(57)【要約】本開示は、少なくとも部分的に、マイコバクテリアのポリヌクレオチドおよびポリペプチド、その断片または変異型、マイコバクテリアのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含む細胞、エクスビボでＴ細胞を拡大するように操作されるマイコバクテリアのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含む細胞、ならびにその使用方法に関する。本開示はまた、少なくとも部分的に、マイコバクテリアポリペプチド（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）および／もしくはマイコバクテリアポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ）、またはそれらの断片もしくは変異型を発現するポリヌクレオチドを含む組成物、ならびにそのような組成物をＴ細胞などの細胞に曝露することに関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＡｇ８５Ｂ抗原もしくはその機能的断片をコードする核酸配列、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＰＰＥ６８抗原もしくはその機能的断片をコードする核酸、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＥＳＸＡ抗原もしくはその機能的断片をコードする核酸、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＥＳＸＢ抗原もしくはその機能的断片をコードする核酸、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＡＤＫ抗原もしくはその機能的断片をコードする核酸、またはそれらの組み合わせを含む、組成物。
【請求項２】
Ａｇ８５Ｂ抗原またはその機能的断片をコードする前記核酸配列が、配列番号１と少なくとも５０％同一である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＰＰＥ６８抗原またはその機能的断片をコードする前記核酸配列が、配列番号２と少なくとも５０％同一である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ＥＳＸＡ抗原またはその機能的断片をコードする前記核酸配列が、配列番号３と少なくとも５０％同一である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
ＥＳＸＢ抗原またはその機能的断片をコードする前記核酸配列が、配列番号４と少なくとも５０％同一である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
ＡＤＫ抗原またはその機能的断片をコードする前記核酸配列が、配列番号５と少なくとも５０％同一である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＡｇ８５Ｂ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＰＰＥ６８抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＥＳＸＡ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＥＳＸＢ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＡＤＫ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、またはそれらの組み合わせを含む、組成物。
【請求項８】
Ａｇ８５Ｂ抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含む前記ポリペプチドが、配列番号６と５０％同一である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
ＰＰＥ６８抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含む前記ポリペプチドが、配列番号７と５０％同一である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
ＥＳＸＡ抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含む前記ポリペプチドが、配列番号８と５０％同一である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
ＥＳＸＢ抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含む前記ポリペプチドが、配列番号９と５０％同一である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
ＡＤＫ抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含む前記ポリペプチドが、配列番号１０と５０％同一である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１３】
１つ以上のアミノ酸配列が、Ａｇ８５Ｂ、ＰＰＥ６８、ＥＳＸＡ、ＥＳＸＢ、およびＡＤＫ抗原の一部またはすべてに及ぶように配列が重複している、請求項７に記載の組成物。
【請求項１４】
前記Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種が、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ、Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｃａｎｅｔｔｉ、Ｍ．ｃａｐｒａｅ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｔ、Ｍ．ｍｕｎｇｉ、Ｍ．ｏｒｙｇｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ａｖｉｕｍ  ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ  ｓｉｌｖａｔｉｃｕｍ、Ｍ．ｃｏｌｕｍｂｉｅｎｓｅ、Ｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｍ．ｇｅｎａｖｅｎｓｅ、Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、およびＭ．ｍｕｃｏｇｅｎｉｃｕｍからなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、免疫細胞を刺激するために使用される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記免疫細胞を刺激することは、前記免疫細胞を活性化することを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記免疫細胞を刺激することは、前記免疫細胞を拡大することを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記免疫細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項１５記載の組成物。
【請求項１９】
前記免疫細胞が、ＮＫ細胞である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２０】
前記免疫細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項１５記載の組成物。
【請求項２１】
（ｉ）配列番号１と少なくとも５０％同一であるＡｇ８５Ｂ抗原をコードする核酸配列、配列番号２と少なくとも５０％同一であるＰＰＥ６８抗原をコードする核酸配列、配列番号３と少なくとも５０％同一であるＥＳＸＡ抗原をコードする核酸配列、配列番号４と少なくとも５０％同一であるＥＳＸＢ抗原をコードする核酸配列、配列番号５と少なくとも５０％同一であるＡＤＫ抗原をコードする核酸配列、もしくはそれらの組み合わせ、
（ｉｉ）配列番号６と少なくとも５０％同一であるＡｇ８５Ｂ抗原をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号７と少なくとも５０％同一であるＰＰＥ６８抗原をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号８と少なくとも５０％同一であるＥＳＸＡ抗原をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号９と少なくとも５０％同一であるＥＳＸＢ抗原をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１０と少なくとも５０％同一であるＡＤＫ抗原をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド、もしくはそれらの組み合わせ、
（ｉｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、もしくは配列番号５の核酸配列の機能的断片をコードする（ｉ）の核酸、および
（ｉｖ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、もしくは配列番号１０のアミノ酸配列の機能的断片をコードする（ｉｉ）のアミノ酸配列、
のうちの１つ、またはそれらの組み合わせを含む、細胞または複数の細胞。
【請求項２２】
前記細胞が、ヘルパー（ＣＤ４＋）Ｔ細胞である、請求項２１に記載の細胞または複数の細胞。
【請求項２３】
前記細胞が、細胞傷害性（ＣＤ８＋）Ｔ細胞である、請求項２１に記載の細胞または複数の細胞。
【請求項２４】
前記細胞が、ガンマ／デルタＴ細胞である、請求項２１に記載の細胞または複数の細胞。
【請求項２５】
前記細胞が、セントラルメモリーＴ細胞である、請求項２１に記載の細胞または複数の細胞。
【請求項２６】
前記細胞が、エフェクターメモリーＴ細胞である、請求項２１に記載の細胞または複数の細胞。
【請求項２７】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞が、全Ｔ細胞集団の約６０％〜約９０％を構成する、請求項２２に記載の細胞または複数の細胞。
【請求項２８】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞が、全Ｔ細胞集団の約０％〜約４０％を構成する、請求項２３に記載の細胞または複数の細胞。
【請求項２９】
前記ガンマ／デルタ細胞が、全Ｔ細胞集団の約０．５％〜約１０％を構成する、請求項２４に記載の細胞または複数の細胞。
【請求項３０】
前記セントラルメモリーＴ細胞が、全Ｔ細胞集団の約０．５％〜約１５％を構成する、請求項２５に記載の細胞または複数の細胞。
【請求項３１】
前記セントラルメモリーＴ細胞が、全Ｔ細胞集団の約２０％〜約６０％を構成する、請求項２６に記載の細胞または複数の細胞。
【請求項３２】
前記複数の細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数が、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数よりも多い、請求項２１に記載の複数の細胞。
【請求項３３】
前記細胞が、ヒト対象からのものである、請求項２１に記載の複数の細胞の細胞。
【請求項３４】
前記ヒト対象が、免疫不全である、請求項３３に記載の細胞または複数の細胞。
【請求項３５】
前記ヒト対象が、マイコバクテリア感染症であると診断されているか、またはそれを有する疑いがある、請求項３３に記載の細胞または複数の細胞。
【請求項３６】
前記細胞または複数の細胞が、細胞培養において拡大される、請求項２１に記載の細胞または複数の細胞。
【請求項３７】
少なくとも１つの初代Ｔ細胞を含む、請求項３６に記載の細胞または複数の細胞。
【請求項３８】
前記細胞が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）である、請求項２１に記載の複数の細胞の細胞。
【請求項３９】
前記ＡＰＣ細胞が、人工抗原提示細胞である、請求項３８に記載の複数の細胞の細胞。
【請求項４０】
前記細胞が、マクロファージである、請求項２１に記載の複数の細胞の細胞。
【請求項４１】
前記細胞が、樹状細胞である、請求項２１に記載の複数の細胞の細胞。
【請求項４２】
マイコバクテリア種からの１つ以上の抗原をさらに含み、前記１つ以上の抗原が表１に提供される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
前記細胞が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＡｇ８５Ｂ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＰＰＥ６８抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＥＳＸＡ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＥＳＸＢ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＡＤＫ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、またはそれらの組み合わせを発現することができる、請求項２１〜４１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４４】
エクスビボでＴ細胞を拡大するように操作された細胞であって、Ａｇ８５Ｂ、ＰＰＥ６８、ＥＳＸＡ、ＥＳＸＢ、およびＡＤＫから選択される少なくとも５つの抗原を含み、前記細胞が、
それぞれが前記少なくとも５つの抗原のうちの１つ以上をコードする１つ以上の核酸を前記細胞に導入することと、前記抗原のうちの１つ以上の産生に好適な条件下で前記細胞を培養することと、を含むプロセスによって産生される、細胞。
【請求項４５】
前記細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、樹状細胞、フィトヘマグルチニン芽細胞、またはＫ５６２もしくは他の細胞株などの不死化細胞に基づく人工抗原提示細胞を含む、抗原提示細胞である、請求項４５に記載の細胞。
【請求項４６】
前記核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む、請求項４５に記載の細胞。
【請求項４７】
前記導入ステップが、ウイルス形質導入を含む、請求項４５に記載の細胞。
【請求項４８】
前記導入ステップが、エレクトロポレーションを含む、請求項４４に記載の細胞。
【請求項４９】
請求項２１〜４１に記載の１つまたは複数の細胞を含む、組成物。
【請求項５０】
（ｉ）薬学的に有効な量の、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物と、
（ｉｉ）薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項５１】
（ｉ）薬学的に有効な量の、請求項２１〜４１のいずれかに記載の１つまたは複数の細胞と、
（ｉｉ）薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項５２】
エクスビボでＴ細胞を拡大する方法であって、
（ａ）１つまたは複数のＴ細胞を培養すること、
（ｂ）前記複数のＴ細胞を、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＡｇ８５Ｂ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＰＰＥ６８抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＥＳＸＡ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＥＳＸＢ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＡＤＫ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、またはそれらの組み合わせと接触させること、あるいは
前記複数のＴ細胞を、請求項１〜１４のいずれかに記載の組成物、または請求項５０の医薬組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項５３】
エクスビボでＴ細胞を拡大するための方法であって、
（ａ）１つまたは複数の単離されたＴ細胞を培養すること、
（ｂ）前記複数のＴ細胞を抗原提示細胞と接触させることを含み、前記抗原提示細胞が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＡｇ８５Ｂ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＰＰＥ６８抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＥＳＸＡ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＥＳＸＢ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＡＤＫ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、またはそれらの組み合わせを発現することによって提示される、方法。
【請求項５４】
前記１つまたは複数のＴ細胞を１つ以上のサイトカインで刺激することをさらに含む、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記サイトカインが、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＮＦβ、およびＩＦＮαからなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記方法が、ステップ（ａ）の前に対象から試料を単離することと、前記試料からＴ細胞を単離することと、をさらに含む、請求項５２または請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
治療を必要とする対象のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染症を治療する方法であって、治療有効量の、請求項１〜１４または４９に記載の組成物、または請求項５０もしくは５１に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
【請求項５８】
前記対象が、免疫不全の宿主である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記対象が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種に感染していると診断されているか、または感染している疑いがある、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記感染症が、活動性感染症である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
治療を必要とする対象のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる感染を予防または遅延する方法であって、治療有効量の、請求項１〜１４または４９に記載の組成物、または請求項５０もしくは５１に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
【請求項６２】
前記Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種が、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ、Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｃａｎｅｔｔｉ、Ｍ．ｃａｐｒａｅ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｔ、Ｍ．ｍｕｎｇｉ、Ｍ．ｏｒｙｇｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ａｖｉｕｍ  ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ  ｓｉｌｖａｔｉｃｕｍ、Ｍ．ｃｏｌｕｍｂｉｅｎｓｅ、Ｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｍ．ｇｅｎａｖｅｎｓｅ、Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、およびＭ．ｍｕｃｏｇｅｎｉｃｕｍからなる群から選択される、請求項５７〜６１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６３】
前記対象が、免疫不全である、請求項５８〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記対象が、２１歳未満の子供である、請求項５８〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記対象が、１２歳未満の子供である、請求項５８〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２０１８年４月２６日に出願された仮米国出願第６２／６６３，２３９号の利益を主張し、その全体は、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、一般に、マイコバクテリアのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含む新規免疫原性の組み合わせ、それらの断片または変異型、および抗原がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からであるそのような組み合わせた抗原を含む細胞に関する。
【背景技術】
【０００３】
マイコバクテリアは遍在性病原体であり、免疫不全患者に深刻な日和見感染を引き起こす可能性がある。マイコバクテリア感染症の治療は、幅広い抗菌薬耐性により複雑になり、多くの場合、複数の薬剤による抗生物質治療が必要となる。
【０００４】
Ｔ細胞の欠損は侵襲性マイコバクテリア感染のリスクが高いため、マイコバクテリアに対するＴ細胞免疫がマイコバクテリア感染の制御および予防に重要であるというエビデンスがある。
【０００５】
マイコバクテリア感染の脅威および世界的な蔓延の増加を考慮して、マイコバクテリア感染のより効果的な予防、治療、および診断のための新しい戦略が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、少なくとも部分的に、マイコバクテリアのポリヌクレオチドおよびポリペプチド、またはそれらの断片もしくは変異型を含む組成物、ならびにそのような組成物をＴ細胞などの細胞に曝露することに関する。本開示はまた、少なくとも部分的に、マイコバクテリアポリペプチド（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）および／もしくはマイコバクテリアポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ）、またはそれらの断片もしくは変異型を発現するポリヌクレオチドを含む組成物、ならびにそのような組成物をＴ細胞などの細胞に曝露することに関する。本開示はまた、マイコバクテリアポリペプチドおよび／もしくはマイコバクテリアポリペプチド、またはそれらの断片もしくは変異型を発現するポリペプチドを含む細胞、ならびにポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドを、（ｉ）ポリヌクレオチドが、ポリペプチドを発現し、細胞（複数可）内のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに対する抗原特異的免疫応答を刺激する、および／または（ｉｉ）ポリペプチドに対する抗原特異的免疫応答を刺激するのに十分な期間の間細胞に曝露することを含む、細胞をプライミングする方法に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、エクスビボでのＴ細胞の拡大、およびその使用方法に関する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はナイーブＴ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、マイコバクテリアに曝露されていない対象からのナイーブＴ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、マイコバクテリア感染症に感染していない対象からのナイーブＴ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、本明細書に開示される１つまたは複数のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのマイコバクテリア感染症に感染していない対象からのナイーブＴ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、マイコバクテリア感染症に感染していない対象からのナイーブＴ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、対象から単離されたナイーブＴ細胞である。本開示はまた、部分的に、健康なドナーからのヒトＴ細胞が、様々なマイコバクテリア抗原、特定の実施形態では、抗原Ａｇ８５Ｂ、ＰＰｅ６８、Ｐ９ＷＮＫ７、ＥＳＸＡ、ＥＳＸＢ、およびＡＤＫを包含する重複する合成ペプチドプールを使用する迅速なエクスビ拡大プロトコルを使用して拡大され得るという驚くべき発見に基づいている。
【０００７】
一態様では、本開示は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＡｇ８５Ｂ抗原もしくはその機能的断片をコードする核酸配列、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＰＰＥ６８抗原もしくはその機能的断片をコードする核酸、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＥＳＸＡ抗原もしくはその機能的断片をコードする核酸、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＥＳＸＢ抗原もしくはその機能的断片をコードする核酸、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＡＤＫ抗原もしくはその機能的断片をコードする核酸、またはそれらの組み合わせを含む組成物を特徴とする。いくつかの実施形態では、Ａｇ８５Ｂ抗原またはその機能的断片をコードする核酸配列は、配列番号１と少なくとも５０％同一である。いくつかの実施形態では、Ａｇ８５Ｂ抗原またはその機能的断片をコードする核酸配列は、配列番号１と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である。いくつかの実施形態では、ＰＰＥ６８抗原またはその機能的断片をコードする核酸配列は、配列番号２と少なくとも５０％同一である。いくつかの実施形態では、ＰＰＥ６８抗原またはその機能的断片をコードする核酸配列は、配列番号２と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である。いくつかの実施形態では、ＥＳＸＡ抗原またはその機能的断片をコードする核酸配列は、配列番号３と少なくとも５０％同一である。いくつかの実施形態では、ＥＳＸＡまたはその機能的断片をコードする核酸配列は、配列番号３と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である。いくつかの実施形態では、ＥＳＸＢ抗原またはその機能的断片をコードする核酸配列は、配列番号４と少なくとも５０％同一である。いくつかの実施形態では、ＥＳＸＢ抗原またはその機能的断片をコードする核酸配列は、配列番号４と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である。いくつかの実施形態では、ＡＤＫ抗原またはその機能的断片をコードする核酸配列は、配列番号５と少なくとも５０％同一である。いくつかの実施形態では、ＡＤＫまたはその機能的断片をコードする核酸配列は、配列番号５と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である。
【０００８】
他の態様では、本開示は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＡｇ８５Ｂ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＰＰＥ６８抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＥＳＸＡ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＥＳＸＢ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＡＤＫ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、またはそれらの組み合わせを含む組成物を特徴とする。いくつかの実施形態では、Ａｇ８５Ｂ抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドは、配列番号６と約５０％同一である。いくつかの実施形態では、Ａｇ８５Ｂ抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドは、配列番号６と約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である。いくつかの実施形態では、ＰＰＥ６８抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドは、配列番号７と５０％同一である。いくつかの実施形態では、ＰＰＥ６８抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドは、配列番号７と約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である。いくつかの実施形態では、ＥＳＸＡ抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドは、配列番号８と５０％同一である。いくつかの実施形態では、ＥＳＸＡ抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドは、配列番号８と約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である。いくつかの実施形態では、ＥＳＸＢ抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドは、配列番号９と５０％同一である。いくつかの実施形態では、ＥＳＸＢ抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドは、配列番号９と約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である。いくつかの実施形態では、ＡＤＫ抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドは、配列番号１０と約５０％同一である。いくつかの実施形態では、ＡＤＫ抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドは、配列番号１０と約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である。別の実施形態では、１つ以上のアミノ酸配列は、Ａｇ８５Ｂ、ＰＰＥ６８、ＥＳＸＡ、ＥＳＸＢ、およびＡＤＫ抗原の一部またはすべてに及ぶように配列が重複している。上記の態様または実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ、Ｍ．ａ���ｉｕｍ、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ、Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｃａｎｅｔｔｉ、Ｍ．ｃａｐｒａｅ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｔ、Ｍ．ｍｕｎｇｉ、Ｍ．ｏｒｙｇｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ａｖｉｕｍ  ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ  ｓｉｌｖａｔｉｃｕｍ、Ｍ．ｃｏｌｕｍｂｉｅｎｓｅ、Ｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｍ．ｇｅｎａｖｅｎｓｅ、Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、およびＭ．ｍｕｃｏｇｅｎｉｃｕｍからなる群から選択される。上記の態様または実施形態のいずれかの別の実施形態では、組成物は、免疫細胞を刺激するために使用される。いくつかの実施形態では、免疫細胞を刺激することは、免疫細胞を活性化することを含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞を刺激することは、免疫細胞を拡大することを含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。
【０００９】
他の態様では、本開示は、（ｉ）配列番号１と少なくとも約５０％同一であるＡｇ８５Ｂ抗原をコードする核酸配列、配列番号２と少なくとも約５０％同一であるＰＰＥ６８抗原をコードする核酸配列、配列番号３と少なくとも約５０％同一であるＥＳＸＡ抗原をコードする核酸配列、配列番号４と少なくとも約５０％同一であるＥＳＸＢ抗原をコードする核酸配列、配列番号５と少なくとも約５０％同一であるＡＤＫ抗原をコードする核酸配列、またはそれらの組み合わせ、（ｉｉ）配列番号６と少なくとも約５０％同一であるＡｇ８５Ｂ抗原をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号７と少なくとも約５０％同一であるＰＰＥ６８抗原をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号８と少なくとも約５０％同一であるＥＳＸＡ抗原をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号９と少なくとも約５０％同一であるＥＳＸＢ抗原をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１０と少なくとも約５０％同一であるＡＤＫ抗原をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそれらの組み合わせ、（ｉｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の核酸配列の機能的断片をコードする（ｉ）の核酸、（ｉｖ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のアミノ酸配列の機能的断片をコードする（ｉｉ）のアミノ酸配列、のうちの１つまたは組み合わせを含む細胞または複数の細胞を特徴とする。いくつかの実施形態では、細胞は、ヘルパー（ＣＤ４＋）Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞傷害性（ＣＤ８＋）Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ガンマ／デルタＴ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、セントラルメモリーＴ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、エフェクターメモリーＴ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、全Ｔ細胞集団の約６０％〜約９０％を構成する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、全Ｔ細胞集団の約０％〜約４０％を構成する。いくつかの実施形態では、ガンマ／デルタＴ細胞は、全Ｔ細胞集団の約０．５％〜約１０％を構成する。いくつかの実施形態では、セントラルメモリーＴ細胞は、全Ｔ細胞集団の約０．５％〜約１５％を構成する。いくつかの実施形態では、セントラルメモリーＴ細胞は、全Ｔ細胞集団の約２０％〜約６０％を構成する。いくつかの実施形態では、複数の細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数よりも多い。別の実施形態では、細胞は、ヒト対象からのものである。さらなる実施形態では、ヒト対象は、免疫不全である。別のさらなる実施形態では、ヒト対象は、マイコバクテリア感染症を有すると診断されているか、またはそれを有する疑いがある。いくつかの実施形態では、細胞または複数の細胞は、細胞培養において拡大される。いくつかの実施形態では、細胞または複数の細胞は、少なくとも１つの初代Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。別の実施形態では、ＡＰＣ細胞は、人工抗原提示細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、マクロファージである。いくつかの実施形態では、細胞は、樹状細胞である。上記の態様または実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、組成物は、マイコバクテリア種からの１つ以上の抗原をさらに含み、１つ以上の抗原は表１に提供される。
【表１】
2021522245.tif 000003
【００１０】
上記の態様または実施形態のいずれかの別の実施形態では、細胞は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＡｇ８５Ｂ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＰＰＥ６８抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＥＳＸＡ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＥＳＸＢ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＡＤＫ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、またはそれらの組み合わせを発現することができる。
【００１１】
他の態様では、本開示は、エクスビボでＴ細胞を拡大するように操作された細胞を特徴とし、細胞は、Ａｇ８５Ｂ、ＰＰＥ６８、ＥＳＸＡ、ＥＳＸＢ、およびＡＤＫから選択される少なくとも５つの抗原を含み、細胞は、それぞれが少なくとも５つの抗原のうちの１つ以上をコードする１つ以上の核酸を細胞に導入することと、抗原のうちの１つ以上の産生に適した条件下で細胞を培養することと、を含むプロセスによって産生される。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、樹状細胞、フィトヘマグルチニン芽細胞、またはＫ５６２もしくは他の細胞株などの不死化細胞に基づく人工抗原提示細胞を含む、抗原提示細胞である。いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、導入ステップは、ウイルス形質導入を含む。いくつかの実施形態では、導入ステップは、エレクトロポレーションを含む。別の実施形態では、本開示は、本明細書の態様または実施形態のいずれかの１つまたは複数の細胞を含む組成物を特徴とする。
【００１２】
他の態様では、本開示は、（ｉ）薬学的に有効な量の、本明細書の態様および実施形態のいずれかの組成物と、（ｉｉ）薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物を特徴とする。他の態様では、本開示は、治療を必要とする対象におけるマイコバクテリア感染症の治療のための（ｉ）薬学的に有効な量の、本明細書の態様および実施形態のいずれかの組成物と、（ｉｉ）薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物を特徴とする。他の態様では、本開示は、対象におけるマイコバクテリア感染症の治療または予防のための（ｉ）薬学的に有効な量の、本明細書の態様および実施形態のいずれかの組成物と、（ｉｉ）薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物を特徴とする。いくつかの実施形態では、対象は、免疫不全である。いくつかの実施形態では、対象は、臓器移植を受けているか、または受けていると同定される。いくつかの実施形態では、対象は、免疫不全である。いくつかの実施形態では、対象は、がんを有するか、またはがんを有すると同定される。いくつかの実施形態では、対象は、免疫不全である。いくつかの実施形態では、対象は、血液癌を有するか、または有すると同定される。
【００１３】
他の態様では、本開示は、（ｉ）薬学的に有効な量の、本明細書の態様および実施形態のいずれかの１つまたは複数の細胞と、（ｉｉ）薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物を特徴とする。
【００１４】
他の態様では、本開示は、エクスビボでＴ細胞を拡大する方法を特徴とし、本方法は、（ａ）１つまたは複数のＴ細胞を培養すること、（ｂ）複数のＴ細胞を、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＡｇ８５Ｂ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＰＰＥ６８抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＥＳＸＡ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＥＳＸＢ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＡＤＫ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、またはそれらの組み合わせと接触させること、あるいは複数のＴ細胞を、本明細書の態様もしくは実施形態のいずれかの組成物、または本明細書の態様もしくは実施形態のいずれかの医薬組成物と接触させることを含む。
【００１５】
他の態様では、本開示は、エクスビボでＴ細胞を拡大するための方法を特徴とし、本方法は、（ａ）１つまたは複数の単離されたＴ細胞を培養すること、（ｂ）複数のＴ細胞を抗原提示細胞と接触させることを含み、抗原提示細胞は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＡｇ８５Ｂ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＰＰＥ６８抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＥＳＸＡ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＥＳＸＢ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＡＤＫ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、またはそれらの組み合わせを発現することによって提示される。いくつかの実施形態では、本方法は、１つまたは複数のＴ細胞を１つ以上のサイトカインで刺激することをさらに含む。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＮＦβ、およびＩＦＮαからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本方法は、ステップ（ａ）の前に対象から試料を単離することと、試料からＴ細胞を単離することと、をさらに含む。
【００１６】
他の態様では、本開示は、治療を必要とする対象においてＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染症を治療する方法を特徴とし、本方法は、治療有効量の、本明細書の態様もしくは実施形態のいずれかの組成物、または本明細書の態様もしくは実施形態のいずれかの医薬組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、免疫不全の宿主である。いくつかの実施形態では、対象は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種に感染している、または感染している疑いがあると診断されている。いくつかの実施形態では、感染症は、活動性感染症である。
【００１７】
他の態様では、本開示は、予防または遅延を必要とする対象においてＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる感染を予防または遅延する方法を特徴とし、本方法は、治療有効量の、本明細書の態様もしくは実施形態のいずれかの組成物、または本明細書の態様もしくは実施形態いずれかの医薬組成物を対象に投与することを含む。上記の態様または実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ、Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｃａｎｅｔｔｉ、Ｍ．ｃａｐｒａｅ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｔ、Ｍ．ｍｕｎｇｉ、Ｍ．ｏｒｙｇｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ａｖｉｕｍ  ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ  ｓｉｌｖａｔｉｃｕｍ、Ｍ．ｃｏｌｕｍｂｉｅｎｓｅ、Ｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｍ．ｇｅｎａｖｅｎｓｅ、Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、およびＭ．ｍｕｃｏｇｅｎｉｃｕｍからなる群から選択される。上記の態様または実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、免疫不全である。上記の態様または実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、２１歳未満の子供である。上記の態様または実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、１２歳未満の子供である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】マイコバクテリア特異的Ｔ細胞のエクスビボ拡大の製造スキーマを示す。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、列記されるマイコバクテリア抗原を包含する重複ペプチドプールで刺激し、サイトカインと共にＧ−Ｒｅｘ−１０バイオリアクターで１０〜１２日間培養する。
【図２Ａ】１０日目のエクスビボで拡大したＭＳＴのＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔが、ＢＣＧ免疫化ドナーおよび非ＢＣＧワクチン接種ドナーの両方において複数のマイコバクテリア抗原に対する特異性を示したことを示す。
【図２Ｂ】ＰＰＥ６８（＊ｐ＝０．０２８）およびＡＤＫ（＊＊ｐ＝０．０１５）に対する応答において、群間に有意差が認められたことを示す。ＳＦＣ、スポット形成コロニー。
【図３Ａ】培養中に拡大したマイコバクテリア特異的Ｔ細胞を示し、平均拡大倍率は４．４であり、ＢＣＧ−＝ＢＣＧ非免疫化；ＢＣＧ＋＝ＢＣＧ免疫化である。
【図３Ｂ】拡大後のＭＳＴの表面表現型は、大きいエフェクターメモリー集団およびより小さいセントラルメモリー集団を有するＣＤ４＋Ｔ細胞の優勢を示した。線、中央値。
【図３Ｃ】ドナー９から拡大されたＭＴＳからのプロット例は、大きいＣＤ４＋エフェクターメモリー（ＴＥＭ）集団、ならびに最小のナイーブＴ細胞（Ｔｎ）を有する小さいエフェクター（Ｔｅｆｆ）およびセントラルメモリー（Ｔｃｍ）集団を示す。
【図４】健康なドナーから拡大されたＭＳＴは多機能であることを示す。細胞内フローサイトメトリーは、健康なドナーから拡大したＭＳＴからのＣＤ４＋Ｔ細胞においてのみマイコバクテリアｐｅｐｍｉｘ再刺激に応答してＩＦＮ−γおよびＴＮＦの産生を示し、ＣＤ８＋Ｔ細胞では応答は見られなかった。
【図５Ａ】原発性免疫不全障害（ＰＩＤ）の患者から拡大したＴ細胞のＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔは、ＮＦＫＢ１ハプロ不全の患者を除いて、マイコバクテリア抗原に対する応答の低下から不在を示した。ＩＦＮ−γ自己抗体を有する２人の患者は、検出可能な反応を示した。ＳＥＢ、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ；ＣＩＤ、複合免疫不全。
【図５Ｂ】ＰＩＤの患者からのＴ細胞のエクスビボ培養は、２人の患者を除く全員において拡大をもたらさなかったことを示す。
【図６Ａ】ペプチド刺激対溶解物またはセンシチン（ｓｅｎｓｉｔｉｎ）を使用したＭＳＴ応答が同等であることを示す。ＴＢ溶解物またはＭ  ａｖｉｕｍセンシチンを使用して拡大されたＭＳＴからのＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔは、溶解物またはセンシチンによる再刺激に対する応答と規模が同等である複数のマイコバクテリアｐｅｐｍｉｘに特異性を示した。応答の差は、ＰＰＥ６８でのみ有意であった（＊ｐ＝０．０３２）。ＳＦＣ、スポット形成コロニー；ＳＥＢ、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ。
【図６Ｂ】ペプチド刺激対溶解物またはセンシチン（ｓｅｎｓｉｔｉｎ）を使用したＭＳＴ応答が同等であることを示す。ＴＢ溶解物またはＭ  ａｖｉｕｍセンシチンを使用して拡大されたＭＳＴからのＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔは、溶解物またはセンシチンによる再刺激に対する応答と規模が同等である複数のマイコバクテリアｐｅｐｍｉｘに特異性を示した。応答の差は、ＰＰＥ６８でのみ有意であった（＊ｐ＝０．０３２）。ＳＦＣ、スポット形成コロニー；ＳＥＢ、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ。
【図７Ａ】ＡＧ８５ＢおよびＥＳＸＢのエピトープマッピングを示す
【図７Ｂ】ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔを介したＡＧ８５ＢおよびＥＳＸＢのエピトープマッピングが、複数の健康なドナーからのＭＳＴによって認識されたＡＧ８５Ｂからの８つのペプチドおよびＥＳＸＢからの３つのペプチドを示す。ＳＦＣ、スポット形成コロニー；ＳＥＢ、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ。
【図８】表面染色フローサイトメトリーのゲーティング戦略を示す。ＣＤ１４／ＣＤ１９は、除外ゲーティングのために組み合わされる。ＬＤ＝生／死。
【図９】細胞内フローサイトメトリーのゲーティング戦略を示す。ＬＤ＝生／死。
【図１０】ｐｅｐｍｉｘ、センシチン、および溶解物を使用して産生されたＭＳＴの表面免疫表現型検査が異なる成長条件のＴ細胞サブセットにおいて最小の差を示したことを示す。拡大した細胞は主にＣＤ４＋エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＣＲ７−）であり、セントラルメモリー集団は小さかった（ＣＤ４／ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＣＲ７＋／ＣＤ６２Ｌ＋）。
【図１１】マイコバクテリア種全体で中程度から高度の保存を示した、ＡＧ８５Ｂからの同定されたＴ細胞エピトープの分析を提供する。ペプチド７の表は、上から下に配列番号１７、１８、１９、２０、２１、および２２である。ペプチド１４の表は、上から下に配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８である。ペプチド１５表は、上から下に配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４である。ペプチド１９の表は、上から下に配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０である。
【図１２】マイコバクテリア種全体で低から中程度の保存を示した、ＥＳＸＢからの同定されたＴ細胞エピトープの分析を提供する。ペプチド８の表は、上から下に配列番号４１、４２、４３、４４、４５、４６である。ペプチド９の表は、上から下に配列番号４７、４８、４９、５０、５１、５２である。ペプチド１０表は、上から下に配列番号５３、５４、５５、５６、５７、５８である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本組成物および方法を説明する前に、本開示は、記載の特定の分子、組成物、方法論、またはプロトコルに限定されないことを理解されたい。説明で使用される用語は、特定のバージョンまたは実施形態を説明することのみを目的としており、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本開示の範囲を限定することを意図しないことも理解されたい。これらの実施形態は、異なる場合があるため、記載の特定の方法論、プロトコル、細胞株、ベクター、および試薬に限定されないことが理解される。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本実施形態または特許請求の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されたい。さらに、説明および特許請求の範囲における第１、第２、第３などの用語は、類似の要素を区別するために使用され、必ずしも逐次的または時系列の順序を説明するために使用されるわけではない。そのように使用される用語は、適切な状況下で交換可能であり、本明細書に記載の本開示の実施形態は、本明細書に記載または図示される順序以外の順序で実施することができることを理解されたい。
【００２０】
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法および材料を、本開示の実施形態の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法、デバイス、および材料を次に説明する。本明細書に記載のすべての刊行物は、参照により組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、事前の開示により、その開示がそのような開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。
【００２１】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段に指示しない限り、複数の指示対象を含む。
【００２２】
量、時間的持続時間などの測定可能な値を指すときに本明細書で使用される「約」という用語は、開示された方法を行うのに適切な変動であるため、指定値から±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．９％、±０．８％、±０．７％、±０．６％、±０．５％、±０．４％、±０．３％、±０．２％、または±０．１％の変動を包含することを意味する。
【００２３】
本明細書および特許請求の範囲において本明細書で使用される場合、「および／または」という句は、そのように結合された要素、すなわち、ある場合には接続的に存在し、他の場合には離接的に存在する要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「および／または」節によって具体的に同定される要素以外の他の要素は、反対が明確に指示されない限り、具体的に同定されるそれらの要素に関連するか否かにかかわらず、任意選択的に存在し得る。したがって、非限定的な例として、「含む」などの非限定的用語と組み合わせて使用される場合、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、いくつかの実施形態では、Ｂを含まないＡ（任意選択的にＢ以外の要素を含む）を指し、別の実施形態では、Ａを含まないＢ（任意選択的にＡ以外の要素を含む）を指し、さらに別の実施形態では、ＡおよびＢの両方（任意選択的に他の要素を含む）等を指す。
【００２４】
本明細書および特許請求の範囲において本明細書で使用される場合、「または」は、上記で定義された「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を区切る場合、「または」または「および／または」は、包括的、すなわち、いくつかのまたはリストの要素のうちの少なくとも１つを含むが、２つ以上、および任意選択的に、追加の列記されていない項目を含むと解釈されるべきである。「１つのみ」または「正確に１つ」などの反対が明確に指示される用語のみ、または特許請求の範囲で使用される場合、「からなる」は、いくつかのまたはリストの要素のうちの正確に１つの要素を含むことを指す。一般に、本明細書で使用される場合、「または」という用語は、排他性の用語である「いずれか」、「一方」、「一方のみ」、または「正確に１つ」が先行する場合、排他的代替（すなわち、「一方または他方、しかし両方ではない」）を示すものとしてのみ解釈されるべきであり、特許請求の範囲で使用される場合、「本質的にからなる」は、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するものとする。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「Ｘ〜Ｙの整数」という句は、エンドポイントを含む任意の整数を意味する。つまり、範囲が開示される場合、エンドポイントを含む範囲内の各整数が開示される。例えば、「Ｘ〜Ｙの整数」という句は、１、２、３、４、または５、ならびに１〜５の範囲を開示する。
【００２６】
本明細書で使用される場合、製品、組成物、および方法を定義するために使用されるとき、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」などのｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇの任意の形態）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに「「ｈａｖｅ」および「ｈａｓ」などのｈａｖｉｎｇの任意の形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」および「ｉｎｃｌｕｄｅ」などのｉｎｃｌｕｄｉｎｇの任意の形態）、または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに「ｃｏｎｔａｉｎｓ」および「ｃｏｎｔａｉｎ」などのｃｏｎｔａｉｎｉｎｇの任意の形態）は、非限定的であり、追加の引用されていない要素または方法ステップを除外しない。したがって、アミノ酸配列がポリペプチドの最終アミノ酸配列の一部であり得る場合、ポリペプチドはアミノ酸配列を「含む」。そのようなポリペプチドは、最大数百の追加のアミノ酸残基（例えば、本明細書に記載のタグおよび標的ペプチド）を有し得る。「本質的にからなる」とは、任意の本質的に重要な他の構成成分またはステップを除外することを意味する。したがって、列挙された構成成分から本質的になる組成物は、微量の汚染物質および薬学的に許容される担体を排除しないであろう。ポリペプチドは、「そのようなアミノ酸配列が最終的にわずかな追加のアミノ酸残基のみで存在する場合、本質的にアミノ酸配列からなる。「からなるは、他の構成成分またはステップの微量以上の要素を除外することを意味する。例えば、ポリペプチドは、「ポリペプチドがアミノ酸を含まないが、列挙されたアミノ酸配列を含む場合、アミノ酸配列からなる。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「実質的に等しい」は、所与の測定された測定基準で異常または正常範囲に相関することが知られている範囲内を意味する。例えば、対照試料が罹患した患者からのものである場合、実質的に等しいは異常な範囲内にある。対照試料が、試験される状態ではないことがわかっている患者からのものである場合、実質的に等しいは、その所与の測定基準の正常範囲内にある。
【００２８】
本明細書で使用される場合、交換可能に使用される「対象」、「個体」、または「患者」という用語は、マウス、ラット、他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、またはヒトなどの霊長類などの哺乳動物を含む任意の動物を意味する。いくつかの実施形態では、対象または患者は、約２０歳以下のヒトの子供である。いくつかの実施形態では、対象または患者は、約１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１歳以下のヒトの子供である。いくつかの実施形態では、対象は、がんと診断されているか、またはがんを有する。いくつかの実施形態では、対象は、骨髄移植などの臓器移植を受けている。いくつかの実施形態では、実施形態がＴ細胞の刺激またはプライミングのためにドナーから１つまたは複数の細胞を単離する方法に関する場合、対象はＴ細胞ドナーである。
【００２９】
「対象」という用語は、細胞試料が採取される動物を説明するために本明細書全体を通して使用される。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。ヒトなどの特定の対象に特有のそれらの状態の診断のために、「患者」という用語は交換可能に使用され得る。本発明の説明におけるいくつかの例では、「患者」という用語は、特定の疾患または障害に罹患しているヒト患者を指す。いくつかの実施形態では、対象は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる感染症を有する疑いがあるか、またはそれを発症するリスクがあると同定されたヒトであり得る。いくつかの実施形態では、対象は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる感染症を有すると診断され、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる感染症を有するか、またはそれを発症するリスクがあると同定され得るものである。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「免疫不全の対象」は、原発性免疫不全障害、化学療法もしくは免疫抑制療法を受けている患者、または造血幹細胞移植を受けている患者を含むがこれらに限定されない、適応免疫または自然免疫における先天性または後天性の異常を有する対象を指すことを意味する。いくつかの実施形態では、対象は、免疫不全の成人または子供である。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「動物」という用語は、ヒト、および野生動物、ラット、フェレットなどのげっ歯類、家畜、ならびにイヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ、およびヤギなどの農場動物などの非ヒト脊椎動物を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、動物は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、動物はヒトである。いくつかの実施形態では、動物は、非ヒト哺乳動物である。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「哺乳動物」という用語は、げっ歯類（すなわち、マウス、ラット、またはモルモット）、サル、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、またはヒトなどの哺乳綱の任意の動物を意味する。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、任意の非ヒト哺乳動物を指す。本開示は、試料が哺乳動物または非ヒト哺乳動物から採取される、本明細書に開示される問題の方法または組成物のいずれかに関する。本開示は、試料がヒトまたは非ヒト霊長類から採取される、本明細書に開示される問題の方法または組成物のいずれかに関する。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「それを必要とする」という句は、動物または哺乳動物が特定の方法または治療の必要性を有すると同定されるか、またはその疑いがあることを意味する。いくつかの実施形態では、同定は、診断または観察の任意の手段によるものであり得る。本明細書に記載の方法および治療のいずれにおいても、動物または哺乳動物はそれを必要とし得る。いくつかの実施形態では、動物または哺乳動物は、特定の障害または状態が蔓延している、もしくは発生する可能性が高い環境にあるか、またはその環境に移動する予定である。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染」は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種への対象の曝露と、それに続く細菌による対象または対象の組織（複数可）のコロニー形成を指す。コロニー形成は、深刻な疾患を引き起こす（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる、結核、ハンセン病、ブルーリ潰瘍など）可能性があるか、または有害な徴候を引き起こさない（無症候性または潜伏感染）可能性がある。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「細胞培養」は、細胞、組織、またはそれらの産物の成長、維持、トランスフェクション、形質導入、および／または増殖を意味する。本明細書で使用される場合、「培養培地」は、インビトロまたはインビボのいずれかで標的細胞の成長を維持することができる任意の溶液、またはインビトロで細胞にまたはインビボで患者に適用される前に標的細胞または外因性核酸が混合される任意の溶液を指す。
【００３６】
本明細書で使用される場合、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸に関する「異種」および「外来」という用語は、交換可能に使用され、それが存在するゲノムまたは細胞の一部として天然に生じないか、またはそれが自然界で生じる場所（複数可）および／または量とは異なるゲノムまたは細胞の場所（複数可）および／または量で見出される核酸、すなわち、細胞に内因性ではなく、細胞に外因的に導入された核酸を指す。異種ＤＮＡの例には、例えば、コードされたタンパク質の産生のために、細胞に導入された目的の遺伝子産物（複数可）をコードするＤＮＡが含まれるが、これに限定されない。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「送達」は、外因性核酸分子が細胞内部に位置するように細胞内に移入されるプロセスを指す。核酸の送達は、核酸の発現とは異なるプロセスである。核酸の材料は、トランスフェクションまたは形質導入などの遺伝子移入法によってエクスビボまたはインビボで細胞に導入されて、遺伝子修飾された細胞を提供することができる。様々な発現ベクター（すなわち、標的細胞への外因性核酸の送達を容易にするためのビヒクル）は、当業者に既知である。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「発現」は、核酸がペプチドに翻訳されるか、またはｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。核酸がゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、適切な真核宿主細胞または生物が選択される場合、ｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。異種核酸が宿主細胞で発現されるためには、最初に細胞に送達され、次いで細胞に入ると、最終的には核に存在しなければならない。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「細胞のトランスフェクション」は、添加されたＤＮＡを組み込むことによる、新しい核酸材料の細胞による獲得を指す。したがって、トランスフェクションは、物理的または化学的方法を使用して細胞に核酸を挿入することを指す。リン酸カルシウムＤＮＡ共沈（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１））、ＤＥＡＥ−デキストラン（上記）、エレクトロポレーション（上記）、カチオン性リポソームを介したトランスフェクション（上記）、およびタングステン粒子促進微粒子銃（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ（１９９０））を含む、いくつかのトランスフェクション技法が当業者に既知である。リン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈（Ｂｒａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７））もトランスフェクションの方法である。
【００４０】
対照的に、「細胞の形質導入」は、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスを使用して細胞に核酸を移入するプロセスを指す。核酸を細胞に移入するためのＲＮＡウイルス（すなわち、レトロウイルス）は、本明細書では、形質導入レトロウイルスとも呼ばれる。レトロウイルス内に含まれる外因性の核酸材料は、形質導入された細胞のゲノムに組み込まれる。ＤＮＡウイルス（例えば、治療薬をコードするｃＤＮＡを運ぶアデノウイルス）で形質導入された細胞は、そのゲノムに組み込まれた外因性核酸材料を有しないが、細胞内の染色体外に保持される外因性核酸材料を発現することができる。
【００４１】
外因性核酸材料は、転写を制御するためのプロモーターと共に、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの抗原をコードする核酸を含むことができる。プロモーターは、転写を開始するために必要な特定のヌクレオチド配列を特徴的に有する。外因性核酸材料は、所望の遺伝子転写活性を得るために必要とされる追加の配列（すなわち、エンハンサー）をさらに含み得る。この考察の目的のために、「エンハンサー」は、単に、プロモーターによって指示された基本的な転写レベルを変更するためにコード配列（シス）と連動する、任意の非翻訳ＤＮＡ配列である。外因性核酸材料は、プロモーターのすぐ下流の細胞ゲノムに導入され得、その結果、プロモーターおよびコード配列は、コード配列の転写を可能にするように作動可能に連結される。発現ベクターは、挿入された外因性遺伝子の転写を制御するための外因性プロモーター要素を含むことができる。そのような外因性プロモーターには、構成的および調節可能なプロモーターの両方が含まれる。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「ドメイン」という用語は、ペプチド内のアミノ酸またはヌクレオチド配列内の核酸の一部または部分配列に適用される。いくつかの実施形態では、ドメインは、機能性、活性、または利益を提供する。いくつかの実施形態では、例えば、ドメインは、受容体または受容体のシグナル伝達部分であり得る。別の実施形態では、ドメインは、２つの他のドメイン間のリンカー機能を有し得る。別の実施形態では、ドメインは、抗原またはケモカインなどの特定の標的分析物（標的ドメイン）に結合するのに役立ち得る。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「組み合わせ」という用語は、様々な構成成分（例えば、マイコバクテリア抗原および／またはコード核酸分子）の可能な任意の配置を指す。そのような配置には、マイコバクテリア抗原の混合物（例えば、個々の抗原の混合物および／または抗原の融合物）または核酸分子の混合物（例えば、１つ以上のベクターによって運ばれる）、ならびにポリペプチド（複数可）および核酸分子（複数可）の混合物が含まれる。本発明は、等モル濃度の各構成成分を含む組み合わせ、ならびに非常に異なる濃度の組み合わせを包含する。各Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ構成成分の最適濃度は、当業者によって決定され得ることが理解される。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「免疫原性」という用語は、免疫原性として認定された構成成分が導入された対象において、測定可能なＴおよび／またはＢ細胞媒介性免疫応答を誘導または刺激する能力を指す。例えば、本発明の抗原性の組み合わせは、生得的および／または特異的（すなわち、該免疫原性の組み合わせに含まれるか、またはそれによって発現される少なくとも１つのマイコバクテリア抗原／エピトープに対して）、体液性および／または細胞性（例えば、抗体および／もしくはサイトカインの産生、ならびに／または細胞傷害性Ｔ細胞、Ｂ、Ｔリンパ球、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞などの活性化）であってもよく、通常、投与された対象に防御応答をもたらす、対象において免疫応答を誘導または刺激することができるという意味で免疫原性である。本明細書に記載されるように、インビボ（動物またはヒト）またはインビトロ（例えば、生物学的試料）のいずれかで構成成分の免疫原性を評価するために、多種多様な直接的または間接的な生物学的アッセイが当該技術分野で利用可能である。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「マイコバクテリア抗原」という用語は、抗体またはＴ細胞受容体によって結合され得るＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種またはその断片（例えば、エピトープ）に存在するか、またはそれから得られるポリペプチドを指す。典型的には、そのような抗原は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の文脈において、特定の抗体またはＴ細胞受容体による認識に関与する１つ以上のＢおよび／またはＴエピトープ（複数可）、特にＣＴＬもしくはＴＨエピトープ（複数可）、またはその両方を含む。本発明の文脈において、この用語は、以下に記載されるように、天然のマイコバクテリアポリペプチド、ならびにその断片および修飾型（すなわち、変異型）を包含する。
【００４６】
「エピトープ」は、抗体、Ｔ細胞受容体、またはＨＬＡ分子によって認識される部位を形成する最小のペプチドモチーフ（通常、８〜２５のアミノ酸残基のセット）に対応する。それらの残基は、連続的（直鎖状エピトープ）または連続的ではなくてもよい（互いに直接隣接していない残基を含む立体配座エピトープ）。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「変異型」という用語は、実質的に類似する配列を意味することを意図している。核酸分子の場合、変異型は、５’および／または３’末端に欠失（すなわち、短縮）、天然ポリヌクレオチドの１つ以上の内部部位において１つ以上のヌクレオチドの欠失および／もしくは付加、ならびに／または天然ポリヌクレオチドの１つ以上の部位において１つ以上のヌクレオチドの置換を有する核酸分子を含む。本明細書で使用される場合、「天然の」核酸分子またはポリペプチドは、それぞれ、天然に生じるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む。核酸分子の場合、保存的変異型には、遺伝暗号の縮重のため、本開示のポリペプチドのうちの１つのアミノ酸配列をコードするそれらの配列が含まれる。変異型核酸分子はまた、例えば、部位特異的突然変異誘発を使用することによって生成されるが、それでも本開示のタンパク質をコードするものなどの、合成的に誘導された核酸分子も含む。一般に、本開示の特定の核酸分子の変異型は、本明細書の別の箇所に記載される配列アラインメントプログラムおよびパラメータによって決定される、その特定のポリヌクレオチドと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有する。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「保存的」アミノ酸置換は、以下の表Ａ、Ｂ、またはＣに示されるように定義され得る。本開示のポリペプチドには、保存的置換（核酸またはアミノ酸配列のいずれかから）が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの抗原（複数可）をコードするポリヌクレオチドの修飾によって導入されたものが含まれる。いくつかの実施形態では、これらのポリペプチドは、ＣＤＲまたはその機能的断片を含む。アミノ酸は、物理的特性、ならびに二次および三次タンパク質構造への寄与に従って分類され得る。保存的置換は、当該技術分野では、あるアミノ酸を、類似する特性を有する別のアミノ酸に置換することとして認識されている。いくつかの実施形態では、保存的置換は、当該技術分野において、ある核酸を、類似する特性を有するか、またはコードされる場合、標的または結合パートナーに対して保存的置換に基づく配列の結合親和性と類似する結合親和性を有する別の核酸に置換することとして認識される。例示的な保存的置換を表Ａに示す。
【表２】
2021522245.tif 000004
【００４９】
あるいは、保存的アミノ酸は、表Ｂに示されるように、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ，Ｎ．Ｙ．（１９７５），ｐｐ．７１−７７）に記載されるように分類され得る。
【表３】
2021522245.tif 000005
【００５０】
あるいは、例示的な保存的置換を表Ｃに示す。
【表４】
2021522245.tif 000006
【００５１】
本明細書に記載のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの抗原（複数可）、またはその任意の断片は、アミノ酸残基の１つ以上の挿入、欠失、もしくは置換、またはそれらの任意の組み合わせ、ならびに限定されないが保存的アミノ酸置換などのアミノ酸残基の挿入、欠失、もしくは置換以外の修飾を有するポリペプチドを含むアミノ酸配列を含むことを意図していることを理解されたい。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「断片」または「機能的断片」という用語は、断片が基づく野生型ポリペプチドに類似するまたは実質的に類似する少なくとも部分的な生物学的機能を保持するのに十分な長さのものであるポリペプチドの任意の部分を意味する。いくつかの実施形態では、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの抗原に関連するポリペプチドの断片は、本明細書に開示の任意のポリペプチド、特に配列番号６〜１０から選択されるアミノ酸配列を含む任意のポリペプチドの５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％配列同一性を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、断片は、本明細書に開示の任意のポリペプチド、特に配列番号６〜１０から選択されるアミノ酸配列を含む任意のポリペプチドの断片であり、少なくとも約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、または約１００の近接するアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、断片は、本明細書に開示の任意のポリペプチド、特に配列番号６〜１０から選択されるアミノ酸配列を含む任意のポリペプチドの断片であり、少なくとも約５０のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、断片は、本明細書に開示の任意のポリペプチド、特に配列番号６〜１０から選択されるアミノ酸配列を含む任意のポリペプチドの断片であり、少なくとも約１００のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、断片は、本明細書に開示の任意のポリペプチド、特に配列番号６〜１０から選択されるアミノ酸配列を含む任意のポリペプチドの断片であり、少なくとも約１５０のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、断片は、本明細書に開示の任意のポリペプチド、特に配列番号６〜１０から選択されるアミノ酸配列を含む任意のポリペプチドの断片であり、少なくとも約２００のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、断片は、表１に開示される任意のポリペプチドの断片であり、少なくとも約２５０のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、断片は、本明細書に開示の任意のポリペプチド、特に配列番号６〜１０から選択されるアミノ酸配列を含む任意のポリペプチドの断片であり、少なくとも約３００のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、断片は、本明細書に開示の任意のポリペプチド、特に配列番号６〜１０から選択されるアミノ酸配列を含む任意のポリペプチドの断片であり、少なくとも約３５０のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、断片は、本明細書に開示の任意のポリペプチド、特に配列番号６〜１０から選択されるアミノ酸配列を含む任意のポリペプチドの断片であり、少なくとも約４００のアミノ酸の長さを有する。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「２つ以上（ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｏｎｅ）」または「２つ以上（ｔｗｏ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上。いくつかの実施形態では、「２つ以上」は、本明細書に記載のアミノ酸または核酸または変異のうちの２、３、４、または５つを意味する。いくつかの実施形態では、「２つ以上」は、本明細書に記載のアミノ酸または核酸または変異のうちの２、３、または４つを意味する。いくつかの実施形態では、「２つ以上」は、本明細書に記載のアミノ酸または核酸または変異のうちの２または３つを意味する。いくつかの実施形態では、「２つ以上」は、本明細書に記載のアミノ酸または核酸または変異のうちの２つを意味する。
【００５４】
「配列相同性」または「配列同一性」または「相同性」は、本明細書において、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、およびギャップＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５，３３８９、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ならびにＰＡＵＰ＊  ４．０ｂＩＯソフトウェア（Ｄ．Ｌ．Ｓｗｏｆｆｏｒｄ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して決定されたヌクレオチドおよびアミノ酸に対して交換可能に使用される。簡潔に、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌの略であるＢＬＡＳＴアルゴリズムは、配列の類似性を決定するのに適している（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９９０，２１５，４０３−４１０、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）により公開されている。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小の合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸と他の核酸との比較における最小合計確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は他の核酸と類似していると見なされる。「類似性のパーセンテージ」または配列同一性のパーセンテージ」は、ＰＡＵＰ＊  ４．ＯｂＩＯソフトウェア（Ｄ．Ｌ．Ｓｗｏｆｆｏｒｄ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して計算することができる。コンセンサス配列の平均類似性は、系統樹のすべての配列と比較して計算される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、配列番号１〜５のいずれかと少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同である核酸配列、または配列番号６〜１０のいずれかと少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同であるアミノ酸配列を含む。
【００５５】
２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の「パーセント同一性」または「パーセント相同性」は、デフォルトのパラメータを使用して、ＧＡＰコンピュータプログラム（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）の一部）を使用して配列を比較することによって決定することができる。２つ以上の核酸またはアミノ酸配列の文脈において本明細書で使用される「同一」または「同一性」は、配列が指定された領域にわたって同じである指定されたパーセンテージの残基を有することを意味し得る。パーセンテージは、２つの配列を最適に整列させ、指定された領域にわたって２つの配列を比較し、両方の配列で同一の残基が生じる位置の数を決定して、一致した位置の数を得、一致した位置の数を指定された領域内の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算することができる。２つの配列の長さが異なるか、またはアラインメントによって１つ以上の付着末端が生成され、指定された比較領域に単一の配列のみが含まれる場合、単一の配列の残基は分母に含まれるが、計算の分子には含まれない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）は同等と見なされる場合がある。同一性は、手動で、またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピュータ配列スアルゴリズムを使用して行うことができる。
【００５６】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、全体を通して交換可能に使用され、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体（例えば、ペプチド核酸および天然に生じないヌクレオチド類似体）を使用して生成されたＤＮＡまたはＲＮＡの類似体、およびそれらのハイブリッドを含む。核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得る。いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、本明細書に記載されるように、抗原をコードする近接するオープンリーディングフレームまたはその断片を含む。本明細書で使用される場合、「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、共に共有結合している少なくとも２つのヌクレオチドを意味し得る。一本鎖の描写は、相補鎖の配列も定義する。したがって、核酸は、描写された一本鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くの変異型は、所与の核酸と同じ目的で使用することができる。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸およびその相補体も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズし得るプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得るか、または二本鎖および一本鎖配列の両方の一部を含み得る。核酸は、ゲノムおよびｃＤＮＡの両方のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであり得、ここで、核酸は、デオキシリボおよびリボヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含み得る。核酸は、化学合成法または組換え法によって得ることができる。核酸は一般にホスホジエステル結合を含むが、少なくとも１つの異なる結合、例えば、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはＯ−メチルホスホロアミダイト結合、ならびにペプチド核酸骨格および結合を有し得る核酸類似体が含まれ得る。他の類似体核酸には、米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号（参照によりその全体が組み込まれる）に記載のものを含む、正の骨格、非イオン性骨格、および非リボース骨格を有するものが含まれる。１つ以上の天然に生じないまたは修飾されたヌクレオチドを含む核酸もまた、核酸の１つの定義に含まれる。修飾されたヌクレオチド類似体は、例えば、核酸分子の５’末端および／または３’末端に位置し得る。ヌクレオチド類似体の代表的な例は、糖−または骨格修飾されたリボヌクレオチドから選択され得る。しかしながら、核酸塩基修飾されたリボヌクレオチド、すなわち、５位で修飾されたウリジンまたはシチジン、例えば、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン；８位で修飾されたアデノシンおよびグアノシン、例えば、８−ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば、７−デアザ−アデノシン；Ｏ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えば、Ｎ６−メチルアデノシンなど、天然に生じる核酸塩基の代わりに天然に生じない核酸塩基を含むリボヌクレオチドが適切であることにも留意するべきである。２’−ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ．ｓｕｂ．２、ＮＨＲ、Ｎ．ｓｕｂ．２、またはＣＮから選択される基で置き換えることができ、ここで、Ｒは、Ｃ．ｓｕｂ．１−Ｃ．ｓｕｂ．６アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、ハロは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである。修飾されたヌクレオチドは、例えば、Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｏｃｔ．３０，２００５）、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１７３−１７８（２００４）、および米国特許公開第２００５／０１０７３２５号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される、例えば、ヒドロキシプロリノール結合を介してコレステロールとコンジュゲートされるヌクレオチドも含む。修飾されたヌクレオチドおよび核酸は、米国特許第２００２／０１１５０８０号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載される、ロックド核酸（ＬＮＡ）も含み得る。追加の修飾されたヌクレオチドおよび核酸は、米国特許公開第２００５／０１８２００５号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。リボース−リン酸骨格の修飾は、様々な理由で、例えば、生理学的環境におけるそのような分子の安定性および半減期を増加させるために、細胞膜にわたる拡散を増強するために、またはバイオチップ上のプローブとして行うことができる。天然に生じる核酸および類似体の混合物が作製され得るか、あるいは、異なる核酸類似体の混合物、および天然に生じる核酸および類似体の混合物が作製され得る。
【００５７】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖状または分枝状であり得、修飾されたアミノ酸を含み得、非天然アミノ酸またはアミノ酸ではない化学基によって中断され得る。本用語は、修飾された、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識構成成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作されたアミノ酸ポリマーを包含する。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびＤまたはＬの両方の光学異性体を含む天然および／もしくは非天然または合成アミノ酸、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣物を含む。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、一般に、少なくとも３つのアミノ酸のポリマーのその当該技術分野で認識されている意味を有する。当業者は、「ポリペプチド」という用語が、本明細書に列挙される完全な配列を有するポリペプチドを包含するだけでなく、そのような完全なポリペプチドの機能的断片（すなわち、少なくとも１つの活性を保持する断片）を表すポリペプチドも包含するように十分に一般的であることが意図されることを理解する。さらに、当業者は、タンパク質配列が一般に、活性を破壊することなく多少の置換を許容することを理解する。したがって、活性を保持し、少なくとも約３０〜４０％の全体的な配列同一性、多くの場合約５０％、６０％、７０％、または８０％超を共有し、さらに通常は非常に高い同一性、多くの場合１つ以上の高度に保存された領域において９０％、またはさらには９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％超の少なくとも１つの領域を含み、通常、同じクラスの別のポリペプチドと共に、少なくとも３〜４個、多くの場合最大２０以上のアミノ酸を包含する任意のポリペプチドは、本明細書で使用される関連用語「ポリペプチド」に包含される。
【００５９】
２つの一本鎖ポリヌクレオチドは、一方のポリヌクレオチドのすべてのヌクレオチドが他方のポリヌクレオチドのその相補的ヌクレオチドと反対であり、ギャップを導入することなく、またいずれかの配列の５’または３’末端において対になっていないヌクレオチドがないように、それらの配列が逆平行配向で整列され得る場合、互いの「補体」である。２つのポリヌクレオチドが適度にストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることができる場合、ポリヌクレオチドは別のポリヌクレオチドに対して「相補的」である。したがって、ポリヌクレオチドは、その補体でなくても、別のポリヌクレオチドに相補的であり得る。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療される」、または「治療すること」という用語は、治療上の処置および／または予防もしくは防止手段を指し得、この目的は、望ましくない生理学的状態、障害、もしくは疾患を予防もしくは鈍化（軽減）すること、または有益なもしくは所望の臨床結果を得ることである。本明細書に記載の実施形態の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果には、症状の緩和；状態、障害、もしくは疾患の程度の減少；状態、障害、もしくは疾患の安定した（すなわち、悪化しない）状態；状態、障害、もしくは疾患の進行の開始の遅延、またはその鈍化；検出可能か検出不可能かにかかわらず、状態、障害、もしくは疾患状態の改善、または寛解（部分的または全体的にかかわらず）；必ずしも患者が認識できるとは限らない、少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの改善；あるいは状態、障害、もしくは疾患の増強または向上が含まれるが、これに限定されない。治療には、過度のレベルの副作用なしに臨床的に有意な応答を誘発することも含まれる。治療には、治療を受けていない場合に予想される生存期間と比較して生存期間を延長することも含まれる。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「診断する」、「診断すること」という用語、またはそれらの変形は、生理学的状態、障害、または疾患の性質を同定することを指す。いくつかの実施形態では、対象を診断することは、患者がマイコバクテリア感染を有するかどうかを同定することを指す。
【００６２】
免疫原性組成物の「非経口」投与という用語は、例えば、皮下（ｓ．ｃ）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、または大槽内注射、腫瘍内、または注入技法を含む。
【００６３】
￥本開示はまた、予防方法も提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるように、細胞またはポリペプチドを、その時点でマイコバクテリア感染症に感染していない対象に投与することにより、マイコバクテリア感染を予防する方法。例えば、ある特定の態様において、本開示は、マイコバクテリア感染症の患者のリスクを低減する方法を提供し、これには、それを必要とする対象に、本明細書に記載される組成物または医薬組成物を、マイコバクテリア感染症のリスクを低減するのに有効な量で投与することが含まれる。例えば、リスクは、例えば、少なくとも２５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％以上低減され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物または医薬組成物は、マイコバクテリア感染症を有さない患者に提供され、その結果、マイコバクテリア感染症が生じた場合、疾患の経過は、本組成物または医薬組成物を受けていない同様の患者の疾患の経過よりも軽度である可能性が高い。そのようなリスクは、例えば、本組成物または医薬組成物を受けていない患者と比較して、少なくとも２５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９以上低減され得る。
【００６４】
「治療有効量」という用語は、所望の治療または予防効果を達成するのに十分な量、例えば、治療されている疾患、例えば、マイコバクテリア感染症に関連する症状の予防または改善または減少をもたらす量を意味する。対象に投与される化合物の量は、疾患の種類および重症度、ならびに一般的な健康、年齢、性別、体重、および薬物に対する耐性などの個体の特徴に依存するだろう。また、疾患の程度、重症度、および種類にも依存する。当業者は、これらおよび他の要因に応じて適切な投与量を決定することができる。投与レジメンは、有効量を構成するものに影響を与える可能性がある。本発明の化合物は、マイコバクテリア感染症の発症前または発症後のいずれかに対象に投与することができる。さらに、いくつかの分割投与量、ならびに時差投与量が、毎日または連続して投与され得るか、または用量が連続的に注入され得るか、またはボーラス注射であり得る。さらに、本発明の化合物（複数可）の投与量は、治療的または予防的状況の緊急性によって示されるように、比例して増加または減少させることができる。典型的には、治療または予防効果を達成するのに十分な本発明の化合物の有効量は、１日あたり体重１キログラムあたり約０．０００００１ｍｇ〜１日あたり体重１キログラムあたり約１０，０００ｍｇの範囲である。好ましくは、投与量の範囲は、１日あたり体重１キログラムあたり約０．０００１ｍｇ〜１日あたり体重１キログラムあたり約１００ｍｇである。本発明の化合物はまた、互いに組み合わせて、または１つ以上の追加の治療用化合物と組み合わせて投与することもできる。一般に、治療有効量とは、本明細書に開示される阻害剤の治療有効量を受けていない個体の症状、疾患の進行速度、または寿命と比較して、単独でまたは他の治療薬もしくは治療と組み合わせて投与された場合、症状を改善する、または疾患の進行速度を逆転、予防、もしくは低減する、または個体の寿命を延長する組成物または医薬組成物の量を指す。
【００６５】
「薬学的に許容される」という句は、生理学的に許容可能であり、ヒトに投与された場合、典型的には、胃の不調、めまいなどのアレルギーまたは同様の有害反応をもたらさない分子実体および組成物を指す。好ましくは、本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、連邦または州政府の規制機関によって承認されたか、または動物、より具体的にはヒトで使用するために米国薬局方または他の一般に認められた薬局方に列記されていることを意味する。
【００６６】
「薬学的に許容される担体」という句は、当該技術分野で認識されており、本発明の化合物を哺乳動物に投与するのに適した薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを含む。担体には、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入材料が含まれ、対象の薬剤をある臓器または体の一部から別の臓器または体の一部に運ぶまたは輸送することに関与する。各担体は、製剤の他の成分と適合性があり、患者に有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。薬学的に許容される担体として役立ち得る材料のいくつかの例としては、ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖類；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのセルロース、ならびにその誘導体；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；ならびに医薬製剤に用いられる他の非毒性適合性物質が挙げられる。適切な医薬担体は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００６７】
「塩」という用語は、無機および／または有機酸で形成された酸性塩、ならびに無機および／または有機塩基で形成された塩基性塩を指す。これらの酸および塩基の例は、当業者に周知である。そのような酸付加塩は、通常、薬学的に許容されるが、非薬学的に許容される酸の塩は、問題の化合物の調製および精製において有用であり得る。本発明の化合物の酸付加塩は、薬学的に許容される酸から最も好適に形成され、例えば、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、またはリン酸、および有機酸、例えば、コハク酸、マレイン酸、酢酸、またはフマル酸で形成されるものを含む。他の非薬学的に許容される塩、例えば、オキサレートは、例えば、本発明の化合物の単離において、実験室での使用のために、またはその後の薬学的に許容される酸付加塩への変換のために使用され得る。本発明の範囲内には、本発明の溶媒和物および水和物も含まれる。
【００６８】
所与の化合物塩の所望の化合物塩への変換は、所与の塩の水溶液を塩基性の溶液、例えば、炭酸ナトリウムまたは水酸化カリウムで処理して遊離塩基を遊離させ、次にエーテルなどの適切な溶媒に抽出する、標準的な技法を適用することによって達成される。次に、遊離塩基を水性部分から分離し、乾燥させ、必要な酸で処理して、所望の塩を得る。本発明のある特定の化合物のインビボ加水分解性エステルまたはアミドは、遊離ヒドロキシまたはアミノ官能性を有するこれらの化合物を、塩化メチレンまたはクロロホルムなどの不活性溶媒において、塩基の存在下で所望のエステルの酸塩化物で処理することによって形成することができる。適切な塩基には、トリエチルアミンまたはピリジンが含まれる。逆に、遊離カルボキシ基を有する本発明の化合物は、活性化とそれに続く好適な塩基の存在下で所望のアルコールでの処理を含み得る標準的な条件を使用してエステル化することができる。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるマイコバクテリア抗原であるアミノ酸配列の１つまたは組み合わせをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを発現するポリヌクレオチドを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる組成物に関する。単離されたＴ細胞を曝露する方法が本明細書に開示されており、本方法は、組成物を１つ以上の単離されたＴ細胞に曝露することを含む。
【００６９】
薬学的に許容される付加塩の例としては、塩酸に由来する塩酸塩、臭化水素酸に由来する臭化水素酸塩、硝酸に由来する硝酸塩、過塩素酸に由来する過塩素酸塩、リン酸に由来するリン酸塩、硫酸に由来する硫酸塩、ギ酸に由来するギ酸塩、酢酸に由来する酢酸塩、アコニット酸に由来するアコニット酸塩、アスコルビン酸に由来するアスコルビン酸塩、ベンズスルホン酸に由来するベンゼンスルホン酸塩、安息香酸に由来する安息香酸塩、桂皮酸に由来する桂皮酸塩、クエン酸に由来するクエン酸塩、エンボン酸に由来するエンボン酸塩、エナント酸に由来するエナント酸塩、フマル酸に由来するフマル酸塩、グルタミン酸に由来するグルタミン酸塩、グリコール酸に由来するグリコール酸塩、乳酸に由来する乳酸塩、マレイン酸に由来するマレイン酸塩、マロン酸に由来するマロン酸塩、マンデル酸に由来するマンデル酸塩、メタンスルホン酸に由来するメタンスルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸に由来するナフタレン−２−スルホン酸塩、フタル酸に由来するフタル酸塩、サリチル酸に由来するサリチル酸塩、ソルビン酸に由来するソルビン酸塩、ステアリン酸に由来するステアリン酸塩、コハク酸に由来するコハク酸塩、酒石酸に由来する酒石酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸に由来するトルエン−ｐ−スルホン酸塩などの非毒性の無機および有機酸付加塩が挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい塩は、本発明の化合物のナトリウム、リジン、およびアルギニン塩である。そのような塩は、当該技術分野で周知および記載の手順によって形成することができる。
【００７０】
薬学的に許容できるとは考えられないシュウ酸などの他の酸は、本発明の化学化合物およびその薬学的に許容される酸付加塩を得る際の中間体として有用な塩の調製に有用であり得る。本発明の化学化合物の金属塩には、カルボキシ基を含む本発明の化学化合物のナトリウム塩などのアルカリ金属塩が含まれる。本発明に従って得られる異性体の混合物は、それ自体が知られている方法で個々の異性体に分離することができる。ジアステレオ異性体は、例えば、多相溶媒混合物間の分配、再結晶化および／またはクロマトグラフィー分離、例えば、シリカゲルで、または例えば、逆相カラムでの中圧液体クロマトグラフィーによって分離することができ、ラセミ体は、例えば、光学的に純粋な塩形成試薬を用いた塩の形成、およびそのようにして得られるジアステレオ異性体の混合物の分離によって、例えば、分別結晶化によって、または光学的に活性なカラム材料でのクロマトグラフィーによって分離することができる。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、本明細書に記載されるように、目的の供給源から得られた、または導かれた生物学的試料を指す。いくつかの実施形態では、目的の供給源は、動物またはヒトなどの生物を含む。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、生物学的組織または流体を含む。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、骨髄、血液、血液細胞、腹水、組織もしくは細針生検試料、細胞を含む体液、浮遊核酸、喀痰、唾液、尿、脳脊髄液、腹膜液、胸水、糞便、リンパ、婦人科液、皮膚スワブ、膣スワブ、口腔スワブ、鼻腔スワブ、管洗浄または気管支肺胞洗浄などの洗浄（ｗａｓｈｉｎｇｓ）または洗浄（ｌａｖａｇｅｓ）、吸引物、擦過物、骨髄標本、組織生検標本、手術標本、糞便、他の体液、分泌物、および／または排泄物、ならびに／またはそれらからの細胞などであるか、またはそれらを含み得る。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、個体から得られた細胞であるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、試料は、任意の適切な手段によって目的の供給源から直接得られる「一次試料」である。例えば、いくつかの実施形態では、一次生物学的試料は、生検（例えば、細針吸引または組織生検）、手術、体液の収集（例えば、血液、リンパ、糞便など）などからなる群から選択される方法によって得られる。いくつかの実施形態では、文脈から明らかであるように、「試料」という用語は、一次試料を処理することによって（例えば、一次試料の１つ以上の構成成分を除去することによって、および／またはそれに１つ以上の薬剤を添加することによって）得られる調製物を指す。例えば、半透膜を使用した濾過。そのような「処理された試料」は、例えば、試料から抽出された、または一次試料をｍＲＮＡの増幅もしくは逆転写、ある特定の構成成分の単離および／もしくは精製などの技法に供することによって得られた核酸またはタンパク質を含み得る。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「対照試料」または「参照試料」は、実験試料との比較に使用される、測定される物質の既知の存在、不在、または量を有する試料を指す。
【００７３】
「キメラ抗原受容体」または代替的に「ＣＡＲ」という用語は、免疫エフェクター細胞または本明細書に開示の複数の細胞において、標的細胞に特異的なおよび細胞内シグナル生成を伴う細胞（複数可）を提供するポリペプチドのセット、最も単純な実施形態では、典型的には２つを指す。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに以下に定義される刺激分子および／または共刺激に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドのセットは、互いに近接している。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのセットは、二量体化分子の存在下で、ポリペプチドを互いに結合することができる、例えば、抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結合することができる二量体化スイッチを含む。一態様では、刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体に関連するゼータ鎖である。一態様では、細胞質シグナル伝達ドメインは、以下に定義される少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つ以上の機能的シグナル伝達ドメインをさらに含む。一態様では、共刺激分子は、本明細書に記載の共刺激分子、例えば、４−１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、および／またはＣＤ２８から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ融合タンパク質を含む。一態様では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激性分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ融合タンパク質を含む。一態様では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに１つ以上の共刺激分子（複数可）に由来する２つの機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ融合タンパク質を含む。一態様では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに１つ以上の共刺激分子（複数可）に由来する少なくとも２つの機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ融合タンパク質を含む。一態様では、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ−ｔｅｒ）に任意選択のリーダー配列を含む。一態様では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＮ末端にリーダー配列をさらに含み、リーダー配列は、任意選択的に、細胞プロセシングおよびＣＡＲの細胞膜への局在化中に、抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）から切断される。
【００７４】
本明細書に記載されるものなどの特定のマイコバクテリア抗原Ｘを標的とする抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、またはＴＣＲ）を含むＣＡＲは、ＸＣＡＲとも呼ばれる。例えば、ＥＳＸＡを標的とする抗原結合ドメインを含むＣＡＲは、ＥＳＸＡ−ＣＡＲと呼ばれる。
【００７５】
「シグナル伝達ドメイン」という用語は、細胞内で情報を伝達して、セカンドメッセンジャーを生成することによって定義されたシグナル伝達経路を介して細胞活性を調節するか、またはそのようなメッセンジャーに応答することによってエフェクターとして機能することによって作用するタンパク質の機能部分を指す。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「結合ドメイン」または「抗体分子」という用語は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質、例えば、免疫グロブリン鎖またはその断片を指す。「結合ドメイン」または「抗体分子」という用語は、抗体および抗体断片を包含する。一実施形態では、抗体分子は、多重特異性抗体分子であり、例えば、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、複数の第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第１のエピトープに対して結合特性を有し、複数の第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第２のエピトープに対して結合特異性を有する。一実施形態では、多重特異性抗体分子は、二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体は、２つ以下の抗原に対して特異性を有する。二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対して結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列、および第２のエピトープに対して結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列を特徴とする。抗体またはその抗体断片を含む本発明のＣＡＲの部分は、抗原結合ドメインが、例えば、単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体、または二重特異性抗体を含む近接するポリペプチド鎖の一部として発現される、様々な形態で存在し得る（Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｉｎ：Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｈｏｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）。一態様では、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインは、抗体断片を含む。さらなる態様では、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体断片を含む。
【００７７】
「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、限定されないが増殖などのＴ細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の同族の結合パートナーを指す。共刺激分子は、効率的な免疫応答に寄与する抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子としては、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、およびＴｏｌｌリガンド受容体、ならびにＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤｌ  ｌａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）が挙げられるが、これらに限定されない。そのような共刺激分子のさらなる例としては、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤｌ  ｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤｌ  ｌａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌ  ｌｂ、ＩＴＧＡＸ  、ＣＤｌ  ｌｃ、ＩＴＧＢ  １、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１  ＣＲＴ  ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドが挙げられる。
【００７８】
「免疫エフェクター細胞」は、その用語が本明細書で使用される場合、免疫応答、例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例としては、Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、肥満細胞、および骨髄由来食細胞が挙げられる。「免疫エフェクター機能または免疫エフェクター応答」は、その用語が本明細書で使用される場合、標的細胞の免疫攻撃を増強または促進する、例えば免疫エフェクター細胞の機能または応答を指す。例えば、免疫エフェクターの機能または応答は、標的細胞の殺傷または成長もしくは増殖の阻害を促進するＴまたはＮＫ細胞の特性を指す。
【００７９】
Ｔ細胞の場合、一次刺激および共刺激は、免疫エフェクターの機能または応答の例である。
【００８０】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種
本明細書に記載されるように、本発明の核酸配列、アミノ酸配列、またはそれらの断片に含まれるマイコバクテリア抗原は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（Ｍ．）種の任意のメンバーから独立して得ることができる。本発明の文脈で使用するための膨大な数のマイコバクテリアが当該技術分野において記載されており、本開示に含まれることが意図される。例示的なマイコバクテリウム種としては、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ、Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｃａｎｅｔｔｉ、Ｍ．ｃａｐｒａｅ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｔ、Ｍ．ｍｕｎｇｉ、Ｍ．ｏｒｙｇｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ａｖｉｕｍ  ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ  ｓｉｌｖａｔｉｃｕｍ、Ｍ．ｃｏｌｕｍｂｉｅｎｓｅ、Ｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｍ．ｇｅｎａｖｅｎｓｅ、Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、およびＭ．ｍｕｃｏｇｅｎｉｃｕｍが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
いくつかの実施形態では、マイコバクテリア抗原は、疾患の結核を引き起こすと伝統的に考えられているそれらの種を含む結核複合体のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、ならびに免疫不全の対象（例えば、ＨＩＶ感染患者）において結核および肺疾患を引き起こすＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ環境および日和見種からのものである。例示的なＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原を以下の表１に示す。
【表５】
2021522245.tif 000007
【００８２】
適切なマイコバクテリア抗原のアミノ酸配列およびコード化ヌクレオチド配列は、公的に入手可能なデータバンクおよび文献において容易に入手可能である。例えば、例示的なＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原のタンパク質ＲｅｆＳｅｑ識別子およびＮＣＢＩ遺伝子参照番号を上の表１に示す。しかしながら、本発明は、これらの例示的なＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種および抗原に限定されないことを理解されたい。実際、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、異なる分離株および株間で変化する可能性があり、この自然の遺伝的変異は、本発明の範囲、ならびに以下に記載されるものなどの非天然の修飾（複数可）に含まれる。
【００８３】
組成物
本開示は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの１つ以上の抗原またはその機能的断片をコードする１つ以上の核酸配列を含む組成物に関する。ある特定の実施形態では、抗原またはその機能的断片は、表１に示される。本開示はまた、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの１つ以上の抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含む１つ以上のポリペプチドを含む組成物にも関する。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの少なくとも２つの抗原またはその機能的断片をコードする少なくとも２つの核酸配列を含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つは、２〜１０の範囲内に含まれる数（すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）である。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの少なくとも３つの抗原またはその機能的断片をコードする少なくとも３つの核酸配列を含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、少なくとも３つは、３〜１０の範囲内に含まれる数（すなわち、３、４、５、６、７、８、９、１０など）である。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの少なくとも４つの抗原またはその機能的断片をコードする少なくとも４つの核酸配列を含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、少なくとも４つは、４〜１０の範囲内に含まれる数（すなわち、４、５、６、７、８、９、１０など）である。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの少なくとも３つの抗原またはその機能的断片をコードする少なくとも５つの核酸配列を含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、少なくとも５つは、約５〜約１０の範囲内に含まれる数（すなわち、５、６、７、８、９、１０など）である。ある特定の実施形態では、抗原またはその機能的断片は、表１に示される。
【００８５】
別の実施形態では、本開示は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの少なくとも２つの抗原をコードする、少なくとも２つのアミノ酸配列またはその断片を含む少なくとも２つのポリペプチドを含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つは、２〜１０の範囲内に含まれる数（すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）である。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの少なくとも３つの抗原をコードする、少なくとも３つのアミノ酸配列またはその断片を含む少なくとも３つのポリペプチドを含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、少なくとも３つは、３〜１０の範囲内に含まれる数（すなわち、３、４、５、６、７、８、９、１０など）である。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの少なくとも４つの抗原をコードする、少なくとも２つのアミノ酸配列またはその断片を含む少なくとも４つのポリペプチドを含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、少なくとも４つは、４〜１０の範囲内に含まれる数（すなわち、４、５、６、７、８、９、１０など）である。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの少なくとも２つの抗原をコードする、少なくとも５つのアミノ酸配列またはその断片を含む少なくとも５つのポリペプチドを含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、少なくとも５つは、５〜１０の範囲内に含まれる数（すなわち、５、６、７、８、９、１０など）である。ある特定の実施形態では、抗原またはその機能的断片は、表１に示される。
【００８６】
本発明の文脈において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの少なくとも２つの抗原、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの少なくとも３つの抗原、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの少なくとも４つの抗原、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの少なくとも５つの抗原は、互いに異なる（例えば、同じマイコバクテリア抗原の複数のコピーを使用することができるが、但し、組み合わせが少なくとも５つの異なるマイコバクテリア抗原を含む／コードすることを条件とする）。ある特定の実施形態では、抗原またはその機能的断片は、表１に示される。
【００８７】
いくつかの実施形態では、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの抗原またはその機能的断片は、Ａｇ８５Ｂ抗原である。いくつかの実施形態では、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの抗原またはその機能的断片は、ＰＰＥ６８抗原である。いくつかの実施形態では、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの抗原またはその機能的断片は、ＥＳＸＡ抗原である。いくつかの実施形態では、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの抗原またはその機能的断片は、ＥＳＸＢ抗原である。いくつかの実施形態では、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの抗原またはその機能的断片は、ＡＤＫ抗原である。
【００８８】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、Ａｇ８５Ｂ、ＰＰＥ６８、ＥＳＸＡ、ＥＳＸＢ、およびＡＤＫからなる群から選択される少なくとも２つのマイコバクテリア抗原を含むか、またはコードする。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、Ａｇ８５Ｂ、ＰＰＥ６８、ＥＳＸＡ、ＥＳＸＢ、およびＡＤＫからなる群から選択される少なくとも３つのマイコバクテリア抗原を含むか、またはコードする。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、Ａｇ８５Ｂ、ＰＰＥ６８、ＥＳＸＡ、ＥＳＸＢ、およびＡＤＫからなる群から選択される少なくとも４つのマイコバクテリア抗原を含むか、またはコードする。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、Ａｇ８５Ｂ、ＰＰＥ６８、ＥＳＸＡ、ＥＳＸＢ、およびＡＤＫからなる群から選択される少なくとも５つのマイコバクテリア抗原を含むか、またはコードする。
【００８９】
一態様では、本開示は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＡｇ８５Ｂ抗原もしくはその機能的断片をコードする核酸配列、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＰＰＥ６８抗原もしくはその機能的断片をコードする核酸、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＥＳＸＡ抗原もしくはその機能的断片をコードする核酸、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＥＳＸＢ抗原もしくはその機能的断片をコードする核酸、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＡＤＫ抗原もしくはその機能的断片をコードする核酸、またはそれらの組み合わせを含む組成物を特徴とする。
【００９０】
いくつかの実施形態では、Ａｇ８５Ｂ抗原は、ＮＣＢＩ遺伝子参照＃８８５７８５（ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ／ミコリルトランスフェラーゼＡｇ８５Ｂ）に対応する。いくつかの実施形態では、Ａｇ８５Ｂ抗原をコードする核酸配列またはその機能的断片は、ＮＣＢＩ遺伝子参照＃８８５７８５と少なくとも５０％同一である。いくつかの実施形態では、Ａｇ８５Ｂ抗原またはその機能的断片をコードする核酸配列は、ＮＣＢＩ遺伝子参照＃８８５７８５と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態では、Ａｇ８５Ｂ抗原またはその機能的断片をコードする核酸配列は、ＮＣＢＩ遺伝子参照＃８８５７８５と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である。ＮＣＢＩ遺伝子番号＃８８５７８５の核酸配列を配列番号１として以下に示す。
配列番号１
ＡＴＧＡＣＡＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＧＡＡＡＧＡＴＴＣＧＡＧＣＴＴＧＧＧＧＡＣＧＣＣＧＡＴＴＧＡＴＧＡＴＣＧＧＣＡＣＧ  ＧＣＡＧＣＧＧＣＴＧＴＡＧＴＣＣＴＴＣＣＧＧＧＣＣＴＧＧＴＧＧＧＧＣＴＴＧＣＣＧＧＣＧＧＡＧＣＧＧＣＡＡＣＣＧＣＧ  ＧＧＣＧＣＧＴＴＣＴＣＣＣＧＧＣＣＧＧＧＧＣＴＧＣＣＧＧＴＣＧＡＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＣＧＴＣＧＣＣＧＴＣＧ
ＡＴＧＧＧＣＣＧＣＧＡＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＴＣＣＡＧＡＧＣＧＧＴＧＧＧＡＡＣＡＡＣＴＣＡＣＣＴＧＣＧＧＴＴ  ＴＡＴＣＴＧＣＴＣＧＡＣＧＧＣＣＴＧＣＧＣＧＣＣＣＡＡＧＡＣＧＡＣＴＡＣＡＡＣＧＧＣＴＧＧＧＡＴＡＴＣＡＡＣＡＣＣ  ＣＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＧＴＧＧＴＡＣＴＡＣＣＡＧＴＣＧＧＧＡＣＴＧＴＣＧＡＴＡＧＴＣＡＴＧＣＣＧＧＴＣＧＧＣＧＧＧ  ＣＡＧＴＣＣＡＧＣＴＴＣＴＡＣＡＧＣＧＡＣＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＣＧＧＣＣＴＧＣＧＧＴＡＡＧＧＣＴＧＧＣＴＧＣＣＡＧ  ＡＣＴＴＡＣＡＡＧＴＧＧＧＡＡＡＣＣＴＴＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＡＧＣＴＧＣＣＧＣＡＡＴＧＧＴＴＧＴＣＣＧＣＣＡＡＣ  ＡＧＧＧＣＣＧＴＧＡＡＧＣＣＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＧＣＴＧＣＡＡＴＣＧＧＣＴＴＧＴＣＧＡＴＧＧＣＣＧＧＣＴＣＧＴＣＧ  ＧＣＡＡＴＧＡＴＣＴＴＧＧＣＣＧＣＣＴＡＣＣＡＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＴＴＣＡＴＣＴＡＣＧＣＣＧＧＣＴＣＧＣＴＧＴＣＧＧ  ＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＣＣＣＣＴＣＴＣＡＧＧＧＧＡＴＧＧＧＧＣＣＴＡＧＣＣＴＧＡＴＣＧＧＣＣＴＣＧＣＧＡＴＧＧＧＴＧ  ＡＣＧＣＣＧＧＣＧＧＴＴＡＣＡＡＧＧＣＣＧＣＡＧＡＣＡＴＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＣＣＣＧＧＣＡＴＧＧＧ  ＡＧＣＧＣＡＡＣＧＡＣＣＣＴＡＣＧＣＡＧＣＡＧＡＴＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＧＴＣＧＣＡＡＡＣＡＡＣＡＣＣＣＧＧＣＴＡＴ  ＧＧＧＴＴＴＡＴＴＧＣＧＧＧＡＡＣＧＧＣＡＣＣＣＣＧＡＡＣＧＡＧＴＴＧＧＧＣＧＧＴＧＣＣＡＡＣＡＴＡＣＣＣＧＣＣＧ  ＡＧＴＴＣＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＴＣＧＴＴＣＧＴＡＧＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＡＴＧＣＧＴＡＣＡＡＣＧ  ＣＣＧＣＧＧＧＣＧＧＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＧＴＧＴＴＣＡＡＣＴＴＣＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＧＣＡＣＧＣＡＣＡＧＣＴＧＧＧ  ＡＧＴＡＣＴＧＧＧＧＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＡＡＣＧＣＣＡＴＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＧＴＴＣＧＴＴＡＧＧＣＧ
ＣＣＧＧＣＴＧＡ
【００９１】
いくつかの実施形態では、ＰＰＥ６８抗原は、ＮＣＢＩ遺伝子参照＃８８６２０１（ＰＰＥファミリータンパク質ＰＰＥ６８）に対応する。いくつかの実施形態では、ＰＰＥ６８抗原をコードする核酸配列またはその機能的断片は、ＮＣＢＩ遺伝子参照＃８８６２０１と少なくとも５０％同一である。いくつかの実施形態では、ＰＰＥ６８抗原またはその機能的断片をコードする核酸配列は、ＮＣＢＩ遺伝子参照＃８８６２０１と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態では、ＰＰＥ６８抗原またはその機能的断片をコードする核酸配列は、ＮＣＢＩ遺伝子参照＃８８６２０１と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である。ＮＣＢＩ遺伝子参照＃８８６２０１の核酸配列を配列番号２として以下に示す。
配列番号２
ＡＴＧＣＴＧＴＧＧＣＡＣＧＣＡＡＴＧＣＣＡＣＣＧＧＡＧＣＴＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＣＧＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＧＧＣＧＣＧ  ＧＧＴＣＣＧＧＣＴＣＣＡＡＴＧＣＴＴＧＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＡＴＧＧＣＡＧＡＣＧＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧ  ＧＡＣＧＣＴＣＡＧＧＣＣＧＴＣＧＡＧＴＴＧＡＣＣＧＣＧＣＧＣＣＴＧＡＡＣＴＣＴＣＴＧＧＧＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＣＴ  ＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＡＣＡＡＧＧＣＧＣＴＴＧＣＧＧＣＴＧＣＡＡＣＧＣＣＧＡＴＧＧＴＧＧＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＡ
ＡＣＣＧＣＧＴＣＡＡＣＡＣＡＧＧＣＣＡＡＧＡＣＣＣＧＴＧＣＧＡＴＧＣＡＧＧＣＧＡＣＧＧＣＧＣＡＡＧＣＣＧＣＧＧＣ  ＡＴＡＣＡＣＣＣＡＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＡＣＧＡＣＧＣＣＧＴＣＧＣＴＧＣＣＧＧＡＧＡＴＣＧＣＣＧＣＣＡＡＣＣＡＣＡＴ  ＣＡＣＣＣＡＧＧＣＣＧＴＣＣＴＴＡＣＧＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＴＣＴＴＣＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＣＧＡＴＣＣＣＧＡＴＣＧＣＧ  ＴＴＧＡＣＣＧＡＧＡＴＧＧＡＴＴＡＴＴＴＣＡＴＣＣＧＴＡＴＧＴＧＧＡＡＣＣＡＧＧＣＡＧＣＣＣＴＧＧＣＡＡＴＧＧＡＧ  ＧＴＣＴＡＣＣＡＧＧＣＣＧＡＧＡＣＣＧＣＧＧＴＴＡＡＣＡＣＧＣＴＴＴＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＣＧＡＧＣＣＧＡＴＧＧＣＧ  ＴＣＧＡＴＣＣＴＴＧＡＴＣＣＣＧＧＣＧＣＧＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＣＧＡＣＧＡＡＣＣＣＧＡＴＣＴＴＣＧＧＡＡＴＧＣＣＣ  ＴＣＣＣＣＴＧＧＣＡＧＣＴＣＡＡＣＡＣＣＧＧＴＴＧＧＣＣＡＧＴＴＧＣＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＴＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＴＣ  ＧＧＣＣＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＡＴＧＡＧＣＧＧＣＣＣＧＡＴＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＧＣＡ  ＧＧＴＧＡＣＧＴＣＧＴＴＧＴＴＣＡＧＣＣＡＧＧＴＧＧＧＣＧＧＣＡＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＡＣＣＣＡＧＣＣＧＡＣＧＡ  ＧＧＡＡＧＣＣＧＣＧＣＡＧＡＴＧＧＧＣＣＴＧＣＴＣＧＧＣＡＣＣＡＧＴＣＣＧＣＴＧＴＣＧＡＡＣＣＡＴＣＣＧＣＴＧＧＣ  ＴＧＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＣＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＧＣＧＣＧＧＡＧＴＣＧＣＴＡＣＣＴＧＧ  ＣＧＣＡＧＧＴＧＧＧＴＣＧＴＴＧＡＣＣＣＧＣＡＣＧＣＣＧＣＴＧＡＴＧＴＣＴＣＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡＡＡＡＧＣＣＧＧＴ  ＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＧＴＧＡＴＧＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＧＧＡＴＣＧＴＣＧＧＣＧＡＣＧＧＧＴＧＧＣＧＣＣＧＣ  ＴＣＣＧＧＴＧＧＧＴＧＣＧＧＧＡＧＣＧＡＴＧＧＧＣＣＡＧＧＧＴＧＣＧＣＡＡＴＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＡＣＣＡＧＧＣＣ  ＧＧＧＴＣＴＧＧＴＣＧＣＧＣＣＧＧＣＡＣＣＧＣＴＣＧＣＧＣＡＧＧＡＧＣＧＴＧＡＡＧＡＡＧＡＣＧＡＣＧＡＧＧＡＣＧ  ＡＣＴＧＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＧＡＣＧＡＣＴＧＧＴＧＡ
【００９２】
いくつかの実施形態では、ＥＳＸＡ抗原は、ＮＣＢＩ遺伝子参照＃８８６２０９（ＥＳＡＴ−６タンパク質ＥｓｘＡ）に対応する。いくつかの実施形態では、ＥＳＸＡ抗原をコードする核酸配列またはその機能的断片は、ＮＣＢＩ遺伝子参照＃８８６２０９と少なくとも５０％同一である。いくつかの実施形態では、ＥＳＸＡ抗原またはその機能的断片をコードする核酸配列は、ＮＣＢＩ遺伝子参照＃８８６２０９と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態では、ＥＳＸＡ抗原またはその機能的断片をコードする核酸配列は、ＮＣＢＩ遺伝子参照＃８８６２０９と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である。ＮＣＢＩ遺伝子参照＃８８６２０９の核酸配列を配列番号３として以下に示す。
配列番号３
ＡＴＧＡＣＡＧＡＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＡＴＴＴＣＧＣＧＧＧＴＡＴＣＧＡＧＧＣＣＧＣＧＧＣＡＡＧＣＧＣＡＡＴＣＣＡ  ＧＧＧＡＡＡＴＧＴＣＡＣＧＴＣＣＡＴＴＣＡＴＴＣＣＣＴＣＣＴＴＧＡＣＧＡＧＧＧＧＡＡＧＣＡＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＡ  ＧＣＴＣＧＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＧＧＧＣＧＧＴＡＧＣＧＧＴＴＣＧＧＡＧＧＣＧＴＡＣＣＡＧＧＧＴＧＴＣＣＡＧＣＡＡＡ  ＡＡＴＧＧＧＡＣＧＣＣＡＣＧＧＣＴＡＣＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＡＡＣＧＣＧＣＴＧＣＡＧＡＡＣＣＴＧＧＣＧＣＧＧＡＣＧ
ＡＴＣＡＧＣＧＡＡＧＣＣＧＧＴＣＡＧＧＣＡＡＴＧＧＣＴＴＣＧＡＣＣＧＡＡＧＧＣＡＡＣＧＴＣＡＣＴＧＧＧＡＴＧＴＴＣ
ＧＣＡＴＡＧ
【００９３】
いくつかの実施形態では、ＥＳＸＢ抗原は、ＮＣＢＩ遺伝子参照＃８８６１９４（ＥＳＡＴ−６様タンパク質ＥｓｘＢ）に対応する。いくつかの実施形態では、ＥＳＸＢ抗原をコードする核酸配列またはその機能的断片は、ＮＣＢＩ遺伝子参照＃８８６１９４と少なくとも５０％同一である。いくつかの実施形態では、ＥＳＸＢ抗原またはその機能的断片をコードする核酸配列は、ＮＣＢＩ遺伝子参照＃８８６１９４と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態では、ＥＳＸＢ抗原またはその機能的断片をコードする核酸配列は、ＮＣＢＩ遺伝子参照＃８８６１９４と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である。ＮＣＢＩ遺伝子参照＃８８６１９４の核酸配列を配列番号４として以下に示す。
配列番号４
ＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＣＧＡＴＧＣＣＧＣＴＡＣＣＣＴＣＧＣＧＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＧＴＡＡＴＴＴＣＧＡＧ  ＣＧＧＡＴＣＴＣＣＧＧＣＧＡＣＣＴＧＡＡＡＡＣＣＣＡＧＡＴＣＧＡＣＣＡＧＧＴＧＧＡＧＴＣＧＡＣＧＧＣＡＧＧＴＴＣＧ  ＴＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＧＧＣＧＣＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＧＡＣＧＧＣＣＧＣＣＣＡＧＧＣＣＧＣＧＧＴＧＧＴＧＣＧ  ＣＴＴＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＣＡＡＴＡＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧＧＡＡＣＴＣＧＡＣＧＡＧＡＴＣＴＣＧＡＣＧＡＡＴＡ  ＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＣＧＧＣＧＴＣＣＡＡＴＡＣＴＣＧＡＧＧＧＣＣＧＡＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＴ  ＣＣＴＣＧＣＡＡＡＴＧＧＧＣＴＴＣＴＧＡ
【００９４】
いくつかの実施形態では、ＡＤＫ抗原は、ＮＣＢＩ遺伝子参照＃８８８５６７（アデニル酸キナーゼ）に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＤＫ抗原をコードする核酸配列またはその機能的断片は、ＮＣＢＩ遺伝子参照＃８８８５６７と少なくとも５０％同一である。いくつかの実施形態では、ＡＤＫ抗原またはその機能的断片をコードする核酸配列は、ＮＣＢＩ遺伝子参照＃８８８５６７と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態では、ＡＤＫ抗原またはその機能的断片をコードする核酸配列は、ＮＣＢＩ遺伝子参照＃８８８５６７と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である。ＮＣＢＩ遺伝子参照＃８８８５６７の核酸配列を配列番号５として以下に示す。
配列番号５
ＧＴＧＡＧＡＧＴＴＴＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＧＣＣＣＧＧＧＧＣＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＡＣＧＣＡＧＧＣＧＧＴＧＡＡ  ＧＣＴＧＧＣＣＧＡＧＡＡＧＣＴＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＧＧＣＧＡＡＣＴＣＴＴＣＣＧＧＣＧＣＡＡ  ＣＡＴＣＧＡＡＧＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＧＧＣＧＴＧＧＡＡＧＣＣＡＡＡＣＧＣＴＡＣＴＴＧＧＡＴＧＣＣＧＧＴＧ  ＡＣＴＴＧＧＴＧＣＣＧＴＣＣＧＡＣＴＴＧＡＣＣＡＡＴＧＡＡＣＴＣＧＴＣＧＡＣＧＡＣＣＧＧＣＴＧＡＡＣＡＡＴＣＣＧＧ  ＡＣＧＣＧＧＣＣＡＡＣＧＧＡＴＴＣＡＴＣＴＴＧＧＡＴＧＧＣＴＡＴＣＣＡＣＧＣＴＣＧＧＴＣＧＡＧＣＡＧＧＣＣＡＡＧＧ  ＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＧＡＴＧＣＴＣＧＡＡＣＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＣＧＡＣＡＴＣＧＡＣＧＣＧＧＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＴＣ  ＧＴＧＴＧＴＣＣＧＡＧＧＡＧＧＴＧＴＴＧＴＴＧＧＡＧＣＧＡＣＴＣＡＡＧＧＧＧＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＣＣＧＡＣＧＡＣＡ  ＣＣＧＡＣＧＡＣＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡＡＣＣＧＧＡＴＧＡＡＧＧＴＣＴＡＣＣＧＣＧＡＣＧＡＧＡＣＣＧＣＧＣＣＧＣＴＧＣ  ＴＧＧＡＧＴＡＣＴＡＣＣＧＣＧＡＣＣＡＡＴＴＧＡＡＧＡＣＣＧＴＣＧＡＣＧＣＣＧＴＣＧＧＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＧ  ＴＧＴＴＣＧＣＣＣＧＴＧＣＧＴＴＧＣＧＧＧＣＴＣＴＧＧＧＡＡＡＧＴＡＧ
【００９５】
本発明の核酸分子は、天然の核酸（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのゲノムまたはゲノム断片から単離された）であり得るか、または１つ以上のヌクレオチド（複数可）の置換、欠失、付加、および／または挿入を含むように修飾され得る。本発明は、クローニング、発現、安定性（例えば、適切な制限部位の導入、所与の宿主細胞における翻訳を最適化するためのヌクレオチド配列の変性および／もしくは最適化、ならびに／または核酸分子もしくはその転写物を不安定化する可能性のある潜在的に負の要素の抑制）を向上させることを目的とする任意の修飾を包含する。いくつかの修飾が企図される場合、それらは連続的および／または非連続的なヌクレオチド残基に関係し得る。本発明によって企図される修飾（複数可）は、コードされたマイコバクテリア抗原および融合ポリペプチドのアミノ酸配列を変更しないサイレント修飾、ならびにコードされたマイコバクテリアポリペプチドに翻訳される修飾を包含する。好ましくは、修飾は、非修飾のものと比較して、コードされたマイコバクテリア抗原および融合ポリペプチドの免疫原性の可能性を低下させない。
【００９６】
あるいは、または加えて、本発明の核酸分子は、特定の宿主細胞または対象、例えば、トリ（例えば、ニワトリ胚線維芽細胞、ＷＯ２０１０／１３０７５６およびＷＯ２０１２／００１０７５に記載のＣａｉｒｉｎａ  ｍｏｓｃｈａｔａ細胞株）、哺乳類、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、またはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）または細菌（例えば、Ｅ  ｃｏｌｉ、ＢＣＧ、またはＬｉｓｔｅｒｉａ）において高レベルの発現を提供するために最適化することができる。所与のアミノ酸をコードするために２つ以上のコドンが利用可能である場合、生物のコドン使用パターンは非常に非ランダムであり、コドンの利用は異なる宿主間で著しく異なる可能性があることが実際に観察されている。本発明で使用されるヌクレオチド配列はほとんどが細菌起源であるため、それらは、高等真核細胞などの宿主細胞での効率的な発現に不適切なコドン使用パターンを有する可能性がある。典型的には、コドン最適化は、目的の宿主細胞でまれにしか使用されないコドンに対応する１つ以上の「天然」（マイコバクテリア）コドンを、より頻繁に使用される同じアミノ酸をコードする１つ以上のコドンで置き換えることによって行われる。部分的に置換しても発現の増加が達成され得るため、まれにしか使用されないコドンに対応するすべての天然コドンを置換する必要はない。さらに、結果として生じる核酸分子への制限部位（複数可）の導入に対応するために、最適化されたコドン使用への厳密な順守からのある程度の逸脱がなされてもよい。
【００９７】
コドン使用の最適化に加えて、ヌクレオチド配列の追加の修飾により、宿主細胞または対象における発現をさらに向上させることができる。例えば、本発明の核酸分子は、濃縮領域に存在するまれな非最適コドンのクラスター化を防止するように、および／または発現レベルに悪影響を与えると予想される「負」の配列要素を抑制または修飾するように修飾することができる。そのような負の配列要素には、非常に高い（＞８０％）もしくは非常に低い（＜３０％）ＧＣ含量を有する領域、ＡＴ豊富もしくはＧＣ豊富配列ストレッチ、不安定な直接もしくは逆方向反復配列、ＲＡ二次構造、ならびに／または内部ＴＡＴＡボックス、ｃｈｉ部位、リボソーム侵入部位、および／もしくはスプライシングドナー／アクセプター部位などの内部潜在的調節要素が含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
本発明は、配列番号６〜１０のいずれかに記載のポリペプチドの群から選択される任意のマイコバクテリア抗原をコードする核酸分子またはその任意の変異型および断片を包含する。
【００９９】
本発明の核酸分子は、当該技術分野でアクセス可能な配列データおよび本明細書に提供される配列情報を使用して生成することができる。例えば、それらは、例えば、ＰＣＲ単離および／または特定の種のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍゲノムもしくはそのゲノム断片、ｃＤＮＡおよびゲノムライブラリ、またはそれを含むことが知られている任意の先行技術ベクターからの従来の分子生物学によるクローニングによって、当該技術分野で周知の通例の技法を使用して単離され得る。あるいは、本発明の核酸分子は、自動プロセスにおける化学合成によっても生成され得る（例えば、重複する合成オリゴヌクレオチドから組み立てられる）。
【０１００】
本発明の別の実施形態は、本発明の核酸分子の断片、例えば、制限エンドヌクレアーゼおよびＰＣＲで生成された断片に関連する。そのような断片は、関連する免疫原性部分（複数可）をコードするプローブ、プライマー、または断片として使用することができる。
【０１０１】
他の態様では、本開示は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＡｇ８５Ｂ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＰＰＥ６８抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＥＳＸＡ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＥＳＸＢ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＡＤＫ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、またはそれらの組み合わせを含む組成物を特徴とする。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、Ａｇ８５Ｂ抗原は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿２１６４０２．１（ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ／ミコリルトランスフェラーゼＡｇ８５Ｂ）として示されるアミノ酸配列に対応する。いくつかの実施形態では、Ａｇ８５Ｂ抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドは、ＮＰ＿２１６４０２．１と５０％同一である。いくつかの実施形態では、Ａｇ８５Ｂ抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿２１６４０２．１と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態では、Ａｇ８５Ｂ抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿２１６４０２．１と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である。ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿２１６４０２．１アミノ酸配列を配列番号６として以下に示す。
配列番号６
１  ｍｔｄｖｓｒｋｉｒａ  ｗｇｒｒｌｍｉｇｔａ  ａａｖｖｌｐｇｌｖｇ  ｌａｇｇａａｔａｇａ  ｆｓｒｐｇｌｐｖｅｙ  ｌｑｖｐｓｐｓｍｇｒ
６１  ｄｉｋｖｑｆｑｓｇｇ  ｎｎｓｐａｖｙｌｌｄ  ｇｌｒａｑｄｄｙｎｇ  ｗｄｉｎｔｐａｆｅｗ  ｙｙｑｓｇｌｓｉｖｍ  ｐｖｇｇｑｓｓｆｙｓ
１２１  ｄｗｙｓｐａｃｇｋａ  ｇｃｑｔｙｋｗｅｔｆ  ｌｔｓｅｌｐｑｗｌｓ  ａｎｒａｖｋｐｔｇｓ  ａａｉｇｌｓｍａｇｓ  ｓａｍｉｌａａｙｈｐ
１８１  ｑｑｆｉｙａｇｓｌｓ  ａｌｌｄｐｓｑｇｍｇ  ｐｓｌｉｇｌａｍｇｄ  ａｇｇｙｋａａｄｍｗ  ｇｐｓｓｄｐａｗｅｒ  ｎｄｐｔｑｑｉｐｋｌ
２４１  ｖａｎｎｔｒｌｗｖｙ  ｃｇｎｇｔｐｎｅｌｇ  ｇａｎｉｐａｅｆｌｅ  ｎｆｖｒｓｓｎｌｋｆ  ｑｄａｙｎａａｇｇｈ  ｎａｖｆｎｆｐｐｎｇ
３０１  ｔｈｓｗｅｙｗｇａｑ  ｌｎａｍｋｇｄｌｑｓ  ｓｌｇａｇ
【０１０３】
いくつかの実施形態では、ＰＰＥ６８抗原は、ＮＣＢＩ参照配列ＹＰ＿１７８０２２．１（ＰＰＥファミリータンパク質ＰＰＥ６８）として示されるアミノ酸配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＰＰＥ６８抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドは、ＹＰ＿１７８０２２．１と５０％同一である。いくつかの実施形態では、ＰＰＥ６８抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照配列ＹＰ＿１７８０２２．１と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態では、ＰＰＥ６８抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照配列ＹＰ＿１７８０２２．１と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である。ＮＣＢＩ参照配列ＹＰ＿１７８０２２．１アミノ酸配列を配列番号７として以下に示す。
配列番号７
１  ｍｌｗｈａｍｐｐｅｌ  ｎｔａｒｌｍａｇａｇ  ｐａｐｍｌａａａａｇ  ｗｑｔｌｓａａｌｄａ  ｑａｖｅｌｔａｒｌｎ  ｓｌｇｅａｗｔｇｇｇ
６１  ｓｄｋａｌａａａｔｐ  ｍｖｖｗｌｑｔａｓｔ  ｑａｋｔｒａｍｑａｔ  ａｑａａａｙｔｑａｍ  ａｔｔｐｓｌｐｅｉａ  ａｎｈｉｔｑａｖｌｔ
１２１  ａｔｎｆｆｇｉｎｔｉ  ｐｉａｌｔｅｍｄｙｆ  ｉｒｍｗｎｑａａｌａ  ｍｅｖｙｑａｅｔａｖ  ｎｔｌｆｅｋｌｅｐｍ  ａｓｉｌｄｐｇａｓｑ
１８１  ｓｔｔｎｐｉｆｇｍｐ  ｓｐｇｓｓｔｐｖｇｑ  ｌｐｐａａｔｑｔｌｇ  ｑｌｇｅｍｓｇｐｍｑ  ｑｌｔｑｐｌｑｑｖｔ  ｓｌｆｓｑｖｇｇｔｇ
２４１  ｇｇｎｐａｄｅｅａａ  ｑｍｇｌｌｇｔｓｐｌ  ｓｎｈｐｌａｇｇｓｇ  ｐｓａｇａｇｌｌｒａ  ｅｓｌｐｇａｇｇｓｌ  ｔｒｔｐｌｍｓｑｌｉ
３０１  ｅｋｐｖａｐｓｖｍｐ  ａａａａｇｓｓａｔｇ  ｇａａｐｖｇａｇａｍ  ｇｑｇａｑｓｇｇｓｔ  ｒｐｇｌｖａｐａｐｌ  ａｑｅｒｅｅｄｄｅｄ
３６１  ｄｗｄｅｅｄｄｗ
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ＥＳＸＡ抗原は、ＮＣＢＩ参照配列ＹＰ＿１７８０２３．１（ＥＳＡＴ−６タンパク質ＥｓｘＡ）として示されるアミノ酸配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＥＳＸＡ抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドは、ＹＰ＿１７８０２３．１と５０％同一である。いくつかの実施形態では、ＥＳＸＡ抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照配列ＹＰ＿１７８０２３．１と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態では、ＥＳＸＡ抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照配列ＹＰ＿１７８０２３．１と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である。ＮＣＢＩ参照配列ＹＰ＿１７８０２３．１アミノ酸配列を配列番号８として以下に示す。
配列番号８
１  ｍｔｅｑｑｗｎｆａｇ  ｉｅａａａｓａｉｑｇ  ｎｖｔｓｉｈｓｌｌｄ  ｅｇｋｑｓｌｔｋｌａ  ａａｗｇｇｓｇｓｅａ  ｙｑｇｖｑｑｋｗｄａ
６１  ｔａｔｅｌｎｎａｌｑ  ｎｌａｒｔｉｓｅａｇ  ｑａｍａｓｔｅｇｎｖ  ｔｇｍｆａ
【０１０５】
いくつかの実施形態では、ＥＳＸＢ抗原は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿２１８３９１．１（ＥＳＡＴ−６タンパク質ＥｓｘＢ）として示されるアミノ酸配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＥＳＸＢ抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドは、ＮＰ＿２１８３９１．１と５０％同一である。いくつかの実施形態では、ＥＳＸＢ抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿２１８３９１．１と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態では、ＥＳＸＢ抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿２１８３９１．１と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である。ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿２１８３９１．１アミノ酸配列を配列番号９として以下に示す。
配列番号９
１  ｍａｅｍｋｔｄａａｔ  ｌａｑｅａｇｎｆｅｒ  ｉｓｇｄｌｋｔｑｉｄ  ｑｖｅｓｔａｇｓｌｑ  ｇｑｗｒｇａａｇｔａ  ａｑａａｖｖｒｆｑｅ
６１  ａａｎｋｑｋｑｅｌｄ  ｅｉｓｔｎｉｒｑａｇ  ｖｑｙｓｒａｄｅｅｑ  ｑｑａｌｓｓｑｍｇｆ
【０１０６】
いくつかの実施形態では、ＡＤＫ抗原は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿２１５２４７．１（アデニル酸キナーゼ）として示されるアミノ酸配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＤＫ抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドは、ＮＰ＿２１５２４７．１と５０％同一である。いくつかの実施形態では、ＡＤＫ抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿２１５２４７．１と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態では、ＡＤＫ抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿２１５２４７．１と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である。ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿２１５２４７．１アミノ酸配列を配列番号１０として以下に示す。
配列番号１０
１  ｍｒｖｌｌｌｇｐｐｇ  ａｇｋｇｔｑａｖｋｌ  ａｅｋｌｇｉｐｑｉｓ  ｔｇｅｌｆｒｒｎｉｅ  ｅｇｔｋｌｇｖｅａｋ  ｒｙｌｄａｇｄｌｖｐ
６１  ｓｄｌｔｎｅｌｖｄｄ  ｒｌｎｎｐｄａａｎｇ  ｆｉｌｄｇｙｐｒｓｖ  ｅｑａｋａｌｈｅｍｌ  ｅｒｒｇｔｄｉｄａｖ  ｌｅｆｒｖｓｅｅｖｌ
１２１  ｌｅｒｌｋｇｒｇｒａ  ｄｄｔｄｄｖｉｌｎｒ  ｍｋｖｙｒｄｅｔａｐ  ｌｌｅｙｙｒｄｑｌｋ  ｔｖｄａｖｇｔｍｄｅ  ｖｆａｒａｌｒａｌｇ
１８１  ｋ
【０１０７】
別の実施形態では、本発明の組成物は、全長ポリペプチドまたはその断片（例えば、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、または９０のアミノ酸残基などの３０の連続するアミノ酸残基の断片）にわたって、本明細書に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性（例えば、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）を示す、少なくとも５つのマイコバクテリア抗原を含むか、またはコードする。
【０１０８】
あるいは、または加えて、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの少なくとも５つの抗原のそれぞれは、天然のマイコバクテリア抗原（例えば、全長抗原）またはその修飾型（断片または変異型）であり得る。「天然」のマイコバクテリア抗原は、自然界のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ源から発見、単離、得ることができる。そのような供給源には、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに感染した、もしくはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに曝露された対象から収集された生物学的試料（例えば、血液、血漿、血清、唾液、喀痰、組織切片、生検標本など）、培養細胞、ならびに寄託機関で入手可能な組換え材料（例えば、ＡＴＣＣまたはＴＢ機関）、ライブラリ、または文献に記載されているもの（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ分離株、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍゲノム、ゲノム断片、ゲノムＲＮＡもしくはｃＤＮＡ、ならびにそのような要素を含むことが当該技術分野で知られている任意のプラスミドおよびベクター）が含まれる。
【０１０９】
修飾されたマイコバクテリア抗原（例えば、変異型）は、典型的には、本明細書に具体的に開示されるポリペプチドまたは１つ以上の位置（複数可）において天然のものとは異なる。１つ以上のアミノ酸残基（複数可）の置換、挿入、付加、および／または欠失、非天然配置、およびこれらの可能性の任意の組み合わせを含む、任意の修飾（複数可）を想定することができる。アミノ酸置換は保存的であってもなくてもよい。いくつかの修飾が企図される場合、それらは連続的残基および／または非連続的残基に関係し得る。修飾（複数可）は、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、ＤＮＡシャッフリングなどの当業者に既知のいくつかの方法によって、および合成技法（例えば、所望のポリペプチド変異型をコードする合成核酸分子をもたらす）によって生成することができる。それらの起源（天然または修飾）が何であれ、本発明の実施形態によれば、本発明の組成物に含まれる、またはそれによってコードされるマイコバクテリア抗原のそれぞれは、Ｂおよび／またはＴ細胞エピトープ（複数可）を含む対応する天然抗原の１つ以上の免疫原性部分を保持する。そのような関連する免疫原性部分を同定するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｔ細胞エピトープは、生物学的アッセイ（例えば、合成重複オリゴペプチドのライブラリを使用するＩＦＮｇアッセイ）または利用可能な予測プログラムを実施することによって同定することができる。
【０１１０】
本発明の文脈で想定され得る各修飾されたマイコバクテリア抗原は、天然の対応物に関して１つ以上の修飾、特に、結果として生じるポリペプチドの合成、プロセシング、安定性、および／もしくは溶解性、ならびに／またはその免疫原性に有益な１つ以上の修飾を含む。好適な修飾の代表的な例としては、（ａ）内部の高度に疎水性の領域（複数可）の欠失、（ｂ）Ｎ末端シグナルペプチドの欠失（必要に応じて異種のものとの置換）、ならびに／または（ｃ）安定性、免疫原性、および組換え発現と負に干渉する可能性のある折り畳まれていない領域の欠失、ならびに／または（ｄ）生物学的活性を無効にするための触媒ドメインの欠失もしくは突然変異が挙げられる。
【０１１１】
ベクター
本発明はまた、本発明の１つ以上の核酸分子（複数可）を含むベクター、ならびにそのようなベクター（複数可）を含む組成物にも関係する。
【０１１２】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、ビヒクル、好ましくは、宿主細胞または対象内での本明細書に記載の核酸分子（複数可）のいずれかの送達、増殖、および／または発現を可能にするために必要な要素を含む核酸分子またはウイルス粒子を指す。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、これは、追加の核酸セグメントを連結することができる直鎖状または環状の二本鎖ＤＮＡ分子を指す。別の種類のベクターはウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）であり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに導入することができる。通常、プラスミドベクターは、対応する選択的薬物の存在下で、プラスミドベクターを保有する宿主細胞を選択することを可能にする選択可能なマーカー遺伝子を含む。様々な陽性および陰性の選択可能なマーカー遺伝子が当該技術分野で知られている。実例として、抗生物質耐性遺伝子は、対応する抗生物質の存在下で宿主細胞を選択することを可能にする陽性の選択可能なマーカー遺伝子として使用することができる。
【０１１３】
ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製することができる（例えば、細菌の複製起点を含む細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。「発現ベクター」は、選択されたポリヌクレオチドの発現を指向することができる種類のベクターである。本開示は、本明細書に開示される任意の１つまたは複数のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む任意の１つまたは複数のベクターに関する。本開示の目的のために、ベクターは、天然に生じる遺伝子源、合成もしくは人工、または天然および人工の遺伝要素のいくつかの組み合わせのものであり得る。
【０１１４】
本開示の文脈において適切なベクターには、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＢＣＧ、またはＬｉｓｔｅｒｉａ）などの原核生物宿主細胞における発現のためのバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドベクター；酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現のためのベクター；昆虫細胞系（例えば、Ｓｆ９細胞）における発現のためのバキュロウイルスベクター；植物細胞系における発現のためのウイルスおよびプラスミドベクター（例えば、Ｔｉプラスミド、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ、タバコモザイクウイルスＴＭＶ）；高等真核細胞または対象における発現のためのプラスミドおよびウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。典型的には、そのようなベクターは市販されているか（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｒｏｍｅｇａなど）、またはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）などの寄託機関から入手可能であるか、またはそれらの配列、構成、および産生方法を記載する多数の刊行物の主題となっており、当業者はそれらを適用することが可能である。適切なプラスミドベクターの代表的な例としては、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＶＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＧＷｉｚ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ）が挙げられるが、これらに限定されない。適切なウイルスベクターの代表的な例は、様々な異なるウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、泡沫状ウイルス、アルファウイルス、小胞性口内炎ウイルスなど）から生成される。上述のように、「ウイルスベクター」という用語は、ベクターＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ならびにそれらの生成されたウイルス粒子、特に感染性ウイルス粒子を包含する。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、本開示で用いられるウイルスベクターは、複製欠損または複製障害であり、これは、それが正常細胞（例えば、正常ヒト細胞）またはそれが投与される対象において任意の顕著な程度まで複製することができないことを意味する（複製機能の障害または欠損は、従来の手段によって、例えば、非許容細胞におけるＤＮＡ合成および／またはウイルス力価の測定を介して評価することがでる）。そのような複製欠損または障害ベクターは、典型的には、欠損／障害機能をもたらす、または補完する増殖、許容細胞株を必要とする。
【０１１６】
本開示の文脈で有用なウイルスベクターの例としては、ワクチン接種、免疫療法、遺伝子移入、または組換え産生のためのいくつかの十分に立証された利点を有するアデノウイルスベクターが挙げられる（概説については、“Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ”，２００２，Ｅｄ  Ｄ．Ｃｕｒｉｅｌ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄｏｕｇｌａｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。本発明のアデノウイルスベクターは、様々なヒトまたは動物源（例えば、イヌ、ヒツジ、サルのアデノウイルスなど）に由来し得る。任意の血清型を用いることができ、ヒトアデノウイルスが特に好ましく、Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ６などの亜属Ｃ、ならびにＡｄｌ  ｌ、Ａｄ３４、およびＡｄ３５などの亜属Ｂが特に好ましい。動物Ａｄを使用することも有利な場合があり、チンパンジーＡｄ３およびＡｄ６３などのチンパンジーＡｄが特に好ましい。引用されたアデノウイルスは、ＡＴＣＣから入手可能であるか、またはそれらの配列、構成、および産生方法を記載する多数の刊行物の主題となっており、当業者はそれらを適用することが可能である（例えば、ＵＳ６，１３６，５９４、ＵＳ６，１３３，０２８、ＷＯ００／５０５７３、ＷＯ００／７００７１、ＷＯ２００４／０８３４１８、ＷＯ２００４／０９７０１６、およびＷＯ２００５／０７１０９３を参照されたい）。
【０１１７】
複製欠損アデノウイルスベクターは、Ｅｌ欠損であり、Ｅｌ欠失がおよそ位置４５９から３３２８、またはおよそ位置４５９から３５１０に及ぶ（受入番号Ｍ７３２６０でＧｅｎｅＢａｎｋにおいて開示されているＡｄ５の配列を参照）。アデノウイルスゲノムの追加部分（複数可）（非必須Ｅ３領域のすべてもしくは一部（例えば、およそ位置２７８６７から３０７４３の欠失）、またはＷ０９４／２８１５２およびＬｕｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７２：２０２２に記載されている他の必須Ｅ２および／もしくはＥ４領域の追加部分を削除することにより、クローニング能力をさらに向上させることができる）。
【０１１８】
本開示の核酸分子は、アデノウイルスゲノムの任意の位置に独立して挿入することができ、Ｅ１および／またはＥ３領域の代わりの挿入が特に好ましい。それらは、問題の領域の自然な転写方向に対してセンスまたはアンチセンス配向に配置され得る。
【０１１９】
ウイルスベクターの他の例には、鶏痘ベクター（例えば、ＦＰ９）、カナリア痘ベクター（例えば、ＡＬＶＡＣ）、およびワクシニアウイルスベクターなどのポックスウイルスベクターが含まれ、後者が好ましい。適切なワクシニアウイルスには、コペンハーゲン株、ワイス株、ＮＹＶＡＣ（ＵＳ５，４９４，８０７）、および修飾されたアンカラ（ＭＶＡ）株（Ａｎｔｏｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９８，Ｖｉｒｏｌ．２４４：３６５、ＷＯ０２／４２４８０）が含まれるが、これらに限定されない。組換えポックスウイルスを構築および産生するための一般的な条件は、当該技術分野で周知である（例えば、ＷＯ２０１０／１３０７５３、ＷＯ０３／００８５３３、ＵＳ６，９９８，２５２、ＵＳ５，９７２，５９７、およびＵＳ６，４４０，４２２を参照されたい）。本発明の核酸分子は、好ましくは、非必須遺伝子座のポックスウイルスゲノム内に挿入される。チミジンキナーゼ遺伝子は、コペンハーゲンワクシニアベクターへの挿入およびＭＶＡベクターへの挿入のための欠失ＩＩまたはＩＩＩに特に適している（ＷＯ９７／０２３５５）。
【０１２０】
他のウイルスベクターは、ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科から得ることができるｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓであり、麻疹ウイルスが特に好ましい。Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ  ＡおよびＢ株（Ｇｒｉｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｆｉｅｌｄ’ｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１４０１−１４４１）、Ｓｃｈｗａｒｚ株（Ｓｃｈｗａｒｚ  Ａ，１９６２，Ａｍ  Ｊ  Ｄｉｓ  Ｃｈｉｌｄ，１０３：２１６）、Ｓ１９１またはＣ−４７株（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００９，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ．８１（８）：１４７７）などの、限定されない様々な弱毒化株が当該技術分野で利用可能である（Ｂｒａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００８，ＣＩＭＩＤ，３１：２７１；Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｊ．ｖｉｒｏｌ．７３（６）：４８２３）。ＰとＭ遺伝子との間、またはＨとＬ遺伝子との間への挿入が特に適切である。
【０１２１】
本開示で使用するのに好適なベクターには、野生型または突然変異体（例えば、無毒）であり得る細菌細胞も含まれる。そのような細菌細胞のよく知られた例としては、無毒のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ（例えば、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ならびにＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａなどの他の微生物が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態は、ＢＣＧベクターがそのような要素（複数可）を発現することを可能にする方法で、上記で定義されるように１つ以上のマイコバクテリア抗原（複数可）または融合ポリペプチド（複数可）をコードする核酸分子のゲノムに組み込まれているＢＣＧベクターを対象とする。
【０１２２】
本開示はまた、リポソーム、リポプレックス、またはナノ粒子などの粒子構造を形成するために脂質またはポリマーと複合体を形成するベクター（例えば、プラスミドＤＮＡ）も包含する。
【０１２３】
本開示によれば、本発明のベクターに含まれる核酸分子は、宿主細胞または対象における発現に好適な形態であり、これは、本明細書に記載の核酸分子のそれぞれが、適切な調節配列に作動可能に連結されていることを意味する。本明細書で使用される場合、「調節要素」または「調節配列」という用語は、核酸（複数可）またはその誘導体（すなわち、ｍ  ＮＡ）の複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、安定性、および／または輸送を含む、所与の宿主細胞または対象における核酸分子（複数可）の発現を可能にするか、それに寄与するか、またはそれを調節する任意の要素を指す。
【０１２４】
調節配列の選択は、ベクター自体、宿主細胞または対象、所望の発現レベルなどの因子に依存し得ることを当業者は理解するであろう。プロモーターは特に重要なものである。本発明の文脈において、それは、多くの種類の宿主細胞における、またはある宿主細胞に特異的な核酸分子の構成的指向発現（例えば、肺特異的調節配列）であるか、あるいは特定の事象もしくは外因性因子（例えば、温度、栄養添加物、ホルモンなど）に応答して、またはウイルスサイクルの段階（例えば、後期または早期）により調節され得る。ベクター産生を最適化し、発現されたポリペプチド（複数可）の潜在的な毒性を回避するために、特定の事象または外因性因子に応答して産生ステップ中に抑制されるプロモーターを使用することもできる。
【０１２５】
哺乳類細胞における構成的発現に好適なプロモーターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター（ＵＳ５，１６８，０６２）、ＲＳＶプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）−１のチミジンキナーゼ（ＴＫ）、およびＴ７ポリメラーゼプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。ｔｒｐ、ｌａｃ、ファージプロモーター、ｔＲ  Ａプロモーター、解糖酵素プロモーターなどのプロモーターは、原核生物宿主において使用することができる。有用な酵母プロモーターには、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、またはエノラーゼもしくはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼなどの他の解糖酵素、マルトースおよびガラクトースの利用に関与する酵素のプロモーター領域が含まれる。ワクシニアウイルスプロモーターは、ポックスウイルスベクターでの発現に特に適している。代表的な例としては、ワクシニア７．５Ｋ、Ｈ５Ｒ、１１Ｋ７．５（Ｅｒｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１５：１８）、ＴＫ、ｐ２８、ｐｌ  ｌ、およびＫ１Ｌプロモーター、ならびにＣｈａｋｒａｂａｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：１０９４−７；Ｈａｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６６：１３５−８；ａｎｄ  Ｋｕｍａｒ  ａｎｄ  Ｂｏｙｌｅ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７９：１５１−８）に記載のものなどの合成プロモーター、ならびに初期／後期キメラプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。麻疹媒介性発現に好適なプロモーターには、麻疹転写単位の発現を指向する任意のプロモーターが含まれるが、これに限定されない（Ｂｒａｎｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｔａｎｇｙ，２００８，ＣＩＭＩＤ  ３１：２７１）。
【０１２６】
当業者は、本開示の核酸分子（複数可）の発現を制御する調節要素が、転写の適切な開始、調節、および／または終結（例えば、ポリＡ転写終結配列）、ｍＲＮＡ輸送（例えば、核局在化シグナル配列）、プロセシング（例えば、スプライシングシグナル）、および安定性（例えば、イントロンおよび非コード５’および３’配列）、宿主細胞または対象への翻訳（例えば、イニシエーターＭｅｔ、三者リーダー配列、ＩＲＥＳリボソーム結合部位、シャイン・ダルガノ配列など）、ならびに精製ステップ（例えば、本明細書に記載のタグ）の追加の要素をさらに含み得ることを理解するであろう。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、マイコバクテリア抗原をコードする核酸分子は、単一のベクターによって運ばれ、任意選択的に、１つ以上のマイコバクテリア抗原に作動可能に連結される調節配列を含む。
【０１２８】
代替の実施形態では、マイコバクテリア抗原をコードする核酸分子は、２つ以上のベクターによって実施される。各ベクターは、本明細書に記載のもののうちの１つ以上のマイコバクテリア抗原をコードする。２つ以上のベクターは、実質的に同時に、または連続して対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、エクスビボで単離されたＴ細胞は、２、３、４、５、６つ以上のプラスミド配列に曝露され、１、２、３、４、５、６つ以上のプラスミドのそれぞれは、マイコバクテリア抗原をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む。組成物は、単離されたＴ細胞（実施例に概説されたステップを使用する健康な対象からの細胞）に曝露され、１つまたは複数の抗原に対する免疫応答を刺激するために一定期間放置される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８−を除くＣＤ３＋／ＣＤ４＋である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４−を除くＣＤ３＋／ＣＤ４＋である。
【０１２９】
必要に応じて、本開示のベクターは、追加のポリペプチドをさらに含み得る。例示的な追加のポリペプチドには、サイトカインおよび潜在的に共感染する生物に由来する任意の他の抗原などの免疫調節物質が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３０】
一実施形態によれば、本開示のベクターは、ウイルス粒子またはリポソームまたは他の粒子（偽粒子など）に封入することができる。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、感染性、弱毒化、および／または非病原性のウイルス粒子の形態である。典型的には、そのようなウイルス粒子は、（ｉ）本発明のウイルスベクターを好適な細胞株に導入するステップ、（ｉｉ）該感染性ウイルス粒子の産生を可能にするために好適な条件下で該細胞株を培養するステップ、（ｉｉｉ）該細胞株の培養物から産生されたウイルス粒子を回収するステップ、および（ｉｖ）任意選択的に、該回収されたウイルス粒子を精製するステップを含むプロセスによって産生される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される１つもしくは複数のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを１つ以上のＴ細胞に曝露するステップは、ウイルス粒子を使用しないステップである。
【０１３１】
ウイルスベクターが複製欠損または複製障害である場合、粒子は通常、許容細胞株において、または欠損／障害機能をトランスで供給するヘルパーウイルスの使用を介して産生される。例えば、Ｅｌ欠失アデノウイルスベクターを補完するための好適な細胞株には、２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２）、ならびにＨＥＲ−９６およびＰＥＲ−Ｃ６細胞（例えば、Ｆａｌｌａｕｘ  ｅｔ  ａｌ，１９９８，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：１９０９−１７；ＷＯ９７／００３２６）、またはこれらの細胞株の任意の誘導体が含まれる。鳥類細胞は、受精卵から得られたニワトリ胚から調製された初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）、およびアヒル細胞株（例えば、ＷＯ０３／０７６６０１、ＷＯ２００９／００４０１６、ＷＯ２０１０／１３０７５６、およびＵＳ２０１１−００８８７２に記載されている）を含むがこれらに限定されないポックスウイルスベクターの増殖に特に好適である。
【０１３２】
感染性ウイルス粒子は、培養上清および／または溶解後の細胞から回収され得る。それらは、標準的な技法（クロマトグラフィー、超遠心分離技法など）によりさらに精製することができる。
【０１３３】
宿主細胞および産生方法
他の態様では、本開示はまた、本明細書に記載される核酸分子またはベクターを含む宿主細胞、ならびにそのような宿主細胞を含む組成物にも関する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書に開示されるＴ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、対象の身体から単離される。いくつかの実施形態では、本開示は、宿主細胞が成長する１つまたは一連の壁および表面を有する容器を含む組織培養システムに関する。いくつかの実施形態では、組織培養システムは、１つまたは複数の宿主細胞、ならびに本明細書に開示される任意の１つまたは複数のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、組織培養システムは、容器を包囲する加熱要素と、細胞に曝露される空気、窒素、二酸化炭素、および／または他のガスの量を調節する空気調節装置と、をさらに含む。いくつかの実施形態では、組織培養システムは、閉鎖減菌システムである。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、組織、臓器、または単離された細胞における特定の構成に関していかなる制限もなく広く理解されるべきである。「宿主細胞」は、核酸を発現するために使用することができる細胞であり、例えば、本開示の核酸は、真核細胞、細菌細胞、昆虫細胞、またはヒト細胞であり得るが、これらに限定されない。好適な真核細胞には、ＰＢＭＣの一次試料からの細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ベロ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、およびＭＤＣＫＩＩ細胞が含まれるが、これらに限定されない。好適な昆虫細胞には、Ｓｆ９細胞が含まれるが、これに限定されない。「組換え宿主細胞」という句は、発現される核酸で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を示すために使用され得る。宿主細胞はまた、核酸を含むが、調節配列が核酸と作動可能に連結されるように宿主細胞に導入されない限り、治療有効量などの所望のレベルでそれを発現しない細胞であり得る。宿主細胞という用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫も指すことが理解される。例えば、突然変異または環境の影響などにより、ある特定の変修飾が次の世代で生じる可能性があるため、そのような子孫は実際には親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書で使用される用語の範囲内に含まれる。宿主細胞はまた、本明細書に記載のベクターのレシピエントであり得る、またはレシピエントであった細胞、ならびにそのような細胞の子孫も含む。
【０１３５】
本発明のまたさらなる態様は、本発明のベクター（またはウイルス粒子）および／または宿主細胞を用いる、本発明の核酸によってコードされるマイコバクテリア抗原の組換え産生のための方法である。典型的には、この方法は、（ｉ）トランスフェクトまたは感染した宿主細胞を産生するために好適な宿主細胞にベクターを導入するステップと、（ｉｉ）宿主細胞の成長に好適な条件下で該トランスフェクトまたは感染した宿主細胞をインビトロで培養するステップと、（ｉｉｉ）細胞培養物を回収するステップと、（ｉｖ）任意選択的に、回収された細胞および／または培養上清からマイコバクテリア抗原（複数可）または融合ポリペプチドを精製するステップと、を含む。
【０１３６】
当業者は、ポリペプチドを発現するための当該技術分野で利用可能な多数の発現系、およびベクターを宿主細胞に導入するための方法に精通していることが予想される。そのような方法には、マイクロインジェクション、ＣａＰ０４を介したトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランを介したトランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション／リポソーム融合、遺伝子銃、形質導入、ウイルス感染、ならびに様々な手段による宿主生物への直接投与が含まれるが、これらに限定されない。この方法は、ポリカチオン性ポリマー（例えば、キトサン、ポリメタクリレート、ＰＥＩなど）およびカチオン性脂質（例えば、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ、トランスフェクタム、リポフェクチンなど）など、宿主細胞への核酸の導入を容易にする従来のトランスフェクション試薬と組み合わせて使用することもできる。
【０１３７】
宿主細胞は、従来の発酵バイオリアクター、フラスコ、およびペトリ皿で培養することができる。培養は、所与の宿主細胞に適切な温度、ｐＨ、および酸素含有量で実施することができる。回収されたマイコバクテリア抗原は、硫酸アンモニウム沈殿、酸抽出、ゲル電気泳動を含む周知の精製方法、ろ過およびクロマトグラフィー法（例えば、逆相、サイズ排除、イオン交換、親和性、疎水性相互作用、ヒドロキシアパタイト、高速液体クロマトグラフィーなど）によって任意選択的に精製することができる。使用される条件および技法は、正味電荷、分子量、疎水性、親水性などの因子に依存し、当業者には明らかであろう。さらに、精製のレベルは、使用目的によって異なる。例えば、タンパク質濃度は、ブランズフォードアッセイ（Ｂｉｏｒａｄ）で評価することができ、エンドトキシンレベルは、ポータブルテストシステム（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）などの技法で評価することができ、精製されたポリペプチドの質量は、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化法（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ））またはエレクトロスプレー法を使用して測定することができる。
【０１３８】
タイリング
ある特定の実施形態によれば、本明細書に開示される１つ以上のアミノ酸配列は、Ａｇ８５Ｂ、ＰＰＥ６８、ＥＳＸＡ、ＥＳＸＢ、およびＡＤＫ抗原の一部またはすべてに及ぶように配列が重複している。
【０１３９】
一実施形態によれば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの第１の抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチド、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの第１の抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドは、重複するアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの第１の抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチド、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの第１の抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸が重複するアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態によれば、重複は、２つのアミノ酸から２３のアミノ酸であり、例えば、重複は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３のアミノ酸である。このようにポリペプチドをタイリングすることにより、本開示で開示されるポリペプチドの１つ以上の長さに及ぶ一連の高度に免疫原性のペプチドによる抗原のより広い認識または提示が提供される。
【０１４０】
ポリペプチドをタイリングするための方法は当該技術分野で既知であり、例えば、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に基づく増殖アッセイで試験された１２のアミノ酸が重複する１５量体ポリペプチドの開発および試験を記載しているＨａｒｄｉｎｇらに記載されている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００５，Ｖｏｌｕｍｅ  ４，Ｉｓｓｕｅ  １１、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｓｔｉｃｋｅｒらは、任意のタンパク質の機能的なＣＤ４（＋）Ｔ細胞エピトープを同定するためのヒト細胞に基づく方法を説明している（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００３  Ｏｃｔ  １；２８１（１−２）：９５−１０８、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１４１】
本発明で利用されるＰｅｐｍｉｘは、約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５のアミノ酸長であり、ある特定の態様では、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１以上のアミノ酸が互いに重複しているペプチドで構成される市販のペプチドライブラリからのものであり得る。例としては、ＪＰＴ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＭｉｌｔｅｎｙｉからのものが挙げられる。特定の実施形態では、ペプチドは、例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５以上のアミノ酸長であり、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４のアミノ酸長が重複している。いくつかの実施形態では、ｐｅｐｍｉｘは、配列番号１１〜５１のいずれか１つまたは組み合わせを含む。それらの配列のいずれかの任意の順列は、任意の１つまたは複数のそのような配列識別子を使用して、配列番号１７〜５９のアミノ酸配列が基づく１つまたは複数の抗原断片に対して、１つまたは複数の細胞において抗原特異的免疫応答を誘発または刺激することができると考えられる。
【０１４２】
ＣＡＲ−Ｔ組成物
いくつかの実施形態では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を提供し、操作された免疫エフェクター細胞は、抗菌抗原特性を示す。好ましい抗原は、本明細書に記載のマイコバクテリア抗原、または本明細書に開示される任意の複数のマイコバクテリア抗原の組み合わせである。一態様では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、部分的にヒト化された抗体断片を含む。一態様では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、部分的にヒト化されたｓｃＦｖを含む。したがって、本発明は、ヒト化抗原結合ドメインを含み、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に操作されるＣＡＲ、および養子療法のためのそれらの使用方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７シグナルドメイン、ＣＤ３ゼータシグナルドメイン、およびそれらの任意の組み合わせの群から選択される少なくとも１つの細胞内ドメインを含む。一態様では、本発明のＣＡＲは、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含み、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）またはＣＤ２８以外の１つ以上の共刺激分子（複数可）からのものである。
【０１４３】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本開示は、ＣＡＲをコードする配列を含む組換えＤＮＡ構築物を包含し、ＣＡＲは、本明細書に記載のがん関連抗原に特異的に結合する抗原結合ドメイン（例えば、抗体または抗体断片、ＴＣＲまたはＴＣＲ断片）を含み、抗原結合ドメインの配列は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と近接し、同じリーディングフレーム内にある。細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメイン、例えばゼータ鎖を含み得る。共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインの少なくとも一部を含むＣＡＲの一部を指す。本開示は、マイコバクテリア抗原に対して特異的なＣＡＲを発現する１つまたは複数のエフェクター細胞を含む組成物に関する。
【０１４４】
一態様では、例示的なＣＡＲ構築物は、任意選択のリーダー配列（例えば、本明細書に記載のリーダー配列）、細胞外抗原結合ドメイン（例えば、本明細書に記載の抗原結合ドメイン）、ヒンジ（例えば、本明細書に記載のヒンジ領域）、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書に記載の膜貫通ドメイン）、および細胞内刺激ドメイン（例えば、本明細書に記載の細胞内刺激ドメイン）を含む。一態様では、例示的なＣＡＲ構築物は、任意選択のリーダー配列（例えば、本明細書に記載のリーダー配列）、細胞外抗原結合ドメイン（例えば、本明細書に記載の抗原結合ドメイン）、ヒンジ（例えば、本明細書に記載のヒンジ領域）、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書に記載の膜貫通ドメイン）、細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載の共刺激シグナル伝達ドメイン）、および／または細胞内一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載の一次シグナル伝達ドメイン）を含む。
【０１４５】
一態様では、本発明は、ＣＡＲをコードする核酸分子を含む組換え核酸構築物を包含し、核酸分子は、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と近接し、同じリーディングフレーム内にある、本明細書に記載の抗原結合ドメインをコードする核酸配列を含む。
【０１４６】
一態様では、本発明は、ＣＡＲをコードする核酸分子を含む組換え核酸構築物を包含し、核酸分子は、抗原結合ドメインをコードする核酸配列を含み、配列は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と近接し、同じリーディングフレーム内にある。ＣＡＲで使用することができる例示的な細胞内シグナル伝達ドメインには、例えば、ＣＤ３−ゼータ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、４−ＩＢＢなどの１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインが含まれるが、これらに限定されない。場合によっては、ＣＡＲは、ＣＤ３−ゼータ、ＣＤ２８、４−ＩＢＢなどの任意の組み合わせを含むことができる。所望の分子をコードする核酸配列は、例えば、核酸分子を発現する細胞からのライブラリをスクリーニングすることによって、それを含むことが既知のベクターから核酸分子を誘導することによって、または標準的な技術を使用して、それを含む細胞および組織から直接単離することによってなど、当該技術分野で既知の組換え方法を使用して得ることができる。あるいは、目的の核酸は、クローニングされるのではなく、合成により産生され得る。
【０１４７】
本開示は、細胞に直接形質導入することができるＣＡＲを発現するレトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物を含む。
【０１４８】
本開示はまた、細胞に直接トランスフェクトすることができるＲＮＡ構築物も含む。トランスフェクションで使用するためのｍＲＮＡを生成するための方法は、３’および５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）（例えば、本明細書に記載の３’および／または５’ＵＴＲ）、５’キャップ（例えば、本明細書に記載の５’キャップ）、および／または内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）（例えば、本明細書に記載のＩＲＥＳ）、発現される核酸、およびｐｏｌｙＡテール（典型的には長さが５０〜２０００塩基）を含む構築物を産生するために、特別に設計されたプライマーを使用したテンプレートのインビトロ転写（ＩＶＴ）とそれに続くｐｏｌｙＡ付加を伴う。そのように産生されたＲＮＡは、異なる種類の細胞を効率的にトランスフェクトすることができる。いくつかの実施形態では、テンプレートは、ＣＡＲのための配列を含む。一実施形態では、ＲＮＡ  ＣＡＲベクターは、エレクトロポレーションにより、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に形質導入される。
【０１４９】
抗原結合ドメイン
いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲは、抗原結合ドメインとも呼ばれる標的特異的結合要素を含む。部分の選択は、標的細胞の表面を定義するリガンドの種類および数に依存する。例えば、抗原結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。したがって、本発明のＣＡＲにおいて抗原結合ドメインのリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例としては、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染に関連するものが挙げられる。一態様では、ＣＡＲ媒介性Ｔ細胞応答は、所望の抗原をＣＡＲに特異的に結合する抗原結合ドメインを操作することによって、目的の抗原に指向され得る。一態様では、抗原結合ドメインを含むＣＡＲの部分は、マイコバクテリア抗原、例えば、本明細書に記載のマイコバクテリア抗原を標的とする抗原結合ドメインを含む。抗原結合ドメインは、ラクダ類由来ナノボディの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および可変ドメイン（ＶＨＨ）などの単一ドメイン抗体、ならびに組換えフィブロネクチンドメイン、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、またはそれらの断片、例えば、一本鎖ＴＣＲなどなどの抗原結合ドメインとして機能することが当該技術分野で既知の代替足場を含むがこれらに限定されない、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、およびそれらの機能的断片を含むが、これらに限定されない抗原に結合する任意のドメインであり得る。場合によっては、ＣＡＲが最終的に使用されるのと同じ種に由来する抗原結合ドメインが有益である。例えば、ヒトで使用するために、ＣＡＲの抗原結合ドメインが、抗体または抗体断片の抗原結合ドメインのためのヒトまたはヒト化残基を含むことが有益であり得る。
【０１５０】
他の態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体または抗体断片を含む。いくつかの態様では、非ヒト抗体はヒト化されており、ここで、抗体の特定の配列または領域は、ヒトまたはその断片において天然に産生される抗体との類似性を高めるように修飾される。一態様では、抗原結合ドメインはヒト化されている。
【０１５１】
ヒト化抗体は、ＣＤＲ移植（例えば、欧州特許第ＥＰ２３９，４００号；国際公開第ＷＯ９１／０９９６７号、ならびに米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号、および同第５，５８５，０８９号を参照されたい、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ベニヤリングまたはリサーフェシング（例えば、欧州特許第ＥＰ５９２，１０６号および同第ＥＰ５１９，５９６号、Ｐａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２８（４／５）：４８９−４９８、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７（６）：８０５−８１４、およびＲｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＰＮＡＳ，９１：９６９−９７３を参照されたい、これらのそれぞれは参照により全体が本明細書に組み込まれる）、チェーンシャッフリング（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたい、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ならびに例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００５／００４２６６４号、米国特許出願公開第ＵＳ２００５／００４８６１７号、米国特許第６，４０７，２１３号、米国特許第５，７６６，８８６号、国際公開第ＷＯ９３１７１０５号、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９：１１１９−２５（２００２）、Ｃａｌｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，１３（５）：３５３−６０（２０００）、Ｍｏｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０（３）：２６７−７９（２０００）、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（１６）：１０６７８−８４（１９９７）、Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，９（１０）：８９５−９０４（１９９６）、Ｃｏｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５（２３  Ｓｕｐｐ）：５９７３ｓ−５９７７ｓ（１９９５）、Ｃｏｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５（８）：１７１７−２２（１９９５），Ｓａｎｄｈｕ  Ｊ  Ｓ，Ｇｅｎｅ，１５０（２）：４０９−１０（１９９４）、およびＰｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３５（３）：９５９−７３（１９９４）（これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている技法を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で既知の様々な技法を使用して産生することができる。多くの場合、フレームワーク領域のフレームワーク残基は、抗原結合を変更、例えば向上させるために、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基で置換される。これらのフレームワーク置換は、当該技術分野で周知の方法によって、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデル化、ならびに特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって同定される。（例えば、Ｑｕｅｅｎらの米国特許第５，５８５，０８９号およびＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３を参照されたい、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。）
【０１５２】
一態様では、本発明は、本明細書に記載のマイコバクテリア関連抗原の発現に関連する疾患を治療するための方法を提供する。一態様では、本発明は、治療を必要とする対象に、ＸＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を提供することにより、潜伏性または活動性マイコバクテリア感染症（すなわち、本明細書の開示されるマイコバクテリア種のいずれかの感染症）を治療する方法を提供し、Ｘは、本明細書に記載のマイコバクテリア抗原またはその機能的断片を表し、対象の感染細胞は、該Ｘ腫瘍抗原または機能的断片を発現する。
【０１５３】
一態様では、本発明は、治療を必要とする対象に、本明細書に記載のＸＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を提供することにより、潜伏性または活動性マイコバクテリア感染症を治療する方法を提供し、感染細胞はＸを発現する。いくつかの実施形態では、Ｘは、正常細胞および細菌感染細胞の両方で発現されるが、正常細胞ではより低いレベルで発現される。いくつかの実施形態では、この方法は、ＸＣＡＲがＸを発現する感染細胞に結合し、それを殺傷することを可能にするが、Ｘを発現している正常細胞の３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％未満しか殺傷しない親和性でＸに結合するＣＡＲを選択することをさらに含む。いくつかの実施形態では、選択されたＣＡＲは、標的抗原に対して１０−’’４Ｍ〜１０−’’８Ｍ、例えば、１０’’５Ｍ〜１０’’７Ｍ、例えば、１０’’６Ｍまたは１０’’７Ｍの結合親和性ＫＤを有する抗原結合ドメインを有する。いくつかの実施形態では、選択された抗原結合ドメインは、参照抗体、例えば、本明細書に記載の抗体よりも少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍、または１，０００倍低い結合親和性を有する。
【０１５４】
本開示は、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変され、ＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＮＫ細胞が療法を必要とするレシピエントに注入される、細胞療法の種類を含む。注入された細胞は、レシピエントの１つ以上のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに感染した細胞を殺傷することができる。抗体療法とは異なり、ＣＡＲ修飾された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、インビボで複製することができ、細菌感染の持続的な制御につながり得る長期持続をもたらす。様々な態様では、患者に投与された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）またはそれらの子孫は、患者へのＴ細胞またはＮＫ細胞の投与後、少なくとも４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２年、３年、４年、または５年間患者に存続する。本発明はまた、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）が、例えば、インビトロで転写されたＲＮＡによって修飾され、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を一時的に発現し、ＣＡＲ  Ｔ細胞またはＮＫ細胞が療法を必要とするレシピエントに注入される、細胞療法の種類を含む。注入された細胞は、レシピエントのｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに感染した細胞を殺傷することができる。したがって、様々な態様では、患者に投与される免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、患者へのＴ細胞またはＮＫ細胞の投与後、１ヶ月未満、例えば、３週間、２週間、１週間存在する。
【０１５５】
ＣＡＲエフェクター細胞を創出および作製する方法は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２２６０号に開示されており、参照によりその全体が組み込まれる。本開示は、ＸＣＡＲを含む１つまたは複数のエフェクター細胞を含む医薬組成物に関し、Ｘは、本明細書に記載されるマイコバクテリア抗原またはその機能的断片を表し、対象の感染細胞は、該Ｘ腫瘍抗原または機能的断片を発現する。
【０１５６】
ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化および拡大
本明細書に記載されるように、本開示の組成物（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの抗原またはその機能的断片をコードする核酸配列を含む組成物、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドを含む組成物）、および本開示の組成物を含む細胞が使用されるか、または例えば、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋細胞）、およびＮＫ細胞を含む、免疫細胞を刺激することができる。好ましい実施形態では、本開示の組成物は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、同時に２種類以上の免疫細胞、例えば、２つ以上の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、および／またはＮＫ細胞を刺激することができる。
【０１５７】
免疫細胞の刺激は、正常な細胞機能を増強するか、または異常な細胞で正常な細胞機能を開始させ得る。したがって、本開示はまた、本明細書に記載の組成物による刺激から生じる細胞集団を提供する。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、免疫細胞を刺激することは、免疫細胞の拡大を指す。いくつかの実施形態では、免疫細胞を刺激することは、免疫細胞の活性化を指す。いくつかの実施形態では、免疫細胞を刺激することは、免疫細胞の細胞傷害性の増加を指す。
【０１５９】
ある特定の実施形態では、本開示の組成物（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの抗原またはその機能的断片をコードする核酸配列を含む組成物、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドを含む組成物）、および本開示の組成物を含む細胞は、エクスビボで免疫キラー細胞を刺激するのに十分である。他の実施形態では、本明細書に記載の組成物および細胞は、インビボで免疫キラー細胞を刺激するのに十分である。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を拡大させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化および拡大させることができる。
【０１６１】
Ｔ細胞の活性化および拡大は、本明細書に記載される様々なアッセイによって測定され得る。例えば、測定され得るＴ細胞活性には、Ｔ細胞の増殖の誘導、Ｔ細胞におけるシグナル伝達の誘導、Ｔ細胞における活性化マーカーの発現の誘導、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の誘導、およびＴ細胞の細胞傷害性活性が含まれる。例えば、ある特定の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、増殖アッセイにより測定される。
【０１６２】
サイトカイン分泌
本開示の組成物または細胞によるＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、ガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａ）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、またはインターロイキン２（ＩＬ−２）などのサイトカインの分泌を決定することにより評価または測定され得る。いくつかの実施形態では、ＥＬＩＳＡを使用して、サイトカイン分泌、例えば、ガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、またはインターロイキン２（ＩＬ−２）の分泌を決定する。ＥＬＩＳＰＯＴ（酵素結合免疫スポット）技法を使用して、本明細書に記載の組成物による刺激に応答して、所与のサイトカイン（例えば、ガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ））を分泌するＴ細胞を検出することができる。Ｔ細胞は、抗ＩＦＮ−γ抗体でコーティングされたウェルにおいて、本明細書に記載の組成物または組成物を含む細胞と共に培養される。分泌されたＩＦＮ−γは、コーティングされた抗体によって捕捉され、発色基質に結合した二次抗体で明らかになる。したがって、局所的に分泌されるサイトカイン分子はスポットを形成し、各スポットは１つのＩＦＮ−γ分泌細胞に対応する。スポットの数により、分析された試料中のＩＦＮ−γ分泌細胞の頻度を決定することができる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、腫瘍壊死因子アルファ、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、およびグランザイムＢ分泌リンパ球の検出についても記載されている（Ｋｌｉｎｍａｎ  Ｄ，Ｎｕｔｍａｎ  Ｔ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．；１９９４．ｐｐ．６．１９．１−６．１９．８、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１６３】
細胞内サイトカインのフローサイトメトリー分析を使用して、培養上清中のサイトカイン含有量を測定することができるが、実際にサイトカインを分泌するＴ細胞の数に関する情報は提供しない。Ｔ細胞がモネンシンまたはブレフェルジンＡなどの分泌阻害剤で処理される場合、それらは活性化時（例えば、本発明の組成物で）にそれらの細胞質内にサイトカインを蓄積する。リンパ球の固定および透過処理の後、細胞内サイトカインはサイトメトリーによって定量化され得る。この技法により、産生されたサイトカイン、これらのサイトカインを産生する細胞型、および細胞あたり産生されたサイトカインの量を決定することができる。
【０１６４】
細胞傷害性
本明細書に記載される組成物または組成物を含む細胞によるＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性活性をアッセイすることによって評価することができる。
【０１６５】
Ｔ細胞の細胞傷害性活性は、当業者に既知の任意の好適な技法によって評価することができる。例えば、本明細書に記載される組成物または組成物を含む細胞に曝露されたＴ細胞を含む試料は、標準的な細胞傷害性アッセイにおいて、適切な期間の後に細胞傷害性活性についてアッセイされ得る。そのようなアッセイには、クロム放出ＣＴＬアッセイおよび当該技術分野で既知のＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（商標）蛍光アッセイが含まれ得るが、これらに限定されない。
【０１６６】
増殖／拡大
本明細書に記載される組成物または細胞がＴ細胞を拡大させる能力は、ＣＦＳＥ染色を使用することによって評価することができる。本明細書に記載の組成物または細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、マイコバクテリア感染症などの疾患または障害に罹患している対象からの）と混合される。細胞拡大の初期速度を比較するために、細胞をＣＦＳＥ染色に供して、本明細書に記載される組成物または組成物を含む細胞がＴ細胞の増殖をどれだけうまく誘導したかを決定する。ＣＦＳＥ染色は、はるかに定量的なエンドポイントを提供し、拡大した細胞の表現型を同時に決定することを可能にする。刺激後、毎日、細胞のアリコートを各培養物から取り出し、フローサイトメトリーで分析する。ＣＦＳＥ染色は細胞を非常に蛍光性にする。細胞分裂時に、蛍光は半分になり、したがって、細胞が分裂する回数が増えると、蛍光は弱くなる。本明細書に記載される組成物または組成物を含む細胞がＴ細胞増殖を誘導する能力は、１回、２回、３回など分裂した細胞の数を測定することによって定量化される。特定の時点で最大数の細胞分裂を誘発する、本明細書に記載される組成物または組成物を含む細胞は、最も強力な拡大剤（ｅｘｐａｎｄｅｒ）と見なされる。
【０１６７】
本明細書に記載されるこれらの組成物または細胞がＴ細胞の長期成長をどれだけうまく促進するかを決定するために、細胞成長曲線を生成することができる。これらの実験は、前述のＣＦＳＥ実験として設定されるが、ＣＦＳＥは使用されない。培養の２〜３日ごとに、Ｔ細胞をそれぞれの培養物から取り出し、存在する細胞の数および細胞の平均体積を測定するコールターカウンターを使用して計数する。平均細胞体積は、細胞をいつ再刺激するかについての最良の予測因子である。一般に、Ｔ細胞が適切に刺激されると、細胞の体積は３倍になる。この体積が初期の芽細胞の約半分超に減少した場合、対数線形拡大を維持するためにＴ細胞を再刺激する必要があり得る（Ｌｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：１９３９−１９４３、Ｌｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：５９２１−５９３０）。本明細書に記載される組成物または組成物を含む細胞が２０の集団倍加を誘導するのにかかる時間を計算する。本明細書に記載される様々な組成物または組成物を含む細胞がこのレベルのＴ細胞拡大を誘導する相対的な差は、組成物または組成物を含む細胞が評価される重要な基準である。
【０１６８】
加えて、本明細書に記載される組成物または組成物を含む細胞によって拡大された細胞の表現型は、特定のサブセットが優先的に拡大されるかどうかを決定するために特徴付けられ得る。各再刺激の前に、拡大するＴ細胞集団の表現型分析を行って、Ａｐｐａｙら（２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．８，３７９−３８５、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって提案されたＣＤ２７およびＣＤ２８の定義、ならびにＳａｌｌｕｓｔｏら（１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  ４０１：７０８−７１２、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって提案されたＣＣＲ７の定義を使用して、拡大したＴ細胞の分化状態を定義する。細胞溶解能を推定するために、パーフォリンおよびグランザイムＢの細胞内染色を使用して、肉眼的測定を行うことができる。
【０１６９】
アポトーシスマーカー
本発明のある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物または細胞を使用したＴ細胞の刺激、活性化、および拡大は、アポトーシスを再び保護するか、さもなければインビボまたはインビトロで生存を延長する、Ｔ細胞におけるある特定の重要な分子の発現を増強する。アポトーシスは通常、Ｔ細胞における特定のシグナルの誘導に起因する。したがって、本明細書に記載される組成物または組成物を含む細胞は、Ｔ細胞の刺激に起因する細胞死からのＴ細胞の保護を提供し得る。したがって、本発明には、早期死から、またはＴ細胞の生存に通常必要なＢｃｌ−ｘＬ、成長因子、サイトカイン、もしくはリンホカインなどの認識されたＴ細胞成長マーカーの欠如もしくは枯渇から、ならびにＦａｓもしくは腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の架橋からの保護による、あるいはある特定のホルモンもしくはストレスへの曝露による、増強されたＴ細胞成長も含まれる。
【０１７０】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種から抗原を発現する細胞
一態様では、本開示は、本明細書に開示の組成物（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの抗原またはその機能的断片をコードする核酸配列を含む組成物、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドを含む組成物）を含む細胞または複数の細胞を提供する。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、１つ以上の細胞を含み、該細胞は、本明細書に記載のマイコバクテリア抗原の少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、該１つ以上の細胞は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの少なくとも２つの抗原を含む。いくつかの実施形態では、該１つ以上の細胞は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの少なくとも３つの抗原を含む。いくつかの実施形態では、該１つ以上の細胞は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの少なくとも４つの抗原を含む。いくつかの実施形態では、該１つ以上の細胞は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの少なくとも５つの抗原を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、互いに異なるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの少なくとも２、３、４、または５つの抗原を含む（例えば、同じマイコバクテリア抗原の複数のコピーを使用することができるが、但し、組み合わせが少なくとも５つの異なるマイコバクテリア抗原含む／コードすることを条件とする）。
【０１７２】
一態様では、本開示は、（ｉ）配列番号１と少なくとも５０％同一であるＡｇ８５Ｂ抗原をコードする核酸配列、配列番号２と少なくとも５０％同一であるＰＰＥ６８抗原をコードする核酸配列、配列番号３と少なくとも５０％同一であるＥＳＸＡ抗原をコードする核酸配列、配列番号４と少なくとも５０％同一であるＥＳＸＢ抗原をコードする核酸配列、配列番号５と少なくとも５０％同一であるＡＤＫ抗原をコードする核酸配列、またはそれらの組み合わせ、（ｉｉ）配列番号６と少なくとも５０％同一であるＡｇ８５Ｂ抗原をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号７と少なくとも７０％同一であるＰＰＥ６８抗原をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号８と少なくとも５０％同一であるＥＳＸＡ抗原をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号９と少なくとも５０％同一であるＥＳＸＢ抗原をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１０と少なくとも５０％同一であるＡＤＫ抗原をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそれらの組み合わせ、（ｉｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の核酸配列の機能的断片をコードする（ｉ）の核酸、（ｉｖ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のアミノ酸配列の機能的断片をコードする（ｉｉ）のアミノ酸配列、のうちの１つまたは組み合わせを含む細胞または複数の細胞を特徴とする。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、細胞は、ヘルパー（ＣＤ４＋）Ｔ細胞である。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、細胞は、細胞傷害性（ＣＤ８＋）Ｔ細胞である。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、細胞は、ガンマ／デルタＴ細胞である。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、細胞は、セントラルメモリーＴ細胞である。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、細胞は、エフェクターメモリーＴ細胞である。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、ヘルパーＴ細胞は、全Ｔ細胞集団の約６０％〜約９０％、全Ｔ細胞集団の約６０％〜約８０％、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約７０％〜約９０％、約８０％〜約９０％を構成する。さらなる実施形態では、ヘルパーＴ細胞は、全Ｔ細胞集団の約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、または約９０％を構成し得る。ヘルパーＴ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞として同定され得る。同定は、例えば、フローサイトメトリーによって実施することができる。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、細胞傷害性Ｔ細胞は、全Ｔ細胞集団の約０％〜約４０％、全Ｔ細胞集団の約０％〜約３０％、約０％〜約２０％、約０％〜約１０％、約１０％〜約２０％、約１０％〜約３０％、約１０％〜約４０％、約２０％〜約４０％、約３０％〜約４０％を構成する。さらなる実施形態では、細胞傷害性Ｔ細胞は、全Ｔ細胞集団の約０％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、または約４０％を構成し得る。細胞傷害性Ｔ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞として同定され得る。同定は、例えば、フローサイトメトリーによって実施することができる。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、ガンマ／デルタＴ細胞は、全Ｔ細胞集団の約０．５％〜約１０％、全Ｔ細胞集団の約０．５％〜約５％、約０．５％〜約１％、約１％〜約５％、約１．５％〜約５％、約２％〜約５％、約３％〜約５％、約４％〜約５％を構成する。さらなる実施形態では、ガンマ／デルタＴ細胞は、全Ｔ細胞集団の約０．５％、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％を構成し得る。ガンマ／デルタＴ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−ＴＣＲｇｄ＋細胞として同定され得る。同定は、例えば、フローサイトメトリーによって実施することができる。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、セントラルメモリーＴ細胞は、全Ｔ細胞集団の約０．５％〜約１５％、全Ｔ細胞集団の約０．５％〜約１０％、約０．５％〜約５％、約０．５％〜約１％、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％、約１％〜約５％、約５％〜約１５％、約５％〜約１０％、約１０％〜約１５％を構成する。さらなる実施形態では、セントラルメモリーＴ細胞は、全Ｔ細胞集団の約０．５％、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、または約１５％を構成し得る。セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋細胞として同定され得る。同定は、例えば、フローサイトメトリーによって実施することができる。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、エフェクターメモリーＴ細胞は、全Ｔ細胞集団の約２０％〜約６０％、全Ｔ細胞集団の約２０％〜約５０％、約２０％〜約４０％、約２０％〜約３０％、約３０％〜約６０％、約３０％〜約５０％、約３０％〜約４０％、約４０％〜約６０％、約４０％〜約５０％、約５０％〜約６０％を構成する。さらなる実施形態では、エフェクターメモリーＴ細胞は、全Ｔ細胞集団の約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、または約６０％を構成し得る。エフェクターメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−細胞として同定され得る。同定は、例えば、フローサイトメトリーによって実施することができる。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、複数の細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数よりも多い。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数より１倍多い。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数より２倍多い。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数より３倍多い。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数より４倍多い。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数より５倍多い。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数よりも６倍多い。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数より７倍多い。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数よりも８倍多い。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数よりも９倍多い。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数よりも１０倍多い。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト対象からのものである。さらなる実施形態では、ヒト対象は、免疫不全である。別の実施形態では、ヒト対象は、マイコバクテリア感染症を有すると診断されているか、またはそれを有する疑いがある。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、細胞または複数の細胞は、細胞培養において拡大される。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、少なくとも１つの初代Ｔ細胞を含む。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、細胞または複数の細胞は、抗原提示細胞、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、精製されたＴ細胞集団、およびＴ細胞株、Ｂ細胞、単球、樹状細胞、フィトヘマグルチニン芽細胞、またはＫ５６２もしくは他の細胞株などの不死化細胞に基づく人工抗原提示細胞である。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。さらなる実施形態では、ＡＰＣは、人工抗原提示細胞である。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、細胞は、マクロファージである。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、細胞は、樹状細胞である。
【０１９０】
ある特定の実施形態では、細胞は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＡｇ８５Ｂ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＰＰＥ６８抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＥＳＸＡ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＥＳＸＢ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＡＤＫ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、またはそれらの組み合わせを発現することができる。いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）配列番号１と少なくとも５０％同一であるＡｇ８５Ｂ抗原をコードする核酸配列、配列番号２と少なくとも５０％同一であるＰＰＥ６８抗原をコードする核酸配列、配列番号３と少なくとも５０％同一であるＥＳＸＡ抗原をコードする核酸配列、配列番号４と少なくとも５０％同一であるＥＳＸＢ抗原をコードする核酸配列、配列番号５と少なくとも５０％同一であるＡＤＫ抗原をコードする核酸配列、および／もしくはそれらの組み合わせ、
（ｉｉ）配列番号６と少なくとも５０％同一であるＡｇ８５Ｂ抗原をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号７と少なくとも５０％同一であるＰＰＥ６８抗原をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号８と少なくとも５０％同一であるＥＳＸＡ抗原をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号９と少なくとも５０％同一であるＥＳＸＢ抗原をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１０と少なくとも５０％同一であるＡＤＫ抗原をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド、および／もしくはそれらの組み合わせ、
（ｉｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、もしくは配列番号５の核酸配列の機能的断片をコードする（ｉ）の核酸、ならびに／または
（ｉｖ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、もしくは配列番号１０のアミノ酸配列の機能的断片をコードする（ｉｉ）のアミノ酸配列のうちの１つ、またはそれらの組み合わせを含む、細胞または複数の細胞に関する。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）配列番号１７〜５９と少なくとも５０％同一であるＡｇ８５Ｂ抗原をコードする核酸配列、配列番号１７〜５９と少なくとも５０％同一であるＰＰＥ６８抗原をコードする核酸配列、配列番号１７〜５９と少なくとも５０％同一であるＥＳＸＡ抗原をコードする核酸配列、配列番号１７〜５９と少なくとも５０％同一であるＥＳＸＢ抗原をコードする核酸配列、配列番号１７〜５９と少なくとも５０％同一であるＡＤＫ抗原をコードする核酸配列、および／もしくはそれらの組み合わせのうちの１つ、またはそれらの組み合わせを含む、細胞または複数の細胞に関する。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）配列番号１７〜５９と少なくとも５０％同一であるＡｇ８５Ｂ抗原をコードする核酸配列、配列番号１７〜５９と少なくとも５０％同一であるＰＰＥ６８抗原をコードする核酸配列、配列番号１７〜５９と少なくとも５０％同一であるＥＳＸＡ抗原をコードする核酸配列、配列番号１７〜５９と少なくとも５０％同一であるＥＳＸＢ抗原をコードする核酸配列、配列番号１７〜５９と少なくとも５０％同一であるＡＤＫ抗原をコードする核酸配列、および／もしくはそれらの組み合わせ、ならびに／または（ｉｉ）配列番号１と少なくとも５０％同一であるＡｇ８５Ｂ抗原をコードする核酸配列、配列番号２と少なくとも５０％同一であるＰＰＥ６８抗原をコードする核酸配列、配列番号３と少なくとも５０％同一であるＥＳＸＡ抗原をコードする核酸配列、配列番号４と少なくとも５０％同一であるＥＳＸＢ抗原をコードする核酸配列、配列番号５と少なくとも５０％同一であるＡＤＫ抗原をコードする核酸配列、および／もしくはそれらの組み合わせ、ならびに／または
（ｉｉｉ）配列番号６と少なくとも５０％同一であるＡｇ８５Ｂ抗原をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号７と少なくとも５０％同一であるＰＰＥ６８抗原をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号８と少なくとも５０％同一であるＥＳＸＡ抗原をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号９と少なくとも５０％同一であるＥＳＸＢ抗原をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１０と少なくとも５０％同一であるＡＤＫ抗原をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド、および／もしくはそれらの組み合わせ、ならびに／または
（ｉｖ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、もしくは配列番号５の核酸配列の機能的断片をコードする（ｉｉ）の核酸、ならびに／または
（ｖ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、もしくは配列番号１０のアミノ酸配列の機能的断片をコードする（ｉｉｉ）のアミノ酸配列のうちの１つ、またはそれらの組み合わせに曝露された、またはそれにより刺激された、単離された細胞または複数の細胞に関する。
【０１９３】
Ｔ細胞を拡大するように設計された細胞
一態様では、本開示は、エクスビボでＴ細胞を拡大するように操作された細胞を提供し、細胞は、Ａｇ８５Ｂ、ＰＰＥ６８、ＥＳＸＡ、ＥＳＸＢ、およびＡＤＫから選択される少なくとも２つの抗原を含み、細胞は、それぞれが少なくとも２つの抗原のうちの１つ以上をコードする１つ以上の核酸を細胞に導入することと、抗原のうちの１つ以上の産生に好適な条件下で細胞を培養することと、を含むプロセスによって産生される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の宿主細胞は、細胞の免疫応答またはクローン拡大を誘発または刺激するために導入されたそれらのポリペプチドまたは核酸配列を除いて、いずれの外因性ＤＮＡおよび／またはＲＮＡおよび／またはポリペプチドを含まない。
【０１９４】
一態様では、本開示は、エクスビボでＴ細胞を拡大するように操作された細胞を提供し、細胞は、Ａｇ８５Ｂ、ＰＰＥ６８、ＥＳＸＡ、ＥＳＸＢ、およびＡＤＫから選択される少なくとも３つの抗原を含み、細胞は、それぞれが少なくとも３つの抗原のうちの１つ以上をコードする１つ以上の核酸を細胞に導入することと、抗原のうちの１つ以上の産生に好適な条件下で細胞を培養することと、を含むプロセスによって産生される。
【０１９５】
一態様では、本開示は、エクスビボでＴ細胞を拡大するように操作された細胞を提供し、細胞は、Ａｇ８５Ｂ、ＰＰＥ６８、ＥＳＸＡ、ＥＳＸＢ、およびＡＤＫから選択される少なくとも４つの抗原を含み、細胞は、それぞれが少なくとも４つの抗原のうちの１つ以上をコードする１つ以上の核酸を細胞に導入することと、抗原のうちの１つ以上の産生に好適な条件下で細胞を培養することと、を含むプロセスによって産生される。
【０１９６】
一態様では、本開示は、エクスビボでＴ細胞を拡大するように操作された細胞を提供し、細胞は、Ａｇ８５Ｂ、ＰＰＥ６８、ＥＳＸＡ、ＥＳＸＢ、およびＡＤＫから選択される少なくとも５つの抗原を含み、細胞は、それぞれが少なくとも５つの抗原のうちの１つ以上をコードする１つ以上の核酸を細胞に導入することと、抗原のうちの１つ以上の産生に好適な条件下で細胞を培養することと、を含むプロセスによって産生される。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、細胞は、抗原提示細胞、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、精製されたＴ細胞集団、およびＴ細胞株、Ｂ細胞、単球、樹状細胞、フィトヘマグルチニン芽細胞、またはＫ５６２もしくは他の細胞株などの不死化細胞に基づく人工抗原提示細胞である。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、核酸核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、導入ステップは、ウイルス形質導入を含む。別の実施形態では、導入ステップは、エレクトロポレーションを含む。
【０１９９】
Ｔ細胞の供給源
特定の実施形態では、拡大の前に、Ｔ細胞の供給源が対象から得られる。対象の非限定的な例としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が挙げられる。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、脾臓組織、臍帯、および腫瘍を含む、いくつかの供給源から得ることができる。ある特定の実施形態では、当該技術分野で利用可能な任意の数のＴ細胞株を使用することができる。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、フィコール分離などの当業者に既知の任意の数の技法を使用して、対象から収集された単位血液から得ることができる。いくつかの実施形態では、個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物には通常、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含むリンパ球が含まれている。アフェレーシスによって収集された細胞を、後続の処理ステップのために洗浄して、血漿画分を除去し、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、またはカルシウムを含まず、かつマグネシウムを含まなくてもよいか、もしくは二価のカチオンのすべてではないがその多くを含まなくてもよい洗浄溶液などの適切な緩衝液または培地に入れてもよい。洗浄後、細胞は、例えば、Ｃａを含まない、Ｍｇを含まないＰＢＳなどの様々な生体適合性緩衝液に再懸濁され得る。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない構成成分を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁することができる。
【０２００】
別の実施形態では、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離によって単球を枯渇させることによって、末梢血から単離される。あるいは、Ｔ細胞は、臍帯から分離することができる。いずれにしても、Ｔ細胞の特定の亜集団は、正または負の選択技法によってさらに単離することができる。
【０２０１】
そのように単離された臍帯血単核細胞は、ＣＤ３４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１９、およびＣＤ５６を含むがこれらに限定されない、ある特定の抗原を発現する細胞を枯渇させることができる。これらの細胞の枯渇は、単離された抗体、腹水などの抗体、物理的支持体に結合した抗体、および細胞結合抗体を含む生物学的試料を使用して達成することができる。
【０２０２】
負の選択によるＴ細胞集団の濃縮は、負に選択された細胞に固有の表面マーカーに指向された抗体の組み合わせを使用して達成され得る。好ましい方法は、負に選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに指向されたモノクローナル抗体のカクテルを使用する、負の磁気免疫付着またはフローサイトメトリーによる細胞選別および／または選択である。例えば、負の選択によりＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルには典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体が含まれている。
【０２０３】
正または負の選択により所望の細胞集団を単離するために、細胞および表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度を変えることができる。ある特定の実施形態では、細胞およびビーズの最大接触を確実にするために、ビーズおよび細胞が一緒に混合される体積を著しく減少させる（すなわち、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましい場合がある。例えば、いくつかの実施形態では、２０億の細胞／ｍｌの濃度が使用される。いくつかの実施形態では、１０億の細胞／ｍｌの濃度が使用される。さらなる実施形態では、１億超の細胞／ｍｌが使用される。さらなる実施形態では、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、または５０００万の細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。さらに別の実施形態では、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００万、または１億の細胞／ｍｌからの細胞濃度が使用される。さらなる実施形態では、１億２５００万または１億５０００万の細胞／ｍｌの濃度が使用され得る。高濃度を使用することにより、細胞収量、細胞活性化、および細胞拡大が増加し得る。
【０２０４】
Ｔ細胞は、洗浄ステップの後に凍結することもでき、これは単球除去ステップを必要としない。理論に拘束されることを望むものではないが、凍結および後続の解凍ステップは、細胞集団における顆粒球およびある程度の単球を除去することにより、より均一な産物を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄ステップの後、細胞を凍結溶液に懸濁することができる。多くの凍結溶液およびパラメータが当該技術分野で既知であり、この文脈で有用であるが、非限定的な例では、１つの方法は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミンを含むＰＢＳ、または他の好適な細胞凍結培地を使用することを伴う。次に、細胞を、毎分１°の速度で−８０℃に凍結し、液体窒素貯蔵タンクの気相に保存する。他の制御された凍結方法、ならびに−２０℃でのまたは液体窒素中での非制御即時凍結を使用することができる。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、細胞集団は、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、Ｔ細胞の精製された集団、およびＴ細胞株を含み得る。別の実施形態では、エレクトロポレーションされる細胞集団は、末梢血単核細胞を含む。さらに別の実施形態では、エレクトロポレーションされる細胞集団は、精製されたＴ細胞を含む。
【０２０６】
Ｔ細胞の拡大
いくつかの実施形態では、本開示は、それぞれが少なくとも２、３、４、または５つの抗原のうちの１つ以上をコードする、１つ以上の核酸を含むＴ細胞を含む組成物に関する。本発明はまた、それぞれが少なくとも２、３、４、または５つの抗原のうちの１つ以上をコードする１つ以上の核酸を含む拡大されたＴ細胞集団も含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の核酸は、細胞集団の少なくとも１つに導入され、細胞の表面上で発現される。本発明はまた、それぞれが配列番号１７〜配列番号５９の組み合わせのいずれか１つから選択される少なくとも１、２、３、４、または５つの抗原のうちの１つ以上をコードする、１つ以上の核酸を含む拡大されたＴ細胞集団も含む。実施形態の任意のセットでは、本明細書に開示される方法または組成物は、単離されたＴ細胞を、個別に、配列番号１７〜配列番号５９の２つ以上の組み合わせのいずれかいずれか１つに曝露するか、またはそれを刺激することを含む。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、拡大されるＴ細胞の供給源は、末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）である。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＡｇ８５Ｂ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＰＰＥ６８抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＥＳＸＡ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＥＳＸＢ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＡＤＫ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、またはそれらの組み合わせと接触させることにより拡大される。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、抗原提示細胞と接触させることにより拡大され、抗原提示細胞は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＡｇ８５Ｂ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＰＰＥ６８抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＥＳＸＡ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＥＳＸＢ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのＡＤＫ抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチド、またはそれらの組み合わせを発現することによって提示される。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、本開示は、集団を培養することを含む、Ｔ細胞集団（例えば、１つまたは複数の単離されたＴ細胞）を拡大する方法を含み、集団に含まれるＴ細胞は、少なくとも約１０倍拡大する。いくつかの実施形態では、集団に含まれるＴ細胞は、少なくとも約５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、２０００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍、６０００倍、７０００倍、８０００倍、９０００倍、１０，０００倍、１００，０００倍、１，０００，０００倍、１０，０００，０００倍以上拡大する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、約５倍〜約１００倍の範囲で拡大する。
【０２１１】
培養後、Ｔ細胞を、培養装置内の細胞培地で、細胞がコンフルエントに、または最適な継代のための高細胞密度に到達するのに十分な時間、または到達するまでインキュベートした後、細胞を別の培養装置に移すことができる。培養装置は、インビトロで細胞を培養するために一般的に使用される任意の培養装置であり得る。ある期間は、インビトロでの細胞の培養に好適な任意の時間であり得る。Ｔ細胞培地は、Ｔ細胞の培養中にいつでも交換することができる。好ましくは、Ｔ細胞培地は、約２〜３日ごとに交換される。次に、Ｔ細胞を培養装置から採取し、Ｔ細胞を直ちに使用するか、凍結保存して後で使用するために保存することができる。いくつかの実施形態では、この方法は、培養したＴ細胞を凍結保存することをさらに含む。
【０２１２】
米国特許第５，１９９，９４２号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法を使用して、細胞をさらに拡大させることができる。米国特許第５，１９９，９４２号などに記載される拡大は、本明細書に記載の他の拡大方法に追加することができる。簡潔に、Ｔ細胞のエクスビボ培養および拡大は、米国特許第５，１９９，９４２号に記載されているものなどの細胞成長因子、またはｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３などの他の因子、およびｃ−ｋｉｔリガンド、例えば、Ｒａｐｉｄ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（ＲＥＰ）について、Ｄｕｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２６（４）：３３２−３４２，２００３に記載されているものへの追加を含む。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、エクスビボでＴ細胞を拡大させるための方法は、本明細書に開示されるマイコバクテリア抗原または機能的断片をコードする核酸および／またはそれをコードするアミノ酸への接触の前後または接触と同時に、１つ以上のサイトカインで１つまたは複数のＴ細胞を刺激することを含む。例示的なサイトカインには、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＦＮα、ＩＬ−１５、およびＴＧＦβが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、サイトカインのそれぞれは、コードされた前述のポリペプチドのヒト変異型またはヒト配列である。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−４は、配列番号１１として以下に示されるＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＨ７０１２３．１に対応する。
配列番号１１
１  ｍｇｌｔｓｑｌｌｐｐ  ｌｆｆｌｌａｃａｇｎ  ｆｖｈｇｈｋｃｄｉｔ  ｌｑｅｉｉｋｔｌｎｓ  ｌｔｅｑｋｔｌｃｔｅ  ｌｔｖｔｄｉｆａａｓ
６１  ｋｎｔｔｅｋｅｔｆｃ  ｒａａｔｖｌｒｑｆｙ  ｓｈｈｅｋｄｔｒｃｌ  ｇａｔａｑｑｆｈｒｈ  ｋｑｌｉｒｆｌｋｒｌ  ｄｒｎｌｗｇｌａｇｌ
１２１  ｎｓｃｐｖｋｅａｎｑ  ｓｔｌｅｎｆｌｅｒｌ  ｋｔｉｍｒｅｋｙｓｋ  ｃｓｓ
【０２１５】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−７は、配列番号１２として以下に示されるＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＨ４７６９８．１に対応する。
配列番号１２
１  ｍｆｈｖｓｆｒｙｉｆ  ｇｌｐｐｌｉｌｖｌｌ  ｐｖａｓｓｄｃｄｉｅ  ｇｋｄｇｋｑｙｅｓｖ  ｌｍｖｓｉｄｑｌｌｄ  ｓｍｋｅｉｇｓｎｃｌ
６１  ｎｎｅｆｎｆｆｋｒｈ  ｉｃｄａｎｋｅｇｍｆ  ｌｆｒａａｒｋｌｒｑ  ｆｌｋｍｎｓｔｇｄｆ  ｄｌｈｌｌｋｖｓｅｇ  ｔｔｉｌｌｎｃｔｇｑ
１２１  ｖｋｇｒｋｐａａｌｇ  ｅａｑｐｔｋｓｌｅｅ  ｎｋｓｌｋｅｑｋｋｌ  ｎｄｌｃｆｌｋｒｌｌ  ｑｅｉｋｔｃｗｎｋｉ  ｌｍｇｔｋｅｈ
【０２１６】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２１は、配列番号１３として以下に示されるＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＢＡ２２６４３．１に対応する。
配列番号１３
１  ｍｒｓｓｐｇｎｍｅｒ  ｉｖｉｃｌｍｖｉｆｌ  ｇｔｌｖｈｋｓｓｓｑ  ｇｑｄｒｈｍｉｒｍｒ  ｑｌｉｄｉｖｄｑｌｋ  ｎｙｖｎｄｌｖｐｅｆ
６１  ｌｐａｐｅｄｖｅｔｎ  ｃｅｗｓａｆｓｃｆｑ  ｋａｑｌｋｓａｎｔｇ  ｎｎｅｒｉｉｎｖｓｉ  ｋｋｌｋｒｋｐｐｓｔ  ｎａｇｒｒｑｋｈｒｌ
１２１  ｔｃｐｓｃｄｓｙｅｋ  ｋｐｐｋｅｆｌｅｒｆ  ｋｓｌｌｑｋｍｉｈｑ  ｈｌｓｓｒｔｈｇｓｅ  ｄｓ
【０２１７】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５は、配列番号１４として以下に示されるＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＩ００９６４．１に対応する。
配列番号１４
１  ｍｒｉｓｋｐｈｌｒｓ  ｉｓｉｑｃｙｌｃｌｌ  ｌｎｓｈｆｌｔｅａｇ  ｉｈｖｆｉｌｇｃｆｓ  ａｇｌｐｋｔｅａｎｗ  ｖｎｖｉｓｄｌｋｋｉ
６１  ｅｄｌｉｑｓｍｈｉｄ  ａｔｌｙｔｅｓｄｖｈ  ｐｓｃｋｖｔａｍｋｃ  ｆｌｌｅｌｑｖｉｓｌ  ｅｓｇｄａｓｉｈｄｔ  ｖｅｎｌｉｉｌａｎｎ
１２１  ｓｌｓｓｎｇｎｖｔｅ  ｓｇｃｋｅｃｅｅｌｅ  ｅｋｎｉｋｅｆｌｑｓ  ｆｖｈｉｖｑｍｆｉｎ  ｔｓ
【０２１８】
いくつかの実施形態では、ＩＦＮαは、配列番号１５として以下に示されるＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ５２７２４．１に対応する。
配列番号１５
１  ｍａｌｌｆｐｌｌａａ  ｌｖｍｔｓｙｓｐｖｇ  ｓｌｇｃｄｌｐｑｎｈ  ｇｌｌｓｒｎｔｌｖｌ  ｌｈｑｍｒｒｉｓｐｆ  ｌｃｌｋｄｒｒｄｆｒ
６１  ｆｐｑｅｍｖｋｇｓｑ  ｌｑｋａｈｖｍｓｖｌ  ｈｅｍｌｑｑｉｆｓｌ  ｆｈｔｅｒｓｓａａｗ  ｎｍｔｌｌｄｑｌｈｔ  ｅｌｈｑｑｌｑｈｌｅ
１２１  ｔｃｌｌｑｖｖｇｅｇ  ｅｓａｇａｉｓｓｐａ  ｌｔｌｒｒｙｆｑｇｉ  ｒｖｙｌｋｅｋｋｙｓ  ｄｃａｗｅｖｖｒｍｅ  ｉｍｋｓｌｆｌｓｔｎ
１８１  ｍｑｅｒｌｒｓｋｄｒ  ｄｌｇｓｓ
【０２１９】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβは、配列番号１６として以下に示されるＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ３６７３８．１に対応する。
配列番号１６
１  ｍｈｖｒｓｌｒａａａ  ｐｈｓｆｖａｌｗａｐ  ｌｆｌｌｒｓａｌａｄ  ｆｓｌｄｎｅｖｈｓｓ  ｆｉｈｒｒｌｒｓｑｅ  ｒｒｅｍｑｒｅｉｌｓ
６１  ｉｌｇｌｐｈｒｐｒｐ  ｈｌｑｇｋｈｎｓａｐ  ｍｆｍｌｄｌｙｎａｍ  ａｖｅｅｇｇｇｐｇｇ  ｑｇｆｓｙｐｙｋａｖ  ｆｓｔｑｇｐｐｌａｓ
１２１  ｌｑｄｓｈｆｌｔｄａ  ｄｍｖｍｓｆｖｎｌｖ  ｅｈｄｋｅｆｆｈｐｒ  ｙｈｈｒｅｆｒｆｄｌ  ｓｋｉｐｅｇｅａｖｔ  ａａｅｆｒｉｙｋｄｙ
１８１  ｉｒｅｒｆｄｎｅｔｆ  ｒｉｓｖｙｑｖｌｑｅ  ｈｌｇｒｅｓｄｌｆｌ  ｌｄｓｒｔｌｗａｓｅ  ｅｇｗｌｖｆｄｉｔａ  ｔｓｎｈｗｖｖｎｐｒ
２４１  ｈｎｌｇｌｑｌｓｖｅ  ｔｌｄｇｑｓｉｎｐｋ  ｌａｇｌｉｇｒｈｇｐ  ｑｎｋｑｐｆｍｖａｆ  ｆｋａｔｅｖｈｆｒｓ  ｉｒｓｔｇｓｋｑｒｓ
３０１  ｑｎｒｓｋｔｐｋｎｑ  ｅａｌｒｍａｎｖａｅ  ｎｓｓｓｄｑｒｑａｃ  ｋｋｈｅｌｙｖｓｆｒ  ｄｌｇｗｑｄｗｉｉａ  ｐｅｇｙａａｙｙｃｅ
３６１  ｇｅｃａｆｐｌｎｓｙ  ｍｎａｔｎｈａｉｖｑ  ｔｌｖｈｆｉｎｐｅｔ  ｖｐｋｐｃｃａｐｔｑ  ｌｎａｉｓｖｌｙｆｄ  ｄｓｓｎｖｉｌｋｋｙ
４２１  ｒｎｍｖｖｒａｃｇｃ  ｈ
【０２２０】
一態様では、Ｔ細胞を拡大する方法は、培養ステップをさらに含み得る。培養ステップは非常に短くてもよく、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３時間などの２４時間未満である。培養ステップは長くてもよく、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日以上である。
【０２２１】
培養中の細胞を説明するために様々な用語が使用される。細胞培養は、一般に、生体から採取され、１つまたは複数の細胞の生存率を維持し、対象の外部で細胞の数を増殖または成長させるために、目的の細胞の培養を確立するのに十分な制御された条件（複数可）下で成長させる細胞を指す。初代細胞培養物は、生物から直接採取された細胞、組織、または臓器の培養物であり、かつ最初の継代培養の前の培養物である。細胞は、細胞の成長および／または分裂を容易にする条件下で成長培地に置かれると、培養で拡大し、より大きな細胞集団をもたらす。細胞が培養で拡大する場合、細胞増殖の速度は、典型的には、細胞の数が２倍になるのに必要な時間両、別名倍加時間によって測定される。
【０２２２】
継代培養の各回は、継代と呼ばれる。細胞が継代培養される場合、それらは継代されたと呼ばれる。細胞の特定の集団または細胞株は、継代された回数によって参照または特徴付けられる。例えば、１０回継代された培養細胞集団は、Ｐ１０培養物と呼ばれる場合がある。初代培養、すなわち組織から細胞を単離した後の最初の培養物は、Ｐ０と示される。最初の継代培養後、細胞は二次培養物（Ｐ１または継代１）と記載される。２回目の継代培養後、細胞は三次培養物（Ｐ２または継代２）などになる。当業者は、継代の期間中に多くの集団倍加があり得、したがって、培養物の集団倍加の数は継代数よりも多くなることを理解するであろう。継代間の期間中の細胞の拡大（すなわち、集団倍加の数）は、播種密度、基質、培地、および継代間の時間を含むがこれらに限定されない多くの要因に依存する。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、細胞は、数時間（約３時間）〜約１４日間、またはその間の任意の時間単位の整数値で培養され得る。Ｔ細胞培養に適切な条件には、血清（例えば、ウシ胎仔またはヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβ、およびＴＮＦ−αを含む増殖および生存に必要な因子、または当業者に既知の細胞の成長のための他の添加物を含み得る適切な培地（例えば、最小必須培地もしくはＲＰＭＩ培地１６４０、またはＸ−ｖｉｖｏ１５（Ｌｏｎｚａ））が含まれる。細胞の成長のための他の添加物には、界面活性剤、ｐｌａｓｍａｎａｔｅ、ならびにＮ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノールなどの還元剤が含まれるが、これらに限定されない。培地には、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５、およびＸ−Ｖｉｖｏ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが含まれ、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンが添加されており、無血清または適切な量の血清（または血漿）もしくは定義されたホルモンのセット、および／またはＴ細胞の成長および拡大に十分な量のサイトカイン（複数可）で補充されているかのいずれかである。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験培養にのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養には含まれない。いくつかの実施形態では、標的細胞は、成長を支持するために必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気＋５％ＣＯ２）下で維持される。
【０２２４】
Ｔ細胞を培養するために使用される培地は、Ｔ細胞を共刺激することができる薬剤を含み得る。例えば、ＣＤ３を刺激することができる薬剤はＣＤ３に対する抗体であり、ＣＤ２８を刺激することができる薬剤はＣＤ２８に対する抗体である。
【０２２５】
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞の特定の集団が単離される。例えば、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞集団は、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ガンマ／デルタＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、および／またはエフェクターメモリーＴ細胞から選択される。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、ヘルパーＴ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞として同定され得る。同定は、例えば、フローサイトメトリーによって実施することができる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性Ｔ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞として同定され得る。同定は、例えば、フローサイトメトリーによって実施することができる。いくつかの実施形態では、ガンマ／デルタＴ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−ＴＣＲｇｄ＋細胞として同定され得る。同定は、例えば、フローサイトメトリーによって実施することができる。いくつかの実施形態では、セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋細胞として同定され得る。同定は、例えば、フローサイトメトリーによって実施することができる。いくつかの実施形態では、エフェクターメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−細胞として同定され得る。同定は、例えば、フローサイトメトリーによって実施することができる。本開示は、対象におけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染症を治療または予防するために必要な薬学的に有効な量で、本明細書に開示される任意の１つまたは複数の細胞を含む医薬組成物を含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、薬学的に有効な量
【０２２７】
治療
本開示の組成物（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの抗原またはその機能的断片をコードする核酸配列を含む組成物、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドを含む組成物）、または本明細書に記載の医薬組成物は、様々な療法に使用することができる。
【０２２８】
ある特定の実施形態では、本開示の組成物（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの抗原またはその機能的断片をコードする核酸配列を含む組成物、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドを含む組成物）、または本明細書に記載の医薬組成物は、治療を必要とする対象において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染症またはそれによって引き起こされるかもしくはそれに関連する任意の疾患および病的状態を治療する際に使用される。ある特定の実施形態では、本開示の組成物（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの抗原またはその機能的断片をコードする核酸配列を含む組成物、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドを含む組成物）、または本明細書に記載の医薬組成物は、予防を必要とする対象において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染症またはそれによって引き起こされるかもしくはそれに関連する任意の疾患および病的状態を予防する際に使用される。そのような使用は、マイコバクテリア抗原／エピトープに対する防御免疫応答を誘導または刺激することを目的とする。本開示は、本明細書に開示される１つまたは複数の組成物によって刺激される１つまたは複数の宿主細胞を対象に投与することを含む、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染症を治療および／または予防する方法に関する。本開示は、本明細書に開示される１つまたは複数の組成物によって刺激される細胞の治療有効量で対象に投与することを含む、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染症を治療および／または予防する方法に関する。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染症は、活動性感染症である。活動性感染症は、深刻な疾患症状が現れるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染症を指す。例えば、ヒト対象では、ＴＢは、一般的な臨床徴候（体重減少、無力症、発熱、寝汗など）、臨床徴候および／もしくは症状（肺ＴＢの場合、咳、喀血、胸郭痛など）、ならびに／または場合によっては、感染部位に応じた肺外徴候（リンパ節、骨形態、髄膜炎、泌尿生殖器形態など）を特徴とする。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、対象は、免疫不全の宿主である。本開示の実施形態では、免疫不全の宿主は、適応免疫または自然免疫における先天性または後天性のいずれかの異常を有する対象（原発性免疫不全障害、化学療法もしくは免疫抑制療法を受けている患者、または造血幹細胞移植を受けている患者を含むがこれらに限定されない）を指す。さらなる実施形態では、免疫不全の宿主は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種に感染している、または感染している疑いがあると診断されている。
【０２３１】
別の実施形態では、治療される対象は、新生児、乳児、若年成人、または成人であり得る。対象は、本明細書に記載の組成物または細胞で治療される前に、以前にＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染症の治療を受けていてもよい。対象は、別の病原性生物（例えば、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ）に同時感染していてもいなくてもよい。いくつかの実施形態では、治療方法は、対象内の全体的な感染を、対象内のマイコバクテリアＤＮＡの検出可能なレベルの約１０％減少させ得る。いくつかの実施形態では、治療は、対象内の全体的な感染を無症状レベルに低減する。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、本方法（複数可）は、活動性疾患を発症した、感染した個体と密接に接触し、したがってＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染症を発症するリスクがある対象における感染（例えば、ＴＢを有する個体が咳をして吐き出した湿った飛沫のｂａｃｉｌｌｉを吸入することによる感染）を予防または遅延させるために使用される。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、感染を予防または遅延させる方法は、潜伏感染した対象において実施される。潜伏感染した対象とは、病原性のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ｍｔｂ）にすでに感染しているが、明らかな疾患症状または臨床徴候を示さない個体を意味する。典型的には、潜伏感染した対象は、体内にＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを保持し、臨床的に病気ではないが、特に免疫抑制の文脈において、臨床疾患へのその後の進行（再活性化）のリスク（例えば、ＨＩＶなどの別の病原体との、またはＴＮＦａ阻害剤などの免疫抑制治療下での共感染）を保持する。Ｍｔｂ潜伏感染した対象は、Ｍｔｂ感染の診断を可能にする任意の検査（例えば、ツベルクリン検査、ＰＰＤ反応性のマントー検査、および／またはＩＦＮｇ放出アッセイ）によって検査された場合、陽性であると予想される。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、本開示は、刺激を必要とする対象においてＴ細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法を特徴とし、この方法は、治療有効量の本開示の組成物（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの抗原またはその機能的断片をコードする核酸配列を含む組成物、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの抗原をコードするアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドを含む組成物）、または本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、本開示は、養子細胞移入療法のための方法を含む。本方法は、マイコバクテリア感染を予防または治療するために、Ｔ細胞を含む拡大された細胞集団を、それを必要とする対象に投与することを含む。この実施形態では、拡大された細胞集団は、本明細書に記載されるように拡大される。本明細書に記載されるように生成された拡大されたＴ細胞は、均一であり、Ｔ細胞機能を有する。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、誘導または刺激された免疫応答は特異的である（すなわち、マイコバクテリアエピトープ／抗原に指向される）。本開示の文脈において、免疫応答は、好ましくは、マイコバクテリア抗原／エピトープに指向された、ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋媒介性Ｔ細胞応答、またはその両方である。
【０２３７】
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞応答は、特定のＴ細胞集団の組み合わせ（１つ以上）の活性化を特徴付とする。例えば、Ｔ細胞応答は、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ガンマ／デルタＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、および／またはエフェクターメモリーＴ細胞の活性化を特徴とし得、各特定のＴ細胞は、全Ｔ細胞集団のパーセントを構成する。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、ヘルパーＴ細胞は、全Ｔ細胞集団の約６０％〜約９０％、全Ｔ細胞集団の約６０％〜約８０％、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約７０％〜約９０％、約８０％〜約９０％を構成する。さらなる実施形態では、ヘルパーＴ細胞は、全Ｔ細胞集団の約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、または約９０％を構成し得る。ヘルパーＴ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞として同定され得る。同定は、例えば、フローサイトメトリーによって実施することができる。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、細胞傷害性Ｔ細胞は、全Ｔ細胞集団の約０％〜約４０％、全Ｔ細胞集団の約０％〜約３０％、約０％〜約２０％、約０％〜約１０％、約１０％〜約２０％、約１０％〜約３０％、約１０％〜約４０％、約２０％〜約４０％、約３０％〜約４０％を構成する。さらなる実施形態では、細胞傷害性Ｔ細胞は、全Ｔ細胞集団の約０％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、または約４０％を構成し得る。細胞傷害性Ｔ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞として同定され得る。同定は、例えば、フローサイトメトリーによって実施することができる。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、ガンマ／デルタＴ細胞は、全Ｔ細胞集団の約０．５％〜約１０％、全Ｔ細胞集団の約０．５％〜約５％、約０．５％〜約１％、約１％〜約５％、約１．５％〜約５％、約２％〜約５％、約３％〜約５％、約４％〜約５％を構成する。さらなる実施形態では、ガンマ／デルタＴ細胞は、全Ｔ細胞集団の約０．５％、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％を構成し得る。ガンマ／デルタＴ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−ＴＣＲｇｄ＋細胞として同定され得る。同定は、例えば、フローサイトメトリーによって実施することができる。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、セントラルメモリーＴ細胞は、全Ｔ細胞集団の約０．５％〜約１５％、全Ｔ細胞集団の約０．５％〜約１０％、約０．５％〜約５％、約０．５％〜約１％、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％、約１％〜約５％、約５％〜約１５％、約５％〜約１０％、約１０％〜約１５％を構成する。さらなる実施形態では、セントラルメモリーＴ細胞は、全Ｔ細胞集団の約０．５％、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、または約１５％を構成し得る。セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋細胞として同定され得る。同定は、例えば、フローサイトメトリーによって実施することができる。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、エフェクターメモリーＴ細胞は、全Ｔ細胞集団の約２０％〜約６０％、全Ｔ細胞集団の約２０％〜約５０％、約２０％〜約４０％、約２０％〜約３０％、全体の約３０％〜約６０％、約３０％〜約５０％、約３０％〜約４０％、約４０％〜約６０％、約４０％〜約５０％、約５０％〜約６０％を構成する。さらなる実施形態では、エフェクターメモリーＴ細胞は、全Ｔ細胞集団の約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、または約６０％を構成し得る。エフェクターメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−細胞として同定され得る。同定は、例えば、フローサイトメトリーによって実施することができる。
【０２４３】
免疫応答を誘導または刺激する本明細書に記載の組成物および細胞の能力は、当該技術分野で標準的な様々な直接的または間接的アッセイを使用して、インビトロまたはインビボのいずれかで評価することができる。
【０２４４】
細胞性免疫の評価は、例えば、本明細書に記載の免疫原性の組み合わせおよび融合ポリペプチドに含まれるか、またはそれによってコードされるマイコバクテリア抗原の少なくとも１つに特異的なＴリンパ球などの免疫細胞における頻度の増加によって推定することができる。放射性標識時に細胞増殖を監視することもできる（例えば、［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイによるＴ細胞増殖アッセイ）。免疫応答を検出するための別の高感度な方法は、ＩＦＮｇ産生細胞の頻度を決定するＥＬＩＳｐｏｔである。抗原特異的Ｔリンパ球の細胞傷害性能力は、感作された対象で、または適切な動物モデルの免疫化によって評価することもできる。通例のバイオアッセイを使用して（例えば、マルチパラメータフローサイトメトリー（ＩＣＳ）、ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ技術またはＥＬＩＳＡを使用したサイトカインプロファイル分析などにより）、活性化Ｔ細胞によって産生される関連するＴｈ１および／またはＴｈ２サイトカイン（複数可）の放出を定量化することにより進めることも可能である。ＰＣＲ技法は、関連するサイトカインをコードするｍＲＮＡの存在を決定するためにも使用され得る。そのような関連するサイトカインの量の有意な増加または減少を使用して、本明細書に記載の１つ以上の活性剤（複数可）の免疫原性活性を評価することができることは、当業者によって理解されるであろう。
【０２４５】
防御免疫応答は、適切な実験動物、例えばマウス、ラット、またはモルモットにおいてインビボで（Ａｓｈｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ，２００８，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐ，３９：５０３−８、Ａｃｏｓｔａ  ｅｔ  ａｌ，２０１１，Ｍａｌａｙｓ  Ｊ  Ｍｅｄ，１８：５−１２）、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの毒性株（例えばＭｔｂ）に感染したが、以前に免疫化されていない実験動物の対照群におけるマイコバクテリアコロニー形成単位（ｃｆｕ）と比較して、本明細書に記載の組成物のうちの１つ以上で以前に免疫化された後にＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の同じ毒性株による攻撃感染を受けた動物から単離された脾臓、肺、または他の組織の破砕物からのマイコバクテリアｃｆｕの減少を測定することによって評価することができる。治療群と非治療群の比較は、動物の生存率で評価することもできる（治療群の生存率の増加は、防御免疫反応と相関する）。
【０２４６】
そのような免疫学的読み出しは、本明細書に記載の活性剤（複数可）によって提供されるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染症に対する防御免疫応答と良好に相関するものである。
【０２４７】
他の態様では、本明細書に記載のＴ細胞は、療法のための組成物に含まれ得る。組成物は、医薬組成物を含み得、薬学的に許容される担体をさらに含む。Ｔ細胞を含む治療有効量の医薬組成物を投与することができる。
【０２４８】
別の実施形態では、本明細書に記載のＴ細胞は、治療を必要とする対象における免疫応答の治療のための薬剤の製造に使用することができる。
【０２４９】
本開示の細胞は、マイコバクテリア感染症を治療するために、動物、好ましくは哺乳動物、さらにより好ましくはヒトに投与することができる。
【０２５０】
本開示の細胞は、適切な前臨床および臨床実験ならびに試験で決定される投与量および経路および回数で投与することができる。細胞組成物は、これらの範囲内の投与量で複数回投与することができる。本開示の細胞の投与は、当業者によって決定されるように、所望の疾患または状態を治療するのに有用な他の方法と組み合わせることができる。
【０２５１】
投与される本開示の細胞は、療法を受けている対象に関して、自己、同種、または異種であり得る。
【０２５２】
本開示の細胞の投与は、当業者に既知の任意の便利な方法で実施することができる。本開示の細胞は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、留置、または移植によって対象に投与され得る。本明細書に記載の組成物は、患者に、経動脈、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、または腹腔内投与することができる。他の例では、本開示の細胞は、対象の炎症部位、対象の局所疾患部位、リンパ節、臓器、腫瘍などに直接注射される。
【０２５３】
本明細書に記載の細胞はまた、任意の数のマトリックスを使用して投与することもできる。本開示は、典型的にはＴ細胞の調節により、免疫系を支持、維持、または調節するように人工リンパ臓器として作用するという新しい文脈の中でそのようなマトリックスを利用する。したがって、本開示は、組織工学において有用性を示したそれらのマトリックス組成物および製剤を利用し得る。したがって、本開示の組成物、デバイス、および方法で使用することができるマトリックスの種類は、事実上無制限であり、生物学的および合成マトリックスの両方を含み得る。ある特定の例では、米国特許第５，９８０，８８９号、同第５，９１３，９９８号、同第５，９０２，７４５号、同第５，８４３，０６９号、同第５，７８７，９００号、または同第５，６２６，５６１号により記載される組成物およびデバイスが利用され、そのため、これらの特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。マトリックスは、哺乳類宿主に投与されたときに生体適合性であることに一般的に関連する特徴を含む。マトリックスは、天然および／または合成材料から形成され得る。マトリックスは、インプラントなどの動物の体内に恒久的な構造または取り外し可能な構造を残すことが望ましい場合、非生分解性であるか、または生分解性であり得る。マトリックスは、スポンジ、インプラント、チューブ、テルファパッド、繊維、中空繊維、凍結乾燥構成成分、ゲル、粉末、多孔質組成物、またはナノ粒子の形態をとることができる。さらに、マトリックスは、播種された細胞または産生されたサイトカインまたは他の活性剤の持続放出を可能にするように設計することができる。ある特定の実施形態では、本開示のマトリックスは、可撓性および弾性であり、無機塩、水性流体、および酸素を含む溶解ガス剤などの物質に対して透過性である半固体足場として説明され得る。
【０２５４】
本明細書では、生体適合性物質の例としてマトリックスを使用する。しかしながら、本開示はマトリックスに限定されないため、マトリックス（複数可）という用語が現れる場合は常に、これらの用語は、細胞の保持または細胞の横断を可能にし、生体適合性であり、物質自体が半透膜であるような物質を直接通過するか、または特定の半透性物質と組み合わせて使用されるかのいずれかで巨大分子を横断させるのを可能にするデバイスおよび他の物質を含むように読まれるべきである。
【０２５５】
医薬組成物
本開示は、（ｉ）薬学的に有効な量の、本明細書に記載の組成物（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの抗原もしくはその機能的断片をコードする核酸配列を含む組成物、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からの抗原をコードするアミノ酸配列もしくはその断片を含むポリペプチドを含む組成物、または両方の組み合わせ）、および（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。本開示はまた、（ｉ）薬学的に有効な量の、本明細書に記載される１つまたは複数の細胞、および（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物にも関する。本開示の医薬組成物は、１つ以上の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載される拡大されたＴ細胞集団を含み得る。そのような組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液、グルコース、マンノース、スクロース、またはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物、タンパク質、グリシンなどのポリペプチドまたはアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、および防腐剤を含み得る。本開示の組成物は、好ましくは、静脈内投与用に製剤化される。
【０２５６】
本開示の医薬組成物は、治療される（または予防される）疾患に適切な方法で投与され得る。投与の量および頻度は、患者の状態、患者の疾患の種類および重症度などの要因によって決定されるが、適切な投与量は臨床試験によって決定され得る。
【０２５７】
本開示の組成物は、生理学的またはわずかに塩基性のｐＨ（例えば、約ｐＨ７〜約ｐＨ９）でのヒトまたは動物の使用に適切であるために、好適に緩衝される。好適な緩衝液には、リン酸緩衝液（例えば、ＰＢＳ）、重炭酸緩衝液、および／またはトリス緩衝液が含まれるが、これらに限定されない。
【０２５８】
本開示の組成物は、ヒトまたは動物の使用に適した希釈剤をさらに含み得る。それは、好ましくは、等張性、低張性、または弱高張性であり、比較的低いイオン強度を有する。代表的な例としては、滅菌水、生理食塩水（例えば、塩化ナトリウム）、リンゲル液、グルコース、トレハロース、またはサッカロース溶液、ハンクス液、および他の生理学的に平衡な塩水溶液が挙げられる（例えば、最新版のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎを参照されたい）。
【０２５９】
追加の薬学的に許容される賦形剤は、例えば、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、減菌性、安定性、製剤の溶解速度の変更または維持、ヒトまたは動物の生物への放出または吸収の変更または維持、血液関門を横断する輸送または特定の臓器（例えば、肺）への浸透の促進を含む、望ましい薬学的または薬力学的特性を提供するために使用され得る。
【０２６０】
加えて、本開示の組成物は、ヒトにおける全身または粘膜適用に好適な１つ以上のアジュバント（複数可）を含み得る。好ましくは、アジュバントは、本開示の組成物に対する免疫、特にＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８、およびＴＬＲ−９などの、例えばトール様受容体（ＴＬＲ）によりＴ細胞媒介性免疫を刺激することができる。有用なアジュバントの代表的な例としては、ミョウバン、フロイント完全および不完全（ＩＦ  Ａ）などの鉱油エマルジョン、リポ多糖またはその誘導体（Ｒｉｂｉ  ｅｔ  ａｌ，１９８６，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏｒｐ．，ＮＹ，ｐ４０７−４１９）、ＱＳ２１などのサポニン（ＷＯ９８／５６４１５）、イミキモドなどのイミダゾ−キノリン化合物（ＷＯ２００７／１４７５２９）、ＣｐＧなどのシトシンリン酸グアノシンオリゴデオキシヌクレオチドおよびＩＣ−３１などのカチオン性ペプチド（Ｋｒｉｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ８２２：２６３）、またはその任意の誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６１】
本開示の組成物に含まれる薬学的に許容されるビヒクルはまた、凍結（例えば、−７０℃、−２０℃）、冷蔵（例えば、４℃）、周囲温度で、製造および長期保存（すなわち、少なくとも１ヶ月、少なくとも１年が好ましい）の条件下でその安定性を保つことが可能でなければならない。そのような「長期」製剤は、当該技術分野で既知である（例えば、ＷＯ９８／０２５２２、ＷＯ０３／０５３４６３）。（ａ）１Ｍサッカロース、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ＩｍＭのＭｇＣｌ２、５４ｍｇ／１のＴｗｅｅｎ  ８０、１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．５、（ｂ）１０ｍｇ／ｍｌのマンニトール、１ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．２、および１５０ｍＭのＮａＣｌ、ならびに（ｃ）本開示の組成物に特に適合される生理食塩水を挙げることができる。
【０２６２】
本開示の組成物は、様々な形態、例えば、固体、液体、または冷凍であり得る。固体（例えば、乾燥粉末または凍結乾燥）組成物は、真空乾燥および凍結乾燥を伴うプロセスによって得ることができる。特定の実施形態では、本開示の組成物は、噴霧乾燥（例えば、ＷＯ２０１０／１３５４９５を参照されたい）または液滴形態（１００〜５０００μｍの平均直径を有する液滴が特に好ましい）での気道（例えば、吸入、鼻腔内、または肺内経路により）への送達用に製剤化される。
【０２６３】
従来の投与経路のいずれも、全身、局所、または粘膜経路を含む、本開示の文脈において適用可能である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、対象と流体連通する袋において静脈内投与される。いくつかの実施形態では、活性化Ｔ細胞のうちの１つ以上の精製された集団は、
【０２６４】
全身投与には、例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、腹腔内、血管内、動脈内注射、ならびに乱刺が含まれる。注射は、従来の注射器および針、または当該技術分野で利用可能な任意の他の適切なデバイス（例えば、エレクトロポレーション）を用いて行うことができる。粘膜投与には、経口／消化管、鼻腔内、気管内、肺内、膣内、または直腸内経路が含まれるが、これらに限定されない。気道への投与は、適切なディスペンサーを使用して、液滴、噴霧、または乾燥粉末組成物の噴霧またはエアロゾル化により行うことができる。局所投与は、経皮的手段（例えば、パッチなど）を使用して行うこともできる。筋肉内、皮内、および皮下経路は、本開示ならびに鼻腔内気管内、および肺内投与の文脈において特に好ましい。
【０２６５】
適切な投与量は、様々なパラメータ、特に組成物に含まれる活性剤（複数可）、投与様式、対象の年齢、健康状態、体重、症状の性質および程度、同時治療の種類、治療の頻度、ならびに／または予防もしくは療法の必要性の関数として適合させることができる。治療のための適切な投与量を決定するために必要な計算のさらなる修正は、関連する状況に照らして、開業医によって日常的に行われる。
【０２６６】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の拡大されたＴ細胞を含む医薬組成物は、１０４〜１０９細胞／ｋｇ体重、好ましくは１０５〜１０６細胞／ｋｇ体重（それらの範囲内のすべての整数値を含む）の投与量で投与することができる。Ｔ細胞組成物はまた、これらの投与量で複数回投与され得る。細胞は、免疫療法で一般的に知られている注入技法を使用することにより投与することができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照されたい）。特定の患者に最適な投与量および治療レジメンは、疾患の徴候について患者を監視し、それに応じて治療を調整することにより、医薬分野の当業者によって容易に決定され得る。
【０２６７】
ある特定の実施形態では、活性化Ｔ細胞を対象に投与し、その後血液を再採取し（またはアフェレーシスが行われる）、本開示に従ってそこからＴ細胞を活性化し、これらの活性化および拡大されたＴ細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間ごとに複数回実施され得る。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、１０ｍｌ〜４００ｍｌの採血から活性化され得る。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、２０ｍｌ、３０ｍｌ、４０ｍｌ、５０ｍｌ、６０ｍｌ、７０ｍｌ、８０ｍｌ、９０ｍｌ、または１００ｍｌの採血から活性化される。理論に拘束されるものではないが、この複数回の採血／複数回の再注入プロトコルを使用することにより、Ｔ細胞のある特定の集団を選択することができる。
【０２６８】
本開示のある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法、またはＴ細胞が治療レベルに拡大される当該技術分野で既知の他の方法を使用して活性化および拡大された細胞は、任意の数の関連する治療様式と共に（例えば、その前に、同時に、またはその後に）、患者に投与される。さらなる実施形態では、本開示のＴ細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、およびＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体、またはＣＡＭ  ＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、または他の抗体療法などの他の免疫除去剤、サイトキシン、フルダリビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、および照射と組み合わせて使用され得る。患者に投与される上記の治療の投与量は、治療される状態の正確な性質および治療のレシピエントによって異なる。ヒト投与のための投与量のスケーリングは、当該技術分野で認められている慣行に従って行われ得る。
【０２６９】
本開示の実施は、特に指示されない限り、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技法を用い、これらは十分に当業者の範囲内である。そのような技法は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１２）、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｇａｉｔ，１９８４）、“Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ”（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，２０１０）、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”  “Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｗｅｉｒ，１９９７）、“Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，１９８７）、“Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ，２００２）、“Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｔｒｏｕｂｌｅｓｈｏｏｔｉｎｇ”，（Ｂａｂａｒ，２０１１）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｃｏｌｉｇａｎ，２００２）などの文献に完全に説明されている。これらの技法は、本開示のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に適用可能であり、したがって、本発明を行い、実施する際に考慮され得る。特定の実施形態に特に有用な技法は、以下のセクションで論じられる。
【０２７０】
本出願および実施例のセクションに列記されているすべての参考文献、特許出願、または他の文書は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０２７１】
実施例１
ＣＴＬ刺激のための樹状細胞の生成およびトランスフェクション（予測）
マイコバクテリア抗原を発現する成熟樹状細胞（ＤＣ）による末梢血（ＰＢ）Ｔ細胞の刺激は、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の再活性化をもたらし得る。ＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で培養することにより、付着性ＰＢ単核細胞（ＰＢＭＣ）から分化させることができる。抗原（複数可）は、開示された抗原をコードするＤＮＡプラスミドでトランスフェクトすることによりＤＣに導入され、次いで、ＤＣは、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦα、およびＰＧＥ−２を含むサイトカインカクテルで培養することにより成熟させることができる。この実施例では、治療用Ｔ細胞の生成に必要な構成成分として樹状細胞を調製およびトランスフェクトするための例示的な手順が提供される。ある特定の実施形態における標本は、対象またはドナー（または以前に凍結されたＰＢＭＣ）からのヘパリン処理した末梢血を含み得る。感染症検査は、採血から７日以内に行われている場合がある。
【０２７２】
新鮮な血液からのＰＢＭＣの調製が行われる（凍結保存された血液を使用する場合には、以下に記載されるように進められる）。ヘパリン処理した末梢血（理想的には６０ｍｌ）を、周囲（室温）温度で等容積のＤ−ＰＢＳまたはＲＰＭＩ１６４０に希釈する。５０ｍｌの遠心管において、約１０ｍｌのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐに約２０ｍｌの希釈血液を慎重に重ねる。必要に応じて調整して、利用可能なすべての細胞を利用する。周囲温度で、４００×Ｇで４０分間遠心分離する。３×１ｍｌの血漿アリコートを確保し、−８０℃で保存する。ＰＢＭＣの界面を等容積のＤ−ＰＢＳまたはＲＰＭＩ１６４０に採取する。周囲温度で、４５０×Ｇで１０分間遠心分離する。上清を吸引する。「指で軽くたたく」ことによりペレットをほぐし、２０ｍＬのＤ−ＰＢＳまたはＲＰＭＩ１６４０に再懸濁する。２０μｌの細胞を取り出す。２０μｌの５０％赤血球溶解緩衝液を添加し、血球計数器を使用して計数する。
【０２７３】
以前に凍結したＰＢＭＣを調製するために、細胞を３７℃で解凍し、凍結細胞１ｍＬあたり１０ｍＬの温かいＣｅｌｌＧｅｎｉｘＤＣ培地に希釈し、計数する。ＤＣ開始に関して、以下のように進める：すべての利用可能なＰＢＭＣを使用するために、プレートあたり−１０×１０６ＰＢＭＣ（７〜１４×１０６の範囲）で播種した６ウェルプレート（複数可）の３５ｍｍのウェルの数を計算する。周囲温度で、４００×Ｇで５分間遠心分離する。播種されるプレートあたり２ｍＬに細胞を再懸濁する。細胞を、２時間、３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターに移して、ＤＣ前駆体を付着させる。ウェルを、１０ｍＬのＤ−ＰＢＳまたはＲＰＭＩで３回すすぎ、ＰＢＭＣ非付着画分を含む上清を組み合わせる。残りの付着細胞に、ウェルあたり１０００単位／ｍｌのＩＬ−４および８００単位／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを含む２ｍＬのＤＣ培養培地を添加する。３７℃、５％Ｃ０２インキュベーターにフラスコ／プレート（複数可）を戻す。以前に凍結保存されていない場合、非付着細胞は、後で使用するレスポンダーＴ細胞のために凍結保存され得る。
【０２７４】
未成熟ＤＣは次のように供給される。３日目または４日目に、ＩＬ−４を１ｍＬあたり１０００単位に、ＧＭ−ＣＳＦを１ｍｌあたり８００単位に補充する。２０Ｘ  ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を含むＣｅｌｌＧｅｎｉｘ培地を作り、ウェルあたり１００μｌを添加する。ＤＣの成熟時に、穏やかな再懸濁により５日目または６日目に未成熟ＤＣを採取する（既にフラスコに付着している細胞はわずかであるはずである）。残っている付着細胞を除去するために、５ｍＬの冷Ｄ−ＰＢＳを約１分間添加し、穏やかに再懸濁して未成熟ＤＣと組み合わせる。細胞の計数は、大きな樹状細胞のみを使用して、血球計数器を使用して行われる。ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ培地に１ｍＬあたり２×１Ｏ６でＤＣを再懸濁し、２４ウェルプレートのウェルあたり１ｍＬを分注する。未使用のウェルに滅菌水を添加する。サイトカイン成熟カクテルを含む１ｍＬのＤＣ培養培地をウェルに添加して、サイトカインの最終濃度を、ＧＭ−ＣＳＦ  ８００Ｕ／ｍｌ、ＩＬ−４  １０００Ｕ／ｍｌ、ＴＮＦ−ｃｃ  １０ｎｇ／ｍｌ、ＰＧＥ−１１μｇ／ｍＬ、ＩＬ−β  １０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６  １００ｎｇ／ｍｌにする。
【０２７５】
ＤＣ細胞を、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで、２０〜２８時間インキュベートする。３ｍＬのトランスファーピペットで穏やかに再懸濁して、２０〜２８時間後に２４時間成熟ＤＣを採取する。血球計数器を使用して細胞を計数する。樹状細胞のトランスフェクションのために、４ｍｌのＣｅｌｌ  Ｇｅｎｉｘ培地を、３７℃／５％Ｃ０２インキュベーター内の６ウェルプレートで予め温める。採取した樹状細胞を、３本（チューブ１〜３）の１５ｍＬ遠心管に分ける。ＤＣ細胞数／チューブは、０．５×１０６より少なくてはならず、２×ｌ０６より多くてはならない。ＤＣは、２００ｇで１０分間遠心分離される。上清を吸引し、５μｇ／プラスミド／チューブの最終濃度でＤＮＡプラスミドをＤＣペレットに添加し、各プラスミドは、本明細書に開示される１、２、３、４つ以上のマイコバクテリア抗原に対応し、それらをコードする。ＤＣおよびＤＮＡを１００μｌのトランスフェクション試薬で再懸濁し、よく混合してヌクレオフェクションキュベットに移す。キュベットは、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒに入れ、プログラムＵ２を選択し、開始ボタンを押してヌクレオフェクションを開始させる。ヌクレオフェクション後、予め温めた培地５００μｌを直ちにキュベットに添加し、細胞を３７℃／５％Ｃ０２インキュベーターに移す。インキュベーター内で１０分後、細胞を１２ウェル組織培養処理プレートに移し、サイトカイン成熟カクテルを含む１．５ｍｌのＤＣ培養培地を、８００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α、１μｇ／ｍｌのＰＧＥ−１、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β、および１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６のサイトカイン最終濃度で添加する。
【０２７６】
次いで、ＤＣを、３７℃、５％Ｃ０２インキュベーターで、１２〜１８時間インキュベートする。Ｔ細胞集団を有するＡＰＣとして使用するために、ＤＣを採取し、照射する。採取して計数した後、３０ＧｙのＡＰＣとして使用するためにＤＣを照射する。次いで、それらを１０ｍＬの培地で一回洗浄し、ＣＴＬ培養培地で、１ｍＬあたり２または１×１０５で再懸濁する。
【０２７７】
実施例２
プラスミドヌクレオフェクトされた樹状細胞を使用した抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬＳ）の生成
本実施例は、抗原特異的細胞傷害性リンパ球の例示的な製造に関する。この手順は、抗原提示細胞としてプラスミドヌクレオフェクトされたＤＣを使用するプロトコル用の細胞を調製するために使用され得る。ある特定の場合では、ＤＣは、本明細書で提供されるマイコバクテリア抗原または機能的断片をコードするプラスミドでヌクレオフェクトされる。
【０２７８】
抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞株（ＣＴＬ）は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、マイコバクテリア抗原をコードするＤＮＡプラスミドから抗原を発現する自己抗原提示細胞（ＡＰＣ）で刺激することにより生成される。本発明のある特定の実施形態では、ＡＰＣは樹状細胞（ＤＣ）である。樹状細胞は、効率的にヌクレオフェクトすることができ、患者からウイルス特異的Ｔ細胞を生成するために使用される強力なＡＰＣである。ある特定の実施形態では、プラスミドヌクレオフェクトされた樹状細胞は、二次またはその後の刺激のために使用され得る。用いた培養条件下では、成長中のＴ細胞株は、目的の抗原（ＣＭＶ−ＩＥ１およびｐｐ６５、アデノウイルス抗原およびＥＢＶ抗原）に特異的なＴ細胞を含んでいるはずである。サイトカイン（ＩＬ−４およびＩＬ−７）は最初の刺激で添加される。ヘパリン処理された末梢血は、患者、または以前に凍結された患者のＰＢＭＣから使用される。感染症検査は、採血から７日以内（特定のプロトコルによる）に行われ得る。プラスミドヌクレオフェクトされた樹状細胞（ＤＣ）は、患者またはドナーから調製される。
【０２７９】
必要に応じて、最終的な拡大されたＴ細胞数を計算することができる。患者の体表面積、予測される用量レベル、および追加用量が許可されるかどうかにより、患者の用量およびＱＣテストに十分な細胞が必要である。ある特定の実施形態では、患者が予想よりも高い用量レベルで登録され得る可能性を考慮に入れる。ＤＣは、特定の場合では、ウシ胎仔血清抗原を含まないことを確実にするために、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ培地で調製するべきである。ＣＴＬの開始は、ＦＣＳの存在下で行われる。
【０２８０】
新鮮な血液からの単核「レスポンダー」細胞の調製は、ヘパリン処理された末梢血（例えば、６０ｍｌ）を、周囲（室温）温度で、等容積のＤ−ＰＢＳまたはＲＰＭＩ１６４０に希釈することによって行われる。５０ｍｌの遠心管において、約１０ｍｌのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐに約２０ｍｌの希釈血液を慎重に重ねる。必要に応じて調整して、利用可能なすべての細胞を利用する。周囲温度で、４００×Ｇで４０分間遠心分離する。３×１ｍｌの血漿アリコートを確保し、−８０℃で保存する。ＰＢＭＣの界面を等容積のＤ−ＰＢＳまたはＲＰＭＩ１６４０に採取する。試料を、周囲温度で、４５０×Ｇで１０分間遠心分離する。次いで、上清を吸引する。細胞ペレットを、「指で軽くたたく」ことによりほぐし、２０ｍＬのＤ−ＰＢＳまたはＲＰＭＩ１６４０に再懸濁する。２０μｌの細胞を取り出す。２０μ１の５０％赤血球溶解緩衝液を添加し、血球計数器を使用して計数する。必要に応じて、プレートまたはバイオリアクターでの樹状細胞によるＰＢＭＣ刺激に進むことができる。
【０２８１】
必要に応じて、以前に凍結されたＰＢＭＣまたは非付着性単核細胞からのＣＴＬの調製を行うことができる。細胞を３７℃で解凍し、凍結細胞１ｍＬあたり１０ｍＬの温かい培地に希釈し、計数する。
【０２８２】
適切な状況において、例えば、実施例１に記載される、プレートまたはバイオリアクターにおいて、樹状細胞によるＰＢＭＣ刺激に進むことができる。ＰＢＭＣを、４００×Ｇで５分間、室温で遠心分離した後、上清を除去する。細胞を、ＣＴＬ培地＋ＩＬ−４（最終濃度１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−７（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）に、１ｍｌあたり２×１０６で再懸濁する。ウェルあたり１ｍＬの細胞アリコートを、２４ウェルに移し、プレートをインキュベーターに戻すか、またはＧＰ４０バイオリアクターにおいて約５〜約７．５ｍＬ（１０〜１５×１０６）ＰＢＭＣに分けて、インキュベーターに戻す。３０Ｇｙで照射し、４回洗浄した、調製されたプラスミドヌクレオフェクトされたＤＣを得る。１０：１または２０：１比のＰＢＭＣ対ＤＣとするために、２×１０５〜１×１０５（ＤＣ）細胞／ｍｌで、抗原提示細胞を再懸濁する。１ｍｌのＤＣのアリコートをＰＢＭＣのウェルに、または７．５ｍＬのＤＣをバイオリアクターに入れ、合計３０ｍＬの培地とするために培地を添加し、細胞を、空気中５％Ｃ０２で、３７℃で７日間培養する。７日目：＜３×１０６細胞／ウェルの場合、半分の培地交換を行う。ウェルあたり約１ｍＬの培地を除去し、約１ｍＬの新しいＣＴＬ培地＋サイトカインと交換する。７日目：＞３×ｌ０６細胞／ウェルの場合、分割し、ＣＴＬを供給し、約１ｍＬのＣＴＬを新しいウェルに移し、約１ｍＬの新しいＣＴＬ培地＋サイトカインを供給する。７日目：バイオリアクターに＜５０×１０６細胞が存在する場合、１０ｍｌの培地を除去し、新しい培地＋サイトカインを補充する。７日目：バイオリアクターに＞５０×１０６細胞が存在する場合、１５ｍｌのＣＴＬを新しいバイオリアクターに移し、両方に新しい培地＋サイトカインを補充する。さらに４〜６日間培養する。臨床凍結保存の場合、十分な細胞が得られたら、細胞を凍結保存し、特徴付けする。ＣＴＬを凍結した一週間以内に、細胞傷害性アッセイが５×ｌ０６〜ｌ×ｌ０７細胞で設定されるべきであり、表現型検査が、特定のプロトコルの要件に従い、追加の２×１０６細胞を用いて行われるべきである。
【０２８３】
ある特定の実施形態では、適切な用量レベル（その時点で決定される）で細胞を患者に注入するための、およびすべてのＱＣ要件：２０：１（同種の場合）でレシピエントＰＨＡ芽細胞を＜１０％未満殺傷、および＜２％のＣＤ８３＋／ＣＤ３細胞（ＤＣを除く）に対する治療有効量のＣＴＬが存在する。
【０２８４】
実施例３
ＳＯＰ：マイコバクテリア特異的ＣＴＬの製造
１．目的
１．１  Ｔ細胞免疫不全の患者は、侵襲性マイコバクテリア感染症に対する感受性を有する場合が多い。
１．２  マイコバクテリア特異的Ｔ細胞は、健康なドナーから拡大され得る。
１．３  この手順の目的は、
様々な抗原：ＡＧ８５Ｂ、ＰＰＥ６８、ＥＳＸＢ、Ｐ９ＷＮＫ７、およびＡＤＫを標的とするマイコバクテリア特異的Ｔ細胞
を製造する手段を提供することである。
１．４  マイコバクテリア抗原の重複ペプチド（Ｐｅｐｍｉｘ）を使用して、Ｔ細胞を刺激する。
１．５．１  Ｐｅｐｍｉｘは、１５のアミノ酸を有するペプチドからなり、１１のアミノ酸が重複して、目的のタンパク質の全長を網羅する。
２．方針
１  訓練を受けたＧＭＰおよびＱＡ／ＱＣスタッフはこの手順に従う必要がある。
２．２  この手順は、ＰｅｐｍｉｘパルスされたＰＢＭＣを抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用するプロトコル用の細胞を調製するために使用され得る。
２．３  日付は概算であり、指定がない限り、週末および休日を考慮して＋／−３日である。
２．４  細胞の計数および生存率は、トリパンブルーなどの有効かつ確立されたアッセイを使用して行わなければならない。しかしながら、認定されたら、同等のアッセイまたは装置を使用することができる。
３．略語および定義
３．１  ＭＳＴ  マイコバクテリア特異的Ｔリンパ球
３．２  Ｐｅｐｍｉｘ重複１５量体ペプチドライブラリ
３．３  ＱＣ  品質管理
３．４  ＧＭＰ  適正製造基準
３．５  ＣＥＴＩ  細胞増強のためのプログラムおよび免疫療法のための技術
３．６  ＦＤＡ  食品医薬品局
３．７  ＰＢＭＣ  末梢血単核細胞
３．８  ＩＮＤ  治験薬
３．９  ＤＣ  樹状細胞
３．１０  ＳＯＰ  標準操作手順
３．１１  ＰＩ  治験責任医師
３．１２  ＱＡ  品質保証
３．１３  ＰＢＳ  リン酸緩衝食塩水
３．１４  ＣＴＬ培地  ４５％ＥＨＡＡクリック、４５％ａｄｖａｎｃｅｄ  ＲＰＭＩ、１０％ＨＩ  ＦＢＳまたはＨＳ、２ｍＭ
ＧｌｕｔａＭＡＸ
３．１５  ＣｏＡ  分析証明書
３．１６  ＨＳ  ヒト血清
３．１７  ＨＩ  熱不活化
３．１８  ＩＬ  インターロイキン
３．１９  ＣＮＭＣ  チルドレンズナショナルメディカルセンター（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）
３．２０  ＡＰＣ  抗原提示細胞
３．２１  ｇ  重力
３．２２  Ｃ  摂氏
３．２３  ＣＯ２  二酸化炭素
３．２４  ＢＳＣ  生物学的安全キャビネット
３．２５  ＨＳＡ  ヒト血清アルブミン（フレックスブミン）
４．標本
４．１  患者／ドナー、以前に凍結された患者ＰＢＭＣからのヘパラン処理された末梢血。
４．１．１  感染症検査は、連邦規制に従って行われなければならない。
５．材料および装置  ５．１材料
５．１．１  ＲＰＭＩ  １６４０  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
５．１．２  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＲＰＭＩ１６４０  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
５．１．３  ＥＨＡＡクリック  Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
５．１．４  ＨＩウシ胎仔血清  ＨｙＣｌｏｎｅ
５．１．５  ヒト血清  Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ
５．１．６  ＧｌｕｔａＭＡＸ（２００ｍＭ）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
５．１．７  組織培養プレート  Ｃｏｒｎｉｎｇ
４．２．８  ガス透過性培養器（ｃｕｌｔｕｒｅｗａｒｅ  ）  Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ
４．２．９  インターロイキン−４  Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ
４．２．１０  インターロイキン−７  Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ
４．２．１１  遠心管  Ｃｏｒｎｉｎｇ
４．２．１２  血清ピペット  Ｆａｌｃｏｎ
４．２．１３  Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ  Ｎｙｃｏｍｅｄ
４．２．１４  ＰＢＳ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
４．２．１５  赤血球溶解緩衝液  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
４．２．１６  樹状細胞培地  ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ
４．２．１７  ピペットチップ  ＡＲＴ
４．２．１８  プラズマトランスファーセット  Ｃｈａｒｔｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ
４．２．１９  注射器  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
４．２．２０  Ｐｅｐｍｉｘｅｓ  ＪＰＴ
【０２８５】
５．２  装置
注：細胞と接触するすべての材料は、減菌かつパイロジェンフリーであり、特に明記されていない限り、製造元の指示に従って保管および使用されなければならない。ＱＡの承認を得て、同等の材料および装置を使用することができるが、すべての変更は適切なワークシートに記録されなければならない。
５．２．１  生物学的安全キャビネット（認定済み）
５．２．２  顕微鏡
５．２．３  遠心機
５．２．４  インキュベーター
５．２．５  照射器
５．２．６  血球計数器
５．２．７  水浴
５．２．８  Ｐｉｐｅｔ  Ａｉｄ  ５．２．９  ＬＳ選択マグネット
６．手順
６．１  健康なドナーからのマイコバクテリア特異的Ｔ細胞の産生：
６．１．１  新鮮な血液からのＰＢＭＣの調製（凍結ＰＢＭＣに関して、以下の凍結ＰＢＭＣステップに進む）
６．１．１．１  ヘパリン処理した末梢血を、周囲温度で等容積のＰＢＳまたはＲＰＭＩ１６４０に希釈する。
６．１．１．２  ５０ｍＬの遠心管において、約１０〜１５ｍＬのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐに約３０ｍＬの希釈血液を慎重に重ねる。
６．１．１．３  レベル１で加速および制動しながら、周囲温度で８００×ｇで２０分間、または４００×ｇで４０分間遠心分離する。
６．１．１．４  １ｍＬの血漿アリコート（複数可）（該当する場合）を確保し、−８０℃で保存する。
６．１．１．５  ＰＢＭＣ界面を等容積のＰＢＳまたはＲＰＭＩ１６４０に採取する。
６．１．１．６  周囲温度で、４５０×ｇで１０分間遠心分離する。上清を吸引する。
６．１．１．７  ペレットをほぐし、細胞を、ある容積のＰＢＳまたはＲＰＭＩ１６４０に再懸濁し、推定１×１０６細胞／ｍＬを得る。
６．１．１．８  計数のために細胞試料を取り出す。トリパンブルーまたは赤血球溶解緩衝液で試料を希釈し、ＳＯＰに従って血球計数器を使用して計数する。認定されたセルカウンターを使用することもできる。
６．１．１．９  以下の活性化ステップに進む
６．１．２  以前に凍結したＰＢＭＣからのレスポンダー細胞の調製
６．１．２．１  ＳＯＰ  Ｍ０２に従って、３７℃で細胞を解凍し、１ｍＬの凍結細胞あたり約１０ｍＬの温かい培地に希釈する。
６．１．２．２  ＳＯＰに従って計数する。
６．１．２．３  バイオリアクターでＣＴＬを開始するために以下の活性化ステップに進む
６．１．３  ウイルスｐｅｐｍｉｘを使用したバイオリアクターでの新鮮な／以前に凍結されたＰＢＭＣの活性化。
６．１．３．１  周囲温度で、４００×ｇで５分間、約１．５×１０７ＰＢＭＣ／チューブを遠心分離する。
６．１．３．２  １バイアルのＰｅｐｍｉｘマスターミックス（４０ｎｇ／ｕＬで５ｕｌ、等しい容積および濃度で混合されたすべての標的マイコバクテリアｐｅｐｍｉｘを含む）を取り、２００ｕＬのＣＴＬ培地に希釈して１ｎｇ／ｕＬにする。
６．１．３．３  ＰＢＭＣから上清を除去し、１００ｕＬの希釈Ｐｅｐｍｉｘ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（１００ｎｇ／ペプチド）で３７℃、５％ＣＯ２で約３０〜６０分間パルスする。
６．１．３．４  ＰｅｐｍｉｘパルスしたＰＢＭＣを、６ｕＬのＩＬ−４（４００Ｕ／ｍｌの最終濃度）および３０ｕＬのＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬの最終濃度）を含む３０ｍＬのＣＴＬ培地に再懸濁する。
６．１．３．５  １．５ｘ１０７細胞ごとに１つのＧ−Ｒｅｘバイオリアクターに移し、インキュベーターに戻す。
６．１．４  ３〜４日目：任意選択の供給
６．１．４．１  各Ｇｒｅｘ−１０に、６ｕＬのＩＬ−４（ストック＝２０００Ｕ／ｍｌ、最終４００Ｕ／ｍｌ）および３０ｕＬのＩＬ−７（ストック＝１０ｎｇ／ｕｌ、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）を添加する。
６．１．４．２  Ｇｒｅｘバイオリアクターをインキュベーターに戻す。
６．１．５  ６〜８日目：Ｔ細胞供給
６．１．５．１  細胞を乱すことなく、各Ｇｒｅｘ−１０から１５ｍＬの培地を除去する。
６．２．５．２  細胞を再懸濁し、ＳＯＰにより細胞数を数える。
６．１．５．３  ＧＲｅｘに＞５．０×１０７細胞が存在する場合、７．５ｍＬのＣＴＬを新しいＧＲｅｘに移し、両方に新しい培地＋サイトカインを最終容積３０ｍＬまで補充する。
６．１．５．４  さらに４〜６日間培養する。
６．１．６  １０〜１２日目：ＳＯＰ  Ｍ０３（臨床使用のための細胞凍結）に進む。
７．注意事項および制限事項
７．１  細胞（ＰＢＭＣおよびＣＴＬ）は、可能な場合はバックアップとして凍結するべきである。
７．２  調製されたすべての細胞は患者への注入を意図しているため、患者試料の誤認または汚染を防ぐために適切な手順に従うことが不可欠である。
７．３  すべての培養容器およびチューブは、患者名および／またはドナー名、構成成分番号、製造日、ならびに患者／ドナーＩＤ（Ｐ番号および／またはＭＲＮ）を含む製品識別子のラベルを付けなければならない。ラベルのない材料は廃棄される。
７．４  一度に２つ以上の患者産物を決して扱わない。
７．５  常に各患者の細胞用に特別に調製および標識された培地を使用する。培地を２つ以上の患者の細胞に供給するために使用しない。
７．６  無菌技法を使用し、普遍的予防措置に従って、認定された生物学的安全キャビネットですべてのステップを行う。
７．７  治験責任医師または被指名人は、必要な最終的な拡大されたＴ細胞数を計算しなければならない。患者の体表面積または体重、予測される用量レベル、および追加用量が許可されるかどうかにより、患者の用量ならびにＱＣ検査に十分な細胞が必要である。可能であれば、患者が予想よりも高い用量レベルで登録される可能性を考慮に入れる。
８．予想される結果および解釈
８．１  細胞は、以下の所与のＩＮＤの放出基準を満たさなければならない（ただし、これらに限定されない）。
８．１．１  適切な用量レベル（その時点で決定される）での患者への注入およびすべてのＱＣ要件に十分なＣＴＬ数。
８．１．２  ２０：１でレシピエントＰＨＡ芽細胞を＜１０％殺傷（同種）
８．１．３  ＜２％のＣＤ１４  ＋細胞（単球）
【０２８６】
実施例４．
対象におけるマイコバクテリア感染症の治療方法
治療有効量のエフェクター細胞が経時的に対象に投与され、投与後の経時的な対象における細菌感染の症状を監視することによって有効性が決定される。
【０２８７】
実施例５．
健康なドナーからのＴ細胞の拡大方法
対象および患者
健康なドナーおよび患者は、チルドレンズナショナルメディカルセンター、国立衛生研究所、および全小児病院での献血の研究プロトコルに同意した。ドナーは、ＢＣＧワクチン接種の前歴について評価され、ワクチン接種を受けたものは、ツベルクリンまたはクォンティフェロン検査での陽性の最近の病歴について評価された。患者試料は、原発性免疫不全障害を有し、Ｍ．ａｖｉｕｍ  ｃｏｍｐｌｅｘまたはＭ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓによる活動性または最近の侵襲性感染症が存在する個人から得た（表２）。
【表６】
2021522245.tif 000008
【０２８８】
末梢血単核細胞の単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、フィコール密度遠心分離により単離された。血液をリン酸緩衝食塩水に１：１で希釈し、１０〜１５ｍＬのリンパ球分離培地（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ＣＡ）の上に重層し、室温で４００Ｇで４０分間回転させた。リンパ球層からＰＢＭＣを採取し、ＭＳＴ株の計数および生成の前に１×ＰＢＳで２回洗浄した。
【０２８９】
健康なドナーおよび患者からのマイコバクテリア特異的Ｔ細胞の迅速な生成
１日目に、ＰＢＭＣ（１０〜１５×１０６）を５０ｍｌのコニカルチューブでペレット化した。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ｐｅｐｍｉｘ）からの抗原を包含する重複する１５量体ペプチドプールをプールし、２μｌの各ＴＢ  ｐｅｐｍｉｘ（５つの１５量体ｐｅｐｍｉｘライブラリ、それぞれ０．５ｎｍｏｌ／μＬの濃度で再構成された）を、２００μｌのＣＴＬ培地（４５％ＲＰＭＩ、４５％クリック培地、２ｍｍｏｌ  Ｌ−グルタミンを含む１０％胎仔ウシ血清）に添加し、最終ペプチド濃度は２５ｎｍｏｌ／ｍｌであった。ＴＢｐｅｐｍｉｘには、ＡＧ８５Ｂ、ＰＰＥ６８（Ｒｖ３８７３）、ＥＳＸＡ（ＥＳＡＴ−６）、ＥＳＸＢ（ＣＦＰ−１０）、およびＡＤＫからのペプチドが含まれた。タンパク質コンセンサス配列は、ｐｅｐｍｉｘ生成のためにＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ（表３）（ＪＰＴ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。
【表７】
2021522245.tif 000009
【０２９０】
ＰＢＭＣペレットを２００μｌのＣＴＬ培地／ｐｅｐｍｉｘに再懸濁し、３７℃で３０〜６０分間インキュベートした（図１）。インキュベーション後、ＰＢＭＣを、１×１０６細胞／ｍｌの最終濃度で、ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−４（４００Ｕ／ｍｌ）を含むＣＴＬ培地／１０％ＦＢＳに再懸濁した（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）。ＰｅｐｍｉｘでパルスされたＰＢＭＣを、２ｍｌ／ウェルで２４ウェルプレートに播種した。３〜５日目に、培養培地を、色および細胞のコンフルエンスに関して観察した。コンフルエントな培養に関して、半培地交換（ＩＬ−７およびＩＬ−４で）を行った。７日目に、培養培地を再度観察し、半培地交換でコンフルエントであった場合、細胞を１：１に分割した。１０〜１２日目に、細胞を採取し、抗原特異性および機能性について評価した。
【０２９１】
Ｍ．ＡｖｉｕｍセンシチンまたはＴＢ溶解物を用いた健康なドナーからのＭＳＴ生成
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ溶解物（株ＣＤＣ１５５１，ＢＥＩ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、１０ｍＭ重炭酸アンモニウム中１０ｍｇ／ｍｌで再構成した。Ｍ．ａｖｉｕｍセンシチン（Ｓｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ，Ｄｅｎｍａｒｋ、Ｄａｒｔｍｏｕｔｈ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＦｏｒｄ  ｖｏｎ  Ｒｅｙｎ博士の厚意により提供された）タンパク質を、１．５ｍｌの食塩水中１ｕｇ／ｍｌで再構成した。１日目に、ＰＢＭＣ（１０〜１５×１０６）を次の条件で溶解物と共にインキュベートした：Ｍ．ａｖｉｕｍセンシチン（５０ｎｇ）またはＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ溶解物（１００μｇ）。ＰＢＭＣ＋溶解物を、１×１０６細胞／ｍｌの最終濃度で、ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−４（４００Ｕ／ｍｌ）を含むＣＴＬ培地／１０％ＦＢＳに再懸濁し、２ｍｌ／ウェルで２４ウェルプレートに播種した。３〜７日目に、培養培地を以前と同様に観察し、必要に応じて交換した。１０〜１２日目に、細胞を採取し、ＴＢ特異性および機能性について評価した。
【０２９２】
ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびエピトープマッピング
Ｔ細胞の抗原特異性は、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）で測定した。Ｔ細胞を、ペプチドまたはアクチン（陰性対照）なし、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）（陽性対照）、または刺激剤としてＴＢ  ｐｅｐｍｉｘおよび溶解物と共に１×１０５／ウェルで播種した。特異性は、両側スチューデントのＴ検定による陰性対照に対する結果の統計的有意性（ｐ＜０．０５）を用いて、最小２０のスポット形成細胞（ＳＦＣ）／１×１０５細胞／ウェルとして定義された。エピトープマッピングに関して、ＡＧ８５ＢおよびＥＳＸＢタンパク質全体に及ぶ１５量体のペプチドを合成し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  Ｔｏｗｎｓｈｉｐ，ＮＪ，ＵＳＡ）、各ペプチド間で５つのアミノ酸を重複させた。ＥＬＩＳＰＯＴプレートは、ＩＦＮ−γＳＦＣの計数およびコンフルエンスの決定のために送られた（Ｚｅｌｌｎｅｔ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ，Ｆｏｒｔ  Ｌｅｅ，ＮＪ，ＵＳＡ）。
【０２９３】
ＭＳＴの免疫表現型検査
ＭＳＴ細胞培養物の表現型検査は、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＣＲ７、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ９５、パーフォリン、ＰＤ−１、ＴＣＲγδ、ＣＴＬＡ４、およびＴＩＭ３（Ｍｉｌｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ、およｂＥｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）に対する抗体を用いたフローサイトメトリーによって行われた（表４）。
【表８】
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【０２９４】
１日目に、健康でＢＣＧワクチン接種を受けたドナーからのＭＳＴを、低用量のＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）で一晩休ませた。２日目に、Ｔ細胞を洗浄し、対応するｐｅｐｍｉｘ、αＣＤ２８／ＣＤ４９共刺激剤、およびブレフェルジンＡと共に１×１０６細胞／ウェルで播種し、６時間インキュベートした。条件は次のとおりであった：２．５ｕｇ／ウェルで、ｐｅｐｍｉｘなし、アクチンｐｅｐｍｉｘ、ＳＥＢ、またはマイコバクテリアペプチドのミックス（等濃度のＰＰＥ６８、ＥＳＸＡ、ＥＳＸＢ、ＡＧ８５Ｂ、およびＡＤＫ  ｐｅｐｍｉｘ）。上記の条件で６時間インキュベートした後、細胞を洗浄し、表面マーカー染色し、洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。次いで、細胞をサポニン（Ｐｅｒｍ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で透過処理し、細胞内抗体で染色し、洗浄した。ＧＤ２に特異的なキメラ抗原受容体で形質導入されたＴ細胞を、共阻害受容体の存在の対照として利用した（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＤｒ．Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｍａｃｋａｌｌの厚意による）（３３）。試料を、ＣｙｔｏＦｌｅｘ  Ｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）で取得し、ＦｌｏｗＪｏ  ＶＸ（ＦｌｏｗＪｏ  ＬＬＣ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）で分析した。標準化されたゲーティング戦略を、表面染色（図８）および細胞内染色（図９）に利用した。
【０２９５】
Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘサイトカインアッセイ
ＭＳＴ産物の機能は、Ｂｉｏｐｌｅｘ  Ｐｒｏ  Ｈｕｍａｎ  １７−ｐｌｅｘ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｓｓａｙキット（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して測定した。１日目に、健康なドナーからのＭＳＴを、低用量のＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）で一晩休ませた。２日目に、Ｔ細胞を洗浄し、１μＬの対応するｐｅｐｍｉｘと共に１×１０６細胞／ウェルで播種した。条件は次のとおりであった：１ｕｇ  ／ウェルで、ｐｅｐｍｉｘなし（対照）、アクチンのみ（対照）、ＳＥＢ（陽性対照）、ＡＧ８５Ｂ、ＰＰＥ６８、ＥＳＸＡ、ＥＳＸＢ、またはＡＤＫ。３日目に、上清をウェルから採取し、沈降させて、細片を除去し、ｍｕｌｔｉｐｌｅｘプレートに播種した。免疫不全患者に関して、細胞数が限られているため、ＥＬＩＳＰＯＴプレートから上清を収集して１７−ｐｌｅｘで実行した。Ｂｉｏｒａｄ  １７−ｐｌｅｘ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ製造業者のプロトコルに従い、ＭＡＧＰＩＸシステム（Ｌｕｍｉｎｅｘ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）で読み取った。
【０２９６】
ＨＬＡタイピング
選択されたドナー試料は、高解像度ＳＳＯ  ＨＬＡタイピングのために送られた（Ｋａｓｈｉ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）。
【０２９７】
データ分析
データ分析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）およびＳＡＳ  ９．３（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ，ＮＣ）で行われた。両側有意水準αが０．０５のクラスカル・ウォリス検定を使用して、複数のデータ群間の差を検定し、両側Ｔ検定をペアワイズデータ分析に使用した。
【０２９８】
結果
マイコバクテリア特異的Ｔ細胞は健康なドナーから拡大することができる
マイコバクテリア抗原に対するＴ細胞応答について、１０人の健康なドナーが評価された。６人のドナーはＢＣＧワクチン接種の前歴があり、そのうちの３人は遅延型過敏症検査で陽性の既往歴があったが、胸部Ｘ線像は陰性であった。１人は以前にクォンティフェロン検査が陰性であった
【０２９９】
ＭＳＴの１０日間のエクスビボ拡大後、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔは、対象につき５つの抗原のうちの３つの中央値に対して反応性を示した（範囲１〜５、表５）。
【表９−１】
2021522245.tif 000011
【表９−２】
2021522245.tif 000012
【０３００】
ＢＣＧ免疫化（図２Ａ）および非免疫化ドナー（図２Ｂ）の比較は、ＢＣＧ非免疫化ドナー（表６）においてＰＰＥ６８（ｐ＝０．０２８）およびＡＤＫ（ｐ＝０．０１５）に対する反応の可能性が高いことを示した。
【表１０】
2021522245.tif 000013
【０３０１】
培養物は平均４．４倍拡大し、７〜１１×１０７細胞が回収された（図３Ａ）。
【０３０２】
エクスビボで拡大させたＭＳＴは主にＣＤ４＋Ｔ細胞である
培養後のバルクＭＳＴのフローサイトメトリーは、細胞の大部分がＣＤ４＋Ｔ細胞（中央値６３．７％ＣＤ３＋／ＣＤ４＋、範囲４７．５〜７７．７％、図３Ｂ）であり、ＣＤ８＋Ｔ細胞（中央値６％ＣＤ３＋／ＣＤ８＋、範囲１．１〜２３％）は少数であることを示した。ＣＤ４＋Ｔ細胞の大部分はエフェクター（中央値６６．１％、範囲６０．８〜６８．９％）であり、セントラルメモリー集団は小さかった（中央値１．６％、範囲１．４〜４．４％）（図３Ｃ）。Ｂ細胞またはＮＫ細胞の成長はなかった。
【０３０３】
マイコバクテリア応答は、原発性免疫不全症の患者にはほとんど見られない
原発性免疫不全障害およびＭ．ａｖｉｕｍ  ｃｏｍｐｌｅｘまたはＭ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓによる侵襲性感染症の７人の対象をマイコバクテリア抗原に対する応答について試験した。基礎的診断は、ＩＬ１２ＲＢ１欠損症、ＮＦＫＢ１ハプロ不全、ＩＦＮＧＲ１欠損症、ＧＡＴＡ２ハプロ不全、歌舞伎症候群、ＮＥＭＯ欠損症、および未定義の複合免疫不全（ＣＩＤ）であった。抗ＩＦＮ−γ自己抗体ならびにＭ．ａｖｉｕｍおよびＭ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓによる侵襲性感染症の２人の患者も評価された。１０日間の拡大後、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴによる特異性の評価により、ＰＩＤの７人の患者のうち２人においてマイコバクテリア抗原に対する特異性が示された（図５Ａ、表７）。
【表１１−１】
2021522245.tif 000014
【表１１−２】
2021522245.tif 000015
【０３０４】
抗ＩＦＮ−γ自己抗体を有する両対象は、マイコバクテリア抗原（一方の対象ではＡＧ８５ＢおよびＡＤＫ、もう一方の対象ではＥＳＸＡおよびＥＳＸＢ）に対して検出可能なＴ細胞応答を有した。培養期間中の細胞拡大は、ＮＦＫＢ１ハプロ不全の対象（３．２倍の拡大）を除いて、すべての患者において最小であるか、または存在しなかった（図５Ｂ）。
【０３０５】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ溶解物またはＭ．ａｖｉｕｍセンシチンに対して拡大されたＭＳＴは、免疫優勢抗原を認識する
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓまたはＭ．ａｖｉｕｍセンシチンからの溶解物で刺激した後に１０日間培養した後の、５人の試験したドナーすべてからのＭＳＴは、マイコバクテリア抗原ｐｅｐｍｉｘまたは溶解物もしくはセンシチンに対して特異性を示した（図６）。ｐｅｐｍｉｘ、溶解物、またはセンシチンに対する拡大後のＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴによるＭＳＴ応答の分析では、ＰＰＥ６８（ｐ＝０．０３２）に対する応答において有意差が示されたが、他の抗原に対して有意差はなかった（表８）。
【表１２】
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【０３０６】
ペアワイズ分析では、ｐｅｐｍｉｘ対センシチン（ｐ＝０．０１６）を使用して生成されたＭＳＴのＰＰＥ６８に対する応答において統計的に有意な差が示されたが、ｐｅｐｍｉｘ対溶解物（ｐ＝０．１７３）または溶解物対センシチン（ｐ＝０．１１６）を使用して生成されたＭＳＴ間に差はなかった。ｐｅｐｍｉｘ、センシチン、または溶解物を使用して生成されたＭＳＴの比較表面フローサイトメトリーはすべて、ＣＤ４＋エフェクターメモリー細胞の優勢を示し、亜集団間に顕著な差はなく、γ／δＴ細胞の割合は最小であった（図１０）。
【０３０７】
マイコバクテリアＡＧ８５ＢおよびＥＳＸＢのエピトープは種間で様々に保存される
ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴを利用したＡＧ８５ＢおよびＥＳＸＢ内でのエピトープ認識のマッピングは、複数のドナーによって認識された各抗原内のいくつかのエピトープを示した。ＡＧ８５Ｂ内で、５人のドナーがアミノ酸位置６１〜７５および１３１〜１４５を包含するペプチド＃７および１４を認識した（図７）。ペプチド１５（ＡＡ１４１〜１５５）は２人のドナーにおいて反応を誘発し、ペプチド１９（ＡＡ１８１〜１９５）は３人のドナーにおいて反応を誘発した。ＥＳＸＢ内で、Ｃ末端（ＡＡ７１〜１００）のペプチド８〜１０が３人のドナーによって認識された。予測アルゴリズムを使用した共有ドナーＨＬＡ対立遺伝子の分析［ＮｅｔＭＨＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣＩＩ／），ＩＥＤＢ  ＭＨＣ  Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ（ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ）］（３４，３５）は、ＨＬＡ  ＤＲＢ４  ０１：０１、ＤＰＢ１  ０４：０１／０２、ＤＲＢ１  ０７：０１、およびＤＲＢ３  ０２：０２によるＡＧ８５ＢペプチドのクラスＩＩ  ＭＨＣ制限、ならびにＨＬＡ  ＤＱＢ１  ０３：０１／０２およびＤＲＢ４  ０１：０１によるＥＳＸＢペプチドのクラスＩＩ制限を示唆した（表１）。これらのエピトープの種間保存の分析は、ＡＧ８５Ｂエピトープの高度な保存（６７〜１００％、図１１）、およびＥＳＸＢエピトープの低から中程度の保存（４０〜９３％、図１２）を示した。
【０３０８】
考察
マイコバクテリア感染症は免疫不全の宿主によく見られ、治療は非常に困難な場合がある。免疫適格性個人の間でも、多剤耐性結核は新たな問題であり、一次抗マイコバクテリア剤に対する耐性が世界中の新規症例の４％および以前に治療された症例の２１％で報告された（１）。ＳＣＩＤまたは同様に重篤な形態のＰＩＤの乳児では、Ｔ細胞免疫の回復なしにマイコバクテリア感染を除去することは不可能である場合が多い（２）。ＢＣＧ免疫化された兄弟からの繰り返し全血輸血の使用は、ＢＣＧｏｓｉｓの向上を伴うＳＣＩＤの乳児に対する補助療法として報告された（３６）。したがって、マイコバクテリアを標的とする養子免疫療法は、抗生物質と並んで有用な補助療法であり得る。
【０３０９】
我々の健康なドナーに由来するＭＳＴの機能性の分析は、選択されたマイコバクテリア抗原に対する応答がＣＤ４＋に制限され、多機能であることを示した。すべてのドナー（ＢＣＧワクチン接種またはその他）は、少なくとも１つの抗原を認識した。ＢＣＧワクチン接種と非ワクチン接種との間の反応分析は、ＰＰＥ６８のＥＬＩＳＰＯＴでの反応規模で差を示したが、他の４つの抗原では差はなかった。ＥＳＸＡおよびＥＳＸＢは、これらの遺伝子がＢＣＧで除去されているという事実にもかかわらず、両方のドナー群によって認識された。結核感染症の前歴のあるドナーはいなかった。これは、ＥＸＳＡおよびＥＳＸＢ（ならびに非ワクチン接種ドナーにおける他の抗原）に対する反応性が、他の遭遇したマイコバクテリア種に対する前の応答を表していることを示唆している可能性がある。正しい場合、これはこれらの種間で共有される交差反応性エピトープの存在を支持するだろう。Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘサイトカイン分析は、抗原再刺激に応答した一貫したＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、およびＧＭ−ＣＳＦの産生、ならびにドナーのサブセットにおけるＩＬ−１３およびＭＩＰ１ａを示した。ＧＭ−ＣＳＦの産生は、実験的なマイコバクテリア感染の設定において説明されてきたが、ヒトの感染におけるその役割はあまり明確ではない（３７）。ＩＬ−１３は、線維症および粘液産生に関連するＴｈ２サイトカインであり、ＢＣＧ非ワクチン接種ドナーでのみ認められた。ＢＣＧワクチン接種は、ワクチン接種されたドナーにＩＬ−１３が存在しない原因である可能性があり、ワクチン接種された個人のこれらの抗原に対するＴｈ１の歪んだサイトカイン応答を強化する可能性がある。多くの研究は、マイコバクテリア症を制御するためにマクロファージを活性化する際のＴｈ１  ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の重要性を強調している（３８）。実験モデルでは、Ｔｈ２サイトカインは、マイコバクテリア感染症の進行に関連しているが、ヒト結核では、Ｔｈ２サイトカインプロファイルの上昇がマイコバクテリア感染症の原因であるか、または結果であるかは不明である。
【０３１０】
部分的にＨＬＡが一致するウイルス特異的Ｔ細胞を用いた養子免疫療法では、１つ以上の免疫優性ウイルスエピトープのＨＬＡ制限を同定することがインビボでの抗ウイルス活性と相関しているため、ＶＳＴドナーとレシピエントとの間のＨＬＡ一致アルゴリズムは、この療法の有効性を向上させる際の重要なステップの１つであるように思われる（３９）。マイコバクテリアのエピトープおよびＨＬＡ制限のマッピングは、部分的に一致したＭＳＴの「既成」使用にも不可欠である可能性がある。ここでは、ＡＧ８５ＢおよびＥＳＸＢ内のいくつかの新規エピトープについて説明する。ＡＧ８５Ｂ内では、認識されたタンパク質領域（ＡＡ６１〜７５、１３１〜１４５、１４１〜１５５、１８０〜１９５）は、種間で非常に安定していた。以前の研究では、これらの領域が二次構造の形成に関与していることが示され、これは、それらの相対的な安定性を説明し得る。アミノ酸１８１〜１９５は、Ｔ細胞エピトープを含ことが以前に予測され、エクスビボＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を誘発したＡＧ８５Ｂのドメインと重複した（３１）。ＥＳＸＢのＣ末端内の認識されたエピトープは、種間でより多様であった。タンパク質のこの領域は、ＥＳＸＢ複合体の単球結合に必須であると説明されており、したがって、マイコバクテリアの病因において重要な役割を果たし得る（４０）。ＥＳＸＡ／ＥＳＸＢの除去がＢＣＧの減衰に寄与すると仮定されている。これらの抗原のＨＬＡ制限の幅、ならびに臨床的に単離されたマイコバクテリア種におけるエピトープの安定性をよりよく理解するためには、広幅のＨＬＡ型を有するさらなるドナーのさらなる検査が必要であろう。異なるマイコバクテリア種間の公開されているタンパク質配列の比較は、異なる程度の相同性を示す（表９）。
【表１３】
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【０３１１】
マイコバクテリア種のゲノムは平均２ＭＢで、多くの種で＞２，０００の遺伝子が記載されている。したがって、この研究で試験された５つの抗原以外にも多数の免疫原性タンパク質が存在する可能性がある。しかしながら、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ溶解物およびＭ．ａｖｉｕｍセンシチンを偏りのない抗原源として使用しても、選択したタンパク質に対する反応性が得られた。抗原応答の幅は、選択されたタンパク質よりも非常に広い可能性があるが、拡大中の抗原競合により薄れることはなかった。以前の研究でも同様に、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓと非結核性マイコバクテリアとの間の交差反応性が記載されているが、これらの共有抗原に対する免疫応答の生物学的重要性は不明なままである（４１）。
【０３１２】
γ／８Ｔ細胞がマイコバクテリアからのリン酸抗原によって活性化されるエビデンスもあるが、マイコバクテリア感染症の制御におけるそれらの役割は不明なままである（４２）。しかしながら、タンパク質に加えて、脂質および炭水化物を含むＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓからの全細胞溶解物を利用した場合でも、γ／８Ｔ細胞の拡大は観察されなかった。
【０３１３】
Ｔ細胞免疫は抗マイコバクテリア防御に明らかに重要であるが、ＧＡＴＡ２ハプロ不全、ＩＦＮＧＲ１／２欠損症、慢性肉芽腫症、およびＩＲＦ８欠損症などの多くの形態の原発性免疫不全症によって示されるように、骨髄細胞も不可欠である。ＰＩＤの試験した患者のうち、マイコバクテリア抗原に対する応答は、ＮＦＫＢ１ハプロ不全（５つの抗原のうちの２つ）およびＮＥＭＯ（５つの抗原のうちの１つ）を有する２人の患者でのみ見られた。応答は、抗ＩＦＮ−γ自己抗体を有する両方の試験した患者において検出可能であり、これは、患者の血清の不在下でこれらの患者の細胞のエクスビボ拡大で予想された。ＮＦＫＢ１および関連障害は、Ｔ細胞増殖の障害を引き起こすことが十分に説明されており、わずかなＴ細胞の異常もＩＦＮＧＲ１欠損症で説明されている（４３、４４）。Ｔ細胞リンパ球減少症は、ＧＡＴＡ２ハプロ不全にも記載されている（４５）。
【０３１４】
この研究では、マイコバクテリア特異的Ｔ細胞が、適正製造基準と互換性のある迅速な拡大プロトコルを使用して、健康なドナーから確実に拡大され得ることを示した。Ｔ細胞療法単独では、主に骨髄性欠損を伴うＰＩＤの形態には役に立たない可能性があるが、さもなければ数ヶ月後まで発生することが予想されないであろう感染のＴ細胞制御の回復を早めるために、移植後の骨髄生着直後にＭＳＴを使用することを想定することができる。理想的なドナー、抗原、およびＴ細胞の特徴をよりよく特徴付けるためにはさらなる作業が必要であるが、マイコバクテリアを標的とするＴ細胞免疫療法は、侵襲性マイコバクテリア感染症を有する患者にとって有用な将来の治療となり得る。
【０３１５】
実施例６−インビボでのマイコバクテリア特異的Ｔ細胞機能の評価
インビボでのマイコバクテリア特異的Ｔ細胞の生物学的活性を評価するために、免疫不全のヒト化ＮＳＧマウス（ｈｕ−ＮＳＧ）が利用されるであろう。このモデルは免疫不全であり、Ｔ細胞および他のヒト細胞系統の迅速な生着を可能にする。
【０３１６】
マイコバクテリア種および感染方法：ＮＳＧマウスを、エアロゾル化されたマイコバクテリア（Ｍ  ａｖｉｕｍ株ＣｈｅｓｔｅｒまたはＭ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株Ｈ３７ＲＶを含み得る）に曝露する。マイコバクテリアの試料を、マウスに感染する前に解凍して４週間培養する。エアロゾル化のために５０〜４００ＣＦＵの用量を１ｍｌの食塩水で利用する。
【０３１７】
ＭＳＴ注入：すべてのＭＳＴ細胞注入は、凍結保存されたバッチからの新鮮な細胞または解凍された細胞を使用して行われる。イソフルランを使用してマウスを麻酔する。麻酔は、動物の足趾をつまんだときの応答および深呼吸（２秒に１回）の欠如によって確認される。ゲージ２７の針を使用して、細胞をゆっくりと静脈内注射する（２×１０４〜１０×１０６細胞／５０ｕＬのＰＢＳ）。マイコバクテリア感染なしでＭＳＴ単独を受けるか、ＭＳＴ注入なしでマイコバクテリア感染を受けるかのいずれかの対照群が維持される。
【０３１８】
臨床観察．腫瘍もしくは免疫細胞、またはその両方を注射した後、特に呼吸器症状に焦点を当てて、マイコバクテリア感染の臨床的徴候および症状について動物を毎日観察する。感染後最大１２週間マウスを追跡する。マイコバクテリアの投与量およびＭＳＴの用量に基づく生存時間は、マトリックスグリッドを使用して決定される。
【０３１９】
以下の基準の１つ以上の存在（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｕ．ｅｄｕ／ｏｒｃｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ／ｉａｃｕｃ／ｐｏｌｉｃｉｅｓ−ａｎｄ−ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ／ｔｕｍｏｒ−ｐｏｌｉｃｙ−ｆｏｒ−ｍｉｃｅ−ａｎｄ−ｒａｔｓ／から）は、安楽死の徴候である：運動障害（食物および水に到達できない）、直立状態を維持できない、重要な生理学的機能への腫瘍干渉（呼吸、咀嚼、嚥下、排尿、排便、または運動を含む）、腫瘍が摩耗されるかもしくは運動に干渉する動物の腹部またはその内腿の腫瘍の位置、＞４８時間の背が丸まった異常姿勢、呼吸困難およびチアノーゼ［青みがかった耳介（耳）または脚または粘膜］、臨床的脱水状態および／または長期にわたる食物摂取量の減少、筋肉萎縮ならびに嗜眠の徴候および身体活動の欠如、体重の２０％を超える体重減少、４８時間を超える慢性下痢、重度の貧血（蒼白な耳介（耳）または脚または粘膜）、任意の開口部からの血痕または膿性分泌物、自傷、＞４８時間のグルーミング行動の欠如／ぼさぼさの／乱れた被毛、眼球突出、顕著な腹部膨満、行動の変化、落ち着きのなさ、発作、または外部刺激に応答しない意識喪失。
【０３２０】
免疫学的アッセイ：動物の血液および組織を、マイコバクテリア感染の存在（組織の抗酸染色による）、ならびに注入されたＭＳＴの存在および拡大について分析する。採血のために眼窩後出血が行われる（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｊｈｕ．ｅｄｕ／ａｎｉｍａｌｃａｒｅ／ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ／ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ．ｈｔｍｌ）。標準的なヘパリン処理または非ヘパリン処理されたマイクロヘマトクリットキャピラリーチューブを採血に使用する。手順の前に、動物をイソフルランで麻酔する。ＭＳＴ分析は、マイコバクテリアｐｅｐｍｉｘを使用してインターフェロン−ガンマＥＬＩＳｐｏｔにより行われ、フローサイトメトリーを介して注入されたＭＳＴ株に関連するＨＬＡタンパク質を同定する。細胞内サイトカイン染色は、インビボで、複数の時点でＭＳＴサイトカイン機能を決定するために行われる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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