(57)【要約】組換え単純ヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）ワクチンベクター、それを含む組成物およびワクチン、ならびにそれらの使用方法がそれぞれ提供される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種抗原に対して向けられたワクチンベクターを製造するプロセスであって、以下を含む、プロセス。
ａ）以下：
（ｉ）完全にまたは部分的に欠失されたＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄをコードする遺伝子、および
（ｉｉ）プロモーター−ＦＰ構築物を含む核酸、ここでＦＰは蛍光タンパク質をコードする核酸である
を含むＨＳＶ−２ゲノムを提供すること；
ｂ）ａ）のＨＳＶ−２ゲノムと異種抗原をコードする直鎖ＤＮＡ断片との間で対立遺伝子組換えが生じる条件下で、宿主細胞を、（ｉ）該ＨＳＶ−２ゲノムおよび（ｉｉ）該ＤＮＡ断片とコトランスフェクトすること；
ｃ）ｂ）から生じるプラークをスクリーニングして、蛍光タンパク質蛍光を誘発する励起光下で蛍光を示さないプラークを同定すること；および
ｄ）ｃ）において蛍光を示さないそれらのプラークから組換えＨＳＶ−２ウイルスまたはビリオンを回収して、該異種抗原に対して向けられたワクチンベクターを得ること。
【請求項２】
請求項１に記載のプロセスであって、ここで宿主細胞はＨＳＶ−１糖タンパク質Ｄ補完細胞である、プロセス。
【請求項３】
請求項１または２に記載のプロセスであって、ここでプロモーター−ＦＰ構築物のプロモーターは異種プロモーターである、プロセス。
【請求項４】
請求項１−３のいずれか一項に記載のプロセスであって、ここでコトランスフェクトすることはエレクトロポレーションにより引き起こされる、プロセス。
【請求項５】
請求項１−４のいずれか一項に記載のプロセスであって、ここで蛍光タンパク質は赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）である、プロセス。
【請求項６】
請求項１−５のいずれか一項に記載のプロセスであって、ここで宿主細胞は、（ｉ）ａ）のＨＳＶ−２ゲノムおよび（ｉｉ）順番に、（ｉ）ＨＳＶ−２ｇＤシグナル配列、該異種抗原、ＨＳＶ−２ｇＤ膜貫通ドメイン、ＨＳＶ−２ｇＤ細胞質ドメインをコードするが、ＨＳＶ−２ｇＤ細胞外ドメインをコードしない、または（ｉｉ）ＨＳＶ−２ｇＤシグナル配列、該異種抗原、およびＨＳＶ−２ｇＤの細胞質ドメインをコードする直鎖ＤＮＡ断片とコトランスフェクトされる、プロセス。
【請求項７】
請求項１−５のいずれか一項に記載のプロセスであって、ここで宿主細胞は、（ｉ）ａ）のＨＳＶ−２ゲノムおよび（ｉｉ）順番に、（ｉ）プロモーター、該異種抗原、および所望によりポリＡシグナルをコードする直鎖ＤＮＡ断片とコトランスフェクトされる、プロセス。
【請求項８】
請求項１−７のいずれか一項に記載のプロセスであって、ここで異種抗原はインフルエンザ抗原である、プロセス。
【請求項９】
請求項１−８のいずれか一項に記載のプロセスであって、ここで異種抗原はインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）抗原である、プロセス。
【請求項１０】
請求項９に記載のプロセスであって、ここでＨＡ抗原は完全長ＨＡ細胞外ドメインまたはＨＡストークである、プロセス。
【請求項１１】
請求項１−７のいずれか一項に記載のプロセスであって、ここで異種抗原はＨＩＶ抗原である、プロセス。
【請求項１２】
請求項１１に記載のプロセスであって、ここでＨＩＶ抗原はＥｎｖ  ｇｐ１４５である、プロセス。
【請求項１３】
請求項１−１２のいずれか一項に記載のプロセスであって、ここで異種抗原は、上流ＣＭＶプロモーターの制御下にあり、下流ＳＶ４０ポリＡシグナルを有する、プロセス。
【請求項１４】
請求項１−１３のいずれか一項に記載のプロセスであって、ここでプロモーターは伸長因子１α遺伝子（ＰＥＦ１α）のプロモーターであり、ここでＰＥＦ１αおよびＦＰはともに融合している（ＰＥＦ１α−ＦＰ）、プロセス。
【請求項１５】
請求項１−１４のいずれか一項に記載の方法により作られる、異種抗原をコードするゲノムを含む、ワクチンベクターまたは組換え単純ヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）。
【請求項１６】
以下：
（ｉ）ゲノムにおけるＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄコード遺伝子の完全欠失；および
（ｉｉ）（ａ）プロモーター、異種抗原シグナル配列、および異種抗原をコードする直鎖ＤＮＡ断片または（ｂ）プロモーターおよび異種抗原をコードすること
を含む、組換え単純ヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）。
【請求項１７】
以下：
（ｉ）ゲノムにおけるＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄコード遺伝子の部分的な欠失；および
（ｉｉ）（ａ）順番に、ＨＳＶ−２ｇＤシグナル配列、異種抗原、ＨＳＶ−２ｇＤ膜貫通ドメイン、所望によりＨＳＶ−２ｇＤ細胞質ドメインをコードするが、ＨＳＶ−２ｇＤ細胞外ドメインをコードしない直鎖ＤＮＡ断片、または（ｂ）順番に、ＨＳＶ−２ｇＤシグナル配列、異種抗原、およびＨＳＶ−２ｇＤの膜貫通細胞質尾部をコードする直鎖ＤＮＡ断片
を含む、組換え単純ヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）。
【請求項１８】
さらに脂質二重層上に寄生虫表面糖タンパク質を含む請求項１６または１７に記載の組換えＨＳＶ−２であって、ここで寄生虫は哺乳動物の寄生虫である、組換えＨＳＶ−２。
【請求項１９】
請求項１６−１８のいずれか一項に記載の組換えＨＳＶ−２であって、ここでＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄコード遺伝子はＨＳＶ−２  ＵＳ６遺伝子である、組換えＨＳＶ−２。
【請求項２０】
請求項１６−１９のいずれか一項に記載の組換えＨＳＶ−２であって、ここで異種抗原はインフルエンザ抗原である、組換えＨＳＶ−２。
【請求項２１】
請求項１６−２０のいずれか一項に記載の組換えＨＳＶ−２であって、ここで異種抗原は血球凝集素（ＨＡ）抗原である、組換えＨＳＶ−２。
【請求項２２】
請求項２１に記載の組換えＨＳＶ−２であって、ここでＨＡ抗原は完全長ＨＡ細胞外ドメインまたはＨＡストークである、組換えＨＳＶ−２。
【請求項２３】
請求項１６−１９のいずれか一項に記載の組換えＨＳＶ−２であって、異種抗原はＨＩＶ抗原である、組換えＨＳＶ−２。
【請求項２４】
請求項２３に記載の組換えＨＳＶ−２であって、ここでＨＩＶ抗原はＥｎｖ  ｇｐ１４５である、組換えＨＳＶ−２。
【請求項２５】
請求項１６−２４のいずれか一項に記載の組換えウイルスを中に含む細胞であって、ここで細胞はヒトにおいて存在しない、細胞。
【請求項２６】
請求項１６−２４のいずれか一項に記載の組換えウイルスを含む、ワクチン組成物。
【請求項２７】
請求項１６−２４のいずれか一項に記載のウイルス、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項２８】
対象において免疫応答を誘発および／または増強する方法であって、対象において免疫応答を誘発および／または増強するのに効果的な量で、請求項１６−２４のいずれか一項に記載の組換えウイルスの量を対象に投与することを含む、方法。
【請求項２９】
対象において免疫応答を誘発および／または増強する方法であって、対象において免疫応答を誘発および／または増強するのに効果的な量で、請求項２６に記載のワクチンの量を対象に投与することを含む、方法。
【請求項３０】
対象において免疫応答を誘発および／または増強する方法であって、対象において免疫応答を誘発および／または増強するのに効果的な量で、請求項２７に記載の医薬組成物の量を対象に投与することを含む、方法。
【請求項３１】
対象においてインフルエンザ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させる方法であって、対象においてインフルエンザ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させるのに効果的な量で、請求項１６−２２のいずれか一項に記載の組換えウイルスの量を対象に投与することを含む、方法。
【請求項３２】
対象においてインフルエンザ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させる方法であって、対象においてインフルエンザ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させるのに効果的な量で、請求項２６に記載のワクチンの量を対象に投与することを含む、方法。
【請求項３３】
対象においてインフルエンザ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させる方法であって、対象においてインフルエンザ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させるのに効果的な量で、請求項２７に記載の医薬組成物の量を対象に投与することを含む、方法。
【請求項３４】
対象においてＨＩＶ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させる方法であって、対象においてＨＩＶ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させるのに効果的な量で、請求項１６−１９、２３または２４のいずれか一項に記載の組換えウイルスの量を対象に投与することを含む、方法。
【請求項３５】
対象においてＨＩＶ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させる方法であって、対象においてＨＩＶ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させるのに効果的な量で、請求項２６に記載のワクチンの量を対象に投与することを含む、方法。
【請求項３６】
対象においてＨＩＶ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させる方法であって、対象においてＨＩＶ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させるのに効果的な量で、請求項２７に記載の医薬組成物の量を対象に投与することを含む、方法。
【請求項３７】
対象をインフルエンザ感染についてワクチン接種する方法であって、対象をインフルエンザ感染についてワクチン接種するのに効果的な量で、請求項１６−２２のいずれか一項に記載の組換えウイルスの量を対象に投与することを含む、方法。
【請求項３８】
対象をインフルエンザ感染についてワクチン接種する方法であって、対象をインフルエンザ感染についてワクチン接種するのに効果的な量で、請求項２６に記載のワクチンの量を対象に投与することを含む、方法。
【請求項３９】
対象をインフルエンザ感染についてワクチン接種する方法であって、対象をインフルエンザ感染についてワクチン接種するのに効果的な量で、請求項２７に記載の医薬組成物の量を対象に投与することを含む、方法。
【請求項４０】
対象をＨＩＶ感染についてワクチン接種する方法であって、対象をＨＩＶ感染についてワクチン接種するのに効果的な量で、請求項１６−１９、２３または２４のいずれか一項に記載の組換えウイルスの量を対象に投与することを含む、方法。
【請求項４１】
対象をＨＩＶ感染についてワクチン接種する方法であって、対象をＨＩＶ感染についてワクチン接種するのに効果的な量で、請求項２６に記載のワクチンの量を対象に投与することを含む、方法。
【請求項４２】
対象をＨＩＶ感染についてワクチン接種する方法であって、対象をＨＩＶ感染についてワクチン接種するのに効果的な量で、請求項２７に記載の医薬組成物の量を対象に投与することを含む、方法。
【請求項４３】
対象において免疫応答を誘発および／または増強する方法であって、該方法は、対象において免疫応答を誘発および／または増強するのに効果的な量で、請求項１−１４のいずれか一項に記載のプロセスにより作られ、かつ（ｉ）ゲノムにおけるＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄコード遺伝子の完全欠失および（ｉｉ）プロモーター、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）抗原シグナル配列、およびＨＡ抗原をコードすることを含む組換え単純ヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）の量を対象に投与することを含む、方法。
【請求項４４】
対象においてインフルエンザ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させる方法であって、該方法は、対象においてインフルエンザ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させるのに効果的な量で、請求項１−１３のいずれか一項に記載のプロセスにより作られ、かつ（ｉ）ゲノムにおけるＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄコード遺伝子の完全欠失および（ｉｉ）プロモーター、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）抗原シグナル配列、およびＨＡ抗原をコードすることを含む組換え単純ヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）の量を対象に投与することを含む、方法。
【請求項４５】
対象をインフルエンザ感染についてワクチン接種する方法であって、該方法は、請求項１−１４のいずれか一項に記載のプロセスにより作られ、かつ（ｉ）ゲノムにおけるＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄコード遺伝子の完全欠失および（ｉｉ）プロモーター、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）抗原シグナル配列、およびＨＡ抗原をコードすることを含む組換え単純ヘルペスウイルス−２の量を対象に投与することを含む、方法。
【請求項４６】
請求項４３−４５のいずれか一項に記載の方法であって、ここでＨＡ抗原は完全長ＨＡ細胞外ドメインである、方法。
【請求項４７】
請求項４６に記載の方法であって、さらに、完全長ＨＡ細胞外ドメインをコードする組換え単純ヘルペスウイルス−２の初期投与に続き、（ｉ）ゲノムにおけるＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄコード遺伝子の完全欠失および（ｉｉ）プロモーター、ＨＡ抗原シグナル配列、およびＨＡストークをコードするが、完全長ＨＡをコードしないことを含む１以上の量の組換え単純ヘルペスウイルス−２を投与することを含む、方法。
【請求項４８】
請求項２８−４７のいずれか一項に記載の方法であって、ここで対象はヒトである、方法。
【請求項４９】
細胞の集団における抗体依存性細胞媒介傷害（ＡＤＣＫ）の率または量を定量する方法であって、該方法は、以下：
細胞における蛍光タンパク質の発現を可能にする条件下で、該細胞の集団の複数の細胞をＨＳＶ−２ｇＤをコードする遺伝子について欠失されたゲノムを含む蛍光タンパク質発現性組換えＨＳＶ−２で感染させること、
該複数の感染細胞を抗体含有溶液および免疫細胞の集団と接触させること、および
生感染細胞の量を経時的に定量し、それにより細胞の集団におけるＡＤＣＫの率または量を定量するように、蛍光タンパク質蛍光および、所望により、１以上のマーカーを示す複数の感染細胞の量を１以上の時点で定量すること
を含む、方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法であって、ここで方法はインビトロで実行される、方法。
【請求項５１】
請求項４９または５０に記載の方法であって、ここで免疫細胞の集団はマクロファージを含む、方法。
【請求項５２】
請求項４９−５１のいずれか一項に記載の方法であって、ここで抗体含有溶液は血清を含む、方法。
【請求項５３】
請求項４９−５１のいずれか一項に記載の方法であって、ここで蛍光タンパク質は赤色蛍光タンパク質である、方法。
【請求項５４】
請求項４９−５３のいずれか一項に記載の方法であって、ここで蛍光タンパク質蛍光および、所望により、１以上のマーカーを示す複数の感染細胞の量は蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により測定される、方法。
【請求項５５】
請求項４９−５５のいずれか一項に記載の方法であって、ここで少なくとも一つのマーカーは細胞膜マーカー、生／死マーカー、またはその組み合わせを含む、方法。
【請求項５６】
請求項４９−５５のいずれか一項に記載の方法であって、さらに、抗体含有溶液と接触されていないが同一である感染細胞の対照集団において、蛍光タンパク質蛍光、および所望により１以上のマーカーを示す細胞の量を１以上の時点で定量すること、および定量された量または率を抗体含有溶液と接触された細胞の集団について定量された量または率と比較することを含む、方法。
【請求項５７】
請求項４９−５６のいずれか一項に記載の方法であって、ここで免疫細胞の集団は５：１またはそれより大きいエフェクター：標的比で存在する、方法。
【請求項５８】
請求項４９−５７のいずれか一項に記載の方法であって、ここで組換えＨＳＶ−２は請求項１−１４のいずれか一項に記載の方法により作られる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援の声明
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金番号ＡＩ１１７３２１およびＡＩ００７５０１の下で政府支援とともになされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
インフルエンザおよびＨＩＶウイルス感染を含む病原体感染は、世界の健康に大きな影響を有する。ワクチンは、インフルエンザおよびＨＩＶウイルス感染の両方を含む多くの病原体のために開発されたが、それらは失敗および限定を有する。ゆえに、新規のワクチン戦略は操作および評価されなければならない。
【発明の概要】
【０００３】
発明の概要
インフルエンザおよびＨＩＶを含む種々の抗原性標的のための新しい改良されたＨＳＶ−２ベースのワクチンが本明細書に開示される。
【０００４】
異種抗原に対して向けられたワクチンベクターを製造するためのプロセスが提供され、該プロセスは、以下を含む：
ａ）以下：
（ｉ）完全にまたは部分的に欠失されたＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄをコードする遺伝子、および
（ｉｉ）プロモーター−ＦＰ構築物を含む核酸、ここでＦＰは蛍光タンパク質をコードする核酸である
を含むＨＳＶ−２ゲノムを提供すること；
ｂ）ａ）のＨＳＶ−２ゲノムと異種抗原をコードする直鎖ＤＮＡ断片との間で対立遺伝子組換えが生じる条件下で、宿主細胞を、（ｉ）該ＨＳＶ−２ゲノムおよび（ｉｉ）該ＤＮＡ断片とコトランスフェクトすること；
ｃ）ｂ）から生じるプラークをスクリーニングして、蛍光タンパク質蛍光を誘発する励起光下で蛍光を示さないプラークを同定すること；
ｄ）ｃ）において蛍光を示さないそれらのプラークから組換えＨＳＶ−２ウイルスまたはビリオンを回収して、該異種抗原に対して向けられたワクチンベクターを得ること。
【０００５】
本明細書に記載されるプロセスにより作られる異種抗原をコードするゲノムを有する組換え単純ヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）も、提供される。
【０００６】
（ｉ）ゲノムにおいてＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄをコードする遺伝子（ΔｇＤ−２と呼ばれる）の完全欠失、および（ｉｉ）（ａ）プロモーター、異種抗原シグナル配列、異種抗原をコードすること、または（ｂ）プロモーター、異種抗原をコードすることを有する組換え単純ヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）も、提供される。
【０００７】
（ｉ）ゲノムにおけるＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄコード遺伝子の部分的な欠失、および（ｉｉ）（ａ）順番に、ＨＳＶ−２  ｇＤシグナル配列、異種抗原、ＨＳＶ−２  ｇＤ膜貫通ドメイン、所望によりＨＳＶ−２  ｇＤ細胞質ドメインをコードするが、ＨＳＶ−２  ｇＤ細胞外ドメインをコードしないこと、または（ｂ）順番に、ＨＳＶ−２  ｇＤシグナル配列、異種抗原、およびＨＳＶ−２  ｇＤの膜貫通細胞質尾部をコードすることを有する組換え単純ヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）も、提供される。
【０００８】
本明細書に記載されるような組換えＨＳＶ−２ウイルスを中に含む単離された細胞であってここで細胞はヒトにおいて存在しない細胞も、提供される。
【０００９】
本明細書に記載されるような組換えＨＳＶ−２ウイルスを含むワクチン組成物も、提供される。
【００１０】
本明細書に記載されるような組換えＨＳＶ−２ウイルス、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も、提供される。
【００１１】
対象において免疫応答を誘発および／または増強するのに効果的な量で、（ｉ）本明細書に記載されるような組換えＨＳＶ−２ウイルス；（ｉｉ）本明細書に記載のワクチン；または（ｉｉｉ）本明細書に記載の医薬組成物の量を対象に投与することを含む、対象において免疫応答を誘発および／または増強する方法も、提供される。
【００１２】
対象においてインフルエンザ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させるのに効果的な量で、（ｉ）本明細書に記載されるような組換えＨＳＶ−２ウイルス；（ｉｉ）本明細書に記載されるようなワクチン；または（ｉｉｉ）本明細書に記載されるような医薬組成物の量を対象に投与することを含む、対象においてインフルエンザ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させる方法も、提供される。
【００１３】
対象においてＨＩＶ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させるのに効果的な量で、（ｉ）本明細書に記載されるような組換えＨＳＶ−２ウイルス；（ｉｉ）本明細書に記載されるようなワクチン；または（ｉｉｉ）本明細書に記載されるような医薬組成物の量を対象に投与することを含む、対象においてＨＩＶ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させる方法も、提供される。
【００１４】
対象をインフルエンザ感染についてワクチン接種するのに効果的な量で、（ｉ）本明細書に記載されるような組換えＨＳＶ−２ウイルス；（ｉｉ）本明細書に記載されるようなワクチン；または（ｉｉｉ）本明細書に記載されるような医薬組成物の量を対象に投与することを含む、対象をインフルエンザ感染についてワクチン接種する方法も、提供される。
【００１５】
対象をＨＩＶ感染についてワクチン接種するのに効果的な量で、（ｉ）本明細書に記載されるような組換えＨＳＶ−２ウイルス；（ｉｉ）本明細書に記載されるようなワクチン；または（ｉｉｉ）本明細書に記載されるような医薬組成物の量を対象に投与することを含む、対象をＨＩＶ感染についてワクチン接種する方法も、提供される。
【００１６】
細胞における蛍光タンパク質の発現を可能にする条件下で、細胞の集団の複数の細胞をＨＳＶ−２  ｇＤをコードする遺伝子について欠失されたゲノムを含む蛍光タンパク質発現性組換えＨＳＶ−２で感染させること、該複数の感染細胞を抗体含有溶液および免疫細胞の集団と接触させること、および生感染細胞の量を経時的に定量し、それにより細胞の集団におけるＡＤＣＫの率または量を定量するように、蛍光タンパク質蛍光、および所望により１以上のマーカーを示す細胞の量を１以上の時点で定量することを含む、細胞の集団における抗体依存性細胞媒介傷害（ＡＤＣＫ）の率または量を定量する方法も、提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
図面の簡単な説明
【図１】図１Ａ−１Ｂ。ＨＳＶ−２  ΔｇＤ：：ＨＡおよびＨＳＶ−２  ΔｇＤ：：ＨＡストークは、プラスミドＤＮＡおよびΔｇＤ−２：：ＰＥＦ１α−ＲＦＰ（Ｂ３ｘ２．８、ΔｇＤ−２：：ＲＦＰとも称される）ゲノムＤＮＡのコトランスフェクションにより作成され、ＰＣＲで検証された。図１Ａ。所望のｇＤ：：ＨＡ遺伝子を含有する精製ｐＹＵＢ２１６９が、ＰａｃＩで切断され、ＨＳＶ−２  ΔｇＤ：：ＰＥＦ１α−ＲＦＰゲノムＤＮＡとともにＶＤ６０細胞中にコトランスフェクトされた。エレクトロポレーションが使用された。得られたＲＦＰ−プラークが、３回精製され、ＨＡの存在について評価された。図１Ｂ。組換えウイルスは、プラスミドおよび組換えウイルスＤＮＡからの細胞外ＨＡドメインのＰＣＲ増幅により検証された。使用されたプライマーは、細胞外ＨＡドメインの１００塩基対（ｂｐ）上流および下流に位置された。プラスミドＤＮＡとの比較により視覚化されるように、組換えウイルスは両方とも所望のバンドを示した。ΔｇＤ＊２（Ｂ３ｘ２．９）からのＤＮＡを含有したウェルにおいて、そのサイズのバンドは存在しなかった（レーン１および４）。レーン２は、完全長ＨＡ構築物を含有するｐＹＵＢ２１６９のＤＮＡを示す。レーン３は、ＨＡの非コドン最適化完全長細胞外ドメインを含有する組換えＨＳＶ−２  ΔｇＤ−２：：ＨＡ（Ｂ３ｘ２．１０）からのＤＮＡを示す。レーン５は、ＨＡのコドン最適化ストークドメインを含有する組換えＨＳＶ−２  ΔｇＤ−２：：  ＨＡストークからのＤＮＡを示す。レーン６は、Ｂ３ｘ２．１１からのＤＮＡを示す。
【００１８】
【図２】図２は、ΔｇＤ−２：：ＧＦＰ（Ｂ３ｘ２．７）またはΔｇＤ−２（Ｂ３ｘ２．９）でのワクチン接種に対する抗体応答を示す。
【００１９】
【図３】図３は、ΔｇＤ−２：：ＧＦＰウイルス対マークされていないΔｇＤ−２ウイルスに感染した細胞の抗体依存性細胞毒性の結果を示す。
【００２０】
【図４】図４。ΔｇＤ−２：：ＧＦＰウイルス対マークされていないウイルスに対するＴ細胞応答。
【００２１】
【図５】図５。ΔｇＤ−２ワクチン接種は、ΔｇＤ−２：：ＧＦＰでの保護と同様に、野生型ＨＳＶ−２株４６７４での抗原投与から保護する。
【００２２】
【図６】図６。マウスにおけるキメラΔｇＤ−２：：ＨＡウイルスの構築および免疫応答。ＨＡ１ストーク領域、ＨＡ１ヘッド領域、ＨＡ２ストーク領域、ＨＡ２膜貫通領域、およびＨＡ２細胞質領域に対応する領域は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／１９３４／８（ＰＲ８）ＨＡ（配列番号２）のアミノ酸配列および機能ドメインにおいて示される。キメラΔｇＤ−２：：ＨＡウイルスについて、ＨＡ１ストーク、ＨＡ１ヘッド（または４つのグリシン残基）、およびＨＡ２ストークは、ＨＳＶ−２（Ｇ）ｇＤの膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、およびシグナル配列ドメインに融合された。ヘッドレス（ｈｅａｄｌｅｓｓ）ΔｇＤ−２：：ＨＡ遺伝子について、ＨＡ１ヘッドドメインは、４つのグリシン残基で置き換えられた。
【００２３】
【図７】図７。ＰＣＲにより検証された組換えウイルスにおけるキメラΔｇＤ−２：：ＨＡの存在。レーンは次のとおりである：レーン１：ΔｇＤ−２ゲノムＤＮＡ、レーン２：ΔｇＤ−２：：ＦＬ  ＨＡ  ｎＯＰゲノムＤＮＡ、レーン３：ｐＢＪＪ１プラスミドＤＮＡ、レーン４：ΔｇＤ−２ゲノムＤＮＡ、レーン５：ΔｇＤ−２：：ＨＬ  ＨＡ  ｎＯＰゲノムＤＮＡ、レーン６：ｐＢＪＪ２プラスミドＤＮＡ。ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーは、ＨＡ細胞外ドメインのすぐ上流および下流に位置された。外因性プロモーターは、発現カセット中に挿入されなかった。結果として、キメラ遺伝子の発現は、内因性プロモーターにより調節された。
【００２４】
【図８】図８。ΔｇＤ−２：：ＦＬ  ＨＡ  ｎＯＰ（β３χ１）およびｇＤ−２：：ＨＬ  ＨＡ  ＯＰＴ（β３χ３）でワクチン接種されたマウスは、ＨＳＶ−２抗原投与から完全に保護されるが、抗ＨＡＩｇＧを形成しない。マウスは、対照ＶＤ６０細胞溶解物または１ｘ１０６ＰＦＵのｇＤ−２：：ＦＬ  ＨＡ  ｎＯＰ、ｇＤ−２：：ＨＬ  ＨＡ  ＯＰＴ、またはΔｇＤ−２：：ＲＦＰで、０日目および２１日目にプライムブーストワクチン接種された。図８Ａ。４２日目に、マウスは、１０ｘＬＤ９０の野生型ＨＳＶ−２  ４６７４で抗原投与された。ｇＤ−２：：ＦＬ  ＨＡ  ｎＯＰおよびｇＤ−２：：ＨＬ  ＨＡ  ＯＰＴでワクチン接種されたマウスは、抗原投与から完全に保護された。図８Ｂ。プライムワクチン接種の４０日後に、血清抗体を調べるためにマウスを採血した。可溶性ＰＲ８ＨＡに対して実行されたＥＬＩＳＡは、マウスにおけるＨＡ特異的ＩｇＧの不在を示す。
【００２５】
【図９】図９は、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１発現プラスミドのマップである。ＰＣＭＶ：：ＨＡ：：ＳＶ４０ポリＡカセットは、ＵＳ６の上流および下流に５．５ｋＢを超えるＨＳＶ−２（Ｇ）ゲノムを含有するプラスミドであるｐＢＲＬ８１２に制限クローニングされた。ｐＢＲＬ８１２は、ＡｓｉＳＩおよびＰａｃＩで切断され、ΔｇＤ−２：：ＲＦＰゲノムＤＮＡとＶＤ６０細胞中にコトランスフェクトされた。対立遺伝子交換は、ＲＦＰ発現の欠如により同定され、ＲＦＰ陰性プラークは、選択され、ＰＣＲによる組換えの検証の前に３回精製された。
【００２６】
【図１０】図１０。上記の図９の説明に記載されているように調製されたｐＢＲＬ８１２  ＨＳＶ組換えプラスミドのマップ。
【００２７】
【図１１Ａ】図１１Ａ。ΔｇＤ−２：：ＰＣＭＶ−ＦＬ  ＨＡ  ｎＯＰの検証。ＰＣＭＶ：：ＨＡ：：ＳＶ４０  ＰｏｌｙＡカセットのすぐ上流および下流のプライマーを使用したＰＣＲ。図１１において、非標識レーン：ＤＮＡラダー、レーン１：ｐＪＨＡ１、レーン２：１．２．１潜在的組換え分離株、およびレーン３：陰性対照ΔｇＤ−２ゲノムＤＮＡ。
【００２８】
【図１１Ｂ】図１１Ｂ。ＰＣＭＶ：：ＨＡ：：ＳＶ４０  ＰｏｌｙＡカセットのすぐ上流および下流のプライマーを使用したＰＣＲを使用したΔｇＤ−２：：ＰＣＭＶ−ＨＬ  ＨＡ  ｎＯＰの検証。非標識レーン：ＤＮＡラダー、レーン１：ｐＪＨＡ２、レーン２：２．２．２潜在的組換え分離株、レーン３：２．３．１潜在的組換え分離株、およびレーン４：陰性対照ΔｇＤ−２ゲノムＤＮＡ。
【００２９】
【図１１Ｃ】図１１Ｃ。ΔｇＤ−２：：ＰＣＭＶ−ＨＬ  ＨＡ  ＯＰＴの検証。ＰＣＭＶ：：ＨＡ：：ＳＶ４０  ＰｏｌｙＡカセットのすぐ上流および下流のプライマーを使用したＰＣＲ。レーン１：ｐＪＨＡ４、レーン２：１．２．２潜在的組換え分離株、レーン３：１．２．３潜在的組換え分離株、非標識レーン：ＤＮＡラダー。後者（１．２．３潜在的組換え）分離株は、元のΔｇＤ−２：：ＰＣＭＶ−ＨＬ  ＨＡ  ＯＰＴ貯蔵物を作るために拡張された。
【００３０】
【図１２】図１２：ΔＧＤ−２：：ＰＣＭＶ−ＨＡ組換えウイルスは、すべてＨＡを発現する。ＶＤ６０細胞は、３ＭＯＩのΔｇＤ−２：：ＰＣＭＶ−ＦＬ  ＨＡ  ｎＯＰ、ΔｇＤ−２：：ＰＣＭＶ−ＨＬ  ＨＡ  ｎＯＰ、またはΔｇＤ−２：：ＰＣＭＶ−ＨＬ  ＨＡ  ＯＰＴに感染された。感染後１６時間で、細胞は、回収され、ＨＳＶタンパク質およびＨＡの発現について染色された。ＨＳＶタンパク質の発現は、ΔｇＤ−２：：ＲＦＰでワクチン接種されたマウスの血清を使用して測定された。ＨＡ発現は、モノクローナル抗ＨＡストークＩｇＧＣ１７９を使用して測定された。細胞は、細胞透過性または細胞不透過性いずれかの方法で染色された。統計値は、対照蛍光とＨＡ発現について染色されたウェルにおける蛍光との間の幾何学的平均のスチューデントのｔ検定により計算された。ΔｇＤ−２：：ＰＣＭＶ−ＦＬ  ＨＡ  ｎＯＰのみ感染細胞膜における高レベルのＨＡ発現を誘導したが、細胞透過性染色により測定されるように、すべての３つのウイルスは、発現を誘導した。
【００３１】
【図１３】図１３は、ΔｇＤ−２：：ＰＣＭＶ−ＦＬ  ＨＡ  ｎＯＰが細胞間で拡散しないことを示す。
【００３２】
【図１４】図１４Ａ−１４Ｅ。親ＨＳＶ−２  ΔｇＤ−２：：ＧＦＰ（ΔｇＤ−２）株と比較したＨＳＶ−２  ΔｇＤ−２：：ＲＦＰ（ΔｇＤ−２：：ＲＦＰ）での蛍光タンパク質発現および感染の動態。図１４Ａ。ＨＳＶ−２  ΔｇＤ−２：：ＲＦＰ（ΔｇＤ−２：：ＲＦＰ）は、ＶＤ６０細胞をＨＳＶ−２  ΔｇＤ−２：：ＧＦＰ（ΔｇＤ−２）ゲノムＤＮＡおよびＨＳＶ−２（Ｇ）ゲノムに相同な領域により両側に隣接されたｐＥＦ１α：：ＲＦＰを含有するプラスミドと同時にトランスフェクトすることにより作成された。ゲノムＤＮＡとプラスミドＤＮＡとの間の相同組換えは、ΔｇＤ−２：：ＲＦＰを生じた。組換えウイルスは、３ラウンドのプラーク精製により単離され、ＰＣＲおよびウイルスゲノム配列決定により検証された。図１４Ｂおよび１４Ｃ。Ｖｅｒｏ細胞は、１ＭＯＩのＨＳＶ−２  ΔｇＤ−２（Ｂ）またはΔｇＤ−２：：ＲＦＰで感染された。感染、ＲＦＰ発現、およびＧＦＰ発現の動態は、経時的にモニターされた。両方のウイルスは、同様の感染の動態を示す。ΔｇＤ−２は、感染後２４時間でもＧＦＰ発現をほとんど誘導しなかったが、ΔｇＤ−２：：ＲＦＰは、感染後４．５時間から高レベルのＲＦＰ発現を誘導した。図１４Ｄおよび１４Ｅ。画像は、１ＭＯＩのΔｇＤ−２：：ＲＦＰでの感染後１２時間のＶｅｒｏ（Ｄ）およびＶＤ６０（Ｅ）細胞を示す。感染ＶＤ６０細胞はシンシチウム(syncytia)を形成しており、生産的な感染を示す。Ｖｅｒｏ細胞は、シンシチウムを形成していなかった。１０倍の倍率でデコンボリューションして撮った画像。
【００３３】
【図１５】図１５Ａ−１５Ｃ。Ｒａｗ  ２６４．７細胞およびＪ７７４．１細胞の両方における新規の迅速な蛍光光度抗体依存性細胞媒介傷害（ＲＦＡＤＣＫ）アッセイの検証。図１５Ａ。膜マーカーおよび生／死マーカーの二重発現を使用したフロー分析により、高発現標的細胞は単離された。次いで、感染標的細胞の集団について平均ＲＦＰ強度を決定することにより、高レベルのＨＳＶタンパク質を発現する細胞の割合はゲートされた。次いで、処置群および未処置群の間のこの集団の割合におけるパーセント差異は、ＡＤＣＫとして計算された。図１５Ｂ。感染標的細胞は、Ｊ７７４．１マクロファージとの共培養の前に、ΔｇＤ−２：：ＲＦＰからの血清の存在下または不在下でインキュベートされた。共培養の１２時間後に細胞は固定され、ＲＦＰ高いおよびＲＦＰ中間標的細胞の割合は定量された。ΔＧＤ−２：ＲＦＰワクチン接種されたマウスからの血清を含有するアッセイウェルにおいて、共培養の終了時に、ＲＦＰ中間またはＲＦＰ高い＋中間細胞ではなく有意に少ないＲＦＰ高い細胞があった（Ｐ＜０．０５、平均＝７０．５、４９．３）。値は、少なくとも２重に行われた３つの独立した実験を表す。図１５Ｃ。ＡＤＣＫアッセイは、エフェクター細胞としてＲａｗ  ２６４．７およびＪ７７４．１マクロファージを使用して並行して実行された。ΔｇＤ−２：ＲＦＰまたはＶＤ６０細胞溶解物でワクチン接種されたマウスからの血清を含有する共培養物において存在するＲＦＰ高い細胞の数を、血清を含まない共培養物のものと比較した。ΔｇＤ−２：ＲＦＰワクチン接種マウスからの血清は、Ｒａｗ  ２６４．７細胞およびＪ７７４．１細胞の両方を含有する共培養物においてより多くの傷害を誘導した（ｐ＝０．０９、ｐ＜０．００１；平均＝１８．８％、３８．３％）。データは、エフェクターと標的細胞の比が１０：１のＪ７７４．１細胞およびＲａｗ  ２６４．７細胞で３重に行われた３つの独立した実験を表す。すべての実験において使用された標的細胞は、ＨＥＫ２９３であった。Ｂにおける統計値は、スチューデントのｔ検定を使用して行われた。Ｃにおける統計値は、一元配置分散分析を使用して行われた。エラーバーはＳＥＭを反映する。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００３４】
【図１６】図１６。ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰは、容易に区別できないが、ＨＳＶ−２  ΔｇＤ−２：：  ＲＦＰワクチン接種マウスからの血清の存在下でＲａｗ  ２６４．７マクロファージにより媒介される。３つのムービーの間に死んだ感染細胞の数の定量は、ＨＳＶ−２  ΔｇＤ−２：：ＲＦＰワクチン接種マウスからの血清の添加が、血清を欠く共培養物で撮られたムービーと比較した場合、対照ＶＤ６０細胞溶解物を与えられたマウスからの血清よりも多くの傷害を誘導することを示唆する（両方の群についてｐ＝０．１４、平均＝１８．５、３．７、ｎ＝５８感染細胞）。画像は、６０倍の倍率で撮られた一つのムービーの部分的なフレームを表す。画像は１５分ごとに２４時間撮られた。ＨＥＫ２９３細胞は、標的細胞として使用された。Ｒａｗ  ２６４．７細胞は、マクロファージとして使用された。すべてのアッセイは、１０：１のエフェクターと標的細胞の比で行われた。統計値は、スチューデントのｔ検定を使用して行われた。
【００３５】
【図１７】図１７Ａ−１７Ｂ。ＡＤＣＫアッセイは、ノックアウトマウス系統および他のモデル生物に適応させることができる。図１７Ａ。ＡＤＣＫアッセイは、ＦｃγＲ−／−マウスおよびＷＴマウスの両方からの骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を使用して行われた。感染標的細胞のベースライン傷害は、ＶＤ６０溶解物ワクチン接種マウスからの血清を含有する共培養物において決定された。データは、ΔｇＤ−２：：ＲＦＰワクチン接種マウスの血清を含有する共培養物とベースラインとのパーセント差異を表す。１０：１の実施形態エフェクター：標的比で、ＷＴ  ＢＭＤＭは、ＨＳＶ−２  ΔｇＤ−２：：ＲＦＰワクチン接種血清の存在下で、ＦｃγＲ−／−  ＢＭＤＭよりも有意に多くのＡＤＣＫを行った（ｐ＜０．０５）。ΔｇＤ−２：：ＲＦＰワクチン接種マウスからの血清を含有する共培養物におけるＦｃγＲ−／−  ＢＭＤＭによる感染細胞の傷害は、ＶＤ６０溶解物模擬ワクチン接種マウスからの血清を含有する共培養物のものと区別できなかった。図１７Ｂ。ＡＤＣＫアッセイは、ナイーブモルモット骨髄由来のＢＭＤＭを使用して行われた。ベースラインＡＤＣＫは、ナイーブ動物からの血清を含有する共培養物により決定された。骨髄の限られた利用可能性のため、５：１のエフェクター：標的比が使用された。この比で、ΔｇＤ−２ワクチン接種モルモットからのプールされた血清を含有する共培養物におけるＢＭＤＭは、ＶＤ６０模擬ワクチン接種モルモットからのプールされた血清を含有する共培養物のＢＭＤＭよりも有意により多くのＡＤＣＫを行った（ｐ＜０．００１）。プールされた各試料は、６−９匹の動物からの血清を含有した。データは、３回実行された２つの独立したアッセイを表す。ＨＥＫ２９３細胞は、標的細胞として使用された。統計値は、スチューデントのｔ検定により行われた。エラーバーは、ＳＥＭを反映する。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００３６】
【図１８】図１８：種々のＰＲ８インフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ）血球凝集素（ＨＡ）ＨＳＶ−２組換え体でのワクチン接種により誘発された抗ＨＡ抗体（図における凡例を参照）。
【００３７】
【図１９】図１９：ＨＳＶ−２組換えΔｇＤ−２：：ＦＬ  ＨＡ  ｎＯＰでのワクチン接種により誘発された抗ＨＡ抗体アイソタイプ。＊＊ｐ＜０．０１。
【００３８】
【図２０】図２０：抗ＰＲ８ＩｇＧアイソタイプＥＬＩＳＡ。
【００３９】
【図２１】図２１Ａ−２１Ｃ：ΔｇＤ−２：：ＦＬＨＡＰＲ８（ΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８）でワクチン接種されたマウスは、ＰＲ８での抗原投与から完全に保護される。マウスは、５×１０６ＰＦＵのΔｇＤ−２：：ＲＦＰまたはΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８で３週間隔で皮下にプライムブーストワクチン接種またはＶＤ６０細胞溶解物で模擬ワクチン接種された。図２１Ａ。ブーストの１週間後にマウスは採血され、血清中和力価はＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／１９３４／８  ＩＡＶ（ＰＲ８）に対して測定された。ΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８で免疫化されたマウスは、ＰＲ８に対して有意な中和Ａｂ力価を発生した（平均＝３０４）。点線は、アッセイについての検出限界を表す。図２１Ｂおよび２１Ｃ。ブーストの３週間後、マウスは６ｘＬＤ５０のＰＲ８で鼻腔内に抗原投与された。初期体重の７５％に達したときに、マウスは犠牲にされた。対照ワクチン接種を受けたマウスはすべて９日目の前に感染に屈した一方、ΔＧＤ−２：：ＨＡＰＲ８で免疫化されたマウスはＰＲ８の抗原投与から完全に保護された。中和力価についての統計値は、ＡＮＯＶＡにより計算された。生存統計値は、Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘログランク検定により計算された＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００４０】
【図２２】図２２Ａ−２２Ｃは、組換えｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８が高レベルのＰＲ８タンパク質を発現することを示す。図２２Ａにおいて、ΔＧＤ−２：：ＲＦＰ  ＤＮＡは、ＰＣＭＶの下流およびポリアデニル化シグナルの上流にＩＡＶ  Ｈ１Ｎ１株  Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／１９３４／８（ＰＲ８）からの赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子を含有するＨＡ発現カセットとともにＶＤ６０細胞中にコトランスフェクトされた。図２２Ｂにおいて、細胞外および細胞内ＨＡ発現は、３ＭＯＩのΔｇＤ−２、ΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８、またはＰＲ８  ＨＡ発現カセットの切断バージョンを含有するΔｇＤ−２（ΔｇＤ−２：：ＨＬ  ＨＡＰＲ８）で感染されたＶｅｒｏおよびＶＤ６０細胞においてフローサイトメトリーにより測定された。
【００４１】
【図２３】図２３Ａ−２３Ｆは、ΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８で免疫化されたマウスが、高力価の機能的およびアイソタイプスイッチ抗ＰＲ８抗体を発現することを示す。マウスは、どちらかＶＤ６０細胞溶解物、ΔｇＤ−２：：ＲＦＰベクター、またはΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８いずれかで２１日間隔でプライムブーストワクチン接種された。プライムの２８日後に、分析のために血清は収集された。図Ａ−Ｅ。抗ＰＲ８抗体は、精製されたＨＡ  ＰＲ８タンパク質に対するＥＬＩＳＡにより測定された。ΔＧＤ：：ＨＡＰＲ８で免疫化されたマウスは、主にＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ２ｂであるアイソタイプ(isotype)スイッチ(switched)抗ＰＲ８  ＨＡ抗体を発生した。図２３Ｆにおいて、ΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８で免疫化されたマウスからの血清は、ΔｇＤ−２で免疫化されたマウスからの血清と比較して有意な血球凝集阻害を誘導した（ｐ＜０．００１；平均ＨＡＩ 力価＝８０）。ΔｇＤ−２：：ＲＦＰで免疫化されたマウスは、いかなる血球凝集阻害抗体も発生しなかった。すべてのグラフは、ｎ＝５マウス／群での一つの代表的な実験を示す。統計値は、スチューデントのＴ検定を使用して計算された。＊＊ｐ＜０．０１。
【００４２】
【図２４】図２４Ａ−２４Ｌは、ΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８で免疫化されたマウスがＩＡＶ抗原投与に対する保護を発生することを示す。マウスは、ＶＤ６０細胞溶解物、ΔｇＤ−２、またはΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８で２１日間隔でプライムブースト免疫化され、プライム後２８日目に採血され、６ｘＬＤ５０のＩＡＶで１４日後に鼻腔内抗原投与された。図２４Ａ−２４Ｃにおいて、ΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８で免疫化されたマウスは、ＰＲ８に対して有意な中和力価を発現した（平均力価ＰＲ８＝１：３０４；ｐＶＤ６０＜０．０１；ｐΔｇＤ−２＜０．０５；ｎ＝１０マウス／群）。ΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８で免疫化されたマウスも、その後ＰＲ８での抗原投与が続く体重減少および死亡から完全に保護された（ｐ＜０．００１、ｎ＝５マウス／群）。図２４Ｄ−２４Ｆ。ΔｇＤ：：ＨＡＰＲ８で免疫化されたマウスは、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／２００９  Ｈ１Ｎ１  （Ａ／Ｃａｌ／２００９）  ＩＡＶに対する有意な中和抗体を発生した（平均力価Ａ／Ｃａｌ＝２６；ｐＶＤ６０＜０．０１  ｐΔｇＤ−２＝０．１；ｎ＝１０マウス／群）。ΔＧＤ：：ＨＡＰＲ８で免疫化されたマウスは、Ａ／Ｃａｌ／２００９での抗原投与後の体重減少および死亡から部分的に保護された（Ｐ＜０．０５、ｎ＝１５マウス／群）。図２４Ｇ−２４Ｉに示されるように、ΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８、ΔｇＤ−２：：ＲＦＰ、またはＶＤ６０細胞溶解物で免疫化されたマウスは、インフルエンザ株Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３／７５  Ｈ３Ｎ２  （Ａ／Ｖｉｃ）、およびＡ／Ａｉｃｈｉ／６８  Ｈ３Ｎ２  （Ｘ−３１）に対する中和抗体力価を発生せず、かつ抗原投与後の体重減少および死亡から保護されなかった（ｎ中和＝１０マウス／群；ｎＡ／Ｖｉｃ 抗原投与＝１５マウス／群；ｎＸ−３１ 抗原投与＝５マウス／群）。中和力価は、それぞれの株に対するマイクロ中和アッセイを使用して測定された。開始体重の７０％に達した後、マウスは犠牲にされた。３元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用して行われた中和アッセイについての統計値。Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘログランク検定を使用して行われた生存についての統計値。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００４３】
【図２５】図２５Ａ−２５Ｆ。ΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８で免疫化されたマウスは、ＨＳＶ−２に対して完全に防御的なＡＤＣＣ免疫を発生する。マウスは、ＶＤ６０細胞溶解物、ΔｇＤ−２、またはΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８のいずれかで２１日間隔でプライムブーストワクチン接種された。図２５Ａおよび２５Ｂにおいて、マウスは、ブーストの１週間後に採血され、血清は、ＥＬＩＳＡにより分析された。ΔｇＤ−２またはΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８を受けたマウスは、同様に高いレベルのＨＳＶ特異的ＩｇＧを生成した（図２５Ａ）。さらに、これらのＩｇＧは主にＩｇＧ２ｃであった。図２５Ｃにおいて、迅速な蛍光抗体依存性細胞傷害（ＲＦＡＤＣＫ）アッセイは、図Ｐ２５Ａおよび２５Ｂと同じ血清を使用して行われた。ΔｇＤ−２またはΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８でワクチン接種されたマウスからの血清は、ＶＤ６０細胞溶解物を与えたマウスからの血清と比較しＪ７７４．１マクロファージ及びΔｇＤ−２感染細胞の存在下で有意なＡＤＣＫ活性を誘発した（Ｐ＜０．０１）。ΔｇＤ−２およびΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８でワクチン接種されたマウスからの血清により誘発されるＡＤＣＫ活性間に差異はなかった。図２５Ｄから２５Ｆにおいて、マウスは、ブーストの２１日後に１０ｘＬＤ９０のＨＳＶ−２  ４６７４で皮膚乱切により抗原投与された。ＶＤ６０細胞溶解物を投与されたマウスは、１０までにＨＳＶ−２に屈し、重大な上皮および神経疾患を発症した。ΔｇＤ−２およびΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８を受けたマウスは、抗原投与後の罹患および死亡から完全に保護された。典型的な実験からのｎ＝５マウス／群。３元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用して行われたＲＦＡＤＣＫアッセイについての統計値。Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘログランク検定を使用して行われた生存についての統計値。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【００４４】
【図２６】図２６は、ＨＳＶ−２  ΔｇＤ：：ＨＡ、ＨＳＶ−２  ΔｇＤ：：ＲＦＰおよび不活化Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４  Ｈ１Ｎ１  ウイルス（ＰＲ８）でワクチン接種されたマウスから収集された連続希釈血清試料に対するｍＦｃγＲＩＶ  ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ応答の結果を示す。ＰＲ８ウイルスに感染したメイディン−ダービー  イヌ腎臓(Madin-Darby Canine Kidney)（ＭＤＣＫ）細胞は標的細胞として使用され、ｍＦｃγＲＩＶを発現するＪｕｒｋａｔＴ細胞はエフェクター細胞として使用された。標的細胞は、段階的に希釈された血清試料およびエフェクター細胞とともにインキュベートされた。Ｂｉｏ−ＧｌｏＴＭ試薬が添加され、発光が測定された。組換えＨＳＶ−２  ΔｇＤ−２：：ＨＡワクチン接種マウスは、ＨＳＶ−２  ΔｇＤ−２：：ＲＦＰおよび不活化ＰＲ８ウイルスでワクチン接種されたマウスと比較して、ｍＦｃγＲＩＶ受容体の有意により高い活性化を示した。有意性についてのｐ値は＜０．０５である。記号：＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。
【００４５】
【図２７】図２７は、ＨＩＶ−１の部分的なＮｅｆとともに、完全長ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ（クレードＣ）およびＲｅｖを増幅するために使用されたプラスミドＺＭ１０９Ｆ．ＰＢ４のマップである。
【００４６】
【図２８】図２８は、ｐＢｋｋ４１２プラスミドのマップである。
【００４７】
【図２９Ａ】図２９Ａ。クローン化されたインサートの存在についての形質転換された大腸菌(E.coli)コロニーのスクリーニング。
【００４８】
【図２９Ｂ】図２９Ｂ。正しい核酸サイズを有するクローンを同定するためのＰＣＲによる分析。
【００４９】
詳細な説明
異種抗原に対して向けられたワクチンベクターを製造するためのプロセスが提供され、該プロセスは、以下を含む：
ａ）以下：
（ｉ）完全にまたは部分的に欠失されたＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄをコードする遺伝子、および
（ｉｉ）プロモーター−ＦＰ構築物を含む核酸、ここでＦＰは蛍光タンパク質をコードする核酸である
を含むＨＳＶ−２ゲノムを提供すること；
ｂ）ａ）のＨＳＶ−２ゲノムと異種抗原をコードする直鎖ＤＮＡ断片との間で対立遺伝子組換えが生じる条件下で、宿主細胞を、（ｉ）該ＨＳＶ−２ゲノムおよび（ｉｉ）該ＤＮＡ断片とコトランスフェクトすること；
ｃ）ｂ）から生じるプラークをスクリーニングして、蛍光タンパク質蛍光を誘発する励起光下で蛍光を示さないプラークを同定すること；
ｄ）ｃ）において蛍光を示さないそれらのプラークから組換えＨＳＶ−２ウイルスまたは  ビリオンを回収して、該異種抗原に対して向けられたワクチンベクターを得ること。
【００５０】
実施形態において、プロモーター−ＦＰ構築物のプロモーターは、異種プロモーターである。
【００５１】
抗原に対して向けられたワクチンベクターを製造するためのプロセスも提供され、該プロセスは、以下を含む：
ａ）以下：
（ｉ）ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄをコードする遺伝子における欠失、および
（ｉｉ）ＰＥＦ１α−ＲＦＰ構築物を含む核酸、ここでＰＥＦ１αは伸長因子１α遺伝子のプロモーターであり、かつＲＦＰは赤色蛍光タンパク質をコードする核酸であり、ここでＰＥＦ１αおよびＲＦＰはともに融合される（ＰＥＦ１α−ＲＦＰ）
を含むＨＳＶ−２ゲノムを提供すること；
ｂ）対立遺伝子組換えを可能にする条件下で、宿主細胞を、（ｉ）ａ）のＨＳＶ−２ゲノムおよび（ｉｉ）順番に、（ｉ）ＨＳＶ−２  ｇＤシグナル配列、抗原、ＨＳＶ−２  ｇＤ膜貫通ドメイン、ＨＳＶ−２  ｇＤ細胞質ドメインをコードするが、ＨＳＶ−２  ｇＤ  細胞外ドメインをコードしない直鎖ＤＮＡ断片、または（ｉｉ）ＨＳＶ−２  ｇＤシグナル配列、抗原、およびＨＳＶ−２  ｇＤの膜貫通細胞質尾部とコトランスフェクトすること；
ｃ）ｂ）から生じるプラークをスクリーニングして、赤色蛍光タンパク質蛍光を誘発する励起光下で赤色蛍光を示さないプラークを同定すること；
ｄ）ｃ）において赤色蛍光を示さないそれらのプラークから組換えＨＳＶ−２ウイルスまたはビリオンを回収して、該抗原に向けられたワクチンベクターを得ること。
【００５２】
様々なプロモーターは使用できる。高効率を有する異種プロモーターを含む異種プロモーターが好ましい。かかるプロモーターは、サイトメガロウイルスの主要な前初期プロモーターを含むＣＭＶプロモーターを含む。ヒト伸長因子−１アルファ（ＥＦ−１アルファ）構成的プロモーターはヒト起源であり、インビトロおよびインビボで異所性遺伝子発現を駆動するために使用できる。様々なＰＥＦ−１アルファは使用されてもよい。ヒトＥＦ１α遺伝子配列は当技術分野で知られており、例えば、ＮＣＢＩ受入番号Ｊ０４６１７を参照のこと。当技術分野で知られており、本発明で使用可能な他の異種プロモーターは、限定はしないが、ニワトリベータアクチンプロモーターに融合されたＣＭＶエンハンサー（ＣＡＧ）、マウスサイトメガロウイルス（マウスＣＭＶ）、チャイニーズハムスター伸長因子−１α（ＣＨＥＦ−１α）、およびホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）を含む。
【００５３】
プロセスの実施形態において、宿主細胞は、補完する細胞、例えば、ＨＳＶ−１糖タンパク質Ｄを表現型的に補完する細胞である。プロセスの実施形態において、宿主細胞は、ＨＳＶ−１  ｇＤを表現型的に補完するＶＤ６０細胞である。実施形態において、製造されたワクチンベクターは、ＨＳＶ−２  ｇＤについて遺伝子型的に欠失され、その脂質二重層上のＨＳＶ−１  ｇＤについて表現型的に補完される。実施形態において、製造されたワクチンベクターは、いかなるＨＳＶ  ｇＤも遺伝子型的にコードしない。
【００５４】
実施形態において、宿主細胞は、（ｉ）ａ）のＨＳＶ−２ゲノムおよび（ｉｉ）順番に、（ｉ）ＨＳＶ−２  ｇＤシグナル配列、該異種抗原、ＨＳＶ−２  ｇＤ膜貫通ドメイン、ＨＳＶ−２  ｇＤ細胞質ドメインをコードするが、ＨＳＶ−２  ｇＤ細胞外ドメインをコードしない直鎖ＤＮＡ断片、または（ｉｉ）ＨＳＶ−２  ｇＤシグナル配列、異種抗原、およびＨＳＶ−２  ｇＤの膜貫通細胞質尾部とコトランスフェクトされる。
【００５５】
実施形態において、宿主細胞は、（ｉ）ａ）のＨＳＶ−２ゲノムおよび（ｉｉ）順番に、（ｉ）プロモーター、異種抗原、および所望によりポリＡシグナルをコードする直鎖ＤＮＡ断片とコトランスフェクトされる。
【００５６】
実施形態において、コトランスフェクトすることはエレクトロポレーションにより達成される。
【００５７】
本発明における使用のための核酸コード可能蛍光タンパク質の例は、赤、遠赤、黄、緑、オレンジ、シアン、または光スイッチ可能蛍光タンパク質を含む。かかるタンパク質の例は、当技術分野でよく知られている。供給は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＵＳＡ）およびＴａｋａｒａ（ＵＳＡ）を含む。ある実施形態において、蛍光タンパク質は赤色蛍光タンパク質である。５５４−５８４ナノメートル（ｎｍ）の励起範囲および５６２−６１０ｎｍの発光範囲を有する蛍光タンパク質は、好ましい。例は、Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＴｏｍａｔｏ、Ｊ−ＲｅｄおよびｍＯｒａｎｇｅを含む。ＲＦＰは、５５６ｎｍの励起および５８４ｎｍの発光を有する。あるいは、ホタルルシフェラーゼまたはナノルシフェラーゼは、使用できる。
【００５８】
実施形態において、抗原はＨＳＶ−２抗原ではない、すなわち、それは異種抗原である。本明細書において使用される場合、抗原は、それがＨＳＶ−２と比較して異種である場合、すなわち、それが野生型ＨＳＶ−２上またはその中に自然に見出されない場合、異種である。
【００５９】
異種抗原は、例えばウイルス、細菌、寄生虫、ヒト細胞、動物細胞、またはそれらの組み合わせを含む生体に由来できる。異種抗原は、表面タンパク質または非表面タンパク質であることができる。
【００６０】
ウイルスは病原性ウイルスであることができ、その例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、コクサッキーウイルス、クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、デングウイルス、ドリウイルス、東部ウマ脳炎（ＥＥＥ）ウイルス、エボラウイルス、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全（ＨＩＶ）ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトＳＡＲＳコロナウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ノーウォークウイルス、狂犬病ウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、血小板減少症候群（ＳＦＴＳ）ウイルスを伴う重度の発熱、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、またはそれらの組み合わせを含む。
【００６１】
細菌は病原性細菌であることができ、その例は、バチルス種、バロネラ種、ボルダテッラ種、ボレリ種(Borelli asp.）、ブルセラ種、カンピロバクター種、クラミジア種、クロストリジウム種、コリネバクテリウム種、エンテロコッカス種、エシェリキア種、ヘモフィルス（Haemophilis）種、ヘリコバクター種、レジオネラ種、レプトスピラ種、リステリア種、マイコバクテリウム種、マイコプラズマ種、髄膜炎菌、リケッチア種、シュードモナス属、サルモネラ種、赤痢菌種、スタフィロコッカス種、ストレプトコッカス種、トレポネーマ種、ビブリオ種、エルシニア種、またはそれらの組み合わせを含む。
【００６２】
寄生虫は病原性寄生虫であることができ、その例は、アカントアメーバ亜種、バラムチア亜種、バベシア種、バランチジウム  コリ、ブラストシスティック種、クリプトスピリジウム属、シクロスポラ  カイエタネンシス、赤痢アメーバ、ランブル鞭毛虫、イソスポラ  ベロ、リーシュマニア種、ネグレリアフォーラー、マラリア原虫種、リノスポリジウム  セーベリ、肉胞子虫種、トキソプラズマ原虫、トリコモナス種、トリパノソーマ種、またはそれらの組み合わせを含む。
【００６３】
ヒト細胞または動物細胞は、例えば、癌細胞であることができる。
【００６４】
実施形態において、異種抗原はインフルエンザ抗原である。実施形態において、異種抗原は、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）抗原である。実施形態において、ＨＡ抗原は、完全長ＨＡ細胞外ドメインまたはＨＡストークドメインである。
【００６５】
実施形態において、異種抗原はＨＩＶ抗原である。実施形態において、ＨＩＶ抗原は、Ｅｎｖ  ｇｐ１４５である。
【００６６】
実施形態において、異種抗原は、上流ＣＭＶプロモーターの制御下にあり、かつ下流ＳＶ４０ポリＡシグナルを有する。ＳＶ４０ポリＡシグナルは当技術分野で知られている。それは、ポリアデニル化および転写終結を促進する。
【００６７】
実施形態において、プロモーターは、伸長因子１α遺伝子（ＰＥＦ１α）のプロモーターであり、ここでＰＥＦ１αおよびＦＰはともに融合される（ＰＥＦ１α−ＦＰ）。
【００６８】
実施形態において、核酸は、発現についてコドン最適化される。例えば、以下の例の表４を参照のこと。
【００６９】
本明細書に記載のプロセスにより作られるワクチンベクターも、提供される。
【００７０】
本明細書に記載のプロセスにより作られる異種抗原をコードするゲノムを有する組換え単純ヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）も、提供される。
【００７１】
（ｉ）ゲノムにおけるＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄコード遺伝子の完全欠失および（ｉｉ）（ａ）プロモーター、異種抗原シグナル配列、および異種抗原をコードすることまたは（ｂ）プロモーターおよび異種抗原をコードすることを有する組換え単純ヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）も、提供される。
【００７２】
（ｉ）ゲノムにおけるＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄコード遺伝子の部分的な欠失および（ｉｉ）（ａ）順番に、ＨＳＶ−２  ｇＤシグナル配列、異種抗原、ＨＳＶ−２  ｇＤ膜貫通ドメイン、所望によりＨＳＶ−２  ｇＤ細胞質ドメインをコードするが、ＨＳＶ−２  ｇＤ  細胞外ドメインをコードしないこと、または（ｂ）順番に、ＨＳＶ−２  ｇＤシグナル配列、異種抗原、ＨＳＶ−２  ｇＤの細胞質ドメインをコードすることを有する組換え単純ヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）も、提供される。
【００７３】
（ｉ）ゲノムにおけるＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄコード遺伝子の部分的な欠失および（ｉｉ）（ａ）順番に、ＨＳＶ−２  ｇＤシグナル配列、異種抗原、ＨＳＶ−２  ｇＤ膜貫通ドメイン、ＨＳＶ−２  ｇＤ細胞質ドメインをコードするが、ＨＳＶ−２  ｇＤ細胞外ドメインをコードしないこと、または（ｂ）順番に、ＨＳＶ−２  ｇＤシグナル配列、異種抗原、およびＨＳＶ−２  ｇＤの膜貫通細胞質尾部をコードすることを有する組換え単純ヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）も、提供される。
【００７４】
実施形態において、組換えＨＳＶ−２は、さらにその脂質二重層上に寄生虫表面糖タンパク質を含み、ここで寄生虫は哺乳動物の寄生虫である。
【００７５】
一実施形態において、ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄをコードする遺伝子は、ＨＳＶ−２  ＵＳ６遺伝子である。（例えば、本明細書にその全体が参考により組み込まれる、Dolan ら. J Virol. 1998 March; 72(3): 2010-2021. (PMCID: PMC109494)ＨＳＶ−２ゲノムおよびＵＳ６遺伝子についての「The Genome Sequence of Herpes Simplex Virus Type 2」を参照）。実施形態において、ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄをコードする遺伝子は、ＨＳＶ−２  ＵＳ６遺伝子と同等である。かかる同等物(equivalent）は、容易に入手可能な配列決定およびアラインメントツールを使用して当業者により容易に同定可能である。
【００７６】
実施形態において、異種抗原はインフルエンザ抗原である。実施形態において、異種抗原は、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）抗原である。
【００７７】
実施形態において、ＨＡ抗原は、完全長ＨＡ細胞外ドメインまたはＨＡストークである。実施形態において、完全長ＨＡは、ＨＡシグナル配列を含む。実施形態において、ＨＡは、ヒトインフルエンザＡまたはヒトインフルエンザＢのＨＡである。血球凝集素遺伝子（「ＨＡ」）の例は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｖ０１０９８．１；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０４０９８０．１．  ＨＡ  遺伝子配列、および当技術分野でよく知られている成熟血球凝集素ペプチド配列、およびＮＣＢＩデータベースで当業者が利用できる複数のＨＡ配列を含む。加えて、当業者は、一般的に議論されているストーク、細胞外ドメイン、および血球凝集素の他の領域を容易に同定できる。加えて、ＨＡ配列を含む季節性インフルエンザウイルス株配列は、当技術分野で日常的に配列決定および同定される。
【００７８】
Ｂ３ｘ２．８（ΔｇＤ−２：：ＰＥＦ１α−ＲＦＰ）で対立遺伝子交換によりΔｇＤ−２に添加できる異種抗原としての他のインフルエンザ遺伝子は、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックスタンパク質１（Ｍ１）、インフルエンザＡウイルスを含むように（ＩＡＶ）マトリックスタンパク質２（Ｍ２）、インフルエンザＢウイルス（ＩＢＶ）マトリックスタンパク質２（Ｍ２）、ヌクレオタンパク質（ＮＰ）、およびインフルエンザＢウイルスＮＢを含む。少なくとも一つの前述のものを含む組み合わせも、使用できる。各株についての対応する修飾ヘッドレスＨＡ遺伝子、並びに三量体化ドメインが安定性を増加させるために追加された各ヘッドレス抗原のバージョンは、追加できる。表１は、他のかかる抗原遺伝子の非限定的なインフルエンザの例を提供する。他の例は、例えばＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／１９８８およびＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／１９８７株からの、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４、ＨＡ、ヘッドレスＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＰ、およびＮＢ遺伝子からのＨＡ遺伝子を挿入することを含む。
【表１】
2021522854.tif 000003
【００７９】
ＨＩＶまたはインフルエンザＡウイルス抗原を発現する組換えＨＳＶ−２ｇＤ−／−ウイルスベクターを生成するための一つの方法は、以下の通りである：
１．糖タンパク質Ｄシグナル配列および膜貫通細胞質ドメイン配列のみが残るように（細胞外ドメイン配列が存在しないように）、遺伝子Ｕｓ６をコードする糖タンパク質Ｄを部分的に欠失させることにより、操作されたＨＳＶ−２ゲノムを生成すること。糖タンパク質Ｄ遺伝子の欠失部分は、ＰＥＦ１−ＲＦＰ遺伝子で置換され、ここで赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）はＰＥＦ１プロモーターの制御下で発現される。
２．コスミドｐＹＵＢ２１６９は、それぞれの側のＨＳＶ−２シグナル配列および膜貫通細胞質ドメイン配列の配列に隣接する選択した異種抗原（例えば、ＨＩＶエンベロープタンパク質抗原Ｅｎｖ  ｇｐ１４５またはインフルエンザウイルスＨＡストーク抗原）についての遺伝子を発現するように操作できる。
３．（１）のＨＳＶ−２  ｇＤ−／−ＲＦＰゲノムおよび（２）の操作されたコスミドｐＹＵＢ２１６９の両方は、ＶＤ６０細胞株中に導入できる。
４．ＶＤ６０細胞株内で、（１）のＨＳＶ−２部分欠失糖タンパク質Ｄ遺伝子（挿入されたＲＦＰ遺伝子）と（２）のｐＹＵＢ２１６９−ＨＩＶ  Ｅｎｖ  ｇｐ１４５またはＡ型インフルエンザウイルスＨＡストーク抗原発現遺伝子との間で、相同組換えが起こる。成功した組換えは、ＲＦＰ遺伝子の喪失、および異種ＨＩＶまたはインフルエンザウイルス抗原を発現するＨＳＶ−２  ｇＤ−／−ウイルスの生成を引き起こすと予想される（図１Ａ−１Ｂを参照）。
５．ＲＦＰ発現について陰性であるＶＤ６０細胞培養プラークは、ＨＳＶ−２ｇＤ−／−を含有し、ウイルス粒子は、ＨＩＶ  Ｅｎｖ  ｇｐ１４５またはＩインフルエンザウイルスＨＡストーク抗原を発現すると予想される。
６．このように生成された異種ＨＩＶ  Ｅｎｖ  ｇｐ１４５またはインフルエンザＡウイルスＨＡストーク抗原を発現するＨＳＶ−２ｇＤ−／−ウイルスは、人にワクチン接種し、ＨＩＶまたはインフルエンザウイルスに対する強力な抗体媒介応答および防御免疫を誘発するために使用できる。
【００８０】
実施形態において、異種抗原はＨＩＶ抗原である。実施形態において、ＨＩＶ抗原は、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２抗原である。例えば、異種抗原はＨＩＶ−１抗原である。実施形態において、ＨＩＶはＣサブタイプである。実施形態において、ＨＩＶ抗原は、Ｅｎｖ、Ｐｏｌ、Ｇａｇ、またはＮｅｆである。一実施形態において、ＨＩＶ抗原はＥｎｖ抗原である。実施形態において、ＨＩＶ抗原は、ＣサブタイプＥｎｖ抗原である。実施形態において、抗原はＥｎｖ  ｇｐ１４５である。実施形態において、異種抗原は、完全に無傷の膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）である。実施形態において、異種抗原は、ポリリジンテールにより伸長される。実施形態において、異種抗原は、ポリリジンテールにより伸長されない。ＨＩＶ  ｇｐ１４５  Ｅｎｖタンパク質配列は、アラインメントツールにより容易に識別可能であり、配列決定するのが日常的である。実施形態において、ＨＩＶ  Ｅｎｖ  ｇｐ１４５の細胞外ドメインは、ＨＳＶ  ｇＤのシグナルペプチドおよび膜貫通細胞質尾部と融合している。
【００８１】
本明細書に記載されるような組換えウイルスを中に含む細胞も提供され、ここで細胞はヒトにおいて存在しない。
【００８２】
本明細書に記載されるような組換えウイルスを含むワクチン組成物も、提供される。実施形態において、ワクチンは、ＨＳＶ−２に由来しないアジュバントを含む。アジュバントは当技術分野でよく知られており、ミョウバン、水中油型または油中水型エマルジョン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウムなどのアルミニウム塩、およびモノホスホリル脂質Ａを含む。実施形態において、ワクチンはアジュバントを含まない。
【００８３】
本明細書に記載されるような組換えＨＳＶ−２ウイルス、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も、提供される。薬学的に許容される担体は、当技術分野でよく知られている。
【００８４】
対象において免疫応答を誘発および／または増強する方法であって、該方法は、対象において免疫応答を誘発および／または増強するのに効果的な量で、（ｉ）本明細書に記載されるような組換えウイルス；（ｉｉ）本明細書に記載されるようなワクチン；または（ｉｉｉ）本明細書に記載されるような医薬組成物の量を対象に投与することを含む方法も、提供される。
【００８５】
異種抗原を発現する病原体に対する対象において免疫応答を誘発および／または増強する方法であって、該方法は、対象において免疫応答を誘発および／または増強するのに効果的な量で、（ｉ）本明細書に記載されるような組換えウイルス；（ｉｉ）本明細書に記載されるようなワクチン；または（ｉｉｉ）本明細書に記載されるような医薬組成物の量を対象に投与することを含み、ここで（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の組換えウイルスは異種抗原を発現する方法も、提供される。
【００８６】
対象においてインフルエンザ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させる方法であって、該方法は、対象においてインフルエンザ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させるのに効果的な量で、（ｉ）本明細書に記載されるような組換えウイルス；（ｉｉ）本明細書に記載されるようなワクチン；または（ｉｉｉ）本明細書に記載されるような医薬組成物の量を投与することを含む。インフルエンザの可能性を処置するかまたは減少させるために、異種抗原は、インフルエンザＨＡ抗原である。対象をインフルエンザ感染についてワクチン接種するのに効果的な量で、対象に（ｉ）本明細書に記載されるような組換えウイルス；（ｉｉ）本明細書に記載されるようなワクチン；または（ｉｉｉ）本明細書に記載されるような医薬組成物を投与することを含む、対象をインフルエンザ感染についてワクチン接種する方法も、提供される。
【００８７】
対象においてＨＩＶ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させる方法であって、該方法は、対象におけるＨＩＶ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させるのに効果的な量で、（ｉ）本明細書に記載されるような組換えウイルス；（ｉｉ）本明細書に記載されるようなワクチン；または（ｉｉｉ）本明細書に記載されるような医薬組成物の量を対象に投与することを含む方法も、提供される。ＨＩＶを処置するかまたはＨＩＶの可能性を減少させるために、異種抗原はＨＩＶ抗原である。対象をＨＩＶ感染についてワクチン接種する方法であって、該方法は、対象をＨＩＶ感染についてワクチン接種するのに効果的な量で、（ｉ）本明細書に記載されるような組換えウイルス；（ｉｉ）本明細書に記載されるようなワクチン；または（ｉｉｉ）本明細書に記載されるような医薬組成物の量を対象に投与することを含む方法も、提供される。
【００８８】
対象において免疫応答を誘発および／または増強する方法であって、該方法は、対象において免疫応答を誘発および／または増強するのに効果的な量で、本明細書に記載されるプロセスにより作られ、かつ（ｉ）ゲノムにおけるＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄコード遺伝子の完全欠失および（ｉｉ）プロモーター、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）抗原シグナル配列、およびＨＡ抗原をコードすることを含む組換え単純ヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）の量を対象に投与することを含む方法も、提供される。
【００８９】
対象においてインフルエンザ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させる方法であって、対象においてインフルエンザ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させるのに効果的な量で、本明細書に記載されるプロセスにより作られ、かつ（ｉ）ゲノムにおけるＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄコード遺伝子の完全欠失および（ｉｉ）プロモーター、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）抗原シグナル配列、およびＨＡ抗原をコードすることを含む組換え単純ヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）の量を対象に投与することを含む方法も、提供される。
【００９０】
対象をインフルエンザ感染についてワクチン接種する方法であって、該方法は、対象をインフルエンザ感染についてワクチン接種するのに効果的な量で、本明細書に記載されるプロセスにより作られ、かつ（ｉ）ゲノムにおけるＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄコード遺伝子の完全欠失および（ｉｉ）プロモーター、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）抗原シグナル配列、およびＨＡ抗原をコードすることを含む組換え単純ヘルペスウイルス−２の量を対象に投与することを含む方法も、提供される。
【００９１】
実施形態において、ＨＡ抗原は、完全長ＨＡ細胞外ドメインである。
【００９２】
実施形態において、方法は、完全長ＨＡ細胞外ドメインをコードする組換え単純ヘルペスウイルス−２の初期投与に続き、（ｉ）ゲノムにおけるＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄコード遺伝子の完全欠失および（ｉｉ）プロモーター、ＨＡ抗原シグナル配列、およびＨＡストークをコードするが、完全長ＨＡをコードしないことを有する１以上の量の組換え単純ヘルペスウイルス−２を投与することをさらに含む。
【００９３】
方法またはプロセスの実施形態において、ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄは、配列番号１：
MGRLTSGVGTAALLVVAVGLRVVCAKYALADPSLKMADPNRFRGKNLPVLDQLTDPPGVKRVYHIQPSLEDPFQPPSIPITVYYAVLERACRSVLLHAPSEAPQIVRGASDEARKHTYNLTIAWYRMGDNCAIPITVMEYTECPYNKSLGVCPIRTQPRWSYYDSFSAVSEDNLGFLMHAPAFETAGTYLRLVKINDWTEITQFILEHRARASCKYALPLRIPPAACLTSKAYQQGVTVDSIGMLPRFIPENQRTVALYSLKIAGWHGPKPPYTSTLLPPELSDTTNATQPELVPEDPEDSALLEDPAGTVSSQIPPNWHIPSIQDVAPHHAPAAPSNPGLIIGALAGSTLAVLVIGGIAFWVRRRAQMAPKRLRLPHIRDDDAPPSHQPLFY (HSV-2 参照株HG52)
に示されるアミノ酸配列を含む。
【００９４】
一実施形態において、ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄをコードする遺伝子が欠失しているＨＳＶ−２は、以下のＧｅｎｂａｎｋ列挙配列の一つに記載されたゲノム（欠失前）を有するＨＳＶ−２である：HSV-2 (G)(KU310668)、HSV-2(4674)(KU310667)、B3x1.1(KU310657)、B3x1.2(KU310658)、B3x1.3(KU310659)、B3x1.4(KU310660)、B3x1.5(KU310661))、B3x2.1(KU310662)、B3x2.2(KU310663)、B3x2.3(KU310664)、B3x2.4(KU310665)、B3x2.5(KU310666)。これらの配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９５】
本明細書に記載されるような組換えＨＳＶ−２ゲノムを中に含む細胞は、提供される。
【００９６】
本明細書に記載されるような組換えＨＳＶ−２ウイルスを含むワクチン組成物も、提供される。一実施形態において、ワクチンは免疫学的アジュバントを含む。一実施形態において、ワクチンは免疫学的アジュバントを含まない。組換えＨＳＶ−２を含む本明細書に記載のワクチン、組成物または医薬組成物の実施形態において、ＨＳＶ−２は弱毒化されている。
【００９７】
本明細書に記載されるような組換えＨＳＶ−２ウイルスを含む組成物であって、ここでウイルスまたはビリオンのゲノムは少なくとも第２の遺伝子の欠失を含み、第２の遺伝子はＨＳＶ−２ウイルス複製または毒性のために必要である組成物も、提供される。
【００９８】
本明細書に記載されるような組換えＨＳＶ−２ウイルス、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【００９９】
一実施形態において、組成物または医薬組成物またはワクチンは、それがヒト対象への皮下投与に適しているように処方される。一実施形態において、組成物または医薬組成物またはワクチンは、それがヒト対象への経口投与に適しているように処方される。一実施形態において、組成物または医薬組成物またはワクチンは、それがヒト対象への膣内投与に適しているように処方される。一実施形態において、組成物または医薬組成物またはワクチンは、それがヒト対象への筋肉内、鼻腔内、または粘膜投与に適しているように処方される。本明細書の方法の実施形態、および本明細書の組成物または医薬組成物またはワクチン製剤の実施形態において、投与は、耳介、頬側、結膜、皮膚、皮下、子宮頸管内、副鼻腔内、気管内、経腸、硬膜外、血液透析を介して、間質性、腹腔内、羊膜内、動脈内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、心臓内、軟骨内、仙骨内、海綿体内、腔内、脳内、槽内、角膜内、冠動脈内、皮内、椎間板内、管内、表皮内、食道内、胃内、膣内(intravaginal)、歯肉内、腸内、腔内、病巣内、リンパ管内、髄内、髄膜内、筋肉内、眼内、卵巣内、心外膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、鼻腔内、脊髄内、滑液嚢内、腱内、精巣内、髄腔内、胸腔内、胸膜内、尿細管内、腫瘍内、鼓室内、子宮内、血管内、静脈内、脳室内、膀胱内、硝子体内、喉頭、経鼻、経鼻胃、眼、経口、口腔咽頭、非経口、経皮(percutaneous)、関節周囲、硬膜外、経直腸、吸入による、眼球後、くも膜下、結膜下、舌下、粘膜下層、局所的、経皮(transdermal)、経粘膜的、経胎盤、経気管、尿管、尿道、または膣(vaginal)であることができる。前述の投与経路のうちの少なくとも一つを含む組み合わせも、使用できる。
【０１００】
対象において免疫応答を誘発する方法であって、該方法は、対象において免疫応答を誘発するのに効果的な量で、（ｉ）本明細書に記載されるような組換えＨＳＶ−２ウイルスの量を対象に投与することを含む方法も、提供される。
【０１０１】
一実施形態において、ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄをコードする遺伝子は、ＨＳＶ−２  ＵＳ６遺伝子である。一実施形態において、ＨＳＶ−２組換えウイルスは、異種表面糖タンパク質をコードする。一実施形態において、異種表面糖タンパク質はＨＳＶ−１ｇＤである。一実施形態において、ＨＳＶ−２組換えウイルスは、非ゲノム型にコードされたＨＳＶ−１  ｇＤを含み、ヘルペスウイルス糖タンパク質ではない、および／またはヘルペスウイルス科感染に関与しておらず、組換えＨＳＶ−２のゲノム中に挿入されている導入遺伝子によりコードされる異種表面糖タンパク質もコードする。一実施形態において、組換えＨＳＶ−２のゲノムは、ヘルペスウイルスｇＤをコードしない。一実施形態において、表面糖タンパク質は、ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄをコードする遺伝子の欠失を有する組換えＨＳＶ−２で細胞を感染させることによりウイルスの脂質二重層上に存在し、ここで細胞はその細胞膜上に表面糖タンパク質を発現させるためトランスフェクトされるかまたはトランスフェクトされており、脂質二重層上に存在する表面糖タンパク質を含む組換えＨＳＶ−２は細胞から産生される。一実施形態において、宿主細胞は、ＨＳＶ−１  ｇＤ補完する細胞である。一実施形態において、宿主細胞は、内因性遺伝子プロモーターの下でＨＳＶ−１  ｇＤをコードする。一実施形態において、宿主細胞は、ＨＳＶ−１  ｇＤ補完ＶＤ６０細胞である。（例えば、参照により本明細書に組み込まれるLigasら, J Virol.1988 May; 62(5):1486-94を参照）。
【０１０２】
本明細書に記載されるような組換えウイルスを中に含む細胞であって、ここで細胞はヒトにおいて存在しない細胞も、提供される。
【０１０３】
本明細書に記載されるような組換えウイルスを含むワクチン組成物。ワクチン組成物の一実施形態において、ワクチン組成物は免疫学的アジュバントを含む。
【０１０４】
本明細書に記載されるような組換えウイルスを含む組成物であって、ここでウイルスのゲノムは少なくとも第２の遺伝子の欠失を含み、第２の遺伝子はＨＳＶ−２ウイルス複製に必要である組成物も、提供される。
【０１０５】
一実施形態において、本明細書に記載されるような組換えウイルスは、第２の遺伝子の欠失を含まない。
【０１０６】
ウイルス感染の可能性を低減することは、未処置の対象と比較して、本明細書に記載のウイルス、ワクチンまたは組成物で処置された対象における関連疾患の発症の程度または感染の機会の改善を意味すると理解される。
【０１０７】
免疫応答を免疫化、ワクチン接種、または誘発するための本明細書の方法の実施形態において、ウイルスまたはそれにより誘導される抗体または免疫因子の受動的伝達は、ある対象から第２の対象へともたらされてもよい。関連する産物は、ある対象からの取得後、別の対象に投与する前に処置されてもよい。本明細書に記載の本発明の好ましい実施形態において、対象は哺乳動物対象である。一実施形態において、哺乳動物対象はヒト対象である。
【０１０８】
一実施形態において、対象を抗原でワクチン接種することは、対象においてその抗原に対する体液性免疫応答を誘発する。ワクチン接種された個人は、通常、ワクチン接種前よりも、その抗原を含む病原体からの後の抗原投与に対して、より効果的な免疫応答を開始できる。
【０１０９】
本明細書に記載の方法の一実施形態において、対象はまだインフルエンザウイルスで感染されていない。本明細書に記載の方法の一実施形態において、対象はまだＨＩＶで感染されていない。本明細書に記載の方法の一実施形態において、対象はインフルエンザウイルスで感染されている。本明細書に記載の方法の一実施形態において、対象はＨＩＶで感染されている。
【０１１０】
実施形態において、インフルエンザ感染症は、ヒトインフルエンザＡ感染症である。実施形態において、インフルエンザ感染症は、ヒトインフルエンザＢ感染症である。実施形態において、ＨＩＶ感染は、ＨＩＶ−１感染である。実施形態において、ＨＩＶ感染は、ＨＩＶ−２感染である。
【０１１１】
「コドン最適化」は、天然配列のコドンの少なくとも１つ、２つ以上、またはかなりの数を、脊椎動物の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることにより、目的の、例えばヒト細胞における増強された発現のために核酸配列を改変することとして定義される。種々の種が、特定のアミノ酸の一定のコドンに対して特定のバイアスを示す。一態様において、本発明は、コドン最適化インサート、核酸またはベクター、またはそれらを含む宿主細胞に関する。
【０１１２】
細胞における蛍光タンパク質の発現を可能にする条件下で、細胞の集団の複数の細胞をＨＳＶ−２  ｇＤをコードする遺伝子について欠失されたゲノムを含む蛍光タンパク質発現性組換えＨＳＶ−２で感染させること、該複数の感染細胞を抗体含有溶液および免疫細胞の集団と接触させること、および生感染細胞の量を経時的に定量し、それにより免疫細胞の集団におけるＡＤＣＫの率または量を定量するように、蛍光タンパク質蛍光、および所望により１以上のマーカーを示す細胞の量を１以上の時点で定量することを含む、細胞の集団における抗体依存性細胞媒介傷害（ＡＤＣＫ）の率または量を定量する方法も、提供される。
【０１１３】
細胞における蛍光タンパク質の発現を可能にする条件下で、細胞の集団の複数の細胞をＨＳＶ−２  ｇＤをコードする遺伝子について欠失されたゲノムを含む蛍光タンパク質−発現発現性組換えＨＳＶ−２で感染させること、複数の感染細胞を抗体含有溶液と接触させること、および生感染細胞の量を経時的に定量し、それにより細胞の集団におけるＡＤＣＫの率または量を定量するように、蛍光タンパク質蛍光、および所望により１以上のマーカーを示す細胞の量を１以上の時点で定量することを含む、細胞の集団における抗体依存性細胞媒介傷害（ＡＤＣＫ）の率または量を定量する方法も、提供される。
【０１１４】
実施形態において、組換えＨＳＶ−２は、本明細書に記載されるようなプロセスにより作られる。
【０１１５】
実施形態において、方法はインビトロで実行される。実施形態において、免疫細胞の集団は、マクロファージの集団を含む。実施形態において、マクロファージはヒトである。実施形態において、抗体含有溶液は血清を含む。実施形態において、蛍光タンパク質は、本明細書における上記のとおりである。一実施形態において、蛍光タンパク質は赤色蛍光タンパク質である。一実施形態において、ＲＦＰ高いとして定量された細胞のみが生きていると見なされる。一実施形態において、複数の細胞は、細胞の感染集団のＲＦｐ発現細胞の平均強度を超えてＲＦＰを発現する場合、ＲＦＰ高いである。実施形態において、該方法は、５：１またはそれより大きいエフェクター：標的比で存在する免疫細胞の集団で実行される。実施形態において、該方法は、１０：１またはそれより大きいエフェクター：標的比で存在する免疫細胞の集団で実行される。
【０１１６】
実施形態において、蛍光タンパク質蛍光および、所望により、一つ以上のマーカーを示す細胞の量は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により測定される。実施形態において、蛍光タンパク質蛍光および、所望により、一つ以上のマーカーを示す細胞の量は、蛍光分光計、蛍光マイクロプレートリーダー、および蛍光顕微鏡または蛍光プレートリーダーにより測定される。実施形態において、一つ以上のマーカーは、細胞膜マーカーおよび／または生／死マーカーを含む。
【０１１７】
実施形態において、方法は、さらに、抗体含有溶液と接触されていないが同一である感染細胞の対照集団において、蛍光タンパク質蛍光および、所望により、１以上のマーカーを示す細胞の量を１以上の時点で定量すること、および定量された量または率を抗体含有溶液と接触された細胞の集団について定量されたものと比較することを含む。
【０１１８】
ＡＤＣＫのためのアッセイに関する本発明の他の実施形態において、組換えＨＳＶ−２  ΔｇＤ−２におけるマーカーは、蛍光タンパク質の代わりに、ベータガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼであることができる。ゆえに、本明細書に開示される方法、プロセスおよび組成物は、変更すべきところは変更して、ベータガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼをコードするゲノムにおける核酸を含む組換えＨＳＶ−２  ΔｇＤ−２を含むことができる。
【０１１９】
例えばオプションＡおよび／またはオプションＢとともに、本明細書において使用される場合、「および／または」は、（ｉ）オプションＡ、（ｉｉ）オプションＢ、および（ｉｉｉ）オプションＡ  プラス  オプションＢの別個の実施形態を包含する。
【０１２０】
本明細書に記載の種々の要素のすべての組み合わせは、本明細書に他に記載のない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、本発明の範囲内にある。
【０１２１】
本発明は、以下の実施例からよりよく理解されてもよい。
【発明を実施するための形態】
【０１２２】
実施例
実施例１
ｇＤ遺伝子（ΔｇＤ−２）を赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を強く発現する遺伝子で置き換える操作されたＨＳＶ−２ウイルスを、構築した。一度達成されると、これは、新しい組換え体を同定および入手するための改善されたスクリーニングを提供した。ΔｇＤ−２：：ＲＦＰ組換え体を、保護を示したΔｇＤ−２から作った。本明細書においてＢ３ｘ２．８またはΔｇＤ−２：：ＰＥＦ１α−ＲＦＰとしても称される赤色蛍光ΔｇＤ−２：ＲＦＰは、ＨＳＶ感染に対する防御免疫を誘発する元のΔｇＤ−２の能力を保持するが、変化していないインビトロ複製キネティック(kinetic)を有するようにも見える。さらに、ΔｇＤ−２：：ＲＦＰは、組換え体を作るためにＨＳＶ−２  ΔｇＤ：：ＧＦＰウイルスよりも有意な利点を有する。ＲＦＰ遺伝子が、高度に効率的なプロモーター、例えばＥＦ１α（伸長因子１α）遺伝子のプロモーターに融合しているため、その発現は蛍光顕微鏡を使用して容易に検出される。加えて、ΔｇＤ−２：：ＲＦＰに感染した細胞における赤色蛍光の視覚化は、緑色蛍光ΔｇＤ−２で見出されるバックグラウンドを有さない。この特徴は、ΔｇＤ−２：：ＰＥＦ１α−ＲＦＰ対立遺伝子が他の対立遺伝子交換基質により置き換えられている組換えウイルスの明確な同定を可能にする。
【０１２３】
骨格としてＨＳＶ−２（Ｇ）を使用するＨＳＶ−２  ΔｇＤ−／＋ｇＤ−１ウイルス（以下「ΔｇＤ−２」と称する）の構築を、以下に詳述するように達成した。対立遺伝子交換構築物を作るために、大腸菌プラスミド中にＧｉｂｓｏｎクローニングし、ＵＳ１からＵＳ９にわたる１２ｋｂのＨＳＶ−２（Ｇ）ウイルスを含有するシャトル（例えばコスミドｐＹＵＢ２１６９）のＳｐｅＩおよびＢｃｌＩ部位間に発現構築物をクローニングし、ｐＹＵＢ２１６９組換え体からのＰａｃＩ制限フラグメントをΔｇＤ−２：：ＲＦＰ  ＤＮＡとともにＶＤ６０細胞中にエレクトロポレーションし、得られたプラークを赤色蛍光の喪失についてスクリーニングすることにより、発現構築物を生成した。（図１を参照）。
【０１２４】
この系を使用して、インフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ）株Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４（ＰＲ８）に由来する血球凝集素（ＨＡ）抗原を含有する２セットの組換えΔｇＤ−２株を、生成した。組換え体の第１のセットは、例えばｐＹＵＢ２１６９の使用を介してΔｇＤ−２のＵＳ６領域に組換えられたキメラｇＤ：：ＨＡ遺伝子を含む。これらの組換え遺伝子は、ＨＳＶ−２（Ｇ）ｇＤの膜貫通ドメイン、細胞質ドメインおよびシグナル配列ドメインに融合したＰＲ８ＨＡの細胞外ドメインで構成されていた。組換え体の第２のセットは、上流ＣＭＶプロモーターおよび下流ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルに融合した修飾または未修飾のＰＲ８ＨＡ遺伝子を含む。これらのカセットを、ｐＢＲＬ８１２として同定される修飾ｐＹＵＢ２１６９を使用してΔｇＤ−２のＵＳ６領域中に挿入した。組換え体の各セットは、３タイプのＨＡ遺伝子を含有した：
ＦＬ  ＨＡ  ｎＯＰ−完全長細胞外ドメイン血球凝集素、非コドン最適化
ＨＬ  ＨＡ  ｎＯＰ−ヘッドレス細胞外ドメイン血球凝集素、非コドン最適化
ＨＬ  ＨＡ  ＯＰＴ−ヘッドレス細胞外ドメイン血球凝集素、コドン最適化。
【０１２５】
以下の構築物を作った：
【０１２６】
ΔｇＤ−２：：ＲＦＰ（ΔｇＤ−２：：ＰＥＦ１α−ＲＦＰ）を、（１）ＲＦＰプラスミドｐｔｗＢにカナマイシンマーカーを導入すること、（２）ｋａｎマーカーおよびＲＦＰ（ｄＴｏｍａｔｏ）をＵＳ６の上流および下流に〜５０ｂｐの相同配列を有するオリゴで増幅すること、（３）ＤＹ３３１細胞に再結合し、ＰＣＲ産物を加えて、次いでコスミドｐＹＵＢ２１５６で形質転換すること、により構築した。（４）ｋａｎマーカーを、制限消化およびライゲーションにより除去した。（５）ＨＳＶ２（Ｇ）ゲノムＤＮＡおよびｐＹＵＢ２１６７を、ＶＤ６０細胞にコトランスフェクトし、対立遺伝子交換によりΔｇＤ−２：：ＲＦＰを生成した。
【０１２７】
ＶＤ６０細胞におけるΔｇＤ−２：：ＲＦＰゲノムでコスミドｐＹＵＢ２１６３をコトランスフェクションし、対立遺伝子交換によりΔｇＤ−２ゲノムを生成することにより、ΔｇＤ−２を得た。このゲノムは、すべてのマーカーおよび抗生物質耐性遺伝子を含まない。得られたマークされていないウイルスを、ＲＦＰ発現の欠如に基づいて分類した。ＲＦＰ陰性プラークを３回精製し、ＲＦＰ遺伝子の欠如をＰＣＲおよび配列決定により検証した。
【０１２８】
ΔｇＤ−２：：ＦＬ  ＨＡ  ｎＯＰを、（１）ｐＹＵＢ２１６９プラスミドにおいて、ＨＳＶ−２（Ｇ）ｇＤの細胞質ドメイン、膜貫通ドメインおよびシグナル配列ドメインを、カスタム合成されたＰＲ８  ＨＡ（Genscript, Piscataway, NJ）の細胞外ドメインにＧｉｂｓｏｎクローニングすること、および（２）得られたプラスミド、ｐＢＪＪ１をＶＤ６０細胞におけるΔｇＤ−２：ＲＦＰゲノムとコトランスフェクトして、対立遺伝子交換により所望の組換え体を生成すること、により構築した。
【０１２９】
ΔｇＤ−２：：ＨＬ  ＨＡ  ｎＯＰを、ΔｇＤ−２：：ＦＬ  ＨＡ  ｎＯＰと同様に、しかしＨＡ１ヘッドドメインが４つのグリシン残基で置き換えられたカスタム合成ＰＲ８  ＨＡ遺伝子（Genscript）を使用して、構築した。トランスフェクションのために使用されたプラスミドを、ｐＢＪＪ２と称した。
【０１３０】
ΔｇＤ−２：：ＨＬ  ＨＡ  ＯＰＴを、ΔｇＤ−２：：ＨＬ  ＨＡ  ｎＯＰと同様に、しかしＨＡ１ヘッドドメインが４つのグリシン残基で置き換えられ、同族(cognate)アミノ酸に対してＨＳＶ−２（Ｇ）ｇＤにおいて９．５％未満の表現(representation)を有したそれぞれのコドンがＨＳＶ−２（Ｇ）ｇＤで最も豊富なコドンで置き換えられたカスタム合成ＰＲ８  ＨＡ遺伝子(Genscript)を使用して、構築した。トランスフェクションのために使用されたプラスミドを、ｐＢＪＪ４と称した。
【０１３１】
ΔｇＤ−２：：ＰＣＭＶ−ＦＬ  ＨＡ  ｎＯＰを、（１）ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Addgene, Cambridge, MA）のｘｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位間に完全長ＰＲ８  ＨＡ遺伝子(Genscript)を制限クローニングすること、（２）ｐＢＲＬ８１２のＳｐｅＩおよびＢｃｌＩ部位中に得られたプラスミドからのＰＣＭＶ−ＦＬ  ＨＡ  ｎＯＰ：：ＳＶ４０ポリＡカセットを制限クローニングすることにより、構築した。得られたプラスミド、ｐＪＨＡ１をＰａｃＩおよびＡｓｉＳＩで切断し、ＶＤ６０細胞においてΔｇＤ−２：：ＲＦＰゲノムとコトランスフェクトして、対立遺伝子交換により所望の組換え体を生成した。
【０１３２】
ΔｇＤ−２：：ＰＣＭＶ−ＨＬ  ＨＡ  ｎＯＰを、ΔｇＤ−２：：ＰＣＭＶ−ＦＬ  ＨＡ  ｎＯＰと同様に、しかしＨＡ１ヘッドドメインが４つのグリシン残基で置き換えられたカスタム合成ＰＲ８  ＨＡ遺伝子（Genscript）を使用して、構築した。トランスフェクションのために使用されたプラスミドを、ｐＪＨＡ２と称した。
【０１３３】
ΔｇＤ−２：：ＰＣＭＶ−ＨＬ  ＨＡ  ＯＰＴを、ΔｇＤ−２：：ＰＣＭＶ−ＦＬ  ＨＡ  ｎＯＰと同様に、しかしＨＡ１ヘッドドメインが４つのグリシン残基で置き換えられ、同族(cognate)アミノ酸に対してＨＳＶ−２（Ｇ）ｇＤにおいて９．５％未満の表現を有したそれぞれのコドンがＨＳＶ−２（Ｇ）ｇＤにおいて最も豊富なコドンで置き換えられたカスタム合成ＰＲ８  ＨＡ遺伝子(Genscript)を使用して、構築した。トランスフェクションのために使用されたプラスミドを、ｐＪＨＡ４と称した。
【表２】
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【０１３４】
全ゲノム配列決定を使用して、ＵＳ６の欠失を検証した。免疫原性を試験するために、マウスを０日目（ｄ０）およびｄ２１にワクチン接種し、次いでｄ４０に血清を採取した。ΔｇＤ−２は、ΔｇＤ−２：：ＧＦＰで得られたものと同様である抗−ＨＳＶ抗体を誘発した（図２を参照）。
【０１３５】
機械論的には、保護の最も重要な相関関係は、ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰであるようである。ΔｇＤ−２ワクチン接種マウスからの血清は、ΔｇＤ−２：：ＧＦＰワクチン接種マウスからの血清よりも有意に多くのＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ免疫を誘導した（図３）。ＣＤ８およびＣＤ４  Ｔ細胞応答は、同じワクチン接種戦略を使用して４０日で同様であった（図４）。
【０１３６】
ΔｇＤ−２ワクチン接種は、Montefiore Hospital, Bronx, NYでのウイルス学研究所から得られる臨床分離株である野生型ＨＳＶ−２  ４６７４およびＧＦＰマークされた構築物での抗原投与に対して、マウスを保護する。マウスを、ｄ０およびｄ２１に野生型ＨＳＶ−２またはＧＦＰマークされた構築物ウイルスのいずれかでワクチン接種した。ブーストの２１日後、マウスを、１０Ｘ  ＬＤ９０  ＨＳＶ−２  ４６７４で皮下に抗原投与し、皮膚病変の変化、後根神経節におけるウイルスの存在、体重、および生存について追跡した。マークされていないウイルスは、すべての測定によりほぼ同じように機能した（図５）。
【０１３７】
材料および方法
ＨＳＶ−１（１７）（Brown ら, 1973）、ＨＳＶ−２（Ｇ）（Ejercito ら, 1968）、ＨＳＶ−１（Ｆ）（Ejercito ら, 1968）、およびＨＳＶ−２（３３３）ＺＡＧ（Nixon ら, 2013）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する組換えウイルスを、Ｖｅｒｏ細胞上で増殖させた。ＨＳＶ−２  ４６７４（Nixon ら, 2013）を、ＨａＣＡＴ細胞上で増殖させた。ＶＤ６０細胞（内因性遺伝子プロモーター下でｇＤ−１をコードするＶｅｒｏ細胞（Ligas および Johnson, 1988））を、１０％ウシ胎児血清を補ったＤＭＥＭ中で継代した。ＨＳＶ−２  ΔｇＤ−２（ΔｇＤ−／＋ｇＤ−１）ウイルスの貯蔵物を、補完するＶＤ６０細胞上で増殖させ、ＶＤ６０およびＶｅｒｏ細胞上で力価測定した。濃縮させたウイルス貯蔵物を、−８０℃で貯蔵し、必要に応じてＰＢＳ中で所望の濃度に希釈した。
【０１３８】
ΔｇＤ−２：：ＧＦＰの構築。プラスミドｐｃＤＮＡ３−ｅＧＦＰ（13031; Addgene, Cambridge, MA, USA）を鋳型として使用し、Ｖａｎ９１Ｉ制限酵素部位に隣接されるｐＣＭＶ−ｅＧＦＰ−ＮｅｏｒおよびＯｒｉＥ−Ａｍｐｒ領域をＰＣＲ増幅した。ｐＣＭＶ−ｅＧＦＰ−Ｎｅｏｒ領域を、プライマーＦｗｄ−ｐＣＭＶおよびＲｅｖ−ＮｅｏＲ−Ｔｅｒｍを使用してＰＣＲ増幅した（プライマーのリストについて表３を参照）。ＯｒｉＥ−Ａｍｐｒ領域を、プライマーＦｗｄ−ＯｒｉｇｉｎおよびＲｅｖ−ＡｍｐＲを使用してＰＣＲ増幅した。
【０１３９】
並行して、ＨＳＶ−２におけるＵＳ６遺伝子（ｇＤ）の左および右に隣接するゲノム領域を、鋳型として精製ウイルスＤＮＡ（ＨＳＶ−２株４６７４）および左の相同性アームのためにプライマーＬＬ−Ｖ９１Ｉ−ＵＳ６  プラス  ＬＲ−Ｖ９１Ｉ−ＵＳ６および右の相同性アームのためにプライマーＲＬ−Ｖ９１Ｉ−ＵＳ６およびＲＲ−Ｖ９１Ｉ−ＵＳ６を使用してＰＣＲ増幅した（配列アラインメントについて表３を参照）。４つのＰＣＲフラグメントすべてをゲル精製し、Ｖａｎ９１Ｉ（Fermentas Molecular Biology Tools, Thermo Scientific, West Palm Beach, FL, USA）で消化し、Ｑｕｉｃｋ−Ｌｉｇａｓｅ［New England Biolabs (NEB), Ipswich, MA, USA］でライゲーションし、ＮＥＢ５−αコンピテント細胞に形質転換した。
【０１４０】
得られたプラスミド（ｅＫＯ２−ＵＳ６）を配列検証し、エンドトキシンフリーのミニプレップキット（MO-BIO Laboratories, Carlsbad, CA, USA）を使用して大腸菌から抽出した。ＨＳＶ−２  ＤＮＡ（１μｇ）を、製造業者の推奨に従って、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（Qiagen, Valencia, CA, USA）を使用してＶＤ６０細胞中に１００ｎｇのｅＫＯ２−ＵＳ６とコトランスフェクトした。
【０１４１】
トランスフェクションの４ｄ後、プレートを緑色のプラークについてスクリーニングし、上清を収集して新鮮なＶＤ６０細胞に１時間被せ(overlaid)、次いで洗浄し、Ｏｐｔｉｍｅｍ（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）において調製した４％低融点アガロースで覆った。単一の緑色蛍光プラークをピックし(picked)、この方法を使用して３回精製した。ＨＳＶ−１  ｇＤ欠失ウイルス（Ligas, 1988）について説明されているように、ウイルス貯蔵物をＶＤ６０細胞上で増殖させ、Ｖｅｒｏ細胞から感染細胞溶解物を回収することにより非補完(noncomplemented)ウイルスを生成した。
【０１４２】
ΔｇＤ−２：：ＧＦＰにおけるｇＤ欠失の遺伝子型確認を、ＰＣＲにより実行した。プライマーセットを使用して、試料中の野生型（ＷＴ）およびΔｇＤ−２ウイルスＤＮＡの存在を確認した（プライマーＲＬ−Ｖ９１Ｉ−ＵＳ６およびＲＬ−Ｖ９１ＩＵＳ６）一方、別のプライマーセット（Ｎｅｏ−ＯｕｔおよびＵＳ８−Ｏｕｔ）を使用して、ｅＫ０２−ＵＳ６を含むＤＮＡ領域およびゲノム標的領域を増幅した。ｇＤ発現の欠失を確認するために、ＶｅｒｏまたはＶＤ６０細胞を親ＷＴまたはΔｇＤ−２ウイルス（ＶＤ６０細胞上で増殖し、ゆえに侵入についてコンピテントである）に１０プラーク形成単位（ＰＦＵ）／細胞（ＶＤ６０力価に基づく）の感染の多重度（ＭＯＩ）で感染させた。インキュベーションの１時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、Ｏｐｔｉｍｅｍ中で３７℃で４８時間インキュベートし、回収して、ウェスタンブロットによりｇＤ発現を評価した。
【表３】
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【０１４３】
ｅＫＯ２−ＵＳ６プラスミドを構築するために使用されるＰＣＲフラグメントについての配列相同性。Ｂｌａｓｔ２を使用してｐＣＭＶ−ｅＧＦＰ−ネオマイシン耐性プライマーについて公開されているＡｄｄｇｅｎｅ  ｐｃＤＮＡ３−ｅＧＦＰ（ｉｄ：１３０３１、６１５９ｂｐ）配列を検索することは、１８１９ｂｐフラグメントを生じる：
【化１】
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【０１４４】
ｐＵＣ  Ｏｒｉｇｉｎ−アンピシリン耐性プライマーについてｐｃＤＮＡ３−ｅＧＦＰ配列を検索することは、１７５４ｂｐフラグメントを生じる：
【化２】
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【０１４５】
単純ヘルペスウイルス（タイプ２）（ｔａｘｉｄ：１０３１０）の左ＵＳ６相同性アームについてblast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiデータベースを検索することは、ヒトＨＳＶ−２株ＨＧ５２、完全なゲノムからの配列を返した：
左−ＵＳ６相同性アームについてのＢＬＡＳＴは、９９１ｂｐ相同領域、１０２９ｂｐフラグメントを生じる：
【化３】
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【０１４６】
右−ＵＳ６相同性アームについてのＢＬＡＳＴは、１０７２ｂｐ相同領域、１１１０ｂｐフラグメントを生じる：
【化４】
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【０１４７】
表４：カスタム合成されたコドン最適化ＨＡ遺伝子において置き換えられるコドン。ＨＡ遺伝子を合成する際、ＨＳＶ−２（Ｇ）ｇＤにおいて９．５％未満の表現を有したＰＲ８  ＨＡにおけるコドンを、ＨＳＶ−２（Ｇ）ｇＤにおいて最も高い表現を有したそれぞれのアミノ酸についてのコドンで置き換えたバージョンを、設計した。
【表４】
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【０１４８】
組換えウイルスにおけるキメラｇＤ：：ＨＡの存在を、ＰＣＲにより検証した（図７を参照）。左から右へのレーンは次のとおりである：レーン１；ΔｇＤ−２ゲノムＤＮＡ、レーン２；ΔｇＤ−２：：ＦＬ  ＨＡ  ｎＯＰ  ゲノムＤＮＡ、レーン３；ｐＢＪＪ１  プラスミドＤＮＡ、レーン４；ΔｇＤ−２ゲノムＤＮＡ、レーン５；ΔｇＤ−２：：ＨＬ  ＨＡ  ｎＯＰ  ゲノムＤＮＡ、およびレーン６；ｐＢＪＪ２プラスミドＤＮＡ。ＰＣＲ増幅のために使用されるプライマーは、ＨＡ細胞外ドメインのすぐ上流および下流に位置された。外因性プロモーターを、発現カセット中に挿入しなかった。その結果、キメラ遺伝子の発現を、内因性プロモーターにより制御した。サンガー配列決定を使用して、組換えウイルスにおけるキメラｇＤ：：ＨＡ遺伝子の適切な構築を確認した。遺伝的検証により、６−８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを、０日目および２１日目にΔｇＤ−２：：ＦＬ  ＨＡ  ｎＯＰまたはΔｇＤ−２：：ＨＬ  ＨＡ  ＯＰＴで、親ΔｇＤ−２：ＲＦＰ株およびＶＤ６０細胞溶解物で模擬ワクチン接種された対照群と並行してプライムブーストワクチン接種した。ブーストの２１日後、マウスを、１０ｘＬＤ９０のＨＳＶ−２  ４６７４で皮膚に抗原投与し、抗−ＨＳＶ免疫が傷つけられたかどうかを決定した。
【０１４９】
ΔｇＤ−２：：ＦＬ  ＨＡ  ｎＯＰおよびΔｇＤ−２：：ＨＬ  ＨＡ  ＯＰＴでワクチン接種されたマウスは、ＨＳＶ−２抗原投与に対して完全に保護されるが、抗−ＨＡ  ＩｇＧを形成しない（図８参照）。マウスを、対照ＶＤ６０細胞溶解物または１×１０６  ＰＦＵのΔｇＤ−２：：ＦＬ  ＨＡ  ｎＯＰ、ΔｇＤ−２：：ＨＬ  ＨＡ  ＯＰＴ、またはΔｇＤ−２：：ＲＦＰで０日目および２１日目にプライムブーストワクチン接種した。４２日目に、マウスを、１０ｘＬＤ９０のＨＳＶ−２  ４６７４で抗原投与した。ΔｇＤ−２：：ＦＬ  ＨＡ  ｎＯＰおよびΔｇＤ−２：：ＨＬ  ＨＡ  ＯＰＴでワクチン接種されたマウスは、抗原投与から完全に保護された（図８Ａ参照）。プライムの４０日後に、血清抗体を調べるためにマウスを採血した。可溶性ＰＲ８  ＨＡに対して実行されたＥＬＩＳＡは、マウスにおけるＨＡ特異的ＩｇＧの不在を示す。（図８Ｂを参照）。
【０１５０】
ΔｇＤ−２：：ＰＣＭＶ−ＨＡウイルスおよびＨＡ発現の構築。構成的プロモーターおよびポリアデニル化配列を含有するカセットにおけるΔｇＤゲノム中に非キメラＨＡ遺伝子を挿入することがより免疫原性であるか否かを、調査した。これを達成するために、合成されたＰＲ８  ＨＡ遺伝子を発現プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１(Addgene)に制限クローニングした。ＨＡ遺伝子を、ｘｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位間に挿入し、プラスミドにおいてＥＧＦＰに置き換えた。
【０１５１】
マウスを、ΔｇＤ−２：：ＰＣＭＶ−ＦＬ  ＨＡ  ｎＯＰでワクチン接種した。マウスを、５×１０６  ＰＦＵの各ウイルスでプライムワクチン接種した（使用される異なるウイルスについて図１８凡例を参照）。ΔｇＤ−２：：ＦＬ  ＨＡ  ｎＯＰについての１０匹のマウスを除いて、ｎ＝５マウス／群。ΔｇＤ−２：：ＦＬ  ＨＡ  ｎＯＰマウスのうち５匹を、ΔｇＤ−２を発現するストークＨＡでブーストし、５μｇ／ｍＬの精製ＰＲ８  ＨＡを抗原の供給源として使用した。ヤギ抗−マウスＩｇ  Ａｂを、全Ａｂ  ＥＬＩＳＡのために使用した。プライムの１４日後に、抗−ＰＲ８  ＨＡ  ＥＬＩＳＡは、ストークＨＡ（ΔｇＤ−２：：ＦＬ  ＨＡ  ｎＯＰ）でワクチン接種されたマウスからの血清が全体的なＡｂ応答を示したが、アイソタイプＥＬＩＳＡではバックグラウンドを超えて記録されなかったことを示した（図１８を参照）。重要なことには、ΔｇＤ−２：：ＰＣＭＶ−ＦＬ  ＨＡ  ｎＯＰ（β３χ４）でのワクチン接種は、ＩｇＧ１よりも有意に多くのＩｇＧ２ｃを生じた（図１９を参照）。全長ＨＡでのワクチン接種は、最大の抗−ＨＡ応答を誘導し、この応答は主にＩｇＧ２ｃである。これは、内因性ＨＳＶタンパク質に関して外因性抗原に対して組換えウイルスワクチンで得ることができる同一のＩｇＧアイソタイプ応答と一致している。
【０１５２】
ΔｇＤ−２：：ＰＣＭＶ−ＨＡ組換えウイルスはすべて、ＨＡを発現する。図１２に示すように、ＶＤ６０細胞を、３ＭＯＩのΔｇＤ−２：：ＰＣＭＶ−ＦＬ  ＨＡ  ｎＯＰ、ΔｇＤ−２：：ＰＣＭＶ−ＨＬ  ＨＡ  ｎＯＰ、またはΔｇＤ−２：：ＰＣＭＶ−ＨＬ  ＨＡ  ＯＰＴで感染させた。感染後１６時間で、細胞を回収し、ＨＳＶタンパク質およびＨＡ発現について染色した。ＨＳＶタンパク質発現を、ΔｇＤ−２：：ＲＦＰでワクチン接種されたマウスからの血清を使用して測定した。ＨＡ発現を、モノクローナル抗−ＨＡ  ストークＩｇＧ  Ｃ１７９を使用して測定した。細胞を、細胞透過性または細胞不透過性方法のいずれかで染色した。統計値を、対照蛍光およびＨＡ発現について染色されたウェルの0蛍光との間の幾何学的手段のスチューデントｔ検定により計算した。β３χ４のみが感染された細胞膜においてＨＡの高レベルの発現を誘導したが、全３つのウイルスは細胞透過性染色により測定されるとき発現を誘導した。
【０１５３】
ΔｇＤ−２中への完全長ＰＲ８  ＨＡの挿入が細胞への侵入の新規の経路を導入するか否かを決定するために、Ｖｅｒｏ細胞を、０．０１ＭＯＩのΔｇＤ−２：：Ｐ−ＣＭＶ−ＦＬ  ＨＡ  ｎＯＰまたはΔｇＤ−２：：ＰＥＦ１α−ＲＦＰに感染させた。感染後１２０時間で、生産的な感染の兆候はなかった。さらに、５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスを、５×１０６ＰＦＵのΔｇＤ−２：：ＰＣＭＶ−ＦＬ  ＨＡ  ｎＯＰで皮下注射を与え、１週間毎日モニタリングした。それらは疾患または苦痛の兆候を示さなかった。さらに、非補完Ｖｅｒｏ細胞をΔｇＤ−２：：ＰＣＭＶ−ＦＬ  ＨＡ  ｎＯＰおよびΔｇＤ−２：：ＰＥＦ１α−ＲＦＰのいずれかの滴定（titrations）に感染させたインビトロアッセイを、実施した。感染後７０時間で、細胞を固定し、ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）について染色した。染色は、各ウイルスの１０−３希釈で単離された感染細胞の存在を示すが、細胞間のウイルス拡散の証拠は示さない（図１３を参照）。どちらもＭ２と名付けられたインフルエンザＡおよびＢプロトンポンプ遺伝子がエンドソームからのビリオンの中間放出を必要とすることを考えると、これは驚くべきことではない。β３χ４−６はプロトンポンプ遺伝子のいずれも含有しないため、それらは侵入後に細胞のエンドソームを出るメカニズムを欠いている。
【０１５４】
実施例２
ＨＳＶ−２  ΔｇＤウイルスにおいて発現するようにＨＩＶ構築物を設計すること：ＨＩＶからの糖タンパク質抗原がＡＤＣＣ誘導ＨＳＶ−２  ΔｇＤベクターから発現されるワクチンベクターを製造することを、研究した。このベクターを使用するための理論的根拠は、それがＨＳＶに対する非中和ＡＤＣＣ誘導ＩｇＧ抗体を誘発することであり、このタイプの免疫応答は、これまでのところ有効性を示す唯一のＨＩＶワクチン試験における保護と相関している（Haynes, Gilbert ら. 2012）。糖タンパク質抗原について、ＣＨＡＶＩ００１急性ＨＩＶ−１感染コホートにおけるドナーＣＨ５０５から、細胞質尾部を欠くＥｎｖ  ｇｐ１４５の伝達／創始者クローンを選択したが、これはこのよく特徴付けられたＨＩＶ−１クレードＣ糖タンパク質が、高いＨＩＶ有病率の地域において感染の障害を通過するものの典型であると考えられているためである（Liao, Lynch ら. 2013）。ＨＩＶ  Ｅｎｖは、自然感染の文脈において特によく発現されず、しばしば外因的にもよく発現しないため、我々の構築物において抗原発現を増強するように工程を研究した。Ｅｎｖ  ｇｐ１４５は、全長よりもウイルス様粒子（ＶＬＰ）中に効率的に組み込まれることが見出されており、Ｅｎｖシグナルペプチドおよび膜貫通ドメインを宿主タンパク質または他のウイルス糖タンパク質からの対応するドメインで置き換えることは、ＶＬＰ中へのさらなる取り込みを増加させた（Wang, Liu ら. 2007）。ＨＩＶ  ＥｎｖのＨＳＶ  ＶＬＰ中への効率的な取り込みを提供するために、ＨＩＶ  Ｅｎｖの細胞外ドメイン（ectodomain）とＨＳＶ−２  ｇＤのシグナルペプチドおよび膜貫通細胞質尾部のキメラを、構築した。ＨＳＶ２  ｇＤのシグナルペプチドは２５残基の長さであり、細胞外ドメインは合計３０６残基である（Eisenberg, Long ら. 1984, Nicola, Willis ら. 1996）。対立遺伝子交換構築物を、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリーにより生成した（Gibson, Young ら. 2009）。簡潔には、オリゴヌクレオチドプライマーを合成して、ＨＳＶ２  ＵＳ６の２５番目のコドンまで〜８００ｂｐ  ５’およびＨＳＶ２  ＵＳ６の３０６番目のコドンまで〜８００ｂｐ  ３’の相同配列のＨＳＶ２株ＧゲノムＤＮＡアームから増幅した。インサートを、ＣＨ５０５  ＴＦ  ｇｐ１４５発現プラスミドＨＶ１３００６３１（Huaxin Liao, Duke Universityのギフト）から、３０番目のコドンからコドン６８０を包含するプライマーで増幅した。フラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素認識部位間でｐＵＣ１９にクローニングした。
【０１５５】
実施例３
導入
（実施例１において作られる）ＲＦＰ発現ＨＳＶ−２  ΔｇＤ株を使用する機能的なインビトロマクロファージ抗体依存性細胞媒介殺傷（ＡＤＣＫ）アッセイ：糖タンパク質Ｄにおいて欠失された単一サイクル単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）株（ΔｇＤ−２）は、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）に結合および活性化する抗体を誘導することにより抗−ＨＳＶ免疫の殺菌を誘発する。マウスＦｃγＲＩＶを、ワクチン接種されたマウスからの血清の存在下で高度に活性化し、マクロファージ、単球、および好中球上で発現させた。ＦｃγＲを介する細胞傷害の正確なメカニズムは十分に理解されておらず、さらなるツールが必要である。ＦｃｙＲ結合抗体は、感染細胞上の抗原に結合し、次いで生来の白血球上のＦｃγＲに結合および活性化することにより、ＨＳＶ感染細胞の傷害を媒介する。これは、本明細書において抗体依存性細胞媒介細胞殺傷（ＡＤＣＫ）と呼ばれる抗体依存性細胞媒介細胞傷害および食作用（ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰ）を促進する。現在のアッセイは、柔軟性のない標的およびエフェクター細胞株、人工抗原提示系、ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰについての間接的または個別の出力、および厄介な放射性同位体の使用を含むがこれらに限定されない多くの制限に直面する。
【０１５６】
これらの制限を克服するために、抗−ＨＳＶ抗体に応答してＡＤＣＫを試験するために定量インビトロアッセイを構築した。赤色蛍光タンパク質（ｒｆｐ）についての遺伝子を高度に発現するΔｇＤ−２変異体を使用して、感染をマークした。次いで、ＲＦＰおよび細胞生存能力マーカーを使用して、生感染標的細胞を同定し、その割合の減少を細胞傷害の結果であると決定した。ＦＡＣＳ分析を使用して、マクロファージとの共培養後の生感染標的細胞の割合の減少を定量した。
【０１５７】
新しいアッセイを使用して、ΔｇＤ−２でワクチン接種されたマウスからの血清は、マウスおよびモルモットの両方からの不死化マクロファージ細胞株および骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）の両方により有意な量のＡＤＣＫを誘導することが、示された。Ｒａｗマクロファージを使用するアッセイのライブイメージングは、傷害読み出しが細胞傷害または食作用に容易に起因することができないが、プロセスは同時に発生する可能性があることを示し、両方を測定するアッセイを使用することの重要性を強調している。さらに、ＦｃγＲ−／−マウスからのＢＭＤＭを使用したときＡＤＣＫは除去され、これは、一次読み出しがＦｃγＲ依存であること、およびアッセイが異なるノックアウトマウス系統におけるＡＤＣＫの研究に適していることを示している。このアッセイは、異なる種および動物モデルにおけるＡＤＣＫおよびその関連遺伝子およびＦｃγＲの正確な研究を可能にする。
【０１５８】
従来、ＡＤＣＣは、厄介な５１Ｃｒ放出アッセイにより測定されていたが、異なる抗原および抗体に応答してＡＤＣＣを測定するように多くのＦＡＣＳ法が開発されている。これらの方法の総称は、迅速な蛍光分析ＡＤＣＣ（ＲＦＡＤＣＣ）である。これらのアッセイにおいて、標的細胞を、持続的な膜色素(die)およびアポトーシスの開始時に消散する生死マーカーで染色する。次いで、ＡＤＣＣ活性を、生死＋でもある膜色素＋細胞の割合の減少として測定する。同様のアッセイにおいて、ＡＤＣＰを、蛍光細胞の食作用によりマークされるマクロファージの割合により測定する。しかしながら、本明細書におけるデータが示すように、ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰはこれらの方法により明確に分離することができないため、このテキストにおいてこれらをまとめて抗体依存性細胞媒介傷害（ＡＤＣＫ）と呼ぶ。従来技術アッセイは、通常、抗体またはエフェクター細胞の選択において制限されているため、いくつかの追加の欠点を有する。同様のアッセイをPetro ら. 2015において使用したが、ＨＳＶが標的細胞およびエフェクター細胞の両方に感染し、複製し、および傷害する能力は、免疫細胞およびそれらのＦｃγＲを試験するためのアッセイの有用性を制限した（Petro ら, 2015）。
【０１５９】
ΔｇＤ−２は、非補完細胞における単一サイクルウイルスであり、最近、インビトロで樹状細胞死を誘導しないことが示された。明るく蛍光を発するΔｇＤ−２株がＡＤＣＫの細胞メカニズムの正確な研究を可能にするか否かを、調査した。ΔｇＤ−２（ΔｇＤ−２：：ＲＦＰ）株を発現するＲＦＰを、ＨＳＶ−２  ΔｇＤ−２：ＲＦＰ感染細胞に対するマクロファージのエフェクター活性をインビトロで正確に測定するＲＦＡＤＣＫアッセイで、構築および開発した。アッセイを、Ｊ７７４細胞、Ｒａｗ  ２６４．７マクロファージ、および骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を使用して、不死化細胞株と初代細胞株の両方について検証した。現在のＲＦＡＤＣＣアッセイとは異なり、この方法は、感染環境をシミュレートし、ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰの両方を測定し、非常に柔軟性であり、ポリクローナル動物血清および異なる細胞株およびマウス系統の使用を可能にする。
【０１６０】
細胞株：Ｖｅｒｏ（CCL-81; ATCC, Manassas, VA）およびＶＤ６０細胞（内因性遺伝子プロモーター下にｇＤ−１の複数のコピーを含有するＶｅｒｏ細胞）を、５％ウシ胎児血清（FBS, Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA）および１０Ｕ／ｍｌペニシリン、および１０μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン（Thermo Fisher Scientific）を添加したＤＭＥＭ（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）中で継代した。骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスから以前に記載されたように得た。骨髄前駆体は、すぐに使用しない場合は、５０％ＦＢＳおよび１０％ＤＭＳＯ（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を添加したＤＭＥＭ中に保存した。マウスＢＭＤＭを、Ｌ９２９細胞培養（ATCC）からの上清を使用して区別した。モルモットＢＭＤＭを、組換えヒトＭ−ＣＳＦ（BioLegend, San Diego, CA）を使用して区別した。Ｒａｗ  ２６４．７、Ｊ７７４．１、およびＨＥＫ  ２９３細胞（ATCC）を、１０％ＦＢＳおよび１％Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐを添加したＤＭＥＭ中で継代した。
【０１６１】
ΔｇＤ−２：：ＲＦＰの作成およびウイルス増殖。ＶＤ６０細胞を、ＨＳＶ−２  ΔｇＤ：ＧＦＰ（ΔｇＤ−２）ゲノムＤＮＡおよび、ＵＳ６遺伝子がＥＦ１αプロモーターの下流でｔｄｔｏｍａｔｏで置き換えられた４０ｋＢのＨＳＶ−２ゲノムを含有するコスミドＤＮＡでコトランスフェクトした。得られたウイルスを、相同組換えのマーカーとしてＲＦＰ発現を使用して３回プラーク精製した。精製されたΔｇＤ−２：：ＲＦＰウイルスを、ＰＣＲおよび配列決定により検証した。
【０１６２】
ΔｇＤ−２およびΔｇＤ−２：：ＲＦＰを、ｇＤ欠失を補い、複数ラウンドの複製を可能にする、ＶＤ６０細胞で増殖した。すべてのウイルス株を、それぞれの細胞タイプ上で連続希釈および増殖により力価測定した。
【０１６３】
動物：ジャクソン研究所（JAX, Bar Harbor, ME）から入手した４−６週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスを使用して、血清を得た。４−６週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６マウスをＪＡＸから入手し、１０％ＦＢＳおよび１％Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐを添加したＤＭＥＭで大腿骨を洗い流すことにより骨髄細胞懸濁液を単離した。５−６週齢の雌のハートレー(Hartley)モルモットを、チャールズリバー研究所（Wilmington, MA）から購入した。骨髄細胞懸濁液を、大腿骨および脛骨を１０％ＦＢＳおよび１％Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐを添加したＤＭＥＭで洗い流すことにより単離した。ワクチン接種を、皮下注射により投与した。すべての手順は、アルバートアインシュタイン医科大学（Albert Einstein College）の施設内動物管理および使用委員会により承認された。
【０１６４】
免疫化：６−８週齢のマウスまたはモルモットを、５×１０６プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＨＳＶ−２  ΔｇＤ：：ＲＦＰまたは２００μＬの総量へリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で等量のＶＤ６０細胞溶解物で皮下にプライムワクチン接種した。２１日後に、動物を同じ用量でブーストした。
【０１６５】
抗体依存性細胞傷害アッセイ：骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）、Ｊ７７４．１マクロファージ、およびＲａｗ  ２６４．７マクロファージを、ＬＰＳ（Sigma-Aldrich）で１２時間インキュベートした後、ＨＥＫ  ２９３細胞（ATCC）と共培養した。ＨＥＫ  ２９３細胞を、製造業者の指示にしたがって、ＰＫＨ６７メンブレン（Sigma-Aldrich）およびＴａｇ−ｉｔ  ＶｉｏｌｅｔＴＭ（Biolegend）色素で二重染色した。共培養４時間前に、ＨＥＫ細胞を無血清ＤＭＥＭ中で３のＭＯＩでＨＳＶ−２  ΔｇＤ：：ＲＦＰに感染させた。感染培地を３．５時間後に除去し、ＨＳＶ−２  ΔｇＤ：：ＲＦＰまたはＶＤ６０細胞溶解物のいずれかで前述のようにプライムブースト注射されたマウスから４０日目に収集された熱不活化マウスまたはモルモット血清の１：５希釈液と交換した。ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞を血清中で３７℃で３０分間インキュベートし、次いで９６ウェル組織培養プレート（Corning Inc, New York City, NY）においてマクロファージ培養物に加えた。共培養物を１２時間インキュベートし、次いで固定し、ＬＳＲＩＩ（BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ）上でフローサイトメトリーにより分析した。ライブイメージング実験について、Ｒａｗ  ２６４．７マクロファージおよびＨＥＫ  ２９３細胞を、ガラス底の９６ウェルプレート（Matrical Bioscience, Spokane WA）上で１０：１の比で共培養し、デコンボリューションを有するＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアを使用して倒立ＮＩＫＯＮ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴｉＥ  顕微鏡でイメージングした。
【０１６６】
統計分析：データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA）において編集した。図に示されるテストを使用する統計分析も、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して行った。統計的有意性は、図において、＊、ｐ＜０．５；＊＊＊、ｐ＜０．００１として示される。
【０１６７】
結果
ＨＳＶ−２  ΔｇＤのＵＳ６中へのｒｆｐの挿入は、ウイルスの増殖表現型を変化させない。Ｖｅｒｏ細胞を、ＨＳＶ−２  ΔｇＤ−２：：ＧＦＰで感染の多重度（ＭＯＩ）１で感染させ、ＧＦＰ発現の動態を決定した。蛍光顕微鏡を使用してＧＦＰ発現を視覚化し、これは感染後２４時間でさえ低かった（図１４Ｂ）。ΔｇＤ−２のＵＳ６遺伝子座におけるＧＦＰをＥＦ１αプロモーター下のＲＦＰで置き換えて、ΔｇＤ−２：：ＲＦＰを作った（図１４Ａ）。ＲＦＰ発現の動態を決定するために、非補完Ｖｅｒｏ細胞を、１ＭＯＩのＨＳＶ−２  ΔｇＤ−２：：ＲＦＰまたはΔｇＤ−２で感染させた。蛍光顕微鏡による視覚化は、ＲＦＰ発現が感染後４．５時間でΔｇＤ−２：：ＲＦＰで始まり、感染後２４時間まで増加し続けたことを示した（図１４Ｃ）。位相差イメージングは、ΔｇＤ−２：：ＲＦＰによるウイルス感染がＶｅｒｏ細胞における親ΔｇＤ−２株の感染と類似しているように見えることを示した（図１４Ｂおよび１４Ｃ）。３のＭＯＩでのΔｇＤ−２：：ＲＦＰによる感染は、感染後１２時間でＶＤ６０においてシンシチウム形成をもたらしたが（図１４Ｅ）、Ｖｅｒｏ細胞においてもたらさず（図１４Ｄ）、これはウイルスがその単一サイクル複製表現型を維持したことを示している。ΔｇＤ−２：：ＧＦＰのｇＤ遺伝子座中へのｐＥＦ１α：：ＲＦＰの導入は、親ΔｇＤ−２株のウイルス動態および単一サイクル表現型を維持しながら、強力なＲＦＰ発現を誘発した。
【０１６８】
ΔｇＤ−２：：ＲＦＰをワクチン接種したマウスからの血清は、ＲＦＡＤＣＫアッセイにおいて有意なＡＤＣＫを誘導する。ΔｇＤ−２：：ＲＦＰをワクチン接種したマウスからの血清により誘発されるＡＤＣＫ活性のレベルを測定するために、以前のＲＦＡＤＣＣアッセイに基づいてインビトロのプロトコルを開発した。標的ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を膜色素および生死マーカーで染色し、３のＭＯＩでΔｇＤ−２：：ＲＦＰで感染させた。感染標的細胞を３．５時間インキュベートした後、感染培地を除去し、培地またはマウス血清を加えてさらに３０分間インキュベートした。感染ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１２時間前にＬＰＳで刺激されたＪ７７４．１マウスマクロファージ細胞と１２時間共培養した。以前に報告されたアッセイに基づいて、１０：１のエフェクターと標的細胞の比を使用した。この比で、ΔｇＤ−２：：ＲＦＰをワクチン接種したマウスからの血清は、高度に感染した（ＲＦＰ高い）標的細胞の約７０．５％の傷害を誘導した（図１５Ｂ）。これは、血清の不在下で傷害された４９．３％よりも有意に多かった（ｐ＜０．０５）。モデルにおけるＲＦＰはウイルスタンパク質発現の代用であり、これらのタンパク質をより高いレベルで発現する細胞は抗体により結合し、ＦｃｙＲと架橋し、ＡＤＣＫを開始するため、ＲＦＰ高い細胞のみが有意に減少するか否かを調査した。２つの処置群間でＲＦＰ中間またはＲＦＰ中間+高い（総感染細胞）の傷害において、有意差は見られなかった（図１５Ｂ）。感染標的細胞を、エフェクター細胞を欠く培養物においてＲＦＰを発現する二重陽性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞として定義した。ＲＦＰ高い細胞は、感染標的細胞の平均強度を超えてＲＦＰを発現する細胞として定義された。ＲＦＰ中間細胞を、平均強度未満でＲＦＰを発現するすべての感染標的細胞として定義した（図１５Ａ）。
【０１６９】
ＡＤＣＫは、ΔｇＤ−２：：ＲＦＰでワクチン接種されたマウスからの血清の存在下で、対照細胞溶解物でワクチン接種されたマウスからの血清と比較して有意に増加される。感染ＨＥＫ２９３細胞を、ΔｇＤ−２：：ＲＦＰまたは対照ＶＤ６０細胞溶解物のいずれかでワクチン接種したマウスからの血清とインキュベートし、異なる不死化マクロファージ細胞株により媒介される傷害が抗原特異的ＡＤＣＫにより引き起こされたか否かを決定した。各処置群について、１６時間の共培養後のＲＦＰ高い細胞の割合を、血清を欠く並行アッセイの割合と比較した。Ｊ７７４．１マクロファージを含有する培養物において、ΔｇＤ−２：：ＲＦＰをワクチン接種したマウスからの血清は、ＶＤ６０を模擬ワクチン接種したマウスからの血清よりもＲＦＰ高い細胞の傷害を有意に多く誘導した（ｐ＜０．００１；図１５ｃ）。同様の傾向は、Ｒａｗ  ２６４．７マクロファージを含有する培養物において見られた（ｐ＝０．０９）。さらに、Ｊ７７４．１マクロファージおよびＲａｗ  ２６４．７マクロファージの両方について、ＶＤ６０を模擬ワクチン接種したマウスからの血清を含有する培養物において測定されたＡＤＣＫは、血清を欠いている培養物と区別することができなかった（平均％差異＝−５．９±７．６、−０．３±３．５）。これは、非特異的抗体が我々のアッセイにおいて傷害を誘導しないことを示す。これらの結果は、ＲＦＡＤＣＫアッセイにおいて測定されるＡＤＣＫが、ΔｇＤ−２：：ＲＦＰでのワクチン接種により誘発されたＨＳＶ特異的抗体の結果であることを確認する。
【０１７０】
ＡＤＣＫアッセイのライブイメージングによる感染細胞の追跡は、細胞傷害および食作用が相互に排他的ではないことを示す。ガラス底の９６ウェルプレートを使用し、エフェクター細胞が、同量のＡＤＣＣおよびＡＤＣＰを実行することが示されるＲａｗ  ２６４．７マウスマクロファージ細胞であったことを除いて、上記のようにＡＤＣＫアッセイを実施した。アッセイを、デコンボリューション顕微鏡で６０ｘの倍率で約１５分ごとに２４時間イメージングした。感染細胞はＲＦＰ＋である。非感染ＨＥＫ２９３細胞は高度にＭｅｍ＋および生／死＋である。マクロファージは元のままである。図１５Ａは、マクロファージによる感染細胞の異なるタイプの細胞傷害（白い矢印）が示された時点で観察されることを示す：マクロファージ（＊）は時間とともに左の感染細胞の周りに集まり、右の感染細胞は４．５時間で観察されるアポトーシスブレブ形成を受ける。これらの得られるブレブは、マクロファージにより迅速に貪食され、ＲＦＰでのこの蛍光を７．５時間で観察した。この感染細胞の制御されたアポトーシスは、ＡＤＣＣが発生したことを示すが、マクロファージによる食作用および後のマクロファージの蛍光は、ＡＤＣＰとしてフロー分析により測定されるであろう。捕捉された感染細胞の総数は少なく、高い変動性をもたらした（ｎ＝５８感染細胞／群）が、３つの実験からのムービーにわたる感染細胞の傷害の定量が、ＲＦＡＤＣＫアッセイにより以前に測定されたときと、Ｒａｗ  ２６４．７マクロファージ細胞の存在下での同様の平均ＡＤＣＫを示す（平均ＲＦＡＤＣＫ＝１８．８％、平均ムービー＝１８．５％傷害；図１５Ｃ、１６Ｂ）。
【０１７１】
骨髄由来マクロファージによるＡＤＣＫ活性は、ＦｃγＲに依存する。ＲＦＡＤＣＫアッセイを、野生型およびＦｃγＲ−／−マウスからの骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）で行い、観察されるＡＤＣＫがＦｃγＲ依存性であるか否かを決定した。ＡＤＣＫ活性を、ＶＤ６０溶解物を模擬ワクチン接種したマウスからの血清での並行培養と比較したＲＦＰ高い細胞の減少として定義した。エフェクターと標的細胞の比が１０：１で、野生型ＢＭＤＭは、ＨＳＶ−２  ΔｇＤ−２：：ＲＦＰをワクチン接種したマウスからの血清の存在下で、ＦｃγＲ−／−  ＢＭＤＭよりも有意に多くの感染標的細胞を傷害した（ｐ＜０．０５；図１７Ａ）。さらに、ＨＳＶ−２  ΔｇＤ−２：：ＲＦＰをワクチン接種したマウスからの血清の存在下でのＦｃγＲ−／−  ＢＭＤＭによるＲＦＰ高い細胞の傷害は、ＶＤ６０溶解物を模擬ワクチン接種したマウスからの血清の存在下での傷害と区別することができなかった（平均％差異＝３．６±４．０）、これは、我々のアッセイにおいて測定されたＡＤＣＫ活性が完全にＦｃγＲに依存していることを示す。
【０１７２】
モルモットの骨髄由来マクロファージを使用するＲＦＡＤＣＫは、マウスの結果を再現する。我々のアッセイにおいてＡＤＣＫを実行する別の種のエフェクター細胞の能力を決定するために、モルモットＢＭＤＭを、ΔｇＤ−２をワクチン接種した、ＶＤ６０溶解物を模擬ワクチン接種した、またはナイーブモルモットからの血清の存在下でΔｇＤ−２：：ＲＦＰ感染ＨＥＫ２９３細胞と共培養した。ナイーブ動物からの血清を含有する並行共培養におけるＲＦＰ高い細胞の傷害を、ベースラインとして使用した。ΔｇＤ−２をワクチン接種した動物からの血清の存在下で、モルモットＢＭＤＭは有意なＡＤＣＫを実施した（ｐ＜０．００１；図１７Ｂ）。
【０１７３】
抗−ＰＲ８  ＩｇＧアイソタイプＥＬＩＳＡ。マウスを、ΔｇＤ−２：：ＲＦＰ、完全長ＰＲ８血球凝集素を発現するΔｇＤ−２（ＦＬ  ｎＯＰ、β３χ４）、ヘッドレスＰＲ８血球凝集素を発現するΔｇＤ−２（ＨＬ  ｎＯＰ、β３χ５）、またはＨＳＶ−２（Ｇ）に対してコドン最適化されているヘッドレスＰＲ８血球凝集素を発現するΔｇＤ−２（ＨＬ  ＯＰＴ、β３χ６）を皮下注射したか、またはＶＤ６０細胞溶解物で模擬ワクチン接種した。５匹のマウス／群を、各処置を別々にプライムブーストワクチン接種した。（図２０を参照）。５匹のマウスをＦＬ  ｎＯＰでプライムし、ＨＬ  ｎＯＰでブーストした。それぞれの場合において、５×１０６ＰＦＵのウイルスを、各注射で与えた。３０日目（ブーストの９日後）に、マウスを採血し、血清を採取した。次いで、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を実行して、ＨＳＶ−２  ４６７４に感染した精製ＰＲ８ＨＡまたはＶｅｒｏ細胞に対する抗体をチェックした。ＦＬ  ｎＯＰでプライムブーストされるか、ＦＬ  ｎＯＰでプライムされ、ＨＬ  ｎＯＰでブーストされるマウスは、ＰＲ８  ＨＡに対するＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ抗体を発生した。他の群は、抗−ＰＲ８  ＩｇＧ抗体を形成しなかった。ＶＤ６０溶解物群を除くすべての群が、同様の高力価の抗−ＨＳＶ  ＩｇＧを発生した。抗−ＨＳＶ  ＩｇＧ  抗−ＨＳＶ  ＩｇＧを、すべてのワクチン株で誘発した。
【０１７４】
実施例４
ΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８でワクチン接種されたマウスは、ＰＲ８での抗原投与から完全に保護される。マウスを、５×１０６ＰＦＵのΔｇＤ−２：：ＲＦＰまたはΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８で３週間隔で皮下にプライムブーストワクチン接種またはＶＤ６０細胞溶解物で模擬ワクチン接種した。ブーストの１週間後にマウスを採血し、血清中和力価をＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／１９３４／８  ＩＡＶ（ＰＲ８）に対して測定した（図２１Ａを参照）。ΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８で免疫化されたマウスは、ＰＲ８に対して有意な中和抗体力価を発生した（平均＝３０４）。点線は、アッセイの検出限界を表す。ブーストの３週間後、マウスを６ｘＬＤ５０のＰＲ８株で鼻腔内に抗原投与した。マウスを、初期体重の７５％に達したときに犠牲にした。図２１Ｂおよび２１Ｃに示されるように、ΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８で免疫化されたマウスは、ＰＲ８抗原投与から完全に保護されたが、対照ワクチン接種を受けたマウスはすべて、９日目までに感染に屈した。
【０１７５】
組換えｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８は、高レベルのＰＲ８タンパク質を発現する。発現を評価するために、ΔｇＤ−２：：ＲＦＰ  ｇＤＮＡを、図２２Ａに説明されているように、ＰＣＭＶの下流およびポリアデニル化シグナルの上流にＩＡＶ  Ｈ１Ｎ１株Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／１９３４／８（ＰＲ８）からの赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子を含有するＨＡ発現カセットとともにＶＤ６０細胞中にコトランスフェクトした。細胞外および細胞内ＨＡ発現を、３ＭＯＩのΔｇＤ−２、ΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８、ＰＲ８  ＨＡ発現カセットの切断バージョンを含有するΔｇＤ−２（ΔｇＤ−２：：ＨＬ  ＨＡＰＲ８）で感染されたＶｅｒｏおよびＶＤ６０細胞においてフローサイトメトリーにより測定し、ＨＡ発現は図２２Ｂに示される。
【０１７６】
ｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８で免疫化されたマウスは、高力価の機能的およびアイソタイプスイッチ抗ＰＲ８抗体を発生する。マウスを、ＶＤ６０細胞溶解物、ΔｇＤ−２：：ＲＦＰベクター、またはΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８（群あたり５匹のマウス）のいずれかで２１日間隔でプライムブーストワクチン接種した。プライムワクチン接種の２８日後、分析のために血清を収集した。抗ＰＲ８抗体を、精製されたＨＡ  ＰＲ８タンパク質に対するＥＬＩＳＡにより測定した。ΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８で免疫化されたマウスは、主にＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ２ｂであったアイソタイプスイッチ抗−ＰＲ８  ＨＡ抗体を発生した（図２３Ａ−２３Ｅを参照）。ΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８で免疫化されたマウスからの血清は、ΔｇＤ−２で免疫化されたマウスからの血清と比較して有意な血球凝集阻害を誘導した（ｐ＜０．００１；平均ＨＡＩ 力価＝８０）（図２３Ｆを参照）。ΔｇＤ−２：：ＲＦＰで免疫化されたマウスは、血球凝集阻害抗体を発生しなかった。
【０１７７】
ｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８で免疫化されたマウスは、ＩＡＶ抗原投与に対する保護を発生する。マウスを、ＶＤ６０細胞溶解物、ΔｇＤ−２、またはΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８で２１日間隔でプライムブースト免疫化し、プライムブーストの２８日後に採血し、６ｘＬＤ５０のＩＡＶで１４日後に鼻腔内に抗原投与した。開始体重の７０％に達した後にマウスを犠牲にし、中和力価をそれぞれの系統に対するマイクロ中和アッセイを使用して測定した。図２４Ａ−２４Ｃに示されるように、ΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８で免疫化されたマウスは、ＰＲ８に対して有意な中和力価を発生した（平均力価ＰＲ８＝１：３０４；ｐＶＤ６０＜０．０１；ｐΔｇＤ−２＜０．０５；ｎ＝１０マウス／群）。ΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８で免疫化されたマウスはまた、ＰＲ８での抗原投与後の体重減少および死亡から完全に保護された（ｐ＜０．００１、ｎ＝５マウス／群）。図２４Ｄ−２４Ｆに示されるように、ΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８で免疫化されたマウスは、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／２００９  Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｃａｌ／２００９）ＩＡＶに対して有意な中和抗体を発生した（平均力価Ａ／Ｃａｌ＝２６；ｐＶＤ６０＜０．０１  ｐΔｇＤ−２＝０．１；ｎ＝１０マウス／群）。ΔｇＤ：：ＨＡＰＲ８で免疫化されたマウスは、Ａ／Ｃａｌ／２００９での抗原投与後の体重減少および死亡から部分的に保護された（Ｐ＜０．０５、Ｎ＝１５マウス／群）。図２４Ｇ−２４Ｉに示されるように、ΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８、ΔｇＤ−２：：ＲＦＰ、またはＶＤ６０細胞溶解物で免疫化されたマウスは、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３／７５  Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ｖｉｃ）およびＡ／Ａｉｃｈｉ／６８  Ｈ３Ｎ２（Ｘ−３１）に対する中和抗体力価を発生せず、抗原投与後の体重減少および死亡から保護されなかった（ｎ中和＝１０マウス／群；ｎＡ／Ｖｉｃ抗原投与＝１５マウス／群；ｎＸ−３１抗原投与＝５マウス／群）。
【０１７８】
ΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８で免疫化されたマウスは、ＨＳＶ−２に対する完全に防御的なＡＤＣＣ免疫を発生する。マウスを、ＶＤ６０細胞溶解物、ΔｇＤ−２、またはΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８のいずれかで２１日間隔でプライムブーストワクチン接種した（群あたり５匹のマウス）。図２５Ａおよび２５Ｂにおいて、ブーストの１週間後にマウスを採血し、血清をＥＬＩＳＡにより分析した。ΔｇＤ−２またはΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８を受けたマウスは、高いレベルのＨＳＶ特異的ＩｇＧを同様に生成した（図２５Ａ）。さらに、これらのＩｇＧは主にＩｇＧ２ｃであった。図２５Ｃにおいて、図２５Ａおよび２５Ｂと同じ血清を使用して、迅速な蛍光抗体依存性細胞媒介性傷害（ＲＦＡＤＣＫ）アッセイを実施した。ΔｇＤ−２またはΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８でワクチン接種されたマウスからの血清は、ＶＤ６０細胞溶解物を与えられたマウスからの血清と比較して、Ｊ７７４．１マクロファージおよびΔｇＤ−２感染細胞の存在下で有意なＡＤＣＫ活性を誘発した（Ｐ＜０．０１）。ΔｇＤ−２およびΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８でワクチン接種されたマウスからの血清により誘発されるＡＤＣＫ活性間に差異はなかった。ブーストの２１日後に、マウスを１０ｘＬＤ９０のＨＳＶ−２  ４６７４で皮膚乱切により抗原投与した。ＶＤ６０細胞溶解物を受けたマウスは、１０までにＨＳＶ−２に屈し、重大な上皮および神経疾患を発症した。ΔｇＤ−２およびΔｇＤ−２：：ＨＡＰＲ８を受けたマウスは、抗原投与後の罹患および死亡から完全に保護された（図２５Ｄから２５Ｆを参照）。
【０１７９】
ｍＦｃγＲＩＶ  ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ応答。ΔｇＤ−２：：ＨＡ、ΔｇＤ−２：：ＲＦＰ、および不活化Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４  Ｈ１Ｎ１ウイルス（ＰＲ８）でワクチン接種されたマウスから収集した血清試料を、連続希釈し、ｍＦｃγＲＩＶ  ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイに供した。ＰＲ８ウイルスに感染したメイディン−ダービー  イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を標的細胞として使用し、ｍＦｃγＲＩＶを発現するＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用した。標的細胞を、連続希釈された血清試料およびエフェクター細胞とインキュベートした。Ｂｉｏ−ＧｌｏＴＭ試薬を添加し、発光を測定した。ＨＳＶ−２  ΔｇＤ：：ＨＡでワクチン接種されたマウスは、ΔｇＤ−２：：ＲＦＰおよび不活化ＰＲ８ウイルスでワクチン接種されたマウスと比較して、試験された各希釈でｍＦｃγＲＩＶ受容体の有意に高い活性化を示した（図２６を参照）。
【０１８０】
実施例５
ＨＳＶ−２遺伝子を含有するｐＢｋｋ４１２プラスミドにおけるＨＩＶ−１  Ｅｎｖのクローニング。完全長ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ（クレードＣ）およびＲｅｖ遺伝子を、部分的なＮｅｆ遺伝子とともに、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ試薬プログラムから入手したプラスミドＺＭ１０９Ｆ．ＰＢ４（図２７）からＰＣＲ増幅した。
【０１８１】
ｂＧＨ  ポリＡシグナルおよびＴ７プロモーターも含有するＰＣＲフラグメント産物を、ＲＥ  ｓｂｆＩおよびｂｌｐＩを使用して、ＣＭＶプロモーターの制御下でｐＢｋｋ４１２プラスミドのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）にクローニングした（図２８を参照）。
【０１８２】
安定したコンピテント大腸菌細胞を形質転換し、寒天＋カルベニシリン上に播種した。ＰＣＲを使用してインサートの存在についてコロニーをスクリーニングし（図２９Ａ）、分析用のＤＮＡを調製するために使用した。ＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、正しいサイズを有するクローン（ＣＬ  １５−６およびＣＬ  ２６−１１）を一過性トランスフェクション用に選択して、ＨＩＶ−１タンパク質発現を評価した（図２９Ｂ）。
【０１８３】
トランスフェクト細胞においてＨＩＶタンパク質の発現を確認すると、細胞を直鎖組換えプラスミドおよびＨＳＶ  ΔｇＤ−２陰性ウイルス（例えば、ΔｇＤ−２：：ＲＦＰ、ΔｇＤ−２：：ＧＦＰ）とコトランスフェクトし、ＨＩＶタンパク質を発現し、ＧＦＰまたはＲＦＰマーカーを発現しない組換え体について選択する。新しい組換えウイルスによるＨＩＶタンパク質の発現を、ウェスタンブロットまたはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により評価する。マウスを筋肉内に（プライムおよびブースト）免疫化し、血清を収集して、ＨＩＶ特異的抗体の存在についてスクリーニングする。Ａｂの機能（例えば、中和および非中和機能）もまた測定する。マウスをＨＩＶに感染しやすくするヒト化マウスモデルも、ワクチンがマウスをＨＩＶ感染から保護するか否かを評価するために使用する。
【０１８４】
本明細書に記載されるプロセス、組換えウイルス、および方法のいくつかの実施形態が、以下に示される。
【０１８５】
実施形態１：異種抗原に対して向けられたワクチンベクターを製造するプロセスであって、以下を含む、プロセス：ａ）以下：（ｉ）完全にまたは部分的に欠失されたＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄをコードする遺伝子、および（ｉｉ）プロモーター−ＦＰ構築物を含む核酸、ここでＦＰは蛍光タンパク質をコードする核酸である、を含むＨＳＶ−２ゲノムを提供すること；ｂ）ａ）のＨＳＶ−２ゲノムと異種抗原をコードする直鎖ＤＮＡ断片との間で対立遺伝子組換えが生じる条件下で、宿主細胞を、（ｉ）該ＨＳＶ−２ゲノムおよび（ｉｉ）該ＤＮＡ断片とコトランスフェクトすること；ｃ）ｂ）から生じるプラークをスクリーニングして、蛍光タンパク質蛍光を誘発する励起光下で蛍光を示さないプラークを同定すること；ｄ）ｃ）において蛍光を示さないそれらのプラークから組換えＨＳＶ−２ウイルスまたはビリオンを回収して、該異種抗原に対して向けられたワクチンベクターを得ること。
【０１８６】
実施形態２：実施形態１のプロセスであって、ここで宿主細胞はＨＳＶ−１糖タンパク質Ｄ補完細胞である、プロセス。
【０１８７】
実施形態３：実施形態１または実施形態２のプロセスであって、ここでプロモーター−ＦＰ構築物のプロモーターが異種プロモーターである、プロセス。
【０１８８】
実施形態４：実施形態１−３のいずれか一つのプロセスであって、ここでコトランスフェクトすることがエレクトロポレーションにより達成される、プロセス。
【０１８９】
実施形態５：実施形態１−４ののいずれか一つのプロセスであって、ここで蛍光タンパク質が赤い蛍光タンパク質（ＲＦＰ）である、プロセス。
【０１９０】
実施形態６：実施形態１−５のいずれか一つのプロセスであって、ここで宿主細胞は、（ｉ）ａ）のＨＳＶ−２ゲノムおよび（ｉｉ）順番に、（ｉ）ＨＳＶ−２  ｇＤシグナル配列、該異種抗原、ＨＳＶ−２  ｇＤ膜貫通ドメイン、ＨＳＶ−２  ｇＤ細胞質ドメインをコードするが、ＨＳＶ−２  ｇＤ  細胞外ドメインをコードしない    直鎖ＤＮＡ断片  、または（ｉｉ）ＨＳＶ−２  ｇＤシグナル配列、該異種抗原、およびＨＳＶ−２  ｇＤの細胞質ドメインとコトランスフェクトされる、プロセス。
【０１９１】
実施形態７：実施形態１−５のいずれか一つのプロセスであって、ここで宿主細胞は、（ｉ）ａ）のＨＳＶ−２ゲノムおよび（ｉｉ）順番に、（ｉ）プロモーター、該異種抗原、および所望によりポリＡシグナルをコードする直鎖ＤＮＡ断片とコトランスフェクトされる、プロセス。
【０１９２】
実施形態８：実施形態１−７のいずれか一つのプロセスであって、ここで異種抗原はインフルエンザ抗原である、プロセス。
【０１９３】
実施形態９：実施形態１−８のいずれか一つのプロセスであって、ここで異種抗原はインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）抗原である、プロセス。
【０１９４】
実施形態１０：実施形態９のプロセスであって、ここでＨＡ抗原は完全長ＨＡ細胞外ドメインであるかまたはＨＡストークである、プロセス。
【０１９５】
実施形態１１：実施形態１−７のいずれか一つのプロセスであって、ここで異種抗原はＨＩＶ抗原である、プロセス。
【０１９６】
実施形態１２：実施形態１１のプロセスであって、ここでＨＩＶ抗原はＥｎｖ  ｇｐ１４５である、プロセス。
【０１９７】
実施形態１３：実施形態１−１２のいずれか一つのプロセスであって、ここで異種抗原は、上流ＣＭＶプロモーターの制御下にあり、下流ＳＶ４０ポリＡシグナルを有する、プロセス。
【０１９８】
実施形態１４：実施形態１−１３のいずれか一つのプロセスであって、ここでプロモーターは伸長因子１α遺伝子（ＰＥＦ１α）のプロモーターであり、ＰＥＦ１αおよびＦＰは、ともに融合している（ＰＥＦ１α−ＦＰ）、プロセス。
【０１９９】
実施形態１５：実施形態１−１４のいずれか一つのプロセスにより作られる異種抗原をコードするゲノムを含む、ワクチンベクターまたは組換え単純ヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）。
【０２００】
実施形態１６：以下：（ｉ）ゲノムにおけるＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄコード遺伝子の完全欠失；および（ｉｉ）（ａ）プロモーター、異種抗原シグナル配列、および異種抗原をコードする直鎖ＤＮＡ断片または（ｂ）プロモーターおよび異種抗原をコードすることを含む、組換え単純ヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）。
【０２０１】
実施形態１７：以下：（ｉ）ゲノムにおけるＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄコード遺伝子の部分的な欠失；および（ｉｉ）（ａ）順番に、ＨＳＶ−２  ｇＤシグナル配列、異種抗原、ＨＳＶ−２  ｇＤ膜貫通ドメイン、所望によりＨＳＶ−２  ｇＤ細胞質ドメインをコードするが、ＨＳＶ−２  ｇＤ  細胞外ドメインをコードしない直鎖ＤＮＡ断片、または（ｂ）順番に、ＨＳＶ−２  ｇＤシグナル配列、異種抗原、およびＨＳＶ−２  ｇＤの膜貫通細胞質尾部をコードする直鎖ＤＮＡ断片を含む、組換え単純ヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）。
【０２０２】
実施形態１８：さらに脂質二重層上に寄生虫表面糖タンパク質を含む実施形態１６または１７の組換えＨＳＶ−２であって、ここで寄生虫は哺乳動物の寄生虫である、組換えＨＳＶ−２。
【０２０３】
実施形態１９：実施形態１６−１８のいずれか一つの組換えＨＳＶ−２であって、ここでＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄコード遺伝子はＨＳＶ−２  ＵＳ６遺伝子である、組換えＨＳＶ−２。
【０２０４】
実施形態２０：実施形態１６−１９のいずれか一つの組換えＨＳＶ−２であって、ここで異種抗原はインフルエンザ抗原である、組換えＨＳＶ−２。
【０２０５】
実施形態２１：実施形態１６−２０のいずれか一つの組換えＨＳＶ−２であって、ここで異種抗原は血球凝集素（ＨＡ）抗原である、組換えＨＳＶ−２。
【０２０６】
実施形態２２：実施形態２１の組換えＨＳＶ−２であって、ここでＨＡ抗原は完全長ＨＡ細胞外ドメインであるかまたはＨＡストークである、組換えＨＳＶ−２。
【０２０７】
実施形態２３：実施形態１６−１９のいずれか一つの組換えＨＳＶ−２であって、ここで異種抗原はＨＩＶ抗原である、組換えＨＳＶ−２。
【０２０８】
実施形態２４：実施形態２３の組換えＨＳＶ−２であって、ここでＨＩＶ抗原はＥｎｖ  ｇｐ１４５である、組換えＨＳＶ−２。
【０２０９】
実施形態２５：実施形態１６−２４のいずれか一つの組換えウイルスを中に含む細胞であって、ここで細胞はヒトにおいて存在しない、細胞。
【０２１０】
実施形態２６：実施形態１６−２４のいずれか一つの組換えウイルスを含む、ワクチン組成物。
【０２１１】
実施形態２７：実施形態１６−２４のいずれか一つのウイルス、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【０２１２】
実施形態２８：対象において免疫応答を誘発および／または増強する方法であって、該方法は、対象において免疫応答を誘発および／または増強するのに効果的な量で、実施形態１６−２４のいずれか一つの組換えウイルスの量を対象に投与することを含む、方法。
【０２１３】
実施形態２９：対象において免疫応答を誘発および／または増強する方法であって、該方法は、対象において免疫応答を誘発および／または増強するのに効果的な量で、実施形態２６のワクチンの量を対象に投与することを含む、方法。
【０２１４】
実施形態３０：対象において免疫応答を誘発および／または増強する方法であって、該方法は、対象において免疫応答を誘発および／または増強するのに効果的な量で、実施形態２７の医薬組成物の量を対象に投与することを含む、方法。
【０２１５】
実施形態３１：対象においてインフルエンザ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させる方法であって、該方法は、対象においてインフルエンザ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させるのに効果的な量で、実施形態１６−２２のいずれか一つの組換えウイルスの量を対象に投与することを含む、方法。
【０２１６】
実施形態３２：対象においてインフルエンザ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させる方法であって、該方法は、対象においてインフルエンザ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させるのに効果的な量で、実施形態２６のワクチンの量を対象に投与することを含む、方法。
【０２１７】
実施形態３３：対象においてインフルエンザ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させる方法であって、該方法は、対象においてインフルエンザ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させるのに効果的な量で、実施形態２７の医薬組成物の量を対象に投与することを含む、方法。
【０２１８】
実施形態３４：対象におけるＨＩＶ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させる方法であって、該方法は、対象におけるＨＩＶ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させるのに効果的な量で、実施形態１６−１９、２３または２４のいずれか一つの組換えウイルスの量を対象に投与することを含む、方法。
【０２１９】
実施形態３５：対象におけるＨＩＶ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させる方法であって、該方法は、対象におけるＨＩＶ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させるのに効果的な量で、実施形態２６のワクチンの量を対象に投与することを含む、方法。
【０２２０】
実施形態３６：対象におけるＨＩＶ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させる方法であって、該方法は、対象におけるＨＩＶ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させるのに効果的な量で、実施形態２７の医薬組成物の量を対象に投与することを含む、方法。
【０２２１】
実施形態３７：対象をインフルエンザ感染についてワクチン接種する方法であって、該寳方法は、対象をインフルエンザ感染についてワクチン接種するのに効果的な量で、実施形態１６−２２のいずれか一つの組換えウイルスの量を対象に投与することを含む、方法。
【０２２２】
実施形態３８：対象をインフルエンザ感染についてワクチン接種する方法であって、該方法は、対象をインフルエンザ感染についてワクチン接種するのに効果的な量で、実施形態２６のワクチンの量を対象に投与することを含む、方法。
【０２２３】
実施形態３９：対象をインフルエンザ感染についてワクチン接種する方法であって、該方法は、対象をインフルエンザ感染についてワクチン接種するのに効果的な量で、実施形態２７の医薬組成物の量を対象に投与することを含む、方法。
【０２２４】
実施形態４０：対象をＨＩＶ感染についてワクチン接種する方法であって、該方法は、対象をＨＩＶ感染についてワクチン接種するのに効果的な量で、実施形態１６−１９、２３または２４のいずれか一つの組換えウイルスの量を対象に投与することを含む、方法。
【０２２５】
実施形態４１：対象をＨＩＶ感染についてワクチン接種する方法であって、該方法は、対象をＨＩＶ感染についてワクチン接種するのに効果的な量で、実施形態２６のワクチンの量を対象に投与することを含む、方法。
【０２２６】
実施形態４２：対象をＨＩＶ感染についてワクチン接種する方法であって、該方法は、対象をＨＩＶ感染についてワクチン接種するのに効果的な量で、実施形態２７の医薬組成物の量を対象に投与することを含む、方法。
【０２２７】
実施形態４３：対象において免疫応答を誘発および／または増強する方法であって、該方法は、対象において免疫応答を誘発および／または増強するのに効果的な量で、実施形態１−１４のいずれか一つのプロセスにより作られ、かつ（ｉ）ゲノムにおけるＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄコード遺伝子の完全欠失および（ｉｉ）プロモーター、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）抗原シグナル配列、およびＨＡ抗原をコードすることを含む組換え単純ヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）の量を対象に投与することを含む、方法。
【０２２８】
実施形態４４：対象においてインフルエンザ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させる方法であって、該方法は、対象においてインフルエンザ感染を処置するかまたは感染の可能性を減少させるのに効果的な量で、実施形態１−１３のいずれか一つのプロセスにより作られ、かつ（ｉ）ゲノムにおけるＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄコード遺伝子の完全欠失および（ｉｉ）プロモーター、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）抗原シグナル配列、およびＨＡ抗原をコードすることを含む組換え単純ヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）の量を対象に投与することを含む、方法。
【０２２９】
実施形態４５：対象をインフルエンザ感染についてワクチン接種する方法であって、該方法は、実施形態１−１４のいずれか一つのプロセスにより作られ、かつ（ｉ）ゲノムにおけるＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄコード遺伝子の完全欠失および（ｉｉ）プロモーター、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）抗原シグナル配列、およびＨＡ抗原をコードすることを含む組換え単純ヘルペスウイルス−２の量を対象に投与することを含む、方法。
【０２３０】
実施形態４６：実施形態４３−４５のいずれか一つの方法であって、ここでＨＡ抗原は完全長ＨＡ細胞外ドメインである、方法。
【０２３１】
実施形態４７：実施形態４６の方法であって、さらに、完全長ＨＡ細胞外ドメインをコードする組換え単純ヘルペスウイルス−２の初期投与に続き、（ｉ）ゲノムにおけるＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄコード遺伝子の完全欠失および（ｉｉ）プロモーター、ＨＡ抗原シグナル配列、およびＨＡストークをコードするが、完全長ＨＡをコードしないことを含む１以上の量の組換え単純ヘルペスウイルス−２を投与することを含む、方法。
【０２３２】
実施形態４８：実施形態２８−４７のいずれか一つの方法であって、ここで対象はヒトである、方法。
【０２３３】
実施形態４９：細胞の集団における抗体依存性細胞媒介傷害（ＡＤＣＫ）の率または量を定量する方法であって、該方法は、以下：細胞における蛍光タンパク質の発現を可能にする条件下で、該細胞の集団の複数の細胞をＨＳＶ−２ｇＤをコードする遺伝子について欠失されたゲノムを含む蛍光タンパク質発現性組換えＨＳＶ−２で感染させること、該複数の感染細胞を抗体含有溶液および免疫細胞の集団と接触させること、および生感染細胞の量を経時的に定量し、それにより細胞の集団におけるＡＤＣＫの率または量を定量するように、蛍光タンパク質蛍光および、所望により、１以上のマーカーを示す複数の感染細胞の量を１以上の時点で定量することを含む、方法。
【０２３４】
実施形態５０：実施形態４９の方法であって、ここで方法はインビトロで実行される、方法。
【０２３５】
実施形態５１：実施形態４９または５０の方法であって、ここで免疫細胞の集団はマクロファージを含む、方法。
【０２３６】
実施形態５２：実施形態４９−５１のいずれか一つの方法であって、ここで抗体含有溶液は血清を含む、方法。
【０２３７】
実施形態５３：実施形態４９−５１のいずれか一つの方法であって、ここで蛍光タンパク質は赤色蛍光タンパク質である、方法。
【０２３８】
実施形態５４：実施形態４９−５３のいずれか一つの方法であって、ここで蛍光タンパク質蛍光および、所望により、１以上のマーカーを示す複数の感染細胞の量は蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により測定される、方法。
【０２３９】
実施形態５５：実施形態４９−５５のいずれか一つの方法であって、ここで少なくとも一つのマーカーは細胞膜マーカー、生／死マーカー、またはその組み合わせを含む、方法。
【０２４０】
実施形態５６：実施形態４９−５５のいずれか一つにの方法であって、さらに、抗体含有溶液と接触されていないが同一である感染細胞の対照集団において、蛍光タンパク質蛍光、および所望により１以上のマーカーを示す細胞の量を１以上の時点で定量すること、および定量された量または率を抗体含有溶液と接触された細胞の集団について定量された量または率と比較することを含む、方法。
【０２４１】
実施形態５７：実施形態４９−５６のいずれか一つの方法であって、ここで免疫細胞の集団は５：１またはそれより大きいエフェクター：標的比で存在する、方法。
【０２４２】
実施形態５８：実施形態４９−５７のいずれか一つの方法であって、ここで組換えＨＳＶ−２は実施形態１−１４のいずれか一つのプロセスにより作られる、方法。
【０２４３】
この出願全体を通して、種々の刊行物が参照される。これらの参考文献についての完全な引用は、明細書の最後に見出されてもよい。これらの刊行物、ならびに本明細書で参照されるすべての特許、特許出願刊行物および本の開示は、本明細書に、対象発明が関係する技術をより完全に説明するために、参照によりその全体が対象出願に組み込まれる。
【０２４４】
当業者は、上記で議論された特定の方法および結果が、その後に続く特許請求の範囲においてより完全に説明されるように、本発明の単なる例示であることを容易に理解するであろう。
参照
【表１−１】
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【表１−２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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