(57)【要約】  本明細書に記載するのは、対応する天然または非改変プレニルトランスフェラーゼと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を有するプレニルトランスフェラーゼ（非天然変異体を含む）であって、野生型の対照群と比較して少なくとも２倍の速度で、カンナビノイド（例えば、カンナビゲロール酸、カンナビゲロバリン酸、カンナビゲロルシン酸、およびカンナビゲロール）を生成できる、プレニルトランスフェラーゼである。プレニルトランスフェラーゼ変異体はまた、所望のカンナビノイド異性体（例えば、ＣＤＢＡ（３−ＧＯＬＡ）、３−ＧＤＶＡ、３−ＧＯＳＡ、およびＣＢＧ（２−ＧＯＬ））に対して位置選択性を示した。上記プレニルトランスフェラーゼ変異体を用いて、プレニル化芳香族化合物を生成でき、３−ＧＯＬＡ、３−ＧＤＶＡ、３−ＧＯＳＡ、およびＣＢＧを含む化合物への経路を有する遺伝子操作微生物中で発現することができる。３−ＧＯＬＡを用いてカンナビゲロール（ＣＢＧ）を調製でき、これを治療用組成物に用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して少なくとも１つのアミノ酸変異を有する非天然プレニルトランスフェラーゼであって、（ａ）野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して少なくとも２倍の速度での、ゲラニルピロリン酸およびオリベトール酸からの３−ゲラニル−オリベトレート（３−ＧＯＬＡ）の生成、（ｂ）３−ＧＯＬＡに対する位置選択性を示すこと、または（ａ）および（ｂ）の両方を、酵素的に実現することが可能な、非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項２】
上記野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して少なくとも５倍の速度での、ゲラニルピロリン酸およびオリベトール酸からの３−ＧＯＬＡの生成を、酵素的に実現することが可能な、請求項１に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項３】
上記野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して少なくとも２０倍の速度での、ゲラニルピロリン酸およびオリベトール酸からの３−ＧＯＬＡの生成を、酵素的に実現することが可能な、請求項２に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項４】
３−ＧＯＬＡに対する９０％以上の位置選択性を酵素的に実現することが可能な、請求項１から３のいずれか一項に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項５】
３−ＧＯＬＡに対する９８％以上の位置選択性を酵素的に実現することが可能な、請求項１から３のいずれか一項に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項６】
野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して少なくとも１つのアミノ酸変異を有する非天然プレニルトランスフェラーゼであって、
（ａ１）野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して少なくとも２倍の速度での、ゲラニルピロリン酸およびジバリノール酸（ＤＶＡ）からのカンナビゲロバリン酸（ＣＢＧＶＡ）の生成、（ａ２）３−ゲラニル−ジバリノール酸（３−ＧＤＶＡ）に対する５０％以上の位置選択性、もしくは（ａ１）および（ａ２）の両方、または
（ｂ１）野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して少なくとも２倍の速度での、ゲラニルピロリン酸およびオルセリン酸（ＯＳＡ）からのカンナビゲロルシン酸（ＣＢＧＯＡ）の生成、（ｂ２）３−ゲラニル−オルセリナート（３−ＧＯＳＡ）に対する５０％以上の位置選択性、もしくは（ｂ１）および（ｂ２）の両方を、
酵素的に実現することが可能な、非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項７】
上記野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して少なくとも５０倍の速度での、（ａ）ゲラニルピロリン酸およびジバリノール酸（ＤＶＡ）からのカンナビゲロバリン酸（ＣＢＧＶＡ）の生成、または（ｂ）ゲラニルピロリン酸およびオルセリン酸（ＯＳＡ）からのカンナビゲロルシン酸（ＣＢＧＯＡ）の生成を、酵素的に実現することが可能な、請求項６に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項８】
上記野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して少なくとも２００倍の速度での、（ａ）ゲラニルピロリン酸およびジバリノール酸（ＤＶＡ）からのカンナビゲロバリン酸（ＣＢＧＶＡ）の生成、または（ｂ）ゲラニルピロリン酸およびオルセリン酸（ＯＳＡ）からのカンナビゲロルシン酸（ＣＢＧＯＡ）の生成を、酵素的に実現することが可能な、請求項７に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項９】
３−ゲラニル−ジバリノール酸（３−ＧＤＶＡ）または３−ゲラニル−オルセリナート（３−ＧＯＳＡ）に対する９０％以上の位置選択性を酵素的に実現することが可能な、請求項６〜８のいずれか一項に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項１０】
３−ゲラニル−ジバリノール酸（３−ＧＤＶＡ）または３−ゲラニル−オルセリナート（３−ＧＯＳＡ）に対する９８％以上の位置選択性を酵素的に実現することが可能な、請求項６〜９のいずれか一項に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項１１】
野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して少なくとも１つのアミノ酸変異を有する非天然プレニルトランスフェラーゼであって、ゲラニルピロリン酸および５−アルキルベンゼン−１，３−ジオールから２−プレニル化５−アルキルベンゼン−１，３−ジオールの位置選択的な生成を酵素的に実現することが可能な、非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項１２】
上記５−アルキルベンゼン−１，３−ジオールはオリベトールであり、２−プレニル化５−アルキルベンゼン−１，３−ジオールはカンナビゲロール（ＣＢＧ；２−ＧＯＬ）である、請求項１１に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項１３】
ゲラニルピロリン酸またはカンナビゲロール（ＣＢＧ；２−ＧＯＬ）に由来する２−プレニル化５−アルキルベンゼン−１，３−ジオールに対する９０％以上の位置選択性を酵素的に実現することが可能な、請求項６〜８のいずれか一項に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項１４】
ゲラニルピロリン酸またはカンナビゲロール（ＣＢＧ；２−ＧＯＬ）に由来する２−プレニル化５−アルキルベンゼン−１，３−ジオールに対する９８％以上の位置選択性を酵素的に実現することが可能な、上記請求項のいずれか一項に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項１５】
野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して少なくとも２つのアミノ酸変異を有する、上記請求項のいずれか一項に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項１６】
野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つのアミノ酸変異を有する、請求項１５に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項１７】
配列番号１または配列番号２〜１５のいずれか一つと５０％以上の同一性を有する、上記請求項のいずれか一項に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項１８】
配列番号１または配列番号２〜１５のいずれか一つと９０％以上の同一性を有する、請求項１７に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項１９】
上記少なくとも１つのアミノ酸変異が、配列番号１または配列番号２〜１５のいずれか一つの上記野生型プレニルトランスフェラーゼになされた、上記請求項のいずれか一項に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項２０】
配列番号１に対して、４９、１２１、１２４、１５９、１７５、２１２、２３２、２６７、２６８、２８５、２８６、２９３、および３００からなる群より選択される部位において一つまたは複数のアミノ酸変異を有する、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項２１】
Ｓ４９Ｔ、Ｆ１２１Ｌ、Ｔ１２４Ｒ、Ｑ１５９Ｈ、Ｑ１５９Ｒ、Ｑ１５９Ｓ、Ｑ１５９Ｔ、Ｑ１５９Ｙ、Ｑ１５９Ａ、Ｑ１５９Ｆ、Ｑ１５９Ｇ、Ｑ１５９Ｉ、Ｑ１５９Ｋ、Ｑ１５９Ｌ、Ｑ１５９Ｍ、Ｑ１５９Ａ、Ｓ１７５Ｈ、Ｓ１７５Ｋ、Ｓ１７５Ｒ、Ｓ２１２Ｈ、Ｉ２３２Ｈ、Ｔ２６７Ｗ、Ｌ２６８Ｙ、Ａ２８５Ｙ、Ｙ２８６Ａ、Ｙ２８６Ｆ、Ｙ２８６Ｌ、Ｙ２８６Ｍ、Ｙ２８６Ｐ、Ｙ２８６Ｉ、Ｙ２８６Ｔ、Ｙ２８６Ｖ、Ｑ２９３Ｆ、Ｑ２９３Ｗ、Ｑ２９３Ｈ、Ｑ２９３Ｃ、Ｑ２９３Ａ、Ｑ２９３Ｓ、Ｑ２９３Ｖ、Ｑ２９３Ｄ、Ｑ２９３Ｙ、Ｑ２９３Ｅ、Ｑ２９３Ｉ、Ｑ２９３Ｍ、Ｑ２９３Ｔ、およびＦ３００Ｋからなる群より選択される位置における一つまたは複数のアミノ酸変異を有する、請求項２０に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項２２】
（ｉ）Ｑ１５９Ａおよび（ｉｉ）Ｑ２９３Ｆ、Ｑ２９３Ｍ、Ｑ２９３Ｆ、Ｑ２９３Ｆ、
（ｉ）Ｑ１５９Ｆおよび（ｉｉ）Ｑ２９３Ｆ、Ｑ２９３Ｗ、またはＱ２９３Ｈ、
（ｉ）Ｑ１５９Ｇおよび（ｉｉ）Ｑ２９３Ｆ、
（ｉ）Ｑ１５９Ｈおよび（ｉｉ）Ｑ２９３Ｗ、Ｑ２９３Ｈ、Ｑ２９３Ｃ、Ｑ２９３Ａ、Ｑ２９３Ｓ、Ｑ２９３Ｖ、Ｑ２９３Ｄ、Ｑ２９３Ｙ、またはＱ２９３Ｅ、
（ｉ）Ｑ１５９Ｉおよび（ｉｉ）Ｑ２９３Ｆ、
（ｉ）Ｑ１５９Ｋおよび（ｉｉ）Ｑ２９３ＶまたはＱ２９３Ｖ、
（ｉ）Ｑ１５９Ｌおよび（ｉｉ）Ｑ２９３ＷまたはＱ２９３Ｆ、
（ｉ）Ｑ１５９Ｍおよび（ｉｉ）Ｑ２９３ＦまたはＱ２９３Ｗ、
（ｉ）Ｑ１５９Ｒおよび（ｉｉ）Ｑ２９３Ｖ、Ｑ２９３Ｍ、またはＱ２９３Ｔ、
（ｉ）Ｑ１５９Ｓおよび（ｉｉ）Ｙ２８６Ｉ、ならびに
（ｉ）Ｓ１７５Ｈおよび（ｉｉ）Ｑ２９３Ｖ
から選択される位置における少なくとも２つのアミノ酸変異を有する、請求項２１に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項２３】
（ｉ）Ｑ１５９Ｈ、（ｉｉ）Ｙ２８６Ａ、および（ｉｉｉ）Ｑ２９３Ｆ、Ｑ２９３Ｍ、またはＱ２９３Ｖ、
（ｉ）Ｑ１５９Ｈ、（ｉｉ）Ｙ２８６Ｉ、および（ｉｉｉ）Ｑ２９３ＭまたはＱ２９３Ｖ、
（ｉ）Ｑ１５９Ｈ、（ｉｉ）Ｙ２８６Ｖ、および（ｉｉｉ）Ｑ２９３Ｆ、Ｑ２９３Ｍ、Ｑ２９３Ｖ、またはＱ２９３Ｗ、
（ｉ）Ｑ１５９Ｌ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｈ、および（ｉｉｉ）Ｑ２９３Ｆ、
（ｉ）Ｓ１７５Ｈ、（ｉｉ）Ｙ２８６Ｖ、および（ｉｉｉ）Ｑ２９３Ｍ、
（ｉ）Ｓ１７５Ｈ、（ｉｉ）Ｙ２８６Ｉ、および（ｉｉｉ）Ｑ２９３ＭまたはＱ２９３Ｖ、
（ｉ）Ｑ１５９Ｓ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｈ、および（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ｉ、
（ｉ）Ｑ１５９Ｓ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｒ、および（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ｖ、
（ｉ）Ｑ１５９Ｓ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｓ、および（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ｉ、ならびに
（ｉ）Ｑ１５９Ｓ、（ｉｉ）Ｓ２１２Ｈ、（ｉｉｉ）Ｙ２８６ＡまたはＹ２８６Ｖ
から選択される位置における少なくとも３つのアミノ酸変異を有する、請求項２２に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項２４】
（ｉ）Ｑ１５９Ｈ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｈ、（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ａ、および（ｉｖ）Ｑ２９３Ｖ、
（ｉ）Ｑ１５９Ｈ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｈ、（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ｖ、および（ｉｖ）Ｑ２９３ＭまたはＱ２９３Ｖ、
（ｉ）Ｑ１５９Ｈ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｒ、（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ｉ、および（ｉｖ）Ｑ２９３Ｍ、
（ｉ）Ｑ１５９Ｌ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｋ、（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ａ、および（ｉｖ）Ｑ２９３Ｖ、
（ｉ）Ｑ１５９Ｍ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｈ、（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ｖ、および（ｉｖ）Ｑ２９３Ｆ、
（ｉ）Ｑ１５９Ｒ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｈ、（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ｉ、および（ｉｖ）Ｑ２９３Ｑ、
（ｉ）Ｑ１５９Ｓ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｈ、（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ｖ、および（ｉｖ）Ｑ２９３Ｆ、
（ｉ）Ｑ１５９Ｓ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｋ、（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ｖ、および（ｉｖ）Ｑ２９３Ｖ、ならびに
（ｉ）Ｑ１５９Ｓ、（ｉｉ）Ｓ２１２Ｈ、（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ｖ、および（ｉｖ）Ｑ２９３Ｍ
から選択される位置における少なくとも４つのアミノ酸変異を有する、請求項２２に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項２５】
（ｉ）Ｑ１５９Ｈ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｒ、（ｉｉｉ）Ｓ２１２Ｈ、（ｉｖ）Ｙ２８６Ａ、および（ｖ）Ｑ２９３Ｖ、ならびに
（ｉ）Ｑ１５９Ｒ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｒ、（ｉｉｉ）Ｓ２１２Ｈ、（ｉｖ）Ｙ２８６Ｉ、および（ｖ）Ｑ２９３Ｍ
から選択される位置における少なくとも５つのアミノ酸変異を有する、請求項２２に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項２６】
配列番号２に対して、５１、１２３、１２６、１６１、１７７、２１４、２３４、２６９、２７０、２８７、２８８、２９５、および３０２からなる群より選択される位置において一つまたは複数のアミノ酸変異を有する、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項２７】
Ｓ５１Ｔ、Ｆ１２３Ｌ、Ｔ１２６Ｒ、Ｑ１６１Ｈ、Ｑ１６１Ｒ、Ｑ１６１Ｓ、Ｑ１６１Ｔ、Ｑ１６１Ｙ、Ｑ１６１Ａ、Ｑ１６１Ｆ、Ｑ１６１Ｇ、Ｑ１６１Ｉ、Ｑ１６１Ｋ、Ｑ１６１Ｌ、Ｑ１６１Ｍ、Ｑ１６１Ａ、Ｓ１７７Ｈ、Ｓ１７７Ｋ、Ｓ１７７Ｒ、Ｓ２１４Ｈ、Ｉ２３４Ｈ、Ｔ２６９Ｗ、Ｌ２７０Ｙ、Ａ２８７Ｙ、Ｙ２８８Ａ、Ｙ２８８Ｆ、Ｙ２８８Ｌ、Ｙ２８８Ｍ、Ｙ２８８Ｐ、Ｙ２８８Ｔ、Ｙ２８８Ｖ、Ｑ２９５Ｆ、Ｑ２９５Ｗ、Ｑ２９５Ｈ、Ｑ２９５Ｃ、Ｑ２９５Ａ、Ｑ２９５Ｓ、Ｑ２９５Ｖ、Ｑ２９５Ｄ、Ｑ２９５Ｙ、Ｑ２９５Ｅ、Ｑ２９５Ｉ、Ｑ２９５Ｍ、Ｑ２９５Ｔ、およびＦ３０３Ｋからなる群より選択される位置における一つまたは複数のアミノ酸変異を有する、請求項２６に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項２８】
（ａ）Ｑ１６１Ｈ、
（ｂ）Ｓ２１４Ｈ、
（ｃ）Ｙ２８８Ｖ、
（ｄ）Ｑ１６１ＲおよびＱ２９５Ｖ、
（ｅ）Ｑ１６１ＨおよびＱ２９５Ｗ、
（ｆ）Ｑ１６１ＨおよびＱ２９５Ｖ、
（ｇ）Ｙ２８８ＩおよびＱ２９５Ｖ、
（ｈ）Ｑ１６１Ｓ、Ｓ２１４Ｈ、およびＹ２８８Ｖ、
（ｉ）Ｑ１６１Ｈ、Ｙ２８８Ｉ、およびＱ２９５Ｗ、ならびに
（ｊ）Ｑ１６１Ｈ、Ｙ２８８Ｖ、およびＱ２９５Ｍ
からなる群より選択される位置における一つまたは複数のアミノ酸変異を有する、請求項２７に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項２９】
配列番号２に対して５０〜９５％の範囲の同一性を有する、請求項２７または２８に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項３０】
アミノ酸モチーフＦＸ３Ｍ（配列番号１６）またはＶＦＸ３ＭＡ（配列番号１７）を有し、Ｘ３はＴである、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項３１】
アミノ酸モチーフＸ４ＦＰＸ５（配列番号１８）を有し、Ｘ４はＦまたはＬであり、Ｘ５はＴまたはＲであり、ただし、単一のモチーフの中では、Ｘ４はＦではなく、Ｘ５はＴではない、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。Ａ
【請求項３２】
アミノ酸モチーフＶＸ６Ｍ（配列番号１９）またはＫＶＸ６ＭＴ（配列番号２０）を有し、Ｘ６はＨ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、およびＡからなる群より選択される、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項３３】
アミノ酸モチーフＦＸ７Ｅ（配列番号２１）またはＹＦＸ７ＥＬ（配列番号２２）を有し、Ｘ７はＨ、Ｋ、およびＲからなる群より選択される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項３４】
アミノ酸モチーフＦＸ８Ｖ（配列番号２３）またはＳＦＸ８ＶＹ（配列番号２４）を有し、Ｘ８はＨである、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項３５】
アミノ酸モチーフＶＸ９Ｓ（配列番号２５）またはＡＶＸ９ＳＮ（配列番号２６）を有し、Ｘ９はＨである、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項３６】
アミノ酸モチーフＲＸ１０Ｘ１１Ｖ（配列番号２７）を有し、Ｘ１０はＴまたはＷであり、Ｘ１１はＬまたはＹであり、単一のモチーフ中では、Ｘ１０はＴではなく、Ｘ１１はＬではない、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項３７】
アミノ酸モチーフＧＸ１２Ｘ１３Ｙ（配列番号２８）を有し、Ｘ１２はＡまたはＹであり、Ｘ１３はＹ、Ａ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｔ、またはＶであり、単一のモチーフの中では、Ｘ１２はＡではなく、Ｘ１３はＹではない、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項３８】
アミノ酸モチーフＸ１４Ｘ１５Ｒ（配列番号２９）またはＤＸ１４Ｘ１５Ｒ（配列番号３０）を有し、Ｘ１４はＶまたはＩであり、Ｘ１５はＦ、Ｗ、Ｈ、Ｃ、Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｄ、Ｙ、Ｅ、Ｉ、Ｍ、またはＴである、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項３９】
アミノ酸モチーフＡＸ１６Ｄ（配列番号３１）またはＫＡＸ１６Ｄ（配列番号３２）を有し、Ｘ１６はＫである、請求項１〜３８に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項４０】
アミノ酸モチーフ（ａ）ＦＸ３Ｍ（配列番号１６）またはＶＦＸ３ＭＡ（配列番号１７）、（ｂ）Ｘ４ＦＰＸ５（配列番号１８）、（ｃ）ＶＸ６Ｍ（配列番号１９）またはＫＶＸ６ＭＴ（配列番号２０）、（ｄ）ＦＸ７Ｅ（配列番号２１）またはＹＦＸ７ＥＬ（配列番号２２）、（ｅ）ＦＸ８Ｖ（配列番号２３）またはＳＦＸ８ＶＹ（配列番号２４）、（ｆ）ＶＸ９Ｓ（配列番号２５）またはＡＶＸ９ＳＮ（配列番号２６）、（ｇ）ＲＸ１０Ｘ１１Ｖ（配列番号２７）、（ｈ）ＧＸ１２Ｘ１３Ｙ（配列番号２８）、（ｉ）Ｘ１４Ｘ１５Ｒ（配列番号２９）またはＤＸ１４Ｘ１５Ｒ（配列番号３０）、および（ｊ）ＡＸ１６Ｄ（配列番号３１）またはＫＡＸ１６Ｄ（配列番号３２）を有し、Ｘ３〜Ｘ１６は本明細書に記載した通りである、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項４１】
配列番号１〜１５のいずれか一つと５０％以上の同一性を有し、以下のアミノ酸モチーフ（ａ）〜（ｊ）のうち一つまたは複数を含む、非天然プレニルトランスフェラーゼ：
（ａ）ＦＸ３Ｍ（配列番号１６）またはＶＦＸ３ＭＡ（配列番号１７）（Ｘ３はＴ）
（ｂ）Ｘ４ＦＰＸ５（配列番号１８）（Ｘ４はＦまたはＬであり、Ｘ５はＴまたはＲであり、単一のモチーフの中では、Ｘ４はＦではなく、Ｘ５はＴではない）
（ｃ）ＶＸ６Ｍ（配列番号１９）またはＫＶＸ６ＭＴ（配列番号２０）（Ｘ６は、Ｈ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ，およびＡからなる群より選択される）、
（ｄ）ＦＸ７Ｅ（配列番号２１）またはＹＦＸ７ＥＬ（配列番号２２）（Ｘ７は、Ｈ，Ｋ，およびＲからなる群より選択される）、
（ｅ）ＦＸ８Ｖ（配列番号２３）またはＳＦＸ８ＶＹ（配列番号２４）（Ｘ８はＨ）
（ｆ）ＶＸ９Ｓ（配列番号２５）またはＡＶＸ９ＳＮ（配列番号２６）（Ｘ９はＨ）
（ｇ）ＲＸ１０Ｘ１１Ｖ（配列番号２７）（Ｘ１０はＴまたはＷであり、Ｘ１１はＬまたはＹであり、単一のモチーフの中では、Ｘ１０はＴではなく、Ｘ１１はＬではない）、
（ｈ）ＧＸ１２Ｘ１３Ｙ（配列番号２８）（Ｘ１２はＡまたはＹであり、Ｘ１３はＹ、Ａ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、ＴまたはＶであり、単一のモチーフの中では、Ｘ１２はＡではなく、Ｘ１３はＹではない）
（ｉ）Ｘ１４Ｘ１５Ｒ（配列番号２９）またはＤＸ１４Ｘ１５Ｒ（配列番号３０）（Ｘ１４はＶまたはＩであり、Ｘ１５はＦ、Ｗ、Ｈ、Ｃ、Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｄ、Ｙ、Ｅ、Ｉ、Ｍ、またはＴ）
（ｊ）ＡＸ１６Ｄ（配列番号３１）またはＫＡＸ１６Ｄ（配列番号３２）（Ｘ１６はＫ）。
【請求項４２】
配列番号１〜１５のいずれか一つに対して、６０％以上の同一性、６５％以上の同一性、７０％以上の同一性、７５％以上の同一性、８０％以上の同一性、８５％以上の同一性、８７．５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９２．５％以上の同一性、または９５％以上の同一性を有する、請求項４１に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項４３】
配列番号１に対して、Ｆ２１１Ｎ、Ｆ２１１Ｓ、Ａ２３０Ｓ、Ｇ２８４Ｓ、およびＹ２８６Ｎから選択される位置における一つ以上のアミノ酸変異、または
配列番号２に対して、Ｆ２１３Ｎ、Ｆ２１３Ｓ、Ａ２３２Ｓ、Ｇ２８６Ｓ、およびＹ２８８Ｎから選択される位置における一つ以上のアミノ酸変異、
を有する、請求項２１〜４２のいずれか一項に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ。
【請求項４４】
請求項１〜４３のいずれか一項に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼをコードする、核酸。
【請求項４５】
請求項４４に記載の核酸を含む、発現コンストラクト。
【請求項４６】
野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して少なくとも１つのアミノ酸変異を有し、（ａ）上記野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して少なくとも２倍の速さでの、ゲラニルピロリン酸およびオリベトール酸からのカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）の生成、（ｂ）３−ゲラニル−オリベトレート（３−ＧＯＬＡ）に対する５０％以上の位置選択性、または（ａ）および（ｂ）の両方を、酵素的に実現することが可能な非天然プレニルトランスフェラーゼを含む、遺伝子操作細胞。
【請求項４７】
野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して少なくとも１つのアミノ酸変異を有し、
（ａ１）野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して少なくとも２倍の速さでの、ゲラニルピロリン酸およびジバリノール酸（ＤＶＡ）からのカンナビゲロバリン酸（ＣＢＧＶＡ）の生成、（ａ２）３−ゲラニル−ジバリノール酸（３−ＧＤＶＡ）に対する５０％以上の位置選択性、もしくは（ａ１）および（ａ２）の両方、または
（ｂ１）野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して少なくとも２倍の速さでの、ゲラニルピロリン酸およびオルセリン酸（ＯＳＡ）からのカンナビゲロルシン酸（ＣＢＧＯＡ）の生成、（ｂ２）３−ゲラニル−オルセリナート（３−ＧＯＳＡ）に対する５０％以上の位置選択性、もしくは（ｂ１）および（ｂ２）の両方、
を酵素的に実現することが可能な、非天然プレニルトランスフェラーゼを含む、遺伝子操作細胞。
【請求項４８】
野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して少なくとも１つのアミノ酸変異を有し、ゲラニルピロリン酸および５−アルキルベンゼン−１，３−ジオールからの２−プレニル化５−アルキルベンゼン−１，３−ジオールの位置選択的な生成を酵素的に実現することが可能な非天然プレニルトランスフェラーゼを含む、遺伝子操作細胞。
【請求項４９】
上記５−アルキルベンゼン−１，３−ジオールはオリベトールであり、上記プレニル化アルコールは２−プレニル化５−アルキルベンゼン−１，３−ジオールはカンナビゲロール（ＣＢＧ；２−ＧＯＬ）である、請求項４８に記載の遺伝子操作細胞。
【請求項５０】
請求項１〜４２に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼ、または請求項４４または４５に記載の核酸を含む、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の遺伝子操作細胞。
【請求項５１】
オリベトール酸経路を有する、請求項４６または５０に記載の遺伝子操作細胞。
【請求項５２】
上記オリベトール酸経路は、ポリケチドシンターゼ／オリベトールシンターゼ（ヘキサノイルコエンザイムＡ（ＣｏＡ）およびマロニルＣｏＡの縮合）を含む、請求項５１に記載の遺伝子操作細胞。
【請求項５３】
ＤＶＡまたはＯＳＡ経路を有する、請求項４７または５０に記載の遺伝子操作細胞。
【請求項５４】
オリベトール経路を有する、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の遺伝子操作細胞。
【請求項５５】
上記オリベトール経路はポリケチドシンターゼを含む、請求項５１に記載の遺伝子操作細胞。
【請求項５６】
ゲラニルピロリン酸経路を有する、請求項４６〜５５のいずれか一項に記載の遺伝子操作細胞。
【請求項５７】
上記ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）経路はゲラニルピロリン酸シンターゼを含む、請求項５６に記載の遺伝子操作細胞。
【請求項５８】
上記ＧＰＰ経路はメバロネート（ＭＶＡ）経路、ＭＥＰ経路、またはその両方を含む、請求項５７に記載の遺伝子操作細胞。
【請求項５９】
２つ以上の外因性核酸を有し、該２つ以上２つ以上の外因性核酸のうちの１つは上記非天然プレニルトランスフェラーゼをコードする、請求項４６〜５８のいずれか一項に記載の遺伝子操作細胞。
【請求項６０】
上記外因性核酸は、（ａ）上記オリベトール酸経路、（ｂ）上記ゲラニルピロリン酸経路、または（ａ）および（ｂ）の両方における酵素をコードする、請求項５９に記載の遺伝子操作細胞。
【請求項６１】
上記外因性核酸は、（ａ）上記ＤＶＡまたはＯＳＡ経路、（ｂ）上記ゲラニルピロリン酸経路、または（ａ）および（ｂ）の両方における酵素をコードする、請求項５９に記載の遺伝子操作細胞。
【請求項６２】
上記外因性核酸は、（ａ）上記オリベトール経路、（ｂ）上記ゲラニルピロリン酸経路、または（ａ）および（ｂ）の両方における酵素をコードする、請求項５９に記載の遺伝子操作細胞。
【請求項６３】
エシェリキア属、コリネバクテリウム属、バシラス属、ラルストニア属、およびブドウ球菌からなる群より選択される、請求項４６〜６２に記載の遺伝子操作細胞。
【請求項６４】
請求項４６、５０〜５２または５５〜６０のいずれか一項に記載の上記遺伝子操作細胞に由来するカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）を含む、細胞抽出物または細胞培養培地。
【請求項６５】
全ゲラニルオリベトレート（３−ＧＯＬＡプラス５−ＧＯＬＡ）のうち５０％以上の割合でカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）を含むか、あるいは全ＣＢＧ（２−ＧＯＬ）プラス４−ＧＯＬのうち５０％以上の割合でＣＢＧを含む、請求項６４に記載の細胞抽出物または細胞培養培地。
【請求項６６】
請求項４６、５０〜５２もしくは５５〜６０のいずれか一項に記載の上記遺伝子操作細胞、または請求項６４もしくは６５に記載の上記細胞抽出物もしくは細胞培養培地に由来する、精製カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）またはＣＢＧ。
【請求項６７】
全ゲラニルオリベトレート（３−ＧＯＬＡプラス５−ＧＯＬＡ）のうち５０％以上の割合でカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）を含む、または全ＣＢＧ（２−ＧＯＬ）プラス４−ＧＯＬのうち５０％以上の割合でＣＢＧを含む、請求項６６に記載の精製カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）またはＣＢＧ。
【請求項６８】
請求項４７、５０〜５３または５６〜６１のいずれか一項に記載の上記遺伝子操作細胞に由来するＣＢＧＶＡまたはＣＢＧＯＡを含む、細胞抽出物または細胞培養培地。
【請求項６９】
請求項４７、５０〜５３もしくは５６〜６１のいずれか一項に記載の上記遺伝子操作細胞、または請求項６８に記載の上記細胞抽出物もしくは細胞培養培地に由来する、精製ＣＢＧＶＡまたはＣＢＧＯＡ。
【請求項７０】
請求項４８〜５０、５４〜５９または６１のいずれか一項に記載の上記遺伝子操作細胞に由来するカンナビゲロール（ＣＢＧ）を含む、細胞抽出物または細胞培養培地。
【請求項７１】
請求項４８〜５０、５４〜５９もしくは６１のいずれか一項に記載の上記遺伝子操作細胞、または請求項７０に記載の上記細胞抽出物もしくは細胞培養培地に由来する、精製カンナビゲロール（ＣＢＧ）。
【請求項７２】
プレニル化芳香族化合物を生成する方法であって、疎水性基質および芳香族基質を請求項１〜４３のいずれか一項に記載の非天然プレニルトランスフェラーゼと接触させる工程を含み、接触によりプレニル化芳香族化合物を生成する、方法。
【請求項７３】
芳香族基質は、オリベトール、オリベトール酸、ジバリノール、ジバリノール酸、オルシノール、およびオルセリン酸からなる群より選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
上記疎水性基質は、イソプレノイド部分、ゲラニル部分、ファルネシル部分、および１つ以上のリン酸基を含み得る、請求項７２または７３に記載の方法。
【請求項７５】
上記接触させる工程は、請求項４６〜６３のいずれか一項に記載の上記遺伝子操作細胞において生じる、請求項６９〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
上記プレニル化芳香族化合物、またはその誘導体を、他の物質から単離または精製する工程をさらに含む、請求項７２〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
上記単離または精製する工程は、連続液液抽出、浸透気化法、蒸発、濾過、膜濾過（逆浸透、ナノ濾過、限界濾過、および精密濾過を含む）、透析濾過による膜濾過、膜分離、逆浸透、電気透析、蒸留、抽出蒸留、反応性蒸留、共沸蒸留、結晶化および再結晶化、遠心分離、抽出濾過、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、吸着クロマトグラフィ、炭素吸着、水素化、および限界濾過の一つまたは複数を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
ゲラニルオリベトレートまたはその誘導体を含む治療用組成物を生成する方法であって、請求項４６、５０〜５２もしくは５５〜６０のいずれか一項の遺伝子操作細胞から得られた、または請求項７２〜７７のいずれか一項の方法によって得られた上記ゲラニルオリベトレートを、治療用組成物に含ませることを含む、方法。
【請求項７９】
請求項４６、５０〜５２もしくは５５〜６０のいずれか一項の遺伝子操作細胞から得られた、または請求項７２〜７７のいずれか一項の方法によって得られたカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）またはその誘導体を含む、治療用または医薬組成物。
【請求項８０】
上記カンナビゲロール酸の誘導体はＣＢＧである、請求項７９に記載の治療用または医薬組成物。
【請求項８１】
上記治療用組成物中の全カンナビノイド成分の６０％以上の、７０％以上の、８０％以上の、８５％以上の、９０％以上の、９１％以上の、９２％以上の、９３％以上の、９４％以上の、９５％以上の、９６％以上の、９７％以上の、９８％以上の、９９％以上の、９９．２％以上の、９９．４％以上の、９９．５％以上の、９９．６％以上の、９９．７％以上の、９９．８％以上の、または９９．９％以上の割合でＣＢＧＡまたはＣＢＧを含む、請求項７９または８０に記載の治療用または医薬組成物。
【請求項８２】
ＣＢＧＶＡもしくはＣＢＧＯＡ、またはその誘導体を含む治療用組成物を生成する方法であって、請求項４７、５０〜５３もしくは５６〜６１のいずれか一項の遺伝子操作細胞から得られた、または請求項７２〜７７のいずれか一項の方法によって得られた上記ＣＢＧＶＡもしくはＣＢＧＯＡ、またはその誘導体を、治療用組成物に含ませることを含む、方法。
【請求項８３】
請求項４７、５０〜５３もしくは５６〜６１のいずれか一項の遺伝子操作細胞から得られた、または請求項７２〜７７のいずれか一項の方法によって得られたＣＢＧＶＡもしくはＣＢＧＯＡ、またはその誘導体を含む、治療用または医薬組成物。
【請求項８４】
上記治療用組成物中の全カンナビノイド成分の６０％以上の、７０％以上の、８０％以上の、８５％以上の、９０％以上の、９１％以上の、９２％以上の、９３％以上の、９４％以上の、９５％以上の、９６％以上の、９７％以上の、９８％以上の、９９％以上の、９９．２％以上の、９９．４％以上の、９９．５％以上の、９９．６％以上の、９９．７％以上の、９９．８％以上の、または９９．９％以上の割合でＣＢＧＶＡまたはＣＢＧＯＡを含む、請求項８３に記載の治療用または医薬組成物。
【請求項８５】
ＣＢＧを含む治療用組成物を生成する方法であって、請求項４８〜５０、５４〜５９または６１のいずれか一項の遺伝子操作細胞から得られた、または請求項７２〜７７のいずれか一項の方法によって得られた上記ＣＢＧを、治療用組成物に含ませることを含む、方法。
【請求項８６】
請求項４８〜５０、５４〜５９もしくは６１のいずれか一項の遺伝子操作細胞から得られた、または請求項７２〜７７のいずれか一項の方法によって得られたＣＢＧを含む、治療用組成物または医薬組成物。
【請求項８７】
上記治療用組成物中の全カンナビノイド成分の６０％以上の、７０％以上の、８０％以上の、８５％以上の、９０％以上の、９１％以上の、９２％以上の、９３％以上の、９４％以上の、９５％以上の、９６％以上の、９７％以上の、９８％以上の、９９％以上の、９９．２％以上の、９９．４％以上の、９９．５％以上の、９９．６％以上の、９９．７％以上の、９９．８％以上の、または９９．９％以上の割合でＣＢＧを含む、請求項８６に記載の治療用組成物または医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権主張）
本出願は２０１８年３月８日に出願された米国仮特許出願第６２／６４０，３８４号（発明の名称：プレニルトランスフェラーゼ変異体およびプレニル化芳香族化合物の製造方法）の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
カンナビノイドは、細胞のカンナビノイド受容体に結合するさまざまなクラスの化学物質を構成する。これらの受容体の変調は、痛覚、記憶、気分、および食欲を含むさまざまな種類の生理学的過程と関連している。体内に存在するエンドカンナビノイド、麻などの植物に含まれるフィトカンナビノイド、および合成カンナビノイドは、カンナビノイド受容体に働きかけ、生物学的反応を誘発することができる。
【０００３】
Cannabis sativaは種々のフィトカンナビノイドを産生し、その最も注目すべきものは、麻における主要な精神活性化合物であるテトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）の前駆体である。しかし、C. sativaは、他のカンナビノイドの前駆体、例えば、カンナビジオール（ＣＢＤ）、カンナビゲロール（ＣＢＧ）、およびカンナビクロメン（ＣＢＣ）なども産生し、これらは、ＴＨＣとは異なり、精神活性をもたない。C. sativaでは、ＣＢＤ、ＣＢＧ、ＣＢＣ、およびＴＨＣの前駆体はそれぞれΔ９−テトラヒドロカンナビノ酸（Δ９−ＴＨＣＡ）、ＣＢＤＡ、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）、およびカンナビクロム酸（ＣＢＣＡ）と呼ばれるカルボン酸含有分子である。Δ９−ＴＨＣＡ、ＣＢＤＡ、ＣＢＧＡ、およびＣＢＣＡは脱炭酸後に生物活性を有する。例えば、加熱によってその生物活性形態となる。例としては、ＣＢＧＡからＣＢＧへの変化が挙げられる。
【０００４】
ＴＨＣのよく知られた作用にもかかわらず、非精神活性ＣＢＤ、ＣＢＧ、およびＣＢＣカンナビノイドにも重要な治療用途がある。例えば、これらのカンナビノイドは、ＣＢ1および／またはＣＢ２カンナビノイド受容体、および／またはα２アドレナリン受容体に対する作用によって変化または改善される状態および疾患の治療のために使用され得る。ＣＢＧは、眼圧を軽減することが示されているため、緑内障の治療に提案されている。ＣＢＧは炎症性腸疾患の治療にも使用できる。さらに、ＣＢＧは脳内のＧＡＢＡの取り込みを阻害することもでき、不安や筋緊張を低下させることができる。ＣＢＧＡを介するＣＢＧの細胞内合成は、オリベトール酸（olivetolic acid）およびゲラニル二リン酸経路に由来する。オリベトール酸の形成は、ヘキサン酸が形成され、次にヘキサノイルＣｏＡシンセターゼを介してヘキサノイル−ＣｏＡに変換される脂肪酸生合成に由来する。ポリケチドシンターゼはヘキサノイルＣｏＡ上にマロニルＣｏＡを３回連続縮合反応して３，５，７−トリオキソドデカノイルＣｏＡを生成し、３，５，７−トリオキソドデカノイルＣｏＡは酵素オリベトール酸シクラーゼによりオリベトール酸（２，４−ジヒドロキシ−６−ペンチル安息香酸）に変換される（Gagne et al., PNAS, 109:12811-12816）ゲラニル二リン酸の生成はメバロン酸経路（ＭＶＡ）またはメチルエリスリトール−４−リン酸経路（ＭＥＰ；デオキシルロース−５−リン酸としても知られる）に由来し、イソペンチルピロリン酸（ＩＰＰ）とジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）を生成し、それらはゲラニルピロリン酸シンターゼを用いてゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）に変換される。
【０００５】
ゲラニルピロリン酸−オリベトール酸ゲラニルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．５．１．１０２、ＧＯＴ）は次の反応を触媒する：
ゲラニル二リン酸＋２，４−ジヒドロキシ−６−ペンチル安息香酸→
二リン酸＋カンナビゲロール酸
C. sativaで上記反応を行う酵素は膜タンパク質のＵｂｉＡスーパーファミリーに属する膜貫通プレニルトランスフェラーゼである。例えば、ＣｓＰＴ１を記載するＷＯ２０１１０１７７９８Ａ１を参照されたい。しかしながら、上記の反応はまた、異なるファミリーの酵素によって実施されることが報告されている。特に、可溶性、非膜貫通性であり、５つの反復αββαモチーフからなる１０本鎖逆平行βバレルを有する芳香族プレニルトランスフェラーゼは、イソプレノイド鎖の芳香環への転移を触媒することができる。例えば、Yang, Y. et al．(Biochemistry 51:2606-180, 2012）は、ストレプトマイセス由来の可溶性酵素であるＮｐｈＢが芳香族基質への１０−炭素ゲラニル基の結合を触媒することを報告している。これは抗酸化剤ナフテルピンの生合成経路において最初に同定された。Ｙａｎｇは、プレニル化工程の反応機構が弱く安定したカルボカチオン中間体を有するＳ（Ｎ）１型解離機構として特徴付けられていることに注目している。ＮｐｈＢはＧＰＰと１，６ジヒドロキシナフタレン（１，６−ＤＨＮ）との間のプレニル転写を触媒し、ゲラニル部分が１，６‐ＤＨＮの異なる炭素原子に結合した３つの生成物を生み出す。主要生成物５ゲラニルＤＨＮおよび副生成物２−ゲラニルＤＨＮを、生成物比１０：１で特徴付けた。
【０００６】
その後の刊行物（Kumano et al 2008 Bioorg. Med. Chem, 16, 8117-8126 (2008)）は、２−および４−ＯＬ環位置の混合位置選択性、ならびに０．００２６ｍｏｌ ２−ゲラニル−ＯＬ／分／ｍｏｌ ＮｐｈＢおよび０．００１６ｍｏｌ ４−ゲラニル−ＯＬ／分／ｍｏｌ ＮｐｈＢという極めて遅い速度での、オリベトールのＮｐｈＢ触媒ゲラニル化の速度および位置選択性測定を報告している。
【発明の概要】
【０００７】
本開示の態様は、プレニル化芳香族化合物（カンナビノイドを含む）、カンナビノイド形成を促進する増大した活性を有する遺伝子操作酵素（例えば、可溶性芳香族プレニルトランスフェラーゼタイプのプレニルトランスフェラーゼ変異体）、上記遺伝子操作酵素を含む非天然細胞、カンナビノイド経路を含むプレニル化芳香族化合物の形成、カンナビノイド経路を用いる発酵方法、および、カンナビノイド生成物の調製を含む、改善されたプレニル化芳香族化合物の調製に関する。特に、本発明に係る開示は、野生型可溶型プレニルトランスフェラーゼのアミノ酸残基とは異なる少なくとも１つのアミノ酸変異を含む非天然プレニルトランスフェラーゼに関する。
【０００８】
本発明に係る実験研究で、オリベトール酸（ＯＬＡ）とゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）との間の反応を触媒して生成物３−ゲラニルオリベトレート（カンナビゲロール酸；ＣＢＧＡ、３−ＧＯＬＡ）を形成する活性またはそれが増大した活性を示すプレニルトランスフェラーゼホモログおよび非天然プレニルトランスフェラーゼ変異体を同定した。本明細書に記載されるのは、増大した活性および／または位置選択性を有する配列番号１の可溶性プレニルトランスフェラーゼならびにその変異体である。また、本明細書に記載されるのは、配列番号１のホモログおよびその変異体であり、活性および／または位置選択性が改善されたプレニルトランスフェラーゼホモログのホモログのそれらのＮｐｈＢおよび非天然プレニルトランスフェラーゼ変異体を含む。
【０００９】
活性が改善され、および／または３−ゲラニルオリベトレート（３−ＧＯＬＡ）に対する位置選択性が示されたユニークな非天然プレニルトランスフェラーゼ変異体が同定され、標的生成物３−ＧＯＬＡ、すなわちＣＢＧＡの方が、それほど好ましくない５−ゲラニル−オリベトール（５−ＧＯＬＡ）よりも優勢であった。諸態様において、増大した活性および／または３−ＧＯＬＡに対する位置選択性を有するプレニルトランスフェラーゼ変異体の本発明の発見は、重要な開示である。ＮｐｈＢの野生型ホモログによって触媒される反応においては、望ましくない５−ＧＯＬＡの方が優勢な生成物だからである。したがって、所望の標的生成物がカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）である場合、５−ＧＯＬＡをもたらす酵素触媒反応を避けることが好ましい。したがって、本発明は、ＣＢＧＡ（３−ＧＯＬＡ）に対して非常に高い位置特異性を有する多数のプレニルトランスフェラーゼ変異体の驚くべき発見を提供する。したがって、これらの高活性および位置特異的酵素を、本発明に従って用いて、遺伝子操作細胞でＣＢＧＡ（３−ＧＯＬＡ）の生成を触媒して、高力価でこの分子を生成し、今度はそれを用いて、カンナビノイド、とりわけＣＢＧＡおよびその誘導体を含む治療用および医薬用調製物を生成することができる。
【００１０】
ジバリノール酸（divarinolic acid）（ＤＶＡ）とゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）との反応を触媒して生成物カンナビゲロバリン酸（ＣＢＧＶＡ）を生成する活性またはそれが増大した活性を示した非天然プレニルトランスフェラーゼ変異体、ならびに、オルセリン酸（ＯＳＡ）とゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）との反応を触媒して生成物カンナビゲルシン酸（ＣＢＧＯＡ）を生成する活性を示した非天然プレニルトランスフェラーゼ変異体を同定した。３−ゲラニル−ジバリノール酸（３−ＧＤＶＡ）および３−ゲラニルオルセリナート（３−ＧＯＳＡ）への位置選択性を示した非天然プレニルトランスフェラーゼ変異体も同定した。
【００１１】
実施形態では、野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して少なくとも１つのアミノ酸変異を含む非天然プレニルトランスフェラーゼを提供する。本開示の非天然プレニルトランスフェラーゼには、（ａ）野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して少なくとも２倍の速度での、ゲラニルピロリン酸およびオリベトール酸からのゲラニル−オリベトレートの生成、または（ｂ）３−ゲラニルオリベトレート（３−ＧＯＬＡ）に対して位置選択性を示すこと、または（ａ）と（ｂ）の両方を酵素的に実現することが可能なものが含まれる。
【００１２】
実施形態において、本発明はまた、野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して少なくとも１つのアミノ酸変異を有する非天然プレニルトランスフェラーゼであって、（ａ１）野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して少なくとも２倍の速度での、ゲラニルピロリン酸およびジバリノール酸（ＤＶＡ）からのカンナビゲロバリン酸（ＣＢＧＶＡ）の生成、(ａ２）３−ゲラニル−ジバリノール酸（３−ＧＤＶＡ）に対する５０％以上の位置選択性、もしくは（ａ１）および（ａ２）の両方、または（ｂ１）野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して少なくとも２倍の速度での、ゲラニルピロリン酸およびオルセリン酸（ＯＳＡ）からのカンナビゲロルシン酸（cannabigerorcinic acid）（ＣＢＧＯＡ）の生成、(ｂ２）３−ゲラニル−オルセリナート（３−ＧＯＳＡ）に対する５０％以上の位置選択性、もしくは（ｂ１）および（ｂ２）の両方を、酵素的に実現することが可能な、非天然プレニルトランスフェラーゼを提供する。
【００１３】
実施形態において、野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して少なくとも１つのアミノ酸変異を有する非天然プレニルトランスフェラーゼであって、ゲラニルピロリン酸および５−アルキルベンゼン−１，３−ジオールから２−プレニル化５−アルキルベンゼン−１，３−ジオールの位置選択的な生成を酵素的に実現することが可能な、非天然プレニルトランスフェラーゼも提供する。例えば、５−アルキルベンゼン−１，３−ジオール基質はオリベトールであり得、２−プレニル化５−アルキルベンゼン−１，３−ジオールはカンナビゲロール（ＣＢＧ；２−ＧＯＬ）であり得る。
【００１４】
本開示の変異体プレニルトランスフェラーゼは、可溶性でαββα（ＡＢＢＡ）構造型である対応する天然プレニルトランスフェラーゼ、または３−ＧＯＬＡに対して増大した活性および／または位置選択性を提供する１つ以上の変異とは異なる１つ以上の変異を有するプレニルトランスフェラーゼと比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。例えば、以前に遺伝子操作されていてもよい種々の変異を有するプレニルトランスフェラーゼを、本明細書中に記載される任意の改変を組み込む前に、鋳型として使用し得る。本明細書に記載される改変を組み込んで新規な遺伝子操作酵素を生成する開始配列であるこのようなプレニルトランスフェラーゼは、本明細書中では、代わりに、野生型、鋳型、開始配列、天然、天然に存在する、未改変、対応する天然プレニルトランスフェラーゼ、アミノ酸置換のない対応する天然プレニルトランスフェラーゼ、対応するプレニルトランスフェラーゼまたはアミノ酸置換のない対応するプレニルトランスフェラーゼと呼ぶことができる。本明細書に記載された実験的研究は、プレニルトランスフェラーゼ配列の長さに沿った多数のアミノ酸位置を置換して、増大した活性および所望の位置選択性を有する非天然プレニルトランスフェラーゼを提供することができることを実証する。本開示に関連する実験的研究は、プレニルトランスフェラーゼ鋳型における単一の置換および置換の組み合わせが、増大した活性および所望の位置選択性を提供し得、したがって、基質転化率および／または位置選択性が増大した、出発または鋳型または対応するプレニルトランスフェラーゼの単一の変異体および組み合わせの変異体（例えば、特に、ＥＣ ２．５．１．１０２の酵素）を提供することを示す。
【００１５】
アミノ酸変異は、配列番号１に対する変異、またはそのホモログであって、Ｓ４９Ｔ、Ｆ１２１Ｌ、Ｔ１２４Ｒ、Ｑ１５９Ｈ、Ｑ１５９Ｒ、Ｑ１５９Ｓ、Ｑ１５９Ｔ、Ｑ１５９Ｙ、Ｑ１５９Ａ、Ｑ１５９Ｆ、Ｑ１５９Ｇ、Ｑ１５９Ｉ、Ｑ１５９Ｋ、Ｑ１５９Ｌ、Ｑ１５９Ｍ、Ｑ１５９Ａ、Ｓ１７５Ｈ、Ｓ１７５Ｋ、Ｓ１７５Ｒ、Ｓ２１２Ｈ、Ｉ２３２Ｈ、Ｔ２６７Ｗ、Ｌ２６８Ｙ、Ａ２８５Ｙ、Ｙ２８６Ａ、Ｙ２８６Ｆ、Ｙ２８６Ｌ、Ｙ２８６Ｍ、Ｙ２８６Ｐ、Ｙ２８６Ｉ、Ｙ２８６Ｔ、Ｙ２８６Ｖ、Ｑ２９３Ｆ、Ｑ２９３Ｗ、Ｑ２９３Ｈ、Ｑ２９３Ｃ、Ｑ２９３Ａ、Ｑ２９３Ｓ、Ｑ２９３Ｖ、Ｑ２９３Ｄ、Ｑ２９３Ｙ、Ｑ２９３Ｅ、Ｑ２９３Ｉ、Ｑ２９３Ｍ、Ｑ２９３Ｔ、およびＦ３００Ｋからなる群より選択される位置における１つ以上の変異を含み得る。アミノ酸変異は、配列番号２に対する変異、またはそのホモログであって、Ｓ５１Ｔ、Ｆ１２３Ｌ、Ｔ１２６Ｒ、Ｑ１６１Ｈ、Ｑ１６１Ｒ、Ｑ１６１Ｓ、Ｑ１６１Ｔ、Ｑ１６１Ｙ、Ｑ１６１Ａ、Ｑ１６１Ｆ、Ｑ１６１Ｇ、Ｑ１６１Ｉ、Ｑ１６１Ｋ、Ｑ１６１Ｌ、Ｑ１６１Ｍ、Ｑ１６１Ａ、Ｓ１７７Ｈ、Ｓ１７７Ｋ、Ｓ１７７Ｒ、Ｓ２１４Ｈ、Ｉ２３４Ｈ、Ｔ２６９Ｗ、Ｌ２７０Ｙ、Ａ２８７Ｙ、Ｙ２８８Ａ、Ｙ２８８Ｆ、Ｙ２８８Ｌ、Ｙ２８８Ｍ、Ｙ２８８Ｐ、Ｙ２８８Ｔ、Ｙ２８８Ｖ、Ｑ２９５Ｆ、Ｑ２９５Ｗ、Ｑ２９５Ｈ、Ｑ２９５Ｃ、Ｑ２９５Ａ、Ｑ２９５Ｓ、Ｑ２９５Ｖ、Ｑ２９５Ｄ、Ｑ２９５Ｙ、Ｑ２９５Ｅ、Ｑ２９５Ｉ、Ｑ２９５Ｍ、Ｑ２９５Ｔ、およびＦ３０３Ｋからなる群より選択される位置における１つ以上の変異を含み得る。
【００１６】
増大した活性および／または位置選択性を提供した変異体の位置および同一性に関する情報、ならびに種々のプレニルトランスフェラーゼホモログの配列アラインメント情報を使用して、変異体の位置を含むプレニルトランスフェラーゼアミノ酸モチーフを同定した。したがって、配列番号１〜１５のいずれか一つと５０％以上の同一性を有し、以下のアミノ酸モチーフ（ａ）〜（ｊ）のうち一つまたは複数を含む、非天然プレニルトランスフェラーゼが提供される：
（ａ）ＦＸ３Ｍ（配列番号１６）またはＶＦＸ３ＭＡ（配列番号１７）（Ｘ３はＴ）
（ｂ）Ｘ４ＦＰＸ５（配列番号１８）（Ｘ４はＦまたはＬであり、Ｘ５はＴまたはＲであり、単一のモチーフ中では、Ｘ４はＦではなく、Ｘ５はＴではない）
（ｃ）ＶＸ６Ｍ（配列番号１９）またはＫＶＸ６ＭＴ（配列番号２０）（Ｘ６は、Ｈ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ，およびＡからなる群より選択される）、
（ｄ）ＦＸ７Ｅ（配列番号２１）またはＹＦＸ７ＥＬ（配列番号２２）（Ｘ７は、Ｈ，Ｋ，およびＲからなる群より選択される）、
（ｅ）ＦＸ８Ｖ（配列番号２３）またはＳＦＸ８ＶＹ（配列番号２４）（Ｘ８はＨ）
（ｆ）ＶＸ９Ｓ（配列番号２５）またはＡＶＸ９ＳＮ（配列番号２６）（Ｘ９はＨ）
（ｇ）ＲＸ１０Ｘ１１Ｖ（配列番号２７）（Ｘ１０はＴまたはＷであり、Ｘ１１はＬまたはＹであり、単一のモチーフ中では、Ｘ１０はＴではなく、Ｘ１１はＬではない）、
（ｈ）ＧＸ１２Ｘ１３Ｙ（配列番号２８）（Ｘ１２はＡまたはＹであり、Ｘ１３はＹ、Ａ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、ＴまたはＶであり、単一のモチーフ中では、Ｘ１２はＡではなく、Ｘ１３はＹではない）
（ｉ）Ｘ１４Ｘ１５Ｒ（配列番号２９）またはＤＸ１４Ｘ１５Ｒ（配列番号３０）（Ｘ１４はＶまたはＩであり、Ｘ１５はＦ、Ｗ、Ｈ、Ｃ、Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｄ、Ｙ、Ｅ、Ｉ、Ｍ、またはＴ）
（ｊ）ＡＸ１６Ｄ（配列番号３１）またはＫＡＸ１６Ｄ（配列番号３２）（Ｘ１６はＫ）。
【００１７】
本開示のいくつかの実施形態は、少なくとも１つのアミノ酸置換（単一および組み合わせ変異体を含む）を含む非天然プレニルトランスフェラーゼを発現する遺伝子操作細胞を対象とする。当該細胞を用いて、カンナビノイド、ＣＢＧＡ(３−ＧＯＬＡ）、またはその誘導体の産生を促進することができる。上記遺伝子操作細胞の実施形態は、カンナビノイド前駆体束を増加させることによって増大したカンナビノイド形成を促進するため、１つ以上のさらなる代謝経路導入遺伝子を任意にさらに含み得、それにより、カンナビノイド誘導体を形成、または遺伝子操作細胞からのカンナビノイドの回収率を改善してよい。。
【００１８】
他の実施形態は、遺伝子操作細胞を含む組成物（例えば、細胞培養組成物）、および、上記遺伝子操作細胞から産生される１つ以上の生成物を含む組成物を対象とする。例えば、組成物は、上記細胞によって産生される標的カンナビノイド生成物を含み得、ここで、組成物は細胞または細胞培養に有用な他の成分を除去するために精製されている。組成物を処理して、標的生成物またはその中間体を濃縮または精製してもよい。
【００１９】
他の実施形態は、プレニル化芳香族化合物を生成する方法を対象とする。上記方法は、疎水性基質および芳香族基質を本開示の非天然プレニルトランスフェラーゼと接触させる工程を含み、接触によりプレニル化芳香族化合物を生成する。芳香族基質として、オリベトール、オリベトール酸、ジバリノール、ジバリノール酸、オルシノールおよびオルセリン酸が挙げられる。疎水性基質は、ゲラニルまたはファルネシル部分などのイソプレノイド部分を含むことができ、リン酸基を含むことができる。
【００２０】
本発明の他の実施形態は、上記遺伝子操作細胞を使用する方法から得られる標的カンナビノイド生成物から生成される生成物を対象とする。生成物として、治療用または薬学的組成物、医薬組成物、インビトロで用いるシステム、診断用組成物、およびさらなる化学修飾（例えば、加熱または生体触媒によるＣＢＧＡからＣＢＧへの脱炭酸化）のための前駆体組成物が含まれる。
【００２１】
本発明の他の実施形態は、１つ以上の変異体アミノ酸を有する非天然プレニルトランスフェラーゼをコードする核酸、ならびに当該核酸を含む発現コンストラクト、および当該核酸または当該発現コンストラクトを含む遺伝子操作細胞を対象とする。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、オリベトール酸（ＯＬＡ）とゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）とのプレニルトランスフェラーゼ触媒反応による生成物３−ゲラニルオリベトレート（３−ＧＯＬＡ；カンナビゲロール酸；ＣＢＧＡ）および５−ゲラニル−オリベトラート（５−ＧＯＬＡ）の生成を示す。
【図２】図２は、ヘキサノイル−ＣｏＡおよびゲラニル二リン酸からの３−ＧＯＬＡ形成を示す例示的代謝経路の図である。
【図３】図３は、プレニルトランスフェラーゼ触媒反応に用いることができる種々の芳香族基質分子の化学構造を示す。
【図４】図４は、Streptomyces antibioticus ＡＱＪ２３＿４０４２５（ＮＣＢＩアクセッション番号ＫＵＮ１７７１９．１； ３０５アミノ酸長；配列番号１）のアミノ酸配列である。
【図５】図５は、配列番号１（Streptomyces antibioticus ＡＱＪ２３＿４０４２５）と他のプレニルトランスフェラーゼホモログ（配列番号２〜１５）とのアラインメントを示す。
【図６】図６は、プレニルトランスフェラーゼアミノ酸モチーフおよび、プレニルトランスフェラーゼ変異体ライブラリのＨＴスクリーニングを介して同定され、ＯＬＡおよびＧＰＰにおける活性および選択性に影響を及ぼす上記モチーフ内の変異残基を記載する表である。
【図７Ａ】図７Ａは、ＤＶＡとＧＰＰとの反応によるＣＢＧＶＡの生成を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＯＳＡとＧＰＰとの反応によるＣＢＧＯＡの生成を示す。
【図８】図８は、ＣＢＧ（２−ＧＯＬ）を形成するためのオリベトールとＧＰＰとの反応を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書で記載される説明の実施形態は、網羅的であることを意図せず、または以下の詳細な説明で開示されるそのままの形態に本開示を限定することを意図しない。むしろ、実施形態は、他の当業者が説明の原理および実践を認識し理解することができるように選択され、記載される。
【００２４】
本明細書で言及される全ての刊行物および特許は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に開示される刊行物および特許は、それらの開示のためにのみ提供される。本明細書中のいかなる記載も、本発明者が、いかなる刊行物および／または特許（本明細書中に引用されるいかなる刊行物および／または特許も含む）にも先行する権利を有さないことを容認するものと解釈されるべきではない。
【００２５】
総じて、本開示は、（ａ）野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して少なくとも２倍の速度での、ゲラニルピロリン酸およびオリベトール酸からの３−ゲラニル−オリベトレート（３−ＧＯＬＡ、カンナビゲロール酸、ＣＢＧＡ）の生成、および（ｂ）ＣＢＧＡ（３−ゲラニル−オリベトレート、３−ＧＯＬＡ）に対する位置選択性を示すこと、または（ａ）と（ｂ）の両方を酵素的に実現することが可能な、非天然プレニルトランスフェラーゼを提供する。非天然プレニルトランスフェラーゼをコードする核酸、ならびに上記核酸を含む発現コンストラクト、および上記核酸または発現コンストラクトを含む遺伝子操作細胞が記載される。図１は、オリベトール酸（ＯＬＡ）およびゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）の反応による生成物３-ゲラニルオリベトレート（３−ＧＯＬＡ；カンナビゲロール酸；ＣＢＧＡ）および５−ゲラニルオリベトーレート（５−ＧＯＬＡ）の生成を示す。
【００２６】
本開示はまた、（ａ１）野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して少なくとも２倍の速度での、ゲラニルピロリン酸およびジバリノール酸（ＤＶＡ）からのカンナビゲロバリン酸（ＣＢＧＶＡ）の生成、（ａ２）３−ゲラニル−ジバリノール酸（３−ＧＤＶＡ）に対する５０％以上の位置選択性、もしくは（ａ１）と（ａ２）の両方、または（ｂ１）野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して少なくとも２倍の速度での、ゲラニルピロリン酸およびオルセリン酸（ＯＳＡ）からのカンナビゲロルシン酸（ＣＢＧＯＡ）の生成、（ｂ２）３−ゲラニル−オルセリナート（３−ＧＯＳＡ）に対する５０％以上の位置選択性、もしくは（ｂ１）と（ｂ２）の両方を、酵素的に実現することが可能な、非天然プレニルトランスフェラーゼを提供する。図７Ａはジバリノール酸（ＤＶＡ）とゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）との反応による生成物カンナビゲロバリン酸（ＣＢＧＶＡ）の生成を示し、図７Ｂは、オルセリン酸（ＯＳＡ）とゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）との反応による生成物カンナビゲロルシン酸（ＣＢＧＯＡ）の生成を示す。
【００２７】
本開示はまた、ゲラニルピロリン酸および５−アルキルベンゼン−１，３−ジオールから２−プレニル化５−アルキルベンゼン−１，３−ジオールの位置選択的な生成を酵素的に実現することが可能な、非天然プレニルトランスフェラーゼ変異体を提供する。特定の実施の態様において、５−アルキルベンゼン−１，３−プロパンジオール基質はオリベトールであり得、２−プレニル化５−アルキルベンゼン−１，３−ジオールはカンナビゲロール（ＣＢＧ；２−ＧＯＬ）であり得、この反応は図８に示される。
【００２８】
カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ；ＣＡＳ＃２５５５５−５７−１）は次の化学名（Ｅ）−３−（３，７−ジメチル−２，６−オクタジエニル）−２，４−ジヒドロキシ−６−ペンチル安息香酸、および３−［（２Ｅ）−３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエン−１−イル］−２，４−ジヒドロキシ−６−ペンチル安息香酸を有し、次の化学構造を有する：
【００２９】
【化１】
2021515563.tif 000002
【００３０】
ＣＢＧＡはまた、３-ゲラニルオリベトレート（３−ＧＯＬＡ）と称され得、これは、オリベトレート部分上のゲラニル部分の位置を反映する。
【００３１】
５−ゲラニルオリベトレート（５−ＧＯＬＡ）はゲラニルピロリン酸とオリベトール酸の酵素反応の生成物であり、以下の構造を有する。
【００３２】
【化２】
2021515563.tif 000003
【００３３】
本明細書で使用する「ゲラニル−オリベトレート」とは一般的に３−ＧＯＬＡまたは５−ＧＯＬＡのいずれかを指す。プレニルトランスフェラーゼ変異体を使用する酵素反応において、「ゲラニル−オリベトレート」生成物を産生することができるが、３−ＧＯＬＡに対して高い位置選択性を有する変異体については５−ＧＯＬＡをほとんどまたは微量しか産生することができない。
【００３４】
３−ＧＯＬＡの脱炭酸形態であるカンナビゲロールは、次のような構造を有する。
【００３５】
【化３】
2021515563.tif 000004
【００３６】
カンナビゲロール（ＣＢＧ；２−ＧＯＬ；２−［（２Ｅ）−３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニル］−５−ペンチルベンゼン−１，３−ジオール；ＣＡＳ♯：２５６５４−３１−３）は、ＧＯＬＡ／ＣＢＧＡの「誘導体」と考えることができる。４−ＧＯＬは芳香環上の４位（すなわち、芳香環上の１または３位の水酸基と、ペンチル基との間）でプレニル化された２−ＧＯＬの異性体である。ＣＢＧはＣＢＧＡの脱カルボキシル化によって、例えば、熱によって、または酵素、全細胞、もしくは細胞抽出物などの生体触媒であり得る触媒作用によって形成され得る。プレニルトランフェラーゼによる触媒反応により、オリベトール酸（ＯＬＡ）を用いて３−ＧＯＬＡ／ＣＢＧＡを生成する（図１参照）のに加えて、本開示は、ＯＬＡに代えて他の基質分子を用いることも意図している。
【００３７】
カンナビゲロール（ＣＢＧ；２−ＧＯＬ）はまた、本開示の非天然プレニルトランスフェラーゼ変異体を用いて、オリベトールおよびゲラニルピロリン酸（図８参照）から位置選択的に生成（すなわち、４−ＧＯＬの過剰生成）され得る。
【００３８】
カンナビゲロバリン酸（ＣＢＧＶＡ；３−ＧＤＶＡ；３−［（２Ｅ）−３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニル］−２，４−ジヒドロキシ−６−プロピル安息香酸；Ｃ２０Ｈ２８Ｏ４；＃６４９２４−０７−８）は、主要ではないカンナビノイドである。
【００３９】
【化４】
2021515563.tif 000005
【００４０】
５−ＧＤＶＡは、（２Ｅ）−３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニル基が芳香環の５位に結合した異性体である。図７Ａは、ジバリノール酸（ＤＶＡ）とゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）との反応による生成物カンナビゲロバリン酸（ＣＢＧＶＡ）の生成を示す。
【００４１】
カンナビゲロルシン酸（ＣＢＧＯＡ；３−ＧＯＳＡ；３−［（２Ｅ）−３，７−ジメチル−２，６−オクタジエン−１−イル］−２，４−ジヒドロキシ−６−メチル−安息香酸；Ｃ１８Ｈ２４Ｏ４；＃６９７３４−８３−４）は別の主要ではないカンナビノイドである。
【００４２】
【化５】
2021515563.tif 000006
【００４３】
５−ＧＯＳＡは、（２Ｅ）−３，７−ジメチル−２，６−オクタジエン−１−イル基が芳香環の５位に結合した異性体である。図７Ｂは、オルセリン酸（ＯＳＡ）およびゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）の反応による生成物カンナビゲロルシン酸（ＣＢＧＯＡ）の生成を示す。
【００４４】
「位置選択的反応」において使用される「位置選択的」および「位置選択性」という用語はある方向の結合形成または切断が、全ての他の考えられる方向よりも優先的に生じることをいう。基質Ａと基質Ｂとの間の反応は２つ以上の反応生成物（例えば、生成物Ｃ、生成物Ｄなど）を生成し得る。位置選択性は、生成される生成物のモル量を決定することによって理解することができる。例えば、基質Ａと基質Ｂが反応して生成物Ｃと生成物Ｄの生成混合物を生成し、生成混合物中の生成物Ｃ：生成物Ｄのモル比がそれぞれ１：１より大きい酵素反応では反応は生成物Ｃに対して位置選択的である。生成混合物中で生成物Ｃ：生成物Ｄのモル比がそれぞれ９：１以上である場合、反応は生成物Ｃに対して９０％以上の位置選択性を有する。
【００４５】
本開示はまた、一般に、プレニル化芳香族化合物を生成するための方法を意図する。該方法は、疎水性基質および芳香族基質を本開示の非天然プレニルトランスフェラーゼと接触させてプレニル化芳香族化合物を生成することを含む。例えば、特に、本開示は、このようなプレニルトランスフェラーゼ触媒反応におけるオリベトール，オリベトール酸，ジバリノール，ジバリノール酸，オルシノール及びオルセリン酸のような種々の芳香族基質の使用を意図する。疎水性基質は、イソプレノイド部分、ゲラニル部分、ファルネシル部分、および１つ以上のリン酸基を含むことができる。該方法はインビボ（例えば、遺伝子操作細胞内）またはインビトロで行うことができる。
【００４６】
また、必要に応じて１つ以上のさらなる代謝経路導入遺伝子を含む非天然プレニルトランスフェラーゼを発現する遺伝子操作細胞；当該細胞を含む細胞培養組成物；当該細胞からの標的カンナビノイドまたはその誘導体の産生を促進するための方法；標的カンナビノイドまたは誘導体を含む組成物；および標的生成物または中間体から作製される生成物も記載される。
【００４７】
「天然に存在しない」という用語は、生物（例えば、微生物）に関して使用される場合、そのような生物が、参照される種の天然に存在する生物において通常見出されない少なくとも１つの遺伝的変化を有することを意味することを意図する。天然に存在する生物は、参照される種の野生型系統と呼ばれることがある。同様に、「天然に存在しない」ポリペプチドまたは核酸は、天然に存在するポリペプチドまたは核酸において通常見出されない少なくとも１つの遺伝的変化を含むことができる。天然に存在する生物、核酸、およびポリペプチドは、参照される種の野生型系統といった「野生型」または「オリジナル」と呼ばれることがある。同様に、野生型生物のポリペプチドにおいて見出されるアミノ酸は、任意のアミノ酸位置に関して「オリジナル」と呼ばれることがある。
【００４８】
生物を非天然にする遺伝子改変として、例えば、代謝ポリペプチドをコードする発現可能な核酸を導入する改変、他の核酸付加、核酸欠失、および／または生物の遺伝物質の他の機能的破壊を挙げ得る。このような改変として、例えば、参照される種についての異種、同種、または異種および同種の両方のポリペプチドについてのコード領域およびその機能的断片が挙げられる。さらなる改変として、例えば、改変が遺伝子またはオペロンの発現を変化させる非コード調節領域が挙げられる。
【００４９】
例えば、可溶性芳香族プレニルトランスフェラーゼ変異体を提供するために、Streptomyces antibioticus ＡＱＪ２３＿４０４２５（ＮＣＢＩアクセッション番号ＫＵＮ１７７１９．１；３０５アミノ酸長；配列番号１）に由来する可溶性ＡＢＢＡ型プレニルトランスフェラーゼを鋳型として選択することができる。本明細書中に記載されるように、変異体は、１つ以上のアミノ酸置換を鋳型に導入して、増大した活性およびＣＢＧＡ（３−ＧＯＬＡ）に対する改善された位置選択性について試験することによって作製され得る。
【００５０】
いくつかの場合では、プレニルトランスフェラーゼ配列番号１の「ホモログ」が最初に同定される。ホモログとは、垂直伝達（vertical descent）によって関連し、異なる生物において実質的に同じまたは同一の機能を担う一つのまたは複数の遺伝子のことである。たとえば、遺伝子が相同であることを示すのに十分な量の配列類似性を共有している場合や、共通の祖先からの進化によって関連している場合には、遺伝子は垂直伝達の関係にある。オルソロガスである遺伝子は、約４５％〜１００％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは約６０％〜１００％のアミノ酸配列同一性の配列類似性を有するタンパク質をコードし得る。遺伝子はまた、一次配列類似性が同定できない程度で、共通の祖先から進化したことを示すのに十分な量の三次元構造を共有（必ずしも配列類似性はない）している場合にも、オルソログとみなすことができる。パラログはゲノム内での重複の関係にある遺伝子であり、これらが元のものと関係していても、新しい機能を進化させることができる。
【００５１】
Streptomyces antibioticus ＡＱＪ２３＿４０４２プレニルトランスフェラーゼに対して所望の同定量（例えば、４５％、５０％、５５％、または６０％以上）を共有する遺伝子（ホモログ、オルソログ、およびパラログを含む）は、当業者に周知の方法によって決定され得る。例えば、２つのポリペプチドについての核酸またはアミノ酸配列の調査は、比較された配列間の配列同一性および類似性を明らかにする。このような類似性に基づいて、当業者は、タンパク質同士が共通の祖先からの進化を通じた関連があることを示すほど高い類似性があるかどうかを判定できる。
【００５２】
配列アラインメントに対する計算的アプローチおよび配列同一性の決定には、グローバルアラインメントおよびローカルアラインメントが含まれる。グローバルアラインメントは、グローバル最適化を使用して、アラインメントがすべてのクエリ配列の全長にわたるようにする。これとは対照的に、ローカルアラインメントは、全体的に広く不一致であることが多い長い配列内の類似領域を同定する。Streptomyces antibioticus ＡＱＪ２３＿４０４２プレニルトランスフェラーゼ鋳型への標的配列の同一性を理解するために、グローバルアラインメントを使用することができる。必要に応じて、鋳型配列とほとんどまたは全く同一性を共有しない標的配列のアミノ末端および／またはカルボキシ末端配列を排除して、グローバルアラインメントおよび同一性スコアを生成することができる。
【００５３】
Ａｌｉｇｎ、ＢＬＡＳＴ、ＣｌｕｓｔａｌＷおよびその他のもの等、当業者に周知のアルゴリズムによって、生の配列の類似性または同一性を比較および判定し、また、重みまたはスコアを割り当て得る配列中のギャップの存在または有意性を決定する。このようなアルゴリズムはまた、当該分野で公知であり、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の類似性または同一性を決定するのにも適用可能である。関連性があると判定するのに十分な類似性を示すパラメータは、統計的類似性、またはランダムなポリペプチドにおいて類似の一致を見出す機会、および決定された一致の有意性を計算する周知の方法に基づいて計算される。所望であれば、２つ以上の配列のコンピューター比較もまた、当業者によって視覚的に最適化され得る。関連する遺伝子産物またはタンパク質は高度の類似性、例えば、４５％〜１００％の配列同一性を有することが予想され得る。無関係なタンパク質は、充分な大きさのデーターベースがスキャンされる場合に偶然に起こると予想されるものと本質的に同じ同一性（約５％）を有することができる。
【００５４】
Streptomyces antibioticus ＡＱＪ２３＿４０４２プレニルトランスフェラーゼ配列番号１を鋳型として用いて、ペアをなすグローバル配列アラインメントを実施することができる。アラインメントは、ＢＡＬＩＧＮツール（http://balign.sourceforge.net/）を介して実施されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Needleman, S & Wunsch, C. A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins J. Mol. Biol, 1970, 48, 443-453）を用いて行うことができる。デフォルトパラメータを位置合わせに使用し、ＢＬＯＳＵＭ６２をスコアリングマトリックスとして使用した。また、本開示は、本明細書にプレニルトランスフェラーゼとして開示され、かつ本明細書に記載されるような改良された活性を有する野生型配列の、本出願人による最初の発見にも関する。そのような野生型配列は、以前、「仮想タンパク質」または「推定タンパク質」として注釈されている。少なくとも本出願人の同定、試験、モチーフ同定、および配列アラインメント（図５を参照）に基づいて、本開示は、本明細書に記載されるような変異体を作製するなど、本開示の遺伝子操作細胞および方法における使用に適したプレニルトランスフェラーゼの同定をさらに可能にする。
【００５５】
アミノ酸位置番号付けのために、配列番号１が参照配列として使用される。例えば、アミノ酸位置４９の記載は配列番号１に対してであるが、異なるプレニルトランスフェラーゼ配列（標的配列または他の鋳型配列）の文脈において、変異体作製のための対応するアミノ酸位置は同じまたは異なる位置番号（例えば、４８、４９または５０）を有し得る。場合によっては、配列番号１の参照鋳型上の元のアミノ酸およびその位置が標的プレニルトランスフェラーゼ上の元のアミノ酸および位置と正確に相関する。他の場合では、配列番号１鋳型上の元のアミノ酸およびその位置は元のアミノ酸と相関するが、標的上のその位置は対応する鋳型位置にはない。しかし、標的上の対応するアミノ酸は鋳型上の位置から所定の距離、例えば、鋳型位置から１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１アミノ酸位置以内であり得る。他の場合では、配列番号１鋳型上の元のアミノ酸は、標的上の元のアミノ酸と正確に相関しない。しかし、標的配列上の対応するアミノ酸が鋳型上のアミノ酸の全体的な位置、および標的アミノ酸の近傍のアミノ酸の配列に基づくものであることを、特に図５に提供されるアラインメントを参照することによって理解することができる。本明細書に特に開示されていないプレニルトランスフェラーゼ配列を用いてさらなるアラインメントを生成することができ、このようなアラインメントを使用して、本発明を考慮して新しいプレニルトランスフェラーゼ変異体を理解し生成することができることが理解される。いくつかの実施の態様において、このアラインメントは標的アミノ酸の近傍における共通のアミノ酸または類似のアミノ酸を理解することを可能にし得、これらのアミノ酸は鋳型配列と標的配列との間にある程度の同一性または類似性を有する「配列モチーフ」と見なし得る。これらの配列モチーフを用いて、変異体アミノ酸が位置するプレニルトランスフェラーゼ配列の部分、およびモチーフ中に存在し得る変異のタイプを記載することができる。
【００５６】
場合によっては、鋳型配列中のアミノ酸モチーフと標的配列との間の配列同一性を理解するために、Basic Local Alignment Search Tool（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズムを使用することが有益であり得る。したがって、好ましい実施の態様において、ＢＬＡＳＴを用いて鋳型と標的タンパク質との間のアミノ酸のより短い伸長（例えば、配列モチーフ）の同一性を同定または理解する。ＢＬＡＳＴは、２つの配列間の短い一致の位置を特定することによりＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを近似する発見的手法を用いて、類似した配列を見つける。（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズムは、ある閾値を上回るクエリ配列に類似するライブラリ配列を識別できる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して２つ以上の配列の関連性を決定するための例示的なパラメータは例えば、以下に記載されるとおりであり得る。簡単に言えば、アミノ酸配列アラインメントは、ＢＬＡＳＴＰバージョン２．０．８（Ｊａｎ−０５−１９９９）および以下のパラメータ：Matrix: 0 BLOSUM62; gap open: 11; gap extension: 1; x_dropoff: 50; expect: 10.0; wordsize: 3; filter: onを用いて実施し得る。核酸配列アラインメントは、ＢＬＡＳＴＮバージョン２．０．６（Ｓｅｐｔ−１６−１９９８）および以下のパラメータ：Match：1; mismatch:-2; gap open: 5; gap extension: 2; x_dropoff: 50; expect: 10.0; wordsize: 11; filter: offを用いて実施し得る。当業者ならば、例えば、比較の厳密さを増加または減少させ、二つ以上の配列の関連性を判定するために、上記のパラメータをどのように修正し得るかわかるであろう。
【００５７】
図５は、配列番号１（Streptomyces antibioticus ＡＱＪ２３＿４０４２５）と他のプレニルトランスフェラーゼホモログ（配列番号２〜１５）とのアラインメントを示す。これらのホモログは、ＢＬＡＳＴ検索によって見出され、配列番号１に対する配列同一性は８８．９％〜５０．８％であった（配列番号２〜１５）。細胞溶解物中のＯＬＡおよびＧＰＰに対する活性についてホモログを試験した。低いが測定可能な活性が１５個全てのホモログにおいて同定され、観察された中で配列番号１が最も活性が高かった。観察された野生型ホモログの活性の低さは、既に述べたＫｕｍａｎｏの報告と一致する。
【００５８】
いくつかの実施形態では、変異体を作製するために１つ以上の変異（本明細書では突然変異または置換とも呼ばれる）が導入されるプレニルトランスフェラーゼ鋳型は、配列番号１に対して５０％以上の同一性、６０％以上の同一性、６５％以上の同一性、７０％以上の同一性、７５％以上の同一性、８０％以上の同一性、８５％以上の同一性、８７．５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９２．５％以上の同一性、または９５％以上の同一性を有するプレニルトランスフェラーゼ配列である。他の実施形態では、プレニルトランスフェラーゼ鋳型は、配列番号２〜１５のいずれか、好ましくは配列番号１または配列番号１５である。プレニルトランスフェラーゼ鋳型の変異体として、好ましくは、本明細書中に記載される（ｉ）Ｑ１５９Ｈおよび（ｉｉ）Ｑ２９３Ｗ、Ｑ２９３Ｈ、Ｑ２９３Ｃ、Ｑ２９３Ａ、Ｑ２９３Ｓ、Ｑ２９３Ｖ、Ｑ２９３Ｄ、Ｑ２９３Ｙ、またはＱ２９３Ｅ変異が少なくとも挙げられ、または、より好ましくは、本明細書に記載される（ｉ）Ｑ１５９Ｈおよび（ｉｉ）Ｑ２９３Ｗ変異が挙げられる。
【００５９】
野生型プレニルトランスフェラーゼ鋳型配列中の特定のアミノ酸の位置に関して、１つ以上のアミノ酸変異を記載することができる。変異体アミノ酸で置換された場合に所望の活性および位置選択性を提供する鋳型中の位置の同定は、本明細書中に記載されるような試験方法によって決定できる。
【００６０】
例えば、プレニルトランスフェラーゼ鋳型配列番号１において、Ｓ４９、Ｆ１２１、Ｔ１２４、Ｑ１５９、Ｓ１７５、Ｓ２１２、Ｉ２３２、Ｔ２６７、Ｌ２６８、Ａ２８５、Ｙ２８６、Ｑ２９３、およびＦ３００の位置の１つ以上が、その位置で野生型アミノ酸とは異なるアミノ酸での置換に供され得る。
【００６１】
しかしながら、他のプレニルトランスフェラーゼ鋳型では、置換する標的アミノ酸の位置は異なっていてもよいが、本明細書中の基準鋳型である配列番号１について同定された位置に対応する。例えば、配列番号１とは異なるプレニルトランスフェラーゼ配列において、標的アミノ酸は、特定のアミノ酸変動位置に基づいて、１０〜−１の範囲、または＋１〜＋１０の範囲でシフトされ得る。例えば、ガイドとして図５のアラインメントを使用して、配列番号１のアミノ酸位置１５９は配列番号２の位置１６１に対応し、配列番号１のアミノ酸位置２９３は、配列番号２の位置２９５に対応する。いくつかの場合において、このシフトは、配列番号１に整列される配列の長さに沿って変化し得る。例えば、シフトは、整列配列中のアミノ酸の第１のストレッチの後に増加または減少し得、次いで、整列配列中のアミノ酸の第２のストレッチの後に増加または減少し得る、などである。シフトのシフトは、鋳型と、タンパク質の長さに沿って整列した配列との間のギャップによって決定され得る。
【００６２】
プレニルトランスフェラーゼの酵素活性を試験するために、公知の方法を使用することができ、このような方法は、プレニルトランスフェラーゼ変異体酵素の活性を試験するためにも使用することができる。概して、プレニルトランスフェラーゼ変異体（精製または細胞溶解物または細胞抽出物）、ゲラニルピロリン酸およびオリベトール酸（基質）を含むインビトロ反応組成物では、基質を生成物ゲラニル−オリベトレート（例えば、ＧＯＬＡ）に変換することができる。ここで特に興味深いのは、ゲラニルピロリン酸およびオリベトール酸のＣＢＧＡへの変換である。添付の図面を参照されたい。
【００６３】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される１つ以上の変異体アミノ酸を有する非天然プレニルトランスフェラーゼは、野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、または少なくとも２０倍の速度での、ゲラニルピロリン酸およびオリベトール酸からのカンナビゲロール酸の生成を酵素的に実現することが可能である。野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して、約３００倍以上のオーダーの速度で、ゲラニルピロリン酸およびオリベトール酸からカンナビゲロール酸を生成するという極めて高い活性を示す変異体も同定された。例えば、野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して、ゲラニルピロリン酸およびオリベトール酸からのカンナビゲロール酸の生成速度の増大は、精製されたプレニルトランスフェラーゼ変異体を使用するインビトロ酵素反応において決定されるように、約２×〜約３００×、約５×〜約３００×、または約１０×〜約３００×であり得る。
【００６４】
本開示の１つ以上の変異体アミノ酸を有する非天然プレニルトランスフェラーゼは、野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）およびジバリノール酸（ＤＶＡ）からのカンナビゲロバリン酸（ＣＢＧＶＡ）の生成、またはゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）およびオルセリン酸（ＯＳＡ）からのカンナビゲロルシン酸（ＣＢＧＯＡ）の生成を、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、または少なくとも２０倍の速度で酵素的に実現可能である。
【００６５】
例えば、野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して、ＧＰＰおよびＤＶＡからのＣＢＧＶＡの生成速度の増大は、約２×〜約４５０×、約５×〜約４００×、または約１０×〜約３７５×であり得る。野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して、ＧＰＰおよびＯＳＡからのＣＢＧＯＡの生成速度の増大は、約２×〜約６００×、約５×〜約５７５×、または約１０×〜約５５０×であり得る。
【００６６】
本開示の１つ以上の変異体アミノ酸を有する非天然プレニルトランスフェラーゼは、野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）およびジバリノール酸（ＤＶＡ）からのカンナビゲロバリン酸（ＣＢＧＶＡ）の生成、またはゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）およびオルセリン酸（ＯＳＡ）からのカンナビゲロルシン酸（ＣＢＧＯＡ）の生成を、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、または少なくとも２０倍の速度で酵素的に実現可能である。
【００６７】
例えば、野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して、ＧＰＰおよびＤＶＡからのＣＢＧＶＡの生成速度の増大は、約２×〜約４５０×、約５×〜約４００×、または約１０×〜約３７５×であり得る。野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して、ＧＰＰおよびＯＳＡからのＣＢＧＯＡの生成速度の増大は、約２×〜約６００×、約５×〜約５７５×、または約１０×〜約５５０×であり得る。
【００６８】
本開示の１つ以上の変異体アミノ酸を有する非天然プレニルトランスフェラーゼは、野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して、ゲラニルピロリン酸および５−アルキルベンゼン−１，３−ジオール（例えば、オリベトール）からの２−プレニル化５−アルキルベンゼン−１，３−ジオール（例えば、ＣＢＧ；２−ＧＯＬ）の生成を、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、または少なくとも２０倍の速度で酵素的に実現可能である。
【００６９】
例えば、野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して、ＧＰＰおよびオリベトールからのＣＢＧの生成速度の増大は、約２×〜約２００×、約５×〜約１７５×、または約１０×〜約１５０×であり得る。
【００７０】
酵素活性の少なくとも２倍の増大を、プレニルトランスフェラーゼ変異体を発現する細菌からの、またはプレニルトランスフェラーゼ変異体の精製された調製物（例えば、細胞溶解物から精製された）からの細胞溶解物を使用するインビトロ反応において見ることができる。多くの変異体について、精製された調製物は細胞溶解物よりも増大した酵素活性を示すことが観察された。これは、いくつかの細胞溶解物において、プレニルトランスフェラーゼが不溶性、または酵素活性を低下させる他の事象に悩まされ得ることを示す。したがって、精製プレニルトランスフェラーゼ調製物は、酵素アッセイにおいて等量のプレニルトランスフェラーゼを制御する、対応する細胞溶解物よりも、２倍、５倍、１０倍、またはさらに２０倍の酵素活性の向上を示し得る。
【００７１】
精製プレニルトランスフェラーゼ調製物を用いて、ＣＢＧＡの生成速度を決定することができる。速度は、μＭ ＣＢＧＡ／分／μＭ酵素で表すことができる。反応条件は、以下の通りである。１ｍＭゲラニルピロリン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および１ｍＭオリベトール酸（Santa Cruz Biotechnology）および５ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５緩衝液。精製フェニルトランスフェラーゼの添加により反応を開始させ、次いで０．５〜２時間の測定期間インキュベートし、アセトニトリルで６５％の最終濃度までクエンチし、次いで遠心分離してペレット変性タンパク質を得る。上清を、ＣＢＧＡ（３−ＧＯＬＡ）および５−ＧＯＬＡのＧＣＭＳ分析のために９６ウェルプレートに移す。
【００７２】
同様に、精製されたプレニルトランスフェラーゼ変異体調製物を使用して、ゲラニルピロリン酸およびオルセリン酸（ＯＳＡ）からのカンナビゲロルシン酸（ＣＢＧＯＡ）の生成速度（図７Ａおよび７Ｂを参照）、ならびにオリベトールおよびゲラニルピロリン酸からのカンナビゲロール（ＣＢＧ）の生成速度（図８を参照）と同様に、ゲラニルピロリン酸およびジバリノール酸（ＤＶＡ）からのカンナビゲロバリン酸（ＣＢＧＶＡ）の生成速度を類似の方法で決定できる。
【００７３】
実施形態では、フェニルトランスフェラーゼ変異体が、０．００５μＭ  ＣＢＧＡ／分／μΜ酵素を超える、約０．０１０μＭ  ＣＢＧＡ／分／μΜ酵素を超える、約０．０２０μＭ  ＣＢＧＡ／分／μΜ酵素を超える、約０．０５０μＭ  ＣＢＧＡ／分／μΜ酵素を超える、約０．１００μＭ  ＣＢＧＡ／分／μΜ酵素を超える、約０．２５０μＭ  ＣＢＧＡ／分／μΜ酵素を超える、約０．５００μＭ  ＣＢＧＡ／分／μΜ酵素を超える、例えば、約０．００５μＭまたは０．０１０μＭ〜約１．２５０μＭのＣＢＧＡ／分／μＭ酵素の範囲、または約０．０２０μＭ〜約１．０μＭのＣＢＧＡ／分／μＭ酵素の範囲にある、ＣＢＧＡの生成速度を提供する。
【００７４】
実施形態において、フェニルトランスフェラーゼ変異体は、本明細書に記載の速度のいずれかに従って、ＤＶＡおよびＧＰＰからのＣＢＧＶＡ、ＯＳＡおよびＧＰＰからのＣＢＧＯＡ、またはオリベトールおよびＧＰＰからのＣＢＧの生成速度を提供する。
【００７５】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される１つ以上の変異体アミノ酸を有する非天然プレニルトランスフェラーゼは、３-ゲラニルオリベトレート（ＣＢＧＡ；３−ＧＯＬＡ）への位置選択性を酵素的に提供し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の変異体アミノ酸を有する非天然プレニルトランスフェラーゼは、精製されたプレニルトランスフェラーゼ変異体を用いたインビトロ酵素反応で決定されるように、総ゲラニルオリベトレート（３−ＧＯＬＡ＋５−ＧＯＬＡ）における３−ゲラニル−オリベトレート（ＣＢＧＡ；３−ＧＯＬＡ）に対する、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上、９９．９５％以上、または１００％の量の位置選択性を示す。したがって、ゲラニル−オリベトール反応生成物のうち、５−ＧＯＬＡは、１０重量％未満、９重量％未満、８重量％未満、７重量％未満、６重量％未満、５重量％未満、４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満、１重量％未満、０．８重量％未満、０．６重量％未満、０．５重量％未満、０．４重量％未満、０．３重量％未満、０．２重量％未満、０．１重量％未満、０．０５重量％未満、または０．０重量％の量である。プレニルトランスフェラーゼ変異体の改善された位置選択性を考慮して、本開示はまた、所望のカンナビノイドおよびその誘導体を濃縮した組成物を提供する。特に、本開示は、ＣＢＧＡ(３−ＧＯＬＡ）および／またはＣＢＧを濃縮した組成物を提供する。濃縮された組成物として、医薬組成物であるもの、ならびに、非医薬目的に使用されるもの、例えば、本明細書に記載されるような９０％以上の３−ＧＯＬＡを含むもの、または、本明細書の他の場所に記載されるような提供される基質（例えば、オリベトール、オリベトール酸など）に依存する他の所望の誘導体を含むものが挙げられる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される１つ以上の変異体アミノ酸を有する非天然プレニルトランスフェラーゼは、ゲラニルピロリン酸およびオリベトール酸からのカンナビゲロール酸の生成速度が、本明細書に記載される量のいずれかにおいて増大することを示し、本明細書に記載される量のいずれかである位置選択性を示す。
【００７６】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される１つ以上の変異体アミノ酸を有する非天然プレニルトランスフェラーゼは、ＧＰＰおよびＯＳＡを反応させた後に形成されるカンナビゲロルシン酸（ＣＢＧＯＡ）の異性体である３−ゲラニルオルセリナート（３−ＧＯＳＡ）への位置選択性を酵素的に提供することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の変異体アミノ酸を有する非天然プレニルトランスフェラーゼは、精製されたプレニルトランスフェラーゼ変異体を用いたインビトロ酵素反応で決定されるように、３−ＧＯＳＡに対する、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上、９９．９５％以上、または１００％の量の位置選択性を示す。
【００７７】
したがって、ゲラニル−オルセリナート反応生成物のうち、５−ＧＯＳＡは、１０重量％未満、９重量％未満、８重量％未満、７重量％未満、６重量％未満、５重量％未満、４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満、１重量％未満、０．８重量％未満、０．６重量％未満、０．５重量％未満、０．４重量％未満、０．３重量％未満、０．２重量％未満、０．１重量％未満、０．０５重量％未満、または０．０重量％である。プレニルトランスフェラーゼ変異体の改善された位置選択性を考慮して、本開示はまた、３−ＧＯＳＡが濃縮された組成物およびその誘導体、例えば、本明細書に記載される９０％以上の３−ＧＯＳＡを有する医薬組成物および非医薬組成物、またはその他の所望の誘導体を提供する。
【００７８】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される１つ以上の変異体アミノ酸を有する非天然プレニルトランスフェラーゼは、オリベトールおよびＧＰＰを反応させた後に形成される４−ＧＯＬ異性体の代わりに、カンナビゲロール（ＣＢＧ；２−ＧＯＬ）への位置選択性を酵素的にもたらし得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の変異体アミノ酸を有する非天然プレニルトランスフェラーゼは、精製されたプレニルトランスフェラーゼ変異体を使用するインビトロ酵素反応において決定されるように、総カンナビゲロール異性体（２−ＧＯＬ＋４−ＧＯＬ）のうち２−ＧＯＬに対して、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上、９９．９５％以上または１００％の量の位置選択性を示す。
【００７９】
したがって、ＧＰＰ−オリベトール反応生成物のうち、４−ＧＯＬは、１０重量％未満、９重量％未満、８重量％未満、７重量％未満、６重量％未満、５重量％未満、４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満、１重量％未満、０．８重量％未満、０．６重量％未満、０．５重量％未満、０．４重量％未満、０．３重量％未満、０．２重量％未満、０．１重量％未満、０．０５重量％未満、または０．０重量％である。プレニルトランスフェラーゼ変異体の改善された位置選択性を考慮して、本開示はまた、２−ＧＯＬを濃縮した組成物、およびその誘導体、例えば、本明細書中に記載される９０％以上の２−ＧＯＬを有する医薬組成物および非医薬組成物、またはその他の所望の誘導体を提供する。
【００８０】
本開示の非天然プレニルトランスフェラーゼは、野生型プレニルトランスフェラーゼ鋳型配列からの、１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、または５つを超えるアミノ酸変異を含み得る。変異は、本明細書中に記載される任意の単一の変異または変異の組み合わせであり得る。本明細書中に記載されるもの以外の任意の変異体を、本明細書中に記載される任意の単一の変異または変異の組み合わせとともに用いることができ、当該任意の変異体は、プレニルトランスフェラーゼ変異体の所望の活性に有害ではないものである。任意の変異の例として、タンパク質特性を著しく変化させない保存的アミノ酸置換などの変異が挙げられる。
図６は、（ａ）野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して少なくとも２倍の速度でゲラニルプロリン酸およびオリベトール酸からカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）を生成するという酵素活性、または（ｂ）ＣＢＧＡ（３−ＧＯＬＡ）に対する５０％以上の位置選択性、または（ａ）および（ｂ）の両方を示すアミノ酸突然変異の位置を列挙する。突然変異は、配列番号１におけるアミノ酸位置の番号付けを参照して記載される。しかし、１つ以上の変異を、記載された位置で配列番号１に、または対応するアミノ酸位置で他のプレニルトランスフェラーゼホモログに導入して、所望の活性および／または位置選択性を有する変異体を得ることができる。図５に示されるアラインメント、または配列番号１を有する任意の他の可溶性プレニルトランスフェラーゼ配列のアラインメントは、所望の鋳型配列に１つ以上の変異を導入するためのガイドとして用いることができる。
【００８１】
変異誘発法の結果、プレニルトランスフェラーゼ鋳型に沿った多数のアミノ酸変異が、野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して少なくとも２倍の速度での、ゲラニル二リン酸とオリベトール酸からのカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）の生成、または（ｂ）ＣＢＧＡ（３−ＧＯＬＡ）に対する５０％以上の位置選択性、または（ａ）と（ｂ）の両方を示すことが明らかになった。
【００８２】
表１および表２に、野生型プレニルトランスフェラーゼと比較して、（ａ）少なくとも２倍の速度での、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）およびオリベトール酸からのカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）の生成、（ｂ）ＧＰＰおよびジバリノール酸（ＤＶＡ）からのカンナビゲロバリン酸（３−ＧＤＶＡ）の生成、（ｃ）ＧＰＰおよびオルセリン酸（ＯＳＡ）からのカンナビゲロルシン酸 （３−ＧＯＳＡおよび５−ＧＯＳＡ）の生成、および（ｄ）オリベトールおよびＧＰＰからのＣＢＧ（２−ＧＯＬ）の生成という酵素活性を示すアミノ酸突然変異の位置を列挙する。表１および表２のデータは、ＣＤＢＡ（３−ＧＯＬＡ）、３−ＧＤＶＡ、３−ＧＯＳＡ、およびＣＢＧ（２−ＧＯＬ）に対する位置選択性も反映している。突然変異は、配列番号１または配列番号２におけるアミノ酸位置の番号付けを参照して記載される。図５に示されるアラインメントと組み合わせて使用される、この表に示される変異体の位置および同一性を用いて、配列番号１または２とアラインメントされ得る任意の他の可溶性プレニルトランスフェラーゼ配列に変異体アミノ酸を導入することができる。
【００８３】
実施形態では、非天然プレニルトランスフェラーゼは、参照鋳型である配列番号１に基づいているか、あるいは、配列番号１に対して５０％以上の同一性、６０％以上の同一性、６５％以上の同一性、７０％以上の同一性、７５％以上の同一性、８０％以上の同一性、８５％以上の同一性、８７．５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９２．５％以上の同一性、または９５％以上の同一性を有し、配列番号１のアミノ酸配列を参照して４９、１２１、１２４、１５９、１７５、２１２、２３２、２６７、２６８、２８５、２８６、２９３、および３００からなる群より選択される位置に１つ以上のアミノ酸変異を有する。前述のように、本明細書中に記載される位置は、そのように明示的に記載されていなくても、配列番号１のアミノ酸配列を参照するものである。
【００８４】
他の実施形態では、プレニルトランスフェラーゼ鋳型は、対応する位置にこれらの変異を含む、配列番号２〜１５のいずれか、またはそのホモログである。例えば、配列番号２において、変異位置はこれらの位置から＋２シフトされ、したがって、配列番号２は、配列番号１のアミノ酸配列を参照して、５１、１２３、１２６、１６１、１７７、２１４、２３４、２６９、２７０、２８７、２８８、２９５、および３０２からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸変異を有し得る。別の実施例として、配列番号１５において、変異位置はタンパク質の長さに沿って異なる量、シフトされる（すなわち、０（第１のストレッチ）、＋１（第２のストレッチ）、＋２（第３のストレッチ）、＋８（第４のストレッチ）、および＋４（第５のストレッチ））。アラインメントに基づいて、配列番号１５は、配列番号１のアミノ酸配列を参照して、４９、１２２、１２５、１６１、１７７、２１４、２４０、２７１、２７２、２８９、２９０、２９７、および３０４からなる群より選択される位置に１つ以上のアミノ酸変異を有し得る。
【００８５】
実施形態において、非天然プレニルトランスフェラーゼは、参照鋳型である配列番号１に基づいているか、あるいは、配列番号１に対する５０％以上の同一性、６０％以上の同一性、６５％以上の同一性、７０％以上の同一性、７５％以上の同一性、８０％以上の同一性、８７．５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９２．５％以上の同一性、または９５％以上の同一性を有し、Ｓ４９Ｔ、Ｆ１２１Ｌ、Ｔ１２４Ｒ、Ｑ１５９Ｈ、Ｑ１５９Ｒ、Ｑ１５９Ｓ、Ｑ１５９Ｔ、Ｑ１５９Ｙ、Ｑ１５９Ａ、Ｑ１５９Ｆ、Ｑ１５９Ｇ、Ｑ１５９Ｉ、Ｑ１５９Ｋ、Ｑ１５９Ｌ、Ｑ１５９Ｍ、Ｑ１５９Ａ、Ｓ１７５Ｈ、Ｓ１７５Ｋ、Ｓ１７５Ｒ、Ｓ２１２Ｈ、Ｉ２３２Ｈ、Ｔ２６７Ｗ、Ｌ２６８Ｙ、Ａ２８５Ｙ、Ｙ２８６Ａ、Ｙ２８６Ｆ、Ｙ２８６Ｌ、Ｙ２８６Ｍ、Ｙ２８６Ｐ、Ｙ２８６Ｔ、Ｙ２８６Ｖ、Ｑ２９３Ｆ、Ｑ２９３Ｗ、Ｑ２９３Ｈ、Ｑ２９３Ｃ、Ｑ２９３Ａ、Ｑ２９３Ｓ、Ｑ２９３Ｖ、Ｑ２９３Ｄ、Ｑ２９３Ｙ、Ｑ２９３Ｅ、Ｑ２９３Ｉ、Ｑ２９３Ｍ、Ｑ２９３Ｔ、およびＦ３００Ｋからなる群より選択される位置における１つ以上のアミノ酸変異を有する。
【００８６】
他の実施形態では、プレニルトランスフェラーゼ鋳型は、対応する位置にこれらの変異を含む配列番号２〜１５のいずれか、またはそのホモログである。例えば、配列番号２において、変異位置は、これらの位置から＋２シフトしている。したがって、配列番号２、または配列番号２に対して同一性を有する配列（例えば、本明細書中で説明したように、５０％以上９５％以下、あるいはそれ以上）は、Ｓ５１Ｔ、Ｆ１２３Ｌ、Ｔ１２６Ｒ、Ｑ１６１Ｈ、Ｑ１６１Ｒ、Ｑ１６１Ｓ、Ｑ１６１Ｔ、Ｑ１６１Ｙ、Ｑ１６１Ａ、Ｑ１６１Ｆ、Ｑ１６１Ｇ、Ｑ１６１Ｉ、Ｑ１６１Ｋ、Ｑ１６１Ｌ、Ｑ１６１Ｍ、Ｑ１６１Ａ、Ｓ１７７Ｈ、Ｓ１７７Ｋ、Ｓ１７７Ｒ、Ｓ２１４Ｈ、Ｉ２３４Ｈ、Ｔ２６９Ｗ、Ｌ２７０Ｙ、Ａ２８７Ｙ、Ｙ２８８Ａ、Ｙ２８８Ｆ、Ｙ２８８Ｌ、Ｙ２８８Ｍ、Ｙ２８８Ｐ、Ｙ２８８Ｔ、Ｙ２８８Ｖ、Ｑ２９５Ｆ、Ｑ２９５Ｗ、Ｑ２９５Ｈ、Ｑ２９５Ｃ、Ｑ２９５Ａ、Ｑ２９５Ｓ、Ｑ２９５Ｖ、Ｑ２９５Ｄ、Ｑ２９５Ｙ、Ｑ２９５Ｅ、Ｑ２９５Ｉ、Ｑ２９５Ｍ、Ｑ２９５Ｔ、およびＦ３０３Ｋからなる群より選択される位置における１つ以上のアミノ酸変異を有する。
【００８７】
したがって、本明細書中のそれぞれの鋳型について明確に意図されるように、非天然プレニルトランスフェラーゼは、鋳型である配列番号２〜１５のいずれか１つに基づいているか、あるいは、配列番号２〜１５のいずれか１つに対して５０％以上の同一性、６０％以上の同一性、６５％以上の同一性、７０％以上の同一性、７５％以上の同一性、８０％以上の同一性、８５％以上の同一性、８７．５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９２．５％以上の同一性、または９５％以上の同一性を有し、配列番号１について列挙される位置に対応する位置からなる群より選択される位置に１つ以上のアミノ酸変異を有する。
【００８８】
実施形態において、非天然プレニルトランスフェラーゼは、鋳型である配列番号１に基づいているか、あるいは、配列番号１に対して５０％以上の同一性、６０％以上の同一性、６５％以上の同一性、７０％以上の同一性、７５％以上の同一性、８０％以上の同一性、８５％以上の同一性、８７．５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９２．５％以上の同一性、または９５％以上の同一性を有し、（ｉ）Ｑ１５９Ａおよび（ｉｉ）Ｑ２９３Ｆ、Ｑ２９３Ｍ、Ｑ２９３Ｆ、Ｑ２９３Ｆ；（ｉ）Ｑ１５９Ｆおよび（ｉｉ）Ｑ２９３Ｆ、Ｑ２９３Ｗ、またはＱ２９３Ｈ；（ｉ）Ｑ１５９Ｇおよび（ｉｉ）Ｑ２９３Ｆ；（ｉ）Ｑ１５９Ｈおよび（ｉｉ）Ｑ２９３Ｗ、Ｑ２９３Ｈ、Ｑ２９３Ｃ、Ｑ２９３Ａ、Ｑ２９３Ｓ、Ｑ２９３Ｖ、Ｑ２９３Ｄ、Ｑ２９３Ｙ、またはＱ２９３Ｅ；（ｉ）Ｑ１５９Ｉまたは（ｉｉ）Ｑ２９３Ｆ；（ｉ）Ｑ１５９Ｋおよび（ｉｉ）Ｑ２９３ＶまたはＱ２９３Ｖ；（ｉ）Ｑ１５９Ｌおよび（ｉｉ）Ｑ２９３ＷまたはＱ２９３Ｆ；（ｉ）Ｑ１５９Ｍおよび（ｉｉ）Ｑ２９３ＦまたはＱ２９３Ｗ；（ｉ）Ｑ１５９Ｒおよび（ｉｉ）Ｑ２９３Ｖ、Ｑ２９３Ｍ、またはＱ２９３Ｔ；（ｉ）Ｑ１５９Ｓおよび（ｉｉ）Ｙ２８６Ｉ；および（ｉ）Ｓ１７５Ｈおよび（ｉｉ）Ｑ２９３Ｖからなる群より選択される位置における２つ以上のアミノ酸変異を有する。
【００８９】
他の実施形態では、プレニルトランスフェラーゼ鋳型は、対応する位置にこれらの変異を含む配列番号２〜１５のいずれか、またはそのホモログである。例えば、配列番号２において、変異位置は、これらの位置から＋２シフトしている。したがって、各鋳型について明確に意図されるように、非天然プレニルトランスフェラーゼは、鋳型である配列番号２〜１５のいずれか一つに基づいているか、あるいは、配列番号２〜１５から選択される鋳型に対して、５０％以上の同一性、６０％以上の同一性、６５％以上の同一性、７０％以上の同一性、７５％以上の同一性、８０％以上の同一性、８５％以上の同一性、８７．５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９２．５％以上の同一性、または９５％以上の同一性を有し、（ｉ）Ｑ１５９Ａおよび（ｉｉ）Ｑ２９３Ｆ、Ｑ２９３Ｍ、Ｑ２９３Ｆ、Ｑ２９３Ｆ；（ｉ）Ｑ１５９Ｆおよび（ｉｉ）Ｑ２９３Ｆ、Ｑ２９３Ｗ、またはＱ２９３Ｈ；（ｉ）Ｑ１５９Ｇおよび（ｉｉ）Ｑ２９３Ｆ；（ｉ）Ｑ１５９Ｈおよび  （ｉｉ）Ｑ２９３Ｗ、Ｑ２９３Ｈ、Ｑ２９３Ｃ、Ｑ２９３Ａ、Ｑ２９３Ｓ、Ｑ２９３Ｖ、Ｑ２９３Ｄ、Ｑ２９３Ｙ、またはＱ２９３Ｅ；（ｉ）Ｑ１５９Ｉおよび（ｉｉ）Ｑ２９３Ｆ；（ｉ）Ｑ１５９Ｋおよび（ｉｉ）Ｑ２９３ＶまたはＱ２９３Ｖ；  （ｉ）Ｑ１５９Ｌおよび（ｉｉ）Ｑ２９３ＷまたはＱ２９３Ｆ；（ｉ）Ｑ１５９Ｍおよび（ｉｉ）Ｑ２９３ＦまたはＱ２９３Ｗ；（ｉ）Ｑ１５９Ｒおよび（ｉｉ）Ｑ２９３Ｖ、Ｑ２９３Ｍ、またはＱ２９３Ｔ；（ｉ）Ｑ１５９Ｓおよび（ｉｉ）Ｙ２８６Ｉ；および（ｉ）Ｓ１７５Ｈおよび（ｉｉ）Ｑ２９３Ｖからなる群より選択される位置における２つ以上のアミノ酸変異を有する。
【００９０】
実施形態では、非天然プレニルトランスフェラーゼは、鋳型である配列番号１に基づいているか、あるいは、配列番号１に対して５０％以上の同一性、６０％以上の同一性、６５％以上の同一性、７０％以上の同一性、７５％以上の同一性、８０％以上の同一性、８５％以上の同一性、８７．５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９２．５％以上の同一性、または９５％以上の同一性を有し、（ｉ）Ｑ１５９Ｈ、（ｉｉ）Ｙ２８６Ａ、および（ｉｉｉ）Ｑ２９３Ｆ、Ｑ２９３Ｍ、またはＱ２９３Ｖ；（ｉ）Ｑ１５９Ｈ、（ｉｉ）Ｙ２８６Ｉ、および（ｉｉｉ）Ｑ２９３ＭまたはＱ２９３Ｖ；（ｉ）Ｑ１５９Ｈ、（ｉｉ）Ｙ２８６Ｖ、および（ｉｉｉ）Ｑ２９３Ｆ、Ｑ２９３Ｍ、Ｑ２９３Ｖ、またはＱ２９３Ｗ；（ｉ）Ｑ１５９Ｌ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｈ、および（ｉｉｉ）Ｑ２９３Ｆ；（ｉ）Ｓ１７５Ｈ、（ｉｉ）Ｙ２８６Ｖ、および（ｉｉｉ）Ｑ２９３Ｍ；（ｉ）  Ｓ１７５Ｈ、（ｉｉ）Ｙ２８６Ｉ、および（ｉｉｉ）Ｑ２９３ＭまたはＱ２９３Ｖ；（ｉ）Ｑ１５９Ｓ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｈ、および（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ｉ；（ｉ）Ｑ１５９Ｓ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｒ、および（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ｖ；（ｉ）Ｑ１５９Ｓ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｓ、および（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ｉ；および（ｉ）Ｑ１５９Ｓ、（ｉｉ）Ｓ２１２Ｈ、（ｉｉｉ）Ｙ２８６ＡまたはＹ２８６Ｖからなる群より選択される位置における３つ以上のアミノ酸変異を有する。
【００９１】
他の実施形態では、プレニルトランスフェラーゼ鋳型は、対応する位置にこれらの変異を含む配列番号２〜１５のいずれか、またはそのホモログである。例えば、配列番号２において、変異位置は、これらの位置から＋２シフトしている。したがって、本明細書中の各鋳型について明確に意図されるように、非天然プレニルトランスフェラーゼは、鋳型である配列番号２〜１５のいずれかに基づいているか、あるいは、配列番号２〜１５から選択される鋳型に対して、５０％以上の同一性、６０％以上の同一性、６５％以上の同一性、７０％以上の同一性、７５％以上の同一性、８０％以上の同一性、８５％以上の同一性、８７．５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９２．５％以上の同一性、または９５％以上の同一性を有し、（ｉ）Ｑ１５９Ｈ、（ｉｉ）Ｙ２８６Ａ、および（ｉｉｉ）Ｑ２９３Ｆ、Ｑ２９３Ｍ、またはＱ２９３Ｖ；（ｉ）Ｑ１５９Ｈ、（ｉｉ）Ｙ２８６Ｉ、および（ｉｉｉ）Ｑ２９３ＭまたはＱ２９３Ｖ；（ｉ）Ｑ１５９Ｈ、（ｉｉ）Ｙ２８６Ｖ、および（ｉｉｉ）Ｑ２９３Ｆ、Ｑ２９３Ｍ、Ｑ２９３Ｖ、またはＱ２９３Ｗ；（ｉ）Ｑ１５９Ｌ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｈ、および（ｉｉｉ）Ｑ２９３Ｆ；（ｉ）Ｓ１７５Ｈ、（ｉｉ）Ｙ２８６Ｖ、および（ｉｉｉ）Ｑ２９３Ｍ；（ｉ）Ｓ１７５Ｈ、（ｉｉ）Ｙ２８６Ｉ、および（ｉｉｉ）Ｑ２９３ＭまたはＱ２９３Ｖ；（ｉ）Ｑ１５９Ｓ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｈ、および（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ｉ；（ｉ）Ｑ１５９Ｓ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｒ、および（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ｖ；（ｉ）Ｑ１５９Ｓ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｓ、および（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ｉ；および（ｉ）Ｑ１５９Ｓ、（ｉｉ）Ｓ２１２Ｈ、（ｉｉｉ）Ｙ２８６ＡまたはＹ２８６Ｖからなる群より選択される位置における３つ以上のアミノ酸変異を有する。
【００９２】
実施形態において、非天然プレニルトランスフェラーゼは、鋳型である配列番号１に基づいているか、あるいは、配列番号１に対して５０％以上の同一性、６０％以上の同一性、６５％以上の同一性、７０％以上の同一性、７５％以上の同一性、８０％以上の同一性、８５％以上の同一性、８７．５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９２．５％以上の同一性、または９５％以上の同一性を有し、（ｉ）Ｑ１５９Ｈ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｈ、（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ａ、および（ｉｖ）Ｑ２９３Ｖ；（ｉ）Ｑ１５９Ｈ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｈ、（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ｖ、および（ｉｖ）Ｑ２９３ＭまたはＱ２９３Ｖ；（ｉ）Ｑ１５９Ｈ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｒ、（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ｉ、および（ｉｖ）Ｑ２９３Ｍ；（ｉ）Ｑ１５９Ｌ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｋ、（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ａ、および（ｉｖ）Ｑ２９３Ｖ；（ｉ）Ｑ１５９Ｍ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｈ、（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ｖ、および（ｉｖ）Ｑ２９３Ｆ；  （ｉ）Ｑ１５９Ｒ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｈ、（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ｉ、および（ｉｖ）Ｑ２９３Ｑ；（ｉ）Ｑ１５９Ｓ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｈ、（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ｖ、および（ｉｖ）Ｑ２９３Ｆ；（ｉ）Ｑ１５９Ｓ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｋ、（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ｖ、および（ｉｖ）Ｑ２９３Ｖ；および（ｉ）Ｑ１５９Ｓ、（ｉｉ）Ｓ２１２Ｈ、（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ｖ、および（ｉｖ）Ｑ２９３Ｍからなる群より選択される位置における４つ以上のアミノ酸変異を有する。      他の実施形態では、プレニルトランスフェラーゼ鋳型は、対応する位置にこれらの変異を含む配列番号２〜１５のいずれか、またはそのホモログである。例えば、配列番号２において、変異位置は、これらの位置から＋２シフトしている。したがって、本明細書中の各鋳型について明確に意図されるように、非天然プレニルトランスフェラーゼは、鋳型である配列番号２〜１５のいずれか１つに基づいているか、あるいは、配列番号２〜１５から選択される鋳型に対して５０％以上の同一性、６０％以上の同一性、６５％以上の同一性、７０％以上の同一性、７５％以上の同一性、８０％以上の同一性、８５％以上の同一性、８７．５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９２．５％以上の同一性、または９５％以上の同一性を有し、（ｉ）Ｑ１５９Ｈ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｈ、（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ａ、および（ｉｖ）Ｑ２９３Ｖ；（ｉ）Ｑ１５９Ｈ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｈ、（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ｖ、および（ｉｖ）Ｑ２９３ＭまたはＱ２９３Ｖ；（ｉ）Ｑ１５９Ｈ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｒ、（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ｉ、および（ｉｖ）Ｑ２９３Ｍ；（ｉ）Ｑ１５９Ｌ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｋ、（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ａ、および（ｉｖ）Ｑ２９３Ｖ；（ｉ）Ｑ１５９Ｍ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｈ、（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ｖ、および（ｉｖ）Ｑ２９３Ｆ；（ｉ）Ｑ１５９Ｒ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｈ、（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ｉ、および（ｉｖ）Ｑ２９３Ｑ；（ｉ）Ｑ１５９Ｓ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｈ、（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ｖ、および（ｉｖ）Ｑ２９３Ｆ；（ｉ）Ｑ１５９Ｓ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｋ、（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ｖ、および（ｉｖ）Ｑ２９３Ｖ；および（ｉ）Ｑ１５９Ｓ、（ｉｉ）Ｓ２１２Ｈ、（ｉｉｉ）Ｙ２８６Ｖ、および（ｉｖ）Ｑ２９３Ｍからなる群より選択される位置における４つ以上の���ミノ酸変異を有する。
【００９３】
実施形態において、非天然プレニルトランスフェラーゼは、鋳型である配列番号１に基づくか、または配列番号１に対して５０％以上の同一性、６０％以上の同一性、６５％以上の同一性、７０％以上の同一性、７５％以上の同一性、８０％以上の同一性、８５％以上の同一性、８７．５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９２．５％以上の同一性、または９５％以上の同一性を有し、（ｉ）Ｑ１５９Ｈ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｒ、（ｉｉｉ）Ｓ２１２Ｈ、（ｉｖ）Ｙ２８６Ａ、および（ｖ）Ｑ２９３Ｖ；および（ｉ）Ｑ１５９Ｒ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｒ、（ｉｉｉ）Ｓ２１２Ｈ、（ｉｖ）Ｙ２８６Ｉ、および（ｖ）Ｑ２９３Ｍからなる群より選択される位置における５つ以上のアミノ酸変異を有する。
【００９４】
他の実施形態では、プレニルトランスフェラーゼ鋳型は、対応する位置にこれらの変異を含む配列番号２〜１５のいずれか、またはそのホモログである。例えば、配列番号２において、変異位置は、これらの位置から＋２シフトしている。したがって、本明細書中でそれぞれの鋳型について明確に意図されるように、非天然プレニルトランスフェラーゼは、鋳型である配列番号２〜１５のいずれか１つに基づいているか、または配列番号２〜１５から選択される鋳型に対して５０％以上の同一性、６０％以上の同一性、６５％以上の同一性、７０％以上の同一性、７５％以上の同一性、８０％以上の同一性、８５％以上の同一性、８７．５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９２．５％以上の同一性、または９５％以上の同一性を有し、（ｉ）Ｑ１５９Ｈ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｒ、（ｉｉｉ）Ｓ２１２Ｈ、（ｉｖ）Ｙ２８６Ａ、および（ｖ）Ｑ２９３Ｖ；および（ｉ）Ｑ１５９Ｒ、（ｉｉ）Ｓ１７５Ｒ、（ｉｉｉ）Ｓ２１２Ｈ、（ｉｖ）Ｙ２８６Ｉ、および（ｖ）Ｑ２９３Ｍからなる群より選択される位置における５つ以上のアミノ酸変異を有する。
【００９５】
いくつかの実施形態において、非天然プレニルトランスフェラーゼは以下のアミノ酸モチーフ：ＦＸ３Ｍ（配列番号１６）、またはＶＦＸ３ＭＡ(配列番号１７）を含み、ここで、Ｘ３は、配列番号１のＴである。配列番号１のアミノ酸位置４９がＸ３に対応する。
【００９６】
いくつかの実施形態において、非天然プレニルトランスフェラーゼは以下のアミノ酸モチーフ：Ｘ４ＦＰＸ５（配列番号１８）を含み、ここで、Ｘ４はＦまたはＬであり、Ｘ５はＴまたはＲであるが、ただし、単一のモチーフの中では、Ｘ４はＦではなく、Ｘ５はＴではない。配列番号１のアミノ酸位置１２１および１２４はＸ４およびＸ５に対応する。
【００９７】
いくつかの実施形態において、非天然プレニルトランスフェラーゼは以下のアミノ酸モチーフ：ＶＸ６Ｍ（配列番号１９）またはＫＶＸ６ＭＴ(配列番号２０）を含み、ここで、Ｘ６はＨ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、およびＡからなる群より選択される。配列番号１のアミノ酸位置１５９はＸ６に対応する。
【００９８】
いくつかの実施形態において、非天然プレニルトランスフェラーゼは以下のアミノ酸モチーフ：ＦＸ７Ｅ（配列番号２１）またはＹＦＸ７ＥＬ(配列番号２２）を含み、ここで、Ｘ７はＨ、Ｋ、およびＲからなる群より選択される。配列番号１のアミノ酸位置１７５はＸ７に対応する。
【００９９】
いくつかの実施形態において、非天然プレニルトランスフェラーゼは以下のアミノ酸モチーフ：ＦＸ８Ｖ（配列番号２３）またはＳＦＸ８ＶＹ(配列番号２４）を含み、ここで、Ｘ８は、配列番号１のＨである。配列番号１のアミノ酸位置２１２はＸ８に対応する。
【０１００】
いくつかの実施形態では、非天然プレニルトランスフェラーゼは以下のアミノ酸モチーフ：ＶＸ９Ｓ（配列番号２５）またはＡＶＸ９ＳＮ(配列番号２６）を含み、ここで、Ｘ９は配列番号１のＨである。配列番号１のアミノ酸位置２３２はＸ９に対応する。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、非天然プレニルトランスフェラーゼが以下のアミノ酸モチーフ：ＲＸ１０Ｘ１１Ｖ（配列番号２７）を含み、ここで、Ｘ１０はＴまたはＷであり、Ｘ１１はＬまたはＹである。ただし、単一のモチーフの中では、Ｘ１０はＴではなく、Ｘ１１はＬではない。配列番号１のアミノ酸位置２６７および２６８はＸ１０およびＸ１１に対応する。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、非天然プレニルトランスフェラーゼは以下のアミノ酸モチーフ：ＧＸ１２Ｘ１３Ｙ（配列番号２８）を含み、ここで、Ｘ１２はＡまたはＹであり、Ｘ１３はＹ、Ａ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、ＴまたはＶである。ただし、単一のモチーフの中では、Ｘ１２はＡではなく、Ｘ１３はＹではない。配列番号１のアミノ酸位置２８５および２８６は、Ｘ１２およびＸ１３に対応する。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、非天然プレニルトランスフェラーゼは以下のアミノ酸モチーフ：Ｘ１４Ｘ１５Ｒ(配列番号２９）またはＤＸ１４Ｘ１５Ｒ(配列番号３０）を含み、Ｘ１４はＶまたはＩであり、Ｘ１５はＦ、Ｗ、Ｈ、Ｃ、Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｄ、Ｙ、Ｅ、Ｉ、Ｍ、またはＴである。配列番号１のアミノ酸位置２９２および２９３はＸ１４およびＸ１５に対応する。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、非天然プレニルトランスフェラーゼは以下のアミノ酸モチーフ：ＡＸ１６Ｄ（配列番号３１）またはＫＡＸ１６Ｄ（配列番号３２）を含み、ここで、Ｘ１６はＫである。配列番号１のアミノ酸位置３００がＸ１６に対応する。
【０１０５】
他の実施形態では、プレニルトランスフェラーゼ鋳型は、これらのモチーフに関して記載される対応する位置に１つ以上の変異を含む、配列番号１または２〜１５のいずれか、またはそれらのホモログである。上記鋳型は、本明細書中に記載されるモチーフの１つ以上を含み得、配列番号１〜１５から選択される鋳型に対して、５０％以上の同一性、６０％以上の同一性、６５％以上の同一性、７０％以上の同一性、７５％以上の同一性、８０％以上の同一性、８５％以上の同一性、８７．５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９２．５％以上の同一性、または９５％以上の同一性を有し得る。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、（ａ）ＦＸ３Ｍ（配列番号１６）またはＶＦＸ３ＭＡ(配列番号１７）、（ｂ）Ｘ４ＦＰＸ５ （配列番号１８）、（ｃ）ＶＸ６Ｍ（配列番号１９）またはＫＶＸ６ＭＴ（配列番号２０）、（ｄ）ＦＸ７Ｅ（配列番号２１）またはＹＦＸ７ＥＬ（配列番号２２）、（ｅ）ＦＸ８Ｖ（配列番号２３）またはＳＦＸ８ＶＹ（配列番号２４）、（ｆ）ＶＸ９Ｓ（配列番号２５）またはＡＶＸ９ＳＮ（配列番号２６）、（ｇ）ＲＸ１０Ｘ１１Ｖ（配列番号２７）、（ｈ）ＧＸ１２Ｘ１３Ｙ（配列番号２８）、（ｉ）Ｘ１４Ｘ１５Ｒ（配列番号２９）またはＤＸ１４Ｘ１５Ｒ（配列番号２９）および（ｊ）ＡＸ１６Ｄ（配列番号３１）またはＫＡＸ１６Ｄ（配列番号３２）から選択される２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸モチーフであり、ここで、Ｘ３〜Ｘ１６は本明細書中に記載されるとおりである。
【０１０７】
必要に応じて、本開示の非天然プレニルトランスフェラーゼは、本明細書に記載される１つ以上の改変体アミノ酸に加えて、配列番号１に対してＦ２１１Ｎ、Ｆ２１１Ｓ、Ａ２３０Ｓ、Ｇ２８４Ｓ、およびＹ２８６Ｎから選択される位置における１つ以上のアミノ酸変異、または配列番号２に対してＦ２１３Ｎ、Ｆ２１３Ｓ、Ａ２３２Ｓ、Ｇ２８６Ｓ、およびＹ２８８Ｎから選択される位置における１つ以上のアミノ酸変異をさらに含み得る。例えば、Valliere, M.A. et al. (2019) Nature Communications,10;565を参照のこと。
【０１０８】
部位特異的突然変異誘発または配列変更（例えば、部位特異的（site-specific）突然変異誘発またはオリゴヌクレオチド特異的）を用いて、標的プレニルトランスフェラーゼＤＮＡ配列に特定の変更を加えて、所望のアミノ酸置換を有するプレニルトランスフェラーゼをコードする変異体ＤＮＡ配列を提供することができる。一般的には、変異体アミノ酸をコードするコドンを提供する配列を有するオリゴヌクレオチドが使用される。あるいは、置換の標的とされる好ましいプレニルトランスフェラーゼは一般に４００アミノ酸長未満であるので、変異体プレニルトランスフェラーゼＤＮＡ配列の全コード領域の人工遺伝子配列を行うことができる。
【０１０９】
変異体プレニルトランスフェラーゼ配列の生成のために変異原性オリゴヌクレオチドを使用する例示的な技術として、ファージミド中に配置されたプレニルトランスフェラーゼ遺伝子配列を利用し得るＫｕｎｋｅｌ法が含まれる。E. coli中のファージミドは、鋳型上で伸長するプライマーであるオリゴヌクレオチドを用いる突然変異誘発のための鋳型であるプレニルトランスフェラーゼｓｓＤＮＡを産生する。
【０１１０】
プレニルトランスフェラーゼＤＮＡ中の目的の位置に隣接する制限酵素部位に応じて、カセット突然変異誘発を用いて、目的の変異配列を作成することができる。カセット突然変異誘発のために、ＤＮＡフラグメントを合成してプラスミドに挿入し、制限酵素で切断し、次いで、プレニルトランスフェラーゼ変異体突然変異を含む相補的オリゴヌクレオチドのペアに連結する。プラスミドおよびオリゴヌクレオチドの制限フラグメントは、互いに連結され得る。
【０１１１】
変異体プレニルトランスフェラーゼ配列を生成するために使用することができる別の技術は、ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発である。変異原性オリゴヌクレオチドプライマーを用いて所望の変異を導入し、変異配列を有するＰＣＲフラグメントを提供する。さらなるオリゴヌクレオチドを用いて変異フラグメントの末端を伸長させて、制限酵素消化および遺伝子への挿入に適した制限部位を提供することができる。
【０１１２】
部位特異的突然変異誘発技術のための市販のキットも利用可能である。例えば、ＱｕｉｋｃｈａｎｇｅＴＭキットは、相補的突然変異誘発プライマーを使用して、ｐｆｕポリメラーゼのような高信頼度非鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを使用して遺伝子領域をＰＣＲ増幅する。この反応によってニックの入った、弛緩した環状ＤＮＡが生じる。鋳型ＤＮＡは、メチル化ＤＮＡに特異的なＤｐｎＩなどの制限酵素による酵素消化によって除去される。
【０１１３】
発現ベクターは、宿主生物において機能的な発現制御配列に作動可能に連結された、本明細書に例示される核酸をコードする１つ以上の変異体プレニルトランスフェラーゼを含むように構築され得る。提供される微生物宿主生物での使用に適用可能な発現ベクターには、例えば、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソームおよび人工染色体が含まれ、これらには宿主染色体への安定した組み込みのために操作可能なベクターおよび選択配列またはマーカーが含まれる。さらに、発現ベクターは、１つ以上の選択マーカー遺伝子および適切な発現制御配列を含み得る。例えば、抗生物質または毒素に対する耐性を提供する、栄養要求性欠損を補完する、または培養培地中に存在しない重要な栄養素を供給する、選択マーカー遺伝子も含めることができる。発現制御配列は、当技術分野で周知の構成的および誘導性プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどを含むことができる。２つ以上の外因性のコード核酸が同時発現される場合、両方の核酸は、例えば、単一の発現ベクター中に、または別個の発現ベクター中に挿入され得る。単一ベクター発現のために、コード核酸は１つの共通の発現制御配列に操作的に連結され得るか、または異なる発現制御配列（例えば、１つの誘導性プロモーターおよび１つの構成的プロモーター）に連結され得る。代謝経路または合成経路に関与する外因性核酸配列の形質転換は、当技術分野で周知の方法を使用して確認することができる。このような方法として、例えば、ｍＲＮＡのノーザンブロットもしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅のような核酸分析、または遺伝子産物の発現のためのイムノブロット、または導入された核酸配列もしくはその対応する遺伝子産物の発現を試験するための他の適切な分析方法が挙げられる。当業者ならば、外因性核酸は、所望の生成物を産生するのに十分な量で発現されることがわかるし、さらに、公知の方法および本明細書に開示される方法を用いて発現レベルを最適化し、十分な発現を得ることができるとわかる。
【０１１４】
用語「外因性」は、参照される分子または参照される活性が宿主微生物に導入されることを意味することが意図される。この分子は、例えば、宿主染色体への組み込み、またはプラスミドのような非染色体遺伝物質への組み込みによって、導入され得る。したがって、この用語がコード核酸の発現に関して用いられる場合は、当該コード核酸を発現可能な形態で微生物に導入することを指す。生合成活性に関して使用される場合、この用語は、宿主参照生物に導入される活性をいう。供給源は、例えば、宿主微生物への導入後に参照される活性を発現する相同または異種コード核酸であり得る。したがって、「内因性」という用語は宿主中に存在する参照分子または活性を指す。同様に、この用語がコード核酸の発現に関して使用される場合は、微生物内に含まれるコード核酸の発現を指す。用語「異種」が参照種以外の供給源に由来する分子または活性を指すのに対し、「相同」は宿主微生物に由来する分子または活性を指す。したがって、コード核酸の外因性発現は、異種または相同コード核酸のいずれかまたは両方を利用し得る。
【０１１５】
２つ以上の外因性核酸が微生物に含まれる場合、当該２つ以上の外因性核酸は、上記のように、参照されるコード核酸または生合成活性を指すことが理解される。本明細書中に開示されるように、２つ以上の外因性核酸が、別々の核酸分子上、ポリシストロン性核酸分子上、またはそれらの組合せ上で宿主微生物に導入され得、そうした場合でも２つ以上の外因性核酸と見なされることがさらに理解される。例えば、本明細書中に開示されるように、微生物は、所望の経路の酵素またはタンパク質をコードする２つ以上の外因性核酸を発現するように操作され得る。所望の活性をコードする２つの外因性核酸が宿主微生物に導入されるケースでは、２つの外因性核酸は単一の核酸として、例えば、単一のプラスミド上で、または別々のプラスミド上で導入することができ、単一の部位または複数の部位で宿主染色体に組み込むことができ、そうした場合でも２つの外因性核酸と見なされることが理解される。同様に、３つ以上の外因性核酸が任意の所望の組合せで、例えば、単一のプラスミド上で、または別々のプラスミド上で宿主生物に導入され得、単一の部位または複数の部位で宿主染色体に組み込まれ得、そうした場合でも２つ以上の外因性核酸（例えば、３つの外因性核酸）と見なされることが理解される。したがって、参照される外因性核酸または生合成活性の数は、宿主生物に導入される個々の核酸の数ではなく、コード核酸の数または生合成活性の数を指す。
【０１１６】
外因性の変異体プレニルトランスフェラーゼをコードする核酸配列は、当該分野で周知の技術を使用して、宿主細胞に安定にまたは一過性的に導入され得る。上記技術として、結合、エレクトロポレーション、化学的形質転換、形質導入、トランスフェクション、および超音波形質転換が挙げられるが、これらに限定されない。必要に応じて、E. coliまたは他の原核生物細胞における外因性発現のために、真核生物核酸の遺伝子またはｃＤＮＡ中のいくつかの核酸配列はＮ端末ミトコンドリアまたは他の標的化シグナルのような標的化シグナルをコードし得、必要ならこれは、原核生物宿主細胞への変換の前に除去され得る。例えば、ミトコンドリアリーダー配列の除去はE. coliにおける発現の増加をもたらした（Hoffmeister et al., J. Biol. Chem. 280:4329-4338 (2005)）。酵母または他の真核細胞における外因性発現のために、遺伝子をリーダー配列を加えずにサイトゾルで発現させることができ、またはミトコンドリアターゲティングまたは宿主細胞に適した分泌シグナルのような適当なターゲティング配列を加えることにより、ミトコンドリアまたは他のオルガネラにターゲティングし、または分泌の標的とすることができる。したがって、標的配列を除去または含むための核酸配列への適切な改変を外因性核酸配列に組み込んで、望ましい特性を付与することができることが理解される。さらに、遺伝子を、当該分野で周知の技術を用いてコドン最適化に供し、タンパク質の最適化された発現を達成することができる。
【０１１７】
用語「微生物」は、古細菌、細菌または真核生物の領域内に含まれる、微細細胞として存在する任意の生物を意味することを意図する。したがって、この用語は、微細なサイズを有する原核または真核細胞または生物を包含することを意図し、すべての種の細菌、古細菌および真正細菌ならびに酵母および真菌などの真核微生物を包含する。この用語はまた、生化学物質の産生のために培養され得る任意の種の細胞培養物を含む。
【０１１８】
用語「単離された」は、微生物に関して使用される場合、天然では参照される微生物とともにある少なくとも１つの成分から実質的にフリーである生物を意味することが意図される。この用語は、その天然環境では有しているいくつかのまたは全ての成分から除去された微生物を含む。この用語はまた、天然に存在しない環境で有しているいくつかのまたは全ての成分から除去される微生物を含む。
【０１１９】
いくつかの態様において、プレニルトランスフェラーゼ変異体遺伝子は、遺伝子破壊により細胞内に導入される。用語「遺伝子破壊」、またはその文法的等価物は、コードされた遺伝子産物を不活性または弱毒化させる遺伝子改変を意味することを意図する。遺伝的改変は、例えば、遺伝子全体の欠失、転写または翻訳に必要な調節配列の欠失、切断された遺伝子産物をもたらす遺伝子の一部の欠失、またはコードされた遺伝子産物を不活性化または減衰させる種々の突然変異ストラテジーのいずれかであり得る。遺伝子破壊の１つの特に有用な方法は、完全な遺伝子欠失である。これは、遺伝的復帰の発生を減少または排除するからである。遺伝子破壊の表現型への影響はヌル変異であり得、不活性化点突然変異、遺伝子の全欠失、染色体断片または染色体全体の欠失など、多くのタイプの突然変異から生じ得る。特定アンチセンス核酸化合物および酵素阻害剤（例えば、抗生物質）はまた、ヌル変異体表現型を産生し得、したがって、遺伝子破壊と同等である。
【０１２０】
代謝改変は、その天然に存在する状態から変化した生化学反応を指す。したがって、微生物は、代謝ポリペプチドまたはその機能的断片をコードする核酸に対する遺伝子改変を有し得る。例示的な代謝改変が本明細書に開示される。
【０１２１】
本明細書中に提供される微生物は安定した遺伝子改変を含み得、これは改変を失うことなく５世代を超えて培養され得る微生物をいう。一般に、安定した遺伝子改変は１０世代を超えて持続する改変を含み、詳細には、安定した改変は約２５世代を超えて持続し、より詳細には、安定した遺伝子改変は５０世代を超える（無期限を含む）。
【０１２２】
当業者は、遺伝子改変（本明細書に例示される代謝改変を含む）が、適切な宿主生物（E. coliなど）およびそれらの対応する代謝反応、または所望の遺伝物質（所望の代謝経路の遺伝子など）の適切な供給源生物を参照して記載されていることを理解するであろう。しかし、多種多様な生物の完全なゲノム配列決定およびゲノム学の分野における高レベルの技術が与えられるならば、当業者は、本明細書中に提供される教示および案内を、原則的には全ての他の生物に容易に適用し得るであろう。例えば、本明細書に例示されるE. coli代謝改変は、参照される種以外の種由来の同一または類似のコード核酸を組み込むことによって、他の種に容易に適用され得る。このような遺伝的変化として、例えば、一般的に、種のホモログの遺伝子改変が挙げられ、特に、オルソログ、パラログまたは非オルソログ遺伝子置換が挙げられる。
【０１２３】
種々の微生物が、任意に１つ以上の他の導入遺伝子と共に、変異体プレニルトランスフェラーゼを組み込むのに好適であり得る。そのような生物として、原核生物と真核生物の両方が挙げられ、これらは、古細菌および真正細菌を含む細菌、ならびに酵母、植物、昆虫、動物、およびヒトを含む哺乳動物を含む真核生物を含むが、これらに限定されない。例示的な種が米国出願番号１３／９７５，６７８（２０１３年８月２６日出願）で報告されている。当該出願は参照により本明細書に組み込まれ、例えば、Escherichia coli、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces kluyveri、Candida boidinii、Clostridium kluyveri、Clostridium acetobutylicum、Clostridium beijerinckii、Clostridium saccharoperbutylacetonicum、Clostridium perfringens、Clostridium difficile、Clostridium botulinum、Clostridium tyrobutyricum、Clostridium tetanomorphum、Clostridium tetani、Clostridium propionicum、Clostridium aminobutyricum、Clostridium subterminale、Clostridium sticklandii、Ralstonia eutropha、Mycobacterium bovis、Mycobacterium tuberculosis、Porphyromonas gingivalis、Arabidopsis thaliana、Thermus thermophilus、Pseudomonas species（Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas putida、Pseudomonas stutzeri、Pseudomonas fluorescensを含む）、Homo sapiens、Oryctolagus cuniculus、Rhodobacter spaeroides、Thermoanaerobacter brockii、Metallosphaera sedula、Leuconostoc mesenteroides、Chloroflexus aurantiacus、Roseiflexus castenholzii、Erythrobacter、Simmondsia chinensis、Acinetobacter species（Acinetobacter calcoaceticusおよびAcinetobacter baylyiを含む）、Porphyromonas gingivalis、Sulfolobus tokodaii、Sulfolobus solfataricus、Sulfolobus acidocaldarius、Bacillus subtilis、Bacillus cereus、Bacillus megaterium、Bacillus brevis、Bacillus pumilus、Rattus norvegicus、Klebsiella pneumonia、Klebsiella oxytoca、Euglena gracilis、Treponema denticola、Moorella thermoacetica、Thermotoga maritima、Halobacterium salinarum、Geobacillus stearothermophilus、Aeropyrum pernix、Sus scrofa、Caenorhabditis elegans、Corynebacterium glutamicum、Acidaminococcus fermentans、Lactococcus lactis、Lactobacillus plantarum、Streptococcus thermophilus、Enterobacter aerogenes、Candida、Aspergillus terreus、Pedicoccus pentosaceus、Zymomonas mobilus、Acetobacter pasteurians、Kluyveromyces lactis、Eubacterium barkeri、Bacteroides capillosus、Anaerotruncus colihominis、Natranaerobius thermophilusm、Campylobacter jejuni、Haemophilus influenzae、Serratia marcescens、Citrobacter amalonaticus、Myxococcus xanthus、Fusobacterium nuleatum、Penicillium chrysogenum、marine gamma proteobacterium、butyrate-producing bacterium、Nocardia iowensis、Nocardia farcinica、Streptomyces griseus、Schizosaccharomyces pombe、Geobacillus thermoglucosidasius、Salmonella typhimurium、Vibrio cholera、Heliobacter pylori、Nicotiana tabacum、Oryza sativa、Haloferax mediterranei、Agrobacterium tumefaciens、Achromobacter denitrificans、Fusobacterium nucleatum、Streptomyces clavuligenus、Acinetobacter baumanii、Mus musculus、Lachancea kluyveri、Trichomonas vaginalis、Trypanosoma brucei、Pseudomonas stutzeri、Bradyrhizobium japonicum、Mesorhizobium loti、Bos taurus、Nicotiana glutinosa、Vibrio vulnificus、Selenomonas ruminantium、Vibrio parahaemolyticus、Archaeoglobus fulgidus、Haloarcula marismortui、Pyrobaculum aerophilum、Mycobacterium smegmatis MC2 155、Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10、Mycobacterium marinum M、Tsukamurella paurometabola DSM 20162、Cyanobium PCC7001、Dictyostelium discoideum AX4、ならびに本明細書中に開示されるか、または対応する遺伝子の供給源生物として利用可能な他の例示的な種が挙げられる。
【０１２４】
特定の実施形態において、適当な生物として、Acinetobacter baumannii Naval-82、Acinetobacter sp. ADP1、Acinetobacter sp. strain M-1、Actinobacillus succinogenes 130Z、Allochromatium vinosum DSM 180、Amycolatopsis methanolica、Arabidopsis thaliana、Atopobium parvulum DSM 20469、Azotobacter vinelandii DJ、Bacillus alcalophilus ATCC 27647、Bacillus azotoformans LMG 9581、Bacillus coagulans 36D1、Bacillus megaterium、Bacillus methanolicus MGA3、Bacillus methanolicus PB1、Bacillus methanolicus PB-1、Bacillus selenitireducens MLS10 、Bacillus smithii、Bacillus subtilis 、Burkholderia cenocepacia、Burkholderia cepacia、Burkholderia multivorans、Burkholderia pyrrocinia、Burkholderia stabilis、Burkholderia thailandensis E264、Burkholderiales bacterium Joshi_001、Butyrate-producing bacterium L2-50、Campylobacter jejuni、Candida albicans、Candida boidinii、Candida methylica、Carboxydothermus hydrogenoformans、Carboxydothermus hydrogenoformans Z-2901、Caulobacter sp. AP07、Chloroflexus aggregans DSM 9485、Chloroflexus aurantiacus J-10-fl、Citrobacter freundii、Citrobacter koseri ATCC BAA-895、Citrobacter youngae 、Clostridium、Clostridium acetobutylicum、Clostridium acetobutylicum ATCC 824、Clostridium acidurici、Clostridium aminobutyricum、Clostridium asparagiforme DSM 15981、Clostridium beijerinckii 、Clostridium beijerinckii NCIMB 8052、Clostridium bolteae ATCC BAA-613、Clostridium carboxidivorans P7、Clostridium cellulovorans 743B、Clostridium difficile、Clostridium hiranonis DSM 13275、Clostridium hylemonae DSM 15053、Clostridium kluyveri、Clostridium kluyveri DSM 555、Clostridium ljungdahli、Clostridium ljungdahlii DSM 13528、Clostridium methylpentosum DSM 5476 、Clostridium pasteurianum、Clostridium pasteurianum DSM 525、Clostridium perfringens、Clostridium perfringens ATCC 13124、Clostridium perfringens str. 13、Clostridium phytofermentans ISDg、Clostridium saccharobutylicum、Clostridium saccharoperbutylacetonicum、Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4、Clostridium tetani、Corynebacterium glutamicum ATCC 14067、Corynebacterium glutamicum R、Corynebacterium sp. U-96、Corynebacterium variabile、Cupriavidus necator N-1、Cyanobium PCC7001、Desulfatibacillum alkenivorans AK-01、Desulfitobacterium hafniense、Desulfitobacterium metallireducens DSM 15288、Desulfotomaculum reducens MI-1、Desulfovibrio africanus str. Walvis Bay、Desulfovibrio fructosovorans JJ、Desulfovibrio vulgaris str. Hildenborough、Desulfovibrio vulgaris str. 'Miyazaki F'、Dictyostelium discoideum AX4、Escherichia coli、Escherichia coli K-12 、Escherichia coli K-12 MG1655、Eubacterium hallii DSM 3353 、Flavobacterium frigoris、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum ATCC 10953 、Geobacillus sp. Y4.1MC1、Geobacillus themodenitrificans NG80-2、Geobacter bemidjiensis Bem、Geobacter sulfurreducens、Geobacter sulfurreducens PCA、Geobacillus stearothermophilus DSM 2334、Haemophilus influenzae、Helicobacter pylori、Homo sapiens、Hydrogenobacter thermophilus、Hydrogenobacter thermophilus TK-6、Hyphomicrobium denitrificans ATCC 51888、Hyphomicrobium zavarzinii、Klebsiella pneumoniae、Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578、Lactobacillus brevis ATCC 367、Leuconostoc mesenteroides、Lysinibacillus fusiformis、Lysinibacillus sphaericus、Mesorhizobium loti MAFF303099、Metallosphaera sedula、Methanosarcina acetivorans、Methanosarcina acetivorans C2A、Methanosarcina barkeri、Methanosarcina mazei Tuc01、Methylobacter marinus、Methylobacterium extorquens、Methylobacterium extorquens AM1、Methylococcus capsulatas、Methylomonas aminofaciens、Moorella thermoacetica、Mycobacter sp. strain JC1 DSM 3803、Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10、Mycobacterium bovis BCG、Mycobacterium gastri 、Mycobacterium marinum M、Mycobacterium smegmatis、Mycobacterium smegmatis MC2 155、Mycobacterium tuberculosis、Nitrosopumilus salaria BD31、Nitrososphaera gargensis Ga9.2、Nocardia farcinica IFM 10152、Nocardia iowensis (sp. NRRL 5646)、Nostoc sp. PCC 7120、Ogataea angusta、Ogataea parapolymorpha DL-1 (Hansenula polymorpha DL-1)、Paenibacillus peoriae KCTC 3763、Paracoccus denitrificans、Penicillium chrysogenum、Photobacterium profundum 3TCK、Phytofermentans ISDg、Pichia pastoris、Picrophilus torridus DSM9790、Porphyromonas gingivalis、Porphyromonas gingivalis W83、Pseudomonas aeruginosa PA01、Pseudomonas denitrificans、Pseudomonas knackmussii、Pseudomonas putida、Pseudomonas sp、Pseudomonas syringae pv. syringae B728a、Pyrobaculum islandicum DSM 4184、Pyrococcus abyssi、Pyrococcus furiosus、Pyrococcus horikoshii OT3、Ralstonia eutropha、Ralstonia eutropha H16、Rhodobacter capsulatus、Rhodobacter sphaeroides、Rhodobacter sphaeroides ATCC 17025、Rhodopseudomonas palustris、Rhodopseudomonas palustris CGA009、Rhodopseudomonas palustris DX-1、Rhodospirillum rubrum、Rhodospirillum rubrum ATCC 11170、Ruminococcus obeum ATCC 29174、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces cerevisiae S288c、Salmonella enterica、Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. LT2、Salmonella enterica typhimurium 、Salmonella typhimurium、Schizosaccharomyces pombe、Sebaldella termitidis ATCC 33386 、Shewanella oneidensis MR-1、Sinorhizobium meliloti 1021、Streptomyces coelicolor、Streptomyces griseus subsp. griseus NBRC 13350、Sulfolobus acidocalarius、Sulfolobus solfataricus P-2、Synechocystis str. PCC 6803、Syntrophobacter fumaroxidans、Thauera aromatica、Thermoanaerobacter sp. X514、Thermococcus kodakaraensis、Thermococcus litoralis、Thermoplasma acidophilum、Thermoproteus neutrophilus、Thermotoga maritima、Thiocapsa roseopersicina、Tolumonas auensis DSM 9187、Trichomonas vaginalis G3、Trypanosoma brucei、Tsukamurella paurometabola DSM  20162、Vibrio cholera、Vibrio harveyi ATCC BAA-1116、Xanthobacter autotrophicus Py2、 Yersinia intermedia、またはZea maysが挙げられる。
【０１２５】
図２は、ヘキサノイル−ＣｏＡおよびゲラニル二リン酸からＣＢＧＡを生成する例示的な経路を示す。いくつかの場合では、本開示の遺伝子操作細胞は、細胞脂肪酸生合成経路から産生されるヘキサノイル−ＣｏＡを用いることができる。例えば、ヘキサノイル−ＣｏＡは、脂肪酸の逆ベータ酸化を介して内因的に形成され得る。
【０１２６】
他の実施形態において、遺伝子操作細胞は、ヘキサノイル−ＣｏＡシンセターゼ（例えば、導入遺伝子上に発現されるもの）をさらに含むことができる。ヘキサノイル−ＣｏＡシンセターゼ遺伝子の例として、細菌（E. coliを含む）ならびに真核生物（酵母およびC. sativaを含む）に対して内因性の酵素が挙げられる（例えば、Stout et al., Plant J., 2012; 71: 353-365を参照のこと）。
【０１２７】
図２は、ヘキサノイル−ＣｏＡとともにオリベトール酸の生成に用いられるマロニル−ＣｏＡの経路生成も示す。内因性のマロニルＣｏＡ生成は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの過剰発現を利用したアセチルＣｏＡからの生成によって補うことができる。したがって、この遺伝子操作細胞は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（例えば、導入遺伝子上で発現されるか、またはゲノムに組み込まれるもの）をさらに含み得る。
【０１２８】
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）はアセチルＣｏＡからマロニルＣｏＡへのＡＴＰ依存性のカルボキシル化を触媒する。この酵素はビオチン依存性であり、いくつかの生物において脂肪酸生合成開始の最初の反応である。例示的な酵素はE. coliのａｃｃＡＢＣＤ（Davis et al., J Biol Chem 275: 28593-8 (2000)）、Saccharomyces cerevisiaeのＡＣＣ１およびホモログ（Sumper et al.,Methods Enzym 71:34-7(1981)）によってコードされる。
【０１２９】
【表１】
2021515563.tif 000007
【０１３０】
図２はまた、ポリケチドシンターゼがポリ−β−ケト中間体を介してヘキサノイル−ＣｏＡをオリベトール酸に変換することを示す。したがって、この遺伝子操作細胞は、ポリケチドシンターゼ（導入遺伝子上で発現されるか、またはゲノムに組み込まれるもの）をさらに含み得る。この遺伝子操作細胞は、３，５，７−トリオキソドデカノイルＣｏＡをオリベトール酸に変換するオリベトール酸シクラーゼ（ｏａｃ）をさらに含み得る。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作細胞は、アルキルベンゼン−１，３−ジオールの酸誘導体の代わりに、（アルコール）基質として５−アルキルベンゼン−１，３−ジオールを優先的に使用する。５−アルキルベンゼン−１，３−ジオールをＧＰＰと反応させて、２−プレニル化５−アルキルベンゼン−１，３−ジオールを生成することができる。例えば、本開示の非天然プレニルトランスフェラーゼ変異体で促進されたオリベトールおよびＧＰＰの反応は、カンナビゲロール（ＣＢＧ；２−ＧＯＬ）を生成することができる。したがって、アルキルベンゼン−１，３−ジオールの酸誘導体の生成は細胞内で回避し得る。酸誘導体の生成を回避するために、オリベトール酸シクラーゼ（ｏａｃ）遺伝子を、経路から排除するか、または細胞から欠失させることができる。Gagne, S.J. et al(PNAS, 109:12811-12816, 2012)は、テトラケチドシンターゼ（ＴＫＳ）を用いてオリベトールに変換、またはオリベトール酸シクラーゼ（ｏａｃ）の作用によってさらにオリベトール酸に変換することができるヘキサノイル−ＣｏＡを利用する経路を記載している。
【０１３２】
必要に応じて、この遺伝子操作細胞は、細胞が通常代謝しない炭素源上で当該細胞が増殖することを可能にする１つ以上の外因性遺伝子、または、細胞が通常使用する炭素源上で当該細胞がよりいっそう増殖することを可能にする１つ以上の外因性遺伝子、または内因性遺伝子に対する１つ以上の改変を含み得る。例えば、ＷＯ２０１５／０５１２９８（ＭＤＨ変異体）およびＷＯ２０１７／０７５２０８（ＭＤＨ融合体）は、細胞がメタノール上で増殖することを可能にする経路を提供する遺伝子改変を記載している。ＷＯ２００９／０９４４８５（合成ガス）は、細胞が合成ガス上で増殖することを可能にする経路を提供する遺伝子改変を記載している。
【０１３３】
本明細書で使用される「生物由来」という用語は生物学的有機体に由来するか、または生物学的有機体によって合成されることを意味し、生物学的有機体によって生成されることができるので、再生可能資源とみなすことができる。このような生物学的有機体、特に本明細書で開示される微生物は、農業源、植物源、細菌源、または動物源から得られる糖または炭水化物などの供給原料またはバイオマスを利用することができる。あるいは、生物学的有機体は、大気炭素を利用することができる。本明細書で使用される場合、「生物ベース」という用語は本開示の生物由来化合物によって全体的または部分的に構成される上記の生成物を意味する。生物ベースまたは生物由来の生成物は石油由来の生成物とは対照的である。石油由来の生成物は、石油または石油化学原料に由来、あるいは石油または石油化学原料から合成される。
【０１３４】
使用される所望の微生物または株に応じて、適切な培養培地が使用され得る。例えば、米国細菌学会の「一般細菌学のための方法マニュアル」（ワシントンＤ．Ｃ．，ＵＳＡ，１９８１）には、様々な培養培地の説明が見られる。本明細書で用いられる「培地」は、増殖源に関する場合、固体状態であれ液体状態であれ、出発培地を指す。一方、本明細書で用いられる「培養した培地」は、発酵的に増殖し、他の細胞バイオマスを含むことができる微生物を含む培地（例えば液体培地）を指す。培地は一般に、１つ以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンおよび／または微量元素を含む。
【０１３５】
炭素源の例として、スクロース、グルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、イソマルトース、キシロース、パノース、マルトース、アラビノース、セロビオースおよびその３−、４−、または５オリゴマーなどの糖炭素が挙げられる。他の炭素源としては、メタノール、エタノール、グリセロール、ギ酸塩および脂肪酸などのアルコール炭素源が挙げられる。さらに他の炭素源としては、合成ガス、廃ガス、メタン、ＣＯ、ＣＯ２およびＣＯ、ＣＯ２とＨ２との任意の混合物などのガスからの炭素源が挙げられる。他の炭素源として、再生供給原料およびバイオマスを挙げ得る。再生供給原料の例として、セルロース系バイオマス、ヘミセルロース系バイオマスおよびリグニン供給原料が挙げられる。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、培養条件は、嫌気性または実質的に嫌気性の増殖または維持条件を含む。嫌気性条件の例は以前に記載されており、当技術分野で周知である。発酵プロセスの嫌気性条件の例は、例えば、２００７年８月１０日に出願された米国特許出願公開第２００９／００４７７１９号に開示されている。これらの状態のいずれも、微生物ならびに当技術分野で周知の他の嫌気性状態と共に使用することができる。
【０１３７】
培養条件として、例えば、液体培養手順、ならびに発酵および他の大規模培養手順を挙げ得る。生成物の有用な収率は、嫌気性または実質的に嫌気性の培養条件下で得ることができる。
【０１３８】
１つ以上のカンナビノイド生成物を達成する増殖条件の例として、嫌気性培養または発酵条件が挙げられる。特定の実施形態では、嫌気性または実質的に嫌気性の状態で、微生物を持続、培養、または発酵させることができる。簡単に言えば、嫌気性条件は、酸素を欠く環境を指す。実質的に嫌気性の条件として、例えば、培地中の溶存酸素濃度が飽和の０〜１０％の間に留まるような培養、バッチ発酵または連続発酵が挙げられる。実質的に嫌気性の条件として、また、液体培地中で、または１％未満の酸素の雰囲気で維持された密閉されたチャンバー内の固体寒天上で、細胞を増殖させるか、またはおいておくことが挙げられる。酸素の割合は、例えば、培養物にＮ２／ＣＯ２又は他の適当な非酸素ガスを散布することによって維持することができる。
【０１３９】
培養条件はカンナビノイド生成物を製造するために連続的にスケールアップし増大させることができる。増殖手順として、例えば、流加発酵およびバッチ分離；流加発酵および連続分離、または連続発酵および連続分離が挙げられる。これらのプロセスの全ては、当該技術分野において周知である。発酵手順は、業務用量のカンナビノイド生成物の生合成生産に特に有用である。一般に、非連続培養手順と同様に、カンナビノイド生成物の連続的および／またはほぼ連続的な生産は、指数期での増殖を維持および／またはほぼ維持するのに十分な栄養素および培地上でカンナビノイド生成物を培養することを含む。このような条件下での連続培養は、例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日以上を含み得る。さらに、連続培養は、１週間、２週間、３週間、４週間、または５週間以上、および数ヶ月までを含み得る。あるいは、特定用途に適切であれば、所望の微生物を数時間培養し得る。連続的および／またはほぼ連続的な培養条件はまた、これらの例示的な期間の間のすべての時間隔を含み得ることが理解されるべきである。微生物を培養する時間は、所望の目的のために十分な量の生成物を産生するのに十分な時間であることがさらに理解される。
【０１４０】
発酵手順は当技術分野で周知である。簡潔には、カンナビノイド生成物の生合成生産のための発酵は、例えば、流加発酵およびバッチ分離、流加発酵および連続分離、または連続発酵および連続分離で用い得る。バッチおよび連続発酵手順の例は、当技術分野で周知である。
【０１４１】
発酵の開始時の培養培地は、約５〜約７のｐＨを有し得る。ｐＨは、１１未満、１０未満、９未満、または８未満であり得る。他の実施形態では、ｐＨが少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、または少なくとも７であり得る。他の実施形態では、媒体のｐＨが約６〜約９．５、６〜約９、約６〜８、または約８〜９であってもよい。
【０１４２】
例えば、３−ゲラニルオリベトレートの産生について試験するための適切な精製および／またはアッセイは、周知の方法を用いて行うことができる。３重にした培養物などの適切な複製物を、試験される各遺伝子操作された株ごとに増殖させることができる。例えば、遺伝子操作生成宿主における生成物および副生成物の生成をモニターすることができる。最終生成物および中間体、ならびに他の有機化合物は、ＨＰＬＣ(高速液体クロマトグラフィ）、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィ−質量分析）およびＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィ−質量分析）などの方法、または当技術分野で周知の所定の手順を用いる他の適切な分析方法によって分析することができる。発酵ブロス中の生成物の放出はまた、培養上清を用いて試験することができる。副生成物および残留グルコースは、例えば、グルコースおよびアルコール用の屈折率検出器、および有機酸用のＵＶ検出器を用いたＨＰＬＣ（Lin et al., Biotechnol. Bioeng. 90:775-779 (2005)）、または当技術分野で周知の他の適切なアッセイおよび検出方法を使用するＨＰＬＣで定量できる。外因性ＤＮＡ配列由来の個々の酵素またはタンパク質活性はまた、当該分野で周知の方法を用いてアッセイできる。
【０１４３】
３−ゲラニルオリベトレート（ＣＢＧＡ）または他の標的分子は、当該分野で周知の種々の方法を使用して、培養物中の他の構成要素から分離できる。このような分離方法としては、例えば、連続液液濾過、浸透気化法、蒸発、濾過、膜濾過（逆浸透、ナノ濾過、限界濾過、および精密濾過を含む）、透析濾過による膜濾過、膜分離、逆浸透、電気透析、蒸留、抽出蒸留、反応性蒸留、共沸蒸留、結晶化および再結晶化、遠心分離、抽出濾過、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、吸着クロマトグラフィ、炭素吸着、水素化、および限界濾過を含む抽出手順ならびに方法が挙げられる。上記の方法の全ては、当該分野で周知である。
【０１４４】
プレニルトランスフェラーゼ変異体の位置選択性を考慮して、本開示はまた、所望のカンナビノイドおよびその誘導体を濃縮した組成物を提供する。特に、本開示は、望ましくない異性体、例えば５−ＧＯＬＡまたは４−ＧＯＬ（脱カルボキシル化５−ＧＯＬＡ）と比較して、ＣＢＧＡ（３−ゲラニルオリベトレート（３−ＧＯＬＡ））および／またはＣＢＧを濃縮した組成物を提供する。このような濃縮組成物には、医学目的を含む。薬学的組成物であるものおよび非薬学目的に使用されるものが含まれる。したがって、いくつかの実施形態では、様々な組成物において存在する場合に望ましくないことがある５−ＧＯＬＡおよび４−ＧＯＬ化合物を含むすべてのゲラニルオリベトレート化合物の中で、３−ゲラニル−オリベトレート（３−ＧＯＬＡ）またはその脱炭素化誘導体ＣＢＧ（（２−ＧＯＬ）が、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上、９９．９５％以上、あるいは１００％であるＣＢＧＡおよび／またはＣＢＧを含む組成物（例えば、薬学的組成物または医薬組成物）が提供される。
【実施例】
【０１４５】
（ライブラリコンストラクトおよび系統）
プレニルトランスフェラーゼの突然変異体は、単一部位および複数部位（組み合わせ）変異誘発法により、変異誘発を受ける位置に特異的プライマーを用い、ＰＣＲによりフラグメントを増幅し、Ｇｉｂｓｏｎ連結によりプラスミドを環状化することにより、プラスミド上のライブラリとして構築した。圧縮コドンアプローチを用いて、コドン冗長性を排除してライブラリサイズを小さくした。使用したプラスミドはｐＣＤＦＤｕｅｔ−１ベクトル（Novagen）であり、プレニルトランスフェラーゼ遺伝子の発現はＴ７プロモーターおよびｌａｃオペレーターで制御した。得られたプレニルトランスフェラーゼタンパク質は、Ｎ末端の６×ヒスチジンタグへの融合を含む。活性変異体を、以下に記載される活性アッセイに対して同定し、配列決定した。プレニルトランスフェラーゼの変異体ライブラリを持つプラスミドをE. coliのＢＬ２１（ＤＥ３）系統に形質転換し、適切な抗生物質を選択して寒天プレート上に平板培養した。
【０１４６】
（ホモログおよび突然変異体ライブラリをスクリーニングするための細胞培養）
突然変異体ライブラリ形質転換体および制御形質転換体の両方から、単一コロニーを採取し、スペクトマイシン抗生物質を含むLuria Bertani（ＬＢ）増殖培地を用いる９６ウェルプレートへ、増殖のために移した。一晩増殖させた後、培養物を、１％グルコースおよび抗生物質を含むＬＢの新鮮な培地中に継代培養した。４時間の増殖後、ＩＰＴＧの添加により遺伝子発現を誘導し、３０℃で一晩増殖させた後、細胞をペレット化し、培地を廃棄した。細胞ペレットを、アッセイの準備ができるまで−２０℃で保存した。スクリーニングされたサンプルの数は、可能な全変異体の計算に基づいて、約３倍のオーバーサンプリングであった。
【０１４７】
（ハイスループット活性アッセイ）
細胞ペレットを解凍し、プロテアーゼ阻害剤カクテル、５ｍＭ β−メルカプトエタノール、およびヌクレアーゼおよびリゾチームの存在下で、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）による化学的溶解に供した。アッセイは、１ｍＭゲラニルピロリン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および１ｍＭオリベトール酸（Santa Cruz Biotechnology）および５ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．５緩衝液中、総容量４０μｌで９６ウェルプレート中で行った。細胞溶解物の添加によって反応を開始し、次いで、８時間までの測定期間インキュベートし、アセトニトリルでクエンチして最終濃度６５％とし、次いで、遠心分離して、ペレット変性タンパク質を得た。ＣＢＧＡ（３−ＧＯＬＡ）のＧＣＭＳ分析のために、上清を新しい９６ウェルプレートに移した。
【０１４８】
（細胞溶解物におけるまたは精製酵素としてのプレニルトランスフェラーゼ活性のＬＣＭＳ分析）
ＣＢＧＡ（３−ＧＯＬＡ）および５−ＧＯＬＡを、Ｅｘａｃｔｉｖｅ(Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ)またはＱＴｒａｐ ４５００（Ｓｃｉｅｘ）質量分析計のいずれかに連結されたＣ１８逆相クロマトグラフィを使用するＬＣＭＳまたはＬＣＭＳ／ＭＳ方法によって分析した。
【０１４９】
酵素反応は、細胞溶解物中で行われるか、または精製タンパク質を用いて行われるかにかかわらず、まず６倍量の有機溶媒（内部標準を含むアセトニトリル）で処理してタンパク質を沈殿させ、上清を回収し、ＬＣＭＳ分析のために、必要に応じてさらに希釈した。
【０１５０】
高分解能ＬＣＭＳ分析を、Ａｃｃｅｌａ ＨＰＬＣクォータナリポンプ、Ｔｈｅｒｍｏ ＰＡＬオートサンプラーおよびＥｘａｃｔｉｖｅ高分解能精密質量分析計を用いて行った。Ｃ１８ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ｇｏｌｄカラム５０×３ｍｍ、１．９ｕｍ粒子サイズを、０．１％ギ酸を含む水（移動相Ａ）および０．１％ギ酸を含むアセトニトリル（移動相Ｂ）と共に、３００ｕＬ／分の流速で、室温で、移動相Ｂ勾配５０〜９５％で、５分間および１０分間の全実行時間で使用した。ＣＢＧＡおよび５−ＧＯＬＡに陰イオン化モードを使用した。ＣＢＧＡおよび５−ＧＯＬＡ異性体は、このクロマトグラフィー法（それぞれ保持時間４．８分および５．０５分）で十分に分解され、明確な定量化が可能となった。理論的ｍ／ｚ付近の狭い±５ｐｐｍ質量窓を用いて高分解能ＭＳ信号を抽出した。きちんとした外部較正標準を用いて定量した。
【０１５１】
（ホモログおよび突然変異体の同定）
ＢＬＡＳＴ検索および合理的アプローチによって見出されたプレニルトランスフェラーゼホモログをクローニングし、E. coli中で発現させ、ＬＣＭＳを用いてＯＬＡおよびＧＰＰに対する活性について細胞溶解物中でアッセイし、上記のようにＣＢＧＡまたは５−ＧＯＬＡを検出した。細胞溶解物を用いたインビトロアッセイでは、すべてのホモログは低いが測定可能な活性を示し、非位置特異的であり、３−ＧＯＬＡ（ＣＢＧＡ）と５−ＧＯＬＡの両方の混合生成物を示した。生成物は、配列番号１〜配列番号１５を有するプレニルトランスフェラーゼについて検出された。精製酵素をアッセイすることにより、選択されたホモログについて活性を確認した。Ｎ端末Ｈｉｓタグ化ホモログを、ニッケルアフィニティークロマトグラフィを用いて精製した。
【０１５２】
プレニルトランスフェラーゼホモログ鋳型を用いて、部位飽和突然変異誘発実験を行って、望ましくない生成物５−ＧＯＬＡよりもＣＢＧＡの生成に対する増大した活性、ならびにＣＢＧＡ（３−ＧＯＬＡ）に対する位置選択性を付与したアミノ酸位置を同定した。これらの研究の結果から、図６に示されるものを含むアミノ酸置換を有する、よく機能する突然変異体を同定することができた。（配列番号１をアミノ酸位置番号付けのための基準鋳型として用いると、変異位置に対応するアミノ酸位置は以下の通りである：Ｘ３＝４９；Ｘ４＝１２１；Ｘ５＝１２４；Ｘ６＝１５９；Ｘ７＝１７５；Ｘ８＝２１２；Ｘ９＝２３２；Ｘ１０＝２６７；Ｘ１１＝２６８；Ｘ１２＝２８５；Ｘ１３＝２８６；Ｘ１４＝２９２；Ｘ１５＝２９３；およびＸ１６＝３００）
いくつかの残基位置での突然変異はＣＢＧＡに対する非常に高い位置特異性をもたらし、アミノ酸の特定のサブセットを有する選択された残基で組み合わせの突然変異誘発を行って、増大した活性および位置選択性を有するさらなる独自の組み合わせの変異体を同定した。３６の独自の個々の変異体が、高い活性、およびＣＢＧＡについて高い位置選択性を有するものとして同定された。
【０１５３】
１つの特定の変異ペア（Ｘ６＝Ｈ；Ｘ１５＝Ｗ)を、多くのプレニルトランスフェラーゼホモログに導入したところ、対応する野生型配列および位置選択性（１００％の位置選択性）と比較して、活性が数倍に増大した（例えば、配列番号１、３、４、５、７、８、１３、１４、および１５）。しかしながら、配列番号６、９、１０、１１、１２には改善は見られなかった。これは、不溶性をもたらす高発現のアーティファクトにおそらく起因すると解釈された。これは、例えば、プラスミド構築において、より弱いプロモーターまたは低コピーベクターを用いて対処することができる。
【０１５４】
（オリベトール酸およびその類似体との活性）
種々の野生型プレニルトランスフェラーゼまたは改変プレニルトランスフェラーゼへの変異を操作することによって生成された非天然プレニルトランスフェラーゼを、野生型酵素（例えば、配列番号２）と比較して、オリベトール酸またはオリベトール酸類似体、ジバリノール酸およびオルセリン酸、ならびに共基質ＧＰＰのいずれかとの活性を調べた。非天然プレニルトランスフェラーゼをE. coli中で発現させ、精製し、アッセイした。アッセイ成分は以下の通りであった。反応容量は、１００マイクロリットル（７５マイクロリットル基質＋２５マイクロリットル酵素）、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌバッファ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＧＰＰ（５ｍＭオリベトール酸，ジバリノール酸，オルセリン酸またはオリベトールを含む）、および５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５マイクロリットル酵素。２２℃で６０分間反応が起こった。反応物の４０マイクロリットルのアリコートを除去し、１％ギ酸＋２つの内部標準を含む７５％アセトニトリル３６０マイクロリットルでクエンチした。遠心分離して粒子を除去した後、試料を分析した。化合物を、それらのＬＣ保持時間および当該化合物に特有のＭＲＭ遷移によって同定した。ＬＣＭＳＭＳ分析は、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ ＱＴＲＡＰ４５００質量分析計と連結した島津製作所のＵＨＰＬＣシステムで行った。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ Ｃ１８カラム（４．６Ｘ３．０ｍｍ、１．８ｕｍ）を用い、移動相Ａとして０．１％酢酸アンモニアを含む水と移動相Ｂとして０．１％酢酸アンモニアを含む９０％メタノールを用いて１ｍＬ／分で１〜２分間の勾配溶離を行った。ＬＣカラム温度は４５℃に保った。陰イオン化モードを、ＣＢＧＡ、ＣＢＧＶＡ、ＣＢＧＯＡ、ＣＢＧおよびそれらの異性体、ならびにＯＬＡ、ＰＤＡＬ、ＯＬおよびヘキサン酸を含むすべての分析対象物について使用した。異性体ペアを適切な勾配溶出で分離した。測定された生成物には、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ、３−ＧＯＬＡ）またはその５−ＧＯＬＡ異性体、カンナビゲロバリン酸（ＣＢＧＶＡ、３−ＧＤＶＡ）またはその５−ＧＤＶＡ異性体、カンナビゲロルシン酸（ＣＢＧＯＡ、３−ＧＯＳＡ）またはその５−ＧＯＳＡ異性体およびカンナビゲロール（ＣＢＧ、２−ＧＯＬ）またはその４−ＧＯＬ異性体が含まれた。酵素は、１年間保管したあとでさえ活性を示した。
【０１５５】
酸基質を用いた結果を、野生型酵素による産生に対する相対的増加倍率として、以下の表１に示す。
【０１５６】
【表２】
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【０１５７】
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【０１５８】
上記の表および以下の表において、「Ｓｅｑ１ｘ」と指定されるすべての非天然プレニルトランスフェラーゼは配列番号１に基づき、「Ｓｅｑ２ｘ」と指定されるものは、配列番号２に基づく。Ｓｅｑ１Ｄと命名された変異体はＳｅｑ１Ｃと同一である（両方とも配列番号１に基づく）が、４５位でのグリシン−セリン挿入で異なり、これにより位置番号付けがシフトした。野生型酵素は、３−ＧＯＬＡと５−ＧＯＬＡの混合物を産生した。この混合物を脱カルボキシル化すると、ＣＢＧ（２−ＧＯＬ）とあまり望ましくない４−ＧＯＬ異性体との混合物を含有する組成物が得られるであろう。非天然プレニルトランスフェラーゼは、例えば、一定時間で産生される所望のカンナビノイド（例えば、ＣＢＧＡ、ＣＢＧＶＡおよびＣＢＧＯＡ）の量において、野生型酵素よりもすべて優れていた。さらに、この非天然プレニルトランスフェラーゼは、望ましくない５−ＧＯＬＡまたは３−ＧＤＶＡ異性体を生成しなかった。これらの独自の組成物は、カンナビノイドを精製するための後続の工程が異性体分離工程を回避することができるというさらなる利点を提供する。混合物を脱カルボキシル化すると、あまり望ましくない４−ＧＯＬを含まない所望の生成物ＣＢＧ（２−ＧＯＬ）を含有するか、または望ましくない異性体を含まない所望の生成物ＣＢＧＶを含有する組成物が得られるであろう。なおさらなる利点は、脱カルボキシル化カンナビノイドを精製するためのその後の工程が異性体分離工程を回避し得ることである。オルセリン酸を用いると、非天然トランスフェラーゼはすべて、野生型に比べて、３−ＧＯＳＡを産生する特異性が増加した。これは、３−ＧＯＳＡの５−ＧＯＳＡに対する相対的レベルの比率はすべて野生型酵素の１：１の比率よりも大きかったためである。さらに、少なくとも４つの変異体は野生型よりも５−ＧＯＳＡ生成が相対的に少なく、それらのうちの２つは５−ＧＯＳＡを生成しなかった。これらの独自の組成物は、カンナビノイドを精製するための後続の工程が異性体分離工程を回避することができるというさらなる利点を提供するか、または、望ましくない異性体がより少なく存在する場合、そのような操作工程を最小限にするという利点を提供する。同様に、これらの混合物を脱カルボキシル化することで、組成物が、所望のＣＢＧＯを、その望ましくない異性体なしに、あるいはその望ましくない異性体がより少ない状態で、含有するという利点がもたらされる。
【０１５９】
アルコール基質を用いた結果を、野生型配列番号２酵素による産生に対する相対的増加倍率として以下の表２に示す。
【０１６０】
【表３】
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【０１６１】
野生型酵素は、ＣＢＧと、それほど望ましくない４−ＧＯＬ異性体との混合物を生成した。１つの変異体を除いて、非天然プレニルトランスフェラーゼは、基質としてオリベトールを用いて産生されたＣＢＧの量において野生型酵素よりも優れていた。さらに、非天然プレニルトランスフェラーゼは４−ＧＯＬを生成せず、生成物ＣＢＧの独自の組成を提供した。
【０１６２】
これらの独自の組成物は、カンナビノイドを精製するための後続の工程が異性体分離工程を回避することができるというさらなる利点を提供する。さらに、非天然プレニルトランスフェラーゼは、酸性前駆体を生成し、脱炭酸する必要なしに、所望のＣＢＧを直接的に生成する方法を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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