(57)【要約】デンプン分枝酵素ＩＩａ（ＳＢＥＩＩａ）及びデンプン分枝酵素ＩＩｂ（ＳＢＥＩＩｂ）をコードしている対立遺伝子にＴＡＬＥヌクレアーゼ誘導突然変異を作製することによるなど、増大したレベルの食物繊維を含む植物（例えば、コムギ属品種）を作製するための材料及び方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物、植物部分又は植物細胞に内在する少なくとも２つのデンプン分枝酵素ＩＩ（ＳＢＥＩＩ）対立遺伝子に欠失若しくは挿入を含むコムギ属植物、植物部分又は植物細胞であって、欠失又は挿入が、レアカッティングエンドヌクレアーゼを使用して作製される、植物、植物部分又は植物細胞。
【請求項２】
ＳＢＥＩＩが、デンプン分枝酵素ＩＩａ（ＳＢＥＩＩａ）である、請求項１に記載の植物、植物部分又は植物細胞。
【請求項３】
ＳＢＥＩＩが、デンプン分枝酵素ＩＩｂ（ＳＢＥＩＩｂ）である、請求項１に記載の植物、植物部分又は植物細胞。
【請求項４】
少なくとも２つのＳＢＥＩＩ対立遺伝子が、１つ又は複数のヌクレオチド塩基対の欠失をそれぞれ含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の植物、植物部分又は植物細胞。
【請求項５】
少なくとも２つのＳＢＥＩＩ対立遺伝子が、植物、植物部分又は植物細胞に内在する１つ又は複数のヌクレオチド塩基対の挿入をそれぞれ含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の植物、植物部分又は植物細胞。
【請求項６】
１つ又は複数のＳＢＥＩＩ対立遺伝子の欠失を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の植物、植物部分又は植物細胞。
【請求項７】
挿入又は欠失が、配列番号１に記載の標的配列、又は配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する標的配列にある、請求項１〜６のいずれか一項に記載の植物、植物部分又は植物細胞。
【請求項８】
レアカッティングエンドヌクレアーゼが、転写活性化因子様エフェクターエンドヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の植物、植物部分又は植物細胞。
【請求項９】
ＴＡＬＥヌクレアーゼが、配列番号１に記載の配列に結合する、請求項８に記載の植物、植物部分又は植物細胞。
【請求項１０】
少なくとも２つのＳＢＥＩＩ対立遺伝子が、ＳＢＥＩＩａ対立遺伝子であり、あらゆる内在性ＳＢＥＩＩａ対立遺伝子が、欠失又は挿入を含む、請求項１、２及び４〜９のいずれか一項に記載の植物、植物部分又は植物細胞。
【請求項１１】
少なくとも２つのＳＢＥＩＩ対立遺伝子が、ＳＢＥＩＩａ対立遺伝子であり、ＳＢＥＩＩａ対立遺伝子が、配列番号１１９１０、１１９１２及び１１９１５に示される配列又は配列番号１１９１０、１１９１３及び１１９１５に示される配列を含む、請求項１、２及び４〜１０のいずれか一項に記載の植物、植物部分又は植物細胞。
【請求項１２】
少なくとも２つのＳＢＥＩＩ対立遺伝子が、ＳＢＥＩＩｂ対立遺伝子であり、あらゆる内在性ＳＢＥＩＩｂ対立遺伝子が、欠失又は挿入を含む、請求項１及び３〜９のいずれか一項に記載の植物、植物部分又は植物細胞。
【請求項１３】
あらゆる内在性ＳＢＥＩＩａ及びＳＢＥＩＩｂ対立遺伝子が、欠失又は挿入を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の植物、植物部分又は植物細胞。
【請求項１４】
少なくとも２つのＳＢＥＩＩ対立遺伝子のそれぞれが、内在性核酸の除去を呈し、どんな外因性核酸も含まない、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の植物、植物部分又は植物細胞。
【請求項１５】
植物部分が、穀物である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の植物、植物部分又は植物細胞。
【請求項１６】
穀物が、製粉した、挽いた、精白した、ローラーでつぶした、粗びきした、湯がいた、又は挽き割りにした穀物である、請求項１５に記載の植物、植物部分又は植物細胞。
【請求項１７】
コムギ属植物、植物部分又は植物細胞が、トリチカム  エスチバム、トリチカム  エチオピクム、トリチカム  アララティクム、トリチカム  ベオチクム、トリチカム  カルシリクム、トリチカム  コンパクタム、トリチカム  ディココイデス、トリチカム  ジコッコン、トリチカム  デュラム、トリチカム  イスパーニカム、トリチカム  カラミシェビイ、トリチカム  マチャ、トリチカム  ミリティナエ、トリチカム  モノコッカム、トリチカム  ポロニクム、トリチカム  スペルタ、トリチカム  スフェロコッカム、トリチカム  チモフェービイ、トリティクムツラニクム、トリチカム  ツルギダム、トリチカム  ウラルツ、トリチカム  バビロビイ又はトリチカム  ズコブスキイ種のものである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の植物、植物部分又は植物細胞。
【請求項１８】
欠失若しくは挿入を欠く対照植物、植物部分又は植物細胞と比較して、増大したレベルの食物繊維を有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の植物、植物部分又は植物細胞。
【請求項１９】
（ａ）機能的ＳＢＥＩＩ対立遺伝子を含むコムギ属植物細胞又は植物部分を内在性ＳＢＥＩＩ対立遺伝子を標的とするレアカッティングエンドヌクレアーゼと接触させるステップと、
（ｂ）少なくとも一部において、レアカッティングエンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性のため少なくとも１つのＳＢＥＩＩ対立遺伝子が欠失又は挿入を含む植物細胞又は植物部分を、植物細胞又は植物部分から選択するステップと、
（ｃ）選択された植物細胞又は植物部分をコムギ属植物へと成長させるステップとを含む方法であって、コムギ属植物が、ＳＢＥＩＩ対立遺伝子が突然変異されていない対照コムギ属植物と比較して増大したレベルの食物繊維を有する、増大したレベルの食物繊維を有するコムギ属植物を生成する方法。
【請求項２０】
レアカッティングエンドヌクレアーゼが、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ又はメガヌクレアーゼである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
コムギ属植物細胞が、プロトプラストである、請求項１９又は請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
接触させるステップが、レアカッティングエンドヌクレアーゼをコードしている核酸でプロトプラストを形質転換するステップを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
核酸が、ｍＲＮＡである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
核酸が、ベクターに含有される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
プロトプラストを培養して、植物系を生成するステップを更に含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
プロトプラストから少なくとも１つのＳＢＥＩＩ対立遺伝子の少なくとも一部を含むゲノムＤＮＡを単離するステップを更に含む、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
コムギ属植物部分が、未成熟胚、胚発生カルス又は胚盤である、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
接触させるステップが、レアカッティングエンドヌクレアーゼをコードしている核酸で未成熟胚、胚発生カルス又は胚盤を形質転換するステップを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
形質転換が、アグロバクテリウム媒介性形質転換又は微粒子銃を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
未成熟胚、胚発生カルス又は胚盤を培養して、植物系を生成するステップを更に含む、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
未成熟胚、胚発生カルス又は胚盤から少なくとも１つのＳＢＥＩＩ対立遺伝子の少なくとも一部を含むゲノムＤＮＡを単離するステップを更に含む、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
欠失又は挿入が、配列番号１に記載の標的配列、又は配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する標的配列にある、請求項１９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
選択された植物細胞又は植物部分が、２つ以上の内在性ＳＢＥＩＩａ対立遺伝子に欠失又は挿入を含む、請求項１９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
２つ以上のＳＢＥＩＩａ対立遺伝子が、配列番号１１９１０、１１９１２及び１１９１５に示される配列、又は配列番号１１９１０、１１９１３及び１１９１５に示される欠失を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
コムギ属植物細胞又は植物部分が、トリチカム  エスチバム、トリチカム  エチオピクム、トリチカム  アララティクム、トリチカム  ベオチクム、トリチカム  カルシリクム、トリチカム  コンパクタム、トリチカム  ディココイデス、トリチカム  ジコッコン、トリチカム  デュラム、トリチカム  イスパーニカム、トリチカム  カラミシェビイ、トリチカム  マチャ、トリチカム  ミリティナエ、トリチカム  モノコッカム、トリチカム  ポロニクム、トリチカム  スペルタ、トリチカム  スフェロコッカム、トリチカム  チモフェービイ、トリティクムツラニクム、トリチカム  ツルギダム、トリチカム  ウラルツ、トリチカム  バビロビイ又はトリチカム  ズコブスキイ種のものである、請求項１９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本文書は、増大したアミロース含有量を含むコムギ品種を生成するための材料及び方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
コムギ（パンコムギ［Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ］）は、一年間の推定生産量７１３，０００，０００トン（国際連合食糧農業機関、２０１０年作物生産データ、オンラインにおいてｆａｏｓｔａｔ．ｆａｏ．ｏｒｇ／ｓｉｔｅ／５６７／ＤｅｓｋｔｏｐＤｅｆａｕｌｔ．ａｓｐｘ？ＰａｇｅＩＤ＝５６７＃ａｎｃｏｒ）で世界的に最も多く生産されている作物の１つである。コムギ穀物を使用して、パン、ケーキ、パスタ並びにビスケット用の小麦粉、及びビールを作る。小麦粉中の主要な栄養成分の１つはデンプンである。コムギデンプンは、α１，４及びα１，６結合によってつながっているグルコースモノマーからなる。得られるポリマーは、２つのクラス：アミロース及びアミロペクチンに分類される。アミロペクチンは、α１，６結合を主に有し、高度に分枝しており、アミロースは、α１，４結合を主に有し、ほとんど分枝していない。アミロース分子は、その比較的直鎖状の構造のため密集しており、不溶性であり、アミロペクチンより消化に耐性である（Ｔｅｔｌｏｗ、Ｓｅｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２１：５〜３２頁、２０１１年）。
【発明の概要】
【０００３】
本文書は、対応するワイルドタイプコムギ品種におけるレベルと比較して、増大したレベルのアミロース、難消化性デンプン及び食物繊維を含むコムギ品種を生成するための材料及び方法を提供する。コムギ穀物内のデンプンは、アミロース約２５％及びアミロペクチン７５％から一般に構成される。その高い分枝構造のため、アミロペクチンは速やかに分解され、グルコースの豊富な供給源となる。他方、アミロースは密集した構造を有し、消化により耐性である。難消化性デンプンの高い食物は、循環へのグルコース流入の率を低下させ、心臓疾患、大腸がん及び糖尿病を含む食事関連の非感染性慢性疾患の危険性を低下させる潜在性を有する（例えば、Ｒｅｇｉｎａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０３：３５４６〜３５５１頁、２００６年；Ｋｅｎｄａｌｌら、Ｊ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔ、８７：７６９〜７７４頁、２００４年；Ｂｒｏｕｎｓら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈ、１３：２５１〜２６１頁、２００２年；及びＢｉｒｄら、Ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ、１：４２３〜４３１頁、２０１０年を参照のこと）。
【０００４】
アミロペクチンにおける分枝形成は、内部α１、４結合を切断し、Ｃ−６ヒドロキシルに還元末端を転移させるデンプン分枝酵素によって触媒される。コムギにおいて、分枝形成は、２つのクラスのデンプン分枝酵素（ＳＢＥ）、ＳＢＥＩ及びＳＢＥＩＩによって調節される。本開示は、増大したレベルのアミロース、難消化性デンプン及び食物繊維を含むコムギ品種が、配列特異的ヌクレアーゼを使用してＳＢＥＩＩ遺伝子及びその対立遺伝子を標的した突然変異又はノックアウトを作製し、それにより生成され得るという発見に少なくとも一部基づく。改変されたコムギ品種は、無改変コムギ品種と比較して増強された栄養価を有し得る。更に、改変されたコムギ品種は、外来ＤＮＡを保有せず、従って規制の負担を減少させることができる。本文書は、配列特異的ヌクレアーゼによって創出される機能喪失ＳＢＥＩＩ突然変異を含むコムギ品種の開発にも少なくとも一部基づく。従って一部の実施形態において、本文書は、植物、植物部分又は植物細胞が突然変異を欠く対照コムギ属植物、植物部分又は植物細胞と比較して、ＳＢＥＩＩ対立遺伝子の発現の減少があるように、植物、植物部分又は植物細胞に内在するＳＢＥＩＩａ及び／若しくはＳＢＥＩＩｂ遺伝子（例えば、少なくとも２つのＳＢＥＩＩ対立遺伝子、少なくとも４つのＳＢＥＩＩ対立遺伝子、少なくとも６つのＳＢＥＩＩ対立遺伝子、少なくとも８つのＳＢＥＩＩ対立遺伝子、又は少なくとも１２個のＳＢＥＩＩ対立遺伝子）由来の少なくとも２つのＳＢＥＩＩ対立遺伝子内に突然変異を有するコムギ属植物、植物部分又は植物細胞を提供する。
【０００５】
第１の態様において、本文書は、植物、植物部分又は植物細胞に内在する少なくとも２つのＳＢＥＩＩ対立遺伝子に欠失若しくは挿入を含むコムギ属植物、植物部分又は植物細胞を特徴とし、欠失又は挿入は、レアカッティングエンドヌクレアーゼを使用して作製された。少なくとも２つのＳＢＥＩＩ対立遺伝子は、ＳＢＥＩＩａ対立遺伝子、ＳＢＥＩＩｂ対立遺伝子又はＳＢＥＩＩａ及びＳＢＥＩＩｂ対立遺伝子を含み得る。少なくとも２つのＳＢＥＩＩ対立遺伝子は、１つ又は複数のヌクレオチド塩基対の欠失をそれぞれ有し得る。少なくとも２つのＳＢＥＩＩ対立遺伝子は、植物、植物部分又は植物細胞に内在する１つ又は複数のヌクレオチド塩基対の挿入をそれぞれ含み得る。植物、植物部分又は植物細胞は、１つ又は複数のＳＢＥＩＩ対立遺伝子の欠失を有し得る。挿入又は欠失は、配列番号１に記載の標的配列、又は配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する標的配列にあり得る。レアカッティングエンドヌクレアーゼは、転写活性化因子様エフェクターエンドヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）であり得る。ＴＡＬＥヌクレアーゼは、配列番号１に記載の配列に結合し得る。一部の場合において、ＳＢＥＩＩ対立遺伝子は、ＳＢＥＩＩａ対立遺伝子であり得、そこではあらゆる内在性ＳＢＥＩＩａ対立遺伝子は、欠失又は挿入を有する。少なくとも２つのＳＢＥＩＩ対立遺伝子が、ＳＢＥＩＩａ対立遺伝子であり得、そこではＳＢＥＩＩａ対立遺伝子は、配列番号１１９１０、１１９１２及び１１９１５に示される配列又は配列番号１１９１０、１１９１３及び１１９１５に示される配列を含む。少なくとも２つのＳＢＥＩＩ対立遺伝子は、ＳＢＥＩＩｂ対立遺伝子であり得、そこではあらゆる内在性ＳＢＥＩＩｂ対立遺伝子は、欠失又は挿入を有する。一部の場合において、あらゆる内在性ＳＢＥＩＩａ及びＳＢＥＩＩｂ対立遺伝子は、欠失又は挿入を有し得る。少なくとも２つのＳＢＥＩＩ対立遺伝子のそれぞれは、どんな外因性核酸も含まず内在性核酸の除去を呈し得る。植物部分は、穀物であり得る。穀物は、製粉した、挽いた、精白した、ローラーでつぶした、粗びきした、湯がいた、又は挽き割りにした穀物であり得る。コムギ属植物、植物部分又は植物細胞は、トリチカム  エスチバム、トリチカム  エチオピクム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｔｈｉｏｐｉｃｕｍ）、トリチカム  アララティクム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｒａｒａｔｉｃｕｍ）、トリチカム  ベオチクム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｂｏｅｏｔｉｃｕｍ）、トリチカム  カルシリクム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｃａｒｔｈｌｉｃｕｍ）、トリチカム  コンパクタム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｃｏｍｐａｃｔｕｍ）、トリチカム  ディココイデス（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｄｉｃｏｃｃｏｉｄｅｓ）、トリチカム  ジコッコン（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｄｉｃｏｃｃｏｎ）、トリチカム  デュラム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｄｕｒｕｍ）、トリチカム  イスパーニクム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｉｓｐａｈａｎｉｃｕｍ）、トリチカム  カラミシェビイ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｋａｒａｍｙｓｃｈｅｖｉｉ）、トリチカム  マチャ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｍａｃｈａ）、トリチカム  ミリティナエ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｍｉｌｉｔｉｎａｅ）、トリチカム  モノコッカム（Ｔｒｉｔｉｃ��ｍ  ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ）、トリチカム  ポロニクム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｐｏｌｏｎｉｃｕｍ）、トリチカム  スペルタ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｓｐｅｌｔａ）、トリチカム  スフェロコッカム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｓｐｈａｅｒｏｃｏｃｃｕｍ）、トリチカム  チモフェービイ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉ）、トリティクムツラニクム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｔｕｒａｎｉｃｕｍ）、トリチカム  ツルギダム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｔｒｕｇｉｄｕｍ）、トリチカム  ウラルツ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｕｒａｒｔｕ）、トリチカム  バビロビイ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｖａｖｉｌｏｖｉｉ）又はトリチカム  ズコブスキイ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｚｈｕｋｏｖｓｋｙｉ）種のものであり得る。植物、植物部分又は植物細胞は、欠失若しくは挿入を欠く対照植物、植物部分又は植物細胞と比較して、増大したレベルの食物繊維を有し得る。
【０００６】
別の態様において、本文書は、増大したレベルの食物繊維を有するコムギ属植物を生成する方法を特徴とし、本方法は、（ａ）機能的ＳＢＥＩＩ対立遺伝子を有するコムギ属植物細胞又は植物部分を内在性ＳＢＥＩＩ対立遺伝子を標的とするレアカッティングエンドヌクレアーゼと接触させるステップと、（ｂ）少なくとも一部において、レアカッティングエンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性のため少なくとも１つのＳＢＥＩＩ対立遺伝子が欠失又は挿入を有する植物細胞又は植物部分を、植物細胞又は植物部分から選択するステップと、（ｃ）選択された植物細胞又は植物部分をコムギ属植物へと成長させるステップとを含み、コムギ属植物は、ＳＢＥＩＩ対立遺伝子が突然変異されていない対照コムギ属植物と比較して増大したレベルの食物繊維を有する。レアカッティングエンドヌクレアーゼは、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ又はメガヌクレアーゼであり得る。コムギ属植物細胞は、プロトプラストであり得る。接触は、レアカッティングエンドヌクレアーゼをコードしている核酸でプロトプラストを形質転換するステップを含み得る。核酸は、ｍＲＮＡであり得、又はベクターに含有され得る。本方法は、プロトプラストを培養して、植物系を生成するステップを更に含み得る。本方法は、プロトプラストから少なくとも１つのＳＢＥＩＩ対立遺伝子の少なくとも一部を含むゲノムＤＮＡを単離するステップを更に含み得る。コムギ属植物部分は、未成熟胚、胚発生カルス又は胚盤であり得る。接触は、レアカッティングエンドヌクレアーゼをコードしている核酸で未成熟胚、胚発生カルス又は胚盤を形質転換するステップを含み得る。形質転換には、アグロバクテリウム媒介性形質転換又は微粒子銃を含み得る。本方法は、未成熟胚、胚発生カルス又は胚盤を培養して、植物系を生成するステップを更に含み得る。本方法は、未成熟胚、胚発生カルス又は胚盤から少なくとも１つのＳＢＥＩＩ対立遺伝子の少なくとも一部を含むゲノムＤＮＡを単離するステップを更に含み得る。欠失又は挿入は、配列番号１に記載の標的配列、又は配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する標的配列にあり得る。選択された植物細胞又は植物部分は、２つ以上の内在性ＳＢＥＩＩａ対立遺伝子中に欠失又は挿入を有し得る。２つ以上のＳＢＥＩＩａ対立遺伝子は、配列番号１１９１０、１１９１２及び１１９１５に示される配列、又は配列番号１１９１０、１１９１３及び１１９１５に示される欠失を含有し得る。コムギ属植物細胞又は植物部分は、トリチカム  エスチバム、トリチカム  エチオピクム、トリチカム  アララティクム、トリチカム  ベオチクム、トリチカム  カルシリクム、トリチカム  コンパクタム、トリチカム  ディココイデス、トリチカム  ジコッコン、トリチカム  デュラム、トリチカム  イスパーニカム、トリチカム  カラミシェビイ、トリチカム  マチャ、トリチカム  ミリティナエ、トリチカム  モノコッカム、トリチカム  ポロニクム、トリチカム  スペルタ、トリチカム  スフェロコッカム、トリチカム  チモフェービイ、トリティクムツラニクム、トリチカム  ツルギダム、トリチカム  ウラルツ、トリチカム  バビロビイ又はトリチカム  ズコブスキイ���のものであり得る。
【０００７】
別の態様において、本文書は、植物、植物部分又は植物細胞は、突然変異を欠く対照コムギ属植物、植物部分又は植物細胞と比較してＳＢＥＩＩの発現の減少があるように、植物、植物部分又は植物細胞に内在する少なくとも２つのＳＢＥＩＩ対立遺伝子中に突然変異を有するコムギ属植物、植物部分又は植物細胞を特徴とする。少なくとも２つのＳＢＥＩＩ対立遺伝子は、ＳＢＥＩＩａ対立遺伝子、ＳＢＥＩＩｂ対立遺伝子又はＳＢＥＩＩａ及びＳＢＥＩＩｂ対立遺伝子であり得る。各突然変異は、植物、植物部分若しくは植物細胞に内在する１つ若しくは複数のヌクレオチド塩基対の欠失又は１つ若しくは複数のヌクレオチド塩基対の挿入であり得る。突然変異は、１つ又は複数のＳＢＥＩＩ対立遺伝子の欠失を含み得る。一部の実施形態において、突然変異は、：１つ又は複数の対立遺伝子の欠失、１つ又は複数の対立遺伝子の逆位、対立遺伝子内の１つ又は複数のヌクレオチドの挿入、対立遺伝子からの１つ又は複数のヌクレオチドの欠失及び対立遺伝子内の１つ又は複数のヌクレオチドの置換のうちの２つ以上の組み合わせを含み得る。突然変異は、配列番号１に記載の標的配列、又は配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する標的配列にあり得る。植物、植物部分又は植物細胞は、レアカッティングエンドヌクレアーゼ（例えば、ＴＡＬＥヌクレアーゼ）を使用して作製され得る。ＴＡＬＥヌクレアーゼは、配列番号１に記載の配列に結合し得る。あらゆる内在性ＳＢＥＩＩａ対立遺伝子は、突然変異され得、一部の場合において、植物、植物部分又は植物細胞のＳＢＥＩＩａの発現は、検出不可能でもよい。あらゆる内在性ＳＢＥＩＩｂ対立遺伝子は、突然変異され得、一部の場合において、植物、植物部分又は植物細胞のＳＢＥＩＩｂの発現は、検出不可能でもよい。一部の実施形態において、あらゆる内在性ＳＢＥＩＩａ及びＳＢＥＩＩｂ対立遺伝子は、突然変異され得、一部の場合において、植物、植物部分又は植物細胞のＳＢＥＩＩａ及びＳＢＥＩＩｂの発現は、検出不可能でもよい。少なくとも２つのＳＢＥＩＩ対立遺伝子のそれぞれは、どんな外因性核酸も含まずに、内在性核酸の除去を呈し得る。コムギ属植物、植物部分又は植物細胞は、トリチカム  エスチバム、トリチカム  エチオピクム、トリチカム  アララティクム、トリチカム  ベオチクム、トリチカム  カルシリクム、トリチカム  コンパクタム、トリチカム  ディココイデス、トリチカム  ジコッコン、トリチカム  デュラム、トリチカム  イスパーニカム、トリチカム  カラミシェビイ、トリチカム  マチャ、トリチカム  ミリティナエ、トリチカム  モノコッカム、トリチカム  ポロニクム、トリチカム  スペルタ、トリチカム  スフェロコッカム、トリチカム  チモフェービイ、トリティクムツラニクム、トリチカム  ツルギダム、トリチカム  ウラルツ、トリチカム  バビロビイ又はトリチカム  ズコブスキイ種のものであり得る。植物、植物部分又は植物細胞は、突然変異を欠く対照植物、植物部分又は植物細胞と比較して、増大したレベルのアミロースを有し得る。
【０００８】
別の態様において、本文書は、増大したレベルのアミロースを有するコムギ属植物を生成する方法を特徴とする。本方法は、（ａ）機能的ＳＢＥＩＩ対立遺伝子を有するコムギ属植物細胞又は植物部分を内在性ＳＢＥＩＩ対立遺伝子を標的とするレアカッティングエンドヌクレアーゼと接触させるステップと、（ｂ）少なくとも一部において、レアカッティングエンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性のため少なくとも１つのＳＢＥＩＩ対立遺伝子が突然変異を有する植物細胞又は植物部分を、植物細胞又は植物部分から選択するステップと、（ｃ）選択された植物細胞又は植物部分をコムギ属植物へと成長させるステップとを含み得、コムギ属植物は、ＳＢＥＩＩ対立遺伝子が突然変異されていない対照コムギ属植物と比較して、増大したレベルのアミロースを有する。レアカッティングエンドヌクレアーゼは、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ又はメガヌクレアーゼであり得る。コムギ属植物細胞は、プロトプラストであり得る。接触は、レアカッティングエンドヌクレアーゼをコードしている核酸でプロトプラストを形質転換するステップを含み得る。核酸は、ｍＲＮＡであり得る。核酸は、ベクターに含有され得る。本方法は、プロトプラストを培養して、植物系を生成するステップと、及び／又はプロトプラストから少なくとも１つのＳＢＥＩＩ対立遺伝子の少なくとも一部を含有するゲノムＤＮＡを単離するステップとを更に含み得る。コムギ属植物部分は、未成熟胚、胚発生カルス又は胚盤であり得る。接触は、レアカッティングエンドヌクレアーゼをコードしている核酸で胚、胚発生カルス又は胚盤を形質転換するステップを含み得る。形質転換には、アグロバクテリウム媒介性形質転換又は微粒子銃があり得る。本方法は、未成熟胚、胚発生カルス又は胚盤を培養して、植物系を生成するステップと、及び／又は未成熟胚、胚発生カルス又は胚盤から少なくとも１つのＳＢＥＩＩ対立遺伝子の少なくとも一部を含有するゲノムＤＮＡを単離するステップとを更に含み得る。突然変異は、配列番号１に記載の標的配列、又は配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する標的配列にあり得る。選択された植物細胞又は植物部分は、２つ以上の内在性ＳＢＥＩＩ対立遺伝子中に突然変異を有し得る。コムギ属植物細胞又は植物部分は、トリチカム  エスチバム、トリチカム  エチオピクム、トリチカム  アララティクム、トリチカム  ベオチクム、トリチカム  カルシリクム、トリチカム  コンパクタム、トリチカム  ディココイデス、トリチカム  ジコッコン、トリチカム  デュラム、トリチカム  イスパーニカム、トリチカム  カラミシェビイ、トリチカム  マチャ、トリチカム  ミリティナエ、トリチカム  モノコッカム、トリチカム  ポロニクム、トリチカム  スペルタ、トリチカム  スフェロコッカム、トリチカム  チモフェービイ、トリティクムツラニクム、トリチカム  ツルギダム、トリチカム  ウラルツ、トリチカム  バビロビイ又はトリチカム  ズコブスキイ種のものであり得る。
【０００９】
別段の規定がない限り、本明細書で使用される技術的及び科学的用語の全ては、本発明が関係する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料と類似又は同等の方法及び材料を使用して本発明を実施できるが、適切な方法及び材料については後述する。本明細書において言及される刊行物、特許出願、特許及び他の参照文献の全ては、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含めて、本明細書が優先されることになる。加えて、材料、方法及び例は、単なる例示であり、限定することを目的としない。
【００１０】
本発明の１つ又は複数の実施形態の詳細が、以下の図面及び説明を付随して示される。本発明の他の特徴、目的及び優位性は、説明及び図面から、並びに請求項から明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Ｔ．エスチバムのヌクレオチド配列のＳＢＥＩＩａ−Ａのエクソン２（配列番号１１８９０）、ＳＢＥＩＩａ−Ａのエクソン３（配列番号１１８９１）、ＳＢＥＩＩａ−Ｂのエクソン２（配列番号１１８９２）、ＳＢＥＩＩａ−Ｂのエクソン３（配列番号１１８９３）、ＳＢＥＩＩａ−Ｄのエクソン２（配列番号１１８９４）及びＳＢＥＩＩａ−Ｄのエクソン３（配列番号１１８９５）を示す図である。
【図２】ＳＢＥＩＩａ遺伝子並びにＴＡＬＥヌクレアーゼ対ＳＢＥＩＩａ＿Ｔ１、ＳＢＥＩＩａ＿Ｔ２及びＳＢＥＩＩａ＿Ｔ３に対する相対的なＴＡＬＥヌクレアーゼ結合部位の実例を示す図である。
【図３】ＴＡＬＥヌクレアーゼ対ＳＢＥＩＩａ＿Ｔ１、ＳＢＥＩＩａ＿Ｔ２及びＳＢＥＩＩａ＿Ｔ３の標的配列を示す図である。特に、標的配列が、ＳＢＥＩＩａ−Ａ遺伝子（配列番号１１８９６）、ＳＢＥＩＩａ−Ｂ遺伝子（配列番号１１８９６）及びＳＢＥＩＩａ−Ｄ遺伝子（配列番号１１８９７）におけるＳＢＥＩＩａ＿Ｔ１；ＳＢＥＩＩａ−Ａ遺伝子（配列番号１１８９８）、ＳＢＥＩＩａ−Ｂ遺伝子（配列番号１１８９９）及びＳＢＥＩＩａ−Ｄ遺伝子（配列番号１１８９９）におけるＳＢＥＩＩａ＿Ｔ２；並びにＳＢＥＩＩａ−Ａ遺伝子（配列番号１１９００）、ＳＢＥＩＩａ−Ｂ遺伝子（配列番号１１９００）及びＳＢＥＩＩａ−Ｄ遺伝子（配列番号１１９０１）におけるＳＢＥＩＩａ＿Ｔ３に対して示される。
【図４】植物Ｔａ１２５−２由来ＳＢＥＩＩａ−Ａ、Ｂ及びＤ遺伝子の突然変異を示す図である。ＳＢＥＩＩａ−Ａ遺伝子は、２ｂｐ挿入（配列番号１１９０９）及び２３ｂｐ欠失（配列番号１１９１０）を有した。ＳＢＥＩＩａ−Ｂ遺伝子は、４ｂｐ欠失（配列番号１１９１２）及び２０ｂｐ欠失（配列番号１１９１３）を有した。ＳＢＥＩＩａ−Ｄ遺伝子は、４ｂｐ欠失（配列番号１１９１５）及び１２ｂｐ欠失（配列番号１１９１６）を有した。
【図５】植物Ｔａ１２８−１由来ＳＢＥＩＩａ−Ｂ及びＤ遺伝子の突然変異を示す図である。ＳＢＥＩＩａ−Ｂ遺伝子は、１ｂｐ挿入（配列番号１１９１７）及び１ｂｐ欠失（配列番号１１９１８）を有した。ＳＢＥＩＩａ−Ｄ遺伝子は、２１ｂｐ欠失（配列番号１１９１９）及び８９０ｂｐ欠失（配列番号１１９２０）を有した。
【図６Ａ】植物Ｔａ１３７−１由来ＳＢＥＩＩａ−Ａ、Ｂ及びＤ遺伝子の突然変異を示す図である。ＳＢＥＩＩａ−Ａ遺伝子は、４ｂｐ欠失（配列番号１１９２１）、７ｂｐ欠失（配列番号１１９２２）、１３ｂｐ欠失（配列番号１１９２３）及び１６７ｂｐ欠失（配列番号１１９２４）を有した。ＳＢＥＩＩａ−Ｂ遺伝子は、１７ｂｐ欠失（配列番号１１９２５）を有した。ＳＢＥＩＩａ−Ｄ遺伝子は、６ｂｐ欠失（配列番号１１９２６）、１０ｂｐ欠失（配列番号１１９２７）、１３ｂｐ欠失（配列番号１１９２８）、１４ｂｐ欠失（配列番号１１９２９）及び１５ｂｐ欠失（配列番号１１９３０）を有した。
【図６Ｂ】植物Ｔａ１３７−１由来ＳＢＥＩＩａ−Ａ、Ｂ及びＤ遺伝子の突然変異を示す図である。ＳＢＥＩＩａ−Ａ遺伝子は、４ｂｐ欠失（配列番号１１９２１）、７ｂｐ欠失（配列番号１１９２２）、１３ｂｐ欠失（配列番号１１９２３）及び１６７ｂｐ欠失（配列番号１１９２４）を有した。ＳＢＥＩＩａ−Ｂ遺伝子は、１７ｂｐ欠失（配列番号１１９２５）を有した。ＳＢＥＩＩａ−Ｄ遺伝子は、６ｂｐ欠失（配列番号１１９２６）、１０ｂｐ欠失（配列番号１１９２７）、１３ｂｐ欠失（配列番号１１９２８）、１４ｂｐ欠失（配列番号１１９２９）及び１５ｂｐ欠失（配列番号１１９３０）を有した。
【図７】植物Ｔａ１３９−１由来ＳＢＥＩＩａ−Ａ、Ｂ及びＤ遺伝子の突然変異を示す図である。ＳＢＥＩＩａ−Ａ遺伝子は、４ｂｐ欠失を有した（配列番号１１９３１）。ＳＢＥＩＩａ−Ｂ遺伝子は、４ｂｐ欠失（配列番号１１９３２）、１０ｂｐ欠失（配列番号１１９３３）及び２２ｂｐ欠失（配列番号１１９３４）を有した。ＳＢＥＩＩａ−Ｄ遺伝子は、１１ｂｐ欠失（配列番号１１９３５）及び１７ｂｐ欠失（配列番号１１９３６）を有した。
【図８】植物Ｔａ１２５−２−１４由来ＳＢＥＩＩａ−Ａ、Ｂ及びＤ遺伝子の突然変異を示す図である。ＳＢＥＩＩａ−Ａ対立遺伝子の両方が、２３ｂｐ欠失を有した（配列番号１１９１０）。ＳＢＥＩＩａ−Ｂ対立遺伝子の両方が、４ｂｐ欠失を有した（配列番号１１９１２）。ＳＢＥＩＩａ−Ｄ対立遺伝子の両方が、１２ｂｐ欠失を有した（配列番号１１９１６）。
【図９】植物Ｔａ１２５−２−４４−１−１ａ（−２３／−２３、−４／−４、−４／−４）由来ＳＢＥＩＩａ−Ａ、Ｂ及びＤ遺伝子の突然変異を示す図である。ＳＢＥＩＩａ−Ａ対立遺伝子の両方が、２３ｂｐ欠失を有した（配列番号１１９１０）。ＳＢＥＩＩａ−Ｂ対立遺伝子の両方が、４ｂｐ欠失を有した（配列番号１１９１２）。ＳＢＥＩＩａ−Ｄ対立遺伝子の両方が、４ｂｐ欠失を有した（配列番号１１９１５）。
【図１０】植物Ｔａ１２５−２−４４−１−２ａ（−２３／−２３、−２０／−２０、−４／−４）由来ＳＢＥＩＩａ−Ａ、Ｂ及びＤ遺伝子の突然変異を示す図である。ＳＢＥＩＩａ−Ａ対立遺伝子の両方が、２３ｂｐ欠失を有した（配列番号１１９１０）。ＳＢＥＩＩａ−Ｂ対立遺伝子の両方が、２０ｂｐ欠失を有した（配列番号１１９１３）。ＳＢＥＩＩａ−Ｄ対立遺伝子の両方が、４ｂｐ欠失を有した（配列番号１１９１５）。
【図１１Ａ】ワイルドタイプと比較して、ＳＢＥＩＩａ対立遺伝子（Ｔａ１２５−２−４４−１−１ａ及びＴａ１２５−２−４４−１−２ａ）内に完全なノックアウト突然変異を持つＴ．エスチバム植物の植物の高さ（図１１Ａ）、穂当たりの種子数（図１１Ｂ）及び発芽効率（図１１Ｃ）をプロットしたグラフである。
【図１１Ｂ】ワイルドタイプと比較して、ＳＢＥＩＩａ対立遺伝子（Ｔａ１２５−２−４４−１−１ａ及びＴａ１２５−２−４４−１−２ａ）内に完全なノックアウト突然変異を持つＴ．エスチバム植物の植物の高さ（図１１Ａ）、穂当たりの種子数（図１１Ｂ）及び発芽効率（図１１Ｃ）をプロットしたグラフである。
【図１１Ｃ】ワイルドタイプと比較して、ＳＢＥＩＩａ対立遺伝子（Ｔａ１２５−２−４４−１−１ａ及びＴａ１２５−２−４４−１−２ａ）内に完全なノックアウト突然変異を持つＴ．エスチバム植物の植物の高さ（図１１Ａ）、穂当たりの種子数（図１１Ｂ）及び発芽効率（図１１Ｃ）をプロットしたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本文書は、対応するワイルドタイプコムギ品種に対して、増大したレベルのアミロース、難消化性デンプン及び食物繊維を含むコムギ品種を生成するための材料及び方法を提供する。コムギデンプンは、アミロース（α１，４結合によってつながっているグルコースの線状鎖）約２５％及びアミロペクチン（α１，６結合によって多くの分枝形成を持つグルコースの線状鎖）７５％で一般に構成される。アミロペクチンは、酵素が結合できる部位を多く提供する、その高い分枝構造のため速やかに分解される。従って、アミロペクチンはグルコースの豊富な供給源である。アミロペクチンにおける分枝形成は、内部α１、４結合を切断し、Ｃ−６ヒドロキシルに還元末端を転移させるデンプン分枝酵素によって触媒される。コムギにおいて、分枝形成は、２つのクラスのデンプン分枝酵素（ＳＢＥ）、ＳＢＥＩ及びＳＢＥＩＩによって調節される。ＳＢＥＩの喪失は、デンプン合成及び組成物に対する効果が最小限なので、ＳＢＥＩＩクラスが、アミロペクチン合成に最も関与する（Ｂｌａｕｔｈら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、４８：２８７〜２９７頁、２００２年）。ＳＢＥＩＩクラスには、２つの遺伝子産物、ＳＢＥＩＩａ及びＳＢＥＩＩｂがあり、それら遺伝子産物は、固有の組織特異的発現パターンを有する。ＳＢＥＩＩｂは、非光合成的貯蔵組織（胚乳）においてのみ発現され、ＳＢＥＩＩａは、偏在的に発現され、コムギ胚乳内でＳＢＥＩＩｂより非常に高いレベルで発現される（Ｂｌａｕｔｈら、Ｐｌａｎｔａ、２２２：８９９〜９０６頁、２００５年）。
【００１３】
コムギにおけるアミロースとアミロペクチンの比は、デンプン合成に関係する酵素の発現プロファイルを改変することによって変更され得る。例えば、ＳＢＥＩＩａノックダウンは、ＲＮＡｉ技術（Ｒｅｇｉｎａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０３：３５４６〜３５５１頁、２００６年；及びＳｅｓｔｉｌｉら、ＢＭＣ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１０：１４４頁、２０１０年）を使用して又はＴＩＬＬＩＮＧ（ゲノム内標的誘導局所損傷法［Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｌｏｃａｌ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｅｓ］；Ｓｌａｄｅら、ＢＭＣ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１２：６９頁、２０１２年；Ｈａｚａｒｄら、Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、５２：１７５４〜１７６６頁、２０１２年）によって達成され得る。そのような技術を使用して、ワイルドタイプ植物における比およそ２５：７５と比較して、およそ４０：６０〜７０：３０の範囲でアミロースとアミロペクチンの比を含有するコムギ品種が生成されてきた。これらの技術は、残存する酵素活性が、最大限の起こり得る表現型変化を妨げ得るような標的遺伝子の不完全なサイレンシング又は不活性化をしばしばもたらす。ＲＮＡｉも、複数世代にわたってＲＮＡ配列を安定して発現するトランスジェニック系の創出を必要とする。
【００１４】
本明細書に記載の通り、配列特異的ヌクレアーゼを使用することにより、アミロース含有量の最大レベルが、完全な遺伝子ノックアウトによって達成され得る。配列特異的ヌクレアーゼを使用してコムギにおいて高アミロースを操作する取り組みは、コムギゲノムの複雑さに関係する難題に立ち向かわねばならない。例えば、パン用コムギゲノムは、３つの異なるゲノム（Ａ、Ｂ及びＤと称される）を持つ異質６倍体であり、ヒトゲノムより５倍大きなサイズの１７Ｇｂｐである。加えて、ゲノムの高いパーセンテージ（８０〜９０％）は、反復配列である。取り組みには、ＳＢＥＩＩａ及びＳＢＥＩＩｂの同一でない３つの同祖対立遺伝子が更に待ち受ける。
【００１５】
本文書は、配列特異的ヌクレアーゼを使用して、コムギのＳＢＥＩＩ対立遺伝子を成功裏に標的とする戦略を提供する。本文書は、増大したレベルのアミロース、難消化性デンプン及び食物繊維を含有するコムギ植物品種（例えば、Ｔ．エスチバム品種）も提供する。そのような植物品種を生成する方法もまた提供される。
【００１６】
本明細書では、用語「植物」及び「植物部分」とは、細胞、組織、器官、穀物及び親植物の鑑別上の特徴を保持している切断部（例えば、根、葉及び花）のことを指す。「穀物」とは、穀物が受精の有無で形成されるかどうかに関係なく、及び穀物構造が稔性か不稔性かに関係なく、正常な成熟点に続く植物の胚珠の連続した分化によって形成される任意の植物構造のことを指す。
【００１７】
用語「対立遺伝子（複数可）」は、特定の座における遺伝子の１つ又は複数の二者択一的な形態のいずれかを意味する。生物の２倍体（又は、複２倍体）細胞において、所与の遺伝子の対立遺伝子は、染色体上の特定の場所又は座に位置し、１つの対立遺伝子は、一対の相同染色体の各染色体上に存在する。同様に、生物の６倍体細胞において、１つの対立遺伝子は、６つの相同染色体の群の各染色体上に存在する。４倍体細胞において、１つの対立遺伝子は、４つの相同染色体の群の各染色体上に存在する。「ヘテロ接合型」対立遺伝子は、特定の座に存在する異なる対立遺伝子であり、対応する相同染色体上で別々に位置する。「ホモ接合」対立遺伝子は、特定の座に存在する同一の対立遺伝子であり、細胞内で対応する相同染色体上で別々に位置する。
【００１８】
本明細書では用語「遺伝子」は、タンパク質をコードするＤＮＡの配列のことを指す。「ＳＢＥＩＩ遺伝子」は、ＳＢＥＩＩａ又はＳＢＥＩＩｂタンパク質をコードするコムギゲノムに内在するＤＮＡの配列である。「ＳＢＥＩＩａ遺伝子」は、ＳＢＥＩＩａタンパク質をコードするコムギゲノムに内在するＤＮＡの配列である。「ＳＢＥＩＩｂ遺伝子」は、ＳＢＥＩＩｂタンパク質をコードするコムギゲノムに内在するＤＮＡ配列である。用語「ＳＢＥＩＩ遺伝子」も、相同染色体上の同じ染色体位置に存在するＳＢＥＩＩ遺伝子の対立遺伝子のことを指す。「ワイルドタイプＳＢＥＩＩ遺伝子」は、ＳＢＥＩＩａ又はＳＢＥＩＩｂタンパク質をコードする天然に存在するＳＢＥＩＩ遺伝子（例えば、天然に存在するＴ．エスチバム植物内に見られる）であり、「変異体ＳＢＥＩＩ遺伝子」は、１つ又は複数の配列変化を受けたＳＢＥＩＩ遺伝子であり、配列変化は、ワイルドタイプＳＢＥＩＩ遺伝子と比較して、翻訳されるタンパク質にアミノ酸の喪失又は改変をもたらす。そのような「変異体ＳＢＥＩＩ遺伝子」は、ＳＢＥＩＩ遺伝子の核酸配列中に１つ又は複数の突然変異を含む場合があり、突然変異（複数可）は、ｉｎ  ｖｉｖｏで植物又は植物細胞のＳＢＥＩＩａ若しくはＳＢＥＩＩｂタンパク質の欠如又はレベルの減少をもたらす。加えて、「変異体ＳＢＥＩＩ遺伝子」は、その遺伝子がＳＢＥＩＩタンパク質をもはや産生できないように完全長コード配列がコムギゲノムから欠失しているＳＢＥＩＩ遺伝子を含み得る。更に、「変異体ＳＢＥＩＩ遺伝子」は、インフレーム挿入又は欠失がＳＢＥＩＩａ又はＳＢＥＩＩｂタンパク質機能に必須のアミノ酸をコードする遺伝子コード配列の領域内に起こったＳＢＥＩＩ遺伝子を含み得る。
【００１９】
多くのコムギ属種は、６倍体であり、Ａ、Ｂ及びＤと称される３つの異なるゲノムを含有する。従って、そのようなコムギ属種の３つのゲノムそれぞれに１つずつ、３つのＳＢＥＩＩａ遺伝子が存在し、コムギゲノムに合計６つのＳＢＥＩＩａ対立遺伝子をもたらす。Ａゲノムに存在するＳＢＥＩＩａ遺伝子は、２つの対立遺伝子を有し、本明細書ではＳＢＥＩＩａ−Ａと称し；Ｂゲノムに存在するＳＢＥＩＩａ遺伝子は、２つの対立遺伝子を有し、本明細書ではＳＢＥＩＩａ−Ｂと称し；Ｄゲノムに存在するＳＢＥＩＩａ遺伝子は、２つの対立遺伝子を有し、本明細書ではＳＢＥＩＩａ−Ｄと称する。本明細書に提供される方法を使用し、１つ又は複数のＴＡＬＥヌクレアーゼ対を使用して、６つ全てのＳＢＥＩＩａ対立遺伝子を不活性化することができる。他のコムギ属種は、２倍体又は４倍体である。本明細書で提供される方法を使用し、１つ又は複数のＴＡＬＥヌクレアーゼ対を使用して、そのような２倍体若しくは４倍体種の両方又は４つ全てのＳＢＥＩＩａ対立遺伝子を不活性化することができる。
【００２０】
本明細書では用語「高アミロース」又は「高レベルのアミロース」とは、無改変コムギ植物と比較して、改変されたコムギ植物におけるアミロースとアミロペクチンの比の差異のことを指す。特に、改変された植物におけるアミロースとアミロペクチンの比は、無改変植物と比較して増大する（例えば、大部分のワイルドタイプコムギ植物が、比２５：７５を含有する場合、改変された植物における比は、３０：７０、４０：６０、５０：５０、６０：４０、７０：３０、８０：２０、９０：１０又は１００：０であり得る）。「高アミロース」とは、アミロペクチンのレベルの低下している改変されたコムギ植物のことも指す。
【００２１】
Ａゲノム由来の、天然に存在するＴ．エスチバムＳＢＥＩＩａヌクレオチド配列の代表的な例が、配列番号１に示される：
【表１】
2021521874.tif 000002
2021521874.tif 000003
2021521874.tif 000004
2021521874.tif 000005
【００２２】
配列番号１の配列は、Ｔ．エスチバム（栽培品種チャイニーズスプリング［Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｓｐｒｉｎｇ］）由来の、ＡゲノムのＳＢＥＩＩａ遺伝子である（ＧＥＮＢＡＮＫ［登録商標］アクセッションＨＥ５９１３８９．１）。太字のヌクレオチドは、エクソン２及びエクソン３配列を示す。
【００２３】
Ｂゲノム由来の、天然に存在するＴ．エスチバムＳＢＥＩＩａヌクレオチド配列の代表的な例が、配列番号５０８１に示される：
GTTGGTTTGCGATCCCGTCCTCCCTCCCGTCCCCTACGCAACGTCGCCTCCACCGTCCATCCGTCGCTGCCACCTCTGTGCGCGCGCACGAGGGAGGAAGACGACGCAGCACACACACTCTCCCCGTGGGTCCCCTTTCCGGCTTGGCGTCTATCTCCTCTCCCCCCCATCCCCATGCACTGCACAGTACCCGCCAGCTTCCACCCCCGCCGCACACGTTGCTCCCCCTTCTCATCGCTTCTCAATTAATATCTCCATCACTCGGGTTCCGCGCTGCATTTCGGCCGGCGGGTTGAGTGAGATCTGGGCCACTGACCGACTCACTCGCTGCGCGGGGATGGCGACGTTCGCGGTGTCCGGCGCGACCCTCGGTGTGGCGCGGCCCGCCAGCGCCGGCGGCGGACTGCTGCGATCCGGCTCGGAGCGGAGGGGCGGGGTGGACTTGCCGTCGCTGCTCCTCAGGAAGAAGGACTCCTCTCGTACGCCTCGCTCCCTCCAATCTCCCCGTCTGTTTTTGGGCCCCCTTCTCTCTCCCTCGCCTCTCTGCGCGCGCATGGCCTGTTCGATGCTGTTCCCCAGTTGATCTCCATGAACGAGAGAGATAGCTGGATTAGGCGATCGCCTCAGGCCCTGGTGTTACCACGGCTTTGATCATCTCCTCCTTTCATGCTGATATTTTCTCACTCTTTCTTCTGTTCTTGCTGTAACTGCAAGTTGTAGCATTTTTTTGGCGAATAAGTTGTAGCATTGTCTCACTATTGTACTCATCCTTGCATTTGCAGGCGCCGTCCTGAGCCGCGCGGCCTCTCCAGGGAAGGTCCTGGTGCCTGACGGTGAGAGCGACGACTTGGCGGCCACTCCAGCGCAACCCGAAGAATTACAGGTACACACCGTCGTGCCGGAAAATCTTCATGCACCCGTTATTCACTTACCAAATATCGGATGAACCAAGCCGCGGAGGCATCAGGTTTCAAGCTTCTTCTATCAGCATTGTGCACTACTTCACTGCCTTGTGCAGTTTGTTAGCTGTGGCCCCGCGCTGGCTCTTGGGCCACTGAAAACTCAGATGGATGTGCATTCTAGCAAGAACTTCACAAAATAATGCACTGTTTGTGGTTTCGTTAGTCTGCTCTACAATTGCTATTTTTCGTGTGCTGTAGATACCTGAAGATATCGAGGAGCAAACGGCTGAAGTGAACATGACAGGGGGGACTGCAGAGAAACTTCAATATTCAGAACCGACTCAGGGCATTGTGGAAACAATCACTGATGGTGTAACCAAAGGAGTTAAGGAACTAGTCGTGGGGGAGAAACCGCGAGTTGTCCCAAAACCAGGAGATGGGCAGAAAATATACGAGATTGACCCAACGCTGAAAGATTTTCGGAGCCATCTTGACTACCGGTAATGCCTACCCGCTAATTTCGCTCATTTTGAATTAAGGTCCTTTCATCATGCAAATTTGGGGAACATCAAAGAGGCAAAGACTAGGGACCACTGTTTCATACAGTTCCCCTCATGGTCTGAGAATATGCTGGGAAGTATATGTATAATTGCTGGCTACAATTGGCTCATAATTGCAATACAAATAACTGTCTCCGATCATTACAATTACAGAGTGGCAAACTGATGAAAATGTGGTGGATGGGTTATGGATTTTACTTTGCTAATTCCTCTACCAAATTCCTGGGGAAAAAATCTACCAGTTGGGCAACTTAGTTTCTTATCTTTGTTGCCTTTTTGTTTTGGGGAAAACACACTGCTAAATTTGAATGATTTTGGGTATGCCTTGGTGGATTCAACAGATACAGCGAATACAAGAGAATTCGTGCTGCTATTGACCAACATGAAGGTGGATTGGAAGCATTTTCTCGTGGTTATGAAAAGCTTGGATTTACCCGCAGGTAAATTTAAAGCTTTACTATGAAACGCCTCCACTAGTCTAATTGCATATCTTGTAAGAAAATTTATAATTCCTGTTTTCCCCTCTCTTTTTTCCAGTGCTGAAGGTATCATCTAATTGCTTATCTTATAAGAAAATTTATAATTCCTGTTTCCCCCCCTCTTTTTCCAGTGCTGAAGGTATCACTTACCGAGAATGGGCTCCTGGAGCGCATGTACGTCTTAACAGACACCTTCTAATCTATTGTTAATGGTCACTATTCACCAACTAGCTTACTGAACTTACAAAATAGCTTACTGAATACTGACCAGTTACTCTAAATTTATGATCTGGCTTTTGCATCCTGTTACAGTCTGCAGCATTAGTAGGTGACTTCAACAATTGGAATCCAAATGCAGATACTATGACCAGAGTATGTCTACAGCTTGGCAATCTTCCACCTTTGCTTCGTAACTACTGATACATCTATTTGTATTTATTTAACTGTTTGCACGTTCGTTAAAGTTGAGCCTCAACTATATCATACCAAAATGGTATAATTTGTCAGTGTCTTAAGCTTCAGCCTAAAGATCCTACTGAATTTAGTCCATCCTTTTGAGATTGAAAATGAGTATATTAAGGGTGATTGAATACTTGCAACACTCCCATTTTTTGGTAGAACCTTTTGCATTATGTGTGCTTTTCCATCCACAATGAGCATATTTCCATGTTATCAGTGAAGGTTTGCTCCTATTGATGCCGATATTTGATATGATCTTTCGATCTTTTCAGGATGATTATGGTGTTTGGGAGATCTTCCTCCCTAACAATGCTGATGGATCCCCAGCTATTCCTCATGGCTCACGTGTAAAGGTAATCTGGCCAATTATTTAGTCGAGGATGTAACATTTTCGAACTCTGCCTACTAAGGGTCCCTTTTCCTCTCTATTTTCTAGATACGGATGGATACTCCATCTGGTGTGAAGGATTCGATTTCTGCTTGGATCAAGTTCTCTGTGCAGGCTCCAGGTGAAATACCATTCAATGGCATATATTATGATCCACCTGAAGAGGTAAGTATCAATCTATGTTACATTATTAAATGGAATTTCCAGTGTTACAGTTTTTTGATACCCACTTCATGTCTCACTGACATGTGAGTCAAGACAATACTTTCGAATTTGGAAGTGACATATGCATTAATTCACCTTCTAAGGGCTAAGGGGCAACCAACCATGGTGATGTGTGTATGCTTGTGTGACTTAAGATCTTATAGCTCTTTTATATGTTCTCTGTTGGTTAGGACATTCCATTTTGACCTTTTGTGACCATTTACTAAGGATATTTTACATGCAAATGCAGGAGAAGTATGTCTTCCAACATCCTCAACCTAAACGACCAGAGTCACTAAGGATTTATGAATCACACATTGGAATGAGCAGCCCGGTATGTCAATAAGTTATTTCACCTGTTTCCGGTCTGATGGTTTATTCTATGGATTTTCTAGTTCTGTTATGTACTGTTAACATACCACACGGTGCATTCACGTGACAACCTCGATTTTATTTTCTAATGTCTTCATATTGGAAAATGCACAACTTTGCTTCCTCTTTGTCTGATCGTTTTTTTGTCTCTAAGATTTCCATTGCATTTCGAGGTAGCGGGCATGTGAAAGTCGAATCTGAATATTTTTTGTCAGAGCACAGTTATATTAAATGCCATTGTTGTTGCAATAGCTTGGTATAATGTAGCCATGTTACTAGCTTAAGAAATATCGCATTGGAGCATCTCCAGCAAGCCATTTCCTACCTTATTACTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTGAATATTTTAGCGTGATCTTGCACAGGAACCGAAGATAAATTCATATGCTAATTTTAGGGATGAGGTGCTGCCAAGAATTAAAAGGCTTGGATACAATGCAGTGCAGATAATGGCAATCCAGGAGCATTCATACTATGCAAGCTTTGGGTATTCATACAGTCCATCTTTTTCTGTTTTTTTTTTCTGTATGTGCCTCTTCACCCATTTCGAGCCATTACATCCTAATGCTTCGTGCACATAAAATACTTGGATATAATTCTTTATTAGACATATAGTACAACACCACTTAGTATTTCTGACTTGTATGATCATTTTATTGTTGTTGGCTTGTTACAGGTACCATGTTACTAATTTTTTTGCACCAAGTAGCCGTTTTGGAACTCCAGAGGACTTAAAATCCTTGATCGATAGAGCACATGAGCTTGGTTTGCTTGTTCTTATGGATATTGTTCATAGGTAATCAGTCCAATTTAATTTTAGTTGCTTTACTGTTTATCTGGTATTGTAAATGGCAGGGCCCTATCGTCGAATATTTTTCCAATCTATATAATTGTGCTACATGACTTATTTTTTCTCAGATGTATTAAACCAGTTGGATATTAAATGTATTTGGTACATCTAGTAAACTGACAGTTTCATAGAATTGTGTTGTAATGGCAACACAATTTGATGGCATAGATGTGGACTGAGAAGTTCAGATGCTATCAGTAATTAATTAACTGGCCATGTACTCGTGGAACTACATAGAGTTTGCAAGTTGGAAAACTGACAGCAATACCTCACTGATAAGTGTCCAGGCCACACTTGCCAGCTTCATATTAGATGTTACTTCCCTGTTGAACTCCTTTGAACATATCACTTAAAGTTCTTCAATTGTCCTAAGTCAAACTTCTTTGACTTTGGCCAAGTCTATTGAAAAATATGTCAACATCTACAGCACCAAATTAGTTTCATAATTTTTATTTTGTTATATTAGCACGTTTTTTATGCTGTAGATATCAGCACATTTTTCTATAGACTTGGTCAAATATAGAGAAGTTTGACTTAGGACAAATCAGAACTTCAAGCAATTTGGATCAGAGGGAATAGTCCATACTGCTTGATTATATTTTCCCAAAGGAGGGAGTGAGGAGCTTGACTTCGGTATCATCAAATGATATTGATAGATGTCAACATTTTAACAAAAAATCAGACCTTGT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【００２４】
Ｄゲノム由来の、天然に存在するＴ．エスチバムＳＢＥＩＩａヌクレオチド配列の代表的な例が、配列番号５０８２に示される：
CAGCGTCGCCTCCACCGTCCGTCCGTCGCTCTCTGCCACCTCTGCTGTGCGCGCGCACGAGGGAGGAAGACGACGCCGCACACACACTCACACACGGCACACTCCCCGTGGGTCCCCTTTCCGGCTCGGCGTCTATCTCCTCTCCCCCGCCCATCCCCATGCACTGCACCGTACCCGCCAGCTTCCACCCCCGCCGCACACGTTGCTCCCCCTTCTCATCGCTTCTCAATTAATATCTCCATCACTCGGGTTCCGCGCTGCATTTCGGCCGGCGGGTTGAGTGAGATCTGGGCGACTGGCTGACTCAATCACTACGCGGGGATGGCGACGTTCGCGGTGTCCGGCGCGACTCTCGGTGTGGCGCGGGCCGGCGTCGGAGTGGCGCGGGCCGGCTCGGAGCGGAGGGGCGGGGCGGACTTGCCGTCGCTGCTCCTCAGGAAGAAGGACTCCTCTCGTACGCCTCGCTCTCTCGAATCTCCCCGTCTGGCTTTGGCTCCCCTTCTCTCTCCTCTGCGCGCGCATGGCCTGTTCGATGCTGTTCCCCAATTGATCTCCATGAGTGAGAGAGATAGCTGGATTAGGCGATCGCGCTTCCTGAACCTGTATTTTTTTCCCCGCGGGGAAATGCGTTAGTGTCACCCAGGCCCTGGTGTTACCACGGCTTTGATCATTCCTCGTTTCATTCTGATATATATTTTCTCACTCTTTTTCTTCCTGTTCTTGCTGTAACTGCAAGTTGTGGCGTTTTTTCACTATTGTAGTCATCCTTGCATTTTGCAGGCGCCGTCCTGAGCCGCGCGGCCTCTCCAGGGAAGGTCCTGGTGCCTGACGGCGAGAGCGACGACTTGGCAAGTCCGGCGCAACCTGAAGAATTACAGGTACACACACTCGTGCCGGTAAATCTTCATACAATCGTTATTCACTTACCAAATGCCGGATGAAACCAACCACGGATGCGTCAGGTTTCGAGCTTCTTCTATCAGCATTGTGCAGTACTGCACTGCCTTGTTCATTTTGTTAGCCTTGGCCCCGTGCTGGCTCTTGGGCCACTGAAAAAATCAGATGGATGTGCATTCTAGCAAGAACTTCACAACATAATGCACCGTTTGGGGTTTCGTCAGTCTGCTCTACAATTGCTATTTTTCGTGCTGTAGATACCTGAAGATATCGAGGAGCAAACGGCGGAAGTGAACATGACAGGGGGGACTGCAGAGAAACTTCAATCTTCAGAACCGACTCAGGGCATTGTGGAAACAATCACTGATGGTGTAACCAAAGGAGTTAAGGAACTAGTCGTGGGGGAGAAACCGCGAGTTGTCCCAAAACCAGGAGATGGGCAGAAAATATACGAGATTGACCCAACACTGAAAGATTTTCGGAGCCATCTTGACTACCGGTAATGCCTACCCGCTGCTTTCGCTCATTTTGAATTAAGGTCCTTTCATCATGCAAATTTGGGGAACATCAAAGAGACAAAGACTAGGGACCACCATTTCATACAGATCCCCTCGTGGTCTGAGAATATGCTGGGAAGTAAATGTATAATTGATGGCTACAATTTGCTCAAAATTGCAATACGAATAACTGTCTCCGATCATTACAATTAAAGAGTGGCAAACTGATGAAAATGTGGTGGATGGGTTATAGATTTTACTTTGCTAATTCCTCTACCAAATTCCTAGGGGGGAAATCTACCAGTTGGGAAACTTAGTTTCTTATCTTTGTGGCCTTTTTGTTTTGGGGAAAACACATTGCTAAATTCGAATGATTTTGGGTATACCTCGGTGGATTCAACAGATACAGCGAATACAAGAGAATTCGTGCTGCTATTGACCAACATGAAGGTGGATTGGAAGCATTTTCTCGTGGTTATGAAAAGCTTGGATTTACCCGCAGGTAAATTTAAAGCTTTATTATTATGAAACGCCTCCACTAGTCTAATTGCATATCTTATAAGAAAATTTATAATTCCTGTTTTCCCCTCTCTTTTTTCCAGTGCTGAAGGTATCGTCTAATTGCATATCTTATAAGAAAATTTATATTCCTGTTTTCCCCTATTTTCCAGTGCTGAAGGTATCACTTACCGAGAATGGGCTCCTGGAGCGCATGTATGTCTTTTAAGTCTTAACAGACACCTTCCAATTTATTGTTAATGGTCACTATTCACCAACTAGCTTACTGGACTTACAAATTAGCTTACTGAATACTGACCAGTTACTATAAATTTATGATCTGGCTTTTGCACCCTGTTACAGTCTGCAGCATTAGTAGGTGACTTCAACAATTGGAATCCAAATGCAGATGCTATGACCAGAGTATGTCTACAGCTTGGCAATTTTCCACCTTTGCTTCATAACTACTGATACATCTATTTGTATTTATTTAGCTGTTTGCACATTCCTTAAAGTTGAGCCTCAACTACATCATATCAAAATGGTATAATTTGTCAGTGTCTTAAGCTTCAGCCCAAAGATTCTACTGAATTTAGTCCATCTTTTTGAGATTGAAAATGAGTATATTAAGGATGAATGAATACGTGCAACACTCCCATCTGCATTATGTGTGCTTTTCCATCTACAATGAGCATATTTCCATGCTATCAGTGAAGGTTTGCTCCTATTGATGCAGATATTTGATATGGTCTTTTCAGGATGATTATGGTGTTTGGGAGATTTTCCTCCCTAACAACGCTGATGGATCCTCAGCTATTCCTCATGGCTCACGTGTAAAGGTAAGCTGGCCAATTATTTAGTCGAGGATGTAGCATTTTCGAACTCTGCCTACTAAGGGTCCCTTTTCCTCTCTGTTTTTTAGATACGGATGGATACTCCATCCGGTGTGAAGGATTCAATTTCTGCTTGGATCAAGTTCTCTGTGCAGGCTCCAGGTGAAATACCTTTCAATGGCATATATTATGATCCACCTGAAGAGGTAAGTATCGATCTACATTACATTATTAAATGAAATTTCCAGTGTTACAGTTTTTTAATACCCACTTCTTACTGACATGTGAGTCAAGACAATACTTTTGAATTTGGAAGTGACATATGCATTAATTCACCTTCTAAGGGCTAAGGGGCAACCAACCTTGGTGATGTGTGTATGCTTGTGTGTGACATAAGATCTTATAGCTCTTTTATGTGTTCTCTGTTGGTTAGGATATTCCATTTTGGCCTTTTGTGACCATTTACTAAGGATATTTACATGCAAATGCAGGAGAAGTATGTCTTCCAACATCCTCAACCTAAACGACCAGAGTCACTAAGGATTTATGAATCACACATTGGAATGAGCAGCCCGGTATGTCAATAAGTTATTTCACCTGTTTCTGGTCTGATGGTTTATTCTATGGATTTTCTAGTTCTGTTATGTACTGTTAACATATTACATGGTGCATTCACTTGACAACCTCGATTTTATTTTCTAATGTCTTCATATTGGCAAGTGCAAAACTTTGCTTCCTCTTTGTCTGCTTGTTCTTTTGTCTTCTGTAAGATTTCCATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGTAGCGTTCTGTATTCTGCGAGCGATTCAAAAACTTCCATTGTTCTGAGGTGTACGTACTGCAGGGATCTCCCATTATGAAGAGGATATAGTTAATTCTTTGTAACCTACTTGGAAACTTGAGTCTTGAGGCATCGCTAATATATACTATCATCACAATACTTAGAGGATGCATCTGAATATTTTAGTGTGATCTTGCACAGGAACCGAAGATAAATTCATATGCTAATTTTAGGGATGAGGTGTTGCCAAGAATTAAAAGGCTTGGATACAATGCAGTGCAGATAATGGCAATCCAGGAGCATTCATACTATGCAAGCTTTGGGTATTCACACAATCCATTTTTTTCTGTATACACCTCTTCACCCATTTGGAGCTATTACATCCTAATGCTTCATGCACATAAAATATTTGGATATAATTCTTTATTAGATATATAGTACAACTACACTTAGTATTCTGACTTTTATGATCATTTTATTGTTGTTGGCTTGTTCCAGGTACCATGTTACTAATTTTTTTGCACCAAGTAGCCGTTTTGGAACTCCAGAGGACTTAAAATCCTTGATCGATAGAGCACATGAGCTTGGTTTGCTTGTTCTTATGGATATTGTTCATAGGTAATTAGTCCAATTTAATTTTAGCTGTTTTACTGTTTATCTGGTATTCTAAAGGGAAAATCAGGCAATTATGATACATTGTCAAAAGCTAAGAGTGGCGAAAGTGAAATGTCAAAATCTAGAGTGGCATAAGGAAAATTGGCAAAAACTAGTGGCAAAAATAAAATTTTCCCATCCTAAATGGCAGGGCCCTATCGCCGAATATTTTTCCATTCTATATAATTGTGCTACGTGACTTCTTTTTTCTCAGATGTATTAAACCAGTTGGACATGAAATGTATTTGGTACATGTAGTAAACTGACAGTTCCATAGAATATCGTTTTGTAATGGCAACACAATTTGATGCCATAGATGTGGATTGAGAAGTTCAGATGCTATCAATAGAATTAATCAACTGGCCATGTACTCGTGGCACTACATATAGTTTGCAAGTTGGAAAACTGACAGCAATACCTCACTGATAAGTGGCCAGGCCCCACTTGCCAGCTTCATACTAGATGTTACTTCCCTGTTGAATTCATTTGAACATATTACTTAAAGTTCTTCATTTGTCCTAAGTCAAACTTCTTTAAGTTTGACCAAGTCTATTGGAAAATATATCAACATCTACAACACCAAATTACTTTGATCAGATTAACAATTTTTATTTTATTATATTAGCACATCTTTGATGTTGTAGATATCAGCACATTTTTCTATAGACTTGGTCAAATATAGAGAAGTTTGACTTAGGACAAATCTAGAACTTCAATCAATTTGGATCAGAGGGAACATCAAATAATATAGATAGATGTCAACACTTCAACAAAAAAATCAGACCTTGTCACCATATATGCATCAGACCATCTGTTTGCTTTAGCCACTTGCTTTCATATTTATGTGTTTGTACCTAATCTACTTTTCCTTCTACTTGGTTTGGTTGATTCTATTTCAGTTGCATTGCTTCATCAATGATTTTGTGTACCCTGCAGTCATTCGTCAAATAATACCCTTGACGGTTTGAATGGTTTCGATGGCACTGATACACATTACTTCCACGGTGGTCCACGCGGCCATCATTGGATGTGGGATTCTCGTCTATTCAACTATGGGAGTTGGGAAGTATGTAGCTCTGACTTCTGTCACCATATTTGGCTAACTGTTCCTGTTAATCTGTTCTTACACATGTTGATATTCTATTCTTATGCAGGTATTGAGATTCTTACTGTCAAACGCGAGATGGTGGCTTGAAGAATATAAGTTTGATGGATTTCGATTTGATGGGGTGACCTCCATGATGTATACTCACCATGGATTACAAGTAAGTCATCAAGTGGTTTCAGTAACTTTTTTAGGGCACTGAAACAATTGCTATGCATCATAACATGTATCATGATCAGGACTTGTGCTACGGAGTCTTAGATAGTTCCCTAGTATGCTTGTACAATTTTACCTGATGAGATCATGGAAGATTGGAAGTGATTATTATTTATTTTCTTTCTAAGTTTGTTTCTTGTTCTAGATGACATTTACTGGGAACTATGGCGAATATTTTGGATTTGCTACTGATGTTGATGCGGTAGTTTACTTGATGCTGGTCAACGATCTAATTCATGGACTTTATCCTGATGCTGTATCCATTGGTGAAGATGTAAGTGCTTACAGTATTTATGATTTTTAACTAGTTAAGTAGTTTTATTTTGGGGATCAGTCTGTTACACTTTTTGTTAGGGGTAAAATCTCTCTTTTCATAACAATGCTAATTTATACCTTGTATGATAATGCATCACTTAGGTAATTTGAAAAGTGCAAGGGCATTCAAGCTTACGAGCATATTTTTTGATGGCTGTAATTTATTTGATAGTATGCTTGTTTGGGTTTTTCAATAAGTGGGAGTGTGTGACTAATGTTGTATTATTTATTTAATTGCGGAAGAAATGGGCAACCTTGTCAATTGCTTCAGAAGGCTAACTTTGATTCCATAAACGCTTTGGAAATGAGAGGCTATTCCCAAGGACATGAATTATACTTCAGTGTGTTCTGTACATGTATTTGTAATAGTGGTTTAACTTAAATTCCTGCACTGCTATGGAATCTCACTGTATGTTGTTAGTGTACACATCCACAAACAAGTAATCCTGAACTTTCAACTCATGAGAAAATAGGAGGTTCCGCTTCTGCCAGCATTAACTGTTCACAGTTCTAATTTGTGTAACTGTGAAATTGTTCAGGTCAGTGGAATGCCTACATTTTGCATCCCTGTTCCAGATGGTGGTGTTGGTTTTGACTACCGCCTGCATATGGCTGTAGCAGATAAATGGATTGAACTCCTCAAGTAAGTGCAGGAATATTGGTGATTACATGCGCACAATGATCTAGATTACATTTTCTAAATGGTAAAAAGGAAAATATGTATGTGAATATCTAGACATTTGCCTGTTATCAGCTTGAATACGAGAAGTCAAATACATGATTTAAATAGCAAATCTCGGAAATGTAATGGCTAGTGTCTTTATGCTGGGCAGTGTACATTGCGCTGTAGCAGGCCAGTCAACACAGTTAGCAATATTTTCAGAAACAATATTATTTATATCCGTATATGAGGAAAGTAGGTATATAAACTGTGGTCATTAATTGTGTTCACCTTTTGTCCTGTTTAAGGATGGGCAGTAGGTAATAAATTTAGCCAGATAAAATAAATCGTTATTAGGTTTACAAAAGGAATATACAGGGTCATGTAGCATATCTAGTTGTAATTAATGAAAAGGCTGACAAAAGGCTCGGTAAAAAAAACTTTATGATGATCCAGATAGATATGCAGGAACGCGACTAAAGCTCAAATACTTATTGCTACTACACAGCTGCCAATCTGTCATGATCTGTGTTCTGCTTTGTGCTATTTAGATTTAAATACTAACTCGATACATTGGCAATAATAAACTTAACTATTCAACCAATTTGGTGGATACCAGAGATTTCTGCCCTCTTGTAGTAATGATGTGCTCCTGCTGCTGTTCTCTGCCGTTACAAAAGCTGTTTTCAGTTTTTTGCATCATTATTTTTGTGTGTGAGTAGTTTAAGCATGTTTTTTGAAGCTGTGAGCTGTTGGTACTTAATACATTCTTGGAAGTGTCCAAATATGCTGCAGTGTAATTTAGCATTTCTTTAACACAGGCAAAGTGACGAATCTTGGAAAATGGGCGATATTGTGCACACCCTAACAAATAGAAGGTGGCTTGAGAAGTGTGTAACTTATGCAGAAAGTCATGATCAAGCACTAGTTGGTGACAAGACTATTGCATTCTGGTTGATGGATAAGGTACTAGCTGTTACTTTTGGACCAAAAGAATTACTCCCTCCGTTCCTAAATATAAGTCTTTGTAGAGATTCCACTATGGACCACATAGTATATAGATGCATTTTAGAGTGTAGATTCACTCATTTTGCTTCGTATGTAGTCCATAGTGAAATCTCTACAGAGACTTATATTTAGGAACGGAGGGAGTACATAATTGATTTGTCTCATCAGATTGCTAGTGTTTTCTTGTGATAAAGATTGGCTGCCTCACCCATCACCAGCTATTTCCCAACTGTTACTTGAGCAGAATTTGCTGAAAACGTACCATGTGGTACTGTGGCGGCTTGTGAACTTTGACAGTTATGTTGCAATTTTCTGTTCTTATTTATTTGATTGCTTATGTTACCGTTCATTTGCTCATTTCTTTCCGAGACCAGCCAAAGTCACGTGTAGCTGTGTGATCTGTTATCTGAATCTTGAGCAAATTTTATTAATAGGCTAAAATCCAACGAATTATTTGCTTGAATTTAAATATACAGACGTATAGTCACCTGGCTCTTTCTTAGATGATTACCATAGTGCCTGAAGGCTGAAATAGTTTTGGTGTTTCTTGGATGCCGCCTAAAGGAGTGATTTTTATTGGATAGATTCCTGGCCGAGTCCTCGTTACAACATACATTTTGGAGATATGCTTAGTAACAGCTCTGGGAAGTTTGGTCACAAGTCTGCATCTACACGCTCCTTGAGGTTTTATTATGGCGCCATCTTTGTAACTAGTGGCACCTGTAAGGAAACACATTCAAAAGGAAACGGTCACATCATTCTAATCAGGACCACCATACTAAGAGCAAGATTCTGTTCCAATTTTATGAGTTTTTGGGACTCCAAAGGGAACAAAAGTGTCTCATATTGTGCTTATAACTACAGTTGTTTTTATACCAGTGTAGTTTTATTCCAGGACAGTTGATACTTGGTACTGTGCTGTAAATTATTTATCCGACATAGAACAGCATGAACATATCAAGCTCTCTTTGTGCAGGATATGTATGATTTCATGGCTCTGGATAGGCCTTCAACTCCTCGCATTGATCGTGGCATAGCATTACATAAAATGATCAGGCTTGTCACCATGGGTTTAGGTGGTGAAGGCTATCTTAACTTCATGGGAAATGAGTTTGGGCATCCTGGTCAGTCTTTACAACATTATTGCATTCTGCATGATTGTGATTTACTGTAATTTGAACCATGCTTTTCTTTCACATTGTATGTATTATGTAATCTGTTGCTTCCAAGGAGGAAGTTAACTTCTATTTACTTGGCAGAATGGATAGATTTTCCAAGAGGCCCACAAACTCTTCCAACCGGCAAAGTTCTCCCTGGAAATAACAATAGTTATGATAAATGCCGCCGTAGATTTGATCTTGTAAGTTTTAGCTGTGCTATTACATTCCCTCACTAGATCTTTATTGGCCATTTATTTCTTGATGAAATCATAATGTTTGTTAGGAAAGATCAACATTGCTTTTGTAGTTTTGTAGACGTTAACATAAGTATGTGTTGAGAGTTGTTGATCATTAAAAATATCATGATTTTTTGCAGGGAGATGCAGATTTTCTTAGATATCGTGGTATGCAAGAGTTCGATCAGGCAATGCAGCATCTTGAGGAAAAATATGGGGTATGTCACTGGTTTGTCTTTGTTGCATAACAAGTCACAGTTTAACGTCAGTCTCTTCAAGTGGTAAAAAAAGTGTAGAATTAATTCCTGTAATGAGATGAAAACTGTGCAAAGGCGGAGCTGGAATTGCTTTTCACCAAAACTATTTTCTTAAGTGCTTGTGTATTGATACATATACCAGCACTGACAATGTAACTGCAGTTTATGACATCTGAGCACCAGTATGTTTCACGGAAACATGAGGAAGATAAGGTGATCATCTTCGAAAGAGGAGATTTGGTATTTGTTTTCAACTTCCACTGGAGCAATAGCTTTTTTGACTACCGTGTTGGGTGTTCCAAGCCTGGGAAGTACAAGGTATGCTTGCCTTTTCATTGTCCACCCTTCACCAGTAGGGTTAGTGGGGGCTTCTACAACTTTTAATTCCACATGGATAGAGTTTGTTGGTCGTGCAGCTATCAATATAAAGAATAGGGTAATTTGTAAAGAAAAGAATTTGCTCGAGCTGTTGTAGCCATAGGAAGGTTGTTCTTAACAGCCCCGAAGCACATACCATTCATTCATATTATCTACTTAAGTGTTTGTTTCAATCTTTATGCTCAGTTGGACTCGGTCTAATACTAGAACTATTTTCCGAATCTACCCTAACCATCCTAGCAGTTTTAGAGCAGCCCCATTTGGACAATTGGCTGGGTTTTTGTTAGTTGTGACAGTTTCTGCTATTTCTTAATCAGGTGGCCTTGGACTCCGACGATGCACTCTTTGGTGGATTCAGCAGGCTTGATCATGATGTCGACTACTTCACAACCGTAAGTCTGGGCTCAAGCGTCACTTGACTCGTCTTGACTCAACTGCTTACAAATCTGAATCAACTTCCCAATTGCTGATGCCCTTGCAGGAACATCCGCATGACAACAGGCCGCGCTCTTTCTCGGTGTACACTCCGAGCAGAACTGCGGTCGTGTATGCCCTTACAGAGTAAGAACCAGCAGCGGCTTGTTACAAGGCAAAGAGAGAACTCCAGAGAGCTCGTGGATCGTGAGCG
AAGCGACGGGCAACGGCGCGAGGCTGCTCCAAGCGCCATGACTGGGAGGGGATCGTGCCTCTTCCCCAGATGCCAGGAGGAGCAGATGGATAGGTAGCTTGTTGGTGAGCGCTCGAAAGAAAATGGACGGGCCTGGGTGTTTGTTGTGCTGCACTGAACCCTCCTCCTATCTTGCACATTCCCGGTTGTTTTTGTACATATAACTAATAATTGCCCGTGCGCTTCAACATGAACATATAAATATTCTAATAGGTTATCCCGTGATTTACCTGCCTAT（配列番号５０８２）
【００２５】
Ｔ．エスチバム（栽培品種チャイニーズスプリング）ＳＢＥＩＩａ遺伝子ＡゲノムによりコードされるＳＢＥＩＩａアミノ酸配列が、配列番号２に示される（ＧＥＮＢＡＮＫ［登録商標］アクセッションＣＣＤ４１７７５．１）：
MATFAVSGATLGVARPAGAGGGLLPRSGSERRGGVDLPSLLLRKKDSSRAVLSRAASPGKVLVPDGESDDLASPAQPEELQIPEDIEEQTAEVNMTGGTAEKLESSEPTQGIVETITDGVTKGVKELVVGEKPRVVPKPGDGQKIYEIDPTLKDFRSHLDYRYSEYRRIRAAIDQHEGGLEAFSRGYEKLGFTRSAEGITYREWAPGAHSAALVGDFNNWNPNADTMTRDDYGVWEIFLPNNADGSPAIPHGSRVKIRMDTPSGVKDSISAWIKFSVQAPGEIPFNGIYYDPPEEEKYVFQHPQPKRPESLRIYESHIGMSSPEPKINSYANFRDEVLPRIKRLGYNAVQIMAIQEHSYYASFGYHVTNFFAPSSRFGTPEDLKSLIDRAHELGLLVLMDIVHSHSSNNTLDGLNGFDGTDTHYFHGGPRGHHWMWDSRLFNYGSWEVLRFLLSNARWWLEEYKFDGFRFDGVTSMMYTHHGLQMTFTGNYGEYFGFATDVDAVVYLMLVNDLIHGLYPDAVSIGEDVSGMPTFCIPVPDGGVGFDYRLHMAVADKWIELLKQSDESWKMGDIVHTLTNRRWLEKCVTYAESHDQALVGDKTIAFWLMDKDMYDFMALDRPSTPRIDRGIALHKMIRLVTMGLGGEGYLNFMGNEFGHPEWIDFPRGPQTLPTGKVLPGNNNSYDKCRRRFDLGDADFLRYRGMQEFDQAMQHLEEKYGFMTSEHQYVSRKHEEDKVIIFERGDLVFVFNFHWSNSFFDYRVGCSRPGKYKVALDSDDALFGGFSRLDHDVDYFTTEHPHDNRPRSFSVYTPSRTAVVYALTE（配列番号２）。
【００２６】
ＳＢＥＩＩａ若しくはＳＢＥＩＩｂ遺伝子の発現が減少する若しくは完全に阻害される、又はＳＢＥＩＩａ酵素若しくはＳＢＥＩＩｂ酵素の活性が失われるように、本明細書で提供されるコムギ属植物、細胞、植物部分、穀物及びその後代は、少なくとも２つの内在性ＳＢＥＩＩ対立遺伝子中に突然変異を有する。従って、植物、細胞、植物部分、穀物及び後代は、高レベルのアミロースを呈する。
【００２７】
本明細書では用語「レアカッティングエンドヌクレアーゼ」とは、長さ約１２〜４０ｂｐ（例えば、長さ１４〜４０、１５〜３６又は１６〜３２ｂｐ）の認識配列（標的配列）を持つ核酸配列に向けたエンドヌクレアーゼ活性を有する天然の又は操作されたタンパク質のことを指す。いくつかのレアカッティングエンドヌクレアーゼは、その認識部位の内側で切断を引き起こし、３’ＯＨ又は５’ＯＨオーバーハングを持つ４ｎｔのスタガードカットを残す。これらのレアカッティングエンドヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼのワイルドタイプ若しくはバリアントタンパク質などのメガヌクレアーゼ、より詳細にはドデカペプチドファミリーに属してもよく（ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ［配列番号３］；国際公開第２００４／０６７７３６号を参照のこと）、又はＤＮＡ結合ドメイン及び切断活性を持つ触媒ドメインを含有する融合タンパク質でもよい。ＴＡＬＥヌクレアーゼ及びジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの触媒ドメインとの融合の例である。カスタマイズされたＴＡＬＥヌクレアーゼは、商品名ＴＡＬＥＮ（商標）（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）で市販されている。レアカッティングエンドヌクレアーゼの総説については、Ｂａｋｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９：２３〜２６頁、２０１２年を参照のこと。本明細書に開示される方法に使用され得る更なるレアカッティングエンドヌクレアーゼは、「ＭｅｇａＴＡＬ」ヌクレアーゼとして既知であり、メガヌクレアーゼとＴＡＬＥ結合ドメインとの融合を含む（例えば、欧州特許第３３２０９１０号及びＢｏｉｓｓｅｌら、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４２（４）：２５９１〜２６０１頁、２０１４年を参照のこと）。更に以下で記載されている通り、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１系と称されるＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼも使用され得る（Ｂｅｇｅｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ７：１１６０６頁、２０１７年も参照のこと）。
【００２８】
本明細書では「突然変異誘発」とは、突然変異が、選択されたＤＮＡ配列に導入される過程のことを指す。エンドヌクレアーゼによって誘導される突然変異は、二重鎖切断によって一般に得られ、その二重鎖切断は、ディープシーケンシング分析によって検出され得る挿入／欠失突然変異（「ｉｎｄｅｌ」）をもたらす。そのような突然変異は一般に、数塩基対の欠失であり、突然変異した対立遺伝子を不活性化する効果を有する。また、突然変異は、同じ染色体上に２つの二本鎖の破断を生成することによって導入され得、その結果２つのｉｎｄｅｌ又は介在配列の欠失／逆位のいずれかを生じる。本明細書に記述される方法において、例えば、突然変異誘発は、植物細胞の選択されたＤＮＡ配列を標的とするＴＡＬＥヌクレアーゼ対によって作製される二本鎖ＤＮＡ破断によって起こる。そのような突然変異誘発は「ＴＡＬＥヌクレアーゼ誘導突然変異」（例えば、ＴＡＬＥヌクレアーゼ誘導ノックアウト）、及び標的にされた遺伝子の発現の減少、又はＳＢＥＩＩタンパク質の活性の減少をもたらす。突然変異誘発後に、植物は、既知の技術（例えば、従来通りの栽培手順に従って種子を植え、その後自家受粉させる）を使用して処理した細胞から再生させ得る。
【００２９】
本明細書に提供される植物、植物細胞、植物部分、穀物及び後代は、ＳＢＥＩＩ対立遺伝子に標的された突然変異を作製するためのＴＡＬＥヌクレアーゼ系を使用して生成され得る。従って、本文書は、レアカッティングエンドヌクレアーゼ（例えば、ＴＡＬＥヌクレアーゼ）を使用して、ＳＢＥＩＩ対立遺伝子の突然変異により高アミロースを含む小麦粉を作製するために使用され得るコムギ属植物及び関連産物（例えば、穀物及び植物部分）を生成するための材料及び方法を提供する。また、操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ及びＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼを含む他の配列特異的ヌクレアーゼを使用して、所望の植物材料が生成されてもよい。
【００３０】
本明細書では用語「発現」とは、特定の核酸配列を転写して、センス若しくはアンチセンスＲＮＡ若しくはｍＲＮＡを産生する、及び／又はｍＲＮＡ分子を翻訳して、その後の翻訳後事象を含む若しくは含まないポリペプチドを産生することを指す。
【００３１】
植物若しくは植物細胞の遺伝子若しくはポリペプチドの「発現を減少させる」又は「発現の減少」とは、遺伝子の転写及び／又はコードされているポリペプチドの翻訳が、遺伝子若しくはポリペプチドの発現が阻害、妨害、ノックアウト又はノックダウンされていない対応する対照植物若しくは植物細胞と比較して減少するように、遺伝子若しくはポリペプチドを阻害、妨害、ノックアウト又はノックダウンすること含む。発現レベルは、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロッティング、ドットブロットハイブリダイゼーション、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、核ランオン及び／若しくは核ランオフ、ＲＮａｓｅプロテクション、若しくはＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ及びウェスタンブロッティングなどの免疫学的及び酵素的方法などの方法を使用して検出並びに／又は測定され得る。
【００３２】
一般に、本明細書に提供される変異体コムギ属植物、植物部分又は植物細胞は、突然変異（複数可）を欠く対照コムギ属植物と比較して６０パーセント超（例えば、７０パーセント超、８０パーセント超又は９０パーセント超）減少したＳＢＥＩＩ対立遺伝子の発現を有し得る。対照コムギ属植物は、例えば、ＳＢＥＩＩ対立遺伝子が突然変異されていないワイルドタイプコムギ属植物であり得る。
【００３３】
一部の実施形態において、変異体コムギ属植物、植物部分又は植物細胞は、代表的なＳＢＥＩＩヌクレオチド配列に対して少なくとも９０パーセントの同一性がある配列を有するＳＢＥＩＩ核酸に突然変異を含有し得る。例えば、突然変異は、代表的な天然に存在するＳＢＥＩＩヌクレオチド配列に対して少なくとも９１パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９３パーセント、少なくとも９４パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント又は少なくとも９９パーセントの配列同一性を持つヌクレオチド配列内にあり得る。
【００３４】
一部の場合において、突然変異は、本明細書に記載のＳＢＥＩＩａコード配列（例えば、配列番号１）に記載の標的配列、又は本明細書に記載のＳＢＥＩＩａ配列（例えば、配列番号１）に記載の配列と少なくとも９０パーセント（例えば、少なくとも９２パーセント、少なくとも９４パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント又は少なくとも９９パーセント）同一である標的配列にあり得る。
【００３５】
特定の核酸又はアミノ酸配列と特定の配列識別番号によって参照付けられた配列間のパーセント配列同一性は、以下の通り決定される。最初に、核酸又はアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴＮバージョン２．０．１４及びＢＬＡＳＴＰバージョン２．０．１４を含有するＢＬＡＳＴＺの独立型バージョンのＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（Ｂｌ２ｓｅｑ）プログラムを使用して特定の配列識別番号で示される配列に対して比較される。ＢＬＡＳＴＺのこの独立型バージョンは、ｆｒ．ｃｏｍ／ｂｌａｓｔ又はｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおいてオンラインで入手することができる。Ｂｌ２ｓｅｑプログラムを使用する方法を説明する説明書は、ＢＬＡＳＴＺに付随するリードミーファイル中に見出だすことができる。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮ又はＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して２つの配列間の比較を実行する。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために使用され、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために使用される。２つの核酸配列を比較するために、選択肢は以下の通りに設定される：−ｉは、比較しようとする第１の核酸配列を含有するファイル（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ）に設定され；−ｊは、比較しようとする第２の核酸配列を含有するファイル（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ）に設定され；−ｐは、ｂｌａｓｔｎに設定され；−ｏは、任意の所望のファイル名（例えば、Ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ）に設定され；−ｑは、−１に設定され；−ｒは、２に設定され；他の全ての選択肢は、それらの初期設定のままに残される。例えば、以下の命令を使用して、２つの配列間の比較を含有する出力ファイルを生成することができる：Ｃ：＼Ｂｌ２ｓｅｑ−ｉ  ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ−ｊ  ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ−ｐ  ｂｌａｓｔｎ−ｏ  ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ−ｑ−１−ｒ２。２つのアミノ酸配列を比較するために、Ｂｌ２ｓｅｑの選択肢は以下の通りに設定される：−ｉは、比較しようとする第１のアミノ酸配列を含有するファイル（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ）に設定され；−ｊは、比較しようとする第２のアミノ酸配列を含有するファイル（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ）に設定され；−ｐは、ｂｌａｓｔｐに設定され；−ｏは、任意の所望のファイル名（例えば、Ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ）に設定され；他の全ての選択肢は、それらの初期設定のままに残される。例えば、以下の命令を使用して、２つのアミノ酸配列間の比較を含有する出力ファイルを生成することができる：Ｃ：＼Ｂｌ２ｓｅｑ−ｉ  ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ−ｊ  ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ−ｐ  ｂｌａｓｔｐ−ｏ  ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ。比較された２つの配列が相同性を共有する場合、その後、指定された出力ファイルは、整列された配列として相同性の領域を示すことになる。比較された２つの配列が相同性を共有しない場合、その後、指定された出力ファイルは、整列された配列を示さないことになる。
【００３６】
一旦整列されたら、同一ヌクレオチド又はアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を計数することによって、一致の数が決定される。パーセント配列同一性は、一致の数を、同定された配列（例えば、配列番号１）に示される配列長、又はまとまった長さ（例えば、同定された配列に示される配列の１００個連続したヌクレオチド又はアミノ酸残基）のいずれかで割り、その後得られた値に１００を掛け算することによって決定される。例えば、配列番号１に示される配列と整列された場合、９５００の一致を有する核酸配列は、配列番号１に示される配列と９６．０パーセント同一である（すなわち、９５００÷９８９３×１００＝９６．０）。パーセント配列同一性値は、最も近い１０分の１に四捨五入されることに留意されたい。例えば、７５．１１、７５．１２、７５．１３及び７５．１４は、７５．１に切り下げられ、７５．１５、７５．１６、７５．１７、７５．１８及び７５．１９は、７５．２に切り上げられる。長さ値が常に整数になる点にも留意されたい。
【００３７】
他で記載されている通り、内在性標的配列を選択し、その配列を標的とするＴＡＬＥヌクレアーゼ対を生成する方法が、実行され得る。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際出願ＰＣＴ公開第２０１１／０７２２４６号を参照のこと。一部の実施形態において、ＴＡＬＥ−ＮＴ  ２．０（Ｄｏｙｌｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４０：Ｗ１１７〜１２２頁、２０１２年）など、ＴＡＬＥヌクレアーゼ認識部位を詳細に同定するソフトウェアが使用され得る。
【００３８】
転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターは、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の植物病原性細菌に見られる。これらのタンパク質は、宿主ＤＮＡを結合し、エフェクター特異的宿主遺伝子を活性化することにより、疾患において重要な役割を演じる、又は防御を起動させる（例えば、Ｇｕら、Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：１１２２〜１１２５頁、２００５年；Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３：１０５０３〜１０５０８頁、２００６年；Ｋａｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：６４８〜６５１頁、２００７年；Ｓｕｇｉｏら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０４：１０７２０〜１０７２５頁、２００７年；及びＲｏｅｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：６４５〜６４８頁、２００７年を参照のこと）。特異性は、不完全な、一般に３４アミノ酸の反復のエフェクター変数によって決まる（Ｓｃｈｏｒｎａｃｋら、Ｊ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １６３：２５６〜２７２頁、２００６年；及び国際公開第２０１１／０７２２４６号）。多型は、反復位置１２及び１３に主に存在し、その多型は反復可変二残基（ＲＶＤ）と称される。
【００３９】
ＴＡＬエフェクターのＲＶＤは、直接、直線的様式で標的部位のヌクレオチドに、１ＲＶＤは、１ヌクレオチドに対応しており、いくつかの退縮を含み、明らかな文脈依存はない。タンパク質−ＤＮＡ認識のこの機序は、新規の標的特異的ＴＡＬエフェクターに対する標的部位予測、並びに標的部位選択及び選択された部位に結合特異性を持つ新規のＴＡＬエフェクターの操作を可能にする。
【００４０】
ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインは、エンドヌクレアーゼ配列などの他の配列に融合させることができ、その結果、特定の選択されたＤＮＡ配列を標的とするキメラエンドヌクレアーゼを得られ、標的した配列又はその近傍でのＤＮＡのその後の切断を導く。例えば、ＤＮＡにおけるそのような切断（すなわち、二本鎖切断）は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同組換えによってワイルドタイプＤＮＡ配列へ突然変異を誘導することができる。一部の場合において、ＴＡＬＥヌクレアーゼを使用して、複雑なゲノムにおける部位特異的突然変異誘発を容易にし、優れた精度及び高い効率で遺伝子機能をノックアウトさもなければ変更することができる。下記の例に記載の通り、Ｔ．エスチバムＳＢＥＩＩ対立遺伝子を標的とするＴＡＬＥヌクレアーゼを使用して、内在性対立遺伝子に突然変異を誘発させ、ＳＢＥＩＩの検出可能な発現を含まない（又は、発現の減少した）植物を得ることができる。一部のエンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）が、二量体として機能するという事実を使用して、ＴＡＬＥヌクレアーゼの標的特異性を増強させることができる。例えば、一部の場合において、異なるＤＮＡ配列を標的とする一対のＴＡＬＥヌクレアーゼモノマーが使用され得る。２つのＴＡＬＥヌクレアーゼ認識部位が非常に近い場合、不活性モノマーが一体となってＤＮＡを切断する機能的な酵素を創出することができる。ヌクレアーゼを活性化するにはＤＮＡ結合を必要とすることより、高度に部位特異的な制限酵素が創出され得る。
【００４１】
ＴＡＬＥヌクレアーゼを使用して内在性遺伝子に突然変異を有するコムギ属植物、植物細胞又は植物部分を生成する方法は、例えば、本明細書の例に記載される方法を含む。例えば、１つ又は複数のＳＢＥＩＩ対立遺伝子中に存在する保存ヌクレオチド配列を標的とするＴＡＬＥヌクレアーゼをコードしている１つ若しくは複数の核酸が、植物細胞又は植物部分（例えば、プロトプラスト又は胚盤）へ形質転換され得、そこで、その核酸は発現され得る。一部の場合において、１つ又は複数のＴＡＬＥヌクレアーゼタンパク質が、植物細胞又は植物部分（例えば、プロトプラスト又は胚盤）に導入され得る。細胞若しくは植物部分若しくは植物細胞系又は細胞から生成された植物部分を、次世代シークエンス技術（例えば、４５４パイロシークエンス又はＩｌｌｕｍｉｎａシークエンス）によってその後分析して、突然変異が標的部位（複数可）で導入されたかどうか決定することができる。シークエンスの鋳型は、例えば、ＰＣＲ（例えば、全てのＳＢＥＩＩ対立遺伝子にわたって保存ヌクレオチド配列に相同であるプライマーを使用する）によって増幅されるＳＢＥＩＩ遺伝子配列中のＴＡＬＥヌクレアーゼ標的部位であり得る。
【００４２】
ＲＮＡ誘導レアカッティングエンドヌクレアーゼも、本明細書に提供される方法に使用され得る。例えば、クラスター化された規則的間隔の短いパリンドローム反復（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ）／ＣＲＩＳＰＲ会合（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）系は、ＲＮＡを使用してＤＮＡ切断を指令する（例えば、Ｂｅｌａｈｊら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９：３９頁、２０１３年を参照のこと）。これらの系は、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１（Ｚｅｔｓｃｈｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３５：３１〜３４頁、２０１７年）エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ［ｃｒＲＮＡ］とトランス活性化ｃｒＲＮＡ［ｔｒａｃｒＲＮＡ］との複合体、又はｃｒＲＮＡの３’末端とｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端との合成融合体）からなり得る。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１結合及びＤＮＡ切断をプロトスペーサー隣接モチーフに隣接する配列に導く（ＰＡＭ；例えば、化膿連鎖球菌［Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ］由来Ｃａｓ９のＮＧＧ）。一旦、標的ＤＮＡ配列に導くと、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１は、標的配列に相補的なｃｒＲＮＡ配列の３’末端から３ヌクレオチドの位置でＤＮＡ二本鎖切断を生成する。ＳＢＥＩＩ対立遺伝子のヌクレオチド配列中にいくつかのＰＡＭモチーフが存在するのでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を利用して、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡがトランスフェクトされ、発現されるコムギ属植物細胞のＳＢＥＩＩ対立遺伝子に突然変異が導入されてもよい。この手法をＴＡＬＥヌクレアーゼに代わる方法として使用して、一部の例において、本明細書に記載の植物及び植物部分を得ることができる。
【００４３】
本文書は、対応するワイルドタイプコムギの穀物中のデンプン含有量と比較して変更されたデンプン含有量を有するコムギ穀物も提供する。本明細書では用語「穀物」とは、本質的に成熟した穀物のことを指す。本用語は、商業的環境で収穫される穀物を含む。一部の実施形態において、変更されたデンプン含有量は、少なくとも部分的にはＳＢＥＩＩａ発現の減少の結果である。一部の実施形態において、穀物のアミロースの割合は増大している（総デンプンのパーセンテージとして）。アミロースの割合の増大は、ワイルドタイプ植物の穀物と比較して、デンプン中のアミロペクチンの割合の減少として決定されてもよい。ワイルドタイプコムギデンプンは、約２０〜３０％のアミロース及び７０〜８０％のアミロペクチンを一般に含有する。本明細書に提供される穀物は、少なくとも約４０％（重量／重量）のアミロースを含むデンプン含有量を有し得る。一部の実施形態において、ＳＢＥＩＩａ及びＳＢＥＩＩｂ両方の活性は、胚乳の発達中に減少する。一部の実施形態において、当業者に理解される方法によって測定されるアミロースの割合は、例えば、穀物の総デンプンの少なくとも４０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％（重量／重量）であり得る。アミロースレベルの増大は、光学顕微鏡下で観察した場合の顆粒の複屈折の喪失によるデンプン粒形態の異常によって、又は他の適切な方法によって明示されてもよい。一部の実施形態において、例えば、アミロースの割合は、アミロース−ヨウ素包接錯体中のアミロースのヨウ素結合容量の電位差測定、電流測定又は比色分析測定を使用して測定され得る。アミロース含有量は、高性能液体クロマトグラフィー（Ｂａｔｅｙ及びＣｕｒｔｉｎ、Ｓｔａｒｃｈ  ４８：３３８〜３４４頁、１９９６年）によって、又はレクチンコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）（Ｙｕｎ及びＭａｔｈｅｓｏｎ、Ｓｔａｒｃｈ／Ｓｔａｒｋｅ  ４２：３０２〜３０５頁、１９９０年）を用いる分枝アミロペクチンの特異的沈殿、その後の加水分解されたアミロース中のＤ−グルコースの比色定量化によっても測定され得る。比色定量化には、例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ及びＬａｉｇｎｅｌｅｔの方法（Ｊ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉ  ９〜２０頁、１９８３年）などの分光光度法があり得る。
【００４４】
本明細書では用語「食物繊維」は、健康なヒトの小腸において吸収せず大腸に入る炭水化物及び炭水化物消化産物を含む。食物繊維は、難消化性デンプン並びに他の可溶性及び不溶性炭水化物ポリマーを含む。大腸内で常在性ミクロフローラにより、少なくとも部分的に、発酵性である炭水化物の部分を含むことが意図される。本明細書に提供されるデンプンは、相対的に高レベルの食物繊維、より詳細にはアミロースを含有する。本明細書に提供される穀物の食物繊維含有量は、少なくとも部分的には、穀物のデンプン中のアミロース含有量の増大、更に、又はそれと相まって、総デンプンのパーセンテージとしての難消化性デンプン含有量の増大に起因する。
【００４５】
「難消化性デンプン」（ＲＳ）は、デンプン及び健康なヒトの小腸に吸収せず大腸に入るデンプン消化産物の合計として本明細書に定義される。文脈によると、難消化性デンプンは、穀物の総デンプンのパーセンテージ又は食物中の総デンプン含有量のパーセンテージによって定義される。従って、難消化性デンプンは、小腸において消化され、吸収される産物を除外する。難消化性デンプンには、物理的に消化酵素が作用できないデンプン（ＲＳ１形態）、難消化性の天然デンプン粒（ＲＳ２）、老化デンプン（ＲＳ３）及び化学改変デンプン（ＲＳ４）がある。食品において消費される場合、変更されたデンプン構造、特に本明細書で提供されるコムギ由来デンプンの高いアミロースレベルは、難消化性デンプンの増大を引き起こす。デンプンは、消化のための消化酵素がいくらか作用できないＲＳ１形態であってもよい。Ｖ−複合体結晶化度によって測定されるデンプン−脂質会合も、難消化性デンプンのレベルに寄与する可能性が高い。
【００４６】
この文書は、アミロースの割合の増大の結果として、難消化性デンプン含有量が変更されたコムギ穀物を提供する。ワイルドタイプコムギの種子は、全体の穀物中に２％未満の難消化性デンプンを含有する。本明細書で提供される穀物は、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約６％、少なくとも約８％、少なくとも約１０％、少なくとも約１２％又は少なくとも約１４％の難消化性デンプンを有し得る。難消化性デンプンの割合は、例えば、アルファアミラーゼ及び膵アミログルコシダーゼにより加水分解されたデンプン中のＤ−グルコースの分光測光定量化によって間接的に測定され得る（例えば、Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ［２００５年］、第１８版  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ、Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ２００２．０２を参照のこと）。
【００４７】
本文書は、ワイルドタイプコムギ穀物と比較して変更された食物繊維含有量を有するコムギ穀物も提供する。変更された食物繊維含有量は、少なくとも部分的には、ＳＢＥＩＩａ発現の減少によるアミロース含有量の増大の結果であり得る。ワイルドタイプコムギの種子は、約１２％〜約１５％の食物繊維含有量を一般に有する。本明細書に提供される穀物は、全体の穀物の少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％又は少なくとも約３５％の食物繊維含有量を有し得る。食物繊維の割合は、例えば、２００９年に採択されたＣＯＤＥＸ定義（Ｃｏｄｅｘ、２００９．０１）と一致して、重合度（ＤＰ）≧３を有しアルコール４部・水１部に沈殿しないＲＳ及び食物繊維（ＳＤＦＳ／ＬＭＷＳＤＦ）を含めた不溶性、可溶性並びに総食物繊維を決定するためのＭｃＣｌｅａｒｙ  ｆｉｂｅｒ法（Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、上記、Ｍｅｔｈｏｄ  ２０１１．２５）を使用して測定され得る。食物繊維の割合は、Ｌｅｅ法を使用しても測定され得る（Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、上記、Ｍｅｔｈｏｄ  ９９１．４３）。
【００４８】
一部の実施形態において、本明細書の実施例に例示されるように、この文書は、配列番号６〜８：ＴＴＣＡＧＡＡＣＣＧＡＣＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＧＴＧＧＡＡＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＡＴＧＧＴＧＴＡＡＣＣＡ（配列番号６）、ＴＡＴＡＣＧＡＧＡＴＴＧＡＣＣＣＡＡＣＧＣＴＧＡＡＡＧＡＴＴＴＴＣＧＧＡＧＣＣＡＴＣＴＴＧＡＣＴＡ（配列番号７）、及び／又はＴＣＣＴＧＡＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＴＣＣＴＧＧＴＧＣＣＴＧＡＣＧＧＣＧＡ（配列番号８）のうちの少なくとも１つに特異的に結合するレアカッティングエンドヌクレアーゼ（複数可）が、上記配列のうちの少なくとも１つを含有するＳＢＥＩＩポリペプチドをコードしている内在性配列を標的するような１つ又は複数のレアカッティングエンドヌクレアーゼを使用して内在性ＳＢＥＩＩａ対立遺伝子へ欠失若しくは挿入を導入することによりコムギ植物を操作する方法を提供する。
【００４９】
改変された植物細胞は、穀物を産生する完全なコムギ植物に再生され得、改変されたコムギ植物は、改変されたコムギ植物が得られた親（ワイルドタイプ）植物と比較され得る。再生された植物から得られる穀物は、総タンパク質含有量及びアミロース含有量が同時に増大することによって一般に特徴付けられ得る。総タンパク質含有量は、対応するワイルドタイプコムギの総タンパク質含有量と比較して、約５〜２０％又はより多く（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％又は少なくとも２０％）増大され得る。アミロース含有量（総デンプンのパーセンテージとして）は、ワイルドタイプコムギのアミロース含有量と比較して、約５〜５０％又はより多く（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％又は少なくとも５０％）増大され得る。加えて、アミロペクチン含有量（総デンプンのパーセンテージ％として）は、ワイルドタイプコムギのアミロペクチン含有量と比較して、約５〜４０％又はより少なく（例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％又は少なくとも４０％）低下され得る。更に、一部の場合において、総デンプン含有量は、ワイルドタイプコムギの総デンプン含有量と比較して、約５〜２０％（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％又は少なくとも１５％）低下され得る。
【００５０】
この文書は、本明細書に提供される穀物から又はそれを使用して産生される小麦粉、挽き割り粉、生地及び他の産物も提供する。これらの産物は、例えば分画又は漂白によって加工されなくても又は加工されてもよい。この文書は、本明細書に提供したコムギ植物から得られる食品生産に有用なコムギ穀物を更に提供する。加えて、この文書は、他の方法で加工された穀物を包含し、そのため、穀物は、製粉され、挽かれ、ローラーでつぶされ、精白され、粗びきされ、若しくは挽き割りにされ、又は湯が（ポレンタ）かれていてもよい。
【００５１】
本発明は、以下の例において更に記載されることになり、その例は、請求項に記載される発明の範囲を制限しない。
【実施例】
【００５２】
実施例１−配列特異的ヌクレアーゼを操作して、ＳＢＥＩＩａ対立遺伝子に突然変異を誘発する
コムギ属植物においてＳＢＥＩＩａ対立遺伝子を減弱する又は不活性化するために、ＳＢＥＩＩａコード配列内の保存ヌクレオチドを標的するように配列特異的ヌクレアーゼを設計した。ＴＡＬＥヌクレアーゼ結合に対するＳＢＥＩＩａ同祖対立遺伝子内の保存配列を同定するために、ゲノムＡ、Ｂ及びＤのＳＢＥＩＩａ対立遺伝子の部分配列を、プライマーｏＮＪＢ０１１（５’−ＡＣＴＣＣＴＣＴＣＧＴＡＣＧＣＣＴＣＧＣ；配列番号４）及びｏＮＪＢ０１３（５’−ＣＣＡＡＴＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴＧＴＴＧＧＴＣＡ；配列番号５）を使用してＰＣＲによって増幅させた。ＳＢＥＩＩａ遺伝子のエクソン２及び３のヌクレオチド配列を、図１に示す。多数のＳＮＰが、ＳＢＥＩＩａ−Ａ、Ｂ及びＤ同祖対立遺伝子間で同定され、ＴＡＬＥヌクレアーゼ設計を困難にした。３つのＴＡＬＥヌクレアーゼ標的部位を選択し、各標的部位において同祖対立遺伝子間に少なくとも１つのヌクレオチドの差異が存在した。ＴＡＬＥヌクレアーゼＴａＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０１、ＴａＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０２及びＴａＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０３の予測された結合部位は、それぞれＴＡＴＡＣＧＡＧＡＴＴＧＡＣＣＣＡＡＣＧＣＴＧＡＡＡＧＡＴＴＴＴＣＧＧＡＧＣＣＡＴＣＴＴＧＡＣＴＡ（配列番号７）、ＴＴＣＡＧＡＡＣＣＧＡＣＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＧＴＧＧＡＡＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＡＴＧＧＴＧＴＡＡＣＣＡ（配列番号６）及びＴＣＣＴＧＡＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＴＣＣＴＧＧＴＧＣＣＴＧＡＣＧＧＣＧＡ（配列番号８）であった。ＴＡＬＥヌクレアーゼ対は、他で記載されている方法と類似の方法を使用して合成された（Ｃｅｒｍａｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３９：ｅ８２頁、２０１１年；Ｒｅｙｏｎら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３０：４６０〜４６５頁、２０１２年；及びＺｈａｎｇら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９：１４９〜１５３頁、２０１１年）。代表的なＳＢＥＩＩａ遺伝子中のＴＡＬＥヌクレアーゼ標的部位の相対的な位置を、図２に示す。各ＳＢＥＩＩａ遺伝子中のＴＡＬＥヌクレアーゼの予測されるヌクレオチド標的部位を、図３に示す。
【００５３】
実施例２−Ｔ．エスチバムのＳＢＥＩＩａ  ＴＡＬＥヌクレアーゼ対の内在性標的部位におけるＳＢＥＩＩａ  ＴＡＬＥヌクレアーゼ対の活性
内在性標的配列におけるＴＡＬＥヌクレアーゼ活性を評価するために、ＴＡＬＥヌクレアーゼ対をコムギゲノム内に安定に組み込み、標的部位を、ＮＨＥＪによって導入された突然変異について調査する。アグロバクテリウム又は微粒子銃のいずれかによってコムギ属ゲノムにＤＮＡを組み込む方法を、他で記載されている通り実行する（Ｃｈｅｎｇら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、１１５：９７１〜９８０頁、１９９７年；Ｒａｓｃｏ−Ｇａｕｎｔら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｏｔａｎｙ、５２：８６５〜８７４頁、２０００年）。形質転換細胞を選択及び再生培地上に置き、トランスジェニックカルス又は小植物体を作製する。ＴＡＬＥヌクレアーゼ活性を評価するために、トランスジェニックカルス又は小植物体のゲノムＤＮＡを臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）に基づく方法を使用して抽出し、ＴＡＬＥヌクレアーゼ標的配列を増幅するために設計したプライマーを使用するＰＣＲの鋳型として使用する。得られたアンプリコンを、次世代シークエンス法（例えば、４５４パイロシークエンス）又は比較的小さいｉｎｄｅｌを検出するための他の方法（例えば、Ｔ７エンドヌクレアーゼダイレクトシークエンス）によってＮＨＥＪ突然変異について評価する。また、ＴＡＬＥヌクレアーゼ活性を、プロトプラストに一過性に発現するＴＡＬＥヌクレアーゼ対によって評価する。プロトプラスト調製及び形質転換の方法は、他（Ｈｅら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、１４：１９２〜１９６頁、１９９４年）に記載される通り、わずかな改変を加えて実行される。簡潔には、１〜２週齢のｉｎ  ｖｉｔｒｏ栽培した苗の葉を使用してプロトプラストを調製した。苗（約４０個）を根より上で切断し、葉を、小さい（およそ１〜２ｍｍ）切片に細かく切った。切片を、マセロザイム（０．７５％）及びセルロース（１．５０％）を含有する酵素溶液へ移した。酵素−植物混合物を、２５ｒｐｍで振盪しながら２５℃で６〜７時間インキュベートした。消化後に、溶液を１００ミクロンフィルターに通し、遠心分離１００ｇ、５分間によってプロトプラストをペレット化した。細胞を、Ｗ５（１５４ｍＭ塩化ナトリウム、１２５ｍＭ塩化カルシウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．７）に再懸濁した。プロトプラスト−Ｗ５溶液を、０．５５Ｍスクロースを含有する管へ次いで移した。溶液を、１０００ｇで５分間回転させた。スクロースクッション上のプロトプラストを取り出し、Ｗ５を含有する管へ移した。細胞を、計数し、ペレット化し、１ｍＬあたり１，０００，０００個細胞の濃度になるようにＭＭＧ（０．４Ｍマンニトール、１５ｍＭ塩化マグネシウム、４ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．７）に再懸濁した。細胞を、ポリエチレングリコールを使用して形質転換した。ＴａＳＢＥＩＩａ  ＴＡＬＥヌクレアーゼモノマーをコードしているＤＮＡを、形質転換溶液に添加した。各プラスミド１５マイクログラム（合計３０マイクログラム）を、各反応に添加した。形質転換後に、細胞を２５℃で４８時間インキュベートした。インキュベーション後に、細胞をペレット化し、ＤＮＡを単離した。このＤＮＡを、ＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０３標的部位を増幅するためにプライマーｏＮＪＢ０１５（ＧＡＧＡＧＡＴＡＧＣＴＧＧＡＴＴＡＧＧＣＧＡＴＣＧ、配列番号９）及びｏＮＪＢ０１６（ＴＴＣＡＧＴＧＧＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＧＣ、配列番号１０）又はＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０１及びＴ０２標的部位を増幅するためにプライマーｏＮＪＢ０１７（ＴＣＡＧＡＴＧＧＡＴＧＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＣＡＡＧ、配列番号１１）及びｏＮＪＢ０１８（ＴＣＣＣＡＧＣＡＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＣＡ、配列番号１２）を使用するＰＣＲ増幅の鋳型として使用した。
【００５４】
ＴａＳＢＥＩＩａ  ＴＡＬＥヌクレアーゼ対によって導入された突然変異を評価するために、ＰＣＲアンプリコンを、４５４パイロシークエンスを使用してディープシーケンシングした。驚くべきことに、標的配列における差異にもかかわらず、ＴＡＬＥヌクレアーゼの対の全てが、３つ全ての同祖対立遺伝子に突然変異を創出したことを観察した。具体的には、ＴＡＬＥヌクレアーゼ対ＴａＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０１の突然変異頻度は、ＴａＳＢＥＩＩａ−Ａ標的で１０．３％、ＴａＳＢＥＩＩａ−Ｂ標的で６．２１％、及びＴａＳＢＥＩＩａ−Ｄ標的で１１．８７％であった。ＴＡＬＥヌクレアーゼ対ＴａＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０２の突然変異頻度は、ＴａＳＢＥＩＩａ−Ａ標的で１３．８９％、ＴａＳＢＥＩＩａ−Ｂ標的で４．９３％、及びＴａＳＢＥＩＩａ−Ｄ標的で５．０３％であった。ＴＡＬＥヌクレアーゼ対ＴａＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０３の突然変異頻度は、ＴａＳＢＥＩＩａ−Ａ標的で１７．７３％、ＴａＳＢＥＩＩａ−Ｂ標的で２０．５７％、及びＴａＳＢＥＩＩａ−Ｄ標的で３４．５８％であった。
【００５５】
ＳＢＥＩＩａ−Ａ対立遺伝子にＴＡＬＥヌクレアーゼ対ＴａＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０１によって導入された突然変異を、配列番号１３〜５１５に示す。
【００５６】
ＳＢＥＩＩａ−Ｂ対立遺伝子にＴＡＬＥヌクレアーゼ対ＴａＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０１によって導入された突然変異を、配列番号５１６〜６９５に示す。
【００５７】
ＳＢＥＩＩａ−Ｄ対立遺伝子にＴＡＬＥヌクレアーゼ対ＴａＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０１によって導入された突然変異を、配列番号６９６〜９５５に示す。
【００５８】
ＳＢＥＩＩａ−Ａ対立遺伝子にＴＡＬＥヌクレアーゼ対ＴａＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０２によって導入された突然変異を、配列番号９５６〜１５２２に示す。
【００５９】
ＳＢＥＩＩａ−Ｂ対立遺伝子にＴＡＬＥヌクレアーゼ対ＴａＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０２によって導入された突然変異を、配列番号１５２３〜１６２９に示す。
【００６０】
ＳＢＥＩＩａ−Ｄ対立遺伝子にＴＡＬＥヌクレアーゼ対ＴａＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０２によって導入された突然変異を、配列番号１６３０〜１７１１に示す。
【００６１】
ＳＢＥＩＩａ−Ａ対立遺伝子にＴＡＬＥヌクレアーゼ対ＴａＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０３によって導入された突然変異を、配列番号１７１２〜２１８５に示す。
【００６２】
ＳＢＥＩＩａ−Ｂ対立遺伝子にＴＡＬＥヌクレアーゼ対ＴａＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０３によって導入された突然変異を、配列番号２１８６〜３２０７に示す。
【００６３】
ＳＢＥＩＩａ−Ｄ対立遺伝子にＴＡＬＥヌクレアーゼ対ＴａＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０３によって導入された突然変異を、配列番号３２０８〜５０８０に示す。
【００６４】
再現性を確実にするために、プロトプラスト実験を繰り返し、ＴＡＬＥヌクレアーゼ標的部位を包含するアンプリコンを、ディープシーケンシングした。ＳＢＥＩＩａ−Ａ又はＳＢＥＩＩａ−Ｂ又はＳＢＥＩＩａ−Ｄ対立遺伝子にＴＡＬＥヌクレアーゼ対ＴａＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０１によって導入された突然変異を、配列番号５０８３〜７２６８に示す。ＳＢＥＩＩａ−Ａ又はＳＢＥＩＩａ−Ｂ又はＳＢＥＩＩａ−Ｄ対立遺伝子にＴＡＬＥヌクレアーゼ対ＴａＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０２によって導入された突然変異を、配列番号７２６９〜８７６３に示す。ＳＢＥＩＩａ−Ａ又はＳＢＥＩＩａ−Ｂ又はＳＢＥＩＩａ−Ｄ対立遺伝子にＴＡＬＥヌクレアーゼ対ＴａＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０３によって導入された突然変異を、配列番号８７６４〜１１８８９に示す。
【００６５】
コムギ細胞におけるＴＡＬＥヌクレアーゼ誘導ＳＢＥＩＩａ突然変異の大多数は、１５ヌクレオチドのＴＡＬＥヌクレアーゼスペーサーの８位又は９位にヌクレオチドの欠失を含んだ。具体的には、ＴＡＬＥヌクレアーゼ対ＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０１は、配列番号１の１０９７位にアデニンヌクレオチドの欠失を含むＳＢＥＩＩａ−Ａ対立遺伝子に突然変異を導入した。ＴＡＬＥヌクレアーゼ対ＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０１は、配列番号５０８１の１３７６位にアデニンヌクレオチドの欠失を含むＳＢＥＩＩａ−Ｂ対立遺伝子に突然変異を導入した。ＴＡＬＥヌクレアーゼ対ＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０１は、配列番号５０８２の１３７０位にアデニンヌクレオチドの欠失を含むＳＢＥＩＩａ−Ｄ対立遺伝子に突然変異を導入した。ＴＡＬＥヌクレアーゼ対ＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０２は、配列番号１の９７７位にグアニンヌクレオチドの欠失を含むＳＢＥＩＩａ−Ａ対立遺伝子に突然変異を導入した。ＴＡＬＥヌクレアーゼ対ＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０２は、配列番号５０８１の１２５６位にグアニンヌクレオチドの欠失を含むＳＢＥＩＩａ−Ｂ対立遺伝子に突然変異を導入した。ＴＡＬＥヌクレアーゼ対ＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０２は、配列番号５０８２の１２５０位にグアニンヌクレオチドの欠失を含むＳＢＥＩＩａ−Ｄ対立遺伝子に突然変異を導入した。ＴＡＬＥヌクレアーゼ対ＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０３は、配列番号１の５３９位にグアニンヌクレオチドの欠失を含むＳＢＥＩＩａ−Ａ対立遺伝子に突然変異を導入した。ＴＡＬＥヌクレアーゼ対ＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０３は、配列番号５０８１の８１３位にグアニンヌクレオチドの欠失を含むＳＢＥＩＩａ−Ｂ対立遺伝子に突然変異を導入した。ＴＡＬＥヌクレアーゼ対ＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０３は、配列番号５０８２の８１１位にグアニンヌクレオチドの欠失を含むＳＢＥＩＩａ−Ｄ対立遺伝子に突然変異を導入した。
【００６６】
実施例３−ＴＡＬＥヌクレアーゼ誘導ＳＢＥＩＩａ突然変異を持つＴ．エスチバム系の再生
１つ以上のＳＢＥＩＩａ対立遺伝子における突然変異を持つＴ．エスチバム系を創出した。Ｔ．エスチバムからの植物部分（例えば、未成熟な胚盤、未成熟胚又は胚発生カルス）に、ＴＡＬＥヌクレアーゼ対及び植物安定マーカーをコードしている１つ又は複数のプラスミドを打ち込んだ。別法として、植物部分を、ＴＡＬＥヌクレアーゼ対及び植物を選択可能なマーカーをコードしている１つ以上のＴ−ＤＮＡを含むアグロバクテリウムによって形質転換する。形質転換後に、植物部分を、選択及び再生培地上に置いた。再生のための材料及び方法を、他で記載されている通りに使用した（Ｓｐａｒｋｓら、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、４７８：７１〜９２頁、２００９年）。プラスミド及びＴ−ＤＮＡは、除草剤耐性を付与し、トランスジェニック植物の選択を容易にするための選択可能なマーカー（例えば、ビアラホス）を含有した。形質転換効率を、対照プラスミド又はｐＮｏｓ：ＹＦＰ及びｐＮｏｓ：Ｂａｒ若しくはｐＮｏｓ：ＰＭＩを含有するＴ−ＤＮＡプラスミドを使用してモニタリングした。ゲノムにこのＤＮＡを安定して組み込んだ細胞又は植物を可視化するために、蛍光立体顕微鏡を使用して、ｐＮｏｓ：ＹＦＰで形質転換した細胞で発現するＹＦＰを可視化した。
【００６７】
３４件の実験（表１）を、ＤＮＡ送達方法として微粒子銃を使用して実施した。コムギ胚盤を未成熟な穀粒から単離し、形質転換及び完全なトランスジェニック植物の再生に使用した。３６００個を超える胚盤を単離し、ＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０３  ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ｐＣＬＳ２７２２４、ｐＣＬＳ２７２２５）をコードしているプラスミドで形質転換した。
【００６８】
選択に対して再生されたＴ０植物全体を、土壌に移した。約１週間の順化期間後、ＤＮＡを葉から単離し、組み込まれたプラスミドＤＮＡの存在についてスクリーニングした。２０個のトランスジェニック植物を同定し、形質転換効率０．５５％を得た。
【００６９】
２０個のトランスジェニック植物を、ＰＣＲ、クローニング及びサンガーシークエンスによるＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０３標的部位における突然変異に対する遺伝子型スクリーニングへ次いで進めた。各ＳＢＥＩＩａ遺伝子に特異的なプライマーを使用して、ＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０３標的部位を増幅した。ＡゲノムにおいてＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０３標的部位を増幅するために使用したプライマーは、ｏＪＧ０２９（ＣＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＧＣＧＡＴ；配列番号１１９０２）及びｏＪＧ０３０（ＴＧＴＡＧＣＣＡＴＣＡＡＴＴＡＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧ；配列番号１１９０３）であった。ＢゲノムにおいてＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０３標的部位を増幅するために使用したプライマーは、ｏＪＧ０３１（ＧＧＣＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＧＡＴＣ；配列番号１１９０４）及びｏＪＧ０３２（ＣＡＡＴＴＧＴＡＧＣＣＡＧＣＡＡＴＴＡＴＡＣＡＴＡ；配列番号１１９０５）であった。ＤゲノムにおいてＳＢＥＩＩａ＿Ｔ０３標的部位を増幅するために使用したプライマーは、ＳＢＥＩＩａ−Ｄ−Ｌ１（ＴＴＴＴＣＣＣＣＧＣＧＧＧＧＡＡＡＴＧＣＧ；配列番号１１９０６）及びｏＮＪＢ０３３（ＴＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴＧＴＴＧＧＴＣＡＡＴＡＧＣＡＧＣ；配列番号１１９０７）であった。得られたアンプリコンをクローニングし、シーケンシングした。
【００７０】
１つ、２つ又は３つ全てのＳＢＥＩＩａ遺伝子の突然変異を持つ４つのＴ０植物を同定した。これらのＴ０植物は、Ｔａ１２５−２、Ｔａ１２８−１、Ｔａ１３７−１及びＴａ１３９−１と称される。
【００７１】
Ｔａ１２５−２は、ＳＢＥＩＩａ−Ａ、ＳＢＥＩＩｂ−Ｂ及びＳＢＥＩＩａ−Ｄ遺伝子に突然変異を含有した（図４）。ＳＢＥＩＩａ−Ａ遺伝子中に同定された突然変異は、２ｂｐ挿入（配列番号１１９０９）及び２３ｂｐ欠失（配列番号１１９１０）であった。ＳＢＥＩＩａ−Ｂ遺伝子中に同定された突然変異は、４ｂｐ欠失（配列番号１１９１２）及び２０ｂｐ欠失（配列番号１１９１３）であった。ＳＢＥＩＩａ−Ｄ遺伝子中に同定された突然変異は、４ｂｐ欠失（配列番号１１９１５）及び１２ｂｐ欠失（配列番号１１９１６）であった。
【００７２】
Ｔａ１２８−１は、ＳＢＥＩＩｂ−Ｂ及びＳＢＥＩＩａ−Ｄ遺伝子に突然変異を含有した（図５）。ＳＢＥＩＩａ−Ｂ遺伝子中に同定された突然変異は、１ｂｐ挿入（配列番号１１９１７）及び１ｂｐ欠失（配列番号１１９１８）であった。ＳＢＥＩＩａ−Ｄ遺伝子中に同定された突然変異は、２１ｂｐ欠失（配列番号１１９１９）及び８９０ｂｐ欠失（配列番号１１９２０）であった。
【００７３】
Ｔａ１３７−１は、ＳＢＥＩＩａ−Ａ、ＳＢＥＩＩｂ−Ｂ及びＳＢＥＩＩａ−Ｄ遺伝子に突然変異を含有した（図６Ａ及び図６Ｂ）。ＳＢＥＩＩａ−Ａ遺伝子中に同定された突然変異は、４ｂｐ欠失（配列番号１１９２１）、７ｂｐ欠失（配列番号１１９２２）、１３ｂｐ欠失（配列番号１１９２３）及び１６７ｂｐ欠失（配列番号１１９２４）であった。ＳＢＥＩＩａ−Ｂ遺伝子中に同定された突然変異は、１７ｂｐ欠失（配列番号１１９２５）であった。ＳＢＥＩＩａ−Ｄ遺伝子中に同定された突然変異は、６ｂｐ欠失（配列番号１１９２６）、１０ｂｐ欠失（配列番号１１９２７）、１３ｂｐ欠失（配列番号１１９２８）、１４ｂｐ欠失（配列番号１１９２９）及び１５ｂｐ欠失（配列番号１１９３０）であった。
【００７４】
Ｔａ１３９−１は、ＳＢＥＩＩａ−Ａ、ＳＢＥＩＩｂ−Ｂ及びＳＢＥＩＩａ−Ｄ遺伝子中に突然変異を含有した（図７）。ＳＢＥＩＩａ−Ａ遺伝子中に同定された突然変異は、４ｂｐ欠失（配列番号１１９３１）であった。ＳＢＥＩＩａ−Ｂ遺伝子中に同定された突然変異は、４ｂｐ欠失（配列番号１１９３２）、１０ｂｐ欠失（配列番号１１９３３）及び２２ｂｐ欠失（配列番号１１９３４）であった。ＳＢＥＩＩａ−Ｄ遺伝子中に同定された突然変異は、１１ｂｐ欠失（配列番号１１９３５）及び１７ｂｐ欠失（配列番号１１９３６）であった。
【００７５】
後代に突然変異を安定して伝えるコムギ系を生成するために、系Ｔａ１２５−２を自家受粉させ、後代をホモ接合性突然変異についてスクリーニングした。系Ｔａ１２５−２を１回自家受粉させた後、ＳＢＥＩＩａ−Ａ、ＳＢＥＩＩａ−Ｂ、ＳＢＥＩＩａ−Ｄ対立遺伝子それぞれに対応して、遺伝子型−２３／−２３、−４／−４、−１２／−１２を持つ変異体を生成した。得られた植物をＴａ１２５−２−１４と命名し、配列番号１１９１０、１１９１２及び１１９１６に示す突然変異を含有させた（図８）。系Ｔａ１２５−２を３回自家受粉させた後、フレームシフトをもたらすと予測されたホモ接合性突然変異を持つ変異体を２つ生成した。Ｔａ１２５−２−４４−１−１ａ（−２３／−２３、−４／−４、−４／−４）と命名した第１の系は、ＳＢＥＩＩａ−Ａ、ＳＢＥＩＩａ−Ｂ、ＳＢＥＩＩａ−Ｄ対立遺伝子それぞれに対応して、遺伝子型−２３／−２３、−４／−４、−４／−４を有する。得られた植物［Ｔａ１２５−２−４４−１−１ａ（−２３／−２３、−４／−４、−４／−４）］は、配列番号１１９１０、１１９１２及び１１９１５に示す突然変異を含有した（図９）。Ｔａ１２５−２−４４−１−２ａ（−２３／−２３、−２０／−２０、−４／−４）と命名した第２の系は、ＳＢＥＩＩａ−Ａ、ＳＢＥＩＩａ−Ｂ、ＳＢＥＩＩａ−Ｄ対立遺伝子それぞれに対応して、遺伝子型−２３／−２３、−２０／−２０、−４／−４を有する。得られた植物［Ｔａ１２５−２−４４−１−２ａ（−２３／−２３、−２０／−２０、−４／−４）］は、配列番号１１９１０、１１９１３及び１１９１５に示す突然変異を含有した（図１０）。
【００７６】
多重ＰＣＲを実行して、形質転換に使用したベクターからのＤＮＡの組み込みを検出した。ＰＣＲは、Ｔａ１２５−２−４４（Ｔａ１２５−２−４４−１−１ａ及びＴａ１２５−２−４４−１−２ａを含む）の後代である６つの系において形質転換したベクターからの配列を増幅できなかった、そのため、導入遺伝子が分離し離れ去っていることを示した。
【００７７】
実施例４−改変されたＴ．エスチバム植物における表現型の評価
ＳＢＥＩＩａ対立遺伝子に突然変異を含有するＴ．エスチバム植物を、総タンパク質及びデンプン含有量、総デンプン中のアミロース及びアミロペクチンのパーセント、並びに総難消化性デンプン及び食物繊維について評価した。組成物分析を、温室条件及び圃場条件で栽培した植物において実行した。
【００７８】
タンパク質含有量を、Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＡＡＣＣ  ４６〜３０及びＡＯＡＣ  ９９２．１５（Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ＡＯＡＣ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ［２００５年］第１８版、ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）に従って決定した。総デンプン及び難消化性デンプンを、Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ＡＯＡＣ  ２００２．０２（上記、Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＡＯＡＣ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ）に従って算出した。アミロース／アミロペクチン比を決定するために、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｂｒａｙ、Ｃｏｕｎｔｙ  Ｗｉｃｋｌｏｗ、Ｉｒｅｌａｎｄ）製Ａｍｙｌｏｓｅ  Ｋｉｔ（Ｋ−ＡＭＹＬ）を使用した。アミロース含有量を分析する別法として、他で記載されているヨウ素結合及び／又はコンカナバリンＡ法を実行する（Ｚｈｕら、Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍ、８５：５１〜５８頁、２００８年；及びＧｉｂｓｏｎら、Ｊ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉ、２５：１１１〜１１９頁、１９９７年）。総食物繊維を、Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＡＯＡＣ  ２００９．０１及び２０１１．２５（Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＡＯＡＣ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ、上記）に従って算出した。
【００７９】
３〜４つの生物学的反復及び１〜３回の技術的反復を使用して、以下の群：（１）Ｔａ１２５−２−４４−１ａ（−２３／−２３、−４／−４、−４／−４）、（２）Ｔａ１２５−２−４４−２ａ（−２３／−２３、−２０／−２０、−４／−４）、（３）Ｔａ１２５−２−１４（−２３／−２３、−４／−４、−１２／−１２）、並びに（４）ワイルドタイプ対照から抽出した精白小麦粉中のタンパク質、デンプン、アミロース、アミロペクチン、難消化性デンプン及び食物繊維の含有量を決定した。
【００８０】
温室条件で栽培した植物から得られた結果は、ワイルドタイプ対照と比較して、完全なノックアウト及び部分的なノックアウト系における総タンパク質の有意な増大を示したが、総デンプンは有意に減少した。アミロース含有量は、完全なノックアウト系、Ｔａ１２５−２−４４−１−１ａ（−２３／−２３、−４／−４、−４／−４）及びＴａ１２５−２−４４−１−２ａ（−２３／−２３、−２０／−２０、−４／−４）それぞれにおいて、ワイルドタイプ対照より２６．５％〜４９．９％及び５０．３％高かった。部分的なノックアウトは、ＷＴと類似のアミロース含有量を示した（表１）。類似の結果が、圃場条件で栽培した植物から得られ、完全なノックアウト及び部分的なノックアウト系は、より高いタンパク質、より低いデンプン含有量を示し、完全なノックアウト系は、より高いアミロース含有量を示した（表２）。
【００８１】
難消化性デンプン及び総食物繊維レベルは、完全なノックアウト試料において有意により高く見られたが、部分的なノックアウト試料においては見られなかった。温室条件で栽培した完全なノックアウト系は、ワイルドタイプ対照と比較して、精白小麦粉中の難消化性デンプンにおいて７〜８倍の増大を示し、Ｔａ１２５−２−４４−１−１ａ（−２３／−２３、−４／−４、−４／−４）及びＴａ１２５−２−４４−１−２ａ（−２３／−２３、−２０／−２０、−４／−４）それぞれにおいて２．２％〜２５．９％及び２８．８％増大した（表３）。温室で栽培した植物と圃場条件で栽培した植物の両方において、精白小麦粉中の総食物繊維は、ワイルドタイプ対照と比較して完全なノックアウト系において有意に増大した。圃場において栽培した完全なノックアウト系は、６．２倍の総食物繊維含有量の増大を示した（表３及び表４）。食物繊維を、温室条件で栽培した植物の全粒粉試料において定量化し、ワイルドタイプ対照と比較して２倍、ワイルドタイプ対照における１８％からＴａ１２５−２−４４−１−１ａ（−２３／−２３、−４／−４、−４／−４）及びＴａ１２５−２−４４−１−２ａ（−２３／−２３、−２０／−２０、−４／−４）それぞれにおける３４．６５％及び３２．７４％への増大を示した（表５）。
【００８２】
実施例５−完全なノックアウトＴ．エスチバム植物における形態の評価
ＳＢＥＩＩａ対立遺伝子に完全なノックアウト突然変異を含有するＴ．エスチバム植物を、形態的特徴について評価した。独立した３つの植物に対して１〜３回の測定を行って、穂当たりの種子数を定量化し、植物の高さを決定した。発芽試験を、「ＡＯＳＡ  Ｒｕｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｅｅｄｓ：第１巻、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ」、６〜６３頁、２０１７年に記載の通り実行した。４００粒の種子をそれぞれ用いる独立した４回の反復を、完全なノックアウト変異体及びワイルドタイプ対照のそれぞれに対して行った。
【００８３】
植物の高さ及び穂当たりの種子数は、変異体系及びワイルドタイプ対照において同程度であった（図１１Ａ及び図１１Ｂ）。発芽は、ワイルドタイプ対照（９８％）と比較してＰ＝０．０５及びＰ＝０．０１両方のレベルでＴａ１２５−２−４４−１−２ａ系において有意に低かった（９４．５％）が、変異体系Ｔａ１２５−２−４４−１−１ａは、ワイルドタイプ対照と同程度の発芽効率を実証した（図１１Ｃ）。
【００８４】
【表２】
2021521874.tif 000006
【００８５】
【表３】
2021521874.tif 000007
【００８６】
【表４】
2021521874.tif 000008
【００８７】
【表５】
2021521874.tif 000009
【００８８】
【表６】
2021521874.tif 000010
【００８９】
他の実施形態
本発明について、その詳細な説明と組み合わせて記載してきたが、前述の説明は、例示することを意図するものであり、本発明の範囲を制限することを意図するものではなく、その範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義されることを理解すべきである。他の態様、優位性及び改変は、以下の特許請求の範囲内にある。
【００９０】
〔関連出願の相互参照〕
本出願は、２０１８年５月２日に出願の米国特許仮出願第６２／６６５，６４３号の優先権の利益を主張する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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