(57)【要約】  本発明は、紫外線で硬化することにより、特にピリミジンヌクレオチドを架橋することにより、核酸ナノ構造体を安定化するための新規方法に関する。
2021526376.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然に存在しない核酸ナノ構造体の安定性を高める方法であって、前記ナノ構造体は、１つ以上の相補的核酸配列上に存在する少なくとも２つの非隣接配列ストレッチに結合する少なくとも１つの１本鎖核酸配列を含み、前記方法は、前記核酸ナノ構造体を紫外線照射に曝露する工程を特徴とし、前記核酸ナノ構造体を紫外線照射に曝露する前記工程は、２つのピリミジンヌクレオチド間の少なくとも１つの化学的結合の形成をもたらし、２つのピリミジンヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、２重らせん部分構造に含まれる相補的ヌクレオチド対の一部ではない、前記方法。
【請求項２】
天然に存在しない核酸ナノ構造体の安定性を高める方法であって、前記ナノ構造体は、１つ以上の相補的核酸配列上に存在する少なくとも２つの非隣接配列ストレッチに結合する少なくとも１つの１本鎖核酸配列を含み、前記方法は前記核酸ナノ構造体を紫外線照射に曝露する工程によって特徴付けられる、前記方法。
【請求項３】
天然に存在しない核酸ナノ構造体の安定性を高める方法であって、前記ナノ構造体は、少なくとも２つの２重らせん部分構造を含み、前記方法は前記核酸ナノ構造体を紫外線照射に曝露する工程によって特徴付けられる、前記方法。
【請求項４】
複数の２重らせん部分構造を含む天然に存在しない核酸ナノ構造体の安定性を高める方法であって、前記ナノ構造体は、少なくとも２つの異なる２重らせん部分構造の一部である少なくとも１つの１本鎖核酸配列を含み、ここで前記方法は前記核酸ナノ構造体を紫外線照射に曝露する工程を特徴とする、前記方法。
【請求項５】
前記天然に存在しない核酸ナノ構造体が、２重らせん部分構造の２次元又は３次元配置のいずれかを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記天然に存在しない核酸ナノ構造体は、前記２重らせん部分構造がそれぞれ１０〜５０００の相補的ヌクレオチド対からなり、前記２重らせん部分構造が、７、８、又は９塩基ごとに、隣接する２重らせん部分構造に接続することができ、前記２重らせん部分構造を形成する１本鎖オリゴヌクレオチドの１つ以上が、同じ又は少なくとも２つの異なる２重らせん部分構造の一部である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記２重らせん部分構造間の接続は、ハニカム、方形形、又は六角形のパッキング形状、又はこれらの組み合わせをもたらす、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記２重らせん部分構造を形成する１本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも８５％は、少なくとも２つの異なる２重らせん部分構造の一部である、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸ナノ構造体を紫外線照射に曝露する前記工程は、２つのピリミジンヌクレオチド間に少なくとも１つの化学結合の形成をもたらす、請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記２つのピリミジンヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、２重らせん部分構造に含まれる相補的ヌクレオチド対の一部ではない、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法であって、前記核酸ナノ構造体は、少なくとも第１の１本鎖ポリヌクレオチドの１つ以上のコピー、及び第２の１本鎖ポリヌクレオチドのセットを含み、第２の１本鎖ポリヌクレオチドのそれぞれは、ｎ個のコア配列からなるｎ特異的配列からなり、ｎは１〜４０の範囲から独立して選択される整数であり、前記ｎ個のコア配列のそれぞれは、（ｉ）前記第１の１本鎖ポリヌクレオチド上の領域に相補的な配列であって、ｎ番目のコア配列に相補的である前記第１の１本鎖ポリヌクレオチド上の領域は、（ｎ−１）番目及び（ｎ＋１）番目のコア配列に相補的な前記第１の１本鎖ポリヌクレオチド上の領域と隣接していない配列と、（ｉｉ）３’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰmと、（ｉｉｉ）５’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰmと、及び（ｉｖ）任意選択的に、ピリミジンヌクレオチドストレッチＰmの１つ以上の挿入とからなり、ここで各ｍは０〜４０の範囲から独立して選択される整数であり、各Ｐはチミジン及びシトシン残基から独立して選択される、上記方法。
【請求項１２】
前記第１の１本鎖ポリヌクレオチドが少なくとも１００個のヌクレオチドを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の１本鎖ポリヌクレオチドが、繊維状バクテリオファージのＤＮＡに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記繊維状バクテリオファージがＭ１３、特にＭ１３ｍｐ１８である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法であって、前記核酸ナノ構造体は１本鎖オリゴヌクレオチドのセットを含み、ここで前記１本鎖ポリヌクレオチドのそれぞれは、ｎ個のコア配列からなるｎ特異的配列からなり、ｎは１〜４０の範囲から独立して選択される整数であり、前記ｎ個のコア配列のそれぞれは、（ｉ）前記セットの１本鎖ポリヌクレオチドの別のメンバーの配列に相補的な配列であって、ｎ番目のコア配列に相補的な前記別のメンバー上の領域は、（ｎ−１）番目及び（ｎ＋１）番目のコア配列に相補的な領域と隣接していない配列と、（ｉｉ）３’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰmと、（ｉｉｉ）５’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰmと、及び（ｉｖ）任意選択的に、ピリミジンヌクレオチドストレッチＰmの１つ以上の挿入とからなり、ここで各ｍは０〜４０の範囲から独立して選択される整数であり、各Ｐはチミジン及びシトシン残基から独立して選択される、上記方法。
【請求項１６】
３’末端及び５’末端の前記ピリミジンヌクレオチドストレッチのそれぞれについて、ｍは０又は１のいずれかであり、Ｐはチミジン残基である、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記コア配列のそれぞれはｘ個のヌクレオチドからなり、ｘは７、８、又は１６の倍数である整数から独立して選択される、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記紫外線照射は、２５０ｎｍ〜３５０ｎｍの範囲の波長の紫外線を用いて行われる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法であって、前記紫外線照射は、以下のパラメータ（約５〜２，０００μｌの試料の容積、試料中の約１〜５００ｎＭの核酸ナノ構造体の濃度）を使用して、約０〜約２５の温度範囲で、トリス緩衝液中で、光線を試料に連結させるための液体ガイドを使用して（試料の溶液表面と光ガイドの末端間の距離は約５ｃｍ未満）キセノン光源（Asahi SpectraのMAX303）を用いて（試料の溶液表面と光ガイドの末端間の距離は約５ｃｍ未満）、試料を約１〜１０ｍＷ／ｃｍ2の紫外線強度で約１〜６時間、紫外線照射に曝露することにより行われる、上記方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法であって、前記核酸ナノ構造体を紫外線照射に曝露する前記工程は、安定状態に到達するために同一条件下で処理された実施例２の基準ＤＮＡナノ構造体に必要な期間実行され、ここで前記安定性は、実施例２に記載のようなゲル電気泳動アッセイにおいて特定され、ここで前記基準ＤＮＡナノ構造体は、（ｉ）未処理のままで、２５℃で５ｍＭトリス、５ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2の基準条件下で、及び（ｉｉ）紫外線処理後、必要な目標条件で、特に高温で、特に９０℃で、純水中、生理学的条件下、又は真空中で、インキュベートされ、ここで、基準ＤＮＡナノ構造体のバンドが基準条件下と同じ電気泳動移動度を示すとすぐに、安定状態に到達する、上記方法。
【請求項２１】
少なくとも第１の１本鎖ポリヌクレオチドの１つ以上のコピーと、１本鎖ポリヌクレオチドのセットとを含む核酸ナノ構造体の作成のためのキットであって、ここで１本鎖ポリヌクレオチドのそれぞれはｎ個のコア配列からなるｎ特異的配列からなり、ｎは１〜４０の範囲から独立して選択される整数であり、ここで前記ｎ個のコア配列のそれぞれは、（ｉ）前記第１の１本鎖ポリヌクレオチド上の領域に相補的な配列であって、ｎ番目のコア配列に相補的な領域が、（ｎ−１）番目と（ｎ＋１）番目のコア配列に相補的な領域と隣接していない上記配列、（ｉｉ）３’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰm、（ｉｉｉ）５’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰm、及び（ｉｖ）任意選択的に、ピリミジンヌクレオチドストレッチＰmの１つ以上の挿入、からなり、ここで各ｍは０〜４０の範囲から独立して選択される整数であり、各Ｐはチミジン及びシトシン残基から独立して選択される、上記キット。
【請求項２２】
１本鎖オリゴヌクレオチドのセットを含む核酸ナノ構造体を作成するためのキットであって、ここで１本鎖ポリヌクレオチドのそれぞれは、ｎ個のコア配列からなるｎ特異的配列からなり、ｎは１〜４０の範囲から独立して選択される整数であり、ここで前記ｎ個のコア配列のそれぞれは、（ｉ）１本鎖ポリヌクレオチドの前記セットの別のメンバーの配列に相補的な配列であって、ｎ番目のコア配列に相補的な前記別のメンバー上の領域が、（ｎ−１）番目と（ｎ＋１）番目のコア配列に相補的な領域と隣接していない上記配列、（ｉｉ）３’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰm、（ｉｉｉ）５’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰm、及び（ｉｖ）任意選択的に、ピリミジンヌクレオチドストレッチＰmの１つ以上の挿入、からなり、ここで各ｍは０〜４０の範囲から独立して選択される整数であり、各Ｐはチミジン及びシトシン残基から独立して選択される、上記キット。
【請求項２３】
３’末端及び５’末端の前記ピリミジンヌクレオチドのストレッチＰmのそれぞれについて、ｍが０又は１であり、Ｐがチミジン残基である、請求項２１又は２２に記載のキット。
【請求項２４】
少なくとも第１の１本鎖ポリヌクレオチドの１つ以上のコピーと、１本鎖ポリヌクレオチドのセットとを含む核酸ナノ構造体であって、１本鎖ポリヌクレオチドのそれぞれはｎ個のコア配列からなるｎ特異的配列からなり、ｎは１〜４０の範囲から選択される整数であり、前記ｎ個のコア配列のそれぞれは、（ｉ）前記第１の１本鎖ポリヌクレオチド上の領域に相補的な配列であって、ｎ番目のコア配列に相補的な領域が、（ｎ−１）番目と（ｎ＋１）番目のコア配列に相補的な領域と隣接していない上記配列、（ｉｉ）３’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰm、（ｉｉｉ）５’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰm、及び（ｉｖ）任意選択的に、ピリミジンヌクレオチドストレッチＰmの１つ以上の挿入、からなり、ここで各ｍは０〜４０の範囲から独立して選択される整数であり、各Ｐはチミジン及びシトシン残基から独立して選択される、上記核酸ナノ構造体。
【請求項２５】
１本鎖オリゴヌクレオチドのセットを含む核酸ナノ構造体であって、１本鎖ポリヌクレオチドのそれぞれはｎ個のコア配列からなるｎ特異的配列からなり、ｎは、１〜４０の範囲から独立して選択され、前記ｎ個のコア配列のそれぞれは、（ｉ）１本鎖ポリヌクレオチドの前記セットの別のメンバーの配列に相補的な配列であって、ｎ番目のコア配列に相補的な前記別のメンバー上の領域が、（ｎ−１）番目と（ｎ＋１）番目のコア配列に相補的な領域と隣接していない上記配列、（ｉｉ）３’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰm、（ｉｉｉ）５’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰm、及び（ｉｖ）任意選択的に、ピリミジンヌクレオチドストレッチＰmの１つ以上の挿入、からなり、ここで各ｍは０〜４０の範囲から独立して選択される整数であり、各Ｐはチミジン及びシトシン残基から独立して選択される、上記核酸ナノ構造体。
【請求項２６】
３’末端及び５’末端の前記ピリミジンヌクレオチドＰmのそれぞれについて、ｍは０又は１のいずれかであり、Ｐはチミジン残基である、請求項２４又は２５に記載の核酸ナノ構造体。
【請求項２７】
空間的に隣接するチミジン及び／又はシトシン残基間に１つ以上の紫外線誘導ブリッジを含む、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の核酸ナノ構造体。
【請求項２８】
前記１つ以上のブリッジが、シクロブタンピリミジンダイマー及び（６，４）ピリミジン−ピリミドンから選択されるピリミジンダイマーを含む、請求項２７に記載の核酸ナノ構造体。
【請求項２９】
前記１つ以上のブリッジが、１本鎖オリゴヌクレオチド又はコア配列の３’末端、１本鎖オリゴヌクレオチド又はコア配列の５’末端にあるＰmストレッチに含まれるチミジン及び／又はシトシン残基の間、及び／又は前記任意のＰm挿入物のうちの１つのチミジンにある、請求項２７又は２８に記載の核酸ナノ構造体。
【請求項３０】
請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の核酸ナノ構造体であって、前記ブリッジのうちの１つ以上が、２つの隣接する１本鎖オリゴヌクレオチド、又は前記核酸ナノ構造体の同じ又は異なる２重らせん部分構造の一部であるコア配列の、３’及び５’末端のチミジン又はシトシン残基間のらせん内ブリッジである、前記核酸ナノ構造体。
【請求項３１】
請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の核酸ナノ構造体であって、前記ブリッジのうちの１つ以上が、１本鎖オリゴヌクレオチド又は前記核酸ナノ構造体の同じ又は異なる２重らせん部分構造の一部であるかかる１本鎖オリゴヌクレオチドの一部に含まれるチミジン又はシトシン残基の間、特に任意挿入物のうちの２つに含まれる２つのチミジン残基の間のらせん間ブリッジである、前記核酸ナノ構造体。
【請求項３２】
請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の核酸ナノ構造体であって、架橋は、ポリヌクレオチドＡの３’末端からポリヌクレオチドＢの５’末端、ポリヌクレオチドＡの３’末端からポリヌクレオチドＢの３’末端、ポリヌクレオチドＡの５’末端からポリヌクレオチドＢの５’末端、ポリヌクレオチドＡの３’末端からポリヌクレオチドＢのコア配列中の挿入部、ポリヌクレオチドＡの５’末端からポリヌクレオチドＢのコア配列の挿入部、及びポリヌクレオチドＡのコア配列の挿入部からポリヌクレオチドＢのコア配列の挿入部のリストから選択される、上記核酸ナノ構造体。
【請求項３３】
請求項２７〜３２のいずれか１項に記載の２つ以上の核酸ナノ構造体の集成から生じる複雑な核酸ナノ構造体。
【請求項３４】
前記集成体が、請求項２７〜３２のいずれか１項に記載の前記核酸ナノ構造体の２つ以上の間に１つ以上の紫外線誘導ブリッジを含む、請求項３３に記載の複雑な核酸ナノ構造体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、紫外線で硬化することにより、特にピリミジンヌクレオチドを架橋することにより、核酸ナノ構造体を安定化するための新規方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、核酸ナノ構造体を安定化するための新規な方法に関し、この方法は、有利な特性、特に高い構造安定性を有するナノ構造体をもたらす。
【０００３】
ＤＮＡナノテクノロジー1-4は、サブナノメートルの正確な形状及びナノメートルからマイクロメートルスケール5-16までの範囲の全体寸法を有し、ギガダルトンスケール17,18までの分子量を有する個別の３次元（３Ｄ）対象物のボトムアップ自己集成を可能にする。得られる対象物は、部位特異的に官能化され、化学基及び生体分子で修飾し得19-21、また機械のような挙動をもたらすメカニズムを含む可能性のある対象物を構築することができる22-24。カスタムＤＮＡ対象物が開発されて、基礎研究の多様な用途でうまく使用されているため、新しい科学的知見が得られ、有用性のある対象物を与えるＤＮＡナノテクノロジーの能力の基礎となっている。例は、構造生物学25-27、生物物理学28-33、光工学34-37、プラズモン学38-42から、分子エレクトロニクス19,43-45にまで及ぶ。医療におけるプログラム可能な薬剤として、設計されたＤＮＡ対象物の使用を探求するための第１歩は開始された24,46。１本鎖ＤＮＡを生成するためのスケールアップ可能なバイオテクノロジーアプローチは、材料や医療用途に必要な量のＤＮＡ対象物を製造する道を切り開くのに役立つ47。様々な状況での用途を見つけるに、設計されたＤＮＡ対象物は、所望の適用効果を達成できるように、目的の条件で十分な時間安定している必要がある。一般に、生理学的流体中、他の溶媒中、空気中、又は真空中、及び５０℃を超える高温での、低イオン強度溶液の適用は不可能である。従って研究者たちは、設計されたＤＮＡ対象物が安定なまま維持される条件の範囲を拡張する方法を模索してきた。化学結合48,49又は酵素的結合50を介して、対応して修飾された鎖末端間の構造例に、追加の共有結合が導入されている。ＤＮＡナノ構造体はまた、８−メトキシソラレン62又はオリゴリジン及びオリゴリジン−ＰＥＧコポリマー51,52などの補助因子を添加することによって、さらに安定化することもできる。これらの進歩にもかかわらず、高価な化学修飾された鎖又は補助因子の添加を必要としない、ＤＮＡナノ構造体の共有結合安定化のための補完的で一般的に適用可能なアプローチを確立することが、依然として望まれている。ＤＮＡナノ構造体のユーザーが規定した部位に追加の共有接続を作成できる可能性は、より広範囲の環境条件で使用するために、構造全体又はその一部を合理的に安定化することを可能にするであろう。さらに、メカニズムや高次集成体でコンフォメーション状態を安定して捕捉できる可能性がある。ここでは、ＤＮＡナノ構造体に追加の共有結合を部位選択的に導入するための一般的でスケールアップ可能な方法を紹介する。標的結合部位は、ＤＮＡ鎖の配列のみで指定され、化学修飾の導入を必要としない。我々の方法は、一般に多様な範囲のＤＮＡナノ構造体に適用可能であり、これは、ＤＮＡ鎖が固相化学合成によって生成されたか又はバイオテクノロジープロセスを使用して生成されたかに関係なく機能する47。
【０００４】
様々な状況での用途を見つけるに、設計されたＤＮＡ対象物は、所望の適用効果を達成できるように、目的の条件で十分な時間安定している必要がある。一般に、生理学的流体中、他の溶媒中、空気中、又は真空中、及び５０℃を超える高温での、低イオン強度溶液の適用は不可能である。従って研究者たちは、設計されたＤＮＡ対象物が安定なまま維持される条件の範囲を拡張する方法を模索してきた。化学結合48,49又は酵素的結合50を介して、対応して修飾された鎖末端間の構造例に、追加の共有結合が導入されている。ＤＮＡナノ構造体はまた、オリゴリジン及びオリゴリジン−ＰＥＧコポリマー51,52などの補助因子を添加することによって、さらに安定化することもできる。これらの進歩にもかかわらず、高価な化学修飾された鎖又は補助因子の添加を必要としない、ＤＮＡナノ構造体の共有結合安定化のための補完的で一般的に適用可能なアプローチを確立することが、依然として望まれている。ＤＮＡナノ構造体のユーザーが規定した部位に追加の共有接続を作成できる可能性は、より広範囲の環境条件で使用するために、構造全体又はその一部を合理的に安定化することを可能にするであろう。さらに、メカニズムや高次集成体でコンフォメーション状態を安定して捕捉できる可能性がある。ここでは、ＤＮＡナノ構造体に追加の共有結合を部位選択的に導入するための一般的でスケールアップ可能な方法を紹介する。標的結合部位は、ＤＮＡ鎖の配列のみで指定され、化学修飾の導入を必要としない。我々の方法は、一般に多様な範囲のＤＮＡナノ構造体に適用可能であり、これは、ＤＮＡ鎖が固相化学合成によって生成されたか又はバイオテクノロジープロセスを使用して生成されたかに関係なく機能する47。
【０００５】
すなわち、核酸ナノ構造体の安定性を高めるという問題に取り組むためにすでに多くの試みがなされてきたという事実にもかかわらず、安定性が増した構築物の形成をもたらす新規アプローチを開発するという大きな満たされていないニーズが依然として存在する。
【０００６】
本発明によって提供されたこの問題の解決策、すなわちピリミジンヌクレオチドの紫外線誘発架橋による核酸ナノ構造体の硬化は、これまでのところ先行技術によって達成も示唆もされていない。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、紫外線を用いて硬化することにより、特にピリミジンヌクレオチドを架橋することにより、核酸ナノ構造体を安定化するための新規な方法に関する。
【０００８】
すなわち第１の態様において、本発明は、天然に存在しない核酸ナノ構造体の安定性を高める方法に関し、ここで前記ナノ構造体は、１つ以上の相補的核酸配列上に存在する少なくとも２つの非隣接配列ストレッチに結合する少なくとも１つの１本鎖核酸配列を含み、ここで前記方法は、前記核酸ナノ構造体を紫外線照射に曝露する工程を特徴とし、ここで前記核酸ナノ構造体を紫外線照射に曝露する前記工程は、２つのピリミジンヌクレオチド間の少なくとも１つの化学的結合の形成をもたらし、ここで２つのピリミジンヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、２重らせん部分構造に含まれる相補的ヌクレオチド対の一部ではない。
【０００９】
第２の態様において、本発明は、天然に存在しない核酸ナノ構造体の安定性を高める方法に関し、ここで前記ナノ構造体は、１つ以上の相補的核酸配列上に存在する少なくとも２つの非隣接配列ストレッチに結合する少なくとも１つの１本鎖核酸配列を含み、ここで前記方法は、前記核酸ナノ構造体を紫外線照射に曝露する工程によって特徴付けられる。
【００１０】
第３の態様において、本発明は天然に存在しない核酸ナノ構造体の安定性を高める方法に関し、ここで前記ナノ構造体は少なくとも２つの２重らせん部分構造を含み、ここで前記方法は、前記核酸ナノ構造体を紫外線照射に曝露する工程によって特徴付けられる。
【００１１】
第４の態様において、本発明は、複数の２重らせん部分構造を含む天然に存在しない核酸ナノ構造体の安定性を高める方法に関し、ここで前記ナノ構造体は、少なくとも２つの異なる２重らせん部分構造の一部である少なくとも１つの１本鎖核酸配列を含み、ここで前記方法は、前記核酸ナノ構造体を紫外線照射に曝露する工程を特徴とする。
【００１２】
第５の態様において、本発明は、少なくとも第１の１本鎖ポリヌクレオチドの１つ以上のコピーと、１本鎖ポリヌクレオチドのセットとを含む核酸ナノ構造体の作成のためのキットに関し、ここで１本鎖ポリヌクレオチドのそれぞれはｎ個のコア配列からなるｎ特異的配列からなり、ｎは１〜４０の範囲から独立して選択される整数であり、ここで前記ｎ個のコア配列のそれぞれは、（ｉ）前記第１の１本鎖ポリヌクレオチド上の領域に相補的な配列であって、ｎ番目のコア配列に相補的な領域が、（ｎ−１）番目と（ｎ＋１）番目のコア配列に相補的な領域と隣接していない上記配列、（ｉｉ）３’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰm、（ｉｉｉ）５’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰm、及び（ｉｖ）任意選択的に、ピリミジンヌクレオチドストレッチＰmの１つ以上の挿入、からなり、ここで各ｍは０〜４０の範囲から独立して選択される整数であり、各Ｐはチミジン及びシトシン残基から独立して選択される。
【００１３】
第６の態様において、本発明は、１本鎖オリゴヌクレオチドのセットを含む核酸ナノ構造体を作成するためのキットに関し、ここで１本鎖ポリヌクレオチドのそれぞれは、ｎ個のコア配列からなるｎ特異的配列からなり、ｎは１〜４０の範囲から独立して選択される整数であり、ここで前記ｎ個のコア配列のそれぞれは、（ｉ）１本鎖ポリヌクレオチドの前記セットの別のメンバーの配列に相補的な配列であって、ｎ番目のコア配列に相補的な前記別のメンバー上の領域が、（ｎ−１）番目と（ｎ＋１）番目のコア配列に相補的な領域と隣接していない上記配列、（ｉｉ）３’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰm、（ｉｉｉ）５’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰm、及び（ｉｖ）任意選択的に、ピリミジンヌクレオチドストレッチＰmの１つ以上の挿入、からなり、ここで各ｍは０〜４０の範囲から独立して選択される整数であり、各Ｐはチミジン及びシトシン残基から独立して選択される。
【００１４】
第７の態様において、本発明は、少なくとも第１の１本鎖ポリヌクレオチドの１つ以上のコピーと、１本鎖ポリヌクレオチドのセットとを含む核酸ナノ構造体に関し、ここで１本鎖ポリヌクレオチドのそれぞれはｎ個のコア配列からなるｎ特異的配列からなり、ｎは１〜４０の範囲から選択される整数であり、前記ｎ個のコア配列のそれぞれは、（ｉ）前記第１の１本鎖ポリヌクレオチド上の領域に相補的な配列であって、ｎ番目のコア配列に相補的な領域が、（ｎ−１）番目と（ｎ＋１）番目のコア配列に相補的な領域と隣接していない上記配列、（ｉｉ）３’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰm、（ｉｉｉ）５’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰm、及び（ｉｖ）任意選択的に、ピリミジンヌクレオチドストレッチＰmの１つ以上の挿入、からなり、ここで各ｍは０〜４０の範囲から独立して選択される整数であり、各Ｐはチミジン及びシトシン残基から独立して選択される。
【００１５】
第８の態様において、本発明は、１本鎖オリゴヌクレオチドのセットを含む核酸ナノ構造体に関し、ここで１本鎖ポリヌクレオチドのそれぞれはｎ個のコア配列からなるｎ特異的配列からなり、ｎは、１、２、３・・・、４０から独立して選択され、前記ｎ個のコア配列のそれぞれは、（ｉ）１本鎖ポリヌクレオチドの前記セットの別のメンバーの配列に相補的な配列であって、ｎ番目のコア配列に相補的な前記別のメンバー上の領域が、（ｎ−１）番目と（ｎ＋１）番目のコア配列に相補的な領域と隣接していない上記配列、（ｉｉ）３’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰm、（ｉｉｉ）５’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰm、及び（ｉｖ）任意選択的に、ピリミジンヌクレオチドストレッチＰmの１つ以上の挿入、からなり、ここで各ｍは１、２、３・・・、４０から独立して選択され、各Ｐはチミジン及びシトシン残基から独立して選択される。
【００１６】
第９の態様において、本発明は、本発明による２つ以上の核酸ナノ構造体の集成から生じる複雑な核酸ナノ構造体に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＤＮＡナノ構造体における架橋のための部位としての近位チミジンを示す。（Ａ）左は、紫外線照射前の２つの近位チミジンの化学構造。右は、紫外線照射前の、鎖末端（１）、半分のクロスオーバー時（２）、全クロスオーバー時（３）における１本鎖チミジン、及びチミジンループ（４）を、特徴とする６らせん束ＤＮＡナノ構造体の概略図。（Ｂ）（Ａ）と同様であるが、３１０ｎｍの波長の光に暴露した後である。ＣＰＤ結合は楕円体として示される。
【００１８】
【図２】多層ＤＮＡ折り紙を用いた紫外線架橋の概念証明を示す。（Ａ）左から右へ：全ての鎖末端及び全ての鎖クロスオーバー位置の追加のチミジンを特徴とするレンガ様ＤＮＡ折り紙対象物のモデル；臭化エチジウムで染色された２．０％アガロースゲルのレーザースキャン蛍光画像。照射（３１０ｎｍで１３５分）及び非照射試料は、それぞれ、異なる温度で３０分間インキュベートするか、又は連続的に濃度が低下する一価塩化ナトリウムを含む２回蒸留水中で室温で３時間インキュベートした。ｐはポケット；ｕは広がった物；ｆは折り畳まれた物；ｃは、架橋したステープル鎖；ｓは、架橋していないステープル鎖；Ｌは、１ｋＢのラダー；ＮＩ及びＩは、それぞれ５ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む折り畳み緩衝液中の非照射及び照射標準試料。ゲルの画像は自動レベリングされ、強調表示された領域は２回自動レベリングされた。２回蒸留水中の照射試料の平均２Ｄ粒子顕微鏡写真。（Ｂ）と（Ｃ）は（Ａ）と同様であるが、それぞれ、全ての鎖末端の、全ての鎖のクロスオーバー位置の追加のチミジン、及び５−Ｔループを特徴とするレンガ様ＤＮＡ折り紙対象物、及び全ての鎖末端、全ての鎖クロスオーバー位置の追加のチミジンを特徴とする及びポインター対象物を有する。全体に自動レベリングされたゲル画像については、図２９を参照されたい。
【００１９】
【図３】生理学的条件下での安定性を証明するアッセイを示す。臭化エチジウムで染色された２．０％アガロースゲルのレーザースキャン蛍光画像。架橋試料を３１０ｎｍで１３５分間照射した。（Ａ）全ての鎖末端及び全ての鎖クロスオーバー位置の追加のチミジンを特徴とするレンガ様ＤＮＡ折り紙対象物を、様々な時間、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中で３７℃でインキュベートした。（Ｂ）全ての鎖末端、全ての鎖クロスオーバー位置の追加のチミジン、及び５Ｔループを特徴とするレンガ様ＤＮＡ折り紙対象物を、様々な時間１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中で３７℃でインキュベートした。（Ｃ）（Ａ）のレンガ様ＤＮＡ折り紙対象物を、一組の異なるヌクレアーゼ（１００Ｕ／ｍｌ）に３７℃で２４時間曝露した。「ｃ」と記したレーンは、ヌクレアーゼの非存在下で試料を対応する緩衝液に溶解した対照を示す。（Ｄ）（Ｂ）のレンガ様ＤＮＡ折り紙対象物を、ＤＮａｓｅＩ（０．４Ｕ／ｍｌ）に様々な時間３７℃で曝露した。（Ｂ）〜（Ｄ）非照射試料と照射試料を、交互にゲルに載せた。ゲルの全ての画像は全体に自動レベリングされた。
【００２０】
【図４】紫外線照射前後のクライオＥＭ構造解析を示す。（Ａ）ＴＴモチーフ１〜３を有する照射されていないレンガ様対象物のクライオＥＭ密度地図（電子顕微鏡データベース識別子ＥＭＤ−４３５４）。（Ｂ）と（Ｃ）それぞれ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む緩衝液又はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液中の１５０ｍＭのＮａＣｌ中の、ＴＴモチーフ１〜３を有する照射された（３１０ｎｍで１３５分）レンガ様対象物のクライオＥＭ密度地図。電子密度の閾値は、側面図で見られるように、最上層の全てのクロスオーバーが見えるように選択される（それぞれ、電子顕微鏡データベース識別子ＥＭＤ−００２７及びＥＭＤ−００２８）。（Ｄ）上から下に（Ａ）〜（Ｃ）に示されている３つの密度地図から得られたｚ方向に沿った切片。ねじれ角デルタシータを決定するために、最初の切片と最後の切片が選択された。（Ｅ）（Ａ）〜（Ｃ）に示されている再構成における３つのクロスオーバー層を示す切片。（Ｆ）５ｍＭ  ＭｇＣｌ2緩衝液中の非架橋変種とＰＢＳ緩衝液中の架橋変種の全体的な寸法の比較。
【００２１】
【図５】コンフォメーション状態及び高次集成体の共有結合を示す。（Ａ）不動のホリデイジャンクション（Holliday junction）によって中央で柔軟に接続された２つの剛性の棒で構成される２状態スイッチの概略図。モデル中の円筒は２重らせんＤＮＡドメインを表し、形態に相補的な表面形状は明るい灰色と暗い灰色で強調表示されている。挿入図は、突出した表面形状（明るい灰色）及びへこんだ表面形状（暗い灰色）の平滑末端の境界面の拡大図示す。平滑末端部位に直接位置するチミジンは、紫外線照射により架橋することができる。結果として得られるＣＰＤ結合は、明るい灰色の楕円体として示される。（Ｂ）臭化エチジウムで染色された２．０％アガロースゲルのレーザースキャン蛍光画像。スイッチ試料を３１０ｎｍで様々な時間照射し、ゲルに載せた；ｏとｃは、それぞれ開いた状態と閉じた状態に存在する粒子である。（Ｃ）（Ｂ）のゲルから得られた、時間の関数としての架橋スイッチ粒子の割合のプロット。実験は三重測定で行った。データの点は平均を表し、誤差棒は標準偏差を表す。（Ｄ）ＴＥＭ顕微鏡写真の例；上は、開いた状態に存在する粒子を有する非照射試料であり、下は、閉じたコンフォメーション状態で固定された粒子を有する照射試料（３１０ｎｍで２０分）である。スケールバーは１００ｎｍ。挿入図は、架橋粒子の平均２Ｄ粒子顕微鏡写真。スケールバーは２０ｎｍ。（Ｅ）左上は、重合して線状フィラメントとなる多層ＤＮＡ折り紙レンガのモデル。示された条件で記録されたＴＥＭ顕微鏡写真の視野。スケールバーは１００ｎｍ。
【００２２】
【図６】ｃａＤＮＡｎｏ66を使用して調製されたレンガ様（ＴＴモチーフ１〜３）対象物の設計図を示す。この対象物は、全てのステープル末端における１チミン長のオーバーハングを特徴とする。さらに、鎖ごとの全てのクロスオーバー部位にＴＴモチーフを挿入した。インターフェースは、ポリチミンのオーバーハングで不動態化された。挿入図の右上は、ハニカム格子で設計された対象物の断面。
【００２３】
【図７】異なる緩衝液／溶媒中のレンガ様対象物（ＴＴモチーフ１〜４）の陰性染色されたＴＥＭ顕微鏡写真の例を示す。画像は、染色勾配を減らすために高域フィルター処理された。挿入図は、対応する平均２Ｄ粒子顕微鏡写真。スケールバーは２０ｎｍ。
【００２４】
【図８】氷冷水浴中で行った２．０％アガロースゲルのレーザースキャンの蛍光画像を示す。異なる溶媒に溶解したＴＴモチーフ１〜３を有するレンガ様対象物をゲルに載せた。ｐはポケット；ｕは広がった物；ｆは折り畳まれた物；Ｌは１ｋＢラダー；Ｒ１は３０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む折り畳み緩衝液中の非照射標準物質；Ｒ２は３０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む折り畳み緩衝液中の３１０ｎｍで１３５分間照射された標準物質。ゲルの画像は自動レベリングされ、強調表示された領域は再度自動レベリングされた。
【００２５】
【図９】周囲温度の水浴中で行った２．０％アガロースゲルのレーザースキャンの蛍光画像を示す。ゲルとランニング緩衝液は、ＭｇＣｌ2を含まない０．５×ＴＢＥを含有した。異なるパーセントのＤＭＳＯの存在下でＴＴモチーフ１〜３を有するレンガ様対象物の試料をゲルに載せた。ｐはポケット；ｕは広がった物；ｆは折り畳まれた物；Ｒ１は３０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む折り畳み緩衝液中の非照射標準物質。ゲルの画像は自動レベリングされた。
【００２６】
【図１０】ｃａＤＮＡｎｏ66を使用して調製されたレンガ様（ＴＴモチーフ１〜４）対象物の設計図を示す。この対象物は、全てのステープル末端における１チミン長のオーバーハングを特徴とする。さらに、鎖ごとの全てのクロスオーバー部位にＴＴモチーフを挿入した。さらに、らせんは、らせん間架橋のための５チミン長のループを特徴とする。インターフェースはポリチミンのオーバーハングで不動態化された。挿入図の右上は、ハニカム格子で設計された対象物の断面。
【００２７】
【図１１】氷冷水浴中に配置された２．０％アガロースゲルのレーザースキャンの蛍光画像を示す。１−Ｔ、３−Ｔ、及び５−Ｔループを特徴とするＴＴモチーフ１〜４を有するレンガ様対象物の様々な変種の照射試料（３１０ｎｍで１３５分）及び非照射試料を様々な温度でインキュベートし、ゲルに載せた。ｐはポケット；ｕは広がった物；ｆは折り畳まれた物；ｃは、架橋ステープル；ｓは非架橋ステープル；Ｌは１ｋＢラダー；Ｒ１は３０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む折り畳み緩衝液中のＴＴモチーフ１〜３を有する非照射レンガ様対象物；Ｒ２は３０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む折り畳み緩衝液のＴＴモチーフ１〜３を有する照射（３１０ｎｍで１３５分）レンガ様対象物。ゲルの画像は自動レベリングされ、強調表示された領域は再度自動レベリングされた。矢印は、ループ長が長くなると強度が増加するバンドを示す。
【００２８】
【図１２】ｃａＤＮＡｎｏ66を使用して調製されたポインター対象物の設計図を示す。この対象物は、全てのステープル末端における１チミン長のオーバーハングを特徴とする。鎖ごとの全てのクロスオーバー部位にＴＴモチーフを挿入した。インターフェースはポリチミンのオーバーハングで不動態化された。挿入図の右上は、方形格子で設計された対象物の断面。
【００２９】
【図１３】異なる緩衝液／溶媒中のポインター対象物の陰性染色されたＴＥＭ顕微鏡写真の例を示す。画像は、染色勾配を減らすために高域フィルター処理された。挿入図は、対応する平均２Ｄ粒子顕微鏡写真。スケールバーは２０ｎｍ。
【００３０】
【図１４】水浴中に配置された２．０％アガロースゲルのレーザースキャンされた蛍光画像を示す。異なる時間照射され異なる温度でインキュベートされたＴＴモチーフ１〜３を有するレンガ様対象物を、ゲルに載せた。ｐはポケット；ｕは広がった物；ｆは折り畳まれた物；ｃは架橋ステープル；ｓは非架橋ステープル；Ｌは１ｋＢラダー；Ｒ１は３０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む折り畳み緩衝液中の非照射標準物質。Ｒ２は３０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む折り畳み緩衝液中で３１０ｎｍで１３５分間照射された標準物質。ゲルの画像は自動レベリングされ、強調表示された領域は再度自動レベリングされた。（Ａ）試料は５ｍＭ  ＭｇＣｌ2の存在下で照射された。（Ｂ）及び（Ｃ）試料は３０ｍＭ  ＭｇＣｌ2の存在下で照射された。
【００３１】
【図１５】水浴中に配置された２．０％アガロースゲルのレーザースキャンされた蛍光画像を示す。異なる時間照射され異なる温度でインキュベートされたＴＴモチーフ１〜４を有するレンガ様対象物を、ゲルに載せた。ｐはポケット；ｕは広がった物；ｆは折り畳まれた物；ｃは架橋ステープル；ｓは非架橋ステープル；Ｌは１ｋＢラダー；Ｒ１は３０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む折り畳み緩衝液中の非照射標準物質。ゲルの画像は自動レベリングされ、強調表示された領域は再度自動レベリングされた。
【００３２】
【図１６】氷冷水浴中に配置された２．０％アガロースゲルのレーザースキャンされた蛍光画像を示す。ゲルとランニング緩衝液は１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含有した。ＴＴモチーフ１〜３及びＴＴモチーフ１〜４を有するシアニン５標識レンガ様対象物を、de-Bruijnアッセイを使用して欠陥分析にかけた58。非照射試料と照射試料を、２つのシアニン３修飾オリゴヌクレオチド（de-Bruijnプローブ；最終濃度１６μＭ）と混合した後、ゲルに載せた。（Ａ）ゲルを２つのチャネルでレーザースキャンした。上のゲル：欠陥チャネル；５３２ｎｍでシアニン３蛍光物質を励起、及び５６０〜５８０ｎｍで発光を採取。下のゲル：構造チャネル；６３５ｎｍでシアニン５蛍光物質を励起、及び６６５ｎｍ超で発光を採取。ｐはポケット及びｆは折り畳まれた物。ゲルの画像は全体に自動レベリングされた。（Ｂ）（Ａ）のゲルから計算された相対的な欠陥強度（すなわち、欠陥と構造チャネルとのバンド強度の比率）のプロット。
【００３３】
【図１７】水浴中に配置された２．０％アガロースゲルのレーザースキャンされた蛍光画像を示す。異なる時間照射され異なる温度でインキュベートされたＴＴ又はＴＣモチーフ１〜３を有するレンガ様対象物を、ゲルに載せた。ｐはポケット；ｕは広がった物；ｆは折り畳まれた物；ｃは架橋ステープル；ｓは非架橋ステープル；Ｌは１ｋＢラダー。ゲルの画像は自動レベリングされた。
【００３４】
【図１８】水浴中に配置された２．０％アガロースゲルのレーザースキャンされた蛍光画像を示す。３６５ｎｍで１３５分（Ａ）、３６５ｎｍで２０時間（Ｂ）照射され、様々な温度でインキュベートされたＴＴモチーフ１〜３を有するレンガ様対象物を、ゲルに載せた。ｐはポケット；ｕは広がった物；ｆは折り畳まれた物；ｓは非架橋ステープル；Ｌは１ｋＢラダー；Ｒ１は３０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む折り畳み緩衝液中の非照射標準物質；Ｒ２は３０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む折り畳み緩衝液中の、３６５ｎｍで（Ａ）１３５分、（Ｂ）２０時間照射された標準物質。ゲルの画像は自動レベリングされ、強調表示された領域は別に自動レベリングされた。
【００３５】
【図１９】水浴中に配置された２．０％アガロースゲルのレーザースキャンされた蛍光画像を示す。ＴＴモチーフ１、１〜２、及び１〜３を有するレンガ様対象物の様々な変種をゲルに載せた。ｐはポケット；ｕは広がった物；ｆは折り畳まれた物；ｓは非架橋ステープル；Ｌは１ｋＢラダー。矢印は、デザインにＴＴモチーフを追加すると、電気泳動移動度が上昇するバンドを示す。ゲルの画像は自動レベリングされた。
【００３６】
【図２０】水浴中に配置された２．０％アガロースゲルのレーザースキャンされた蛍光画像を示す。ＤＮａｓｅＩ反応緩衝液で希釈した０．４Ｕ／ｍｌ  ＤＮａｓｅＩを用いて、異なる時間インキュベートされたＴＴモチーフ１〜３（左）及びＴＴモチーフ１〜４（右）を有するレンガ様対象物をゲルに載せた。ｐはポケット；ｕは広がった物；ｆは折り畳まれた物；ｃは架橋ステープル；ｓは非架橋ステープル；Ｒ１：非照射標準物質；Ｒ２：３１０ｎｍで１３５分間照射された標準物質。標準試料Ｒ１及びＲ２は、ＤＮａｓｅＩの非存在下でＤＮａｓｅＩ緩衝液に溶解された。ゲルの画像は自動レベリングされ、強調表示された領域は再度自動レベリングされた。
【００３７】
【図２１】折り畳み緩衝液中で架橋する前の、ＴＴモチーフ１〜３を有するレンガ様対象物のクライオＥＭデータを示す：（Ａ）５ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む折り畳み緩衝液中で架橋する前の、ＴＴモチーフ１〜３を有するレンガ様対象物のデータセットの、動き補正及び線量加重クライオＥＭ顕微鏡写真。スケールバーは１００ｎｍを表す。１５フレームの線量分割ムービーが、３００ｋＶで動作するFEI Titan KriosG2で２．３Åの拡大ピクセルサイズと６０ｅ-／Å2の総線量で取得された。（Ｂ）異なる方向を示す代表的な２次元クラス平均。スケールバーは４０ｎｍを表す。（Ｃ）尖鋭化後の分解能を示す様々なＦＳＣ曲線のグラフ。（Ｄ）粒子の方向の分布を表す３次元ヒストグラム。（Ｅ）１６５，０００個の個々の粒子から再構成された尖鋭化最終地図の６つの異なる図。尖鋭化には−１，０００のＢ係数を使用した。
【００３８】
【図２２】折り畳み緩衝液中で架橋した後の、ＴＴモチーフ１〜３を有するレンガ様対象物のクライオＥＭデータを示す：（Ａ）５ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む折り畳み緩衝液中で架橋した後の、ＴＴモチーフ１〜３を有するレンガ様対象物のデータセットの、動き補正及び線量加重クライオＥＭ顕微鏡写真。スケールバーは１００ｎｍを表す。１５フレームの線量分割ムービーが、３００ｋＶで動作するFEI Titan KriosG2で２．３Åの拡大ピクセルサイズと６０ｅ-／Å2の総線量で取得された。（Ｂ）異なる方向を示す代表的な２次元クラス平均。スケールバーは４０ｎｍを表す。（Ｃ）尖鋭化後の分解能を示す様々なＦＳＣ曲線のグラフ。（Ｄ）粒子の方向の分布を表す３次元ヒストグラム。（Ｅ）９５，０００個の個々の粒子から再構成された尖鋭化最終地図の６つの異なる図。尖鋭化には−１，０００のＢ係数を使用した。
【００３９】
【図２３】リン酸緩衝生理食塩水中で架橋した後の、ＴＴモチーフ１〜３を有するレンガ様対象物のクライオＥＭデータを示す。（Ａ）ＰＢＳ緩衝液中で架橋した後の、ＴＴモチーフ１〜３のレンガ様対象物のデータセットの、動き補正及び線量加重クライオＥＭ顕微鏡写真。スケールバーは１００ｎｍを表す。１５フレームの線量分割ムービーが、３００ｋＶで動作するFEI Titan KriosG2で２．３Åの拡大ピクセルサイズと６０ｅ-／Å2の総線量で取得された。（Ｂ）異なる方向を示す代表的な２次元クラス平均。スケールバーは４０ｎｍを表す。（Ｃ）尖鋭化後の分解能を示す様々なＦＳＣ曲線のグラフ。（Ｄ）粒子の方向の分布を表す３次元ヒストグラム。（Ｅ）５７，０００個の個々の粒子から再構成された尖鋭化最終地図の６つの異なる図。尖鋭化には−１，０００のＢ係数を使用した。
【００４０】
【図２４】レンガ試料から決定されたクライオＥＭ地図の切片ごとの視覚化を示す。らせん軸が図の平面に直交する（ｚ方向と表記）ように３Ｄボリュームを回転させた。元のボリュームは、１ピクセルあたり２．３Åのサイズで４００ｘ４００ｘ４００ピクセルを有した。切片解析では、ボリュームをｘｙ平面で２００ｘ２００にトリミングし、ｚ方向にビニングして、各切片の厚さが３．３５Åになるようにした。これは、らせん方向に沿った１つの塩基対の寄与に対応する。画像Ｊを使用して、３Ｄボリュームのモンタージュを作成した。（Ａ）全てのステープル末端にチミンを有し、鎖ごとの全てのクロスオーバー部位にＴＴモチーフを有するレンガ変種。（Ｂ）らせん間結合を作成するためにさらに５−Ｔループを有するレンガ変種。
【００４１】
【図２５】折り畳み緩衝液中で架橋する前の、ＴＴモチーフ１〜４を有するレンガ様対象物のクライオＥＭデータを示す：（Ａ）５ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む折り畳み緩衝液中で架橋する前の、ＴＴモチーフ１〜４を有するレンガ様対象物のデータセットの、動き補正及び線量加重クライオＥＭ顕微鏡写真。スケールバーは１００ｎｍを表す。１５フレームの線量分割ムービーが、３００ｋＶで動作するFEI Titan KriosG2で２．３Åの拡大ピクセルサイズと６０ｅ-／Å2の総線量で取得された。（Ｂ）異なる方向を示す代表的な２次元クラス平均。スケールバーは４０ｎｍを表す。（Ｃ）尖鋭化後の分解能を示す様々なＦＳＣ曲線のグラフ。（Ｄ）粒子の方向の分布を表す３次元ヒストグラム。（Ｅ）３３，０００個の個々の粒子から再構成された尖鋭化最終地図の６つの異なる図。尖鋭化には−１，０００のＢ係数を使用した。
【００４２】
【図２６】折り畳み緩衝液中で架橋した後の、ＴＴモチーフ１〜４を有するレンガ様対象物のクライオＥＭデータを示す：（Ａ）５ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む折り畳み緩衝液中で架橋した後の、ＴＴモチーフ１〜４を有するレンガ様対象物のデータセットの、動き補正及び線量加重クライオＥＭ顕微鏡写真。スケールバーは１００ｎｍを表す。１５フレームの線量分割ムービーが、３００ｋＶで動作するFEI Titan KriosG2で２．３Åの拡大ピクセルサイズと６０ｅ-／Å2の総線量で取得された。（Ｂ）異なる方向を示す代表的な２次元クラス平均。スケールバーは４０ｎｍを表す。（Ｃ）尖鋭化後の分解能を示す様々なＦＳＣ曲線のグラフ。（Ｄ）粒子の方向の分布を表す３次元ヒストグラム。（Ｅ）７５，０００個の個々の粒子から再構成された尖鋭化最終地図の６つの異なる図。尖鋭化には−１，０００のＢ係数を使用した。
【００４３】
【図２７】ｃａＤＮＡｎｏ66を使用して調製されたスイッチ対象物の設計図を示す。インターフェースはポリチミンのオーバーハングで不動態化された。挿入図の左下はハニカム格子で設計された対象物の断面。
【００４４】
【図２８】ｃａＤＮＡｎｏ66を使用して調製された重合レンガ対象物の設計図を示す。インターフェースはポリチミンのオーバーハングで不動態化された。挿入図の右上はハニカム格子で設計された対象物の断面。
【００４５】
【図２９】水浴中に配置された２．０％アガロースゲルのレーザースキャンの蛍光画像を示す。（Ａ）左から右へ：全ての鎖末端及び全ての鎖クロスオーバー位置における追加のチミジンを特徴とするレンガ様ＤＮＡ折り紙対象物のモデル；臭化エチジウムで染色された２．０％アガロースゲルのレーザースキャン蛍光画像。照射（３１０ｎｍで１３５分）及び非照射試料は、それぞれ、異なる温度で３０分間インキュベートするか、又は連続的に低下する濃度の一価塩化ナトリウムを含む２回蒸留水中で室温で３時間インキュベートした。ｐはポケット；ｕは広がった物；ｆは折り畳まれた物；ｃは架橋したステープル鎖；ｓは架橋していないステープル鎖；Ｌ：１ｋＢのラダー；ＮＩ及びＩ：それぞれ５ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む折り畳み緩衝液中の非照射及び照射標準試料。ゲルの画像は全体的に自動レベリングされた。（Ｂ）と（Ｃ）は（Ａ）と同様であるが、全ての鎖末端に、全ての鎖のクロスオーバー位置に追加のチミジンを、及び５−Ｔループを特徴とするレンガ様ＤＮＡ折り紙対象物と、全ての鎖末端に及び全ての鎖クロスオーバー位置に追加のチミジンを特徴とするポインター対象物を有する。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明は、紫外線で硬化することにより、特にピリミジンヌクレオチドを架橋することにより、核酸ナノ構造体を安定化するための新規な方法に関する。
【００４７】
特に他に明記されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関係する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００４８】
すなわち第１の態様において、本発明は、天然に存在しない核酸ナノ構造体の安定性を高める方法に関し、ここで前記ナノ構造体は、１つ以上の相補的核酸配列上に存在する少なくとも２つの非隣接配列ストレッチに結合する少なくとも１つの１本鎖核酸配列を含み、ここで前記方法は、前記核酸ナノ構造体を紫外線照射に曝露する工程を特徴とし、ここで前記核酸ナノ構造体を紫外線照射に曝露する前記工程は、２つのピリミジンヌクレオチド間の少なくとも１つの化学的結合の形成をもたらし、ここで２つのピリミジンヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、２重らせん部分構造に含まれる相補的ヌクレオチド対の一部ではない。
【００４９】
第２の態様において、本発明は、天然に存在しない核酸ナノ構造体の安定性を高める方法に関し、ここで前記ナノ構造体は、１つ以上の相補的核酸配列上に存在する少なくとも２つの非隣接配列ストレッチに結合する少なくとも１つの１本鎖核酸配列を含み、ここで前記方法は、前記核酸ナノ構造体を紫外線照射に曝露する工程によって特徴付けられる。
【００５０】
本明細書において「含む（comprising）」及び「含む（including）」という用語は、特に他に明記されない限り、それらの制限のない非限定的な意味で使用される。従って、そのような後者の実施態様に関して、「含む」という用語は、より狭い用語「からなる」を含む。
【００５１】
本発明を説明する文脈において（特に以下の特許請求の範囲の文脈において）「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語及び同様の参照は、特に他に明記されない限り、又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方を包含すると解釈されるべきである。例えば、「細胞」という用語は、それらの混合物を含む複数の細胞を含む。化合物、塩等に複数形が使用される場合、これは単一の化合物、塩なども意味すると解釈される。
【００５２】
本発明の文脈において「ナノ構造体」という用語は、より小さな部分構造の複合体及び少なくとも部分的に規則的な配置から形成される３次元構造に関する。本発明の文脈において、より小さな部分構造は、２重らせん部分構造を含む。特定の実施態様において２重らせん部分構造は、異なる２重らせん部分構造間の規則的な接続によってより複雑なナノ構造体に配置され、ここで前記接続は、１本鎖核酸配列によって形成され、異なる核酸配列対照物上の少なくとも２つの異なる配列ストレッチに相補的であることによって、異なる２重らせん部分構造間のクロスオーバーを形成する。
【００５３】
本発明の文脈において「１本鎖核酸配列」という用語は、リン酸基によって、修飾されたリン酸基によって、又はリン酸類似体によって、連結された核酸モノマー単位（ヌクレオシド）の１本鎖に関する（ヌクレオシドとリン酸ベースの連結基は合わせてヌクレオチドと呼ばれる）。デオキシリボ核酸ベースの核酸配列の場合、核酸モノマーは、（ｉ）４つの窒素含有核酸塩基であるシトシン［Ｃ］、グアニン［Ｇ］、アデニン［Ａ］、又はチミン［Ｔ］から選択される核酸塩基と、デオキシリボースと呼ばれる糖とを含むヌクレオシド、及び（ｉｉ）リン酸基から形成される。リボ核酸ベースの核酸配列の場合、核酸モノマーは、（ｉ）４つの窒素含有核酸塩基であるシトシン［Ｃ］、グアニン［Ｇ］、アデニン［Ａ］又は、チミン［Ｔ］から選択される核酸塩基と、リボースと呼ばれる糖とを含むヌクレオシド、及び（ｉｉ）リン酸基から形成される。
【００５４】
特定の実施態様において１本鎖核酸配列は、デオキシリボ核酸ベースの核酸配列に基づく。
【００５５】
本発明の文脈において「非隣接配列ストレッチ」という用語は、直接連結されていない核酸配列のストレッチに関する。非隣接配列ストレッチは、異なる核酸配列上に位置し得るか、又は１つの核酸配列上に位置し得るが、但し、前記非隣接配列ストレッチのいずれの一部でもない前記非隣接配列ストレッチの間に少なくとも１つのヌクレオチドが存在する。
【００５６】
本発明の文脈において「少なくとも２つの非隣接配列ストレッチに結合する少なくとも１つの１本鎖核酸配列」という用語は、一方では前記少なくとも１つの１本鎖核酸配列中に、及び他方では前記少なくとも２つの非隣接配列ストレッチ中に、含まれる相補的塩基間の水素結合の形成を介して結合することを意味する。前記結合は、本発明による紫外線照射後に、前記少なくとも１つの１本鎖核酸配列と、前記少なくとも２つの非隣接配列ストレッチの１つ、両方、又は全てとの間に形成される共有結合によってさらに増強され得る。
【００５７】
第３の態様において、本発明は天然に存在しない核酸ナノ構造体の安定性を高める方法に関し、ここで前記ナノ構造体は少なくとも２つの２重らせん部分構造を含み、ここで前記方法は、前記核酸ナノ構造体を紫外線照射に曝露する工程によって特徴付けられる。
【００５８】
本発明の文脈において「２重らせん部分構造」という用語は、２つの相補的な核酸配列ストレッチによって形成される２重らせん配置にある本発明によるナノ構造体のサブパートに関する。２重らせん部分構造の末端は、（ｉ）２つの相補的核酸配列ストレッチの１つはその３’又は５’末端に到達し、又は（ｉｉ）２つの相補的核酸配列ストレッチのうちの１つは、別の又は異なる核酸配列上の第２の非隣接配列ストレッチに対する相補性によって別の２重らせん部分構造を形成し続けるという事実によって、相補性領域の末端に起因する可能性がある。
【００５９】
第４の態様において本発明は、複数の２重らせん部分構造を含む、天然に存在しない核酸ナノ構造体の安定性を高める方法に関し、ここで前記ナノ構造体は、少なくとも２つの異なる２重らせん部分構造の一部である少なくとも１つの１本鎖核酸配列を含み、前記方法は、前記核酸ナノ構造体を紫外線照射に曝露する工程によって特徴付けられる。
【００６０】
特定の実施態様において前記天然に存在しない核酸ナノ構造体は、２重らせん部分構造の２次元又は３次元配置のいずれかを含む。
【００６１】
特定の実施態様において、前記天然に存在しない核酸ナノ構造体は、前記２重らせん部分構造がそれぞれ１０〜５０００の相補的ヌクレオチド対からなり、前記２重らせん部分構造が、７、８、又は９塩基ごとに、隣接する２重らせん部分構造に接続することができ、前記２重らせん部分構造を形成する１本鎖オリゴヌクレオチドの１つ以上が、同じ又は少なくとも２つの異なる２重らせん部分構造の一部である。
【００６２】
特定の実施態様において、前記２重らせん部分構造間の接続は、ハニカム、方形形、又は六角形のパッキング形状、又はこれらの組み合わせをもたらす。
【００６３】
特定の実施態様において、前記２重らせん部分構造を形成する１本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも８５％は、少なくとも２つの異なる２重らせん部分構造の一部である。
【００６４】
特定の実施態様において、前記核酸ナノ構造体を紫外線照射に曝露する前記工程は、２つのピリミジンヌクレオチド間に少なくとも１つの化学結合の形成をもたらす。
【００６５】
特定の実施態様において、前記２つのピリミジンヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、２重らせん部分構造に含まれる相補的ヌクレオチド対の一部ではない。
【００６６】
特定の実施態様において、前記核酸ナノ構造体は、少なくとも第１の１本鎖ポリヌクレオチドの１つ以上のコピー、及び第２の１本鎖ポリヌクレオチドのセットを含み、第２の１本鎖ポリヌクレオチドのそれぞれは、ｎ個のコア配列からなるｎ特異的配列からなり、ｎは１〜４０の範囲から独立して選択される整数であり、前記ｎ個のコア配列のそれぞれは、（ｉ）前記第１の１本鎖ポリヌクレオチド上の領域に相補的な配列であって、ｎ番目のコア配列に相補的である前記第１の１本鎖ポリヌクレオチド上の領域は、（ｎ−１）番目及び（ｎ＋１）番目のコア配列に相補的な前記第１の１本鎖ポリヌクレオチド上の領域と隣接していない配列と、（ｉｉ）３’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰmと、（ｉｉｉ）５’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰmと、及び（ｉｖ）任意選択的に、ピリミジンヌクレオチドストレッチＰmの１つ以上の挿入とからなり、ここで各ｍは０〜４０の範囲から独立して選択される整数であり、各Ｐはチミジン及びシトシン残基から独立して選択される。
【００６７】
本発明の文脈において、前記第１の１本鎖ポリヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチド又は主鎖ポリヌクレオチドと見なすことができる。
【００６８】
本発明の文脈において、ｍ＝０の値は、コア配列が、核酸配列の対応する末端でピリミジンヌクレオチドストレッチＰmに隣接していないことを示す。特定の実施態様において、前記セットの第２の１本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも５０％は、３’末端又は５’末端のいずれかに少なくとも１つのピリミジンヌクレオチドストレッチを有する。特定の実施態様において、少なくとも７５％、特に少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％は、３’末端又は５’末端のいずれかに少なくとも１つのピリミジンヌクレオチドストレッチを有する。特定の実施態様において、前記セットの第２の１本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも３５％は、３’末端及び５’末端の両方に２つのピリミジンヌクレオチドストレッチを有する。特定の実施態様において、少なくとも５０％、特に少なくとも７５％、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％は、３’末端及び５’末端の両方に２つのピリミジンヌクレオチドストレッチを有する。
【００６９】
特定の実施態様において、前記第１の１本鎖ポリヌクレオチドは少なくとも１００個のヌクレオチドを含む。
【００７０】
特定の実施態様において、前記第１の１本鎖ポリヌクレオチドは、繊維状バクテリオファージのＤＮＡに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する。特定の実施態様において、前記１本鎖ポリヌクレオチドは、少なくとも８０％の配列同一性、詳細には少なくとも８５％、より詳細には少なくとも９０％、そして最も詳細には少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【００７１】
特定の実施態様において、前記繊維状バクテリオファージはＭ１３、特にＭ１３ｍｐ１８である。
【００７２】
特定の実施態様において、前記核酸ナノ構造体は１本鎖オリゴヌクレオチドのセットを含み、ここで前記１本鎖ポリヌクレオチドのそれぞれは、ｎ個のコア配列からなるｎ特異的配列からなり、ｎは１〜４０の範囲から独立して選択される整数であり、前記ｎ個のコア配列のそれぞれは、（ｉ）前記セットの１本鎖ポリヌクレオチドの別のメンバーの配列に相補的な配列であって、ｎ番目のコア配列に相補的な前記別のメンバー上の領域は、（ｎ−１）番目及び（ｎ＋１）番目のコア配列に相補的な領域と隣接していない配列と、（ｉｉ）３’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰmと、（ｉｉｉ）５’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰmと、及び（ｉｖ）任意選択的に、ピリミジンヌクレオチドストレッチＰmの１つ以上の挿入とからなり、ここで各ｍは０〜４０の範囲から独立して選択される整数であり、各Ｐはチミジン及びシトシン残基から独立して選択される。
【００７３】
特定の実施態様において、各ｍは０〜５の範囲から独立して選択される整数である。
【００７４】
特定の実施態様において、３’末端及び５’末端の前記ピリミジンヌクレオチドストレッチのそれぞれについて、ｍは０又は１のいずれかであり、Ｐはチミジン残基である。
【００７５】
特定の実施態様において、前記核酸ナノ構造体は、ピリミジンヌクレオチドストレッチＰmの１つ以上の挿入を含み、ここで、ｍは１〜５の範囲から独立して選択され、特にｍは１、３、及び５から独立して選択される。
【００７６】
特定の実施態様において、前記コア配列のそれぞれはｘ個のヌクレオチドからなり、ｘは７、８、又は１６の倍数である整数から独立して選択される。
【００７７】
本発明の文脈において、ｘの値はＤＮＡ２重らせんの形状によって決定される。当業者は、本発明に従って安定化されるナノ構造体内の２重らせん部分構造の規則的な配置を可能にするために、存在しなければならない２重らせんのサイズ及びヌクレオチドの数を決定することができる。
【００７８】
特定の実施態様において、前記紫外線照射は、２５０ｎｍ〜３５０ｎｍの範囲の波長の紫外線を用いて行われる。
【００７９】
特定の実施態様において、前記紫外線照射は、以下のパラメータ（約５〜２，０００μｌの試料の容積、試料中の約１〜５００ｎＭの核酸ナノ構造体の濃度）を使用して、約０〜約２５の温度範囲で、トリス緩衝液中で、光線を試料に連結させるための液体ガイドを使用して（試料の溶液表面と光ガイドの末端間の距離は約５ｃｍ未満）キセノン光源（Asahi SpectraのMAX303）を用いて行われる。試料は、約１〜１０ｍＷ／ｃｍ2の紫外線強度で約１〜６時間、紫外線照射に曝露される。
【００８０】
本発明の文脈において、値又は値の範囲と組み合わせた「約」という用語は、所定の値又は値の範囲が、具体的に列挙された値又は値の範囲に近い値を除外しないことを示す。特に、文脈に応じて「約」という用語は、指定された値のプラスマイナス１０％の範囲内にある値を含む。具体的な実施態様において、「約」という用語は無視され、値又は値の範囲は記載されているとおりに使用される。
【００８１】
具体的な実施態様において、前記核酸ナノ構造体を紫外線照射に曝露する前記工程は、安定状態に到達するために同一条件下で処理された実施例２の基準ＤＮＡナノ構造体に必要な期間実行され、ここで前記安定性は、実施例２に記載のようなゲル電気泳動アッセイにおいて特定され、ここで前記基準ＤＮＡナノ構造体は、（ｉ）未処理のままで、２５℃で５ｍＭトリス、５ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2の基準条件下で、及び（ｉｉ）紫外線処理後、必要な目標条件で、特に高温で、特に９０℃で、純水中、生理学的条件下、又は真空中で、インキュベートされ、ここで、基準ＤＮＡナノ構造体のバンドが基準条件下と同じ電気泳動移動度を示すとすぐに、安定状態に到達する。
【００８２】
第５の態様において、本発明は、少なくとも第１の１本鎖ポリヌクレオチドの１つ以上のコピーと、１本鎖ポリヌクレオチドのセットとを含む核酸ナノ構造体の作成のためのキットに関し、ここで１本鎖ポリヌクレオチドのそれぞれはｎ個のコア配列からなるｎ特異的配列からなり、ｎは１〜４０の範囲から独立して選択される整数であり、ここで前記ｎ個のコア配列のそれぞれは、（ｉ）前記第１の１本鎖ポリヌクレオチド上の領域に相補的な配列であって、ｎ番目のコア配列に相補的な領域が、（ｎ−１）番目と（ｎ＋１）番目のコア配列に相補的な領域と隣接していない上記配列、（ｉｉ）３’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰm、（ｉｉｉ）５’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰm、及び（ｉｖ）任意選択的に、ピリミジンヌクレオチドストレッチＰmの１つ以上の挿入、からなり、ここで各ｍは０〜４０の範囲から独立して選択される整数であり、各Ｐはチミジン及びシトシン残基から独立して選択される。
【００８３】
具体的な実施態様において、各ｍは０〜５の範囲から独立して選択される整数である。
【００８４】
具体的な実施態様において、３’末端及び５’末端の前記ピリミジンヌクレオチドストレッチＰmのそれぞれについて、ｍは０又は１のいずれかであり、Ｐはチミジン残基である。
【００８５】
具体的な実施態様において、前記核酸ナノ構造体は、ピリミジンヌクレオチドストレッチＰmの１つ以上の挿入を含み、ここで、ｍは１〜５の範囲から独立して選択され、特にｍは１、３、及び５から独立して選択される。
【００８６】
第６の態様において、本発明は、１本鎖オリゴヌクレオチドのセットを含む核酸ナノ構造体を作成するためのキットに関し、ここで１本鎖ポリヌクレオチドのそれぞれは、ｎ個のコア配列からなるｎ特異的配列からなり、ｎは１〜４０の範囲から独立して選択される整数であり、ここで前記ｎ個のコア配列のそれぞれは、（ｉ）１本鎖ポリヌクレオチドの前記セットの別のメンバーの配列に相補的な配列であって、ｎ番目のコア配列に相補的な前記別のメンバー上の領域が、（ｎ−１）番目と（ｎ＋１）番目のコア配列に相補的な領域と隣接していない上記配列、（ｉｉ）３’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰm、（ｉｉｉ）５’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰm、及び（ｉｖ）任意選択的に、ピリミジンヌクレオチドストレッチＰmの１つ以上の挿入、からなり、ここで各ｍは０〜４０の範囲から独立して選択される整数であり、各Ｐはチミジン及びシトシン残基から独立して選択される。
【００８７】
具体的な実施態様において、各ｍは０〜５の範囲から独立して選択される整数である。
【００８８】
具体的な実施態様において、３’末端及び５’末端の前記ピリミジンヌクレオチドストレッチＰmのそれぞれについて、ｍは０又は１のいずれかであり、Ｐはチミジン残基である。
【００８９】
具体的な実施態様において、前記核酸ナノ構造体は、ピリミジンヌクレオチドストレッチＰmの１つ以上の挿入を含み、ここで、ｍは１〜５の範囲から独立して選択され、特にｍは１、３、及び５から独立して選択される。
【００９０】
第７の態様において、本発明は、少なくとも第１の１本鎖ポリヌクレオチドの１つ以上のコピーと、１本鎖ポリヌクレオチドのセットとを含む核酸ナノ構造体に関し、ここで１本鎖ポリヌクレオチドのそれぞれはｎ個のコア配列からなるｎ特異的配列からなり、ｎは１〜４０の範囲から選択される整数であり、前記ｎ個のコア配列のそれぞれは、（ｉ）前記第１の１本鎖ポリヌクレオチド上の領域に相補的な配列であって、ｎ番目のコア配列に相補的な領域が、（ｎ−１）番目と（ｎ＋１）番目のコア配列に相補的な領域と隣接していない上記配列、（ｉｉ）３’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰm、（ｉｉｉ）５’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰm、及び（ｉｖ）任意選択的に、ピリミジンヌクレオチドストレッチＰmの１つ以上の挿入、からなり、ここで各ｍは０〜４０の範囲から独立して選択される整数であり、各Ｐはチミジン及びシトシン残基から独立して選択される。
【００９１】
具体的な実施態様において、各ｍは０〜５の範囲から独立して選択される整数である。
【００９２】
具体的な実施態様において、３’末端及び５’末端の前記ピリミジンヌクレオチドストレッチＰmのそれぞれについて、ｍは０又は１のいずれかであり、Ｐはチミジン残基である。
【００９３】
具体的な実施態様において、前記核酸ナノ構造体は、ピリミジンヌクレオチドストレッチＰmの１つ以上の挿入を含み、ここで、ｍは１〜５の範囲から独立して選択され、特にｍは１、３、及び５から独立して選択される。
【００９４】
第８の態様において、本発明は、１本鎖オリゴヌクレオチドのセットを含む核酸ナノ構造体に関し、ここで１本鎖ポリヌクレオチドのそれぞれはｎ個のコア配列からなるｎ特異的配列からなり、ｎは、１〜４０の範囲から独立して選択され、前記ｎ個のコア配列のそれぞれは、（ｉ）１本鎖ポリヌクレオチドの前記セットの別のメンバーの配列に相補的な配列であって、ｎ番目のコア配列に相補的な前記別のメンバー上の領域が、（ｎ−１）番目と（ｎ＋１）番目のコア配列に相補的な領域と隣接していない上記配列、（ｉｉ）３’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰm、（ｉｉｉ）５’末端のピリミジンヌクレオチドストレッチＰm、及び（ｉｖ）任意選択的に、ピリミジンヌクレオチドストレッチＰmの１つ以上の挿入、からなり、ここで各ｍは０〜４０の範囲から独立して選択される整数であり、各Ｐはチミジン及びシトシン残基から独立して選択される。
【００９５】
具体的な実施態様において、各ｍは０〜５の範囲から独立して選択される整数である。
【００９６】
具体的な実施態様において、３’末端及び５’末端の前記ピリミジンヌクレオチドストレッチＰmのそれぞれについて、ｍは０又は１のいずれかであり、Ｐはチミジン残基である。
【００９７】
具体的な実施態様において、前記核酸ナノ構造体は、ピリミジンヌクレオチドストレッチＰmの１つ以上の挿入を含み、ここで、ｍは１〜５の範囲から独立して選択され、特にｍは１、３、及び５から独立して選択される。
【００９８】
具体的な実施態様において、前記核酸ナノ構造体は、空間的に隣接するチミジン及び／又はシトシン残基間に１つ以上の紫外線誘導ブリッジを含む。
【００９９】
具体的な実施態様において、前記１つ以上のブリッジは、シクロブタンピリミジンダイマー及び（６，４）ピリミジン−ピリミドンから選択されるピリミジンダイマーを含む。
【０１００】
具体的な実施態様において、前記１つ以上のブリッジは、１本鎖オリゴヌクレオチド又はコア配列の３’末端に、１本鎖オリゴヌクレオチド又はコア配列の５’末端にあるＰmストレッチに含まれるチミジン及び／又はシトシン残基、及び／又は前記任意のＰm挿入物のうちの１つのチミジンの間にある。
【０１０１】
具体的な実施態様において、前記ブリッジの１つ以上は、前記核酸ナノ構造体の同じか又は異なる２重らせん部分構造の一部である、２つの隣接する１本鎖オリゴヌクレオチド又はコア配列の３’及び５’末端のチミジン又はシトシン残基間の、らせん内ブリッジである。
【０１０２】
具体的な実施態様において、前記ブリッジの１つ以上は、前記核酸ナノ構造体の２つの異なる２重らせん部分構造の一部である、１本鎖オリゴヌクレオチド又はそのような１本鎖オリゴヌクレオチドの一部に含まれるチミジン又はシトシン残基間の、特に前記任意の挿入物の２つに含まれる２つのチミジン残基間の、らせん間ブリッジである。
【０１０３】
具体的な実施態様において、架橋は以下のリストからである：ポリヌクレオチドＡの３’末端からポリヌクレオチドＢの５’末端、ポリヌクレオチドＡの３’末端からポリヌクレオチドＢの３’末端、ポリヌクレオチドＡの５’末端からポリヌクレオチドＢの５’末端、ポリヌクレオチドＡの３’末端からポリヌクレオチドＢのコア配列中の挿入部、ポリヌクレオチドＡの５’末端からポリヌクレオチドＢのコア配列の挿入部、及びポリヌクレオチドＡのコア配列の挿入部からポリヌクレオチドＢのコア配列の挿入部。
【０１０４】
第９の態様において、本発明は、本発明による２つ以上の核酸ナノ構造体の集成から生じる複雑な核酸ナノ構造体に関する。
【０１０５】
具体的な実施態様において、前記集成体は、本発明による前記核酸ナノ構造体の２つ以上の間の１つ以上の紫外線誘導ブリッジを含む。
【実施例】
【０１０６】
以下の実施例は、その範囲を限定することなく本発明を説明する。
【０１０７】
ＤＮＡナノテクノロジーの方法を使用するカスタムナノ構造体のボトムアップ製造は、科学技術の多くの分野における応用に大きな可能性を秘めている。応用に対する１つの重要な障害は、ＤＮＡ対象物がその構造を保持する制約された環境条件に関係する。ここで我々は、ＤＮＡナノ構造体の構造安定性を高めるために、追加の共有結合を導入するための一般的、部位選択的で、スケールアップ可能な方法を提示する。主要な概念は、紫外線照射を介してシクロブタンピリミジンダイマー（ＣＰＤ）共有結合を導入するための部位を合理的に作成するための、ユーザーに定義されたＤＮＡナノ構造体内のチミジンの近接した配置である。これらの追加の結合は、配列プログラム可能な方法で使用して、遊離鎖末端を連結し、クロスオーバー部位で発生する鎖切断を除去し、すなわちクロスオーバー部位での鎖切断をつなぎ、そして追加のらせん間接続を作成することができる。その結果、化学修飾を必要とせずに、ユーザーがプログラム可能な部位で共有結合的に架橋された対象物が得られる。従って、設計された多層ＤＮＡ折り紙対象物はその全体的な形状を維持し、従って９０℃までの温度でかつ追加の陽イオンの存在なしで純粋な２回蒸留水中で、安定した状態を維持できる。さらに、これらの対象物は大幅に延長された寿命、すなわちヌクレアーゼ活性に対する耐性の強化を示す。非架橋及び架橋対象物の低温電子顕微鏡（クライオＥＭ）構造解析は、照射後もクロスオーバーの全体的な形状と内部ネットワークが維持されることを示した。生理学的イオン強度で決定されたＣＰＤ安定化多層ＤＮＡ折り紙対象物のクライオＥＭ地図は、実質的な膨潤挙動を明らかにし、この挙動はおそらく反発静電力によって引き起こされ、これは、共有結合安定化なしでは、低イオン強度で脱集成を引き起こすであろう。我々の方法は、ＤＮＡナノ構造体を、より広い範囲の条件で従って様々な分野で応用するための新しい道を開く。
【０１０８】
実施例１
アプローチと達成された結果の一般的な説明
ピリミジンダイマーは、ＤＮＡの光化学反応によって生成される分子的障害である53。紫外線は、チミン（Ｔ）又はシトシン（Ｃ）塩基中のＣ＝Ｃ２重結合での反応を通じて共有結合の形成を誘導する（図１、左）。一般的な生成物は、チミンダイマーを含むシクロブタン−ピリミジンダイマー（ＣＰＤ）である。（６−４）ピリミジン−ピリミドン及びデュワー異性体などのマイナーな副産物も、紫外線照射で形成される可能性がある。これらの障害は、ＤＮＡの複製と転写を停止させる可能性があるため、発癌性であり、細胞のＤＮＡ修復機構の標的となる54。１９８２年にLewis and Hanawaltは、ＣＰＤが、相補的ＤＮＡ鎖をテンプレート化することによりまとめられた別々のＤＮＡ鎖中の隣接する末端チミンからも、形成される可能性があることを報告した55。しかし、ＤＮＡナノテクノロジーにおける安定性の問題を解決するためのこの知見の可能性は、これまで認識されてこなかった。我々の研究の重要な概念は、紫外線照射を介して共有ＣＰＤ結合を導入するための部位を合理的に作成するための、ユーザーに定義されたＤＮＡナノ構造体内のチミジンの近接した配置である。これらの追加の結合を使用して、遊離鎖末端を連結して、クロスオーバー部位で発生する鎖切断を除去し、追加のらせん間接続を作成することができる（図１、右）。
【０１０９】
ＤＮＡナノテクノロジーの基本的な構成要素は、２重らせんＤＮＡドメインである。ＤＮＡ折り紙対象物では3,4,56、これらのドメインは、短い１本鎖ステープルオリゴヌクレオチドのセットを長い１本鎖足場分子にハイブリダイゼーションすることによって形成される。ＤＮＡタイル−レンガ対象物16などの他のタイプのＤＮＡナノ構造体では、２重らせんドメインは、１本鎖オリゴヌクレオチド間でのみ形成される。ＤＮＡ折り紙とタイルレンガ対象物には何百もの１本鎖の切れ目が含まれ、これは弱点である。これは、遊離端が、絡み合った２重らせんドメインの形成だけでなく溶解も可能にするためである。標的対象物の自己集成後に１本鎖切断を除去するためのオプションを作成するために、我々は両方の鎖末端に追加のチミジンを含むＤＮＡ鎖を調製する（図１Ａ、モチーフ１）。追加された塩基はワトソン−クリック塩基対の形成に関与しないが、チミジンは折り畳まれた対象物の１本鎖切断部位で近接し、これが、波長３１０ｎｍの光の照射によって２つのチミジン間にＣＰＤ結合を形成することを可能にする。
【０１１０】
ＤＮＡ対象物において２重らせんドメインは、通常半クロスオーバーとダブルクロスオーバーの両方を含む逆平行１本鎖クロスオーバーによって形成されるらせん間接続によって、隣接する２重らせんドメインに接続される（図１Ａ、モチーフ２対モチーフ３）。例えば、ＤＮＡタイルレンガ対象物はほぼ排他的に半クロスオーバーを介して接続されるが、ＤＮＡ折り紙対象物では両方のタイプのらせん間接続が発生する可能性がある。クロスオーバー位置は、らせん方向の主鎖結合が中断されているため、ＤＮＡナノ構造体の弱点も表す。自己集成後に弱いリンクを閉じるためのオプションを作成するために、図１Ａ（モチーフ２及び３）に示すように、我々は、クロスオーバー位置のステープル鎖に追加の不対チミジン塩基を追加することができる。近接を利用して、３１０ｎｍの光を再度照射すると、らせん方向に沿って鎖を共有結するＣＰＤ結合の形成が誘発され（図１Ｂ、モチーフ２及び３）、こうしてらせんの巻き戻しに別のトポロジー的障害が生じる。ＤＮＡ対象物を設計する場合、鎖のクロスオーバーは通常、らせん状の主鎖が互いに接近する位置で、隣接する２重らせん状ドメインの間に配置される。鎖のクロスオーバーを補完するものとして、光によって誘発されるＣＰＤダイマー結合を利用して、対象物の自己集成後に追加のらせん間結合を作成することもできる。この目的のために、隣接するＤＮＡらせんの主鎖が大まかに整列する位置に、１本鎖チミジンループ（Ｔループ）を配置する（図１Ａ、モチーフ４）。次に、３１０ｎｍでの照射により、らせん間共有結合の作成を誘導することができる（図１Ｂ、モチーフ４）。
【０１１１】
概念証明：高温及び低塩安定性
我々の方法を試験するために、多層ＤＮＡ折り紙対象物のいくつかの変種で、図１に示す設計変更を行った。融解実験（図２、左）と溶液から陽イオンを除去した実験（図２、右）で、波長３１０ｎｍの光を照射した後に得られた対象物の安定性を試験した。全ての鎖末端と全ての鎖クロスオーバー位置の両方に追加のチミジンを挿入することにより、ハニカムパッキング形状（図６）のレンガ様多層ＤＮＡ折り紙57対象物を修飾した。ゲル電気泳動で見られるように、折り畳まれた対象物を示すバンドの消失と遊離ステープル鎖の出現（図２Ａ、左ゲル）により、非照射対照試料が約５０℃で分解する（「広がる」）ことが分かった。対照的に、照射された試料は、折り畳まれた物の電気泳動移動度がほとんど変化しないままであるという事実から判断して、その全体的な形状を９０℃まで維持した。高い電気泳動移動度でのわずかなしみは、高温で折り畳まれた対象物からのいくつかの鎖がまだ分離していることを示す。しかしながら、分離した鎖は電気泳動移動度がはるかに低く、従って、溶融した非照射対照試料から出現したステープル鎖よりも質量が大きかった。照射された対象物の高温耐性とより高質量の鎖の出現は、紫外線照射により、設計されたチミジン部位に共有結合架橋がうまく導入されたことの証拠を提供する。
【０１１２】
また我々は、溶液から陽イオンを除去した場合の、照射試料と非照射試料の安定性を試験した。濾過を使用して緩衝液を交換し、試料を、連続的に濃度が低下する一価塩化ナトリウムを含む２回蒸留水に溶解した（図２Ａ、右）。照射された試料は、陽イオンが添加されていない２回蒸留水中でも折り畳まれたままであったが、非照射対照は、強い移動度シフトと高い移動度を有する１本鎖の出現によって明らかなように、３００〜１５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の間で分解した。純水に溶解した照射試料の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）イメージングにより、予測された形状の粒子が明らかになった（図７）。純水中の試料の不均一性の程度は、高塩条件下よりも少し高かった。純水中で最大１日保存した後の電気泳動分析では、電気泳動の移動度に変化は見られず、折り畳まれた対象物から分離したステープル鎖は検出できなかった（図８）。従って、単純な設計変更と紫外線照射により、生理学的条件（約１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）及びさらに低いイオン強度条件下での使用のための、通常は非常に陽イオンに敏感な多層ＤＮＡ折り紙の安定化が可能になる。紫外線安定化後は、他の多くの過酷な環境も利用できる可能性がある。簡単な証明として、我々は、陽イオンを添加していないジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；有機溶媒）の水性混合物に、架橋対象物を溶解した（図９）。
【０１１３】
２番目の例として、全ての鎖末端と全てのクロスオーバー位置の余分なチミジン意外に、１本鎖Ｔループ（図１のモチーフ４）も挿入したレンガ様対象物の変種を調製し試験した（図１０）。照射後の熱的及び陽イオン的安定化の程度（図２Ｂ）は、１本鎖Ｔループを欠くデザイン変種に類似していた。１、３、及び５個のチミジンを含むループを試験した。５−Ｔループを有する変種は、ゲル電気泳動のバンド強度から判断すると、高温（８０℃）で安定化の程度が徐々に大きくなった（図１１）。らせん間結合のための追加の５−Ｔループを有するレンガ変種に照射すると、非照射対照と比較して電気泳動移動度がわずかに増加すること（図２Ｂ、レーンＲ２対レーンＲ１）がわかり、これは、追加のらせん間結合が、ある程度の圧縮又は機械的安定化をもたらし得ることを示唆している。
【０１１４】
３番目の例として、我々は、方形格子パッキング形状の多層ＤＮＡ折り紙である前述の「ポインター」対象物13を選択し、全ての鎖末端と全てのクロスオーバー位置に追加のチミジンを加えた（図１２）。レンガの変種に関しては、紫外線照射が、この対象物を９０℃までの温度の暴露に対して安定化させ、ポインター対象物は陽イオンなしで純水に溶解することができる（図２Ｃ）。電気泳動移動度分析（図２Ｃ）及びＴＥＭイメージング（図１３）により明らかなように、照射していない対照ポインター試料はすでに４５℃〜５０℃の間で分解され、折り畳まれたままであるためには、溶液中に３００ｍＭ超のＮａＣｌが必要であった。我々の方法を確立する過程で、紫外線照射への曝露時間などのいくつかのパラメータを試験した。さらに我々は、de-Bruijnアッセイ58を使用して欠陥分析を行い、紫外線照射時のＤＮＡ対象物中の２重らせんドメインの構造的完全性を評価した。我々の紫外線構成に約２時間曝露すると、構造劣化の兆候無しで（図１６）、試験した全ての構造で最も効率的な安定化が実現する（図１４及び図１５）。より短い照射時間では、架橋は完全ではなく、これは、紫外線処理前の融解温度を大幅に超える温度に曝露されると構造体は生き残れないことを意味する。最適な照射時間よりも長い照射時間の場合、対象物の電気泳動移動度が連続的に低下することに反映されるように、構造的な放射線損傷が蓄積された。従って、紫外線照射への曝露はGoldilocks原理に従う。最適な照射時間は紫外線源の詳細やその他のパラメータに依存するため、我々の最適な照射時間は必ずしも他の状況で維持されるとは限らない。ただし、ユーザーは、我々が実行したのと同様のスクリーニングを使用して、最適な照射時間を特定することができる。
【０１１５】
はじめに概説したように、我々の方法はシクロブタン−ピリミジンダイマーに依存しており、これは、Ｔ−Ｔ間だけでなく、例えばＴ−Ｃ接点間でも形成される可能性がある。例として、全ての鎖末端及び全ての鎖クロスオーバー位置で、Ｔ−ＴとＴ−Ｃを使用して調製したレンガ変種の架橋効率を比較した（図１７）。紫外線曝露後の高温への曝露に耐える構造体の量に基づくと、Ｔ−Ｔ結合はＴ−Ｃ接点よりも大幅に効率的に形成され、完全な安定化につながる。架橋は、３１０ｎｍの光に曝露することでうまく機能した。３６５ｎｍのＵＶＡ光への曝露によってもＣＰＤ結合が形成される可能性があると報告されているが（図１８）、３６５ｎｍのようなより長い波長では、安定化が得られなかった59。
【０１１６】
生理学的条件下での安定性
我々の紫外線架橋法は、生理学的条件下での用途のために、ＤＮＡナノ構造体、特に多層ＤＮＡ折り紙対象物の安定性を実質的に高めるために使用され得る。証明として、我々は、全てのステープル末端と全てのクロスオーバー位置に追加のＴを含むレンガ様多層ＤＮＡ折り紙対象物をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、対象物を３７℃の生理学的温度でインキュベートした。３７℃のＰＢＳで２日間保存した後でも、照射され共有結合で架橋された試料の分解は検出されなかった（図３Ａ）。対照的に、非照射対照は、これらの条件に曝露後、数分以内に分解された。照射されたレンガ試料のデザイン変種が生理学的温度及びイオン強度で安定したままであった程度から判断すると、全ての鎖末端に、全てのハーフ及び全クロスオーバー位置に追加のＴ塩基を有したデザイン変種について、安定化は完全と思われた。遊離鎖末端とクロスオーバーのサブセットのみを連結することは、完全な構造を維持するのに十分な効果がなかった（図１９）。３７℃の１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中で、照射されたレンガ試料は数時間生存し、非照射対照よりも大幅に長く生存した（図３Ｂ）。血清では、おそらく、折り畳まれた構造体の消失は、溶液の低いイオン強度ではなく、酵素活性によって引き起こされた。血清などの生理学的流体には、ＤＮＡ分子を消化するための様々なエキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼが含まれている。様々なヌクレアーゼの活性を解明するために、我々は、鎖末端、全てのクロスオーバー位置、及びＴループでＴを特徴とするレンガ様多層ＤＮＡ折り紙対象物を、そのような酵素のパネルに曝露した（図３Ｃ）。ＥｘｏＶＩＩＩやＴ７Ｅｘｏなどの一部の酵素は、デフォルトでは、照射されているかどうかに関係なく、レンガの試料では不活性のようである。ただし、その他（ＥｘｏＩｅ、ＥｘｏＴ、Ｔ７Ｅｎｄｏ、ＥｘｏＩＩＩなど）の場合、照射による追加の共有結合の導入により、非照射対照試料と比較して、架橋対象物の寿命が大幅に延長された。最も活性の高いＤＮＡ分解酵素はデオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅＩ）であった。血漿活性レベル６０でＤＮａｓｅＩを使用したレンガ様対象物の消化の速度論的分析により、照射されて安定化されたレンガ試料は、非照射対照よりもはるかにゆっくりと消化されることが明らかになった。バンド強度の分析により、架橋によって試験された条件下で、１０分から６０分への約５倍〜６倍の寿命の延長が明らかになった（図３Ｄ）。鎖末端及び全てのクロスオーバー位置で余分なＴのみを特徴とするレンガ変種（らせん間Ｔループがない）は、ＤＮａｓｅＩ消化に対する回復力がやや弱かった（図２０）。
【０１１７】
紫外線架橋多層ＤＮＡ折り紙対象物のクライオＥＭ構造解析
ＤＮＡ対象物の構造に対する紫外線照射とＣＰＤ結合形成の影響を解明するために、単粒子クライオＥＭを使用して５つの電子密度地図を例示的に決定した（図４、Ａ〜Ｃ）。最初に、全ての鎖末端と全ての鎖クロスオーバー位置に追加のＴを含む非照射対照多層レンガ試料の単粒子クライオＥＭデータを採取した（図２１）。再構築された３Ｄ−ＥＭ密度地図は、予測された全体的に長方形のレンガ様形状を明らかにした（図４Ａ）。しかし、対象物は全体的なねじれ変形も示し（図４Ｄ）、その範囲は、追加のＴ17を欠く同様のレンガ様対象物の以前の解析に基づいて予測されたものよりも顕著であった。おそらく、追加されたＴはクロスオーバー部位の柔軟性を高め、これがらせんのパッキング形状に影響を与える可能性がある。我々は、ねじれ変形のキラリティーは断層撮影の傾斜シリーズを使用して右利きであると判定した。
【０１１８】
第２に、我々は、紫外線照射後のレンガ様対象物の単粒子クライオＥＭデータを採取した（図２２）。再構築された３Ｄ−ＥＭ密度地図は、全体的に長方形のレンガ様形状を再度明らかにした（図４Ｂ）。照射後、右巻きの全体的なねじれは大幅に減少した（図４Ｄ）。ねじれの減少は、クロスオーバー部位での追加の共有結合の生成の原因であると考えられ、これは、接合の柔軟性を低下させ、らせんをデフォルトのハニカムパッキング設計に近い形状で再度整列させる。以前、Chenと共同研究者らは、放射線による損傷を調べるために単層ＤＮＡ折り紙の長方形に紫外線を照射し、ねじれを低減する平坦化効果を観察した61。しかし、Chenと共同研究者らの試料は、チミジン−チミジン架橋部位を含むように特別に設計されていないため、ねじれの除去につながるメカニズムは我々の試料とは異なる場合がある。
【０１１９】
第３に、我々は、照射されたレンガ様対象物が生理的イオン強度のＰＢＳ緩衝液に溶解された後、それの単一粒子クライオＥＭデータを採取した（図２３）。得られた３Ｄ−ＥＭ密度地図は、再度全体的に長方形のレンガ様形状を示した（図４Ｃ）。これらの３つのクライオＥＭ地図の切片ごとの比較は、クロスオーバーの内部ネットワークが、照射及び低イオン強度条件への曝露後に保存されていることを示す（図４Ｅ、図２４）。低（生理学的）イオン強度で架橋試料に対して決定されたクライオＥＭ密度地図の全体的なアスペクト比は、マグネシウムの存在下でより高いイオン強度で決定されたクライオＥＭ密度地図とは異なっていた（図４Ａ〜Ｃ及びＦ）。対象物の断面は、生理学的条件で約１５％拡大し、らせん方向に約８％縮小した。この変形はおそらく、ＰＢＳ緩衝液内の強い静電反発力の結果であり、これがらせんを互いに遠ざけている。紫外線照射がなければ、これらの力は通常、対象物の分解につながる。しかし、紫外線露光後の追加の共有ＣＰＤ結合は、２重らせんＤＮＡドメインの巻き戻しと解離を防ぐ。
【０１２０】
最後に、我々は、紫外線照射の前及び後に、それぞれらせん間結合用の追加のＴループを用いて設計されたレンガ様変種の単一粒子クライオＥＭデータも採取した。結果として得られた３Ｄ−ＥＭ密度地図は、予測される全体的に長方形のレンガ様形状を再度明らかにした（それぞれ図２５及び図２６）。しかし、内部クロスオーバー格子は、追加のＴループがないデザイン変種よりも十分に分解されず、我々は、これは、追加の柔軟なＴループの存在によって引き起こされるこれらの試料中の分子の不均一性が、より顕著であるためであると考えている。
【０１２１】
界面を通過する共有結合コンフォメーション状態と高次集成体
塩基対形成したチミジンの標的化導入により、結合界面を通過するＤＮＡベースのメカニズムと高次集成体とを共有結合で架橋することが可能になる。ここでは、既に記載されている２状態スイッチ11を用いてコンフォメーション状態をロックする可能性を示す（図２７）。スイッチを閉じた状態は、２つの横棒の形状補完面が直接接触すると、塩基対スタッキング接点によって、安定化される（図５Ａ）。対象物は、温度を上げ下げするか、塩化マグネシウムなどの陽イオンを加えることで、２つの状態を切り替えることができる。
【０１２２】
我々は、閉じた状態では、平滑末端の塩基対スタッキング接点に直接配置された末端チミジンは、紫外線照射時のＣＰＤダイマー結合の形成を可能にするのに十分に近接していると仮定した。スイッチのデザインには、そのようなＴＴスタッキング接点がすでにいくつか含まれていた。３０ｍＭ  ＭｇＣｌ2（閉じた状態を安定化する）の存在下でのスイッチに対する紫外線照射の影響の時間分解解析は、３０分の曝露後、粒子の約８０％が閉じた状態で不可逆的に捕捉されたことを示す。これは、通常５ｍＭ  ＭｇＣｌ2でスイッチを開かせる低イオン強度条件下でのゲル電気泳動のバンドパターンから、結論付けられる（図５、Ｂ及びＣ）。従って、ＣＰＤ結合はまた、近接して保持されている完全に分離した２重らせんＤＮＡドメイン間でも形成される可能性がある。
【０１２３】
さらに、我々は、形状補完的な塩基対スタッキング接点を介して高イオン強度で、線形フィラメントにオリゴマー化する前述の多層ＤＮＡ折り紙レンガ（図２８）を用いて、高次の集成体を安定化させる可能性を示す11。デフォルトでは、溶液のイオン強度が再度低下すると、フィラメントは溶解する（図５Ｅ）。塩基対スタッキング接点にＴＴモチーフを配置することにより、高次フィラメントも単純な紫外線照射によって共有結合的に安定化することができる。その結果、ＴＥＭイメージングにより明らかなように、フィラメントは低イオン強度条件に再度さらされても解離しない（図５Ｅ）。特定のコンフォメーション状態又は高次集成体を安定化する可能性は、生理学的又は低イオン強度条件での応用のために、多くのサブユニットから構築された容器又はメカニズムを調製するのに特に有用となり得る。図１に示すような内部デザインと、図５に示すような界面結合スキームを組み合わせると、広範囲の条件に耐えるサブユニットと高次の集成体を生成することができるであろう。
【０１２４】
考察
我々の方法のユーザーは、ＴＴ配列モチーフを作成することによりＤＮＡ集成体内の共有結合の部位を簡単に定義することができ、ここで２つのＴは２重らせんドメイン内に配置する必要はない。バクテリオファージ由来の足場鎖自体がすでに複数のＴＴ及びＡＡモチーフを含んでいたため、本明細書で研究された対象物は、デフォルトでＣＰＤ結合形成のためのいくつかの部位を特徴としていた。照射時の望ましくないＣＰＤダイマーの形成を抑制し、所望の場合は余分なＴの挿入を回避するために、将来新しいカスタム足場配列を開発することができる。設計上、これらの配列はＴＴモチーフを欠いてもよく、ハニカム又は方形格子パッキング形状の内部接合間隔ルールに対応する一定の間隔のＡＡモチーフを特徴としてもよい。タイルレンガ構造体15などの足場のないＤＮＡ対象物は、紫外線照射による共有結合を可能にするために、クロスオーバーと鎖末端にＴＴモチーフを選択的に配置する配列を使用して、特別に設計することもできる。我々の結果は、チミジンの単なる近接が、紫外線照射による共有結合の形成をテンプレート化するのに十分であることを示す。さらにチミジンは、これらの結合を形成するために、必ずしも２重らせん内に配置される必要はない。
【０１２５】
ここに示されたクライオＥＭ地図は、ＤＮＡ対象物が紫外線処理後も全体的な形状を維持していることを示す。我々の地図はまた、ＤＮＡナノテクノロジーの構造データの本体に追加され、設計の詳細と結果として生じる形状との関係を理解するのに役立つ。例えば我々は、生理学的イオン強度で多層ＤＮＡ折り紙クライオＥＭ地図を提示した。以前は、これらの条件下では対象物が「爆発」するため、これらの構造を分析することはできなかった。生理学的条件における我々のクライオＥＭ地図は、実質的な膨潤挙動を明らかにし、これは全体的な形状への静電気の寄与を理解するのに役立つ。生理学的条件についての将来の設計では、仕様に従って形状を生成するために膨潤挙動を考慮する必要がある。我々の方法は、特に構造的に複雑な多層３Ｄ  ＤＮＡ対象物に対して、ＤＮＡベースのナノテクノロジーの幅広い適用性を支持し、これはおそらく設計者に魅力的な自由度を提供するが、環境条件に対してより敏感になる傾向がある。簡便性、配列のプログラム可能性、及びスケールアップ可能性のために、紫外線照射による共有結合は、様々な分野の広範な条件でのＤＮＡナノ構造体の応用への道を切り開くのに役立つであろう。
【０１２６】
実施例２
材料と方法
２．１．  ＤＮＡ折り紙対象物の折り畳み
反応混合物は、それぞれ２０ｎＭ濃度の足場ＤＮＡと２００ｎＭ濃度のオリゴヌクレオチド鎖を含有した。折り畳み緩衝液は、５ｍＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８）、及び２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含有した。反応混合物は、TETRAD (MJ Research, 現在はBio-Rad) 熱サイクリング装置を使用して熱アニーリング傾斜に付した。オリゴヌクレオチドEurofins MWG (Ebersberg, Germany)から購入した。
・  「ＴＴモチーフ１〜３を有するレンガ様対象物」を作成するために使用される２１３個のオリゴは、配列リストに配列番号１〜２１３で示される。
・  「ＴＴモチーフ１〜４を有するレンガ様対象物」を作成するために使用される１７６個のオリゴは、配列リストに配列番号２１４〜３８９で示される。
・  「ポインター」対象物を作成するために使用される１５９個のオリゴは、配列リストに配列番号３９０〜５４８で示される。
・  「スイッチ」対象物を作成するために使用される２０６個のオリゴは、配列リストに配列番号５４９〜７５４で示される。
・  「重合レンガ」対象物を作成するために使用される２１１個のオリゴは、配列リストに配列番号７５５〜９６５で示される。
【０１２７】
以下の表は、この試験で説明した対象物を組み立てるために使用された折り畳み傾斜を示す。
【表１】
2021526376.tif 000003
【０１２８】
２．２．  ＤＮＡ折り紙対象物の精製と濃縮
折り畳み反応後、全ての反応生成物を１回のＰＥＧ沈殿を使用して精製した63。得られたペレットを、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む折り畳み緩衝液（５ｍＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＮａＣｌ）に溶解した。最終容量は、１００ｎＭのモノマー濃度が得られるように選択した。試料は、振盪インキュベーター（EppendorfのThermomix comfort）で３０℃、４５０ｒｐｍで一晩平衡化した。全ての操作は前述のように行った64。
【０１２９】
２．３．  紫外線照射
紫外線照射には、３１０ｎｍを中心とする高透過率帯域フィルター（Asahi SpectraのXAQA310）を備えた３００Ｗのキセノン光源（Asahi SpectraのMAX-303）を使用した。ライトガイド（Asahi Spectra）を使用して、０．６５ｍｌの反応チューブの上に直接光源を配置することにより、試料に光源を連結した。特に他に明記されない限り、レンガ様試料は１３５分間照射し、ポインターの試料は１２０分間、重合するレンガの試料は３０分間照射した。特に他に明記されない限り、試料は３０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む折り畳み緩衝液（５ｍＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＮａＣｌ）中で照射された。
【０１３０】
２．４．  濃縮のための限外濾過と緩衝液交換
全ての試料（架橋及び非架橋）を３回の限外濾過（１００ｋカットオフのAmicon Ultra 500μl）に付した。限外濾過は、２０℃及び７ｋの相対遠心力（Eppendorf 5424R）で行った。緩衝液を、折り畳み緩衝液（５ｍＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＮａＣｌ；５ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む）、ＰＢＳ、又は３００、１５０、１００、５０、２５、又は０ｍＭ  ＮａＣｌを添加した２回蒸留水に交換した。極低温電子顕微鏡法に使用される試料は、１，０００ｎＭに濃縮した。
【０１３１】
２．５．  ＤＮＡ折り紙対象物のゲル電気泳動
特に他に明記されない限り、試料は、０．５ｘトリスホウ酸−ＥＤＴＡと５ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む２．０％アガロースゲルで、水浴又は氷浴に浸したゲルボックス内で９０Ｖバイアス電圧で約２時間電気泳動した。試料は、約５ｎＭのモノマー濃度でゲルに載せた。電気泳動したアガロースゲルを、Typhoon FLA 9500レーザースキャナー（GE Healthcare）を使用して２５μｍ／ピクセルの分解能でスキャンした。得られた１６ビットｔｉｆ画像を、ImageJ 1.440を使用して分析した。
【０１３２】
２．６．  陰性染色透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）：データの準備、取得、及び処理
試料を、グロー放電、コロジオン支持、カーボンコーティング（１０ｎｍ）Ｃｕ４００  ＴＥＭグリッド（内製）に吸着させ、２５ｍＭ水酸化ナトリウムを含む２％ギ酸ウラニル水溶液を使用して染色した。使用した緩衝液／溶媒に応じて、試料を１５〜３００秒間インキュベートした。低濃度の正に帯電したイオンを含む溶媒に溶解した試料には、より高いモノマー濃度（５０  ｎＭ）とより長いインキュベーション時間を使用した。１０，０００倍〜３０，０００倍の倍率を使用してデータを取得した。イメージングは種々の顕微鏡で行った。以下の表を参照されたい。
【表２】
2021526376.tif 000004
【０１３３】
図で使用されているＴＥＭ顕微鏡写真は、長距離染色勾配を除去するために高域フィルター処理され、コントラストは自動レベリングされた（Adobe Photoshop CS6）。２Ｄ画像処理については、RELION-2ピッキングルーチンを使用した粒子ピッキングによって、個々の粒子顕微鏡写真のライブラリを作成した65。平均２Ｄ粒子顕微鏡写真の作成は、RELION-2を使用して行った65。通常、約２，０００個の個々の粒子が平均化された。
【０１３４】
２．７．  クライオ電子顕微鏡法：データの準備、取得、及び処理
ＴＴモチーフ１〜３を有するレンガ様対象物について、７００ｎＭ〜８５０ｎＭの濃度を使用した。試料を、Ｃ−Ｆｌａｔ  １．２／１．３、１．２／１．３厚、２／１又は２／２厚グリッド（Protochips）に適用した。プランジ凍結は、FEI Vitrobot Mark V装置を使用して、ブロット時間３秒、ブロット力−１、ドレイン時間０秒で、湿度９５％及び２２℃で行った。ＴＴモチーフ１〜４を有するレンガ様対象物については、５６０ｎＭ〜８００ｎＭの濃度を使用した。試料を、Ｃ−Ｆｌａｔ  １．２／１．３、２／１、又は２／２厚のグリッドに適用した。プランジ凍結は、FEI Vitrobot Mark Vを使用して、ブロット時間３秒、ブロット力−１、ドレイン時間０秒で、湿度９５％及び２２℃で行った。自動データ採取は、３００ｋＶで動作し、まずFalconIII直接検出器（ＦＥＩ）を備えたTitan Krios G2電子顕微鏡（ＦＥＩ）で行った。単一粒子にはＥＰＵを使用し、傾斜シリーズの取得にはＦＥＩ断層撮影を使用した。様々な条件下での全てのレンガ様対象物について、１５フレーム、１．５秒〜２秒の露光時間、及び６０ｅ-／Å2の総線量で構成されるムービーを、Falcon III（ＦＥＩ）直接電子検出カメラで、２．３Åの拡大ピクセルサイズで２９，０００倍のキャリブレーションされた倍率の分割モードで記録した。−１〜−３μｍの範囲のデフォーカス値を使用した。記録された動画はMotionCor267でモーション補正し、続いてコントラスト伝達関数パラメータをCTFFIND4.168で推定し、その後の全ての処理工程はRELION-2.165,69で行った。各データセットについて、自動ピッキングの基準値は、手動で選択された約５，０００個の粒子から計算した。選択された粒子を使用して、基準なしの２Ｄ分類を複数回実行した。目視検査によって判断された最良の２Ｄクラス平均を選択した。初期モデルは、CanDoによって作成されたｂｉｌｄファイルから作成された。３Ｄ分類を複数回行った後、最も多くの特徴を示すクラスを３Ｄ自動改良用に選択し、続いて、手動で選択された様々なＢ因子を用いて、改良された地図を尖鋭化するための後処理を行った。ねじれ方向の検証のためのクライオトモグラムは、ＦＥＩ断層撮影で２．３Åの拡大ピクセルサイズに対応する２９，０００×のキャリブレーションされた倍率で−３μｍのデフォーカス値を用いて得られた。５０°まで２°の増分で双方向傾斜としてセッションを設定し、画像あたりの線量は約２ｅ-／Å2に設定した。得られた傾斜シリーズは、IMOD4.9ルーチンで処理した70。
【０１３５】
２．８．  追加の実験
２．８．１  図２に示す結果につながる実験
試料を折り畳んでＰＥＧ精製し、ＭｇＣｌ2濃度を３０ｍＭに調整した。紫外線照射後、超遠心分離を使用して緩衝液を標的緩衝液／溶媒に交換した。ゲル電気泳動の前に、試料を室温で約２〜３時間インキュベートした。温度スクリーニング用の試料を、示された温度で３０分間インキュベートした。陰性染色ＴＥＭの試料を５０ｎＭのモノマー濃度で調製し、グリッド上で３〜５分間インキュベートした。
【０１３６】
２．８．２  図３に示す結果につながる実験。
図３Ｂでは、１０％ウシ胎児血清（熱不活化されていない、Gibco（登録商標）、A3160801、Thermo Fisher Scientific）を補足した折り畳み緩衝液（５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）中の安定性スクリーニングを、２０ｎＭのモノマー濃度で３７℃で示された時間行った。試料を液体窒素で凍結し、アガロースゲル電気泳動を使用して分析した。
図３Ｃでは、全てのヌクレアーゼをNewEngland Biolabsから購入し、供給されたメーカーの緩衝液中で１００Ｕ／ｍＬの濃度で使用した。試料（１０ｎＭ）を３７℃で２４時間インキュベートした。
図３Ｄにおいて、ＤＮａｓｅＩヌクレアーゼ消化に対する安定性の経時変化を、供給されたＤＮａｓｅＩ緩衝液中のモノマー濃度１０ｎＭで３７℃で調べた。
【０１３７】
２．８．３  図５に示す結果につながる実験：
図５では、スイッチの照射時間スクリーニングを三重測定で行った。照射量は、５ｎＭのモノマー濃度で２５μｌであった。図５Ｂに示すゲルの分析において、我々は、閉じた粒子を含むバンドと、開いた粒子と閉じた粒子を含むバンドとの比率を計算した。各バンドのグレースケール値は、積分によって得た。図５Ｃのデータポイントは平均を表し、誤差棒は３つの独立した実験の標準偏差を表す。フィラメントの集成のために、モノマーを折り畳んでＰＥＧ精製した。ペレットを折り畳み緩衝液（５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）に溶解して、１００ｎＭのモノマー濃度を得た。平衡化後、ＭｇＣｌ2濃度を２０ｍＭに調整し、試料を４０℃で３日間TETRAD中でインキュベートしてフィラメントを得た。試料の一部を３１０ｎｍで３０分間照射した。ＥＤＴＡの添加によりＭｇＣｌ2濃度は５ｍＭに低下させた。
【０１３８】
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【０１３９】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施態様によって範囲が限定されるものではない。実際、本明細書の記載に加えて、本発明の様々な修正が、前述の説明から当業者には明らかになるであろう。このような修正は、添付の特許請求の範囲内に含まれることを意図している。
【０１４０】
本明細書で引用される全ての特許、出願、刊行物、試験方法、文献、及び他の引用資料は、それぞれの特許法の下で可能な範囲で、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2021526376.tif 000005
【図２】
2021526376.tif 000006
【図３】
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【図４Ａ−Ｄ】
2021526376.tif 000008
【図４Ｅ−Ｆ】
2021526376.tif 000009
【図５Ａ−Ｃ】
2021526376.tif 000010
【図５Ｄ−Ｅ】
2021526376.tif 000011
【図６】
2021526376.tif 000012
【図７】
2021526376.tif 000013
【図８】
2021526376.tif 000014
【図９】
2021526376.tif 000015
【図１０】
2021526376.tif 000016
【図１１】
2021526376.tif 000017
【図１２】
2021526376.tif 000018
【図１３】
2021526376.tif 000019
【図１４Ａ】
2021526376.tif 000020
【図１４Ｂ】
2021526376.tif 000021
【図１４Ｃ】
2021526376.tif 000022
【図１５】
2021526376.tif 000023
【図１６】
2021526376.tif 000024
【図１７】
2021526376.tif 000025
【図１８】
2021526376.tif 000026
【図１９】
2021526376.tif 000027
【図２０】
2021526376.tif 000028
【図２１】
2021526376.tif 000029
【図２２】
2021526376.tif 000030
【図２３】
2021526376.tif 000031
【図２４】
2021526376.tif 000032
【図２５】
2021526376.tif 000033
【図２６】
2021526376.tif 000034
【図２７−１】
2021526376.tif 000035
【図２７−２】
2021526376.tif 000036
【図２８−１】
2021526376.tif 000037
【図２８−２】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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