(57)【要約】本発明によれば、抗原および生分解性ポリマーブレンド基質を含むワクチンであって、ポリマーブレンドは疎水性ポリマーおよび両親媒性ブロック共重合体を含み、ワクチンはマイクロカプセルの形で存在し、マイクロカプセルの内部はマルチチャンバ構造を含み、マイクロカプセルの平均粒径は好ましくは１０−１００μｍ、より好ましくは３０−６０μｍであり、マイクロカプセルは、まずポリマーブレンドにより開孔マイクロスフェアを製造し、そしてそれを抗原含有溶液と混合し、次に抗原溶液が充填された開孔マイクロスフェアを密封し、抗原が充填された密封マイクロカプセルを形成する方法により製造されるワクチンが提供される。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原および生分解性ポリマーブレンド基質を含むワクチンであって、
前記ポリマーブレンドは疎水性ポリマーおよび両親媒性ブロック共重合体を含み、前記ワクチンはマイクロカプセルの形で存在し、マイクロカプセルの内部はマルチチャンバ構造を含み、前記マイクロカプセルの平均粒径は好ましくは１０−１００μｍ、より好ましくは３０−６０μｍであり、前記マイクロカプセルは、まずポリマーブレンドにより開孔マイクロスフェアを製造し、そしてそれを抗原含有溶液と混合し、次に抗原溶液が充填された開孔マイクロスフェアを密封し、抗原が充填された密封マイクロカプセルを形成する方法により製造されるワクチン。
【請求項２】
前記ワクチンは、哺乳類被験体中の腫瘍または肝炎に対する予防型または治療型処理に適用され、前記ワクチンは例えば治療型ワクチンであり、好ましくは抗腫瘍ワクチンまたは治療型Ｂ型肝炎ワクチンであり、好ましい抗原は腫瘍抗原またはＢ型肝炎表面抗原である請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
ケモカインを含み、前記ケモカインは例えば顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージ炎症性タンパク質３α（ＭＩＰ−３α）および単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）であり、好ましくは、前記抗原含有溶液にケモカインを含み、前記ケモカインは、開孔マイクロスフェアの密封により密封マイクロカプセルに充填される請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
前記疎水性ポリマーは、ラクチドポリマー、グリコリドポリマー、ラクチド−グリコリド共重合体、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステルおよび／またはポリ酸無水物であり、好ましくは、重量平均分子量が５，０００−１００，０００ダルトン、より好ましくは１０，０００−５０，０００ダルトンである請求項１に記載のワクチン。
【請求項５】
前記両親媒性ブロック共重合体は、ポリエチレングリコールまたはモノメトキシエチレングリコールとラクチドおよび／またはグリコリドの共重合体であり、好ましくはその重量平均分子量が５，０００−１０，０００ダルトン、より好ましくは１０，０００−５０，０００ダルトンである請求項１に記載のワクチン。
【請求項６】
前記両親媒性ブロック共重合体は、マイクロカプセル中のポリマーブレンド基質に対する重量比が少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％または少なくとも２０％である請求項１に記載のワクチン。
【請求項７】
免疫刺激増強剤、例えば、モノホスホリル脂質Ａ、シトシン−グアニンオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはポリイノシン酸−ポリシチジル酸を含む請求項１に記載のワクチン。
【請求項８】
抗原が充填された開孔マイクロスフェアをマイクロスフェアのガラス転移温度に近い温度、好ましくは、マイクロスフェアのガラス転移温度より１〜２℃低い温度に加熱することによりそれを密封する請求項１に記載のワクチン。
【請求項９】
前記開孔マイクロスフェアは、複合エマルション溶剤除去法により製造される請求項１に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記開孔マイクロスフェアの孔隙率は４０％以上、例えば５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上であり、好ましくは孔径８００ｎｍ−５μｍのチャネルを有する請求項１に記載のワクチン。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１項に記載のワクチン、密封マイクロカプセル、および薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１から１０のいずれか１項に記載のワクチン、開孔マイクロスフェアまたは密封マイクロカプセルの抗腫瘍ワクチンまたは治療型ワクチンの製造における使用。
【請求項１３】
抗腫瘍薬物、肝炎、例えばＢ型肝炎の治療薬、または腫瘍細胞若しくは腫瘍に対する細胞毒性細胞の応答を誘導する薬物の製造における請求項１から１０のいずれか１項に記載のワクチン、密封マイクロカプセルの使用。
【請求項１４】
患者に有効量のワクチン、好ましくは抗腫瘍ワクチンを投与することを含む患者体内で腫瘍細胞または腫瘍に対する細胞毒性細胞の応答を誘導することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロカプセルに基づくワクチンに関する。このワクチンは、抗原および生分解性ポリマーブレンド基質を含み、このワクチンは、例えば抗腫瘍ワクチンである。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍生物学と免疫学の発展に伴い、自己免疫システムの調節を主な特性とする免疫療法は、腫瘍治療のために新しいアイデアを提供した。多くの免疫治療方法において、腫瘍ワクチンは、体が病原体に対抗する方式をシミュレートし、腫瘍細胞に対する天然「識別」および応答を回復させることにより腫瘍細胞を特異的に破壊することができため、ますます注目を集めている。
【０００３】
抗腫瘍ワクチンが効果的な作用を発揮することには、単一腫瘍抗原は体の持続的で効果的な免疫反応を誘導することが困難である問題がある。ナノサイズのキャリアにより腫瘍抗原を充填することにより、免疫細胞のエンドサイトーシスおよび成熟を効果的に向上させることで、体のより強い免疫反応を誘導することができる。しかし、ナノキャリアは、サイズが小さく、体にクリアされやすいため、持続的な抗腫瘍効果を奏することができない。複合エマルション溶液法により抗原を包埋してミクロンサイズのキャリアを製造することにより、上記問題が効果的に回避され得る。しかし、抗原の放出が遅すぎるので、効果的な免疫応答を誘導できない問題がある。
【０００４】
ＣＮ１０１６０１８６０Ａには、ポリマー粒子に基づくワクチンが開示されている。その抗原組成には、生分解性ポリマー粒子に吸着された抗原および吸着されていない抗原（遊離抗原）の２つの形態がある。上記粒子は、平均粒径が０．１〜２０μｍであり、以下の方法により調製される。ポリマー粒子とＢ型肝炎表面抗原溶液とを混合し、ポリマー粒子と抗原溶液との吸着作用により懸濁液であるワクチン製品を製造する。本発明のワクチンは、生体内で免疫応答を迅速に誘導するとともに、生体に比較的高いレベルの体液免疫および細胞免疫が発生するように誘導することができる。
【０００５】
ＣＮ１０２４８９２３０Ａには、生分解性材料マイクロカプセルの製造方法が開示されている。この方法は、開孔マイクロスフェアの調製、カプセルコア材料の充填、および開孔マイクロスフェアの密封を含む。従来の複合エマルション包埋方法に比べ、この方法はより温和で、生物活性物質の損傷を回避することができ、包埋後溶液における残りのカプセルコア材料は回収利用することができるため、環境により優しく、報道された粒径および孔径と同じレベルに達し、かつキャビティ容積がより大きく、カプセルコア材料の充填により有利である。しかし、この特許文献には、この生分解性材料マイクロカプセルが低分子、生体高分子物質の包埋に使用できることしか開示されていない。ナノおよびミクロンサイズの粒子を充填することもできる。
【０００６】
上記のさまざまな研究にもかかわらず、より良好に体を刺激して特異的免疫を発生できるワクチンの研究開発、例えば、細胞毒性Ｔ細胞により腫瘍細胞を死滅させることは、その臨床応用に対して非常に重要である。
【発明の概要】
【０００７】
本発明者は、複合エマルション−溶剤除去法により生分解性ポリマーで調製された開孔マイクロスフェアを製造した後、この開孔マイクロスフェアに腫瘍抗原を充填し、この開孔マイクロスフェアを密封し、粒径が比較的大きくマウス体内の局所に滞留可能な密封マイクロカプセルを作製し、マイクロカプセルが貪食されて代謝されにくく、分解しやすく、分解過程において生体を刺激して持続的な炎症反応を引き起こすことができるため、マイクロカプセルが抗原倉庫として抗原提示細胞、例えば、樹状細胞（ＤＣ）を絶えずに注射部位に動員して抗原を貪食し、ポリマー基質の代謝による酸性微小環境と共同で動員される細胞の数を顕著に向上させ、抗原に対する細胞のエンドサイトーシスを向上させ、ＤＣの成熟と分化を刺激することができ、最終的にＤＣがリンパ節へホーミングし、生体を刺激して効率的で持続的な免疫反応を引き起こし、Ｔ細胞の継続的な増殖と分化を促進するとともに、特異的で持続的な殺傷を引き起こし、腫瘍の成長を顕著に抑制し、マウスの生存期間を延長できることを発見した。
【０００８】
以上の事情を鑑み、本発明によれば、ワクチンが提供される。このワクチンは、抗原および生分解性ポリマーブレンド基質を含む。上記ポリマーブレンドは、疎水性ポリマーおよび両親媒性ブロック共重合体を含む。上記ワクチンはマイクロカプセルの形で存在する。マイクロカプセルの内部にはマルチチャンバ構造がある。上記マイクロカプセルの平均粒径は、好ましくは１０−１００μｍ、より好ましくは３０−６０μｍである。上記マイクロカプセルは、まずポリマーブレンドで開孔マイクロスフェアを作製し、そしてそれを抗原含有溶液と混合し、さらに抗原溶液が入った開孔マイクロスフェアを密封し、抗原が入った密封マイクロカプセルを形成する方法により製造される。
【０００９】
好ましくは、本発明のワクチンにおいて、製造プロセスのパラメータ最適化により、抗原の放出と、ワクチンが体内の局所に滞留するときの細胞動員行とが相乗効果を生み出し、放出された抗原が動員されてきた未熟なＤＣにより貪食され、これによって、抗原の利用率が顕著に向上する。
【００１０】
好ましくは、上記ワクチンは、治療型ワクチンであり、例えば、抗腫瘍ワクチンまたは治療型Ｂ型肝炎ワクチンである。好ましい抗原は、腫瘍抗原またはＢ型肝炎表面抗原である。
【００１１】
本発明のワクチンにおいて、多孔質マイクロスフェアシステムに特定量のケモカイン、例えば顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージ炎症性タンパク質３α（ＭＩＰ−３α）および単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）を充填することにより、細胞に対するマイクロカプセルの動員を増強させ、抗原の利用率さらに向上させ、免疫応答を増強させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＰＬＡで製造されたマイクロスフェアのＳＥＭ図である。
【図２】ＰＬＡとＰＥＬＡで製造されたマイクロスフェアのＳＥＭ図である。
【図３】ＰＬＡとＰＥＬＡで製造されたマイクロスフェアの粒度分布図である。
【図４】ＰＬＡとＰＥＬＡで製造されたマイクロスフェアの内部構造のＳＥＭ図である。
【図５】ＰＬＡとＰＥＬＡで製造されたマイクロスフェアの内部孔径分布図である。
【図６】本発明の密封マイクロカプセルのＳＥＭ図である。
【図７】本発明の密封マイクロカプセルの内部構造である。
【図８】本発明の密封マイクロカプセルにおける抗原ＯＶＡの充填率および包埋率である。
【図９】本発明の密封マイクロカプセルにおけるポリペプチドＭＵＣ１の充填率および包埋率である。
【図１０】異なるワクチン製剤の注射部位での抗原蛍光強度定量図である。
【図１１】本発明マイクロカプセルの炎症細胞に対する動員挙動を示す。図１１（ａ）は、局所に密封マイクロカプセルを含む組織が細胞を動員する代表的な組織切片の画像である。（ｂ）それぞれのマイクロカプセルにより動員される細胞数を定量分析することを示す。
【図１２】異なるワクチン製剤抗原の利用率の比較である。図１２（ａ）は、ＯＶＡ＋細胞数を示す。図１２（ｂ）は、ＯＶＡ＋細胞の抗原エンドサイトーシス量（平均蛍光強度で表す）を示す。図１２（ｃ）は、抗原利用率を示す。
【図１３】本発明のマイクロカプセルの分解過程における局所微小環境でのｐＨ変化曲線である。
【図１４】酸性と中性微小環境でのＣＤ８６＋のＤＣにおけるＭＨＣ−ＩとＭＨＣ−ＩＩの比率を示す。
【図１５】異なるワクチン製剤で免疫した後のＥ．Ｇ７担癌マウスの腫瘍増殖曲線である。
【図１６】異なるワクチン製剤で免疫した後のＢ１６担癌マウスの腫瘍増殖曲線である。
【図１７】異なるワクチン製剤で治療した後の肺部（ａ）と腎臓（ｂ）組織中の転移巣の定量分析を示す。
【図１８】異なるワクチン製剤で免疫した後の４Ｔ１担癌マウスの腫瘍増殖曲線である。
【図１９】異なるワクチン製剤で治療した後の術後再発の腫瘍増殖曲線である。
【図２０】術後再発モデル生物の発光イメージング画像および定量を示す。
【図２１】ブランク密封マイクロカプセル（ａ）およびケモカインＧＭ−ＣＳＦを充填する密封マイクロカプセル（ｂ）が皮下組織で細胞を動員するＨ＆Ｅ染色図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜ワクチン＞
本発明は、哺乳類被験体の腫瘍などの疾患に対する予防型または治療型処理に使用されるワクチンに関する。このワクチンは、抗原および生分解性ポリマーブレンド基質を含む。上記ポリマーブレンドは、疎水性ポリマーおよび両親媒性ブロック共重合体を含む。上記ワクチンはマイクロカプセルの形で存在する。マイクロカプセルの内部にはマルチチャンバ構造がある。上記マイクロカプセルの平均粒径は好ましくは１０−１００μｍ、より好ましくは３０−６０μｍである。上記マイクロカプセルは、まずポリマーブレンドで貫通孔を有する開孔マイクロスフェアを作製し、そしてそれを抗原含有溶液と混合し、さらに抗原溶液が入った開孔マイクロスフェアを密封し、抗原が入った密封マイクロカプセルを形成する方法により製造される。本発明のワクチンは、薬学的に許容されるキャリア、塩または希釈剤をさらに含んでもよい。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態において、上記ワクチンは抗腫瘍ワクチンである。上記ワクチンは、製造が簡単で、全ての腫瘍の再発予防、転移抑制および治療に適用できる汎用性を有し、抗腫瘍効果が良好である。抗腫瘍ワクチンを接種した後、まず抗原提示細胞（Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ，ＡＰＣ）は腫瘍抗原を摂取して加工し、抗原ペプチドセグメントに変換させ、そして細胞表面の主要組織適合遺伝子複合体（Ｍａｊｏｒｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ，ＭＨＣ）類分子に結合する。ＡＰＣは、さらにペプチドセグメント情報をＴ細胞に提示し、後続の免疫応答過程を引き起こす。この過程において、大部分の抗原はリソソーム内でペプチドセグメントに加工された後、ＭＨＣ−ＩＩ類分子に結合してＣＤ４＋Ｔ細胞に提示される。さらに重要なことには、小部分の抗原は、細胞質内のプロテアソームによりペプチドセグメントに加工され、ＭＨＣ−Ｉ類分子に結合してＣＤ８＋Ｔ細胞に提示され、それを細胞毒性Ｔリンパ球（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＣＴＬ）に変換させることもできる。ＣＴＬは腫瘍細胞に直接結合して溶解殺傷を奏する一方、ＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞と共同でサイトカインを分泌して腫瘍を殺傷し、最終的には腫瘍をアポトーシス溶解させる。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態において、上記抗原は腫瘍抗原である。腫瘍抗原は、腫瘍の発生、発展および生体抗腫瘍免疫効果の誘導において重要な役割を果たし、腫瘍免疫治療の標的分子である。腫瘍抗原は、その特異性によって（１）腫瘍関連抗原と（２）腫瘍特異的抗原の２種類に大別される。（１）腫瘍関連抗原とは、腫瘍組織中で高発現し、正常組織中である程度発現する抗原を指す。（２）腫瘍特異的抗原とは、腫瘍組織のみで発現し、正常組織に存在しない抗原を指し、腫瘍抗原としてより高い安全性を有する。しかし、腫瘍ワクチン発展の初期、技術的な制限により、腫瘍特異的抗原の発見と精製が困難であったため、その応用が制限された。近年、遺伝子編集技術の開発に伴い、研究者は、腫瘍ワクチン免疫の新しい標的となるいくつかの特異的抗原および新しい抗原を発見し、狙いがはっきりして特異的腫瘍抗原を製造してワクチンの免疫効果を向上させ、最終的に抗原選択の問題を解決した。しかしながら、適切な腫瘍抗原は、依然として免疫応答を効果的に誘導しにくい。これは、単一の腫瘍抗原の半減期が短く、注射された後、すぐに分解して代謝されることで生体免疫システムを効果的に活性化しにくいためである。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態において、上記抗腫瘍抗原は、生腫瘍細胞表面タンパク質のペプチドを収集することにより得られる。上記ペプチドは、初代培養された生腫瘍細胞に細胞死を引き起こさないプロテアーゼを周期的に加えて処理して得られる。例えば、事前に増殖培地から溶出した生腫瘍細胞を初代培養し、プロテアーゼで腫瘍細胞に対して細胞死を引き起こさない処理を行い、放出された表面腫瘍抗原を収集する。次いで、一定時間をおいた後、プロテアーゼで初代培養された生腫瘍細胞を再度処理する。この時間の間隔は、表面腫瘍抗原の活性が細胞によって回復されるのに十分である。ワクチン接種の用量に達するまで表面腫瘍抗原を収集（濃縮）し、得られた表面腫瘍抗原の成分を制御する。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態において、上記腫瘍抗原は、例えば、ムチン（ＭＵＣ１）、腫瘍膜抗原、腫瘍全細胞抗原、または腫瘍新生抗原である。
【００１８】
本発明の抗腫瘍ワクチンは、１つまたは複数の細胞毒性Ｔリンパ球クローンを産生するために１種または複数種の腫瘍抗原を含んでもよい。これらの細胞毒性Ｔリンパ球クローンはそれぞれ特異的抗原ペプチドを識別し、より有効な免疫応答を引き起こす。複数の腫瘍抗原が存在する場合、上記腫瘍抗原を選択して１タイプの腫瘍または腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導することが好ましい。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の抗腫瘍ワクチンは、その基本的な組成が異なる抗原の混合物または抗原と異なる免疫刺激物質との混合物である。
【００２０】
腫瘍治療については、顕著にＣＴＬを活性化し、Ｔｈ１型サイトカインを分泌して初めて、体が腫瘍を攻撃し、消滅することを促進できる。ワクチン成分が放出される際に、ワクチンを貪食するのに十分なＡＰＣが動員されたか否かは、効果的な免疫応答を引き起こすことができるか否かを影響する最も重要な要因でもある。ＡＰＣは生体の各組織に広く分布するため、病原性微生物の発見に重要な役割を果たしている。末梢組織の皮膚において、ランゲルハンス細胞、他のタイプのＤＣおよびマクロファージは、いずれも危険信号和抗原を検出することができ、活性化された後、リンパ器官にホーミングして抗原情報を提示し、免疫応答を活性化する。生体内では、末梢組織からリンパ器官までのこれらの免疫細胞の遊走が複雑であり、その遊走挙動は、主に多くのケモカインによって制御される。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態において、上記抗原は、Ｂ型肝炎表面抗原であり、このワクチンは、治療型Ｂ型肝炎ワクチンである。
【００２２】
Ｂ型肝炎（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ）はＢ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ，ｈＢＶ）によって引き起こされるグローバル感染症であり、これまでに、世界中で２０億人がＢ型肝炎ウイルスに感染しており、そのうち、約３．５億人は慢性Ｂ型肝炎感染者である。Ｂ型肝炎に対する有効な治療薬はまだない。現在、抗ウイルス療法で一般的に使用されているインターフェロンおよびラミブジンは、ウイルスの複製を素早く阻害することができるが、薬剤を止めた後、リバウンド現象が発生しやすく、変異株が生成することもある。
【００２３】
慢性ＨＢＶ感染者の体内において、免疫寛容のため、特異的Ｔ細胞の反応が低下する。治療型ワクチンの目的は、ウイルス除去作用を発揮する細胞免疫反応、主に特異的細胞毒性Ｔリンパ球  （ＣＴＬ）の細胞溶解作用であり、すなわち、ＣＴＬは、パーフォリン、グランザイムを放出して感染した肝細胞を殺傷し、またはＦａｓ媒介経路により感染した肝細胞のアポトーシスを誘導する。しかし、近年の研究により、Ｔｈｌ細胞およびＣＴＬが分泌するサイトカインが関与する非細胞溶解メカニズムは抗ウイルス免疫において主導的な役割を果たしていることが示されている。ＩＦＮ−αなどのサイトカインは、いずれも非細胞変性の方式によりウイルス複製を阻害し、さらにウイルスＤＮＡを取り除くことができる。特に、複数の動物モデルを用いる研究により、ＩＦＮ−γはＨＢＶ複製中間生成物およびＨＢＶ特異的ｍＲＮＡを阻害する作用を有し、ウイルス除去に重要な役割を果たし、自体の細胞免疫応答を刺激することでＩＦＮ−γを主とするサイトカインの分泌を促進し、ウイルスを除去することが示されている。
【００２４】
Ｂ型肝炎表面抗原については、選択可能な抗原タイプが多くある。出芽酵母およびハンゼヌラ酵母が発現するＢ型肝炎表面抗原を選択してもよく、哺乳類細胞系が発現するＣＨＯＢ型肝炎表面抗原を選択してもよいが、好ましい抗原タイプは、ハンゼヌラ酵母発現システムにより得られたＢ型肝炎表面抗原である。由来源が異なるＨＢｓＡｇは、構造と性質には大きな違いがあり、同じまたは類似の遺伝子コードを有しても、異なる発現システムが発現するＨＢｓＡｇ粒子は、依然として異なる分子サイズ、分子量および異なるサブユニットの数を有することで異なる電荷性、疎水性および免疫原性などを示す。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態において、本発明のワクチンは、ケモカインをさらに含む。ケモカインは分子量が１０ＫＤａのポリペプチドであり、主に細胞表面Ｇ糖タンパク質が結合した関連受容体ファミリーと作用する。ケモカインおよび他の走化性吸引関連分子は局所で産生され、拡散して可溶性または固体の濃度勾配を形成し、この場合、ケモカイン受体を発現する細胞は濃度勾配情報に従って走化性情報が由来するところに到達する。
【００２６】
多くのケモカインはＤＣおよび単球の遊走に関係があり、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、単球走化性タンパク質２（ＭＣＰ−２）、マクロファージ炎症性タンパク質  １α（ＭＩＰ−１α）、マクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ−１β）、正常Ｔ細胞の発現および分泌を調節して活性化する（Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｕｐｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｎｏｒｍａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ，ＲＡＮＴＥＳ）ケモカイン、補体Ｃ５ａ、β−ディフェンシン（β−ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ）および細菌由来のホルミルペプチドなどを含む。正常の状況において、末梢組織および血液におけるＤＣの比率が１％またはそれ以下であるため、ワクチンが局所でケモカインの倉庫を構築できれば、絶えずに放出されるケモカインにより体内でのＤＣの注射部位への動員挙動をシミュレート、強化することにより、免疫応答を顕著に増強することができる。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態において、上記ケモカインは、例えば、マクロファージ炎症性タンパク質  ３α（ＭＩＰ−３α）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）およびＧＭ−ＣＳＦであり、好ましくはＧＭ−ＣＳＦである。上記抗原含有溶液にはケモカインを含む。このケモカインは、開孔マイクロスフェアの密封により密封マイクロカプセルに充填される。本発明の好ましい実施形態において、本発明のワクチンのマイクロカプセルのチャンバ閉鎖の構造により、密封された後のマイクロカプセルに充填された分子が効果的にチャンバに密封されることが保証され、持続的で効果的な放出が実現される。放出過程全体には、顕著な急激放出も停滞期もなく、代謝速度が遅くて効果的であり、最終的には有効代謝率が９０％と高く、基本的に抗原が完全に放出される。
【００２８】
マイクロカプセルの素晴らしい抗原滞留能力により、抗原の体内でのより持続的な放出が保証され、抗原の放出に伴い、マイクロカプセルが注射された後、その場保持効果により炎症応答が引き起こされ、さらに炎症関連細胞を動員してキャリアおよび放出された抗原を貪食する。抗原およびアジュバントであるポリマー基質が放出するダイナミクスは、免疫反応の制御に対して重要であり、ワクチンの最終的な免疫効果に影響を与える。両者のダイナミクス放出が同期ではない場合、すなわち、抗原が遅く放出され、アジュバントがより速くまたはより遅く放出される場合、いずれも局所でワクチンを貪食するＡＰＣが活性化されるレベルに影響を与えるため、効果的な免疫応答を刺激しにくくなる。
【００２９】
数多くのＡＰＣの中で、ＤＣ（Ｄｅｎｔｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）は、生体において機能が最も強いＡＰＣであり、その成熟、分化の状態によって、ＤＣ前駆細胞、未熟および成熟ＤＣに分けられる。ＤＣ前駆細胞は、正常状態でＤＣ表現型または機能がない細胞であり、生体が病原性微生物感染または炎症刺激を受けていると、直ちに動員され、未熟ＤＣへ分化、発展する。未熟ＤＣは、正常状態での大部分のＤＣ状態であり、抗原を効率的に摂取、加工および提示することができ、高い遊走能力を有する。成熟ＤＣは、活性化されたため、抗原摂取能力が低くなり、抗原情報を提示し、初期Ｔ細胞の活性化を刺激する能力が高くなる。本発明の密封マイクロカプセルの局所で大量のＤＣケモカインが生成し、より多いＤＣの動員に有利であり、抗原をより効果的に加工、提示し、生体を刺激してより効果的な免疫応答を引き起こす。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態において、局所で産生した炎症微小環境は、絶えずに炎症関連細胞およびＡＰＣを注射部位へ動員して抗原を貪食する。この過程において、ケモカインの分泌は、細胞動員の種類および数に対して重要な役割を果たす。キャリアであるポリマー基質の分解速度および抗原放出挙動はケモカインの分泌量に顕著に影響する。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態において、抗原放出と細胞動員挙動とは相乗的に作用して最適な効果を発揮し、段階全体で放出される抗原は全て抗原提示効率が最も高い細胞、すなわち未熟ＤＣ細胞により貪食され、このＤＣ細胞は抗原を大量貪食する機能を有し、抗原の利用率をさらに向上させる。
【００３２】
キャリアであるポリマー基質の代謝過程において、局所で産生した炎症微小環境は、絶えずに炎症関連細胞およびＡＰＣを注射部位へ動員して抗原を貪食する。この過程において、ケモカインの分泌は、細胞動員の種類および数に対して重要な役割を果たす。キャリアの分解速度および抗原放出挙動はケモカインの分泌量に顕著に影響する。本発明の好ましい実施形態において、キャリアであるポリマー基質の代謝により産生した酸性微小環境は、動員される細胞の数を顕著に増加できるとともに、抗原に対する細胞のエンドサイトーシスを顕著に増強できる。ポリ乳酸などのマイクロカプセルで構築される酸性微小環境はそれ自体が非常に高い免疫アジュバント特性を有し、この酸性微小環境は抗原利用率を向上するための重要な要素でもあり、活性化されたＤＣの滞留部位とすることができ、すなわち、さらなるワクチンアジュバントの追加および複数回免疫の必要がなく、活性化されたＡＰＣホーミングをリンパ節に持続的に提供でき、酸性微小環境は、交叉抗原提示およびＴｈ１型サイトカインの分泌を顕著に増強できる。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態において、本発明のワクチンは、免疫刺激増強剤、例えば、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）、シトシン−グアニンオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはポリイノシン酸−ポリシチジル酸を含む。
【００３４】
＜マイクロカプセルの調製＞
本発明の好ましい実施形態において、マイクロカプセルの調製とは、特定の方法により機能材料をシェル材料に被覆させられまたは分散させることにより粒状複合体を調製する過程を指す。好ましい本発明のマイクロカプセルの内部にはマルチチャンバ構造があり、上記マイクロカプセルの平均粒径は好ましくは１０−１００μｍ、より好ましくは２０−８０μｍ、さらに好ましくは３０−６０μｍである。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態において、上記開孔マイクロスフェアの孔隙率は４０％以上であり、例えば５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上であり、孔径１−５μｍのチャネルを有する。好ましくは、開孔マイクロスフェアは、複合エマルションおよび溶剤除去法により調整される。この方法では、生分解性高分子をシェル材料として使用することができ、薬物充填マイクロカプセルの開発に適用される。上記開孔マイクロスフェアは、貫通孔構造を有し、マルチチャンバの内部構造および多孔質のシェル材料を有し、複合エマルション進化および複合エマルション硬化の２つの動的過程の制御により、開孔マイクロスフェアの開孔構造および開孔数を容易に制御することができ、次いで開孔マイクロスフェアを抗原含有溶液に浸漬し、抗原が拡散してマイクロスフェアの内部に入る。溶剤膨潤法、照射法および昇温アニール法により開孔マイクロスフェアを密封することができる。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態において、マイクロカプセルの調製は、主に開孔マイクロスフェアの調製、抗原の充填、および開孔マイクロスフェアの密封を含む。好ましくは、上記方法は以下のステップを含む。
（１）油相を調製する。上記油相はポリマー基質溶液であり、溶剤は有機溶剤である。内水相溶液および外水相溶液を調製する。外水相に界面活性剤を添加する。
（２）内水相を油相に分散し、油中水型一次エマルジョンを形成する。さらに、一次エマルジョンを外水相に分散し、水中油中水型複合エマルションを形成する。
（３）溶剤除去法により油相を硬化し、貫通孔を有する開孔マイクロスフェアを得る。
（４）開孔マイクロスフェアと抗原含有溶液とを混合し、抗原が溶液中で拡散による物質移動により多孔質マイクロスフェアの表面から内部のチャンバに入り、抗原が充填された開孔マイクロスフェアが得られる。
（５）開孔マイクロスフェアを密封し、抗原が充填された密封マイクロカプセルを形成する。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態において、複合エマルションが調製された後、進化の過程において複合エマルション中の内水相小液滴は徐々に融合して大きくなるとともに、内外水相の塩濃度差により内水相は脱出するため、進化の過程において水相融合と脱出は同時に行う。内水相の融合によりマイクロスフェアの内部多孔質の構造が形成され、内水相の脱出によりマイクロスフェア表面の多孔質形態が形成される。本発明の好ましい実施形態において、上記ポリマー基質は、生分解性ポリマーブレンド基質である。上記ポリマーブレンドは、疎水性ポリマーおよび両親媒性ブロック共重合体を含む。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態において、上記疎水性ポリマーは、ラクチドポリマー（通常、ＰＬＡと略す）、グリコリドポリマー、ラクチド−グリコリド共重合体（通常、ＰＬＧＡと略す）、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステルおよび／またはポリ酸無水物である。好ましくは、重量平均分子量は、５，０００−１００，０００ダルトン、より好ましくは１０，０００−５０，０００ダルトンである。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態において、上記両親媒性ブロック共重合体中の親水性ブロックは、ポリエチレングリコール類、ポリアクリル酸類、ポリオキシエチレン類、ポリビニルアルコール類である。疎水性ブロックは、ラクトン類共重合体またはホモポリマーである。好ましくは、親水性ブロックはポリエチレングリコールまたはモノメトキシエチレングリコールであり、疎水性ブロックはポリ乳酸（ＰＬＡ）または乳酸とグリコール酸の共重合体（ＰＬＧＡ）である。上記両親媒性ブロック共重合体の親水性ブロックは５００−３０，０００ダルトンの重量平均分子量を有し、疎水性ブロックは５００−５０，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。好ましくは、親水性ブロックの重量平均分子量は１，０００−２０，０００ダルトン、例えば４，０００−１０，０００ダルトンであり、疎水性ブロックの重量平均分子量は５，０００−２０，０００ダルトンである。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態において、上記両親媒性ブロック共重合体は、ポリエチレングリコールあるいはモノメトキシエチレングリコールとラクチドおよび／またはグリコリドとの共重合体（通常、ＰＬＧＡと略す）である。その重量平均分子量は５，０００−１０，０００ダルトン、好ましくは１０，０００−５０，０００ダルトンである。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態において、上記両親媒性ブロック共重合体は、一次エマルジョンの安定化に適用できる。これによって、マルチチャンバ構造を有する多孔質マイクロスフェアを製造することができる。マイクロカプセル中のポリマーブレンド基質における上記両親媒性ブロック共重合体の重量比は５％以上、好ましくは１０％以上、１５％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上または５０％以上である。ＰＬＡは、比較的強い局所炎症免疫応答を有するため、薬物制御放出分野における使用が少ない。ＰＥＬＡは、生体適合性に優れた材料としてよく使用されており、孔隙率がより高い開孔マイクロスフェアの製造に有利であり、両者の比率を変更することにより、マイクロスフェアの疎水性および孔隙率が改善されるとともに、キャリアの炎症応答を調節し、生体適合性を改善することができる。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態において、ステップ（１）の上記有機溶剤は揮発性で水不溶性の有機溶剤である。例えば、ｎ−ブタノール、メチルエチルケトン、エチルエーテル、クロロホルム、テトラクロロメタン、トルエンなどである。揮発性で水に部分的に溶解可能な有機溶剤を含む。例えば、酢酸エチル、フェノールなどである。さらに好ましくは、水に溶解できないアルコール、ケトン、エステル、エーテル、アルキルベンゼン、ハロゲン化アルカン、ハロゲン化芳香族のうちの１種または２種以上の組み合わせである。上記組み合わせの典型的な例には、アルコール、ケトンの組み合わせ；アルコール、ケトン、エステル、エーテルの組み合わせ；エステル、アルキルベンゼン、ハロゲン化アルカンの組み合わせ；エステル、アルキルベンゼン、ハロゲン化アルカン、ハロゲン化芳香族炭化水素の組み合わせなどが含まれるが、これらに限定されない。特に好ましくは、アルコール、エステル、アルキルベンゼン、塩素化アルカン、塩素化芳香族炭化水素のうちの１種または２種以上の組み合わせである。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態において、マイクロカプセルを製造する際に、ステップ（１）の上記有機溶剤に免疫刺激増強剤、例えば、モノホスホリル脂質Ａを添加する。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態において、抗原を充填するときにさらに免疫刺激増強剤、例えば、シトシン−グアニンオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはポリイノシン酸−ポリシチジル酸を充填する。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態において、ステップ（３）の上記溶剤除去法は、溶剤抽出法であるが、静置して溶剤を揮発させ、撹拌して溶剤を揮発させ、または他の溶剤を除去する方法であってもよい。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態において、ステップ（３）の上記硬化過程では、内水相と外水相とが融合して貫通孔を形成する。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態において、ステップ（３）の内外貫通孔を有する開孔マイクロスフェアは多孔質構造である。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態において、本発明の上記開孔マイクロスフェアは表面多孔質マイクロスフェアである。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態において、開孔マイクロスフェアの孔隙率は４０％以上、例えば、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上である。好ましくは孔径１−５μｍのチャネルを有する。好ましくはマイクロスフェアの内部孔径は８００ｎｍ−５μｍであり、平均孔径は約１μｍである。
【００５０】
本発明の好ましい実施形態において、ステップ（３）では、油相を硬化した後、残留した界面活性剤を除去し、特に好ましくは篩掛けまたは遠心洗浄により残留した界面活性剤を除去する。  
【００５１】
本発明の好ましい実施形態において、好ましくは、上記開孔マイクロスフェアの密封プロセスは、溶剤膨潤法、照射法および昇温アニール法を含む。当業者は、当該技術分野の技術知識／新しい技術により開孔マイクロスフェアを密封してもよい。
【００５２】
本発明において、当業者であれば、可以理解上記「密封」とは抗原および／または他の物質、例えば、ケモカインをマイクロカプセルの内部に包埋、固定または滞留することを意味することを理解できる。本発明において、密封マイクロカプセルは、マイクロカプセルの表面に何らの開孔がないことを意味せず、抗原および／または他の物質、例えば、ケモカインは、密封プロセスにより部分的にマイクロカプセルの内部に包埋、固定または滞留できることを意味する。抗原および／または他の物質、例えば、ケモカインは、マイクロカプセルの分解によりマイクロカプセルから放出することができる。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態において、昇温アニール法は理想的な密封方法である。例えば、ポリ乳酸などの生分解性ポリマーブレンド基質の独特な自己合着密封特性を利用することができる。照射または加熱の方法によりマイクロスフェアの表面の分子がエネルギーを吸収して再配列することで、表面の孔が合着して密封する。例えば、抗原が充填された開孔マイクロスフェアをマイクロスフェアのガラス転移温度に近い温度、好ましくはマイクロスフェアのガラス転移温度より１〜２℃低い温度までゆっくりと昇温し、一定の時間後、ゆっくりと降温し、開孔マイクロスフェアの表面の孔を密閉して密封の多孔マイクロカプセルを製造するとともに、抗原がマイクロカプセル内に効果的に密封され、充填率および包埋率は安定である。昇温に必要な温度はポリ乳酸材料のガラス転移温度に近く、マイクロスフェアの合着密封を実現するために、昇温の条件を制御する必要があり、マイクロスフェアの形態に対する影響は大きくない。
【００５４】
本発明の他の実施形態において、開孔マイクロスフェアは、ポリマーと細孔形成剤の相分離により製造できる。細孔形成の過程において、溶剤は細孔形成剤と呼ばれることが多く、通常油溶性低分子を選択する。ポリマーと溶剤の相分離はポリマー連鎖成長過程で発生し、ポリマー分子量の増加または分子間の架橋により、高分子は低分子溶剤から徐々に沈殿して個体高分子になる。高分子溶液系で発生することもできる。環境条件の変化、例えば、温度の変化、良溶媒の除去または貧溶媒の添加により、高分子に対する溶剤の溶解能力が低下し、高分子は沈殿して固相になる。
【００５５】
本発明の目的は、患者体内で腫瘍細胞または腫瘍に対する細胞毒性細胞の応答を誘導する方法を提供することである。この方法は、この患者に有効量の本発明のワクチン、好ましくは抗腫瘍ワクチンを投与し、特に静脈内、注射または輸液、好ましくは輸液により投与することを含む。この方法の目的は、特に、患者の樹状細胞の活性化およびＣＤ８＋細胞毒性細胞の応答を誘導し、特異的ＣＤ４＋補助およびＣＤ８＋細胞毒性応答を取得する。
【００５６】
本発明のワクチンは、がんまたは肝炎（例えばＢ型肝炎）などの疾患の予防および処理に適用でき、特に免疫療法に適用できる。本発明は、がんまたは肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）を予防的または治療的に処理する方法を提供する。この方法は、上記処理を必要とする哺乳類被験体に予防または治療有効量のワクチンを投与することを含む。
【００５７】
本発明において、用語「予防接種」とは、能動免疫を指し、すなわち、投与により発生する特異的免疫応答の誘導である。この投与は、例えば、皮下、皮内、筋肉内、傾向または経鼻により少量の抗原を投与することを指す。この抗原は、接種された個体に外来性として識別されるため、適切な処方において免疫原性である。従って、抗原は、免疫システムの「トリガー」として使用され、この抗原に対する特異的免疫応答を構築する。
【００５８】
本発明によれば、予防接種は治療型または予防型であってもよい。例えば、がんに罹患していない個体に予防接種することにより、がん疾患に対する予防型保護を達成することができる。このような予防型接種ワクチンを使用できる個体の例は、がんに罹患するリスクが高い個体であるが、これらに限定されない。がんに罹患するリスクがある患者は、原発腫瘍、転移巣、またはがんの傾向にも関わらず、腫瘍が発生している可能性がある。
【００５９】
本発明において、用語「有効量」とは、ヒトまたは動物に投与するときに免疫反応を誘発する抗原性／免疫原性組成物の量を指す。当業者は、通常のプロセスに従って有効量を容易に確定することができる。
【００６０】
本発明で提供されるワクチンまたは医薬組成物は、滅菌粉末製剤に調製することができる。例えば、上記滅菌粉末は、ワクチンおよびマンニトールを含み、以下の方法により製造することができる。マイクロカプセルを取り、注射用水で洗浄し、凍結乾燥プレートに移し、マンニトールおよび適量の注射用水を加え、凍結乾燥機に入れて凍結乾燥させ、凍結乾燥品を篩掛けして均一に混合し、無菌で小分けし、蓋をすることで滅菌粉末を得る。患者に投与する前に、滅菌粉末を許容される分散溶剤に懸濁する。上記分散溶剤は、懸濁剤、ｐＨ調節剤、等張化剤、界面活性剤のうちの１種または複数種および注射用水からなる。上記懸濁剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム、グリセリンのうちの１種または複数種であり得る。上記等張化剤は、塩化ナトリウム、グルコース、マンニトール、ソルビトールのうちの１種または複数種などであり得る。上記界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベートシリーズ（例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート６０等）である。
【００６１】
本発明で提供される医薬組成物、例えば、ワクチンマイクロカプセルについては、当業者に知られている方法により本発明のワクチンを例えば、動脈内、静脈内、経皮注射、経鼻、経気管支、筋肉内または経口により患者に投与することができる。用量および投与方法は、患者の体重、年齢および投与方法によって異なり、当業者が必要に応じて選択することができる。
【００６２】
液体医薬組成物は、通常ｐＨが約３．０−９．０、好ましくは約４．５−８．５、より好ましくは約５．０−８．０である。組成物のｐＨは、緩衝液、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、Ｔｒｉｓまたはヒスチジンにより維持することができ、濃度が通常約ｌｍＭ−５０ｍＭである。組成物のｐＨは、生理学的に許容できる酸または塩基により調整することもできる。
【００６３】
上記医薬組成物は、予防有効量または治療有効量（場合によって確定する。予防であるが、治療にみなされる場合もある）で個体に投与されることで個体に有利である。通常、これは、個体に有利な治療上有用な活性を示す。投与される化合物の実際量、投与速度および時間過程は、処理される病状の性質および重症度に依存する。処方、例えば、用量決定などは、一般開業医や他の医師の責任の範囲内であり、通常、処理される病症、患者の状況、送達部位、投与方法および医師に知られている他の要因に依存する。
【００６４】
本明細書に開示された実施形態は、本発明のいくつかの態様を説明するものである。
【００６５】
＜比較例１＞ＰＬＡを用いる開孔マイクロスフェアの製造
１００ｍｇ分子量が２００００ダルトンのラセミ化末端カルボキシルポリ乳酸（ＰＬＡ，済南岱崗生物工程有限公司）を２ｍＬ酢酸エチル中（油相，Ｏ）に溶解し、０．５ｍＬ０．０５％の塩化ナトリウム水溶液（内水相Ｗ１）を加え、超音波破砕機で一次エマルジョン（油中水，Ｗ１／Ｏ）を調製し、一次エマルジョンを１５  ｍＬのＰＶＡ（日本クラレ）を含む水溶液（外水相  Ｗ２）に入れ、ホモジナイザで乳化して複合エマルション（水中油中水，Ｗ１／Ｏ／Ｗ２）を調製する。その後、縦型ミキサーで２５ｍｉｎ混合し、複合エマルション進化を行う。次いで、複合エマルションを５００ｍＬ超純水に入れ、室温で１０  ｍｉｎ（５００ｒｐｍ／ｍｉｎ）磁気撹拌し、マイクロスフェアを硬化する。最後に、複数回遠心分離（５００ｇ，５ｍｉｎ）し、上清を捨て、底部のマイクロスフェアを収集し、さらに１ｍＬ超純水をマイクロスフェアに添加し、４℃で保存する。
【００６６】
ＰＬＡマイクロスフェア懸濁液を５０ｕＬ吸い取り、アルミ箔に滴下し、室温で乾燥させる。導電性接着剤でサンプルを含むアルミ箔をサンプル調製台に貼り付け、ゴールドスプレーした後、ＳＥＭでマイクロスフェア形態を観察する。得られたＰＬＡマイクロスフェアを図１に示す。単にＰＬＡで製造されたマイクロスフェアには顕著な多孔質構造がなく、本発明の密封マイクロスフェアを開発するために本発明の多孔質マイクロスフェアとして使用するのに適してない。
【００６７】
（実施例１）ＰＬＡおよびＰＥＬＡを用いる開孔マイクロスフェアの製造
９５ｍｇ分子量が２００００ダルトンのラセミ化末端カルボキシルポリ乳酸（ＰＬＡ，済南岱崗生物工程有限公司）と５ｍｇ分子量が３８０００ダルトンのポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ，Ｍｗ：２０００）−ラセミ化末端カルボキシルポリ乳酸（ＰＬＡ，Ｍｗ：３６０００）共重合体（ＰＥＬＡ，済南岱崗生物工程有限公司）を２ｍＬ酢酸エチル（油相，Ｏ）に溶解し、０．５ｍＬの０．０５％塩化ナトリウム水溶液（内水相  Ｗ１）に加え、超音波破砕機により一次エマルジョン（油中水，Ｗ１／Ｏ）を調製し、その後、一次エマルジョンを１５ｍＬのＰＶＡを含む水溶液（外水相Ｗ２）に入れ、ホモジナイザで乳化して複合エマルション（水中油中水，Ｗ１／Ｏ／Ｗ２）を調製する。その後、縦型ミキサーで２５ｍｉｎ混合し、複合エマルション進化を行う。次いで、複合エマルションを５００ｍＬ超純水に入れ、室温で１０  ｍｉｎ（５００ｒｐｍ／ｍｉｎ）磁気撹拌し、マイクロスフェアを硬化する。最後に、複数回遠心分離（５００ｇ，５ｍｉｎ）し、上清を捨て、底部のマイクロスフェアを収集し、さらに１ｍＬ超純水をマイクロスフェアに添加し、４℃で保存する。
【００６８】
上記マイクロスフェア懸濁液を５０ｕＬ吸い取り、アルミ箔に滴下し、室温で乾燥させる。導電性接着剤でサンプルを含むアルミ箔をサンプル調製台に貼り付け、ゴールドスプレーした後、ＳＥＭでマイクロスフェア形態を観察する。図２に示すように、表面孔径が１−２μｍであり、表面開口の構造を有する。その粒度分布を図に示す。マイクロスフェアの平均粒径は６０μｍである。また、マイクロスフェアの内部構造を観察するために、超薄型ブレードで乾燥したマイクロスフェアを破砕する。そして、サンプルを導電性接着剤に接着してゴールドスプレーし、ＳＥＭで観察する。図４に示すように、マイクロスフェアは、同様に内部が多孔質で互いに貫通する構造を有し、内部孔径が約１−５μｍである。
【００６９】
３０ｍｇ凍結乾燥後の多孔質マイクロスフェアを取り、水銀ポロシメータで３回測定し、多孔質マイクロスフェアの孔隙率および平均孔径分布を算出した結果、多孔質マイクロスフェアの孔隙率は８２％である。図５に示すように、マイクロスフェアの内部孔径は８００ｎｍ−５μｍであり、平均孔径は約１μｍである。
【００７０】
（実施例２）抗原が充填された密封マイクロカプセルの製造
実施例１で調製された乾燥重量３０ｍｇの開孔マイクロスフェア懸濁液１ｍＬを１．５ｍＬの遠沈管に入れ、遠心分離して上清を除去し、５０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬの抗原ＯＶＡ（Ｓｉｇｍａ社）５００μＬまたは８ｍｇ／ｍＬのＭＵＣ１ペプチドセグメント（吉爾生化上海有限公司）５００μＬを加えてマイクロスフェアと混合し、縦型ミキサーに置き、４ｈ（３００ｒｐｍ）懸濁し、タンパク質またはペプチドセグメントをマイクロスフェアに貫通したチャネルによりマイクロスフェアチャンバの内部に十分に入った後、縦型ミキサーおよびマイクロスフェアを３９℃の恒温ボックスに置き、昇温して密封する。この過程において、懸濁速度は１００ｒｐｍであり、マイクロスフェアが昇温過程全体で均等に加熱され、沈降しないことを保証する。２ｈ反応した後、密封が完成する。遠心分離（５００ｇ，５ｍｉｎ）して上清を除去し、タンパク質、ポリペプチド分子が充填された密封マイクロカプセルを得る。
【００７１】
抗原ＯＶＡを含む密封マイクロカプセル懸濁液５０ｕＬを吸い取り、アルミ箔に滴下し、室温で乾燥させる。導電性接着剤でサンプルを含むアルミ箔をサンプル調製台に貼り付け、ゴールドスプレーした後、ＳＥＭでマイクロカプセルの表面形態を観察する。図６に示すように、表面の複数の孔が完全に密閉し、密封マイクロカプセルが形成される。同時に、密封マイクロカプセルの内部構造を観察するために、超薄型ブレードで乾燥したマイクロカプセルを破砕する。そして、サンプルを導電性接着剤に接着してゴールドスプレーし、ＳＥＭで観察する。図７に示すように、マイクロカプセルの内部に内部多孔質構造があり、かつ孔径が約１−５μｍであるが、内部で貫通した多孔質構造は密閉するとともに独立した多孔質構造となっている。
【００７２】
マイクロスフェアを密封した後、密封後のマイクロカプセルにおける抗原ＯＶＡまたはペプチドセグメントＭＵＣ１の充填率および包埋率を評価する。ＯＶＡタンパク質およびＭＵＣ１ポリペプチドの含有量の測定方法は以下のとおりである。
＜密封マイクロカプセルにおけるタンパク質ＯＶＡの抽出＞  ＯＶＡが充填された凍結乾燥マイクロスフェア（ｎ＝３）５ｍｇを取り、１ｍＬの０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加え、４℃で一晩（１２ｈ）反応させ、マイクロカプセルが完全に分解された後、遠心分離して上清を取り、０．１Ｍの塩酸で滴定して溶液をｐＨにし、そこから１００μＬの上清を吸い取り、ＢＣＡキットでタンパク質含有量を測定する。
【００７３】
＜密封マイクロカプセルにおけるポリペプチドＭＵＣ１の抽出＞ＭＵＣ１ポリペプチドが充填された凍結乾燥マイクロカプセル（ｎ＝３）５ｍｇを秤量し、まず３００μＬアセトニトリルを加えて材料を完全に溶解させ、システムが澄んだ後、０．０１５ＭのＨＣｌ溶液１．７ｍＬを加え、最後に０．４５μｍの濾過膜でシステム中の不溶分および不純物を除去し、最後にＲＰ−ＨＰＬＣでＭＵＣ１ペプチドセグメントの濃度を測定する。実験条件は以下のとおりである。
＜検出条件＞０．１％トリフルオロ酢酸の脱イオン水（移動相Ａ）；０．１％トリフルオロ酢酸のＨＰＬＣ用のアセトニトリル（移動相Ｂ）；溶出勾配：流動Ｂ：０％−６０％、０−２５  ｍｉｎ；流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；検出波長：２２０ｎｍ。
【００７４】
最終マイクロカプセルの薬物充填率（％）の計算方法は、以下のとおりである。密封マイクロカプセル内の抗原（ＯＶＡ／ＭＵＣ１）の質量をマイクロスフェアの質量（乾燥重量）で割り、さらに１００％をかける。マイクロカプセル包埋率（％）の計算方法は、以下のとおりである。密封マイクロカプセル内の抗原（ＯＶＡ／ＭＵＣ１）の質量を充填前の抗原（ＯＶＡ／ＭＵＣ１）の質量（濃度×体積）で割り、さらに１００％をかける。
【００７５】
図８および図９に示すように、初期抗原ＯＶＡタンパク質およびＭＵＣ１ペプチドセグメントの濃度の増加に伴い、マイクロカプセルの充填率は線形の増加傾向にあり、抗原濃度が１００ｍｇ／ｍＬである場合、マイクロカプセルの充填率は２０％と高い。抗原濃度の増加に伴い、密封マイクロカプセルの包埋率は常に相対的安定的なレベルに維持される。これは、マイクロカプセルの包埋率がマイクロカプセルのチャンバの体積にのみ依存することを示している。このような充填率の線形増加および包埋率の相対的安定な特徴は、抗原とマイクロカプセルの比率の調整に有利であり、異なる充填系の需要を満たすことができる。
【００７６】
（実施例３）抗原およびＭＰＬＡが充填された密封マイクロカプセルの製造
まず、１ｍｇのＭＰＬＡ（Ｓｉｇｍａ）を５００μＬクロロホルム（ＣＨＣｌ３）に溶解し、そして１００μＬクロロホルムを１．９ｍＬ油相酢酸エチルに加え、さらに９５ｍｇ分子量が２００００ダルトンのラセミ化末端カルボキシルポリ乳酸（ＰＬＡ，済南岱崗生物工程有限公司）と５ｍｇ分子量が３８０００ダルトンのポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ，Ｍｗ：２０００）−ラセミ化末端カルボキシルポリ乳酸（ＰＬＡ，Ｍｗ：３６０００）の共重合体（ＰＥＬＡ，済南岱崗生物工程有限公司）をクロロホルムおよびＭＰＬＡを含む油相２ｍＬに溶解し、０．０５％の塩化ナトリウム水溶液（内水相Ｗ１）０．５ｍＬを加え、超音波破砕機で一次エマルジョン（油中水，Ｗ１／Ｏ）を調製し、次いで一次エマルジョンをＰＶＡを含む水溶液（外水相Ｗ２）１５ｍＬに加え、ホモジナイザで乳化して複合エマルション（水中油中水，Ｗ１／Ｏ／Ｗ２）を調製する。その後、縦型ミキサーで２５ｍｉｎ懸濁して複合エマルション進化を行う。次に、複合エマルションを５００ｍＬ超純水に入れ、室温で磁気撹拌（５００ｒｐｍ）によりマイクロスフェアを硬化させる。最後に、複数回遠心分離（５００ｇ，５ｍｉｎ）し、上清を捨て、底部のマイクロスフェアを収集し、さらに１ｍＬ超純水をマイクロスフェアに添加し、４℃で保存する。
【００７７】
抗原およびＭＰＬＡが充填された密封マイクロカプセルの製造過程は以下のとおりである。１ｍＬのＭＰＬＡが充填されたマイクロスフェア懸濁液を１．５ｍＬの遠沈管に入れ、遠心分離して上清を捨て、残ったマイクロスフェアの体積は５００μＬである。そして、１０ｍｇ／ｍＬ抗原ＯＶＡ（Ｓｉｇｍａ社）  ５００μＬまたは８ｍｇ／ｍＬのＭＵＣ１ペプチドセグメント（吉爾生化上海有限公司）５００μＬを加えてマイクロスフェアと混合し、縦型ミキサーに入れて４ｈ（３００ｒｐｍ）懸濁し、ペプチドセグメントがマイクロスフェアに貫通したチャネルによりマイクロスフェアチャンバの内部に十分に入った後、３９℃の恒温ボックス中で昇温して密封し、２ｈ反応させた後、密封を完成する。遠心分離（５００ｇ，５  ｍｉｎ）し、上清を捨て、抗原およびＭＰＬＡが充填された密封マイクロカプセルを得る。計算した結果、マイクロカプセル中のＯＶＡの実際充填率は２％、ペプチドセグメントＭＵＣ１の実際充填率は１．７％、ＭＰＬＡの実際充填率は１‰である。
【００７８】
（実施例４）ケモカインが充填された密封マイクロカプセルの製造
乾燥重量が３０ｍｇの実施例２で調製された開孔マイクロスフェア懸濁液を１．５ｍＬの遠沈管に入れ、遠心分離して上清を捨て、残ったマイクロスフェアの体積が５００μＬである。１ｍｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦケモカイン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）溶液５００ｕＬを加え、マイクロスフェアと混合し、縦型ミキサーに入れて４ｈ懸濁（３００ｒｐｍ／ｍｉｎ）し、ケモカインがマイクロスフェアチャンバの内部に十分に入った後、３９℃恒温ボックスに置いて昇温して合着し、２時間反応させた後、密封が完成する。遠心分離して上清を捨て、ケモカインが充填された密封マイクロカプセルを得る。計算した結果、マイクロカプセル中のＧＭ−ＣＳＦの実際充填率は２．４‰である。
【００７９】
（実施例５）抗原が充填された密封マイクロカプセルの抗原放出と細胞動員との相乗作用
まず、週齢６−８のＣ５７ＢＬ／６雌マウス（ｎ＝４，北京維通利華実験動物有限公司）の背部に異なるワクチン製剤を皮下注射し、それぞれ単一蛍光抗原（染料Ｃｙ５で標識された抗原ＯＶＡ，ＯＶＡ−Ｃｙ５）群、蛍光抗原と多孔質マイクロスフェアの混合群、蛍光抗原が密封マイクロカプセル内に密封された包埋群を構築する。全ての群では、マイクロスフェアおよび抗原の注射量はそれぞれ３ｍｇおよび６０μｇである。代謝の異なる段階（１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、０．５ｄ、１ｄ、２ｄ、４ｄ、７ｄ、１０ｄ、１４ｄ、１７ｄ、２１ｄ、２５ｄおよび３０ｄ）で、小動物ライブイメージングシステムにより多孔質マイクロスフェアおよび密封マイクロスフェアでの抗原の異なる代謝挙動を観察する。
【００８０】
図１０に示すように、単一のＯＶＡ抗原は、３日目に局所蛍光強度はほとんど消えた。これは、抗原の代謝速度が非常に速く、基本的に完全に代謝したことを示している。混合群は、２４ｈ内のバースト放出は５０％であり、代謝の初期に、マイクロスフェアの外部に遊離する抗原が組織に迅速に代謝されるため、代謝速度が比較的速いためである。その後、多孔質マイクロスフェア内の抗原はさらに放出される。しかし、５日目に依然として比較的強い蛍光強度がある。図から分かるように、１０％の抗原が代謝されていない。これは、マイクロスフェアの局所滞留およびチャネルのディレイ効果により、抗原の代謝が顕著に遅くなるためであり、合計代謝時間は約７日に延長した。これに対し、包埋群では、検出開始の２週間内で常に比較的強い蛍光強度を保持し、定量図から分かるように、早期代謝には顕著なバースト放出効果がなく、２４ｈ内の放出が１０％である。密封マイクロカプセルの表面の孔が密閉であり、抗原が一時的に材料表面のナノチャネルから遅く放出されるしかできないため、３日間でわずか２０％の抗原が代謝された。代謝時間に伴い、キャリア表面および内部構造が変化し、マイクロカプセル内の抗原は大量に放出され、７日間で約５０％の抗原が放出される。そして、代謝速度がさらに遅くなり、１４日間代謝しても非常に強い蛍光強度を有する。図１０に示すように、依然として３５％の抗原が代謝されていない。
【００８１】
抗原の放出に伴い、マイクロカプセルを注射した後、その場滞留効果により炎症応答が引き起こされ、炎症関連細胞を動員してキャリアおよび放出された抗原を貪食する。細胞動員の現象をさらに観察するために、週齢６−８のＣ５７ＢＬ／６雌マウス（ｎ＝４，北京維通利華実験動物有限公司）の背部に実施例２のブランク密封マイクロカプセルを注入し、体内での異なる代謝時点でマウスを安楽死させる。マウス背部のマイクロカプセルが注入された部位を切開し、ピンセットで皮下におけるキャリアを包んだ局所皮下組織を取り出し、ハサミで組織を切り、４％のホルマリン溶液に２４ｈ浸漬する。次いで、パラフィンで包埋し、切片し、Ｈ＆Ｅ染色し、封じ、Ｈ＆Ｅ染色サンプルを作製し、最後に、病理学的スライスパノラマスキャンおよび分析システム（Ｖｅｃｔｒａ  ３．０，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により注射部位の炎症反応を観察する。異なる代謝時点でマウスを安楽死させる。皮下におけるキャリアを包んだ局所組織を取り出し、Ｈ＆Ｅ染色サンプルを作製し、最後に、病理学的スライスパノラマスキャンおよび分析システムにより注射部位の炎症反応を観察する。
【００８２】
図１１ａに示すように、３日目に、細胞（暗色点状物）は徐々にマイクロカプセル（浅色環状物）の周囲に動員される。分解時間の延長に伴い、マイクロスフェア周囲の細胞は増加し続き、炎症反応は強くなり、いくつかのマイクロカプセルの内部にも炎症細胞の浸潤が観察される。Ｉｎｆｏｒｍソフトウェアにより点の数およびマイクロカプセルの数を統計し、局所での各マイクロカプセルが動員した細胞数を定量的に計算する。分析した結果、図１１ｂに示すように、１４日目に各マイクロスフェアは約２０個の細胞を動員することができる。従って、全体の代謝過程に置いて、分解生成物の累積により局所炎症応答が徐々に強くなる。また、マウスを解剖しても局所組織に発赤、腫れ、肉芽および膿が発生する現象が観察されない。これは、密封マイクロカプセルにより引き起こされる炎症反応は安全である。
【００８３】
それぞれＣｙ５染料標識ＯＶＡ（Ｃｙ５−ＯＶＡ）の単一抗原群、Ｃｙ５−ＯＶＡと多孔質マイクロスフェア混合群、Ｃｙ５−ＯＶＡが密封マイクロカプセル内に充填された包埋群を設定する。それぞれ週齢６−８のＣ５７ＢＬ／６雌マウス（ｎ＝４，北京維通利華実験動物有限公司）の太ももの筋肉内に注射する。５日後、マウスを安楽死させる，局所にマイクロスフェアを含む筋肉組織を取り出し、ハサミで小さく切り、懸濁液に研磨し、４℃のＰＢＳ中で再懸濁させ、遠心分離して上清を除去する。さらに１ｍＬの混合酵素溶液（１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＤと１００Ｕ／ｍＬの組換えＤＮａｓｅ  ＩをＲＰＭＩ  １６４０培地に溶解する）を加え、３７℃で３０  ｍｉｎ反応させる。その後、ＰＢＳで洗浄し、２０μｍの細胞篩で不純物を濾過し、単細胞懸濁液を作製する。フローサイトメトリーのサンプル染色の操作手順に従って、それぞれサンプルに抗マウスＦＩＴＣ−  ＣＤ１１ｃ、ｅＦｌｏｕｒ４５０−Ｆ４／８０の蛍光抗体標識ＤＣおよびマクロファージを加える。さらにＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメトリーによりＯＶＡ＋細胞、ＣＤ１１ｃ＋ＯＶＡ＋細胞およびＦ４／８０＋ＯＶＡ＋細胞を検出し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアで分析して処理する。
【００８４】
図１２に示すように、単一抗原群（対照群）では、ＯＶＡ＋の細胞数および細胞内ＯＶＡの蛍光強度はいずれも弱く、局所の抗原が５日目にほとんど完全に代謝されたことを示している。混合群では、多孔質マイクロスフェアの滞留効果により抗原利用率が顕著に向上し、ＯＶＡ＋の細胞数が約１０倍増加し、細胞のＯＶＡに対するエンドサイトーシス量が２倍増加し、対応する抗原利用率が約２０倍増加する。包埋群では、優れた抗原滞留効果および抗原効果的放出能力により、ＯＶＡ＋の細胞数が約５０倍増加し、ＯＶＡエンドサイトーシス量が４倍以上増加し、抗原利用率が最終的に２００倍以上増加する。以上の結果から分かるように、密封マイクロカプセルは、マイクロカプセルシステム中の抗原放出および細胞動員挙動を効果的に調整し、両者を相乗作用させ、抗原の利用率を向上させることができる。抗原利用率の算式：ＯＶＡ＋細胞数×蛍光強度である。単独のＯＶＡ群の抗原利用率を用いて正規化処理を行う。この相乗作用は、より多い細胞が抗原を貪食することを促進し、細胞の抗原に対するエンドサイトーシス量を向上させ、抗原の利用率を最大限に向上できる。
【００８５】
（実施例６）抗原が充填された密封マイクロカプセルの酸性微小環境の細胞動員に対する影響。
【００８６】
ポリ乳酸マイクロカプセル分解生成物である乳酸は局所微小環境の酸化を引き起こすことがある。酸化の程度、変化および持続時間は、いずれも後続の免疫効果に影響を与える可能性がある。そのため、局所微小環境の酸化過程および変化を正確に監視する必要がある。ＳＮＡＲＦ（登録商標）−１は、ｐＨ（監視範囲６−９）感受性プローブであり、４８８ｎｍで励起され、６４０ｎｍおよび５８０ｎｍの２つの波長で受け、蛍光強度の比はＩ６４０／Ｉ５８０であり、システムのｐＨ値に対応する。この比が小さいほど、システムのｐＨが低いことを示す。従って、マイクロスフェアにＳＮＡＲＦ（登録商標）−１を搭載し、レーザ共焦点顕微鏡によりポリ乳酸マイクロカプセルの分解生成物である乳酸の局所微小環境ｐＨに対する変化をリアルタイムに監視することができる。
【００８７】
具体的な操作は以下のとおりである。雌Ｃ５７／ＢＬ６マウス（ｎ＝６）の背部にＳＮＡＲＦ（登録商標）−１が包埋された密封マイクロカプセルを皮下注射し、それぞれ３、５、７および１４日目にマウスを安楽死させる。皮下におけるマイクロスフェアを包んだ組織を取り出し、レーザ走査型共焦点顕微鏡で局所組織ｐＨの変化状況を観察する。その蛍光画像を観察し、蛍光強度比Ｉ６４０／Ｉ５８０を計算し、標準曲線に基づいて実際のｐＨ値を算出する。
【００８８】
実験により、３日間代謝した後、局所微小環境が中性から酸性に変化したことが発見された。図１３に示すように、局所ｐＨは中性の７．２から弱酸性の６．５に変化した。材料の持続的代謝に伴い、局所酸性環境のさらなる酸化が観察されず、約ｐＨ  ６．５に維持され、すなわち、通常の非多孔質ポリ乳酸類マイクロスフェアが徐々に分解することによる乳酸体積の問題が発生しなかった。通常の非多孔質ポリ乳酸類マイクロスフェアの材料の内部と外部が同時に分解する時に、内部代謝で産生する乳酸の移動がブロックされることにより累積することで、内部のｐＨが外部よりも低くなり、局所乳酸の体積を招き、ｐＨの突然低下または不安定の現象が発生しやすくなる。本発明の密封マイクロカプセルは、その独特な内部多孔質貫通構造により、上記乳酸体積および物質移動ブロックの問題を効果的に回避し、内部材料が分解して賛成した乳酸を効率的に外部と置換する。生体乳酸の代謝とポリ乳酸材料の分解による乳酸の生成が体内で動的平衡になる場合、局所のｐＨは比較的安定したレベルに維持し、局所細胞のために相対的安定した微小環境を作って機能を発揮するとともに、定常状態の局所細胞に対する影響の分析に有利である。
【００８９】
多くの生理学的炎症の状況で、炎症部位は大量の細胞を動員し、炎症部位が酸化を伴うため、酸性は細胞動員挙動に関係があるので、中性微小環境（Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，ＮＭ）および酸性微小環境（Ａｃｉｄｉｃ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，ＡＭ）の細胞動員に対する影響を主に調査する。ポリ乳酸マイクロカプセルに強塩基弱酸性塩ＮａＨＣＯ３を装填することにより、それとマイクロカプセルの分解生成物である乳酸の中和作用により局所の酸性を解消し、局所で中性微小環境を構築し、ポリ乳酸マイクロカプセルの酸性微小環境と比較する。
【００９０】
酸性環境は、細胞動員を増加し、細胞の抗原に対するエンドサイトーシスを刺激することにより抗原の利用率を向上させ、抗原放出挙動と細胞動員挙動との協働しか抗原の利用率の向上を改善することができない。例えば、抗原の利用率をさらに向上させるために、免疫細胞を抗原を大量に貪食するように刺激する有益な微小環境が必要である。従って、抗原の利用率を最大化するために、抗原放出挙動、細胞動員挙動、ＤＣ数とタイプ、エンドサイトーシスを刺激する酸性微小環境などの複数の要因の共同作用が必要である。混合群およびＮａＨＣＯ３が充填された包埋群では、上記のいずれかの要素が不可欠であり、本発明の密封マイクロカプセルしかこれらの要素を同時に作動させ、相乗的にそれぞれの機能を発揮し、抗原を最も高い効率的に利用することができない。
【００９１】
ＤＣが抗原を貪食した後、抗原が加工および処理されて抗原ペプチドになり、抗原ペプチド−主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の形でＡＰＣ表面で発現され、Ｔ細胞により識別される。しかし、ＡＰＣが抗原を貪食するだけで、外部の刺激物による刺激がない場合、ＡＰＣは共刺激分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０）を効果的に発現してＴ細胞を活性化することがない。また、多くの場合において、ＤＣが外来抗原を貪食した後、抗原に対する加工および提示は主にリソソーム経路を使用し、この過程はＭＨＣ−ＩＩ分子により制限され、主にＴ細胞体液免疫に関連する反応を媒介する。いくつかの特殊な場合には、外因性抗原は細胞質ゾル提示経路、すなわちＭＨＣ−Ｉ分子経路により提示し、細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を直接活性化し、標的細胞を直接で効果的に死滅する。従って、治療型腫瘍ワクチンにとって、腫瘍をより効果的に死滅するために、抗原をＭＨＣ−Ｉ分子としてより多く提示する必要がある。
【００９２】
酸性環境は、ＡＰＣ、特にＤＣの抗原に対するエンドサイトーシスを顕著に向上できる。しかし、ＡＰＣの活性化、抗原の提示数および経路をさらに研究する必要がある。具体的には、まずそれぞれ２０ｍＭのＮａＨＣＯ３およびＰＢＳ溶液でＯＶＡを溶解し、密封マイクロカプセルを製造し、混合方法および密封方法は抗原の充填を参照されたい。それぞれ週齢６−８の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝６，北京維通利華実験動物有限公司）の太ももの筋肉に注入し、５日目に解剖して合着マイクロカプセルを含む組織を取り出す。ハサミで粉砕し、さらに１ｍＬの混合酵素溶液（１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＤと１００Ｕ／ｍＬの組換えＤＮａｓｅ  ＩをＲＰＭＩ  １６４０培地に溶解する）を加え、３７℃で３０ｍｉｎ反応させる。さらに細胞ホモジナイザーに置いて撹拌し、単細胞懸濁液を作製し、遠心分離して上清を捨て、細胞を収集し、２０μｍの細胞篩で濾過して不純物を除去し、ハンドヘルドセルカウンターでカウントする。そしてフローサイトメトリー用抗体により染色標識を行い、それぞれＰＥ−ＣＤ１１ｃ、ＡＰＣ−ＣＤ８０、ＡＰＣ−Ｃｙ７−ＣＤ８６、ｅＦｌｏｕｒ  ４５０−ＭＨＣ−Ｉ、ＢＶ  ６５５−ＭＨＣ−ＩＩでＤＣ表面の共刺激分子および主要組織相容性複合体のマーカを標識し、活性化された局所ＤＣの比率を測定する。
【００９３】
図１４に示すように、酸性環境に置いて、ＤＣが顕著に活性化される。ＣＤ８６＋ＤＣにおいて、ＭＨＣ−Ｉ分子の発現量はＭＨＣ−ＩＩの４０倍であり、ＤＣがより多くＭＨＣ−Ｉとして抗原を提示することを示し、マイクロカプセルが抗原の交差提示を効率的に促進する能力を有することを示している。しかし、中性環境において、ＣＤ８６＋ＤＣにおけるＭＨＣ−Ｉの比率が１倍以上低下し、環境がマイクロカプセルが抗原の交差提示の促進において非常に重要な役割を果たすことを示している。
【００９４】
（実施例７）密封マイクロカプセルのＥ．Ｇ７リンパ腫固形腫瘍に基づく動物実験効果
まず、Ｅ．Ｇ７担癌マウス（北京維通利華実験動物有限公司）を構築し、１＊１０６のＥ．Ｇ７腫瘍細胞（ＡＴＣＣ）を週齢６−８の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腋下に注入し、そして担癌マウスを６匹／群でランダムに分け、４日目に腫瘍体積が５０−６０  ｍｍ３に達した時にワクチンを接種する。ワクチンの群別は以下のように設定する。ＰＢＳ、ＯＶＡ低用量複数回（２０μｇ；７ｄ、１４ｄにそれぞれ単回免疫増強）、ＯＶＡ高用量単回（６０μｇ）、多孔質マイクロスフェアとＯＶＡの混合（３ｍｇマイクロスフェア、６０μｇ  ＯＶＡ）、ＯＶＡが充填された密封マイクロカプセル群（製造方法は実施例２を参照）（３ｍｇマイクロスフェア、６０μｇ  ＯＶＡ）、ＯＶＡが包埋されＭＰＬＡが充填された密封マイクロスフェア群（製造方法は実施例３を参照）（３ｍｇマイクロスフェア、６０μｇ  ＯＶＡ、３μｇ  ＭＰＬＡ）。腫瘍モデルを構築した日から、隔日にマウスの毛、体重および生存状況を観察し、ノギスで腫瘍の長さおよび幅を測定し、以下の算式により腫瘍体積を計算する。Ｖ＝１／２×Ｌ×Ｗ２（Ｌ：長さ；Ｗ：幅）。
【００９５】
図１５の腫瘍増殖曲線に示すように、単一抗原群において、低用量複数回群および高用量単回群は、いずれも腫瘍増殖を抑制しにくく、２５日の生存率（ＳＲ）はわずか１７％である。混合群では、マイクロスフェアのアジュバント効果下で生存率を５０％に向上させるが、腫瘍の初期での増殖が比較的速い。包埋群の腫瘍は、初期から顕著に抑制され、増殖速度が遅く、マウスの２５日の生存率は１００％に達する。マイクロカプセルシステムは、抗原のみを使用し、他の分子アジュバントを添加しない場合、腫瘍抗原の十分利用により比較的良い治療効果が得られる。合着マイクロカプセルの材料に微量のアジュバントＭＰＬＡ（３μｇ）が装填された場合、生存率が１００％であるとともに、担癌マウスの腫瘍増殖もより顕著に抑制され、２６日目に５０％のマウスの腫瘍体積が基本的に治療初期とは変わらず、６０％以上のマウスの生存期間は４０日間を超え、マイクロスフェアシステムとＭＰＬＡシステムの適合性が腫瘍抑制を増強できる効果をさらに実証している。
【００９６】
（実施例８）密封マイクロカプセルのＢ１６黒色腫固形腫瘍に基づく動物実験の効果
まず、Ｂ１６担癌マウス（北京維通利華実験動物有限公司）を構築し、５＊１０５  Ｂ１６黒色腫細胞（吉林大学により提供）を週齢６−８の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腋下に注入し、そして担癌マウスを６匹／群でランダムに分け、４日目に腫瘍面積が１０ｍｍ２を超えた時にワクチンを接種する。群別は以下のように設置する。ＰＢＳ群、ＭＵＣ１ペプチドセグメント群（５０μｇ）、密封マイクロカプセルにＭＵＣ１ペプチドセグメントが充填された包埋群（マイクロスフェア３ｍｇ、ペプチドセグメント５０μｇ）、ＭＵＣ１が包埋されＭＰＬＡが充填された密封マイクロカプセル群（マイクロスフェア３ｍｇ、ペプチドセグメント６０μｇ、ＭＰＬＡ  ３μｇ）。腫瘍モデルを構築した日から、隔日にマウスの毛、体重および生存状況を観察し、ノギスで腫瘍の長さおよび幅を測定し、以下の算式により腫瘍体積を計算する。Ｖ＝１／２×Ｌ×Ｗ２（Ｌ：長さ；Ｗ：幅）。
【００９７】
図１６の腫瘍増殖曲線に示すように、ＰＢＳおよび高用量単回群はいずれも黒色腫の増殖を効果的に抑制することができない。密封マイクロスフェアは、腫瘍の増殖を顕著に抑制することができ、３３％のマウス腫瘍体積は５００ｍｍ３未満であり、２２日間内の生存率は１００％である。ＭＰＬＡが充填された密封マイクロスフェアは最適な抗腫瘍効果を示し、２２日目に５０％のマウスの腫瘍はほとんど増殖せず、個別のマウスの黒色腫は消える。
【００９８】
（実施例９）密封マイクロカプセルのＢ１６黒色腫転移性腫瘍に基づく動物実験の効果
まず、Ｂ１６転移性モデルマウス（北京維通利華実験動物有限公司）を構築し、２＊１０５のＢ１６黒色腫細胞（吉林大学により提供）を週齢６−８の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に注入し、そして、マウスを６匹／群でランダムに分け、４日目にワクチンを接種する。具体的な免疫計画は実施例８に一致する。接種した後の１８日目に、各群ではそれぞれ２匹のマウスを安楽死させ、臓器中の肺、腎臓の黒色腫の転移状況を観察し、臓器中の転移巣をカウントして統計する。
【００９９】
図１７に示すように、ＰＢＳ群では、肺部に大量の黒色腫転移が発生し、カウントした結果、各マウスの肺部には約１００個の転移巣が分布し、腎臓組織には総体積が１００ｍｍ３の転移巣が成長し、黒色腫転移モデルの構築が成功したことを示している。ワクチン免疫の１８日後に、密封マイクロスフェア群のマウスを解剖した結果、ＰＢＳ群に比べ、肺部転移巣が１００個から１５−２０まで減少し、腎臓腫瘍の体積が１００ｍｍ３から１０ｍｍ３まで減少する。密封マイクロスフェアにＭＰＬＡを添加した後、抗腫瘍転移効果がさらに向上し、肺部には顕著な転移巣がほとんどなく、腎臓にも腫瘍増殖がないため、マイクロカプセルシステムとＴＬＲ受容体アゴニストとの併用により最適な抗腫瘍転移効果が得られる。
【０１００】
（実施例１０）腫瘍新生抗原が充填された密封マイクロカプセルの４Ｔ１乳がんに基づく動物実験の効果
選ばれた腫瘍新生抗原は８種類のポリペプチドを等比率で組み合わせたものであり（上記８種類のポリペプチドのアミノ酸配列はそれぞれＳＰＮＲＳＷＶＳＬ、ＨＰＭＹＬＦＬＳＭ、ＶＡＶＫＶＮＦＹＶＩ、ＫＡＰＨＮＦＱＦＶ、ＹＨＹＶＬＮＳＭＶ、ＥＹＳＡＭＴＴＲＧＴＩ、ＧＳＰＰＲＦＦＹＭおよびＣＰＱＴＨＡＶＶＬである）、このポリペプチドの製造過程は以下のとおりである。４Ｔ１腫瘍細胞系および正常Ｂａｌｂ／ｃマウス組織（国家生化工程重点実験室により提供）を比較してシーケンシングすることにより腫瘍変異遺伝子を選別し、そしてコンピューターアルゴリズムにより変異ポリペプチドを予測し（深セン裕策生物科技公司）、さらにポリペプチド合成を行う（金斯瑞生物科技公司）。
【０１０１】
ＡＳ０４アジュバント群の製造方法は以下のとおりである。まず、ＭＰＬＡを０．５％のトリエタノールアミン溶液に溶解し、次で６５℃に加熱して５ｍｉｎ保持して溶解を促進し、その後、超音波プローブを用いて６０Ｗの電力で１ｍｉｎかけて３回超音波処理し、完全に溶解した後、ＨＣｌによりｐＨを約７．４に調節する。次いで、ＭＰＬＡ水溶液とアルミニウムアジュバントとを混合し、３０ｓ超音波処理し、本発明の腫瘍新生抗原を加えて均一に混合し、各マウスワクチンの各群の用量をＭＰＬＡ（３μｇ）に確保し、アルミニウムアジュバント（１００μｇ）および腫瘍新生抗原２００μｇを１００μＬ生理食塩水溶液に溶解する。
【０１０２】
ここで、腫瘍新生抗原が包埋されＭＰＬＡが充填された密封マイクロカプセル群の製造方法は本発明の実施例３を参照されたい。
【０１０３】
４Ｔ１上皮内がんモデルマウス（北京維通利華実験動物有限公司）を構築し、５＊１０５  ４Ｔ１乳がん細胞（ＡＴＣＣ）を週齢６−８の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの右下乳腺脂肪パットに注入し、そして、マウスを６匹／群でランダムに分け、４日目にワクチンを接種する。
【０１０４】
群別を以下のように設置する。ＰＢＳ群、単一腫瘍新生抗原群（２００μｇ）、腫瘍新生抗原が充填されたＡＳ０４アジュバント群（アルミニウムアジュバント１００μｇ、腫瘍新生抗原２００μｇ、ＭＰＬＡ  ３μｇ）、腫瘍新生抗原が包埋されＭＰＬＡが充填された密封マイクロカプセル群（マイクロスフェア３ｍｇ、腫瘍新生抗原２００μｇ、ＭＰＬＡ  ３μｇ）。
【０１０５】
腫瘍モデルを構築した日から、隔日にマウスの毛、体重および生存状況を観察し、ノギスで腫瘍の長さおよび幅を測定し、以下の算式により腫瘍体積を計算する。Ｖ＝１／２×Ｌ×Ｗ２（Ｌ：長さ；Ｗ：幅）。
【０１０６】
図１８の腫瘍増殖曲線に示すように、ＰＢＳおよび単一腫瘍新生抗原群はいずれも乳がんの増殖を効果的に抑制することができない。ＡＳ０４アジュバント群は腫瘍増殖に対してある程度の抑制作用を有し、比較的顕著な腫瘍遅延増殖を示す。比較すると、密封マイクロカプセル群の抗腫瘍効果は最も高く、２８日目に８３％のマウスにおける腫瘍体積が５００ｍｍ３未満である。
【０１０７】
（実施例１１）腫瘍新生抗原が充填された密封マイクロカプセルの４Ｔ１乳がん術後再発に基づく動物実験の効果
４Ｔ１−ｌｕｃ乳がん術後再発モデルマウス（北京維通利華実験動物有限公司）を構築し、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ルシフェラーゼ）がトランスフェクションされた５＊１０５  ４Ｔ１−ｌｕｃ乳がん細胞（ＡＴＣＣ）を週齢６−８の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの右下乳腺脂肪パットに注入し、腫瘍が２００ｍｍ３まで増殖した後、マウスに対して腫瘍切除手術を行い、生物発光イメージングにより残った腫瘍組織のサイズをほぼ同じであるように制御し、マウスを６匹／群でランダムに分け、２日目にワクチン免疫を行う。
【０１０８】
具体的な免疫計画は実施例１０に一致する。  腫瘍モデルを構築した日から、隔日にマウスの毛、体重および生存状況を観察し、生物発光イメージングにより腫瘍再発状況を監視し、ノギスで腫瘍の長さおよび幅を測定し、以下の算式により腫瘍体積を計算する。Ｖ＝１／２×Ｌ×Ｗ２（Ｌ：長さ；Ｗ：幅）。
【０１０９】
図１９の腫瘍増殖曲線に示すように、ＰＢＳおよび単一腫瘍新生抗原群はいずれも乳がんの術後再発を効果的に抑制することができず、全てのマウスには腫瘍再発が発生し、腫瘍進展が比較的大きく、迅速に死亡した。ＡＳ０４アジュバント群は一部のマウスの腫瘍再発を防止し、１３％のマウスが２２日目に腫瘍増殖が観察されないが、長期の監視中で死亡した。密封マイクロスフェア群は最適な術後の再発防止効果を示し、２２日目に１匹のマウスしか腫瘍再発が発生せず、８３％のマウスはいずれも腫瘍再発がない。図２０の生物発光イメージング画像および統計図に示すように、手術で切除した後、腫瘍病巣の残留体積が近く、後続の異なる治療された後、腫瘍再発は顕著に異なる。密封マイクロスフェア群は、１４日目に生物発光イメージングにより何らの腫瘍病巣も観察されず、他の群は全部または一部に腫瘍再発がある。
【０１１０】
（実施例１２）ケモカインが充填された密封マイクロカプセルの細胞動員効果の比較
週齢６−８の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４，北京維通利華実験動物有限公司）の背部にそれぞれ３ｍｇマイクロスフェアのブランク密封マイクロカプセルおよび７μｇケモカインＧＭ−ＣＳＦが充填された密封マイクロカプセルを注入し、体内で５日間代謝５した後、マウスを安楽死させる。マウスの背部におけるマイクロカプセルが注入された部位を切開し、ピンセットでキャリアを包んだ局所皮下組織を取り出し、ハサミで組織を切り出し、４％のホルマリン溶液に２４ｈ浸漬する。次にパラフィン包埋、切片、Ｈ＆Ｅ染色およびブロックを行い、Ｈ＆Ｅ染色サンプルを作製し、最後に病理学的スライスパノラマスキャンおよび分析システム（Ｖｅｃｔｒａ  ３．０，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により注射部位の炎症反応を観察する。
【０１１１】
図２１に示すように、５日間体内代謝した後、少量の炎症細胞（黒色点状物）のみがブランクマイクロスフェア（浅色円状物）の周囲に動員される。ケモカインＧＭ−ＣＳＦが充填されたマイクロカプセルは、より多い細胞を材料の周囲に動員することができ、上記ケモカインＧＭ−ＣＳＦが充填されたマイクロカプセルから放出された抗原がより多く細胞により貪食され、抗原提示の効率および最終的な免疫効果を増強できることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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