(57)【要約】  本明細書では、細胞中でＳＭＮタンパク質の発現を増強するための組成物および方法が提供される。一実施形態では、組成物は、ヒトＳＭＮ２遺伝子のＩＳＳ−Ｎ１領域を標的とする部位特異的ヌクレアーゼを含む。脊髄性筋萎縮症を処置するまたは寛解させるための組成物および方法も提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼまたはそれをコードする核酸；および
（２）ヒトＳＭＮ２遺伝子のＩＳＳ−Ｎ１領域を標的とする、ｇＲＮＡまたはそれをコードする核酸、
を含む組成物。
【請求項２】
ＩＳＳ−Ｎ１領域は配列番号１を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＣａｓヌクレアーゼまたはｇＲＮＡをコードする核酸を含み、核酸はウイルスベクターに含有されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
細胞に導入されると、細胞中でＳＭＮタンパク質の発現を増強することができる、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
細胞中でＳＭＮ２  ｍＲＮＡのエクソン７の包含が増大する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
ＳＭＡを有する対象に投与されると、ＳＭＡの少なくとも１つの症状を寛解させることができる、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
対象の運動ニューロン中でＳＭＮ２  ｍＲＮＡのエクソン７の包含が増大する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
対象に投与されると、ＳＭＡを有する対象の運動ニューロン中で改変ＩＳＳ−Ｎ１を生成することができる、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
第２のｇＲＮＡをさらに含み、第１および第２のｇＲＮＡは、細胞に導入されると、細胞中でＩＳＳ−Ｎ１領域のヌクレオチド配列を欠失させることができる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
細胞に導入されると、細胞中で改変ＩＳＳ−Ｎ１を生成することができ、改変ＩＳＳ−Ｎ１を標的とする第２のｇＲＮＡまたはそれをコードする核酸をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
ヒト細胞中でＳＭＮタンパク質の発現を増強する方法であって、ヒト細胞に、
（１）ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼまたはそれをコードする核酸；および
（２）ヒトＳＭＮ２遺伝子のＩＳＳ−Ｎ１領域を標的とする、ｇＲＮＡまたはそれをコードする核酸、
を含む組成物を導入することを含む方法。
【請求項１２】
組成物はＣａｓヌクレアーゼまたはｇＲＮＡをコードする核酸を含み、核酸はウイルスベクターに含有されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞は運動ニューロンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
細胞中でＳＭＮ２  ｍＲＮＡのエクソン７の包含が増大する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
細胞中で改変ＩＳＳ−Ｎ１を生成し、組成物は、改変ＩＳＳ−Ｎ１を標的とする、第２のｇＲＮＡまたはそれをコードする核酸をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）に伴う少なくとも１つの症状を有する対象に、
（１）ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼまたはそれをコードする核酸；および
（２）ヒトＳＭＮ２遺伝子のＩＳＳ−Ｎ１領域を標的とする、ｇＲＮＡまたはそれをコードする核酸、
を含む組成物を投与することを含む方法。
【請求項１７】
対象は乳児である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
組成物はＣａｓヌクレアーゼまたはｇＲＮＡをコードする核酸を含み、核酸はウイルスベクターに含有されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
組成物は対象に全身的に投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
組成物は皮下注射によって投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
組成物は静脈内注射によって投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
組成物は対象の中枢神経系に投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
組成物は対象の脳脊髄液に投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
組成物は対象の髄腔内スペースに投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
組成物は筋肉内注射を介して投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
対象においてＳＭＡの少なくとも１つの症状を寛解させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
対象の運動ニューロン中でＳＭＮ２  ｍＲＮＡのエクソン７の包含が増大する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２８】
対象の運動ニューロン中で改変ＩＳＳ−Ｎ１を生成する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２９】
組成物は、改変ＩＳＳ−Ｎ１を標的とする、第２のｇＲＮＡまたはそれをコードする核酸をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願第６２／６５９，１１９号、２０１８年４月１７日に出願、の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は概して、脊髄性筋萎縮症を処置するまたは寛解させるための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）は、乳児死亡の主要な遺伝的死因である。ＳＭＡは、脊髄のアルファ運動ニューロンの変性の特徴を有し、進行性の筋脱力、これに続く呼吸不全にいたる。ＳＭＡは、ＳＭＮ１遺伝子のホモ接合性欠失または変異性に起因する生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質が低レベルであるによって主に引き起こされる。ヒトでは、ＳＭＮタンパク質はＳＭＮ２遺伝子によってもコードされている。しかし、ＳＭＮ２遺伝子は、ＳＭＮ１遺伝子と比較して、エクソン７内に点変異を保有しており、ほとんどのＳＭＮ２  ｍＲＮＡにおいてエクソン７を欠損するスプライシングの変化を招く。結果として生じる短縮型ＳＭＮタンパク質は不安定で、機能が低下している。通常、ＳＭＮ１は十分なＳＭＮタンパク質を産生する。しかし、ＳＭＮ１がホモ接合性変異であると、ＳＭＮ２遺伝子によって機能的なＳＭＮタンパク質は少量しか産生されないということになり、結果的にＳＭＡにいたる。
【０００４】
ＳＭＡを処置するまたは寛解させるために、いくつかのアプローチが探求されてきた。例えば、ＳＭＮ２遺伝子のプレメッセンジャーＲＮＡスプライシングを改変し、それにより完全長ＳＭＮタンパク質の産生を促進するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドが使用されている（Ｆｉｎｋｅｌ  ＲＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｓｉｎｅｒｓｅｎ  ｖｅｒｓｕｓ  Ｓｈａｍ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎ  Ｉｎｆａｎｔｉｌｅ−Ｏｎｓｅｔ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｍｕｓｃｕｌａｒ  Ａｔｒｏｐｈｙ，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ（２０１７）３７７：１７２３−３２；米国特許第７８３８６５７号、を参照されたい）。変異ＳＭＮ１遺伝子の機能的置換も試験され、この遺伝子療法の効能が示されている（Ｍｅｎｄｅｌｌ  ＪＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｉｎｇｌｅ−Ｄｏｓｅ  Ｇｅｎｅ−Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｍｕｓｃｕｌａｒ  Ａｔｒｏｐｈｙ，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ（２０１７）３７７：１７１３−２２）。特に、ＳＭＡのアンチセンスオリゴヌクレオチド媒介性スプライシング補正が、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって最近承認された。しかし、承認された処置は、各年６回の脊髄注射が必要であり、これには、初年で６２５，０００ドル〜＄７５９，０００ドル、以後、毎年約３７５，０００ドルの金額がかかる。加えて、アンチセンスオリゴヌクレオチド媒介性の処置はまた、多くの副作用がある。したがって、ＳＭＡに対する新しい処置法を開発するニーズが継続的にある。
【発明の概要】
【０００５】
一態様では、本開示は、細胞中でＳＭＮタンパク質の発現を増強することができる組成物を提供する。ある特定の実施形態では、組成物は、ヒトＳＭＮ２遺伝子のＩＳＳ−Ｎ１領域を標的とする部位特異的ヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮヌクレアーゼである。
【０００６】
一実施形態では、組成物は、（１）ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼまたはそれをコードする核酸、および（２）ヒトＳＭＮ２遺伝子のＩＳＳ−Ｎ１領域を標的とするｇＲＮＡまたはそれをコードする核酸、を含む。
【０００７】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、ＣａｓヌクレアーゼまたはｇＲＮＡをコードする核酸を含み、核酸はウイルスベクターに含有されている。
【０００８】
本明細書に記載の組成物のある特定の実施形態では、ＩＳＳ−Ｎ１領域は配列番号１（ＣＣＡＧＣＡＴＴＡＴＧＡＡＡＧ）を含む。一部の実施形態では、ＩＳＳ−Ｎ１領域は配列番号１からなる。
【０００９】
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、細胞中でＳＭＮ２  ｍＲＮＡのエクソン７の包含を増大させることができる。
【００１０】
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、対象に導入されると、細胞中で改変ＩＳＳ−Ｎ１を生成することができる。一部の実施形態では、組成物は、改変ＩＳＳ−Ｎ１を標的とする第２のｇＲＮＡまたはそれをコードする核酸をさらに含む。
【００１１】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、ＳＭＡを有する対象に投与されると、ＳＭＡの少なくとも１つの症状を寛解させることができる。
【００１２】
別の態様では、本開示は、ヒト細胞中でＳＭＮタンパク質の発現を増強する方法を提供する。一実施形態では、本発明の方法は、本明細書に記載の組成物をヒト細胞に導入することを含む。
【００１３】
ある特定の実施形態では、細胞は運動ニューロンである。
【００１４】
さらに別の態様では、本開示は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を処置するまたは寛解させるための方法を提供する。一実施形態では、本発明の方法は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）に伴う少なくとも１つの症状を有する対象に、治療有効量の本明細書に記載の組成物を投与することを含む。
【００１５】
本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、対象は乳児である。
【００１６】
本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、組成物は対象に全身的に〔systematically〕投与される。ある特定の実施形態では、組成物は皮下注射によって投与される。ある特定の実施形態では、組成物は静脈内注射によって投与される。
【００１７】
本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、組成物は対象の中枢神経系に投与される。ある特定の実施形態では、組成物は対象の脳脊髄液に投与される。ある特定の実施形態では、組成物は対象の髄腔内スペースに投与される。
【００１８】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象においてＳＭＡの少なくとも１つの症状を寛解させる。一部の実施形態では、対象の運動ニューロン中でＳＭＮ２  ｍＲＮＡのエクソン７の包含が増大する。
【００１９】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある特定の態様をさらに明示するために含まれるものである。本開示は、本明細書に提示の特定の実施形態に関する詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の１つまたは複数を参照することで一層理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ヒトＳＭＮ２遺伝子のエクソン６〜エクソン８領域を示す。イントロン７領域の５’末端の配列が例示されており、ＩＳＳ−Ｎ１領域の配列は下線が引かれている。
【図２】図２は、ｓｇＣａｓ９を使用した、ＩＳＳ−Ｎ１領域を標的とする例示的ｇＲＮＡを示す。ｇＲＮＡ配列中で下線のあるヌクレオチドはＰＡＭを表す。垂直の矢印は、二本鎖切断が導入される位置を示す。
【図３】図３は、ｓａＣａｓ９を使用した、ＩＳＳ−Ｎ１領域を標的とする例示的ｇＲＮＡを示す。ｇＲＮＡ配列中で下線のあるヌクレオチドはＰＡＭを表す。垂直の矢印は、二本鎖切断が導入される位置を示す。
【図４】図４は、２つのｇＲＮＡおよびｘＣａｓ９−３．７を使用したＩＳＳ−Ｎ１領域の欠失を例示する。ｇＲＮＡ配列中で下線のあるヌクレオチドはＰＡＭを表す。垂直の矢印は、二本鎖切断が導入される位置を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本開示をより詳細に説明する前に、この開示は、記載されている特定の実施形態に限定されるものではなく、したがって、当然ながら、変化し得ることが理解されるべきである。本明細書において使用されている用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、制限することは意図されていないことも理解されたい。
【００２２】
異なる定義がなされていない限り、本明細書中に使用されるすべての技術的および科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。本開示を実施または試験するにあたり、本明細書に記載のものと類似の、または均等の任意の方法および材料を使用することもできるが、ここでは好ましい方法および材料について記載する。
【００２３】
本明細書で引用されるすべての刊行物および特許は、あたかも個々の刊行物または特許それぞれが参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように参照により本明細書に組み込まれ、当該刊行物が引用されることに関連して方法および／または材料を開示および説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は出願日前の刊行物の開示のためのものであって、本開示が先行発明を理由としてかかる刊行物に先行しないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供された刊行物の日付は、独立して確認をする必要がある場合もある実際の刊行日と異なっているかもしれない。
【００２４】
本開示を読むと当業者にとっては明らかなことであろうが、本明細書で記載および例示されている個々の実施形態それぞれは、本開示の範囲または精神から逸脱することなく他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴と容易に区別または組み合わせ得る別々の成分および特徴を有する。示された任意の方法は、示された事象の順序または論理的に可能なその他の順序で実施することができる。
【００２５】
定義
本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈にそうでないことが明記されていない限り、複数の言及を含む。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「寛解させる〔ameliorate〕」、「寛解させること〔ameliorating〕」という用語およびその文法的変形は、対象における疾患の症状の重症度を低下させることを意味する。
【００２７】
本開示では、「含む〔comprises〕」、「含んだ〔comprised〕」、「含んでいる〔comprising〕」、「含有する〔contains〕」、「含有している〔containing〕」等の用語は、これらは包括的またはオープンエンドであり、追加的な、引用されていない要素または方法ステップを排除しないことに注意されたい。「からなる〔consists of〕」および「からなっている〔consisting of〕」という用語はクローズエンドである。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「細胞」は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。原核細胞には、例えば、細菌が含まれる。真核細胞には、例えば、真菌、植物細胞および動物細胞が含まれる。動物細胞（例えば、哺乳類細胞またはヒト細胞）の種類には、例えば、循環系／免疫系または器官由来の細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞、顆粒球（例えば、好塩基性顆粒球、好酸性顆粒球、好中性顆粒球および過分葉好中球）、単核球またはマクロファージ、赤血球細胞（例えば、網状赤血球）、肥満細胞、血小板または巨核球、および樹状細胞）；内分泌系または器官由来の細胞（例えば、甲状腺細胞（例えば、甲状腺上皮細胞、傍濾胞細胞）、副甲状腺細胞（例えば、副甲状腺主細胞、好酸性細胞）、副腎細胞（例えば、クロム親和性細胞）および松果体の細胞（例えば、松果体細胞））；神経系または器官由来の細胞（例えば、神経膠芽細胞（例えば、星状膠細胞および乏突起膠細胞）、小膠細胞、巨細胞性神経分泌細胞、星状細胞、ベッチェル細胞および下垂体細胞（例えば、性腺刺激ホルモン分泌細胞、副腎皮質刺激ホルモン分泌細胞、甲状腺刺激ホルモン分泌細胞、成長ホルモン分泌細胞および乳腺刺激ホルモン分泌細胞））；呼吸系または器官由来の細胞（例えば、肺胞細胞（Ｉ型肺胞細胞およびＩＩ型肺胞細胞）、クララ細胞、杯状細胞、肺胞マクロファージ）；循環系または器官由来の細胞（例えば、心筋細胞および周辺細胞）；消化系または器官由来の細胞（例えば、胃主細胞、壁細胞、杯状細胞、パネート細胞、Ｇ細胞、Ｄ細胞、ＥＣＬ細胞、Ｉ細胞、Ｋ細胞、Ｓ細胞、腸内分泌細胞、腸クロム親和性細胞、ＡＰＵＤ細胞、肝臓の細胞（例えば、肝実質細胞およびクッパー細胞））；外被系または器官由来の細胞（例えば、骨の細胞（例えば、骨芽細胞、骨細胞および破骨細胞）、歯の細胞（例えば、セメント芽細胞およびエナメル芽細胞）、軟骨の細胞（例えば、軟骨芽細胞および軟骨細胞）、皮膚／毛の細胞（例えば、毛胞、角化細胞およびメラニン形成細胞（母斑細胞））、筋肉細胞（例えば、筋細胞）、脂肪細胞、線維芽細胞および腱細胞）、泌尿器系または器官由来の細胞（例えば、有足細胞、傍糸球体細胞、糸球体内メサンギウム細胞、糸球体外メサンギウム細胞、腎臓近位尿細管刷子縁細胞および緻密斑細胞）ならびに生殖器系または器官由来の細胞（例えば、精子、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞、卵子、卵母細胞）が含まれる。細胞は、正常で健康な細胞であっても、病的で不健康な細胞（例えば、がん細胞）であってもよい。細胞にはさらに、哺乳類接合子または胚性幹細胞、胎児幹細胞、人工多能性幹細胞および成人幹細胞を含む幹細胞が含まれる。幹細胞とは、未分化状態を維持しながら細胞分裂のサイクルを経て、特殊化した細胞種に分化することができる細胞である。幹細胞は、全能性幹細胞、多能性幹細胞、複能性幹細胞、寡能性幹細胞および単能性幹細胞とすることができ、いずれも体細胞から誘導することができる。幹細胞にはまた、がん性幹細胞が含まれ得る。哺乳類細胞は、齧歯類細胞、例えば、マウス、ラット、ハムスター細胞であってもよい。哺乳類細胞は、ウサギ目細胞、例えば、ウサギ細胞であってもよい。哺乳類細胞はまた、霊長類細胞、例えば、ヒト細胞であってもよい。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「構築物」または「核酸構築物」という用語は、目的のポリヌクレオチド配列がベクターに挿入されている核酸を指す。本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、タンパク質の発現をもたらすように、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に挿入できるビヒクルを指す。ベクターが担持する遺伝エレメントの宿主細胞内での発現をもたらすように、ベクターを使用して、宿主細胞を形質転換し、形質導入し、またはトランスフェクトすることができる。ベクターの例としては、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）、もしくはＰ１−由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、ラムダファージもしくはＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、および動物ウイルスが挙げられる。ベクターとして使用される動物ウイルスの範疇には、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルスおよびパポバウイルス（例えばＳＶ４０）が含まれる。ベクターは、発現を制御する様々なエレメントを含有することができ、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択可能エレメント、およびレポーター遺伝子が含まれる。加えて、ベクターは複製起点を含有することができる。ベクターは、ベクターの細胞侵入を補助する物質を含むこともでき、それらに限定されないが、ウイルス粒子、リポソーム、またはタンパク質コーティングが含まれる。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「二本鎖の」という用語は、それらの長さの少なくとも一部に沿ってハイブリッドを形成した１つまたは２つの核酸鎖を指す。ある特定の実施形態では、「二本鎖の」とは、核酸が完全に二本鎖でなければならないことを意味しない。代わりに、二本鎖の核酸は、１つまたは複数の一本鎖のセグメントおよび１つまたは複数の二本鎖のセグメントを有することができる。例えば、二本鎖核酸は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、または二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ化合物とすることができる。核酸の形態は、ＳＹＢＲグリーンで染色され、電気泳動によって区別される分子バンドなどの、当技術分野で一般的な方法を使用して決定することができる。
【００３１】
核酸配列を細胞に挿入するという文脈において「導入する」または「導入された」または「導入すること」という用語は、「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」を意味し、真核細胞または原核細胞への核酸配列の組込みへの言及を含み、ここで、核酸配列は、細胞内に一時的に存在してもよく、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、またはミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれ、自律レプリコンに変換されてもよい。本開示の構築物を、当技術分野で知られている任意の方法を使用して細胞に導入することができる。動物細胞をトランスフェクトする種々の技法を用いることができ、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス媒介性遺伝子移入、エレクトロポレーション、トランスフェクション等（例えば、Ｋｅｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９９０）１８５：５２７−５３７を参照されたい）が含まれる。一実施形態では、構築物はウイルスを介して細胞に導入される。
【００３２】
「改変」または「遺伝子改変」という用語は、細胞によって発現される遺伝子の発現または活性の低下または増大をもたらすことができるゲノムレベルでの破壊を指す。例示的な改変としては、挿入、欠失、置換、フレームシフト変異、点変異、エクソン除去等を挙げることができる。
【００３３】
遺伝子編集という文脈において「望ましい改変」とは、マニピュレーターによって実行される、目的の遺伝子改変を指す。本開示の望ましい改変とは、遺伝子の正常な機能または選択された機能を回復し、増強し、または変更することができる、あるいは遺伝子の発現を増大させまたは低下させることができる、ゲノム領域における改変とすることができる。「望ましくない改変」とは「望ましい改変」と反対であり、これは、望まれるものとは異なるランダムな改変から生じる不要の改変である。本開示のある特定の実施形態では、ゲノム領域の１つもしくは複数の望ましい改変および／または１つもしくは複数の望ましくない改変は、ＣＲＩＳＰＲ関連システムによって生成することができる。
【００３４】
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は同義に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、すなわちデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体、を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、既知のまたは未知の任意の機能を実行することができる。ポリヌクレオチドの非限定的な例には、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、ｓｈＲＮＡ、一本鎖の短鎖または長鎖ＲＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、調節領域、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーが含まれる。核酸分子は、直鎖状であっても環状であってもよい。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「ヌクレアーゼ」とは、核酸のヌクレオチドサブユニット間でホスホジエステル結合を切断することができる酵素である。「ヌクレアーゼドメイン」とは、ヌクレアーゼ活性を有する独立して折り畳まれたタンパク質ドメインである。「部位特異的ヌクレアーゼ」とは、その機能が特定のヌクレオチド配列に依存するヌクレアーゼを指す。通常、部位特異的ヌクレアーゼは、特定のヌクレオチド配列を認識し結合し、ヌクレオチド配列内のホスホジエステル結合を切断する。ある特定の実施形態では、二本鎖切断は、部位特異的ヌクレアーゼを使用する部位特異的切断によって生じる。部位特異的ヌクレアーゼの例には、限定されないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびＣＲＩＳＰＲ（クラスタ化され規則的に間隔を置いた短鎖パリンドローム反復）関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼが含まれる。
【００３６】
部位特異的ヌクレアーゼは通常、ＤＮＡ結合ドメインおよびＤＮＡ切断ドメインを含有する。例えば、ＺＦＮは、３個から６個の間の別々のジンクフィンガー反復を通常は含有するＤＮＡ結合ドメインと、ＤＮＡ切断を担うＦｏｋＩ制限酵素からなるヌクレアーゼドメインとを含有する。ＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは９から１８の間の塩基対を認識することができる。ＴＡＬＥＮの例では、これはＴＡＬＥドメインおよびＤＮＡ切断ドメインを含有するが、ＴＡＬＥドメインは、１２番目および１３番目のアミノ酸を除き、保存性が高い反復性の３３〜３４個のアミノ酸配列を含有し、この配列の変異は、特異的なヌクレオチド認識との強い相関を示す。別の例については、典型的なＣａｓヌクレアーゼであるＣａｓ９は、Ｎ末端認識ドメインとＣ末端の２つのエンドヌクレアーゼドメイン（ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメイン）とから構成される。
【００３７】
「作動可能に連結している」という用語は、そのように記載された成分がその通常の機能を実行するように構成されているエレメントの配置を指す。したがって、ポリペプチドに作動可能に連結している所与のシグナルペプチドは、細胞からポリペプチドの分泌へと導く。プロモーターの場合、コード配列に作動可能に連結しているプロモーターは、コード配列の発現へと導くことになる。プロモーターまたはその他の制御エレメントは、コード配列の発現へと導くように機能する限り、上記コード配列に隣接している必要はない。例えば、非翻訳のものにもかかわらず転写される介在配列が、プロモーター配列とコード配列の間に存在することができ、上記プロモーター配列は、やはりコード配列に「作動可能に連結している」と考えられる。
【００３８】
本明細書で使用する場合「対象」または「動物」または「患者」という用語は、ウイルス感染や腫瘍などの疾患または障害の診断、予後、寛解、予防および／または処置を必要とする、ヒトまたは非ヒト動物を指し、哺乳動物または霊長類が含まれる。哺乳類の対象には、ヒト、飼育動物、家畜、および動物園の、競技用の、またはペットの動物が含まれ、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ブタ、ウシ、クマ等である。
【００３９】
ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成という文脈において、「標的とする」とは、ゲノム領域（すなわち、標的配列）に対して相補性を有するように設計されたガイド配列（すなわち、ｇＲＮＡ）を指し、ここで、ゲノム領域とガイドＲＮＡの間のハイブリッド形成によって、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成が促進される。「相補性」および「相補的」という用語は、塩基対形成規則によって関連付けられるポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）に関連して使用される。相補性は、「部分的」であってもよく、この場合、核酸の塩基の一部のみが塩基対形成規則に従って一致する（例えば、１０個のうちの５、６、７、８、９、１０個は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および１００％相補的である）。または、核酸どうしの間に「完全な」または「全体の」相補性が存在してもよい。核酸鎖どうしの間の相補性の程度は、相互のハイブリッド形成の効率および強さに対して著しい影響を有する。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「有効量」または「治療有効量」とは、任意の障害または疾患の症状および／または根底にある原因を予防し、処置し、軽減しおよび／または寛解させるのに十分な薬剤の量、または細胞に所望の効果を生じるのに十分な薬剤の量、を意味する。一実施形態では、「治療有効量」とは、疾患の症状を軽減しまたは排除するのに十分な量である。別の実施形態では、治療有効量とは、疾患それ自身を克服するのに十分な量である。
【００４１】
「転写物」とは、タンパク質発現のための遺伝子転写によって形成されたｍＲＮＡを指す。１つまたは複数の転写変異体が、差次的スプライシングを介して同じＤＮＡセグメントから形成される。このようなプロセスでは、遺伝子の特定のエクソンがメッセンジャーｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ）内に含まれる場合も有り、メッセンジャーｍＲＮＡから除外される場合も有り、結果として、様々なアミノ酸を含有し、かつ／または様々な生物学的機能を保有する翻訳タンパク質が得られることになる。
【００４２】
部位特異的ヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）は、一般的な常染色体劣性遺伝疾患であり、脊髄の前角における運動ニューロンの喪失の特徴付けられる（Ｐｅａｒｎ  Ｊ，Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｉｅｓ，Ｌａｎｃｅｔ（１９８０）８１７４，９１９−９２２）。ＳＭＡの原因となる遺伝子は、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）遺伝子であることが示されてきた（Ｌｅｆｅｂｖｒｅ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｇｅｎｅ，Ｃｅｌｌ（１９９５）８０：１５５−６５）。ヒトでは、ほぼ同一の２つのＳＭＮ遺伝子（ＳＭＮ１およびＳＭＮ２）が染色体５ｑ１３上に存在する。ＳＭＮ２遺伝子内ではなく、ＳＭＮ１遺伝子内の欠失または変異が、あらゆる形態のＳＭＡを引き起こす（Ｌｅｆｅｂｖｒｅ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｇｅｎｅ，Ｃｅｌｌ（１９９５）８０：１５５−６５）。ＳＭＮ１は、細胞生存に不可欠なプロセスであるｈｎＲＮＰアセンブリに必要である、遍在的に発現する３８ｋＤａのＳＭＮタンパク質をコードする（Ｗａｎ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ｓｎＲＮＰ  ａｓｓｅｍｂｌｙ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（２００５）２５：５５４３−５１）。ＳＭＮ１遺伝子のほぼ同一のコピーであるＳＭＮ２はＳＭＮ１遺伝子の近くに位置するが、ＳＭＮ１の喪失を補填することができず、なぜなら、ＳＭＮ２のエクソン７はｍＲＮＡスプライシング中に大幅にスキップされ、不安定な短縮型のタンパク質ＳＭＮΔ７を産生するからである（Ｌｏｒｓｏｎ  ＣＬ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＭＮ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｄｅｆｅｃｔ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９８）１９：６３−６６）。ＳＭＮ１とＳＭＮ２とでは、エクソン７の６位（ＳＭＮ２の転写物ではＣ６Ｕ）での重大な意味を持つＣからＴへの置換によって異なる（Ｌｏｒｓｏｎ  ＣＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＳＭＮ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９）９６：６３０７−１１；Ｍｏｎａｎｉ  ＵＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ａｌｔｅｒｓ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ  ｔｈｅ  ＳＭＡ  ｇｅｎｅ  ＳＭＮ１  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｃｏｐｙ  ｇｅｎｅ  ＳＭＮ２，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９９）８：１１７７−８３）。Ｃ６Ｕはコード配列を変化させないが、ＳＭＮ２中でエクソン７スキッピングをもたらすのに十分である。
【００４３】
イントロン内スプライシングサイレンサーＮ１（ＩＳＳ−Ｎ１）が、ＳＭＮ２エクソン７の包含を妨げる強力な阻害性シスエレメントとして発見され、したがって、ＳＭＮ２エクソン７のスプライシング調節のマスターチェックポイントと呼ばれる（Ｓｉｎｇｈ  ＮＫ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｅｘｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｓｉｌｅｎｃｅｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｌｏｃａｔｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌａｓｔ  ｉｎｔｒｏｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２００６）２６：１３３３−４６）．ＩＳＳ−Ｎ１は、ＩＳＳ−Ｎ１の上流および下流での他の調節エレメントの存在によって影響を受ける複雑な調節エレメントであることが示されてきた（Ｓｉｎｇｈ  ＮＮ  ａｎｄ  Ｓｉｇｎｈ  ＲＮ，Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｉｎ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｕｎｄｅｒｓｃｏｒｅｓ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｔｒｏｎ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌ．（２０１１）８：６００−０６；Ｓｉｎｇｈ  ＮＮ  ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＡ１  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｅｘｏｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２０１１）３１：９３５−５４；Ｓｉｎｇｈ  ＮＮ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎ  ｉｎｔｒｏｎｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｅｎａｂｌｅｄ  ｂｙ  ａ  ｌｏｎｇ−ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｓｅｒｖｅｓ  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２０１３）４１：８１４４−６５；Ｓｉｎｇｈ  ＮＮ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｅｘｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｇｅｎｅｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，（２００７）３５：３７１−８９）。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ中で相補的ＩＳＳ−Ｎ１にアニーリングして、ＳＭＮ２スプライシングをリダイレクトし、エクソン７を含むように、設計するのに成功している（Ｆｉｎｋｅｌ  ＲＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｓｉｎｅｒｓｅｎ  ｖｅｒｓｕｓ  ｓｈａｍ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎ  ｉｎｆａｎｔｉｌｅ−ｏｎｓｅｔ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ（２０１７）３７７：１７２３−３２）。
【００４４】
したがって、一態様での本開示は、細胞中でＳＭＮ２遺伝子のＩＳＳ−Ｎ１領域を破壊し、その結果、細胞中でエクソン７の包含およびＳＭＮタンパク質の発現を増大させる、部位特異的ヌクレアーゼを使用した遺伝子編集の組成物および方法を提供する。一部の実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む。
【００４５】
一実施形態では、本発明の方法は、ヒト細胞に、ヒトＳＭＮ２遺伝子のＩＳＳ−Ｎ１領域を標的とする部位特異的ヌクレアーゼを含む組成物を導入することを含む。組成物が細胞に導入されると、ＩＳＳ−Ｎ１領域で二本鎖切断が生成し、それにより、ＮＨＥＪ修復経路を介してＩＳＳ−Ｎ１領域にインデルがもたらされる。インデルはＩＳＳ−Ｎ１の機能を破壊し、スプライシングを変化させ、ＳＭＮ２  ｍＲＮＡでのエクソン７の包含を増大させ、細胞内のＳＭＮタンパク質を増大させる。
【００４６】
一実施形態では、本発明の方法は、ヒト細胞に、（１）Ｃａｓヌクレアーゼまたはそれをコードする核酸、および（２）ヒトＳＭＮ２遺伝子のＩＳＳ−Ｎ１領域を標的とするｇＲＮＡまたはそれをコードする核酸、を含む組成物を導入することを含む。
【００４７】
「ＣＲＩＳＰＲ（ＲＮＡ誘導型クラスタ化され規則的に間隔を置いた短鎖パリンドローム反復）／Ｃａｓシステム」という用語は、もともと、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与しまたはその活性を導く、原核細胞中の転写物および他のエレメントを指し、これには、核酸配列を切断し二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成するＣａｓヌクレアーゼをコードする配列、ガイド配列、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）配列、ｔｒａｃｒ−メイト配列、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からのその他の配列および転写物、が含まれる。真核細胞では、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムはＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼおよびスモールガイドＲＮＡを含む。標的ＤＮＡ配列（プロトスペーサー）は、使用されている特定のＣａｓタンパク質によって認識される短鎖ＤＮＡ配列である「プロトスペーサー隣接モチーフ」（ＰＡＭ）を含有する。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含み、これらは、それぞれ、タンパク質Ｃａｓ３、Ｃａｓ９およびＣａｓ１０を含む。
【００４８】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼＣａｓ９は、様々なモデルシステムにおいて遺伝子特異的ノックアウトを生成するのに広く利用されているＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの成分である。本開示の一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは「配列特異的ヌクレアーゼ」である。Ｃａｓ９の異所性発現とシングルガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の導入は、目的の特定のゲノム領域で二本鎖切断（ＤＳＢ）の形成をもたらすのに十分であり、これにより、ＮＨＥＪ経路を介してインデルがもたらされる。インデルは多くの場合、挿入／欠失されたヌクレオチドの数が３の倍数である場合を除いて、フレームシフト変異という結果となる。
【００４９】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼとともに、ＣＲＩＳＰＲの試みには、標的核酸（例えば、ＤＮＡ）に特異的な約１５〜３０個の塩基配列を含有するガイドＲＮＡの導入が必要である。目的のゲノム領域を、例えばタンパク質の機能ドメインをコードする特定のエクソンを標的とするように設計されたｇＲＮＡは、上記タンパク質をコードする各遺伝子において変異を生じることになる。結果として生じた改変されたゲノム領域は１つまたは複数の変異体を含むことができ、そのそれぞれが変異において異なる。例えば、変異は、望ましい改変を伴う改変ゲノム領域、および／または望ましくない改変を伴う改変ゲノム領域をもたらすことになる。このアプローチは、様々なモデルシステムで遺伝子特異的なノックアウトを生成するのに広く利用されてきた。ある特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個ヌクレオチド長を有する。ｇＲＮＡは、ＲＮＡとして、またはプロモーターに作動可能に連結されたｇＲＮＡコード配列を有するベクター（例えば、プラスミド）でのトランスフェクションによって、真核細胞または原核細胞に送達することができる。
【００５０】
ある特定の実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼおよびｇＲＮＡは、同種に由来する。ある特定の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、例えば、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、スタフィロコッカス・シウリ（Staphylococcus sciuri）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、大腸菌（Escherichia coli）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyrogenes）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）、ストレブトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、コレラ菌（Vibrio cholera）、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Achromobacter xylosoxidans）、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、シトロバクター・デヴェルズス（Citrobacter diversus）、シトロバクター・フレウンデー（Citrobacter freundii）、ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus leuteus）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）、スタフィロコッカス・ラグドゥネギス（Staphylococcus lugdunegis）、腸チフス菌（Salmonella typhi）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）Ａ群、ストレプトコッカス属Ｂ群、Ｓ．マルセッセンス（S. marcescens）、エンテロバクター・クロアカ（Enterobacter cloacae）、炭疽菌（Bacillus anthracis）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、クロストリジウム属ｓｐ．（Clostridium sp.）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheria）、モラクセラ（ブランハメラ）・カタラーリス（Moraxalla（Brauhamella）catarrhalis）、赤痢菌属ｓｐｐ．（Shigella spp.）、ヘモフィルスインフルエンザ菌（Haemophilus influenza）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophili）、シュードモナス・ペロレンス（Pseudomonas perolens）、シュードモナス・フラギ〔Pseuomonas fragi〕、バクテロイデス・フラギリス（Bacteroides fragilis）、フソバクテリウム属ｓｐ.（Fusobacterium sp.）、ベイロネラ属ｓｐ．（Veillonella sp.）、ペスト菌（Yersinia pestis）、および仮性結核菌（Yersinia pseudotuberculosis）に由来する。
【００５１】
ｇＲＮＡは、Ｔａｒｇｅｔ  Ｆｉｎｄｅｒ、Ｅ−ＣＲＩＳＰＲ、ＣａｓＦｉｎｄｅｒ、およびＣＲＩＳＰＲ  Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｆｉｎｄｅｒなどの、当技術分野における既知の任意のソフトウェアを使用して設計することができる。
【００５２】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、ＣＡＳヌクレアーゼまたはｇＲＮＡをコードする核酸を含み、核酸はベクターに含有されている。一部の実施形態では、組成物は、ＣＡＳヌクレアーゼタンパク質およびｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、ＣＡＳヌクレアーゼをコードする第１の核酸およびｇＲＮＡをコードする第２の核酸を含み、第１および第２の核酸は、１つのベクターに含有されている。一部の実施形態では、第１および第２の核酸は、別々の２つのベクターに含有されている。一部の実施形態では、少なくとも１つのベクターはウイルスベクターである。
【００５３】
ある特定の実施形態では、ＩＳＳ−Ｎ１領域は、配列番号１（ＣＣＡＧＣＡＴＴＡＴＧＡＡＡＧ）を含む。一部の実施形態では、ＩＳＳ−Ｎ１領域は、配列番号１からなる。
【００５４】
一部の実施形態では、組成物は、ＩＳＳ−Ｎ１領域を挟む配列を標的とする２つのｇＲＮＡを含む。組成物が細胞に導入されると、２つのｇＲＮＡがＣａｓヌクレアーゼとの組み合わせでＩＳＳ−Ｎ１領域を欠失させ、ＩＳＳ−Ｎ１の阻害機能を破壊する。
【００５５】
一部の実施形態では、組成物は、細胞に導入されると、ＩＳＳ−Ｎ１のスプライシング阻害機能を実質的に破壊しない改変ＩＳＳ−Ｎ１を細胞中で生成する。このような場合、改変ＩＳＳ−Ｎ１を標的とする第２のｇＲＮＡを細胞に導入して、ＩＳＳ−Ｎ１領域をさらに編集し、それにより、ＳＭＮ２ｍＲＮＡにおけるエクソン７の包含を増大させる、変化されたＩＳＳ−Ｎ１領域を生成することができる。
【００５６】
したがって、本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、組成物は、第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡ（または、それぞれ、第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡを転写するための２つの構築物またはＤＮＡ断片）を含む。第１のｇＲＮＡは、複数のヒト細胞中でＳＭＮ２遺伝子のＩＳＳ−Ｎ１領域を標的とし、細胞の異なるサブセットにおいて、それぞれ、望ましい改変（ＩＳＳ−Ｎ１のスプライシング阻害機能が破壊された状態）および望ましくない改変（ＩＳＳ−Ｎ１のスプライシング阻害機能が実質的に破壊されていない状態）を含む改変ＩＳＳ−Ｎ１領域のいくつかの変異体を生成する。第２のｇＲＮＡは、望ましい改変をさらに生成し、遺伝子編集効率を増強するために、望ましくない改変を標的にするように設計されている。一部の実施形態では、複数の望ましくない改変が存在する。このような場合では、望ましくない改変を標的とする複数のｇＲＮＡを使用することができる。例えば、ある特定の実施形態では、本開示は、遺伝子編集効率をさらに増強するために、第２のｇＲＮＡによって標的とされるものとは違う望ましくない変異を標的とする第３のｇＲＮＡを含む。
【００５７】
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを発現するための遺伝物質は、第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡを含有する配列を転写するための、およびＣａｓタンパク質を発現するための、構築物またはＤＮＡ断片（または、それぞれ、第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡを転写するための２つの構築物またはＤＮＡ断片）から特異的に構成される；あるいは、第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡを含有する配列を転写するための構築物またはＤＮＡ断片（または、それぞれ、第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡを転写するための２つの構築物またはＤＮＡ断片）と、Ｃａｓタンパク質を発現するための構築物またはＤＮＡ断片またはＲＮＡと、から特異的に構成される；あるいは
第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡを含有するＲＮＡ配列（または第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡ）と、Ｃａｓタンパク質を発現するための構築物またはＤＮＡ断片またはＲＮＡと、から特異的に構成される。好ましい一部の実施形態では、第１および第２のｇＲＮＡは同じベクター内に構築され、その結果、第２のｇＲＮＡが望ましくない変異を標的とする可能性を高める。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ポリペプチドとして細胞に導入される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＤＮＡ構築物を使用せずに、すなわちＲＮＡとして細胞に導入される。
【００５８】
ある特定の実施形態では、同じ構築物に含有されている第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡは、多シストロン性ｇＲＮＡであり、その結果、両方のｇＲＮＡは、同じ多シストロン性オペロン内に位置し、同時に転写される。ある特定の実施形態では、同じ構築物に含有されている第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡは、それ自身のプロモーターとともにそれぞれが多シストロン性のまたは単シストロン性の２つのオペロンに位置し、個々に転写される。
【００５９】
ある特定の実施形態では、前記ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの間に部分的な塩基対形成によって形成されるパリンドローム構造を有するＲＮＡである。前記ｃｒＲＮＡは、標的部位に相補的に結合することができるＲＮＡ断片を含有する。
【００６０】
ある特定の実施形態では、ゲノム領域の望ましくない改変とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の連続したヌクレオチドの挿入、欠失、または置換である。第１のｇＲＮＡによって生成された結果として生じた改変ゲノム領域の配列は、当技術分野における従来の手段を使用して遺伝子型決定によって、例えば、次世代配列決定（ＮＧＳ）によって決定することができる。
【００６１】
本明細書で着想および開示の方法はまた、二本鎖切断を引き起こすことなく、またはＮＨＥＪまたは相同組換えを使用せずに、標的配列を改変することができる変異体または操作した部位特異的ヌクレアーゼを使用することを含む。例えば、ＭＩＴのＤａｖｉｄ  Ｌｉｕのグループは、Ｃａｓ９とシチジンデアミナーゼ酵素を融合している操作したＣａｓ９であるｄＣａｓ９について記載しているが、これは、ｄｓＤＮＡ切断を誘導しないが、ＣからＴ（またはＧからＡ）への置換を媒介する（Ｋｏｍｏｒ  ＡＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｂａｓｅ  ｉｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｃｌｅａｖａｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ（２０１６）１９：５３３：４２０−２４を参照されたい）。アデニンデアミナーゼ活性を有する融合酵素も開発されている（Ｇａｕｄｅｌｌｉ  ＭＮ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｂａｓｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  Ａ・Ｔ  ｔｏ  Ｇ・Ｃ  ｉｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ＤＮＡ  ｃｌｅａｖａｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ（２０１７）５５１：４６４−７１）。一部の実施形態では、遺伝子編集方法は、そのような操作した部位特異的酵素、例えば、ｄＣａｓ９、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮとシチジンデアミナーゼとの融合、を細胞に導入することを含み、それにより、ＩＳＳ−Ｎ１領域を編集して、ＩＳＳ−Ｎ１の機能を破壊する。一実施形態では、遺伝子編集方法は、操作した部位特異的酵素を細胞に導入して、ＳＭＮ２遺伝子のエクソン７の６位でＴからＣへの置換を媒介し、その結果、ＳＭＮ２遺伝子をＳＭＮ１遺伝子に変換することを含む。
【００６２】
脊髄性筋萎縮症の処置
別の態様では、本開示は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を処置するまたは寛解させるための方法を提供する。一実施形態では、本発明の方法は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）に伴う少なくとも１つの症状を有する対象に、治療有効量の本明細書に記載の組成物を投与することを含む。
【００６３】
ＳＭＡは、脊髄運動ニューロンの変性を特徴とする遺伝的障害である。ＳＭＡは、ＳＭＮ１遺伝子の両方の機能的コピーのホモ接合性の喪失によって引き起こされる。しかし、ヒトでは、ＳＭＮ２遺伝子はＳＭＮ１と同じタンパク質をコードし、したがって、ＳＭＡ患者の遺伝的欠陥を解決する可能性がある。ＳＭＮ２はエクソン７の＋６位に翻訳上のサイレント変異（Ｃ→Ｔ）を含有し、これにより、ＳＭＮ２転写物においてエクソン７が非効率的に包含されることになる。したがって、エクソン７を欠くＳＭＮ２転写物によってコードされるＳＭＮ２タンパク質の優勢型は、不安定で不活性である。したがって、ＳＭＮ２スプライシングをモジュレートし、その結果、エクソン７を含有するＳＭＮ２転写物のパーセンテージを増大させることができる治療用組成物は、ＳＭＡの処置に有用であろう。
【００６４】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物を投与されている対象は、ＳＭＡの１つまたは複数の指標を有する。ある特定の実施形態では、対象は、１つまたは複数の筋肉の電気活動の低下を有する。ある特定の実施形態では、対象は変異型ＳＭＮ１遺伝子を有する。ある特定の実施形態では、対象のＳＭＮ１遺伝子は非存在であるか、または機能的なＳＭＮタンパク質を産生することができない。ある特定の実施形態では、対象は、遺伝子検査によって診断される。ある特定の実施形態では、対象は筋生検によって特定される。ある特定の実施形態では、対象はまっすぐに座ることができない。ある特定の実施形態では、対象は立つまたは歩くことができない。ある特定の実施形態では、対象は、呼吸および／または食するのに援助を必要とする。ある特定の実施形態では、対象は、筋肉の電気生理学的測定および／または筋生検によって特定される。
【００６５】
ある特定の実施形態では、対象は、Ｉ型ＳＭＡを有する。ある特定の実施形態では、対象は、ＩＩ型ＳＭＡを有する。ある特定の実施形態では、対象はＩＩＩ型ＳＭＡを有する。ある特定の実施形態では、対象は、子宮内にＳＭＡを有すると診断される。本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、対象は乳児である。ある特定の実施形態では、対象は誕生後１週間以内にＳＭＡを有すると診断される。ある特定の実施形態では、対象は誕生の１カ月以内にＳＭＡを有すると診断される。ある特定の実施形態では、対象は３カ月齢までにＳＭＡを有すると診断される。ある特定の実施形態では、対象は６カ月齢までにＳＭＡを有すると診断される。ある特定の実施形態では、対象は１歳までにＳＭＡを有すると診断される。ある特定の実施形態では、対象は１歳から２歳の間にＳＭＡを有すると診断される。ある特定の実施形態では、対象は、１歳から１５歳の間にＳＭＡを有すると診断される。ある特定の実施形態では、対象が１５歳を超えたときに、対象はＳＭＡを有すると診断される。
【００６６】
本明細書に記載の組成物は、当技術分野で知られている任意の経路または方法を使用して対象に投与することができる。一部の実施形態では、組成物は対象に全身的に投与される。ある特定の実施形態では、組成物は皮下注射によって投与される。ある特定の実施形態では、組成物は静脈内注射によって投与される。
【００６７】
本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、組成物は対象の中枢神経系に投与される。ある特定の実施形態では、組成物は対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）に投与される。ある特定の実施形態では、組成物は対象の髄腔内スペースに投与される。ある特定の実施形態では、組成物は筋肉内注射を介して投与される。
【００６８】
ＣＳＦとは脳室を満たす透明な液であり、くも膜下腔に存在し、脳および脊髄を囲んでいる。ＣＳＦは、脈絡叢によって、脳による脳室への組織液のしみ出しまたは透過を介して、産生される。脈絡叢は、側脳室底および第三および第四脳室の天井部を裏打ちする構造である。ある研究によれば、こうした構造は、１日に４回中枢神経系腔を満たす量に一致する、１日当たり４００〜６００ｃｃｓの液を産生することが可能であることが示された。成人において、この液の容量を計算すると、１２５から１５０ｍｌ（４〜５ｏｚ）である。ＣＳＦは、連続的に形成され、循環し、吸収されている。ある研究によれば、約４３０〜４５０ｍｌ（ほぼ２カップ）のＣＳＦが毎日産生可能であることが示された。ある計算によれば、産生は成人で毎分約０．３５ｍｌに、乳児で毎分０．１５ｍｌに等しいと推定される。側脳室の脈絡叢は、ＣＳＦの大部分を産生している。ＣＳＦは、モンロー孔を通って第三脳室に流れ込み、第三脳室からの産生によって追加され、シルビウス水道を通して第４脳室へと下降し続ける。第４脳室はＣＳＦをさらに追加する；次いで、この液は、マジャンディ孔およびルシュカ孔を通して、くも膜下腔中へと移動する。次いで、ＣＳＦは、脳の基底全体を通して、脊髄周辺へと下降し、そして大脳両半球を覆って上方へと、循環する。ＣＳＦは、くも膜絨毛および頭蓋内血管静脈洞を介して血液中に注ぐ。
【００６９】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象においてＳＭＡの少なくとも１つの症状を寛解させる。一部の実施形態では、対象に投与された組成物は、ニューロン、例えば運動ニューロンに入り、ニューロンにおいてＳＭＮ２遺伝子のＩＳＳ−Ｎ１領域で二本鎖切断を生成し、このことによって、ＮＨＥＪ修復経路を介してＩＳＳ−Ｎ１領域にインデルがもたらされる。インデルはＩＳＳ−Ｎ１のスプライシング阻害機能を破壊し、その結果、ＳＭＮ２  ｍＲＮＡでのエクソン７の包含を増大させ、細胞内のＳＭＮタンパク質を増大させる。
【００７０】
ある特定の実施形態では、非ニューロン細胞におけるＳＭＮ機能の改善は、ニューロン内部のＳＭＮ機能が改善されるか否かにかかわらず、ニューロン細胞の機能の改善を提供する。例えば、ある特定の実施形態では、本発明の医薬組成物の全身投与によって、筋肉細胞中でＳＭＮタンパク質の増大がもたらされる。筋肉細胞中のそのようなＳＭＮタンパク質の増大は、筋肉細胞に関連する運動−ニューロンまたはニューロン全般に対して、利益を提供することができる。そのような実施形態では、ＳＭＮ機能が回復した筋肉細胞は、ニューロンの生存能力および／または機能を改善する因子を提供することができる。
【実施例】
【００７１】
以下の実施例は、特許請求される発明をより十分に例示するために提供されており、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。以下に記載された特定の組成物、材料および方法のすべてが、全体的にまたは部分的に、本発明の範囲内に包含される。これらの特定の組成物、材料、および方法は、本発明を限定するものではなく、本発明の範囲内に包含される特定の実施形態を単に例示するものである。当業者であれば、発明に到る能力を発揮せずとも、本発明の範囲から逸脱することなく、均等の組成物、材料および方法を開発することができる。記載の本明細書における手順において、本発明の範囲内になお留めながら、多くの変形をなし得ることを理解されたい。そのような変形が本発明の範囲内に含まれていることは、本発明者の意図するところである。
【００７２】
［実施例１］
以下の実施例は、細胞中でＳＭＮ２の発現を増大させるための例示的な組成物および方法を例示するものである。
【００７３】
ＳＭＮ１ノックアウト細胞株（ＳＭＮ１  −／−）を、ＨＥＫ２９３細胞をベースとして作出した。ｓｐＣＡＳ９／ｇＲＮＡ１  ＲＮＰ複合体をトランスフェクションに使用した。野生型配列（Ｃｔｒｌ）における、ｇＲＮＡ標的配列に下線を引き、ＣＡＳ９切断部位を矢印で示した。それぞれの細胞クローンを作出し、配列決定によって遺伝子型を決定した。各ホモ接合性クローンのゲノム配列を図２Ａに示した。ＲＴ−ＰＣＲを、プライマーＳＭＮｅｘ６−Ｆ  ＴＴＣＴＣＴＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＴＴＧＧ（配列番号１９）およびエクソン８プライマーＲ  ＧＴＣＴＧＡＴＣＧＴＴＴＣＴＴＴＡＧＴＧＧＴＧＴＣＡ（配列番号２０）とともに各クローンからのｍＲＮＡを用いて実行した。図２Ｂに示すように、上のバンドは、スプライシング形態がエクソン７（エクソン６７８）を含むことを示し、下のバンドは、エクソン７がスキップしているスプライシング形態（ｅｘ６＿８）を示す。
【００７４】
図２Ｂに示すように、すべてのクローン（特に、クローン１５３、１７９、１８９、３３３、２７６および３３５）はスプライシング形態エクソン６７８が増大し、結果的に、機能的で安定なＳＭＮ２タンパク質の発現が増大した。
【００７５】
［実施例２］
以下の実施例は、細胞中でＳＭＮ２タンパク質を増大させるための例示的な組成物および方法を例示するものである。
【００７６】
図３に例示するように、ｇＲＮＡをｓｇＣａｓ９とともにＩＳＳ−Ｎ１を標的にするように設計する。野生型配列（Ｃｔｒｌ）における、ｇＲＮＡの標的配列に下線を引き、ＣＡＳ９切断部位を矢印で示す。ｇＲＮＡをコードする核酸を、ｓｇＣａｓ９をコードするヌクレオチドを含むベクターにクローニングする。次いで、構築物をＳＭＮ２ミニ遺伝子とともにＨＥＫ２９３細胞に導入する。結果が示すところは、ＳＭＮ２のｍＲＮＡにおいてエクソン７の包含が増大していることである。
【００７７】
［実施例３］
以下の実施例は、細胞中でＳＭＮ２タンパク質を増大させるための例示的な組成物および方法を例示するものである。
【００７８】
図４に示すように、ｇＲＮＡをｓａＣａｓ９とともにＩＳＳ−Ｎ１を標的にするように設計する。野生型配列における、ｇＲＮＡの標的配列に下線を引き、ＣＡＳ９切断部位を矢印で示す。ｇＲＮＡをコードする核酸を、ｓａＣａｓ９をコードするヌクレオチドを含むベクターにクローニングする。次いで、構築物をＳＭＮ２ミニ遺伝子とともにＨＥＫ２９３細胞に導入する。結果が示すところは、ＳＭＮ２のｍＲＮＡにおいてエクソン７の包含が増大していることである。
【００７９】
［実施例４］
以下の実施例は、細胞中でＳＭＮ２タンパク質を増大させるための例示的な組成物および方法を例示するものである。
【００８０】
図５に示すように、２つのｇＲＮＡを、ｘＣａｓ９−３．７とともにＩＳＳ−Ｎ１を標的にするように設計する（Ｈｕ  ＪＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｖｏｌｖｅｄ  Ｃａｓ９  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｂｒｏａｄ  ＰＡＭ  ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ  ＤＮＡ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ｎａｔｕｒｅ（２０１８）５５６：５７−６３）。野生型配列における、ｇＲＮＡの標的配列に下線を引き、ＣＡＳ９切断部位を矢印で示す。ｇＲＮＡをコードする核酸を、ｘＣａｓ９−３．７をコードするヌクレオチドを含むベクターにクローニングする。次いで、構築物をＳＭＮ２ミニ遺伝子とともにＨＥＫ２９３細胞に導入する。結果が示すところは、ｇＲＮＡによって導入された二本鎖切断によってＩＳＳ−Ｎ１領域の欠失がもたらされ、ＳＭＮ２のｍＲＮＡにおいてエクソン７の包含が増大していることである。
【００８１】
本開示について特定の実施形態（そのうちの一部は好ましい実施形態である）を参照することで特に示し、説明してきたが、本明細書に開示の本開示の精神および範囲から逸脱することなく、形態および詳細において様々な改変がその中でなし得ることを、当業者であれば理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年12月17日(2020.12.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
【図１】図１は、ヒトＳＭＮ２遺伝子のエクソン６〜エクソン８領域を示す。イントロン７領域の５’末端の配列が例示されており、ＩＳＳ−Ｎ１領域の配列は下線が引かれている。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、ｇＲＮＡを用いて標的化したＣＲＩＳＰＲがＳＭＮの発現の増加をもたらすことを示す。ＳＭＮ１ノックアウト細胞株（ＳＭＮ１  −／−）を作出した。ｓｐＣＡＳ９／ｇＲＮＡ１  ＲＮＰ複合体をトランスフェクションに使用した。野生型配列（Ｃｔｒｌ）における、ｇＲＮＡ標的配列に下線を引き、ＣＡＳ９切断部位を矢印で示した。それぞれの細胞クローンを作出し、配列決定によって遺伝子型を決定した。各ホモ接合性クローンのゲノム配列を示した（図２Ａ）。図２Ｂは、プライマーＳＭＮｅｘ６−Ｆおよびエクソン８プライマーＲとともに各クローンからのｍＲＮＡを用いて実行した、ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。示されている上のバンドは、スプライシング形態がエクソン７（ｅｘ６７８）を含むことを示し、下のバンドは、エクソン７がスキップしているもの（ｅｘ６＿８）を示す。
【図３】図３は、ｓｐＣａｓ９を使用した、ＩＳＳ−Ｎ１領域を標的とする例示的ｇＲＮＡを示す。ＣＣＡＧＣＡＴＴＡＴＧＡＡＡＧは、ＩＳＳ−Ｎ１領域を表す。配列番号２中で下線のあるヌクレオチドは、ｇＲＮＡによって標的にされる領域を表す。垂直の矢印は、二本鎖切断が導入される位置を示す。
【図４】図４は、ｓａＣａｓ９を使用した、ＩＳＳ−Ｎ１領域を標的とする例示的ｇＲＮＡを示す。ＣＣＡＧＣＡＴＴＡＴＧＡＡＡＧは、ＩＳＳ−Ｎ１領域を表す。配列番号２中で下線のあるヌクレオチドは、ｇＲＮＡによって標的にされる領域を表す。垂直の矢印は、二本鎖切断が導入される位置を示す。
【図５】図５は、２つのｇＲＮＡおよびｘＣａｓ９−３．７を使用したＩＳＳ−Ｎ１領域の欠失を例示する。配列番号１６中で下線のあるヌクレオチドは、ｇＲＮＡによって標的にされる領域を表す。垂直の矢印は、二本鎖切断が導入される位置を示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
ＳＭＮ１ノックアウト細胞株（ＳＭＮ１  −／−）を、ＨＥＫ２９３細胞をベースとして作出した。ｓｐＣＡＳ９／ｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体をトランスフェクションに使用した。野生型配列（Ｃｔｒｌ）における、ｇＲＮＡ標的配列に下線を引き、ＣＡＳ９切断部位を矢印で示した。それぞれの細胞クローンを作出し、配列決定によって遺伝子型を決定した。各ホモ接合性クローンのゲノム配列を図２Ａに示した。ＲＴ−ＰＣＲを、プライマーＳＭＮｅｘ６−Ｆ  ＴＴＣＴＣＴＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＴＴＧＧ（配列番号１９）およびエクソン８プライマーＲ  ＧＴＣＴＧＡＴＣＧＴＴＴＣＴＴＴＡＧＴＧＧＴＧＴＣＡ（配列番号２０）とともに各クローンからのｍＲＮＡを用いて実行した。図２Ｂに示すように、上のバンドは、スプライシング形態がエクソン７（エクソン６７８）を含むことを示し、下のバンドは、エクソン７がスキップしているスプライシング形態（ｅｘ６＿８）を示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
図３に例示するように、ｇＲＮＡをｓｐＣａｓ９とともにＩＳＳ−Ｎ１を標的にするように設計する。野生型配列（Ｃｔｒｌ）における、ｇＲＮＡの標的領域に下線を引き、ＣＡＳ９切断部位を矢印で示す。したがって、ｇＲＮＡの標的配列は、配列番号１４に記載されている通りである。ｇＲＮＡをコードする核酸を、ｓｐＣａｓ９をコードするヌクレオチドを含むベクターにクローニングする。次いで、構築物をＳＭＮ２ミニ遺伝子とともにＨＥＫ２９３細胞に導入する。結果が示すところは、ＳＭＮ２のｍＲＮＡにおいてエクソン７の包含が増大していることである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
図４に示すように、ｇＲＮＡをｓａＣａｓ９とともにＩＳＳ−Ｎ１を標的にするように設計する。野生型配列における、ｇＲＮＡの標的配列に下線を引き（配列番号１５に記載されている通り）、ＣＡＳ９切断部位を矢印で示す。ｇＲＮＡをコードする核酸を、ｓａＣａｓ９をコードするヌクレオチドを含むベクターにクローニングする。次いで、構築物をＳＭＮ２ミニ遺伝子とともにＨＥＫ２９３細胞に導入する。結果が示すところは、ＳＭＮ２のｍＲＮＡにおいてエクソン７の包含が増大していることである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
図５に示すように、２つのｇＲＮＡを、ｘＣａｓ９−３．７とともにＩＳＳ−Ｎ１を標的にするように設計する（Ｈｕ  ＪＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｖｏｌｖｅｄ  Ｃａｓ９  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｂｒｏａｄ  ＰＡＭ  ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ  ＤＮＡ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ｎａｔｕｒｅ（２０１８）５５６：５７−６３）。ＣＣＡＧＣＡＴＴＡＴＧＡＡＡＧは、ＩＳＳ−Ｎ１領域を表す。野生型配列における、ｇＲＮＡの標的領域に下線を引き、ＣＡＳ９切断部位を垂直の矢印で示す。したがって、ｇＲＮＡの標的配列は、配列番号１７および１８に記載されている通りである。ｇＲＮＡをコードする核酸を、ｘＣａｓ９−３．７をコードするヌクレオチドを含むベクターにクローニングする。次いで、構築物をＳＭＮ２ミニ遺伝子とともにＨＥＫ２９３細胞に導入する。結果が示すところは、ｇＲＮＡによって導入された二本鎖切断によってＩＳＳ−Ｎ１領域の欠失がもたらされ、ＳＭＮ２のｍＲＮＡにおいてエクソン７の包含が増大していることである。
【国際調査報告】
2021521889.tif 000008