(57)【要約】  本出願は、新規なプロモーター及びこれを用いたＬ−アミノ酸生産方法に関するものであり、より詳細には、プロモーター活性を有する新規ポリヌクレオチド、これを含むベクター、及びコリネバクテリウム属微生物、前記微生物を用いたＬ−アミノ酸の生産方法、発酵組成物の製造方法、及び前記発酵組成物に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表されるヌクレオチド配列の３７番目ヌクレオチドがＧに置換された、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１のヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、目的タンパク質をコードする遺伝子と作動可能に連結される、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１または２のポリヌクレオチド；及び前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結された目的タンパク質をコードする遺伝子を含む、ベクター。
【請求項５】
前記目的タンパク質が、乳酸脱水素酵素（lactate dehydrogenase）である、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
請求項１に記載のポリヌクレオチド；及び前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結された目的タンパク質をコードする遺伝子を含む、コリネバクテリウム属微生物。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１のヌクレオチド配列からなる、請求項６に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項８】
前記目的タンパク質が、乳酸脱水素酵素（lactate dehydrogenase）である、請求項６に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項９】
前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１０】
請求項６〜８のいずれか一項に記載のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；及び前記の培地から目的物質を回収する段階を含む、目的物質を生産する方法。
【請求項１１】
前記目的物質が、アミノ酸である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項６〜８のいずれか一項に記載のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養して発酵する段階を含む、発酵組成物の製造方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法により製造された、発酵組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、新規なプロモーター及びこれを用いたＬ−アミノ酸生産方法に関するものであり、より詳細には、プロモーター活性を有する新規ポリヌクレオチド、これを含むベクター及びコリネバクテリウム属微生物、前記微生物を用いたＬ−アミノ酸の生産方法、発酵組成物の製造方法、及び前記発酵組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタミン酸は発酵によって生産される代表的なアミノ酸であって、特有の独特の味を有し、食品分野ではもちろん、医薬品分野、その他の動物飼料の分野などに広く利用されている重要なアミノ酸の一つである。
【０００３】
グルタミン酸を生産する通常の方法としては、主にブレビバクテリウム（Brevibacterium）やコリネバクテリウム属及びその変異株を含むコリネ型バクテリア（Coryneform bacteria）を用いて発酵を介して生産し（非特許文献１）、その他にも大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus）、放線菌（Streptomyces）、ペニシリウム（Penicillum）属、クレブシエラ（Klebsiella）、エルウィニア（Erwinia）、パントエア（Pantoea）属などの微生物を用いる方法などが知られている（特許文献１及び２）。微生物の発酵を介してグルタミン酸を製造する場合、発酵物の内にはＬ−グルタミン酸のほかに有機酸をはじめとする様々な物質が混合される。
【０００４】
前記有機酸は、酸性の有機化合物であって、乳酸、酢酸、ギ酸、クエン酸、シュウ酸、尿酸などを含む。食品内の有機酸は、酸味とうま味を示し、食品のｐＨを下げて腐敗を防止する効果を有する。通常、乳酸は、微生物の発酵を介して生成される有機酸の中で最も多くの割合を占めていることが知られている。
【０００５】
しかし、発酵で生産される乳酸の割合が高いほど発酵物内の酸味が増加するため、嗜好性が低下するおそれがある。したがって、微生物の発酵を介して生成された発酵物内の乳酸の生成量を調節する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第３，２２０，９２９号
【特許文献２】米国特許第６，６８２，９１２号
【特許文献３】韓国登録特許公報第１０−０２９２２９９号
【特許文献４】韓国登録特許第１０−０９２４０６５号
【特許文献５】国際公開特許第２００８−０３３００１号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Amino Acid Fermentation、Gakkai Shuppan Center ：195-215、1986
【非特許文献２】Karlin ＆ Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)
【非特許文献３】Methods Enzymol., 183, 63, 1990
【非特許文献４】Sambrook et al.,supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8
【非特許文献５】Appl. Microbiol. Biothcenol.,1999,52:541-545
【非特許文献６】Nat. Protoc., 2014 Oct;9(10):2301-16
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、グルタミン酸を生産する微生物の有機酸生成能を低減させるために努力した結果、本出願のプロモーター活性を有する新規ポリヌクレオチドを開発し、これは菌株のグルタミン酸の生成能を増加させて、乳酸の生成能は低下させうることを確認し、本出願を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本出願の一つの目的は、配列番号２で表されるヌクレオチド配列の３７番目ヌクレオチドがＧに置換された、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドを提供することにある。
【００１０】
本出願の他の一つの目的は、前記ポリヌクレオチド；及び前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結された目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを提供することにある。
【００１１】
本出願のもう一つの目的は、前記ポリヌクレオチド；及び前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結された目的タンパク質をコードする遺伝子を含むコリネバクテリウム属微生物を提供することにある。
【００１２】
本出願のもう一つの目的は、前記コリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；及び前記の培地から目的物質を回収する段階を含む、目的物質を生産する方法を提供することにある。
【００１３】
本出願のもう一つの目的は、前記コリネバクテリウム属微生物を培地で培養して発酵する段階を含む、発酵組成物の製造方法を提供することにある。
【００１４】
本出願のもう一つの目的は、前記方法により製造された発酵組成物を提供することにある。
【発明の効果】
【００１５】
本出願の新規プロモーターは、アミノ酸を生産する微生物に導入され、微生物のアミノ酸の生成量は増加させ、有機酸の生成量は減少させうる。具体的には、本出願の新規プロモーターを用いてグルタミン酸を製造する場合、発酵物内のグルタミン酸の量と有機酸の量を調節して発酵物の味と嗜好性を向上させうる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
これを具体的に説明すると、次の通りである。一方、本出願で開示された各説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用されてもよい。すなわち、本出願で開示された様々な要素の任意の組み合わせが本出願のカテゴリに属する。また、下記記述された具体的な叙述によって、本出願のカテゴリが制限されるとは見られない。
【００１７】
前記のような目的を達成するために、本出願の一つの様態は、配列番号２で表されるヌクレオチド配列の３７番目ヌクレオチドがＧに置換された、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドを提供する。
【００１８】
本出願において、用語、「配列番号２で表されるヌクレオチド配列」は、乳酸脱水素酵素（lactate dehydrogenase：ＬＤＨ）をコードする遺伝子のプロモーター配列の一部を意味してもよい。
【００１９】
この時、前記用語、「乳酸脱水素酵素」は、ピルビン酸を基質として、ラクテート、すなわち乳酸を生成する酵素であり、本明細書で「ＬＤＨ」と混用されて命名してもよい。具体的には、前記乳酸脱水素酵素の遺伝子は、配列番号３のヌクレオチド配列を含んでもよく、そのタンパク質は配列番号４のアミノ酸配列を含んでもよいが、これに制限されない。
【００２０】
本出願において、用語、「プロモーター」は、ポリメラーゼ（polymerase）の結合部位を含み、プロモーター目的遺伝子のｍＲＮＡへの転写開始の活性を有する、コーディング領域の上位（upstream）の非解読されたヌクレオチド配列、すなわち、ポリメラーゼが結合して遺伝子の転写を開始するようにするＤＮＡ領域を意味する。前記プロモーターは、ｍＲＮＡ転写開始部位の５’部位に位置してもよい。この時、前記プロモーターの目的遺伝子は、乳酸脱水素酵素であってもよいが、これに制限されない。
【００２１】
本出願のポリヌクレオチドは、前記配列番号２で表されるヌクレオチド配列、すなわち、乳酸脱水素酵素遺伝子のプロモーター配列が変異されたものであり、具体的には、前記変異は前記配列の３７番目ヌクレオチドであるＴがＧに置換されたものであってもよい。それに応じて、前記ポリヌクレオチドは配列番号１のヌクレオチド配列からなるもの（consist of）であってもよい。
【００２２】
この時、前記用語、「変異」は、遺伝的または非遺伝的に安定的な表現型的な変化を意味し、本明細書で「突然変異」と混用して命名してもよい。
【００２３】
具体的には、前記ポリヌクレオチドは、変異を含まないポリヌクレオチドに比べて変異された（増加または減少された）プロモーター活性を有してもよい。したがって、前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結された目的遺伝子の発現及び前記目的遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を調節（増加または減少）してもよく、さらに目的遺伝子の他の遺伝子以外の発現を調節してもよい。
【００２４】
本出願の目的上、前記ポリヌクレオチドは、乳酸脱水素酵素の活性の弱化のためのものであってもよい。
【００２５】
また、前記ポリヌクレオチドは、グルタミン酸生成量の増加及び／または乳酸生成量の減少のためのものであってもよい。
【００２６】
前記乳酸脱水素酵素は乳酸生成に関与することが知られていたが、グルタミン酸の生成との関連性については公知されておらず、本発明者らによって初めて究明された。特に、前記のような乳酸脱水素酵素のプロモーター変異による乳酸脱水素酵素の活性の減少、及びこれに伴うグルタミン酸生成量の増加と乳酸生成量の減少効果は、本発明者らによって初めて究明された。
【００２７】
この時、前記用語、「グルタミン酸」（L-glutamic acid、L-glutamate）は、アミノ酸の一種であり、非必須アミノ酸に区分される。中枢神経系で最も一般的な興奮性神経伝達物質として知られており、また、うま味がでるといわれ、このモノナトリウム塩（monosodium glutamate：ＭＳＧ）が調味料として開発され、広く用いられている。一般的に、グルタミン酸を生産する微生物の発酵を介して製造される。
【００２８】
また、前記用語、「乳酸」は、酸味のある有機酸の一種であり、ラクテート（Lactate）とも呼ばれる。食用には果実エキス、シロップ、清涼飲料の酸味剤として用いられ、酒類の発酵初期に腐敗菌の繁殖防止にも用いられる。一般的に、乳酸を生産する微生物の発酵を介して製造されるが、過剰に生成される場合、過度の酸味によって発酵物の品質を低下させることがあるため、乳酸の濃度は培養時に適切に調節される必要がある。
【００２９】
具体的には、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列からなるものであってもよい。
【００３０】
また、本出願のヌクレオチド配列は、従来知られている突然変異誘発法、例えば、方向性進化法（direct evolution）及び部位特異的突然変異法（site-directed mutagenesis）などにより変形されてもよい。
【００３１】
したがって、前記ポリヌクレオチドは、前記配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％以上、具体的には、７０％以上、より具体的には、８０％以上、さらに具体的には、８３％以上、８４％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９７％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含んでもよい。前記配列と相同性を有する配列として、実質的に配列番号１のヌクレオチド配列と同一または相応する生物学的活性を有するポリヌクレオチド配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加されたポリヌクレオチド配列を有する場合も、本出願のカテゴリに含まれるのは自明である。
【００３２】
本出願において、用語、「相同性」は、与えられたヌクレオチド配列と一致する程度を意味し、パーセンテージとして示してもよい。本明細書で、与えられたヌクレオチド配列と同一または類似の活性を有するその相同性配列が「％相同性」として示される。前記ヌクレオチド配列に対する相同性は、例えば、文献によるアルゴリズムＢＬＡＳＴ [参照：非特許文献２]やＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（参照：非特許文献３）を使用して決定してもよい。これらのアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（参照：http://www.ncbi.nlm.nih.gov）。
【００３３】
前記「厳しい条件」は、ポリヌクレオチド間の特異的混成化を可能にする条件を意味する。これらの条件は、文献（例えば、非特許文献４）に具体的に記載されている。例えば、相同性が高い遺伝子同士、６０％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９７％以上、特に具体的には、９９％以上の相同性を有する遺伝子同士ハイブリッド化し、それより相同性が低い遺伝子同士ハイブリッド化しない条件、または通常のサザンハイブリッド化の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１ ％ＳＤＳ、より具体的には、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で、１回、具体的には、２回〜３回洗浄する条件を列挙しうる。混成化は、たとえ混成化の厳格度に応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能としても、２つのヌクレオチドが相補的配列を有することを要求する。前記用語「相補的」は、互いに混成化が可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するために用いられる。例えば、ＤＮＡに関すると、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本出願は、また実質的に類似のポリヌクレオチド配列だけでなく、全体の配列に相補的な単離されたポリヌクレオチド断片を含んでもよい。
【００３４】
具体的には、相同性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値で混成化段階を含む混成化条件を用い、上述した条件を用いて探知してもよい。また、前記Ｔｍ値は６０℃、６３℃または６５℃であってもよいが、これに制限されるものではなく、その目的に応じて、当業者によって適切に調節してもよい。
【００３５】
ポリヌクレオチドを混成化する適切な厳格度は、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野でよく知られている（非特許文献４を参照）。
【００３６】
特に、前記配列番号１のヌクレオチド配列からなる（consist of）という表現は、当該ポリヌクレオチドをプロモーターとして目的遺伝子に連結して用いる時、制限酵素の使用のように目的遺伝子に連結する過程の中で発生しうるヌクレオチドの追加、及び／または削除、及び／または変異などの場合を排除しない。
【００３７】
例えば、配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるプロモーター活性を有する前記ポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列の全体または一部に対する相補配列と厳格な条件下でハイブリッド化され、本出願のプロモーター活性を有するヌクレオチド配列であれば、制限なく含んでもよい。
【００３８】
さらに、本出願のポリヌクレオチドは、目的タンパク質をコードする遺伝子と作動可能に連結されてもよい。
【００３９】
本出願において、用語、「遺伝子発現調節配列」は、本出願のポリヌクレオチドを含み、これに作動可能に連結されている目的遺伝子を発現させうる配列を意味する。
【００４０】
本出願において、用語、「作動可能に連結された」（operatively linked）は、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドが目的遺伝子の転写を開始及び媒介するように、前記遺伝子配列と機能的に連結されていることを意味する。作動可能な連結は、当業界の公知された遺伝子組換え技術を用いて製造してもよく、部位特異的ＤＮＡ切断及び連結は、当業界の切断及び連結酵素などを用いて製作してもよいが、これに制限されない。
【００４１】
さらに、本出願の遺伝子発現調節配列は、遺伝子の転写を実施するためのプロモーターの他に転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列及び転写及び解読の終結を調節するＤＮＡなどをさらに含んでもよい。
【００４２】
例えば、原核生物に適した調節配列は、プロモーターの他に、リボソーム結合部位をさらに含んでもよいが、これに制限されない。本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、通常の当業者によって必要に応じて前記のような遺伝子発現調節のための配列を構成してもよい。
【００４３】
本出願で前記目的遺伝子は、微生物で発現を調節しようとする目的タンパク質をコードする遺伝子を意味する。
【００４４】
例えば、アミノ酸（グルタミン酸など）、有機酸（乳酸など）、及びこれらの組み合わせで構成された群から選択される産物の生産に関与する遺伝子であってもよいが、これに制限されるものではない。具体的には、前記遺伝子は、アミノ酸（グルタミン酸など）の生合成に関連する酵素をコードする遺伝子及び／または有機酸（乳酸など）の生合成に関連する酵素をコードする遺伝子であってもよいが、これに制限されるものではない。より具体的には、前記遺伝子は、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）をコードする遺伝子であってもよいが、これに制限されるものではない。前記ＬＤＨをコードする遺伝子の配列は、米国国立衛生研究所のＧｅｎＢａｎｋのような公知のデータベースを介して当業者が容易に入手してもよい。
【００４５】
例えば、本出願の前記遺伝子発現調節配列は、ＬＤＨをコードする遺伝子配列と作動可能に連結され、微生物内グルタミン酸の生成量を増加させて、乳酸生成量を減少させることができる。
【００４６】
本出願のもう一つの様態は、前記ポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結された目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを提供する。
【００４７】
前記ポリヌクレオチドは、前述のとおりである。
【００４８】
具体的には、前記目的タンパク質は、乳酸脱水素酵素（lactate dehydrogenase：ＬＤＨ）であってもよい。
【００４９】
本出願において、用語、「ベクター」は、適合した宿主内で目的遺伝子を発現させうるように遺伝物質を保有する人為的ＤＮＡ分子であって、前記ポリヌクレオチドまたは適合した遺伝子発現調節配列；及びこれに作動可能に連結された目的タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ製造物を意味する。
【００５０】
本出願で用いられるベクターは、宿主細胞内で発現可能なものであれば特に制限されず、当業界に知られている任意のベクターを用いて宿主細胞を形質転換させてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然状態であるか、組換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。
【００５１】
例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＬＢ３、λＢＬ４、λＩＸＩＩ、λＡＳＨＩＩ、λＡＰＩＩ、λｔ１０、λｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いてもよく、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを用いてもよい。
【００５２】
また、宿主細胞内の染色体挿入用ベクターを介して染色体内に内在的プロモーターを本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドと交替できる。例えば、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣ、ｐＣＥＳ２０８、ｐＸＭＪ１９ベクターなどを用いてもよいが、これに制限されない。
【００５３】
また、前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界で知られている任意の方法、例えば、相同組換えによって行ってもよい。
【００５４】
本出願のベクターは、相同組換えを起こして染色体内に挿入されうるため、前記染色体が挿入されたかどうかを確認するための選別マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、すなわちポリヌクレオチドの挿入有無を確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現のような選択可能な表現型を付与するマーカーが用いられてもよい。選択剤（selective agent）が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみ生存するか、または他の表現形質を示すため、形質転換された細胞を選別できる。
【００５５】
本出願において、用語、「形質転換」は、前記ポリヌクレオチドまたは遺伝子発現調節配列及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを宿主細胞内に導入し、宿主細胞内で前記遺伝子が発現できるようにすることを意味する。さらに、宿主細胞内で目的遺伝子が発現することさえできれば、形質転換された前記ポリヌクレオチド及び目的タンパク質をコードする遺伝子は、宿主細胞の染色体上に位置するか、染色体外に位置するか関係なく、これらすべての場合を含んでもよい。
【００５６】
前記形質転換する方法は、前記遺伝子発現調節配列及び目的タンパク質をコードする遺伝子を細胞内に導入するすべての方法を含み、宿主細胞に応じて、当分野で公知のように、適合した標準技術を選択して行ってもよい。例えば、電気穿孔法（electroporation）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微細注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥデキストラン法、陽イオンリポソーム法、及び酢酸リチウムＤＭＳＯ法などがあるが、これに制限されない。
【００５７】
本出願のもう一つの様態は、前記ポリヌクレオチド；及び前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結された目的タンパク質をコードする遺伝子を含む、コリネバクテリウム属微生物を提供する。
【００５８】
前記ポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結された目的タンパク質をコードする遺伝子は、先に説明した通りである。
【００５９】
本出願において、用語、「微生物」は、野生型微生物や、自然的または人為的に遺伝的変形が起きた微生物をすべて含み、外部遺伝子が挿入されたり、内在的遺伝子の活性が強化されたり弱化されるなどの原因によって特定機序が弱化されたりまたは増強された微生物のすべてを含む概念である。
【００６０】
本出願で、前記微生物は前記ポリヌクレオチドを含んでもよく、具体的には、前記ポリヌクレオチド及び／または前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結されて、目的タンパク質をコードする遺伝子を含んでもよい。または、前記微生物は、前記ポリヌクレオチドまたは遺伝子発現調節配列及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを含んでもよいが、これに制限されない。また、前記ポリヌクレオチド、前記目的タンパク質をコードする遺伝子及びベクターは、形質転換によって前記微生物に導入されてもよいが、これに制限されない。さらに、前記微生物は前記遺伝子が発現できれば、前記ポリヌクレオチド及び目的タンパク質をコードする遺伝子が、染色体上に位置するか、染色体外に位置するかとは関係がない。
【００６１】
本出願の目的上、前記ポリヌクレオチド及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含む微生物は、グルタミン酸の生成量が増加して、乳酸の生成量が減少したものであってもよい。
【００６２】
例えば、前記微生物は、ポリヌクレオチドは、乳酸脱水素酵素の活性が弱化されたものであってもよい。
【００６３】
本出願で前記微生物は本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドが導入されてプロモーターとして作動できる微生物であれば、制限なく含まれてもよい。
【００６４】
具体的には、前記微生物はコリネバクテリウム属微生物であってもよく、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）またはコリネバクテリウム・フラバム（Corynebacterium flavum）であってもよく、最も具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムであってもよいが、これに制限されない。
【００６５】
本出願のもう一つの様態は、前記コリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；及び前記の培地から目的物質を回収する段階を含む、目的物質を生産する方法を提供する。
【００６６】
前記ポリヌクレオチド及び微生物は、前述のとおりである。
【００６７】
本出願で、前記目的物質はアミノ酸であってもよい。具体的には、前記アミノ酸は別に言及しない限り、Ｌ−形態のアミノ酸であってもよく、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、セリン、システイン、グルタミン、メチオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、及びこれらの組み合わせで構成された群から選択されてもよいが、これに制限されない。
【００６８】
より具体的には、前記アミノ酸はグルタミン酸であってもよいが、これに制限されない。
【００６９】
本出願において、用語、「培養」は、微生物を適当に人工的に調節した環境条件で生育させることを意味する。本出願で前記ポリヌクレオチドを含む微生物を用いて目的物質を生産する方法は、当業界に広く知られている方法を用いて行ってもよい。具体的には、前記培養は、バッチ工程、注入バッチまたは反復注入バッチ工程（fed batch or repeated fed batch process）で連続式で培養してもよいが、これに制限されるものではない。培養に用いられる培地は、適切な方法で特定菌株の要件を満たす必要がある。コリネバクテリウム菌株に対する培養培地は公知されている（例えば、Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981）。
【００７０】
培地中に用いられる糖源としては、ブドウ糖、サッカロース、乳糖、果糖、マルトース、でん粉、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツ油などのようなオイル及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれる。これらの物質は、個別的に、または混合物として用いられてもよく、これに制限されるものではない。
【００７１】
用いられる窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆ミール、及び尿素または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源も、個別的に、または混合物として用いてもよく、これに制限されるものではない。
【００７２】
用いられるリン源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウムを含有する塩が含まれてもよい。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有してもよい。最後に、前記物質に加えて、アミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が用いられてもよい。また、培養培地に適切な前駆体が用いられてもよい。前記された原料は、培養過程で培養物に適切な方法によって回分式または連続式で添加してもよい。
【００７３】
前記微生物の培養中に水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような基礎化合物またはリン酸または硫酸のような酸化合物を適切な方法で用いて培養物のｐＨを調節してもよい。また、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡の生成を抑制してもよい。好気状態を維持するために培養物内に酸素または酸素含有気体（例えば、空気）を注入してもよい。
【００７４】
培養物（培地）の温度は、通常２０℃〜４５℃、具体的には、２５℃〜４０℃であってもよい。培養時間は、所望の目的物質の生成量が得られるまで続いてもよいが、具体的には、１０〜１６０時間であってもよい。
【００７５】
培養物（培地）からの目的物質の回収は、当業界に知られている通常の方法によって分離されて回収されうる。これらの分離方法には、遠心分離、ろ過、クロマトグラフィー及び結晶化などの方法が用いられる。例えば、培養物を低速遠心分離してバイオマスを除去して得られた上澄み液を、イオン交換クロマトグラフィーを介して分離してもよいが、これに制限されるものではない。別の方法として、培養物（培地）から菌体分離及びろ過工程を行い、別の精製工程なしに目的物質を回収してもよい。別の方法として、前記回収段階は、精製工程をさらに含んでもよい。
【００７６】
本出願のもう一つの様態は、前記コリネバクテリウム属微生物を培地で培養して発酵する段階を含む、発酵組成物の製造方法を提供する。
【００７７】
本出願のもう一つの様態は、前記方法により製造された発酵組成物を提供する。
【００７８】
前記ポリヌクレオチド及び微生物は先に説明した通りであり、前記微生物を培地で培養する段階も前述した通りである。
【００７９】
本出願において、用語、「前記発酵組成物」は、本出願の微生物を培養して得られた組成物を意味する。さらに、前記発酵組成物は、前記微生物を培養した後、適切な後処理工程を経た後、得られた液状または粉末形態の組成物を含んでもよい。この時、適切な後処理工程は、例えば、前記微生物の培養工程、菌体除去工程、濃縮工程、ろ過工程、及び担体混合工程を含んでもよく、追加で乾燥工程をさらに含んでもよい。場合に応じて、前記後処理工程は、精製工程を含まなくてもよい。前記発酵組成物は、本出願の微生物を培養することにより、グルタミン酸の生成量が増加して乳酸の生成量が減少した組成物を含むことにより、最適な味を出せる。
【００８０】
また、「前記発酵組成物」は、前記の液状または粉末形態の組成物が含まれた調味料製品（例えば、スープ用粉末製品、スナックシーズニング製品など）を排除しない。さらに、「前記発酵組成物」は、本出願の微生物を培養して得られた組成物を含みさえすれば、非発酵の工程で得られた物質及び／または非天然の工程で得られた別の物質を追加で混合した場合を排除しない。
【００８１】
以下、本出願の実施例を介してより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本出願を例示的に説明するためのもので、本出願の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００８２】
実施例１．乳酸生成能低下変異株の選別
実施例１-１．ＵＶ調査を介したランダム突然変異の誘発
発酵の目的産物であるグルタミン酸の生成能は向上され、発酵産物の嗜好性を低下させる乳酸の生成能が低下した変異菌株を選別するために、まず野生型コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum、ＡＴＣＣ１３８６９）を寒天を含む栄養培地に塗抹して、３０℃で１６時間培養した。このように獲得した数百個のコロニーを室温でＵＶを照射して菌株内ゲノム上にランダム突然変異を誘発させた。
【００８３】
実施例１-２．突然変異誘発菌株の発酵力価の実験及び菌株の選別
以後、ランダム突然変異が誘発された前記突然変異菌株を対象に発酵力価実験を実施した。
【００８４】
それぞれのコロニーを栄養培地で継代培養した後、発酵培地で５時間培養した。その後、それぞれの培地に２５％ツイン４０（tween40）を０．４％濃度で追加し、それぞれのコロニーを再び３２時間培養した。
【００８５】
栄養培地：
グルコース１％、肉汁０．５％、ポリペプトン１％、塩化ナトリウム０．２５％、酵母エキス０．５％、寒天２％、ウレア０．２％、ｐＨ７．２
発酵培地：
粗糖６％、炭酸カルシウム５％、硫酸アンモニウム２．２５％、１リン酸カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０４％、硫酸鉄１０ｍｇ ／Ｌ、ビオチン０．３ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩０．２ｍｇ／Ｌ
前記条件でそれぞれのコロニーを培養して、野生型コリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１３８６９）と同等するか、それ以上のＬ−グルタミン酸を生産する突然変異菌株を選別した。その後、選別した突然変異菌株に対してＹＳＩを用いてＬ−グルタミン酸濃度を測定し、ＨＰＬＣを用いて乳酸濃度を測定した。測定したＬ−グルタミン酸及び乳酸の濃度は下記表１に示した。
【００８６】
【表１】
2021514602.tif 000002
表１を参照して、野生型菌株に比べてグルタミン酸の生産量が増加して、乳酸の生産量が減少した変異体菌株として、「ＡＴＣＣ１３８６９−ｍ７」及び「ＡＴＣＣ１３８６９−ｍ９」を選別した。
【００８７】
実施例２．遺伝子シーケンシングを介した変異の確認
前記突然変異菌株の遺伝子変異を確認するために、ＡＴＣＣ１３８６９−ｍ７及びＡＴＣＣ１３８６９−ｍ９菌株の遺伝子を野生型菌株と比較した。
【００８８】
その結果、前記ＡＴＣＣ１３８６９−ｍ７及びＡＴＣＣ１３８６９−ｍ９菌株は、乳酸脱水素酵素（lactate dehydrogenase）をコードする遺伝子のプロモーター領域（promoter region）の特定位置に同一の変異を含んでいることを確認した。
【００８９】
具体的には、ＡＴＣＣ１３８６９−ｍ７及びＡＴＣＣ１３８６９−ｍ９は、配列番号２で表されるプロモーター領域の配列内３７番目ヌクレオチドであるＴがＧに置換された変異を含んでいることを確認した。配列番号２で表される前記プロモーター領域は、コリネバクテリウム属微生物、より具体的には、野生型コリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１３８６９、ＡＴＣＣ１４０６７）に共通的に含まれる配列であることを確認した。
【００９０】
したがって、以下実施例３及び４では、前記変異がコリネバクテリウム属微生物のグルタミン酸及び乳酸生成量に影響を与えるかを確認した。
【００９１】
実施例３．変異が導入された菌株の製作及び乳酸生成量の確認
実施例３−１．変異が導入された菌株の製作
前記実施例２を介して確認した変異が導入された変異菌株を製作した。具体的には、前記変異を野生型コリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１３８６９及びＡＴＣＣ１３０３２）に導入（配列番号２で表されるポリヌクレオチド配列の３７番目ヌクレオチドをＧに置換）するために、ターゲット変異を含む逆方向のオリゴヌクレオチドを７５マー（mer）の長さにデザインした。
【００９２】
具体的には、配列番号５のオリゴヌクレオチド３０μｇをコリネバクテリウム・グルタミカム野生型ＡＴＣＣ１３８６９菌株とＡＴＣＣ１３０３２菌株に電気パルス法（非特許文献５）で形質転換し、複合液体培地を１ｍｌ添加して、３０℃で３０分間、１６０ｒｐｍで振とう培養した。その後、培養液を氷で１０分間インキュベーション（incubation）して、４℃で１０分間４０００ｒｐｍで遠心分離した後、上澄み液を除去して菌体を確保した。その後、４℃の１０％グリセロール溶液を１ｍｌ添加し混合した後、４℃で１０分間４０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄み液を除去して菌体を洗浄した。このように菌体を１回さらに洗浄し、４℃の１０％グリセロール溶液を０．１ｍｌ添加して、次の形質転換のための菌株を準備した。その後、前記のような電気パルス法で配列番号５のオリゴヌクレオチドを用いて形質転換する過程を１０回繰り返した後、複合平板培地に塗抹してコロニーを確保した（非特許文献６）。
【００９３】
前記確保したコロニーの遺伝子配列解析を行った結果、菌株に前記のターゲット変異が導入されたことを確認し、変異が導入された前記菌株を「ＡＴＣＣ１３８６９：：ｌｄｈ−ｐｒｏ−１ｍｔ」及び「ＡＴＣＣ１３０３２：：ｌｄｈ−ｐｒｏ−１ｍｔ」と命名した。
【００９４】
実施例３−２．乳酸生産量の確認
前記実施例３−１を介して製作した変異菌株ＡＴＣＣ１３８６９：：ｌｄｈ−ｐｒｏ−１ｍｔ及びＡＴＣＣ１３０３２：：ｌｄｈ−ｐｒｏ−１ｍｔと、これらの各野生型コリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１３８６９及びＡＴＣＣ１３０３２）は、それぞれ実施例１−２と同様の方法で培養した。
【００９５】
培養が完了した後、各培地内のＬ−グルタミン酸の濃度及び乳酸の濃度を測定した。測定したＬ−グルタミン酸及び乳酸の濃度は表２に示した。
【００９６】
【表２】
2021514602.tif 000003
表２に示すように、変異が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９：：ｌｄｈ−ｐｒｏ−１ｍｔ菌株が生産したＬ−グルタミン酸の濃度は、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９が生産したＬ−グルタミン酸濃度に比べて、約４．７ｇ／Ｌ（約３２％）がより高いことを確認した。一方、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９は、乳酸を１．５ｇ／Ｌ生産したが、ＡＴＣＣ１３８６９：：ｌｄｈ−ｐｒｏ−１ｍｔ菌株を培養した培地では乳酸が測定されなかった。
【００９７】
また、変異が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２：：ｌｄｈ−ｐｒｏ−１ｍｔ菌株が生産したＬ−グルタミン酸の濃度は、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２が生産したＬ−グルタミン酸の濃度に比べて、約２．６ｇ／Ｌ（約３２％）がより高いことを確認した。一方、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２は、乳酸を２．７ｇ／Ｌ生産したが、ＡＴＣＣ１３０３２：：ｌｄｈ−ｐｒｏ−１ｍｔ菌株を培養した培地では乳酸が非常に微量（０．３ｇ／Ｌ）測定された。
【００９８】
すなわち、前記変異は、微生物のＬ−グルタミン酸の生成能を増加させて、乳酸の生成能を低下させるということを確認した。
【００９９】
また、前記菌株ＡＴＣＣ１３８６９：：ｌｄｈ−ｐｒｏ−１ｍｔをＣＡ０２−９２０９と命名し、２０１８年２月２８日付でブダペスト条約下の寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に国際寄託してＫＣＣＭ１２２２７Ｐの寄託番号を付与された。
【０１００】
実施例４．変異が導入されたＫＦＣＣ１１０７４菌株の乳酸生成量及び酵素活性の確認
実施例４−１．変異が導入されたベクターの製作
野生型菌株の他に、グルタミン酸の生産能が増加された菌株でも前記変異が同様の効果を示すかどうかを確認するために、グルタミン酸生産菌株として知られているＫＦＣＣ１１０７４菌株（特許文献３）に前記変異を導入した。
【０１０１】
具体的には、前記菌株が含む配列番号２で表されるポリヌクレオチド配列の３７番目ヌクレオチドをＧに置換するために遺伝子置換ベクターを製作した。ベクターを製作するための遺伝子断片は、ＡＴＣＣ１３８６９ゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを介して獲得した。米国国立衛生研究所ジーンバンク（NIH GenBank）に登録されているコリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１３８６９）遺伝子及び周辺の塩基配列に対する情報を基づいて、配列番号６、７、８、及び９のポリヌクレオチドを含むプライマーを製作した。
【０１０２】
ＰＣＲは９５℃で５分間変性した後、９５℃で２０秒の変性、５５℃で２０秒のアニーリング、７２℃で３０秒の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応で行った。より具体的には、配列番号６及び７のプライマーを用いて増幅した５００ｂｐのポリヌクレオチドと配列番号８及び９のプライマーを用いて増幅した５００ｂｐのポリヌクレオチドを得た。前記得られた２つの遺伝子断片を制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩで切断したｐＤＺベクター（特許文献４及び５）にインフュージョン酵素を用いて連結することにより、遺伝子置換ベクターを製作し、これを「ｐＤＺ−ｌｄｈ−ｐｒｏ−１ｍｔ」と命名した。前記のベクター製作のために用いられたプライマー配列情報は、下記表３に示した。
【０１０３】
【表３】
2021514602.tif 000004
実施例４−２．変異が導入されたＫＦＣＣ１１０７４の製作及び乳酸生成量の確認
前記実施例４−１を介して製作した遺伝子置換ベクターをＫＦＣＣ１１０７４菌株に導入して変異が導入されたグルタミン酸生産菌株「ＫＦＣＣ１１０７４：：ｌｄｈ−ｐｒｏ−１ｍｔ」を製作した。変異が導入されないコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１１０７４及び前記ＫＦＣＣ１１０７４：：ｌｄｈ−ｐｒｏ−１ｍｔ菌株は、それぞれ実施例１−２と同様の方法で培養した。
【０１０４】
培養が完了した後、各培地内のＬ−グルタミン酸濃度及び乳酸濃度を測定した。測定したＬ−グルタミン酸及び乳酸の濃度は、下記表４に示した。
【０１０５】
【表４】
2021514602.tif 000005
表４に示すように、変異が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１１０７４：：ｌｄｈ−ｐｒｏ−１ｍｔ菌株が生産したＬ−グルタミン酸の濃度は、変異が導入されないコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１１０７４が生産したＬ−グルタミン酸の濃度に比べて、約８ｇ／Ｌ（約８８％）がより高いことを確認した。
【０１０６】
一方、前記ＫＦＣＣ１１０７４：：ｌｄｈ−ｐｒｏ−１ｍｔ菌株が生産した乳酸の濃度は、変異が導入されないコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１１０７４が生産した乳酸の濃度に比べて、１７ｇ／Ｌ低いことを確認した。
【０１０７】
すなわち、前記変異は微生物のＬ−グルタミン酸の生成能を増加させて、乳酸の生成能を減少させることをもう一度確認した。
【０１０８】
実施例４−３．変異が導入されたＫＦＣＣ１１０７４の酵素活性の確認
前記実施例４−２を介して製作したＫＦＣＣ１１０７４：：ｌｄｈ−ｐｒｏ−１ｍｔ菌株の乳酸生成能の減少に対するメカニズムを確認するとともに、前記変異は乳酸脱水素酵素（lactate dehydrogenase：ＬＤＨ）のプロモーター内に含まれていることを確認し、前記変異に伴う乳酸生産酵素である乳酸脱水素酵素の活性を確認した。
【０１０９】
具体的には、前記酵素の活性の評価は、次のような方法で行った。まず、細胞を下記組成の＃３号培地２５ ｍｌ（２５０ｍｌ flask）に６時間（３０℃、２００ｒｐｍ）培養した後、細胞を沈殿させて（４０００ｒｐｍ、１０分）上澄み液を除去し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）２５ｍｌで細胞の洗浄を繰り返して３回行った。洗浄した後、上澄み液を除去し、細胞抽出のために２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）の組成に１５％グリセロールバッファー（glycerol buffer）２ｍｌで再懸濁（resuspension）して、１ｍｌをビードチューブ（bead tube）に入れてホモジナイザーを用いて４６／３０秒の条件で均質化を６回行った。その後４℃、１３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。
【０１１０】
＃３号培地：
グルコース２％、ポリペプトン１％、（ＮＨ４）２ＳＯ４１％、ＫＨ２ＰＯ４０．５２％、Ｋ２ＨＰＯ４１．０７％、酵母エキス１％、ウレア（urea）０．１５％、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ０．０５％、ｄ−ビオチン（d-Biotin）１．８ｍｇ／Ｌ、チアミン−ＨＣｌ（Thiamin-HCl）９ｍｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム（Ca-pantothenic）９ｍｇ／Ｌ、ナイアシンアミド（Niacinamide）６０ｍｇ／Ｌ
以後、ビードチューブで得られた上澄み液（サンプル）に含まれているタンパク質の濃度を確認及び標準化するために、ブラッドフォードアッセイ（Bradford assay）を行った。ブラッドフォードアッセイは、以下の表５及び６を参照し、標準曲線（standard curve）を確保して、サンプルの濃度を確認した。この時、総２０μｌ体積のサンプルに１×バイオラッドプロテインアッセイ（Biorad protein assay）試薬を９８０μｌ添加及びボルテックス（vortexing）して吸光度を３分内外で５９５ｎｍで測定した。
【０１１１】
【表５】
2021514602.tif 000006
【０１１２】
【表６】
2021514602.tif 000007
以後、ＫＦＣＣ１１０７４及びＫＦＣＣ１１０７４：：ｌｄｈ−ｐｒｏ−１ｍｔ菌株の乳酸脱水素酵素に対する活性の実験は、下記表７の反応液組成比を用いて行い、スターター（Starter）として３０ｍＭピルビン酸ナトリウム（sodium pyruvate）を用いた。また、下記表８の条件で測定した前記２つの菌株の乳酸脱水素酵素の活性は下記表9に示した。
【０１１３】
【表７】
2021514602.tif 000008
【０１１４】
【表８】
2021514602.tif 000009
【０１１５】
【表９】
2021514602.tif 000010
表９に示すように、変異が導入された菌株では乳酸脱水素酵素の活性が減少することが確認できた。
【０１１６】
すなわち、前記変異は、微生物の乳酸脱水素酵素の活性を減少させることで乳酸の生成能を低下させるということを確認した。
【０１１７】
前記結果をすべて総合すると、本出願のポリヌクレオチドは、１つの塩基が置換された変異を含む乳酸脱水素酵素のプロモーターであって、変異されたプロモーター活性を介して野生型またはグルタミン酸の生産菌株で乳酸脱水素酵素の活性を弱化させて発酵の目的産物であるグルタミン酸の生産能を増加させ、さらに発酵産物の嗜好性を低下させる乳酸の生産能を減少させることができるため、グルタミン酸を高収率で生産しようとする様々な産業分野に有用に用いられる。
【０１１８】
以上の説明から、本願が属する技術分野の当業者は、本願がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、制限的なものではないものと理解しなければならない。本願の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本願の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【０１１９】
2021514602.tif 000011
【配列表】
2021514602000001.app
【国際調査報告】
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