＮＴに影響を与えるには不十分な実験条件下で、ＣＤ４Ｔ細胞をＰＬＡ２−ＧＩＢによる阻害に対して感作する。
【０２５７】
（２．ＨＩＶ−１不活性化ウイルス粒子がＣＤ４Ｔ細胞をＩＬ−７に応答したＰＬＡ２−ＧＩＢ阻害活性に感作させる）
ＨＩＶ−１ウイルス製品がウイルス血症血漿の補因子活性に役割を果たし得るという仮説を検証するために、健康なドナーのＣＤ４Ｔ細胞のＩＬ−７に対するｐＳＴＡＴ５  ＮＴ応答におけるＨＩＶ−１粒子の影響を最初に調査した。ＡＴ−２で予め不活性化されたＴ−ｔｒｏｐｉｃ  ＨＩＶ−１  ＮＤＫウイルスのＨＩＶ−１粒子を用いて、感染がない場合のＣＤ４Ｔ細胞に対するウイルスタンパク質の効果を試験した。補因子活性を試験するために、ＣＤ４Ｔ細胞をＩＬ−７に応答するリン酸化ＳＴＡＴ５核移行を阻害しない量のＰＬＡ２−ＧＩＢ（５ｎＭ）に単独で又は様々な量のＨＩＶ粒子（ＭＯＩ  １、０．１、０．０１及び０．００１）存在下で曝露した（図２）。ＩＬ−７に応答するｐＳＴＡＴ５  ＮＴは、ＰＬＡ２−ＧＩＢを含まない場合では９２％以上で５ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢと生物学的に類似しており、７５ｎＭと２５０ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢを含む場合では予想通り５０％と１０％だけであった。ＨＩＶ−１粒子単独では、ＩＬ−７に応答するｐＳＴＡＴ５  ＮＴに影響を与えない。注目すべきことに、ＨＩＶ−１粒子は、５ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢ（５ｐｇ／ｍｌのｐ２４（ＭＯＩ＝０．００１）を含むｐＳＴＡＴ５  ＮＴの阻害率４８％から５０００ｐｇ／ｍｌのｐ２４（ＭＯＩ＝１）を含むｐＳＴＡＴ５  ＮＴの阻害率わずか８％、ｐ＜０．００１、図２）存在下でｐＳＴＡＴ５  ＮＴの用量反応阻害を引き起こすが、５ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢを含む対照（モック）と同様の希釈は、ＩＬ−７に応答してｐＳＴＡＴ５  ＮＴに影響を与えない。これらの結果は、ウイルス成分の一部が、ウイルス血症患者の血漿で観察されるようにＰＬＡ２−ＧＩＢ活性に対してＣＤ４Ｔ細胞を感作させる補因子の役割を果たし得ることを示している。
【０２５８】
（３．ＨＩＶ−１  ｇｐ４１タンパク質がＩＬ−７で刺激されたＣＤ４Ｔ細胞のｐＳＴＡＴ５  ＮＴに対するＰＬＡ２−ＧＩＢ阻害活性を増加させる）
補因子（５ｎＭ）の非存在下で、組換えｇｐ４１タンパク質若しくはｇｐ４１タンパク質のみとともに又はそれを組み合わせずに、ＰＬＡ２−ＧＩＢを含まずに（ＧＩＢなし）、ｐＳＴＡＴ５  ＮＴを阻害し得ない用量のＰＬＡ２−ＧＩＢで前処理した細胞中のＩＬ−７に対するｐＳＴＡＴ５  ＮＴ応答を分析した。図３に示すように、ＩＬ−７へのｐＳＴＡＴ５  ＮＴ応答に対する微小な阻害効果としてｇｐ４１タンパク質単独は、０．５μｇ／ｍｌのｇｐ４１でわずか１０％の阻害率であり、０．２５〜０．０５μｇ／ｍｌのｇｐ４１で阻害率は８％以下であった（図３Ａ及び３Ｂ）。顕著な対照として、５ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢの存在下で、０．５μｇ／ｍｌのｇｐ４１タンパク質は、６０％を超えるｐＳＴＡＴ５  ＮＴの阻害を引き起こし（図３Ｂ）、０．００５μｇ／ｍｌのｇｐ４１では用量依存性阻害が１８％まで阻害された（図３Ａ）。
【０２５９】
（４．ＨＩＶ−１  ｇｐ４１タンパク質がＩＬ−７で刺激されたＣＤ４Ｔ細胞のｐＳＴＡＴ５  ＮＴにおけるウイルス血症患者の血漿の阻害活性に重要な役割を果たす）
ｇｐ４１タンパク質がウイルス血症患者の血漿中のＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子であり得ることを確認するために、ｇｐ４１に対するポリクローナル抗体（ｐＡｂ抗ｇｐ４１）又は対照ポリクローナル抗体（対照ｐＡｂ）でウイルス血症患者の血漿を枯渇させた。健康なドナー血漿は、陰性対照として同様に処置した。図４に示すように、ｐＳＴＡＴ５  ＮＴの阻害率は、予想どおり７５ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢで４９％、２５０ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢで７９％であり、１％の抗体のないウイルス血症患者の血漿で阻害率が３９％、３％の抗体のないウイルス血症患者の血漿で阻害率が５４％であった。健康なドナー血漿は、抗体を含まないＩＬ−７に応答するｐＳＴＡＴ５  ＮＴに対する阻害効果がなく、対照ポリクローナル抗体又は抗ｇｐ４１ポリクローナル抗体は、抗体がＣＤ４Ｔ細胞に対して毒性がないことを示している（図４）。対照ポリクローナル抗体によるウイルス血症患者血漿の処置は、１％と３％血漿での阻害率はそれぞれ４３％と５５％で阻害活性を変化させない（図４）。特に、抗ｇｐ４１ポリクローナル抗体による免疫枯渇は、１％と３％の免疫枯渇血漿で、６％と１０％の残存阻害活性を含むウイルス血症患者の血漿の阻害活性をほぼ無効にした（ｐ＜０．００１  ｐＡｂ抗ｇｐ４１対対照ｐＡｂ処理された血漿、図４）。要するに、これらの結果は、ｇｐ４１がウイルス血症患者の血漿中のＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子であることを示している。
【０２６０】
（５．ｇｐ４１のＰＥＰ３モチーフがＩＬ−７で刺激されたＣＤ４Ｔ細胞のｐＳＴＡＴ５  ＮＴを阻害する）
ＣＤ４Ｔ細胞は、潜在的なＣ１ｑＲ結合要素を含むｇｐ４１の１５アミノ酸ペプチドドメインに曝露された。ペプチドは、ＳＷＳＮＫＳモチーフを含む。細胞もまた、５ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢ（５ｎＭ  ＧＩＢ）とともに、又はそれを含まないで対照（ＣＴＬ）ペプチド（図５Ａ）に曝露した。ＣＴＬペプチド単独若しくはＰＬＡ２−ＧＩＢを含むＣＴＬペプチド又はＰＥＰ３単独では、ｐＳＴＡＴ５  ＮＴに影響を与えないが、ＰＥＰ３と５ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢによる処理は、０．０２５μｇ／ｍｌ〜２．５μｇ／ｍｌのＰＥＰ３それぞれでｐＳＴＡＴ５  ＮＴの阻害率が１８％〜５１％のＰＥＰ３用量依存性阻害をもたらした（図５Ｂ）。図５Ｃに要約されているように、０．５μｇ／ｍｌのＰＥＰ３単独による処理は、ＣＤ４Ｔ細胞中のｐＳＴＡＴ５  ＮＴ阻害率が５％だけであり、５ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢと０．５μｇ／ｍｌのＰＥＰ３による処理は、阻害率が５５％であった。（ｐ＜０．０５、ｎ＝３ドナー）。
【０２６１】
（６．ＰＥＰ３がＰＬＡ２−ＧＩＢに補因子効果を持つ）
ＰＬＡ２−ＧＩＢ活性に対するＰＥＰ３の効果を、［３Ｈ］ＡＡ  Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６．１Ｔ細胞でアッセイした。５×１０４細胞Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６．１を、ＰＥＰ３又はスクランブルＰＥＰ３で様々な時間（最大２１時間）で前処理した。処理の２時間後、細胞を２００ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢでインキュベートした。結果を図１１に示す（３つの実験のプ−ル）。
【０２６２】
わかるように、ペプチドＰＥＰ３ペプチド（１１μＭ）で４時間以上細胞を前処理すると、スクランブルＰＥＰ３と比較して、Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６．１Ｔ細胞膜のＰＬＡ２−ＧＩＢ活性が著しく増加した（ｐ＜０．００１）。これらの結果は、ＰＥＰ３がＰＬＡ２−ＧＩＢに補因子効果を持つことを確認する。
【０２６３】
（７．ＰＬＡ２−ＧＩＢに対するＰＥＰ３の補因子活性及びウイルス血症患者の血漿の阻害活性がｇＣ１ｑに依存する）
我々は、ｇＣ１ｑＲがウイルス血症患者の血漿の阻害活性に役割を果たし得ると仮定した。ｐＳＴＡＴ５  ＮＴのＰＬＡ２−ＧＩＢ阻害におけるｇＣ１ｑＲの役割を調べるために、ＰＬＡ２−ＧＩＢ活性に対するｇＣ１ｑＲの天然リガンドであるＣ１ｑの効果を試験した。Ｃ１ｑ単独では、４０％のｐＳＴＡＴ５  ＮＴを阻害できることがわかった（ｐ＜０．００１）。Ｃ１ｑへのＰＬＡ２−ＧＩＢの追加は、この阻害活性を７５〜８５％の阻害に増加させ（ｐ＜０．０１、図６Ａ）、ＰＬＡ２−ＧＩＢに対するＣ１ｑ効果及び補因子効果は、応答の７５％を回復する２つの異なる抗ｇＣ１ｑＲ抗体で著しく阻害した（６０．１１及び７５．４．２抗ｇＣ１ｑＲ抗体がＣ１ｑ及び５ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢを含む対照ＩｇＧ１に対して、ｐ＜０．００１、図６Ａ）。特に、抗ｇＣ１ｑＲ抗体７４．５．２は、ＰＥＰ３及びＰＬＡ２−ＧＩＢの存在下で５４％のｐＳＴＡＴ５  ＮＴを回復し（図６Ｂ、ｐ＜０．０００１）、１％のウイルス血症患者の血漿で処理された細胞で３２％のｐＳＴＡＴ５  ＮＴを回復している（図６Ｃ、ｐ＜０．０００１）。対照的に、対照抗体（対照ＩｇＧ１）は、ＰＬＡ２−ＧＩＢに対するＰＥＰ３補因子活性も、ウイルス血症患者の血漿効果も阻害しない（図６Ｂ及び６Ｃ）。
【０２６４】
（８．ＰＥＰ３がｇＣ１ｑＲに結合する）
ＰＥＰ３のｇＣ１ｑＲへの結合は、「材料及び方法」に記載されているように、マイクロプレート上のＥＬＩＳＡアッセイによって試験された。スクランブルペプチド又は対照ペプチドを対照として使用した。
【０２６５】
結果を図１２に示す。それらは、ＰＥＰ３がｇＣ１ｑＲに結合するが、スクランブルペプチド及び対照ペプチドは本質的には結合しないことを示している。
【０２６６】
（９．ｇＣ１ｑＲがＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞膜に対するＰＥＰ３補因子効果に関与する）
ＰＬＡ２−ＧＩＢ活性に対するＰＥＰ３及びｇＣ１ｑＲの効果を、［３Ｈ］ＡＡ  Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６．１細胞で試験した。５×１０４細胞Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６．１  ＷＴ、ｇＣ１ｑＲ  ＫＯ（２Ｇ９）を、ＰＥＰ３又はスクランブルＰＥＰ３で２１時間前処理した。処理の２時間後、細胞をＰＬＡ２−ＧＩＢでインキュベートした。
【０２６７】
結果を図１３に示す（３つの実験のプ−ル）。ｇＣ１ｑＲ  ＫＯ細胞ではなくＷＴ細胞のＰＥＰ３ペプチドによる２１時間の前処理では、ＰＬＡ２−ＧＩＢ活性がスクランブルＰＥＰ３に対して著しく増加した（ｐ＜０．０１）。ＷＴに対するＰＬＡ２−ＧＩＢ活性は、ｇＣ１ｑＲ  ＫＯ細胞よりも著しく高い。
【０２６８】
これらの結果はさらに、ｇＣ１ｑＲがＰＥＰ３補因子効果に関与していることを示している。
【０２６９】
（１０．ｇｐ４１タンパク質がＣＤ４Ｔ細胞膜をＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性に感作させる）
ＣＤ４Ｔ細胞膜に対するＰＬＡ２−ＧＩＢ効果を調べるために、ＣＤ４Ｔ細胞を［３Ｈ］アラキドン酸で標識する新規な酵素アッセイを開発した。これらの細胞をＰＬＡ２−ＧＩＢに曝露すると、ＣＤ４Ｔ細胞に対する酵素活性が［３Ｈ］アラキドン酸を放出する。［３Ｈ］アラキドン酸の定量により、ＰＬＡ２−ＧＩＢ活性を定量化することができた。
【０２７０】
上記でｇｐ４１タンパク質がｐＳＴＡＴ５  ＮＴに対するＰＬＡ２−ＧＩＢ阻害活性を増加し得ることを観察したので、ｇｐ４１がＣＤ４Ｔ細胞膜に対するＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性を増加し得ると仮定した。実際に、ＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性は、ｇｐ４１が存在するときにｇｐ４１が用量依存的に極めて著しく増加している（ｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１、図７）。Ｇｐ４１処理単独では、ＣＤ４Ｔ細胞による［３Ｈ］アラキドン酸の放出に影響はない。０．５〜５μｇ／ｍｌのｇｐ４１で処理すると、６３ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢ活性は２．２〜２１倍となり、ｇｐ４１の最大値が５μｇ／ｍｌのときのＣＤ４Ｔ細胞による［３Ｈ］アラキドン酸放出に対する２００ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢ活性は、１．５〜１１．６倍増加した。５μｇ／ｍｌのｇｐ４１で処理すると、一部のドナーではＰＬＡ２−ＧＩＢ活性が７０倍以上増加し得る。
【０２７１】
（１１．その他のＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子）
ｇＣ１ｑＲがＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子のセンサであるという我々の証明は、他のｇＣ１ｑＲリガンドを調査することにつながった。
【０２７２】
表２に、ｇＣ１ｑＲに結合してＰＬＡ２−ＧＩＢ活性に影響を与え得る３０の異なる分子を示す。これらの分子の約半分は、病原体由来である。９つはウイルス性タンパク質、４つは細菌成分、１つは熱帯熱マラリア原虫である（表２）。１つの分子、ＬｙＰ−１は人工ｇＣ１ｑＲリガンドであり、他の１５は内因性成分で、５つは血清から、１０つは細胞からである。まとめると、これらの結果はＰＬＡ２−ＧＩＢ活性が様々な異なる病原体成分及び内因性因子によって調節され得、この経路が病因の一般的なメカニズムであることを示唆している。
【０２７３】
（１２．ＨＣＶコアタンパク質がＣＤ４Ｔ細胞膜をＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性に感作させる）
組換えＨＣＶコアタンパク質の存在下で、ＣＤ４Ｔ細胞に対するＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性を分析した（図８）。ＨＣＶコアタンパク質は、ｇＣ１ｑＲ結合要素を含む（表２を参照）。我々の結果は、ＨＣＶコアタンパク質のみが、１０及び２０μｇ／ｍｌでＣＤ４Ｔ細胞による［３Ｈ］アラキドン酸の放出をわずかに誘発することを示している（図８Ａ）。興味深いことに、ＰＬＡ２−ＧＩＢ及びＨＣＶコアタンパク質によるＣＤ４Ｔ細胞の処理は、ＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性を非常に増加させ、１０及び２０μｇ／ｍｌのＨＣＶコアタンパク質での６３ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢ活性を２６倍及び３６倍増加させ、２００ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢ活性を１６倍及び２６倍増加させる（図８Ａ）。図８Ｂに要約されているように、１０μｇ／ｍｌのＨＣＶコアタンパク質のみでの処理は、ＣＤ４Ｔ細胞による［３Ｈ］アラキドン酸の放出をわずかに著しく増加させる。さらに、ＨＣＶコアタンパク質は、非常に強力なＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子であり、６３ｎＭ及び２００ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢ活性をそれぞれ２６倍及び１６倍増加させる（ｐ＜０．００１、ｎ＝３ドナー）。これらの結果は、ＨＣＶコアタンパク質がＣＤ４Ｔ細胞をＰＬＡ２−ＧＩＢ阻害に感作させてＣ型肝炎感染患者のＣＤ４Ｔ細胞機能の阻害をもたらし得ることを示している。
【０２７４】
（１３．ＨＣＶコアタンパク質がＪｕｒｋａｔ  Ｅ６．１Ｔ細胞膜をＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性に感作させる）
ＰＬＡ２−ＧＩＢ活性に対するＨＣＶコアタンパク質の効果は、Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６．１細胞でさらに試験された。ＨＣＶコア（５９５ｎＭは１０μｇ／ｍｌに相当）を５×１０ｅ４細胞でインキュベートした。ｅｑ緩衝液中のＰＬＡ２−ＧＩＢマイナス活性に起因する［３Ｈ］ＡＡの放出を測定した。
【０２７５】
結果を図１４に示す。それらは、ＨＣＶコアタンパク質がＣＤ４Ｔ細胞膜で観察されたのと同様に、Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６．１Ｔ細胞膜に対するＰＬＡ２−ＧＩＢ活性を著しく増加させたことを示している。
【０２７６】
したがって、ＨＣＶコアタンパク質は、強力な補因子効果を示す。
【０２７７】
（１４．Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓプロテインＡ（ＳＡプロテインＡ）がＣＤ４Ｔ細胞をＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性に感作させる）
ＳＡプロテインＡである別のｇＣ１ｑＲ結合タンパク質（表２）がＣＤ４Ｔ細胞のＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性に及ぼす効果を分析した（図９）。ＨＣＶコアタンパク質で観察されたように、ＳＡプロテインＡ単独では、１０、２５及び５０μｇ／ｍｌでＣＤ４Ｔ細胞による［３Ｈ］アラキドン酸の放出をわずかに誘発している（図９Ａ、ｐ＜０．０１）。特に、ＰＬＡ２−ＧＩＢ及びＳＡプロテインＡによるＣＤ４Ｔ細胞の処理は、１０〜５０μｇ／ｍｌのＳＡプロテインＡにおいて、ＰＬＡ２−ＧＩＢ酵素活性を２００ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢ活性の１．５倍〜３倍多く増加させている（図９Ｂ、ｐ＜０．０００１）。これらの結果は、ＳＡプロテインＡがＣＤ４Ｔ細胞をＰＬＡ２−ＧＩＢ阻害に感作させて黄色ブドウ球菌感染患者のＣＤ４Ｔ細胞機能の阻害をもたらし得ることを示す。これらの結果はまた、ウイルスタンパク質ＨＣＶコアでの上記の観察を完了させ、ｇＣ１ｑＲに結合する細菌タンパク質がＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子であり得ることを示す。ＨＣＶコアタンパク質とＳＡプロテインＡの実験をまとめると、ｇＣ１ｑＲ活性化／ＰＬＡ２−ＧＩＢ感作は、病原体が作用する一般的なメカニズムであり得ることが示唆されている。
【０２７８】
（１５．ＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子として作用し得るｇＣ１ｑＲ結合ドメイン含有タンパク質の同定）
ＰＥＰ３ペプチド配列でタンパク質データベースをスクリーニングし、ｇＣ１ｑＲ結合要素を含む他のタンパク質を同定した。２７の異なる細菌種と１つの真菌（カンジダ・グラブラタ）から４２のタンパク質が同定され、１つはアナナスから、もう１つは線虫から、最後の１つはヒトからであった（表１）。それらの中で、表３にまとめられているように、ＰＬＡ２−ＧＩＢ活性を調節し得る９つのヒト病原体（８つの細菌と１つの真菌）から１１のタンパク質を同定した。例えば、ポルフィロモナス・ジンジバリス感染症は、膵臓癌、関節リウマチ及びアルツハイマー病に関連し、カンジダ・グラブラタ感染症は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ患者、癌患者、化学療法治療及び臓器移植の皮膚カンジダ症に関連している。
【０２７９】
（１６．ＨＰポルフィロモナス・ジンジバリスＰＥＰＴＩＤＥ８（ＨＰ  Ｐｇ）がＰＬＡ２−ＧＩＢに補因子効果を持つ）
ＰＬＡ２−ＧＩＢ活性に対するペプチドＨＰ  Ｐｇの効果は、［３Ｈ］ＡＡ  Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６．１細胞で測定された。１０ｅ５（左パネル）又は５×１０ｅ４（右パネル）の細胞Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６．１を、ＨＰ  Ｐｇ、スクランブルＰＥＰ３又はＰＥＰ３で２１時間前処理した。処理の２時間後、細胞を２００ｎＭのＰＬＡ２−ＧＩＢでインキュベートした。
【０２８０】
結果を図１５に示す。ＨＰ  Ｐｇ（配列番号８）での前処理によって、ＰＬＡ２−ＧＩＢ活性がスクランブルＰＥＰ３と比較して著しく増加したことが示されている。
【０２８１】
これらの結果は、ＨＰ  Ｐｇに補因子効果があることを示す。
【０２８２】
（１７．ＰＤＡＣ血漿がＰＬＡ２−ＧＩＢに補因子効果を持つ）
リン酸化ＳＴＡＴ５核移行（ｐＳＴＡＴ５  ＮＴ）を測定することで、ＰＤＡＣ患者からの血漿がＣＤ４Ｔ細胞のＩＬ−２応答を調節する能力を試験した。
【０２８３】
図１６に示すように、１％及び３％希釈でＣＤ４Ｔ細胞のＩＬ−２応答に対するＰＤＡＣ血漿の阻害効果が観察された。この結果は、癌患者において、腫瘍微小環境又は血漿が免疫調節、例えば阻害を提供することを示している。この発見は、癌がＴ細胞をＰＬＡ２−ＧＩＢによる不活性化に対して感受性にするＰＬＡ２−ＧＩＢ補因子を含むことを示している。
【０２８４】
【表１】
2021514990.tif 000002
2021514990.tif 000003
2021514990.tif 000004
【０２８５】
【表２】
2021514990.tif 000005
【０２８６】
【表３】
2021514990.tif 000006
【０２８７】
参考文献
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【図１Ａ】
2021514990.tif 000007
【図１Ｂ】
2021514990.tif 000008
【図２】
2021514990.tif 000009
【図３】
2021514990.tif 000010
【図４】
2021514990.tif 000011
【図５】
2021514990.tif 000012
【図６Ａ】
2021514990.tif 000013
【図６Ｂ】
2021514990.tif 000014
【図６Ｃ】
2021514990.tif 000015
【図７】
2021514990.tif 000016
【図８】
2021514990.tif 000017
【図９Ａ】
2021514990.tif 000018
【図９Ｂ】
2021514990.tif 000019
【図１０】
2021514990.tif 000020
【図１１】
2021514990.tif 000021
【図１２】
2021514990.tif 000022
【図１３】
2021514990.tif 000023
【図１４】
2021514990.tif 000024
【図１５】
2021514990.tif 000025
【図１６】
2021514990.tif 000026
【配列表】
2021514990000001.app
【国際調査報告】
2021514990.tif 000027
2021514990.tif 000028
2021514990.tif 000029