(57)【要約】  誘電泳動（ＤＥＰ）センサは、標的粒子を液体中に閉じ込めるためのチャネルに隣接するグラフェン電極；前記グラフェン電極の表面に取り付けられた表面プローブであって、前記標的粒子との選択的反応を有する表面プローブ；前記グラフェン電極に電気的に接続され、前記グラフェン電極に電圧を印加して、前記グラフェン電極において前記標的粒子のＤＥＰ捕捉を生じさせるように構成された電圧源；を備える。【選択図】図１ａ
2021526638.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘電泳動（ＤＥＰ）センサであって、
液体中にターゲット粒子を閉じ込めるためのチャネルに隣接するグラフェン電極；
前記グラフェン電極の表面に取り付けられ、前記ターゲット粒子との選択的反応性を有する表面プローブ；
前記グラフェン電極に対して電気的に接続され、前記グラフェン電極に対して電圧を印加して、前記グラフェン電極における前記ターゲット粒子のＤＥＰトラッピングを引き起こすように構成された電圧源；
を備えるＤＥＰセンサ。
【請求項２】
前記表面プローブおよび前記ターゲット粒子は、
分子、タンパク質、アプタマー、抗体、脂質、小胞、細胞由来粒子、官能化ナノ粒子、全細胞、
のグループから選択される相補対である、
請求項１記載のＤＥＰセンサ。
【請求項３】
前記グラフェン電極は複数のストリップを含む、請求項１または２記載のＤＥＰセンサ。
【請求項４】
前記ストリップは互いに平行である、請求項３記載のＤＥＰセンサ。
【請求項５】
前記ＤＥＰセンサはさらに、前記グラフェン電極と重なり前記電圧源と電気的に接続された第２電極を備える、
請求項１から４のいずれか１項記載のＤＥＰセンサ。
【請求項６】
前記ＤＥＰセンサはさらに、前記グラフェン電極および前記第２電極と電気的に接続されたソースメータを備える、
請求項５記載のＤＥＰセンサ。
【請求項７】
前記ＤＥＰセンサは、抵抗ベースのセンサである、請求項１記載のＤＥＰセンサ。
【請求項８】
前記ＤＥＰセンサは、キャパシタンスベースのセンサである、請求項１記載のＤＥＰセンサ。
【請求項９】
グラフェン電極と、前記グラフェン電極の表面に取り付けられた表面プローブとを備え、前記表面プローブがターゲット粒子との選択的反応性を有する、誘電泳動（ＤＥＰ）センサのための読み出し方法であって、
前記グラフェン電極に対して誘電泳動的に前記ターゲット粒子を引きつけるのに十分なＡＣ励起を印加するステップ；
測定信号を前記グラフェン電極に対して印加するステップであって、前記測定信号は、前記ターゲット粒子の存在を示す前記ＤＥＰセンサからの応答を読み出すのに十分である、ステップ；
を有する読み出し方法。
【請求項１０】
前記測定信号は、ＤＣ信号である、請求項９記載の読み出し方法。
【請求項１１】
前記測定信号は、ＡＣ信号である、請求項９または１０記載の読み出し方法。
【請求項１２】
前記ＡＣ励起の振幅は前記測定信号の振幅よりも大きい、
請求項９から１１のいずれか１項記載の読み出し方法。
【請求項１３】
前記読み出しは、前記センサによって測定される静電容量の変化に基づく、
請求項９から１２のいずれか１項記載の読み出し方法。
【請求項１４】
前記読み出しは、前記センサによって測定される電流の変化に基づく、
請求項９から１２のいずれか１項記載の読み出し方法。
【請求項１５】
前記表面プローブおよび前記ターゲット粒子は、
分子、タンパク質、アプタマー、抗体、脂質、小胞、細胞由来粒子、官能化ナノ粒子、全細胞、
のグループから選択される相補対である、
請求項９から１４のいずれか１項記載の読み出し方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
＜関連出願の相互参照＞
本出願は、２０１８年６月５日に提出された米国特許出願第.６２／６８０，７７７の優先権を主張するものである。同先行出願の開示は、本出願の開示の一部とみなされ、その全体が本出願に組み込まれる。
【０００２】
世界保健機関によれば、食品媒介性腸疾患により５億５，０００万人が病気になり、毎年２３万人が死亡している。サルモネラ属菌および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの感染は、これらの腸疾患の中で最も一般的なものである。サルモネラ属菌は、動物において見られる細菌であり、摂取すると重篤な健康障害を引き起こす可能性がある。このような問題は、年少児、高齢者、免疫機能が低下している人など、合併症のリスクが高い人では特に深刻である。同様に、大腸菌は大腸菌群の細菌ありで、その菌株とその人の感受性に応じて、ヒトに病気を起こし、死に至ることさえある。ミネソタ州および米国全土では、サルモネラ属菌および大腸菌のアウトブレイクは依然として公衆衛生に対する継続的な脅威である。
【０００３】
病原体細菌ＤＮＡのための一般的に使用される試験方法は、培養および／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析を含み、これは、一連の反復増幅配列を使用して標的ＤＮＡ分子を増幅するために使用される実験室技術である。ＰＣＲは優れた感度を有するが、特定の種の存在または非存在を決定するために数十サイクルを必要とし、時間と費用がかかり、そしてしばしば、最初の集積培養工程を必要とする。食品または臨床検体中の病原生物を検出するための、ますます迅速かつ高感度な方法が開発されている。特にサルモネラ属菌を検出する方法は、この細菌が食品媒介病原体として重要であることから急速に求められてきた。最近の進歩により、他の方法を用いた検出のスピードと感度はさらに向上したが、これらの技術はハンドヘルドシステムに必要なスピードと感度の短さを未だ有していない。
【０００４】
ハンドヘルドシステムのＤＮＡ検出の特に有望な方法は、グラフェンベースのセンサの使用を含み、文献中の多くの報告は、グラフェンがＤＮＡを選択的に感知するための優れた代替方法を提供することができることを示している。グラフェンは、機械的剥離によって、または化学気相成長法を用いた銅上の成長によって、単層の形態で実現することができる、ｓｐ2結合カーボンの２次元薄板である。
【０００５】
その単層の性質に起因して、グラフェンは吸着された生体分子に対して優れた感度を提供することができ、化学的に活性な標的に対して選択性を提供するように官能化することもできる。
【０００６】
従来のグラフェンセンサは、粒子を表面に引きつけるために単純な拡散プロセスを利用している。これは遅いことがある。他方、誘電泳動（ＤＥＰ）は粒子を高電場勾配の範囲に引きつけるために使用することができるが、選択的検知の好適な手段を提供するものではない。本発明では、表面上のプローブ材料で官能化されたグラフェンを使用することによって、ＤＥＰベースのセンサ内でどのように選択性を達成するかという問題を解決するセンサが記載される。また、比較的大きいＤＥＰ−引力バイアス電圧と、より小さい検知バイアス電圧とを分離する方法を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特定の側面において、本発明は、特異性および選択的感知を達成するために表面官能化を利用するグラフェンエッジ誘電泳動（ＤＥＰ）センサを特徴とする。いくつかの態様において、本発明はセンサの選択的応答を検出する方法を特徴とする。
【０００８】
実施形態において、グラフェンベースのＤＥＰセンサが選択性を達成するために、グラフェンまたは隣接する表面（または基板）上の表面官能化を利用する。グラフェンベースのＤＥＰセンサはＤＥＰ引力のための時変励起を使用することができ、これにより、ＤＥＰ  ＡＣ励起とは無関係にセンサ応答を読み出すことができる。
【０００９】
他の利点の中でも、実施形態は、ＤＥＰベースのグラフェンセンサを使用して、ある範囲の標的分子または生物粒子に対する選択性を達成することができる。また実施形態は、粒子をグラフェン端部に引き寄せることを意味する比較的大きなＡＣ励起が存在する場合に、センサ応答を読み出すことを可能にすることができる。
【００１０】
添付図面と以下の説明において、本発明の１以上の実施形態の詳細を説明する。本発明の他の特徴、対象、および利点は、当該説明および図面、ならびに特許請求範囲から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１ａ】抵抗ベースのＤＥＰセンサの上面図を示す概略図である。図１ａは、標的を含有する溶液中の、グラフェン表面上に取り付けられたプローブを有するセンサを示す。
【図１ｂ】抵抗ベースのＤＥＰセンサの上面図を示す概略図である。図１ｂは、印加されたＡＣバイアスを介してＤＥＰを用いてグラフェンエッジに引き付けられたターゲットを有するセンサを示す。
【図１ｃ】抵抗ベースのＤＥＰセンサの上面図を示す概略図である。図１ｃは、ＤＥＰ励起を除去した後の近くのプローブへのターゲット結合を示しており、センサ読み出しを可能にしている。
【図２ａ】容量ベースのＤＥＰセンサの上面図を示す概略図である。図２ａは、ターゲットを含む溶液中の、グラフェン表面に取り付けられたプローブを有するセンサを示す。
【図２ｂ】容量ベースのＤＥＰセンサの上面図を示す概略図である。図２ｂは、印加されたＡＣバイアスを介してＤＥＰを用いてグラフェンエッジに引き付けられたターゲットを有するセンサを示す。
【図２ｃ】容量ベースのＤＥＰセンサの上面図を示す概略図である。図２ｃは、ＤＥＰ励起を除去した後の近くのプローブへのターゲット結合を示しており、センサの読み出しが可能である。
【図３】抵抗ベースのＤＥＰセンサについての印加電圧信号および予想される応答のプロットを示す。
【図４】静電容量ベースのＤＥＰセンサについての印加電圧信号および予想される応答のプロットを示す。
【図５】ＡＣバイアスを変化させた静電容量ベースのＤＥＰセンサの予想される応答のプロットを示す。
【図６ａ】グラフェンエッジＤＥＰピンセット製造プロセスを示す図である。図６ａは、ゲート酸化物凹部およびゲート金属パターニングを示す図である。
【図６ｂ】グラフェンエッジＤＥＰピンセット製造プロセスを示す図である。図６ｂはグラフェン移動を示す。
【図６ｃ】グラフェンエッジＤＥＰピンセット製造プロセスを示す図である。図６ｃは、トラッピングセグメントへのグラフェンパターニングを示す図である。
【図６ｄ】グラフェンエッジＤＥＰピンセット製造プロセスを示す図である。図６ｄは、接触メタライゼーションおよびリフトオフを示す。
【図６ｅ】グラフェンエッジＤＥＰピンセット製造プロセスを示す図である。図６ｅは、プローブオブジェクトによる表面機能化を示す。
【００１２】
種々の図面における同じ参照記号は同じ要素を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
図１ａは、グラフェン端部誘電泳動センサ１０５の実施形態を示す。このセンサは、２０１７年６月１６日に出願された発明の名称「Electrodes formed from 2D materials for dielectrophoresis and systems and methods for utilizing the same」の米国仮出願第６２／５２１，０９６号、および２０１８年６月１８日に出願された米国特許出願第２０１８／０３６１４００号（両方とも参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、抵抗感知モードで動作する。
【００１４】
ＤＥＰセンサ１０５は、第１指状電極１１３と、グラフェン電極１８２と、接点１８４とを含む。接点１８４は、グラフェン電極１８２に電気的に結合される。ＤＥＰセンサ１０５は３端子デバイスであり、第１指状電極１１３がゲート電極として働き、２つの接点１８４がソース端子およびドレイン端子として働く。グラフェン電極１８２は、蛇行形状に配置されて、第１指状電極１１３との交差部位を増加させる。交差部位を増やすと、粒子を捕捉できるエッジの数が増える。例えば、グラフェン電極１８０の蛇行状ストライプの幅は１００ｎｍから５μｍの範囲とすることができ、第１指状電極１１３の指の幅は、０．１μｍから５μｍの範囲とすることができる。
【００１５】
グラフェン電極１８２は、第１指状電極１１３から電気的に絶縁される。例えば、絶縁層１３０と同様の絶縁層を、第１指状電極１１３とグラフェン電極１８２との間に配置することができる。このように、ＤＥＰセンサ１０５の例示的な積み重ね構造は、リストに示すような順序で、第１指状電極１１３、絶縁層、およびグラフェン電極１８２を含んでもよい。絶縁層は、グラフェン電極１８２および第１指状電極１１３によって形成される３端子ＦＥＴデバイスの「ゲート酸化物」として作用してもよい。
【００１６】
接点１８４は、種々の導電性材料から形成されてもよい。導電性材料の例としては、金、パラジウム、白金、タングステン、クロム、チタン、イリジウム、モリブデン、アルミニウム、または銅などの金属、ケイ化物、または合金が含まれる。いくつかの実施態様では、導電性材料の異なる層を積み重ねて接点１８４を形成することができる。
【００１７】
ＤＥＰセンサ１０５は、接点１８４を介してグラフェン電極１８２の２つの端部間にＤＣ電圧、ＡＣ電圧、またはその両方（まとめて「測定電圧」と呼ぶ）を印加し、第１指状電極１１３（「ゲート電極」）とグラフェン電極１８２との間にＡＣ電圧（「トラッピング電圧」）を印加してＤＥＰトラッピングを誘導しながら、結果として生じるドレイン電流（ＩＤ）を測定することによって電気的に測定することができる。トラッピング電圧は電圧源１８６を介して印加することができる。測定電圧は、電圧を印加して対応する電流を測定するように構成されたソースメータ１８８を介して印加することができる。最初に、特定の種類の粒子についてのＤＥＰトラッピング（例えば、１ＭＨｚ）に対応しない周波数で、ゲート電極１１３とグラフェン電極１８２との間にトラッピング電圧が印加され、粒子は捕捉されない。
【００１８】
測定電圧は、典型的にはトラッピング電圧よりも小さく、ドレイン電流ＩＤの流れによって生じるグラフェン電極１８４の２つの端子間の電圧降下を緩和する。例えば、測定電圧は、トラッピング電圧の振幅よりも１０〜１００倍小さくすることができる。
【００１９】
幾つかの実装形態において、トラッピング電圧は、ＡＣ電圧に加えてＤＣバイアスを有することができる。ＤＣバイアスは例えば、グラフェン電極１８２にバイアスをかけてその伝導率を制御するために使用することができる。
【００２０】
図１ａに示すように、表面プローブ１０１がグラフェン電極１８２に取り付けられ、プローブはターゲット１０２と選択的に反応するように設計されている。プローブおよび標的は任意の分子の相補対を特徴とする。この分子は例えば、タンパク質、アプタマー、抗体、脂質、小胞、細胞由来粒子、官能化ナノ粒子、または全細胞であり、プローブはグラフェンの表面に付着させることができる特性を有し、標的は、ＤＥＰを使用してグラフェン表面に引きつけることができかつグラフェン上の表面プローブに選択的に付着させることができるような分極性粒子である。
【００２１】
このようなプローブ／標的ペアの例は、相補的なマッチングを有する一本鎖ＤＮＡ分子である。別の例は、ストレプトアビジン標的の検出のためのビオチンまたはビオチン標識タンパク質を使用するグラフェンの官能化である。
【００２２】
プローブへの標的の選択的付着は、センサを使用して検出することができる。これは、グラフェン端ＤＥＰ形状を用いて、米国仮出願６２／５２１，０９６および米国特許出願２０１８／０３６１４００に既述の容量性または抵抗性センシング手段のいずれかを用いて達成することができる。センシングは、ＤＥＰエキサイションを用いてターゲット粒子を最初にグラフェン表面に引きつけ、次にエキサイティングをオフにして、より小さいシグナルを用いてグラフェンセンサレスポンスを評価する「引きつけおよび読み取り」モードを用いて達成することができる。
【００２３】
このモードの図はＤＮＡ検出を示す図１ａ〜１ｃに示されている。ＤＥＰ誘引パルスの前に、標的ＤＮＡは、端部がゲート端を横切るグラフェンの領域に誘引される。ＤＥＰパルスの放出後、図１ｃに示すように、標的ＤＮＡは近くのグラフェン表面上のプローブＤＮＡに付着することができ、これにより電気応答を生成する。この応答は、図１ａ〜１ｃに示す抵抗構成を用いて、または図２ａ〜２ｃに示すような容量性構成で達成することができる。
【００２４】
図２Ｆは、グラフェンバラクタ一体型ＤＥＰデバイス２０４の上面図を示す。ＤＥＰデバイス２０４は、第１フィンガー電極２１３、第２フィンガー電極２３３、およびグラフェン電極２８０を含む。グラフェン電極２８０は、第２指状電極２３３に電気的に結合される。グラフェン電極２８０は、粒子を捕捉することができる第１フィンガー電極２１３上のグラフェン電極２８０の縁部および交差部の数を増加させるために、いくつかのより小さなフィンガーに細分化されている。例えば、細分化されたフィンガーの幅は、１００ｎｍ〜５μｍの範囲とすることができる。
【００２５】
グラフェン電極２８０は、第１指状電極２１３から電気的に絶縁されている。例えば、絶縁層１３０と同様の絶縁層を、第１指状電極２１３とグラフェン電極２８０との間に配置することができる。このように、ＤＥＰ装置２０４の例示的な積み重ね構造は、リストに示すような順序で、第１指状電極２１３、絶縁層、グラフェン電極２８０、および第２指状電極２３３を含んでもよい。さらに、材料の他の層が、第１指状電極２１３、絶縁層、およびグラフェン電極２８０の間に存在してもよい。
【００２６】
第１および第２指状電極２１３、２３３は、多様な導電性物質から形成することができる。導電性材料の例としては、金、パラジウム、白金、タングステン、クロム、チタン、イリジウム、モリブデン、アルミニウム、または銅などの金属、ケイ化物、または合金が含まれる。いくつかの実施態様では、第１および第２電極２１３および２３３を形成するために、導電性材料の異なる層を積層することができる。このような積層は、金属と絶縁層またはグラフェンとの間の接着を改善するために、およびグラフェン電極２８０への電気的接触の品質を改善するために、有益である。
【００２７】
最初に、特定の種類の粒子についてのＤＥＰトラッピング（例えば、１ＭＨｚ）に対応しない周波数で、第１指状電極２１３（「ゲート電極」）とグラフェン電極２８０に結合された第２指状電極２３３との間にＡＣバイアスが印加され、その結果、粒子は捕捉されない。ＡＣバイアスは、電圧源２１６を介して印加することができる。
【００２８】
印加される電圧（下側のプロット）および予想される応答（上側のプロット）を、抵抗性感知モードについて図３に示す。本装置において、直流のドレイン・ソース間電圧ＶＤＳと一定のゲート電圧ＶＧＳを印加することにより、電流を読み出すことができる。ＤＮＡがサンプルに対して適用される場合、応答は典型的には遅い。しかし、より大きな交流ＶＧＳ信号が印加されると、ＤＥＰによりＤＮＡを試料端部へ誘引することが可能となり、装置の反応が加速される。ＡＣ信号が除去されると、センサは、標的分子を表面に捕捉することに対応する電流の変化を読み取る。この読み出しは、ゲート電圧を掃引し、電流をモニタして最小電流が生じるゲート電圧であるＤｉｒａｃ電圧を決定することによっても達成することができる。
【００２９】
図４において、容量ベースのセンサのための感知シナリオを示す。ここでは、小さなＡＣゲートバイアスを用いて簡単な２端子構成でセンサを読み出す。もう一度、デバイス応答を加速するために、より大きなＡＣバイアスを印加し、次いで、再び低減させて、センサ静電容量応答を読み出すことができる。抵抗センサと同様に、読み出しは、ゲート電圧を掃引し、容量が最小となるゲート電圧であるＤｉｒａｃ電圧をモニタすることによっても達成することができる。
【００３０】
図５に示されるように、いくつかの実施形態では、このシナリオが異なる濃度の標的分析物について繰り返し利用される。これは、分析物が単純な拡散プロセスを経由して表面に移動することを可能にすることと比較して、応答を速めるという利点を有する。これはまた、ＤＥＰ信号が連続的に印加され、センサ応答がＤＥＰ信号と同時に読み出される、代替の検知モードとは異なる。同様のパルスシーケンスを利用して、負のＤＥＰを実行することができ、この場合、センサがターゲット含有流体に曝された後に、不要な粒子が表面からはね返される。感知機器は、励起の周波数が溶液中の特定の粒子がはじかれるようなものであることを除いて、同様である。
【００３１】
一般に、上記で開示したセンサおよび技法は、様々な用途で実施することができる。例えば、それらは、ポイントオブケアセンサに配備することができる。いくつかの実施形態において、本実施形態は、ＤＮＡベースのバーコードセンサに展開される。
【００３２】
仮想例１： センサの製作とトラッピングの検証。
【００３３】
ＤＥＰベースのセンサを作製し、次のようにそのトラッピング能力を検証した。既存のグラフェン可変キャパシタ（または「バラクタ」）製造プロセス（例えば、Ｍ．Ａ．Ｅｂｒｉｓｈ、Ｈ．Ｓｈａｏ、およびＳ．Ｊ．Ｋｏｅｓｔｅｒの「Operation of multi-finger graphene quantum capacitance varactors using planarized local bottom gate electrodes」、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．１００，１４３１０２（２０１２）を参照）は、グラフェン表面近傍の粒子の大密度のトラッピングに適するように修正される。
【００３４】
グラフェン端ＤＥＰセンサの製造プロセスの一例を図６ａ〜６ｅに示す。この装置の製造は、厚いＳｉＯ２が熱酸化によって成長するシリコンウェハから始まる。次に、光リソグラフィーを用いてゲートコンタクト電極をパターニングし、その酸化膜を深さ〜５０ｎｍまで凹ませた後、ゲート金属（通常はＴｉ／Ｐｄ）を蒸着し、リフトオフして準平面電極を形成する（図６ａ）。ゲートメタライゼーションの後、薄いＨｆＯ２が原子層蒸着（ＡＬＤ）を用いて試料全体に蒸着される（通常〜７〜１０ナノメートル）。次に、化学蒸着（ＣＶＤ）グラフェンを、ＰＭＭＡハンドル層を用いてサンプル上に転写し、次いで、溶媒クリーンおよび真空アニーリングを用いてＰＭＭＡを除去する（図６ｂ）。
【００３５】
次に、グラフェンは、一連の狭いストリップにパターン化され、分子が捕捉されるより多くのエッジを生成する。光リソグラフィーを用い、ストリップは４μｍピッチで幅２μｍのサイズである。電子ビームリソグラフィーを用いて、ストリップは２００ｎｍピッチで１００ｎｍの幅である。パターン化グラフェンの概略を図６ｃに示す。次に、図６ｄに示すように、Ｃｒ／Ａｕ（１０／１００ｎｍ）メタライゼーションをパターン化してグラフェンへのオーミックコンタクトを形成する。デバイスの製造は、テスト中に流体閉じ込めのための微小体積を形成するために、活性デバイス領域の上にのみパターニングおよび開口されるＳＵ−８のような厚い（数ミクロン）分離層を含むことができる。最後に、図６ｅに示すように、官能化を適用してプローブをグラフェン表面に付着させる。
【００３６】
同時トラッピングとセンシングを実現する最適構造を決定するために、異なるデバイス形状を探索することができる。この設計最適化にはいくつかの要因がある。これらは以下を含む：（１）十分に効果的なトラッピングを達成するために必要なエッジの数；（２）キャパシタンスまたは抵抗感知；および（３）ＤＮＡフラグメントを誘引および感知するための励起の最適な配列。
【００３７】
センサは１ｍＭ  ＫＣｌ緩衝液中の濾過されたＤＮＡサンプルを使用して試験される（例えば、A. Barik, Y. Zhang, R. Grassi, B. P. Nadappuram, J. B. Edel, T. Low, S. J. Koester, and S.-H. Ohの「Graphene-edge dielectrophoretic tweezers for trapping of biomolecules」、Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８，１８６７（２０１７）を参照）。ただし、細胞膜や残余タンパク質などの別粒子を有する複合媒体を試すこともできる。食品媒介病原体検出のために、ＤＮＡサンプルにネズミチフス菌の断片を含めることができる。フラグメントは、サンプルを得るために使用されるＰＣＲ法のタイプ（ゲルベース、サイバーグリーン、またはリアルタイム）に基づいて、１ｋｂ〜１００ｂｐの長さで変化する。
【００３８】
仮想例２：グラフェンへのＤＮＡプローブ付着およびグラフェン端ＤＥＰピンセットを用いたネズミチフス菌および大腸菌に対する選択的ＤＮＡ感知。
【００３９】
この実施例は、２つの主要な要素を実証する：（１）グラフェン上のプローブＤＮＡの表面官能化、（２）図６ｄに示されるデバイス構造を使用するセンシング検証。
【００４０】
１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＰＢＡＳＥ）をグラフェン表面に付着させる。ＰＢＡＳＥのピレン末端はπ−π相互作用によりグラフェンに結合し、スクシンイミド部分はグラフェンから外側に伸びてプローブＤＮＡへの結合を可能にする。プローブを付着させるために、ＤＮＡの５’末端はアミン基を含むように修飾される。この修飾ＤＮＡを溶液中のＰＢＡＳＥ被覆グラフェンに暴露し、スクシンイミドと架橋させて安定な官能化層を形成させる。一般に、官能化手順はアセトニトリルなどのプローブＤＮＡ含有溶液中に基板全体を浸漬することによって達成されるが、このプロセスはノズルベースまたは３Ｄ印刷を使用して、同じチップ上で局所的に官能化されたデバイスを達成するように容易に改変することができ、これにより多重化された感知能力を可能にする。
【００４１】
プローブＤＮＡのグラフェン表面への付着は最初に、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）およびラマン分光法を用いてブランケットグラフェン層上で確認することができる。グラフェン上の官能化分子は、ラマン分光法を使用して、官能化種に特異的なピークを同定すること、ならびにグラフェン中の電子または正孔濃度の系統的な変化を示すＧおよび２Ｄピークのシフトを分析することの両方によって、検証できる。これらの技術を使用して官能化が確認された後、ＤＮＡプローブは、センサデバイス構造上のグラフェンに付着される。これらの構造において、プローブＤＮＡ付着は、Ｄｉｒａｃ電圧のシフトを分析することによってさらに検証される。Ｄｉｒａｃポイントシフトは、ピレンボロン酸機能化を用いて実証されたような表面機能付加の信頼できる指標であると考えられている（例えば、. Zhang, R. Ma, X. Zhen, Y. C. Kudva, P. Buhlmann, and S. J. Koester、"Capacitive sensing of gloce in graphene quantum varactors"，ACS Appl. Mater. Interfaces 9，３８８６３−３８８６９ （２０１７）を参照）。ここで、グラフェン官能化は、プローブ−ＤＮＡ含有溶液の濃度を増加させ、濃度の関数としてＤｉｒａｃ点シフトをモニタすることによって検証することができる。デバイス処理からの残留物が存在する可能性があり、ラマンによる裸のグラフェンからの同等のドーピング結果と、電気試験からのデバイスグラフェンとの比較が、その後の検知のための重要な検証を提供するので、この検証は重要である。
【００４２】
グラフェンデバイスのＤＥＰ強化センシングは、以下のように検証される。中〜高導電率ＫＣｌ溶液を、濃度約０．１×の標準リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と共に利用する。最初の試験では、大腸菌およびネズミチフス菌ＰＣＲから抽出した１００〜１０００ｂｐのＤＮＡ断片を、１ｎＭから１ｆＭまでの範囲の濃度で評価する。プローブＤＮＡは一本鎖ＤＮＡからなり、標的ＤＮＡはプローブと相補的な塩基対が一致する一本鎖ＤＮＡからなる。
【００４３】
試料は、フローセル形状を用いて試験される。試験手順では、標的ＤＮＡを含有する溶液を、あらかじめ機能化されたセンサの露出領域上で循環させる。フローセルの幾何学的形状により、単一のデバイスが様々なＤＮＡ濃度で試験されることが可能となる。
【００４４】
緩衝溶液の導電性によって引き起こされる寄生効果は、センサの外因性領域を隔離し、活性センサ領域のみが試験溶液と相互作用することを可能にするＳＵ−８層によって、最小限に抑えられる。しかしながら、このような問題が持続する場合、センシング溶液をさらに希釈すべきである。標準的なプローブステーションを使用してデバイスの試験を可能にする試験チップが使用され、この場合、プローブは、試験液中の活性デバイス領域から遠くに配置される。加えて、全ての感知実験は差動感知を利用し、「ブランク」センサ（ピレンのみで機能化された）が制御デバイスとして利用される。受容体のない電極から信号を差し引くことによって、バックグラウンド信号、ドリフト問題、および温度変動を排除することができる。このような差動センシングは、ＡＣ励起によって誘起された流体運動により加熱効果が生じ得るＤＥＰにおいて重要であるかもしれない。
【００４５】
図１ａ〜図１ｃおよび図２ａ〜図２ｃに示されている２つのタイプのセンサ形状に基づいて、２つの主な検知プロトコルが記載されている。第１は、図１ａ〜１ｃに示される抵抗ベースの幾何学的形状である。このジオメトリでは、グラフェンが複数の指状の埋め込み電極を数回横切るような形状にパターン化されている。グラフェンを蛇行形状に配置して、特定の領域内のゲートエッジ交差の数を増やすことができる。この形状では、グラフェン蛇行の両端間に小さなＤＣまたはＡＣバイアス（１００ｍＶオーダ）が印加される。センサの反応は、種々のＤＮＡ濃度についてＶＤＳ対時間の固定値での相対ドレイン電流変化（ΔＩＤ ／ＩＤ）を監視することにより決定される。感知は単にゲート電圧ＶＧＳを固定値に設定し、ΔＩＤ ／ＩＤ対時刻を監視することによって、ＤＥＰなしで監視することができる。この応答時間は、ＤＥＰ増強センシングを比較するためのベースラインに設定され、センサ表面での標的ＤＮＡの拡散時間およびその後のハイブリダイゼーションによって制限される。
【００４６】
このベースラインが確立された後、グラフェン端ＤＥＰ感知が評価される。例えば、各濃度において、ＤＣ応答を５分間モニタしてベースラインを確立し、次いで、ＡＣ励起を所定の時間（例えば、５分間）ゲート電極に加え、除去し、ＤＣ応答を再びモニタする。ＡＣ電圧はゼロを中心とし（ＤＣ成分なし）、ピークツーピーク値および周波数はトラッピングに依存する研究に基づいて決定される。この幾何学的形状では、トラッピング能率がセンサの長さに沿って変化しないことを保証するために、トラッピングの間、ＶＤＳをＡＣピークツーピークシグナルよりもはるかに小さく保つことが大切である。
【００４７】
評価される第２デバイスの幾何形状は、図２ａ〜２ｃに示されるバラクタの幾何形状である。幾何形状は並列配置で動作するので、ゲートエッジのグラフェンの小さな破断は性能に影響を与えないはずである。この装置はまた、ＶＤＳ＝０で動作し、したがって、様々な捕捉部位で変動を感知するという課題を有さない。バラクタ構成はキャパシタンス測定が既に高周波数で実行されており、したがって、ＤＮＡを捕捉するために励起の振幅のみを変更する必要があるという利点を有する。
【００４８】
最後に、干渉粒子に対するセンサの選択性が、現実的な生物学的培養における感知の効果を模倣するために評価される。ＤＮＡ分子は、タンパク質および脂質よりも高い電気分極率を有するので、最適なＤＥＰ周波数範囲および電圧がＤＮＡ分子を選択的に濃縮する一方で、望ましくない干渉物質および残屑を排除することが期待される。
【００４９】
複数の実施形態が記載されているが、様々な修正が本発明の精神および範囲から逸脱することなく行われることは理解されるだろう。したがって、他の態様は特許請求の範囲の範囲内にある。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【国際調査報告】
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