(57)【要約】  本発明は、１つ以上の有機溶媒を含む溶液または懸濁液中の未溶解および／または不溶性ＧＬＰ−１ペプチドのインキュベーションを含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）未溶解および／または不溶性リラグルチドならびに有機溶媒アセトニトリルまたはＤＭＦを含む第１の組成物を得るステップであって、前記第１の組成物が、溶液または懸濁液の形態である、ステップと、
（ｂ）前記第１の組成物を２〜８５℃の範囲の温度でインキュベートするステップと、を含む、方法であって、
前記有機溶媒がＤＭＦである場合、前記インキュベートすることが、少なくとも２０分の期間、（ｉ）５．０未満のｐＨで、５〜２８％（重量／重量）の範囲のＤＭＦの濃度で、または（ｉｉ）５．０〜５．５の範囲のｐＨで、０〜３５％（重量／重量）の範囲のＤＭＦの濃度で行われるか、あるいは
前記有機溶媒がアセトニトリルである場合、前記インキュベートすることが、少なくとも２分の期間、（ｉ）６．０未満のｐＨで、少なくとも３０％（重量／重量）のアセトニトリルの濃度で、（ｉｉ）３．５未満のｐＨで、少なくとも１４％（重量／重量）のアセトニトリルの濃度で、または（ｉｉｉ）前記温度が少なくとも５０℃である場合、（１）５．５〜６．０の範囲のｐＨで、１０％（重量／重量）未満のアセトニトリルの濃度で、もしくは（２）３．５未満のｐＨで行われる、方法。
【請求項２】
前記方法が、場合によっては本明細書のアッセイ（Ｉ）で記載されるように決定される、３時間のインキュベーション期間後に少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌの溶解リラグルチドの増加を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）での前記インキュベーションの温度が、２〜４０℃、４０〜８５℃、または１０〜５０℃からなる群から選択される、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の組成物が、溶液または懸濁液の形態である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記有機溶媒が、ＤＭＦであり、ステップ（ｂ）（ｉ）において、前記ＤＭＦの濃度が、７〜２３％（重量／重量）の範囲である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記期間が、少なくとも１時間である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記有機溶媒が、ＤＭＦであり、ステップ（ｂ）（ｉ）において、
ａ．前記ｐＨが、３．８未満であり、
ｂ．前記ＤＭＦの濃度が、９〜２５％（重量／重量）の範囲であり、
ｃ．前記期間が、少なくとも８時間である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記有機溶媒が、ＤＭＦであり、ステップ（ｂ）において、前記インキュベーション時間が少なくとも８時間である場合、前記インキュベーションが、（ｉ）５．０未満のｐＨで、２〜４０％（重量／重量）の範囲のＤＭＦの濃度で、または（ｉｉ）５．０〜６．０の範囲のｐＨで、０〜４０重量％（重量／重量）の範囲のＤＭＦの濃度で行われる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記有機溶媒が、ＤＭＦであり、ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、前記ＤＭＦの濃度が、最大２０％（重量／重量）または最大１９％（重量／重量）である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記有機溶媒が、アセトニトリルであり、ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、前記アセトニトリルの濃度が、少なくとも２０％（重量／重量）または少なくとも５５％（重量／重量）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記有機溶媒が、アセトニトリルであり、ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、前記ｐＨが、３．４未満または３．２未満である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記有機溶媒が、アセトニトリルであり、ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、前記期間が、最大１６時間、または５分〜２０時間の範囲である、請求項１または１０〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記有機溶媒が、アセトニトリルであり、ステップ（ｂ）（ｉｉｉ）（２）において、前記アセトニトリルの濃度が、少なくとも４０％（重量／重量）または少なくとも４５％（重量／重量）である、請求項１または１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記有機溶媒が、アセトニトリルであり、ステップ（ｂ）（ｉｉ）またはステップ（ｂ）（ｉｉｉ）（２）において、前記ｐＨが、３．４未満または３．３未満である、請求項１または１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、アセトニトリルまたはＤＭＦを実質的に含まない組成物を得るステップを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＬＰ−１ペプチドの可溶性を増加させるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＬＰ−１ペプチドは、生理学的に活性であり、ｐＨ７．４で水中に容易に溶解する、第１の物理的構造、および非常に少ないＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性を有するか、またはＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性を全く有さず、ｐＨ７．４で水中に実質的に不溶性である、第２の物理的構造で存在する。物理的構造のこの変化は、任意の理論に束縛されることなく、ＧＬＰ−１ペプチド中のアルファ−ヘリックス二次構造のベータ−シート二次構造への変換によって説明され得る（例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９４，８３（８），１１７５−８０）。
【０００３】
水を含むＧＬＰ−１溶液が撹拌され、疎水性表面に曝露されるか、または大きな空気／水界面を有する場合、未溶解および／または不溶性ＧＬＰ−１ペプチドが形成され得る。ＧＬＰ−１ペプチドは、例えば、精製中、取り扱いの単純な結果として未溶解および／または不溶性となる傾向があることが知られている（例えば、Ｓｅｎｄｅｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９８，８７（２），１８３−１８９）。加えて、ＧＬＰ−１ペプチドは、それらの製造のプロセス中にそれらの未溶解および／または不溶性形態へと変化し得る。例えば、ポンプを通した混合操作または連続動作は、大規模な製造プロセスにおける共通の操作であり、これらの操作は、撹拌、空気／水界面、ならびに／またはＧＬＰ−１ペプチドの未溶解および／もしくは不溶性形態をもたらす疎水性表面との接触を引き起こす。
【０００４】
ＧＬＰ−１ペプチドの未溶解および／または不溶性形態の存在は、活性ＧＬＰ−１ペプチドの大規模生成に大きく影響を及ぼす。大規模生成では、少量の未溶解および／または不溶性ＧＬＰ−１ペプチドでも、生成の費用効率を低下させる。
【０００５】
ＷＯ０１／５５２１３は、不溶性ＧＬＰ−１ペプチドを溶解するために、水溶液中の非常にアルカリ性のｐＨを使用することを記載するとされている。ＷＯ２００６／０５１１１０は、ＧＬＰ−１ペプチドの物理的安定性などを改善するために、特定の加熱条件およびインキュベーション時間と組み合わせて水溶液中のアルカリ性のｐＨを使用することを記載するとされている。
【０００６】
溶液中のＧＬＰ−１ペプチドを提供するための改善された方法は依然として、例えば、活性な、可溶性ＧＬＰ−１ペプチドおよびその安定な医薬製品の製造のための高収率方法を提供するために、またはより単純な生成方法を許容するために、望ましい。そのような改善された方法には、未溶解および／または不溶性ＧＬＰ−１ペプチドを活性な、可溶性ＧＬＰ−１ペプチドに変換することが含まれる。
【発明の概要】
【０００７】
一部の実施形態において、本発明の方法は、未溶解および／または不溶性ＧＬＰ−１ペプチドを、水と１つ以上の有機溶媒とを含む溶液または懸濁液において、活性な、可溶性ＧＬＰ−１ペプチドへと、特定の条件下で溶解することを含む。
【０００８】
一部の実施形態において、本発明は、（ａ）未溶解および／または不溶性リラグルチドならびに有機溶媒アセトニトリルまたはＤＭＦを含む第１の組成物を得るステップであって、当該第１の組成物が、溶液または懸濁液の形態であるステップと、（ｂ）当該第１の組成物を２〜８５℃の範囲の温度でインキュベートするステップと、を含む、方法に関し、
当該有機溶媒がＤＭＦである場合、当該インキュベートすることは、少なくとも２０分の期間、（ｉ）５．０未満のｐＨで、５〜２８％（重量／重量）、または（ｉｉ）５．０〜５．５の範囲のｐＨで、０〜３５％（重量／重量）の範囲の当該ＤＭＦの濃度で行われるか、あるいは
当該有機溶媒がアセトニトリルである場合、当該インキュベートすることは、少なくとも２分の期間、（ｉ）６．０未満のｐＨで、少なくとも３０％（重量／重量）の当該アセトニトリルの濃度で、（ｉｉ）３．５未満のｐＨで、１４％（重量／重量）の当該アセトニトリルの濃度で、または（ｉｉｉ）当該温度が少なくとも５０℃である場合、（１）５．５〜６．０の範囲のｐＨで、１０％（重量／重量）未満の当該アセトニトリルの濃度で、もしくは（２）３．５未満のｐＨで行われる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明者らは、驚くべきことに、未溶解および／または不溶性ＧＬＰ−１ペプチドを、水と１つ以上の有機溶媒とを含む溶液において、活性な、可溶性ＧＬＰ−１ペプチドへと、特定の条件下で溶解することができることを見出した。一部の実施形態において、未溶解および／または不溶性ＧＬＰ−１ペプチドは、例えば、５００ｎＭ超または１０００ｎＭ超などの１００ｎＭ超のヒトＧＬＰ−１受容体上のＥＣ５０で、実質的に非活性である。
【００１０】
一部の実施形態において、本発明の方法は、（ａ）ＧＬＰ−１ペプチドおよび１つ以上の有機溶媒を含む組成物を得るステップと、（ｂ）当該溶液を少なくとも５分の期間などの期間インキュベートするステップと、を含み、当該組成物は、溶液または懸濁液の形態である。一部の実施形態において、本発明の方法は、（ａ）ＧＬＰ−１ペプチドおよび１つ以上の有機溶媒を含む組成物を得るステップと、（ｂ）当該溶液を本明細書で定義される期間インキュベートするステップと、を含み、当該組成物は、溶液または懸濁液の形態である。
【００１１】
一態様では、本発明は、（ｘ）溶解および／もしくは可溶性ＧＬＰ−１ペプチド、（ｙ）溶液中のＧＬＰ−１ペプチドの貯蔵安定性の改善、または（ｚ）溶解ＧＬＰ−１ペプチドの量の増加を提供するためのより単純な方法を提供する。別の態様では、本発明は、（ｘ）〜（ｙ）のうちの１つ以上の組み合わせを提供する。「溶解ＧＬＰ−１ペプチドの量の増加」は、不溶性ＧＬＰ−１ペプチドの量の減少および可溶性ＧＬＰ−１ペプチドの実質的に同一の量の増加として観察され得る。本発明の方法による不溶性ＧＬＰ−１ペプチドの減少または除去は、可溶性および不溶性ＧＬＰ−１ペプチドの両方を含む溶液を含む、不溶性ＧＬＰ−１ペプチドを含む溶液において行われ得る。本発明はまた、例示的な実施形態の開示から明らかとなる、さらなる問題を解決することができる。
【００１２】
一部の実施形態において、本発明の方法は、水を含む溶液中の溶解および／または可溶性ＧＬＰ−１ペプチドの量を増加させる。一部の実施形態において、本発明の方法は、少なくとも６０％（重量／重量）の水などの水を含む溶液中の溶解ＧＬＰ−１ペプチドの量の増加を提供する。
【００１３】
一部の実施形態において、本発明の方法は、例えば、５℃で１年間もしくは２年間の貯蔵後、または室温で２ヶ月間の貯蔵後の、溶液中のＧＬＰ−１ペプチドの貯蔵安定性の改善を提供する。一部の実施形態において、本明細書で使用されるＧＬＰ−１ペプチドの貯蔵安定性は、中間体生成物の一部としてのＧＬＰ−１ペプチドの貯蔵安定性を指す。中間体生成物の一部としてのＧＬＰ−１ペプチドは、精製ステップ後などの医薬製品を調製するプロセスに存在し得る。一部の実施形態において、本明細書で使用されるＧＬＰ−１ペプチドの貯蔵安定性は、中間体生成物の一部としてのＧＬＰ−１ペプチドの可溶性を指す。中間体生成物は、典型的には、２ヶ月以内、例えば、２週間以内または１週間以内に使用され得る。
【００１４】
一部の実施形態において、室温は、２１〜２５℃、例えば、２３℃である。
【００１５】
一部の実施形態において、本発明の方法は、任意に本明細書においてアッセイ（Ｉ）で記載されるように、３時間のインキュベーション期間後に少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌの溶液中のＧＬＰ−１ペプチドの増加を提供する。一部の実施形態において、本発明の方法は、任意に本明細書においてアッセイ（Ｉ）で記載されるように、３時間のインキュベーション期間後に少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌの溶解ＧＬＰ−１ペプチドの増加を提供する。
【００１６】
一部の実施形態において、有機溶媒を含む組成物（溶液または懸濁液など）に関連して本明細書で使用される「ｐＨ」という用語は、例えば、有機溶媒の添加前の、有機溶媒を含まない当該組成物溶液において決定されるｐＨを指す。
【００１７】
一部の実施形態において、本発明の方法は、（ａ）ＧＬＰ−１ペプチドおよび１つ以上の有機溶媒を含む組成物を得るステップと、（ｂ）当該溶液を少なくとも５分の期間インキュベートするステップと、を含み、当該組成物は、溶液または懸濁液の形態である。
【００１８】
一部の実施形態において、本発明の方法は、以下の追加ステップ：（ｃ）ステップ（ｂ）から得られる組成物中の当該有機溶媒の濃度を減少させ、任意にＧＬＰ−１ペプチドを単離することを含む。
【００１９】
一部の実施形態において、本発明の方法のステップ（ｂ）でのインキュベーションは、ｐＨ１〜１３の範囲のｐＨで行われる。
【００２０】
一部の実施形態において、本発明の方法のステップ（ｂ）でのインキュベーションは、当該１つ以上の有機溶媒を含む溶液の凝固点と沸点との間の温度で行われる。一部の実施形態において、ステップ（ｂ）での当該インキュベーションの温度は、当該インキュベーションを受けた溶液の凝固点を上回り、５０℃を下回る。一部の実施形態において、ステップ（ｂ）での当該インキュベーションの温度は、５０〜８５℃の範囲である。
【００２１】
一部の実施形態において、本発明の方法のステップ（ｂ）でのインキュベーションは、５分〜４８時間の期間行われる。
【００２２】
一部の実施形態において、「＊」という用語は、乗算を指す。一部の実施形態において、「１つ（ａ）」という用語は、「１つ以上」を意味する。一部の実施形態において、「約」という用語は、言及された値の±１０％を意味する。別段本明細書に示されない限り、単数形で提示される用語はまた、複数の状況も含む。
【００２３】
ＧＬＰ−１ペプチドに関して本明細書で使用される場合、「不溶性」または「実質的に不溶性」、例えば、「不溶性ＧＬＰ−１ペプチド」という用語は、非活性であり、０．５ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、０．１または０．０１ｍｇ／ｍｌ未満のｐＨ７．４での水中の可溶性を有するＧＬＰ−１ペプチドを指す。同様に、ＧＬＰ−１ペプチドと関連して本明細書で使用される場合、「未溶解」、例えば、「未溶解ＧＬＰ−１ペプチド」という用語は、０．５ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、０．１または０．０１ｍｇ／ｍｌ未満の可溶性を有するＧＬＰ−１ペプチドを指し、当該可溶性は、任意のｐＨで、例えば、ｐＨ３〜１１の範囲のｐＨで、水および／または有機溶媒を含む溶液中であり得る。一部の実施形態において、ＧＬＰ−１ペプチドに関して本明細書で使用される場合、「未溶解」、例えば、「未溶解ＧＬＰ−１ペプチド」という用語は、０．５ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、０．１または０．０１ｍｇ／ｍｌ未満のｐＨ７．４での水中の可溶性を有するＧＬＰ−１ペプチドを指す。
【００２４】
ＧＬＰ−１ペプチドと関連して本明細書で使用される場合、「未溶解」、例えば、「未溶解ＧＬＰ−１ペプチド」という用語は、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも０．７または１ｍｇ／ｍｌのｐＨ７．４での水中の可溶性を有するＧＬＰ−１ペプチドを指し、当該可溶性は、任意のｐＨで、例えば、ｐＨ３〜１１の範囲のｐＨで、水および／または有機溶媒を含む溶液中であり得る。一部の実施形態において、ＧＬＰ−１ペプチドに関して本明細書で使用される場合、「溶解」、例えば、「溶解ＧＬＰ−１ペプチド」という用語は、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも０．７または１ｍｇ／ｍｌのｐＨ７．４での水中の可溶性を有するＧＬＰ−１ペプチドを指す。同様に、ＧＬＰ−１ペプチドに関して使用される場合、「可溶性」または、例えば、本明細書で使用される「可溶性ＧＬＰ−１ペプチド」という用語は、活性であり、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも０．７または１．０ｍｇ／ｍｌのｐＨ７．４での水中の可溶性を有するＧＬＰ−１ペプチドを指す。ＧＬＰ−１ペプチドの可溶性は、本明細書に記載されるアッセイ（ＩＩ）の方法を使用して決定され得る。
【００２５】
ＧＬＰ−１ペプチドに関して使用される場合、「活性」、例えば、本明細書で使用される「活性ＧＬＰ−１ペプチド」という用語は、１０ｎＭ未満、例えば、５ｎＭ未満、１ｎＭ未満、または０．５ｎＭ未満のＥＣ５０によって発現されるＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性を有するＧＬＰ−１ペプチドを指す。ＧＬＰ−１ペプチドに関して使用される場合、「非活性」、例えば、本明細書で使用される「非活性ＧＬＰ−１ペプチド」という用語は、２０ｎＭ超、例えば、０．１μＭ超、０．５μＭ超、または１μＭ超のＥＣ５０によって発現されるＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性を有するＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性を有するＧＬＰ−１ペプチドを指す。
【００２６】
一部の実施形態において、ＧＬＰ−１ペプチドのＥＣ５０は、本明細書に記載されるアッセイ（ＩＩ）の方法を使用して決定される。「ＥＣ５０」という用語は、用量応答曲線への参照によってベースラインと最大値との中間の応答を誘発する濃度を指す。言い換えれば、ＥＣ５０は、その最大効果の５０％が観察される濃度を表すと見られ得る。ＥＣ５０値が低いほど、ＧＬＰ−１ペプチドの、効力とも呼ばれる活性が良好である。一部の実施形態において、ＧＬＰ−１ペプチドの活性は、ヒトＧＬＰ−１受容体の活性化を指す。ＧＬＰ−１ペプチドの活性は、ヒトＧＬＰ−１受容体を発現する膜を含有する媒体において、および／またはヒトＧＬＰ−１受容体を発現する全細胞でのアッセイにおいて決定され得る。例えば、ヒトＧＬＰ−１受容体を発現する安定なトランスフェクト細胞株からの精製された血漿膜は、ＧＬＰ−１ペプチドで刺激され得、ｃＡＭＰ生成の効力は、例えば、特定の抗体を使用して捕捉され得る、内因的に形成されたｃＡＭＰと外因的に添加されたビオチン標識ｃＡＭＰとの間の競合に基づいて、測定され得る。また、またはあるいは、ＧＬＰ−１ペプチドへのヒトＧＬＰ−１受容体の応答は、例えば、ヒトＧＬＰ−１受容体を発現し、プロモーターに結合したｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）のＤＮＡおよびホタルルシフェラーゼ（ＣＲＥルシフェラーゼ）の遺伝子を含有する安定にトランスフェクトされたＢＨＫ細胞株において、レポーター遺伝子アッセイで測定され得、ＧＬＰ−１受容体の活性化の結果としてｃＡＭＰが生成される場合、これは順に、ルシフェラーゼの発現をもたらし、ルシフェラーゼは、酵素によって、オキシルシフェリンに変換され、測定されてインビトロ効力の尺度である、生物発光を生成する、ルシフェリンを添加することによって決定され得、そのようなアッセイの１つの非限定的な例は、本明細書においてアッセイ（ＩＩ）に記載されている。
【００２７】
有機溶媒
本発明の方法で使用される有機溶媒は、アセトニトリル、ＤＭＦ、およびそれらの混合物からなる群から選択される。一部の実施形態において、有機溶媒は、アセトニトリルである。一部の実施形態において、有機溶媒は、ＤＭＦである。本明細書で使用されるとき、「ＤＭＦ」という用語は、ジメチルホルムアミドを指し得る。
【００２８】
一部の実施形態において、有機溶媒の濃度は、０．０１〜８０％（重量／重量）の範囲である。一部の実施形態において、有機溶媒の濃度は、溶液中のＧＬＰ−１ペプチドの０．５ｍｇ／ｍｌ以下が室温で３時間以内に沈殿する濃度未満である。一部の実施形態において、有機溶媒は、少なくとも１％（重量／重量）の濃度のフェノールである。一部の実施形態において、「有機溶媒の濃度」という用語は、複数の有機溶媒が存在する場合の有機溶媒の総濃度を指す。一部の実施形態において、「有機溶媒の濃度」という用語は、例えば、ステップ（ａ）後およびステップ（ｂ）前に、本発明の第１のインキュベーション前に決定される有機溶媒の濃度を指す。
【００２９】
最終生成物
一部の実施形態において、ステップ（ｂ）から得られる組成物は、溶液の形態である。一部の実施形態において、ステップ（ｂ）から得られる組成物は、懸濁液の形態である。一部の実施形態において、本発明の方法のステップ（ｂ）から得られる組成物中の未溶解ＧＬＰ−１ペプチドは、例えば、濾過によって当該組成物から除去される。一部の実施形態において、ステップ（ｂ）から得られる組成物中の有機溶媒の濃度は、例えば、希釈、クロマトグラフィー、またはＵＦ／ＤＦ濾過によって減少される。
【００３０】
出発材料
ＧＬＰ−１ペプチドを含む組成物は、水を含み、溶液または懸濁液の形態であってもよい。一部の実施形態において、ＧＬＰ−１ペプチドを含む溶液または懸濁液は、例えば、本明細書に記載されるアッセイ（Ｉ）の方法２によって調製される、沈殿物または粉末などの固体形態のＧＬＰ−１ペプチドから調製され得る。粉末は、溶液または懸濁液からの溶媒の蒸発によって形成され得、例えば、本明細書に記載されるアッセイ（Ｉ）の方法１によって調製される。懸濁液は、固体形態のＧＬＰ−１ペプチドを含み得る。一部の実施形態において、懸濁液は、不溶性であるＧＬＰ−１ペプチドを含む。
【００３１】
ＧＬＰ−１ペプチドを含む溶液または懸濁液は、水および／または有機溶媒などの溶媒をＧＬＰ−１ペプチド組成物に添加することによって調製され得る。ＧＬＰ−１ペプチドを含む溶液または懸濁液は、本明細書で例に記載されるように調製され得る。
【００３２】
特定の方法ステップ
リラグルチド
一部の実施形態において、本発明の方法は、表１ａ、１ｂ、および２に定義される可溶性基準を有する方程式（Ｅｑ．）１〜９２のいずれか１つに記載のリラグルチドを含む組成物のインキュベーションを含む。これらの方程式はまた、単純に本明細書では、「表１ａ、１ｂ、および２で定義される方程式」として、または特定の方程式、例えば、これらの表におけるＥｑ．１の「方程式１」を参照して言及され得る。
【表１】
2021514936.tif 000002
【表２】
2021514936.tif 000003
【表３】
2021514936.tif 000004
一例として、「ｙ＜計算」とは、ｐＨが表１ａ、１ｂ、および２で定義される方程式に従って計算されるｐＨ未満であるべきであることを意味する。
【００３３】
一部の実施形態において、有機溶媒のｐＨおよび濃度は、本明細書で定義される方程式３２、３３、３４によって定義される通りである。一部の実施形態において、有機溶媒のｐＨおよび濃度は、本明細書で定義される方程式３５、３６、３７によって定義される通りである。一部の実施形態において、有機溶媒のｐＨおよび濃度は、本明細書で定義される方程式６５、６６、６７によって定義される通りである。一部の実施形態において、有機溶媒のｐＨおよび濃度は、本明細書で定義される方程式６８、６９、または７０によって定義される通りである。一部の実施形態において、有機溶媒のｐＨおよび濃度は、本明細書で定義される方程式７１、７２、または７３によって定義される通りである。一部の実施形態において、有機溶媒のｐＨおよび濃度は、本明細書で定義される方程式７４、７５、または７６によって定義される通りである。一部の実施形態において、有機溶媒のｐＨおよび濃度は、本明細書で定義される方程式７７、７８、または７９によって定義される通りである。一部の実施形態において、有機溶媒のｐＨおよび濃度は、本明細書で定義される方程式８０、８１、８２、または８３によって定義される通りである。一部の実施形態において、有機溶媒のｐＨおよび濃度は、本明細書で定義される方程式８４、８５、８６、または８７によって定義される通りである。
【００３４】
一部の実施形態において、有機溶媒がアセトニトリルである場合、インキュベートするステップ（ｂ）は、（ｉ）６．０未満のｐＨで、少なくとも３０％（重量／重量）の当該アセトニトリルの濃度で、（ｉｉ）３．５未満のｐＨで、少なくとも１４％（重量／重量）の当該アセトニトリルの濃度で、または（ｉｉｉ）当該温度が少なくとも４０℃である場合、（１）５．５〜６．０の範囲のｐＨで、１０％（重量／重量）未満の当該アセトニトリルの濃度で、もしくは（２）３．５未満のｐＨで行われる。一部の実施形態において、本発明は、（ａ）未溶解および／または不溶性リラグルチドならびに有機溶媒アセトニトリルを含む第１の組成物を得るステップであって、当該第１の組成物が、溶液または懸濁液の形態である、ステップと、（ｂ）当該第１の組成物を少なくとも２分の期間、２〜８５℃の範囲の温度でインキュベートするステップと、を含む、方法に関し、インキュベーションは、（ｉ）６．０未満のｐＨで、少なくとも３０％（重量／重量）の当該アセトニトリルの濃度で、（ｉｉ）３．５未満のｐＨで、１４％（重量／重量）の当該アセトニトリルの濃度で、または（ｉｉｉ）当該温度が少なくとも４０℃である場合、（１）５．５〜６．０の範囲のｐＨで、１０％（重量／重量）未満の当該アセトニトリルの濃度で、もしくは（２）３．５未満のｐＨで行われる。ステップ（ｂ）（ｉ）において、ｐＨは、少なくとも３．５であり得る。ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該アセトニトリルの濃度は、３０〜１００％（重量／重量）の範囲または少なくとも４０％（重量／重量）であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該アセトニトリルの濃度は、少なくとも１８％（重量／重量）または少なくとも２０％（重量／重量）であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該アセトニトリルの濃度は、少なくとも３０％（重量／重量）、例えば、少なくとも３３％（重量／重量）または少なくとも３５％（重量／重量）であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該アセトニトリルの濃度は、少なくとも４４％（重量／重量）、例えば、少なくとも４５％（重量／重量）または少なくとも４６％（重量／重量）であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該アセトニトリルの濃度は、少なくとも５５％（重量／重量）であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該アセトニトリルの濃度は、最大９８％（重量／重量）、例えば、最大９５％（重量／重量）または最大９０％（重量／重量）であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該アセトニトリルの濃度は、最大８０％（重量／重量）、例えば、最大７０％（重量／重量）または最大６０％（重量／重量）であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該アセトニトリルの濃度は、最大６０％（重量／重量）、例えば、最大４０％（重量／重量）または最大２２％（重量／重量）であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該アセトニトリルの濃度は、３０〜１００％（重量／重量）または少なくとも４０％（重量／重量）であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該ｐＨは、３．４未満、３．３未満、または３．２未満であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該ｐＨは、少なくとも１．０、少なくとも１．５、または少なくとも２．０であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該ｐＨは、少なくとも２．５、または少なくとも３．０であり得る。ステップ（ｂ）（ｉ）での当該インキュベーションの温度は、２〜４０℃、４０〜８５℃、または１０〜５０℃からなる群から選択され得る。ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該温度は、５〜５０℃の範囲または１０〜４０℃の範囲であり得る。ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該温度は、１５〜３０℃の範囲または２１〜２５℃の範囲であり得る。ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該期間は、５分〜２時間の範囲、例えば、５〜３０分の範囲または２〜６時間の範囲であり得る。ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該期間は、１〜４８時間の範囲または８〜４０時間の範囲であり得る。ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該期間は、１２〜３６時間の範囲または１８〜３２時間の範囲であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉｉ）（２）において、当該アセトニトリルの濃度は、０〜２０％（重量／重量）または少なくとも２８％（重量／重量）、例えば、３０〜１００％（重量／重量）であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉｉ）（２）において、当該アセトニトリルの濃度は、少なくとも４０％（重量／重量）または少なくとも４２％（重量／重量）であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉｉ）（２）において、当該アセトニトリルの濃度は、少なくとも４５％（重量／重量）または少なくとも５０％（重量／重量）であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉｉ）（２）において、当該アセトニトリルの濃度は、１〜１８％（重量／重量）または２〜１６％（重量／重量）であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該温度は、少なくとも２〜４０℃、例えば、５〜３０℃の範囲であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該濃度は、１５〜１００％（重量／重量）の範囲であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、アセトニトリルの当該濃度は、少なくとも１５％（重量／重量）、例えば、少なくとも１８％（重量／重量）または少なくとも２０％（重量／重量）であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、アセトニトリルの当該濃度は、９９％（重量／重量）以下、例えば、９８％（重量／重量）以下または９５％（重量／重量）以下であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、アセトニトリルの当該濃度は、５５％（重量／重量）以下、例えば、４０％（重量／重量）以下または２２％（重量／重量）以下であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該ｐＨは、１〜３．５の範囲であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、またはステップ（ｂ）（ｉｉｉ）（２）において、当該ｐＨは、３．４未満または３．３未満であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、またはステップ（ｂ）（ｉｉｉ）（２）において、当該ｐＨは、３．２未満、例えば、３．１未満または３．０未満であり得る。ステップ（ｂ）（ｉ）またはステップ（ｂ）（ｉｉｉ）、例えば、ステップ（ｂ）（ｉｉｉ）（１）またはステップ（ｂ）（ｉｉｉ）（２）において、当該温度は、少なくとも４０℃、例えば、少なくとも５０℃または少なくとも６０℃であり得る。
【００３５】
ＤＭＦ
一部の実施形態において、有機溶媒がＤＭＦである場合、インキュベートするステップ（ｂ）は、少なくとも２０分の期間、（ｉ）５．０未満のｐＨで、５〜２８％（重量／重量）、または（ｉｉ）５．０〜５．５の範囲のｐＨで、０〜３５％（重量／重量）の範囲の当該ＤＭＦの濃度である。一部の実施形態において、本発明は、（ａ）未溶解および／または不溶性リラグルチドならびに有機溶媒ＤＭＦを含む第１の組成物を得るステップであって、当該第１の組成物が、溶液または懸濁液の形態である、ステップと、（ｂ）当該第１の組成物を少なくとも２０分の期間、２〜８５℃の範囲の温度でインキュベートするステップと、を含む、方法に関し、インキュベーションは、５．０未満のｐＨで、（ｉ）５〜２８％（重量／重量）の範囲、または（ｉｉ）５．０〜５．５の範囲のｐＨで、０〜３５％（重量／重量）の範囲の当該ＤＭＦの濃度で行われる。ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ｐＨは、４未満、任意に少なくとも１であり得る。ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ｐＨは、３．８未満、例えば、３．７未満または３．６未満であり得る。ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ＤＭＦの濃度は、７〜２３％（重量／重量）の範囲または８〜２６％（重量／重量）の範囲であり得る。ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ＤＭＦの濃度は、９〜２５％（重量／重量）の範囲または１０〜２３％（重量／重量）の範囲であり得る。ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該温度は、５〜５０℃の範囲または１０〜４０℃の範囲であり得る。ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該温度は、１５〜３０℃の範囲または２１〜２５℃の範囲であり得る。ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該期間は、１〜４８時間の範囲または８〜４０時間の範囲であり得る。ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該期間は、１２〜３６時間の範囲または１８〜３２時間の範囲であり得る。先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法において、当該有機溶媒は、ＤＭＦであり得、ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ＤＭＦの濃度は、７〜２３％（重量／重量）の範囲であり得る。先行する実施形態に記載の方法において、当該期間は、少なくとも１時間であり得る。先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法において、当該有機溶媒は、ＤＭＦであり得、ステップ（ｂ）（ｉ）において、ａ．当該ｐＨは、３．８未満であり得、ｂ．当該ＤＭＦの濃度は、９〜２５％（重量／重量）の範囲であり得、ｃ．当該期間は、少なくとも８時間であり得る。ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ＤＭＦの濃度は、少なくとも８％（重量／重量）または少なくとも１０％（重量／重量）であり得る。ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ＤＭＦの濃度は、最大２２％（重量／重量）、最大２１％（重量／重量）、または最大２０％（重量／重量）であり得る。ステップ（ｂ）（ｉ）において、ｐＨは、１．０〜５．０未満の範囲であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、ｐＨは、少なくとも２．０、少なくとも２．５、または少なくとも３．０であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、ｐＨは、４．８未満または４．９未満であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、ｐＨは、４．８〜６．０の範囲であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、ｐＨは、少なくとも４．８または少なくとも４．９であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、ｐＨは、最大５．８、最大５．７、または最大５．６であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、ｐＨは、最大６．０または最大５．９であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該ＤＭＦの濃度は、少なくとも１％（重量／重量）、少なくとも２％（重量／重量）、または少なくとも３％（重量／重量）であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該ＤＭＦの濃度は、少なくとも１％（重量／重量）、少なくとも４％（重量／重量）、または少なくとも５％（重量／重量）であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該ＤＭＦの濃度は、最大３７％（重量／重量）、最大３２％（重量／重量）、または最大３０％（重量／重量）であり得る。ステップ（ｂ）において、インキュベーション時間は、８時間未満であり得る。ステップ（ｂ）において、インキュベーション時間は、６時間未満であり得る。ステップ（ｂ）において、インキュベーション時間は、５時間未満であり得る。ステップ（ｂ）において、インキュベーション時間は、３０分〜８時間未満の範囲であり得る。ステップ（ｂ）において、インキュベーション時間は、少なくとも１時間であり得る。ステップ（ｂ）において、インキュベーション時間は、少なくとも１．５時間であり得る。ステップ（ｂ）において、インキュベーション時間が少なくとも８時間である場合、インキュベーションは、（ｉ）５．０未満のｐＨで、２〜４０％（重量／重量）の範囲、または（ｉｉ）５．０〜６．０の範囲のｐＨで、０〜４０重量％（重量／重量）の範囲の当該ＤＭＦの濃度で行われ得る。ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ＤＭＦは、少なくとも３％（重量／重量）、少なくとも４％（重量／重量）、または少なくとも５％（重量／重量）の濃度であり得る。ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ＤＭＦは、最大３５％（重量／重量）、最大３０％（重量／重量）、または最大２８％（重量／重量）の濃度であり得る。ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ＤＭＦは、最大２７％（重量／重量）、最大２６％（重量／重量）、または最大２５％（重量／重量）の濃度であり得る。ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ｐＨは、４．５未満、４．４未満、または４．３未満であり得る。ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ｐＨは、４．２未満、４．１未満、または４．０未満であり得る。ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ｐＨは、３．９未満、３．８未満、または３．７未満であり得る。ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ｐＨは、少なくとも１．０、少なくとも１．５、または少なくとも２．０であり得る。ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ｐＨは、少なくとも２．５、または少なくとも３．０であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、ｐＨが５．５未満であり得る場合、当該ＤＭＦの濃度は、０〜２０％（重量／重量）の範囲であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、ｐＨが５．４未満または５．３未満であり得る場合、当該ＤＭＦの濃度は、０〜２０％（重量／重量）の範囲であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該ＤＭＦの濃度は、最大２０％（重量／重量）または最大１９％（重量／重量）であり得る。ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該ＤＭＦの濃度は、最大１８％（重量／重量）または最大１７％（重量／重量）であり得る。
一部の実施形態において、方法は、アセトニトリルまたはＤＭＦを実質的に含まない組成物を得るステップを含む。
【００３６】
ＧＬＰ−１ペプチド
本明細書で使用される「ＧＬＰ−１ペプチド」という用語は、ペプチドを含む化合物を指し、これは、活性である場合、ヒトＧＬＰ−１受容体を完全または部分的に活性化する。一部の実施形態において、ＧＬＰ−１ペプチドは、任意に１つの置換基を含む、ＧＬＰ−１類似体である。ＧＬＰ−１ペプチド（以下「ペプチド」）を参照して本明細書で使用される「類似体」という用語は、ペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基が、別のアミノ酸残基で置換されている、および／または少なくとも１つのアミノ酸残基が、ペプチドから欠失している、および／または少なくとも１つのアミノ酸残基が、ペプチドに付加されている、および／またはペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基が、修飾されている、ペプチドを意味する。アミノ酸残基のそのような付加または欠失は、ペプチドのＮ末端および／またはペプチドのＣ末端に発生し得る。一部の実施形態において、ＧＬＰ−１ペプチドを記載するために単純な用語体系が使用され、例えば、［Ａｉｂ８］ＧＬＰ−１（７−３７）は、ＧＬＰ−１（７−３７）の類似体を示し、８位の天然発生Ａｌａは、Ａｉｂで置換されている。一部の実施形態において、ＧＬＰ−１ペプチドは、例えば、ＧＬＰ−１（７−３７）と比較して、例えば、置換、欠失、挿入、および／または修飾によって変更された、１２個の最大値、例えば、１０、８、または６個の最大値のアミノ酸を含む。一部の実施形態において、類似体は、例えば、ＧＬＰ−１（７−３７）と比較して、最大１０個の置換、欠失、付加、および／もしくは挿入、例えば、最大９個の置換、欠失、付加、および／もしくは挿入、最大８個の置換、欠失、付加、および／もしくは挿入、最大７個の置換、欠失、付加、および／もしくは挿入、最大６個の置換、欠失、付加、および／もしくは挿入、最大５個の置換、欠失、付加、および／もしくは挿入、最大４個の置換、欠失、付加、および／もしくは挿入、または最大３個の置換、欠失、付加、および／もしくは挿入を含む。別段記述されない限り、ＧＬＰ−１は、Ｌ−アミノ酸のみを含む。
【００３７】
一部の実施形態において、本明細書で使用される「ＧＬＰ−１類似体」または「ＧＬＰ−１の類似体」という用語は、ヒトグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１（７−３７））のバリアントである、ペプチド、または化合物を指す。ＧＬＰ−１（７−３７）は、配列ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶ  ＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（配列番号１）を有する。一部の実施形態において、「バリアント」という用語は、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、付加、および／または挿入を含む化合物を指す。
【００３８】
一部の実施形態において、ＧＬＰ−１ペプチドは、ＧＬＰ−１（７−３７）の全長にかけてＧＬＰ−１（７−３７）に対する少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、または９０％の配列同一性を示す。２つの類似体の間の配列同一性の決定のための方法の一例として、２つのペプチド［Ａｉｂ８］ＧＬＰ−１（７−３７）およびＧＬＰ−１（７−３７）を整列させる。ＧＬＰ−１（７−３７）に対する［Ａｉｂ８］ＧＬＰ−１（７−３７）の配列同一性は、整列された同一の残基の数から異なる残基の数を減算し、ＧＬＰ−１（７−３７）中の残基の総数で除算することによって得られる。したがって、当該例では、配列同一性は、（３１−１）／３１である。
【００３９】
ＧＬＰ−１ペプチドの濃度は、任意の好適な方法を使用して決定され得る。例えば、ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー質量分光法）を使用してもよく、またはＲＩＡ（放射免疫測定法）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、およびＬＯＣＩ（発光酸素チャネリング免疫測定法）などの免疫測定法を使用することができる。好適なＲＩＡおよびＥＬＩＳＡアッセイに対する一般的なプロトコルは、例えば、ＷＯ２００９／０３０７３８（ｐ．１１６〜１１８）に見出される。
【００４０】
一部の実施形態において、ＧＬＰ−１ペプチドは、リラグルチドである。リラグルチドは、Ａｒｇ３４，Ｌｙｓ２６−（Ｎ−イプシロン−（ガンマ−Ｌ−グルタミル（Ｎ−アルファ−ヘキサデカノイル）））−ＧＬＰ−１（７−３７）であり、Ｎ２６−（ヘキサデカノイル−γ−グルタミル）−［３４−アルギニン］ＧＬＰ−１−（７−３７）−ペプチドとしても知られている（ＷＨＯ  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｖｏｌ．１７、Ｎｏ．２、２００３）。リラグルチドは、ＷＯ９８／０８８７１の実施例３７に記載されるように調製され得る。
【００４１】
ＧＬＰ−１ペプチドの生成のためのプロセスは、当該技術分野で周知である。ＧＬＰ−１ペプチド（またはその断片）のアミノ酸配列、例えば、Ａｒｇ３４−ＧＬＰ−１（７−３７）などの未分岐アミノ酸配列は、例えば、古典的なペプチド合成、例えば、ｔ−Ｂｏｃ化学もしくはＦｍｏｃ化学または他の十分に確立された技法を用いた固相ペプチド合成によって生成され得、例えば、Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９９，Ｆｌｏｒｅｎｃｉｏ  Ｚａｒａｇｏｚａ  Ｄｏｒｗａｌｄ，“Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｎ  ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ”，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ，２０００，ａｎｄ  “Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００を参照されたい。また、またはあるいは、それらは、組換え方法によって、すなわち、未分岐アミノ酸配列（ペプチド）をコードし、するＤＮＡ配列を含み、かつペプチドの発現を許容する条件下の好適な栄養培地においてペプチドを発現することができる宿主細胞を培養することによって、生成され得る。これらのペプチドの発現に好適な宿主細胞の非限定的な例は、大腸菌、出芽酵母、ならびに哺乳類ＢＨＫまたはＣＨＯ細胞株である。
【００４２】
ＧＬＰ−１ペプチドは、薬学的に許容される塩、アミド、またはエステルの形態であり得る。塩は、例えば、塩基と酸との間の化学反応、例えば：２ＮＨ３＋Ｈ２ＳＯ４→（ＮＨ４）２ＳＯ４によって形成される。塩は塩基性塩、酸性塩である場合があり、またはどちらでもない場合もある（すなわち、中性塩）。塩基性塩は、水中で水酸化イオンを、酸性塩はヒドロニウムイオンを生成する。ＧＬＰ−１ペプチドの塩は、それぞれ、アニオン基とカチオン基との間に、付加されたカチオンまたはアニオンで形成され得る。これらの基は、ペプチド部分、および／またはＧＬＰ−１ペプチドの側鎖に位置し得る。Ａｒｇ３４−ＧＬＰ−１（７−３７）は、ＧＬＰ−１ペプチドのペプチド部分とみなされ得る。ガンマ−Ｌ−グルタミル（Ｎ−アルファ−ヘキサデカノイル）は、ＧＬＰ−１ペプチドの側鎖とみなされ得る。ＧＬＰ−１ペプチドのアニオン基の非限定的な例には、側鎖およびペプチド部分における遊離カルボキシル基が含まれる。ＧＬＰ−１ペプチドのペプチド部分は、Ｃ末端での遊離カルボン酸基を含み、また内部酸性アミノ酸残基での遊離カルボキシル基、例えば、ＡｓｐおよびＧｌｕを含み得る。ペプチド部分におけるカチオン基の非限定的な例には、Ｎ末端での遊離アミノ基、ならびに内部塩基性アミノ酸残基の任意の遊離アミノ基、例えば、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、およびＬｙｓが含まれる。ＧＬＰ−１ペプチドのエステルは、遊離カルボン酸基とアルコールまたはフェノールとの反応によって形成され得、これは、アルコキシまたはアリールオキシ基による少なくとも１つのヒドロキシル基の置換をもたらす。エステル形成は、ペプチドのＣ末端における遊離カルボキシル基、および／または側鎖内の任意の遊離カルボキシル基に関与し得る。ＧＬＰ−１ペプチドのアミドは、遊離カルボン酸基とアミンもしくは置換アミンとの反応によって、または遊離もしくは置換アミノ基とカルボン酸との反応によって形成され得る。アミド形成には、ペプチドのＣ末端にある遊離カルボキシル基、側鎖の任意の遊離カルボキシル基、ペプチドのＮ末端にある遊離アミノ基、ならびに／またはペプチドおよび／もしくは側鎖のペプチドの遊離もしくは置換アミノ基が関与し得る。一部の実施形態において、ＧＬＰ−１ペプチドは、薬学的に許容される塩の形態である。一部の実施形態において、ＧＬＰ−１ペプチドは、好ましくはペプチドのＣ末端にアミド基を有する、薬学的に許容されるアミドの形態である。一部の実施形態において、ＧＬＰ−１ペプチドは、薬学的に許容されるエステルの形態である。
【００４３】
医薬組成物
本発明の方法から得られる生成物は、医薬組成物または医薬組成物の製造に使用される中間組成物であり得る。医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含み得る。「賦形剤」という語は、活性治療成分（複数可）以外の任意の成分を広く指す。賦形剤は、不活性物質、非活性物質、および／または医薬的に活性でない物質であり得る。賦形剤は、例えば、担体、ビヒクル、希釈剤、錠剤補助剤などの様々な目的を果たし、ならびに／あるいは活性物質の投与および／または吸収を改善するように機能し得る。様々な賦形剤を伴った薬学的に活性な成分の製剤は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（例えば、第１９版（１９９５年）、および任意のそれ以降の版）を参照されたい。賦形剤の非限定的な例は、溶媒、希釈剤、緩衝液、防腐剤、張性調節剤、キレート剤、および安定剤である。医薬組成物は、７．０〜１０．０、例えば、７．４〜９．０または７．８〜８．４の範囲のｐＨを有し得る。一部の実施形態において、当該医薬組成物のｐＨは、８．０〜８．３の範囲、例えば、８．１５である。一部の実施形態において、当該賦形剤は、等張剤（例えば、プロピレングリコール）、緩衝液（例えば、リン酸二ナトリウム二水和物などのリン酸緩衝液）、および防腐剤（例えば、フェノール）からなる群から選択される１つ以上である。
【００４４】
一部の実施形態において、本発明の方法は、安定な医薬組成物を提供する。本明細書で使用される場合、「安定な医薬組成物」という用語は、ＧＬＰ−１ペプチドを含む組成物、例えば、溶液または懸濁液であって、当該組成物において貯蔵後に当該ＧＬＰ−１ペプチドの少なくとも９０％（重量／重量）が溶液中に残る、組成物を指す。この安定な医薬組成物についての貯蔵の条件は、５℃で１年間または２年間であり得る。あるいは、この貯蔵の条件は、５℃で２４時間または１週間であり得る。さらに別の代替において、この貯蔵の条件は、２ヶ月間室温であり得る。当該安定な医薬組成物において溶液中に残るＧＬＰ−１ペプチドの比は、少なくとも９５％（重量／重量）、例えば、少なくとも９７％（重量／重量）または少なくとも９９％（重量／重量）であり得る。
【００４５】
適応
本発明の方法によって得られる医薬組成物は、医学における使用のためのものであり得る。本発明の医薬組成物は、２型糖尿病または肥満の治療および／または予防における使用のためのものであり得る。一部の実施形態において、本発明の医薬組成物は、糖尿病合併症、例えば、血管障害、末梢神経障害を含む神経障害、腎症、および／または網膜症の予防および／または治療における使用のためのものである。一部の実施形態において、本発明の医薬組成物は、１つ以上の心血管疾患の予防および／または治療における使用のためのものである。一部の実施形態において、本発明の医薬組成物は、睡眠時無呼吸の予防および／または治療における使用のためのものである。
【００４６】
本発明の非限定的な特定の実施形態
１．（ａ）未溶解および／または不溶性ＧＬＰ−１ペプチドならびにアセトニトリルおよびＤＭＦからなる群から選択される１つ以上の有機溶媒を含む第１の組成物を得るステップであって、当該第１の組成物が、溶液または懸濁液の形態である、ステップと、
（ｂ）当該第１の組成物（例えば、溶液）を少なくとも２分の期間、２〜８５℃の範囲の温度でインキュベートするステップと、を含む、方法であって、
ただし、ＧＬＰ−１ペプチドがリラグルチドであり、有機溶媒がフェノールである場合、当該有機溶媒の濃度が、少なくとも１％（重量／重量）であり、
当該方法が、溶解および／または不溶性ＧＬＰ−１ペプチドの量を増加させる、方法。
２．（ａ）未溶解および／または不溶性リラグルチドならびに有機溶媒アセトニトリルまたはＤＭＦを含む第１の組成物を得るステップであって、当該第１の組成物が、溶液または懸濁液の形態である、ステップと、
（ｂ）当該第１の組成物を２〜８５℃の範囲の温度でインキュベートするステップと、を含む、方法であって、
当該有機溶媒がＤＭＦである場合、当該インキュベートすることは、少なくとも２０分の期間、（ｉ）５．０未満のｐＨで、７〜２３％（重量／重量）、または（ｉｉ）５．０〜５．５の範囲のｐＨで、０〜３５％（重量／重量）の範囲の当該ＤＭＦの濃度で行われるか、あるいは
有機溶媒がアセトニトリルである場合、当該インキュベートすることが、少なくとも２分の期間、（ｉ）６．０未満のｐＨで、少なくとも３０％（重量／重量）の当該アセトニトリルの濃度で、（ｉｉ）３．５未満のｐＨで、１４％（重量／重量）の当該アセトニトリルの濃度で、または（ｉｉｉ）当該温度が少なくとも５０℃である場合、（１）５．５〜６．０の範囲のｐＨで、１０％（重量／重量）未満の当該アセトニトリルの濃度で、もしくは（２）３．５未満のｐＨで行われる、方法。
３．（ａ）未溶解および／または不溶性リラグルチドならびに有機溶媒アセトニトリルまたはＤＭＦを含む第１の組成物を得るステップであって、当該第１の組成物が、溶液または懸濁液の形態である、ステップと、
（ｂ）当該第１の組成物を２〜８５℃の範囲の温度でインキュベートするステップと、を含む、方法であって、
当該有機溶媒がＤＭＦである場合、当該インキュベートすることは、少なくとも２０分の期間、（ｉ）５．０未満のｐＨで、７〜２３％（重量／重量）、または（ｉｉ）５．０〜５．５の範囲のｐＨで、０〜３５％（重量／重量）の範囲の当該ＤＭＦの濃度で行われるか、あるいは
当該有機溶媒がアセトニトリルである場合、当該インキュベートすることが、少なくとも２分の期間、（ｉ）６．０未満のｐＨで、少なくとも３０％（重量／重量）の当該アセトニトリルの濃度で、（ｉｉ）３．５未満のｐＨで、１４％（重量／重量）の当該アセトニトリルの濃度で、または（ｉｉｉ）当該温度が少なくとも５０℃である場合、（１）５．５〜６．０の範囲のｐＨで、１０％（重量／重量）未満の当該アセトニトリルの濃度で、もしくは（２）３．５未満のｐＨで行われる、方法。
４．有機溶媒が、アセトニトリルであり、当該インキュベートするステップ（ｂ）が、
（ｉ）６．０未満のｐＨで、少なくとも３０％（重量／重量）の当該アセトニトリルの濃度で、
（ｉｉ）３．５未満のｐＨで、少なくとも１４％（重量／重量）の当該アセトニトリルの濃度で、または
（ｉｉｉ）当該温度が少なくとも４０℃である場合、（１）５．５〜６．０の範囲のｐＨで、１０％（重量／重量）未満の当該アセトニトリルの濃度で、もしくは（２）３．５未満のｐＨで行われる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５．（ａ）未溶解および／または不溶性リラグルチドならびに有機溶媒アセトニトリルを含む第１の組成物を得るステップであって、当該第１の組成物が、溶液または懸濁液の形態である、ステップと、
（ｂ）当該第１の組成物を少なくとも２分の期間、２〜８５℃の範囲の温度でインキュベートするステップと、を含む、方法であって、インキュベーションが、
（ｉ）６．０未満のｐＨで、少なくとも３０％（重量／重量）の当該アセトニトリルの濃度で、
（ｉｉ）３．５未満のｐＨで、少なくとも１４％（重量／重量）の当該アセトニトリルの濃度で、または
（ｉｉｉ）当該温度が少なくとも４０℃である場合、（１）５．５〜６．０の範囲のｐＨで、１０％（重量／重量）未満の当該アセトニトリルの濃度で、もしくは（２）３．５未満のｐＨで行われる、方法。
６．ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ｐＨが、少なくとも３．５である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
７．ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該アセトニトリルの濃度が、３０〜１００％（重量／重量）の範囲または少なくとも４０％（重量／重量）である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
８．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該アセトニトリルの濃度が、少なくとも１８％（重量／重量）または少なくとも２０％（重量／重量）である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
９．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該アセトニトリルの濃度が、少なくとも３０％（重量／重量）、例えば、少なくとも３３％（重量／重量）または少なくとも３５％（重量／重量）である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１０．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該アセトニトリルの濃度が、少なくとも４４％（重量／重量）、例えば、少なくとも４５％（重量／重量）または少なくとも４６％（重量／重量）である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１１．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該アセトニトリルの濃度が、少なくとも５５％（重量／重量）である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１２．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該アセトニトリルの濃度が、最大９８％（重量／重量）、例えば、最大９５％（重量／重量）または最大９０％（重量／重量）である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１３．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該アセトニトリルの濃度が、最大８０％（重量／重量）、例えば、最大７０％（重量／重量）または最大６０％（重量／重量）である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１４．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該アセトニトリルの濃度が、最大６０％（重量／重量）、例えば、最大４０％（重量／重量）または最大２２％（重量／重量）である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１５．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該アセトニトリルの濃度が、３０〜１００％（重量／重量）または少なくとも４０％（重量／重量）である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１６．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該ｐＨが、３．４未満、３．３未満、または３．２未満である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１７．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該ｐＨが、少なくとも１．０、少なくとも１．５、または少なくとも２．０である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１８．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該ｐＨが、少なくとも２．５、または少なくとも３．０である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１９．ステップ（ｂ）（ｉ）での当該インキュベーションの温度が、２〜４０℃、４０〜８５℃、または１０〜５０℃からなる群から選択される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２０．ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該温度が、５〜５０℃の範囲または１０〜４０℃の範囲である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２１．ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該温度が、１５〜３０℃の範囲または２１〜２５℃の範囲である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２２．ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該期間が、５分〜２時間の範囲、例えば、５〜３０分の範囲、または２〜６時間の範囲である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２３．ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該期間が、１〜４８時間の範囲または８〜４０時間の範囲である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２４．ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該期間が、１２〜３６時間の範囲または１８〜３２時間の範囲である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２５．ステップ（ｂ）（ｉｉｉ）（２）において、当該アセトニトリルの濃度が、０〜２０％（重量／重量）または少なくとも２８％（重量／重量）、例えば、３０〜１００％（重量／重量）である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２６．ステップ（ｂ）（ｉｉｉ）（２）において、当該アセトニトリルの濃度が、少なくとも４０％（重量／重量）または少なくとも４２％（重量／重量）である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２７．ステップ（ｂ）（ｉｉｉ）（２）において、当該アセトニトリルの濃度が、少なくとも４５％（重量／重量）または少なくとも５０％（重量／重量）である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２８．ステップ（ｂ）（ｉｉｉ）（２）において、当該アセトニトリルの濃度が、１〜１８％（重量／重量）または２〜１６％（重量／重量）である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２９．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該温度が、２〜４０℃、例えば、少なくとも５〜３０℃の範囲である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３０．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、アセトニトリルの当該濃度が、１５〜１００％（重量／重量）の範囲である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３１．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、アセトニトリルの当該濃度が、少なくとも１５％（重量／重量）、例えば、少なくとも１８％（重量／重量）または少なくとも２０％（重量／重量）である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３２．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、アセトニトリルの当該濃度が、９９％（重量／重量）以下、例えば、９８％（重量／重量）以下または９５％（重量／重量）以下である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３３．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、アセトニトリルの当該濃度が、５５％（重量／重量）以下、例えば、４０％（重量／重量）以下または２２％（重量／重量）以下である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３４．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該ｐＨが、１〜３．５の範囲である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３５．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、またはステップ（ｂ）（ｉｉｉ）（２）において、当該ｐＨが、３．４未満または３．３未満である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３６．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、またはステップ（ｂ）（ｉｉｉ）（２）において、当該ｐＨが、３．２未満、例えば、３．１未満または３．０未満である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３７．ステップ（ｂ）（ｉ）またはステップ（ｂ）（ｉｉｉ）、例えば、ステップ（ｂ）（ｉｉｉ）（１）またはステップ（ｂ）（ｉｉｉ）（２）において、当該温度が、少なくとも４０℃、例えば、少なくとも５０℃または少なくとも６０℃である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３８．当該有機溶媒の当該ｐＨおよび濃度が、本明細書で定義される方程式３２、３３、３４によって定義される通りである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
３９．当該有機溶媒の当該ｐＨおよび濃度が、本明細書で定義される方程式３５、３６、３７によって定義される通りである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
４０．当該有機溶媒の当該ｐＨおよび濃度が、本明細書で定義される方程式６５、６６、６７によって定義される通りである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
４１．当該有機溶媒の当該ｐＨおよび濃度が、本明細書で定義される方程式６８、６９、または７０によって定義される通りである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
４２．当該有機溶媒の当該ｐＨおよび濃度が、本明細書で定義される方程式７１、７２、または７３によって定義される通りである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
４３．当該有機溶媒の当該ｐＨおよび濃度が、本明細書で定義される方程式７４、７５、または７６によって定義される通りである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
４４．当該有機溶媒の当該ｐＨおよび濃度が、本明細書で定義される方程式７７、７８、または７９によって定義される通りである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
４５．当該有機溶媒の当該ｐＨおよび濃度が、本明細書で定義される方程式８０、８１、８２、または８３によって定義される通りである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
４６．有機溶媒が、ＤＭＦであり、当該インキュベートするステップ（ｂ）が、少なくとも２０分の期間、
（ｉ）５．０未満のｐＨで、５〜２８％（重量／重量）の範囲の当該ＤＭＦの濃度、または
または（ｉｉ）５．０〜５．５の範囲のｐＨで、０〜３５％（重量／重量）の範囲の当該ＤＭＦの濃度である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
４７．（ａ）未溶解および／または不溶性リラグルチドならびに有機溶媒ＤＭＦを含む第１の組成物を得るステップであって、当該第１の組成物が、溶液または懸濁液の形態である、ステップと、
（ｂ）当該第１の組成物を少なくとも２０分の期間、２〜８５℃の範囲の温度でインキュベートするステップと、を含む、方法であって、インキュベーションが、
（ｉ）５．０未満のｐＨで、５〜２８％（重量／重量）の範囲の当該ＤＭＦの濃度、または
（ｉｉ）５．０〜５．５の範囲のｐＨで、０〜３５％（重量／重量）の範囲の当該ＤＭＦの濃度で行われる、方法。
４８．ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ｐＨが、４未満、任意に少なくとも１である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
４９．ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ｐＨが、３．８未満、例えば、３．７未満または３．６未満である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５０．ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ＤＭＦの濃度が、７〜２３％（重量／重量）の範囲または８〜２６％（重量／重量）の範囲である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５１．ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ＤＭＦの濃度が、９〜２５％（重量／重量）の範囲または１０〜２３％（重量／重量）の範囲である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５２．ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該温度が、５〜５０℃の範囲または１０〜４０℃の範囲である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５３．ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該温度が、１５〜３０℃の範囲または２１〜２５℃の範囲である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５４．ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該期間が、１〜４８時間の範囲または８〜４０時間の範囲である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５５．ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該期間が、１２〜３６時間の範囲または１８〜３２時間の範囲である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５６．当該有機溶媒が、ＤＭＦであり、ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ＤＭＦの濃度が、７〜２３％（重量／重量）の範囲である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５７．当該期間が、少なくとも１時間である、先行する実施形態に記載の方法。
５８．当該有機溶媒が、ＤＭＦであり、ステップ（ｂ）（ｉ）において、
ａ．当該ｐＨが、３．８未満であり、
ｂ．当該ＤＭＦの濃度が、９〜２５％（重量／重量）の範囲であり、
ｃ．当該期間が、少なくとも８時間である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
５９．ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ＤＭＦの濃度が、少なくとも８％（重量／重量）または少なくとも１０％（重量／重量）である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６０．ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ＤＭＦの濃度が、最大２２％（重量／重量）、最大２１％（重量／重量）、または最大２０％（重量／重量）である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６１．ステップ（ｂ）（ｉ）において、ｐＨが、１．０〜５．０未満の範囲である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６２．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、ｐＨが、少なくとも２．０、少なくとも２．５、または少なくとも３．０である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６３．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、ｐＨが、４．８未満または４．９未満である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６４．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、ｐＨが、４．８〜６．０の範囲である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６５．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、ｐＨが、少なくとも４．８または少なくとも４．９である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６６．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、ｐＨが、最大５．８、最大５．７、または最大５．６である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６７．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、ｐＨが、最大６．０または最大５．９である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６８．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該ＤＭＦの濃度が、少なくとも１％（重量／重量）、少なくとも２％（重量／重量）、または少なくとも３％（重量／重量）である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
６９．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該ＤＭＦの濃度が、少なくとも１％（重量／重量）、少なくとも４％（重量／重量）、または少なくとも５％（重量／重量）である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
７０．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該ＤＭＦの濃度が、最大３７％（重量／重量）、最大３２％（重量／重量）、または最大３０％（重量／重量）である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
７１．当該有機溶媒の当該ｐＨおよび濃度が、本明細書で定義される方程式８４、８５、８６、または８７によって定義される通りである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
７２．ステップ（ｂ）において、インキュベーション時間が、８時間未満である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
７３．ステップ（ｂ）において、インキュベーション時間が、６時間未満である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
７４．ステップ（ｂ）において、インキュベーション時間が、５時間未満である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
７５．ステップ（ｂ）において、インキュベーション時間が、３０分〜８時間未満の範囲である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
７６．ステップ（ｂ）において、インキュベーション時間が、少なくとも１時間である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
７７．ステップ（ｂ）において、インキュベーション時間が、少なくとも１．５時間である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
７８．ステップ（ｂ）において、インキュベーション時間が少なくとも８時間である場合、インキュベーションが、
（ｉ）５．０未満のｐＨで、２〜４０％（重量／重量）の範囲の当該ＤＭＦの濃度、または
（ｉｉ）５．０〜６．０の範囲のｐＨで、０〜４０％（重量／重量）の範囲の当該ＤＭＦの濃度で行われる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
７９．ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ＤＭＦが、少なくとも３％（重量／重量）、少なくとも４％（重量／重量）、または少なくとも５％（重量／重量）の濃度である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
８０．ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ＤＭＦが、最大３５％（重量／重量）、最大３０％（重量／重量）、または最大２８％（重量／重量）の濃度である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
８１．ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ＤＭＦが、最大２７％（重量／重量）、最大２６％（重量／重量）、または最大２５％（重量／重量）の濃度である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
８２．ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ｐＨが、４．５未満、４．４未満、または４．３未満である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
８３．ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ｐＨが、４．２未満、４．１未満、または４．０未満である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
８４．ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ｐＨが、３．９未満、３．８未満、または３．７未満である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
８５．ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ｐＨが、少なくとも１．０、少なくとも１．５、または少なくとも２．０である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
８６．ステップ（ｂ）（ｉ）において、当該ｐＨが、少なくとも２．５、または少なくとも３．０である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
８７．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、ｐＨが５．５未満である場合、当該ＤＭＦの濃度が、０〜２０％（重量／重量）の範囲である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
８８．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、ｐＨが５．４未満または５．３未満である場合、当該ＤＭＦの濃度が、０〜２０％（重量／重量）の範囲である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
８９．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該ＤＭＦの濃度が、最大２０％（重量／重量）または最大１９％（重量／重量）である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
９０．ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、当該ＤＭＦの濃度が、最大１８％（重量／重量）または最大１７％（重量／重量）である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
９１．ステップ（ｂ）において、インキュベーション時間が、少なくとも１２時間、少なくとも１６時間、または少なくとも２０時間である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
９２．ステップ（ｂ）において、インキュベーション時間が、８〜４８時間の範囲である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
９３．ステップ（ｂ）において、インキュベーション時間が、３６時間未満または２８時間未満である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
９４．ステップ（ｂ）において、当該ｐＨが、５．０未満である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
９５．ステップ（ｂ）において、当該ｐＨが、４．５未満または４．０未満である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
９６．ステップ（ｂ）において、当該ｐＨが、３．５未満または３．０未満である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
９７．ステップ（ｂ）において、当該ｐＨが、少なくとも１．０である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
９８．当該温度が、１０〜５０℃である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
９９．当該温度が、１５〜４０℃である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１００．温度が、２０〜３０℃または２１〜２５℃である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１０１．当該温度が、１０〜５０℃である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１０２．（ａ）未溶解および／または不溶性リラグルチドならびにＤＭＦを含む第１の組成物を得るステップであって、当該第１の組成物が、溶液または懸濁液の形態である、ステップと、
（ｂ）当該溶液を少なくとも５分間、５０℃未満の温度でインキュベートするステップと、を含む、方法であって、（ｉ）インキュベーション温度が少なくとも１５℃である場合、インキュベーションが、（１）ｐＨ６．５超で行われるか、もしくは（２）インキュベーションが４時間を超えて行われる場合、当該溶液のｐＨ（ｐＨ）に関連した当該有機溶媒の濃度が、ｃ（有機溶媒）〜８０％（重量／重量）の範囲であり、式中、ｃ（有機溶媒）≧−１３．３＊ｐＨ＋１２３であり、または（ｉｉ）インキュベーション温度が１５℃未満である場合、インキュベーションが、ｐＨ７．０超で行われ、ただし、インキュベーション時間が３０分未満である場合、当該有機溶媒の濃度が、２５％（重量／重量）未満であり、ただし、有機溶媒がフェノールである場合、当該有機溶媒の濃度が、少なくとも１％（重量／重量）であり、当該方法が、溶解リラグルチドの量を増加させる、方法。
１０３．ステップ（ｂ）（ｉ）（２）において、溶液のｐＨ（ｐＨ）に関する当該有機溶媒の濃度が、ｃ（有機溶媒）〜８０％（重量／重量）の範囲であり、ｃ（有機溶媒）≧−４０＊ｐＨ＋３１０である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１０４．ステップ（ｉ）（２）において、溶液のｐＨ（ｐＨ）に関する当該有機溶媒の濃度が、ｃ（有機溶媒）〜８０％（重量／重量）の範囲であり、ｃ（有機溶媒）≧−４０＊ｐＨ＋３１０である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１０５．ステップ（ｉｉ）において、当該有機溶媒の濃度が、２３％（重量／重量）未満、例えば、２２％（重量／重量）未満または２１％（重量／重量）未満である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１０６．ステップ（ｉｉ）において、当該有機溶媒の濃度が、２０％（重量／重量）未満、例えば、１９％（重量／重量）未満または１８％（重量／重量）未満である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１０７．ステップ（ｂ）の当該ｐＨが、６．５〜１２．５または７．０〜１２．５の範囲である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１０８．ステップ（ｂ）の当該ｐＨが、少なくとも６．７、例えば、少なくとも６．８、少なくとも６．９、または少なくとも７．０である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１０９．ステップ（ｂ）の当該温度が、２℃〜５０℃、例えば、４℃〜４０℃、または５〜３０℃の範囲である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１１０．ステップ（ｂ）の当該温度が、４０℃未満、例えば、４０℃未満、３０℃未満、または２５℃未満である、実施形態７に記載の方法。
１１１．ステップ（ｂ）の当該温度が、少なくとも４℃、例えば、少なくとも１０℃、少なくとも１５℃、または少なくとも２０℃である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１１２．当該方法が、以下の追加ステップ：
（ｃ）ステップ（ｂ）に供される第１の組成物中の当該有機溶媒の濃度を減少させ、任意にリラグルチドを単離することを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
１１３．当該方法が、任意に本明細書においてアッセイ（Ｉ）で記載されるように、３時間のインキュベーション期間後に少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌの溶解ＧＬＰ−１ペプチド、例えば、リラグルチドの増加を提供する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
１１４．ステップ（ａ）の当該第１の組成物が、（ｉ）沈殿粉末の形態であるか、または（ｉｉ）懸濁液もしくは溶液に未溶解および／もしくは不溶性である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
１１５．ステップ（ａ）の第１の組成物のｐＨが、ｐＨ１〜１３の範囲である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
１１６．ステップ（ｂ）での当該インキュベーションの温度が、
（Ａ）当該１つ以上の有機溶媒を含む第１の組成物の凝固点と沸点との間の温度であるか、
（Ｂ）当該インキュベーションに供される溶液の凝固点を上回り、５０℃を下回るか、
（Ｃ）５０〜８５℃の範囲である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
１１７．当該有機溶媒が、エタノール、２−プロパノール、アセトニトリル、フェノール、およびＤＭＳＯからなる群から選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
１１８．ステップ（ａ）の第１の組成物が、０．０１〜８０％（重量／重量）の範囲の当該有機溶媒の濃度を有する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
１１９．当該第１の組成物が、溶液または懸濁液の形態である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１２０．当該ステップ（ａ）前に、当該未溶解および／または不溶性リラグルチドが、初期組成物中に存在し、当該初期組成物が、少なくとも０．１％（重量／重量）の未溶解および／または不溶性リラグルチドを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１２１．当該ステップ（ａ）前に、当該未溶解および／または不溶性リラグルチドが、初期組成物中に存在し、当該初期組成物が、少なくとも１％（重量／重量）または少なくとも５％（重量／重量）の未溶解および／または不溶性リラグルチドを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１２２．当該ステップ（ａ）前に、当該未溶解および／または不溶性リラグルチドが、初期組成物中に存在し、当該初期組成物が、少なくとも１０％（重量／重量）または少なくとも５０％（重量／重量）の未溶解および／または不溶性リラグルチドを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１２３．当該インキュベーションが、本明細書において表１および２の方程式で定義される通りである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１２４．当該方法が、ステップ（ｂ）に続いて、さらなるステップ（ｃ）を含み、当該ステップ（ｃ）が、任意の順序で、
（１）当該有機溶媒の濃度を減少させることと、
（２）ｐＨを中和させることと、
（３）温度を低下させることと、
（４）当該有機溶媒の濃度を減少させることと、
（５）任意にリラグルチドを単離することと、からなる群から選択される１つ以上を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１２５．ステップ（ｂ）後、当該方法が、ステップ（ｂ）から得られる組成物を用いて、任意の順序で、以下の追加ステップ：
（ｃ１）ステップ（ｂ）からの当該組成物中の当該有機溶媒の濃度を減少させることと、
（ｃ２）ステップ（ｂ）からの当該組成物のｐＨを中和させることと、
（ｃ３）ステップ（ｂ）からの当該組成物の温度を低下させることと、
（ｃ４）リラグルチドを単離することと、のうちの１つ以上を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１２６．ステップ（ｂ）後、当該方法が、以下の追加ステップ：
（ｃ）ステップ（ｂ）から得られる組成物中の当該有機溶媒の濃度を減少させ、任意にリラグルチドを単離することを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１２７．当該中和することが、７．０〜１０．０の範囲のｐＨへである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１２８．当該中和することが、７．４〜９．０または７．８〜８．４の範囲のｐＨへである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１２９．当該温度を低下させることが、２〜４０℃、例えば、４〜３５℃または５〜３０℃の範囲の温度へである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１３０．ステップ（ｂ）から得られる組成物が、第２の組成物と呼ばれる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１３１．当該方法が、溶解ＧＬＰ−１ペプチド、例えば、リラグルチドの量を増加させる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１３２．当該方法が、少なくとも１０％（重量／重量）、例えば、少なくとも２０％（重量／重量）または少なくとも３０％（重量／重量）の溶解ＧＬＰ−１ペプチドの増加を提供する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１３３．当該方法が、任意に本明細書においてアッセイ（Ｉ）で記載されるように決定される、３時間のインキュベーション期間後に少なくとも０．２ｍｇ／ｍｌの溶解ＧＬＰ−１ペプチド、例えば、リラグルチドの増加を提供する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１３４．当該方法が、任意に本明細書においてアッセイ（Ｉ）で記載されるように決定される、３時間のインキュベーション期間後に０．２〜１．０ｍｇ／ｍｌの溶解ＧＬＰ−１ペプチド、例えば、リラグルチドの増加を提供する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１３５．当該方法が、任意に本明細書においてアッセイ（Ｉ）で記載されるように決定される、３時間のインキュベーション期間後に少なくとも０．３ｍｇ／ｍｌの溶解ＧＬＰ−１ペプチド、例えば、リラグルチドの増加を提供する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１３６．当該方法が、任意に本明細書においてアッセイ（Ｉ）で記載されるように決定される、３時間のインキュベーション期間後に少なくとも０．４ｍｇ／ｍｌの溶解ＧＬＰ−１ペプチド、例えば、リラグルチドの増加を提供する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１３７．当該方法が、任意に本明細書においてアッセイ（Ｉ）で記載されるように決定される、３時間のインキュベーション期間後に少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌの溶解ＧＬＰ−１ペプチド、例えば、リラグルチドの増加を提供する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１３８．当該方法が、任意に本明細書においてアッセイ（Ｉ）で記載されるように決定される、３時間のインキュベーション期間後に少なくとも０．６ｍｇ／ｍｌの溶解ＧＬＰ−１ペプチド、例えば、リラグルチドの増加を提供する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１３９．当該方法が、任意に本明細書においてアッセイ（Ｉ）で記載されるように決定される、３時間のインキュベーション期間後に少なくとも０．７ｍｇ／ｍｌの溶解ＧＬＰ−１ペプチド、例えば、リラグルチドの増加を提供する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１４０．当該方法が、任意に本明細書においてアッセイ（Ｉ）で記載されるように決定される、３時間のインキュベーション期間後に少なくとも０．８ｍｇ／ｍｌの溶解ＧＬＰ−１ペプチド、例えば、リラグルチドの増加を提供する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１４１．当該方法が、任意に本明細書においてアッセイ（Ｉ）で記載されるように、３時間のインキュベーション期間後に少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌの溶解ＧＬＰ−１ペプチド、例えば、リラグルチドの増加を提供する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１４２．溶解ＧＬＰ−１ペプチドの濃度が、本明細書においてアッセイ（Ｉ）で記載されるように、および任意に３時間のインキュベーション期間後に決定される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１４３．当該ＧＬＰ−１ペプチドが、リラグルチドである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１４４．ステップ（ａ）の当該組成物が、（ｉ）沈殿物の形態、（ｉｉ）粉末の形態であるか、または（ｉｉｉ）懸濁液もしくは溶液に未溶解および／もしくは不溶性である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１４５．ステップ（ａ）の当該組成物が、懸濁液または溶液中の未溶解および／または不溶性リラグルチドを含む初期組成物から調製される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１４６．ステップ（ａ）の当該組成物が、懸濁液または溶液中の未溶解リラグルチドを含む初期組成物から調製される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１４７．ステップ（ａ）の当該組成物が、懸濁液または溶液中の不溶性リラグルチドを含む初期組成物から調製される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１４８．当該第１の組成物が、懸濁液の形態である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１４９．当該第１の組成物が、溶液の形態である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１５０．ステップ（ｂ）での当該インキュベーションに供される組成物のｐＨが、ｐＨ１〜１３の範囲である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１５１．ステップ（ｂ）での当該インキュベーションに供される溶液のｐＨが、ｐＨ１〜１３の範囲である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１５２．ステップ（ｂ）での当該インキュベーションに供される組成物のｐＨが、ｐＨ３〜１１の範囲である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１５３．当該インキュベーションが、当該１つ以上の有機溶媒を含む溶液の凝固点と沸点との間の温度で行われる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１５４．ステップ（ｂ）での当該インキュベーションの温度が、当該インキュベーションに供される溶液の凝固点を上回り、５０℃を下回る、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１５５．ステップ（ｂ）での当該インキュベーションの温度が、２〜４０℃、４０〜８５℃、または１０〜５０℃からなる群から選択される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１５６．ステップ（ｂ）での当該インキュベーションの温度が、５０〜８５℃の範囲である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１５７．溶液中のリラグルチドの貯蔵安定性の当該増加が、５℃で１年間または２年間の貯蔵後に溶液中に残る当該リラグルチドの少なくとも９０％（重量／重量）を指す、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１５８．溶液中のリラグルチドの貯蔵安定性の当該増加が、室温で２ヶ月間の貯蔵後に溶液中に残る当該リラグルチドの少なくとも９０％（重量／重量）を指す、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１５９．溶液中のリラグルチドの貯蔵安定性の当該増加が、５℃で２４時間または１週間の貯蔵後に溶液中に残る当該リラグルチドの少なくとも９０％（重量／重量）を指す、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１６０．当該リラグルチドの少なくとも９５％（重量／重量）が、貯蔵後に溶液中に残る、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１６１．当該リラグルチドの少なくとも９７％（重量／重量）が、貯蔵後に溶液中に残る、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１６２．当該リラグルチドの少なくとも９９％（重量／重量）が、貯蔵後に溶液中に残る、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１６３．当該方法が、アセトニトリルまたはＤＭＦを実質的に含まない組成物を得るステップを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１６４．先行する実施形態のいずれか１つにおいて定義される方法によって得られるＧＬＰ−１ペプチドを含む安定な医薬組成物であって、当該医薬組成物が、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
【実施例】
【００４７】
略語のリスト
ＣＡＰＳ：  Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸
ＤＭＳＯ：  ジメチルスルホキシド
ＥｔＯＨ：  エタノール
ＨＥＰＥＳ：    ２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸
ＭｅＣＮ：  アセトニトリル
ＭＥＳ：   ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
ＩＳＯＰ：  イソプロパノール
【００４８】
一般的な方法
アッセイ（Ｉ）：可溶性の決定
９６ウェルプレート調製
固体形態の標的ペプチドを含有する９６ウェルプレートを、２つの方法のうちの１つで調製した。
方法１（蒸発）：４〜６ｍｇ／ｍｌの濃度の当該ペプチドの１００μｌストック溶液の、９６ウェルハーフエリアプレート（１５０μｌウェルサイズ）の各ウェルへの添加。その後、溶媒が完全に除去されるまで、真空を適用することによって、溶媒を蒸発させた。
方法２（沈殿）：特定の体積の当該ペプチド含有のストック溶液の９６ウェルハーフエリアプレートの各ウェルへの添加に続いて、４．６のｐＨを得るために特定の体積の濃縮リン酸を添加し、続いて２０％体積／体積の最終エタノール濃度をもたらす特定の体積のエタノールを添加した。その後、プレートを４℃で１時間貯蔵し、次いで４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。最終的に上清を除去した。ストック溶液の濃度は、上清除去後のペプチドの最終量がウェルあたり＞０．４ｍｇであるように選択された。
【００４９】
両方の場合において、脱イオン水を特定の量の当該ペプチドの粉末に添加し、続いて当該ペプチドが完全に溶液になるまで、少量の濃縮水酸化ナトリウム溶液を段階的に添加することによって、ストック溶液を調製した。
【００５０】
可溶性測定
異なるｐＨおよび有機溶媒濃度で標的ペプチドの可溶性を決定するために、２つの異なる緩衝液系を独立した実験で使用して、ｐＨ３．０〜ｐＨ１１．０の全範囲をカバーした。緩衝液系１は、ｐＨ３．０〜７．５をカバーし、緩衝液系２はｐＨ７．５〜１１．０をカバーする。各緩衝液系について、９６個の異なる溶媒組成物を、以下の方法で予め混合した。
１．（ｐＨ３．０またはｐＨ７．５のいずれかに調節された）低ｐＨ緩衝液および（ｐＨ７．５またはｐＨ１１．０のいずれかに調節された）高ｐＨ緩衝液を、８つの異なる比で混合して、それぞれ、ｐＨ３．０〜ｐＨ７．５またはｐＨ７．５〜ｐＨ１１．０の値を得た。混合後の総体積は、３００μｌであった。
２．次いで、これらの緩衝液に１２の異なる量の有機溶媒を加えて、０〜７０％重量／重量の有機溶媒（例えば、エタノール）濃度を得た。
３．水を加えて、各ウェルにおいて１．０ｇの溶媒の総重量を得た。
【００５１】
９６個の異なる溶媒系を調製した後、各系の１００μｌを、（セクション「９６ウェルプレート調製」に記載されるように調製される）標的ペプチドの固体形態を含有する９６ウェルプレートに移した。プレートを、４００ｒｐｍに設定された回転振盪機上で、所定の時間、所定の温度（５℃〜７０℃）で貯蔵した。規則的な時間間隔で、プレートを遠心分離し（４，０００ｒｐｍ１０分間）、１０μｌ試料を各ウェルから採取した。次いで、試料を、ペプチド定量化のために２８０ｎｍでのＵＶ吸収によって分析した。ペプチド濃度結果は、１０μｌの水を含むウェルの２８０ｎｍでのＵＶ吸収を減算した試料の２８０ｎｍでのＵＶ吸収として与えられる。
【００５２】
使用された緩衝液は、以下の通りであった。
【表４】
2021514936.tif 000005
【表５】
2021514936.tif 000006
【００５３】
アッセイ（ＩＩ）：  ＧＬＰ−１ペプチドのインビトロ効力（ＣＲＥルシフェラーゼ、全細胞）
この例の目的は、インビトロでＧＬＰ−１ペプチドの、効力とも呼ばれる、活性を試験することである。インビトロ効力は、全細胞アッセイにおけるヒトＧＬＰ−１受容体活性化の尺度である。
原理：インビトロ効力は、レポーター遺伝子アッセイにおけるヒトＧＬＰ−１受容体の応答を測定することによって決定される。アッセイは、ヒトＧＬＰ−１受容体を発現し、プロモーターに結合したｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）のＤＮＡおよびホタルルシフェラーゼ（ＣＲＥルシフェラーゼ）の遺伝子を含有する安定にトランスフェクトされたＢＨＫ細胞株において行われる。ヒトＧＬＰ−１受容体が活性化される場合、ｃＡＭＰの生成をもたらし、これは順に、ルシフェラーゼタンパク質の発現をもたらす。アッセイインキュベーションが完了した時に、ルシフェラーゼ基質（ルシフェリン）を追加し、酵素がルシフェリンをオキシルシフェリンに変換して、生物発光を生じる。発光はアッセイの読み取り値として測定される。
細胞培養および調製：このアッセイで使用される細胞（例えば、クローンＦＣＷ４６７−１２Ａ／ＫＺ１０−１）は、親細胞株としてＢＨＫＴＳ１３を有するＢＨＫ細胞である。細胞は、ヒトＧＬＰ−１受容体を発現するクローン（例えば、ＦＣＷ４６７−１２Ａ）由来であり、ＣＲＥルシフェラーゼでのさらなるトランスフェクションによって確立し、現在のクローンを得る。細胞は、５％ＣＯ２で細胞培養培地において培養する。それらを、アリコートし、液体窒素中で貯蔵する。各アッセイ前に、アリコートは、ＰＢＳ中で吸収され、２回洗浄された後、アッセイ特異的緩衝液中の所望濃度で懸濁される。９６ウェルプレートについて、懸濁液は、５×１０３細胞／ウェルの最終濃度をもたらすように作製される。
材料：アッセイでは以下の化学物質が使用され得る。プルロニックＦ−６８（１０％）（Ｇｉｂｃｏ  ２４０４）、オボアルブミン（Ｓｉｇｍａ  Ａ５５０３）、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  １１８８０−０２８）、１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ  １５６３０）、Ｇｌｕｔａｍａｘ  １００×（Ｇｉｂｃｏ  ３５０５０）、およびステディーライトプラス（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ６０１６７５７）。
緩衝液：細胞培養培地は、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １６１４０−０７１）、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １５１４０−１２２）、２４０ｎＭのＭＴＸ（メトトレキサート、Ｓｉｇｍａ  Ｍ９９２９）、および１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １５１４０−１２２）を有するＤＭＥＭ培地からなる。アッセイ培地は、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、および１ｘ  Ｇｌｕｔａｍａｘからなる。アッセイ緩衝液は、アッセイ培地中の２％オボアルブミンおよび０．２％プルロニックＦ−６８からなる。
手順：１）細胞ストックを３７℃水浴で解凍する。２）細胞をＰＢＳで３回洗浄する。３）細胞を計数し、アッセイ培地中の５×１０３細胞／５０μｌ（１×１０５細胞／ｍｌ）に調節し、細胞の５０μｌアリコートをアッセイプレートにおける各ウェルに移す。４）試験化合物（およびもしあれば参照化合物）のストックを、アッセイ緩衝液中の０．２μＭの濃度に希釈し、化合物を１０倍希釈して、以下の濃度：２×１０−７Ｍ、２×１０−８Ｍ、２×１０−９Ｍ、２×１０−１０Ｍ、２×１０−１１Ｍ、２×１０−１２Ｍ、２×１０−１３Ｍ、および２×１０−１４Ｍを得る。５）化合物またはブランクの５０μｌアリコートを、希釈プレートからアッセイプレートへ移し、化合物を以下の最終濃度：１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍ、１×１０−１３Ｍ、および１×１０−１４Ｍで試験する。６）アッセイプレートを５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で３時間インキュベートする。７）アッセイプレートを、インキュベーターから取り出し、１５分間室温で放置する。８）ステディーライトプラス試薬の１００μｌアリコートをアッセイプレートの各ウェルに加える（試薬は感光性であった）。９）各アッセイプレートを、アルミホイルで覆って光から保護し、室温で３０分間振盪する。１０）各アッセイプレートを、プレート読み取り機器、例えば、Ｐａｃｋａｒｄ  ＴｏＰｃｏｕｎｔ  ＮＸＴで読み取る。
計算および結果：プレート読み取り機器からのデータをソフトウェア（例えば、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）に移し、これは非線形回帰（ログ（アゴニスト）対応答）を行い、ｐＭで報告され得るＥＣ５０値を計算する。最低２つのレプリケートを各試料について測定する。報告される値は、レプリケートの平均である。
【００５４】
［実施例１］リラグルチド可溶性
リラグルチドの可溶性を、本明細書に記載されるアッセイ（Ｉ）を使用して決定した。サブセクション「９６ウェルプレート調製」に記載されるように、方法１（蒸発）または方法２（沈殿）を使用してリラグルチドを調製した。結果および使用される特定のパラメータを表３ａおよび表３ｂに示す。
【表６−１】
2021514936.tif 000007
【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
2021514936.tif 000011
【表７−１】
2021514936.tif 000012
【表７−２】
2021514936.tif 000013
【表７−３】
2021514936.tif 000014
【表７−４】
2021514936.tif 000015
【表７−５】
2021514936.tif 000016
【表７−６】
2021514936.tif 000017
【表７−７】
2021514936.tif 000018
【表７−８】
2021514936.tif 000019
【表７−９】
2021514936.tif 000020
【表７−１０】
2021514936.tif 000021
【表７−１１】
2021514936.tif 000022
【表７−１２】
2021514936.tif 000023
【表７−１３】
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【表７−１４】
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【表７−１５】
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【表７−１６】
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【表７−１７】
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【表７−１８】
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【００５５】
表３ａおよび３ｂにおける結果は、特定の条件で、有機溶媒の存在が溶解ＧＬＰ−１ペプチドの量を増加させることを示す。
【００５６】
本明細書で使用される「有機溶媒」または「修飾剤」という用語は、有機溶媒を意味する。
【００５７】
本発明のある特定の特徴を本明細書において例示および説明してきたが、数多くの修正、置換、変更、および均等物がここで当業者には思い浮かぶであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨内に収まるそのようなすべての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。
【配列表】
2021514936000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月22日(2020.6.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
未溶解および／または不溶性ＧＬＰ−１ペプチドを、水と１つ以上の有機溶媒とを含む溶液または懸濁液において、活性な、可溶性ＧＬＰ−１ペプチドへと溶解するための方法であって、
（ａ）未溶解および／または不溶性リラグルチドならびに有機溶媒アセトニトリルまたはＤＭＦを含む第１の組成物を得るステップであって、前記第１の組成物が、溶液または懸濁液の形態である、ステップと、
（ｂ）前記第１の組成物を２〜８５℃の範囲の温度でインキュベートするステップと、を含み、
前記有機溶媒がＤＭＦである場合、前記インキュベートすることが、少なくとも２０分の期間、（ｉ）５．０未満のｐＨで、５〜２８％（重量／重量）の範囲のＤＭＦの濃度で、または（ｉｉ）５．０〜５．５の範囲のｐＨで、０〜３５％（重量／重量）の範囲のＤＭＦの濃度で行われるか、あるいは
前記有機溶媒がアセトニトリルである場合、前記インキュベートすることが、少なくとも２分の期間、（ｉ）６．０未満のｐＨで、少なくとも３０％（重量／重量）のアセトニトリルの濃度で、（ｉｉ）３．５未満のｐＨで、少なくとも１４％（重量／重量）のアセトニトリルの濃度で、または（ｉｉｉ）前記温度が少なくとも５０℃である場合、（１）５．５〜６．０の範囲のｐＨで、１０％（重量／重量）未満のアセトニトリルの濃度で、もしくは（２）３．５未満のｐＨで行われる、方法。
【請求項２】
前記方法が、場合によっては本明細書のアッセイ（Ｉ）で記載されるように決定される、３時間のインキュベーション期間後に少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌの溶解リラグルチドの増加を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）での前記インキュベーションの温度が、２〜４０℃、４０〜８５℃、または１０〜５０℃からなる群から選択される、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の組成物が、溶液または懸濁液の形態である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記有機溶媒が、ＤＭＦであり、ステップ（ｂ）（ｉ）において、前記ＤＭＦの濃度が、７〜２３％（重量／重量）の範囲である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記期間が、少なくとも１時間である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記有機溶媒が、ＤＭＦであり、ステップ（ｂ）（ｉ）において、
ａ．前記ｐＨが、３．８未満であり、
ｂ．前記ＤＭＦの濃度が、９〜２５％（重量／重量）の範囲であり、
ｃ．前記期間が、少なくとも８時間である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記有機溶媒が、ＤＭＦであり、ステップ（ｂ）において、前記インキュベーション時間が少なくとも８時間である場合、前記インキュベーションが、（ｉ）５．０未満のｐＨで、２〜４０％（重量／重量）の範囲のＤＭＦの濃度で、または（ｉｉ）５．０〜６．０の範囲のｐＨで、０〜４０重量％（重量／重量）の範囲のＤＭＦの濃度で行われる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記有機溶媒が、ＤＭＦであり、ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、前記ＤＭＦの濃度が、最大２０％（重量／重量）または最大１９％（重量／重量）である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記有機溶媒が、アセトニトリルであり、ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、前記アセトニトリルの濃度が、少なくとも２０％（重量／重量）または少なくとも５５％（重量／重量）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記有機溶媒が、アセトニトリルであり、ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、前記ｐＨが、３．４未満または３．２未満である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記有機溶媒が、アセトニトリルであり、ステップ（ｂ）（ｉｉ）において、前記期間が、最大１６時間、または５分〜２０時間の範囲である、請求項１または１０〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記有機溶媒が、アセトニトリルであり、ステップ（ｂ）（ｉｉｉ）（２）において、前記アセトニトリルの濃度が、少なくとも４０％（重量／重量）または少なくとも４５％（重量／重量）である、請求項１または１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記有機溶媒が、アセトニトリルであり、ステップ（ｂ）（ｉｉ）またはステップ（ｂ）（ｉｉｉ）（２）において、前記ｐＨが、３．４未満または３．３未満である、請求項１または１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、アセトニトリルまたはＤＭＦを実質的に含まない組成物を得るステップを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
2021514936.tif 000030
2021514936.tif 000031