(57)【要約】  ＮＫ細胞をＥＧＦＲ陽性細胞に関与させるための四価の二重特異性ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質が記載される。様々な薬物動態（ＰＫ）特性を有するＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質が記載される。さらに、ＥＧＦＲ陽性腫瘍などのＥＧＦＲ陽性悪性腫瘍の治療のための二重特異性ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の使用が記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＧＦＲおよびＣＤ１６Ａに対する抗原結合部位を含む多特異性抗原結合タンパク質であって、抗原結合部位が、重鎖定常ドメインＣＨ２およびＣＨ３を含むポリペプチドに融合され、ＥＧＦＲに対する抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、
（ｉ）ＶＨが、配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含み、ＶＬが、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含み、または
（ｉｉ）ＶＨが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、ＶＬが、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する、多特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２】
ＣＤ１６Ａに対する抗原結合部位が、
（ｉ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号６もしくは１１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメイン（ＶＨ）、ならびに配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）、または
（ｉｉ）配列番号１２もしくは１４に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む、請求項１に記載の多特異性抗原結合タンパク質。
【請求項３】
抗原結合タンパク質が、ＥＧＦＲに対する少なくとも２つの抗原結合部位と、ＣＤ１６Ａに対する少なくとも２つの抗原結合部位とを含む、請求項１または２に記載の多特異性抗原結合タンパク質。
【請求項４】
抗原結合タンパク質が、２つのポリペプチド鎖からなり、各ポリペプチド鎖が、第１の抗原結合部位のＶＨにペプチドリンカーによって連結されたＶＬを含む第１の一本鎖Ｆｖユニット（ｓｃＦｖ１）であって、ＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドのＣＨ２ドメインにヒンジ領域によってＮ末端で融合される第１の一本鎖Ｆｖユニット（ｓｃＦｖ１）と、第２の抗原結合部位のＶＨにペプチドリンカーによって連結されたＶＬを含む第２の一本鎖Ｆｖユニット（ｓｃＦｖ２）であって、ＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドのＣＨ３ドメインにペプチドリンカーによってＣ末端で融合される第２の一本鎖Ｆｖユニット（ｓｃＦｖ２）と、を含む、請求項３に記載の多特異性抗原結合タンパク質。
【請求項５】
ｓｃＦｖ１が、ＣＤ１６Ａに対する抗原結合部位であり、ｓｃＦｖ２が、ＥＧＦＲに対する抗原結合部位である、請求項４に記載の多特異性抗原結合タンパク質。
【請求項６】
抗体が、Ｆ（ａｂ´）２断片およびＦｃ部分を含み、
（ｉ）Ｆ（ａｂ´）２断片が、ＣＤ１６Ａに対する２つのＦｖ抗原結合部位を含み、ＥＧＦＲに対する抗原結合部位を含む２つの一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が、Ｆｃ部分に融合され、ｓｃＦｖのそれぞれが、Ｆｃ部分のＣＨ３ドメインにＣ末端で融合され、または
（ｉｉ）Ｆ（ａｂ´）２断片が、ＥＧＦＲに対する２つのＦｖ抗原結合部位を含み、ＣＤ１６Ａに対する抗原結合部位を含む２つの一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が、Ｆｃ部分に融合され、ｓｃＦｖのそれぞれが、Ｆｃ部分のＣＨ３ドメインにＣ末端で融合される、請求項３に記載の多特異性抗原結合タンパク質。
【請求項７】
重鎖および軽鎖を含む、請求項６に記載の多特異性抗原結合タンパク質であって、
（ｉ）重鎖が、構造ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ（ＥＧＦＲ）−ＶＬ（ＥＧＦＲ）を有し、軽鎖が、構造ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＣＬを有し、または
（ｉｉ）重鎖が、構造ＶＨ（ＥＧＦＲ）−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）を有し、軽鎖が、構造ＶＬ（ＥＧＦＲ）−ＣＬを有する、多特異性抗原結合タンパク質。
【請求項８】
抗原結合タンパク質が、Ｆｃガンマ受容体に結合しないが、新生児Ｆｃ受容体に結合する、請求項１から７のいずれか一項に記載の多特異性抗原結合タンパク質。
【請求項９】
タンパク質が、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号２９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖、配列番号４３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖、または配列番号４５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の多特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１０】
（ｉ）血清アルブミンに対する抗原結合部位、または
（ｉｉ）抗原結合タンパク質に融合した血清アルブミン
をさらに含む、請求項１または９のいずれか一項に記載の多特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１１】
治療用化合物として使用するための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の多特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１２】
ＥＧＦＲ陽性細胞またはＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性細胞を特徴とするがんの治療に使用するための、請求項１１に記載の多特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１３】
がんが、結腸直腸がん、頭頸部がん、肺がんおよび神経膠芽腫からなる群から選択される、請求項１２に記載の使用のための多特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１４】
増殖性疾患または腫瘍性疾患を治療または改善する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１から１０のいずれか一項に記載の多特異性抗原結合タンパク質を投与する工程を含む、上記方法。
【請求項１５】
増殖性疾患または腫瘍性疾患が、ＥＧＦＲ陽性細胞またはＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性細胞を特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
増殖性疾患または腫瘍性疾患が、結腸直腸がん、頭頸部がん、肺がんおよび神経膠芽腫からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＧＦＲ陽性細胞にＮＫ細胞を関与させるための四価の二重特異性ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質、およびＥＧＦＲ陽性腫瘍などのＥＧＦＲ陽性悪性腫瘍の治療のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、いくつかの固形腫瘍の治療のための検証された標的である。ＥＧＦＲを標的とする現在のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）は、シグナル伝達の遮断を介して主に機能する。さらに、これらの薬剤による治療効果は、多数の患者に治療固有の耐性または獲得耐性を引き起こし得るチロシンキナーゼドメインのＴ７９０Ｍゲートキーパー変異、またはシグナル伝達カスケード（例えば、ＲＡＳまたはＲＡＦ）の下流の変異など、受容体またはシグナル伝達経路の変異状態に左右される。さらに、ＥＧＦＲ標的療法は、処方率に影響を与えると考えられる副作用と関連している。
【０００３】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、受容体チロシンキナーゼのＨＥＲファミリーのメンバーであり、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）の４つのメンバーからなる。リガンド結合による受容体の刺激（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦａ、ＨＢ−ＥＧＦ、ニューレグリン、ベータセルリン、アンフィレグリン）は、チロシンリン酸化を通じて固有の受容体チロシンキナーゼを活性化し、ＨＥＲファミリーメンバーとの受容体ホモ二量体化またはヘテロ二量体化を促進する。これらのホスホチロシンは、ＭＡＰＫおよびＰＩ（３）Ｋ／Ａｋｔを含む様々なアダプタータンパク質または酵素のドッキング部位として機能し、細胞増殖、血管新生、アポトーシス抵抗性、浸潤および転移に影響を与える多くのシグナル伝達カスケードを同時に開始する。
【０００４】
受容体チロシンキナーゼの上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーは、悪性腫瘍などの多種多様な病態生理学的状態の発症および増殖の促進因子として説明されており、多くのヒト上皮がんでは、ＥＧＦＲの異常な発現または活性が同定されている。具体的には、ＥＧＦＲ遺伝子は多くのがんで増幅されることが説明されており、ＥＧＦＲのキナーゼ活性化変異の多くが説明され、十分に特徴付けられている。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、ＥＧＦＲコード配列のエクソン２〜７にわたる塩基対のフレーム内欠失から生じる、ＥＧＦＲの細胞外ドメイン変異体であり、変異体をリガンドに結合できなくする。ＥＧＦＲｖＩＩＩ変異腫瘍では、ＥＧＦＲシグナル伝達は構成的に活性であり、それにより腫瘍の進行が促進されることが報告されている。また、ＥＧＦＲを含むＨＥＲファミリーメンバーに結合し活性化するリガンドは、オートクリン刺激ループ内で過剰発現するかオートクリン刺激ループに関与することが報告されている。さらに、ＨＥＲ２は多くのがんで遺伝子増幅され、自己リン酸化されたＨＥＲ２受容体（ホモ二量体化）または構成的に活性化されたヘテロ二量体（例えば、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２）を生じると説明されている。
【０００５】
ＥＧＦＲに特異的なＴＫＩが開発され、多くのがんに対して市販されているが、他のがん治療薬と同様に重度の副作用を示している。これらの副作用の理由は、正常な機能についてＥＧＦＲシグナル伝達に依存している組織内のＥＧＦＲ活性とＭＡＰＫなどの下流分子の活性との同時阻害である。これらの薬物が影響を及ぼす最も一般的な組織は皮膚である。副作用には、にきび様の発疹、皮膚乾燥、掻痒、爪の変化、および髪の変化が含まれる。皮膚でのＥＧＦＲシグナル伝達の重要性のため、ＴＫＩとともに皮膚毒性が頻繁に記載されている。結果として生じる重大な身体的および心理社会的不快感は、抗がん剤の中断または用量変更につながる可能性がある。
【０００６】
さらに詳細には、これらの部位でのＥＧＦＲ活性の阻害は、ケラチノサイトなどの正常なＥＧＦＲ陽性細胞の異常な増殖、遊走および／または分化、および炎症細胞の動員による皮膚の完全性の破壊をもたらし得る。ＥＧＦＲシグナル伝達の薬理学的または治療的に媒介される遮断は、生存についてＥＧＦＲに依存する正常細胞の増殖停止およびアポトーシスをもたらす。皮膚は３つの層から構成される。表皮は最も浅い層であり、真皮（支持および引張強度を提供する）および皮下組織（脂肪組織）を覆っている。表皮はケラチノサイト（細胞の約９０％）から主に構成されており、ケラチノサイトは、基底層および基底上層では最も高い数のＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）を発現する。毛包の基底層および膨隆部には増殖性の幹細胞が含まれており、増殖性の幹細胞は最終的に分化するケラチノサイトを生じ、このケラチノサイトが外側に遊走し、角質層を形成し、そこでは無核細胞が保護バリアを形成する。毛包の外毛根鞘は基底層に隣接しており、生化学的特性と高いＥＧＦＲ発現とを共有している。
【０００７】
ＴＫＩが基底ケラチノサイトに影響を及ぼし、皮膚の副作用の発現をもたらすことは広く認められている。ＥＧＦＲ標的阻害剤による治療中に、表皮細胞ではＥＧＦＲのリン酸化レベルが減少または消失することが示されており、この脱リン酸化レベルは皮膚毒性の程度と相関する。基底ケラチノサイトでのＥＧＦＲの阻害は、増殖停止および早期分化につながる。その後、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害は、重度の皮膚発疹などの特徴的な皮膚症状をいずれも引き起こす、増殖停止およびアポトーシスの誘発、細胞遊走の減少、細胞の付着および分化の増加、ならびに炎症の刺激により、ケラチノサイトなどのＥＧＦＲ発現細胞に影響を及ぼす。炎症は発疹に関連する多くの徴候および症状の原因であるが、主要な事象は薬物誘発性、抗体誘発性またはＴＫＩ誘発性のＥＧＦＲシグナル伝達の変化であると考えられる。
【０００８】
臨床試験では、効果は、主に発疹の形の皮膚毒性と関連している。これは、ＥＧＦＲを標的とするｍＡｂ、例えば、セツキシマブおよびパニツムマブ、ならびにＴＫＩの両方に当てはまる。全体として、ＥＧＦＲ標的薬剤を使用した多くの第ＩＩ相および第ＩＩＩ相臨床試験は、発疹発生率、重症度および生存率の間の関連を示している。
【０００９】
セツキシマブは、サルを対象としたピボタル反復投与毒性試験では、最初の高負荷用量後に、７．５、２４および７５ｍｇ／ｋｇの用量で週１回投与された。セツキシマブの皮膚毒性の発現は、高、中および低用量群では、それぞれ１５、２２および６４日後に観察された。さらに、パニツムマブの投与後７〜１４日以内に（すなわち、２または３回の投与後に）皮膚毒性が観察された。
【００１０】
モノクローナル抗体ニモツズマブの臨床経験は、臨床効果が、低い毒性プロファイルを伴うこともあることを示唆している。ＥＧＦＲを標的とする他のモノクローナル抗体と関連する典型的な重度の皮膚毒性は、ニモツズマブでは観察されておらず、中から高レベルのＥＧＦＲを発現する細胞に限定される結合に起因する可能性がある。
【００１１】
ＥＧＦＲ＋腫瘍細胞を排除する別のアプローチは、Ｌｕｔｔｅｒｂｕｓｅら（ＰＮＡＳ  ２０１０，１０７（２８），ｐ１２６０５）に記載されているＢｉＴＥ構築物などの二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーの使用であった。しかし、このタイプのアプローチからは、受容体遮断から免疫細胞の動員を介して標的細胞を排除し、それにより標的細胞を死滅させる作用機序の単純な変化は、すでにカニクイザルを用いたμｇ／ｋｇ／ｄ範囲実験での比較的低用量の投与後、重度の肝臓および腎臓毒性の観察のために終了しなければならなかったことから、重度の副作用を回避するのに成功しなかったことが示された。
【発明の概要】
【００１２】
したがって、本発明の課題は、腫瘍特異的殺傷能力を有し、リン酸化に対する作用が低下しているか全くなく、皮膚毒性が軽微から無であるＥＧＦＲ標的治療薬を提供することである。
【００１３】
この課題は、特許請求の範囲で定義された主題によって解決される。
【００１４】
ＥＧＦ誘発性ＥＧＦＲリン酸化に対する阻害作用が全くないか、ほとんどないことを示す、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞ベースのＥＧＦＲ標的アプローチのためのＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質を提供する（例６）。これは、本明細書で提供されるＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質が、組織の恒常性についてＥＧＦＲシグナル伝達に依存する組織、例えば皮膚での毒性の低下を示すことを示唆している。
【００１５】
ＥＧＦＲのＥＧＦ媒介リン酸化に対する作用は、抗原結合タンパク質の特定の３次元構造の固有の特性と関連しているはずである。
【００１６】
さらに、本明細書に記載される、ＥＧＦＲに対する抗原結合部位は、ＥＧＦＲｖＩＩＩにも結合する（例３）。したがって、ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質は、ＥＧＦＲ発現がんおよびＥＧＦＲｖＩＩＩ発現がんの両方の治療に使用することができる。ＥＧＦＲとは対照的に、ＥＧＦＲｖＩＩＩはがん細胞のみに発現し、健康な組織には発現しない。したがって、本明細書に記載されるＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質により、さらに多様なＥＧＦＲ陽性腫瘍および／またはＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性腫瘍、ひいては、さらに広範囲な患者集団を標的とすることができる。
【００１７】
本発明は、ＮＫ細胞媒介殺傷の方向をＥＧＦＲ陽性腫瘍および／またはＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性腫瘍に変えるように設計された様々な薬物動態（ＰＫ）特性を有する様々な多特異性、特に二重特異性ＮＫ細胞関与抗原結合タンパク質を提供する。Ｆｖ抗体結合ドメイン、および様々な抗体または抗体断片融合フォーマットを使用して、ヒトおよびカニクイザルのＥＧＦＲおよびＣＤ１６Ａを標的とする様々な二重特異性ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質を設計した。
【００１８】
増大した血清半減期は、インビボでの使用に適している。ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質は、ＩｇＧベースの抗体に匹敵する投薬を可能にする薬物動態（ＰＫ）プロファイルを有する抗体を含め、様々な血清半減期を有する。血清半減期の延長にもかかわらず、本明細書に記載されるＦｃ融合抗原結合タンパク質はまた、他のＥＧＦＲ標的療法と比較して、選択されたＢｉ−ｓｃＦｖ−ＦｃおよびｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ抗原結合タンパク質の特定の３Ｄ立体配座によってもたらされる改善された安全性プロファイル、例えば、皮膚毒性の低下に関与する。したがって、本発明は、モノクローナル抗体と同様の薬物動態プロファイルを有するが、改善された安全性プロファイルをさらに有する抗原結合タンパク質を提供する。
【００１９】
ＣＤ１６Ａ受容体を介したＮＫ細胞が、多特異性抗原結合タンパク質によってＥＧＦＲ陽性腫瘍細胞（そのＥＧＦＲ抗原を介して）に関与すると、強力な活性化シグナルを生じる免疫シナプスを形成する。多特異性抗原結合タンパク質が、ＣＤ１６Ａ受容体を介してＮＫ細胞に、ＥＧＦＲを介して腫瘍細胞に同時に関与すると、ＣＤ１６Ａを介したＮＫ細胞の活性化、および免疫シナプスの形成が誘発され、パーフォリンおよびグランザイムを含有する溶解性顆粒の極性エキソサイトーシス、ならびにＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬおよびＴＮＦ‐αの細胞表面発現が引き起こされ、これにより、連続した追加の酵素活性（カスパーゼカスケード）を開始することによって腫瘍細胞死が誘発され、腫瘍細胞アポトーシス（プログラム細胞死）が引き起こされる。
【００２０】
したがって、そのような多特異性抗原結合タンパク質は、ＥＧＦＲ陽性がん細胞のＮＫ細胞溶解の方向を選択的に変えることができる。対照的に、ＩｇＧアイソタイプの完全長抗体は、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ（ＦｃγＲＩＩＩＢ）、ＣＤ３２Ａ（ＦｃγＲＩＩＡ）、ＣＤ３２Ｂ（ＦｃγＲＩＩＢ）およびＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）を含むそれらのＦｃ領域活性化および阻害性Ｆｃγ受容体を介して結合する。ただし、ＣＤ１６Ａに対する特異性を有する抗原結合タンパク質は、好中球ではなく、ＮＫ細胞およびマクロファージに見られる活性化サブタイプＣＤ１６Ａを選択的に標的とする。さらに、ＮＫ細胞関与抗原結合タンパク質は、ＣＤ１６Ａと二価で相互作用し、通常の抗体の約１，０００倍の親和性をもたらす。
【００２１】
ＣＤ１６Ａは、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を引き起こす活性化受容体である。ＣＤ１６Ａに対する抗体の親和性は、ＮＫ細胞の活性化を引き起こすそれらの能力と直接相関する。ＣＤ１６Ａに二価で結合する、すなわち２つの抗原結合部位と結合することにより、ＣＤ１６Ａに対するさらに高い結合力に起因して親和性を増加させる抗原結合タンパク質が提供される。これらの抗原結合タンパク質の投与は、以下の作用機序に基づいて、（皮膚）毒性を全く生じないか、軽微な（皮膚）毒性しか生じない：
【００２２】
一実施形態では、多特異性抗原結合タンパク質は、ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ二重特異性タンデムダイアボディである。タンデムダイアボディは、その構造に、ＥＧＦＲおよびＣＤ１６Ａ抗原結合部位の可変Ｆｖドメインのみを含み、Ｆｃ部分を含まない。タンデムダイアボディは、Ｆｃ部分を欠くため、正常組織ではＦｃＲｎによって血管空間から間質に輸送されず、主として血管系にとどまる。腫瘍では、タンデムダイアボディなどのマクロタンパク質に対する腫瘍血管の選択的かつ高い透過性（血管透過性・滞留性亢進効果［ＥＰＲ］）のため、ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディの適切なレベルが達成される。
【００２３】
カニクイザルに対してＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディを隔日投与しても、皮膚毒性は誘発されなかった。タンデムダイアボディがＦｃ部分を欠くことは、ＩｇＧまたは他のＦｃ含有抗体断片と比較して、ＦｃＲｎによる正常組織への移行がない、または少なくとも大幅に減少することの原因となり得る。
【００２４】
別の実施形態では、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆｃ部分を含む二重特異性ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質である。二重特異性ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質は、Ｆｃ部分の存在により、ＦｃＲｎによって正常組織に輸送される可能性がある。しかし、正常組織には間質腔内のＮＫ細胞が浸潤せず、正常なＥＧＦＲ陽性細胞がＮＫ細胞を介して殺傷されることはほとんどない。腫瘍では、ＮＫ細胞がはるかに多数存在し、Ｆｃ部分を含む抗原結合タンパク質は、タンデムダイアボディについて上記で説明したように、ＥＰＲ効果により適切なレベルに達する。
【００２５】
さらに、詳細に説明するように、ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質を含むＦｃ部分によるＥＧＦＲシグナル伝達の阻害は、インビトロではセツキシマブと比較して大幅に減少する。
【００２６】
さらに、本明細書に記載されるＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質は、細胞傷害性アッセイで試験した際に、従来公知のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）または他のＦｃ増強抗体と比較して優れた効力および効果を示した。選択された抗体のインビボでの効果は、ヒト化マウスのＡ−４３１腫瘍モデルに対して実証された。
【００２７】
したがって、ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質は、ＥＧＦＲ発現がんの治療に適した薬物候補であり、改善された安全性プロファイルを提供する可能性がある。
【００２８】
参照による組込み
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３重鎖定常ドメインを有するＩｇＧ様抗原結合タンパク質を示す。抗ＣＤ１６Ａ可変ドメインは、抗原結合部位としてＩｇＧのＮ末端Ｆａｂ部分に組み込まれ、抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖは、ＣＨ２−ＣＨ３ホモ二量体の各ポリペプチドにＣ末端で融合される（Ｈ：可変重鎖ドメイン、Ｌ：可変軽鎖ドメイン、Ｃ：Ｃ末端、λ：Ｃｌａｍｂｄａ軽鎖定常ドメイン、１：ＣＤ１６Ａ抗原結合部位、２：ＥＧＦＲ抗原結合部位）。
【図２】２つのＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドのホモ二量体を有するｓｃＦｖ−Ｆｃ融合抗原結合タンパク質を示す。各ポリペプチドでは、ＣＤ１６Ａ  ｓｃＦｖユニットはヒンジ領域によってＣＨ２にＮ末端で融合され、抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖはＣＨ２−ＣＨ３ホモ二量体にＣ末端で融合される（Ｈ：可変重鎖ドメイン、Ｌ：可変軽鎖ドメイン、Ｃ：Ｃ末端、１：ＣＤ１６Ａ抗原結合部位、２：ＥＧＦＲ抗原結合部位）。
【図３】２つのポリペプチド鎖からなる二重特異性ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディを示し、各ポリペプチド鎖では、軽鎖（Ｌ）可変ドメインおよび重鎖（Ｈ）可変ドメインがペプチドリンカーによって次々に連結され、これらのポリペプチドのうちの２つは互いに非共有結合し、それによって四価の抗原結合タンパク質を形成する（Ｎ：Ｎ末端、Ｈ６：ヘキサヒスチジンタグ、１：ＣＤ１６Ａ抗原結合部位、２：ＥＧＦＲ抗原結合部位）。
【図４】抗ＣＤ１６ＡダイアボディユニットにＮ末端で融合した抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖユニットと、ＣＤ１６ＡダイアボディユニットにＣ末端で融合した抗ＨＳＡ  ｓｃＦｖユニットとを含む第１のポリペプチドからなる三重特異性ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ／ＨＳＡ  ａＴｒｉＦｌｅｘ抗原結合タンパク質を示す（Ｈ：可変重鎖ドメイン、Ｌ：可変軽鎖ドメイン、Ｎ：Ｎ末端、Ｈ６：ヘキサヒスチジンタグ、１：ＣＤ１６Ａ抗原結合部位、２：ＥＧＦＲ抗原結合部位、３：ＨＳＡ抗原結合部位）。
【図５】Ｓｔａｉｎ−ｆｒｅｅイメージング技術（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により可視化された、精製後のｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２およびＢｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ＿０２のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル画像を示す。
【図６】（Ａ）ＥＧＦＲ抗原または（Ｂ）ＣＤ１６Ａ抗原に対するＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディの濃度依存的結合を示す。
【図７】（Ａ）単量体ＥＧＦＲ−ｍＦｃに対するＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ  ｓｃＦｖの、または（Ｂ）ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ  ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂに対するＣＤ１６Ａ抗原もしくはＣＤ１６Ｂ抗原の濃度依存的結合を示す。
【図８】（Ａ）単量体ＥＧＦＲ−ｍＦｃに対するＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ  Ｂｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃの、または（Ｂ）ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ  Ｂｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃに対するＣＤ１６Ａ抗原もしくはＣＤ１６Ｂ抗原の濃度依存的結合を示す。
【図９】（Ａ）ＥＧＦＲ抗原または（Ｂ）ＣＤ１６Ａ抗原に対するＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ  ａＴｒｉＦｌｅｘの濃度依存的結合を示す。
【図１０】初代ヒトＮＫ細胞に対する１０ｍｇ／ｍＬのヒトポリクローナルＩｇＧ（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ）の存在下および非存在下でのいくつかの二重特異性ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の結合親和性の評価を示す。漸増濃度での平均蛍光強度。
【図１１】ＥＧＦＲ発現腫瘍Ａ−４３１細胞に対するいくつかの二重特異性ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の結合親和性の評価を示す。
【図１２】Ｅ：Ｔ比５：１でエフェクター細胞として濃縮ヒトＮＫ細胞を用いた、Ａ−４３１（Ａ）標的細胞およびＨＣＴ−１１６（Ｂ）標的細胞に対する４時間カルセイン放出アッセイにおける二重特異性ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の細胞傷害活性を示す。
【図１３】様々な抗ＥＧＦＲ抗体構築物および対照抗体による、Ａ−４３１細胞に対するＥＧＦ誘発性ＥＧＦＲリン酸化の阻害を示す。リン酸化ＥＬＩＳＡでリン酸化ＥＧＦＲを測定し、４５０ｎｍでの吸光度としてプロットした。
【図１４】様々な抗ＥＧＦＲ抗体構築物および対照抗体による、Ａ−４３１細胞に対するＥＧＦ誘発性ＥＧＦＲリン酸化の阻害を示す。リン酸化ＥＬＩＳＡでリン酸化ＥＧＦＲを測定し、４５０ｎｍでの吸光度としてプロットした。
【図１５】Ａ−４３１細胞（図１５ａ）およびＡ−５４９細胞（図１５ｂ）におけるＥＧＦ刺激性ＥＧＦＲリン酸化の阻害を示す。リン酸化ＥＬＩＳＡでリン酸化ＥＧＦＲを測定し、４５０ｎｍでの吸光度としてプロットした。
【図１６】ＥＧＦにより５分間刺激した試料のウエスタンブロットメンブレンを示す。リンタンパク質（ブロットの左パネル）および総タンパク質（ブロットの右パネル）がそれぞれ示されている。
【図１７】ＥＧＦにより１５分間刺激した試料のウエスタンブロットメンブレンを示す。リンタンパク質（ブロットの左パネル）および総タンパク質（ブロットの右パネル）がそれぞれ示されている。
【図１８】ｐＥＧＦＲのバンド強度の定量を示す。未処理対照のＧＡＰＤＨシグナル強度に対して、各レーンのＧＡＰＤＨシグナルの強度を正規化した。未処理対照のｐＥＧＦＲに対して、ｐＥＧＦＲの強度を正規化した。示された相対的バンド強度は、正規化されたＧＡＰＤＨシグナルと比較して、正規化されたｐＥＧＦＲシグナルに対応する。白いバー：５分の刺激、黒いバー：１５分の刺激。
【図１９】ｐＡｋｔのバンド強度の定量を示す。未処理対照のＧＡＰＤＨシグナル強度に対して、各レーンのＧＡＰＤＨシグナルの強度を正規化した。未処理対照のｐＡｋｔに対して、ｐＡｋｔの強度を正規化した。示された相対的バンド強度は、正規化されたＧＡＰＤＨシグナルと比較して、正規化されたｐＡｋｔシグナルに対応する。白いバー：５分の刺激、黒いバー：１５分の刺激。
【図２０】ｐＥｒｋのバンド強度の定量を示す。未処理対照のＧＡＰＤＨシグナル強度に対して、各レーンのＧＡＰＤＨシグナルの強度を正規化した。未処理対照のｐＥｒｋに対して、ｐＥｒｋの強度を正規化した。示された相対的バンド強度は、正規化されたＧＡＰＤＨシグナルと比較して、正規化されたｐＥｒｋシグナルに対応する。白いバー：５分の刺激、黒いバー：１５分の刺激。
【図２１】ＥＧＦＲ＋Ａ−４３１細胞との共培養時のＰＢＭＣによるＩＬ−６のｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２誘発性放出を示す。漸増濃度のｓｃＦｖ＿ＩｇＡｂ＿０２の存在下または非存在下での共培養のインキュベーション時間を示す。Ａ−４３１標的細胞の非存在下でのＩＬ−６放出のバックグラウンドレベルをグラフの下に示す。
【図２２】ＥＧＦＲ＋Ａ−４３１細胞との共培養時のＰＢＭＣによるＴＮＦ−αのｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２誘発性放出を示す。漸増濃度のｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２の存在下または非存在下での共培養のインキュベーション時間を示す。Ａ−４３１標的細胞の非存在下でのＴＮＦ−α放出のバックグラウンドレベルをグラフの下に示す。
【図２３】４時間の共培養後のＥＧＦＲ＋Ａ−４３１細胞との共培養時のＰＢＭＣによるＩＦＮ−γのｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２誘発性放出を示す。Ａ−４３１標的細胞の非存在下でのＩＦＮ−γ放出のバックグラウンドレベルをグラフの下に示す。
【図２４】ＥＧＦＲ＋Ａ−４３１の存在下または非存在下で、ＰＢＭＣをｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２と２４時間共培養した後の活性化ＮＫ細胞を示す。ＰＢＭＣ（Ａ）およびＰＢＭＣ＋Ａ−４３１細胞（Ｂ）の培養では、ＳｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２は、ＣＤ６９およびＣＤ２５を発現する活性化ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の増加を誘発した。
【図２５】ＥＧＦＲ＋Ａ−４３１の存在下または非存在下で、ＰＢＭＣをｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２と４８時間共培養した後の活性化ＮＫを示す。ＰＢＭＣ（Ａ）およびＰＢＭＣ＋Ａ−４３１細胞（Ｂ）の培養では、ＳｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２は、ＣＤ６９およびＣＤ２５を発現する活性化ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の増加を誘発した。
【図２６】Ｔｒａｎｓｃｕｒｅ予防試験の７日目から３５日目までの腫瘍増殖を示す。
【図２７】Ｔｒａｎｓｃｕｒｅ予防試験における腫瘍増殖を示す。
【図２８】予防的設定（Ａ）および処置的設定（Ｂ）におけるＡ４３１腫瘍増殖に対するＲＳＶ−ＥＧＦＲおよび様々なｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２濃度の効果。  説明：各群について腫瘍増殖の平均±ＳＤを表す。Ｎ＝７〜８／処置群、Ｎ＝１２／予防群。
【図２９】Ｔｒａｎｓｃｕｒｅ試験の予防群を示す。腫瘍増殖試験では、添付の例１１に記載されているように、ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２および対照抗体構築物ＲＳＶ／ＥＧＦＲを投与した。
【図３０】Ｔｒａｎｓｃｕｒｅ試験の処置群を示す。ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２および対照抗体構築物ＲＳＶ／ＥＧＦＲによる１０ｍｇ／ｋｇ処置により、腫瘍増殖の有意な減少が観察された。
【図３１】例１３に記載されるｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２の組織分布の結果を示す。Ａ４３１異種移植マウスへの１２５Ｉ−ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２のＩＶ注射後に採取された血液および臓器／組織において回収されたＩＤの割合（％  ＩＤ／ｇ）
【図３２】例１３に記載されるように、Ａ４３１異種移植マウスに１２５Ｉ−ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２をＩＶ注射した後の腫瘍／臓器比を示す。
【図３３】添付の例１３に詳細に記載されるように、１２５Ｉ−ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２のＩＶ注射後３３６時間（１４日間）の時点で殺処分したマウスの全身オートラジオグラムを示す。
【図３４】添付の例１４に記載される毒性学試験で観察された個々の動物の血清ＩＬ−６レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、ＥＧＦＲおよびＣＤ１６Ａに対する抗原結合部位を含む多特異性、例えば二重特異性抗原結合タンパク質に関する。
【００３１】
用語「多特異性」は、少なくとも２つの異なる標的、すなわち異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む抗原結合タンパク質を指す。「多特異性」には、限定するものではないが、二重特異性、三重特異性および四重特異性が含まれる。抗原結合タンパク質は、抗原ＥＧＦＲおよびＣＤ１６Ａに少なくとも特異的に結合し、したがって、少なくとも二重特異性である。特定の実施形態では、抗原結合分子は、第３の抗原に対する第３の特異性を有し得る。例えば、第３の特異性は、血清アルブミン、特にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に特異的な抗原結合側（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｄｅ）であり得る。三重特異性抗原結合タンパク質の例は、ＥＧＦＲに特異的な抗原結合部位と、ＣＤ１６Ａに特異的な２つの抗原結合部位と、ＨＳＡに特異的な１つの抗原結合部位とを含む、以下に記載される四価のａＴｒｉＦｌｅｘである。他の実施形態では、第３の特異性は、二重腫瘍標的化抗原結合タンパク質を作製するための第２の腫瘍抗原であり得、例えば、抗原結合タンパク質は、第２の腫瘍抗原、例えば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ｃ−ＭＥＴ、ＡＸＬ、ＦＧＦＲ４、ＶＥＧＦ−Ａ、ＨＧＦに対する少なくとも１つの追加の抗原結合部位を含み得る。
【００３２】
用語「抗原結合タンパク質」は、抗原結合特性を有する免疫グロブリン（Ｉｇ）誘導体を指す。好ましくは、抗原結合タンパク質は、ヒトタンパク質またはヒト化タンパク質である。すなわち、抗原結合タンパク質は、生殖系列Ｉｇ由来のヒト配列からほとんどなる。抗原結合タンパク質がヒトまたはヒト化である場合、抗原結合タンパク質は、例えば、ＣＤＲ内、リンカー内の、または変異によって組み込まれた単一の非ヒト残基または非ヒト部分を含み得る。Ｉｇは、共有結合による鎖間ジスルフィド結合によって複合体に結合されている２つの同一の軽鎖（Ｌ）ポリペプチドおよび２つの同一の重鎖（Ｈ）ポリペプチドから構成される多量体タンパク質である。Ｎ末端部分では、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が重鎖（Ｈ）の可変ドメイン（ＶＨ）と会合して、Ｉｇの抗原結合部位であるＦｖを形成する。加えて、軽鎖（Ｌ）および重鎖（Ｈ）のそれぞれは定常領域を有する。したがって、軽鎖（Ｌ）は、１つの可変（ＶＬ）ドメインおよび１つの定常（ＣＬ）ドメイン、例えば、ラムダまたはカッパを有し、重鎖（Ｈ）は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３と称される３つの定常ドメインを有する。したがって、重鎖（Ｈ）は、１つの可変（ＶＨ）ドメインおよび３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を有する。重鎖（Ｈ）はまた、３つの機能単位、すなわち、ＶＨおよびＣＨ１を含むＦｄ領域、ヒンジ領域、ならびにＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチド鎖を含むＦｃ部分に分割することができる。Ｆｃ部分は、抗体依存性細胞媒介型細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、およびＦｃ受容体への結合などのエフェクター機能に関与し、Ｆｃ部分を欠くポリペプチドと比較して、（新生児Ｆｃ（ＦｃＲｎ）受容体への結合を介して）インビボでの半減期の延長をもたらす。さらに、ＩｇＧでは、互いに会合した２つのＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチド鎖のホモ二量体が、抗体のＦｃ領域を形成する。抗原結合タンパク質は、標的抗原に結合することができる免疫学的に機能的な免疫グロブリン部分を含む。免疫学的に機能的な免疫グロブリン部分は、免疫グロブリンの部分（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ）、免疫グロブリン部分に由来する融合ペプチド、または抗原結合部位を形成する免疫グロブリン部分を組み合わせたコンジュゲートを含み得る。特定の実施形態では、抗原結合部位は、部分的または完全にヒトまたはヒト化である。結合タンパク質は、標的抗原に結合する、結合タンパク質の領域、部分またはドメインである抗原結合部位を含む。各抗原結合部位は、抗原結合部位が由来する免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲを少なくとも含む。用語「抗原結合タンパク質」は、いくつかの実施形態では、例えば、任意のＩｇクラス、特に、少なくともＣＨ２、いくつかの実施形態では、ＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチド鎖、特に２つのＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチド鎖のホモ二量体を含むＩｇＧ１などのＩｇＧサブクラス由来のＦｃ部分に融合された抗原結合部位に基づくＩｇＧ様または非ＩｇＧ様融合ペプチドを含め、それらの抗原に対する特異性および親和性を保持する抗体誘導体または抗体様結合タンパク質を指す。定常領域は、完全なＩｇ定常領域、すなわち、ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、またはＦｃ部分のみ、すなわち、ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、例えば、本明細書に記載されているｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ、Ｂｉ−ｓｃＦｖ−ＦｃまたはＦｃ−ｓｃＦｖを含み得る。他の実施形態では、抗原結合タンパク質とは、追加の定常ドメインの有無に関わらずＦｖドメインに基づく抗体誘導体、例えばＦｖ断片、一本鎖Ｆｖ、タンデム一本鎖Ｆｖ（（ｓｃＦｖ）２）、二重特異性ＮＫ細胞エンゲージャー（ＢｉＫＥ）、二重親和性再標的化抗体（ＤＡＲＴ（商標））、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディおよびタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））；ａＴｒｉＦｌｅｘ、トリアボディ、トリボディまたは三重特異性ＮＫ細胞エンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）を指す。Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，ｍＡｂｓ，２０１７，９（２）：１８２−１９２  ｏｒ  ｉｎ  Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６７：９５−１０６では、様々な抗原結合タンパク質足場が概説されている。
【００３３】
用語「抗原結合部位」は、抗原の抗原決定基（エピトープ）に特に特異的に結合する抗原結合タンパク質の抗体抗原結合部位またはパラトープを指す。抗原結合部位は、ヒトまたはヒト化であり得る。抗原結合部位は、抗原を認識することができ、抗原に特異的に結合する抗原結合タンパク質の結合部分である。抗原結合部位は、抗原と結合する、すなわち、抗原のエピトープに結合する軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の両方の可変ドメインを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、単一ドメイン（ｓｄＡｂ）、例えば、ラクダ科動物由来のＶＨＨ断片または軟骨魚類由来のＶＮＡＲ断片であり得る。
【００３４】
各抗原結合部位は、同じエピトープに結合する抗体、すなわち免疫グロブリン、可変重鎖ドメイン（ＶＨ）および抗体可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）によって形成されるのに対して、可変重鎖ドメイン（ＶＨ）は、３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、すなわち、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）は、３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、すなわち、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む。抗原結合部位の可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインは、例えば、ペプチドリンカーによって互いに共有結合されるか、互いに非共有結合されて、Ｆｖ抗原結合部位を形成し得る。
【００３５】
「一本鎖可変抗体断片」または「ｓｃＦｖ」は、ペプチドリンカーを介して軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）からなる抗原結合部位を含む。ｓｃＦｖは、ポリペプチド鎖、すなわち、ポリペプチド鎖のＮ末端からＣ末端までのＶＬ−リンカー−ＶＨまたはＶＨ−リンカー−ＶＬであり得る（Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８８，８５：５８７９−８３）。
【００３６】
「抗原結合（Ｆａｂ）断片」または「Ｆａｂ」は、重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）のそれぞれの１つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＬ）および１つの可変ドメイン（ＶＨ、ＶＬ）を含み、可変ドメインＶＨおよびＶＬは、抗原結合部位に会合する。２つのＦａｂ´断片は、ヒンジ領域を介してＦ（ａｂ´）２断片としてＦｃ部分にＮ末端で結合される。
【００３７】
「リンカー」は、他のペプチドを連結するペプチドである。典型的には、ペプチドリンカーは、１〜約５０、好ましくは１〜約３０、最も好ましくは１〜約２０アミノ酸である。リンカーの長さは、ポリペプチド鎖の柔軟性に影響を及ぼす。所望の柔軟性は、標的抗原密度、および標的抗原の接近可能性に応じて決まる。リンカーが長いほど、機敏性の高い抗原結合部位がもたらされる。ＶＨドメインとＶＬドメインとを接続するリンカーが約１２以上のアミノ酸残基からなる場合、ポリペプチドは頭尾に折り畳まれ、ｓｃＦｖを形成することができる。特定の実施形態では、ｓｃＦｖ内のＶＨおよびＶＬのリンカーは、約１５〜約２５、好ましくは約１５〜約２０、例えば１８アミノ酸からなる。リンカーを約１２以下のアミノ酸残基まで短くすると、一般に、同じポリペプチド鎖の隣接ドメインが互いに相互作用するのを妨げる。ただし、そのようなリンカーは、Ｆｃ部分にｓｃＦｖを融合するために使用することができる。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、ペプチド結合によってＦｃ部分に直接融合される。リンカーのアミノ酸組成に関して、いくつかの実施形態では、抗原結合部位の構築を妨害しないペプチドが選択される。例えば、グリシン残基およびセリン残基を含むリンカーは、一般に、柔軟性およびプロテアーゼ耐性を提供する。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列（ＧａＳｂ）ｃを含み、式中、ａ＝１〜５、ｂ＝１〜３およびｃ＝１〜８である。特定の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列（ＧＧＳ）ｘを含み得、式中、ｘ＝１〜８または（ＧＧＧＧＳ）ｙであり、式中、ｙ＝１〜５である。
【００３８】
用語「ポリペプチド」または「ポリペプチド鎖」は、アミド結合によって連結されたアミノ酸残基のポリマーを指す。ポリペプチド鎖は、好ましくは、分岐していない一本鎖融合タンパク質である。抗原結合タンパク質は、少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。そのような抗原結合タンパク質は、多量体、例えば、二量体、三量体または四量体である。タンデムダイアボディまたはＢｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃなどの特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ホモ二量体であり、２つの同一のポリペプチド鎖からなる。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ａＴｒｉＦｌｅｘなどのヘテロ二量体またはｓｃＦｖ−ＩｇＡｂなどのヘテロ四量体である。
【００３９】
抗原結合部位は、ＥＧＦＲまたはＣＤ１６Ａに特異的に結合する。
【００４０】
「ＥＧＦＲ」は、ヒトの上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ；ＥｒｂＢ−１；ＨＥＲ１を指し、活性化変異を伴って記載され、病態生理学的プロセスに関与するあらゆるアイソフォームまたは変異体を含む。ＥＧＦＲ抗原結合部位は、ＥＧＦＲの細胞外ドメインのエピトープを認識する。特定の実施形態では、抗原結合部位は、ヒトおよびカニクイザルのＥＧＦＲに特異的に結合する。
【００４１】
「ＥＧＦＲｖＩＩＩ」は、ＥＧＦＲコード配列のエクソン２〜７にわたる塩基対のフレーム内欠失から生じる、ＥＧＦＲの細胞外ドメイン変異体を指す（Ｇａｎ  ＨＫ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  ２０１３，２８０：５３５０−５３７０）。
【００４２】
特定の実施形態では、ＥＧＦＲに対する抗原結合部位は、ＥＧＦＲに特異的な重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み、（ｉ）ＥＧＦＲに特異的な重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含み、ＥＧＦＲに特異的な軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含み、または
（ｉｉ）ＥＧＦＲに特異的な重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、および／または
（ｉｉｉ）ＥＧＦＲに特異的な軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する。
【００４３】
ＥＧＦＲに対するこの抗原結合部位は、ＥＧＦＲｖＩＩＩにも結合する（例３）。それにより、治療にこの抗原結合部位を使用すると、ＥＧＦＲ発現がんおよびＥＧＦＲｖＩＩＩ発現がんの両方の治療が可能になる。ＥＧＦＲとは対照的に、ＥＧＦＲｖＩＩＩはがん細胞のみに発現し、健康な組織には発現しない。他のＥＧＦＲ標的療法は、ＥＧＦＲｖＩＩＩによるＥＧＦＲシグナル伝達経路の腫瘍形成能および構成的活性化の増強により、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性がんでは効果が低くなる可能性がある。
【００４４】
「ＣＤ１６Ａ」は、ＦｃγＲＩＩＩＡとしても知られ、ＮＫ細胞の細胞表面に発現する活性化受容体ＣＤ１６Ａを指す。ＣＤ１６Ａは、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を引き起こす活性化受容体である。ＣＤ１６Ａに対する抗体の親和性は、ＮＫ細胞活性化を引き起こすそれらの能力と直接相関しているため、ＣＤ１６Ａに対する親和性が高いほど、活性化に必要な抗体用量が減少する。抗原結合タンパク質の抗原結合部位はＣＤ１６Ａに結合するが、ＣＤ１６Ｂには結合しない。例えば、ＣＤ１６Ｂに存在しない、ＣＤ１６ＡのＣ末端配列ＳＦＦＰＰＧＹＱ（配列番号３）のアミノ酸残基および／または残基Ｇ１３０および／またはＹ１４１（配列番号４）を含むＣＤ１６Ａのエピトープに特異的に結合する抗原結合部位によって、ＣＤ１６Ａに結合するがＣＤ１６Ｂには結合しない重鎖（ＶＨ）可変ドメインおよび軽鎖（ＶＬ）可変ドメインを含む抗原結合部位が得られ得る。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合部位は、ＣＤ１６Ａに特異的な重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み、（ｉ）ＣＤ１６Ａに特異的な重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号６もしくは１１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含み、ＣＤ１６Ａに特異的な軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含み、または
（ｉｉ）ＣＤ１６Ａに特異的な重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、配列番号１２もしくは１４に記載のアミノ酸配列を有し、および／または
（ｉｉｉ）ＣＤ１６Ａに特異的な軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する。
【００４６】
ＣＤ１６Ａに対するこの抗原結合部位は、ＣＤ１６Ｂに結合せず、類似の親和性で既知のＣＤ１６ＡアロタイプＦ１５８およびＶ１５８に結合する。ヒトＣＤ１６Ａでは、ＩｇＧのヒンジ領域との相互作用に重要な１５８位のアミノ酸を変化させる２つの対立遺伝子一塩基多型が同定されている。白人集団内では、ホモ接合性１５８Ｆ／Ｆとヘテロ接合性１５８Ｖ／Ｆ対立遺伝子との対立遺伝子頻度は類似しており、それぞれ３５〜５２％または３８〜５０％の範囲であったが、ホモ接合性１５８Ｖ／Ｖ対立遺伝子は１０〜１５％にのみ見出された（Ｌｏｐｅｚ−Ｅｓｃａｍｅｚ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ．；ＢＭＣ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  ２０１１；１２：２）。したがって、類似の親和性に起因する、あらゆる患者に対するこの抗ＣＤ１６ＡドメインによるＮＫ細胞の活性化は有利である。ＣＤ１６Ａに結合するがＣＤ１６Ｂには結合しない重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む追加のＣＤ１６Ａ抗原結合部位は、国際公開第２００６／１２５６６８号パンフレットに記載されている。
【００４７】
別の実施形態では、重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインには、本明細書に記載されるＣＤＲ配列またはフレームワーク配列の免疫学的に活性な相同体または変異体が組み込まれる。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＤ１６ＡまたはＥＧＦＲに結合する重鎖ドメインまたは軽鎖ドメイン内のＣＤＲ配列は、配列番号５〜１１または２１〜２６に示されるアミノ酸配列に類似しているが、同一ではない。特定の例では、ＣＤＲ変異体配列は、５〜１１または２１〜２６の配列と比較して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％または８０％の配列同一性を有し、免疫学的に活性である。
【００４８】
他の例では、ＣＤＲ変異体配列は、非重要残基、または非重要領域内の残基を変化させるように改変される。重要でないアミノ酸は、親和性成熟、ＣＤＲウォーキング突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、結晶化、核磁気共鳴、光親和性標識またはアラニンスキャニング突然変異誘発などの公知の方法によって同定することができる。
【００４９】
抗原結合タンパク質は多価である。「多価」は、存在する２つ以上の抗原結合部位、例えば、２、３、４、５、６またはそれ以上を指す。天然のＩｇＧ抗体は２つの結合部位を有し、二価である。多特異性抗原結合タンパク質は、少なくとも４つの抗原結合部位を有し、少なくとも四価である。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＥＧＦＲに対する２つの抗原結合部位およびＣＤ１６Ａに対する２つの抗原結合部位を有し、すなわち、抗原結合タンパク質は、ＥＧＦＲに二価的に、およびＣＤ１６Ａに二価的に結合する。
【００５０】
一実施形態では、ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の足場は、タンデムダイアボディによって得られる（図３）。用語「タンデムダイアボディ」は、抗原結合ホモ二量体に、別の同一のポリペプチドに会合した単一のポリペプチド内の少なくとも４つの可変ドメイン（２つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および２つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ））を連結することによって構築される抗原結合タンパク質を指す。このようなタンデムダイアボディでは、リンカーの長さは、可変ドメインの分子内対合を妨げることにより、ポリペプチド鎖がそれ自体を折り返して単量体の一本鎖タンパク質を形成することができず、むしろ別の鎖の相補的ドメインと対合することを余儀なくされるような長さである。可変ドメインはまた、この二量体化中に対応する可変ドメインが対合するように配置される（Ｗｅｉｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ，２０（１）：２７−３２）。したがって、タンデムダイアボディは抗原結合タンパク質であり、各ポリペプチド鎖では、可変ドメインは、
（ｉ）ＶＨ−Ｌ１−ＶＬ−Ｌ２−ＶＨ−Ｌ３−ＶＬ、または
（ｉｉ）ＶＬ  ｖｌ−Ｌ１−ＶＨ−Ｌ２−ＶＬ−Ｌ３−ＶＨの順で、ペプチドリンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３によって次々に連結され、Ｎ末端からＣ末端まで２つのポリペプチド鎖のそれぞれの内部に配置され、
特定の実施形態では、リンカーＬ２によって連結されたポリペプチド鎖の中央の可変ドメインはＣＤ１６Ａに特異的であり、それぞれＮ末端およびＣ末端の周辺ドメインはＥＧＦＲに特異的である。そのような実施形態では、可変ドメインは、
（ｉ）ＶＨ（ＥＧＦＲ）−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ３−ＶＬ（ＥＧＦＲ）、または
（ｉｉ）ＶＬ（ＥＧＦＲ）−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ３−ＶＨ（ＥＧＦＲ）の順で、Ｎ末端からＣ末端まで各ポリペプチド鎖内に配置され、
好ましい実施形態では、可変ドメインは、（ｉ）ＶＨ（ＥＧＦＲ）−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ３−ＶＬ（ＥＧＦＲ）の順で配置される。
【００５１】
報告された試験によれば、リンカーの長さは、そのような多特異性抗原結合タンパク質の柔軟性に影響を及ぼす。タンデムダイアボディ内のペプチドリンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３の長さは「短く」、すなわち、ポリペプチド鎖の可変ドメインが別のポリペプチドのドメインと分子間で会合してタンデムダイアボディを形成する０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２アミノ酸残基からなる。したがって、特定の例では、リンカーは、約１２以下のアミノ酸残基、例えば、３〜１２、３〜１０または３〜９アミノ酸残基からなる。
【００５２】
単一の遺伝子構築物からの発現に続いて、２つの同一のポリペプチド鎖が頭尾に折り畳まれて、約１０５ｋＤａの機能的な非共有結合ホモ二量体を形成する。分子間共有結合がないにもかかわらず、ホモ二量体は一度形成されると非常に安定であり、無傷のままであり、単量体の形に戻ることはない。タンデムダイアボディは抗体可変ドメインのみを含み、定常ドメインを欠く。タンデムダイアボディは、ＣＤ１６Ａに対する二価結合とＥＧＦＲに対する二価結合とを可能にする。約１０５ｋＤａのタンデムダイアボディのサイズはＩｇＧのサイズよりも小さいが、初回通過腎クリアランスの閾値を十分に超えており、抗体結合ドメインまたは非抗体足場に基づく小さな二重特異性フォーマットと比較して薬物動態的利点を提供する。さらに、タンデムダイアボディは、これらの薬物動態特性および結合力特性に基づいて、ＢｉＴＥ（登録商標）分子またはＤＡＲＴ（商標）分子などの他の二重特異性結合タンパク質よりも有利であり、固有の半減期が長くなり、細胞傷害性が増強される。タンデムダイアボディは、宿主細胞、例えば、哺乳動物のＣＨＯ細胞によく発現する。タンデムダイアボディには、堅牢な上流および下流の製造プロセスが利用可能であると考えられる。
【００５３】
別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、国際公開第２０１７／０６４２２１号パンフレットに開示されているような非対称の三重特異性フレキシボディ（ｆｌｅｘｉｂｏｄｙ）（ａＴｒｉＦｌｅｘ）である。そのようなａＴｒｉＦｌｅｘは、少なくとも６つの可変ドメインを含む第１のポリペプチドと、少なくとも２つの可変ドメインを含む第２のポリペプチドとの二量体である（図４）。そのような実施形態では、第２のポリペプチドはダイアボディユニットの一部であり、好ましくは、第１のポリペプチドに組み込まれた２つの並置可変ドメインの他方の対と非共有結合する。第１のポリペプチド鎖が６つの可変ドメインからなり、第２のポリペプチドが２つの可変ドメインからなる実施形態では、可変ドメインは、例えば、以下の配向で、ポリペプチドのＮ末端からＣ末端まで配置され得る：ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨ（第１のポリペプチド）およびＶＬ−ＶＬ（第２のポリペプチド）；ＶＬ−ＶＨ−ＶＨ−ＶＨ−ＶＨ−ＶＬ（第１のポリペプチド）およびＶＬ−ＶＬ（第２のポリペプチド）；ＶＨ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ（第１のポリペプチド）およびＶＨ−ＶＨ（第２のポリペプチド）；ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ（第１のポリペプチド）およびＶＨ−ＶＨ（第２のポリペプチド）またはＶＨ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＬ−ＶＨ（第１のポリペプチド）およびＶＨ−ＶＨ（第２ポリペプチド）。配向ＶＨ−ＶＨの２つの可変ドメインの一方の対と、配向ＶＬ−ＶＬの２つの可変ドメインの他方の対とを有するダイアボディユニットは、特に多特異性、例えば、三重特異性抗体分子の正しい折り畳みに有利に働く。好ましい実施形態では、ＣＤ１６Ａに特異的な可変ドメインは、６つの可変ドメインからなる第１のポリペプチド鎖の中央に位置し、第２のポリペプチドは、ＣＤ１６Ａに特異的な相補的可変ドメインからなる。このようなａＴｒｉＦｌｅｘは四価であり、二重特異性または三重特異性である。一実施形態では、ａＴｒｉＦｌｅｘは三重特異性であり、ＥＧＦＲに対する１つの抗原結合部位と、ＣＤ１６Ａに対する２つの抗原結合部位と、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）に対する１つの抗原結合部位とを含む。特定の実施形態では、ａＴｒｉＦｌｅｘは、（ｉ）ＶＨ（ＥＧＦＲ）−ＶＬ（ＥＧＦＲ）−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＨＳＡ）−ＶＬ（ＨＳＡ）の順に配置された可変ドメインを有する第１のポリペプチド鎖と、ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）または（ｉｉ）ＶＨ（ＥＧＦＲ）−ＶＬ（ＥＧＦＲ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＨＳＡ）−ＶＬ（ＨＳＡ）の順に配置された可変ドメインを有する第２のポリペプチド鎖と、ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）の順に配置された可変ドメインを有する第２のポリペプチド鎖とからなる。そのようなａＴｒｉＦｌｅｘ抗原結合タンパク質の生成および作製は、国際公開第２０１７／０６４２２１号パンフレットに記載されている。
【００５４】
さらなる実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥのクラスから選択される免疫グロブリンの免疫グロブリン定常ドメインと、それに結合する抗原結合部位を含むｓｃＦｖとを含むＦｃ融合タンパク質である。ＩｇＧ、特にＩｇＧ１の定常ドメインが好ましい。したがって、いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合抗原結合タンパク質はＦｃ部分を含む。ＦｃＲｎにＦｃ部分が結合することにより、Ｆｃ融合抗原結合タンパク質の血清半減期は、Ｆｖドメインに基づく抗原結合タンパク質、例えば、タンデムダイアボディまたはａＴｒｉＦｌｅｘなどと比較して大幅に増大する。
【００５５】
「Ｆｃ融合抗原結合タンパク質」は、免疫グロブリンのＦｃ部分と、Ｆｃ部分にＮ末端および／またはＣ末端で融合した少なくとも１つの抗原結合部位との組合せを含む抗原結合タンパク質を指す。本発明は、Ｎ末端に結合した２つの抗原結合部位と、Ｆｃ部分のＣ末端に結合した２つの抗原結合部位とを有する多特異性かつ少なくとも四価のＦｃ融合抗原結合タンパク質を提供する。Ｎ末端に結合した２つの抗原結合部位は、ヒンジドメインを介してＦｃ部分のＣＨ２のＮ末端に結合した抗原結合Ｆａｂ´または抗原結合ｓｃＦｖ´であり得る。Ｃ末端に配置された２つの抗原結合部位のそれぞれは、ペプチドリンカーによってＦｃ部分のＣＨ３のＣ末端に融合したｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、Ｆｃ部分のＮ末端に配置された２つの抗原結合部位は第１の抗原に特異的であり、Ｃ末端に配置された２つの抗原結合部位は第２の抗原に特異的である。したがって、四価の抗原結合分子は、第１の抗原に二価で、第２の抗原に二価で結合するが、この二価の結合は、結合力を高め、それにより、２つの抗原のそれぞれに対する結合親和性を高める。特定の実施形態では、Ｆｃ部分のＮ末端に配置された抗原結合部位はＣＤ１６Ａに特異的であり、Ｆｃ部分のＣ末端に配置された抗原結合部位はＥＧＦＲに特異的である。
【００５６】
「Ｆｃ部分」は、定常Ｉｇ領域のＦｃ領域の少なくとも１つの機能、特にＦｃＲｎに対する結合の機能を保持するポリペプチドを指し、少なくともＣＨ２ドメイン、好ましくはＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチド鎖を含む。ＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチド鎖は、別のＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチド鎖と会合して、互いに結合した２つのＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドのホモ二量体になり、二量体化は、ＣＨ２ドメインに対するヒンジ領域Ｃ末端によって促進される。したがって、いくつかの実施形態では、Ｆｃ部分は、２つのＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチド鎖のホモ二量体とヒンジ領域とを含む。好ましくは、Ｆｃ部分は、ＩｇＧクラスの定常ドメイン、特にＩｇＧ１定常ドメインを含む。
【００５７】
さらに、「ヒンジドメイン」は、Ｆｃ部分にＮ末端で結合され得る。ヒンジドメインは、Ｆｃ部分と同じまたは異なるＩｇＧクラスであり得るか、天然ではなく、操作されたヒンジドメインであり得る。
【００５８】
このようなＦｃ融合抗原結合タンパク質は、２つの抗原結合部位がＦａｂ断片またはｓｃＦｖとして、ヒンジドメインを介してＦｃ部分にＮ末端で融合され、２つのｓｃＦｖ抗原結合部位がＦｃ部分にＣ末端で融合されるように、ＣＤ１６ＡおよびＥＧＦＲに対する抗原結合部位と好ましくはＩｇＧ１  Ｆｃ部分とをモジュラー結合することによって生成することができ、それによって、二重特異性かつ四価の抗原結合タンパク質を提供する。
【００５９】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合抗原結合タンパク質は、ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ（図１）またはＢｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ（図２）である。
【００６０】
したがって、さらなる実施形態では、多特異性抗原結合タンパク質は、２つのＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドのホモ二量体を含む四価かつ二重特異性のＦｃ融合タンパク質（Ｂｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ）（図２）であり、２つのＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチドのそれぞれは、ｓｃＦｖの抗原結合部位を形成するための柔軟なリンカーによって共有結合された可変重鎖（ＶＨ）ドメインおよび可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含むｓｃＦｖにＮ末端およびＣ末端で融合される。したがって、そのようなＢｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗原結合タンパク質は、２つのポリペプチド鎖からなり、各ポリペプチドは、第１の抗原結合部位のＶＨにペプチドリンカーによって連結されたＶＬからなる第１の一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ（１））と（このｓｃＦｖ（１）は、ＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチド鎖のＣＨ２ドメインにヒンジ領域によってＮ末端で融合され）、ＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチド鎖のＣＨ３ドメインにペプチドリンカーによってＣ末端で融合された第２の抗原結合部位のＶＨにペプチドリンカーによって連結されたＶＬからなる第２の一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ（２））とを含む。したがって、そのようなＢｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗原結合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端までの構造：ｓｃＦｖ（１）−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ｓｃＦｖ（２）を有する２つのポリペプチド鎖からなる。特に、（ｉ）ｓｃＦｖ（１）がＣＤ１６Ａに対する抗原結合部位であり、ｓｃＦｖ（２）がＥＧＦＲに対する抗原結合部位であるか、（ｉｉ）ｓｃＦｖ（１）がＥＧＦＲに対する抗原結合部位であり、ｓｃＦｖ（２）がＣＤ１６Ａに対する抗原結合部位である。好ましくは、ＣＨ２−ＣＨ３ホモ二量体からなるＦｃ部分は、サイレンシングされる、すなわち、Ｆｃガンマ受容体に本質的に結合しないが、ＦｃＲｎに対する結合を保持する。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有するＣＨ２−ＣＨ３重鎖定常ドメインを含む。
【００６１】
さらなる実施形態では、多特異性Ｆｃ融合抗原結合分子は、四価かつ二重特異性のｓｃＦｖ−Ｉｇ抗原結合タンパク質（ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ；図１）である。そのようなｓｃＦｖ−ＩｇＡｂは、ＩｇＧ、好ましくはＩｇＧ１、足場、およびそれらにＣ末端で融合した２つのｓｃＦｖからなる。したがって、そのようなｓｃＦｖ−ＩｇＡｂは、２つの重鎖（Ｈ）および２つの軽鎖（Ｌ）から会合される。重鎖（Ｈ）は、ヒンジ領域によってＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチド鎖にＣ末端で連結されたＣＨ１ドメインにＣ末端で結合された可変重鎖（ＶＨ）ドメインからなり、ＣＨ３ドメインは、柔軟なリンカーによって可変重鎖（ＶＨ）ドメインに連結された可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを有する抗原結合部位を含むｓｃＦｖに融合される。軽鎖（Ｌ）は、ラムダまたはカッパ軽鎖定常ドメインなどの軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に結合した可変軽鎖（ＶＬ）ドメインからなる。ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ抗原結合タンパク質は、２つの重鎖（Ｈ）および２つの鎖（Ｌ）から会合され、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインは、会合してＦａｂ´の２つのＦｖ抗原結合部位をＮ末端に形成する。一実施形態では、Ｆａｂ´のＮ末端Ｆｖ抗原結合部位は、ＣＤ１６Ａに特異的であり、Ｃ末端ｓｃＦｖ抗原結合部位は、ＥＧＦＲに特異的である。別の実施形態では、Ｆａｂ´のＮ末端Ｆｖ抗原結合部位は、ＥＧＦＲに特異的であり、Ｃ末端ｓｃＦｖ抗原結合部位は、ＣＤ１６Ａに特異的である。
【００６２】
特に、多特異性抗原結合タンパク質は、重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）を含み、（ｉ）重鎖（Ｈ）が、構造ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ（ＥＧＦＲ）−ＶＬ（ＥＧＦＲ）を有し、軽鎖が、構造ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＣＬを有し、または（ｉｉ）重鎖が、構造ＶＨ（ＥＧＦＲ）−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）を有し、軽鎖が、構造ＶＬ（ＥＧＦＲ）−ＣＬを有し、または（ｉｉｉ）ＶＨ（ＥＧＦＲ）−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ（ＣＤ１６Ａ）−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）および軽鎖が、構造ＶＬ（ＥＧＦＲ）−ＣＬを有する。いくつかの実施形態では、ＣＨ２−ＣＨ３ホモ二量体からなるＦｃ部分はサイレンシングされる、すなわち、ＦｃγＲに本質的に結合しないが、ＦｃＲｎに対する結合を保持する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、サイレンシングされたＦｃ部分を含む。そのようなＦｃ部分は、ＩｇＧと比較して、ＦｃγＲに対する結合の点でサイレンシングされる。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖定常ドメインおよび／または配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するラムダ軽鎖ドメインを含む。
【００６４】
「サイレンシングされたＦｃ部分」は、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）に結合しないが、延長した半減期および長い血清持続性のために新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合を保持する改変Ｆｃ部分を指す。抗原結合タンパク質は、ＣＤ１６Ａ抗原を介してＮＫ細胞に特異的に関与するように設計されているため、好ましい実施形態では、Ｆｃガンマ受容体に対するＦｃの結合は妨げられるはずである。加えて、ＦｃＲｎは分解からＩｇＧを保護し、上皮バリアを越えたＩｇＧの輸送に関与することが報告されている。したがって、ＦｃＲｎ結合を保持または増強する、Ｆｃ融合抗原結合タンパク質のＦｃ部分の改変が好ましい。
【００６５】
Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ２３８Ｓ、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｐ３３１Ｓからなる群の変異から選択される、Ｆｃガンマ受容体に対する結合が低下したかＦｃガンマ受容体に結合しないＩｇＧ１を生成するための変異または変化のいくつかのセット、またはＨ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３１Ｓからなる群から選択され得る、Ｆｃガンマ受容体に対する結合が低下したＩｇＧ２を生成するための変異、またはＬ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｅ３１８Ａからなる群から選択され得る、Ｆｃガンマ受容体に対する結合が低下したＩｇＧ４を生成するための変異が記載されている（Ｓｔｒｏｈｌ  Ｗ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００９，２０：１−７；Ｋａｎｅｋｏ  Ｅ  ａｎｄ  Ｎｉｗａ  Ｒ，Ｂｉｏｄｒｕｇｓ  ２０１１，２５（１）：１−１１；Ｂａｕｄｉｎｏ  Ｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００８，１８１：６６６４−６６６９）。
【００６６】
さらに、Ｆｃ部分は、血清半減期を延長するように設計され得る。抗原結合タンパク質の血清半減期を増大させるＩｇＧ１  Ｆｃ部分の以下の変異が記載されている：Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｙ（Ｓｒｏｈｌ  Ｗ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００９，２０：１−７；Ｂｏｒｒｏｋ  ＭＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２０１７，１０６（４）：１００８−１０１７）。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃ部分は、Ｋａｂａｔナンバリングに従って、２３４位、２３５位および２６５位に一連の変異を含み、特に一連の変異は、Ｌ２３４Ｆ／Ｖ／Ａ、Ｌ２３５Ａ／ＥおよびＤ２６５Ａから選択される。特に好ましいのは、一連の変異Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５ＥおよびＤ２６５Ａ（配列番号２０）を含むＩｇＧ１  Ｆｃ部分である。したがって、いくつかの実施形態では、Ｂｉ−ｓｃＦｖ−ＦｃまたはｓｃＦｖ−ＩｇＡｂなどのＦｃ融合抗原結合分子は、一連の変異Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５ＥおよびＤ２６５Ａを有するサイレンシングされたＩｇＧ１  Ｆｃ部分を含む。列挙された変異はいずれも、Ｋａｂａｔナンバリング系に対応する（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ−ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎ°  ９１−３２４２，ｐｐ  ６６２，６８０，６８９（１９９１）。
【００６８】
別の実施形態では、ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の血清半減期は、（ｉ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する少なくとも１つの抗原結合部位を抗原結合タンパク質に融合すること、または（ｉｉ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を抗原結合タンパク質に融合もしくは結合することによって延長され得る。
【００６９】
本明細書に記載される実施形態のいずれか１つによる抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質を形成する個々のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを発現させることによって生成され得る。したがって、本発明のさらなる実施形態は、本明細書で上述した抗原結合タンパク質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡである。ポリヌクレオチドは、当業者に公知の方法によって、例えば、好適なプロモーター、および場合により好適な転写ターミネーターに作動可能に連結された遺伝子構築物に、ペプチドリンカーによって分離されたかポリペプチド鎖のペプチド結合によって直接連結された可変ドメインおよび定常ドメインをコードする遺伝子を組み合わせ、それを細菌または他の適切な発現系、例えばＣＨＯ細胞などに発現させることによって構築され得る（例１）。
【００７０】
本発明はさらに、多特異性抗原結合タンパク質、特に、本明細書で上述される多特異性抗原結合分子と、少なくとも１つの追加の成分とを含む組成物を提供する。
【００７１】
さらなる実施形態では、本発明の多特異性抗原結合タンパク質は、治療用化合物として使用するためのものである。好ましくは、本発明による多特異性抗原結合タンパク質は、ＥＧＦＲ陽性細胞またはＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性細胞を特徴とするがんの治療に使用するためのものである。
【００７２】
本発明の別の実施形態では、増殖性疾患または腫瘍性疾患を治療または改善する方法が提供され、方法は、それを必要とする対象に、本発明による多特異性抗原結合タンパク質を投与する工程を含む。治療される対象はヒトであってよい。本発明の特定の実施形態では、増殖性疾患または腫瘍性疾患は、ＥＧＦＲ陽性細胞またはＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性細胞を特徴とする。
【００７３】
治療用化合物として使用するために、またはＥＧＦＲ陽性疾患もしくはＥＧＦＲ陽性がんおよび／またはＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性がんを治療するために、多特異性抗原結合タンパク質を含む組成物は、好ましくは、好適な薬学的に許容される担体と組み合わされる。用語「薬学的に許容される担体」は、成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、それが投与される患者に対する毒性がない任意の担体を包含することを意味する。好適な医薬担体の例は、当技術分野で周知であり、リン酸緩衝食塩水、水、エマルジョン、例えば、油／水エマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、無菌溶液などを含む。そのような担体は、従来の方法によって製剤化することができ、好適な用量で対象に投与することができる。好ましくは、組成物は無菌である。これらの組成物はまた、保存剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含有し得る。様々な抗細菌剤および抗真菌剤を含めることによって、微生物の作用の防止が確実にされ得る。好適な組成物の投与は、様々な方法によって、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与または皮内投与によって行われ得る。言うまでもなく、投与経路は、治療の種類、および医薬組成物に含有される化合物の種類に応じて決まる。投与量レジメンは、主治医および他の臨床的要因によって決定される。
【００７４】
本発明の抗原結合タンパク質を使用して治療することができるＥＧＦＲ陽性がんおよび／またはＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性がんには、限定するものではないが、例えば、結腸直腸がん、頭頸部がん、肺がんおよび神経膠芽腫が含まれる
【００７５】
以下の例は、本発明の範囲を限定することなく、記載された実施形態をさらに説明するはずである。本発明による抗原結合タンパク質は、ＥＧＦ誘発性ＥＧＦＲリン酸化に対する阻害作用を全くまたはほとんど有しない一方で、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を誘発することができることが実証される。
【００７６】
例１：ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の生成および作製
材料
【表１】
2021515798.tif 000002
【００７７】
ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の生成
タンデムダイアボディ
Ｒｅｕｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，ｍＡｂｓ  ６：３，７２８−７３９に記載されているようにタンデムダイアボディ（図３）を構築する。タンデムダイアボディを構築するために、抗ＥＧＦＲ  Ｆｖドメイン（配列番号１、２）を抗ＣＤ１６Ａ  Ｆｖドメイン（配列番号１２、１３）と組み合わせる。抗ＥＧＦＲドメインおよび抗ＣＤ１６ＡドメインがＶＨ＿ＥＧＦＲ−Ｌ１−ＶＬ＿ＣＤ１６Ａ−Ｌ２−ＶＨ＿ＣＤ１６Ａ−Ｌ３−ＶＬ＿ＥＧＦＲの順に配置されるように、タンデムダイアボディ用の発現カセットをクローニングする。リンカーＬ１およびＬ３には９アミノ酸リンカー（Ｇ２Ｓ）３（配列番号３６）を使用し、リンカーＬ２には６アミノ酸リンカー（Ｇ２Ｓ）２（配列番号３５）を使用する。得られたＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディは、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドからなる。
【００７８】
ａＴｒｉＦｌｅｘ
国際公開第２０１７／０６４２２１号パンフレットに記載されているようにａＴｒｉＦｌｅｘ（図４）を構築する。ａＴｒｉＦｌｅｘを構築するために、抗ＥＧＦＲ  Ｆｖドメイン（配列番号１、２）を抗ＣＤ１６Ａ  Ｆｖドメイン（配列番号１２、１３）および抗ＨＳＡ  Ｆｖドメイン（配列番号３１、３２）と組み合わせる。抗ＥＧＦＲドメインおよび抗ＣＤ１６Ａドメインが、第１のポリペプチドではＶＨ＿ＥＧＦＲ−Ｌ１−ＶＬ＿ＥＧＦＲ−Ｌ２−ＶＬ＿ＣＤ１６Ａ−Ｌ２−ＶＬ＿ＣＤ１６Ａ−Ｌ２−ＶＨ＿ＨＳＡ−Ｌ１−ＶＬ＿ＨＳＡ、および第２のポリペプチドではＶＨ（ＣＤ１６Ａ）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ１６Ａ）順序の順に配置されるように、ａＴｒｉＦｌｅｘ用の発現カセットをクローニングし、リンカーＬ１には１８アミノ酸リンカー（Ｇ２Ｓ）６（配列番号１８）を使用し、リンカーＬ２には９アミノ酸リンカー（Ｇ２Ｓ）３（配列番号３６）を使用する。
【００７９】
Ｂｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ
ＣＨＯ細胞内のＢｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗原結合タンパク質（図２）の発現のために、哺乳動物発現ベクター系に分子のコード配列をクローニングした。要約すると、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により、ペプチドリンカーによって接続された抗ＥＧＦＲ  Ｆｖドメイン（配列番号１、２）および抗ＣＤ１６Ａ  Ｆｖドメイン（配列番号１２、１３）をコードする遺伝子配列を合成した。対応するプライマーを用いて、様々な可変ドメインのＰＣＲアンプリコンと、サイレンシング点変異を含むＦｃ部分（配列番号２０）のＰＣＲアンプリコンとを生成した。その後、様々なオーバーラップしたＤＮＡ断片と線形化されたバックボーンベクターとを１つの等温反応で組み合わせる。それぞれ抗体の分泌および精製を容易にするために、Ｎ末端シグナルペプチドおよびＦｃ部分のコード配列を含むようにＢｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ発現構築物を設計した。プライマー対５´−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３´（配列番号３３）および５´−ＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＴＣＧＡＧＧ−３´（配列番号３４）を使用して、ＧＡＴＣ（Ｋｏｌｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でのＤＮＡ配列決定により構築物の配列を確認した。抗ＥＧＦＲドメインおよび抗ＣＤ１６ＡドメインがＶＬ＿ＣＤ１６Ａ−Ｌ１−ＶＨ＿ＣＤ１６Ａ−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｌ２−ＶＨ＿ＥＧＦＲ−Ｌ３−ＶＬ＿ＥＧＦＲの順に配置されるように、Ｂｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ用の発現カセットをクローニングし、リンカーＬ１には（Ｇ２Ｓ）７を使用し、リンカーＬ２には（Ｇ４Ｓ）２を使用し、リンカーＬ３には（Ｇ２Ｓ）６を使用する。得られたＢｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ−＿０２は、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドからなる。
【００８０】
ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ（図１）
同じベクターからの共発現のために、Ｆｃサイレンシング点変異（配列番号１５、１６）を有する重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含むＣＭＶ制御発現カセットを含む改変された哺乳動物発現ベクターに、抗ＣＤ１６Ａ  Ｆｖドメインのコード配列（配列番号１２、１３）をクローニングすることによって、ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂをコードするＤＮＡ発現構築物を生成する。その後、対応するプライマーを用いて、配列番号１８（ＶＨ−（Ｇ２Ｓ）６−ＶＬ）に示されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーにより分離された抗ＥＧＦＲ  Ｆｖドメイン（配列番号１、２）をコードする遺伝子配列からＰＣＲアンプリコンを生成する。結果として生じるオーバーラップしたＤＮＡ断片を、関連する位置で共発現ベクターに挿入する。Ｆｃサイレンシング点変異を含む可変ドメインおよび定常ドメインをコードする必要な遺伝子配列はいずれも、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成された。それぞれ抗体の分泌および精製を容易にするために、Ｎ末端シグナルペプチドおよびＦｃ部分のコード配列を含むようにｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ発現構築物を設計した。カスタムメイドプライマーを使用して、ＧＡＴＣ（Ｋｏｌｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でのＤＮＡ配列決定により全構築物の配列を確認した。抗ＥＧＦＲドメイン、抗ＣＤ１６Ａドメインおよび定常ドメインが、第１のポリペプチドではＶＨ＿ＣＤ１６Ａ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｌ１−ＶＨ＿ＥＧＦＲ−Ｌ２−ＶＬ＿ＥＧＦＲ、および第２のポリペプチドではＶＬ＿ＣＤ１６Ａ−ＣＬａｍｂｄａの順に配置されるように、ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ用の発現カセットをクローニングする。リンカーＬ１には（Ｇ４Ｓ）２（配列番号３５）を使用し、リンカーＬ２には（Ｇ２Ｓ）６（配列番号１８）を使用する。得られたｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２は、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖と会合した、配列番号２８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖からなる。
【００８１】
宿主細胞培養
Ｌ−グルタミン、１０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌゼオシンを補充したＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘ中で、Ｆｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣＨＯ−Ｋ１チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−６１）の派生物（Ｋａｏ  ａｎｄ  Ｐｕｃｋ，１９６８）を培養した。０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて付着細胞を分離し、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって提供される標準的な細胞培養プロトコルに従って継代培養した。
【００８２】
懸濁液中での増殖への適応のために、組織培養フラスコから細胞を分離し、血清不含ＨｙＣｌｏｎｅ  ＣＤＭ４  ＣＨＯ培地中に入れ、その後３７℃、５％ＣＯ２および１２０ｒｐｍで振盪フラスコ内でインキュベートした。懸濁液に適応させたＦｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ宿主細胞の培養のための標準培地は、Ｌ−グルタミン、ＨＴ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１００μｇ／ｍＬゼオシンを補充したＨｙＣｌｏｎｅ  ＣＤＭ４  ＣＨＯであった。懸濁液に適応させた細胞を、１０％ＤＭＳＯを含む培地中で凍結保存し、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）検出キット（Ｌｏｎｚａ）を使用して、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）が陰性であることを検査した。
【００８３】
安定にトランスフェクトされた細胞プールの生成
懸濁液に適応させた宿主細胞のトランスフェクションによって、分泌された組換え抗体、Ｆｃ融合構築物またはコンパレーター抗体および膜係留抗原を安定に発現する組換えＦｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞株を生成した。このために、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して、目的のタンパク質（ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ）をコードする発現プラスミド（２．５μｇ）と、Ｆｌｐリコンビナーゼ（ｐＯＧ４４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とを共トランスフェクションする１日前に、ゼオシン不含標準培地に細胞を入れた。要約すると、ＤＮＡ：ＰＥＩ比１：３（μｇ／μｇ）で合計１００μＬのＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ培地中でベクターＤＮＡとトランスフェクション試薬とを混合し、１０分間インキュベートしてから、１ｍｌのＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に懸濁した２Ｅ＋６  Ｆｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞に加えた。２４〜４８時間のインキュベーション後、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地中で培養物を０．１Ｅ＋６生細胞／ｍＬの密度に希釈した後、６〜７μｇ／ｍＬピューロマイシン二塩酸塩を加えて、安定にトランスフェクトされた細胞の選択を開始した。Ｆｌｐリコンビナーゼは、部位特異的ＤＮＡ組換えを介して、組み込まれたＦＲＴ部位でのゲノムへのＦｌｐ−Ｉｎ発現構築物の挿入を媒介する（Ｏ’  Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９１）。選択中に、生細胞密度を週に２回測定し、細胞を遠心分離し、最大密度０．１Ｅ＋６生細胞／ｍＬで、新鮮な選択培地に再懸濁した。選択の２〜３週間後に、組換えタンパク質産物を安定に発現する細胞プールを回収し、その時点で、振盪フラスコ内の標準的な培養培地に細胞を移した。Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｓｔａｉｎ−Ｆｒｅｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）技術（以下を参照）またはフローサイトメトリーをそれぞれ使用した細胞培養上清のタンパク質ゲル電気泳動によって、組換え分泌タンパク質または膜係留タンパク質の発現を確認した。７．５％ＤＭＳＯを含有する培地中で、安定な細胞プールを凍結保存した。
【００８４】
流加ＣＨＯ細胞懸濁培養における組換えタンパク質の作製
細胞培養上清への分泌により、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の１０日間または１１日間の流加培養で、組換えタンパク質を作製した。このために、ガス透過性キャップを備えたポリカーボネートＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内の標準的な培養培地に、６Ｅ＋５細胞／ｍＬの開始密度で組換え抗体、Ｆｃ融合抗原またはコンパレーター抗体を安定に発現する細胞を播種し、１４０ｒｐｍで撹拌しながら３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。流加培養中、培地には、４０ｍＬ／Ｌ  ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｆｅｅｄ  Ａ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および４ｍＬ／Ｌ  ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｆｅｅｄ  Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を０日目（開始日）に、これらを２倍の量で３日目、５日目および７日目に補充した。典型的に＞７５％の培養生存率で１０日後または１１日後に細胞培養上清を収集した。フィーディング前に１日おきに生成培養物から試料を収集し、細胞密度および生存率を評価した。収集日に、遠心分離と、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＰＬＵＳメンブレンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用した真空濾過（０．２２μｍ）とにより細胞培養上清を除去し、その後使用した。
【００８５】
発現力価の定量
生成培養物の５日目、７日目および１０日目または１１日目のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、細胞培養上清（ＣＳＳ）のタンパク質発現力価および生成物完全性を分析する。４〜２０％Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  Ｐｒｅｃａｓｔ  ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏｒａｄ）にロードする前に、試料とＳＤＳ  ＰＡＧＥ試料緩衝液とを混合する。Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｓｔａｉｎ−ｆｒｅｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒイメージングシステム（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して、ゲル中の総タンパク質を可視化する。既知の濃度の参照抗体と比較することにより、生成物の力価を半定量的に決定する。
【００８６】
抗ＥＧＦＲ抗体の精製
プロテインＡおよび分取ＳＥＣを含む２段階手順で、清澄化したＣＨＯ細胞培養上清から抗ＥＧＦＲ抗原結合タンパク質を精製した。プロテインＡの場合、清澄化した上清をＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅカラムにロードした。リン酸緩衝食塩水ｐＨ７．４および１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で洗浄した後、５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ３．５および１０ｍＭグリシン／ＨＣＬ  ｐＨ２．０を用いた２段階勾配でタンパク質を溶出した。ＳＥ−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して画分の純度を分析した。許容可能な純度を示す画分をプールし、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅカラムを使用した分取ゲル濾過に供した。精製した抗ＥＧＦＲ抗原結合タンパク質を含有する溶出画分をプールし、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、４．５％ソルビトールｐＨ５．０に対してＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを使用した緩衝液交換に供し、限外濾過により約１ｍｇ／ｍＬの典型的な濃度に濃縮した。還元および非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、最終試料の均一性（ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿２約７９％およびＢｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ＿２約８５％）を評価した（図５を参照）。非還元２ｘ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液、または還元剤としてジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有する還元２ｘ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液と試料を混合した。４〜２０％のＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  Ｐｒｅｃａｓｔ  ＳＤＳ  Ｐａｇｅゲルにロードする前に、全試料を９５℃で５分間加熱した。１レーン当たり２μｇの精製タンパク質試料を使用した。ゲル中のタンパク質を分離するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを１ｘ  Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳ緩衝液で３００Ｖで約２２分間実行した。Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｓｔａｉｎ−ｆｒｅｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒイメージングシステム（ＢｉｏｒａｄＢｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、ゲル中の総タンパク質を可視化した。分子量マーカーとしてＰａｇｅ  Ｒｕｌｅｒ  Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌａｄｄｅｒを使用した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００ＧＬカラムを使用した分析用ＳＥ−ＨＰＬＣにより、純度（ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿２約９９％およびＢｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ＿２約９７％）を評価した。精製タンパク質は、その後使用するまでアリコートとして−８０℃で保存した。
【００８７】
ＥＬＩＳＡにおけるＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の結合の分析
ＥＬＩＳＡにおける結合の分析
１００ｍＭカーボナート−バイカーボナート緩衝液中の組換え抗原または抗体により、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｉｍｍｕｎｏ  ＭａｘｉＳｏｒｐ；Ｎｕｎｃ）を４℃で一晩コーティングした。ＥＧＦＲ−ｍＦｃ抗原は２．５μｇ／ｍＬ、ＥＧＦＲ−Ｆｃは３μｇ／ｍＬ、ＣＤ１６Ａ−Ｆｃは１．５μｇ／ｍｌ、ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ  ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂは３．８μｇ／ｍｌ、またはＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ  Ｂｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃは３μｇ／ｍＬの濃度でコーティングした。ＰＢＳに溶解した３％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳（Ｍｅｒｃｋ）を用いたブロッキング工程の後、０．３％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳を含有するＰＢＳ中の様々な抗体または可溶性抗原の連続希釈液をプレート上で室温で１．５時間インキュベートした。０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳを１ウェル当たり３００μＬ用いて３回洗浄した後、プレートを検出抗体と室温で１時間インキュベートした。Ｈｉｓタグ付き検体の検出には、Ｐｅｎｔａ−ＨＩＳ−ＨＲＰ（Ｑｉａｇｅｎ）を１：３０００希釈で使用した。ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ  ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂまたはＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ  Ｂｉ−ｓｃＦｖ−ＦｃがＥＧＦＲ−ｍＦｃ抗原に結合していることを検出するために、ビオチン化ＣＤ１６−Ｆｃをプレート上で１μｇ／ｍＬで１時間、室温でインキュベートした後、洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート（Ｒｏｃｈｅ）と１：１００００希釈で、室温で１時間インキュベートした。０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳを１ウェル当たり３００μＬ用いて３回洗浄した後、発色がはっきりと見えるまで、プレートをテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｓｅｒａｍｕｎ）とインキュベートした。１ウェル当たり１００μＬの０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えて、反応を停止した。マルチラベルプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、４５０ｎｍで吸光度を測定した。吸光度値をプロットし、非線形回帰、シグモイド型用量反応（可変勾配）、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６．０７による最小二乗（通常）適合（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ）を使用して分析した。
【００８８】
ＦｃＲｎおよび様々なＦｃγ受容体に対する結合
ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質中のサイレンシングされたＦｃの特性評価のために、表面プラズモン共鳴分光法（ＳＰＲ）を使用して、様々なＦｃγ受容体およびＦｃＲｎ（ｐＨ６．０）に対する結合を測定した。
【００８９】
材料および方法
リガンド分子
モノＦｃ（ｍＦｃ）およびＡｖｉ−Ｔａｇに融合した様々なＦｃγ受容体（ヒト、イヌ、カニクイザル、マウス）をＣＨＯに発現させ、プロテインＡおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により精製した。ビオチン−タンパク質リガーゼ／ＢｉｒＡキット（ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ）を使用して、Ａｖｉ−Ｔａｇで分子をビオチン化した。
ＣＤ６４      ヒト          ＦｃγＲＩ−ｍＦｃ−Ａｖｉ
ＣＤ３２Ａ    ヒト          ＦｃγＲＩＩａ−ｍＦｃ−Ａｖｉ
ＣＤ３２Ｂ    ヒト          ＦｃγＲＩＩｂ−ｍＦｃ−Ａｖｉ
ＣＤ３２Ｃ    ヒト          ＦｃγＲＩＩｃ−ｍＦｃ−Ａｖｉ
ＣＤ１６Ａ    ヒト          ＦｃγＲＩＩＩａ（４８Ｒ−１５８Ｖ）−ｍＦｃ−Ａｖｉ
ＣＤ１６Ｂ    ヒト          ＦｃγＲＩＩＩｂ（ＮＡ１）−ｍＦｃ−Ａｖｉ
ＣＤ６４      マウス        ＦｃγＲＩ−ｍＦｃ−Ａｖｉ
ＣＤ３２      マウス        ＦｃγＲＩＩｂ−ｍＦｃ−Ａｖｉ
ＣＤ１６      マウス        ＦｃγＲＩＩＩ−ｍＦｃ−Ａｖｉ
ＣＤ１６−２  マウス        ＦｃγＲＩＶ−ｍＦｃ−Ａｖｉ
ＣＤ１６      イヌ          ＦｃγＲＩＩＩ−ｍＦｃ−Ａｖｉ
ＣＤ３２Ａ    カニクイザル  ＦｃγＲＩＩａ−ｍＦｃ−Ａｖｉ
ＣＤ３２Ｂ／Ｃカニクイザル  ＦｃγＲＩＩｂ／ｃ−ｍＦｃ−Ａｖｉ
ＣＤ１６      カニクイザル  ＦｃγＲＩＩＩ−ｍＦｃ−Ａｖｉ
ビオチン化ＦｃＲｎ分子（ヒト、マウス、カニクイザル）を購入した：
【表２】
2021515798.tif 000003
【００９０】
ＳＰＲ法
Ａ）様々なＦｃγ受容体に対する結合
ＨＢＳ−Ｐ＋を使用して、様々なＦｃγ受容体に対するＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の結合をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器上で２５℃で測定した。
【００９１】
ｂ）ＦｃＲｎに対する結合
ランニング緩衝液として、および希釈のために（１×Ｇｉｂｃｏ  ＰＢＳ、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０、４Ｍ  ＨＣｌを使用してｐＨ６．０まで滴定）、ｐＨ６．０のＰＢＳ−Ｔ緩衝液を使用して、２５℃で、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器上で、ＦｃＲｎ（ヒト、カニクイザル、マウス）に対するＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の結合を測定した。この目的のために、Ｂｉｏｔｉｎ  ＣＡＰｔｕｒｅキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＭｕｌｔｉ  Ｃｙｃｌｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃ実験を行った。センサー表面を活性化するために、フローセルＦｃ  １〜４にＢｉｏｔｉｎ  ＣＡＰｔｕｒｅ試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を注入し（１００秒、５μＬ／分）、２１００ＲＵ〜２８００ＲＵの反応をもたらした。フローセルＦｃ  ２に様々な種のビオチン化ＦｃＲｎを注入し（５μＬ／分）、約８〜約１５ＲＵの反応をもたらした。ランニング緩衝液として、および希釈のために、ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の希釈系列を（ｐＨ７．４）に入れた。この目的のために、Ｂｉｏｔｉｎ  ＣＡＰｔｕｒｅキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｙｃｌｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃ実験を行った。センサー表面を活性化するために、フローセルＦｃ  １〜４にＢｉｏｔｉｎ  ＣＡＰｔｕｒｅ試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を注入し（１００秒、５μＬ／分）、２１００ＲＵ〜２８００ＲＵの反応をもたらした。フローセルＦｃ  ２、Ｆｃ  ３、Ｆｃ  ４）内にビオチン化Ｆｃγ受容体を捕捉した（３５ＲＵ〜５５ＲＵ）。Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｙｃｌｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃモード（３０μＬ／分、会合１８０秒、解離２４０秒、６０００ｎＭ〜１．４７ｎＭ希釈１：４）で、フローセルＦｃ  １〜４に抗ＥＧＦＲ抗体構築物の希釈系列を注入した。再生溶液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してチップを再生した（１０μＬ／分、フローセル１〜４、１２０秒）。ゼロ濃度サイクルの減算、および参照チャネルＦｃ  １（Ｆｃ  ２−１、Ｆｃ  ３−１、Ｆｃ  ４−１）内のシグナルの減算によってセンサーグラムを参照する。フローセルＦｃ  １、２（３０μＬ／分、会合２４０秒、解離１００秒、３０００ｎＭ〜１２．５ｎＭ希釈１：３）に導入したＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して、１：１結合モデル（０に対するＲＩ定数）にデータを適合させることによって結合速度を評価した。再生溶液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してチップを再生した（１０μＬ／分、フローセル１〜４、１２０秒）。ゼロ濃度サイクルの減算、および参照チャネルＦｃ  １（Ｆｃ  ２−１）内のシグナルの減算によってセンサーグラムを参照する。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して、１：１結合モデルにデータを適合させることによって（ＲｍａｘおよびＲＩをローカルに適合）、結合速度を評価した。
【００９２】
結果
Ｆｃγ受容体結合アッセイでは、ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２は、ヒトＣＤ１６Ａ  ＦｃγＲＩＩＩａ（４８Ｒ−１５８Ｖ）−ｍＦｃ−Ａｖｉ（ＫＤ  １２．５ｎＭ）およびカニクイザルＣＤ１６  ＦｃγＲＩＩＩ−ｍＦｃ−Ａｖｉ（ＫＤ  １９．９ｎＭ）に対する結合を示したが、他の試験したＦｃγ受容体についてはいずれも、結合相互作用は検出されなかった（表１）。Ｂｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ＿０２は、ＣＤ１６Ａ  ＦｃγＲＩＩＩａ（４８Ｒ−１５８Ｖ）−ｍＦｃ−Ａｖｉ（ＫＤ  １２．２ｎＭ）およびカニクイザルＣＤ１６  ＦｃγＲＩＩＩ−ｍＦｃ−Ａｖｉ（ＫＤ  ２５．２ｎＭ）のみに対する結合を示した。対照分子ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディは、ヒトＣＤ１６Ａ  ＦｃγＲＩＩＩａ（４８Ｒ−１５８Ｖ）−ｍＦｃ−Ａｖｉ（ＫＤ  ４．４ｎＭ）およびカニクイザルＣＤ１６  ＦｃγＲＩＩＩ−ｍＦｃ−Ａｖｉ（ＫＤ  ８．９ｎＭ）に対する結合を示した。様々なＩｇＧ１対照分子によって、試験した全Ｆｃγ受容体の機能性を示した（データは示さず）。
【００９３】
ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２およびＢｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ＿０２でのＦｃのサイレンシングは、試験したＦｃγ受容体に対する結合相互作用の欠如によって確認することができる（抗ＣＤ１６Ａドメインを介したヒトＣＤ１６ＡおよびカニクイザルＣＤ１６に対する特異的結合を除く）。
【００９４】
ｐＨ６．０でのｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２およびＢｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ−０２のＦｃＲｎ結合は、ヒトＦｃＲｎ（ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿２  ＫＤ  ４３０ｎＭ、Ｂｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ＿０２  ＫＤ  ４１０ｎＭ）、マウスＦｃＲｎ（ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２  ＫＤ  １８０ｎＭ、Ｂｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ＿０２  ＫＤ  １２１ｎＭ）およびカニクイザルＦｃＲｎ（ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２  ＫＤ  ８４２ｎＭ、Ｂｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ＿０２  ＫＤ  ２６８ｎＭ）に対して示された。対照分子ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディについては結合相互作用は測定されなかった。ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２およびＢｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ＿０２のサイレンシングされたＦｃでのＦｃＲｎ結合能の維持を検証することができる。
【表３】
2021515798.tif 000004
【表４】
2021515798.tif 000005
【００９５】
例２
１０ｍｇ／ｍＬポリクローナルヒトＩｇＧの存在下または非存在下での初代ヒトＮＫ細胞に対する二重特異性ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の結合
方法
バフィーコートからのＰＢＭＣの単離およびヒトＮＫ細胞の濃縮
密度勾配遠心分離によって、バフィーコート（Ｇｅｒｍａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からＰＢＭＣを単離した。２〜３倍容量のＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：１４１９０−１６９）を用いてバフィーコート試料を希釈し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号：０７８６１）のクッション上に重層し、ブレーキをかけずに室温で８００×ｇで２５分間遠心分離した。界面に位置するＰＢＭＣを収集し、ＰＢＳで３回洗浄した後、１０％ＦＣＳを補充した完全ＲＰＭＩ  １６４０培地中で一晩刺激することなく培養した。ＮＫ細胞を濃縮するために、ＰＢＭＣを一晩培養物から収集し、製造業者の指示に従って未接触ヒトＮＫ細胞の免疫磁気単離のためのＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＮＫ細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号：１９９５５）と、Ｂｉｇ  Ｅａｓｙ  ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｍａｇｎｅｔ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号：１８００１）とを使用する１ラウンドの陰性選択のために使用した。
【００９６】
細胞結合アッセイおよびフローサイトメトリー分析
２％熱不活性化ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：１０２７０−１０６）、０．１％アジ化ナトリウム（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号：Ａ１４３０．０１００）を含有するＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：１４１９０−１６９）中の１０ｍｇ／ｍＬポリクローナルヒトＩｇＧ（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ，Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）の存在下または非存在下で、様々な二重特異性ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の連続希釈液１００μＬとともに、示された細胞型のアリコートを３７℃で４５分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で繰り返し洗浄した後、１０ｍｇ／ｍＬ抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ（クローン６２−１−１  Ｂｉｏｇｅｎｅｓ）、続いて１５μｇ／ｍＬ  ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｄｉａｎｏｖａ、カタログ番号：１１５−０９５−０６２）を用いて、細胞結合抗体を検出した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲートストレプトアビジン（Ｄｉａｎｏｖａ  ０１６−５４０−０８４）によって、ビオチン化セツキシマブおよびビオチン化抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧ抗体（ＩｇＡｂ＿ｗｔＦｃ、ＩｇＡｂ＿ｅｎｈＦｃ）を検出した。最後の染色工程の後、細胞を再度洗浄し、２μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｐ４１７０）を含有するＦＡＣＳ緩衝液０．２ｍＬに再懸濁して、死細胞を除外した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｇｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、２〜５ｘ１０３の生細胞の蛍光を測定した。Ｉｎｃｙｔｅソフトウェア（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、細胞試料の平均蛍光強度を計算した。二次および三次試薬のみを用いて染色した細胞の蛍光強度値を差し引いた後、それらの値をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６．００、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ）を使用した非線形回帰分析に使用した。ＫＤの計算には、１部位結合（双曲線）の方程式を使用した。
【００９７】
結果
二重特異性ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の結合能に対するヒトＩｇＧの生理学的濃度の影響を評価するために、図１０に例示された１０ｍｇ／ｍＬポリクローナルヒトＩｇＧの存在下または非存在下で、初代ヒトＮＫ細胞に対していくつかの二重特異性ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質を用いた結合アッセイを行った。表３は、両条件下での示された二重特異性抗原結合タンパク質の結合親和性を要約している。初代ヒトＮＫ細胞に対するＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディの見かけの親和性は、１０ｍｇ／ｍＬポリクローナルヒトＩｇＧの存在下では実質的に変化しない。しかし、ＩｇＧを加えると、Ｂｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ＿０２の親和性が５ｎＭから２０ｎＭに約４分の１低下する。
【表５】
2021515798.tif 000006
【００９８】
例３
組換えヒトＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するＣＨＯ細胞に対するＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディの結合
細胞結合アッセイおよびフローサイトメトリー分析
２％熱不活性化ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：１０２７０−１０６）、０．１％アジ化ナトリウム（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号：Ａ１４３０．０１００）を含有するＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：１４１９０−１６９）中のＨｉｓタグ付きタンデムダイアボディの連続希釈液１００μＬとともに、示された細胞のアリコートを３７℃で４５分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で繰り返し洗浄した後、１０μｇ／ｍＬ抗Ｈｉｓ  ｍＡｂ  １３／４５／３１−２（Ｄｉａｎｏｖａ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号：ＤＩＡ９１０−１ＭＧ）、続いて１５μｇ／ｍＬ  ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｄｉａｎｏｖａ、カタログ番号：１１５−０９５−０６２）を用いて、細胞結合抗体を検出した。最後の染色工程の後、細胞を再度洗浄し、２μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｐ４１７０）を含有するＦＡＣＳ緩衝液０．２ｍＬに再懸濁して、死細胞を除外した。ＭＸＰソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用するＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＦＣ５００  ＭＰＬフローサイトメーター、またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｇｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、２〜５ｘ１０３の生細胞の蛍光を測定した。ＣＸＰソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）またはＩｎｃｙｔｅソフトウェア（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、細胞試料の平均蛍光強度を計算した。二次および三次試薬のみを用いて染色した細胞の蛍光強度値を差し引いた後、それらの値をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６．００、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ）を使用した非線形回帰分析に使用した。ＫＤの計算には、１部位結合（双曲線）の方程式を使用した。
【００９９】
結果
ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディは、３７℃でヒトＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する細胞と同様の見かけの親和性を有する（表４）。
【０１００】
したがって、ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質は、ＥＧＦＲ発現がんおよびＥＧＦＲｖＩＩＩ発現がんの両方の治療に使用することができる。ＥＧＦＲとは対照的に、ＥＧＦＲｖＩＩＩはがん細胞のみに発現し、健康な組織には発現しない。
【表６】
2021515798.tif 000007
【０１０１】
例４
ＥＧＦＲ＋Ａ−４３１およびＨＣＴ−１１６細胞に対するＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ構築物の結合
方法
細胞株の培養
１０％熱不活性化ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１００ＩＵ／ｍＬペニシリンＧナトリウムおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン硫酸塩（成分はいずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を補充したＤＭＥＭ培地中で、標準条件下で、Ａ−４３１（ＡＴＣＣ、カタログ番号：ＣＲＬ−１５５５、ＲＡＳ  ｗｔ）を培養した。
【０１０２】
１０％熱不活性化ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１００ＩＵ／ｍＬペニシリンＧナトリウムおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン硫酸塩を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地（成分はいずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、本明細書では完全ＲＰＭＩ  １６４０培地と呼ぶ）中で、標準条件下で、ＨＣＴ−１１６（ＡＴＣＣ、カタログ番号：ＣＣＬ−２４７、ＲＡＳ  ｍｕｔ）を培養した。細胞株はいずれも、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中で３７℃で培養した。
【０１０３】
細胞結合アッセイおよびフローサイトメトリー分析
２％熱不活性化ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：１０２７０−１０６）、０．１％アジ化ナトリウム（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号：Ａ１４３０．０１００）を含有するＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：１４１９０−１６９）中の示された二重特異性ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の連続希釈液１００μＬとともに、示された細胞型のアリコートを３７℃で４５分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で繰り返し洗浄した後、１０μｇ／ｍＬの抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ（クローン４−１−１（Ｂｉｏｇｅｎｅｓ））、続いてＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ  ｍｉｎ  Ｘ（Ｄｉａｎｏｖａ；カタログ番号１１５−０９５−０６２）を用いて、細胞結合抗体を検出した。ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｄｉａｎｏｖａ；カタログ番号１０９−０９５−０８）によって、細胞表面に結合したセツキシマブ、ｗｔＦｃ（ＩｇＡｂ＿ｗｔＦｃ；ＩｇＡｂ＿４９）を有する抗ＥＧＦＲ、増強されたＦｃ（ＩｇＡｂ＿ｅｎｈＦｃ、ＩｇＡｂ＿５３）を有する抗ＥＧＦＲを検出した。最後の染色工程の後、細胞を再度洗浄し、２μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｐ４１７０）を含有するＦＡＣＳ緩衝液０．２ｍＬに再懸濁して、死細胞を除外した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｇｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、２〜５ｘ１０３の生細胞の蛍光を測定した。Ｉｎｃｙｔｅソフトウェア（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、細胞試料の平均蛍光強度を計算した。二次および三次試薬のみを用いて染色した細胞の蛍光強度値を差し引いた後、それらの値をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６．００、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ）を使用した非線形回帰分析に使用した。ＫＤの計算には、１部位結合（双曲線）の方程式を使用した。
【０１０４】
結果
ＥＧＦＲ＋腫瘍細胞株に対する二重特異性ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の見かけの親和性を、独立した結合実験で決定し、表５に要約した。
【表７】
2021515798.tif 000008
【０１０５】
例５
ＥＧＦＲ＋腫瘍細胞株に対する二重特異性ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の細胞傷害活性
方法
細胞株の培養
１０％熱不活性化ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１００ＩＵ／ｍＬペニシリンＧナトリウムおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン硫酸塩（成分はいずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を補充したＤＭＥＭ培地中で、標準条件下で、Ａ−４３１（ＡＴＣＣ、カタログ番号：ＣＲＬ−１５５５）を培養した。１０％熱不活性化ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１００ＩＵ／ｍＬペニシリンＧナトリウムおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン硫酸塩を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地（成分はいずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、本明細書では完全ＲＰＭＩ  １６４０培地と呼ぶ）中で、標準条件下で、ＨＣＴ−１１６（ＡＴＣＣ、カタログ番号：ＣＣＬ−２４７）を培養した。細胞株はいずれも、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中で３７℃で培養した。
【０１０６】
バフィーコートからのＰＢＭＣの単離およびヒトＮＫ細胞の濃縮
密度勾配遠心分離によって、バフィーコート（Ｇｅｒｍａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からＰＢＭＣを単離した。２〜３倍容量のＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：１４１９０−１６９）を用いてバフィーコート試料を希釈し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号：０７８６１）のクッション上に重層し、ブレーキをかけずに室温で８００×ｇで２５分間遠心分離した。界面に位置するＰＢＭＣを収集し、ＰＢＳで３回洗浄した後、１０％ＦＣＳの代わりに１０％ヒトプール血清（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｈ４５２２）を補充した完全ＲＰＭＩ  １６４０培地中で一晩刺激することなく培養した。ＮＫ細胞を濃縮するために、ＰＢＭＣを一晩培養物から収集し、製造業者の指示に従って未接触ヒトＮＫ細胞の免疫磁気単離ためのＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＮＫ細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号：１９０５５）と、Ｂｉｇ  Ｅａｓｙ  ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｍａｇｎｅｔ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号：１８００１）とを使用する１ラウンドの陰性選択のために使用した。
【０１０７】
４時間カルセイン放出細胞傷害性アッセイ
カルセイン放出細胞傷害性アッセイのために、示された標的細胞を培養物から収集し、ＦＣＳ不含ＲＰＭＩ  １６４０培地で洗浄し、３７℃でＦＣＳ不含ＲＰＭＩ培地中で３０分間かけて１０μＭカルセインＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号：Ｃ３１００ＭＰ）を用いて標識した。標識細胞を穏やかに洗浄した後、完全ＲＰＭＩ培地（１０％熱不活性化ＦＣＳ、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン硫酸塩を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地）に１ｘ１０５／ｍＬの密度まで再懸濁した。次いで、丸底９６ウェルマイクロプレートの個々のウェルに、総容量２００μＬ／ウェルで２連で、１２段階希釈で、Ｅ：Ｔ比５：１の濃縮初代ヒトＮＫ細胞、および示された抗体とともに、１×１０４の標的細胞を播種した。抗体の非存在下でのエフェクターによる標的の自発的放出、最大放出および殺傷を、各プレートに対して４連で決定した。
【０１０８】
２００ｇで２分間遠心分離した後、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中で、アッセイを３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション終了の１５分前に、標的細胞を含むウェルに、ＲＰＭＩ培地中の２０μＬの１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加えた。２０μＬのＲＰＭＩ培地を他の全ウェルに加えた。５００ｇで５分間さらに遠心分離した後、各ウェルから１００μＬの細胞培養上清を収集し、蛍光プレートリーダー（ＥｎＳｉｇｈｔ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅプレートリーダー、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して５２０ｎｍで、放出されたカルセインの蛍光を測定した。測定されたカウントに基づいて、以下の式に従って、特異的な細胞溶解を計算した：［蛍光（試料）−蛍光（自発的）］／［蛍光（最大）−蛍光（自発的）］ｘ１００％。蛍光（自発的）は、エフェクター細胞および抗体の非存在下での標的細胞からの蛍光カウントを表し、蛍光（最大）は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加えることによって誘発された総細胞溶解を表す。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６．００、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ）を使用して、非線形回帰／４パラメーターロジスティックフィット（４−ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｆｉｔ）によって、シグモイド型用量反応曲線およびＥＣ５０値を計算した。
【０１０９】
結果
ＥＧＦＲ＋Ａ−４３１およびＨＣＴ−１１６標的細胞に対する４時間カルセイン放出細胞傷害性アッセイでは、対照構築物とともに、様々な二重特異性ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質を試験した。抗原結合タンパク質はオフターゲットの細胞傷害性を示さなかった。図１２は、１つの例示的な実験の結果を示している。表６（Ａ−４３１標的細胞）および表７（ＨＣＴ−１１６標的細胞）に、３つの独立した実験から得られた結果を要約する。
【表８】
2021515798.tif 000009
【表９】
2021515798.tif 000010
【０１１０】
例６
ＥＧＦＲリン酸化の阻害
ＥＧＦ誘発性ＥＧＦＲシグナル伝達に対する様々なＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の阻害作用を比較するために、Ａ−４３１細胞を用いたリン酸化アッセイを行った。
【０１１１】
材料および方法
細胞株の培養
１０％熱不活性化ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１００ＩＵ／ｍＬペニシリンＧナトリウムおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン硫酸塩（成分はいずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を補充したＤＭＥＭ培地中で、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、３７℃で、標準条件下でＡ−４３１（ＡＴＣＣ、カタログ番号：ＣＲＬ−１５５５）を培養した。
【０１１２】
リン酸化アッセイ
要約すると、１０％熱不活性化ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１００ＩＵ／ｍＬペニシリンＧナトリウムおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン硫酸塩（成分はいずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を補充したＤＭＥＭ培地中で、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、３７℃で２０時間かけて、９６ウェルプレートの個々のウェルに、５ｘ１０４のＡ−４３１細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号：ＣＲＬ−１５５５）のアリコートを播種した。次いで、血清不含培地中で４時間かけて細胞を飢餓状態にしてから、示された抗体構築物の連続希釈液を加えた。３７℃で３０分間インキュベートした後、ＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：１０６０５−ＨＮＡＥ−２５０）を１００ｎｇ／ｍＬの最終濃度まで加え、培養物を３７℃で１０分間さらにインキュベートした後、氷冷ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：１４１９０−１６９）で細胞を洗浄し、溶解させ、製造業者の指示に従ってＰｈｏｓｐｈｏ−ＥＧＦＲ  ＥＬＩＳＡキット（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号：ＰＥＬ−ＥＧＦＲ−Ｙ）を使用したリン酸化ＥＧＦＲの相対的定量のために使用した。マルチプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ  ３、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、４５０ｎｍで吸光度を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６．００、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ）を使用して、吸光度値を分析しプロットした。
【０１１３】
細胞結合アッセイおよびフローサイトメトリー分析
２％熱不活性化ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：１０２７０−１０６）、０．１％アジ化ナトリウム（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号：Ａ１４３０．０１００）を含有するＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：１４１９０−１６９）中の示された抗体の連続希釈液１００μＬとともに、示された細胞のアリコートを３７℃で４５分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で繰り返し洗浄した後、１０μｇ／ｍＬ抗Ｈｉｓ  ｍＡｂ  １３／４５／３１−２（Ｄｉａｎｏｖａ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号：ＤＩＡ９１０−１ＭＧ）、続いて１５μｇ／ｍＬ  ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｄｉａｎｏｖａ、カタログ番号：１１５−０９５−０６２）を用いて、または抗ＣＤ１６Ａ  Ｆｖドメイン（（配列番号１２、１３）に対して生成されたｍＡｂ  ４−１−１、続いて１５μｇ／ｍＬ  ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧを用いて、細胞結合タンデムダイアボディを検出した。ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｄｉａｎｏｖａ、カタログ番号：１０９−０９５−０８８）によって、またはｍＡｂ  ４−１−１、続いて１５μｇ／ｍＬ  ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧを用いて、細胞表面に結合したＢｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ＿０２（配列番号３０）、ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０１およびｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２（配列番号２８、２９）を検出した。ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｄｉａｎｏｖａ、カタログ番号：１０９−０９５−０８８）によって、細胞表面に結合したセツキシマブおよびＩｇＡｂ＿ｗｔＦｃ（ＩｇＡｂ＿０４９）を検出した。最後の染色工程の後、細胞を再度洗浄し、２μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｐ４１７０）を含有するＦＡＣＳ緩衝液０．２ｍＬに再懸濁して、死細胞を除外した。ＭＸＰソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用するＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＦＣ５００  ＭＰＬフローサイトメーター、またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｇｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、２〜５ｘ１０３の生細胞の蛍光を測定した。ＣＸＰソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）またはＩｎｃｙｔｅソフトウェア（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、細胞試料の平均蛍光強度を計算した。二次および三次試薬のみを用いて染色した細胞の蛍光強度値を差し引いた後、それらの値をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６．００、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ）を使用した非線形回帰分析に使用した。ＫＤの計算には、１部位結合（双曲線）の方程式を使用した。
【０１１４】
結果
陽性対照として使用された抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧセツキシマブ、およびイムガツズマブ（ｉｍｇａｔｕｚｕｍａｂ）（ＩｇＡｂ＿０６５）由来の抗ＥＧＦＲ  Ｆａｂドメインを有するヒトＩｇＧ１は、ＥＧＦ誘発性ＥＧＦＲリン酸化を用量依存的に阻害し、ＥＣ５０値は７μｇ／ｍＬ〜９μｇ／ｍＬの範囲であった。
【０１１５】
ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディ、ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ  ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０１、ＦｃサイレンシングＩｇＧ１（ＩｇＡｂ＿０４７）およびｗｔ  ＩｇＧ１（ＩｇＡｂ＿０４９）は、いずれも配列番号１および２に示される可変ドメインを含む抗ＥＧＦＲ  Ｆａｂドメインを含み、実質的に低い効力でＥＧＦＲリン酸化を阻害し、ＥＣ５０値は１００μｇ／ｍＬよりも高かった。
【０１１６】
特に、ＦｃのＣ末端に融合したｓｃＦｖとして配列番号１および２に示される抗ＥＧＦＲドメインを含むｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２は、ＥＧＦ誘発性ＥＧＦＲリン酸化に対する阻害作用を全く示さないか、ほんのわずかしか示さなかった。
【０１１７】
これらのデータは、ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２がセツキシマブおよびイムガツズマブと比較して受容体拮抗作用の低下を示し、したがって、組織の恒常性についてＥＧＦＲシグナル伝達に依存する組織、例えば皮膚で毒性の低下を示すことを示唆している。
【０１１８】
陰性対照として使用したＣＤ１９／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディは、ＥＧＦＲリン酸化の阻害を示さなかった。図１３および図１４に示した実験から得られた結果を表８に要約する。
【表１０】
2021515798.tif 000011
【０１１９】
Ａ‐４３１細胞に対する見かけの結合親和性（ＫＤ値）はＥＧＦ誘発性ＥＧＦＲリン酸化の阻害の効力と相関しないため（表９、図１４）、ＥＧＦ誘発性ＥＧＦＲリン酸化に対する阻害作用での試験した抗体構築物およびフォーマット間の差は、ＥＧＦＲに対するそれらの親和性の差に起因し得ない。
【０１２０】
例えば、ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディは、ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２またはＢｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ＿０２と比較して、Ａ−４３１細胞に対してわずかに低い／または同様の結合親和性を示すが、ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２またはＢｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ＿０２よりも実質的に強力なリン酸化阻害作用を有する。または、Ａ−４３１上のＥＧＦＲに対するｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０１またはＢｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ＿０２の見かけの親和性はセツキシマブと同じ範囲であるが、ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０１またはＢｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ＿０２のＥＧＦＲリン酸化に対する阻害作用は、セツキシマブと比較して実質的に低い。
【０１２１】
試験したＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質はいずれも、ＥＧＦＲおよびＣＤ１６Ａに対する同じ結合ドメインを含むため、ＥＧＦＲのＥＧＦ媒介リン酸化に対する作用は、抗原結合タンパク質の３次元構造の固有の特性に関連するはずである。Ｃ末端位置にＥＧＦＲ結合ドメインを含むｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２およびＢｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ＿０２のみが、この特異的な特性を示す（リン酸化に対する阻害作用がない、またはわずかな阻害作用のみ）。
【０１２２】
したがって、この独特の特性が、例えばセツキシマブと比較して改善された副作用プロファイルにつながることが予測される。この仮定の背後にある理由は、ＥＧＦＲ阻害剤によって見られる皮膚毒性が、前述のように、皮膚のケラチノサイトのＥＧＦＲシグナル伝達に対する望ましくない阻害作用に起因するということである。
【表１１】
2021515798.tif 000012
【０１２３】
例７
薬物動態（ＰＫ）特性の評価
それぞれの抗体の単回静脈内注射後のＣＤ１マウスを対象としたｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２およびＢｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ＿０２の血清中濃度の決定
ＣＤ１マウスを対象とした単回投与ＰＫ試験では、ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質のＰＫ評価を行った。ＣＤ１マウスでは名目上の標的に対する結合はなく、このモデルでは標的を介した作用を検討することはできないことに留意しなければならない。しかし、被験物質はマウスのＦｃＲｎ受容体と完全に交差反応性であり、半減期に対するＦｃＲｎの作用は完全に反映されるはずである。マウス血清に対するＰＫ分析では、２つの試験系を実施して、ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質を評価した。最初の試験系をＥＬＩＳＡフォーマットで設定し、その後このプラットフォームをＭＳＤリーダープラットフォームに移行させた。２つのアッセイから、一貫した血清中濃度およびＰＫデータが明らかにされた。
【０１２４】
３００μｇ／マウスの用量の緩徐なボーラス静脈内注射用のｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２およびＢｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ＿０２の投与溶液を調製して、３００μｇ／２５０μＬの最終濃度を得た。
２つのＰＫ試験を行った：
【０１２５】
採血（試料収集は処置前（投与前）、処置から最大１６８時間後（試験１）および処置から最大５０４時間後（試験２）に行った。
採血数／動物：３
動物数／時点：４
【０１２６】
イソフルラン麻酔下で眼球後静脈叢の穿刺により採血を行った。血液量は１００〜１５０μＬ（約３０μＬの血清）であった。
【０１２７】
３回目の最終採血の直後に動物を殺処分した。
【０１２８】
全血を血清に処理し、全試料を直ちに凍結し、−６５℃未満で保存した。
【０１２９】
第１の試験では、ＭＳＤおよびＥＬＩＳＡによって、１６８時間の期間（７日間）にわたる血清薬物動態の評価を行った。半減期は以下の通りであった：
ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２：７９時間
Ｂｉ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ＿０２：９６時間
【０１３０】
採血期間が短すぎて最終消失時間を適切に計算することができなかったため、その後の試験を行った。したがって、第２の試験では、ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２に関してのみ（ＥＬＩＳＡによる血清中濃度の決定）、５０４時間の期間（２１日間）にわたって血清薬物動態の評価を行った。観察時間は十分であり、消失相に対して明らかに信頼性の高い半減期計算を行うことができた。ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２の半減期は以下の通りであった：
３２９．２時間
マウスを対象とした半減期の決定
薬物動態パラメーターは、Ｓｕｍｍｉｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（６８９１１  Ｏｐｅｎ  Ｆｉｅｌｄ  Ｄｒ．，Ｍｏｎｔｒｏｓｅ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ  ８１４０１  ＵＳＡ）製のプログラムＰＫ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（バージョン２．０）を使用して、非コンパートメントによって決定した。
【０１３１】
例８
Ａ−４３１細胞およびＡ−５４９細胞におけるＥＧＦ刺激性ＥＧＦＲリン酸化の阻害
ＥＧＦ誘発性ＥＧＦＲシグナル伝達に対する様々なＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の阻害作用を比較するために、Ａ−４３１細胞およびＡ−５４９細胞を用いたリン酸化アッセイを行った。
【０１３２】
材料および方法
細胞株の培養
１０％熱不活性化ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１００ＩＵ／ｍＬペニシリンＧナトリウムおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン硫酸塩（成分はいずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を補充したＤＭＥＭ培地中で、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、３７℃で、標準条件下でＡ−４３１（ＡＴＣＣ、カタログ番号：ＣＲＬ−１５５５）およびＡ−５４９（ＤＳＭＺ、カタログ番号：ＡＣＣ  １０７）を培養した。
【０１３３】
リン酸化アッセイ
要約すると、１０％熱不活性化ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１００ＩＵ／ｍＬペニシリンＧナトリウムおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン硫酸塩（成分はいずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を補充したＤＭＥＭ培地中で、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、３７℃で２０〜２２時間かけて、９６ウェルプレートの個々のウェルに、５ｘ１０４のＡ−４３１細胞またはＡ−５４９細胞のアリコートを播種した。次いで、血清不含培地中で４時間かけて細胞を飢餓状態にしてから、示された抗体構築物の連続希釈液を加えた。３７℃で３０分間インキュベートした後、ＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：１０６０５−ＨＮＡＥ−２５０）を１００ｎｇ／ｍＬの最終濃度まで加え、培養物を３７℃で１０分間さらにインキュベートした後、氷冷ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：１４１９０−１６９）で細胞を洗浄し、溶解させ、製造業者の指示に従ってＰｈｏｓｐｈｏ−ＥＧＦＲ  ＥＬＩＳＡキット（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号：ＰＥＬ−ＥＧＦＲ−Ｙ）を使用したリン酸化ＥＧＦＲの相対的定量のために使用した。マルチプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ  ３、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、４５０ｎｍで吸光度を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６．００、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ）を使用して、吸光度値を分析しプロットした。
【０１３４】
結果
Ａ−４３１細胞（図１５ａ）およびＡ−５４９細胞（図１５ｂ）を使用して、ＥＧＦによる刺激時のＥＧＦＲのリン酸化に対するＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ  ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ（ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２）、参照抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧセツキシマブ、およびパニツムマブならびに様々な対照抗体の阻害作用を評価した。抗体の概要、およびＥＧＦＲリン酸化の用量依存的阻害について決定されたＥＣ５０値の要約を表１０に示す。
【０１３５】
参照抗体として使用した抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧセツキシマブおよびパニツムマブは、ＥＧＦ誘発性ＥＧＦＲリン酸化を用量依存的に阻害し、ＥＣ５０値はそれぞれ、Ａ−４３１細胞では７．７μｇ／ｍＬおよび８．２μｇ／ｍＬ、Ａ−５４９細胞では０．１μｇ／ｍＬおよび０．３μｇ／ｍＬであった。ＲＳＶ／ＣＤ１６Ａ  ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ（ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿４４）は、陰性対照として使用し、ＥＧＦ刺激性ＥＧＦＲリン酸化に対する阻害作用を示さなかった。
【０１３６】
Ｗｔ  ＩｇＧ１（ＩｇＡｂ＿４９）およびＦｃ増強ＩｇＧ１（ＩｇＡｂ＿５３）は、いずれも配列番号１および２に示される可変ドメインを含む抗ＥＧＦＲ  Ｆａｂドメインを含み、セツキシマブまたはパニツムマブよりも実質的に低い効力でＥＧＦＲリン酸化を阻害し、ＥＣ５０値はＡ−４３１細胞では５〜６倍、Ａ−５４９細胞では７５〜３００倍であった。
【０１３７】
特に、ＦｃのＣ末端に融合したｓｃＦｖとして配列番号１および２に示される抗ＥＧＦＲドメインを含み、Ｆａｂドメインのみが異なるｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２およびｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿４５は、高濃度でのみＥＧＦ誘発性ＥＧＦＲリン酸化に対する阻害作用を示し、ＥＣ５０値は、Ａ−４３１細胞では１．１ｍｇ／ｍＬ〜１．５ｍｇ／ｍＬ、Ａ−５４９細胞では４７８μｇ／ｍＬ〜６４３μｇ／ｍＬの範囲であった。
【０１３８】
これらのデータは、ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２が、同一の抗ＥＧＦＲ  Ｆｖドメイン（ＩｇＡｂ＿４９およびＩｇＡｂ＿５３）を含むＩｇＧ１抗体と比較して、受容体拮抗作用の低下を示すことを示唆している。セツキシマブを介した阻害と比較すると差はさらに強力であり、ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ  ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２について、Ａ−４３１細胞では約２００分の１の効力、Ａ−５４９細胞では約５０００分の１の効力を観察することができた。これらのデータから、ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２のＥＧＦＲシグナル伝達阻害の減少は副作用プロファイルの改善に関連し、セツキシマブおよびパニツムマブなどの強力な受容体拮抗作用特性を有する抗ＥＧＦＲ抗体によって通常見られる皮膚毒性の低下につながるとの結論を下すことができた。
【表１２】
2021515798.tif 000013
【０１３９】
例９
ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２によるＥＧＦ処理時のＥＧＦＲシグナル伝達タンパク質のリン酸化の阻害の評価
方法
細胞株の培養
１０％熱不活性化ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１００ＩＵ／ｍＬペニシリンＧナトリウムおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン硫酸塩（成分はいずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を補充したＤＭＥＭ培地中で、標準条件下で、Ａ−４３１（ＡＴＣＣ、カタログ番号：ＣＲＬ−１５５５）を培養した。実験に使用する前に、飢餓培地（１％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中で細胞を１時間培養した。
【０１４０】
抗体によるＥＧＦＲシグナル伝達の阻害
示されていれば、２０μｇ／ｍＬのそれぞれの抗体とともに、加湿雰囲気中、３７℃で３ｘ１０６の細胞を１時間インキュベートした。続いて、加湿雰囲気中、３７℃で５分間または１５分間、１００ｎｇ／ｍＬの濃度で組換えヒトＥＧＦ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃１０６０５ＨＮＡＥ２５０）を加えることにより、細胞を刺激した。次いで、細胞を洗浄し、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、＃１３１６５９．１２１１）、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００（Ｒｏｔｈ、＃３０５１２）、０．０５％デオキシコール酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、＃Ｄ６７５０）、０．１％ＳＤＳ（Ｒｏｔｈ、＃ＣＮ３０．１）、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（Ｂｉｏｍｏｌ、＃０８００３．１）、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、＃１１６９７４９８００１）およびホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、＃４９０６８４５００１）を含有する放射免疫沈降アッセイ緩衝液（ＲＩＰＡ）を用いて、氷上で４５分間溶解させた。３００ｘｇ、４℃で１５分間遠心分離した後、上清を、６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、５％グリセリン（Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ、＃Ａ２９２６，０５５）、２００ｍＭブロモフェノールブルー（Ｒｏｔｈ、＃Ａ５１２．１）、０．１Ｍ  ＤＴＴ（Ｒｏｔｈ、＃６９０８．２）を含有する還元試料緩衝液と１：１で混合し、１０分間かけて９５℃に加熱し、続いて、１×Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、＃１６１０７３２）中の４〜２０％Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  Ｐｒｅｃａｓｔ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、＃５６７８０９５）上で３００Ｖで２２分間ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。イムノブロッティングでは、製造業者の指示に従ってＴｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、タンパク質をＰＶＤＦメンブレン（ＢｉｏＲａｄ、＃１７０４１５７）に転写した。次いで、メンブレンをＴＢＳ中の５％脱脂乳（Ｓｉｇｍａ、＃７０１６６）中で室温で１時間ブロッキングし、ＴＢＳで３回洗浄し、供給業者によって推奨されるように希釈した、５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、＃Ａ３０５９）中の一次抗体、ＴＢＳ中の０．０５％ＮａＮ３（Ｒｏｔｈ、＃Ｋ３０５．１）とともに、室温で１時間または４℃で一晩インキュベートした。続いて、メンブレンをＴＢＳで３回洗浄し、ＴＢＳおよび５％脱脂乳中のＨＲＰコンジュゲート二次抗体と室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳで洗浄した後、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰイメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、ＥＣＬ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃３２２０９）を加えた後の化学発光を測定し、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用して分析した。試験した抗体の一覧を表１１に示し、タンパク質の検出に使用した抗体の一覧を表１２に示す。
【表１３】
2021515798.tif 000014
【表１４】
2021515798.tif 000015
【０１４１】
結果
ＥＧＦ誘発性ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害に対するＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ  ｓｃＦｖ＿ＩｇＡｂ＿０２の作用を評価するために、ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２とともに、および対照としてＥＧＦＲ／ＲＳＶ  ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿４５、または抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧ１セツキシマブとともにＡ−４３１細胞をインキュベートした。刺激はそれぞれ５分および１５分行い、ウエスタンブロットを介してリン酸化の誘発を評価した。
【０１４２】
ブロット画像を図１６および図１７に示す。それぞれのリンタンパク質の相対的バンド強度の定量を図１８、図１９および図２０に示す。
【０１４３】
この例に提示した結果は、ＥＧＦによりＡ−４３１細胞を刺激した際のＥＧＦＲ、ＡｋｔおよびＥｒｋのリン酸化を示している。ＥＧＦＲのリン酸化およびその阻害は、ＥＧＦによる刺激から５分後および１５分後に測定可能であり（図１８）、ｐＡｋｔおよびｐＥｒｋの差は、それぞれ５分後（図１９）または１５分後（図２０）に最も顕著であった。
【０１４４】
セツキシマブとともに細胞をプレインキュベーションすると、ＥＧＦＲ、ＡｋｔおよびＥｒｋのＥＧＦ刺激が遮断されたが、ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ  ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２またはＥＧＦＲ／ＲＳＶ  ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿４５とのプレインキュベーションでは、ＥＧＦＲ、ＡｋｔおよびＥｒｋのＥＧＦ刺激性リン酸化に対する阻害作用は全くないか、わずかしかなかった。ＥＧＦ刺激および抗体処理は、ＥＧＦＲ、ＡｋｔおよびＥｒｋの総タンパク質レベルに影響を与えなかった。
【０１４５】
例１０
ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２によって誘発される、ＰＢＭＣからのサイトカイン放出
バフィーコートからのＰＢＭＣの単離
密度勾配遠心分離によって、バフィーコート（Ｇｅｒｍａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からＰＢＭＣを単離した。２〜３倍容量のＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：１４１９０−１６９）を用いてバフィーコート試料を希釈し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号：０７８６１）のクッション上に重層し、ブレーキをかけずに室温で８００×ｇで２５分間遠心分離した。界面に位置するＰＢＭＣを収集し、ＰＢＳで３回洗浄した後、１０％ＦＣＳを補充した完全ＲＰＭＩ  １６４０培地中で一晩刺激することなく培養した。
【０１４６】
細胞株の培養
１０％熱不活性化ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１００ＩＵ／ｍＬペニシリンＧナトリウムおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン硫酸塩（成分はいずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を補充したＤＭＥＭ培地中で、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、３７℃で、標準条件下でＡ−４３１（ＡＴＣＣ、カタログ番号：ＣＲＬ−１５５５）を培養した。
【０１４７】
ＥＧＦＲ＋標的細胞の存在下または非存在下でｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２によって刺激されたＰＢＭＣから放出されたサイトカインの定量
エフェクター対標的比５０：１で、ＥＧＦＲ＋Ａ−４３１標的細胞と、５ｘ１０５の初代ヒトＰＢＭＣとを共培養した。総容量２００μＬで漸増濃度のｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２の存在下または非存在下で、１０％ＦＣＳを補充した完全ＲＰＭＩ  １６４０培地中で、共培養物をインキュベートした。ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２の存在下または非存在下で、ＰＢＭＣまたはＡ−４３１細胞のみの培養を含めることによって、培養物中のバックグラウンドサイトカインレベルを評価した。陽性対照として、共培養物をＤｙｎａＢｅａｄｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１１３２Ｄ）とインキュベートし、ＰＢＭＣ集団内のＴ細胞からの試験した全サイトカインの放出を刺激した。加湿インキュベーター内で全培養物を３７℃、５％ＣＯ２で４時間、２４時間または４８時間インキュベートしてから、７０ｘｇで２分間、室温で遠心分離した。各ウェルから細胞培養上清（７０μＬ）を収集し、ＢＤ（商標）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）Ｈｕｍａｎ  Ｔｈ１／Ｔｈ２  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してＢｉｏａｓｓａｙ  ＧｍｂＨ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でビーズベースのマルチプレックス法によりサイトカインを定量するまで、−８０℃で保存するために丸底９６ウェルマイクロプレートに移した。Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｖ６．００／７．０３、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用して、結果を分析およびプロットした。
【０１４８】
標的細胞およびｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２の存在下または非存在下でのＰＢＭＣ共培養時のＮＫ活性化状態の決定
サイトカイン定量のために上清を収集した後、細胞ペレットのフローサイトメトリーによって、ＮＫ細胞の活性化を評価した。このために、細胞を洗浄し、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（２％熱不活性化ＦＣＳおよび０．１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ）の総染色容量で、ＣＤ５６−ＰＣ７（５μＬ／試験；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ２１６９２）、ＣＤ２５−ＰＥ（１０μＬ／試験；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ０７７７４）およびＣＤ６９−ＰＣ５（５μＬ／試験；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＩＭ２６５６）に再懸濁した。暗所で氷上で１５分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１４９】
結果
漸増濃度のｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２の存在下または非存在下で、ＰＢＭＣとＡ−４３１とを４時間、２４時間および４８時間共培養した後の細胞培養上清中の６つのサイトカイン、すなわち、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の放出を評価した。
【０１５０】
ＰＢＭＣ単独で、およびＡ−４３１の存在下でインキュベートしてもＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−αまたはＩＦＮ−γの検出可能な増加はもたらされなかったが、ＣＤ３／ＣＤ２８アクチベータービーズを用いて刺激すると、試験した全サイトカインの顕著な放出がもたらされた（データは示さず）。漸増濃度のｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２にＰＢＭＣを曝露すると、全サイトカインのわずかな放出がもたらされた。ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２単独によって誘発されたＰＢＭＣからの最大のサイトカイン放出は、それぞれのサイトカインのバックグラウンドレベルと考えられた（表１３）。
【０１５１】
バックグラウンドレベルの５倍を超えて増加した、ＰＢＭＣおよびＡ−４３１標的の細胞培養上清中のサイトカインレベルを陽性シグナルと考え、表１３に要約する。これらの分析により、ＰＢＭＣとＥＧＦＲ＋標的細胞との共培養におけるＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γのｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２誘発性の用量依存的放出が、示された時点まで明らかにされた。他の試験した全サイトカインの、バックグラウンドレベルを超えるｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２誘発性放出は検出することはできなかった。
【表１５】
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【０１５２】
ＰＢＭＣとＡ−４３１との２４時間および４８時間の共培養後に、それぞれ３．７ｐＭおよび７．１ｐＭの効力（ＥＣ５０）で、ＩＬ−６のＳｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２誘発性の用量依存的放出が検出された（表１３；図２１）。
【０１５３】
ＴＮＦ−αのＳｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２誘発性分泌は、それぞれ４時間後および２４時間後に評価することができ（表１３；図２２）、高レベルのＩＦＮ−γは４時間後にのみ測定することができた（表１３；図２３）。
【０１５４】
ＣＤ６９＋ＮＫ細胞の抗体用量依存的増加は、ＰＢＭＣとＡ−４３１細胞との２４時間および４８時間の共培養後に最大４４％で検出することができ、適用されたアッセイ設定でのＮＫ細胞の活性化を裏付けた（図２４Ｂ、図２５Ｂ）。また、高濃度のｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２のみを用いた、Ａ−４３１細胞の非存在下での２４時間培養後に、高レベルのＣＤ６９＋ＮＫ細胞を検出することができた。Ａ−４３１細胞の存在下でＰＢＭＣをそれぞれ２４時間および４８時間共培養しても、後期ＮＫ細胞活性化マーカーＣＤ２５の明らかなｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２誘発性増加は検出されなかった。
【０１５５】
例１１
薬力学的インビボ試験（ＰＯＣ）
異種移植されたヒトＥＧＦＲ＋腫瘍を担持するヒト化マウスモデルを対象に予防的および治療的投薬レジメンを用いて、ｓｃＦｖ−ＩｇＡｂ＿０２のいくつかのインビボＰＯＣ試験を行った。モデルは、臍帯血由来ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞をあらかじめ移植した、流体力学的にＩＬ−１５によりブーストしたＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌマウス（ＮＯＧ）からなった。０日目（Ｄ０）に、１ｘ１０６のＡ−４３１細胞の皮下接種により、腫瘍を移植した。モデルは、ＴｒａｎｓＣｕｒｅ  ＢｉｏＳｅｒｖｉｃｅｓ  ＳＡＳ，Ｆｒａｎｃｅにより提供された。前試験では、ヒト免疫エフェクター細胞（ヒトＮＫ細胞を含む）を用いた確実な再構成、ならびに一貫したＡ−４３１腫瘍の取り込みおよび増殖が実証された。このモデルは現在、ヒトＮＫ細胞再構成（末梢血１ｍＬ当たり約１〜２ｘ１０４のヒトＮＫ細胞で生じる）に関して最良のヒト化マウスモデルであるように思われる。
【０１５６】
上記のマウスモデルに対してｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２を使用した４つの試験を以下にさらに詳しく示す。
【０１５７】
予防的処置設定（すなわち、腫瘍接種時に開始する処置）では、５ｍｇ／ｋｇでｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２処置による腫瘍増殖の減少傾向が観察され、１０ｍｇ／ｋｇ以降では腫瘍増殖の有意な阻害が観察された。処置的設定（すなわち、腫瘍が５０〜１００ｍｍ３の体積に達した際に開始する処置）でも、１０ｍｇ／ｋｇ以降の用量レベルではｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２処置による腫瘍増殖の有意な阻害が見られ、マウスモデルに対するｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２の抗腫瘍効果が実証された。
【０１５８】
インビトロ試験を示す上記の例によれば、ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２は、
Ａ）ＣＤ１６Ａ＋ＮＫ細胞および／またはマクロファージとの相互作用を強制することによる、ＥＧＦＲ＋腫瘍細胞に対するＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰの誘発
Ｂ）ＥＧＦＲ受容体を遮断することによる、ＥＧＦＲ＋腫瘍細胞に対する直接の増殖阻害効果、からなる二重の抗腫瘍作用機序を有すると結論付けられ、
ＡＤＣＣ（および／またはＡＤＣＰ）の誘発は、ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２によって発揮される主要な抗腫瘍効果である（ＥＧＦＲリン酸化を遮断することによる直接的な増殖阻害が主要であるセツキシマブとは対照的）。
【０１５９】
マウスＰＯＣ試験のうちの２つは、参照項目としてＲＳＶ／ＥＧＦＲを含めることにより、直接の増殖阻害からＡＤＣＣを区別することを意図して行った。この場合のＲＳＶ／ＥＧＦＲは、ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２の同一のＥＧＦＲ結合領域およびＦｃ部分を含む分子であるが、無関係なＲＳＶ結合ドメイン（呼吸器合胞体ウイルス）によって置換されるＣＤ１６Ａ結合部分を欠き、したがって、ＡＤＣＣを誘発することはできない。
【０１６０】
２つのＲＳＶ／ＥＧＦＲ試験のうちの第１の試験は、ＲＳＶ／ＥＧＦＲよりもわずかに優れたｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２の抗腫瘍効果を示した（したがって、マウスＡ−４３１腫瘍モデルでは、全体的な抗腫瘍効果に対するＡＤＣＣの寄与を示している）。ただし、第２の試験では、予防的処置群および治療的処置群に対するｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２とＲＳＶ／ＥＧＦＲとのいくつかの異なる用量レベルを比較すると、マウスＡ−４３１腫瘍モデルに対する両変異体の同等の効力が示された。したがって、再構成されたマウスモデルにおいて、ヒトの状況と比較した場合、このモデルに存在するＮＫ細胞の数が少ないことにおそらく起因して、ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２の重複する薬力学的効果では、リン酸化（ＥＧＦＲシグナル伝達）の阻害が優位を占めているように思われる。
【０１６１】
このように、ヒト化マウスモデルは、インビボでのｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２の抗腫瘍効果に対する一般的なＰＯＣを提供するが、ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２の主要なエフェクター機構として、ＥＧＦＲ＋腫瘍に対するＡＤＣＣの誘発を描写するのには適していない。
【０１６２】
最初の試験では、Ａ４３１腫瘍を担持するｅＨＩＳ−ＩＬ１５−ｈｕＮＯＧマウスを対象とした予防的設定で、様々な二重特異性ＥＧＦＲ／ＣＤ１６抗原結合タンパク質（ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２および構造的変異体／対照）を比較した。ＩＬ−１５によりブーストしたＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌマウス（ＮＯＧ）に、臍帯血由来ＣＤ３４＋造血幹細胞を移植し（ＨｕＮＯＧ）、０日目（Ｄ０）に１ｘ１０６のＡ４３１細胞を皮下接種した。動物に、１日目から４週間（ｑ７ｄ×４）にわたり、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量で、ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２およびＢｉ−ｓｃＦｖ＿Ｆｃ＿０２を毎週静脈内投与した。セツキシマブは、同一の投薬間隔を使用して、５および０．５ｍｇ／ｋｇの用量で陽性対照として機能させた。
【０１６３】
処置した動物ではいずれも、セツキシマブ（５ｍｇ／ｋｇ）、ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２（１５ｍｇ／ｋｇ）およびＢｉ−ｓｃＦｖ＿Ｆｃ＿０２（１５ｍｇ／ｋｇ）は、腫瘍細胞移植の１２日後すぐに、ビヒクルと比較して腫瘍増殖の有意な遅延を誘発した（図２６）。低用量（５ｍｇ／ｋｇ）のｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２およびＢｉ−ｓｃＦｖ＿Ｆｃ＿０２は、腫瘍増殖を遅延させる傾向があり（有意ではない）、セツキシマブ（０．５ｍｇ／ｋｇ）は効果を示さなかった。
【０１６４】
その後の有効性試験では、予防的設定で様々な用量レベルでｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２を試験した。ＩＬ−１５によりブーストしたＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌマウス（ＮＯＧ）に、臍帯血由来ＣＤ３４＋造血幹細胞を移植し（ＨｕＮＯＧ）、０日目（Ｄ０）に１ｘ１０６のＡ４３１細胞を皮下接種した。ヒト化率とヒト白血球中のＮＫ細胞の割合とに基づいて、ＨｕＮＯＧマウスを処置群（ｎ＝７）に無作為化した。動物に、５、１５および４５ｍｇ／ｋｇの用量（Ｄ１から（ｑ７ｄ×４））で、ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２を毎週静脈内投与した。
【０１６５】
腫瘍細胞移植の１１日後すぐに、ビヒクル群と、ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２（１５ｍｇ／ｋｇ）およびｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２（４５ｍｇ／ｋｇ）により処置された群との間で、有意な腫瘍体積の減少が観察された。腫瘍細胞移植の４１日後（殺処分時）、ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２（５ｍｇ／ｋｇ）の毎週注射では、ビヒクルと比較して腫瘍体積が７０％減少した。ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２（１５および４５ｍｇ／ｋｇ）では、ビヒクルと比較して腫瘍体積が９５％減少した（図２７）。
【０１６６】
要約すると、５ｍｇ／ｋｇでは、ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２処置による腫瘍増殖の減少傾向が観察された。１５ｍｇ／ｋｇおよび４５ｍｇ／ｋｇでの有意な阻害が見られ、用量依存性が示された。
【０１６７】
別のＴｒａｎｓｃｕｒｅ試験では、処置的設定で有効性評価を行った。
【０１６８】
同じ試験で並行して、予防的設定でｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２と対照構築物ＲＳＶ−ＥＧＦＲとを比較した。ＲＳＶ−ＥＧＦＲは、ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２のＥＧＦＲ結合領域と同一のＦｃ部分とを含む分子であるが、無関係なＲＳＶ結合ドメインによって置換されるＣＤ１６Ａ結合部分を欠く。
【０１６９】
ＩＬ−１５によりブーストしたＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌマウス（ＮＯＧ）に、臍帯血由来ＣＤ３４＋造血幹細胞を移植し（ＨｕＮＯＧ）、０日目（Ｄ０）に１ｘ１０６のＡ４３１細胞を皮下接種した。ヒト化率とヒト白血球中のＮＫ細胞の割合とに基づいて、ＨｕＮＯＧマウスを処置群（ｎ＝７）に無作為化した。
【０１７０】
治療的処置
Ｄ１７にＡ−４３１腫瘍が５０〜１００ｍｍ３のサイズに達した際に、動物に、５、１５および４５ｍｇ／ｋｇの用量（ｑ７ｄ×４）で、ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２を毎週静脈内投与した。
【０１７１】
２つの最高用量のｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２（１５ｍｇ／ｋｇおよび４５ｍｇ／ｋｇ）は、Ａ４３１腫瘍増殖をそれぞれ７０および９０％有意に減少させた。５ｍｇ／ｋｇのｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２は、腫瘍増殖に対して有意な効果を示さなかった（図２８Ａ）。
【０１７２】
予防的処置
動物に、Ｄ１から４５ｍｇ／ｋｇの用量（ｑ７ｄ×４）でｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２またはＲＳＶ−ＥＧＦＲを毎週静脈内投与した。
【０１７３】
ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２（４５ｍｇ／ｋｇ）およびＲＳＶ−ＥＧＦＲ（４５ｍｇ／ｋｇ）による処置は、腫瘍細胞移植後の最初の２４日間の腫瘍増殖を完全に予防した。ＲＳＶ−ＥＧＦＲ群の腫瘍増殖は、Ｄ２４から、ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２群よりも速かった。殺処分時の平均腫瘍体積は、ＲＳＶ−ＥＧＦＲ群では８３７ｍｍ３に達したが、ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２群では４４９ｍｍ３にとどまった（図２８Ｂ）。この差は統計的に有意であり、両構築物によりＥＧＦＲリン酸化を遮断することによる、ＥＧＦＲ＋腫瘍細胞に対する最高の直接増殖阻害効果に対するｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２のＡＤＣＣによる追加の薬力学的効果が示唆された。
【０１７４】
ｈｕマウスのＡ４３１腫瘍モデルを対象に、作用機序としてのＡＤＣＣの存在に対する影響／証拠を検討するために、ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２およびＲＳＶ−ＥＧＦＲの低投与量範囲で予防的処置を試験した。さらに、ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２およびＲＳＶ−ＥＧＦＲによる治療的処置を単回用量レベルで比較した。
【０１７５】
ヒト化率とＮＫ細胞（ＣＤ５６＋細胞）の量とに基づいて、ＩＬ１５によりブーストしたヒト化マウス９０匹を２群に無作為化した。
【０１７６】
予防群：
予防群（１群当たりマウス６匹）の右側腹部に、１×１０６のＡ４３１細胞を移植した。腫瘍細胞接種の１日後、マウスを処置した（４週間にわたり週１回静脈内注射、および殺処分の３日前に最後の注射）。０日目は腫瘍細胞接種日と規定される。以下の処置を行った：
・第１群：ＩＬ１５−ｈｕＮＯＧ＋Ａ４３１＋ビヒクル（毎週、ＩＶ）
・第２群：ＩＬ１５−ｈｕＮＯＧ＋Ａ４３１＋ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２（１．２５ｍｇ／ｋｇ、毎週、ＩＶ）
・第３群：ＩＬ１５−ｈｕＮＯＧ＋Ａ４３１＋ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２（２．５ｍｇ／ｋｇ、毎週、ＩＶ）
・第４群：ＩＬ１５−ｈｕＮＯＧ＋Ａ４３１＋ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２（５ｍｇ／ｋｇ、毎週、ＩＶ）
・第５群：ＩＬ１５−ｈｕＮＯＧ＋Ａ４３１＋ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２（１０ｍｇ／ｋｇ、毎週、ＩＶ）
・第６群：ＩＬ１５−ｈｕＮＯＧ＋Ａ４３１＋ＲＳＶ／ＥＧＦＲ（１．２５ｍｇ／ｋｇ、毎週、ＩＶ）
・第７群：ＩＬ１５−ｈｕＮＯＧ＋Ａ４３１＋ＲＳＶ／ＥＧＦＲ（２．５ｍｇ／ｋｇ、毎週、ＩＶ）
・第８群：ＩＬ１５−ｈｕＮＯＧ＋Ａ４３１＋ＲＳＶ／ＥＧＦＲ（５ｍｇ／ｋｇ、毎週、ＩＶ）
・第９群：ＩＬ１５−ｈｕＮＯＧ＋Ａ４３１＋ＲＳＶ／ＥＧＦＲ（１０ｍｇ／ｋｇ、毎週、ＩＶ）
【０１７７】
腫瘍細胞移植の３５日後に全マウスを殺処分した。末梢血および腫瘍浸潤細胞に対してフローサイトメトリー分析を行った。
【０１７８】
処置群：
処置群の右側腹部に、１ｘ１０６のＡ４３１細胞を移植した。腫瘍体積が５０〜１００ｍｍ３に達した際に、腫瘍体積、ヒト化率およびＮＫ細胞数に基づいてマウスを無作為化し、処置を開始した。０日目は、最初の処置日として規定される。第１０群の動物、ならびに第１１群および第１２群の追加の動物６匹は、フローサイトメトリー分析のためのサテライト動物として機能させた。
【０１７９】
以下の処置を行った（４週間にわたり週１回静脈内注射、および殺処分の３日前に最後の注射）：
・第１０群：ＩＬ１５−ｈｕＮＯＧ＋Ａ４３１＋ビヒクル（毎週、ＩＶ）ｎ＝６
・第１１群：ＩＬ１５−ｈｕＮＯＧ＋Ａ４３１＋ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２（１０ｍｇ／ｋｇ、毎週、ＩＶ）ｎ＝１５
・第１２群：ＩＬ１５−ｈｕＮＯＧ＋Ａ４３１＋ＲＳＶ／ＥＧＦＲ（１０ｍｇ／ｋｇ、毎週、ＩＶ）ｎ＝１５
【０１８０】
処置開始の３日後および１０日後にサテライトマウスを殺処分した。第１１群のマウス３匹および第１２群のマウス３匹を各時点で殺処分した。処置開始の２４日後、各群から、腫瘍体積が最も高いマウス３匹を殺処分した。処置開始の３０日後に、処置群の残りの全マウスを殺処分した。サテライトマウスの末梢血および腫瘍浸潤細胞に対してフローサイトメトリー分析を行った。また、処置開始の３０日後、フローサイトメトリーによってリンパ球を表現型決定した。
【０１８１】
ヒト類表皮がんＡ４３１ヒト化マウス腫瘍モデルに対する１０ｍｇ／ｋｇの用量のｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２およびＲＳＶ／ＥＧＦＲによる予防的処置により、腫瘍体積が有意に減少した。それよりも低い用量（１．２５、２．５および５ｍｇ／ｋｇ）では、ビヒクルと比較して腫瘍増殖は有意に阻害されなかった。ＲＳＶ／ＥＧＦＲによる処置およびｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２による処置は、試験したいずれの用量でも、腫瘍増殖に同様の効果を示した（図２９）。このヒト化マウスモデルのＮＫ細胞数は、腫瘍細胞に対して効果的なＡＤＣＣを完全に開始するには少なすぎる可能性がある。
【０１８２】
サテライト動物の末梢血に対するフローサイトメトリー分析により、血球数は経時的に一定のままであるが、ＮＫ細胞（ＣＤ６９およびＮＫｐ４４）上の活性化マーカーは腫瘍細胞移植後に有意に増加したことが明らかにされた。
【０１８３】
腫瘍浸潤免疫細胞の表現型も検討した。細胞数では、ＣＤ４５細胞、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の群間に有意差は認められなかった。注目すべきことに、ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２およびＲＳＶ／ＥＧＦＲの両方の最高用量は、ビヒクル群と比較して、ＮＫ細胞の表面でのＣＤ６９およびＮＫｐ４４の発現を有意に増加させた。
【０１８４】
１０ｍｇ／ｋｇの用量のｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２およびＲＳＶ／ＥＧＦＲによる治療的処置は、ビヒクルと比較して腫瘍体積を有意に減少させた（図３０）。ＲＳＶ／ＥＧＦＲとｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２処置との間に有意差は認められなかった。
【０１８５】
末梢血に対するフローサイトメトリー分析により、ＣＤ４５細胞、ＮＫ細胞、Ｔ細胞およびＣＤ１４陽性細胞の数が経時的に一定のままであることが示された。群間に有意差は認められなかった。
【０１８６】
腫瘍では、ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２による処置開始の３０日後に、ＣＤ４５細胞、ＮＫ細胞およびＴ細胞ならびにＣＤ１４陽性細胞の全体的な増加が観察された。活性化マーカーの発現は、ビヒクルおよびＲＳＶ／ＥＧＦＲ処置群と比較して、ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２によって処置されたマウスの方が高くなる傾向があった。脾臓では、群間に有意差は認められなかった。
【０１８７】
例１２
薬物動態
ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２の薬物動態プログラムには以下が含まれる
カニクイザル血清マトリックスにおける高感度分析アッセイの開発
カニクイザルを対象とした静脈内単回投与ＰＫ試験（３つの用量レベル）
カニクイザルを対象とした投与範囲設定試験からのＰＫ／ＴＫ評価（データは未だ保留中）
カニクイザルを対象としたピボタル２８日毒性試験からのＰＫ／ＴＫ評価（データは未だ保留中）
【０１８８】
カニクイザル由来の薬物動態試料の生物分析
カニクイザル由来の薬物動態試料の生物分析のために、ＭＳＤ（登録商標）プラットフォームに基づく電気化学発光免疫アッセイを行った。ＭＳＤ（登録商標）プラットフォームは、ＥＬＩＳＡのような同様の設定を利用するが、主な相違は、読み出しが従来のＥＬＩＳＡのような酵素的基質変換に基づくのではなく、電気化学発光反応に基づくことである。そのため、捕獲抗体を吸着する電極表面とともに専用のマイクロプレートが使用される。さらに、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）（ＮＨＳエステルとしてコンジュゲートしたルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジン）と呼ばれる電気化学発光標識によって標識された検出器が必要である。ＭＳＤ読み取り緩衝液（トリプロピルアミン、ＴＰＡを含有する）の存在下で、電気化学発光に適した化学環境が提供される。ＭＳＤ（登録商標）イメージャーは、プレート電極に電圧を印加し、プレートの底部に近接したＳＵＬＦＯ−Ｔａｇが一連の還元反応および酸化反応を通じて光を放出するようにする。放出された光の強度が検出される。各標識の複数の励起サイクルによってシグナルを増幅して、光レベルを高め、感度を向上させることができる。刺激機構（電気）はシグナル（光）から分離されているため、最小のバックグラウンドシグナルおよび高いシグナル対バックグラウンド比が可能である。アッセイは５ｎｇ／ｍｌのＬＬＯＱを有し、ＬＬＯＱで優れた選択性を示す。１４／１４の個体がＲＥ％＜２０を示す。
【０１８９】
この方法は、ＧＬＰの下で完全に検証されて、ピボタル毒性試験でのＴＫ評価を裏付ける。
【０１９０】
カニクイザルを対象とした単回投与ＰＫ
Ｃｉｔｏｘｌａｂ試験では、合計９匹の雄カニクイザルを登録した。以下の表に従って、８ｍｇ／ｋｇ（雄３匹）、２５ｍｇ／ｋｇ（雄３匹）および７５ｍｇ／ｋｇ（雄３匹）の用量レベルでｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２を投与される３群に動物を割り当てた。投与は２時間の注入により５ｍＬ／ｋｇ／ｈの速度で行った。
【表１６】
2021515798.tif 000017
【０１９１】
試験中、各動物の死亡率および罹患率を１日２回確認した。臨床徴候の記録のために、各動物を少なくとも１日に２回観察した。投与部位でのあらゆる局所反応を記録するために特に注意を払った。
【０１９２】
体重は、処置前の期間中に２回記録し、次いで１日目に、および１週間に少なくとも１回、試験が終了するまで記録した。
【０１９３】
投与日（１日目）の投与前および注入終了直後、注入終了後５分、０．５時間、１時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間および４８時間ならびに５日目（９６時間）、８日目（１６８時間）、１１日目（２４０時間）、１５日目（３３６時間）および２２日目（５０４時間）の時点で採血した。ＰＫ試料と同時に、前処置時ならびに８日目、１５日目および２２日目に、免疫原性について各動物をサンプリングした。
【０１９４】
生物分析および免疫原性分析は、Ｃｈｉｍｅｒａ  Ｂｉｏｔｅｃで行った。この文献の編集時点で、免疫原性の結果は未だ保留中であった。薬物動態分析は、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）ソフトウェアｖ６．４の非コンパートメント分析を使用して、Ｃｉｔｏｘｌａｂ  Ｆｒａｎｃｅで行った。分析した試料の測定濃度から、以下のパラメーター、すなわち、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、ＡＵＣ０−ｌａｓｔおよびＡＵＣ０−ｉｎｆ、ｔ１／２、ＶＺ、ＣＬ、ＭＲＴならびにＡＵＭＣを決定した。
【０１９５】
観察期間の完了後、２７日目に、全動物に塩酸ケタミンを筋肉内注射して鎮静させ、ペントバルビタールナトリウムを静脈内注射して麻酔し、放血により安楽死させた。
【０１９６】
ＰＫの結果に関して、投与前の試料では、定量可能な量のｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２は見出されなかった。
【０１９７】
得られたデータに基づいて、以下の結論を下すことができる（表１４を参照）：
・全動物に対して、被験物質に対する全身曝露を達成した、
・予測通り、ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２注入の終了時にＴｍａｘに達した、
・終末半減期は３３．４〜１５４時間の範囲であった、
・用量正規化ＡＵＣ０−ｔ値に基づいて、投与された用量レベルの範囲にわたって血清被験物質曝露の用量比例的な増加を超える増加が認められたが、用量正規化Ｃｍａｘを考慮すると、ほぼ用量比例的な増加が観察された。
・用量レベルの増加に伴う終末半減期値のわずかな増加が観察されたことから、ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２の観察された全身ＣＬの用量関連変化が確認された。
・終末分布容積（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｖｏｌｕｍｅ  ｏｆ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）ＶＺはサルにおける全血漿容積に近似し、ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２が血漿容積内に主に位置することを示す
・用量の増加に伴って終末分布容積値の減少が観察され、被験物質の組織分布／内在化の飽和機構の可能性が示唆された。
【表１７】
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【０１９８】
例１３
ＥＧＦＲ＋腫瘍担持マウスにおけるｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２の組織分布
Ａ４３１細胞を用いたマウス異種移植モデルへの１２５Ｉ−ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２の静脈内投与によって、ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２の組織分布の評価を行った。
【０１９９】
酸化剤としてＩｏｄｏｇｅｎを使用する放射ヨウ素標識により、２ｍＣｉ／ｍｇの最終比放射能までｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２を放射性標識した。サイズ排除クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって標識分子の完全性を確認した。
【０２００】
ｈｕＣＤ１６Ａに対するＲＩＡアッセイおよびＡ−４３１細胞に対する飽和結合アッセイによって生物学的活性を確認して、それぞれのＫＤ値を決定した（それぞれＫＤ：０．７２９ｎＭおよび６．９８２；データはここに示さず）。７日間にわたってマウス血漿の安定性を確認した。
【０２０１】
マウス３８匹の右側腹部に、５ｘ１０６のＡ−４３１細胞を皮下異種移植した。１２５Ｉ−ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２注射日の平均腫瘍体積は、約２８９±８３ｍｍ３であった（接種後２週間の増殖期間に対応する）。
【０２０２】
８つの最終時点、すなわち、３０分、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１６８時間および３３６時間に、組織分布（腫瘍標的化を含む）を評価した。さらに、動物３匹を代謝ケージに最長１６８時間入れ、尿および糞便を採取し、排泄経路および質量収支を決定した。並行して、投与４８時間後および３３６時間後に定量的全身オートラジオグラフィー試験を行った。
【０２０３】
腫瘍内の放射能の最高濃度は８時間から４８時間の間に観察され、１２５Ｉ−ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２の最大腫瘍取り込みは投与２４時間後に生じ、８．５６％  ＩＤ／ｇに達した。その後の時点で、腫瘍内の放射能は徐々に減少し、９６時間後でも５．６２％  ＩＤ／ｇであった。放射能は３３６時間の時点で腫瘍から完全には消失せず（１．２１％  ＩＤ／ｇ）、腫瘍組織にｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２が保持されていることが示唆された（図３１）。
【０２０４】
大部分の臓器（胃および子宮頸部を除く）では、腫瘍対臓器比が３０分から２４〜４８時間の間に増加したことから、腫瘍に蓄積された放射能が臓器で測定された放射能よりも緩徐に排出されたことが示唆され、これもまた腫瘍組織にｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２が保持されていることを示している（図３２）。
【０２０５】
１２５Ｉ−ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２の注射後３０分以内に、ほぼすべての正常組織（８および２４時間の時点で最高濃度が観察された皮膚、子宮頸部、筋肉および消化管を除く）でピーク放射能取り込みが観察された。その後、これらの組織内の放射能レベルは、顕著な保持を伴わずに時間とともに減少し、プール血液活性の低下と一致した。
【０２０６】
観察期間を通じて、タンパク質代謝、および体循環からの排泄に関与する臓器、例えば、％ＩＤ／ｇがそれぞれ７．２５、８．３７および１４．７５である肝臓、脾臓および腎臓、ならびに遊離ヨウ素の選択的蓄積に関与する臓器、例えば、胃（８時間の時点で４．１４％  ＩＤ／ｇ）に、最も高い正常臓器放射能濃度が認められた。さらに、肺では、１０．０２％  ＩＤ／ｇの高レベルの放射能が３０分の時点で認められ、これはおそらく、投与溶液（ＳＥ−ＨＰＬＣ分析によれば約３％）中、ならびに卵巣および子宮頸部（それぞれ３０分の時点で１１．２２％  ＩＤ／ｇおよび２４時間の時点で６．５４％  ＩＤ／ｇ）内に凝集物が存在するためである。
【０２０７】
１２５Ｉ−ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２のＩＶ投与後、注射された放射能の約半分が１６８時間の時点で排泄物中に回収され、累積的な尿中および糞便中排泄量はそれぞれ４３．２７％および７．４０％であった。腎臓を介して排泄された放射能は、ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２に関連している可能性は低かったが、脱ハロゲン化プロセス中に放出された遊離ヨウ素１２５に対応するはずである。
【０２０８】
オートラジオグラフィーのために、投与後４８時間および３３６時間の時点でマウスを殺処分した。全身オートラジオグラフィーの結果は、組織切開法により得られた結果と比較して、予測された生体分布パターンを示した。実際に、放射能は、投与後４８時間の時点で、腫瘍、肺、ならびに代謝および排泄機構に関与する肝臓、腎臓および脾臓などの臓器に主に認められた。３３６時間の時点の写真では、あらゆる臓器／組織で放射能がほぼ完全に減少していたが、残りの放射能のほとんどが腫瘍内に認められたことが示された（図３３）。
【０２０９】
例１４
毒性学
関連種としてカニクイザルを用いて、後期腫瘍患者を対象としたＦＩＭ試験を裏付ける、二重特異性ＥＧＦＲ／ＣＤ１６抗原結合タンパク質の毒性学試験を行った。他の種を対象とした毒性学試験は行わなかった。
これまでに行ったｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２の毒性学プログラムには、以下が含まれる
カニクイザルを対象とした２８日間の静脈内反復投与範囲決定試験（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｄｏｓｅ  ｒａｎｇｅ  ｆｉｎｄｅｒ  ｓｔｕｄｙ）（非ＧＬＰ）
カニクイザルを対象とした２８日間のピボタル静脈内反復投与毒性試験（ＧＬＰ）
【０２１０】
ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２については、構造的類似性、および部分的に類似した作用機序により、セツキシマブと同様の毒性プロファイルを予測することができる。ただし、ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２がＥＧＦＲリン酸化を阻害する可能性が低いため、改善された副作用プロファイル（皮膚毒性の消失または低下）が予測され得ることに言及することが重要である。それでもなお、カニクイザルにセツキシマブを静脈内投与した３９週間の試験から用量レベルを適応させた（Ｓｔｕｄｙ  ０７０−０８７，ＥＭＥＡ２００４；Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｐｐｒｏｖａｌ  ｏｆ  Ｅｒｂｉｔｕｘ）。
【０２１１】
静脈内反復投与範囲決定試験では、ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２は全身毒性または局所毒性を誘発しなかった。ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２は、７５ｍｇ／ｋｇ（ｑ７ｄ×５）の最大試験用量レベルまで、臨床所見、体重、体温、または臨床的病態もしくは解剖学的病態に影響を及ぼさなかった。注目すべき唯一の作用は、いずれの用量レベル（ｐ．ｉ．の６時間以内）でも初回投与後に循環ＩＬ‐６レベルが一過性に上昇したことであった。ＩＬ−６レベルは、初回投与後２４時間以内に正常に戻った。ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２は、初回投与後、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αのレベルに影響を及ぼさなかった。さらに、ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２は、２４ｍｇ／ｋｇ以上の用量で、初回投与から７日後に、末梢血中の絶対ＮＫ細胞数（ＣＤ３−ＣＤ２０−ＣＤ１５９＋陽性）およびＣＤ６９＋活性化ＮＫ細胞の一過性の減少を引き起こした。
【０２１２】
ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２のピボタル２８日間静脈内毒性試験では、被験物質は最大用量レベル７５ｍｇ／ｋｇ（ｑ７ｄ×５）まで優れた耐容性を示した。これまでに確認された被験物質関連所見は、１日目の７５ｍｇ／ｋｇの用量での動物２匹の嘔吐、ならびに１日目の投与後４時間の時点での白血球および特に好中球の増加のみであった。好中球数の一過性の増加は、血清ＩＬ−６レベルの一過性の増加によって誘発される可能性がある（これは、文献データによって少なくとも示唆されている）。この文献の編集時点で、このピボタル試験のいくつかのエンドポイントは未だ保留中である。
【０２１３】
カニクイザルを対象とした反復投与静脈内投与範囲設定試験
この試験の目的は、カニクイザルへの４週間（合計５回の注入）にわたる毎週の反復ＩＶ注入（２時間の椅子注入（ｃｈａｉｒ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ））、および５週間の回復期に続いて、被験物質の最大耐量を決定することであった。モーリシャス原産のカニクイザル１０匹（雄５匹および雌５匹）を以下のように用量群に割り当てた。
【表１８】
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【０２１４】
構造的および機能的類似性のため、セツキシマブ毒性評価に厳密に従って用量レベルおよび投薬レジメンを選択した（ＥＭＡ  ２００４  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ：ＷＣ５０００２９１１３１）。
【０２１５】
毒性の評価は、臨床所見、体重、体温、ならびに臨床的病態および解剖学的病態に基づくものとした。
【０２１６】
マルチプレックス技術によりＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−αおよびＩＮＦ−γのサイトカインレベルを決定し、各用量レベル（ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ１６、ＣＤ１５９ａ）後のリンパ球サブセットのフローサイトメトリー評価を含めた。
【０２１７】
全動物に対して完全剖検を行い、全組織の肉眼的異常を記録した。臓器重量および顕微鏡検査を行った。
【０２１８】
ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２および抗薬物抗体の毒物動態学的評価のために血液を採取した。毒物動態学的試料の生物分析および抗薬物抗体分析は保留中である。
【０２１９】
ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２は、臨床所見、体重、体温、または臨床的病態もしくは解剖学的病態に影響を及ぼさなかった。
【０２２０】
ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２の薬理作用は、初回投与の２〜４時間後の全用量レベルでの循環ＩＬ‐６レベルの一過性の上昇により示され、４時間後のＩＬ‐６レベルの急速な低下は２４時間後にベースラインに戻った（図３４を参照）。
【０２２１】
ＮＫ細胞恒常性の動的性質、およびこの試験での低用量群のサイズを考慮すると、ＮＫ細胞数および活性化状態に対するｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２関連の効果を明確に評価することはできない。ほぼすべてのデータは、投与前データセットの変動性の範囲内であった。２４ｍｇ／ｋｇ以上の用量で、絶対ＮＫ細胞数（ＣＤ３−ＣＤ２０−ＣＤ１５９＋）およびＣＤ６９＋活性化ＮＫ細胞の一過性の減少傾向が８日目に認められたが、これは、対照群には影響がなかったことから、ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２と関連があると考えられる。
【０２２２】
要約すると、ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２は全身毒性または局所毒性を誘発しなかった。ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２は、注入用椅子で２時間にわたりＩＶ注入により週１回２８日間カニクイザルに投与した場合、最高用量（７５ｍｇ／ｋｇ）まで優れた耐容性を示した。
【０２２３】
カニクイザルを対象としたピボタル２８日間静脈内毒性試験
カニクイザルを対象とした４週間の期間のピボタルＧＬＰ準拠反復投与毒性試験を行った（ＣＲＯ：Ｃｏｖａｎｃｅ）。この文献の執筆時点で、試験の存続期間は完了しており、初期または部分的な結果が得られた。ただし、この試験の特定の最終分析（例えば、組織病理学、毒物動態学）は未だ保留中であった。
【０２２４】
この試験の目的は、カニクイザルへの２８日間（合計５回の注入）の反復静脈内注入（週１回、２時間注入）後のｓｃＦｖ‐ＩｇＡＢ＿０２の毒性を決定し、２８日間の回復期があれば、観察された効果の可逆性を評価することであった。意図されたヒト治療用経路であることから、静脈内投与経路を選択した。
【０２２５】
ｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２の用量レベルは０、８、２４および７５ｍｇ／ｋｇであった。試験は、ビヒクル、中用量および高用量の回復動物を含む、以下の表に従った４つの終了時殺処分群からなった。
【表１９】
2021515798.tif 000020
【０２２６】
投与期間中、サルの臨床徴候、体温、体重、血液学的検査および血液化学検査、尿分析、ならびにＥＣＧ、血圧および眼底検査を観察した。さらに、マルチプレックス技術によりＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−αおよびＩＮＦ−γのサイトカインレベルを決定し、各用量レベル（ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ１６、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１４）後のリンパ球サブセットのフローサイトメトリー評価を行った。
【０２２７】
皮膚はセツキシマブの主要な標的であるため、皮膚毒性（特に遅延毒性）に特に焦点を当てた。セツキシマブによる最も顕著な皮膚所見は、浅在性化膿性皮膚病変であった。
【０２２８】
試験終了後、組織のＥＭＡリスト全体を収集し、内部器官のその後の関与を伴うびらん性および潰瘍性皮膚炎に起因する二次重複感染にさらに焦点を当てて組織病理学的検査に供した。
【０２２９】
試験は、統合ＴＫ評価およびＡＤＡ評価を含む。
【０２３０】
終了前死亡例はなく、被験物質に関連した獣医師による処置も必要とされていない。
【０２３１】
試験期間中、１〜４群では１匹に皮膚変化が見られたが、明らかな用量依存性は認められなかった。これらの所見は偶発的なものであり、被験物質の投与とは無関係であると考えられた。
【０２３２】
臨床所見に関しては、高用量群の雄２匹（動物Ｐ０３０１およびＰ０３０５）が初回投与中に嘔吐した（液体および／またはムコイドの嘔吐）。これは高用量でのみ認められたため、この所見は被験物質に関連すると考えられる。
【０２３３】
腫脹および軟便などの追加の臨床所見は、頻度が低いか、用量反応性を欠くか、この実験動物種に典型的に観察される所見と同等であるため、偶発的なものと考えられた。
【０２３４】
７５ｍｇ／ｋｇまでのｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２による処置は、体重発達に対する影響を示さなかった。投与期および回復期の間の体重発達は対照と同等であった。
【０２３５】
７５ｍｇ／ｋｇまでのｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２による処置は体温に対する影響を示さなかった。被験物質を投与した動物と対照群との間に群平均体温の有意差が認められたが、用量反応性を欠いていたため、偶発的なものと考えられた。
【０２３６】
被験物質に関連する眼科所見は認められなかった。出血、明るい領域、圧迫、ドルーゼン、乳頭前膜、病変、混濁、色素沈着または瘢痕などの所見は、処置動物および対照動物に散発的に認められ、および／または投与前にも認められ、カニクイザルに典型的に認められる所見と同等であった。
【０２３７】
７５ｍｇ／ｋｇまでのｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２による処置は、血圧および呼吸数に対する影響を示さなかった。
血液学的検査に関して
・全群の動物が、投与期の８日目から網赤血球数の増加を示した。これは、頻繁な採血の生理的代償作用と考えられる。
・投与期の１日目、投与後４時間の時点で、第２群〜第４群の動物ではＷＢＣ数が増加し、好中球数が確実に増加した。差は用量依存的でなかった。
中用量群（２４ｍｇ／ｋｇ）の２匹では、増加は投与後２４時間の時点で完全に可逆的であった。他の動物および群については、２４時間の時点で試料を収集しなかった。他の全群では８日目に回復が示された。ただし、２４時間の時点での全群の完全な回復が予測される。
【０２３８】
７５ｍｇ／ｋｇまでのｓｃＦｖ−ＩｇＡＢ＿０２による処置は、臨床化学、凝固および尿パラメーターに対する影響を示さなかった。
【０２３９】
当面の間、組織病理学、ＴＫおよびＡＤＡ評価、ならびにＥＣＧ分析、免疫表現型分析、サイトカイン分析などの他のいくつかのエンドポイントは未だ保留中である。予備的な肉眼的観察はいずれも、この種に一般的に見られる自然発生的なバックグラウンド変化と一致した。ただし、試験病理学者による最終的な評価は保留中である。臓器重量についても同様である。
【０２４０】
要約すると、これまでに確認された被験物質関連の所見は以下の通りであった：
・１日目の７５ｍｇ／ｋｇの用量での２匹の嘔吐
・１日目の投与後４時間の時点でのＷＢＣ、特にＡＮＥＵの増加
【表２０−１】
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【表２０−２】
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【表２０−３】
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【表２０−４】
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【配列表フリーテキスト】
【０２４１】
配列表１  ＜２２３＞ｖｈドメイン
配列表２  ＜２２３＞ｖｌドメイン
配列表１５  ＜２２３＞サイレンシングされたＦｃ
配列表１７〜１８  ＜２２３＞リンカー
配列表２０  ＜２２３＞サイレンシングされたＦｃ
配列表２７  ＜２２３＞タンデムダイアボディ
配列表２８  ＜２２３＞重鎖
配列表２９  ＜２２３＞軽鎖
配列表３３〜３４  ＜２２３＞プライマー
配列表３５〜３７  ＜２２３＞リンカー
配列表４３  ＜２２３＞重鎖
配列表４４  ＜２２３＞軽鎖
配列表４５  ＜２２３＞重鎖
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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