(57)【要約】  本発明は、ネイティブのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）に対して向けられたアイソタイプＧ抗体であって、  −  高度なシアル化を示すＦｃ断片、および  −  自己抗原に結合することが可能なＦａｂ断片を含む、抗体に関する。本発明はまた、このような抗体を含有する組成物、および療法におけるその使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネイティブのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）に対して向けられたアイソタイプＧ抗体であって、
−  高度なシアル化を示すＦｃ断片、および
−  自己抗原に結合することが可能なＦａｂ断片
を含む、抗体。
【請求項２】
Ｆｃ断片が、親抗体のそれと比べて改変されており、前記Ｆｃ断片の２４０位〜２４３位、２５８位〜２６７位および２９０位〜３０５位におけるアミノ酸から選択される少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含み、番号付けは、ＥＵインデックスの番号付けまたはＫａｂａｔにおけるそれと同等なものである、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
突然変異が、Ｖ２６２ｄｅｌ、Ｖ２６３Ｆ、Ｖ２６３Ｋ、Ｖ２６３Ｗ、Ｖ２６４Ｋ、Ｖ２６４Ｐ、Ｄ２６５Ａ、Ｄ２６５Ｅ、Ｄ２６５Ｇ、Ｄ２６５Ｌ、Ｄ２６５Ｓ、Ｄ２６５Ｖ、Ｖ２６６Ａ、Ｖ２６６Ｐ、Ｖ２６６Ｓ、Ｖ２６６Ｔ、Ｓ２６７Ｎ、Ｓ２６７Ｐ、Ｓ２６７Ｒ、Ｓ２６７Ｗ、Ｐ２９１Ｃ、Ｐ２９１Ｖ、Ｐ２９１Ｙ、Ｐ２９１Ｗ、Ｒ２９２Ａ、Ｒ２９２ｄｅｌ、Ｒ２９２Ｔ、Ｒ２９２Ｖ、Ｒ２９２Ｙ、Ｅ２９３ｄｅｌ、Ｅ２９３Ｆ、Ｅ２９３Ｐ、Ｅ２９３Ｗ、Ｅ２９３Ｙ、Ｅ２９４ｄｅｌ、Ｅ２９４Ｄ、Ｅ２９４Ｎ、Ｅ２９４Ｗ、Ｅ２９４Ｆ、Ｅ２９３ｄｅｌ／Ｅ２９４ｄｅｌ、Ｑ２９５Ｄ、Ｑ２９５ｄｅｌ、Ｑ２９５Ｆ、Ｑ２９５Ｇ、Ｑ２９５Ｋ、Ｑ２９５Ｎ、Ｑ２９５Ｒ、Ｑ２９５Ｗ、Ｙ２９６Ａ、Ｙ２９６Ｃ、Ｙ２９６ｄｅｌ、Ｙ２９６Ｅ、Ｙ２９６Ｇ、Ｙ２９６Ｑ、Ｙ２９６Ｒ、Ｙ２９６Ｖ、Ｓ２９８ｄｅｌ、Ｓ２９８Ｅ、Ｓ２９８Ｆ、Ｓ２９８Ｇ、Ｓ２９８Ｌ、Ｓ２９８Ｍ、Ｓ２９８Ｎ、Ｓ２９８Ｐ、Ｓ２９８Ｒ、Ｓ２９８Ｔ、Ｓ２９８Ｗ、Ｓ２９８Ｙ、Ｙ３００Ｄ、Ｙ３００ｄｅｌ、Ｙ３００Ｇ、Ｙ３００Ｎ、Ｙ３００Ｐ、Ｙ３００Ｒ、Ｙ３００Ｓ、Ｒ３０１Ａ、Ｒ３０１Ｆ、Ｒ３０１Ｇ、Ｒ３０１Ｈ、Ｒ３０１Ｉ、Ｒ３０１Ｋ、Ｒ３０１Ｑ、Ｒ３０１Ｖ、Ｒ３０１Ｗ、Ｒ３０１Ｙ、Ｖ３０２ｄｅｌ、Ｖ３０２Ａ、Ｖ３０２Ｆ、Ｖ３０２Ｇ、Ｖ３０２Ｐ、Ｖ３０３Ａ、Ｖ３０３Ｃ、Ｖ３０３Ｐ、Ｖ３０３Ｌ、Ｖ３０３Ｓ、Ｖ３０３Ｙ、Ｓ３０４Ｃ、Ｓ３０４Ｍ、Ｓ３０４Ｑ、Ｓ３０４Ｔ、Ｖ３０５ＦおよびＶ３０５Ｌから選択され、番号付けは、ＥＵインデックスの番号付けまたはＫａｂａｔにおけるそれと同等なものである、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
Ｆｃ断片が、親抗体のそれと比べて改変されており、少なくともＥ２９４ｄｅｌ突然変異を含み、番号付けは、ＥＵインデックスの番号付けまたはＫａｂａｔにおけるそれと同等なものである、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
ネイティブのＭＯＧに対して向けられており、以下の６つのＣＤＲ：
Ｈ−ＣＤＲ１：配列番号１１、
Ｈ−ＣＤＲ２：配列番号１２、
Ｈ−ＣＤＲ３：配列番号１３、
Ｌ−ＣＤＲ１：配列番号１４、
Ｌ−ＣＤＲ２：ＧＡＳ、および
Ｌ−ＣＤＲ３：配列番号１５
を含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４から選択され、好ましくは、ＩｇＧ１である、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
キメラ、ヒト化またはヒトである、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
ＥＵインデックスの番号付けまたはＫａｂａｔにおけるそれと同等なもので、重鎖として、２９４位にグルタミン酸の欠失を有する配列番号２４の配列、および軽鎖として、配列番号２５の配列を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
薬学的に許容される媒体中に、請求項１から８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を含む組成物。
【請求項１０】
医薬としてのその使用のための、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体または請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
自己免疫疾患を防止および／または処置することにおけるその使用のための、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体または請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
抗ＭＯＧ抗体が関与する脱髄疾患、好ましくは、急性播種性脳脊髄炎、デビックの視神経脊髄炎および多発性硬化症から選択される脱髄疾患を防止および／または処置するためのその使用のための、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体または請求項９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己抗原に対して向けられたアイソタイプＧ抗体、好ましくはネイティブのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）に対して向けられたアイソタイプＧ抗体であって、
−  高度なシアル化を示すＦｃ断片、および
−  自己抗原に結合することが可能なＦａｂ断片
を含む、抗体に関する。
【０００２】
本発明はまた、このような抗体を含有する組成物、療法におけるその使用、特定には、多発性硬化症の防止および／または処置におけるその使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
自己免疫疾患は、免疫応答が、誤って組織や臓器の天然成分を標的とする場合に起こる。生じた炎症性応答は、臓器の天然の機能を妨げ、重度の組織傷害を引き起こし、結果として疾患の発現が生じる。ＴおよびＢリンパ球の活性化は、全ての自己免疫疾患に共通しており、有害な細胞性および体液性の炎症性応答を引き起こす。これらの応答は、Ｔリンパ球受容体およびＢリンパ球の存在のために抗原特異的であり、自己免疫の場合、標的化された攻撃性を組織由来の自己抗原に科す。これはなぜなら、病変から単離された抗体およびＴリンパ球は、炎症を起こしている組織に存在する自己抗原に容易に反応するためである。
【０００４】
現在、臓器特異的自己免疫疾患の処置は、免疫細胞を枯渇させ、その組織損傷への移動をブロックし、エフェクターサイトカインを中和することを目的とする緩和アプローチに基づいており、または静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）の投与に基づくことさえある。しかしながら、これらの処置が効果的であるとしても、一旦処置が終わってしまえば、疾患の天然の経過が復活する。
【０００５】
免疫介在性の炎症性疾患を治すことを目的とする将来的な療法は、処置期間を過ぎても持続するその有効性を増加させる必要がある。臓器特異的自己免疫疾患の場合、これは、免疫寛容が回復するように免疫系を再学習させることを含む。
【０００６】
１つの臓器特異的自己免疫疾患は、多発性硬化症（ＭＳ）である。
【０００７】
ＭＳは、中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患である。ＣＮＳは、脳および脊髄で構成される。顕微鏡レベルで、中枢神経系は、主として星状細胞、ミエリン形成に関与する希突起膠細胞、およびニューロンで構成され、ニューロンのそれぞれは、細胞体とミエリン鞘で囲まれた伸長部分（軸索）で構成される。
【０００８】
このミエリン鞘は、神経線維を隔離し保護するのに役立ち、さらに、情報を有する神経インパルスのニューロンに沿った伝播速度においても役割を果たす。
【０００９】
ＭＳは、脳と脊髄の両方の白質における限局性病変を特徴とする。この疾患の病理学的なマーカーとしては、髄鞘脱落、希突起膠細胞のアポトーシス、軸索の損傷、および最終的にはニューロンの損失が挙げられる。この組織損傷は、病変へのリンパ球および骨髄性細胞の浸潤によって示されるように、炎症によって引き起こされる。この病態生理学は、軸索内における神経インパルス伝導を困難にしており、それが運動、知覚および認知障害の原因となる。期間に程度の差はあるが、これらの障害は、回復不能のハンディキャップに進行する可能性がある。
【００１０】
最も一般的には、ＭＳは、再発−寛解期間から始まるが、その間、活発な臨床的障害を有する期間と、それに続く長期の寛解期とが起こる。病変内で、炎症が消失し、修復メカニズム（再ミエリン化）により患者は適切な神経伝導を回復させることができる。ただし残念なことに、ＭＳの一部の進行型において、または重度の炎症性の攻撃の間、再ミエリン化メカニズムはそれに負けて、対応する神経学的兆候を伴って回復不能の神経インパルス伝導障害が始まる。臨床的に、これらの患者は、段階的な進行を特徴とする二次進行経過に進行する。
【００１１】
ＭＳは、自己免疫疾患とみなされる。ＭＳにおいて、免疫系は、ミエリンを含むＣＮＳにおける抗原性の標的を攻撃する。免疫応答の全ての要素が関与しており、これにはリンパ球、骨髄性細胞だけでなく、合成されたサイトカインや免疫細胞によって放出されたサイトカインも含まれ、これは、時には攻撃を促進し、時にはそれを和らげる。ＭＳにおける免疫応答は、固定ではなく、複合的であり、抗原特異性に関して、さらには発病メカニズムにおいての両方で長期にわたり進行する。現在使用されているＤＭＡＲＤは、リンパ球に直接的に作用するか、またはそれを枯渇させることによって、もしくはそれらのＣＮＳへの移動を抑制して炎症性の攻撃の程度を制限することによって作用するかのいずれかである。
【００１２】
しかしながら、現在の処置がぶり返しを低減し、患者の生活の質を改善する一方で、それらは、疾患の進行を制御することにおいて十分に有効ではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、特定には、疾患の進行の速度を遅くすること、および／または疾患の進行を低減することが可能な、ＭＳの有効な処置への必要性がある。
【００１４】
より一般的には、自己免疫疾患、特定には臓器特異的自己免疫疾患の有効な処置への必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、この問題に取り組むものである。
【００１６】
本発明は、自己抗原に対して向けられたアイソタイプＧ抗体であって、
−  高度なシアル化を示すＦｃ断片、および
−  自己抗原に結合することが可能なＦａｂ断片
を含む、抗体に関する。
【００１７】
より好ましくは、本発明は、ネイティブのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）に対して向けられたアイソタイプＧ抗体であって、
−  高度なシアル化を示すＦｃ断片、および
−  ネイティブのＭＯＧに結合することが可能なＦａｂ断片
を含む、抗体に関する。
【００１８】
実際に、実施例で実証されたように、発明者らは、疾患の進行の速度を遅くすること、および／または疾患の進行を低減することが可能な特異的な抗ＭＯＧ  ＩｇＧ抗体を同定した。この抗体は、病原性クローン８−１８Ｃ５（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから参照番号ＭＡＢ５６８０で商業的に入手可能）から得られ；これは、ネイティブのヒトまたはネズミＭＯＧタンパク質に結合できるが、直鎖状断片ＭＯＧ３５〜５５には結合できない。
【００１９】
加えて、この抗体は、特定には高度にシアル化されたＦｃ断片を含むという点で、病原性クローン８−１８Ｃ５と比較して改変されている。より正確には、そのＦｃは、２９４位にグルタミン酸の点欠失を含み（番号付けは、ＥＵインデックスの番号付けまたはＫａｂａｔにおけるそれと同等なものである）、それにより、この欠失が存在しないＦｃと比較して増加したシアル化がそれに付与される。
【００２０】
この欠失は、特定には、ＦｃＲｎへの結合に影響を与えずに、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩＩＢに対して低減された結合親和性；および抗炎症特性をバリアントに付与する。この抗体は、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）のマウスモデルにおいて、疾患の重症度を弱くする。
【００２１】
本出願において使用される定義は、以下の通りである：
「Ｆｃ断片」または「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリンの第１の定常領域ドメイン（すなわちＣＨ１−ＣＬ）を除いた全長免疫グロブリン（抗体）の定常領域を意味する。したがってＦｃ断片は、それぞれの単量体が、ＩｇＧの最後の２つの定常ドメイン（すなわちＣＨ２およびＣＨ３）、およびこれらのドメインのＮ末端のフレキシブルなヒンジ領域を含むホモ二量体を指す。本発明による抗体のＦｃ断片は、好ましくはヒトＦｃ断片であり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のＦｃ断片から選択することができる。好ましくは、本発明において、Ｎ末端のフレキシブルなヒンジおよびＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、すなわちアミノ酸Ｃ２２６からＣ末端までの部分からなるＩｇＧ１のＦｃ断片が使用され、番号付けは、ＥＵインデックスまたはＫａｂａｔにおけるそれと同等なものに従って示される。好ましくは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片（すなわち、ＥＵインデックスまたはＫａｂａｔにおけるそれと同等なものに従って、アミノ酸２２６〜４４７）が使用される。この場合、ＥＵインデックスまたはＫａｂａｔにおけるそれと同等なものに従って、下のヒンジは、２２６位〜２３０位を指し、ＣＨ２ドメインは、２３１位〜３４０位を指し、ＣＨ３ドメインは、３４１位〜４４７位を指す。本発明に従って使用されるＦｃ断片はまた、２２６位の上流に上のヒンジ領域の一部を含んでいてもよい。この場合、好ましくは、その領域の一部を含むヒトＩｇＧ１のＦｃ断片が使用され、２１６位〜２２６位（ＥＵインデックスに従って）の間に配置される。この場合、ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片は、アミノ酸２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４または２２５から、Ｃ端部までの部分を指す。
【００２２】
好ましくは、本発明による抗体のＦｃ断片は、ＩｇＧ１のＦｃ断片である。
【００２３】
本発明による抗体のＦｃ断片は、好ましくはヒトである。
【００２４】
本出願において、Ｆｃ断片の残基の番号付けは、ＥＵインデックスまたはＫａｂａｔにおけるそれと同等なものの番号付けである（免疫学的に興味深いタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１））。この番号付けは、ヒトＦｃ断片のみにとって好適である。
【００２５】
この番号付けの、ネズミ科（すなわちマウスまたはラット）Ｆｃ断片のための等価なものは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙによる、Ｚａｕｎｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １２．４、２０１３に記載されている。この論文は、特定には図２において、ヒトＦｃとネズミＦｃとの間のグリコシル化の差を記載している。
【００２６】
「アミノ酸突然変異」は、本明細書において、ポリペプチドのアミノ酸配列における変化を意味する。突然変異は、特定には、置換、挿入および欠失から選択される。
【００２７】
「置換」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置における、１つまたは複数のアミノ酸の、同じ数の他のアミノ酸での置き換えを意味する。好ましくは、置換は、点置換（ｐｕｎｃｔｕａｌ）であり、すなわち単一のアミノ酸のみに関する。例えば、Ｎ４３４Ｓ置換は、ＥＵインデックスまたはＫａｂａｔにおけるそれと同等なものに従ってＦｃ断片の４３４位のアスパラギンがセリンで置き換えられた、親ポリペプチドのバリアントを指す。
【００２８】
「挿入」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置における少なくとも１つのアミノ酸の付加を意味する。例えば、挿入Ｇ＞２３５〜２３６は、２３５位と２３６位との間におけるグリシンの挿入を意味する。
【００２９】
「欠失」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置における少なくとも１つのアミノ酸の除去を意味する。例えば、Ｅ２９４ｄｅｌは、２９４位におけるグルタミン酸の除去を意味する。
【００３０】
「親ポリペプチド」および「親抗体」は、それぞれ、その後に改変されてバリアントを生成するポリペプチドまたは改変されていない抗体を意味する。前記親ポリペプチドまたは抗体は、天然起源、天然に存在するポリペプチドもしくは抗体のバリアント、天然のポリペプチドもしくは抗体の改変型、または合成のポリペプチドもしくは抗体に由来するものであってもよい。好ましくは、親ポリペプチドまたは抗体は、野生型Ｆｃ断片、その断片およびその突然変異体から選択されるＦｃ断片を含む。それゆえに、親ポリペプチドまたは抗体は、任意選択で、野生型Ｆｃ断片と比較した、Ｆｃ断片における既存のアミノ酸改変を含んでいてもよい。したがって、好ましくは、親ポリペプチドまたは抗体のＦｃ断片はすでに、少なくとも１つの追加の突然変異（すなわち既存の改変）、好ましくはＰ２３０Ｓ、Ｔ２５６Ｎ、Ｖ２５９Ｉ、Ｎ３１５Ｄ、Ａ３３０Ｖ、Ｎ３６１Ｄ、Ａ３７８Ｖ、Ｓ３８３Ｎ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｙから選択される突然変異を含む。
【００３１】
好ましくは、親ポリペプチドまたは抗体のＦｃ断片は、配列番号１、２、３、４および５の配列から選択される。好ましくは、親ポリペプチドまたは抗体のＦｃ断片は、配列番号１の配列を有する。
【００３２】
配列番号１、２、３、４および５に示される配列は、Ｎ末端にヒンジ領域を含まない。
【００３３】
配列番号６、７、８、９および１０に提示される配列はそれぞれ、配列番号１、２、３、４および５に提示される配列に対応し、それらのＮ末端にヒンジ領域を有する。また特定の実施態様において、親ポリペプチドまたは抗体のＦｃ断片は、配列番号６、７、８、９および１０の配列からも選択される。
【００３４】
好ましくは、親ポリペプチドまたは抗体のＦｃ断片は、配列番号６位の配列の、１位〜２３２位、２位〜２３２位、３位〜２３２位、４位〜２３２位、５位〜２３２位、６位〜２３２位、７位〜２３２位、８位〜２３２位、９位〜２３２位、１０位〜２３２位または１１位〜２３２位に対応する配列を有する。
【００３５】
「バリアント」は、少なくとも１つのアミノ酸改変で親ポリペプチドの配列と異なるポリペプチド配列を意味する。
【００３６】
好ましくは、バリアントの配列は、親ポリペプチドの配列と、少なくとも８０％の同一性を有し、より好ましくは少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する。
【００３７】
本出願にわたり、２つのアミノ酸配列間の「同一性のパーセンテージ」という表現は、本発明の意味の範囲内において、最良のアライメント後に得られた比較される２つの配列間の同一なアミノ酸残基のパーセンテージを意味することが意図され、このパーセンテージは、純粋に統計であり、２つの配列間の差は、ランダムに、それらの全長にわたり分布している。「最良のアライメント」または「最適なアライメント」は、後述するように決定された同一性のパーセンテージが最大であるアライメントを意味する。従来、２つのアミノ酸配列間の配列比較は、それらを最適にアライメントした後にこれらの配列を比較することによって行われ、前記比較は、配列類似性を有する局所的な領域を同定し比較するための、セグメントまたは「比較ウィンドウ」で行われる。比較のための配列の最適なアライメントは、手作業の他にも、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのローカルホモロジーアルゴリズム（１９８１、Ｊ．Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ．、１８：３８〜４６）によって、ＮｅｄｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの‘ローカルホモロジーアルゴリズム（１９７０）によって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性サーチ方法（１９８８、ＰＮＡＳ、８５：２４４４〜２４４８）によって、これらのアルゴリズムを使用したコンピューターソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおける、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  Ｎ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって達成することができる。
【００３８】
より好ましくは、本発明による抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４から選択され、好ましくは、ＩｇＧ１である。
【００３９】
本発明による抗体は、キメラ、ヒト化されたまたはヒトであってもよい。
【００４０】
用語「キメラ」抗体は、所与の種の抗体由来の天然可変領域（軽鎖および重鎖）と、それに連結された前記所与の種にとって異種の種の抗体の軽鎖および重鎖の定常領域とを含有する抗体を意味することが意図される。有利には、抗体は、キメラである場合、ヒト定常領域を含む。キメラ抗体は、非ヒト抗体（特定にはネズミの）から始めて、当業者周知の遺伝学的組換え技術を使用して調製することができる。例えば、キメラ抗体は、重鎖および軽鎖に関して、プロモーター、ならびに非ヒト抗体の可変領域をコードする配列、およびヒト抗体の定常領域をコードする配列を含む組換えＤＮＡをクローニングすることによって生産することができる。キメラ抗体を調製する方法に関して、例えば、Ｖｅｒｈｏｅｙｎらの文書（Ｖｅｒｈｏｅｙｎら、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ、８：７４、１９８８）を参照することができる。
【００４１】
用語「ヒト化」抗体は、非ヒト起源の抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有し、抗体分子の他の部分は、１種の（またはそれより多くの）ヒト抗体由来である抗体を意味するものと理解される。加えて、フレームワーク領域（または「フレームワーク」または「ＦＲ」）の残基の一部は、結合親和性を保持するように改変されていてもよい（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５、１９８６；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７、１９８８）。ヒト化抗体は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏら（Ａｌｍａｇｒｏら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  １３、１６１９〜１６３３、２００８年１月１日）による総論で要約されるような、「ＣＤＲグラフティング」、「リサーフェイシング」、「ヒト鎖含有（Ｈｕｍａｎ  ｓｔｒｉｎｇ  ｃｏｎｔｅｎｔ）」、「ＦＲライブラリー」、「ガイド選択」、「ＦＲシャッフリング」および「ヒューマニアリング（Ｈｕｍａｎｅｅｒｉｎｇ）」などの当業者公知の技術によって調製することができる。
【００４２】
「ヒト」抗体は、抗体の配列全体がヒト起源である抗体、すなわちそのコード配列が、抗体をコードするヒト遺伝子の組換えによって生産された抗体を意味する。実際に、現在、免疫化されると、免疫グロブリンの内因性生産の非存在下でヒト抗体の全レパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を生産することが可能である（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５〜２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ、７：３３（１９９３）；Ｄｕｃｈｏｓａｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：２５８（１９９２）；米国特許第５，５９１，６６９号；米国特許第５，５９８，３６９号；米国特許第５，５４５，８０６号；米国特許第５，５４５，８０７号；米国特許第６，１５０，５８４号を参照）。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーからも得ることができる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、２２２：５８１〜５５９７（１９９１）；Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １４：３０９（１９９６））。
【００４３】
本発明による抗体は、自己抗原に対して向けられている。
【００４４】
「自己抗原」は、自己免疫疾患における場合のように、正常な組織の成分であるにもかかわらず体液性または細胞性免疫応答の標的である抗原を意味する（Ｍｉｌｌｅｒ−Ｋｅａｎｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａにおける定義を参照）。
【００４５】
好ましくは、本発明による抗体は、ネイティブのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、グルコース−６ホスファターゼの触媒性の２つのサブユニット（ＩＧＲＰ、ＵｎｉｐｒｏｔでＧ６ＰＣ２遺伝子；Ｑ９ＮＱＲ９によってコードされた）、２型コラーゲンおよびアクアポリン−４（ＵｎｉｐｒｏｔでＰ５５０８７）から選択される自己抗原に対して向けられている。
【００４６】
これらの自己抗原は、特定には、
−  抗ＭＯＧ抗体が関与する脱髄疾患、例えば多発性硬化症；
−  アクアポリン−４（ＡＱＰ−４）および／またはＭＯＧを標的化することによる、デビックの視神経脊髄炎（ＮＭＯ／ＮＭＯＳＤ）；
−  グルコース−６ホスファターゼ（ＩＧＲＰ）の触媒性の２つのサブユニットを標的化することによる、１型糖尿病
から選択される自己免疫疾患の防止および／または処置に関連する。ＩＧＲＰは、２型コラーゲンを標的化することによって、ランゲルハンス島；および
−  リウマチ様関節炎
に特異的である。
【００４７】
ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）は、ＭＳにおいて免疫反応性が検出されるミエリンおよびニューロンにおける数種の抗原の１つである。この糖タンパク質は、ＣＮＳの軸索を隔離するミエリン鞘の微量成分である。
【００４８】
このネイティブのヒトタンパク質の配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔにおいて、受託番号Ｑ１６６５３で見出すことができる。成熟（ネイティブ）ヒトタンパク質は、２１８アミノ酸を含有する（すなわち２９アミノ酸のシグナルペプチドの切断後に）。
【００４９】
同様に、ネイティブのマウスＭＯＧ配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔにおいて受託番号Ｑ６１８８５で入手可能である。成熟（ネイティブ）マウスタンパク質は、２１８アミノ酸を含有する（すなわち２８アミノ酸のシグナルペプチドの切断後に）。ネイティブのヒトおよびマウスＭＯＧタンパク質は、８９％同一である。
【００５０】
好ましくは、本発明は、ネイティブのＭＯＧに対して向けられたアイソタイプＧ抗体であって、
−  高度なシアル化を示すＦｃ断片、および
−  ネイティブのＭＯＧに結合することが可能なＦａｂ断片
を含む、抗体に関する。
【００５１】
特定には、Ｂｒｅｉｔｈａｕｐｔら、ＰＮＡＳ、２００３年８月５日、第１００巻、第１６号で詳述されたように、ネイティブのＭＯＧエピトープは、ＭＯＧ膜の遠位側に、特定には、配列番号２６の配列の残基１０１〜１０８（Ｒ１０１ＤＨＳＹＱＥＥ１０８、これは、成熟ヒトＭＯＧの２１８における残基１０１〜１０８に対応する）のレベルに配置された３つのループからなり、これらの残基は、推定上のリガンド結合部位の上のエッジを形成するループを含有する。
【００５２】
好ましくは、本発明は、ネイティブのＭＯＧに対して向けられたアイソタイプＧ抗体であって、
−  高度なシアル化を示すＦｃ断片、および
−  ネイティブのＭＯＧ、特定には配列番号２６の配列の残基１０１〜１０８に結合することが可能なＦａｂ断片
を含む、抗体に関する。
【００５３】
好ましくは、本発明による抗体は、ネイティブのＭＯＧに対して向けられている。好ましくは、本発明による抗体は、ネズミ抗体８−１８Ｃ５の６つのＣＤＲを含む。好ましくは、本発明による抗体は、以下の６つのＣＤＲ：
Ｈ−ＣＤＲ１：配列番号１１、
Ｈ−ＣＤＲ２：配列番号１２、
Ｈ−ＣＤＲ３：配列番号１３、
Ｌ−ＣＤＲ１：配列番号１４、
Ｌ−ＣＤＲ２：ＧＡＳ、および
Ｌ−ＣＤＲ３：配列番号１５
を含む。
【００５４】
特定の実施態様によれば、本発明によるネイティブのＭＯＧに対して向けられた抗体は、キメラであり、ＶＨとして、配列番号１６の配列、およびＶＬとして、配列番号１７の配列を含む。特定の実施態様によれば、本発明による抗体は、キメラであり、ＥＵインデックスの番号付けまたはＫａｂａｔにおけるそれと同等なもので、重鎖として、２９４位にグルタミン酸の欠失を有する配列番号２４の配列、および軽鎖として、配列番号２５の配列を含む。
【００５５】
本出願はまた、ネイティブのＭＯＧに対して向けられたネズミ抗体も記載し、典型的には、これは、重鎖として、配列番号１９の配列を含み、この配列は、１７１位にグルタミン酸の欠失を含み、軽鎖として、配列番号２０の配列を含む。ＥＵインデックスの番号付けまたはＫａｂａｔにおけるそれと同等なものにより、ネズミＦｃにおける１７１位は、ヒトＦｃにおける２９４位に対応する。
【００５６】
有利には、本発明によるネイティブのＭＯＧに対して向けられた抗体の軽鎖のそれぞれの可変領域は、配列番号１７のネズミ配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列によってコードされ、本発明によるネイティブのＭＯＧに対して向けられた抗体の重鎖のそれぞれの可変領域は、配列番号１６のネズミ核酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列によってコードされる。
【００５７】
本発明の抗体はまた、ＦＲ領域（フレームワーク、可変領域の高度に保存された領域であり、「フレーム」とも呼ばれる）に連結された、８−１８Ｃ５抗体のＣＤＲ（相補性決定領域）領域を有するネイティブのＭＯＧに対して向けられたあらゆる抗体を意味することも理解される。このような抗体は、ネズミ８−１８Ｃ５抗体と、極めて同等の、好ましくは同一な、親和性および特異性を有する。
【００５８】
好ましくは、上記で示したように、本発明によるネイティブのＭＯＧに対して向けられた抗体は、ネズミ抗体８−１８Ｃ５の６つのＣＤＲを含む。好ましくは、本抗体は、以下の６つのＣＤＲ：
Ｈ−ＣＤＲ１：配列番号１１、
Ｈ−ＣＤＲ２：配列番号１２、
Ｈ−ＣＤＲ３：配列番号１３、
Ｌ−ＣＤＲ１：配列番号１４、
Ｌ−ＣＤＲ２：ＧＡＳ、および
Ｌ−ＣＤＲ３：配列番号１５
を含む。
【００５９】
有利には、本発明によるネイティブのＭＯＧに対して向けられた抗体のＶＬ領域のＦＲ領域は、配列番号１７のネズミ配列のＦＲ領域と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列によってコードされ、本発明によるネイティブのＭＯＧに対して向けられた抗体のＶＨ領域のＦＲ領域は、配列番号１６のネズミ配列のＦＲ領域と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列によってコードされる。
【００６０】
有利には、本発明によるネイティブのＭＯＧに対して向けられた抗体は、Ｆｃ領域として、ヒトＦｃ領域、好ましくは配列番号１〜１０から選択されるヒトＦｃ領域、好ましくは、配列番号１によってコードされ、ＥＵインデックスの番号付けまたはＫａｂａｔにおけるそれと同等なもので２９４位にグルタミン酸の欠失を含むＦｃ領域を含む。
【００６１】
本発明による、自己抗原に対して向けられた、特定には、ネイティブのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）に対して向けられたアイソタイプＧ抗体は、ファージバンクでの選択により得ることができ、具体的には、Ｎｉｘｏｎら、候補同定を実施するためファージディスプレイから得られた薬物（Ｄｒｕｇｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ，Ｆｒｏｍ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｍＡｂｓ）、ｍＡｂｓ  ６：１、７３〜８５；２０１４年１月／２月に記載される通りである。
【００６２】
また本発明は、高度なシアル化を示すＦｃ断片を含む上述したようなアイソタイプＧの抗体組成物にも関する。このＦｃに対する高度なシアル化は、典型的には、親抗体組成物のそれを超えて増加または改善される。
【００６３】
「増加したシアル化」または「改善されたシアル化」は、得られた抗体組成物のＦｃのシアル化が、前記親抗体組成物のＦｃのシアル化に基づき、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２５％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも４５％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％増加していることを意味する。
【００６４】
タンパク質のシアル化は、周知のグリコシル化メカニズムである（具体的には、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｖａｒｋｉら、２００９を参照）。これは、タンパク質のグリコシル化鎖における、少なくとも１つのシアル酸（すなわちＮ−アセチルノイラミン酸およびその誘導体、例えばＮ−グリコシルノイラミン酸、Ｎ−アセチルグリコシルノイラミン酸）の共有結合による付加に相当する。
【００６５】
好ましくは、Ｆｃ断片におけるシアル化は、Ｆｃ断片の突然変異により得られる。
【００６６】
したがって、好ましくは、Ｆｃ断片、特定にはヒトＦｃ断片は、親抗体のそれと比較して改変されており、前記Ｆｃ断片の２４０位〜２４３位、２５８位〜２６７位および２９０位〜３０５位におけるアミノ酸から選択される少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含み、番号付けは、ＥＵインデックスの番号付けまたはＫａｂａｔにおけるそれと同等なものである。
【００６７】
好ましくは、突然変異は、２４０位、２４１位、２４２位、２４３位、２５８位、２５９位、２６０位、２６１位、２６２位、２６３位、２６４位、２６５位、２６６位、２６７位、２９０位、２９１位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、２９９位、３００位、３０１位、３０２位、３０３位、３０４位または３０５位に配置された、Ｆｃ断片の少なくとも１つのアミノ酸に行われ、番号付けは、ＥＵインデックスの番号付けまたはＫａｂａｔにおけるそれと同等なものである。
【００６８】
好ましくは、突然変異は、Ｖ２６２ｄｅｌ、Ｖ２６３Ｆ、Ｖ２６３Ｋ、Ｖ２６３Ｗ、Ｖ２６４Ｋ、Ｖ２６４Ｐ、Ｄ２６５Ａ、Ｄ２６５Ｅ、Ｄ２６５Ｇ、Ｄ２６５Ｌ、Ｄ２６５Ｓ、Ｄ２６５Ｖ、Ｖ２６６Ａ、Ｖ２６６Ｐ、Ｖ２６６Ｓ、Ｖ２６６Ｔ、Ｓ２６７Ｎ、Ｓ２６７Ｐ、Ｓ２６７Ｒ、Ｓ２６７Ｗ、Ｐ２９１Ｃ、Ｐ２９１Ｖ、Ｐ２９１Ｙ、Ｐ２９１Ｗ、Ｒ２９２Ａ、Ｒ２９２ｄｅｌ、Ｒ２９２Ｔ、Ｒ２９２Ｖ、Ｒ２９２Ｙ、Ｅ２９３ｄｅｌ、Ｅ２９３Ｆ、Ｅ２９３Ｐ、Ｅ２９３Ｗ、Ｅ２９３Ｙ、Ｅ２９４ｄｅｌ、Ｅ２９４Ｄ、Ｅ２９４Ｎ、Ｅ２９４Ｗ、Ｅ２９４Ｆ、Ｅ２９３ｄｅｌ／Ｅ２９４ｄｅｌ、Ｑ２９５Ｄ、Ｑ２９５ｄｅｌ、Ｑ２９５Ｆ、Ｑ２９５Ｇ、Ｑ２９５Ｋ、Ｑ２９５Ｎ、Ｑ２９５Ｒ、Ｑ２９５Ｗ、Ｙ２９６Ａ、Ｙ２９６Ｃ、Ｙ２９６ｄｅｌ、Ｙ２９６Ｅ、Ｙ２９６Ｇ、Ｙ２９６Ｑ、Ｙ２９６Ｒ、Ｙ２９６Ｖ、Ｓ２９８ｄｅｌ、Ｓ２９８Ｅ、Ｓ２９８Ｆ、Ｓ２９８Ｇ、Ｓ２９８Ｌ、Ｓ２９８Ｍ、Ｓ２９８Ｎ、Ｓ２９８Ｐ、Ｓ２９８Ｒ、Ｓ２９８Ｔ、Ｓ２９８Ｗ、Ｓ２９８Ｙ、Ｙ３００Ｄ、Ｙ３００ｄｅｌ、Ｙ３００Ｇ、Ｙ３００Ｎ、Ｙ３００Ｐ、Ｙ３００Ｒ、Ｙ３００Ｓ、Ｒ３０１Ａ、Ｒ３０１Ｆ、Ｒ３０１Ｇ、Ｒ３０１Ｈ、Ｒ３０１Ｉ、Ｒ３０１Ｋ、Ｒ３０１Ｑ、Ｒ３０１Ｖ、Ｒ３０１Ｗ、Ｒ３０１Ｙ、Ｖ３０２ｄｅｌ、Ｖ３０２Ａ、Ｖ３０２Ｆ、Ｖ３０２Ｇ、Ｖ３０２Ｐ、Ｖ３０３Ａ、Ｖ３０３Ｃ、Ｖ３０３Ｐ、Ｖ３０３Ｌ、Ｖ３０３Ｓ、Ｖ３０３Ｙ、Ｓ３０４Ｃ、Ｓ３０４Ｍ、Ｓ３０４Ｑ、Ｓ３０４Ｔ、Ｖ３０５ＦおよびＶ３０５Ｌから選択され、番号付けは、ＥＵインデックスの番号付けまたはＫａｂａｔにおけるそれと同等なものである。
【００６９】
より好ましくは、本発明による抗体のＦｃ断片は、親抗体のそれと比べて改変されており、少なくともＥ２９４ｄｅｌ突然変異を含み、番号付けは、ＥＵインデックスの番号付けまたはＫａｂａｔにおけるそれと同等なものである。
【００７０】
好ましくは、本発明による抗体のＦｃ断片、特定にはヒトＦｃ断片は、親抗体のそれと比べて改変されており、Ｅ２９４ｄｅｌ突然変異からなり、番号付けは、ＥＵインデックスの番号付けまたはＫａｂａｔにおけるそれと同等なものである。
【００７１】
本発明によれば、本発明による抗体のＦｃ断片が、マウスＦｃである場合、それは、親抗体のそれと比較して、特定には配列番号１８の配列の親抗体のそれと比較して改変されており、突然変異Ｅ１７１ｄｅｌからなる。
【００７２】
好ましくは、本発明による抗体のＦｃ断片、特定にはヒトＦｃ断片は、親抗体のそれと比べて改変されており、Ｙ３００ｄｅｌ突然変異からなり、番号付けは、ＥＵインデックスの番号付けまたはＫａｂａｔにおけるそれと同等なものである。好ましくは、このような抗体は、ＨＥＫ細胞で生産される。
【００７３】
好ましくは、本発明の抗体は、前記親抗体のエフェクター活性に対して低減されたＦｃ断片によって媒介される少なくとも１つのエフェクター活性を示す。
【００７４】
「Ｆｃ断片によって媒介されるエフェクター活性」とは、特に、抗体に依存する細胞傷害（ＡＤＣＣ又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ又は補体依存性細胞傷害）、抗体依存性細胞貪食、抗体（ＡＤＣＰ）、エンドサイトーシス活性又はサイトカインの分泌を意味する。好ましくは、本発明において考慮されるＦｃ断片によって媒介されるエフェクター活性は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）及びサイトカインの分泌から選択される。
【００７５】
「低減された」エフェクター活性とは、低減された、又は無効にされたエフェクター活性を意味する。したがって、本発明の抗体は、無効にされたＦｃ断片によって媒介される少なくとも１つのエフェクター活性を示し得る。好ましくは、本発明の抗体は、少なくとも１０％の、好ましくは、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％の親抗体のものに対して低減しているＦｃ領域によって媒介されるエフェクター活性を示す。
【００７６】
好ましくは、本発明の抗体は、前記Ｆｃ断片によって媒介される任意のエフェクター活性を欠く。
【００７７】
別の態様によれば、本発明の抗体は、Ｆｃ領域（ＦｃＲ）の受容体のうち少なくとも１つに対して、親抗体の親和性に対して低減された、Ｆｃ断片によって媒介される親和性を示す。
【００７８】
「Ｆｃ領域の受容体」又は「ＦｃＲ」とは、特に、Ｃ１ｑ及びＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）を意味する。「Ｆｃγ受容体」又は「ＦｃγＲ」とは、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）、ＣＤ３２（ＦｃγＲＩＩ）及びＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）と呼ばれるＩｇＧ受容体、特に、５つの発現された受容体ＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂを指す。免疫細胞の活性化を阻害する受容体であるヒトＦｃγＲＩＩｂを除いて、すべてエフェクター細胞の受容体活性化因子である（Ｍｕｔａ  Ｔら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９４年、３６８巻：７０〜７３頁）。
【００７９】
Ｃ１ｑ補体は、ＣＤＣ活性に関与している。
【００８０】
ＦｃｇＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）受容体は、ＡＤＣＣに関与しており、１５８位でＶ／Ｆ多型を示す。
【００８１】
ＦｃｇＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）受容体は、血小板活性化及び貪食に関与しており、１３１位でＨ／Ｒ多型を示す。
【００８２】
最後に、ＦｃｇＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）受容体は、細胞活性の阻害に関与している。
【００８３】
「減少した」親和性とは、減少した、又は無効にされた親和性を意味し、好ましくは、親和性は、Ｆｃ断片を含む親抗体のものに対して、少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％低減される。
【００８４】
好ましくは、本発明の抗体は、補体Ｃ１ｑ及びＦｃｇＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃｇＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）及びＦｃｇＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）受容体から選択されるＦｃ領域（ＦｃＲ）の受容体のうち少なくとも１つに対して、親抗体の親和性に対して低減された、前記Ｆｃ断片によって媒介される親和性を示す。好ましくは、本発明の抗体は、２つの受容体Ｃ１ｑ及びＣＤ１６ａに対して、親抗体の親和性に対して低減された、前記Ｆｃ断片によって媒介される親和性を示す。
【００８５】
ＦｃＲに対するＦｃ断片を含む抗体の親和性は、先行技術において周知の方法によって評価され得る。例えば、当業者ならば、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）又はＯｃｔｅｔ（登録商標）技術（ＢＬＩ「バイオレイヤー干渉法」技術、Ｐａｌｌ）を使用して親和性（Ｋｄ）を決定できる。或いは、当業者ならば、適当なＥＬＩＳＡ試験を実施できる。適当なＥＬＩＳＡアッセイは、親Ｆｃ及び突然変異Ｆｃの結合力の比較を可能にする。突然変異Ｆｃ及び親Ｆｃに特異的な検出されたシグナルが比較される。結合親和性は、抗体全体を評価することによって、又はそれから単離されたＦｃ領域を評価することによって決定され得る。
【００８６】
好ましくは、本発明のＩｇＧ型抗体は、天然ＭＯＧに対して向けられ、
−以下の６つのＣＤＲ：
Ｈ−ＣＤＲ１：配列番号１１、
Ｈ−ＣＤＲ２：配列番号１２、
Ｈ−ＣＤＲ３：配列番号１３、
Ｌ−ＣＤＲ１：配列番号１４、
Ｌ−ＣＤＲ２：ＧＡＳ、及び
Ｌ−ＣＤＲ３：配列番号１５、並びに
−前記Ｆｃ断片の２４０〜２４３位、２５８〜２６７位及び２９０〜３０５位のアミノ酸から選択される少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む、親抗体のものに対して修飾されたヒトＦｃ断片であって、番号付けは、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックス又は等価物のものである、ヒトＦｃ断片、好ましくは、少なくともＥ２９４ｄｅｌ突然変異（又は少なくともＹ３００ｄｅｌ突然変異）を含む、親抗体のものから修飾されたヒトＦｃ断片であって、番号付けは、ＥＵインデックスのもの又はＫａｂａｔにおける等価物のものである、ヒトＦｃ断片を含む。
【００８７】
好ましくは、本発明のＩｇＧ型抗体は、天然ＭＯＧに対して向けられ、
−以下の６つのＣＤＲ：
Ｈ−ＣＤＲ１：配列番号１１、
Ｈ−ＣＤＲ２：配列番号１２、
Ｈ−ＣＤＲ３：配列番号１３、
Ｌ−ＣＤＲ１：配列番号１４、
Ｌ−ＣＤＲ２：ＧＡＳ、及び
Ｌ−ＣＤＲ３：配列番号１５、並びに
−少なくともＥ１７１ｄｅｌ突然変異（ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックス又は等価物の番号付けを用いて、ヒトＦｃ断片のＥ２９４ｄｅｌに対応する）を含む親抗体のものから修飾されたマウスＦｃ断片を含む。好ましくは、マウスＦｃ断片は、配列番号１８の配列を有し、Ｅ１７１ｄｅｌ突然変異を含む。
【００８８】
好ましい実施形態では、上記で定義されるようなＩｇＧ型抗体は、天然ＭＯＧに対して向けられ、
−配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５及び配列番号１０７の配列からなる群から選択される配列を含む、若しくはからなる重鎖の可変ドメイン並びに／又は、
−配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６及び配列番号１０８の配列からなる群から選択される配列を含む、若しくはからなる軽鎖の可変ドメインを含む。
【００８９】
好ましい実施形態では、上記で定義されるＩｇＧ型抗体は、天然ＭＯＧに対して向けられ、配列：
−配列番号２９及び配列番号３０、
−配列番号３１及び配列番号３２、
−配列番号３３及び配列番号３４、
−配列番号３５及び配列番号３６、
−配列番号３７及び配列番号３８、
−配列番号３９及び配列番号４０、
−配列番号４１及び配列番号４２、
−配列番号４３及び配列番号４４、
−配列番号４５及び配列番号４６、
−配列番号４７及び配列番号４８、
−配列番号４９及び配列番号５０、
−配列番号５１及び配列番号５２、
−配列番号５３及び配列番号５４、
−配列番号５５及び配列番号５６、
−配列番号５７及び配列番号５８、
−配列番号５９及び配列番号６０、
−配列番号６１及び配列番号６２、
−配列番号６３及び配列番号６４、
−配列番号６５及び配列番号６６、
−配列番号６７及び配列番号６８、
−配列番号６９及び配列番号７０、
−配列番号７１及び配列番号７２、
−配列番号７３及び配列番号７４、
−配列番号７５及び配列番号７６、
−配列番号７７及び配列番号７８、
−配列番号７９及び配列番号８０、
−配列番号８１及び配列番号８２、
−配列番号８３及び配列番号８４、
−配列番号８５及び配列番号８６、
−配列番号８７及び配列番号８８、
−配列番号８９及び配列番号９０、
−配列番号９１及び配列番号９２、
−配列番号９３及び配列番号９４、
−配列番号９５及び配列番号９６、
−配列番号９７及び配列番号９８、
−配列番号９９及び配列番号１００、
−配列番号１０１及び配列番号１０２、
−配列番号１０３及び配列番号１０４、
−配列番号１０５及び配列番号１０６、又は
−配列番号１０７及び配列番号１０８
の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む。
【００９０】
本出願に記載される配列は、以下のとおりにまとめることができる（情報について、Ｋａｂａｔによる２９４位のＦｃのグルタミン酸は、ヒト配列では太字で、下線が引かれて示されている）：
【００９１】
【表１−１】
2021522216.tif 000002
【表１−２】
2021522216.tif 000003
【表１−３】
2021522216.tif 000004
【表１−４】
2021522216.tif 000005
【表１−５】
2021522216.tif 000006
【表１−６】
2021522216.tif 000007
【表１−７】
2021522216.tif 000008
【表１−８】
2021522216.tif 000009
【表１−９】
2021522216.tif 000010
【表１−１０】
2021522216.tif 000011
【表１−１１】
2021522216.tif 000012
【表１−１２】
2021522216.tif 000013
【表１−１３】
2021522216.tif 000014
【表１−１４】
2021522216.tif 000015
【表１−１５】
2021522216.tif 000016
【表１−１６】
2021522216.tif 000017
【表１−１７】
2021522216.tif 000018
【表１−１８】
2021522216.tif 000019
【表１−１９】
2021522216.tif 000020
【表１−２０】
2021522216.tif 000021
【表１−２１】
2021522216.tif 000022
【表１−２２】
2021522216.tif 000023
【表１−２３】
2021522216.tif 000024
【表１−２４】
2021522216.tif 000025
【００９２】
本発明の目的はまた、本発明の抗体を得るための方法であって、以下のステップ：
ｉ）ＩｇＧ重鎖をコードする核酸配列を提供するステップであり、前記重鎖は、（ａ）可変ドメイン中に自己抗原と結合する３つのＣＤＲと、（ｂ）Ｆｃ断片中に２４０〜２４３位、２５８〜２６７位及び２９０〜３０５位のアミノ酸から選択されるアミノ酸の突然変異、好ましくは、少なくともＥ２９４ｄｅｌ又はＹ３００ｄｅｌ突然変異とを含み、番号付けは、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックス又は等価物のものである、ステップと、
ｉｉ）ＩｇＧ軽鎖をコードする核酸配列が提供されるステップであり、前記軽鎖は、可変ドメイン中に、ｉ）において標的化されるものと同一の自己抗原の３つの結合性ＣＤＲを含む、ステップと、
ｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）において得られた核酸配列が、宿主細胞において発現され、抗体が回収されるステップと
を含む、方法である。
【００９３】
ＩｇＧ重鎖をコードする核酸配列（ポリヌクレオチド又はヌクレオチド配列）は、突然変異を有するＦｃ断片を含む。ＩｇＧの重鎖をコードする核酸配列は、化学的に合成され得る（Ｙｏｕｎｇ  Ｌ及びＤｏｎｇ  Ｑ．、２００４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、４月１５日；３２巻（７号）、Ｈｏｏｖｅｒ，  ＤＭ及びＬｕｂｋｏｗｓｋｉ，  Ｊ．  ２００２年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３０巻、Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓ  Ａら、２００６年．  ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、６月６日；７巻：２８５頁）。ＩｇＧ重鎖をコードするヌクレオチド配列はまた、適したプライマーを使用するＰＣＲによって増幅され得る。ＩｇＧ重鎖をコードするヌクレオチド配列はまた、発現ベクター中にクローニングされ得る。
【００９４】
例えば、配列番号２７の核酸配列（重鎖配列番号１９をコードする）も使用され得る。
【００９５】
これらの技術は、参考マニュアルに詳細に記載されている：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、第３版−Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌ編（２００１年）及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ａｕｓｕｂｅｌら編（２００７年）。
【００９６】
親ポリペプチドをコードするｉ）において提供された核酸配列（ポリヌクレオチド）は、次いで、バリアントをコードする核酸配列を得るために修飾される。
【００９７】
このステップは、実際の突然変異ステップである。先行技術から公知の任意の方法によって、特に、位置指定突然変異誘発によって実施され得る。
【００９８】
好ましくは、アミノ酸置換及び欠失は、位置指定突然変異誘発によって、挿入された修飾に対応するオリゴヌクレオチドを使用するアセンブリーＰＣＲ技術によって実施される（例えば、Ｚｏｌｌｅｒ及びＳｍｉｔｈ、１９８２年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １０巻）：６４８７〜６５００頁；Ｋｕｎｋｅｌ、１９８５年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２巻：４８８頁を参照のこと）。
【００９９】
ステップｉｉ）では、ＩｇＧ軽鎖をコードする核酸配列が提供され、前記軽鎖は、可変ドメイン中に、ｉ）において標的化されるものと同一の自己抗原の３つの結合性ＣＤＲを含む。
【０１００】
例えば、配列番号２８の核酸配列（軽鎖配列番号２０をコードする）が使用され得る。
【０１０１】
最後に、ステップｉｉｉ）において、ｉ）及びｉｉ）において得られた核酸配列が、宿主細胞において発現され、このように得られた抗体が回収される。
【０１０２】
ｉ）及びｉｉ）において得られた核酸配列は、バイシストロニックベクター中に挿入され得る。
【０１０３】
細胞宿主は、原核生物又は真核生物の系から、例えば、細菌細胞だけでなく、酵母細胞又は動物細胞からも、特に、哺乳動物細胞から選択され得る。昆虫細胞又は植物細胞を使用することもあり得る。
【０１０４】
好ましい宿主細胞として、ラット系ＹＢ２／０、ハムスター系ＣＨＯ、特に、ＣＨＯ  ｄｈｆｒ−及びＣＨＯ  Ｌｅｃ１３系、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）系（Ｃｒｕｃｅｌｌ）、ＨＥＫ系、特に、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、系ＥＢ６６、Ｋ５６２、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＮＩＨ／３Ｔ３又はＣＯＳがある。より好ましくは、ラット系ＹＢ２／０が使用される。これらの宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞に、シアル酸転移酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子をトランスフェクトできる。
【０１０５】
好ましくは、本発明の抗体のＦｃ断片は、特に、ヒトが、親抗体のものに対して修飾され、Ｙ３００ｄｅｌ突然変異からなる場合には、それは、ＨＥＫ２９３細胞などのＨＥＫ細胞において産生される。
【０１０６】
重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチドはまた、特に、ある特定の細胞におけるその発現のために（ステップｉｉｉ））最適化されたコドンを含み得る。コドン最適化の目的は、天然コドンを、考慮される細胞種においてアミノ酸を運ぶトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）が最も頻繁に見られるコドンと置き換えることである。頻繁に遭遇するｔＲＮＡを動員するという事実は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡｓ）の翻訳の速度を高め、したがって、最終力価を増大するという主な利点を有する（Ｃａｒｔｏｎ  ＪＭらＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ、２００７年）。コドン最適化はまた、リボソーム複合体による読み取りを減速し得る二次ｍＲＮＡ構造の予測に影響を及ぼす。コドン最適化はまたｍＲＮＡの半減期と、したがって、その翻訳能と直接的に関連しているＧ／Ｃのパーセンテージに対しても影響を有する（Ｃｈｅｃｈｅｔｋｉｎ，  Ｊ．  ｏｆ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４２巻、２００６年９２２〜９３４頁）。
【０１０７】
コドン最適化は、哺乳動物の、より詳しくは、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）のコドン頻度表（コドン利用表）を使用する天然コドンの置換によって行われ得る。この配列最適化が実施されることを可能にする、インターネットで入手可能な、合成遺伝子の供給業者によって入手可能にされたアルゴリズムがある（ＤＮＡ２．０、ＧｅｎｅＡｒｔ、ＭＷＧ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）。
【０１０８】
好ましくは、重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞又はＹＢ２／０細胞などのＨＥＫ細胞におけるその発現のために最適化されたコドンを含む。より好ましくは、重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、ＹＢ２／０細胞におけるその発現のために最適化されたコドンを含む。
【０１０９】
本発明の目的はまた、生理学的に許容される培地中に本発明のモノクローナル抗体を含む組成物である。
【０１１０】
「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」又はモノクローナル抗体の「ｍＡｂ」とは、同一及び固有の抗原特異性を有する抗体分子を含む組成物を意味する。組成物中に存在する抗体分子は、すべて同一の重鎖及び軽鎖配列によってコードされ、したがって、同一タンパク質配列を有する。
【０１１１】
本発明の目的はまた、医薬としての上記のような、本発明の抗体の使用又は組成物の使用である。
【０１１２】
本発明の抗体は、治療用組成物を形成するための、薬学的に許容される賦形剤と、任意選択で、生分解性ポリマーなどの持続放出マトリックスと組み合わせてもよい。
【０１１３】
医薬組成物は、経口的に、舌下に、皮下に、筋肉内に、静脈内に、動脈内に、くも膜下腔内に、眼内に、脳内に、経皮的に、肺性に、局所的に又は直腸性に投与され得る。次いで、有効成分は、投与の単位形態で、従来の製薬担体との混合物で投与され得る。単位投与形として、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤及び経口溶液又は懸濁液、舌下及び頬側投与形、エアロゾルなどの経口形、皮下留置剤、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下、くも膜下腔内、鼻腔内（経鼻）投与形及び直腸投与形が挙げられる。
【０１１４】
好ましくは、医薬組成物は、注射されることが可能な製剤のための薬学的に許容されるビヒクルを含有する。それらは、特に、等張性、滅菌処方、生理食塩水溶液（リン酸一ナトリウム又は二ナトリウム、塩酸ナトリウム、カリウム、カルシウム又はマグネシウムなど、又はこのような塩の混合物を有する）、又は必要に応じて、滅菌水若しくは生理学的血清の添加の際に、注射用溶液の構成を可能にする凍結乾燥組成物であり得る。
【０１１５】
注射用使用に適した投与形として、滅菌水溶液又は分散物、滅菌注射用溶液（１つ又は複数）、分散物の即時調製のためのゴマ油、ピーナッツオイル及び滅菌散剤を含む油性製剤が挙げられる。すべての場合において、形態は、無菌でなくてはならず、シリンジによって注射されなければならない限り流体でなくてはならない。製造及び保存の条件下で安定でなくてはならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。
【０１１６】
本発明の分散物は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール若しくはその混合物中、又はオイル中で調製され得る。保存及び使用の正常状況下では、これらの調製物は、微生物の成長を防ぐために防腐剤を含有する。
【０１１７】
薬学的に許容される担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、これら及び／又は植物油の適した混合物を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸又はさらにチメロサールによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、組成物における吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム又はゼラチンの使用によってもたらされ得る。
【０１１８】
滅菌注射用溶液は、適当な溶媒中に必要な量の活性物質を、必要に応じて上記で列挙された他の成分のうちいくつかとともに組み込むことと、それに続く濾過による滅菌法によって調製される。一般に、分散物は、滅菌有効成分を、基本分散媒と上記で列挙されるものからの必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌散剤の場合には、好ましい調製法は、真空乾燥及び凍結乾燥である。製剤化では、溶液は、投与量製剤と適合する方法で、治療上有効な量で投与される。製剤は、種々の投与形、例えば、上記の注射用溶液で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども使用され得る。水溶液での非経口投与には、例えば、溶液は、適宜緩衝されるべきであり、液体希釈剤は、十分な生理食塩水又はグルコースで等張性にされるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹膜内投与に特に適している。この関連で、使用できる滅菌水性媒体は、当業者に公知である。例えば、用量を、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解し、次いで、１０００ｍｌの適当な液体に添加し、注入の提案された部位に注射できる。処置されている対象の状態に応じて、投与量のある特定の変動が適用され得る。
【０１１９】
本発明の医薬組成物は、用量あたり約０．０００１〜１．０ミリグラム又は約０．００１〜０．１ミリグラム又は約０．１〜１．０ミリグラム又はさらに約１０ミリグラム又はそれより多くを含む治療用混合物に製剤化され得る。複数回用量も投与され得る。個々の患者の具体的な治療上有効な用量レベルは、処置されている障害及び疾患の重症度、使用される特定の化合物の活性、使用される特定の組成物、年齢、体重、全身の健康、患者の性別及び食事、投与の時間、投与経路、使用される特定の化合物の排出速度、処置の期間又は並行して使用される薬物を含む種々の因子に応じて変わり得る。
【０１２０】
好ましくは、本発明は、自己免疫疾患の予防及び／又は処置における本発明の抗体の使用に関する。また、自己免疫疾患の予防及び／又は処置のための本発明のモノクローナル抗体を含む組成物の使用にも関する。
【０１２１】
好ましくは、自己免疫疾患は、以下から選択される：
−抗ＭＯＧ抗体が関与する脱髄疾患、例えば、多発性硬化症、
−特に、アクアポリン−４（ＡＱＰ−４）及び／又はＭＯＧを標的化することによる、デビック視神経脊髄炎（ｎｅｕｒｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｏｐｔｉｃ）（ＮＭＯ／ＮＭＯＳＤ）、
−特に、グルコース−６ホスファターゼ（ＩＧＲＰ）の触媒２サブユニットを標的化することによる１型糖尿病。ＩＧＲＰは、ランゲルハンス島に対して特異的である、及び
−特に、２型コラーゲンを標的化することによる関節リウマチ。
【０１２２】
好ましくは、本発明の抗体又は組成物は、抗ＭＯＧ抗体が関与する脱髄疾患の予防及び／又は処置において使用される。
【０１２３】
このような疾患は、好ましくは、急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、デビック視神経脊髄炎（ｎｅｕｒｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｏｐｔｉｃ）（ＮＭＯ／ＮＭＯＳＤ）及び多発性硬化症（ＭＳ）の中から選択される。
【０１２４】
実際、主に小児において生じる急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）を有する患者の４０％は、抗ＭＯＧ抗体について血清陽性である。デビック視神経脊髄炎（ｎｅｕｒｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｏｐｔｉｃ）（ＮＭＯ／ＮＭＯＳＤ）では、成人抗アクアポリン−４（ＡＱＰ−４）血清陰性患者のサブグループは、抗ＭＯＧ抗体の高力価を示す。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】ＭＯＧ３５〜５５を有するＥＡＥモデルにおいて、抗体８−１８Ｃ５で処置したバリアントのパイロット実験を示す図である。  ７日目に、５０μｇのＹＢ２／０細胞において産生された８−１８Ｃ５−Ｄｅｌ抗体（「Ｄｅｌ」、ｎ＝４）、ＨＥＫ細胞において産生された８−１８Ｃ５−ＷＴ（「ＷＴ」、ｎ＝４）、又は等体積のＰＢＳ（「ＰＢＳ」、ｎ＝４）をマウスに注射した。Ａ）臨床スコア、Ｂ）カプランマイヤー生存曲線。
【図２】ＨＥＫ細胞において産生された８−１８Ｃ５−ＷＴ抗体（「ＷＴ」、ｎ＝３）、細胞ＹＢ２／０において産生された８−１８Ｃ５−Ｄｅｌバリアント（「Ｄｅｌ」（ｎ＝２）、又は等体積のＰＢＳ（「ＰＢＳ」、ｎ＝４）で処置したマウスのＣＤ４５ｈｉ  ＣＤ１１ｂｈｉ  ＣＮＳに浸潤するマクロファージの絶対数のヒストグラムを示す図である。
【図３】ＨＥＫ細胞において産生された８−１８Ｃ５−ＷＴ抗体（「ＷＴ」、ｎ＝３）、ＹＢ２／０細胞において産生された８−１８Ｃ５−Ｄｅｌバリアント（「Ｄｅｌ」）（ｎ＝２）、又は等体積のＰＢＳ（「ＰＢＳ」、ｎ＝４）で処置したマウスの生存可能なＣＤ４＋  Ｔｈ１．２＋  Ｔ細胞上の、ＣＮＳに浸潤する活性化したＦｏｘｐ３＋制御性Ｔリンパ球の絶対数のヒストグラムを示す図である。データは、平均＋／−ＳＥＭとしてプロットした。
【図４】異なる抗体：ＹＢ２／０細胞において産生された８−１８Ｃ５−Ｄｅｌ抗体（「Ｄｅｌ（ＹＢ２／０）」）、ＹＢ２／０細胞において産生された抗体８−１８Ｃ５−ＷＴ（「ＷＴ（ＹＢ２／０）」）及びＨＥＫ細胞において産生された８−１８Ｃ５−ＷＴ（「ＷＴ（ＨＥＫ）」）に関する、α２．６シアル酸に特異的なレクチン（ＳＮＡ）を使用するウエスタンブロットを示す図である。
【図５】ＭＯＧ３５〜５５を有するＥＡＥの中程度モデルにおける抗体８−１８Ｃ５で処置したバリアントのパイロット実験を示す図である。  ９日目に、５０μｇの抗体８−１８Ｃ５−Ｄｅｌ（「Ｄｅｌ」、ｎ＝８）、８−１８Ｃ５−ＷＴ（「ＹＢ２」、ｎ＝８）、又は等量のＰＢＳ（「ＰＢＳ」、ｎ＝７）をマウスに注射した。Ａ）臨床スコア、Ｂ）カプランマイヤー生存曲線。
【実施例】
【０１２６】
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例証するために与えられる。
（例１）
マウスのモノクローナル抗体８−１８Ｃ５のＦｃのクローニング及び操作、並びにＩ型Ｆｃ受容体、ＦｃＲｎ及びその抗原への結合についての特徴付け
ＩｇＧ１である組換えマウスのｍＡｂ  ８−１８Ｃ５クローンをコードするＤＮＡベクターからＦｃの操作を実施した。本発明者らは、コンセンサス定常ドメインをコードする配列をｍＡｂ  ８−１８Ｃ５の可変ドメイン（Ｆａｂ）と結合させることによって、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでクローニング構築物を作成した。Ｆａｂ  ８−１８Ｃ５断片の結晶化構造は、ＰＤＢ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）において受託番号１ＰＫＱにより利用可能である。定常ドメインとして、本発明者らは、オンラインデータベースＩＭＧＴ（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）に列挙されたマウスのＩｇＧ１（ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ＩＧＨＧ１＊０１）のコンセンサス配列を選択した。重鎖及び軽鎖に相当する配列をｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成し、別々のｐＣＤＮＡ３ベクター（例えば、Ｇｅｎｅａｒｔ）中にクローニングした。次いで、２つの配列を単一の哺乳動物のバイシストロニックベクター中にサブクローニングし、マウスのｍＡｂ  ８−１８Ｃ５（８−１８Ｃ５−ＷＴ）の産生を可能にした。
【０１２７】
次いで、本発明者らは、ヒトのＥ２９４Ｄｅｌ欠失に対して相同な欠失を作成した（番号付けは、ＥＵインデックスのもの又は等価なＫａｂａｔにおけるものである）：本発明者らは、８−１８Ｃ５−Ｄｅｌバリアントを得るために、組換え８−１８Ｃ５  ｍＡｂの配列番号１８（定常領域）の１７１位のグルタミン酸を欠失させた。
【０１２８】
組換え８−１８Ｃ５マウスの抗体８−１８Ｃ５−ＷＴをＨＥＫ細胞において産生させた。
【０１２９】
シアリル化のレベルを最適化するために（５０〜９０％）、組換えマウス８−１８Ｃ５の８−１８Ｃ５−ＷＴ抗体及びバリアントである８−１８Ｃ５−Ｄｅｌ抗体をＹＢ２／０細胞において産生させ、シアリル化のレベルを最適化した（５０〜９０％）。有利なことに、ＹＢ２／０細胞系は、非常に高いレベルのシアリル化を伴う８−１８Ｃ５−Ｄｅｌバリアントを得ることを可能にする。
【０１３０】
ＹＢ２／０細胞における（又は８−１８Ｃ５−ＷＴに関してはＨＥＫ細胞においても）産生後に、８−１８Ｃ５−ＷＴ及び８−１８Ｃ５−Ｄｅｌ抗体をプロテインＧ上で精製し、それらの純度（＞９７％）及びそれらの完全性（凝集率＜２％）を検証するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣによって特徴付けした。
【０１３１】
次いで、ＦｃＲｎ及び様々なＦｃγＲｓに関してＥＬＩＳＡによってこれらを特徴付けした。
【０１３２】
ＦｃＲｎ（ヒト又はマウス）に関するＥＬＩＳＡ：
８−１８Ｃ５−ＷＴ及び８−１８Ｃ５−Ｄｅｌ抗体のＦｃＲｎへの結合を、標準的なＥＬＩＳＡ試験によって測定した。このために、Ｍａｘｉｓｏｒｐのイムノプレートを組換えヒト又はマウスＦｃＲｎタンパク質でコーティングした。プレートを５％のＰＢＳ−ＬＥで飽和させた後、８−１８Ｃ５−ＷＴ又は８−１８Ｃ５−Ｄｅｌ抗体の溶液を異なる濃度（５ｎｇ／ｍＬから０．５μｇ／ｍＬまで）で各ウェルに添加し、３７℃で１時間３０分の間インキュベートした。次いで、ヤギ抗ヒト（又は抗マウス）ＩｇＧ  ＨＲＰ  Ｆ（ａｂ’）２を３７℃で１時間３０分の間、１／２５００でインキュベートした。次いで、ＥＬＩＳＡプレートをＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ）により可視化させ、４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。
【０１３３】
ＦｃγＲｓ（ヒト又はマウス）に関するＥＬＩＳＡ
８−１８Ｃ５−ＷＴ及び８−１８Ｃ５−Ｄｅｌ抗体のヒト又はマウスのＦｃγＲｓへの結合を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  ＨＲＰのＦ（ａｂ’）２を穏やかに撹拌しながら、室温で２時間インキュベート（各分子について、０．５μｇ／ｍｌの最終濃度で）した後に、ＥＬＩＳＡによって測定した。次いで、Ｆ（ａｂ’）２に凝集したＩｇＧを、前もってＦｃγＲでコーティングし、４％のＰＢＳ−ＢＳＡで飽和させたＭａｘｉｓｏｒｐ又はＮｉＮＴＡイムノプレート上で、穏やかにかき混ぜながら、３０℃で１時間インキュベートした。次いで、ＥＬＩＳＡプレートをＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ）により可視化させ、４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。
【０１３４】
８−１８Ｃ５−ＷＴ及び８−１８Ｃ５−Ｄｅｌ抗体のＥＬＩＳＡによる特徴付けによって、Ｆｃドメインにおける点欠失の導入が抗原の認識（組換えＭＯＧタンパク質、ｒＭＯＧを使用する）に影響を及ぼさなかったことを確認した。以下の表１において示すように、ＦｃＲｎへの結合に影響を及ぼさないことは印象的であるが、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃγＲＩＩＢへの結合は低減される。
【０１３５】
【表２】
2021522216.tif 000026
【０１３６】
マウスのＩｇＧ１アイソタイプはＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）及びＦｃγＲＩＶに結合しないため、このことは、８−１８Ｃ５−ＤｅｌバリアントがマウスのＩ型Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）のいずれにももはや結合しないことを示す。さらに、「Ｄｅｌ」突然変異の導入によって誘導されるシアル化の増加をα２．６シアル酸に特異的なレシチン（ＳＮＡ）を使用してウエスタンブロットによって確認した（図４）。これについては、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動工程の後に、抗体をニトロセルロース膜上に移し、次いで、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  ＳＮＡに供した：条件は以下の通りであった：
飽和：ＴＢＳ＋１％のＢＳＡ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、４℃で一晩、
洗浄：Ｐｈｙ  Ｗａｔｅｒ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、５×５分、１回目のインキュベーション：１／１０００のビオチン化ＳＮＡ（ＶＥＣＴＯＲ）、室温で９０分
２回目のインキュベーション：１／２０００のストレプトアビジンペルオキシダーゼ、室温で６０分
化学発光検出
【０１３７】
（例２）
自己免疫脳疾患へのｍＡｂ  ８−１８Ｃ５−Ｄｅｌバリアントに存在するＦｃの操作の影響
無傷の血液脳関門は、ＣＮＳの実質への抗体の浸潤を防止する。したがって、組織を「予備刺激する」ために、ＣＮＳに軽度の自己免疫性炎症を誘導することが必須である。これによって、抗体を実質に侵入させ、それらの免疫機能を働かせることが可能になる。
【０１３８】
選択した実験モデルは、中枢神経系の壊滅的な自己免疫性炎症性疾患である実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）である。１９９３年のその記載から、これは、現在市販されている疾患修飾性処置のほとんどが検証されている、過敏症（特に、ＩＶ型）の原型モデル及び多発性硬化症（ＭＳ）の前臨床モデルとしての役割を果たしている。最も一般的な形態は、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて、ＭＯＧタンパク質の直鎖状の３５〜５５ペプチドによる免疫化によって、脱髄疾患が誘導される、活性ＥＡＥである（Ｒａｍａｄａｎ  Ａ、Ｌｕｃｃａ  ＬＥ、Ｃａｒｒｉｅ  Ｎ、Ｄｅｓｂｏｉｓ  Ｓ、Ａｘｉｓａ  ＰＰ、Ｈａｙｄｅｒ  Ｍ、Ｂａｕｅｒ  Ｊ、Ｌｉｂｌａｕ  ＲＳ、Ｍａｒｓ  ＬＴ．  別個の自己抗原を認識するＴ細胞のｉｎ  ｓｉｔｕでの増殖はＣＮＳにおける自己免疫を持続させる（Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈａｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｓｅｌｆ−ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｓｕｓｔａｉｎｓ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＣＮＳ）。Ｂｒａｉｎ（２０１６）  １３９：１４３３〜１４４６頁）。ＭＡｂ  ８−１８Ｃ５は、ＭＯＧの高次構造エピトープに特異的である（Ｂｒｅｉｔｈａｕｐｔ  Ｃ、Ｓｃｈａｆｅｒ  Ｂ、Ｐｅｌｌｋｏｆｅｒ  Ｈ、Ｈｕｂｅｒ  Ｒ、Ｌｉｎｉｎｇｔｏｎ  Ｃ、Ｊａｃｏｂ  Ｕ．  脱髄性ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質に特異的な自己抗体応答は齧歯類の１つの優勢な高次構造エピトープ領域に集中する（Ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ  ｍｙｅｌｉｎ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｓ  ｆｏｃｕｓｅｄ  ｏｎ  ｏｎｅ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｉｎ  ｒｏｄｅｎｔｓ）。Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００８）  １８１：１２５５〜１２６３頁）：
【０１３９】
ＭＡｂ  ８−１８Ｃ５は、免疫化に使用される直鎖状ＭＯＧ３５−５５ペプチドを認識せず、ＣＮＳに存在する無傷の天然ＭＯＧタンパク質と相互作用するだけである。したがって、ｍＡｂ  ８−１８Ｃ５によって誘導される免疫媒介性作用は、炎症病変内で局所的に天然ＭＯＧに結合することの結果である。
【０１４０】
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の麻痺性疾患に関する８−１８Ｃ５−ＷＴ（ＨＥＫにおいて産生された）及び８−１８Ｃ５−Ｄｅｌ抗体の影響は、パイロット実験において決定され、その結果を図１及び５に示す。
【０１４１】
−  試験１：
６００μｇの不活性化結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７ＲＡを含むＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）中５０μｇのＭＯＧ３５−５５で免疫化し、続いて、０日目（２００ｎｇ）と２日目（４００ｎｇ）に百日咳毒素を２回注射することによって、ＥＡＥの誘導をＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて行う。
【０１４２】
免疫化の７日後に、マウス１匹当たり５０μｇの単回用量で、各抗体を注射した。８−１８Ｃ５抗体のこの２．５ｍｇ／ｋｇ用量は、計画的に、同一疾患を処置するためのＩＶＩｇの用量（合計４ｇ／ｋｇ：４×１ｇ／ｋｇ）よりも低い。
【０１４３】
結果は以下の通りである：
ＰＢＳを注射した対照マウスと比較して、８−１８Ｃ５−ＷＴ（ＷＴ）抗体で処置したマウスは、ＥＡＥの悪化を示し、注射の５〜６日後にこれらのマウスのすべてが死亡する結果となった（図１Ｂ）。
【０１４４】
８−１８Ｃ５−Ｄｅｌバリアントは反対の結果をもたらす：このバリアントは、その本来の病原性を失っただけでなく（この場合、疾患の重症度は、ＰＢＳで処置したマウスのものに類似することとなった）、疾患の重症度を低下させた。８−１８Ｃ５−Ｄｅｌバリアントで処置したマウスは、ＰＢＳに関する４匹のマウスのうちの２匹と比較して、１匹も死亡せず（図１Ｂ）、ＥＡＥの重症度は、明確化の遅れを反映する臨床スコア２で停滞した。麻痺の最も重篤な段階（＞３）には達しなかった（図１Ａ）。
【０１４５】
−  試験２：
１００μｇの不活性化結核菌Ｈ３７ＲＡを含むＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）中１００μｇのＭＯＧ３５−５５で免疫化し、続いて、０日目（２００ｎｇ）と２日目（２００ｎｇ）に百日咳毒素を２回注射することによって、中程度のＥＡＥの誘導を行う。
【０１４６】
１１日目のＥＡＥの誘導の２日前である９日目に、各抗体（ＹＢ２／０（ＹＢ２）細胞において産生されたマウスの８−１８Ｃ５、Ｅ１７１（Ｄｅｌ）欠失（ヒトのＤｅｌ２９４欠失に相当する）を有するバリアント）をマウス１匹当たり５０μｇの単回用量で注射し、ＰＢＳを対照マウスに注射する。
【０１４７】
結果は以下の通りである：
ＰＢＳを注射した対照マウスと比較して、８−１８Ｃ５−ＷＴ抗体（ＹＢ２）で処置したマウスは、ＥＡＥの悪化を示し、免疫化のおよそ１５日後にマウスの３８％が死亡する結果となった（図５Ｂ及び表２）
【０１４８】
８−１８Ｃ５−Ｄｅｌ（Ｄｅｌ）バリアントは、その本来の病原性を失い（この場合、疾患の重症度は、ＰＢＳで処置したマウスのものに類似することとなった）、疾患の重症度を低減した。ＥＡＥの重症度はスコア２で停滞し、麻痺の最も重篤な段階には達しない（図５Ａ）。
【０１４９】
最後に、８−１８Ｃ５−Ｄｅｌ（Ｄｅｌ）バリアントは、すべてのマウスの完全な臨床的回復を可能にし、一方、ＰＢＳ処置は、マウスの５７％の臨床的回復を可能にし、８−１８Ｃ５抗体による処置は、３８％の動物の臨床的回復しか可能にしない（表２）。
【表３】
2021522216.tif 000027
【０１５０】
結論
−  ８−１８Ｃ５−Ｄｅｌバリアントは、ＩＶＩＧよりも４００倍弱く、組換えシアリル化バリアントＦ２４１Ａよりも４０倍弱い単回用量でＥＡＥを改善する（Ｆｉｅｂｉｇｅｒ  ＢＭ、Ｍａａｍａｒｙ  Ｊ、Ｐｉｎｃｅｔｉｃ  Ａ、Ｒａｖｅｔｃｈ  ＪＶ．  抗炎症性ＩｇＧ  Ｆｃｓによる抗体及びＴ細胞に媒介される自己免疫疾患における保護にはＩＩ型ＦｃＲが必要とされる（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｂｙ  ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ＩｇＧ  Ｆｃｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ＦｃＲｓ）。Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２０１５）  １１２：Ｅ２３８５〜Ｅ２３９４頁に記載されている）。これらのパラメーター間の臨界差は、８−１８Ｃ５抗体が、疾患に関連する自己抗原を認識することである。
【０１５１】
−  注射の時、すなわち、疾患発症の直前には、８−１８Ｃ５−Ｄｅｌバリアントが、進行している病態メカニズムに関して効果を有することが強く示される。さらに、８−１８Ｃ５抗体は、中枢神経系において排他的に発現される天然ＭＯＧタンパク質のみを認識するため、この効果は、炎症組織において局所的に生じる傾向がある。
【０１５２】
（例３）
脳における細胞浸潤物の組成に関する８−１８Ｃ５−Ｄｅｌバリアントの効果
低用量の自己抗原に誘導される機序による免疫寛容の回復は、ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞の蓄積をもたらすことが多い。８−１８Ｃ５−ＤｅｌバリアントがＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞の富化を促進し得るかどうかを決定するために、本発明者らは、例２において処置したマウスの脳におけるＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞の大きさを評価する間に実験を実施した。
【０１５３】
免疫化後１６日目に、本発明者らは、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配を使用して脳に浸潤している単核細胞を単離し、フローサイトメトリーによって免疫浸潤物の細胞組成を分析した。
【０１５４】
図２に示したように、ＰＢＳ対照群と比較して、浸潤しているマクロファージの比率及び総数が低いことを考慮すると、８−１８Ｃ５−Ｄｅｌバリアントで処置したマウスの炎症性活性は低減されている。
【０１５５】
マクロファージの低減と同時に、８−１８Ｃ５−Ｄｅｌバリアントで処置したマウスにおけるＣＮＳ浸潤によって、ＰＢＳで処置したＥＡＥマウスと比較して、活性化Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の比率及び絶対数の著しい増加が示された。
【０１５６】
結論
これらの研究は、８−１８Ｃ５−Ｄｅｌバリアントが、標的ＭＯＧ抗原に対して特異的な制御性Ｔリンパ球の増殖を駆動することによって免疫系を再教育する（ｒｅ−ｅｄｕｃａｔｅ）シナリオと一致する。このメカニズムは、ＭＯＧ自己抗原が、エフェクターＴ細胞の病原性応答の損失に対して制御性Ｔ細胞を優先的に活性化する免疫寛容原性抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって提示されることを必要とするようである。
【０１５７】
これによって、ＩＩ型Ｆｃ受容体を発現する免疫寛容原性ＡＰＣに自己抗原を選択的に移動させるための特有のベクターとして、本発明による８−１８Ｃ５−Ｄｅｌバリアントが特定されることになる。
【０１５８】
（例４）
ファージディスプレイによる８−１８Ｃ５と同等な抗体の選択
ヒトｓｃＦｖライブラリーの選択（ＭＧ−ＵｍＡｂ）：
選択工程の間に、標準的手順（Ｓｍｉｔｈ  ＧＰ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５（１９８５））を使用して、ヒトｓｃＦｖライブラリー（ＭＧ−ＵｍＡｂ）をバクテリオファージＭ１３の表面に発現させた。ベクターｐＭＧ７２において発現及びクローニングされるライブラリーを含有する大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細菌を１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン及び１％（ｐ／ｖ）のグルコースを補充した６０ｍｌの２ＹＴ培地中で、３０℃にて培養した。次いで、ヘルパーファージＭ１３（Ｍ１３Ｋ０７、Ｂｉｏｌａｂｓ、細菌／ファージ比＝１／３）を３７℃で２０分間細胞に感染させ、ファージ−ｓｃＦｖの生成を０．５ｍＭのＩＰＴＧ及び１ｍｌ当たり５０μｇのカナマイシンを含む２ＹＴ／アンピシリン／グルコース中で、２３０ｒｐｍで、２６℃にて一晩継続させた。次の日に、標準プロトコールを使用してＰＥＧ６０００を用いてファージを沈殿させ、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液１ｍｌ中に再懸濁させ、用量設定して、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞に感染させた。
【０１５９】
固相選択のために、ＰＢＳ／４％のスキムミルク／０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０中に希釈したファージ−ｓｃＦｖを組換えヒトＭＯＧ又はビオチン化したＭＯＧタンパク質（ストレプトアビジンプレート上で）で前もってコーティングした８ウェルのＭａｘｉｓｏｒｐプレート（１ウェル当たり１〜２×１０１１個のファージで最終１００μｌ）中でインキュベートし、ＰＢＳ中４％のスキムミルクでブロックした。３７℃で２時間のインキュベーション後に、ウェルをＰＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０で１０回及びＰＢＳで２回洗浄した。次いで、選択したファージを指数増殖期のＸＬ１−Ｂｌｕｅ細菌による感染によって溶出させた（２×１５０μｌ／ウェル、２０分、振盪せずに３７℃にて）。次いで、感染した細菌を２ＹＴ／アンピシリン／グルコースの固体培地上にプレーティングした。次の日に、１５％のグリセロールを含む２ＹＴ培地中に細胞を再懸濁させ、凍結させて、次回の選択まで−８０℃で保存した。
【０１６０】
液相選択のために、４×１０１１個のファージをビオチン化したヒトＭＯＧ組換えタンパク質と共に、穏やかに浸透させながら、室温で１時間最初にインキュベートした。次いで、ＰＢＳ中４％のスキムミルクで前もってブロックした、ストレプトアビジン（Ｄｙｎａｌ）をコーティングした磁気ビーズを室温で３０分間ファージに添加した。ファージ−ビーズ複合体をＰＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０で１０回及びＰＢＳで２回、磁石を使用して洗浄した。次いで、ファージ−ビーズ複合体を使用して、５ｍｌの指数増殖中のＸＬ１−Ｂｌｕｅ細菌に感染させ、これらを２ＹＴ／アンピシリン／グルコース固体培地上にプレーティングした。次の日に、１５％のグリセロールを含む２ＹＴ培地中に細胞を再懸濁させ、凍結させて、次回の選択まで−８０℃で保存した。
【０１６１】
特異的なｓｃＦｖが選択されたことを確実にするために、異なる条件下で（４〜６の固相及び／又は４〜６の液相）、数回の選択を実行した。最も密接に関連するｓｃＦｖを選択するために、標的濃度（組換えヒトＭＯＧタンパク質）を漸次低減させた。これらのタンパク質も認識するｓｃＦｖを得るために、相同的なマウス及びカニクイザルのＭＯＧ組換えタンパク質に関しても、選択ラウンドを行った（２回目又は３回目の選択からの類似するスクリーニング条件）。最後に、参照抗体８１８−Ｃ５に類似するエピトープを標的とするｓｃＦｖを得るために、この抗体を進歩的な選択工程（４回目の選択に由来する）における直接的な競争相手として使用した。
【０１６２】
得られたｓｃＦｖの配列は以下の通りである：
【０１６３】
【表４−１】
2021522216.tif 000028
【表４−２】
2021522216.tif 000029
【表４−３】
2021522216.tif 000030
【０１６４】
ＭＯＧタンパク質への結合の決定：ＭＯＧタンパク質（ヒト及びマウス）に関するファージ−ＳｃＦｖのＥＬＩＳＡ試験：
スクリーニングの間に単離されたファージの表面に発現したｓｃＦｖの結合の特徴を組換えＭＯＧタンパク質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用するＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定した。選択したクローンと一緒に、ファージ−ｓｃＦｖ−８−１８Ｃ５が発現され、ＥＬＩＳＡに対する陽性対照としての役割を果たす。簡潔には、ファージ−ｓｃＦｖをヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（前述した通り）を感染させた８００μｌの２ＹＴ／アンピシリン／グルコース培養物中で、９６ウェルプレート上で単離したクローンの形態で生成した。次いで、２６℃で一晩生成させたファージを３０００ｇで３０分間遠心分離した後、上清中に回収した。これらの上清をＰＢＳ／４％のＢＳＡ／０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０中で１／２に直接希釈し、１ウェル当たり０．５μｇのヒト若しくはマウスのＭＯＧ又はＰＢＳ（ＢＳＡにおけるバックグラウンド対照（ｂｄｆ））で前もってコーティングしたＭａｘｉｓｏｒｐイムノプレート上で試験し、ＰＢＳ中４％のＢＳＡでブロックした。３７℃で２時間のインキュベーション後に、ＰＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ−２０で３回ウェルを洗浄し、結合したファージ−ｓｃｆｖを抗Ｍ１３  ＨＲＰ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて検出した。プレートをプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）で４５０ｎｍ（ＯＤ）にて読み取った。結果を比として表す：標的／ＯＤ  ｂｄｆに関するＯＤ（ＢＳＡで飽和させたコーティングされていないプレートに関するＯＤ）及び比を陽性対照について得られたものと比較する。
【０１６５】
【表５−１】
2021522216.tif 000031
【表５−２】
2021522216.tif 000032
【０１６６】
上記の生成したクローンは、８−１８Ｃ５陽性対照の比よりも高い比を有した；したがって、これらは、ＭＯＧタンパク質に対してより良好に結合する。
【０１６７】
さらに、以下の実験を追加で行ってもよい：
【０１６８】
Ｔ細胞応答への影響を決定する：
免疫化後１６日目に、本発明者らは、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配を使用して、脳に浸潤している単核細胞を単離し、フローサイトメトリーによって免疫浸潤物の細胞組成を分析した。制御性（Ｆｏｘｐ３＋）及び病原性（Ｔｈ１／Ｔｈ１７）Ｔリンパ球の振幅を決定し、８−１８Ｃ５−Ｄｅｌで処置したマウスにおいて、病原性応答の収縮が増殖制御性Ｔ細胞応答と相関するかどうかを形式的に示してもよい。
【０１６９】
病原性及び免疫調節性Ｔ細胞応答の特異性を決定する：
抗原ブースター実験を使用すると、ＭＨＣ四量体及びＴ細胞は、ＭＯＧ３５−５５に対して特異的なトランスジェニックＴＣＲを発現し、制御性及び病原性Ｔ細胞応答の特異性を確立することができる。目的は、モノクローナル抗体８−１８Ｃ５の治療効果を媒介するＭＯＧ自己抗原の中心的役割を確立することである。
【０１７０】
８−１８Ｃ５−Ｄｅｌと相互作用する免疫寛容原性骨髄性サブセットを同定する：
疾患の改善中に、ｍ８−１８Ｃ５−Ｄｅｌバリアント（Ｉ型受容体に結合していない）は、とりわけ、Ｃ型のレシチンに対するＣＤ２０９受容体（ＳＩＧＮ−Ｒ１）及びＣＤ２３を含むＩＩ型ＦｃＲに結合すると考えられる。８−１８Ｃ５−Ｄｅｌ抗体の標的細胞を特定するために、２つのアプローチを有利に開発することができる：
−  ８−１８Ｃ５−Ｄｅｌ及び８−１８Ｃ５−ＷＴを別個の蛍光色素で標識し、いずれか又は両方の抗体に結合する、脳に浸潤している免疫細胞をフローサイトメトリーによって分析する。
−  脳に浸潤している免疫細胞上のＩ型又はＩＩ型Ｆｃ受容体のプロファイルは、フローサイトメトリーアプローチを使用して確立する。
【０１７１】
ＤＣ−ＳＩＧＮ＋マクロファージ／免疫調節性ミクログリアに対して、及び抗炎症性Ｍ２マクロファージ／ミクログリアＡｒｇ−１＋  ＣＤ４５＋  ＣＤ１１Ｂ＋  Ｆ４／８０＋  ＣＤ６８＋に対して、特に注意を払う。骨髄に由来するサプレッサー細胞及び形質細胞様ＤＣは、ＥＡＥをさらに悪化させることが報告されているため、より不十分な候補である。
【０１７２】
上述の戦略と同様に、免疫化後１６日目に、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配を使用して、脳に浸潤している単核細胞を単離することによって、これらのアプローチを実施する。
【０１７３】
特定した免疫寛容原性骨髄性サブセットの機能的意義
ＣＮＳ単離後に、免疫寛容原性サブセットをトランスジェニックＴＣＲ  Ｔ細胞と共培養し、ＭＯＧ抗原の提示によって制御性Ｔ細胞が増殖することを実証する。次に、中和抗体のアプローチをｉｎ  ｖｉｖｏで使用し、関与する細胞の誘導又は機能を遅らせる。
【図１】
2021522216.tif 000033
【図２】
2021522216.tif 000034
【図３】
2021522216.tif 000035
【図４】
2021522216.tif 000036
【図５】
2021522216.tif 000037
【配列表】
2021522216000001.app
【国際調査報告】
2021522216.tif 000038
2021522216.tif 000039
2021522216.tif 000040
2021522216.tif 000041
2021522216.tif 000042
2021522216.tif 000043