(57)【要約】本開示は、改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質、およびがんを処置するための免疫療法におけるその使用を提供する。一部の実施形態では、融合タンパク質を発現し、がんおよび他の疾患を処置するための細胞免疫療法において用途を有する宿主免疫細胞が提供される。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、本開示によるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。本開示は、一般的に、改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質（例えば、キメラ抗原受容体、キメラ共刺激受容体）に関する。
2021514631.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）標的抗原に特異的に結合する結合ドメインを含む細胞外成分；
（ｂ）改変された機能的なＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞内成分であって、前記改変された機能的なＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、細胞内成分；および
（ｃ）前記細胞外成分と前記細胞内成分との間に配置された疎水性部分
を含む融合タンパク質であって、
前記融合タンパク質は、野生型ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質とは異なる１つまたは複数の機能的な活性を有する、融合タンパク質。
【請求項２】
前記ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン中の少なくとも１つのチロシン残基が、異なるアミノ酸残基で置換されている、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記少なくとも１つのチロシン残基が、１９１、２０６、２０９および２１８位のいずれか１つから選択される、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
１９１、２０６、２０９、および２１８位のいずれかから選択される少なくとも２つのチロシン残基がそれぞれ、異なるアミノ酸残基で置換されている、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
１９１、２０６、２０９、および２１８位のいずれかから選択される少なくとも３つのチロシン残基がそれぞれ、異なるアミノ酸残基で置換されている、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
１９１、２０６、２０９、および２１８位における４つのチロシン残基が、異なるアミノ酸残基で置換されている、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
各チロシン残基が、独立して、トリプトファン残基またはフェニルアラニン残基で置換されている、請求項２から６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
各チロシン残基が、フェニルアラニン残基で置換されている、請求項２から６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
各チロシン残基が、トリプトファン残基で置換されている、請求項２から６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインが、Ｙ２１８Ｆ置換を含む、請求項２から７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインが、Ｙ２０６Ｆ、Ｙ２０９Ｆ、およびＹ２１８Ｆ置換を含む、請求項２から７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインが、Ｙ１９１Ｆ、Ｙ２０６Ｆ、Ｙ２０９Ｆ、およびＹ２１８Ｆ置換を含む、請求項２から７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン中の少なくとも１つのプロリン残基が、異なるアミノ酸残基で置換されている、請求項１から１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのプロリン残基が、１９６、１９９、２０８、および２１１位のいずれか１つから選択される、請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
１９６、１９９、２０８、および２１１位のいずれかから選択される少なくとも２つのプロリン残基がそれぞれ、異なるアミノ酸残基で置換されている、請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
１９６、１９９、２０８、および２１１位のいずれかから選択される少なくとも３つのプロリン残基がそれぞれ、異なるアミノ酸残基で置換されている、請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
１９６、１９９、２０８、および２１１位における４つのプロリン残基が、異なるアミノ酸残基で置換されている、請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
各プロリン残基が、アラニン残基で置換されている、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
前記改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインが、Ｌ１８６およびＬ１８７置換をさらに含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
前記Ｌ１８６置換が、Ｌ１８６Ｇであり、前記Ｌ１８７置換が、Ｌ１８７Ｇである、請求項１９に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
前記改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインが、Ｙ１９１、Ｐ２０８、Ｐ２１１、またはそれらのあらゆる組合せにおける置換を含まない、請求項１から１１、１３から１５、および１８から２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
前記結合ドメインが、ｓｃＦｖ、ｓｃＴＣＲ、受容体の細胞外ドメイン、またはリガンドである、請求項１から２１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
前記結合ドメインが、ＣＤ８の細胞外結合ドメインまたは部分も、機能的なＩｇＶ様ドメインを含むそれらのいずれの部分も含まない、請求項１から２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
前記結合ドメインが、ＣＤ８α鎖由来の結合ドメインも、ＣＤ８β鎖由来の結合ドメインも、ＣＤ８αホモ二量体由来の結合ドメインも、ＣＤ８αβヘテロ二量体由来の結合ドメインも含まない、請求項２３に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
前記結合ドメインが、キメラ、ヒト、またはヒト化されたものである、請求項１から２４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
前記細胞外成分が、前記結合ドメインと前記疎水性部分との間に配置されたスペーサーをさらに含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
前記スペーサーが、免疫グロブリンのヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはそれらのあらゆる組合せを含む、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
前記免疫グロブリンのヒンジ領域が、ＩｇＧ４のヒンジ領域である、請求項２７に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
前記細胞外成分が、前記結合ドメインと前記疎水性部分との間に配置されたタグをさらに含む、請求項１から２８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
前記タグが、Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（配列番号４０）のアミノ酸配列を有する、請求項２９に記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
前記細胞内成分が、ＩＴＡＭ含有Ｔ細胞活性化ドメインをさらに含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
前記ＩＴＡＭ含有Ｔ細胞活性化ドメインが、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＦｃεＲＩのガンマ鎖、またはＦｃγＲＩのガンマ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項３１に記載の融合タンパク質。
【請求項３３】
前記細胞内成分が、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項３２に記載の融合タンパク質。
【請求項３４】
前記細胞内成分が、少なくとも１つの追加の共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項１から３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの追加の共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ４０Ｌ、ＧＩＴＲ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＡＲＤ１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ−４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ  ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、ＺＡＰ７０、ＣＤ５、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、またはそれらの組合せから選択される、請求項３４に記載の融合タンパク質
【請求項３６】
前記疎水性部分が、膜貫通ドメインである、請求項１から３５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３７】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３００、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、Ａ２ａＲ、ＤＡＰ１０、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、ＧＡＬ９、ＫＩＲ、Ｌｃｋ、ＬＡＴ、ＬＲＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＰＴＣＨ２、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、Ｓｌｐ７６、ＳＩＲＰα、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＩＭ３、ＴＲＩＭ、ＬＰＡ５、またはＺａｐ７０の膜貫通ドメインを含む、請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項３８】
前記標的抗原が、がん抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、または自己抗原である、請求項１から３７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３９】
前記標的抗原が、ＢＣＭＡ、ＣＤ３、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥｐｈＡ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＧＤ２、Ｏ−アセチルＧＤ２、Ｏ−アセチルＧＤ３、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＦＬＴ４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１５１、ＣＡ１２５、ＣＥＡ、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ６Ｒ、ｇｐ１３０、ルイスＡ、ルイスＹ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＨＶＥＭ、ＭＡＧＥ−Ａ、メソテリン、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫ、ＲＯＲ１、ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ４０、ＣＤ１３７、ＴＷＥＡＫ−Ｒ、ＨＬＡ、ＨＬＡに結合した腫瘍または病原体関連のペプチド、ＨＬＡに結合したｈＴＥＲＴペプチド、ＨＬＡに結合したチロシナーゼペプチド、ＨＬＡに結合したＷＴ−１ペプチド、ＬＴβＲ、ＬＩＦＲβ、ＬＲＰ５、ＭＵＣ１、ＯＳＭＲβ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１７１、ＣＤ２７６、Ｂ７Ｈ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＰＴＣＨ１、ＷＴ−１、ＨＡ１−Ｈ、Ｒｏｂｏ１、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＯＸ４０、ＰＲＡＭＥ、およびＳＳＸ−２から選択されるがん抗原である、請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項４０】
請求項１から３９のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４１】
核酸分子が、コドン最適化されている、請求項４０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４２】
配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、４８、５０、５２、５４、５６、または５８のいずれか１つに記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも約７５％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項４０または４１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４３】
形質導入マーカー、自殺遺伝子、またはその両方をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項４０から４２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４４】
前記形質導入マーカーが、トランケート型ＥＧＦＲ分子である、請求項４３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４５】
配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、４８、５０、５２、５４、５６、または５８のいずれか１つに対して少なくとも約７５％の同一性を有するポリヌクレオチドを含むかまたはそれからなる、請求項４０から４４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４６】
請求項４０から４５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４７】
ウイルスベクターである、請求項４６に記載のベクター。
【請求項４８】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスまたはレトロウイルスベクターである、請求項４７に記載のベクター。
【請求項４９】
請求項１から３９のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項４０から４５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、または請求項４６から４８のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５０】
免疫系細胞である、請求項４９に記載の宿主細胞。
【請求項５１】
前記免疫系細胞が、Ｔ細胞である、請求項５０に記載の宿主細胞。
【請求項５２】
前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項５１に記載の宿主細胞。
【請求項５３】
前記Ｔ細胞が、メモリーＴ細胞である、請求項５１または５２に記載の宿主細胞。
【請求項５４】
ヒト細胞である、請求項４９から５３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５５】
内因性遺伝子の発現が、前記宿主細胞中で阻害され、阻害される前記内因性遺伝子は、ＴＣＲ遺伝子、ＨＬＡ遺伝子、免疫抑制成分の遺伝子、またはそれらのあらゆる組合せから選択される、請求項４９から５４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５６】
前記ＴＣＲ遺伝子が、Ｔ細胞受容体α定常（ＴＲＡＣ）遺伝子、Ｔ細胞受容体β定常（ＴＲＢＣ）遺伝子、またはその両方である、請求項５５に記載の宿主細胞。
【請求項５７】
請求項４０から４５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、または請求項４６から４８のいずれか一項に記載のベクターが、エンドヌクレアーゼ系を介して、前記ＴＣＲ遺伝子またはＨＬＡ遺伝子の遺伝子座に標的化されている、請求項５５または５６に記載の宿主細胞。
【請求項５８】
前記エンドヌクレアーゼ系が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）系、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系である、請求項５７に記載の宿主細胞。
【請求項５９】
前記融合タンパク質の持続的なリン酸化の減少、前記融合タンパク質のシグナル伝達の減少、サイトカイン発現の減少、存続の強化、抗原特異的な細胞溶解活性の強化、またはそれらのあらゆる組合せを呈示する、請求項４９から５８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項６０】
野生型ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質を含む宿主細胞と比較して減少したレベルの標的抗原によって誘導されたＩＬ−２、ＴＮＦ−α、またはその両方を発現する、請求項４９から５９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項６１】
請求項４０から４５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項４６から４８のいずれか一項に記載のベクター、または請求項４９から６０のいずれか一項に記載の宿主細胞、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項６２】
被験体における疾患を処置する方法であって、請求項４９から６０のいずれか一項に記載の宿主細胞または請求項６１に記載の医薬組成物を前記被験体に投与することを含み、前記疾患は、融合タンパク質と結合した抗原の存在に関連する、方法。
【請求項６３】
前記疾患が、ウイルス感染、細菌感染、がん、炎症性疾患、または自己免疫疾患である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記被験体が、ヒトである、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記宿主細胞が、前記被験体にとって同種または自己である、請求項６２から６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記被験体が、前記処置の後、低いレベルまたは軽度のサイトカイン放出症候群、低いレベルまたは軽度の細胞関連脳症症候群、またはその両方を有するか、および／あるいは参照宿主細胞または組成物が投与された参照被験体と比較して、低減されたサイトカイン放出症候群、低減された細胞関連脳症症候群、またはその両方を有し、前記融合タンパク質は、野生型ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項６２から６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記疾患が、がんである、請求項６２から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記がんが、固形腫瘍、黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞癌、腎臓がん、血液がん、前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん、結腸がん、直腸がん、胃がん、食道がん、膀胱がん、頭頸部がん、甲状腺がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、肺がん、尿路上皮がん、膵臓がん、膠芽腫、肝細胞がん、骨髄腫、多発性骨髄腫、白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄異形成症候群、脳がん、ＣＮＳがん、または悪性神経膠腫である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
化学療法剤または免疫抑制成分の阻害剤を投与することをさらに含む、請求項６２から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
（ａ）請求項４６から４８のいずれか一項に記載のベクターまたは発現構築物、および前記ベクターまたは前記発現構築物を宿主細胞に形質導入するための必要に応じた試薬；
（ｂ）請求項４０から４５のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを宿主細胞に形質導入するための必要に応じた試薬；ならびに／あるいは
（ｃ）請求項４９から６０のいずれか一項に記載の宿主細胞
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表に関する陳述
本出願に関連する配列表は、紙コピーの代わりにテキストフォーマットで提供され、これにより参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、３６００５６＿４５８ＷＯ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。テキストファイルは、２７４ＫＢであり、これは、２０１９年２月２０日に作成され、ＥＦＳ−ウェブを介して電子的に提出された。
【０００２】
政府の権利の陳述
本発明は、国立衛生研究所によって付与されたＣＡ１１４５３６に基づく政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
がん抗原に対して標的化された遺伝子操作された受容体で改変されたＴ細胞を使用する養子免疫療法は、血液がんにおいて臨床上の成功を実証しており、他のがんおよび疾患の処置における将来性を示している。操作された受容体としては、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および強化された親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が挙げられる。例えば、Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｋｒａｎｚ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｃｉ．  ３７（３）：２２０  （２０１６）を参照されたい。操作された受容体ががん抗原と結合すると、改変されたＴ細胞は、標的腫瘍細胞の細胞溶解の誘発およびサイトカイン放出によって抗腫瘍応答を媒介して、免疫応答を刺激する。
【０００４】
抗原が駆動する刺激に加えて、ＣＡＲおよびＴＣＲはまた、Ｔ細胞において持続的（抗原非依存性または構成的な）または過剰なシグナル伝達を呈示することもある。操作された受容体の高い表面発現、自己凝集特性（例えば、ｓｃＦｖオリゴマー化）、ガンマレトロウイルスベクターにおける発現、およびある特定の共刺激シグナル伝達ドメインの存在は、持続的および／または過剰なシグナル伝達に寄与する可能性がある（Ｇｏｍｅｓ−Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２１：１７−２６  （２０１７）；Ｌｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ２１：５８１−５９０  （２０１５）；Ｆｒｉｇａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｓ．  ３：３５６−３６７  （２０１５））。持続的および／または過剰なシグナル伝達は、形質導入されたＴ細胞の構成的な活性化および増殖をもたらし、Ｔ細胞分化を促進し、Ｔ細胞の存続を制限し、Ｔ細胞の消耗を増加させ、Ｔ細胞のアポトーシスを増加させ、免疫チェックポイント分子受容体（例えば、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、およびＬＡＧ−３）の発現を増加させ、および／またはＴ細胞の抗腫瘍活性を減少させる可能性がある（Ｇｏｍｅｓ−Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａ；Ｆｒｉｇａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａ；Ｌｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａ；Ｅｙｑｕｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ５４３：１１３  （２０１７））。
【０００５】
さらに、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法はまた、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）およびＣＡＲ  Ｔ細胞関連脳症症候群（ＣＲＥＳ）を含む顕著な毒性にも関連する。サイトカイン放出症候群は、Ｔ細胞の活性化および増殖に伴う上昇したレベルのサイトカインによって生じる全身性炎症性応答を指す。ＣＲＳは、発熱や筋肉痛の症状を伴う軽度で自己限定性の場合もあれば、または血管漏出、低血圧、呼吸器および腎機能不全、血球減少症、凝固障害、多臓器不全、ならびに神経学的な毒性などの症状を伴うより重度の場合もある。神経学的な毒性は、発作、せん妄、失語、および幻覚などの様々な神経学的および精神医学的な症状として生じる可能性がある。ＣＲＥＳは、ＣＲＳと同時に、またはその後に起こる可能性があり、致死的な脳浮腫を引き起こす場合がある。
【０００６】
したがって、がんを処置するための養子細胞療法における新しい戦略が必要である。ここで開示された実施形態は、これらの必要性に取り組むものであり、他の関連の利点を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｇｏｍｅｓ−Ｓｉｌｖａら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１７）２１：１７〜２６
【非特許文献２】Ｌｏｎｇら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．（２０１５）２１：５８１〜５９０
【非特許文献３】Ｆｒｉｇａｕｌｔら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｓ．（２０１５）３：３５６〜３６７
【非特許文献４】Ｅｙｑｕｅｍら、Ｎａｔｕｒｅ（２０１７）５４３：１１３
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｇは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲのスペーサー領域にＳｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）ＩＩ（ＳＴＩＩ）タグを含むことにより、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）シグナル伝達を活性化するための正確な方法が提供されることを示す。図１Ａ：細胞外ヒンジ中に単一のＳＴＩＩ配列を取り込んだＳＴＩＩ  ＣＡＲ設計の概略図。ＣＡＲは、ＣＤ１９特異的ＦＭＣ６３  ｓｃＦｖ（配列番号８）またはＲＯＲ１特異的Ｒ１２  ｓｃＦｖ（配列番号９）のいずれかを含有していた。図１Ｂ：ＳＴＩＩ  ｍＡｂでコーティングされたＳＴＩＩ磁気ビーズに結合したＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の概略図。図１Ｃ：ＣＤ１９＋ＬＣＬ拡大増殖の後の選別精製したＣＤ１９特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の代表的なＦＡＣＳプロット。図１Ｄおよび１Ｅ：代表的なＦＡＣＳプロットは、細胞表面ＣＡＲのＳＴＩＩ染色（Ｄ）および拡大増殖後の選別精製したＣＤ１９特異的またはＲＯＲ１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の表現型決定（Ｅ）を示す。点線：ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、実線：４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、影を付けたヒストグラム：アイソタイプ対照。図１Ｆ：代表的なＦＡＣＳプロットは、ＣＡＲ  Ｔ細胞のＤＮＡ含量の染色を示す。ゲートは、細胞の頻度をＧ０／Ｇ１で定量化する。図１Ｇ：様々な量のＳＴＩＩ磁気ビーズ、Ｋ５６２細胞、またはＲＯＲ１が形質導入されたＫ５６２（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）細胞との４５分の共培養後における、ＣＡＲ  Ｔ細胞（４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ）から調製された溶解産物のウェスタンブロット分析。溶解産物をＰＬＣ−γ１  ｐＹ７８３、ＰＬＣ−γ１、ＳＬＰ−７６  ｐＳ３７６、ＳＬＰ−７６、ＣＤ２４７  ｐＹ１４２、およびＣＤ２４７に対してブロットした。図１Ｃ〜１Ｆのデータは、４つの独立した実験の代表的なものである。図１Ｇのブロットは、２つの独立した実験の代表的なものである。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｇは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲのスペーサー領域にＳｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）ＩＩ（ＳＴＩＩ）タグを含むことにより、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）シグナル伝達を活性化するための正確な方法が提供されることを示す。図１Ａ：細胞外ヒンジ中に単一のＳＴＩＩ配列を取り込んだＳＴＩＩ  ＣＡＲ設計の概略図。ＣＡＲは、ＣＤ１９特異的ＦＭＣ６３  ｓｃＦｖ（配列番号８）またはＲＯＲ１特異的Ｒ１２  ｓｃＦｖ（配列番号９）のいずれかを含有していた。図１Ｂ：ＳＴＩＩ  ｍＡｂでコーティングされたＳＴＩＩ磁気ビーズに結合したＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の概略図。図１Ｃ：ＣＤ１９＋ＬＣＬ拡大増殖の後の選別精製したＣＤ１９特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の代表的なＦＡＣＳプロット。図１Ｄおよび１Ｅ：代表的なＦＡＣＳプロットは、細胞表面ＣＡＲのＳＴＩＩ染色（Ｄ）および拡大増殖後の選別精製したＣＤ１９特異的またはＲＯＲ１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の表現型決定（Ｅ）を示す。点線：ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、実線：４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、影を付けたヒストグラム：アイソタイプ対照。図１Ｆ：代表的なＦＡＣＳプロットは、ＣＡＲ  Ｔ細胞のＤＮＡ含量の染色を示す。ゲートは、細胞の頻度をＧ０／Ｇ１で定量化する。図１Ｇ：様々な量のＳＴＩＩ磁気ビーズ、Ｋ５６２細胞、またはＲＯＲ１が形質導入されたＫ５６２（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）細胞との４５分の共培養後における、ＣＡＲ  Ｔ細胞（４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ）から調製された溶解産物のウェスタンブロット分析。溶解産物をＰＬＣ−γ１  ｐＹ７８３、ＰＬＣ−γ１、ＳＬＰ−７６  ｐＳ３７６、ＳＬＰ−７６、ＣＤ２４７  ｐＹ１４２、およびＣＤ２４７に対してブロットした。図１Ｃ〜１Ｆのデータは、４つの独立した実験の代表的なものである。図１Ｇのブロットは、２つの独立した実験の代表的なものである。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｇは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲのスペーサー領域にＳｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）ＩＩ（ＳＴＩＩ）タグを含むことにより、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）シグナル伝達を活性化するための正確な方法が提供されることを示す。図１Ａ：細胞外ヒンジ中に単一のＳＴＩＩ配列を取り込んだＳＴＩＩ  ＣＡＲ設計の概略図。ＣＡＲは、ＣＤ１９特異的ＦＭＣ６３  ｓｃＦｖ（配列番号８）またはＲＯＲ１特異的Ｒ１２  ｓｃＦｖ（配列番号９）のいずれかを含有していた。図１Ｂ：ＳＴＩＩ  ｍＡｂでコーティングされたＳＴＩＩ磁気ビーズに結合したＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の概略図。図１Ｃ：ＣＤ１９＋ＬＣＬ拡大増殖の後の選別精製したＣＤ１９特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の代表的なＦＡＣＳプロット。図１Ｄおよび１Ｅ：代表的なＦＡＣＳプロットは、細胞表面ＣＡＲのＳＴＩＩ染色（Ｄ）および拡大増殖後の選別精製したＣＤ１９特異的またはＲＯＲ１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の表現型決定（Ｅ）を示す。点線：ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、実線：４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、影を付けたヒストグラム：アイソタイプ対照。図１Ｆ：代表的なＦＡＣＳプロットは、ＣＡＲ  Ｔ細胞のＤＮＡ含量の染色を示す。ゲートは、細胞の頻度をＧ０／Ｇ１で定量化する。図１Ｇ：様々な量のＳＴＩＩ磁気ビーズ、Ｋ５６２細胞、またはＲＯＲ１が形質導入されたＫ５６２（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）細胞との４５分の共培養後における、ＣＡＲ  Ｔ細胞（４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ）から調製された溶解産物のウェスタンブロット分析。溶解産物をＰＬＣ−γ１  ｐＹ７８３、ＰＬＣ−γ１、ＳＬＰ−７６  ｐＳ３７６、ＳＬＰ−７６、ＣＤ２４７  ｐＹ１４２、およびＣＤ２４７に対してブロットした。図１Ｃ〜１Ｆのデータは、４つの独立した実験の代表的なものである。図１Ｇのブロットは、２つの独立した実験の代表的なものである。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｇは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲのスペーサー領域にＳｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）ＩＩ（ＳＴＩＩ）タグを含むことにより、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）シグナル伝達を活性化するための正確な方法が提供されることを示す。図１Ａ：細胞外ヒンジ中に単一のＳＴＩＩ配列を取り込んだＳＴＩＩ  ＣＡＲ設計の概略図。ＣＡＲは、ＣＤ１９特異的ＦＭＣ６３  ｓｃＦｖ（配列番号８）またはＲＯＲ１特異的Ｒ１２  ｓｃＦｖ（配列番号９）のいずれかを含有していた。図１Ｂ：ＳＴＩＩ  ｍＡｂでコーティングされたＳＴＩＩ磁気ビーズに結合したＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の概略図。図１Ｃ：ＣＤ１９＋ＬＣＬ拡大増殖の後の選別精製したＣＤ１９特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の代表的なＦＡＣＳプロット。図１Ｄおよび１Ｅ：代表的なＦＡＣＳプロットは、細胞表面ＣＡＲのＳＴＩＩ染色（Ｄ）および拡大増殖後の選別精製したＣＤ１９特異的またはＲＯＲ１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の表現型決定（Ｅ）を示す。点線：ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、実線：４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、影を付けたヒストグラム：アイソタイプ対照。図１Ｆ：代表的なＦＡＣＳプロットは、ＣＡＲ  Ｔ細胞のＤＮＡ含量の染色を示す。ゲートは、細胞の頻度をＧ０／Ｇ１で定量化する。図１Ｇ：様々な量のＳＴＩＩ磁気ビーズ、Ｋ５６２細胞、またはＲＯＲ１が形質導入されたＫ５６２（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）細胞との４５分の共培養後における、ＣＡＲ  Ｔ細胞（４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ）から調製された溶解産物のウェスタンブロット分析。溶解産物をＰＬＣ−γ１  ｐＹ７８３、ＰＬＣ−γ１、ＳＬＰ−７６  ｐＳ３７６、ＳＬＰ−７６、ＣＤ２４７  ｐＹ１４２、およびＣＤ２４７に対してブロットした。図１Ｃ〜１Ｆのデータは、４つの独立した実験の代表的なものである。図１Ｇのブロットは、２つの独立した実験の代表的なものである。
【図１Ｅ】図１Ａ〜１Ｇは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲのスペーサー領域にＳｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）ＩＩ（ＳＴＩＩ）タグを含むことにより、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）シグナル伝達を活性化するための正確な方法が提供されることを示す。図１Ａ：細胞外ヒンジ中に単一のＳＴＩＩ配列を取り込んだＳＴＩＩ  ＣＡＲ設計の概略図。ＣＡＲは、ＣＤ１９特異的ＦＭＣ６３  ｓｃＦｖ（配列番号８）またはＲＯＲ１特異的Ｒ１２  ｓｃＦｖ（配列番号９）のいずれかを含有していた。図１Ｂ：ＳＴＩＩ  ｍＡｂでコーティングされたＳＴＩＩ磁気ビーズに結合したＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の概略図。図１Ｃ：ＣＤ１９＋ＬＣＬ拡大増殖の後の選別精製したＣＤ１９特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の代表的なＦＡＣＳプロット。図１Ｄおよび１Ｅ：代表的なＦＡＣＳプロットは、細胞表面ＣＡＲのＳＴＩＩ染色（Ｄ）および拡大増殖後の選別精製したＣＤ１９特異的またはＲＯＲ１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の表現型決定（Ｅ）を示す。点線：ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、実線：４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、影を付けたヒストグラム：アイソタイプ対照。図１Ｆ：代表的なＦＡＣＳプロットは、ＣＡＲ  Ｔ細胞のＤＮＡ含量の染色を示す。ゲートは、細胞の頻度をＧ０／Ｇ１で定量化する。図１Ｇ：様々な量のＳＴＩＩ磁気ビーズ、Ｋ５６２細胞、またはＲＯＲ１が形質導入されたＫ５６２（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）細胞との４５分の共培養後における、ＣＡＲ  Ｔ細胞（４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ）から調製された溶解産物のウェスタンブロット分析。溶解産物をＰＬＣ−γ１  ｐＹ７８３、ＰＬＣ−γ１、ＳＬＰ−７６  ｐＳ３７６、ＳＬＰ−７６、ＣＤ２４７  ｐＹ１４２、およびＣＤ２４７に対してブロットした。図１Ｃ〜１Ｆのデータは、４つの独立した実験の代表的なものである。図１Ｇのブロットは、２つの独立した実験の代表的なものである。
【図１Ｆ】図１Ａ〜１Ｇは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲのスペーサー領域にＳｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）ＩＩ（ＳＴＩＩ）タグを含むことにより、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）シグナル伝達を活性化するための正確な方法が提供されることを示す。図１Ａ：細胞外ヒンジ中に単一のＳＴＩＩ配列を取り込んだＳＴＩＩ  ＣＡＲ設計の概略図。ＣＡＲは、ＣＤ１９特異的ＦＭＣ６３  ｓｃＦｖ（配列番号８）またはＲＯＲ１特異的Ｒ１２  ｓｃＦｖ（配列番号９）のいずれかを含有していた。図１Ｂ：ＳＴＩＩ  ｍＡｂでコーティングされたＳＴＩＩ磁気ビーズに結合したＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の概略図。図１Ｃ：ＣＤ１９＋ＬＣＬ拡大増殖の後の選別精製したＣＤ１９特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の代表的なＦＡＣＳプロット。図１Ｄおよび１Ｅ：代表的なＦＡＣＳプロットは、細胞表面ＣＡＲのＳＴＩＩ染色（Ｄ）および拡大増殖後の選別精製したＣＤ１９特異的またはＲＯＲ１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の表現型決定（Ｅ）を示す。点線：ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、実線：４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、影を付けたヒストグラム：アイソタイプ対照。図１Ｆ：代表的なＦＡＣＳプロットは、ＣＡＲ  Ｔ細胞のＤＮＡ含量の染色を示す。ゲートは、細胞の頻度をＧ０／Ｇ１で定量化する。図１Ｇ：様々な量のＳＴＩＩ磁気ビーズ、Ｋ５６２細胞、またはＲＯＲ１が形質導入されたＫ５６２（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）細胞との４５分の共培養後における、ＣＡＲ  Ｔ細胞（４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ）から調製された溶解産物のウェスタンブロット分析。溶解産物をＰＬＣ−γ１  ｐＹ７８３、ＰＬＣ−γ１、ＳＬＰ−７６  ｐＳ３７６、ＳＬＰ−７６、ＣＤ２４７  ｐＹ１４２、およびＣＤ２４７に対してブロットした。図１Ｃ〜１Ｆのデータは、４つの独立した実験の代表的なものである。図１Ｇのブロットは、２つの独立した実験の代表的なものである。
【図１Ｇ】図１Ａ〜１Ｇは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲのスペーサー領域にＳｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）ＩＩ（ＳＴＩＩ）タグを含むことにより、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）シグナル伝達を活性化するための正確な方法が提供されることを示す。図１Ａ：細胞外ヒンジ中に単一のＳＴＩＩ配列を取り込んだＳＴＩＩ  ＣＡＲ設計の概略図。ＣＡＲは、ＣＤ１９特異的ＦＭＣ６３  ｓｃＦｖ（配列番号８）またはＲＯＲ１特異的Ｒ１２  ｓｃＦｖ（配列番号９）のいずれかを含有していた。図１Ｂ：ＳＴＩＩ  ｍＡｂでコーティングされたＳＴＩＩ磁気ビーズに結合したＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の概略図。図１Ｃ：ＣＤ１９＋ＬＣＬ拡大増殖の後の選別精製したＣＤ１９特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の代表的なＦＡＣＳプロット。図１Ｄおよび１Ｅ：代表的なＦＡＣＳプロットは、細胞表面ＣＡＲのＳＴＩＩ染色（Ｄ）および拡大増殖後の選別精製したＣＤ１９特異的またはＲＯＲ１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の表現型決定（Ｅ）を示す。点線：ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、実線：４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、影を付けたヒストグラム：アイソタイプ対照。図１Ｆ：代表的なＦＡＣＳプロットは、ＣＡＲ  Ｔ細胞のＤＮＡ含量の染色を示す。ゲートは、細胞の頻度をＧ０／Ｇ１で定量化する。図１Ｇ：様々な量のＳＴＩＩ磁気ビーズ、Ｋ５６２細胞、またはＲＯＲ１が形質導入されたＫ５６２（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）細胞との４５分の共培養後における、ＣＡＲ  Ｔ細胞（４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ）から調製された溶解産物のウェスタンブロット分析。溶解産物をＰＬＣ−γ１  ｐＹ７８３、ＰＬＣ−γ１、ＳＬＰ−７６  ｐＳ３７６、ＳＬＰ−７６、ＣＤ２４７  ｐＹ１４２、およびＣＤ２４７に対してブロットした。図１Ｃ〜１Ｆのデータは、４つの独立した実験の代表的なものである。図１Ｇのブロットは、２つの独立した実験の代表的なものである。
【０００９】
【図２−１】図２Ａ〜２Ｇは、ＣＡＲリンタンパク質シグナル伝達の定量分析を描写し、これは、ＣＡＲが内因性Ｔ細胞シグナル伝達タンパク質を介してシグナル伝達することを示す。図２Ａおよび２Ｂ：ＣＡＲ  Ｔ細胞の刺激条件および実験設計。図２Ｃ：棒グラフは、図２Ａおよび２Ｂに記載される３つの質量分析（ＭＳ）実験で同定された固有なホスホセリン（「ｐＳ」）、ホスホスレオニン（「ｐＴ」）およびホスホチロシン（「ｐＹ」）部位の総数を示す。図２Ｄ：全てのＭＳ実験で検出されたＰＯ４部位間のオーバーラップを示すベン図。図２Ｅおよび２Ｆ：散布ドットプロットは、１０分（Ｅ）および４５分（Ｆ）のＣＡＲ刺激後における基準のＴＣＲシグナル伝達ＰＯ４事象のｌｏｇ２変化倍率の平均および範囲を示す。図２Ｇ：ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の１０および４５分の刺激からの溶解産物のウェスタンブロット分析。ブロットは、図２Ａおよび２Ｂに記載される３つの独立した実験の代表的なものである。
【図２−２】図２Ａ〜２Ｇは、ＣＡＲリンタンパク質シグナル伝達の定量分析を描写し、これは、ＣＡＲが内因性Ｔ細胞シグナル伝達タンパク質を介してシグナル伝達することを示す。図２Ａおよび２Ｂ：ＣＡＲ  Ｔ細胞の刺激条件および実験設計。図２Ｃ：棒グラフは、図２Ａおよび２Ｂに記載される３つの質量分析（ＭＳ）実験で同定された固有なホスホセリン（「ｐＳ」）、ホスホスレオニン（「ｐＴ」）およびホスホチロシン（「ｐＹ」）部位の総数を示す。図２Ｄ：全てのＭＳ実験で検出されたＰＯ４部位間のオーバーラップを示すベン図。図２Ｅおよび２Ｆ：散布ドットプロットは、１０分（Ｅ）および４５分（Ｆ）のＣＡＲ刺激後における基準のＴＣＲシグナル伝達ＰＯ４事象のｌｏｇ２変化倍率の平均および範囲を示す。図２Ｇ：ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の１０および４５分の刺激からの溶解産物のウェスタンブロット分析。ブロットは、図２Ａおよび２Ｂに記載される３つの独立した実験の代表的なものである。
【図２−３】図２Ａ〜２Ｇは、ＣＡＲリンタンパク質シグナル伝達の定量分析を描写し、これは、ＣＡＲが内因性Ｔ細胞シグナル伝達タンパク質を介してシグナル伝達することを示す。図２Ａおよび２Ｂ：ＣＡＲ  Ｔ細胞の刺激条件および実験設計。図２Ｃ：棒グラフは、図２Ａおよび２Ｂに記載される３つの質量分析（ＭＳ）実験で同定された固有なホスホセリン（「ｐＳ」）、ホスホスレオニン（「ｐＴ」）およびホスホチロシン（「ｐＹ」）部位の総数を示す。図２Ｄ：全てのＭＳ実験で検出されたＰＯ４部位間のオーバーラップを示すベン図。図２Ｅおよび２Ｆ：散布ドットプロットは、１０分（Ｅ）および４５分（Ｆ）のＣＡＲ刺激後における基準のＴＣＲシグナル伝達ＰＯ４事象のｌｏｇ２変化倍率の平均および範囲を示す。図２Ｇ：ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の１０および４５分の刺激からの溶解産物のウェスタンブロット分析。ブロットは、図２Ａおよび２Ｂに記載される３つの独立した実験の代表的なものである。
【図２−４】図２Ａ〜２Ｇは、ＣＡＲリンタンパク質シグナル伝達の定量分析を描写し、これは、ＣＡＲが内因性Ｔ細胞シグナル伝達タンパク質を介してシグナル伝達することを示す。図２Ａおよび２Ｂ：ＣＡＲ  Ｔ細胞の刺激条件および実験設計。図２Ｃ：棒グラフは、図２Ａおよび２Ｂに記載される３つの質量分析（ＭＳ）実験で同定された固有なホスホセリン（「ｐＳ」）、ホスホスレオニン（「ｐＴ」）およびホスホチロシン（「ｐＹ」）部位の総数を示す。図２Ｄ：全てのＭＳ実験で検出されたＰＯ４部位間のオーバーラップを示すベン図。図２Ｅおよび２Ｆ：散布ドットプロットは、１０分（Ｅ）および４５分（Ｆ）のＣＡＲ刺激後における基準のＴＣＲシグナル伝達ＰＯ４事象のｌｏｇ２変化倍率の平均および範囲を示す。図２Ｇ：ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の１０および４５分の刺激からの溶解産物のウェスタンブロット分析。ブロットは、図２Ａおよび２Ｂに記載される３つの独立した実験の代表的なものである。
【図２−５】図２Ａ〜２Ｇは、ＣＡＲリンタンパク質シグナル伝達の定量分析を描写し、これは、ＣＡＲが内因性Ｔ細胞シグナル伝達タンパク質を介してシグナル伝達することを示す。図２Ａおよび２Ｂ：ＣＡＲ  Ｔ細胞の刺激条件および実験設計。図２Ｃ：棒グラフは、図２Ａおよび２Ｂに記載される３つの質量分析（ＭＳ）実験で同定された固有なホスホセリン（「ｐＳ」）、ホスホスレオニン（「ｐＴ」）およびホスホチロシン（「ｐＹ」）部位の総数を示す。図２Ｄ：全てのＭＳ実験で検出されたＰＯ４部位間のオーバーラップを示すベン図。図２Ｅおよび２Ｆ：散布ドットプロットは、１０分（Ｅ）および４５分（Ｆ）のＣＡＲ刺激後における基準のＴＣＲシグナル伝達ＰＯ４事象のｌｏｇ２変化倍率の平均および範囲を示す。図２Ｇ：ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の１０および４５分の刺激からの溶解産物のウェスタンブロット分析。ブロットは、図２Ａおよび２Ｂに記載される３つの独立した実験の代表的なものである。
【００１０】
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｆは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζまたは４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激が、異なる動態および強度で類似のタンパク質リン酸化事象をモジュレートすることを示す。図３Ａ〜３Ｄ：ボルケーノプロットは、２つまたはそれより多くの実験におけるＭＳによって同定されたＰＯ４部位のｌｏｇ２変化倍率および偽発見率（ＦＤＲ）を示す。Ｌｉｍｍａを使用して、ｌｏｇ２変化倍率およびＦＤＲカットオフを満たすＣＡＲ刺激応答性ＰＯ４部位（ボルケーノプロットの左上（Ｃ、Ｄ）および右上（Ａ、Ｃ、Ｄ）部分における灰色のドット）を定義した。図３Ｅ：４５分の時点におけるＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激応答性ＰＯ４部位を比較する散布プロット。格子（点線で定義される；垂直の「０」の線上の灰色のドットを含む）の中央の上および中央の下の部分における灰色のドットは、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激によってより強くモジュレートされたＰＯ４部位を意味する。格子の右下および左上部分における薄灰色のドットは、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激によって逆方向にモジュレートされたＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激応答性ＰＯ４部位を意味する。図３Ｆ：散布ドットプロットは、ＣＡＲ刺激後の公知のＣＤ２８および４−１ＢＢシグナル伝達経路メンバーにおけるＰＯ４部位のｌｏｇ２変化倍率の平均および範囲を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｆは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζまたは４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激が、異なる動態および強度で類似のタンパク質リン酸化事象をモジュレートすることを示す。図３Ａ〜３Ｄ：ボルケーノプロットは、２つまたはそれより多くの実験におけるＭＳによって同定されたＰＯ４部位のｌｏｇ２変化倍率および偽発見率（ＦＤＲ）を示す。Ｌｉｍｍａを使用して、ｌｏｇ２変化倍率およびＦＤＲカットオフを満たすＣＡＲ刺激応答性ＰＯ４部位（ボルケーノプロットの左上（Ｃ、Ｄ）および右上（Ａ、Ｃ、Ｄ）部分における灰色のドット）を定義した。図３Ｅ：４５分の時点におけるＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激応答性ＰＯ４部位を比較する散布プロット。格子（点線で定義される；垂直の「０」の線上の灰色のドットを含む）の中央の上および中央の下の部分における灰色のドットは、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激によってより強くモジュレートされたＰＯ４部位を意味する。格子の右下および左上部分における薄灰色のドットは、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激によって逆方向にモジュレートされたＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激応答性ＰＯ４部位を意味する。図３Ｆ：散布ドットプロットは、ＣＡＲ刺激後の公知のＣＤ２８および４−１ＢＢシグナル伝達経路メンバーにおけるＰＯ４部位のｌｏｇ２変化倍率の平均および範囲を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｆは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζまたは４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激が、異なる動態および強度で類似のタンパク質リン酸化事象をモジュレートすることを示す。図３Ａ〜３Ｄ：ボルケーノプロットは、２つまたはそれより多くの実験におけるＭＳによって同定されたＰＯ４部位のｌｏｇ２変化倍率および偽発見率（ＦＤＲ）を示す。Ｌｉｍｍａを使用して、ｌｏｇ２変化倍率およびＦＤＲカットオフを満たすＣＡＲ刺激応答性ＰＯ４部位（ボルケーノプロットの左上（Ｃ、Ｄ）および右上（Ａ、Ｃ、Ｄ）部分における灰色のドット）を定義した。図３Ｅ：４５分の時点におけるＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激応答性ＰＯ４部位を比較する散布プロット。格子（点線で定義される；垂直の「０」の線上の灰色のドットを含む）の中央の上および中央の下の部分における灰色のドットは、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激によってより強くモジュレートされたＰＯ４部位を意味する。格子の右下および左上部分における薄灰色のドットは、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激によって逆方向にモジュレートされたＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激応答性ＰＯ４部位を意味する。図３Ｆ：散布ドットプロットは、ＣＡＲ刺激後の公知のＣＤ２８および４−１ＢＢシグナル伝達経路メンバーにおけるＰＯ４部位のｌｏｇ２変化倍率の平均および範囲を示す。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｆは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζまたは４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激が、異なる動態および強度で類似のタンパク質リン酸化事象をモジュレートすることを示す。図３Ａ〜３Ｄ：ボルケーノプロットは、２つまたはそれより多くの実験におけるＭＳによって同定されたＰＯ４部位のｌｏｇ２変化倍率および偽発見率（ＦＤＲ）を示す。Ｌｉｍｍａを使用して、ｌｏｇ２変化倍率およびＦＤＲカットオフを満たすＣＡＲ刺激応答性ＰＯ４部位（ボルケーノプロットの左上（Ｃ、Ｄ）および右上（Ａ、Ｃ、Ｄ）部分における灰色のドット）を定義した。図３Ｅ：４５分の時点におけるＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激応答性ＰＯ４部位を比較する散布プロット。格子（点線で定義される；垂直の「０」の線上の灰色のドットを含む）の中央の上および中央の下の部分における灰色のドットは、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激によってより強くモジュレートされたＰＯ４部位を意味する。格子の右下および左上部分における薄灰色のドットは、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激によって逆方向にモジュレートされたＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激応答性ＰＯ４部位を意味する。図３Ｆ：散布ドットプロットは、ＣＡＲ刺激後の公知のＣＤ２８および４−１ＢＢシグナル伝達経路メンバーにおけるＰＯ４部位のｌｏｇ２変化倍率の平均および範囲を示す。
【図３Ｅ】図３Ａ〜３Ｆは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζまたは４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激が、異なる動態および強度で類似のタンパク質リン酸化事象をモジュレートすることを示す。図３Ａ〜３Ｄ：ボルケーノプロットは、２つまたはそれより多くの実験におけるＭＳによって同定されたＰＯ４部位のｌｏｇ２変化倍率および偽発見率（ＦＤＲ）を示す。Ｌｉｍｍａを使用して、ｌｏｇ２変化倍率およびＦＤＲカットオフを満たすＣＡＲ刺激応答性ＰＯ４部位（ボルケーノプロットの左上（Ｃ、Ｄ）および右上（Ａ、Ｃ、Ｄ）部分における灰色のドット）を定義した。図３Ｅ：４５分の時点におけるＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激応答性ＰＯ４部位を比較する散布プロット。格子（点線で定義される；垂直の「０」の線上の灰色のドットを含む）の中央の上および中央の下の部分における灰色のドットは、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激によってより強くモジュレートされたＰＯ４部位を意味する。格子の右下および左上部分における薄灰色のドットは、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激によって逆方向にモジュレートされたＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激応答性ＰＯ４部位を意味する。図３Ｆ：散布ドットプロットは、ＣＡＲ刺激後の公知のＣＤ２８および４−１ＢＢシグナル伝達経路メンバーにおけるＰＯ４部位のｌｏｇ２変化倍率の平均および範囲を示す。
【図３Ｆ】図３Ａ〜３Ｆは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζまたは４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激が、異なる動態および強度で類似のタンパク質リン酸化事象をモジュレートすることを示す。図３Ａ〜３Ｄ：ボルケーノプロットは、２つまたはそれより多くの実験におけるＭＳによって同定されたＰＯ４部位のｌｏｇ２変化倍率および偽発見率（ＦＤＲ）を示す。Ｌｉｍｍａを使用して、ｌｏｇ２変化倍率およびＦＤＲカットオフを満たすＣＡＲ刺激応答性ＰＯ４部位（ボルケーノプロットの左上（Ｃ、Ｄ）および右上（Ａ、Ｃ、Ｄ）部分における灰色のドット）を定義した。図３Ｅ：４５分の時点におけるＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激応答性ＰＯ４部位を比較する散布プロット。格子（点線で定義される；垂直の「０」の線上の灰色のドットを含む）の中央の上および中央の下の部分における灰色のドットは、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激によってより強くモジュレートされたＰＯ４部位を意味する。格子の右下および左上部分における薄灰色のドットは、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激によって逆方向にモジュレートされたＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激応答性ＰＯ４部位を意味する。図３Ｆ：散布ドットプロットは、ＣＡＲ刺激後の公知のＣＤ２８および４−１ＢＢシグナル伝達経路メンバーにおけるＰＯ４部位のｌｏｇ２変化倍率の平均および範囲を示す。
【００１１】
【図４】図４は、ＣＤ２８／ＣＤ３ζまたは４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激が、類似のシグナル伝達経路および細胞区画にわたりタンパク質リン酸化を変更することを示す。全てのＭＳ実験の分析からの４５分のＣＡＲ  Ｔ細胞刺激後における差次的にリン酸化された、選択されたタンパク質のマップ。
【００１２】
【図５−１】図５Ａ〜５Ｃは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激が、タンパク質ＰＯ４において４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激より大きい規模の変化を生じることを示す。図５Ａ：ドットプロットは、ＣＡＲ刺激後に２０種の最もリン酸化された部位間の平均ｌｏｇ２変化倍率を示す。図５Ｂ：ドットプロットは、ＣＡＲ刺激後に公知のＫＥＧＧ  ＴＣＲシグナル伝達経路タンパク質で検出された各ＰＯ４部位の絶対ｌｏｇ２変化倍率を示す。絶対ｌｏｇ２変化倍率を使用して、ＣＡＲ活性化の後に一部の部位が脱リン酸化されたため、ＰＯ４変更の規模を定量化した。図５Ｃ：所与の時間にわたりＳＴＩＩ磁気ビーズで刺激されたＣＡＲ  Ｔ細胞のウェスタンブロット分析。ブロットは、３つの独立した実験の代表的なものである。図５Ａおよび５ＢのＰ値を、対応のない２つの試料のｔ検定を使用して計算した。
【図５−２】図５Ａ〜５Ｃは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激が、タンパク質ＰＯ４において４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激より大きい規模の変化を生じることを示す。図５Ａ：ドットプロットは、ＣＡＲ刺激後に２０種の最もリン酸化された部位間の平均ｌｏｇ２変化倍率を示す。図５Ｂ：ドットプロットは、ＣＡＲ刺激後に公知のＫＥＧＧ  ＴＣＲシグナル伝達経路タンパク質で検出された各ＰＯ４部位の絶対ｌｏｇ２変化倍率を示す。絶対ｌｏｇ２変化倍率を使用して、ＣＡＲ活性化の後に一部の部位が脱リン酸化されたため、ＰＯ４変更の規模を定量化した。図５Ｃ：所与の時間にわたりＳＴＩＩ磁気ビーズで刺激されたＣＡＲ  Ｔ細胞のウェスタンブロット分析。ブロットは、３つの独立した実験の代表的なものである。図５Ａおよび５ＢのＰ値を、対応のない２つの試料のｔ検定を使用して計算した。
【００１３】
【図６−１】図６Ａ〜６Ｋは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲシグナルが、ｉｎ  ｖｉｖｏの抗腫瘍活性が低減したエフェクター細胞様の表現型を促進することを示す。図６Ａ〜６Ｂ：棒グラフは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζまたは４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を制御するように刺激されたものと比較した、遺伝子発現における平均ｌｏｇ２変化倍率値を示す。図６Ｃ：ボルケーノプロットは、刺激されたＣＤ２８／ＣＤ３ζを４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較した、遺伝子発現のｌｏｇ２変化倍率および偽発見率（ＦＤＲ）を示す。Ｌｉｍｍａを使用して、ｌｏｇ２変化倍率およびＦＤＲカットオフを満たす差次的に発現された遺伝子（点線で定義されるグラフの左上および右上部分における灰色のドット）を定義した。図６Ｄ：棒グラフは、ｑＰＣＲによって測定した場合の、ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を比較したＩＬ７Ｒ、ＫＬＦ２、およびＦＯＸＯ４発現のｌｏｇ２変化倍率を示す。グラフは、単回のｑＰＣＲ試行で一緒に定量化したｎ＝３の生物学的反復からの平均および標準偏差を描写する。図６Ｅ：代表的なＦＡＣＳプロットは、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞とＫ５６２またはＫ５６２／ＲＯＲ１細胞との５時間の共培養後におけるサイトカイン生産の細胞内染色を示す。図６Ｆ：棒グラフは、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞とＫ５６２／ＲＯＲ１細胞との共培養の２４時間後におけるサイトカイン生産の変化倍率の平均および標準偏差を示す。ｎ＝３〜４つの独立した実験。＊は、ウェルチのｔ検定により、ｐ＜０．０５を意味する。図６Ｇ：ＦＡＣＳプロットは、ＳＴＩＩビーズでの刺激の７２時間後にＣＦＳＥ色素希釈によって測定した場合のＣＡＲ  Ｔ細胞増殖を示す。ヒストグラムの線は、図の記号表で示される通りである。図６Ｈ：Ｒａｊｉ／ｆｆｌｕｃ生着の７日後における、ＣＡＲ  Ｔ細胞の単回の輸注で処置されたＮＳＧマウスの生存分析（３．０×１０６個の細胞、左、または７．５×１０５個のＴ細胞、右）。１群当たり６、９、または１５匹のマウスの生存分析は、２または３つの独立した実験からプールされる。図６Ｉ：代表的な生物発光画像は、示された時点におけるマウスの全ラジアンス（ｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒ）を示す。図６Ｊ〜６Ｋ：棒グラフは、フローサイトメトリーによって測定した場合の、２０日目における、骨髄または末梢血液におけるＣＡＲ  Ｔ細胞頻度（Ｊ）、または骨髄のＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＰＤ−１、Ｌａｇ−３、またはＴｉｍ−３発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）（Ｋ）を示す。１群当たりｎ＝５匹のマウス。対応のない両側スチューデントｔ検定を使用して、群の平均を比較した。図６Ｇのデータは、４つの独立した実験の代表的なものである。図６Ｈ−６Ｋのデータは、２つの独立した実験の代表的なものである。
【図６−２】図６Ａ〜６Ｋは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲシグナルが、ｉｎ  ｖｉｖｏの抗腫瘍活性が低減したエフェクター細胞様の表現型を促進することを示す。図６Ａ〜６Ｂ：棒グラフは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζまたは４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を制御するように刺激されたものと比較した、遺伝子発現における平均ｌｏｇ２変化倍率値を示す。図６Ｃ：ボルケーノプロットは、刺激されたＣＤ２８／ＣＤ３ζを４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較した、遺伝子発現のｌｏｇ２変化倍率および偽発見率（ＦＤＲ）を示す。Ｌｉｍｍａを使用して、ｌｏｇ２変化倍率およびＦＤＲカットオフを満たす差次的に発現された遺伝子（点線で定義されるグラフの左上および右上部分における灰色のドット）を定義した。図６Ｄ：棒グラフは、ｑＰＣＲによって測定した場合の、ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を比較したＩＬ７Ｒ、ＫＬＦ２、およびＦＯＸＯ４発現のｌｏｇ２変化倍率を示す。グラフは、単回のｑＰＣＲ試行で一緒に定量化したｎ＝３の生物学的反復からの平均および標準偏差を描写する。図６Ｅ：代表的なＦＡＣＳプロットは、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞とＫ５６２またはＫ５６２／ＲＯＲ１細胞との５時間の共培養後におけるサイトカイン生産の細胞内染色を示す。図６Ｆ：棒グラフは、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞とＫ５６２／ＲＯＲ１細胞との共培養の２４時間後におけるサイトカイン生産の変化倍率の平均および標準偏差を示す。ｎ＝３〜４つの独立した実験。＊は、ウェルチのｔ検定により、ｐ＜０．０５を意味する。図６Ｇ：ＦＡＣＳプロットは、ＳＴＩＩビーズでの刺激の７２時間後にＣＦＳＥ色素希釈によって測定した場合のＣＡＲ  Ｔ細胞増殖を示す。ヒストグラムの線は、図の記号表で示される通りである。図６Ｈ：Ｒａｊｉ／ｆｆｌｕｃ生着の７日後における、ＣＡＲ  Ｔ細胞の単回の輸注で処置されたＮＳＧマウスの生存分析（３．０×１０６個の細胞、左、または７．５×１０５個のＴ細胞、右）。１群当たり６、９、または１５匹のマウスの生存分析は、２または３つの独立した実験からプールされる。図６Ｉ：代表的な生物発光画像は、示された時点におけるマウスの全ラジアンス（ｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒ）を示す。図６Ｊ〜６Ｋ：棒グラフは、フローサイトメトリーによって測定した場合の、２０日目における、骨髄または末梢血液におけるＣＡＲ  Ｔ細胞頻度（Ｊ）、または骨髄のＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＰＤ−１、Ｌａｇ−３、またはＴｉｍ−３発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）（Ｋ）を示す。１群当たりｎ＝５匹のマウス。対応のない両側スチューデントｔ検定を使用して、群の平均を比較した。図６Ｇのデータは、４つの独立した実験の代表的なものである。図６Ｈ−６Ｋのデータは、２つの独立した実験の代表的なものである。
【図６−３】図６Ａ〜６Ｋは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲシグナルが、ｉｎ  ｖｉｖｏの抗腫瘍活性が低減したエフェクター細胞様の表現型を促進することを示す。図６Ａ〜６Ｂ：棒グラフは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζまたは４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を制御するように刺激されたものと比較した、遺伝子発現における平均ｌｏｇ２変化倍率値を示す。図６Ｃ：ボルケーノプロットは、刺激されたＣＤ２８／ＣＤ３ζを４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較した、遺伝子発現のｌｏｇ２変化倍率および偽発見率（ＦＤＲ）を示す。Ｌｉｍｍａを使用して、ｌｏｇ２変化倍率およびＦＤＲカットオフを満たす差次的に発現された遺伝子（点線で定義されるグラフの左上および右上部分における灰色のドット）を定義した。図６Ｄ：棒グラフは、ｑＰＣＲによって測定した場合の、ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を比較したＩＬ７Ｒ、ＫＬＦ２、およびＦＯＸＯ４発現のｌｏｇ２変化倍率を示す。グラフは、単回のｑＰＣＲ試行で一緒に定量化したｎ＝３の生物学的反復からの平均および標準偏差を描写する。図６Ｅ：代表的なＦＡＣＳプロットは、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞とＫ５６２またはＫ５６２／ＲＯＲ１細胞との５時間の共培養後におけるサイトカイン生産の細胞内染色を示す。図６Ｆ：棒グラフは、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞とＫ５６２／ＲＯＲ１細胞との共培養の２４時間後におけるサイトカイン生産の変化倍率の平均および標準偏差を示す。ｎ＝３〜４つの独立した実験。＊は、ウェルチのｔ検定により、ｐ＜０．０５を意味する。図６Ｇ：ＦＡＣＳプロットは、ＳＴＩＩビーズでの刺激の７２時間後にＣＦＳＥ色素希釈によって測定した場合のＣＡＲ  Ｔ細胞増殖を示す。ヒストグラムの線は、図の記号表で示される通りである。図６Ｈ：Ｒａｊｉ／ｆｆｌｕｃ生着の７日後における、ＣＡＲ  Ｔ細胞の単回の輸注で処置されたＮＳＧマウスの生存分析（３．０×１０６個の細胞、左、または７．５×１０５個のＴ細胞、右）。１群当たり６、９、または１５匹のマウスの生存分析は、２または３つの独立した実験からプールされる。図６Ｉ：代表的な生物発光画像は、示された時点におけるマウスの全ラジアンス（ｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒ）を示す。図６Ｊ〜６Ｋ：棒グラフは、フローサイトメトリーによって測定した場合の、２０日目における、骨髄または末梢血液におけるＣＡＲ  Ｔ細胞頻度（Ｊ）、または骨髄のＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＰＤ−１、Ｌａｇ−３、またはＴｉｍ−３発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）（Ｋ）を示す。１群当たりｎ＝５匹のマウス。対応のない両側スチューデントｔ検定を使用して、群の平均を比較した。図６Ｇのデータは、４つの独立した実験の代表的なものである。図６Ｈ−６Ｋのデータは、２つの独立した実験の代表的なものである。
【図６−４】図６Ａ〜６Ｋは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲシグナルが、ｉｎ  ｖｉｖｏの抗腫瘍活性が低減したエフェクター細胞様の表現型を促進することを示す。図６Ａ〜６Ｂ：棒グラフは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζまたは４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を制御するように刺激されたものと比較した、遺伝子発現における平均ｌｏｇ２変化倍率値を示す。図６Ｃ：ボルケーノプロットは、刺激されたＣＤ２８／ＣＤ３ζを４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較した、遺伝子発現のｌｏｇ２変化倍率および偽発見率（ＦＤＲ）を示す。Ｌｉｍｍａを使用して、ｌｏｇ２変化倍率およびＦＤＲカットオフを満たす差次的に発現された遺伝子（点線で定義されるグラフの左上および右上部分における灰色のドット）を定義した。図６Ｄ：棒グラフは、ｑＰＣＲによって測定した場合の、ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を比較したＩＬ７Ｒ、ＫＬＦ２、およびＦＯＸＯ４発現のｌｏｇ２変化倍率を示す。グラフは、単回のｑＰＣＲ試行で一緒に定量化したｎ＝３の生物学的反復からの平均および標準偏差を描写する。図６Ｅ：代表的なＦＡＣＳプロットは、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞とＫ５６２またはＫ５６２／ＲＯＲ１細胞との５時間の共培養後におけるサイトカイン生産の細胞内染色を示す。図６Ｆ：棒グラフは、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞とＫ５６２／ＲＯＲ１細胞との共培養の２４時間後におけるサイトカイン生産の変化倍率の平均および標準偏差を示す。ｎ＝３〜４つの独立した実験。＊は、ウェルチのｔ検定により、ｐ＜０．０５を意味する。図６Ｇ：ＦＡＣＳプロットは、ＳＴＩＩビーズでの刺激の７２時間後にＣＦＳＥ色素希釈によって測定した場合のＣＡＲ  Ｔ細胞増殖を示す。ヒストグラムの線は、図の記号表で示される通りである。図６Ｈ：Ｒａｊｉ／ｆｆｌｕｃ生着の７日後における、ＣＡＲ  Ｔ細胞の単回の輸注で処置されたＮＳＧマウスの生存分析（３．０×１０６個の細胞、左、または７．５×１０５個のＴ細胞、右）。１群当たり６、９、または１５匹のマウスの生存分析は、２または３つの独立した実験からプールされる。図６Ｉ：代表的な生物発光画像は、示された時点におけるマウスの全ラジアンス（ｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒ）を示す。図６Ｊ〜６Ｋ：棒グラフは、フローサイトメトリーによって測定した場合の、２０日目における、骨髄または末梢血液におけるＣＡＲ  Ｔ細胞頻度（Ｊ）、または骨髄のＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＰＤ−１、Ｌａｇ−３、またはＴｉｍ−３発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）（Ｋ）を示す。１群当たりｎ＝５匹のマウス。対応のない両側スチューデントｔ検定を使用して、群の平均を比較した。図６Ｇのデータは、４つの独立した実験の代表的なものである。図６Ｈ−６Ｋのデータは、２つの独立した実験の代表的なものである。
【図６−５】図６Ａ〜６Ｋは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲシグナルが、ｉｎ  ｖｉｖｏの抗腫瘍活性が低減したエフェクター細胞様の表現型を促進することを示す。図６Ａ〜６Ｂ：棒グラフは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζまたは４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を制御するように刺激されたものと比較した、遺伝子発現における平均ｌｏｇ２変化倍率値を示す。図６Ｃ：ボルケーノプロットは、刺激されたＣＤ２８／ＣＤ３ζを４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較した、遺伝子発現のｌｏｇ２変化倍率および偽発見率（ＦＤＲ）を示す。Ｌｉｍｍａを使用して、ｌｏｇ２変化倍率およびＦＤＲカットオフを満たす差次的に発現された遺伝子（点線で定義されるグラフの左上および右上部分における灰色のドット）を定義した。図６Ｄ：棒グラフは、ｑＰＣＲによって測定した場合の、ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を比較したＩＬ７Ｒ、ＫＬＦ２、およびＦＯＸＯ４発現のｌｏｇ２変化倍率を示す。グラフは、単回のｑＰＣＲ試行で一緒に定量化したｎ＝３の生物学的反復からの平均および標準偏差を描写する。図６Ｅ：代表的なＦＡＣＳプロットは、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞とＫ５６２またはＫ５６２／ＲＯＲ１細胞との５時間の共培養後におけるサイトカイン生産の細胞内染色を示す。図６Ｆ：棒グラフは、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞とＫ５６２／ＲＯＲ１細胞との共培養の２４時間後におけるサイトカイン生産の変化倍率の平均および標準偏差を示す。ｎ＝３〜４つの独立した実験。＊は、ウェルチのｔ検定により、ｐ＜０．０５を意味する。図６Ｇ：ＦＡＣＳプロットは、ＳＴＩＩビーズでの刺激の７２時間後にＣＦＳＥ色素希釈によって測定した場合のＣＡＲ  Ｔ細胞増殖を示す。ヒストグラムの線は、図の記号表で示される通りである。図６Ｈ：Ｒａｊｉ／ｆｆｌｕｃ生着の７日後における、ＣＡＲ  Ｔ細胞の単回の輸注で処置されたＮＳＧマウスの生存分析（３．０×１０６個の細胞、左、または７．５×１０５個のＴ細胞、右）。１群当たり６、９、または１５匹のマウスの生存分析は、２または３つの独立した実験からプールされる。図６Ｉ：代表的な生物発光画像は、示された時点におけるマウスの全ラジアンス（ｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒ）を示す。図６Ｊ〜６Ｋ：棒グラフは、フローサイトメトリーによって測定した場合の、２０日目における、骨髄または末梢血液におけるＣＡＲ  Ｔ細胞頻度（Ｊ）、または骨髄のＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＰＤ−１、Ｌａｇ−３、またはＴｉｍ−３発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）（Ｋ）を示す。１群当たりｎ＝５匹のマウス。対応のない両側スチューデントｔ検定を使用して、群の平均を比較した。図６Ｇのデータは、４つの独立した実験の代表的なものである。図６Ｈ−６Ｋのデータは、２つの独立した実験の代表的なものである。
【図６−６】図６Ａ〜６Ｋは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲシグナルが、ｉｎ  ｖｉｖｏの抗腫瘍活性が低減したエフェクター細胞様の表現型を促進することを示す。図６Ａ〜６Ｂ：棒グラフは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζまたは４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を制御するように刺激されたものと比較した、遺伝子発現における平均ｌｏｇ２変化倍率値を示す。図６Ｃ：ボルケーノプロットは、刺激されたＣＤ２８／ＣＤ３ζを４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較した、遺伝子発現のｌｏｇ２変化倍率および偽発見率（ＦＤＲ）を示す。Ｌｉｍｍａを使用して、ｌｏｇ２変化倍率およびＦＤＲカットオフを満たす差次的に発現された遺伝子（点線で定義されるグラフの左上および右上部分における灰色のドット）を定義した。図６Ｄ：棒グラフは、ｑＰＣＲによって測定した場合の、ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を比較したＩＬ７Ｒ、ＫＬＦ２、およびＦＯＸＯ４発現のｌｏｇ２変化倍率を示す。グラフは、単回のｑＰＣＲ試行で一緒に定量化したｎ＝３の生物学的反復からの平均および標準偏差を描写する。図６Ｅ：代表的なＦＡＣＳプロットは、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞とＫ５６２またはＫ５６２／ＲＯＲ１細胞との５時間の共培養後におけるサイトカイン生産の細胞内染色を示す。図６Ｆ：棒グラフは、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞とＫ５６２／ＲＯＲ１細胞との共培養の２４時間後におけるサイトカイン生産の変化倍率の平均および標準偏差を示す。ｎ＝３〜４つの独立した実験。＊は、ウェルチのｔ検定により、ｐ＜０．０５を意味する。図６Ｇ：ＦＡＣＳプロットは、ＳＴＩＩビーズでの刺激の７２時間後にＣＦＳＥ色素希釈によって測定した場合のＣＡＲ  Ｔ細胞増殖を示す。ヒストグラムの線は、図の記号表で示される通りである。図６Ｈ：Ｒａｊｉ／ｆｆｌｕｃ生着の７日後における、ＣＡＲ  Ｔ細胞の単回の輸注で処置されたＮＳＧマウスの生存分析（３．０×１０６個の細胞、左、または７．５×１０５個のＴ細胞、右）。１群当たり６、９、または１５匹のマウスの生存分析は、２または３つの独立した実験からプールされる。図６Ｉ：代表的な生物発光画像は、示された時点におけるマウスの全ラジアンス（ｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒ）を示す。図６Ｊ〜６Ｋ：棒グラフは、フローサイトメトリーによって測定した場合の、２０日目における、骨髄または末梢血液におけるＣＡＲ  Ｔ細胞頻度（Ｊ）、または骨髄のＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＰＤ−１、Ｌａｇ−３、またはＴｉｍ−３発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）（Ｋ）を示す。１群当たりｎ＝５匹のマウス。対応のない両側スチューデントｔ検定を使用して、群の平均を比較した。図６Ｇのデータは、４つの独立した実験の代表的なものである。図６Ｈ−６Ｋのデータは、２つの独立した実験の代表的なものである。
【図６−７】図６Ａ〜６Ｋは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲシグナルが、ｉｎ  ｖｉｖｏの抗腫瘍活性が低減したエフェクター細胞様の表現型を促進することを示す。図６Ａ〜６Ｂ：棒グラフは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζまたは４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を制御するように刺激されたものと比較した、遺伝子発現における平均ｌｏｇ２変化倍率値を示す。図６Ｃ：ボルケーノプロットは、刺激されたＣＤ２８／ＣＤ３ζを４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較した、遺伝子発現のｌｏｇ２変化倍率および偽発見率（ＦＤＲ）を示す。Ｌｉｍｍａを使用して、ｌｏｇ２変化倍率およびＦＤＲカットオフを満たす差次的に発現された遺伝子（点線で定義されるグラフの左上および右上部分における灰色のドット）を定義した。図６Ｄ：棒グラフは、ｑＰＣＲによって測定した場合の、ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を比較したＩＬ７Ｒ、ＫＬＦ２、およびＦＯＸＯ４発現のｌｏｇ２変化倍率を示す。グラフは、単回のｑＰＣＲ試行で一緒に定量化したｎ＝３の生物学的反復からの平均および標準偏差を描写する。図６Ｅ：代表的なＦＡＣＳプロットは、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞とＫ５６２またはＫ５６２／ＲＯＲ１細胞との５時間の共培養後におけるサイトカイン生産の細胞内染色を示す。図６Ｆ：棒グラフは、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞とＫ５６２／ＲＯＲ１細胞との共培養の２４時間後におけるサイトカイン生産の変化倍率の平均および標準偏差を示す。ｎ＝３〜４つの独立した実験。＊は、ウェルチのｔ検定により、ｐ＜０．０５を意味する。図６Ｇ：ＦＡＣＳプロットは、ＳＴＩＩビーズでの刺激の７２時間後にＣＦＳＥ色素希釈によって測定した場合のＣＡＲ  Ｔ細胞増殖を示す。ヒストグラムの線は、図の記号表で示される通りである。図６Ｈ：Ｒａｊｉ／ｆｆｌｕｃ生着の７日後における、ＣＡＲ  Ｔ細胞の単回の輸注で処置されたＮＳＧマウスの生存分析（３．０×１０６個の細胞、左、または７．５×１０５個のＴ細胞、右）。１群当たり６、９、または１５匹のマウスの生存分析は、２または３つの独立した実験からプールされる。図６Ｉ：代表的な生物発光画像は、示された時点におけるマウスの全ラジアンス（ｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒ）を示す。図６Ｊ〜６Ｋ：棒グラフは、フローサイトメトリーによって測定した場合の、２０日目における、骨髄または末梢血液におけるＣＡＲ  Ｔ細胞頻度（Ｊ）、または骨髄のＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＰＤ−１、Ｌａｇ−３、またはＴｉｍ−３発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）（Ｋ）を示す。１群当たりｎ＝５匹のマウス。対応のない両側スチューデントｔ検定を使用して、群の平均を比較した。図６Ｇのデータは、４つの独立した実験の代表的なものである。図６Ｈ−６Ｋのデータは、２つの独立した実験の代表的なものである。
【００１４】
【図７−１】図７Ａ〜７Ｈは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲが、内因性ＬｃｋおよびＣＤ２８と差次的に会合すること、およびＣＤ２８ドメイン中のチロシンが、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞に関連する固有な特性に寄与することを示す。図７Ａおよび７Ｂ：静止（Ａ）または刺激された（Ｂ）ＣＡＲ  Ｔ細胞からの全細胞溶解産物（Ｌ）および免疫沈降画分（ＩＰ）のウェスタンブロット分析。（Ａ）のブロットは、３つの独立した実験の代表的なものである；（Ｂ）のブロットは、１つの実験の代表的なものである。図７Ｃ：ＣＡＲ  ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインになされたチロシン変異の概略図。図７Ｄ：ＦＡＣＳプロットは、Ｋ５６２／ＲＯＲ１細胞との共培養の７２時間後にＣＦＳＥ色素希釈によって測定した場合のＣＡＲ  Ｔ細胞増殖を示す。ヒストグラムの線は、図の記号表で示される通りである。図７Ｅ：棒グラフは、Ｋ５６２／ＲＯＲ１細胞との共培養の２４時間後におけるサイトカイン生産の変化倍率の平均および標準偏差を示す。ｎ＝３つの独立した実験。図７Ｆ：静止ＣＡＲ  Ｔ細胞からの全細胞溶解産物（Ｌ）および免疫沈降画分（ＩＰ）のウェスタンブロット分析。ブロットは、３つの独立した実験の代表的なものである。図７Ｇ：所与の時間にわたりＳＴＩＩ磁気ビーズで刺激されたＣＡＲ  Ｔ細胞のウェスタンブロット。図７Ｈ：Ｒａｊｉ／ｆｆｌｕｃ生着の７日後におけるＣＡＲ  Ｔ細胞の単回の輸注で処置されたＮＳＧマウスの生存分析。１群当たり６または１５匹のマウスの生存分析は、２から３つの独立した実験からプールされる。
【図７−２】図７Ａ〜７Ｈは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲが、内因性ＬｃｋおよびＣＤ２８と差次的に会合すること、およびＣＤ２８ドメイン中のチロシンが、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞に関連する固有な特性に寄与することを示す。図７Ａおよび７Ｂ：静止（Ａ）または刺激された（Ｂ）ＣＡＲ  Ｔ細胞からの全細胞溶解産物（Ｌ）および免疫沈降画分（ＩＰ）のウェスタンブロット分析。（Ａ）のブロットは、３つの独立した実験の代表的なものである；（Ｂ）のブロットは、１つの実験の代表的なものである。図７Ｃ：ＣＡＲ  ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインになされたチロシン変異の概略図。図７Ｄ：ＦＡＣＳプロットは、Ｋ５６２／ＲＯＲ１細胞との共培養の７２時間後にＣＦＳＥ色素希釈によって測定した場合のＣＡＲ  Ｔ細胞増殖を示す。ヒストグラムの線は、図の記号表で示される通りである。図７Ｅ：棒グラフは、Ｋ５６２／ＲＯＲ１細胞との共培養の２４時間後におけるサイトカイン生産の変化倍率の平均および標準偏差を示す。ｎ＝３つの独立した実験。図７Ｆ：静止ＣＡＲ  Ｔ細胞からの全細胞溶解産物（Ｌ）および免疫沈降画分（ＩＰ）のウェスタンブロット分析。ブロットは、３つの独立した実験の代表的なものである。図７Ｇ：所与の時間にわたりＳＴＩＩ磁気ビーズで刺激されたＣＡＲ  Ｔ細胞のウェスタンブロット。図７Ｈ：Ｒａｊｉ／ｆｆｌｕｃ生着の７日後におけるＣＡＲ  Ｔ細胞の単回の輸注で処置されたＮＳＧマウスの生存分析。１群当たり６または１５匹のマウスの生存分析は、２から３つの独立した実験からプールされる。
【図７−３】図７Ａ〜７Ｈは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲが、内因性ＬｃｋおよびＣＤ２８と差次的に会合すること、およびＣＤ２８ドメイン中のチロシンが、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞に関連する固有な特性に寄与することを示す。図７Ａおよび７Ｂ：静止（Ａ）または刺激された（Ｂ）ＣＡＲ  Ｔ細胞からの全細胞溶解産物（Ｌ）および免疫沈降画分（ＩＰ）のウェスタンブロット分析。（Ａ）のブロットは、３つの独立した実験の代表的なものである；（Ｂ）のブロットは、１つの実験の代表的なものである。図７Ｃ：ＣＡＲ  ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインになされたチロシン変異の概略図。図７Ｄ：ＦＡＣＳプロットは、Ｋ５６２／ＲＯＲ１細胞との共培養の７２時間後にＣＦＳＥ色素希釈によって測定した場合のＣＡＲ  Ｔ細胞増殖を示す。ヒストグラムの線は、図の記号表で示される通りである。図７Ｅ：棒グラフは、Ｋ５６２／ＲＯＲ１細胞との共培養の２４時間後におけるサイトカイン生産の変化倍率の平均および標準偏差を示す。ｎ＝３つの独立した実験。図７Ｆ：静止ＣＡＲ  Ｔ細胞からの全細胞溶解産物（Ｌ）および免疫沈降画分（ＩＰ）のウェスタンブロット分析。ブロットは、３つの独立した実験の代表的なものである。図７Ｇ：所与の時間にわたりＳＴＩＩ磁気ビーズで刺激されたＣＡＲ  Ｔ細胞のウェスタンブロット。図７Ｈ：Ｒａｊｉ／ｆｆｌｕｃ生着の７日後におけるＣＡＲ  Ｔ細胞の単回の輸注で処置されたＮＳＧマウスの生存分析。１群当たり６または１５匹のマウスの生存分析は、２から３つの独立した実験からプールされる。
【図７−４】図７Ａ〜７Ｈは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲが、内因性ＬｃｋおよびＣＤ２８と差次的に会合すること、およびＣＤ２８ドメイン中のチロシンが、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞に関連する固有な特性に寄与することを示す。図７Ａおよび７Ｂ：静止（Ａ）または刺激された（Ｂ）ＣＡＲ  Ｔ細胞からの全細胞溶解産物（Ｌ）および免疫沈降画分（ＩＰ）のウェスタンブロット分析。（Ａ）のブロットは、３つの独立した実験の代表的なものである；（Ｂ）のブロットは、１つの実験の代表的なものである。図７Ｃ：ＣＡＲ  ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインになされたチロシン変異の概略図。図７Ｄ：ＦＡＣＳプロットは、Ｋ５６２／ＲＯＲ１細胞との共培養の７２時間後にＣＦＳＥ色素希釈によって測定した場合のＣＡＲ  Ｔ細胞増殖を示す。ヒストグラムの線は、図の記号表で示される通りである。図７Ｅ：棒グラフは、Ｋ５６２／ＲＯＲ１細胞との共培養の２４時間後におけるサイトカイン生産の変化倍率の平均および標準偏差を示す。ｎ＝３つの独立した実験。図７Ｆ：静止ＣＡＲ  Ｔ細胞からの全細胞溶解産物（Ｌ）および免疫沈降画分（ＩＰ）のウェスタンブロット分析。ブロットは、３つの独立した実験の代表的なものである。図７Ｇ：所与の時間にわたりＳＴＩＩ磁気ビーズで刺激されたＣＡＲ  Ｔ細胞のウェスタンブロット。図７Ｈ：Ｒａｊｉ／ｆｆｌｕｃ生着の７日後におけるＣＡＲ  Ｔ細胞の単回の輸注で処置されたＮＳＧマウスの生存分析。１群当たり６または１５匹のマウスの生存分析は、２から３つの独立した実験からプールされる。
【図７−５】図７Ａ〜７Ｈは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲが、内因性ＬｃｋおよびＣＤ２８と差次的に会合すること、およびＣＤ２８ドメイン中のチロシンが、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞に関連する固有な特性に寄与することを示す。図７Ａおよび７Ｂ：静止（Ａ）または刺激された（Ｂ）ＣＡＲ  Ｔ細胞からの全細胞溶解産物（Ｌ）および免疫沈降画分（ＩＰ）のウェスタンブロット分析。（Ａ）のブロットは、３つの独立した実験の代表的なものである；（Ｂ）のブロットは、１つの実験の代表的なものである。図７Ｃ：ＣＡＲ  ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインになされたチロシン変異の概略図。図７Ｄ：ＦＡＣＳプロットは、Ｋ５６２／ＲＯＲ１細胞との共培養の７２時間後にＣＦＳＥ色素希釈によって測定した場合のＣＡＲ  Ｔ細胞増殖を示す。ヒストグラムの線は、図の記号表で示される通りである。図７Ｅ：棒グラフは、Ｋ５６２／ＲＯＲ１細胞との共培養の２４時間後におけるサイトカイン生産の変化倍率の平均および標準偏差を示す。ｎ＝３つの独立した実験。図７Ｆ：静止ＣＡＲ  Ｔ細胞からの全細胞溶解産物（Ｌ）および免疫沈降画分（ＩＰ）のウェスタンブロット分析。ブロットは、３つの独立した実験の代表的なものである。図７Ｇ：所与の時間にわたりＳＴＩＩ磁気ビーズで刺激されたＣＡＲ  Ｔ細胞のウェスタンブロット。図７Ｈ：Ｒａｊｉ／ｆｆｌｕｃ生着の７日後におけるＣＡＲ  Ｔ細胞の単回の輸注で処置されたＮＳＧマウスの生存分析。１群当たり６または１５匹のマウスの生存分析は、２から３つの独立した実験からプールされる。
【図７−６】図７Ａ〜７Ｈは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲが、内因性ＬｃｋおよびＣＤ２８と差次的に会合すること、およびＣＤ２８ドメイン中のチロシンが、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞に関連する固有な特性に寄与することを示す。図７Ａおよび７Ｂ：静止（Ａ）または刺激された（Ｂ）ＣＡＲ  Ｔ細胞からの全細胞溶解産物（Ｌ）および免疫沈降画分（ＩＰ）のウェスタンブロット分析。（Ａ）のブロットは、３つの独立した実験の代表的なものである；（Ｂ）のブロットは、１つの実験の代表的なものである。図７Ｃ：ＣＡＲ  ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインになされたチロシン変異の概略図。図７Ｄ：ＦＡＣＳプロットは、Ｋ５６２／ＲＯＲ１細胞との共培養の７２時間後にＣＦＳＥ色素希釈によって測定した場合のＣＡＲ  Ｔ細胞増殖を示す。ヒストグラムの線は、図の記号表で示される通りである。図７Ｅ：棒グラフは、Ｋ５６２／ＲＯＲ１細胞との共培養の２４時間後におけるサイトカイン生産の変化倍率の平均および標準偏差を示す。ｎ＝３つの独立した実験。図７Ｆ：静止ＣＡＲ  Ｔ細胞からの全細胞溶解産物（Ｌ）および免疫沈降画分（ＩＰ）のウェスタンブロット分析。ブロットは、３つの独立した実験の代表的なものである。図７Ｇ：所与の時間にわたりＳＴＩＩ磁気ビーズで刺激されたＣＡＲ  Ｔ細胞のウェスタンブロット。図７Ｈ：Ｒａｊｉ／ｆｆｌｕｃ生着の７日後におけるＣＡＲ  Ｔ細胞の単回の輸注で処置されたＮＳＧマウスの生存分析。１群当たり６または１５匹のマウスの生存分析は、２から３つの独立した実験からプールされる。
【００１５】
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｂは、Ｊｕｒｋａｔ細胞および初代Ｔ細胞におけるＴＣＲシグナル伝達の質量分析が、タンパク質リン酸化における著しい差を明らかにすることを示す。図８Ａ：初代ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞を、マウス抗ヒトＣＤ３ε  ｍＡｂおよび抗マウスＩｇＧで刺激するか、または抗マウスＩｇＧ単独で処置することによって刺激されないままにした。図８Ｂ：近位のＴＣＲシグナル伝達経路における公知のＰＯ４部位のｌｏｇ２変化倍率を示すヒートマップ。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｂは、Ｊｕｒｋａｔ細胞および初代Ｔ細胞におけるＴＣＲシグナル伝達の質量分析が、タンパク質リン酸化における著しい差を明らかにすることを示す。図８Ａ：初代ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞を、マウス抗ヒトＣＤ３ε  ｍＡｂおよび抗マウスＩｇＧで刺激するか、または抗マウスＩｇＧ単独で処置することによって刺激されないままにした。図８Ｂ：近位のＴＣＲシグナル伝達経路における公知のＰＯ４部位のｌｏｇ２変化倍率を示すヒートマップ。
【００１６】
【図９】図９は、タンデム質量タグ（ＴＭＴ）試薬および多段階のホスホペプチド濃縮を使用したペプチド標識が、初代ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるタンパク質リン酸化の詳細な分析を可能にすることを示す。例示的なホスホペプチド濃縮戦略の概略図を提供する。簡単に言えば、溶解産物を還元し、アルキル化し、トリプシンで消化し、次いでＴＭＴ試薬で標識した。標識されたペプチドをプールし、ホスホチロシン（ｐＴｙｒ）ペプチドの免疫沈降に供した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳのために溶出液を保持した。塩基性逆相液体クロマトグラフィー、それに続き固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を使用したグローバルなホスホペプチド濃縮を使用して、フロースルーを１３画分に分けた。次いで、全ての１４個の濃縮画分（１つのｐ−Ｔｙｒ＋１３個のＩＭＡＣ）をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。
【００１７】
【図１０】図１０は、ＰＯ４のｌｏｇ２変化倍率の要約統計量を示す。ヒストグラムは、３つの実験にわたるｌｏｇ２変化倍率（シミュレーションとそれに対する対照）値の分布を示す。標準偏差は、凡例に記載される。
【００１８】
【図１１−１】図１１Ａ〜１１Ｄは、ＣＡＲ−Ｌｃｋの会合が、部分的にＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞に関連するシグナル強度の増加に関与することを示す。図１１Ａ：ＣＡＲ  ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインになされた変異の概略図。図１１Ｂ：静止ＣＡＲ  Ｔ細胞からの全細胞溶解産物（Ｌ）および免疫沈降画分（ＩＰ）のウェスタンブロット分析。ブロットは、２つの独立した実験の代表的なものである。図１１Ｃ：所与の時間にわたりＳＴＩＩ磁気ビーズで刺激されたＣＡＲ  Ｔ細胞のウェスタンブロット分析。ブロットは、３つの独立した実験の代表的なものである。図１１Ｄ：棒グラフは、Ｋ５６２／ＲＯＲ１細胞との共培養の２４時間後における平均サイトカイン濃度を示す。データは、２つの独立した実験の代表的なものである。
【図１１−２】図１１Ａ〜１１Ｄは、ＣＡＲ−Ｌｃｋの会合が、部分的にＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞に関連するシグナル強度の増加に関与することを示す。図１１Ａ：ＣＡＲ  ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインになされた変異の概略図。図１１Ｂ：静止ＣＡＲ  Ｔ細胞からの全細胞溶解産物（Ｌ）および免疫沈降画分（ＩＰ）のウェスタンブロット分析。ブロットは、２つの独立した実験の代表的なものである。図１１Ｃ：所与の時間にわたりＳＴＩＩ磁気ビーズで刺激されたＣＡＲ  Ｔ細胞のウェスタンブロット分析。ブロットは、３つの独立した実験の代表的なものである。図１１Ｄ：棒グラフは、Ｋ５６２／ＲＯＲ１細胞との共培養の２４時間後における平均サイトカイン濃度を示す。データは、２つの独立した実験の代表的なものである。
【図１１−３】図１１Ａ〜１１Ｄは、ＣＡＲ−Ｌｃｋの会合が、部分的にＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞に関連するシグナル強度の増加に関与することを示す。図１１Ａ：ＣＡＲ  ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインになされた変異の概略図。図１１Ｂ：静止ＣＡＲ  Ｔ細胞からの全細胞溶解産物（Ｌ）および免疫沈降画分（ＩＰ）のウェスタンブロット分析。ブロットは、２つの独立した実験の代表的なものである。図１１Ｃ：所与の時間にわたりＳＴＩＩ磁気ビーズで刺激されたＣＡＲ  Ｔ細胞のウェスタンブロット分析。ブロットは、３つの独立した実験の代表的なものである。図１１Ｄ：棒グラフは、Ｋ５６２／ＲＯＲ１細胞との共培養の２４時間後における平均サイトカイン濃度を示す。データは、２つの独立した実験の代表的なものである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本開示は、一般的に、改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質（例えば、キメラ抗原受容体、キメラ共刺激受容体）に関する。ある特定の態様では、本開示は、標的抗原に特異的に結合する結合ドメインを含む細胞外成分；改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞内成分；および細胞外成分と細胞内成分との間に配置された疎水性部分を含む融合タンパク質であって、改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインは、野生型ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質と比較した場合、融合タンパク質の機能的な活性（すなわち、本明細書で提供される１つまたは複数の機能的な活性）をモジュレートする少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、融合タンパク質を提供する。このような融合タンパク質、およびそれを発現する宿主細胞は、がんを処置するための、例えば養子免疫療法の方法において使用することができる。
【００２０】
背景の目的で言えば、Ｔ細胞の特異性を再び方向付ける、および／または所望のエフェクター機能を促進する合成受容体が、がん、自己免疫、および感染のための免疫療法試薬として開発中である（Ｓａｄｅｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ５４５：４２３−４３１  （２０１７）。Ｔ細胞の特異性を再び方向付けること、および／または所望のエフェクター機能を促進することが可能な例示的な受容体としては、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、キメラケモカイン受容体、キメラ共刺激受容体、および操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が挙げられる。例えば、一部のＣＡＲは、細胞外抗原特異的単鎖可変（ｓｃＦｖ）断片を、ＴＣＲ活性化を模倣する細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインに連結することによって、Ｔ細胞の特異性を腫瘍細胞に対して再び方向付ける（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｔｅｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  １４：４９９−５０９  （２０１５）。ＣＡＲで改変されたＴ細胞は、様々な悪性疾患およびがんの処置に関する将来性が示されている（例えば、Ｋａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ３：９５ｒａ７３  （２０１１）；Ｍａｕｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７１：１５０７−１５１７  （２０１４）；Ｄａｖｉｌａ  ｅｔ．ａｌ．，  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ６：２２４ｒａ２５  （２０１４）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ  ３８５：５１７−５２８  （２０１５）；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．３３：５４０−５４９  （２０１５）；Ｔｕｒｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １２６：  ２１２３−２１３８  （２０１６）；Ｔｕｒｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ８，  ３５５ｒａ１１６  （２０１６）；Ｔｕｒｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ３５：３０１０−３０２０  （２０１７）を参照）。
【００２１】
ＴＣＲ係合によって媒介されるＴ細胞活性化は、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含有するＣＤ３δ、ε、γ、およびζ鎖によって開始されるタンパク質リン酸化（ＰＯ４）を引き起こす（Ｂｒｏｗｎｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３：２５７−２６９  （２０１３））。共刺激分子からトランスで送達されたＰＯ４シグナルと組み合わされることによって、これらの事象は、Ｔ細胞転写プログラムを変更し、サイトカイン放出を促進し、増殖を誘導する（Ｋａｅｃｈ  ａｎｄ  Ｃｕｉ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２：７４９−７６１  （２０１２））。ＣＡＲは、一般的に、ＣＤ２８および／または４−１ＢＢ由来の共刺激ドメインを含む単鎖構築物中にＣＤ３ζエンドドメインを含有する。ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞はどちらも、患者における腫瘍の処置において有効であるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、および前臨床マウスモデルで機能的な差を呈示する（Ｋａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ３，  ９５ｒａ７３  （２０１１）；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｔｅｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  １４：４９９−５０９  （２０１５）；Ｃｈｅｒｋａｓｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １２６：３１３０−３１４４  （２０１６）；Ｋａｗａｌｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４４：３８０−３９０  （２０１６））。例えば、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、低レベルの持続的な（ｔｏｎｉｃ）（抗原非依存性の）ＣＤ３ζリン酸化を呈示することが報告されており、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して持続的なシグナル伝達を呈示する可能性がより高いようである。持続的なＣＡＲシグナル伝達は、同族の抗原への結合と無関係の過剰なサイトカイン放出、限定的な存続、消耗、アポトーシス、免疫チェックポイント分子受容体の発現の増加、または抗腫瘍活性の減少などの、ＣＡＲ  Ｔ細胞に対して有害効果を有する可能性がある（Ｆｒｉｇａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ３：３５６−３６７  （２０１５）；Ｌｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１：５８１−５９０  （２０１５）。
【００２２】
本開示は、変更された場合、ＣＡＲのＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの持続的なリン酸化および／または内因性Ｔ細胞シグナル伝達分子との会合を改変するある特定のアミノ酸残基の１つまたは複数における変更を有するＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含有する融合タンパク質を提供する。さらに、本開示の改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲは、野生型ＣＤ２８共刺激ドメインを含有するものと比較して、サイトカイン生産の低減したレベルを呈示し、それにより、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の臨床上の毒性（例えば、サイトカイン放出症候群またはＣＡＲ  Ｔ細胞関連脳症症候群）を低減することができる。
【００２３】
本開示をより詳細に記載する前に、本明細書において使用されるある特定の用語の定義を提供することが、その理解にとって有用であり得る。追加の定義は、この開示の全体にわたり記載される。
【００２４】
本発明の記載において、あらゆる濃度の範囲、パーセンテージの範囲、比率の範囲、または整数の範囲は、別段の指定がない限り、列挙された範囲内のあらゆる整数値、および適切な場合はそれらの分数（例えば整数値の１０分の１および１００分の１）を含むことが理解されるものとする。また、あらゆる物理的な特徴、例えばポリマーのサブユニット、サイズまたは厚さに関する本明細書で列挙されたあらゆる数値範囲も、別段の指定がない限り、列挙された範囲内のあらゆる整数を含むことが理解されるものとする。用語「約」は、本明細書で使用される場合、別段の指定がない限り、示された範囲、値、または構造の±２０％を意味する。用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、本明細書で使用される場合、列挙された要素の「１つまたは複数」を指すことが理解されるものとする。選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢のいずれか一方、両方、またはそれらのあらゆる組合せを意味することが理解されるものとする。用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、本明細書で使用される場合、同意語として使用され、これらの用語およびそれらの変化形は、非限定的と解釈されることが意図される。
【００２５】
加えて、本明細書に記載される構造および置換基の様々な組合せから生じる個々の化合物または化合物の群は、各化合物または化合物の群が個々に記載されたのと同程度に本出願によって開示されることが理解されるものとする。したがって、特定の構造または特定の置換基の選択は、本開示の範囲内である。
【００２６】
用語「から本質的になる」は、「含む」と同等ではなく、特定された物質もしくは工程、または特許請求された発明の基礎的な特徴に著しく影響を与えない物質もしくは工程を指す。例えば、タンパク質のドメイン、領域、モジュールもしくはカセット（例えば、結合ドメイン、ヒンジ領域、リンカーモジュール、タグカセット）またはタンパク質（１つまたは複数のドメイン、領域、モジュールまたはカセットを有していてもよい）は、ドメイン、領域、モジュール、カセットまたはタンパク質のアミノ酸配列が、組み合わせて、ドメイン、領域、モジュール、カセットまたはタンパク質の長さの最大で２０％（例えば、最大で１５％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％または１％）に寄与し、ドメイン、領域、モジュール、カセットまたはタンパク質の活性（例えば、結合タンパク質またはタグカセットの標的結合親和性）に実質的に影響を与えない（すなわち、５０％より多く活性を低減しないことであり、例えば、活性の低減が、４０％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下である）伸長、欠失、変異、またはそれらの組合せ（例えば、アミノもしくはカルボキシ末端における、またはドメイン間におけるアミノ酸）を含む場合、特定のアミノ酸配列「から本質的になる」。
【００２７】
「融合タンパク質」は、少なくとも２つの別個のドメイン（例えば、抗原結合ドメインおよび改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン）を有する単鎖ポリペプチドを含み、これらのドメインは、天然で、タンパク質中に一緒に見出されない。融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＰＣＲの使用、組換えによる操作などによって構築されてもよいし、またはこのような融合タンパク質は、合成によって作製されてもよい。融合タンパク質はさらに、他の成分（例えば、共有結合で結合した）、例えばタグ、リンカー、形質導入マーカー、または生物活性分子を含有していてもよい。ある特定の実施形態では、融合結合タンパク質は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体ベースのＣＡＲ（ＴＣＲ−ＣＡＲ）、またはキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）である。
【００２８】
用語「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）は、本明細書で使用される場合、天然に存在しない配列で一緒に連結された２つまたはそれより多くの別個のドメインを含む融合タンパク質であって、細胞の表面上で発現される場合、受容体として機能することができ、抗原に特異的な抗原結合ドメインを含む細胞外成分；必要に応じた細胞外スペーサードメイン；疎水性部分または膜貫通ドメイン；および細胞内活性化ドメイン（例えば、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）含有Ｔ細胞活性化モチーフ）、細胞内共刺激ドメイン、またはその両方を含む細胞内成分を含む、融合タンパク質を指す。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達成分は、ＩＴＡＭ含有Ｔ細胞活性化ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）および細胞内共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８）を有する。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、単一のポリペプチド鎖として合成されるか、または核酸分子によって単鎖ポリペプチドとしてコードされる。
【００２９】
「キメラ共刺激受容体」（ＣＣＲ）は、抗原結合ドメインを含む細胞外成分、必要に応じた細胞外スペーサードメイン、疎水性部分または膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内共刺激ドメインを含むが、細胞内活性化ドメイン（例えば、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）含有Ｔ細胞活性化モチーフ）を含まない融合タンパク質を指す。ＣＣＲは、単一のポリペプチド鎖として合成されてもよいし、または核酸分子によって単鎖ポリペプチドとしてコードされてもよい。ある特定の実施形態では、ＣＣＲは、ヘテロ二量体化ドメインをさらに含む。ヘテロ二量体化ドメインを含むＣＣＲ構築物は、細胞内活性化ドメイン（例えば、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）含有Ｔ細胞活性化モチーフ）および対応するヘテロ二量体化ドメインを含む第２のポリペプチドと宿主細胞中で共発現させることができる。ヘテロ二量体化剤（例えば、小分子）の投与は、ＣＣＲと細胞内活性化ドメインを含むポリペプチドとの、その対応するヘテロ二量体化ドメインを介した集合を容易にする。このような二重のポリペプチドヘテロ二量体化構築物は、「オンスイッチＣＡＲ」または「スプリットＣＡＲ」（例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５０：ａａｂ４０７７  （２０１５）を参照）と称することもでき、これらの構築物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３０】
「Ｔ細胞受容体ベースのキメラ抗原受容体」（ＴＣＲ−ＣＡＲ）は、抗原に特異的な可溶性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む細胞外成分、疎水性部分または膜貫通ドメイン、および細胞内活性化ドメイン（例えば、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）含有Ｔ細胞活性化モチーフ）、細胞内共刺激ドメイン、またはその両方を含む細胞内成分を含むヘテロ二量体融合タンパク質を指す（例えば、Ｗａｌｓｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ７：１０７１３，  （２０１７）を参照；そのＴＣＲ−ＣＡＲ構築物および方法は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。ある特定の実施形態では、ＴＣＲ−ＣＡＲは、ＴＣＲα定常ドメインに連結されたＴＣＲα鎖可変ドメイン（Ｖα）またはその部分を含む細胞外成分を含む第１のポリペプチド鎖；およびＴＣＲβ鎖定常ドメインに連結されたＴＣＲβ鎖可変ドメイン（Ｖβ）またはその部分を含む細胞外成分を含む第２のポリペプチド鎖；疎水性部分または膜貫通ドメイン、ならびに細胞内活性化ドメイン（例えば、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）含有Ｔ細胞活性化モチーフ）、細胞内共刺激ドメイン、またはその両方を含む細胞内成分を含むかまたはそれからなる。ある特定の実施形態では、ＴＣＲ−ＣＡＲの細胞内シグナル伝達成分は、ＩＴＡＭ含有Ｔ細胞活性化ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）および細胞内共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８）を有する。ある特定の実施形態では、ＴＣＲα鎖定常ドメイン（またはその部分）の細胞外部分およびＴＣＲβ鎖定常ドメイン（またはその部分）の細胞外部分はどちらも、二量体化が増加するように、システイン残基が付加されるように改変されている。
【００３１】
「単鎖ＴＣＲ」（ｓｃＴＣＲまたはｓｃＴｖ）は、可撓性リンカー（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２〜５、例えば、配列番号１７５を有する）でＴＣＲ  Ｖβドメインに連結されたＴＣＲ  Ｖαドメインを含む細胞外成分を含む融合タンパク質を指す。ｓｃＴＣＲは、リンカーがＴＣＲ  ＶαドメインのＣ末端をＴＣＲ  ＶβドメインのＮ末端に接続するか、またはＴＣＲ  ＶαドメインのＮ末端をＴＣＲ  ＶβドメインのＣ末端に接続するように配列できることが理解されるものとする。
【００３２】
「結合ドメイン」（「抗原結合ドメイン」または「結合領域」または「結合部分」とも称される）は、本明細書で使用される場合、標的分子（例えば、ウイルス抗原、細菌抗原、がん抗原、自己免疫疾患抗原、自己抗原）と、特異的に、および非共有結合によって会合する、一体化する、または結合する能力を有するペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質などの分子を指す。結合ドメインは、生体分子または目的の他の標的に対する、あらゆる天然に存在する、合成の、半合成の、または組換え生産された結合パートナーを含む。一部の実施形態では、結合ドメインは、抗原結合ドメインであり、例えば抗体もしくはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはそれらの機能的な結合ドメインもしくは抗原結合断片である。例示的な結合ドメインとしては、単鎖抗体可変領域（例えば、ドメイン抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の抗原結合領域、例えば、単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）または可溶性ＴＣＲ、受容体エクトドメイン、リガンド、または生体分子に結合する特異的な能力に関して選択された合成ポリペプチドが挙げられる。ある特定の実施形態では、結合ドメインは、ＣＤ８エクトドメインまたは細胞外ドメイン由来の結合ドメインでも、機能的なＩｇＶ様ドメインを含むそれらのいずれの部分でもない（すなわち、ＣＤ８α鎖またはＣＤ８β鎖由来の抗原ペプチド：ＭＨＣ複合体に特異的な結合ドメインではない）。ＣＤ８の２つのサブユニットであるＣＤ８αおよびＣＤ８βが存在し、ＣＤ８補助受容体は、αホモ二量体またはαβヘテロ二量体として存在することができる。さらなる実施形態では、結合ドメインは、ＣＤ８α単量体、ＣＤ８β単量体、ＣＤ８ααホモ二量体、またはＣＤ８αβヘテロ二量体エクトドメインまたは細胞外ドメイン由来の結合ドメインでも、機能的なＩｇＶ様ドメインを含むそれらのいずれの部分でもない。ＣＤ８αへの言及は、「基準の」ヒトＣＤ８αタンパク質（ＮＰ＿００１７５９．３）に加えて、膜貫通ドメインを含む内部セグメントが欠如しており、結果として分泌されたタンパク質を生じるスプライスアイソフォーム２（ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿７４１９６９．１）、および代替のプロモーターおよび５’ＵＴＲを使用するスプライスアイソフォーム３（ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿００１１３９３４５．１）を含む。ＣＤ８βへの言及は、「基準の」ヒトＣＤ８βタンパク質（ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿００４９２２）に加えて、ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ７４２０９９、ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿７４２１００、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ１０９６６−４、ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿７５７３６２、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ１０９６６−７、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ１０９６６−８、およびＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿００１１７１５７１に対応するアイソフォーム２〜８を含む。例示的なＩｇＶ様ドメインは、ヒト基準ＣＤ８αタンパク質（配列番号４３）のアミノ酸２２〜１３５およびヒト基準ＣＤ８βタンパク質（配列番号４４）のアミノ酸２２〜１３２に見出すことができる。ある特定の実施形態では、ＣＤ８結合ドメインは、ＴＣＲの環境で抗原ペプチド：ＭＨＣ  Ｉ複合体と結合し、これは、ＴＣＲ（例えば、ｓｃＴＣＲまたはＴＣＲベースのＣＡＲ）由来の結合ドメインを含む、天然に存在する、組換え、または操作された、または他のあらゆる組換え結合分子であり得る。
【００３３】
「特異的に結合する」は、本明細書で使用される場合、親和性または１０５Ｍ−１に等しいかまたはそれより大きいＫａ（すなわち、１／Ｍの単位での特定の結合相互作用の平衡会合定数）で、結合ドメインまたはその融合結合タンパク質が、標的分子に会合または一体化するが、試料中の他のいずれの分子または成分と有意に会合または一体化しないことを指す。結合ドメイン（またはその融合結合タンパク質）は、「高親和性」結合ドメイン（またはその融合結合タンパク質）として、または「低い親和性」結合ドメイン（またはその融合結合タンパク質）として分類することができる。「高親和性」結合ドメインは、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、または少なくとも１０１３Ｍ−１のＫａを有する結合ドメインを指す。「低親和性」結合ドメインは、最大１０７Ｍ−１、最大１０６Ｍ−１、最大１０５Ｍ−１のＫａを有する結合ドメインを指す。代替として、親和性は、Ｍの単位での特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）と定義される場合もある（例えば、１０−５Ｍから１０−１３Ｍ）。ある特定の実施形態では、結合ドメインは、「強化された親和性」を有していてもよく、これは、野生型（または親）結合ドメインより強い標的抗原への結合を有する選択または操作された結合ドメインを指す。例えば、強化された親和性は、標的抗原に対して野生型結合ドメインより高いＫａ（平衡会合定数）に起因していてもよいし、または標的抗原に対して野生型結合ドメインのそれより低いＫｄ（解離定数）に起因していてもよいし、または標的抗原に対して野生型結合ドメインのそれより低いオフレート（Ｋｏｆｆ）に起因していてもよい。
【００３４】
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体、抗体、もしくは結合ドメインまたはそれらの断片は、「強化された親和性」を有していてもよく、これは、野生型（または親）結合ドメインより強い標的抗原への結合を有する選択または操作された受容体または結合ドメインを指す。例えば、強化された親和性は、標的抗原に対して野生型結合ドメインより高いＫａ（平衡会合定数）に起因していてもよいし、標的抗原に対して野生型結合ドメインのそれより低いＫｄ（解離定数）に起因していてもよいし、標的抗原に対して野生型結合ドメインのそれより低いオフレート（ｋｏｆｆ）に起因していてもよいし、またはそれらの組合せであってもよい。ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質、例えばＣＡＲまたはＴＣＲなどは、特定の宿主細胞、例えばＴ細胞における発現が強化されるようにコドン最適化されていてもよい（Ｓｃｈｏｌｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１９：１３５  （２００６））。
【００３５】
特定の標的と特異的に結合する本開示の結合ドメインを同定するための、加えて結合ドメインまたは融合タンパク質の親和性を決定するための様々なアッセイが公知であり、例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、分析超遠心分離、分光法、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））分析、およびＭＨＣ四量体アッセイなどがある（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ５１：６６０  （１９４９）；Ｗｉｌｓｏｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５：２１０３  （２００２）；Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５３：２５６０  （１９９３）；Ａｌｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：９４−９６  （１９９６）；ならびに米国特許第５，２８３，１７３号および５，４６８，６１４号、または等価物を参照）。
【００３６】
「タグカセット」は、本明細書で使用される場合、目的のタンパク質に付着させた、目的のタンパク質に融合した、または目的のタンパク質の一部である固有なペプチド配列であって、異種または非内因性の同族の結合分子（例えば、受容体、リガンド、抗体、または他の結合パートナー）がそれに特異的に結合することが可能なものを指し、この場合、特に、タグを有するタンパク質が、タンパク質または他の材料の不均質な集団の一部である場合、またはタグを有するタンパク質を発現する細胞が、細胞の不均質な集団（例えば、末梢血液のような生体試料）の一部である場合、タグを有するタンパク質またはタグを有するタンパク質を発現する細胞を、検出する、同定する、単離する、または精製する、追跡する、濃縮する、または標的化するのに、結合特性を使用することができる。ある特定の実施形態では、タグを有するタンパク質を発現する細胞は、異種または非内因性の同族の結合分子と接触させ、生体反応を誘導する、例えば細胞活性化、細胞増殖または細胞死を促進することができる。提供される融合結合タンパク質において、同族の結合分子と特異的に結合するタグカセットの能力は、標的分子に特異的に結合する結合ドメインの能力と異なるか、またはそれに加えられる。タグカセットは、一般的に、抗原結合分子ではなく、例えば、抗体でもＴＣＲでもなく、それらの抗原結合性部位でもない。例示的なタグカセットは、本明細書で提供される。一部の実施形態では、タグカセットは、本開示の融合タンパク質の細胞外成分中に含まれ、例えば、結合ドメインと疎水性部分との間に、または結合ドメインポリペプチド（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＴＣＲα、ＴＣＲβなど）のＮ末端またはＣ末端に配置されていてもよいし、または融合タンパク質の結合ドメイン内に（例えば、ＶＨとＶＬとの間、またはＴＣＲαとＴＣＲβとの間に）配置されていてもよく、ただしタグは、抗原への結合に干渉しないか、または実質的に干渉しない。
【００３７】
「ヒンジ領域」または「ヒンジ」は、本明細書で使用される場合、（ａ）免疫グロブリンのヒンジ配列（例えば、免疫グロブリンのヒンジの上の領域およびコア領域で構成される）もしくはその機能的な断片もしくはバリアント、（ｂ）ＩＩ  Ｃ型レクチンインタードメイン（ストーク）領域もしくはその機能的な断片もしくはバリアント、または（ｃ）表面抗原分類（ＣＤ）分子ストーク領域もしくはその機能的なバリアントを指す。「野生型免疫グロブリンのヒンジ領域」は、本明細書で使用される場合、抗体の重鎖に見出される、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に挿入され、それらを接続するか（ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤの場合）、またはＣＨ１ドメインとＣＨ３ドメインとの間に挿入され、それらを接続する（ＩｇＥおよびＩｇＭの場合）、天然に存在する上および中央のヒンジアミノ酸配列を指す。ある特定の実施形態では、ヒンジ領域は、ヒトであり、特定の実施形態では、ヒトＩｇＧのヒンジ領域を含む。ＩｇＧのヒンジ領域としては、ＩｇＧ１のヒンジ領域、ＩｇＧ２のヒンジ領域、ＩｇＧ３のヒンジ領域、またはＩｇＧ４のヒンジ領域のいずれか１つまたは複数が挙げられる。
【００３８】
「疎水性部分」は、本明細書で使用される場合、細胞膜において熱力学的に安定な３次元構造を有し、一般的に約１５アミノ酸から約３０アミノ酸の長さの範囲を有するあらゆるアミノ酸配列を意味する。疎水性ドメインの構造は、アルファへリックス、ベータバレル、ベータシート、ベータへリックス、またはそれらのあらゆる組合せを含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、疎水性部分は、膜貫通ドメインであり、例えば、ＣＤ８、ＣＤ２８、またはＣＤ２７分子由来の膜貫通ドメインである。
【００３９】
「免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）Ｔ細胞活性化ドメイン」は、本明細書で使用される場合、免疫細胞受容体または細胞表面マーカー上に天然に、または内因的に存在し、少なくとも１つの免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する細胞内シグナル伝達ドメインまたはその機能的部分を指す。ＩＴＡＭは、ＹＸＸＬ／Ｉ−Ｘ６〜８−ＹＸＸＬ／Ｉ（配列番号４２）の保存されたモチーフを指す（式中、Ｘは、あらゆるアミノ酸（すなわち、ＩＴＡＭの長さにわたり同一または異なるアミノ酸）である）。ある特定の実施形態では、ＩＴＡＭシグナル伝達ドメインは、１、２、３、４つ、またはそれより多くのＩＴＡＭを含有する。ＩＴＡＭシグナル伝達ドメインは、抗原結合またはリガンド係合後にＴ細胞活性化シグナル伝達を開始させることができる。ＩＴＡＭシグナル伝達ドメインとしては、例えば、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃεＲＩまたはＦｃγＲＩ、ＦｃＲγ２ａ、ＦｃＲγ２ｂ１、ＦｃＲγ２ａ１、ＦｃＲγ２ｂ２、ＦｃＲγ３ａ、ＦｃＲγ３ｂ、ＦｃＲβ１、ＦｃεＲのガンマ鎖）、ナチュラルキラー細胞受容体タンパク質（例えば、ＤＡＰ１２）、ＣＤ５、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８９、ＣＤ２７８、ならびにＣＤ６６ｄの細胞内シグナル伝達ドメインが挙げられる。これらのＩＴＡＭ配列およびウイルス由来のもの（例えば、ＢＬＶ  ｇｐ３０；ＥＢＶ  ＬＭＰ２Ａ）の例示的なアミノ酸配列は、Ｐａｕｌ，  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３０７  （Ｗｏｌｔｅｒｓ  Ｋｌｕｗｅｒ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ；Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｅｄ．，  ２００８に記載されている）。これらのＩＴＡＭおよび機能的な断片ならびにそれらのバリアントはまた、ここで開示された融合タンパク質および宿主細胞での使用も企図され、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４０】
「共刺激シグナル伝達ドメイン」は、本明細書で使用される場合、一次または典型的な（例えば、ＩＴＡＭで駆動される）活性化シグナル（例えばＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインによって提供されるもの）と共に活性化されると、Ｔ細胞応答、例えばＴ細胞活性化、サイトカインの生産、増殖、分化、生存、エフェクター機能、またはそれらの組合せを促進または強化する、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインまたはその機能的部分を指す。共刺激シグナル伝達ドメインとしては、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、ＧＩＴＲ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＡＲＤ１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ−４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２２６、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＬＦＡ−１、ＬＩＧＨＴ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、ＺＡＰ７０、ＣＤ５、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、またはそれらのあらゆる組合せが挙げられる。
【００４１】
「ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン」は、本明細書で使用される場合、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインまたはその機能的部分を指す。ＣＤ２８は、全てのヒトＣＤ４＋Ｔ細胞およびヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の約５０％で構成的に発現される共刺激分子である（Ｌｉｎｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１：１９１−２１２  （１９９３）；Ｊｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．    Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  １１：２１１−１６  （１９９０））。ＣＤ２８は、ＴＣＲと協同して、一部の場合においてＴＣＲライゲーション単独では達成できないＴ細胞活性化の閾値の低下をもたらすことが示されている「早期」共刺激分子であり、クローンの拡大増殖および分化に必要な生存の強化およびサイトカイン生産（例えば、ＩＬ−２）の増加をもたらす（Ｂｏｕｒ−Ｊｏｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  ２４１：１８０−２０５  （２０１１））。例示的な「野生型」または「内因性」ヒトＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。ヒトＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインへの改変（例えば、アミノ酸置換）は、本明細書に記載される場合、配列番号１に記載の全長野生型ヒトＣＤ２８ポリペプチド配列中の位置を指す場合もある。
【００４２】
抗体技術分野の当業者によって理解される用語はそれぞれ、本明細書において明示的に異なって定義されない限り、当技術分野において獲得された意味が与えられる。用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続した少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む無傷抗体（なお重鎖抗体は、軽鎖が欠如しているが、それでも用語「抗体」に包含されることが理解されるものとする）、加えて、標的分子と結合する能力を有するかまたは保持する無傷抗体の抗原結合性部位を指す。抗体としては、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体が挙げられる。抗体は、天然に存在する、組換え生産された、遺伝子操作された、または改変されたものであってもよく、その例としては、免疫グロブリンの改変された形態、例えばイントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、単一ドメイン抗体、および多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、タンデムジ−ｓｃＦＶ、タンデムトリ−ｓｃＦｖ）などが挙げられる。
【００４３】
抗体由来の「結合断片」、「結合部分」、または「結合ドメイン」は、無傷抗体の一部を含み、抗体の抗原性を決定する可変領域または相補性決定領域を含有する「抗体断片」を指す。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体、ｓｃＦｖ（すなわち、一般的に約１０から約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドで接続された、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）領域の融合タンパク質）、ＶＨＨ、単一ドメイン抗体（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ）、ならびに抗体断片を含む多重特異性抗体が挙げられる。モノクローナル抗体またはその抗原結合性部位は、非ヒト、キメラ、ヒト化、またはヒトであってもよく、好ましくは、ヒト化またはヒトである。免疫グロブリンの構造および機能は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １４（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８８）で総論されている。抗体は、ＩｇＧおよびそのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ならびにＩｇＤなどの、あらゆるクラスまたはサブクラスに属するものであり得る。
【００４４】
用語「可変軽鎖」（ＶＬ）および「可変重鎖」（ＶＨ）は、それぞれ抗体軽鎖および重鎖由来の可変結合領域を指す。可変結合領域は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ、ＨＶＲ（高度可変領域）とも称される）および「フレームワーク領域」（ＦＲ）として公知の別々の明確に定義された部分領域で構成されている。ＣＤＲは、抗原特異性および／または結合親和性を付与し、ＦＲによって隔てられている抗体可変領域内のアミノ酸の配列を指す。各抗体軽鎖可変領域中に、３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）があり、各抗体重鎖可変領域中に、３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＲ２、ＨＣＤＲ３）がある。
【００４５】
用語「ＣＬ」は、「免疫グロブリン軽鎖定常領域」または「軽鎖定常領域」、すなわち、抗体軽鎖由来の定常領域を指す。
【００４６】
用語「ＣＨ」は、「免疫グロブリン重鎖定常領域」または「重鎖定常領域」を指し、これはさらに、抗体アイソタイプに応じて、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ）、またはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメイン（ＩｇＥ、ＩｇＭ）に分けることができる。
【００４７】
「Ｆａｂ」（抗原結合断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ））は、抗原に結合する抗体の一部であり、その例としては、鎖間のジスルフィド結合を介して軽鎖に連結された重鎖の可変領域およびＣＨ１が挙げられる。
【００４８】
「Ｆｃ領域部分」は、本明細書で使用される場合、抗体由来のＦｃ断片の重鎖定常領域セグメント（「結晶化可能な断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）」領域またはＦｃ領域）を指し、これは、１つまたは複数の定常ドメイン、例えばＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、またはそれらのあらゆる組合せを含み得る。ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域部分としては、ＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＤ抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、もしくはそれらのあらゆる組合せ、またはＩｇＭもしくはＩｇＥ抗体のＣＨ３およびＣＨ４ドメイン、もしくはそれらのあらゆる組合せが挙げられる。他の実施形態では、ＣＨ２ＣＨ３またはＣＨ３ＣＨ４構造は、同じ抗体アイソタイプ由来の部分領域のドメインを有し、ヒトであり、例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ（例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４由来のＣＨ２ＣＨ３）である。
【００４９】
背景の目的で言えば、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンのエフェクター機能、例えばＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）、ＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）および補体結合、Ｆｃ受容体（例えば、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＦｃＲｎ）への結合、Ｆｃ領域が欠失したポリペプチドと比べてより長いｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期、プロティンＡ結合に関与し、さらには胎盤通過にも関与する可能性がある（Ｃａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５  （１９８９）を参照）。ある特定の実施形態では、本開示の融合結合タンパク質中に見出されるＦｃ領域部分は、これらのエフェクター機能の１つまたは複数を媒介することが可能であるか、または例えば当技術分野において公知の１つまたは複数の変異によって、これらの活性の１つまたは複数または全てを欠如していると予想される。例えば、Ｆｃの機能性を改変する（例えば、改善する、低減する、または消失させる）ためのアミノ酸の改変（例えば、置換）としては、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ；Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ；Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ；Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ；Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＋Ａ３２７Ｇ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ；Ｅ３３３Ａ；Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ；Ｐ２５７Ｉ／Ｑ３１１；Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ｓ；Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｇ２３６Ａ；Ｎ２９７Ｑ；Ｋ３２２Ａ；Ｓ２２８Ｐ；Ｌ２３５Ｅ＋Ｅ３１８Ａ／Ｋ３２０Ａ／Ｋ３２２Ａ；Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ；およびＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ変異が挙げられ、これらの変異は、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（２０１１）によって公開された「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｆｃ  Ｒｅｇｉｏｎｓ」に要約され、注釈がつけられており、ｗｗｗ．ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ＰＤＦ／ｒｅｖｉｅｗ／ｒｅｖｉｅｗ−Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ−Ｆｃ−Ｒｅｇｉｏｎｓ−ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ．ｐｄｆ？ｕｔｍ＿ｓｏｕｒｃｅ＝ｒｅｖｉｅｗ＆ｕｔｍ＿ｍｅｄｉｕｍ＝ｐｄｆ＆ｕｔｍ＿ｃａｍｐａｉｇｎ＝ｒｅｖｉｅｗ＆ｕｔｍ＿ｃｏｎｔｅｎｔ＝Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ−Ｆｃ−Ｒｅｇｉｏｎｓにおいてオンラインで入手可能であり、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５０】
「免疫系細胞」は、本明細書で使用される場合、２つの主要な系統、すなわち骨髄性前駆細胞（これは、骨髄性細胞、例えば単球、マクロファージ、樹状細胞、巨核球および顆粒球を生じる）およびリンパ前駆細胞（これは、リンパ系細胞、例えばＴ細胞、Ｂ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を生じる）を生じる、骨髄中の造血幹細胞に由来する免疫系のあらゆる細胞を意味する。例示的な免疫系細胞としては、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−二重陰性Ｔ細胞、γδＴ細胞、調節性Ｔ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、および樹状細胞が挙げられる。マクロファージおよび樹状細胞は、「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」と称することもでき、これらは、ペプチドと複合体化したＡＰＣの表面上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）受容体がＴ細胞の表面上のＴＣＲと相互作用するとＴ細胞を活性化できる特殊化した細胞である。
【００５１】
「Ｔ細胞」（または「Ｔリンパ球」）は、胸腺で成熟し、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を生産する免疫系細胞であり、これは、例えば末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から入手でき（濃縮または単離でき）、本明細書では「バルク」Ｔ細胞と称される。Ｔ細胞の単離の後、細胞傷害性（ＣＤ８＋）およびヘルパー（ＣＤ４＋）Ｔ細胞の両方は、拡大増殖の前または後のいずれかに、ナイーブ、メモリー、およびエフェクターＴ細胞の部分集団に選別することができる。Ｔ細胞は、ナイーブ（抗原に曝露されていない；ＴＣＭと比較した場合、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ１２７、およびＣＤ４５ＲＡの発現の増加、ならびにＣＤ４５ＲＯの発現の減少）、メモリーＴ細胞（ＴＭ）（抗原を経験した、寿命が長い）、およびエフェクター細胞（抗原を経験した、細胞傷害性）であり得る。ＴＭはさらに、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ、ナイーブＴ細胞と比較した場合、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、およびＣＤ９５の発現の増加、ならびにＣＤ５４ＲＡの発現の減少）、幹細胞メモリーＴ細胞、およびエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ、ナイーブＴ細胞またはＴＣＭと比較した場合、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡの発現の減少、およびＣＤ１２７の発現の増加）のサブセットに分けることができる。エフェクターＴ細胞（ＴＥ）は、ＴＣＭと比較した場合、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８の発現が減少し、グランザイムおよびパーフォリンに関して陽性である、抗原を経験したＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を指す。ヘルパーＴ細胞（ＴＨ）は、サイトカインを放出することによって他の免疫細胞の活性に影響を与えるＣＤ４＋細胞である。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、適応免疫応答を活性化および抑制することができ、どの作用が誘導されるかは、他の細胞およびシグナルの存在に依存すると予想される。Ｔ細胞は、公知の技術に従って収集でき、様々な部分集団またはそれらの組合せは、公知の技術によって、例えば抗体への親和性結合、フローサイトメトリー、または免疫磁気選択によって濃縮または枯渇させることができる。
【００５２】
「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲ）は、ＣＤ３に関連して、一般的に、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識に関与するＴ細胞（またはＴリンパ球）の表面上で見出される分子を指す。ほとんどのＴ細胞において、ＴＣＲは、高度に可変のαおよびβ鎖（それぞれＴＣＲαおよびＴＣＲβとしても公知）のジスルフィド結合したヘテロ二量体を有する。Ｔ細胞のサブセットにおいて、ＴＣＲは、可変γおよびδ鎖（それぞれＴＣＲγおよびＴＣＲδとしても公知）のヘテロ二量体で構成されている。ＴＣＲの各鎖は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、１つのＮ末端免疫グロブリン可変ドメイン、１つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、およびＣ末端における短い細胞質テールを有する（Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  ３ｒｄ  Ｅｄ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ｐ．  ４：３３，  １９９７を参照）。ＴＣＲは、本開示において使用される場合、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヤギ、ウマ、または他の哺乳動物を含む様々な動物種由来であってもよい。ＴＣＲは、細胞結合型であってもよいし（すなわち、膜貫通領域またはドメインを有する）、または可溶性の形態であってもよい。
【００５３】
ＴＣＲα鎖（Ｖα）およびβ鎖（Ｖβ）の、またはγδＴＣＲの場合はＶγおよびＶδの、用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、ＴＣＲの抗原への結合（例えば、ペプチド抗原：ＭＨＣ複合体における）に関与するＴＣＲの部分を指す。天然のＴＣＲのＶαおよびＶβは、一般的に、類似の構造を有し、各可変ドメインは、４つの保存されたＦＲおよび３つのＣＤＲを含む。Ｖαドメインは、２つの別個のＤＮＡセグメント、可変遺伝子セグメントおよび連結遺伝子セグメント（ｊｏｉｎｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｓｅｇｍｅｎｔ）（Ｖ−Ｊ）によってコードされ；Ｖβドメインは、３つの別個のＤＮＡセグメント、可変遺伝子セグメント、多様性遺伝子セグメント、および連結遺伝子セグメント（Ｖ−Ｄ−Ｊ）によってコードされる。抗原結合特異性を付与するのに、単一のＶαまたはＶβドメインが十分であり得る。さらに、特定の抗原と結合するＴＣＲは、その抗原と結合するＴＣＲ由来のＶαまたはＶβドメインを使用して単離でき、それぞれ相補的ＶαまたはＶβドメインのライブラリーをスクリーニングすることができる。
【００５４】
「主要組織適合複合体分子」（ＭＨＣ分子）は、ペプチド抗原を細胞表面に送達する糖タンパク質を指す。ＭＨＣクラスＩ分子は、膜貫通α鎖（３つのαドメインを有する）および非共有結合によって会合したβ２ミクログロブリンからなるヘテロ二量体である。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、２つの膜貫通糖タンパク質、αおよびβで構成され、これらはどちらも膜貫通型である。各鎖は、２つのドメインを有する。ＭＨＣクラスＩ分子は、サイトゾル中で生じたペプチドを細胞表面に送達し、そこでペプチド：ＭＨＣ複合体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、小胞系で生じたペプチドを細胞表面に送達し、そこでそれらは、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識される。ＭＨＣ分子は、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳動物などの様々な動物種由来であり得る。
【００５５】
「抗原」または「Ａｇ」は、本明細書で使用される場合、免疫応答を引き起こす免疫原性分子を指す。この免疫応答は、抗体産生、特定の免疫担当細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性化、またはその両方を含み得る。抗原（免疫原性分子）は、例えば、ペプチド、糖ペプチド、ポリペプチド、糖ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖、脂質などであり得る。抗原は、合成でき、組換え生産でき、または生体試料から誘導できることが容易に理解される。１種または複数の抗原を含有し得る例示的な生体試料としては、組織試料、腫瘍試料、細胞、生体液、またはそれらの組合せが挙げられる。抗原は、抗原を発現するように改変または遺伝子操作された細胞、または内因的に（例えば、ヒトの介入による改変も遺伝子操作も含まない）免疫原性である変異または多型を発現する細胞によって生産することができる。融合タンパク質の結合ドメインが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）由来の抗原結合領域（例えば、ＴＣＲＶαおよびＶβ）を含むある特定の実施形態では、抗原は、ペプチド：ＭＨＣ複合体を含み、結合ドメインは少なくともペプチドに接触する。
【００５６】
用語「エピトープ」または「抗原エピトープ」は、同族の結合分子、例えば免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体、または他の結合分子、ドメインもしくは融合タンパク質によって認識され、それと特異的に結合するあらゆる分子、構造、アミノ酸配列またはタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、一般的に、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基を含有し、特異的な３次元構造の特徴に加えて、特異的な電荷の特徴を有し得る。
【００５７】
「核酸」または「核酸分子」は、本明細書で使用される場合、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳によって生成した、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、それらの断片のいずれかを指し、さらに、ライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、またはエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成した断片も指す。ある特定の実施形態では、本開示の核酸は、ＰＣＲによって生産される。核酸は、天然に存在するヌクレオチド（例えばデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド）、天然に存在するヌクレオチドのアナログ（例えば、天然に存在するヌクレオチドのα−鏡像異性体の形態）、またはその両方の組合せである単量体で構成されていてもよい。改変されたヌクレオチドは、糖部分、またはピリミジンもしくはプリン塩基部分中に改変を有していてもよいし、またはそれらが置き換えられていてもよい。核酸単量体は、ホスホジエステル結合またはこのような連結のアナログによって連結されていてもよい。ホスホジエステル結合のアナログとしては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロジセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロアニリデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌｉｄａｔｅ）、ホスホルアミデートなどが挙げられる。核酸分子は、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。
【００５８】
用語「単離された」は、物質が、その元の環境（例えば、それが天然に存在する場合、天然環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きた動物中に存在する天然に存在する核酸またはポリペプチドは、単離されていないが、天然系において共存する物質の一部または全てから分離された同じ核酸またはポリペプチドは、単離されている。このような核酸は、ベクターの一部であってもよいし、および／またはこのような核酸またはポリペプチドは、組成物（例えば、細胞溶解産物）の一部であってもよく、それでもなお、このようなベクターまたは組成物は、核酸またはポリペプチドの天然環境の一部ではないという点で、これらは単離されている。用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖生産に関与するＤＮＡのセグメントを意味し、遺伝子は、コード領域の前および後の領域（「リーダーおよびトレーラー」）、加えて個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含む。
【００５９】
用語「構築物」は、組換え核酸分子を含有するあらゆるポリヌクレオチドを指す。構築物は、ベクター（例えば、細菌ベクター、ウイルスベクター）中に存在していてもよいし、またはゲノムに組み込まれていてもよい。
【００６０】
「ベクター」は、別の核酸を輸送することが可能な核酸分子である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、ファージ、ＲＮＡベクター、または染色体、非染色体、半合成もしくは合成の核酸分子を含み得る直鎖もしくは環状のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子であってもよい。例示的なベクターは、それが連結されている核酸分子の自律複製（エピソームベクター）または発現（発現ベクター）が可能なものである。
【００６１】
「レトロウイルス」は、ＲＮＡゲノムを有するウイルスである。「ガンマレトロウイルス」は、レトロウイルス科の属を指す。例示的なガンマレトロウイルスとしては、マウス幹細胞ウイルス、マウス白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、およびトリ細網内皮症ウイルスが挙げられる。
【００６２】
「レンチウイルス」は、分裂および非分裂細胞に感染することが可能なレトロウイルスの属を指す。レンチウイルスのいくつかの例としては、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶ１型、およびＨＩＶ２型を含む）；ウマ伝染性貧血ウイルス；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。
【００６３】
「レンチウイルスベクター」は、本明細書で使用される場合、遺伝子送達のためのＨＩＶベースのレンチウイルスベクターであって、組み込み型であっても非組み込み型であってもよく、比較的大きいパッケージング能力を有し、様々な異なる細胞型に形質導入できるものを意味する。レンチウイルスベクターは、通常、３種（パッケージング、エンベロープおよびトランスファー）またはそれより多くのプラスミドの産生細胞への一過性トランスフェクションの後、生成される。ＨＩＶのように、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面糖タンパク質と細胞表面上の受容体との相互作用を介して標的細胞に侵入する。侵入のとき、ウイルスＲＮＡは、ウイルス逆転写酵素複合体によって媒介される逆転写を受ける。逆転写産物は、二本鎖直鎖状のウイルスＤＮＡであり、これは、感染細胞のＤＮＡへのウイルス組み込みのための基質である。
【００６４】
用語「動作可能に連結した」は、一つの核酸分子の機能が他のものの影響を受けるように、単一の核酸断片上で２つまたはそれより多くの核酸分子が会合していることを指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現に影響を与えることが可能である場合、そのコード配列と動作可能に連結している（すなわち、コード配列は、プロモーターの転写制御下である）。「非連結」は、会合した遺伝学的エレメントが、互いに近接して会合しておらず、一方の機能が他方に影響を与えないことを意味する。
【００６５】
用語「発現」は、本明細書で使用される場合、核酸分子、例えば遺伝子のコード配列に基づきポリペプチドが生産されるプロセスを指す。このプロセスは、転写、転写後制御、転写後修飾、翻訳、翻訳後制御、翻訳後修飾、またはそれらのあらゆる組合せを含み得る。
【００６６】
「発現ベクター」は、本明細書で使用される場合、好適な宿主中で核酸分子の発現を実行することが可能な好適な制御配列に動作可能に連結された核酸分子を含有するＤＮＡ構築物を指す。このような制御配列としては、転写を実行するためのプロモーター、このような転写を制御するための必要に応じたオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が挙げられる。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、ウイルスであってもよいし、または単に能力を有するゲノム挿入物であってもよい。好適な宿主に形質転換されたら、ベクターは、宿主ゲノムとは独立して複製および機能することができ、または一部の場合において、ゲノムそのものに組み込まれる場合もある。本明細書において、「プラスミド」、「発現プラスミド」、「ウイルス」および「ベクター」は、しばしば同義的に使用される。
【００６７】
細胞に核酸分子を挿入する状況における用語「導入される」は、「トランスフェクション」、または「形質転換」、または「形質導入」を意味し、さらに、真核または原核細胞への核酸分子の取込みへの言及を含み、その場合、核酸分子は、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、またはミトコンドリアＤＮＡ）に取り込まれて、自律的なレプリコンに変換されるか、または一時的に発現させることができる（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）。
【００６８】
「異種」核酸分子、構築物または配列は、本明細書で使用される場合、宿主細胞にとって天然ではないが、宿主細胞由来の核酸分子または核酸分子の一部に相同であり得る核酸分子または核酸分子の一部を指す。異種核酸分子、構築物または配列の供給源は、異なる属または種由来であってもよい。ある特定の実施形態では、異種核酸分子は、例えば、コンジュゲーション、形質転換、トランスフェクション、形質導入、電気穿孔などによって、宿主細胞または宿主ゲノムに付加され（すなわち、内因性でも天然でもない）、この場合、付加された分子は、宿主ゲノムに組み込まれる場合もあれば、または染色体外の遺伝物質として（例えば、プラスミドまたは自己複製ベクターの他の形態として）存在する場合もあり、複数のコピーで存在していてもよい。加えて、「異種」は、宿主細胞が相同なタンパク質または活性をコードしているとしても、宿主細胞に導入された、非天然の酵素、タンパク質、または非内因性核酸分子によってコードされた他の活性を指す。
【００６９】
用語「相同な」または「相同体」は、宿主細胞、宿主種または宿主株に見出される、またはそれらに由来する分子または活性を指す。例えば、異種分子または異種分子をコードする遺伝子は、それぞれ異種分子をコードする天然の宿主または宿主細胞の分子または遺伝子に相同であってもよく、必要に応じて、変更された構造、配列、発現レベルまたはそれらの組合せを有していてもよい。
【００７０】
用語「内因性」または「天然の」は、本明細書で使用される場合、通常、宿主または宿主細胞中に存在する遺伝子、タンパク質、化合物、分子または活性を指す。さらに、親遺伝子、タンパク質または活性と比較して、変異している、過剰発現される、シャッフルされる、二倍化される、またはそれ以外の方法で変更される遺伝子、タンパク質または活性は、それでもなお、その特定の宿主細胞にとって内因性または天然とみなされる。例えば、第１の遺伝子由来の内因性制御配列（例えば、プロモーター、翻訳を減衰させる配列）は、第２の天然の遺伝子または核酸分子の発現を変更または調節するのに使用でき、この場合、第２の天然の遺伝子または核酸分子の発現または調節は、親細胞における通常の発現または調節とは異なる。
【００７１】
用語「操作された」、「組換え」、「改変された」または「非天然の」は、本明細書で使用される場合、異種核酸分子の導入によって改変された生物、微生物、細胞、核酸分子、またはベクターを指すか、またはヒトの介入により遺伝子操作された、すなわち異種核酸分子の導入によって改変された細胞または微生物を指すか、または内因性核酸分子または遺伝子の発現が、制御されるか、調節解除されるか、または構成的になるように変更された細胞または微生物を指し、この場合、このような変更または改変は、遺伝子操作によって導入することができる。ヒトによって生成された遺伝的変更としては、例えば、１つまたは複数のタンパク質、融合結合タンパク質、または酵素をコードする核酸分子を（これは、発現制御エレメント、例えばプロモーターを含んでいてもよい）導入する改変、または他の核酸分子の付加、欠失、置換、または細胞の遺伝物質の他の機能的な破壊もしくは細胞の遺伝物質への付加を挙げることができる。例示的な改変としては、参照または親分子からの、異種または相同ポリペプチドのコード領域またはその機能的な断片における改変が挙げられる。追加の例示的な改変としては、例えば、非コード調節領域における改変が挙げられ、その改変によって遺伝子またはオペロンの発現が変更される。
【００７２】
「変異」は、本明細書で使用される場合、それぞれ参照または野生型核酸分子またはポリペプチド分子と比較した場合の、核酸分子またはポリペプチド分子の配列における変化を指す。変異は、配列中に、ヌクレオチドまたはアミノ酸の置換、挿入または欠失などの数々の異なるタイプの変化を生じさせることができる。
【００７３】
「配列同一性」は、本明細書で使用される場合、最大の配列同一性パーセントを達成するために配列をアライメントし、必要に応じてギャップを導入した後の、配列同一性の一部としていずれの保存的置換（アミノ酸配列の場合）も考慮に入れない、１つの配列中における、別の参照ポリペプチド（またはヌクレオチド）配列中のアミノ酸残基（またはヌクレオチド）と同一なアミノ酸残基（またはヌクレオチド）のパーセンテージを指す。配列同一性のパーセンテージ値は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２  （１９９７）によって定義されたＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ  ２．０ソフトウェアをデフォルト値に設定されたパラメーターで使用して得ることができる。
【００７４】
「養子細胞免疫療法」または「養子免疫療法」は、天然に存在する、または遺伝子操作された疾患抗原特異的免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の投与を指す。養子細胞免疫療法は、自己（免疫細胞がレシピエント由来である）、同種（免疫細胞が同じ種のドナー由来である）または同系（免疫細胞が、レシピエントに遺伝学的に同一なドナー由来である）であってもよい。
【００７５】
「処置する」または「処置」または「好転させる（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）」は、被験体（例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば霊長類、ウマ、イヌ、マウス、ラット）の疾患、障害、または状態の医学的管理を指す。一般的に、本開示の標的抗原に特異的に結合する結合ドメインを含む細胞外成分、および改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞内成分、および細胞外成分と細胞内成分との間に配置された疎水性部分を含む融合結合タンパク質を発現する宿主細胞を含む適切な用量または処置レジメンは、治療または予防の利益を惹起するのに十分な量で投与される。治療または予防／防止的な利益としては、臨床転帰の改善；疾患に関連する症状の低減または軽減；症状の出現の減少；生活の質の改善；より長い無病状態；疾患の程度の減縮、病態の安定化；疾患進行の遅延；寛解；生存；生存の延長；またはそれらのあらゆる組合せが挙げられる。
【００７６】
本開示の融合結合タンパク質または融合結合タンパク質を発現する細胞の「治療有効量」または「有効量」は、統計学的に有意な方式での処置されている疾患の１つまたは複数の症状の好転をもたらすのに十分な化合物または細胞の量を指す。単独で投与される個々の活性成分または単一の活性成分を発現する細胞に対して言及される場合、治療有効用量は、その成分またはその成分を発現する細胞単独での作用を指す。組合せに対して言及される場合、治療有効用量は、逐次的に投与されるか、または同時に投与されるかにかかわらず、活性成分または組み合わされた補助的な活性成分と、活性成分を発現する細胞との、治療作用をもたらす組み合わされた量を指す。別の組合せは、１種より多くの活性成分、例えば２種の異なる融合タンパク質、または他の関連する治療的物質を発現する細胞であり得る。
【００７７】
用語「持続的」は、本明細書で使用される場合、シグナル伝達の「基底」レベルまたは「抗原非依存性」のシグナル伝達を指し、このようなシグナル伝達としては、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）において、その同族のＴＣＲまたは融合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）を介した標的抗原特異的活性化の非存在下で起こる、タンパク質リン酸化、活性化、サイトカイン発現、増殖、またはそれらの組合せなどが挙げられる。
【００７８】
融合タンパク質
本明細書で開示される養子免疫療法組成物として使用するための融合タンパク質は、改変された機能的なＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む。改変された機能的なＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。このような改変された機能的なＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質は、野生型ＣＤ２８共刺激ドメインを含む融合タンパク質と異なる機能的な活性を有する。例えば、本明細書で提供されるＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインへの改変は、融合タンパク質の活性、シグナル伝達の動態、またはシグナル伝達の強度などの機能的な活性を調整し、それによって臨床的な有効性を改善すること、毒性（例えば、被験体に投与される場合、融合タンパク質を発現する宿主細胞の毒性）を低減すること、またはその両方を可能にする。
【００７９】
ある特定の態様では、本開示は、標的抗原に特異的に結合する結合ドメインを含む細胞外成分；改変された機能的なＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞内成分であって、改変された機能的なＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、細胞内成分；および細胞外成分と細胞内成分との間に配置された疎水性部分を含む融合タンパク質であって、野生型ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質とは異なる機能的な活性を有する、融合タンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、宿主細胞によって発現され、機能的な活性は、シグナル伝達の動態（例えば、シグナル伝達のタイミング、順番、配列、または速度）、シグナル伝達の強度、サイトカイン生産、細胞増殖、細胞の存続、抗抗原（例えば、抗腫瘍細胞）活性、持続的なシグナル伝達、免疫抑制成分の遺伝子の発現、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
【００８０】
本開示の融合結合タンパク質での使用に好適な結合ドメインは、あらゆる抗原結合ポリペプチドであり得る。結合ドメインは、天然抗体、合成もしくは組換え抗体構築物、またはそれらの抗原結合断片を含んでいてもよい。例えば、結合ドメインは、全長重鎖、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変重鎖ドメイン（ＶＨドメイン）、可変軽鎖ドメイン（ＶＬドメイン）、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、単一ドメインのラクダ科抗体（ＶＨＨ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、または単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を含んでいてもよく、一部の実施形態では、多重特異性を有していてもよい。結合ドメインの他の例としては、単鎖Ｔ細胞受容体（ｓｃＴＣＲ）、可溶性ＴＣＲ、可変アルファ鎖ドメイン（Ｖα）、可変ベータ鎖ドメイン（Ｖβ）、受容体の細胞外結合ドメイン、細胞表面受容体／分子のためのリガンド、腫瘍結合タンパク質／ペプチド、およびサイトカインが挙げられる。ある特定の実施形態では、本開示の融合結合タンパク質の結合ドメインは、ＣＤ８の細胞外結合ドメインまたは部分も、機能的なＩｇＶ様ドメインを含むそれらのいずれの部分（すなわち、同族のリガンドとの結合が可能なＩｇＶ様ドメイン、例えばペプチド：ＭＨＣ複合体）も含まない。特定の実施形態では、本開示の融合結合タンパク質の結合ドメインは、ＣＤ８α鎖由来の結合ドメインも、ＣＤ８β鎖由来の結合ドメインも、ＣＤ８αホモ二量体由来の結合ドメインも、ＣＤ８αβヘテロ二量体由来の結合ドメインも含まない。さらなる実施形態では、本開示の融合結合タンパク質の結合ドメインは、配列番号４３に記載のＣＤ８α  ＩｇＶ様ドメインも、配列番号４４に記載のＣＤ８β  ＩｇＶ様ドメインも含まない。
【００８１】
ある特定の実施形態では、結合ドメインは、マウス、ウサギ、ラクダ科、軟骨魚類由来、キメラ、ヒト、またはヒト化である。
【００８２】
ある特定の実施形態では、結合ドメインは、抗ＣＤ１９抗体ＦＭＣ６３または抗ＲＯＲ１抗体Ｒ１２由来のｓｃＦｖを含む。一部の実施形態では、結合ドメインは、配列番号８に記載のＦＭＣ６３  ｓｃＦｖアミノ酸配列または配列番号９に記載のＲ１２  ｓｃＦｖアミノ酸配列を含む。
【００８３】
ＲＯＲ１に特異的な追加の例示的な結合ドメインとしては、例えば、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６：ｅ２１０１８  ｄｏｉ：１０．１３７１，  ２０１１；Ｐａｒｅｄｅｓ−Ｍｏｓｃｏｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １２８：２０５２，  ２０１６；ＰＣＴ公報第ＷＯ２０１４／０３１１７４号、同第ＷＯ２０１６／０９４８７３号、および同第ＷＯ２０１７０７２３６１号Ａ１；ならびに米国特許／付与前公報第２０１３／０２５１６４２号、同第９，３１６，６４６号、同第９，２１７，０４０号、同第９，２４２，０１４号、同第８，２１２，００９号、同第９，２２６，９５２号、同第９，２２８，０２３号、および同第９，１５０，６４７号に開示された抗体由来のものが挙げられる。これらの抗体およびそれらの結合ドメインは、それらのアミノ酸配列を含めて参照により本明細書に組み込まれる。
【００８４】
ある特定の実施形態では、ＲＯＲ１抗原に結合する結合ドメインは、Ｒ１２抗体、Ｒ１１抗体、２Ａ２抗体、Ｒ１２抗体、ＵＣ−９６１抗体、Ｄ１０抗体、Ｙ３１抗体、またはＨ１０抗体由来である。
【００８５】
融合タンパク質の細胞外成分は、必要に応じて、細胞外の非シグナル伝達スペーサーまたはリンカー領域を含んでいてもよく、これは、例えば、宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）表面から離れて結合ドメインを位置決めして、適した細胞／細胞の接触、抗原結合および活性化を可能にする（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：  ４１２−４１９  （１９９９））。融合結合タンパク質の細胞外スペーサー領域は、一般的に、疎水性部分または膜貫通ドメインと細胞外結合ドメインとの間に配置される。スペーサー領域の長さは、選択された標的分子、選択された結合エピトープ、または抗原結合ドメインのサイズおよび親和性に基づき、抗原認識（例えば、腫瘍認識）を最大化するために変更されてもよい（例えば、Ｇｕｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ２８：２０３−１１  （２００５）；ＰＣＴ公報第ＷＯ２０１４／０３１６８７号を参照）。ある特定の実施形態では、スペーサー領域は、免疫グロブリンのヒンジ領域を含む。免疫グロブリンのヒンジ領域は、野生型免疫グロブリンのヒンジ領域であってもよいし、または変更された野生型免疫グロブリンのヒンジ領域であってもよい。ある特定の実施形態では、免疫グロブリンのヒンジ領域は、ヒト免疫グロブリンのヒンジ領域である。免疫グロブリンのヒンジ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭのヒンジ領域であり得る。ＩｇＧのヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のヒンジ領域であり得る。例示的な変更されたＩｇＧ４のヒンジ領域は、ＰＣＴ公報第ＷＯ２０１４／０３１６８７号に記載されており、そのヒンジ領域は、それらのアミノ酸配列を含めて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、変更されたＩｇＧ４のヒンジ領域は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む。本明細書に記載される融合結合タンパク質で使用されるヒンジ領域の他の例としては、１型膜タンパク質の細胞外領域、例えばＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８およびＣＤ７中に存在するヒンジ領域が挙げられ、これらは、野生型またはそのバリアントであってもよい。
【００８６】
ある特定の実施形態では、細胞外スペーサー領域は、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、またはそれらのあらゆる組合せから選択されるＦｃドメインの全部または一部を含む（例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ２０１４／０３１６８７号を参照。そのスペーサーは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。Ｆｃドメインまたはその部分は、変更された機能を有する（例えば、抗体のエフェクター機能を低減するように）野生型であり得る。ある特定の実施形態では、細胞外成分は、結合ドメインと疎水性部分との間に配置された、免疫グロブリンのヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはそれらのあらゆる組合せを含む。ある特定の実施形態では、細胞外成分は、ＩｇＧ１のヒンジ領域、ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン、およびＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含む。さらなる実施形態では、ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインは、（ｉ）Ｎ２９７Ｑ変異、（ｉｉ）最初の６アミノ酸（ＡＰＥＦＬＧ）のＡＰＰＶＡでの置換、または（ｉ）および（ｉｉ）の両方を含む。ある特定の実施形態では、免疫グロブリンのヒンジ領域、Ｆｃドメインまたはその部分、またはその両方は、ヒトである。
【００８７】
ある特定の実施形態では、細胞外スペーサー領域は、タグをさらに含む。タグは、養子細胞療法で使用されるタグを有する融合タンパク質を発現する細胞がそれを必要とする被験体にうまく移植されるかどうか、またはタグを有する融合タンパク質を発現する細胞が、養子細胞療法を受けている被験体における目的の部位で増殖する、存続する、もしくは局所化するかどうかを決定するのに有用であり得る。タグを有する融合タンパク質を発現する細胞は、タグペプチドに特異的に結合する抗体またはその結合断片を使用して検出することができる。タグはまた、被験体またはその試料から（例えば、全血から、ＰＢＭＣから、または腫瘍組織もしくは部位から）のタグを有する融合タンパク質を発現する細胞または細胞の集団を濃縮または単離することにも有用であり得る。タグはまた、タグを有する融合タンパク質を発現する細胞または細胞の集団を活性化または拡大増殖させることにも有用であり得る。タグは、酵素、色素、蛍光標識、またはペプチドタグであり得る。例示的なタグペプチドとしては、細菌タンパク質であるストレプトアビジン、およびその誘導体Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎと高親和性で結合する、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ（ＷＲＨＰＱＦＧＧ、配列番号３９）、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ、配列番号４０）、およびＳｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ  ９−ｍｅｒ（ＮＷＳＨＰＱＦＥＫ、配列番号１０）が挙げられる。例えば、米国特許第７，９８１，６３２号（そこに記載されるＳｔｒｅｐタグは、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。１つまたは複数のタグペプチドを含有するタグを有する融合タンパク質（例えば、キメラ抗原受容体）および検出、単離、濃縮、活性化、または拡大増殖方法は、ＰＣＴ公報第ＷＯ２０１５／０９５８９５号に記載されており、それに記載のタグ、タグを有する融合タンパク質、および方法は、参照により本明細書に組み込まれる。タグの他の例としては、発色性レポーター酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ、シアニン色素、クマリン、ローダミン、キサンテン、フルオレセインまたはそれらのスルホン化誘導体、ＰＥ、パシフィックブルー、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ、ＡＰＣ、ＦＩＴＣ、蛍光タンパク質、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ａｖｉタグ、カルモジュリンタグ、ポリグルタメートタグ、ＨＡタグ、Ｎｕｓタグ、Ｓタグ、Ｘタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆｔａｇ、Ｖ５タグ、ＣＢＰ、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＧＦＰ、チオレドキシンタグ、またはそれらのあらゆる組合せを含む酵素が挙げられる。
【００８８】
疎水性部分または膜貫通ドメインは、融合タンパク質の細胞外成分と細胞内成分との間に配置されている。膜貫通ドメインは、宿主細胞膜（例えば、Ｔ細胞）を横断し、その中で融合タンパク質を固定する疎水性アルファへリックスである。ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、存在する場合、細胞内成分の由来と同じ分子、例えば、ＣＤ２８、ＩＴＡＭ含有Ｔ細胞活性化ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ）から選択されるか、または別のＩ型膜貫通タンパク質、例えばＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７から選択される。ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、細胞内成分の由来と異なる分子から選択される。ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３００、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、Ａ２ａＲ、ＤＡＰ１０、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、ＧＡＬ９、ＫＩＲ、Ｌｃｋ、ＬＡＴ、ＬＲＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＰＴＣＨ２、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、Ｓｌｐ７６、ＳＩＲＰα、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＩＭ３、ＴＲＩＭ、ＬＰＡ５、またはＺａｐ７０の膜貫通ドメインを含む。例示的なＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号１３または配列番号４１のアミノ酸配列を含む。
【００８９】
背景の目的で言えば、Ｔ細胞のロバストな活性化は、一般的に、２つの別個のシグナル伝達事象：（１）Ｔ細胞活性化を促進する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体による抗原の認識を介して提供される抗原特異的シグナル、および（２）抗原提示細胞上で発現される共刺激分子とＴ細胞との相互作用またはライゲーションによって提供される非抗原特異的な「共刺激シグナル」を含む。共刺激の非存在下におけるＴ細胞活性化は、アネルギー、アポトーシス、または免疫寛容を引き起こす可能性がある。共刺激シグナルは、抗原と共にＴ細胞を刺激し、Ｔ細胞の増殖、分化、および存続を促進する。
【００９０】
細胞内成分は、融合タンパク質の標的抗原への結合に応答して宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）の内部にシグナルを導入し、エフェクター機能、例えば、活性化、サイトカイン生産、増殖、分化、存続、細胞傷害性活性、ホーミング、腫瘍の微環境への侵入、またはそれらのあらゆる組合せを惹起する融合結合タンパク質の一部を指す。
【００９１】
本開示の融合タンパク質の細胞内成分は、改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ＣＤ２８は、ナイーブＴ細胞のための主要な共刺激受容体であり、Ｔ細胞応答の開始に関与する。ＣＤ２８は、主として抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞）上で発現されるＣＤ８０およびＣＤ８６に結合する。ＣＤ２８のそのリガンドとの結合は、Ｔ細胞受容体シグナル伝達と共に、抗原で刺激されたＴ細胞の拡大増殖およびエフェクターおよびメモリー細胞への分化を促進する。ＣＤ２８シグナル伝達は、サイトカイン生産（例えば、ＩＬ−２）を強化し、細胞生存遺伝子（例えば、Ｂｃｌ−ｘＬ）を上方調節し、エネルギー代謝を促進し、細胞周期の進行を容易にする。ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８の全長細胞内ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインのトランケートされた部分を指す場合もあり、ただし、トランケートされた部分は、シグナル伝達活性（例えば、野生型ＣＤ２８の、少なくとも約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または野生型ＣＤ２８に実質的に類似した活性）を保持する。例示的な野生型、全長ヒトＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。改変された機能的なＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、改変された機能的なＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質は、野生型ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質と異なる機能的な活性を有すると予想される。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、または少なくとも約１５個のアミノ酸置換を含み、ただし、改変されたＣＤ２８共刺激ドメインは、Ｔ細胞活性化を促進するのに十分なシグナル伝達活性を保持する（すなわちこれは、機能的なバリアントである）。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインは、少なくとも約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２５、または約３０個のアミノ酸置換を含み、ただし、改変されたＣＤ２８共刺激ドメインは、Ｔ細胞活性化を促進するのに十分なシグナル伝達活性を保持する（すなわちこれは、機能的なバリアントである）。融合タンパク質の機能性を測定するための例示的なアッセイとしては、サイトカイン生産（例えば、サイトカインＥＬＩＳＡ）、Ｔ細胞増殖（例えば、ＦＡＣＳによって）、殺腫瘍細胞活性（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ標識クロム放出アッセイ（ＣＲＡ）を使用する、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍サイズのイメージングによる）、共刺激マーカーのＴ細胞表面発現、および抗原刺激に応答するＴ細胞消耗マーカーの非存在（または存在）（例えば、検出可能に標識された抗体を使用することによる）を測定するためのアッセイが挙げ��れる。
【００９２】
ある特定の実施形態では、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸は、野生型ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインにおいてその位置に天然に存在するアミノ酸以外のあらゆるアミノ酸で置換される。ある特定の実施形態では、アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸で置換される。
【００９３】
「保存的置換」は、１つのアミノ酸の、類似の特性を有する別のアミノ酸（例えば、別の天然に存在する、もしくは合成的に生産されたアミノ酸、またはそれらの模倣物）での置換として当技術分野において認められている。ある特定の実施形態では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。例示的な保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換を含む。類似のアミノ酸は、以下のカテゴリーに含まれ得る：塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）；酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）；非荷電性の極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、ヒスチジン）；非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）。プロリンは、分類がより難しいとみなされており、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（例えば、ロイシン、バリン、イソロイシン、およびアラニン）と特性を共有する。ある特定の環境において、グルタミン酸のグルタミンでの置換またはアスパラギン酸のアスパラギンでの置換は、グルタミンおよびアスパラギンはそれぞれグルタミン酸およびアスパラギン酸のアミド誘導体であるという点で、類似の置換とみなすことができる。さらなる例示的な保存的置換は当技術分野において周知であり（例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ９７／０９４３３号、１０頁；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．  ＮＹ，  ＮＹ，  ｐｐ．７１−７７，  １９７５；Ｌｅｗｉｎ，  Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ，  ｐ．  ８，  １９９０を参照）、これらに記載の保存的置換は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００９４】
ある特定の実施形態では、融合タンパク質中に全長ＣＤ２８分子が存在しない場合もあるが、参照の目的で、アミノ酸置換は、全長ＣＤ２８ポリペプチド内のアミノ酸残基の位置を指す場合もある。具体的な実施形態では、アミノ酸置換は、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ１０７４７（配列番号１）に記載の全長ヒトＣＤ２８ポリペプチド内のアミノ酸残基の位置を指す。
【００９５】
ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、その場合、少なくとも１つの（すなわち、１つまたは複数の）チロシン残基が、異なるアミノ酸残基で置換されているか、少なくとも１つのプロリン残基が、異なるアミノ酸残基で置換されているか、またはその両方である。一部の実施形態では、少なくとも１、２、３、または４つのチロシン残基が置換されている。２つまたはそれより多くのチロシン置換を含む改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインの場合、各チロシン置換は、同一でもよいし、または異なっていてもよい。さらなる実施形態では、少なくとも１つのチロシン残基は、保存的アミノ酸で置換されている。具体的な実施形態では、少なくとも１つのチロシン残基は、フェニルアラニン残基で置換されている。別の具体的な実施形態では、少なくとも１つのチロシン残基は、トリプトファン残基で置換されている。一部の実施形態では、少なくとも１つのチロシン残基が、トリプトファン残基で置換されており、少なくとも１つのチロシン残基が、フェニルアラニン残基で置換されている。
【００９６】
一部の実施形態では、少なくとも１、２、３、または４つのプロリン残基が置換されている。２つまたはそれより多くのプロリン置換を含む改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインの場合、各プロリン置換は、同一でもよいし、または異なっていてもよい。さらなる実施形態では、少なくとも１つのプロリン残基は、保存的アミノ酸で置換されている。具体的な実施形態では、少なくとも１つのプロリン残基は、アラニン残基で置換されている。一部の実施形態では、少なくとも１つのプロリン残基は、アラニン残基で置換されており、少なくとも１つのプロリン残基は、異なる（アラニンではない）アミノ酸で置換されている。
【００９７】
ある特定の実施形態では、置換のための少なくとも１つのチロシン残基は、１９１、２０６、２０９、および２１８位のいずれか１つから選択される（位置は、配列番号１に記載の全長の野生型ヒトＣＤ２８を参照する）。一部の実施形態では、１９１、２０６、２０９、および２１８位のいずれか１つから選択される少なくとも２、３、または４つのチロシン残基が置換されている。一部の実施形態では、少なくとも１つのチロシン残基は、保存的アミノ酸、例えばフェニルアラニンで置換されている。
【００９８】
ある特定の実施形態では、置換のための少なくとも１つのプロリン残基は、１９６、１９９、２０８、および２１１位のいずれか１つから選択される（位置は、配列番号１に記載の全長の野生型ヒトＣＤ２８を参照する）。一部の実施形態では、１９６、１９９、２０８、および２１１位のいずれかから選択される少なくとも２、３、または４つのプロリン残基が置換されている。一部の実施形態では、少なくとも１つのプロリン残基は、保存的アミノ酸、例えばアラニンで置換されている。
【００９９】
一部の実施形態では、改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインは、Ｙ１９１、Ｙ２０６、Ｙ２０９、Ｙ２１８、Ｙ１９１／Ｙ２０６、Ｙ１９１／Ｙ２０９、Ｙ１９１／Ｙ２１８、Ｙ２０６／Ｙ２０９、Ｙ２０６／Ｙ２１８、Ｙ２０９／Ｙ２１８、Ｙ１９１／Ｙ２０６／Ｙ２０９、Ｙ１９１／Ｙ２０６／Ｙ２１８、Ｙ１９１／Ｙ２０９／Ｙ２１８、Ｙ２０６／Ｙ２０９／Ｙ２１８、またはＹ１９１／Ｙ２０６／Ｙ２０９／Ｙ２１８置換を含む。
【０１００】
一部の実施形態では、改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインは、Ｐ１９６、Ｐ１９９、Ｐ２０８、Ｐ２１１、Ｐ１９６／Ｐ１９９、Ｐ１９６／Ｐ２０８、Ｐ１９６／Ｐ２１１、Ｐ１９９／Ｐ２０８、Ｐ１９９／Ｐ２１１、Ｐ２０８／Ｐ２１１、Ｐ１９６／Ｐ１９９／Ｐ２０８、Ｐ１９６／Ｐ１９９／Ｐ２１１、Ｐ１９６／Ｐ２０８／Ｐ２１１、Ｐ１９９／Ｐ２０８／Ｐ２１１、またはＰ１９６／Ｐ１９９／Ｐ２０８／Ｐ２１１置換を含む。
【０１０１】
一部の実施形態では、改変されたＣＤ２８共刺激ドメインは、Ｙ１９１、Ｙ２０６、Ｙ２０９、Ｙ２１８、Ｙ１９１／Ｙ２０６、Ｙ１９１／Ｙ２０９、Ｙ１９１／Ｙ２１８、Ｙ２０６／Ｙ２０９、Ｙ２０６／Ｙ２１８、Ｙ２０９／Ｙ２１８、Ｙ１９１／Ｙ２０６／Ｙ２０９、Ｙ１９１／Ｙ２０６／Ｙ２１８、Ｙ１９１／Ｙ２０９／Ｙ２１８、Ｙ２０６／Ｙ２０９／Ｙ２１８、またはＹ１９１／Ｙ２０６／Ｙ２０９／Ｙ２１８のいずれか１つから選択される少なくとも１つのチロシン置換；およびＰ１９６、Ｐ１９９、Ｐ２０８、Ｐ２１１、Ｐ１９６／Ｐ１９９、Ｐ１９６／Ｐ２０８、Ｐ１９６／Ｐ２１１、Ｐ１９９／Ｐ２０８、Ｐ１９９／Ｐ２１１、Ｐ２０８／Ｐ２１１、Ｐ１９６／Ｐ１９９／Ｐ２０８、Ｐ１９６／Ｐ１９９／Ｐ２１１、Ｐ１９６／Ｐ２０８／Ｐ２１１、Ｐ１９９／Ｐ２０８／Ｐ２１１、またはＰ１９６／Ｐ１９９／Ｐ２０８／Ｐ２１１のいずれか１つから選択される少なくとも１つのプロリン置換を含む。
【０１０２】
さらなる実施形態では、改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインは、Ｙ１９１Ｆ、Ｙ２０６Ｆ、Ｙ２０９Ｆ、Ｙ２１８Ｆ、Ｙ１９１Ｆ／Ｙ２０６Ｆ、Ｙ１９１Ｆ／Ｙ２０９Ｆ、Ｙ１９１Ｆ／Ｙ２１８Ｆ、Ｙ２０６Ｆ／Ｙ２０９Ｆ、Ｙ２０６Ｆ／Ｙ２１８Ｆ、Ｙ２０９Ｆ／Ｙ２１８Ｆ、Ｙ１９１Ｆ／Ｙ２０６Ｆ／Ｙ２０９Ｆ、Ｙ１９１Ｆ／Ｙ２０６Ｆ／Ｙ２１８Ｆ、Ｙ１９１Ｆ／Ｙ２０９Ｆ／Ｙ２１８Ｆ、Ｙ２０６Ｆ／Ｙ２０９Ｆ／Ｙ２１８Ｆ、またはＹ１９１Ｆ／Ｙ２０６Ｆ／Ｙ２０９Ｆ／Ｙ２１８Ｆ置換を含む。
【０１０３】
一部の実施形態では、改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインは、Ｐ１９６Ａ、Ｐ１９９Ａ、Ｐ２０８Ａ、Ｐ２１１Ａ、Ｐ１９６Ａ／Ｐ１９９Ａ、Ｐ１９６Ａ／Ｐ２０８Ａ、Ｐ１９６Ａ／Ｐ２１１Ａ、Ｐ１９９Ａ／Ｐ２０８Ａ、Ｐ１９９Ａ／Ｐ２１１Ａ、Ｐ２０８Ａ／Ｐ２１１Ａ、Ｐ１９６Ａ／Ｐ１９９Ａ／Ｐ２０８Ａ、Ｐ１９６Ａ／Ｐ１９９Ａ／Ｐ２１１Ａ、Ｐ１９６Ａ／Ｐ２０８Ａ／Ｐ２１１Ａ、Ｐ１９９Ａ／Ｐ２０８Ａ／Ｐ２１１Ａ、またはＰ１９６Ａ／Ｐ１９９Ａ／Ｐ２０８Ａ／Ｐ２１１Ａ置換を含む。
【０１０４】
一部の実施形態では、改変されたＣＤ２８共刺激ドメインは、Ｙ１９１Ｆ、Ｙ２０６Ｆ、Ｙ２０９Ｆ、Ｙ２１８Ｆ、Ｙ１９１Ｆ／Ｙ２０６Ｆ、Ｙ１９１Ｆ／Ｙ２０９Ｆ、Ｙ１９１Ｆ／Ｙ２１８Ｆ、Ｙ２０６Ｆ／Ｙ２０９Ｆ、Ｙ２０６Ｆ／Ｙ２１８Ｆ、Ｙ２０９Ｆ／Ｙ２１８Ｆ、Ｙ１９１Ｆ／Ｙ２０６Ｆ／Ｙ２０９Ｆ、Ｙ１９１Ｆ／Ｙ２０６Ｆ／Ｙ２１８Ｆ、Ｙ１９１Ｆ／Ｙ２０９Ｆ／Ｙ２１８Ｆ、Ｙ２０６Ｆ／Ｙ２０９Ｆ／Ｙ２１８Ｆ、またはＹ１９１Ｆ／Ｙ２０６Ｆ／Ｙ２０９Ｆ／Ｙ２１８Ｆのいずれか１つから選択される少なくとも１つのチロシン置換；およびＰ１９６Ａ、Ｐ１９９Ａ、Ｐ２０８Ａ、Ｐ２１１Ａ、Ｐ１９６Ａ／Ｐ１９９Ａ、Ｐ１９６Ａ／Ｐ２０８Ａ、Ｐ１９６Ａ／Ｐ２１１Ａ、Ｐ１９９Ａ／Ｐ２０８Ａ、Ｐ１９９Ａ／Ｐ２１１Ａ、Ｐ２０８Ａ／Ｐ２１１Ａ、Ｐ１９６Ａ／Ｐ１９９Ａ／Ｐ２０８Ａ、Ｐ１９６Ａ／Ｐ１９９Ａ／Ｐ２１１Ａ、Ｐ１９６Ａ／Ｐ２０８Ａ／Ｐ２１１Ａ、Ｐ１９９Ａ／Ｐ２０８Ａ／Ｐ２１１Ａ、またはＰ１９６Ａ／Ｐ１９９Ａ／Ｐ２０８Ａ／Ｐ２１１Ａのいずれか１つから選択される少なくとも１つのプロリン置換を含む。
【０１０５】
本明細書に記載される改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインのいずれかにおいて、改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインは、Ｌ１８６位およびＬ１８７位のそれぞれにおける置換をさらに含んでいてもよい。一部の実施形態では、改変されたＣＤ２８共刺激ドメインは、Ｌ１８６Ｇ／Ｌ１８７Ｇ置換を含む。１８６位および１８７位における２つのロイシンの２つのグリシンへの置換は、宿主免疫細胞において融合タンパク質発現を増加させることが示されている（Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １０２：４３２０−４３２５  （２００３）を参照、これらに記載の置換変異は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインは、Ｙ１９１、Ｐ２０８、Ｐ２１１、またはそれらのあらゆる組合せにおける置換を含まない。
【０１０７】
改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインの例示的なアミノ酸配列は、配列番号４〜６および４５〜４７で提供される。
【０１０８】
本開示に記載される改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質は、「野生型」ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質と比較した場合、前記融合タンパク質を発現する免疫細胞においてモジュレートされた機能的な活性を呈示する。融合タンパク質を発現する免疫細胞の機能的な活性のモジュレーションとしては、シグナル伝達の動態（例えば、シグナル伝達のタイミング、順番、配列、または速度）のモジュレーション、シグナル伝達の強度、サイトカイン生産、細胞増殖、細胞の存続、抗腫瘍活性、持続的なシグナル伝達、免疫抑制成分の遺伝子の発現、またはそれらのあらゆる組合せを挙げることができる。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインは、融合タンパク質を発現する免疫細胞におけるサイトカイン生産を低減する。発現が低減され得るサイトカインの例としては、ＩＬ−２およびＴＮＦ−αが挙げられる。サイトカインレベルを測定する方法は当技術分野において公知であり、その例としては、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、抗体アレイ、フローサイトメトリー、および血球計算ビーズアレイによる定量化が挙げられる。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインは、融合タンパク質を発現する免疫細胞において持続的なシグナル伝達を低減する。持続的なシグナル伝達は、持続的なタンパク質リン酸化、活性化、サイトカイン発現、増殖、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。具体的な実施形態では、改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインは、前記融合タンパク質を発現するＴ細胞において、ＣＤ３ζ、例えばＹ１４２位におけるＣＤ３ζの持続的なリン酸化を低減する。
【０１１０】
細胞内成分は、必要に応じて、受容体由来の細胞内活性化ドメイン、例えばＩＴＡＭ含有Ｔ細胞活性化ドメインをさらに含む。本開示の融合タンパク質で使用されるＩＴＡＭ含有Ｔ細胞活性化モチーフは、少なくとも１つのＩＴＡＭを含有する免疫細胞受容体または細胞表面マーカーの、細胞内シグナル伝達ドメインまたはその部分と同一であってもよいし、またはそれらの機能的なバリアントであってもよい。一般的に、ＩＴＡＭ含有Ｔ細胞活性化ドメインは、融合タンパク質の結合ドメインがその標的抗原と係合するとき、Ｔ細胞活性化シグナルを提供する。本明細書に記載される融合タンパク質において使用できるＩＴＡＭ含有細胞内活性化ドメインの非限定的な例としては、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＣＤ３８、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄ、ＦｃεＲＩまたはＦｃγＲＩ、ＦｃＲγ２ａ、ＦｃＲγ２ｂ１、ＦｃＲγ２ａ１、ＦｃＲγ２ｂ２、ＦｃＲγ３ａ、ＦｃＲγ３ｂ、ＦｃＲβ１、ＦｃεＲのガンマ鎖）、ナチュラルキラー細胞受容体タンパク質（例えば、ＤＡＰ１２）、ＣＤ５、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ８９、ならびにＣＤ２７８上に存在するものが挙げられる。特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質の細胞内シグナル伝達成分は、ＣＤ３ζ  ＩＴＡＭ含有Ｔ細胞活性化ドメインを含む。例示的なＣＤ３ζ  ＩＴＡＭ含有Ｔ細胞活性化ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質の細胞内成分は、改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ζ  ＩＴＡＭ含有Ｔ細胞活性化ドメインを含む。
【０１１１】
細胞内成分は、必要に応じて、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン以外の追加の共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。追加の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８以外の共刺激分子の全長細胞内ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインのトランケートされた部分を含んでいてもよく、ただしトランケートされた部分は、十分なシグナル伝達活性を保持する。ある特定の実施形態では、追加の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ４０Ｌ、ＧＩＴＲ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＡＲＤ１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ−４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ  ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、ＺＡＰ７０、ＣＤ５、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、またはそれらの組合せから選択される。ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質の細胞内成分は、改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ζ  ＩＴＡＭ含有Ｔ細胞活性化ドメイン、およびＣＤ２７、ＣＤ４０Ｌ、ＧＩＴＲ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＡＲＤ１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ−４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ  ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、ＺＡＰ７０、ＣＤ５、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、またはそれらの組合せから選択される追加の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。具体的な実施形態では、改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ζ  ＩＴＡＭ含有Ｔ細胞活性化ドメイン、および４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインを含む。例示的な４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
【０１１２】
本開示の融合タンパク質は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）、スプリット−ＣＡＲまたはオンスイッチＣＡＲ、細胞内シグナル伝達ドメインに連結された単鎖Ｔ細胞受容体（ｓｃＴＣＲまたはｓｃＴｖ）、またはＴＣＲ−ＣＡＲの形態であってもよい。一部の実施形態では、ＣＡＲは、一般的に、活性化シグナルを提供する単一の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζまたはＦｃγＲＩの細胞内シグナル伝達ドメインまたは他のＩＴＡＭ含有Ｔ細胞活性化ドメイン）を有する。一部の実施形態では、ＣＡＲはさらに、細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、内因性Ｔ細胞の共刺激受容体、例えばＣＤ２８、４−１ＢＢ、またはＩＣＯＳ由来の共刺激シグナル伝達ドメイン）を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲはさらに、第２の共刺激ドメインを含む。ＣＣＲは、設計がＣＡＲと類似しており、共刺激シグナル伝達ドメインを介して共刺激を提供するが、ＩＴＡＭ含有Ｔ細胞活性化ドメインを含まない。ＣＣＲは、適切なヘテロ二量体化剤（例えば、スプリット−ＣＡＲまたはオンスイッチＣＡＲ設計）が投与されたときの集合のための細胞内活性化ドメインおよび対応するヘテロ二量体化ドメインを含むポリペプチドと宿主細胞中で共発現させるためのヘテロ二量体化ドメインをさらに含んでいてもよい。ＴＣＲ−ＣＡＲは、一般的に可溶性ＴＣＲ（ＶαＣαポリペプチド鎖およびＶβＣβポリペプチド鎖）を含むヘテロ二量体の融合タンパク質であり、ＶβＣβポリペプチド鎖は、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達成分に連結されている（例えば、ＩＴＡＭ含有Ｔ細胞活性化ドメインおよび必要に応じて共刺激シグナル伝達ドメインを含む）。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、ｓｃＴＣＲを含む結合ドメイン（Ｖβに連結されたＴＣＲ  Ｖα）、必要に応じた細胞外スペーサー、膜貫通ドメイン、ならびにＴ細胞活性化シグナルを提供する単一の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ  ＩＴＡＭ含有Ｔ細胞活性化ドメイン）および必要に応じて共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞内成分を含む（Ａｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １９：３６５−３７４  （２０１２）；Ｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ６３：１１６３−７６  （２０１４）を参照）。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、病原体由来の抗原、自己免疫疾患関連の抗原、がん抗原、または自己抗原を標的化する結合ドメインを含む。病原体関連または病原体特異的抗原の例としては、ウイルス抗原（例えば、ＨＩＶ抗原、ＨＣＶ抗原、ＨＢＶ抗原、ＣＭＶ抗原、ＨＰＶ抗原、ＥＢＶ抗原、インフルエンザ抗原、呼吸器合胞体ウイルス抗原）、寄生生物抗原、および細菌抗原が挙げられる。がん抗原は、それに対してがん細胞または腫瘍の殺滅を引き起こす細胞媒介性免疫応答を誘発させることが望ましいと予想される臨床的な利益を有するあらゆる抗原であり得る。融合タンパク質によって標的化され得るがん抗原の非限定的な例としては、ＢＣＭＡ、ＣＤ３、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥｐｈＡ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＧＤ２、Ｏ−アセチルＧＤ２、Ｏ−アセチルＧＤ３、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＦＬＴ４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１５１、ＣＡ１２５、ＣＥＡ、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ６Ｒ、ｇｐ１３０、ルイスＡ、ルイスＹ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＨＶＥＭ、ＭＡＧＥ−Ａ（例えば、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、およびＭＡＧＥ−Ａ４を含む）、メソテリン、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫ、ＲＯＲ１、ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ４０、ＣＤ１３７、ＴＷＥＡＫ−Ｒ、ＨＬＡ、ＨＬＡに結合した腫瘍または病原体関連のペプチド、ＨＬＡに結合したｈＴＥＲＴペプチド、ＨＬＡに結合したチロシナーゼペプチド、ＨＬＡに結合したＷＴ−１ペプチド、ＬＴβＲ、ＬＩＦＲβ、ＬＲＰ５、ＭＵＣ１、ＯＳＭＲβ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１７１、ＣＤ２７６、Ｂ７Ｈ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＰＴＣＨ１、ＷＴ−１、ＨＡ１−Ｈ、Ｒｏｂｏ１、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＯＸ４０、ＰＲＡＭＥ、およびＳＳＸ−２が挙げられる。
【０１１４】
本明細書で提供される実施形態のいずれかでは、融合タンパク質は、「ユニバーサルキメラ抗原受容体」であり得る。ユニバーサルＣＡＲは、疾患関連抗原ではなくタグに結合する結合ドメインを含む。ユニバーサルＣＡＲを含む改変された免疫細胞は、疾患関連抗原に結合するタグを有するタンパク質（例えば、疾患関連抗原に結合するタグを有する抗体）を投与することによって、疾患関連抗原に再び方向付けることができる。タグは、タンパク質、ペプチド、小分子、またはハプテンであり得る。例示的なタグとしては、ホルモン由来のペプチド、リガンド由来のペプチド、サイトカイン由来のペプチド、ケモカイン由来のペプチド、増殖因子由来のペプチド、細胞接着分子由来のペプチド、シグナル伝達ペプチド、受容体由来のペプチド、細胞表面ペプチド、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ジニトロフェノール、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体、緑色蛍光タンパク質、ビオチン、フィコエリトリン（ＰＥ）、ヒスチジン、ストレプトアビジン、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、パルミトイル化、ニトロシル化、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、ＤＯＴＡ、ジニトロフェノール、キノン、ビオチン、アニリン、アトラジン、アニリン誘導体、ｏ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノ安息香酸、ヒドララジン、ハロタン、ジゴキシゲニン、ベンゼンアルソネート、ラクトース、トリニトロフェノール、ハプテン、ステロイド、ビタミン、ビタマー、代謝産物、抗生物質、単糖、二糖、脂質、脂肪酸、核酸、アルカロイド、配糖体、フェナジン（ｐｈｅｎｚｉｎｅ）、ポリケチド、テルペン、テトラピロール、およびヒト核タンパク質由来のペプチド（例えば、ヒト核Ｌａタンパク質（Ｅ５Ｂ９））が挙げられる。ユニバーサルＣＡＲならびにその作製および使用方法は当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第９，２３３，１２５号；ＰＣＴ公報第ＷＯ２０１３／０４４２２５号；ＰＣＴ公報第ＷＯ２０１６／１６８７６６号；ＰＣＴ公報第ＷＯ２０１６／１６８７７３号；および米国特許公開第２０１７／０２４０６１２号に記載されており、それらそれぞれに記載のＣＡＲおよび関連方法は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１５】
一部の実施形態では、本開示のＣＡＲは、ＣＤ１９またはＲＯＲ１に特異的な結合ドメインを含む細胞外成分；必要に応じてタグ（すなわち、融合タンパク質がユニバーサルＣＡＲである場合、ユニバーサルＣＡＲと結合するタグと異なるタグ）；免疫グロブリンのヒンジ領域；疎水性部分；ならびにＩＴＡＭ含有Ｔ細胞活性化ドメインおよび改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインまたはそれらの機能的部分を含む細胞内成分を含み、改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能的部分は、Ｌ１８６、Ｌ１８７、Ｙ１９１、Ｙ２０６、Ｙ２０９、Ｙ２１８、Ｐ１９６、Ｐ１９９、Ｐ２０８、およびＰ２１１位の１つまたは複数に本明細書で開示された置換を含む。特定の実施形態では、改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能的部分は、以下の位置：（ａ）Ｌ１８６、Ｌ１８７、およびＹ２１８；（ｂ）Ｌ１８６、Ｌ１８７、Ｙ２０６、Ｙ２０９、およびＹ２１８；（ｃ）Ｌ１８６、Ｌ１８７、Ｙ１９１、Ｙ２０６、Ｙ２０９、およびＹ２１８；（ｄ）Ｌ１８６Ｇ、Ｌ１８７Ｇ、およびＹ２１８Ｆ；（ｅ）Ｌ１８６Ｇ、Ｌ１８７Ｇ、Ｙ２０６Ｆ、Ｙ２０９Ｆ、およびＹ２１８Ｆ；または（ｆ）Ｌ１８６Ｇ、Ｌ１８７Ｇ、Ｙ１９１Ｆ、Ｙ２０６Ｆ、Ｙ２０９Ｆ、およびＹ２１８Ｆに置換を含む。上述の実施形態のいずれかでは、タグは、Ｓｔｒｅｐ  ｔａｇ  ＩＩを含む。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲは、ＦＭＣ６３（抗ＣＤ１９）ｓｃＦｖ、Ｓｔｒｅｐ  ｔａｇ  ＩＩペプチド、変更されたＩｇＧ４のヒンジ領域を含む細胞外成分；ＣＤ２８膜貫通ドメインを含む疎水性部分；Ｌ１８６Ｇ、Ｌ１８７Ｇ、およびＹ２１８Ｆ置換を含む改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびにＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含むＩＴＡＭ含有Ｔ細胞活性化ドメインを含む。このようなＣＡＲ（例えば、ＣＡＲ発現構築物によってコードされたポリペプチド）は、配列番号２７（アミノ酸１〜２２にシグナルペプチドを含む）またはアミノ酸１〜２２を含まない配列番号２７のアミノ酸配列を含んでいてもよい。さらなる実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２７のＴ２ＡおよびｔＥＧＦＲのアミノ酸配列を欠如していてもよい。
【０１１７】
さらなる実施形態では、本開示のＣＡＲは、ＦＭＣ６３（抗ＣＤ１９）ｓｃＦｖ、Ｓｔｒｅｐ  ｔａｇ  ＩＩペプチド、変更されたＩｇＧ４のヒンジ領域を含む細胞外成分；ＣＤ２８膜貫通ドメインを含む疎水性部分；Ｌ１８６Ｇ、Ｌ１８７Ｇ、Ｙ２０６Ｆ、Ｙ２０９Ｆ、およびＹ２１８Ｆ置換を含む改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびにＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含むＩＴＡＭ含有Ｔ細胞活性化ドメインを含む。このようなＣＡＲ（例えば、ＣＡＲ発現構築物によってコードされたポリペプチド）は、配列番号２９（アミノ酸１〜２２にシグナルペプチドを含む）またはアミノ酸１〜２２を含まない配列番号２９のアミノ酸配列を含んでいてもよい。さらなる実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２９のＴ２ＡおよびｔＥＧＦＲのアミノ酸配列を欠如していてもよい。
【０１１８】
よりさらなる実施形態では、本開示のＣＡＲは、ＦＭＣ６３（抗ＣＤ１９）ｓｃＦｖ、Ｓｔｒｅｐ  ｔａｇ  ＩＩペプチド、変更されたＩｇＧ４のヒンジ領域を含む細胞外成分；ＣＤ２８膜貫通ドメインを含む疎水性部分；Ｌ１８６Ｇ、Ｌ１８７Ｇ、Ｙ１９１Ｆ、Ｙ２０６Ｆ、Ｙ２０９Ｆ、およびＹ２１８Ｆ置換を含む改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびにＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含むＩＴＡＭ含有Ｔ細胞活性化ドメインを含む。このようなＣＡＲ（例えば、ＣＡＲ発現構築物によってコードされたポリペプチド）は、配列番号３５（アミノ酸１〜２２にシグナルペプチドを含む）またはアミノ酸１〜２２を含まない配列番号３５のアミノ酸配列を含んでいてもよい。さらなる実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３５のＴ２ＡおよびｔＥＧＦＲのアミノ酸配列を欠如していてもよい。
【０１１９】
よりさらなる実施形態では、本開示のＣＡＲは、Ｒ１２（抗ＲＯＲ１）ｓｃＦｖ、Ｓｔｒｅｐ  ｔａｇ  ＩＩペプチド、変更されたＩｇＧ４のヒンジ領域を含む細胞外成分；ＣＤ２８膜貫通ドメインを含む疎水性部分；Ｌ１８６Ｇ、Ｌ１８７Ｇ、およびＹ２１８Ｆ置換を含む改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびにＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含むＩＴＡＭ含有Ｔ細胞活性化ドメインを含む。このようなＣＡＲ（例えば、ＣＡＲ発現構築物によってコードされたポリペプチド）は、配列番号３１（アミノ酸１〜２２にシグナルペプチドを含む）またはアミノ酸１〜２２を含まない配列番号３１のアミノ酸配列を含んでいてもよい。さらなる実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３１のＴ２ＡおよびｔＥＧＦＲのアミノ酸配列を欠如していてもよい。
【０１２０】
さらなる実施形態では、本開示のＣＡＲは、Ｒ１２（抗ＲＯＲ１）ｓｃＦｖ、Ｓｔｒｅｐ  ｔａｇ  ＩＩペプチド、変更されたＩｇＧ４のヒンジ領域を含む細胞外成分；ＣＤ２８膜貫通ドメインを含む疎水性部分；Ｌ１８６Ｇ、Ｌ１８７Ｇ、Ｙ２０６Ｆ、Ｙ２０９Ｆ、およびＹ２１８Ｆ置換を含む改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびにＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含むＩＴＡＭ含有Ｔ細胞活性化ドメインを含む。このようなＣＡＲ（例えば、ＣＡＲ発現構築物によってコードされたポリペプチド）は、配列番号３３（アミノ酸１〜２２にシグナルペプチドを含む）またはアミノ酸１〜２２を含まない配列番号３３のアミノ酸配列を含んでいてもよい。さらなる実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３３のＴ２ＡおよびｔＥＧＦＲのアミノ酸配列を欠如していてもよい。
【０１２１】
よりさらなる実施形態では、本開示のＣＡＲは、Ｒ１２（抗ＲＯＲ１）ｓｃＦｖ、Ｓｔｒｅｐ  ｔａｇ  ＩＩペプチド、変更されたＩｇＧ４のヒンジ領域を含む細胞外成分；ＣＤ２８膜貫通ドメインを含む疎水性部分；Ｌ１８６Ｇ、Ｌ１８７Ｇ、Ｙ１９１Ｆ、Ｙ２０６Ｆ、Ｙ２０９Ｆ、およびＹ２１８Ｆ置換を含む改変されたＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびにＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含むＩＴＡＭ含有Ｔ細胞活性化ドメインを含む。このようなＣＡＲ（例えば、ＣＡＲ発現構築物によってコードされたポリペプチド）は、配列番号３７（アミノ酸１〜２２にシグナルペプチドを含む）またはアミノ酸１〜２２を含まない配列番号３７のアミノ酸配列を含んでいてもよい。さらなる実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３７のＴ２ＡおよびｔＥＧＦＲのアミノ酸配列を欠如していてもよい。
【０１２２】
一部の実施形態では、本開示のＣＡＲは、配列番号６４〜６９のいずれか１つのアミノ酸配列（配列番号６４〜６９それぞれのアミノ酸１〜２２にシグナルペプチドを含むかまたは含まない）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ配列を含んでいてもよい。
【０１２３】
一部の実施形態では、本開示のＣＡＲ（例えば、ＣＡＲ発現構築物によってコードされたポリペプチド）は、配列番号４９、５１、５３、５５、５７、または５９のいずれか１つのアミノ酸配列（配列番号４９、５１、５３、５５、５７、または５９それぞれのアミノ酸１〜２２にシグナルペプチドを含むかまたは含まない）に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ配列を含んでいてもよい。さらなる実施形態では、ＣＡＲは、配列番号４９、５１、５３、５５、５７、または５９のＴ２ＡおよびｔＥＧＦＲのアミノ酸配列を欠如していてもよい。
【０１２４】
ポリヌクレオチド、ベクター、および宿主細胞
ある特定の態様では、本明細書に記載されるいずれか１つまたは複数の融合タンパク質をコードする核酸分子が提供される。所望の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９  ａｎｄ  ２００１  ｅｄｉｔｉｏｎｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ）およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２００３）に記載されたような、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、およびＤＮＡシーケンシングの使用を含むあらゆる好適な分子生物学の操作技術を使用することによって達成することができる。代替として、目的の配列は、合成的に生産することができる。効率的な転写および翻訳を達成するために、各組換え発現構築物中のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの適切な発現制御配列（調節配列とも称される）、例えばリーダー配列、および特に免疫原をコードするヌクレオチド配列に動作可能に（すなわち、作動可能に）連結されたプロモーターを含む。
【０１２５】
本開示の核酸は、あらゆる形態の一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを指すことができ、アンチセンスＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡなどの、互いに相補的な核酸のプラス鎖およびマイナス鎖を含み得る。またｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、リボザイム、および他の様々なＤＮＡまたはＲＮＡの天然に存在する、または合成の形態も含まれる。
【０１２６】
本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、本開示のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドを含有する宿主細胞における効率的な発現のためにコドン最適化されていてもよい（例えば、Ｓｃｈｏｌｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１９：１３５−１４５  （２００６）を参照）。「コドン最適化された」ポリヌクレオチドは、本明細書で使用される場合、目的の宿主細胞における多量のｔＲＮＡレベルに対応するサイレント変異で改変されたコドンを有する異種ポリヌクレオチドを含む。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、４８、５０、５２、５４、５６、または５８のいずれか１つに記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリヌクレオチドを含み、必要に応じて、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、４８、５０、５２、５４、５６、または５８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含んでいてもよいし、またはそれからなっていてもよい。
【０１２８】
単一のポリヌクレオチド分子は、本明細書で開示された実施形態のいずれかに従って１、２種、またはそれより多くの融合タンパク質をコードしていてもよい。１つより多くの転写物をコードするポリヌクレオチドは、多シストロン性発現のための各転写物間に配置された配列（例えば、ウイルス２Ａペプチドをコードする配列）を含んでいてもよい。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ベクターの１つまたは複数のある特定のエレメントに作動可能に連結されていてもよい。例えば、それらがライゲーションしているコード配列の発現およびプロセシングを実行するのに必要なポリヌクレオチド配列が、作動可能に連結されていてもよい。発現制御配列としては、適切な転写開始、終結、プロモーター、およびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を強化する配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を強化する配列；および場合によってタンパク質の分泌を強化する配列を挙げることができる。発現制御配列は、目的の遺伝子と連続している場合、それと作動可能に連結されていてもよく、発現制御配列は、トランスで、または目的の遺伝子を制御するような距離で作用する。
【０１３０】
ある特定の実施形態は、ベクター中に含有される本開示のポリヌクレオチドを含む。例示的なベクターは、それに連結された別の核酸分子を輸送することが可能な核酸分子、または宿主生物中での複製が可能な核酸分子を含んでいてもよい。ベクターの一部の例としては、プラスミド、ウイルスベクター、コスミドなどが挙げられる。一部のベクターは、それらが導入される宿主細胞中での自律複製が可能なものであってもよいし（例えば細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）、それに対して他のベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれるものでもよいし、または宿主細胞に導入されるときにポリヌクレオチド挿入物の組み込みを促進し、それによって宿主ゲノムと共に複製するものでもよい（例えば、レンチウイルスベクター）。加えて、一部のベクターは、それらが作動可能に連結した遺伝子の発現を指示することが可能である（これらのベクターは、「発現ベクター」と称することもできる）。関連の実施形態によれば、１つまたは複数の作用物質（例えば、本明細書に記載される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）が被験体に共投与される場合、そのそれぞれの作用物質は、別個の、または同じベクターに存在していてもよく、複数のベクター（それぞれ異なる作用物質または同じ作用物質を含有する）が細胞または細胞集団に導入されてもよいし、または被験体に投与されてもよいことがさらに理解される。
【０１３１】
ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、ＲＮＡベクター、または染色体、非染色体、半合成もしくは合成の核酸分子を含み得る直鎖もしくは環状のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子であってもよい。例示的なベクターは、それが連結されている核酸分子の自律複製（エピソームベクター）または発現（発現ベクター）が可能なものである。
【０１３２】
ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えばオルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病および水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）、プラス鎖ＲＮＡウイルス、例えばピコルナウイルスおよびアルファウイルス、ならびに二本鎖ＤＮＡウイルス、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純疱疹ウイルス１型および２型、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘およびカナリア痘瘡）が挙げられる。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては、トリ白血病肉腫、哺乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ群、レンチウイルス、スプーマウイルスが挙げられる（Ｃｏｆｆｉｎ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：  Ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｂ．  Ｎ．  Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ．，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  １９９６）。
【０１３３】
ウイルスベクターは、ある特定の実施形態では、ガンマレトロウイルス、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来のベクターであってもよい。他の実施形態では、ウイルスベクターは、より複雑なレトロウイルス由来のベクター、例えば、レンチウイルス由来のベクターであってもよい。ＨＩＶ−１由来のベクターは、このカテゴリーに属する。他の例としては、ＨＩＶ−２、ＦＩＶ、ウマ伝染性貧血ウイルス、ＳＩＶ、およびマエディビスナウイルス（ヒツジレンチウイルス）由来のレンチウイルスベクターが挙げられる。哺乳動物宿主細胞をＣＡＲ導入遺伝子を含有するウイルス粒子で形質導入するためのレトロウイルスおよびレンチウイルスのウイルスベクターならびにパッケージング細胞の使用方法は当技術分野において公知であり、これまでに、例えば、米国特許第８，１１９，７７２号；Ｗａｌｃｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６：３２７９３０  （２０１１）；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７４：４４１５  （２００５）；Ｅｎｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １４：１１５５  （２００３）；Ｆｒｅｃｈａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  １８：１７４８  （２０１０）；およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５０６：９７  （２００９）で記載されている。レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物および発現系も商業的に入手可能である。ＤＮＡウイルスベクター、例えばアデノウイルスベースのベクターおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースのベクターなど；単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）由来のベクター、例えばアンプリコンベクター、複製欠損ＨＳＶおよび弱毒化ＨＳＶなどを含む他のウイルスベクターも、ポリヌクレオチド送達のために使用することができる（Ｋｒｉｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ５：１５１７  （１９９８））。
【０１３４】
遺伝子治療での使用のために開発された他のベクターも、本開示の組成物および方法と共に使用することができる。このようなベクターとしては、バキュロウイルスおよびα−ウイルス由来のもの（Ｊｏｌｌｙ，  Ｄ  Ｊ．  １９９９．  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ．  ｐｐ．  ２０９−４０  ｉｎ  Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ  Ｔ．  ｅｄ．  Ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ）、またはプラスミドベクター（例えばスリーピングビューティーまたは他のトランスポゾンベクター）が挙げられる。
【０１３５】
効率的な転写および翻訳を達成するために、各組換え発現構築物中のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの適切な発現制御配列（調節配列とも称される）、例えばリーダー配列、および特に免疫原をコードするヌクレオチド配列に動作可能に（すなわち、作動可能に）連結されたプロモーターを含む。
【０１３６】
マーカーは、異種ポリヌクレオチドの発現を、それで形質導入された宿主細胞によって同定またはモニターするのに、または目的の融合タンパク質を発現する細胞を検出するのに使用されることがある。ある特定の実施形態では、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、マーカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。マーカーは、薬物耐性を付与する選択マーカー、または検出可能なマーカー、例えばフローサイトメトリーなどの方法によって検出できる蛍光マーカーまたは細胞表面タンパク質であり得る。ある特定の実施形態では、マーカーをコードするポリヌクレオチドは、免疫グロブリン結合タンパク質または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの３’に配置される。他の実施形態では、マーカーをコードするポリヌクレオチドは、免疫グロブリン結合タンパク質または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’に配置される。例示的なマーカーとしては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ヒトＣＤ２の細胞外ドメイン、トランケート型ヒトＥＧＦＲ（ｈｕＥＧＦＲｔ；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １１８：１２５５  （２０１１）を参照されたい）、トランケート型ヒトＣＤ１９（ｈｕＣＤ１９ｔ）、トランケート型ヒトＣＤ３４（ｈｕＣＤ３４ｔ）；またはトランケート型ヒトＮＧＦＲ（ｈｕＮＧＦＲｔ）が挙げられる。ある特定の実施形態では、コードされたマーカーは、ＥＧＦＲｔ、ＣＤ１９ｔ、ＣＤ３４ｔ、またはＮＧＦＲｔを含む。例示的なトランケート型ヒトＥＧＦＲ配列は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。
【０１３７】
ある特定の実施形態では、ベクターは、自殺遺伝子をさらに含んでいてもよく、自殺遺伝子の発現は、ベクターを含む宿主細胞の死を引き起こす。例えば、一部の場合において、本発明の融合タンパク質の長期の発現は、望ましくない。ベクター中の自殺遺伝子の包含は、被験体における融合タンパク質発現のより精密な制御を可能にする。ある特定の実施形態では、例えば、自殺遺伝子の発現を調節する誘導性プロモーターを使用する場合、自殺遺伝子の発現は誘導性である。具体的な実施形態では、自殺遺伝子は、誘導性カスパーゼ−９遺伝子である（米国付与前特許公報第２０１３／００７１４１４号を参照、そこに記載の自殺遺伝子は、参照により本明細書に組み込まれる）。他の自殺遺伝子としては、医薬品グレードの抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体のためのコンフォメーション的に無傷の結合エピトープ、セツキシマブ（アービタックス）；ＥＧＦＲｔ、カスパーゼポリペプチド（例えば、ｉＣａｓｐ９；Ｓｔｒａａｔｈｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １０５：４２４７−４２５４，  ２００５；Ｄｉ  Ｓｔａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３６５：１６７３−１６８３，  ２０１１；Ｚｈｏｕ  ａｎｄ  Ｂｒｅｎｎｅｒ，  Ｅｘｐ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ｐｉｉ：Ｓ０３０１−４７２Ｘ（１６）３０５１３−６．  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｘｐｈｅｍ．２０１６．０７．０１１）、ＲＱＲ８（Ｐｈｉｌｉｐ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １２４：１２７７−１２８７，  ２０１４）、本明細書で論じられるようなヒトｃ−ｍｙｃタンパク質（Ｍｙｃ）の１０アミノ酸のタグ（Ｋｉｅｂａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０５：６２３−６２８，  ２００８）、およびマーカー／セーフティースイッチポリペプチド、例えばＲＱＲ（ＣＤ２０＋ＣＤ３４；Ｐｈｉｌｉｐ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）のいずれか１つまたは複数をコードする遺伝子が挙げられる。
【０１３８】
ウイルスベクターゲノムが、宿主細胞中で別個の転写物として発現させようとする複数のポリヌクレオチドを含む場合、ウイルスベクターはまた、バイシストロン性または多シストロン性発現を可能にする２つの（またはそれより多くの）転写物間に追加の配列を含んでいてもよい。ウイルスベクターで使用されるこのような配列の例としては、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、フューリン切断部位、ウイルス２Ａペプチド、またはそれらのあらゆる組合せが挙げられる。
【０１３９】
本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、ポリヌクレオチドは、自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含んでいてもよく、自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、マーカーをコードするポリヌクレオチドとの間に配置される。ある特定の実施形態では、自己切断ポリペプチドは、ブタテッショウウイルス−１（Ｐ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス（Ｔ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）、またはそれらのバリアント由来の２Ａペプチドを含む。ある特定の実施形態では、例示的なＴ２Ａペプチド配列は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。２Ａペプチドのさらなる例示的な核酸およびアミノ酸配列は、例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  （ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ  ６：ｅ１８５５６  （２０１１）、そこに記載の２Ａ核酸およびアミノ酸配列は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１４０】
本開示の融合タンパク質は、ある特定の態様では、宿主細胞の表面上で発現させてもよいし、または宿主細胞によって分泌させてもよいし、または宿主細胞から単離してもよい。宿主細胞としては、ベクターの受け入れまたは核酸の取込みまたはタンパク質の発現が可能なあらゆる個々の細胞または細胞培養物を挙げることができる。この用語はまた、遺伝学的または表現型的に同一かまたは異なるかどうかにかかわらず、宿主細胞の後代も包含する。好適な宿主細胞は、ベクターによって決めることができ、その例としては、哺乳動物細胞、動物細胞、ヒト細胞、サル細胞、昆虫細胞、酵母細胞、および細菌細胞を挙げることができる。これらの細胞は、ウイルスベクター、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔、マイクロインジェクション、または他の方法を介した形質転換の使用によってベクターまたは他の物質を取り込むように誘導されてもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：    Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｄ  ｅｄ．  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  １９８９）を参照されたい。
【０１４１】
ベクターに加えて、ある特定の実施形態は、本開示に従って、融合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）をコードする異種ポリヌクレオチド、または融合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）をコードする異種ポリヌクレオチドを含むベクターを含有するように改変された（すなわち、遺伝子操作された）宿主細胞に関する。少なくとも１つの融合タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含む、改変されたまたは遺伝子操作された宿主細胞は、その細胞表面で、少なくとも１つの本開示の融合タンパク質を発現する。改変された宿主細胞は、本開示の、単一のタイプの融合タンパク質、または２つまたはそれより多くの異なるタイプの融合タンパク質を発現することができる。宿主細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで改変されていてもよい。宿主細胞としては、ベクターの受け入れまたは核酸もしくはタンパク質の取込みが可能なあらゆる個々の細胞または細胞培養物、加えてあらゆる後代細胞を挙げることができる。この用語はまた、遺伝学的または表現型的に同一かまたは異なるかどうかにかかわらず、宿主細胞の後代も包含する。好適な宿主細胞は、ベクターによって決めることができ、その例としては、哺乳動物細胞、動物細胞、ヒト細胞、サル細胞、昆虫細胞、酵母細胞、および細菌細胞を挙げることができる。これらの細胞は、ウイルスベクター、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔、マイクロインジェクション、または他の方法を介した形質転換の使用によってベクターまたは他の物質を取り込むように誘導されてもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：    Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｄ  ｅｄ．  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  １９８９）を参照されたい。上述の実施形態のいずれかでは、本開示の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞は、例えば養子免疫療法の手順において、改変された宿主細胞を受ける被験体にとって自己、同種または同系である細胞で構成される。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質を発現するように形質導入された宿主細胞は、造血前駆細胞またはヒト免疫系細胞である。「造血前駆細胞」は、本明細書で使用される場合、造血幹細胞または胎児組織から誘導でき、成熟細胞型（例えば、免疫系細胞）へのさらなる分化が可能な細胞である。例示的な造血前駆細胞としては、ＣＤ２４ＬｏＬｉｎ−ＣＤ１１７＋表現型を有するもの、または胸腺で見出されるもの（胸腺前駆細胞と称される）が挙げられる。
【０１４３】
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、免疫系細胞であり、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−二重陰性Ｔ細胞、γδ  Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞）、ナチュラルキラー細胞（例えば、ＮＫ細胞またはＮＫ−Ｔ細胞）、または樹状細胞などである。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、Ｔ細胞である。Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞（ＴＭ）、幹細胞メモリーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞（ＴＨ）、エフェクターＴ細胞（ＴＥ）、γδ  Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、またはそれらのあらゆる組合せであり得る。ＴＭはさらに、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ、ナイーブＴ細胞と比較した場合、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、およびＣＤ９５の発現の増加、ならびにＣＤ５４ＲＡの発現の減少）、およびエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ、ナイーブＴ細胞またはＴＣＭと比較した場合、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡの発現の減少、およびＣＤ１２７の発現の増加）のサブセットに分けることができる。
【０１４５】
Ｔ細胞は、公知の技術を使用して収集でき、様々な部分集団またはそれらの組合せは、公知の技術によって、例えば抗体に結合する親和性、フローサイトメトリー、または免疫磁気選択によって濃縮または枯渇させることができる。
【０１４６】
Ｔ細胞を所望の核酸でトランスフェクト／形質導入するための方法が記載されており（例えば、米国特許出願公開第２００４／００８７０２５号；米国特許第６，４１０，３１９号；ＰＣＴ公報第ＷＯ２０１４／０３１６８７号；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １３：５４２６  （２００７））、所望の標的特異性を有するＴ細胞を使用する養子移入手順を有するものとして記載されており（例えば、Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎ．  ２０：１２４０  （２００９）；Ｄｏｓｓｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  １７：７４２  （２００９）；Ｔｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １１２：２２６１  （２００８）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １８：７１２  （２００７）；Ｋｕｂａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １０９：２３３１  （２００７）；ＵＳ２０１１／０２４３９７２；ＵＳ２０１１／０１８９１４１；Ｌｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２５：２４３  （２００７）；Ｋａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．  ３：９５ｒａ７３  （２０１１）；Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３６５：７２５−３３  （２０１１））、これらの手法は、本明細書における教示に基づき、本開示の融合タンパク質に方向付けられたものを含めて、ここで開示された実施形態に適合されることが意図される。
【０１４７】
この開示に従ってポリヌクレオチド、ベクター、またはタンパク質を内包する場合、本開示の態様として予期される真核宿主細胞としては、ヒト免疫細胞（例えば、ヒト患者自身の免疫細胞）に加えて、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系（発現された多価結合分子のグリコシル化パターンを改変することが可能な改変されたＣＨＯ細胞など、米国付与前特許公報第２００３／０１１５６１４号を参照）、ＣＯＳ細胞（例えばＣＯＳ−７）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｎ細胞、３Ｔ３細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞、ならびにこの開示によるタンパク質またはペプチドの発現および必要に応じて単離において有用であることが当技術分野において公知の他のあらゆる真核細胞が挙げられる。また、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、ストレプトミセス菌などの原核細胞、またはこの開示によるタンパク質またはペプチドの発現および必要に応じて単離に好適であることが当技術分野において公知のあらゆる原核細胞も予期される。原核細胞からのタンパク質またはペプチドの単離において、特に、封入体からタンパク質を抽出するための当技術分野において公知の技術を使用できることが予期される。本開示の融合タンパク質をグリコシル化する宿主細胞が予期される。
【０１４８】
形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞は、選ばれた宿主細胞の成長に必要な栄養素および他の成分を含有する培養培地中で従来の手順に従って培養される。既定培地および複合培地などの様々な好適な培地が当技術分野において公知であり、その例としては、一般的に、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミンおよびミネラルが挙げられる。培地はまた、必要に応じて増殖因子または血清のような成分を含有していてもよい。成長培地は、一般的に、例えば、発現ベクターに運搬されている、または宿主細胞に共トランスフェクトされた選択可能マーカーによって補完される薬物選択または必須栄養素の欠乏によって、異種ポリヌクレオチドを含有する細胞を選択すると予想される。
【０１４９】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、標的抗原への結合が宿主細胞から活性または応答を惹起するように宿主細胞の表面上で発現される。このような発現されたタンパク質は、Ｔ細胞の結合、活性化または誘導の決定など、さらには抗原特異的なＴ細胞応答の決定などの、宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性をアッセイするための多数の技術分野で容認された手法のいずれかに従って機能的に特徴付けることができる。その例としては、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞のサイトカイン放出、抗原特異的Ｔ細胞の刺激、ＭＨＣ拘束性のＴ細胞刺激、ＣＴＬ活性（例えば、事前にローディングした標的細胞からの５１Ｃｒまたはユーロピウム放出を検出することによって）、Ｔ細胞表現型マーカー発現の変化の決定、およびＴ細胞の機能の他の尺度が挙げられる。これらおよび類似のアッセイを実行するための手順は、例えば、Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ：  Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  １９９８）に見出すことができる。また、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；Ｗｅｉｒ，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡ  （１９８６）；Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｇｉｉ  （ｅｄｓ．）  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ  （１９７９）；Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｒｅｅｄ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１３０９  （１９９８）およびそこで引用された文献も参照されたい。
【０１５０】
サイトカインのレベルは、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、細胞内サイトカイン染色、およびフローサイトメトリーならびにそれらの組合せ（例えば、細胞内サイトカイン染色とフローサイトメトリー）などの、本明細書に記載され、当技術分野で実施される方法に従って決定することができる。免疫応答の抗原特異的な惹起または刺激の結果生じる免疫細胞増殖およびクローン拡大増殖は、リンパ球、例えば末梢血液細胞の試料中の循環性リンパ球またはリンパ節由来の細胞を単離すること、細胞を抗原で刺激すること、および例えばトリチウム化したチミジンの取り込み、または非放射性アッセイ、例えばＭＴＴアッセイなどによって、サイトカイン生産、細胞増殖および／または細胞生存度を測定することによって決定することができる。Ｔｈ１免疫応答とＴｈ２免疫応答とのバランスに対する本明細書に記載される免疫原の作用は、例えば、Ｔｈ１サイトカイン、例えばＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、およびＴＮＦ−β、ならびに２型サイトカイン、例えばＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３のレベルを決定することによって検査することができる。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、内因性遺伝子の発現、例えばＴＣＲ遺伝子、ＨＬＡ遺伝子、β２Ｍ遺伝子、免疫抑制成分の遺伝子（例えば、免疫チェックポイント分子遺伝子）、またはそれらのあらゆる組合せの発現が、改変された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）において阻害される。ある特定の実施形態では、ＴＣＲ遺伝子は、Ｔ細胞受容体α定常（ＴＲＡＣ）遺伝子、Ｔ細胞受容体β定常（ＴＲＢＣ）遺伝子、またはその両方である。ある特定の実施形態では、ＨＬＡ遺伝子は、ＨＬＡクラスＩ遺伝子、ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子、またはその両方である。本明細書で提供される実施形態のいずれかでは、改変された免疫細胞は、免疫応答に関与する１つまたは複数の内因性遺伝子の発現が低減または消失されるように改変されてもよい。例えば、Ｔ細胞は、ＨＬＡ複合体成分、またはＴＣＲもしくはＴＣＲ複合体成分の１つまたは複数のポリペプチドの発現が低減または消失されるように改変されてもよい。理論に拘束されることは望まないが、ある特定の内因的に発現される免疫細胞タンパク質は、改変された免疫細胞を受ける同種の宿主によって外来として認識される場合もあり、それにより、改変された免疫細胞（例えば、ＨＬＡ対立遺伝子）の消失が起こる可能性があり、内因的に発現される受容体（例えば、ＴＣＲ）を介して移植片対宿主病を媒介する可能性があり、宿主細胞による発現に関して本開示の異種融合タンパク質と競合する可能性があり、または本開示の異種発現された融合タンパク質の結合活性に干渉する可能性がある（例えば、非腫瘍関連抗原に結合し、改変された免疫細胞の抗原特異的融合タンパク質が腫瘍関連抗原に特異的に結合することに干渉する内因性ＴＣＲ）。したがって、このような内因性遺伝子またはタンパク質の発現または活性を減少させる、阻害する、または消失させることは、同種の宿主の環境における改変された免疫細胞の活性、寛容、または存続を改善でき、一部の実施形態では、細胞の普遍的な（例えば、ＨＬＡ型に関係なくあらゆるレシピエントへの）投与を可能にする。
【０１５２】
ある特定の実施形態では、免疫抑制成分の遺伝子（例えば、免疫チェックポイント分子遺伝子）の発現は、改変された免疫細胞において阻害される。用語「免疫抑制成分」または「免疫抑制成分」は、本明細書で使用される場合、阻害性シグナルを提供して免疫応答の制御または抑制を助けるための、１種または複数の細胞、タンパク質、分子、化合物または複合体を指す。例えば、免疫抑制成分としては、免疫刺激を部分的もしくは完全にブロックする分子；免疫活性化を減少させる、防止する、もしくは遅延させる分子；または免疫抑制を増加させる、活性化する、もしくは上方調節する分子が挙げられる。例示的な免疫抑制成分の標的としては、免疫チェックポイント分子、例えばＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＶＥＭ、アデノシン、ＧＡＬ９、ＶＩＳＴＡ、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＰＶＲＬ２、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ａ２ａＲ、ＣＤ２４４／２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ−１、ＰＶＲＩＧ／ＣＤ１１２Ｒ；代謝酵素、例えばアルギナーゼ、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）；免疫抑制性サイトカイン、例えばＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−３５；Ｔｒｅｇ細胞、またはそれらのあらゆる組合せが挙げられる。
【０１５３】
ＴＣＲ遺伝子（例えば、ＴＣＲ可変領域またはＴＣＲ定常領域をコードする遺伝子；例えば、Ｔｏｒｉｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｃｉ．  Ｒｅｐ．  ６：２１７５７  （２０１６）；Ｔｏｒｉｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １１９（２４）：５６９７  （２０１２）；およびＴｏｒｉｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １２２（８）：１３４１  （２０１３）を参照、それらに記載の遺伝子編集技術、組成物、および養子細胞療法は、それらの全体が本明細書に取り込まれる）、ＨＬＡ遺伝子（例えば、α１マクログロブリン、α２マクログロブリン、α３マクログロブリン、β１ミクログロブリン、またはβ２ミクログロブリンをコードする遺伝子）、免疫抑制成分の遺伝子、またはそれらのあらゆる組合せの発現は、改変された免疫細胞において、遺伝子レベル、転写レベル、翻訳レベル、またはその両方で、ノックダウン、ノックアウト、または阻害され得る。ＴＣＲ、ＨＬＡ、または免疫抑制成分の遺伝子の発現の例示的な阻害剤としては、阻害性核酸分子およびエンドヌクレアーゼが挙げられる。染色体遺伝子のノックアウトを引き起こす変更としては、例えば、導入されたナンセンス変異（未成熟終止コドンの形成を含む）、ミスセンス変異、遺伝子欠失、および鎖切断、加えて宿主細胞において内因性遺伝子発現を阻害する阻害性核酸分子の異種発現を挙げることができる。
【０１５４】
「阻害性核酸」は、標的遺伝子またはｍＲＮＡ転写物に相補的な配列を有し、標的遺伝子またはｍＲＮＡ転写物の発現を低減することが可能な短い一本鎖または二本鎖の核酸分子を指すか、またはこのような分子をコードするポリヌクレオチドを指す。阻害性核酸分子としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子、およびエンドリボヌクレアーゼによって調製されたｓｉＲＮＡ（ｅｓｉＲＮＡ）分子）が挙げられる。低減された発現は、転写または翻訳のブロック（例えば、立体障害）、標的ｍＲＮＡ転写物の分解、プレｍＲＮＡスプライシング部位のブロック、ｍＲＮＡプロセシングのブロック（例えば、キャッピング、ポリアデニル化）を含む様々なプロセスを介して達成されてもよい。ある特定の実施形態では、阻害性核酸分子は、遺伝子ノックダウン方法のために使用することができる。ＴＣＲ、ＨＬＡ、および免疫抑制成分の遺伝子のゲノムおよびｍＲＮＡ配列は、例えば、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースで公共的に利用可能である。ｍＲＮＡを標的化する阻害性核酸分子を作製するための方法は当技術分野において公知であり、例えば、Ｏｚｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．  ８７：１０８−１１９  （２０１６）に記載されている。阻害性核酸分子を使用して免疫細胞における遺伝子の発現を阻害する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、米国付与前特許公報第２０１２／０３２１６６７号および同第２００７／００３６７７３号；Ｃｏｎｄｏｍｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  １０：ｅ０１３０５１８  （２０１５）；Ｏｈｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  １：２１  （２０１３））に記載されている。
【０１５５】
染色体編集は、例えば、エンドヌクレアーゼを使用して実行することができる。「エンドヌクレアーゼ」は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合の切断を触媒することが可能な酵素を指す。ある特定の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、標的化された遺伝子を切断することによって標的化された遺伝子を不活性化または「ノックアウト」することが可能である。エンドヌクレアーゼは、天然に存在する、組換え、遺伝子改変された、または融合エンドヌクレアーゼであり得る。エンドヌクレアーゼによって引き起こされる核酸鎖の切断は、一般的に、相同組換えまたは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の別個のメカニズムを介して修復される。相同組換え中、ドナー核酸分子は、遺伝子「ノックイン」に使用されて、標的遺伝子を不活性化することができる。ＮＨＥＪは、切断部位においてＤＮＡ配列に、変化、例えば少なくとも１つのヌクレオチドの置換、欠失、または付加をもたらすことが多いエラープローン修復プロセスである。ＮＨＥＪは、標的遺伝子を「ノックアウト」するのに使用することができる。エンドヌクレアーゼの例としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼ、およびメガヌクレアーゼが挙げられる。
【０１５６】
「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」（ＺＦＮ）は、本明細書で使用される場合、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどの非特異的なＤＮＡ切断ドメインに融合したジンクフィンガーＤＮＡ−結合ドメインを含む融合タンパク質を指す。約３０アミノ酸の各ジンクフィンガーモチーフは、約３塩基対のＤＮＡに結合し、ある特定の残基におけるアミノ酸を、三つ組の配列特異性が変更されるように変化させることができる（例えば、Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９０：２２５６−２２６０  （１９９３）；Ｗｏｌｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２８５：１９１７−１９３４  （１９９９）を参照）。所望のＤＮＡ配列、例えば約９から約１８塩基対の範囲の長さを有する領域に対して結合特異性を生じるように、複数のジンクフィンガーモチーフがタンデムで連結されていてもよい。背景の目的で言えば、ＺＦＮは、ゲノム中の部位特異的なＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）の形成を触媒することによってゲノム編集を媒介し、ＤＳＢの部位におけるゲノムに相同な隣接配列を含む導入遺伝子の標的化された統合は、相同組換え修復によって促進される。代替として、ＺＦＮによって生成したＤＳＢは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による修復を介した標的遺伝子のノックアウトをもたらすことができ、これは、切断部位におけるヌクレオチドの挿入または欠失をもたらすエラープローン細胞修復経路である。ある特定の実施形態では、ＴＣＲ遺伝子、ＨＬＡ遺伝子、または免疫抑制成分の遺伝子のノックアウトは、ＺＦＮ分子を使用して作製された挿入、欠失、変異またはそれらの組合せを含む。
【０１５７】
「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ」（ＴＡＬＥＮ）は、本明細書で使用される場合、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ−結合ドメインおよびＤＮＡ切断ドメイン、例えばＦｏｋＩエンドヌクレアーゼを含む融合タンパク質を指す。「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つまたは複数のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位で構成され、これらはそれぞれ、一般的に高度に保存された３３〜３５アミノ酸の配列を有し、１２番目および１３番目のアミノ酸が分岐している。ＴＡＬＥ反復ドメインは、標的ＤＮＡ配列へのＴＡＬＥの結合に関与する。分岐アミノ酸残基、反復可変二残基（Ｒｅｐｅａｔ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ：ＲＶＤ）と称され、特異的なヌクレオチド認識と相関する。これらのＴＡＬＥのＤＮＡ認識のための天然（基準の）コードは、１２および１３位におけるＨＤ配列が、シトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴに、ＮＩがＡに結合し、ＮＮがＧまたはＡに結合し、ＮＧがＴに結合するように決定されており、非基準の（非定型）ＲＶＤも公知である（例えば、米国付与前特許公報第２０１１０３０１０７３号、そこに記載の非定型ＲＶＤは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＴＡＬＥＮは、Ｔ細胞のゲノムにおける部位特異的な二本鎖切断（ＤＳＢ）を指示するのに使用することができる。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、アニーリングのための配列のオーバーラップがほとんどないかまたは全くない二本鎖切断の両方の側からのＤＮＡをライゲーションし、それによって遺伝子発現をノックアウトするエラーを導入する。代替として、相同組換え修復は、ＤＳＢの部位において導入遺伝子を導入でき、導入遺伝子中に相同な隣接配列を提供する。ある特定の実施形態では、ＴＣＲ遺伝子、ＨＬＡ遺伝子、または免疫抑制成分の遺伝子のノックアウトは、ＴＡＬＥＮ分子を使用して作製された挿入、欠失、変異またはそれらの組合せを含む。
【０１５８】
「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート／Ｃａｓ」（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）ヌクレアーゼ系は、本明細書で使用される場合、塩基対形成の相補性を介してゲノム内の標的部位（プロトスペーサーとして公知）を認識し、次いで短い保存されたプロトスペーサー会合モチーフ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｔｉｆ：ＰＡＭ）が相補的標的配列の３’の直後にある場合、ＤＮＡを切断するのに、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）ガイドＣａｓヌクレアーゼを採用する系を指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｃａｓヌクレアーゼの配列および構造に基づいて３つの型（すなわち、Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型）に分類される。ＩおよびＩＩＩ型のｃｒＲＮＡガイドサーベイランス複合体は、複数のＣａｓサブユニットを必要とする。ＩＩ型系は、最も研究されているものであり、少なくとも３つの成分：ＲＮＡガイドＣａｓ９ヌクレアーゼ、ｃｒＲＮＡ、およびトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。ｔｒａｃｒＲＮＡは、二重鎖形成領域を含む。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと相互作用し、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーとＰＡＭ上流の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のワトソン−クリック塩基対形成を介してＣａｓ９／ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を標的ＤＮＡ上の特異的な部位にガイドすることが可能な二重鎖を形成する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ｃｒＲＮＡスペーサーによって画定される領域内の二本鎖切断部分を切断する。ＮＨＥＪによる修復は、標的化された遺伝子座の発現を中断させる挿入および／または欠失をもたらす。代替として、ＤＳＢの部位に、相同組換え修復を介して相同な隣接配列を有する導入遺伝子を導入することができる。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ）に操作されていてもよい（例えば、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６−２１，  ２０１２を参照）。さらに、標的部位に相補的なガイドＲＮＡの領域は、所望の配列を標的化するように変更またはプログラム化することができる（Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ  ９：ｅ１００４４８，  ２０１４；米国付与前特許公開第２０１４／００６８７９７号、米国付与前特許公開第２０１４／０１８６８４３号；米国特許第８，６９７，３５９号、およびＰＣＴ公報第ＷＯ２０１５／０７１４７４号；これらのそれぞれは参照により取り込まれる）。ある特定の実施形態では、ＴＣＲ遺伝子、ＨＬＡ遺伝子、または免疫抑制成分の遺伝子のノックアウトは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系を使用して作製された挿入、欠失、変異またはそれらの組合せを含む。
【０１５９】
「メガヌクレアーゼ」はまた、本明細書で使用される場合、「ホーミングエンドヌクレアーゼ」とも称され、これは、大きい認識部位（約１２から約４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）で特徴付けられるエンドデオキシリボヌクレアーゼを指す。メガヌクレアーゼは、配列および構造モチーフに基づいて５つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ−ＹＩＧ、ＨＮＨ、Ｈｉｓ−ＣｙｓボックスおよびＰＤ−（Ｄ／Ｅ）ＸＫに分けることができる。例示的なメガヌクレアーゼとしては、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられ、それらの認識配列は公知である（例えば、米国特許第５，４２０，０３２号および６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３７９−３３８８，  １９９７；Ｄｕｊｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ８２：１１５−１１８，  １９８９；Ｐｅｒｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：１１２５−１１２７，  １９９４；Ｊａｓｉｎ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  １２：２２４−２２８，  １９９６；Ｇｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６３：１６３−１８０，  １９９６；Ａｒｇａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２８０：３４５−３５３，  １９９８を参照）。ある特定の実施形態では、天然に存在するメガヌクレアーゼは、ＴＣＲ遺伝子、ＨＬＡ遺伝子、または免疫抑制成分の遺伝子の部位特異的なゲノム改変を促進するのに使用することができる。他の実施形態では、ＴＣＲ遺伝子、ＨＬＡ遺伝子、または免疫抑制成分の遺伝子に対して新規の結合特異性を有する操作されたメガヌクレアーゼは、部位特異的なゲノム改変に使用される（例えば、Ｐｏｒｔｅｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３：９６７−７３，  ２００５；Ｓｕｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３４２：３１−４１，  ２００４；Ｅｐｉｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１：２９５２−６２，  ２００３；Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｃｅｌｌ  １０：８９５−９０５，  ２００２；Ａｓｈｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：６５６−６５９，  ２００６；Ｐａｑｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ７：４９−６６，  ２００７；米国付与前特許公報第２００７／０１１７１２８号；同第２００６／０２０６９４９号；同第２００６／０１５３８２６号；同第２００６／００７８５５２号；および同第２００４／０００２０９２号を参照）。
【０１６０】
さらなる実施形態では、本開示の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼ、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼを介して、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）のＴＣＲ遺伝子、ＨＬＡ遺伝子、または免疫抑制成分の遺伝子座に挿入される。理論に拘束されることは望まないが、融合タンパク質をＴＣＲ遺伝子座に標的化することは、融合タンパク質を発現するＴ細胞の抗腫瘍活性を強化することができる（Ｅｙｑｕｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ５４３：１１３−１１７  （２０１７）を参照）。
【０１６１】
他の態様では、（ａ）本明細書に記載されるベクターまたは発現構築物、およびベクターまたは発現構築物を宿主細胞に形質導入するための必要に応じた試薬、（ｂ）本明細書で開示される単離されたポリヌクレオチドもしくは発現ベクター、およびポリヌクレオチドまたは発現ベクターを宿主細胞に形質導入するための必要に応じた試薬、または（ｃ）本開示の宿主細胞を含むキットが提供される。
【０１６２】
処置方法
ある特定の態様では、本開示において提供される組成物は、被験体における疾患を処置するための方法において使用でき、本方法は、融合タンパク質；融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター；融合タンパク質を発現する改変された宿主細胞；またはそれらの医薬組成物を被験体に投与することを含み、疾患は、融合タンパク質に結合した抗原の存在に関連する。ある特定の実施形態では、疾患は、ウイルス感染、細菌感染、がん、炎症性疾患、または自己免疫疾患である。
【０１６３】
用語「がん」は、本明細書において使用される場合、固形腫瘍および血液学的悪性疾患（例えば、白血病）を含む。処置され得る例示的ながんとしては、黒色腫；非小細胞肺がん；腎細胞癌；腎臓がん；血液がん；前立腺がん；去勢抵抗性前立腺がん；結腸がん；直腸がん；胃がん；食道がん；膀胱がん；頭頸部がん；甲状腺がん；乳がん；トリプルネガティブ乳がん；卵巣がん；子宮頸がん；肺がん；尿路上皮がん；膵臓がん；膠芽腫；肝細胞がん；脳がん；ＣＮＳがん；悪性の神経膠腫、肉腫および癌腫、例えば軟骨肉腫など；線維肉腫（線維芽細胞肉腫）；隆起性皮膚線維肉腫（ＤＦＳＰ）；骨肉腫；横紋筋肉腫；ユーイング肉腫；消化管間質腫瘍；平滑筋肉腫；血管肉腫（血管肉腫）；カポジ肉腫；脂肪肉腫；多形肉腫；滑膜肉腫；ＰＮＥＴ；悪性血管内皮腫；悪性神経鞘腫；骨肉腫；胞状軟部肉腫；血管肉腫；葉状嚢肉腫；類腱腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；類上皮肉腫；骨外性軟骨肉腫；骨外性骨肉腫；血管外皮細胞腫；血管肉腫；リンパ管肉腫；リンパ肉腫；未分化多形肉腫；悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）；神経線維肉腫；横紋筋肉腫；未分化多形肉腫；扁平上皮癌；腺癌；腺扁平上皮癌；未分化癌；大細胞癌；小細胞癌；乳癌（例えば、非浸潤性乳管癌（非侵襲性）、上皮内小葉癌（非侵襲性）、侵襲性乳管癌、侵襲性小葉癌、非侵襲性癌腫）；肝臓癌（例えば、肝細胞癌、胆管癌または胆管がん）；肺癌（例えば、腺癌、扁平上皮癌（類表皮癌）、大細胞未分化癌、気管支肺胞上皮癌）；卵巣癌（例えば、表層上皮性−間質性腫瘍（腺癌）または卵巣上皮癌（これは、漿液性腫瘍、類内膜腫瘍および粘液性嚢胞腺癌を含む）、類表皮（扁平上皮癌）、胎児性癌および絨毛癌（胚細胞腫瘍））；腎臓癌（例えば、腎腺癌、グラヴィッツ腫瘍（ｈｙｐｅｒｎｅｐｈｒｏｍａ）、移行上皮癌（腎盂）、扁平上皮癌、ベリニ管癌、明細胞腺癌、移行上皮癌、腎盂のカルチノイド腫瘍）；副腎癌（例えば、副腎皮質癌）、精巣癌（例えば、生殖細胞癌（精上皮腫、絨毛癌、胎児性癌（Ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｃａｒｃｉｒｏｍａ）、奇形癌）、漿液性癌）；胃癌（例えば、腺癌）；腸癌（例えば、十二指腸腺癌）；結腸直腸癌；または皮膚癌（例えば、基底細胞癌、扁平上皮癌）；基底細胞癌、腺癌；形成性胃組織炎；ビポーマ；胆管癌；肝細胞癌；腺様嚢胞癌；腎細胞癌；グラビッツ腫瘍、上衣細胞腫；星細胞腫；乏突起細胞腫；脳幹神経膠腫；視神経膠腫（ｏｐｔｉｃｅ  ｎｅｒｖｅ  ｇｌｉｏｍａ）；卵巣癌、卵巣上皮癌、子宮頸部腺癌または小細胞癌、膵臓癌、結腸直腸癌（例えば、腺癌または扁平上皮癌）、肺癌、乳管癌、前立腺腺癌、軟骨肉腫；線維肉腫（線維芽細胞肉腫）；隆起性皮膚線維肉腫（ＤＦＳＰ）；骨肉腫；横紋筋肉腫；多形肉腫；または滑膜肉腫；肺癌（例えば、腺癌、扁平上皮癌（類表皮癌）；扁平上皮癌；腺癌；腺扁平上皮癌；未分化癌；大細胞癌；小細胞癌；乳癌（例えば、非浸潤性乳管癌（非侵襲性）、上皮内小葉癌（非侵襲性）、侵襲性乳管癌、侵襲性小葉癌、非侵襲性癌腫）；肝臓癌（例えば、肝細胞癌、胆管癌または胆管がん）；大細胞未分化癌、気管支肺胞上皮癌）；卵巣癌（例えば、表層上皮性−間質性腫瘍（腺癌）または卵巣上皮癌（これは、漿液性腫瘍、類内膜腫瘍および粘液性嚢胞腺癌を含む）、類表皮（扁平上皮癌）、胎児性癌および絨毛癌（胚細胞腫瘍））；腎臓癌（例えば、腎腺癌、グラヴィッツ腫瘍、移行上皮癌（腎盂）、扁平上皮癌、ベリニ管癌、明細胞腺癌、移行上皮癌、腎盂のカルチノイド腫瘍）；副腎癌（例えば、副腎皮質癌）、精巣癌（例えば、生殖細胞癌（精上皮腫、絨毛癌、胎児性癌、奇形癌）、漿液性癌）；胃癌（例えば、腺癌）；腸癌（例えば、十二指腸腺癌）；結腸直腸癌；または皮膚癌（例えば、基底細胞癌、扁平上皮癌）；卵巣癌、卵巣上皮癌、子宮頸部腺癌または小細胞癌、膵臓癌、結腸直腸癌（例えば、腺癌または扁平上皮癌）、肺癌、乳管癌、または前立腺腺癌が挙げられる。
【０１６４】
例示的な血液学的悪性疾患としては、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；慢性好酸球性白血病（ＣＥＬ）；骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）；ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）（例えば、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、または慢性リンパ球性白血病）；骨髄腫；多発性骨髄腫（ＭＭ）；形質細胞腫；形質細胞性白血病；ワルデンストレームマクログロブリン血症；Ｂ細胞リンパ腫；リンパ形質細胞性リンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｐｌａｓｍａｃｔｙｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）；バーキットリンパ腫；小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）；濾胞性リンパ腫；免疫芽球性大細胞リンパ腫；前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫；およびマントル細胞リンパ腫；ＣＤ３７＋樹状細胞リンパ腫；リンパ形質細胞性リンパ腫；脾性辺縁帯リンパ腫；粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）の節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫；節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫；縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫；血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫；原発性滲出性リンパ腫；成人Ｔ細胞リンパ腫；節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫；鼻型；腸症関連Ｔ細胞リンパ腫；肝脾Ｔ細胞リンパ腫；芽球型ＮＫ細胞リンパ腫；セザリー症候群、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫；未分化大細胞リンパ腫が挙げられる。
【０１６５】
本明細書で提供される組成物を使用して処置され得る他の疾患としては、ウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＢＫポリオーマウイルス、アデノウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、細菌、および寄生生物などの病原微生物による感染が挙げられる。別の態様では、全身性エリテマトーデス、糖尿病、関節リウマチ、反応性関節炎、多発性硬化症、尋常性天疱瘡、セリアック病、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、および自己免疫性甲状腺疾患などの自己免疫疾患を処置するための方法が提供される。
【０１６６】
ある特定の実施形態では、被験体は、ヒトまたは非ヒト動物、例えば非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、ヤギ、マウス、ラット、ウサギ、モルモットである。一実施形態では、被験体は、ヒト、例えばヒト成人、青年、小児、または乳児である。
【０１６７】
ある特定の実施形態では、被験体に投与される改変された宿主細胞は、自己、同種、または同系である。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、本開示において提供される組成物で処置された被験体は、低いもしくは軽度のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、低いもしくは軽度のＣＡＲ  Ｔ細胞関連脳症症候群（ＣＲＥＳ）、またはその両方を呈示する。ある特定の実施形態では、本開示において提供される組成物で処置された被験体は、参照宿主細胞または組成物が投与された被験体（すなわち、参照被験体または同じ被験体）と比較して、低減されたサイトカイン放出症候群、細胞関連脳症症候群、またはその両方を呈示し、ここで融合タンパク質は、野生型ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【０１６９】
ＣＤ１９特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の臨床適用からのデータは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲは、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲより、患者において重度のＣＲＳを誘導する可能性が高いことを示唆する（Ｄａｖｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．  ６：２２４ｒａ２５  （２０１４）；Ｔｕｒｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １２６：２１２３−２１３８  （２０１６））。本開示によるＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインの改変は、ＣＲＳ、ＣＲＥＳ、またはその両方の発生率または重症度を低減することができ、これは、ある特定の実施形態では、抗腫瘍細胞傷害を保持しながらシグナル伝達およびサイトカイン生産の強度を低減することによって達成することができる。理論に縛られることはないが、ＣＲＳおよびＣＲＥＳは、過剰な炎症を引き起こす深刻なＴ細胞増殖およびサイトカイン放出の結果として発症する。ＣＲＳの症状としては、発熱、倦怠感、筋肉痛、食欲低下、吐き気、頻脈、毛細血管漏出、心臓の機能不全、腎機能障害、肝不全、播種性血管内凝固症候群、低血圧、低酸素症が挙げられ、体内のあらゆる臓器系に影響を与える可能性がある。ＣＲＥＳは、錯乱、せん妄、発作、および脳浮腫で特徴付けられる毒性の脳障害状態である。ＣＲＳは、重度の免疫活性化、リンパ組織球の組織浸潤、および免疫介在性の多臓器不全によって特徴付けられる激症の血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）に発展する可能性がある。高い血漿中のサイトカイン、例えば、インターフェロン−γ；ＩＬ−６；ＩＬ−８；ｓＩＬ−２Ｒα；可溶性糖タンパク質１３０（ｇｐ１３０）；ｓＩＬ−６Ｒ；ＩＬ−１５；ＩＬ−８；ＩＬ−１０；単球走化性タンパク質（ＭＣＰ１）；マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ１）−α；ＭＩＰ１−βおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などが、特にＣＡＲ  Ｔ細胞処置の早期において、重度のＣＲＳと高度に関連する。ＣＲＳの格付けは、発熱、低血圧、低酸素症、および臓器毒性の存在に基づきグレード１から４の範囲であり、重度のＣＲＳは、グレード≧３に割り当てられ、臓器毒性を呈示するか、および／または場合によっては生命を脅かすものであり、積極的な臨床的介入を必要とする。グレード１のＣＲＳは、発熱およびグレード１の臓器毒性として生じる可能性があり、一方でグレード２〜４については、発熱以外の基準のいずれか１つで十分である。ＣＲＥＳは、神経学的な評価スコアおよび頭蓋内圧の上昇の存在、ならびに発作または運動の衰弱に基づき１〜４に格付けされる。ＣＲＳおよびＣＲＥＳを評価するための方法は、当技術分野において公知である（例えば、Ｎｅｅｌａｐｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃ．  １５：４７−６２  （２０１８）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  （２０１４）；ＣＴＣＡＥ  ｖ４．０３）；Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  Ｏｎｃｏｌ．  １１：３５  （２０１８）；およびＬｉｕ  ａｎｄ  Ｚｈａｏ，  Ｊ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  Ｏｎｃｏｌ．  １１：１２１  （２０１８）を参照）、これらの方法および格付けシステムは、参照により本明細書に組���込まれる）。ある特定の実施形態では、本開示で提供される組成物で処置された被験体は、その後、３以上のグレードを有するＣＲＳもＣＲＥＳも示さない。ある特定の実施形態では、低いレベルまたは軽度のＣＲＳまたはＣＲＳは、３未満のグレード、２のグレード、または１のグレードを有するＣＲＳまたはＣＲＥＳを指す。格付けは、あらゆる当技術分野で容認された方法、スケール、または解説、例えば本明細書に記載されるものなどに従っていてもよい。
【０１７０】
抗原特異的なＴ細胞応答は、適切な環境で同族の抗原（例えば、免疫適合性の抗原提示細胞によって提示される場合、Ｔ細胞を刺激または活性化するのに使用される抗原）に曝露されるＴ細胞と、その代わりに構造的に異なるまたは関連性がない対照抗原に曝露される同じ供給源の集団からのＴ細胞との間に生じる可能性がある、本明細書で記載されたＴ細胞の機能的なパラメーター（例えば、増殖、サイトカイン放出、ＣＴＬ活性、変更された細胞表面マーカー表現型など）のいずれかによる観察されたＴ細胞応答の比較によって決定することができる。統計的有意性を有して、対照抗原に対する応答より大きい同族の抗原に対する応答は、抗原特異性を意味する。
【０１７１】
生体試料は、免疫応答の存在およびレベル、例えばＣＡＲまたはＴＣＲを発現するＴ細胞によるサイトカイン放出の存在およびレベルを決定するために、被験体から得ることができる。「生体試料」は、本明細書で使用される場合、血液試料（それから血清または血漿を調製してもよい）、生検検体；体液（例えば、肺洗浄液、腹水、粘膜の洗液、滑液）；骨髄；リンパ節；組織外植片；臓器培養物；または他のあらゆる組織もしくは被験体または生物学的供給源からの細胞調製物であり得る。生体試料はまた、いずれの免疫原性組成物を受ける前に被験体から得てもよく、このような生体試料は、ベースライン（すなわち、免疫化前の）データを確立するための対照として有用である。
【０１７２】
本発明によって処置され得る被験体は、一部の実施形態では、ヒトおよび他の霊長類被験体であり、例えば、獣医学の目的の場合、サルおよび類人猿である。上述の実施形態のいずれかでは、被験体は、ヒト被験体であり得る。被験体は、男性または女性であってもよく、乳児、若年、青年、成人、および老齢の被験体などのあらゆる好適な年齢の被験体であってもよい。本開示による細胞は、医学分野の当業者によって決定される、処置しようとする疾患、状態、または障害に適切な方式で投与することができる。上記実施形態のいずれかでは、本明細書に記載される細胞を含む細胞は、静脈内に、腹腔内に、腫瘍内に、骨髄に、リンパ節に、または脳脊髄液に投与される。組成物の適切な用量、好適な持続時間、および投与の頻度は、患者の年齢、サイズ、性別、および状態；疾患、状態、または障害のタイプおよび重症度；活性成分の特定の形態；ならびに投与方法のような要因によって決定されると予想される。
【０１７３】
本明細書に記載される融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、または改変された宿主細胞は、薬学的もしくは生理学的に許容される、または好適な賦形剤または担体中で被験体に投与することができる。薬学的に許容される賦形剤は、ヒトまたは他の非ヒト哺乳動物被験体への投与に好適な、生体適合性のビヒクル、例えば、生理的食塩水であり、これらは本明細書においてより詳細に記載される。養子細胞療法の状況における治療有効用量は、処置されたヒトまたは非ヒト哺乳動物において、臨床的に所望の結果（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞応答）を統計学的に有意な方式でもたらすことが可能な、養子移入で使用される宿主細胞（本開示による結合タンパク質を発現する）の量である。医療分野において周知の通り、いずれか１人の患者ごとの投与量は、患者のサイズ、体重、体表面積、年齢、投与しようとする具体的な療法、性別、投与の時間および経路、全身の健康状態、ならびに並行して投与される他の薬物などの多くの要因によって決まる。用量は、様々であると予想されるが、本明細書に記載される組換え発現ベクターを含む宿主細胞の投与のための好ましい用量は、細胞約１０５個／ｍ２、細胞約５×１０５個／ｍ２、細胞約１０６個／ｍ２、細胞約５×１０６個／ｍ２、細胞約１０７個／ｍ２、細胞約５×１０７個／ｍ２、細胞約１０８個／ｍ２、細胞約５×１０８個／ｍ２、細胞約１０９個／ｍ２、細胞約５×１０９個／ｍ２、細胞約１０１０個／ｍ２、細胞約５×１０１０個／ｍ２、または細胞約１０１１個／ｍ２である。
【０１７４】
細胞の数は、組成物が意図される最終的な使用に加えて、そこに含まれる細胞のタイプに依存すると予想される。例えば、ある特定の実施形態では、融合タンパク質を含有するように改変された細胞は、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％のこのような細胞を含有する細胞集団を構成すると予想される。本明細書で提供される使用のために、細胞は、一般的に、１リットルまたはそれ未満、５００ｍｌまたはそれ未満、２５０ｍｌまたはそれ未満、または１００ｍｌまたはそれ未満の体積である。実施形態では、所望の細胞の密度は、典型的に細胞１０４個／ｍｌより大きく、一般的に、細胞１０７個／ｍｌより大きく、一般的に細胞１０８個／ｍｌまたはそれより大きい。細胞は、単回の輸注として投与されてもよいし、またはある範囲の時間にわたり複数回の輸注で投与されてもよい。累積的に１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、または１０１１個の細胞に等しいかまたはそれを超える臨床的に関連性のある数の免疫細胞を、複数回の輸注に配分してもよい。
【０１７５】
ある特定の実施形態では、単位用量は、（ｉ）少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の改変された、または改変されていないＣＤ４＋Ｔ細胞を含む組成物と、（ｉｉ）少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の改変された、または改変されていないＣＤ８＋Ｔ細胞を含む組成物との約１：１の比率での組合せを含み、単位用量は、低減された量のナイーブＴ細胞を含むかまたはそれを実質的に含まない（すなわち、単位用量中に存在するナイーブＴ細胞の集団は、同等の数のＰＢＭＣを有する患者試料と比較した場合、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満、または約１％未満である）。
【０１７６】
一部の実施形態では、単位用量は、（ｉ）少なくとも約５０％の改変された、または改変されていないＣＤ４＋Ｔ細胞を含む組成物と、（ｉｉ）少なくとも約５０％の改変された、または改変されていないＣＤ８＋Ｔ細胞を含む組成物との約１：１の比率での組合せを含み、単位用量は、低減された量のナイーブＴ細胞を含むかまたはそれを実質的に含まない。さらなる実施形態では、単位用量は、（ｉ）少なくとも約６０％の改変された、または改変されていないＣＤ４＋Ｔ細胞を含む組成物と、（ｉｉ）少なくとも約６０％の改変された、または改変されていないＣＤ８＋Ｔ細胞を含む組成物との約１：１の比率での組合せを含み、単位用量は、低減された量のナイーブＴ細胞を含むかまたはそれを実質的に含まない。よりさらなる実施形態では、単位用量は、（ｉ）少なくとも約７０％の改変された、または改変されていないＣＤ４＋Ｔ細胞を含む組成物と、（ｉｉ）少なくとも約７０％の改変された、または改変されていないＣＤ８＋Ｔ細胞を含む組成物との約１：１の比率での組合せを含み、単位用量は、低減された量のナイーブＴ細胞を含むかまたはそれを実質的に含まない。一部の実施形態では、単位用量は、（ｉ）少なくとも約８０％の改変された、または改変されていないＣＤ４＋Ｔ細胞を含む組成物と、（ｉｉ）少なくとも約８０％の改変された、または改変されていないＣＤ８＋Ｔ細胞を含む組成物との約１：１の比率での組合せを含み、単位用量は、低減された量のナイーブＴ細胞を含むかまたはそれを実質的に含まない。一部の実施形態では、単位用量は、（ｉ）少なくとも約８５％の改変された、または改変されていないＣＤ４＋Ｔ細胞を含む組成物と、（ｉｉ）少なくとも約８５％の改変された、または改変されていないＣＤ８＋Ｔ細胞を含む組成物との約１：１の比率での組合せを含み、単位用量は、低減された量のナイーブＴ細胞を含むかまたはそれを実質的に含まない。一部の実施形態では、単位用量は、（ｉ）少なくとも約９０％の改変された、または改変されていないＣＤ４＋Ｔ細胞を含む組成物と、（ｉｉ）少なくとも約９０％の改変された、または改変されていないＣＤ８＋Ｔ細胞を含む組成物との約１：１の比率での組合せを含み、単位用量は、低減された量のナイーブＴ細胞を含むかまたはそれを実質的に含まない。
【０１７７】
本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、単位用量は、等しい、またはほぼ等しい数の改変された、または改変されていないＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ３＋ＣＤ８＋および改変された、または改変されていないＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＴＭ細胞を含む。
【０１７８】
また、本明細書で開示される融合タンパク質または融合タンパク質を発現する細胞、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物も予期される。好適な賦形剤としては、水、食塩水、デキストロース、グリセロールなど、およびそれらの組合せが挙げられる。実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質または宿主細胞を含む組成物は、好適な輸注媒体をさらに含む。好適な輸注媒体は、あらゆる等張媒体配合物であってもよく、典型的には、生理食塩液、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ  Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ）またはＰｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ  Ａ（Ｂａｘｔｅｒ）、水中の５％デキストロース、乳酸リンゲル液を利用することができる。輸注媒体は、ヒト血清アルブミンまたは他のヒト血清成分が補充されていてもよい。
【０１７９】
医薬組成物は、医学分野の当業者によって決定される処置（または防止）しようとする疾患または状態に適切な方式で投与することができる。組成物の適切な用量および好適な持続時間および投与の頻度は、患者の健康状態、患者のサイズ（すなわち、体重、大きさ、または体表面積）、患者の疾患のタイプおよび重症度、活性成分の特定の形態、ならびに投与方法のような要因によって決定されると予想される。一般的に、適切な用量および処置レジメンは、治療的および／または予防的な利益（例えば、本明細書に記載されるようなものであり、例えば、臨床転帰の改善、例えばより高頻度の完全もしくは部分寛解、またはより長い無病および／もしくは全生存、または症状重症度の低減など）を提供するのに十分な量で組成物を提供する。予防的使用の場合、用量は、疾患または障害に関連する疾患を防止する、その発症を遅延させる、または疾患または障害に関連する疾患の重症度を低減するのに十分な用量と予想される。本明細書に記載される方法に従って投与される免疫原性組成物の予防的な利益は、前臨床（ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの動物実験を含む）および臨床研究を実行すること、およびそれから得られたデータを、全て当業者により容易に実施することができる適切な統計学的、生物学的および臨床的な方法および技術によって分析することによって決定することができる。
【０１８０】
本明細書に記載される医薬組成物は、単位用量または複数回用量用の容器で、例えば密封したアンプルまたはバイアルで提供されてもよい。このような容器は、配合物の安定性を保つために凍結されてもよい。ある特定の実施形態では、単位用量は、本明細書に記載される組換え宿主細胞を、細胞約１０５個／ｍ２から細胞約１０１１個／ｍ２の用量で含む。様々な処置レジメンで本明細書に記載される特定の組成物を使用するのに好適な投与量および処置レジメンの開発は、例えば、非経口または静脈内の投与または配合物を含む。
【０１８１】
対象組成物が非経口的に投与される場合、組成物はまた、滅菌された水性または油性の溶液または懸濁物を含んでいてもよい。好適な非毒性の非経口的に許容できる希釈剤または溶媒としては、水、リンゲル液、等張塩溶液、１，３−ブタンジオール、エタノール、水との混合物の形態のプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールが挙げられる。水性の溶液または懸濁物は、１種または複数の緩衝化剤、例えば酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウムまたは酒石酸ナトリウムをさらに含んでいてもよい。当然ながら、あらゆる投薬単位配合物の調製で使用されるあらゆる材料が、採用される量で、薬学的に純粋であり、実質的に非毒性であるべきである。加えて、持続放出調製物および配合物に、活性化合物が取り込まれていてもよい。投薬単位形態は、本明細書で使用される場合、処置しようとする被験体のための一体的な投与量として適した物理的に別々の単位を指し、各単位は、適切な医薬用担体と共に、所望の治療作用を生じるように計算された、予め決定された量の組換え細胞または活性化合物を含有していてもよい。
【０１８２】
一般的に、適切な投薬および処置レジメンは、活性な分子または細胞を、治療または予防的な利益を提供するのに十分な量で提供する。このような応答は、処置されていない被験体と比較して、処置された被験体における臨床転帰の改善（例えば、より高頻度の完全または部分寛解、またはより長い無病生存）を確立することによってモニターすることができる。以前から存在する腫瘍タンパク質に対する免疫応答における増加は、一般的に、臨床転帰の改善と相関する。このような免疫応答は、一般的に、処置の前および後に被験体から得られた試料を使用して実行できる標準的な増殖、細胞傷害またはサイトカインアッセイを使用して、評価することができる。
【０１８３】
ある特定の実施形態では、疾患を処置する方法は、改変された免疫細胞を、１種または複数の追加の薬剤と組み合わせて投与することを含む。
【０１８４】
ある特定の実施形態では、本開示の改変された免疫細胞は、免疫抑制成分の阻害剤と共に被験体に投与される。
【０１８５】
用語「免疫抑制成分（ｉｍｍｕｎｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」または「免疫抑制成分（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」は、本明細書で使用される場合、免疫応答の制御または抑制を助けるための阻害性シグナルを提供する、１種または複数の細胞、タンパク質、分子、化合物または複合体を指す。例えば、免疫抑制成分としては、免疫刺激を部分的または完全にブロックする分子；免疫活性化を減少させる、防止する、もしくは遅延させる分子；または免疫抑制を増加させる、活性化する、もしくは上方調節する分子が挙げられる。例示的な免疫抑制成分の標的は、本明細書でさらに詳細に記載されており、その例としては、免疫チェックポイント分子、例えばＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＶＥＭ、アデノシン、ＧＡＬ９、ＶＩＳＴＡ、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＰＶＲＬ２、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ａ２ａＲ、ＣＤ２４４／２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ−１、ＰＶＲＩＧ／ＣＤ１１２Ｒ；代謝酵素、例えばアルギナーゼ、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）；免疫抑制性サイトカイン、例えばＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−３５；Ｔｒｅｇ細胞、またはそれらのあらゆる組合せが挙げられる。
【０１８６】
免疫抑制成分の阻害剤は、化合物、抗体、抗体断片もしくは融合ポリペプチド（例えば、Ｆｃ融合、例えばＣＴＬＡ４−ＦｃまたはＬＡＧ３−Ｆｃ）、アンチセンス分子、リボザイムもしくはＲＮＡｉ分子、または低分子量の有機分子であり得る。本明細書で開示された実施形態のいずれかでは、方法は、改変された免疫細胞を、以下の免疫抑制成分のいずれか１種の１種または複数の阻害剤と共に、単独で、またはあらゆる組合せで投与することを含んでいてもよい。
【０１８７】
ある特定の実施形態では、改変された免疫細胞は、ＰＤ−１阻害剤、例えばＰＤ−１特異的抗体またはその結合断片、例えばピディリズマブ、ニボルマブ（キイトルーダ、以前はＭＤＸ−１１０６）、ペンブロリズマブ（オプジーボ、以前はＭＫ−３４７５）、ＭＥＤＩ０６８０（以前はＡＭＰ−５１４）、ＡＭＰ−２２４、ＢＭＳ−９３６５５８またはそれらのあらゆる組合せと組み合わせて使用される。
【０１８８】
ある特定の実施形態では、改変された免疫細胞は、ＰＤ−Ｌ１特異的抗体またはその結合断片、例えばＢＭＳ−９３６５５９、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、アテゾリズマブ（ＲＧ７４４６）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、またはそれらのあらゆる組合せと組み合わせて使用される。
【０１８９】
ある特定の実施形態では、改変された免疫細胞は、ＬＡＧ３阻害剤、例えばＬＡＧ５２５、ＩＭＰ３２１、ＩＭＰ７０１、９Ｈ１２、ＢＭＳ−９８６０１６、またはそれらのあらゆる組合せと組み合わせて使用される。
【０１９０】
ある特定の実施形態では、改変された免疫細胞は、ＣＴＬＡ４の阻害剤と組み合わせて使用される。特定の実施形態では、改変された免疫細胞は、ＣＴＬＡ４特異的抗体またはその結合断片、例えばイピリムマブ、トレメリムマブ、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質（例えば、アバタセプト、ベラタセプト）、またはそれらのあらゆる組合せと組み合わせて使用される。
【０１９１】
ある特定の実施形態では、改変された免疫細胞は、Ｂ７−Ｈ３特異的抗体またはその抗原結合断片、例えばエノブリツズマブ（ｅｎｏｂｌｉｔｕｚｕｍａｂ）（ＭＧＡ２７１）、３７６．９６、またはその両方と組み合わせて使用される。
【０１９２】
ある特定の実施形態では、改変された免疫細胞は、Ｂ７−Ｈ４特異的抗体またはその結合断片、例えば、例えば、Ｄａｎｇａｊ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７３：４８２０，  ２０１３に記載されているような、ｓｃＦｖまたはその融合タンパク質、加えて米国特許第９，５７４，０００号ならびにＰＣＴ特許公報第ＷＯ２０１６／４０７２４号および同第ＷＯ２０１３／０２５７７９号に記載されているものと組み合わせて使用される。
【０１９３】
一部の実施形態では、改変された免疫細胞は、ＣＤ２４４の阻害剤と組み合わせて使用される。
【０１９４】
ある特定の実施形態では、改変された免疫細胞は、ＢＬＴＡ、ＨＶＥＭ、ＣＤ１６０の阻害剤、またはそれらのあらゆる組合せと組み合わせて使用される。抗ＣＤ１６０抗体は、例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ２０１０／０８４１５８号に記載されている。
【０１９５】
さらなる実施形態では、改変された免疫細胞は、ＴＩＭ３の阻害剤と組み合わせて使用される。
【０１９６】
よりさらなる実施形態では、改変された免疫細胞は、Ｇａｌ９の阻害剤と組み合わせて使用される。
【０１９７】
ある特定の実施形態では、改変された免疫細胞は、アデノシンシグナル伝達の阻害剤、例えばデコイアデノシン受容体と組み合わせて使用される。
【０１９８】
ある特定の実施形態では、改変された免疫細胞は、Ａ２ａＲの阻害剤と組み合わせて使用される。
【０１９９】
ある特定の実施形態では、改変された免疫細胞は、ＫＩＲの阻害剤、例えばリリルマブ（ｌｉｒｉｌｕｍａｂ）（ＢＭＳ−９８６０１５）と組み合わせて使用される。
【０２００】
ある特定の実施形態では、改変された免疫細胞は、阻害性サイトカイン（典型的には、ＴＧＦβ以外のサイトカイン）またはＴｒｅｇの発生または活性の阻害剤と組み合わせて使用される。
【０２０１】
ある特定の実施形態では、改変された免疫細胞は、ＩＤＯ阻害剤、例えばレボ−１−メチルトリプトファン、エパカドスタット（ＩＮＣＢ０２４３６０；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １１５：３５２０−３０，  ２０１０）、エブセレン（Ｔｅｒｅｎｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４９：５９１−６００，  ２０１０）、インドキシモド、ＮＬＧ９１９（Ｍａｕｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０４ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ２０１３；Ａｐｒ  ６−１０，  ２０１３）、１−メチル−トリプトファン（１−ＭＴ）−チラパザミン、またはそれらのあらゆる組合せと組み合わせて使用される。
【０２０２】
ある特定の実施形態では、改変された免疫細胞は、アルギナーゼ阻害剤、例えばＮ（オメガ）−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）、Ｎ−オメガ−ヒドロキシ−ノル−ｌ−アルギニン（ノル−ＮＯＨＡ）、Ｌ−ＮＯＨＡ、２（Ｓ）−アミノ−６−ボロノヘキサン酸（ＡＢＨ）、Ｓ−（２−ボロノエチル）−Ｌ−システイン（ＢＥＣ）、またはそれらのあらゆる組合せと組み合わせて使用される。
【０２０３】
ある特定の実施形態では、改変された免疫細胞は、ＶＩＳＴＡの阻害剤、例えばＣＡ−１７０（Ｃｕｒｉｓ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）と組み合わせて使用される。
【０２０４】
ある特定の実施形態では、改変された免疫細胞は、ＬＡＩＲ１阻害剤と組み合わせて使用される。
【０２０５】
ある特定の実施形態では、改変された免疫細胞は、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ−５の阻害剤、またはそれらのあらゆる組合せと組み合わせて使用される。
【０２０６】
ある特定の実施形態では、改変された免疫細胞は、刺激性免疫チェックポイント分子の活性を増加させる（すなわち、アゴニストである）薬剤と組み合わせて使用される。例えば、改変された免疫細胞は、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）アゴニスト（例えば、ウレルマブなど）、ＣＤ１３４（ＯＸ−４０）アゴニスト（例えば、ＭＥＤＩ６４６９、ＭＥＤＩ６３８３、またはＭＥＤＩ０５６２など）、レナリドマイド、ポマリドマイド、ＣＤ２７アゴニスト（例えば、ＣＤＸ−１１２７など）、ＣＤ２８アゴニスト（例えば、ＴＧＮ１４１２、ＣＤ８０、またはＣＤ８６など）、ＣＤ４０アゴニスト（例えば、ＣＰ−８７０、８９３、ｒｈｕＣＤ４０Ｌ、またはＳＧＮ−４０など）、ＣＤ１２２アゴニスト（例えば、ＩＬ−２など）、ＧＩＴＲのアゴニスト（例えば、ＰＣＴ特許公報第ＷＯ２０１６／０５４６３８号に記載されるヒト化モノクローナル抗体など）、もしくはＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）のアゴニスト（例えば、ＧＳＫ３３５９６０９、ｍＡｂ８８．２、ＪＴＸ−２０１１、Ｉｃｏｓ１４５−１、またはＩｃｏｓ３１４−８など）、またはそれらのあらゆる組合せと組み合わせて使用することができる。本明細書で開示された実施形態のいずれかでは、方法は、改変された免疫細胞を、単独の、またはあらゆる組合せの、前述したもののいずれかなどの刺激性免疫チェックポイント分子の１種または複数のアゴニストと共に投与することを含んでいてもよい。
【０２０７】
他の実施形態では、本開示の方法は、標的化される固形腫瘍によって発現されるがん抗原に特異的な抗体または抗原結合断片；化学療法剤；外科手術；放射線療法処置；サイトカイン；ＲＮＡ干渉療法の１つまたは複数、またはそれらのあらゆる組合せを含む二次療法を投与することをさらに含む。
【０２０８】
がん療法において有用な例示的なモノクローナル抗体としては、例えば、Ｇａｌｌｕｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ５（２４）：１２４７２−１２５０８  （２０１４）（そこに記載の抗体は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるモノクローナル抗体が挙げられる。
【０２０９】
ある特定の実施形態では、併用療法の方法は、改変された免疫細胞を投与すること、および被験体に放射線処置または外科手術をさらに施すことを含む。放射線療法としては、Ｘ線療法、例えばガンマ放射線照射、および放射線医薬療法が挙げられる。所与のがんまたは非炎症性固形腫瘍を処置するのに適切な手術および外科的技術を、本開示の改変された免疫細胞と組み合わせて被験体において使用することができる。
【０２１０】
ある特定の実施形態では、併用療法の方法は、改変された免疫細胞および化学療法剤を被験体に投与することを含む。化学療法剤としては、これらに限定されないが、クロマチン機能の阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管阻害薬、ＤＮＡ傷害剤、代謝拮抗物質（例えば葉酸拮抗剤、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、および糖修飾されたアナログ）、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡ相互作用剤（例えばインターカレート剤）、およびＤＮＡ修復阻害剤が挙げられる。例示的な化学療法剤としては、これらに限定されないが、以下の群：代謝拮抗物質／抗がん剤、例えばピリミジンアナログ（５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビンおよびシタラビン）およびプリンアナログ、葉酸拮抗剤および関連の阻害剤（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチンおよび２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））；抗増殖剤／抗有糸分裂剤、例えば、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン）、微小管破壊剤、例えばタキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロンおよびナベルビン、エピジポドフィロトキシン（エトポシド、テニポシド）、ＤＮＡ傷害剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン（ｍｅｒｃｈｌｏｒｅｈｔａｍｉｎｅ）、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌａｍｉｄｅ）、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびエトポシド（ＶＰ１６））など；抗生物質、例えばダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）およびマイトマイシン；酵素（Ｌ−アスパラギンを全身代謝し、それ自体のアスパラギンを合成する能力を有さない細胞を枯渇させるＬ−アスパラギナーゼ）；抗血小板剤；抗増殖剤／抗有糸分裂性アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミドおよびアナログ、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミンおよびメチルメラミン（ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）、アルキルスルホネートであるブスルファン、ニトロソウレア（カルムスチン（ＢＣＮＵ）およびアナログ、ストレプトゾシン）、トリアゼン類（ｔｒａｚｅｎｅｓ）であるダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｉｎｅ）（ＤＴＩＣ）；抗増殖性／抗有糸分裂性の代謝拮抗物質、例えば葉酸アナログ（メトトレキセート）；白金配位錯体（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモンアナログ（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）およびアロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝血剤（ヘパリン、合成ヘパリン塩および他のトロンビン阻害剤）；線維素溶解剤（例えば組織プラスミノゲン活性化因子、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼ）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗遊走剤（ａｎｔｉｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）；抗分泌剤（ブレフェルジン（ｂｒｅｖｅｌｄｉｎ））；免疫抑制剤（シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）；抗血管新生化合物（ＴＮＰ４７０、ゲニステイン）および増殖因子阻害剤（血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）阻害剤）；アンジオテンシン受容体ブロッカー；酸化窒素供与体；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（トラスツズマブ、リツキシマブ）；キメラ抗原受容体；細胞周期阻害剤および分化誘導物質（トレチノイン）；ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド（ｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）およびミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン）、コルチコステロイド（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン（ｍｅｔｈｙｌｐｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、プレドニゾン、およびプレドニゾロン（ｐｒｅｎｉｓｏｌｏｎｅ））；増殖因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能不全誘導物質（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｒ）、コレラ毒素、リシン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのアデニル酸シクラーゼ毒素、またはジフテリア毒素などの毒素、およびカスパーゼ活性化剤；ならびにクロマチン破壊剤が挙げられる。
【０２１１】
サイトカインは、抗がん活性に対する宿主免疫応答を操作するのに使用することができる。例えば、Ｆｌｏｒｏｓ  ａｎｄ  Ｔａｒｈｉｎｉ，  Ｓｅｍｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ４２：５３９，  ２０１５を参照されたい。抗がんまたは抗腫瘍応答を促進するのに有用なサイトカインとしては、例えば、単独の、またはあらゆる組合せでの、ＩＦＮ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２４、およびＧＭ−ＣＳＦが挙げられる。
【０２１２】
別のがん療法アプローチは、がん細胞による成長、維持、増殖、および免疫回避に必要な癌遺伝子および他の遺伝子の発現を低減することを含む。ＲＮＡ干渉、および特にマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用は、がん遺伝子の発現をノックダウンするためのアプローチを提供する。例えば、Ｌａｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．  Ｒｅｖ．  １６：１２８，  ２０１７を参照されたい。
【０２１３】
本明細書で開示された実施形態のいずれかでは、治療剤（例えば、改変された免疫細胞、免疫抑制成分の阻害剤、刺激性免疫チェックポイント分子のアゴニスト、化学療法剤、放射線療法、外科手術、サイトカイン、または阻害性ＲＮＡ）のいずれかは、処置経過にわたり、１回で投与してもよいし、または１回より多く被験体に投与してもよく、組合せの形態の場合、あらゆる順番で（例えば、同時に、並行して、またはあらゆる順序で）、またはあらゆる組合せで被験体に投与してもよい。組成物の適切な用量、好適な持続時間、および投与の頻度は、患者の状態；腫瘍またはがんのサイズ、タイプ、伝播、成長、および重症度；活性成分の特定の形態；ならびに投与方法のような要因によって決定されると予想される。
【０２１４】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される改変された免疫細胞の複数の用量が被験体に投与され、これは、約２から約４週間の投与間の間隔で投与されてもよい。さらなる実施形態では、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１）は、逐次的に投与され、ただしサイトカイン投与の前に、被験体には組換え宿主細胞が少なくとも３回または４回投与された。ある特定の実施形態では、サイトカインは、宿主細胞と同時に投与される。ある特定の実施形態では、サイトカインは、皮下に投与される。
【０２１５】
よりさらなる実施形態では、処置されている被験体は、免疫抑制療法、例えばカルシニューリン阻害剤、コルチコステロイド、微小管阻害剤、低用量のミコフェノール酸プロドラッグ、またはそれらのあらゆる組合せをさらに受けている。よりさらなる実施形態では、処置されている被験体は、骨髄非破壊的または骨髄破壊的な造血細胞移植を受けたことがあり、この場合、処置は、骨髄非破壊的な造血細胞移植の少なくとも２ヶ月後から少なくとも３ヶ月後に施され得る。
【０２１６】
有効量の治療または医薬組成物は、投薬のとき、および必要な期間にわたり、本明細書に記載されるような所望の臨床結果または有益な処置を達成するのに十分な量を指す。有効量は、１つまたは複数の投与で送達することができる。投与が、疾患または疾患状態を有することがすでにわかっているかまたは確認された被験体に対する場合、用語「治療量」は、処置に関して使用することができ、それに対して「予防有効量」は、疾患または疾患状態（例えば、再発）を発症しやすいかまたはそのリスクがある被験体に、防止的な過程として有効量を投与することを述べるのに使用することができる。
【実施例】
【０２１７】
（実施例１）
材料および方法
健康なドナーからの末梢血Ｔ細胞の獲得
健康な成人（＞１８歳）を、施設内倫理審査委員会によって承認された末梢血液収集に関する研究に登録した。インフォームドコンセントを全ての登録者から得た。研究参加者に関する全ての個人を特定できる情報に対して研究者を盲検化し、ドナーの年齢と特徴を示さないドナーＩＤ番号のみを提供した。静脈穿刺によって４００ｃｃの末梢血液を収集し、リンパ球分離培地（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号２５−０７２−ＣＶ）を使用した密度勾配によって単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号１７９５２および１７９５３）を使用して、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、ＣＤ６２Ｌ−ＰＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号１２−０６２９−４２）での染色、それに続くＥａｓｙＳｅｐヒトＰＥ選択キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号１８５５１によって、ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞をさらに濃縮した。単離を製造元の指示に従って実行した。
【０２１８】
細胞培養
２９３Ｔ  ＬｅｎｔｉＸ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈカタログ番号６３２１８０）を、１０％ウシ胎仔血清、１ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、および１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。Ｋ５６２（ＣＣＬ−２４３）およびＪｕｒｋａｔ（ＴＩＢ−１５２）細胞をＡＴＣＣから得て、５％ウシ胎仔血清および１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。初代ヒトＴ細胞を、１０％ヒト血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン、５０μＭのβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、および５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ  Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ／アルデスロイキン）が補充されたＲＰＭＩ−１６４０からなるＣＴＬ培地中で培養した。全ての細胞を３７℃および５％ＣＯ２で培養し、２ヶ月に１回、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔマイコプラスマ検出キット（Ｌｏｎｚａカタログ番号ＬＴ０７−３１８）を使用してマイコプラスマの非存在に関して試験した。
【０２１９】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および組換えレンチウイルスベクターの生成
ＣＤ１９特異的およびＲＯＲ１特異的なＣＡＲ構築物は、これまでに記載されている（Ｈｕｄｅｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １９：３１５３−３１６４  （２０１３）；  Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ３０：４９２−５００  （２０１６）（図１Ａ）。単一のＳｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ配列（配列番号１０）および２つのＧ４Ｓリンカーを、ＦＭＣ６３（配列番号８）またはＲ１２単鎖可変断片（配列番号９）とＩｇＧ４のヒンジ配列（配列番号１２）との間に挿入した（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３４：４３０−４３４  （２０１６））。これらを、ヒトＣＤ２８の２７アミノ酸の膜貫通ドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ１０７４７；配列番号１３）に、さらに、（ｉ）天然ＣＤ２８タンパク質の１８６〜１８７位に配置されたＬＬからＧＧの置換を有するヒトＣＤ２８の４１アミノ酸の細胞質ドメイン（Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １０２：４３２０−４３２５  （２００３）（配列番号３）、または（ｉｉ）ヒト４−１ＢＢの４２アミノ酸の細胞質ドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ０７０１１；配列番号１４）のいずれかを含むシグナル伝達モジュールに連結し、これらのそれぞれを、ヒトＣＤ３ζのアイソフォーム３の１１２アミノ酸の細胞質ドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ２０９６３−３；配列番号１５）に連結した。ＣＤ２８のＵｎｉＰｒｏｔ位置２０６、２０９、および２１８においてチロシンからフェニルアラニンへの置換を有する変異体ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲを部位特異的変異誘発によって生成した。全てのＣＡＲ遺伝子構築物を、Ｔ２Ａ（配列番号１６）をコードする配列によってトランケート型上皮増殖因子受容体をコードする配列（ＥＧＦＲｔ；配列番号１７）に連結し、コドン最適化し、ＨＩＶ７レンチウイルスベクターにクローニングした。抗原陽性Ｋ５６２細胞を作製するために、ヒトＣＤ１９のアミノ酸１〜３２５（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ１５３９１）をＨＩＶ７レンチウイルスベクターにクローニングし、ヒトＲＯＲ１のアミノ酸１〜９３７（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ０１９７３）をｍｐ７１レトロウイルスベクターにクローニングした。全てのクローニングを、ＰＣＲ、酵素消化、および／またはギブソンアセンブリによって実行した。プラスミドをキャピラリーシーケンシングおよび制限酵素消化によって検証した。
【０２２０】
レンチウイルスの調製および形質導入
ＣＡＲ  Ｔ細胞を調製するために、ＬｅｎｔｉＸ細胞を、ＨＩＶ７  ＣＡＲベクター、加えてｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅカタログ番号１２２６０）およびｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅカタログ番号１２２５９）パッケージングプラスミドを用いて一時的にトランスフェクトした。１日後（１日目）、初代Ｔ細胞をＤｙｎａｂｅａｄｓヒトＴ−活性化剤ＣＤ３／ＣＤ２８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号１１１３２Ｄ）を使用して活性化し、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２が補充されたＣＴＬ中で培養した。次の日（２日目）、レンチウイルスの上清をＬｅｎｔｉＸ細胞から回収し、０．４５μｍのＰＥＳシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号ＳＬＨＰ０３３ＲＢ）を使用してろ過し、活性化されたＴ細胞に添加した。ポリブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号ＴＲ−１００３−Ｇ）を添加して、４．４μｇ／ｍＬの最終濃度にし、細胞を８００×ｇおよび３２℃で９０分、スピン接種（ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ）した。８時間後にウイルス上清を５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２が補充された新しいＣＴＬと交換した。次いで４８時間毎に、半分の培地交換を、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２が補充されたＣＴＬを使用して行った。６日目にＤｙｎａｂｅａｄｓを除去した、９日目に、ＣＤ８＋ＥＧＦＲｔ＋形質導入Ｔ細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＦＡＣＳ選別した。
【０２２１】
Ｋ５６２／ＣＤ１９細胞を調製するために、ＬｅｎｔｉＸ細胞を、ｐｓＰＡＸ２、ｐＭＤ２．Ｇ、およびＣＤ１９をコードするＨＩＶ７レンチウイルスベクターで一時的にトランスフェクトした。Ｋ５６２／ＲＯＲ１細胞を調製するために、ＬｅｎｔｉＸ細胞を、ＭＬＶｇ／ｐ、１０Ａ１、およびＲＯＲ１をコードするｍｐ７１レトロウイルスベクターで一時的にトランスフェクトした（Ｕｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １１：１００５−１０１４  （２０００））。２日後、ウイルス上清を、０．４５μｍのＰＥＳシリンジフィルターを使用してろ過し、Ｋ５６２細胞に添加した。５日後、形質導入されたＫ５６２細胞を、ＣＤ１９に特異的なモノクローナル抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３０２２１２）またはＲＯＲ１に特異的なモノクローナル抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃカタログ番号１３０−０９８−３１７）で染色し、ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩでＦＡＣＳ選別した。
【０２２２】
質量分析および機能分析のためのＴ細胞の拡大増殖
ＭＳおよび／または機能分析の前に、ＦＡＣＳ選別したＣＤ８＋ＥＧＦＲｔ＋細胞を単回の刺激サイクルにわたり拡大増殖した。ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋リンパ芽球様細胞系（ＬＣＬ）との、１：７（Ｔ細胞：ＬＣＬ）の比率での共培養によって拡大増殖させ、刺激の８日後にアッセイした。ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を、精製したＯＫＴ３、ＬＣＬ、放射線照射したＰＢＭＣを含有する迅速拡大増殖プロトコールを使用して拡大増殖させ、刺激の１１日後にアッセイした。拡大増殖中、２〜３日毎に、培養物に５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含有する新しいＣＴＬ培地を供給した。
【０２２３】
フローサイトメトリーおよび細胞表現型決定
Ｔ細胞を、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、またはＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した１：１００希釈のフルオロフォアコンジュゲートモノクローナル抗体で染色した。セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）および３Ｅ８（抗ＳＴＩＩ、ＦＨＣＲＣ）ｍＡｂを、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ビオチンキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号２１２１７）を使用してビオチン化し、続いてＺｅｂａ  Ｓｐｉｎ脱塩カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号８９８８２）でクリーニングし、これを、ストレプトアビジン−ＡＰＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号１７−４３１７−８２）と共にＴ細胞を染色するのに使用した。Ｔ細胞を７０％の氷冷エタノールで固定し、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ８７８７）で細胞を透過化し、１００μｇ／ｍＬのＲＮアーゼＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号ＥＮ０５３１）でＲＮＡを分解し、２０μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号Ｐ３５６６）でＤＮＡを染色することによって、ＤＮＡ含量の染色を実行した。全てのデータをＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に収集し、ＦｌｏｗＪｏバージョン９（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）で分析した。
【０２２４】
抗ＳＴＩＩおよび対照ビーズの調製
１ｍＬのストレプトアビジンでコーティングした磁気粒子（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈカタログ番号ＳＶＭＳ−３０−１０）を、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＢＳ＋Ｐ／Ｓ）が補充された過量の１×ＰＢＳ中で卓上型の磁石を使用して１回洗浄した。１ｍＬのＰＢＳ＋Ｐ／Ｓ中にビーズペレットを再懸濁することによって、抗ＳＴＩＩビーズを調製した。ボルテックスで混合しながら、１ｍＬのビーズ当たり１６．６７μｇの抗ＳＴＩＩ  ｍＡｂ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔカタログ番号Ａ０１７３７）を添加した。ビーズおよび抗ＳＴＩＩ抗体を３Ｄオービタルシェーカー上で終夜インキュベートし、卓上型の磁石を使用して過量のＰＢＳ＋Ｐ／Ｓで３回洗浄し、４ｍＬのＰＢＳ＋Ｐ／Ｓ中に再懸濁した。対照ビーズを作製するために、１ｍＬのストレプトアビジンでコーティングされた磁気粒子を、卓上型の磁石を使用して１回洗浄し、ビーズペレットを４ｍＬのＰＢＳ＋Ｐ／Ｓ中に再懸濁した。全てのビーズを４℃で貯蔵した。
【０２２５】
細胞刺激、タンパク質溶解産物、およびＲＮＡ単離
ＣＡＲ  ＴまたはＪｕｒｋａｔ細胞を洗浄し、温かいＣＴＬ培地中に再懸濁した。ＯＫＴ３刺激のために、細胞を、１．２５μｇ／ｍＬのＯＫＴ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３１７３０３）と共に氷上で５分、次いで、５μｇ／ｍＬの抗マウスＩｇＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号Ａ１６０６８）と共に氷上で１０分インキュベートした。細胞を３７℃の水浴に移して、シグナル伝達を開始させた。Ｋ５６２細胞ベースの刺激のために、ＣＡＲ  Ｔ細胞を、３７℃の水浴中、４：１のエフェクターと標的との比率で、Ｋ５６２またはＫ５６２／ＣＤ１９細胞と共培養した。ビーズベースの刺激のために、Ｔ細胞を、３７℃の水浴中、細胞１×１０６個当たり３０μＬのビーズの比率で、ＳＴＩＩまたは対照マイクロビーズと共にインキュベートした（図１Ｂ）。配分された時間の後、細胞を、氷冷ＰＢＳを使用して２回迅速に洗浄し、次いで、１：１００希釈での、プロテアーゼ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ８３４０−１ＭＬ）およびホスファターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ５７２６−１ＭＬおよびＰ００４４−１ＭＬ）が補充された、６Ｍの尿素、２５ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ溶液中で溶解させた。これをここでは溶解緩衝液と称する。溶解産物を１５秒間超音波処理し、その後、１０，０００×ｇおよび４℃で１０分遠心分離した。溶解産物の清澄化中にビーズを除去した。６時間の刺激の後、ＲＮＡ単離を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌカタログ番号７４０９５５）を製造元の指示に従って使用して実行した。細胞溶解の前に、卓上型の磁石を使用してビーズを除去した。
【０２２６】
タンパク質消化、ＴＭＴ標識化、およびホスホチロシン（ｐＴｙｒ）ペプチド免疫沈降
溶解産物中のタンパク質をマイクロＢＣＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号２３２３５）によって定量化し、溶解産物を、溶解緩衝液を使用して２ｍｇ／ｍＬに希釈した。溶解産物を、振盪しながら、３７℃で３０分、２４ｍＭのＴＣＥＰ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号７７７２０）中で還元し、続いて、暗所で、室温で３０分、４８ｍＭのヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ３２２１）でアルキル化した。次いで溶解産物を、２００ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）で２Ｍの尿素濃度に希釈した。Ｌｙｓ−Ｃ（Ｗａｋｏカタログ番号１２５−０５０６１）を、２５ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）中に２００ｕｇ／ｍＬで溶解し、１：１００（酵素：タンパク質）の質量比で溶解産物に添加し、振盪しながら、３７℃で２時間インキュベートした。試料をさらに２００ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）で１Ｍの尿素濃度に希釈し、その後、１：５０のトリプシン：タンパク質の比率でトリプシンを添加した。２時間後、第２のトリプシンアリコートを、１：１００のトリプシン：タンパク質の比率で添加した。消化を、振盪しながら３７℃で終夜行った。１６時間後、１体積％の最終濃度までのギ酸で、反応をクエンチした。Ｏａｓｉｓ  ＨＬＢ  ９６−ウェルプレート（Ｗａｔｅｒｓカタログ番号ＷＡＴ０５８９５１）および正圧マニホールド（Ｗａｔｅｒｓカタログ番号１８６００５５２１）を使用して試料を脱塩した。プレートのウェルを、３×４００μＬの５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＦＡで洗浄し、次いで４×４００μＬの０．１％ＦＡで平衡化した。消化物をウェルに適用し、次いで４×４００μＬの０．１％ＦＡで洗浄し、その後、３×４００μＬの５０％ＭｅＣＮ／０．１％ＦＡを一滴ずつ用いて溶出させた。溶出液を凍結乾燥し、続いて使用まで−８０℃で貯蔵した。ＴＭＴ標識化（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号９０４０６）のために、脱塩したペプチドを、開始タンパク質質量に基づき１ｍｇ／ｍＬで５０ｍＭのＨＥＰＥＳ中に再懸濁した。ＴＭＴ試薬を２５７μＬのＭｅＣＮ中に再懸濁し、ペプチド試料に移した。試料を室温で混合しながら１時間インキュベートした。標識化反応を、５０μＬの５％ヒドロキシルアミン（Ｓｉｇｍａカタログ番号４３８２２７）の添加によってクエンチし、混合しながら室温で１５分インキュベートした。次いで独立した標識化反応物を一緒にプールし、凍結乾燥した。標識されたペプチドを上述した通りに脱塩し、次いで凍結乾燥し、−８０℃で貯蔵した。次いで、ｐＴｙｒペプチド（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇカタログ番号８８０３）の免疫沈降を製造元の指示の通りに実行した。濃縮されたｐＴｙｒペプチド画分を、Ｃ１８  Ｓｐｉｎ  Ｔｉｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号８４８５０）を使用して精製し、凍結乾燥し、分析まで−８０℃で貯蔵した。フロースルー画分を脱塩し、凍結乾燥し、−８０℃で貯蔵した。
【０２２７】
塩基性（高ｐＨ）逆相液体クロマトグラフィー
脱塩したｐＴｙｒペプチド枯渇フロースルーを、高ｐＨ逆相（ＲＰ）液体クロマトグラフィーによって分画した。４ｍｇのタンパク質消化物を、５ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ１０）（Ａ）および９０％ＭｅＣＮ中の５ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ１０）（Ｂ）の移動相を有するＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣからなるＬＣシステム上にローディングした。４．６ｍｍ×２５０ｍｍのＺｏｒｂａｘ  Ｅｘｔｅｎｄ−Ｃ１８、３．５μｍのカラム（Ａｇｉｌｅｎｔカタログ番号７７０９５３−９０２）によって、９６分にわたり、１．０ｍＬ／分の流量で、以下のタイムテーブルによってペプチドを分離した：０％のＢで９分の保持、４分にわたり０から１０％のＢ、５０分にわたり１０から２８．５％のＢ、５．５分にわたり２８．５から３４％のＢ、１３分にわたり３４から６０％のＢの勾配、８．５分にわたり６０％のＢでの保持、１分にわたり６０から０％のＢ、５分にわたり０％のＢでの再平衡化。１分間の画分を、１ｍＬのディープウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏカタログ番号９５０４０４５０）中の列ごとの最短経路で０〜９６分にわたり収集した。高ｐＨ  ＲＰ画分を、１５分目から開始して、１つおきのプレートカラムにつき２４個の試料に結び付けた（例えば、試料１は、ウェルＢ１０、Ｄ１０、Ｆ１０などからの画分を含有していた）。１２分から１４分の画分が試料１に加えられ、８６分後の全ての画分が試料２４に加えられ、０分から１１分の全ての画分が試料「Ａ」に合わされるように、残りの画分を合わせた。２４個の試料の１２番目毎の画分のうちの９５％を合わせて（１、１３；２、１４；・・・）、１２個のさらなる試料を生成し、これを完全に乾かし、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによるホスホペプチド濃縮の前に−８０℃で貯蔵した。
【０２２８】
固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）
ＥＤＴＡでストリッピングしたＮｉ−ＮＴＡ−アガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号３６１１３）を使用してＩＭＡＣ濃縮を実行し、１０ｍＭのＦｅＣｌ３溶液中でインキュベートして、Ｆｅ３＋−ＮＴＡ−アガロースビーズを調製した。分画した溶解産物を、８０％ＭｅＣＮ中の２００μＬの０．１％ＴＦＡ中に再構成し、１００μＬの５％ビーズ懸濁物と共に室温で混合しながら３０分インキュベートした。インキュベーションの後、ビーズを、８０％ＭｅＣＮ中の３００μＬの０．１％ＴＦＡで３回洗浄した。リン酸化されたペプチドを、２００μＬの７０％ＡＣＮ、１％水酸化アンモニウムを使用して、室温でかき混ぜながら１分にわたりビーズから溶出させた。試料を、６０ｕＬの１０％ＦＡを含有する新しいチューブに移し、完全に乾かし、０．１％ＦＡ、３％ＭｅＣＮ中に再懸濁した。試料を分析まで−８０℃で凍結した。
【０２２９】
ナノ液体クロマトグラフィータンデム質量分析
ホスホペプチド濃縮試料を、陽イオンモードで作動させたＬＴＱ−オービトラップフュージョン質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）にカップリングしたＥａｓｙ−ｎＬＣ１０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でのＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。ＬＣシステムは、排気様式で構成されており、社内でＲｅｐｒｏＳｉｌ−Ｐｕｒ  Ｃ１８−ＡＱ、３μｍを充填した、石英ガラスナノスプレーニードル（ＰｉｃｏＴｉｐ（商標）エミッター、５０μｍのＩＤ×２０ｃｍ、Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）、および分析カラムと同じ樹脂を含有するトラップ（ＩｎｔｅｇｒａＦｒｉｔ（商標）キャピラリー、１００μｍのＩＤ×２ｃｍ、Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）からなっており、水中の０．１％ＦＡ（Ａ）およびＭｅＣＮ中の０．１％ＦＡ（Ｂ）の移動相を用いた。ペプチド試料を２０μＬの０．１％ＦＡ、３％ＭｅＣＮで希釈し、８．５μＬをカラム上にローディングし、２１０分にわたり、３００ｎＬ／分の流量で、２分にわたり５から７％のＢ、１５０分にわたり７から３５％のＢ、１分にわたり３５から５０％のＢの勾配、５０％のＢで９分の保持、２分にわたり５０から９５％のＢ、９５％のＢで７分の保持、１分にわたり９５から５％のＢ、３８分にわたり５％のＢでの再平衡化を用いて分離した。２０００Ｖのスプレー電圧をナノスプレーチップに印加した。ＭＳ／ＭＳ分析は、解像度１２０，０００での３５０〜１５００ｍ／ｚからの１回のフルスキャンＭＳからなる３秒のサイクル時間にわたり行われ、それに続いて、最も豊富なイオンの２７％正規化衝突エネルギーでのＨＣＤ活性化を使用したデータ依存型ＭＳ／ＭＳスキャンを行った。選択されたイオンを、１の繰り返し回数の後に４５秒にわたり動的に排除した。
【０２３０】
ウェスタンブロッティング
５〜１３．３μｇの範囲の等しい質量のタンパク質溶解産物を、４〜１２％ビス−トリスＮｕＰＡＧＥゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）または３〜８％トリス−アセテートＮｕＰＡＧＥゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）にローディングした。タンパク質をニトロセルロース膜（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号ＬＣ２００１）上に移した後、膜をウェスタンブロッキング試薬（Ｓｉｇｍａカタログ番号１１９２１６７３００１）でブロックした。膜を、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）が補充されたＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋで希釈した一次および二次ｍＡｂで染色した。この研究では、以下の抗体が使用された：抗ヒトＣＤ２４７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号５５１０３４）、抗ヒトＣＤ２４７  ｐＹ１４２（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号５５８４０２）、抗ＺＡＰ−７０  ｐＹ３１９（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇカタログ番号２７１７Ｓ）、抗ＳＬＰ−７６  ｐＳ３７６（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇカタログ番号１４７４５Ｓ）、抗ＰＬＣ−ｇ１  ｐＹ７８３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇカタログ番号１４００８Ｓ）、および抗ＤＡＰＰ１  ｐＹ１３９（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇカタログ番号１３７０３Ｓ）、抗マウスＨＲＰ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇカタログ番号７０７６Ｓ）、および抗ウサギＨＲＰ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇカタログ番号７０７４Ｓ）。典型的な抗体希釈は１／１０，０００から１／２，５００の範囲であった。ブロットを、ＣＬ−ＸＰｏｓｕｒｅフィルム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号３４０９１）またはＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ＋システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して展開した。
【０２３１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイ
ＣＡＲ  Ｔ細胞を、Ｋ５６２、Ｋ５６２／ＣＤ１９、またはＫ５６２／ＲＯＲ１細胞と、２：１のＴ細胞と腫瘍細胞との比率で共培養した。一部の実験において、ＣＡＲ  Ｔ細胞も、対照または抗ＳＴＩＩビーズと共に、細胞１００万個当たり３０μＬのビーズの比率でインキュベートした。刺激の２４時間後に、細胞上清中のサイトカイン濃度を、ＥＬＩＳＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号８８−７３１６−８８、８８−７０２５−８８、８８−７３４６−８８）によって定量化した。細胞内サイトカイン染色のために、アッセイのセットアップ中にＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号５５５０２９）を添加し、細胞を回収し、５時間の刺激後に染色した。カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号Ｃ３４５５４）の０．２μＭ溶液でＣＡＲ  Ｔ細胞を染色し、ＣＡＲ  Ｔ細胞を、Ｋ５６２／ＣＤ１９、Ｋ５６２／ＲＯＲ１細胞、対照ビーズ、または抗ＳＴＩＩビーズと共に７２時間インキュベートすることによって、Ｔ細胞増殖を定量化した。
【０２３２】
ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ−ｓｅｑ）
ＲＮＡを、３人のドナーからの２４個の試料から抽出した。全ＲＮＡの完全性を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ４２００  ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してチェックし、Ｔｒｉｎｅａｎ  ＤｒｏｐＳｅｎｓｅ９６分光光度計（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して定量化した。ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーを、ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡサンプルプレップキットｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａカタログ番号ＲＳ−１２２−２００１）およびＳｃｉｃｌｏｎｅ  ＮＧＳｘワークステーション（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して全ＲＮＡから調製した。ライブラリーサイズ分布を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ４２００  ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎを使用して検証した。追加のライブラリーの品質管理、プールされたインデックス付きのライブラリーのブレンド、およびクラスター最適化を、Ｑｕｂｉｔ  ２．０フルオロメーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して実行した。ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーをプールし（６〜８乗の数）、フローセルレーン上にクラスター化した。対合した末端を有する５０塩基のリード長さ（ＰＥ５０）のシーケンシング戦略を採用した迅速様式でＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２５００を使用して、シーケンシングを実行した。
【０２３３】
定量ＰＣＲ
ＲＮＡを抽出し、５００ｎｇを使用して、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号１１７５２−２５０）を用いてｃＤＮＡを調製した。１５ｎｇのｃＤＮＡを、以下のＴａｑＭａｎアッセイプローブ：Ｈｓ００９５３１７８＿ｍ１（ＥＰＨＡ４）、Ｈｓ００１７２９７３＿ｍ１（ＦＯＸＯ４）、Ｈｓ００９０２２３４＿ｍ１（ＩＬ７Ｒ）、Ｈｓ００３６０４３９＿ｇ１（ＫＬＦ２）、またはＨｓ９９９９９９０７＿ｍ１（Ｂ２Ｍ）のうち１つと共に反応物に添加した。反応を、１つの３８４−ウェルプレートで、２連または３連で行った。ＥＰＨＡ４、ＦＯＸＯ４、ＩＬ７Ｒ、およびＫＬＦ２プローブからの技術的な３連の平均Ｃｔを、ハウスキーピング遺伝子β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の平均Ｃｔで割ることによって、ΔＣｔ値を計算した。ＣＤ２８／ＣＤ３ζ、Ｍ１、またはＭ３対４−１ＢＢ／ＣＤ３ζの比率を各ドナーにつき計算し、ｌｏｇ２変換に供した。
【０２３４】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ−／−（ＮＳＧ）マウスモデル
６〜８週齢の雄ＮＳＧマウスに、５×１０５個のＲａｊｉ／ｆｆｌｕｃ細胞を尾静脈注射を介して生着させた。１週間後、ＰＢＳまたはＣＤ１９＋エプスタイン−バーウイルスリンパ芽球様細胞と共に９日間拡大増殖されたＣＤ８＋およびＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞の混合物（細胞９×１０５個）を、静脈内注射した。生物発光イメージングを、Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ３０：４９２−５００  （２０１６））に記載されたようにして実行した。個々のマウス間の差が予測される実験のために、データ分析につき実験群当たり少なくとも５匹のマウスを使用して、８１％の検出力を提供して、片側０．０５レベルの有意性を用いたｔ検定に基づき１．７５の効果量を検出した。マウスの取扱者を、群の割り当てに対して盲検化した。処置群は以下の通りであった：ＰＢＳ／Ｓｈａｍ（ｎ＝６匹のマウス）；４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ｎ＝１５匹のマウス）；ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ｎ＝１５匹のマウス）；ＣＤ２８／ＣＤ３ζＹ１  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ｎ＝１５匹のマウス）；ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  Ｙ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ｎ＝１５匹のマウス）。
【０２３５】
ショットガン質量分析データ分析
各反復実験からの生ＭＳ／ＭＳスペクトルを、ＭａｘＱｕａｎｔ／Ａｎｄｒｏｍｅｄａサーチエンジンバージョン１．６．０．１（Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２６：１３６７−１３７２  （２００８）を使用して、一般的な実験汚染物質を用いた再調査したヒトＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＵｎｉＰｒｏｔ）配列データベース（リリース２０１６＿０１）に対して一緒にサーチした。サーチは、最大２つの誤った切断についてトリプシン酵素の制約を用いて実行された。可変の改変は、酸化されたメチオニン、リン酸化されたセリン、リン酸化されたスレオニン、およびリン酸化されたチロシンであった。カルバミドメチル化されたシステインを静的な改変として設定した。ペプチドＭＨ＋質量許容差を２０ｐｐｍに設定した。全体的なＦＤＲを、リバースデータベースターゲットデコイアプローチを使用して≦１％に設定した。
【０２３６】
３つのＴＭＴ実験のために、ホスホペプチド部位の局在化を、ＭａｘＱｕａｎｔによって決定し、Ｐｅｒｓｅｕｓバージョン１．６．０．７（Ｔｙａｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３：７３１−７４０  （２０１６））を使用してリン酸化部位に変換した。この工程において、逆のヒットおよび存在し得る汚染物質を、さらなる分析から排除した。各ＴＭＴチャネルをチャネル中央値に拡張し、続いてｌｏｇ２変換することによって、データ正規化を実行した。刺激されたチャネルから適切な対照チャネルを引くことによって、刺激対対照の比率を計算した。不十分なＭＳサンプリングにより、一部のリン酸化部位（特徴）はわずか１または２回の反復実験で見出されたに過ぎず、より一層少数（＜１％）の部位は、どのＴＭＴチャネルにも見出されなかった。
【０２３７】
ｌｉｍｍａ統計フレームワークおよび関連するＲパッケージを使用して、ＰＯ４部位に対する差次的な発現分析を実行した（Ｇ．Ｋ．  Ｓｍｙｔｈ，  Ｓｔａｔ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３：Ａｒｔｉｃｌｅ３  （２００４）；  Ｒｉｔｃｈｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ４３：ｅ４７  （２０１５））。これらの分析のために、少なくとも２つの実験および全てのＴＭＴチャネルで価値のある特徴のみを維持し、１４，４９０個の定量化したリン酸化部位を残した。線形モデルを各ＰＯ４部位にフィッティングし、実験ベイズの調整ｔ統計量を使用して、発現／存在度における差を評価した。刺激対対照処置を比較する対比を試験した。ＲＯＲ１特異的およびＣＤ１９特異的ＣＡＲが２人のドナーにわたり類似の表現型を示し、リガンドとは無関係に同じように刺激されたと仮定すれば（図１Ｄ〜１Ｆ）、対応する測定は、複製とみなされた。同じ患者および同じ抗原に由来する測定値を考慮に入れるためにｌｉｍｍａパッケージの複製の相関関数を使用して、級内相関を推測した（Ｓｍｙｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２１：２０６７−２０７５  （２００５））。０．７の絶対ｌｏｇ２変化倍率カットオフ（刺激対対照）および５％の偽発見率（ＦＤＲ）カットオフを使用して、差次的に発現されるＰＯ４部位を決定した。ＳｔｒｉｎｇＤＢを使用してシグナル伝達ネットワークおよびＫＥＧＧ経路の分析を実行した。
【０２３８】
ＲＮＡシーケンシングデータ分析
画像分析および塩基コーリングを、Ｉｌｌｕｍｉｎａのリアルタイム分析ｖ１．１８ソフトウェア、続いてインデックス付きのリードの「デマルチプレキシング」を使用して実行し、ＦＡＳＴＱファイルの作成をＩｌｌｕｍｉｎａのｂｃｌ２ｆａｓｔｑ変換ソフトウェアｖ１．８．４を使用して実行した。ＲＮＡ−ｓｅｑデータを、ＳＴＡＲを使用してヒトゲノム（ＵＣＳＣヒトゲノムアセンブリＧＲＣｈ３８参照）にアライメントし、遺伝子定量化を、ＲＳＥＭを使用して実行した（Ｄｏｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２９：１５−２１  （２０１３）；  Ｌｉ  ＆  Ｄｅｗｅｙ，  ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １２：３２３  （２０１１））。非ゼロのリード計数が１０未満の遺伝子（技術的な反復を考慮に入れる）を捨て、１８，４９８個の発現された遺伝子を残した。全てのライブラリーが品質管理基準（２００，０００個より多くのリード、１２，０００個の検出された遺伝子およびエクソン範囲＞６０％を有するライブラリー）を合格した。生の計数データをＲにインポートした。ｅｄｇｅＲを使用して正規化係数を計算して、生のライブラリーサイズを測り、続いてｌｉｍｍａ  Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージからのｖｏｏｍ変換を行った（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＆  Ｏｓｈｌａｃｋ，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．  １１：Ｒ２５  （２０１０）；    Ｌａｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．  １５：Ｒ２９  （２０１４））。これは、計数データを１００万当たりのｌｏｇ２計数に変換し、適切な観察レベルの重量を計算するための平均分散関係を推測する。ショットガン質量分析データ分析において上述したように、差次的な遺伝子発現分析のために対象のランダム効果を用いた線形モデルを再び使用した。処置（対照対刺激）またはＣＡＲ（ＣＤ２８／ＣＤ３ζ対４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ）を比較する対比を試験した。１の絶対ｌｏｇ２変化倍率カットオフおよび１％のＦＤＲカットオフを使用して、差次的に発現される遺伝子を決定した。
【０２３９】
（実施例２）
ＣＡＲシグナル伝達の分析のための臨床的に関連性のある初代Ｔ細胞モデル
ＴＣＲシグナル伝達は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）で刺激された形質転換したＪｕｒｋａｔＴ細胞のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を使用して研究されてきた（Ｍａｙｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ  ２：ｒａ４６−ｒａ４６  （２００９）；  Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ８：２４１８−２４３１  （２００９）；  Ｓａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８：ｅ７７４２３  （２０１３））。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、一般的な分子生物学の技術を使用して容易に成長および操作できることから、シグナル伝達研究のために選択した。シグナル伝達を分析するためにＣＡＲをＪｕｒｋａｔ細胞に導入することが考えられたが、抗ＣＤ３ｍＡｂ刺激後のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる公知の近位ＴＣＲシグナル伝達分子のＰＯ４の比較から、不死化Ｊｕｒｋａｔおよび培養された初代ヒトＴ細胞が、タンパク質ＰＯ４の別個のパターンを呈示したことが解明された（図８Ａ〜８Ｂ）。不死化Ｊｕｒｋａｔ細胞とは対照的に、初代Ｔ細胞は、刺激の後に、ＣＤ３鎖およびＺＡＰ−７０の長期化したＰＯ４、ならびに差次的にリン酸化されたＣＤ２８、ＬＡＴ、ＬＣＫ、ＰＡＫ２、ＳＨＰ１、ＳＯＳ１、およびＶＡＶ１を示した。したがって、初代ヒトＴ細胞でＣＡＲシグナル伝達を研究して、臨床的に関連性のあるデータを得た。
【０２４０】
（実施例３）
ＣＡＲシグナル伝達の分析のためのタグを有するＣＡＲの設計
ＣＡＲ抗原を発現する腫瘍細胞は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳのために初代ＣＡＲ  Ｔ細胞を刺激するのに使用できるが、このアプローチは、同位体標識したアミノ酸（ＳＩＬＡＣ）と共に腫瘍細胞およびＴ細胞両方を長期培養して、ホスホペプチドを各細胞型から区別できるようにすることを必要とする。腫瘍細胞はまた、シグナル伝達タンパク質のリン酸化に寄与するＴ細胞上のアクセサリー分子とも係合することができる。これらの細胞ベースの刺激の欠点を回避するために、ＣＡＲシグナル伝達を活性化するための無細胞方法が開発された（図１Ａ〜１Ｂ）。スペーサー領域中にＣＤ２８／ＣＤ３ζまたは４−１ＢＢ／ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインのいずれかおよび９アミノ酸のＳｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ（ＳＴＩＩ；配列番号１０）配列を含有するＣＤ１９特異的およびＲＯＲ１特異的ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを設計した（配列番号１９、２１、２３、および２５）（図１Ａ）。全ての構築物は、ＣＡＲを発現するＴ細胞の精製のために、Ｔ２Ａエレメントの下流にトランケート型ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）形質導入マーカーを含有していた（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １１８：１２５５−１２６３  （２０１１）。これまでに、ＳＴＩＩ配列の包含は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の認識にも機能にも干渉しないこと、およびＳＴＩＩ  ＣＤ２８／ＣＤ３ζまたは４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、抗ＳＴＩＩ  ｍＡｂとのシミュレーションによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで効率的に活性化および拡大増殖させることができることが示された（（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３４，  ４３０−４３４  （２０１６））。
【０２４１】
初代ＣＤ８＋Ｔ細胞を４つのレンチウイルスベクターのそれぞれで形質導入し、ＥＧＦＲｔ＋発現に関して選別し、単回サイクルの刺激を用いて、それに続く分析のために１．６×１０８個を超える細胞に拡大増殖させた（図１Ｃ）。各ｓｃＦｖ特異性のＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲが、細胞表面上における類似のレベルで存在した（図１Ｄ）。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、類似のレベルのＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７、およびＣＤ２８も発現したが（図１Ｅ）、よりわずかに大きい頻度のＣＤ１９  ４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞がＣＤ６２Ｌを発現した。ＰＤ−１およびＴｉｍ３はいずれのＣＡＲ  Ｔ細胞集団によっても発現されず、ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の８５％超がＧ０／Ｇ１細胞周期相であったが、これは、有意な持続的なシグナル伝達の欠如と一致する（図１Ｅ〜１Ｆ）。
【０２４２】
ＭＳ分析のための溶解産物を調製する前に、ＳＴＩＩライゲーションにより誘導された基準のＴ細胞シグナル伝達事象を評価した。ＲＯＲ１特異的４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、様々な量の抗ＳＴＩＩ  ｍＡｂでコーティングされたマイクロビーズと共に４５分インキュベートし、ウェスタンブロットによってＣＤ３ζ  Ｙ１４２、ＳＬＰ−７６  Ｙ３７６、およびＰＬＣ−γ１  Ｙ７８３を測定した。比較のために、ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＲＯＲ１が形質導入されたＫ５６２（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）腫瘍細胞で刺激した。最大のビーズ対細胞の比率のときに、抗ＳＴＩＩビーズ刺激は、ＣＤ３ζ、ＳＬＰ−７６、およびＰＬＣ−γ１のＰＯ４を、Ｋ５６２／ＲＯＲ１細胞で刺激されたＣＡＲ  Ｔ細胞からの溶解産物で観察されたレベルと類似のレベルに増加させ、このビーズ対細胞の比率を全てのそれに続く実験に使用した（図１Ｇ）。またこれらの基質のＰＯ４は、Ｋ５６２／ＣＤ１９または抗ＳＴＩＩ  ｍＡｂでコーティングされたビーズで刺激されたＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞においても類似していた。したがって、抗ＳＴＩＩ  ｍＡｂでコーティングされたビーズは、初代Ｔ細胞においてＣＡＲシグナル伝達を選択的に活性化するための正確な方法を提供する。
【０２４３】
（実施例４）
別個の共刺激ドメインを有するＣＡＲを含有するＴ細胞におけるタンパク質リン酸化の分析
ＣＤ２８／ＣＤ３ζまたは４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、抗ＳＴＩＩ  ｍＡｂでコーティングされた、またはコーティングされていない（対照）磁気ビーズと共に１０または４５分インキュベートして、ＣＡＲ刺激によって開始させた初期および後期のＰＯ４事象を捕獲した３つの独立した実験を実行した（図２Ａ）。２人の異なるドナーから生成したＣＤ１９特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞を２つの実験で使用し、第３の実験は、２人のドナーのうち１人から得たＲＯＲ１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞を利用した（図２Ｂ）。各実験中のホスホペプチドの相対的な定量化を提供するために、各トリプシン消化溶解産物を固有な等重タンデム質量タグ（ＴＭＴ）で標識し、抗ホスホチロシン免疫沈降、それに続く残りの溶出液の固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって、ホスホペプチドに関して濃縮した（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ７５：１８９５−１９０４  （２００３））（図９）。
【０２４４】
これらの技術を使用して、合計２６，８０４個のＰＯ４部位を、４，８４９個の遺伝子産物に相当する３つの実験にわたり検出した。ＰＯ４部位のうち、５７１個（２．１３％）がホスホチロシンであり、４，６４７個（１７．３３％）がホスホスレオニンであり、２１，５８６個（８０．５３％）がホスホセリンであった（図２Ｃ）。反復実験間で、捕獲されたホスホプロテオームにおいて顕著なオーバーラップがあった（図２Ｄ）。各実験で検出されたＰＯ４部位の９９％が、刺激されていない、および刺激されたＴ細胞溶解産物の両方に存在していたことから、ＣＡＲ活性化により誘導された変化の定量化が可能になった（Ｎａｖａｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２：３５２−３６１  （２０１１）；  ｖａｎ  Ｏｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３：５７７１−５７８０  （１９９３））。
【０２４５】
（実施例５）
ＣＡＲは基準のＴ細胞シグナル伝達中間体のリン酸化を変更する
まず、よく説明されたＴＣＲ刺激によって誘導されたＰＯ４事象をＭＳデータセット内で分析して、これらの部位もＣＡＲ刺激応答性であるかどうかを決定した（Ｂｒｏｗｎｌｉｅ  ａｎｄ  Ｚａｍｏｙｓｋａ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３：２５７−２６９  （２０１３））。刺激された試料を適切な対照と比較すること（すなわちＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲの１０分の刺激  対  ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲの１０分の対照）によって、各反復実験でｌｏｇ２変化倍率（ｌｏｇ２ＦＣ）値を各ＰＯ４部位につき計算した。１０分で、Ｙ８３、Ｙ１１１、およびＹ１４２におけるＣＤ３ζのＰＯ４増加、加えてＹ４９３におけるＺＡＰ−７０のＰＯ４増加が、刺激されたＣＡＲ  Ｔ細胞で見出された（図２Ｅ）。留意すべきことに、ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の両方が、Ｙ２０６およびＹ２０９におけるＣＤ２８のＰＯ４増加を示したことから、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲのライゲーションは内因性ＣＤ２８のＰＯ４をもたらしたことが実証される。４５分の刺激後、Ｓ１２４８におけるＰＬＣ−γ１およびＳ１３８におけるＢＣＬ１０のＰＯ４増加を含み、ＰＯ４が下流ＴＣＲシグナル伝達ノードに拡がったことが観察された（図２Ｆ）（Ｒｕｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７８：４３７３−４３８４  （２００７）；  Ｉｓｈｉｇｕｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４４：２０９５−２１００  （２００７）も参照）。これらの公知の部位の大部分に関して、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲの刺激は、１０および４５分の両方で４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲより大きい規模のｌｏｇ２ＦＣを開始させた。抗ＣＤ３刺激の後にＴ細胞においてリン酸化されることが公知であるＣＤ３δ、ε、またはγ  ＩＴＡＭのＰＯ４における再現可能な変化は、いずれの時点でも観察されなかった。
【０２４６】
ＭＳデータセットにおいてＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の間で観察された規模で差の一部を検証するために、細胞溶解産物を、ウェスタンブロットによって、３つのＣＡＲ活性化によって誘導されたリンタンパク質シグナル伝達事象、すなわちＣＤ３ζ  ｐＹ１４２；ＺＡＰ−７０  ｐＹ３１９；およびＰＬＣ−γ１  ｐＹ７８３に関して評価した。図２Ｇで示されるように、ＣＤ２８／ＣＤ３ζまたは４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激は、ＣＡＲ  ＣＤ３ζドメイン、ＺＡＰ−７０およびＰＬＣ−γ１のＰＯ４を増加させた。ＭＳデータと一致して、これらのタンパク質のより強いＰＯ４が、刺激されたＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で観察された。留意すべきことに、低レベルの基底のＣＡＲ  ＣＤ３ζ  ＰＯ４が、いずれかの特異性を有する４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞中に存在していなかった、刺激されていないＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＤ１９およびＲＯＲ１  ＣＡＲ  Ｔ細胞で検出された。構成的ＣＡＲ  ＣＤ３ζドメインＰＯ４が数々のＣＡＲに関して記載されており、有害なＴ細胞表現型およびＴ細胞消耗マーカーの上方調節に関連付けることができる（Ｆｒｉｇａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ３：３５６−３６７  （２０１５）；  Ｌｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１：５８１−５９０  （２０１５）を参照）。しかしながら、刺激されていないＣＤ２８／ＣＤ３ζまたは４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞における細胞周期またはＰＤ−１もしくはＴｉｍ３の発現の差は観察されなかった（図１Ｅ〜１Ｆ）。したがって、刺激されていないＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で検出された低レベルの基底ＰＯ４は、異なるｓｃＦｖ特異性を有する一部のＣＡＲで観察されたより極端な持続的なシグナル伝達と異なっていた。
【０２４７】
（実施例６）
別個の共刺激ドメインを有するＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化は、異なる動態および規模で類似のタンパク質リン酸化事象を誘導する
ショットガンＭＳの利点は、公知の実験的に検証された抗体がない何千ものＰＯ４事象を定量的に測定することである。ｌｉｍｍａ統計フレームワークおよび関連のＲパッケージを使用して、ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲライゲーションの後にモジュレートされたＰＯ４部位を同定した（Ｇ．  Ｋ．  Ｓｍｙｔｈ，  Ｓｔａｔ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３：Ａｒｔｉｃｌｅ３  （２００４））。ＰＯ４部位は、３つの実験のうち少なくとも２つで検出され、１０または４５分において、刺激された条件と刺激されていない条件との間で平均｜ｌｏｇ２ＦＣ｜≧０．７を示し、５％のＦＤＲカットオフを満たした場合、それはＣＡＲ刺激応答性であると同定した。０．７のｌｏｇ２ＦＣカットオフが、ｌｏｇ２ＦＣ値の分布のおよそ２標準偏差を表すため選択された（図１０）。
【０２４８】
これらの厳格なカットオフを使用して、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞における２２個のタンパク質からの２６個のＰＯ４部位を、１０分の時点において刺激応答性として同定した。これらの差次的にリン酸化されたタンパク質を、ＫＥＧＧ  ＴＣＲシグナル伝達経路のメンバーにつき濃縮したところ、Ｓ６４におけるｐ２１活性化キナーゼ２（ＰＡＫ２）、Ｓ２３１におけるＣＤ８アルファ（ＣＤ８Ａ）、Ｓ３７０におけるプロテインキナーゼＣθ（ＰＫＣＴ）、ならびにＳ７４８およびＴ７４９における癌原遺伝子ｖａｖ（ＶＡＶ１）の増加したＰＯ４を含んでいた（図３Ａおよび表１Ａ〜１Ｂ）。対照的に、１０分の時点でｌｏｇ２ＦＣおよびＦＤＲ基準を満たした４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞からの部位はなかった（図３Ｂ）。７４個のＰＯ４部位がｌｏｇ２ＦＣカットオフを満たしたが、ＦＤＲカットオフを満たさず、これらのなかでも、Ｓ４９０３における神経芽細胞分化関連タンパク質（ＡＨＮＡＫ）、およびＳ３１５およびＳ３１９におけるカルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ型サブユニットデルタ（ＣＡＭＫ２Ｄ）のＰＯ４増加が検出されたが、これは、モジュレートされたＣａ２＋シグナル伝達を示す（表１Ａ〜１Ｂ）。４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲにより誘導された早期のタンパク質ＰＯ４におけるロバストな変更の欠如は予想外であったが、１０分においてＣＡＲ  ＣＤ３ζおよびＰＬＣ−γ１の最小のＰＯ４を示すウェスタンブロットデータと一致する（図２Ｇ）。
【０２４９】
４５分の刺激の後、より強いタンパク質ＰＯ４が生じ、ＣＤ２８／ＣＤ３ζまたは４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ試料のいずれかからの１，２８９個のＰＯ４部位がｌｏｇ２ＦＣおよびＦＤＲカットオフを満たした。これらは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞における７４３個の遺伝子産物からの１，２７９個のＰＯ４部位、および４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞における３４６個の遺伝子産物からの５２２個の部位を含んでいた（図３Ｃ〜３Ｄ）。したがって、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲの刺激が続くことにより、より多数のＰＯ４部位の変更がもたらされた。しかしながら、印象的なことに、ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激によってほぼ全ての部位が類似の様式でモジュレートされた刺激応答性ＰＯ４部位間の強い相関が観察された（図３Ｅ）。ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ試料におけるカットオフを満たした１，２８９個の部位の１２個（０．９３％）のみが４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激によって差次的にモジュレートされ、４３個の（３．３％）部位のみが４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激の後により大きい規模のｌｏｇ２ＦＣを呈示したが、これは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲの下流においてより強いシグナル伝達を示唆する先行のデータと一致している（図３Ｅ）。さらに、これらの１２および４３個の部位のサブセットは、現在のところ定義された４−１ＢＢシグナル伝達ネットワークにマッピングされなかった。
【０２５０】
ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲの刺激後におけるタンパク質ＰＯ４事象にほとんど差がないという発見は予想外であり、基準のＴ細胞共刺激シグナル伝達経路に関与するタンパク質がどの程度影響を受けたかという課題を引き出した。４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲが内因性ＣＤ２８を活性化したという初期の発見と一致して、ＣＤ２８シグナル伝達中間体ＶＡＶ１、ＰＫＣＴ、およびＰＩＫ３Ｃ２Ａは、ＣＡＲのいずれかの刺激の後にＰＯ４増加を示した（図３Ｆ）（Ａｃｕｔｏ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈｅｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３：９３９−９５１  （２００３））。４−１ＢＢシグナル伝達経路内において、４−１ＢＢおよびＴＲＡＦ２シグナル伝達の直接の標的であるＬＳＰ１は、両方のＣＡＲによってモジュレートされた（Ｓａｂｂａｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｌｅｕｋｏｃ．  Ｂｉｏｌ．  ９３：７１３−７２１  （２０１３））。これらの類似性にもかかわらず、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲは、４−１ＢＢシグナル伝達経路におけるものを含む各ＰＯ４部位を、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲより大きい規模でモジュレートした。したがって、分岐シグナル伝達ネットワークを活性化するのではなく、受容体中の別個の共刺激ドメインから予測され得るように、ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲのライゲーションは、基準のＣＤ２８および４−１ＢＢシグナル伝達中間体の両方を包含する細胞内タンパク質ＰＯ４において、高度に類似した変化を誘導した。
【０２５１】
ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激によって影響を受ける主要な経路および個々のタンパク質リン酸化事象を例示するマップは、基準のＴＣＲシグナル伝達およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路に関与するタンパク質を含む（図４および表１Ａ）。
【０２５２】
（実施例７）
ＣＡＲライゲーション後に持続するＣＡＲシグナル伝達の規模の差
ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激によって媒介されるタンパク質ＰＯ４は高度に類似していたが、ＰＯ４部位の大部分において強度の点で異なっていた。ＣＡＲ刺激後にタンパク質ＰＯ４における変化を定量化することは、ＣＡＲシグナル強度の全体論的な尺度を提供できることは理にかなっていた。ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ試料からの４５分における刺激応答性ＰＯ４部位を、ｌｏｇ２ＦＣを減少させることによって配置した。両方のＣＡＲが類似の様式でタンパク質ＰＯ４をモジュレートしたことを示す先行の結果と一致して、刺激の後に２０種の最もリン酸化された部位のうち１５種が、ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞間で共通していた（表２Ａ〜２Ｂ）。しかしながら、上位２０個の部位のＰＯ４は、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ試料において平均して１１．１５倍増加したが、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ試料では平均してわずか５．８倍であった（図５Ａ）。ＣＡＲ刺激応答性ＰＯ４部位をシグナル伝達経路によって階層化することにより、ＫＥＧＧ  ＴＣＲシグナル伝達経路内の平均ＰＯ４部位が、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ試料において２．５２倍モジュレートされたが、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ試料ではわずか１．６９倍であったことがさらに示された（図５Ｂ）。
【０２５３】
４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲシグナルが、後の時間でＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲのものに類似した強度に達したかどうかを決定するために、ＣＡＲ  Ｔ細胞を、６０、１２０、または１８０分刺激し、基準の、および新たに同定されたシグナル伝達中間体のＰＯ４をウェスタンブロットによって測定した。図５Ｃで示されるように、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激は、全ての試料においてＳＬＰ−７６、ＰＬＣ−γ１、およびＤＡＰＰ１のより強いＰＯ４をもたらしたことから、この時間枠中に、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激は決してＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲシグナル強度に匹敵しないことが示される。
【０２５４】
（実施例８）
ＣＡＲシグナル強度はエフェクター細胞様表現型と正に相関し、ｉｎ  ｖｉｖｏの抗腫瘍活性を低減した
Ｔ細胞の活性化およびシグナル伝達の強度は、エフェクター細胞の分化およびメモリー形成を調節する転写の差をもたらす（Ｋａｅｃｈ  ａｎｄ  Ｃｕｉ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２：７４９−７６１  （２０１２））。ＲＮＡ−Ｓｅｑを使用して、６時間のＳＴＩＩビーズ刺激後におけるＣＤ２８／ＣＤ３ζまたは４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞における転写プログラムを分析し、｜ｌｏｇ２ＦＣ｜＞１．０およびＦＤＲ＜１％を満たす差次的に発現される遺伝子を同定した。より速く、より強いリンタンパク質シグナルと一致して、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激は、より著しく早期の転写変化を開始させた。ｌｉｍｍａを使用して、刺激されたＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ−Ｔ細胞と、刺激されていないＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ−Ｔ細胞との比較は、４，８９４個の差次的に発現される遺伝子を同定し、それに対して、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激は、１９７個の差次的に発現される遺伝子をもたらした。Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９は、ＣＤ２８／ＣＤ３ζまたは４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ刺激によって類似の程度に上方調節されたが（図６Ａ）、エフェクター分子であるグランザイムＢ（ＧＺＭＢ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮＧ）、インターロイキン−２（ＩＬ２）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ６）、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＣＣＬ３）、およびマクロファージ炎症性タンパク質１β（ＣＣＬ４）の発現における、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較してより大きい倍率の増加が、活性化されたＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で観察された（図６Ｂ）。
【０２５５】
刺激されたＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ試料の直接の比較は、１，６７３個の差次的に発現される遺伝子を同定した（表３）。これらのなかでも、クルッペル様因子２（ＫＬＦ２）、インターロイキン−７受容体（ＩＬ７Ｒ）、およびＲｈｏファミリー相互作用細胞極性化レギュレーター２（ＲＩＰＯＲ２、以前はＦＡＭ６５Ｂとして公知）が、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞試料においてより低いレベルで発現された（図６Ｃ）。ＫＬＦ２およびＩＬ７Ｒは、メモリーＴ細胞形成と関連し、転写因子のＦＯＸＯファミリーの標的である（Ｒｏｕｇｅｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９０：７４８−７５５  （２０１３）；  Ｋａｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４：１１９１−１１９８  （２００３）；  Ｋｅｒｄｉｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０：１７６−１８４  （２００９））。これらの線に沿って、ＦＯＸＯ４発現は、刺激されたＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞において低減された。ｑＰＣＲによって、これらの発現の差が確認され、これらのＴ細胞メモリー関連遺伝子は、刺激されていないＣＤ２８／ＣＤ３ζまたは４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞において差次的に発現されなかったことが示された（図６Ｄ）。したがって、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ活性化は、エフェクター分子の発現の増加およびＦＯＸＯファミリー遺伝子標的の喪失を特徴とする転写プロファイルを優先的に誘導した。
【０２５６】
ＴＣＲシグナル伝達のように、ＣＤ２８／ＣＤ３ζと４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲとの間のシグナル量の差は、Ｔ細胞の機能に影響を与えるという仮説が立てられた。これを試験するために、ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞をＣＡＲ抗原を発現するＫ５６２細胞またはＳＴＩＩビーズで活性化し、様々な時点でサイトカイン生産および増殖を測定した。５時間後、より大きい比率のＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、およびＴＮＦ−αを生産し（図６Ｅ）、２４時間後、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞より著しく多くのＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、およびＴＮＦ−αを分泌した（図６Ｆ）。７２時間後、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞より多くの数のＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が分裂し、それより多くの回数の分裂を経た（図６Ｇ）。
【０２５７】
優れたｉｎ  ｖｉｔｒｏエフェクター機能にもかかわらず、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍制御においてそれほど有効ではないことが証明された。確立されたＣＤ１９＋Ｒａｊｉリンパ腫異種移植片を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ−／−（ＮＳＧ）マウスに３×１０６個のＣＡＲ  Ｔ細胞が養子導入したところ、ＣＤ２８／ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の両方が、完全な腫瘍退縮を媒介した（図６Ｈ）。しかしながら、低減された（７．５〜８×１０５個の）細胞の用量の輸注は、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞よりはるかに有効性が低く、４０日以内に全てのＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置したマウスが腫瘍進行のために死亡したことを示した。腫瘍の影響を受けた骨髄において、より高い頻度にＣＡＲ  Ｔ細胞が蓄積されたにもかかわらず、より少ないＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞用量で処置したマウスにおいて腫瘍進行が起こった（図６Ｉ）。消耗した表現型の獲得と一致して、骨髄におけるＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、より高いレベルのＰＤ−１、Ｌａｇ−３、およびＴｉｍ−３を発現した（図６Ｊ）。総合すると、これらのデータは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ活性化によって媒介される迅速で強いシグナル伝達が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるサイトカイン生産およびＴ細胞増殖の増加にもかかわらず、Ｔ細胞表現型の消耗と低減した抗腫瘍活性をもたらしたことを示す。
【０２５８】
（実施例９）
ＣＤ２８／ＣＤ３ｚおよび４−１ＢＢ／ＣＤ３ｚ  ＣＡＲは内因性ＣＤ２８およびＬＣＫと差次的に会合する
ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲシグナル伝達の動態および強度の増加の可能性のある原因を調べるために、ＣＤ８＋Ｔ細胞からＣＡＲ複合体を免疫沈降し、基底状態における関連するＴ細胞シグナル伝達タンパク質間の差を探索した。ウェスタンブロットによって、効率的なＣＡＲのプルダウンが確認され、内因性ＣＤ２８およびＬｃｋとＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲとの会合が示されたが、最小限のＣＤ２８およびＬｃｋと４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲとの会合しか示されなかった（図７Ａ）。４５分のＣＡＲ刺激後における活性化された４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞からの免疫沈降でも、内因性ＣＤ２８を検出できなかった（図７Ｂ）。基底のＣＡＲリン酸化はＣＤ２８共刺激ドメインの存在によって付与され、ＣＡＲ刺激後にＹ２０６、Ｙ２０９、およびＹ２１８は強くリン酸化されたため（ＭＳデータ）、これらの残基においてチロシンからフェニルアラニンへの変異を有するＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲを構築した（図７Ｂ）。Ｙ２１８Ｆ置換を有するＣＤ１９特異的ＣＡＲとＹ２０６Ｆ、Ｙ２０９Ｆ、およびＹ２１８Ｆ置換を有するＣＤ１９  ＣＡＲとは、それぞれ配列番号２７および２９に記載のアミノ酸配列を含む。Ｙ２１８Ｆ置換を有するＲＯＲ１特異的ＣＡＲとＹ２０６Ｆ、Ｙ２０９Ｆ、およびＹ２１８Ｆ置換を有するＲＯＲ１  ＣＡＲとは、それぞれ配列番号３１および３３に記載のアミノ酸配列を含む。
【０２５９】
１つ（Ｙ１）または３つ全てのチロシン（Ｙ３）に変異を有するＣＤ１９およびＲＯＲ１特異的ＣＡＲは、Ｔ細胞において効率的に発現され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ＲＯＲ１＋またはＣＤ１９＋腫瘍細胞との共培養に応答して、増殖し、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）を生産することによって機能化された（図７Ｃ〜７Ｄ）。留意すべきことに、ＩＬ−２およびＴＮＦ−αの分泌は、チロシン変異によって段階的に低減した。免疫沈降により、内因性ＣＤ２８はＹ３  ＣＡＲと会合しなかったにもかかわらず、Ｌｃｋ会合はＹ１およびＹ３変異によって消失しなかったことが示された（図７Ｆ）。基底のＣＡＲ  ＣＤ３ζ  ＰＯ４の部分的な（Ｙ１）または完全な（Ｙ３）消失は、変異体ＣＡＲで観察されたが（図７Ｇ）、Ｙ１およびＹ３  ＣＡＲはそれでもなお、ＳＴＩＩビーズ刺激の後、野生型ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲと類似した動態および強度でＳＬＰ−７６およびＰＬＣ−γ１をリン酸化した（図７Ｇ）。Ｙ１およびＹ３シグナル強度の増加を示すウェスタンブロットデータと一致して、Ｙ１またはＹ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置されたマウスは、野生型ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置されたマウスに類似した生存中央値と、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の生存中央値より短い生存中央値を示した（図７Ｈ）。まとめると、これらの結果から、基底のＣＡＲ  ＣＤ３ζリン酸化も内因性ＣＤ２８の会合も、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲのシグナル動態および強度の増加に関与していなかったことが示唆された。
【０２６０】
構成的Ｌｃｋ活性化は、Ｔ細胞エフェクター機能を促進する（Ｔａｖａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７３：５３９２−５３９７  （２００４））。ＬｃｋのＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲとの会合が、ＣＡＲ活性化後にシグナル伝達中間体の迅速でロバストなリン酸化を媒介するかどうかを検査するために、ＣＤ２８のＬｃｋ結合部位においてプロリンからアラニンへの変異を生成した（図１１Ａ）。野生型および変異体ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲの免疫沈降により、プロリンからアラニンへの変異を有するＣＡＲにおいてＬｃｋ会合は存在しなかったことが示された（図１１Ｂ）。シグナル伝達分析から、ＣＤ２８Ｐ  ＣＡＲ中の単独のプロリン残基の変異は、基底のＣＡＲ  ＣＤ３ζリン酸化を部分的に消失させたが、シグナル強度を低減させなかったことが実証された（図１１Ｃ）。対照的に、Ｙ３Ｐ  ＣＡＲにおけるプロリンおよびチロシン残基の同時の変異は、基底のＣＡＲリン酸化を十分に消失させ、刺激の後におけるＳＬＰ−７６およびＰＬＣ−γ１のリン酸化の規模を低減させた。留意すべきことに、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＴＮＦ−αの分泌は、サイトカイン生産の全体的なレベルが４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞に類似するようなプロリンからアラニンへの変異によって低減された（図１１Ｄ）。これらのデータは、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲと４−１ＢＢ／ＣＤ３ζ  ＣＡＲとの間のＣＡＲシグナル強度における差が、より大きいＬｃｋのＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ＣＡＲとの会合に部分的に関連することを示す。さらに、ＣＡＲシグナル強度および炎症促進性サイトカイン生産は、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインにおけるチロシンおよびプロリン残基を変異させることによって変更することができる。
【０２６１】
（実施例１０）
改変されたＣＤ２８−ＣＡＲ  Ｔ細胞を使用したがんの処置
自己Ｔ細胞を、固形または血液がんを有する患者のＰＢＭＣから単離し、選別して、エフェクターおよびヘルパーＴ細胞を単離する。Ｔ細胞画分を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズおよびＩＬ−２と共に培養し、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、目的の腫瘍抗原に特異的なｓｃＦｖ、スペーサー、膜貫通ドメイン、Ｙ２０６Ｆ、Ｙ２０９Ｆ、およびＹ２１８Ｆ置換を含む改変されたＣＤ２８共刺激ドメイン、ならびに細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするレンチウイルス構築物で形質導入する。この構築物は、形質導入のための細胞表面マーカーもコードする。形質導入されたＴ細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、抗原を発現する腫瘍細胞での刺激に応答する機能性（増殖、サイトカイン放出）に関して検査する。その後、ＣＡＲ  Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大増殖させる。
【０２６２】
患者に、リンパ球枯渇化学療法を施し、その後、臨床的に関連性のある用量のＣＡＲ  Ｔ細胞を静脈内輸注を介して投与する。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、養子移入後に患者中で拡大増殖し、フローサイトメトリーおよびベクター配列のｑ−ＰＣＲによって測定される。ｉｎ  ｖｉｖｏの拡大増殖のピークにおいて試料を処置した患者から採取して、表現型を測定し、機能を評価し、抗腫瘍性の持続を決定する。フローサイトメトリーおよび遺伝子発現プロファイリングを実行して、細胞における遺伝子発現を特徴付ける。腫瘍サイズ、数、および分布の低減をＭＲＩによってモニターする。
【０２６３】
上述した様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。２０１８年２月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／６３５，４５０号、２０１８年５月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／６７６，７８７号、および２０１８年１０月１日に出願された米国仮特許出願第６２／７３９，７９２号を含む、本明細書で参照および／または出願データシート中に列挙された、米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および特許以外の刊行物の全ては、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。よりさらなる実施形態を提供するために、実施形態の態様は、様々な特許、出願および公報の概念が採用されるように必要に応じて改変することができる。
【０２６４】
上記の詳細な説明の観点から、これらおよび他の変化が実施形態になされてもよい。一般的に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、明細書および特許請求の範囲に開示された具体的な実施形態に特許請求の範囲を限定すると解釈されるべきではないが、このような特許請求の範囲の権利が及ぶ均等物の全範囲と共に、あらゆる可能な実施形態を含むと解釈されるものとする。したがって、特許請求の範囲は本開示によって限定されない。
【０２６５】
表
【表１−１】
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【表１−２】
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【０２６６】
【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【０２６７】
【表２−１】
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【０２６８】
【表２−２】
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【０２６９】
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表３−１０】
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【表３−１１】
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【表３−１２】
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【表３−１３】
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【表３−１４】
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【表３−１５】
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【表３−１６】
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【表３−１７】
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【表３−１８】
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【表３−１９】
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【表３−２０】
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【表３−２１】
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【表３−２２】
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【表３−２３】
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【表３−２４】
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【表３−２５】
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【表３−２６】
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【表３−２７】
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【表３−２８】
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【表３−２９】
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【表３−３０】
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【表３−３１】
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【表３−３２】
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【表３−３３】
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【表３−３４】
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【表３−３５】
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【表３−３６】
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【表３−３７】
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【表３−３８】
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【表３−３９】
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【表３−４０】
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【表３−４１】
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【表３−４２】
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【表３−４３】
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【表３−４４】
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【表３−４５】
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【表３−４６】
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【表３−４７】
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【表３−４８】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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