(57)【要約】  本明細書で提供されるのは、標的細菌を殺すための方法および組成物である。また、改変されたバクテリオファージも開示されている。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細菌を死滅させるための方法であって、前記方法は、
（ａ）標的細菌中の標的遺伝子由来の標的ヌクレオチド配列に相補的なスペーサー配列、またはそこから転写されたｃｒＲＮＡをコードする第１の核酸配列、および
（ｂ）前記標的細菌の溶解を誘導することができる遺伝子を含む
バクテリオファージを標的細菌に導入する工程を含み、
ここで、前記標的細菌は、スペーサー配列またはそこから転写されたｃｒＲＮＡを使用して、バクテリオファージの溶解活性、または、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性によって死滅させられる、方法。
【請求項２】
前記第１の核酸配列が、少なくとも１つの反復配列をさらに含むＣＲＩＳＰＲアレイである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記バクテリオファージが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムのための転写活性化因子をコードする第２の核酸をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子がバクテリオファージに対して内因性である、請求項１−３のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子がバクテリオファージに対して外因性である、請求項１−３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記転写活性化因子がクオラムセンシング（ＱＳ）シグナルによって制御される、請求項３−５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記転写活性化因子が、細菌膜のストレスの感知に関与するタンパク質である、請求項３−５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ストレスの感知に関与するタンパク質が、応答制御因子ＢａｅＳＲである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記転写活性化因子が、Ｃａｓを安定させるタンパク質である、請求項３−５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｃａｓを安定化するタンパク質が、熱ショックタンパク質Ｇ（ＨｔｐＧ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記転写活性化因子が、代謝感知タンパク質である、請求項３−５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記代謝感知タンパク質が、ｃＡＭＰ受容体タンパク質（ＣＲＰ）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣＲＰがサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）に対して感受性である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記代謝感知タンパク質がシグマ因子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記シグマ因子がＲｐｏＮ（σ５４）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記転写活性化因子が阻害要素の活性を破壊する、請求項３−５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記阻害要素が、熱安定性核様体構造化タンパク質（Ｈ−ＮＳ）、ロイシン応答性制御タンパク質（ＬＲＰ）、またはＣｏｄＹを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記阻害要素が転写リプレッサーである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記転写リプレッサーがグローバル転写リプレッサーである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記転写活性化因子が、ＬｅｕＯまたは配列番号１と少なくとも７５％の配列相同性を有するポリペプチドを含む、請求項３−１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記転写活性化因子が、ＣＤ２９８３または配列番号２と少なくとも７５％の配列相同性を有するポリペプチドを含む、請求項３−１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが、標的細菌に対して内因性である、請求項１−２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが、標的細菌に対して外因性である、請求項１−２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである、請求項１−２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的ヌクレオチド配列が、標的遺伝子のためのプロモーター配列の全部または一部を含む、請求項１−２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記標的ヌクレオチド配列が、標的遺伝子の転写領域のコード鎖上に位置するヌクレオチド配列の全部または一部を含む、請求項１−２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的ヌクレオチド配列が、標的細菌の生存に必要とされる必須遺伝子の少なくとも一部である、請求項１−２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記必須遺伝子が、Ｔｓｆ  ａｃｐＰ、ｇａｐＡ、ｉｎｆＡ、ｓｅｃＹ、ｃｓｒＡ、ｔｒｍＤ、ｆｔｓＡ、ｆｕｓＡ、ｇｌｙＱ、ｅｎｏ、またはｎｕｓＧである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの反復配列が、その５’末端またはその３’末端のいずれかでスペーサー配列に動作可能に連結されている、請求項２−２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記標的細菌が、バクテリオファージの溶解活性によってのみ死滅させられる、請求項１−３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記標的細菌が、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性によってのみ死滅させられる、請求項１―３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記標的細菌が、バクテリオファージの溶解活性とＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性との両方の組み合わせによって死滅させられる、請求項１−３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記標的細菌が、バクテリオファージの溶解活性と独立して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性によって死滅させられる、請求項１−３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性が、バクテリオファージの溶解活性を補完または増強する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記スペーサー配列が第２のスペーサー配列と重複する、請求項１−３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記バクテリオファージの溶解活性および前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性が、相乗的である、請求項１−３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記バクテリオファージの溶解活性、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性、またはその両方が、バクテリオファージの濃度によって調節される、請求項１−３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記バクテリオファージが複数の菌株に感染する、請求項１−３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記バクテリオファージが偏性溶解性バクテリオファージである、請求項１−３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記バクテリオファージが、溶解性にされた溶原バクテリオファージである、請求項１−３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記バクテリオファージが、バクテリオファージの溶解活性および／またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓアレイの活性によって引き起こされる細胞死を超えて、標的細菌にいかなる新しい特性も付与しない、請求項１−４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記標的細菌がＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである、請求項１−４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記バクテリオファージが、φＣＤ１４６またはφＣＤ２４−２である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記標的細菌が大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）である、請求項１−４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記バクテリオファージがＴ４、Ｔ７、またはＴ７ｍである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
スペーサー配列またはｃｒＲＮＡをコードする第１の核酸が、非必須バクテリオファージ遺伝子に挿入される、請求項１−４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記非必須遺伝子がｇｐ４９である、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
前記非必須遺伝子がｇｐ７５である、請求項４７記載の方法。
【請求項５０】
前記非必須遺伝子がｈｏｃである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記非必須遺伝子がｇｐ０．７、ｇｐ４．３、ｇｐ４．５、またはｇｐ４．７である、請求項４７記載の方法。
【請求項５２】
前記非必須遺伝子がｇｐ０．６、ｇｐ０．６５、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、またはｇｐ４．５である、請求項４７記載の方法。
【請求項５３】
バクテリオファージであって、
（ａ）標的細菌中の標的遺伝子由来の標的ヌクレオチド配列に相補的なスペーサー配列、またはそこから転写されたｃｒＲＮＡをコードする第１の核酸、および
（ｂ）前記標的細菌の溶解を誘導することができる遺伝子を含み、
ここで、前記標的細菌は、スペーサー配列またはそこから転写されたｃｒＲＮＡを使用して、バクテリオファージの溶解活性、または、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性によって死滅させられる、バクテリオファージ。
【請求項５４】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムのための転写活性化因子をコードする第２の核酸をさらに含む、請求項５３に記載のバクテリオファージ。
【請求項５５】
前記転写活性化因子がクオラムセンシング（ＱＳ）シグナルによって制御される、請求項５４に記載のバクテリオファージ。
【請求項５６】
前記転写活性化因子が、細菌膜のストレスの感知に関与するタンパク質である、請求項５４に記載のバクテリオファージ。
【請求項５７】
前記タンパク質が応答制御因子ＢａｅＳＲである、請求項５６に記載のバクテリオファージ。
【請求項５８】
前記転写活性化因子が、Ｃａｓを安定化するタンパク質である、請求項５４に記載のバクテリオファージ。
【請求項５９】
前記Ｃａｓを安定化するタンパク質が、熱ショックタンパク質Ｇ（ＨｔｐＧ）である、請求項５８に記載のバクテリオファージ。
【請求項６０】
前記転写活性化因子が、代謝感知タンパク質である、請求項５４に記載のバクテリオファージ。
【請求項６１】
前記代謝感知タンパク質が、ｃＡＭＰ受容体タンパク質（ＣＲＰ）である、請求項６０に記載のバクテリオファージ。
【請求項６２】
前記ＣＲＰがサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）に対して感受性である、請求項６１に記載のバクテリオファージ。
【請求項６３】
前記代謝感知タンパク質がシグマ因子である、請求項６０に記載のバクテリオファージ。
【請求項６４】
前記シグマ因子がＲｐｏＮ（σ５４）である、請求項６３に記載のバクテリオファージ。
【請求項６５】
前記転写活性化因子が、標的細菌の阻害要素の活性を破壊する、請求項５４に記載のバクテリオファージ。
【請求項６６】
前記阻害要素が、熱安定性核様体構造化タンパク質（Ｈ−ＮＳ）、ロイシン応答性制御タンパク質（ＬＲＰ）、またはＣｏｄＹである、請求項６５に記載のバクテリオファージ。
【請求項６７】
前記阻害要素が転写リプレッサーである、請求項６５に記載のバクテリオファージ。
【請求項６８】
前記転写リプレッサーがグローバル転写リプレッサーである、請求項６７に記載のバクテリオファージ。
【請求項６９】
前記転写活性化因子が、ＬｅｕＯまたは配列番号１と少なくとも７５％の配列相同性を有するポリペプチドを含む、請求項５４−６８のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項７０】
前記転写活性化因子が、ＣＤ２９８３または配列番号２と少なくとも７５％の配列相同性を有するポリペプチドを含む、請求項５４−６８のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項７１】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが、標的細菌に対して内因性である、請求項５３−７０のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項７２】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが、標的細菌に対して外因性である、請求項５３−７０のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項７３】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである、請求項５３−７２のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項７４】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである、請求項７３に記載のバクテリオファージ。
【請求項７５】
前記標的ヌクレオチド配列が、標的遺伝子のためのプロモーター配列の全部または一部を含む、請求項５３−７４のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項７６】
前記標的ヌクレオチド配列が、標的遺伝子の転写領域のコード鎖上に位置するヌクレオチド配列の全部または一部を含む、請求項５３−７５のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項７７】
前記標的ヌクレオチド配列が必須遺伝子にある、請求項５３−７６のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項７８】
前記必須遺伝子が、Ｔｓｆ、ａｃｐＰ、ｇａｐＡ、ｉｎｆＡ、ｓｅｃＹ、ｃｓｒＡ、ｔｒｍＤ、ｆｔｓＡ、ｆｕｓＡ、ｇｌｙＱ、ｅｎｏ、またはｎｕｓＧである、請求項７７に記載のバクテリオファージ。
【請求項７９】
前記標的ヌクレオチド配列が非必須遺伝子である、請求項５３−７６のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項８０】
前記第１の核酸配列が、少なくとも１つの反復配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイである、請求項５３−７９のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項８１】
前記少なくとも１つの反復配列が、その５’末端またはその３’末端のいずれかでスペーサー配列に動作可能に連結されている、請求項８０に記載のバクテリオファージ。
【請求項８２】
前記バクテリオファージが複数の菌株に感染する、請求項５３−８１のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項８３】
前記バクテリオファージが偏性溶解性バクテリオファージである、請求項５３−８２のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項８４】
前記バクテリオファージが、溶解性にされた溶原バクテリオファージである、請求項５３−８２のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項８５】
前記溶原バクテリオファージが、１以上の溶原性遺伝子の除去、置換、または不活性化によって溶解性にされた、請求項８４に記載のバクテリオファージ。
【請求項８６】
前記標的細菌がＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである、請求項５３−８５のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項８７】
前記バクテリオファージが、φＣＤ１４６またはφＣＤ２４−２である、請求項８６に記載のバクテリオファージ。
【請求項８８】
前記標的細菌が大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）である、請求項５３−８５のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項８９】
前記バクテリオファージがＴ４、Ｔ７、またはＴ７ｍである、請求項８８に記載のバクテリオファージ。
【請求項９０】
前記スペーサー配列またはｃｒＲＮＡをコードする第１の核酸が、非必須遺伝子に挿入される、請求項５３−８９のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項９１】
前記非必須遺伝子がｇｐ４９である、請求項５３−９０のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項９２】
前記非必須遺伝子がｇｐ７５である、請求項５３−９０のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項９３】
前記非必須遺伝子がｈｏｃである、請求項５３−９０のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項９４】
前記非必須遺伝子がｇｐ０．７、ｇｐ４．３、ｇｐ４．５、またはｇｐ４．７である、請求項５３−９０のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項９５】
前記非必須遺伝子がｇｐ０．６、ｇｐ０．６５、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、またはｇｐ４．５である、請求項５３−９０のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項９６】
標的細菌におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性を調節するための方法であって、標的細菌におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムのための転写活性化因子をコードする核酸を含むバクテリオファージを導入する工程を含む方法。
【請求項９７】
前記転写活性化因子がクオラムセンシング（ＱＳ）シグナルによって制御される、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記転写活性化因子が、細菌膜へのストレスの感知に関与するタンパク質である、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
前記ストレスの感知に関与するタンパク質が、応答制御因子ＢａｅＳＲである、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記転写活性化因子が、Ｃａｓを安定化するタンパク質である、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０１】
前記Ｃａｓを安定化するタンパク質が、熱ショックタンパク質Ｇ（ＨｔｐＧ）である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記転写活性化因子が、代謝感知タンパク質である、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０３】
前記代謝感知タンパク質が、ｃＡＭＰ受容体タンパク質（ＣＲＰ）である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ＣＲＰがサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）に対して感受性である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記代謝感知タンパク質がシグマ因子である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０６】
前記シグマ因子がＲｐｏＮ（σ５４）である、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記転写活性化因子が阻害要素の活性を破壊する、請求項９６−１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記阻害要素が、熱安定性核様体構造化タンパク質（Ｈ−ＮＳ）、ロイシン応答性制御タンパク質（ＬＲＰ）、またはＣｏｄＹである、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記阻害要素が転写リプレッサーである、請求項１０７−１０８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記転写リプレッサーがグローバル転写リプレッサーである、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記転写活性化因子が、ＬｅｕＯまたは配列番号１と少なくとも７５％の配列相同性を有するポリペプチドを含む、請求項９６−１１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記転写活性化因子が、ＣＤ２９８３または配列番号２と少なくとも７５％の配列相同性を有するポリペプチドを含む、請求項９６−１１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが、標的細菌に対して内因性である、請求項９６−１１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが、標的細菌に対して外因性である、請求項９６−１１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである、請求項９６−１１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記バクテリオファージが複数の菌株に感染する、請求項９６−１１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記バクテリオファージが偏性溶解性バクテリオファージである、請求項９６−１１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記バクテリオファージが、溶解性にされた溶原バクテリオファージである、請求項９６−１１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記標的細菌がＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである、請求項９６−１１９に記載のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記バクテリオファージが、φＣＤ１４６またはφＣＤ２４−２である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記標的細菌が大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）である、請求項９６−１１９に記載のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記バクテリオファージがＴ４、Ｔ７、またはＴ７ｍである、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
転写活性化因子をコードする核酸が、非必須バクテリオファージ遺伝子に挿入される、請求項９６−１２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記非必須遺伝子がｇｐ４９である、請求項９６−１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記非必須遺伝子がｇｐ７５である、請求項９６−１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記非必須遺伝子がｈｏｃである、請求項９６−１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２８】
前記非必須遺伝子がｇｐ０．７、ｇｐ４．３、ｇｐ４．５、またはｇｐ４．７である、請求項９６−１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記非必須遺伝子がｇｐ０．６、ｇｐ０．６５、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、またはｇｐ４．５である、請求項９６−１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３０】
標的細菌中におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの転写活性化因子をコードする核酸を含む、バクテリオファージ。
【請求項１３１】
前記転写活性化因子がクオラムセンシング（ＱＳ）シグナルによって制御される、請求項１３０に記載のバクテリオファージ。
【請求項１３２】
前記転写活性化因子が、細菌膜へのストレスの感知に関与するタンパク質である、請求項１３０に記載のバクテリオファージ。
【請求項１３３】
前記ストレスの感知に関与するタンパク質が、応答制御因子ＢａｅＳＲである、請求項１３２に記載のバクテリオファージ。
【請求項１３４】
前記転写活性化因子が、Ｃａｓを安定化するタンパク質である、請求項１３０に記載のバクテリオファージ。
【請求項１３５】
前記Ｃａｓを安定化するタンパク質が、熱ショックタンパク質Ｇ（ＨｔｐＧ）である、請求項１３４に記載のバクテリオファージ。
【請求項１３６】
前記転写活性化因子が、代謝感知タンパク質である、請求項１３０に記載のバクテリオファージ。
【請求項１３７】
前記代謝感知タンパク質が、ｃＡＭＰ受容体タンパク質（ＣＲＰ）である、請求項１３６に記載のバクテリオファージ。
【請求項１３８】
前記ＣＲＰがサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）に対して感受性である、請求項１３７に記載のバクテリオファージ。
【請求項１３９】
前記代謝感知タンパク質がシグマ因子である、請求項１３６に記載のバクテリオファージ。
【請求項１４０】
前記シグマ因子がＲｐｏＮ（σ５４）である、請求項１３９に記載のバクテリオファージ。
【請求項１４１】
前記転写活性化因子が阻害要素の活性を破壊する、請求項１３０−１４０のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項１４２】
前記阻害要素が、熱安定性核様体構造化タンパク質（Ｈ−ＮＳ）、ロイシン応答性制御タンパク質（ＬＲＰ）、またはＣｏｄＹである、請求項１４１に記載のバクテリオファージ。
【請求項１４３】
前記阻害要素が転写リプレッサーである、請求項１４１−１４２のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項１４４】
前記転写リプレッサーがグローバル転写リプレッサーである、請求項１４３に記載のバクテリオファージ。
【請求項１４５】
前記転写活性化因子が、ＬｅｕＯまたは配列番号１と少なくとも７５％の配列相同性を有するポリペプチドを含む、請求項１３０−１４４のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項１４６】
前記転写活性化因子が、ＣＤ２９８３または配列番号２と少なくとも７５％の配列相同性を有するポリペプチドを含む、請求項１３０−１４４のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項１４７】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが、標的細菌に対して内因性である、請求項１３０−１４６のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項１４８】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが、標的細菌に対して外因性である、請求項１３０−１４６のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項１４９】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである、請求項１３０−１４８のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項１５０】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである、請求項１４９に記載のバクテリオファージ。
【請求項１５１】
前記バクテリオファージが複数の菌株に感染する、請求項１３０−１５０のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項１５２】
前記バクテリオファージが偏性溶解性バクテリオファージである、請求項１３０−１５１のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項１５３】
前記バクテリオファージが、溶解性にされた溶原バクテリオファージである、請求項１３０−１５１のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項１５４】
前記標的細菌がＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである、請求項１３０−１５３のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項１５５】
前記バクテリオファージが、φＣＤ１４６またはφＣＤ２４−２である、請求項１５４に記載のバクテリオファージ。
【請求項１５６】
前記標的細菌が大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）である、請求項１３０−１５３のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項１５７】
前記バクテリオファージがＴ４、Ｔ７、またはＴ７ｍである、請求項１５６に記載のバクテリオファージ。
【請求項１５８】
転写活性化因子をコードする核酸が、非必須バクテリオファージ遺伝子に挿入される、請求項１３０−１５７のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項１５９】
前記非必須遺伝子がｇｐ４９である、請求項１３０−１５８のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項１６０】
前記非必須遺伝子がｇｐ７５である、請求項１３０−１５８のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項１６１】
前記非必須遺伝子がｈｏｃである、請求項１３０−１５８のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項１６２】
前記非必須遺伝子がｇｐ０．７、ｇｐ４．３、ｇｐ４．５、またはｇｐ４．７である、請求項１３０−１５８のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項１６３】
前記非必須遺伝子がｇｐ０．６、ｇｐ０．６５、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、またはｇｐ４．５である、請求項１３０−１５８のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項１６４】
標的細菌にバクテリオファージを導入する工程を含む、標的細菌を死滅させる方法であって、
前記バクテリオファージは、
（ａ）溶解活性、および
（ｂ）抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする第１の核酸配列を含み、
ここで、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドが、バクテリオファージの溶解活性を増強する、方法。
【請求項１６５】
前記抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを不活性化する、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
前記抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドが、遺伝子制御干渉を含むプロセスを使用して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを不活性化する、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
前記抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドが、ヌクレアーゼ動員干渉を含むプロセスを使用して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを不活性化する、請求項１６５−１６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６８】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである、請求項１６５−１６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６９】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７０】
前記抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドが、カスケードまたはカスケード様複合体に直接的または間接的に結合する、請求項１６４−１６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７１】
前記抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドが、短縮型タンパク質、融合タンパク質、二量体タンパク質、または変異タンパク質である、請求項１６４−１７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７２】
前記バクテリオファージが、ＣＲＩＳＰＲアレイをコードする第２の核酸をさらに含む、請求項１６４−１７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７３】
前記ＣＲＩＳＰＲアレイが、少なくとも１つの反復配列および、標的細菌中の標的遺伝子由来の標的ヌクレオチド配列に相補的である、少なくとも１つのスペーサー配列を含む、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７４】
バクテリオファージであって、
（ｃ）溶解活性、および
（ｄ）抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする第１の核酸配列を含み、
ここで、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドが、バクテリオファージの溶解活性を増強する、バクテリオファージ。
【請求項１７５】
前記抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを不活性化する、請求項１７４に記載のバクテリオファージ。
【請求項１７６】
前記抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドが、遺伝子制御干渉を含むプロセスを使用して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを不活性化する、請求項１７５に記載のバクテリオファージ。
【請求項１７７】
前記抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドが、ヌクレアーゼ動員干渉を含むプロセスを使用して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを不活性化する、請求項１７５または１７６に記載のバクテリオファージ。
【請求項１７８】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである、請求項１７５−１７７のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項１７９】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである、請求項１７８に記載のバクテリオファージ。
【請求項１８０】
前記抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドが、カスケードまたはカスケード様複合体に直接的または間接的に結合する、請求項１７４−１７９のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項１８１】
前記抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドが、短縮型タンパク質、融合タンパク質、二量体タンパク質、または変異タンパク質である、請求項１７４−１８０のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項１８２】
前記バクテリオファージが、ＣＲＩＳＰＲアレイをコードする第２の核酸をさらに含む、請求項１７４−１８０に記載のいずれか１項に記載のバクテリオファージ。
【請求項１８３】
前記ＣＲＩＳＰＲアレイが、少なくとも１つの反復配列および、標的細菌中の標的遺伝子由来の標的ヌクレオチド配列に相補的である、少なくとも１つのスペーサー配列を含む、請求項１８２に記載のバクテリオファージ。
【請求項１８４】
請求項５３−９５、１３０−１６３または１７４−１８３のいずれか１項に記載のバクテリオファージを対象に投与する工程を含む、対象の疾患を治療する方法。
【請求項１８５】
前記対象が哺乳動物である、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８６】
前記疾患が細菌性感染症である、請求項１８４−１８５に記載のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８７】
細菌性感染症を引き起こす細菌が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ種、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ複合体、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｔｒａｔｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループ  Ｇｌ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループ  Ｇ２、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ種、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ複合体、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、非結核性ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ種、  Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ種、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｌｔｅａｅ、およびこれらの任意の組合せである、請求項１８６に記載の方法。
【請求項１８８】
前記細菌が、少なくとも１つの抗生物質に耐性の薬剤耐性細菌である、請求項１８７に記載の方法。
【請求項１８９】
前記細菌が、少なくとも１つの抗生物質に耐性の多剤耐性細菌である、請求項１８７または１８８に記載の方法。
【請求項１９０】
前記抗生物質が、セファロスポリン、フルオロキノロン、カルバペネム、コリスチン、アミノグリコシド、バンコマイシン、ストレプトマイシン、またはメチシリンを含む、請求項１８８または１８９に記載の方法。
【請求項１９１】
前記投与が動脈内、静脈内、筋肉内、経口、皮下、吸入、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項１８４−１９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９２】
ａおよびｂを含む、医薬組成物。
ａ．請求項５３−９５、１３０−１６３または１７４−１８３のいずれか１つに記載のバクテリオファージ、
ｂ．薬学的に許容される賦形剤。
【請求項１９３】
錠剤、液体、シロップ、経口製剤、静脈内投与製剤、鼻腔内投与製剤、眼用製剤、耳用製剤、皮下注製剤、吸入性呼吸製剤、坐剤、およびそれらの任意の組み合わせの形態である、請求項１９２に記載の医薬組成物。
【請求項１９４】
標的細菌を死滅させる方法であって、前記方法は、
溶原バクテリオファージを標的細菌に導入する工程を含み、
ここで、溶原バクテリオファージの溶原性遺伝子が、除去、置換、または不活性化され、および前記溶原バクテリオファージが溶解性にされ、それによって標的細菌を死滅させる、方法。
【請求項１９５】
前記溶原性遺伝子が、ｃｌファージリプレッサー遺伝子を含む、請求項１９４記載の方法。
【請求項１９６】
前記バクテリオファージが複数の菌株に感染する、請求項１９４または１９５に記載の方法。
【請求項１９７】
前記標的細菌がＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである、請求項１９４−１９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９８】
前記バクテリオファージが、φＣＤ１４６またはφＣＤ２４−２である、請求項１９７に記載の方法。
【請求項１９９】
前記バクテリオファージが、スペーサー配列、またはそこから転写されたｃｒＲＮＡをコードする第１の核酸をさらに含む、請求項１９４−１９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２００】
前記スペーサー配列が、標的細菌中の標的遺伝子由来の標的ヌクレオチド配列に相補的である、請求項１９９に記載の方法。
【請求項２０１】
前記第１の核酸配列が、少なくとも１つの反復配列をさらに含むＣＲＩＳＰＲアレイである、請求項１９９または２００に記載の方法。
【請求項２０２】
前記少なくとも１つの反復配列が、その５’末端またはその３’末端のいずれかでスペーサー配列に動作可能に連結されている、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２０３】
前記バクテリオファージが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムのための転写活性化因子をコードする第２の核酸をさらに含む、請求項１９９−２０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０４】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが、標的細菌に対して内因性である、請求項２０３に記載の方法。
【請求項２０５】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが、標的細菌に対して外因性である、請求項２０３に記載の方法。
【請求項２０６】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである、請求項２０３−２０５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０７】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを含む、請求項２０３−２０５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０８】
前記標的ヌクレオチド配列が、標的遺伝子のためのプロモーター配列の全部または一部を含む、請求項２００−２０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０９】
前記標的ヌクレオチド配列が、標的遺伝子の転写領域のコード鎖上に位置するヌクレオチド配列の全部または一部を含む、請求項２００−２０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１０】
標的ヌクレオチド配列が、標的細菌の生存に必要とされる必須遺伝子の少なくとも一部分を含む、請求項２００−２０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１１】
前記標的細菌が、バクテリオファージの溶解活性およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性との両方の組み合わせによって死滅させられる、請求項２０３−２１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１２】
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性が、バクテリオファージの溶解活性を補完または増強する、請求項２１１に記載の方法。
【請求項２１３】
前記標的細菌が、バクテリオファージの溶解活性とは独立して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性によって死滅させられる、請求項２０３−２１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１４】
前記バクテリオファージの溶解活性および前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性が、相乗的である、請求項２０３−２１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１５】
前記バクテリオファージの溶解活性、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性、またはその両方が、バクテリオファージの濃度によって調節される、請求項１９４−２１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１６】
医薬組成物であって：（ａ）溶原性遺伝子が除去、置換、または不活性化されている、溶原バクテリオファージ、および（ｂ）薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項２１７】
錠剤、液体、シロップ、経口製剤、静脈内投与製剤、鼻腔内投与製剤、眼用製剤、耳用製剤、皮下注製剤、吸入性呼吸製剤、坐剤、およびそれらの任意の組み合わせの形態である、請求項２１６に記載の医薬組成物。
【請求項２１８】
対象のマイクロバイオームを調整する方法であって、請求項１９２−１９３または２１６−２１７のいずれか１つに記載の医薬組成物を対象に投与する工程を含む方法。
【請求項２１９】
前記細菌がシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）である、請求項１８７−１９１に記載のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２０】
前記細菌がブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）である、請求項１８７−１９１に記載のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２１】
前記細菌がメチシリン耐性である、請求項１８７−１９１または２１９−２２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２２】
前記細菌がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）である、請求項１８７−１９１または２２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２３】
前記細菌が多剤耐性緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）である、請求項１８７−１９１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本願は、２０１８年５月４日に出願された米国仮出願第６２／６６７，４００号、２０１８年１０月１０日に出願された米国仮出願第６２／７４３，７４０号、および２０１９年３月１３日に出願された米国仮出願第６２／８１８，０６６号の利益を主張し、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、標的細菌を死滅させるための方法である。いくつかの実施形態において、標的細菌を死滅させるための方法は、標的細菌中の標的遺伝子由来の標的ヌクレオチド配列に相補的なスペーサー配列、および標的細菌の溶解を誘導することができる遺伝子を含むバクテリオファージを標的細菌に導入する工程を含む。いくつかの実施形態において、標的細菌は、スペーサー配列またはそこから転写されたｃｒＲＮＡを使用して、バクテリオファージの溶解活性、またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性によって死滅させられる。いくつかの実施形態において、第１の核酸配列が、少なくとも１つの反復配列をさらに含むＣＲＩＳＰＲアレイである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムのための転写活性化因子をコードする第２の核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記遺伝子は内因性または外因性である。いくつかの実施形態において、転写活性化因子はクオラムセンシング（ＱＳ）シグナルによって制御される。いくつかの実施形態において、転写活性化因子は細菌膜のストレスの感知に関与するタンパク質である。いくつかの実施形態において、ストレスの感知に関与するタンパク質は応答制御因子ＢａｅＳＲである。いくつかの実施形態において、転写活性化因子はＣａｓを安定させるタンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓを安定化するタンパク質は熱ショックタンパク質Ｇ（ＨｔｐＧ）である。いくつかの実施形態において、転写活性化因子は代謝感知タンパク質である。いくつかの実施形態において、代謝感知タンパク質はｃＡＭＰ受容体タンパク質（ＣＲＰ）である。いくつかの実施形態において、ＣＲＰがサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）に対して感受性である。いくつかの実施形態において、代謝感知タンパク質がシグマ因子である。いくつかの実施形態において、シグマ因子はＲｐｏＮ（σ５４）である。いくつかの実施形態において、転写活性化因子は阻害要素の活性を破壊する。阻害要素は熱安定性核様体構造化タンパク質（Ｈ−ＮＳ）、ロイシン応答性制御タンパク質（ＬＲＰ）、またはＣｏｄＹを含む。いくつかの実施形態において、阻害要素は転写リプレッサーである。いくつかの実施形態において、転写リプレッサーはグローバル転写リプレッサーである。いくつかの実施形態において、転写活性化因子はＬｅｕＯまたは配列番号１と少なくとも７５％の配列相同性を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、転写活性化因子はＣＤ２９８３または配列番号２と少なくとも７５％の配列相同性を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは標的細菌に対して内因性である。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは標的細菌に対して外因性である。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムはＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態において、ＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムはＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを含む。いくつかの実施形態���おいて、標的ヌクレオチド配列は標的遺伝子のためのプロモーター配列の全部または一部を含む。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は標的遺伝子の転写領域のコード鎖上に位置するヌクレオチド配列の全部または一部を含む。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は標的細菌の生存に必要とされる必須遺伝子の少なくとも一部である。いくつかの実施形態において、必須遺伝子はＴｓｆ、ａｃｐＰ、ｇａｐＡ、ｉｎｆＡ、ｓｅｃＹ、ｃｓｒＡ、ｔｒｍＤ、ｆｔｓＡ、ｆｕｓＡ、ｇｌｙＱ、ｅｎｏ、またはｎｕｓＧである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの反復配列はその５’末端またはその３’末端のいずれかでスペーサー配列に動作可能に連結されている。いくつかの実施形態において、標的細菌はバクテリオファージの溶解活性によってのみ死滅させられる。いくつかの実施形態において、標的細菌はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性によってのみ死滅させられる。いくつかの実施形態において、標的細菌はバクテリオファージの溶解活性とＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性との両方の組み合わせによって死滅させられる。いくつかの実施形態において、標的細菌はバクテリオファージの溶解活性と独立して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性によって死滅させられる。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性はバクテリオファージの溶解活性を補完または増強する。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は第２のスペーサー配列と重複する。いくつかの実施形態において、バクテリオファージの溶解活性およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性は相乗的である。いくつかの実施形態において、バクテリオファージの溶解活性、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性、またはその両方はバクテリオファージの濃度によって調節される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは複数の菌株に感染する。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは偏性溶解性バクテリオファージである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは溶解性にされた溶原バクテリオファージである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはバクテリオファージの溶解活性および／またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓアレイの活性によって引き起こされる細胞死を超えて、標的細菌にいかなる新しい特性も付与しない。いくつかの実施形態において、標的細菌はＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはφＣＤ１４６またはφＣＤ２４−２である。いくつかの実施形態において、標的細菌が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＴ４、Ｔ７、またはＴ７ｍである。いくつかの実施形態において、スペーサー配列またはｃｒＲＮＡをコードする第１の核酸は非必須バクテリオファージ遺伝子に挿入される。いくつかの実施形態において、非必須遺伝子は、ｇｐ４９、ｇｐ７５、またはｈｏｃである。いくつかの実施形態において、非必須遺伝子はｇｐ０．７、ｇｐ４．３、ｇｐ４．５、またはｇｐ４．７である。いくつかの実施形態において、非必須遺伝子は、ｇｐ０．６、ｇｐ０．６５、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、またはｇｐ４．５である。
【０００３】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、標的細菌および非標的細菌を含む細菌の混合集団などにおいて（例えば、本明細書に記載されるような治療プロセスおよび／または環境処理プロセスにおいて）、複数の標的細菌を死滅させるための方法である。特定の実施形態において、標的細菌は、本明細書に記載の任意のプロセスに従って処理され（例えば、標的細菌を死滅させるために）、標的細菌の第１の集団は、バクテリオファージの溶解活性によって死滅させられ、標的細菌の第２の集団はスペーサー配列またはそこから転写されたｃｒＲＮＡを使用するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性により死滅させられる（例えば、非標的細菌は死滅させられない）（例えば、標的細菌よりも低い比率で、例えば、５０％の比率で、２５％未満の比率、１０％未満の比率、または２０％未満の比率、１０％未満の比率、５％未満の比率などで死滅させられる）。
【０００４】
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、標的細菌におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性を調節するための方法である。いくつかの実施形態において、この方法は、標的細菌におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムのための転写活性化因子をコードする核酸を含むバクテリオファージを導入する工程を含む。いくつかの実施形態において、転写活性化因子がクオラムセンシング（ＱＳ）シグナルによって制御される。いくつかの実施形態において、転写活性化因子は細菌膜へのストレスの感知に関与するタンパク質である。いくつかの実施形態において、ストレスの感知に関与するタンパク質は応答制御因子ＢａｅＳＲである。いくつかの実施形態において、転写活性化因子はＣａｓを安定化するタンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓを安定化するタンパク質は熱ショックタンパク質Ｇ（ＨｔｐＧ）である。いくつかの実施形態において、転写活性化因子は代謝感知タンパク質である。いくつかの実施形態において、代謝感知タンパク質はｃＡＭＰ受容体タンパク質（ＣＲＰ）である。いくつかの実施形態において、ＣＲＰはサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）に対して感受性である。いくつかの実施形態において、代謝感知タンパク質はシグマ因子である。いくつかの実施形態において、上記シグマ因子はＲｐｏＮ（σ５４）である。いくつかの実施形態において、転写活性化因子は阻害要素の活性を破壊する。いくつかの実施形態において、阻害要素は熱安定性核様体構造化タンパク質（Ｈ−ＮＳ）、ロイシン応答性制御タンパク質（ＬＲＰ）、またはＣｏｄＹである。いくつかの実施形態において、阻害要素が転写リプレッサーである。いくつかの実施形態において、転写リプレッサーはグローバル転写リプレッサーである。いくつかの実施形態において、転写活性化因子はＬｅｕＯまたは配列番号１と少なくとも７５％の配列相同性を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、転写活性化因子はＣＤ２９８３または配列番号２と少なくとも７５％の配列相同性を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは標的細菌に対して内因性である。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは標的細菌に対して外因性である。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムはＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムはＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは複数の菌株に感染する。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは偏性溶解性バクテリオファージである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは溶解性にされた溶原バクテリオファージである。いくつかの実施形態において、標的細菌はＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはφＣＤ１４６またはφＣＤ２４−２である。いくつかの実施形態において、標的細菌は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＴ４、Ｔ７、またはＴ７ｍである。いくつかの実施形態において、転写活性化因子をコードする核酸は非必須バクテリオファージ遺伝子に挿入される。いくつかの実施形態において、非必須遺伝子はｇｐ４９である。いくつかの実施形態において、非必須遺伝子はｇｐ７５である。いくつかの実施形態において、非必須遺伝子はｈｏｃである。いくつかの実施形態において、非必須遺伝子はｇｐ０．７、ｇｐ４．３、ｇｐ４．５、またはｇｐ４．７である。いくつかの実施形態において、非必須遺伝子がｇｐ０．６、ｇｐ０．６５、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、またはｇｐ４．５である。
【０００５】
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、標的細菌を死滅させる方法である。この方法は、標的細菌に、溶解活性、および抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする第１の核酸配列を含むバクテリオファージを導入する工程を含む。特定の実施形態において、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドはバクテリオファージの溶解活性を増強する（例えば、標的細菌がどれだけ速く死滅させられるかによって決定されるように）。いくつかの実施形態において、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを不活性化する。いくつかの実施形態において、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは遺伝子制御干渉を含むプロセスを使用して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを不活性化する。いくつかの実施形態において、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドはヌクレアーゼ動員干渉を含むプロセスを使用して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを不活性化する。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムはＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムはＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態において、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドはカスケードまたはカスケード様複合体に直接的または間接的に結合する。いくつかの実施形態において、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは短縮型タンパク質、融合タンパク質、二量体タンパク質、または変異タンパク質である。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＣＲＩＳＰＲアレイをコードする第２の核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイは少なくとも１つの反復配列および、標的細菌中の標的遺伝子由来の標的ヌクレオチド配列に相補的である、少なくとも１つのスペーサー配列を含む。特定の実施形態において、標的細菌を死滅させる方法が本明細書で開示される（例えば、標的細菌および非標的細菌を含む細菌の混合集団などにおいて）。この方法は、溶解活性、および
抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする第１の核酸配列を有するバクテリオファージを標的細菌に導入する工程を含む。特定の実施形態において、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドはバクテリオファージの溶解活性を増強する（所定の時間で死滅させられる標的細菌の数によって測定されるように）。
【０００６】
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、（例えば、標的）細菌中の（例えば、標的）遺伝子由来の（例えば、標的）ヌクレオチド配列に相補的なスペーサー配列、またはそこから転写されたｃｒＲＮＡをコードする第１の核酸、および（例えば、標的）細菌の溶解を誘導することができる遺伝子を含むバクテリオファージである。特定の実施形態において、標的細菌は、スペーサー配列またはそこから転写されたｃｒＲＮＡを使用して、バクテリオファージの溶解活性、または、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性によって死滅させられる。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはさらに、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムのための転写活性化因子をコードする第２の核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、転写活性化因子はクオラムセンシング（ＱＳ）シグナルによって制御される。いくつかの実施形態において、転写活性化因子は細菌膜のストレスの感知に関与するタンパク質である。いくつかの実施形態において、タンパク質は応答制御因子ＢａｅＳＲである。いくつかの実施形態において、転写活性化因子はＣａｓを安定化するタンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓを安定化するタンパク質は熱ショックタンパク質Ｇ（ＨｔｐＧ）である。いくつかの実施形態において、転写活性化因子は代謝感知タンパク質である。いくつかの実施形態において、代謝感知タンパク質はｃＡＭＰ受容体タンパク質（ＣＲＰ）である。いくつかの実施形態において、ＣＲＰはサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）に対して感受性である。いくつかの実施形態において、代謝感知タンパク質はシグマ因子である。いくつかの実施形態において、シグマ因子はＲｐｏＮ（σ５４）である。いくつかの実施形態において、転写活性化因子は標的細菌の阻害要素の活性を破壊する。いくつかの実施形態において、阻害要素は熱安定性核様体構造化タンパク質（Ｈ−ＮＳ）、ロイシン応答性制御タンパク質（ＬＲＰ）、またはＣｏｄＹである。いくつかの実施形態において、阻害要素は転写リプレッサーである。いくつかの実施形態において、転写リプレッサーはグローバル転写リプレッサーである。いくつかの実施形態において、転写活性化因子はＬｅｕＯまたは配列番号１と少なくとも７５％の配列相同性を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、転写活性化因子はＣＤ２９８３または配列番号２と少なくとも７５％の配列相同性を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは標的細菌に対して内因性である。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは標的細菌に対して外因性である。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムはＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムはＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は標的遺伝子のためのプロモーター配列の全部または一部を含む。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は標的遺伝子の転写領域のコード鎖上���位置するヌクレオチド配列の全部または一部を含む。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は必須遺伝子にある。いくつかの実施形態において、必須遺伝子はＴｓｆ、ａｃｐＰ、ｇａｐＡ、ｉｎｆＡ、ｓｅｃＹ、ｃｓｒＡ、ｔｒｍＤ、ｆｔｓＡ、ｆｕｓＡ、ｇｌｙＱ、ｅｎｏ、またはｎｕｓＧである。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は非必須遺伝子である。いくつかの実施形態において、第１の核酸配列は少なくとも１つの反復配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイである。少なくとも１つの反復配列はその５’末端またはその３’末端のいずれかでスペーサー配列に動作可能に連結されている。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの反復配列はその５’末端またはその３’末端のいずれかでスペーサー配列に動作可能に連結されている。いくつかの実施形態において、バクテリオファージが複数の菌株に感染する。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは偏性溶解性バクテリオファージである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは溶解性にされた溶原バクテリオファージである。いくつかの実施形態において、溶原バクテリオファージは１以上の溶原性遺伝子の除去、置換、または不活性化によって溶解性にされている。いくつかの実施形態において、標的細菌はＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはφＣＤ１４６またはφＣＤ２４−２である。いくつかの実施形態において、標的細菌が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。いくつかの実施形態において、バクテリオファージがＴ４、Ｔ７、またはＴ７ｍ。いくつかの実施形態において、スペーサー配列またはｃｒＲＮＡをコードする第１の核酸は非必須遺伝子に挿入される。いくつかの実施形態において、非必須遺伝子はｇｐ４９である。いくつかの実施形態において、非必須遺伝子はｇｐ７５である。いくつかの実施形態において、非必須遺伝子はｈｏｃである。いくつかの実施形態において、非必須遺伝子がｇｐ０．７、ｇｐ４．３、ｇｐ４．５、またはｇｐ４．７である。いくつかの実施形態において、非必須遺伝子がｇｐ０．６、ｇｐ０．６５、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、またはｇｐ４．５である。本明細書でまた開示されるのは、いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージ、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。いくつかの実施形態において、この医薬組成物は、錠剤、液体、シロップ、経口製剤、静脈内投与製剤、鼻腔内投与製剤、眼用製剤、耳用製剤、皮下注製剤、吸入性呼吸製剤、坐剤、およびそれらの任意の組み合わせの形態である。本明細書でさらに開示されるのは、いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージを対象に投与する工程を含む、対象の疾患を治療する方法である。いくつかの実施形態において、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、疾患は細菌性感染症である。いくつかの実施形態において、細菌性感染症を引き起こす細菌はＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ種、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ複合体、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄ��ｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｔｒａｔｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループ  Ｇｌ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループ  Ｇ２、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ種、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ複合体、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、非結核性ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ種、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ種、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｌｔｅａｅ、およびこれらの任意の組合せである。いくつかの実施形態において、細菌は少なくとも１つの抗生物質に耐性の薬剤耐性細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は少なくとも１つの抗生物質に耐性の多剤耐性細菌である。いくつかの実施形態において、細菌はシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）である。いくつかの実施形態において、細菌はブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）である。いくつかの実施形態において、細菌は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。いくつかの実施形態において、細菌はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである。いくつかの実施形態において、細菌はメチシリン耐性である。いくつかの実施形態において、細菌はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）である。いくつかの実施形態において、細菌は多剤耐性緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）である。いくつかの実施形態において、抗生物質には、セファロスポリン、フルオロキノロン、カルバペネム、コリスチン、アミノグリコシド、バンコマイシン、ストレプトマイシン、またはメチシリンが含まれる。いくつかの実施形態において、投与は、動脈内、静脈内、筋肉内、経口、皮下、局所的、吸入、膀胱内、またはこれらの任意の組み合わせである。
【０００７】
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、（例えば、標的）細菌においてＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムのための転写活性化因子をコードする核酸を含むバクテリオファージである。いくつかの実施形態において、転写活性化因子は細菌膜のストレスの感知に関与するタンパク質である。いくつかの実施形態において、ストレスの感知に関与するタンパク質は応答制御因子ＢａｅＳＲである。いくつかの実施形態において、転写活性化因子が、Ｃａｓを安定化するタンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓを安定化するタンパク質は熱ショックタンパク質Ｇ（ＨｔｐＧ）である。いくつかの実施形態において、転写活性化因子は代謝感知タンパク質である。いくつかの実施形態において、代謝感知タンパク質はｃＡＭＰ受容体タンパク質（ＣＲＰ）である。いくつかの実施形態において、ＣＲＰがサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）に対して感受性である。いくつかの実施形態において、代謝感知タンパク質はシグマ因子である。いくつかの実施形態において、シグマ因子はＲｐｏＮ（σ５４）である。いくつかの実施形態において、転写活性化因子は標的細菌の阻害要素の活性を破壊する。いくつかの実施形態において、阻害要素は、熱安定性核様体構造化タンパク質（Ｈ−ＮＳ）、ロイシン応答性制御タンパク質（ＬＲＰ）、またはＣｏｄＹである。いくつかの実施形態において、阻害要素が転写リプレッサーである。いくつかの実施形態において、転写リプレッサーはグローバル転写リプレッサーである。いくつかの実施形態において、転写活性化因子は、ＬｅｕＯまたは配列番号１と少なくとも７５％の配列相同性を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、転写活性化因子は、ＣＤ２９８３または配列番号２と少なくとも７５％の配列相同性を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは内因性である。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは外因性である。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムはＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは複数の菌株に感染する。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは偏性溶解性バクテリオファージである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、溶解性にされた溶原バクテリオファージである。いくつかの実施形態において、標的細菌はＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはφＣＤ１４６またはφＣＤ２４−２である。いくつかの実施形態において、標的細菌は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＴ４、Ｔ７、またはＴ７ｍである。いくつかの実施形態において、転写活性化因子をコードする核酸は非必須バクテリオファージ遺伝子に挿入される。いくつかの実施形態において、非必須遺伝子はｇｐ４９である。いくつかの実施形態において、非必須遺伝子がｇｐ７５である。いくつかの実施形態において、非必須遺伝子がｈｏｃである。いくつかの実施形態において、非必須遺伝子はｇｐ０．７、ｇｐ４．３、ｇｐ４．５、またはｇｐ４．７である。いくつかの実施形態において、非必須遺伝子がｇｐ０．６、ｇｐ０．６５、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、またはｇｐ４．５である。本明細書にまた開示されるのは、いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージ、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、錠剤、液体、シロップ、経口製剤、静脈内投与製剤、鼻腔内投与製剤、眼用製剤、耳用製剤、皮下注製剤、吸入性呼吸製剤、坐剤、およびそれらの任意の組み合わせの形態である。いくつかの実施形態において、本明細書にさらに開示されるのは、本発明のバクテリオファージを対象に投与する工程を含む、対象の疾患を治療する方法である。いくつかの実施形態において、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、疾患は細菌性感染症である。いくつかの実施形態において、細菌性感染症を引き起こす細菌は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ種、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ複合体、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｔｒａｔｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループ  Ｇｌ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループ  Ｇ２、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ種、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ複合体、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、非結核性ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ種、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ種、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｌｔｅａｅ、およびこれらの任意の組合せである。いくつかの実施形態において、細菌は少なくとも１つの抗生物質に耐性の薬剤耐性細菌である。いくつかの実施形態において、細���は少なくとも１つの抗生物質に耐性の多剤耐性細菌である。いくつかの実施形態において、細菌がシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）である。いくつかの実施形態において、細菌はブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）である。いくつかの実施形態において、細菌は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。いくつかの実施形態において、細菌はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである。いくつかの実施形態において、細菌はメチシリン耐性である。いくつかの実施形態において、細菌はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）である。いくつかの実施形態において、細菌は多剤耐性緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）である。いくつかの実施形態において、抗生物質には、セファロスポリン、フルオロキノロン、カルバペネム、コリスチン、アミノグリコシド、バンコマイシン、ストレプトマイシン、またはメチシリンが含まれる。いくつかの実施形態において、投与は、動脈内、静脈内、筋肉内、経口、皮下、局所的、吸入、またはこれらの任意の組み合わせである。
【０００８】
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、溶解活性、および抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする第１の核酸配列を含むバクテリオファージである。いくつかの実施形態において、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドはバクテリオファージの溶解活性を増強する。いくつかの実施形態において、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを不活性化する。いくつかの実施形態において、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドが、遺伝子制御干渉を含むプロセスを使用して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを不活性化する。いくつかの実施形態において、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、ヌクレアーゼ動員干渉を含むプロセスを使用して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを不活性化する。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである。抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドが、カスケードまたはカスケード様複合体に直接的または間接的に結合する。いくつかの実施形態において、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、短縮型タンパク質、融合タンパク質、二量体タンパク質、または変異タンパク質である。いくつかの実施形態において、バクテリオファージが、ＣＲＩＳＰＲアレイをコードする第２の核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイは、少なくとも１つの反復配列および、標的細菌中の標的遺伝子由来の標的ヌクレオチド配列に相補的である、少なくとも１つのスペーサー配列を含む。本明細書にまた開示されるのは、いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージ、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。いくつかの実施形態において、いくつかの実施形態において、この医薬組成物は、錠剤、液体、シロップ、経口製剤、静脈内投与製剤、鼻腔内投与製剤、眼用製剤、耳用製剤、
皮下注製剤、吸入性呼吸製剤、坐剤、およびそれらの任意の組み合わせの形態である。本明細書でさらに開示されるのは、いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージを対象に投与する工程を含む、対象の疾患を治療する方法である。いくつかの実施形態において、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、疾患は細菌性感染症である。いくつかの実施形態において、細菌性感染症を引き起こす細菌はＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ種、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ複合体、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｔｒａｔｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループ  Ｇｌ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループ  Ｇ２、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ種、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ複合体、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、非結核性ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ種、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ種、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｌｔｅａｅ、およびこれらの任意の組合せである。いくつかの実施形態において、細菌は少なくとも１つの抗生物質に耐性の薬剤耐性細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は少なくとも１つの抗生物質に耐性の多剤耐性細菌である。いくつかの実施形態において、細菌はシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）である。いくつかの実施形態において、細菌はブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）である。いくつかの実施形態において、細菌は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。いくつかの実施形態において、細菌はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである。いくつかの実施形態において、細菌はメチシリン耐性である。いくつかの実施形態において、細菌はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）であ���。いくつかの実施形態において、細菌は多剤耐性緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）である。いくつかの実施形態において、抗生物質には、セファロスポリン、フルオロキノロン、カルバペネム、コリスチン、アミノグリコシド、バンコマイシン、ストレプトマイシン、またはメチシリンが含まれる。いくつかの実施形態において、投与は、動脈内、静脈内、筋肉内、経口、皮下、局所的、吸入、膀胱内、またはこれらの任意の組み合わせである。
【０００９】
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、標的細菌を死滅させる方法であって、この方法は、溶原バクテリオファージを標的細菌に導入する工程を含み、ここで、溶原バクテリオファージの溶原性遺伝子が、除去、置換、または不活性化され、および前記溶原バクテリオファージが溶解性にされ、それによって標的細菌を死滅させる。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子はｃｌファージリプレッサー遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは複数の菌株に感染する。いくつかの実施形態において、標的細菌はＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはφＣＤ１４６またはφＣＤ２４−２である。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、スペーサー配列、またはそこから転写されたｃｒＲＮＡをコードする第１の核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、標的細菌中の標的遺伝子由来の標的ヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態において、第１の核酸配列は、少なくとも１つの反復配列をさらに含むＣＲＩＳＰＲアレイである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの反復配列が、その５’末端またはその３’末端のいずれかでスペーサー配列に動作可能に連結されている。いくつかの実施形態において、バクテリオファージが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムのための転写活性化因子をコードする第２の核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、標的細菌に対して内因性である。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、標的細菌に対して外因性である。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムはＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを含む。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、標的遺伝子のためのプロモーター配列の全部または一部を含む。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、標的遺伝子の転写領域のコード鎖上に位置するヌクレオチド配列の全部または一部を含む。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、標的細菌の生存に必要とされる必須遺伝子の少なくとも一部分を含む。いくつかの実施形態において、標的細菌は、バクテリオファージの溶解活性およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性との両方の組み合わせによって死滅させられる。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性は、バクテリオファージの溶解活性を補完または増強する。いくつかの実施形態において、標的細菌は、バクテリオファージの溶解活性とは独立して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性によって死滅させられる。いくつかの実施形態において、バクテリオファージの溶解活性および前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性は相乗的である。いくつかの実施形態において、バクテリオファージの溶解活性、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性、またはその両方が、バクテリオファージの濃度に��って調節される。
【００１０】
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、（ａ）少なくとも１つの溶原性遺伝子が除去、置換、または不活性化されている、溶原バクテリオファージ、および（Ｂ）薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物である。いくつかの実施形態において、この医薬組成物は、錠剤、液体、シロップ、経口製剤、静脈内投与製剤、鼻腔内投与製剤、眼用製剤、耳用製剤、皮下注製剤、吸入性呼吸製剤、坐剤、およびそれらの任意の組み合わせの形態である。
【００１１】
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、対象のマイクロバイオームを調整する方法であって、この方法は、本明細書に開示される医薬組成物を対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、マイクロバイオームの不均衡を処置する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
本開示の特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に記載されている。本開示の特徴および利点のより良い理解は、本開示の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって得られる。
【図１】ＣＲＩＳＰＲで増強されたバクテリオファージを操作するためのワークフロープロセスを例証する。
【図２Ａ】Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの５つの株内からのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの線形配列の概略図と、さまざまなＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ構成要素の同定を示す。
【図２Ｂ】Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株６３０およびＲ２０２９１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムオペロン構造の概略図をさらに例示する。
【図３Ａ】ネイティブの野生型バクテリオファージＴ７ｍまたは対応する操作されたｃｒファージＴ７ｍで処理した場合の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＷ２５１１３の細胞集団の減少を例示する。天然の野生型バクテリオファージは、溶解活性による細菌死滅を示す。ＬｅｕＯおよびｆｔｓＡ用のＣＲＩＳＰＲアレイを含む対応するｃｒＴ７ｍは、野生型バクテリオファージＴ７ｍよりも細菌死滅活性がさらに５−ｌｏｇ改善されていることを例示する。
【図３Ｂ】ファージ送達とは独立して細菌に直接投与した場合のｆｔｓＡに対するＣＲＩＳＰＲアレイの致死性（７−ｌｏｇの減少）を例示する。
【図４Ａ】ネイティブの野生型バクテリオファージφＣＤｌ４６または対応する操作されたｃｒファージφＣＤｌ４６で処理した場合のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株Ｒ２０２９ｌの細胞集団の減少を例示する。天然の野生型バクテリオファージは、溶解活性による細菌の死滅を示しす。しかし、対応するｃｒファージφＣＤｌ４６は、野生型バクテリオファージよりも殺菌活性がさらに１−ｌｏｇ改善されていることを例示する。
【図４Ｂ】ファージ送達とは独立して細菌に直接投与した場合のＲ２０２９１−３に対するＣＲＩＳＰＲアレイの致死性（３．５−ｌｏｇの減少）を例示する。
【図５】野生型ファージφＣＤ１４６による溶解に感受性でないＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株０６９の細菌のローンを例示する。画像の左側でのファージプラークの欠如は、野生型ファージφＣＤ１４６による死滅の欠如を示している。画像の右側でのｃｒファージφＣＤｌ４６によるプラークの存在は、Ｒ２０２９１−３を標的とするＣＲＩＳＰＲアレイの活性による細菌死を例示する。
【図６Ａ】図６Ａ−Ｖは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性の増強を例示する。図６Ａは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株０４３に対するｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性を例示する。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株の個体数の増加は、野生型またはＣＲＩＳＰＲアレイを含むｃｒファージφＣＤｌ４６のいずれかで処理後、６００ｎｍでの光学密度によって最大６時間モニターされた。
【図６Ｂ】図６Ａ−Ｖは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性の増強を例示する。図６Ｂは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株０５１に対するｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性を例示する。
【図６Ｃ】図６Ａ−Ｖは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性の増強を例示する。図６Ｃは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株０７３に対するｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性を例示する。
【図６Ｄ】図６Ａ−Ｖは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性の増強を例示する。図６Ｄは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株０９３に対するｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性を例示する。
【図６Ｅ】図６Ａ−Ｖは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性の増強を例示する。図６Ｅは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株０１８０に対するｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性を例示する。
【図６Ｆ】図６Ａ−Ｖは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性の増強を例示する。図６Ｆは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株１０６に対するｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性を例示する。
【図６Ｇ】図６Ａ−Ｖは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性の増強を例示する。図６Ｇは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株１２８に対するｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性を例示する。
【図６Ｈ】図６Ａ−Ｖは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性の増強を例示する。図６Ｈは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株１９９に対するｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性を例示する。
【図６Ｉ】図６Ａ−Ｖは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性の増強を例示する。図６Ｉは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株１１１に対するｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性を例示する。
【図６Ｊ】図６Ａ−Ｖは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性の増強を例示する。図６Ｊは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株１０８に対するｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性を例示する。
【図６Ｋ】図６Ａ−Ｖは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性の増強を例示する。図６Ｋは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株２５に対するｃｒファージφＣＤ１４６の致死性を例示する。
【図６Ｌ】図６Ａ−Ｖは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性の増強を例示する。図６Ｌは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株１４８に対するｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性を例示する。
【図６Ｍ】図６Ａ−Ｖは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性の増強を例示する。図６Ｍは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株１５４に対するｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性を例示する。
【図６Ｎ】図６Ａ−Ｖは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性の増強を例示する。図６Ｎは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株１９５に対するｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性を例示する。
【図６Ｏ】図６Ａ−Ｖは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性の増強を例示する。図６Ｏは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株ＦＯＢＴ１９５に対するｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性を例示する。
【図６Ｐ】図６Ａ−Ｖは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性の増強を例示する。図６Ｐは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株０３８に対するｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性を例示する。
【図６Ｑ】図６Ａ−Ｖは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性の増強を例示する。図６Ｑは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株１１２に対するｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性を例示する。
【図６Ｒ】図６Ａ−Ｖは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性の増強を例示する。図６Ｒは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株１９６に対するｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性を例示する。
【図６Ｓ】図６Ａ−Ｖは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性の増強を例示する。図６Ｓは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株１０５に対するｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性を例示する。
【図６Ｔ】図６Ａ−Ｖは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性の増強を例示する。図６Ｔは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株ＵＫ１に対するｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性を例示する。
【図６Ｕ】図６Ａ−Ｖは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性の増強を例示する。図６Ｕは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株ＵＫ６に対するｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性を例示する。
【図６Ｖ】図６Ａ−Ｖは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性の増強を例示する。図６Ｖは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株ＢＩ−９に対するｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性を例示する。
【図７Ａ】図７Ａ−図７Ｃは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤ２４−２の致死性の増強を例示する。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株の個体数の増加は、野生型またはＣＲＩＳＰＲアレイを含むｃｒファージφＣＤ２４−２のいずれかで処理した後、６００ｎｍでの光学密度によって最大６時間モニターされた。図７Ａは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株０４１に対するｃｒファージφＣＤｌ４６の致死性を例示する。
【図７Ｂ】図７Ａ−図７Ｃは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤ２４−２の致死性の増強を例示する。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株の個体数の増加は、野生型またはＣＲＩＳＰＲアレイを含むｃｒファージφＣＤ２４−２のいずれかで処理した後、６００ｎｍでの光学密度によって最大６時間モニターされた。図７Ｂは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株０４２に対するｃｒファージφＣＤ１４６の致死性を例示する。
【図７Ｃ】図７Ａ−図７Ｃは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤ２４−２の致死性の増強を例示する。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株の個体数の増加は、野生型またはＣＲＩＳＰＲアレイを含むｃｒファージφＣＤ２４−２のいずれかで処理した後、６００ｎｍでの光学密度によって最大６時間モニターされた。図７Ｃは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株０４６に対するｃｒファージφＣＤ１４６の致死性を例示する。
【図８Ａ】図８Ａ−図８Ｅは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤ１４６の致死性の増強を例示する。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株の個体数の増加は、野生型またはＣＲＩＳＰＲアレイを含むｃｒファージφＣＤ１４６のいずれかで処理した後、最大６時間ＣＦＵ低減アッセイを使用してモニターされた。ＣＦＵ減少アッセイは、光学密度測定よりも定量感度の増強を提供する。図８Ａは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株０４３に対するｃｒファージφＣＤ１４６の致死性を例示する。
【図８Ｂ】図８Ａ−図８Ｅは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤ１４６の致死性の増強を例示する。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株の個体数の増加は、野生型またはＣＲＩＳＰＲアレイを含むｃｒファージφＣＤ１４６のいずれかで処理した後、最大６時間ＣＦＵ低減アッセイを使用してモニターされた。ＣＦＵ減少アッセイは、光学密度測定よりも定量感度の増強を提供する。図８Ｂは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株０５１に対するｃｒファージφＣＤ１４６の致死性を例示する。
【図８Ｃ】図８Ａ−図８Ｅは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤ１４６の致死性の増強を例示する。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株の個体数の増加は、野生型またはＣＲＩＳＰＲアレイを含むｃｒファージφＣＤ１４６のいずれかで処理した後、最大６時間ＣＦＵ低減アッセイを使用してモニターされた。ＣＦＵ減少アッセイは、光学密度測定よりも定量感度の増強を提供する。図８Ｃは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株０７３に対するｃｒファージφＣＤ１４６の致死性を例示する。
【図８Ｄ】図８Ａ−図８Ｅは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤ１４６の致死性の増強を例示する。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株の個体数の増加は、野生型またはＣＲＩＳＰＲアレイを含むｃｒファージφＣＤ１４６のいずれかで処理した後、最大６時間ＣＦＵ低減アッセイを使用してモニターされた。ＣＦＵ減少アッセイは、光学密度測定よりも定量感度の増強を提供する。図８Ｄは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株０９３に対するｃｒファージφＣＤ１４６の致死性を例示する。
【図８Ｅ】図８Ａ−図８Ｅは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤ１４６の致死性の増強を例示する。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのさまざまな菌株の個体数の増加は、野生型またはＣＲＩＳＰＲアレイを含むｃｒファージφＣＤ１４６のいずれかで処理した後、最大６時間ＣＦＵ低減アッセイを使用してモニターされた。ＣＦＵ減少アッセイは、光学密度測定よりも定量感度の増強を提供する。図８Ｅは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株Ｒ２０２９１に対するｃｒファージφＣＤ１４６の致死性を例示する。
【図９】Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株Ｆ１９に対する野生型バクテリオファージと比較したｃｒファージφＣＤ２４−２の致死性の増強を例示する。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株ＣＤ１９の個体数の増加は、野生型またはＣＲＩＳＰＲアレイを含むｃｒファージφＣＤ２４−２のいずれかで処理した後、最大６時間ＣＦＵ減少アッセイを使用してモニターした。ＣＦＵ減少アッセイの使用は、光学密度測定を超えて定量的感度の増加を提供する。
【図１０】Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株０４３に対してテストされたｃｒファージφＣＤ１４６とｃｒファージφＣＤ２４−２の組み合わせ比較を例示する。ｃｒファージφＣＤ１４６およびｃｒファージφＣＤ２４−２抗菌活性のＣＦＵアッセイを、各ｃｒファージについて個別に、および一緒に投与した場合に実施した。同時投与は、両方の野生型ファージを一緒に組み合わせた処理と比較して、死滅効果の改善を示した。
【図１１】ｃｒファージφＣＤ１４６の死滅活性は、Ｒ２０２９１−３を標的とするＣＲＩＳＰＲアレイを用いて、広い範囲のウイルス力値ＭＯＩにわたって、野生型ファージの致死性を一貫して上回っていることを例示する。
【図１２Ａ】図１２Ａ−図１２Ｂは、ｃｒＲＮＡによって標的とされる独立した遺伝子の数の関数として、標的部位の変異に起因して時間の経過とともに出現する耐性クローンの数を予測するインシリコモデルを例示する。これらのモデルは、（１）突然変異率が遺伝子標的に依存しないこと、および（２）ｃｒＲＮＡの３２塩基すべてが活性のために一致することという非常に保存的な仮定を前提としている。２つのタイプの感染がモデル化され、図１２Ａに示すように６時間ごとに２倍になることによって合計負荷が１０１０ＣＦＵに上昇する急性感染、または図１２Ｂに示すように２０分ごとに２倍になることで合計負荷が１０１４ＣＦＵになる攻撃的な感染である。両方のモデルは、３つの独立した遺伝子標的が感染期間２８日までの突然変異の逃避を防ぐために十分であることを例示する。
【図１２Ｂ】図１２Ａ−図１２Ｂは、ｃｒＲＮＡによって標的とされる独立した遺伝子の数の関数として、標的部位の変異に起因して時間の経過とともに出現する耐性クローンの数を予測するインシリコモデルを例示する。これらのモデルは、（１）突然変異率が遺伝子標的に依存しないこと、および（２）ｃｒＲＮＡの３２塩基すべてが活性のために一致することという非常に保存的な仮定を前提としている。２つのタイプの感染がモデル化され、図１２Ａに示すように６時間ごとに２倍になることによって合計負荷が１０１０ＣＦＵに上昇する急性感染、または図１２Ｂに示すように２０分ごとに２倍になることで合計負荷が１０１４ＣＦＵになる攻撃的な感染である。両方のモデルは、３つの独立した遺伝子標的が感染期間２８日までの突然変異の逃避を防ぐために十分であることを例示する。
【図１３】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムの保存領域を標的にした一連の個々のタイプＩ−Ｅ  ｃｒＲＮＡの菌株カバレッジを例示する。ｃｒＲＮＡアレイ標的には、菌株カバレッジの割合が高いものから低いものの順に次の遺伝子が含まれる。Ｔｓｆ（ｌ００％）、ａｃｐＰ（９９％）、ｇａｐＡ（９９％）、ｉｎｆＡ（９９％）、ｓｅｃＹ（９９％）、ｓｅｃＹ’２（９９％）、ｃｓｒＡ（９９％）、ｔｒｍＤ（９９％）、ｆｔｓＡ（９９％）、ｎｕｓＧ（９９％）、ｆｕｓＡ’２（９９％）、ｆｕｓＡ（９８％）、ｇｌｙＱ（９８％）、ｅｎｏ（９５％）、ｇａｐＡ’２（９１％）、ｅｎｏ’２（８９％）、およびｎｕｓＧ’２（７３％）。
【図１４】は、大腸菌ゲノムの保存領域を標的としたスペーサーを備えた一連の個々のタイプＩ−Ｅ  ｃｒＲＮＡの機能的致死性評価を例示する。ｃｒＲＮＡ標的には、ａｃｐＰ、ｃｓｒＡ、ｅｎｏ、ｆｕｓＡ、ｇａｐＡ、ｇｌｙＱ、ｉｎｆＡ、ｎｕｓＧ、ｓｅｃＹ、ｔｒｍＤ、およびＴｓｆの遺伝子が含まれる。
【図１５】は、転写活性化因子ＬｅｕＯおよびＣＲＩＳＰＲアレイをコードする同一のＤＮＡ配列を含む３つの異なる偏性溶解性バクテリオファージのカクテルとして開発された大腸菌に対する３つの改変されたＣＲＩＳＰＲ増強バクテリオファージの概略図を例証する。３つの操作されたＬｅｕＯ増強バクテリオファージには、ｃｒＴ４、ｃｒＴ７、及びｃｒＴ７ｍが含まれる。
【図１６Ａ】大腸菌における標準的なタイプＩ−Ｅ又はタイプＩ−Ｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの相対的な普及率と分布を例示する。公的に入手可能な６２５の大腸菌ゲノムが分析され、これは、尿路病原性大腸菌（ＵＰＥＣ）、志賀毒素産生性大腸菌、（ＳＴＥＣ）、Ｏｌ５７：ＩＴ７血清型大腸菌、下痢原性大腸菌（ＤＥＣ）、非１５７Ｏ抗原型大腸菌、および腸内病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）を含む多様な菌株にまたがっている。
【図１６Ｂ】図１６Ａでテストされたすべての菌株の約７８％（４８７／６２５）がタイプＩ−ＥまたはタイプＩ−Ｆのいずれかの完全なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムを有していることを例示する。
【図１７】は、ＣＲＩＳＰＲ媒介致死性についてのＬｅｕＯ発現への依存性をテストするように設計された検証済みのｆｔｓＡスペーサー配列を使用する、ＬｅｕＯ増強ＣＲＩＳＰＲアレイ構築物の非溶解性Ｍ１３由来ファージミド送達を例示する。ＬｅｕＯ増強ファージミドベクターの致死性は、野生型Ｈ−ＮＳ抑制大腸菌タイプＩＥ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３オペロン、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３オペロン中にＨ−ＮＳ抑制モチーフを欠くＢＷ２５１１３−誘導体（Δｈｎｓ）、過剰発現されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３オペロンを含むＢＷ２５１１３−誘導体（ＢＷ＋Ｃａｓ）、およびＣａｓ３遺伝子を欠くＢＷ２５１１３−誘導体（ＢＷΔＣａｓ）を含む、親ＥＭＧ２を含む一連の菌株へのＭ１３バクテリオファージの形質導入によってテストされた。
【図１８Ａ】図１８Ａ−Ｃは、野生型バリアントと比較して、転写活性化因子ＬｅｕＯとＣＲＩＳＰＲアレイを含む３つのＬｅｕＯ増強ｃｒファージ（図１８Ａ−ｃｒＴ７ｍ、図１８Ｂ−ｃｒＴ４、および図１８Ｃ−ｃｒＴ７）についての致死性動態の改善を例示する。標的大腸菌は、増殖培地中で、各ファージについて示された感染多重度（ファージ対細菌の比率）で、それぞれ、ｃｒＴ７ｍ、ｃｒＴ４、およびｃｒＴ７について２時間または５時間インキュベートされた。３つのｃｒファージすべてでＣＦＵの減少に有意差が観察された。
【図１８Ｂ】図１８Ａ−Ｃは、野生型バリアントと比較して、転写活性化因子ＬｅｕＯとＣＲＩＳＰＲアレイを含む３つのＬｅｕＯ増強ｃｒファージ（図１８Ａ−ｃｒＴ７ｍ、図１８Ｂ−ｃｒＴ４、および図１８Ｃ−ｃｒＴ７）についての致死性動態の改善を例示する。標的大腸菌は、増殖培地中で、各ファージについて示された感染多重度（ファージ対細菌の比率）で、それぞれ、ｃｒＴ７ｍ、ｃｒＴ４、およびｃｒＴ７について２時間または５時間インキュベートされた。３つのｃｒファージすべてでＣＦＵの減少に有意差が観察された。
【図１８Ｃ】図１８Ａ−Ｃは、野生型バリアントと比較して、転写活性化因子ＬｅｕＯとＣＲＩＳＰＲアレイを含む３つのＬｅｕＯ増強ｃｒファージ（図１８Ａ−ｃｒＴ７ｍ、図１８Ｂ−ｃｒＴ４、および図１８Ｃ−ｃｒＴ７）についての致死性動態の改善を例示する。標的大腸菌は、増殖培地中で、各ファージについて示された感染多重度（ファージ対細菌の比率）で、それぞれ、ｃｒＴ７ｍ、ｃｒＴ４、およびｃｒＴ７について２時間または５時間インキュベートされた。３つのｃｒファージすべてでＣＦＵの減少に有意差が観察された。
【図１９】図１９Ａ−Ｅは、各ｃｒファージまたはｃｒファージカクテルについて、大腸菌株ＭＧ１６５５に対する、ＬｅｕＯで増強されたｃｒファージ  ｃｒＴ４、ｃｒＴ７、およびｃｒＴ７ｍについての用量反応インビトロ死滅曲線、およびその結果生じる集団の変化を光学密度によって測定したことを例示する。大腸菌は対数増殖期中期まで増殖させ、感染多重度（ＭＯＩ；ファージ対細菌の比率）で次のように処理した。図１９Ａ、ｃｒＴ７は、０．０００１、０．０１、および１．０のＭＯＩでインキュベートされた。図１９Ｂ、ｃｒＴ７ｍは０．０００９、０．０９、および９．０のＭＯＩでインキュベートされた。図１９Ｃ、ｃｒＴ４は０．０００６、０．０６、および６．０のＭＯＩでインキュベートされた。図１９Ｄに示すように、各ファージは等量混合してｃｒファージカクテル（「カクテル」）を作製し、０．０００６、０．０６、および６．０のＭＯＩ（各ｃｒファージ）でインキュベートした。図１９Ｅは、図１９Ｄの拡大グラフである。
【図２０】ＬｅｕＯで増強されたｃｒファージの濃度と、得られる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５の溶解までの時間との間に観察された用量依存的な関係を例示する。大腸菌を対数増殖期中期まで増殖させ、各ｃｒファージに示されているような感染多重度（ＭＯＩ；ファージ対細菌の比率）で処理した。テストした３つのｃｒファージのすべてで、ＭＯＩが１．０を超えると、溶解までの時間が最速になり、おそらく各ファージの溶解期間によって制限されていた。各ファージで観察された溶解までの時間は、ｃｒＴ７ｍおよびｃｒＴ７で約１５−２０分、ｃｒＴ４の場合は約４５−５０分であった。
【図２１】図２１Ａ−図２１Ｇは、３つのＬｅｕＯ増強ｃｒファージ  ｃｒＴ４、ｃｒＴ７、およびｃｒＴ７ｍのインビボ認容性の投与パラメーターの概略タイムライン表現を例示する。図２１Ｂ−図２１Ｇに示すように、獣医の観察中に明白な毒性は観察されず、各ｃｒファージ製剤の投与後に体温または体重の測定可能な変化は認められなかった。図２１Ｂと図２１Ｅは、それぞれ投与後のｃｒＴ７の体温と体重を例示する。図２１Ｃと図２１Ｆは、それぞれ投与後のｃｒＴ７Ｍの体温と体重を例示する。図２１Ｄと図２１Ｇは、それぞれ投与後のｃｒＴ４の体温と体重を例示する。
【図２２】図２２Ａ−図２２Ｄは、ＬｅｕＯで増強されたｃｒファージを使用した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用したマウスのインビボ腹膜炎モデルの治療パラメーターの概略タイムライン表現と結果を例示する。雌性ＣＤ−１マウスに致死量の大腸菌（〜５×ｌ０７ＣＦＵ／ＡＴＣＣ８７３９のマウス）を腹腔内注射した後、３０分以内に生理食塩水またはｃｒファージを腹腔内注射した。ｃｒファージの単回投与（２．０×１０１１ＰＦＵ／用量のｃｒＴ７（図２２Ｂ）、３．７×ｌ０９ＰＦＵ／用量のｃｒＴ７ｍ（図２２Ｃ）または６．０×ｌ０８ＰＦＵ／用量のｃｒＴ４（図２２Ｄ））は、有意な保護をもたらした。
【図２３】図２３Ａ−図２３Ｅは、細菌の生物負荷減少への影響と結果をモニターするために、ＬｅｕＯ増強ｃｒファージで処理された大腸菌を使用したマウスのインビボ大腿部感染モデルについての処理パラメーターの概略タイムライン表現を例示する。マウスに、４．０×１０１１ＰＦＵ／用量のｃｒＴ７、２．０×１０１１ＰＦＵ／用量のｃｒＴ７Ｍ、２．０×ｌ０１０ＰＦＵ／用量のｃｒＴ４、または１．０×ｌ０１０ＰＦＵ／用量の各ファージを含むカクテルの対応する用量の、示されたｃｒファージまたはｃｒファージカクテルを筋肉内注射する３０分前に、大腿部への筋肉内注射によって、１０５ＣＦＵの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５を接種した。各ｃｒファージを注射した後、示された時点で大腿部の筋肉全体を切除し、ホモジナイズし、すぐに希釈してプレーティングし、組織１グラムあたりの生存細菌コロニーをカウントした。ＣＦＵの減少は、ｃｒＴ４（図２３Ｃ）で約２−ｌｏｇ、ｃｒＴ７Ｍ（図２３Ｄ）で３−ｌｏｇ、およびｃｒＴ７（図２３Ｂ）と組み合わせたｃｒファージカクテル（図２３Ｅ）の両方で＞５−ｌｏｇと測定された。
【図２４】ＬｅｕＯで増強されたｃｒファージのインビボでの持続性と分布を例示する。雌性ＣＤ−１マウスは、膀胱への直接的な尿道内注入によって、約１．０×１０９ＰＦＵ／用量／ファージのｃｒＴ７／ｃｒＴ７ｍカクテルで処理した。接種後０、０．５、１、６、１２、２４および７２時間の時点で、各時点で３匹のマウスを屠殺し、収集した膀胱、腎臓、血液、肝臓、および脾臓の全組織ホモジネートを希釈し、ファージ滴定分析に供して、ｃｒＴ７とｃｒＴ７ｍの全体の合計量を定量化した。活性ｃｒファージの存在は、投与後７２時間まで検出された。ｃｒファージレベルは膀胱で時間とともに減少し、腎臓、肝臓、血液、および脾臓では７２時間までに検出できなかった。腎臓で有意なファージ力価が観察され、尿道内投与経路は場合によっては、下部および上部尿路での曝露をもたらすことを示唆している。また、ファージ力価は血液、肝臓、脾臓の組織で検出され、ｃｒファージが尿路上皮を通過することによって循環に入っているように見えることを示す。
【図２５】図２５Ａ−図２５Ｃは、ＰＦＵアッセイの代わりに定量的ＰＣＲ検出を使用した、図２４に見られるものと同様のＬｅｕＯ増強ｃｒファージの小規模なインビボ持続性および分布研究を例示する。各ｃｒＴ７、ｃｒＴ７ｍおよびｃｒＴ４の合計２．７×１０９ＰＦＵの単回投与を強制経口投与した。処理したマウスを屠殺し、全組織ホモジネートから全ＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲ分析を行って、存在するｃｒＴ７（図２５Ａ）、ｃｒＴ４（図２５Ｂ）、またはｃｒＴ７ｍ（図２５Ｃ）の量を定量化した。
【図２６Ａ】図２６Ａ−図２６Ｂは、溶原性形成率の減少と、ｃＩノックアウトバクテリオファージで処理された生存ＣＤ１９細胞の減少を例示する。図２６Ａは、ＷＴ  ＣＤ２４−２で処理されたＣＤ１９細胞と比較して、ΔｃＩ  ＣＤ２４−２で処理された場合の生存可能なＣＤ１９細胞の減少を例示する。
【図２６Ｂ】図２６Ａ−図２６Ｂは、溶原性形成率の減少と、ｃＩノックアウトバクテリオファージで処理された生存ＣＤ１９細胞の減少を例示する。図２６Ｂは、ＷＴ  ＣＤ２４−２で処理されたＣＤ１９細胞と比較して、ΔｃＩ  ＣＤ２４−２で処理された生存しているＣＤ１９細胞におけるパーセント溶原菌の減少を例示する。
【図２７Ａ】図２７Ａ−図２７Ｂは、野生型ファージ（ｗｔファージ）、ｃｒファージおよびシプロフロキサシンの静脈内送達（図２７Ａ）または局所送達（図２７Ｂ）を介する膀胱内のＣＦＵ減少の比較を示す。結果は、ｗｔファージと比較してｃｒファージによるＣＦＵ削減の改善を例示する。
【図２７Ｂ】図２７Ａ−図２７Ｂは、野生型ファージ（ｗｔファージ）、ｃｒファージおよびシプロフロキサシンの静脈内送達（図２７Ａ）または局所送達（図２７Ｂ）を介する膀胱内のＣＦＵ減少の比較を示す。結果は、ｗｔファージと比較してｃｒファージによるＣＦＵ削減の改善を例示する。
【図２８Ａ】図２８Ａ−図２８Ｂは、膀胱（図２８Ａ）および腎臓（図２８Ｂ）におけるｃｒファージ処理の用量反応を例示する。ｃｒファージは尿道内に送達された。
【図２８Ｂ】図２８Ａ−図２８Ｂは、膀胱（図２８Ａ）および腎臓（図２８Ｂ）におけるｃｒファージ処理の用量反応を例示する。ｃｒファージは尿道内に送達された。
【図２９】静脈内（ＩＶ）、尿道内（ＩＵ）、またはＩＶとＩＵの同時送達を介して、ＷＴと人工カクテルを比較した研究グレードの材料を用いたＵＴＩ有効性研究の概略図を示す。
【図３０Ａ】図３０Ａ−図３０Ｄは、尿路内（ＩＵ）または静脈内（ＩＶ）投与後の膀胱（図３０Ａおよび図３０Ｂ）および腎臓（図３０Ｃおよび図３０Ｄ）における大腸菌の減少を実証するＵＴＩ有効性研究を例示する。図３０Ａおよび図３０Ｃでは、感染の５４時間後に測定が行われた。図３０Ｂおよび図３０Ｄでは、感染の１０２時間後に測定が行われた。結果は、ｃｒファージカクテルが膀胱内にて１２０時間でｗｔファージカクテルよりも１．５から３．５−ｌｏｇ改善された死滅を有することを例示する。結果はまた、送達経路に関係なく、１２０時間でｃｒファージカクテルが膀胱内のシプロフロキサシンと同等に機能することを例示する。
【図３０Ｂ】図３０Ａ−図３０Ｄは、尿路内（ＩＵ）または静脈内（ＩＶ）投与後の膀胱（図３０Ａおよび図３０Ｂ）および腎臓（図３０Ｃおよび図３０Ｄ）における大腸菌の減少を実証するＵＴＩ有効性研究を例示する。図３０Ａおよび図３０Ｃでは、感染の５４時間後に測定が行われた。図３０Ｂおよび図３０Ｄでは、感染の１０２時間後に測定が行われた。結果は、ｃｒファージカクテルが膀胱内にて１２０時間でｗｔファージカクテルよりも１．５から３．５−ｌｏｇ改善された死滅を有することを例示する。結果はまた、送達経路に関係なく、１２０時間でｃｒファージカクテルが膀胱内のシプロフロキサシンと同等に機能することを例示する。
【図３０Ｃ】図３０Ａ−図３０Ｄは、尿路内（ＩＵ）または静脈内（ＩＶ）投与後の膀胱（図３０Ａおよび図３０Ｂ）および腎臓（図３０Ｃおよび図３０Ｄ）における大腸菌の減少を実証するＵＴＩ有効性研究を例示する。図３０Ａおよび図３０Ｃでは、感染の５４時間後に測定が行われた。図３０Ｂおよび図３０Ｄでは、感染の１０２時間後に測定が行われた。結果は、ｃｒファージカクテルが膀胱内にて１２０時間でｗｔファージカクテルよりも１．５から３．５−ｌｏｇ改善された死滅を有することを例示する。結果はまた、送達経路に関係なく、１２０時間でｃｒファージカクテルが膀胱内のシプロフロキサシンと同等に機能することを例示する。
【図３０Ｄ】図３０Ａ−図３０Ｄは、尿路内（ＩＵ）または静脈内（ＩＶ）投与後の膀胱（図３０Ａおよび図３０Ｂ）および腎臓（図３０Ｃおよび図３０Ｄ）における大腸菌の減少を実証するＵＴＩ有効性研究を例示する。図３０Ａおよび図３０Ｃでは、感染の５４時間後に測定が行われた。図３０Ｂおよび図３０Ｄでは、感染の１０２時間後に測定が行われた。結果は、ｃｒファージカクテルが膀胱内にて１２０時間でｗｔファージカクテルよりも１．５から３．５−ｌｏｇ改善された死滅を有することを例示する。結果はまた、送達経路に関係なく、１２０時間でｃｒファージカクテルが膀胱内のシプロフロキサシンと同等に機能することを例示する。
【図３１Ａ】図３１Ａ−図３１Ｄは、感染後７８時間の尿（図３１Ａ）、感染後１０２時間の腎臓（図３１Ｂ）、感染後１０２時間の膀胱（図３１Ｃ）、および感染後１０２時間の脾臓（図３１Ｄ）などへの、さまざまな組織へのファージの経路依存的な浸透を例示する。
【図３１Ｂ】図３１Ａ−図３１Ｄは、感染後７８時間の尿（図３１Ａ）、感染後１０２時間の腎臓（図３１Ｂ）、感染後１０２時間の膀胱（図３１Ｃ）、および感染後１０２時間の脾臓（図３１Ｄ）などへの、さまざまな組織へのファージの経路依存的な浸透を例示する。
【図３１Ｃ】図３１Ａ−図３１Ｄは、感染後７８時間の尿（図３１Ａ）、感染後１０２時間の腎臓（図３１Ｂ）、感染後１０２時間の膀胱（図３１Ｃ）、および感染後１０２時間の脾臓（図３１Ｄ）などへの、さまざまな組織へのファージの経路依存的な浸透を例示する。
【図３１Ｄ】図３１Ａ−図３１Ｄは、感染後７８時間の尿（図３１Ａ）、感染後１０２時間の腎臓（図３１Ｂ）、感染後１０２時間の膀胱（図３１Ｃ）、および感染後１０２時間の脾臓（図３１Ｄ）などへの、さまざまな組織へのファージの経路依存的な浸透を例示する。
【図３２】静脈内（ＩＶ）、尿道内（ＩＵ）、またはＩＶとＩＵの同時送達を介して、ＷＴと人工カクテルを比較した研究グレードの材料を用いた例示的なＵＴＩ有効性研究の概略図を例示する。
【図３３Ａ】図３３Ａ−図３３Ｄは、ｃｒファージカクテルのＩＶ投与が有効性のために高用量を必要とする一方で、ＩＵ送達は低用量でさえも効果的であり、高用量のｃｒファージはシプロフロキサシンよりも優れていることを例示する。図３３Ａ（膀胱）と図３３Ｃ（腎臓）のＣＦＵは、感染後５４時間で分析される。図３３Ｂ（膀胱）と図３３Ｄ（腎臓）のＣＦＵは、感染の１０２時間後に分析される。
【図３３Ｂ】図３３Ａ−図３３Ｄは、ｃｒファージカクテルのＩＶ投与が有効性のために高用量を必要とする一方で、ＩＵ送達は低用量でさえも効果的であり、高用量のｃｒファージはシプロフロキサシンよりも優れていることを例示する。図３３Ａ（膀胱）と図３３Ｃ（腎臓）のＣＦＵは、感染後５４時間で分析される。図３３Ｂ（膀胱）と図３３Ｄ（腎臓）のＣＦＵは、感染の１０２時間後に分析される。
【図３３Ｃ】図３３Ａ−図３３Ｄは、ｃｒファージカクテルのＩＶ投与が有効性のために高用量を必要とする一方で、ＩＵ送達は低用量でさえも効果的であり、高用量のｃｒファージはシプロフロキサシンよりも優れていることを例示する。図３３Ａ（膀胱）と図３３Ｃ（腎臓）のＣＦＵは、感染後５４時間で分析される。図３３Ｂ（膀胱）と図３３Ｄ（腎臓）のＣＦＵは、感染の１０２時間後に分析される。
【図３３Ｄ】図３３Ａ−図３３Ｄは、ｃｒファージカクテルのＩＶ投与が有効性のために高用量を必要とする一方で、ＩＵ送達は低用量でさえも効果的であり、高用量のｃｒファージはシプロフロキサシンよりも優れていることを例示する。図３３Ａ（膀胱）と図３３Ｃ（腎臓）のＣＦＵは、感染後５４時間で分析される。図３３Ｂ（膀胱）と図３３Ｄ（腎臓）のＣＦＵは、感染の１０２時間後に分析される。
【図３４Ａ】尿路の再発性および無症候性の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニー形成を伴う成人で実施された例示的なヒト研究の概略図である。
【図３４Ｂ】ＵＴＩフェーズ１ｂ研究の例示的な研究参加者の包含および除外基準である。
【図３５Ａ】図３５Ａ−図３５Ｆは、人工ファージ（ｐ３３ｓおよびｐ３３ｓ−６）はタイプＩＥとタイプＩＦの両方の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に対する死滅の増加を示していることを例示する。
【図３５Ｂ】図３５Ａ−図３５Ｆは、人工ファージ（ｐ３３ｓおよびｐ３３ｓ−６）はタイプＩＥとタイプＩＦの両方の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に対する死滅の増加を示していることを例示する。
【図３５Ｃ】図３５Ａ−図３５Ｆは、人工ファージ（ｐ３３ｓおよびｐ３３ｓ−６）はタイプＩＥとタイプＩＦの両方の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に対する死滅の増加を示していることを例示する。
【図３５Ｄ】図３５Ａ−図３５Ｆは、人工ファージ（ｐ３３ｓおよびｐ３３ｓ−６）はタイプＩＥとタイプＩＦの両方の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に対する死滅の増加を示していることを例示する。
【図３５Ｅ】図３５Ａ−図３５Ｆは、人工ファージ（ｐ３３ｓおよびｐ３３ｓ−６）はタイプＩＥとタイプＩＦの両方の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に対する死滅の増加を示していることを例示する。
【図３５Ｆ】図３５Ａ−図３５Ｆは、人工ファージ（ｐ３３ｓおよびｐ３３ｓ−６）はタイプＩＥとタイプＩＦの両方の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に対する死滅の増加を示していることを例示する。
【図３６Ａ】図３６Ａ−図３６Ｆは、人工ファージ（ＣＲＩＳＰＲファージｃｒｐ００４６）はタイプＩＥとタイプＩＦの両方の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に対する死滅の増加を示していることを例示する。
【図３６Ｂ】図３６Ａ−図３６Ｆは、人工ファージ（ＣＲＩＳＰＲファージｃｒｐ００４６）はタイプＩＥとタイプＩＦの両方の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に対する死滅の増加を示していることを例示する。
【図３６Ｃ】図３６Ａ−図３６Ｆは、人工ファージ（ＣＲＩＳＰＲファージｃｒｐ００４６）はタイプＩＥとタイプＩＦの両方の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に対する死滅の増加を示していることを例示する。
【図３６Ｄ】図３６Ａ−図３６Ｆは、人工ファージ（ＣＲＩＳＰＲファージｃｒｐ００４６）はタイプＩＥとタイプＩＦの両方の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に対する死滅の増加を示していることを例示する。
【図３６Ｅ】図３６Ａ−図３６Ｆは、人工ファージ（ＣＲＩＳＰＲファージｃｒｐ００４６）はタイプＩＥとタイプＩＦの両方の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に対する死滅の増加を示していることを例示する。
【図３６Ｆ】図３６Ａ−図３６Ｆは、人工ファージ（ＣＲＩＳＰＲファージｃｒｐ００４６）はタイプＩＥとタイプＩＦの両方の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に対する死滅の増加を示していることを例示する。
【図３７Ａ】図３７Ａ−図３７Ｃは、ファージカクテルの切り替えが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の標的細菌耐性を克服することを例示する。
【図３７Ｂ】図３７Ａ−図３７Ｃは、ファージカクテルの切り替えが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の標的細菌耐性を克服することを例示する。
【図３７Ｃ】図３７Ａ−図３７Ｃは、ファージカクテルの切り替えが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の標的細菌耐性を克服することを例示する。
【図３８Ａ】図３８Ａ−図３８Ｂは、野生型ファージＰＢ１およびＣＲＩＳＰＲで増強されたＰＢ１（ｃｒ−ＰＢ１）の緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株に対する比較を例示する。
【図３８Ｂ】図３８Ａ−図３８Ｂは、野生型ファージＰＢ１およびＣＲＩＳＰＲで増強されたＰＢ１（ｃｒ−ＰＢ１）の緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株に対する比較を例示する。
【図３９Ａ】図３９Ａ−図３９Ｂは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムによる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）でのプラスミドベースの死滅を例示する。
【図３９Ｂ】図３９Ａ−図３９Ｂは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムによる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）でのプラスミドベースの死滅を例示する。
【００１３】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書の開示の説明で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、開示を限定することを意図するものではない。
【００１４】
文脈が別段の指示をしない限り、本明細書に記載の本開示の様々な特徴を任意の組み合わせで使用できることが特に意図されている。さらに、本開示はまた、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意の特徴または特徴の組み合わせが除外または省略されることを企図する。例証するために、組成物が成分Ａ、ＢおよびＣを含むと明細書が述べている場合、Ａ、ＢまたはＣのいずれか、またはそれらの組み合わせは省略され、単独でまたは任意の組み合わせで免責される。
【００１５】
当業者は、文献における一貫性の欠如およびそのような用語を統一するための当技術分野における継続的な努力のために、様々なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムおよびそれらの構成要素を指定する用語の互換性を理解するであろう。同様に、当業者はまた、文献における一貫性の欠如およびそのような用語を統一するための当該技術分野における継続的な努力のために、様々な抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質を指定する用語の互換性を理解するであろう。
【００１６】
説明および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数形も含むことを意図している。また、本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連するリストされた項目の１つまたは複数のありとあらゆる可能な組み合わせ、ならびに代替で解釈される場合（「または」）の組み合わせの欠如を指し、および包含する。
【００１７】
投与量または期間などの測定可能な値を指すときに本明細書で使用される「約」という用語は、指定量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、＋０．５％、または±０．１％さえの変動を指す。本明細書で使用される場合、「ＸとＹの間」および「約ＸとＹの間」などの句は、ＸとＹを含むと解釈されるべきである。本明細書で使用される場合、「約ＸとＹの間」などの句は、「約Ｘと約Ｙの間」を意味し、「約ＸからＹ」などの句は、「約Ｘから約Ｙ」を意味する。
【００１８】
本明細書で使用される「含む」、「包含する」、および「含むこと」、「含有する」、「含有すること」、「有する」および「有すること」という用語は、述べられた特徴、工程、操作、要素、および／またはコンポーネント。ただし、１つまたは複数の他の機能、ステップ、操作、要素、コンポーネント、および／またはそれらの群の存在または追加を排除するものではない。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という移行句は、特許請求の範囲は特許請求の範囲に列挙された特定の材料または工程、および特許請求された開示の基本的および新規の特徴に実質的に影響を及ぼさないものを包含すると解釈されることを意味する。したがって、本開示の請求項で使用される場合の「から本質的になる」という用語は、「含む」と同等であると解釈されることを意図するものではない。
【００２０】
本明細書で使用される「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」および「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語は、他に直接述べられていない任意の特色、工程、操作、要素、および／またはコンポーネントを除外する。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」の使用は、その節に記載されている機能、ステップ、操作、要素、および／またはコンポーネントのみを制限し、他の特色、工程、操作、要素、および／またはコンポーネントをその請求項から全体として除外する。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「キメラ」とは、少なくとも２つの成分が異なる供給源（例えば、異なる生物、異なるコード領域）に由来する核酸分子またはポリペプチドを指す。
【００２２】
本明細書で使用される「相補」は、比較ヌクレオチド配列との１００％の相補性または同一性を意味するか、または１００％未満の相補性（例えば、約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％などの相補性）を意味する。相補または相補的はまた、変異に対して「相補性」まであるか、または変異を「相補すること」の観点から使用され得る。
【００２３】
本明細書で使用される「相補」または「相補性」という用語は、塩基対形成による許容塩および温度条件下でのポリヌクレオチドの自然な結合を指す。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は相補配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は「部分的」であり、ヌクレオチドの一部のみが結合するか、一本鎖分子間に完全な相補性が存在する場合に完全になる。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に有意な影響を及ぼす。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、抗マイクロＲＮＡ、調節ＲＮＡなどを生成するために使用することができる核酸分子を指す。遺伝子は、機能的なタンパク質または遺伝子産物を生産するために使用できる場合とできない場合がある。遺伝子には、コーディング領域と非コーディング領域の両方が含まれる（例えば、イントロン、調節エレメント、プロモーター、エンハンサー、終結配列、および／または５’および３’非翻訳領域）。遺伝子は「単離された」ものであり、それは、その天然状態の核酸に関連して通常見出される成分を実質的または本質的に含まない核酸を意味する。そのような成分には、他の細胞材料、組換え生産からの培養培地、および／または核酸を化学的に合成するのに使用される様々な化学物質が含まれる。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「標的ヌクレオチド配列」は、組換えＣＲＩＳＰＲアレイのスペーサー配列に相補的である標的遺伝子の部分を指す。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「標的ＤＮＡ」、「標的ヌクレオチド配列」、「標的領域」、または「ゲノム中の標的領域」は、生物のゲノムの領域を指し、（例えば、少なくとも７０％相補的（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）ＣＲＩＳＰＲアレイのスペーサー配列に完全に相補的または実質的に相補的である。いくつかの実施形態において、標的領域は、生物のゲノム中のＰＡＭ配列（標的領域のすぐ３’に位置するＰＡＭ配列）に直接隣接して位置する長さ約１０から約４０ヌクレオチドの連続である。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）に隣接して位置するか、またはそれに隣接する。ＰＡＭは特定のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムに固有であることがよくあると同時に、ＰＡＭ配列は適切な方法で決定される。したがって、例えば、実験的アプローチは、すべての可能なヌクレオチド配列に隣接する配列を標的化すること、および標的ＤＮＡのインビトロ切断または標的プラスミドＤＮＡの形質転換などを介して標的化を受けない配列メンバーを同定することを含む。いくつかの実施形態において、計算アプローチは、バクテリオファージまたはプラスミド中の元の標的ＤＮＡ配列を同定するために天然スペーサーのＢＬＡＳＴ検索を実行し、そしてこれらの配列を整列させて標的配列に隣接する保存配列を決定することを含む。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「プロトスペーサー隣接モチーフ」または「ＰＡＭ」という用語は、ガイドＲＮＡスペーサーに一致する配列に隣接する標的ＤＮＡ分子上に存在するＤＮＡ配列を指す。このモチーフは、スペーサー配列がその領域に相補的である結果として結合する領域の隣の標的遺伝子に見られ、スペーサーヌクレオチド配列との塩基対形成が始まる点を特定する。タイプＩシステムの場合、ＰＡＭはスペーサーに一致する配列のすぐ５’に位置し、したがってスペーサーヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列の３’に位置する。ＰＡＭの非限定的な例には、ＣＣＡ、ＣＣＴ、ＣＣＧ、ＣＣＴ、ＣＣＡ、ＴＴＣ、ＡＡＧ、ＡＧＧ、ＡＴＧ、ＧＡＧ、および／またはＣＣが含まれる。タイプＩシステムの場合、ＰＡＭはカスケードによって直接認識される。必要な正確なＰＡＭ配列は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムごとに異なり、確立されたバイオインフォマティクスと実験手順によって特定される。プロトスペーサーが認識されると、カスケードは一般にエンドヌクレアーゼＣａｓ３を誘導し、これが標的ＤＮＡを切断して分解する。
【００２８】
タイプＩＩシステムの場合、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡがＲループを形成して、ガイドＲＮＡとゲノムのワトソンクリックペアリングを介して特定のＤＮＡ配列を調べるには、ＰＡＭが必要である。ＰＡＭの特異性は、Ｃａｓ９タンパク質のＤＮＡ結合特異性の関数である（例えば、Ｃａｓ９のＣ末端にあるプロトスペーサー隣接モチーフ認識ドメイン）。
【００２９】
ここで使用されているように、タイプＩクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）−抗ウイルス防御のための関連複合体（Ｃａｓｃａｄｅ）は、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのプロセシングとそれに続くＩ型の標的ＤＮＡ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムへの結合に関与するポリペプチドの複合体を指する。これらのポリペプチドには、Ｉ型サブタイプ１−Ａ、ｌ−Ｂ、ｌ−Ｃ、ｌ−Ｄ、ｌ−Ｅおよびｌ−Ｆのカスケードポリペプチドが含まれるはこれらに限定されない。Ｉ型−Ａポリペプチドの非限定的な例には、Ｃａｓ７（Ｃｓａ２）、Ｃａｓ８ａｌ（Ｃｓｘｌ３）、Ｃａｓ８ａ２（Ｃｓｘ９）、Ｃａｓ５、Ｃｓａ５、Ｃａｓ６ａ、Ｃａｓ３’および／またはＣａｓ３”が含まれる。タイプ１−Ｂポリペプチドの非限定的な例には、Ｃａｓ６ｂ、Ｃａｓ８ｂ（Ｃｓｈｌ）、Ｃａｓ７（Ｃｓｈ２）および／またはＣａｓ５が含まれる。タイプＩＣポリペプチドの非限定的な例には、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ８ｃ（Ｃｓｄｌ）、および／またはＣａｓ７（Ｃｓｄ２）が含まれる。タイプＩＤポリペプチドの非限定的な例には、Ｃａｓ１０ｄ（Ｃｓｃ３）、Ｃｓｃ２、Ｃｓｃｌ、および／またはＣａｓ６ｄが含まれる。タイプ１−Ｅポリペプチドの非限定的な例には、Ｃｓｅｌ（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃａｓ７（ＣａｓＣ）、Ｃａｓ５（ＣａｓＤ）および／またはＣａｓ６ｅ（ＣａｓＥ）が含まれる。タイプＩ−Ｆポリペプチドの非限定的な例には、Ｃｙｓ１、Ｃｙｓ２、Ｃａｓ７（Ｃｙｓ３）および／またはＣａｓ６ｆ（Ｃｓｙ４）が含まれる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組換え核酸は、ＣＲＩＳＰＲアレイを処理し、続いて、ガイドとして処理されたＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡのスペーサーを使用して標的ＤＮＡに結合するように機能する１型カスケードポリペプチドのサブセットをコードするヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【００３０】
本明細書で使用される「ＣＲＩＳＰＲアレイ」は、少なくとも２つの反復配列、または上記反復配列のそれぞれの一部、および少なくとも１つのスペーサー配列を含む核酸分子を意味する。２つの反復配列の１つまたはその一部は、スペーサー配列の５’末端に結合されており、２つの反復配列の他方、またはその一部は、スペーサー配列の３’末端に結合されている。組換えＣＲＩＳＰＲアレイでは、反復配列とスペーサー配列の組み合わせは合成であり、人が作ったものであり、自然界には見られない。いくつかの実施形態において、「ＣＲＩＳＰＲアレイ」は、５’から３’までの少なくとも１つのリピートスペーサー配列（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５以上のリピートスペーサー配列、およびその中の任意の範囲または値）を含む核酸構築物を指す。アレイの３’の最もリピートスペーサー配列の３’末端はリピート配列にリンクされており、それにより、上記アレイ内のすべてのスペーサーは、リピート配列によって５’末端と３’末端の両方に隣接している。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「スペーサー配列」または「スペーサー」は、標的ＤＮＡ（すなわち、ゲノム中の標的領域またはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接する「プロトスペーサー配列」）に相補的なヌクレオチド配列を指す。スペーサー配列は、（例えば、少なくとも約７０％相補的（例えば、約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）標的ＤＮＡに対して完全に相補的または実質的に相補的である。
【００３２】
本明細書で使用される「反復配列」は、例えば、「スペーサー配列」によって分離された野生型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の任意の反復配列または合成ＣＲＩＳＰＲアレイの反復配列（例えば、反復スペーサー−配列を繰り返する）。本開示で有用な反復配列は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の既知のまたは後で同定された反復配列であるか、またはＣＲＩＳＰＲシステム、例えば、ＣＲＩＳＰＲタイプＩシステムで機能するように設計された合成反復である。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲファージ」、「ＣＲＩＳＰＲ増強ファージ」、および「ｃｒファージ」という用語は、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含むバクテリオファージＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を指す。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの少なくとも１つの構成要素（例えば、ＣＲＩＳＰＲアレイ、ｃｒＲＮＡ；例えば、ｃｒＲＮＡ標的化の挿入を含むＰＩバクテリオファージ）をコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの少なくとも１つの転写活性化因子をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドの少なくとも１つの成分をコードする。
【００３４】
本明細書で使用される場合、２つの核酸分子、ヌクレオチド配列またはタンパク質配列の文脈における「実質的に同一」または「実質的な同一性」という句は、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および／または１００％ヌクレオチドまたは、以下の配列比較アルゴリズムのいずれかを使用して、または目視検査によって測定された、最大の対応のために比較および整列された場合のアミノ酸残基の同一性。を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。いくつかの実施形態において、実質的な同一性は、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５、９６、９６、９７、９８、または９９％の同一性を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。配列比較では、通常、１つの配列がテスト配列と比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、テスト配列と参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じてサブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対するテスト配列のパーセント配列同一性を計算する。
【００３５】
比較ウィンドウを整列させるための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎのローカル相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈの相同性整列アルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎの類似性メソッドの検索、およびオプションで  ＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）の一部として利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡなどのこれらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装などのツールによって実行される。テスト配列と参照配列のアラインメントされたセグメントの「同一性の割合」は、２つのアラインメントされた配列によって共有される同一のコンポーネントの数を、参照配列セグメント内のコンポーネントの総数、つまり参照配列全体または参照配列のより小さな定義された部分。パーセント配列同一性は、同一性の割合に１００を掛けたものとして表される。１つまたは複数のポリヌクレオチド配列の比較は、全長ポリヌクレオチド配列またはその一部、あるいはより長いポリヌクレオチド配列に対するものである。場合によっては、「パーセント同一性」は、翻訳されたヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＸバージョン２．０を使用し、ポリヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を使用して決定される。
【００３６】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換え核酸分子、ヌクレオチド配列およびポリペプチドは、「単離される」。「単離された」核酸分子、「単離された」ヌクレオチド配列または「単離された」ポリペプチドは、その本来の環境から離れて存在する核酸分子、ヌクレオチド配列またはポリペプチドである。場合によっては、単離された核酸分子、ヌクレオチド配列またはポリペプチドは、天然に存在する生物またはウイルスの他の成分の少なくともいくつか、例えば、細胞またはウイルスの構造成分から少なくとも部分的に分離された精製形態で存在する。または、ポリヌクレオチドに関連して一般的に見られる他のポリペプチドまたは核酸。代表的な実施形態において、単離された核酸分子、単離されたヌクレオチド配列および／または単離されたポリペプチドは、少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上の純度である。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「抗ＣＲＩＳＰＲ」または「Ａｃｒ」という用語は、機能的な抗ＣＲＩＳＰＲ活性を有する任意のタンパク質または遺伝子産物を指す。文献の一貫性が欠如しているため、当業者は、様々な抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質を指定する用語の互換性を理解するであろう。例えば、ここで使用されているように、Ａｃｒ１−Ｂｏの指定はＡｃｒＩＩＣｌＢｏｅおよびＡｃｒ２−Ｎｍの指定は、ＡｃｒＩＩＣ２Ｎｍｅと互換性がある。また、本明細書で使用されるように、Ａｃｒ８８ａ−３２の指定はＡｃｒＥ２と交換可能である。抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、細菌のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの機能を妨げる活性を持つバクテリオファージタンパク質である。抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の活性は、宿主細菌が侵入するバクテリオファージに対するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムベースの防御を開始するのを防ぐ。
【００３８】
「治療する」、「治療する」、または「治療」という用語は、対象の状態の重症度が軽減されるか、少なくとも部分的に改善または修正され、少なくとも１つの臨床症状のいくらかの緩和、緩和または減少が達成された、および／または疾患または状態の進行の遅延、および／または疾患または疾患の発症の遅延がある。感染症、疾患または状態に関して、この用語は、感染症、疾患または状態の症状または他の症状の減少を指す。いくつかの実施形態において、治療は、感染症、疾患または状態の症状または他の症状を少なくとも約５％、例えば、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％以上減少させる。
【００３９】
本明細書で使用される「感染症」、「疾患」、または「状態」に関する用語は、対象における任意の有害、陰性、または有害な生理学的状態を指す。いくつかの実施形態では、「感染」、「疾患」、または「状態」の原因は、対象および／または対象における標的細菌集団の存在である。いくつかの実施形態では、細菌集団は、１つまたは複数の標的細菌種を含む。いくつかの実施形態において、細菌集団中の１つ以上の細菌は、１つ以上の細菌の１つ以上の株を含む。いくつかの実施形態において、「感染」、「疾患」、または「状態」を引き起こす標的細菌集団は、急性または慢性である。いくつかの実施形態では、「感染」、「疾患」、または「状態」を引き起こす標的細菌集団は、限局性または全身性である。いくつかの実施形態では、「感染」、「疾患」、または「状態」を引き起こす標的細菌集団は特発性である。いくつかの実施形態では、「感染症」、「疾患」、または「状態」を引き起こす標的細菌集団は、呼吸器吸入、摂取、皮膚および創傷感染症、血流感染症、中耳の感染症、胃腸管感染症、腹膜感染症、尿路感染症、泌尿生殖器管感染症、口腔軟組織感染症、腹腔内感染症、表皮または粘膜吸収、眼感染症（接触レンズ汚染を含む）、心内膜炎、嚢胞性線維症の感染症、関節プロテーゼ、歯科用インプラント、カテーテルおよび心臓用インプラントなどの留置医療機器の感染症、性的接触、および／または病院で取得した換気装置に関連する細菌性肺炎を含むがこれらに限定されない手段によって獲得される。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「バイオフィルム」という用語は、多糖類のマトリックスに埋め込まれた微生物の蓄積を意味する。バイオフィルムは、固体の生物学的または非生物学的表面に形成され、医学的に重要であり、体内の微生物感染の８０パーセント以上を占めている。
【００４１】
「予防する」、「予防すること」、および「予防」（およびそれらの文法的変形）という用語は、対象における感染症、疾患、状態および／または臨床症状の発症の予防および／または遅延を指し、／または感染症、疾患、状態、および／または臨床症状の発症の重症度は疾患、障害、および／または疾患の発症前に本明細書に開示された方法を実行しない場合に起こるであろうものと比較して減少する。／または臨床症状。したがって、いくつかの実施形態では、感染を防ぐために、食品、表面、医療ツールおよびデバイスは、本明細書に開示される組成物および方法によって処理される。
【００４２】
本明細書に開示される「対象」には、細菌が関与する感染症、疾患、または状態を有する、またはその可能性がある任意の動物が含まれる。したがって、いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、または魚類である。哺乳動物の対象には、ヒト、ヒト以外の霊長類（例えば、ゴリラ、サル、ヒヒ、およびチンパンジーなど）、犬、猫、山羊、馬、豚、牛、羊など、および実験動物（例えば、ラット、モルモット、マウス、スナネズミ、ハムスターなど）が含まれるはこれらに限定されない。鳥類の対象には、ニワトリ、アヒル、七面鳥、ガチョウ、ウズラ、キジ、ペットとして飼育されている鳥（インコ、オウム、コンゴウインコ、オウム、カナリアなど）が含まれるはこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、適切な対象は、男性および女性の両方、ならびに胚性（例えば、子宮内または卵内）、乳児、若年、青年、成人および老人の対象を含む任意の年齢の対象を含む。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
【００４３】
「薬学的に許容される」とは、生物学的またはその他の望ましくないものではない材料を意味し、すなわち、材料は、毒性などの望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく対象に投与される。
【００４４】
様々な実施形態で提供されるのは、本明細書に記載の任意の核酸を特徴づけおよび／または含むバクテリオファージである。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、溶原バクテリオファージ（例えば、本明細書に記載されるような溶解活性を有するバクテリオファージ）である。特定の実施形態において、溶原バクテリオファージは、少なくとも１つの溶原性遺伝子の除去、置換、または不活性化を含む。特定の実施形態では、溶解活性を有し、（ａ）スペーサー配列をコードする核酸および／または（ｂ）そこから転写されたｃｒＲＮＡを含むバクテリオファージが本明細書で提供される。いくつかの特定の実施形態では、本明細書の特定の実施形態で提供されるのは、（ｉ）スペーサー配列および／またはそこから転写されたｃｒＲＮＡをコードする第１の核酸、および（ｉｉ）細菌（例えば、標的細菌）の溶解を誘導することができる遺伝子を含むバクテリオファージ。より具体的な実施形態では、スペーサー配列は、細菌（例えば、標的細菌）のまたはその中の標的遺伝子の核酸配列に相補的である。いくつかで提供本明細書の実施形態は、細菌（例えば、標的細菌）におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムのための転写活性化因子をコードする核酸を含むバクテリオファージである。
特定の本明細書で提供される実施形態は、溶解活性および抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする（および／または抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドを含む）第１の核酸配列を有するバクテリオファージである。様々な実施形態において、本明細書で提供されるバクテリオファージは、上記の参照特性および／または活性のうちの任意の１つ以上を有する。さらに、本明細書の様々な実施形態では、そのようなバクテリオファージは、本明細書の要約または詳細な説明に記載されている任意の１つまたは複数の特徴または活性を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、そのようなバクテリオファージが利用され、本明細書に記載されるような様々な組成物（例えば、医薬組成物）および方法が利用される。特定の実施形態では、そのようなバクテリオファージは、本明細書に記載されるものなど、任意の数の用途および方法（例えば、それを必要とするものなどの個人または対象のマイクロバイオームを調整する）において有用である。いくつかの実施形態では、そのようなバクテリオファージは、細菌（例えば、標的細菌）を死滅させる（例えば、選択的に死滅させる）方法またはそれを含む方法で利用される。特定の実施形態では、標的細菌は、個体、環境、または本明細書に記載されるような他の適切な場所などの細菌の混合集団にある。
【００４６】
特定の実施形態において、本明細書で提供されるバクテリオファージは、例えば、標的細菌または細菌ではない細菌は標的細菌よりも低い速度で、例えば、５０％未満の速度で死滅させられるように、標的細菌または細菌を選択的に死滅させる。標的細菌または細菌と比較して、２５％未満の割合、１０％未満の割合、または約０％の割合（すなわち、まったくない）。本明細書で提供される特定の方法などのいくつかの例では、非標的細菌の５０％未満が死滅させられる、２５％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満が死滅させられるなどである。死滅させられた。
【００４７】
ＣＲＩＳＰＲアレイ
本明細書においてＣＲＩＳＰＲアレイが開示されている。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイをコードする核酸は、少なくとも１つの反復配列および少なくとも１つのスペーサー配列を含む。標的細菌の標的遺伝子からの標的ヌクレオチド配列に相補的。
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイは、任意の長さであり、１つ以上の標的遺伝子の使用によって標的細菌の所望のレベルの死滅を達成するために必要な反復ヌクレオチド配列と交互になる任意の数のスペーサーヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイは、１から約１００のスペーサーヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、それぞれがその５’末端およびその３’末端で反復ヌクレオチド配列に連結される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えＣＲＩＳＰＲアレイは、本質的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５からなるか、またはそれらからなる。１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、またはそれ以上のスペーサーヌクレオチド配列。
【００４８】
スペーサー
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のスペーサー配列は、標的ＤＮＡと比較して、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、ミスマッチは隣接している。いくつかの実施形態では、ミスマッチは連続していない。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、標的ＤＮＡに対して７０％の相補性を有する。いくつかの実施形態において、スペーサーヌクレオチド配列は、標的ＤＮＡに対して８０％の相補性を有する。いくつかの実施形態において、スペーサーヌクレオチド配列は、標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列に対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の相補性である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、標的ＤＮＡに対して１００％の相補性を有する。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、長さが少なくとも約８ヌクレオチドから約１５０ヌクレオチドである標的ヌクレオチド配列の領域にわたって完全な相補性または実質的な相補性を有する。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、長さが少なくとも約２０ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドである標的ヌクレオチド配列の領域にわたって完全な相補性または実質的な相補性を有する。いくつかの実施形態において、スペーサー配列の５’領域は、標的ＤＮＡに対して１００％相補的であり、一方、スペーサーの３’領域は、標的ＤＮＡに対して実質的に相補的であり、したがって、標的ＤＮＡに対するスペーサー配列の全体的な相補性は１００％より少ない。例えば、いくつかの実施形態では、２０ヌクレオチドスペーサー配列（シード領域）の３’領域の最初の７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６ヌクレオチドは、１００％相補的である。スペーサー配列の５’領域の残りのヌクレオチドは、標的ＤＮＡに対して実質的に相補的である（例えば、少なくとも約７０％相補的である）。いくつかの実施形態では、スペーサー配列の３’末端の最初の７から１２ヌクレオチドは、標的ＤＮＡに１００％相補的であり、一方、スペーサー配列の５’領域の残りのヌクレオチドは、実質的に相補的である（例えば、少なくとも約５０％相補的（例、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上））標的ＤＮＡに対して。いくつかの実施形態では、スペーサー配列の３’末端の最初の７から１０ヌクレオチドは、標的ＤＮＡに７５％〜９９％相補的であり、一方、スペーサー配列の５’領域の残りのヌクレオチドは、少なくとも約５０％である。標的ＤＮＡに約９９％相補的である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列の３’末端の最初の７から１０ヌクレオチドは、標的ＤＮＡに１００％相補的であり、一方、スペーサー配列の５’領域の残りのヌクレオチドは、実質的に相補的である（例えば、少なくとも約標的ＤＮＡに対して７０％相補的）。いくつかの実施形態では、スペーサー配列の最初の１０ヌクレオチド（シード領域内）は、標的ＤＮＡに１００％相補的であり、一方、スペーサー配列の５’領域の残りのヌクレオチドは、実質的に相補的である（例えば、少なくとも約７０％相補的）標的ＤＮＡに。いくつかの実施形態において、スペーサー配列の５’領域（例えば、５’末端の最初の８ヌクレオチド、５’末端の最初の１０ヌクレオチド、５’末端の最初の１５ヌクレオチド、最初の２０ヌクレオチド５’末端）は、標的ＤＮＡに対して約７５％以上の相補性（７５％から約１００％の相補性）を有し、一方、スペーサー配列の残りは、標的ＤＮＡに対して約５０％以上の相補性を有する。いくつかの実施形態において、スペーサー配列の５’末端の最初の８ヌクレオチドは、１００％を有する。標的ヌクレオチド配列に対する相補性、または１つまたは２つの突然変異を有するため、それぞれ、標的ＤＮＡに対して約８８％相補的または約７５％相補的であり、一方、スペーサーヌクレオチド配列の残りは、少なくとも約５０％以上標的ＤＮＡに相補的である。
【００４９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のスペーサー配列は、長さが約１５ヌクレオチドから約１５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スペーサーヌクレオチド配列は、長さが約１５ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドである（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００ヌクレオチド以上）。いくつかの実施形態において、スペーサーヌクレオチド配列は、約８から約１５０ヌクレオチド、約８から約１００ヌクレオチド、約８から約５０ヌクレオチド、約８から約４０ヌクレオチド、約８から約３０ヌクレオチド、約８から約２５ヌクレオチド、約８から約２０ヌクレオチド、約１０から約１５０ヌクレオチド、約１０から約１００ヌクレオチド、約１０から約８０ヌクレオチド、約１０から約５０ヌクレオチド、約１０から約４０、約１０から約３０、約１０から約２５、約１０から約２０、約１５から約１５０、約１５から約１００、約１５から約５０、約１５から約４０、約１５から約３０、約２０から約１５０ヌクレオチド、約２０から約１００ヌクレオチド、約２０から約８０ヌクレオチド、約２０から約５０ヌクレオチド、約２０から約４０、約２０から約３０、約２０から約２５、少なくとも約８、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３２、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４４、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０ヌクレオチドの長さ、またはそれ以上、およびその中の任意の値または範囲の長さである。
【００５０】
いくつかの実施形態において、の２つ以上のスペーサーヌクレオチド配列の同一性本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲアレイは同じである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲアレイの２つ以上のスペーサーヌクレオチド配列の同一性は異なる。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイの２つ以上のスペーサーヌクレオチド配列の同一性は異なるは１つ以上の標的ヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイの２つ以上のスペーサーヌクレオチド配列の同一性は異なり、重複する配列である１つ以上の標的ヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイの２つ以上のスペーサーヌクレオチド配列の同一性は異なり、重複する配列ではない１つ以上の標的ヌクレオチド配列に相補的である。
【００５１】
コドン最適化
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のポリヌクレオチド、ヌクレオチド配列および／または組換え核酸分子（例えば、ＣＲＩＳＰＲアレイ、カスケードポリペプチド、Ｃａｓ９ポリペプチド、Ｃａｓ３ポリペプチド、Ｃａｓ３’ポリペプチド、Ｃａｓ３”ポリペプチド、組換えタイプＩまたはタイプＩＩ、タイプＩＩＩ、タイプＩＶ、タイプＶ、タイプＶＩ  ＣＲＩＳＰＲ−本開示のＣａｓシステム、転写活性化因子をコードするポリヌクレオチドなど）は、目的の任意の種での発現のために最適化されたコドンである。コドン最適化には、種固有のコドン使用頻度表を使用したコドン使用頻度バイアスのヌクレオチド配列の変更が含まれる。コドン使用頻度表は、目的の種で最も高度に発現している遺伝子の配列分析に基づいて生成される。ヌクレオチド配列が核で発現される場合、コドン使用頻度表は、目的の種について高度に発現された核遺伝子の配列分析に基づいて生成される。ヌクレオチド配列の修飾は、種特異的コドン使用量表を天然のポリヌクレオチド配列に存在するコドンと比較することによって決定される。ヌクレオチド配列のコドン最適化は、１００％未満の同一性を有するヌクレオチド配列をもたらす（例えば、５０％、６０％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％など）は、天然のヌクレオチド配列に対してであるはそれでも、元のヌクレオチド配列によってコードされるものと同じ機能を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、本開示のヌクレオチド配列および／または組換え核酸分子は、目的の生物／種における発現のために最適化されたコドンである。
【００５２】
反復ヌクレオチド配列
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイの反復ヌクレオチド配列は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの任意の既知の反復ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態において、反復ヌクレオチド配列は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム（例えば、内部ヘアピン）からの天然反復の二次構造を含む合成配列のものである。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲアレイのスペーサーヌクレオチド配列は、その５’末端でリピート配列の３’末端に連結されている。いくつかの実施形態において、スペーサーヌクレオチド配列は、その５’末端で、反復ヌクレオチド配列の３’末端の約１から約８、約１から約１０、または約１から約１５ヌクレオチドに連結されている。いくつかの実施形態において、反復ヌクレオチド配列の約１から約８、約１から約１０、約１から約１５ヌクレオチドは、反復ヌクレオチド配列の３’末端の一部である。いくつかの実施形態において、スペーサーヌクレオチド配列は、その３’末端でリピートヌクレオチド配列の５’末端に連結されている。いくつかの実施形態では、スペーサーは、その３’末端で、反復ヌクレオチド配列の５’末端の約１から約８、約１から約１０、または約１から約１５ヌクレオチドに連結されている。いくつかの実施形態において、反復ヌクレオチド配列の約１から約８、約１から約１０、約１から約１５ヌクレオチドは、反復ヌクレオチド配列の５’末端の一部である。
【００５４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のスペーサーヌクレオチド配列は、その５’末端で第１のリピートヌクレオチド配列に連結され、その３’末端で第２のリピートヌクレオチド配列に連結されて、リピートスペーサーリピート配列を形成する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のスペーサーは、その５’末端で第１の反復配列の３’末端の約１から約８、約１から約１０、または約１から約１５ヌクレオチドに連結され、第２の反復配列の５’末端の約１から約８、約１から約１０、または約１から約１５ヌクレオチドの３’末端。いくつかの実施形態において、第１の反復配列の約１から約８、約１から約１０、約１から約１５ヌクレオチドは、第１の反復ヌクレオチド配列の３’末端の一部である。いくつかの実施形態において、第１の第２の配列の約１から約８、約１から約１０、約１から約１５ヌクレオチドは、第２の反復ヌクレオチド配列の３’末端の一部である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるスペーサーヌクレオチド配列は、その５’末端で第１の反復ヌクレオチド配列の３’末端に連結され、その３’末端で第２の反復ヌクレオチド配列の５’に連結され、スペーサーヌクレオチド配列および２番目のリピートヌクレオチド配列が繰り返されて、ｎが１から１００までの任意の整数になるようなリピート−（スペーサー−リピート）ｎ配列が形成される。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるリピート（スペーサーリピート）ｎ配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、以上のスペーサーヌクレオチド配列を含むか、本質的になるか、またはそれからなる。
【００５５】
したがって、いくつかの実施形態では、反復配列は、野生型ＣＲＩＳＰＲタイプＩ、ＩＩ、またはＩＩＩ遺伝子座からの反復配列と同一であるか、または実質的に同一である。
いくつかの実施形態において、反復配列は、野生型反復配列の一部を含む（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または野生型反復配列のより連続したヌクレオチド）。いくつかの実施形態では、反復配列は、少なくとも１つのヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、以上のヌクレオチド、またはその中の任意の範囲）を含む、本質的になる、またはそれからなる。
【００５６】
調節エレメント
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えＣＲＩＳＰＲアレイ、ヌクレオチド配列、および／または核酸分子は、様々な生物または細胞における発現のための様々なプロモーター、ターミネーターおよび他の調節エレメントと作動可能に関連している。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのプロモーターおよび／またはターミネーターは、本明細書に開示される組換え核酸分子および／または組換えＣＲＩＳＰＲアレイに作動可能に連結されている。本開示で有用な任意のプロモーターが使用され、例えば、本明細書に記載のように、目的の生物で機能するプロモーター、ならびに構成的、誘導性、発生調節、組織特異的／好ましいプロモーターなどが含まれる。本明細書で使用される調節エレメントは、内因性または異種である。いくつかの実施形態において、対象生物に由来する内因性調節エレメントは、それが自然に発生しない遺伝的状況に挿入され（例えば、自然界に見られるものとは異なるゲノム内の位置）、それにより、組換えまたは非天然の核酸を生成する。
【００５７】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される構築物の発現は、構成的、誘導的、時間的に調節される、発達的に調節される、または化学的に調節される。いくつかの実施形態において、構築物は、構築物を目的の生物において機能的なプロモーターに作動可能に連結することによって、構成的、誘導可能、時間的調節、発達的調節、または化学的に調節される。いくつかの実施形態において、抑制は、本明細書に開示される組換え核酸構築物を、目的の生物において機能的である誘導性プロモーターに作動可能に連結することによって可逆的にされる。本明細書に記載のプロモーターの選択は、発現のための量的、時間的および空間的要件に応じて、また形質転換される宿主細胞に応じて変化するであろう。
【００５８】
本明細書に開示される方法、バクテリオファージおよび組成物と共に使用するための例示的なプロモーターには、細菌において機能的であるプロモーターが含まれる。例えば、Ｌ−アラビノース誘導性（ａｒａＢＡＤ、ＰＢＡＤ）プロモーター、任意のｌａｃプロモーター、Ｌ−ラムノース誘導性（ｒｈａＰＢＡＤ）プロモーター、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージプロモーター（ｐＬｐＬ−９Ｇ−５０）、アンヒドロテトラサイクリン−誘導性（ｔｅｔＡ）プロモーター、ｔｒｐ、Ｉｐｐ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ｐｒｏ  Ｕ、ｃｓｔ−１、ｃａｄＡ、ｎａｒ、Ｉｐｐ−ｌａｃ、ｃｓｐＡ、１１−ｌａｃオペレーター、Ｔ３−ｌａｃオペレーター、Ｔ４遺伝子３２、Ｔ５−ｌａｃオペレーター、ｎｐｒＭ−  ｌａｃオペレーター、Ｖｈｂ、プロテインＡ、コリネバクテリア大腸菌様プロモーター、ｔｈｒ、ｈｏｒｎ、ジフテリア毒素プロモーター、ｓｉｇ  Ａ、ｓｉｇ  Ｂ、ｎｕｓＧ、ＳｏｘＳ、ｋａｔｂ、ａ−アミラーゼ（Ｐａｍｙ）、Ｐｔｍｓ、Ｐ４３（２つの重複するＲＮＡポリメラーゼのσ因子認識部位、σＡ、σＢで構成される）、Ｐｔｍｓ、Ｐ４３、ｒｐｌＫ−ｒｐｌＡ、フェレドキシンプロモーター、および／またはキシロースプロモーター。
【００５９】
いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターが使用される。いくつかの実施形態において、化学的に調節されるプロモーターは、外因性の化学調節剤の適用を通じて、生物における遺伝子の発現を調節するために使用される。化学的に調節されたプロモーターの使用は、例えば、生物が誘導化学物質で処理される場合にのみ、本明細書に開示されるＲＮＡおよび／またはポリペプチドを合成することを可能にする。化学誘導性プロモーターが使用されるいくつかの実施形態では、化学物質の適用は遺伝子発現を誘導する。化学的に抑制可能なプロモーターが使用されるいくつかの実施形態では、化学物質の適用は遺伝子発現を抑制する。いくつかの実施形態において、プロモーターは、光誘導性プロモーターであり、特定の波長の光の適用が遺伝子発現を誘導する。いくつかの実施形態において、プロモーターは、光抑制性プロモーターであり、特定の波長の光の適用が遺伝子発現を抑制する。
【００６０】
形質転換
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるヌクレオチド配列、構築物、および発現カセットは、一過性に発現され、および／または宿主生物のゲノムに安定して組み込まれる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、当業者に知られている任意の方法によって細胞に導入される。形質転換の例示的な方法には、以下が含まれる。コンピテントセルのエレクトロポレーションによる形質転換、コンピテントセルによる受動的取り込み、コンピテントセルの化学的形質転換、ならびに細胞への核酸の導入をもたらすその他の電気的、化学的、物理的（機械的）および／または生物学的メカニズム。それらの任意の組み合わせ。いくつかの実施形態では、細胞の形質転換は核形質転換を含む。いくつかの実施形態において、細胞の形質転換は、プラスミド形質転換および接合を含む。
【００６１】
いくつかの実施形態において、２つ以上のヌクレオチド配列が導入される場合、ヌクレオチド配列は、単一の核酸構築物の一部として、または別個の核酸構築物として組み立てられ、同じまたは異なる核酸構築物上に位置する。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、単一の目的の細胞に導入される。
【００６２】
発現カセット
いくつかの実施形態において、核酸構築物は、「発現カセット」または発現カセット内にある。本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、目的のヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子（例えば、本明細書に開示される組換え核酸分子およびＣＲＩＳＰＲアレイ）を意味し、ここで、ヌクレオチド配列は、少なくとも対照配列（例えば、、プロモーター）。いくつかの実施形態において、発現カセットは、本明細書に開示される組換え核酸分子および／または組換えＣＲＩＳＰＲアレイを発現するように設計される。
【００６３】
いくつかの実施形態では、目的のヌクレオチド配列を含む発現カセットはキメラであり、これは、その成分の少なくとも１つは他の成分の少なくとも１つに関して異種であることを意味する。いくつかの実施形態では、発現カセットは天然に存在するは異種発現に有用な組換え形態で得られている。
【００６４】
いくつかの実施形態において、発現カセットは、選択された宿主細胞において機能的である転写および／または翻訳終結領域（すなわち、終結領域）を含む。いくつかの実施形態において、終結領域は、目的の異種ヌクレオチド配列を超えた転写の終結および正しいｍＲＮＡポリアデニル化に関与する。いくつかの実施形態において、終結領域は、転写開始領域に固有であるか、目的の作動可能に連結されたヌクレオチド配列に固有であるか、宿主細胞に固有であるか、または別の供給源に由来する（すなわち、プロモーターに対して外来または異種である）。目的のヌクレオチド配列、宿主、またはそれらの任意の組み合わせ）。いくつかの実施形態において、ターミネーターは、本明細書に開示される組換え核酸分子およびＣＲＩＳＰＲアレイに作動可能に連結されている。
【００６５】
いくつかの実施形態において、発現カセットは、選択可能なマーカーのためのヌクレオチド配列を含む。本明細書で使用される場合、「選択可能なマーカー」は、発現されると、マーカーを発現する宿主細胞に別個の表現型を付与し、したがってそのような形質転換細胞をマーカーを有さない細胞から区別することを可能にするヌクレオチド配列を意味する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、マーカーは選択剤（例えば、抗生物質）を使用するなどの化学的手段によって選択される形質を与えるかどうか、またはマーカーが単にスクリーニング（例えば、蛍光）などによる観察または試験を通じて特定する。
【００６６】
ベクター
発現カセットに加えて、本明細書に記載の核酸分子およびヌクレオチド配列（例えば、ＣＲＩＳＰＲアレイを含むポリヌクレオチド、転写活性化因子をコードするポリヌクレオチド、または抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチド）はベクターに関連して使用される。「ベクター」という用語は、核酸（または複数の核酸）を細胞に移入、送達、または導入するための組成物を指す。ベクターは、移入、送達、または導入されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。ベクターの一般的なクラスの非限定的な例には、ウイルスベクター、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、バクテリオファージ、人工染色体、またはアグロバクテリウムバイナリーが含まれるはこれらに限定されない。二本鎖または一本鎖の線形または円形のベクターで、自己伝達性または可動性である場合とそうでない場合がある。本明細書で定義されるベクターは、細胞ゲノムへの組み込みによって、または染色体外に存在するかのいずれかによって、原核生物または真核生物の宿主を形質転換する（例えば、複製起点を有する自律複製プラスミド）。さらに、シャトルベクターが含まれる。これは、２つの異なる宿主生物で複製できるＤＮＡビヒクルを意味する。いくつかの実施形態において、シャトルベクターは、放線菌および細菌および／または真核生物において複製する。いくつかの実施形態において、ベクター中の核酸は、宿主細胞における転写のための適切なプロモーターまたは他の調節エレメントの制御下にあり、そしてそれらに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、ベクターは、複数の宿主において機能する二機能性発現ベクターである。
【００６７】
ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステム
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、細菌や古細菌に見られる自然適応免疫システムである。ＣＲＩＳＰＲシステムは、侵入するファージやプラスミドに対する防御に関与するヌクレアーゼシステムであり、獲得免疫の一形態を提供する。ｃａｓ遺伝子のセットとそれらの系統発生的関係に基づいたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムには多様性がある。少なくとも６つの異なるタイプ（ＩからＶＩ）があり、タイプＩは細菌と古細菌の両方で特定されたすべてのシステムの５０％以上を表している。いくつかの実施形態では、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩ、タイプＩＶ、タイプＶ、またはタイプＶＩのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが本明細書で使用される。
【００６８】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲアレイのプロセシングは、以下のプロセスを含むがこれらに限定されない：１）ＣＲＩＳＰＲアレイをコードする核酸の、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡおよび任意のｔｒａｃｒＲＮＡへの転写。２）Ｃａｓ６またはＣａｓ９／ＲｎａｓｅＩＩＩによる成熟ｃｒＲＮＡへのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡプロセッシング。３）成熟したｃｒＲＮＡ複合体形成Ｃａｓ９またはＣａｓｃａｄｅ；４）複合体化した成熟ｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９またはｃｒＲＮＡ／Ｃａｓｃａｄｅ複合体による標的認識。５）二本鎖または一本鎖ＤＮＡの切断を導く標的でのヌクレアーゼ活性。
【００６９】
タイプＩシステムに関して、タイプＩシステムは、タイプＩ−Ａ、タイプＩ−Ｂ、タイプＩ−Ｃ、タイプＩ−Ｄ、タイプＩ−Ｅ、タイプＩ−Ｆ、およびタイプＩ−Ｕを含む７つのサブタイプに分けられる。タイプＩＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムには、Ｃａｓｃａｄｅ（抗ウイルス防御に関連する複合体用）と呼ばれるマルチサブユニット複合体、Ｃａｓ３（標的ＤＮＡの分解に関与するヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、およびエキソヌクレアーゼ活性を持つタンパク質）、およびｃｒＲＮＡ（安定化カスケード複合体であり、ＣａｓｃａｄｅとＣａｓ３をＤＮＡ標的に向ける）。カスケードはｃｒＲＮＡと複合体を形成し、タンパク質−ＲＮＡペアは、ｃｒＲＮＡ配列の５’末端と事前定義されたプロトスペーサーとの間の相補的な塩基対形成によってそのゲノム標的を認識する。この複合体は、ｃｒＲＮＡ内にコードされた領域および病原体ゲノム内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を介して、病原体ＤＮＡの相同遺伝子座に向けられる。塩基対形成はｃｒＲＮＡと標的ＤＮＡ配列の間で起こり、コンフォメーション変化を引き起こする。タイプＩ−Ｅシステムでは、ＰＡＭはカスケード内のＣａｓＡタンパク質によって認識され、次に隣接するＤＮＡを巻き戻して、標的とｃｒＲＮＡのスペーサー部分との間の塩基対形成の程度を評価する。十分な認識により、カスケードはＣａｓ３を採用して活性化する。次に、Ｃａｓ３は非標的鎖にニックを入れ、鎖を３’から５’の方向に分解し始める。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲアレイは、処理された成熟ｃｒＲＮＡをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、成熟ｃｒＲＮＡは、本明細書に記載のファージまたは標的細菌に導入される。いくつかの実施形態では、ファージは、処理された成熟ｃｒＲＮＡをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、内因性または外因性のＣａｓ６は、ＣＲＩＳＰＲアレイを成熟したｃｒＲＮＡに処理する。いくつかの実施形態において、外因性Ｃａｓ６は、ファージに導入される。いくつかの実施形態において、ファージは、外因性Ｃａｓ６を含む。いくつかの実施形態において、外因性Ｃａｓ６は、標的細菌に導入される。
【００７１】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、標的細菌に対して内因性である。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、標的細菌に対して外因性である。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、タイプＩＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである。
【００７２】
いくつかの実施形態では、タイプＩ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが本明細書で使用される。上記のように、タイプＩカスケードポリペプチドはＣＲＩＳＰＲアレイを処理して、処理されたＲＮＡを生成する。これは、処理されたＲＮＡのスペーサーに相補的なＤＮＡに複合体を結合するために使用される。いくつかの実施形態では、バクテリオファージに導入される第１の核酸は、本明細書に開示される第１の核酸のプロセシングに関与するカスケードポリペプチドをコードする。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＩ型カスケードポリペプチドは、野生型Ｉ型カスケードポリペプチドと実質的な同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のカスケードポリペプチドは、任意の全長タイプ１カスケードポリペプチドの機能的フラグメントである。いくつかの実施形態において、Ｉ型カスケード複合体は、Ｉ−Ａ型カスケードポリペプチド、Ｉ−Ｂ型カスケードポリペプチド、Ｉ−Ｃ型カスケードポリペプチド、Ｉ−Ｄ型カスケードポリペプチド、Ｉ−Ｅ型カスケードポリペプチド、Ｉ−Ｆ型カスケードポリペプチド、またはタイプＩ−Ｕカスケードポリペプチド。
【００７４】
いくつかの実施形態において、Ｉ型カスケード複合体は、（ａ）Ｃａｓ６ｂポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ８ｂ（Ｃｓｈｌ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ７（Ｃｓｈ２）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、およびＣａｓ５ポリペプチド（タイプ１−Ｂ）；  （ｂ）Ｃａｓ５ｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ８ｃ（Ｃｓｄｌ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、およびＣａｓ７（Ｃｓｄ２）ポリペプチド（タイプＩ−Ｃ）をコードするヌクレオチド配列。（ｃ）Ｃｓｅｌ（ＣａｓＡ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ７（ＣａｓＣ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ５（ＣａｓＤ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、およびヌクレオチドＣａｓ６ｅ（ＣａｓＥ）ポリペプチド（タイプ１−Ｅ）をコードする配列。（ｄ）Ｃｙｓ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃｙｓ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ７（Ｃｙｓ３）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、およびＣａｓ６ｆポリペプチド（タイプ１−Ｆ）をコードするヌクレオチド配列。（ｅ）Ｃａｓ７（Ｃｓａ２）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ８ａｌ（Ｃｓｘｌ３）ポリペプチドまたはＣａｓ８ａ２（Ｃｓｘ９）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃｓａ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ヌクレオチドＣａｓ６ａポリペプチドをコードする配列、Ｃａｓ３’ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、およびヌクレアーゼ活性を有さないＣａｓ３”ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（タイプＩ−Ａ）；および／または（ｆ）Ｃａｓ１０ｄ（Ｃｓｃ３）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃｓｃ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃｓｃｌポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、およびＣａｓ６ｄポリペプチド（タイプ１−Ｄ）をコードするヌクレオチド配列。
【００７５】
バクテリオファージ
バクテリオファージまたは「ファージ」は、細菌ウイルスのグループを表し、環境源から設計または供給される。個々のバクテリオファージの宿主範囲は通常狭い。つまり、ファージは細菌種の１つの菌株または少数の菌株に非常に特異的であり、この特異性により抗菌作用が独特になる。バクテリオファージは、宿主の細胞機構に依存して複製する細菌ウイルスである。一般に、ファージは一般に、溶解性、溶原性、温帯性の３つのカテゴリーに分類される。溶菌性バクテリオファージは宿主細胞に感染し、複製を何度も繰り返し、細胞溶解を引き起こして新しく作られたバクテリオファージ粒子を放出する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される溶解性バクテリオファージは、それらの複製能力を保持する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される溶解性バクテリオファージは、細胞溶解を誘発するそれらの能力を保持している。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される溶解性バクテリオファージは、それらの複製能力および細胞溶解を誘発する能力の両方を保持する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、ＣＲＩＳＰＲアレイを含む。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイは、細胞溶解を複製および／または誘発するバクテリオファージの能力に影響を及ぼさない。溶原性バクテリオファージは、細菌ゲノム内または染色体外プラスミドとして、宿主細胞内に恒久的に存在する。溶原バクテリオファージは、溶解性または溶原性である可能性があり、増殖条件および細胞の生理学的状態に応じて、どちらか一方を選択する。溶原性細菌が悪条件にさらされると、溶原性状態は終了する。このプロセスは誘導と呼ばれる。溶原状態の終了に有利な有害条件には、乾燥、ＵＶまたは電離放射線への曝露、および変異原性化学物質への曝露が含まれる。これは、ファージ遺伝子の発現、統合プロセスの逆転、および溶解増殖につながる。
【００７６】
バクテリオファージは、３つの一般的なアプローチを使用して合成ＤＮＡをパッケージ化して配信する。最初のアプローチでは、合成ＤＮＡはランダムにバクテリオファージゲノムに再結合される。バクテリオファージゲノムには通常、選択可能なマーカーが含まれる。２番目のアプローチでは、ファージ内の制限部位を使用して、インビトロで合成ＤＮＡを導入する。３番目のアプローチでは、一般にファージパッケージング部位と複製起点をコードするプラスミドがバクテリオファージ粒子の集合の一部としてパッケージングされる。得られたプラスミドは「ファージミド」と呼ばれている。
【００７７】
ファージは、進化の理由から特定の細菌株に限定されている。場合によっては、それらの遺伝物質を適合性のない株に注入することは逆効果である。したがって、ファージは、限られた断面の菌株に特異的に感染するように進化してきた。しかし、遺伝物質を広範囲の細菌に注入するファージがいくつか発見されている。古典的な例はＰＩファージで、これはさまざまなグラム陰性菌にＤＮＡを注入することが示されている。
【００７８】
いくつかの実施形態において、バクテリオファージまたはファージミドＤＮＡは、溶原性または溶原バクテリオファージに由来する。いくつかの実施形態において、バクテリオファージまたはファージミドＤＮＡは、偏性溶解性バクテリオファージに由来する。いくつかの実施形態において、バクテリオファージまたはファージミドは、ＰＩファージ、Ｍｌ３ファージ、ａλファージ、Ｔ４ファージ、φＣ２ファージ、φＣＤ２７ファージ、φＮＭＩファージ、Ｂｃ４３１  ｖ３ファージ、φ１０ファージ、φ２５ファージ、φ１５１ファージ、Ａ５１１様ファージ、Ｂ０５４、０１７６様ファージ、またはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒファージ（ＮＣＴＣ１２６７６やＮＣＴＣ１２６７７など）を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、φ１４６Ｃ．ディフィシルバクテリオファージである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、φ２４−２Ｃ．ディフィシルバクテリオファージである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、Ｔ４  Ｅ．ｃｏｌｉバクテリオファージである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、Ｔ７  Ｅ．ｃｏｌｉバクテリオファージである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、Ｔ７ｍ  Ｅ．ｃｏｌｉバクテリオファージである。
【００７９】
いくつかの実施形態では、複数のバクテリオファージが一緒に使用される。いくつかの実施形態では、一緒に使用される複数のバクテリオファージは、サンプルまたは対象内の同じまたは異なる細菌を標的とする。いくつかの実施形態では、一緒に使用されるバクテリオファージは、Ｔ４ファージ、Ｔ７ファージ、Ｔ７ｍファージ、または本明細書に記載のバクテリオファージの任意の組み合わせを含む。
【００８０】
いくつかの実施形態において、目的のバクテリオファージは、環境源または商業的研究ベンダーから得られる。いくつかの実施形態において、得られたバクテリオファージは、細菌のライブラリーおよびそれらの関連株に対する溶解活性についてスクリーニングされる。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、スクリーニングされた細菌において一次耐性を生成するそれらの能力について、細菌のライブラリーおよびそれらの関連株に対してスクリーニングされる。
【００８１】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、標的細菌に、スペーサー配列をコードする核酸またはそこから転写されたｃｒＲＮＡを含むバクテリオファージを導入することを含む、標的細菌を死滅させる方法であり、スペーサー配列は、標的細菌の遺伝子；標的細菌の溶解を誘導することができる遺伝子からの標的ヌクレオチド配列に相補的である。ここで、標的細菌は、バクテリオファージの溶解活性またはスペーサー配列またはそこから転写されたｃｒＲＮＡを使用するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性によって死滅させられる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、以下を含むバクテリオファージである：スペーサー配列またはそこから転写されるｃｒＲＮＡをコードする核酸であって、スペーサー配列は、標的細菌中の標的遺伝子と標的細菌の溶解を誘導することができる遺伝子からの標的ヌクレオチド配列に相補的である。ここで、標的細菌は、バクテリオファージの溶解活性またはスペーサー配列またはそこから転写されたｃｒＲＮＡを使用するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性によって死滅させられる。
【００８２】
挿入部位
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイをコードする核酸のバクテリオファージへの導入は、バクテリオファージの溶解活性を破壊しない。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイをコードする核酸のバクテリオファージへの導入は、バクテリオファージの溶解活性を保存する。いくつかの実施形態では、核酸は、バクテリオファージゲノムである。いくつかの実施形態において、核酸は、目的のオペロンの末端の転写ターミネーター部位でバクテリオファージゲノムに挿入される。いくつかの実施形態において、核酸は、１つ以上の除去された非必須遺伝子の代替物としてバクテリオファージゲノムに挿入される。いくつかの実施形態において、核酸は、１つ以上の除去された溶原性遺伝子の代替物としてバクテリオファージゲノムに挿入される。 いくつかの実施形態において、非必須および／または溶原性遺伝子の核酸による置換は、バクテリオファージの溶解活性に影響を及ぼさない。
いくつかの実施形態において、非必須および／または溶原性遺伝子の核酸による置換は、バクテリオファージの溶解活性を増強する。いくつかの実施形態において、非必須および／または溶原性遺伝子の核酸による置換は、溶原性バクテリオファージを溶解性にする。
【００８３】
いくつかの実施形態において、核酸は、第１の位置でバクテリオファージゲノムに導入され、一方、１つ以上の非必須および／または溶原性遺伝子は、別個の位置でバクテリオファージゲノムから別個に除去および／または不活化される。いくつかの実施形態において、１つ以上の非必須および／または溶原性遺伝子の除去および／または不活性化は、バクテリオファージの溶解活性に影響を及ぼさない。いくつかの実施形態において、１つ以上の非必須および／または溶原性遺伝子の除去および／または不活性化は、バクテリオファージの溶解活性を保存する。いくつかの実施形態において、１つ以上の非必須および／または溶原性遺伝子の除去は、溶原性バクテリオファージを溶原性バクテリオファージにする。同様に、いくつかの実施形態では、１つまたは複数の溶解性遺伝子がバクテリオファージに導入されて、非溶解性の溶原性になる。溶菌性バクテリオファージへのバクテリオファージ。
【００８４】
いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、前述の手段のいずれかによって溶解性にされた溶原バクテリオファージである。いくつかの実施形態では、溶原バクテリオファージは、１つまたは複数の溶原性遺伝子の除去、置換、または不活性化によって溶解性になる。いくつかの実施形態において、バクテリオファージの溶解活性は、少なくとも１つの溶原性遺伝子の除去、置換、または不活性化によるものである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、１つ以上の溶原性遺伝子の除去、置換、または不活性化によって溶解性にされ、そして、少なくとも１つのスペーサーを含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む。標的細菌の標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、１つ以上の溶原性遺伝子に向けられたスペーサーを含むＣＲＩＳＰＲアレイを介した１つ以上の溶原性遺伝子の除去、置換、または不活性化によって溶解性にされ、標的細菌の標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、バクテリオファージにおける溶原性サイクルの維持において役割を果たす。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、バクテリオファージにおける溶原性サイクルを確立することにおいて役割を果たす。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、溶原性サイクルの確立およびバクテリオファージにおける溶原性サイクルの維持の両方において役割を果たす。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、リプレッサー遺伝子である。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、ｃｌリプレッサー遺伝子である。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、活性化因子遺伝子である。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、ｃＩＩ遺伝子である。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、ｌｅｘＡ遺伝子である。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、ｉｎｔ（インテグラーゼ）遺伝子である。いくつかの実施形態では、２つ以上の溶原性遺伝子が除去、置換、または不活性化されて、バクテリオファージ溶原性サイクルの停止および／または溶解サイクルの誘導を引き起こす。いくつかの実施形態において、温和なバクテリオファージは、１つ以上の溶解性遺伝子の挿入によって溶解性にされる。いくつかの実施形態において、温和なバクテリオファージは、溶解サイクルの誘導に寄与する１つ以上の遺伝子の挿入によって溶解性にされる。いくつかの実施形態において、温和なバクテリオファージは、溶解サイクルの誘導に寄与する１つ以上の遺伝子の発現を変化させることによって溶解性にされる。いくつかの実施形態において、温和なバクテリオファージは、表現型的に、溶原性バクテリオファージから溶解性バクテリオファージに変化する。いくつかの実施形態において、温和なバクテリオファージは、環境の変化によって溶解性にされる。いくつかの実施形態では、環境の変化には、温度、ｐＨ、または栄養素の変化、抗生物質、過酸化水素、外来ＤＮＡ、またはＤＮＡ損傷剤への曝露、有機炭素の存在、および重金属の存在（例えば、クロム（ＶＩ）の形で。いくつかの実施形態において、溶解性にされる温和なバクテリオファージは、溶原性状態に戻ることが防止される。いくつかの実施形態において、溶解性にされる温和なバクテリオファージは、追加のＣＲＩＰＳＲアレイを導入することによって、溶原性状態に戻ることが防止される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、バクテリオファージの溶解活性および／またはＣＲＩＳＰＲアレイの活性によって引き起こされる細胞死を超えて、標的細菌にいかなる新しい特性も付与しない。
【００８５】
いくつかの実施形態において、１つ以上の非必須および／または溶原性遺伝子の置換、除去、不活性化、またはそれらの任意の組み合わせは、化学的、生化学的、および／または任意の適切な方法によって達成される。いくつかの実施形態において、１つ以上の溶解性遺伝子の挿入は、相同組換えによる任意の適切な化学的、生化学的、および／または物理的方法によって達成される。
【００８６】
いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、偏性溶解性バクテリオファージである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、φＣＤ１４６  Ｃ．ディフィシルバクテリオファージである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、φＣＤ２４−２  Ｃ．ディフィシルバクテリオファージである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、Ｔ４  Ｅ．ｃｏｌｉバクテリオファージである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、Ｔ７  Ｅ．ｃｏｌｉバクテリオファージである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、Ｔ７ｍ  Ｅ．ｃｏｌｉバクテリオファージである。
【００８７】
非必須遺伝子
いくつかの実施形態では、バクテリオファージから除去および／または置換される非必須遺伝子は、バクテリオファージの生存に非必須である遺伝子である。いくつかの実施形態において、バクテリオファージから除去および／または置換される非必須遺伝子は、溶解サイクルの誘導および／または維持に非必須である遺伝子である。いくつかの実施形態では、バクテリオファージから除去および／または置換される非必須遺伝子は、φＣＤ１４６Ｃ．ディフィシルバクテリオファージからのｇｐ４９である。いくつかの実施形態において、バクテリオファージから除去および／または置換されるべき非必須遺伝子は、φＣＤ２４−２Ｃ．ディフィシルバクテリオファージからのｇｐ７５である。いくつかの実施形態では、バクテリオファージはから除去および／または置換される必須でない遺伝子は、Ｔ４  Ｅ．ｃｏｌｉバクテリオファージのｈｏｃ遺伝子である。いくつかの実施形態において、除去および／または置換されるべき非必須遺伝子には、Ｔ７Ｅ．ｃｏｌｉバクテリオファージからのｇｐ０．７、ｇｐ４．３、ｇｐ４．５、ｇｐ４．７、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、除去および／または置換されるべき非必須遺伝子は、Ｔ７ｍＥ．ｃｏｌｉバクテリオファージからのｇｐ０．６、ｇｐ０．６５、ｇｐＯ．７、ｇｐ４．３、ｇｐ４．５、またはそれらの任意の組み合わせである。
【００８８】
転写活性化因子
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、転写活性化因子をさらに含む。いくつかの実施形態において、コードされる転写活性化因子は、標的細菌内の目的の遺伝子の発現を調節する。いくつかの実施形態において、転写活性化因子は、外因性であろうと内因性であろうと、標的細菌内の目的の遺伝子の発現を活性化する。いくつかの実施形態において、転写活性化因子は、標的細菌内の１つ以上の阻害要素の活性を破壊することによって、標的細菌内の目的の発現遺伝子を活性化する。いくつかの実施形態では、阻害要素は、転写抑制因子である。いくつかの実施形態において、阻害要素は、全体的な転写抑制因子を含む。いくつかの実施形態において、阻害要素は、ヒストン様核様体構造化（Ｈ−ＮＳ）タンパク質またはその相同体または機能的断片である。いくつかの実施形態において、阻害要素は、ロイシン応答性調節タンパク質（ＬＲＰ）である。いくつかの実施形態において、阻害要素は、ＣｏｄＹタンパク質である。
【００８９】
一部の細菌では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの発現が不十分であり、ほとんどの環境条件下でサイレントと見なされる。これらの細菌では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの調節は、転写調節因子、例えば、宿主ゲノムの転写調節に広く関与しているヒストン様核様体構造化（Ｈ−ＮＳ）タンパク質の活性の結果である。Ｈ−ＮＳは、ＡＴに富む部位に沿った多量体化によって宿主の転写調節を制御し、ＤＮＡの屈曲を引き起こする。大腸菌などの一部の細菌では、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３オペロンの調節はＨ−ＮＳによって調節されている。
【００９０】
同様に、一部の細菌では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの抑制は、抑制性要素、例えばロイシン応答性調節タンパク質（ＬＲＰ）によって制御される。ＬＲＰは、転写開始部位の上流および下流領域への結合に関与している。特に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの発現調節におけるＬＲＰの活性は細菌によって異なる。幅広い種間抑制活性を持つＨ−ＮＳとは異なり、ＬＲＰは宿主のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの発現を特異的に調節することが示されている。そのため、場合によっては、ＬＲＰは、さまざまな細菌におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの発現を調節する宿主特異的な手段を反映している。
【００９１】
場合によっては、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの抑制も抑制性要素ＣｏｄＹによって制御される。ＣｏｄＹは、ＤＮＡ結合を介して作用するＧＴＰ感知転写リプレッサーである。ＧＴＰの細胞内濃度は、環境の栄養状態の指標として機能する。通常の培養条件下では、ＧＴＰは豊富で、ＣｏｄＹと結合して転写活性を抑制する。ただし、ＧＴＰ濃度が減少すると、ＣｏｄＹはＤＮＡの結合活性が減少し、以前は抑制されていた遺伝子の転写が起こる。そのため、ＣｏｄＹは厳格なグローバル転写リプレッサーとして機能する。
【００９２】
いくつかの実施形態において、転写活性化因子は、ＬｅｕＯポリペプチド、その任意の相同体または機能的フラグメント、それをコードする核酸配列、またはＬｅｕＯをアップレギュレートする薬剤である。いくつかの実施形態において、転写活性化因子は、ＬｅｕＯの任意のオルソログまたは機能的同等物を含む。一部の細菌では、ＬｅｕＯは、細菌の環境栄養状態に応答するグローバルな転写調節因子として作用することにより、Ｈ−ＮＳに対抗して作用する。通常の状態では、ＬｅｕＯはほとんど発現されていない。しかし、アミノ酸の飢餓および／または細菌のライフサイクルにおける定常期の到達の下で、ＬｅｕＯはアップレギュレートされる。ＬｅｕＯの発現が増加すると、重複するプロモーター領域でＨ−ＮＳに拮抗し、遺伝子発現に影響を及ぼする。ＬｅｕＯの過剰発現は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの発現をアップレギュレートする。大腸菌とＳ．ｔｐｈｙｉｍｕｒｉｕｍでは、ＬｅｕＯはＣａｓＡの上流にあるＬｅｕＯとＨ−ＮＳの結合配列を予測したｃａｓＡＢＣＤＥオペロンの発現増加を促進する。
【００９３】
いくつかの実施形態において、ＬｅｕＯの発現は、阻害要素の破壊をもたらす。いくつかの実施形態において、ＬｅｕＯの発現による阻害要素の破壊は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの転写抑制を取り除く。いくつかの実施形態において、ＬｅｕＯの発現は、Ｈ−ＮＳの活性に起因するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの転写抑制を取り除く。いくつかの実施形態において、ＬｅｕＯの発現は、ＬＲＰの活性に起因するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの転写抑制を取り除く。いくつかの実施形態において、ＬｅｕＯの発現による阻害要素の破壊は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの発現の増加を引き起こす。いくつかの実施形態において、ＬｅｕＯの発現によって引き起こされる阻害要素の破壊によるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの発現の増加は、ＣＲＩＳＰＲアレイをコードする核酸のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプロセシングの増加を引き起こす。いくつかの実施形態において、ＬｅｕＯの発現による阻害要素の破壊によるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの発現の増加は、ＣＲＩＳＰＲアレイをコードする核酸のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプロセシングの増加を引き起こし、細菌に対するＣＲＩＳＰＲアレイの致死性のレベルが上昇する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される転写活性化因子は、本明細書に記載されるバクテリオファージおよび／またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性の増加を引き起こす。
【００９４】
いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｋ１２からのＬｅｕＯまたはその任意の相同体または機能的フラグメントの配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を含むはこれらに限定されない：ＡＰ００９０４０８．１。ＬｅｕＯのタンパク質配列は、以下にＦＡＳＴＡ形式で配列番号１として記載されている。：
【００９５】
【化１】
2021522857.tif 000003
【００９６】
いくつかの実施形態において、転写活性化因子は、ＣＤ２９８３ポリペプチドまたはその任意の相同体または機能的フラグメント、あるいはそれをコードする核酸である。
いくつかの実施形態では、転写活性化因子は、ＣＤ２９８８３の任意のオルソログまたは機能的同等物である。一部の細菌では、ＣＤ２９８３は細菌の環境栄養状態に応答する特定の転写調節因子として機能する。一部の細菌では、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムはｃｃｐＡに依存する方法でグルコースの環境栄養状態によって調節されている。ただし、通常の状態では、ＣＤ２９８３はＣｏｄＹによって抑制される。栄養ストレス下では、ＣｏｄＹはＣＤ２９８３の発現を可能にするために活性が低下する。ＣＤ２９８３のアップレギュレーションは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムのアップレギュレーションに関連している。
【００９７】
いくつかの実施形態において、ＣＤ２９８３の発現は、阻害要素の破壊をもたらす。いくつかの実施形態において、ＣＤ２９８３の発現による阻害要素の破壊は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの転写抑制を取り除く。いくつかの実施形態において、ＣＤ２９８３の発現は、ＣｏｄＹの活性に起因するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの転写抑制を取り除く。いくつかの実施形態において、ＣＤ２９８３の発現による阻害要素の破壊は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの発現の増加を引き起こす。いくつかの実施形態において、ＣＤ２９８３の発現によって引き起こされる阻害要素の破壊によるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの発現の増加は、ＣＲＩＳＰＲアレイをコードする第１の核酸のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプロセシングの増加を引き起こす。いくつかの実施形態において、ＣＤ２９８３の発現による阻害要素の破壊によるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの発現の増加は、細菌に対するＣＲＩＳＰＲアレイの致死性のレベルが増加するように、ＣＲＩＳＰＲアレイをコードする第１の核酸のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプロセシングの増加を引き起こす。
【００９８】
いくつかの実施形態において、Ｃ。ディフィシル株６３０からのＣＤ２９８３またはその任意の相同体または機能的断片の配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ６９８７７．１を含むが、これらに限定されない。
ＣＤ２９８３のタンパク質配列は、以下にＦＡＳＴＡ形式で配列番号２として記載されている。
【００９９】
【化２】
2021522857.tif 000004
【０１００】
いくつかの実施形態において、標的細菌の死滅は、標的細菌の標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列に相補的なバクテリオファージの溶解活性によって達成される。いくつかの実施形態において、標的細菌の死滅は、少なくとも１つのスペーサーを含むＣＲＩＳＰＲアレイをコードする第１の核酸の活性によって達成される。いくつかの実施形態において、細菌の死滅は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベースのエンドヌクレアーゼ活性、および／または細菌の標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列での切断を指示することができる処理されたｃｒＲＮＡを生成する、タイプＩ、タイプＩＩ、またはタイプＩＩＩのＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムによるＣＲＩＳＰＲアレイの処理によって達成される。いくつかの実施形態において、細菌の死滅は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム転写活性化因子をコードする第２の核酸の発現による、ＣＲＩＳＰＲアレイの増強されたプロセシングによって達成される。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、細菌の死滅は、バクテリオファージの溶解活性と標的細菌の標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列に相補的である少なくとも１つのスペーサーを含むＣＲＩＳＰＲアレイをコードする核酸の活性を組み合わせることによって達成される。組み合わせて。いくつかの実施形態において、細菌の死滅は、バクテリオファージの溶解活性によって、および発現された転写活性化因子の活性によるＣＲＩＳＰＲアレイをコードする核酸の増強された活性によって達成される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージの溶解活性の組み合わせによる、およびＣＲＩＳＰＲアレイをコードする核酸の活性による細菌の死滅は、相乗的である。いくつかの実施形態において、バクテリオファージの溶解活性の組み合わせによる、およびＣＲＩＳＰＲアレイをコードする核酸の活性による細菌の死滅は、第２の核酸によってコードされるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ転写活性化因子の発現のために相乗的である。
【０１０２】
増強された溶菌性バクテリオファージ
本明細書に開示されるのは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムのための転写活性化因子をコードする核酸を含むバクテリオファージを産生する方法である。
また、本明細書に開示されるのは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムのための転写活性化因子をコードする核酸を含むバクテリオファージである。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの転写活性化因子をコードする核酸のバクテリオファージへの導入は、標的細菌におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性を調節するために使用される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージによって導入された転写活性化因子は、標的細菌におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの発現を増加させる。いくつかの実施形態において、第１のバクテリオファージによる転写活性化因子の導入による標的細菌におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの発現の増加は、前の実施形態によって記載されるように、ＣＲＩＳＰＲアレイを含む第２の異なるバクテリオファージの致死性を増強する。いくつかの実施形態において、第１のバクテリオファージによる転写活性化因子の導入による標的細菌におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの発現の増加は、前の実施形態によって説明された前処理された未成熟または処理された成熟ｃｒＲＮＡを含む第２の異なるバクテリオファージの致死性を増強する。
【０１０４】
転写活性化因子による調節に加えて、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは他の手段と調節メカニズムによって厳密に制御されている。クオラムセンシング（ＱＳ）は、細菌集団内の細菌間の化学的コミュニケーションであり、集団密度に関する遺伝子発現の調整を可能にする。ＱＳは、細菌の増殖中に生成および蓄積される化学信号に依存している。閾値レベルに達すると、ＱＳシグナルは転写調節因子に結合して細菌の遺伝子発現に影響を与える。一部の細菌では、ＱＳシグナル伝達は、その発現を抑制解除することにより、細菌防御のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを増強する。ＱＳシグナリングに加えて、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム発現の調節は、宿主細菌の膜の完全性の摂動に敏感であると考えられている。ＢａｅＳＲは、宿主の膜エンベロープストレスをＣａｓ遺伝子の活性化にリンクする２成分応答レギュレーターシステムである。同様に、熱ショックタンパク質Ｇ（ＨｔｐＧ）は、ファージ感染による誘導時にＣａｓを安定化することが示されている。さらに、ｃＡＭＰ代謝物感知ｃＡＭＰ受容体タンパク質（ＣＲＰ）などの代謝感知タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ発現を活性化することができる。Ｃａｓの発現を調節する他の代謝感知タンパク質には、窒素飢餓に応答するシグマ因子ＲｐｏＮ（σ５４）が含まれる。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、転写活性化因子は、ＱＳシグナルを含む。いくつかの実施形態において、転写活性化因子は、宿主細菌の膜へのストレスの感知に関与するタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、このタンパク質は、ＢａｅＳＲを含む。いくつかの実施形態において、転写活性化因子は、Ｃａｓを安定化するタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、このタンパク質は、ＨｔｐＧを含む。いくつかの実施形態において、転写活性化因子は、代謝感知タンパク質である。いくつかの実施形態において、代謝感知タンパク質は、ＣＲＰまたはＲｐｏＮ（σ５４）を含む。いくつかの実施形態において、転写活性化因子またはその機能的フラグメントをコードする核酸は、標的細菌に導入される。いくつかの実施形態において、転写活性化因子またはその機能的フラグメントをコードする核酸は、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲアレイを介して標的細菌に導入される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、標的細菌におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムのための転写活性化因子をコードする核酸を含むバクテリオファージを導入することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、標的細菌におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムのための転写活性化因子をコードする核酸を含むバクテリオファージである。
【０１０６】
抗ＣＲＩＳＰＲアレイ
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、抗ＣＲＩＳＰＲをさらに含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、溶解活性、および抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする第１の核酸配列を含むバクテリオファージを標的細菌に導入することを含み、ここで、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、バクテリオファージの溶解活性を増強する。。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、溶解活性、および抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする第１の核酸配列を含むバクテリオファージであり、ここで、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、バクテリオファージの溶解活性を増強する。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする核酸は、バクテリオファージまたは別のバクテリオファージの溶解活性を直接増強する。いくつかの実施形態において、バクテリオファージの溶解活性の増強は、宿主標的細菌におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性を阻害、不活性化、および／または抑制する抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドによるものである。抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、細菌のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの機能を妨げる活性を持つバクテリオファージタンパク質である。抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の活性は、宿主細菌が侵入するバクテリオファージに対するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムベースの防御を開始するのを防ぐ。いくつかの実施形態において、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、遺伝子調節干渉を含むプロセスを使用して、宿主細菌のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを不活性化する。いくつかの実施形態において、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、ヌクレアーゼ動員干渉を含むプロセスを使用して、宿主細菌のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを不活性化する。いくつかの実施形態において、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性を阻害、不活性化、および／または抑制する。
いくつかの実施形態において、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドまたは導入された抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする核酸のタンパク質産物は、カスケードまたはカスケード様複合体に直接的または間接的に結合する。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、切断され、変異され、または目的の別のタンパク質に融合されている。いくつかの実施形態において、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、二量体タンパク質である。いくつかの実施形態において、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、ホモダイマーまたはヘテロダイマータンパク質である。一実施形態では、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、ＡｃｒＩＩＣｌＢｏｅ、ＡｃｒＩＩＣｌＮｍｅ、ＡｃｒＩＩＣ２Ｎｍｅ、ＡｃｒＩＩＣ３Ｎｍｅ、ＡｃｒＩＩＣ４Ｈｐａ、ＡｃｒＩＩＣ５Ｓｍｕ、またはそれらの任意の機能的フラグメントを含む。一実施形態では、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム上の特定の結合部位に特定の親和性で結合する。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、標的細菌におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性を阻害、不活性化、または抑制し、ここで、上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドをコードする核酸を含むバクテリオファージを標的とする。いくつかの実施形態において、抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドは、標的細菌におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性を阻害、不活性化、または抑制する。ここで、上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、第１のバクテリオファージとは異なる第２の直交バクテリオファージを標的とする。いくつかの実施形態では、第２の直交バクテリオファージは、第１のバクテリオファージとは異なる。いくつかの実施形態において、第１のバクテリオファージからの抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドによる標的細菌におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム活性の阻害、不活性化、または抑制は、第１のバクテリオファージまたは第２の直交バクテリオファージの活性を増強する。いくつかの実施形態では、第２の直交バクテリオファージは溶解活性を有する。いくつかの実施形態では、第２の直交バクテリオファージは、本明細書に開示される実施形態のいずれかのバクテリオファージを含む。
【０１１１】
標的細菌を死滅させる方法
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、細菌を死滅させる方法である。いくつかの実施形態において、標的細菌の死滅は、バクテリオファージの溶解活性によって達成される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージの溶解活性は、少なくとも１つの溶原性遺伝子の除去、置換、または不活性化によるものである。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、バクテリオファージにおける溶原性サイクルの維持において役割を果たす。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、バクテリオファージにおける溶原性サイクルを確立することにおいて役割を果たす。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、溶原性サイクルの確立およびバクテリオファージにおける溶原性サイクルの維持の両方において役割を果たす。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、リプレッサー遺伝子である。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、ｃｌリプレッサー遺伝子である。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、活性化因子遺伝子である。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、ｃＩＩ遺伝子である。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、ｌｅｘＡ遺伝子である。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、ｉｎｔ（インテグラーゼ）遺伝子である。いくつかの実施形態において、溶原バクテリオファージは、溶解サイクルの誘導に寄与する１つ以上の遺伝子の挿入によって溶解性にされる。いくつかの実施形態では、温和なバクテリオファージは、溶解サイクルの誘導に寄与する１つまたは複数の遺伝子の発現を変化させることによって溶解性にされる。いくつかの実施形態において、温和なバクテリオファージは、表現型的に、溶原性バクテリオファージから溶解性バクテリオファージに変化する。いくつかの実施形態において、溶原バクテリオファージは、環境の変化によって溶解性にされる。いくつかの実施形態では、環境の変化には、温度、ｐＨ、または栄養素の変化、抗生物質、過酸化水素、外来ＤＮＡ、またはＤＮＡ損傷剤への曝露、有機炭素の存在、および重金属（例えば、クロム（ＶＩ）の存在によるものが含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、溶解性にされる温和なバクテリオファージは、溶原性状態に戻ることが防止される。いくつかの実施形態において、溶解性にされる温和なバクテリオファージは、追加のＣＲＩＰＳＲアレイを導入することによって、溶原性状態に戻ることが防止される。いくつかの実施形態において、標的細菌の死滅は、標的細菌の標的遺伝子における標的ヌクレオチド配列に相補的である少なくとも１つのスペーサーを含むＣＲＩＳＰＲアレイの活性によって達成される。いくつかの実施形態において、標的細菌の死滅は、成熟したｃｒＲＮＡの活性によって達成される。いくつかの実施形態において、細菌の死滅は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベースのエンドヌクレアーゼ活性、および／または細菌の標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列での切断を指示することができる処理されたｃｒＲＮＡを生成する、タイプＩ、タイプＩＩ、またはタイプＩＩＩのＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムによるＣＲＩＳＰＲアレイの処理によって達成される。いくつかの実施形態において、標的細菌の死滅は、バクテリオファージの溶解および／または非溶解活性とは独立したＣＲＩＳＰＲアレイの活性によって達成される。いくつかの実施形態において、標的細菌の死滅は、本明細書に開示される任意の方法または方法の組み合わせによる。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、細菌の死滅は、バクテリオファージの溶解活性によってのみ達成される。いくつかの実施形態において、細菌の死滅は、少なくとも１つのスペーサーを含むＣＲＩＳＰＲアレイをコードする核酸の活性によってのみ達成される。いくつかの実施形態において、細菌の死滅は、成熟したｃｒＲＮＡをコードする核酸の活性によってのみ達成される。いくつかの実施形態において、細菌の死滅は、バクテリオファージの溶解活性と、ＣＲＩＳＰＲアレイまたは成熟ｃｒＲＮＡの活性との組み合わせによって達成される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージの溶解活性の組み合わせによる、およびＣＲＩＳＰＲアレイをコードする第１の核酸の活性による細菌の死滅は、相乗的である。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイまたは成熟ｃｒＲＮＡの死滅活性は、バクテリオファージの溶解活性を補足または増強する。いくつかの実施形態において、標的細菌の死滅は、２つ以上のシステムの相乗効果である。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、細菌の相乗的死滅は、バクテリオファージの濃度および／またはＣＲＩＳＰＲアレイの設計によって調節される。いくつかの実施形態において、細菌の相乗的死滅は、の濃度を増加させることにより、ＣＲＩＳＰＲアレイの活性よりもバクテリオファージの溶解活性による死滅を支持するように調節される。バクテリオファージは細菌に投与される。いくつかの実施形態において、細菌の相乗的死滅は、細菌に投与されるバクテリオファージの濃度を減少させることにより、ＣＲＩＳＰＲアレイの活性よりもバクテリオファージの溶解活性による死滅を嫌うように調節される。いくつかの実施形態では、低濃度で、溶解複製は、標的細菌の増幅および死滅を可能にする。いくつかの実施形態では、高濃度では、ファージの増幅は必要とされない。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、細菌の相乗的死滅は、ＣＲＩＳＰＲアレイの致死性を高めるためのスペーサーのバクテリオファージの数、長さ、組成、同一性、またはそれらの任意の組み合わせを変更することにより、バクテリオファージの溶解活性よりもＣＲＩＳＰＲアレイの活性による死滅を支持するように調節される。いくつかの実施形態において、細菌の相乗的死滅は、バクテリオファージの数、長さ、組成、同一性、またはそれらの任意の組み合わせを変更することにより、ＣＲＩＳＰＲアレイの致死性を低下させるためのスペーサーのバクテリオファージの溶解活性よりもＣＲＩＳＰＲアレイの活性による死滅を嫌うように調節される。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、死滅させられる細菌中の標的ヌクレオチド配列は、目的の任意の必須の標的ヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、必須ではない配列である。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、標的遺伝子のプロモーターまたはその相補体をコードするヌクレオチド配列の全部または一部を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、スペーサーヌクレオチド配列は、標的遺伝子のプロモーターまたはその一部に相補的である。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列は、ＤＮＡのコード鎖または非コード鎖に位置するヌクレオチド配列の全部または一部を含む。いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列は、標的遺伝子の転写領域のコーディング上に位置するヌクレオチド配列の全部または一部を含む。
【０１１７】
必須遺伝子とは、その生存に重要な生物の遺伝子である。しかし、不可欠であるかどうかは、生物が住んでいる状況に大きく依存する。例えば、でんぷんを消化するために必要な遺伝子は、でんぷんが唯一のエネルギー源である場合にのみ不可欠である。いくつかの実施形態では、必須遺伝子には、ａｃｐＰ、ｃｓｒＡ、ｅｎｏ、ｆｕｓＡ、ｇａｐＡ、ｇｆｙＱ、ｉｎｆＡ、ｎｕｓＧ、ｓｅｃＹ、ｔｒｍＤ、Ｔｓｆ、およびｆｔｓＡが含まれるはこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、非必須遺伝子は、生存にとって重要ではない生物の任意の遺伝子である。しかし、本質的でないことは、生物が住んでいる状況に大きく依存している。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、目的の標的遺伝子の非限定的な例は、転写調節因子、翻訳調節因子、ポリメラーゼ遺伝子、代謝酵素、トランスポーター、ＲＮａｓｅ、プロテアーゼ、ＤＮＡ複製酵素、ＤＮＡを修飾または分解する酵素、調節ＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、またはリボソームＲＮＡをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、細胞分裂、細胞構造、代謝、運動性、病原性または毒性に関与する遺伝子である。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、その機能がまだ特徴付けられていない仮想遺伝子を含む。したがって、例えば、標的遺伝子は、任意の細菌からの任意の遺伝子である。
【０１１９】
抗菌剤およびペプチド
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、抗菌ペプチド、抗菌ペプチドの機能的フラグメント、または溶解遺伝子を発現するようにさらに遺伝子改変される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、本明細書に開示される少なくとも１つの抗菌剤またはペプチドを発現する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、核酸配列のタンパク質産物がファージ耐性細菌を標的とする酵素をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、バイオフィルムマトリックスを分解または分解するのを助ける酵素をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、ディスペルシンＤアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファガラクトシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファグルコシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼまたはリアーゼをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、酵素は、セルラーゼＡとも呼ばれるグリコシルヒドロキシラーゼ５ファミリーの酵素などの、セルラーゼのグリコシルヒドロキシラーゼファミリーなどのセルラーゼ、ポリグルコサミン（ＰＧＡ）デポリメラーゼ；および結腸酸デポリメラーゼ、例えば、１，４−Ｌ−フコダイス加水分解酵素コラン酸を分解する１，４−ベータ−フコシド加水分解酵素、解重合アルギナーゼ、ＤＮａｓｅＩ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、本明細書に開示される酵素を分泌する。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、抗菌剤またはペプチドは、本明細書に開示されるバクテリオファージによって発現および／または分泌される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、アンピシリン、ペニシリン、ペニシリン誘導体、セファロスポリン、モノバクタム、カルバペネム、オフロキサシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、ガチフロキサシン、ノルフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、ロメフロキサシン、トロバフロキサシン、スパフロキサシン、ゲミフロキサシン、パズフロキサシンなどの抗生物質を分泌および発現する。本明細書に開示されている抗生物質。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、抗菌ペプチドをコードする核酸配列を含み、抗菌ペプチドを発現するか、または標的細菌の死滅を助けるまたは増強するペプチドを分泌する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、ペプチドをコードする核酸配列、抗菌ペプチドをコードする核酸配列を含み、抗菌ペプチドを発現するか、またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性を補助または増強するペプチドを分泌する。
【０１２１】
用途
細菌感染症
本明細書に開示されるのは、細菌感染症を治療する方法である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、ヒトまたは動物の対象において本明細書に開示されるように、細菌によって媒介または引き起こされる疾患または状態を治療または予防する。そのような細菌は、通常、腸、口腔、肺、脇の下、眼、膣、肛門、耳、鼻、または喉の組織を含む対象の組織と接触している。いくつかの実施形態において、細菌感染は、細菌の活性を調節することによって、および／または細菌を直接死滅させることによって治療される。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、細菌集団に存在する１つまたは複数の標的細菌は病原性である。いくつかの実施形態において、病原性細菌は尿路病原性である。いくつかの実施形態では、病原性細菌は尿路病原性大腸菌（ＵＰＥＣ）である。いくつかの実施形態において、病原性細菌は下痢原性である。いくつかの実施形態において、病原性細菌は糖尿病誘発性大腸菌（ＤＥＣ）である。いくつかの実施形態において、病原性細菌は志賀毒素産生性である。いくつかの実施形態において、病原性細菌は志賀毒素産生大腸菌（ＳＴＥＣ）である。いくつかの実施形態において、病原性細菌は志賀毒素産生性である。いくつかの実施形態において、病原性細菌は志賀毒素産生大腸菌（ＳＴＥＣ）である。いくつかの実施形態において、病原性細菌は志賀毒素産生大腸菌（ＳＴＥＣ）である。いくつかの実施形態において、病原性細菌は様々な０抗原：Ｈ抗原血清型大腸菌である。いくつかの実施形態において、病原性細菌は腸内病原性である。いくつかの実施形態において、病原性細菌は、腸内病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）である。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、病原性細菌は、ＣＤ０４３、ＣＤ０５、ＣＤ０７３、ＣＤ０９３、ＣＤ１８０、ＣＤ１０６、ＣＤ１２８、ＣＤ１９９、ＣＤ１１１、ＣＤ１０８、ＣＤ２５、ＣＤ１４８、ＣＤ１５４、ＦＯＢＴ１９５、ＣＤ０３、ＣＤ０３８、ＣＤ１１２、ＣＤ１９６、ＣＤ１０５、ＵＫ１、ＵＫ６、ＢＩ−９、ＣＤ０４１、ＣＤ０４２、ＣＤ０４６、ＣＤ１９、またはＲ２０２９ｌを含むＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの様々な株である。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオファージは、対象の胃腸管における感染症、疾患、または状態を治療するために使用される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、対象のマイクロバイオームまたは腸内細菌叢内の標的細菌を調節および／または死滅させるために使用される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、対象のマイクロバイオームまたは腸内細菌叢内の複数の細菌から１つ以上の標的細菌を選択的に調節および／または死滅させるために使用される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、対象のマイクロバイオームまたは腸内細菌叢内の複数の細菌から１つ以上の標的腸内病原性細菌を選択的に調節および／または死滅させるために使用される。いくつかの実施形態において、標的腸内病原性細菌は、腸内病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、対象のマイクロバイオームまたは腸内細菌叢内の複数の細菌から１つまたは複数の標的下痢原性細菌を選択的に調節および／または死滅させるために使用される。いくつかの実施形態において、標的下痢原性細菌は、下痢原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＥＣ）である。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、対象のマイクロバイオームまたは腸内細菌叢内の複数の細菌から１つまたは複数の標的ベロ毒素産生細菌を選択的に調節および／または死滅させるために使用される。いくつかの実施形態において、標的の志賀毒素産生細菌は、志賀毒素産生大腸菌（ＳＴＥＣ）である。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、ＣＤ０４３、ＣＤ０５、ＣＤ０７３、ＣＤ０９３、ＣＤ１８０、ＣＤ１０６、ＣＤ１２８、ＣＤ１９９、ＣＤ１１１、ＣＤ１０８、ＣＤ２５、ＣＤ１４８、ＣＤ１５４、ＦＯＢＴ１９５、ＣＤ０３、ＣＤ０３８、ＣＤ１１２、ＣＤ１９６、ＣＤ１０５、ＵＫ１、ＵＫ６、ＢＩ−９、ＣＤ０４１、ＣＤ０４２、ＣＤ０４６、ＣＤ１９、又はＲ２０２９ｌを含む対象のマイクロバイオームまたは腸内細菌叢内の１つ以上の標的腸内病原性Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌株を選択的に調節および／または死滅させるために使用される。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオファージは、対象の尿路における感染症、疾患、または状態を治療するために使用される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、対象の尿路細菌叢内の標的細菌を調節および／または死滅させるために使用される。尿路細菌叢には、表皮ブドウ球菌、エンテロコッカスフェカーリス、および一部のアルファ溶血性連鎖球菌が含まれるはこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、対象の尿路細菌叢内の複数の細菌から１つ以上の標的尿路病原性細菌を選択的に調節および／または死滅させるために使用される。いくつかの実施形態において、標的細菌は、尿路病原性大腸菌（ＵＰＥＣ）である。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、対象の皮膚上の感染症、疾患、または状態を治療するために使用される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、対象の皮膚上の標的細菌を調節および／または死滅させるために使用される。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオファージは、対象の粘膜上の感染症、疾患、または状態を治療するために使用される。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、対象の粘膜上の標的細菌を調節および／または死滅させるために使用される。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、病原性細菌は抗生物質耐性である。一実施形態では、病原性細菌は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）である。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、細菌集団に存在する１つ以上の標的細菌は、バイオフィルムを形成する。いくつかの実施形態では、バイオフィルムは病原性細菌を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオファージは、バイオフィルムを処理するために使用される。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、標的細菌の非限定的な例には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種  、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種、Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ａｃｉｎｅｔｏｉｂａｃｔｅｒ種、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、またはｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａが挙げられる。いくつかの実施形態において、細菌の非限定的な例には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、ｏｒ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａが挙げられる。いくつかの実施形態において、細菌の非限定的な例には、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、カルバペネム耐性Ｅｎｔｅｒｏａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｔｒａｔｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｏｕｐ  Ｇ１、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｏｕｐ  Ｇ２、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ種、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ種、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ種、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｌｉｓ、またはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎが挙げられる。細菌のさらなる非限定的な例には、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ種を含むがこれに限定されない電気燃料細菌株、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種、もしくはＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、または植物や哺乳動物に病原性のある細菌が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、細菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである。いくつかの実施形態において、細菌はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、ニキビおよび他の関連する皮膚感染症を治療する。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、標的細菌は、多剤耐性（ＭＤＲ）細菌株である。ＭＤＲ株は、少なくとも１つの抗生物質に耐性のある細菌株である。いくつかの実施形態において、細菌株は、セファロスポリン、フルオロキノロン、カルバペネム、コリスチン、アミノグリコシド、バンコマイシン、ストレプトマイシン、およびメチシリンなどの抗生物質クラスに耐性がある。いくつかの実施形態において、細菌株は、セフトビプロール、セフタロリン、クリンダマイシン、ダルババンシン、ダプトマイシン、リネゾリド、ムピロシン、オリタバンシン、テジゾリド、テラバンシン、チゲシークライン、バンコマイシン、アミノグリコシド、カルバペネム、セフタジジム、セフェピム、セフトビプロール、フルオロキノロン、ピペラシリン、チカルシリン、リネゾリド、ストレプトグラミン、チゲサイクリン、ダプトマイシン、などの抗生物質またはそれらの任意の組み合わせに耐性がある。ＭＤＲ株の例には、バンコマイシン耐性腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）（ＶＲＥ）、メチシリン耐性スタフィロコッカスアウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）、拡張スペクトルβ−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）産生グラム陰性菌、クレブシエラ  ニューモニエ  カルバペネマーゼ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｃａｒｂａｐｅｎｅｍａｓｅ）（ＫＰＣ）が含まれる。およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ種Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどの多剤耐性グラム陰性桿菌（ＭＤＲ  ＧＮＲ）ＭＤＲＧＮ細菌が挙げられる。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、標的細菌はクレブシエラニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である。いくつかの実施形態では、標的細菌は黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）である。いくつかの実施形態では、標的細菌は腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ．）である。いくつかの実施形態では、標的細菌はアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）である。いくつかの実施形態では、標的細菌はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ．）である。いくつかの実施形態では、標的細菌はエンテロバクターである。いくつかの実施形態では、標的細菌はクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）である。いくつかの実施形態において、標的細菌は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。いくつかの実施形態において、標的細菌は、クロストリジウム・ボルテエ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｌｔｅａｅ）である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、獣医および医療用途、ならびに研究用途で使用するためのものである。
【０１３５】
「マイクロバイオーム」、「マイクロバイオータ」、および「微生物生息地」は、以下で交換可能に使用され、対象の体表面、空洞、および体液上またはその中に生息する微生物の生態学的群集を指す。ミクロビオームの生息地の非限定的な例には、腸、結腸、皮膚、皮膚表面、皮膚孔、膣腔、臍帯領域、結膜領域、腸領域、胃、鼻腔および通路、胃腸管、泌尿生殖器管、唾液、粘液、および糞便が含まれる。いくつかの実施形態では、マイクロバイオームは、細菌、古細菌、原生生物、真菌、およびウイルスを含むがこれらに限定されない微生物材料を含む。いくつかの実施形態では、微生物材料は、グラム陰性菌を含む。いくつかの実施形態では、微生物材料は、グラム陽性菌を含む。いくつかの実施形態では、微生物材料は、プロテオバクテリア、放線菌、バクテロイデス門、またはフィルミクテス門を含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオファージは、対象のマイクロバイオーム内の標的細菌を調節または死滅させるために使用される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、溶解活性、またはそれらの組み合わせによって、マイクロバイオーム内の標的細菌を調節および／または死滅させるために使用される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、対象のマイクロバイオーム内の標的細菌を調節および／または死滅させるために使用される。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、対象のマイクロバイオーム内の複数の細菌から１つまたは複数の標的細菌を選択的に調節および／または死滅させるために使用される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、対象のマイクロバイオーム内の複数の細菌から１つ以上の標的腸内病原性細菌を選択的に調節および／または死滅させるために使用される。いくつかの実施形態において、標的腸内病原性細菌は、腸内病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）である。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、対象のマイクロバイオーム内の複数の細菌から１つまたは複数の標的下痢菌を選択的に調節および／または死滅させるために使用される。いくつかの実施形態において、標的下痢原性細菌は、下痢原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＥＣ）である。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、対象のマイクロバイオーム内の複数の細菌から１つまたは複数の標的ベロ毒素産生細菌を選択的に調節および／または死滅させるために使用される。いくつかの実施形態において、標的の志賀毒素産生細菌は、志賀毒素産生大腸菌（ＳＴＥＣ）である。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、ＣＤ０４３、ＣＤ０５、ＣＤ０７３、ＣＤ０９３、ＣＤ１８０、ＣＤ１０６、ＣＤ１２８、ＣＤ１９９、ＣＤ１１１、ＣＤ１０８、ＣＤ２５、ＣＤ１４８、ＣＤ１５４、ＦＯＢＴ１９５、ＣＤ０３、ＣＤ０３８、ＣＤ１１２、ＣＤ１９６、ＣＤ１０５、ＵＫ１、ＵＫ６、ＢＩ−９、ＣＤ０４１、ＣＤ０４２、ＣＤ０４６、ＣＤ１９、またはＲ２０２９ｌを含む対象のマイクロバイオーム内の１つ以上の標的腸内病原性Ｃ．ディフィシル細菌株を選択的に調節および／または死滅させるために使用される。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、対象の胃腸管のマイクロバイオームまたは腸内細菌叢内の標的の単一または複数の細菌を調節または死滅させるために使用される。ミクロビオームまたは腸内細菌叢の改変（例えば、腸内毒素症）は、糖尿病、精神障害、潰瘍性大腸炎、結腸直腸癌、自己免疫障害、肥満、糖尿病、中枢神経系の疾患および炎症性腸疾患などの健康状態のリスクを高める。胃腸管の疾患および状態に関連し、ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、ｂｌａｕｔｉａ、ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、ｄｏｒｅａ、ｂｌａｕｔｉａ、ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｕｃｃｕｓ、ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｏｒｉｂｉｌｌｕｍ、ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ、ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃａｃｃａｅ、ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ、ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｕｍ、ｂｌａｕｔｉａ  ｈａｎｓｅｎｉｉ、ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｎａｖｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｅｘｉｌｅ、ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉエール、ローズブリア腸内細菌、コプロコッカスが来る、放線菌、ラクトコッカス、ローズブリア、連鎖球菌、ブラウティア、ダイアリスター、デスルホビブリオ、エシェリキア、ラクトバチルス、コプロコッカス、クロストリジウム、ビフィズス菌、コプロボバクテリウム、クレブシエラ、グラニュリカテラ、ユーバクテリウム、アナエ、ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、、ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ、ａｌｉｓｔｉｐｅｓ、ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ、ａｒｅｖｏｔｅｌｌａ、ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ、ｂｉｌｏｐｈｉｌａ、ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、ｈｏｌｄｅｍａｎｉａ、ｇｅｍｅｌｌａ、ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ、ｒｏｔｈｉａ、ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ、ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ、ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、およびｐｒｏｔｅｕｓなどのバクテリオファージによって調節または死滅させられる細菌の例示的なリストには、エンテロバクテリア科、パスツレラ科、フソバクテリア科、ナイセリア科、ビフィズス菌、ゲメラ科、バクテリオダレス、クロトリオダレスの菌株、亜菌株、およびエンテロタイプが含まれる。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオファージは、健康なマイクロバイオームを促進するために対象に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、対象のマイクロバイオームの健康を促進するマイクロバイオーム組成物に回復するために対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオファージを含む組成物は、プレバイオティクスまたは第３の薬剤を含む。いくつかの実施形態において、マイクロバイオーム関連の疾患または障害は、本明細書に開示されるバクテリオファージによって治療される。
【０１４０】
環境療法
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオファージは、食品および農業の衛生（肉、果物および野菜の衛生を含む）、病院の衛生、家庭の衛生、車両および設備の衛生、産業衛生などにさらに使用される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、抗生物質耐性または他の望ましくない病原体を、医学、獣医、畜産、または任意の追加の環境から除去するために使用される。
【０１４１】
医療機関でのファージの環境への応用は、内視鏡などの機器や、消毒が困難または不可能な病原体による院内感染の潜在的な原因であるＩＣＵなどの環境向けである。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるファージは、一般的に使用される消毒剤に対して耐性となるシュードモナスなどの細菌属が生息する機器または環境を治療するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるファージ組成物は、無生物を消毒するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される環境は、ファージ力価を有する水溶液で噴霧、塗装、または注がれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の溶液は、１０１−１０２０プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌの間を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、バクテリオファージの環境への分布を容易にするために、乾燥分散剤を含むエアロゾル化剤によって適用される。いくつかの実施形態では、物体は、本明細書に開示されるバクテリオファージを含む溶液に浸漬される。。
【０１４２】
衛生
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、様々な分野において、消毒剤、洗剤、界面活性剤、水などの薬剤、衛生剤として使用される。「ファージ」または「バクテリオファージ」という用語を使用することができるは適切な場合、この用語は、単一のバクテリオファージ、バクテリオファージ混合物などの複数のバクテリオファージ、およびバクテリオファージとバクテリオファージとの混合物を含むと広く解釈されるべきであることに留意されたい。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、手術室、病室、待合室、実験室、または他の雑多な病院設備を含む病院施設を消毒するために使用される。いくつかの実施形態では、この機器は、心電計、呼吸器、心臓血管補助装置、大動脈内バルーンポンプ、注入装置、他の患者ケア装置、テレビ、モニター、リモコン、電話、ベッドなどを含む。状況によっては、バクテリオファージはエアロゾルキャニスターを介して適用される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、トランスファービヒクルで物体上のファージを拭くことによって適用される。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のバクテリオファージは、患者ケアデバイスと組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、従来の人工呼吸器または呼吸療法装置と組み合わせて使用されて、患者間の内面および外面を洗浄する。人工呼吸器の例には、手術中の換気をサポートするデバイス、無能力の患者の換気をサポートするデバイス、および同様の機器が含まれる。いくつかの実施形態では、従来の治療法には、自動または電動装置、または救急治療室や救急車で一般的に見られるような手動のバッグタイプの装置が含まれる。いくつかの実施形態では、呼吸療法は、慢性閉塞性肺疾患または喘息で一般的に使用される気管支拡張薬などの薬物を導入するための吸入器、または持続的気道陽圧装置などの気道開存性を維持するための装置を含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のバクテリオファージは、髄膜炎または腸管感染症などの伝染性の高い細菌性疾患が存在する領域において、表面を洗浄し、コロニー形成した人々を治療するために使用される。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、給水は、本明細書に開示される組成物で処理される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオファージは、汚染された水、貯水槽、井戸、貯水池、貯蔵タンク、水道、導管、および同様の配水装置に見られる水を処理するために使用される。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、水、油、冷却液、および他の液体が収集プールに蓄積する工業用貯蔵タンクに適用される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオファージは、細菌の増殖を低減するために、定期的に工業用貯蔵タンクに導入される。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオファージは、家、アパート、マンション、寮、または任意の居間などの居間を消毒するために使用される。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、劇場、コンサートホール、美術館、駅、空港、ペット用ベッドなどのペットエリア、またはトイレなどの公共エリアを消毒するために使用される。この能力において、バクテリオファージは、ポンプ噴霧器、エアゾール容器、噴出ボトル、事前に湿らせたタオルなどを含む従来の装置から分配され、消毒される領域に直接適用される（例えば、噴霧される）か、またはタオル、スポンジなどの輸送体を介して。その領域に移される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるファージは、台所、寝室、浴室、ガレージ、地下室などを含む、家の様々な部屋に適用される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるファージは、従来のクリーナーと同じ方法である。いくつかの実施形態において、ファージは、従来のクリーナーが適切なバクテリオファージの生物学的活性を維持するように処方されるという条件で、従来のクリーナーと組み合わせて（前、後、または同時に）適用される。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオファージは、紙製品の処理中または処理の完了後のいずれかで、紙製品の成分に添加される。本明細書に開示されるバクテリオファージが添加される紙製品には、ペーパータオル、トイレットペーパー、ウェットティッシュが含まれるはこれらに限定されない。
【０１４９】
食品安全
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のバクテリオファージは、汚染を防止するために、任意の食品または栄養補助食品に使用される。食品または医薬品の例としては、牛乳、ヨーグルト、カード、チーズ、発酵乳、牛乳ベースの発酵製品、アイスクリーム、発酵穀物ベースの製品、牛乳ベースの粉末、乳児用調合乳または錠剤、液体懸濁液、乾燥経口サプリメント、湿式経口サプリメント、またはドライチューブ給餌がある。
【０１５０】
バクテリオファージの衛生に関する幅広い概念は、他の農業用途や生物にも適用できる。果物や野菜、乳製品、その他の農産物を含む農産物。例えば、切りたての農産物は、病原菌で汚染された加工工場に頻繁に到着する。これは、発生する可能性のある食品媒介性疾患の発生につながった。いくつかの実施形態において、バクテリオファージ調製物の農産物への適用は、食品媒介性疾患に関連する細菌の種に対して特異性を有する単一のファージまたはファージ混合物の適用を通じて、食品媒介性疾患の可能性を実質的に低減または排除する。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、その時点での細菌汚染を低減するために、またはその後の時点での汚染から保護するために、生産および処理の様々な段階で適用される。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、特定のバクテリオファージは、レストラン、食料品店、農産物流通センターでの農産物に適用される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオファージは、サラダバーの果物および野菜の内容物に定期的または継続的に適用される。いくつかの実施形態において、サラダバーへの、または食品の外部を消毒するためのバクテリオファージの適用は、噴霧または噴霧プロセスまたは洗浄プロセスである。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のバクテリオファージは、肉、農産物、果物や野菜のカット、および他の食品を含むパッケージを含むマトリックスまたは支持媒体で使用される。いくつかの実施形態において、包装に適したポリマーは、バクテリオファージ調製物で含浸される。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のバクテリオファージは、農家および家畜飼料において使用される。いくつかの実施形態では、家畜を飼育している農場では、家畜は、飲料水、食物、またはその両方にバクテリオファージを備えている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のバクテリオファージは、死骸に噴霧され、と畜場を消毒するために使用される。
【０１５４】
農産物の生物的防除剤として特定のバクテリオファージを使用すると、多くの利点が得られる。例えば、バクテリオファージは、一般的な化学消毒剤のように天然の微生物叢の生態学的バランスを乱すことはないは対象となる食品由来の病原菌を特異的に溶解する、天然の無毒な製品である。バクテリオファージは、化学消毒剤とは異なり、宿主細菌とともに進化する天然物であるため、最近出現した耐性菌に対して活性のある新しいファージが必要に応じて迅速に特定されるは新しい効果的な消毒剤の特定ははるかに長いプロセスであり、数年である。
【０１５５】
医薬組成物
いくつかの実施形態において、本開示は、細菌、古細菌感染症を治療するために、または領域を消毒するために、医薬組成物およびそれを投与する方法を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、医薬的に許容される担体中に上記で論じた試薬のいずれかを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物または方法は、肺感染症（ＣＦＰ、ＮＣＦＢ、ＨＡＰ／ＶＡＰ）全身感染症（細菌血症、ＳＳＳＩ）ＧＩマイクロバイオーム腸内毒素症（ＣＤＩ）および／または尿路感染症（ｃＵＴＩ）を治療する。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、医薬品、医薬品、担体、アジュバント、分散剤、希釈剤などを含む。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、適切な方法に従った医薬担体での投与。いくつかの実施形態では、本開示による医薬組成物の製造において、バクテリオファージは、とりわけ、許容可能な担体と混合される。いくつかの実施形態では、担体は、固体（粉末を含む）または液体、あるいはその両方であり、好ましくは、単位用量組成物として処方される。いくつかの実施形態において、１つ以上のバクテリオファージは、薬局の任意の適切な方法によって調製される、本明細書に開示される組成物。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、対象のインビボで治療する方法であって、本明細書に開示されているバクテリオファージを含む医薬組成物を対象に投与することを含む方法。医薬組成物が治療有効量で投与される、医薬的に許容される担体。いくつかの実施形態において、バクテリオファージのヒト対象またはそれを必要とする動物への投与は、当技術分野で知られている任意の手段による。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、経口投与用である。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、カプセル、錠剤、および粉末などの固体剤形、またはエリキシル、シロップ、および懸濁液などの液体剤形で投与される。いくつかの実施形態において、頬側（舌下）投与に適した組成物および方法は、フレーバーベース、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカント中にバクテリオファージを含むロゼンジを含む。ゼラチンとグリセリンまたはスクロースとアカシアなどの不活性塩基中にバクテリオファージを含むトローチを含む。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、本開示の方法および組成物は、バクテリオファージの無菌の水性および非水性注射溶液を含む非経口投与に適している。いくつかの実施形態では、これらの調製物は、意図されたレシピエントの血液と等張である。いくつかの実施形態において、これらの調製物は、組成物を意図されたレシピエントの血液と等張にする抗酸化剤、緩衝液、細菌および溶質を含む。いくつかの実施形態において、水性および非水性の滅菌懸濁液は、懸濁剤および増粘剤を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組成物は、単位用量または複数用量の容器、例えば密封されたアンプルおよびバイアルに提示され、例えば、使用直前に注射用の生理食塩水または水、滅菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥（フリーズドライ）状態で保存される。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、直腸投与に適した方法および組成物は、単位用量坐剤として提示される。いくつかの実施形態において、これらは、バクテリオファージを１つ以上の従来の固体担体、例えば、カカオバターと混合し、次いで、得られた混合物を成形することによって調製される。いくつかの実施形態では、皮膚への局所適用に適した方法および組成物は、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、または油の形態である。いくつかの実施形態では、使用される担体には、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、経皮増強剤、およびそれらの２つ以上の組み合わせが含まれる。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、経皮投与に適した方法および組成物は、レシピエントの表皮と長期間密接に接触したままであるように適合された別個のパッチとして提示される。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、対象の鼻投与に適した、または他の方法で肺に投与される方法および組成物は、例えば、対象が吸入するバクテリオファージ組成物を含む呼吸可能な粒子のエアロゾル懸濁液によって投与される任意の適切な手段を含む。いくつかの実施形態では、呼吸可能な粒子は液体または固体である。本明細書で使用される場合、「エアロゾル」は、細気管支または鼻腔に吸入することができる任意のガス媒介懸濁相を含む。いくつかの実施形態では、液体粒子のエアロゾルは、圧力駆動エアロゾルネブライザーまたは超音波ネブライザーなどの任意の適切な手段によって生成される。いくつかの実施形態では、組成物を含む固体粒子のエアロゾルは、製薬分野で知られている技術によって、任意の固体粒子状薬剤エアロゾル発生器で生成される。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオファージを対象物または対象物の表面に投与するのに適した方法および組成物は、水溶液を含む。いくつかの実施形態では、そのような水溶液は、物体または対象の表面に噴霧される。いくつかの実施形態では、水溶液は、細菌を含む異物の破片から対象の物理的創傷を洗浄および洗浄するために使用される。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、治療有効量で対象に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される少なくとも１つのバクテリオファージ組成物は、医薬製剤として製剤化される。いくつかの実施形態において、医薬製剤は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のバクテリオファージを含む。本明細書に開示される。場合によっては、医薬製剤は、本明細書に記載のバクテリオファージと、賦形剤、希釈剤、または担体のうちの少なくとも１つを含む。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、医薬製剤は、賦形剤を含む。賦形剤は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（１９８６）のＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓに記載されており、溶媒、分散媒体、希釈剤、またはその他の液体ビヒクル、分散または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、防腐剤、固体バインダー、および潤滑剤が含まれるはこれらに限定されない。
【０１６７】
適切な賦形剤の非限定的な例には、緩衝剤、防腐剤、安定剤、結合剤、圧縮剤、潤滑剤、キレート剤、分散促進剤、崩壊剤、香味剤、甘味料、着色剤が含まれるはこれらに限定されない。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、賦形剤は緩衝剤である。適切な緩衝剤の非限定的な例には、クエン酸ナトリウム、炭酸マグネシウム、重炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、および重炭酸カルシウムが含まれるはこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、医薬製剤は、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、水酸化マグネシウム、乳酸塩マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、水酸化アルミニウム、クエン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、ナトリウムポリリン酸塩、ポリリン酸カリウム、ピロリン酸ナトリウム、ピロリン酸カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸三カリウム、メタリン酸カリウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、酢酸カルシウム、グリセロリン酸カルシウム、塩化カルシウム、カルシウム水酸化カルシウムおよび他のカルシウム塩の任意の１つ以上の緩衝剤を含む。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、賦形剤は防腐剤である。適切な防腐剤の非限定的な例には、α−トコフェロールおよびアスコルビン酸塩などの抗酸化剤、ならびにパラベン、クロロブタノール、およびフェノールなどの抗菌剤が含まれるはこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、抗酸化剤には、ＥＤＴＡ、クエン酸、アスコルビン酸、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、亜硫酸ナトリウム、ｐ−アミノ安息香酸、グルタチオン、没食子酸プロピル、システイン、メチオニン、エタノールが含まれるはこれらに限定されない。およびＮ−アセチルシステイン。いくつかの実施形態において、保存剤は、バリダマイシンＡ、ＴＬ−３、オルトバナジン酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、Ｎ−α−トシル−フェ−クロロメチルケトン、Ｎ−ａ−トシル−Ｌｙｓ−クロロメチルケトン、アプロチニン、フェニルメチルスルホニルフルオリド、ジイソプロピルフルオロホスフェート、プロテアーゼ阻害剤、還元剤、アルキル化剤、抗菌剤、オキシダーゼ阻害剤、または他の阻害剤。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、医薬製剤は、賦形剤として結合剤を含む。適切な結合剤の非限定的な例には、デンプン、アルファ化デンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルオキソアゾリド、ポリビニルアルコール、Ｃｌ２−Ｃｌ８脂肪酸アルコール、ポリエチレングリコール、ポリオール、糖類、オリゴ糖、およびそれらの組み合わせ。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、医薬製剤で使用される結合剤は、馬鈴薯澱粉、コーンスターチ、小麦澱粉などの澱粉から選択される。ショ糖、ブドウ糖、ブドウ糖、乳糖、マルトデキストリンなどの糖；天然および合成ガム；ゼラチン；微結晶性セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロースなどのセルロース誘導体。ポリビニルピロリドン（ポビドン）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ワックス；炭酸カルシウム；リン酸カルシウム；ソルビトール、キシリトール、マンニトール、水などのアルコール、またはそれらの組み合わせ。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、医薬製剤は、賦形剤として潤滑剤を含む。適切な潤滑剤の非限定的な例には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、水素化植物油、ステロテックス、ポリオキシエチレンモノステアレート、タルク、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、および軽質鉱油が含まれる。いくつかの実施形態において、医薬製剤中にある潤滑剤は、金属ステアリン酸塩（ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウムなど）、脂肪酸エステル（ステアリルフマル酸ナトリウムなど）、脂肪酸（ステアリン酸など）、脂肪から選択される。アルコール、ベヘン酸グリセリル、ミネラルオイル、パラフィン、水素化植物油、ロイシン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属ラウリル硫酸塩（ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムなど）、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、タルクまたはそれらの組み合わせ。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、賦形剤は香味料を含む。いくつかの実施形態では、香味料は天然油を含む。植物、葉、花、果物、およびそれらの組み合わせからの抽出物。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、賦形剤は甘味料を含む。適切な甘味料の非限定的な例には、グルコース（コーンシロップ）、デキストロース、転化糖、フルクトース、およびそれらの混合物（担体として使用されない場合）が含まれる。サッカリンおよびナトリウム塩などのその様々な塩；アスパルテームなどのジペプチド甘味料；ジヒドロカルコン化合物、グリチルリチン；ステビアレバウディアナ（ステビオシド）；スクラロースなどのスクロースのクロロ誘導体；およびソルビトール、マンニトール、シリトールなどの糖アルコール。
【０１７５】
場合によっては、医薬製剤は着色剤を含む。適切な着色剤の非限定的な例には、食品、薬物および化粧品の色（ＦＤ＆Ｃ）、薬物および化粧品の色（Ｄ＆Ｃ）、および外部の薬物および化粧品の色（Ｅｘｔ．Ｄ＆Ｃ）。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される医薬製剤は、キレート剤を含む。いくつかの実施形態では、キレート剤は、エチレンジアミン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−四酢酸（ＥＤＴＡ）、二ナトリウム、三ナトリウム、四ナトリウム、二カリウム、三カリウム、二リチウムおよびＥＤＴＡのジアンモニウム塩；ＥＤＴＡのバリウム、カルシウム、コバルト、銅、ジスプロシウム、ユーロピウム、鉄、インジウム、ランタン、マグネシウム、マンガン、ニッケル、サマリウム、ストロンチウム、または亜鉛キレートを含む
【０１７７】
場合によっては、医薬製剤は希釈剤を含む。希釈剤の非限定的な例には、水、グリセロール、メタノール、エタノール、および他の同様の生体適合性希釈剤が含まれる。いくつかの実施形態において、希釈剤は、酢酸、クエン酸、マレイン酸、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸などの水性酸である。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、医薬製剤は、界面活性剤を含む。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート）、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリルフマル酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリオキシエチレンヒマシ油、誘導体、ドキュセートナトリウム、第四アンモニウム化合物、Ｌ−ロイシンなどのアミノ酸、脂肪酸の糖エステル、脂肪酸のグリセリド、またはそれらの組み合わせから選択されるが、これらに限定されない。
【０１７９】
場合によっては、医薬製剤は、追加の医薬剤を含む。いくつかの実施形態では、追加の医薬品は抗生物質である。いくつかの実施形態において、抗生物質は、アミノグリコシド、アンサマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、セファロスポリン（第１、第２、第３、第４および第５世代セファロスポリンを含む）、リンコサミド、マクロライド、モノバクタム、ニトロフラン、キノロン、ペニシリン、スルホンアミドからなる群である。、ポリペプチドまたはテトラサイクリン。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗生物質は、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシンまたはパロモマイシンなどのアミノグリコシドである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗生物質は、ゲルダナマイシンまたはハービマイシンなどのアンサマイシンである。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗生物質は、ロラカルベフなどのカルバセフェムである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗生物質は、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチンまたはメロペネムなどのカルバペネムである。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗生物質は、セファドロキシル、セファゾリン、セファレキシン、セファロチンまたはセファロチンなどのセファロスポリン（第１世代）、あるいはセファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジルまたはセフロキシムなどのセファロスポリン（第２世代）である。いくつかの実施形態において、抗生物質は、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフチブテンなどのセファロスポリン（第３世代）、セフトリアキソンとセフトリアキソン、またはセフェピムなどのセファロスポリン（第４世代）またはセフトビプロールである。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗生物質は、クリンダマイシンおよびアジスロマイシンなどのリンコサミド、またはアジスロマイシン、クラリスロマイシンなどのマクロライド、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、テリスロマイシン、スペクチノマイシンである。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗生物質は、アズトレオナムなどのモノバクタム、またはフラゾリドンまたはニトロフラントインなどのニトロフランである。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗生物質は、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧまたはＶ、ピペラシリン、テモシリンおよびチカルシリンなどのペニシリンである。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗生物質は、マフェニド、スルホナミドクリソイジン、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジアジン、スルファメトキサゾール、スルファメトキサゾール、スルファニルイミド、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、トリメトプリム、またはトリメトプリム−スルファメトキサゾール（コトリモキサゾール）（ＴＭＰ−ＳＭＸ）、銀などのスルホンアミドである。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗生物質は、以下のようなキノロンである。シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシンおよびテマフロキサシン。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗生物質は、バシトラシン、コリスチンまたはポリミキシンＢのような、ポリペプチドである。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗生物質は、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリンまたはオキシテトラサイクリンのような、テトラサイクリンである。
【０１９０】
用量
本明細書に開示される組成物の投与量および投与期間は、対象の年齢、対象の体重、およびファージの耐性を含む様々な要因に依存するであろう。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、経口投与によって患者に投与される。いくつかの実施形態では、１０３から１０２０ＰＦＵの間のファージの用量が与えられる。
例えば、いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、１０３から１０１１ＰＦＵの間の量の組成物中に存在する。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、約１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８、１０１９、１０２０、１０２１、１０２２、１０２３、ｌ０２４ＰＦＵ以上の量の組成物中に存在する。
いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、１０１ＰＦＵ未満の量の組成物中に存在する。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、１０４から１０８、１０４と１０９、１０５と１０１０、または１０７と１０１１ＰＦＵの間の量の組成物中に存在する。いくつかの実施形態において、バクテリオファージまたは混合物は、１日１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４回それを必要とする対象に投与される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージまたは混合物は、週に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１回。でそれを必要とする対象に投与される。いくつかの実施形態では、バクテリオファージまたは混合物は、月に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、又は９０回それを必要とする対象に投与される。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物（バクテリオファージ）は、疾患または状態の発生前、発生中、または発生後に投与される。いくつかの実施形態では、バクテリオファージを含む組成物を投与するタイミングは変化する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は予防薬として使用され、疾患または状態の発生を防ぐために、状態または疾患の傾向がある対象に継続的に投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、症状の発症中または発症後できるだけ早く対象に投与される。いくつかの実施形態において、組成物の投与は、症状の発症の最初の４８時間以内、症状の発症の最初の２４時間以内、症状の発症の最初の６時間以内、または３以内に開始される。症状の発症時間。いくつかの実施形態では、組成物の最初の投与は、本明細書に記載の任意の製剤を使用する本明細書に記載の任意の経路によるなど、実用的な任意の経路を介する。いくつかの実施形態において、組成物は、疾患または状態の発症が検出または疑われる後、実行可能であるとすぐに、そして疾患の治療に必要な期間、例えば、約１ヶ月から約３ヶ月まで投与される。いくつかの実施形態では、治療の長さは、被験者ごとに異なる。
キット
【０１９２】
本明細書に開示されているのは、使用するためのキットである。
いくつかの実施形態において、キットは、ＣＲＩＳＰＲアレイ、転写活性化因子、および／または抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドのための核酸構築物、ならびにバクテリオファージおよび／または本明細書に開示される任意の他のベクター／発現カセットを、導入に適した形態で含む。細胞および／または対象への投与。いくつかの実施形態では、キットは、他の治療薬、担体、緩衝液、容器、投与用デバイスなどを含む。いくつかの実施形態において、キットは、標的遺伝子の発現の抑制および／または標的遺伝子の発現の抑制の調節のための標識および／または指示を含む。いくつかの実施形態において、標識および／または指示は、例えば、ＣＲＩＳＰＲアレイ、転写活性化因子、および抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドのための核酸構築物の導入および／または投与の量、頻度および方法に関する情報、ならびにバクテリオファージおよび／またはその他のベクター／発現カセットを含む。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、１つの標的細菌を死滅させるためのキットが提供され、上記キットは、ＣＲＩＳＰＲアレイ、転写活性化因子、および／または抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチド、ならびにバクテリオファージのための核酸構築物から本質的になることからなる。および／または本明細書に開示される任意の実施形態による標的細菌の死滅を達成するために必要な任意の他のベクター／発現カセットを含む。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、標的細菌におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの活性を調節するためのキットが提供され、キットは、ＣＲＩＳＰＲアレイ、転写活性化因子、および抗ＣＲＩＳＰＲのための核酸構築物から本質的になることからなる。ポリペプチド、ならびにバクテリオファージおよび／または本明細書に開示される任意の実施形態による標的細菌におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの調節を達成するために必要な任意の他のベクター／発現カセット。
【０１９５】
いくつかの実施形態において、上記キットのＣＲＩＳＰＲアレイ、転写活性化因子、および／または抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドのための核酸構築物は、単一のベクターまたは発現カセット上、または別個のベクターまたは発現カセット上、あるいは単一のバクテリオファージまたは複数のバクテリオファージ内に含まれる。バクテリオファージの。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に開示される１つまたは複数のバクテリオファージを含む。いくつかの実施形態では、キットは、使用説明書を含む。いくつかの実施形態では、方法を実施するための指示は、適切な記録媒体に記録される。いくつかの実施形態では、説明書は、紙またはプラスチックなどの基材に印刷される。いくつかの実施形態では、説明書は、キットまたはその構成要素の容器のラベル付けにおいて、添付文書としてキットに存在する（すなわち、包装またはサブパッケージ）など。いくつかの実施形態では、命令は、適切なコンピュータ可読記憶媒体上に存在する電子記憶データファイルとして存在する。ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブなど。いくつかの実施形態では、実際の指示はキットに存在しないは遠隔ソースから（例えばインターネットを介して）指示を取得するための手段が提供される。いくつかの実施形態では、キットは、指示が表示される、および／または指示がダウンロードされるウェブアドレスを含む。
【０１９６】
本明細書に開示される特定の実施形態は、それらの方法および組成物の両方において、以下の実施例を参照して説明される。これらの実施例は、特許請求の範囲を開示に限定することを意図するものではなく、むしろ特定の実施形態の例示を意図するものであることを理解されたい。当業者に生じる例示された方法のいかなる変形も、本開示の範囲内に入ることが意図されている。
【実施例】
【０１９７】
実施例１：ＣＲＩＳＰＲ増強バクテリオファージを生成するための概要
ＣＲＩＳＰＲで増強されたバクテリオファージは、溶菌生活環に不可欠な遺伝子を維持するバクテリオファージゲノムからＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ構築物を発現するように操作されたファージである。関与する工程は、細菌に対する広範な宿主範囲を有するバクテリオファージおよびバクテリオファージのカクテルを調達、分離、および同定し、続いて細菌のゲノムを標的とする発現構築物（例えば、ｃｒＲＮＡ）を有するように各ファージを操作して、臨床リード候補として使用されるｃｒファージの最適化された組み合わせを検証することである。いくつかの実施形態では、一般的なプロセスは、図１のステップ１〜５に概略的に示されている通りである。ステップ１〜５は、次のように適切な数の野生型バクテリオファージを特定するように設計されている。
【０１９８】
１．以下の表１で提案されている最低品質基準（溶原性、病原性遺伝子、または抗生物質耐性遺伝子の不在）を満たす。
【０１９９】
表１：ファージの特性評価の要約
【０２００】
【表１】
2021522857.tif 000005
【０２０１】
２．臨床単離物パネルの約９０％以上に対して収集活動を行う。
【０２０２】
３．任意の単一のバクテリオファージに耐性がある場合にカクテルに対する菌株の感受性を確保することを目的とした、カクテル内の少なくとも２つのファージ（２つ以上のファージの混合物）による各菌株の感染をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のカクテルは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０、１００以上のバクテリオファージを含む。
【０２０３】
４．野生型ゲノムからｃｒＲＮＡ構築物を発現させるために、各候補バクテリオファージの遺伝子工学を含める。操作された各ｃｒファージは、溶解活性を保持することを目的としている。次に、ｃｒファージをインビトロ分析にかけ、宿主の範囲とインビトロでの有効性を評価する。これらの研究は、ｃｒファージが生産的な溶解感染の非存在下で致死的なｃｒＲＮＡ構築物を形質導入する能力によって拡大された宿主範囲ではないにしても、広い宿主範囲を保持し、各ｃｒファージについて同族の野生型バクテリオファージに対する致死性の改善を確認することを意図している。
【０２０４】
５．宿主範囲、製造上の制限、または非臨床効果を改善するために最適化されたカクテルで使用するためのｃｒファージを特定する。
【０２０５】
実施例２：ファージの単離
バクテリオファージベクターは、ノースカロライナ州の環境源から入手した。
ファージは、尿路病原性大腸菌のＥＣＯＲ  １４、６２、６４、および７１と共培養することにより、これらのサンプルから直接単離した。次に、各ファージを、増幅、濾過、および摂氏４度での長期保存の前に、合計３ラウンドの二重寒天オーバーレイにわたる単一プラーク単離によるクローン精製に供した。各ファージを増幅し、濾過し、塩化セシウム勾配精製に供し、１×トリス緩衝生理食塩水に透析した。ファージゲノムＤＮＡは、カラムベースのファージＤＮＡ調製キット（Ｎｏｒｇｅｎ）を使用して精製ファージストックから抽出され、必要に応じてＭｉＳｅｑまたはＰａｃＢｉｏ配列決定によるゲノム配列決定、およびサードパーティベンダー（Ｇｅｎｅｗｉｚ）でのアセンブリに提出された。以前に単離されたファージ、Ｋ１Ｆが得られ、これは尿路病原性大腸菌分離株に感染することが以前に示されており、既知のゲノムを有する（Ｋ１Ｆ：ＮＣ＿００７４５６）。
【０２０６】
実施例３：ファージ宿主範囲分析
野生型バクテリオファージのこのライブラリーは、各標的を複製および溶解する能力について、大腸菌パネルに対して個別に特徴付けられた。このプロセスにより、尿路病原性大腸菌のパネルの約９０％を溶解し、２４時間のチャレンジ研究中に最小限の耐性を示す野生型バクテリオファージパネルが得られると予想された。このマスターライブラリーから、短縮された野生型バクテリオァージライブラリーが生成され、尿路病原性大腸菌パネルの約９０％に対して予測された活性が保持された。
【０２０７】
各ファージは、進化的に幅広い大腸菌のパネルに対する溶解活性についてテストされた。簡単に説明すると、ファージを高力価（１０９−１０１１ＰＦＵ／ｍＬ）で生成し、ろ過し、増殖培地に懸濁したままにした。各標的宿主を対数増殖期中期まで増殖させ、軟寒天オーバーレイに組み込んで細菌ローンを作製した。ファージを約１０３〜１０５ＰＦＵ／ｍＬまで段階希釈し、各希釈液の５マイクロリットルを各細菌ローンにスポットプレートした。各ファージに対する宿主の感受性は、各スポット内の観察可能なクリアランスゾーンとして定義された。場合によっては、この分析には、標的宿主に吸着し、生産的な溶解感染によって引き起こされる溶解からではなく、ないことからの溶解（ｌｙｓｉｓ−ｆｒｏｍ−ｗｉｔｈｏｕｔ）と呼ばれる現象を引き起こすいくつかのファージが含まれる。しかし、吸着から生じることがない溶解は、生産的な溶解感染が存在しない場合でさえ、ＤＮＡ形質導入を可能にするという仮定の下で、これらのデータ点を意図的に除外しないことを選択した。
【０２０８】
この予備分析から、以下の表２に示すように、ヒト患者から単離された４つの尿中病原体を含む、パネルでテストされた１８の分離株のうち１７（９４％）に集合的に感染する１０のファージが選択された。ファージは、強調表示されているように、ＥＣＯＲ  １４、６２、６４、または７１に対して単離またはテストされ、次に、示されているより広いパネルに対してテストされた。重要なことに、ファージ宿主範囲はすべての生産的な溶解事象と見なされ、ないことからの溶解から生じた事象が含まれている。
【０２０９】
表２：大腸菌染色の多様なセットに対する単離されたバクテリオファージの宿主範囲分析
【０２１０】
【表２】
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灰色の影付きの行は、尿路病原性大腸菌分離株に対する予備的な宿主範囲の範囲を実証した。
【０２１１】
実施例４：ファージを単離するための一次耐性
この省略されたライブラリー内の複数の野生型バクテリオファージに感受性のある選択された大腸菌を使用して、チャレンジファージと一晩インキュベートした後、治療を受けていない宿主で耐性クローンを生成する能力について個々のバクテリオファージを評価した。個々の野生型バクテリオファージに対する見かけの耐性コロニーをクローン的に単離し、元のバクテリオファージおよびライブラリー内の他のバクテリオファージで再チャレンジした。これらのデータを使用して、どのバクテリオファージが急速な一次耐性を生成する可能性が高いかを通知した。これは、同じバクテリオファージで再チャレンジした後の安定した耐性表現型として定義される。安定した耐性表現型は、チャレンジバクテリオファージを含む培地での２４時間培養中の増殖曲線の検査による明らかな溶解を示さなかった。クローンの５０％より上で一次耐性を生成するバクテリオファージは、さらなる研究から除外された。次に、さらなる特性評価ステップで、短縮ライブラリー内の他の野生型バクテリオファージに対する各クローンの感度を測定する。
【０２１２】
すべてのファージストックは、発酵、ろ過、および＞１０１０ＰＦＵ／ｍＬ力価の検証により、増殖培地中の野生型、野生型バクテリオファージの粗溶解物として生成された。提案された１０ファージカクテルの各野生型ファージの経験的耐性プロファイルを決定するために、特定の宿主に対して推定耐性クローンを生成した：二重寒天オーバーレイ上の〜１０８コロニー形成単位の大腸菌宿主を高力価溶解物とインキュベートすることによるファージペアリング（＞ｌ０８ＰＦＵ、ＭＯＩ＞１．０）。一晩培養した後、トリプルコロニー精製により推定耐性クローンを単離した。増殖後、各クローンは、省略された１０ファージカクテルからの各元のファージを用いるチャレンジに供された。特に、最初のチャレンジ後の生存として定義される見かけの耐性表現型を持つ多数のクローンは、以下の表３に示すように、ファージチャレンジの非存在下での増殖後に明らかに感度を回復した。
表３：大腸菌ＥＣＯＲ７１に対する選択されたｃｒファージの耐性プロファイルデータ。
【０２１３】
【表３】
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2021522857.tif 000008
Ｒ：耐性、Ｓ：感受性、Ｔ：一過性（最初は敏感であると定義され、その後抵抗性の表現型が出現する）。Ｘ：未定。灰色の網掛けのボックスは、元の推定耐性クローンを単離するために使用された示されたバクテリオファージで再チャレンジされたクローンからの結果を示す。
【０２１４】
他の場合では、個々のクローンは、元のチャレンジファージに対する安定した表現型耐性で容易に同定された。しかし、これらのクローンのそれぞれは、元の野生型ファージに耐性がある一方で、パネル内のファージの少なくとも１つに対する感受性を保持していた。最初のファージチャレンジごとに１つだけがテストされた。場合によっては、ファージ間および個々のファージの耐性プロファイルは、テストに応じて変化する。
【０２１５】
実施例５：カクテル用のリードバクテリオファージの同定
潜在的な野生型バクテリオファージおよびその中の組み合わせは、以下のパラメーターに対して、それぞれ表２および表３の個々の野生型ファージ宿主範囲および耐性結果からのデータを使用して評価された：１）ファージは臨床単離物パネルの約９０％以上に対して集合的活性を有する。２）ファージは、カクテル内の少なくとも２つのファージによるそれぞれの感染を引き起こし、これは、任意の単一のバクテリオファージに対する耐性の事象においてカクテルに対する感受性を確保することを意図している。３）ファージは、単離されたクローンの５０％より多くで一次耐性を生成せず、一次耐性は、クローンの増殖と再チャレンジの後にその特定のファージに対する耐性を保持する個々のファージでのチャレンジ後のエスケープクローンの出現として定義され、最後に４）ファージは、カクテル内の他のすべてのファージに対する交差耐性を生成しない。これは、最初のチャレンジファージに対する持続的な耐性と、提案されたカクテル内の他のファージに対する新しい耐性を示す、最初のチャレンジおよびクローン増殖後のエスケープクローンの出現として定義される。クローンは以前には治療を受けていなかった。
【０２１６】
表２に示されている野生型バクテリオファージの組み合わせ（約９４％の累積宿主範囲）を、表３に示されている耐性プロファイルと比較した。これらのデータから、上記の最適化パラメーターに基づいて、１８の遺伝的に多様な大腸菌分離株のパネルに対してテストした場合、５つの候補バクテリオファージが約９４％の宿主範囲をカバーし、５つのファージのそれぞれが最低２の感受性を持っていることが確認された。各野生型ファージは、一次耐性を示す５０％未満の出現クローンをもたらし、提案されたカクテルのすべてのファージに対する耐性を示すクローンはないと予測されている。これらのデータは表４、表５、および表６に要約されており、ｃｒファージカクテルの予備開発の基礎を形成している。単一のｃｒＲＮＡ発現構築物は、評価された大腸菌ゲノムの約７８％（ｎ＝６２５）に存在するタイプＩ−ＥおよびタイプＩ−Ｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムの活性を方向付けて、評価されたゲノムの９９％以上に集合的に存在する複数の高度に保存された遺伝子座において宿主大腸菌染色体を標的とするように設計されている。個々のｃｒＲＮＡは、大腸菌分離株への形質転換によってインビトロで検証され、標的となる大腸菌配列に対する個々のｃｒＲＮＡの活性が実証された。次に、これらのｃｒＲＮＡは、バクテリオファージゲノムから発現され、内因性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムによって処理されて宿主染色体を標的とするアレイに組み立てられる。
【０２１７】
提案されている野生型バクテリオファージは、現在、表１に概説されているように、溶原性、病原性遺伝子、または抗生物質耐性遺伝子がないかどうかについて評価されている。
表４：提案されたｃｒファージカクテルの５つの個別のバクテリオファージの宿主範囲。
【０２１８】
【表４】
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灰色の影付きの行は、尿路病原性大腸菌分離株に対する予備的な宿主範囲の範囲を示した。
表５：提案されたｃｒファージカクテルの５つの個々のバクテリオファージの耐性プロファイル。
（表３で観察されたφＫｌＦに対するＥＣＯＲ７１の感受性に基づいて表２から改訂）
【０２１９】
【表５】
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灰色の網掛けのボックスは、元の推定耐性クローンを単離するために使用された示されたバクテリオファージで再チャレンジされたクローンからの結果を示している。
表６：提案されたｃｒファージカクテルについての５つの個別のバクテリオファージの要約データ。
【０２２０】
【表６】
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＊一次チャレンジファージに対する耐性については、ファージ感受性データを決定できなかった単一のデータ点を除外した（Ｎ＝３）。
＊＊カクテル感受性については、いくつかの個々のファージライブラリデータ点を決定できなかったため、６つの耐性分離株のデータを除外した（Ｎ＝６）。
【０２２１】
提案されたｃｒファージカクテルは、以下の表７にさらに要約されている。
表７：提案された予備的なｃｒファージカクテルの要約。
【０２２２】
【表７】
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【０２２３】
提案されたｃｒファージカクテルのｃｒＲＮＡアレイの組成は、以下の表８に要約されている。
表８：個々のｃｒＲＮＡ情報の要約。
【０２２４】
【表８】
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【０２２５】
実施例６：致死性のためにＣＲＩＳＰＲアレイを最適化する
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対して使用するための効果的なＣＲＩＳＰＲ増強バクテリオファージを開発するために、ＣＲＩＳＰＲアレイにさまざまな変更が加えられた。
【０２２６】
図２Ａは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの５つの株内から同定されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの線形配列と、さまざまなＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ構成成分の同定の概略図を示している。６３０株とＲ２０２９１株のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムオペロン構造を図２Ｂにさらに示する。
【０２２７】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを標的とするｃｒファージ内の最初のｃｒＲＮＡアレイは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ６３０またはＲ２０２９１のＣＲＩＳＰＲアレイのネイティブ・リーダー配列と、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに見られるネイティブＣＲＩＳＰＲアレイのコンセンサス反復配列を組み合わせたものであった。スペーサー配列は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの内因性タイプＩ−ＢシステムのコンセンサスＰＡＭ配列によって定義され、ｄｍｓＢ、ｐｈｉ  ｆ、ｐｈｉ２を含む３つの選択されたＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ標的宿主遺伝子に相補的である。ネイティブリーダー配列の代わりに内因性エノラーゼプロモーターを使用するｃｒＲＮＡアレイと、ＩＤＴ合成を容易にするために２番目の反復配列が変更されたｃｒＲＮＡアレイ（Ｒ２  Ａ＞Ｇ）を含む２つの追加構成がテストされた。したがって、バクテリオファージを操作するためのＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡの構成は、ｌｅａｄｅｒ−ｒｅｐｅａｔ−ｓｐａｃｅｒ−ｒｅｐｅａｔである。遺伝子操作されたバクテリオファージは、クロストリジウムの遺伝子操作のためにデモクラタイズされた（ｄｅｍｏｃｒａｔｉｚｅｄ）プラスミドを使用して、溶原菌としての天然細菌宿主における相同組換えによって作成された。
【０２２８】
クロストリジウム・ディフィシル菌株６３０およびＲ２０２９１は、嫌気性環境で３７℃のブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培地で一晩増殖させた後、１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）接種物で５ｍＬの新鮮なＢＨＩに継代培養した。次に、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株をＯＤが０．２になるまでインキュベートしてから、ＣＦＵ減少アッセイを開始した。バクテリオファージのすべての調製および取り扱いは、以前に記載されたように実施された。各培養物に、１０の野生型またはＣＲＩＳＰＲファージ溶解物の合計ＭＯＩを、最終濃度が１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭＣａＣｌ２で添加した。次に、ＯＤとＣＦＵを６時間にわたってモニターした。
【０２２９】
同様に、ＣＲＩＳＰＲアレイ内のリピート配列のヌクレオチド組成の変更は、ｃｒＲＮＡの全体的な致死性にわずかな影響を及ぼした。クロストリジウム・ディフィシル株６３０コンセンサス配列番号１１／５’−ＧＴＴＴＴＡＴＡＴＴＡＡＣＴＡＴＡＴＧＧＡＡＴＧＴＡＡＡＴ−３’は、ＣＲＩＳＰＲのネイティブリーダー配列を含むｃｒＲＮＡのシングルポイントヌクレオチド変異で変化したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ６３０またはＲ２０２９１からのアレイ、または内因性エノラーゼ遺伝子プロモーターおよびｄｍｓＢまたはｉｎｔＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ宿主遺伝子に相補的なスペーサー。反復配列の変化は、全体的なｃｒＲＮＡ活性に影響を与えるヘアピンの二次構造を変化させると予想される。以下の表９は、さまざまな構築物のｃｒＲＮＡ致死性の変化をまとめたものである。
表９：ｃｒＲＮＡアレイリピートの変更はｃｒＲＮＡの致死性に影響する。
【０２３０】
【表９】
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【０２３１】
実施例７：ｃｒファージは死滅活性を増強した
大腸菌およびＣ．ディフィシルに対するＣＲＩＳＰＲ増強バクテリオファージは、野生型ファージゲノムに埋め込まれた機能的な自己標的型ＣＲＩＳＰＲＲＮＡをコードする同一のＤＮＡ配列を含む別個の偏性溶解性バクテリオファージから開発された。図３Ａに見られるように、１０１０個の細菌細胞を含む大腸菌培養物を天然の未修飾ファージで処理すると、ファージの溶解活性によって細菌細胞が５−ｌｏｇ減少した。改変されたｃｒファージによる治療は、大腸菌の死滅活性をさらにおよそ５対数改善する。場合によっては、抗菌活性の改善は、ファージの生来の溶解活性とは無関係であり、ＣＲＩＳＰＲアレイ自体の抗菌活性の結果である。ＣＲＩＳＰＲアレイによる処理は、図３Ｂに示すように、細菌細胞集団の約７−ｌｏｇの減少を示す。
【０２３２】
同様に、約１０８個の細菌細胞を含むＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ培養物を天然の未修飾ファージで処理すると、ファージの溶解活性によって細菌細胞が約１．５−ｌｏｇ減少した。図４Ａに示すように、改変ｃｒファージで処理すると、細菌細胞の死滅活性の追加のｌ−ｌｏｇ減少が見られた。場合によっては、抗菌活性の改善はファージの生来の溶解活性とは無関係であるが、代わりにＣＲＩＳＰＲアレイ自体の抗菌活性の結果である。図４Ｂに示すように、ＣＲＩＳＰＲアレイによる処理では、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細胞集団の約３．５−ｌｏｇの減少のみが示された。
【０２３３】
実施例８：ｃｒファージは、死滅活動を拡大し、宿主範囲と関連した
同一濃度の野生型またはｃｒファージを、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株０６９を播種した寒天プレートにスポットして、ｃｒファージの感受性を確認した。図５に示すように、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌ローンプレート上のファージプラークの存在を使用して、ｃｒファージφＣＤ１４６による死滅に感受性があるが野生型ファージφＣＤｌ４６には非感受性であるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株を同定した。野生型ファージφＣＤｌ４６ではなくｃｒファージφＣＤ１４６による細胞死は、バクテリオファージベースの溶解活性とは無関係である細菌細胞死を示している。代わりに、これは、溶菌性ファージφＣＤｌ４６感染に対して本来非感受性であるＣ．ディフィシル株に対するＣＲＩＳＰＲアレイによる細菌細胞死を表している。使用したｃｒＲＮＡアレイはＲ２０２９１−３を標的とした。
【０２３４】
実施例９：ｃｒファージは、広範囲のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株で死滅活性を高めている
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの異なる菌株のパネルに対して有効であるｃｒファージの能力が決定された。ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｒ２０２９１のＣＲＩＳＰＲアレイのネイティブリーダー配列を組み込んだ後、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅにあるネイティブＣＲＩＳＰＲアレイのコンセンサスリピート配列と組み合わせて操作された。スペーサー配列は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの内因性タイプＩ−ＢシステムのコンセンサスＰＡＭ配列によって定義され、長さは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの内因性ＣＲＩＳＰＲアレイに見られる最も代表的なスペーサー長によって決定された。したがって、バクテリオファージを操作するためのＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡの構成は、リーダー−反復−スペーサー−リピートである。遺伝子操作されたバクテリオファージは、クロストリジウムの遺伝子操作のためにデモクラタイズされた（ｄｅｍｏｃｒａｔｉｚｅｄ）プラスミドを使用して、溶原菌としての天然細菌宿主において相同組換えを通して作製された。
【０２３５】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株は、嫌気性環境で３７℃のブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培地で一晩増殖させた後、１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）接種物で５ｍＬの新鮮なＢＨＩに継代培養した。次に、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株を、ＯＤ減少アッセイのＯＤが０．１、ＣＦＵ減少アッセイのＯＤが０．２になるまでインキュベートした。バクテリオファージのすべての調製および取り扱いは、以前に記載されたように実施された。各培養物に、合計ＭＯＩが１０の野生型またはＣＲＩＳＰＲファージ溶解物を、最終濃度１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＣａＣｌ２を添加した。次に、ＯＤとＣＦＵを６時間にわたってモニターした。
【０２３６】
図６Ａ−図６Ｖに示すように、２つのｃｒファージバリアントに対する野生型ファージの比較を、φＣＤ１４６についてのｃｒファージＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株１−２２に対する光学密度（ＯＤ６００ｎｍ）で測定した。図７Ａ−図７Ｃに示すように、追加のバリアントであるｃｒファージφＣＤ２４−２をＣ．Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株２３−２５に対して同様にテストした。
【０２３７】
選択した菌株のサブセットを、コロニー形成単位（ＣＦＵ）列挙を使用してさらに調べ、ｃｒファージφＣＤ１４６および２の殺菌活性を比較した。野生型およびｃｒファージφ１４６に対するＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株１〜４のＣＦＵアッセイを図８Ａ〜図８Ｄに示する。図９は、野生型およびｃｒファージφＣＤ２４−２に対するＣＤ１９株のＣＦＵアッセイを示している。ｃｒファージφＣＤ１４６とｃｒファージφＣＤ２４−２の組み合わせ比較を図１０でテストした。ｃｒファージφＣＤ１４６およびｃｒファージφＣＤ２４−２抗菌活性のＣＦＵアッセイは、各ｃｒファージについて個別に、および一緒に投与した場合に実施した。同時投与は、両方の野生型ファージを一緒に組み合わせた処理と比較して、改善された死滅効果を示した。野生型ファージφＣＤ２４−２は、野生型ファージφＣＤ１４６と比較してより強力な抗菌死滅活性を示したが、一緒に投与した場合、死滅の複合効果は著しく低下した。これは、野生型ファージφＣＤ２４−２の活性を潜在的に妨害する野生型φＣＤ１４６ファージを示唆している。しかし、ｃｒファージφＣＤ１４６とｃｒファージφＣＤ２４−２の組み合わせは、野生型ファージφＣＤ２４−２自体と比較して、わずかに改善された細菌死滅能力に等しいことを示している。
【０２３８】
細菌の増殖に対するＭＯＩの影響を評価するために、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株Ｒ２０２９ｌの培養物を増殖させ、０〜１６のさまざまなＭＯＩで野生型φ１４６またはｃｒファージφＣＤ１４６を接種した。標的宿主細菌に対するＲ２０２９１−３に対する溶解活性とＣＲＩＳＰＲアレイ活性の複合効果を評価した。野生型とｃｒファージの両方で、ＭＯＩが高いほど、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのより大きなｌｏｇ減少をもたらした。しかし、図１１に示すように、ｃｒファージφＣＤ１４６は、テストしたすべてのＭＯＩで、野生型ファージφＣＤｌ４６と比較して細菌数の減少に一貫した改善を示した。
【０２３９】
実施例１０：耐性率を克服するためのＣＲＩＳＰＲアレイのＣＲＩＳＰＲ増強ｃｒファージインシリコ設計
ＣＲＩＳＰＲベースの標的化に対する潜在的な耐性率を決定するために、数学モデルを開発して、標的ゲノム内の約３２塩基対の任意の所定の潜在的な標的部位での変異の頻度を決定した。
【０２４０】
生存を付与する変異を有する細胞の数＝
（１−（１−（［変異率／ゲノム／世代］＊［ゲノム／塩基対の数］＊世代の数））３２）ｎ＊（ＣＦＵロード）
【０２４１】
集団内のエスケープ変異体を推定する計算では、任意の遺伝子の一般的な変異率は、世代ごとのゲノムあたり１０００変異に１つであり、典型的な細菌ゲノムの長さは約５ｘ１０６塩基対長であり、世代の総数は、感染の長さを生物の倍加時間で割ったものの合計として推定される。したがって、この方程式は、特定のゲノムの独立した突然変異率に集団内のゲノム（細胞など）の総数を掛けたものと仮定して、すべての潜在的なスペーサー標的において感染の過程で突然変異を獲得する細胞として生存細胞の総数を推定する。
【０２４２】
ｃｒＲＮＡによって標的とされる独立した遺伝子の数の関数としての標的部位の突然変異のために時間とともに出現する耐性クローンの数のインシリコ予測。これらのモデルは、（１）突然変異率が遺伝子標的に依存せず、（２）ｃｒＲＮＡの３２塩基すべてが活性に一致するという非常に保存的な仮定を前提としている。ＣＲＩＳＰＲに対する潜在的な耐性に対する独立して標的化された遺伝子の数の影響を理解するために、２セットの仮定がテストされた。２つのタイプの感染がモデル化された。図１２Ａに示すように６時間ごとに２倍になることで合計負荷が１０１０ＣＦＵになる急性感染、または図１２Ｂに示すように２０分ごとに２倍になることで合計負荷が１０１４ＣＦＵになる攻撃的な感染である。これらの仮定の下で、両方のモデルは、３つの独立した遺伝子標的が感染期間の２８日までの突然変異のエスケープを防ぐために十分であることを示している。
【０２４３】
これらの推定値は、次のように保存的であると見なされる：（１）ｃｒＲＮＡ標的は必須遺伝子の高度に保存された領域内にあるため、おそらくここで計算されるよりも変異する可能性が低く、（２）ｃｒＲＮＡがその標的部位で１つ以上のミスマッチを許容することを示すデータとは対照的に、このモデルは３２塩基対ｃｒＲＮＡの単一の変異が活性を排除することを想定している。標的は。ＣＲＩＳＰＲアレイは、４つの独立した標的に対して４つの独立したｃｒＲＮＡを発現するように設計されており、ＣＲＩＳＰＲ標的の喪失による耐性がほとんどないことを保証する。さまざまな大腸菌株の中で最も有病率の高い標的を特定するために、図１３に示すように、各スペーサー標的の株カバレッジを分析した。ｃｒＲＮＡアレイ標的には、株カバレッジの割合が高いものから低いものの順に次の遺伝子が含まれる。Ｔｓｆ（１００％）、ｃｐＰ（９９％）、ｇａｐＡ（９９％）、ｉｎｆＡ（９９％）、ｓｅｃＹ（９９％）、ｓｅｃＹ’２（９９％）、ｃｓｒＡ（９９％）、ｔｒｍＤ（９９％）ｆｔｓＡ（９９％）、ｎｕｓＧ（９９％、ｆｕｓＡ’２（９９％）、ｆｕｓＡ（９８％）、ｇｌｙＱ（９８％）、ｅｎｏ（９５％）、ｇａｐＡ’２（９１％）、ｅｎｏ’２（  ８９％）、およびｎｕｓＧ’２（７３％）。
【０２４４】
図１４に示すように、大腸菌ゲノムの保存領域を標的とする一連の個別のタイプＩＥ  ｃｒＲＮＡを構築した。ｃｒＲＮＡ標的には、ａｃｐＰ、ｃｓｒａ、ｅｎｏ、ｆｕｓＡ、ｇａｐＡ、ｇｌｙＱ、ｉｎｆ  Ａ、ｎｕｓＧ、ｓｅｃＹ、ｔｒｍＤ、およびＴｓｆの遺伝子が含まれる。これらの個々のタイプＩＥ  ｃｒＲＮＡ構築物は、ｃｒＲＮＡ発現構築物をタイプＩＥ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムを構成的に発現する大腸菌細胞に形質転換することによってテストされた。形質転換効率は入力ＤＮＡのマイクログラムあたりの形質転換体として計算され、各データポイントは３つの独立した実験からの単一の複製である。テストされた各ｃｒＲＮＡは、レシピエントの大腸菌に形質転換されたときに、同様の観察されたレベルの致死性をもたらした。これらのスペーサーから、４つのタイプＩ−Ｅ  ｃｒＲＮＡが各サブセットから選択され、最終的なアレイにアセンブルされた。
【０２４５】
実施例１１：ＬｅｕＯ転写活性化因子で増強されたｃｒファージ
大腸菌に対するＣＲＩＳＰＲ増強バクテリオファージは、野生型ファージゲノムに埋め込まれた機能的な自己標的型ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡカセット）をコードする同一のＤＮＡ配列を含む最大３つの異なる偏性溶解性バクテリオファージのカクテルとして開発された。バクテリオファージは、２つの方法のいずれかによって操作された：（１）活性ファージ感染を伴う大腸菌細胞での相同組換え、または（２）細胞外で組み立てられた操作ファージＤＮＡの形質転換により、操作されたゲノムで活性ファージを再構成する。各ファージは、２つの要素を含む同様のｃｒＲＮＡカセットで操作された：（１）合成プロモーターの前にある大腸菌由来のＬｅｕＯ転写因子遺伝子、および（２）合成プロモーターの前にあるｆｔｓＡ遺伝子を標的とするｃｒＲＮＡをコードするリピートスペーサーリピート。３つのバクテリオファージ構築物が操作された：ｃｒＴ４、ｃｒＴ７、およびｃｒＴ７ｍ。３つのバクテリオファージ構築物すべてを図１５に模式的に示する。操作されたさまざまなｃｒファージで使用されるｃｒＲＮＡ発現カセットには、以下の表１０に示すように単一のｃｒＲＮＡが含まれている。
表１０．ｃｒＲＮＡ発現カセット。
【０２４６】
【表１０】
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【０２４７】
バクテリオファージｃｒＴ４は、ｈｏｃ遺伝子を削除し、ｃｒＲＮＡカセットに置き換えることによって操作された。バクテリオファージｃｒＴ７は、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、ｇｐ４．５、およびｇｐ４．７を削除し、ｃｒＲＮＡカセットに置き換えることによって操作された。バクテリオファージｃｒＴ７ｍは、ｇｐ０．６、ｇｐ０．６５、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、およびｇｐ４．５を削除し、ｃｒＲＮＡカセットに置き換えることによって操作された。これらの欠失後にすべてのファージが首尾よく操作されたという観察に基づいて、これらの初期のファージ遺伝子はファージの生存に必須ではないと結論付けられた。これらの操作されたバクテリオファージの詳細は、以下の表１１に要約されている。
表１１．操作されたｃｒファージの要約。
【０２４８】
【表１１】
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【０２４９】
感染中にＤＮＡが形質導入されると、ＬｅｕＯはファージゲノムから発現し、その後、大腸菌で内因性のＩ−ＥＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３オペロンの発現をアップレギュレートする。同時に、合成ｆｔｓＡｓｒｉ標的化ｃｒＲＮＡは、内因性のタイプＩ−ＥＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３タンパク質複合体によって認識および処理されるファージゲノムから発現される。次に、このｃｒＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３複合体にロードされ、それによって標的細菌ＤＮＡの標的化と分解を方向付ける。
【０２５０】
実施例１２：大腸菌におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの普及と分布
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムのタイプとサブタイプにはさまざまな種類があり、発見されたシステムの大部分（＞６０％）は、Ｃａｓ３シグネチャーヌクレアーゼを持つという独自の機能を共有するタイプＩグループに属している。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムは、一本鎖ニックを生成し、続いて標的ＤＮＡの進行性のエキソヌクレアーゼ分解を生成するという点で独特である。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、タイプＩ−ＥとタイプＩ−Ｆの２つの異なるサブタイプに属しており、分解にこのシグネチャーＣａｓ３ヌクレアーゼを使用する。
【０２５１】
大腸菌におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムのおおよその分布を決定するために、尿路病原性大腸菌（ＵＰＥＣ）、志賀毒素産生性大腸菌、（ＳＴＥＣ）を含む多様な菌株にまたがる６２５の公的に入手可能な大腸菌ゲノムを分析した。Ｏｌ５７：Ｈ７血清型大腸菌、下痢原性大腸菌（ＤＥＣ）、非１５７  Ｏ抗原型大腸菌、および腸内病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）。各ゲノムは、標準的なタイプＩ−ＥまたはタイプＩ−Ｆ  大腸菌ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムに類似したオペロンについてスキャンされた。図１６Ａは、これらの大腸菌ゲノムのそれぞれの相対量を示している。図１６Ｂは、すべての菌株の約７８％（４８７／６２５）はタイプＩ−ＥまたはタイプＩ−Ｆのいずれかの完全なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムをすでに持っていることを示している。提案された生成物は、ゲノムを標的とする内因性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムを活性化するために必要なガイドとアクセサリーのみを提供することにより、大部分の大腸菌におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３タンパク質の存在を利用する。
【０２５２】
実施例１３：大腸菌のＣａｓオペロンの近くにＬｅｕＯ結合部位が存在する
大腸菌ゲノムのＣａｓオペロン付近のＬｅｕＯ結合部位の有病率を決定するために、６２８個のＥ．ｃｏｌｉゲノムは尿路病原性大腸菌（ＵＰＥＣ）、志賀毒素産生大腸菌（ＳＴＥＣ）、さまざまなＯ−抗原：大腸菌の場合はＨ−抗原の血清型、下痢原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＥＣ）、および腸内病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）などの多様性にまたがるアクセッション番号でＮＣＢＩから直接ダウンロードされた。次に、「ＣａｓＢ」と注釈が付けられた遺伝子についてゲノムを照会した。ＣａｓＢコード配列と両側に隣接する５ｋｂを抽出して、さらに注釈を付けた。完全なカスケードオペロンは、ＣａｓＡＢＣＤＥまたはＣａｓ３遺伝子のトランケートされた遺伝子の目視検査によって決定された。４０１個のインタクトなＣａｓｃａｄｅ−Ｃａｓ３オペロンが検出された（クエリされたすべてのゲノムの６４％）。次に、Ｃａｓ３の上流とＣａｓ３の下流の２００〜４００ヌクレオチドをそれぞれ分析のために抽出した。候補ＬｅｕＯ結合配列を取得して整列させ、コンセンサス配列を作成した。次に、個々のコンセンサス配列を、Ｃａｓ３の上流および下流の配列に対して６０％の閾値ヌクレオチド同一性で照会した。まとめると、候補のＬｅｕＯ結合部位は、インタクトなＣａｃａｄｅ−Ｃａｓ３オペロンを含む株の８８．５％で観察された。表１２は、以下のＥ．ｃｏｌｉゲノムの検索分析をまとめたものである。
【０２５３】
表１２．大腸菌ゲノムにおけるＬｅｕＯ有病率の要約。
【０２５４】
【表１２】
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【０２５５】
実施例１４：ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの致死性を引き出すにはＬｅｕＯの発現が必要
ほとんどの大腸菌は、ゲノム内のＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３活性に必要な成分をコードしている。ただし、Ｅ。ｃｏｌｉＴｙｐｅ  Ｉ−Ｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３オペロンは、ヒストン様核様体構造化（Ｈ−ＮＳ）抑制によって制御されており、通常の培養条件下では発現しない。ＬｅｕＯは、重複するプロモーター領域でＨ−ＮＳに対抗して作用し、遺伝子発現を活性化する。Ｈ−ＮＳとＬｅｕＯ活性の相互作用は、Ｓ。ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍとＥ．ｃｏｌｉで、ＬｅｕＯの過剰発現またはノックアウトに関連する全体的な転写変化を調べることによって研究されている。従来の培養条件下では、ＬｅｕＯ自体は発現せずに、飢餓および定常期にアップレギュレートされる。しかし、大腸菌とＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのｃａｓＡＢＣＤＥオペロンは、ＬｅｕＯの過剰発現により有意にアップレギュレートされ、ＣａｓＡの上流にあるＨ−ＮＳとＬｅｕＯの結合配列を予測している。しかし、ＬｅｕＯ発現カセットがない場合、ｃａｓＡＢＣＤＥの発現は、自己標的型ｃｒＲＮＡを介した致死性をサポートするのに十分ではない。
【０２５６】
ＬｅｕＯ発現カセットを病原体に送達する主なリスクには、レギュロン内の非標的（非Ｃａｓ）遺伝子への影響が含まれる。Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍでは、ＬｅｕＯは病原性に関連するいくつかの遺伝子をアップレギュレートするが、発現に有意な増加があるかどうか、およびこの観察がＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ以外の細菌にどのように適用されるかは不明である。大腸菌では、ＬｅｕＯは特定のクラスの抗生物質に対する耐性を増加または減少させる。
【０２５７】
大腸菌のＣＲＩＳＰＲを介した致死性におけるＬｅｕＯの機能を検証するために、内因性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３オペロンの野生型抑制を克服するためにＬｅｕＯ発現カセットをコードするファージミドを設計した。設計されたファージミドはＭ１３バクテリオファージに由来し、これは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３ベースの致死性を混乱させないように非溶解性であることが示されているバクテリオファージである。ファージミドはまた、保存された大腸菌ｆｔｓＡ遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲアレイをコードし、それによってこのアレイの発現が活性化され、タイプＩ−Ｅ大腸菌ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３システムの自己標的化を方向付けして細胞死を誘発する。
【０２５８】
図１７は、ＣＲＩＳＰＲを介した致死性のＬｅｕＯ発現への依存性をテストするために操作された検証済みのｆｔｓＡスペーサー配列を使用したＣＲＩＳＰＲ構築物の非溶解性Ｍｌ３由来ファージミド送達を示している。ファージミドは１ミリリットルあたり１０９変換単位の力価で生産され、インビトロ研究のために増殖培地で維持された。ファージミドベクターは、ｆｔｓＡリピートスペーサーアレイ、ＬｅｕＯ発現カセット、およびＭ１３互換の複製起点をコードする。ファージミドベクターの致死性は、野生型Ｈ−ＮＳ抑制大腸菌タイプＩ−Ｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３オペロンを含有する一定の範囲の親ＥＭＧ２、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３オペロン（Ａｈｎｓ）におけるＨ−ＮＳを欠くＢＷ２５１ｌ３誘導体、過剰発現したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３オペロン（ＢＷ＋Ｃａｓ）を含むＢＷ２５１１３誘導体、およびＢＷ２５１１３−Ｃａｓ３遺伝子を欠く誘導体（ＢＷΔＣａｓ）を含む、Ｍ１３バクテリオファージの形質導入を介してテストされた。、を含む範囲への抑制モチーフ、。
【０２５９】
示された大腸菌を、各Ｍ１３ファージミドのミリリットルあたり１０９の形質導入単位に感染させ、選択培地にプレーティングして、形質導入された細胞を回収し、生き残ったコロニー形成単位（形質導入体）を数えた。それぞれは、凡例に示されている以下のファージミドで形質導入された：対照、一般的なＭ１３形質導入対照。ｐＣＲＩＳＰＲ、非標的化ｃｒＲＮＡを構成的に発現するファージミド、ＬｅｕＯ、Ｅ．ｃｏｌｉＬｅｕＯ遺伝子を構成的に発現するファージミド、ｆｔｓＡ、Ｅ．ｃｏｌｉに存在する保存されたｆｔｓＡ遺伝子を標的とするｃｒＲＮＡを構成的に発現するファージミド；ｆｔｓＡ：：ＬｅｕＯ、ファージミドは、ｆｔｓＡを標的とするＬｅｕＯ遺伝子およびｃｒＲＮＡを構成的に発現する。
【０２６０】
ＬｅｕＯおよびｆｔｓＡ標的化スペーサーの同時送達は、Ｃａｓ３活性を欠くＢＷＡＣａを除いて、それぞれにわたる対照と比較して、３．４ログ（±０．０４）から４．３ログ（±０．０６）の範囲の減少をもたらし、確認した。その致死性は、ファージミドゲノムから発現される構築物に依存していることを確認した。特に、ｆｔｓＡ標的化スペーサーのみの発現によるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３の致死性は、ＢＷ＋Ｃａｓ細胞株でのみ観察され、Ｈ−ＮＳ抑制の除去だけでは有意なレベルの内因性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ３標的化をレスキューするのに十分ではないことを示している。これらのデータに基づくと、ｆｔｓＡスペーサーとＬｅｕＯの両方は操作されていない野生型大腸菌の細胞死に必要である。
【０２６１】
実施例１５：ＬｅｕＯで増強されたｃｒファージにより、致死性の動態が改善された
各ｃｒファージを野生型ファージと全身的に比較して、それぞれの野生型バクテリオファージと比較したＣＲＩＳＰＲ増強ファージの効力の変化を決定した。ｃｒファージおよび対応する野生型バクテリオファージが生成され、ろ過され、増殖培地で同じ力価に調整された。既存の公的に入手可能な配列決定データに基づくと、３つの野生型ファージは著しく異なるゲノム構造を持っているが、偏性溶解性ファージである（データは示していない）。標的大腸菌は、増殖培地中で、各ファージについて示された感染多重度（バクテリオファージに対するファージの比率）で、それぞれ、ｃｒＴ７ｍ、ｃｒＴ７、およびｃｒＴ４について２時間または５時間インキュベートされた。インキュベーション後、培養物を直ちに収集し、段階的に希釈し、プレーティングして、生き残ったコロニーを数えた。３つすべてのｃｒファージでＣＦＵの低下に有意差が観察された。図１８Ａ〜図１８Ｃに示すように、野生型ファージの比較では、ｃｒＴ７ｍの最大約４  ｌｏｇの改善（図１８Ａ）、ｃｒＴ４の約４．５  ｌｏｇの改善（図１８Ａ）が含まれる。図１８Ｂ）およびｃｒＴ７（図１８Ｃ）活動の約ｌ−ｌｏｇの改善。これらのデータは、ＣＲＩＳＰＲで増強されたファージは選択された時点で、野生型バクテリオファージとは対照的に、標的の大腸菌集団を排除することを示唆している。
【０２６２】
実施例１６：ＬｅｕＯで増強されたｃｒファージのインビトロ死滅曲線
図１９Ａ−図１９Ｅは、各ｃｒファージの用量反応インビトロ死滅曲線を示している。各ｃｒファージは、標準的な溶解増幅によって生成された。ろ過し、元の増殖培地（ＬＢブロス）に懸濁したままにする。すべての実験はＬＢブロスで実施された。大腸菌ＭＧ１６５５を対数増殖期中期まで増殖させた後、各ｃｒファージ、ｃｒファージカクテル、またはＬＢのみのネガティブコントロールの示された感染多重度（ＭＯ  Ｉ）と混合した。
処理された集団は、光学密度（ＯＤ  ６３０ｎｍ）によって処理された集団の成長をモニターするために、プレートリーダーで３７℃で２４時間、好気性の振とう条件下で成長させた。
【０２６３】
大腸菌ＭＧ１６５５を対数増殖期中期まで増殖させ、感染多重度（ＭＯＩ；ファージと細菌の比率）で次のように処理した。図１９Ａ、ｃｒＴ７をＭＯＩ  ０．０００１、０．０１、および１．０でインキュベートした。図１９Ｂ、ｃｒＴ７ｍは０．０００９、０．０９、および９．０のＭＯＩでインキュベートされた。図１９Ｃでは、ｃｒＴ４は０．０００６、０．０６、および６．０のＭＯＩでインキュベートされた。図１９Ｄに示すように、各ファージを等量混合してｃｒファージカクテル（「カクテル」）を作成し、０．０００６、０．０６、および６．０のＭＯＩ（各ｃｒファージ）でインキュベートした。図１９Ｅは、図１９Ｄの拡大グラフである。
【０２６４】
予想通り、すべてのｃｒファージはＭＯＩとは無関係に標的を溶解した。特に、ｃｒＴ７ｍ高用量集団（図１９Ｂ）およびｃｒＴ４低用量集団（ＭＯＩ＝０．０００６、図１９Ｃ）における緊急耐性集団は、最初のファージ用量の存在下での２４時間の連続培養によって観察された。ただし、ｃｒＴ７、ｃｒＴ７ｍ、およびｃｒＴ４のカクテルでチャレンジした場合、耐性集団は観察されなかった（図１９Ｄおよび図１９Ｅ）。
【０２６５】
ＭＯＩと比較して溶解までの時間を定量化するために実施された図２０に示すように、ｃｒファージの濃度と観察可能な溶解までの時間の間に用量依存的な関係が観察された。溶解までの時間は、バクテリオファージの増幅が推定されたために細菌集団が崩壊した後、増殖曲線の一次導関数がゼロに達する時間として定義された。宿主ゲノムのエンドヌクレアーゼ分解は、細菌を死滅させるための非溶解メカニズムであると考えられているため、ＣＲＩＳＰＲを介した致死性は増殖曲線分析では観察されないと予想される。
【０２６６】
大腸菌ＭＧ１６５５を対数増殖期中期まで増殖させ、各ｃｒファージに示されているように感染多重度（ＭＯＩ；ファージと細菌の比率）で処理した。成長曲線は平滑化され、平滑化された線の一次導関数は、ＰＲＩＳＭソフトウェアスイートを使用して決定された。溶解までの時間は、最初に観察された人口減少の直後に一次導関数がゼロに達する時間として計算された。
【０２６７】
テストした３つのｃｒファージのすべてで、ＭＯＩが１．０を超えると、溶解までの時間が最短になり、おそらく各ファージの溶解期間によって制限される。観察された溶解までの時間は、それぞれ、ｃｒＴ７ｍおよびｃｒＴ７で約１５〜２０分、ｃｒＴ４で４５〜５０分であり、野生型溶解ファージＴ７（−１７分）、Ｔ７ｍ（−１５〜２０）で知られている値とほぼ一致する。分）とＴ４（３５分）。
【０２６８】
実施例１７：ＬｅｕＯはｃｒファージのインビボ忍容性を増強した
腹膜炎モデルでの生存研究の前に、各ｃｒファージの忍容性をインビボで決定した。以下の表１３に記載されているように、ｃｒファージは忍容性のために調製された。
【０２６９】
表１３：インビボの忍容性研究のためのｃｒファージ
【０２７０】
【表１３】
2021522857.tif 000033
【０２７１】
忍容性の治療概要を図２１Ａに模式的に示す。忍容性試験では、２．０×１０１１ＰＦＵ／日／マウスのｃｒＴ７で５日間、３．７×１０９ＰＦＵ／日／マウスのｃｒＴ７Ｍで５日間、または６．０×１０８ＰＦＵ／日／マウスのｃｒＴ４で１日間の腹腔内注射によって、雌のＣＤ−１マウスはそれぞれ１日あたり１００マイクロリットルの用量を投与された。。ｃｒＴ７およびｃｒＴ７ｍは、エンドトキシンを含まない滅菌０．９％生理食塩水に懸濁し、ｃｒＴ４は、各ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２を１０ｍＭ補完したエンドトキシンを含まない滅菌ＩＸトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ  ７．４）に懸濁した。図２１Ｂ−図２１Ｇに示すように、獣医の観察中に明白な毒性は観察されず、各ｃｒファージ製剤の投与後に体温または体重の測定可能な変化は認められなかった。
【０２７２】
実施例１８：ＬｅｕＯ増強ｃｒファージインビボ腹膜炎モデル研究
以下の表１４に記載されているように、ｃｒファージを腹膜炎モデル用に準備した。
【０２７３】
表１４：インビボ腹膜炎モデル研究のｃｒファージ
【０２７４】
【表１４】
2021522857.tif 000034
【０２７５】
糞便性大腸菌分離株（ＡＴＣＣ  ８７３９、ｃｒＴ７ＭおよびｃｒＴ７）または実験室（ＭＧ１６５５、ｃｒＴ４）に対する３つのｃｒファージの活性に基づいて、３つのｃｒファージについて大腸菌を用いたマウス腹膜炎モデルで評価した。腹膜炎モデルの治療概要を図２２Ａに模式的に示する。雌のＣＤ−１マウスに致死量の大腸菌（〜５×ｌ０７ＣＦＵ／ＡＴＣＣ  ８７３９のマウス）を腹腔内注射した後、３０分以内に生理食塩水またはｃｒファージを腹腔内注射した。以前と同様に、ｃｒＴ７とｃｒＴ７ｍは、エンドトキシンを含まない滅菌生理食塩水０．９％生理食塩水に懸濁し、ｃｒＴ４は、ＣａＣｌ２とＭｇＣｌ２をそれぞれ１０ｍＭ添加したエンドトキシンフリーの滅菌ＩＸトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ  ７．４）に懸濁した。図２２Ｂ−図２２Ｄに示すように、ｃｒファージの単回投与（２．０ｘ１０ｕＰＦＵ／ｃｒＴ７の投与、３．７ｘｌ０９ＰＦＵ  ／  ｃｒＴ７Ｍの投与または６．０ｘｌ０８ＰＦＵ／ｃｒＴ４の投与）は、この急性の非常に致死的な細菌チャレンジにおいて有意な保護をもたらした。対照動物は生理食塩水注射のみで治療された。
これらのデータは、バクテリオファージが感染の関連する動物モデルにおける致死的な病気の挑戦を救うのに十分な数の標的細菌に感染して死滅させることができることを示している。
【０２７６】
実施例１９：大腿部モデルにおけるＬｅｕＯ増強ｃｒファージ  インビボバイオバーデン削減
［０２９９］  以下の表１５に記載されているように、大腿部モデルにおけるインビボバイオバーデン削減のためにｃｒファージを調製した。
表１５：大腿部モデル研究におけるインビボバイオバーデン削減のためのｃｒファージ。
【０２７７】
【表１５】
2021522857.tif 000035
【０２７８】
インビボでの有効性の２番目の実証として、マウスの大腿感染モデルを実施して、ｃｒファージ治療後の生物負荷の減少を測定した。この大腿モデルの治療概要を図２３Ａに模式的に示する。この研究で使用された元のｃｒファージストックは、４．０×１０１２ＰＦＵ／ｍＬのｃｒＴ７、２．０×１０１２ＰＦＵ／ｍＬのｃｒＴ７Ｍ、および２．０ｘ１０１１ＰＦＵ／ｍＬのｃｒＴ４の効力を有し、各ファージは滅菌されたエンドトキシンフリーの１×トリス緩衝生理食塩水（ｐＨ  ７．４）。３つのｃｒファージは、＜１０３ＥＵ／ｍＬの推定エンドトキシン含有量を含む各ファージの最終濃度が１×１０１１ＰＦＵ／ｍＬのカクテルにプールされた。
【０２７９】
細菌接種の１日前および４日前に、雌のＣＤ−１マウスを、１５０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドを左腹部に腹腔内注射することによって好中球減少症にした。
示されたｃｒファージまたは１×トリス緩衝生理食塩水（ファージビヒクル）を筋肉内注射する３０分前に、大腿部に筋肉内注射することにより、１０５ＣＦＵのＥ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５をマウスに接種した。各個々のｃｒファージまたは３ｃｒファージのカクテルは、同じ大腿部に１００マイクロリットルのｃｒファージ溶液を筋肉内注射することにより投与された。これは、４．０×１０１１ＰＦＵ／用量のｃｒＴ７、２．０×１０１１ＰＦＵ／用量のｃｒＴ７Ｍ、２．０×ｌ０１０ＰＦＵ／用量のｃｒＴ４、または１．０×ｌ０１０ＰＦＵ／用量のｃｒＴ４の各ファージを含むカクテルの用量に対応する。各ｃｒファージを注射した後、示された時点で大腿部の筋肉全体を切除し、ホモジナイズし、すぐに希釈してプレーティングし、組織１グラムあたりの生存細菌コロニーをカウントした。図２３Ｂ−図２３Ｅに示すように、ＣＦＵの減少は、ｃｒＴ４で約２−ｌｏｇ、ｃｒＴ７Ｍで３−ｌｏｇ、ｃｒＴ７と組み合わせたｃｒファージカクテルの両方で＞５−ｌｏｇと測定された。図２２Ｂ−図２２Ｄに示されている腹膜炎の結果と合わせて、これらのデータは、ｃｒファージがインビボで非常に効果的な抗菌剤になる可能性があることを示している。
【０２８０】
実施例２０：ファージ滴定によって測定されたＬｅｕＯ増強ｃｒファージインビボ持続性および分布研究
活性ファージベースの生成物のユニークなＰＫ／ＰＤ／ＡＤＭＥの考慮事項を考慮して、健康な動物の曝露の動態を理解するために、標的組織と遠位臓器の両方における各ｃｒファージの持続性と分布を評価した。以下の表１６に記載されているように、ｃｒファージは、尿道内投与によるインビボ持続性および分布研究のために調製された。
表１６：インビボでの持続性と分布の研究のためのｃｒファージ。
【０２８１】
【表１６】
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【０２８２】
雌のＣＤ−１マウスを、条件／時点あたりＮ＝３マウスへの尿道内注入によるＩＸトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に懸濁されたｃｒＴ７／ｃｒＴ７ｍカクテルの約１０×１０９ＰＦＵ／用量／ファージで処理した。尿道内注入は、シリコンチップの注射器を雌マウスの尿道に配置することによって行われ、溶液は膀胱に直接注射された。イソフルラン麻酔下で、尿道内注入により、各マウスに約５０μＬのビヒクルまたはファージカクテルを投与した。接種後０（尿道内投与直後）、０．５、１、６、１２、２４および７２時間の時点で、各時点で３匹のマウスを屠殺し、膀胱、腎臓、血液、肝臓および脾臓を収集し、全組織ホモジネートを希釈した。ファージ滴定分析を行って、ｃｒＴ７とｃｒＴ７ｍの合計量を定量化した。示されている平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）は、３匹の動物からの３回の技術的複製の結果であり、ｃｒＴ７またはｃｒＴ７ｍのいずれかのグラム（膀胱、腎臓、肝臓、脾臓）またはミリリットル（血液）あたりのプラーク形成単位を定量化する。アッセイはどちらのｃｒファージにも固有ではない）。ｃｒファージは、ｃｒＴ７とｃｒＴ７ｍの両方に影響を受けやすい既知の宿主に対する従来のファージ滴定を使用したプール測定として定量化された。
【０２８３】
図２４に示すように、投与後７２時間までに活性ｃｒファージの存在が検出された。
この期間中の見かけの増幅は観察されなかったが、これは正常組織に標的大腸菌複製宿主がなく、哺乳動物細胞で複製できないことが予想された。重要なことに、ｃｒファージレベルは膀胱内で時間とともに減少し、腎臓、肝臓、血液、および脾臓では７２時間までに検出できず、治療した動物に適切な大腸菌複製宿主が存在しないと、時間の経過とともにｃｒファージが失われることを示唆している。特に、有意なファージ力価が腎臓で観察され、尿道内投与経路は、場合によっては、下部および上部尿路での曝露をもたらすことを示唆している。また、血液、肝臓、脾臓の組織で有意なファージ力価が検出され、ｃｒファージが尿路上皮を通過することによって循環に入っているように見えることを示している。
【０２８４】
実施例２１：定量的ＰＣＲによって測定されたＬｅｕＯ増強ｃｒファージインビボ持続性および分布研究
定量的ＰＣＲベースの方法が開発され、特定のカクテル内の各ｃｒファージの検出について検証された（データは示していない）。これにより、複雑なサンプル（例えば、混合マウス血液と全ＤＮＡ）の全ＤＮＡあたり５０コピーまでの検出レベルが可能になる。
定量ＰＣＲは、ＤＮＡを検出および定量するための非常に特異的な方法であり、プライマーは同一のｃｒＲＮＡカセットインサートを含む特定のファージゲノムを認識するように設計されているため、理論的にはサンプル内の各操作されたｃｒファージの総量を測定できる。以下の表１７に記載されているように、ｃｒファージは、経口投与によるインビボ持続性および分布研究のために調製された。
【０２８５】
【表１７】
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表１７：インビボでの持続性と分布の研究のためのｃｒファージ。
【０２８６】
ｃｒファージ溶液の単回経口投与後、経時的に複数のｃｒファージの存在を決定するために、マウスで小規模な研究が行われた。潜在的なファージ分解を軽減するために、マウスに０．２ｍＬの６％重炭酸ナトリウムを強制経口投与して、ｃｒファージ投与の約３０分前に胃酸レベルを低下させた。２００μＬの１×トリス緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中の各ｃｒＴ７、ｃｒＴ７ｍおよびｃｒＴ４の合計２．７×１０９ＰＦＵの単回投与を、条件／時点ごとにＮ＝３マウスに強制経口投与した。動物をさまざまな時点で屠殺し、全組織ホモジネートから全ＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲ分析を行って、存在するｃｒＴ７（図２５Ａ）、ｃｒＴ４（図２５Ｂ）、またはｃｒＴ７ｍ（図２５Ｃ）の量を定量化した。示されている平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）は、３匹の動物からの３回の技術的複製の結果である。
【０２８７】
図２５Ａ−図２５Ｃに示すように、消化管を通過する際、および糞便中においても各ｃｒファージを正常に検出することができた。７２時間までに、かなりの量のｃｒファージカクテルがどの組織でも検出されなくなり、ｃｒファージが正常に除去されたことを示している。これらのデータは、図２４のファージ滴定によって定量化された、尿道内単回投与後の経時的なｃｒファージの喪失の観察を裏付けている。特に、これらのデータは、図２４の尿道内投与後に観察されるように、ｃｒファージの経口投与は特に血液および肝臓組織での全身曝露をもたらすことを示唆している。
【０２８８】
実施例２２：ＬｅｕＯ増強ｃｒファージ非ＧＬＰ毒性試験
ｃｒＴ７およびｃｒＴ７ｍを含むｃｒファージカクテルの試験品を静脈内（１０×１０１１ＰＦＵ／用量／ファージ）または膀胱へのカテーテル内注入（０．５×１０１１ＰＦＵ／用量／ファージ）により、雌のＣｒｌ：ＣＤ−１マウスに７日間連続して１日１回。以下の表１８に記載されているように、ｃｒファージは７日間の毒物学研究のために調製された。
【０２８９】
【表１８】
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表１８：７日間の毒物学研究のためのｃｒファージ。
ｃｒファージ調製物は、無菌のエンドトキシンフリーのＩＸトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ  ７．４）を使用して調製した。グループ１および２（９匹の雌マウス／グループ）に、０．１ｍＬのビヒクル（ＩＸトリス緩衝生理食塩水、ｐＨ  ７．４）または尾静脈内の試験品を投与した。グループ３および４（９匹の雌マウス／グループ）に、カテーテル注射器を使用して、０．０５ｍＬのビヒクルまたは試験品を膀胱に投与した。グループの割り当てと投与量のレベルは、以下の表１９に記載されている。
【０２９０】
表１９：非ＧＬＰ毒性試験のグループ割り当てと用量レベル。
【０２９１】
【表１９】
2021522857.tif 000039
【０２９２】
研究期間中、動物の臨床徴候を１日２回モニターした。詳細な臨床観察は、投与前期間中および８日目の剖検前に１回実施された。体重は、投与前の期間と１、３、および７日目に１回測定された。食物消費量は７日間の投与期間中に測定された。８日目に、グループごとに６匹の動物が剖検のためにランダムに選択され、残りの３匹は剖検なしで廃棄された。剖検時に、少なくとも４時間絶食させた動物から体重を収集し、体重に対する臓器重量の計算に使用した。臨床病理学評価、血液学（３匹のマウス／グループ）および血清化学パラメーター（３匹のマウス／グループ）は、予定された剖検の日に行われた。死後の評価には、剖検と選択した臓器重量の測定が含まれていた。完全な組織リストは剖検時に収集された。収集した組織を、液体窒素で凍結した１つのセクション（＜−７０°Ｃで凍結保存）で切片化し、２番目のセクションを１０％中性緩衝ホルマリンで保存した。
【０２９３】
ｃｒファージに関連する死亡率または罹患率はなく、体重への影響も、どちらの投与経路でも異常な臨床的観察はないであった。血液学に対するファージ関連の影響は、ｃｒファージ  ＩＶ治療群において、ヘモグロビンレベルの低下と他のＲＢＣ質量関連パラメーターの減少、網状赤血球数の増加、および好酸球数の減少に限定されていた。血清化学に対するｃｒファージ関連の影響は、ｃｒファージＩＵ治療群のコレステロールとトリグリセリドのレベルが高いことに限定されていた。臓器重量に対するｃｒファージ関連の影響（絶対および体重と脳の重量に対する相対）は、ｃｒファージＩＶ治療群の脾臓と腎臓の重量の増加と肺の重量の減少で構成されていた。
【０２９４】
結論として、ｃｒファージの１日１回のＩＶまたはＩＵ投与は十分に許容された。ファージＩＶ治療群で考えられる試験品関連の影響は、赤血球量関連パラメーターの減少、網状赤血球数の増加、好酸球の減少、脾臓、腎臓の増加、および肺重量の減少に限定されていた。ファージＩＵ治療群で考えられる試験品関連の影響は、コレステロールとトリグリセリドのレベルが高いことに限定されていた。この研究の臨床化学と臓器重量の結果は、使用されるサンプルサイズが小さい（臨床化学の場合は３、臓器重量の場合は６）こと、およびこれらの変化がサンプルサイズが小さいことによるアーティファクトである可能性との関連で検討する必要がある。
【０２９５】
実施例２３：Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅで同等のＬｅｕＯを特定する
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓオペロンは、Ｅ。ｃｏｌｉで見られるようにＬｅｕＯおよびＨ−ＮＳによって制御されていない。むしろ、調節は、ｃｃｐＡ結合部位の非存在下でｃｃｐＡ依存的にグルコースによって調節される。特に、ＣＤ２９８３のアップレギュレーションは、栄養素シフト中のＣａｓオペロンのアップレギュレーションと関連している。さらに、ＣＤ２９８３の規制は、グローバルな厳格な応答レギュレーターであるＣｏｄＹによって制御されているようである。タイプＩ−Ｄシステムで配列が類似している（＞４０％の類似性）タンパク質が失われると、Ｃａｓオペロンからの発現が増加することが示されている。
【０２９６】
そのため、ＣｏｄＹおよびＣＤ２９８３は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＨＮＳおよびＬｅｕＯと類似している可能性がある。両方のシステム間の類似性は、以下の表２０に要約されている。
【０２９７】
【表２０】
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表２０：Ｅ．ｃｏｌｉおよびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅにおけるＣａｓオペロン調節の特徴の要約。
【０２９８】
実施例２４：溶原モジュールノックアウトバクテリオファージのエンジニアリングと検証
操作−ｃｐＣＤ２４−２の溶原領域に隣接する相同性アームと溶原領域を標的とする逆選択的ｃｒＲＮＡを含むプラスミドをｉｎｓｉｌｉｃｏで設計し、ＢｉｏＢａｓｉｃで合成した。プラスミドをＡ．ｃｏｌｉに形質転換し、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株ＣＤ１９にコンジュゲートした。ｃｐＣＤ２４−２はエンジニアリングプラスミドを保持するＣＤ１９で増幅された。得られたファージ集団を、人工ファージの存在についてＰＣＲスクリーニングした。バルクＰＣＲスクリーニングが陽性の場合、ライセートにプラークを塗布し、ｃｌリプレッサー遺伝子ノックアウトについて個々のプラークをスクリーニングした。純粋に人工ファージは、検証研究で使用するために高力価に増幅された。
【０２９９】
検証−対数増殖期中期のＣＤ１９培養物を、ＢＨＩ（増殖培地、処理コントロールなし）、ＷＴ  ＣＤ２４−２、またはＡｃｔ  ＣＤ２４−２（すなわち、溶原モジュールノックアウト）で処理した。図２６Ａは、処理後のさまざまな時点でカウントされた生存細胞数（ＣＦＵ／ｍＬ）を示している。生き残った細胞は、溶原化されたＣＤ２４−２の存在についてさらにスクリーニングされた。図２６Ｂは、処理後のさまざまな時点で存在する溶原菌の割合を示している。
【０３００】
実施例２５：マイクロバイオーム関連障害の治療
対象のマイクロバイオームを調整するために、本明細書に記載の操作されたバクテリオファージを含む医薬組成物を対象に投与することができる。医薬組成物は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ活性、溶解活性、またはそれらの組み合わせによって、マイクロバイオーム内の単一または複数の細菌集団を調節または死滅させることができる。
【０３０１】
実施例２６：尿道内（ＩＵ）または静脈内（ＩＶ）投与後の膀胱および腎臓における大腸菌の減少を示すＵＴＩ有効性研究
ＮＣ１０１でコロニー形成したマウスを生理食塩水、ファージカクテル（２．４ｘｌ０１０ＰＦＵ／ｍＬ）で処理した。またはシプロフロキサシン。
シプロフロキサシン（１−シクロプロピ］−６−フルオロ−１．４ジヒドロ−４−オキソ−７−（１−ピペラジニル）−３−キノリンカルホキシル酸塩酸塩）は抗生物質であるは効果的であるは使用すると無数の副作用と細菌耐性が生じる。
【０３０２】
この実施例では、組織は単回投与後または５回投与後に収集され、ＣＦＵについて分析された。ファージ治療は、膀胱（図３０Ａ−図３０Ｂ）と腎臓（図３０Ｃ−図３０Ｄ）の両方のＣＦＵを減少させる。結果は、ファージのＩＵおよびＩＶ送達が膀胱内のＣＦＵを減少させることを例示している。さらに、結果は、ｃｒファージカクテルが膀胱内の１２０時間でｗｔファージカクテルよりも１．５〜３．５  ｌｏｇ改善された死滅を有することを例示している（図３０Ｂ）。結果はまた、送達経路に関係なく、１２０時間でｃｒファージカクテルが膀胱内のシプロフロキサシンと同等に機能することを例例示する。
【０３０３】
この研究はさらに、尿（図３１Ａ）、腎臓（図３１Ｂ）、膀胱（図３１Ｃ）、脾臓（図３１Ｄ）などのさまざまな組織や体液へのファージの経路依存的な浸透を示している。結果は、治療経路に関係なく、尿中に測定可能なファージが存在することを示している。
【０３０４】
実施例２７：異なる投与経路を介してＷＴと人工カクテルを比較した研究グレードの材料のＵＴＩ有効性研究の比較
ＮＣ１０１でコロニー形成したマウスを生理食塩水で処理した。ファージカクテル（２．４ｘｌ０１０ＰＦＵ／ｍＬ）；またはシプロフロキサシン。組織は、単回投与後または５回投与後に収集され、ＣＦＵについて分析された。ファージ治療は、膀胱（図３３Ａ−図３３Ｂ）と腎臓（図３３Ｃ−図３３Ｄ）の両方のＣＦＵを減少させる。結果は、ファージのＩＵおよびＩＶ送達が膀胱内のＣＦＵを減少させることを例示している。さらに、結果は、高力価のｃｒファージカクテルが膀胱内で１２０時間でビヒクルよりも５．１  ｌｏｇ改善された死滅を示し（図３３Ｂ）、送達経路に関係なく、高用量のｃｒファージが１２０時間で膀胱内のシプロフロキサシンよりも優れていることを示している（図３３Ｂ）。
【０３０５】
実施例２８：大腸菌がコロニーを形成した成人におけるｃｒファージの安全性、薬物動態、および潜在的な有効性を評価するための臨床試験
フェーズｌｂ−安全性、忍容性、およびＰＫ研究は、カテーテル注入による最大実行可能用量ＢＩＤによる尿路コロニー形成の患者で実施される。
ファージの持続時間、分布および排泄に関連する薬物動態は膀胱で確認されている。非毒性でヒト細胞に感染することができないバクテリオファージは、高い治療指数を与える。
【０３０６】
フェーズ２−非劣性、２：１ランダム化対標準治療、二重盲検臨床試験は、ＭＤＲおよびＣＲ株を含む再発性尿路感染症（ＵＴＩ）の成人患者、および腎盂腎炎の患者で実施される。ＩＶ投与および投与計画が評価される。
【０３０７】
主要評価項目：治療終了時のＵＴＩ症状の解消と治癒試験（ＴＯＣ−治療終了後７日）、ＴＯＣで測定された尿培養での細菌性病原体の減少＜１０３ＣＦＵ／ｍＬ（微生物学的成功）の実証。
【０３０８】
二次エンドポイント：免疫原性（抗ファージ抗体の存在）、ＱｏＬ測定（疼痛／不快感など）、応答の持続性。
【０３０９】
図３４Ａは、尿路の再発性および無症候性のＥ．ｃｏｌｉコロニー形成を伴う成人で実施された例示的なヒト研究の概略図である。図３４Ｂは、ＵＴＩフェーズ１ｂ研究の例示的な研究参加者の包含および除外基準である。
【０３１０】
実施例２９：ＣＤＡＤ患者のフェーズｌｂ設計
フェーズ１：安全性、忍容性、およびＰＫ研究は、健康なボランティアで実施される（Ｃ．ｄｉｆｆコロニー形成は自然に発生する）。１０〜１４日間の経口投与レジメンと２８日間のフォローアップが評価される。安全性と忍容性が評価される。糞便中のファージとＣ．ディフィシルのＰＫ分析を経時的に評価する。
【０３１１】
フェーズ２：非劣性試験、２：１ランダム化、活性対標準治療（すなわち、バンコマイシン）、２次および３次ＣＤＩ患者を対象とした二重盲検試験
・探索的線量検出
・活性なｃｒファージカクテルとバンコマイシンを１０〜１４日間経口投与（または、未解決の場合は症状が解決するまで）
・主要評価項目：下痢の解消までの時間（ＴＴＲＯＤ）、ＣＤ  ＡＤの再発（下痢までの時間）、および治療期間の完了後８週間までに評価された下痢のグレード、安全性と忍容性の評価、ＰＫ分析
・副次的評価項目：免疫原性（抗ファージ抗体の存在）、追加のＱｏＬ指標、反応の持続性。
【０３１２】
フェーズ３：１０〜１４日間の投与計画（４０日間の研究）でのＳＯＣ（バンコマイシン）と比較した、ファーストラインおよび再発性ＣＤＩのより多くの患者集団における有効性研究、最前線対再発性患者治療のサブ分析
・最初のＦＤＡの相互作用を対象としたプラセボ対照二重盲検試験により、どの拡張データセットが必要かが決定される
・フェーズ２データが有効性と安全性の十分な証拠を提供する場合、より小さなデータセットで十分な場合がある
【０３１３】
実施例３０：人工ファージは、タイプＩＥおよびタイプＩＦのＥ．ｃｏｌｉ株の両方に対して死滅の増加を示す
すべての宿主範囲およびＣＦＥＴ還元実験について、菌株およびファージを以下のように調製した。すべての実験は、塩（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２）を含むＬＢ中の最終容量が２００ｕＬの９６ウェル平底透明プレートで実施した。ＷＴファージとＣＲＩＳＰＲファージを比較するために３つの株を選択した。各大腸菌株を、単独で、ＷＴファージ（ｐ３３ｓ；ｐ４６）とともに、またはＭＯＩ  ０．１のｃｒファージ（ｐ３３ｓ−６；ｐ４６ｃｒ）とともにマイクロタイタープレートに配置した。宿主範囲実験では、培養物をプレートリーダーにて３７℃で２０時間インキュベートし、光学密度（ＯＤ；６００ｎｍ）で集団の増殖をモニターした。ＣＦＵ減少実験では、培養物を振とうインキュベーター内にて３７℃で２４時間インキュベートし、アリコートを（０、３、６、および２４時間）で採取した。結果は、図３５Ａ−図３５Ｆ、および図３６Ａ−図３６Ｆに例示されている。
【０３１４】
実施例３１：ファージカクテルの切り替えは、Ｅ．ｃｏｌｉの標的細菌耐性を克服する
菌株５０８および５２７に対するｃｒＣｏｃｋｔａｉｌ（ｃｒ３３ｓ、ｃｒ４６、ｃｒ４ｋ）について、上記のように宿主範囲実験を設定した。２４時間後、５０８株のみが生存可能なコロニーを生じた。コロニーを３回再ストリークしてファージを除去した。
５０８の耐性株は、同じ宿主範囲プロトコルを使用して、ｃｒＣｏｃｋｔａｉｌおよびＷＴカクテル２（ｐＦＯ、ｐＪＯ、ｐＪｃ、ｐＥ８、ｐＥ４、およびｐＪ４）で再評価された。結果は図３７Ａ−図３７Ｃに例示されている。
【０３１５】
実施例３２：緑膿菌株に対する野生型ファージＰＢ１およびＣＲＩＳＰＲ増強ＰＢ１の比較
４４の緑膿菌株のパネルを、０．０１のＭＯＩ（〜５×１０５細菌および５×１０３ファージまたはＬＢ）でＬＢ、ＰＢ１、またはｃｒ−ＰＢ１のいずれかと混合した。菌株＋ファージまたはＬＢを３７℃で２０時間増殖させ、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６０ｏ）を１時間ごとに測定して増殖曲線を作成した。
ｔ＝４時間からｔ＝１２時間までの値のリーマン和を、非感染、ＰＢ  １感染、およびｃｒ−ＰＢ１感染の培養物について計算した。結果を表２１に示する。表の値は、感染していないコントロールと比較した、ＰＢ１またはｃｒ−ＰＢ１（ＰＢ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）の曲線下面積（ＡＵＣ）の比率を表している。数値が小さいほど、光学濃度の低下が大きくなる。灰色のボックスは、ＡＵＣ比が０．７未満であることを示する。ヒット率は、ＡＵＣ比が０．７未満の株の割合である。
【０３１６】
【表２１】
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2021522857.tif 000042
2021522857.tif 000043
【０３１７】
増殖曲線：ＬＦＰ８０５の固定相培養物を、補足ＬＢ（ＬＢ＋１０ｍＭＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  ＣａＣｌ２）で−１０７ＣＦＵ／ｍｌの濃度に希釈した。野生型ＰＢ１およびｃｒ−ＰＢ１ファージのストックは、補充されたＬＢで１０５ＰＦＵ／ｍｌの濃度に希釈された。細菌とファージのストックを１：１（ＭＯＩ  ０．０１）で混合し、プレートリーダーにて３７℃で２０時間通気しながら増殖させた。ＯＤ６ｏｏは１０分ごとに測定された。増殖曲線は、図３８ＡのＰＢ１およびｃｒ−ＰＢ１について例示されている。
【０３１８】
ＣＦＵの減少：ＬＦＰ８０５の固定相培養物を１．０の光学密度に希釈し、１０ｐＬの希釈培養物を１８０ｐＬのＬＢ（−１０５細菌）に添加した。ＰＢ１およびｃｒ−ＰＢ１を１０８ＰＦＵ／ｍｌに希釈し、１０μＬのファージ（１０６ＰＦＵ）または１０μＬのＬＢのいずれかを加えた。培養物を３７℃で通気しながら増殖させ、接種後４時間および８時間で１０倍希釈液をＬＢ寒天培地にプレーティングして、各培養物のＣＦＵ／ｍｌを決定した。４時間および８時間で計算されたＣＦＵ／ｍｌは、図３８Ｂに、非感染（黒いバー）、野生型ＰＢ１感染（薄い灰色のバー）、またはｃｒ−ＰＢ１ファージ感染培養（中程度の灰色のバー）で例示されている。Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ比較によるｔテストを使用して、ＣＦＵをＰＢ１とｃｒ−ＰＢ１の間で比較した。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＊＝ｐ＜０．００１
【０３１９】
実施例３３：タイプＩＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムによるＥ．ｃｏｌｉおよびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのプラスミドベースの死滅
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｙｐｅ  Ｉテスト：５つのＴｙｐｅ−ＩＣａｓシステムが細菌ｇＤＮＡからｐＵＣＰｌ９にクローン化された。
対応するＥ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）標的化スペーサーは、２番目の互換性のあるプラスミド（ｐＲＳＦｌｂ）にクローン化された。Ｂ１２１エレクトロコンピテントセルは、各Ｃａｓシステムプラスミドと標的化スペーサーまたはｐＲＳＦｌｂコントロールで形質転換された。形質転換体を希釈し、Ｋａｎ  ／  ＣａｒｂＬＢプレートにスポットプレーティングした。３７℃で一晩インキュベートした後、ＣＦＵをカウントした。結果は図３９Ａに例示されている。
【０３２０】
緑膿菌タイプＩテスト：４つのタイプＩＣａｓシステムは細菌ｇＤＮＡからシュードモナス標的化スペーサーとともにｐＵＣＰｌ９にクローン化された。エレクトロコンピテントＰＡ０１セルは、Ｌｏｃｕｓｌａｂプロトコルを使用してコンピテントになった。細胞をＣａｓ  ＋スペーサープラスミドまたはＣａｓプラスミドで形質転換した。形質転換体を希釈し、Ｃａｒｂ３００ＬＢプレートにスポットプレートした。３７℃で一晩インキュベートした後、ＣＦＵをカウントした。結果は図３９Ｂに例示されている。結果は、４つのシステムのうち３つは最小３ログの削減でＰＡ０１を正常に標的にできたことを示している。１つのシステムはどちらのプラスミドに対してもＣＦＵを示さなかった。
【０３２１】
本開示の好ましい実施形態が本明細書に示され、説明されてきたはそのような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者には明らかであろう。多数の変形、変更、および置換は本開示から逸脱することなく、当業者に発生するであろう。本明細書に記載の本開示の実施形態に対する様々な代替案は本開示を実施する際に使用されることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は、開示の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造、ならびにそれらの同等物は、それによってカバーされることが意図されている。
【図１】
2021522857.tif 000044
【図２Ａ】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
2021522857.tif 000050
【図４Ｂ】
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【図５】
2021522857.tif 000052
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2021522857.tif 000054
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
2021522857.tif 000060
【図６Ｉ】
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【図６Ｊ】
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【図６Ｋ】
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【図６Ｌ】
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【図６Ｍ】
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【図６Ｎ】
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【図６Ｏ】
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【図６Ｐ】
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【図６Ｑ】
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【図６Ｒ】
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【図６Ｓ】
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【図６Ｔ】
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【図６Ｕ】
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【図６Ｖ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
2021522857.tif 000129
【図３５Ｅ】
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【図３５Ｆ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３６Ｄ】
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【図３６Ｅ】
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【図３６Ｆ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【国際調査報告】
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