(57)【要約】レポーター、および患者に投与された場合活性センサーの分布または滞留時間を改変する少なくとも１つの調整ドメインを含有するナノ粒子活性センサー。患者に投与された場合、活性センサーは、それが疾患等の生理学的状態に特異的な酵素によって切断される細胞または組織に入って、検出可能な分析物を放出する。調整ドメインは、早すぎる切断および無差別の加水分解から粒子を保護し、免疫検出およびクリアランスから粒子を遮蔽することによって、または特定の組織、体液、もしくは細胞タイプに粒子を標的化することによって、分布または減衰をモジュレートする分子構造を含む。
2021526859.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数の分子サブユニットを含む担体、および
酵素の切断部位を含有する切断可能なリンカーによってそれぞれが前記担体に連結された、複数の検出可能なレポーター
を含む活性センサーであって、１つまたは複数の酵素による切断の際に前記レポーターを放出することによって前記１つまたは複数の酵素の活性をレポートする、活性センサー。
【請求項２】
担体が、共有結合により連結されたＰＥＧサブユニットのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）足場を含む、請求項１に記載の活性センサー。
【請求項３】
少なくとも４つの異なる酵素の活性をレポートするために、少なくとも４つの検出可能なレポーターが切断部位を介して連結されている、請求項１に記載の活性センサー。
【請求項４】
各検出可能なレポーターおよび切断可能なリンカーが、プロテアーゼによる切断に感受性のポリペプチドを含む、請求項１に記載の活性センサー。
【請求項５】
対象に投与された場合、前記対象内での前記活性センサーの分布または滞留時間を改変する調整ドメインをさらに含む、請求項１に記載の活性センサー。
【請求項６】
前記担体がマルチアームＰＥＧ足場を含み、前記検出可能なレポーターおよび切断可能なリンカーがそれぞれ、前記ＰＥＧ足場に連結されたポリペプチドを含む、請求項５に記載の活性センサー。
【請求項７】
特定の細胞または特定の組織タイプの受容体に対するリガンドを含む複数の調整ドメインをさらに含む、請求項５に記載の活性センサー。
【請求項８】
前記活性センサーが対象に投与された場合、前記リガンドが、前記特定の組織タイプまたは身体区画における前記活性センサーの蓄積を促進し、前記リガンドがそれぞれ、小分子、ペプチド、抗体、抗体の断片、核酸、およびアプタマーからなる群から選択される１つを含む、請求項７に記載の活性センサー。
【請求項９】
細胞膜を横切る前記活性センサーの拡散を容易にする疎水性鎖を含む複数の調整ドメインをさらに含む、請求項５に記載の活性センサー。
【請求項１０】
複数のレポーターおよび複数の調整ドメインをさらに含み、前記調整ドメインが、前記レポーターに連結された生体適合性ポリマーを含む、請求項５に記載の活性センサー。
【請求項１１】
前記担体が、共有結合により連結されたポリ（エチレングリコール）の複数のサブユニットを含み、前記レポーターが、１つまたは複数の酵素による切断に感受性のペプチド鎖を含み、前記生体適合性ポリマーが、前記ペプチド鎖から伸び、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて前記活性センサーを保護し、それによって、前記調整ドメインを欠く活性センサーと比べて、対象に投与された場合の前記活性センサーの血清半減期が増加する、請求項１０に記載の活性センサー。
【請求項１２】
前記担体が、生体適合性足場を含み、前記レポーターが、１つまたは複数のプロテアーゼによる切断に感受性のポリペプチドを含み、前記調整ドメインが、免疫検出から前記ポリペプチドを遮蔽するか、またはマクロファージによる前記活性センサーの細胞取り込みを阻害するポリマーを含む、請求項１０に記載の活性センサー。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、特定の疾患と関連することが知られるプロテアーゼによる切断に感受性の配列を含み、前記調整ドメインポリマーが、ＰＥＧ側鎖を含む、請求項１２に記載の活性センサー。
【請求項１４】
前記担体が、約３０〜４０ｋＤａの生体適合性足場を含み、
前記レポーターが、１つまたは複数のプロテアーゼによる切断に感受性のポリペプチドを含み、
前記調整ドメインが、前記足場と前記ポリペプチドとの間にポリマーを含むことで、前記活性センサーの部分間の立体干渉を減少させ、それによって前記プロテアーゼへの前記ポリペプチドの接近可能性を増加させて切断の成功を促進する、請求項１０に記載の活性センサー。
【請求項１５】
前記担体が生体適合性足場を含み、前記レポーターが１つまたは複数のプロテアーゼによる切断に感受性のポリペプチドを含み、前記調整ドメインがＤ−アミノ酸を含む前記ポリペプチドの領域を含むことで、前記領域のタンパク質分解的切断を阻止する、請求項１０に記載の活性センサー。
【請求項１６】
前記プロテアーゼが、ある特定の疾患または医学的状態で発現されることが知られ、さらに、前記疾患または状態に冒された対象の組織への前記活性センサーの送達が、前記ポリペプチドの切断および前記対象由来の試料において検出可能な分析物の放出をもたらし、前記Ｄ−アミノ酸が、検出まで前記分析物を消化から保護する、請求項１５に記載の活性センサー。
【請求項１７】
特定のタイプの組織における前記ポリペプチドの切断部位が、前記ポリペプチドにおける前記Ｌ−およびＤ−アミノ酸の組成または相対的順序によって決定される、請求項１５に記載の活性センサー。
【請求項１８】
前記レポーターが、疾患または生理学的状態と関連したプロテアーゼによって前記活性センサーから切断されるポリペプチドを含み、前記調整ドメインが、切断後の体循環への前記レポーターの通過を容易にする１つまたは複数のポリマーを前記ポリペプチド上に含む、請求項５に記載の活性センサー。
【請求項１９】
前記レポーターが、疾患または生理学的状態と関連したプロテアーゼによって前記活性センサーから遊離されるポリペプチドを含み、前記調整ドメインが、前記対象からの排泄前の前記遊離したレポーターに対する酵素活性を阻害する１つまたは複数のポリマーを前記ポリペプチド上に含む、請求項５に記載の活性センサー。
【請求項２０】
前記調整ドメインが、免疫検出およびクリアランスから前記活性センサーを保護する生体適合性ポリマーを含む、請求項５に記載の活性センサー。
【請求項２１】
前記レポーターが、揮発性有機化合物、元素質量タグ、１つまたは複数のＤ−アミノ酸を含むペプチド、核酸、およびネオアンチゲンからなる群から選択される１つを含む、請求項２０に記載の活性センサー。
【請求項２２】
前記レポーターが、２０よりも大きい原子番号の元素を含む元素質量タグを含む、請求項２１に記載の活性センサー。
【請求項２３】
前記レポーターが、ハイブリダイゼーションアッセイによって検出可能な抗原を含む、請求項２１に記載の活性センサー。
【請求項２４】
前記担体が生体適合性足場を含み、前記レポーターが、検出可能な分析物が放出されるように、プロテアーゼによる切断に感受性の少なくとも１つのポリペプチドを含み、前記調整ドメインが前記検出可能な分析物の一部分を形成する、請求項５に記載の活性センサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、参照により組み込まれる、２０１８年６月８日に出願された米国仮出願第６２／６８２，４９２号の利益を主張するものである。
【０００２】
技術分野
本発明は、生理学的状態を特徴付けるための調整可能な分析物に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
がん等の疾患を検出するか、または診断するための現在の手法は、組織生検を獲得する、および顕微鏡下で細胞を調べる、またはＤＮＡをシーケンシングして疾患の遺伝子マーカーを検出する等の技法を伴う。一部の処置は早期介入による成功のより大きい見込みを有するため、早期検出は有利であると考えられる。例えば、がんに関して、腫瘍は外科的に除去され得、がんが転移として知られる過程において全身に広がる前に検出された場合、患者は完全寛解になり得る。医学的コンセンサスは、腫瘍切除後の完全寛解等の好ましい転帰は早期検出を要するということである。
【０００４】
不運なことに、疾患検出のための既存の手法は、必ずしも疾患をその初期に検出するわけではない。とはいえ、例えば、身体検査によって検出することができない腫瘍をｘ線が検出し得るという点において、ｘ線マンモグラムは指診を上回る進歩を示す。それにもかかわらず、そのような試験では、検出がなされるためには腫瘍がある程度進行している必要がある。液体生検は、疾患検出のための１つの潜在的な方法を代表する。液体生検では、血液試料が採取され、腫瘍ＤＮＡの小さい断片についてスクリーニングされる。不運なことに、ｘ線マンモグラム、組織試料の顕微鏡検査、および液体生検は、ある程度の進歩を有する疾患のみを検出し、必ずしも医学的に最も有益であろうほど早期に疾患を検出するわけではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
要旨
本発明は、疾患状態等の生理学的状態に特徴的な活性を非侵襲的に検出するのに有用な活性センサーを提供する。活性センサーは、切断可能なリンカーを介していくつかの切断可能な検出可能な分析物に連結された分子担体構造を含む。リンカーは、目的の生理学的状態の下で差次的に発現する酵素による切断に感受性である。例えば、活性センサーは、切断可能な分析物としての４つまたはそれよりも多いポリペプチドレポーターに連結されたマルチアームポリエチレングリコール（ＰＥＧ）足場であり得る。切断可能なリンカーは、活性が組織の状態に特徴的である種々の酵素に特異的である。患者に投与された場合、活性センサーは標的組織に位置し、そこでそれらは酵素によって切断されて検出可能な分析物を放出する。分析物は、尿試料等の患者試料において検出される。検出された分析物は、その酵素が組織において活性であるレポートとして働く。
【０００６】
酵素は、疾患段階または疾患進行の程度等、目的の生理学的状態の下で差次的に発現するため、試料の分析は、臓器、身体区画、体液、または組織の生理学的状態（例えば、疾患段階または状態）についての非侵襲的試験を提供する。担体構造は、好ましくは複数の分子サブユニットを含み、例えばマルチアームポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー、脂質ナノ粒子、またはデンドリマーであり得る。検出可能な分析物は、例えば、指定の生理学的状態の下で、例えば疾患に冒された、組織または臓器において差次的に発現するプロテアーゼによって切断されるポリペプチドであり得る。担体構造および検出可能な分析物は、標的組織に位置する生体適合性分子構造であり、疾患関連酵素によって切断されて試料において検出可能な分析物を放出するため、本開示の組成物は、臓器または組織の疾患状態または段階を検出および特徴付けるための非侵襲的方法を提供する。組成物は、酵素活性によって検出可能な分析物として放出される基質を提供するため、試料における分析物の定量的検出は、臓器または組織における酵素の活性の速度についての尺度を提供する。ゆえに、本開示の方法および組成物は、標的臓器または組織における疾患または状態の段階および進行の速度の両方を測定するための非侵襲的技法を提供する。
【０００７】
加えて、活性センサーは、体内でのセンサーのトラフィッキング、または粒子の酵素的切断もしくは他の代謝的分解のタイミングに影響を与える付加的な分子構造を含み得る。分子構造は、制御されたタイミングの下で活性センサーを標的組織に位置させるように身体によって作用を受ける調整ドメイン、付加的な分子サブユニット、またはリンカーとして機能し得る。例えば、調整ドメインは、早すぎる切断および無差別の加水分解から活性センサーを保護すること、免疫検出およびクリアランスから粒子を遮蔽することによって、または特定の組織もしくは細胞タイプに粒子を標的化することによって、粒子の運命をモジュレートし得る。例えばＰＥＧ足場のサイズを増加させて、体内での粒子の分解を遅らせることによって、コア担体ポリマーに付加的な分子構造を含めることによって、トラフィッキングは影響を受け得る。
【０００８】
本発明は、疾患等の生理学的状態と関連した酵素活性を明らかにする調整可能な活性センサーを提供する。活性レポーターが患者に投与された場合、それは身体を通って特定の細胞または特定の組織にトラフィッキングされる。あるいは、センサーは、それが循環内に、例えば血液もしくはリンパまたはその両方の中にとどまるように設計または調整され得る。特定の疾患の条件下で差次的に発現する酵素が存在する場合、それらの酵素はレポーターを切断し、検出可能な分析物を放出する。分析物は、疾患に冒された組織において活性であることが知られる酵素の切断標的によって担体／足場に連結されているため、分析物の検出は疾患状態を示す。例えば、活性センサーが、肝線維症において発現するプロテアーゼの切断標的を含む場合、センサーは肝臓において切断されて、検出可能な分析物を循環内に放出し、その後腎臓濾過により検出可能な分析物は尿中に排泄される。患者由来の尿試料における分析物の存在は、患者における肝線維症のサインである。
【０００９】
分子構造を調整ドメインとして活性センサーに含めて、対象内での活性センサーの分布または滞留時間を調整または改変することができる。調整ドメインは、担体／足場にまたは検出可能な分析物に連結され得、数々の仕方で改変され得る。調整ドメインの使用により、特定の組織へのｉｎ  ｖｉｖｏトラフィッキング経路に応じた体内での活性センサーの分布、または体循環内もしくは特定の組織内でのその滞留時間を改変することができる。加えて、調整ドメインは、組織特異的酵素によるレポーターの有効な切断を促進、または早すぎる切断もしくは加水分解を阻止し得る。
【００１０】
本開示に従った活性センサーは、疾患関連活性を検出するための高感度かつ非侵襲的な方法を提供する。活性センサーは、検出可能な分析物が、非常に早い段階で重大な疾患状態を示すような様式で放出されるように、患者の体内で作用を受ける。活性センサーは、身体が活性センサーを検出可能な様式でプロセシングした場合にのみ、検出可能な分析物を収集可能な試料中に放出する分子複合体を提示することによる試料調製のために身体を用いる調整ドメインとして付加的な分子構造を含み得る。調整ドメインは、活性センサーの生物学的運命の精確な調整を可能にする。加えて、検出可能な分析物は酵素活性の産物であり、活性センサーは過剰に提供され得るため、分析物によって与えられるシグナルは有効に増幅され、非常に少ない分量の活性酵素の存在さえ検出され得る。調整ドメインは、活性センサーを身体の特定の組織に標的化し得るため、およびレポーターは、疾患と関連した酵素によって切断されることが知られているため、活性センサーは、非常に迅速かつ高感度の疾患検出を提供する。
【００１１】
ある特定の態様では、本発明は、活性センサーを含む組成物を提供する。活性センサーは、酵素の切断部位を含有する切断可能なリンカーによってそれぞれが担体に連結された、複数の分子サブユニットおよび複数の検出可能なレポーターを含む担体を含む。活性センサーは、酵素による切断の際にレポーターを放出することによって、複数の個別の酵素の活性をレポートする。一部の実施形態では、担体は、共有結合により連結されたＰＥＧサブユニットのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）足場を含む。活性センサーは、好ましくは、少なくとも４つの対応する酵素の活性をレポートするために、少なくとも４つの個別の酵素特異的切断部位を介して連結された、少なくとも４つの個別の検出可能なレポーターを含む。各検出可能なレポーターおよび切断可能なリンカーは、プロテアーゼによる切断に感受性のポリペプチドによって提供され得る。活性センサーは、対象に投与された場合、対象内での活性センサーの分布または滞留時間を改変する分子構造または調整ドメインをさらに含み得る。
【００１２】
一部の実施形態では、調整ドメインは、特定の細胞または特定の組織タイプの受容体に対するリガンドを含む。活性センサーが対象に投与された場合、リガンドは、特定の組織タイプにおける活性センサーの蓄積を促進する。各リガンドは、例えば小分子、ペプチド、抗体もしくは抗体の断片、核酸、またはアプタマーであり得る。ある特定の実施形態では、リガンドは、マレイミド−チオールカップリングまたはアミド結合を介して足場にコンジュゲートされたペプチドである。
【００１３】
ある特定の実施形態では、生体適合性足場は、共有結合により連結されたポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）マレイミドの複数のサブユニットを含み、約１０〜約８０ｋＤａ（好ましくは２０〜４０の間、例えば約４０ｋＤａ）の間の分子量を有する。調整ドメインは、特定の細胞または組織タイプの受容体に結合するリガンドであり得、それによって特定の組織タイプにおける活性センサーの蓄積を促進する。
【００１４】
一部の実施形態では、活性センサーは、細胞膜を横切る活性センサーの拡散を容易にする疎水性鎖の形態にある複数の調整ドメインを含む。例えば、活性センサーは、特定の細胞または組織タイプの受容体に対するペプチドリガンド、および細胞膜を横切る活性センサーの拡散を容易にする疎水性鎖の両方を含み得る。ある特定の実施形態では、調整ドメインは、例えばポリアルギニンペプチドまたはステープルペプチド等の細胞透過性ドメインを含む。他の実施形態では、活性センサーは、例えば血液、リンパ、またはその両方の中で循環したままであるように設計される。
【００１５】
活性センサーは、レポーターに連結された調整ドメインを有し得る。例えば、調整ドメインは、切断後にそれらが検出可能な分析物と会合するように連結され得る。活性センサーは、複数のレポーターおよび複数の調整ドメインを含み得、調整ドメインは、レポーターに連結された生体適合性ポリマーを含む。担体は、１つまたは複数の酵素による切断に感受性のペプチド鎖を含むレポーターとともに、共有結合により連結されたＰＥＧマレイミドの複数のサブユニットを含み得る。調整ドメインを、ペプチド鎖から伸びる生体適合性ポリマーとして含めて、ｉｎ  ｖｉｖｏ分解から活性センサーを保護し、それによって、調整ドメインを欠く活性センサーと比べて、患者に投与された場合の活性センサーの血清半減期が増加することができる。
【００１６】
ある特定の実施形態では、担体は生体適合性足場を含み、レポーターは、１つまたは複数のプロテアーゼによる切断に感受性のポリペプチドを含み、調整ドメインは、免疫検出からポリペプチドを遮蔽するか、またはマクロファージによる活性センサーの細胞取り込みを阻害するポリマーを含む。ポリペプチドは、特定の疾患と関連することが知られるプロテアーゼによる切断に感受性の配列を含み得、調整ドメインポリマーはＰＥＧ側鎖を含み得る。
【００１７】
活性センサーは、１つまたは複数のプロテアーゼによる切断に感受性のポリペプチドを有するレポーターに連結された、約２０〜５０ｋＤａ（好ましくは約３０〜４５ｋＤａの間）の生体適合性足場を使用する担体を含み得、調整ドメインは、足場とポリペプチドとの間のポリマーである。一部の実施形態では、調整ドメインは、担体とレポーターとの間に空間を付加して、活性センサーの部分間の立体障害を減少させ、それによってプロテアーゼへのポリペプチドの接近可能性を増加させて、切断の成功を促進する。
【００１８】
ある特定の実施形態では、担体は生体適合性足場であり、レポーターは、１つまたは複数のプロテアーゼによる切断に感受性のポリペプチドを含み、調整ドメインは、Ｄ−アミノ酸を含むポリペプチドの領域として提供されて、領域のタンパク質分解的切断を阻止する。疾患に冒された対象の組織への活性センサーの送達は、ポリペプチドの切断および対象由来の試料において検出可能な分析物の放出をもたらし、一方でＤ−アミノ酸は、検出まで分析物を消化から保護する。一部の実施形態では、特定のタイプの組織におけるポリペプチドの切断部位は、ポリペプチドにおけるＬ−およびＤ−アミノ酸の組成または相対的順序によって決定される。
【００１９】
好ましい実施形態では、レポーターは、疾患と関連したプロテアーゼによって活性センサーから切断されるポリペプチドを含み、調整ドメインは、切断後の体循環へのレポーターの通過を容易にする１つまたは複数のポリマーをポリペプチド上に含む。レポーターは、疾患と関連したプロテアーゼによって活性センサーから遊離されるポリペプチドを含み得、調整ドメインは、対象からの排泄前の遊離したレポーターに対する酵素活性を阻害する１つまたは複数のポリマーをポリペプチド上に含み得る。
【００２０】
調整ドメインは、免疫検出およびクリアランスから活性センサーを保護する生体適合性ポリマーであり得る。レポーターは、揮発性有機化合物、元素質量タグ、１つもしくは複数のＤ−アミノ酸を含むペプチド、核酸、またはネオアンチゲンのうちの１つまたは複数であり得る。レポーターは、元素質量タグ（例えば質量分析において、例えば、一般的な生物学的元素と区別するために、好ましくは２０よりも大きい原子番号の元素を有する分子キレート剤）であり得る。ある特定の実施形態では、レポーターは、ハイブリダイゼーションアッセイによって検出可能な抗原を含む。一部の実施形態では、担体は生体適合性足場であり、レポーターは、検出可能な分析物が放出されるように、プロテアーゼによる切断に感受性の少なくとも１つのポリペプチドを含み、調整ドメインは検出可能な分析物の一部分を形成する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、活性センサーを設計するための方法のステップを図示する。
【００２２】
【図２】図２は、活性センサーを示す。
【００２３】
【図３】図３は、ポリ（エチレングリコール）−マレイミド（ＰＥＧ−ＭＡＬ）を示す。
【００２４】
【図４】図４は、８アームＰＥＧ−ＭＡＬ足場を示す。
【００２５】
【図５】図５は、酵素と活性センサーとの間の反応を図解する。
【００２６】
【図６】図６は、ある特定の実施形態に従った活性検出を示す。
【００２７】
【図７】図７は、特定の細胞または組織タイプに対するリガンドを有する活性センサーを示す。
【００２８】
【図８】図８は、生体適合性足場および調整ドメインを有する活性センサーを示す。
【００２９】
【図９】図９は、疎水性鎖を有する活性センサーを示す。
【００３０】
【図１０】図１０は、細胞受容体に対するリガンドを有する活性センサーを示す。
【００３１】
【図１１】図１１は、生体適合性ポリマーを有する活性センサーを示す。
【００３２】
【図１２】図１２は、担体とレポーターとの間にポリマーを有する活性センサーを示す。
【００３３】
【図１３】図１３は、Ｄ−アミノ酸を有する調整ドメインを有する活性センサーを示す。
【００３４】
【図１４】図１４は、ポリマー調整ドメインを有する活性センサーを示す。
【００３５】
【図１５】図１５は、ポリマー調整ドメインを有する活性センサーを示す。
【００３６】
【図１６】図１６は、生体適合性ポリマー調整ドメインを有する活性センサーを示す。
【００３７】
【図１７】図１７は、調整ドメインによって形成される検出可能な分析物を有する活性センサーを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
詳細な説明
本発明は、担体、担体に連結された少なくとも１つのレポーター、および対象に投与された場合、対象内での活性センサーの分布または滞留時間を改変する少なくとも１つの調整ドメインを含む活性センサーを提供する。活性センサーは、体内における任意の酵素活性、例えば疾患状態を示す調節不全のプロテアーゼ活性等の目的の生理学的状態の下で差次的に発現する酵素を検出およびレポートするように設計され得る。調節不全のプロテアーゼは、それらが細胞シグナル伝達を変更し、がん細胞増殖、浸潤、血管新生、アポトーシスの回避、および転移を推進するのを助け得るという点において、がん等の疾患の進行において重大な結果をもたらす。
【００３９】
活性センサーは、特定の細胞におけるまたは特定の組織における体内での酵素活性を検出することを容易にする数々の仕方で、調整ドメインを介して調整され得る。例えば、活性センサーは、特異的組織への活性センサーの分布を促進するように、または対象におけるもしくは特定の組織における活性センサーの滞留時間を向上させるように調整され得る。
【００４０】
対象に投与された場合、活性センサーは、身体を通ってトラフィッキングされ、体循環から特定の組織に拡散し得、レポーターは、疾患を示す酵素により切断されて、検出可能な分析物を放出し得る。次いで、検出可能な分析物は、循環に拡散して戻り得、それは腎臓濾過を通過し、尿中に排泄され得、それによって尿試料における検出可能な分析物の検出は、レポーターに対する酵素活性を示す。
【００４１】
担体は、対象に投与された場合、対象の身体を通ってレポーターをトラフィッキングするための任意の適切なプラットフォームであり得る。担体は、担体またはプラットフォームとして働くのに適した任意の材料またはサイズであり得る。好ましくは、担体は生体適合性、非毒性、かつ非免疫原性であり、それが投与される対象の体内において免疫応答を誘発しない。担体は、活性センサーを組織、細胞、または分子に標的化する標的化手段としても機能し得る。一部の実施形態では、担体ドメインは、ポリマー足場等の粒子である。担体は、例えば、循環による腫瘍または他の特定の組織への受動的標的化をもたらし得る。担体の他のタイプには、例えば、組織、細胞、または分子への能動的標的化を容易にする化合物が含まれる。担体の例には、酸化鉄または金ナノ粒子等のナノ粒子、アプタマー、ペプチド、タンパク質、核酸、多糖、ポリマー、抗体または抗体断片、および小分子が含まれるが、それらに限定されない。
【００４２】
担体は、鉄、セラミック、金属等の多様な材料、ヒアルロン酸等の天然ポリマー材料、ポリグリセロールセバケート等の合成ポリマー材料、および非ポリマー材料、またはそれらの組合せを含み得る。担体は、全体においてまたは一部において、アルミナ、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、リンケイ酸カルシウム、リン酸ナトリウム、アルミン酸カルシウム、およびシリケート等のポリマーまたは非ポリマー材料から構成され得る。ポリマーには、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、アクリル酸エステルとメタクリル酸エステルとのポリマー、メチルセルロース、エチルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロースが含まれるが、それらに限定されない。非生分解性ポリマーの例には、エチレン酢酸ビニル、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリアミド、それらの共重合体および混合物が含まれる。
【００４３】
生分解性ポリマーの例には、乳酸とグリコール酸とのポリマー、ポリ無水物、ポリウレタン等の合成ポリマー、ならびにアルギネート、およびデキストランとセルロースを含めた他の多糖、コラーゲン、アルブミン、および他のタンパク質等の天然ポリマー、それらの共重合体および混合物が含まれる。一般的に、これらの生分解性ポリマーは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの酵素的加水分解または水への曝露によって、表面またはバルク浸食によってのいずれかで分解する。これらの生分解性ポリマーは、単独で、物理的混合物（混成物）として、または共重合体として使用され得る。
【００４４】
好ましい実施形態では、担体は生分解性ポリマーを含み、それにより、レポーターが担体から切断されるかどうかにかかわらず、担体は体内で分解される。生分解性担体を提供することによって、体内にとどまる無傷の活性センサーの蓄積および任意の関連する免疫応答または意図しない効果は最小限に抑えられ得る。
【００４５】
他の生体適合性ポリマーには、ＰＥＧ、ＰＶＡ、およびＰＶＰが含まれ、すべて市販されている。ＰＶＰは、およそ１０，０００〜７００，０００の範囲の平均分子量を有する非イオン性の親水性ポリマーであり、化学式（Ｃ６Ｈ９ＮＯ）［ｎ］を有する。ＰＶＰは、ポリ［１（２オキソ１ピロリジニル）エチレン］としても公知である。ＰＶＰは非毒性で高吸湿性であり、水または有機溶媒に容易に溶解する。
【００４６】
ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）は、ヒドロキシル基でのアセテート基の置き換えによってポリ酢酸ビニルから調製されるポリマーであり、化学式（ＣＨ２ＣＨＯＨ）［ｎ］を有する。ほとんどのポリビニルアルコールは、水に可溶性である。
【００４７】
ポリ（オキシエチレン）グリコールとしても知られるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、酸化エチレンと水との縮合重合体である。ＰＥＧとは、反復するエチレングリコール単位を含む化合物を指す。ＰＥＧの構造は、Ｈ−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−ＯＨとして表現され得る。ＰＥＧは、生物学的に不活性（すなわち、非免疫原性）であり、一般的にヒトへの投与に安全であるとみなされる親水性化合物である。
【００４８】
ＰＥＧが粒子に連結される場合、それは、可溶性の向上、循環寿命の増加、安定性、タンパク質分解的分解からの保護、マクロファージによる細胞取り込みの低下、ならびに免疫原性および抗原性の欠如等の有利な特性を提供する。ＰＥＧは高度に柔軟性でもあり、立体障害なしに、粒子のバイオコンジュゲーションおよび表面処置を提供する。ＰＥＧを、ペプチド、タンパク質、抗体断片、アプタマー、酵素、および小分子等の生物学的に活性な化合物の化学的修飾に使用して、化合物の分子特性を特定の適用に合わせることができる。さらに、ＰＥＧ分子は、ＰＥＧ分子の末端への様々な官能基、例えばアミン反応性ＰＥＧ（ＢＳ（ＰＥＧ）ｎ）またはスルフヒドリル反応性ＰＥＧ（ＢＭ（ＰＥＧ）ｎ）の化学的付加によって官能化され得る。
【００４９】
ある特定の実施形態では、担体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む足場等の生体適合性足場である。好ましい実施形態では、担体は、共有結合により連結されたポリ（エチレングリコール）マレイミド（ＰＥＧ−ＭＡＬ）の複数のサブユニットを含む生体適合性足場、例えば８アームＰＥＧ−ＭＡＬ足場である。ＰＥＧ含有足場は、それが生体適合性で、安価であり、商業的に容易に獲得され、細網内皮系（ＲＥＳ）による最小限の取り込みを有し、かつ多くの有利な挙動を示すため、選択され得る。例えば、ＰＥＧ足場は、マクロファージ等の数々の細胞タイプによる粒子の細胞取り込みを阻害し、それは、特定の組織への適正な分布を容易にし、組織における滞留時間を増加させる。
【００５０】
８アームＰＥＧ−ＭＡＬは、ヘキサグリセロールコアに接続されているその８本のアームの各末端にマレイミド基を有するマルチアームＰＥＧ誘導体の１タイプである。マレイミド基は、マイケル付加により遊離チオール、ＳＨ、スルフヒドリル、またはメルカプト基と選択的に反応して、安定な炭素硫黄結合を形成する。８アームＰＥＧ−ＭＡＬ足場の各アームは、例えばマレイミド−チオールカップリングまたはアミド結合を介して、ペプチドにコンジュゲートされ得る。
【００５１】
ＰＥＧ−ＭＡＬ足場は、様々なサイズのもの、例えば１０ｋＤａ足場、２０ｋＤａ足場、４０ｋＤａ足場、または４０ｋＤａよりも大きい足場であり得る。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のＰＥＧ足場の流体力学的直径は、当技術分野において知られる様々な方法によって、例えば動的光散乱によって決定され得る。そのような技法を使用して、４０ｋＤａのＰＥＧ−ＭＡＬ足場の流体力学的直径はおよそ８ｎｍであると測定された。好ましい実施形態では、活性センサーは体循環内に容易に拡散するが、細網内皮系によって容易には一掃されないため、活性センサーが皮下投与される場合、４０ｋＤａのＰＥＧ−ＭＡＬ足場が担体として提供される。
【００５２】
直径が約５ｎｍよりも小さい粒子は、タンパク質分解的切断がなくても、身体の腎臓濾過により効率的に一掃されるため、ＰＥＧ−ＭＡＬ足場のサイズは、体内での活性センサーの分布および滞留時間に影響を及ぼす。さらに、直径が約１０ｎｍよりも大きい粒子は、リンパ管に流れ込むことが多い。１つの例において、４０ｋＤａの８アームＰＥＧ−ＭＡＬ足場が静脈内投与された場合、足場は腎臓で尿中に一掃されなかった。
【００５３】
レポーターは、酵素活性に感受性の任意のレポーターであり得、それにより、レポーターの切断はその酵素活性を示す。レポーターは、特定の疾患状態において活性である酵素に依存する。例えば、腫瘍は、特定のセットの酵素と関連する。腫瘍に対して、活性センサーは、腫瘍または他の罹患組織によって発現される酵素のものと合致する酵素感受性部位を考慮して設計され得る。あるいは、酵素特異的部位は、普段は存在するが特定の疾患状態には存在しない酵素と関連し得る。この例において、疾患状態は、酵素と関連したシグナルの欠如、または通常の参照もしくは健常対象における先行測定と比較して低下したレベルのシグナルと関連する場合がある。
【００５４】
様々な実施形態では、レポーターは、ペプチド、核酸、小分子、揮発性有機化合物、元素質量タグ、またはネオアンチゲン等の天然に存在する分子を含む。他の実施形態では、レポーターは、Ｄ−アミノ酸、合成元素、または合成化合物等の天然に存在しない分子を含む。レポーターは、質量コード化レポーター、例えば、知られる質量または同位体を有するポリペプチド等の公知かつ個々に識別可能な質量を有するレポーターであり得る。
【００５５】
酵素は、生物の代謝過程を加速させるまたは触媒する、生細胞において産生される様々なタンパク質のいずれかであり得る。酵素は基質に作用する。酵素によって触媒される反応が起こる前に、基質は、活性部位と呼ばれる場所で酵素に結合する。一般的に、酵素には、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、リパーゼ、ヘパリナーゼ、ホスファターゼが含まれるが、それらに限定されない。対象における疾患と関連する酵素の例には、ＭＭＰ、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、カリクレイン、カテプシン、セプラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）、グルコセレブロシダーゼ、ピルビン酸キナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１５、ならびにマトリプターゼが含まれるが、それらに限定されない。
【００５６】
疾患関連酵素に対する基質の例には、インターロイキン１ベータ、ＩＧＦＢＰ−３、ＴＧＦ−ベータ、ＴＮＦ、ＦＡＳＬ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＦＧＦＲ１、デコリン、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ６、ＰＤＧＦ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、およびＭＭＰの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）が含まれるが、それらに限定されない。
【００５７】
活性センサーによって検出される疾患または状態は、酵素活性と関連する任意の疾患または状態であり得る。例えば、がん進行および転移、心血管疾患、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、関節炎、ウイルス、細菌、寄生虫もしくは真菌感染症、アルツハイマー病、肺気腫、血栓症、血友病、脳卒中、臓器不全、任意の炎症状態、血管疾患、実質性疾患、または薬理学的に誘導された状態はすべて、酵素活性と関連することが公知である。
【００５８】
調整ドメインは、活性センサーが対象に投与された場合、対象内での活性センサーの分布または滞留時間を改変する任意の適切な材料を含み得る。例えば、調整ドメインは、ＰＥＧ、ＰＶＡ、またはＰＶＰを含み得る。別の例において、調整ドメインは、ポリペプチド、ペプチド、核酸、多糖、揮発性有機化合物、疎水性鎖、または小分子を含み得る。
【００５９】
図１は、活性センサーを設計するための方法１００のステップを図示する。ステップ１０５で、例えば、次世代シーケンシングプラットフォームを使用して遺伝子転写物に対してＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）を実施し、測定された転写物からのリード数を健常対照リード数に対して正規化することにより疾患と関連した転写物の発現レベルの倍率変化を決定することによって、知られる疾患を有する対象における遺伝子発現が決定され得る。
【００６０】
ステップ１１０で、例えば、非罹患状態に関係して上方調節される遺伝子発現を決定して、例えば疾患を示す候補プロテアーゼを識別し得る。疾患を示す候補プロテアーゼを識別することによって、関連するプロテアーゼ基質も識別され、活性センサーのレポーターに組み込まれ得る。
【００６１】
ステップ１１５で、担体、担体に連結された少なくとも１つのレポーター、および少なくとも１つの調整ドメインを含む活性センサーがアセンブルされ得る。
【００６２】
図２は、担体２０５、レポーター２０７、および調整ドメイン２１５を有する活性センサー２００を示す。図解されるように、担体２０５は、共有結合により連結されたポリ（エチレングリコール）マレイミド（ＰＥＧ−ＭＡＬ）の複数のサブユニットを含む生体適合性足場である。担体２０５は、約２０〜８０ｋＤａの間の分子量を有する８アームＰＥＧ−ＭＡＬ足場である。レポーター２０７は、識別されたプロテアーゼに感受性の領域を含むポリペプチドである。レポーターを切断する識別されたプロテアーゼの活性は、疾患を示す。レポーター２０７は、検出可能な分析物２１０に接続された切断可能な基質２２１を含む。識別されたプロテアーゼによる切断が、切断可能な基質２２１に対して生じた場合、検出可能な分析物２１０は活性センサー２００から放出され、組織から排泄され、身体から排泄され、検出され得る。
【００６３】
図３は、それぞれが各末端にマレイミド（Ｈ２Ｃ２（ＣＯ）２ＮＨ）基を有する８本のアームを有する、ポリ（エチレングリコール）−マレイミド（ＰＥＧ−ＭＡＬ）分子３０１を示す。マレイミド基は、ペプチドおよび他のチオール分子におけるスルフヒドリル（−ＳＨ）基と特異的かつ効率的に架橋する。そのため、ポリペプチドは、例えばマレイミド−チオールカップリングまたはアミド結合を介して、ＰＥＧ−ＭＡＬ分子の各アームの末端におけるマレイミド基のそれぞれに連結され得る。
【００６４】
図４は、８アームＰＥＧ−ＭＡＬ足場４００である担体を示す。８アームＰＥＧ−ＭＡＬ足場は、ＰＥＧ−ＭＡＬから構成される。担体は、中心領域４０３、および中心領域４０３の周辺に配置されたマレイミド基４０８を含む。
【００６５】
レポーターは、ステップ１１０において識別されるプロテアーゼ活性に感受性のポリペプチド等の任意の適切なレポーターであり得る。調整ドメインは、活性センサーがトラフィッキングされるべきｉｎ  ｖｉｖｏ経路または意図される検出の方法に基づいて、活性センサーに連結され得る。例えば、調整ドメインはＰＥＧであり、活性センサーに連結されて、肝臓への活性センサーの分布を容易にして、肝臓におけるプロテアーゼ活性を検出し得、レポーターは、ＥＬＩＳＡアッセイ等のリガンド結合アッセイにより検出され得る。
【００６６】
ステップ１２０で、疾患を有する対象に活性センサーを投与して、調節不全のプロテアーゼ活性等の疾患を示す酵素活性を検出し得る。
【００６７】
活性センサーは、任意の適切な送達の方法によって投与され得る。好ましい実施形態では、活性センサーは静脈内に送達されるか、またはエアロゾル化され、例えば噴霧器を介して肺に送達される。他の例において、活性センサーは、経皮的に、皮内に、動脈内に、病変内に、腫瘍内に、頭蓋内に、関節内に、腫瘍内に、筋肉内に、皮下に、経口で、局所的に、局部的に、吸入、注射、注入、または他の方法もしくは当技術分野において知られる任意の組合せによって対象に投与され得る（例えば、参照により組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （１９９０）を参照されたい）。
【００６８】
ステップ１２５で、標的酵素活性が任意の生体試料において検出され得る。好ましい実施形態では、生体試料は非侵襲的に獲得され、好ましくは身体から天然に排泄される体液または他の物質である。
【００６９】
活性センサーが罹患微小環境、例えば罹患した肝臓または腎臓の組織に入った場合、レポーターポリペプチドに特異的な活性を有するプロテアーゼがポリペプチドを切断し、担体からレポーターを遊離させる。次いで、遊離したレポーターは、循環に再び入り得、腎臓濾過を通って尿となるか、または組織からおよび疾患を有する対象から任意の様式で別様に排泄され得る。次いで、レポーターは、任意の適切な様式で、例えば質量分析またはＥＬＩＳＡに基づくアッセイ等のリガンド結合アッセイによって、排泄された試料から検出され得る。試料における遊離したレポーターを検出することによって、活性センサーに対する酵素活性の存在が示され、それによって標的酵素活性が検出される。
【００７０】
図５は、酵素５２０と活性センサー５００との反応を図解する。示されるように、活性センサー５００は、担体５０５、レポーター５１０、および調整ドメイン５１５を含む。酵素５２０は、酵素感受性部位でレポーター５１０のそれぞれを切断し、担体５０５からレポーター５１０を遊離させる。１つの例において、レポーターは、疾患が存在する場合、調節不全になるプロテアーゼに対する基質であるポリペプチドを含む。プロテアーゼは担体からレポーターを切断し、放出されると、レポーター５１０は担体５０５から拡散し得、循環に再び入って排泄および検出され得る。
【００７１】
検出される酵素活性は、任意のタイプの酵素、例えばプロテアーゼ、キナーゼ、エステラーゼ、ペプチダーゼ、アミダーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、ライザーゼ（ｌｙｓａｓｅ）、イソメラーゼ、またはリガーゼの活性であり得る。
【００７２】
生体試料は、レポーターが検出され得る、対象由来の任意の試料であり得る。例えば、試料は、組織試料（血液試料、硬組織試料、軟部組織試料等）、尿試料、唾液試料、粘液試料、糞便試料、精液試料、または脳脊髄液試料であり得る。
レポーター検出
【００７３】
レポーターは、直接的または間接的に、検出可能な分析物内の分子の分量の存在を検出することができる任意の適切な検出法によって検出され得る。例えば、レポーターは、親和性作用物質への捕捉リガンドの結合を伴う試験であるリガンド結合アッセイにより検出され得る。レポーターは、捕捉後に、光学密度、放射性発光、非放射性エネルギー移動により直接的に検出され得る。あるいは、レポーターは、抗体コンジュゲート、親和性カラム、ストレプトアビジン−ビオチンコンジュゲート、ＰＣＲ分析、ＤＮＡマイクロアレイ、または蛍光分析を用いて間接的に検出され得る。
【００７４】
リガンド結合アッセイは、蛍光、比色、生物発光、および化学発光ＥＬＩＳＡを含めたＥＬＩＳＡ、紙試験ストリップもしくはラテラルフローアッセイ、またはビーズに基づく蛍光アッセイ等の検出ステップを伴うことが多い。
【００７５】
１つの例において、紙に基づくＥＬＩＳＡ試験を使用して、尿中の遊離したレポーターを検出し得る。紙に基づくＥＬＩＳＡは、商業用ソリッドインクプリンターから堆積したワックスをリフローして、１枚の紙の上に試験スポットのアレイを創出する等によって、安価に創出され得る。ソリッドインクを液体または半液体状態に加熱した場合、プリントされたワックスは紙に浸透し、疎水性バリアが創出される。次いで、疎水性バリア間の空間が、個々の反応ウェルとして使用され得る。ＥＬＩＳＡアッセイは、個々の反応ウェル上で検出抗体を乾燥させ、紙上で試験スポットを成し、その後にブロッキングおよび洗浄ステップが続くことによって実施され得る。次いで、対象から採取された尿試料からの尿を試験スポットに添加することができ、次いで、ストレプトアビジンアルカリホスフェート（ＡＬＰ）コンジュゲートを検出抗体として試験スポットに添加することができる。次いで、結合しているＡＬＰを、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（５−ブロモ−４−クロロ−３’−インドリルホスフェート（ｉｎｄｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ｐ−トルイジン塩／ニトロブルーテトラゾリウムクロリド）等の呈色反応剤に曝露し得、それにより紫色の沈殿物が生じ、レポーターの存在が示される。
【００７６】
別の例において、揮発性有機化合物は、ガスクロマトグラフィー機器、ブレサライザー、質量分析計、または光学もしくは音響センサーの使用等の分析プラットフォームによって検出され得る。
【００７７】
ガスクロマトグラフィーを使用して、分解せずに揮発し得る化合物（例えば、揮発性有機化合物）を検出することができる。ガスクロマトグラフィー機器は、カラムと呼ばれる１個のガラス製または金属製チューブの内側に、担体ガス、例えばヘリウム等の不活性ガスまたは窒素等の非反応性ガスである移動相（または動く相）、および不活性固体支持体上の液体またはポリマーの微視的層である静止相を含む。カラムは静止相でコーティングされ、分析される気体化合物はカラムの壁と相互作用し、それらを種々の時間に溶出させる（すなわち、カラムにおいて様々な保持時間を有する）。化合物は、それらの保持時間によって区別され得る。
【００７８】
改変型ブレサライザー機器を使用しても、揮発性有機化合物を検出することができる。血中のアルコールレベルを検出するために使用される伝統的ブレサライザーでは、対象は機器の中に息を吐き、対象の息に存在する任意のエタノールが、陽極で酢酸に酸化される。陰極では、大気中酸素が還元される。全体的な反応は、酢酸および水へのエタノールの酸化であり、それは、マイクロコントローラーによって検出および定量され得る電流を生じさせる。他の反応を利用した改変型ブレサライザー機器を使用して、様々な揮発性有機化合物を検出することができる。
【００７９】
図６は、ステップ１２５に記載されるように、標的活性を検出するために使用され得る質量スペクトルである。質量分析を使用して、質量の差に基づいてレポーターを検出および区別することができる。質量分析では、試料を、例えばそれに電子を浴びせることによってイオン化する。試料は、固体、液体、または気体であり得る。試料をイオン化することによって、試料の分子の一部は、壊れて荷電断片になる。次いで、これらのイオンは、それらの質量対電荷比に従って分離され得る。これは、イオンを加速させ、それらを電場または磁場に供することによって実施されることが多く、同じ質量対電荷比を有するイオンは、同じ量の偏向を受ける。偏向した場合、イオンは、荷電粒子を検出することが可能なメカニズム、例えば電子増倍管によって検出され得る。検出された結果は、質量対電荷比の関数としての、検出されたイオンの相対存在量のスペクトルとして示され得る。次いで、試料中の分子は、分子全体の質量等の既知の質量と識別された質量とを相関させることによって、または特徴的な断片化パターンにより識別され得る。
【００８０】
レポーターが核酸を含む場合、レポーターは、当技術分野において知られる様々なシーケンシング法、例えば伝統的なサンガーシーケンシング法によってまたは次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって検出され得る。ＮＧＳとは、一般的に、多く（すなわち、数千、数百万、または数十億）の核酸鎖が並行してシーケンシングされ得る、サンガーに基づかないハイスループット核酸シーケンシング技術を指す。そのようなＮＧＳシーケンシングの例には、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（例えば、ＨｉＳｅｑ、ＭｉＳｅｑ、ＮｅｘｔＳｅｑ、ＭｉｎｉＳｅｑ、およびｉＳｅｑ１００）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（例えば、ＳｅｑｕｅｌおよびＲＳＩＩ）によって産生されたプラットフォーム、およびＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒによるＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（例えば、Ｉｏｎ  Ｓ５、Ｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ、Ｉｏｎ  ＰＧＭ、およびＩｏｎ  Ｃｈｅｆシステム）が含まれる。任意の適切なＮＧＳシーケンシングプラットフォームをＮＧＳに使用して、本明細書に記載される検出可能な分析物の核酸を検出することができることが理解される。
【００８１】
分析は、生体試料に対して直接実施され得る、または検出可能な分析物は、まずある程度精製され得る。例えば、精製ステップは、生体試料における他の構成要素から検出可能な分析物を単離することを伴い得る。精製は、親和性クロマトグラフィー等の方法を含み得る。単離されたまたは精製された検出可能な分析物は、分析前に１００％純粋であるまたは実質的に純粋でさえある必要はない。
【００８２】
検出可能な分析物を検出することは、酵素の比較活性レベルを示す、定性的査定（例えば、検出可能な分析物が存在するか存在しないか）または定量的査定（例えば、存在する検出可能な分析物の量）を提供し得る。定量的値は、試料に存在する各画分の相対量パーセントを決定する等による任意の手段によって計算され得る。これらのタイプの計算を行うための方法は、当技術分野において公知である。
【００８３】
検出可能な分析物は標識され得る。例えば、単離された検出可能な分析物がＰＣＲに供される場合、標識は核酸に直接付加され得る。例えば、標識されたプライマーまたは標識されたヌクレオチドを使用して実施されるＰＣＲ反応は、標識された産物をもたらす。フルオレセインで標識されたＣＴＰ等の標識されたヌクレオチドが市販されている。核酸に標識を付着させるための方法は、当業者に周知であり、ＰＣＲ法に加えて、例えばニックトランスレーションおよび末端標識化を含む。
【００８４】
レポーターにおける使用に適した標識には、分光学的、光化学的、生化学的、電気的、光学的、または化学的方法を含めた、標準的方法によって検出可能な任意のタイプの標識が含まれる。標識は蛍光標識であり得る。蛍光標識は、少なくとも１つのフルオロフォアを含む化合物である。市販の蛍光標識には、例えばフルオレセインホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｄｅ）、ローダミン、ポリメタジン色素誘導体、リン光体、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、緑色蛍光タンパク質、ＣＹ３、およびＣＹ５が含まれる。
【００８５】
化学発光または比色（酵素的呈色反応）等の他の公知の技法を使用しても、レポーターを検出することができる。酵素に対する結合部位である短い橋によって、「ドナー」フルオロフォアが「アクセプター」クロモフォアに接合されているクエンチャー組成物も使用され得る。ドナーフルオロフォアのシグナルは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）等の共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）を伴うと思われる過程を通じて、アクセプタークロモフォアによってクエンチされる。ペプチドの切断は、クロモフォアとフルオロフォアの分離、クエンチの除去、およびドナーフルオロフォアから測定される後続シグナルの生成をもたらす。ＦＲＥＴペアの例には、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）とＣＰＱ２、ＦＡＭとＤＡＢＣＹＬ、Ｃｙ５とＱＳＹ２１、Ｃｙ３とＱＳＹ７が含まれる。
【００８６】
図７は、調整ドメインとして、特定の細胞または特定の組織タイプの受容体に対するリガンド７１５を有する活性センサー７００を示す。
【００８７】
対象に投与された場合、活性センサー７００は、それがどのように体内に入るかに応じた様々な経路を通って体内でトラフィッキングされる。例えば、活性センサー７００が静脈内投与される場合、それは注射の地点から体循環に入り、身体を通って受動的にトラフィッキングされ得る。
【００８８】
活性センサー７００が特定の細胞内の酵素活性を検出するには、体内におけるその滞留時間の間のある時点で、活性センサー７００が、酵素の存在下に入り、ポリペプチドレポーター７１０が酵素によって切断される機会を有しなければならない。標的化の観点から、目的のそのような酵素が存在し得る特定の細胞または特定の組織タイプを標的化する手段を活性センサーに提供することが有利である。これを達成するために、特定の細胞または特定の組織タイプの受容体に対するリガンド７１５が調整ドメインとして提供され、ポリペプチド７１０に連結され得る。
【００８９】
細胞表面受容体は、細胞の外表面のリガンドに結合する、膜に固定されたタンパク質である。１つの例において、リガンドは、リガンドの結合に応答して開くイオンチャネルであるリガンド開口型イオンチャネルに結合し得る。リガンド開口型イオンチャネルは、細胞の膜にまたがり、途中に親水性チャネルを有する。チャネルの細胞外領域へのリガンド結合に応答して、タンパク質の構造は、ある特定の粒子またはイオンが通過し得るように変化する。細胞表面に存在するタンパク質に対するリガンドを含む調整ドメインを活性センサーに提供することによって、活性センサーは、特定の細胞に到達し入って、それらの細胞内の酵素活性を検出するより大きい機会を有する。
【００９０】
活性センサー７００は、担体としての生体適合性足場７０５、レポーターとしてのポリペプチド７１０、および調整ドメインとしてのリガンド７１５を含む。
【００９１】
図解されるように、担体７０５は、各アームの末端がレポーター７１０に連結されている８アームＰＥＧ−ＭＡＬ足場であり、リガンド７１５は、特定の細胞または特定の組織タイプの受容体に結合する。リガンド７１５は、標的化された細胞上の細胞表面タンパク質へのリガンド７１５の結合を介して、対象における特定の細胞または特定の組織に活性センサーを標的化し得るため、調整ドメイン７１５を活性センサー７００に提供することによって、活性センサー７００の分布は改変され得る。調整ドメイン７１５のリガンドは、小分子、ペプチド、抗体、抗体の断片、核酸、およびアプタマーを含む群から選択され得る。例えば、リガンドは、マレイミド−チオールカップリングまたはアミド結合を介して、担体７０５の足場にコンジュゲートされたペプチドを含み得る。
【００９２】
活性センサー７００が特定の組織に到達すると、リガンド７１５は、特定の組織タイプにおける活性センサーの蓄積も促進し得る。特定の組織において活性センサー７００を蓄積させることは、活性センサーの滞留時間を増加させ、ポリペプチドレポーター７１０が組織におけるプロテアーゼによって、そのようなプロテアーゼが存在する場合、酵素的に切断されるより大きい機会を提供する。
【００９３】
図８は、担体としての生体適合性足場８０５、および特定の組織における活性センサー８００の蓄積を促進する調整ドメイン８１５を有する活性センサー８００を示す。
【００９４】
活性センサー８００が対象に投与された場合、それは免疫系によって外来物質として認識され、免疫クリアランスに供され得、それによって、レポーター８１０が酵素活性を検出し得る特定の細胞または特定の組織には決して到達しない。免疫検出を阻害するために、それが免疫応答を引き出さないように生体適合性足場８０５、例えば共有結合により連結されたポリ（エチレングリコール）マレイミドの複数のサブユニットを含む生体適合性足場を担体として使用することが好ましい。さらに、ポリ（エチレングリコール）マレイミド足場の分子量を改変して、体内でのトラフィッキングを容易にし、細網内皮系による活性センサーのクリアランスを阻止することができる。そのような改変を通じて、体内におけるまたは特定の組織における活性センサーの分布および滞留時間は向上され得る。
【００９５】
活性センサー８００は、生体適合性足場である担体８０５、およびポリペプチドレポーター８１０、および調整ドメインとしての抗体８１５を含む。
【００９６】
図解されるように、担体は、共有結合により連結されたポリ（エチレングリコール）マレイミドの複数のサブユニットを含むことで、８アームＰＥＧ−ＭＡＬ足場８０５を形成する。このＰＥＧ−ＭＡＬ足場８０５は、約２０〜８０ｋＤａの間の分子量を有する。ポリペプチド８２１は、足場８０５の８本のアームのそれぞれの末端に連結される。抗体８１５は調整ドメインとして提供されて、抗体８１５の抗原が存在する特定の組織における活性センサー８００の蓄積を促進する。抗体８１５を活性センサー８００に提供することによって、活性センサー８００の分布は、抗原として認識される特定の組織の細胞上の細胞表面タンパク質への抗体８１５の結合によって改変され得る。
【００９７】
ある特定の実施形態では、調整ドメイン８１５は、小分子、ペプチド、抗体、抗体の断片、核酸、およびアプタマーを含む群から選択され得る。
【００９８】
図９は、細胞膜を横切る活性センサーの拡散を容易にする調整ドメインとして提供される疎水性鎖９１５を有する活性センサー９００を示す。
【００９９】
対象に投与された場合、活性センサー９００は、それがどのように体内に入るかに応じた様々な経路を通って体内でトラフィッキングされる。例えば、活性センサー９００が静脈内投与される場合、それは注射の地点から体循環に入り、身体を通って受動的にトラフィッキングされ得る。
【０１００】
活性センサー９００が特定の細胞内の酵素活性を検出するには、体内におけるその滞留時間の間のある時点で、活性センサー９００は、酵素の存在下に入り、レポーター９１０が酵素によって切断される機会を有しなければならない。それゆえ、目的のそのような酵素が存在し得る特定の細胞に入る手段を活性センサーに提供することが有利である。これを達成するために、疎水性鎖９１５が、細胞膜を横切る活性センサーの拡散を容易にする調整ドメインとして提供され、活性センサー９００に連結され得る。
【０１０１】
活性センサー９００は、担体９０５、担体に連結されているレポーター９１０、および疎水性鎖を含む調整ドメイン９１５を含む。
【０１０２】
図解されるように、８アームＰＥＧ−ＭＡＬ足場９０５は、各アームの末端がレポーター９１０に連結されている担体であり、脂肪酸鎖９１５は、脂質細胞膜を横切る活性センサー９００の拡散を容易にする調整ドメインとして提供される。
【０１０３】
調整ドメインは、拡散を容易にする任意の適切な疎水性鎖、例えば、中性、飽和、（ポリ／モノ）不飽和の油脂（モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド）、リン脂質、ステロール（ステロイドアルコール）、動物ステロール（コレステロール）、ワックス、および脂溶性ビタミン（ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、およびＫ）を含めた脂肪酸鎖を含み得る。
【０１０４】
一部の実施形態では、調整ドメインは細胞透過性ペプチドを含む。細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、本開示の活性センサーの細胞摂取／取り込みを容易にする短いペプチドである。ＣＰＰは、好ましくは、リシンもしくはアルギニン等の正荷電アミノ酸の高い相対存在量を含有する、または極性／荷電アミノ酸および非極性の疎水性アミノ酸の交互パターンを含有する配列を有する、アミノ酸組成を有する。参照により組み込まれる、Ｍｉｌｌｅｔｔｉ，  ２０１２，  Ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  ｃｌａｓｓｅｓ，  ｏｒｉｇｉｎ，  ａｎｄ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ，  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  １７：８５０−８６０を参照されたい。適切なＣＰＰには、Ｔａｔ、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、ペネトラチン、ｐＶＥｃ、ＲＲＬヘリックス、Ｓｈｕｆｆｌｅ、およびＰｅｎｅｔｒａｍａｘのような、文献において知られるものが含まれる。参照により組み込まれる、Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，  ２０１６，  Ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｔｏｏｌｓ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｎｏｎ−ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｒｒｉｅｒｓ  ４（２）：ｅ１１７８３６９を参照されたい。
【０１０５】
図１０は、調整ドメインとしての、特定の細胞または組織タイプの受容体に対するペプチドリガンド１０２０、および細胞膜を横切る活性センサー１０００の拡散を容易にする疎水性鎖１０１５を有する活性センサー１０００を示す。
【０１０６】
対象に投与された場合、活性センサー１０００は、それがどのように体内に入るかに応じた様々な経路を通って体内でトラフィッキングされる。例えば、活性センサー１０００が静脈内投与される場合、それは注射の地点から体循環に入り、身体を通って受動的にトラフィッキングされ得る。
【０１０７】
活性センサー１０００が特定の細胞内の酵素活性を検出するには、体内におけるその滞留時間の間のある時点で、活性センサー１０００は、酵素の存在下に入り、レポーター１００５が酵素によって切断される機会を有しなければならない。それゆえ、特定の細胞を標的化して、それらの細胞内の酵素活性を検出する手段を活性センサーに提供することが有利である。これを達成するために、特定の細胞または組織タイプの受容体に対するペプチドリガンド１０１５が調整ドメインとして提供され、レポーター１０１０に連結される。加えて、目的のそのような酵素が存在し得るそれらの特定の細胞に入る手段を活性センサー１０００に提供することが有利である。これを達成するために、疎水性鎖１０１５が活性センサー１０００に連結されて、細胞膜を横切る活性センサー１０００の拡散を容易にする。
【０１０８】
細胞表面受容体は、細胞の表面のリガンドに結合する、膜に固定されたタンパク質である。１つの例において、リガンドは、リガンドの結合に応答して開くイオンチャネルであるリガンド開口型イオンチャネルに結合し得る。リガンド開口型イオンチャネルは、細胞の膜にまたがり、途中に親水性チャネルを有する。チャネルの細胞外領域へのリガンド結合に応答して、タンパク質の構造は、ある特定の粒子またはイオンが通過し得るように変化する。細胞表面に存在するタンパク質に対するリガンドを含む調整ドメインを活性センサーに提供することによって、活性センサーは、特定の細胞に到達し入って、それらの細胞内の酵素活性を検出するより大きい機会を有する。
【０１０９】
活性センサー１０００は、担体１００５、担体に連結されているレポーター１０１０、ならびに調整ドメイン１０１５および調整ドメイン１０２０を含む。
【０１１０】
図解されるように、担体１００５は、各アームの末端がレポーター１０１０に連結されている８アームＰＥＧ−ＭＡＬ足場であり、調整ドメイン１０１５は、特定の細胞または組織タイプの受容体に対するペプチドリガンド、および細胞膜を横切る活性センサーの拡散を容易にする疎水性鎖１０２０を含む。調整ドメイン１０１５を活性センサー１０００に連結させることによって、活性センサー１０００は特定の細胞または組織タイプに標的化され得、疎水性鎖は、活性センサー１０００が細胞膜の脂質二重層を通して拡散して細胞に入るのを可能にする。細胞に入った後、担体からレポーター１０１０を切断することができる酵素が存在する場合、それらの酵素は、活性センサー１０００からレポーター１０１０を切断および遊離させ得る。次いで、レポーター１０１０は身体から排泄され、検出されて、疾患状態または疾患の進行もしくは退行を決定することができる。
【０１１１】
調整ドメインは、拡散を容易にする任意の適切な疎水性鎖、例えば、中性、飽和、（ポリ／モノ）不飽和の油脂（モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド）、リン脂質、ステロール（ステロイドアルコール）、動物ステロール（コレステロール）、ワックス、および脂溶性ビタミン（ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、およびＫ）を含めた脂肪酸鎖を含み得る。
【０１１２】
図１１は、免疫検出からポリペプチドレポーター１１１０を遮蔽するか、またはマクロファージによる活性センサー１１００の細胞取り込みを阻害する調整ドメインとしての、生体適合性ポリマー１１１５を有する活性センサー１１００を示す。
【０１１３】
対象に投与された場合、活性センサー１１００は、それがどのように体内に入るかに応じた様々な経路を通って体内でトラフィッキングされる。例えば、活性センサー１１００が静脈内投与される場合、それは注射の地点から体循環に入り、身体を通って受動的にトラフィッキングされ得る。
【０１１４】
活性センサー１１００が特定の細胞内の酵素活性を検出するには、体内におけるその滞留時間の間のある時点で、活性センサー１１００は、酵素の存在下に入り、レポーター１１１０が酵素によって切断される機会を有しなければならない。
【０１１５】
外来物質が抗原として認識された場合、免疫系によって抗体応答が誘引され得る。一般的に、次いで抗体が外来物質に付着し、抗原−抗体複合体を形成し、次いでそれは、マクロファージおよび他の食細胞によって捕食されて、身体からそれらの外来物質が一掃される。そのため、活性センサー１１００が体内に入った場合、それは抗原として認識され、免疫クリアランスに供され、活性センサー１１００が特定の組織に到達して酵素活性を検出することが阻止され得る。活性センサー１１１０の免疫検出を阻害するために、例えばＰＥＧ調整ドメイン１１１５が活性センサー１１００に連結され得る。ＰＥＧは遮蔽物として作用し、免疫系による活性センサー１１００の外来物質としての認識を阻害する。免疫検出を阻害することによって、調整ドメイン１１１５は、体内におけるまたは特定の組織における活性センサー１１００の滞留時間を向上させる。
【０１１６】
マクロファージは、健常な体細胞に特徴的であるある特定の細胞表面タンパク質を欠く物体を飲み込み消化する、免疫系の白血球の１タイプである。例えば、マクロファージは、外来物質、微生物、細胞残屑、がん細胞を飲み込み消化することができる。マクロファージは、身体の本質的にすべての組織において見い出され、非特異的防御の形態を提供し得る。
【０１１７】
活性センサー１１００が体内に入った場合、それは外来物質として認識され得、マクロファージはそれを飲み込み消化し、活性センサー１１００が特定の組織に到達するのを阻止することができる。マクロファージによる活性センサー１１００の細胞取り込みを阻害するために、例えばＰＥＧ１１１５が活性センサー１１００に連結され得る。ＰＥＧ１１１５は遮蔽物として作用し、マクロファージによる活性センサーの外来物質としての認識を阻害する。マクロファージ認識を阻害することによって、調整ドメイン１１１５は、体内におけるまたは特定の組織における活性センサー１１００の滞留時間を向上させ、活性センサー１１００が特定の組織に到達して酵素活性を検出するのを可能にする。
【０１１８】
活性センサー１１００は、生体適合性足場である担体１１０５、およびそれぞれが担体１１０５に連結されたポリペプチドレポーター１１１０を含む。ポリペプチド１１１０は、１つまたは複数のプロテアーゼによる切断に感受性である。活性センサー１１００は、免疫検出からポリペプチド１１１０を遮蔽するか、またはマクロファージによる活性センサーの細胞取り込みを阻害する、複数のポリマー調整ドメイン１１１５も含む。ポリペプチド１１１０は、特定の疾患と関連することが知られるプロテアーゼによる切断に感受性の配列を含み得、調整ドメインポリマーはＰＥＧ側鎖を含み得る。レポーター１１１０は、酵素的切断に感受性の任意のポリペプチドを含み得る。
【０１１９】
図解されるように、担体１１０５は、各アームの末端がポリペプチド１１１０に連結されている８アームＰＥＧ−ＭＡＬ足場である。活性センサー１１００は、免疫検出からポリペプチド１１１０を遮蔽する、ポリペプチド１１１０に連結された調整ドメイン１１１５を含み、それは、特定の組織に到達する前の活性センサー１１００の免疫クリアランスを阻止する。同様に、ＰＥＧ１１１５は、マクロファージによる活性センサー１１００の認識を阻害する。マクロファージが活性センサー１１００を認識することができない場合、活性センサー１１００は、細胞取り込みおよび早すぎる分解から保護される。免疫検出から活性センサー１１００を遮蔽するか、またはマクロファージによる活性センサーの細胞取り込みを阻害するいずれかの事象において、調整ドメイン１１１５は、対象における活性センサー１１００の滞留時間を向上させ、それによって、それが特定の組織に到達し酵素活性を検出するのを可能にする。
【０１２０】
図１２は、調整ドメインとしてのポリマー１２１５を有する活性センサー１２００を示し、ポリマー１２１５は、担体足場１２０５とポリペプチドレポーター１２１０との間に配置されて、足場１２０５とポリペプチドレポーター１２１０との間の立体障害を減少させ、それによってプロテアーゼへのポリペプチド１２１０の接近可能性を増加させ、切断の成功を促進する。
【０１２１】
対象に投与された場合、活性センサー１２００は、それがどのように体内に入るかに応じた様々な経路を通って体内でトラフィッキングされる。例えば、活性センサー１２００が静脈内投与される場合、それは注射の地点から体循環に入り、身体を通って受動的にトラフィッキングされ得る。
【０１２２】
活性センサー１２００が特定の細胞内の酵素活性を検出するには、体内におけるその滞留時間の間のある時点で、活性センサー１２００は、酵素の存在下に入り、レポーターが酵素によって切断される機会を有しなければならない。酵素は、基質の相補的な形状、電荷、および親水性／疎水性特徴を有するポケットに結合することによって、特定の基質に対する高い特異性を有する。そのため、酵素は、化学選択的（すなわち、代替反応よりも化学反応の結果を好む）、位置選択的（すなわち、他のすべての考え得る方向よりも、化学結合形成または破壊の１つの方向を好む）、および立体特異的（すなわち、立体異性体の１つまたはサブセットにのみ反応する）である非常に類似した基質分子間を区別し得る。
【０１２３】
立体効果は、立体障害をもたらす、イオンおよび分子の形状（すなわち、コンフォメーション）および反応性に影響を与える非結合性相互作用である。立体障害は、立体的かさ高さに起因した化学反応の減速であり、分子間反応に影響を及ぼす。分子の様々な基を改変して、基の間での立体障害を制御し、例えば、不要な副反応を阻害するため等の選択性を制御し得る。担体足場とレポーターとの間に調整ドメインを活性センサーに提供することによって、活性センサー１２００の構成要素間の立体障害を最小限に抑えて、プロテアーゼへのレポーターの接近可能性を増加させ得る。
【０１２４】
標的活性を検出するために、ポリペプチド１２１０は切断されなければならず、足場１２０５からポリペプチド１２１０の一部分が遊離する。切断の成功を促進するために、ポリマー１２１５が、足場１２０５とポリペプチド１２１０との間で、足場１２０５およびポリペプチド１２１０に連結され得る。足場１２０５とポリペプチド１２１０との間の立体障害を減少させることによって、ポリペプチド１２１０は酵素に提示されて、酵素がポリペプチド１２１０を切断するのを可能にし得る。ある特定の実施形態では、ポリマー１２１５は、ＰＥＧまたは他の任意の適切な生体適合性ポリマーであり得る。
【０１２５】
一実施形態では、活性センサー１２００は、約３０〜４０ｋＤａである生体適合性足場担体１２０５、およびそれぞれが足場１２０５に連結されたポリペプチドレポーター１２１０を含む。活性センサー１２００は、足場１２０５とポリペプチド１２１０との間に配置されるポリマー調整ドメイン１２１５も含むことで、足場１２０５とポリペプチド１２１０との間の立体障害を減少させ、それによってプロテアーゼへのポリペプチド１２１０の接近可能性を増加させ、切断の成功を促進する。
【０１２６】
図解されるように、担体１２０５は８アームＰＥＧ−ＭＡＬ足場であり、各アームの末端が、足場１２０５とポリペプチド１２１０との間に配置されるＰＥＧ１２１５に連結されて、足場１２０５とポリペプチド１２１０との間の立体障害を減少させる。活性センサー１２００の部分間の立体障害を減少させることによって、ＰＥＧ１２１５は、プロテアーゼへのポリペプチド１２１０の接近可能性を増加させて、切断の成功を促進する。
【０１２７】
ポリマー１２１５は任意のサイズのものであり得、足場１２０５とポリペプチド１２１０との間の距離を調整するように選択され得る。一部の実施形態では、足場１２０５とポリペプチド１２１０との間の距離は、約１．５オングストローム〜約１０００オングストローム、約１０オングストローム〜約５００オングストローム（例えば、１０〜５００の間の任意の整数）、約５０オングストローム〜約８００オングストローム（例えば、５０〜８００の間の任意の整数）、約６００オングストローム〜約１０００オングストローム（例えば、６００〜１０００の間の任意の整数）、または１０００オングストロームよりも大きい範囲である。
【０１２８】
ポリマー１２１５には、乳酸とグリコール酸とのポリマー、ポリ無水物、ポリウレタン等の合成ポリマー、またはアルギネート、ならびにデキストランおよびセルロースを含めた他の多糖、コラーゲン、アルブミン、ならびに他の親水性タンパク質、ゼインおよび他のプロラミン、ならびに疎水性タンパク質等の天然ポリマー、それらの共重合体および混合物が含まれ得る。
【０１２９】
図１３は、ポリペプチドレポーター１３１０、およびＤ−アミノ酸を含むポリペプチド１３１０の領域を構成してそれらの領域のタンパク質分解的切断を阻止する調整ドメイン１３１５を有する活性センサー１３００を示す。
【０１３０】
酵素は、化学選択的（すなわち、代替反応よりも化学反応の結果を好む）、位置選択的（すなわち、他のすべての考え得る方向よりも、化学結合形成または破壊の１つの方向を好む）、および立体特異的（すなわち、立体異性体の１つまたはサブセットにのみ反応する）であるため、酵素は、非常に類似した基質分子間を区別し得る。アミノ酸は、Ｌ−またはＤ−アミノ酸のいずれかとして存在し得る。Ｌ−およびＤ−アミノ酸とは、一般的に、それぞれアミノ酸の左巻きおよび右巻きの立体配置を指し、中心炭素原子を中心にして２つの異なる鏡像異性体（立体異性体）を表す。
【０１３１】
一般的に、Ｌ−アミノ酸のみが細胞内で製造され、Ｄ−アミノ酸はそうではない。酵素は立体特異的であるため、ほとんどのプロテアーゼは、Ｄ−アミノ酸を含有する位置でペプチド鎖を切断することができない。そのため、ポリペプチド１３１０の領域として調整ドメイン１３１５を提供することによって、調整ドメイン１３１５がＤ−アミノ酸を含む場合、調整ドメイン１３１５はそのような領域のタンパク質分解的切断を阻止する。
【０１３２】
加えて、特定のタイプの組織におけるポリペプチドの切断部位は、ポリペプチドにおけるＬ−およびＤ−アミノ酸の組成または相対的順序によって決定され得る。レポーターならびに調整ドメインにおけるアミノ酸の相対的順序または組成を改変することによって、切断の部位は、意図される切断部位にＬ−アミノ酸、および保護されるべき他の領域にＤ−アミノ酸を単に提供することによって制御され得る。また、Ｄ−アミノ酸から構成されるペプチドは、内因性ペプチダーゼおよびプロテアーゼに抵抗性であり、対象において液性免疫応答を誘導する可能性が低い。
【０１３３】
Ｄ−アミノ酸を用いて図解されているものの、合成非天然アミノ酸、置換アミノ酸、または１つもしくは複数のＤ−アミノ酸を含めた他のノンネイティブアミノ酸が、複数の調整ドメイン１３１５のポリペプチドに組み込まれ得る。
【０１３４】
活性センサー１３００は、担体としての生体適合性足場１３０５、それぞれが足場１３０５に連結されたポリペプチド１３１０、およびＤ−アミノ酸を含む調整ドメイン１３１５を含み、調整ドメイン１３１５は、ポリペプチド１３１０の領域を構成して、それらの領域のタンパク質分解的切断を阻止する。加えて、プロテアーゼが、ある特定の疾患または医学的状態で発現されることが知られ、かつ活性センサー１３００が疾患または状態に冒された対象の組織に送達される場合、それらのプロテアーゼは、ポリペプチド１３１０を切断し、対象由来の試料において検出可能な分析物を放出し得る。ある特定の実施形態では、Ｄ−アミノ酸は、検出まで、検出可能な分析物を消化から保護し得る。
【０１３５】
図解されるように、各アームの末端がレポーターとしての各ペプチド鎖１３１０に連結されている、８アームＰＥＧ−ＭＡＬ足場１３０５が担体として提供される。調整ドメイン１３１５は、ポリペプチド１３１０の領域を構成する。調整ドメイン１３１５を活性センサー１３００に提供することによって、ポリペプチド１３１０のタンパク質分解的切断は制御され得、Ｄ−アミノ酸を含む領域のタンパク質分解的切断は阻止され得る。
【０１３６】
図１４は、ポリペプチドレポーター１４１０、および切断後の体循環へのレポーター１４１０の通過を容易にする、レポーター１４１０に連結されたポリマー調整ドメイン１４１５を有する活性センサー１４００を示す。
【０１３７】
対象に投与された場合、活性センサー１４００は、それがどのように体内に入るかに応じた様々な経路を通って体内でトラフィッキングされる。例えば、活性センサー１４００が静脈内投与される場合、それは注射の地点から体循環に入り、身体を通って受動的にトラフィッキングされ得る。
【０１３８】
活性センサー１４００が特定の細胞内の酵素活性を検出するには、体内におけるその滞留時間の間のある時点で、活性センサー１４００は、酵素の存在下に入り、レポーター１４１０が酵素によって切断される機会を有しなければならない。同様に、レポーター１４１０が切断された後、レポーター１４１０は担体１４０５から遊離され、レポーター１４１０は、好ましくは組織から体循環に拡散して、検出のために身体から排泄される。体循環への拡散を促進するために、ポリマー１４１５を活性センサー１４００に連結させて、切断後の体循環へのレポーター１４１０の通過を容易にし得る。例えば、ＰＥＧ調整ドメイン１４１５がレポーター１４１０に連結され得る。ＰＥＧは遮蔽物として作用し、免疫系によるレポーター１４１０の外来物質としての認識を阻害する。免疫検出を阻害することによって、ＰＥＧ１４１５は、体循環へのレポーター１４１０の拡散を容易にする。
【０１３９】
活性センサー１４００は、足場１４０５、およびそれぞれが担体１４０５に連結されたレポーター１４１０を含む。活性センサー１４００は、切断後の体循環へのレポーター１４１０の通過を容易にする調整ドメインとしてのポリマー１４１５も含む。
【０１４０】
図解されるように、担体１４０５は、各アームの末端がポリペプチド１４１０に連結されている８アームＰＥＧ−ＭＡＬ足場である。ポリペプチド１４１０が足場１４０５から切断されると、ポリペプチド１４１０の切断された部分は、検出可能な分析物として検出され得る。これらの検出可能な分析物は、好ましくは組織から体循環に戻って、腎臓濾過を通過し、尿中に排泄される。ＰＥＧ調整ドメイン１４１５を検出可能な分析物に連結させて、切断後の体循環への検出可能な分析物の通過を容易にし得る。
【０１４１】
ポリマー１４１５には、乳酸とグリコール酸とのポリマー、ポリ無水物、ポリウレタン等の合成ポリマー、ならびにアルギネート、およびデキストランとセルロースを含めた他の多糖、コラーゲン、アルブミン、および他の親水性タンパク質、ゼインおよび他のプロラミン、および疎水性タンパク質等の天然ポリマー、それらの共重合体および混合物が含まれ得る。
【０１４２】
図１５は、ポリペプチドレポーター１５１０、および対象からの排泄前のポリペプチド１５１０の切断された部分に対する酵素活性を阻害する調整ドメインとしてのポリマー１５１５を有する活性センサー１５００を示す。
【０１４３】
対象に投与された場合、活性センサー１５００は、それがどのように体内に入るかに応じた様々な経路を通って体内でトラフィッキングされる。例えば、活性センサー１５００が静脈内投与される場合、それは注射の地点から体循環に入り、身体を通って受動的にトラフィッキングされ得る。
【０１４４】
活性センサー１５００が特定の細胞内の酵素活性を検出するには、体内におけるその滞留時間の間のある時点で、活性センサー１５００は、酵素の存在下に入り、ポリペプチド１５１０が酵素によって切断される機会を有しなければならない。同様に、ポリペプチド１５１０が切断されて検出可能な分析物を放出した後、検出可能な分析物は、好ましくは組織から体循環に拡散して、検出のために身体から排泄される。検出可能な分析物が他の酵素によって非意図的に切断されないことも重要である。例えば、選択された検出法が質量分析によるものである場合、検出可能な分析物は、対象の排泄前に実質的に無傷のままであり、それにより、その質量の正確な測定値を決定することができることは重要である。
【０１４５】
切断後の検出可能な分析物に対する酵素活性を阻害するために、調整ドメイン１５１５は、検出可能な分析物部分を含む、レポーター１５１０の任意の部分またはすべてに連結またはコーティングされ得る。例えば、ＰＥＧ調整ドメイン１５１５は、検出可能な分析物部分を含む、レポーター１５１０の任意の部分またはすべてに連結またはコーティングされ得る。ＰＥＧは遮蔽物として作用し、切断の前および後の両方の、ポリペプチド１５１０に対する酵素活性を阻害する。
【０１４６】
図解されるように、各アームの末端が各ポリペプチドレポーター１５１０に連結されている、８アームＰＥＧ−ＭＡＬ足場１５０５が担体として提供される。ポリペプチド１５１０が切断されると、ＰＥＧ調整ドメイン１５１５は、対象からの排泄前の検出可能な分析物に対する酵素活性を阻害する。
【０１４７】
調整ドメイン１５１５において使用されるポリマーには、乳酸とグリコール酸とのポリマー、ポリ無水物、ポリウレタン等の合成ポリマー、ならびにアルギネート、およびデキストランとセルロースを含めた他の多糖、コラーゲン、アルブミン、および他の親水性タンパク質、ゼインおよび他のプロラミン、および疎水性タンパク質等の天然ポリマー、それらの共重合体および混合物が含まれ得る。
【０１４８】
図１６は、免疫検出およびクリアランスから活性センサー１６００を保護する生体適合性ポリマー調整ドメイン１６１５を有する活性センサー１６００を示す。
【０１４９】
対象に投与された場合、活性センサー１６００は、それがどのように体内に入るかに応じた様々な経路を通って体内でトラフィッキングされる。例えば、活性センサー１６００が静脈内投与される場合、それは注射の地点から体循環に入り、身体を通って受動的にトラフィッキングされ得る。
【０１５０】
活性センサー１６００が特定の細胞内の酵素活性を検出するには、体内におけるその滞留時間の間のある時点で、活性センサー１６００は、酵素の存在下に入り、レポーター１６０５が酵素によって切断される機会を有しなければならない。身体を通ってトラフィッキングされる間、活性センサー１６００が免疫系によって外来物質として認識され、免疫クリアランスに供されてしまい、それによって、レポーター１６１０が酵素活性を検出し得る特定の細胞または特定の組織には決して到達しない、ということにはならないことが好ましい。免疫検出を阻害するために、生体適合性ポリマー１６１５を活性センサー１６００に連結させて、免疫検出およびクリアランスから活性センサー１６００を保護し得る。例えば、調整ドメインは、ＰＥＧ、ＰＶＡ、またはＰＶＰポリマーを含み得る。ＰＥＧは遮蔽物として作用し、免疫系による活性センサー１６００の外来物質としての認識を阻害する。免疫検出を阻害することによって、調整ドメイン１６１５は、体内におけるまたは特定の組織における活性センサー１６００の滞留時間を向上させ、特定の組織への活性センサー１６００の所望の分布を容易にする。
【０１５１】
図解されるように、各アームの末端がレポーター１６１０に連結されている、８アームＰＥＧ−ＭＡＬ足場１６０５が担体として提供される。示されるように、ＰＥＧ調整ドメイン１６１５をレポーター１６１０に連結させて、免疫検出およびクリアランスから活性センサー１６００を保護する。ＰＥＧ１６１５は、免疫検出およびクリアランスから活性センサー１６００を保護する。この例において、レポーター１６１０は、２０よりも大きい原子番号の元素を含む元素質量タグである。
【０１５２】
様々な実施形態では、レポーター１６１０は、揮発性有機化合物、元素質量タグ、１つまたは複数のＤ−アミノ酸を含むペプチド、核酸、およびネオアンチゲンを含む群から選択される任意の１つであり得る。一実施形態では、レポーター１６１０は、ハイブリダイゼーションアッセイによって検出可能な抗原を含む。検出の方法は、使用されるレポーター１６１０のタイプに基づいて選択され得る。例えば、揮発性有機化合物は、ガスクロマトグラフィー機器、ブレサライザー、質量分析計、または光学もしくは音響センサーの使用により検出され得る。
【０１５３】
図１７は、ポリペプチド１７１０から放出された場合、検出可能な分析物を放出するポリペプチドレポーター１７１０、および検出可能な分析物の一部分を形成する調整ドメイン１７１５を有する活性センサー１７００を示す。
【０１５４】
対象に投与された場合、活性センサー１７００は、それがどのように体内に入るかに応じた様々な経路を通って体内でトラフィッキングされる。例えば、活性センサー１７００が静脈内投与される場合、それは注射の地点から体循環に入り、身体を通って受動的にトラフィッキングされ得る。
【０１５５】
活性センサー１７００が特定の細胞内の酵素活性を検出するには、体内におけるその滞留時間の間のある時点で、活性センサーは、酵素の存在下に入り、レポーター１７１０が標的酵素によって切断される機会を有しなければならない。酵素は、化学選択的（すなわち、代替反応よりも化学反応の結果を好む）、位置選択的（すなわち、他のすべての考え得る方向よりも、化学結合形成または破壊の１つの方向を好む）、および立体特異的（すなわち、立体異性体の１つまたはサブセットにのみ反応する）であるため、酵素は、非常に類似した基質分子間を区別し得る。アミノ酸は、Ｌ−またはＤ−アミノ酸のいずれかとして存在し得る。Ｌ−およびＤ−アミノ酸とは、一般的に、それぞれアミノ酸の左巻きおよび右巻きの立体配置を指し、中心炭素原子を中心にして２つの異なる鏡像異性体（立体異性体）を表す。
【０１５６】
一般的に、Ｌ−アミノ酸のみが細胞内で製造され、Ｄ−アミノ酸はそうではない。酵素は立体特異的であるため、Ｄ−アミノ酸から構成されるペプチドは、内因性ペプチダーゼおよびプロテアーゼに抵抗性であり、対象において液性免疫応答を誘導する可能性が低い。
【０１５７】
一実施形態では、検出可能な分析物の一部分を形成する調整ドメイン１７１５を提供することによって、調整ドメイン１７１５がＤ−アミノ酸を含む場合、Ｄ−アミノ酸は、検出可能な分析物のさらなるタンパク質分解的切断を、それがポリペプチド１７１０から放出された後に阻止し得る。
【０１５８】
活性センサー１７００は、生体適合性足場担体１７０５、および足場１７０５に連結されたポリペプチドレポーター１７１０、およびポリペプチド１７１０が切断された場合ポリペプチド１７１０から放出される検出可能な分析物の一部分を形成する調整ドメイン１７１５を含む。
【０１５９】
図解されるように、各アームの末端がポリペプチドレポーター１７１０に連結されている、８アームＰＥＧ−ＭＡＬ足場１７０５が担体として提供される。ポリペプチド１７１５はポリペプチドレポーター１７１０に連結され、それによって、検出可能な分析物の一部分を形成する。プロテアーゼがポリペプチド１７１０を切断した場合、ポリペプチド調整ドメイン１７１５を含む検出可能な分析物が放出される。示されるように、調整ドメイン１７１５は、検出可能な分析物の一部分を形成するＤ−アミノ酸を含む。
【０１６０】
当業者であれば、本開示の活性センサーにおけるプロテアーゼ切断部位として、どのペプチドセグメントを含めるを知っているであろう。オンラインツールまたは刊行物を使用して、切断部位を識別することができる。例えば、切断部位は、参照により組み込まれる、Ｓｏｎｇ，  ２０１２，  ＰＲＯＳＰＥＲ：  Ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｆｅａｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅｓ，  ＰＬｏＳＯｎｅ  ７（１１）：ｅ５０３００に記載されるオンラインデータベースＰＲＯＳＰＥＲにおいて予測される。本明細書において記述される組成物、構造、方法、または活性センサーのいずれかは、例えば、切断部位としての、ＰＲＯＳＰＥＲ等のデータベースにおける配列等の任意の適切な切断部位、ならびにいずれかさらなる任意のポリペプチドセグメントを含むことで、任意の所望の分子量を獲得し得る。オフターゲット切断を阻止するために、切断部位の外側にある１つまたは任意の数のアミノ酸は、任意の分量でＤおよび／またはＬ型の混合物であり得る。
参照による組込み
【０１６１】
特許、特許出願、特許公報、雑誌、書籍、学術論文、ウェブコンテンツ等の他の文書への参照および引用が、本開示全体を通してなされている。すべてのそのような文書は、すべての目的のために、本明細書における参照によりそれらの全体として本明細書によって組み込まれる。
均等物
【０１６２】
本明細書において示され、記載されるものに加えて、本発明の様々な改変およびその多くのさらなる実施形態が、本明細書において引用される科学的および特許文献への参照を含めた、本文書の全内容から当業者に明白になるであろう。本明細書における主題は、その様々な実施形態およびその均等物における本発明の実践に適応され得る重要な情報、例示、およびガイダンスを含有する。
【実施例】
【０１６３】
肝線維症を検出する活性センサーの調整
肝線維症は、慢性肝傷害に対する創傷治癒応答であり、肝硬変、肝不全、およびがんにつながり得る瘢痕組織の形成をもたらす。肝線維症が発達するにつれて、主として調節不全のプロテアーゼ活性、例えばマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）等のマトリックス再構築プロテアーゼおよびそれらの阻害剤に起因して、肝臓組織の細胞外マトリックスは再編成される。
【０１６４】
肝線維症を示す酵素活性を診断するために、肝線維症を有することが既知の対象における遺伝子発現を決定することができ、肝線維症を有する対象において発現されるプロテアーゼを識別し、活性センサーをアセンブルすることができる。次いで、肝線維症を有する対象に活性センサーを投与して、肝線維症を有する細胞によって発現されるプロテアーゼによって切断されることが知られる基質に対するプロテアーゼ活性の検出に基づいて疾患を診断し得る。活性センサーは、担体、対象に投与された場合対象内での活性センサーの分布または滞留時間を改変する少なくとも１つの調整ドメイン、および担体に連結された少なくとも１つのレポーターを含み、レポーターは識別されたプロテアーゼに対する基質を含む。
【０１６５】
肝線維症を有する対象に投与された場合、活性センサーは、身体の循環を介して肝臓にトラフィッキングされ、臓器または疾患特異的な血管開窓（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｆｅｎｅｓｔｒａｔｉｏｎ）、例えば、肝動脈からの酸素に富んだ血液と門脈からの栄養素に富んだ血液とを混合するための場所として働く不連続内皮に起因して有窓である肝洞様毛細血管上皮、洞様血管を通って疾患微小環境に入る。
【０１６６】
肝臓等の疾患微小環境において、レポーターは、レポーターに組み込まれた選択基質に特異的なプロテアーゼによって担体から切断され得る。担体から遊離した場合、レポーターは循環に再び入り、腎臓濾過を通過し、対象から排泄され、そこでそれは検出され得、それによって標的プロテアーゼ活性が検出される。
遺伝子発現の決定
【０１６７】
肝線維症を有することが既知の対象における遺伝子発現を決定するために、肝線維症の進行の間に活性なまたは調節不全のプロテアーゼを記述している研究から、候補ペプチド基質のリストを集めることができる。肝線維症に関与するプロテアーゼのペプチド基質のリストを、候補基質として識別した。
肝線維症を有する対象において発現されるプロテアーゼの識別
【０１６８】
約５０種の候補ペプチド基質のフルオレセインで標識された誘導体を、ＰＥＧをコーティングした長期循環酸化鉄ナノワーム（ＮＷ）活性センサーにコンジュゲートし、肝線維症において一般に過剰発現される組換えプロテアーゼ、例えばＭＭＰおよびカテプシンとともにインキュベートした。ペプチド分解により生じる試料蛍光の増加をモニターし、以前にホモクエンチされた（ｈｏｍｏｑｕｅｎｃｈｅｄ）フルオロフォアが溶液中に自由に放たれるのを可能にすることによって、各プロテアーゼ−基質組合せに対する相対基質活性を決定した。各基質活性の相対蛍光を査定することによって、広いプロテアーゼ感受性を有するペプチド基質のライブラリーを選択した。
活性センサーのアセンブリング
【０１６９】
肝線維症を有する対象において発現されるプロテアーゼを識別し、識別されたプロテアーゼに感受性のペプチド基質を選択した後、プロテアーゼ活性を検出するために使用され得る活性センサーをアセンブルした。活性センサーは、担体、対象に投与された場合対象内での活性センサーの分布または滞留時間を改変する少なくとも１つの調整ドメインを含む。レポーターを、識別されたプロテアーゼ基質を組み込んだポリペプチドとして構築する。担体は、共有結合により連結されたポリ（エチレングリコール）マレイミドの複数のサブユニットを含有する生体適合性足場の８アームＰＥＧ−ＭＡＬ足場であるように選択する。レポーターペプチド鎖のそれぞれを、マレイミド−チオールカップリングを介して担体の８本のアームのそれぞれにコンジュゲートする。肝線維症を有する対象に投与される場合、活性センサーは肝臓にトラフィッキングされて肝臓における調節不全のプロテアーゼ活性を検出しなければならないため、ＰＥＧ調整ドメインを活性センサーのそれぞれに連結させて、免疫検出からポリペプチドを遮蔽する、またはマクロファージによる活性センサーの細胞取り込みを阻害する。
【０１７０】
ＰＥＧ調整ドメインを活性センサーに提供することによって、活性センサーの分布および滞留時間は、調整ドメインを欠く活性センサーと比べて向上する。そのため、活性センサーは、静脈内投与された場合、循環系を通って肝臓にトラフィッキングされ、一方で調整ドメインは、白血球による免疫検出およびクリアランスを阻止し、循環内におよび肝臓の組織に存在するマクロファージによる細胞取り込みを阻害する。
【０１７１】
肝臓に到達すると、活性センサーは罹患微小環境に入り、レポーターのプロテアーゼ感受性基質は、罹患エリアに存在するプロテアーゼによって切断され、レポーターは担体から遊離する。次いで、遊離したレポーターは、循環に再び入り、そこでそれは腎臓濾過を通過し、尿中に排泄される。肝線維症を有する対象から尿試料を獲得し、レポーターを例えば質量分析によって検出し、それによって、肝線維症の状態、または対象における肝線維症の進行もしくは退行と関連した標的プロテアーゼ活性が検出する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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