(57)【要約】  本発明は、自家がんワクチン、および、以下のステップ：ａ）がん患者から得られた血清または血漿のサンプルからタンパク質を抽出するステップ、およびｂ）ステップａ）で抽出されたタンパク質をヒドロキシアパタイトおよび／またはリン酸三カルシウムの粒子と接触させるステップを含む、該自家がんワクチンの製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍抗原を担持したヒドロキシアパタイトおよび／またはリン酸三カルシウムの粒子を含む自家がんワクチンを製造するための方法であって、前記方法は、以下のステップ：
ａ）がん患者から得られた血清または血漿のサンプルに含まれるタンパク質を抽出するステップ；および
ｂ）自家ワクチンを得るために、ステップａ）で抽出したタンパク質をヒドロキシアパタイトのおよび／またはリン酸三カルシウムの粒子と接触させるステップ
を含む、方法。
【請求項２】
患者がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
患者がイヌ、ウマまたはネコである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
がんが、黒色腫、癌腫、腺癌、肉腫、中枢神経系腫瘍、白血病、リンパ腫、および感染性由来のがんから選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
がんが、骨肉腫、ＢまたはＴリンパ腫、乳腺腫瘍、黒色腫、血管肉腫、肥満細胞腫、線維肉腫、脳または中枢神経系腫瘍、シュワン細胞腫、中皮腫、セミノーマ、テラトーマおよび芽細胞腫から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
がんが、膠芽腫、肉腫、黒色腫、癌腫または腺癌である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
がんが、転移を示すがんである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
腫瘍抗原を担持したヒドロキシアパタイトのおよび／またはリン酸三カルシウムの粒子を含む自家ワクチンであって、該自家ワクチンは、請求項１から７のいずれか一項に記載の製造方法から得られる、自家ワクチン。
【請求項９】
血清および／または血漿のサンプルが得られた患者のがんの治療に使用するための、請求項８に記載の自家ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫療法によるがんの治療に関する。本発明は、特に自家がんワクチン（autologous cancer vaccine）の製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫療法は、がんを治療するための、認知されまたよく確立されている代替療法である。これは、いくつかの異なる治療法を組み合わせたものであるが、それらはすべて、患者の疾患を認識し攻撃するために患者の免疫系を刺激することに基づいている。
【０００３】
免疫系の細胞は通常、体の細胞内の異常の存在を監視および検出することができる。しかしながら、大部分の腫瘍では、この監視から逃れるためにいくつかのメカニズムが発達しており、その場合、腫瘍に対する免疫系の耐容性が認められる。Ｔリンパ球などの免疫細胞を刺激して腫瘍細胞を特異的に認識するようにすることで、この耐容性を高めることができる。
【０００４】
この刺激は、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）がＴリンパ球を刺激するように、腫瘍抗原をマクロファージまたは関連細胞と直接（インビトロまたはインビボで）接触させることによって行うことができる。これが治療用がんワクチンの概念である。インビボ刺激の場合、その原理は、腫瘍から異常なタンパク質を取り出し、それらを免疫系に見える形態で再注入することである。
【０００５】
治療用がんワクチンは、ｇｐ９６やＨＳＰ７０などのヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）の使用に基づくことができる。これらのタンパク質はシャペロン分子であり、各患者の腫瘍に特異的な抗原を含めた様々なペプチドと結合する。したがって、これらは、根絶しようとする腫瘍の分子フィンガープリントを構成し、患者毎に、また腫瘍毎に異なる。同じ腫瘍の場合、該フィンガープリントは時間経過とともに進化する。
【０００６】
このワクチン接種ストラテジーでは、患者を免疫する必要のある各腫瘍から、かつ所与の時間に、ワクチン接種タンパク質を精製する必要がある。精製プロトコルは長く、工業化が難しく、エンドトキシンによるコンタミネーションを何度も受ける。従来、一連の遠心分離、沈殿、Ｃｏｎ  Ａクロマトグラフィー、電気泳動分析、およびＭｏｎｏ  ＱＦＰＬＣクロマトグラフィーに供された破砕された腫瘍材料からＨＳＰを精製する必要がある。米国特許第６，４４７，７８１号、第６，４３６，４０４号、第６，４１０，０２８号、第６，３８３，４９４号および第６，０３０，６１８号には、Ｃｏｎ  Ａシャペロンクロマトグラフィーカラムを使用することを含むＨＳＰタンパク質の精製方法が記載されている。
【０００７】
特許出願ＷＯ２００６／１２２９１４には、組織抽出物からワクチン接種用タンパク質を精製するためにヒドロキシアパタイト粒子（ＨＡＰ）を使用することの有用性が記載されている。この出願は、生化学者の資格を受けていないスタッフが大規模に用いることができるようにするための、腫瘍抗原の製造のためのワンステップ法をより具体的に記載しており、これらは免疫系によって認識可能な形態とすることが意図されている。ＷＯ２００６／１２２９１４はまた、ＨＡＰ粉末および他のカルシウム塩をワクチン接種アジュバントとして使用できること、そして腫瘍特異的腫瘍抗原を吸着したヒドロキシアパタイト粉末を該腫瘍に対する薬として使用できることを開示している。したがって、同じＨＡＰ粉末を、腫瘍に特異的なタンパク質を精製するためと、該粉末とタンパク質が一緒に注射されたときに該タンパク質に対する免疫系を刺激するためと、の両方に用いることができる。
【０００８】
また、ヒドロキシアパタイトおよび／またはリン酸三カルシウムの粉末を製造するための改良された方法の開発が特許出願ＷＯ２０１４／１８４５５３に記載されている。このようにして得られた粉末を、さらなる毒性または二次的作用なしに先天免疫のレベルを増加させる治療用抗腫瘍ワクチンを生成するために、腫瘍生検から直接精製された腫瘍タンパク質と接触させ、それにより、腫瘍の細胞の固有性（cellular identity）をマーキングする。
【０００９】
この技術は安全で、化学療法と組み合わせることができ、有毒な残留物を生成しない。本発明者らは、ワクチン接種後にＴリンパ球が腫瘍細胞を認識できることを実証した。ワクチン接種のサイクルは、抗感染症ワクチンに使用されるものと非常に似ている。ワクチンは皮下組織に注射され、数回の注射が必要である（週に１回を４週間、月に１回を４か月）。
【００１０】
このタイプの免疫療法は、予後不良の一部のがんにおいて寛解と全快の違いを生む可能性がある。このことは、例えば獣医学で実証されており、この場合、このワクチン接種は、高悪性度Ｂリンパ腫（ＤＬＢＣＬ）などの致死性のがんに対して、化学療法単独と比較してイヌの生存率を高める。また骨がん（骨肉腫）、肥満細胞腫、あるいは黒色腫などの固形腫瘍でも優れた結果が得られている。
【００１１】
しかし、生検からのこれらのワクチンの生産には、産業的使用を相当に損なう難点がいくつかある。これらの難点のうち最初に挙げられるのは、壊死性ではなく、かつ腫瘍全体の抗原レベルおよび該腫瘍からの転移の可能性を代表する領域における腫瘍の生検が必要であることである。
【００１２】
さらに、生検は、特に、複数のダメージの大きい病態のために麻酔リスクが大きい個体において、生検自体が致命的なリスクや、重大な後遺症のリスクとなる場合、常に得られるとは限らない。このリスクは、膵臓腺癌や到達困難な脳腫瘍などの腫瘍、さらに高悪性度の前立腺腫瘍では、播種のリスクがあるため特に重大である。
【００１３】
さらに、規制の観点では、生検の管理は困難で複雑な問題である。組織バンクの設立、厳格な規制の順守、低温流通（cold chain）の監視、および複雑なロジスティクスの保証が必要である。
【００１４】
したがって、生検および組織バンクにおけるその後の管理のコストは、治療自体のコストよりも容易に高くなり得る。
【００１５】
したがって、腫瘍から製造されたワクチンに匹敵する有効性を維持しながら、腫瘍生検に依存することなく製造できるがんワクチンを開発できることは極めて有利かつ有益であろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の簡単な説明
驚くべきことに、本発明者らは、出願ＷＯ２０１４／１８４５５３に記載されたワクチン（腫瘍生検に由来するタンパク質およびＨＡＰ粒子に基づく）で得られた結果と同等またはそれ以上の結果をもたらすがんワクチンを開発することに成功したが、これは、腫瘍生検を用いるものではない。
【００１７】
本発明者らは、実際に、がんに罹患している個体の血液、特に血清から腫瘍タンパク質を直接抽出することによってそのようなワクチンを開発することが可能であることに気づいた。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
これに関連して、本発明は、自家がんワクチンを製造するための方法に関し、前記方法は、以下のステップ：
ａ）がん患者から得られた血清または血漿のサンプルに含まれるタンパク質を抽出するステップ；および、
ｂ）ステップａ）で抽出したタンパク質をヒドロキシアパタイトのおよび／またはリン酸三カルシウムの粒子と接触させるステップ
を含む。
【００１９】
本発明はまた、上述の製造方法から得られた自家ワクチンに関する。
【００２０】
最後に、本発明はまた、治療、特に血清および／または血漿のサンプルが得られた患者のがんの治療に使用する（自家ワクチン）ための上述の製造方法から得られた自家ワクチンに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】様々な腫瘍から製造したワクチンの粉末表面から分離したタンパク質のＳＤＳページ。左から右へ：乳腺腺癌、びまん性リンパ腫、および骨肉腫。結果は質的にも量的にも異なっている。ｋＤａでのスケール。
【図２】血清から調製したワクチンから得られたタンパク質のＳＤＳページ。左から右へ、黒色腫（最初の２列）、舌がん（次の２列）、血管肉腫（次の２列）。ｋＤａでのスケール。多数のわずかなコンタミネーションがあり、定量的に主要なバンドは１６０〜１１０ｋＤａの間にある。これは非常に再現性がある。
【図３】ペルオキシダーゼ標識（褐色沈着物）によって示されるように、ワクチン接種後に抗腫瘍細胞抗体が存在することを示す、抗ヒトＩｇＧを用いた膠芽腫切片の標識。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明者らは、腫瘍抗原を提示するヒドロキシアパタイト粒子に基づいて効果的ながんワクチンを開発することが可能であることを実証し、ここで、前記腫瘍抗原は、先行技術の場合のように腫瘍生検から得られたものではなく、患者の血漿または血清のサンプルから得られている。
【００２３】
したがって、第１の態様では、本発明は、がんワクチン、特に自家がんワクチンを製造するための方法に関し、前記製造方法は、以下のステップ：
ａ）がん患者から得られた血清または血漿のサンプルに含まれるタンパク質を抽出するステップ；および
ｂ）ステップａ）で抽出したタンパク質をヒドロキシアパタイトのおよび／またはリン酸三カルシウムの粒子と接触させるステップ
を含む。
【００２４】
「自家（autologous）」ワクチンとは、ワクチン接種することが意図される患者から腫瘍タンパク質／抗原が得られるワクチンを指す。
【００２５】
「患者」または「対象」は、ヒト、または動物、例えば、哺乳動物、特にイヌ、ウマもしくはネコである。
【００２６】
血清または血漿のサンプルは、典型的には、治療しようとする患者から採取された血液サンプルから得られる。血液を、最も重い成分を上清から分離するために、遠心分離にかける。この上清は、抗凝固血を含む場合は血漿を構成し、血液が自然に凝固した場合は血清を構成する。
【００２７】
「腫瘍タンパク質／抗原」の概念は、当業者によく知られている。これらは、腫瘍細胞によって特異的に発現されるタンパク質および／または分子であり、ＴおよびＢリンパ球によって認識することができる。
【００２８】
本発明によれば、腫瘍タンパク質／抗原は、治療しようとする患者から得られた血清または血漿のサンプルから直接抽出される。典型的には、血清または血漿のサンプルから抽出された腫瘍タンパク質／抗原の質量は、６０ｋＤａ〜１３０ｋＤａ、特に７０ｋＤａ〜１１０ｋＤａである。
【００２９】
当業者は、血清または血漿のサンプルからタンパク質を抽出するための数多くの技術を知っている。典型的には、腫瘍タンパク質／抗原は、血清サンプルを生理食塩水で沈殿させることによって抽出され、そうして得られた混合物は次に遠心分離され、得られたペレットは抽出されたタンパク質を表す。
【００３０】
一つの特定の実施形態では、本発明に係るワクチンを製造するために、血漿／血清から抽出されたすべてのタンパク質／抗原が使用され、接触される。すなわち、血漿／血清から抽出されたタンパク質／抗原の「ペレット」全体がヒドロキシアパタイト粒子と接触される。
【００３１】
「ヒドロキシアパタイト」は、式Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２のリン酸カルシウムファミリーの鉱物であり、結晶構造の単位格子は六角形である。ヒドロキシアパタイトは、アパタイトグループのヒドロキシル化メンバーである。結晶単位格子のイオンは、電荷やサイズの近い他のイオンで置き換えることができ、また単位格子には、特定のアミノ酸などの小分子を収容できるトンネルもある。これらはこの鉱物に非常に特殊な吸着特性を与える特有の特徴である。
【００３２】
本発明に係るヒドロキシアパタイト粒子は、出願ＷＯ２０１４／１８４５５３（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているのと同じ方法で得られる。この文書は、特に、高温での低速の沈殿を含む、塩基性媒体中でのカルシウム塩とリン塩の複分解により得られた、リン酸カルシウムハイドロキシアパタイトＣａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２粒子を製造する方法を記載している。反応は一定温度で大きな反応容量で行われ、これに熟成段階と水洗段階が続く。このようにして得られた沈殿物は、固溶分離（solid/solution separation）のさらなる変換ステップを経る。この後者のステップは、ろ過、蒸気処理（stoving）による乾燥および破砕、または流動床を使用した噴霧乾燥のいずれかによって行われる。選択された固溶分離技術にかかわらず、粉末は、本発明の適用に特有の２つの変換ステップを経る：対象の粒子サイズ帯（２５μｍ未満、または２５から４５μｍ）のみを保持するための乾式ふるい分けによる粒子サイズ選択のステップ、次いで、粉末を適温で焼結する間の最終ステップであって、これにより、粒子（grain）の融合が確実となり、非常に特有の粉末の表面仕上げ（優位には３０ｍ２／ｇ以上）がもたらされる。これらの２つの最終ステップは、逆にする、すなわち、選択してから焼結しても、焼結してから選択してもよい。「焼結」とは、粉末を溶解させることなく加熱することを含むプロセスである。本発明の文脈において、焼結は、例えば、４００℃〜６００℃の温度で行われる。こうして得られたＨＡＰは、粉末形態であってよく、また１回以上洗浄してもよい。
【００３３】
典型的には、腫瘍タンパク質／抗原は、前記腫瘍タンパク質／抗原をクロマトグラフィーカラムなどのヒドロキシアパタイト粒子のカラムに通すことによって、ヒドロキシアパタイト粒子と接触させる。腫瘍抗原は、任意で、溶液中で接触させ、次に遠心分離によって洗浄してもよい。次に、腫瘍タンパク質／抗原をヒドロキシアパタイト粒子の表面に吸着させる。ヒドロキシアパタイト粒子は、特に粉末形態であってよい。
【００３４】
クロマトグラフィーカラムを使用する場合、例えば、圧力下に置くことができる。
【００３５】
ヒドロキシアパタイト粒子に腫瘍のタンパク質／抗原を一旦担持（load）したら、それらは注射液に懸濁され、血清／血漿サンプルが得られた患者に注射される。
【００３６】
典型的には、注射液は、カルボキシメチルセルロースなどの注入を容易にする有機剤を含む。
【００３７】
本発明の一態様は、がん患者の血清または血漿のサンプルから得られた腫瘍抗原を担持したヒドロキシアパタイトのおよび／またはリン酸三カルシウムの粒子を含む自家ワクチンである。
【００３８】
典型的には、自家ワクチンは懸濁液の形態である。
【００３９】
典型的には、血清または血漿のサンプルから抽出された腫瘍抗原の質量は、６０ｋＤａ〜１３０ｋＤａ、特に７０ｋＤａ〜１１０ｋＤａである。
【００４０】
１つの特定の実施形態によれば、自家ワクチンは、上記の方法に従って得られる。
【００４１】
したがって、本発明に係る自家ワクチンは、患者特異的な腫瘍抗原（前記患者の血清または血漿のサンプルから得られる）を吸着しており、かつ再懸濁されている、ＨＡＰのおよび／またはリン酸三カルシウムの粒子を含む。
【００４２】
次に、このワクチンは、好ましくは注射によって、例えば皮下注射または皮内注射によって投与される。ワクチンは、経口投与することも、経粘膜ワクチン接種を可能にするその他の手段によって投与することもできる。
【００４３】
本発明はまた、治療、特に腫瘍タンパク質／抗原が得られた患者のがんの治療におけるその使用のための、上記方法に従って得られた自家ワクチンの使用に関する。
【００４４】
本発明の別の態様はまた、がん患者を治療する方法に関し、前記方法は、以下のステップ：
ａ）がん患者から得られた血清または血漿のサンプルに含まれるタンパク質を抽出するステップ；
ｂ）ステップａ）で抽出したタンパク質をヒドロキシアパタイトのおよび／またはリン酸三カルシウムの粒子と接触させるステップ；
ｃ）ステップｂ）でタンパク質と接触させたヒドロキシアパタイトのおよび／またはリン酸三カルシウムの粒子を注射液に懸濁するステップ；
ｄ）ステップｃ）で得られた混合物を、ステップａ）で使用された血清または血漿のサンプルを得た患者に注射するステップ
を含む。
【００４５】
本発明の文脈において、「がん」は、免疫療法が適応とされ得る任意のがんであってよい。がんは、上皮細胞および／または腺細胞から発生する黒色腫、癌腫または腺癌、結合組織または筋肉組織細胞から発現する肉腫、中枢神経系腫瘍、白血病およびリンパ腫などの造血系腫瘍を含めた非網羅的なリストから特に選択され得る。また、感染症に由来するさまざまながんを含めることもでき、その最も代表的なものは、子宮頸癌、肝臓の原発性癌、および胃癌である。
【００４６】
一つの特定の実施形態では、がんは、骨肉腫、ＢまたはＴリンパ腫、乳腺腫瘍、黒色腫、血管肉腫、肥満細胞腫、線維肉腫、脳または中枢神経系腫瘍、シュワン細胞腫、中皮腫、セミノーマ、テラトーマおよび膠芽腫からなる群から選択される。
【００４７】
一つの好ましい実施形態では、がんは、膠芽腫、肉腫（骨肉腫または線維肉腫など）、黒色腫、癌腫、または腺癌から選択される。
【００４８】
一つの特定の実施形態では、がんは、播種性癌、すなわち転移性を有するがんである（ＴＮＭ分類によるＮｘＭｘカテゴリーに分類される患者）。
【００４９】
患者は単回または多回の注射、ワクチンの投与を受けることができる。一回量（dose）は、一般に、３０〜５０ｍｇのヒドロキシアパタイトおよび／またはリン酸三カルシウムならびに１０００〜２０００μｇのタンパク質を含む。
【００５０】
好ましくは、患者は、時間の間隔を空けて、例えば、数日、数週、または数ヶ月の間隔で数回の注射を受けることができる。好ましい実施形態では、注射は、最初の月の間は１週間の間隔、次の４か月間は１か月の間隔を空ける。
【００５１】
各注射は、ワクチンからの逃避（escape）または無効の兆候が見られた場合、特に腫瘍マーカーのレベルが上昇した場合は、理想的には、患者からの新しい腫瘍タンパク質サンプルから調製することができる。
【００５２】
本発明のワクチンは、腫瘍生検を用いる技術と比較して、タンパク質を細胞質内区域から抽出する必要がないというプロトコルのかなりの進化を表す。
【００５３】
注射用に準備された粉末に固定されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動は、タンパク質バンドが腫瘍生検によって得られたもの（出願ＷＯ２０１４／１８４４５３のように）のバンドとは異なることを示す。さらに、以下に示すように、本発明に係るワクチンで得られた結果は良好であり、あるいはより良好である。
【００５４】
本発明に係る自家ワクチンは、放射線療法、化学療法、または別の免疫療法剤などの別の抗癌治療と組み合わせて使用することができる。
【００５５】
本発明を、以下の実施例においてより詳細に示す。これらの例は、例示のみを目的として提供され、本発明の範囲を限定するものと解釈されることはない。
【実施例】
【００５６】
本発明のプロトコルは、予後が非常に悪い病態を示し、その時点で使用されている治療法では治癒できない患者で実施した。患者は、参加を明示的に求め、インフォームドコンセントに署名することによって本プロトコルに参加した。
【００５７】
本プロトコルは、従来の治療法の失敗後の最終選択治療として、任意に化学療法または他の免疫療法と組み合わせて、播種性がんに適応することができる。術後に有効な治療法がないがんの再発の防止も想定され得る。
【００５８】
２７人の患者がこのプロトコルに組み込まれた。９人の患者は化学療法による治療を追加することなく該免疫療法プロトコルに従った。１０人の患者は膠芽腫、２人は肉腫、１５人は癌腫または腺癌を有していた。２２人の患者は免疫療法プロトコルを適用したときに進行性疾患を有しており、これらの患者のうち１３人は、プロトコル開始後５ヶ月で、疾患を有しないか、安定的な疾患または部分的退行を示した。膠芽腫を除くと、ワクチン接種時に進行性疾患に罹患していた患者の７２％は、ワクチン接種の２か月後に、安定（ＳＤ：stable state）または部分退行（ＰＲ：partial regression）に移行した。結論として、このシリーズは不均一ではあるが、かなりの割合の症例がこの最終選択の技術に臨床反応を示し、副作用は発生しなかった。播種性がんは、この技術によって安定化することができ、急速に進行した進行性疾患であっても、ヒトにおいて免疫応答が得られることを示している。
【００５９】
実施例１：血清または腫瘍生検と接触した粉末に吸着されたタンパク質の電気泳動の違い
生検あるいは血清タンパク質から調製したワクチンに含まれるタンパク質の電気泳動を比較した。
【００６０】
ＨＡＰ粒子は、典型的には、出願ＷＯ２０１４／１８４５５３の実施例１に記載の方法に従って得られたものである。
【００６１】
一回量（doses）は以下のように調製した：
【００６２】
−生検から開始：
ワクチンを調製するために使用される腫瘍組織およびすべての材料は、層流フードにおいて無菌的に扱った。組織用ボールホモジナイザーを使用して、凍結腫瘍組織（２００ｍｇ）をホモジナイズした。ホモジネート１ｍｌあたり１ｍｌのＮａＨＣＯ３（３０ｍＭ、ｐＨ７）を添加した。
【００６３】
次に、組織残渣をすべて除去するために、得られたホモジネートを１０００ｇで１５分間、４℃で遠心分離した。上清を硝酸アンモニウムの過飽和溶液中に５０％で混合し、４℃に１時間留置してから遠心分離する。ペレットを０．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７に再懸濁する。次に、この溶液を、ＨＡＰ粉末を含むクロマトグラフィーカラムに浸透させる。カラム（Ｐｏｌｙ−ｐｒｅｐクロマトグラフィーカラム、Ｃａｔ．７３１−１５５０、ＢｉｏＲａｄ）に０．２ｇのＨＡＰ（０〜２５μｍ）を充填し、１０倍量のリン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７）で平衡化した。次に、再懸濁したペレットを添加した。次に、カラムを３ｍｌの１００ｍＭ  ＮａＣｌ溶液で洗浄した。次に、粉末を５ｍｌのカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）溶液（２０ｍＭ  ＮａＣｌ中２％）に懸濁した。この溶液０．５ｍｌを各ワクチン注射に使用した。
【００６４】
−血清から開始：
手順ははるかに簡単であり、３ｃｃの血清を過飽和硝酸アンモニウム溶液中５０％に希釈し、４℃に１時間留置し、その後遠心分離する。ペレットを０．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７に再懸濁する。次に、この溶液を、ＨＡＰ粉末を含むクロマトグラフィーカラムに浸透させる。カラム（Ｐｏｌｙ−ｐｒｅｐクロマトグラフィーカラム、Ｃａｔ．７３１−１５５０、ＢｉｏＲａｄ）に０．２ｇのＨＡＰ（０−２５μｍ）を充填し、１０倍量のリン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７）で平衡化した。次に、再懸濁したペレットを添加した。次に、カラムを３ｍｌの１００ｍＭ  ＮａＣｌ溶液で洗浄した。次に、粉末を５ｍｌのカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）溶液（２０ｍＭ  ＮａＣｌ中２％）に懸濁した。この溶液０．５ｍｌを各ワクチン注射に使用した。
【００６５】
いずれの電気泳動の場合も、粉末上に吸着されたタンパク質は電気泳動前に脱離する。ワクチン投与薬の粉末１０ｍｇを５００ｇで２分間遠心分離する。上清を除去し、ペレットを０．５ｍｌの０．５Ｍ  ＮａＣｌに再懸濁する。粉末を撹拌して再懸濁し、５００ｇで遠心分離する。次に、１０μｌの上清液を界面活性剤中に５０％に希釈し、７０℃で５分間加熱した後、電気泳動ウェルに投入する。
【００６６】
結果：
２つの方法で得られた電気泳動プロファイルには顕著な違いがある。最も顕著なのは、生検由来のものと比較して、血液由来の電気泳動におけるバンド数の減少である（図１、２）。また、血液由来の電気泳動ははるかに均質であり、精製の再現性がより良好であることを示している。
【００６７】
実施例２：腺癌患者への本発明に係るワクチンの投与の結果
この患者は、術前および術後に２サイクルのパクリタキセルおよびカルボプラチンで治療した子宮内膜腺癌（ＴＮＭ  ７ａ）を呈していた。患者が肺の粟粒陰影（pulmonary miliaria）および後腹膜部位への二次転移を示してから１８か月後、彼女はホルモン療法（酢酸メゲストロール）を受け、ワクチン接種を開始した。ワクチン接種の３か月後（ＭＲＩ、ＰＥＴ）、彼女は肺病変の安定化と後腹膜腫瘤の体積のわずかな退行を示し、これはその後も継続し、１８ヶ月で後腹膜腫瘤は実質的に消失し、肺の粟粒陰影はまだ存在するも退行していた。この部分退行は、２年半の観測後も依然として安定している。
【００６８】
この例は、血清タンパク質を用いたワクチン接種の臨床効果が３０か月を超えるかなりの期間にわたって維持され得ることを示す。
【００６９】
実施例３：結腸腺癌患者への本発明に係るワクチンの投与の結果
この患者は、外科的におよびアドリアマイシンで治療された結腸腺癌を呈していた。３年後、肺転移と肝転移が見られたが、肺葉と肝臓葉に限局していたため、肺および肝臓の手術とその後の化学療法が可能であった。５年後、ゲムシタビン、カペシタビン、およびベバシズマブによる化学療法が、多数の肝および後腹膜リンパ節転移の再発後に開始された。化学療法にもかかわらず、疾患は進行し続けた。肺塞栓症に続く化学療法の中止後、腫瘍マーカー（ＡＣＥ）が急激に上昇した。患者を血清タンパク質を用いたワクチン接種によって治療すると（最初の月に１週間間隔で４回の注射、その後１か月に１注射）、マーカーレベルの著しい低下がもたらされた。その後、マーカーは３か月後に再上昇し、ワクチン接種前に実施されたのと同じＰＥＴ（陽電子放出断層撮影）によって、腫瘍のワクチン逃避が示唆された。そのため、別の血清サンプルを用いて別の調製物を製造し、３週間毎に注射し、これにより、３か月未満でマーカーが正常値を下回る結果となった。ＰＥＴにより、免疫療法の開始から１年後に肝転移の壊死が明らかとなった。
【００７０】
結論：血液から製造されたワクチンは、最初のステップとして、細胞増殖マーカーによって検出可能な細胞増殖を阻害し、その後、数ヶ月から１年というはるかに長い期間にわたってＰＥＴによって検出可能な遅延効果を示す。
【００７１】
実施例４：血液から調製したワクチンによるワクチン接種後の抗膠芽腫血清抗体。
この患者は、右側側頭部のステージＩＶ膠芽腫の発見および外科的生検の６か月後にワクチン接種を受けた。第一選択療法は、放射線療法と交互に行うテモダールに基づくＳｔｕｐｐプロトコル（Ｓｔｕｐｐ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ｐｌｕｓ  Ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００５；３５２：９８７−９９６）であった。血清タンパク質を用いたワクチン接種は、患者の生存期間中、１週間間隔で１か月間４回注射し、その後１か月に１回注射する頻度で行った。患者は、１０か月間の完全寛解を維持し、死亡前の２か月間は進行した（ＲＥＣＩＳＴ基準）。腫瘍細胞に対する抗体が存在するかどうかを確認するために、患者の腫瘍生検の切片で血清抗体（ＩｇＧ）の存在を試験した。
【００７２】
５μｍ厚のパラフィン包埋組織切片を使用した。これらをキシロールで脱パラフィンし、エタノール還元溶液で再水和する。内因性ペルオキシダーゼはＨ２Ｏ２で阻害する。患者の血清をＨｅｐｅｓ緩衝液中に１／１００に希釈したが、これは、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧを使用するマーカーにおいて一次抗体として機能する。次に、ペルオキシダーゼを、過酸化水素の存在下で酸化したＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）を用いて呈色すると、該ペルオキシダーゼはアルコール不溶性の褐色の沈着物を生成する（図３）。ネガティブコントロールは、一次抗体（希釈血清）なしで同条件下で処理した切片である。
【００７３】
標識は、腫瘍細胞の大部分が陽性であることを示しているが、その一部は陽性ではないことに留意すべきである。これは、ワクチンが腫瘍細胞に対する応答を引き起こし、生検とワクチン製造との間の期間は、すべてのクローンがワクチンに表れているわけではないことを意味したことを示唆している。
【００７４】
この組織学的結果は、血清タンパク質のワクチン接種が体液性抗腫瘍免疫応答を引き起こすことを示す。
【００７５】
実施例５：腫瘍生検から製造したワクチンによって誘導された陽性ＥＬＩＳＰＯＴの比率と血清から製造したワクチンによって誘導された陽性ＥＬＩＳＰＯＴの比率との差
血液または生検から製造したワクチンによって誘導されたＣＤ８刺激を比較した。これは、生検が入手可能であるかに応じて生検または血清のサンプルを採取した、さまざまながん性病変を有する一連の患者で行われた。Ｅｌｉｓｐｏｔによって検出された細胞性免疫の刺激は、必ずしも臨床結果と相関しているわけではないことに留意されたい。ＥｌｉｓｐｏｔはすべてのＣＤ８刺激状態を検出するわけではない。ＥＬＩＳＰＯＴ試験は、各患者において、５回目の注射時、すなわち最初のワクチン接種から３か月後に行った。
【００７６】
１０ｍｌの血液をクエン酸チューブに収集し、サンプリングしてから４時間以内に、ｆｉｃｏｌｌ  ４００中で遠心分離する。次に、有核細胞をＲＰＭＩ培地で洗浄し、２×１０５細胞／ウェルの濃度で、ワクチンタンパク質でコーティングしたウェルで培養する。ワクチンタンパク質は、ワクチンの電気泳動の実施について前述したようにして得られる。１０ｍｇのタンパク質を担持させた粉末を０．５ｍｌの０．２Ｍ  ＮａＣｌで洗浄する。プレートのコーティングには、溶液を０．０２Ｍに戻す。次に、細胞を、５％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩで、５％ＣＯ２のインキュベータにおいて３７℃で一晩培養する。次に、細胞を、０．１％のＴｗｅｅｎ２０界面活性剤を含むＰＢＳで１０分間洗浄する。次に、ウェルを、０．１％のＢＳＡおよび１／１０００に希釈したペルオキシダーゼ標識抗インターフェロンガンマ抗体を含む１ｍｌのＰＢＳ中で１時間インキュベートする。次に、ペルオキシダーゼを実施例４のように呈色する。
【００７７】
１５人の患者を血清から製造したワクチンでワクチン接種し、１３人を腫瘍生検から製造したワクチンでワクチン接種した。５回目の注射、すなわちワクチン接種の３か月めにＥＬＩＳＰＯＴを実施した。ネガティブコントロールは、同じタイプの腫瘍を有するワクチン非接種の患者の血液である。血清を使用してワクチン接種した１５人中１４人の患者はＥＬＩＳＰＯＴが陽性であり、一方、生検を用いてワクチン接種した患者１３人中６人のみがＥＬＩＳＰＯＴが陽性であった。これは統計的に異なる差である。
【００７８】
これらの様々な結果に照らして、電気泳動によって見える組成の違い、ならびに臨床的におよび生物学的に観察された結果を考慮すると、本方法を用いて得られたワクチンには驚くべき効果がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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