(57)【要約】被験体の食道の領域由来の固有筋層から粘膜および粘膜下組織を解離するための方法が開示される。これらの方法は、被験体の食道の領域に、膀胱細胞外マトリックス（ＥＣＭ）ヒドロゲルを含む医薬組成物を粘膜下注射して、食道の領域における粘膜下組織とその下にある固有筋層との間にクッションを形成するステップであって、ＥＣＭヒドロゲルは、以下の特徴：ａ）約３７℃の温度において２０分未満の５０％ゲル化までの時間、ｂ）食道への注入に好適な流動粘度、およびｃ）約１０〜約４００パスカル（Ｐａ）の剛性を有する、ステップを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の食道の領域由来の固有筋層から粘膜および粘膜下組織を解離するための方法であって、
前記被験体の前記食道の前記領域に、膀胱細胞外マトリックス（ＥＣＭ）ヒドロゲルを含む医薬組成物を粘膜下注射して、前記食道における前記粘膜下組織とその下にある前記固有筋層との間にクッションを形成するステップであって、前記ＥＣＭヒドロゲルは、以下の特徴：
ａ）約３７℃の温度において２０分未満の５０％ゲル化までの時間、
ｂ）前記食道への注入に好適な流動粘度、および
ｃ）約１０〜約４００パスカル（Ｐａ）の剛性
を有する、ステップと、
それによって前記食道の前記領域における前記粘膜および前記粘膜下組織を、その下にある前記固有筋層から解離し、前記被験体における前記食道の前記領域の炎症を抑制するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記５０％ゲル化までの時間が、約３７℃において約２〜約２０分である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記５０％ゲル化までの時間が、約３７℃において約２〜約１０分である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記５０％ゲル化までの時間が、約３〜約８分である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記流動粘度が、約０．１／ｓの剪断速度において約０．１〜約１００Ｐａ＊ｓであり、１０００／ｓの剪断速度において約０．０１〜約０．２Ｐａ＊ｓである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記流動粘度が、１／ｓの剪断速度において約０．１〜約２５Ｐａ＊ｓであり、約１００／ｓの剪断速度において約０．０２〜約０．８Ｐａ＊ｓである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＥＣＭヒドロゲルが１０〜３００Ｐａの剛性を有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒドロゲルにおけるＥＣＭ濃度が２ｍｇ／ｍｌ〜約１６ｍｇ／ｍｌである、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＥＣＭヒドロゲルが、内視鏡的にまたはカテーテルを介して投与される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＥＣＭヒドロゲルが、
（ａ）脱細胞化細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を、酸性溶液において酸性プロテアーゼを用いる組織の消化によって可溶化して、消化ＥＣＭを作製すること、および
（ｂ）前記消化ＥＣＭのｐＨを７．２〜７．８の間のｐＨに上昇させて、中和消化溶液を作製すること
によって作製される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
（ｂ）前記消化ＥＣＭの前記ｐＨを上昇させることが、塩基または等張緩衝液を添加して前記消化ＥＣＭの前記ｐＨを上昇させることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記酸性プロテアーゼが、ペプシン、トリプシン、またはそれらの組合せである、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＥＣＭヒドロゲルが、前記被験体への投与前、２５℃または２５℃未満に維持される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＥＣＭヒドロゲルが、内視鏡的にまたはカテーテルを介して注射される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
臓器が、食道であり、前記方法が、前記食道から食道異形成、食道腺癌、または食道癌を解離する方法を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
バレット食道を有する被験体の食道から粘膜および粘膜下組織を解離するステップを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記クッション上で内視鏡的切除手技を実施するステップをさらに含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記切除手技が、解離した前記粘膜および前記粘膜下組織を除去するための内視鏡的粘膜切除術または内視鏡的粘膜下層解離術である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ヒドロゲルがその下にある前記食道の前記固有筋層上に保持され、前記粘膜および前記粘膜下組織が前記食道の前記領域から除去されるように前記クッションを分割するステップを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記被験体がヒトである、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記解離する方法が、内視鏡的粘膜切除術または内視鏡的粘膜解離術を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記膀胱ＥＣＭヒドロゲルが膀胱マトリックス（ＵＢＭ）ＥＣＭヒドロゲルである、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記膀胱ＥＣＭヒドロゲルが膀胱粘膜下組織（ＵＢＳ）ＥＣＭヒドロゲルである、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法における使用のための、膀胱ＥＣＭヒドロゲルを含む組成物であって、前記ＥＣＭヒドロゲルは、以下の特徴：
ａ）約３７℃の温度において２０分未満の５０％ゲル化までの時間、
ｂ）食道への注入に好適な流動粘度、および
ｃ）約１０〜約４００パスカル（Ｐａ）の剛性
を有する、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２０１８年６月２１日に出願された米国仮出願第６２／６８８，１９１号の利益を主張する。
【０００２】
これは、内視鏡的切除、詳細には、食道における固有筋層から粘膜および粘膜下組織を解離するための粘膜下クッションとしての膀胱マトリックス細胞外マトリックス（ＥＣＭ）ヒドロゲルの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
内視鏡検査は、内視鏡と呼ばれる器具によって、侵襲性の外科手術を用いることなく身体の中空臓器の内部または空洞の検査を可能にする手技である。内視鏡検査は、出血している血管の焼灼、狭い食道を拡張すること、ポリープ、腺腫、および小さな腫瘍を除去すること、生検を実施すること、または異物を除去すること等の外科的手技のために使用することができる。内視鏡的手技は、胃腸管、気道、耳、尿路、女性の生殖器系において、ならびに小さな切開部を介して通常では閉じている体腔、例えば、腹腔または骨盤腔（腹腔鏡検査）、関節の内部（関節鏡検査）、および胸部の臓器（胸腔鏡検査および縦隔鏡検査）において実施することができる。内視鏡は、診断または治療を目的として中空臓器または中空部分（例えば食道）の内部を可視化するための、光源付き、通例光ファイバーの、軟性または硬性の管状の器具であり、典型的には器具（例えば、鉗子、電気メス、内視鏡用注射針、もしくは剪刀）の通過を可能にするかまたは生検試料の取り出しを容易にする１つまたは複数のワーキングチャネルを有する。内視鏡は、遠位部に好適なランプと撮像デバイスとを備え、口、肛門、耳、鼻等の身体の生来存在する開口部、または小さな外科的切開部を介して挿入することができる。
【０００４】
内視鏡的手技は、胃腸管において広く適用される。例えば、内視鏡的手技は、胃腸腔に広がる粘膜を検査するため、ならびに小さなおよび大きな病理学的病変、例えば、炎症組織、ポリープ、偽ポリープ、鋸歯状病変、腺腫、潰瘍、異形成、前新生物および新生物形成、ならびに腫瘍を検出するために使用することができる。内視鏡的手技は、病理的病変（ポリープ、腺腫、異形成、バレット異形成、前新生物および新生物形成、腫瘍）の生検および除去のために使用することができる。外科的介入には、胃腸内視鏡検査において病理学的病変を除去するために一般的に使用される２種類の内視鏡的切除手技：内視鏡的粘膜切除術（ＥＭＲ）および内視鏡的粘膜下層解離術（ＥＳＤ）が含まれる。これらの２つの技法は、胃腸ポリープ、腺腫、異形成、バレット異形成、およびリンパ節転移の最小のリスクを伴う早期がんの最小侵襲処置を可能にする。食道における内視鏡的手技において有用な薬剤の必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の前述および他の特色および利点は、添付の図面を参照して行われる以下のいくつかの実施形態の詳細な説明から、より明らかとなるだろう。
【０００６】
被験体の食道の領域由来の固有筋層から粘膜および粘膜下組織を解離するための方法が本明細書に開示される。これらの方法は、被験体の食道の領域に、膀胱細胞外マトリックス（ＥＣＭ）ヒドロゲルを含む医薬組成物を粘膜下注射して、食道における粘膜下組織とその下にある固有筋層との間にクッションを形成するステップであって、ＥＣＭヒドロゲルは、以下の特徴：ａ）約３７℃の温度において２０分未満の５０％ゲル化までの時間、ｂ）食道への注入に好適な流動粘度、およびｃ）約１０〜約４００パスカル（Ｐａ）の剛性を有する、ステップを含む。方法は、食道の領域における粘膜および粘膜下組織を、その下にある固有筋層から解離する。方法はまた、被験体における食道の領域の炎症を抑制することができる。
【０００７】
被験体の食道の領域由来の固有筋層から粘膜および粘膜下組織を解離するための方法もまた本明細書に開示される。これらの方法は、被験体の食道の領域に膀胱細胞外マトリックス（ＥＣＭ）ヒドロゲルを含む医薬組成物を粘膜下注射して、食道における粘膜下組織とその下にある固有筋層との間にクッションを形成するステップを含む。方法は、食道の領域における粘膜および粘膜下組織を、その下にある固有筋層から解離する。方法はまた、被験体における食道の領域の炎症を抑制することができる。
【０００８】
一部の実施形態では、解離する方法は、内視鏡的粘膜切除術または内視鏡的粘膜解離術を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、粘膜下流体クッションとしてのＥＣＭのｉｎ  ｖｉｖｏにおける使用を示す図である。ＥＭＲが既に実施されている可視区域を含む、粘膜下流体クッションとしての膀胱細胞外マトリックス（ＵＢＭ−ＥＣＭ）ヒドロゲルの使用（Ａ）。粘膜下流体クッション（ＳＦＣ）と共に除去された食道組織は、除去された食道粘膜の部位に存在するゲルを示す（Ｂ）。粘膜の全周を切り取る全周性ＥＭＲの結果（Ｃ）。
【００１０】
【図２−１】図２Ａおよび２Ｂは、膀胱の断面図である。膀胱粘膜下組織（ＵＢＳ）ＥＣＭヒドロゲルは、膀胱のＤ−粘液下層（粘膜筋板および粘液下層を含む）を含む膀胱粘膜下組織から調製される（Ａ）。膀胱マトリックス（ＵＢＭ）ＥＣＭヒドロゲルは、膀胱のＢ−上皮基底膜およびＣ−固有層を含むＵＢＭから調製される（Ｂ）。Ｌは内腔の場所を示す。これらの図は、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，５７６，２６５号から引用される。
【図２−２】同上。
【００１１】
【図３−１】図３Ａ〜３Ｃは、ＵＢＭの流動粘度（Ａ）、ＵＢＭの時間掃引（Ｂ）、およびＵＢＭの５０％ゲル化までの時間（Ｃ）を含むレオロジーデータを示す図である。
【図３−２】同上。
【図３−３】同上。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
例えば食道内視鏡検査において病理学的病変を除去するために一般的に使用される任意の内視鏡的切除手技、例えばＥＭＲおよびＥＳＤにおける、食道における固有筋層から粘膜および粘膜下組織を解離するための粘膜下クッションとしての膀胱細胞外マトリックス（ＥＣＭ）ヒドロゲルの使用が本明細書に開示される。膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、ＵＢＭ  ＥＣＭヒドロゲルまたはＵＢＳ  ＥＣＭヒドロゲルであり得る。
【００１３】
用語
別段の指摘がない限り、技術的用語は従来の語法に従って使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，  Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９４  （ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）、Ｋｅｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，  １９９４  （ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）、およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ  （ｅｄ．），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．，  １９９５  （ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）に見出すことができる。
本開示の様々な実施形態の検討を容易にするために、具体的な用語に関する以下の説明が提供される。
【００１４】
酸性プロテアーゼ：ペプチド結合を切る酵素であって、酸性ｐＨにおいてペプチド結合を切ることに関する増加した活性を有する、酵素。例えば、限定されないが、酸性プロテアーゼとしてはペプシンおよびトリプシンを挙げることができる。
【００１５】
バレット食道：食道、典型的には食道の下（遠位）部の細胞の異常な変化（化生または異形成）。バレット食道とは、食道の正常重層扁平上皮内壁の複数の部分が杯細胞を含む単層円柱上皮によって置き換えられている場合の診断である。バレット食道は、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）のための医療を求める患者の５〜１５％に見られるが、バレット食道を有する患者の大きなサブグループは症状を有しない。バレット食道は、食道腺癌と強く関連し、前悪性状態と考えられる。バレット食道の主な原因は、胃逆流からの慢性酸曝露に対する適応であると考えられている。バレット食道の細胞は、生検後、４つの一般カテゴリー：非異形成、低度異形成、高度異形成、および明らかな癌腫に分類される。
【００１６】
塩基：７より大きいｐＨを有する化合物または化合物の溶液。例えば、限定されないが、塩基は、アルカリ水酸化物またはアルカリ水酸化物の水溶液である。ある特定の実施形態では、塩基は、ＮａＯＨまたはＰＢＳ中のＮａＯＨである。
【００１７】
粉砕する（粉砕および粉砕すること）：例えば、限定されないが、磨砕すること、ブレンドすること、破砕すること、スライスすること、製粉すること、切断すること、または破砕することによって、大きな粒子を小さな粒子へと小さくするプロセス。ＥＣＭは、水分補給された形態、凍結シート形態、風乾シート形態、凍結乾燥シート形態、粉末シート形態を含むがこれらに限定されない任意の形態のままで粉砕することができる。
【００１８】
診断：疾患を、その徴候、症状、および様々な試験の結果によって同定するプロセス。そのプロセスによって達した結論も「診断」と呼ばれる。一般的に実施される試験形態としては、血液検査、医用撮像、および生検が挙げられる。
【００１９】
解離：組織を、例えば外科的手技中に分離するかまたは切り離すプロセス。
【００２０】
内視鏡用注射針または内視鏡用注射針カテーテル：全般的に長い（例えば最大約２３０ｃｍ）デバイスであって、遠位注射針を有する内部注射管が内側にスライド可能に配置されている長いカテーテルを備える、デバイス。全般的に、近位作動ハンドルは、一方を他方に対して移動させるために、カテーテルおよび注射管に連結している。針は格納可能であり得る。流体の注射管へのアクセスは、典型的にはハンドルのルアーコネクタを介して実現される。
【００２１】
内視鏡用注射針は、典型的には内視鏡のカテーテルによって注射部位に送達される。内腔を損傷から保護するために、注入針デバイスのハンドルを操作して遠位注射針をカテーテルの内腔に収納した後でデバイスを内視鏡に挿入する。内視鏡用注射針デバイスの遠位端が注射部位に位置付けられる場合、そのハンドルを操作して注射針をカテーテルの内腔から遠位に移動させる。一部の実施形態では、最も遠位の位置まで進んだ場合、注射針の露出部分は約４〜６ｍｍの長さであり得る。
【００２２】
内視鏡的粘膜切除術（ＥＭＲ）：胃腸（ＧＩ）管の表層（粘膜および粘膜下組織）に限局される無茎または扁平の新生物の除去のために開発された内視鏡的技法。粘膜および粘膜下組織は、その下にある固有筋層から切除される。内視鏡的粘膜解離術（ＥＳＤ）とは、特により大きな病変を、例えば胃腸管から除去するために開発された内視鏡的技法であって、粘膜および粘膜下組織が胃腸管のその他の層から解離される、内視鏡的技法を指す。ＥＭＲとＥＭＤとの両方は典型的には、標的とした病変の下、すなわち粘膜下組織とその下にある固有筋層との間への、クッションとして作用して粘膜下組織とその上にある粘膜とを挙上させる物質の注射を伴う。ＥＭＲの場合、次いで、挙上した病変はスネアを用いて除去され、吸引によって小さなカップへ引き離される。ＥＳＤの場合、病変の下の粘膜下組織は特殊化したナイフを用いて解離され、粘膜下組織およびその上にある粘膜の分離を引き起こす。ＥＳＤは、治癒目的では、ＥＭＲを用いて可能であるよりも大きな病変および潜在的により深部の病変の除去を可能にする。ＥＭＲとＥＳＤとの両方は、上にある粘膜を下にある固有筋層から効果的に分離し、同時に粘膜を隣接する食道粘膜よりも高く挙上させる、食道の粘膜下組織面への物質の注射によって容易になる。この層の分離および罹患した組織の挙上は、外科医が目的の組織を単離し、把持し、除去するのに役立つ。
【００２３】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）：組織および臓器の非細胞成分。天然のＥＣＭ（哺乳動物およびヒト等の多細胞生物に見出されるＥＣＭ）は、コラーゲン、エラスチン、ラミニン、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、抗菌物質、化学誘引物質、サイトカイン、および増殖因子を含むがこれらに限定されない、構造的および非構造的生体分子の複合混合物であり、典型的には、異なる組織間および臓器間では具体的な組成が異なる。哺乳動物では、ＥＣＭは多くの場合、乾燥重量で約９０％のコラーゲンを様々な形態で含む。ＥＣＭから構成される生物学的足場は、細胞を所与の組織または臓器から除去して、ＥＣＭを残すことによって創出することができる。ＥＣＭの組成および構造は、組織の解剖学的供給源に応じて変動する。例えば、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）、膀胱マトリックス（ＵＢＭ）、膀胱粘膜下組織（ＵＢＳ）、食道（Ｅ）、および肝臓間質ＥＣＭはそれぞれ、各組織に必要な独特の細胞のニッチのために、全体の構造および組成が異なる。無傷「細胞外マトリックス」および「無傷ＥＣＭ」の生体足場は、可溶化しておらず、３次元超微細構造を保持し、理想的には、コラーゲン、エラスチン、ラミニン、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、抗菌物質、化学誘引物質、サイトカイン、および増殖因子を含むがこれらに限定されない構造的および非構造的生体分子の活性を保持する細胞外マトリックス、例えば、限定されないが、本明細書に記載される粉砕ＥＣＭからなる。
【００２４】
ＥＣＭ内の生体分子の活性は、例えば化学的もしくは酵素的架橋によって、および／またはＥＣＭを透析することによって、化学的または機械的に変更することができる。無傷ＥＣＭは本質的には、酵素的に消化も、架橋も、および／または透析もされておらず、このことは、無傷ＥＣＭが消化、透析、および／または架橋プロセスにも、可溶化前のＥＣＭの保存および取扱い中に天然に存在するプロセス以外の条件にも供されていないことを意味する。したがって、（本明細書に記載される使用におけるＥＣＭのゲル化および機能的特徴に実質的に影響を及ぼさない、取るに足らない手法以外の任意の手法において）透析されるＥＣＭは、「無傷」であるとは考えられない。
【００２５】
食道胃十二指腸鏡検査（ＥＧＤ）または上部胃腸内視鏡検査：十二指腸までの胃腸管の任意の上部を可視化する診断的内視鏡的手技。「食道内視鏡検査」とは、食道を可視化する任意の内視鏡的手技である。食道内視鏡検査は、場合によってはＥＧＤまたは上部胃腸内視鏡検査の一部として実施され得る。これらの用語は、相互に排他的であることが明白に述べられていない限り、相互に排他的ではない。
【００２６】
ゲル化：ゾルからのゲルの形成。
【００２７】
胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）：胃から食道へ逆流する胃酸内容物によって引き起こされる粘膜損傷の慢性症状。ＧＥＲＤは通例、通常では胃の最上部（近位部）を閉鎖しておく下部食道括約筋の異常な弛緩、胃逆流の食道からの排出障害、または裂孔ヘルニアを含む、胃と食道との間の障壁の変化によって引き起こされる。これらの変化は永続的であっても一時的であってもよい。
【００２８】
流動粘度：剪断応力または引張応力による漸進的な変形に対する流体の抵抗性の尺度。粘度とは、流体において、異なる速度で移動する流体の２つの表面の間の相対的な運動に対抗する流体の特性である。流体が管を通る場合、流体を構成する粒子は全般的に、管の軸付近ではより速く移動し、管の壁付近ではより遅く移動する。応力（例えば、管の２つの端部の間の圧力差）は、粒子層間の摩擦を克服して流体を移動させ続けるために必要である。所与の速度パターンに関して、必要とされる応力は流体の粘度に比例する。粘度は、粘度計およびレオメータを用いて測定される。粘度は、パスカル秒（Ｐａ＊ｓ）として測定することができる。２０℃の水は１．００２ｍＰａ＊ｓの粘度を有する。
【００２９】
ヒドロゲル：水が分散媒体であるコロイドゲルとして見出される場合がある、親水性のポリマー鎖のネットワーク。ヒドロゲルは、高度に吸収性の天然または合成ポリマーネットワークである。ヒドロゲルはまた、天然の組織に類似する程度の柔軟性を有する。「膀胱ＥＣＭヒドロゲル」という用語には、ＵＢＭおよびＵＢＳヒドロゲルが含まれる。
【００３０】
炎症：組織に対する傷害によって誘発される局在化した応答。炎症は、正常な（健康な）状況下で組織の任意の領域内に見出される任意のクラスの白血球細胞の数を超える数のそのような細胞の、任意の組織空間、単位、または領域における出現またはそれらへの遊走によって特徴付けられる。炎症は、病原体、損傷細胞、または刺激物質等の有害な刺激に対する血管組織の複合的な生物学的応答によって形成される。
【００３１】
等張緩衝溶液：７．２〜７．８の間のｐＨに緩衝され、平衡濃度の塩を有し、等張環境を促進する溶液。
【００３２】
低度異形成および高度異形成ならびに化生（食道の）：異常な細胞形態によって特徴付けられるが、細胞型が依然として扁平上皮として認識可能である、食道の病理学的状態。全般的に、食道異形成では、食道の内壁細胞に頂端ムチンが存在しない。低検出力の場合、これらの区域は無関係の区域と比較してより高色素性に見える場合がある。
【００３３】
高度異形成の場合、細胞形態の変化はより顕著となるが、細胞は技術的には依然として扁平上皮の１種である。
【００３４】
細胞が扁平上皮細胞から別の細胞型、例えば、多くの場合立方体または円柱形状である腺細胞に変化する場合、このプロセスは化生と称される。化生に関しては、通例、食道の腺構造の歪みが存在し、際立っている場合があり、この歪みは、腺窩の分岐および側方への伸長、粘膜表面の絨毛様の構成、または「連続する」腺の篩状パターンを形成する上皮の腺内架橋から構成される。粘膜表面に核極性の喪失を伴う異常な上皮が存在し、この上皮は、核の「丸み」、および核の互いに対する一貫した関係性の非存在によって特徴付けられる。
【００３５】
防止することまたは処置すること：疾患を阻害することとは、例えば炎症によって引き起こされるような疾患のリスクがある人において、疾患の部分的または完全な発症を阻害することを指す。食道腺癌のリスクがある人の一例は、バレット食道またはＧＥＲＤを有する人である。疾患プロセスを阻害することには、疾患の発症を防止することが含まれる。「処置」とは、例えば疾患または病理学的状態が発症し始めた後に、その徴候または症状を改善する治療介入を指す。
【００３６】
剪断（Ｓｈｅｅｒ）応力：材料断面と同一平面上の応力の成分。剪断応力は、断面と平行な力ベクトル成分から生じる。平均剪断応力を算出する式は、単位面積当たりの力
【数１】
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（式中、τ＝剪断応力、Ｆ＝加えられた力、Ａ＝加えられた力のベクトルと平行な面積を含む、材料の断面積）である。
【００３７】
狭窄：嚥下困難を引き起こす、食道のせばまりまたは締め付け。食道狭窄の症状としては、胸やけ、口内の苦味もしくは酸味、窒息、咳、息切れ、頻繁なげっぷもしくはしゃっくり、嚥下痛もしくは嚥下障害、吐血、および／または体重減少が挙げられる。食道の狭窄は、胃食道逆流症、食道炎、下部食道括約筋機能不全、運動障害、アルカリ液摂取（ｌｙｅ  ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ）、または裂孔ヘルニアによって引き起こされ得る。狭窄は、食道の外科手術および他の処置、例えばレーザー療法または光線力学療法の後に形成され得る。区域が治癒すると同時に瘢痕が形成され、これは組織が牽引され締め付ける原因となり、嚥下の困難をもたらす。狭窄は炎症の結果であり得る。バリウム嚥下試験または上部胃腸内視鏡検査は、食道狭窄を診断するために使用することができる。
【００３８】
剛性：物体または流体の硬性。細胞外マトリックスの剛性は、硬領域指向性運動（ｄｕｒｏｔａｘｉｓ）における細胞の遊走を導くために重要である。剛性は、１ニュートン毎平方メートルであるパスカル（Ｐａ）単位の尺度であり得る。
【００３９】
治療剤：包括的な意味で使用される場合、治療剤には処置剤、予防剤、および代替剤が含まれる。「処置」または「処置すること」とは、膀胱ＥＣＭヒドロゲル、例えばＵＢＭまたはＵＢＳヒドロゲル等の物質を患者に、任意の疾患症状を測定可能な程度軽減、抑制、もしくは緩和するか、疾患進行を緩徐化するか、または疾患退行を引き起こすのに十分な量で提供することを意味する。ある特定の実施形態では、疾患の処置は、患者が疾患の症状を示す前に開始してもよい。開示される方法は、食道の炎症を抑制する、および／または食道の炎症の影響を緩和する。
【００４０】
治療有効量：膀胱ＥＣＭヒドロゲル等の組成物の「治療有効量」とは、患者に投与された場合に、症状の改善、低減した減衰進行等の治療利益を提供するか、または疾患退行を引き起こすのに効果的な量を意味する。膀胱ＥＣＭヒドロゲルの分量は、処置される被験体において所望の効果を達成する、例えば食道の粘膜下の組織に注射された場合にゲルを形成して、上にある粘膜を下にある固有筋層から解離するのに十分である場合、治療的に有効である。粘膜下クッションを形成するのに有効な量は、適用される調製物、処置される被験体、苦痛の重症度および種類、ならびに投与手法に依存する。
【００４１】
本明細書に開示される方法において有用な膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、医学的環境と獣医学的環境の両方における適用を有する。したがって、「被験体」または「患者」という一般用語には、ヒトまたは獣医学的被験体、例えば他の霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシを含むがこれらに限定されない全ての動物が含まれると理解される。
【００４２】
膀胱ＥＣＭ：任意の哺乳動物の膀胱に由来する細胞外マトリックス。この用語には、膀胱マトリックス（ＵＢＭ）ＥＣＭ、および膀胱粘膜下組織（ＵＢＳ）ＥＣＭが含まれる。膀胱の壁は、以下の層：粘液層（ｔｕｎｉｃａ  ｍｕｃｏｓａ）（移行上皮層および固有層を含む）、粘膜下組織層、最大３つの筋肉および外膜の層（疎性結合組織層）−厚さ断面において管腔側から反管腔側へ列挙−から構成される。ＵＢＳは、反管腔側の筋肉層から剥がされた膀胱の粘膜下の組織、および少なくとも脊椎動物の膀胱のセグメントの粘液層の管腔側の部分を含む組織組成物から調製される。参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，５５４，３８９号を参照のこと）。ＵＢＭ  ＥＣＭは、膀胱上皮基底膜および基底膜の直下にある固有層から調製される。参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，５７６，２６５号を参照のこと。
【００４３】
別段の説明がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という用語は、文脈上別段の指示が明確にない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「または」という語は、文脈上別段の指示が明確にない限り、「および」を含むことが意図される。核酸またはポリペプチドに関して与えられる全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量の値は、近似値であり、説明のために提供されることがさらに理解されるべきである。本明細書に記載されるものと類似または同等である方法および材料が本開示の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が以下に記載される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。「約」という用語は５パーセント以内を示す。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が参照によって組み込まれる。矛盾する場合は、用語の説明を含む本明細書が優先する。加えて、材料、方法、および例は、例証的なものに過ぎず、限定することを意図するものではない。
【００４４】
膀胱細胞外マトリックス（ＥＣＭ）ヒドロゲル
膀胱ＥＣＭヒドロゲルを調製する方法は、例えば、米国特許第８，３６１，５０３号、同第６，５７６，２６５号、および同第５，５５４，３８９号に開示されている。ヒドロゲルを作製するいかなる方法も、本明細書に開示される方法において有用な膀胱ＥＣＭヒドロゲルを作製するために使用することができる。追加の方法は、例えば、ＥＣＭに関する米国特許第４，９０２，５０８号、同第４，９５６，１７８号、同第５，２８１，４２２号、同第５，３５２，４６３号、同第５，３７２，８２１号、同第５，５５４，３８９号、同第５，５７３，７８４号、同第５，６４５，８６０号、同第５，７７１，９６９号、同第５，７５３，２６７号、同第５，７６２，９６６号、同第５，８６６，４１４号、同第６，０９９，５６７号、同第６，４８５，７２３号、同第６，５７６，２６５号、同第６，５７９，５３８号、同第６，６９６，２７０号、同第６，７８３，７７６号、同第６，７９３，９３９号、同第６，８４９，２７３号、同第６，８５２，３３９号、同第６，８６１，０７４号、同第６，８８７，４９５号、同第６，８９０，５６２号、同第６，８９０，５６３号、同第６，８９０，５６４号、および同第６，８９３，６６６号に開示されている。ＥＣＭは膀胱に由来する。ある特定の実施形態では、膀胱ＥＣＭは、脊椎動物、例えば、限定されないが、ヒト、サル、ウマ、ブタ、ウシ、およびヒツジを含むがこれらに限定されない哺乳動物から単離される。哺乳動物は獣医学的動物であってもよい。非限定的な具体例では、膀胱ＥＣＭはブタまたはヒト膀胱ＥＣＭである。一部の実施形態では、ＥＣＭは、膀胱ＥＣＭの基底膜部分を含む。ある特定の実施形態では、膀胱ＥＣＭは基底膜の少なくとも一部分を含む。他の実施形態では、ＥＣＭは細胞培養物から採取される。膀胱ＥＣＭの調製のために使用される供給源組織は、非常に多様な方法で採取することができ、採取された組織の多様な部分は、採取された直後に使用してもよい。膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、ＵＢＭまたはＵＢＳ  ＥＣＭヒドロゲルであり得る。図２Ａおよび２Ｂを参照のこと。
【００４５】
米国特許第８，３６１，５０３号（参照によって本明細書に組み込まれる）に開示されているように、ブタ膀胱ＥＣＭ等の膀胱ＥＣＭは、メスハンドルと湿らせたガーゼとを用いる長軸方向の拭取り動作を使用して、膀胱組織を摩耗させ、漿膜、筋層、および粘液下層の全てを含む外側（反管腔側）の層を除去することによって調製される。組織セグメントの外転後、粘液層の管腔側の部分を、同じ拭取り動作を使用して、その下にある組織から剥がす。これらの組織が除去された後、結果として得られるＥＣＭは、粘膜固有層とその上にある基底膜とからなる。参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，８９３，６６６号もまた、膀胱、皮膚、食道、および小腸由来のＥＣＭの作製を開示している。
【００４６】
一実施形態では、ＥＣＭは、膀胱マトリックス（ＵＢＭ）を調製するために、収穫されたブタ膀胱から単離される。過剰な結合組織および残尿は膀胱から除去される。漿膜、外筋層、粘液下層、および大半の粘膜筋板は、機械的摩耗（上記を参照のこと）によって、または酵素処理、水分補給、および摩耗の組合せによって除去することができる。これらの組織の機械的除去は、外側の層（特に反管腔側の平滑筋層）、および粘液層（上皮層）の管腔側の部分さえ除去する、長軸方向の拭取り動作を使用する摩耗によって遂行することができる。これらの組織の機械的除去は、例えばアドソン・ブラウン鉗子およびメッツェンバウム剪刀を用いる腸間膜組織の除去、ならびに湿らせたガーゼに包んだメスハンドルまたは他の硬い物体を用いる長軸方向の拭取り動作を使用して筋層および粘液下層を拭い去ることによって遂行される。粘液層の上皮細胞は、組織を脱上皮化溶液、例えば、限定されないが、高張食塩水に浸漬することによっても解離することができる。結果として得られるＵＢＭは、粘液層の基底膜および隣接する固有層を含み、過酢酸を用いてさらに処理され、凍結乾燥され、粉末化される。米国特許第８，３６１，５０３号を参照のこと。
【００４７】
一部の実施形態では、上皮細胞は、初めに組織を脱上皮化溶液、例えば高張食塩水、例えば、限定されないが、１．０Ｎ食塩水に、１０分〜４時間の範囲の期間浸漬することによって剥がすことができる。高張食塩溶液への曝露は、上皮細胞をその下にある基底膜から効果的に除去する。最初の剥脱手技後に残っている組織には、上皮基底膜、および上皮基底膜に対して反管腔側の組織層が含まれる。次に、この組織は、上皮基底膜ではなく反管腔側の組織の大部分を除去するさらなる処理に供される。外側の漿膜組織、外膜組織、平滑筋組織、粘液下層、および大半の粘膜筋板は、機械的摩耗によって、または酵素処理、水分補給、および摩耗の組合せによって残りの脱上皮化組織から除去される。
【００４８】
市販の膀胱ＥＣＭ調製物もまた、本明細書に記載される方法、デバイス、および組成物において使用することができる。市販の調製物としては、これに限定されないが、ＭＡＴＲＩＳＴＥＭ  ＵＢＭ（商標）（Ａｃｅｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｊｅｓｓｕｐ、Ｍｄ．）が挙げられる。
【００４９】
膀胱ＥＣＭは、過酢酸への曝露を含むがこれらに限定されない任意の数の標準的な技法によって殺菌することができる。膀胱ＥＣＭは、低線量ガンマ線放射、ガスプラズマ滅菌、酸化エチレン処理、超臨界ＣＯ２、または電子線処理を含むがこれらに限定されない任意の数の標準的な技法によって滅菌することができる。より典型的には、ＥＣＭの殺菌は、０．１％（ｖ／ｖ）過酢酸、４％（ｖ／ｖ）エタノール、および９５．９％（ｖ／ｖ）滅菌水に２時間浸漬することによって得られる。過酢酸残渣は、ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）を用いて１５分間２回、および滅菌水を用いて１５分間２回洗浄することによって除去される。その後、ＥＣＭ材料は、酸化プロピレンもしくは酸化エチレン処理、ガンマ線照射処理（０．０５〜４ｍＲａｄ）、ガスプラズマ滅菌、超臨界ＣＯ２、または電子線処理によって滅菌することができる。ＥＣＭはタンパク質材料の架橋を引き起こすグルタルアルデヒドを用いた処理によって滅菌することもできるが、この処理は、材料がゆっくりと再吸収されるかまたは全く再吸収されず、構築的リモデリングよりもむしろ瘢痕組織形成または被包によりよく似ている異なる種類の宿主リモデリングを促すように、材料を実質的に変更する。タンパク質材料の架橋は、カルボジイミド、または熱脱水（ｄｅｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌ）もしくは光酸化法を用いて誘導することもできる。米国特許第８，３６１，５０３号に開示されているように、ＥＣＭは、０．１％（ｖ／ｖ）過酢酸（ａ）、４％（ｖ／ｖ）エタノール、および９６％（ｖ／ｖ）滅菌水への２時間の液浸によって殺菌される。次いで、ＥＣＭ材料は、ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）を用いて１５分間２回、および脱イオン水を用いて１５分間２回洗浄される。
【００５０】
目的の組織の単離後、脱細胞化が様々な方法、例えば、限定されないが、高張食塩水、過酢酸、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）−Ｘ、または他の界面活性剤への曝露によって実施される。殺菌および脱細胞化は同時であってもよい。例えば、限定されないが、上述の過酢酸を用いた殺菌は、ＥＣＭを脱細胞化することにも貢献し得る。次いで、脱細胞化ＥＣＭは乾燥、すなわち凍結乾燥（フリーズドライ）または風乾され得る。乾燥ＥＣＭは、破断すること、製粉すること、切断すること、磨砕すること、および剪断することを含むがこれらに限定されない方法によって粉砕することができる。粉砕ＥＣＭは、例えば、限定されないが、凍結またはフリーズドライ状態における磨砕または製粉等の方法によって粉末化形態にさらに加工することもできる。
【００５１】
ＥＣＭヒドロゲルを調製することにおける使用のための可溶化ＥＣＭ組織を調製するために、粉砕ＥＣＭは、酸性溶液において酸性プロテアーゼを用いて消化されて、消化溶液を形成する。ＥＣＭの消化溶液は典型的には、室温である特定の量の時間、一定の撹拌で保たれる。ＥＣＭ消化物は、直ぐに使用されても、−２０℃で保存されても、例えば、限定されないが、−２０℃または−８０℃で凍結されてもよい。
【００５２】
ＥＣＭが可溶化されると（典型的には実質的に完全に）、溶液のｐＨは、７．２〜７．８の間、一実施形態では、７．４のｐＨまで上昇される。塩基、例えばＮａＯＨを含む水酸化物イオンを含有する塩基は、溶液のｐＨを上昇させるために使用することができる。同様に、緩衝液、例えば、限定されないが、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む等張緩衝液は、溶液を標的ｐＨにするため、またはゲルのｐＨおよびイオン強度を標的レベル、例えば生理的ｐＨおよびイオン条件に維持することを援助するために使用することができる。これは「プレゲル」溶液を形成する。この「プレゲル」は、室温において、粘性溶液としての液体形態である。中和消化溶液（プレゲル）は、生理的温度に接近する、３７℃に接近する温度でゲル化し得る。方法は、典型的にはゲル化前に透析ステップを含まず、典型的には３７℃において特有の速さでゲル化するより完全なＥＣＭ様マトリックスを生じる（下記を参照のこと）。
【００５３】
したがって、ＥＣＭは膀胱に由来する。膀胱ＥＣＭは、１名／匹の被験体、または１名／匹よりも多い被験体、例えば、２、３、もしくは４名／匹の被験体、あるいは膀胱細胞株から作製することができる。ＥＣＭは市販の膀胱ＥＣＭであってもよい。非限定的な一実施形態では、ＥＣＭは凍結乾燥され、粉砕される。次いで、ＥＣＭは、消化ＥＣＭを作製するために酸性溶液において酸性プロテアーゼを用いて可溶化される。酸性プロテアーゼは、限定されないが、ペプシンもしくはトリプシン、またはそれらの組合せであり得る。次いで、ＥＣＭは、プロテアーゼに好適または最適な酸性ｐＨ、例えば約２よりも大きいｐＨまたは４までのｐＨで、例えば０．０１Ｍ  ＨＣｌ溶液において可溶化され得る。溶液は典型的には、組織型に応じて（例えば下記の例を参照のこと）約１２〜約４８時間、混合（撹拌、かき混ぜ、混和、ブレンド、回転、および傾け等）しながら可溶化される。ＥＣＭヒドロゲルは、（ｉ）細胞外マトリックスを粉砕すること、（ｉｉ）無傷であるか、透析されていないか、または架橋されていない細胞外マトリックスを、酸性溶液において酸性プロテアーゼを用いる消化によって可溶化して、消化溶液を作製すること、（ｉｉｉ）消化溶液のｐＨを７．２〜７．８の間のｐＨに上昇させて、中和消化溶液（プレゲル溶液）を作製すること、および（ｉｖ）溶液を、目的の被験体の食道内においておよそ３７℃の温度でゲル化させることによって調製される。酸性プロテアーゼがＥＣＭを消化するために使用される場合、プレゲル溶液、および結果として得られるヒドロゲルは、不活化プロテアーゼを含有し得る。これらの膀胱ＥＣＭヒドロゲルのいずれも、本明細書に開示される方法において有用である。
【００５４】
膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、約３７℃の温度に曝露された場合、ゲルを形成する。「プレゲル」形態の膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、例えば、限定されないが、−２０℃または−８０℃で凍結および保存することができる。「プレゲル」形態の膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、室温、例えば約２５℃で保存することができる。したがって、膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、３７℃未満、例えば、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４℃においてプレゲル形態である。膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、保存のために凍結させることができ、したがって、０℃未満で保存することができる。本明細書で使用される場合、「プレゲル形態」または「プレゲル」という用語は、ｐＨが増加しているが、ゲル化していない膀胱ＥＣＭヒドロゲルを指す。例えば、限定されないが、プレゲル形態の膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、７．２〜７．８の間のｐＨを有する。膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、例えば経口的に、カテーテルを介して、または内視鏡的に、プレゲル形態において食道の炎症を有する被験体に送達することができる。
【００５５】
プレゲル形態の膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、患者の食道への導入に適している。およそ３７℃である食道の粘膜下に導入されると、膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、ゲル化し、食道の固有筋層と粘膜下組織との間にＥＣＭヒドロゲルのクッションを創出して、外科的切除のために粘膜下組織を持ち上げる。
【００５６】
一部の実施形態では、膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、以下の特徴：ａ）約３７℃の温度において２０分未満の５０％ゲル化までの時間、ｂ）食道への注入に好適な流動粘度、およびｃ）ｉ）約１０〜約４００パスカル（Ｐａ）、ｉｉ）約１０〜約４５０Ｐａ、ｉｉｉ）約１０〜約６００Ｐａ、ｉｖ）約５〜約１，０００Ｐａ、ｖ）約１０〜１，０００Ｐａ、またはｖｉ）約１０〜約７０Ｐａの剛性を有する。
【００５７】
複数の実施形態では、膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、以下の特徴：ａ）約３７℃の温度において３０分未満の５０％ゲル化までの時間、ｂ）食道への注入に好適な流動粘度、およびｃ）約１０〜約４００パスカル（Ｐａ）の剛性を有する。他の実施形態では、ＥＣＭヒドロゲルは、以下の特徴：ａ）約３７℃の温度において２０分未満の５０％ゲル化までの時間、ｂ）食道への注入に好適な流動粘度、およびｃ）約１０〜約４５０パスカル（Ｐａ）の剛性を有する。他の実施形態では、膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、以下の特徴：ａ）約３７℃の温度において２０分未満の５０％ゲル化までの時間、ｂ）食道への注入に好適な流動粘度、およびｃ）約１０〜約６００パスカル（Ｐａ）の剛性を有する。
【００５８】
他の実施形態では、膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、以下の特徴：ａ）約３７℃の温度において２０分未満の５０％ゲル化までの時間、ｂ）食道への注入に好適な流動粘度、およびｃ）約５〜約１，０００パスカル（Ｐａ）の剛性を有する。他の実施形態では、膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、以下の特徴：ａ）約３７℃の温度において２０分未満の５０％ゲル化までの時間、ｂ）食道への注入に好適な流動粘度、およびｃ）約１０〜約１，０００パスカル（Ｐａ）の剛性を有する。さらなる実施形態では、膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、以下の特徴：ａ）約３７℃の温度において２０分未満の５０％ゲル化までの時間、ｂ）食道への注入に好適な流動粘度、およびｃ）１０〜７０パスカル（Ｐａ）の剛性を有する。
【００５９】
追加の非限定的な具体例では、膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、（ａ）無細胞の細胞外マトリックスを、酸性溶液において酸性プロテアーゼを用いる膀胱の消化によって可溶化して、消化ＥＣＭを作製すること、（ｂ）消化ＥＣＭのｐＨを７．２〜７．８の間のｐＨに上昇させて、中和消化溶液を作製すること、（ｃ）消化ＥＣＭを約２ｍｇ／ｍｌ〜約１６ｍｇ／ｍｌ、例えば約８ｍｇ／ｍｌ〜約１２ｍｇ／ｍｌの濃度の膀胱ＥＣＭヒドロゲルに希釈することによって作製される。次いで、この膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、被験体の食道に導入され、そこでゲル化する。
【００６０】
本明細書に開示される方法において有用な膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、約３７℃の温度において２０分未満、例えば、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２分未満の５０％ゲル化までの時間を有する。一部の実施形態では、膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、約３７℃の温度において１０分未満の５０％ゲル化までの時間を有する。他の実施形態では、５０％ゲル化までの時間は、約３７℃の温度において約２〜約２０分である。さらなる実施形態では、５０％ゲル化までの時間は、約３７℃の温度において約２〜約１０分である。さらに他の実施形態では、５０％ゲル化までの時間は、約３７℃の温度において約３〜約８分である。
【００６１】
開示される膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、食道の粘膜下組織の空間への注入／注射に好適な流動粘度を有することができる。一部の実施形態では、膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、０．１／ｓの剪断速度において約０．１〜約１００Ｐａ＊ｓ、例えば０．１／ｓの剪断速度において約０．２、１、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０Ｐａ＊ｓの流動粘度を有する。さらなる実施形態では、膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、０．１／ｓの剪断速度において約１〜約４０Ｐａ＊ｓ、例えば０．１／ｓの剪断速度において約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０Ｐａ＊ｓの流動粘度を有する。
【００６２】
他の実施形態では、膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、１０００／ｓの剪断速度において約０．０１〜約０．２０Ｐａ＊ｓ、または１０００／ｓの剪断速度において約０．０１〜約０．１０Ｐａ＊ｓ、例えば１０００／ｓの剪断速度において約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１９、または０．２の流動粘度を有する。
【００６３】
さらなる実施形態では、膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、１００／ｓの剪断速度において約０．０２〜約０．８Ｐａ＊ｓ、または１００／ｓの剪断速度において約０．１〜約０．８Ｐａ＊ｓ、例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、または０．８Ｐａ＊ｓを有する。
【００６４】
さらなる実施形態では、膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、０．２／ｓの剪断速度において約１０〜約１００Ｐａ＊ｓの流動粘度、および１０００／ｓの剪断速度において約０．０１〜約０．１０Ｐａ＊ｓの流動粘度を有する。さらなる実施形態では、ＥＣＭヒドロゲルは、０．１／ｓの剪断速度において１〜４０Ｐａ＊ｓ、および１０００／ｓの剪断速度において０．０１〜０．２Ｐａ＊ｓの流動粘度を有する。
【００６５】
他の実施形態では、膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、１／ｓの剪断速度において、約０．１〜約２５Ｐａ＊ｓ、例えば、１〜約２５Ｐａ＊ｓ、または１〜約２０Ｐａ＊ｓ、または１〜約１０Ｐａ＊ｓ、例えば１／ｓの剪断速度において０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５Ｐａ＊ｓの流動粘度を有する。剪断速度は、例えば、１／ｓの剪断速度において５、１０、１５、または２０Ｐａ＊ｓであり得る。他の実施形態では、膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、１００／ｓの剪断速度において約０．０２５〜約０．６、例えば１００／ｓの剪断速度において約０．０２５、０．０３０、０．０３５、０．０４０、０．０４５、０．０５０、０．０５５、または０．０６０の流動粘度を有する。流動粘度は、１／ｓの剪断速度において約０．１〜約２５Ｐａ＊ｓであり、１００／ｓの剪断速度において約０．０２〜約０．８Ｐａ＊ｓである。追加の実施形態では、流動粘度は、１／ｓの剪断速度において約１〜約１０Ｐａ＊ｓであり、１００／ｓの剪断速度において約０．１〜約０．３である。
【００６６】
さらなる実施形態では、膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、０．２／ｓの剪断速度において約１０〜約１００Ｐａ＊ｓの流動粘度を有する。他の実施形態では、膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、１０００／ｓの剪断速度において約０．０１〜約０．１０Ｐａ＊ｓの流動粘度を有する。他の実施形態では、膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、０．１／ｓの剪断速度において約１〜約４０Ｐａ＊ｓの流動粘度を有し、１０００／ｓの剪断速度において０．０１〜０．２Ｐａ＊ｓである。
【００６７】
開示される膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、ｉ）約１０〜約４００パスカル（Ｐａ）、ｉｉ）約１０〜約６００Ｐａ、ｉｉｉ）約５〜約１，０００Ｐａ、ｉｖ）約１０〜１，０００Ｐａ、またはｖ）約１０〜約７０Ｐａの剛性を有する。膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、約１０〜約４００パスカル（Ｐａ）、例えば、約１０〜約７０Ｐａ、約１０〜約１００パスカル（Ｐａ）、または約１０〜約１５０Ｐａ、約１０〜約２００Ｐａ、または約１０〜約２５０Ｐａの剛性を有し得る。一部の実施形態では、開示される膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７０Ｐａの剛性を有する。他の実施形態では、開示される膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、約１０〜約８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、または４００Ｐａの剛性を有する。さらなる実施形態では、開示される膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、約７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００Ｐａの剛性を有し得る。
【００６８】
一部の実施形態では、ヒドロゲルにおける膀胱ＥＣＭ濃度は、約２ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、例えば約８ｍｇ／ｍｌ〜約１２ｍｇ／ｍｌまたは約２ｍｇ／ｍｌ〜約１６ｍｇ／ｍｌである。他の実施形態では、ヒドロゲルにおける膀胱ＥＣＭ濃度は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６ｍｇ／ｍｌである。有用な例示的な濃度としては、これらに限定されないが、約９ｍｇ／ｍｌ〜約１１ｍｇ／ｍｌおよび約１０ｍｇ／ｍｌ〜約１２ｍｇ／ｍｌが挙げられる。追加の例示的な濃度としては、約８ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約８ｍｇ／ｍｌ〜約１１ｍｇ／ｍｌ、約８ｍｇ／ｍｌ〜約１３ｍｇ／ｍｌ、約８ｍｇ／ｍｌ〜約１４ｍｇ／ｍｌ、約８ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌ、および約８ｍｇ／ｍｌ〜約１６ｍｇ／ｍｌが挙げられる。有用なさらなる例示的な濃度としては、約６ｍｇ／ｍｌ〜約１２ｍｇ／ｍｌ、約１３ｍｇ／ｍｌ、約１４ｍｇ／ｍｌ、約１５ｍｇ／ｍｌ、または約１６ｍｇ／ｍｌも挙げられる。
【００６９】
処置の方法
被験体の食道における固有筋層から粘膜および粘膜下組織を解離するための方法が本明細書に開示され、これらの方法は、食道に、膀胱細胞外マトリックス（ＥＣＭ）ヒドロゲル、例えばＵＢＳまたはＵＢＭ  ＥＣＭヒドロゲルを含む医薬組成物を粘膜下注射して、臓器の領域における粘膜下組織とその下にある固有筋層との間にクッションを形成するステップを含む。方法はＥＭＲまたはＥＭＤであり得る。
【００７０】
ＥＭＲは、ＧＩ管の表層（粘膜および粘膜下組織）に限局される無茎または扁平の新生物の除去のために開発された内視鏡的技法である。ＥＭＲは典型的には、２ｃｍよりも小さい病変の除去、またはより大きな病変の漸次除去のために使用される。ＥＭＲはまた、正確な病理学的ステージ分類のために切除した検体の評価においても重要な役割を果たす。ポリープ切除術と異なり、ＥＭＲは、流動剤、一般的には生理食塩水（ＮＳ）溶液を粘膜下層に注射することによる、筋肉の層からの病変の持上げを伴う。ＥＭＲはまた、正確な組織病理学的ステージ分類のために検体を取得して、リンパ節転移のリスクを決定するのにも有用である。ＥＭＲは、腸壁粘膜下組織の中央またはより深部の部分を切り取ることによって、罹患した粘膜の完全な除去を容易にする。様々なＥＭＲ技法が記載されており、スネア切除を伴う４つの方法：（１）注射および切断方法、（２）注射、持上げ、および切断方法、（３）キャップ補助ＥＭＲ（ＥＭＲＣ）、ならびに（４）結紮を伴うＥＭＲ（ＥＭＲＬ）が一般的に使用される。注射および切断技法では、患部粘膜は、粘膜下流体クッションを創出することによって筋肉の層から持ち上げられ、捕捉され、電気外科用スネアを使用して絞扼され、次いで切除される。しかしながら、薄い粘膜下層への注射は繊細なプロセスであり、注射溶液は短時間で散逸する傾向があり、扁平病変および陥没性病変は隆起性病変と比較してスネアを用いて捕捉することが難しく、大きなまたは厄介な位置にある病変は除去することが困難である可能性がある（Ｕｒａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００８：２  １３１−１３８）。注射補助ＥＭＲは、多くの場合、大きな扁平結腸ポリープのために使用される。
【００７１】
内視鏡的粘膜下層解離術（ＥＳＤ）は、特に、より大きな病変を除去するために開発された。病変は、電気メスを使用して粘膜下層に沿って直接解離され、結果として大きな病変でさえ一括切除される。ＥＳＤは、ある特定のがんステージを処置することにおける従来の外科手術に取って代わると予測されているが、従来のＥＭＲよりも高い比率の穿孔および出血性合併症を有するため、ＥＭＲよりも高度な内視鏡の技術および経験が必要とされる。ＥＳＤは、多数の電気メス、例えば、絶縁チップジアテルミーナイフ、ニードルナイフ、フックナイフ、フレックスナイフ、三角ナイフ（ｔｒｉａｎｇｌｅ  ｔｉｐｐｅｄ  ｋｎｉｆｅ）、フラッシュナイフ、スプラッシュニードル、および小口径先端透明フードを使用することができる。これらのナイフは、高周波電気外科電流（ＨＦＥＣ）発生装置と共に使用することができる。ＥＳＤは、３つのステップ：（１）流体を注射して粘膜下クッションを形成し、病変を筋肉層から挙上させること、（２）病変の周囲の粘膜の円形切断、および（３）病変の下の粘膜下組織の結合組織の解離によって特徴付けられる（参照によって本明細書に組み込まれるＫａｋｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｗｏｌｄ  Ｊ．  Ｇｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．  １４（９）：  ２９６２−２９６７，  ２００８を参照のこと。様々な粘膜下注射溶液がこれまでに開発されており、ＥＭＲ中の使用に関して十分であることが示されているが、より長時間にわたるＥＳＤ手技の導入は、粘膜下層の解離中に切断線を同定するのに役立つ、より長時間持続する溶液を必要とした（Ｕｒａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００８：２  １３１−１３８）。本開示の方法はこの必要性を満たす。
【００７２】
粘膜下クッションへの流体の注射は、例えばスネアを用いる標的病変の捕捉の直前の、除去される組織の単離を容易にし、それによって熱傷、ならびに穿孔および出血のリスクを低減すると同時に切除を容易にもするため、粘膜下注射はＥＭＲにおいて使用される。溶液は、所定の位置に十分な持続時間保持されなければならず、スネアリングを容易にする半球形を形成する必要があるため、粘膜下注射はＥＭＲ手技において重要な役割を果たす。加えて、十分に高い粘膜下組織の挙上を実現することは、ＥＳＤ手技中の安全な粘膜下組織の切断をもたらす（Ｕｒａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００８：２  １３１−１３８）。さらに、炎症は手技に起因するため、手技部位に保持されるいかなるクッションも抗炎症特性を有するべきである。膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、狭窄を軽減し、再上皮化を促進する。本開示の方法は、この必要性も満たす。
【００７３】
一部の実施形態では、開示される方法は、抗炎症特性を有し、安価かつ非毒性で注射するのが容易であり、長時間持続する高い粘膜下クッションを提供するＥＣＭヒドロゲルを利用する。ＥＣＭヒドロゲルは、プレゲル形態において投与され、次いで注射の部位においてゲル化して、クッションを形成する。クッションは、一部のヒドロゲルがその下にある固有筋層に留まり、それによって治癒を援助するように、手技中に解離することができる。開示されるＥＣＭヒドロゲルは、切除した粘膜／粘膜下組織の除去によって創出される創傷の閉鎖を容易にする。一部の実施形態では、手技はＥＳＤである。他の実施形態では、手技はＥＭＲである。
【００７４】
生理食塩溶液（ＮＳ）およびより希薄な溶液（例えばＥＬＥＶＩＥＷ（商標）、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第９，２２６，９９６号を参照のこと）は、内視鏡的切除のための粘膜下クッションとして使用されているが、これらの溶液の固有の特徴は、溶液の急速な分散のために、適した粘膜下流体クッションを生成すること、所望の高さを維持すること、およびクッションを所望の場所に保持することを困難にする。さらに、ＥＳＤでは、粘膜／粘膜下組織が除去されると、これらの薬剤は、その下にある固有筋層に保持されなくなると考えられる。さらに、これらの薬剤は、炎症を軽減すること等によって治癒プロセスを援助しない。膀胱ＥＣＭヒドロゲルの使用は、これらの必要性を満たす。
【００７５】
本明細書に開示される膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、任意のＥＳＤまたはＥＳＲにおいて使用することができる。参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第９，３６４，５８０号に開示されているように、内視鏡用注射針は、長い可能性がある（最大約２３０）ｃｍデバイスであって、遠位注射針を有する内部注射管が内側にスライド可能に配置されている比較的長いカテーテルを備える、デバイスである。近位作動ハンドルは、必要な場合に一方を他方に対して移動させるために、カテーテルおよび注射管に連結している。注射管への流体のアクセスは、典型的にはハンドルのルアー（ｌｅｅｒ）コネクタを介して実現される。内視鏡用注射針デバイスは、典型的には内視鏡のワーキングチャネルを通って注射部位に送達される。内視鏡ワーキングチャネルの内腔を損傷から保護するために、注入針デバイスのハンドルを操作して遠位注射針をカテーテルの内腔に収納した後でデバイスを内視鏡に挿入する。デバイスは内視鏡の内腔を通って移動するため、このことは、注射針の鋭い先端の露出を防止する。内視鏡用注射針デバイスの遠位端が注射部位に位置付けられる場合、そのハンドルを再び操作して注射針をカテーテルの内腔から遠位に移動させる。最も遠位の位置まで進んだ場合、注射針の露出部分はおよそ４〜６ｍｍの長さである。
【００７６】
注射部位が貫通された後、注射針のハンドルに接続したルアーロックフィッティングを備える５ｍＬ〜１０ｍＬのシリンジに通例含有されるプレゲル形態のＥＣＭが、注射管および針を通って注射部位、例えば粘膜下組織とその下にある固有筋層との間に送達され得る。
【００７７】
内視鏡的手技中に一般的に使用される注射針ならびに他の付属品、例えばポリープ切除術のためのスネア、クリップデバイス、生検鉗子等は、通例ワーキングチャネルまたは操作チャネルと呼ばれる内視鏡の１つまたは複数の特有のチャネルを通過する。使用される内視鏡の種類に応じて、ワーキングチャネルの内径は変動し得る。しかしながら、ＧＩ内視鏡検査において使用される最も一般的な内視鏡は、約２ｍｍ〜約５ｍｍの範囲の内径のワーキングチャネルを有する。全般的に、内視鏡の付属品の製造業者は、付属品が全てのワーキングチャネルに適合することを可能にする外径を有する付属品を作製する。内視鏡用注射針の一部の実施形態では、カテーテルの外径は１．９ｍｍ〜２．３ｍｍ、例えば、約１．９、２．０、２．１、２．２、または２．３ｃｍの範囲である。したがって、内部注射管が外部カテーテルに含有されることを考慮すると、その内側の直径は通例１ｍｍであるか、またはそれよりも小さい。プレゲル形態の開示される膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、これらのカテーテルを容易に通過することができる。
【００７８】
プレゲル形態の膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、内視鏡的切除手技において、ある容積のエマルションをその一次容器からシリンジによって吸引し、好適な容積の前記エマルションを内視鏡のワーキングチャネルに挿入された内視鏡用注射針によって表面の粘膜層の直ぐ下に注射して、所定の位置にある場合にクッションとなる液体容積を粘膜下層に置くことによって使用することができ、粘膜表面の挙上は、病変が扁平であり、したがって内腔、例えば食道内腔に隆起していない場合であっても、内視鏡医が内視鏡的手技の実行中に発見する粘膜病変の容易な切除を実施することを可能にする。
【００７９】
クッション中の少なくとも１種類の色素の存在は、粘膜の下の構造（例えば粘膜下層および外部筋肉壁）を可視化し、それによって切除手技を実施する内視鏡医が前記構造に対する損傷を引き起こし得るリスクを低下させるように内視鏡医を援助することができる。色素の使用は、クッション腔および粘膜基底部の可視化を可能にすることができる。粘膜表面からの病変の除去は粘膜創傷を生じる。注射容積の医薬組成物によって生じたクッションの残存は、内視鏡的切除手技が再注射を必要とせずに実施されることを可能にする。プレゲル形態の膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、被験体の臓器、例えば病変または腫瘍の領域に粘膜下注射されて、臓器の領域における粘膜下組織とその下にある固有筋層との間にクッションを形成する。クッションは、膀胱ＥＣＭヒドロゲルの一部分がその下にある固有筋層に維持され、治癒プロセスを援助するように解離することができる。
【００８０】
開示される方法は、食道において有用である。非限定的な一例では、臓器は、食道であり、方法は、食道から食道癌または食道腺癌を解離する方法を含む。別の非限定的な例では、方法は、バレット食道を有する被験体の食道から粘膜および粘膜下組織を解離することを含む。
【００８１】
本明細書に開示される膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、ゲル化する温度、またはそれよりも低い温度、例えば室温（例えば約２５℃）または室温未満に維持される。膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、投与前、例えば２５℃または４℃に維持され得る。次いで、有効量のプレゲル形態の膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、被験体の食道に投与される。膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、凍結乾燥または凍結形態で提供され、被験体への投与の直前に再構成され得る。
【００８２】
開示される方法は、ヒトおよび獣医学的被験体を含む任意の被験体において有用である。被験体はいかなる年齢であってもよい。一実施形態では、プレゲル形態の膀胱ＥＣＭヒドロゲルを含む組成物は、ヒトの標的組織に注射され、切除手技等の内視鏡的外科的手技に次いで必要に応じて供されるクッションを形成する。膀胱ＥＣＭは、処置される被験体と同じ種由来であってもよく、異なる種由来であってもよい。一部の実施形態では、被験体はヒトであり、膀胱ＥＣＭヒドロゲルはヒトおよび／またはブタ膀胱に由来する。他の実施形態では、膀胱ＥＣＭヒドロゲルは非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシに由来する。膀胱ＥＣＭはまた、商業的供給源由来であってもよい。
【００８３】
開示される方法は、被験体の腸管の臓器の領域由来の固有筋層から粘膜および粘膜下組織を解離する注射を必要とするため、侵襲性である。本明細書に開示される方法のいずれも、被験体の食道に膀胱ＥＣＭヒドロゲルを含む医薬組成物を粘膜下注射して、臓器の領域における粘膜下組織とその下にある固有筋層との間にクッションを形成するステップを含み得る。膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、以下の特徴：ａ）約３７℃の温度において２０分未満の５０％ゲル化までの時間、ｂ）食道への注入に好適な流動粘度、およびｃ）約１０〜約４００パスカル（Ｐａ）の剛性を有する。膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、ゲル化し、粘膜および粘膜下組織をその下にある固有筋層から解離し、被験体における食道の領域の炎症を抑制する。プレゲル形態の膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、内視鏡的にまたはカテーテルを介して投与され得る。
【００８４】
一部の実施形態では、切除手技は、内視鏡的粘膜切除術または食道内視鏡的粘膜下層解離術であり、方法は、食道から食道癌または食道腺癌を解離する方法を含む。さらなる実施形態では、方法は、異形成を有する患者の食道から粘膜および粘膜下組織を解離することを含む。さらなる実施形態では、方法は、バレット食道を有する被験体の食道から粘膜および粘膜下組織を解離することを含む。
【００８５】
方法は、クッション上で内視鏡的切除手技を実施することも含み得る。一部の実施形態では、方法は、ヒドロゲルがその下にある臓器の固有筋層上に保持され、粘膜および粘膜下組織が臓器の領域から除去されるようにクッションを分割することを含む。一部の非限定的な例では、その下にある固有筋層上に保持されるヒドロゲルクッションの一部分は、この組織における炎症誘発性マクロファージ活性化を下方調節する。
【００８６】
一部の実施形態では、ヒドロゲルの５０％ゲル化までの時間は、約３７℃の温度において２０分未満である。一部の非限定的な具体例では、５０％ゲル化までの時間は、約３７℃において約２〜約２０分である。他の非限定的な具体例では、５０％ゲル化までの時間は、約３７℃において約２〜約１０分である。さらなる非限定的な例では、５０％ゲル化までの時間は、約３〜約８分である。
【００８７】
追加の実施形態では、プレゲル形態の流動粘度は、食道への注射に十分である。一部の実施形態では、膀胱ＥＣＭヒドロゲルの流動粘度は、約０．１／ｓの剪断速度において約０．１〜約１００Ｐａ＊ｓであり、１０００／ｓの剪断速度において約０．０１〜約０．２Ｐａ＊ｓである。一部の非限定的な例では、流動粘度は、１／ｓの剪断速度において約０．１〜約２５Ｐａ＊ｓであり、約１００／ｓの剪断速度において約０．０２〜約０．８Ｐａ＊ｓである。
【００８８】
さらなる実施形態では、膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、組織に導入された場合、約１０〜約４００パスカル（Ｐａ）の剛性を有し、ＥＣＭヒドロゲルは１０〜７０Ｐａの剛性を有する。さらなる実施形態では、ヒドロゲルにおけるＥＣＭ濃度は２ｍｇ／ｍｌ〜約１６ｍｇ／ｍｌである。
【００８９】
膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、本明細書に開示されるいずれの方法によっても作製することができる。一部の実施形態では、ＥＣＭヒドロゲルは、（ａ）脱細胞化細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を、酸性溶液において酸性プロテアーゼを用いる組織の消化によって可溶化して、消化ＥＣＭを作製すること、および（ｂ）消化食道ＥＣＭのｐＨを７．２〜７．８の間のｐＨに上昇させて、中和消化溶液を作製することによって作製される。さらなる実施形態では、消化ＥＣＭのｐＨを上昇させるステップ（ｂ）は、塩基または等張緩衝液を添加して消化ＥＣＭのｐＨを上昇させることを含む。さらなる実施形態では、ペプシン、トリプシン、またはそれらの組合せ等の酸性プロテアーゼが使用される。
【００９０】
一部の実施形態では、膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、被験体への投与前、２５℃または２５℃未満に維持される。一部の実施形態では、ＥＣＭヒドロゲルは、約４℃〜約２８℃、例えば、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８℃に維持される。ＥＣＭヒドロゲルは、約４℃に維持されて、約４℃〜約２５℃において使用されても、または使用直前にほぼ２５℃まで加温されてもよい。一部の実施形態では、温度を制御することは、ＥＣＭヒドロゲルがプレゲル形態に維持され、したがって粘膜下組織とその下にある固有筋層との間への注射に好適であることを保証する。さらなる実施形態では、ヒドロゲルは、被験体への投与時に、例えば３７℃の温度に達する場合等にゲル化する。
【実施例】
【００９１】
ＥＬＥＶＩＥＷ（商標）と膀胱ＥＣＭヒドロゲルとは異なる生物材料である。ＥＬＥＶＩＥＷ（商標）（Ａｒｉｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ、Ｄｕｂｌｉｎ、Ｉｒｅｌａｎｄ）は、ＥＭＲおよびＥＳＤ手技のための粘膜下組織の持上げを提供するために臨床的に使用される、市販のポロキサマー１８８の低粘度エマルションである。ＥＬＥＶＩＥＷ（商標）は、３７℃において安定に形成されるヒドロゲルを形成せず、むしろ３７℃において１時間を超えて液体のままである。対照的に、膀胱ＥＣＭ（本明細書に開示される方法に従って、すなわちＥＣＭのプロテアーゼ消化によって調製される）は、３７℃（体温）において安定に形成されるヒドロゲルを形成する。ＥＬＥＶＩＥＷ（商標）、ならびにＵＢＭおよびＵＢＳ  ＥＣＭヒドロゲルを含む膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、粘膜の下に注射することができる。理想的な生物材料であれば、両方の層に付着する。膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、強力な粘膜付着特性と有益な生物学的特性とを有する。膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて粘膜下クッションとして効果的に使用することができ、したがって粘膜下組織をその下にある固有筋層から解離するために使用することができる。
【００９２】
（実施例１）
材料および方法
膀胱ＥＣＭの調製：表面を、７０％エタノールおよび２５％  Ｐｙｒｏｃｌｅａｎを用いて滅菌した。−２０℃で保存したブタ膀胱（Ａｎｉｍａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を解凍し、Ｉ型水を用いて徹底的に洗浄した。膀胱を尖部から頂部まで開裂し、管腔側を下にして扁平にした。斜め刃のアクリル製スクレーパーおよび鉗子を使用して、反管腔側の平滑筋組織（漿膜、外筋層、粘液下層、および粘膜筋板層）を機械的に除去し、固有層（板）および基底膜（ＵＢＭを含む組織層）を残した。ＵＢＭをＩ型水中に４℃で一晩保存し、４％エタノール中０．１％過酢酸（ＰＡＡ）を４時間、ならびにＰＢＳ、１型水、ＰＢＳ、および１型水の１５分の洗浄を使用して脱細胞化して、ＵＢＭを創出した。全ての脱細胞化ステップは、振盪板上にて３００ｒｐｍでかき混ぜて、室温で実施した。
【００９３】
膀胱ＥＣＭヒドロゲルの形成：ＵＢＭを凍結乾燥し、Ｗｉｌｅｙミルを使用して粉末化し、１０ｍｇ／ｍＬの粉末化ＥＣＭを、０．０１Ｍ  ＨＣｌにおいてペプシン（１ｍｇ／ｍＬ）によって室温で４８時間消化した。ＥＣＭ消化物およびペプシン対照を、使用まで−２０℃で保存した。実験の当日、ＥＣＭ消化物およびペプシン対照を、０．１Ｍ  ＮａＯＨ（プレゲル溶液の１／１０容積）、７．４のｐＨの１０×ＰＢＳ（プレゲル溶液の１／９容積）を４℃で用いて中和し、４℃の氷冷１×ＰＢＳを使用して５ｍｇ／ｍＬのＥＣＭ濃度に希釈した。参照によって本明細書に組み込まれるＦｒｅｙｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．．  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２９（１１）：  ｐ．  １６３０−７．  ２００８を参照のこと。
【００９４】
レオロジー：膀胱ＥＣＭの粘弾性特性を、温度制御された４０ｍｍ平行平板型レオメータ（ＡＲ２０００）を用いて決定した。試料を４℃に保ち、予め１０℃に冷却した平行平板形状を有するレオメータに装填した。鉱油を使用して、試料−平板界面を封止し、試験中の蒸発を最小限にした。一連のレオロジー試験を各試料に関して順番に行った。１０℃における定常状態流動曲線を実施して、種々の剪断速度（０．１〜１０００ｓ−１）における試料の粘度プロファイルを決定した。平板温度を１０℃から３７℃まで急速に上昇させ、振動時間掃引を、１ｒａｄ／ｓの周波数の、小さな０．５％の振動歪みを加えることによって、３７℃で実施して、最大貯蔵弾性率（Ｇ’）、最大損失弾性率（Ｇ”）、およびゲル化動態を測定した。データを統計分析のために抽出し、Ｐｒｉｓｍ（バージョン６、ＧｒａｐｈＰａｄ）において分析した（ｎ＝３）。
【００９５】
ＥＭＲのための粘膜下流体クッションとしてのＥＣＭのｉｎ  ｖｉｖｏにおける使用：麻酔を、アセプロマジン（０．０１ｍｇ／ｋｇ、ＳＣ）およびケタミン（５〜１１ｍｇ／ｋｇ）を用いて誘導し、外科的水準の麻酔を、１〜５％イソフルラン（Ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）を用いて気管内チューブを介して維持した。手技および手術期間直後にわたり、動物に２ｍｌ／ｋｇ／時の乳酸リンガー液をＩ．Ｖ．投与した。温度を、動物の下に置いた温水再循環加温パッドによって制御した。生理学的パラメーター、例えば、心拍数、呼吸数、体温、および応答性を手技中にモニタリングした。２５ｍｇ／ｋｇのセファゾリンを用いる抗生物質予防を投与した後で手技を開始した。
【００９６】
動物を仰臥位に置き、Ｐｅｎｔａｘ  ＥＧ３４３０Ｋ内視鏡を使用して食道を評価した。口からＧＥ接合部までの距離を測定した。食道における基準点を同定した後、切取りの部位における粘膜および粘膜下組織を、注射に関して、Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｉｎｊｅｃｔｏｒｆｏｒｃｅ  ４ｍｍ  ２３Ｇ針を使用して８ｍｇ／ｍｌの青色染色膀胱マトリックスヒドロゲルによって４℃において分離した。この温度を全ての時間において維持して、ゲル化および潜在的な針の閉塞を防止した。およそ２〜５ｍｌの青色ゲルを部位ごとに注射した。５ｃｍの長さの粘膜の全周（１００％）を、バンド結紮ＥＭＲ技法を使用して除去した。ＥＭＲに関しては、結紮バンドを含むＣｏｏｋ  Ｄｕｅｔｔｅキットを使用した。次いで、粘膜を、スネアの使用により切り取った。
【００９７】
（実施例２）
ＥＭＲのための粘膜下流体クッションとしての膀胱ＥＣＭヒドロゲルのｉｎ  ｖｉｖｏにおける使用
膀胱ＥＣＭヒドロゲルは、いかなる抵抗も伴わずに長い内視鏡用針を介して送達可能であった。粘膜の挙上は、成功裏に達成かつ維持されて、ＥＭＲ手技を容易にし、青色色素は、可視的であり、解離が除去のために創出された位置を示した（図１Ａ）。組織はスネアの使用により容易に除去された。肉眼的観察において、除去した食道粘膜組織にはゲルの一部が含まれた（図１Ｂ）。ヒドロゲルにおける青色色素は、粘膜および全周を除去することがヒドロゲルの使用により達成された後、食道の周縁に拡散するようであった（図１Ｃ）。
【００９８】
（実施例３）
レオロジーデータ
ＵＢＭの粘弾性特性を図３に示す。ＵＢＭに関して記載したのと同様に実施した定常状態流動曲線（図３Ａ）は、ＵＢＭヒドロゲルのＥＣＭ濃度およびずり減粘流動プロファイルの増加と共に、粘度の濃度依存的な増加を示す、すなわち、粘度は、各ＥＣＭ濃度の剪断速度の増加と共に減少する。
【００９９】
ＵＢＭ  ＥＣＭ（図３Ｂ）は、ＥＣＭの増加と共に増加する貯蔵弾性率（剛性）を示した。ＵＢＭは、安定に形成されるＥＣＭヒドロゲルの定義（Ｆｒｅｙｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  ２００８．  ２９（１１）：  ｐ．  １６３０−７）に従い、各ＥＣＭ濃度において損失弾性率（Ｇ”）よりもおよそ１桁大きい貯蔵弾性率（Ｇ’）を示した。ＵＢＭは、濃度非依存的なゲル化時間を示した、すなわち、ゲル化時間は全てのＥＣＭ濃度に関して一定のままであった（図３Ｃ）。
【０１００】
本発明者らの発明の原理が適用され得る多くの可能な実施形態を考慮すると、例証された実施形態は本発明の例に過ぎず、本発明の範囲に関する限定と考えられるべきではないということが認識されるべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲およびその趣旨に当てはまる全てのものを本発明者らの発明として特許請求する。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【国際調査報告】
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