(57)【要約】  本発明は、組み換え酵母、構築方法、並びに、その組み換え酵母を用いたチロソール及び誘導体の製造方法に関し、前記組み換え酵母はエリトロース−４−リン酸とホスホエノールピルビン酸からチロソールを合成する代謝経路を備えるように改変させた酵母細胞に、外因性のフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの発現遺伝子を導入して構築されたものである。本発明は、酵母においてフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼを発現する時、フルクトース−６−リン酸がフルクトース−１，６−ビスリン酸を合成すると同時に、触媒されてエリスロース−４−リン酸及びリン酸アセチルになり、キシルロース−５−リン酸が触媒されてグリセルアルデヒド−３−リン酸及びリン酸アセチルになることを初めて開示する。これにより、酵母における炭素代謝フラックス分布が変わって、チロソール生合成の重要な中間体、エリスロース−４−リン酸の合成が増強され、チロソール合成の代謝経路が最適化され、チロソール及びヒドロキシチロソール等誘導体の収率が向上する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エリトロース−４−リン酸とホスホエノールピルビン酸からチロソールを合成する代謝経路を備えるように改変させた酵母細胞に、外因性のフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの発現遺伝子を導入して構築されたチロソール及び誘導体の生産に利用できる組み換え酵母。
【請求項２】
前記改変させた酵母細胞は、芳香族アルデヒド合成酵素及びコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼを組み込むことによって、又は芳香族アルデヒド合成酵素を組み込むことによって得られ、
好ましくは、前記芳香族アルデヒド合成酵素はパセリに由来し、酵素番号はＥＣ４．１．１．２５であり、前記コリスミ酸ムターゼは大腸菌に由来し、酵素番号はＥＣ１．３．１．１２、ＥＣ５．４．９９．５であり、前記プレフェン酸デヒドラターゼは大腸菌に由来し、酵素番号は５．４．９９．５であることを特徴とする請求項１に記載の組み換え酵母。
【請求項３】
前記フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの発現遺伝子はビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンティウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、リゥコノストック・メゼンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ビフィドバクテリウム・モンゴリエンセ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｏｎｇｏｌｉｅｎｓｅ）、ラクトバチルス・パラプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ビフィドバクテリウム・シュードロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、ロドトルラ・グラミニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、サッカロミケス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）等に由来し、
好ましくは、前記フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼのアミノ酸配列は配列番号１又は配列番号２に記載のとおりであり、発現遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号３又は配列番号４に記載のとおりであり、
好ましくは、前記フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼのアミノ酸配列は配列番号３０に記載のとおりであり、発現遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号３１に記載のとおりであることを特徴とする請求項１に記載の組み換え酵母。
【請求項４】
前記酵母細胞は、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、シゾサッカロミケス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロマイセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、カンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、トルロプシス・グラブラタ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｇｌａｂｒａｔａ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、ロドトルラ・グラミニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、サッカロミケス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、チゴサッカロミケス・ルキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、トルラスポラ・デルブルツキ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、デバリオミセス・ハンゼニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）、シェフェルソマイセス・スティピィティス（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔｅｓ）、メイエロザイマ・ギリエルモンディイ（Ｍｅｙｅｒｏｚｙｍａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、ロデロマイセス・エロンギスポラス（Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・オルソプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｏｒｔｈｏｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・メタプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍｅｔａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・デュブリニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）、クラビスポラ・ルシタニアエ（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ  ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、カンジダ・アウリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｕｒｉｓ）等であり、
好ましくは、前記酵母細胞は、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり、菌種番号はＣＩＣＣ１９６４であり、前記クルイベロマイセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）であり、菌種番号はＮＢＲＣ１７７７であり、
好ましくは、前記改変させた酵母細胞は、パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）に由来する芳香族アルデヒド合成酵素をサッカロミケス・セレビシエＣＩＣＣ１９６４のデルタ（ｄｅｌｔａ）１２サイトに組み込むことによって得られ、
より好ましくは、前記改変させた酵母細胞は、パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）に由来する芳香族アルデヒド合成酵素をサッカロミケス・セレビシエＣＩＣＣ１９６４のデルタ（ｄｅｌｔａ）１２サイトに組み込み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼでサッカロミケス・セレビシエＣＩＣＣ１９６４のｐｄｃ１遺伝子を置き換えることによって得られ、
好ましくは、前記改変させた酵母細胞は、パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）に由来する芳香族アルデヒド合成酵素をクルイベロマイセス・マルシアヌスＮＢＲＣ１７７７のデルタ（ｄｅｌｔａ）１２サイトに組み込むことによって得られ、
より好ましくは、前記改変させた酵母細胞は、パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）に由来する芳香族アルデヒド合成酵素をクルイベロマイセス・マルシアヌスＮＢＲＣ１７７７のデルタ（ｄｅｌｔａ）１２サイトに組み込み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼでクルイベロマイセス・マルシアヌスＮＢＲＣ１７７７のｐｄｃ１遺伝子を置き換えることによって得られることを特徴とする請求項１に記載の組み換え酵母。
【請求項５】
（１）発現カセットを構築するステップであって、発現カセットはプロモータ、ターミネータ、ホモロジーアーム及びフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの発現遺伝子を融合させて得られるステップと、
（２）改変させた酵母細胞に、ステップ（１）によって構築された発現カセットを形質転換して、チロソール高生産性組み換え酵母を得るステップとを含み、
前記改変させた酵母細胞はエリトロース−４−リン酸とホスホエノールピルビン酸からチロソールを合成する代謝経路を備える酵母細胞であることを特徴とするチロソール高生産性組み換え酵母の構築方法。
【請求項６】
前記ステップ（１）で、フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの発現遺伝子はビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンティウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、リゥコノストック・メゼンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ビフィドバクテリウム・モンゴリエンセ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｏｎｇｏｌｉｅｎｓｅ）、ラクトバチルス・パラプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ビフィドバクテリウム・シュードロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、ロドトルラ・グラミニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、サッカロミケス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）等に由来し、
好ましくは、前記フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼのアミノ酸配列は配列番号１又は配列番号２に記載のとおりであり、発現遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号３又は配列番号４に記載のとおりであり、
好ましくは、前記フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼのアミノ酸配列は配列番号３０に記載のとおりであり、発現遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号３１に記載のとおりであり、
好ましくは、前記ステップ（１）で、ホモロジーアームはサッカロミケス・セレビシエ菌株ＣＩＣＣ１９６４又はクルイベロマイセス・マルシアヌスＮＢＲＣ１７７７のゲノムをテンプレートとし、プライマーを利用してプレフェン酸デヒドラターゼ（ｐｒｅｐｈｅｎａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）遺伝子ｐｈａ２の上流及び下流を５００ｂｐ増幅させた遺伝子断片であり、前記上流ホモロジーアームの増幅プライマーのヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号５、配列番号６に記載のとおりであり、下流ホモロジーアームの増幅プライマーのヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号７、配列番号８に記載のとおりであり、
好ましくは、前記ステップ（１）で、プロモータはサッカロミケス・セレビシエ菌株ＣＩＣＣ１９６４又はクルイベロマイセス・マルシアヌスＮＢＲＣ１７７７のゲノムをテンプレートとし、プライマーを利用して増幅させたプロモータｔｐｉ１であり、前記プロモータｔｐｉ１の増幅プライマーのヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号９、配列番号１０に記載のとおりであり、
好ましくは、前記ステップ（１）で、ターミネータはサッカロミケス・セレビシエ菌株ＣＩＣＣ１９６４又はクルイベロマイセス・マルシアヌスＮＢＲＣ１７７７のゲノムをテンプレートとし、プライマーを利用して増幅させたターミネータｇｐｍ１であり、前記ターミネータｇｐｍ１の増幅プライマーのヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号１１及び配列番号１２に記載のとおりであり、
好ましくは、前記ステップ（２）で、改変させた酵母細胞は芳香族アルデヒド合成酵素及びコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼを組み込むことによって、又は芳香族アルデヒド合成酵素を組み込むことによって得られ、
より好ましくは、前記ステップ（２）で、芳香族アルデヒド合成酵素はパセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）に由来し、酵素番号はＥＣ４．１．１．２５であり、前記コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来し、酵素番号はＥＣ１．３．１．１２、ＥＣ５．４．９９．５であり、
好ましくは、前記ステップ（２）で、前記酵母細胞は、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、シゾサッカロミケス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロマイセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、カンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、トルロプシス・グラブラタ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｇｌａｂｒａｔａ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、ロドトルラ・グラミニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、サッカロミケス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、チゴサッカロミケス・ルキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、トルラスポラ・デルブルツキ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、デバリオミセス・ハンゼニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）、シェフェルソマイセス・スティピィティス（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔｅｓ）、メイエロザイマ・ギリエルモンディイ  （Ｍｅｙｅｒｏｚｙｍａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、ロデロマイセス・エロンギスポラス（Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・オルソプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｏｒｔｈｏｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・メタプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍｅｔａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・デュブリニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）、クラビスポラ・ルシタニアエ（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ  ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、カンジダ・アウリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｕｒｉｓ）等であり、
より好ましくは、前記酵母細胞は、サッカロミケス・セレビシエであり、菌種番号はＣＩＣＣ１９６４であり、前記クルイベロマイセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）であり、菌種番号はＮＢＲＣ１７７７であり、
より好ましくは、前記ステップ（２）で、改変させた酵母細胞は、パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）に由来する芳香族アルデヒド合成酵素をサッカロミケス・セレビシエＣＩＣＣ１９６４のデルタ（ｄｅｌｔａ）１２サイトに組み込むことによって得られ、
さらに好ましくは、前記ステップ（２）で、改変させた酵母細胞は、パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）に由来する芳香族アルデヒド合成酵素をサッカロミケス・セレビシエＣＩＣＣ１９６４のデルタ（ｄｅｌｔａ１２）サイトに組み込み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼでサッカロミケス・セレビシエＣＩＣＣ１９６４のｐｄｃ１遺伝子を置き換えることによって得られ、
より好ましくは、前記ステップ（２）で、前記改変させた酵母細胞は、パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）に由来する芳香族アルデヒド合成酵素をクルイベロマイセス・マルシアヌスＮＢＲＣ１７７７のデルタ（ｄｅｌｔａ）１２サイトに組み込むことによって得られ、
さらに好ましくは、前記改変させた酵母細胞は、パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）に由来する芳香族アルデヒド合成酵素をクルイベロマイセス・マルシアヌスＮＢＲＣ１７７７のデルタ（ｄｅｌｔａ）１２サイトに組み込み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼでクルイベロマイセス・マルシアヌスＮＢＲＣ１７７７のｐｄｃ１遺伝子を置き換えることによって得られることを特徴とする請求項５に記載の構築方法。
【請求項７】
請求項５もしくは請求項６に記載の方法で構築されたチロソール高生産性組み換え酵母を用いるチロソール及びその誘導体の生産方法。
【請求項８】
チロソールの発酵製造において、発酵培地に少なくともグルコース、フルクトース、スクロースの１種又は２種以上の組み合わせ及びチロシンが含まれることが好ましい、請求項７に記載のチロソール及びその誘導体の生産方法。
【請求項９】
請求項７に記載のチロソール高生産性組み換え酵母を用いるヒドロキシチロソールの生産方法。
【請求項１０】
請求項７に記載のチロソール高生産性組み換え酵母を発酵させることによってチロソールを製造した後、４−ヒドロキシフェニル酢酸ヒドロキシラーゼによって反応させてヒドロキシチロソールを得、
好ましくは、４−ヒドロキシフェニル酢酸ヒドロキシラーゼを過剰発現する大腸菌で、請求項８に従って製造されたチロソールを触媒することによって、ヒドロキシチロソールを得、
より好ましくは、前記発酵の発酵培地に少なくともグルコース、フルクトース、スクロースの１種又は２種以上の組み合わせ及びチロシンが含まれることを特徴とするヒドロキシチロソールの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物遺伝子工学の技術分野に属し、組み換え酵母、構築方法、並びに、その組み換え酵母を用いたチロソール及び誘導体の製造方法に関し、特に、外因性のフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｋｅｔｏｌａｓｅ、略称ｆｘｐ）の発現遺伝子を酵母に導入し、当該菌株を用いてチロソール及びその誘導体を効率的に生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
チロソールは、オリーブ油に由来する天然の抗酸化物質であり、フェネチルアルコールの誘導体である。コウケイテン（和名イワベンケイ）の主な薬用有効成分として知られ、サリドロシド、ヒドロキシチロソールの前駆体である。細胞を酸化損傷から防御する効果が認められることから、産業上価値の高いフェノール類化合物とされる。チロソール及びその誘導体は様々な有機化合物の合成の前駆体である。チロソールは医薬品に使用することができ、チロソールの誘導体、ヒドロキシチロソールは、抗酸化作用に優れ、様々な生理的・医学的機能を持ち、チロソールよりも抗酸化能が高く、様々なポリマーの合成に使うことができ、しかも毒性を持たないため、生物医学、機能性食品等分野で心血管疾患、骨減少症等の予防など幅広く用いられる。現在、ヒドロキシチロソールはオリーブの葉から抽出したのがほとんどで、コストが高く、オリーブの栽培には大量の農地が必要になる。
【０００３】
化学的手法で合成する場合、フェネチルアルコールが用いられ、その多くはヒドロキシ基保護を行いながら、硝化、還元、ジアゾ化、加水分解という手順でｐ−ヒドロキシフェネチルアルコールを得る。収率は７０％と低く、高価なフェネチルアルコールを原料とするため、原料の確保に問題がある。ニトロトルエンから合成する場合は、価格は安いが工程が長く、全工程収率も低い。ｐ−ヒドロキシスチレンから合成する場合は、収率が９６％、純度が９９％とある程度価値が認められるが、原料コストが高いのは問題である。このように化学的手法でチロソールを製造する場合、製造コストが高く、環境に優しくない。これらの理由からチロソールの大量生産が制限され、生物学的手法によるチロソール及びその誘導体の合成は、研究のホットスポットになっている。
【０００４】
チロソール（Ｔｙｒｏｓｏｌ）の化学名は、４−（２−ヒドロキシエチル）フェノール（４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｏｌ）であり、分子式はＣ８Ｈ１０Ｏ２であり、分子量は１３８．１６４であり、ＣＡＳ登録番号は５０１−９４−０である。構造式は次に示すとおりである。
【０００５】
【化１】
2021522852.tif 000002
【０００６】
特許文献１には、チロソール及びヒドロキシチロソールを生産する酵母及びその構築方法を開示されている。ＰｃＡＡＳ及びＡＤＨ配列を酵母ＢＹ４７４１に導入し、チロソールを生産するＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ組み換え酵母を得るステップと、前記ＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ組み換え酵母にｐｄｃ１遺伝子ノックアウトカセット、ｔｙｒＡ発現カセットを導入してチロソールを生産するＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ−Δｐｄｃ１−ｔｙｒＡ組み換え酵母を得るステップと、ＨｐａＢＣのＤＮＡ配列をＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ−Δｐｄｃ１−ｔｙｒＡ組み換え酵母に導入して、ヒドロキシチロソールを生産するＰｃＡＡＳ−ＡＤＨ−ＨｐａＢＣ−Δｐｄｃ１−ｔｙｒＡ組み換え酵母を得るステップとを含む。酵母ＢＹ４７４１を用いてチロソール又はヒドロキシチロソールの生合成経路を構築し、チロソール又はヒドロキシチロソールの生産量を高めるというものである。しかし、当該技術により酵母におけるチロソールの生産量を向上させたものの、大量生産を満たすほどの生産量ではない。酵母によるチロソール合成は様々な代謝経路から影響を受け、関連の代謝経路はまだ完全に解明されておらず、酵母発酵によるチロソール生産の産業化をどのように実現するかは解決すべき課題である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＣＮ１０８７５３６３６Ａ
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６０，９７９−９８４，２０１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、従来技術の欠点に対し、組み換え酵母、構築方法、並びに、その組み換え酵母を用いたチロソール及び誘導体の製造方法を提供する。
【００１０】
本発明の第１態様は、発明特許出願（出願番号２０１８１０６０１２１３．８）を踏まえ、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、菌種番号ＡＴＣＣ  １５７０３）に由来するフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｋｅｔｏｌａｓｅ、ＥＣ４．１．２．２２、アミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＦ３９４６８．１に記載、配列番号１）又はビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）ＢＢＲＩ４に由来するフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｋｅｔｏｌａｓｅ、ＥＣ４．１．２．２２、アミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ：ＫＮＤ５３３０８．１に記載、配列番号２）の遺伝子断片等を酵母において発現するものであり、フルクトース−６−リン酸の触媒により、チロソールの生合成の重要な前駆体であるエリスロース−４−リン酸を生成するという新規な経路を構築することにより、チロソールの収率を高めることを特徴とする。
【００１１】
本発明の第２態様は、ヒドロキシチロソールの生産方法を提供する。
【００１２】
本発明の第３態様は、チロソール生産酵母の構築方法を提供する。
【００１３】
本発明の第４態様は、チロソールの生産におけるチロソール生産酵母又は構築方法の用途を提供する。
【００１４】
本発明の第５態様は、ヒドロキシチロソールの生産におけるチロソール生産酵母又は構築方法の用途を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明が上記の課題を解決するために採用する技術的解決手段は以下のとおりである。
エリトロース−４−リン酸とホスホエノールピルビン酸からチロソールを合成する代謝経路を備えるように改変させた酵母細胞に、外因性のフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの発現遺伝子を導入して構築されたチロソール及び誘導体の生産に利用できる組み換え酵母である。
【００１６】
本発明において、好ましくは、前記改変させた酵母細胞は、芳香族アルデヒド合成酵素及びコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼを組み込むことによって、又は芳香族アルデヒド合成酵素を組み込むことによって得られる。
本発明において、より好ましくは、前記芳香族アルデヒド合成酵素はパセリに由来し、酵素番号はＥＣ４．１．１．２５であり、前記コリスミ酸ムターゼは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来し、酵素番号はＥＣ１．３．１．１２であり、前記プレフェン酸デヒドラターゼは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来し、酵素番号はＥＣ１．３．１．１２、ＥＣ５．４．９９．５である。
【００１７】
本発明において、好ましくは、前記フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの発現遺伝子はビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンティウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、リゥコノストック・メゼンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ビフィドバクテリウム・モンゴリエンセ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｏｎｇｏｌｉｅｎｓｅ）、ラクトバチルス・パラプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ビフィドバクテリウム・シュードロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、ロドトルラ・グラミニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、サッカロミケス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）等に由来する。
【００１８】
好ましくは、前記フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼのアミノ酸配列は配列番号１又は配列番号２に記載のとおりであり、発現遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号３又は配列番号４に記載のとおりである。
好ましくは、前記フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼのアミノ酸配列は配列番号３０に記載のとおりであり、発現遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号３１に記載のとおりである。
【００１９】
本発明において、好ましくは、前記酵母細胞は、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、シゾサッカロミケス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロマイセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、カンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、トルロプシス・グラブラタ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｇｌａｂｒａｔａ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、ロドトルラ・グラミニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、サッカロミケス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、チゴサッカロミケス・ルキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）、カンジダ・グラブラータ （Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、トルラスポラ・デルブルツキ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、デバリオミセス・ハンゼニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）、シェフェルソマイセス・スティピィティス（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔｅｓ）、メイエロザイマ・ギリエルモンディイ（Ｍｅｙｅｒｏｚｙｍａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、ロデロマイセス・エロンギスポラス（Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・オルソプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｏｒｔｈｏｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・メタプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍｅｔａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・デュブリニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）、クラビスポラ・ルシタニアエ（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ  ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、カンジダ・アウリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｕｒｉｓ）である。
【００２０】
より好ましくは、前記酵母細胞は、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり、菌種番号はＣＩＣＣ１９６４であり、前記クルイベロマイセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）であり、菌種番号はＮＢＲＣ１７７７である。
【００２１】
本発明において、好ましくは、前記改変させた酵母細胞は、パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）に由来する芳香族アルデヒド合成酵素をサッカロミケス・セレビシエＣＩＣＣ１９６４のデルタ（ｄｅｌｔａ）１２サイトに組み込み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼでサッカロミケス・セレビシエＣＩＣＣ１９６４のｐｄｃ１遺伝子を置き換えることによって得られる。
【００２２】
（１）発現カセットを構築するステップであって、発現カセットはプロモータ、ターミネータ、ホモロジーアーム及びフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの発現遺伝子を融合させて得られるステップと、
（２）改変させた酵母細胞に、ステップ（１）によって構築された発現カセットを形質転換して、チロソール高生産性組み換え酵母を得るステップとを含み、
前記改変させた酵母細胞はエリトロース−４−リン酸とホスホエノールピルビン酸からチロソールを合成する代謝経路を備える酵母細胞である、チロソール高生産性組み換え酵母の構築方法である。
【００２３】
本発明において、より好ましくは、前記改変させた酵母細胞は、パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）に由来する芳香族アルデヒド合成酵素をサッカロミケス・セレビシエＣＩＣＣ１９６４のデルタ（ｄｅｌｔａ）１２サイトに組み込み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼでサッカロミケス・セレビシエＣＩＣＣ１９６４のｐｄｃ１遺伝子を置き換えることによって得られる。
本発明において、より好ましくは、前記改変させた酵母細胞は、パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）に由来する芳香族アルデヒド合成酵素をクルイベロマイセス・マルシアヌスＮＢＲＣ１７７７のデルタ（ｄｅｌｔａ）１２サイトに組み込み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼでクルイベロマイセス・マルシアヌスＮＢＲＣ１７７７のｐｄｃ１遺伝子を置き換えることによって得られる。
【００２４】
本発明において、好ましくは、前記ステップ（１）で、フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの発現遺伝子はビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・デンティウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）、リゥコノストック・メゼンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ビフィドバクテリウム・モンゴリエンセ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｏｎｇｏｌｉｅｎｓｅ）、ラクトバチルス・パラプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ビフィドバクテリウム・シュードロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、ロドトルラ・グラミニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、サッカロミケス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）等に由来する。
【００２５】
好ましくは、前記フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼのアミノ酸配列は配列番号１又は配列番号２に記載のとおりであり、発現遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号３又は配列番号４に記載のとおりである。
【００２６】
好ましくは、前記フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼのアミノ酸配列は配列番号３０に記載のとおりであり、発現遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号３１に記載のとおりである。
【００２７】
本発明において、好ましくは、前記ステップ（１）で、ホモロジーアームはサッカロミケス・セレビシエ菌株ＣＩＣＣ１９６４又はクルイベロマイセス・マルシアヌスＮＢＲＣ１７７７のゲノムをテンプレートとし、プライマーを利用してプレフェン酸デヒドラターゼ（ｐｒｅｐｈｅｎａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）遺伝子ｐｈａ２の上流及び下流を５００ｂｐ増幅させた遺伝子断片であり、前記上流ホモロジーアームの増幅プライマーのヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号５、配列番号６に記載のとおりであり、下流ホモロジーアームの増幅プライマーのヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号７、配列番号８に記載のとおりである。
本発明において、好ましくは、前記ステップ（１）で、プロモータはサッカロミケス・セレビシエ菌株ＣＩＣＣ１９６４又はクルイベロマイセス・マルシアヌスＮＢＲＣ１７７７のゲノムをテンプレートとし、プライマーを利用して増幅させたプロモータｔｐｉ１であり、前記プロモータｔｐｉ１の増幅プライマーのヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号５、配列番号６に記載のとおりである。
本発明において、好ましくは、前記ステップ（１）で、ターミネータはサッカロミケス・セレビシエ菌株ＣＩＣＣ１９６４又はクルイベロマイセス・マルシアヌスＮＢＲＣ１７７７のゲノムをテンプレートとし、プライマーを利用して増幅させたターミネータｇｐｍ１であり、前記ターミネータｇｐｍ１の増幅プライマーのヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号９、配列番号１０に記載のとおりである。
本発明において、好ましくは、前記ステップ（２）で、改変させた酵母細胞は芳香族アルデヒド合成酵素及びコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼを組み込むことによって、又は芳香族アルデヒド合成酵素を組み込むことによって得られる。
本発明において、より好ましくは、前記ステップ（２）で、芳香族アルデヒド合成酵素はパセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）に由来し、酵素番号はＥＣ４．１．１．２５であり、前記コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来し、酵素番号はＥＣ１．３．１．１２、ＥＣ５．４．９９．５である。
【００２８】
本発明において、好ましくは、前記ステップ（２）で、前記酵母細胞は、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、シゾサッカロミケス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロマイセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、カンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、トルロプシス・グラブラタ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｇｌａｂｒａｔａ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、ロドトルラ・グラミニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、サッカロミケス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、チゴサッカロミケス・ルキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）、カンジダ・グラブラータ （Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、トルラスポラ・デルブルツキ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、デバリオミセス・ハンゼニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）、シェフェルソマイセス・スティピィティス（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔｅｓ）、メイエロザイマ・ギリエルモンディイ（Ｍｅｙｅｒｏｚｙｍａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、ロデロマイセス・エロンギスポラス（Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・オルソプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｏｒｔｈｏｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・メタプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍｅｔａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・デュブリニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）、クラビスポラ・ルシタニアエ（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ  ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、カンジダ・アウリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｕｒｉｓ）等である。
【００２９】
より好ましくは、前記酵母細胞は、サッカロミケス・セレビシエであり、菌種番号はＣＩＣＣ１９６４であり、前記クルイベロマイセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）であり、菌種番号はＮＢＲＣ１７７７である。
【００３０】
より好ましくは、前記ステップ（２）で、改変させた酵母細胞は、パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）に由来する芳香族アルデヒド合成酵素をサッカロミケス・セレビシエＣＩＣＣ１９６４のデルタ（ｄｅｌｔａ）１２サイトに組み込むことによって得られる。
【００３１】
本発明において、さらに好ましくは、前記ステップ（２）で、改変させた酵母細胞は、パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）に由来する芳香族アルデヒド合成酵素をサッカロミケス・セレビシエＣＩＣＣ１９６４のデルタ（ｄｅｌｔａ）１２サイトに組み込み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼでサッカロミケス・セレビシエＣＩＣＣ１９６４のｐｄｃ１遺伝子置き換えることによって得られる。
【００３２】
より好ましくは、前記ステップ（２）で、前記改変させた酵母細胞は、パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）に由来する芳香族アルデヒド合成酵素をクルイベロマイセス・マルシアヌスＮＢＲＣ１７７７のデルタ（ｄｅｌｔａ）１２サイトに組み込むことによって得られる。
【００３３】
本発明において、より好ましくは、前記ステップ（２）で、前記改変させた酵母細胞は、パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）に由来する芳香族アルデヒド合成酵素をクルイベロマイセス・マルシアヌスＮＢＲＣ１７７７のデルタ（ｄｅｌｔａ）１２サイトに組み込み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼでクルイベロマイセス・マルシアヌスＮＢＲＣ１７７７のｐｄｃ１遺伝子を置き換えることによって得られる。
【００３４】
前記方法で構築されたチロソール高生産性組み換え酵母を用いるチロソール及びその誘導体の生産方法である。
チロソール及びその誘導体の発酵生産方法である。
【００３５】
本発明において、好ましくは、前記発酵の発酵培地に少なくともグルコース、フルクトース、スクロースの１種又は２種以上の組み合わせ及びチロシンが含まれる。
【００３６】
前記チロソール高生産性組み換え酵母を用いるヒドロキシチロソールの生産方法である。
【００３７】
本発明において、好ましくは、前記チロソール高生産性組み換え酵母を発酵させることによってチロソールを製造した後、ヒドロキシラーゼによって反応させてヒドロキシチロソールを得る。
【００３８】
本発明において、好ましくは、４−ヒドロキシフェニル酢酸ヒドロキシラーゼを過剰発現する大腸菌で、前記チロソール高生産性組み換え酵母の発酵により得たチロソールを触媒することによって、ヒドロキシチロソールを得る。
【００３９】
本発明において、より好ましくは、前記発酵の発酵培地に少なくともグルコース、フルクトース、スクロースの１種又は２種以上の組み合わせ及びチロシンが含まれる。
【発明の効果】
【００４０】
本発明は次の有益な効果を有する。
１．本発明は、酵母で発現する時、フルクトース−６−リン酸（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）がフルクトース−１，６−ビスリン酸（ｂｅｔａ−Ｄ−Ｆｒｕｃｔｏｓｅ  １，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を合成すると同時に、触媒されてエリスロース−４−リン酸（Ｅｒｙｔｈｒｏｓｅ−４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及びリン酸アセチル（Ａｃｅｔｙｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）になり、キシルロース−５−リン酸（Ｘｙｌｕｌｏｓｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が触媒されてグリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅｓ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及びリン酸アセチルになることを初めて開示する。酵母における炭素代謝フラックス分布が変わって、チロソール生合成の重要な中間体、エリスロース−４−リン酸の合成が増強され、チロソール合成の代謝経路が最適化され、チロソール及びヒドロキシチロソール等誘導体の収率が向上する。
【００４１】
２．本発明では、改変させた酵母細胞に外因性のフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの発現遺伝子を導入して、組み換え酵母を得る。当該組み換え酵母はチロソールの収率を高めることができ、４−ヒドロキシフェニル酢酸ヒドロキシラーゼを過剰発現する大腸菌でチロソールを触媒することにより、ヒドロキシチロソールを得る。
【００４２】
３．本発明は、環境配慮がなされた新規なチロソール及びヒドロキシチロソール生物学的合成技術を提供し、チロソール及びヒドロキシチロソールの大規模な生産のための基礎を作り、経済的価値も社会的利益も大きい。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、実施例１の組み換えプラスミドｐＵＧ６の構造図である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
下記の詳細な説明は全てが例示的なもので、本願の一層の説明に供する。特段の説明がない限り、本明細書で使用される科学技術用語は本願の技術分野の当業者が理解している通常の意味のものである。
【００４５】
なお、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するために使われるが、本願の例示的な実施形態に限定を加えるためのものではない。また、文脈の中で明確な説明を添えない限り、本明細書で単数の形で使われるものには、複数の形も含まれる。また、本明細書で使用される用語「含む」及び／又は「備える」は、特徴、ステップ、操作、装置、部品及び／又はこれらの組み合わせが存在することを意味する。
【００４６】
次に、実施例と結び付けて本発明の更なる説明を行う。
【表１】
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【００４７】
下記の実施例では、大腸菌ＢＬ２１及び発現ベクターｐＥＴ−２８ａは市販品である。下記の実施例で具体的な条件説明を添えない実験方法は、通常の条件で行われる。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」に記載の条件、又は生物学用試薬のメーカーが推奨する条件に従って行われる。ＰＣＲ増幅反応の手順は、例えば通常のＰＣＲ増幅反応手順である。
【００４８】
サッカロミケス・セレビシエＣＩＣＣ１９６４は、中国産業微生物菌種寄託管理センターから購入され、菌種番号はＣＩＣＣ１９６４であり、非寄託菌株である。
発明特許出願（出願番号２０１８１０６０１２１３．８）の方法に従って、パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）に由来する芳香族アルデヒド合成酵素（ＡＡＳ、ａｒｏｍａｔｉｃ  ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＥＣ４．１．１．２５）をサッカロミケス・セレビシエＣＩＣＣ１９６４のデルタ（ｄｅｌｔａ）１２サイトに組み込み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ＴｙｒＡ、ｆｕｓｅｄ  ｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ  ｍｕｔａｓｅ  Ｔ／ｐｒｅｐｈｅｎａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＥＣ１．３．１．１２、ＥＣ５．４．９９．５）でサッカロミケス・セレビシエＣＩＣＣ１９６４のｐｄｃ１遺伝子を置き換えることによって、ＳＣ−１菌株を得る。
【００４９】
（実施例１）
Ｂａｆｘｐｋ及びＢｂｆｘｐｋ発現カセットの構築
宿主サッカロミケス・セレビシエのコドン優先度に基づき、配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列に対しコドン最適化を行って、配列番号１及び配列番号２に対応する最適化後のヌクレオチド配列である配列番号３及び配列番号４を得た後、遺伝子合成を行う。プライマー対Ｂａｆｘｐｋ−Ｆ／Ｂａｆｘｐｋ−Ｒ及びＢｂｆｘｐｋ−Ｆ／Ｂｂｆｘｐｋ−Ｒを使用し、Ｖａｚｙｍｅ社のＰｈａｎｔａ  Ｍａｘ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼで増幅させて目的遺伝子フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの発現遺伝子（Ｂａｆｘｐｋ断片のヌクレオチド配列は配列番号３に記載、Ｂｂｆｘｐｋ断片のヌクレオチド配列は配列番号４に記載）を得る。サッカロミケス・セレビシエＣＩＣＣ１９６４のゲノムをテンプレートとして、プライマー対Ｕ−Ｆ／Ｕ−Ｒ及びＤ−Ｆ／Ｄ−Ｒを使用し、ＰＣＲにより上流及び下流ホモロジーアームのＤＮＡ断片を増幅させ、プライマー対Ｐｔｐｉ１−Ｆ／Ｐｔｐｉ１−Ｒ及びＴｇｐｍ１−Ｆ／Ｔｇｐｍ１−Ｒでプロモータｔｐｉ１及びターミネータｇｐｍ１断片を増幅させる。ジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）耐性遺伝子ＫａｎＭＸ４（ヌクレオチド配列は配列番号２４に記載）を持つ組み換えプラスミドｐＵＧ６（図１参照）のＤＮＡをテンプレートとして、プライマー対Ｇ４１８−Ｆ／Ｇ４１８−Ｒを使用し、ＰＣＲにより耐性遺伝子ＫａｎＭＸ４のＤＮＡ断片を増幅させる。アガロースゲル電気泳動によりバンドサイズの正確性を検証した後、バンドを切り取り、ＯＭＥＧＡゲル抽出キットで遺伝子断片を回収する。ＰＣＲ増幅プライマーは以下のとおりである。
プライマー対Ｂａｆｘｐｋ−Ｆ／Ｂａｆｘｐｋ−Ｒの配列は配列番号１３及び配列番号１４である。プライマー対Ｂｂｆｘｐｋ−Ｆ／Ｂｂｆｘｐｋ−Ｒの配列は配列番号１５及び配列番号１６である。プライマー対Ｕ−Ｆ／Ｕ−Ｒの配列は配列番号５及び配列番号６である。プライマー対Ｄ−Ｆ／Ｄ−Ｒの配列は配列番号７及び配列番号８である。プライマー対Ｐｔｐｉ１−Ｆ／Ｐｔｐｉ１−Ｒの配列は配列番号９及び配列番号１０である。プライマー対Ｔｇｐｍ１−Ｆ／Ｔｇｐｍ１−Ｒの配列は配列番号１１及び配列番号１２である。プライマー対Ｇ４１８−Ｆ／Ｇ４１８−Ｒの配列は配列番号１７及び配列番号１８である。
ハイフィデリティーＰｈａｎｔａ  Ｍａｘ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、各断片が隣り合う断片と５０ｂｐの相同配列を有するように目的遺伝子断片を増幅させ、ＰＣＲ産物にゲル電気泳動を行った後、ＤＮＡ断片ゲル回収キットを用いて回収し、ＤＮＡ濃度を測定する。その後、融合ＰＣＲ法により、相同配列を持つ精製後のＤＮＡ断片に対し融合させる。
（１）Ｐｈａｎｔａ  Ｍａｘ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、断片をライゲーションさせる。反応系は表２に記載のとおりである。
【表２】
2021522852.tif 000004
【００５０】
上記試薬をＰＣＲ用試験管に加え、反応条件は表３に示すとおりである。
【表３】
2021522852.tif 000005
【００５１】
（２）ステップ１のＰＣＲ反応産物をＰＣＲ増幅テンプレートとし、プライマー対Ｙｚａｗ−Ｆ／Ｙｚａｗ−Ｒを使用して、Ｖａｚｙｍｅ社のＰｈａｎｔａ  Ｍａｘ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼで増幅させて目的断片を得る。アガロースゲル電気泳動によりバンドサイズの正確性を検証した後、バンドを切り取り、ＯＭＥＧＡゲル抽出キットでＤＮＡ断片を回収して、Ｂａｆｘｐｋ及びＢｂｆｘｐｋ発現カセットのＤＮＡ断片を得る。ＰＣＲ増幅プライマーは以下のとおりである。
Ｙｚａｗ−Ｆの配列は配列番号１９であり、Ｙｚａｗ−Ｒの配列は配列番号２０である。
（３）ステップ２で得たＢａｆｘｐｋ及びＢｂｆｘｐｋ発現カセットのＤＮＡ断片に対し、配列決定を行って検証する。
【００５２】
（実施例２）
Ｂａｆｘｐｋ及びＢｂｆｘｐｋ異種発現菌株の構築（サッカロミケス・セレビシエを使う）
ＰＥＧ／ＬｉＡｃ法によりチロソール合成菌株サッカロミケス・セレビシエＣＩＣＣ１９６４の形質転換を行い、培地にＧ４１８耐性を付与しスクリーニングしてモノクローナルをピッキングし、ゲノムを抽出し、プライマー対Ｙｚａｗ−Ｆ／Ｙｚａｗ−Ｒを使用してＰＣＲ検証を行って、ＳＣ−ｂａｆｘｐｋ及びＳＣ−ｂｂｆｘｐｋ菌株を得る。
【００５３】
（実施例３）
チロソール合成微生物の発酵（サッカロミケス・セレビシエを使う）
チロソールを生産する菌株ＣＩＣＣ１９６４、ＳＣ−ｂａｆｘｐｋ及びＳＣ−ｂｂｆｘｐｋのプレートからモノクローナルをピッキングして、５ｍＬのＹＰＤ液体培地に接種し、３０〜３２℃及び２００ｒｐｍで２４時間培養した後、５０ｍＬのＹＰＤ液体培地に移し、接種初期ＯＤ６００は０．２であり、３０℃及び２００ｒｐｍで１２時間培養した後、１００ｍＬのＹＰＤ液体培地に移し、接種初期ＯＤ６００は０．２であり、培地にはそれぞれ２％グルコース、２％スクロース、又は２％グルコースと１％チロシン等の炭素源が含まれ、２４時間培養後、再び２％グルコース、２％スクロース、又は２％グルコースと１％チロシン等の炭素源を加え、合計で７２時間発酵させる。非特許文献１に記載のＨＰＬＣ法で、発酵液中のチロソール濃度を検出する。培養条件の炭素源別チロソール生産量は表４に記載のとおりである。
【表４】
2021522852.tif 000006
【００５４】
（実施例４）
遺伝子ＨｐａＢＣ及び大腸菌発現ベクターの取得方法
大腸菌において、大腸菌に由来する４−ヒドロキシフェニル酢酸ヒドロキシラーゼ（ＨｐａＢＣ、４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｔｅ  ３−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ、酵素番号ＥＣ１．５．１．３７）のＤＮＡ配列遺伝子クラスターを過剰発現し、大腸菌全細胞でチロソールを触媒して、ヒドロキシチロソールを得る。
【００５５】
前記４−ヒドロキシフェニル酢酸ヒドロキシラーゼのアミノ酸配列遺伝子クラスターに含まれる４−ヒドロキシフェニル酢酸ヒドロキシラーゼ（ＨｐａＢ）のアミノ酸配列は配列番号２１であり、対応するヌクレオチド配列は配列番号２３である。４−ヒドロキシフェニル酢酸ヒドロキシラーゼ（ＨｐａＣ）のアミノ酸配列は配列番号２２であり、対応するヌクレオチド配列は配列番号２４である。
【００５６】
細菌ゲノムキットを用いて大腸菌ＤＥ３ゲノムを抽出し、これをテンプレートとしてそれぞれプライマー対ｈｐａＢ−Ｆ／ｈｐａＢ−Ｒ及びｈｐａＣ−Ｆ／ｈｐａＣ−Ｒを用いて配列番号２３及び配列番号２４に対し増幅させ、配列決定を行って検証する。ｈｐａＢ−Ｆの配列は配列番号２５である。ｈｐａＢ−Ｒの配列は配列番号２６である。ｈｐａＣ−Ｆの配列は配列番号２７である。ｈｐａＣ−Ｒの配列は配列番号２８である。
【００５７】
ｐＥＴ−２８ａを発現ベクターとして使い、ｐＥＴ−２８ａ空ベクターを含む大腸菌を培養し、細菌プラスミド抽出キットを用いてｐＥＴ−２８ａプラスミドを抽出し、通常の分子生物学的手法で、発現ベクターｐＥＴｈｐａＢＣ（配列番号２９）を構築する。その後、ｐＥＴｈｐａＢＣで大腸菌発現型ベクターＢＬ２１を形質転換し、カナマイシンをマーカーとしてスクリーニングし、モノクローナルＢＬ２１−ｐＥＴｈｐａＢＣを得る。
【００５８】
ＢＬ２１−ｐＥＴｈｐａＢＣを振盪培養し、１ｍＭのＩＰＴＧを使ってＨＰＡＢ／Ｃの発現を誘導する。
【００５９】
ＢＬ２１−ｐＥＴｈｐａＢＣ菌株を得て実施例３の培養液に加え、３時間反応させた後、ヒドロキシチロソール生産量を検出し、結果を表５に示す。
【表５】
2021522852.tif 000007
【００６０】
（実施例５）
クルイベロマイセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、菌種番号ＮＢＲＣ１７７７）を使用し、発明特許出願（出願番号２０１８１０６０１２１３．８）の方法に従って、パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）に由来する芳香族アルデヒド合成酵素（ＡＡＳ、ａｒｏｍａｔｉｃ  ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＥＣ４．１．１．２５）をクルイベロマイセス・マルシアヌスのデルタ（ｄｅｌｔａ）１２サイトに組み込み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ＴｙｒＡ、ｆｕｓｅｄ  ｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ  ｍｕｔａｓｅ  Ｔ／ｐｒｅｐｈｅｎａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＥＣ１．３．１．１２、ＥＣ５．４．９９．５）でクルイベロマイセス・マルシアヌスのｐｄｃ１遺伝子を置き換えることによって、エリトロース−４−リン酸とホスホエノールピルビン酸からチロソールを合成する代謝経路を備えるクルイベロマイセス・マルシアヌス菌株を得る。
【００６１】
本発明の実施例１、実施例２に記載の方法に従い、ただし、クルイベロマイセス・マルシアヌス細胞の培養温度は４２〜４９℃として、フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｋｅｔｏｌａｓｅ、ＥＣ４．１．２．２２）を用いて、ＫＭ−ｂａｆｘｐ及びＫＭ−ｂｂｆｘｐ菌株を製造する。
【００６２】
（実施例６）
ビフィドバクテリウム・デンティウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ）に由来するフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ（ｂｄｆｘｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＱ２６９５７．１、アミノ酸配列は配列番号３０に記載）を使用し、実施例３、実施例４に記載の方法に従う。使用するプライマー対Ｂｄｆｘｐ−Ｆ／Ｂｄｆｘｐ−Ｒの配列は配列番号３２及び配列番号３３である。実施例３、実施例４と同等の結果が得られ、チロソール及びヒドロキシチロソールの生産量が向上している。結果の詳細は以下のとおりである。
【表６】
2021522852.tif 000008
【表７】
2021522852.tif 000009
【００６３】
（実施例７）
実施例１、実施例２に記載の方法に従って、パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）に由来する芳香族アルデヒド合成酵素（ＡＡＳ、ａｒｏｍａｔｉｃ  ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＥＣ４．１．１．２５）をサッカロミケス・セレビシエＣＩＣＣ１９６４のデルタ（ｄｅｌｔａ）１２サイトに組み込み、配列番号４に示すフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｋｅｔｏｌａｓｅ、ＥＣ４．１．２．２２）を前記酵母に導入して、ＳＣ−ｂｂｆｘｐｋ−ＡＡＳ菌株を得る。実施例３のＳＣ−ｂｂｆｘｐｋ菌株と同等のチロソール生産量を得る。
【００６４】
ＢＬ２１−ｐＥＴｈｐａＢＣ菌培養液を得てチロソールを含む前記培養液に加え、３時間反応させた後、ヒドロキシチロソール生産量を検出し、実施例４のＳＣ−ｂｂｆｘｐｋ菌株と同等の生産量である。このことが、酵母にコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ＴｙｒＡ、ｆｕｓｅｄ  ｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ  ｍｕｔａｓｅ  Ｔ／ｐｒｅｐｈｅｎａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＥＣ１．３．１．１２、ＥＣ５．４．９９．５）遺伝子が導入されなくても、チロソール及びヒドロキシチロソールの生産量は同等であるということを示す。結果の詳細は表８、表９に示すとおりである。
【表８】
2021522852.tif 000010
【表９】
2021522852.tif 000011
【００６５】
（実施例８）
実施例６に記載の方法に従い、それぞれビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ）に由来するフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ（ｂａｉｆｘｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＷＰ＿０５２８２６２５５．１、アミノ酸配列は配列番号１００に記載）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）に由来するフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ（ｂｂｉｆｘｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＷＰ＿０４７２８９９４５．１、アミノ酸配列は配列番号１０１に記載）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）に由来するフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ（ｂｌａｆｘｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＣ２９１２１．１、アミノ酸配列は配列番号１０２に記載）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）に由来するフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ（ｂｌｏｆｘｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＰＷＨ０９３４３．１、アミノ酸配列は配列番号１０３）、ビフィドバクテリウム・モンゴリエンセ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｏｎｇｏｌｉｅｎｓｅ）に由来するフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ（ｂｍｆｘｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＣ２９１２１．１、アミノ酸配列は配列番号１０４に記載）、ビフィドバクテリウム・シュードロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ）に由来するフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ（ｂｐｆｘｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＷＰ＿０３４８８３１７４．１、アミノ酸配列は配列番号１０５に記載）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）に由来するフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ（Ａｎｆｘｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＢＦ７６４９２．１、アミノ酸配列は配列番号１０６に記載）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）に由来するフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ（Ｃａｆｘｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＨＤ３６０８８．１、アミノ酸配列は配列番号１０７に記載）、リゥコノストック・メゼンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）に由来するフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ（Ｌｍｆｘｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＶ６６０７７．１、アミノ酸配列は配列番号１０８に記載）、ラクトバチルス・パラプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ）に由来するフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ（Ｌｐｒｆｘｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＬＯ０４８７８．１、アミノ酸配列は配列番号１０９に記載）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）に由来するフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ（Ｌｐｌｆｘｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＲＵ１９７５５．１、アミノ酸配列は配列番号１１０に記載）に対応する遺伝子断片で改変させたサッカロミケス・セレビシエを形質転換し、それぞれ改変菌株ＳＣ−ｂａｉｆｘｐ、ＳＣ−ｂｂｉｆｘｐ、ＳＣ−ｂｌａｆｘｐ、ＳＣ−ｂｌｏｆｘｐ、ＳＣ−ｂｍｆｘｐ、ＳＣ−ｂｐｆ��ｐ、ＳＣ−Ａｎｆｘｐ、ＳＣ−Ｃａｆｘｐ、ＳＣ−Ｌｍｆｘｐ、ＳＣ−Ｌｐｒｆｘｐ、ＳＣ−Ｌｐｌｆｘｐを得る。前記改変させたサッカロミケス・セレビシエはパセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）に由来する芳香族アルデヒド合成酵素をサッカロミケス・セレビシエＣＩＣＣ１９６４のデルタ（ｄｅｌｔａ）１２サイトに組み込んだものである。実施例３、実施例４と同等の結果が得られ、チロソール及びヒドロキシチロソールの生産量が向上している。結果の詳細は表１０、表１１に示すとおりである。
【表１０】
2021522852.tif 000012
【表１１】
2021522852.tif 000013
【００６６】
上記の結果から分かるように、酵母細胞において上記の外因性のフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼを発現した場合、生産量に差はあるが、実施例３、実施例４、実施例５のビフィドバクテリウム・アドレセンティス、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・デンティウムに由来するフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼと比べ、生産量が低いものの、出発菌株と比べ、チロソールの生産量もヒドロキシチロソールの生産量も明らかに向上している。
【００６７】
発明者が実施例７の結果に基づいて、フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼに対応する前記遺伝子断片で、特許文献１に記載の方法で得たＳＣ−１菌株を形質転換し、つまり、パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）に由来する芳香族アルデヒド合成酵素（ＡＡＳ、ａｒｏｍａｔｉｃ  ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＥＣ４．１．１．２５）をサッカロミケス・セレビシエＣＩＣＣ１９６４のデルタ（ｄｅｌｔａ）１２サイトに組み込み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ＴｙｒＡ、ｆｕｓｅｄ  ｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ  ｍｕｔａｓｅ  Ｔ／ｐｒｅｐｈｅｎａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＥＣ１．３．１．１２、ＥＣ５．４．９９．５）でサッカロミケス・セレビシエＣＩＣＣ１９６４のｐｄｃ１遺伝子を置き換える。ｂａｉｆｘｐ、ｂｂｉｆｘｐ、ｂｌａｆｘｐ、ｂｌｏｆｘｐ、ｂｍｆｘｐ、ｂｐｆｘｐ、Ａｎｆｘｐ、Ｃａｆｘｐ、Ｌｍｆｘｐ、Ｌｐｒｆｘｐ、Ｌｐｌｆｘｐでは実施例７のｂｂｆｘｐｋと同等の結果を得た結果から、酵母にコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ＴｙｒＡ、ｆｕｓｅｄ  ｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ  ｍｕｔａｓｅ  Ｔ／ｐｒｅｐｈｅｎａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＥＣ１．３．１．１２、ＥＣ５．４．９９．５）遺伝子が導入されてもされなくても、チロソール及びヒドロキシチロソールの生産量に顕著な影響はないことが示される。
【００６８】
結果分析
前記結果から、酵母細胞において外因性のフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼを発現する場合、チロソールの生産量が明らかに向上し、しかも当該現象は特定由来のフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ又は特定の酵母細胞に限られないことが分かる。本発明の技術を踏まえれば、エリトロース−４−リン酸とホスホエノールピルビン酸からチロソールを合成する代謝経路を備える酵母細胞においてフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼを過剰発現すると、外因性のフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの発現が酵母細胞の糖代謝経路に影響を与えることで、チロソール産物の生成が促されるため、本願に記載の技術効果を得るということが予想される。
【００６９】
上述したのが本願の好ましい実施例に過ぎず、本願を限定するものではなく、当業者が理解したように、本願には様々な変更や変更を行うことができる。本願の趣旨を逸脱することなく行われた補正、同等な置換、改善等は、いずれも本願の保護範囲に含まれる。
【図１】
2021522852.tif 000014
【配列表】
2021522852000001.app
【国際調査報告】
2021522852.tif 000015
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