(57)【要約】本開示は、ヒト分化抗原群８０（ＣＤ８０）の細胞外ドメイン及びヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のフラグメント結晶化可能（Ｆｃ）ドメインを含む融合タンパク質を、それを必要とする対象、例えばがん患者に投与する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト患者の固形腫瘍を治療する方法であって、ヒト分化抗原群８０（ＣＤ８０）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）及びヒト免疫グロブリンＧ  １（ＩｇＧ１）の結晶化可能フラグメント（Ｆｃ）ドメインを含む約０．０７ｍｇ〜約７０ｍｇの融合タンパク質を前記患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
約７．０ｍｇ〜約７０ｍｇの前記融合タンパク質が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
約７０ｍｇの前記融合タンパク質が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
約４２ｍｇの前記融合タンパク質が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
約２１ｍｇの前記融合タンパク質が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
約７ｍｇの前記融合タンパク質が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
約２．１ｍｇの前記融合タンパク質が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
約０．７ｍｇの前記融合タンパク質が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
約０．２１ｍｇの前記融合タンパク質が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
約０．０７ｍｇの前記融合タンパク質が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記融合タンパク質が３週間ごとに１回投与される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記融合タンパク質が静脈内に投与される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ヒトＣＤ８０の前記ＥＣＤが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ヒトＩｇＧ１の前記Ｆｃドメインが、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ヒトＩｇＧ１の前記Ｆｃドメインが、ヒトＣＤ８０の前記ＥＣＤのカルボキシ末端に連結されている、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記融合タンパク質が、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記融合タンパク質が少なくとも２０分子のＳＡを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記融合タンパク質が少なくとも１５分子のＳＡを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記融合タンパク質が１５〜６０分子のＳＡを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記融合タンパク質が１５〜４０分子のＳＡを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記融合タンパク質が１５〜３０分子のＳＡを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記融合タンパク質が２０〜３０分子のＳＡを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記融合タンパク質が、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む医薬組成物で投与される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記医薬組成物が、融合タンパク質１モルあたり少なくとも２０モルのＳＡを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記医薬組成物が、融合タンパク質１モルあたり少なくとも１５モルのＳＡを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記医薬組成物が、融合タンパク質１モルあたり１５〜６０モルのＳＡを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記医薬組成物が、融合タンパク質１モルあたり１５〜４０モルのＳＡを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記医薬組成物が、融合タンパク質１モルあたり１５〜３０モルのＳＡを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記医薬組成物が、融合タンパク質１モルあたり２０〜３０モルのＳＡを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記固形腫瘍が進行した固形腫瘍である、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記固形腫瘍が原発性中枢神経系腫瘍ではない、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記固形腫瘍が、結腸直腸癌、乳癌、胃癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、黒色腫、頭頸部の扁平上皮癌、卵巣癌、膵臓癌、腎細胞癌、肝細胞癌、膀胱癌、または子宮内膜癌である請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記固形腫瘍が、腎細胞癌である、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記固形腫瘍が黒色腫である、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記患者がＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストによる以前の治療を受けたことがない、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記患者がＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト及びＰＤ−１アンタゴニストから選択される少なくとも１つのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストによる以前の治療を受けたことがある、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストが、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、またはアベルマブである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記少なくとも１つのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストが、進行性の設定または転移性の設定で投与された、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記患者が少なくとも１つの抗血管新生剤による以前の治療を受けたことがある、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗血管新生剤が、スニチニブ、ソラフェニブ、パゾパニブ、アキシチニブ、チボザニブ、ラムシルマブ、またはベバシズマブである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗血管新生剤が、進行性の設定または転移性の設定で投与された、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記患者がＢＲＡＦ変異を有する、請求項３４〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記患者が少なくとも１つのＢＲＡＦ阻害剤による以前の治療を受けている、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＢＲＡＦ阻害剤が、ベムラフェニブまたはダブラフェニブである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＢＲＡＦ阻害剤が、進行性の設定または転移性の設定で投与された、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記固形腫瘍が、外科手術、化学療法、放射線療法、及びそれらの組み合わせから選択される治療後に再発性または進行性である、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＥＦＳ−ＷＥＢを介して電子的に提出された配列表への参照
電子的に提出された配列表の内容（名称：３９８６＿０１７ＰＣ０２＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５；サイズ：１８，８６４バイト；及び作成日：２０１９年８月２８日）は、米国特許法第１．５２（ｅ）（５）に従って参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
分野
本出願は、がんの治療のためのＣＤ８０（Ｂ７−１）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）及び免疫グロブリンフラグメント結晶化可能（Ｆｃ）ドメインを含む融合タンパク質の投与レジメンに関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｔ細胞の調節は、複数のシグナル伝達経路、すなわち：Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体を介し、ならびに共刺激及び共阻害の両方の共シグナル伝達受容体を通じたシグナル伝達の統合に関与する。ＣＤ８０（分化抗原群８０であり、Ｂ７、Ｂ７．１、Ｂ７−１としても公知である）は、十分特徴付けられた共シグナル伝達リガンドである。ＣＤ８０は、樹状細胞及び活性化マクロファージなどの専門的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）で発現される。同族ペプチド−主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のＴＣＲ認識に続いて、ＣＤ８０は、Ｔ細胞上に発現するその受容体である分化抗原群２８（ＣＤ２８）との相互作用を介して共刺激リガンドとして機能する。ＣＤ２８を介したシグナル伝達に加えて、ＣＤ８０はまた共阻害性分子である細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４）及びプログラムされたデスリガンド１（ＰＤ−Ｌ１）とも相互作用する。ＣＤ８０とＣＴＬＡ−４の相互作用は、活性化されたＴ細胞応答が一旦、もはや不要になれば、Ｔ細胞応答を弱めるための中心となるが、ＣＤ８０とＰＤ−Ｌ１との相互作用の生物学的重要性はあまりよく理解されていない。まとめると、共刺激リガンド及び共阻害リガンドは、自己抗原に対する耐性と非自己抗原に対する適切な免疫応答を開始する能力の両方を保証する。
【０００４】
免疫系は、最初はＴＣＲ依存性及び非依存性の機構を介して腫瘍細胞に対して効果的な免疫応答を開始し得る場合が多いが、一部の腫瘍は免疫応答を回避し得る。これが発生する機構には、自己抗原（ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−Ｌ１を含む）に対する末梢性寛容を強制する経路のアップレギュレーションが含まれる。最近の免疫腫瘍学のアプローチは、初期の免疫応答を回避した腫瘍に対して効果的な免疫応答を開始するために免疫系を再プログラミングすることに焦点を合わせている。これらのアプローチには、「チェックポイント阻害剤」の使用が含まれる。例えば、プログラムされた細胞死タンパク質（ＰＤ−１）／ＰＤ−Ｌ１系とＣＴＬＡ−４系の両方に対する抗体の遮断は、一部の患者では、無増悪生存期間（ＰＦＳ）及び全生存期間（ＯＳ）の改善など、抗腫瘍免疫に効果的である。ただし、反応はえり抜きの腫瘍タイプでのみ観察されており、その範囲内では患者のごく一部のみがチェックポイント阻害剤に応答する。一部の患者は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１及びＣＴＬＡ−４系に対するブロッキング抗体を使用して長期的な疾患制御を達成するが、大多数の患者は応答しないか、または応答してその後再発する。したがって、追加の免疫腫瘍学アプローチの必要性が存在し、ＣＤ８０シグナル伝達系は介入の追加の機会を提供し得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のヒト分化抗原群８０（ＣＤ８０）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）及びフラグメント結晶化（Ｆｃ）ドメインを含む融合タンパク質を治療上有効な量で用いて投与する方法及び安全な投与レジメンが本明細書に提供されている。本明細書に記載されるように、これらの方法は、例えば、ＣＤ８０と、異なる親和性を有する３つの異なる受容体との相互作用を含む、ＣＤ８０の複雑な作用機序（これらの相互作用の１つの生物学的重要性は不明なままである）と、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）及び他の望ましくない影響など、ＣＤ８０及びその受容体の作用機序に独自に関連する毒性作用の可能性と、を含む、そのような融合タンパク質の投与を特に困難にさせる複数の要因を考慮に入れる。
【０００６】
特定の態様では、ヒト患者の固形腫瘍を治療する方法は、ヒトＣＤ８０のＥＣＤ及びヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含む、約０．０７ｍｇ〜約７０ｍｇの融合タンパク質を患者に投与することを含む。
【０００７】
特定の態様では、約７．０ｍｇ〜約７０ｍｇの融合タンパク質が投与される。特定の態様では、約７０ｍｇの融合タンパク質が投与される。特定の態様では、約４２ｍｇの融合タンパク質が投与される。特定の態様では、約２１ｍｇの融合タンパク質が投与される。特定の態様では、約７ｍｇの融合タンパク質が投与される。特定の態様では、約２．１ｍｇの融合タンパク質が投与される。特定の態様では、約０．７ｍｇの融合タンパク質が投与される。特定の態様では、約０．２１ｍｇの融合タンパク質が投与される。特定の態様では、約０．０７ｍｇの融合タンパク質が投与される。
【０００８】
特定の態様では、この融合タンパク質は、３週間に１回投与される。
【０００９】
特定の態様では、この融合タンパク質は、静脈内投与される。
【００１０】
特定の態様では、ヒトＣＤ８０のＥＣＤは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインは、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインは、ヒトＣＤ８０のＥＣＤのカルボキシ末端に連結されている。特定の態様では、この融合タンパク質は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む。
【００１１】
特定の態様では、この融合タンパク質は、少なくとも２０分子のシアル酸（ＳＡ）を含む。特定の態様では、この融合タンパク質は、少なくとも１５分子のＳＡを含む。特定の態様では、この融合タンパク質は、１５〜６０分子のＳＡを含む。特定の態様では、この融合タンパク質は、１５〜４０分子のＳＡを含む。特定の態様では、この融合タンパク質は、１５〜３０分子のＳＡを含む。特定の態様では、この融合タンパク質は、２０〜３０分子のＳＡを含む。
【００１２】
特定の態様では、この融合タンパク質は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む医薬組成物で投与される。特定の態様では、この医薬組成物は、融合タンパク質１モルあたり少なくとも２０モルのＳＡを含む。特定の態様では、この医薬組成物は、融合タンパク質１モルあたり少なくとも１５モルのＳＡを含む。特定の態様では、この医薬組成物は、融合タンパク質１モルあたり１５〜６０モルのＳＡを含む。特定の態様では、この医薬組成物は、融合タンパク質１モルあたり１５〜４０モルのＳＡを含む。特定の態様では、この医薬組成物は、融合タンパク質１モルあたり１５〜３０モルのＳＡを含む。特定の態様では、この医薬組成物は、融合タンパク質１モルあたり２０〜３０モルのＳＡを含む。
【００１３】
特定の態様では、固形腫瘍は、進行性の固形腫瘍である。特定の態様では、固形腫瘍は、原発性中枢神経系腫瘍ではない。特定の態様では、固形腫瘍は、結腸直腸癌、乳癌、胃癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、黒色腫、頭頸部の扁平上皮癌、卵巣癌、膵臓癌、腎細胞癌、肝細胞癌、膀胱癌、または子宮内膜癌である。特定の態様では、固形腫瘍は腎細胞癌である。特定の態様では、固形腫瘍は黒色腫である。
【００１４】
特定の態様では、患者はＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストによる以前の治療を受けたことがない。特定の態様では、患者は、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト及びＰＤ−１アンタゴニストから選択される少なくとも１つのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストによる以前の治療を受けている。特定の態様では、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストは、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、またはアベルマブである。特定の態様では、少なくとも１つのＰＤ−１／ＰＤ−１アンタゴニストは、進行した設定または転移性の設定で投与した。
【００１５】
特定の態様では、患者は少なくとも１つの抗血管新生剤による以前の治療を受けている。特定の態様では、抗血管新生剤は、スニチニブ、ソラフェニブ、パゾパニブ、アキシチニブ、チボザニブ、ラムシルマブ、またはベバシズマブである。特定の態様では、少なくとも１つの抗血管新生剤は、進行した設定または転移性の設定で投与された。
【００１６】
特定の態様では、患者（例えば、黒色腫の患者）にＢＲＡＦ変異がある。特定の態様では、患者は、少なくとも１つのＢＲＡＦ阻害剤による以前の治療を受けている。特定の態様では、ＢＲＡＦ阻害剤はベムラフェニブまたはダブラフェニブである。特定の態様では、ＢＲＡＦ阻害剤は、進行したまたは転移性の設定で投与された。
【００１７】
特定の態様では、固形腫瘍は、手術、化学療法、放射線療法、及びそれらの組み合わせから選択される治療後に再発性または進行性である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】０．０１、０．１、または１μｇ／ウェルのＣＤ８０  ＥＣＤ  ＩｇＧ１Ｆｃドメイン融合分子（ＣＤ８０−Ｆｃ）でコーティングされたプロテインＡビーズに曝露された９６ウェル組織培養プレート上のＴ細胞からのサイトカインＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの放出を示している。Ａ及びＣは、可溶性サイトカイン産生によって測定されるように、ビーズ固定化ＣＤ８０−Ｆｃ単独では、有意なＴ細胞活性化を引き起こさなかったことを示している。Ｂ及びＤは、少量のＯＫＴ３−ｓｃＦｖ（それ自体でＴ細胞刺激を引き起こすには低すぎる）がＣＤ８０−Ｆｃと共に固定化された場合、サイトカイン放出が観察されたことを示す。（例１を参照のこと。）
【図１Ｂ】０．０１、０．１、または１μｇ／ウェルのＣＤ８０  ＥＣＤ  ＩｇＧ１Ｆｃドメイン融合分子（ＣＤ８０−Ｆｃ）でコーティングされたプロテインＡビーズに曝露された９６ウェル組織培養プレート上のＴ細胞からのサイトカインＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの放出を示している。Ａ及びＣは、可溶性サイトカイン産生によって測定されるように、ビーズ固定化ＣＤ８０−Ｆｃ単独では、有意なＴ細胞活性化を引き起こさなかったことを示している。Ｂ及びＤは、少量のＯＫＴ３−ｓｃＦｖ（それ自体でＴ細胞刺激を引き起こすには低すぎる）がＣＤ８０−Ｆｃと共に固定化された場合、サイトカイン放出が観察されたことを示す。（例１を参照のこと。）
【図１Ｃ】０．０１、０．１、または１μｇ／ウェルのＣＤ８０  ＥＣＤ  ＩｇＧ１Ｆｃドメイン融合分子（ＣＤ８０−Ｆｃ）でコーティングされたプロテインＡビーズに曝露された９６ウェル組織培養プレート上のＴ細胞からのサイトカインＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの放出を示している。Ａ及びＣは、可溶性サイトカイン産生によって測定されるように、ビーズ固定化ＣＤ８０−Ｆｃ単独では、有意なＴ細胞活性化を引き起こさなかったことを示している。Ｂ及びＤは、少量のＯＫＴ３−ｓｃＦｖ（それ自体でＴ細胞刺激を引き起こすには低すぎる）がＣＤ８０−Ｆｃと共に固定化された場合、サイトカイン放出が観察されたことを示す。（例１を参照のこと。）
【図１Ｄ】０．０１、０．１、または１μｇ／ウェルのＣＤ８０  ＥＣＤ  ＩｇＧ１Ｆｃドメイン融合分子（ＣＤ８０−Ｆｃ）でコーティングされたプロテインＡビーズに曝露された９６ウェル組織培養プレート上のＴ細胞からのサイトカインＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの放出を示している。Ａ及びＣは、可溶性サイトカイン産生によって測定されるように、ビーズ固定化ＣＤ８０−Ｆｃ単独では、有意なＴ細胞活性化を引き起こさなかったことを示している。Ｂ及びＤは、少量のＯＫＴ３−ｓｃＦｖ（それ自体でＴ細胞刺激を引き起こすには低すぎる）がＣＤ８０−Ｆｃと共に固定化された場合、サイトカイン放出が観察されたことを示す。（例１を参照のこと。）
【図２】生理食塩水対照または０．３もしくは０．６ｍｇ／ｋｇ用量の３つの異なるロットのＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合体分子（３つの異なるシアル酸（ＳＡ）含有量を有する）による治療後のマウスＣＴ２６腫瘍の腫瘍増殖を示している。ロットＡには５ｍｏｌ  ＳＡ／ｍｏｌのタンパク質を有し、ロットＤには１５ｍｏｌ  ＳＡ／ｍｏｌのタンパク質を有し、ロットＥには２０ｍｏｌ  ＳＡ／ｍｏｌのタンパク質を有する。０．３または０．６ｍｇ／ｋｇで投与されたＣＤ８０  ＥＣＤ−ＦｃロットＥによる治療は、対照と比較して腫瘍増殖の９３％及び９８％の阻害をもたらした（Ｐ＜０．００１）。０．３または０．６ｍｇ／ｋｇで投与されたＣＤ８０  ＥＣＤ−ＦｃロットＤによる治療は、対照と比較して腫瘍増殖の９３％及び９５％の阻害をもたらした（Ｐ＜０．００１）。比較すると、０．３ｍｇ／ｋｇのＣＤ８０  ＥＣＤ−ＦｃロットＡによる治療は、対照と比較して腫瘍増殖を阻害せず、０．６ｍｇ／ｋｇで投与した場合、腫瘍増殖の７０％阻害（Ｐ＜０．００１）しか誘導しなかった。（実施例２を参照のこと。）
【図３】１０ｍｇ／ｋｇのマウスＩｇＧ２ｂ；０．３ｍｇ／ｋｇのマウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ  ＳＡ  ２０ｍｏｌ／ｍｏｌ；１０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ４抗体クローン９Ｄ９；及び１．５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ４抗体クローン９Ｄ９で治療されたＣＴ２６腫瘍の腫瘍増殖を示している。矢印は、マウスがいつ投与されたかを示している。アスタリスク記号（＊）は、０．３ｍｇ／ｋｇのマウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ  ＳＡ  ２０ｍｏｌ／ｍｏｌと他の治療法との間の統計的に有意な差を示す。（実施例３を参照のこと）。
【図４】１０ｍｇ／ｋｇのマウスＩｇＧ２ｂ；３ｍｇ／ｋｇのマウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ  ＳＡ  ２０ｍｏｌ／ｍｏｌ；１０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ４抗体クローン９Ｄ９；及び１．５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ４抗体クローン９Ｄ９で処理されたＭＣ３８腫瘍の腫瘍増殖を示している。矢印は、マウスがいつ投与されたかを示している。アスタリスク記号（＊）は、３ｍｇ／ｋｇのマウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ  ＳＡ  ２０ｍｏｌ／ｍｏｌと他の治療法との間の統計的に有意な差を示す。（実施例３を参照のこと。）
【図５】１０ｍｇ／ｋｇのマウスＩｇＧ２ｂ；３ｍｇ／ｋｇのマウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ  ＳＡ  ２０ｍｏｌ／ｍｏｌ；１０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ４抗体クローン９Ｄ９；及び１．５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ４抗体クローン９Ｄ９で治療されたＢ１６腫瘍の腫瘍増殖を示している。矢印は、マウスがいつ投与されたかを示している。アスタリスク記号（＊）は、３ｍｇ／ｋｇのマウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ  ＳＡ  ２０ｍｏｌ／ｍｏｌと他の治療法との間の統計的に有意な差を示す。（実施例３を参照のこと。）
【図６】フェーズ１ａ及び１ｂの研究スキームを示す。ＤＬＴ＝用量制限毒性；ＲＣＣ＝腎細胞癌；ＲＤ＝推奨用量。（実施例８及び９を参照のこと。）
【図７】腫瘍細胞中、及びＣＴ２６結腸直腸癌細胞を接種したＢＡＬＢ／ｃマウスの血液中、及びナイーブＢＡＬＢ／ｃマウス血液中のグランザイムＢ（Ｇｚｍｂ）及びインターフェロンガンマ（Ｉｆｎｇ）の正規化された発現を示している。ＣＴ２６担癌マウス及びナイーブマウスに、ｍＩｇＧ２ａ（対照）またはある用量のマウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃのいずれかを投与した。アスタリスク記号（＊Ｐ＜０．０５）または（＊＊Ｐ＜０．０１）は、対照治療と比較したマウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ間の統計的に有意な差を示す。（実施例１０を参照のこと）。
【図８】Ａ及びＢは、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃによって誘導される刺激因子依存性の同種異系Ｔ細胞サイトカイン分泌を示している。ＨＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃは、培養上清中のＩＬ−２（８ａ）及びＩＦＮγ（８ｂ）の同種異系誘導を増強した。全血を２量のプールされ照射されたＰＢＭＣに添加し、Ｆｃ−Ｈｉｎｇｅ対照またはｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃを複数回添加した後５日間培養した。全てのデータは、６人の個々のドナー由来の６つの技術的複製の平均の平均±ＳＤである。統計分析は、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ事後検定を使用した一元ＡＮＯＶＡであり。ここで＊Ｐ＜０．０５である。（実施例１１を参照のこと）。
【図９】Ａ及びＢは、ｈＣＤ８０ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃによって誘導される刺激因子依存性Ｔ細胞共刺激を示す。（Ａ）ＥｄＵの取り込みによって決定されるように、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃで刺激されたＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の増殖の増大。（Ｂ）ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃ刺激後のＣＤ２５のアップレギュレーション。全血を２量のプールされ照射されたＰＢＭＣに添加し、Ｆｃ−Ｈｉｎｇｅ対照またはｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃを複数回添加した後５日間培養した。培養後５日目に上清を除去した後、ＥｄＵを含む追加の培地を培養に加えた。２４時間後、細胞を収集し、表面抗体で染色し、固定し、透過処理し、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴＥｄＵキット反応用に染色してＥｄＵを標識した。全てのデータは、６人の個々のドナー由来の６つの技術的複製の平均の平均±ＳＤである。統計分析は、クラスカル・ウォリス事後検定を使用した一元配置分散分析であり、＊  Ｐ＜０．０５、＊＊  Ｐ＜０．０１である。（実施例１１を参照のこと。）
【図１０】ＣＴ２６腫瘍の増殖に対するマウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃの影響を示している。２１日目の全ての群の平均腫瘍成長（左のグラフ）及び個々の腫瘍の容積（右のグラフ）を示している。免疫応答性ＢＡＬＢ／ｃマウスに１×１０６個のＣＴ２６腫瘍細胞を接種した。マウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃによる治療は１０日目に開始した。１０、１３、及び１７日目に３回投与した。マウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃは、腫瘍増殖を有意に阻害した（＊＊＊＊は０．３ｍｇ／ｋｇでＰ＜０．０００１を示し、＊＊は１ｍｇ／ｋｇでＰ＜０．０１を示し、＊＊＊は３ｍｇ／ｋｇでＰ＜０．００１を示す）。統計的有意性は一元ＡＮＯＶＡによって決定した。略語：ＳＤ＝標準偏差。（実施例１２を参照のこと。）
【発明を実施するための形態】
【００１９】
１．定義
別途定義されない限り、本発明に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上別途要求されない限り、単数形の用語は、複数形の用語を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【００２０】
具体的に述べられるか、文脈から明らかでない限り、本明細書で使用されるとき、「または」という用語は包括的であることが理解される。「及び／または」という用語は、本明細書で「Ａ及び／またはＢ」のような表現で使用されるとき、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」及び「Ｂ」の双方を含むことを意図する。同様に、「及び／または」という用語は「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」のような表現で使用されるとき、以下の各実施形態：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡとＣ；ＡとＢ；ＢとＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）のそれぞれを包含することを意図している。
【００２１】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、同義に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指し、最少の長さに限定はされない。アミノ酸残基のそのようなポリマーは、天然または非天然のアミノ酸残基を含み得、そしてこれらには、限定するものではないが、アミノ酸残基のペプチド、オリゴペプチド、二量体、三量体、及び多量体が挙げられる。全長タンパク質とそのフラグメントの両方が定義に包含される。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアル化、アセチル化、リン酸化などを含む。さらに、本発明の目的に関して、「ポリペプチド」とは、タンパク質が所望の活性を維持する限り、天然配列に対する欠失、付加、及び置換（一般に本質的に保存的）などの修飾を含むタンパク質を指す。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発などによる意図的なものである場合もあれば、タンパク質を産生する宿主の変異またはＰＣＲ増幅によるエラーなどによる偶発的なものである場合もある。
【００２２】
本明細書で使用される「融合分子」とは、自然界では一緒に発生せず、共有結合または非共有結合して新しい分子を形成する２つ以上の異なる分子から構成される分子を指す。例えば、融合分子は、ポリペプチド及びＰＥＧなどのポリマー、または２つの異なるポリペプチドから構成され得る。「融合タンパク質」とは、自然界では単一の分子には存在しない２つ以上のポリペプチドから構成される融合分子を指す。
【００２３】
「ＣＤ８０細胞外ドメイン」または「ＣＤ８０  ＥＣＤ」とは、ＣＤ８０の細胞外ドメインポリペプチドを指し、これには、その天然のバリアント及び操作されたバリアントを含む。ＣＤ８０  ＥＣＤは、例えば、配列番号１または２に示されるアミノ酸配列のセットを含んでもよいし、それらから本質的になってもよいし、またはそれらからなってもよい。「ＣＤ８０  ＥＣＤ融合分子」とは、ＣＤ８０  ＥＣＤ及び融合パートナーを含む分子を指す。融合パートナーは、例えば、ＣＤ８０  ＥＣＤのＮ末端もしくはＣ末端に、または内部位置に共有結合され得る。「ＣＤ８０  ＥＣＤ融合タンパク質」とは、ＣＤ８０  ＥＣＤと、ＦｃドメインなどのＣＤ８０  ＥＣＤと自然には会合しない別のポリペプチドとを含むＣＤ８０  ＥＣＤ融合分子である。ＣＤ８０  ＥＣＤ融合タンパク質は、例えば、配列番号４または５に記載のアミノ酸配列を含んでもよいし、本質的にそれからなってもよいし、またはそれからなってもよい。
【００２４】
本明細書で使用される「単離された」という用語は、自然界で通常見られる成分の少なくともいくつかから分離された分子を指す。例えば、ポリペプチドは、それが産生された細胞の成分の少なくともいくつかから分離されている場合、「単離された」と呼ばれる。ポリペプチドが発現後に細胞によって分泌される場合、ポリペプチドを含む上清をそれを産生した細胞から物理的に分離することは、ポリペプチドを「単離する」と見なされる。同様に、ポリヌクレオチドは、それが通常自然に見られる、より大きなポリヌクレオチド（例えば、ゲノムＤＮＡまたはＤＮＡポリヌクレオチドの場合のミトコンドリアＤＮＡなど）の一部ではない場合に、または、例えば、ＲＮＡポリヌクレオチドの場合、それが産生された細胞の成分の少なくともいくつかから分離されている場合に、「単離された」と呼ばれる。したがって、宿主細胞内のベクターに含まれるＤＮＡポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが自然界でそのベクターに見出されない限り、「単離された」と呼ばれ得る。
【００２５】
「対象」及び「患者」という用語は、本明細書では、ヒトを指して相互交換可能に使用される。いくつかの実施形態において、げっ歯類、サル、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、哺乳動物実験動物、哺乳動物家畜、哺乳動物スポーツ動物、及び哺乳動物ペットを含むがこれらに限定されない他の哺乳動物を治療する方法も提供される。
【００２６】
「がん」という用語は、本明細書では、異常に高いレベルの増殖及び成長を示す細胞のグループを指して使用される。がんは、固形腫瘍、例えば、結腸直腸癌、乳癌、胃癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、黒色腫、頭頸部の扁平上皮癌、卵巣癌、膵臓癌、腎細胞癌、肝細胞癌、膀胱癌、または子宮内膜癌であり得る。
【００２７】
「治療（処置）すること」、「治療（処置）」、及び「治療（処置）すること」のような用語は、病的状態または障害の症状を治癒させ、減速させ、軽減するか、及び／またはその進行を止める治療手段を指す。したがって、治療を必要とするものとしては、すでにその障害があると診断されるか、またはその疑いがあるものが挙げられる。特定の実施形態では、患者が以下：がん細胞の数の減少または完全な非存在；腫瘍サイズの低下；例えば、軟組織及び骨へのがんの広がりを含む、末梢器官へのがん細胞浸潤の阻害または非存在；腫瘍転移の阻害または非存在；腫瘍増殖の阻害または非存在；特定のがんに関連する１つ以上の症状の緩和；罹患率と死亡率の低下；生活の質の改善；腫瘍の腫瘍形成性、腫瘍形成頻度、または腫瘍形成能の低下；腫瘍におけるがん幹細胞の数または頻度の低下；腫瘍原性細胞の非腫瘍原性状態への分化；増加した無増悪生存期間（ＰＦＳ）、無病生存期間（ＤＦＳ）、全生存期間（ＯＳ）、完全奏効（ＣＲ）、部分奏効（ＰＲ）、安定した疾患（ＳＤ）、進行性疾患（ＰＤ）の減少、進行時間の短縮（ＴＴＰ）、またはその任意の組み合わせの１つ以上を示す場合、その対象は、本発明の方法に従ってがんについて首尾よく「治療」されている。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「投与する」、「投与すること」、「投与」等の用語は、生物作用の所望の部位への薬物、例えば、抗ＣＤ８０  ＥＣＤ融合タンパク質の送達を可能にするのに使用され得る方法（例えば、静脈内投与）を指す。本明細書に記載されている作用剤及び方法とともに採用され得る投与技術は、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ及びＧｉｌｍａｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｃｕｒｒｅｎｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ；ならびにＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｃｕｒｒｅｎｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．に見出される。
【００２９】
「治療有効量」という用語は、対象において疾患または障害を治療するのに有効な薬物、例えば、ＣＤ８０  ＥＣＤ融合タンパク質の量を指す。がんの場合、治療上有効な量の薬物はがん細胞の数を減らし得；腫瘍のサイズまたは負荷を軽減し得；末梢臓器へのがん細胞の浸潤をある程度阻害し得；腫瘍転移を、ある程度阻害し得；腫瘍の成長を、ある程度阻害し得；がんに関連する症状の１つ以上をある程度緩和し得るか；及び／または無増悪生存期間（ＰＦＳ）、無病生存期間（ＤＦＳ）、全生存期間（ＯＳ）、完全奏効（ＣＲ）、部分奏効（ＰＲ）、場合によっては安定した疾患（ＳＤ）、進行性疾患の減少（ＰＤ）、進行までの時間の短縮（ＴＴＰ）、もしくはそれらの任意の組み合わせのような良好な反応をもたらし得る。
【００３０】
治療剤による治療の文脈で使用される場合の「耐性」または「非反応性」という用語は、その対象が、過去の標準用量の治療剤に対する対象の反応と比較して、または標準用量の治療剤に対する、同様の障害を有する同様の対象の予想される反応と比較して、治療剤の標準用量に対して反応の低下または反応の欠如を示すことを意味する。したがって、いくつかの実施形態では、対象は、以前に治療剤を投与されていなくても治療剤に耐性を示す場合があるか、または対象は、１つ以上の以前の機会に薬剤に応答した後にその治療剤に耐性を発現する場合もある。
【００３１】
「不応性」がんとは、化学療法剤のような抗腫瘍治療ががん患者に投与されているにもかかわらず進行するがんである。
【００３２】
「再発性」がんとは、初期療法に応答した後に、初期の部位または遠位部位で再増殖しているがんである。
【００３３】
「プログラム細胞死タンパク質１」及び「ＰＤ−１」という用語は、ＣＤ２８ファミリーに属する免疫抑制受容体を指す。ＰＤ−１は、生体内（インビボ）で以前に活性化されたＴ細胞に主として発現し、２つのリガンドＰＤ−Ｌ１とＰＤ−Ｌ２に結合する。本明細書で使用されるとき、「ＰＤ−１」という用語は、ヒトＰＤ−１（ｈＰＤ−１）、ｈＰＤ−１の天然に存在するバリアント及びアイソフォーム、ならびにｈＰＤ−１の種ホモログを含む。成熟したｈＰＤ−１配列を、配列番号６として示す。
【００３４】
「プログラム細胞死１リガンド１」及び「ＰＤ−Ｌ１」という用語は、ＰＤ−１に結合した際のＴ細胞の活性化及びサイトカイン分泌を下方調節する、ＰＤ−１の２つの細胞表面糖タンパク質リガンドのうちの一方（他方はＰＤ−Ｌ２）を指す。本明細書で使用されるとき、「ＰＤ−Ｌ１」という用語は、ヒトＰＤ−Ｌ１（ｈＰＤ−Ｌ１）、ｈＰＤ−１の天然に存在するバリアント及びアイソフォーム、ならびにｈＰＤ−Ｌ１の種ホモログを含む。成熟したｈＰＤ−Ｌ１配列を、配列番号７として示す。
【００３５】
「ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト」という用語は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路を破壊する部分を指す。いくつかの実施形態では、アンタゴニストは、ＰＤ−１及び／またはＰＤ−Ｌ１への結合によってＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のシグナル伝達経路を阻害する。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストはＰＤ−Ｌ２にも結合する。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストは、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１及び任意でＰＤ−Ｌ２への結合を遮断する。非限定の例示的なＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストとしては、ＰＤ−１に結合する抗体のようなＰＤ−１アンタゴニスト（例えば、ニボルマブ及びペンブロリズマブ）；ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体のようなＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト（例えば、アテゾリズマブ、デュルバルマブ及びアベルマブ）；ＡＭＰ−２２４のような融合タンパク質；及びＡＵＲ−０１２のようなペプチドが挙げられる。
【００３６】
「血管形成阻害剤」または「抗血管形成剤」とは、血管新生、脈管形成、または望まれない血管透過性を、直接的または間接的のいずれかで阻害する、低分子量物質、ポリヌクレオチド、（例としては、例えば、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡ））、ポリペプチド、単離されたタンパク質、組み換えタンパク質、抗体、またはこれらの抱合体もしくは融合タンパク質などの因子を指す。抗血管新生剤としては、血管新生因子またはその受容体に結合しその血管新生活性を遮断する薬剤が含まれることを理解すべきである。例えば、抗血管新生剤は、血管新生剤に対する抗体または他のアンタゴニスト、例えば、ＶＥＧＦ−Ａ（例えば、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））に対する抗体、またはＶＥＧＦ−Ａ受容体（例えば、ＫＤＲ受容体またはＦＬＴ−１受容体）に対する抗体、抗ＰＤＧＦＲ阻害剤、例えばグリベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）（登録商標）（メシル酸イマチニブ）、ＶＥＧＦ受容体シグナル伝達を遮断する低分子（例えば、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２８４、ＳＵ６６６８、Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）／ＳＵ１１２４８（リンゴ酸スニチニブ）、ＡＭＧ７０６、または、例えば、国際特許出願ＷＯ２００４／１１３３０４）に記載のもの）である。抗血管新生剤はまた、例えば、アンギオスタチン、エンドスタチンなどの天然の血管新生阻害剤を含む。例えば、Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ  ａｎｄ  Ｄ’Ａｍｏｒｅ（１９９１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ５３：２１７−３９；Ｓｔｒｅｉｔ  ａｎｄ  Ｄｅｔｍａｒ（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：３１７２−３１７９（例えば、Ｔａｂｌｅ  ３  ｌｉｓｔｉｎｇ  ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ（悪性黒色腫における抗血管新生療法を列挙する表３））；Ｆｅｒｒａｒａ＆Ａｌｉｔａｌｏ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５（１２）：１３５９−１３６４；Ｔｏｎｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：６５４９−６５５６（例えば、Ｔａｂｌｅ  ２  ｌｉｓｔｉｎｇ  ｋｎｏｗｎ  ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ（公知の抗血管新生因子を列挙する表２））；Ｓａｔｏ（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．８：２００−２０６（例えば、Ｔａｂｌｅ  １  ｌｉｓｔｉｎｇ  ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ａｇｅｎｔｓ  ｕｓｅｄ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ（臨床試験で使用された抗血管新生剤を列挙する表１））、及びＪａｙｓｏｎ（２０１６）Ｌａｎｃｅｔ  ３３８（１００４３）：５１８−５２９を参照のこと。
【００３７】
「医薬組成物」という用語は、有効成分の生物学的活性が有効になることを可能にするような形態であり、かつその製剤が投与される対象に許容できない程度に毒性であるさらなる成分を含有しない調製物を指す。製剤は無菌であり得る。医薬組成物は、「医薬担体」を含んでもよく、これは、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、かつこの製剤の他の成分と適合性である担体を指す。薬学的に許容される担体は、使用される製剤に適切である。例えば、治療剤が静脈内投与される場合、担体は理想的には皮膚に過敏性ではなく、注射部位反応を引き起こさない。
【００３８】
本明細書で使用されるとき、「約」及び「およそ」という用語は、数値または数値範囲を変更するために使用される場合、その値または範囲の５％〜１０％を上回る及び５％〜１０％を下回る逸脱は、その言及された値または範囲の意図された意味の範囲内にとどまることを示す。
【００３９】
本明細書で提供される任意の組成物または方法は、本明細書で提供される任意の他の組成物及び方法のうち１つ以上と組み合わせてもよい。
【００４０】
２．ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質
ＣＤ８０  ＥＣＤ及びＦｃドメインを含むＣＤ８０  ＥＣＤ融合タンパク質（「ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質」）を投与する方法が本明細書に提供される。
【００４１】
ＣＤ８０  ＥＣＤは、例えば、ヒトＣＤ８０  ＥＣＤであってもよい。特定の態様では、ヒトＣＤ８０  ＥＣＤは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【００４２】
Ｆｃドメインは、ＩｇＧのＦｃドメインであってもよい。Ｆｃドメインは、ヒト免疫グロブリンのＦｃドメインであってもよい。特定の態様では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧＦｃドメインである。特定の態様では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインである。特定の態様では、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【００４３】
ＣＤ８０  ＥＣＤ及びＦｃドメインは、ＦｃドメインのＮ末端アミノ酸がＣＤ８０  ＥＣＤのＣ末端アミノ酸の直後に続くように直接連結されてもよい。特定の態様では、ＣＤ８０  ＥＣＤ及びＦｃドメインは、ＣＤ８０  ＥＣＤ及びＦｃドメインの両方をコードするコード配列から単一のポリペプチドとして翻訳される。特定の態様では、Ｆｃドメインは、ＣＤ８０  ＥＣＤポリペプチドのカルボキシ末端に直接融合されている。特定の態様では、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質は、ヒトＣＤ８０  ＥＣＤ及びヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。特定の態様では、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【００４４】
ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質は、その産生方法に応じて、特定のグリコシル化修飾のレベルが異なってもよい。例えば、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質は、異なる量のシアル酸（ＳＡ）残基を持ってもよい。
【００４５】
特定の態様では、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）は、１０〜６０分子のＳＡを含む。特定の態様では、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）は、１５〜６０分子のＳＡを含む。特定の態様では、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）は、１０〜４０分子のＳＡを含む。特定の態様では、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）は、１５〜３０分子のＳＡを含む。特定の態様では、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）は、１５〜２５分子のＳＡを含む。特定の態様では、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）は、２０〜４０分子のＳＡを含む。特定の態様では、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）は、２０〜３０分子のＳＡを含む。特定の態様では、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）は、３０〜４０分子のＳＡを含む。特定の態様では、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０分子のＳＡを含む。特定の態様では、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）は、少なくとも１５分子のＳＡを含む。特定の態様では、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）は、少なくとも２０分子のＳＡを含む。特定の態様では、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）は、少なくとも２５分子のＳＡを含む。特定の態様では、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）は、少なくとも３０分子のＳＡを含む。特定の態様では、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）は、少なくとも３５分子のＳＡを含む。特定の態様では、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）は、少なくとも４０分子のＳＡを含む。
【００４６】
３．ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質を含む医薬組成物
【００４７】
本明細書で提供されるのは、生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（１９９０），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）において、例えば、所望の純度を有するＣＤ８０ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質を含む医薬組成物を投与する方法である。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、採用される投与量及び濃度でレシピエントに無毒である。（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ｗｉｔｈ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ：Ｄｒｕｇｆａｃｔｓ  Ｐｌｕｓ，２０ｔｈ  ｅｄ．（２００３）；Ａｎｓｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，７ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００４）；Ｋｉｂｂｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）を参照のこと）。生体内（インビボ）投与に使用される組成物は無菌であり得る。これは、例えば、無菌濾過膜を通じた濾過によって容易に達成される。
【００４８】
特定の態様では、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質を含む医薬組成物（例えば、配列番号５を含む）は、静脈内投与のために処方される。
【００４９】
特定の態様では、医薬組成物は、７０ｍｇのＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）を含む。特定の態様では、医薬組成物は、４２ｍｇのＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）を含む。特定の態様では、医薬組成物は、２１ｍｇのＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）を含む。特定の態様では、医薬組成物は、７ｍｇのＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）を含む。特定の態様では、医薬組成物は、２．１ｍｇのＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）を含む。特定の態様では、医薬組成物は、０．７ｍｇのＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）を含む。特定の態様では、医薬組成物は、０．２１ｍｇのＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）を含む。特定の態様では、医薬組成物は、０．０７ｍｇのＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）を含む。
【００５０】
特定の態様では、医薬組成物は、０．０７〜７０ｍｇのＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）を含む。特定の態様では、医薬組成物は、７〜７０ｍｇのＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）を含む。
【００５１】
特定の態様では、医薬組成物は、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質１モルあたり１０〜６０モルのＳＡを含むＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）を含む。特定の態様では、医薬組成物は、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質１モルあたり１５〜６０モルのＳＡを含むＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）を含む。特定の態様では、医薬組成物は、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質１モルあたり１０〜４０モルのＳＡを含むＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）を含む。特定の態様では、医薬組成物は、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質１モルあたり１５〜３０モルのＳＡを含むＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）を含む。特定の態様では、医薬組成物は、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質１モルあたり１５〜２５モルのＳＡを含むＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）を含む。特定の態様では、医薬組成物は、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質１モルあたり２０〜４０モルのＳＡを含むＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）を含む。特定の態様では、医薬組成物は、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質１モルあたり２０〜３０モルのＳＡを含むＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）を含む。特定の態様では、医薬組成物は、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質１モルあたり３０〜４０モルのＳＡを含むＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）を含む。特定の態様では、医薬組成物は、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質１モルあたり１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０モルのＳＡを含むＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）を含む。特定の態様では、医薬組成物は、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質１モルあたり少なくとも１５モルのＳＡを含むＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）を含む。特定の態様では、医薬組成物は、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質１モルあたり少なくとも２０モルのＳＡを含むＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）を含む。特定の態様では、医薬組成物は、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質１モルあたり少なくとも２５モルのＳＡを含むＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）を含む。特定の態様では、医薬組成物は、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質１モルあたり少なくとも３０モルのＳＡを含むＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）を含む。特定の態様では、医薬組成物は、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質１モルあたり少なくとも３５モルのＳＡを含むＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）を含む。特定の態様では、医薬組成物は、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質１モルあたり少なくとも４０モルのＳＡを含むＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号５を含む）を含む。
４.   ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質の方法及び使用
【００５２】
本明細書に提示されるのは、それを必要とする対象にＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質を投与することを含む、ヒト対象の固形腫瘍を治療するための方法である。ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質は、ヒトＣＤ８０の細胞外ドメイン及びヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含んでもよい。
【００５３】
一態様では、ヒト患者の固形腫瘍を治療する方法は、約７０ｍｇのＣＤ８０  ＥＣＤ融合タンパク質（例えば、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む）を、例えば、３週間に１回、患者に投与することを含む。一態様では、ヒト患者の固形腫瘍を治療する方法は、約４２ｍｇのＣＤ８０  ＥＣＤ融合タンパク質（例えば、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む）を、例えば、３週ごとに１回患者に投与することを含む。一態様では、ヒト患者の固形腫瘍を治療する方法は、約２１ｍｇのＣＤ８０  ＥＣＤ融合タンパク質（例えば、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む）を、例えば、３週ごとに１回患者に投与することを含む。一態様では、ヒト患者の固形腫瘍を治療する方法は、約７ｍｇのＣＤ８０  ＥＣＤ融合タンパク質（例えば、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む）を、例えば、３週ごとに１回患者に投与することを含む。一態様では、ヒト患者の固形腫瘍を治療する方法は、約２．１ｍｇのＣＤ８０  ＥＣＤ融合タンパク質（例えば、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む）を、例えば、３週ごとに１回患者に投与することを含む。一態様では、ヒト患者の固形腫瘍を治療する方法は、約０．７ｍｇのＣＤ８０  ＥＣＤ融合タンパク質（例えば、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む）を、例えば、３週ごとに１回患者に投与することを含む。一態様では、ヒト患者の固形腫瘍を治療する方法は、約０．２１ｍｇのＣＤ８０  ＥＣＤ融合タンパク質（例えば、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む）を、例えば、３週ごとに１回患者に投与することを含む。一態様では、ヒト患者の固形腫瘍を治療する方法は、約０．０７ｍｇのＣＤ８０  ＥＣＤ融合タンパク質（例えば、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む）を、例えば、３週ごとに１回患者に投与することを含む。
【００５４】
一態様では、ヒト患者の固形腫瘍を治療する方法は、７０ｍｇのＣＤ８０  ＥＣＤ融合タンパク質（例えば、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む）を、例えば、３週間ごとに１回患者に投与することを含む。一態様では、ヒト患者の固形腫瘍を治療する方法は、４２ｍｇのＣＤ８０  ＥＣＤ融合タンパク質（例えば、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む）を、例えば、３週間ごとに１回患者に投与することを含む。一態様では、ヒト患者の固形腫瘍を治療する方法は、２１ｍｇのＣＤ８０  ＥＣＤ融合タンパク質（例えば、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む）を、例えば、３週間ごとに１回患者に投与することを含む。一態様では、ヒト患者の固形腫瘍を治療する方法は、７ｍｇのＣＤ８０  ＥＣＤ融合タンパク質（例えば、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む）を、例えば、３週間ごとに１回患者に投与することを含む。一態様では、ヒト患者の固形腫瘍を治療する方法は、２．１ｍｇのＣＤ８０  ＥＣＤ融合タンパク質（例えば、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む）を、例えば、３週間ごとに１回患者に投与することを含む。一態様では、ヒト患者の固形腫瘍を治療する方法は、０．７ｍｇのＣＤ８０  ＥＣＤ融合タンパク質（例えば、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む）を、例えば、３週間ごとに１回患者に投与することを含む。一態様では、ヒト患者の固形腫瘍を治療する方法は、０．２１ｍｇのＣＤ８０  ＥＣＤ融合タンパク質（例えば、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む）を、例えば、３週間ごとに１回患者に投与することを含む。一態様では、ヒト患者の固形腫瘍を治療する方法は、０．０７ｍｇのＣＤ８０  ＥＣＤ融合タンパク質（例えば、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む）を、例えば、３週間ごとに１回患者に投与することを含む。
【００５５】
一態様では、ヒト患者の固形腫瘍を治療する方法は、約０．０７ｍｇ〜約７０ｍｇのＣＤ８０  ＥＣＤ融合タンパク質（例えば、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む）を、例えば、３週間ごとに１回患者に投与することを含む。一態様では、ヒト患者の固形腫瘍を治療する方法は、約７ｍｇ〜約７０ｍｇのＣＤ８０  ＥＣＤ融合タンパク質（例えば、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む）を、例えば、３週間ごとに１回患者に投与することを含む。
【００５６】
本明細書で提供される方法によれば、ＣＤ８０  ＥＣＤ融合タンパク質（例えば、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む）の１つを静脈内投与してもよい。
【００５７】
本明細書で提供される方法によれば、固形腫瘍は、例えば、進行した固形腫瘍であってもよい。特定の例では、固形腫瘍は原発性中枢神経系腫瘍ではない。
【００５８】
場合によっては、固形腫瘍は腎細胞癌である。
【００５９】
場合によっては、固形腫瘍は黒色腫である。
【００６０】
場合によっては、固形腫瘍は、結腸直腸癌、乳癌、胃癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、黒色腫、頭頸部扁平上皮癌、卵巣癌、膵臓癌、腎細胞癌、肝細胞癌、膀胱癌、または子宮内膜癌である。
【００６１】
本明細書で提供される方法に従って治療される患者は、ＰＤ−１アンタゴニスト及びＰＤ−Ｌ１アンタゴニストから選択される少なくとも１つのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストによる以前の治療を受けていてもよい。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストは、例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、またはアベルマブであり得る。ＰＤ−１／ＰＤＬ−１アンタゴニストは、進行性の設定または転移性の設定で投与されていてもよい。他の場合には、本明細書で提供される方法に従って治療される患者は、ＰＤ−１／ＰＤＬ−１アンタゴニストによる以前の治療を受けていない。
【００６２】
本明細書で提供される方法に従って治療される患者は、抗血管新生剤による以前の治療を受けていてもよい。抗血管新生剤は、例えば、スニチニブ、ソラフェニブ、パゾパニブ、アキシチニブ、チボザニブ、ラムシルマブ、またはベバシズマブであり得る。抗血管新生剤は、進行性の設定または転移性の設定で投与されていてもよい。
【００６３】
本明細書で提供される方法に従って治療される患者、例えば黒色腫を有する患者は、ＢＲＡＦ変異を有し得る。患者はＢＲＡＦ阻害剤による以前の治療を受けていてもよい。ＢＲＡＦ阻害剤は、例えば、ベムラフェニブ及びダブラフェニブであり得る。ＢＲＡＦ阻害剤は、進行性の設定または転移性の設定で投与されていてもよい。
【００６４】
本明細書で提供される方法に従って治療される腫瘍は、手術、化学療法、放射線療法、及びそれらの組み合わせから選択される療法の後に再発性であっても、または進行性であってもよい。
【００６５】
本明細書で提供される方法に従って治療される腫瘍は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、またはアベルマブなどのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストに対して耐性であってもまたは非応答性であってもよい。本明細書で提供される方法に従って治療される腫瘍は、スニチニブ、ソラフェニブ、パゾパニブ、アキシチニブ、チボザニブ、ラムシルマブ、またはベバシズマブなどの抗血管新生剤に対して耐性であってもまたは非応答性であってもよい。本明細書で提供される方法に従って治療される腫瘍は、ベムラフェニブまたはダブラフェニブなどのＢＲＡＦ阻害剤に対して耐性であってもまたは非応答性であってもよい。
【００６６】
本明細書で提供される方法に従って治療される腫瘍は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、またはアベルマブなどのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストに対して不応性であってもよい。本明細書で提供される方法に従って治療される腫瘍は、スニチニブ、ソラフェニブ、パゾパニブ、アキシチニブ、チボザニブ、ラムシルマブ、またはベバシズマブなどの抗血管新生剤に対して不応性であってもよい。本明細書で提供される方法に従って治療される腫瘍は、ベムラフェニブまたはダブラフェニブなどのＢＲＡＦ阻害剤に対して不応性であってもよい。
【００６７】
本明細書で提供される方法に従って治療される腫瘍は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、またはアベルマブなどのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストによる治療後に再発する場合もある。本明細書で提供される方法に従って治療される腫瘍は、スニチニブ、ソラフェニブ、パゾパニブ、アキシチニブ、チボザニブ、ラムシルマブ、またはベバシズマブなどの抗血管新生剤での治療後に再発する場合もある。本明細書で提供される方法に従って治療される腫瘍は、ベムラフェニブまたはダブラフェニブなどのＢＲＡＦ阻害剤による治療後に再発する場合もある。
【００６８】
いくつかの実施形態において、本発明は、固形腫瘍の治療のための医薬として使用するために本明細書に提供されるＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質または医薬組成物に関し、この医薬は、例えば３週間ごとに１回、０．０７ｍｇ〜７０ｍｇ（例えば、０．０７ｍｇ、０．２１ｍｇ、０．７ｍｇ、２．１ｍｇ、７ｍｇ、２１ｍｇ、４２ｍｇ、または７０ｍｇ）のＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合物の投与用である。いくつかの局面において、本発明は、固形腫瘍の治療方法で使用するための、本明細書で提供されるＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質または医薬組成物に関し、ここでＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合物の０．０７ｍｇ〜７０ｍｇ（例えば、０．０７ｍｇ、０．２１ｍｇ、０．７ｍｇ、２．１ｍｇ、７ｍｇ、２１ｍｇ、４２ｍｇ、または７０ｍｇ）が、例えば３週間ごとに１回投与される。
【実施例】
【００６９】
以下に論じられる実施例は、単に本発明の例示となるよう意図されており、決して本発明を限定するものと見なされるべきではない。本実施例は、以下の実験が行われる全ての実験であることも唯一の実験であることも表す意図ではない。使用される数（例えば、量、温度等）に対する正確さを確保するよう努力されているが、いくつかの実験誤差及び偏差が計上されるべきである。別途示されない限り、部は、重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏温度であり、圧力は、大気圧であるか、またはそれに近い。
【００７０】
実施例１：ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合分子のサイトカイン放出効果
方法
タンパク質治療
ヒトＣＤ８０  ＥＣＤ  ＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質（「ＣＤ８０−Ｆｃ」）は、ＲＰＭＩ  １６４０、１００ＩＵペニシリン／１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ｎＭ非必須アミノ酸、５５ｕＭ  ２−メルカプトエタノール及び１０％超低ＩｇＧ胎児ウシ血清を含むＴ細胞増殖培地で磁性プロテインＡビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に結合した。結合反応は、９６ウェル平底組織培養プレートで１ウェルあたり１００μｌの容量で、１ｍｌあたり３００万ビーズのビーズ濃度で実施した。ＣＤ８０−Ｆｃは、１０、１、０．１μｇ／ｍｌの一連の濃度でビーズに結合した。３ｎｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３−ｓｃＦｖを添加して、結合反応の追加セットも実行した。タンパク質をロッキングプラットフォーム上で室温で１時間結合させた後、１００μｌの２０μｇ／ｍｌ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）ＩｇＧ１  Ｆｒｅｅ−Ｆｃ（ＦＰＴ）を各ウェルに添加し、ビーズ上の占有されていないプロテインＡ結合部位をブロックするためにさらに１時間結合させた。次に、完全にロードされブロックされたビーズを、磁気９６ウェルプレートスタンドを使用してＰＢＳで３回洗浄し、未結合のタンパク質を除去した。１×１０６細胞／ｍｌの濃度のヒト汎Ｔ細胞の１００μｌを、その後、乾燥した洗浄ビーズの各ウェルに添加した。各条件を３連で試験した。
【００７１】
細胞
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）密度勾配遠心分離を用いて単離の約１８時間前に健康なドナーから採取したアフェレーシス−富化血液（バフィーコート）から分離した。次に、ヒト汎（Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎ）Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、ＰＢＭＣから汎Ｔ細胞（ｐａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ）を分離した。Ｔ細胞を、８ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２及び１個の細胞あたりヒトＴ細胞アクチベーターダイナビーズ（Ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ）１個のビーズを補充した（上記の）増殖培地中でＴ２２５組織培養フラスコ中に１００万個の細胞／ｍｌの密度で播種した。播種後、細胞に新鮮なＩＬ−２を供給し、２日ごとに新鮮な増殖培地を添加することにより、３０万細胞／ｍｌの濃度に継続的に維持した。細胞を５％ＣＯ２で維持した３７℃のウォータージャケットインキュベーターで保持した。増殖の６日後、磁気チューブスタンドを使用して活性化因子ビーズを除去し、細胞をＩＬ−２を含まない新鮮な増殖培地に１００万細胞／ｍｌの濃度で再浮遊した。２４時間後、細胞をプロテインＡビーズ固定化タンパク質でアッセイした。
【００７２】
サイトカイン測定
可溶性インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）及び腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）レベルは、細胞を製造元の指示に従ってプロテインＡ−ビーズを固定タンパク質で処理してから２４時間後にＨＴＲＦ−ＥＬＩＳＡキット（Ｃｉｓｂｉｏ）を使用して上清で測定した。
【００７３】
結果
ビーズ固定化ＣＤ８０−Ｆｃ単独では、可溶性サイトカイン産生によって測定されるように、有意なヒトＴ細胞活性化を引き起こさなかった（図１ａ及びｃ）。しかし、少量のＯＫＴ３−ｓｃＦｖをＣＤ８０−Ｆｃとともに固定化すると、強力なＣＤ８０依存性ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの放出が観察された（図１ｂ及びｄ）。ここで使用されるＯＫＴ３−ｓｃＦｖの量は、それ自体でＴ細胞刺激を引き起こすには少なすぎたので、共刺激タンパク質としてＣＤ８０の存在を必要とした。したがって、これらの結果、このアッセイで使用されたＣＤ８０−Ｆｃが実際に生物学的に活性であることが確認される。
【００７４】
このアッセイでのＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの放出は、ＣＤ８０−Ｆｃが生物学的に活性であることを示したが、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αなどのサイトカインの過剰放出は有害である場合がある。したがって、ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ治療の潜在的な安全性に対処するために、これらの結果を、Ｔ細胞の「スーパーアゴニスト」であり、過剰で有害なレベルのサイトカイン、例えば、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αをヒト対象で放出することが示されたモノクローナル抗ＣＤ２８抗体であるＴＧＮ１４１２で以前に発表された結果と比較した。
【００７５】
固定化されたＴＧＮ１４１２単独は、ヒトＣＤ８０単独よりもヒトＴ細胞からのサイトカイン放出を誘導するのに有意に強力であるように思われる。Ｆｉｎｄｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ３５２：１−１２（２０１０）、１μｇ／ウェルのＴＧＮ１４１２が強力なＴＮＦα放出（約２，０００  ｐｇ／ｍｌ）を引き起こしたことを報告しており、Ｖｅｓｓｉｌｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４２４：４３−５２（２０１５）は、同量のＴＧＮ１４１２が安定したＩＦＮ−γ、約１０，０００  ｐｇ／ｍｌを生じたことを報告している。同量の固定化ＣＤ８０−Ｆｃは、いずれのサイトカインの有意な放出も引き起こさなかった。これらの結果は、ＣＤ８０−ＦｃがＴＧＮ１４１２と比較してサイトカイン放出の誘発において少なくとも１０００分の１の効力であり、したがってＴＧＮ１４１２よりもヒトにサイトカインストームを誘発するリスクが有意に低いことを示唆している。
実施例２：異なるシアル酸（ＳＡ）含量を有するＦｃドメインを有する生体内（インビボ）のＣＴ２６腫瘍におけるＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ融合分子の効果
【００７６】
インビボ研究は、異なるシアル酸（ＳＡ）含量を有する野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃに融合した三つの異なるロットのＣＤ８０  ＥＣＤの効果を分析するためにＣＴ２６腫瘍中で行った。具体的には、ＣＤ８０  ＥＣＤ−ＦｃのロットＥには、２０ｍｏｌ  ＳＡ／ｍｏｌのタンパク質が含まれ、ロットＤには１５ｍｏｌ  ＳＡ／ｍｏｌのタンパク質が含まれ、ロットＡには５ｍｏｌ    ＳＡ／ｍｏｌのタンパク質が含まれる。
【００７７】
７週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）から購入し、研究開始前の１週間、順化した。マウス結腸直腸癌細胞株ＣＴ２６を、マウス１匹あたり２００μＬあたり１．０×１０６個の細胞で、マウスの右脇腹上で皮下に移植した。接種に先立って、細胞は１０％熱非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地にて３継代を超えずに培養した。細胞は、５％ＣＯ２の加湿された雰囲気で３７℃にて増殖させた。８０〜８５％の集密度に達したら、細胞を回収し、無血清ＲＰＭＩ１６４０及び１ミリリットルあたり５×１０６個の細胞のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の１：１混合物に再浮遊させた。
【００７８】
細胞移植後、週に２回、マウスを腫瘍の増殖についてモニターした。腫瘍の測定については、キャリパーを用いて各腫瘍の長さ及び幅を測定し、容積を式：腫瘍容積（ｍｍ３）＝（幅（ｍｍ）×長さ（ｍｍ２）／２に従って算出した。７日目に、全ての腫瘍を測定し、マウスを無作為に７つの治療群に割り当てた（ｎ＝１つの実験群あたりマウス１０匹）。登録した全ての動物の平均腫瘍容積は９４ｍｍ３であった。最初の群には、２００μｌのＰＢＳ（対照）を尾静脈に静脈内（ｉｖ）注射した。２番目の群には、２０ｍｏｌ  ＳＡ／ｍｏｌのタンパク質（ロットＥ）のＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃを、０．３ｍｇ／ｋｇでｉ．ｖ．（静脈内）投与で注射した。３番目の群には、２０ｍｏｌ  ＳＡ／ｍｏｌのタンパク質（ロットＥ）のＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃを、０．６ｍｇ／ｋｇでｉ．ｖ．投与で注射した。４番目の群には、１５ｍｏｌ  ＳＡ／ｍｏｌのタンパク質（ロットＤ）のＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃを、０．３ｍｇ／ｋｇでｉ．ｖ．投与で注射した。５番目の群には、１５ｍｏｌ  ＳＡ／ｍｏｌのタンパク質（ロットＤ）のＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃを、０．６ｍｇ／ｋｇでｉ．ｖ．投与で注射した。６番目の群には、５ｍｏｌ  ＳＡ／ｍｏｌのタンパク質（ロットＡ）のＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃを、０．３ｍｇ／ｋｇでｉ．ｖ．投与で注射した。７番目の群には、５ｍｏｌ  ＳＡ／ｍｏｌのタンパク質（ロットＡ）のＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃを、０．６ｍｇ／ｋｇでｉ．ｖ．投与で注射した。腫瘍は１０、１４、１６、１８、２２、２４日目に測定した。
【００７９】
０．３または０．６ｍｇ／ｋｇで投与された２０ｍｏｌ  ＳＡ／ｍｏｌのタンパク質（ロットＥ）のＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃによる治療は、対照と比較して腫瘍増殖の９３％及び９８％の阻害をもたらした（Ｐ＜０．００１）。０．３または０．６ｍｇ／ｋｇで投与された１５ｍｏｌ  ＳＡ／ｍｏｌのタンパク質（ロットＤ）のＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃによる治療は、対照と比較して腫瘍増殖の９３％及び９５％の阻害をもたらした（Ｐ＜０．００１）。比較すると、０．３ｍｇ／ｋｇ（１ｍｏｌのタンパク質あたり５ｍｏｌのＳＡ）のＣＤ８０  ＥＣＤ−ＦｃロットＡによる治療は、対照と比較して腫瘍増殖を阻害せず、０．６ｍｇ／ｋｇで投与した場合、７０％の阻害しか誘導しなかった（Ｐ＜０．００１）（図２）。
【００８０】
腫瘍のないマウスの発生率を３７日目に分析した。０．３または０．６ｍｇ／ｋｇで投与された２０ｍｏｌ／ｍｏｌ  ＳＡのＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ（ロットＥ）による治療は、マウスの８／１０（８０％）または１０／１０（１００％）で完全な腫瘍退縮をもたらした。０．３または０．６ｍｇ／ｋｇで投与された１５ｍｏｌ／ｍｏｌ  ＳＡ（ロットＤ）のＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃによる治療は、マウスの９／１０（９０％）で完全な腫瘍退縮をもたらした。比較すると、以下の表１に示すように、０．６ｍｇ／ｋｇで投与されたＣＤ８０  ＥＣＤ−ＦｃロットＡによる治療は、マウスの１／１０（１０％）でしか腫瘍退縮を誘発しなかった。
【表１】
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実施例３：３つの異なる同系腫瘍モデルにおける腫瘍増殖に対するマウスＣＤ８０  ＥＣＤ−マウスＦｃ融合分子の効果
【００８１】
生体内（インビボ）研究は、マウスＩｇＧ２ａ野生型（マウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ）のＦｃドメインに連結されたマウスＣＤ８０の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含むマウス代理を使用して実施された。マウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃの効果を、３つの異なる同系腫瘍モデル（ＣＴ２６結腸癌、ＭＣ３８結腸癌、及びＢ１６黒色腫モデル）で抗ＣＴＬＡ４抗体クローン９Ｄ９（ＩｇＧ２ｂ）の効果と比較した。
ＣＴ２６腫瘍モデル
【００８２】
７週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）から購入し、研究開始前の１週間、順化した。マウス結腸直腸癌細胞株ＣＴ２６を、１．０×１０６個の細胞／２００μＬ／マウスで、マウスの右脇腹上で皮下に移植した。接種に先立って、細胞は１０％熱非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地にて３継代を超えずに培養した。細胞は、５％ＣＯ２の加湿された雰囲気で３７℃にて増殖させた。８０〜８５％の集密度に達したら、細胞を回収し、無血清ＲＰＭＩ１６４０とマトリゲルの１：１混合液に再浮遊させた。
【００８３】
腫瘍の成長について細胞移植後、マウスを週に２回モニターした。腫瘍の測定については、キャリパーを用いて各腫瘍の長さ及び幅を測定し、容積を以下の式：腫瘍容積（ｍｍ３）＝（幅（ｍｍ）×長さ（ｍｍ２）／２に従って算出した。７日目に、全ての腫瘍を測定し、マウスを７つの治療群に無作為に割り当てた（ｎ＝１実験群あたり１５匹のマウス）。登録された全ての動物の平均腫瘍容積は、９６ｍｍ３であった。４、７、及び１１日目にマウスに３回投与した。最初の群には、マウスＩｇＧ２ｂ（ｍＩｇＧ２ｂ）を１０ｍｇ／ｋｇ（対照）のｉ．ｐ．（腹腔内）投与で注射した。２番目の群には、マウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ  ２０ｍｏｌ／ｍｏｌ  ＳＡを０．３ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．投与で注射した。３番目の群には、抗ＣＴＬＡ４抗体クローン９Ｄ９（ＩｇＧ２ｂ）を１．５ｍｇ／ｋｇでｉ．ｐ．（腹腔内）投与で注射した。４番目の群には、抗ＣＴＬＡ４抗体クローン９Ｄ９（ＩｇＧ２ｂ）を１０ｍｇ／ｋｇでｉ．ｐ．（腹腔内）投与で注射した。腫瘍は１０、１３、１７、１９、２１、及び２４日目に測定した。
【００８４】
２１日目（全ての対照がまだ研究中であったとき）、０．３ｍｇ／ｋｇで投与された２０ｍｏｌ／ｍｏｌ  ＳＡのマウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃによる治療は、対照と比較して腫瘍増殖の９０％阻害をもたらした。（Ｐ＜０．００１）。１０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ４抗体による治療は、対照と比較して腫瘍増殖の７５％の阻害をもたらした（Ｐ＜０．００１）。比較すると、１．５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ４抗体での治療は、腫瘍増殖の５３％の阻害しか生じなかった（Ｐ＜０．００１）（図３）。２１日目に、０．３ｍｇ／ｋｇで投与された２０ｍｏｌ／ｍｏｌ  ＳＡのマウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃによる治療の腫瘍増殖への影響は、１．５ｍｇ／ｋｇ（Ｐ＜０．００１）または１０ｍｇ／ｋｇ（Ｐ＝０．００９）で投与された抗ＣＴＬＡ４抗体よりも有意に大きかった。
【００８５】
腫瘍のないマウスの発生率を３７日目に分析した。０．３ｍｇ／ｋｇで投与された２０ｍｏｌ／ｍｏｌ  ＳＡのマウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃによる治療は、マウスのうち７／１５（４７％）で完全な腫瘍退縮をもたらした。１０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ４抗体による治療は、マウスの３／１５（２０％）で完全な腫瘍退縮をもたらした。１．５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ４抗体で治療されたマウスのいずれも完全な腫瘍退縮を示さなかった。
【００８６】
ＭＣ３８腫瘍モデル
７週齢の雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）から購入し、研究開始前の１週間、順化した。マウス結腸直腸癌細胞株ＭＣ３８は、マウス１匹あたり１００μＬあたり０．５×１０６個の細胞でマウスの右脇腹上で皮下に移植した。接種に先立って、細胞を、１０％熱非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地にて３継代を超えずに培養した。細胞は、５％ＣＯ２を含む加湿された雰囲気で３７℃にて増殖させた。８０〜８５％の集密度に達したら、細胞を回収し、無血清ＲＰＭＩ１６４０及びマトリゲルの１：１混合液に再浮遊させた。
【００８７】
腫瘍の増殖について細胞移植後、マウスを週に２回モニターした。腫瘍の測定については、キャリパーを用いて各腫瘍の長さ及び幅を測定し、容積を式：腫瘍容積（ｍｍ３）＝（幅（ｍｍ）×長さ（ｍｍ）２）／２に従って算出した。７日目に、全ての腫瘍を測定し、マウスを無作為に７つの治療群に割り当てた（ｎ＝１つの実験群あたりマウス１５匹）。登録された全ての動物の平均腫瘍容積は、７８ｍｍ３であった。マウスに３回投与した：７、１０、及び１４日目。最初の群には、マウスＩｇＧ２ｂ（ｍＩｇＧ２ｂ）を１０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．（腹腔内）投与で注射した（対照）。２番目の群には、マウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ  ２０ｍｏｌ／ｍｏｌ  ＳＡを、３ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．投与で注射した。３番目の群には、抗ＣＴＬＡ４抗体クローン９Ｄ９（ＩｇＧ２ｂ）を１．５ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．（腹腔内）投与で注射した。４番目の群には、抗ＣＴＬＡ４抗体クローン９Ｄ９（ＩｇＧ２ｂ）を１０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．（腹腔内）投与で注射した。腫瘍は１１、１４、１７、及び１９日目に測定した。
【００８８】
１９日目（全ての対照がまだ研究中であったとき）、３ｍｇ／ｋｇで投与された２０ｍｏｌ／ｍｏｌ  ＳＡのマウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃによる治療は、対照と比較して（Ｐ＜０．００１）腫瘍増殖の７９％阻害をもたらした。さらに、２０ｍｏｌ／ｍｏｌ  ＳＡのマウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃは、抗ＣＴＬＡ４抗体と比較して腫瘍増殖に大きな影響を及ぼした（Ｐ＜０．００１）。１０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ４抗体による治療は、対照と比較して腫瘍増殖を２１％減少させたが（Ｐ＝０．０５）、１．５ｍｇ／ｋｇでは腫瘍サイズに有意な影響を与えなかった（図４）。２１日目に、腫瘍増殖に対する３ｍｇ／ｋｇで投与された２０ｍｏｌ／ｍｏｌ  ＳＡのマウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃによる治療の影響は、１．５ｍｇ／ｋｇ（Ｐ＜０．００１）または１０ｍｇ／ｋｇ（Ｐ＝０．００９）で投与された抗ＣＴＬＡ４抗体よりも有意に大きかった。
【００８９】
これらの実験には３ｍｇ／ｋｇのＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃを使用したが、ＭＣ３８腫瘍モデルでは０．３ｍｇ／ｋｇの用量のＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃも腫瘍細胞の増殖を軽減した。
【００９０】
Ｂ１６腫瘍モデル
７週齢の雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）から購入し、研究開始前の１週間、順化した。このマウス黒色腫細胞株Ｂ１６−Ｆ１０をマウス１匹あたり１００μＬあたり０．５×１０６個の細胞でマウスの右側腹部に皮下移植した。接種に先立って、細胞は１０％熱非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ培地にて３継代を超えずに培養した。細胞は、５％ＣＯ２を含む加湿された雰囲気で３７℃にて増殖させた。８０〜８５％の集密度に達したら、細胞を回収し、無血清ＤＭＥＭ及びマトリゲルの１：１混合液に再浮遊させた。
【００９１】
腫瘍の成長について細胞移植後、マウスを週に２回モニターした。腫瘍の測定については、キャリパーを用いて各腫瘍の長さ及び幅を測定し、容積を式：腫瘍容積（ｍｍ３）＝（幅（ｍｍ）×長さ（ｍｍ））２／２に従って算出した。７日目に、全ての腫瘍を測定し、マウスを無作為に７つの治療群に割り当てた（ｎ＝１つの実験群あたりマウス１５匹）。登録された全ての動物の平均腫瘍容積は、７０ｍｍ３であった。マウスに３回投与した：３、６及び１０日目。最初の群には、１０ｍｇ／ｋｇ（対照）のｉ．ｐ．（腹腔内）投与でマウスＩｇＧ２ｂ（ｍＩｇＧ２ｂ）を注射した。２番目の群には、３ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．（静脈内）投与でマウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ  ２０ｍｏｌ／ｍｏｌ  ＳＡを注射した。３番目の群には、１．５ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．投与で抗ＣＴＬＡ４抗体クローン９Ｄ９（ＩｇＧ２ｂ）を注射した。４番目の群には、１０ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．投与で抗ＣＴＬＡ４抗体クローン９Ｄ９（ＩｇＧ２ｂ）を注射した。腫瘍は１０、１３、１５、１６、１７日目に測定された。
【００９２】
１３日目（全ての対照がまだ研究中であったとき）に、３ｍｇ／ｋｇで投与された２０ｍｏｌ／ｍｏｌ  ＳＡのマウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃによる治療は、対照と比較して（Ｐ＜０．００１）腫瘍増殖の４１％阻害をもたらした。１０ｍｇ／ｋｇまたは１．５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ４抗体による治療は、対照と比較して腫瘍増殖に有意な影響を与えなかった（図５）。
【００９３】
実施例４：ＣＤ８０及びＰＤ−Ｌ１の相互作用
ＣＤ８０は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、及びＰＤ−Ｌ１の３つの結合パートナーと相互作用することが報告されている。結合研究を実施して、配列番号５のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ８０  ＥＣＤ：ヒトＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質（すなわち、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃ）の関連する結合パートナーを決定した。これらの研究では、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、及びフローサイトメトリーを使用した。
【００９４】
ＳＰＲ研究によって、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１ＦｃがＣＴＬＡ−４に対して最も高い親和性（１．８  ｎＭ）、ＰＤ−Ｌ１に対して中程度の親和性（１８３  ｎＭ）、及びＣＤ２８に対して低い親和性（＞１μＭ）を有することが実証された。ＣＤ２８に対するｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃの低い親和性は、文献の報告と一致している。（Ｇｒｅｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７１：２６７６２−２６７７１（１９９６）及びＣｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １７：２０１−２０１（２００２）．を参照のこと）。
【００９５】
ＥＬＩＳＡ研究の結果によってまた、ＣＴＬＡ−４に対するｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃの強い親和性も裏付けており、フローサイトメトリー研究では、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃが細胞表面ＣＴＬＡ−４及びＣＤ２８と係合しているが、ＰＤ−Ｌ１とは係合していないことが示された。ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃ結合を、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）で試験した場合、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃは主に濃度依存的にＴ細胞サブセットに結合した。強力な結合はまた、インビトロで活性化された従来のＣＤ４＋Ｔ細胞及びＴｒｅｇでも実証された。Ｔ細胞へのＨＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃの結合は、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４を介して媒介された。無細胞ＳＰＲ研究とは対照的に、細胞表面ＰＤ−Ｌ１への結合は実証され得なかった。
【００９６】
したがって、ＣＤ８０とＰＤ−Ｌ１との相互作用の生物学的重要性は明らかではない。
【００９７】
実施例５：非臨床での薬物動態
ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃの薬物動態（ＰＫ）及びトキシコキネティクス（ＴＫ）を、マウス、ラット、及びカニクイザルで検討した。これらの研究には、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃの用量を０．０３ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇまで試験したマウスでの１回の単回投与ＰＫ研究と、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃの用量を１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまで試験したラット及びカニクイザルでの４週ごとの投与による２回の反復投与研究とを含んだ。４回の反復投与研究のうち、ラットで１回のＰＫ研究、カニクイザルで１回のパイロット毒性研究、及び各種で１回のＧｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＬＰ）毒性研究があった。全ての研究において、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃは静脈内（ＩＶ）投与によって投与された。
【００９８】
マウスでの０．０３〜３ｍｇ／ｋｇの範囲の単回ＩＶ投与後、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃの最大観察血清濃度（Ｃｍａｘ）は、０．０３ｍｇ／ｋｇから０．９ｍｇ／ｋｇへの比例用量、及び０．９ｍｇ／ｋｇから３ｍｇ／ｋｇへの比例用量よりも増大した。血清中濃度下面積（ＡＵＣ）−０日目から４日目までの時間曲線は、０．０３ｍｇ／ｋｇから３ｍｇ／ｋｇに用量比例的に増大し、推定クリアランスは１８．０〜２６．３ｍＬ／日／ｋｇで、終末半減期は１〜２日であった。ラットまたはカニクイザルにおける４週間の毎週の反復投与研究では、Ｃｍａｘと０日目から７日目までのＡＵＣ時間曲線の両方が、１回目と４回目の投与後１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの用量範囲の用量レベルにほぼ比例して増大した。推定終末半減期は４〜６日であった。４週間の用量投与後、蓄積はほとんどまたはまったくなかった。抗薬物抗体（ＡＤＡ）は、大多数のラットに存在していた（ＰＫ研究及びＧＬＰ毒性研究ではそれぞれ１１／１６及び２３／２４）。それぞれパイロット毒性研究及びＧＬＰ毒性研究でｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃで治療されたカニクイザル１２匹中７匹及び３０匹中２匹がＡＤＡ陽性であった。ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃの血清濃度に対するＡＤＡの影響を観察したところ、ＡＤＡ陽性動物で大きく変動していた。
【００９９】
要約すると、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃは、マウスで０．０３ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ、ラット及びカニクイザルで１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの用量範囲で線形クリアランスを示す。ＨＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃは、動物の一般的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）よりもクリアランスが速く、半減期が短くなっている。動物におけるｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１ＦｃのＰＫ特性によって、ヒトへのＩＶ注入が支持される。
【０１００】
実施例６：毒物学
毒性研究は、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃでも実施した。これらの研究には、カニクイザルでのパイロット反復投与毒性研究、ならびにラット及びカニクイザルでのＧＬＰ反復投与毒性研究を可能にする治験新薬（ＩＮＤ）申請が含まれる。
【０１０１】
ラットでの反復投与ＧＬＰ毒性研究では、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃを、４回の毎週投与の間、０（ビヒクル）、１、１０、または１００ｍｇ／ｋｇ／用量の用量レベルで投与した。最終投与後の７週間の回復期間中に毒性の可逆性を評価した。
【０１０２】
ＨＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃは、１００ｍｇ／ｋｇまでのラットで臨床的に十分に耐容された。１００ｍｇ／ｋｇの用量では、好中球、リンパ球、単球の増加；赤血球（ＲＢＣ）のわずかな減少及び網状赤血球の増加など、血液学的パラメーターの変化が観察された。臨床化学パラメーターの変化は、１００ｍｇ／ｋｇで主に見られ、これには、トリグリセリドの減少、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の増加、アルブミンの減少、及びグロブリンの増加を含み、アルブミン／グロブリン比の関連する低下をともなう。微視的変化が、複数の組織における単核細胞の炎症、リンパ組織の変化、肝臓の変化、ならびに甲状腺及び腎臓の単核細胞の浸潤など、１０及び１００ｍｇ／ｋｇの用量で雄性及び雌性のラットで観察された。単核細胞の炎症は、胃、腸、膵臓、唾液腺、及びハーダー腺で見られ、主に１００ｍｇ／ｋｇで観察され、１０ｍｇ／ｋｇではまれで最小限の所見しか見られなかった。リンパ節、脾臓、腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）でリンパ系細胞性の増加が観察され、主に１００ｍｇ／ｋｇでも観察されたが、１０ｍｇ／ｋｇでは頻度が低く、観察される変化はそれほど大きくなかった。１００ｍｇ／ｋｇで観察された肝変化には、細胞性の増加、肝細胞肥大、髄外造血、単核細胞浸潤、リンパ球／組織球凝集体、及び混合細胞浸潤による壊死が含まれていた。結論として、重要なラット研究で無毒性量（ｎｏ−ｏｂｓｅｒｖｅｄ−ａｄｖｅｒｓｅ−ｅｆｆｅｃｔ  ｌｅｖｅｌ  ）（ＮＯＡＥＬ）は、１００ｍｇ／ｋｇで観察された膵臓、胃腸管、唾液腺、及びハーダー腺でのより重度の単核細胞炎症の治療関連効果に起因して、４回の毎週の用量で１０ｍｇ／ｋｇであると決定された。
【０１０３】
パイロット反復投与毒性研究では、カニクイザルに０（ビヒクル）、１、１０、及び５０ｍｇ／ｋｇというｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃを４回の毎週ＩＶ（静脈内）投与した。用量は全てカニクイザルによって十分に耐容された。免疫表現型分析では、１０ｍｇ／ｋｇ及び５０ｍｇ／ｋｇの用量群でｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃ関連の用量依存的な増殖及び中央記憶Ｔ細胞の増殖が示されたが、１ｍｇ／ｋｇ群では示されなかった。組織病理学的には、終末壊死時に、肝臓で単核細胞浸潤の数の増加が見られ、脾臓及び腸間膜リンパ節で濾胞性肥大が見られ、骨髄の細胞性の増加が全ての用量レベルで見られた。これらの知見は、６週間の回復期間後に解決した。
【０１０４】
カニクイザルでの反復投与ＧＬＰ毒性研究では、ｈＣＤ８０ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃタンパク質を、０（ビヒクル）、１、１０、及び１００ｍｇ／ｋｇ／投与の用量レベルで４回の毎週投与で投与した。最終用量の投与後の６週間の回復期間中に毒性の可逆性を評価した。
【０１０５】
ＨＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃは十分に耐容され、１ｍｇ／ｋｇで４回の毎週投与した場合、臨床的または病理学的変化は確認されなかったが、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃは１０及び１００ｍｇ／ｋｇの用量では耐容されず、研究１４日目から３０日目までの間に、それぞれ６／１０及び４／１０の動物の予定外の犠牲及び剖検を必要とした。
【０１０６】
罹患した動物は、体重減少と無気力を示し、脱水症状と一致する兆候があり、触ると冷たかった。一部のサルは散発性の下痢を患っていた。安楽死の数日前に有意な体重減少が観察された。罹患した動物は、低ナトリウム血症、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、及びクレアチニン上昇、ならびに急性期反応の兆候（フィブリノーゲンの増加、グロブリンの増加、Ｃ反応性タンパク質［ＣＲＰ］の増加、及びアルブミンの減少）など、電解質の有意な不均衡を示した。アルドステロン及びコルチゾールのレベルが増加し、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）が減少した。血液学的分析は、５匹の動物で網状赤血球の深刻な減少を示した。凝固の変化は観察されなかった。予定外の安楽死の日の血清サイトカイン測定（ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子［ＧＭ−ＣＳＦ］）は、急性ストレス反応の兆候（ＴＮＦ−α及びＩＬ８の増加）を示したが、罹患したサイトカインのパターン及び変化の大きさは、急性サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を示しておらず、すなわち、ＩＬ２でもＩＬ６でも増加はなかった。
【０１０７】
予定外の剖検動物における治療関連の病理学的所見は、主に大腸及びリンパ組織に見られ、腎臓及び副腎に治療関連の顕微鏡的変化をともなった可能性がある。消化管では、粘膜びらん、陰窩拡張、及び／または大腸、特に直腸の固有層における単核細胞の浸潤が観察された。観察されたリンパ系の変化としては、鼠径部、下顎、及び腸間膜のリンパ節のリンパ系細胞性の変化（増加及び減少）が挙げられる。脾臓及び胸腺でリンパ系細胞性の低下が観察された。ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃとの不確かな関係の知見としては、腎臓における尿細管円柱及び石灰化を伴う尿細管拡張の発生率の増大、ならびに副腎における副腎肥大（束状帯）の発生率の増大が含まれていた。
【０１０８】
１０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇ群の生存動物では、予定外の安楽死動物に共通する体重減少及び活動低下の臨床観察も、予定された安楽死に到達した２匹の動物で見られた。散発的な最小から軽度の下痢が見られ、１０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇを投与された動物でより高い発生率が見られた。１０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇの群の臨床化学パラメーターのＨＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃ関連の変化としては、１０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇでのアルブミンの軽度の減少及びグロブリンの軽度の増加が含まれていた。これらの変化には、急性期反応を示唆するフィブリノーゲンの増加を伴っていた。これらの変化は、回復期間の終わりにはベースラインに戻った。臨床化学におけるこれらの変化は、予定された剖検まで生き残った動物では観察されなかった。ＣＲＳ事象と一致する発熱またはサイトカインの増大など、ＣＲＳを示す兆候は観察されなかった。
【０１０９】
眼科検査及び心臓評価では、どの用量レベルでもｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃ関連の変化は見られなかった。予定された剖検では、組織病理学的粘膜侵食及び陰窩拡張が、１００ｍｇ／ｋｇを投与された動物の大腸で見られ、１０ｍｇ／ｋｇを投与された動物では散発的な所見が見られた。また、予定された剖検では、リンパ節でリンパ球細胞性の増加が観察されたのに対し、脾臓及び胸腺ではリンパ球細胞性の減少が観察された。
【０１１０】
全体として、組織病理学的変化は、１０ｍｇ／ｋｇ以上の用量で観察された瀕死状態を説明するほどの大きさではなかった。腸で観察された変化は最小限から軽度であり、罹患した動物の間で下痢は散発的であった。サイトカインレベルの変化のタイミング及び大きさは、急性ＣＲＳと一致せず、ストレス反応とより一致していた。ＢＵＮ及びクレアチニンの上昇と組み合わされた低ナトリウム血症は、腎臓または副腎／下垂体への影響を示している可能性がある。しかし、腎臓と副腎の組織病理学的所見は最小限であり、下垂体では組織病理学的所見は検出されなかった。観察された脱水症は一次腎毒性を示している場合があるが、最小限の組織病理学的腎損傷のみが確認され、安楽死時の尿検査がないせいで解釈は制限される。ＡＣＴＨ、アルドステロン、及びコルチゾールホルモンレベルの変化は、根底にある内分泌障害を示している場合があるが、これらの変化は、水分喪失及び代償性ストレス反応によっても説明され得る。
【０１１１】
要約すると、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃは、ラットで臨床的に十分に耐容され、ラットのＮＯＡＥＬは４週間の用量で１０ｍｇ／ｋｇと見なされる。カニクイザルでは、ＧＬＰ毒性研究に基づいて、１０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇの用量は耐容されなかった。１０ｍｇ／ｋｇの用量のサルの中には、散発性の下痢、脱水症、無気力があり、触ると冷たかったものもあった。静脈内水分補給は一時的に症状を改善するだけであった。びまん性のリンパ球及び単球の浸潤がさまざまな臓器で観察されたが、この毒性の機構は不明である。１ｍｇ／ｋｇの低用量群では臨床的観察も有害所見も見られなかったため、これはＮＯＡＥＬと確定された。０．０７ｍｇ（７０ｋｇのヒトでは０．００１ｍｇ／ｋｇ）の開始用量は、予想される最小生物学的効果レベル（ＭＡＢＥＬ）アプローチ（下記の実施例７を参照のこと）に基づいて計算されており、ＮＯＡＥＬの約１０００分の１である。ＣＴ２６腫瘍モデルでは、０．１ｍｇ／ｋｇの低用量でも有意な抗腫瘍活性が明らかであり、これはラットとサルの両方でＮＯＡＥＬの約１０分の１である。したがって、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃの潜在的な治療域が存在する。
【０１１２】
実施例７：ヒト患者のための用量の選択
ＭＡＢＥＬアプローチに基づく保守的な開始用量、綿密な患者モニタリング、時間差のある登録、及び慎重な用量漸増を設計して、患者へのリスクを限定した。
【０１１３】
ＭＡＢＥＬアプローチを使用したのは、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃが、Ｔ細胞受容体係合後のＴ細胞に対するＣＤ２８の同時刺激、及び内因性ＣＤ８０についての競合からＣＴＬＡ−４を遮断することを含んで２つの主要なＴ細胞レギュレーターまたはモジュレーターを介して機能することが理由である。ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃについては、ＣＴＬＡ−４及びＣＤ２８の両方を介した受容体占有率（ＲＯ）と薬理活性（ＰＡ）の評価を検討した。Ｃｍａｘに基づいて人の線量を予測するために、２８００ｍＬの中央コンパートメントの分布の血漿量及び７０ｋｇの平均患者体重の仮定を使用して、ＲＯ及びＰＡのパーセントを計算した。
【０１１４】
ＣＴＬＡ−４及びＣＤ２８の両方を通じてＲＯ及びＰＡの評価を統合し、０．０７ｍｇの開始用量を選択した。調べたＰＡアッセイの中で、ＣＴＬＡ−４  ＥＬＩＳＡは、生物学的に関連性がありかつ感度が高いと考えられた。このＥＬＩＳＡアッセイを使用すると、５０％ＰＡは、切り捨てられた場合、０．０７ｍｇという予測開始用量につながる。ＣＤ２８活性に関するいくつかのＰＡアッセイを検討した。しかし、これらのアッセイは、生物学的に関連性がないと考えられたか、はるかに高い開始用量が予測された。
【０１１５】
Ｑ３Ｗ投与間隔を選択した。ヒト患者におけるｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃの半減期は、１０日未満であると予測されているが、前臨床の証拠によって、Ｃｔｒｏｕｇｈではなく総曝露が有効性の重要な推進力であり得ることが示唆されている。ＣＤ２８を過剰発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の結合アッセイを使用して、０．０７ｍｇの開始用量がＣＤ２８の名目上の（＜１％）ＰＡを達成すると予測されている。用量漸増コホートを、Ｃｍａｘでの各用量レベルでのＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４の予測ＰＡとともに、以下に要約している（表２）。用量漸増中、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃは、７ｍｇ以上の用量でＣｍａｘでＣＴＬＡ−４の９９％ＰＡを達成すると予測されている。ＫＤ及び観察されたＣｍａｘに基づいて、イピリムマブ、抗ＣＴＬＡ４抗体は、３ｍｇ／ｋｇの臨床的に承認された用量でＣＴＬＡ−４について９９％のＲＯを達成することが予測された。
【表２−１】
2021535083.tif 000003
【表２−２】
2021535083.tif 000004
【０１１６】
したがって、選択されたヒトの用量は、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４の両方を通じてＲＯ及びＰＡを考慮に入れている。ＣＤ２８のＰＡが低い間は、固定の３倍の漸増の増分が提案され、予想されるＣＤ２８活性レベルが高いほど、より保守的な増分（２倍以下）が提案される。
【０１１７】
実施例８：フェーズ１ａの用量漸増及び探索研究
フェーズ１ａ非盲検多施設研究は、ｈＣＤ８０ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃを用いて、進行性固形腫瘍の患者最大７８名で実施される。一部の患者は、１つ以上の用量レベルで登録され得る。この研究の患者は、中枢神経系腫瘍を除いて、進行した固形腫瘍を有する。この患者は、悪性腫瘍のために全ての標準的な治療法に抵抗性であるか、または標準的な治療法が適切ではない患者である。
【０１１８】
（Ａ）研究設計
フェーズ１ａには、用量漸増フェーズ及び用量探索フェーズが含まれる。フェーズ１ａ研究のスキーマを図６に示す。用量漸増フェーズ及び用量探索フェーズの両方で、ｈＣＤ８０ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃは、各２１日サイクルの１日目に３週ごと（Ｑ３Ｗ）の６０分間の静脈内（ＩＶ）注入として投与される。ＨＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃは均一用量として投与される。
【０１１９】
フェーズ１ａの用量漸増には、初期の加速用量設定設計とそれに続いて、フェーズ１ｂの推奨用量（ＲＤ）が決定されるまで、標準３＋３の用量漸増設計が含まれる。最大４８人の患者が用量漸増相に参加する。下の表３に概説されているコホート１つあたりに０．０７ｍｇ〜７０ｍｇの用量を投与し、患者の２回目の投与は最初の投与後少なくとも２１日である。
【０１２０】
免疫腫瘍剤は、免疫媒介性の毒性の遅延と関連しているため、２１日間の用量制限毒性（ＤＬＴ）評価期間中及びそれ以降の両方で観察された毒性を評価する。
【表３−１】
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【表３−２】
2021535083.tif 000006
【０１２１】
フェーズ１ａの用量漸増の間、用量制限毒性（ＤＬＴ）の評価は注入開始時の治療の初日に始まり、２１日間続く。ＤＬＴは、関連するｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃとして次のいずれかとして定義される：（ｉ）絶対好中球数（ＡＮＣ）が、５日を超えて１Ｌあたり１．０×１０９未満、またはグレード３の発熱性好中球減少症（例えば、ＡＮＣが１Ｌあたり１．０×１０９未満で、３８．３℃を超える単一温度、または１時間を超えて３８℃を超える発熱がある）；（ｉｉ）血小板が１Ｌあたり２５×１０９未満であるか、または血小板が１Ｌあたり５０×１０９未満であり、臨床的に重大な出血がある；（ｉｉｉ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ／アラニントランスアミナーゼ（ＡＳＴ／ＡＬＴ）は正常上限（ＵＬＮ）の３倍を超え、同時総ビリルビンはＵＬＮの２倍を超え、肝臓のがんとの関連はない；（ｉｖ）グレード３以上の非血液学的毒性（７日未満続くグレード３の疲労を除く；最適な制吐剤及び／または下痢止め療法を投与されていない患者におけるグレード３の悪心ならびにグレード３−４の嘔吐及び下痢が７２時間未満続く；ホルモン補充によって適切に治療されるグレード３の内分泌障害；及び／または４８時間以内の補充によって修正され得る検査値）；及び／または（ｖ）登録時にグレード１〜２の末梢神経障害を有する患者における頭痛及び末梢神経障害を除く、グレード２の神経学的毒性。
【０１２２】
各用量レベルで少なくとも１人の患者を登録する加速用量設定設計を、用量レベル０．０７、０．２１、０．７及び２．１ｍｇ／ｋｇについて実施する。次の用量レベルへの用量漸増は、少なくとも１人の患者が２１日間のＤＬＴ評価間隔を完了した後に進行する。２１日間の評価間隔中に１人の患者がＤＬＴを経験する場合、標準３＋３用量漸増基準を、そのコホート及びその後の全ての投薬コホートに適用する。少なくとも２人の患者が中等度の有害事象（ＡＥ）を経験する場合（加速用量設定用量レベルで）、標準の３＋３用量漸増基準を、中等度のＡＥが経験された最高用量レベルに適用して、追加の患者を登録する。その後、全ての投与コホートは、標準の３＋３用量漸増基準に従う。中等度のＡＥとは、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃに関連するグレード２以上のＡＥとして定義される。グレード２の臨床検査値は、臨床的続発症を伴わない限り、この目的では中程度のＡＥとは見なされない。
【０１２３】
７．０ｍｇ未満の用量レベルで登録された患者では、患者内の用量漸増が許可されるが、ただし以下の条件である：（ｉ）患者がＤＬＴを経験しなかった；（ｉｉ）他の全てのＡＥが用量漸増前にグレード１以下に回復している；（ｉｉｉ）患者が、２１日ごとに最大１用量レベルまで、及び投与レベルがＤＬＴレビューをクリアした後にだけ用量漸増され得る；ならびに（ｉｖ）患者は７．０ｍｇ用量レベルを超えて用量漸増できない。
【０１２４】
以下の表４に概説されているアルゴリズムは、全ての標準３＋３用量漸増に使用される。
【表４】
2021535083.tif 000007
【０１２５】
フェーズ１ａ用のｈＣＤ８０ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃの最大耐容量（ＭＴＤ）及び／または推奨用量（ＲＤ）は、全体的な安全性、忍容性、薬力学、薬物動態、及び予備的有効性の評価に基づいて特定される。ＭＴＤとは、１／６以下の患者がＤＬＴを報告する用量レベルである。ＲＤは、全ての利用可能な安全性、忍容性、薬物動態、及び薬力学のデータの評価に基づいて特定される。ＲＤは、ＤＬＴ評価期間中及びそれ以降の両方で観察された毒性、ならびにＤＬＴ基準を満たしていない毒性に起因する投薬の減少及び中止を考慮する。したがって、ＲＤは特定されたＭＴＤと同じであってもよいし、または同じでなくてもよい。例えば、ＭＴＤに達していない場合、またはフェーズ１ａの後続の治療サイクルからのデータが安全性プロファイルに関する追加の洞察を提供する場合、ＲＤはＭＴＤより高くはないが、異なる用量であってもよい。
【０１２６】
フェーズ１ａ用量探索コホートには、安全性、薬物動態、薬力学、及び臨床活動をさらに評価するために１つ以上の用量レベルで登録され得る合計で最大３０人の患者を登録する。これらの患者で観察された毒性は、安全性及び忍容性の全体的な評価に貢献し、ＲＤの選択のために情報提供し得る。臨床活性は、安全性、薬物動態、薬力学、及び有効性のデータに基づいて、特定の腫瘍タイプで評価され得る。
【０１２７】
循環中のＩＬ−６、ＴＮＦ、及びＩＦＮγレベルを含むサイトカインレベルをモニターする。
【０１２８】
（Ｂ）対象
フェーズ１ａの合計７８人までの患者を、以下の包括基準及び除外基準に基づいて特定する。
【０１２９】
フェーズ１ａの患者は以下の選択基準の全てを満たす。
●患者は１８歳以上でなければならない。
●組織学的に確認された固形腫瘍（原発性中枢神経系腫瘍を除く）；
●切除不能、局所進行、または転移性であり、かつ全ての標準治療の後に進行した（すなわち難治性）、または標準治療に適さない疾患。
●ＲＥＣＩＳＴ  ｖ１．１によるベースラインでの少なくとも１つの測定可能な病変；以前に照射された領域、または他の局所療法を受けた領域にある腫瘍部位は、病変の進行が証明されていない限り、測定可能とは見なされない。
【０１３０】
フェーズ１ａの患者は、以下の基準のいずれかが当てはまる場合、研究から除外される。
●任意の抗がん療法による治療、または研究治療投与の初回投与前もしくは本研究中の２８日以内もしくは５半減期以下（いずれか短い方）の別の治験薬もしくは生物学的治験への参加。
●フェーズ１ａの用量漸増及び探索コホートに参加している患者の場合：イピリムマブ及びトレメリムマブを含むＣＴＬＡ−４拮抗薬による以前の治療。
●以前に免疫調節療法（免疫アゴニストまたはプログラムされたデスリガンド１（［ＰＤ−Ｌ１］／プログラムされた細胞死タンパク質１［ＰＤ−１］アンタゴニストを含むレジメンを含む）を受けた患者は、以下の全てが適用されない限り登録は許されない：（ａ）以前の免疫療法の永久的な中止につながる薬物関連の毒性を経験してはならず、かつ（ｂ）治療は、研究治療の最初の投与の５半減期または９０日前（いずれか短い方）に投与された。
●以前の治療による進行中の副作用＞米国国立がん研究所の有害事象共通用語基準（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｖｅｎｔｓ）（ＮＣＩ  ＣＴＣＡＥ）グレード１（グレード２の脱毛症または末梢神経障害を除く）。
●以前の生物製剤に対する重度のアレルギー、アナフィラキシー、またはその他の注入関連反応。
【０１３１】
（Ｃ）結果
ＡＥ、重篤なＡＥ、臨床検査異常、及び心電図（ＥＣＧ）異常の発生率を評価したところ、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃが進行性固形腫瘍の患者に安全かつ耐容可能なことが示される。用量制限毒性として定義されるＡＥの発生率、用量制限毒性として定義される臨床検査異常、ならびに薬物動態及び薬力学の全体的な評価を評価して、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃの推奨用量を決定する。
【０１３２】
進行性固形腫瘍患者における薬物動態パラメーター（ＡＵＣ、Ｃｍａｘ、Ｃｔｒｏｕｇｈ、ＣＬ、ｔ１／２、Ｖｓｓ（定常状態での分布容積））を、非コンパートメント分析を用いてｈＣＤ８０ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃの血清濃度−時間のデータから決定する。データが利用可能な場合、用量比例、蓄積率、及び定常状態の達成などの他のパラメータも計算される。ｈＣＤ８０ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃの血清濃度は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法を用いて決定する。
【０１３３】
ｈＣＤ８０ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃに対する曝露に対する進行性固形腫瘍患者の免疫原性（すなわち、ｈＣＤ８０ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃに対する抗薬物抗体免疫応答）の影響は、全ての患者からの総抗ｈＣＤ８０ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃ抗体を測定することによって評価する。
【０１３４】
進行性固形腫瘍ヒト患者におけるｈＣＤ８０ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃの臨床的利益を実証する。腫瘍の評価には、臨床検査と画像診断（例えば、ＲＥＣＩＳＴ  ｖ  １．１による適切な切片厚のコンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンまたは磁気共鳴画像解析（ＭＲＩ））が含まれる。腫瘍を、スクリーニング時、最初の投与から２４週間は６週ごと、次いで１２週ごとに評価し、その後、腫瘍増殖の阻害及び腫瘍退縮（例えば、完全な腫瘍退縮）が示される。最初のＣＲまたはＰＲに気づいたら、確認スキャンを４〜６週間後に実行する必要がある。循環ＩＬ−６、ＴＮＦ、及びＩＦＮγの有意な増大がないことによって、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃがサイトカインストームを引き起こさないことが示されている。
【０１３５】
客観的奏効率（ＯＲＲ）も有効性の尺度として決定される。ＯＲＲは、応答が確認された患者の総数（ＲＥＣＩＳＴ  ｖ．１．１による完全応答（ＣＲ）または部分応答（ＰＲ）のいずれか）を、応答について評価可能な患者の総数で割ったものとして定義される。
【０１３６】
７人の患者をｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃ（０．０７−７ｍｇの範囲の用量）で治療した後、用量制限毒性は観察されなかった。７人の患者の年齢の中央値は５８歳であり、患者の５７％が東部共同腫瘍学グループのパフォーマンスステータス（Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｓｔａｔｕｓ）（ＥＣＯＧ  ＰＳ）が１であった。以前の治療の中央値は４であった（範囲：２−８）。有害事象の共通用語基準（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｖｅｎｔｓ）（ＣＴＣＡＥ）グレード３以上の治療に起因する有害事象（ＴＥＡＥ）で報告されたのは２つだけであった（胆管閉塞、及び新しい中枢神経病変；両方の場合とも疾患進行から）。重篤な有害事象はないか、またはｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃに起因するグレード３以上のＴＥＡＥがあり、複数の患者でｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃに起因する唯一のＴＥＡＥは倦怠感であった（ｎ＝２）。
【０１３７】
実施例９：フェーズ１ｂの用量拡大
フェーズ１ｂ非盲検多施設研究は、ｈＣＤ８０ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃを用いて、進行性固形腫瘍の患者最大１８０名で実施する。
【０１３８】
（Ａ）研究設計
フェーズ１ｂは研究の用量拡大部分である。フェーズ１ｂの研究スキーマを、図６に示す。フェーズ１ｂ用量拡大への登録は、フェーズ１ａにおける最大耐容量（ＭＴＤ）及び／または推奨用量（ＲＤ）の特定後に開始する。
【０１３９】
フェーズ１ｂには、表５に示すように、それぞれ最大３０人の患者の腫瘍特異的コホートが含まれる。以前に抗ＰＤ（Ｌ）１療法に失敗した腎細胞癌または黒色腫の患者を登録する。残りの４つのフェーズ１ｂコホートの追加の腫瘍タイプは、他の免疫療法からの安全性、翻訳、及び安全性の情報と、承認された免疫療法の処方情報の変更に基づいて決定される。
【表５】
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【０１４０】
ＨＣＤ８０ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃは、各２１日サイクルの１日目に３週ごと（Ｑ３Ｗ）に６０分間の静脈内（ＩＶ）投与として投与される。ＨＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃは、均一用量として投与される。
【０１４１】
（Ｂ）対象
最大３０人の患者が各特定のフェーズ１ｂコホートに登録される。
【０１４２】
フェーズ１ｂの患者は以下の選択基準の全てを満たす。
●フェーズ１ａの全ての包含基準。
●コホート１ｂ１の場合−腎細胞癌
〇組織学的または細胞学的に確認された、明細胞成分を伴う進行性または転移性の腎細胞癌；
〇患者は、進行性または転移性の設定で、少なくとも１つの以前の抗血管新生療のレジメン（例えば、スニチニブ、ソラフェニブ、パゾパニブ、アキシチニブ、チボザニブ、またはベバシズマブ）を受けていなければならない。そして
〇患者は、進行または転移の状況で少なくとも１つの抗ＰＤ（Ｌ）１療法（例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、またはアベルマブ）を受けていなければならない。以前のサイトカイン療法（例えば、ＩＬ−２またはＩＦＮ−α）及び抗ＣＴＬＡ４療法（例えば、イピリムマブ）は許可されているが、必須ではない。
●コホート１ｂ２の場合−黒色腫
〇組織学的または細胞学的に切除不能なステージＩＩＩまたはステージＩＶの皮膚黒色腫が確認された患者（これは局所療法には修正できない）。
〇患者は、進行または転移の状況で少なくとも１つの抗ＰＤ（Ｌ）１療法（例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、またはアベルマブ）を受けていなければならない。以前のサイトカイン療法（例えば、ＩＬ−２またはＩＦＮ−α）及び抗ＣＴＬＡ４療法（例えば、イピリムマブ）は許可されているが、必須ではない、そして
〇ＢＲＡＦ変異を有する患者は、進行性または転移性の設定で以前にＢＲＡＦ阻害剤療法（例えば、ベムラフェニブまたはダブラフェニブ）を受けている必要がある。
【０１４３】
患者は、フェーズ１ｂの研究に含まれるためには、フェーズ１ａと同じ除外基準に準拠する必要がある。
【０１４４】
（Ｃ）結果
ＡＥ、重篤なＡＥ、臨床検査異常、及び心電図（ＥＣＧ）異常の発生率を評価して、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃが進行性固形腫瘍の患者に安全かつ耐容可能であることを示す。用量制限毒性として定義されるＡＥの発生率、用量制限毒性として定義される臨床検査異常、ならびに薬物動態及び薬力学の全体的な評価を評価して、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃの推奨用量を決定する。
【０１４５】
進行固形腫瘍患者における薬物動態パラメーター（ＡＵＣ、Ｃｍａｘ、Ｃｔｒｏｕｇｈ、ＣＬ、ｔ１／２、Ｖｓｓ（定常状態での分布量））を、非コンパートメント分析を用いてｈＣＤ８０ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃ血清濃度−時間のデータから決定する。データが利用できる場合は、用量比例、蓄積率、定常状態の達成などの他のパラメータも計算される。ｈＣＤ８０ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃの血清濃度は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法を用いて決定する。
【０１４６】
ｈＣＤ８０ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃ曝露に対する進行性固形腫瘍患者の免疫原性（すなわち、ｈＣＤ８０ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃに対する抗薬物抗体免疫応答）の影響は、全ての患者からの総抗ｈＣＤ８０ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃ抗体を測定することによって評価する。
【０１４７】
進行性固形腫瘍患者におけるｈＣＤ８０ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃの臨床的利益が実証される。腫瘍の評価には、臨床検査と画像診断（例えば、ＲＥＣＩＳＴ  ｖ  １．１による適切な切片厚のコンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンまたは磁気共鳴画像解析（ＭＲＩ））が含まれる。腫瘍を、スクリーニング時、最初の投与から２４週間は６週ごと、次いで１２週ごとに評価し、その後、腫瘍増殖の阻害及び腫瘍退縮（例えば、完全な腫瘍退縮）が示される。最初のＣＲまたはＰＲに気づいたら、確認スキャンを４〜６週間後に実行する必要がある。
【０１４８】
客観的な奏効率（ＯＲＲ）、奏効期間（ＤＯＲ）、無増悪生存期間（ＰＦＳ）、病勢コントロール率（ＤＣＲ）、及び全生存期間（ＯＳ）も有効性の指標として決定される。ＯＲＲは、応答が確認された患者の総数（ＲＥＣＩＳＴ  ｖ．１．１による完全応答（ＣＲ）または部分応答（ＰＲ）のいずれか）を、応答について評価可能な患者の総数で割ったものとして定義される。ＤＯＲは、最初の応答（ＲＥＣＩＳＴ  ｖ１．１によるＣＲまたはＰＲ）からの時間であって、その後確認される、進行性の疾患の発現または何らかの原因による死亡（いずれか最初）までの時間として定義される。ＰＦＳは、患者の最初の投与から、疾患進行または何らかの原因による死亡（いずれか最初）が最初に観察されるまでの時間として定義される。ＤＣＲは、ＲＥＣＩＳＴ  ｖ１．１によるＣＲ、ＰＲ，または安定な病勢のいずれかの応答が確認された患者の総数を、応答について評価可能な患者の総数で割ったものとして定義される。ＯＳは、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃの初回投与から何らかの原因で死亡するまでの時間として定義される。
【０１４９】
実施例１０：マウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃで処理された担癌の及びナイーブなＢＡＬＢ／ｃのマウスにおけるグランザイムＢ及びインターフェロンガンマの遺伝子発現分析。
免疫応答性のＢＡＬＢ／ｃマウスにマウス結腸直腸癌であるＣＴ２６を接種し、腫瘍が約１００ｍｍ３に達したときに、マウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃによる治療を静脈内に施した。マウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃは、マウスＩｇＧ２ａ野生型（ｍＣＤ８０−Ｆｃ）のＦｃドメインに結合したマウスＣＤ８０の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含むマウス代理融合タンパク質である。マウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃは、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、及び０．９ｍｇ／ｋｇの４つの用量レベルで評価した。ナイーブ動物における遺伝子発現の変化を評価するために、非担がんのＢＡＬＢ／ｃマウスに０．９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇｍのＣＤ８０−Ｆｃを投与した。陰性対照として、マウスに０．９ｍｇ／ｋｇ（担癌）または５０ｍｇ／ｋｇ（ナイーブ）のｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照を投与した。投与１１日後のトランスクリプトーム解析のためにサンプルを収集した。腫瘍を切除し、液体窒素で急速冷凍し、血液サンプルをＱｉａｇｅｎ  ＲＮＡｐｒｏｔｅｃｔ動物血液チューブ（１００μｌ）に収集した。ＲＮＡを単離し、標的配列決定ライブラリー（Ｍｏｕｓｅ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙキット、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＭＭ−００９Ｚ）の調製に使用した。腫瘍ライブラリー及び血液ライブラリーは別々に実行した。血液ＤＮＡライブラリーは、感度を高めるために、より高いシーケンシング深度で配列決定した。
【０１５０】
腫瘍及び血液の変化の用量依存性を決定するために、Ｔ細胞活性化の２つのマーカーを評価した。結果を図７に示す。グランザイムＢ（Ｇｚｍｂ）は、腫瘍において用量依存的なアップレギュレーションを示し、ｍＣＤ８０−Ｆｃの２つの最高用量レベルである０．３ｍｇ／ｋｇ及び０．９ｍｇ／ｋｇで有意性に達した。このアップレギュレーションは、同じ用量レベルで担癌動物の血液でも観察され、０．９ｍｇ／ｋｇのｍＣＤ８０−Ｆｃで有意に達した。対照的に、ｍＣＤ８０−Ｆｃ治療は、試験した最高用量レベルである５０ｍｇ／ｋｇを除いて、非担がん動物のＧｚｍｂ発現に影響を与えなかった。インターフェロンガンマ（Ｉｆｎｇ）は、腫瘍と担癌マウスの血液の両方で０．９ｍｇ／ｋｇで有意にアップレギュレートされ、両方のコンパートメントとも０．３ｍｇ／ｋｇで発現が増加する傾向がわずかにあった。マウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ治療は、ナイーブ動物の血液中のＩｆｎｇ発現を５０ｍｇ／ｋｇでアップレギュレートしただけであった。これらのデータによって、ｍＣＤ８０−Ｆｃが腫瘍微小環境で優先的な活性を有すること、１０ｍｇ／ｋｇまでの用量レベルでは非特異的なポリクローナルＴ細胞の活性化が観察されないことが示されている。これらのデータによってまた、ｍＣＤ８０−Ｆｃが提案された臨床用量レベルで担癌動物においてＴ細胞活性化を誘導することが示されている。まとめると、このデータによって、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃが、提案された臨床用量レベルで患者の腫瘍微小環境において比活性を有し、この分子の安全性及び有効性の両方をさらに支持することが示唆されている。
【０１５１】
実施例１１：全血混合リンパ球応答におけるＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ活性
ＨＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃは、個々のドナーの血液Ｔ細胞を刺激するために複数のドナーからプールされ照射されたＰＢＭＣを使用して、初代Ｔ細胞アッセイでインビトロで試験した（Ｂｒｏｍｅｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４７：１−８（２０００）。アロ反応性Ｔ細胞は血液中に高頻度で見られ、照射されたＰＢＭＣの表面に提示されたさまざまなペプチド：ＭＨＣに反応し、これはまた、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃに結合し得、応答するＴの共刺激を媒介し得るＦｃ受容体（ＦｃＲ）も発現する。このフォーマットにより、生理学的に関連する抗原提示細胞（ＡＰＣ）集団を用いたｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃ活性の試験が可能になり、プールされたＰＢＭＣを使用することで、Ｔ細胞応答におけるドナー間のばらつきを減らすことに役立つ。
【０１５２】
ヒト全血サンプルを、個々のドナーからのＰＢＭＣ分離のために処理して、５０００〜６０００ラドで照射した。各ドナーから等しい数のＰＢＭＣを、１×１０６細胞／ｍＬの最終濃度で、ＲＰＭＩ−１０（２ｍＭのＬ−グルタミン、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、１Ｘペニシリン／ストレプトマイシン、２ＭＥ及び１０％ヒト血清を補充したＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  １６４０培地）中にプールした。
【０１５３】
試験条件は、培地中で望ましい最終濃度の４倍で調製し、９６ウェルＵ底組織培養プレートでウェルごとに以下を組み合わせた。
●５０、２５、または１２．５  μＬの照射済みＰＢＭＣ（それぞれ、８、４、及び２ｘ１０５個のＰＢＭＣ）とＲＰＭＩ−１０を合計５０μＬに補充。
●５０μｌの１０００、５００、または２５０μｇ／ｍｌのＦｃ−Ｈｉｎｇｅ対照またはｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃ（最終濃度は２５０、１２５、及び６２．５μｇ／ｍｌ）。
●抗体を含む５０μｌの培地：４０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３２（最終１０μｇ／ｍｌ）、４ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（最終１μｇ／ｍｌ）、４０μｇ／ｍｌ（最終１０μｇ／ｍｌ）の抗ＰＤＬ１、または４０ｕｇ／ｍｌ（最終１０μｇ／ｍｌ）のイピリムマブ；
●血清を含まないＲＰＭＩで希釈した５０μｌの全血（２０μＬの全血を含む３０μＬのＲＰＭＩ、約２ｘ１０４個のＴ細胞を含む）
【０１５４】
プレートを３７℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベートし、上清を除去し、細胞を１０μＭエチンデオキシウリジン（ＥｄＵ）を含むＲＰＭＩ−１０に再浮遊した。各条件のアリコートを収集し、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、１０μｇ／ｍｌ）及び抗ＣＤ２８（ＣＤ２８．２、２μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。細胞をさらに２４時間インキュベートし、ブレフェルジンＡを添加した後、抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激細胞をさらに５時間培養した。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離し、製造元の指示に従って１ｘ  ＰＢＳ中で調製し希釈した１００μＬのＬｉｖｅ／ＤｅａｄＮｅａｒＩＲ生存色素に再浮遊し、次いで４℃で２０分間インキュベートした。遠心分離により細胞をペレット化し、Ｔ細胞の表現型及び機能に関する３つの別々の染色パネルを１００μｌのＦＡＣＳバッファーでサンプルに添加し、４℃で３０分間インキュベートした。次に、細胞をＦｏｘＰ３、細胞内サイトカイン染色、及びＣｌｉｋ−ｉＴＥｄＵで標識した。
【０１５５】
サンプルはＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで取得し、ＦｌｏｗＪｏ、Ｅｘｃｅｌ、及びＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して分析した。簡単に言えば、シングレットイベントは散乱特性を比較することによって識別し、Ｔ細胞は系統−（ＣＤ１４−、ＣＤ１５−、ＣＤ１９−、及びＣＤ５６−）、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞として識別した。いくつかの実験では、活性化の細胞表面マーカーも評価した（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ９５、ＰＤ１）。
【０１５６】
分泌されたサイトカインは、製造元の指示に従って市販のキットを使用した比色ＥＬＩＳＡによってアッセイ上清で測定した。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  ２１０３を使用してアッセイプレートを読み取り、Ｅｘｃｅｌ及びＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してデータを分析した。
【０１５７】
共刺激の非存在下で、２×１０５または８×１０５個のＰＢＭＣで刺激したときに生じるサイトカインは少なかった。さらに、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞はどちらも、追加のシグナル伝達なしに、ＣＤ２５の増殖または活性化誘導性のアップレギュレーションをほとんど示さなかった。培養物に抗ＣＤ２８抗体（クローン２８．２）を補充すると、ＰＢＭＣ刺激因子依存性物質のＴ細胞活性化が増大した。抗ＣＤ２８と組み合わせた少数のＰＢＭＣは、ＣＤ４  Ｔ細胞上のＣＤ２５の発現を増大させただけであったが、多数のＰＢＭＣは、ＥｄＵの取り込み及びＣＤ２５のアップレギュレーションによって特定されるとおり、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γ分泌を増大させ、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の両方の増殖及び活性化を刺激した。
【０１５８】
ＨＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃは、Ｔ細胞によるＩＬ−２及びＩＦＮγの分泌を増強し、この効果は刺激細胞の数に依存していた（図８）。ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃの最大効果は、飽和アゴニスト抗ＣＤ２８で観察された効果よりも高かった。ＨＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃはまた、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の増殖、ならびにＣＤ２５の発現を刺激因子依存性の方式で増大させた（図９）。しかし、２×１０５個のＰＢＭＣで刺激した場合、サイトカインレベルとは異なり、Ｔ細胞増殖の増大は有意であった。ＣＤ２５のＣＤ４Ｔ細胞のアップレギュレーションは、少数及び多数のＰＢＭＣによる刺激後にも観察された。ＨＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃは、全血及び自己照射ＰＢＭＣを利用した対照サンプルから明らかなように、ＴＣＲ刺激がない場合はＴ細胞を活性化しなかった。
【０１５９】
これらのアッセイによって、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃによる増殖、サイトカイン、及び活性化マーカー応答の増強が実証された。この最大応答は、飽和量の従来の抗ＣＤ２８アゴニスト抗体で観察されたものと同等またはそれよりも高かった。この共刺激活性には同種異系のＴＣＲ刺激が必要であり、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１ＦｃにはＴＣＲに依存しないスーパーアゴニスト活性がなかったことを示している。
【０１６０】
追加の実験では、初代ヒト免疫細胞でのｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃの補体活性化を評価した。あるアッセイでは、非活性化のままで（ＣＤ８０リガンド及びＣＤ２８及びＰＤ−Ｌ１のみを発現）または活性化されてＣＤ２８及びＰＤ−Ｌ１に加えてＣＴＬＡ−４の細胞表面発現を誘導するＰＢＭＣを使用して、ヒト免疫細胞結合ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１ＦｃへのＣ１ｑの結合を測定した。有意なｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃ結合にもかかわらず、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１ＦｃとｈＩｇＧ１−Ｆｃ（対照）処理細胞との間でＣ１ｑ結合に有意差は検出されず、これによってＣ１ｑが初代ヒト免疫細胞に結合したときにｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃに特異的に係合しないことが示されている。インビトロで  ｈＣＤ８０ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃ及び補体の存在下で、ＣＤ４＋Ｔ細胞の溶解を、別のアッセイで測定した。非活性化及び活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃで処理し、ヒト血清補体の存在下で培養した。細胞溶解を測定したところ、ｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃは、試験したいずれの濃度でもＣＤ４＋Ｔ細胞死を引き起こさなかった。これらの結果によって、補体依存性細胞毒性ＣＤＣがｈＣＤ８０  ＥＣＤ：ｈＩｇＧ１Ｆｃ活性の機構ではないことが示されている。
実施例１２：ＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃは、２００ｍｍ２の腫瘍において活性である
【０１６１】
ＣＴ２６腫瘍に対するマウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃの活性は、上記の実施例３に示されている。より大きなＣＴ２６腫瘍に対するマウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃの活性も評価した。これらの実験では、腫瘍容積が約２００ｍｍ２（１９５−１９８ｍｍ２）に達した１０日目に治療を開始した。具体的には、１０、１３、及び１７日目に、マウス（各グループでｎ＝１５）に生理食塩水、０．３ｍｇ／ｋｇマウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ、１ｍｇ／ｋｇマウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃ、または３ｍｇ／ｋｇマウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃを投与した。図１０に示されるように、マウスＣＤ８０  ＥＣＤ−Ｆｃの３つの用量全てが、生理食塩水治療群と比較して、ＣＴ２６腫瘍の増殖を有意に阻害した。
＊＊＊
【０１６２】
本発明は、本明細書に記載されている特定の実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際、記載されているものに加えて、本発明の様々な改変が上記の説明及び添付の図面から当業者に明らかとなるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲内に含まれるものとする。
【０１６３】
本明細書で引用されている全ての参考文献（例えば、刊行物または特許または特許出願）は、各個々の参考文献（例えば、刊行物または特許または特許出願）が、あらゆる目的でその全体が参照によって組み込まれるように具体的かつ個別に指示されたかのような同じ程度に、その全体があらゆる目的で参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１６４】
他の実施形態は以下の特許請求の範囲内にある。
【０１６５】
配列表
以下の表は、本明細書で参照されている特定の配列の列挙を示している。
【表６−１】
2021535083.tif 000009
【表６−２】
2021535083.tif 000010
【図１Ａ】
2021535083.tif 000011
【図１Ｂ】
2021535083.tif 000012
【図１Ｃ】
2021535083.tif 000013
【図１Ｄ】
2021535083.tif 000014
【図２】
2021535083.tif 000015
【図３】
2021535083.tif 000016
【図４】
2021535083.tif 000017
【図５】
2021535083.tif 000018
【図６】
2021535083.tif 000019
【図７】
2021535083.tif 000020
【図８】
2021535083.tif 000021
【図９】
2021535083.tif 000022
【図１０】
2021535083.tif 000023
【配列表】
2021535083000001.app
【国際調査報告】
2021535083.tif 000024
2021535083.tif 000025
2021535083.tif 000026
2021535083.tif 000027