(57)【要約】  本開示は、検体を検出するための非膜タンパク質で組み立てられるナノ細孔システムを提供する。開示されるナノ細孔システムを使用する、方法、キット、および検出デバイスも開示される。前記ナノ細孔システムは、単一分子検出、ＤＮＡ／ＲＮＡ／ペプチド配列、化学物質、生物学的試薬、ポリマーの検知、および疾患診断など、様々な用途を有する。
2021514189.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体を検出するためのナノ細孔アセンブリであって、複数のサブユニットから形成されるチャネルを含み、各サブユニットは、タンパク質チャネルを形成し得る非膜タンパク質を含む、ナノ細孔アセンブリ。
【請求項２】
サブユニットのそれぞれが、配列番号１〜３５からなる群から選択されるポリペプチド配列と少なくとも７５％同一のポリペプチド配列を有するポリペプチドを含む、請求項１に記載のナノ細孔アセンブリ。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、システインで置換された少なくとも１つの残基を含む、請求項１または２に記載のナノ細孔アセンブリ。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、配列番号４〜１２と少なくとも７５％同一のポリペプチド配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のナノ細孔アセンブリ。
【請求項５】
検体を検出するためのプローブをさらに含み、前記プローブがサブユニットの少なくとも１つに作動的に連結されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載のナノ細孔アセンブリ。
【請求項６】
前記プローブが、化学物質、炭水化物、アプタマー、核酸、ペプチド、タンパク質、抗体、および受容体からなる群から選択される、請求項５に記載のナノ細孔アセンブリ。
【請求項７】
前記プローブが、配列番号３６〜７９からなる群から選択される配列と少なくとも７５％同一の配列を含む、請求項５に記載のナノ細孔アセンブリ。
【請求項８】
前記プローブが抗ＰＳＡ抗体である、請求項５に記載のナノ細孔アセンブリ。
【請求項９】
前記検体が、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ポリマー、および化学分子からなる群から選択される、請求項５に記載のナノ細孔アセンブリ。
【請求項１０】
前記検体が、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＶＣＡＭ、ＭｉＲ−１５５、ＭｉＲ−２２、ＭｉＲ−７、ＭｉＲ−９２ａ、ＭｉＲ−１２２、ＭｉＲ−１９２、ＭｉＲ−２２３、ＭｉＲ−２６ａ、ＭｉＲ−２７ａ、およびＭｉＲ−８０２からなる群から選択される、請求項５に記載のナノ細孔アセンブリ。
【請求項１１】
前記検体が、ＰＳＡまたはそのフラグメントである、請求項５に記載のナノ細孔アセンブリ。
【請求項１２】
前記プローブが、共有結合を介して前記サブユニットの少なくとも１つに作動的に連結されている、請求項５〜９のいずれか１項に記載のナノ細孔アセンブリ。
【請求項１３】
前記共有結合が、ジスルフィド結合、エステル結合、またはスルフヒドリル結合を含む、請求項１２に記載のナノ細孔アセンブリ。
【請求項１４】
前記プローブが、前記チャネルの開口部に近接した位置に作動的に連結されている、請求項５〜１３のいずれか１項に記載のナノ細孔アセンブリ。
【請求項１５】
前記プローブが、前記チャネルの内側の位置に作動的に連結されている、請求項５〜１３のいずれか１項に記載のナノ細孔アセンブリ。
【請求項１６】
前記チャネルがポリマーソームに埋め込まれている、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のナノ細孔アセンブリ。
【請求項１７】
膜をさらに含み、前記チャネルが前記膜に挿入されている、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のナノ細孔アセンブリ。
【請求項１８】
前記膜がポリマー膜または脂質膜を含む、請求項１７に記載のナノ細孔アセンブリ。
【請求項１９】
前記ポリマー膜が、交互コポリマー、周期的コポリマー、ブロックコポリマー、ジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、ターポリマー、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１８に記載のナノ細孔アセンブリ。
【請求項２０】
前記ポリマー膜がＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡを含む、請求項１９に記載のナノ細孔アセンブリ。
【請求項２１】
コレステロールおよびポルフィリンの少なくとも１つをさらに含む、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のナノ細孔アセンブリ。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載のナノ細孔アセンブリと、場合によっては前記ナノ細孔アセンブリの担体とを含む、検体を検出するための装置。
【請求項２３】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載のナノ細孔アセンブリと、場合によっては前記ナノ細孔アセンブリを使用するための説明書とを含む、キット。
【請求項２４】
（ａ）検体を含むサンプルを請求項１〜２１のいずれか１項に記載のナノ細孔アセンブリと接触させること；
（ｂ）前記ナノ細孔アセンブリの前記チャネルに電流を流すこと；
（ｃ）１つまたは複数の時間間隔で前記チャネルを通過する電流を決定すること；および、
（ｄ）１つまたは複数の時間間隔で測定された電流を基準電流と比較すること；
を含み、前記基準電流に対する電流の変化が前記サンプル中の前記検体の存在を示す、検体を検出する方法。
【請求項２５】
前記基準電流が、前記検体を含まないサンプルを用いて測定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ナノ細孔アセンブリが担体上に配置される、請求項２４または２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１８年２月１２日に出願された、その開示がその全体において参照により本明細書に援用される、米国仮特許出願第６２／６２９，６０４号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
［技術分野］
本開示は、通常、ナノ細孔に関し、より具体的には、検体を検出するために非膜タンパク質で組み立てられたナノ細孔を使用するシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
生物学的ナノ細孔は、基質、典型的には脂質膜に埋め込まれたタンパク質チャネルである。自然界の多種多様なタンパク質複合体が、優れたチャネル状の構造を形成し、そのいくつかは、α−溶血素、ＭｓｐＡ、エアロリシン、ＦｌｕＡ、Ｏｍｐ  Ｆ／Ｇ、ＣｓｇＧ、ＣｌｙＡ、およびＰＡ６３が含まれる、ナノ細孔として探求されてきた。例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの生物学的タンパク質ナノ細孔α溶血素（αＨＬ）は、単一分子の検出に使用されている。
【０００４】
近年、研究者は、単一分子分析において、生物学的、固体状、ＤＮＡ折り紙、およびハイブリッドの、ナノ細孔を採用している。生物学的ナノ細孔には、合成ナノ細孔と比較して利点があり、これは主に、人工ナノ細孔では未だ対応し得ない原子レベルの精度で再現性よく製造および修正され得るためである。しかしながら、生物学的ナノ細孔の既存の使用には欠点も有する。例えば、様々な検体を高い感度と特異性で検出するために、様々な形状、サイズ、および親水性／疎水性の特性を提供することにおいて、それらは融通が利かない。
【０００５】
従って、別個の特性を有する検体を検出するために修正可能な頑強なナノ細孔システムが依然として強く求められている。
【発明の概要】
【０００６】
この開示は、検体を検出するためのナノ細孔アセンブリを提供することにより、当技術分野におけるこの必要性に対処する。前記ナノ細孔アセンブリは、複数のサブユニットから形成されるチャネルを含む。各サブユニットは、タンパク質チャネルを形成し得る非膜タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、各サブユニットは、配列番号１〜３５からなる群から選択されるポリペプチド配列と少なくとも７５％同一のポリペプチド配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号４〜１２と少なくとも７５％同一のポリペプチド配列を含む。
【０００７】
いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドとしては、システインで置換される少なくとも１つの残基が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドはｐｈｉ２９ポータルまたはテールタンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、ｐｈｉ２９テールタンパク質としては、１つまたは複数のＥ５９５Ｃ、Ｋ３２１Ｃ、およびＫ３５８Ｃの置換が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、前記ｐｈｉ２９テールタンパク質としては、１つまたは複数の、Ｋ１３４Ｉ、Ｄ１３８Ｌ、Ｄ１３９Ｌ、Ｄ１５８Ｌ、Ｅ１６３Ｖ、Ｅ３０９Ｖ、Ｄ３１１Ｖ、Ｋ３２１Ｖ、Ｋ３５６Ａ、Ｋ３５８Ａ、Ｄ３７７Ａ、Ｄ３８１Ｖ、Ｎ３８８Ｌ、Ｒ５２４Ｉ、Ｒ５３９Ａ、およびＥ５９５Ｖの置換が挙げられ得る。
【０００８】
一態様では、前記ナノ細孔アセンブリは、検体を検出するためのプローブをさらに含む。前記プローブは、少なくとも１つのサブユニットに作動的に連結される。前記ブローブは、化学物質、炭水化物、アプタマー、核酸、ペプチド、タンパク質、抗体、受容体の１つである。いくつかの実施形態では、前記プローブは、配列番号３６〜７９からなる群から選択される配列と少なくとも７５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、前記プローブは抗ＰＳＡ抗体である。前記プローブは、共有結合を介して少なくとも１つのサブユニットに作動的に連結され得る。前記共有結合としては、ジスルフィド結合、エステル結合、またはスルフヒドリル結合が挙げられる。いくつかの実施形態では、前記プローブは、チャネルの入口の近くの位置、またはチャネルの内側の位置に作動的に連結される。
【０００９】
前記検体は、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ポリマー、および化学分子の１つであり得る。いくつかの実施形態では、前記検体は、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＶＣＡＭ、ＭｉＲ−１５５、ＭｉＲ−２２、ＭｉＲ−７、ＭｉＲ−９２ａ、ＭｉＲ−１２２、ＭｉＲ−１９２、ＭｉＲ−２２３、ＭｉＲ−２６ａ、ＭｉＲ−２７ａ、およびＭｉＲ−８０２の１つである。
【００１０】
ナノ細孔アセンブリのいくつかの実施形態によれば、前記チャネルは、ポリマーソームに埋め込まれる。いくつかの実施形態では、前記チャネルは膜に挿入される。前記膜としては、ポリマー膜または脂質膜が挙げられ得る。前記ポリマー膜としては、交互コポリマー、周期的コポリマー、ブロックコポリマー、ジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、ターポリマー、またはそれらの組み合わせが挙げられ得る。いくつかの実施形態では、前記ポリマー膜はＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡを含む。いくつかの実施形態では、前記ナノ細孔アセンブリとしては、コレステロールおよび／またはポルフィリンがさらに挙げられ得る。
【００１１】
他の態様では、本開示はまた、検体を検出するための装置を提供する。前記装置としては、上記のナノ細孔アセンブリと、場合によってはナノ細孔アセンブリの担体が挙げられる。前記装置としてはさらに、ナノ細孔アセンブリがつながれる電極が挙げられ得る。
【００１２】
他の態様では、本開示はさらに、上記のナノ細孔アセンブリ、および任意で、前記ナノ細孔アセンブリを使用するための説明書、などの、キットを提供する。
【００１３】
他の態様では、本開示は、検体を検出する方法を提供する。前記方法は以下のもの：（１）記載されるように検体を含むサンプルを前記ナノ細孔アセンブリと接触させること；（２）前記ナノ細孔アセンブリのチャネルに電流を流すこと；（３）１つまたは複数の時間間隔で前記チャネルを通過する電流を測定すること；および（４）１つまたは複数の時間間隔で測定された電流を基準電流と比較すること、を含み、ここで、基準電流に対する電流の変化は、サンプル中の検体の存在を示す。前記検体は、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ポリマー、および化学分子のいずれか１つであり得る。いくつかの実施形態では、前記基準電流は、検体を含まないサンプルで測定される。いくつかの実施形態では、前記ナノ細孔アセンブリは、担体上に配置される。
【００１４】
前述の概要は、本開示のすべての態様を定義することを意図したものではなく、かつ、追加の態様は、以下の詳細な説明などの他のセクションに記載される。文献全体は、統一された開示として関連付けられることを意図し、特徴の組み合わせが本文献の同じ文、段落、またはセクションで一緒に見つからない場合であっても、本明細書に記載されている特徴の全ての組み合わせが企図されていることを理解されたい。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、この詳細な説明から、本開示の思想および範囲の、様々な変更および修正が当業者に明らかとなるため、詳細な説明および特定の例は、本開示の特定の実施形態を示しているが、例示の手段としてのみ与えられていることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、ポリマー膜包埋ナノ細孔として使用される典型的な非膜タンパク質（切頭円錐構造として示される）の異なる機能層を示す概略図である。図１Ａは、膜の固定に重要な３つの異なるドメインを示している。図１Ｂは、単一分子検知のための機能モジュールの結合のために特に重要な２つの領域を示している。
【図２】図２は、直接膜挿入のための膜固定層の変異誘発の例を示し、ここでは、ｐｈｉ２９ｇｐ９ΔＬｏｏｐテールタンパク質が例として示されている。直接膜挿入の能力を高めるための、中間層（囲まれている）で行われる、一連の疎水性変異の前後の、ｐｈｉ２９ｇｐ９ΔＬｏｏｐテールタンパク質チャネルの構造。例示的な突然変異部位としては：Ｋ１３４Ｉ、Ｄ１３８Ｌ、Ｄ１３９Ｌ、Ｄ１５８Ｌ、Ｅ１６３Ｖ、Ｅ３０９Ｖ、Ｄ３１１Ｖ、Ｋ３２１Ｖ、Ｋ３５６Ａ、Ｋ３５８Ａ、Ｄ３７７Ａ、Ｄ３８１Ｖ、Ｎ３８８Ｌ、Ｒ５２４Ｉ、Ｒ５３９Ａ、およびＥ５９５Ｖが挙げられる。発現および精製の後、変異タンパク質は自動的にポリマー膜に挿入された。代表的な正に帯電した残基（例えば、ＲおよびＫ）および代表的な負に帯電した残基（例えばＥ、Ｑ、Ｄ、およびＮ）が示されている。
【図３】図３は、バクテリオファージタンパク質の発現および精製の例を示しており、ｐｈｉ２９ｇｐ９テールタンパク質の、タンパク質発現および精製が示された。クマシーブルーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、分子量７０．３３ｋＤａのｐｈｉ２９ｇｐ−９テールタンパク質チャネルの発現を示している。
【図４】図４は、クマシーブルーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの例であり、前記ｇｐ−９テールタンパク質チャネルの大部分が精製および組み立て後には１００ｋＤａのカラムに存在することを示しており、前記チャネルが、約７０ｋＤａのそのモノマー単位から組み立てられていることを明示している。
【図５】図５は、前記ｐｈｉ２９ｇｐ９テールタンパク質を使用して実証される、非膜タンパク質表面における標的部位選択の例である。ｐｈｉ２９ｇｐ９テールタンパク質の構造は、疎水性膜固定モジュールを結合するために、システインへの変異誘発が可能な３つの残基を示している。
【図６】図６は、前記ｐｈｉ２９ｇｐ９ΔＬｏｏｐテールタンパク質を使用して実証される、ポリマー膜に挿入される非膜タンパク質チャネルの例を示している。単一チャネルの記録データは、ｐｈｉ２９ｇｐ９ΔＬｏｏｐチャネルが組成ＰＭＯＸＡ６−ＰＤＭＳ６５−ＰＭＯＸＡ６のポリマー膜に直接挿入されていることを示している。導電性バッファー：１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６。印加電圧：７５ｍＶ。
【図７】図７Ａおよび図７Ｂは、バクテリオファージＰ２２  ｇｐ１ポータルタンパク質全長（図７Ａ）およびバレル欠失変異体（図７Ｂ）の構造を示す。
【図８】図８は、Ｐ２２  ｇｐ１ポータルタンパク質を使用して実証される、膜固定のための、非膜タンパク質における標的部位選択の例を示す。膜固定ドメインを組み込むための、代表的な結合部位（例えば、利用可能なシステイン残基Ｃ２８３）は、バクテリオファージＰ２２  ｇｐ１ポータルタンパク質の構造上に示されている。
【図９】図９は、ＶＣＡＭ１と融合したＰ２２  ｇｐ１ポータルタンパク質を使用して実証される、融合ペプチドプローブで機能化された非膜タンパク質細孔の例を示している。クマシーブルーに染色されたゲルは、精製されたバクテリオファージＰ２２  ｇｐ１ポータルタンパク質の全長と、Ｃ末端で融合したＶＣＡＭ１プローブを持つバレル欠失変異体を示している。
【図１０】図１０は、ＰＳＡと融合したＰ２２  ｇｐ１ポータルタンパク質を使用して実証される、融合ペプチドプローブで機能化された非膜タンパク質細孔の例を示している。クマシーブルーで染色されたゲルは、Ｃ末端に融合したＰＳＡプローブを持つ、精製されたバクテリオファージＰ２２  ｇｐ１ポータルタンパク質バレル欠失変異体を示している。
【図１１】図１１は、ＰＳＡを検出するためにＰＳＡプローブと融合したＰ２２  ｇｐ１ポータルタンパク質を使用して実証される、単一分子検知のための融合ペプチドプローブで機能化された非膜タンパク質細孔の例を示す。単一チャネルの記録データは、融合ＰＳＡプローブを内包するＰ２２  ｇｐ１タンパク質チャネルが、組成ＰＭＯＸＡ６−ＰＤＭＳ３５−ＰＭＯＸＡ６のポリマー膜に直接挿入されていることを示している。ＰＳＡ（１０ｎｇ／ｕＬ）の存在下で、前記プローブはＰＳＡに結合し、特徴的な電流遮断イベントが発生する。導電性バッファー：１Ｍ  ＫＣｌ、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６。印加電圧：７５ｍＶ。
【図１２】図１２は、Ｔ４  ｇｐ２０ポータルタンパク質を使用して実証される、膜固定のための非膜タンパク質における標的部位選択の例を示す。膜固定ドメインを組み込むための代表的な結合部位（例えば、利用可能なシステイン残基、Ｃ２１７、Ｃ２４５、Ｃ２４６を介して）は、バクテリオファージＴ４  ｇｐ２０ポータルタンパク質の構造上に示されている。
【図１３】図１３は、Ｔ４  ｇｐ２０ポータルタンパク質を使用して実証される、膜固定のためにコレステロール−ＰＥＧ−マレイミドで非膜タンパク質チャネルを標識する例を示している。
【図１４】図１４は、コレステロールを内包するＴ４  ｇｐ２０ポータルタンパク質を使用して実証される、ポリマー膜に挿入される非膜タンパク質チャネルの例を示している。タンパク質の段階的直接挿入が、適用電位下で観察された。導電性バッファー：１Ｍ  ＫＣｌ、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６。印加電圧：１００ｍＶ。膜：ＰＭＯＸＡ６−ＰＤＭＳ３５−ＰＭＯＸＡ６。
【図１５】図１５は、ｐｈｉ２９ｇｐ１０ポータルタンパク質を使用して実証される、クリックケミストリーを介してプローブを非膜タンパク質チャネルに結合する例を示している。チオール−ｍｉＲ−２１プローブをＴＣＯ（ｔｒａｎｓ−シクロオクテン）で標識した後、ＴＣＯ−ｍｉＲ−２１プローブをメチルテトラジン−タンパク質に結合させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、タンパク質に結合したｍｉＲ−２１プローブへの標的ｍｉＲ−２１結合を検証する。
【図１６】図１６は、Ｔ４ ｇｐ２０ポータルタンパク質を使用して実証される、プローブ機能化非膜タンパク質細孔を使用する、検体（例えば、ｍｉＲＮＡ）検出の例を示している。標的ｍｉＲＮＡの存在下では、電流遮断イベントが観察され、単一分子レベルでのｍｉＲＮＡの検出を示した。導電性バッファー：１Ｍ  ＫＣｌ、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６。印加電圧：１００  ｍＶ。膜：ＰＭＯＸＡ６−ＰＤＭＳ３５−ＰＭＯＸＡ６。
【図１７】図１７Ａは、ＰＭＯＸＡ６−ＰＤＭＳ６５−ＰＭＯＸＡ６を使用して実証される、ナノ細孔としての非膜タンパク質の挿入のためのポリオキサゾリンベースのトリブロックコポリマーの例を示している。図１７Ｂは、２日間にわたる平面膜の安定性を示している。前記膜は膜漏れの兆候を示さない。膜：ＰＭＯＸＡ６−ＰＤＭＳ３５−ＰＭＯＸＡ６。図１７Ｃおよび図１７Ｄは、ｐｈｉ２９ｇｐ９テールタンパク質（図１７Ｃ）およびＰ２２  ｇｐ１ポータルタンパク質（図１７Ｄ）を使用して実証される、ポリマーソームと平面ポリマー膜との融合を使用して非膜タンパク質細孔を挿入する例を示している。図１７Ｃにおける平面膜およびポリマーソーム組成：ＰＭＯＸＡ１１−ＰＤＭＳ６５−ＰＭＯＸＡ１１；図１７Ｄにおける平面膜およびポリマーソーム組成：ＰＭＯＸＡ５−ＰＤＭＳ１３−ＰＭＯＸＡ５。
【図１８】図１８は、ｐｈｉ２９ｇｐ１０ポータルタンパク質を使用して実証される、検体プローブを組み込むためのスパイタグ／スパイキャッチャー系を有する非膜タンパク質の例を示している。クマシーブルーで染色されるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、ｐｈｉ２９ｇｐ１０ポータルタンパク質に組み込まれたスパイタグとＰＳＡ−スパイキャッチャータンパク質とが結合して複合体を形成していることを示している。次に、機能化された細孔は、図１９に示されるように、ＰＳＡを感知するために使用され得る。
【図１９】図１９は、ｐｈｉ２９ｇｐ１０ポータルタンパク質を使用して実証される、スパイタグ−スパイキャッチャー系を使用する検体検出のための非膜タンパク質チャネルの例を示している。直接挿入後、前記ｐｈｉ２９ｇｐ１０ポータルのスパイタグ／スパイキャッチャー（ＰＳＡプローブ）は、電流遮断イベントとして示されているように、溶液内のＰＳＡ（１０ｎｇ／ｕＬ）を検出し得た。導電性バッファー：１Ｍ  ＫＣｌ、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６。印加電圧：１００ｍＶ。膜：ＰＭＯＸＡ６−ＰＤＭＳ３５−ＰＭＯＸＡ６。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
［発明の詳細な説明］
この開示は、異なる検体を検出するために適応可能で頑強なナノ細孔システムおよび方法を提供する。それは、単一分子、および他の汚染物質とともに存在する標的分子の検出を可能にする。前記システムは、ラベルフリー、増幅フリーのリアルタイム検出を提供する。それは、必要なサンプル量が非常に少なく、ハイスループット分析に使用され得る。前記システムは、異なる形状、サイズ、および親水的／疎水的特性を有する様々な検体（例えば、低分子、ポリマー、ポリペプチド、およびヌクレオチド）を高い感度および高い特異性で検出するように適合させ得る。
【００１７】
この開示は、バクテリオファージに由来するタンパク質などの、非膜タンパク質で形成されるナノ細孔を提供することにより、当技術分野における必要性に対処する。開示されるナノ細孔を生成するために、バクテリオファージタンパク質は発現、精製、自己組織化し、かつ脂質またはポリマー膜に挿入された。しかしながら、非膜タンパク質チャネルは、脂質二重層またはポリマー膜に直接挿入することがより困難である。膜タンパク質チャネルとは異なり、非膜タンパク質チャネルは通常、中央の疎水性層と両端の親水性層を欠いている。本発明は、ポリマー膜において、直接または非常に効率的な融合機構を介してのいずれかで、様々なタンパク質チャネルを挿入するための一連の方法を使用することによってこの制限を克服する。さらに、いくつかの状況では、部位特異的変異誘発、アミノ酸の挿入および削除、および機能モジュールの導入、などのタンパク質工学が実行され、ナノ細孔の特性を調整して様々な検出ニーズを満たす。
【００１８】
開示されるナノ細孔システムは、単一分子の検出、ＤＮＡ／ＲＮＡ／ペプチド配列決定、化学物質、生物学的試薬、およびポリマー、の検知、ならびに疾患診断、などの、これらに限定されない幅広い用途を有する。以下でさらに記載されるように、開示されたナノ細孔システムを使用する方法、キット、および検出デバイスもまた、本開示の範囲内である。
【００１９】
Ｉ．ナノ細孔アセンブリ
本開示の一態様は、非膜タンパク質で形成されるナノ細孔に関する。ナノ細孔を形成するのに適した非膜タンパク質は、細胞のＤＮＡトランスロカーゼ、ヘリカーゼ、ターミナーゼ、ＡＴＰアーゼ、およびそれらのフラグメントに由来し得る。ナノ細孔の形成に適した非膜タンパク質としては、ＤＮＡ修復、複製、組換え、染色体分離、ＤＮＡ／ＲＮＡ輸送、膜ソーティング、細胞再編成、細胞分裂、細菌二分裂、およびその他のプロセス、に関与するタンパク質もまた挙げられ得る。
【００２０】
前記ナノ細孔としては、非膜タンパク質をそれぞれ含む複数のサブユニットが挙げられ得る。例えば、前記ナノ細孔としては、ファージポータルタンパク質の１０〜１５サブユニットまたは５〜１０のファージテールタンパク質が挙げられ得る。ナノ細孔を形成する非膜タンパク質チャネルは、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ７、ＳＰＰ１、Ｐ２２、Ｐ２、Ｐ３、Ｌａｍｂｄａ、Ｍｕ、ＨＫ９７およびＣ１などの、これらに限定されないバクテリオファージポータルタンパク質に由来し得る。例えば、ナノ細孔を形成する非膜タンパク質チャネルは、ｐｈｉ２９、Ｃ１、髄膜炎菌血清群Ｂ、Ｔ４、ｐｈｉＸ１７４、ラムダ、ＳＰＰ１、Ｔ５、Ｍｕ、Ｆ４−１、Ｐ２、セラチアファージＫＳＰ９０、腸内細菌ファージＴ７Ｍ、バクテリオファージＨＫ９７などの、これらに限定されない、バクテリオファージのテールタンパク質に由来し得る。
【００２１】
Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ７、ＳＰＰ１、Ｐ２２、Ｐ２、Ｐ３、ラムダ、Ｍｕ、ＨＫ９７、およびＣ１などの、これらに限定されない、バクテリオファージタンパク質（例えば、バクテリオファージのポータルタンパク質またはテールタンパク質）に対して有意な同一性を有する変異体および相同体もまた、本開示の範囲内である。例えば、そのような変異体および相同体は、本明細書に記載のバクテリオファージポータルタンパク質の配列と、少なくとも約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性の配列を有し得る。
【００２２】
生物学的細孔変異誘発を使用して、本明細書に記載の組成物または方法における、組み立てまたは使用のために、タンパク質細孔を最適化し得る。例えば、タンパク質工学および変異誘発技術を使用して、生物学的孔を変異させ、特定の用途に合わせてその特性を調整し得る。従って、前記ナノ細孔アセンブリとしては、複数のサブユニットから形成されるチャネルが挙げられ得る。それぞれの前記サブユニットは、配列番号１〜３５からなる群から選択されるポリペプチド配列と少なくとも７５％の同一性を有するポリペプチド配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号４〜１２と少なくとも７５％同一のポリペプチド配列を含む。
【００２３】
前記サブユニットは、ナノ細孔の機能化または膜への挿入を容易にするような、１つまたは複数の置換、欠失、または挿入を含み得る。例えば、前記サブユニットは、少なくとも１つの、システインで置換された残基を含み、ジスルフィド結合を介して官能基を前記サブユニットに結合し得る。例えば、システイン残基は、ポルフィリンなどの化学物質を前記ナノ細孔に結合させるために使用し得る。いくつかの実施形態では、前記サブユニットとしては、Ｅ５９５Ｃ、Ｋ３２１Ｃ、およびＫ３５８Ｃ置換の１つまたは複数を有する、ｐｈｉ２９ｇｐ９タンパク質が挙げられ得る。
【００２４】
さらに、前記サブユニットとしては、Ｋ１３４Ｉ、Ｄ１３８Ｌ、Ｄ１３９Ｌ、Ｄ１５８Ｌ、Ｅ１６３Ｖ、Ｅ３０９Ｖ、Ｄ３１１Ｖ、Ｋ３２１Ｖ、Ｋ３５６Ａ、Ｋ３５８Ａ、Ｄ３７７Ａ、Ｄ３８１Ｖ、Ｎ３８８Ｌ、Ｒ５２４Ｉ、Ｒ５３９Ａ、およびＥ５９５Ｖ置換の１つまたは複数を有するｐｈｉ２９ｇｐ９タンパク質が挙げられ得る。荷電残基（例えば、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ）を疎水性残基（例えば、Ａ、Ｖ、Ｌ）で置換すると、タンパク質の疎水性が局所的および全体的に高まる。
【００２５】
いくつかの実施形態では、膜またはナノディスクにタンパク質チャネルを組み込むプロセスは、タンパク質のアフィニティタグ（例えば、ポリヒスチジンアフィニティタグ）から、およびアフィニティカラム（例えば、Ｎｉカラム）による混合ナノ細孔群の精製から利益が得られ得る。アフィニティタグおよび化学的結合技術（例えば、上記のシステインの修飾）を使用して、本明細書に記載の様々な方法、組成物または装置で使用のために、テザーをナノ細孔に付着させ得る。例えば、得られたテザーを使用して、ナノ細孔を固体担体または電極に誘引または付着させ得る。
【００２６】
【表１−１】
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【００２７】
【表１−２】
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【００２８】
【表１−３】
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【００２９】
【表１−４】
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【００３０】
【表１−５】
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【００３１】
【表１−６】
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【００３２】
【表１−７】
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【００３３】
【表１−８】
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【００３４】
【表１−９】
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【００３５】
【表１−１０】
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【００３６】
【表１−１１】
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【００３７】
【表１−１２】
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【００３８】
【表２−１】
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【００３９】
【表２−２】
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【００４０】
【表２−３】
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【００４１】
【表３−１】
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【００４２】
【表３−２】
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【００４３】
【表３−３】
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【００４４】
【表３−４】
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【００４５】
【表３−５】
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【００４６】
【表３−６】
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【００４７】
【表３−７】
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【００４８】
【表３−８】
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【００４９】
【表３−９】
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【００５０】
【表３−１０】
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【００５１】
【表３−１１】
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【００５２】
【表３−１２】
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【００５３】
【表３−１３】
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【００５４】
【表３−１４】
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【００５５】
【表３−１５】
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【００５６】
【表３−１６】
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【００５７】
【表３−１７】
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【００５８】
【表３−１８】
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【００５９】
【表３−１９】
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【００６０】
【表３−２０】
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【００６１】
【表３−２１】
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【００６２】
【表３−２２】
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【００６３】
【表３−２３】
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【００６４】
ポリペプチド「変異体」は、用語が本明細書で使用される場合、１つまたは複数の置換、欠失、付加、および／または挿入において、本明細書で具体的に開示されるポリペプチドと通常は異なるポリペプチドである。そのような変異体は、天然に発生し得るか、または、例えば、本開示の上記のポリペプチド配列の１つまたは複数を修飾し、本明細書に記載のポリペプチドの１つまたは複数の生物活性を評価することにより、および／または当技術分野で知られているいくつかの技術のいずれかを使用することによって、合成的に生成し得る。
【００６５】
例えば、特定のアミノ酸は、他のポリペプチドまたは細胞に結合するその能力をそれほど失うことなく、タンパク質構造内において他のアミノ酸に置き換え得る。タンパク質の生物学的機能活性を定義するのはタンパク質の結合能力および性質であるため、特定のアミノ酸配列置換がタンパク質配列に、およびそれに応じて、その基礎となるＤＮＡコード配列に生じ得て、それによって同様の特性を有するタンパク質が得られる。従って、開示された組成物のペプチド配列、または前記ペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列に、それらの生物学的有用性または活性をそれほど失うことなく、様々な変更を加え得ると考えられる。
【００６６】
変異配列としては、本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾により保存的置換が導入されたものが挙げられる。アミノ酸は、物理的性質および二次および三次タンパク質構造への寄与に従って分類され得る。このような保存的修飾としては、アミノ酸の置換、付加、および欠失が挙げられる。保存的アミノ酸置換は、そのアミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。
【００６７】
「配列同一性」または「相同性」は、最大の相同性割合を達成するために、必要に応じて、配列を整列させ、ギャップを導入した後の前記非変異配列と同一である、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列変異体の残基の割合を指す。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド変異体は、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性を有する。
【００６８】
ポリペプチド変異体配列は、本開示に列挙された配列と７０％以上（すなわち、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはそれより上の）の配列同一性を共有し得る。ポリペプチド変異体としてはまた、本明細書に開示されるアミノ酸配列の連続したストレッチの様々な長さを含むポリペプチド断片が挙げられ得る。ポリペプチド変異体配列としては、１つまたは複数の本明細書に開示される配列の、少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、またはそれより上の連続ペプチド、ならびにそれらの間のすべての中間の長さが挙げられる。
【００６９】
ＩＩ．プローブで機能化されるナノ細孔アセンブリ
一態様では、前記ナノ細孔アセンブリは、検体を検出するためのプローブをさらに含む。前記プローブは、少なくとも１つの前記サブユニットに作動的に連結される。そのようなプローブは、ナノ細孔アセンブリに結合されて、１つまたは複数の検体の選択的結合を可能にする。プローブは、様々な化学量論（プローブとナノ細孔アセンブリ間のモル比）で前記ナノ細孔アセンブリに結合され得る。一例では、前記プローブは、それぞれの前記サブユニットに結合され得る。他の例では、１つのプローブのみがナノ細孔アセンブリに結合される。２つ以上の異なるタイプのプローブを含むナノ細孔アセンブリをも企図される。そのような機能化されたナノ細孔アセンブリは、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ポリマー、および化学分子などの検体を検出するために使用され得る。いくつかの実施形態では、前記検体は、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＶＣＡＭ、ＭｉＲ−１５５、ＭｉＲ−２２、ＭｉＲ−７、ＭｉＲ−９２ａ、ＭｉＲ−１２２、ＭｉＲ−１９２、ＭｉＲ−２２３、ＭｉＲ−２６ａ、ＭｉＲ−２７ａ、ＭｉＲ−８０２またはそれらのフラグメントの１つである。
【００７０】
「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」、および「特異的に結合する」という用語は、ナノ細孔アセンブリ上のプローブが、サンプル中に存在する他の汚染物質よりも強くサンプル中の検体に結合することを指す。例えば、前記プローブは、結合アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、平衡透析、またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００表面プラズモン共鳴装置における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術、により測定した場合、およそ１０−６Ｍ未満、例えばおよそ１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満、あるいはさらにより低い平衡解離定数（Ｋｄ）で検体と結合し得る。
【００７１】
前記プローブは、化学物質、炭水化物、アプタマー、核酸、ペプチド、タンパク質、抗体、および受容体の１つである。いくつかの実施形態では、前記プローブとしては、配列番号３６〜７９の配列と少なくとも７５％同一の配列が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、前記プローブは、抗ＰＳＡ抗体である。前記プローブは、共有結合を介して前記サブユニットの少なくとも１つに作動的に連結されている。前記プローブは、サブユニット上の１つまたは複数の機能部位を介してサブユニットに結合され得る。そのような機能部位は、突然変異誘発、例えばシステインまたは他の非天然アミノ酸による置換によって導入され得る。前記プローブはまた、エステル結合、クリックケミストリー、およびスルフヒドリル結合などの、これらに限定されない確立された化学的方法を介して前記チャネルに結合され得る。いくつかの実施形態では、前記プローブは、前記チャネルの入口に近接する位置または前記チャネルの内側の位置に作動的に連結される。
【００７２】
ＩＩＩ．膜を有するナノ細孔アセンブリ
他の態様では、本開示は、前記チャネルが前記膜に挿入されるナノ細孔アセンブリを提供する。前記ポリマー膜は、独立型またはマイクロ流体デバイスのいずれかの用途に応じて、様々な組成のものであり得る。前記ポリマー膜埋め込みチャネルは、頑強な電気生理学的特性、単一分子ナノ細孔ベースの分析に予め必要な機能を示す。前記膜としては、ポリマー膜（例えば、平面ポリマー膜）または脂質膜が挙げられ得る。前記ポリマー膜は、本質的に対称または非対称のいずれかであり得る。例えば、前記ポリマー膜は、交互コポリマー（例えば、Ａ−Ｂ−Ａ−Ｂ−．．．．）または周期的コポリマー（例えば、ＡＡ−ＢＢ−ＡＡ−ＢＢ．．．．）である。他の例では、前記ポリマー膜は、共有結合によって連結された２つまたはそれより多いホモポリマーサブユニットを含むブロックコポリマーであり得る。あるいは、前記ポリマー膜は、ジブロックまたはトリブロックコポリマー（例えば、ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡ）であり得る。前記ポリマー膜はまた、３つの異なるモノマーからなるターポリマーであり得る。
【００７３】
いくつかの実施形態では、前記ポリマー膜は、交互コポリマー、周期的コポリマー、ブロックコポリマー、ジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、ターポリマー、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、前記ポリマー膜はＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡを含む。
【００７４】
いくつかの実施形態では、前記チャネルは、様々な大きさのポリマーソームに埋め込まれる。いくつかの実施形態では、前記ポリマーソームは、平面ポリマー膜と融合して前記チャネルを挿入される。ポリマーソームは、中央の水性コアを有する二層小胞系に配置された親水性−疎水性ブロックコポリマーで構成される。それらは親水性の内部コアおよび疎水性の二重層を有する。それらは、ナノ粒子の場合のように、疎水性コアではなく親水性コアを含むという点でナノ粒子とは異なる。それらは二重層構造を有するが、厚くて硬い二重層が存在するため、リポソームよりも高い安定性を示す。それらは、タンパク質に適した環境を提供する親水性コアを含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、前記チャネルは、様々な組成の任意の界面活性剤（例えば、ＤＤＭ、ＤＯＣ、Ｔｗｅｅｎ、ＳＤＳ、Ｂｒｉｊベースの界面活性剤）の存在下でポリマー膜に挿入される。いくつかの実施形態では、前記タンパク質チャネルは、高効率の融合のために、様々な量のグリセロール、ＣｓＣｌ、および／またはスクロースの存在下でポリマーソームに再構成される。
【００７６】
いくつかの実施形態では、前記タンパク質チャネルは、突然変異誘発（例えば、１つから複数の置換を含む）によって再設計され、（平面）ポリマー膜への挿入を容易にする。さらに、前記タンパク質チャネルは、ポリマー膜に挿入する目的で、化学物質または生体高分子による部位特異的標識のための機能部位を導入するように再設計される。そのような機能部位としては、ポルフィリンなどの化学物質、または、コレステロール、もしくは様々な長さの任意の疎水性脂質モジュールまたは核酸、などの生体分子、を結合するためのシステイン残基が挙げられる。前記の機能部位／グループとしては、エステル、クリックケミストリー、およびスルフヒドリルなど、これらに限定されない確立された化学的方法によって作製された非天然アミノ酸や結合もまた挙げられ得る。
【００７７】
いくつかの実施形態では、前記結合位置は、Ｔ４  ｇｐ  ２０ポータルタンパク質の残基７０〜８０、１１０〜１４０、１５５〜２４５、３００〜３４０、４１０〜４３５；Ｐ２２  ｇｐ１ポータルタンパク質の残基１０〜４５、２５０〜３００；およびｐｈｉ２９  ｇｐ９テールタンパク質の残基１３０〜１７０、３００〜３２５、３５０〜３９０、５３０〜５９５；などのチャネルの膜固定層にある。従って、膜挿入の目的でベルト領域の疎水性を増減するため、再設計としては、Ｔ４  ｇｐ  ２０ポータルタンパク質の残基７０〜８０、１１０〜１４０、１５５〜２４５、３００〜３４０、４１０〜４３５；Ｐ２２  ｇｐ１ポータルタンパク質の残基４５０〜５００、３５０〜３８０；およびｐｈｉ２９  ｇｐ９テールタンパク質の残基１３０〜１７０、３００〜３２５、３５０〜３９０、５３０〜５９５；のいずれか１つ、の変異誘発（例えば、置換、挿入、削除）が挙げられ得る。
【００７８】
いくつかの実施形態では、前記結合位置は、Ｔ４  ｇｐ  ２０ポータルタンパク質の残基４６５〜５１５、２８５〜３０５；Ｐ２２  ｇｐ１ポータルタンパク質の残基４５０〜５００、３５０〜３８０；およびｐｈｉ２９  ｇｐ９テールタンパク質の残基２０〜５０、および２５０〜３００；などの、チャネルのシスおよびトランス親水性層にある。従って、膜挿入の目的でベルト領域の疎水性を増減するため、再設計としては、Ｔ４  ｇｐ  ２０ポータルタンパク質の残基４６５〜５１５、２８５〜３０５；Ｐ２２  ｇｐ１ポータルタンパク質の残基４５０〜５００、３５０〜３８０；およびｐｈｉ２９  ｇｐ９テールタンパク質の残基２０〜５０および２５０〜３００；のいずれか１つ、の変異誘発（例えば、置換、挿入、削除）が挙げられ得る。
【００７９】
ＩＶ．ナノ細孔アセンブリを含むデバイスおよびキット
他の態様では、本開示はまた、検体を検出するためのキットおよび検出装置を提供する。前記キットとしては、記載されるナノ細孔アセンブリ、任意に緩衝液、および任意にナノ細孔アセンブリを使用するための説明書が挙げられ得る。
【００８０】
前記装置は、記載されるようなナノ細孔アセンブリおよびナノ細孔アセンブリのための担体が挙げられ得る。前記検出装置としては、固体担体に埋め込まれた電極がさらに挙げられ得る。前記電極は、膜へのタンパク質ナノ細孔の集合を測定するために使用され得る。前記電極は、検体検出段階中のデータ収集にも使用され得る。測定および検出に使用される電極は、担体に埋め込まれる必要はなく、例えば、別個の特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）チップにおいて提供され得る。
【００８１】
本明細書で使用する場合、「担体」という用語は、水性液体に不溶性であり、開口部がないと液体を通過させることができない剛直な基質を指す。例示的な固体担体としては、ガラスおよび修飾または機能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレンおよびスチレンと他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン（登録商標）ＴＭ、環状オレフィン、ポリイミドなど）、ナイロン、セラミック、樹脂、ゼオノア、シリカ、またはシリコンおよび修飾シリコン、炭素、金属、無機ガラス、光ファイバーバンドル、およびポリマーなどのシリカベースの材料が挙げられるが、これらに限定されない。特に有用な担体は、Ｓｉ基板上のＳｉＮ膜などの修飾されたシリコンを含む。いくつかの実施形態では、担体はフローセル装置または他の容器内に配置される。
【００８２】
いくつかの実施形態では、ナノ細孔は、チップ、ディスク、ブロック、プレートなどの基質上に組み立てられる。そのような基質は、シリコン、ガラス、セラミック、ゲルマニウム、ポリマー（例えば、ポリスチレン）、および／またはヒ化ガリウム、などのこれらに限定されない様々な材料から作製され得る。前記基質はエッチングされてもされなくてもよく、例えば、チップは半導体チップであり得る。
【００８３】
特定の実施形態では、検出装置としては、ナノ細孔の配列と接触するリザーバーが挙げられ得る。前記リザーバーは、タンパク質ナノ細孔によって形成された開口部を通して電流を印加するように配置される電極を含み得る。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本開示の検出装置としては、（ａ）電極；（ｂ）電極に連結されるナノ細孔；および（ｃ）ナノ細孔を取り囲む膜、が挙げられ得る。多重実施形態もまた提供される。例えば、検出装置は、（ａ）複数の電極；（ｂ）複数のナノ細孔、複数の電極中の電極に連結される各ナノ細孔；および（ｃ）各ナノ細孔を取り囲む膜；が挙げられ得る。
【００８５】
ナノ細孔は、共有結合部位または非共有結合部位を使用して、（例えば、誘電体パッドを介して）電極に結合され得る。共有結合の例は、核酸テザーが前記ナノ細孔に共有結合され、前記誘電体パッドに共有結合される場合である。他のテザーは、例えば、ポリエチレングリコールまたは他の合成ポリマーなどの非核酸テザーなどの、共有結合のために同様に使用され得る。非共有結合の例は、ナノ細孔がポリヒスチジンタグ、ストレップタグまたは他のアミノ酸コード化親和性部位などの、結合した親和性部位を有している場合である。親和性部位は、ポリヒスチジンに結合するニッケルまたは他の二価カチオン、またはストレップタグに結合するビオチン（またはその類似体）などの誘電体パッド上の配位子に非共有結合し得る。いくつかの実施形態では、前記アミノ酸親和性部位は使用される必要がない。
【００８６】
本明細書で記載されるように、前記ナノ細孔（ハイブリッドナノ細孔またはテザーナノ細孔のいずれか）は、本開示の方法で電気信号を記録するために、例えば、パッチクランプ回路、トンネル電極回路、または横方向コンダクタンス測定回路（グラフェンナノリボン、またはグラフェンナノギャップなど）などの、検出回路と結合され得る。さらに、前記細孔はまた、ポリヌクレオチド上の標識、例えば、蛍光部位またはラマン信号生成部位を検出する光学センサーと結合され得る。
【００８７】
本開示の検出装置は、イオン、核酸、ヌクレオチド、ポリペプチド、生物学的に活性な小分子、脂質、糖などを含むがこれらに限定されない様々な検体のいずれかを検出するために使用され得る。従って、これらの検体の１つまたは複数は、本明細書に記載の装置内のタンパク質ナノ細孔の開口部に存在し得るか、またはそれを通過し得る。
【００８８】
本明細書に記載の装置に適用され得る他の検出技術としては、特に、分子がＤＮＡまたはポリメラーゼなどのＤＮＡに結合する酵素である場合、分子またはその分子の一部の動きなどのイベントの検出、が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、参照により本明細書で援用される、Ｏｌｓｅｎら，  ＪＡＣＳ  １３５：  ７８５５−７８６０  （２０１３）は、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント（ＫＦ）の単一分子を電子ナノ回路に生体共役させ、個々のヌクレオチド取り込みイベントの解明により、酵素機能と動的変動の電気的記録を可能にすることを開示している。または、例えば、参照により本明細書で援用される、Ｈｕｒｔら，  ＪＡＣＳ  １３１：  ３７７２−３７７８  （２００９）は、印加電場におけるナノ細孔上でのＫＦとのＤＮＡの複合体の滞留時間の測定を開示している。または、例えば、参照により本明細書で援用される、Ｋｉｍら，  Ｓｅｎｓ．  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ  Ｃｈｅｍ．  １７７：  １０７５−１０８２  （２０１２）は、α溶血素ナノ細孔に捕捉されたＤＮＡを含む実験で電流測定センサーを使用することを開示している。または、例えば、参照により本明細書で援用される、Ｇａｒａｌｄｅら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８６：  １４４８０−１４４９２  （２０１１）は、α溶血素の細孔の上にある電場で捕捉されたとき、それらの特性に基づいてＫＦ−ＤＮＡ複合体を区別することを開示している。α−ヘモリシンを含む測定を開示する他の参考文献には、以下が挙げられ、それらはすべて、参照により本明細書で援用される、Ｈｏｗｏｒｋａらによるものである：ＰＮＡＳ  ９８：  １２９９６−１３３０１  （２００１）；  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ８３：  ３２０２−３２１０  （２００２）；およびＮａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９：  ６３６−６３９  （２００１）。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本発明は、脂質二重層膜へと組み立てられるチャネルタンパク質に関する。検体の存在は、検体とチャネルタンパク質との相互作用を示す電流の遮断を伴い、固定された印加電位で前記細孔を通過するイオン電流によって測定される。いくつかの実施形態では、安定化されたセンサーチップは単一のタンパク質ナノ細孔タンパク質を含む。前記タンパク質ナノ細孔センサーチップは、単一分子レベルでの測定、つまり確率的検知に適用され得る。一定の印加電位で前記細孔を通過するイオン電流を測定することにより、個々の電流遮断イベントの振幅と持続時間に基づいて、様々な検体が区別され得る。
【００９０】
Ｖ．ナノ細孔アセンブリを使用して検体を検出する方法
他の態様では、本開示は、検体を検出／検知する方法を提供する。前記方法は、（１）検体を含有するサンプルを、記載されているようなナノ細孔アセンブリと接触させること；（２）前記ナノ細孔アセンブリの前記チャネルに電流を流すこと；（３）１つまたは複数の時間間隔で前記チャネルを通過する電流を決定すること；および（４）１つまたは複数の時間間隔で測定された電流を基準電流と比較すること、を含み、ここで、基準電流に対する電流の変化は、サンプル中の検体の存在を示す。いくつかの実施形態では、前記基準電流は、検体を含まないサンプルで測定される。いくつかの実施形態では、前記ナノ細孔アセンブリは担体上に配置される。
【００９１】
いくつかの実施形態では、前記方法は、チャネルを介した前記検体またはポリマーの各ユニットの移動によって引き起こされる、前記イオン電流および／または電流シグネチャの変化の測定を含み得る。いくつかの実施形態では、前記方法は、電流シグネチャの変化を引き起こす、チャネル上に結合されたプローブへの前記検体またはポリマーの各ユニットの一時的または永久的な結合によって引き起こされる、前記イオン電流および／または電流シグネチャの変化の測定を含み得る。
【００９２】
本開示の開示された方法によって検出され得る検体は、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ポリマー、および化学分子のいずれか１つであり得る。前記方法で検出される核酸は、一本鎖、二本鎖であり得るか、または一本鎖と二本鎖の両方の配列を含み得る。前記核酸分子は、二本鎖の形態（例えば、ｄｓＤＮＡ）で発生し得て、必要に応じて一本鎖の形態に変換され得る。前記核酸分子はまた、一本鎖の形態（例えば、ｓｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ）で発生し得て、前記ｓｓＤＮＡは必要に応じて二本鎖の形態に変換され得る。
【００９３】
ＶＩ．定義
本開示による組成物および方法の詳細な説明の理解を助けるために、いくつかの明確な定義が提供され、本開示の様々な態様の明確な開示を容易にする。
【００９４】
別段に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、この開示が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。
【００９５】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかかつ別段に示さない限り、複数の参照が挙げられることに留意されたい。「挙げられる」、「含む」、「含有する」、または「有する」という用語およびそれらの変形は、特に明記されない限り、その後に列挙される項目およびその均等物、ならびに追加の主題を包含することが意図される。
【００９６】
本明細書で使用される場合、用語「それぞれ」は、項目の集積に関して使用される場合、集積内の個々の項目を識別することを意図しているが、集積内のすべての項目を必ずしも指すとは限らない。明示的な開示または文脈が明確に他のことを指示している場合、例外が発生し得る。
【００９７】
本明細書で提供されるありとあらゆる例、または例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をよりよく明らかにすることを意図しており、別段の請求がない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいかなる言語も、請求されていない要素を本発明の実施に必須であることを示すと解釈されるべきではない。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「ナノ細孔」および「チャネル」という用語は、イオン電流が流れ得るナノスケールの通路を有する構造を指すために使用される。ナノ細孔の内径は、デバイスの使用目的に応じて大幅に異なり得る。典型的には、前記チャネルまたは前記ナノ細孔は、少なくとも約０．５ｎｍ、通常は少なくとも約１ｎｍ、より通常は少なくとも約１．５ｎｍの内径を有し、ここで、直径は５０ｎｍ以上の大きさであり得るが、多くの実施形態では約１０ｎｍを超えず、通常は約２ｎｍを超えない。
【００９９】
本明細書で使用される場合、「検体」という用語は、分析を受けている、または検出されることが求められている物質または化学成分を指す。本発明が特定の検体に限定されることは意図されていない。代表的な検体としては、イオン、糖類、タンパク質、核酸、および核酸配列が挙げられる。
【０１００】
本明細書で使用する場合、「膜」という用語は、電流または流体の通過を防止するシートまたは他の障壁を指す。前記膜は、本明細書に記載の固体担体とは対照的に、典型的には柔軟であるか、または圧縮可能である。前記膜は、例えば脂質二重層を形成するために脂質材料から作製され得るか、または前記膜は非脂質材料から作製され得る。前記膜は、例えば、ジブロックポリマーまたはトリブロックポリマーにより形成されるコポリマー膜の形態か、または例えば、ボラリピドにより形成される単層の形態であり得る。例えば、参照により本明細書で援用される、Ｒａｋｈｍａｔｕｌｌｉｎａら，  Ｌａｎｇｍｕｉｒ：  ｔｈｅ  ＡＣＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ２４：６２５４−６２６１  （２００８）を参照のこと。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、「脂質膜」という用語は、飽和または不飽和、分岐または非分岐、芳香族または非芳香族の炭化水素基を含む化合物で主に作製されるフィルムを意味する。前記フィルムは複数の脂質で構成され得る。脂質の例としては、脂肪酸、モノ−、ジ−、およびトリグリセリド、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロイド、リポタンパク質、および糖脂質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
「核酸」または「核酸配列」または「核酸分子」は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーを指す。核酸という用語は、遺伝子、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換的に使用される。前記用語は、合成の、天然に存在する、および非天然に存在する、参照核酸と同様の結合特性を有し、かつ参照ヌクレオチドと同様の方法で代謝される、公知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基または結合を含む核酸を包含する。前記類似体の例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。前記用語は、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデニン、アジリジニル−シトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシ−メチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソ−ペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ−メチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン、５′−メトキシカルボニル−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、クオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、クオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリンなどの、これらに限定されない、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基類似体のいずれかから形成された分子を含む。
【０１０３】
別段の指示のない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾された変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列、ならびに明示的に示された配列を暗に包含する。具体的には、いくつかの態様では、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択される（またはすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換される配列を生成することによって達成される（Ｂａｔｚｅｒら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １９：  ５０８１，  １９９１；  Ｏｈｔｓｕｋａら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６０：  ２６０５−８，  １９８５；  Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｒｏｂｅｓ  ８：  ９１−８，  １９９４）。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換的に使用される。
【０１０４】
「ポリペプチド」は、その従来の意味で、すなわちアミノ酸の配列として使用される。前記ポリペプチドは特定の長さの生成物に限定されない。ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質は、ポリペプチドの定義内に含まれ、そのような用語は、特に別段の指示がない限り、本明細書では互換的に使用され得る。前記用語としてはまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに、天然に存在するものおよび天然に存在しないものの両方の、当技術分野で公知の他の修飾が挙げられる。ポリペプチドは、タンパク質全体またはその部分配列であり得る。
【０１０５】
当技術分野で知られている「同一」またはパーセント「同一性」という用語は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。当技術分野では、「同一性」は、場合によっては、２つ以上のヌクレオチドまたは２つ以上のアミノ酸配列のストリング間の一致によって決定される、核酸分子またはポリペプチド間の配列関連性の程度をも意味する。「同一性」は、特定の数学的モデルまたはコンピュータープログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によってアドレス指定されるギャップアラインメント（存在する場合）を有する、２つ以上のより小さい配列間の同一的一致の割合を評価する。「実質的な同一性」とは、指定された配列に対する、少なくとも約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する配列を指す。いくつかの態様では、前記同一性は、少なくとも約５０〜１００のアミノ酸またはヌクレオチドの長さの領域に存在する。他の態様では、前記同一性は、少なくとも約１００〜２００のアミノ酸またはヌクレオチドの長さの領域に存在する。他の態様では、前記同一性は、少なくとも約２００〜５００のアミノ酸またはヌクレオチドの長さの領域に存在する。特定の態様では、割合配列同一性は、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔ、およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムからなる群から選択されるコンピュータープログラムを使用して決定される。
【０１０６】
「類似性」という用語は、「同一性」と関連する概念であるが、「同一性」とは対照的であり、同一的一致と保存的置換の一致との両方などの類似性の尺度を指す。２つのポリペプチド配列が、たとえば１０／２０の同一のアミノ酸を有し、残りがすべて非保存的置換である場合、同一性割合と類似性割合はどちらも５０％となる。同一の例で、保存的置換がある位置がさらに５つある場合、同一性の割合は５０％のままであるが、類似性の割合は７５％（１５／２０）となる。従って、保存的置換がある場合、２つのポリペプチド間の類似性の割合の程度は、これら２つのポリペプチド間の同一性の割合よりも高くなる。
【０１０７】
また、本明細書に記載されている数値としては、下限値から上限値までのすべての値が挙げられること、すなわち、列挙された最低値と最高値の間の数値のすべての可能な組み合わせは、本出願で明示的に述べられていると見なされること、をも明確に理解されている。例えば、濃度範囲が約１％〜５０％と指定されている場合、本明細書では、２％〜４０％、１０％〜３０％、１％〜３％などの値が明示的に列挙されていることが意図されている。上記の値は、具体的に意図されているものの例にすぎない。
【０１０８】
範囲は、様々な態様において、本明細書では、「約」または「およそ」１つの特定の値から、および／または「約」または「およそ」他の特定の値までとして表される。値が近似値として表現されている場合、先の「約」を使用することにより、ある程度の変動が範囲に含まれることが理解されよう。
【０１０９】
「作動的に連結された」という用語は、核酸発現制御配列（プロモーターまたは転写因子結合部位のアレイなど）と第２の核酸配列との間の作動的連結を指し、ここで、前記発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を指示する。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、「精製された」または「実質的に精製された」という用語は、所望のタンパク質が少なくとも２０％まで、より好ましくは少なくとも５０％まで、さらにより好ましくは少なくとも７５％まで、最も好ましくは、少なくとも９０％、またはさらに９５％まで濃縮されていることを指す。
【０１１１】
本明細書に引用される各刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、本開示と矛盾しない範囲で、その全体が参照により援用される。
【０１１２】
本明細書に開示される刊行物は、本発明の出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供される。本明細書中のいかなるものも、本発明が先行発明によりそのような刊行物に先行する権利を与えられないことの承認として解釈されるべきではない。さらに、提供される公開日は実際の公開日とは異なり得て、個別に確認することが必要となり得る。
【０１１３】
本明細書での値の範囲の列挙は、本明細書で別段の指示がない限り、範囲および各エンドポイントに含まれる各個別の値を個別に参照するための簡略法として機能することのみを意図しており、各個別の値とエンドポイントは、本明細書に個別に記載されているかのように、本明細書に組み込まれる。
【０１１４】
本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書で別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行される。提供される方法のいずれかに関して、前記方法のステップは、同時にまたは連続して発生し得る。前記方法のステップが順番に行われる場合、別段に明記されていない限り、前記ステップは任意の順序で行われ得る。
【０１１５】
方法がステップの組み合わせを含む場合、本明細書で別段の記載がない限り、ステップのありとあらゆる組み合わせまたは部分的組み合わせは、本開示の範囲内に包含される。
【０１１６】
本明細書で使用されているセクションの見出しは、整理を目的としたのみのものであり、記載されている主題を制限するものではない。
【０１１７】
本明細書に記載されている例および実施形態は、例示を目的としたのみのものであること、およびそれらに照らした様々な修正または変更が当業者に示唆され、本出願の思想および範囲、ならびに添付の特許請求の範囲に含まれるべきであることが理解される。
【実施例】
【０１１８】
ＶＩＩ．例
実施例１
本実施例では、後続の例で使用される材料および方法について説明する。
【０１１９】
材料と方法
非膜タンパク質チャネルの再構築
非膜タンパク質チャネルの場合、膜タンパク質チャネルとは異なり、それらは通常、中央の疎水性層と両端の親水性層を欠き、広範囲にわたる設計が必要であるため、脂質二重層またはポリマー膜に直接挿入することは困難である。バイオセンシング、またはシーケンシングに使用するために、非膜タンパク質チャネルも異なるプローブで設計および機能化する必要がある。非膜タンパク質チャネルは、異なる配列、形状、構造、または特性を有する様々なソースから発生し得るが、再設計してナノ細孔を使用し得るようにするための戦略と方法は、いくつかの共通機能を共有する。図１Ａおよび１Ｂに示すように、３つの異なるドメインは膜固定に重要であり、２つの領域は単一分子検知の機能モジュールの結合に特に重要である。これらの異なるドメインを再設計して、疎水性または親水性の特性、または機能化された結合部位またはプローブを変更するため、一連の分子クローニング作業が含まれる。通常、一般的な制限酵素クローニング法は、様々な設計目的で使用される。しかしながら、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、ＴＯＰＯ（登録商標）Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｔｙｐｅ  ＩＩＳ  Ａｓｓｅｍｂｌｙなどの他のクローン手法もまた使用され得る。
【０１２０】
非膜タンパク質の発現および精製
非膜タンパク質チャネルは、異なる配列、形状、構造、または特性を有する様々なソースから発生し得るが、それらを発現および精製するために使用される戦略と方法は、いくつかの共通の機能を共有する。
【０１２１】
最初に、再設計された非膜タンパク質チャネル遺伝子を、末端におけるタグの有無にかかわらず、発現ベクターにクローニングした。次に、ベクターを適切なタンパク質発現宿主、例えば、大腸菌系に形質転換した。前記タンパク質チャネルが前記宿主で発現した後、宿主を溶解し、宿主の破片を取り除くための一連のステップを実行した。最後に、非膜タンパク質を、以下の方法：アフィニティークロマトグラフィー、交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、または他の一般的に使用される精製方法などの１つまたはその組み合わせによって精製することができた。
【０１２２】
例として、前記非膜タンパク質チャネル遺伝子および変異遺伝子を、Ｎ末端にＨｉｓタグを有するＰＥＴ２３ａベクターにクローニングした。ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した後、抗生物質の存在下で１つのＢＬ２１（ＤＥ３）コロニーを５ｍＬの新しいＬＢ培地に植菌し、ＯＤが０．８に達するまでシェーカーで３７℃にて数時間培養した。次に、フラスコを４℃に保ち冷却した。次に、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧをフラスコに加え誘導した。その細菌を１６℃にてシェーカーで一晩培養した。その細菌を８０００ｒｐｍで１０分間収集し、上澄みを廃棄し、ペレットを溶解バッファーで懸濁した。その細菌溶液を、その溶液が透明になり、粘着性がなくなるまで超音波処理した。１２０００ｒｐｍで３０分間超音波処理した後、溶液を遠心分離し、上澄みを廃棄し、ペレットを収集した。１０ｍｌの尿素（８Ｍ）を沈殿物に加え、沈殿物が尿素に完全に溶解するまで、発振器で低速で振動させた。溶液を１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄みを１００ｍＬのタンパク質再生バッファーに加え、一晩攪拌した。溶液を１２０００ｒｐｍで３０分間リフォールディングした後、溶液を遠心分離し、ペレットを廃棄し、上澄みを収集した。上澄みを０．４５μｍシリンジフィルターに通して、変性タンパク質を廃棄した。上澄みを透析バッグに加え、透析液を３回交換した。透析バッグ内の液体を収集し、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ペレットを廃棄して、上澄みを収集した。ニッケルビーズを溶解バッファーで均一化し、上澄みをビーズに加えた。次にビーズを洗浄緩衝液で洗浄した。タンパク質は７〜１０カラム容量の溶出バッファーを使用して溶出された。溶出液を集め、５ｍＬに濃縮した。溶出液を１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄みを吸収させ、シリンジでＡＫＴＡ  ＦＰＬＣに注入した。注入前に、サンプルループを１０ｍＬの溶解バッファーで洗浄した。サイズ排除カラムを通した後、タンパク質を収集した。ＳＥＣ後にタンパク質サンプルを確認するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを実行し、−８０℃で保存した。
【０１２３】
結合
異なるプローブで機能化するか、または非膜タンパク質チャネルの疎水性または親水性を増強するために、様々な結合方法を使用することができた。非膜タンパク質チャネルは、異なる配列、形状、構造、または特性を有する様々なソースから発生し得るが、結合に使用される戦略および方法はいくつかの共通の機能を共有する。疎水性部分を非膜タンパク質チャネルに結合するため、タンパク質チャネルのシステイングループで反応は実行され得た。前記タンパク質チャネルには、サブユニットごとに１つまたは複数のシステインが含まれ、これらはチャネルの中間層にあり、その環境で利用可能である。前記タンパク質溶液は、ｐＨ  ６．８の０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５％グリセロールを含むバッファーで調製した。溶液を脱気し、１００倍過剰のＴＣＥＰを溶液に加えた。室温で２０分のインキュベーション後、４μＬの４ｍＭコレステロール−ＰＥＧ−マレイミドをタンパク質溶液に滴下し、反応混合物を暗所で室温にて２時間インキュベートした。過剰量のコレステロール−ＰＥＧ−マレイミドをＮａｎｏＳｅｐ  １００Ｋスピンカラムで除去した。タンパク質の標識を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。
【０１２４】
プローブを非膜タンパク質チャネルに結合するため、テトラジン−アルケンライゲーションなどのクリックケミストリー、またはアジド−アルキンクリックケミストリーを使用する。テトラジン−アルケン連結反応の場合、タンパク質溶液を、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５％グリセロールを含む、ｐＨ  ６．８のバッファーで調製した。溶液を脱気し、１００倍過剰のＴＣＥＰを溶液に加えた。２０分のインキュベーション後、１．６μＬの１０ｍＭメチルテトラジン−ＰＥＧ４−マレイミドをタンパク質溶液に滴下し、混合物を暗所、室温で１時間インキュベートした。過剰量のメチルテトラジン−ＰＥＧ４−マレイミドを、脱塩スピンカラムを使用して脱塩することにより除去した。０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ６．８を含むバッファーで５０μＬのプローブ溶液を調製した。溶液を脱気し、１００倍過剰のＴＣＥＰを溶液に加えた。２０分のインキュベーション後、２５ｍＭ  ＴＣＯ−ＰＥＧ３−マレイミド６μＬをオリゴ溶液に滴下し、混合物を室温で２時間インキュベートした。過剰量のＴＣＯ−ＰＥＧ３−マレイミドを脱塩カラムで除去した。プローブの標識は、２０％尿素−ＰＡＧＥゲルで確認された。
【０１２５】
アジド−アルキン連結反応では、ＴＣＯ修飾プローブをメチルテトラジン標識タンパク質と異なるモル比で混合して、最適なタンパク質標識効率を達成した。混合物を室温で１時間インキュベートした。結合は１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認された。２０μＭのタンパク質溶液４０μＬを、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５％グリセロールを含む、ｐＨ  ６．８のバッファーで調製した。溶液を脱気し、１００倍過剰のＴＣＥＰを溶液に加えた。２０分のインキュベーション後、１．６μＬの１０ｍＭ  Ｓｕｌｆｏ  ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミドをタンパク質溶液に滴下し、混合物を暗所、室温で１時間インキュベートした。脱塩スピンカラムを使用して脱塩することにより、過剰量のマレイミド試薬を除去した。ＤＢＣＯ修飾タンパク質をアジド修飾プローブと等モル濃度で混合し、反応混合物を室温で２時間インキュベートした。結合を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで確認した。
【０１２６】
ナノ細孔実験のセットアップおよびデータの記録
非膜タンパク質チャネルは、異なる配列、形状、構造、または特性を持つさまざまなソースから発生し得るが、すべての非膜タンパク質チャネルまたは変異体は、同様のナノ細孔セットアップまたはデバイスに適用され得る。通常、前記セットアップには、１つまたは複数の開口部を持つセンサーチップまたはアレイが含まれる。前記センサーチップは脂質またはポリマー膜の形成を支持することができ、コンパートメントをシス（上）コンパートメントおよびトランス（下）コンパートメントに分離し得る。両方のコンパートメントを導電性バッファーで満たした。入力電極をコンパートメントの１つに埋め込み、接地電極を他のコンパートメントに埋め込んだ。さらに、前記セットアップは、流体システムと組み合わせて、１つの容器からセンサーデバイスへのサンプルフローを可能にもした。非膜タンパク質チャネルを脂質またはポリマー膜に挿入するため、タンパク質チャネルをそれぞれの保存バッファーに懸濁し、導電性バッファー（通常１Ｍ  ＫＣｌまたは１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳまたはＴｒｉｓ、ｐＨ  ７．６）で５０〜１００倍に希釈し、上部コンパートメントに追加する。界面活性剤の有無にかかわらず、印加電位（一定の保持電圧または傾斜電圧）の下で、平面膜へのタンパク質チャネルの直接挿入が観察され得る。検体が存在しない場合、前記電流は安定していてクリーンである。検体が存在する場合、プローブとの相互作用により生じる電流変化が記録された。
【０１２７】
データ分析
非膜タンパク質チャネルは、異なる配列、形状、構造、または特性を有する様々なソースから発生し得るが、データ分析に使用される戦略と方法は共通の機能を共有している。通常、約１０，０００以上の電流遮断イベント（転座または単一分子結合イベント）が分析され、結果が統計的有意性の範囲内にあることが確認される。イベントの定量的高速処理のために、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）またはＰＹＴＨＯＮベースのカスタムアルゴリズムが開発された。通常、２つのパラメーターが使用される：（１）［（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｕｎｂｌｏｃｋｅｄ −Ｃｕｒｒｅｎｔ ａｆｔｅｒ  ａｎａｌｙｔｅ  ｂｌｏｃｋ）／Ｃｕｒｒｅｎｔ ｕｎｂｌｏｃｋｅｄ］として表される電流閉塞率；および（２）滞留時間：τｏｆｆ（イベント中）およびτｏｎ（連続イベント間）。τｏｆｆおよびτｏｎから、κｏｎ（会合速度定数）およびκｏｆｆ（解離速度定数）が得られて、最終的にＫｄ（平衡解離定数）が得られる。検体濃度の関数として捕捉率を示す検量線を作成した。未知の濃度の検体をナノ細孔に導入すると、平均捕捉率を計算でき、検量線から検体濃度を決定し得る。臨床サンプルの分析では、「汚染」すなわち非特異的信号と、検体によって引き起こされる真のイベントとを明確に区別するため、分析アルゴリズムをさらに調整する必要がある。検体検出システムを標準化するために、「スパイクイン」コントロールを備えた「内因性」ノーマライザが一般的に採用されている。次に、イムノアッセイやｑＲＴ−ＰＣＲなどの診断分野で通常使用されている標準的なアッセイを使用して、プラットフォームデータを相互検証した。最終的に、統計サンプルサイズ／検出力分析は、２グループ比較の２サンプルｔ検定と２つの因子の組み合わせの２因子分散分析（ＡＮＯＶＡ）を基礎とした。
【０１２８】
実施例２
ｐｈｉ２９  ｇｐ−９テールタンパク質の発現と精製
ＳＤＳ  ＰＡＧＥにおける、精製されたｐｈｉ２９  ｇｐ−９テールタンパク質およびその変異体を図３〜４に示す。発現および精製工程は以下の通りである。前記ｐｈｉ２９  ｇｐ−９テールタンパク質遺伝子および変異体遺伝子を、Ｎ末端にＨｉｓタグを付けてベクターｐＢＤＨＴにクローニングした。ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した後、抗生物質を入れた５ｍＬの新しいＬＢ培地に１つのＢＬ２１コロニーを植菌し、ＯＤが０．８に達するまでシェーカー（２２０  ｒｐｍ）で３７℃にて数時間培養した。次に、フラスコを４℃に保ち冷却した。次に、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧをフラスコに加え誘導した。細菌をシェーカー（１８０ｒｐｍ）で１６℃にて一晩培養した。細菌を８０００ｒｐｍで１０分間収集し、上澄みを廃棄し、ペレットを溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）で再懸濁した。溶液が透明になり、粘着性がなくなるまで細菌溶液を超音波処理した。１２０００ｒｐｍで３０分間超音波処理した後、溶液を遠心分離し、上澄みを廃棄し、ペレットを収集した。１０ｍＬの尿素（８Ｍ）を沈殿物に加え、沈殿物が尿素に完全に溶解するまで、発振器で低速で振動させた。溶液を１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄みを１００ｍＬのタンパク質再生バッファー（１５％グリセロール、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２Ｍ  Ｌ−アルギニン、ｐＨ８．０）に加え、一晩攪拌した。溶液を１２０００ｒｐｍで３０分間リフォールディングした後、溶液を遠心分離し、ペレットを廃棄し、上澄みを収集した。上澄みを０．４５μｍシリンジフィルターに通して、変性タンパク質を廃棄した。上澄みを透析バッグに加え、透析液（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ）を３回交換した。透析バッグ内の液体を収集し、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ペレットを廃棄し、上澄みを収集した。ニッケルビーズを溶解バッファーで均一化し、上澄みをビーズに加えた。ビーズを洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾール）で５０カラム容量で洗浄した。前記タンパク質は、７〜１０カラム容量の溶出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール）を使用して溶出された。溶出液を集め、５ｍＬに濃縮した。溶出液を１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄みを吸収し、シリンジでＡＫＴＡ  ＦＰＬＣに注入した。注入前に、サンプルループを１０ｍＬの溶解バッファーで洗浄した。サイズ排除カラムを通過した後に前記タンパク質を回収した。ＳＥＣ後にタンパク質サンプルを確認するため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを実行し、−８０℃で保存した。
【０１２９】
実施例３
ナノ細孔としてのファージテールタンパク質
多くのバクテリオファージには、長い収縮または非収縮、または短い非収縮のテールが含まれる。前記テールは、宿主細胞の認識、膜浸透、およびウイルスのゲノム放出のプロセスで重要な役割を果たす。前記テールタンパク質は、ｐｈｉ２９、Ｔ４、Ｔ３、Ｔ５、Ｔ７、ＳＰＰ１、Ｐ２２、Ｐ２、Ｐ３、ラムダ、Ｍｕ、ＨＫ９７およびＣ１などに由来するが、これらに限定されない。
【０１３０】
本発明のこれらのタンパク質チャネルは、疾患関連バイオマーカー、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列などの生体分子のバイオセンシングおよび配列決定に理想的である。改良された膜機能により、修飾されたタンパク質チャネルは脂質またはポリマー膜に効率的に挿入され、バイオセンシングおよびシーケンシングのためのナノ細孔として機能する。様々なプローブと結合することにより、前記の修飾されたタンパク質チャネルは、特定の疾患関連バイオマーカーを高い感度と特異性で検出する能力を有する。本発明の細孔は、同種または異種の細孔中に存在し得る。
【０１３１】
代表的な例：ｐｈｉ２９のｇｐ−９テールタンパク質
ｐｈｉ２９バクテリオファージのテール（ｇｐ９）の結晶構造は、６つのｇｐ９サブユニットが六量体すなわち円筒状のチューブ構造を形成していることを示している。構造内部では、ＤＮＡ排出が発動される前に、遠位端が６つの柔軟な疎水性ループによってブロックされる。ゲノムｄｓＤＮＡを宿主細胞の細胞質に運搬するには、前記ｐｈｉ２９テールが細胞膜を貫通する必要がある。チューブの長さは約１２．５ｎｍである。チューブの内径は約４ｎｍ、外径は約９ｎｍである。チューブの壁は、主にβシートで構成され、厚さは約２．５ｎｍである。
【０１３２】
ｇｐ９Δｌｏｏｐ［４１７−４９１］など、完全長のｇｐ９および一連の変異体のクローンが構築され（図２〜６）、ここで、無秩序な領域（残基４１７〜４９１）は削除された。結晶構造によると、ｇｐ９Δ４１７−４９１構造も円筒形のチューブ状ホモヘキサマーである。テールタンパク質の構造を研究することにより、アミノ酸１３０〜１７０、３００〜３２５、３５０〜３９０、５３０〜５９５は、膜の疎水性層と相互作用し得る中央のチャネルの表面にある。従って、これらの部位への疎水性基の結合、またはこれらのアミノ酸の、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、およびトリプトファン（Ｔｒｐ）などの疎水性アミノ酸への変異は、膜挿入のチャネルの機能を変更し得る。特に、以下のサイトの１つまたは任意の組み合わせの変異は重要である：Ｋ１３４Ｉ、Ｄ１３８Ｌ、Ｄ１３９Ｌ、Ｄ１５８Ｌ、Ｅ１６３Ｖ、Ｅ３０９Ｖ、Ｄ３１１Ｖ、Ｋ３２１Ｖ、Ｋ３５６Ａ、Ｋ３５８Ａ、Ｄ３７７Ａ、Ｄ３８１Ｖ、Ｎ３８８Ｌ、Ｒ５２４Ｉ、Ｒ５３９Ａ、Ｅ５９５Ｖ。前記チャネルの中央部分に疎水性基を結合するには、以下の部位のシステインへの変異が重要である：Ｅ５９５Ｃ、Ｋ３２１Ｃ、およびＫ３５８Ｃ。さらに、アミノ酸２５０〜３００、および２０〜５０は、チャネルの上部と下部の表面にあり、親水性環境と相互作用し得る。
【０１３３】
ナノ細孔としてのウイルスポータルタンパク質
ポータルタンパク質は、バクテリオファージｐｈｉ２９、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ７、ＳＰＰ１、およびＰ２２だけでなく、アデノウイルスやヘルペスウイルスなどの他のウイルス系にも存在する。コネクタと呼ばれる前記ポータルチャネルは、パッケージング中にウイルスのキャプシドに入り、感染中に排出するための、ゲノムＤＮＡの経路として機能する中央チャネルを有する細孔のようなタンパク質構造である。構造研究は、異なるウイルスコネクタタンパク質間の配列相同性およびサイズの有意差を示しているが、それらはすべて、切頭円錐形とトポロジー的に類似している。過剰発現したタンパク質に由来するコネクタの化学量論は、多くの場合、発現条件によって異なる。本発明のこれらのタンパク質チャネルは、それらが頑強なポリマー膜に直接挿入され得る場合、バイオセンシングおよび配列決定用途に理想的であり得る。異なるウイルスポータルタンパク質からのコネクタの構造は同様の特性を示すため、上記で概説した原理はまた、拡張によってそれらすべてに適用される。
【０１３４】
代表的な例：Ｐ２２ポータルチャネル
Ｐ２２は、その後強力なパッケージングモーターによってウイルスＤＮＡでパッケージ化される空の前駆体キャプシドを組み立てるテールバクテリオファージである。Ｐ２２ポータルタンパク質は、ウイルスＤＮＡの双方向通過のためのチャネルのような構造を形成する。短テールｄｓＤＮＡバクテリオファージのＰｏｄｏｖｉｒｉｄａｅファミリーには、Ｓｆ６、ＣＵＳ−３、ｅｐｓｉｌｏｎ３４、ＡＰＳＥ−１などのＰ２２のようなサブグループのメンバーが挙げられる。前ポータルバレルは非常に動的であり、溶液中でのタンパク質分解を受けやすい。Ｐ２２ポータルタンパク質は、中央チャネルの周りに対称的に配置された１２個の同一のサブユニットで構成されている。全体の高さは約３０ｎｍで、直径約１７ｎｍの漏斗状のコアが長さ約２０ｎｍのαヘリカルチューブに接続されている。チャネルの平均内径は、構造全体で３．５ｎｍ〜７．５ｎｍである。一連の変異体が構築されており（図７〜１１）、これには、以下の明確な特徴が含まれる：（１）ポータルコア（残基１〜６０２）は他のウイルスタンパク質チャネルとトポロジー的に類似しているが、らせん状のバレルチューブの存在はＰ２２に固有である。ポータルコアとヘリカルバレルとの間の結合は、溶液中でキモトリプシンによって容易に切断されることができ、このことは、２つのドメインが本質的に柔軟であることを示している。本発明としては、６０３〜７２５のバレル残基の除去、および別個の認識ドメインとしての任意のペプチドまたは核酸の配列における置換が挙げられる。（２）電気生理学的特性および／または検出能力を変更するための内部の柔軟なループ残基４６４〜４９２の変更（削除、短縮、突然変異）も本発明の範囲内である。（３）十量体複合体を構築するためのＥＤＴＡ（６０ｍＭ以上）の使用も本発明の範囲内である：十量体環の正しい組み立てには、単量体−単量体界面で非特異的に捕捉された二価カチオンのキレート化が必要である。（４）（Ｇｌｕ４２３、Ｇｌｕ４１４、Ｇｌｕ４０６、Ｇｌｕ３９３、およびＧｌｕ３９６と一緒にクラスター化されている）残基Ｇｌｕ７０の５つの環を変更することにより、チャネル内部の全体的な電気陰性特性を変更することも本発明の範囲内である。（５）表面の疎水性を変化させるために、ウィングドメイン（Ｐｈｅ２４、Ｉｌｅ２５、Ｌｅｕ２８、Ｐｈｅ６０、Ｐｈｅ１２８、Ｐｒｏ１２９、およびＰｒｏ１３２）の下でベルトを形成する任意の疎水性アミノ酸を変更することも本発明の範囲内である；（６）これらのアミノ酸を、追加機能のための、または膜挿入とチャネル安定性のための電気生理学的特性（親水性または疎水性タグ）を変更するためのアンカーポイント（システイン、リジン、アルギニンなど）として使用する目的で、末端にいくつかのアミノ酸（任意の天然または非天然アミノ酸）を付加することも本発明の範囲内である；（７）疎水性層および親水性層における突然変異誘発も本発明の範囲内である；中央部：２５０〜３００のアミノ酸１０〜４５；上部：４５０〜５００；下部：３５０〜３８０；結合のためのＡｒｇ  ４７６またはＣ末端からＣｙｓへの変異；コレステロールを結合するＣｙｓ変異誘発のための中間部ＴＨＲ２４０、ＶＡＬ��４４、Ａｒｇ  ２７３。
【０１３５】
代表的な例：Ｔ４ポータルチャネル
前記Ｔ４ポータルは、長さが１４ｎｍ、幅が７ｎｍ、直径が３ｎｍの内部チャネルである１２員環（タンパク質の発現条件に応じて１１員環または１３員環）として存在する。チャネルは１２のサブユニットから組み立てられるため、１つの単量体の残基を変更すると、分子の同じ平面に変異が存在するチャネル全体で効果が発動される。本発明は：（１）荷電残基の環を変更することにより、チャネル内部の全体的な電気陰性特性を変更すること；（２）内部チャネル入口で２つの基本的な残基、Ｒ３３８とＫ３４２を（親水性を変更するいずれかのアミノ酸に）変更すること；（３）機能追加のため、または膜挿入およびチャネル安定性における電気生理学的特性（親水性または疎水性タグ）を変更するため、または（システイン、リジン、アルギニンなど）アンカーポイントとしてこれらのアミノ酸を使用する目的で、末端にいくつかのアミノ酸（任意の天然または非天然のアミノ酸）を追加すること；および、（５）電気生理学的特性および／または検出機能を変更するための内部柔軟性ループ残基３７４〜３９８の変更（削除、トランケーション、突然変異）も含む（図１２〜１４、および図１６）。
【０１３６】
実施例４
ナノ細孔ハウジング用の膜の組成
平面二重層脂質膜（ＢＬＭ）またはポリマー膜は、（ａ）ＢＣＨ−１Ａ水平ＢＬＭセル（Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）または（ｂ）自作のカスタムチャンバーで生成された。１００または２００μｍの開口部を有するテフロン（登録商標）仕切りを装置に配置して、ＢＬＭセルをシス（上）およびトランス（下）コンパートメントに分離した。前記自作のチャンバーには、シスコンパートメントとトランスコンパートメントを分離する１００または２００ｕｍの穴が予め開けられている。
【０１３７】
脂質膜：様々な組成の平面脂質二重層は、ヘキサンの脂質で開口部を事前に塗付し（濃度：０．５ｍｇ／ｍｌ）、その後ｎ−デカンの脂質で濃度を変えて（濃度：２０〜３０ｍｇ／ｍｌ）形成された。脂質組成の例としては：（ｉ）１００％ＤＰｈＰＣまたはＤＯＰＣまたはＰＯＰＣなどの双性イオン脂質；（ｉｉ）組成（ｉ）と比例的に混合される（最終的な比率は１００％となる）、ＤＰｈＰＧ／ＤＯＰＧ／ＰＯＰＧまたはＤＰｈＰＳ／ＤＯＰＳ／ＰＯＰＳなどの０〜５０％のアニオン性脂質；（ｉｉｉ）組成物（ｉ）および組成物（ｉｉ）に比例して混合された０〜２５％のコレステロール；が挙げられる。正確な脂質組成は、タンパク質の特性に依存する。使用される典型的な脂質膜組成としては：１００％ＤＰｈＰＣ；３０％ＤＰｈＰＳ；７０％ＤＰｈＰＣ：２８％ＤＰｈＰＧ：２％コレステロールが挙げられる。
【０１３８】
ポリマー膜：デカンまたはシリコーンオイル（粘度２０ｍＰａ．ｓのポリフェニルメチルシロキサンベースまたはポリジメチルシロキサンベース）などの有機溶媒に懸濁した膜を使用して手動で塗付することにより、様々な組成の平面ポリマー膜を形成した。前記膜組成は、ポリオキサゾリンベースのトリブロックコポリマー（図１７）であり、例えば：
（ｉ）ＰＥＯＸＡ−ＰＥＯ−ＰＥＯＸＡ  ［ポリ（２−エチルオキサゾリン）−ｂ−ポリ（エチレンオキシド）−ｂ−ポリ（２−エチルオキサゾリン）］；
（ｉｉ）ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡ  ［ポリ（２−メチルオキサゾリン）−ｂ−ポリ（ジメチルシロキサン）−ｂ−ポリ（２−メチルオキサゾリン）］；  （ブロック間にエチル−ベンジルまたはプロピル相互作用またはプロピル−エトキシ相互作用を有する）
（ｉｉｉ）ＰＭＯＸＡ−ＰＢ−ＰＭＯＸＡ  ［ポリ（２−メチルオキサゾリン）−ｂ−ポリ（１，４−ブタジエン）−ｂ−ポリ（２−メチルオキサゾリン）］；
（ｉｖ）ＰＭＯＸＡ−ＰＥ−ＰＭＯＸＡ  ［ポリ（２−メチルオキサゾリン）−ｂ−ポリ（エチレン）−ｂ−ポリ（２−メチルオキサゾリン）］；
（ｖ）ＰＭＯＸＡ−ＰＥＯ−ＰＭＯＸＡ  ［ポリ（２−メチルオキサゾリン）−ｂ−ポリ（エチレンオキシド）−ｂ−ポリ（２−メチルオキサゾリン）］
用される代表的な膜としては、ＰＭＯＸＡ６−ＰＤＭＳ３５−ＰＭＯＸＡ６；ＰＭＯＸＡ６−ＰＤＭＳ６５−ＰＭＯＸＡ６；  ＰＭＯＸＡ１１−ＰＤＭＳ６５−ＰＭＯＸＡ１１；  ＰＭＯＸＡ５−ＰＤＭＳ１３−ＰＭＯＸＡ５；  ＰＭＯＸＡ３−ＰＤＭＳ３８−ＰＭＯＸＡ３が挙げられる（図１７）。前記ブロックの長さ（ＰＭＯＸＡＸ−ＰＤＭＳＹ−ＰＭＯＸＡＸでは下付き文字ＸおよびＹで示される）（これは、親水性または疎水性ブロックの長さを決定する）は、以下の要因に応じて調整され得る：（１）タンパク質の細孔を安定して挿入するには、特定の膜の厚さが必要である；（２）膜は非常に低い透過性を保持する必要がある；（３）膜は、極端なｐＨ（１〜１２）や高塩／低塩環境など、様々な溶液条件下で長期間、機械的および化学的に安定している必要がある。
【０１３９】
実施例５
膜へのタンパク質チャネルの挿入
通常、それぞれの保存バッファーに懸濁されたタンパク質チャネル（テールタンパク質またはポータルチャネル）は、伝導バッファー（通常１Ｍ  ＫＣｌまたは１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳまたはＴｒｉｓ、ｐＨ  ７．６）で５０〜１００倍に希釈され、ＢＬＭセルの上部コンパートメントに添加される。印加電位（一定の保持電圧または傾斜電圧）の下で、平面膜へのタンパク質チャネルの直接挿入が観察され得る（図６、図１１、図１４、図１６、および図１９）。
【０１４０】
必要に応じて、記載されている膜組成物を使用して、前記タンパク質チャネルを再構成するために、多分散性が変化し、小胞ポリマーソーム構造を生成もし得る。高い挿入効率のために、様々な量のグリセロール、ＣｓＣｌ、および／またはスクロースは前記ポリマーソーム内にカプセル化され得る。得られたプロテオポリマーソームは次に、同じ組成の平面二重層と、塩依存的および電圧依存的に融合し得る。
【０１４１】
実施例６
システイン残基との反応を介した非膜タンパク質チャネルへの疎水性部分の結合
ここでは、Ｔ４  ｇｐ２０ポータルタンパク質を例として使用して、システイン残基との反応を介して疎水性部分を非膜チャネルに結合する方法を示す。前記タンパク質チャネルは、サブユニットあたり３つのシステインを含み、チャネルの中間層に位置し、環境に利用可能である（図１３）。２０μＭタンパク質溶液４０μＬを、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５％グリセロール、ｐＨ  ６．８のバッファーで調製した。溶液を脱気し、１００倍過剰のＴＣＥＰを溶液に加えた。室温で２０分のインキュベーション後、４μＬの４ｍＭコレステロール−ＰＥＧ−マレイミドをタンパク質溶液に滴下し、反応混合物を暗所で室温にて２時間インキュベートした。過剰量のコレステロール−ＰＥＧ−マレイミドをＮａｎｏＳｅｐ  １００Ｋスピンカラムで除去した。タンパク質の標識を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した（図１３）。
【０１４２】
実施例７
脂質またはポリマー膜への疎水性部分を運ぶ非膜タンパク質チャネルの挿入
平面ポリマー膜を作製した。印加電圧（一定の保持電圧または傾斜電圧）下で、疎水性部位を運搬する非膜タンパク質チャネルの直接挿入が、タンパク質チャネルをシスチャンバーに追加した後に観察された（図１４）。疎水性アミノ酸への変異または中間層ｐｈｉ２９  ｇｐ−９テールタンパク質への疎水性基の結合は、挿入プロセスとその安定性を有意に向上させ得る。
【０１４３】
実施例８
クリック反応による非膜タンパク質チャネルへのプローブの結合
ｐｈｉ２９  ｇｐ１０ポータルタンパク質を代表例として使用した。
【０１４４】
戦略１：テトラジン−アルケン連結反応経由：４０μＬの２０μＭタンパク質溶液を、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５％グリセロールを含む、ｐＨ６．８のバッファーで調製した。溶液を脱気し、１００倍過剰のＴＣＥＰを溶液に加えた。２０分のインキュベーション後、１．６μＬの１０ｍＭメチルテトラジン−ＰＥＧ４−マレイミドをタンパク質溶液に滴下し、混合物を暗所、室温で１時間インキュベートした。脱塩スピンカラムを使用して脱塩することにより、過剰量のメチルテトラジン−ＰＥＧ４−マレイミドを除去した。５０μＬの３０μＭチオール修飾ｍｉＲＮＡプローブ溶液を、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓを含む、ｐＨ６．８のバッファーで調製した。溶液を脱気し、１００倍過剰のＴＣＥＰを溶液に追加した。２０分のインキュベーション後、６μＬの２５ｍＭ  ＴＣＯ−ＰＥＧ３−マレイミドをオリゴ溶液に滴下して加え、混合物を室温で２時間インキュベートした。過剰量のＴＣＯ−ＰＥＧ３−マレイミドを脱塩カラムで除去した。ｍｉＲＮＡプローブの標識を、２０％尿素−ＰＡＧＥゲルで確認した。前記ｍｉＲＮＡプローブをタンパク質に結合させるために、ＴＣＯ修飾ｍｉＲＮＡプローブをメチルテトラジン標識タンパク質と、異なるモル比で混合して、最適なタンパク質標識効率を達成した。混合物を室温で１時間インキュベートした。前記結合を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで検証した。
【０１４５】
戦略２：アジドアルキンクリックケミストリー経由：４０μＬの２０μＭタンパク質溶液は、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５％グリセロールを含む、ｐＨ６．８のバッファーで調製した。溶液を脱気し、１００倍過剰のＴＣＥＰを溶液に加えた。２０分のインキュベーション後、１．６μＬの１０ｍＭ  Ｓｕｌｆｏ  ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミドをタンパク質溶液に滴下して加え、混合物を暗所、室温で１時間インキュベートした。脱塩スピンカラムを使用して脱塩することにより、過剰量のマレイミド試薬を除去した。前記ＤＢＣＯ修飾タンパク質をアジド修飾ｍｉＲＮＡプローブと等モル濃度で混合し、反応混合物を室温で２時間インキュベートした。前記結合を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで検証した。
【０１４６】
実施例９
タンパク質に結合したＤＮＡプローブの検証
前記タンパク質−ｍｉＲＮＡプローブ結合体を、室温で３０分間、等モル濃度の標的ｍｉＲＮＡオリゴとインキュベートした。タンパク質−ｍｉＲＮＡプローブと標的ｍｉＲＮＡとの結合を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した（図１５）。
【０１４７】
実施例１０
設計された非膜タンパク質チャネルを使用するＰＳＡ検出
タンパク質プローブをナノ細孔チャネルに結合するために、システイン残基とメチルテトラジン−ＰＥＧ４−マレイミドとの反応、およびその後のＴＣＯ標識プローブとの反応、スパイキャッチャー／スパイタグタンパク質結合系などの、様々な方法が試行され、試験されている。ＰＳＡに対する一本鎖抗体がどのようにスパイキャッチャー／スパイタグを介してｐｈｉ２９  ｇｐ１０ポータルタンパク質チャネルに結合するかが示された。Ｃ末端のスパイタグペプチドを有するｐｈｉ２９  ｇｐ１０タンパク質チャネルを構築し、精製した。Ｃ末端のスパイキャッチャーを有するＰＳＡに対する一本鎖抗体を構築し、精製した。組み立てられたタンパク質チャネル−ＰＳＡ一本鎖抗体を、ゲルによって確認した（図１８）。次に、精製され、組み立てられたタンパク質チャネル−ＰＳＡ一本鎖抗体をポリマー膜に挿入して、ＰＳＡ抗原とのその結合能力を試験した。電気生理学的実験をセットアップする手順は以前に記載されている。挿入後、一連の異なる濃度のＰＳＡ抗原をチャンバーに加え、独特の結合イベントを観察した（図１９）。
【０１４８】
実施例１１
設計された非膜タンパク質チャネルを使用するマイクロＲＮＡ検出
核プローブをナノ細孔チャネルに結合させるために、実施例６に概説されるように、様々な異なる方法が試行され、試験されてきた。ｍｉＲ−２１プローブがＴ４  ｇｐ２０ポータルタンパク質チャネルに結合し得ることが実証された。精製された共役複合体をポリマー膜に挿入して、対応するマイクロＲＮＡに結合する能力を試験した。電気生理学的実験をセットアップする手順は以前に記載されている。挿入後、一連の異なる濃度のマイクロＲＮＡをチャンバーに加え、固有の結合イベントを観察した（図１６）。
【０１４９】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および実施例は、本発明の特定の実施形態を示しているが、例示の手段としてのみ与えられていることを理解されたい。さらに、本発明の思想および範囲内の変更および修正は、この詳細な説明から当業者に明らかになると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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