(57)【要約】  本発明は、変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質またはその生物活性断片、ならびに前記タンパク質またはその断片をコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドに関し、前記変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質またはその生物活性断片は、ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸（ＨＰＰ）からホモゲンチジン酸への変換を触媒する特性を保持または強化し、ＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する感受性が野生型ＨＰＰＤよりも著しく低い。本発明はまた、前記ポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト、発現ベクターおよび宿主細胞、ならびにｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸（ＨＰＰ）からホモゲンチジン酸への変換を触媒する特性を有し、ＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する感受性が著しく低い植物を製造するための方法に関する。
2021526849.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質またはその生物活性断片であって、前記変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質のアミノ酸配列が、野生型イネｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質のアミノ酸配列と比較して、配列番号２で表される野生型イネｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質のアミノ酸配列の９３、１０３、１４１、１６５、１９１、２２０、２２６、２７６、２７７、３３６、３３７、３３８、３４２、３４６、３７０、３７７、３８６、３９０、３９２、４０３、４１０、４１８、４１９、４２０、４３０および４３１に対応する１つ以上の位置に、９３Ｓ、１０３Ｓ、１４１Ｒ、１４１Ｋ、１４１Ｔ、１６５Ｖ、１９１Ｉ、２２０Ｋ、２２６Ｈ、２７６Ｗ、２７７Ｎ、３３６Ｄ、３３７Ａ、３３８Ｄ、３３８Ｓ、３３８Ｙ、３４２Ｄ、３４６Ｃ、３４６Ｄ、３４６Ｈ、３４６Ｓ、３４６Ｙ、３７０Ｎ、３７７Ｃ、３８６Ｔ、３９０Ｉ、３９２Ｌ、４０３Ｇ、４１０Ｉ、４１８Ｐ、４１９Ｆ、４１９Ｌ、４１９Ｖ、４２０Ｓ、４２０Ｔ、４３０Ｇおよび４３１Ｌからなる群から選択される１つ以上の変異を有する、前記変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質またはその生物活性断片。
【請求項２】
前記変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して、さらに少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１に記載の変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質またはその生物活性断片。
【請求項３】
前記変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質が、請求項１で規定される１つ以上のアミノ酸変異を有すること以外は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質またはその生物活性断片。
【請求項４】
前記変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２で表される野生型イネｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質のアミノ酸配列の９３、１０３、１４１、１６５、１９１、２２０、２２６、２７６、２７７、３３６、３３７、３３８、３４２、３４６、３７０、３７７、３８６、３９０、３９２、４０３、４１０、４１８、４１９、４２０、４３０および４３１に対応する１つ以上の位置に、Ｒ９３Ｓ、Ａ１０３Ｓ、Ｈ１４１Ｒ、Ｈ１４１Ｋ、Ｈ１４１Ｔ、Ａ１６５Ｖ、Ｖ１９１Ｉ、Ｒ２２０Ｋ、Ｇ２２６Ｈ、Ｌ２７６Ｗ、Ｐ２７７Ｎ、Ｐ３３６Ｄ、Ｐ３３７Ａ、Ｎ３３８Ｄ、Ｎ３３８Ｓ、Ｎ３３８Ｙ、Ｇ３４２Ｄ、Ｒ３４６Ｃ、Ｒ３４６Ｄ、Ｒ３４６Ｈ、Ｒ３４６Ｓ、Ｒ３４６Ｙ、Ｄ３７０Ｎ、Ｉ３７７、Ｐ３８６Ｔ、Ｌ３９０Ｉ、Ｍ３９２Ｌ、Ｅ４０３Ｇ、Ｋ４１０Ｉ、Ｋ４１８Ｐ、Ｇ４１９Ｆ、Ｇ４１９Ｌ、Ｇ４１９Ｖ、Ｎ４２０Ｓ、Ｎ４２０Ｔ、Ｅ４３０ＧおよびＹ４３１Ｌからなる群から選択される１つ以上の変異を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質またはその生物活性断片。
【請求項５】
前記変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質が、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２または配列番号８４で表されるアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質またはその生物活性断片。
【請求項６】
前記変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質のアミノ酸配列が以下のアミノ酸変異：Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ、Ｈ１４１Ｒ／Ｄ３７０Ｎ、Ｇ３４２Ｄ／Ｄ３７０Ｎ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ、Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ、Ｋ４１８Ｐ／Ｇ４１９Ｆ、Ｇ４１９Ｆ／Ｎ４２０Ｓ、Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｃ、Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｈ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ４２０Ｓ、Ｇ３３８Ｄ／Ｋ４１８Ｐ、Ｐ２７７Ｎ／Ｎ３３８Ｄ、Ｌ２７６Ｗ／Ｐ２７７Ｎ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｄ３７０Ｎ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｎ４２０Ｓ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｓ／Ｎ４２０Ｓ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｓ／Ｇ３４２Ｄ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｙ／Ｇ３４２Ｄ、Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｃ、Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｈ、Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｓ、Ｎ３３８Ｓ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｃ、Ｎ３３８Ｓ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｈ、Ｎ３３８Ｓ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｓ、Ｎ３３８Ｙ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｃ、Ｎ３３８Ｙ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｈ、Ｎ３３８Ｙ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｓ、Ｐ３３６Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｃ、Ｐ３３６Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｈ、Ｐ３３６Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｓ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｄ／Ｒ３４６Ｃ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｄ／Ｒ３４６Ｈ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｄ／Ｒ３４６Ｓ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｓ／Ｒ３４６Ｃ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｓ／Ｒ３４６Ｈ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｓ／Ｒ３４６Ｓ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｙ／Ｒ３４６Ｃ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｙ／Ｒ３４６Ｈ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｙ／Ｒ３４６Ｓ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｋ４１８Ｐ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｇ４１９Ｆ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｐ３８６Ｔ、Ｋ４１８Ｐ／Ｇ４１９Ｆ／Ｎ４２０Ｔ、Ｋ４１８Ｔ／Ｇ４１９Ｆ／Ｎ４２０Ｔ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｃ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｈ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｎ４２０Ｓ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｐ２７７Ｎ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｐ３３６Ｄ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｌ２７６Ｗ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｓ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｌ３９０Ｉ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｉ３７７Ｃ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｍ３９２Ｌ、Ｈ１４１Ｒ／Ｐ３３７Ａ／Ｇ３４２Ｄ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｓ／Ｇ３４２Ｄ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｙ／Ｇ３４２Ｄ、Ｐ２７７Ｎ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ、Ｐ２７７Ｎ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｃ、Ｐ２７７Ｎ／Ｎ３３８Ｄ／Ｎ４２０Ｓ、Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｋ４１８Ｐ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｋ４１８Ｐ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｇ４１９Ｆ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｐ３８６Ｔ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｃ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｈ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｋ４１８Ｐ／Ｇ４１９Ｆ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｌ２７６Ｗ／Ｐ２７７Ｎ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｃ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｈ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｓ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｓ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｃ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｓ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｈ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｓ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｓ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｙ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｃ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｙ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｈ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｙ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｓ、Ｐ２７７Ｎ／Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ、Ｐ２７７Ｎ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｃ、Ｐ２７７Ｎ／Ｎ３３８Ｄ／Ｋ４１８Ｐ／Ｇ４１９Ｆ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｋ４１８Ｐ／Ｇ４１９Ｆ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｇ４１９Ｆ／Ｎ４２０Ｓ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３３６Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｋ４１８Ｐ／Ｇ４１９Ｆ／Ｎ４２０Ｓ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｋ４１８Ｐ／Ｇ４１９Ｆ／Ｎ４２０Ｓ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｋ４１８Ｐ／Ｇ４１９Ｆ／Ｎ４２０Ｔ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｃ／Ｋ４１８Ｐ／Ｇ４１９Ｆ／Ｎ４２０Ｓ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｈ／Ｋ４１８Ｐ／Ｇ４１９Ｆ／Ｎ４２０Ｓ、Ｈ１４１Ｒ／Ｐ２７７Ｎ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｋ４１８Ｐ／Ｇ４１９Ｆ／Ｎ４２０ＳまたはＨ１４１Ｒ／Ｐ２７７Ｎ／Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｋ４１８Ｐ／Ｇ４１９Ｆ／Ｎ４２０Ｓを有する、請求項４に記載の変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質またはその生物活性断片。
【請求項７】
前記変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質が、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８または配列番号２６０で表されるアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質またはその生物活性断片。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異型ＨＰＰＤタンパク質またはその生物活性断片、およびそれに融合される追加の成分、例えば、タグペプチド、例えば、６×Ｈｉｓ、色素体への誘導ペプチド、例えば、葉緑体への誘導ペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異型ｐ-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質もしくはその生物活性断片、または請求項８に記載の融合タンパク質、またはその相補配列をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、好ましくは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらのハイブリッドであり、好ましくは一本鎖または二本鎖である、前記ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
（１）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８もしくは配列番号２６０に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列、またはそれらの相補配列；
（２）配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号２０７、配列番号２０９、配列番号２１１、配列番号２１３、配列番号２１５、配列番号２１７、配列番号２１９、配列番号２２１、配列番号２２３、配列番号２２５、配列番号２２７、配列番号２２９、配列番号２３１、配列番号２３３、配列番号２３５、配列番号２３７、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５７もしくは配列２５９で表される核酸配列番号、またはそれらの相補配列；
（３）ストリンジェントな条件下で（１）または（２）に示される配列とハイブリダイズする核酸配列；および
（４）遺伝暗号の縮重により（１）または（２）に示される配列と同じアミノ酸配列をコードする核酸配列、またはその相補配列
から選択される核酸配列を有する、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記核酸配列が、植物細胞で発現するように最適化されている、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、およびそれに作動可能に連結される調節エレメントを含む、核酸コンストラクト。
【請求項１３】
請求項９〜１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結される発現調節エレメントを含む、発現ベクター。
【請求項１４】
請求項９〜１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項１２に記載の核酸コンストラクト、または請求項１３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは植物細胞である、前記宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載の植物細胞を植物に再生することを含む、除草剤に対する抵抗性（resistance）または耐性（tolerance）が改善された植物を生産する方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法によって生産される、植物。
【請求項１７】
ＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する植物細胞、植物組織、植物部分または植物の抵抗性または耐性を改善する方法であって、請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質もしくはその生物活性断片、または請求項８に記載の融合タンパク質を植物細胞、植物組織、植物部分または植物において発現させることを含むか；または、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質もしくはその生物活性断片、または請求項８に記載の融合タンパク質を発現する植物と別の植物とを交配し、ＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する抵抗性または耐性が改善された植物またはその部分をスクリーニングすることを含むか；または、
植物細胞、植物組織、植物部分または植物の内因性ＨＰＰＤタンパク質の遺伝子編集をして、請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質もしくはその生物活性断片、または請求項８に記載の融合タンパク質の発現を達成すること含む、
前記方法。
【請求項１８】
ＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する宿主細胞、植物細胞、植物組織、植物部分または植物の抵抗性または耐性を改善のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異型ｐ-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質もしくはその生物活性断片、請求項８に記載の融合タンパク質、または請求項９〜１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの使用であって、前記宿主細胞が、好ましくは細菌細胞または真菌細胞である、前記使用。
【請求項１９】
植物栽培場所における雑草を防除する方法であって、除草上有効量の１つ以上のＨＰＰＤ阻害性除草剤を前記栽培場所に適用することを含み、前記植物が、請求項１６に記載の植物、または請求項１５および１７のいずれか一項に記載の方法により生産された植物を含み；好ましくは、前記ＨＰＰＤ阻害性除草剤が、以下の有効成分：１）トリケトン：スルコトリオン、メソトリオン、ビシクロピロン、テンボトリオン、テフリルトリオンおよびベンゾビシクロン；２）ジケトン：２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−メチルスルホニル−４−トリフルオロメチルフェニル）プロパン−１，３−ジオン、２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−メチルスルホニル−３，４−ジクロロフェニル）プロパン−１，３−ジオンおよび２−シアノ−１−［４−（メチルスルホニル）−２−トリフルオロメチルフェニル］−３−（１−メチルシクロプロピル）プロパン−１，３−ジオン；３）イソキサゾール：イソキサフルトール、イソキサクロルトールおよびクロマゾン；４）ピラゾール：トプラメゾン、ピラスルホトール、ピラゾキシフェン、ピラゾレート、ベンゾフェナプ、シュアンズオカオトン、トルピラレート、ベンズオフカオトン、ファンビフカオトンおよびサンズオファンカオトン；５）ベンゾフェノン；および６）その他：ランコトリオン、フェンキノトリオンの少なくとも１つを含み；より好ましくは、ＨＰＰＤ阻害性除草剤は、少なくとも１つの有効成分：テンボトリオン、ベンズオフカオトン、ファンビフカオトン、トプラメゾン、メソトリオンおよびシュアンズオカオトンを含む、前記方法。
【請求項２０】
前記植物が、食用作物、マメ科作物、油料作物、繊維作物、果物作物、根茎作物、野菜作物、花作物、薬用作物、工業作物、牧草作物、糖作物、飲料作物、芝生植物、樹木作物、ナッツ作物等の二子葉植物または単子葉植物である、請求項１６に記載の植物、請求項１７および１９のいずれか一項に記載の方法、または請求項１８に記載の使用。
【請求項２１】
ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸（ＨＰＰ）からホモゲンチジン酸への変換を触媒する特性を保持または増強し、ＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する感受性が野生型ＨＰＰＤよりも著しく低い変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質の製造方法であって、野生型ＨＰＰＤをコードする核酸を変異させる工程、変異した核酸と発現ベクターの溶解性増強成分をコードする核酸配列とをインフレームで融合および結合させて融合タンパク質をコードする配列を形成する工程、得られた組換え発現ベクターを宿主細胞に形質転換する工程、ＨＰＰＤ阻害性除草剤およびＨＰＰＤ酵素基質を含む適切な条件下で前記融合タンパク質を発現させる工程、およびｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸（ＨＰＰ）からホモゲンチジン酸への変換を触媒する特性を保持または増強し、ＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する感受性が著しく低い変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質をスクリーニングする工程を含み；前記溶解性増強成分が、好ましくは、本発明の変異型ＨＰＰＤタンパク質と融合タンパク質を形成するＮｕｓＡから選択され；前記発現ベクターが、好ましくは、ｐＥＴ−４４ａベクターから選択され；前記宿主細胞が、好ましくは、細菌細胞、真菌細胞または植物細胞から選択される、前記製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農業遺伝子工学の分野に属し、特に、植物に対してＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する抵抗性または耐性を付与する新規の変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）、それをコードする核酸およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）は、ヒドロキシフェニルピルビン酸（ＨＰＰ）がホモゲンチジン酸に変換される反応を触媒する酵素である。この反応は、酵素に結合した鉄および酸素の存在下で起こる。ＨＰＰＤを阻害することによって機能する除草剤はよく公知であり、イソオキサゾール、ジケトンニトリル、トリケトンおよびピラゾリン塩等の様々なタイプが挙げられる。ＨＰＰＤを阻害することにより、チロシンからのプラストキノン（ＰＱ）の生合成が遮断される。ＰＱは、光合成中心の光防護に必要なカロテノイド色素の生合成に不可欠な補因子である。ＨＰＰＤを阻害する除草剤は、師部を通導することができる白化剤であり、光にさらされた新しい分裂組織や葉が白く見える原因になる。カロテノイドが存在しない場合、クロロフィルは光破壊性であり、それ自体が一重項酸素の光増感によって光化学的切断剤になる。
【０００３】
ＨＰＰＤ阻害性除草剤に耐性のある植物を提供するための技術的経路および方法も知られており、阻害剤の存在下であっても植物が利用可能な機能性の酵素を十分に有するように、所定の除草剤に十分に適切な量のＨＰＰＤ酵素が生成されるようにＨＰＰＤ酵素を過剰発現させること、または標的ＨＰＰＤを除草剤に対する感受性が低い機能性ＨＰＰＤに変異させることを含む。ＨＰＰＤ阻害性除草剤は、多くの異なるタイプを網羅する大きなクラスである。所定のＨＰＰＤ酵素は、いくつかのＨＰＰＤ阻害性除草剤に対して有用なレベルの耐性をもたらし得る一方で、異なる、より望ましいＨＰＰＤ阻害性除草剤に対して商業的レベルの耐性をもたらすことは全く不十分である可能性がある（例えば、米国出願公開第２００４／００５８４２７；およびＰＣＴ出願公開第ＷＯ９８／２０１４４およびＷＯ０２／４６３８７；ＨＰＰＤに対して比較的抵抗性を有する大豆品種の識別および標識に関連する米国出願公開第２００５／０２４８００も参照されたい）。さらに、異なるＨＰＰＤ阻害性除草剤は、それらが防除する雑草の範囲、適用される対象作物、製造コストおよびそれぞれについての環境上の利点の観点で異なり得る。したがって、異なる作物および作物品種に対してＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する抵抗性／耐性を付与するための新規の変異型ＨＰＰＤが、当技術分野において依然として必要とされている。
【０００４】
トランスジェニック技術は、除草剤に対して耐性を有する作物や作物品種の作出に広く使用されている。しかしながら、登録コスト（registration cost）が高いため、トランスジェニック作物の使用は制限されており、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に代表される遺伝子編集技術の進歩により、この状況は変わる可能性がある。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、２０１２年以降に登場した新たな部位特異的遺伝子編集技術である（Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., and Charpentier, E. 2012. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337: 816-821.；Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, P. D., Wu, X., Jiang, W., Marraffini, L. A., and Zhang, F. 2013. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339: 819-823；Li, J. F., Norville, J. E., Aach, J., Mccormack, M., Zhang, D., Bush, J., Church, G. M., and Sheen, J. 2013. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nat. Biotechnol. 31: 688.；Mali, P., Yang, L., Esvelt, K. M., Aach, J., Guell, M., Dicarlo, J. E., Norville, J. E., and Church, G. M. 2013. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339: 823.）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにより編集された標的の認識は、核酸分子間の塩基対形成に依存している。このシステムは、ＰＡＭ（ＮＧＧ）に隣接する任意の２０ｂｐの標的配列を編集することができる。さらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは操作が簡単であり、標的ごとに元のベクターの２０〜３０ｂｐの標的ヌクレオチド配列を置換するだけで済み、ハイスループット操作に適している。このシステムによって、複数の異なる遺伝子と同じように、同じ遺伝子の複数の部位を同時に編集することができる。現在、この技術は、生物医学、機能性ゲノミクス、形質の改善、動植物の新たな形質の創出に大きな展望を示しており、動植物の育種を促進する上で革命的な役割を果たしている（Hui Zhang, Jinshan Zhang, Zhaobo Lang, Jose Ramon Botellad, and Jian-Kang Zhu. 2017. Genome Editing-Principles and Applications for Functional Genomics Research and Crop Improvement, Critical Reviews in Plant Sciences, 36:4, 291-309, DOI:10.1080/07352689.2017. 1402989） 。
【０００５】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、第３世代の遺伝子編集ツールとして、３つの主要な方法で部位指向の編集を実現する。第一に、変異型を得るための部位特異的遺伝子ノックアウトである。具体的には、Ｃａｓ９は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の指示の下で標的部位を認識して切断し、二本鎖ＤＮＡ切断を生成する。ＤＮＡ切断は通常は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復され、フレームシフト変異が修復の過程で簡単に発生し、遺伝子の破壊をもたらす。部位特異的遺伝子ノックアウトの有効性は高いものである。第二に、標的配列を置換するか、または部位特異的挿入を達成するための標的の相同置換である。二本鎖ＤＮＡの切断が生じた場合、相同修復のテンプレートが近くに存在すると、相同置換または部位特異的挿入が起こることがある。相同置換の有効性は低く、置換される配列の長さが長くなるにつれて極めて低くなる。第三に、３番目のアプローチは塩基編集である（Komor AC, Kim YB, Packer MS, Zuris JA, Liu DR. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 2016 May 19; 533(7603):420-4. doi: 10.1038/nature17946；Gaudelli NM, Komor AC, Rees HA, Packer MS, Badran AH, Bryson DI, Liu DR. Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature. 2017 Nov 23; 551(7681): 464-471. doi: 10.1038/nature 24644. Epub 2017 Oct 25. Erratum in: Nature. 2018 May 2）。塩基編集は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用して、ゲノム内の特定の部位にデアミナーゼを標的として、特定の塩基を修飾する遺伝子編集方法である。この方法は、イネにおいて良好に適用されている。例えば、Yan F., Kuang Y., Ren B., Wang J., Zhang D., Lin H., Yang B., Zhou X., and Zhou H. (2018). High-efficient A・T to G・C base editing by Cas9n-guided tRNA adenosine deaminase in rice. Mol. Plant. doi: 10.1016/j.molp. 2018.02.008。
【０００６】
さらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１も遺伝子編集に使用することができる（Zetsche, B., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Slaymaker, I.M., Makarova, K. S., Essletzbichler, P., Volz, S. E., Joung, J., Oost, J., Regev, A., Koonin, E. V., and Zhang, F. 2015. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a Class 2 CRISPR Cas system. Cell. 163: 759-771；Endo, A., Masafumi, M., Kaya, H., and Toki, S. 2016a. Efficient targeted mutagenesis of rice and tobacco genomes usingCpf1 from Francisella novicida. Sci. Rep. 6: 38169.）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１は、Ｃｐｆ１酵素と、システムの特異性を決定するｃｒＲＮＡとの２つの主要成分を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに類似しているが、これらの間には特定の重要な違いがある（Hui Zhang, Jinshan Zhang, Zhaobo Lang, Jose Ramon Botella & Jian-Kang Zhu (2017) Genome Editing - Principles and Applications for Functional Genomics Research and Crop Improvement, Critical Reviews in Plant Sciences, 36:4, 291-309, DOI:10.1080/07352689.2017.1402989）。第一に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、ＣＲＳＩＰＲ／Ｃａｓ９システムに必要なトランス作用性ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を必要としない。第二に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは比較的短く、１９ヌクレオチドのリピートと２３〜２５ヌクレオチドのスペーサーを含む４２〜４４ヌクレオチド
を有するのみである。第三に、同じ位置（ＰＡＭの３〜４ｂｐ上流）においてＤＮＡ二本鎖を切断して平滑末端を生成するＣａｓ９とは異なり、Ｃｐｆ１はＰＡＭ配列の２３ｂｐ下流で標的配列を切断し、ＰＡＭ配列の１８ｂｐ下流で非標的一本鎖を切断して、５ｂｐのオーバーハングを有する粘着末端を生成する。生じる粘着末端は、ＨＤＲを介したドナーＤＮＡのＣｐｆ１の切断部位への挿入の効率を高めることができる。第四に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、複数の標的または遺伝子を編集するときに小さなｃｒＲＮＡの複数のアレイを駆動するために、必要なプロモーターが１つのみであるため、複数の標的の編集に最適である。第五に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、標的配列の３’末端にＧリッチ（５’−ＮＧＧ−３’）ＰＡＭ配列を必要とするのに対し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１は、標的配列の５’末端にＴリッチ（５’−ＴＴＴＮ−３’）ＰＡＭ配列を必要とし、複数のＡ／ＴＤＮＡまたは遺伝子の編集に適している。現在、フランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）のＦｎＣｐｆ１、アシダミノコッカス種（Acidaminococcus sp.）のＡｓＣｐｆ１およびラクノスピラセア科細菌（Lachnospiraceae bacterium）のＬｂＣｐｆ１を含む、３つの設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムが開発されている。これら３つのＣｐｆ１システムはすべて、イネ、シロイヌナズナ、タバコおよびダイズを含むいくつかの種における植物ゲノム編集に使用されている（Endo, A., Masafumi, M., Kaya, H., and Toki, S. 2016a. Efficient targeted mutagenesis of rice and tobacco genomes usingCpf1 from Francisella novicida. Sci. Rep. 6: 38169；Kim, H., Kim, S. T., Ryu, J., Kang, B. C., Kim, J. S., and Kim, S.G. 2017. CRISPR/Cpf1-mediated DNA-free plant genome editing. Nat. Commun. 8: 14406.；Tang, X., Lowder, L. G., Zhang, T., Malzahn, A. A., Zheng, X., Voytas, D. F., Zhong, Z., Chen, Y., Ren, Q., and Li, Q. 2017. A CRISPR-Cpf1 system for efficient genome editing and transcriptional repression in plants. Nat. Plants. 3: 17018.；Wang, M., Mao, Y., Lu, Y., Tao, X., and Zhu, J. K. 2017a. Multiplex gene editing in rice using the CRISPR-Cpf1 system. Mol. Plant. 10: 1011-1013）。
【０００７】
現在、遺伝子編集の分野における研究の焦点の１つは、遺伝子編集による相同置換、部位特異的改変または単一塩基編集によって、重要な作物の除草剤に対する耐性をいかに改善するかということであり、いくつかの成功例が報告されているが、それらのほとんどは、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）阻害性除草剤に対する耐性（Yongwei Sun, Xin Zhang, Chuanyin Wu, Ubing He, Youzhi Ma, Han Hou, Xiuping Guo, Wenming Du, Yunde Zhao and Lanqin Xia. 2016. Engineering Herbicide-Resistant Rice Plants through CRISPR/Cas9-Mediated Homologous Recombination of Acetolactate Synthase. Molecular Plant 9,628-631 doi.org/10.1016/j.molp.2016.01.001；Yiyu Chen, Zhiping Wang, Hanwen Ni, Yong Xu, Qijun Chen, Linjian Jiang. 2017. CRISPR/Cas9-mediated base-editing system efficiently generates gain-of-function mutations in Arabidopsis. Sci China Life Sci 60. doi: 10.1007/s11427-017-9021-5）およびグリホセート除草剤（ＷＯ２０１７０２８７６８Ａ１）に焦点を当てたものである。したがって、科学者は、様々なタイプの除草剤に対する作物の耐性を改善するために、研究を継続し、新しいアプローチを開発する必要がある。
【発明の概要】
【０００８】
上記を踏まえ、本発明は、植物に対してＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する抵抗性または耐性を付与する変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）を提供するものであり、上記変異型ＨＰＰＤは、ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸（ＨＰＰ）からホモゲンチジン酸への変換を触媒する特性を保持または増強し、ＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する感受性が野生型ＨＰＰＤよりも著しく低い。本発明はまた、変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの生物活性断片、上記タンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチド、およびそれらの使用に関する。
【０００９】
したがって、一つの態様において、本発明によれば、配列番号２で表される野生型イネｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質のアミノ酸配列の９３、１０３、１４１、１６５、１９１、２２０、２２６、２７６、２７７、３３６、３３７、３３８、３４２、３４６、３７０、３７７、３８６、３９０、３９２、４０３、４１０、４１８、４１９、４２０、４３０および４３１に対応する１つ以上の位置に、９３Ｓ、１０３Ｓ、１４１Ｒ、１４１Ｋ、１４１Ｔ、１６５Ｖ、１９１Ｉ、２２０Ｋ、２２６Ｈ、２７６Ｗ、２７７Ｎ、３３６Ｄ、３３７Ａ、３３８Ｄ、３３８Ｓ、３３８Ｙ、３４２Ｄ、３４６Ｃ、３４６Ｄ、３４６Ｈ、３４６Ｓ、３４６Ｙ、３７０Ｎ、３７７Ｃ、３８６Ｔ、３９０Ｉ、３９２Ｌ、４０３Ｇ、４１０Ｉ、４１８Ｐ、４１９Ｆ、４１９Ｌ、４１９Ｖ、４２０Ｓ、４２０Ｔ、４３０Ｇおよび４３１Ｌからなる群から選択される１つ以上の変異を有する変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質が提供される。好ましくは、上記変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質のアミノ酸配列はさらに、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。より好ましくは、上記変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質は、配列番号２で表される野生型イネｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質のアミノ酸配列の９３、１０３、１４１、１６５、１９１、２２０、２２６、２７６、２７７、３３６、３３７、３３８、３４２、３４６、３７０、３７７、３８６、３９０、３９２、４０３、４１０、４１８、４１９、４２０、４３０および４３１の位置に対応する１つ以上の位置に、９３Ｓ、１０３Ｓ、１４１Ｒ、１４１Ｋ、１４１Ｔ、１６５Ｖ、１９１Ｉ、２２０Ｋ、２２６Ｈ、２７６Ｗ、２７７Ｎ、３３６Ｄ、３３７Ａ、３３８Ｄ、３３８Ｓ、３３８Ｙ、３４２Ｄ、３４６Ｃ、３４６Ｄ、３４６Ｈ、３４６Ｓ、３４６Ｙ、３７０Ｎ、３７７Ｃ、３８６Ｔ、３９０Ｉ、３９２Ｌ、４０３Ｇ、４１０Ｉ、４１８Ｐ、４１９Ｆ、４１９Ｌ、４１９Ｖ、４２０Ｓ、４２０Ｔ、４３０Ｇおよび４３１Ｌからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸変異を有すること以外は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する。
【００１０】
別の態様において、本発明によれば、変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質の生物活性断片が提供され、該断片は、上記タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端の１つ以上（例えば、１〜５０、１〜２５、１〜１０または１〜５０、例えば、１、２、３、４または５）アミノ酸残基の部分を欠くが、完全長タンパク質の所望の生物学的活性が依然として保持されており、すなわち、上記断片は、ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸（ＨＰＰ）からホモゲンチジン酸への変換を触媒する特性を保持または強化し、ＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する感受性が野生型ＨＰＰＤまたは対応するその生物活性断片よりも大幅に低い。
【００１１】
本発明はさらに、本発明の変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質またはその生物活性断片、およびそれに融合される追加の成分、例えば、ペプチドまたはポリペプチド成分を含む融合タンパク質に関する。好ましくは、上記成分は、例えば、その単離および精製を容易にし、その安定性を高め、その半減期を延長し、追加の生物活性をもたらし、そして融合ＨＰＰＤタンパク質を、色素体等、例えば葉緑体等の標的領域に誘導する等の、所望の特性を融合タンパク質に付与する。対応する成分の選択肢は、当業者に公知である。
【００１２】
別の態様において、本発明によれば、上記変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質もしくはその生物活性断片または上記融合タンパク質をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００１３】
本発明によれば、上記ポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結された調節エレメントを含む核酸コンストラクトがさらに提供される。
【００１４】
さらなる態様において、本発明によれば、上記ポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結された発現調節エレメントを含む発現ベクターが提供される。
【００１５】
さらに別の態様において、本発明によれば、上記ポリヌクレオチド、核酸コンストラクトまたは発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。
【００１６】
本発明によれば、ＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する抵抗性または耐性が改善された植物を生産する製造する方法がさらに提供される。
【００１７】
本発明はさらに、上記方法によって製造された植物に関する。
【００１８】
本発明によれば、上記変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質もしくはその生物活性断片または本発明の融合タンパク質を植物中で発現させることを含む、植物のＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する抵抗性または耐性を改善する方法も提供される。
【００１９】
本発明によれば、上記変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質もしくはその生物活性断片または本発明の融合タンパク質を発現する植物と、他の植物とを交配することを含む、植物のＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する抵抗性または耐性を改善する方法がさらに提供される。
【００２０】
本発明によれば、植物細胞、植物組織、植物部分または植物の内因性ＨＰＰＤタンパク質遺伝子の遺伝子編集をすることを含む、植物のＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する抵抗性または耐性を改善する方法がさらに提供される。
【００２１】
本発明はさらに、植物のＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する抵抗性または耐性を改善するための、上記変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質もしくはその生物活性断片または本発明の融合タンパク質の使用に関する。
【００２２】
本発明はさらに、除草有効量の１つ以上のＨＰＰＤ阻害性除草剤を本発明の植物または種子を含む場所に適用することを含む、植物に有意な影響を与えることなく、植物栽培場所における雑草を防除する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、９６ウェルプレートで培養した野生型または変異型イネのＨＰＰＤ遺伝子で形質転換した組換え大腸菌の培地の呈色反応を示し、組換え大腸菌は野生型イネＨＰＰＤ（ＷＴ）または単一部位変異型イネＨＰＰＤの１つを発現し、組換え大腸菌は、除草剤であるテンボトリオン（左）またはベンズオフカオトンの代謝産物（右、構造式は
【化１】
2021526849.tif 000003
）を様々な濃度で含む培地で培養され、様々な程度の色の変化を呈する。同じ濃度の除草剤を含むウェルでは、色が濃いほど、その除草剤に対する抵抗性／耐性が高い。
【００２４】
【図２】図２は、９６ウェルプレートで培養した野生型または変異型イネのＨＰＰＤ遺伝子で形質転換した組換え大腸菌の培地の呈色反応を示し、組換え大腸菌は野生型イネＨＰＰＤ（ＷＴ）または各単一部位変異型イネＨＰＰＤの１つを発現し、組換え大腸菌は、除草剤であるファンビフカオトン（左）またはトプラメゾン（右）を様々な濃度で含む培地で培養され、様々な程度の色の変化を呈する。同じ濃度の除草剤を含むウェルでは、色が濃いほど、その除草剤に対する抵抗性／耐性が高い。
【００２５】
【図３】図３は、９６ウェルプレートで培養した野生型または変異型イネのＨＰＰＤ遺伝子で形質転換した組換え大腸菌の培地の呈色反応を示し、組換え大腸菌は野生型イネＨＰＰＤ（ＷＴ）または各単一部位変異型イネＨＰＰＤの１つを発現し、組換え大腸菌は、除草剤であるメソトリオンを様々な濃度で含む培地で培養され、様々な程度の呈色反応を示す。同じ濃度の除草剤を含むウェルでは、色が濃いほど、その除草剤に対する抵抗性／耐性が高い。
【００２６】
【図４】図４は、９６ウェルプレートで培養した野生型または変異型イネのＨＰＰＤ遺伝子で形質転換した組換え大腸菌の培地の呈色反応を示し、組換え大腸菌は野生型イネＨＰＰＤ（ＷＴ）、またはＨ１４１Ｒ、Ｇ３４２ＤもしくはＤ３７０Ｎもしくはそれらの組み合わせの変異を含む単一部位変異型ＨＰＰＤを発現し、組換え大腸菌は、除草剤であるテンボトリオン（上）またはベンズオフカオトンの代謝産物（下）を様々な濃度で含む培地で培養され、様々な程度の色の変化を呈する。同じ濃度の除草剤を含むウェルでは、色が濃いほど、その除草剤に対する抵抗性／耐性が高い。
【００２７】
【図５】図５は、９６ウェルプレートで培養した野生型または変異型イネのＨＰＰＤ遺伝子で形質転換した組換え大腸菌の培地の呈色反応を示し、組換え大腸菌は野生型イネＨＰＰＤ（ＷＴ）、またはＨ１４１Ｒ、Ｇ３４２Ｄ、Ｄ３７０Ｎもしくはそれらの組み合わせの変異を含む単一部位変異型ＨＰＰＤ（１４１＋３４２はＨ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄを表し、１４１＋３７０はＨ１４１Ｒ／Ｄ３７０Ｎを表し、３４２＋３７０はＧ３４２Ｄ／Ｄ３７０Ｄを表し；かつ１４１＋３４２＋３７０はＨ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｄ３７０Ｎを表す）を発現し、組換え大腸菌は、除草剤であるファンビフカオトン（上）またはトプラメゾンの代謝産物（下）を様々な濃度で含む培地で培養され、様々な程度の色の変化を呈する。同じ濃度の除草剤を含むウェルでは、色が濃いほど、その除草剤に対する抵抗性／耐性が高い。
【００２８】
【図６】図６は、９６ウェルプレートで培養した野生型または変異型イネのＨＰＰＤ遺伝子で形質転換した組換え大腸菌の培地の呈色反応を示し、組換え大腸菌は野生型イネＨＰＰＤ（ＷＴ）、またはＨ１４１Ｒ、Ｇ３４２ＤもしくはＤ３７０Ｎもしくはそれらの組み合わせの変異を含む単一部位変異型ＨＰＰＤを培地中で発現し、組換え大腸菌は、除草剤であるメソトリオンを様々な濃度で含む培地で培養され、様々な程度の色の変化を呈する。同じ濃度の除草剤を含むウェルでは、色が濃いほど、その除草剤に対する抵抗性／耐性が高い。
【００２９】
【図７】図７は、野生型イネＨＰＰＤタンパク質に見られるすべてのアミノ酸変異を示す。
【００３０】
【図８】図８は、９６ウェルプレートで培養した変異型イネＨＰＰＤ遺伝子で形質転換した組換え大腸菌の培地の呈色反応を示し、組換え大腸菌は、近接する位置３３６−３３８−３４２−３４６における様々な変異の組み合わせ、および１４１Ｒ＋３４２Ｄ＋３７０Ｎの組み合わせ（３３６Ｄ、３３８Ｄ、３３８Ｓ、３３８Ｙ、３４２Ｄ、３４６Ｃ、３４６Ｈおよび３４６Ｓは、それぞれＰ３３６Ｄ、Ｎ３３８Ｄ、Ｎ３３８Ｓ、Ｎ３３８Ｙ、Ｇ３４２Ｄ、Ｒ３４６Ｃ、Ｒ３４６ＨおよびＲ３４６Ｓを表し；１４１Ｒ＋３４２Ｄ＋３７０Ｎは、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｄ３７０Ｎを表す）を含む変異型ＨＰＰＤを培地中で発現し、組換え大腸菌は、除草剤であるシュアンズオカオトンの代謝産物（コード番号は１０１、構造式は
【化２】
2021526849.tif 000004
）を様々な濃度で含む培地で培養され、様々な程度の色の変化を呈する。同じ濃度の除草剤を含むウェルでは、色が濃いほど、その除草剤に対する抵抗性／耐性が高い。
【００３１】
【図９】図９は、９６ウェルプレートで培養した変異型イネＨＰＰＤ遺伝子で形質転換した組換え大腸菌の培地の呈色反応を示し、組換え大腸菌は、３または４つの位置の変異の様々な組み合わせ（１４１Ｒ、３３６Ｄ、３３８Ｄ、３３８Ｓ、３３８Ｙ、３４２Ｄ、３４６Ｃ、３４６Ｓ、３４６Ｈ、３７０Ｎ、４１８Ｐおよび４１９Ｆは、それぞれＨ１４１Ｒ、Ｐ３３６Ｄ、Ｎ３３８Ｄ、Ｎ３３８Ｓ、Ｎ３３８Ｙ、Ｇ３４２Ｄ、Ｒ３４６Ｃ、Ｒ３４６Ｓ、Ｒ３４６Ｈ、Ｄ３７０Ｎ、Ｋ４１８ＰおよびＧ４１９Ｆを表す）を含む変異型ＨＰＰＤを培地中で発現し、組換え大腸菌は、除草剤であるシュアンズオカオトンの代謝産物を様々な濃度で含む培地で培養され、様々な程度の色の変化を呈する。同じ濃度の除草剤を含むウェルでは、色が濃いほど、その除草剤に対する抵抗性／耐性が高い。
【００３２】
【図１０】図１０は、シュアンズオカオトンの代謝産物によるＯｓＨＰＰＤ  ＷＴおよびさまざまな変異型の阻害に関する曲線を示し、横軸は化合物１０１の濃度を示し、縦軸は化合物１０１の様々な濃度での酵素の残留活性を示し、阻害剤の濃度が０の場合の反応速度は１００％であり、図中の数字は様々な変異部位を表す。図から、野生型ＷＴは化合物１０１に対して極めて感受性であり、約６０μＭの濃度の化合物１０１で活性が完全に阻害され、各変異型は強く増強された抵抗性を示すことがわかる。この結果に基づいて、化合物１０１による各変異型の活性の阻害を表すＩＣ５０値を計算することができ、同様に、各変異型が、野生型ＯｓＨＰＰＤと比較して顕著に改善された抵抗性を示すことが確認される（１４１Ｒ、３３８Ｄ、３４２Ｄ、３４６Ｃ、３４６Ｈ、３７０Ｎ、３８６Ｔ、４１８Ｐ、４１９Ｆおよび４２０Ｓは、それぞれＨ１４１Ｒ、Ｎ３３８Ｄ、Ｇ３４２Ｄ、Ｒ３４６Ｃ、Ｒ３４６Ｈ、Ｄ３７０Ｎ、Ｐ３８６Ｔ、Ｋ４１８Ｐ、Ｇ４１９ＦおよびＮ４２０Ｓを表す）。
【００３３】
【図１１】図１１は、トランスジェニックイネ（Ｚｈｏｎｇｈｕａ  １１）のＨＰＰＤ阻害性除草剤であるテンボトリオンに対する感受性を示す。変異型ＯｓＨＰＰＤ３Ｍ（Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｄ３７０Ｎ）を発現するイネは、３μＭのテンボトリオンを含む培地で緑色を保つことができるが、ネガティブコントロール（ＣＫ）であるｍＣｈｅｒｒｙを発現する苗も１．０μＭのテンボトリオンの培地で著しく白化する（植物毒性）。
【００３４】
【図１２】図１２は、トランスジェニックイネ（Ｚｈｏｎｇｈｕａ  １１）のＨＰＰＤ阻害性除草剤であるシュアンズオカオトンに対する耐性を示す。イネ変異型ＯｓＨＰＰＤ３Ｍを発現するＴ０世代の植物は、１μ（ｍｕ）当たり有効成分であるシュアンズオカオトン８〜１６グラムに対して耐性を有するが、非トランスジェニックコントロール（ＣＫ）は重度の白化の直後に死滅する（Ａ、Ｂ）；イネ変異型ＯｓＨＰＰＤ３Ｍを発現するＴ１世代の植物は、１μ（ｍｕ）当たり有効成分であるシュアンズオカオトン３２〜６４グラムに対して耐性を有するが、非トランスジェニックコントロールは重度の白化の直後に死滅する（Ｃ、Ｄ）。
【００３５】
【図１３】図１３は、イネＨＰＰＤ遺伝子の塩基編集ベクターを示す。
【００３６】
【図１４】図１４は、塩基編集されたイネ苗とその標的Ｈ１４１Ｒ（ＣＡＣ＞ＣＧＣ）の配列分析を示す。  Ａ：塩基編集された苗：０．４μＭのテンボトリオンを含む培地では、編集に失敗した苗は白化し（植物毒性）、編集に成功した苗は緑色を維持する。  Ｂ：塩基編集された標的配列：野生型イネＨＰＰＤの１４１位のアミノ酸はヒスチジン（Ｈｉｓ）であり、対応するコドンはＣＡＣ（上のパネル）であるが、編集後、対応するアミノ酸はアルギニン（Ａｒｇ）であり、対応するコドンはＣＧＣである（例はハイブリッドであり、二重のピークを示す）。
【００３７】
【図１５】図１５は、イネのｈｐｐｄ遺伝子（Ｏｓｈｐｐｄ＞ＮＣ０２９２５７．１）の構造を示し、２つのエクソン、１つのイントロン、３つの変異部位（１４１、３４２、３７０）、および設計された標的切断部位（ｇＲＮＡ１−２、ｇＲＮＡ２−１）を示す。
【００３８】
【図１６】図１６は、テンプレートＤＮＡの構造を示し、３つの変異アミノ酸１４１−３４２−３７０のコア置換領域の長さは１０５６ｂｐであり、左右の相同性アームの長さはそれぞれ３５０ｂｐであり、６ｂｐはベクターからの切断後、左端と右端のそれぞれで左にあり、テンプレートの全長は１７６８ｂｐであり；ＰＣＲ増幅後のＰＣＲ産物の迅速な遺伝子型決定を容易にするために、ＮｃｏＩ切断部位が除去されており；置換後の再切断を回避するために、テンプレートの元の切断部位にあるＰＡＭ（ＮＧＧ）も除去される。
【００３９】
【図１７】図１７は、イネＨＰＰＤ遺伝子の相同置換された３つの変異部位（Ｈ１４１Ｒ−Ｇ３４２Ｄ−Ｄ３７０Ｎ）を示す。  Ａ：イネＨＰＰＤ遺伝子が編集された苗：０．４μＭのテンボトリオンを含む培地では、編集に失敗した苗（野生型ＷＴ）は白化し（植物毒性）、編集に成功した苗（２つの苗：ＡＷ２およびＡＷ３）は緑色を維持する；  Ｂ：相同置換後、３４２位および３７０位のアミノ酸に対応するコドンが変化する、すなわち、ＧＧＣがＧＡＣになり、ＧＡＣがＡＡＣになる（ハイブリッド；部分的なＧ３４２ＤおよびＤ３７０Ｎがもたらされる）；Ｈ１４１Ｒ（ＣＡＣ＞ＣＧＣ）も正常に編集される（配列は図に示されていない）。
【発明の詳細な説明】
【００４０】
本明細書で使用されるいくつかの用語は、次のように定義される。
【００４１】
本発明において、「ＨＰＰＤ阻害性除草剤」という用語は、それ自体が除草活性を有する物質、またはその効果を変えることができる他の除草剤および／または添加剤と組み合わせて使用される物質を指し、その物質はＨＰＰＤを阻害することにより作用し得る。ＨＰＰＤを阻害することによって除草活性をもたらし得る物質は、当技術分野で公知であり、多くの種類：１）トリケトン、例えば、スルコトリオン（ＣＡＳ番号：９９１０５−７７−８）、メソトリオン（ＣＡＳ番号：１０４２０６−８２−８）、ビシクロピロン（ＣＡＳ番号：３５２０１０−６８−５）、テンボトリオン（ＣＡＳ番号：３３５１０４−８４−２）、テフリルトリオン（ＣＡＳ番号：４７３２７８−７６−１）、ベンゾビシクロン（ＣＡＳ番号：１５６９６３−６６−５）；２）ジケトニトリル、例えば、２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−メチルスルホニル−４−トリフルオロメチルフェニル）プロパン−１，３−ジオン（ＣＡＳ番号：１４３７０１−７５−１）、２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−メチルスルホニル−３，４−ジクロロフェニル）プロパン−１，３−ジオン（ＣＡＳ番号：２１２８２９−５５−５）、２−シアノ−１−［４−（メチルスルホニル）−２−トリフルオロメチルフェニル］−３−（１−メチルシクロプロピル）プロパン−１，３−ジオン（ＣＡＳ番号：１４３６５９−５２−３）；３）イソキサゾール、例えば、イソキサフルトール（ＣＡＳ番号：１４１１１２−２９−０）；イソキサクロルトール（ＣＡＳ番号：１４１１１２−０６−３）、クロマゾン（ＣＡＳ番号：８１７７７−８９−１）；４）ピラゾール、例えば、トプラメゾン（ＣＡＳ番号：２１０６３１−６８−８）；ピラスルホトール（ＣＡＳ番号：３６５４００−１１−９）、ピラゾキシフェン（ＣＡＳ番号：７１５６１−１１−０）；ピラゾレート（ＣＡＳ番号：５８０１１−６８−０）、ベンゾフェナプ（ＣＡＳ番号：８２６９２−４４−２）、シュアンズオカオトン（ＣＡＳ番号：１６２２９０８−１８−２）、トルピラレート（ＣＡＳ番号：１１０１１３２−６７−５）、ベンズオフカオトン（ＣＡＳ番号：１９９２０１７−５５−６）、ファンビフカオトン（ＣＡＳ番号：１８５５９２９−４５−１）、サンズオファンカオトン（ＣＡＳ番号：１９１１６１３−９７−２）；５）ベンゾフェノン；６）その他：ランコトリオン（ＣＡＳ番号：１４８６６１７−２１−３）、フェンキノトリオン（ＣＡＳ番号：１３４２８９１−７０−６）が挙げられる。好ましくは、上記除草剤は、テンボトリオン、ベンズオフカオトン、ファンビフカオトン、トプラメゾン、メソトリオン、シュアンズオカオトンまたはそれらの任意の組み合わせ等である。
【００４２】
「ＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する耐性が増強された」または「ＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する抵抗性が増強された」植物とは、野生型ＨＰＰＤ遺伝子を有する植物と比較して、上記ＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する抵抗性または耐性が高い植物を指す。「ＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する耐性の増強」または「ＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する抵抗性の増強」を有するＨＰＰＤ酵素とは、対応する野生型ＨＰＰＤ酵素タンパク質の活性を阻害することが知られている除草剤濃度で、野生型ＨＰＰＤ酵素よりも少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１５％、より好ましくは少なくとも２０％高い酵素活性を示すようなＨＰＰＤ酵素を指す。本発明において、「ＨＰＰＤ阻害性除草剤耐性」および「ＨＰＰＤ阻害性除草剤抵抗性」という用語は交換可能に使用され、いずれもＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する耐性およびＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する抵抗性を指す。
【００４３】
「野生型」という用語は、自然界に見られる既存の核酸分子またはタンパク質を指す。
【００４４】
「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、本発明において交換可能に使用することができ、１つ以上のアミノ酸残基が天然アミノ酸残基である化学類似体（chemical analog）のポリマーを含む、アミノ酸残基のポリマーを指す。本発明のタンパク質およびポリペプチドは、組換え的に産生されてもよく、または化学的に合成されてもよい。「変異したタンパク質」または「変異タンパク質」という用語は、対応する野生型タンパク質のアミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸残基の置換、挿入、欠失および／または付加を有するタンパク質を指す。
【００４５】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は交換可能に使用され、、二本鎖または一本鎖のいずれかのＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらのハイブリッドを含む。
【００４６】
本発明において、「宿主生物」は、変異型ＨＰＰＤタンパク質をコードする核酸を導入することができる任意の単細胞生物または多細胞生物を意味すると理解されるべきであり、例えば、大腸菌（Eescherichia coli）等の細菌、酵母（例えば、Saccharomyces cerevisiae）等の真菌、カビ（例えば、アスペルギルス）、植物細胞、植物等が挙げられる。
【００４７】
本発明において、「植物」は、光合成を行うことができる任意の分化した多細胞生物、特に単子葉植物または双子葉植物を意味すると理解されるべきであり、例えば、（１）食用作物：Oryza sativa、Oryza latifolia、Oryza sativa、Oryza glaberrimaのようなイネ属種（Oryza spp.）；Triticum aestivum、T. Turgidumssp. durumのようなコムギ属種（Triticum spp.）；Hordeum vulgare、Hordeum arizonicumのようなオオムギ属種（Hordeum spp.）；Secale cereale；Avena sativa、Avena fatua、Avena byzantine、Avena fatua var.sativa、Avena hybridaのようなカラスムギ属種（Avena spp.）；Pennisetum glaucumのようなヒエ属種（Echinochloa spp.）、モロコシ属（Sorghum）、Sorghum bicolor、Sorghum vulgare、Triticale、Zea maysまたはMaize, Millet、イネ（Rice）、Foxtail millet、Proso millet、Sorghum bicolor、キビ類（Panicum）、ソバ属種（Fagopyrum spp.）、Panicum miliaceum、Setaria italica、Zizania palustris、Eragrostis tef、Panicum miliaceum、Eleusine coracana；（２）マメ科作物：Glycine max、Soja hispida、Soja maxのようなダイズ属種（Glycine spp.）、ソラマメ属種（Vicia spp.）、ササゲ属種（Vigna spp.）、エンドウ属種（Pisum spp.）、ソラマメ（field bean）、ルピナス属種（Lupinus spp.）、ソラマメ属（Vicia）、Tamarindus indica、Lens culinaris、レンリソウ属種（Lathyrus spp.）、フジマメ属（Lablab）、ソラマメ（broad bean）、リョクトウ（mung bean）、アズキ（
red bean）、ヒヨコマメ（chickpea）、（３）油料作物：Arachis hypogaea、ラッカセイ属種（Arachis spp）、ゴマ属種（Sesamum spp.）、Helianthus annuusのようなヒマワリ属種（Helianthus spp.）、Eiaeis guineensis、Elaeis oleiferaのようなアブラヤシ属（Elaeis）、ダイズ（soybean）、Brassica napus、Brassica oleracea、Sesamum orientale、Brassica juncea、セイヨウアブラナ（Oilseed rape）、Camellia oleifera、アブラヤシ（oil palm）、オリーブ（olive）、トウゴマ（castor-oil plant）、Brassica napus L.、キャノーラ（canola）；（４）線維作物：Agave sisalana、ワタ（Gossypium）、Gossypium barbadense、Gossypium hirsutumのようなワタ属種（Gossypium spp.）、Hibiscus cannabinus、Agave sisalana、Musa textilis Nee、Linum usitatissimum、Corchorus capsularis L、Boehmeria nivea (L.)、Cannabis sativa、Cannabis sativa；（５）果実植物：ナツメ属種（Ziziphus spp.）、キュウリ属種（Cucumis spp.）、Passiflora edulis、ブドウ属種（Vitis spp.）、スノキ属種（Vaccinium spp.）、Pyrus communis、サクラ属種（Prunus spp.）、バンジロウ属種（Psidium spp.）、Punica granatum、リンゴ属種（Malus spp.）、Citrullus lanatus、ミカン属種（Citrus spp.）、Ficus carica、キンカン属種（Fortunella spp.）、オランダイチゴ属種（Fragaria spp.）、サンザシ属種（Crataegus spp.）、カキノキ属種（Diospyros spp.）、Eugenia unifora
、Eriobotrya japonica、Dimocarpus longan、Carica papaya、ココヤシ属種（Cocos spp.）、Averrhoa carambola、マタタビ属種（Actinidia spp.）、Prunus amygdalus、バショウ属種（Musa spp.）（台湾バナナ（musa acuminate））、ワニナシ属種（Persea spp.）（アボカド（Persea Americana））、Psidium guajava、Mammea Americana、Mangifera indica、Canarium album（オリーブ（Olea europaea））、パパイア（Caricapapaya）、Cocos nucifera、Malpighia emarginata、Manilkara zapota、Ananas comosus、バンレイシ属種（Annona spp.）、Citrus reticulate（ミカン属種（Citrus spp.））、パンノキ属種（Artocarpus spp.）、Litchi chinensis、スグリ属種（Ribes spp.）、キイチゴ属種（Rubus spp.）、ナシ、モモ、アプリコット、プラム、ヤマモモ、レモン、キンカン、ドリアン、オレンジ、イチゴ、ブルーベリー、ハミウリ、マスクメロン、ナツメヤシ、クルミの木、サクラの木；（６）根茎作物：イモノキ属種（Manihot spp.）、Ipomoea batatas、Colocasia esculenta、tuber mustard、Allium cepa（タマネギ）、eleocharis tuberose（シログワイ）、Cyperus rotundus、Rhizoma dioscoreae；（７）野菜作物：ホウレンソウ属種（Spinacia spp.）、インゲンマメ属種（Phaseolus spp.）、Lactuca sativa、ツルレイシ属種（Momordica spp.）、Petroselinum crispum、トウガラシ属種（Capsicum spp.）、ナス属種（Solanum spp.）（Solanum tuberosum、Solanum integrifolium、Solanum lycopersicum等）、トマト属種（Lyco
persicon spp.）（Lycopersicon esculentum、Lycopersicon lycopersicum、Lycopersicon pyriforme等）、マクロチロマ属種（Macrotyloma spp.）、ケール、Luffa acutangula、レンズマメ、オクラ、タマネギ、ジャガイモ、アーティチョーク、アスパラガス、ブロッコリー、メキャベツ、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、カラードグリーン、カボチャ、Benincasa hispida、Asparagus officinalis、Apium graveolens、アマランサス属種（Amaranthus spp.）、ネギ属種（Allium spp.）、トロロアオイ属種（Abelmoschus spp.）、Cichorium endivia、カボチャ属種（Cucurbita spp.）、Coriandrum sativum、B.carinata、Rapbanus sativus、アブラナ属種（Brassica spp.）（Brassica napus、Brassica rapa ssp.、キャノーラ、セイヨウアブラナ、アブラナ（turnip rape）、アブラナ（turnip rape）、カラシナ、カベツ、クロガラシ、キャノーラ（セイヨウアブラナ）、メキャベツ、ナス科（Solanaceae）（ナス）、Capsicum annuum（ピーマン）、キュウリ、ヘチマ属、ハクサイ、セイヨウアブラナ、キャベツ、ヒョウタンノキ、ニラ、ハス、レンコン、レタス；（８）花作物：Tropaeolum minus、Tropaeolum majus、Canna indica、オプンティア属種（Opuntia spp.）、コウオウソウ属種（Tagetes spp.）、シンビジウム（ラン）、Crinum asiaticum L.、Clivia Hippeastrum rutilum、Rosa rugosa、Rosa Chinensis、Jasminum sambac、Tulipa gesneriana L.、サクラ亜属種（Cerasus sp.）、Pharbitis nil （L.） Choisy、Calendula officinalis L.、ハス属種（Nelumbo sp.）、Bellis perennis L.、Dianthus caryophyllus、Petunia hybrida、Tulipa gesneriana L.、Lilium brownie、Prunus mume、Narcissus tazetta L.、Jasminum nudiflorum Lindl.、Primula malacoides、Daphne odora、Camellia japonica、Michelia alba、Magnolia liliiflora、Viburnum macrocephalum、Clivia miniata、Malus spectabilis、Paeonia suffruticosa、Paeonia lactiflora、Syzygium aromaticum、Rhododendron simsii、Rhododendron hybridum、Michelia figo (Lour.) Spreng.、Cercis chinensis、Kerria japonica、Weigela florida、Fructus forsythiae、Jasminum mesnyi、Parochetus communis、Cyclamen persicum Mill.、Phalaenophsis hybrid、Dendrobium nobile、Hyacinthus orientalis、Iris tectorum Maxim、Zantedeschia aethiopica、Calendula officinalis、Hippeastrum rutilum、Begonia semperflorenshybr、Fuchsia hybrida、Begonia maculate Raddi、ゼラニウム；（９）薬用作物：Carthamus tinctorius、ハッカ属種（Mentha spp.）、Rheum rhabarbarum、Crocus sativus、Lycium chinense、Polygonatum odoratum、Polygonatum Kingianum、Anemarrhena asphodeloides Bunge、Radix ophiopogonis、Fritillaria cirrhosa、Curcuma aromatica、Amomum villosum Lour.、Polygonum multiflorum、Rheum officinale、Glycyrrhiza uralensis Fisch、Astragalus membranaceus、Panax ginseng、Panax notoginseng、Acanthopanax gracilistylus、Angelica sinensis、Ligusticum wallichii、Bupleurum sinenses DC.、Datura stramonium Linn.、Datura metel L.、Mentha haplocalyx、Leonurus sibiricus L.、Agastache rugosus、Scutellaria baicalensis、Prunella vulgaris L.、Pyrethrum carneum、Ginkgo biloba L.、Cinchona ledgeriana、Hevea brasiliensis（野生）、Medicago sativa Linn、Piper Nigrum L.；（１０）原料作物：Hevea brasiliensis、Ricinus communis、Vernicia fordii、Morus alba L.、Hops Humulus lupulus、カバノキ属（Betula）、Alnus cremastogyne Burk.、Rhus verniciflua stokes；（１１）牧草作物：コムギダマシ属種（Agropyron spp.）、シャジクソウ属種（Trifolium spp.）、Miscanthus sinensis、チカラシバ属種（Pennisetum sp.）、Phalaris arundinacea、Panicum virgatum、プレーリーグラス（prairiegrasses）、インディアングラス（Indiangrass）、ビッグブルーステム（Big bluestem grass）、Phleum pratense、シバ、カヤツリグサ科（cyperaceae）（Kobresia pygmaea、Carex pediformis、Carex humilis）、Medicago sativa Linn、Phleum pratense L.、Medicago sativa、Melilotus suavcolen、Astragalus sinicus、Crotalaria juncea、Sesbania cannabina、Azolla imbircata、Eichhornia crassipes、Amorpha fruticosa、Lupinus micranthus、シャジクソウ属（Trifolium）、Astragalus adsurgens pall、Pistia stratiotes linn、Alternanthera philoxeroides、ドクムギ属（Lolium）；（１２）糖作物：サトウキビ属種（Saccharum spp.）、ビート；（１３）飲料作物：Camellia sinensis、Camellia Sinensis、チャ、コーヒー（コーヒーノキ属種（Coffea spp.））、Theobroma cacao、Humulus lupulus Linn.；（１４）芝生植物：Ammophila arenaria、イチゴツナギ属種（Poa spp.）（Poa pratensis （イチゴツナギ））、ヌカボ属種（Agrostis spp.）（Agrostis matsumurae、Agrostis palustris）、ドクムギ属種（Lolium spp.）（ドクムギ属（Lolium））、ウシノケグサ属種（Festuca spp.）（Festuca ovina L.）、シバ属種（Zoysia spp.）（Zoysia japonica）、ギョウギシバ属種（Cynodon spp.）（Cynodon dactylon／ギョウギシバ）、Stenotaphrum secunda tum（Stenotaphrum secundatum）、スズメノヒエ属種（Paspalum spp.）、Eremochloa ophiuroides（チャボウシノシッペイ）、アクソノプス属種（xonopus spp.）（カーペットウィード）、Bouteloua dactyloides（ヤギュウシバ）、グラマグラス属種（Bouteloua var. spp.）（ブルーグラマ（Bouteloua gracilis））、Digitaria sanguinalis、Cyperus rotundus、ヒメグサ（Kyllingabrevifolia）、
チャガヤツリ（Cyperusamuricus）、Erigeron canadensis、Hydrocotyle sibthorpioides、ハヤズソウ（Kummerowiastriata）Euphorbia humifusa、Viola arvensis、Carex rigescens、Carex heterostachya、シバ；（１５）樹木作物：マツ属種（Pinus spp.）、ヤナギ属種（Salix spp.）、カエデ属種（Acer spp.）、フヨウ属種（Hibiscus spp.）、ユーカリ属種（Eucalyptus spp.）、Ginkgo biloba、ホウライチク属種（Bambusa sp.）、ヤマナラシ属種（Populus spp.）、プロソピス属種（Prosopis spp.）、コナラ属種（Quercus spp.）、ナツメヤシ属種（Phoenix spp.）、ブナ属種（Fagus spp.）、Ceiba pentandra、ニッケイ属種（Cinnamomum spp.）、ツナソ属種（Corchorus spp.）、Phragmites australis、ホオズキ属種（Physalis spp.）、ヌスビトハギ属種（Desmodium spp.）、ポプラ、Hedera helix、Populus tomentosa Carr、Viburnum odoratissinum、Ginkgo biloba L.、オーク、Ailanthus altissima、Schima superba、Ilex pur-purea、Platanus acerifolia、ligustrum lucidum、Buxus megistophylla Levl.、Dahurian larch、Acacia mearnsii、Pinus massoniana、Pinus khasys、Pinus yunnanensis、Pinus finlaysoniana、Pinus tabuliformis、Pinus koraiensis、Juglans nigra、Citrus limon、Platanus acerifolia、Syzygium jambos、Davidia involucrate、Bombax malabarica L.、Ceiba pentandra (L.)、Bauhinia blakeana、Albizia saman、Albizzia julibrissin、Erythrina corallodendron、Erythrina indica、Magnolia gradiflora、Cycas revolute、Lagerstroemia indica、球果植物門、高木（macrophanerophytes）、低木（Frutex）；（１６）ナッツ作物：Bertholletia excelsea、クリ属種（Castanea spp.）、ハシバミ属種（Corylus spp.）、ペカン属種（Carya spp.）、クルミ属種（Juglans spp.）、Pistacia vera、Anacardium occidentale、マカダミア属（Macadamia）（Macadamia integrifolia）、Carya illinoensis Koch、マカダミア属（Macadamia）、ピスタチオ、アーモンド、ナッツを産生する他の植物；（１７）その他：arabidopsis thaliana、Bra chiaria eruciformis、Cenchrus echinatus、Setaria faberi、eleusine indica、Cadaba farinose、algae、Carex elata、ornamental plants、Carissa macrocarpa、チョウセンアザミ属種（Cynara spp.）、Daucus carota、ヤマノイモ属種（Dioscorea spp.）、エリアンサス属種（Erianthus sp.）、Festuca arundinacea、Hemerocallis fulva、ハス属種（Lotus spp.）、Luzula sylvatica、Medicago sativa、シナガワハギ属種（Melilotus spp.）、Morus nigra、タバコ属種（Nicotiana spp.）、オリーブ属種（Olea spp.）、オルニソパス属種（Ornithopus spp.）、Pastinaca sativa、ニワトコ属種（Sambucus spp.）、シロガラシ属種（Sinapis sp.）、フトモモ属種（Syzygium spp.）、Tripsacum dactylo
ides、Triticosecale rimpaui、Viola odorata等である。
【００４８】
本発明において、「植物組織」または「植物部分」という用語は、植物細胞、プロトプラスト、植物組織培養物、植物カルス、植物ブロック、および植物の胚、花粉、胚珠、種子、葉、茎、花、枝、苗木、果実、芯、穂、根、根端、葯等を包含する。
【００４９】
本発明において、「植物細胞」は、例えば、カルス等の未分化組織、胚、植物部分、植物または種子等の分化組織を形成することができる植物に由来するか、または植物中に見出される任意の細胞を意味するものと理解されるべきである。
【００５０】
本明細書において使用されるアミノ酸置換に関する用語について、最初の文字は特定の配列の特定の位置に天然に存在するアミノ酸を表し、それに続く番号は配列番号２に対応する位置を表し、２番目の文字は天然に存在するアミノ酸に置換される別のアミノ酸を表す。例えば、Ａ１０３Ｓは、配列番号２のアミノ酸配列に対して、１０３位のアラニンがセリンで置換されていることを表す。最初の文字が存在しないアミノ酸置換については、野生型タンパク質のアミノ配列に対して、配列番号２に対応する位置の天然に存在するアミノ酸が、番号の後の２番目の文字で表されるアミノ酸で置換されていることを意味する。二重または複数の変異の場合、各変異は「／」で区切られる。例えば、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｄ３７０Ｎは、配列番号２のアミノ酸配列に対して、１４１位のヒスチジンがアルギニンに置換され、３４２位のグリシンがアスパラギン酸に置換され、３７０位のアスパラギン酸がアスパラギンで置換されており、３つの変異すべてが特定の変異型ＨＰＰＤタンパク質に存在することを意味する。
【００５１】
一つの態様において、本発明は、変異型ＨＰＰＤタンパク質またはその生物活性断片を開示し、これは、野生型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質と比較して、ＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する抵抗性または耐性が改善されている一方で、ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸（ＨＰＰ）からホモゲンチジン酸への変換を触媒する活性を保持している。具体的には、本発明の変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質は、配列番号２で表される野生型イネｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質のアミノ酸配列の９３、１０３、１４１、１６５、１９１、２２０、２２６、２７６、２７７、３３６、３３７、３３８、３４２、３４６、３７０、３７７、３８６、３９０、３９２、４０３、４１０、４１８、４１９、４２０、４３０および４３１位に対応する１つ以上の位置に、９３Ｓ、１０３Ｓ、１４１Ｒ、１４１Ｋ、１４１Ｔ、１６５Ｖ、１９１Ｉ、２２０Ｋ、２２６Ｈ、２７６Ｗ、２７７Ｎ、３３６Ｄ、３３７Ａ、３３８Ｄ、３３８Ｓ、３３８Ｙ、３４２Ｄ、３４６Ｃ、３４６Ｄ、３４６Ｈ、３４６Ｓ、３４６Ｙ、３７０Ｎ、３７７Ｃ、３８６Ｔ、３９０Ｉ、３９２Ｌ、４０３Ｇ、４１０Ｉ、４１８Ｐ、４１９Ｆ、４１９Ｌ、４１９Ｖ、４２０Ｓ、４２０Ｔ、４３０Ｇおよび４３１Ｌからなる群から選択される１つ以上の変異を有する。好ましくは、変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して、さらに少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。より好ましくは、変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質は、配列番号２で表される野生型イネｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質のアミノ酸配列の９３、１０３、１４１、１６５、１９１、２２０、２２６、２７６、２７７、３３６、３３７、３３８、３４２、３４６、３７０、３７７、３８６、３９０、３９２、４０３、４１０、４１８、４１９、４２０、４３０および４３１位に対応する１つ以上の位置に、９３Ｓ、１０３Ｓ、１４１Ｒ、１４１Ｋ、１４１Ｔ、１６５Ｖ、１９１Ｉ、２２０Ｋ、２２６Ｈ、２７６Ｗ、２７７Ｎ、３３６Ｄ、３３７Ａ、３３８Ｄ、３３８Ｓ、３３８Ｙ、３４２Ｄ、３４６Ｃ、３４６Ｄ、３４６Ｈ、３４６Ｓ、３４６Ｙ、３７０Ｎ、３７７Ｃ、３８６Ｔ、３９０Ｉ、３９２Ｌ、４０３Ｇ、４１０Ｉ、４１８Ｐ、４１９Ｆ、４１９Ｌ、４１９Ｖ、４２０Ｓ、４２０Ｔ、４３０Ｇおよび４３１Ｌからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸変異を有すること以外は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する。
【００５２】
一つの実施形態において、本発明の変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２で表される野生型イネｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質のアミノ酸配列に対して、さらに少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し、配列番号２で表される野生型イネｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質のアミノ酸配列の９３、１０３、１４１、１６５、１９１、２２０、２２６、２７６、２７７、３３６、３３７、３３８、３４２、３４６、３７０、３７７、３８６、３９０、３９２、４０３、４１０、４１８、４１９、４２０、４３０および４３１位に対応する１つ以上の位置に、９３Ｓ、１０３Ｓ、１４１Ｒ、１４１Ｋ、１４１Ｔ、１６５Ｖ、１９１Ｉ、２２０Ｋ、２２６Ｈ、２７６Ｗ、２７７Ｎ、３３６Ｄ、３３７Ａ、３３８Ｄ、３３８Ｓ、３３８Ｙ、３４２Ｄ、３４６Ｃ、３４６Ｄ、３４６Ｈ、３４６Ｓ、３４６Ｙ、３７０Ｎ、３７７Ｃ、３８６Ｔ、３９０Ｉ、３９２Ｌ、４０３Ｇ、４１０Ｉ、４１８Ｐ、４１９Ｆ、４１９Ｌ、４１９Ｖ、４２０Ｓ、４２０Ｔ、４３０Ｇおよび４３１Ｌからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸変異を有する。好ましくは、変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質は、配列番号２で表される野生型イネｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質のアミノ酸配列の９３、１０３、１４１、１６５、１９１、２２０、２２６、２７６、２７７、３３６、３３７、３３８、３４２、３４６、３７０、３７７、３８６、３９０、３９２、４０３、４１０、４１８、４１９、４２０、４３０および４３１に対応する１つ以上の位置に、Ｒ９３Ｓ、Ａ１０３Ｓ、Ｈ１４１Ｒ、Ｈ１４１Ｋ、Ｈ１４１Ｔ、Ａ１６５Ｖ、Ｖ１９１Ｉ、Ｒ２２０Ｋ、Ｇ２２６Ｈ、Ｌ２７６Ｗ、Ｐ２７７Ｎ、Ｐ３３６Ｄ、Ｐ３３７Ａ、Ｎ３３８Ｄ、Ｎ３３８Ｓ、Ｎ３３８Ｙ、Ｇ３４２Ｄ、Ｒ３４６Ｃ、Ｒ３４６Ｄ、Ｒ３４６Ｈ、Ｒ３４６Ｓ、Ｒ３４６Ｙ、Ｄ３７０Ｎ、Ｉ３７７Ｃ、Ｐ３８６Ｔ、Ｌ３９０Ｉ、Ｍ３９２Ｌ、Ｅ４０３、Ｋ４１８Ｐ、Ｇ４１９Ｆ、Ｇ４１９Ｌ、Ｇ４１９Ｖ、Ｎ４２０Ｓ、Ｎ４２０Ｔ、Ｅ４３０ＧおよびＹ４３１Ｌからなる群から選択される１つ以上の変異を有すること以外は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する。
【００５３】
本発明のタンパク質内の特定のアミノ酸位置（番号付け）は、標準的な配列アラインメントツールを使用して、目的のタンパク質のアミノ酸配列と配列番号２とをアラインメントすることによって決定され、例えば、Ｓｍｉｔｈ−ＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズムまたはＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ２アルゴリズムが、２つの配列をアラインメントするために使用され、これらの配列は、アラインメントスコアが最も高い場合にアラインメントされていると見なされる。アラインメントスコアは、Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. (1983), “Rapid similarity searches of nucleic acid and protein data banks,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 726-730に記載される方法によって計算することができる。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ２（１．８２）アルゴリズムで使用されるデフォルトのパラメータは、好ましくは：タンパク質ギャップオープニングペナルティ（protein gap opening penalty）＝１０．０；タンパク質ギャップエクステンションペナルティ（protein gap extension penalty）＝０．２；タンパク質マトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ；タンパク質／ＤＮＡエンドギャップ＝−１；およびタンパク質／ＤＮＡ  ＧＡＰＤＩＳＴ＝４。
【００５４】
好ましくは、ＡｌｉｇｎＸプログラム（ベクターＮＴＩセットの一部）を使用して、複数のアラインメントのデフォルトパラメータ（ギャップオープニングペナルティ：１０ｏｇ、ギャップエクステンションペナルティ：０．０５）をマッチさせ、タンパク質のアミノ酸配列と配列番号２とをアラインメントさせることによって、本発明のタンパク質中の特定のアミノ酸の位置が決定される。
【００５５】
アミノ酸配列の同一性は、従来の方法によって、例えば、Smith and Waterman（1981, Adv. Appl. Math. 2: 482, Pearson & Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444）の教示、Thompson et al.（1994, Nucleic Acids Res 22:467380等、コンピューター処理（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Genetics Computer Group in the Wisconsin Genetics software package) により決定されるか、またはthe National Center for Biotechnology Information www.ncbi.nlm.nih.gov/から入手可能なＢＬＡＳＴアルゴリズム（Altschul et al., 1990, Mol. Biol. 215:403-10）を使用することによって決定することができる）のデフォルトのパラメータを用いたコンピューター上のアルゴリズムを照会することによって決定することができる。
【００５６】
さらなる一つの実施形態において、本発明の変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質は、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２または配列番号８４で表されるアミノ酸配列を有する。
【００５７】
さらなる一つの実施形態において、本発明の変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質は、そのアミノ酸配列に以下のアミノ酸変異を有する：Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ、Ｈ１４１Ｒ／Ｄ３７０Ｎ、Ｇ３４２Ｄ／Ｄ３７０Ｎ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ、Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ、Ｋ４１８Ｐ／Ｇ４１９Ｆ、Ｇ４１９Ｆ／Ｎ４２０Ｓ、Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｃ、Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｈ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ４２０Ｓ、Ｇ３３８Ｄ／Ｋ４１８Ｐ、Ｐ２７７Ｎ／Ｎ３３８Ｄ、Ｌ２７６Ｗ／Ｐ２７７Ｎ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｄ３７０Ｎ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｎ４２０Ｓ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｓ／Ｎ４２０Ｓ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｓ／Ｇ３４２Ｄ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｙ／Ｇ３４２Ｄ、Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｃ、Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｈ、Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｓ、Ｎ３３８Ｓ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｃ、Ｎ３３８Ｓ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｈ、Ｎ３３８Ｓ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｓ、Ｎ３３８Ｙ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｃ、Ｎ３３８Ｙ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｈ、Ｎ３３８Ｙ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｓ、Ｐ３３６Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｃ、Ｐ３３６Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｈ、Ｐ３３６Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｓ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｄ／Ｒ３４６Ｃ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｄ／Ｒ３４６Ｈ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｄ／Ｒ３４６Ｓ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｓ／Ｒ３４６Ｃ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｓ／Ｒ３４６Ｈ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｓ／Ｒ３４６Ｓ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｙ／Ｒ３４６Ｃ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｙ／Ｒ３４６Ｈ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｙ／Ｒ３４６Ｓ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｋ４１８Ｐ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｇ４１９Ｆ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｐ３８６Ｔ、Ｋ４１８Ｐ／Ｇ４１９Ｆ／Ｎ４２０Ｔ、Ｋ４１８Ｔ／Ｇ４１９Ｆ／Ｎ４２０Ｔ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｃ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｈ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｎ４２０Ｓ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｐ２７７Ｎ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｐ３３６Ｄ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｌ２７６Ｗ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｓ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｌ３９０Ｉ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｉ３７７Ｃ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｍ３９２Ｌ、Ｈ１４１Ｒ／Ｐ３３７Ａ／Ｇ３４２Ｄ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｓ／Ｇ３４２Ｄ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｙ／Ｇ３４２Ｄ、Ｐ２７７Ｎ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ、Ｐ２７７Ｎ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｃ、Ｐ２７７Ｎ／Ｎ３３８Ｄ／Ｎ４２０Ｓ、Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｋ４１８Ｐ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｋ４１８Ｐ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｇ４１９Ｆ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｐ３８６Ｔ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｃ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｈ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｋ４１８Ｐ／Ｇ４１９Ｆ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｌ２７６Ｗ／Ｐ２７７Ｎ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｃ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｈ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｓ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｓ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｃ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｓ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｈ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｓ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｓ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｙ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｃ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｙ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｈ、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｙ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｓ、Ｐ２７７Ｎ／Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ、Ｐ２７７Ｎ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｃ、Ｐ２７７Ｎ／Ｎ３３８Ｄ／Ｋ４１８Ｐ／Ｇ４１９Ｆ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｋ４１８Ｐ／Ｇ４１９Ｆ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｇ４１９Ｆ／Ｎ４２０Ｓ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３３６Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｋ４１８Ｐ／Ｇ４１９Ｆ／Ｎ４２０Ｓ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｋ４１８Ｐ／Ｇ４１９Ｆ／Ｎ４２０Ｓ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｋ４１８Ｐ／Ｇ４１９Ｆ／Ｎ４２０Ｔ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｃ／Ｋ４１８Ｐ／Ｇ４１９Ｆ／Ｎ４２０Ｓ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｈ／Ｋ４１８Ｐ／Ｇ４１９Ｆ／Ｎ４２０Ｓ、Ｈ１４１Ｒ／Ｐ２７７Ｎ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｋ４１８Ｐ／Ｇ４１９Ｆ／Ｎ４２０ＳまたはＨ１４１Ｒ／Ｐ２７７Ｎ／Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｋ４１８Ｐ／Ｇ４１９Ｆ／Ｎ４２０Ｓ。
【００５８】
さらに別の実施形態において、本発明の変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質は、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８または配列番号２６０で表されるアミノ酸配列を有する。
【００５９】
本発明において、野生型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質は、任意の植物、特に前述の単子葉植物または双子葉植物に由来するものであってもよい。他の供給源からのいくつかの野生型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質の配列およびそのコード配列は、参照により本明細書に組み込まれる先行技術文献に開示されている。
【００６０】
好ましくは、本発明の野生型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質は、イネ属種（Oryza）、特にイネ（Oryza sativa）に由来する。より好ましくは、野生型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列、または配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００６１】
タンパク質の構造が、その活性および機能性に悪影響を与えることなく変更され得ること、例えば、１つ以上の保存的アミノ酸置換が、タンパク質分子の活性および／または三次元構成に悪影響を与えることなく、タンパク質のアミノ酸配列に導入され得ることも当業者には明らかであろう。当業者であれば、保存的アミノ酸置換の例および実施形態を知っている。具体的には、特定の部位のアミノ酸残基を、置換されるアミノ酸と同じグループに属する別のアミノ酸残基で置換することができ、すなわち、非極性アミノ酸残基が別の非極性アミノ酸残基で置換され、極性非荷電アミノ酸残基が別の極性非荷電アミノ酸残基で置換され、塩基性アミノ酸残基が別の塩基性アミノ酸残基で置換され、酸性アミノ酸残基が酸性アミノ酸残基で置換される。置換がタンパク質の生物学的活性を損なわない限り、あるアミノ酸が同じグループに属する他のアミノ酸によって置換されるような保存的置換は、本発明の範囲内にある。
【００６２】
したがって、本発明の変異型ＨＰＰＤタンパク質は、上記の変異に加えて、アミノ酸配列における保存的置換等の１つ以上の他の変異をさらに含み得る。さらに、本発明はまた、非保存的置換が本発明のタンパク質の所望の機能および生物学的活性に有意に影響を及ぼさない限り、１つ以上の他の非保存的置換をさらに含む変異型ＨＰＰＤタンパク質を包含する。
【００６３】
当技術分野で公知であるように、１つ以上のアミノ酸残基は、タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端から欠失させてもよく、タンパク質は依然として機能および活性を保持する。したがって、別の態様において、本発明はまた、所望の機能および活性を保持しながら、変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に１つ以上のアミノ酸残基を欠失させた断片に関する。本発明の範囲内で、断片は生物活性断片と呼ばれる。本発明において、「生物活性断片」とは、本発明の変異型ＨＰＰＤタンパク質の生物学的活性を保持しながら、変異を有さないＨＰＰＤ断片と比較してＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性または耐性が改善されている、本発明の変異型ＨＰＰＤタンパク質の一部を指す。例えば、変異型ＨＰＰＤタンパク質の生物活性断片は、タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端のアミノ酸残基の１つ以上（例えば、１〜５０、１〜２５、１〜１０または１〜５、例えば、１、２、３、４または５）の部分を欠くが、完全長タンパク質の所望の生物学的活性を保持する生物活性断片であり得る。
【００６４】
本発明によれば、本発明の変異型ＨＰＰＤタンパク質またはその生物活性断片、およびそれに融合される追加の成分を含む融合タンパク質も提供される。一つの好ましい実施形態において、追加の成分は、変異型ＨＰＰＤタンパク質が葉緑体を標的とすることを可能にする葉緑体への誘導ペプチド等の、色素体への誘導ペプチドである。別の実施形態において、追加の成分は、６×Ｈｉｓ等のタグペプチドである。さらに別の実施形態において、追加の成分は、ＮｕｓＡペプチド等の変異型ＨＰＰＤタンパク質の溶解度の増大に寄与するペプチドである。
【００６５】
さらに別の態様において、本発明によれば、上記変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質またはその生物活性断片をコードする核酸配列、またはその相補的配列を含む、単離されたポリヌクレオチドが提供される。「単離された」ポリヌクレオチドという用語は、ポリヌクレオチドが、天然に存在する環境において通常それに付随している成分を実質的に含まないことを意味する。一つの実施形態において、変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し、配列番号２で表される野生型イネｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質のアミノ酸配列の９３、１０３、１４１、１６５、１９１、２２０、２２６、２７６、２７７、３３６、３３７、３３８、３４２、３４６、３７０、３７７、３８６、３９０、３９２、４０３、４１０、４１８、４１９、４２０、４３０および４３１位に対応する１つ以上の位置に、９３Ｓ、１０３Ｓ、１４１Ｒ、１４１Ｋ、１４１Ｔ、１６５Ｖ、１９１Ｉ、２２０Ｋ、２２６Ｈ、２７６Ｗ、２７７Ｎ、３３６Ｄ、３３７Ａ、３３８Ｄ、３３８Ｓ、３３８Ｙ、３４２Ｄ、３４６Ｃ、３４６Ｄ、３４６Ｈ、３４６Ｓ、３４６Ｙ、３７０Ｎ、３７７Ｃ、３８６Ｔ、３９０Ｉ、３９２Ｌ、４０３Ｇ、４１０Ｉ、４１８Ｐ、４１９Ｆ、４１９Ｌ、４１９Ｖ、４２０Ｓ、４２０Ｔ、４３０Ｇおよび４３１Ｌからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸変異をさらに有する。より好ましくは、変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質またはその生物活性断片は、イネＨＰＰＤタンパク質に由来し、上記のものから選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する。
【００６６】
当業者にとって、遺伝暗号の縮重により、様々な異なる核酸配列が本明細書に開示されるアミノ酸配列をコードし得ることが明らかであろう。当業者であれば、同じタンパク質をコードする追加の核酸配列を生成することができ、したがって、本発明は、遺伝暗号の縮重により同じアミノ酸配列をコードする核酸配列を包含する。例えば、植物等の宿主生物において異種遺伝子の高い発現を達成するために、より良好な発現のために宿主に好ましいコドンを使用して遺伝子を最適化することができる。
【００６７】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは：
（１）:配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８または配列番号２６０で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列、またはそれらの相補配列；
（２）配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号２０７、配列番号２０９、配列番号２１１、配列番号２１３、配列番号２１５、配列番号２１７、配列番号２１９、配列番号２２１、配列番号２２３、配列番号２２５、配列番号２２７、配列番号２２９、配列番号２３１、配列番号２３３、配列番号２３５、配列番号２３７、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５７または配列番号２５９で表される核酸配列、またはそれらの相補配列；
（３）ストリンジェントな条件下で（１）または（２）で示される配列にハイブリダイズする核酸配列；および
（４）遺伝暗号の縮重により（１）または（２）で示される配列と同じアミノ酸配列をコードする核酸配列、またはそれらの相補配列
から選択される核酸配列を有する。
【００６８】
さらに好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは：配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号２０７、配列番号２０９、配列番号２１１、配列番号２１３、配列番号２１５、配列番号２１７、配列番号２１９、配列番号２２１、配列番号２２３、配列番号２２５、配列番号２２７、配列番号２２９、配列番号２３１、配列番号２３３、配列番号２３５、配列番号２３７、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５７または配列番号２５９で表される核酸配列、またはそれらの相補配列
から選択される核酸配列を有する。
【００６９】
好ましくは、ストリンジェントな条件は、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳおよび０．５×ＳＳＣの条件、またはそれに相当するハイブリダイゼーション条件を指し、また、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣ、またはそれに相当するハイブリダイゼーション条件等の、より高いストリンジェンシーの条件を指す。様々な条件において、温度は約４０℃を超えてもよく、例えば、より高いストリンジェンシーの条件が必要とされる場合、温度は、例えば、約５０℃、さらには約６５℃であり得る。
【００７０】
より好ましくは、アミノ酸変異部位に対応する野生型および変異型コドンは、以下のチャートの通りである：
【表１】
2021526849.tif 000005
2021526849.tif 000006
【００７１】
本発明によれば、本発明の変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質もしくはその生物活性断片、またはその融合タンパク質をコードする核酸配列、およびそれらに作動可能に連結された１つ以上の調節エレメントを含む核酸コンストラクトも提供される。本発明において使用される「調節エレメント」という用語は、それに作動可能に連結された核酸の転写および／または翻訳を調節することができる核酸配列を指す。
【００７２】
調節エレメントは、本発明のタンパク質をコードする核酸配列の発現のために宿主細胞によって認識される適切なプロモーター配列であり得る。プロモーター配列は、タンパク質の発現を媒介する転写調節配列を含む。プロモーターは、変異型プロモーター、切断型（truncated）プロモーターおよびハイブリッドプロモーターを含む、選択された宿主細胞において転写活性を示す任意のヌクレオチド配列であり得、宿主細胞の遺伝子と相同または非相同である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。植物細胞または植物において発現されるプロモーターとして、ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの天然に存在するプロモーターまたは植物中で活性を有する異種プロモーターを使用することができる。プロモーターは、構成的発現または誘導性発現をもたらすものであってもよい。プロモーターの例としては、例えば、ヒストンプロモーター、イネアクチンプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター等の植物ウイルスプロモーター等が挙げられる。
【００７３】
調節エレメントはまた、転写を終結させるために宿主細胞によって認識される適切な転写ターミネーター配列であり得る。ターミネーター配列は、本発明のタンパク質をコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結されている。選択された宿主細胞において機能する任意のターミネーターを本発明で使用することができる。
【００７４】
調節エレメントはまた、適切なリーダー配列、すなわち、宿主細胞における翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域であり得る。リーダー配列は、本発明のタンパク質をコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結されている。選択された宿主細胞において機能する任意のリーダー配列を本発明で使用することができる。
【００７５】
調節エレメントはまた、ポリアデニル化配列、すなわち、核酸配列の３’末端に作動可能に連結され、転写中に転写されたｍＲＮＡにポリアデニル酸残基を付加するためのシグナルとして宿主細胞によって認識される配列であり得る。選択された宿主細胞において機能する任意のポリアデニル化配列を本発明で使用することができる。
【００７６】
調節エレメントはまた、タンパク質のアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードし、コードされたタンパク質を細胞内の分泌経路に誘導するシグナルペプチドコード領域であり得る。核酸配列のコード配列の５’末端は、翻訳リーディングフレーム内の分泌ポリペプチドをコードするコード領域に天然に連結されているシグナルペプチドコード領域を実質的に含んでもよい。あるいは、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来性であるシグナルペプチドコード領域を含んでもよい。コード配列がシグナルペプチドコード領域を天然に含まない場合、外来シグナルペプチドコード領域が必要とされる。あるいは、外来シグナルペプチドコード領域は、天然のシグナルペプチドコード領域を置換するだけで、ポリペプチドの分泌が促進される。いずれにせよ、発現されるポリペプチドを選択された宿主細胞の分泌経路に誘導する、すなわち、ポリペプチドを培養培地に分泌する任意のシグナルペプチドコード領域を本発明で使用することができる。
【００７７】
ポリペプチドの発現が宿主細胞の増殖に従って調節されることを可能にする調節配列もまた好適に添加することができる。調節システムとしては、例えば、ｌａｃ、ｔｅｃおよびｔｉｐオペロンシステム、ＡＤＨ２システムまたはＧＡＬ１等の化学的または物理的刺激（調節化合物の存在を含む）に応答して遺伝子発現をオンまたはオフにすることを可能にする調節システムが挙げられる。他の調節配列の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核生物のシステムでは、これらには、メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および重金属に起因して増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、調節配列に作動可能に連結されるであろう。
【００７８】
本発明において、調節エレメントはまた、転写活性化因子、すなわち、エンハンサー、例えば、ＷＯ８７／０７６４４に記載のタバコモザイクウイルス翻訳活性化因子、または、例えば、トウモロコシ  ａｄｈ１イントロン、トウモロコシ  ブロンズ１遺伝子イントロンまたはイネ  アクチンイントロン１等のイントロン等であり得る。それらは、トランスジェニック植物において、本発明の変異型ＨＰＰＤタンパク質、その生物活性断片または融合タンパク質の発現を増強することができる。
【００７９】
本発明によれば、本発明の変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質もしくはその生物活性断片、または融合タンパク質をコードする核酸配列、およびそれらに作動可能に連結された発現調節エレメントを含む発現ベクターも提供される。発現ベクターはまた、自己複製のための複製起点を少なくとも１つ含む。ベクターの選択は、一般に、ベクターとベクターが導入される宿主細胞との適合性に依存する。ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち染色体外実体として存在するベクターであり得、その複製は、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体または人工染色体等の染色体複製とは無関係である。ベクターは、自己複製を確実にする任意の要素を含めることができる。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されたときに宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それが組み込まれている染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。さらに、単一のベクターまたはプラスミド、または宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡまたはトランスポゾンを含む２つ以上のベクターまたはプラスミドを使用することができる。あるいは、ベクターは、宿主細胞の内因性ＨＰＰＤ遺伝子の遺伝子編集のためのベクターであり得る。
【００８０】
ベクターは、プラスミド、ウイルス、コスミドまたはファージ等であり得、これらは、当業者に公知であり、本技術分野において多数記載されている。好ましくは、本発明における発現ベクターはプラスミドである。発現ベクターは、プロモーター、翻訳開始のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、転写ターミネーター、エンハンサー等を含み得る。このような選択可能なマーカーとしては、ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子、ネオマイシンに対する耐性を付与する遺伝子、テトラサイクリンまたはアンピシリンに対する耐性を付与する遺伝子等が挙げられる。
【００８１】
本発明のベクターは、宿主細胞のゲノムへのベクターの組み込み、または細胞内のゲノムとは独立した自律複製を可能にするエレメントを含み得る。宿主細胞のゲノムへの組み込みのために、ベクターは、相同組換えまたは非相同組換えによってゲノムに適切に組み込まれる、ポリヌクレオチドまたはベクターの他の任意のエレメントをコードするポリヌクレオチド配列に依存し得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞のゲノムの染色体上の正確な位置における相同組換えによるベクターの組み込みを誘導するための追加のヌクレオチド配列を含み得る。正確な位置における組み込みの可能性を高めるために、好ましくは、組み込みエレメントは、１００〜１０，０００塩基対、好ましくは４００〜１０，０００塩基対、より好ましくは８００〜１０，０００塩基対等の十分な数の核酸を含むべきであり、それらは相同組換えの可能性を高めるために、対応する標的配列と非常に高い同一性を有する。組み込みエレメントは、宿主細胞のゲノム内の標的配列に相同な任意の配列であり得る。さらに、組み込み要素は、非コーディングまたはコーディングヌクレオチド配列であり得る。別の態様において、ベクターは、非相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。自律複製の場合、ベクターは、該ベクターが宿主細胞内で自律的に複製されることを可能にする複製起点をさらに含み得る。複製起点は、自律複製を媒介し、細胞内で機能する任意のプラスミドレプリコンであり得る。「複製起点」または「プラスミドレプリコン」という用語は、本明細書において、プラスミドまたはベクターがｉｎ  ｖｉｖｏで複製されることを可能にするヌクレオチド配列として定義される。
【００８２】
本発明のコピーを複数有するポリヌクレオチドは、遺伝子産物の収量を増加させるために宿主細胞に挿入される。ポリヌクレオチドコピーの数の増加は、少なくとも１つの追加のコピーを有する配列を宿主細胞のゲノムに組み込むことによって、または増幅可能な選択可能なマーカー遺伝子とポリヌクレオチドとを一緒に組み合わせることによって達成することができる。後者の場合、増幅されたコピーを有する選択可能なマーカー遺伝子および追加のコピーを有するポリヌクレオチドを含む細胞は、適切な選択可能な製剤の存在下で細胞を人工的に培養することによってスクリーニングすることができる。
【００８３】
本発明の核酸配列は、様々な方法によって、例えば、インサートおよびベクターを適切な制限エンドヌクレアーゼで消化し、次いでライゲーションを行うことによって、ベクターに挿入することができる。様々なクローニング技術が当技術分野で知られており、当業者の知識の範囲内にある。
【００８４】
本発明における使用に好適なベクターとしては、市販のプラスミド、例えば、限定されないが、ｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ  ３７０１７）、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、スウェーデン、ウプサラ）、ＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ社製、米国、ウィスコンシン州、マディソン）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ社製）、ｐＤ１０、ｐｓｉＸ１７４  ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＫＫ２３２−８、ｐＣＭ７、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等が挙げられる。
【００８５】
本発明によれば、本発明の核酸配列、核酸コンストラクトまたは発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。本出願のベクターは、該ベクターが染色体成分の一部として、または前述のように自己複製のための染色体外ベクターとして存在するように、または該ベクターが宿主細胞において内因性ＨＰＰＤ遺伝子を遺伝的に編集できるように宿主細胞に導入される。宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞または植物細胞等の原核細胞および真核細胞を含む、当業者に公知の任意の宿主細胞であり得、例としては、エシェリヒア・コリ（E. coli）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、シュードモナス（Pseudomonas）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、スポドプテラ（Spodoptera）  Ｓｆ９、ＣＨＯ、ＣＯＳ等である。当業者であれば、適切な宿主細胞を選択することができる。
【００８６】
本発明において、「宿主細胞」という用語は、複製中に起こる突然変異のために親細胞と完全に同一ではない親細胞の任意の子孫も包含する。
【００８７】
本発明の核酸配列、核酸コンストラクトまたは発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃またはＴｉ−プラスミド媒介遺伝子送達、およびリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーション等を含む様々な技術によって宿主細胞に導入することができる。（Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, 1986を参照されたい）。
【００８８】
特定の実施形態において、本発明の変異型ＨＰＰＤタンパク質は、葉緑体等の植物中の色素体を標的とすることができる。これは、本発明の変異型ＨＰＰＤタンパク質をコードする核酸配列を、葉緑体誘導性ペプチド等のプラスチド誘導性ペプチドをコードする核酸配列のリーディングフレームに連結することによって達成することができ、または本発明のポリヌクレオチド、核酸コンストラクトまたは発現ベクターを植物細胞の葉緑体ゲノムに直接形質転換することにより達成することができる。当業者であれば、植物細胞の葉緑体ゲノムを形質転換するために使用することができるベクターおよび方法を知っている。例えば、本発明の変異型ＨＰＰＤタンパク質をコードする核酸配列は、ＤＮＡ被覆イオンによる標的植物の葉のイオン衝撃、相同組換えまたは非相同組換えによって組み込むことができる。
【００８９】
必要に応じて、形質転換された宿主細胞は、従来の栄養培地で培養してもよい。適切な宿主細胞を形質転換し、宿主細胞を適切な細胞密度に培養した後、選択されたプロモーターは温度変化または化学的誘導等の適切な方法によって誘導され得、該細胞は、本発明の変異型ＨＰＰＤタンパク質もしくはその生物活性断片、または融合タンパク質に対して追加の期間培養され得る。
【００９０】
したがって、本発明はまた、本発明の変異型ＨＰＰＤタンパク質もしくはその生物活性断片、または融合タンパク質を製造する方法に関し：（ａ）前記変異型ＨＰＰＤタンパク質もしくはその生物活性断片、または融合タンパク質の産生を促進する条件下で前記宿主細胞を培養すること；（ｂ）変異型ＨＰＰＤタンパク質もしくはその生物活性断片、または融合タンパク質を回収することを含む。
【００９１】
本発明の製造方法において、細胞は、当技術分野で公知の方法によってポリペプチドを産生するのに適した栄養培地上で培養される。例えば、細胞は、ポリペプチドの発現および／または単離が可能な条件下で、実験室または工業用発酵槽の適切な培地中で、シャフトフラスコ培養および小規模または大規模発酵（連続、バッチ、バッチでの供給、または固体発酵を含む）の培養手段で培養される。培養は、当技術分野で公知の手順により、炭素源および窒素源ならびに無機塩を含む適切な栄養培地上で行われる。適切な培地は、供給業者から購入するか、または開示された組成物（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログに開示されているもの）に従って処方することができる。ポリペプチドが栄養培地に分泌される場合、ポリペプチドは培養培地から直接回収することができる。ポリペプチドが培地に分泌されない場合は、細胞溶解物から回収することができる。
【００９２】
ポリペプチドは、当技術分野で知られているポリペプチドに特有の方法によって検出することができる。これらの検出方法は、特異的な抗体の使用、酵素生成物の形成、または酵素基質の喪失を含み得る。
【００９３】
産生されたポリペプチドは、当技術分野で公知の方法によって回収することができる。例えば、細胞は遠心分離によって収集され、物理的または化学的手段によって破壊され、得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。本発明の変異型ＨＰＰＤタンパク質もしくはその生物活性断片、または融合タンパク質を発現する形質転換された宿主細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用を含む任意の好適な手段によって溶解することができる。これらの方法は当業者に公知である。本発明の変異型ＨＰＰＤタンパク質またはその生物活性断片は、形質転換された宿主細胞の培養物から回収および精製することができ、使用される方法としては、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびフィトヘマグルチニンクロマトグラフィー等が挙げられる。
【００９４】
本発明はまた、ＨＰＰＤ阻害性除草剤に対して抵抗性または耐性である宿主生物、具体的には植物細胞、植物組織、植物部分または植物を調製するための方法にも関し、宿主生物を、本発明の変異型ＨＰＰＤタンパク質またはその生物活性断片をコードする核酸配列、または該核酸配列を含む核酸構造または発現ベクターで形質転換することを含む。植物細胞等の宿主細胞を形質転換するための方法は当技術分野において公知であり、例えば、プロトプラスト形質転換、融合、インジェクション、エレクトロポレーション、ＰＥＧ媒介形質転換、イオン衝撃、ウイルス形質転換、アグロバクテリウム媒介形質転換、エレクトロポレーション穿孔（electroporation perforation）または衝撃等が挙げられる。このような一連の形質転換方法は公知技術文献に記載されており、例えば、ＥＰ１１８６６６６に記載されているダイズ形質転換のための技術、およびＷＯ９２／０９６９６に記載されている単子葉植物、特にイネを形質転換するための適切な技術である。ＤＮＡを植物細胞に移入するために、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を用いて植物外植片を培養することも効果的である。次いで、選別のための抗生物質または農薬を含む適切な培地において、感染した植物材料の部分（葉の断片、茎の部分、根、プロトプラストまたは浮遊培養細胞等）から植物全体を再生することができる。形質転換された細胞は通常の方法により植物中で成長させ、生殖細胞を形成させ、形質転換された形質を後代植物に移入させることができる。そのような植物は、通常の方法で培養され、同様の形質転換された遺伝的要因または他の遺伝的要因を有する植物と交配され得る。得られる雑種個体は、対応する表現型の特性を有している。
【００９５】
本発明によれば、ＨＰＰＤ阻害性除草剤に対して抵抗性または耐性である宿主生物、具体的には植物細胞、植物組織、植物部分または植物を調製するための方法であって、本発明の変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質またはその生物活性断片をコードする核酸を宿主生物のゲノムに組み込み、該核酸を発現させることを含む方法も提供される。適切なベクターおよび選択可能なマーカーは当業者に公知であり、例えば、タバコゲノムに組み込む方法はＷＯ０６／１０８８３０に記載されており、そこに含まれる開示は参照により本明細書に組み込まれる。目的の遺伝子は、好ましくは、植物細胞において構成的または誘導性プロモーターのいずれかによって発現される。発現すると、ｍＲＮＡはタンパク質に翻訳され、それによって目的のアミノ酸がタンパク質に組み込まれる。植物細胞で発現するタンパク質をコードする遺伝子は、構成的プロモーター、組織特異的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。例えば、オクトピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーターおよびマンノピンシンターゼプロモーター等の細菌起源のプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（３５Ｓおよび１９Ｓ）、３５Ｔ（再設計された３５Ｓプロモーター、米国特許第６，１６６，３０２号、特に実施例７Ｅを参照されたい）を使用することができる。植物プロモーター調節因子も使用することができ、限定されないが、リブロース−１，６−ビスリン酸（ＲＵＢＰ）カルボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓｕ）、β−コングリシニンプロモーター、β−ファセオリンプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ヒートショックプロモーターおよび組織特異的プロモーターが挙げられる。構成的プロモーター調節因子を使用することもでき、それにより、すべての細胞型において常に継続的な遺伝子発現を誘導することができる（例えば、アクチン、ユビキチン、ＣａＭＶ  ３５Ｓ等）。組織特異的プロモーター調節因子は、葉または種子等の特定の細胞または組織タイプにおける遺伝子発現に関与し（例えば、ゼイン、オレオシン、ナピン、ＡＣＰ、グロブリン等）、これらも本発明において使用され得る。プロモーター調節因子は、植物の発達の特定の段階で活性（または非活性）になる場合もある。そのような例としては、限定されないが、花粉特異的、胚特異的、トウモロコシヒゲ特異的（corn-silk-specific）、綿繊維特異的（cotton-fiber-specific）、根特異的、種子胚乳特異的または栄養相特異的プロモーター調節因子等が挙げられる。特定の状況下では、物理的刺激（ヒートショック遺伝子）、光（ＲＵＢＰカルボキシラーゼ）、ホルモン（Ｅｍ）、代謝物、化学物質（テトラサイクリン応答性）およびストレス等の特定のシグナルに応答して遺伝子の発現に関与する誘導性プロモーター調節因子を使用することが望ましい。植物において機能する他の望ましい転写因子および翻訳因子を使用することができる。
【００９６】
本発明によれば、ＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する植物細胞、植物組織、植物部分または植物の抵抗性または耐性を改善する方法であって、植物または植物部分を、本発明の変異型ＨＰＰＤタンパク質もしくはその生物活性断片、または融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子で形質転換すること、および該核酸分子を発現させることを含む方法も提供される。核酸分子は、染色体外物（extrachromosomal entity）として発現させることができ、またはそれを植物細胞のゲノムに組み込むことによって発現させることができ、特に、相同組換えによって植物細胞の内因性遺伝子位置に組み込むことによって発現させることができる。これらの実施形態はいずれも、本発明の範囲内である。
【００９７】
本発明によれば、ＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する植物またはその部分の抵抗性または耐性を改善する方法であって、本発明の変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質もしくはその生物活性断片、または融合タンパク質を発現する植物と別の植物とを交配させ、ＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する抵抗性および耐性が改善された植物をスクリーニングすることを含む方法も提供される。
【００９８】
本発明によれば、ＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する植物細胞、植物組織、植物部分または植物の抵抗性または耐性を改善する方法であって、植物細胞、植物組織、植物部分または植物の内因性ＨＰＰＤタンパク質遺伝子の遺伝子編集をして、本発明の変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質もしくはその生物活性断片、または融合タンパク質の発現を達成することを含む方法も提供される。
【００９９】
本発明によれば、従来の育種技術によって除草剤に対する抵抗性または耐性を有する植物を調製する方法であって、本発明の変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質または生物活性物質をコードする核酸配列がゲノム中に組み込まれた植物を自己交配または交配すること、ヘテロ接合性またはホモ接合性の核酸配列を含む後代をスクリーニングすることを含む方法も提供される。
【０１００】
本発明はさらに、上記の方法によって得られる植物細胞、植物組織、植物部分および植物、ならびにそれらの後代に関する。
【０１０１】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドで形質転換された植物細胞、植物組織または植物部分は、植物全体に再生することができる。本発明には、組織細胞培養物、液体培養物および固体プレート培養物を含む細胞培養物が包含される。本発明の植物によって産生される種子、および／または本発明の植物を再生するために使用される種子もまた、本発明の範囲内に包含される。他の植物組織および部分もまた、本発明に包含される。本発明には、本発明の核酸分子を含む植物または細胞を製造する方法も包含される。そのような植物を生産する好ましい方法は、本発明の種子を植えることを含む。このように形質転換された植物には、異なる作用様式を有する様々な除草剤に対する抵抗性を付与することができる。
【０１０２】
例えば、アグロバクテリウムを使用する植物細胞の形質転換のために、外植片を、形質転換をするのに十分な時間、形質転換されたアグロバクテリウムと組み合わせてインキュベートすることができる。形質転換後、適切な抗生物質で選択することによりアグロバクテリウムを死滅させ、植物細胞を適切な選択培地で培養する。カルスが形成されると、植物組織培養および植物再生の分野で公知の方法に従って、適切な植物ホルモンを使用して芽の形成を促進することができる。しかしながら、カルスの中間段階は必ずしも必要ではない。芽の形成後、植物細胞は、根の形成を促進する培地に移され、それによって植物の再生を完了すことができる。次いで、植物を成長させて種子を産生させ、該種子を使用して将来の世代を確立することができる。形質転換技術によらず、細菌タンパク質をコードする遺伝子は、好ましくは、ベクターに植物プロモーターエレメント、およびＮｏｓ等の３’非翻訳転写終結領域を含めることにより、植物細胞中で該遺伝子を発現するように適応させた遺伝子導入ベクターに組み込まれる。
【０１０３】
本発明によれば、植物栽培場所における雑草を防除するための方法であって、除草有効量の１種以上のＨＰＰＤ阻害性除草剤を、本発明の植物または種子を含む場所に適用することを含む方法も提供される。
【０１０４】
本発明において、「栽培場所」という用語は、土壌等の本発明の植物が栽培される場所を包含し、例えば、植物種子、植物苗および成長した植物も包含する。「除草有効量」という用語は、対象となる雑草の成長または発育に影響を与えるのに十分な除草剤の量を意味し、例えば、対象となる雑草の成長または発育を防止または阻害したり、雑草を死滅させたりする。有利には、除草有効量は、本発明の植物種子、植物苗または植物の成長および／または発育に有意に影響を及ぼさない。当業者であれば、従来の実験を通じてそのような除草有効量を決定することができる。
【０１０５】
本発明によれば、ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸（ＨＰＰ）からホモゲンチジン酸への変換を触媒する特性を保持または増強し、ＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する感受性が野生型ＨＰＰＤよりも著しく低い変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質を製造する方法であって、野生型ＨＰＰＤをコードする核酸を変異させる工程、発現ベクター内の変異した核酸を、溶解性増強成分をコードする核酸リーディングフレーム配列に一貫して融合および結合させて融合タンパク質をコードする配列を形成する工程、得られた組換え発現ベクターを宿主細胞に形質転換する工程、ＨＰＰＤ阻害性除草剤およびＨＰＰＤ酵素基質を含む適切な条件下で融合タンパク質を発現させる工程、およびｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸（ＨＰＰ）からホモゲンチジン酸への変換を触媒する特性を保持または増強し、ＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する感受性が著しく低い変異型ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質をスクリーニングする工程を含む方法も提供される。好ましくは、溶解性増強成分は、好ましくは、本発明の変異型ＨＰＰＤタンパク質と融合タンパク質を形成するＮｕｓＡから選択される。より好ましくは、発現ベクターは、ｐＥＴ-４４ａベクターから選択される。宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞または植物細胞から選択される。
【０１０６】
特に明記または示唆されない限り、本明細書で使用される「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語は、「少なくとも１つ」を意味する。本明細書で言及または引用されるすべての特許、特許出願および刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、その引用の程度は、個々の引用文献のそれと同じである。  
【０１０７】
本発明の詳細な実施形態
本発明を、以下の実施例と併せてさらに説明する。例に記載されているすべての方法と操作は例示として提供されるものであり、限定として解釈されるべきではない。ＤＮＡ操作の方法については、Current Protocols in Molecular Biology, Volumes 1 and 2, Ausubel F.M., Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, 1989, Molecular Cloning, T. Maniatis et al., 1982、またはSambrook J. and Russell D., 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual, version 3を参照されたい。
【実施例】
【０１０８】
実施例１  イネＨＰＰＤ（ＯｓＨＰＰＤ）遺伝子のクローニング
イネ（Oryza sativa、Japonica Group）の４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）遺伝子は、２番目の染色体Ｏｓ０２ｇ０１６８１００の部位に位置していた。コード領域ＤＮＡ（ＯｓＨＰＰＤ）（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｈｕｚｈｏｕ、Ａｎｈｕｉ  Ｐｒｏｖｉｎｃｅ、中国）は、対応するｃＤＮＡ配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＸＰ＿０１５６２６１６３．１）に従って直接合成され、ＰＣＲテンプレートとして使用した。プライマーＮｕｓＯｓＦ：ａｃｇａｔｔｇａｔｇａｃｇａｃｇａｃａａｇ  ＡＴＧＣＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＣＡＣＣＣＣおよびＮｕｓＯｓＲ：ｔｃｃａｃｇａｇｃｔｃｃｃｇｇａｃｔｃ  ＴＴＡ  ＣＴＡＧＧＡＴＣＣＴＴＧＡＡＣＴＧＴＡＧを、ベクターｐＥＴ−４４ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）およびＸＰ＿０１５６２６１６３．１の配列に従って設計および合成した。これらのプライマー、合成されたテンプレートおよびＱ５  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、New England Biolabs、ボストン、米国）を使用してＰＣＲ増幅を行った。増幅は、以下の条件下で行われた：９８℃で２分間；次いで、９８℃で２０秒間、６５℃で３０秒間、および７２℃で６０秒間を３５サイクル；および７２℃で２分間。増幅された断片はアガロースゲル電気泳動で１．３Ｋｂであることが示され、そのＤＮＡ濃度は回収後の紫外線吸収によって決定された。
【０１０９】
ｐＥＴ−４４ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）プラスミドをＢｏｘＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、上海、中国）を使用して３７℃で１時間消化し、次いで、６５℃に加熱してＢｏｘＩを不活化した。ＯｓＨＰＰＤ  ＤＮＡ断片とＢｏｘＩ線形化（linearized）ｐＥＴ−４４ａベクターとを等量混合し、それに等量の２×Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｈａｎｂｉｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ．、上海、中国）を添加し、混合し、５０℃で１時間インキュベートし；５μｌのライゲーション生成物を使用して、コンピテント大腸菌ＤＨ５ａを形質転換し、１００ｐｐｍのアンピシリンを含むＬＢ固体培地プレートの表面に細菌溶液を適用し、３７℃で一晩培養した。翌日、個々の細菌コロニーＰＣＲによって正しいクローンを確認した後、３つの正しいクローンを３７℃で一晩培養し、十分なプラスミドＤＮＡを抽出して、Ｑｉｎｇｋｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．（北京、中国）に送ってＳａｎｇｅｒシーケンシング法により配列を決定した。シーケンシング結果から、正しい完全長のイネＨＰＰＤコード領域ＤＮＡが得られたことが確認された。
【０１１０】
実施例２  イネＨＰＰＤ（ＯｓＨＰＰＤ）タンパク質の各アミノ酸の飽和ランダム変異
イネの全長ＯｓＨＰＰＤ酵素は４４６個のアミノ酸を有し、そのアミノ酸配列は配列番号２で表され、アミノ酸１〜５０は葉緑体への誘導に関与するシグナルペプチドを構成すると考えられている（Siehl et al. Plant Physiol. 2014 Nov.; 166(3): 1162-1176.）したがって、５１位のアミノ酸から４６６位のアミノ酸まで、各アミノ酸に飽和ランダム変異を生じさせた。これは、ＮＮＫに変異するアミノ酸のコード配列を含むプライマーと別の適切な従来のプライマーとを使用してブリッジＰＣＲを行うことによって達成された。ＮＮＫにおいて、ＮはＡ／Ｔ／Ｇ／Ｃを表し、ＫはＧ／Ｔを表し、ＮＮＫコドンは２０個のアミノ酸またはターミネーターのいずれか１つをコードし得る。したがって、これは飽和突然変異であったKille S, Acevedo-Rocha CG, Parra LP, Zhang ZG, Opperman DJ, Reetz MT, Acevedo JP (2013) Reducing codon redundancy and screening effort of combinatorial protein libraries created by saturation mutagenesis. ACS Synth Biol 2(2):83-92；Directed Evolution Library Creation: methods and protocols 2nd ed. Edited by Elizabeth M.J. Gillam, Janine N. Copp and David F. Ackerley New York, NY United States: Springer, 2014. doi:10.1007/978-1-4939-1053-3を参照されたい。多数の変異型が生成された。変異型を線形化ｐＥＴ−４４ａベクターにクローニングし、大腸菌に形質転換し、該大腸菌を、９６ウェルプレートを使用して、ＨＰＰＤ阻害性除草剤（１〜２μＭのテンボトリオン等）および基質チロシン（１ｇ／Ｌ）を含む２×ＹＴ培養液で、２８℃、１５０ｒｐｍのシェーカーで２４時間培養して発現させ、次いで、変異型をその色の褐色化に応じて迅速にスクリーニングした。この方法を使用することにより、１０個の単一アミノ酸変異、Ａ１０３Ｓ、Ｈ１４１Ｒ、Ｈ１４１Ｋ、Ｈ１４１Ｔ、Ａ１６５Ｖ、Ｖ１９１Ｉ、Ｒ２２０Ｋ、Ｇ３４２Ｄ、Ｄ３７０ＮおよびＫ４１０Ｉがスクリーニングされた。野生型と比較した場合における、テンボトリオンおよびベンズオフカオトンの代謝産物の存在下でのこれらの抵抗性変異型の呈色反応を図１に示す。これらの中で、Ｈ１４１ＲおよびＧ３４２Ｄの色の変化が最も顕著であり、野生型よりも明らかに濃かった。
【０１１１】
本特許の方法は、ＮｕｓＡとイネＨＰＰＤタンパク質とを融合させることにより、細菌で発現されたＨＰＰＤの溶解性を高め、それによりタンパク質を発現させ、２８℃で酵素反応を同時に行うことができ、スクリーニング時間と工程が大幅に削減された。
【０１１２】
同様に、他の３つのＨＰＰＤ阻害性除草剤、ファンビフカオトン、トプラメゾン、メソトリオンの存在下でのこれらの変異型の呈色反応を測定した；図２および３を参照されたい。５つの除草剤に対する各変異型の抵抗性／耐性を、その色の変化に基づいて概算し、その結果を表１に示す。プラス記号「＋」が多いほど、野生型と比較して色が濃くなり、抵抗性／耐性が高い。
【０１１３】
【表２】
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【０１１４】
全体のプロセスを、Ｈ１４１Ｒ変異型の産生とスクリーニングを例として説明する。
【０１１５】
１．ＮｕｓＯｓＦおよびＯｓＨＰＰＤ−Ｈ１４１Ｒ−Ｒ：ＣＡＣＣＧＣＧＡＧＧＣＣＧＴＧＧＴＣＣをプライマーとして使用し、合成された完全長ＯｓＨＰＰＤテンプレートおよびＱ５  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ボストン、米国）を使用してＰＣＲ増幅を行い、フォワード断片ＤＮＡを得た。増幅を以下の条件下で行った：９８℃／２分；９８℃／２０秒→６５℃／３０秒→７２℃／６０秒（３５サイクル）；および７２℃／２秒。アガロースゲル電気泳動で検出した後、正しいサイズのバンドを回収し、紫外線吸収により濃度を測定した。同様に、ＮｕｓＯｓＲおよびＯｓＨＰＰＤ−Ｈ１４１Ｒ−Ｆ：ＣＡＣＧＧＣＣＴＣＧＣＧＧＴＧＮＮＫＧＣＣＧＴＧＧＣＧＣＴＧＣＧＣＧをプライマーとして使用し、合成された完全長ＯｓＨＰＰＤテンプレートおよびＱ５  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ボストン、米国）を使用してＰＣＲ増幅を行い、リバースＤＮＡ断片を得た。
２．フォワード断片とリバース断片とでは、中央に１９個の重複する塩基がある（ＯｓＨＰＰＤ−Ｈ１４１Ｒ−ＦおよびＯｓＨＰＰＤ−Ｈ１４１Ｒ−Ｒ）。そこで、２つの断片を等モル量混合し、等量の２×Ｇｌｏｄｓｔａｒ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＣｏｍＷｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、北京）を添加し、プライマーとして１０ｐｍｏｌのＮｕｓＯｓＦおよびＮｕｓＯｓＲを添加して、ブリッジＰＣＲ反応を行った。増幅を以下の条件下で行った：９６℃で２分間；９６℃で２０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で６０秒間（３０サイクル）；および７２℃で５分間。アガロースゲル電気泳動で検出した後、正しいサイズ（１．３Ｋｂ）のバンドを回収し、紫外線吸収により濃度を測定した。
３．ＯｓＨＰＰＤＭｕｔ  ＤＮＡ断片を上記の線形化ｐＥＴ−４４ａベクターと等量混合し、それに等量の２×Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｈａｎｂｉｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を添加し、５０℃で１時間インキュベートし；５μｌのライゲーション生成物を使用して、コンピテント大腸菌ＤＨ５ａを形質転換し、１００ｐｐｍのアンピシリンを含むＬＢ固体培地プレートの表面に細菌溶液を適用し、３７℃で一晩培養した。プレート上のすべてのクローン（コロニー）を破壊し、プラスミドを抽出し、ＵＶ吸収によってＤＮＡを定量した。１００ｎｇのプラスミドをコンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、プレートをコーティングし、３７℃で一晩培養した。変異型をスクリーニングするために、形質転換された大腸菌を含むプレートを一時的に４℃で保存した。
４．呈色反応によるＨＰＰＤ阻害性除草剤に耐性を有する変異型のスクリーニング
ＨＰＰＤ阻害性除草剤はＨＰＰＤ酵素活性を阻害した。チロシントランスアミナーゼの作用下でチロシンが４−ヒドロキシフェニルピルビン酸（ＨＰＰ）に変換された場合、不活化ＨＰＰＤは４−ヒドロキシフェニルピルビン酸をホモゲンチジン酸（ＨＧＡ）に酸化することができなかった。ＨＧＡは暗褐色であった。したがって、ＨＰＰＤ変異型が除草剤に抵抗性または耐性を有する場合、大腸菌で発現させた後、変異型は４−ヒドロキシフェニルピルビン酸をホモゲンチジン酸に酸化することもでき、そのため暗褐色が現れた。そのため、９６ウェルプレートを用いてＨＰＰＤ阻害性除草剤および基質チロシンを含む２×ＹＴ培地で大腸菌を培養し、色の変化に応じて迅速にスクリーニングした。
【０１１６】
（１）２×ＹＴ培地の調製（１ｇ／Ｌ  Ｌ−Ｔｙｒ、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ、０．０１ｍＭ  ＭｎＣｌ２および１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを添加）。
（２）上記培地０．１ｍＬを９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、上記形質転換により得られた大腸菌プレートからのＯｓＨＰＰＤ野生型または変異型（ＯｓＨＰＰＤ  Ｍｕｔ）の発現クローンを９６ウェルプレートの液体培地に供した。選択した様々な薬剤に応じて、最終濃度が１μＭ〜２０μＭのＨＰＰＤ阻害剤を添加し、例えば、テンボトリオンの最終濃度は１．７μＭであり、メソトリオンは１０μＭであった。すべての成分を添加した後、強力なガス透過性シーリングフィルム（Ｓｕｏｌａｉｂａｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、北京、中国）をカバーとして適用した。
（３）９６ウェルプレートをシェーカー上で２８℃、１５０ｒｐｍで２４時間インキュベートした。培養物の４００ｎｍでの光吸収を可視化または検出し、接種ループ（inoculating loop）を使用して黒色色素を有意に生成するクローンを選択し、さらに培養した。プラスミドＤＮＡを抽出し、ＯｓＨＰＰＤタンパク質の発現、精製、酵素活性アッセイ等のさらなる研究のために配列を決定した。
【０１１７】
単一部位変異型Ａ１０３Ｓ、Ａ１６５Ｖ、Ｖ１９１Ｉ、Ｒ２２０Ｋ、Ｄ３７０Ｎ、Ｋ４１０Ｉおよび３部位変異型Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｄ３７０Ｎは、それぞれ表２に示すプライマーを用いて、同じ方法を使用して得られた。
【０１１８】
【表３】
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【０１１９】
さらに、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ、Ｈ１４１Ｒ／Ｄ３７０Ｎ、Ｇ３４２Ｄ／Ｄ３７０Ｎ等の単一部位の変異の組み合わせを含むいくつかの２部位変異型も、ブリッジＰＣＲと同様の方法で調製した。
【０１２０】
実施例３  イネＨＰＰＤ（ＯｓＨＰＰＤ）タンパク質の複数部位変異の組み合わせ
本発明では、異なる９６ウェルプレート上の異なる時間におけるＨ１４１Ｒ、Ｇ３４２Ｄ、Ｄ３７０Ｎおよびそれらの組み合わせを含む変異型ＨＰＰＤタンパク質と、５つの異なるＨＰＰＤ阻害性除草剤、例えば、テンボトリオン、ベンズオフカオトンの代謝産物、ファンビフカオトン、トプラメゾンおよびメソトリオンとの呈色反応についても試験をした。試験結果を図４、５および６に示す。表３は、色合いに基づいて推定される対応する除草剤に対するこれらの変異型の抵抗性／耐性を示す。表３から、２部位変異型と３部位変異型も高い除草剤耐性を有し、アミノ酸変異の組み合わせがイネＨＰＰＤ（ＯｓＨＰＰＤ）タンパク質に組み合わせて存在する可能性があり、これらもＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する高い抵抗性および／耐性をもたらすことが示された。
【０１２１】
【表４】
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【０１２２】
実施例４  ３部位変異型Ｈ１４１Ｒ−Ｇ３４２Ｄ−Ｄ３７０Ｎに基づくさらなる飽和変異
１．Ｅ．ｃｏｌｉで発現した３部位変異型ＯｓＨＰＰＤＨ１４１Ｒ−Ｇ３４２Ｄ−Ｄ３７０Ｎの呈色反応において、シュアンズオカオトン（コード１０１）を阻害に使用した場合、有意な呈色反応が起こらないためには１２０μＭの濃度が必要であった。したがって、１２０μＭの化合物１０１を最初のスクリーニングに選択した。上述の技術的経路を使用することにより、５１〜４４６アミノ酸位置（１４１Ｒ、３４２Ｄおよび３７０Ｎ部位を除く）の各アミノ酸に対してそれぞれプライマーのペアが設計され、そのうちの１つは飽和変異を受けるアミノ酸部位においてＮＮＫによって表された。一連の変異型はＰＣＲ増幅によって生成され、次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）中で発現され、１２０μＭの化合物１０１で繰り返しスクリーニングされた。すべての単一部位変異がスクリーニングされた後、１８の新しい変異部位が得られた。新しい部位は：Ｒ９３Ｓ、Ｇ２２６Ｈ、Ｌ２７６Ｗ、Ｐ２７７Ｎ、Ｐ３３６Ｄ、Ｐ３３７Ａ、Ｎ３３８Ｄ、Ｎ３３８Ｓ、Ｎ３３８Ｙ、Ｒ３４６Ｃ、Ｒ３４６Ｄ、Ｒ３４６Ｈ、Ｒ３４６Ｓ、Ｒ３４６Ｙ、Ｉ３７７Ｃ、Ｐ３８６Ｔ、Ｌ３９０Ｉ、Ｍ３９２Ｌ、Ｅ４０３Ｇ、Ｋ４１８Ｐ、Ｇ４１９Ｆ、Ｇ４１９Ｌ、Ｇ４１９Ｖ、Ｎ４２０Ｓ、Ｎ４２０Ｔ、Ｅ４３０Ｇ、Ｙ４３１Ｌであった。これらの新しい変異部位のアミノ酸変化およびヌクレオチド（塩基）、ならびにこれらの新しい変異部位を生成するために使用されるプライマーを表４に示し、プライマーの配列を表５に示す。すなわち、図７に示すように、合計２６の変異部位がスクリーニングによって得られ、いくつかの部位の１つの元のアミノ酸は、いくつかの異なるアミノ酸、例えば、Ｈ１４１Ｒ、Ｋ、Ｔ；Ｎ３３８Ｄ、Ｓ、Ｙ；Ｒ３４６Ｃ、Ｄ、Ｈ、Ｓ、Ｙ；Ｇ４１９Ｆ、Ｌ、ＶおよびＮ４２０Ｓ、Ｔに変更することができる。
【０１２３】
【表５】
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【０１２４】
【表６】
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【０１２５】
実施例５  突然変異部位の組み合わせ
変異部位は、以下の３つの原則に基づいて組み合わされた：遺伝子編集における相同置換を容易にするために部位が近接しており、編集効率が高く；塩基の変化は、塩基編集を容易化するために、Ａ→Ｇ／Ｔ→ＣまたはＣ→Ｔ／Ｇ→Ａと同じであり；抵抗性部位は、編集を容易にし、起こりうる悪影響を回避するために、可能な限り小さくした。上記の原則に基づいて、対応するプライマーと原核生物発現ベクターとの組み合わせを設計し、次いで、呈色反応によってスクリーニングして、遺伝子編集を行うための編集に適した顕著な抵抗性のある組み合わせを見出した。
【０１２６】
（１）近接の原則に基づいて、合計３３の組み合わせが設計され、そのうち２４の組み合わせは３つの変異部位を有し、９つの組み合わせは４つの変異部位を有していた。これらの組み合わせおよび使用したプライマー配列を表６に示す。
【表７】
2021526849.tif 000013
2021526849.tif 000014
【０１２７】
図８に示すように、これらの近接する変異部位の様々な組み合わせをクローン化し、発現させ、呈色反応によって比較し、それぞれＮ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｃ、Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６ＨおよびＮ３３８Ｓ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｃの変異部位を有する３つの組み合わせが、それぞれ最高の抵抗性を示し、１０００〜１５００μＭのシュアンズオカオトンの代謝産物１０１の存在下でも有意な呈色反応を示し、Ｐ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６ＣおよびＰ３３６Ｄ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｈの４つの近接変異部位を有する２つの組み合わせが続くことが見出された。
【０１２８】
（２）６つの組み合わせ、すなわち、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｎ４２０Ｓ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｓ／Ｎ４２０Ｓ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ、ならびに同じＡ→Ｇ／Ｔ→Ｃに対応するＨ１４１Ｒ／Ｎ４２０Ｓ、ならびに同じＣ→Ｔ／Ｇ→Ａに対応するＧ３４２Ｄ／Ｒ３４６ＣおよびＧ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｈが、塩基編集の容易化の原則に基づいて設計された。これらの組み合わせを生成するためのプライマーおよびそれらの配列を表７に示す。
【０１２９】
【表８】
2021526849.tif 000015
【０１３０】
検出後、上記６つの組み合わせの呈色反応も強く、除草剤１０１を６００〜１０００μＭの濃度で含むＥ．ｃｏｌｉ培養液で呈色反応を識別できることが見出された。
【０１３１】
（３）その他の組み合わせを表８に示す。
【表９】
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【０１３２】
検出後、上記の２つの変異部位の組み合わせの呈色反応は肉眼で弱く観察され、それらすべてについて１００μＭ以内の化合物１０１であることが見出され；３、４またはそれ以上の部位の組み合わせでは、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｎ３３８Ｄ／Ｒ３４６Ｃ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｎ３３８Ｄ／Ｒ３４６Ｈ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｎ３３８Ｄ／Ｋ４１８Ｐ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ４１９ＦおよびＨ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ４１９Ｆ／Ｎ４２０Ｓの呈色反応は強く、化合物１０１の濃度が１０００〜２０００μＭでも呈色した（図９に示される）。
【０１３３】
すなわち、単一部位変異は１０〜２０μＭで抵抗性を示し；２つの変異部位の組み合わせは約２０〜１２０μｍで抵抗性を示し、その抵抗性は単一部位変異の抵抗性よりも強く、かつ１００μＭで色が薄くなり；３つの変異部位の組み合わせ、すなわち、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｋ４１８Ｐ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｇ４１９Ｆ、３３８Ｄ／３４２Ｄ／３４６Ｃ／Ｈ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｎ４２０Ｓ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｎ４２０Ｓ等は、順調に良好な耐性を示し、１０００μＭまでは淡い色を呈し；４つ以上の変異部位の組み合わせ、すなわち、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｋ４１８Ｐ、Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｋ４１８Ｐ／Ｇ４１９Ｆ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｃ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｈ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｋ４１８Ｐ／Ｇ４１９Ｆ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｇ４１９Ｆ／Ｎ４２０Ｓ、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｋ４１８Ｐ／Ｇ４１９Ｆ／Ｎ４２０Ｓ等は、より高い抵抗性を示し、２５００μＭの濃度の化合物１０１でも呈色が顕著であった。
【０１３４】
実施例６  ＯｓＨＰＰＤタンパク質の発現、単離および精製
イネのＯｓＨＰＰＤタンパク質およびホモゲンチジン酸１，２−ジオキシゲナーゼ（ＨＧＤ）を、大腸菌で異種発現させることにより、すなわち遺伝子をｐＥＴ−１５ｂ発現ベクターに挿入し、ＢＬ２１（ＤＥ３）発現株で発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂により精製することにより得た。
【０１３５】
（１）陽性クローンのＨＰＰＤオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をｐＥＴ−１５ｂベクターにクローニングして６Ｈｉｓ−ＨＰＰＤ発現ベクターを形成し、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。発現株を１０ｍＬの２×ＹＴ培地に接種し、３７℃、２００ｒｐｍのシェーカーで一晩培養した。１０ｍＬの培養物を１Ｌの２×ＹＴ培地に接種し、ＯＤ６００が０．６〜０．８に達するまで培養し、１６℃の温度に冷却し、０．２ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）で一晩誘導発現させた。菌株を、２８００×ｇでの遠心分離によって収集した。
（２）収集した菌株をバッファーＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  イミダゾール）で再懸濁し、ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルホニルフルオリド）を最終濃度１ｍＭおよび２５０μＬのプロテアーゼ阻害剤カクテル（すなわち、複数のプロテアーゼ阻害剤の混合物）を添加し、混合した。細胞を氷浴中で超音波（総出力の４０％、３秒／６秒間隔で作業、２×３０分（Ｎｉｎｇｂｏ  Ｓｃｉｅｎｔｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、寧波、中国））によって破壊し、４℃で３０分間、１２０００ｒｐｍで遠心分離し；上清を０．２２μｍフィルターメンブレンでろ過した。
（３）Ｎｉ−ＮＴＡカラムによる精製：上清をＮｉ−ＮＴＡ樹脂と接触させ、次いで、５０ｍＭイミダゾールを含むバッファーＡで洗浄して不純物を除去し、最後に４００ｍＭイミダゾールを含む溶出バッファーで溶出した。
（４）目的のタンパク質のおおよその純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。目的のタンパク質を含む溶出液を合わせ、限外ろ過装置（１０ｋＤａ分子量カットオフ、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）で濃縮した。溶液を、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌを含むｐＨ７．５の溶液で少なくとも３回置換して、脱塩した。総タンパク質濃度をＢＣＡ法により測定した。発現および精製されたすべてのイネＨＰＰＤ野生型およびその様々な変異型を表９に示す。
【０１３６】
【表１０】
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【０１３７】
（５）透析または脱塩カラムの通過：バッファーを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０および５００ｍＭ  ＮａＣｌのストック溶液と置換した。濃度をＢＣＡ法により測定した。包装して液体窒素で急速冷凍した後、溶出液を−８０℃の冷蔵庫に保存した。
【０１３８】
実施例７  ＯｓＨＰＰＤタンパク質の様々な酵素パラメーターに対する化合物の効果の決定
１．ＨＰＰＤ酵素の活性は、ＨＰＰＤ酵素によって触媒される４−ヒドロキシフェニルピルビン酸（４−ＨＰＰ）からホモゲンチジン酸（ＨＧＡ）への変換、およびホモゲンチジン酸ジオキシゲナーゼによって触媒されるＨＧＡからマレイルアセトアセテート（ＭＡＡ）への変換を検出することによって決定された。マレイルアセトアセテートは、３１８ｎｍで最大吸収を示し、吸収定数は１４．７ＯＤ  Ｍ−１．ｃｍ−１であった。
２．基質の最終濃度の５０倍の濃度の４−ヒドロキシフェニルピルビン酸（４−ＨＰＰ）６μｌをＥＬＳＡプレートに添加し、次いで、ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）２９４μＬを、最終濃度２５ｍＭ、ｐＨ７、２ｍＭのビタミンＣ、１０ｍＭ  ＦｅＳＯ４、５０ｎＭのホモゲンチセートジオキシゲナーゼおよび５〜２４０ｎＭ  ＨＰＰＤ酵素と共に一度に添加した。反応基質４−ＨＰＰの最終濃度は、通常１〜１００μＭの範囲であった。
３．３１８ｎｍでの反応ウェルの吸光度変化を、ＵＶ  ＥＬＩＳＡ検出器（ＲｅａｄＭａｘ  １９００  光吸収型全波長マイクロプレートリーダー）（上海）で継続的にモニターした。
４．ＯｓＨＰＰＤのＫｍ、ＫｃａｔおよびＫｃａｔ／Ｋｍの決定
Ｖｍａｘは、酵素触媒作用によって達成可能な最大触媒反応速度である。ミカエリス定数Ｋｍは、酵素が反応を触媒して最大速度（Ｖｍａｘ）の半分を達成するときに必要な基質の濃度である。Ｋｍ値は一定であり、酵素濃度に依存せず、基質の種類、反応温度、ｐＨおよびイオン強度の変化に応じて変化する。Ｋｃａｔは酵素の触媒定数であり、酵素分子または酵素活性中心によって１秒あたりに触媒され得る基質分子の数を指す。Ｋｃａｔ／Ｋｍは酵素の触媒効率を表す。表１０に示すように、野生型イネＨＰＰＤ（ＷＴ）および様々な変異型の酵素パラメーターを決定した。表のデータから、ほとんどのＨＰＰＤ変異型の触媒効率が向上していることが示された。
【０１３９】
【表１１】
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【０１４０】
５．ＯｓＨＰＰＤタンパク質に対する除草剤１０１およびファンビフカオトンの阻害活性（ＩＣ５０）の測定
図１０および表１１に示すように、シュアンズオカオトンの代謝産物およびファンビフカオトンのイネ野生型（ＷＴ）および様々な変異型ＯｓＨＰＰＤタンパク質に対する阻害活性を測定し、この結果から、様々な変異型に対する化合物１０１およびフアンビフカオトン除草剤化合物のＩＣ５０値は、野生型に対するのと比較して明らかに増強さたことが示された。例えば、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｋ４１８Ｐ／Ｇ４１９Ｆ／Ｎ４２０Ｓ変異型に対する化合物１０１除草剤化合物のＩＣ５０値は、野生型のＩＣ５０値と比較して１３．７倍増大し、変異型に対するフアンビフカオトンのＩＣ５０値は１．８倍増大した。ＩＣ５０値の増大は、ＨＰＰＤ除草剤に対するこれらの変異型の耐性が改善されたことを示す。１０１およびファンビフカオトンのそれぞれの固有の特性により、ＩＣ５０値の増大の程度は、２つのＨＰＰＤ除草剤で完全に一貫しているわけではない。
【０１４１】
【表１２】
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【０１４２】
６．阻害剤に対するＯｓＨＰＰＤタンパク質の酵素適合性の決定
酵素の適合性は、阻害剤に対する酵素の適応性の指標であり、その値が高いほど、阻害剤に対する酵素の抵抗性が強い。反応中の基質の濃度はＫｍ値よりもはるかに高く、異なるＯｓＨＰＰＤ変異型の反応条件は同じであるため、Ｋｃａｔは、同じ濃度の酵素（５００ｎＭ）での触媒作用によって達成されるＶｍａｘに置換することができる。
酵素適合性＝Ｋｃａｔ＊Ｋｍ−１＊Ｋｉ、  Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋Ｓ／Ｋｍ）（阻害定数）
イネＨＰＰＤＷＴおよび様々な変異型に対する除草剤化合物１０１およびファンビフカオトンの阻害定数、ならびにそれらに対応する酵素適合性を検出して、除草剤に対するこれらの変異型の耐性をさらに評価した。表１２に示す結果から、変異型の酵素適合性がすべて野生型と比較して異なるレベルの増強を有することが示唆され、それらの増強された耐性が確認された。
【０１４３】
【表１３】
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【０１４４】
要約すると、一連の酵素試験により、除草剤に対するイネのＯｓＨＰＰＤ変異型の耐性が、野生型ＷＴと比較して改善されていることが確認された。その中で、呈色反応で最も強い抵抗性を示した４部位変異型Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｋ４１８Ｐは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素活性実験でも高い抵抗性を示した。さらに、結果から、Ｋ４１８Ｐ変異を有する変異型が大幅に改善された抵抗性を示すが、基質（Ｋｍ）への親和性が低下したことが示された。変異型Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｐ２７７Ｎおよび変異型Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｋ４１８Ｐは同等の抵抗性を有し、基質（Ｋｍ）に対する親和性は低下しなかった。さらに、３部位変異型Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄおよび４部位変異型Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｐ３８６Ｔも比較的高い抵抗性を有し、そのＫｍは低下しなかった。最も短い３部位変異型Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｈも良好な抵抗性を示し、編集が容易であった。
【０１４５】
Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ／Ｒ３４６Ｈ（最も短く、相同置換ＨＤＲに適している）、Ｈ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｇ３４２Ｄ（より短く、相同置換にも適している）およびＨ１４１Ｒ／Ｎ３３８Ｄ／Ｎ４２０Ｓ（塩基編集に適しており、より強い抵抗性）を優先的にさらなる試験で検討した。遺伝子導入と遺伝子編集を行った後、植物の耐性変化を検出した。
【０１４６】
実施例８  トランスジェニックイネにおける３部位変異型ＯｓＨＰＰＤ３Ｍの過剰発現
１．過剰発現ベクターの構築
１）プライマー：プライマーは、選択した制限部位および遺伝子自体のヌクレオチド配列に従って設計され、３部位変異型ＨＰＰＤ（Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｄ３７０Ｎ）（ＯｓＨＰＰＤ３Ｍ）を増幅する。設計されたプライマーは、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｑｉｎｇｋｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．で合成された：ＨＰＰＤ−Ｆ、ＧＡＴＡＧＣＣＧＧＴＡＣＧＧＧＴＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣ  ＡＴＧＣＣＴＣＣＣＡＣＴ  ＣＣＣＡＣＣＣ、ＨＰＰＤ−Ｒ、ＣＡＴＣＴＴＴＧＴＡＡＴＣＧＧＧＧＴＡＣＣＴＡＧＧＡＴＣＣＴＴＧＡＡＣＴＧＴＡＧＧＧＧＣ。
２）ＰＣＲ増幅：合成されたプライマーおよびＱ５  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ボストン、米国）を使用して、目的の遺伝子を増幅した。増幅産物をアガロースゲル電気泳動でアッセイし、ＴＩＡＮｑｕｉｃｋ  Ｍｉｄｉ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットの操作説明書に従って産物を回収した。回収が完了した後、抽出されたＤＮＡの濃度をＮａｎｏｄｒｏｐで測定した。
３）イネ過剰発現ベクターの構築：イネ過剰発現ベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３０１−ＯｓＨＰＰＤ３Ｍを、ＨａｎＢｉｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（上海）のＨＢ−ｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ（商標）シームレスクローニングキットを使用して、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって消化された回収ＨＰＰＤ断片およびプラスミドｐＣＡＭＢＩＡ１３０１を使用して構築し、次いで、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換して陽性クローンを得；配列決定および制限エンドヌクレアーゼ消化後に、陽性クローンをアグロバクテリウムに形質転換した。
【０１４７】
２．形質転換アグロバクテリウムに感染したイネのカルスおよびトランスジェニックイベントの発生
１）イネ過剰発現ベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３０１−ＯｓＨＰＰＤ３ＭおよびｍＣｈｅｒｒｙ（蛍光タンパク質のマーカー遺伝子）のみを発現する空のベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３０１を、それぞれ１μｇでコンピテントアグロバクテリウムＥＨ１０５に添加し、それぞれ氷上で５分間静置し、液体窒素に５分間浸して急速に凍結し、３７℃で５分間放置し、最後に氷上に５分間静置し；これに５００μｌのＹＥＢ溶液培地（抗生物質不含）を添加し、シェーカーで２８℃、２００ｒｐｍで２〜３時間培養し；３５００ｒｐｍでの遠心分離によって細胞を収集し、収集した細胞をＹＥＢ（カラマイシン＋リファンピシン）プレートに適用し、２８℃のインキュベーターで２日間培養し；単一クローンを選択し、液体培地で培養し、−８０℃で保存した。
２）アグロバクテリウムの培養：形質転換されたモノクローナルアグロバクテリウムを選択し、ＹＥＢ液体培地（カラマイシン＋リファンピシン）でＯＤ６００が０．５になるまで２８℃で培養し、３５００ｒｐｍでコロニーを収集し、等量のＡＡＭ液体培地（１ｍｌ  ＡＡＭ＋１μｌ  １０００×ＡＳ）で希釈しまし、カルスの感染に使用した。
３）イネ品種Ｚｈｏｎｇｈｕａ  １１のカルスの誘導：アグロバクテリウムを調製する前に、最初にイネのカルスを調製した。イネの種子の皮をむき、洗浄時間を制限せずに洗浄水が透明になるまで滅菌水で洗浄し、７０％アルコールで３０秒間、次いで５％次亜塩素酸ナトリウムで殺菌し、次いで、水平シェーカーで２０分間培養し、次亜塩素酸ナトリウムで殺菌し、滅菌水で５回洗浄し、滅菌吸収紙の上に静置して種子表面の水を風乾し、誘導培地に接種して２８℃でカルスを培養した。
４）イネのカルスへのアグロバクテリウムの感染：直径３ｍｍのＨｕａｉｄａｏ  Ｎｏ．５のカルスを選択して１０日間予備培養し、カルスを５０ｍｌの遠心分離管に収集した。カルスを含む遠心分離管に、濃度を調節したアグロバクテリウムの細菌溶液を添加し、遠心分離管を２８℃、２００ｒｐｍのシェーカーに静置して２０分間感染させ；感染が完了した後、細菌溶液を取り出し、カルスを滅菌濾紙上に静置し、約２０分間風乾し、ＡＡＭ（１ｍｌ  ＡＡＭ＋３０μｌ  １０００×ＡＳ）液体培地で湿らせた滅菌濾紙で覆った共培養プレート上で共培養し；侵入の３日後、アグロバクテリウムを洗浄して除去し（すなわち、滅菌水で５回洗浄し、次いで、５００ｍｇ／Ｌのセファロスポリン抗生物質で２０分間洗浄）、カルスを５０ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンスクリーニング培地で培養した。
５）抵抗性カルスのスクリーニング、分化および発根：共培養されたカルスを、初回のスクリーニング（２週間）のためにスクリーニング培地に移し；初回のスクリーニングの後、新しく成長したカルスを２回目のスクリーニング（２週間）のためにスクリーニング培地（５０ｍｇ／Ｌハイグロマイシンを含む）に移し；スクリーニング終了後、成長状態が良好なブロンドの（blond）カルスを選抜して分化させ、除草剤耐性のスクリーニングのために１μＭ〜５μＭのテンボトリオンを分化培地に添加した。３〜４週間後、約１ｃｍの苗が得られた。分化した苗を発根培養のために発根培地に移し；発根した苗に順化処理を施し、次いで、温室で栽培するために土壌の入ったポットに移し；５５のＯｓＨＰＰＤ３Ｍ苗またはイベントを得た。
【０１４８】
３．トランスジェニック苗の除草剤耐性の予備的検出（Ｔ０世代）：１〜５μＭのテンボトリオンを分化培地に添加した結果、空のベクターコントロールを有する苗はテンボトリオンに耐性がなく、３部位変異型ＨＰＰＤ（Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｄ３７０Ｎ）を過剰発現する形質転換された苗は、図１１に示すように、３μＭのテンボトリオンに耐性があることが示された。
【０１４９】
４．トランスジェニック苗の除草剤耐性の再検出（Ｔ０世代）：Ｔ０世代のトランスジェニック苗を温室内の大きなプラスチック製のバケツに移植して、Ｔ１世代の種子を得た。接合段階で過剰発現した変異型イベントから２つのイベントをランダムに選択し、２つのイベントおよびコントロールとして同じ成長段階の非トランスジェニックイネ品種Ｚｈｏｎｇｈｕａ  １１の除草剤耐性を検出した。使用した除草剤はシュアンズオカオトンであった。シュアンズオカオトンのフィールドレート（field rate）は通常４ｇ  ａ．ｉ．／ｍｕであった。この試験では、シュアンズオカオトンの割合は１ｍｕ当たり８および１６ｇであった。
【０１５０】
抵抗性検出の結果：噴霧（１６ｇ／ｍｕ）の後５日目と噴霧（８ｇ／ｍｕ）の後７日目に、非トランスジェニックイネの苗は白化し始めたが、過剰発現トランスジェニック変異型、イベント１、イベント２、イベント３およびイベント４は緑色であった。噴霧の３２日後、除草剤を噴霧した非トランスジェニック苗はほぼ死滅したが、除草剤を８ｇ／ｍｕまたは１６ｇ／ｍｕで処理した過剰発現トランスジェニック変異型は依然として緑色であり、正常に成長した、および穂を出し始めた（図１２Ａおよび１２Ｂに示す）。
【０１５１】
５．トランスジェニック苗（Ｔ１世代）の除草剤耐性の再検出：
ａ）過剰発現トランスジェニック変異型ＨＰＰＤから選択された３つのイベント、イベント２０、イベント２８およびイベント３７、ならびに非トランスジェニック野生型Ｈｕａｉｄａｏ  Ｎｏ．５（Ｈｕａｉｄａｏ  Ｎｏ．５は、Ｚｈｏｎｇｈｕａ  １１よりもＨＰＰＤ阻害剤シュアンズオカオトンに対する自然耐性が高く、Ｈｕａｉｄａｏ  Ｎｏ．５に基づいて抵抗倍数を計算することはできず、実際の抵抗はもっと高いはずでる）が使用された。
ｂ）使用されたシュアンズオカオトンの割合は０、４、８、１６、３２および６４ｇ／ｍｕであった。冬の温室内は低温であり照明が弱いため、植物毒性の症状はゆっくりと現れた。噴霧の１４日目に、３２および６４ｇ／ｍｕの除草剤で処理された非トランスジェニック  Ｈｕａｉｄａｏ  Ｎｏ．５は症状を示したが、トランスジェニックイベントは無症状であり、緑色のままであった（図１２Ｃおよび１２Ｄ）。
【０１５２】
結論として、過剰発現３部位変異型ＯｓＨＰＰＤ３Ｍ（Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｄ３７０Ｎ）は、トランスジェニックイネ品種のＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する耐性を、少なくとも４倍増強し得る。Ｔ０世代およびＴ１世代の成長、発達、開花および結実の予備観察から、ほとんどの植物が正常であることが示された。
【０１５３】
実施例９  トランスジェニックイネで過剰発現されたＨＰＰＤコピー数の決定
ハイグロマイシン抵抗性遺伝子：イネのｈｐｐｄ（Ｏｓｈｐｐｄ）遺伝子は、ＧＣ含量が高く、ＰＣＲ増幅の効率に影響を及ぼした。さらに、イネにはｈｐｐｄの内因性コピーが存在する。したがって、コピー数を推定するために、選択的マーカー遺伝子であるハイグロマイシン耐性遺伝子ｈｙｇを外因性遺伝子として選択し、スクロースホスフェートシンターゼ（ＳＰＳ）遺伝子を内因性参照遺伝子として選択した。ＳＰＳ遺伝子はイネ特異的遺伝子であり、イネの内因性参照遺伝子として機能し得る単一コピーである（Ding Jiayu, Jia Junwei, Yang Li tao et al. Validation of a rice specific gene, sucrose phosphate synthase, used as the endogenous reference gene for qualitative and real-time quantitative PCR detection of transgenes [J] .J. Agric. Food Chem., 2004, 52: 3372-7）。過剰発現したｈｐｐｄのコピー数は、トランスジェニックイネの選択マーカー遺伝子ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇ）のコピー数を決定することによって間接的に推定することができる。
【０１５４】
ゲノムＤＮＡ：Ｔｉａｎ’ｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（北京）の植物ゲノムＤＮＡ抽出キットを用いて、イネ葉のゲノムＤＮＡを抽出および精製し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ核酸分析装置（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）によりＤＮＡの含有量および純度を検出した。ＯＤ２６０／ＯＤ２８０の比率が１．８〜２．０の範囲である場合、ＯＤ２６０／ＯＤ２３０の比率が約２．０の場合に純度が良好であると考えられた。
【０１５５】
プライマー：２対のプライマーを設計した：Ｈｙｇ−Ｆ：５’−ＧＴＡＣＡＣＡＡＡＴＣＧＣＣＣＧＣＡＧ−３’およびＨｙｇ−Ｒ：５’−ＴＣＴＡＴＴＴＣＴＴＴＧＣＣＣＴＣＧＧＡＣ−３’を使用して、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子の１１１ｂｐ断片の長さを増幅した；Ｓｐｓ−Ｆ：５’−ＧＴＡＣＡＣＡＡＡＴＣＧＣＣＣＧＣＡＧ−３’およびＳｐｓ−Ｒ：５’−ＴＣＴＡＴＴＴＣＴＴＴＧＣＣＣＴＣＧＧＡＣ−３’を使用して、スクロースホスフェートシンターゼ（ＳＰＳ）遺伝子の１７０ｂｐ断片を増幅した。
【０１５６】
定量的ＰＣＲ反応システム：反応溶液（２０μＬ）を、リアルタイム蛍光定量的ＰＣＲ用のＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  ＥｘＴａｑ  ＩＩシステムに従って調製した。ＰＣＲ増幅の手順：予備変性９５℃／３０秒、次いで、９５℃／５秒→５５℃／３０秒→７２℃／３０秒、４０サイクル。
【０１５７】
標準曲線の描画：定量的にＰＣＲ増幅された断片を含むＳＰＳまたはＨＹＧ遺伝子のそれぞれの４００ｂｐの配列を選択し、それらを相同組換えによって連結し、次いで、ｐＣｌｏｎｅ００７ベクターに連結した。ＨＹＧ遺伝子およびＳＰＳ遺伝子を含む構築された標準産物プラスミドを制限エンドヌクレアーゼＰｓｈａＩで線形化ＤＮＡに消化し、核酸タンパク質検出器でその濃度を測定し、グラジエントｄｄＨ２Ｏで１０６コピー／μＬ、１０５コピー／μＬ、１０４コピー／μＬ、１０３コピー／μＬおよび１０２コピー／μＬに希釈した。希釈率の異なる５つの標準サンプルおよびコントロールを同時に増幅し、各サンプルについて３つの技術的複製を設定した。上記のようにＰＣＲ増幅を行った。濃度とコピー数との換算式は：コピー数（コピー／ｍＬ）＝（６．０２×１０２３コピー／ｍｏｌ）×（ＤＮＡ濃度ｇ／ｍｌ）／（ＭＷｇ／ｍｏｌ）であった。平均分子量（ＭＷ  ｇ／ｍｏｌ）：ｄｓＤＮＡ＝（塩基数）×（６６０ダルトン／ｂｐ）。
【０１５８】
導入遺伝子のコピー数の計算：試験された各サンプルは、閾値に達した時点のサイクル数Ｃｔを有していた。サンプル中の初期テンプレートの量を得るために、Ｃｔ値を標準曲線に代入し、初期テンプレート数の内因性遺伝子の初期テンプレートの量に対する目的の遺伝子の初期テンプレート量の比率は目的の遺伝子のコピー数であった。実験から得られたデータを、ソフトウェアによってエクスポートし、Ｅｘｃｅｌによって分析した。
【０１５９】
リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ：トランスジェニックイネにおける関連遺伝子の発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲ法を使用して分析し、遺伝子過剰発現の効率を検証した。イネのＵＢＱ５遺伝子を内因性参照遺伝子として使用した。リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ用に反応溶液を調製した。ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  ＥｘＴａｑ  ＩＩシステムに従って、反応液（２０μＬ）を調製した。ｑＲＴ−ＰＣＲ増幅手順は以下のとおりであった：９５℃で３０秒間の予備変性；９５℃で５秒間の変性；６０℃で３０秒間のアニーリング；６５℃で５分間の伸長、合計４０サイクル。実験から得られたデータを、ソフトウェアによってエクスポートし、Ｅｘｃｅｌによって分析した。遺伝子の相対的な発現レベルを△△ＣＴによって計算した。すべてのサンプルについて、３つの独立した生物学的複製が設定された。
【０１６０】
この試験では、５４の陽性ＰＣＲ植物および４つの非トランスジェニック植物をコントロールとして選択し、植物ゲノムＤＮＡ抽出キットによってゲノムＤＮＡを抽出した。各サンプルは、増幅曲線を得るための定量的ＰＣＲ反応のために３つの複製を有しており、蛍光閾値を、遺伝子標準曲線を描くのと同じ方法で設定した。試験するサンプルのＣｔ値を得、サンプルのＨＹＧ遺伝子の初期テンプレートの数を式：ＨＹＧ０＝１０（−０．２６０ＣＴ＋１０．４４２）で計算し、また、このサンプルのＳｐｓ遺伝子の初期テンプレートの数を式：ＳＰＳ０＝１０（−０．２６０ＣＴ＋１０．１７２）で計算した。イネの内因性参照遺伝子Ｓｐｓはホモ接合性二倍体であり、トランスジェニック植物の外因性遺伝子がホモ接合体である確率は非常に小さかったため、イネゲノムにおける目的の遺伝子のコピー数は、ＨＹＧの初期テンプレートの数をＳＰＳの初期テンプレートの数で割って得られたデータに２を掛けて得られた値に等しい。目的の遺伝子Ｈｙｇの初期テンプレートの数を、イネの内因性参照遺伝子Ｓｐｓの初期テンプレートの数と比較し、表１３の結果から、５４のトランスジェニック植物のうち、３６の植物が１のコピー数を有し、１３の植物が２のコピー数を有し、４の植物が３のコピー数を有し、１の植物が４のコピー数を有し、ネガティブコントロールのコピー数は０であることが示された。
【０１６１】
【表１４】
2021526849.tif 000024
2021526849.tif 000025
【０１６２】
実施例１０  遺伝子編集により得られたＨＰＰＤ阻害性除草剤に耐性のあるイネ品種
イネＨＰＰＤ遺伝子を突然変異させてスクリーニングし、３つの変異部位１４１、３４２および３７０ならびにそれらの組み合わせを得、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨＰＰＤ阻害性除草剤に対する耐性を試験した。これに基づいて、組み合わせ変異型ＯｓＨＰＰＤ３Ｍ（Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｄ３７０Ｎ）をトランスジェニックイネで過剰発現させて、変異型がＨＰＰＤ阻害性除草剤に対して顕著に耐性であることを確認した。次いで、ＨＰＰＤ遺伝子を遺伝子編集して、遺伝子編集によって得られたＨＰＰＤ阻害性除草剤に耐性のある非トランスジェニックイネ品種を得た。まず、アミノ酸１４１、３４２または３７０位に対応する３つの部位をそれぞれ塩基編集に供し、アミノ酸１４１、３４２および３７０位に対応する３つの部位を相同置換に供した。遺伝子編集のプロセスおよび結果は以下の通りである。
【０１６３】
（１）塩基編集は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用して、ゲノムの特定の部位にデアミナーゼをターゲティングし、特定の塩基を改変する遺伝子編集方法である。この方法は、イネにおいて効果的に適用されてきたものである。例えば：Yan F., Kuang Y., Ren B., Wang J., Zhang D., Lin H., Yang B., Zhou X., and Zhou H. (2018). High-efficient A・T to G・C base editing by Cas9n-guided tRNA adenosine deaminase in rice. Mol. Plant. doi: 10.1016/j.molp.2018.02.008。
【０１６４】
本実施例では、第２染色体のＯｓ０２ｇ０１６８１００遺伝子座にあるイネＨＰＰＤ遺伝子の部位、すなわち、アミノ酸１４１、３４２または３７０位に対応する部位がそれぞれ編集された。イネＨＰＰＤの１４１位のアミノ酸残基ヒスチジン（コドンＣＡＣ）が、塩基編集によりアルギニンに編集（コドンＣＧＣ；元のＡがＧに変更）された。同様に、３４２位のアミノ酸残基グリシン（コドンＧＧＣ）が、アスパラギン酸に編集（コドンＧＡＣ；元のＧがＡに変更）され；３７０位のアミノ酸残基アスパラギン酸（コドンＧＡＣ）がアスパラギンに編集（コドンＡＡＣ；元のＧがＡに変更）された。より広いＰＡＭ互換性を有するＣａｓ９タンパク質の変異タンパク質ｘＣａｓ９（３．７）−ＡＢＥを編集ツールとして選択した（Hu, J.H. et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature http://dx.doi.org/10.1038/nature26155 (2018)）。
【０１６５】
ｓｇＲＮＡ標的部位は、アミノ酸１４１位に対応するイネＨＰＰＤ遺伝子のＤＮＡ配列に従って設計され：ＧＧＴＧＣａＣＧＣＣＧＴＧＧＣＧＣＴＧＣ−ＧＣＧ、ａは、ＡからのＧへの編集を実現するためのＡＢＥの作用部位を表す。このｓｇＲＮＡのＰＡＭは、ｘＣａｓ９（３．７）の要件を満たすＧＣＧであった。
【０１６６】
同様に、ｓｇＲＮＡ標的部位は、アミノ酸３４２位に対応するイネＨＰＰＤ遺伝子のＤＮＡ配列に従って設計され：ＧＣＡＣＧｃＣＧＴＣＧＴＡＧＴＡＧＴＴＧＧＧＣ、ｃは、ＣからＴへの編集を実現するためのＣＢＥの作用部位を表す。このｓｇＲＮＡのＰＡＭは、ｘＣａｓ９（３．７）の要件を満たすＧＧＣであった。
【０１６７】
アミノ酸３７０位に対応するイネＨＰＰＤ遺伝子近傍の部位のＤＮＡ配列を分析して、ｓｇＲＮＡ標的部位を設計した：ＣＣＴＧＧＴｃＡＴＣＣＣＴＧＴＣＣＡＣＧＡＧＣ、ｃは、ＣからのＴへの編集を実現するためのＣＢＥの作用部位を表す。このｓｇＲＮＡは、ｘＣａｓ９（３．７）の要件を満たすＧＧＣであった。
【０１６８】
したがって、３つのプライマーペア：１４１ＧＥ−Ｆ：ｇｇｃｇＧＴＧＣａＣＧＣＣＧＴＧＧＣＧＣＴＧＣと１４１ＧＥ−Ｒ：ａａａｃＧＣＡＧＣＧＣＣＡＣＧＧＣＧｔＧＣＡＣ；３４２ＧＥ−Ｆ：ｇｇｃｇＣＡＣＧｃＣＧＴＣＧＴＡＧＴＡＧＴＴＧと３４２ＧＥ−Ｒ：ａａａｃＣＡＡＣＴＡＣＴＡＣＧＡＣＧｇＣＧＴＧ；３７０ＧＥ−Ｆ：ｇｇｃｇＣＣＴＧＧＴｃＡＴＣＣＣＴＧＴＣＣＡＣＧと３７０ＧＥ−Ｒ：ａａａｃＣＧＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＴｇＡＣＣＡＧＧを合成し、次いで、超純水で１０μＭに希釈し、等量混合し；混合物を沸騰水浴に静置し、準備のために室温まで自然冷却した。１μｇのｐＱＹ０００１４０ベクターをＢｓａＩ酵素により３７℃で１時間切断し；アガロースゲル電気泳動で検出した後、標的断片を回収し、次いで、紫外線吸収によって濃度を測定し、アニールした断片と１：１０の比率で混合し、１６℃で２時間Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ボストン、米国）と連結し、Ｔｒａｎｓ５ａコンピテントセル（ＴｒａｎｓＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、北京）に形質転換した。形質転換された細胞を３７℃で一晩培養した。モノクローナル成分をＳａｎｇｅｒシーケンシング法でシーケンシングし、一塩基編集ベクターの配列が正しいかどうかを確認した。構築されたベクターｐＱＹ０００１４１を図１３に示す。正しくシーケンスされた大腸菌をクローン化し、プラスミドを抽出してＥＨ１０５アグロバクテリウム（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｗｅｉｄｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に形質転換した。
【０１６９】
Ｈｕａｉｄａｏ  Ｎｏ．５のカルス（少なくとも３０００カルス）に、上述のイネカリスにアグロバクテリウムを感染させる方法に従って感染させた。アグロバクテリウムに感染させた後、感染したカルスをスクリーニング培養のための５０ｍｇ／Ｌのｈｙｇスクリーニング培地に移した。スクリーニングを３回（１５日×３）行った後、成長状態が良好なブロンドの（blond）カルスを選抜して分化培地で分化させ、分化過程で０．２μＭのテンボトリオンを添加してスクリーニングした。３〜４週間後、約１ｃｍの苗が約１，５００本得られた。約１，５００本の分化した苗については、その大部分が白化しており、４本の苗だけが通常の緑色のままであった。その４本の苗を、０．４μＭのテンボトリオンを含む発根培地に移植し、２週間培養したところ、２本の苗は白化したが、他の２本の苗は緑色のままであった（図１４Ａ）。少数の葉を使用して、ＣＴＡＢ法によりゲノムＤＮＡを抽出した。プライマーｏｓｈｐｐｄ５４Ｆ：ＴＴＣＣＡＣＣＡＣＧＴＣＧＡＧＣＴＣおよびＯｓｈｐｐｄ３５６Ｒ：  ＧＧＴＧＡＡＣＣＣＧＧＡＧＡＴＧＴＡＣＧを使用してＰＣＲを行った。増幅産物を１％アガロース電気泳動で検出し、Ｓａｎｇｅｒシーケンシング法でシーケンシングした。
【０１７０】
シーケンシングの結果から、２つの緑色の苗（ＱＹ０００１４１−１およびＱＹ０００１４１−２）の両方においてアミノ酸１４１位が正常に編集され（図１４Ｂ）、白化したものは野生型であることが示された。
【０１７１】
（２）ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９を介したイネＨＰＰＤ変異型の相同置換による除草剤耐性の獲得
トランスジェニックイベントで過剰発現した３部位変異型Ｈ１４１Ｒ／Ｇ３４２Ｄ／Ｄ３７０Ｎを得た後、除草剤耐性のある非トランスジェニックイネを得るために、３つの変異部位の組み合わせを相同置換した。
【０１７２】
イネのｈｐｐｄ遺伝子は、２つのエクソンと１つのイントロンを有している。３つの標的部位Ｈ１４１、Ｇ３４２およびＤ３７０は最初のエクソンにある。
【０１７３】
ｇＲＮＡの設計：少なくとも１つのｇＲＮＡをＨ１４１の上流およびＤ３７０の下流にそれぞれ設計し、１回切断し；３つの部位を相同置換によって同時に置換した。エクソン１の配列をhttp://crispor.tefor.net/に入力して、考えられるすべてのｇＲＮＡを評価した。特定のスコア値が９０より大きいという原則（Hsu PD, Scott DA, Weinstein JA, Ran FA, Konermann S, Agarwala V, Li Y, Fine EJ, Wu X, Shalem O, Cradick TJ, Marraffini LA, Bao G, Zhang F. Nat Biotechnol. 2013 Sep;31(9):827-32. doi: 10.1038/nbt.2647. Epub 2013 Jul 21）に従うと、オフターゲット効果が回避され、長さが可能な限り短くなり、下記の２つのｇＲＮＡＯｓｈｐｐｄｇＲＮＡ−ＰＡＭ１−２：５’−ＧＧＡＡＣＧＣＧＡＧＣＧＣＣＴＧＧＡＡＣＣＧＧ−３’（ＧＣ＝７０％）（下鎖）；およびＯｓｈｐｐｄｇＲＮＡ−ＰＡＭ２−１（ＧＣ＝３９％）：５’−ＣＡＣＣＴＣＴＴＴＣＡＴＧＡＴＧＡＡＡＡＴＧＧ−３’（上鎖）が選択され、下線はＰＡＭ配列であり、太字のＧは、置換されるテンプレートＤＮＡが設計されていることを意味し、このＧは、ＰＡＭを破壊し、置換後の再切断を回避するために、置換テンプレートの他の塩基に変更される。
【０１７４】
イネのゲノムＤＮＡにおける２つのｇＲＮＡ１−２およびｇＲＮＡ２−１の分布は図１５のとおりであった。
【０１７５】
テンプレートドナーＤＮＡの設計は、Ｚｈａｏｙｕｎｄｅラボにより行われた試験（Sun Y, Zhang X, Wu C, He Y, Ma Y, Hou H, Guo X, Du W, Zhao Y, Xia L.Engineering Herbicide-Resistant Rice Plants through CRISPR/Cas9-Mediated Homologous Recombination of Acetolactate Synthase. Mol Plant. 2016 Apr 4; 9(4): 628-31. doi: 10.1016/j.molp.2016.01.001. Epub 2016 Jan. 6）に基づき図１６に示すとおりであり、３５０ｂｐの相同アームが最初に設計され；相同置換の可能性を高めるために、各編集ベクター用に２つのバージョンのテンプレートドナーが設計され；テンプレートは編集ベクターに直接取り付けられ、そのためｇＲＮＡ、Ｃａｓ９およびテンプレートは同じ細胞に同時に移入され得た。細胞ゲノム標的ＤＮＡがＣａｓ９およびｇＲＮＡによって切断されると、テンプレートドナーＤＮＡを時間内に修復することができる。もう１つのバージョンは、ＰＣＲ増幅によって生成されたフリーテンプレートドナーＤＮＡである。これらの追加の修復テンプレートを編集ベクターと２０：１（遊離の修復テンプレート：編集ベクターのモル比率）で混合し、遺伝子ガンで衝撃を行った。３つの変異アミノ酸１４１−３４２−３７０のコア置換領域の長さは、２つの選択されたＲＮＡ標的切断部位（すなわち、１０５６ｂｐ）によって決定され、左右の相同性アームはそれぞれ３５０ｂｐの長さであり、ベクターからの切断後、左端および右端のそれぞれに６ｂｐが残っており、テンプレートの全長は１７６８ｂｐであり；ＰＣＲ増幅後のＰＣＲ産物の迅速な遺伝子型決定を容易にするために、ＮｃｏＩ切断部位が除去され；また、置換後の再切断を回避するために、テンプレートの元の切断部位のＰＡＭ（ＮＧＧ）も除去された。
【０１７６】
編集ベクター：ｇＲＮＡ１−２およびｇＲＮＡ２−１のそれぞれが、イネＵ３プロモーターによって発現された。２つのｇＲＮＡ発現カセットをテンプレートと共に連結し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（南京）に送って合成した。合成されたＤＮＡ断片を、シームレスクローニング技術（Ｈｕａｚｈｏｎｇ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙおよびDr. Yu Bing, Mol Plant. 2016 Apr 4; 9(4): 628-31. doi: 10.1016/ J.molp.2016.01.001. Epub 2016 Jan. 6）を使用して、ＫｐｎＩで骨格ベクターｐＣＸＵＮ−Ｃａｓ９に連結し、編集ベクターを生成した。
【０１７７】
遺伝子ガンによる形質転換、苗のスクリーニング、分化、発根および土壌培養：上記で構築された編集ベクターは、シーケンシングおよび多酵素切断によって確認され、ＰＣＲ増幅によって生成された遊離テンプレートドナーＤＮＡと２０：１（遊離の修復テンプレート：編集ベクターのモル比率、モル比率）で混合し、Ｈｕａｉｄａｏ  Ｎｏ．５カルスを遺伝子ガンによって形質転換した。約３０００個のカルスを形質転換し、５０ｍｇ／Ｌのｈｙｇスクリーニング培地に移して培養物をスクリーニングし、トランスジェニック植物を得た。スクリーニングを３回（１５日×３）行った後、成長状態が良好なブロンドの（blond）のカルスを選抜して分化培地で分化させ、分化過程で０．２μＭのテンボトリオンを添加してスクリーニングした。３〜４週間後、約１ｃｍの苗が約１０００本得られた。約１０００本の分化した苗については、その大部分が白化しており、２１本の苗だけが緑色のままであった。その２１本の苗木を、０．４μＭのテンボトリオンを含む発根培地に移植し、根の成長を促進するために継続的に栽培した。２週間後、１９本の苗が白化した。残りの２本の緑の苗（ＡＷ２およびＡＷ３）をポットに移植し、温室で栽培した。移植前に撮影した緑色の苗の写真は図１７Ａのとおりである。
【０１７８】
編集された苗のｈｐｐｄ遺伝子型の同定：遺伝子型を同定するために、３対のＰＣＲプライマーを設計して、３４２−３７０変異部位領域、３４２−３７０領域と下流のゲノムＤＮＡ配列の一部、および１４１の単一部位をそれぞれ増幅した。これらのプライマーペアは：２９０−Ｆ：ＡＧＡＴＡＣＡＧＡＣＧＴＡＣＣＴＧＧＡＣＣＡＣＣＡと１５５３−Ｒ：ＧＣＣＧＧＣＡＡＡＡＡＧＧＡＡＣＴＧＧＧ（３４２−３７０変異部位領域）；９０−Ｆ：ＡＧＡＴＡＣＡＧＡＣＧＴＡＣＣＴＧＧＡＣＣＡＣＣＡとｄｏｎｏｒ−ｏｕｔ−Ｒ：ＡＧＴＧＡＴＴＧＴＡＣＣＡＴＣＡＴＴＴＧＴＣ（３４２−３７０領域と下流のゲノムＤＮＡ配列の一部）；および５４−Ｆ：ＴＴＣＣＡＣＣＡＣＧＴＣＧＡＧＣＴＣと３５６−Ｒ：  ＧＧＴＧＡＡＣＣＣＧＧＡＧＡＴＧＴＡＣＧ  （１４１の単一部位）であった。
【０１７９】
同定結果から以下のことが示された：２つの緑色の苗が良好に編集された（図１７Ｂ）。ＰＣＲ産物をＮｃｏＩ酵素で切断することによって生成したバンドは想定されたものであった。シーケンシングの結果から、野生型ヒスチジンＨｉｓが１４１位でアルギニンＡｒｇに変更（コドンがＣＡＣからＣＧＣに変更）され、野生型グリシンＧｌｙが３４２位でアスパラギン酸Ａｓｐに変更（コドンがＧＧＣからＧＡＣに変更）され、野生型アスパラギン酸Ａｓｐが３７０位でアスパラギンＡｓｎに変更（コドンがＧＡＣからＡＡＣに変更）されたことが示された。
【０１８０】
同時に、本発明の遺伝子をシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）やミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）等のモデル植物に導入することにより、対応する除草剤耐性が向上することが多くの試験により見出された。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムによる上記の変異部位およびそれらの組み合わせの編集も適用される。結果として、トランスジェニック技術または遺伝子編集技術が、食用作物、マメ科作物、油料作物、繊維作物、果物作物、根茎作物、野菜作物、花作物、薬用作物、工業作物、牧草作物、糖作物、飲料作物、芝生植物、樹木作物、ナッツ作物等の上記の植物に適用された場合、対応する抵抗性特性が得られ、良好な工業的価値を有することとなる。
【０１８１】
本明細書に記載されているすべての刊行物および特許出願は、各刊行物または特許出願が別個にまたは特に参照により本明細書に組み込まれるのと同様に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８２】
上記の発明を、明確な理解のために図解および例を通して詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲内での変更および修正を実施することができることは明らかである。そのような変更および修正は、本発明の範囲内である。
【図１】
2021526849.tif 000026
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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