(57)【要約】  本発明は、マイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物及び前記微生物を用いたマイコスポリン様アミノ酸の生産方法に関する。  本発明の微生物は、マイコスポリン様アミノ酸の生産能が向上するので、マイコスポリン様アミノ酸の生産に効率的に用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxyphosphoheptonate aldolase）、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ（phosphoenolpyruvate synthetase）及びトランスケトラーゼ（transketolase）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質活性が強化された、マイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物。
【請求項２】
前記微生物は、マイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子のクラスターをさらに含む、請求項１に記載のマイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物。
【請求項３】
前記マイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子のクラスターは、２−ジメチル４−デオキシガズソールシンターゼ（2-demetyl 4-deoxygadusol synthase）、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（O-methyltransferase）及びＣ−Ｎリガーゼ（C-N ligase）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項２に記載のマイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物。
【請求項４】
前記マイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子のクラスターは、非リボソームペプチドシンテターゼ（non-ribosomal peptide synthetase）、非リボソームペプチドシンテターゼ様酵素（non-ribosomal peptide synthetase-like enzyme: NRPS-like enzyme）及びＤ−アラニンＤ−アラニンリガーゼ（D-Ala D-Ala ligase）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項２に記載のマイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物。
【請求項５】
前記微生物は、コリネバクテリウム属微生物、エシェリキア属微生物又は酵母である、請求項１に記載のマイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物。
【請求項６】
前記マイコスポリン様アミノ酸は、マイコスポリン−２−グリシン（Mycosporine-2-glycine）、パリチノール（Palythinol）、パリテン酸（Palythenic acid）、デオキシガズソール（deoxygadusol）、マイコスポリン−メチルアミン−トレオニン（Mycosporine-methylamine-threonine）、マイコスポリン−グリシン−バリン（Mycosporine-glycine-valine）、パリチン（Palythine）、アステリナ−３３０（Asterina-330）、シノリン（Shinorine）、ポルフィラ−３３４（Porphyra-334）、オイハロテセ−３６２（Euhalothece-362）、マイコスポリン−グリシン（Mycosporine-glycine）、マイコスポリン−オルニチン（Mycosporine-ornithine）、マイコスポリン−リシン（Mycosporine-lysine）、マイコスポリン−グルタミン酸−グリシン（Mycosporine-glutamic acid-glycine）、マイコスポリン−メチルアミン−セリン（Mycosporine-methylamine-serine）、マイコスポリン−タウリン（Mycosporine-taurine）、パリテン（Palythene）、パリテン−セリン（Palythine-serine）、パリテン−セリン−サルフェート（Palythine-serine-sulfate）、パリチノール（Palythinol）及びウスジレン（Usujirene）からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載のマイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の微生物を培地で培養するステップと、
前記培養した微生物又は培地からマイコスポリン様アミノ酸を回収するステップとを含む、マイコスポリン様アミノ酸の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物及び前記微生物を用いたマイコスポリン様アミノ酸の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
太陽から放出される紫外線は、ＵＶ Ａ（紫外線Ａ，約３２０〜４００ｎｍの領域）と、ＵＶ Ｂ（紫外線Ｂ，約２９０〜３２０ｎｍの領域）と、ＵＶ Ｃ（紫外線Ｃ，約１００〜２８０ｎｍの領域）とから構成されている。紫外線Ａは真皮層まで侵入して主に色素沈着及び皮膚老化を誘発し、光線過敏性皮膚症の発生に関与し、紫外線Ｂは高エネルギー光線であり、表皮と真皮の上部に侵入して日光皮膚炎、色素沈着及び皮膚癌の発生に関与することが知られている。
【０００３】
これらの副作用を防止するために、紫外線を遮断しようとする試みがなされている。紫外線遮断剤の種類としては、化学的紫外線遮断剤（Chemical sunscreen agent）と、物理的紫外線遮断剤（Physical sunscreen agent）が挙げられるが、化学的紫外線遮断剤は主に紫外線の吸収により、物理的紫外線遮断剤は反射及び散乱により、紫外線の侵入を防止する。
【０００４】
化学的紫外線遮断剤に含まれる成分としては、紫外線Ｂを主に吸収するＰＡＢＡ、ＰＡＢＡエステル（Amyl dimethyl PABA, octyl dimethyl PABA）、ケイ皮酸塩（Cinnamates: Cinoxate）、サリチル酸塩（Salicylate: Homomenthyl salicylate）、ショウノウ（Camphor）などや、紫外線Ａを主に吸収するベンゾフェノン（Benzophenone: Oxybenzone, Dioxybenzone, Suliso benzene）、ジベンゾイルメタン（Dibenzoyl methane）、アントラニル酸塩（Anthranilate）などが知られている。このような化学的紫外線遮断剤は紫外線を吸収して遮断する効果が得られるが、これらのうちの一部は皮膚や目に刺激を与えることがあり、特にＰＡＢＡ、ＰＡＢＡエステル、ベンゾフェノン、ケイ皮酸などは接触性皮膚炎を誘発することが知られている。また、一部は皮膚の光過敏性反応を誘発するなどの問題が報告されており、一部の国では化学的紫外線遮断剤の使用やその使用量を制限している。
【０００５】
物理的紫外線遮断剤に含まれる成分としては、二酸化チタン（Titanium dioxide）、タルク（Talc; Magnesium silicate）、酸化マグネシウム（Magnesium oxide）、酸化亜鉛（Zinc oxide）、カオリン（Kaolin）などが知られている。これらは接触性皮膚炎などの副作用がなく、水に流されにくいという利点があるが、所望の剤形にすると同時に有効な含有量を維持することは困難であり、皮膚に塗布すると白濁現象などが現れるという欠点がある。
【０００６】
マイコスポリン様アミノ酸（Mycosporine-like amino acids: MAAs）は、自然生物体に存在する物質であり、ＵＶＡ、ＵＶＢを効果的に吸収することが知られている。ＭＡＡｓは、自然界に３５種以上存在することが知られている（非特許文献４，１５）。近年、様々な糖が付いた形態のＭＡＡｓが微細藻類に存在し、それは抗酸化機能に優れることが報告されている（非特許文献５）。また、ＭＡＡｓは、紫外線遮断能だけでなく、酸化、浸透及び熱ストレスに対する抵抗性などを付与することが知られている（非特許文献１１，１３）。
【０００７】
しかし、微細藻類内で生産されるＭＡＡｓの量が数μｇレベルと非常に低く、微細藻類を培養してＭＡＡｓを分離、抽出、精製する条件が複雑であるので、ＭＡＡｓ素材を大量生産するのは困難であるという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００９／０９６６８９号
【特許文献２】国際公開第２００６／０６５０９５号
【特許文献３】韓国登録特許第１０−１７８３１７０号公報
【特許文献４】韓国登録特許第１０−１６３２６４２号公報
【特許文献５】国際公開第２００８／０８２１７９号
【特許文献６】韓国登録特許第１０−０６２００９２号公報
【特許文献７】国際公開第２００９／１２５９９２号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Comp. Biochem. Physiol. B 1995, 112: 105-114.
【非特許文献２】FEMS Microbiol Lett. 2007, 269: 1-10.
【非特許文献３】Ann. Rev. Physiol. 2002, 64: 223-262.
【非特許文献４】Mar. Biol. 1991, 108: 157-166.
【非特許文献５】Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 2015, 142: 154-168
【非特許文献６】Biol. Rev. 1999, 74: 311-345.
【非特許文献７】Mol. Biol. Evol. 2006, 23: 1437-1443.
【非特許文献８】Science, 2010, 329: 1653-1656.
【非特許文献９】Genomics 2010, 95: 120-128.
【非特許文献１０】Geomicrobiol. J. 1997. 14: 231-241.
【非特許文献１１】Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 2007. 146: 60-78.
【非特許文献１２】Can. J. Bot. 2003. 81: 131-138.
【非特許文献１３】J. Photochem. Photobiol. B. 2007, 89: 29-35.
【非特許文献１４】J. Bacteriol. 2011. 193(21): 5923-5928.
【非特許文献１５】Planta Med. 2015. 81: 813-820
【非特許文献１６】ACS Appl. Mater. Interfaces. 2015. 7: 16558-16564
【非特許文献１７】Appl Environ Microbiol. 2016, 82(20): 6167-6173
【非特許文献１８】ChemBioChem. 2015, 16: 320-327
【非特許文献１９】Methods Mol Biol. 2013, 1073: 43-7
【非特許文献２０】Nature Review, 2011, 9: 791-802
【非特許文献２１】J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor,New York, 1989
【非特許文献２２】F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York
【非特許文献２３】Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、微生物においてＭＡＡｓの生産を増加させるために鋭意努力した結果、ＭＡＡｓを生産する微生物において２−ｄｅｈｙｄｒｏ−３−ｄｅｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｈｅｐｔｏｎａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ、ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ及びｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅタンパク質の活性を強化する多方面の研究によりＭＡＡｓの生産が増加することを確認し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxyphosphoheptonate aldolase）、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ（phosphoenolpyruvate synthetase）及びトランスケトラーゼ（transketolase）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質活性が強化された、マイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物を提供することを目的とする。
【００１２】
また、本発明は、前記微生物を培地で培養するステップと、前記培養した微生物又は培地からマイコスポリン様アミノ酸を回収するステップとを含む、マイコスポリン様アミノ酸の生産方法を提供することを目的とする。
【００１３】
さらに、本発明は、マイコスポリン様アミノ酸を生産するための前記微生物の用途を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の微生物は、マイコスポリン様アミノ酸の生産能が向上するので、マイコスポリン様アミノ酸の生産に効率的に用いられる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１６】
なお、本明細書で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本明細書で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本発明に含まれる。また、以下の具体的な記述に本発明が限定されるものではない。さらに、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、通常の実験のみを用いて本明細書に記載された本発明の特定の態様の多くの等価物を認識し、確認することができるであろう。さらに、このような等価物も本発明に含まれることが意図されている。
【００１７】
前記目的を達成するための本発明の一態様は、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxyphosphoheptonate aldolase）、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ（phosphoenolpyruvate synthetase）及びトランスケトラーゼ（transketolase）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質活性が強化された、マイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物を提供する。
【００１８】
本発明における「２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxyphosphoheptonate aldolase）」とは、下記反応式の可逆反応を触媒する酵素を意味し、具体的には３−デオキシ−アラビノ−ヘプツロン酸−７−リン酸（3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate, DAHP）を合成する酵素を意味するが、これに限定されるものではない。
【００１９】
【化１】
2021514621.tif 000002
【００２０】
本発明における２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼは、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロン酸−７−リン酸（DAHP）シンターゼと混用される。
【００２１】
本発明における「ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ（phosphoenolpyruvate synthetase）」とは、下記反応式の可逆反応を触媒する酵素を意味し、具体的にはホスホエノールピルビン酸を合成する酵素を意味するが、これに限定されるものではない。
【００２２】
【化２】
2021514621.tif 000003
【００２３】
本発明における「トランスケトラーゼ（transketolase）」とは、下記反応式（化学式３又は４）の可逆反応を触媒する酵素を意味する。
【００２４】
【化３】
2021514621.tif 000004
【００２５】
【化４】
2021514621.tif 000005
【００２６】
前記２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ、トランスケトラーゼの遺伝的情報は、公知のデータベースから得られ、例えば米国国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information; NCBI）のＧｅｎＢａｎｋなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
前記２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ、トランスケトラーゼは、微生物の種又は微生物に応じて活性を示すタンパク質のアミノ酸配列が異なることがあるので、その由来や配列に限定されるものではない。
【００２８】
具体的には、前記２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼは、配列番号２、３７又は１２４のアミノ酸配列を含むタンパク質であり、前記ホスホエノールピルビン酸シンテターゼは、配列番号１９又は９８のアミノ酸配列を含むタンパク質であり、トランスケトラーゼは、配列番号２４、９６又は１２３のアミノ酸配列を含むタンパク質であるが、これらに限定されるものではない。本発明における「アミノ酸配列を含むタンパク質」は、「アミノ酸配列を有するタンパク質」又は「アミノ酸配列からなるタンパク質」という表現と混用されてもよい。
【００２９】
また、本発明における前記酵素には、各酵素と同一又は相当する生物学的活性を有するものであれば、前述した配列番号だけでなく、前記アミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性又は同一性を示すタンパク質が含まれてもよい。
【００３０】
さらに、前記配列と相同性又は同一性を有する配列であって、実質的に前述した配列番号の酵素タンパク質と同一又は相当する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものも本発明に含まれることは言うまでもない。
【００３１】
本発明における「相同性又は同一性」とは、与えられたアミノ酸配列又はヌクレオチド配列に一致する程度を意味し、百分率で表される。本明細書において、与えられたアミノ酸配列又はヌクレオチド配列と同一又は類似の活性を有するその相同性配列は「％の相同性」又は「％の同一性」と表される。例えば、スコア（score）、同一性（identity）、類似度（similarity）などのパラメーター（parameter）を計算する標準ソフトウェア、具体的にはＢＬＡＳＴ ２．０を用いるか、定義されたストリンジェントな条件（stringent condition）下にてサザンハイブリダイゼーション実験で配列を比較することにより確認することができ、定義される好適なハイブリダイゼーション条件は当該技術の範囲内であり、当業者に公知の方法（例えば、非特許文献２１、２２）で決定されてもよい。前記「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。例えば、このような条件は文献（例えば、非特許文献２１）に具体的に記載されている。
【００３２】
本発明における２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ、トランスケトラーゼには、前述した各酵素と同一又は相当する生物学的活性を有するものであれば、前述した配列番号のアミノ酸配列又は前記配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性又は同一性を示すタンパク質をコードするポリヌクレオチドが含まれてもよい。
【００３３】
また、前記酵素をコードするポリヌクレオチドは、コドンの縮退（degeneracy）により前記タンパク質を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮し、コード領域から発現するタンパク質のアミノ酸配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。よって、前記ポリヌクレオチドは、各酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列であればいかなるものでもよい。
【００３４】
さらに、公知の遺伝子配列から調製されるプローブ、例えば前記ポリヌクレオチド配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることにより前記２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ、トランスケトラーゼ酵素タンパク質の活性を有するタンパク質をコードする配列であればいかなるものでもよい。
【００３５】
前記「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は文献（例えば、非特許文献２１）に具体的に記載されている。例えば、相同性又は同一性の高い遺伝子同士、４０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９７％以上、特に具体的には９９％以上の相同性又は同一性を有する遺伝子同士をハイブリダイズし、それより相同性又は同一性の低い遺伝子同士をハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である、６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度において、１回、具体的には２回〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００３６】
ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションの厳格さに応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つのポリヌクレオチドが相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられるものである。例えば、ＤＮＡにおいて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本発明には、実質的に類似したポリヌクレオチド配列だけでなく、全配列に相補的な単離されたポリヌクレオチド断片が含まれてもよい。
【００３７】
具体的には、相同性又は同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーションステップが行われるハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて探知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃又は６５℃であってもよいが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節されてもよい。
【００３８】
ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切な厳格さはポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野で公知である（非特許文献２３参照）。本発明における「活性の強化」とは、酵素タンパク質の活性が導入されるか、微生物が有する内在性活性又は修飾前の活性に比べて活性が向上することを意味する。前記活性の「導入」とは、微生物が本来持っていなかった特定タンパク質の活性が自然に又は人為的に現れるようにすることを意味する。具体的には、酵素タンパク質の活性が強化された微生物とは、天然の野生型微生物又は非変型微生物より酵素タンパク質の活性が向上した微生物を意味する。例えば、前記活性の強化には、外来の２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ及び／もしくはトランスケトラーゼを導入して強化すること、又は内在性２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ及び／もしくはトランスケトラーゼの活性を強化することが全て含まれる。具体的には、本発明における活性強化の方法は、１）前記酵素をコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、２）前記ポリヌクレオチドの発現を増加させる発現調節配列の改変、３）前記酵素の活性を強化する染色体上のポリヌクレオチド配列の改変、４）それらの組み合わせにより強化する改変などにより行われるが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
前記１）ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、特にこれらに限定されるものではないが、ベクターに作動可能に連結された形態で行われるか、宿主細胞内の染色体内に挿入されることにより行われてもよい。また、コピー数の増加の一態様として、酵素の活性を示す外来ポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入することにより行われてもよい。前記外来ポリヌクレオチドは、前記酵素と同一／類似の活性を示すものであれば、その由来や配列が限定されるものではない。前記導入は、公知の形質転換方法を当業者が適宜選択して行うことができ、宿主細胞内で前記導入されたポリヌクレオチドが発現することにより酵素が生成されるので、その活性が増加する。
【００４０】
次に、２）ポリヌクレオチドの発現を増加させる発現調節配列の改変は、特にこれらに限定されるものではないが、前記発現調節配列の活性がさらに強化されるように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行われるか、より強い活性を有する核酸配列に置換することにより行われてもよい。前記発現調節配列には、特にこれらに限定されるものではないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び翻訳の終結を調節する配列などが含まれてもよい。
【００４１】
具体的には、ポリヌクレオチド発現単位の上流には、本来のプロモーターに代えて強力な異種プロモーターが連結されてもよいが、前記強力なプロモーターの例としては、ＣＪ７プロモーター、ｌｙｓＣＰ１プロモーター、ＥＦ−Ｔｕプロモーター、ｇｒｏＥＬプロモーター、ａｃｅＡ又はａｃｅＢプロモーターなどが挙げられる。より具体的には、コリネバクテリウム属由来のプロモーターであるｌｙｓＣＰ１プロモーター（特許文献１）、ＣＪ７プロモーター（特許文献２）、ＳＰＬプロモーター（特許文献３）又はｏ２プロモーター（特許文献４）に作動可能に連結されることにより、前記酵素をコードするポリヌクレオチドの発現率を向上させることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
また、３）染色体上のポリヌクレオチド配列の改変は、特にこれらに限定されるものではないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性がさらに強化されるように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行われるか、より強い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に置換することにより行われてもよい。
【００４３】
最後に、４）前記１）〜３）の組み合わせにより強化する改変は、前記酵素をコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、その発現を増加させる発現調節配列の改変、染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の改変、及び前記酵素の活性を示す外来ポリヌクレオチド又はそのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドの改変の少なくとも１つの方法を共に適用することにより行われてもよい。
【００４４】
前記ポリヌクレオチドは、機能するポリヌクレオチドの集合体であれば、遺伝子ともいう。本発明において、ポリヌクレオチドと遺伝子は混用されてもよく、ポリヌクレオチド配列とヌクレオチド配列は混用されてもよい。
【００４５】
本発明における「ベクター」とは、好適な宿主内で標的タンパク質を発現させることができるように、好適な調節配列に作動可能に連結された前記標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ産物を意味する。前記調節配列には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれてもよい。ベクターは好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製及び機能することができ、ゲノム自体に組み込まれる。
【００４６】
本発明に用いられるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知の任意のベクターを用いることができる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣ、ｐＳＫＨ、ｐＲＳ−４１３、ｐＲＳ−４１４、ｐＲＳ−４１５ベクターなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
本発明に使用可能なベクターは、特に限定されるものではなく、公知の発現ベクターを用いることができる。また、細胞内染色体挿入用ベクターにより、染色体内に標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換えにより行うことができるが、これに限定されるものではない。前記染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択、すなわち標的核酸分子が挿入されたか否かを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、表面タンパク質の発現などの選択可能表現型を付与するマーカーが用いられてもよい。選択剤（selective agent）で処理した環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、異なる表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。
【００４８】
本発明における「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、それらが全て含まれてもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含むものである。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクター形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。前記形質転換する方法は、核酸を細胞内に導入するいかなる方法であってもよく、当該分野において公知であるように、宿主細胞に適した標準技術を選択して行うことができる。例えば、エレクトロポレーション（electroporation）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ4）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）沈殿、微量注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＥＡＥ−デキストラン法、カチオン性リポソーム法、酢酸リチウム−ＤＭＳＯ法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４９】
また、前記「作動可能に連結」されたものとは、本発明の標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するプロモーター配列と前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されたものを意味する。作動可能な連結は当該技術分野で公知の遺伝子組換え技術を用いて作製することができ、部位特異的ＤＮＡ切断及び連結は当該技術分野の切断及び連結酵素などを用いて作製することができるが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
本発明の微生物は、さらに３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ（3-dehydroquinate dehydratase）のタンパク質活性が不活性化されたものであってもよい。
【００５１】
本発明における「３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ（3-dehydroquinate dehydratase）」とは、下記反応式の可逆反応を触媒する酵素を意味し、具体的には３−デヒドロキナ酸（3-dehydroquinate）を３−デヒドロシキミ酸（3-dehydroshikimate）に変換するものであるが、これに限定されるものではない。
【００５２】
【化５】
2021514621.tif 000006
【００５３】
３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼは、微生物の種又は微生物に応じて活性を示すタンパク質のアミノ酸配列が異なることがあるので、その由来や配列に限定されるものではない。具体的には、配列番号９０のアミノ酸配列を含むタンパク質であるが、これに限定されるものではない。また、配列番号９０のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性もしくは同一性を有するアミノ酸配列が含まれてもよい。さらに、このような相同性又は同一性を有し、前記タンパク質と同一又は相当する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものも本発明に含まれることは言うまでもない。
【００５４】
本発明における「不活性化」とは、本来微生物が有する酵素タンパク質の内在性活性又は修飾前の活性に比べてその活性が低下することや、タンパク質が全く発現しないことや、発現してもその活性がないことを意味する。前記不活性化は、酵素をコードするポリヌクレオチドの変異などにより酵素自体の活性が、本来微生物が有する酵素の活性より低下したり、除去された場合や、酵素をコードする遺伝子の発現阻害又は翻訳（translation）阻害などにより細胞内で全体的な酵素活性の程度が天然の微生物より低下したり、除去された場合や、酵素をコードする遺伝子の一部又は全部が欠失した場合や、それらの組み合わせを含む概念であるが、これらに限定されるものではない。すなわち、酵素タンパク質の活性が不活性化された微生物とは、天然の野生型微生物又は非変型微生物より酵素タンパク質の活性が低下したり、除去された微生物を意味する。
【００５５】
前記酵素活性の不活性化は、当該分野で公知の様々な方法の適用により達成することができる。前記方法の例として、１）前記酵素をコードする染色体上の遺伝子の全部又は一部を欠失させる方法、２）前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子の発現が減少するように発現調節配列を改変する方法、３）前記タンパク質の活性が欠失又は低下するようにタンパク質をコードする染色体上の遺伝子配列を改変する方法、４）前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子の転写体に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入する方法、５）前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子のシャイン・ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列を付加することにより２次構造物を形成させてリボソーム（ribosome）の付着を不可能にする方法、６）前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に逆転写するようにプロモーターを付加する方法（Reverse transcription engineering, RTE）などが挙げられ、それらの組み合わせによっても達成することができるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００５６】
前記酵素をコードする染色体上の遺伝子の全部又は一部を欠失させる方法は、微生物内の染色体挿入用ベクターを用いて、染色体内の内在性標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを一部のヌクレオチド配列が欠失したポリヌクレオチド又はマーカー遺伝子に置換することにより行うことができる。このようなポリヌクレオチドの全部又は一部を欠失させる方法の一例として、相同組換えによりポリヌクレオチドを欠失させる方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５７】
前記発現調節配列を改変する方法は、前記発現調節配列の活性がさらに低下するように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行うこともでき、より低い活性を有する核酸配列に置換することにより行うこともできる。前記発現調節配列には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と翻訳の終結を調節する配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５８】
前記染色体上の遺伝子配列を改変する方法は、前記酵素の活性がさらに低下するように、遺伝子配列を欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行うこともでき、より低い活性を有するように改良された遺伝子配列又は活性がなくなるように改良された遺伝子配列に置換することにより行うこともできるが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
前記「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類により異なり、具体的には１〜３００個、より具体的には１〜１００個、さらに具体的には１〜５０個であるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００６０】
本発明の微生物は、さらに３−デヒドロキナ酸シンターゼ（3-dehydroquinate synthase）のタンパク質活性が非変型微生物より強化されてもよい。
【００６１】
前記３−デヒドロキナ酸シンターゼ（3-dehydroquinate synthase）とは、下記反応式の可逆反応を触媒する酵素を意味し、具体的には３−デヒドロキナ酸（3-dehydroquinate, 3-DHQ）を合成することができるが、これに限定されるものではない。
【００６２】
【化６】
2021514621.tif 000007
【００６３】
本発明における「マイコスポリン様アミノ酸（mycosporine-like amino acids; MAAs）」とは、紫外線を吸収する環型化合物を意味する。本発明におけるマイコスポリン様アミノ酸は、紫外線を吸収するものであればいかなるものでもよく、具体的にはシクロヘキサノン（cyclohexanone）又はシクロヘキセンイミン（cyclohexenimine）の中心環を有する化合物、又は前記中心環にアミノ酸などの様々な物質が結合された化合物であってもよく、より具体的にはマイコスポリン−２−グリシン（Mycosporine-2-glycine）、パリチノール（Palythinol）、パリテン酸（Palythenic acid）、デオキシガズソール（deoxygadusol）、マイコスポリン−メチルアミン−トレオニン（Mycosporine-methylamine-threonine）、マイコスポリン−グリシン−バリン（Mycosporine-glycine-valine）、パリチン（Palythine）、アステリナ−３３０（Asterina-330）、シノリン（Shinorine）、ポルフィラ−３３４（Porphyra-334）、オイハロテセ−３６２（Euhalothece-362）、マイコスポリン−グリシン（Mycosporine-glycine）、マイコスポリン−オルニチン（Mycosporine-ornithine）、マイコスポリン−リシン（Mycosporine-lysine）、マイコスポリン−グルタミン酸−グリシン（Mycosporine-glutamic acid-glycine）、マイコスポリン−メチルアミン−セリン（Mycosporine-methylamine-serine）、マイコスポリン−タウリン（Mycosporine-taurine）、パリテン（Palythene）、パリテン−セリン（Palythine-serine）、パリテン−セリン−サルフェート（Palythine-serine-sulfate）、パリチノール（Palythinol）、ウスジレン（Usujirene）又はそれらの組み合わせであってもよい。
【００６４】
本発明におけるマイコスポリン様アミノ酸は、ＭＡＡやＭＡＡｓと混用されてもよい。
【００６５】
本発明における「マイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物」とは、マイコスポリン様アミノ酸の生合成に関与する酵素の遺伝子又は前記遺伝子のクラスターを含む微生物を意味するか、又は前記クラスターが導入又は強化された微生物を意味する。また、本発明における「マイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子のクラスター」とは、マイコスポリン様アミノ酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子群を意味する。具体的には、マイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子、マイコスポリン様アミノ酸にさらなるアミノ酸残基を付加する活性を有する酵素の遺伝子、又はそれら遺伝子のクラスターが挙げられる。前記マイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子には、それを含む微生物がマイコスポリン様アミノ酸を生産するものであれば、微生物の外来及び／又は内在性遺伝子が全て含まれる。前記外来遺伝子は、同種及び／又は異種であってもよい。
【００６６】
前記マイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子は、それを含む微生物がマイコスポリン様アミノ酸生合成に関与する酵素を生産して結果としてマイコスポリン様アミノ酸を生産するものであれば、前記遺伝子の由来微生物種はいかなるものでもよく、具体的にはシアノバクテリア（cyanobacteria）であるアナベナ・バリアビリス（Anabaena variabilis）、ノストック・パンクチフォルム（Nostoc punctiforme）、ノデュラリア・スプミゲナ（Nodularia spumigena）、シアノセイス属ＰＣＣ７４２４（Cyanothece sp. PCC 7424）、リングビア属ＰＣＣ８１０６（Lyngbya sp. PCC 8106）、ミクロキスティス・エルギノーサ（Microcystis aeruginosa）、ミクロコレス・クソノプラステス（Microcoleus chthonoplastes）、シアノセイス属ＡＴＣＣ５１１４２（Cyanothece sp. ATCC 51142）、クロコスファエラ・ワトソニー（Crocosphaera watsonii）、シアノセイス属ＣＣＹ０１１０（Cyanothece sp. CCY 0110）、シリンドロスペルマム・スタグナレ属ＰＣＣ７４１７（cylindrospermum stagnale sp,PCC 7417）、アファノセケ・ハロフィチカ（Aphanothece halophytica）もしくはトリコデスミウム・エリスラエウム（Trichodesmium erythraeum）であるか、又は菌類（fungi）であるマグナポルテ・オリゼ（Magnaporthe oryzae）、ピレノフォラ・トリチシ・レペンチス（Pyrenophora tritici-repentis）、アスペルギルス・クラバタス（Aspergillus clavatus）、ネクトリア・ヘマトコッカ（Nectria haematococca）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、ジベレラ・ゼアエ（Gibberella zeae）、バーティシリウム・アルボ・アトラム（Verticillium albo-atrum）、ボトリオチニア・フッケリアナ（Botryotinia fuckeliana）、ファエオスファエリア・ノドラム（Phaeosphaeria nodorum）であるか、又はネマトステラ・ベクテンシス（Nematostella vectensis）、ヘテロカプサ・トリケトラ（Heterocapsa triquetra）、オキシリス・マリナ（Oxyrrhis marina）、カルロディニウム・ミクルム（Karlodinium micrum）、アクチノシネマ・ミルム（Actinosynnema mirum）などであるが、これらに限定されるものではない。
【００６７】
一実施態様によれば、本発明のマイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物は、マイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子又はそのクラスターを含む。具体的には、前記微生物は、マイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子のクラスターが導入されるか、又は前記遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が内在性活性又は修飾前の活性に比べて向上してもよいが、これらに限定されるものではない。
【００６８】
また、前記マイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子は、微生物がマイコスポリン様アミノ酸を生産するものであれば酵素名や由来微生物が限定されるものではなく、２−ジメチル４−デオキシガズソールシンターゼ（2-demetyl 4-deoxygadusol synthase）、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（O-methyltransferase）及びＣ−Ｎリガーゼ（C-N ligase）からなる群から選択される少なくとも１つ、具体的には１つ以上、２つ以上、３つ以上又は全ての酵素タンパク質、又はそれと同一及び／もしくは類似の活性を有する酵素タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
【００６９】
例えば、前記２−ジメチル４−デオキシガズソールシンターゼ（2-demetyl 4-deoxygadusol synthase）は、セドヘプツロース−７−リン酸（sedoheptulose-7-phosphate）を２−ジメチル−４−デオキシガズソール（2-demethyl-4-deoxygadusol）に変換する酵素である。前記Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（O-methyltransferase）は２−ジメチル−４−デオキシガズソール（2-demethyl-4-deoxygadusol）を４−デオキシガズソール（4-deoxygadusol）に変換する酵素であり、前記４−デオキシガズソール（4-deoxygadusol）のグリシル化（glycylation）は前記Ｃ−Ｎリガーゼ（C-N ligase）により触媒される。
【００７０】
また、マイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物は、マイコスポリン様アミノ酸にさらなるアミノ酸残基を付加する活性を有する酵素の遺伝子又は前記遺伝子のクラスターを含んでもよい。前記遺伝子又は前記遺伝子のクラスターは、マイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物が少なくとも２つのアミノ酸残基が付加されたマイコスポリン様アミノ酸を生産するものであれば酵素名や由来微生物が限定されるものではなく、具体的には非リボソームペプチドシンテターゼ（non-ribosomal peptide synthetase: NRPS）、非リボソームペプチドシンテターゼ様酵素（non-ribosomal peptide synthetase-like enzyme: NRPS-like enzyme）及びＤ−アラニンＤ−アラニンリガーゼ（D-Ala D-Ala ligase: DDL）からなる群から選択される少なくとも１つ、具体的には１つ以上、２つ以上、３つ以上又は全ての酵素タンパク質、又はそれと同一及び／もしくは類似の活性を有する酵素タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
【００７１】
一部のマイコスポリン様アミノ酸は、マイコスポリン−グリシンに２番目のアミノ酸残基を含む。前記非リボソームペプチドシンテターゼ、非リボソームペプチドシンテターゼ様酵素及びＤ−アラニンＤ−アラニンリガーゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素は、マイコスポリン−グリシンに２番目のアミノ酸残基を付加することができる。
【００７２】
一実施態様によれば、マイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物は、非リボソームペプチドシンテターゼ、非リボソームペプチドシンテターゼ様酵素及びＤ−アラニンＤ−アラニンリガーゼのように、マイコスポリン−グリシンに２番目のアミノ酸を付加する活性を有する酵素であれば酵素名や由来微生物種はいかなるものでもよい。
【００７３】
一例として、アナベナ・バリアビリス（Anabaena variabilis）内の非リボソームペプチドシンテターゼ様酵素（Ava_3855）、又はノストック・パンクチフォルム（Nostoc punctiforme）内のＤ−アラニンＤ−アラニンリガーゼ（NpF5597）は、マイコスポリン−グリシンにセリン残基を付加してシノリンを形成させることができる。他の例として、マイコスポリン−２−グリシンは、アファノセケ・ハロフィチカ（Aphanothece halophytica）内のＤ−アラニンＤ−アラニンリガーゼホモログ（Ap_3855）による２番目のグリシン残基の付加により形成されてもよい。同様に、アクチノシネマ・ミルム（Actinosynnema mirum）においては、Ｄ−アラニンＤ−アラニンリガーゼによりセリン又はアラニンが付加されてシノリン又はマイコスポリン−グリシン−アラニンが形成されてもよい。本出願の一実施例による微生物は、前述した酵素又はそれと同一及び／又は類似の活性を有する酵素から、目的とするマイコスポリン様アミノ酸生産に適したものを選択して含んでもよい。
【００７４】
本発明に用いられる前記２−ジメチル４−デオキシガズソールシンターゼ、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、Ｃ−Ｎリガーゼ、非リボソームペプチドシンテターゼ、非リボソームペプチドシンテターゼ様酵素及び／又はＤ−アラニンＤ−アラニンリガーゼは、由来する微生物種が限定されるものではなく、同一及び／又は類似の機能及び役割を有する酵素として公知のものであればいかなるものでもよく、それらの相同性又は同一性の数値範囲も限定されるものではない。例えば、シリンドロスペルマム・スタグナレＰＣＣ７４１７（C. stagnale PCC 7417）のＭｙｌＡ、ＭｙｌＢ、ＭｙｌＤ、ＭｙｌＥ及びＭｙｌＣは、アナベナ・バリアビリス（Anabaena variabilis）及びノストック・パンクチフォルム（Nostoc punctiforme）由来の２−ジメチル４−デオキシガズソールシンターゼ、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、Ｃ−Ｎリガーゼ及びＤ−アラニンＤ−アラニンリガーゼに対応し（homologous）、それらの類似度は約６１〜８８％である（非特許文献１７，１４）。すなわち、本発明に用いられる酵素は、同一及び／又は類似の機能及び効果を示すことが知られているものであれば、由来する微生物種や配列相同性又は同一性が限定されるものではない。また、先行技術文献として挙げた非特許文献は、全て本出願に参照として含まれる。
【００７５】
また、マイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子は、配列番号１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１又は１２２のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００７６】
さらに、マイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子は、配列番号１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１又は１２２のアミノ酸配列と５０％、６０％又は７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、さらに具体的には９５％以上、一層具体的には９９％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでもよく、微生物がマイコスポリン様アミノ酸を生産するものであれば、前記相同性又は同一性を有しないタンパク質をコードするヌクレオチド配列のいかなるものを含んでもよい。具体的には、マイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子は、配列番号１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８又は１０９のヌクレオチド配列を含んでもよいが、これらに限定されるものではない。
【００７７】
また、前記配列と相同性又は同一性を有する配列であって、実質的に前述した配列番号のタンパク質と同一又は相当する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものも本願に含まれることは言うまでもない。
【００７８】
さらに、前記ヌクレオチド配列は、コドンの縮退（degeneracy）により前記タンパク質を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮し、コード領域から発現するタンパク質のアミノ酸配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。よって、前記マイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子は、マイコスポリン様アミノ酸生合成に関与するタンパク質をコードするヌクレオチド配列であれば本願に全て含まれる。
【００７９】
あるいは、公知の遺伝子配列から調製されるプローブ、例えば前記ヌクレオチド配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることによりマイコスポリン様アミノ酸生合成に関与するタンパク質をコードする配列であれば本発明に全て含まれる。
【００８０】
一実施態様によれば、マイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物は、由来が異なるマイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子を含んでもよい。
【００８１】
本発明において、タンパク質の活性強化及び／又は遺伝子の導入は、順序に関係なく同時、順次、逆順に行われてもよい。
【００８２】
前記マイコスポリン様アミノ酸を生産する微生物は、マイコスポリン様アミノ酸生合成遺伝子のクラスターを含むので、マイコスポリン様アミノ酸を生産することができ、さらに２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ及びトランスケトラーゼからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の活性を強化することにより、マイコスポリン様アミノ酸の生産能が向上した微生物であってもよい。また、本発明の微生物は、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ及びトランスケトラーゼからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の活性を強化することにより、マイコスポリン様アミノ酸の生産能が向上した微生物であればいかなるものでもよく、具体的にはコリネバクテリウム属微生物、エシェリキア属微生物又は酵母であってもよい。
【００８３】
前記コリネバクテリウム属微生物は、具体的にはコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）などであってもよく、より具体的にはコリネバクテリウム・グルタミカムであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００８４】
前記エシェリキア属微生物は、具体的にはエシェリキア・アルベルティイ（Escherichia albertii）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、エシェリキア・フェルグソニイ（Escherichia fergusonii）、エシェリキア・ヘルマンニイ（Escherichia hermannii）、エシェリキア・バルネリス（Escherichia vulneris）などであり、より具体的にはエシェリキア・コリであるが、これらに限定されるものではない。
【００８５】
前記酵母は、具体的には子嚢菌門（Ascomycota）であるサッカロミケス亜門（Saccharomycotina）、タフリナ菌亜門（Taphrinomycotina）、又は担子菌門（Basidiomycota）であるハラタケ亜門（Agaricomycotina）、サビキン亜門（Pucciniomycotina）などに属する微生物であってもよく、より具体的にはサッカロマイセス（Saccharomyces）属微生物、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属微生物、ファフィア（Phaffia）属微生物、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）属微生物、ピキア（Pichia）属微生物、カンジダ（Candida）属微生物であってもよく、さらに具体的にはサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００８６】
本発明の他の態様は、本発明の微生物を培地で培養するステップと、前記培養した微生物又は培地からマイコスポリン様アミノ酸を回収するステップとを含む、マイコスポリン様アミノ酸の生産方法を提供する。
【００８７】
前記「微生物」及び「マイコスポリン様アミノ酸」については前述した通りである。
【００８８】
本発明における「培養」とは、前記微生物を好適に調節された環境条件で生育させることを意味する。本発明の培養過程は、当該技術分野で公知の好適な培地と培養条件で行われてもよい。このような培養過程は、選択される微生物に応じて当業者が容易に調整して用いることができる。前記微生物を培養するステップは、特にこれらに限定されるものではないが、公知の回分培養法、連続培養法、流加培養法などにより行われてもよい。本発明の微生物の培養に用いられる培地及びその他の培養条件は、通常の微生物の培養に用いられる培地であれば特に限定されるものではなく、いかなるものでも用いることができ、具体的には本発明の微生物を好適な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有する通常の培地内において、好気性条件下で温度、ｐＨなどを調節して培養することができる。具体的には、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニア）又は酸性化合物（例えば、リン酸又は硫酸）を用いて適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜９、具体的にはｐＨ６〜８、最も具体的にはｐＨ６．８）に調節することができるが、これらに限定されるものではない。また、培養物の好気状態を維持するために、培養物中に酸素又は酸素含有気体を注入してもよく、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体を注入しなくてもよく、窒素、水素又は二酸化炭素ガスを注入してもよいが、これらに限定されるものではない。さらに、培養温度は２０〜４５℃、具体的には２５〜４０℃に維持してもよく、約１０〜１６０時間培養してもよいが、これらに限定されるものではない。さらに、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制してもよいが、これに限定されるものではない。
【００８９】
さらに、用いられる培養用培地において、炭素供給源としては、糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス、デンプン及びセルロース）、油脂（例えば、大豆油、ヒマワリ油、落花生油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセリン及びエタノール）、有機酸（例えば、酢酸）などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕及びウレア）、無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、それらに相当するナトリウム含有塩などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。また、培地は、その他金属塩（例えば、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄）、アミノ酸、ビタミンなどの必須成長促進物質を含んでもよい。
【００９０】
前記培養により生産されたＭＡＡｓは、培地中に分泌されるか、細胞内に残留する。
【００９１】
本発明における「培地」とは、本発明の微生物を培養する培養培地、及び／又は培養して得られた産物を意味する。前記培地は、微生物を含む形態、及び前記微生物を含む培養液から遠心分離、濾過などにより微生物を除去した形態をどちらも含む概念である。
【００９２】
本発明の前記培養するステップで生産されたＭＡＡｓを回収するステップは、培養方法に応じて、当該分野で公知の好適な方法により培養液から目的とするＭＡＡｓを回収することができる。例えば、遠心分離、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化、ＨＰＬＣなどが用いられてもよく、当該分野で公知の好適な方法を用いて培養された微生物又は培地から目的とするＭＡＡｓを回収することができる。前記ＭＡＡｓを回収するステップは、分離工程及び／又は精製工程をさらに含んでもよい。
【００９３】
本発明のさらに他の態様は、マイコスポリン様アミノ酸を生産するための本発明の微生物の用途を提供する。
【００９４】
前記「微生物」及び「マイコスポリン様アミノ酸」については前述した通りである。
【実施例】
【００９５】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００９６】
＜大腸菌由来ＭＡＡｓ生産組換え微生物の作製及びそれを用いたＭＡＡｓ生産＞
（実施例１）
【００９７】
２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ（2-dehydro-3-deoxyphosphoheptonate aldolase）活性強化菌株の作製
微生物のＭＡＡｓ生産能を増加させるために、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼの活性が強化された大腸菌を作製した。具体的には、大腸菌Ｗ３１１０をベース菌株とし、ａｒｏＧ（２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ；配列番号１及び２）遺伝子をさらに導入した。プラスミドの作製に用いた鋳型及びプライマーを表１に示す。
【００９８】
【表１】
2021514621.tif 000008
【００９９】
前記鋳型及びプライマーを用いてＰＣＲにより遺伝子断片を増幅し、その後ｆｈｕＡ ａｒｍ １及びｆｈｕＡ ａｒｍ ２遺伝子断片をＢａｍＨ１−Ｓｐｅ１制限酵素で切断したｐＳＫＨベクター（特許文献５（ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００６９３３））に、前述したように増幅した断片をＩｎ−ＦｕｓｉｏｎR ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（clontech）によりライゲーション（ligation）した。作製したベクターをｐＳＫＨ−ΔｆｈｕＡと命名した。前記ｆｈｕＡ遺伝子欠損により大腸菌のファージ感染が抑制される。
【０１００】
Ｐｎ＿ａｒｏＧ遺伝子断片をＳｐｅ１−ＥｃｏＲＶ制限酵素で切断したｐＳＫＨ−ΔｆｈｕＡベクターにＩｎ−ＦｕｓｉｏｎR ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（clontech）によりライゲーション（ligation）し、強化されたプロモーターとして知られるＰｔｒｃ及びＰｃｊ１遺伝子断片をＳｐｅ１−Ｎｄｅ１制限酵素で切断し、ａｒｏＧ遺伝子断片をＮｄｅ１−ＥｃｏＲＶ制限酵素で切断し、次いでＰｔｒｃ及びａｒｏＧ遺伝子断片又はＰｃｊ１（特許文献６）及びａｒｏＧ遺伝子断片をそれぞれＳｐｅ１−ＥｃｏＲＶ制限酵素で切断したｐＳＫＨ−ΔｆｈｕＡベクターにＩｎ−ＦｕｓｉｏｎR ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（clontech）によりライゲーション（ligation）した。作製したベクターをそれぞれｐＳＫＨ−ΔｆｈｕＡ−Ｐｎ−ａｒｏＧ、ｐＳＫＨ−ΔｆｈｕＡ−Ｐｔｒｃ−ａｒｏＧ、ｐＳＫＨ−ΔｆｈｕＡ−Ｐｃｊ１−ａｒｏＧと命名した。
【０１０１】
前記ベクターは、シーケンシングによりクローニングの是非とベクターの遺伝子配列を確認し、その後野生型大腸菌Ｗ３１１０菌株にエレクトロポレーションにより形質転換した。形質転換した遺伝子は、１次組換え（交差）により染色体に導入し、その後２次組換え（交差）により染色体からプラスミド部位を除去（excision）した。前記２次組換えが完了した大腸菌形質転換株を対象に、配列番号１４（正方向）及び８（逆方向）のプライマーを用いたＰＣＲによりａｒｏＧ遺伝子導入を確認した。
（実施例２）
【０１０２】
微細藻類由来シノリン生合成遺伝子を過剰発現するベクターの作製
Ａ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓベースのシノリン生合成遺伝子クラスターは、２−ジメチル４−デオキシガズソールシンターゼ（2-demetyl 4-deoxygadusol synthase）、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（O-methyltransferase）、Ｃ−Ｎリガーゼ（C-N ligase）及び非リボソームペプチドシンテターゼ（non-ribosomal peptide synthetase）をコードする４つの遺伝子（Ava_ABCD）で形成されており、Ａ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２９４１３のゲノムＤＮＡを用いてシノリン生合成遺伝子クラスターを同定した。ｐＥＣＣＧ１１７＿Ｐｃｊ１＿ＧＦＰ＿ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒベクターを用いて、Ａ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２９４１３由来のシノリン生合成遺伝子を含むベクターを作製した。シノリン生合成遺伝子発現ベクターの名称とベクターを作製するために用いた各鋳型及びプライマーを表２に示す。
【０１０３】
【表２】
2021514621.tif 000009
【０１０４】
前記鋳型とプライマーを用いて遺伝子断片を得た。その後、各遺伝子断片をＥｃｏＲＶ−ＸｂａＩ制限酵素で処理したｐＥＣＣＧ １１７＿Ｐｃｊ１＿ＧＦＰ＿ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒベクターにＩｎ−ＦｕｓｉｏｎR ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（clontech）によりライゲーション（ligation）した。作製したベクターをｐＥＣＣＧ１１７＿Ｐｃｊ１＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤと命名し、シーケンシングによりクローニングの是非とベクターの遺伝子配列を確認した。Ａｖａ＿ＡＢＣＤのヌクレオチド配列を配列番号１７に示す。
（実施例３）
【０１０５】
２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ活性強化菌株のシノリン生産能の評価
実施例１で作製したａｒｏＧ遺伝子強化菌株及び野生型Ｗ３１１０菌株に、実施例２で作製したｐＥＣＣＧ１１７＿Ｐｃｊ１＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤプラスミドをそれぞれエレクトロポレーションにより導入し、その後ＬＢ固体培地に塗抹した。前記菌株を３７℃の培養器で一晩培養し、その後２５ｍＬの力価培地［培地の組成：グルコース４０ｇ／Ｌ，ＫＨ2ＰＯ4 ０．３ｇ／Ｌ，Ｋ2ＨＰＯ4 ０．６ｇ／Ｌ，（ＮＨ4）2ＳＯ4 １５ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ4７Ｈ2Ｏ １ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ２．５ｇ／Ｌ，Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ １．２ｇ／Ｌ，酵母抽出物２．５ｇ／Ｌ，炭酸カルシウム４０ｇ／Ｌ：ｐＨ７．０］に１白金耳ずつ接種し、次いでそれを３７℃、２００ｒｐｍの培養器で４８時間培養した。ＨＰＬＣ（waters社）を用いた分析結果を表３に示す。
【０１０６】
【表３】
2021514621.tif 000010
【０１０７】
表３に示すように、遺伝子ａｒｏＧが強化された菌株（Ｗ３１１０ΔｆｈｕＡ：：Ｐｎ−ａｒｏＧ／ｐＥＣＣＧ１１７＿Ｐｃｊ１＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤ）から生産されたシノリン濃度は、対照群に比べて約２０％増加した。特に、プロモーターを強化することにより遺伝子ａｒｏＧが強化された菌株（Ｗ３１１０ΔｆｈｕＡ：：Ｐｔｒｃ−ａｒｏＧ／ｐＥＣＣＧ１１７＿Ｐｃｊ１＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤ，Ｗ３１１０ΔｆｈｕＡ：：Ｐｃｊ１−ａｒｏＧ／ｐＥＣＣＧ１１７＿Ｐｃｊ１＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤ）においては、６９％、９４％増加した。
（実施例４）
【０１０８】
ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ（phosphoenolpyruvate synthetase）活性強化菌株の作製
微生物のＭＡＡｓ生産能を増加させるために、ホスホエノールピルビン酸シンテターゼの活性が強化された大腸菌を作製した。具体的には、大腸菌Ｗ３１１０をベース菌株とし、ｐｐｓ（ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ；配列番号１８及び１９）遺伝子をさらに導入した。プラスミドの作製に用いた鋳型及びプライマーを表４に示す。
【０１０９】
【表４】
2021514621.tif 000011
【０１１０】
前記鋳型及びプライマーを用いてＰＣＲにより遺伝子断片を増幅し、その後Ｐｎ＿ｐｐｓ遺伝子断片をＳｐｅ１−ＥｃｏＲＶ制限酵素で切断したｐＳＫＨ−ΔｆｈｕＡベクターにＩｎ−ＦｕｓｉｏｎR ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（clontech）によりライゲーション（ligation）した。実施例１で作製したＰｔｒｃ及びＰｃｊ１遺伝子断片をＳｐｅ１−Ｎｄｅ１制限酵素で切断し、ｐｐｓ遺伝子断片をＮｄｅ１−ＥｃｏＲＶ制限酵素で切断し、次いでＰｔｒｃ及びｐｐｓ遺伝子断片又はＰｃｊ１及びｐｐｓ遺伝子断片をそれぞれＳｐｅ１−ＥｃｏＲＶ制限酵素で切断したｐＳＫＨ−ΔｆｈｕＡベクターにＩｎ−ＦｕｓｉｏｎR ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（clontech）によりライゲーション（ligation）した。作製したベクターをそれぞれｐＳＫＨ−ΔｆｈｕＡ−Ｐｎ−ｐｐｓ、ｐＳＫＨ−ΔｆｈｕＡ−Ｐｔｒｃ−ｐｐｓ、ｐＳＫＨ−ΔｆｈｕＡ−Ｐｃｊ１−ｐｐｓと命名した。
【０１１１】
前記ベクターは、シーケンシングによりクローニングの是非とベクターの遺伝子配列を確認し、その後野生型大腸菌Ｗ３１１０菌株にエレクトロポレーションにより形質転換した。形質転換した遺伝子は、１次組換え（交差）により染色体に導入し、その後２次組換え（交差）により染色体からプラスミド部位を除去（excision）した。前記２次組換えが完了した大腸菌形質転換株を対象に、配列番号１４（正方向）及び２１（逆方向）のプライマーを用いたＰＣＲによりｐｐｓ遺伝子導入を確認した。
（実施例５）
【０１１２】
ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ活性強化菌株のシノリン生産能の評価
実施例４で作製したｐｐｓ遺伝子導入菌株及び野生型Ｗ３１１０菌株に、実施例２で作製したｐＥＣＣＧ１１７＿Ｐｃｊ１＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤプラスミドをそれぞれエレクトロポレーションにより導入し、その後ＬＢ固体培地に塗抹した。前記菌株を３７℃の培養器で一晩培養し、その後実施例３の２５ｍＬの力価培地に１白金耳ずつ接種し、次いでそれを３７℃、２００ｒｐｍの培養器で４８時間培養した。その結果を表５に示す。
【０１１３】
【表５】
2021514621.tif 000012
【０１１４】
表５に示すように、遺伝子ｐｐｓが強化された菌株から生産されたシノリン濃度は４１％増加し、強いプロモーターに置換することにより活性を強化したものにおいては、対照群に比べて最大で６０％増加した。
（実施例６）
【０１１５】
トランスケトラーゼ（transketolase I/II）活性強化菌株の作製
微生物のＭＡＡｓ生産能を増加させるために、トランスケトラーゼの活性が強化された大腸菌を作製した。具体的には、大腸菌Ｗ３１１０をベース菌株とし、ｔｋｔＡ（トランスケトラーゼ；配列番号２３及び２４）遺伝子をさらに導入した。プラスミドの作製に用いた鋳型及びプライマーを表６に示す。
【０１１６】
【表６】
2021514621.tif 000013
【０１１７】
前記鋳型及びプライマーを用いてＰＣＲにより遺伝子断片を増幅し、その後Ｐｎ＿ｔｋｔＡ遺伝子断片をＳｐｅ１−ＥｃｏＲＶ制限酵素で切断したｐＳＫＨ−ΔｆｈｕＡベクターにＩｎ−ＦｕｓｉｏｎR ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（clontech）によりライゲーション（ligation）した。実施例１で作製したＰｔｒｃ及びＰｃｊ１遺伝子断片をＳｐｅ１、Ｎｄｅ１制限酵素で切断し、ｔｋｔＡ遺伝子断片をＮｄｅ１−ＥｃｏＲＶ制限酵素で切断し、次いでＰｔｒｃ及びｔｋｔＡ遺伝子断片又はＰｃｊ１及びｔｋｔＡ遺伝子断片をそれぞれＳｐｅ１−ＥｃｏＲＶ制限酵素で切断したｐＳＫＨ−ΔｆｈｕＡベクターにＩｎ−ＦｕｓｉｏｎR ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（clontech）によりライゲーション（ligation）した。作製したベクターをそれぞれｐＳＫＨ−ΔｆｈｕＡ−Ｐｎ−ｔｋｔＡ、ｐＳＫＨ−ΔｆｈｕＡ−Ｐｔｒｃ−ｔｋｔＡ、ｐＳＫＨ−ΔｆｈｕＡ−Ｐｃｊ１−ｔｋｔＡと命名した。
【０１１８】
前記ベクターは、シーケンシングによりクローニングの是非とベクターの遺伝子配列を確認し、その後野生型大腸菌Ｗ３１１０菌株にエレクトロポレーションにより形質転換した。形質転換した遺伝子は、１次組換え（交差）により染色体に導入し、その後２次組換え（交差）により染色体からプラスミド部位を除去（excision）した。前記２次組換えが完了した大腸菌形質転換株を対象に、配列番号１４（正方向）及び２６（逆方向）のプライマーを用いたＰＣＲによりｔｋｔＡ遺伝子導入を確認した。
（実施例７）
【０１１９】
トランスケトラーゼ活性強化菌株のシノリン生産能の評価
実施例６で作製したｔｋｔＡ遺伝子導入菌株及び野生型Ｗ３１１０菌株に、実施例２で作製したｐＥＣＣＧ１１７＿Ｐｃｊ１＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤプラスミドをそれぞれエレクトロポレーションにより導入し、その後ＬＢ固体培地に塗抹した。前記菌株を３７℃の培養器で一晩培養し、その後実施例３の２５ｍＬの力価培地に１白金耳ずつ接種し、次いでそれを３７℃、２００ｒｐｍの培養器で４８時間培養した。その結果を表７に示す。
【０１２０】
【表７】
2021514621.tif 000014
【０１２１】
表７に示すように、遺伝子ｔｋｔＡが強化された菌株から生産されたシノリン濃度は４．５％増加し、強いプロモーターに置換することにより活性を強化したものにおいては、対照群に比べて最大で３２％増加した。
（実施例８）
【０１２２】
２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ／ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ／トランスケトラーゼ活性強化菌株の作製
微生物のＭＡＡｓ生産能を増加させるために、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ／ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ／トランスケトラーゼの活性が強化された大腸菌を作製した。具体的には、大腸菌Ｗ３１１０をベース菌株とし、ａｒｏＧ、ｐｐｓ、ｔｋｔＡ遺伝子をさらに導入した。プラスミドの作製に用いた鋳型及びプライマーを表８に示す。
【０１２３】
【表８】
2021514621.tif 000015
【０１２４】
前記鋳型及びプライマーを用いてＰＣＲにより遺伝子断片を増幅し、その後Ｓｐｅ１−ＥｃｏＲＶ制限酵素で切断したｐＳＫＨ−ΔｆｈｕＡベクターにＩｎ−ＦｕｓｉｏｎR ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（clontech）によりライゲーション（ligation）した。作製したベクターをｐＳＫＨ−ΔｆｈｕＡ−Ｐｃｊ１−ａｒｏＧ−Ｐｃｊ１−ｐｐｓＡ−Ｐｃｊ１−ｔｋｔＡと命名した。
【０１２５】
前記ベクターは、シーケンシングによりクローニングの是非とベクターの遺伝子配列を確認し、その後野生型大腸菌Ｗ３１１０菌株にエレクトロポレーションにより形質転換した。形質転換した遺伝子は、１次組換え（交差）により染色体に導入し、その後２次組換え（交差）により染色体からプラスミド部位を除去（excision）した。前記２次組換えが完了した大腸菌形質転換株を対象に、配列番号１４（正方向）及び２６（逆方向）のプライマーを用いたＰＣＲによりａｒｏＧ、ｐｐｓ、ｔｋｔＡ遺伝子導入を確認した。
（実施例９）
【０１２６】
２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ／ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ／トランスケトラーゼ活性強化菌株のシノリン生産能の評価
実施例８で作製したａｒｏＧ、ｐｐｓ、ｔｋｔＡ遺伝子導入菌株及び野生型Ｗ３１１０菌株に、実施例２で作製したｐＥＣＣＧ１１７＿Ｐｃｊ１＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤプラスミドをエレクトロポレーションにより導入し、その後ＬＢ固体培地に塗抹した。前記菌株を３７℃の培養器で一晩培養し、その後実施例３の２５ｍＬの力価培地に１白金耳ずつ接種し、次いでそれを３７℃、２００ｒｐｍの培養器で４８時間培養した。その結果を表９に示す。
【０１２７】
【表９】
2021514621.tif 000016
【０１２８】
表９に示すように、遺伝子３種（ａｒｏＧ，ｐｐｓ，ｔｋｔＡ）が組み合わされて強化された菌株から生産されたシノリン濃度は、対照群に比べて２６７％増加した。これは、各遺伝子のプロモーターを強いプロモーターに置換して得た最大増加量の和に比べて予期せぬレベルに向上した結果である。すなわち、前記ａｒｏＧ、ｐｐｓ、ｔｋｔＡの３種の遺伝子を組み合わせると、より高い濃度のシノリンを生産できることが確認された。
（実施例１０）
【０１２９】
３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ（3-dehydroquinate dehydratase）が不活性された菌株の作製
微生物のＭＡＡｓ生産能を増加させるために、３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ（ａｒｏＤ）が不活性された菌株を作製した。
【０１３０】
具体的には、遺伝子導入マーカーとしてｐＫＤ３のクロラムフェニコール（chloramphenicol）耐性遺伝子を用い、ａｒｏＤ遺伝子の一部分とｐＫＤ３プラスミドのクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むａｒｏＤ欠損カセットは、配列番号３２（正方向）及び３３（逆方向）のプライマーを用いてＰＣＲにより作製した。野生型大腸菌Ｗ３１１０、及び実施例８で作製したａｒｏＧ、ｐｐｓ、ｔｋｔＡ遺伝子導入菌株に、ラムダレッドリコンビナーゼ遺伝子を含むｐＫＤ４６プラスミドを形質転換し、アラビノース（arabinose）を用いて当該遺伝子の発現を誘導することによりコンピテント細胞を作製した。コンピテント細胞にａｒｏＤ欠損カセットをエレクトロポレーションにより導入し、その後クロラムフェニコールを３０ｍｇ／Ｌ含むＬＢ固体培地に塗抹した。このようにして得た菌株を配列番号３４（正方向）及び３５（逆方向）のプライマーでＰＣＲし、１３００ｂｐの増幅した断片を観察してａｒｏＤ遺伝子欠損を確認した。
（実施例１１）
【０１３１】
３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼが不活性された菌株のシノリン生産能の評価
実施例１０で作製したａｒｏＤ遺伝子欠損菌株に、実施例２で作製したｐＥＣＣＧ１１７＿Ｐｃｊ１＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤプラスミドをエレクトロポレーションにより導入し、その後ＬＢ固体培地に塗抹した。前記菌株を３７℃の培養器で一晩培養し、その後実施例３の２５ｍＬの力価培地に１白金耳ずつ接種し、次いでそれを３７℃、２００ｒｐｍの培養器で４８時間培養した。その結果を表１０に示す。
【０１３２】
【表１０】
2021514621.tif 000017
【０１３３】
表１０に示すように、ａｒｏＧ、ｐｐｓ、ｔｋｔＡが強化されたシノリン生産菌株に比べて、さらにａｒｏＤが欠損した菌株は、シノリンの濃度が６６％増加した。前記ａｒｏＧ、ｐｐｓ、ｔｋｔＡが強化された菌株Ｗ３１１０ΔｆｈｕＡ：：Ｐｃｊ１−ａｒｏＧ−Ｐｃｊ１−ｐｐｓ−Ｐｃｊ１−ｔｋｔＡ／ｐＥＣＣＧ１１７＿ＰＣＪ１＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤ菌株をＣＢ０６−００２０と命名し、ブダペスト条約に基づいて２０１８年２月１４日付けで韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM）に寄託番号ＫＣＣＭ１２２２４Ｐとして寄託した。
【０１３４】
＜コリネバクテリウム・グルタミカムベースのＭＡＡｓ生産組換え微生物の作製及びそれを用いたＭＡＡｓ生産＞
（実施例１２）
【０１３５】
２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ活性強化ベクターの作製及びシノリン生産能の評価
微生物のＭＡＡｓ生産能を増加させるために、２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼの活性が強化されたコリネバクテリウム属微生物を作製した。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２をベース菌株とし、ａｒｏＧ（２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ；配列番号３６及び３７）遺伝子をさらに導入した。プラスミドの作製に用いた鋳型及びプライマーを表１１に示す。
【０１３６】
【表１１】
2021514621.tif 000018
【０１３７】
前記鋳型とプライマーを用いて遺伝子断片を得て、その後各遺伝子断片をＥｃｏＲＶ／ＸｂａＩ制限酵素で処理したｐＥＣＣＧ １１７、ｐＥＣＣＧ １１７＿Ｐｃｊ７＿ＧＦＰ＿ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（特許文献６，ｐ１１７−ｃｊ７−ｇｆｐ）ベクターにＩｎ−ＦｕｓｉｏｎR ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（clontech）によりライゲーション（ligation）した。作製したベクターをそれぞれｐＥＣＣＧ１１７＿Ｐｎ＿ｃｇｌ ａｒｏＧ、ｐＥＣＣＧ１１７＿Ｐｃｊ７＿ｃｇｌ ａｒｏＧと命名した。前記ベクターは、シーケンシングによりクローニングの是非とベクターの遺伝子配列を確認した。
【０１３８】
まず、コリネバクテリウム属微生物はシノリンを生産することができないので、シノリン生合成経路を導入した菌株を作製した。具体的には、ｐＥＣＣＧ１１７＿Ｐｔｒｃ＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤを鋳型とし、配列番号４２（正方向）及び４３（逆方向）のプライマー対を用いてＡｖａ＿ＡＢＣＤをＰＣＲした。約７ｋｂのＰＣＲ断片をＮｄｅＩ制限酵素で処理したｐＤＺＴｎベクター（特許文献７）にＩｎ−ＦｕｓｉｏｎR ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（clontech）によりライゲーション（ligation）してｐＤＺＴｎ＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤを作製した。その後、配列番号４４（正方向）及び４５（逆方向）のプライマー対でＯ２プロモーター（特許文献４）断片をＰＣＲし、ｐＤＺＴｎ＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤをＮｄｅＩ制限酵素で処理したベクターにＩｎ−ＦｕｓｉｏｎR ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（clontech）によりライゲーション（ligation）してｐＤＺＴｎ＿ＰＯ２＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤを作製した。
【０１３９】
前記組換えプラスミドを野生のコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２にエレクトロポレーションにより形質転換し（van der Rest et al. 1999）、前記プラスミドを１次組換え（交差）により染色体に導入し、その後２次組換え（交差）により染色体からプラスミドを除去（excision）した。
【０１４０】
前記２次組換えが完了したコリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、各遺伝子特異的プライマー（gene-specific primer）対である配列番号４２及び４３を用いたＰＣＲによりＡｖａ＿ＡＢＣＤ遺伝子の導入を確認した。作製した菌株をコリネバクテリウム・グルタミカム１３０３２△Ｎ１０２１ＰＯ２＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤと命名した。
【０１４１】
前記コリネバクテリウム・グルタミカム１３０３２△Ｎ１０２１＿ＰＯ２＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤ菌株にそれぞれｐＥＣＣＧ１１７＿Ｐｎ＿ｃｇｌ ａｒｏＧ、ｐＥＣＣＧ１１７＿Ｐｃｊ７＿ｃｇｌ ａｒｏＧベクターをエレクトロポレーションにより形質転換した。
【０１４２】
前述したように作製した菌株及び対照群であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２（ｃ．ｇｌ １３０３２）を、カナマイシン（Kanamycin）を含むＢＨＩＳ固体培地で一晩培養し、前記菌株を２５ｍＬの力価培地［培地の組成：グルコース４０ｇ／Ｌ，ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ／Ｌ，（ＮＨ4）2ＳＯ4 １０ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ4７Ｈ2Ｏ ５ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ，酵母抽出物５ｇ／Ｌ，炭酸カルシウム３０ｇ／Ｌ：ｐＨ７．０］に１白金耳ずつ接種し、次いでそれを３７℃、２００ｒｐｍの培養器で４８時間培養した。その結果を表１２に示す。
【０１４３】
【表１２】
2021514621.tif 000019
【０１４４】
表１２に示すように、シノリン生合成遺伝子を含む菌株のａｒｏＧ発現量を増加させると、シノリンの濃度が３９％増加した。特に、プロモーターを強化すると、シノリンの濃度が８０％まで向上することが確認された。
（実施例１３）
【０１４５】
ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ／トランスケトラーゼ活性強化ベクターの作製及びシノリン生産能の評価
微生物のＭＡＡｓ生産能を増加させるために、ｔｋｔ又はｐｐｓの活性が強化されたコリネバクテリウム・グルタミカムを作製した。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２をベース菌株とし、ｔｋｔ（トランスケトラーゼ；配列番号９５及び９６）又はｐｐｓ（ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ；配列番号９７及び９８）遺伝子をさらに導入した。プラスミドの作製に用いた鋳型及びプライマーを表１３に示す。
【０１４６】
【表１３】
2021514621.tif 000020
【０１４７】
鋳型とプライマーの組み合わせを合わせてＰＣＲ技法により得た遺伝子断片とＥｃｏＲＶ／ＸｂａＩ制限酵素で処理したｐＥＣＣＧ１１７、ｐＥＣＣＧ１１７＿Ｐｔｒｃ＿ＧＦＰ＿ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ及びｐＥＣＣＧ １１７＿Ｐｃｊ７＿ＧＦＰ＿ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒベクターをＩｎ−ＦｕｓｉｏｎR ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（clontech）によりライゲーション（ligation）して作製した。作製したベクターをそれぞれｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｎ−ｔｋｔ／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｔｋｔ及びｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｔｒｃ−ｐｐｓ／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｐｐｓと命名した。前記ベクターは、シーケンシングによりクローニングの是非とベクターの遺伝子配列を確認し、その後コリネバクテリウム・グルタミカム１３０３２△Ｎ１０２１＿ＰＯ２＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤ菌株にエレクトロポレーションにより形質転換した。作製したＫａｎａｍｙｃｉｎを含むＢＨＩＳ固体培地で一晩培養した菌株を実施例１２の２５ｍＬの力価培地に１白金耳ずつ接種し、次いでそれを３７℃、２００ｒｐｍの培養器で４８時間培養した。その結果を表１４に示す。
【０１４８】
【表１４】
2021514621.tif 000021
【０１４９】
表１４に示すように、遺伝子ｔｋｔ、ｐｐｓを強化すると、シノリン生産がそれぞれ最大で５７％又は７２％向上することが確認された。
（実施例１４）
【０１５０】
２−デヒドロ−３−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ／ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ／トランスケトラーゼ活性強化菌株の作製及び評価
微生物のＭＡＡｓ生産能を増加させるために、ａｒｏＧ、ｐｐｓ及びｔｋｔの活性が強化されたコリネバクテリウム・グルタミカムを作製し、より高いＭＡＡｓ生産量を得るために、さらに３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ（ａｒｏＤ）も不活性化した。具体的には、ａｒｏＧ、ｐｐｓ、ｔｋｔＡ遺伝子の強化のためにｐＤＺ−ΔａｒｏＤ−Ｐｃｊ７−ａｒｏＧ−Ｐｃｊ７−ｐｐｓ−Ｐｃｊ７−ｔｋｔＡプラスミドを作製した。前記ｐＤＺ−ΔａｒｏＤ−Ｐｃｊ７−ａｒｏＧ−Ｐｃｊ７−ｐｐｓ−Ｐｃｊ７−ｔｋｔＡプラスミドの作製に用いた鋳型及びプライマーを表１５に示す。
【０１５１】
【表１５】
2021514621.tif 000022
【０１５２】
まず、コリネバクテリウム・グルタミカムのａｒｏＤ遺伝子（配列番号８９及び９０）欠失菌株を作製するために、ａｒｏＤのオープンリーディングフレーム（open reading frame）が内部で欠失したｐＤＺ−ΔａｒｏＤプラスミドを作製した。前記ｐＤＺ−ΔａｒｏＤの内部での遺伝子消失は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ １３０３２ゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号９１及び９２、並びに配列番号９３及び９４の正方向及び逆方向プライマー対で交差ＰＣＲを行って生成した遺伝子断片をｐＤＺベクターに導入することにより作製した。
【０１５３】
次に、表１５の鋳型及びプライマーを用いてａｒｏＧ、ｐｐｓ及びｔｋｔの各遺伝子断片をＰＣＲにより増幅し、その後ＳｐｅＩ制限酵素で切断したｐＤＺ−ΔａｒｏＤベクターにそれぞれ導入した。前記２種のベクターは、シーケンシングによりクローニングの是非とベクターの遺伝子配列を確認し、その後コリネバクテリウム・グルタミカム１３０３２△Ｎ１０２１＿ＰＯ２＿Ａｖａ＿ＡＢＣＤ菌株にエレクトロポレーションにより形質転換した。作製したＫａｎａｍｙｃｉｎを含むＢＨＩＳ固体培地で一晩培養した菌株を実施例１２の２５ｍＬの力価培地に１白金耳ずつ接種し、次いでそれを３７℃、２００ｒｐｍの培養器で４８時間培養した。その結果を表１６に示す。
【０１５４】
【表１６】
2021514621.tif 000023
【０１５５】
表１６に示すように、遺伝子３種（ａｒｏＧ，ｐｐｓ，ｔｋｔＡ）が強化された菌株から生産されたシノリン濃度は、対照群に比べて約２５％増加した。よって、ａｒｏＤ欠損によりシノリン生産能を向上させた菌株においても、前記３種の遺伝子を組み合わせると高い濃度でシノリンを生産できることが確認された。また、前記３種の遺伝子の強化を組み合わせた菌株においてさらにａｒｏＤ遺伝子を不活性化すると、より高い濃度でシノリンを生産できるものと解釈される。
【０１５６】
＜ＹｅａｓｔベースのＭＡＡｓ生産組換え微生物の作製及びそれを用いたＭＡＡｓ生産＞
（実施例１５）
【０１５７】
シノリンを生産するサッカロマイセス・セレビシエ（S. cerevisiae）菌株の作製
サッカロマイセス・セレビシエ（S. cerevisiae）をシノリン生産菌株として用いるために、Ａ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２９４１３由来のシノリン生合成遺伝子をｙｅａｓｔ発現用ベクターに導入した。ＧＰＤプロモーターを用いてｐＲＳ−４１３ベクターにＡｖａ＿Ａ及びＡｖａ＿Ｂ遺伝子を挿入した。具体的には、ｐＧＰＤ−Ａｖａ＿Ａ、ｐＧＰＤ−Ａｖａ＿Ｂ部位をｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲにより連結し、その後ベクターとＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔを制限酵素ＢａｍＨ Ｉ、Ｓａｌ Ｉで処理し、次いでＴ４リガーゼを用いて連結することによりｐＲＳ−４１３−ｐＧＰＤ−Ａｖａ＿Ａ−ｐＧＰＤ−Ａｖａ＿Ｂベクターを作製した。
【０１５８】
次に、ＧＰＤプロモーターを用いてｐＲＳ−４１４ベクターにＡｖａ＿Ｃ及びＡｖａ＿Ｄ遺伝子を挿入した。具体的には、ｐＧＰＤ−Ａｖａ＿Ｃ、ｐＧＰＤ−Ａｖａ＿Ｄ部位をｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲにより連結し、その後ベクターとＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔを制限酵素ＢａｍＨ Ｉ、Ｓａｌ Ｉで処理し、次いでＴ４リガーゼを用いて連結することにより、ｐＲＳ−４１４−ｐＧＰＤ−Ａｖａ＿Ｃ−ｐＧＰＤ−Ａｖａ＿Ｄベクターを作製した。ベクターの作製に用いたプライマーと鋳型ＤＮＡを表１７に示す。
【０１５９】
【表１７】
2021514621.tif 000024
【０１６０】
ｐＲＳ−４１３−ｐＧＰＤ−Ａｖａ＿Ａ−ｐＧＰＤ−Ａｖａ＿Ｂベクター及びｐＲＳ−４１４−ｐＧＰＤ−Ａｖａ＿Ｃ−ｐＧＰＤ−Ａｖａ＿Ｄベクターをサッカロマイセス・セレビシエＣＥＮ．ＰＫ−１Ｄ（S. cerevisiae CEN.PK-1D）に酢酸リチウム形質転換法により導入し、その後シノリン生産の有無を確認した。ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ ｍａｒｋｅｒであるＴｒｐ、Ｈｉｓを除去したＳＣ（synthetic complete）固体培地に塗抹し、その後３０℃の培養器で一晩培養した。Ｔｒｐ、Ｈｉｓを除去したＳＣ（synthetic complete）固体培地で一晩培養した菌株を表１８の２５ｍＬの力価培地に１白金耳ずつ接種し、次いでそれを３０℃、１５０ｒｐｍの培養器で２４時間培養した。その結果を表１９に示す。
【０１６１】
【表１８】
2021514621.tif 000025
【０１６２】
【表１９】
2021514621.tif 000026
【０１６３】
実験の結果、シノリンを生産しない野生型サッカロマイセス・セレビシエ菌株にシノリン生合成遺伝子を導入すると、３３１ｍｇ／ｌのシノリンを生産することが確認された。
（実施例１６）
【０１６４】
サッカロマイセス・セレビシエのＴＫＬ１（トランスケトラーゼ）強化によるシノリン生産量の増大
ＭＡＡｓ生産能を増加させるために、ＴＫＬ１の活性が強化されたサッカロマイセス・セレビシエ菌株を作製した。そのために、ｐＲＳ−４１５−ｐＧＰＤ、ｐＲＳ−４１５−ｐＡＤＨ、ｐＲＳ−４１５−ｐＴＥＦベクターにＴＫＬ１遺伝子（配列番号１１０及び１２３）をクローニングすることによりＴＫＬ１遺伝子の発現を強化した。
【０１６５】
前記ｐＲＳ−４１５−ｐＧＰＤベクターに含まれるＧＰＤプロモーターは、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）、ｉｓｏｚｙｍｅ ３（ＴＤＨ3）遺伝子のプロモーターであり、ＴＨＤ３遺伝子のＯＲＦの開始コドンから−６７４ｂｐ〜−１ｂｐの配列を含む。
【０１６６】
前記ｐＲＳ−４１５−ｐＡＤＨベクターに含まれるＡＤＨプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH1: Alcohol dehydrogenase）遺伝子のプロモーターであり、ＡＤＨ１遺伝子のＯＲＦの開始コドンから−１５００ｂｐ〜−１ｂｐの配列を含む。
【０１６７】
前記ｐＲＳ−４１５−ｐＴＥＦベクターに含まれるＴＥＦプロモーターは、翻訳伸長因子（TEF1: Translational elongation factor EF-1 alpha）遺伝子のプロモーターであり、ＴＥＦ１遺伝子のＯＲＦの開始コドンから−５００ｂｐ〜−１ｂｐの配列を含む。
【０１６８】
具体的には、表２０のプライマーを用いてＴＫＬ１遺伝子をＰＣＲし、その後ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔとｐＲＳ−４１５−ｐＧＰＤ、ｐＲＳ−４１５−ｐＡＤＨ、ｐＲＳ−４１５−ｐＴＥＦベクターを制限酵素ＢａｍＨ Ｉ及びＳａｌ Ｉで処理し、次いでＴ４リガーゼを用いて連結することによりｐＲＳ−４１５−ｐＧＰＤ−ＴＫＬ１、ｐＲＳ−４１５−ｐＡＤＨ−ＴＫＬ１、ｐＲＳ−４１５−ｐＴＥＦ−ＴＫＬ１ベクターを作製した。
【０１６９】
【表２０】
2021514621.tif 000027
【０１７０】
次に、実施例１５で作製したシノリン生合成プラスミドをｐＲＳ−４１５−ｐＧＰＤ−ＴＫＬ１、ｐＲＳ−４１５−ｐＡＤＨ−ＴＫＬ１、ｐＲＳ−４１５−ｐＴＥＦ−ＴＫＬ１と共にサッカロマイセス・セレビシエＣＥＮ．ＰＫ−１Ｄ菌株に導入し、Ｔｒｐ、Ｕｒａ、Ｈｉｓを除去したＳＣ（synthetic complete）固体培地に塗抹し、その後３０℃の培養器で一晩培養した。Ｔｒｐ、Ｕｒａ、Ｈｉｓを除去したＳＣ（synthetic complete）固体培地で一晩培養した菌株を２５ｍＬの力価培地に１白金耳ずつ接種し、次いでそれを３０℃、１５０ｒｐｍの培養器で２４時間培養した。その結果を表２１に示す。
【０１７１】
【表２１】
2021514621.tif 000028
【０１７２】
表２１に示すように、ＧＰＤプロモーターを用いてＴＫＬ１遺伝子の発現を強化した菌株において、ＷＴに比べてシノリン生産量が増加することが確認された。また、プロモーターの強度が増加するにつれて（ｐＧＰＤ＞ｐＴＥＦ＞ｐＡＤＨ）シノリン生産量が増加することも確認された。
（実施例１７）
【０１７３】
サッカロマイセス・セレビシエのＡＲＯ４（３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロン酸−７−リン酸（ＤＡＨＰ）シンターゼ）強化によるシノリン生産量の増大
ＭＡＡｓ生産能を増加させるために、ＡＲＯ４の活性が強化されたサッカロマイセス・セレビシエ菌株を作製した。そのために、ｐＲＳ−４１５−ｐＧＰＤ、ｐＲＳ−４１５−ｐＡＤＨ、ｐＲＳ−４１５−ｐＴＥＦベクターにＡＲＯ４遺伝子（配列番号１１１及び１２４）をクローニングすることによりＡＲＯ４遺伝子の発現を強化する方法を用いた。具体的には、表２２のプライマーを用いてＡＲＯ４遺伝子をＰＣＲし、その後ＡＲＯ４ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔとｐＲＳ−４１５−ｐＧＰＤ、ｐＲＳ−４１５−ｐＡＤＨ、ｐＲＳ−４１５−ｐＴＥＦベクターを制限酵素ＢａｍＨ Ｉ及びＳａｌ Ｉで処理し、次いでＴ４リガーゼを用いて連結することによりｐＲＳ−４１５−ｐＧＰＤ−ＡＲＯ４、ｐＲＳ−４１５−ｐＡＤＨ−ＡＲＯ４、ｐＲＳ−４１５−ｐＴＥＦ−ＡＲＯ４ベクターを作製した。
【０１７４】
【表２２】
2021514621.tif 000029
【０１７５】
次に、実施例１５で作製したシノリン生合成プラスミドをｐＲＳ−４１５−ｐＧＰＤ−ＡＲＯ４、ｐＲＳ−４１５−ｐＡＤＨ−ＡＲＯ４、ｐＲＳ−４１５−ｐＴＥＦ−ＡＲＯ４と共にサッカロマイセス・セレビシエＣＥＮ．ＰＫ−１Ｄ菌株に導入し、Ｔｒｐ、Ｕｒａ、Ｈｉｓを除去したＳＣ（synthetic complete）固体培地に塗抹し、その後３０℃の培養器で一晩培養した。Ｔｒｐ、Ｕｒａ、Ｈｉｓを除去したＳＣ（synthetic complete）固体培地で一晩培養した菌株を２５ｍＬの力価培地に１白金耳ずつ接種し、次いでそれを３０℃、１５０ｒｐｍの培養器で２４時間培養した。その結果を表２３に示す。
【０１７６】
【表２３】
2021514621.tif 000030
【０１７７】
表２３に示すように、ＧＰＤプロモーターを用いてＡＲＯ４遺伝子の発現を強化した菌株において、ＷＴに比べてシノリン生産量が１８７％増加することが確認された。
（実施例１８）
【０１７８】
サッカロマイセス・セレビシエのｐｐｓ（ホスホエノールピルビン酸シンテターゼ）強化によるシノリン生産量の増大
ＭＡＡｓ生産能を向上させるために、ｐｐｓの活性が強化されたサッカロマイセス・セレビシエ菌株を作製した。そのために、ｐＲＳ−４１５−ｐＧＰＤ、ｐＲＳ−４１５−ｐＡＤＨ、ｐＲＳ−４１５−ｐＴＥＦベクターに大腸菌のｐｐｓ遺伝子をクローニングすることによりｐｐｓ遺伝子の発現を強化する方法を用いた。
【０１７９】
具体的には、表２４のプライマーを用いてｐｐｓ遺伝子をＰＣＲし、その後ｐｐｓ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔとｐＲＳ−４１５−ｐＧＰＤ、ｐＲＳ−４１５−ｐＡＤＨ、ｐＲＳ−４１５−ｐＴＥＦベクターを制限酵素ＢａｍＨ Ｉ及びＳａｌ Ｉで処理し、次いでＴ４リガーゼを用いて連結することによりｐＲＳ−４１５−ｐＧＰＤ−ｐｐｓ、ｐＲＳ−４１５−ｐＡＤＨ−ｐｐｓ、ｐＲＳ−４１５−ｐＴＥＦ−ｐｐｓベクターを作製した。
【０１８０】
【表２４】
2021514621.tif 000031
【０１８１】
次に、実施例１５で作製したシノリン生合成プラスミドをｐＲＳ−４１５−ｐＧＰＤ−ｐｐｓ、ｐＲＳ−４１５−ｐＡＤＨ−ｐｐｓ、ｐＲＳ−４１５−ｐＴＥＦ−ｐｐｓと共にサッカロマイセス・セレビシエＣＥＮ．ＰＫ−１Ｄ菌株に導入し、Ｔｒｐ、Ｕｒａ、Ｈｉｓを除去したＳＣ（synthetic complete）固体培地に塗抹し、その後３０℃の培養器で一晩培養した。Ｔｒｐ、Ｕｒａ、Ｈｉｓを除去したＳＣ（synthetic complete）固体培地で一晩培養した菌株を２５ｍＬの力価培地に１白金耳ずつ接種し、次いでそれを３０℃、１５０ｒｐｍの培養器で２４時間培養した。その結果を表２５に示す。
【０１８２】
【表２５】
2021514621.tif 000032
【０１８３】
表２５に示すように、ｐｐｓ遺伝子を過剰発現する菌株において、ＷＴに比べてシノリン生産量が７０％増加することが確認された。また、プロモーターの強度が増加するにつれて（ｐＧＰＤ＞ｐＴＥＦ＞ｐＡＤＨ）シノリン生産量が増加することも確認された。
（実施例１９）
【０１８４】
サッカロマイセス・セレビシエ菌株におけるＴＫＬ１強化、ＡＲＯ４強化、ｐｐｓ遺伝子導入によるシノリン生産量の増大
実施例１６、１７及び１８の結果に基づいて、サッカロマイセス・セレビシエにおいてシノリン生合成に影響を与える有効因子としてＴＫＬ１、ＡＲＯ４、ｐｐｓ（E. coli）遺伝子を選定し、その３種の遺伝子の同時強化によりシノリン生合成を増大させることを試みた。３種の有効遺伝子を導入するために、ｐＲＳ−４１５−ｐＧＰＤ−ＴＫＬ１−ｐＧＰＤ−ＡＲＯ４、ｐＲＳ−４１６−ｐＧＰＤ−ｐｐｓベクターを作製した。具体的には、ｐＧＰＤ−ＴＫＬ１、ｐＧＰＤ−ＡＲＯ４部位をｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲにより連結し、その後ベクターとＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔを制限酵素ＢａｍＨ Ｉ、Ｓａｌ Ｉで処理し、次いでＴ４リガーゼを用いて連結することによりｐＲＳ−４１５−ｐＧＰＤ−ＴＫＬ１−ｐＧＰＤ−ＡＲＯ４ベクターを作製した。
【０１８５】
次に、大腸菌由来のｐｐｓ遺伝子をＰＣＲし、その後ｐｐｓ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔとｐＲＳ−４１６−ｐＧＰＤベクターを制限酵素ＢａｍＨ Ｉ及びＳａｌ Ｉで処理し、次いでＴ４リガーゼを用いて連結することによりｐＲＳ−４１６−ｐＧＰＤ−ｐｐｓベクターを作製した。ベクターの作製に用いたプライマーと鋳型ＤＮＡを表２６に示す。
【０１８６】
【表２６】
2021514621.tif 000033
【０１８７】
次に、実施例１５で作製したシノリン生合成プラスミドをｐＲＳ−４１５−ｐＧＰＤ−ＴＫＬ１−ｐＧＰＤ−ＡＲＯ４、ｐＲＳ−４１６−ｐＧＰＤ−ｐｐｓベクターと共にサッカロマイセス・セレビシエＣＥＮ．ＰＫ−１Ｄ菌株に導入し、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、Ｕｒａ、Ｈｉｓを除去したＳＣ（synthetic complete）固体培地に塗抹し、その後３０℃の培養器で一晩培養した。Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、Ｕｒａ、Ｈｉｓを除去したＳＣ（synthetic complete）固体培地で一晩培養した菌株を２５ｍＬの力価培地に１白金耳ずつ接種し、次いでそれを３０℃、１５０ｒｐｍの培養器で２４時間培養した。その結果を表２７に示す。
【０１８８】
【表２７】
2021514621.tif 000034
【０１８９】
表２７に示すように、３種の有効遺伝子（ｐｐｓ，ＴＫＬ１，ＡＲＯ４）が過剰発現する菌株において、ＷＴに比べてシノリン生産量が２３０％に画期的に増加することが確認された。
【０１９０】
本明細書においては、本発明の技術分野における通常の知識を有する者であれば十分に認識、類推できる内容はその詳細な記載を省略し、本明細書に記載されている具体的な例示以外に、本発明の技術的思想や必須構成を変更しない範囲で様々な変形をすることができる。よって、本発明は、本明細書において具体的に説明、例示したものとは異なる方式で実施することができ、それらは本発明の技術分野における通常の知識を有する者であれば理解できる事項である。
【０１９１】
2021514621.tif 000035
【配列表】
2021514621000001.app
【国際調査報告】
2021514621.tif 000036
2021514621.tif 000037
2021514621.tif 000038
2021514621.tif 000039
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