(57)【要約】  本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、鎌状赤血球変異を含むヘモグロビン関連変異の改変などの、ヘモグロビン遺伝子座の改変に関する。いくつかの実施形態は、鎌状赤血球変異部位のホスホジエステルDNA鎖に切断を導入することによる鎌状赤血球変異の改変に関する。
2021521855.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞においてHBB遺伝子を編集する方法であって、
（ｉ）ガイドRNA（gRNA）をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する工程、および
（ii）鋳型ポリヌクレオチドを前記細胞に導入する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記gRNAが、配列番号１〜６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記gRNAが、配列番号７〜１２のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する核酸を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記gRNAが、配列番号１〜６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記gRNAが、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記gRNAが、配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
gRNAをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する前記工程が、該gRNAをコードするポリヌクレオチドとCAS9タンパク質とを含むリボ核タンパク質（RNP）に前記細胞を接触させることを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記CAS9タンパク質と前記gRNAをコードするポリヌクレオチドの比率が、０．１：１〜１：１０である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記CAS9タンパク質と前記gRNAをコードするポリヌクレオチドの比率が、１：１〜１：５である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記CAS9タンパク質と前記gRNAをコードするポリヌクレオチドの比率が、約１：２．５である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記鋳型ポリヌクレオチドが、HBB遺伝子の少なくとも一部またはその相補鎖をコードしている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記鋳型ポリヌクレオチドが、野生型HBB遺伝子の少なくとも一部またはその相補鎖をコードしている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記HBB遺伝子の少なくとも一部が、該HBB遺伝子のエキソン１を含む、請求項１〜１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記鋳型ポリヌクレオチドがウイルスベクターに含まれている、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ベクターが、自己相補型AAV（scAAV）ベクターである、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記鋳型ポリヌクレオチドが、前記HBB遺伝子の少なくとも約４ｋｂを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記鋳型ポリヌクレオチドが、一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ssODN）に含まれている、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ssODNが、配列番号６４〜７２のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ssODNが、配列番号６４〜７２のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記HBB遺伝子のエキソン１に二本鎖切断が生じる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記二本鎖切断が、前記HBB遺伝子のエキソン１の６番目のコドンに隣接する位置に生じる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｉ）が、工程（ii）の前に実施される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｉ）と工程（ii）が、同時に実施される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ｉ）および／または工程（ii）が、ヌクレオフェクションを実施することを含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ヌクレオフェクションの実施が、ロンザ社製のシステムの使用を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記システムが、方形波パルスの使用を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
工程（ｉ）および／または工程（ii）が、約200,000個の細胞と２０μｌのヌクレオフェクション反応液を接触させることを含み、該ヌクレオフェクション反応液が、前記gRNAおよび／または前記鋳型ポリヌクレオチドを含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞が初代細胞である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞が造血幹細胞（HSC）である、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞がＴ細胞またはＢ細胞である、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞がＣＤ３４＋細胞である、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記HBB遺伝子が、配列番号３７に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
対象において鎌状赤血球貧血を治療または緩和する方法であって、鎌状赤血球貧血の治療または緩和を必要とする対象に、請求項１〜３５のいずれか１項に従って調製された細胞を投与する工程を含む方法。
【請求項３７】
前記対象がヒトである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
HBB遺伝子の相同組換え修復（HDR）用核酸であって、
HBB遺伝子の少なくとも一部をコードする第１の配列；
ガイドRNA切断部位をコードする第２の配列；および
ヌクレアーゼ結合部位をコードする第３の配列
を含む核酸。
【請求項３９】
前記HBB遺伝子の少なくとも一部が、該HBB遺伝子のエキソン１を含む、請求項３８に記載の核酸。
【請求項４０】
前記HBB遺伝子が、配列番号３７に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する核酸を含む、請求項３８または３９に記載の核酸。
【請求項４１】
第２の配列が、配列番号１〜６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する核酸を含む、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項４２】
第２の配列が、配列番号１〜６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む、請求項３８〜４１のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項４３】
第２の配列が、配列番号７〜１２のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項４４】
第２の配列が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項３８〜４３のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項４５】
前記１つ以上のヌクレアーゼ結合部位が、フォワードTALEN（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）結合部位およびリバースTALEN結合部位を含む、請求項３８〜４４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項４６】
前記１つ以上のヌクレアーゼ結合部位が、clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）関連タンパク質９（Cas9）結合部位である、請求項３８〜４５のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項４７】
１つ以上のエンハンサーエレメントをさらに含む、請求項３８〜４６のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項４８】
相同アーム配列をさらに含む、請求項３８〜４７のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項４９】
プロモーターをコードする核酸配列をさらに含む、請求項３８〜４８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項５０】
請求項３８〜４９のいずれか１項に記載の核酸を含む細胞。
【請求項５１】
哺乳動物細胞である、請求項５０に記載の細胞。
【請求項５２】
ヒト細胞である、請求項５０または５１に記載の細胞。
【請求項５３】
初代細胞である、請求項５０〜５２のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５４】
造血幹細胞（HSC）である、請求項５０〜５３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５５】
Ｔ細胞またはＢ細胞である、請求項５０〜５４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５６】
ＣＤ３４＋細胞である、請求項５０〜５５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５７】
エクスビボの細胞である、請求項５０〜５６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５８】
請求項３８〜４９のいずれか１項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項５９】
アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）である、請求項５８に記載のベクター。
【請求項６０】
自己相補型AAV（scAAV）ベクターである、請求項５８または５９に記載のベクター。
【請求項６１】
細胞におけるHBB遺伝子の相同組換え修復（HDR）用システムであって、請求項５９または６０に記載のベクターと、ヌクレアーゼをコードする核酸とを含むシステム。
【請求項６２】
前記ヌクレアーゼがTALENヌクレアーゼである、請求項６１に記載のシステム。
【請求項６３】
前記ヌクレアーゼがCASヌクレアーゼである、請求項６１に記載のシステム。
【請求項６４】
前記ベクターおよび前記核酸が、前記細胞に共送達されるように構成されている、請求項６１〜６３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６５】
前記細胞への前記共送達によって、内在性HBB遺伝子座が改変される、請求項６４に記載のシステム。
【請求項６６】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項６１〜６５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６７】
前記細胞がヒト細胞である、請求項６１〜６６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６８】
前記細胞が初代細胞である、請求項６１〜６７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６９】
前記細胞が造血幹細胞（HSC）である、請求項６１〜６８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７０】
前記細胞がＴ細胞またはＢ細胞である、請求項６１〜６９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７１】
前記細胞がＣＤ３４＋細胞である、請求項６１〜７０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７２】
前記HBB遺伝子が、配列番号３７のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項６１〜７１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７３】
HBB遺伝子の相同組換え修復（HDR）の促進を必要とする対象において、HBB遺伝子の相同組換え修復（HDR）を促進する方法であって、
請求項５０〜５７のいずれか１項に記載の細胞または請求項５８〜６０のいずれか１項に記載のベクターを前記対象に投与する工程；および
ヌクレアーゼを前記対象に投与する工程
を含む方法。
【請求項７４】
前記ヌクレアーゼがTALENヌクレアーゼである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ヌクレアーゼがCASヌクレアーゼである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記ヌクレアーゼが、前記細胞または前記ベクターとともに前記対象に共投与される、請求項７３〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記投与が養子細胞移入を含む、請求項７３〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記細胞がヒト細胞である、請求項７３〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記細胞が初代細胞である、請求項７３〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記細胞が自家細胞である、請求項７３〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記細胞がＴ細胞である、請求項７３〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記細胞が造血幹細胞（HSC）である、請求項７３〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記細胞がＣＤ３４＋造血幹細胞（HSC）である、請求項７３〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記対象が鎌状赤血球症に罹患している、請求項７３〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
HDRの促進により前記HBB遺伝子に１つ以上の編集が行われる、請求項７３〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記HBB遺伝子への前記１つ以上の編集が、鎌状赤血球変異の修正を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記鎌状赤血球変異がＥ７Ｖ変異を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
鎌状赤血球症（SCD）またはSCDに伴う症状の治療、抑制または緩和を必要とする対象において、鎌状赤血球症（SCD）またはSCDに伴う症状を治療、抑制または緩和する方法であって、
請求項５０〜５７のいずれか１項に記載の細胞もしくは請求項５８〜６０のいずれか１項に記載のベクターを前記対象に投与する工程；
ヌクレアーゼを前記対象に投与する工程；
任意で、SCDもしくはSCDに伴う症状の治療の恩恵を受け得る対象として前記対象を特定もしくは選択する工程；および／または
任意で、前記対象において、SCDの進行の改善もしくはSCDに伴う症状の改善を測定する工程
を含む方法。
【請求項８９】
前記ヌクレアーゼがTALENヌクレアーゼである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記ヌクレアーゼがCRISPR/Casヌクレアーゼである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
前記ヌクレアーゼが、前記細胞または前記ベクターとともに前記対象に共投与される、請求項８８〜９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
前記細胞が前記対象から得られたものであり、該細胞が、先行する請求項のいずれか１項に記載の核酸の導入により遺伝子組換えされている、請求項８８〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
前記投与が養子細胞移入によって行われる、請求項８８〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
前記細胞がヒト細胞である、請求項８８〜９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
前記細胞が初代細胞である、請求項８８〜９４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
前記細胞が自家細胞である、請求項８８〜９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
前記細胞がＴ細胞である、請求項８８〜９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
前記細胞が造血幹細胞（HSC）である、請求項８８〜９７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
前記細胞がＣＤ３４＋造血幹細胞（HSC）である、請求項８８〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
前記対象の骨髄に前記細胞を生着させる工程をさらに含む、請求項８８〜９９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記細胞が、前記対象から得られたものであり、かつ前記骨髄と同じ対象から得られたものである、請求項１００に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2019年3月19日に出願された「ヘモグロビン関連変異の編集のための相同組換え修復用鋳型の設計およびその送達」という名称の米国仮出願第62/820521号、および2018年4月27日に出願された「ヘモグロビン関連変異の編集のための相同組換え修復用鋳型の設計およびその送達」という名称の米国仮出願第62/663553号の優先権の利益を主張するものであり、これらの出願に開示された内容は、引用によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
配列表の参照
本願は電子形式の配列表とともに出願されたものである。この配列表は、SCRI194WOSEQLISTINGのファイル名で2019年4月15日に作成された約159kbのファイルとして提供されたものである。この電子形式の配列表に記載の情報は、引用によりその全体が本明細書に援用される。
【０００３】
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態のいくつかは、鎌状赤血球変異を含むヘモグロビン関連変異の改変などの、ヘモグロビン遺伝子座の改変に関する。いくつかの実施形態は、鎌状赤血球変異部位のホスホジエステルDNA鎖に切断を導入することによる鎌状赤血球変異の改変に関する。
【背景技術】
【０００４】
鎌状赤血球症（SCD）は、鎌状赤血球貧血などの血液疾患を含む。SCDは、場合によっては、赤血球内に見られる酸素運搬タンパク質のヘモグロビンに異常が発生することがある。このヘモグロビンの異常によって、柔軟性に乏しい鎌状の赤血球が見られることがあり、かつ／または貧血が起こることがある。
【０００５】
エンドヌクレアーゼを使用した系は、重要な遺伝子編集ツールとして急速に発展している。エンドヌクレアーゼを使用した遺伝子編集アプローチとしては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、メガヌクレアーゼ（MegaTALなど）またはCRISPR/Cas9を含むシステムがあるが、これらに限定されない。鎌状赤血球症（SCD）を抑制または治療するためのさらなるアプローチが必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書で提供する方法および組成物の実施形態は、鎌状赤血球変異を含むヘモグロビン関連変異の改変などの、ヘモグロビン遺伝子座の改変に関する。いくつかの実施形態は、HBB遺伝子の相同組換え修復（HDR）用の核酸に関する。
【０００７】
いくつかの実施形態は、細胞においてHBB遺伝子を編集する方法であって、（ｉ）ガイドRNA（gRNA）をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する工程、および（ii）鋳型ポリヌクレオチドを前記細胞に導入する工程を含む方法を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号１〜６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号７〜１２のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号１〜６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、gRNAをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する前記工程は、該gRNAをコードするポリヌクレオチドとCAS9タンパク質とを含むリボ核タンパク質（RNP）に前記細胞を接触させることを含む。いくつかの実施形態において、前記CAS9タンパク質と前記gRNAをコードするポリヌクレオチドの比率は、０．１：１〜１：１０である。いくつかの実施形態において、前記CAS9タンパク質と前記gRNAをコードするポリヌクレオチドの比率は、１：１〜１：５である。いくつかの実施形態において、前記CAS9タンパク質と前記gRNAをコードするポリヌクレオチドの比率は、約１：２．５である。
【００１０】
いくつかの実施形態において、前記鋳型ポリヌクレオチドは、HBB遺伝子の少なくとも一部またはその相補鎖をコードしている。いくつかの実施形態において、前記鋳型ポリヌクレオチドは、野生型HBB遺伝子の少なくとも一部またはその相補鎖をコードしている。いくつかの実施形態において、前記HBB遺伝子の少なくとも一部は、該HBB遺伝子のエキソン１を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、前記鋳型ポリヌクレオチドはウイルスベクターに含まれる。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは自己相補型AAV（scAAV）ベクターである。いくつかの実施形態において、前記鋳型ポリヌクレオチドは、HBB遺伝子の少なくとも約４ｋｂを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、前記鋳型ポリヌクレオチドは、一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ssODN）に含まれている。いくつかの実施形態において、前記ssODNは、配列番号６４〜７２のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ssODNは、配列番号６４〜７２のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、前記HBB遺伝子のエキソン１に二本鎖切断が生じる。いくつかの実施形態において、前記二本鎖切断は、前記HBB遺伝子のエキソン１の６番目のコドンに隣接する位置に生じる。
【００１４】
いくつかの実施形態において、工程（ｉ）は、工程（ii）の前に実施される。いくつかの実施形態において、工程（ｉ）と工程（ii）は、同時に実施される。いくつかの実施形態において、工程（ｉ）および／または工程（ii）は、ヌクレオフェクションを実施することを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオフェクションの実施は、ロンザ社製のシステムの使用を含む。いくつかの実施形態において、前記システムは、方形波パルスの使用を含む。いくつかの実施形態において、工程（ｉ）および／または工程（ii）は、約200,000個の細胞と20μlのヌクレオフェクション反応液を接触させることを含み、該ヌクレオフェクション反応液は、前記gRNAおよび／または前記鋳型ポリヌクレオチドを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、前記細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞（HSC）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞またはＢ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋細胞である。
【００１６】
いくつかの実施形態において、前記HBB遺伝子は、配列番号３７のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する。
【００１７】
いくつかの実施形態において、前記核酸は、HBB遺伝子をコードする第１の配列；１つ以上のガイドRNA切断部位をコードする第２の配列；および１つ以上のヌクレアーゼ結合部位をコードする第３の配列のうちの１つ以上を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、前記HBB遺伝子は、配列番号３７に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の配列は、配列番号１に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のヌクレアーゼ結合部位は、フォワードTALEN（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）結合部位およびリバースTALEN結合部位を含む。いくつかの実施形態において、前記１つ以上の核酸結合部位は、clustered regularly interspaced short palindromic repeats （CRISPR）関連タンパク質９（Cas9）結合部位である。いくつかの実施形態は、１つ以上のエンハンサーエレメントを含む。いくつかの実施形態は、相同アーム配列を含む。いくつかの実施形態は、プロモーターをコードする核酸配列を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態は、細胞におけるHBBタンパク質の発現に対するHDR促進用ベクターに関する。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、HBB遺伝子をコードする第１の配列；１つ以上のガイドRNA切断部位をコードする第２の配列；および１つ以上のヌクレアーゼ結合部位をコードする第３の配列のうちの１つ以上を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、前記HBB遺伝子は、配列番号３７に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の配列は、配列番号１に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のヌクレアーゼ結合部位は、フォワードTALEN（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）結合部位およびリバースTALEN結合部位を含む。いくつかの実施形態において、前記１つ以上の核酸結合部位は、clustered regularly interspaced short palindromic repeats （CRISPR）関連タンパク質９（Cas9）結合部位である。いくつかの実施形態は、１つ以上のエンハンサーエレメントを含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）である。いくつかの実施形態において、前記ベクターは自己相補型AAV（scAAV）ベクターである。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は自家細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞（HSC）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD34+HSCである。いくつかの実施形態は、細胞におけるCD40Lタンパク質の発現に対するHDR促進用システムに関する。いくつかの実施形態において、前記システムは、前記段落の１つ以上に記載のベクターと、ヌクレアーゼをコードする核酸とを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはTALENヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはCasヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ベクターおよび前記核酸は、前記細胞に共送達されるように構成されている。いくつかの実施形態において、前記細胞への共送達によって、内在性HBB遺伝子座が改変される。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒト造血細胞である。
【００２１】
いくつかの実施形態は、HBB発現用細胞に関する。いくつかの実施形態において、前記細胞は核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、HBB遺伝子をコードする第１の配列；プロモーターをコードする第２の配列；１つ以上のガイドRNA切断部位をコードする第３の配列；および１つ以上のヌクレアーゼ結合部位をコードする第４の配列のうちの１つ以上を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態において、前記核酸はベクターに組み込まれている。いくつかの実施形態において、前記ベクターはAAVである。いくつかの実施形態において、前記AAVはscAAVである。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は自家細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はHSCである。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD34+HSCである。
【００２３】
いくつかの実施形態は、HBB遺伝子の相同組換え修復（HDR）の促進を必要とする対象において、HBB遺伝子の相同組換え修復（HDR）を促進する方法に関する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記段落の１つ以上に記載の細胞またはベクターを前記対象に投与する工程；およびヌクレアーゼを前記対象に投与する工程のうちの１つ以上を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはTALENヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはCasヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、前記細胞または前記ベクターとともに前記対象に共投与される。いくつかの実施形態において、前記細胞は、前記対象から得られたものであり、前記段落の１つ以上に記載の核酸またはベクターを導入することによって遺伝子組換えされている。いくつかの実施形態において、前記投与は養子細胞移入によって行われる。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は自家細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はHSCである。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD34+HSCである。いくつかの実施形態において、前記対象は鎌状赤血球症に罹患している。いくつかの実施形態において、HDRの促進により前記HBB遺伝子に１つ以上の編集が行われる。いくつかの実施形態において、前記HBB遺伝子への前記１つ以上の編集は、鎌状赤血球変異の修正を含む。いくつかの実施形態において、前記鎌状赤血球変異はＥ７Ｖ変異を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態は、鎌状赤血球症（SCD）またはSCDに伴う症状の治療、抑制または緩和を必要とする対象において、鎌状赤血球症（SCD）またはSCDに伴う症状を治療、抑制または緩和する方法に関する。いくつかの実施形態において、この方法は、前記段落の１つ以上に記載の細胞またはベクターを前記対象に投与する工程；ヌクレアーゼを前記対象に投与する工程；任意で、SCDもしくはSCDに伴う症状の治療の恩恵を受け得る対象として前記対象を特定もしくは選択する工程；および／または任意で、前記対象において、SCDの進行の改善もしくはSCDに伴う症状の改善を測定する工程のうちの１つ以上を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはTALENヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはCRISPR/Casヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、前記細胞または前記ベクターとともに前記対象に共投与される。いくつかの実施形態において、前記細胞は、前記対象から得られたものであり、前記段落の１つ以上に記載の核酸またはベクターを導入することによって遺伝子組換えされている。いくつかの実施形態において、前記投与は養子細胞移入によって行われる。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は自家細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はHSCである。いくつかの実施形態において、前記細胞はCD34+HSCである。いくつかの実施形態は、前記対象の骨髄に前記細胞を生着させる工程を含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は、前記対象から得られたものであり、かつ前記骨髄と同じ対象から得られたものである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃは、各ヌクレアーゼによってHBB遺伝子座が効率的に編集されたこと示すデータを示したグラフである。図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃは、各ヌクレアーゼに応答したINDEL率（%）をそれぞれ示したグラフである。
【００２８】
【図２】図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅおよび図２Ｆは、欠失修復鋳型1242、1243、1244および1245のrAAV6による送達試験の設計を示した図と、これに関連するデータを示す。
【００２９】
【図３】図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ、図３Ｅおよび図３Ｆは、非欠失修復鋳型1289および1290のrAAV6による送達試験の設計を示した図と、これに関連するデータを含む。
【００３０】
【図４】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃおよび図４Ｄは、ヒトのコドンに最適化された鎌状赤血球導入カセット1246、1247、1248および1249のrAAV6による送達試験の設計を示した図と、これに関連するデータを含む。
【００３１】
【図５】図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅおよび図５Ｆは、鎌状赤血球変異導入（GTC）用鋳型1314のrAAV6による送達試験の設計を示した図と、これに関連するデータを含む。
【００３２】
【図６】図６Ａ、図６Ｂおよび図６Ｃは、鎌状赤血球導入用修復鋳型1321のrAAV6による送達試験の設計を示した図と、これに関連するデータを含む。
【００３３】
【図７】図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃおよび図７Ｄは、鎌状赤血球変異（GTCへの変化）を導入するためのssODNの試験の設計を示した図と、これに関連するデータを含む。
【００３４】
【図８】図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃ、図８Ｄ、図８Ｅおよび図８Ｆは、鎌状赤血球の修正（CCC GAAへの変化）用のssODNの試験の設計を示した図と、これに関連するデータを含む。
【００３５】
【図９】図９Ａ、図９Ｂおよび図９Ｃは、１２週間後におけるW41マウスの骨髄における編集されたヒト細胞の生着を示すデータを示したグラフを含む。
【００３６】
【図１０Ａ】sgRNAの結合部位およびTALENの結合部位の位置を示したHBB遺伝子ゲノムの概略図を示す。GAG（６番目のコドン）からGTCまたはGTGにヌクレオチドが置換されることによって、アミノ酸がグルタミン酸からバリンに変化し、鎌状赤血球症（SCD）が起こる。
【００３７】
【図１０Ｂ】HBB遺伝子において二本鎖切断（DSB）を作製するためのTALEN mRNA（T）またはsgRNA候補（g1〜g6；RNPとして送達）を、TIDE/ICEでの測定によりスクリーニングした結果を示す（ドナーn=2〜3）。
【００３８】
【図１０Ｃ】mPBSCにおいて編集効率を最大限まで向上させるためのcas9：sgRNAの比率の最適化を示す。NHEJ率はTIDE/ICEで分析した（Cas9：sgRNAの比率＝１：１（各40pmol）、ドナーn=2；またはCas9：sgRNAの比率＝１：２．５（20pmolのCas9と50pmolのsgRNA、ドナーn=15））。
【００３９】
【図１０Ｄ】RNPとして送達されたsgRNA-g1を使用した場合の、mPBSCにおけるHBB遺伝子のオンターゲットな破壊とHBD遺伝子の潜在的なオフターゲットな破壊のMiSeq分析による評価を示す（ドナーn=7）。
【００４０】
【図１０Ｅ】NEONエレクトロポレーションシステム（ドナーn=15）またはロンザ社のヌクレオフェクションシステム（ドナーn=3）を使用した場合の、RNPとして送達したsgRNA-g1の編集効率を示す。棒グラフはいずれも平均値±SDを示す。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001。p値は、二元配置分散分析とDunnettの多重比較によって、各試料の平均値をそれぞれに対応するコントロール試料の平均値と比較することによって算出した。
【００４１】
【図１０Ｆ】CCTopアルゴリズムによって予測された上位５つのオフターゲット遺伝子のオフターゲット分析を示す。ゲルは、mock処理試料（M）またはsgRNA-g1 RNPで処理した試料（RNP）から増幅された上位５つのオフターゲット遺伝子のアンプリコンのT7エンドヌクレアーゼアッセイによる評価を示す。（ｉ）OT1：DENND3（レーン1〜2）、（ii）OT2：MIR7974（レーン3〜4）、（iii）OT3：LINC01206（レーン5〜6）、（iv）OT4：HBD（レーン7〜8）、（ｖ）OT5：TULP4（レーン9〜10）、（vi）標的部位：HBB（レーン11〜12）を示す。アスタリスク（*）は切断されたバンドを示す。#は、切断断片と考えられる断片のいずれとも一致しないゴーストバンドを示す（TULP4において313bpおよび143bp）。
【００４２】
【図１０Ｇ】上位５つのオフターゲット遺伝子のTIDE/ICEシーケンシング分析を示す。（ｉ）OT1：DENND3（ii）OT2：MIR7679（iii）OT3：LINC01206（iv）OT4：HBD（ｖ）OT5：TULP4（vi）標的部位：HBBを示す（実験はn=2で行った）。
【００４３】
【図１１Ａ】鎌状赤血球変異を導入するGTC（E6V）またはコドン最適化するSNP変化を導入するGAA（E6optE）が、HDRによって６番目のコドンに誘導されるように設計したrAAV6カセットの概略図を示す。
【００４４】
【図１１Ｂ】RNPとrAAV6の送達による遺伝子編集を試験し、次いでmPBSCにおいて赤血球系分化を行う実験のタイムラインを示す。
【００４５】
【図１１Ｃ】RNPのみをエレクトロポレーションした場合、rAAV6ドナー鋳型のみを形質導入した場合、またはグラフに示した濃度のGTC（E6V）rAAV6ドナー鋳型とRNPを共送達した場合の、ddPCRで測定したHDR率（%）、TIDE/ICEシーケンシングで測定したNHEJ率（%）、およびWT（%）を示す（ドナーn=4）。
【００４６】
【図１１Ｄ】RNPのみで処理した細胞、rAAV6のみで処理した細胞、またはRNPとGTC（E6V）rAAV6で処理した細胞において、β−グロビンの発現を測定した赤血球系細胞のRP-HPLC分析を示す（ドナーn=7）。
【００４７】
【図１１Ｅ】RNPのみをエレクトロポレーションし、rAAV6ドナー鋳型のみを形質導入した場合、またはグラフに示した濃度のGAA（E6optE）rAAV6ドナー鋳型（1%rAAV6）とRNPを共送達した場合の、ddPCRで測定したHDR率（%）およびTIDE/ICEシーケンシングで測定したNHEJ率（%）、ならびにWT（%）を示す（ドナーn=3）。
【００４８】
【図１１Ｆ】RNPのみで処理した細胞、rAAV6のみで処理した細胞、またはRNPとGAA（E6optE）rAAV6で処理した細胞において、β−グロビンの発現を測定した赤血球系細胞のRP-HPLC分析を示す（ドナーn=3）。（βＡ＝成人グロビン、βＳ＝鎌状赤血球グロビン、γＧ＝γ２、γＡ＝γ１）。棒グラフはいずれも平均値±SDを示す。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001。p値は、二元配置分散分析とDunnettの多重比較によって、各試料のNHEJ率（%）、HDR率（%）、WT（%）またはグロビンのサブタイプ（%）の平均値を、それぞれに対応するmock試料のNHEJ率（%）、HDR率（%）、WT（%）またはグロビンのサブタイプ（%）と比較することによって算出した。
【００４９】
【図１１Ｇ】Neonエレクトロポレーションシステム（n=3）またはロンザ社のヌクレオフェクションシステム（n=1）を使用して、RNPとGTC（E6V）rAAV6を共送達した場合の、ddPCRで測定したHDRの結果およびTIDE/ICEシーケンシングで測定したNHEJの結果を示す。
【００５０】
【図１１Ｈ】Neonエレクトロポレーションを使用して、RNPで編集しGTC（E6V）rAAV6で形質導入した試料（n = 5）のコロニーシーケンシングを示す。
【００５１】
【図１１Ｉ】エレクトロポレーションおよびGTC（E6V）rAAV6またはGAA（E6optE）rAAV6による形質導入を行った２日目におけるmPBSCの生存能力を示す。
【００５２】
【図１１Ｊ】rAAV6のみで処理した細胞およびRNPとGTC（E6V）rAAV6で処理した細胞においてインビトロでグロビン四量体を測定した赤血球系細胞のイオン交換クロマトグラフィーを示す（HbF：胎児ヘモグロビン、HbA：成人ヘモグロビン、HbA2：成人の微小成分、ヘモグロビンＳ：鎌状赤血球）。棒グラフはいずれも平均値±SDを示す。nは、個々の実験の数を示す。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001。p値は、二元配置分散分析とDunnettの多重比較によって、各試料の平均値をそれぞれに対応するコントロール試料の平均値と比較することによって算出した。
【００５３】
【図１１Ｋ】編集し分化させた赤血球系細胞のRP-HPLC分析を示す。参照試料、Mock細胞、rAAV6のみを形質導入した細胞、および鎌状赤血球グロビンの発現を誘導するGTC（E6V）rAAV6（3%）とRNPを形質導入した細胞のRP-HPLCクロマトグラムのトレースを示す（α＝αグロビン、βＡ＝成人、βＳ＝鎌状赤血球、γＧ＝γ２、γＡ＝γ１）。垂直方向に示した数値はHPLCの溶出時間である。下方に示したトレースは、鎌状赤血球グロビンの発現を示す（赤色の矢印）。
【００５４】
【図１１Ｌ】sgRNA-g1 RNPと組み合わせて試験するためにrAAV6として送達した複雑なcDNAカセットの概略図を示す。cDNAカセット1321は、GTC変化（E6Vへのアミノ酸変化）を誘導するHBG1Δ13プロモーターと、赤血球系細胞のエンハンサーであるHPFH-2およびHS-40を有する。MND-GFPは、HDR用のサロゲートとして使用し、SV40ポリアデニル化配列と逆方向である。cDNAカセット1322は、HBBプロモーターを除去するための欠失（Δ−127、Δ−71）を有すること以外は、cDNAカセット1321と同一の設計を有する。実験のセットアップは図１１Ｂと同様とした。
【００５５】
【図１１Ｍ】RNPのみ、rAAV6のみ、またはRNPとrAAV6をエレクトロポレーションおよび形質導入した１４日後にフローサイトメトリーで測定したGFPの発現を示す（1321のドナー：n=2、1322のドナー：n=1）。
【００５６】
【図１１Ｎ】RNPのみで処理した細胞、rAAV6のみで処理した細胞、またはRNPとGTC（E6V）1321/1322 rAAV6で処理した細胞において、β−グロビンの発現を測定した赤血球系細胞のRP-HPLC分析を示す。棒グラフはいずれも平均値±SDを示す。nは、個々の実験の数を示す。（α＝αグロビン、βＡ＝成人、βＳ＝鎌状赤血球、γＧ＝γ２、γＡ＝γ１）。
【００５７】
【図１１Ｏ】編集し分化させた赤血球系細胞のRP-HPLC分析を示す。Mock細胞、rAAV6のみを形質導入した細胞、および成人グロビンの発現を誘導するGAA（E6optE）rAAV6とRNPを形質導入した細胞のRP-HPLCクロマトグラムのトレースを示す（α＝αグロビン、βＡ＝成人、βＳ＝鎌状赤血球、γＧ＝γ２、γＡ＝γ１）。垂直方向に示した数値はHPLCの溶出時間である。下方に示したトレースは、成人グロビンの発現の回復を示す。
【００５８】
【図１２Ａ】鎌状赤血球変異を導入するGTC（E6V）またはコドン最適化するSNP変化を導入するGAA（E6optE）がHDRによって６番目のコドンに誘導されるように設計したssODNカセットの概略図を示す。
【００５９】
【図１２Ｂ】RNPとssODNの送達による遺伝子編集を試験し、次いでmPBSCにおいて赤血球系分化を行う実験のタイムラインを示す。
【００６０】
【図１２Ｃ】RNPのみをエレクトロポレーションした場合、またはグラフに示した濃度（50pmolのssODN）のGTC（E6V）ssODNドナー鋳型とRNPを共送達した場合の、ddPCRで測定したHDR率（%）、TIDE/ICEシーケンシングで測定したNHEJ率（%）、およびWT（%）を示す（ドナーn=5）。
【００６１】
【図１２Ｄ】RNPのみで処理した細胞、またはRNPとGTC（E6V）ssODN（50pmolのssODN）で処理した細胞において、β−グロビンの発現を測定した赤血球系細胞のRP-HPLC分析を示す（ドナーn=5）。
【００６２】
【図１２Ｅ】RNPのみをエレクトロポレーションした場合、またはグラフに示した濃度（50pmolのssODN）のGAA（E6optE）ssODNとRNPを共送達した場合の、ddPCRで測定したHDR率（%）、TIDE/ICEシーケンシングで測定したNHEJ率（%）、およびWT（%）を示す（ドナーn=8）。
【００６３】
【図１２Ｆ】RNPのみで処理した細胞、またはRNPとGAA（E6optE）ssODN（50pmolのssODN）で処理した細胞において、β−グロビンの発現を測定した赤血球系細胞のRP-HPLC分析を示す（ドナーn=6）。（α＝αグロビン、βＡ＝成人、βＳ＝鎌状赤血球、γＧ＝γ２、γＡ＝γ１）。棒グラフはいずれも平均値±SDを示す。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001。p値は、二元配置分散分析とDunnettの多重比較によって、各試料のNHEJ率（%）、HDR率（%）、WT（%）またはグロビンのサブタイプ（%）の平均値を、それぞれに対応するmock試料のNHEJ率（%）、HDR率（%）、WT（%）またはグロビンのサブタイプ（%）と比較することによって算出した。
【００６４】
【図１２Ｇ】鎌状赤血球変異をHDRにより６番目のコドンに導入するGTC（E6V）ssODNもしくはGTG（E6V）ssODN、またはコドン最適化されたSNP変化をHDRにより６番目のコドンに導入するGAA（E6optE）ssODNをエレクトロポレーションした２日後におけるCD34+mPBSCの生存能力を示す。
【００６５】
【図１２Ｈ】RNPのみをエレクトロポレーションした場合、またはグラフに示した濃度（50pmolのssODN）のGTG（E6V）ssODNドナーとRNPを共送達した場合の、ddPCRで測定したHDR率（%）、TIDE/ICEシーケンシングで測定したNHEJ率、およびWT（%）を示す（ドナーn=3）。
【００６６】
【図１２Ｉ】Neonエレクトロポレーションシステムを使用した試験において、RNPで編集し、GTG（E6V）ssODNまたはGAA（E6optE）ssODNで改変した試料のコロニーシーケンシングを示す（ドナーn=3）。
【００６７】
【図１２Ｊ】GTG（E6V）ssODNの送達により編集した細胞において、グロビンの発現を測定した赤血球系細胞のRP-HPLC分析を示す（ドナーn=3）。（α＝αグロビン、βＡ＝成人、βＳ＝鎌状赤血球、γＧ＝γ２、γＡ＝γ１）。
【００６８】
【図１２Ｋ】Neonエレクトロポレーションシステム（50pmolのssODN、n=2）またはロンザ社のヌクレオフェクションシステム（50pmolのssODN、n=3）を使用して、RNPのみをエレクトロポレーションした場合、またはグラフに示した濃度のGAA（E6optE）ssODNとRNPを共送達した場合の、ddPCRで測定したHDR率（%）、TIDE/ICEシーケンシングで測定したNHEJ率（%）、およびWT（%）を示す。棒グラフはいずれも平均値±SDを示す。nは、個々の実験の数を示す。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001。
【００６９】
【図１２Ｌ】編集し分化させた赤血球系細胞のRP-HPLC分析を示す。Mock細胞、RNPのみを形質導入した細胞、および鎌状赤血球グロビンの発現を誘導するGTC（E6V）ssODNドナー鋳型とRNPを形質導入した細胞、または鎌状赤血球グロビンの発現を誘導するrAAV6ドナー鋳型とRNPを形質導入した細胞のRP-HPLCクロマトグラムのトレースを示す（α＝αグロビン、βＡ＝成人、βＳ＝鎌状赤血球、γＧ＝γ２、γＡ＝γ１）。垂直方向に示した数値はHPLCの溶出時間である。下方に示したトレースは、鎌状赤血球グロビンの発現を示す（赤色の矢印）。
【００７０】
【図１２Ｍ】編集し分化させた赤血球系細胞のRP-HPLC分析を示す。参照試料、Mock細胞、RNPのみを形質導入した細胞、および鎌状赤血球グロビンの発現を誘導するGTG（E6V）ssODNとRNPを形質導入した細胞のRP-HPLCクロマトグラムのトレースを示す（α＝αグロビン、βＡ＝成人、βＳ＝鎌状赤血球、γＧ＝γ２、γＡ＝γ１）。垂直方向に示した数値はHPLCの溶出時間である。下方に示したトレースは、鎌状赤血球グロビンの発現を示す（矢印）。
【００７１】
【図１２Ｎ】編集し分化させた赤血球系細胞のRP-HPLC分析を示す。Mock細胞、RNPのみを形質導入した細胞、および成人グロビンの発現を誘導するGAA（Eopt6E）ssODNドナー鋳型とRNPを形質導入した細胞、または鎌状赤血球グロビンの発現を誘導するrAAV6ドナー鋳型とRNPを形質導入した細胞のRP-HPLCクロマトグラムのトレースを示す（α＝αグロビン、βＡ＝成人、βＳ＝鎌状赤血球、γＧ＝γ２、γＡ＝γ１）。垂直方向に示した数値はHPLCの溶出時間である。下方に示したトレースは、成人グロビンの発現の回復を示す。
【００７２】
【図１３Ａ】GTC（E6V）rAAV6（n=6）で処理した細胞または（GTC ssODN（E6V、n=8）、GTG ssODN（E6V、n=3）もしくはGAA ssODN（E6optE、n=2）を使用して）ssODNで処理した細胞において、HDRによる編集とNHEJによる編集をMiSeq分析で定量して比較した結果を示す。
【００７３】
【図１３Ｂ】rAAV6またはssODNを送達してHDRを促進後、MiSeqによって、RNPのみを介した編集と細胞中のindelの残存を比較したindelスペクトル分析を示す（ドナーn=6）。
【００７４】
【図１３Ｃ】Mock、RNPのみを送達した試料、rAAV6とRNPを共送達した試料、およびssODNとRNPを共送達した試料において測定したWT、NHEJ（挿入、置換、欠失）およびHDRを示す。分析した試料は、編集後１４日目に分析した移植前のインプット試料であった（n= 4）。棒グラフはいずれも平均値±SDを示す。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001。p値は、二元配置分散分析とDunnettの多重比較によって、各試料の平均NHEJ率（%）および平均HDR率（%）をそれぞれに対応するmock試料のNHEJ率（%）およびHDR率（%）と比較することによって算出した。
【００７５】
【図１３Ｄ】編集されたインビトロの試料およびインビボの骨髄試料から得たアライメントしたペアエンドリードの数を示す。各ドットはユニークな試料を示す。
【００７６】
【図１３Ｅ】Mock、RNPのみを送達した試料、rAAV6とRNPを共送達した試料、およびssODNとRNPを共送達した試料において観察された主なNHEJイベントから得たコンセンサス配列を示す。
【００７７】
【図１３Ｆ】rAAV6またはssODNを送達してHDRを促進後、MiSeqによって、フレームシフト変異率（%）をインビトロおよびインビボで定量した結果を示す。
【００７８】
【図１４Ａ】GTC（E6V）rAAV6で処理した細胞またはssODNで処理した細胞の遺伝子編集を、インビトロのmPBSCまたはインビボのNBSGWマウスモデルにおいて試験するための実験のタイムラインを示す。
【００７９】
【図１４Ｂ】FSC/SSCおよび単一細胞でゲーティングした場合の、骨髄および脾臓におけるヒト細胞（hCD45+）のキメリズムを示す。
【００８０】
【図１４Ｃ】骨髄中hCD45+集団におけるヒトCD19+サブセットおよびヒトCD33+サブセットを示す。
【００８１】
【図１４Ｄ】mCD45-集団をゲーティングした骨髄中ヒトCD235+細胞を示す。骨髄細胞を赤血球系細胞分化培地中で１４日間にわたりエクスビボで培養し、フローサイトメトリーでCD235+細胞（エクスビボ）を測定した。
【００８２】
【図１４Ｅ】骨髄中hCD45+集団におけるヒトCD34+細胞およびヒトCD34+CD38lo細胞の割合を示す。
【００８３】
【図１４Ｆ】GTC（E6V）rAAV6で処理した細胞またはssODNで処理したインプット細胞（１４日目；n=4）；移植の３週間後（２１日目；n=2）、および移植の１２〜１４週間後（８４〜９６日目）において、ddPCRで測定したHDR率を示す（Mock：n=8、RNP+rAAV6：n=17、RNP+ssODN：n=18）。
【００８４】
【図１４Ｇ】GTC（E6V）rAAV6で処理した細胞またはssODNで処理したインプット細胞（１４日目）、移植の３週間後（２１日目）、および移植の１２〜１４週間後（８４〜９６日目）において、TIDE/ICEシーケンシングで測定したNHEJ率を示す。
【００８５】
【図１４Ｈ】GTC（E6V）rAAV6で処理した細胞またはssODNで処理した細胞をグラフに示した時点においてMiSeq分析で測定したHDR率を示す。
【００８６】
【図１４Ｉ】GTC（E6V）rAAV6で処理した細胞またはssODNで処理した細胞をグラフに示した時点においてMiSeq分析で測定したNHEJ率を示す。nは試料の数または動物の頭数を示す。インプットn = 4、棒グラフはいずれも平均値±SDを示す。ns：有意差なし。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001。p値は、二元配置分散分析とDunnettの多重比較によって、各試料のNHEJ率（%）、HDR率（%）またはWT（%）の平均値を、それぞれに対応するmock試料のNHEJ率（%）、HDR率（%）またはWT（%）と比較することによって算出した。
【００８７】
【図１４Ｊ】hCD45+集団をゲーティングした脾臓中のヒトCD19+集団およびヒトCD33+集団を示す。
【００８８】
【図１４Ｋ】非CD19+細胞および非CD33+細胞をゲーティングした骨髄および脾臓中のヒトCD3+集団を示す。
【００８９】
【図１４Ｌ】GTC（E6V）ドナーで編集したHSCを移植したNBSGWレシピエントマウスの骨髄中のヒト細胞（hCD45+）の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。フローサイトメトリープロットは、（ｉ）Mock編集細胞のレシピエント、（ii）rAAV6で編集した細胞のレシピエント、または（iii）ssODNで編集した細胞のレシピエントの骨髄中のCD19+細胞、CD33+細胞およびCD235+細胞を含む多系統の細胞の生着を示す。ゲーティング方法：単一のhCD45+生細胞＞CD19+ CD33+。赤血球系細胞は、mCD45-細胞に対してゲーティングした。
【００９０】
【図１４Ｍ】左パネルは、（ｉ）Mock編集集団、（ii）rAAV6で編集した集団または（iii）ssODNで編集（GTC（E6V）で改変）した集団における、移植前のCD34+細胞およびCD34+CD38lo細胞の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。ゲーティング方法：単一のhCD45+生細胞＞CD34+CD38+＞CD90+CD133+。右のパネルは、CD133+CD90+ダブルポジティブ細胞として同定されるLT-HSC濃縮集団を同定するためにさらなるマーカーを使用した、CD34+CD38lo細胞の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。
【００９１】
【図１４Ｎ】（ｉ）Mock編集細胞（ii）rAAV6で編集した細胞または（iii）ssODN（GTC（E6V）ドナーコンストラクト）で編集した細胞を移植したNBSGWマウスの骨髄から得たCD34+コンパートメントおよびCD34+CD38loコンパートメントの代表的なフローサイトメトリープロットを示す。ゲーティング方法：単一のhCD45+生細胞＞CD34+ CD38+。
【００９２】
【図１４Ｏ】GTC（E6V）rAAV6送達またはssODN送達を使用してCD34+mPBSCの遺伝子編集を行った後、赤血球系培養においてβ−グロビンのサブタイプを測定したRP-HPLC分析を示す。
【００９３】
【図１４Ｐ】mock改変細胞（n=2）、GTC（E6V）で編集したrAAV6で改変した細胞（n=4）、またはssODNで改変した細胞（n = 3）を移植したレシピエントマウスから１２〜１４週間後に単離した骨髄細胞を、採取後に２週間にわたって赤血球系細胞の培養条件下においてエクスビボで拡大増殖させた。その後、発現されたグロビンのサブタイプをRP-HPLC分析により測定した（α＝αグロビン、βＡ＝成人、βＳ＝鎌状赤血球、γＧ＝γ２、γＡ＝γ１）。
【００９４】
【図１４Ｑ】遺伝子編集後に発現されたグロビン四量体を測定するための、（methocult培地中での培養から発生した）単一のBFU-Eコロニーのイオン交換HPLCを示す。
【００９５】
【図１４Ｒ】遺伝子編集された細胞において発現されたグロビン四量体を測定するための、単一のBFU-Eコロニーのイオン交換HPLCの結果の総括を示す（HbF：胎児ヘモグロビン、HbA：成人ヘモグロビン、HbA2：成人の微小成分、ヘモグロビンＳ：鎌状赤血球）。棒グラフはいずれも平均値±SDを示す。nは、個々の動物の頭数を示す。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001。p値は、二元配置分散分析とDunnettの多重比較によって、各試料の平均値をそれぞれに対応するmock試料またはコントロール試料の平均値と比較することによって算出した。
【００９６】
【図１４Ｓ】編集し分化させた赤血球系コロニーのIEC分析を示す。グロビン四量体を測定するための、４種の移植から得た単一のBFU-Eコロニーのイオン交換HPLCの例を示す（HbF：胎児ヘモグロビン、HbA：成人ヘモグロビン、HbA2：成人の微小成分、ヘモグロビンＳ：鎌状赤血球）。下方に示したトレースは、GTC（E6V）ssODNで編集し生着させたHSCに由来する単一コロニーにおける鎌状赤血球グロビンの発現を示す（赤色の矢印）。垂直方向に示した数値はHPLCの溶出時間である。
【００９７】
【図１４Ｔ】編集し分化させた赤血球系コロニーのIEC分析を示す。グロビン四量体を測定するための、３種の移植から得た単一のBFU-Eコロニーのイオン交換HPLCを示す（HbF：胎児ヘモグロビン、HbA：成人ヘモグロビン、HbA2：成人の微小成分、ヘモグロビンＳ：鎌状赤血球）。下方に示したトレースは、GTC（E6V）ssODNで編集し生着させたHSCに由来するコロニーにおける鎌状赤血球グロビンの発現を示す（赤色の矢印）。垂直方向に示した数値はHPLCの溶出時間である。
【００９８】
【図１５Ａ】SCGM培地またはSFEM-II培地において、ロンザ社のヌクレオフェクション方法であるCM149法またはER100法を使用した場合の、細胞数で測定した編集後の生存能力（%）のグラフ、ddPCRで測定したHDR率（%）のグラフ、ICEで測定したNHEJ率（%）のグラフ、およびフローサイトメトリーで測定したLT-HSCコンパートメント（ゲーティング方法：単一のCD34+CD38lo生細胞＞CD90+ CD133+）のグラフを示す。
【００９９】
【図１５Ｂ】SCGM培地またはSFEM-II培地において、ロンザ社のヌクレオフェクション方法であるCM149法またはER100法を使用した場合の、編集後のβ様グロビンの割合（%）のグラフ、およびrAAV6ドナー鋳型またはssODNドナー鋳型を使用したHDR率のグラフを示す。
【０１００】
【図１６Ａ】SFEM-II培地においてロンザ社のヌクレオフェクション方法であるCM149法またはER100法を使用し、ヌクレオフェクション時の細胞密度を様々に変えた場合の生存能力（%）のグラフを示す。
【０１０１】
【図１６Ｂ】SFEM-II培地においてロンザ社のヌクレオフェクション方法であるCM149法またはER100法を使用し、ヌクレオフェクション時の細胞密度を様々に変えた場合のHDR率のグラフを示す。
【０１０２】
【図１６Ｃ】SFEM-II培地においてロンザ社のヌクレオフェクション方法であるCM149法またはER100法を使用し、ヌクレオフェクション時の細胞密度を様々に変えた場合のNHEJ率（%）のグラフを示す。
【０１０３】
【図１７Ａ】ロンザ社の様々なヌクレオフェクションプロトコルを使用して、EP、RNP、またはRNPとssODNで処理した細胞における編集後２〜１４日目の生存能力（%）を示したグラフを示す。
【０１０４】
【図１７Ｂ】ロンザ社の様々なヌクレオフェクションプロトコルを使用して、EP、RNP、またはRNPとssODNで処理した細胞における編集後２〜１４日目のHDR率（%）、NHEJ率（%）およびβ様グロビンの発現を示したグラフを示す。
【０１０５】
【図１７Ｃ】ロンザ社の様々なヌクレオフェクションプロトコルで処理した細胞における生存能力およびHDR率の比較を示す。
【０１０６】
【図１８】ロンザ社のヌクレオフェクションプロトコルDU100またはCX100で処理した細胞の生存能力（%）、HDR率およびNHEJ率を示したグラフを示す。
【０１０７】
【図１９】mock処理試料、AAV処理試料、RNP処理試料ならびにE6V（GTC）への変化またはEoptE（GAA）への変化を誘導したRNP+ AAV処理試料およびRNP+ssODN処理試料の代表例のddPCRアッセイの結果を示す。
【０１０８】
【図２０Ａ】ddPCRデータから測定したHDR率（%）のグラフを示す。
【０１０９】
【図２０Ｂ】ICEのアルゴリズムデータから測定したHDR率（%）のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１１０】
本明細書で開示する組成物および方法の実施形態のいくつかは、ヘモグロビン関連変異の編集に関する。このような実施形態のいくつかは、鎌状赤血球変異部位のホスホジエステルDNA鎖に切断を導入することによる鎌状赤血球変異のインサイチュー編集に関する。
【０１１１】
鎌状赤血球症（SCD）は、単一のヌクレオチドのトランスバージョンにより成人のグロビン（βＡ）の疎水性が増加して、グロビンが重合しやすくなることに起因する。SCD患者は、輸血に依存することが多く、死亡率が高く、寿命も短い。HLAの一致した健常ドナーからの同種移植により根治的治療を行うことができるものの、HLA一致ドナーが見つかるかどうかは限定的であり、また、移植片対宿主病（GvHD）を発症する可能性ならびに高強度の骨髄破壊的前処置による短期的かつ長期的な影響があることから、結果がどのようになるかは判断しにくい。自家幹細胞において遺伝子編集を行うことにより、HLA一致ドナーを見つけることが難しいという問題を回避することができ、かつ自己複製幹細胞において疾患原因変異を直接修正することができる。さらに、確実な標的化遺伝子編集が確立できれば、初期のウイルスベクターによって過去に引き起こされてきた無作為な組み込みのリスクを軽減することができると考えられる。
【０１１２】
遺伝子編集では、部位特異的エンドヌクレアーゼにより二本鎖切断（DSB）が作製され、この二本鎖切断が、細胞内のDNA修復機構によって継ぎ目のない修復として解消される。DNA修復機構としては、エラーを起こしやすい非相同末端結合（NHEJ）またはDNAドナー鋳型の存在下での正確な相同組換え修復（HDR）が利用される。これらの修復の結果は、細胞周期の段階による影響を顕著に受ける。G0/G1期の休止細胞におけるDSBは、主にNHEJによって解消されるが、HDRによるDSBの解消には、S/G2期への移行が必要とされる。これらの修復結果は互いに排他的であることから、個々のHSC内およびHSC集団全体での全体的な結果は、NHEJによる修復とHDRによる修復とが競合する。
【０１１３】
鎌状赤血球症（SCD）患者のHBB遺伝子のエキソン１における単一ヌクレオチド変異は、デザイナーヌクレアーゼ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）mRNA、TALEN、CRISPR/Cas9など）を利用し、これに様々なDNA修復鋳型の共送達方法（インテグラーゼ欠損レンチウイルス（IDLV）、rAAV6、ssODNなど）を組み合わせた相同組換え修復によって修正することができる（Hoban, MD, et al. (2015). Blood 125: 2597-2604; DeWitt, MA, et al (2017) Methods 121-122: 9-15; Dever, DP, et al. (2016) Nature 539: 384-389; and Hoban, MD, et al. (2016) Mol Ther 24: 1561-1569.）17-20；これらの文献はいずれも引用によりその全体が本明細書に明示的に援用される）。これらのアプローチのうち、rAAV6または一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ssODN）の使用は、最も効率的なドナー鋳型送達プラットフォームの１つである。しかし、総体的な編集結果（正確なHDR頻度と正確なNHEJ頻度の比較を含む）は、rAAV6ドナー鋳型の送達方法およびssODNドナー鋳型の送達方法に対して同時に比較されたことはない。さらに、臨床的に意義があり、かつ治療に有用な信頼性の高いHDR結果を得るには、それに相応して、エラーを起こしやすいNHEJによって不適切にDSBが修復されてゲノムの不安定性を引き起こすという問題を克服する必要がある。
【０１１４】
（ｉ）HDRの結果とNHEJの結果の比率；（ii）編集後のHSCコンパートメントの完全性および長期的な生着能力の維持；および（iii）編集された細胞の長期的な持続性の向上において、ドナー鋳型送達の役割についての理解をさらに深めるため、本明細書で開示するように、インビトロおよびインビボで成人CD34+mPBSCにドナー鋳型を送達する様々な方法を評価した。これらの研究では、鎌状赤血球変異（GTCまたはGTG；グルタミン酸からバリンへの変化をコード（E6V））または同義変化（GAA；グルタミン酸からグルタミン酸への変化をコード（E6optE））を含み、これらの変異を健常ドナー由来mPBSCに導入した。RNPを介してHBBのエキソン１を破壊し、従来のものとは異なる新規なドナー鋳型を送達した後、ddPCRによる分子解析と、鎌状赤血球グロビンの誘導（βＳ；GTCまたはGTGの場合E6Vへの変化）によるグロビンの発現または成人グロビンの回復（GAAへの変化の場合E6optE）とを機能的結果として利用して、遺伝子編集の結果を評価した。これらのアプローチを利用して、従来のものとは異なる新規な送達プラットフォームによる結果を直接比較した。インビトロ研究では、ssODNドナー鋳型を送達した場合、HDRの導入よりもNHEJの導入の方が有意に多く見られたが、rAAV6の送達は、NHEJよりもHDRを比例的に高頻度に誘導するという点で優れていることが示された。これと並行して、GTCへの変化（E6V）を含むようにHDRにより編集されたHSC細胞を移植し、移植したHSC細胞の生着および持続性を長期的に評価した。インビトロでの知見とは対照的に、ssODNドナー鋳型で改変した細胞は、NBSGWレシピエントマウスの骨髄（BM）において、１２〜１４週間後も非常に高い割合で生存を維持した。これらの知見から、HDRに基づく新規な遺伝子編集方法の重要な機能性評価が得られた。
【０１１５】
本明細書で提供される遺伝子編集システムおよび遺伝子編集方法は、遺伝子破壊および／または遺伝子標的化を含む（ただしこれらに限定されない）、ヌクレアーゼに基づく遺伝子編集アプローチに適用することができる。たとえば、本開示の態様は、CRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集に関する。いくつかの実施形態において、Cas9ヌクレアーゼを使用して遺伝子編集効率を向上させる。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼに基づく遺伝子編集システムおよびその方法が提供される。ヌクレアーゼに基づく遺伝子編集アプローチとしては、ZFN、TALEN、メガヌクレアーゼ（たとえばMegaTAL）、CRISPR/Cas9などのヌクレアーゼを含むシステムが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼにより、ゲノムの所望の位置に特定の二本鎖切断を導入することによって標的化されたゲノム改変を行い、細胞の修復機構を利用して、相同遺伝子組換え機構および非相同末端結合機構により、この誘導された切断を修復する。いくつかの種類の組換えヌクレアーゼを使用することができる。ヌクレアーゼの例としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、CRISPR/Casシステム、RNA誘導性エンドヌクレアーゼ、組換えメガヌクレアーゼ、および再組換えホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。標的化遺伝子破壊は、研究利用、治療利用、農業利用および工業利用などの幅広い適用性を有する。標的化遺伝子破壊を作製するための戦略の１つとして、部位特異的なエンドヌクレアーゼによるDNA二本鎖切断の作製によるものがある。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、CRISPR/Cas9を利用することにより、広範な種類の細胞においてガイドRNAを効率的に発現させることが可能になる。ガイドRNA発現用システムの一例として、アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）の使用に基づくシステムが挙げられる。AAVベクターを利用することにより、広範な種類の初代細胞に形質導入を行うことができる。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、Cas9に基づくアプローチは、Cas9による標的化に必要なガイドRNAを発現させるためにアデノ随伴ウイルスベクター（AAV）を使用する場合、毒性を最小限に抑え、遺伝子編集効率を向上させることができる。
【０１１９】
用語の定義
本明細書において「a」または「an」は、１つまたは１つ以上を意味してもよい。
【０１２０】
本明細書において「約」は、特定の値が、この値を決定するために用いられた方法に本質的に付随する誤差の変動または実験間での変動を含むことを示す。
【０１２１】
「核酸」または「核酸分子」は、ポリヌクレオチドを指し、たとえば、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により得られる断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかにより得られる断片が挙げられる。核酸分子は、天然のヌクレオチドモノマー（DNAやRNAなど）、または天然のヌクレオチドの類似体（たとえば、天然のヌクレオチドのエナンチオマー）からなるモノマー、またはこれらの組み合わせから構成されていてもよい。修飾ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジン塩基部分もしくはプリン塩基部分に修飾を有していてもよい。糖部分の修飾としては、たとえば、ハロゲン、アルキル基、アミンまたはアジド基による１つ以上のヒドロキシル基の置換が挙げられ、糖部分はエーテル化またはエステル化されていてもよい。さらに、糖部分全体が、立体構造的に類似の構造や電子的に類似の構造と置換されていてもよく、このような構造として、たとえば、アザ糖および／または炭素環式糖類似体が挙げられる。修飾塩基部分としては、アルキル化プリン、アルキル化ピリミジン、アシル化プリン、アシル化ピリミジン、またはその他の公知の複素環置換基が挙げられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはこれと似た結合により連結することができる。ホスホジエステル結合と似た結合としては、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホロセレノエート結合、ホスホロジセレノエート結合、ホスホロアニロチオエート（phosphoroanilothioate）結合、ホスホロアニリデート（phosphoranilidate）結合およびホスホロアミデート結合が挙げられる。「核酸分子」は、いわゆる「ペプチド核酸」も包含し、これは、ポリアミド主鎖に付加された天然の核酸塩基または修飾核酸塩基を含む。核酸は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。
【０１２２】
本明細書において「コードする」は、遺伝子、cDNA、mRNAなどのポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列が、所定のアミノ酸配列などの別の巨大分子を合成するための鋳型として機能するという特性を指す。したがって、特定の遺伝子に対応するmRNAが転写および翻訳されて、細胞またはその他の生物系においてタンパク質が産生された場合、その遺伝子はこのタンパク質をコードする。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、CRISPR/Cas9システムの基本的な構成要素は、標的遺伝子、ガイドRNA、およびCas9エンドヌクレアーゼまたはその誘導体もしくは断片を含む。いくつかの実施形態において、CRISPR/Cas9を使用して遺伝子編集を行う一態様は、広範な種類の細胞にガイドRNAを効率よく送達できるシステムを必要とする。このようなシステムは、たとえば、インビトロで作製された核酸としてのガイドRNA（インビトロ転写または化学合成により作製されたガイドRNA）を送達することを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ガイドRNAをコードする核酸は、２’Ｏ−メチル塩基などの修飾塩基の組み込みによりヌクレアーゼ耐性が付与されている。
【０１２４】
本明細書に記載の実施形態において有用な典型的なガイドRNAは、本明細書に記載の１つ以上の修飾塩基を含んでいてもよく、これらのガイドRNAは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６によってコードされる配列において提供される。アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを使用することによって、広範な初代細胞に形質導入を行うことができるため、いくつかの実施形態では、ガイドRNAを発現させる重要なシステムにおいてAAVベクターを使用している。いくつかの実施形態において、AAVベクターは感染症を引き起こすことがなく、また、ゲノムに組み込まれないことが知られている。したがって、いくつかの実施形態において、AAVベクターは、安全かつ効果的に使用できるという利点がある。
【０１２５】
「相補的である」とは、相補的配列が、ポリヌクレオチド参照配列の全体またはその１つ以上の部分と相同であることを指す。たとえば、ヌクレオチド配列「CATTAG」は、参照配列「CATTAG」と一致し、参照配列「GTAATC」に相補的である。
【０１２６】
「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を誘導するヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、プロモーターは遺伝子の５’末端の非コード領域に位置し、構造遺伝子の転写開始点の近傍にある。プロモーター内部の、転写開始において機能する配列エレメントは、コンセンサスヌクレオチド配列により特徴付けられることが多い。このようなプロモーターエレメントとして、RNAポリメラーゼ結合部位、TATA配列、CAAT配列、分化特異的エレメント（DSE；McGehee et al., Mol. Endocrinol. 7:551 (1993)；この文献は引用によりその全体が本明細書に明示的に援用される）、サイクリックAMP応答エレメント（CRE）、血清反応エレメント（SRE；Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1:47 (1990)；この文献は引用によりその全体が本明細書に明示的に援用される）、グルココルチコイド応答エレメント（GRE）、およびその他の転写因子結合部位、たとえば、CRE/ATF（O’Reilly et al., J. Biol. Chem. 267:19938 (1992)）、AP2（Ye et al., J. Biol. Chem. 269:25728 (1994)）、SP1、cAMP応答エレメント結合タンパク質（CREB；Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993)）および八量体因子（全般的な事項に関しては、Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987)およびLemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303:1 (1994)を参照されたい；これらの文献はいずれも引用によりその全体が本明細書に明示的に援用される）が挙げられる。本明細書において、プロモーターは、構成的に活性なプロモーター、抑制型プロモーター、誘導型プロモーターのいずれであってもよい。プロモーターが誘導型プロモーターである場合、転写率は誘導剤に応答して上昇する。これに対して、プロモーターが構成的プロモーターである場合、転写率は誘導剤による制御を受けない。抑制型プロモーターも公知である。いくつかの実施形態において、調節エレメントは非翻訳領域であってもよい。いくつかの実施形態において、非翻訳領域は５’末端側の非翻訳領域である。いくつかの実施形態において、非翻訳領域は３’末端側の非翻訳領域である。いくつかの実施形態において、５’末端側の非翻訳領域または３’末端側の非翻訳領域が使用される。いくつかの実施形態において、５’末端側の非翻訳領域と３’末端側の非翻訳領域の両方が使用される。当業者であれば、本発明の実施形態における「非翻訳領域」の意味を理解できるであろう。
【０１２７】
「調節エレメント」は、コアプロモーターの活性を調節するヌクレオチド配列である。たとえば、調節エレメントは、特定の細胞、組織または細胞小器官において、転写を可能とする細胞因子と特異的または選択的に結合するヌクレオチド配列を含んでいてもよい。このような調節エレメントは、通常、「細胞特異的」、「組織特異的」または「細胞小器官特異的」に発現される遺伝子と関連している。いくつかの実施形態において、細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子の編集用システムであって、CRISPRガイドRNAをコードする第１の核酸配列；Cas9タンパク質をコードする第２の核酸配列；第１のアデノウイルスタンパク質をコードする第３の核酸配列；および第２のアデノウイルスタンパク質をコードする第４の核酸配列を含み、前記CRISPRガイドRNAが、細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的であること、および第１の核酸配列がベクター中に含まれていることを特徴とするシステムを提供する。いくつかの実施形態において、第１の核酸配列、第２の核酸配列、第３の核酸配列および第４の核酸配列は、ヒト細胞などの真核細胞において作動可能な調節エレメントに連結されている。
【０１２８】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基で構成されるポリマーであり、天然由来のものおよび合成されたものを含む。約１０アミノ酸残基未満のポリペプチドは、一般に「ペプチド」と呼ばれる。ポリペプチドはタンパク質と見なすこともできる。
【０１２９】
「タンパク質」は、１つ以上のポリペプチド鎖を含む巨大分子である。タンパク質は、糖鎖基などの非ペプチド成分をさらに含んでいてもよい。タンパク質への糖鎖やその他の非ペプチド性置換基の付加は、該タンパク質を産生する細胞によって行われてもよく、付加される糖鎖やその他の非ペプチド性置換基の種類は細胞の種類によって異なる。本明細書において、タンパク質は、そのアミノ酸主鎖構造によって定義されるものであり、糖鎖基などの置換基は特に規定されないが、このような置換基がタンパク質中に含まれていてもよい。いくつかの実施形態において、細胞の少なくとも１つの標的遺伝子を編集するシステムが提供され、該システムは、CRISPRガイドRNAをコードする第１の核酸配列；Cas9タンパク質をコードする第２の核酸配列；第１のアデノウイルスタンパク質をコードする第３の核酸配列；および第２のアデノウイルスタンパク質をコードする第４の核酸配列を含み、前記CRISPRガイドRNAが、細胞における少なくとも１つの標的遺伝子と相補的であること、ならびに第１の核酸配列がベクターに含まれていることを特徴とする。
【０１３０】
「宿主細胞」は、本発明の実施形態に記載のCas9 mRNA/AAVガイドRNAが導入される細胞、および本明細書に記載のシステムとともに提供される細胞を指す。宿主細胞は、原核細胞であってもよく、真核細胞であってもよい。原核細胞である宿主細胞としては、大腸菌、窒素固定細菌、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・アルバス（Staphylococcus albus）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、炭疽菌（Bacillus anthracis）、枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・チューリゲンシス（Bacillus thuringiensis）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）、マイコプラズマ、およびシアノバクテリアが挙げられるが、これらに限定されない。真核細胞である宿主細胞としては、原生動物細胞、真菌細胞、藻類細胞、植物細胞、昆虫細胞、両生類細胞、鳥類細胞および／または哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、細胞の少なくとも１つの標的遺伝子を編集するシステムであって、該細胞が真核細胞であることを特徴とするシステムを提供する。いくつかの実施形態において、前記細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は形質転換細胞ではない。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代リンパ球である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、初代リンパ球、ＣＤ３４＋幹細胞、肝細胞、心筋細胞、神経細胞、グリア細胞、筋細胞または腸細胞である。
【０１３１】
「エンドヌクレアーゼ」は、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する酵素を指す。前記ポリヌクレオチドは、二本鎖DNA（dsDNA）、一本鎖DNA（ssDNA）、RNA、DNAおよび／もしくはRNAの二本鎖ハイブリッド、ならびに／または合成DNA（たとえば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ以外の塩基を含むもの）であってもよい。エンドヌクレアーゼは、対称的な位置でポリヌクレオチドを切断して「平滑」末端を生じるものや、少しずれた位置でポリヌクレオチドを切断して突出末端を生じるものがあり、この突出部位は「粘着末端」とも呼ばれる。本明細書に記載の方法および組成物は、エンドヌクレアーゼにより生じた切断部位に対して使用してもよい。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、該システムは、Cas9、TALEN、MegaTALなどのエンドヌクレアーゼをコードする核酸、またはCas9、TALEN、MegaTAL、１つ以上のそれらの部分などのエンドヌクレアーゼドメインを含む融合タンパク質をさらに提供することができる。ただし、これらの例には限定されず、その他のエンドヌクレアーゼ、その他のエンドヌクレアーゼを含む前記システムおよび方法の実施形態、ならびにこれらの例示的な実施形態を変更または改良したものを、過度な実験を行うことなく実施することができる。このような変更や修正はいずれも本開示の範囲内に含まれる。
【０１３２】
「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ」または「TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）」は、ヌクレアーゼドメインに融合したTALエフェクタードメインを含むヌクレアーゼを指す。植物病原菌であるキサントモナス（Xanthomonas）属から単離されたTALエフェクターのDNA結合ドメインが報告されている（Boch et al., (2009) Science 29 Oct. 2009 (10.1126/science.117881) and Moscou and Bogdanove, (2009) Science 29 Oct. 2009 (10.1126/science.1178817）を参照されたい；これらの文献はいずれも引用によりその全体が明示的に本明細書に援用される）。これらのDNA結合ドメインは、所望の標的と結合するように遺伝子操作することができ、ヌクレアーゼドメイン（たとえばFok1ヌクレアーゼドメインなど）と融合させることによってTALエフェクタードメインとヌクレアーゼの融合タンパク質を誘導することができる。本明細書に記載の方法およびシステムは、TALエフェクターヌクレアーゼにより生じた切断部位に対して使用してもよい。本明細書で提供されるシステムの実施形態のいくつかにおいて、該システムは、TALENヌクレアーゼ、またはTALENヌクレアーゼをコードするベクターもしくは核酸をさらに含んでいてもよい。本明細書で提供される方法の実施形態のいくつかにおいて、該方法は、TALENヌクレアーゼなどのヌクレアーゼを提供することをさらに含んでいてもよい。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、TALENは、TalエフェクターDNA結合ドメインとDNA切断ドメインを融合させることにより作製された人工制限酵素である。Talエフェクターは、細菌由来のDNA結合タンパク質であり、互いに高い相同性を持つ34個のアミノ酸モジュールからなっていてもよく、各アミノ酸モジュールは、特定の１つのヌクレオチドに高い親和性で結合することができる。TALENモジュールの１２番目および１３番目の可変アミノ酸は、repeat variable dinucleotide（RVD）と呼ばれ、塩基特異性を付与し（すなわち、NN→G/A、NI→A、NG→T、NK→G、HD→C、およびNS→A/T/C/G）、各TALENモジュールを組み合わせることによって、ヌクレオチド配列を標的とすることが可能なTALENアレイを作製することができる。前述のアミノ酸配列とDNAの認識の関係から、対応するRepeat Variable Diresidue（RVD）と接触する反復配列セグメントの組み合わせを選択することによって、特異的なDNA結合ドメインの作製が可能である。TALENを使用して、目的の細胞において二本鎖切断（DSB）を誘導すると、その細胞がいくつかの種類の修復機構により応答し、その結果、ゲノム編集を行うことができる。
【０１３４】
MegaTALは、DNAを標的とする２種の酵素を組み合わせて誘導されたものである。メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼとも呼ばれる）は、DNA認識能とヌクレアーゼ機能を同一ドメインに併せ持つという利点を有する単鎖ペプチドである。本明細書で提供されるシステムの実施形態のいくつかにおいて、該システムは、MegaTALヌクレアーゼ、またはMegaTALヌクレアーゼをコードするベクターもしくは核酸をさらに含んでいてもよい。本明細書で提供される方法の実施形態のいくつかにおいて、該方法は、MegaTALヌクレアーゼ、またはMegaTALヌクレアーゼをコードするベクターもしくは核酸を提供することをさらに含んでいてもよい。
【０１３５】
ジンクフィンガータンパク質（ZFP）は、真核生物のDNA結合タンパク質である。ゲノム編集用の最も一般的なZFPモチーフは、たとえば、Cys2-His2型フィンガーであり、種類ごとに特定のヌクレオチドトリプレットに特異的である。各ジンクフィンガーを組み合わせることによって、通常9〜18ヌクレオチド長の特定のDNA配列を標的とする人工ZFPドメインを作製することができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）は、様々な種類のヒト細胞において標的ゲノム操作を行うための強力なツールである。ZFNは、遺伝子組換えされたDNA結合性ジンクフィンガードメインが、非特異的エンドヌクレアーゼドメインに連結されたものであり、相同組換えおよび非相同組換えの両方を刺激する二本鎖切断（DSB）を導入することができ、これを利用してゲノム操作を行うことができる。したがって、ZFPは、研究用途および遺伝子療法用途の両方において潜在的能力を備えている。
【０１３６】
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（CRISPR）は、短い反復塩基配列を含みうるDNA遺伝子座を含み、各反復塩基配列の後ろには、暴露したウイルスに由来する短いスペーサーDNAセグメントが組み込まれている。CRISPR領域は、CRISPRと関連するタンパク質をコードするcas遺伝子と関連している場合がある。CRISPR/Casシステムは、原核生物の免疫系であり、プラスミドやファージなどの外来遺伝因子に対する耐性を付与し、後天性免疫として機能する。CRISPRスペーサーは、真核生物で見られるRNAiとよく似た方法で、これらの外来性遺伝因子を認識し切断する。ゲノム編集機構としては、RNA誘導エンドヌクレアーゼ、Casタンパク質および適切なガイドRNAを、特定の生物の細胞に送達することができ、所望の位置でこの生物のゲノムを切断することができる。CRISPRは、遺伝子標的化および遺伝子組換え用の効率的な機構であり、その機構は当業者に知られている。
【０１３７】
Cas9（CRISPR関連タンパク質９）は、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）などの微生物が持つ獲得免疫機構であるCRISPR（Clustered Regularly Interspersed Palindromic Repeats）に関連するRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼ酵素である。化膿レンサ球菌は、Cas9を利用して、侵入してきたバクテリオファージDNAやプラスミドDNAなどの外来性DNAを記憶し、同じ外来性DNAが再侵入してくると、外来性DNAを解読してこれを切断する。Cas9は、外来性DNAを巻き戻して、ガイドRNAに存在する20bpのスペーサー領域と相補的かどうかを確認することによって、外来性DNAを解読する。DNA塩基がガイドRNAと相補的であれば、Cas9は侵入してきたDNAを切断する。
【０１３８】
CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）は、短い反復塩基配列を含む原核生物由来のDNAセグメントである。各反復配列の後ろには、過去に遭遇した細菌ウイルスやプラスミドに由来する短い「スペーサーDNA」セグメントが組み込まれている。CRISPR/Casシステムは、あらゆる生命において遺伝子編集（特定の遺伝子配列の付加、破壊または変更）や遺伝子制御に使われてきた。Cas9タンパク質またはその誘導体もしくは断片と適切なガイドRNAを細胞に送達することによって、生物のゲノムを所望とする位置で切断することができる。CRISPRを用いて、特定の集団全体のゲノムを改変することが可能なRNA誘導型編集遺伝子を構築することが可能である。いくつかの実施形態において、細胞の少なくとも１つの標的遺伝子を編集するシステムが提供され、該システムは、CRISPRガイドRNAをコードする第１の核酸配列；Cas9タンパク質、またはその誘導体もしくは断片をコードする第２の核酸配列；第１のアデノウイルスタンパク質をコードする第３の核酸配列；および第２のアデノウイルスタンパク質をコードする第４の核酸配列を含み、前記CRISPRガイドRNAが、細胞における少なくとも１つの標的遺伝子と相補的であること、ならびに第１の核酸配列がベクターに含まれていることを特徴とする。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、化学的に修飾されたガイドRNAを使用することが意図される。化学的に修飾されたガイドRNAは、ヒト初代細胞においてCRISPR-Casゲノム編集を実施する際に使用されている（Hendel, A. et al., Nat Biotechnol. 2015 Sep; 33(9):985-9）。ガイドRNAによる化学的修飾には、ヌクレアーゼに対する耐性を付与する修飾が含まれていてもよい。ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼもしくはエキソヌクレアーゼ、またはこの両方であってもよい。化学的修飾のいくつかとして、２’−フルオロ、２’Ｏ−メチル、ホスホロチオエートジチオール３’−３’末端結合、２−アミノ−ｄＡ、５−メチル−ｄＣ、Ｃ−５プロピニル−Ｃ、Ｃ−５プロピニル−Ｕ、モルホリノなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明はこれらの例示に限定されず、その他の化学修飾、これらの典型的な化学修飾の別法および変法も本発明に含まれる。
【０１４０】
「切断」は、共有結合で形成されたポリヌクレオチドバックボーンの切断を指す。切断は、様々な方法によって開始することができ、たとえば、ホスホジエステル結合を酵素的加水分解または化学的加水分解することによって開始することができるが、切断を開始する方法はこれらに限定されない。一本鎖切断および二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、別個の２本の一本鎖が切断された結果として生じる。二本鎖DNA、RNAまたはDNA/RNAハイブリッドが切断されると、平滑末端または突出末端が生じうる。
【０１４１】
本明細書に記載の「対象」は、非ヒト霊長類およびヒトなどの、動物界に属するあらゆる生物を含む。いくつかの実施形態において、細胞の少なくとも１つの標的遺伝子を編集するシステムが提供され、該システムは、CRISPRガイドRNAをコードする第１の核酸配列；Cas9タンパク質、またはその誘導体もしくは断片をコードする第２の核酸配列；第１のアデノウイルスタンパク質をコードする第３の核酸配列；および第２のアデノウイルスタンパク質をコードする第４の核酸配列を含み、前記CRISPRガイドRNAが、細胞における少なくとも１つの標的遺伝子と相補的であること、ならびに第１の核酸配列がベクターに含まれていることを特徴とする。いくつかの実施形態において、編集された遺伝子を含む細胞は、この細胞を必要とする対象に送達される。
【０１４２】
切断部位を見出すことが難しいエンドヌクレアーゼを用いた標的化DNA二本鎖切断は、非相同性末端結合DNA修復経路を利用することによって、様々な種類の細胞における遺伝子破壊に適用することができる。しかしながら、エンドヌクレアーゼによって化学的にきれいに切断されたDNAは、正確に修復されることが多いため、標的遺伝子の破壊効率はそれほど高くならない。本明細書に記載のいくつかの実施形態は、エンドヌクレアーゼにより誘導された部位特異的DNA二本鎖切断の不正確な修復によって生じる標的遺伝子破壊の効率を向上させる方法に関する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステムは、末端プロセシング酵素と組み合わせることによって、標的遺伝子の破壊効率が向上した部位特異的エンドヌクレアーゼをさらに含んでいてもよい。酵素の併用は、たとえば、物理的作用、空間的作用および／または時間的作用によるものであってもよい。
【０１４３】
特定の理論に縛られるものではないが、「エラーを生じやすい」非相同末端結合（NHEJ）によって切断部位に挿入および欠失を作製することができることから、NHEJにより切断された二本鎖DNAの解離を利用することによって、標的遺伝子破壊および標的遺伝子ノックアウトを行うことができる。NHEJはいくつかの副経路を介して起こり、どの副経路を介するかによって得られる変異が異なる。古典的NHEJ（cNHEJ）経路は、KU/DNA-PKcs/Lig4/XRCC4複合体が含まれ、最低限のプロセシングを経て末端を再結合する。設計されたエンドヌクレアーゼプラットフォーム（ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）およびホーミングエンドヌクレアーゼ（HE））によるDNA切断では、いずれも、特別な前処理を必要とせずに容易に連結することが可能な、化学的にきれいに切断された突出部位が得られるため、このような切断面を利用することによって、cNHEJ経路を介した正確な修復を行うことができる。古典的NHEJ経路による切断後にDNAが解離しなかったり、DNAの解離に失敗した場合、代替NHEJ経路（altNHEJ）を使用することができるが、この経路ではかなり変異が起こりやすい。
【０１４４】
特定の理論に縛られるものではないが、切断されたDNA二本鎖を末端プロセシング酵素によって修飾することによって、altNHEJ経路を介したDNA修復を誘導することができる。また、末端プロセシング酵素の種類を変えることによって、様々な別の機構を介して破壊効率を向上することができる。たとえば、３’突出部位に露出されたホスホジエステル結合を特異的に加水分解するエキソヌクレアーゼであるTrex2は、切断部位に欠失変異を導入するDNA修復を誘導する。これに対して、鋳型非依存性ポリメラーゼであるターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）は、ヌクレオチド塩基の付加を促進して連結前にDNA末端を変化させ、これによって、切断部位に挿入変異を導入するDNA修復を誘導すると予想される。したがって、当業者であれば、本明細書で提供される前記システムまたは前記方法のいずれかにおいて、様々な活性を有する末端プロセシング酵素を使用することによって所望の遺伝子組換えを行うことができるであろう。また、当業者であれば、様々な末端プロセシング酵素を使用して相乗作用を得ることによって、効果を最大まで高めたり、ユニークな効果を得ることができると考えられる。
【０１４５】
本明細書に記載のエンドヌクレアーゼ、末端プロセシング酵素および融合タンパク質をコードする様々なRNA分子を構築することによって、選択されたタンパク質またはペプチドを細胞に提供してもよい。当技術分野でよく知られているように、本明細書に記載のエンドヌクレアーゼ、末端プロセシング酵素および融合タンパク質をコードするRNA分子のコドンを別のコドンに変更することによって、選択された宿主細胞における発現を最適化してもよい。いくつかの実施形態において、前記RNAは、50個、100個、150個、200個、250個、300個、350個、400個、450個または500個のアデノシン残基が共有結合で連結されたポリ（Ａ）テールを含んでいてもよく、前記値のいずれか２つによって定義される範囲にある残基数のポリ（Ａ）テールを含んでいてもよい。
【０１４６】
本発明のシステムの実施形態のいくつかは、部位特異的エンドヌクレアーゼおよび末端プロセシング酵素を同時に発現させるためのベクターまたは核酸をさらに含み、これによって、標的遺伝子の破壊効率を最大で約70倍高め、標的部位を含む細胞集団において72時間未満で100%の変異導入率を実質的に達成することができる。
【０１４７】
発現ベクター
いくつかの実施形態において、発現コンストラクトは、当技術分野で公知の方法を使用して設計することができる。核酸発現ベクターとしては、組換えウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、プラスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体、ヒト人工染色体、ミニサークルDNA、エピソーム、cDNA、RNA、およびPCR産物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、核酸発現ベクターは、単一のペプチド（たとえば、エンドヌクレアーゼ、末端プロセシング酵素、またはエンドヌクレアーゼ活性および末端プロセシング活性を有する融合タンパク質）をコードする。いくつかの実施形態において、核酸発現ベクターは、単一のポリシストロン性発現カセットにおいて１つ以上のエンドヌクレアーゼおよび１つ以上の末端プロセシング酵素をコードする。前記システムの実施形態のいくつかにおいて、2Aペプチド配列または「自己切断（autocleavage）」もしくは自己切断（self-cleavage）配列を介して互いに連結された、１つ以上のエンドヌクレアーゼおよび１つ以上の末端プロセシング酵素が提供される。いくつかの実施形態において、前記核酸発現ベクターは、DNA発現ベクターである。いくつかの実施形態において、前記核酸発現ベクターは、RNA発現ベクターである。いくつかの実施形態において、前記発現ベクターはウイルスベクターである。本明細書で提供される前記システムの実施形態のいくつかにおいて、前記ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、核酸発現ベクターは、選択マーカーとともに１つまたは複数の前記エンドヌクレアーゼ、１つまたは複数の前記末端プロセシング酵素ならびに／またはエンドヌクレアーゼ活性および末端プロセシング活性を有する１つまたは複数の前記融合タンパク質が導入されて、これらが発現された宿主細胞の同定または選択を容易にする１つ以上の選択マーカーをさらに含む。選択マーカーとしては、蛍光タンパク質をコードする遺伝子（たとえば、EGFP、DS-Red、YFPまたはCFP）；選択剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子（たとえば、PuroR遺伝子、ZeoR遺伝子、HygroR遺伝子、neoR遺伝子またはブラストサイジン耐性遺伝子）が挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、前記選択マーカーは、蛍光リポーターおよび選択マーカーを含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、DNA発現ベクターは、１つまたは複数のエンドヌクレアーゼ、１つまたは複数の末端プロセシング酵素、ならびに／またはエンドヌクレアーゼ活性および末端プロセシング活性を有する１つまたは複数の融合タンパク質の発現を誘導することができるプロモーターを含む。プロモーターの例として、レトロウイルスのLTRエレメント；CMV、HSV1-TK、SV40、EF-1α、β−アクチンなどの構成的プロモーター；Tetオペレーターエレメントを含む誘導型プロモーターなどの誘導型プロモーター；および／または組織特異的プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。適切な細菌プロモーターおよび真核生物プロモーターは、当技術分野でよく知られており、たとえば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990);およびCurrent Protocols in Molecular Biology (2010)；これらの文献は引用によりその全体が本明細書に明示的に援用される）に記載されている。植物プロモーターとしては、シロイヌナズナ（A.thaliana）のユビキチン３から得られたプロモーター配列（ubi-3）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、１つ以上のエンドヌクレアーゼ、１つ以上の末端プロセシング酵素、ならびに／またはエンドヌクレアーゼ活性および末端プロセシング活性もしくはエキソヌクレアーゼ活性を有する１つ以上の融合タンパク質をコードする核酸を、真核細胞を形質転換するためのベクターにクローニングして、本明細書で提供される前記システムのベクターおよび核酸とともに使用する。いくつかの実施形態において、様々なエンドヌクレアーゼおよび様々な末端プロセシング酵素をコードする複数の核酸を同じベクターにクローニングする。この場合、様々なエンドヌクレアーゼおよび様々な末端プロセシング酵素をコードする複数の核酸は、T2A、自己切断配列、プロテアーゼ切断部位またはIRES配列を介して隔てもよい。ベクターは、原核生物ベクター（たとえばプラスミド）、シャトルベクター、昆虫ベクター、または真核生物ベクター（本明細書に記載の植物ベクターなど）であってもよい。前記ヌクレアーゼおよび前記融合タンパク質の発現は、構成的プロモーターまたは誘導型プロモーターの制御下で行われてもよい。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、Cas9またはその誘導体もしくは断片をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、Trexをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターに含まれる遺伝子および／または核酸は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記ベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、Cas9タンパク質またはその誘導体もしくは断片をコードするmRNAである。いくつかの実施形態において、Cas9タンパク質またはその誘導体もしくは断片をコードする前記核酸は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、Cas9タンパク質またはその誘導体もしくは断片は、化膿レンサ球菌（S. pyogenes）に由来するものであるか、またはその他の生物に由来する別のCas9タンパク質から作製されたコンセンサス配列である。
【０１５１】
エンドヌクレアーゼ活性および／もしくは末端プロセシング活性を有するポリペプチド、ならびに／またはエンドヌクレアーゼ活性および／もしくは末端プロセシング活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本明細書に記載の好適な核酸送達方法またはタンパク質送達方法、または当業者に公知の好適な核酸送達方法またはタンパク質送達方法を使用して宿主細胞に導入してもよい。本明細書に記載のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、インビトロにおいて培養細胞に送達することができ、また、インサイチューにおいて組織および生物の全身に送達することもできる。本明細書に記載の実施形態によるポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、化学的方法、生物学的方法または物理的方法を使用して宿主細胞に導入することができる。化学的方法、生物学的方法または物理的方法としては、エレクトロポレーション、ソノポレーション、遺伝子銃の使用、リポトランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、デンドリマーの使用、マイクロインジェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、AAVベクター、レトロウイルスベクターなど）の使用、ならびにグループIIリボザイムが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５２】
AAVベクターに対する免疫応答
アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターは、遺伝子療法に基づく遺伝性疾患の治療に使用してもよい。しかし、AAVベクターは免疫応答を引き起こすため、その治療有効性が低くなることがある。これと同様に、CRISPR/Cas9に基づく（または１つ以上の他のヌクレアーゼに基づく）ゲノム編集で使用されるAAVベクターが免疫応答を引き起こすと、遺伝子標的化の有効性が低くなることがある。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、CRISPR/Cas9に基づく（および／または１つ以上の他のヌクレアーゼに基づく）ゲノム編集に使用されるAAVベクターは、免疫原性が低減されていることが企図される。いくつかの実施形態において、CRISPR/Cas9に基づく（および／または１つ以上の他のヌクレアーゼに基づく）ゲノム編集に使用されるAAVベクターは、免疫原性がないことが企図される。いくつかの実施形態において、AAVベクターは免疫原性が低減されているため、AAVベクターに対して耐性が発生する可能性は最小限まで抑えられている。いくつかの実施形態において、AAVベクターは免疫原性がないため、AAVベクターに対して耐性が発生する可能性は低いか、その可能性はない。
【０１５４】
生物
本明細書に記載の実施形態は、遺伝子の編集が所望される真核生物であればどのようなものにでも適用してもよく、特に、たとえばヘモグロビン遺伝子またはヘモグロビン関連遺伝子の編集が所望される真核生物であればどのようなものにでも適用してもよい。真核生物としては、藻類、植物、動物（たとえば、マウス、ラット、霊長類、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマなどの哺乳動物）、魚類、および昆虫が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記生物から単離された細胞は、本明細書の記載に従って遺伝子組換えが施される。いくつかの実施形態において、遺伝子組換えが施された細胞は、生殖能を有する成熟生物を発生する。真核細胞（たとえば、藻類細胞、酵母細胞、植物細胞、真菌細胞、魚類細胞、鳥類細胞または哺乳動物細胞）を使用することもできる。１つ以上のさらなる遺伝子組換えを含む生物から得られた細胞を使用することもできる。
【０１５５】
哺乳動物細胞としては、目的とする生物に由来する任意の細胞または細胞株が挙げられ、たとえば、卵母細胞、体細胞、K562細胞、CHO（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、HEP-G2細胞、BaF-3細胞、シュナイダー細胞、COS細胞（SV40 T抗原を発現するサル腎細胞）、CV-1細胞、HuTu80細胞、NTERA2細胞、NB4細胞、HL-60細胞、HeLa細胞、293細胞、ミエローマ細胞（たとえばSP2細胞またはNS0細胞）などが挙げられる。末梢血単核球（PBMC）またはＴ細胞も使用することができ、同様に、胚性幹細胞および成体幹細胞を使用することもできる。たとえば、使用することができる幹細胞としては、胚性幹細胞（ES）、人工多能性幹細胞（iPSC）、間葉系幹細胞、造血幹細胞、筋肉幹細胞、皮膚幹細胞、脂肪由来幹細胞、および神経幹細胞が挙げられる。いくつかの実施形態において、細胞の少なくとも１つの標的遺伝子を編集するシステムが提供され、該システムは、CRISPRガイドRNAをコードする第１の核酸配列；Cas9タンパク質、またはその誘導体もしくは断片をコードする第２の核酸配列；第１のアデノウイルスタンパク質をコードする第３の核酸配列；および第２のアデノウイルスタンパク質をコードする第４の核酸配列を含み、前記CRISPRガイドRNAが、細胞における少なくとも１つの標的遺伝子と相補的であること、ならびに第１の核酸配列がベクターに含まれていることを特徴とする。いくつかの実施形態において、前記細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞などの哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は形質転換細胞ではない。いくつかの実施形態において、前記細胞は、初代リンパ球、ＣＤ３４＋幹細胞、肝細胞、心筋細胞、神経細胞、グリア細胞、筋細胞または腸細胞である。
【０１５６】
本明細書で述べる「造血幹細胞」すなわち「HSC」は、骨髄系細胞に分化することができる前駆細胞であり、該骨髄系細胞としては、たとえば、マクロファージ、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞およびリンパ系細胞（たとえば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、NK細胞など）が挙げられる。いくつかの実施形態において、HSCは３種の幹細胞を含む異種細胞集団であり、これら３種の幹細胞は血液中のリンパ系子孫細胞と骨髄系子孫細胞の割合（Ｌ／Ｍ）によって区別される。
【０１５７】
医薬投与
本明細書で提供されるシステムまたは方法により製造される細胞は、DNA配列の標的化切断を目的として、かつ治療適用または予防適用を目的として、たとえば鎌状赤血球症やβサラセミアなどのヘモグロビン関連疾患を治療、抑制または緩和することを目的として、患者に直接投与することができる。いくつかの実施形態において、細胞は、本明細書で提供される組成物、システムまたは方法により製造される。いくつかの実施形態において、前記細胞を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、疾患を治療、予防、緩和もしくは抑制する方法、または疾患に伴う状態もしくは症状を緩和する方法において使用することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される細胞または組成物を投与することによって、遺伝疾患を治療、予防、緩和または抑制することができる。
【０１５８】
前記細胞を含む前記組成物は、適切な任意の方法で投与され、また、いくつかの実施形態においては、薬学的に許容される担体とともに投与される。前記タンパク質または前記ポリヌクレオチドの好適な投与方法を利用することができ、当業者であれば、そのような投与方法を熟知しているであろう。前記組成物の種類によっては、２つ以上の投与経路を使用できる場合もあるが、特定の経路が別の経路よりも即時性および有効性に優れていることもしばしばある。
【０１５９】
薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物およびその組成物を投与するための特定の方法などに応じて選択される。したがって、医薬組成物の好適な製剤として、幅広い種類の製剤が挙げられる（たとえば、Remington’s Pharmaceutical Sciencesを参照されたい）。
【０１６０】
静脈内経路、筋肉内経路、皮内経路、皮下経路などの非経口投与に適した製剤としては、水性または非水性の滅菌等張注射液剤が挙げられ、該注射液剤は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤または投与対象のレシピエントの血液と等張にするための溶質を含んでいてもよい。前記非経口投与に適した製剤としては、さらに、水性または非水性の滅菌懸濁剤が挙げられ、該滅菌懸濁剤は、懸濁化剤、可溶化剤、粘稠化剤、安定剤または保存剤を含んでいてもよい。本明細書により開示された組成物は、たとえば、点滴静注投与、経口投与、局所投与、腹腔内投与、膀胱内投与または鞘内投与することができる。前記組成物の製剤は、アンプルやバイアルなどの、単一用量または複数用量の密閉容器に入れて提供することができる。注射用の液剤および懸濁剤は、上記した種類の滅菌された散剤、顆粒剤および／または錠剤から調製することもできる。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、非経口投与経路、皮下投与経路、関節腔内投与経路、気管支内投与経路、腹腔内投与経路、関節包内投与経路、軟骨内投与経路、腔内投与経路、体腔内投与経路、小脳内投与経路、脳室内投与経路、結腸内投与経路、頸管内投与経路、胃内投与経路、肝内投与経路、心筋内投与経路、骨内投与経路、骨盤内投与経路、心膜内投与経路、腹膜内投与経路、胸膜内投与経路、前立腺内投与経路、肺内投与経路、直腸内投与経路、腎内投与経路、網膜内投与経路、脊髄内投与経路、滑液包投与経路、胸腔内投与経路、子宮内投与経路、膀胱内投与経路、病巣内投与経路、ボーラス投与、経膣投与経路、直腸投与経路、頬側投与経路、舌下投与経路、鼻腔内投与経路または経皮投与経路の１つ以上が企図される。いくつかの実施形態において、投与される組成物は、前記経路の１つ以上を介した送達用に製剤化することができる。
【０１６２】
核酸組成物
いくつかの実施形態は、HBB遺伝子の編集用組成物に関する。いくつかの実施形態において、この組成物は核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、配列番号１、２、３、４、５または６によってコードされる単鎖ガイドRNA（sgRNA）などの、単鎖ガイドRNA（sgRNA）を含む。いくつかの実施形態において、前記sgRNAをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１、２、３、４、５または６と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性、またはこれらのパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の同一性を有する。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、前記核酸は、ガイドRNA（gRNA）足場と組み合わせたsgRNAを含み、たとえば、配列番号７、８、９、１０、１１または１２によってコードされるsgRNAを含む。いくつかの実施形態において、前記sgRNAをコードするヌクレオチド配列は、配列番号７、８、９、１０、１１または１２と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性、またはこれらのパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の同一性を有する。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、前記核酸は、配列番号１３〜１８のいずれか１つによってコードされるプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）配列を含む。
【０１６５】
いくつかの実施形態は、鎌状赤血球変異部位のDNAを直接切断するsgRNA、たとえばSCL-g1（本明細書において「SCL-1」または「g1」とも呼ばれる）を含む。たとえば、Cas9ヌクレアーゼと一緒に使用されるCRISPRの実施形態は、非可変足場配列の５’末端側の標的DNAに特異的な約20塩基の配列を含むsgRNAを導入することを含んでいてもよい。sgRNAはRNAとして送達してもよく、あるいは、プロモーターの制御下にsgRNAのコード配列を含むプラスミドで細胞を形質転換することによって送達してもよい。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、前記核酸は、AAVによって送達される鋳型などの、欠失修復鋳型または非欠失修復鋳型を含む。いくつかの実施形態において、前記鋳型は、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０および２１のうちの１つ以上を含むか、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０および２１のいずれか１つに示される配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性、またはこれらのパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、前記修復鋳型のヌクレオチド配列は、配列番号２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５および３６のいずれか１つに示される配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性、またはこれらのパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の同一性を有する。前記鋳型は、相同組換え修復（HDR）を最大限に向上させるため、調節因子および／またはエンハンサーを含んでいてもよい。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、前記核酸は、TALENを含み、たとえば、配列番号２２または配列番号２３によってコードされるTALENなどを含む。いくつかの実施形態において、前記TALENは、配列番号２２もしくは配列番号２３にコードされる配列または配列番号２２もしくは配列番号２３に示される配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性、またはこれらのパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の同一性を有する。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、前記核酸は、一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ssODN）を含む。いくつかの実施形態において、前記ssODNは、配列番号１９、２０および２１のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、前記ssODNは、配列番号１９、２０もしくは２１にコードされる配列、または配列番号１９、２０もしくは２１に示される配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性、またはこれらのパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の同一性を有する。
【０１６９】
HBB遺伝子を編集する特定の方法
本明細書で提供される方法および組成物の実施形態のいくつかは、細胞においてHBB遺伝子を編集する方法を含む。そのような実施形態のいくつかにおいて、前記編集は相同組換え修復（HDR）を含んでいてもよい。いくつかの実施形態は、（ｉ）ガイドRNA（gRNA）をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入するか、あるいはTALENをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する工程；および（ii）鋳型ポリヌクレオチドを前記細胞に導入する工程を含む。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号１〜６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも約８５％、約９０％または約９５％の同一性を有する核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号７〜１２のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも約８５％、約９０％または約９５％の同一性を有する核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号１〜６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記gRNAは、配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含む。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、gRNAをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する前記工程は、該gRNAをコードするポリヌクレオチドとCAS9タンパク質とを含むリボ核タンパク質（RNP）に前記細胞を接触させることを含む。いくつかの実施形態において、前記CAS9タンパク質と前記gRNAをコードするポリヌクレオチドの比率は、０．１：１〜１：１０または１：１〜１：５である。いくつかの実施形態において、前記CAS9タンパク質と前記gRNAをコードするポリヌクレオチドの比率は、約１：２．５である。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、前記鋳型ポリヌクレオチドは、HBB遺伝子の少なくとも一部またはその相補鎖をコードしている。いくつかの実施形態において、前記鋳型ポリヌクレオチドは、野生型HBB遺伝子の少なくとも一部またはその相補鎖をコードしている。いくつかの実施形態において、前記HBB遺伝子の少なくとも一部は、該HBB遺伝子のエキソン１を含む。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、前記鋳型ポリヌクレオチドはウイルスベクターに含まれている。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは自己相補型AAV（scAAV）ベクターである。いくつかの実施形態において、前記鋳型ポリヌクレオチドは、HBB遺伝子の少なくとも約４ｋｂを含む。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、前記鋳型ポリヌクレオチドは、一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ssODN）に含まれている。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、前記ssODNは、配列番号６４〜７２のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ssODNは、配列番号６４〜７２のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、前記HBB遺伝子のエキソン１に二本鎖切断が生じる。いくつかの実施形態において、前記二本鎖切断は、前記HBB遺伝子のエキソン１の６番目のコドンに隣接する位置に生じる。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、工程（ｉ）は、工程（ii）の前に実施される。いくつかの実施形態において、工程（ｉ）と工程（ii）は、同時に実施される。いくつかの実施形態において、工程（ｉ）および／または工程（ii）は、ヌクレオフェクションを実施することを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオフェクションの実施は、ロンザ社製のシステムの使用を含む。いくつかの実施形態において、前記システムは、方形波パルスの使用を含む。いくつかの実施形態において、工程（ｉ）および／または工程（ii）は、約200,000個の細胞と20μlのヌクレオフェクション反応液を接触させることを含み、該ヌクレオフェクション反応液は、前記gRNAおよび／または前記鋳型ポリヌクレオチドを含む。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、前記細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞（HSC）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞またはＢ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋細胞である。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、前記HBB遺伝子は、配列番号３７のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する。
【０１８０】
治療方法
鎌状赤血球症（SCD）は、HBB遺伝子のエキソン１における単一のヌクレオチドのトランスバージョンにより、６番目のアミノ酸がグルタミン酸からバリンに置換される（E6V）ことに起因する。この変化によって、成人グロビン（βＡ）の疎水性が増加して、成人グロビンが重合しやすくなり、特徴的な鎌状赤血球化パターンの赤血球が発生する。SCD患者は依然として輸血に依存しており、死亡率が高く、寿命も短い。ドナー鋳型（組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）またはssODN）の存在下において、ヌクレアーゼにより遺伝子編集を行うことによって、変異を修正することができ、細胞の修復機構を介して鋳型の誘導により修復を行うことができる。SCDにおける臨床遺伝子編集では、利点を最適化するため、ドナー指向性のヌクレオチド変化を効率化すると同時に、ヌクレアーゼの誘導によるNHEJを介したオンターゲットなHBB遺伝子破壊を制限する必要があると考えられる。
【０１８１】
したがって、本明細書で提供するいくつかの実施形態は、ゲノム編集治療アプローチを使用して、鎌状赤血球症（SCD）を治療、緩和、抑制または改善することに関する。いくつかの実施形態において、内在性プロモーターおよび内在性エンハンサーの制御下のインタクトなHBB cDNAをHSPCに導入するシステムおよびそのための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステムおよび方法によって、HBBの免疫学的欠陥および機能的欠陥を回復させることができ、根治療法を提供することができる。
【０１８２】
いくつかの実施形態は、HBB遺伝子を編集する方法に関する。たとえば、この方法は、HBB遺伝子を含む細胞を提供する工程を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の１種以上の核酸組成物を細胞に提供する工程を含み、本明細書に記載の１種以上の核酸組成物としては、たとえば、配列番号１〜３６のうちの１つ以上に従った配列もしくは配列番号１〜３６のうちの１つ以上に示される配列によってコードされる配列、または、たとえば、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５および３６のうちのいずれか１つに従った配列もしくはこれらの配列番号のうちのいずれか１つによってコードされる配列と、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性、もしくはこれらのパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲内の同一性を有する配列が挙げられる。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、前記細胞は、哺乳動物細胞、ヒト細胞、初代細胞、リンパ球、ＣＤ３４＋幹細胞、肝細胞、心筋細胞、神経細胞、グリア細胞、筋細胞もしくは腸細胞、または本明細書に記載の細胞のいずれかである。いくつかの実施形態において、細胞への核酸の提供は、ウイルスベクターを使用して細胞に形質導入することによって、あるいはウイルスを細胞に感染させることによって行われる。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターは、組換えAAVなどのアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである。前記AAVは、（血清型６型などの）単一の血清型のものであってもよく、複数の血清型の混合物であってもよい。たとえば、組換え血清型６型AAV（rAAV6）がいくつかの実施形態で使用されている。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、核酸は、宿主細胞（たとえばヒト細胞などの真核細胞）における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態は、Cas9タンパク質などの遺伝子編集タンパク質をコードする第２の核酸を前記細胞に提供することを含む。いくつかの実施形態において、第２の核酸は、第１の核酸とは別個の核酸であり、１つ以上のAAV遺伝子をコードする核酸などであってもよく、第１の核酸と組み合わせてもよい。いくつかの実施形態において、前記核酸を提供することによって、HBB遺伝子に１つ以上の編集が行われ、たとえば、鎌状赤血球変異の修正などが行われる。いくつかの実施形態において、鎌状赤血球変異の修正は、Ｅ７Ｖ変異の修正を含む。いくつかの実施形態において、前記核酸を提供することによって、HBB遺伝子のエキソン１におけるリン酸ジエステル結合が切断される。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、前記方法は、前記対象の骨髄に前記細胞を生着させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は、前記対象から得られたものであり、かつ前記骨髄と同じ対象から得られたものである。換言すれば、生着される細胞は、前記対象の細胞または骨髄と同種であってもよい。いくつかの実施形態において、前記細胞は、前記対象の細胞または骨髄と同種である。
【０１８６】
特定の配列
いくつかの実施形態は、配列番号１〜３６から選択される１つ以上の配列を含む。表１に配列番号１〜２１の配列を示すが、これらの配列は、表２に示した配列番号２２〜３６と比べて比較的短い。配列番号１〜６はsgRNA標的配列である。配列番号１および6はアンチセンス鎖配列を含み、配列番号２〜５はセンス鎖配列を含む。配列番号１〜３６は５’→３’方向である。配列番号３６は配列番号３５と似ているが、HBBプロモーターの直接反復が存在しないため、小さな欠失を有する。このrAAV6鋳型（配列番号３６）は、HBB遺伝子座にE7V変異を誘導するHBG1プロモーターを駆動し、天然のイントロン１を保持している。配列番号３６において、MND-GFPは、プロモーターの干渉を防ぐため逆方向である。表２は、配列番号２４〜３６に関する追加情報を提供する。配列番号２２は、配列長15,662および49kbのサイズのDNA分子であり、配列番号２３は、配列長15,866および54kbのサイズのDNA分子である。配列番号２２および２３に示されるベクターは、pWNY2.0と適合するpEVL300 noBsmBI GGである。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表２】
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【実施例】
【０１８７】
実施例１−β−グロビン（HBB）遺伝子座におけるHDR用rAAV6とHDR用ssODNの比較
Crispr/Cas9リボ核タンパク質（RNP）を使用して、ヒト動員末梢血CD34+細胞（hPBSC）に鎌状赤血球変異E6Vを導入することにより、rAAV6またはssODNの送達による鎌状赤血球症（SCD）の修正効果およびその臨床的意義を評価した。２種のドナー送達方法として、2.2kbの相同アーム（HA）を有するrAAV6（AMS#1314）と、168個のヌクレオチドを含むssODN（GTCへの変化によるE7VもしくはGTGへの変化によるE7V、またはCCCGAAへの変化によるV7Eを有する）を使用した。Crispr/Cas9 RNPにより二本鎖切断を作製した後、HDR効率とNHEJの残存率を比較した（3%のrAAV6（AMS#1314）、および12.5pmol、25pmol、50pmolまたは100pmolのssODNを使用）。
【０１８８】
サイトカインとして各100ng/mlのSCF、IL-6、Flt-3LおよびTPOを含むSCGM培地中でヒト動員末梢血CD34+細胞を48時間かけて解凍した。解凍の48時間後、細胞にエレクトロポレーションを行い、ウイルス含有回復培地（3%rAAV6、AMS#1314）に加えてrAAV6を送達した。また、GTCもしくはGTGへの変化によるE7V変異を含むssODN、またはCCCGAAへの変化によるV7E変異を含むssODNを使用して、ssODNの用量を12.5pmol、25pmol、50pmolまたは100pmolに漸増しながら、RNPとともにエレクトロポレーションし、その後、回復培地に加えた。18〜24時間後、1%ペニシリン／ストレプトマイシン、20ng/mL hSCF、1ng/mL hIL-3、2IU/mL EPOおよび20%熱不活化FBSを添加したIMDMを含む分化培地に細胞を移した。細胞を１４日間分化させ、得られた赤血球系細胞の様々なグロビンのサブタイプを分析した。
【０１８９】
インビトロ試験後、rAAV6（AMS#1314）を使用して試験した場合、５人のCD34+ドナー全体での編集後１０日目のHDR：NHEJの比率は31%：18%であり、ssODN E7V GTGを使用して試験した場合、３人のCD34+ドナー全体での編集後１０日目のHDR：NHEJの比率は13%：30%であった（rAAV6での約2：1の比率に対してssODNでは約1：2の比率）。編集したCD34+細胞を２週間かけて赤血球系細胞へと分化させ、RP-HPLCにより赤血球系前駆細胞のβＳ（鎌状赤血球グロビン）の量を定量した。rAAV6鋳型を送達した場合のβＳの量は18〜27%（n=5）であり、ssODNの送達を使用した場合では0〜9%（n=3）であった。したがって、rAAV6またはssODN E7V GTGを送達することによって、HBB遺伝子座内に標的化されたヌクレオチド変化を導入することができた。HBB遺伝子座内への標的化されたヌクレオチド変化の導入方法として、rAAV6（AMS#1314）の方が優れていた。さらに、これらの知見では、オンターゲットな遺伝子破壊を制限しながら、ヌクレオチド変化を導入するように設計した臨床遺伝子編集の潜在能力の評価において、HDR：NHEJの比率と治療用タンパク質の量を測定基準として測定することの利点も強調された。
【０１９０】
実施例２−HBB遺伝子のエキソン１内の鎌状赤血球変異の編集および修正のためのHDR鋳型の設計およびその送達
鎌状赤血球変異を編集および修正するため、HBB遺伝子のE7V変異を編集するためのヌクレアーゼを開発した。HBB遺伝子のエキソン１における編集を行うため、Crispr/Cas9リボ核タンパク質による化学修飾単鎖ガイドRNA（sgRNA）の送達とTALENを最適化した。得られたデータから、K562細胞およびヒト造血幹細胞（CD34+）において、鎌状赤血球遺伝子座が効率的に編集されたことが示された。ユニークな複数の調節エレメントを有する新規なHDR修復鋳型をrAAV6により送達するため、様々な修復鋳型構造を設計した。抗鎌状赤血球化（T87Q）グロビンカセット、鎌状赤血球グロビン導入カセットおよび鎌状赤血球修正カセットをHBB遺伝子座においてそれぞれ試験した。これらの鋳型の設計はユニークなものであった。HBB遺伝子座において得られたそれぞれの相同性依存性修復（HDR）率は、効率的かつ臨床的意義のあるものであった。
【０１９１】
さらに、ssODNによる修復鋳型の送達を設計および最適化し、HBB遺伝子座においてHDRを誘導した。鎌状赤血球変異を導入するssODNと、鎌状赤血球変異を修正するssODNを設計し、試験した。鎌状赤血球遺伝子座において、単一のアレルへのHDRの組み込みと、両アレルへのHDRの組み込みがいずれも達成された。さらに、いずれの送達方法でも、組み込まれた鋳型から臨床的意義のあるグロビン発現が観察された。
【０１９２】
ヒトHBB遺伝子のエキソン１に二本鎖（ds）切断を作製するため、RNPおよびTALENをスクリーニングした。図１Ａは、RNPとして送達した様々なsgRNAとTALENを比較したヌクレアーゼの効率を示す。最も高いINDEL率（%）を示したヌクレアーゼは、g4、g5およびg6であった。編集効率を最大限に向上させるため、Cas9：sgRNAの比率を調節したところ、Cas9：sgRNAの比率を20：50とした場合、Cas9：sgRNAの比率を40：40とした場合よりも高いINDEL率（%）が得られた（図１Ｂ）。図１Ｃに示すように、RNPとして送達したsgRNA1およびsgRNA6を使用して、様々なCD34+ドナーにおける編集効率を評価した。これらの結果から、ヌクレアーゼよりHBB遺伝子座が効率的に編集されたことが示された。
【０１９３】
抗鎌状赤血球化グロビン（βT87Q）を導入する欠失鋳型1242〜1245を使用して、HDRが最大限に向上するように調節因子およびエンハンサーを構成した。図２Ａは、欠失鋳型1242〜1245の概略図と、それぞれの鋳型において使用したエレメントを示す。図２Ｂに示すように、エレクトロポレーションおよびAAV6による形質導入の実施後２日目に、CD34+細胞の生存能力を測定した。欠失修復鋳型を形質導入した場合、約60%の生存能力となる傾向が認められた。図２Ｃは、欠失鋳型1242〜1245のいずれかとともに、３種のガイドをRNPとして送達した際のHDRの比較を示す。また、図２Ｄに示すように、RNPと欠失鋳型を使用した場合の、ddPCRにより測定した相対的HDR率（%）は、欠失鋳型1242〜1245を使用して測定した。さらに、TIDEシーケンシング分析（図２Ｅ）により編集効率を測定し、赤血球系細胞分化培地中で２週間分化させた細胞におけるβ−グロビンの発現を調べるため、HPLC分析（図２Ｆ）を行った。これらの結果から、抗鎌状赤血球化グロビンを含む欠失修復鋳型が、rAAV6によって効果的かつ効率的に細胞に送達され、細胞のゲノムに組み込まれたことが示された。
【０１９４】
さらに、抗鎌状赤血球化グロビンβT87Qを導入するため、非欠失鋳型を用いたHDRを構成した。図３Ａは、非欠失鋳型1289〜1290の概略図と、それぞれの鋳型において使用したエレメントを示す。図３Ｂに示すように、エレクトロポレーションおよびAAV6による形質導入の実施後２日目に、CD34+細胞の生存能力を測定したところ、ここでも、CD34+細胞の生存能力は約60%となる傾向が示され、約30%〜約90%の範囲で変動した。図３Ｃは、RNPおよび非欠失鋳型1289および1290を使用した場合の、フローサイトメトリーで測定したHDR率（%）を示す。また、図３Ｄに示すように、RNPと非欠失鋳型を使用した場合の、ddPCRにより測定した相対的HDR率（%）は、欠失鋳型1289および1290を使用して測定した。さらに、TIDEシーケンシング分析（図３Ｅ）により編集効率を測定し、赤血球系細胞分化培地中でバルクGFP+集団またはソートしたGFP+/-細胞を２週間分化させた細胞におけるβ−グロビンの発現を調べるため、HPLC分析（図３Ｆ）を行った。これらの結果から、抗鎌状赤血球化グロビンを含む非欠失修復鋳型が、rAAV6によって効果的かつ効率的に細胞に送達され、効果的なHBB遺伝子座の変化が達成されたことが示された。
【０１９５】
様々なHRアーム長を有し、ヒトのコドンに最適化された鋳型を使用した、鎌状赤血球変異を導入するためのHDRを開発した。図４Ａは、ヒトのコドンに最適化した鋳型1246〜1249の概略図を含む。図４Ｂに示すように、エレクトロポレーションおよびAAV6による形質導入の実施後２日目に、CD34+細胞の生存能力を測定した。図４Ｃは、ヒトのコドンに最適化した鋳型1246〜1249とRNPを使用した場合の、ddPCRで測定した絶対HDR率（%）を示す。さらに、図４Ｄに示すように、赤血球系細胞分化培地中で２週間分化させた細胞におけるβ−グロビンの発現を調べるため、HPLC分析を行った。これらの結果から、抗鎌状赤血球化グロビンを含み、ヒトのコドンに最適化された鋳型が、rAAV6によって効果的かつ効率的に細胞に送達され、効果的なHBB遺伝子座の変化が達成されたことが示された。
【０１９６】
鋳型1314を用いたHDRは、鎌状赤血球変異の導入に有効であった。図５Ａは、鋳型1314の概略図を含む。図５Ｂに示すように、エレクトロポレーションおよびAAV6による形質導入の実施後２日目に、CD34+細胞の生存能力を測定した。図５Ｃは、５人の異なるドナーから得た細胞をRNPと鋳型1314で編集した試料のコロニーシーケンシングの結果を示す。さらに、４人のドナー由来の細胞において、TIDEシーケンシング（図５Ｄ）により編集効率を測定し、赤血球系細胞分化培地中で２週間分化させた細胞におけるβ−グロビンの発現を調べるため、HPLC分析（図５Ｅ）を行った。分化１４日目のHDR試料において、クロマトグラム（図５Ｆ）を作製したところ、様々なグロビンのサブタイプが示された。これらの結果から、rAAV6により鋳型を送達することによって、鎌状赤血球変異が導入されたことが示された。
【０１９７】
鎌状赤血球変異を導入するため、非欠失鋳型を用いたHDRを構成した。図６Ａは、非欠失鋳型1321の概略図を含む。図６Ｂに示すように、エレクトロポレーションおよびAAV6による形質導入の実施後２日目に、CD34+細胞の生存能力を測定した。鋳型1321を用いて編集した試料において、HDRイベントを測定した（図６Ｃ）。これらの結果から、rAAV6により非欠失鋳型を送達することによって、鎌状赤血球変異が導入されたことが示された。
【０１９８】
鎌状赤血球変異を導入するため、ssODNを用いたHDRを構成した。図７Ａは、ssODN E7Vの概略図を含む。図７Ｂに示すように、GTC変異を導入するためのエレクトロポレーションを100pmol、50pmol、25pmolまたは12.5pmolの用量で実施した後、２日目に、CD34+細胞の生存能力を測定した。図７Ｃおよび図７Ｄでも同じ用量を使用した。用量を漸増したE7V ssODNで編集した試料において、ddPCRによりHDR率およびNHEJ率を測定した（図７Ｃ）。図７Ｄに示すように、赤血球系細胞において発現された様々なグロビンのサブタイプのHPLC分析を行った。これらの結果から、ssODNの送達により鎌状赤血球変異が導入されたことが示された。
【０１９９】
鎌状赤血球変異（CCC GAA）を修正するため、ssODNを用いたHDRを構成した。図８Ａは、ssODN V7Eの概略図を含む。図８Ｂに示すように、エレクトロポレーションの実施後２日目に、CD34+細胞の生存能力を測定した。３人の異なるドナー由来の細胞を編集後、TIDEシーケンシングによりINDEL率を評価した（図８Ｃ）。図８Ｄに示すように、用量を漸増したV7E ssODNで編集した試料において、ddPCRによりHDR率およびNHEJ率を測定した。図８Ｅに示すように、V7E ssODNで編集した試料において、コロニーシーケンシングでもHDR率およびNHEJ率を測定した。赤血球系細胞において、様々なグロビンのサブタイプをHPLCにより分析した（図８Ｆ）。これらの結果から、ssODNが、送達および鎌状赤血球の修正に有効であることが示された。
【０２００】
編集した細胞をW41 SCIDマウスに生着させた。図９Ａは、１２週間後にヒトCD45+細胞を骨髄に生着させた結果を示す。生着方法は以下の手順を含んでいた。まず、６〜８週齢のW41マウスを25mg/kgのブスルファンで処置した。2×106個のヒト細胞を尾静脈注射により送達した。マウスを１２週間モニターし、マウスの屠殺時に全体的なヒトキメリズム、多系統の細胞の生着および赤血球系細胞の再構成を測定した。さらに、ヒト特異的プライマーを使用したddPCRによりHDR率（%）を測定し、TIDEシーケンシングによりIndel率（%）を測定した。
【０２０１】
図９Ｂに示すように、TIDEシーケンシングにより、生着させたヒト細胞におけるINDEL率を測定した。図９Ｃに示すように、１２週間後にddPCRにより骨髄におけるHDR率を測定した。これらの結果、編集された細胞は、対象の骨髄に生着し、非鎌状赤血球を産生したことが示された。
【０２０２】
本明細書で述べるように、様々な戦略を使用することにより、HBB遺伝子座に挿入することが可能なHDR用鋳型を設計し、鎌状赤血球変異を修正することができた。前述の鋳型には以下の３つの群が含まれていた。
第１群：様々なエンハンサー、イントロン、プロモーターおよびポリＡテール、様々な長さの相同アーム、ならびに／またはHBB遺伝子への抗鎌状赤血球化グロビン（T87Q）の挿入用欠失カセットまたは非欠失カセットを含む、rAAV6ベースのHDR用鋳型。この鋳型では、HDRが実証され、ヒト細胞への修復鋳型の挿入により誘導されたユニークな抗鎌状赤血球化（T87Q）グロビンの発現が示された。
第２群：様々なエンハンサー、イントロン、プロモーターおよびポリＡテール、様々な長さの相同アーム、ならびに／またはHBB遺伝子への鎌状赤血球変異の挿入用または鎌状赤血球変異の修正用の欠失カセットまたは非欠失カセットを含む、rAAV6ベースのHDR用鋳型。この鋳型では、HDRが実証され、ヒト細胞への修復鋳型の挿入により誘導されたユニークな鎌状赤血球グロビン（HbS）の発現または成体ヘモグロビン（HbA）の発現が示された。
第３群：HBB遺伝子への鎌状赤血球変異の挿入または鎌状赤血球の修正を誘導する、ssODNベースの鋳型。データから、HDRが実証され、ヒト細胞へのssODNの挿入により誘導されたユニークな鎌状赤血球グロビンの発現または成体ヘモグロビン（HbA）の発現が示された。
【０２０３】
本明細書において設計し、試験した新規鋳型の例として、以下のものが挙げられる：本明細書に記載の、rAAV6を使用したHDR修復用鋳型の設計；rAAV6として送達されるHDR修復用鋳型（1242、1243、1244、1245、1246、1247、1248、1249、1289、1290、1314、1321、1322を含む）；HBB遺伝子のエキソン１の７番目のコドンにGTCへの変化またはGTGへの変化を誘導する鎌状赤血球変異導入用ssODNの設計（GTCへの変化を誘導するE7VカセットおよびGTGへの変化を誘導するE7Vカセットはいずれもユニークなものであり、過去に報告されていない）；ならびにHBB遺伝子の６番目のコドンおよび７番目のコドンにおいて鎌状赤血球変異を修正し、CCC GAAへの変化を誘導するssODNの設計。
【０２０４】
鎌状赤血球変異部位から17塩基離れたsgRNA（SCL-g6）を使用した。HDR用鋳型はscAAV6として送達し、このHDR用鋳型から長いcDNAカセットをHBB遺伝子に組み込み、抗鎌状赤血球化HBB cDNA（HbAS3）を導入する。このcDNAは、転写開始点に挿入され、内在性プロモーター／エンハンサー機能を保持している。別の方法として、過去に試験されたHDR用鋳型に2.2kbの相同アームを有するrAAV6 E6Vドナーを使用し、７番目のコドンをGTCに変化させるとともに、様々なコドンにおいて５つのコドンを最適化させるヌクレオチド配列変化を導入する（gTCgagaagtctgcAgtCactgcTctAtggggGaaA；配列番号３８）。これらの鋳型は、RNPとして送達されるSCLガイド6とともに作用するように設計した。
【０２０５】
ssODN鋳型において、HBB遺伝子のエキソン１内の７番目のコドンに、GTAへの変化によるE7V変異（Dewittら）またはGAAへの変化によるV7E変異をあらかじめ導入することを試み、鎌状赤血球変異から得た17塩基からなるSCL-g6 sgRNAと組み合わせて作用させた。一方、本明細書に記載のrAAV6ドナーカセットには、鎌状赤血球変異を特異的に切断する新規ガイドSCL-g1を利用している。本明細書に記載のこれらの新規なrAAV6修復鋳型およびssODN修復鋳型を使用することによって、欠失を起こさないHDRイベントを発生させ、これにより予想外にもHDRを高頻度に誘導することができ、これは臨床的に意義のあるものである。いくつかの実施形態において、この新規ドナー鋳型は、（a）抗鎌状赤血球化T87Qグロビンを挿入すること、（b）鎌状赤血球変異を導入すること、または（c）ヒトのコドンに最適化された鎌状赤血球修正を送達することができる。また、本明細書に記載のこの新規rAAV6カセットは、プロモーター、エンハンサー、ポリＡテールおよび調節エレメントのユニークな組み合わせを利用していることから、グロビンの発現を最大限に向上させることができる。
【０２０６】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のこのアプローチの利点の１つは、変異部位の編集により機能的結果を改善することができることである。いくつかの実施形態において、前記sgRNAは、鎌状赤血球変異部位を切断する。いくつかの実施形態において、相同アームに切断部位が近いと、変異の変換を向上させることができる。いくつかの実施形態において、鎌状赤血球変異部位を編集するSCL-g1と共同して作用するように、rAAV6鋳型またはssODN鋳型を特異的に作製することによって、鎌状赤血球変異を高い効率で修正することが可能となる。
【０２０７】
いくつかの実施形態において、鋳型の設計によって、HBB遺伝子座におけるHDRを最大限に向上させることができる。いくつかの実施形態において、予想外にも、本明細書で示されているように、HBB遺伝子座の両アレルにおいて組み込みが起こる傾向も示され、いくつかの実施形態では、これは治療上の大きな利点となる。
【０２０８】
いくつかの実施形態において、グロビンの発現は、調節エレメントの選択により最大限に向上される。たとえば、特定の調節エレメントを選択することによって、抗鎌状赤血球化T87Qグロビンまたは成人グロビンの発現を改善または増加させることができる。いくつかの実施形態において、シミアンウイルス40（SV40）のポリＡテール、HPFH-2エンハンサーおよび／またはwPRE-3エレメントのうちの１種以上によって、より高頻度なHDRの誘導が調節され、グロビンの発現が増加する。
【０２０９】
いくつかの実施形態において、ヒトのコドンに最適化された鎌状赤血球症修正カセットを送達することによって、鎌状赤血球症患者における機能性HbAヘモグロビンの回復を補助することができる。いくつかの実施形態において、天然のイントロン１を近傍に配置することによって、グロビンの発現を最大限に向上させることができる。
【０２１０】
実施例３−新規ドナー鋳型の送達方法を使用したインビボでのHSCのHBB遺伝子における相同組換え修復の結果
実験プロトコル
rAAV6の作製：
rAAV6ストックを作製した。AAVベクタープラスミド、血清型ヘルパープラスミドおよびHgT1-adenoヘルパープラスミドをHEK293Ｔ細胞にトランスフェクトした。48時間後に細胞を回収し、溶解し、ベンゾナーゼで処理した。イオジキサノール密度勾配を使用して、組換えrAAV6ゲノムを含むビリオンを精製した。ITR特異的プライマーおよびプローブを使用して、qPCRに基づいたrAAV6ゲノムの力価を測定した。培地量の1%、2%または3%でrAAV6を使用して、mPBSCにrAAV6を形質導入した。
【０２１１】
CD34+造血幹細胞：
凍結mPBSCは、Fred Hutchinson Cancer Research Institute（ワシントン州シアトル）のCooperative Center for Excellence in Hematologyから購入した。
【０２１２】
sgRNAおよびTALENの設計：
CRISPR設計ツールを使用して、鎌状赤血球変異に近い部位を切断すると予測されたガイドを設計した（http://crispr.mit.edu/およびhttp://crispor.tefor.net/）。すべてのガイドは、５’末端の最初の３つの残基および３’末端の最初の３つの残基をそれぞれ３’ホスホロチオエートヌクレオチド間結合で修飾した化学修飾２’−Ｏメチル類似体として合成した（Synthego Inc.、カリフォルニア州）。鎌状赤血球変異を切断するTALENは、Golden Gateクローニング法を使用して構築した。TALEN mRNAは、過去に公開されているプロトコルに基づいて作製した（Grier, AE, et al., (2016). Mol Ther Nucleic Acids 5: e306；この文献は引用によりその全体が本明細書に明示的に援用される）。
【０２１３】
エレクトロポレーション、細胞の形質導入および赤血球分化培養：
すべての研究において、Alt-R S.p Cas9ヌクレアーゼ3NLSタンパク質（Integrated DNA Technologies Inc.、アイオワ州コーラルビル）を使用した。CD34+細胞は、各100ng/mlのFLT-3リガンド、TPO、hSCFおよびIL-6（Peprotech、ニュージャージー州ロッキーヒル）を添加したSCGM培地（CellGenix、ニューハンプシャー）中で培養した。細胞のエレクトロポレーションは、細胞を解凍してから48時間後に、Neonエレクトロポレーションシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して、1300V、20ミリ秒の条件で１回パルスを加えることによって、あるいはロンザ社の4-D nucleofector（ロンザ、スイス、バーゼル；プロトコルCM149）を使用して行った。Cas9 RNPは、エレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションの直前に、20pmolのCas9と50pmolのsgRNAを混合することによって作製した（細胞2×105個あたり、Cas9：sgRNAの比率＝1：2.5）。RNP混合物は必要時に新たに作製し、室温で15分間インキュベートした。ssODNドナー鋳型は、細胞2×105個あたり100pmol、50pmol、25pmolまたは12.5 pmolで使用し、エレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションの直前にRNP混合物に加えた。エレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションを行ったssODN処理細胞およびコントロール細胞は、rAAV6（培地量の1%、2%または3%；3%GTC rAAV6、MOI＝約4500〜5100；1% GAA rAAV6、MOI＝約2190）を含むサイトカイン添加SCGM培地またはrAAV6を含んでいないサイトカイン添加SCGM培地に加えた。培地中において細胞を37℃で18時間かけて一晩インキュベートした。18時間後に、1ng/ml hIL-3、2 IU/ml EPO、20ng/ml h-SCF、20%熱不活化FBSおよび1%ペニシリン／ストレプトマイシン（フィッシャー・サイエンティフィック、ニューハンプシャー州ハンプトン、およびPeprotech、ニュージャージー州ロッキーヒル）を添加したIMDM培地を入れた組織培養用未処理プレートに細胞を移した。細胞密度は、5×105個/ml〜1×106個/mlの間で維持することにより、増殖ストレスまたは過密状態による胎児性ヘモグロビンの誘導を最小限に抑えた。CD235の発現は、BV421で標識されたグリコホリンA抗体（BD、562938）を使用したフローサイトメトリーにより１４日目に観察した。
【０２１４】
rAAV6およびssODNによるHDRイベントのddPCRによる測定：
DNeasy blood & tissue kit（キアゲン、メリーランド州ジャーマンタウン）を使用してgDNAを抽出し、RNaseで処理した。100ngのgDNAに6ユニットのECORV-HF（New England Biolabs、マサチューセッツ州イプスウィッチ）を加えて37℃で15分間処理して、アンプリコン領域の外側のgDNAを切断した。ddPCRフォワードプライマーおよびリバースプライマー（ddPCR F/R）を使用して、210bpのアンプリコンを増幅した。このアッセイは、WT-HEXプローブとHDR-FAMプローブを同時に走らせたデュアルプローブアッセイとして設計し、参照用HEXプローブは、同じddPCR F/Rプライマーと、ddPCR supermix for probes（No dUTP）（バイオ・ラッド）を使用して別のウェルにおいて並行して走らせた。使用したプライマーおよびプローブの一覧を表３および表４に示す。
【表３】
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【表４】
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【０２１５】
バイオ・ラッド社製のサーモサイクラーにおいてドロップレットを作製し、増幅を行った（95℃：5分、94℃：30秒、56℃：1分、72 ℃：1分、ステップ2に移行：49サイクル、98℃：10分、12℃：∞）。バイオ・ラッド社製QX200装置（バイオ・ラッド、カリフォルニア州ハーキュリーズ）において、FAMおよびHEXの蛍光強度を測定した。参照遺伝子（REF-HEX+、表３）で補正後、HDRイベント（%）（HDR-FAM+）およびWT（WT-HEX+）イベントを算出した。
【０２１６】
INDEL頻度の測定：
エレクトロポレーションから１０日目のgDNAを使用して、フォワードプライマーおよびリバースプライマー（HBB-F/R-1250（表３））により切断部位の周辺の1250bpのアンプリコンを増幅した。NucleoSpin gel and PCR clean-upキット（Machery Nagel、ペンシルベニア州ベスレヘム）を使用して、PCR産物を精製し、シーケンシングプライマー（SCL-F/R-386（表３））を使用してサンガーシーケンシングを行った。TIDE/ICEアルゴリズムを使用して配列を分析し、編集後のINDELを測定した。
【０２１７】
MiSeq分析：
PrimeSTAR GXL DNA ポリメラーゼ（TaKaRa、日本、草津）とMiSeqプライマー（表３）を使用して、200ngのgDNAからHBB（386bp）遺伝子特異的アンプリコンおよびHBD（301bp）遺伝子特異的アンプリコンを増幅した。これらのプライマーによって、アンプリコンにオーバーハングアダプター配列が付加された。Nextera 96インデックスキット（FC-121-1012、イルミナ、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して、各試料に５’末端および３’末端のユニークなインデックスを付加した。Agencourt AMPure XP（ベックマン・コールター、カリフォルニア州ブレア）で各試料を精製し、アガロース／PAGEゲル上でバンドを確認した。各試料を測定し、プールしてライブラリーを作製し、Qubit（サーモフィッシャーサイエンティフィック、マサチューセッツ州ウォルサム）で品質管理を行い、MiSeq 500 CycleV2キット（イルミナ、カリフォルニア州サンディエゴ）で分析した。Crispresso2アルゴリズムを使用して、データマイニングを行った。HBBの分析は、オンターゲットな遺伝子改変に使用し、HBDは、オフターゲットな分析に使用した。
【０２１８】
NBSGWマウスにおける生着研究：
NOD, B6, SCID Il2rγ-/- Kit（W41/W41）（NBSGW）マウスは、ジャクソン研究所から購入し、所定の無菌室で飼育した。すべての動物実験は、Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care（AAALAC）による基準に従って実施し、Seattle Children’s Research Instituteの動物実験委員会によって承認された。
【０２１９】
６〜７週齢のNBSGWマウスを、編集細胞の移植の24時間前にブスルファン（Selleckchem）で処置した。編集の24時間後に、2×106個の編集細胞を尾静脈から注入した。マウスは定期的にモニターした。移植の３週間後および１２〜１４週間後に、マウスから骨髄および脾臓を採取し、得られた細胞から、ヒトキメリズム（hCD45+、mCD45+）と、多系統の細胞の生着（CD19+細胞、CD33+細胞、CD235+細胞、CD3+細胞、CD34+細胞およびCD38+細胞）について分析した。骨髄細胞からgDNAを回収し、ddPCRで分析して、HDR率（%）とWT率（%）を測定した。Indelは、TIDE/ICEシーケンシングで分析した。骨髄細胞は、採取後、赤血球分化培地中で２週間培養した。エクスビボ分化培養した細胞は、フローサイトメトリーによりCD235+の発現を測定した。さらに、採取の２週間後に細胞をペレット化し、洗浄し、RP-HPLCで分析してグロビンの発現を測定した。骨髄細胞（プレート１枚あたりmethocult培地3ml中30,000個）を、methocult完全培地（STEMCELL technologies、カナダ、バンクーバー）に加えて、プレートに播種し、CFUを分析した。採取の１４日後に、単一の赤芽球バースト形成単位（BFU-E）コロニーを採取し、水で溶解し、イオン交換クロマトグラフィー（IEC）で分析してグロビンの発現を調べた。
【０２２０】
統計分析：
実験から収集したデータは、二元配置分散分析とDunnettの多重比較検定を使用して、Graph Pad Prism 7で分析した。各群のすべての試料は、コントロール細胞またはmock処理細胞と比較して、有意性を評価した。ns：有意差なし、* p<0.05、** p<0.01、*** p<0.001、**** p<0.0001。
【０２２１】
赤血球系細胞の溶解：
赤血球系細胞を分化培地中で１４日間培養し、回収し、PBSで洗浄して夾雑タンパク質を除去した。HPLCグレードの水中で細胞を低張溶解した。溶血液の上清を20,000×g、4℃で30分間遠心分離し、得られたタンパク質1〜10μgをカラムに注入した。
【０２２２】
赤血球系細胞のRP-HPLC分析：
赤血球分化後、Aeris 3.6μm Widepore C4 250×4.6mmカラム（Phenomenex）を使用した島津製作所製Prominence UFLCクロマトグラフでRP-HPLCを実施して、グロビンのサブタイプの発現を評価した。A：水／0.1%TFA（トリフルオロ酢酸）とB：アセトニトリル／0.08%TFAを移動相として使用し、0.8ml/分の流速で流した。グラジエントは、75分で移動相Bを39%から50%まで上昇させるプログラムで実施した。カラムオーブンの温度は40℃とし、試料トレイは4℃で維持した。ピークは220nmで検出された。参照試料を流し、様々なグロビンのピークの溶出時間を比べた。
【０２２３】
赤血球系細胞のイオン交換クロマトグラフィー（IEC）：
Ａ相（40mMのTrisと3mMのKCNをHPLCグレードの水に加え、酢酸でpH6.5に調整）およびＢ相（40mMのTris、3mMのKCNおよび0.2MのNaClをHPLCグレードの水に加え、酢酸でpH6.5に調整）を移動相として使用したPolyCAT A（200×2.1mm、5μm、1000Å）（PolyC#202CT0510）上で、PBSで洗浄後の赤血球系細胞を分析した。24分間に設定したプログラムを使用して、Ｂ相を2%から100%に上昇させるグラジエントを形成し、0.3mL/分の流速で流した。カラムオーブンの温度は30℃とし、試料トレイは4℃で維持した。ピークは418nmで検出された。参照試料を流し、グロビン四量体の溶出時間を比べた。
【０２２４】
コロニーシーケンシング：
GXL DNAポリメラーゼ（タカラバイオ）とHBB-1250フォワードプライマーおよびリバースプライマー（表３）を使用して、50ngのgDNAから切断部位の周辺の1250bpのアンプリコンを増幅した。NucleoSpin Gel and PCR Clean-upキット（Macherey-Nagel、ペンシルベニア州ベスレヘム）を使用して、PCR産物を精製し、Zero Blunt TOPO PCR Cloningベクター（フィッシャー・サイエンティフィック、ニューハンプシャー州ハンプトン）にサブクローニングし、TOP10コンピテントセル（フィッシャー・サイエンティフィック、ニューハンプシャー州ハンプトン）の形質転換を行った。カナマイシン耐性コロニーを釣菌し、SCL-386プライマーでシーケンシングした。個々の配列を分析して、各配列がWTであるのか、NHEJにより得られたものであるのか、あるいはHDRにより得られたものであるのかを判定した。
【０２２５】
T7エンドヌクレアーゼアッセイ：
GXL DNAポリメラーゼ（タカラバイオ）とHBB-1250プライマーを使用して、全gDNAからヌクレアーゼ切断部位の周辺の1250bpの領域を増幅した。NucleoSpin Gel and PCR Clean-upキット（Macherey-Nagel、ペンシルベニア州ベスレヘム）を使用して、PCR産物を精製した。400ngのPCR産物を変性させ、反応液量を19μlとして、1×バッファー2（New England Biolabs、マサチューセッツ州イプスウィッチ）中で再アニーリングした。T7エンドヌクレアーゼＩ（New England Biolabs、マサチューセッツ州イプスウィッチ）で試料を処理し、37℃で15分間インキュベートした後、1%アガロースゲルにロードして、画像を取得した。
【０２２６】
フローサイトメトリー分析：
フローサイトメトリー分析は、LSR IIフローサイトメーター（BDバイオサイエンス）で行い、データ分析は、FlowJoソフトウェア（Tree Star）を使用して行った。生細胞に対応するFSC/SSC集団をゲートし、FSC-A/FSC-Wを使用してシングレットをゲートした。
【０２２７】
ssODNの設計：
各種の一本鎖オリゴヌクレオチド（ssODN）は、IDT社（Ultramer（登録商標）DNAオリゴヌクレオチド）の商用サービスを利用して、５’末端および３’末端の２つの末端ヌクレオチドをホスホロチオエート結合で修飾して合成した。HDRに使用したssODN配列の一覧を表５に示す。
【表５】
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【０２２８】
CD34細胞におけるヌクレアーゼの効率
HBB遺伝子のエキソン１内において二本鎖切断（DSB）を効率的に作製する方法を同定するため、ヌクレアーゼのスクリーニングを行った（図１０Ａ）。RNP複合体として送達した新規sgRNAまたはTALENベースのヌクレアーゼの切断効率をCD34+mPBSCにおいて評価した。最初のヌクレアーゼスクリーニングでは、RNPとしての送達した一連のsgRNA候補をCas9において試験したところ、Cas9とsgRNAの比率を1：1とし、ガイド4（g4）、g5、g6またはg1を使用した場合に、DSBが最も効率的に作製されることが同定された（図１０Ｂ）。これらの知見に基づいて、SCD変異部位である６番目のコドンに隣接して二本鎖切断（DSB）が作製されるように、sgRNA-g1を最適化した。これと並行して、sgRNA-g6（G10）も広範に試験した。Cas9においてこれらのガイドを試験したところ、NeonエレクトロポレーションシステムにおいてCas9とsgRNAの比率を1：2.5とした場合に、sgRNA-g1による総編集率が２倍になった（g1：17.8±4.4%から35.2±10.6%へと上昇し；g6：26.7±1.6%から38.3±8.7%へと上昇した；図１０Ｃ）。sgRNA-g1を使用した場合のオンターゲットなHBB破壊は、MiSeq分析で測定したところ、38.7±12.2%（ドナーn=7）であり、オフターゲットなHBD破壊は0.129±0.01%であった（図１０Ｄ）。CCTop 22によって予測したsgRNA-g1による上位５つのオフターゲット遺伝子は、T7エンドヌクレアーゼアッセイ（図１０Ｆ）でもTIDEシーケンシング（図１０Ｇ）でもIndelを示さなかった。ヌクレオフェクションシステム（ロンザ社；86±2.6%、ドナーn = 3）を使用した場合の全体的な編集率は、エレクトロポレーションシステム（Neon；35.2±10.6%、ドナーn = 15）を使用した場合と比べて約2.5倍上昇した（図１０Ｅ）。
【０２２９】
rAAV6ドナー鋳型の送達によるGTCへの変化の導入
HBB遺伝子のエキソン１の６番目のコドンにGTC（E6Vをコード）または同義変化GAA（E6optEをコード）が導入されるように、2.2kbの相同アームを有するrAAV6ベクターを構築した。転写および翻訳が最大限に向上するように、イントロン１および天然のプロモーター／エンハンサー領域が保存されるように注力して設計を行った（図１１Ａ）。実験のタイムラインを図１１Ｂに示す。（E6Vをコードする）3%のGTC rAAV6ドナー鋳型を送達し、RNPを介した切断による試験を行ったところ、HDR率が37.5±15%となり、残存NHEJ率が12.7±5.3%となった（図１１Ｃ）。また、エレクトロポレーションシステムおよびヌクレオフェクションを使用して、（E6Vをコードする）GTC rAAV6を試験したところ、総編集率が上昇し、その結果、HDR率および残存NHEJ率がいずれも上昇することが示された（図１１Ｇ）。さらに、RNPをGTC rAAV6と共送達した場合に測定されたHDR率および残存NHEJ率を、コロニーシーケンシングによって検証した（HDR率＝30.8±6.3%、NHEJ率＝17.9±7.2%、ドナーn=5、図１１Ｈ）。また、エレクトロポレーションを行い、GTC rAAV6を培地量の3%の量で加えて形質導入を行った後の細胞の生存能力は、平均で79.2%であった（図１１Ｉ）。また、分化させた赤血球系前駆細胞において、逆相HPLC（RP-HPLC）によりグロビンのサブタイプを測定した。RNPのみで編集を行った場合、およびGTC rAAV6の存在下でRNPによる編集を行った場合、βＡが顕著に減少し（Neonを使用して82%〜54±16%）、γＡ（HBG1）およびγＧ（HBG2）が２倍になった。また、RNPと3%のGTC rAAV6を共送達すると、28.4±9.8%のβＳ発現が誘導された（ドナーn=6、図１１Ｄ）。RNPと（E6Vをコードする）GTC rAAV6の共送達により発生した赤血球系細胞におけるグロビン四量体をイオン交換クロマトグラフィー（IEC）で測定した。RNPと3%のGTC rAAV6を共送達すると、HbAの減少と用量依存的なヘモグロビンＳ四量体の増加（15.8%）が観察された（図S2D）。（E6Vをコードする）GTC rAAV6で処理した細胞試料をRP-HPLCで分析したクロマトグラムでは、38.6%のβｓのピークの存在が確認された（図１１Ｋ）。
【０２３０】
これらのヌクレオチド変化に関する研究と並行して、新規な組織特異的なエンハンサーおよび調節因子とともにGFP発現カセットを導入するように設計したより複雑なrAAV6ドナー鋳型コンストラクトの広範な試験も行った（図１１Ｌ）。後から作製したこれらのrAAV6ドナー鋳型では大幅にHDR率が向上したが（1321：14.4%および1322：18.4%、図１１Ｍ）、所望のグロビンの発現は低下した（βｓ=1.35〜2.6%、図１１Ｎ）。
【０２３１】
rAAV6ドナー鋳型の送達によるGAAへのSNP変化の導入
正常細胞への鎌状赤血球変異の導入では、患者の細胞において変異を元に戻す能力は評価できず、編集された赤血球系前駆細胞の適合性を変化させてしまう恐れもある。鎌状赤血球症（SCD）対象から得たHSCを使用した研究の代わりに、サイレントSNP変化（GAA；E6optEをコードする）の導入を試験した。（E6optEをコードする）GAA rAAV6ドナー鋳型（培地量の1%）をRNPと共送達して試験を行ったところ、HDR率が37.5±6%となり、NHEJ率が43.7±11.5%となった（図１１Ｅ）。RNPと（E6Vをコードする）GTC rAAV6カセットを共送達した場合と比較して、RNPと（E6optEをコードする）GAA rAAV6を共送達した場合に総NHEJイベント数が増加したが、これは、恐らく、ヌクレオフェクションシステムを使用した全体的な編集率が増加したことを反映していると見られることには注意されたい。（E6Vをコードする）GTC rAAV6による編集により得られたデータは、Neonエレクトロポレーションシステム（n=3）を使用した実験およびロンザ社のヌクレオフェクションシステム（n=1）を使用した実験の両方のデータが含まれていたが、（E6optEをコードする）GAA rAAV6による共送達ではロンザ社のヌクレオフェクションシステムのみ（n=3）を使用して試験した。また、エレクトロポレーションを行い、（E6optEをコードする）GAA rAAV6を1%の量で加えて形質導入を行った後の細胞の生存能力は、平均で60%であった（図１１Ｉ）。RP-HPLC分析を行ったところ、RNPで編集した試料において、βＡ量が顕著に低下し（コントロール細胞では82%であったのに対して、RNPで編集した細胞では16.9±15%まで低下）、βＡ（HBG1）とγＧ（HBG2）が３倍に増加したことが同定された。これに対して、RNPと（E6optEをコードする）1% GAA rAAV6を共送達したところ、βＡ量の低下はそれほど顕著ではなく（βＡ発現：54.2±10%；n=3、図１１Ｆ）、βＡ（HBG1）およびγＧ（HBG2）の増加もそれほど突出していなかった。RNPおよび（E6optEをコードする）GAA rAAV6の共送達後にβＡ発現が維持されたことは、AAVを介したHDRによるものだと考えられる。この結論と一致して、RNPと（E6optEをコードする）GAA rAAV6の共送達により処理した細胞のRP-HPLC分析では、HDR後にβＡの発現が64.7%を占めることが示された（図１１Ｏ）。本発明者らが得た以上の知見から、RNPとrAAV6の共送達によりHBBのエキソン１において高頻度なHDRを促進することができ、これにより、鎌状赤血球変異を導入することができ、あるいは患者の細胞において鎌状赤血球変異を元に戻すように設計されたサイレント変異を導入できることが示された。
【０２３２】
ssODNドナー鋳型の送達によるGTC変化の導入
mPBSCにおいてrAAV6を使用して導入したものと同じヌクレオチド変化を、RNPとssODNの共送達により導入する際の効率を評価するため、研究を行った。（E6Vをコードする）GTGへのヌクレオチド変化、（E6Vをコードする）GTCへのヌクレオチド変化または（E6optEをコードする）GAAへのヌクレオチド変化が発生するように、別の168bpのssODNを設計した（図１２Ａ）。実験のタイムラインを図１２Ｂに示す。試験に使用したssODNの濃度を上昇させると、用量依存的に細胞傷害性が増加した（図１２Ｇ）。RNPと50pmolのssODNを共送達した際のHDRによる遺伝子変換率は、GTCへの変化を誘導するODNでは11.9±3.4%であり、GTGへの変化を誘導するODNでは17±4.3%であり、一方、残存NHEJ率は、GTCへの変化を誘導するODNでは17.4±17.5%であり、GTGへの変化を誘導するODNでは20.0±1.7%であった（図１２Ｃおよび図１２Ｈ）。（E6Vをコードする）GTG ssODNを50pmolの量で使用した場合のHDR率およびNHEJ率をコロニーシーケンシングによりさらに検証したところ、HDR率は12.6±8.8%であり、NHEJ率は30.1±12.4%であった（図１２Ｉ）。また、グロビンのサブタイプをRP-HPLCで評価した。RNPを介した二本鎖破壊後、βＡの大幅な減少が観察され、βＡ（HBG1）およびγＧ（HBG2）の1.5倍の増加が観察された。RNPと様々な濃度のssODNを共送達すると、（E6Vをコードする）GTC ssODN（図１２Ｄ）またはGTG ssODN（図１２Ｊ）を50pmolの量で送達した場合に、用量依存的な鎌状赤血球グロビンの発現の増加と最適なβＳの発現が観察された。また、（E6Vをコードする）GTC ssODNによる編集では、βＳの発現が5.2%を占め（50pmol、n=5、図３Ｄ）、（E6Vをコードする）GTG ssODNによる編集では、βＳの発現が5.3%を占めた（50pmol、n=3）（図１２Ｊ）。これらの平均値と一致して、分化させた赤血球系細胞から得た試料のクロマトグラムでは、（E6Vをコードする）GTC ssODNによる編集では、βＳの発現が8.9%を占め（図１２Ｌ）、（E6Vをコードする）GTG ssODNによる編集では、βＳの発現が9.2%を占めることが示された（図１２Ｍ）。同じドナーに由来するmPBSCにおける編集を、GTC ssODNとAAV6の間で直接比較したところ、βＳの発現がGTC ssODNを使用した場合は8.9%となり、AAV6を使用した場合は24.5%になることが示された（図１２Ｌ）。
【０２３３】
ssODNドナー鋳型の送達によるGAAへのSNP変化の導入
rAAV6ドナー鋳型を使用した研究と同様に、別の形態の導入としてサイレントSNP変化（GAA；E6optEをコードする）を試験した。50pmolの（E6optEをコードする）GAA ssODNとRNPを共送達すると、HDR遺伝子変換率が24.5±7.6%となり、残存NHEJ率が44±13.8%となった（図１２Ｅ）。ssODNの濃度を増加させると、Neonシステムおよびロンザ社システムのいずれを使用した場合でも、用量依存的にHDR率が上昇し、これに応じてNHEJ率が低下することが観察された（図１２Ｋ）。Neonエレクトロポレーションシステムを使用した編集結果をコロニーシーケンシングによりさらに検証したところ、HDR率が10.6±2.8%となり、残存NHEJ率が35.5±8.6%となることが示された（図１２Ｉ）。RNPを介した二本鎖破壊後に分化させた赤血球系細胞のペレットにおいてグロビンのサブタイプを測定したところ、βＡの発現が顕著に減少し（25.7%、ドナーn=6）、βＡ（HBG1）およびγＧ（HBG2）の発現が1.5〜３倍に増加することが観察された。これに対して、（E6optEをコードする）GAA ssODNドナー鋳型を使用すると、βＡの発現が58.4%で維持された（ドナーn=6、図１２Ｆ）。編集後に分化させた赤血球系細胞試料におけるグロビンのサブタイプを示したクロマトグラムでは、RNPと（E6optEをコードする）GAA ssODNの共送達によりRNPを介して二本鎖破壊した試料において、HbAの発現が0%から75.6%まで上昇することが示された（図１２Ｎ）。また、RNPのみで編集した細胞と、RNPおよびHDRドナー鋳型の共送達を使用して編集したmPBSCを直接比較したところ、GAA ssODNドナー鋳型を送達した場合にHbAの発現が0%から75.6%まで上昇し、rAAV6ドナー鋳型を送達した場合にHbAの発現が0%から64.7%に上昇することが示された（図１２Ｎ）。
【０２３４】
MiSeq分析によるssODNドナー鋳型送達方法とrAAV6によるドナー鋳型送達方法の比較
本発明者らによる新規プラットフォームの使用により達成される遺伝子編集効率をさらに評価するため、MiSeq分析を使用して編集結果を検証した。作製したすべてのssODNドナー鋳型のいずれかとRNPの共送達と、（E6Vをコードする）GTC rAAV6ドナー鋳型とRNPの共送達を比較するため、Neonエレクトロポレーションシステムにより達成されるHDR率およびNHEJ率を評価した。インビトロ試料（およびインビボ試料）から、平均で113,000個のペアワイズアライメントリードが得られた（図１３Ｄ）。得られたデータから、rAAV6ドナー鋳型は、NHEJよりもHDRを高頻度に誘導し（GTC rAAV6：HDR率27.8%、NHEJ率16%）、ssODNの送達は、インビトロにおいてHDRよりNHEJを高頻度に誘導すること（GTC ssODN：HDR率14.3%およびNHEJ率19.6%）が示された（図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｃ）。indelスペクトラムを作製して分析したところ、RNPのみを送達した場合、60.4%の欠失（主に-3bp、-1bp、-5bp、-6bpおよび-12bpの欠失）が起こり、2%の挿入が起こった。RNPとドナー鋳型を共送達すると、indelスペクトラムは、主に-3bpおよび-1bpの欠失に減少した（図１３Ｂ、 図１３Ｅ）。野生型（WT）では、rAAV6で編集した試料およびssODNで編集した試料において、欠失を生じたNHEJとHDRアレルが観察された（図１３Ｃ）。Crispresso27アルゴリズムによる分析では、ssODNドナー鋳型の送達により起こるフレームシフト変異と比べて（インビトロで12.2%およびインビボで5.3%；図１３Ｆ）、rAAV6ドナー鋳型の送達により起こるフレームシフト変異は少ない（インビトロで8.6%およびインビボで1.4%）ことが同定された。
【０２３５】
HDRで編集された細胞のインビボでの生着の持続に対するssODN送達の効果とrAAV6送達の効果の比較
HDRで編集したCD34+細胞の長期的な生着能力の変化において、新規ドナー鋳型プラットフォームが果たす役割を理解するため、健常者コントロールとしてのmPBSCを編集して、（E6Vをコードする）GTCへの変化を導入し、ブスルファン（12.5〜25mg/kg）であらかじめ処置したNBSGWレシピエントマウス（ヒト赤血球系のコンパートメントの発生が可能な免疫不全系統）に移植した。同一ドナーから得た細胞を、各プラットフォーム（2×106個の細胞）で編集し、エレクトロポレーション後１日目に移植した。移植を受けたマウスを経時的に評価し、３週間後および１２〜１４週間後に骨髄および脾臓におけるヒト細胞の生着を評価した（図１４Ａ）。
【０２３６】
ヒトキメリズムは、mock編集細胞のレシピエントでもssODNで編集した細胞のレシピエントでも同程度であった。これに対して、rAAV6で編集した細胞のレシピエントにおいて、hCD45+細胞の生着の有意な減少が観察された（図１４Ｂ）。さらに、rAAV6で編集した細胞を移植した群において、CD19+Ｂ細胞の割合がやや増加したことから、より分化した子孫細胞が得られる傾向が示唆された（図１４Ｃ）。骨髄系細胞（CD33+）、Ｔ細胞（CD3+）、赤血球系細胞（CD235+）などのその他の細胞系列は、各コホートを通して等しく観察された（図１４Ｃ、図１４Ｄ、図１４Ｊ、図１４Ｋ、図１４Ｌ）。骨髄から単離した細胞を赤血球系細胞分化培地中で採取後２週間にわたって培養し、CD235+細胞を拡大増殖させた（採取時の4.01%からエクスビボ培養において27.6%まで増加した；図１４Ｄ）。移植前および移植後の編集されたドナー細胞の代表的なフローサイトメトリープロットから、CD34+細胞、CD34+CD38lo細胞およびCD34+CD38loCD133+CD90+細胞を含む原始HSC亜集団が同等の割合で存在することが判明した（図１４Ｅ、図１４Ｍ、図１４Ｎ）。４種の移植におけるインプットされたHDR率（培養の１４日目）は、rAAV6送達方法で24.28±7.5%であり、ssODN送達方法で17.5±6%であった。移植の３週間後における骨髄中のHDR編集細胞のHDR率は、rAAV6送達では13.58±0.16%まで低下し、ssODN送達では15.19±2.8%まで低下した（n = 2）。１２〜１４週間後には、rAAV6ドナー鋳型で編集した細胞のレシピエントにおいてHDR率が0.66±0.66%まで急速に低下した（n = 17）。驚くべきことに、ssODNドナー鋳型で編集した細胞のレシピエントでもHDR率が低下したが、その程度は大幅に少なく、HDR率は4.136±2.1%であった（n = 18）（図１４Ｆ）。インプットされたNHEJ率は、rAAV6ドナー鋳型送達方法で7±1.4%であり、ssODNドナー鋳型送達方法で13.5±3.7%であったが、移植の３週間後でも変化は見られず（rAAV6：9±3%、ssODN：12.3±2.1%）、１２〜１４週間後に低下した（NHEJ率：rAAV6：1.3±0.85%、ssODN：5±2.7%、図１４Ｇ）。インビボの骨髄中におけるHDR率およびNHEJ率をMiSeq分析で検証した（HDR率：rAAV6：0.65±0.65%、ssODN：3.84±2.1%；NHEJ率：rAAV6：2.5±2.5%およびssODN：9.9±5.3%、図１４Ｈ、図１４Ｉ）。
【０２３７】
編集した未分化細胞集団のサブセットを赤血球系細胞の培養条件下でインビトロで維持し、グロビンのサブタイプを分析した。rAAV6で編集した細胞におけるβＳの発現は、16.4±6.8%を占め、ssODN編集では、βＳの発現が12.42±4.4%を占めた（図１４Ｏ）。エクスビボでの骨髄培養をHPLCで分析したところ、ssODNで編集した群ではβＳの発現が3.8%を示した（マウスn=3）。これに対して、rAAV6で編集した試料（マウスn=4）やmock編集試料（マウスn= 2、図１４Ｐ）では、βＳは検出されなかった。また、69個のBFU-EコロニーをHPLCで分析したところ、ssODNで編集した群から得た35個のコロニーのうち3個においてβＳの発現が確認され、平均で5.13%のβＳの発現が見られた。これに対して、rAAV6で編集したコロニー（コロニーn=26）やmock編集コロニー（コロニーn=8、図１４Ｑ、図１４Ｒ）では、βＳの発現は検出されなかった。ssODNで編集した群から得た単一の赤血球コロニーのクロマトグラムでは、38.7%、84.5%および56.3%のβＳの発現が示された（図１４Ｓ、 図１４Ｔ）。mock試料から得た単一コロニーのHPLCプロファイルでは、97%のHbAが含まれていたが、編集した群ではHbAが減少しているとともに、HbFが増加しており（rAAV6：17.4%、ssODN：17.9%）、かつ／またはHbSも増加していた（図１４Ｑ、図１４Ｒ、図１４Ｓ、図１４Ｔ）。以上のことから、この研究では、ssODNで改変された細胞が、rAAV6で改変された細胞よりもインビボでの性能が優れており、HDR編集細胞の生着と鎌状赤血球グロビンの発現が長期にわたり持続したことが示された。
【０２３８】
DNAドナー鋳型の送達は、ヒト造血幹細胞において標的化された遺伝子切断を行うことにより、遺伝子を正確に修正するという点で有用である。NHEJに対するHDRの全体的な比率は、鎌状赤血球症における遺伝子修正の臨床的有用性に影響を与えた。本明細書で開示した研究では、インビトロで初期遺伝子の変換を達成するための送達方法における新規なドナー鋳型の役割、ならびに新規ドナー鋳型が、編集された細胞の生存に与える影響、幹細胞様能力に与える影響およびインビボでの生着の持続に与える影響について評価した。得られたデータを合わせると、複雑さが垣間見えたが、鎌状赤血球症（SCD）での長期的かつ臨床的な遺伝子の修正におけるいくつかの問題点にも対処することができた。HSCの生存能力には大きな差異は観察されなかったが、rAAV6を使用した場合の表現型またはインビトロでの拡大増殖を、ssODNを使用した場合と比較すると、rAAV6ドナー鋳型を使用した場合は、HDR：NHEJの比率が一貫して高いことが示された。これに対して、移植実験では、ssODNドナー鋳型で編集したHSCを使用することによって、非常に高頻度なHDRが持続した。
【０２３９】
鎌状赤血球変異部位の周囲の53bpの領域に及ぶ複数のガイドRNA候補と、TALENペア候補の一次スクリーニングを行った。本明細書で述べたように、sgRNA-g1は、鎌状赤血球変異部位（21〜22bp）のすぐ隣の位置において効率的に二本鎖切断（DSB）を作製したことから、鎌状赤血球変異部位から16bp離れた位置において二本鎖切断（DSB）を作製したsgRNA-g6（G10）よりも有用なガイドとして選択された。Cas9：sgRNAの比率を1：2.5にすることによって、ヒトmPBSCにおける編集率が最も高くなり、実証可能なオフターゲット効果も認められなかった（図１０Ｄ、図１０Ｆ、図１０Ｇ）。ヌクレオフェクションシステム（図１０Ｅ）を使用した場合、総編集率が２倍以上となり、インビトロにおけるHDR率および残存indelがいずれも増加したことは注目すべきである（図１１Ｇ、 図１２Ｇ）。sgRNA-g1を含むRNPを送達後、HBBのエキソン１の６番目のコドンにおいて１つまたは２つのヌクレオチド変化を誘導する能力について新規rAAV6カセットまたは一連のssODNを試験した。このインビトロでの試験の結果、rAAV6の促進によって、NHEJ率よりもHDR率が高くなることが示された（GTC rAAV6：HDR率37.5±15%およびNHEJ率12.7±5.3%、図１１Ｃ）。これに対して、ssODNの送達では、HDRよりもNHEJが高頻度に誘導される（GTC ssODN：HDR率11.9±3.4%およびNHEJ率17.4±17.5%、図１２Ｃ、図１３Ａ）。
【０２４０】
実施例４−ロンザ社のCM149法とER100法の比較
RNPによる編集後、rAAV6ドナー鋳型またはssODNドナー鋳型の送達を実施した場合の、ロンザ社のCM149ヌクレオフェクション法とER100ヌクレオフェクション法を比較した。SCGM培地（100万個/ml）またはSFEM-II培地（250,000個/ml）中で培養した動員CD34+HSCにおいて、ロンザ社のプログラムであるCM149またはER100を使用して、生存能力の結果（MUSEセルカウンターを使用して評価）、HDRの結果（ddPCRで評価）およびNHEJの結果（ICEで評価）を比較した。
【０２４１】
試験した培地のいずれにおいても、ロンザ社のこれら２つの方法による、RNPのみを使用したNHEJ破壊率およびHDR後の残存indelは同程度であった。これに対して、CM149法を使用して50pmolまたは25pmolの濃度のssODNとRNPでHDR編集を行った場合、ER100法よりも編集後２日目の生細胞の数が多くなった（図１５Ａ）。SFEM-II培地中でRNP+50pmolのssODNを使用して40%のHDR率が達成された。50pmolまたは25pmolのssODNを使用した場合、ER100法によるHDR率はCM149法よりも高くなったが、ER100法を使用すると生存能力および細胞数が大幅に低下したことから、望ましいものではなかった。SFEM-II培地において低密度で培養を行った場合、SCGM培地よりもLT-HSC（CD34+CD38Lo）コンパートメント内の細胞がより多く維持されたことから、インビボでの生着に好ましいと見られた。いずれの方法でも、両方の試験培地において、約30%の成人グロビン（βＡ）の発現が誘導された（図１５Ｂ）。また、いずれの方法でも編集後（２日目）の細胞の生存能力は70%を下回っていたことから、ロンザ社のいずれの方法も、恐らくは、長期的な生着には最適以下であると見られた。
【０２４２】
実施例５−ヌクレオフェクション時の細胞密度の比較
最適なHDR、NHEJおよび生存能力の誘導における細胞密度の役割を評価するため、ヌクレオフェクション時の細胞密度を比較した。生存能力、HDRおよびNHEJの結果に対して細胞数が一定の役割を有しているのか否かを解明するため、RNPによる編集およびrAAV6ドナー鋳型またはssODNの送達後に、ロンザ社の反応液20μl中の細胞密度を様々に変えた（ヌクレオフェクション反応液20μlあたり200,000個、400,000個または600,000個）。
【０２４３】
試験した方法（CM149およびER100）のいずれでも、ヌクレオフェクション後２日目において、ヌクレオフェクション反応液20μlあたり200,000個の細胞密度が、編集後のCD34+細胞の生存能力の点においてその他の細胞密度よりも優れていた（図１６Ａ）。また、ヌクレオフェクション反応液20μlあたり200,000個の細胞密度は、編集後１４日目に測定したHDR率の点でその他の細胞密度よりも優れていたが、例外的に、反応液20μlあたり400,000個の細胞密度で、RNP+50pmolのssODNをER100法で試験した場合に、最も良好な結果が得られた（図１６Ｂ）。細胞密度はNHEJ率には影響を及ぼさなかった（図１６Ｃ）。試験した方法のいずれでも、細胞密度を様々に変えて行ったHDR後の総NHEJ率および残存NHEJ率は同程度であった。
【０２４４】
実施例６−細胞の生存能力およびHDR率の評価
ロンザ社の代替プログラムをRNPおよびssODNの送達と組み合わせて使用して、細胞の生存能力およびHDR率を評価した。
【０２４５】
CX100プログラムにより、編集後２日目に70%の生存能力と１４日目に27%のHDR率が達成された。EO100プログラム、DU100プログラムおよびDZ100プログラムでは、HDR率は40〜50%となったが、編集後２日目の生存能力はわずか20〜45%であった（図１７Ａ）。生存能力に関しては、ER100＜DZ100＜DU100＜EO100＜CM149＜CX100の順で優れていた。HDR率に関しては、ER100＜CM149＜CX100＜DZ100＜EO100＜DU100の順で優れていた（図１７Ｂ）。生存能力が高く、かつHDR率が高いことが好ましいため、RNPとssODNの送達と組み合わせて、長期にわたり生存可能なHSCにおいてHDRを達成するためには、CX100プログラムが最も望ましいプラットフォームであった（図１７Ｃ）。
【０２４６】
実施例７−ssODNの評価
生存能力とHDR率を最大限に向上させることを目的として、CX100プログラムまたはDU100プログラムを使用したssODNの評価（pmol単位での力価測定）を行った。２日目の細胞の生存能力およびHDR率が最大となる条件を見出すことを目的として、最も良好な結果を示したロンザ社のヌクレオフェクション方法においてssODNの様々な用量を評価した。ロンザ社のDU100プログラムまたはCX100プログラムを使用して、100pmol、50pmolまたは25pmolの用量のssODNとRNPを試験した。
【０２４７】
CX100プログラムは、DU100プログラムよりも生存能力が高くなった。50pmolのssODN+RNPを使用したCX100プログラムでは、生存能力が80%となり、HDR率が30%となった。RNPによる破壊はいずれの方法でも同程度であった。RNP+50pmolのssODNを使用した場合の残存NHEJ率は、DU100プログラムよりもCX100プログラムを使用した場合に高くなった（図１８）。
【０２４８】
実施例４〜７では、ロンザ社の様々なヌクレオフェクション方法を使用して、生存能力を維持しながらHDR率を最大とする条件を示した。全体として、SFEM-II培地を使用した場合、より多くの細胞がLT-HSCコンパートメントに保持されていたことから、SFEM-II培地はSCGM培地よりも望ましいものであった。ロンザ社のCX100プログラムは、編集された細胞を80%の生存能力で維持するとともに、30%のHDR率をもたらした。したがって、これらの研究では、ssODNまたはrAAV6を使用したHDRによるHBB遺伝子編集の臨床への移行に最も適した一定の条件範囲が明らかになった。この条件範囲には、以下のものが含まれる。（a）250,000〜1000,000個/mlの低密度の培養条件でのSFEM-II培地の使用；（b）SFEM-II培地における各100ng/mlのIL-6、TPO、FLT-3L、SCFの各サイトカインの使用；（c）以下の条件を使用した、最適な結果を得ることができるロンザ社の代替プログラムの使用：（ｉ）HDR率を最大限に向上させる目的では、ER100＜CM149＜CX100＜DZ100＜EO100＜DU100である；（ii）生存能力を最大限に向上させる目的では、ER100＜DZ100＜DU100＜EO100＜CM149＜CX100である；（iii）1：1、1：2.5または1：5の比率でのRNPの使用（40pmolのCas9に対して20pmolを使用）；（iv）200,000個の細胞に対して10pmol〜100pmolの濃度でssODNを使用；（ｖ）ウイルス力価に基づいたMOI 2000〜6000で培地量の1〜3%のrAAV6を使用。
【０２４９】
実施例８−インビボおよびインビトロにおけるHDRおよび野生型の検出
ddPCRアッセイを使用して、HDRイベントおよび未編集イベント（野生型）を測定した。アッセイは、HDR FAMプローブまたは野生型HEXプローブがゲノムDNA（gDNA）に結合する相互排他的アッセイとして開発した。FAMプローブとHEXプローブを混合し、同じウェル内の結合部位に対して競合させた。同じアンプリコン内のすべてのgDNAに結合する参照用HEXプローブを内部標準として使用し、並行してアッセイを行った。算出は以下の式で行った。
HDR（%）=（FAM+（%））／（参照用HEX+）
WT（%）=（HEX+（%））／（参照用HEX+）
【０２５０】
図１９は、mock処理試料、AAV処理試料、RNP処理試料ならびにE6V（GTC）への変化またはEoptE（GAA）への変化を誘導したRNP+ AAV処理試料およびRNP+ssODN処理試料の代表例のddPCRアッセイの結果を示す。FAM+イベントはいずれもHDRイベントを明確に示し、HEX+イベントは野生型イベントを示した。
【０２５１】
実施例９−ddPCRによるHDRの検証およびICEによるNHEJの検証
ddPCRデータからHDR率（%）を算出し（図２０Ａ）、ICEのアルゴリズムデータからNHEJ率（%）を算出した（図２０Ｂ）。ICE分析はNHEJ率（%）の測定に使用した。ICEのアルゴリズムを使用して、ノックアウト率（NHEJ）とノックイン率（HDR）の両方を測定することができる。indelとHDRを明確に区別するため、ガイド配列とドナー鋳型配列を提供した。この分析から、indelとHDRが正しく同定されていることを確認するための配列トレースを得た。HDRデータおよびNHEJデータを１つのグラフに組み込んで編集率（総編集率=NHEJ率（%）+HDR率（%））を示したところ、HDR率が増加するに従ってNHEJ率が減少することが実証された。さらに、Crispressoアルゴリズムを使用して、HDRデータおよびNHEJデータをMiSeq分析で検証してICEデータおよびddPCRデータを確認したところ、RNPの送達によるNHEJイベントの大部分は主に欠失であることが示された。
【０２５２】
本明細書で使用されている「含む（comprising）」という用語は、「含む（including）」、「含む（containing）」または「特徴とする（characterized by）」という用語と同義であるとともに、オープンエンドで包括的な意味であり、本明細書には記載されていないさらなる要素や工程を除外するものではない。
【０２５３】
前述の説明は、本発明のいくつかの方法および材料を開示するものである。本発明の方法および材料は、変更することができ、製造方法および器具も変更することができる。このような変更は、本明細書に開示された本発明の実施または本開示を考慮に入れて、当業者であれば容易に理解することができる。したがって、本発明は、本明細書に開示された特定の実施形態に限定されず、本発明の真の範囲および要旨において可能なあらゆる変更およびその他の態様を包含する。
【０２５４】
本明細書において引用された公開特許出願、非公開特許出願、特許および学術文献を含む（ただしこれらに限定されない）すべての参考文献は、引用によりその全体が本明細書に援用され、本明細書の一部を構成する。参照によって援用された文献、特許または特許出願が本明細書の開示内容と矛盾する場合、このような矛盾事項よりも本明細書の記載が採用および／または優先される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
2021521855.tif 000048
【図９Ｃ】
2021521855.tif 000049
【図１０Ａ】
2021521855.tif 000050
【図１０Ｂ】
2021521855.tif 000051
【図１０Ｃ】
2021521855.tif 000052
【図１０Ｄ】
2021521855.tif 000053
【図１０Ｅ】
2021521855.tif 000054
【図１０Ｆ】
2021521855.tif 000055
【図１０Ｇ】
2021521855.tif 000056
【図１１Ａ】
2021521855.tif 000057
【図１１Ｂ】
2021521855.tif 000058
【図１１Ｃ】
2021521855.tif 000059
【図１１Ｄ】
2021521855.tif 000060
【図１１Ｅ】
2021521855.tif 000061
【図１１Ｆ】
2021521855.tif 000062
【図１１Ｇ】
2021521855.tif 000063
【図１１Ｈ】
2021521855.tif 000064
【図１１Ｉ】
2021521855.tif 000065
【図１１Ｊ】
2021521855.tif 000066
【図１１Ｋ】
2021521855.tif 000067
【図１１Ｌ】
2021521855.tif 000068
【図１１Ｍ】
2021521855.tif 000069
【図１１Ｎ】
2021521855.tif 000070
【図１１Ｏ】
2021521855.tif 000071
【図１２Ａ】
2021521855.tif 000072
【図１２Ｂ】
2021521855.tif 000073
【図１２Ｃ】
2021521855.tif 000074
【図１２Ｄ】
2021521855.tif 000075
【図１２Ｅ】
2021521855.tif 000076
【図１２Ｆ】
2021521855.tif 000077
【図１２Ｇ】
2021521855.tif 000078
【図１２Ｈ】
2021521855.tif 000079
【図１２Ｉ】
2021521855.tif 000080
【図１２Ｊ】
2021521855.tif 000081
【図１２Ｋ】
2021521855.tif 000082
【図１２Ｌ】
2021521855.tif 000083
【図１２Ｍ】
2021521855.tif 000084
【図１２Ｎ】
2021521855.tif 000085
【図１３Ａ】
2021521855.tif 000086
【図１３Ｂ】
2021521855.tif 000087
【図１３Ｃ】
2021521855.tif 000088
【図１３Ｄ】
2021521855.tif 000089
【図１３Ｅ】
2021521855.tif 000090
【図１３Ｆ】
2021521855.tif 000091
【図１４Ａ】
2021521855.tif 000092
【図１４Ｂ】
2021521855.tif 000093
【図１４Ｃ】
2021521855.tif 000094
【図１４Ｄ】
2021521855.tif 000095
【図１４Ｅ】
2021521855.tif 000096
【図１４Ｆ】
2021521855.tif 000097
【図１４Ｇ】
2021521855.tif 000098
【図１４Ｈ】
2021521855.tif 000099
【図１４Ｉ】
2021521855.tif 000100
【図１４Ｊ】
2021521855.tif 000101
【図１４Ｋ】
2021521855.tif 000102
【図１４Ｌ】
2021521855.tif 000103
【図１４Ｍ】
2021521855.tif 000104
【図１４Ｎ】
2021521855.tif 000105
【図１４Ｏ】
2021521855.tif 000106
【図１４Ｐ】
2021521855.tif 000107
【図１４Ｑ】
2021521855.tif 000108
【図１４Ｒ】
2021521855.tif 000109
【図１４Ｓ】
2021521855.tif 000110
【図１４Ｔ】
2021521855.tif 000111
【図１５Ａ】
2021521855.tif 000112
【図１５Ｂ】
2021521855.tif 000113
【図１６Ａ】
2021521855.tif 000114
【図１６Ｂ】
2021521855.tif 000115
【図１６Ｃ】
2021521855.tif 000116
【図１７Ａ】
2021521855.tif 000117
【図１７Ｂ】
2021521855.tif 000118
【図１７Ｃ】
2021521855.tif 000119
【図１８】
2021521855.tif 000120
【図１９】
2021521855.tif 000121
【図２０Ａ】
2021521855.tif 000122
【図２０Ｂ】
2021521855.tif 000123
【配列表】
2021521855000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年2月2日(2021.2.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図１】
2021521855.tif 000124
【図２Ａ】
2021521855.tif 000125
【図２Ｂ−Ｃ】
2021521855.tif 000126
【図２Ｄ−Ｆ】
2021521855.tif 000127
【図３Ａ】
2021521855.tif 000128
【図３Ｂ−Ｃ】
2021521855.tif 000129
【図３Ｄ−Ｅ】
2021521855.tif 000130
【図３Ｆ】
2021521855.tif 000131
【図４Ａ】
2021521855.tif 000132
【図４Ｂ−Ｃ】
2021521855.tif 000133
【図４Ｄ】
2021521855.tif 000134
【図５Ａ】
2021521855.tif 000135
【図５Ｂ−Ｃ】
2021521855.tif 000136
【図５Ｄ−Ｅ】
2021521855.tif 000137
【図５Ｆ】
2021521855.tif 000138
【図６Ａ】
2021521855.tif 000139
【図６Ｂ−Ｃ】
2021521855.tif 000140
【図７Ａ】
2021521855.tif 000141
【図７Ｂ−Ｃ】
2021521855.tif 000142
【図７Ｄ】
2021521855.tif 000143
【図８Ａ】
2021521855.tif 000144
【図８Ｂ−Ｃ】
2021521855.tif 000145
【図８Ｄ−Ｅ】
2021521855.tif 000146
【図８Ｆ】
2021521855.tif 000147
【図９Ａ−Ｂ】
2021521855.tif 000148
【図９Ｃ】
2021521855.tif 000149
【図１０Ａ−Ｅ】
2021521855.tif 000150
【図１０Ｆ−Ｇ】
2021521855.tif 000151
【図１１Ａ−Ｂ】
2021521855.tif 000152
【図１１Ｃ−Ｆ】
2021521855.tif 000153
【図１１Ｇ−Ｊ】
2021521855.tif 000154
【図１１Ｋ】
2021521855.tif 000155
【図１１Ｌ−Ｎ】
2021521855.tif 000156
【図１１Ｏ】
2021521855.tif 000157
【図１２Ａ−Ｂ】
2021521855.tif 000158
【図１２Ｃ−Ｆ】
2021521855.tif 000159
【図１２Ｇ−Ｋ】
2021521855.tif 000160
【図１２Ｌ】
2021521855.tif 000161
【図１２Ｍ】
2021521855.tif 000162
【図１２Ｎ】
2021521855.tif 000163
【図１３Ａ−Ｂ】
2021521855.tif 000164
【図１３Ｃ】
2021521855.tif 000165
【図１３Ｄ−Ｆ】
2021521855.tif 000166
【図１４Ａ−Ｅ】
2021521855.tif 000167
【図１４Ｆ−Ｉ】
2021521855.tif 000168
【図１４Ｊ−Ｌ】
2021521855.tif 000169
【図１４Ｍ−Ｎ】
2021521855.tif 000170
【図１４Ｏ−Ｒ】
2021521855.tif 000171
【図１４Ｓ】
2021521855.tif 000172
【図１４Ｔ】
2021521855.tif 000173
【図１５Ａ】
2021521855.tif 000174
【図１５Ｂ】
2021521855.tif 000175
【図１６Ａ−Ｃ】
2021521855.tif 000176
【図１７Ａ−Ｃ】
2021521855.tif 000177
【図１８】
2021521855.tif 000178
【図１９】
2021521855.tif 000179
【図２０Ａ−Ｂ】
2021521855.tif 000180
【国際調査報告】
2021521855.tif 000181
2021521855.tif 000182
2021521855.tif 000183