(57)【要約】ペプチド−薬物複合体のための薬学的組成物などの組成物及び使用が開示されている。そのような組成物は、軟骨における標的領域、組織、構造または細胞に薬物、ペプチド、またはそれらの複合体を送達し得る。様々な態様では、本開示は、複合体であって、その複合体は、抗関節炎剤と、シスチン高密度ペプチドであって、対象へ投与するとシスチン高密度ペプチドは、対象の軟骨にホーミングし、それを標的とし、それに移動し、それに蓄積し、それに結合し、それによって保持され、またはそれに誘導される、シスチン高密度ペプチドと、リンカーであって、そのリンカーは、環状カルボン酸、環状ジカルボン酸、芳香族ジカルボン酸、またはアミノ酸を含み、そのリンカーは、エステル結合、カルバメート結合、カルボネート結合、またはアミド結合を介して抗関節炎剤及びシスチン高密度ペプチドを複合体化する、リンカーと、を含む、複合体を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複合体であって、前記複合体は、
抗関節炎剤と、
シスチン高密度ペプチドであって、対象へ投与すると前記シスチン高密度ペプチドは、前記対象の軟骨にホーミングし、それを標的とし、それに移動し、それに蓄積し、それに結合し、それによって保持され、またはそれに誘導される、前記シスチン高密度ペプチドと、
リンカーであって、前記リンカーは、環状カルボン酸、環状ジカルボン酸、芳香族ジカルボン酸、またはアミノ酸を含み、前記リンカーは、エステル結合、カルバメート結合、カルボネート結合、またはアミド結合を介して前記抗関節炎剤及び前記シスチン高密度ペプチドを複合体化する、前記リンカーと、
を含む、前記複合体。
【請求項２】
前記抗関節炎剤は、抗炎症剤である、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記抗炎症剤は、グルココルチコイドまたはＮＳＡＩＤである、請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
前記抗炎症剤は、デキサメタゾン、ブデソニド、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブチキシコート、コルチゾール（ヒドロコルチゾン）、クロベタゾール、エストリオール、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、デス−シクレソニド、デスイソブチリル−シクレソニド、ヒドロコルチン、コルチゾン、デオキシコルチコステロン、フルチカゾン、フルチカゾンフロエート、フルチカゾンプロピオネート、フルオシノニド、フルドロコルチゾン、フルニソリド、フルオロメトロン、ヘキセストロール、メチマゾール、メチルプレドニゾロン、モメタゾン、モメタゾンフロエート、１７−モノプロピオネート、パラメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、またはそれらの薬学的に許容可能な塩であるグルココルチコイドである、請求項３に記載の複合体。
【請求項５】
前記グルココルチコイドは、デキサメタゾンである、請求項４に記載の複合体。
【請求項６】
前記グルココルチコイドは、デス−シクレソニドである、請求項４に記載の複合体。
【請求項７】
前記グルココルチコイドは、ブデソニドである、請求項４に記載の複合体。
【請求項８】
前記グルココルチコイドは、トリアムシノロンアセトニドである、請求項４に記載の複合体。
【請求項９】
前記環状カルボン酸、前記環状ジカルボン酸、または前記芳香族ジカルボン酸は、単環式、二環式、三環式、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１０】
前記環状カルボン酸、前記環状ジカルボン酸、または前記芳香族ジカルボン酸は、４、５、６、７、もしくは８員環、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１１】
前記リンカーは、前記環状カルボン酸を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１２】
前記環状カルボン酸は、
【化６３】
2021522172.tif 000103
またはその置換アナログもしくは立体異性体を含む、請求項１１に記載の複合体。
【請求項１３】
前記環状カルボン酸は、
【化６４】
2021522172.tif 000104
またはその置換アナログもしくは立体異性体を含む、請求項１１に記載の複合体。
【請求項１４】
前記リンカーは、前記環状ジカルボン酸を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１５】
前記環状ジカルボン酸は、以下の群：
【化６５】
2021522172.tif 000105
のうちの１つまたはその置換アナログもしくは立体異性体を含む、請求項１４に記載の複合体。
【請求項１６】
前記環状ジカルボン酸は、以下の群：
【化６６】
2021522172.tif 000106
のうちの１つを含む、請求項１４に記載の複合体。
【請求項１７】
前記環状ジカルボン酸は、
【化６７】
2021522172.tif 000107
またはその置換アナログもしくは立体異性体を含む、請求項１４に記載の複合体。
【請求項１８】
前記リンカーは、前記芳香族ジカルボン酸を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１９】
前記芳香族ジカルボン酸は、
【化６８】
2021522172.tif 000108
またはその置換アナログを含む、請求項１８に記載の複合体。
【請求項２０】
前記リンカーは、前記アミノ酸を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項２１】
前記アミノ酸は、
【化６９】
2021522172.tif 000109
またはその置換アナログもしくは立体異性体を含む、請求項２０に記載の複合体。
【請求項２２】
前記リンカーは、表２に列挙された化合物２〜１７のうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項２３】
複合体であって、前記複合体は、
グルココルチコイドであって、前記グルココルチコイドは、ブデソニドでもデキサメタゾンでもない、前記グルココルチコイドと、
シスチン高密度ペプチドであって、対象へ投与すると前記シスチン高密度ペプチドは、前記対象の軟骨にホーミングし、それを標的とし、それに移動し、それに蓄積し、それに結合し、それによって保持され、またはそれに誘導される、前記シスチン高密度ペプチドと、
リンカーであって、前記リンカーは、線状ジカルボン酸を含み、前記リンカーは、エステル結合、カルバメート結合、またはアミド結合を介して前記グルココルチコイド及び前記シスチン高密度ペプチドを複合体化する、前記リンカーと、
を含む、前記複合体。
【請求項２４】
前記グルココルチコイドは、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブチキシコート、コルチゾール（ヒドロコルチゾン）、クロベタゾール、エストリオール、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、デス−シクレソニド、デスイソブチリル−シクルソニド、ヒドロコルチン、コルチゾン、デオキシコルチコステロン、フルチカゾン、フルチカゾンフロエート、フルチカゾンプロピオネート、フルオシノニド、フルドロコルチゾン、フルニソリド、フルオロメトロン、ヘキセストロール、メチマゾール、メチルプレドニゾロン、モメタゾン、モメタゾンフロエート、１７−モノプロピオネート、パラメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、またはそれらの薬学的に許容可能な塩である、請求項２３に記載の複合体。
【請求項２５】
複合体であって、前記複合体は、
グルココルチコイドであって、前記グルココルチコイドは、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、ブチキシコート、コルチゾール（ヒドロコルチゾン）、クロベタゾール、エストリオール、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、デス−シクレソニド、デスイソブチリル−シクレソニド、ヒドロコルチン、コルチゾン、デオキシコルチコステロン、フルチカゾン、フルチカゾンフロエート、フルチカゾンプロピオネート、フルオシノニド、フルドロコルチゾン、フルニソリド、フルオロメトロン、ヘキセストロール、メチマゾール、メチルプレドニゾロン、モメタゾン、モメタゾンフロエート、１７−モノプロピオネート、パラメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、またはそれらの薬学的に許容可能な塩である、前記グルココルチコイドと、
シスチン高密度ペプチドであって、対象へ投与すると前記シスチン高密度ペプチドは、前記対象の軟骨にホーミングし、それを標的とし、それに移動し、それに蓄積し、それに結合し、それによって保持され、またはそれに誘導される、前記シスチン高密度ペプチドと、
リンカーであって、前記リンカーは、線状ジカルボン酸を含み、前記リンカーは、エステル結合、カルバメート結合、カルボネート結合、またはアミド結合を介して前記グルココルチコイド及び前記シスチン高密度ペプチドを複合体化する、前記リンカーと、
を含む、前記複合体。
【請求項２６】
前記グルココルチコイドは、トリアムシノロンアセトニドである、請求項２３または２５に記載の複合体。
【請求項２７】
前記線状ジカルボン酸は、以下の群：
【化７０】
2021522172.tif 000110
のうちの１つまたはその置換アナログもしくは立体異性体、
（式中、各ｎ１、ｎ２、及びｍは、独立して、１〜１０の値であり、ｍは、０〜１０の値である）を含む、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項２８】
前記線状ジカルボン酸は、以下の群：
【化７１】
2021522172.tif 000111
のうちの１つまたはその置換アナログもしくは立体異性体（式中、各ｎ１及びｎ２は、独立して、１〜１０の値である）を含む、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項２９】
前記線状ジカルボン酸は、前記線状ジカルボン酸の多重結合を使用して官能化されている、請求項２８に記載の複合体。
【請求項３０】
前記官能化は、少なくとも１つの分子を前記線状ジカルボン酸に結合させることを含む、請求項２９に記載の複合体。
【請求項３１】
前記線状ジカルボン酸の前記多重結合を介した前記官能化は、付加反応、置換反応、環化付加、またはそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を含む、請求項２９〜３０のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項３２】
前記付加反応は、求核または求電子付加反応である、請求項３１に記載の複合体。
【請求項３３】
前記付加反応は、臭化水素の使用を含む、請求項３２に記載の複合体。
【請求項３４】
前記官能化は、求核置換反応をさらに含む、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項３５】
前記求核置換反応は、前記付加反応の後に生じる、請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項３６】
前記環化付加は、１，３−双極性環化付加である、請求項３１に記載の複合体。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの分子は、活性剤または検出可能剤である、請求項２９〜３６のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの分子は、（ｉ）軟骨における前記複合体の取り込み、（ｉｉ）軟骨における前記複合体の保持、（ｉｉｉ）前記複合体の加水分解速度、またはそれらの任意の組み合わせを変化させる、請求項２９〜３７のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項３９】
前記線状ジカルボン酸は、以下の群：
【化７２】
2021522172.tif 000112
のうちの１つまたはその置換アナログもしくは立体異性体である、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項４０】
前記リンカーは、表２に列挙された化合物１８〜２２のうちの少なくとも１つを含む、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項４１】
前記リンカーは、安定である、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項４２】
前記リンカーは、切断可能である、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項４３】
前記リンカーは、加水分解、酵素、ｐＨ変化、還元、自己犠牲、放射線、または化学反応によって切断可能である、請求項１〜４０、または４２のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項４４】
前記複合体の５０％未満は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、リン酸緩衝生理食塩水、ヒト血漿、またはラット血漿中で２０℃から３７℃までまたは４０℃までで、２４時間、３２時間、５６時間、または１００時間以内に切断される、請求項４２〜４３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項４５】
前記複合体の５０％未満は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、ヒト血漿またはラット血漿中で２０℃から３７℃までまたは４０℃までで、１０時間、３０時間、または６０時間以内に切断される、請求項４２〜４３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項４６】
前記複合体の前記リンカーは、カルバメート結合を含む、請求項４４または４５に記載の複合体。
【請求項４７】
前記複合体の５０％未満は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、リン酸緩衝生理食塩水、ヒト血漿、またはラット血漿中で２０℃から４０℃までで３２時間後に切断される、請求項４６に記載の複合体。
【請求項４８】
前記複合体の５０％未満は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、ヒト血漿中で２０℃から４０℃までで３２時間後に切断される、請求項４６に記載の複合体。
【請求項４９】
前記複合体の５０％未満は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、ラット血漿中で２０℃から４０℃までで３２時間後に切断される、請求項４６に記載の複合体。
【請求項５０】
前記リンカーは、以下の群：
【化７３】
2021522172.tif 000113
のうちの１つまたはその置換アナログもしくは立体異性体を含む、請求項４７〜４９のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項５１】
前記リンカーは、以下の群：
【化７４】
2021522172.tif 000114
のうちの１つまたはその置換アナログもしくは立体異性体を含む、請求項４７〜４９のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項５２】
前記リンカーは、
【化７５】
2021522172.tif 000115
またはその置換アナログもしくは立体異性体を含む、請求項４７〜４９のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項５３】
前記リンカーは、以下の群：
【化７６】
2021522172.tif 000116
のうちの１つまたはその置換アナログもしくは立体異性体（式中、ｎ１及びｎ２は、それぞれ独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）を含む、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項５４】
前記複合体の５０％〜１００％は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、ヒト血漿中で２０℃から３７℃までまたは４０℃までで１０〜３０時間または１０〜４０時間以内に切断される、請求項４２または４３に記載の複合体。
【請求項５５】
前記複合体の少なくとも５０％は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、リン酸緩衝生理食塩水、ヒト血漿、またはラット血漿中で２０℃から３７℃までまたは４０℃までで、０．５〜１００時間、１〜５０時間、１〜２０時間、または２〜１０時間以内に切断される、請求項４２または４３に記載の複合体。
【請求項５６】
前記リンカーは、
【化７７】
2021522172.tif 000117
またはその置換アナログを含み、
前記複合体の５０％〜１００％は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、ヒト血漿またはラット血漿中で３７℃で１〜８時間以内に切断される、請求項４２または４３に記載の複合体。
【請求項５７】
前記リンカーは、
【化７８】
2021522172.tif 000118
またはその置換アナログを含み、
前記複合体の５０％〜１００％は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、リン酸緩衝生理食塩水中で３７℃で１〜８時間以内に切断される、請求項４２または４３に記載の複合体。
【請求項５８】
前記リンカーは、
【化７９】
2021522172.tif 000119
またはその置換アナログもしくは立体異性体を含み、前記複合体の５０％〜１００％は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、ラット血漿中で３７℃で１〜８時間以内に切断される、請求項４２または４３に記載の複合体。
【請求項５９】
前記リンカーは、
【化８０】
2021522172.tif 000120
またはその置換アナログもしくは立体異性体を含み、
前記複合体の２５％〜５０％は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、ヒト血漿中で３７℃で１〜８時間以内に切断される、請求項４２または４３に記載の複合体。
【請求項６０】
前記リンカーは、
【化８１】
2021522172.tif 000121
またはその置換アナログもしくは立体異性体を含み、
前記複合体の５０％〜１００％は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、ヒト血漿中で３７℃で１０〜３０時間以内に切断される、請求項４２または４３に記載の複合体。
【請求項６１】
前記リンカーは、
【化８２】
2021522172.tif 000122
またはその置換アナログもしくは立体異性体を含み、
前記複合体の５％〜５０％は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、ラット血漿中で３７℃で１〜８時間以内に切断される、請求項４２または４３に記載の複合体。
【請求項６２】
前記リンカーは、
【化８３】
2021522172.tif 000123
またはその置換アナログもしくは立体異性体を含み、
前記複合体の２％〜２５％は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、ヒト血漿中で３７℃で１〜８時間以内に切断される、請求項４２または４３に記載の複合体。
【請求項６３】
前記リンカーは、
【化８４】
2021522172.tif 000124
またはその置換アナログもしくは立体異性体を含み、
前記複合体の５０％〜１００％は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、ヒト血漿中で３７℃で１０〜４０時間以内に切断される、請求項４２または４３に記載の複合体。
【請求項６４】
前記リンカーは、
【化８５】
2021522172.tif 000125
またはその置換アナログを含み、
前記複合体の７５％〜１００％は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、ラット血漿中で３７℃で１〜８時間以内に切断される、請求項４２または４３に記載の複合体。
【請求項６５】
前記リンカーは、
【化８６】
2021522172.tif 000126
またはその置換アナログを含み、
前記複合体の５０％超は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、ラット血漿またはヒト血漿中で２０℃〜３７℃で１０、３０、または６０時間によって切断される、請求項４２または４３に記載の複合体。
【請求項６６】
前記リンカーは、
【化８７】
2021522172.tif 000127
またはその置換アナログもしくは立体異性体を含み、
前記複合体の５０％未満は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、リン酸緩衝生理食塩水、ヒト血漿、またはラット血漿中で３７℃で１〜８時間以内に切断される、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項６７】
前記リンカーは、
【化８８】
2021522172.tif 000128
またはその置換アナログもしくは立体異性体を含み、
前記複合体の５０％未満は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、リン酸緩衝生理食塩水、ヒト血漿、またはラット血漿中で３７℃で８〜３２時間以内に切断される、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項６８】
前記複合体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで切断される、請求項４２〜６７のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項６９】
前記複合体は、動物に投与した場合に切断される、請求項６８に記載の複合体。
【請求項７０】
前記複合体は、ヒトに投与した場合に切断される、請求項６８に記載の複合体。
【請求項７１】
前記複合体は、加水分解によって切断される、請求項４３〜７０のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項７２】
前記複合体は、ｐＨ変化、還元、自己犠牲、放射線または化学反応によって切断される、請求項４３〜７０のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項７３】
前記複合体は、酵素的プロテイナーゼ活性によって切断可能なアミノ酸配列をさらに含む、請求項１〜７２のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項７４】
前記複合体は、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）のための切断部位を含む、請求項７３に記載の複合体。
【請求項７５】
前記ＭＭＰは、ＭＭＰ１３である、請求項７４に記載の複合体。
【請求項７６】
前記複合体は、カテプシンのための切断部位を含む、請求項７３に記載の複合体。
【請求項７７】
前記複合体は、カテプシンで切断可能なリンカーを含む、請求項７３に記載の複合体。
【請求項７８】
前記カテプシンで切断可能なリンカーは、バリン−シトルリンリンカーである、請求項７７に記載の複合体。
【請求項７９】
前記カテプシンは、カテプシンＫである、請求項７６に記載の複合体。
【請求項８０】
前記複合体は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子のための切断部位を含む、請求項７３に記載の複合体。
【請求項８１】
前記複合体は、トロンビンのための切断部位を含む、請求項７３に記載の複合体。
【請求項８２】
前記シスチン高密度ペプチドは、ジスルフィドノットを介してジスルフィドを含む、請求項１〜８１のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項８３】
前記シスチン高密度ペプチドは、システイン残基の間に形成された複数のジスルフィド架橋を含む、請求項１〜７３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項８４】
前記シスチン高密度ペプチドは、システイン残基の間に形成された３つ以上のジスルフィド架橋を含み、前記ジスルフィド架橋の１つは、２つの他のジスルフィド架橋によって形成されたループを通過する、請求項１〜８３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項８５】
前記シスチン高密度ペプチドは、４つ以上のシステイン残基を含む、請求項１〜８４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項８６】
前記シスチン高密度ペプチドは、６つ以上の塩基性残基及び２つ以下の酸性残基を含む、請求項１〜８５のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項８７】
前記シスチン高密度ペプチドは、少なくとも２つのシステイン残基、及び少なくとも２つの正に荷電したアミノ酸残基を含有する４〜１９アミノ酸残基フラグメントを含む、請求項１〜８６のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項８８】
前記シスチン高密度ペプチドは、少なくとも２つのシステイン残基、２つ以下の塩基性残基及び少なくとも２つの正に荷電したアミノ酸残基を含有する２０〜７０アミノ酸残基フラグメントを含む、請求項１〜８６のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項８９】
前記シスチン高密度ペプチドは、少なくとも３つの正に荷電したアミノ酸残基を含む、請求項１〜８８のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項９０】
前記正に荷電したアミノ酸残基は、Ｋ、Ｒ、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項８９に記載の複合体。
【請求項９１】
前記シスチン高密度ペプチドは、配列番号２１〜配列番号２４７または配列番号２８２〜配列番号５１０、またはそのフラグメントのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜９０のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項９２】
前記シスチン高密度ペプチドは、配列番号１〜配列番号２０、配列番号２４８〜配列番号２６７、またはそのフラグメントのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項９１に記載の複合体。
【請求項９３】
前記シスチン高密度ペプチドは、配列番号１０３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜９０のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項９４】
前記シスチン高密度ペプチドは、配列番号１８４に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜９０のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項９５】
前記シスチン高密度ペプチドは、配列番号１０５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜９０のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項９６】
前記複合体は、化合物２３、２６〜３１、３４、３６、３８、４０  ４３、４５〜４６、または４９〜５６のいずれか１つを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項９７】
化合物２３、２６〜２８、または４０〜４６のいずれか１つを含む、請求項５に記載の複合体。
【請求項９８】
化合物４５〜４６、または４９〜５６のいずれか１つを含む、請求項６に記載の複合体。
【請求項９９】
化合物２９〜３１、３４、または３６のいずれか１つを含む、請求項８に記載の複合体。
【請求項１００】
化合物４４または４９〜５６のいずれか１つを含む、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１０１】
化合物３２、３３、３５、４６、または４９〜５６のいずれか１つを含む、請求項２４に記載の複合体。
【請求項１０２】
前記シスチン高密度ペプチドは、配列番号１０３、配列番号１０５、または配列番号１８４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜９０のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１０３】
化合物４６、または４９〜５６のいずれか１つを含む、請求項１０２に記載の複合体。
【請求項１０４】
請求項１〜１０３のいずれか１項に記載の複合体またはその薬学的に許容可能な塩、及び薬学的に許容可能な担体を含む、薬学的組成物。
【請求項１０５】
前記薬学的組成物は、吸入、鼻腔内投与、経口投与、局所投与、静脈内投与、皮下投与、関節内（ｉｎｔｒａ−ａｒｔｉｃｕｌａｒ）投与、筋肉内投与、腹膜内投与、関節内（ｉｎｔｒａ−ｊｏｉｎｔ）投与、またはそれらの任意の組み合わせのために製剤化されている、請求項１０４に記載の薬学的組成物。
【請求項１０６】
前記薬学的組成物は、単回単位用量である、請求項１０４または１０５に記載の薬学的組成物。
【請求項１０７】
前記薬学的組成物は、液体である、請求項１０４〜１０６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１０８】
前記薬学的組成物は、固体投薬形態である、請求項１０４〜１０６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１０９】
前記薬学的組成物は、凍結乾燥されている、請求項１０４〜１０８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１１０】
容器内の請求項１〜１０３のいずれか１項に記載の複合体または請求項１０４〜１０９のいずれか１項に記載の薬学的組成物及びその使用のための指示書を含む、キット。
【請求項１１１】
請求項１〜１０３のいずれか１項に記載の複合体または請求項１０４〜１０９のいずれか１項に記載の薬学的組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項１１２】
前記方法は、抗関節炎剤単独の対応する投与によって提供されるものと比較して、前記抗関節炎剤に関連する有害作用の減少または予防を前記対象に提供する、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記方法は、前記抗関節炎剤単独の前記投与と比較して、前記対象における前記有害作用の発生を減少させる、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１４】
前記方法は、前記抗関節炎剤単独の前記投与と比較して、前記対象における前記有害作用の強度を減少させる、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１５】
前記方法は、前記有害作用の前記発生または強度を少なくとも１０％〜２０％減少させる、請求項１１１〜１１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記方法は、前記有害作用の前記発生もしくは強度またはその両方を少なくとも１０％〜５０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％減少させる、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記減少は、前記投与の１、２、３、６、９、１２、１８、または２４ヶ月後に測定される、請求項１１５または１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記減少は、前記投与の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５日後に測定される、請求項１１５または１１６に記載の方法。
【請求項１１９】
前記減少は、前記投与の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０週間後に測定される、請求項１１５または１１６に記載の方法。
【請求項１２０】
前記減少は、前記投与の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヵ月後に測定される、請求項１１５または１１６に記載の方法。
【請求項１２１】
前記有害作用は、体重減少、免疫抑制、皮膚菲薄化、紫斑病、クッシング外観、眼の白内障もしくは緑内障、骨粗鬆症もしくは骨折、視床下部−下垂体−副腎系（ＨＰＡ）軸の抑制、高血糖症及び糖尿病、重篤な心血管事象の発生率の増加、脂質異常症、ミオパシー、胃炎、胃腸潰瘍及び出血、精神障害、血糖値の上昇、血清コルチゾールもしくはコルチコステロンの減少、副腎、胸腺、もしくは脾臓の萎縮、循環リンパ球の減少、骨髄の細胞性の低下、筋萎縮、筋機能の低下、疼痛、筋肉痛、関節炎痛、関節痛、関節変形、可動性の低下、関節における動作範囲の減少、柔軟性の低下、強度の低下、バランスの低下、耐糖能の低下、食欲喪失、骨代謝の低下、免疫の障害、ネフローゼ症候群、疲労感、真菌感染症、ウイルス感染症、細菌感染症、ＧＩ穿孔、行動及び気分の乱れ、二次性副腎皮質機能不全、水分保持、白内障、緑内障、血圧上昇、骨粗鬆症、小児の成長の抑制、インスリン要求量の増加、体重増加、吐き気、クッシング症候群、筋骨格系、消化器系、皮膚系、神経系、内分泌系、眼科系、代謝系、もしくは心血管系の機能不全、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１１１〜１２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記有害作用は、前記体重減少である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２３】
前記方法は、前記抗関節炎剤単独の前記投与と比較して、前記投与後１２日間にわたって前記対象の総体重の５％未満の減少をもたらす、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記複合体の前記投与は、前記抗関節炎剤単独の前記投与と比較して、前記投与後１３日間にわたって前記対象の総体重の１０％未満の減少をもたらす、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２５】
前記有害作用は、好中球、リンパ球、単球、マクロファージ、またはそれらの任意の組み合わせの機能または数の減少を特徴とする免疫抑制を含む、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２６】
前記有害作用は、Ｔ細胞欠損症、体液性免疫欠損症、好中球減少症、またはそれらの任意の組み合わせを特徴とする免疫抑制を含む、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２７】
前記方法は、前記抗関節炎剤単独の対応する投与と比較して、前記対象に対してより低い毒性をもたらす、請求項１１１〜１２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２８】
前記複合体は、前記抗関節炎剤単独と比較して、より少ない投薬量で治療的に有効である、請求項１１１〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記複合体は、前記抗関節炎剤単独と比較して、より少ない投薬頻度で治療的に有効である、請求項１１１〜１２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記複合体は、前記投与後１５〜６０分以内に放出される、請求項１１１〜１２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記複合体は、前記投与後１５〜３０分以内に放出される、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記複合体は、１、３、６、１２、２４、または３２時間を超える半減期を有する、請求項１１１〜１３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記複合体は、１〜３時間以内に標的軟骨または関節に蓄積する、請求項１１１〜１３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３４】
前記複合体は、前記投与後に標的軟骨または関節で切断される、請求項１１１〜１３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記投与は、吸入、鼻腔内、経口、局所、静脈内、皮下、関節内、筋肉内投与、腹腔内、またはそれらの任意の組み合わせによる、請求項１１１〜１３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記方法は、前記対象における軟骨の機能に関連する病態を治療または予防する、請求項１１１〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記方法は、前記抗関節炎剤単独の対応する投与によって提供されるものと比較して、軟骨の機能に関連する病態の改善の増大を前記対象に提供する、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
前記病態は、炎症、がん、悪化、成長障害、遺伝疾患、裂傷、感染症、または負傷である、請求項１３６または１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
前記病態は、軟骨形成異常である、請求項１３６または１３７に記載の方法。
【請求項１４０】
前記病態は、外傷性断裂または剥離である、請求項１３６または１３７に記載の方法。
【請求項１４１】
前記病態は、肋軟骨炎である、請求項１３６または１３７に記載の方法。
【請求項１４２】
前記病態は、ヘルニアである、請求項１３６または１３７に記載の方法。
【請求項１４３】
前記病態は、多発性軟骨炎である、請求項１３６または１３７に記載の方法。
【請求項１４４】
前記病態は、脊索腫である、請求項１３６または１３７に記載の方法。
【請求項１４５】
前記病態は、関節炎の一種である、請求項１３６または１３７に記載の方法。
【請求項１４６】
前記関節炎の一種は、関節リウマチである、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
前記関節炎の一種は、変形性関節症である、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４８】
前記関節炎の一種は、強直性脊椎炎である、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４９】
前記関節炎の一種は、乾癬性関節炎である、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１５０】
前記関節炎の一種は、痛風である、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１５１】
前記病態は、軟骨形成不全である、請求項１３６または１３７に記載の方法。
【請求項１５２】
前記病態は、良性軟骨腫または悪性軟骨肉腫である、請求項１３６または１３７に記載の方法。
【請求項１５３】
前記病態は、ループス腎炎、ループス関節炎、または全身性エリテマトーデスである、請求項１３６または１３７に記載の方法。
【請求項１５４】
前記病態は、滑液包炎、腱炎、痛風、偽痛風、関節症、または感染症である、請求項１３６または１３７に記載の方法。
【請求項１５５】
前記病態は、負傷、負傷に由来する損傷した組織、または負傷によって引き起こされる疼痛である、請求項１３６または１３７に記載の方法。
【請求項１５６】
前記病態は、裂傷または裂傷に由来する損傷した組織である、請求項１３６または１３７に記載の方法。
【請求項１５７】
前記投与は、１年に１、２、３、または４回行われる、請求項１１１〜１５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５８】
前記投与は、１日に１、２、３、４、５、６、７、または８回行われる、請求項１１１〜１５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５９】
前記投与は、１週間に１、２、３、４、５、６、または７回行われる、請求項１１１〜１５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６０】
前記投与は、１ヶ月に１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回行われる、請求項１１１〜１５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６１】
前記複合体は、前記対象の体重当たり０．２〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．２ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．００１ｍｇ／ｋｇ、または０．００１〜０．０１ｍｇ／ｋｇで投与される、請求項１１１〜１５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６２】
前記対象は、ヒトである、請求項１１１〜１６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６３】
請求項１〜１０３のいずれか１項に記載の複合体を作製する方法であって、前記方法は、
ａ）前記リンカー及び前記抗関節炎剤を混合してエステル結合、カルバメート結合、またはアミド結合を形成することと、
ｂ）前記シスチン高密度ペプチドを添加して前記リンカーとエステル結合、カルバメート結合、またはアミド結合を形成することと、を含む、前記方法。
【請求項１６４】
工程ａ）の前に前記抗関節炎剤の複合体化部位を活性化することをさらに含む、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
工程ｂ）の前に前記リンカーの官能基を活性化することをさらに含む、請求項１６３または１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
抗関節炎剤での治療を受けている患者における副作用を低減する方法であって、請求項１〜１０３のいずれか１項に記載の複合体または請求項１０４〜１０９のいずれか１項に記載の薬学的組成物を前記患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項１６７】
前記副作用は、体重減少、免疫抑制、皮膚菲薄化、紫斑病、クッシング外観、眼の白内障もしくは緑内障、骨粗鬆症もしくは骨折、視床下部−下垂体−副腎系（ＨＰＡ）軸の抑制、高血糖症及び糖尿病、重篤な心血管事象の発生率の増加、脂質異常症、ミオパシー、胃炎、胃腸潰瘍及び出血、精神障害、血糖値の上昇、血清コルチゾールもしくはコルチコステロンの減少、副腎、胸腺、もしくは脾臓の萎縮、循環リンパ球の減少、骨髄の細胞性の低下、筋萎縮、筋機能の低下、疼痛、筋肉痛、関節炎痛、関節痛、関節変形、可動性の低下、関節における動作範囲の減少、柔軟性の低下、強度の低下、バランスの低下、耐糖能の低下、食欲喪失、骨代謝の低下、免疫の障害、ネフローゼ症候群、疲労感、真菌感染症、ウイルス感染症、細菌感染症、ＧＩ穿孔、行動及び気分の乱れ、二次性副腎皮質機能不全、水分保持、白内障、緑内障、血圧上昇、骨粗鬆症、小児の成長の抑制、インスリン要求量の増加、体重増加、吐き気、クッシング症候群、筋骨格系、消化器系、皮膚系、神経系、内分泌系、眼科系、代謝系、もしくは心血管系の機能不全、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１６６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１８年４月２３日に出願された米国仮出願第６２／６６１，５７７号の利益を主張し、この出願はすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含有し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１９年４月１９日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、４４１８９−７２２＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズは２８５，５５１バイトである。
【背景技術】
【０００３】
軟骨は、細胞外マトリックス、主にコラーゲン、プロテオグリカン（例えば、アグリカン）、及び弾性線維の成分を生成する特化した細胞型である軟骨細胞を含む。細胞外マトリックスタンパク質は、関節、耳、鼻及び気管などの身体の軟骨に富む部分に支持性、クッション、及び耐久性を提供する。軟骨は、血管を含有しない体内の数少ない組織の１つであり、無血管組織と考えられている。血流及び拡散の組み合わせに依存する体内の多くの細胞とは異なり、軟骨細胞は拡散に依存する。それは、他の結合組織と比較して、直接的な血液供給を有さないので、軟骨は、はるかに遅く成長及び修復する。結果として、軟骨障害は、治療が特に困難である。
【発明の概要】
【０００４】
様々な態様では、本開示は、複合体であって、その複合体は、抗関節炎剤と、シスチン高密度ペプチドであって、対象へ投与するとシスチン高密度ペプチドは、対象の軟骨にホーミングし、それを標的とし、それに移動し、それに蓄積し、それに結合し、それによって保持され、またはそれに誘導される、シスチン高密度ペプチドと、リンカーであって、そのリンカーは、環状カルボン酸、環状ジカルボン酸、芳香族ジカルボン酸、またはアミノ酸を含み、そのリンカーは、エステル結合、カルバメート結合、カルボネート結合、またはアミド結合を介して抗関節炎剤及びシスチン高密度ペプチドを複合体化する、リンカーと、を含む、複合体を提供する。いくつかの態様では、抗関節炎剤は、抗炎症剤である。いくつかの態様では、抗炎症剤は、グルココルチコイドまたはＮＳＡＩＤである。いくつかの態様では、抗炎症剤は、デキサメタゾン、ブデソニド、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブチキシコート、コルチゾール（ヒドロコルチゾン）、クロベタゾール、エストリオール、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、デス−シクレソニド、デスイソブチリル−シクレソニド、ヒドロコルチン、コルチゾン、デオキシコルチコステロン、フルチカゾン、フルチカゾンフロエート、フルチカゾンプロピオネート、フルオシノニド、フルドロコルチゾン、フルニソリド、フルオロメトロン、ヘキセストロール、メチマゾール、メチルプレドニゾロン、モメタゾン、モメタゾンフロエート、１７−モノプロピオネート、パラメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、またはそれらの薬学的に許容可能な塩であるグルココルチコイドである。いくつかの態様では、グルココルチコイドは、デキサメタゾンである。いくつかの態様では、グルココルチコイドは、デス−シクレソニドである。いくつかの態様では、グルココルチコイドは、ブデソニドである。いくつかの態様では、グルココルチコイドは、トリアムシノロンアセトニドである。いくつかの態様では、環状カルボン酸、環状ジカルボン酸、または芳香族ジカルボン酸は、単環式、二環式、三環式、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様では、環状カルボン酸、環状ジカルボン酸、または芳香族ジカルボン酸は、４、５、６、７、もしくは８員環、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、リンカーは、環状カルボン酸を含む。いくつかの態様では、環状カルボン酸は、
【化１】
2021522172.tif 000002
またはその置換アナログもしくは立体異性体を含む。いくつかの態様では、環状カルボン酸は、
【化２】
2021522172.tif 000003
またはその置換アナログもしくは立体異性体を含む。いくつかの態様では、リンカーは、環状ジカルボン酸を含む。いくつかの態様では、環状ジカルボン酸は、以下の群：
【化３】
2021522172.tif 000004
のうちの１つまたはその置換アナログもしくは立体異性体を含む。いくつかの態様では、環状ジカルボン酸は、以下の群：
【化４】
2021522172.tif 000005
のうちの１つを含む。いくつかの態様では、環状ジカルボン酸は、
【化５】
2021522172.tif 000006
またはその置換アナログもしくは立体異性体を含む。いくつかの態様では、リンカーは、芳香族ジカルボン酸を含む。いくつかの態様では、芳香族ジカルボン酸は、
【化６】
2021522172.tif 000007
またはその置換アナログを含む。いくつかの態様では、リンカーは、アミノ酸を含む。いくつかの態様では、アミノ酸は、
【化７】
2021522172.tif 000008
またはその置換アナログもしくは立体異性体を含む。いくつかの態様では、リンカーは、表２に列挙された化合物２〜１７のうちの少なくとも１つを含む。
【０００５】
様々な態様では、本開示は、複合体であって、その複合体は、グルココルチコイドであって、そのグルココルチコイドは、ブデソニドでもデキサメタゾンでもない、グルココルチコイドと、シスチン高密度ペプチドであって、対象へ投与するとシスチン高密度ペプチドは、対象の軟骨にホーミングし、それを標的とし、それに移動し、それに蓄積し、それに結合し、それによって保持され、またはそれに誘導される、シスチン高密度ペプチドと、リンカーであって、そのリンカーは、線状ジカルボン酸を含み、そのリンカーは、エステル結合、カルバメート結合、またはアミド結合を介してグルココルチコイド及びシスチン高密度ペプチドを複合体化する、リンカーと、を含む、複合体を提供する。いくつかの態様では、グルココルチコイドは、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブチキシコート、コルチゾール（ヒドロコルチゾン）、クロベタゾール、エストリオール、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、デス−シクレソニド、デスイソブチリル−シクレソニド、ヒドロコルチン、コルチゾン、デオキシコルチコステロン、フルチカゾン、フルチカゾンフロエート、フルチカゾンプロピオネート、フルオシノニド、フルドロコルチゾン、フルニソリド、フルオロメトロン、ヘキセストロール、メチマゾール、メチルプレドニゾロン、モメタゾン、モメタゾンフロエート、１７−モノプロピオネート、パラメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、またはそれらの薬学的に許容可能な塩である。
【０００６】
様々な態様では、本開示は、複合体であって、その複合体は、グルココルチコイドであって、そのグルココルチコイドは、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、ブチキシコート、コルチゾール（ヒドロコルチゾン）、クロベタゾール、エストリオール、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、デス−シクレソニド、デスイソブチリル−シクレソニド、ヒドロコルチン、コルチゾン、デオキシコルチコステロン、フルチカゾン、フルチカゾンフロエート、フルチカゾンプロピオネート、フルオシノニド、フルドロコルチゾン、フルニソリド、フルオロメトロン、ヘキセストロール、メチマゾール、メチルプレドニゾロン、モメタゾン、モメタゾンフロエート、１７−モノプロピオネート、パラメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、またはそれらの薬学的に許容可能な塩である、グルココルチコイドと、シスチン高密度プチドであって、対象へ投与するとシスチン高密度ペプチドは、対象の軟骨にホーミングし、それを標的とし、それに移動し、それに蓄積し、それに結合し、それによって保持され、またはそれに誘導される、シスチン高密度ペプチドと、リンカーであって、そのリンカーは、線状ジカルボン酸を含み、そのリンカーは、エステル結合、カルバメート結合、カルボネート結合、またはアミド結合を介してグルココルチコイド及びシスチン高密度ペプチドを複合体化する、リンカーと、を含む、複合体を提供する。いくつかの態様では、グルココルチコイドは、トリアムシノロンアセトニドである。いくつかの態様では、線状ジカルボン酸は、以下の群：
【化８】
2021522172.tif 000009
のうちの１つまたはその置換アナログもしくは立体異性体
（式中、各ｎ１、ｎ２、及びｍは、独立して、１〜１０の値であり、ｍは、０〜１０の値である）を含む。いくつかの態様では、線状ジカルボン酸は、以下の群：
【化９】
2021522172.tif 000010
のうちの１つまたはその置換アナログもしくは立体異性体（式中、各ｎ１及びｎ２は、独立して、１〜１０の値である）を含む。いくつかの態様では、線状ジカルボン酸は、線状ジカルボン酸の多重結合を使用して官能化されている。いくつかの態様では、官能化は、少なくとも１つの分子を線状ジカルボン酸に結合させることを含む。いくつかの態様では、線状ジカルボン酸の多重結合を介した官能化は、付加反応、置換反応、環化付加、またはそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を含む。いくつかの態様では、付加反応は、求核または求電子付加反応である。いくつかの態様では、付加反応は、臭化水素の使用を含む。いくつかの態様では、官能化は、求核置換反応をさらに含む。いくつかの態様では、求核置換反応は、付加反応後に生じる。いくつかの態様では、環化付加は、１，３−双極性環化付加である。いくつかの態様では、少なくとも１つの分子は、活性剤または検出可能剤である。いくつかの態様では、少なくとも１つの分子は、（ｉ）軟骨における複合体の取り込み、（ｉｉ）軟骨における複合体の保持、（ｉｉｉ）複合体の加水分解速度、またはそれらの任意の組み合わせを変化させる。いくつかの態様では、線状ジカルボン酸は、以下の群：
【化１０】
2021522172.tif 000011
のうちの１つまたはその置換アナログもしくは立体異性体である。いくつかの態様では、リンカーは、表２に列挙された化合物１８〜２２のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの態様では、リンカーは、安定である。いくつかの態様では、リンカーは、切断可能である。いくつかの態様では、リンカーは、加水分解、酵素、ｐＨ変化、還元、自己犠牲、放射線、または化学反応によって切断可能である。いくつかの態様では、複合体の５０％未満は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、リン酸緩衝生理食塩水、ヒト血漿、またはラット血漿中で２０℃から３７℃までまたは４０℃までで、２４時間、３２時間、５６時間、または１００時間以内に切断される。いくつかの態様では、複合体の５０％未満は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、ヒト血漿またはラット血漿中で２０℃から３７℃までまたは４０℃までで、１０時間、３０時間、または６０時間以内に切断される。いくつかの態様では、複合体のリンカーは、カルバメート結合を含む。いくつかの態様では、複合体の５０％未満は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、リン酸緩衝生理食塩水、ヒト血漿、またはラット血漿中で２０℃から４０℃までで３２時間後に切断される。いくつかの態様では、複合体の５０％未満は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、ヒト血漿中で２０℃から４０℃までで３２時間後に切断される。いくつかの態様では、複合体の５０％未満は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、ラット血漿中で２０℃から４０℃までで３２時間後に切断される。いくつかの態様では、リンカーは、以下の群：
【化１１】
2021522172.tif 000012
のうちの１つまたはその置換アナログもしくは立体異性体を含む。いくつかの態様では、リンカーは、以下の群：
【化１２】
2021522172.tif 000013
のうちの１つまたはその置換アナログもしくは立体異性体を含む。いくつかの態様では、リンカーは、
【化１３】
2021522172.tif 000014
またはその置換アナログもしくは立体異性体を含む。いくつかの態様では、リンカーは、以下の群：
【化１４】
2021522172.tif 000015
のうちの１つまたはその置換アナログもしくは立体異性体（式中、ｎ１及びｎ２は、それぞれ独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）を含む。いくつかの態様では、複合体の５０％〜１００％は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、ヒト血漿中で２０℃から３７℃までまたは４０℃までで、１０〜３０時間または１０〜４０時間以内に切断される。いくつかの態様では、複合体の少なくとも５０％は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、リン酸緩衝生理食塩水、ヒト血漿、またはラット血漿中で２０℃から３７℃までまたは４０℃までで、０．５〜１００時間、１〜５０時間、１〜２０時間、または２〜１０時間以内に切断される。いくつかの態様では、リンカーは、
【化１５】
2021522172.tif 000016
またはその置換アナログを含み、
複合体の５０％〜１００％は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、ヒト血漿またはラット血漿中で３７℃で１〜８時間以内に切断される。いくつかの態様では、リンカーは、
【化１６】
2021522172.tif 000017
またはその置換アナログを含み、
複合体の５０％〜１００％は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、リン酸緩衝生理食塩水中で３７℃で１〜８時間以内に切断される。いくつかの態様では、リンカーは、
【化１７】
2021522172.tif 000018
、
またはその置換アナログもしくは立体異性体を含み、複合体の５０％〜１００％は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、ラット血漿中で３７℃で１〜８時間以内に切断される。いくつかの態様では、リンカーは、
【化１８】
2021522172.tif 000019
またはその置換アナログもしくは立体異性体を含み、
複合体の２５％〜５０％は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、ヒト血漿中で３７℃で１〜８時間以内に切断される。いくつかの態様では、リンカーは、
【化１９】
2021522172.tif 000020
またはその置換アナログもしくは立体異性体を含み、
複合体の５０％〜１００％は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、ヒト血漿中で３７℃で１０〜３０時間以内に切断される。いくつかの態様では、リンカーは、
【化２０】
2021522172.tif 000021
またはその置換アナログもしくは立体異性体を含み、
複合体の５％〜５０％は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、ラット血漿中で３７℃で１〜８時間以内に切断される。いくつかの態様では、リンカーは、
【化２１】
2021522172.tif 000022
またはその置換アナログもしくは立体異性体を含み、
複合体の２％〜２５％は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、ヒト血漿中で３７℃で１〜８時間以内に切断される。いくつかの態様では、リンカーは、
【化２２】
2021522172.tif 000023
またはその置換アナログもしくは立体異性体を含み、
複合体の５０％〜１００％は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、ヒト血漿中で３７℃で１０〜４０時間以内に切断される。いくつかの態様では、リンカーは、
【化２３】
2021522172.tif 000024
またはその置換アナログを含み、
複合体の７５％〜１００％は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、ラット血漿中で３７℃で１〜８時間以内に切断される。いくつかの態様では、リンカーは、
【化２４】
2021522172.tif 000025
またはその置換アナログを含み、
複合体の５０％超は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、ラット血漿またはヒト血漿中で２０℃〜３７℃で１０、３０、または６０時間によって切断される。いくつかの態様では、リンカーは、
【化２５】
2021522172.tif 000026
またはその置換アナログもしくは立体異性体を含み、
複合体の５０％未満は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、リン酸緩衝生理食塩水、ヒト血漿、またはラット血漿中で３７℃で１〜８時間以内に切断される。いくつかの態様では、リンカーは、
【化２６】
2021522172.tif 000027
またはその置換アナログもしくは立体異性体を含み、
複合体の５０％未満は、ＬＣ／ＭＳによって測定して、リン酸緩衝生理食塩水、ヒト血漿、またはラット血漿中で３７℃で８〜３２時間以内に切断される。いくつかの態様では、複合体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで切断される。いくつかの態様では、複合体は、動物に投与した場合に切断される。いくつかの態様では、複合体は、ヒトに投与した場合に切断される。いくつかの態様では、複合体は、加水分解によって切断される。いくつかの態様では、複合体は、ｐＨ変化、還元、自己犠牲、放射線または化学反応によって切断される。いくつかの態様では、複合体は、酵素的プロテイナーゼ活性によって切断可能なアミノ酸配列をさらに含む。いくつかの態様では、複合体は、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）のための切断部位を含む。いくつかの態様では、ＭＭＰは、ＭＭＰ１３である。いくつかの態様では、複合体は、カテプシンのための切断部位を含む。いくつかの態様では、複合体は、カテプシンで切断可能なリンカーを含む。いくつかの態様では、カテプシンで切断可能なリンカーは、バリン−シトルリンリンカーである。いくつかの態様では、カテプシンは、カテプシンＫである。いくつかの態様では、複合体は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子のための切断部位を含む。いくつかの態様では、複合体は、トロンビンのための切断部位を含む。いくつかの態様では、シスチン高密度ペプチドは、ジスルフィドノット（ｋｎｏｔ）を介してジスルフィドを含む。いくつかの態様では、シスチン高密度ペプチドは、システイン残基間に形成された複数のジスルフィド架橋を含む。いくつかの態様では、シスチン高密度ペプチドは、システイン残基間に形成された３つ以上のジスルフィド架橋を含み、ジスルフィド架橋の１つは、２つの他のジスルフィド橋によって形成されたループを通過する。いくつかの態様では、シスチン高密度ペプチドは、４つ以上のシステイン残基を含む。いくつかの態様では、シスチン高密度ペプチドは、６つ以上の塩基性残基及び２つ以下の酸性残基を含む。いくつかの態様では、シスチン高密度ペプチドは、少なくとも２つのシステイン残基、及び少なくとも２つの正に荷電したアミノ酸残基を含有する４〜１９アミノ酸残基フラグメントを含む。いくつかの態様では、シスチン高密度ペプチドは、少なくとも２つのシステイン残基、２つ以下の塩基性残基及び少なくとも２つの正に荷電したアミノ酸残基を含有する２０〜７０アミノ酸残基フラグメントを含む。いくつかの態様では、シスチン高密度ペプチドは、少なくとも３つの正に荷電したアミノ酸残基を含む。いくつかの態様では、正に荷電したアミノ酸残基は、Ｋ、Ｒ、またはそれらの組み合わせから選択される。いくつかの態様では、シスチン高密度ペプチドは、配列番号２１〜配列番号２４７もしくは配列番号２８２〜配列番号５１０、またはそのフラグメントのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、シスチン高密度ペプチドは、配列番号１〜配列番号２０、配列番号２４８〜配列番���２６７、またはそのフラグメントのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、シスチン高密度ペプチドは、配列番号１０３に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、シスチン高密度ペプチドは、配列番号１８４に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、シスチン高密度ペプチドは、配列番号１０５に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、複合体は、化合物２３、２６〜３１、３４、３６、３８、４０  ４３、４５〜４６、または４９〜５６のいずれか１つを含む。いくつかの態様では、複合体は、化合物２３、２６〜２８、または４０〜４６のいずれか１つを含む。いくつかの態様では、複合体は、化合物４５〜４６、または４９〜５６のいずれか１つを含む。いくつかの態様では、複合体は、化合物２９〜３１、３４、または３６のいずれか１つを含む。いくつかの態様では、複合体は、化合物４４または４９〜５６のいずれか１つを含む。いくつかの態様では、複合体は、化合物３２、３３、３５、４６、または４９〜５６のいずれか１つを含む。いくつかの態様では、シスチン高密度ペプチドは、配列番号１０３、配列番号１０５、または配列番号１８４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、複合体は、化合物４６、または４９〜５６のいずれか１つを含む。
【０００７】
様々な態様では、本開示は、本明細書に記載される複合体またはその薬学的に許容可能な塩、及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの態様では、薬学的組成物は、吸入、鼻腔内投与、経口投与、局所投与、静脈内投与、皮下投与、関節内（ｉｎｔｒａ−ａｒｔｉｃｕｌａｒ）投与、筋肉内投与、腹膜内投与、関節内（ｉｎｔｒａ−ｊｏｉｎｔ）投与、またはそれらの任意の組み合わせのために製剤化される。いくつかの態様では、薬学的組成物は、単回単位用量のものである。いくつかの態様では、薬学的組成物は、液体である。いくつかの態様では、薬学的組成物は、固体投薬形態である。いくつかの態様では、薬学的組成物は、凍結乾燥される。様々な態様では、本開示は、容器内の本開示の複合体または本明細書に記載される薬学的組成物及びそれを使用するための指示書を含むキットを提供する。
【０００８】
様々な態様では、本開示は、本開示の複合体または本開示の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの態様では、方法は、抗関節炎剤単独の対応する投与によって提供されるものと比較して、抗関節炎剤に関連する有害作用の減少または予防を対象に提供する。いくつかの態様では、方法は、抗関節炎剤単独の投与と比較して、対象における有害作用の発生を減少させる。いくつかの態様では、方法は、抗関節炎剤単独の投与と比較して、対象における有害作用の強度を減少させる。いくつかの態様では、方法は、有害作用の発生または強度を少なくとも１０％〜２０％減少させる。いくつかの態様では、その方法は、有害作用の発生もしくは強度またはその両方を少なくとも１０％〜５０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％減少させる。いくつかの態様では、その減少は、投与の１、２、３、６、９、１２、１８、または２４ヶ月後に測定される。いくつかの態様では、その減少は、投与の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５日後に測定される。いくつかの態様では、その減少は、投与の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０週間後に測定される。いくつかの態様では、その減少は、投与の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヶ月後に測定される。いくつかの態様では、有害作用は、体重減少、免疫抑制、皮膚菲薄化、紫斑病、クッシング外観、眼の白内障もしくは緑内障、骨粗鬆症もしくは骨折、視床下部−下垂体−副腎系（ＨＰＡ）軸の抑制、高血糖症及び糖尿病、重篤な心血管事象の発生率の増加、脂質異常症、ミオパシー、胃炎、胃腸潰瘍及び出血、精神障害、血糖値の上昇、血清コルチゾールもしくはコルチコステロンの減少、副腎、胸腺、もしくは脾臓の萎縮、循環リンパ球の減少、骨髄の細胞性の低下、筋萎縮、筋機能の低下、疼痛、筋肉痛、関節炎痛、関節痛、関節変形、可動性の低下、関節における動作範囲の減少、柔軟性の低下、強度の低下、バランスの低下、耐糖能の低下、食欲喪失、骨代謝の低下、免疫の障害、ネフローゼ症候群、疲労感、真菌感染症、ウイルス感染症、細菌感染症、ＧＩ穿孔、行動及び気分の乱れ、二次性副腎皮質機能不全、水分保持、白内障、緑内障、血圧上昇、骨粗鬆症、小児の成長の抑制、インスリン要求量の増加、体重増加、吐き気、クッシング症候群、筋骨格系、消化器系、皮膚系、神経系、内分泌系、眼科系、代謝系、もしくは心血管系の機能不全、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、有害作用は、体重減少である。いくつかの態様では、方法は、抗関節炎剤単独の投与と比較して、投与後１２日間にわたって対象の総体重の５％未満の減少をもたらす。いくつかの態様では、複合体の投与は、抗関節炎剤単独の投与と比較して、投与後１３日間にわたって対象の総体重の１０％未満の減少をもたらす。いくつかの態様では、有害作用は、好中球、リンパ球、単球、マクロファージ、またはそれらの任意の組み合わせの機能または数の減少を特徴とする免疫抑制を含む。いくつかの態様では、有害作用は、Ｔ細胞欠損症、体液性免疫欠損症、好中球減少症、またはそれらの任意の組み合わせを特徴とする免疫抑制を含む。いくつかの態様では、方法は、抗関節炎剤単独の対応する投与と比較して、対象に対してより低い毒性をもたらす。いくつかの態様では、複合体は、抗関節炎剤単独と比較して、より少ない投薬量で治療的に有効である。いくつかの態様では、複合体は、抗関節炎剤単独と比較して、より少ない投薬頻度で治療的に有効である。いくつかの態様では、複合体は、投与後１５〜６０分以内に放出される。いくつかの態様では、複合体は、投与後１５〜３０分以内に放出される。いくつかの態様では、複合体は、１、３、６、１２、２４、または３２時間よりも長い半減期を有する。いくつかの態様では、複合体は、１〜３時間以内に標的軟骨または関節に蓄積する。いくつかの態様では、複合体は、投与後に標的軟骨または関節で切断される。いくつかの態様では、投与は、吸入、鼻腔内、経口、局所、静脈内、皮下、関節内、筋肉内投与、腹腔内、またはそれらの組み合わせによる。いくつかの態様では、方法は、対象における軟骨の機能に関連する病態を治療または予防する。いくつかの態様では、方法は、抗関節炎剤単独の対応する投与によって提供されるものと比較して、軟骨の機能に関連する病態の改善の増大を対象に提供する。いくつかの態様では、病態は、炎症、がん、悪化、成長障害、遺伝疾患、裂傷、感染症、または負傷である。いくつかの態様では、病態は、軟骨形成異常である。いくつかの態様では、病態は、外傷性断裂または剥離である。いくつかの態様では、病態は、肋軟骨炎である。いくつかの態様では、病態は、ヘルニアである。いくつかの態様では、病態は、多発性軟骨炎である。いくつかの態様では、病態は、脊索腫である。いくつかの態様では、病態は、関節炎の一種である。いくつかの態様では、関節炎の一種は、関節リウマチである。いくつかの態様では、関節炎の一種は、変形性関節症である。いくつかの態様では、関節炎の一種は、強直性脊椎炎である。いくつかの態様では、関節炎の一種は、乾癬性関節炎である。いくつかの態様では、関節炎の一種は、痛風である。いくつかの態様では、病態は、軟骨形成不全である。いくつかの態様では、病態は、良性軟骨腫または悪性軟骨肉腫である。いくつかの態様では、病態は、ループス腎炎、ループス関節炎、または全身性エリテマトーデスである。いくつかの態様では、病態は、滑液包炎、腱炎、痛風、偽痛風、関節症、または感染症である。いくつかの態様では、病態は、負傷、負傷に由来する損傷した組織、または負傷によって引き起こされる疼痛である。いくつかの態様では、病態は、裂傷または裂傷に由来する損傷した組織である。いくつかの態様では、投与は、１年に１、２、３、または４回行われる。いくつかの態様では、投与は、１日に１、２、３、４、５、６、７、または８回行われる。いくつかの態様では、投与は、１週間に１、２、３、４、５、６、または７回行われる。いくつかの態様では、投与は、１ヶ月に１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回行われる。いくつかの態様では、複合体は、対象の体重当たり０．２〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．２ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．００１ｍｇ／ｋｇ、または０．００１〜０．０１ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの態様では、
対象は、ヒトである。
【０００９】
様々な態様では、本開示は、本明細書に記載されるような複合体を作製する方法であって、その方法は、リンカー及び抗関節炎剤を混合して、エステル結合、カルバメート結合、またはアミド結合を形成することと、シスチン高密度ペプチドを添加して、リンカーとエステル結合、カルバメート結合、またはアミド結合を形成することとを含む、方法を提供する。いくつかの態様では、その方法は、工程ａ）の前に抗関節炎剤の複合体化部位を活性化することをさらに含む。いくつかの態様では、その方法は、工程ｂ）の前にリンカーの官能基を活性化することをさらに含む。
【００１０】
様々な態様では、本開示は、抗関節炎剤での治療を受けている患者における副作用を減少させる方法であって、本明細書に記載されるような複合体または本明細書に記載されるような薬学的組成物を患者に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの態様では、副作用は、体重減少、免疫抑制、皮膚菲薄化、紫斑病、クッシング外観、眼の白内障もしくは緑内障、骨粗鬆症もしくは骨折、視床下部−下垂体−副腎系（ＨＰＡ）軸の抑制、高血糖症及び糖尿病、重篤な心血管事象の発生率の増加、脂質異常症、ミオパシー、胃炎、胃腸潰瘍及び出血、精神障害、血糖値の上昇、血清コルチゾールもしくはコルチコステロンの減少、副腎、胸腺、もしくは脾臓の萎縮、循環リンパ球の減少、骨髄の細胞性の低下、筋萎縮、筋機能の低下、疼痛、筋肉痛、関節炎痛、関節痛、関節変形、可動性の低下、関節における動作範囲の減少、柔軟性の低下、強度の低下、バランスの低下、耐糖能の低下、食欲喪失、骨代謝の低下、免疫の障害、ネフローゼ症候群、疲労感、真菌感染症、ウイルス感染症、細菌感染症、ＧＩ穿孔、行動及び気分の乱れ、二次性副腎皮質機能不全、水分保持、白内障、緑内障、血圧上昇、骨粗鬆症、小児の成長の抑制、インスリン要求量の増加、体重増加、吐き気、クッシング症候群、筋骨格系、消化器系、皮膚系、神経系、内分泌系、眼科系、代謝系、もしくは心血管系の機能不全、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００１１】
参照による組み込み
本明細書で言及、開示または参照されるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、各々の個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度にかつそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００１２】
本発明の新規な特徴は、特に添付の特許請求の範囲に示されている。本開示の特徴及び利点のより良好な理解は、本開示の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、及び添付の図面を参照することによって得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本開示のペプチド−薬物複合体のペプチド成分を製造する方法を示している。
【図２Ａ】ＰＢＳ、ラット血漿、及びヒト血漿中のペプチド−デキサメタゾン複合体の加水分解速度を示している。グラフは、配列番号１０５に示されるアミノ酸配列を有するペプチドに複合体化した異なるリンカー（記述されている）を有する５つの異なるペプチド−薬物複合体からの薬物デキサメタゾン（「Ｄｅｘ」）の放出のための加水分解アッセイの測定結果を示している。加水分解率は、最大薬物放出の値としての最終時点でのデキサメタゾンについての曲線下平均面積（ＡＵＣ）を使用して計算した。ＰＢＳ、ラット血漿、及びヒト血漿中でインキュベートしたペプチドの加水分解半減期を決定した。ペプチドを、ＰＢＳ、ラット血漿、またはヒト血漿中で３７℃でインキュベートした。サンプルを一定間隔で除去し、溶媒抽出によって処理し、ＬＣ／ＭＳによって分析して遊離デキサメタゾン（すなわち、Ｄｅｘ）の放出を定量化した。各アッセイは、少なくとも９つの時点（２分から３２時間までの範囲）を含み、１つの時点当たり３連のサンプルを用いた。ペプチド−薬物複合体（ペプチド（配列番号１０５）−ジメチルアジピン酸−Ｄｅｘ（ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ）と省略される）をヒト血漿中で最大５６時間モニターした。ヒト血漿、ラット血漿、及びＰＢＳそれぞれにおけるペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−グルタル酸−Ｄｅｘの加水分解速度を示している。
【図２Ｂ】ＰＢＳ、ラット血漿、及びヒト血漿中のペプチド−デキサメタゾン複合体の加水分解速度を示している。グラフは、配列番号１０５に示されるアミノ酸配列を有するペプチドに複合体化した異なるリンカー（記述されている）を有する５つの異なるペプチド−薬物複合体からの薬物デキサメタゾン（「Ｄｅｘ」）の放出のための加水分解アッセイの測定結果を示している。加水分解率は、最大薬物放出の値としての最終時点でのデキサメタゾンについての曲線下平均面積（ＡＵＣ）を使用して計算した。ＰＢＳ、ラット血漿、及びヒト血漿中でインキュベートしたペプチドの加水分解半減期を決定した。ペプチドを、ＰＢＳ、ラット血漿、またはヒト血漿中で３７℃でインキュベートした。サンプルを一定間隔で除去し、溶媒抽出によって処理し、ＬＣ／ＭＳによって分析して遊離デキサメタゾン（すなわち、Ｄｅｘ）の放出を定量化した。各アッセイは、少なくとも９つの時点（２分から３２時間までの範囲）を含み、１つの時点当たり３連のサンプルを用いた。ペプチド−薬物複合体（ペプチド（配列番号１０５）−ジメチルアジピン酸−Ｄｅｘ（ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ）と省略される）をヒト血漿中で最大５６時間モニターした。ヒト血漿、ラット血漿、及びＰＢＳそれぞれにおけるペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−トランス−１，４−シクロヘキシル−Ｄｅｘの加水分解速度を示している。
【図２Ｃ】ＰＢＳ、ラット血漿、及びヒト血漿中のペプチド−デキサメタゾン複合体の加水分解速度を示している。グラフは、配列番号１０５に示されるアミノ酸配列を有するペプチドに複合体化した異なるリンカー（記述されている）を有する５つの異なるペプチド−薬物複合体からの薬物デキサメタゾン（「Ｄｅｘ」）の放出のための加水分解アッセイの測定結果を示している。加水分解率は、最大薬物放出の値としての最終時点でのデキサメタゾンについての曲線下平均面積（ＡＵＣ）を使用して計算した。ＰＢＳ、ラット血漿、及びヒト血漿中でインキュベートしたペプチドの加水分解半減期を決定した。ペプチドを、ＰＢＳ、ラット血漿、またはヒト血漿中で３７℃でインキュベートした。サンプルを一定間隔で除去し、溶媒抽出によって処理し、ＬＣ／ＭＳによって分析して遊離デキサメタゾン（すなわち、Ｄｅｘ）の放出を定量化した。各アッセイは、少なくとも９つの時点（２分から３２時間までの範囲）を含み、１つの時点当たり３連のサンプルを用いた。ペプチド−薬物複合体（ペプチド（配列番号１０５）−ジメチルアジピン酸−Ｄｅｘ（ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ）と省略される）をヒト血漿中で最大５６時間モニターした。ヒト血漿、ラット血漿、及びＰＢＳそれぞれにおけるペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘの加水分解速度を示している。
【図２Ｄ】ＰＢＳ、ラット血漿、及びヒト血漿中のペプチド−デキサメタゾン複合体の加水分解速度を示している。グラフは、配列番号１０５に示されるアミノ酸配列を有するペプチドに複合体化した異なるリンカー（記述されている）を有する５つの異なるペプチド−薬物複合体からの薬物デキサメタゾン（「Ｄｅｘ」）の放出のための加水分解アッセイの測定結果を示している。加水分解率は、最大薬物放出の値としての最終時点でのデキサメタゾンについての曲線下平均面積（ＡＵＣ）を使用して計算した。ＰＢＳ、ラット血漿、及びヒト血漿中でインキュベートしたペプチドの加水分解半減期を決定した。ペプチドを、ＰＢＳ、ラット血漿、またはヒト血漿中で３７℃でインキュベートした。サンプルを一定間隔で除去し、溶媒抽出によって処理し、ＬＣ／ＭＳによって分析して遊離デキサメタゾン（すなわち、Ｄｅｘ）の放出を定量化した。各アッセイは、少なくとも９つの時点（２分から３２時間までの範囲）を含み、１つの時点当たり３連のサンプルを用いた。ペプチド−薬物複合体（ペプチド（配列番号１０５）−ジメチルアジピン酸−Ｄｅｘ（ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ）と省略される）をヒト血漿中で最大５６時間モニターした。ヒト血漿、ラット血漿、及びＰＢＳそれぞれにおけるペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−［シクロヘキシル−（Ｎ−４−アミノメチル−トランス−１−カルバモイル）］−Ｄｅｘの加水分解速度を示している。
【図２Ｅ】ＰＢＳ、ラット血漿、及びヒト血漿中のペプチド−デキサメタゾン複合体の加水分解速度を示している。グラフは、配列番号１０５に示されるアミノ酸配列を有するペプチドに複合体化した異なるリンカー（記述されている）を有する５つの異なるペプチド−薬物複合体からの薬物デキサメタゾン（「Ｄｅｘ」）の放出のための加水分解アッセイの測定結果を示している。加水分解率は、最大薬物放出の値としての最終時点でのデキサメタゾンについての曲線下平均面積（ＡＵＣ）を使用して計算した。ＰＢＳ、ラット血漿、及びヒト血漿中でインキュベートしたペプチドの加水分解半減期を決定した。ペプチドを、ＰＢＳ、ラット血漿、またはヒト血漿中で３７℃でインキュベートした。サンプルを一定間隔で除去し、溶媒抽出によって処理し、ＬＣ／ＭＳによって分析して遊離デキサメタゾン（すなわち、Ｄｅｘ）の放出を定量化した。各アッセイは、少なくとも９つの時点（２分から３２時間までの範囲）を含み、１つの時点当たり３連のサンプルを用いた。ペプチド−薬物複合体（ペプチド（配列番号１０５）−ジメチルアジピン酸−Ｄｅｘ（ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ）と省略される）をヒト血漿中で最大５６時間モニターした。ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−アジピン酸−Ｄｅｘのラット血漿中のみの加水分解速度を示している。
【図３Ａ】放射性標識されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−トリアムシノロンアセトニド（ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ）（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）であって、ペプチド−薬物複合体内のペプチドが、アミノ酸配列配列番号１０５を含むもの、または放射性標識された薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−トリアムシノロンアセトニド（１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ）の投与から３時間後の代表的なオートラジオグラフ画像の群を示している。ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）のシグナルは、これらの切片において膝の軟骨（標識されている）、肋骨軟骨、椎間板（ＩＶＤ）、及び気管にホーミングし、それを標的とし、それに誘導され、それによって保持され、それに蓄積し、それに移動し、及び／またはそれに結合することが示されている。軟骨における１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ対照についての観察可能なシグナルは存在しない。１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡシグナルは、椎骨及び長骨の骨髄において明らかである。投与から３時間後の放射性標識されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の生体内分布及び軟骨取り込みを示している。
【図３Ｂ】放射性標識されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−トリアムシノロンアセトニド（ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ）（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）であって、ペプチド−薬物複合体内のペプチドが、アミノ酸配列配列番号１０５を含むもの、または放射性標識された薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−トリアムシノロンアセトニド（１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ）の投与から３時間後の代表的なオートラジオグラフ画像の群を示している。ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）のシグナルは、これらの切片において膝の軟骨（標識されている）、肋骨軟骨、椎間板（ＩＶＤ）、及び気管にホーミングし、それを標的とし、それに誘導され、それによって保持され、それに蓄積し、それに移動し、及び／またはそれに結合することが示されている。軟骨における１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ対照についての観察可能なシグナルは存在しない。１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡシグナルは、椎骨及び長骨の骨髄において明らかである。投与から３時間後の放射性標識されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の生体内分布及び軟骨取り込みを示している。
【図３Ｃ】放射性標識されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−トリアムシノロンアセトニド（ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ）（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）であって、ペプチド−薬物複合体内のペプチドが、アミノ酸配列配列番号１０５を含むもの、または放射性標識された薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−トリアムシノロンアセトニド（１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ）の投与から３時間後の代表的なオートラジオグラフ画像の群を示している。ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）のシグナルは、これらの切片において膝の軟骨（標識されている）、肋骨軟骨、椎間板（ＩＶＤ）、及び気管にホーミングし、それを標的とし、それに誘導され、それによって保持され、それに蓄積し、それに移動し、及び／またはそれに結合することが示されている。軟骨における１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ対照についての観察可能なシグナルは存在しない。１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡシグナルは、椎骨及び長骨の骨髄において明らかである。投与から３時間後の１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ対照（ペプチドを有さない）の生体内分布及び軟骨取り込みを示している。
【図３Ｄ】放射性標識されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−トリアムシノロンアセトニド（ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ）（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）であって、ペプチド−薬物複合体内のペプチドが、アミノ酸配列配列番号１０５を含むもの、または放射性標識された薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−トリアムシノロンアセトニド（１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ）の投与から３時間後の代表的なオートラジオグラフ画像の群を示している。ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）のシグナルは、これらの切片において膝の軟骨（標識されている）、肋骨軟骨、椎間板（ＩＶＤ）、及び気管にホーミングし、それを標的とし、それに誘導され、それによって保持され、それに蓄積し、それに移動し、及び／またはそれに結合することが示されている。軟骨における１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ対照についての観察可能なシグナルは存在しない。１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡシグナルは、椎骨及び長骨の骨髄において明らかである。投与から３時間後の１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ対照（ペプチドを有さない）の生体内分布及び軟骨取り込みを示している。
【図４Ａ】図３に記載された放射性標識された薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡまたは放射性標識されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の投与後３時間（ｎ＝６）及び２４時間（ｎ＝６）での膝及び椎間板（ＩＶＤ）（標識されている）におけるペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の蓄積の定量化を示している。（「＊＊＊」は、両側検定（ｐ＜０．０００１）に基づいて互いに有意に異なっていた処置群を表す）。ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）及び１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ対照の注射後３時間（ｎ＝６）での膝及びＩＶＤ（標識されている）における蓄積の定量化を示している。
【図４Ｂ】図３に記載された放射性標識された薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡまたは放射性標識されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の投与後３時間（ｎ＝６）及び２４時間（ｎ＝６）での膝及び椎間板（ＩＶＤ）（標識されている）におけるペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の蓄積の定量化を示している。（「＊＊＊」は、両側検定（ｐ＜０．０００１）に基づいて互いに有意に異なっていた処置群を表す）。ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）及び１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ対照の注射後２４時間（ｎ＝６）での膝及びＩＶＤ（標識されている）における蓄積の定量化を示している。
【図５】生体内分布試験におけるコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）ラットについての放射性標識されたペプチドのみの対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）、放射性標識されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、または放射性標識された薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘそれぞれの投与日と９日目（無症状）との間の足首直径（ｍｍ）の変化を示すグラフを示している。
【図６Ａ】図５に示されたＣＩＡモデルでの膝及び足首における蓄積を比較したオートラジオグラフ画像を示している。放射性標識されたペプチドのみの対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）または放射性標識されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）を摂取した動物の足首関節は、３時間で同様のパターンの軟骨のホーミング、標的化、保持、結合及び／または蓄積を実証する。膝または足首の軟骨には、放射線標識された薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘの観察可能な蓄積はない。「Ｄｅｘ」は、デキサメタゾンの略称である。足首関節は、同一切片で捉えた場合、膝と比較して同様の軟骨蓄積パターンを実証した。膝及び足首の軟骨における放射性標識されたペプチド対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）及びペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の両方の蓄積があるが、いずれの関節の軟骨においても薬物（１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）単独についての検出可能なシグナルはない。ペプチドのみの対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）の蓄積を示す膝のオートラジオグラフ画像を示している。
【図６Ｂ】図５に示されたＣＩＡモデルでの膝及び足首における蓄積を比較したオートラジオグラフ画像を示している。放射性標識されたペプチドのみの対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）または放射性標識されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）を摂取した動物の足首関節は、３時間で同様のパターンの軟骨のホーミング、標的化、保持、結合及び／または蓄積を実証する。膝または足首の軟骨には、放射線標識された薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘの観察可能な蓄積はない。「Ｄｅｘ」は、デキサメタゾンの略称である。足首関節は、同一切片で捉えた場合、膝と比較して同様の軟骨蓄積パターンを実証した。膝及び足首の軟骨における放射性標識されたペプチド対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）及びペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の両方の蓄積があるが、いずれの関節の軟骨においても薬物（１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）単独についての検出可能なシグナルはない。ペプチドのみの対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）の蓄積を示す足首のオートラジオグラフ画像を示している。
【図６Ｃ】図５に示されたＣＩＡモデルでの膝及び足首における蓄積を比較したオートラジオグラフ画像を示している。放射性標識されたペプチドのみの対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）または放射性標識されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）を摂取した動物の足首関節は、３時間で同様のパターンの軟骨のホーミング、標的化、保持、結合及び／または蓄積を実証する。膝または足首の軟骨には、放射線標識された薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘの観察可能な蓄積はない。「Ｄｅｘ」は、デキサメタゾンの略称である。足首関節は、同一切片で捉えた場合、膝と比較して同様の軟骨蓄積パターンを実証した。膝及び足首の軟骨における放射性標識されたペプチド対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）及びペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の両方の蓄積があるが、いずれの関節の軟骨においても薬物（１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）単独についての検出可能なシグナルはない。ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の蓄積を示す膝のオートラジオグラフ画像を示している。
【図６Ｄ】図５に示されたＣＩＡモデルでの膝及び足首における蓄積を比較したオートラジオグラフ画像を示している。放射性標識されたペプチドのみの対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）または放射性標識されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）を摂取した動物の足首関節は、３時間で同様のパターンの軟骨のホーミング、標的化、保持、結合及び／または蓄積を実証する。膝または足首の軟骨には、放射線標識された薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘの観察可能な蓄積はない。「Ｄｅｘ」は、デキサメタゾンの略称である。足首関節は、同一切片で捉えた場合、膝と比較して同様の軟骨蓄積パターンを実証した。膝及び足首の軟骨における放射性標識されたペプチド対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）及びペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の両方の蓄積があるが、いずれの関節の軟骨においても薬物（１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）単独についての検出可能なシグナルはない。ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の蓄積を示す足首のオートラジオグラフ画像を示している。
【図６Ｅ】図５に示されたＣＩＡモデルでの膝及び足首における蓄積を比較したオートラジオグラフ画像を示している。放射性標識されたペプチドのみの対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）または放射性標識されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）を摂取した動物の足首関節は、３時間で同様のパターンの軟骨のホーミング、標的化、保持、結合及び／または蓄積を実証する。膝または足首の軟骨には、放射線標識された薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘの観察可能な蓄積はない。「Ｄｅｘ」は、デキサメタゾンの略称である。足首関節は、同一切片で捉えた場合、膝と比較して同様の軟骨蓄積パターンを実証した。膝及び足首の軟骨における放射性標識されたペプチド対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）及びペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の両方の蓄積があるが、いずれの関節の軟骨においても薬物（１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）単独についての検出可能なシグナルはない。薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘの軟骨蓄積の欠如を示す膝のオートラジオグラフ画像を示している。
【図６Ｆ】図５に示されたＣＩＡモデルでの膝及び足首における蓄積を比較したオートラジオグラフ画像を示している。放射性標識されたペプチドのみの対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）または放射性標識されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）を摂取した動物の足首関節は、３時間で同様のパターンの軟骨のホーミング、標的化、保持、結合及び／または蓄積を実証する。膝または足首の軟骨には、放射線標識された薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘの観察可能な蓄積はない。「Ｄｅｘ」は、デキサメタゾンの略称である。足首関節は、同一切片で捉えた場合、膝と比較して同様の軟骨蓄積パターンを実証した。膝及び足首の軟骨における放射性標識されたペプチド対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）及びペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の両方の蓄積があるが、いずれの関節の軟骨においても薬物（１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）単独についての検出可能なシグナルはない。薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘの軟骨蓄積の欠如を示す足首のオートラジオグラフ画像を示している。
【図７Ａ】ＷＢＡによる注射後（ｐ．ｉ．）１時間、３時間、及び２４時間における各処置についての膝軟骨における放射性標識されたペプチドのみの対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）、放射性標識されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、及び放射性標識された薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘのｉｎ  ｖｉｖｏ生体内分布を示している。１時間の画像における黒色矢印は、軟骨の領域を強調表示しており、黒色星は、骨髄腔を示している。注射後１時間における膝軟骨中のペプチドのみの対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）の蓄積を示している。
【図７Ｂ】ＷＢＡによる注射後（ｐ．ｉ．）１時間、３時間、及び２４時間における各処置についての膝軟骨における放射性標識されたペプチドのみの対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）、放射性標識されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、及び放射性標識された薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘのｉｎ  ｖｉｖｏ生体内分布を示している。１時間の画像における黒色矢印は、軟骨の領域を強調表示しており、黒色星は、骨髄腔を示している。注射後３時間における膝軟骨中のペプチドのみの対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）の蓄積を示している。
【図７Ｃ】ＷＢＡによる注射後（ｐ．ｉ．）１時間、３時間、及び２４時間における各処置についての膝軟骨における放射性標識されたペプチドのみの対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）、放射性標識されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、及び放射性標識された薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘのｉｎ  ｖｉｖｏ生体内分布を示している。１時間の画像における黒色矢印は、軟骨の領域を強調表示しており、黒色星は、骨髄腔を示している。注射後２４時間における膝軟骨中のペプチドのみの対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）の蓄積を示している。
【図７Ｄ】ＷＢＡによる注射後（ｐ．ｉ．）１時間、３時間、及び２４時間における各処置についての膝軟骨における放射性標識されたペプチドのみの対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）、放射性標識されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、及び放射性標識された薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘのｉｎ  ｖｉｖｏ生体内分布を示している。１時間の画像における黒色矢印は、軟骨の領域を強調表示しており、黒色星は、骨髄腔を示している。注射後１時間における膝軟骨中のペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の蓄積を示している。
【図７Ｅ】ＷＢＡによる注射後（ｐ．ｉ．）１時間、３時間、及び２４時間における各処置についての膝軟骨における放射性標識されたペプチドのみの対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）、放射性標識されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、及び放射性標識された薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘのｉｎ  ｖｉｖｏ生体内分布を示している。１時間の画像における黒色矢印は、軟骨の領域を強調表示しており、黒色星は、骨髄腔を示している。注射後３時間における膝軟骨中のペプチド−薬物複合体ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の蓄積を示している。
【図７Ｆ】ＷＢＡによる注射後（ｐ．ｉ．）１時間、３時間、及び２４時間における各処置についての膝軟骨における放射性標識されたペプチドのみの対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）、放射性標識されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、及び放射性標識された薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘのｉｎ  ｖｉｖｏ生体内分布を示している。１時間の画像における黒色矢印は、軟骨の領域を強調表示しており、黒色星は、骨髄腔を示している。注射後２４時間における膝軟骨中のペプチド−薬物複合体ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の蓄積を示している。
【図７Ｇ】ＷＢＡによる注射後（ｐ．ｉ．）１時間、３時間、及び２４時間における各処置についての膝軟骨における放射性標識されたペプチドのみの対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）、放射性標識されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、及び放射性標識された薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘのｉｎ  ｖｉｖｏ生体内分布を示している。１時間の画像における黒色矢印は、軟骨の領域を強調表示しており、黒色星は、骨髄腔を示している。注射後１時間における膝軟骨中の薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘの蓄積の欠如を示している。
【図７Ｈ】ＷＢＡによる注射後（ｐ．ｉ．）１時間、３時間、及び２４時間における各処置についての膝軟骨における放射性標識されたペプチドのみの対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）、放射性標識されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、及び放射性標識された薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘのｉｎ  ｖｉｖｏ生体内分布を示している。１時間の画像における黒色矢印は、軟骨の領域を強調表示しており、黒色星は、骨髄腔を示している。注射後３時間における膝軟骨中の薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘの蓄積の欠如を示している。
【図７Ｉ】ＷＢＡによる注射後（ｐ．ｉ．）１時間、３時間、及び２４時間における各処置についての膝軟骨における放射性標識されたペプチドのみの対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）、放射性標識されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、及び放射性標識された薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘのｉｎ  ｖｉｖｏ生体内分布を示している。１時間の画像における黒色矢印は、軟骨の領域を強調表示しており、黒色星は、骨髄腔を示している。注射後２４時間における膝軟骨中の薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘの蓄積の欠如を示している。
【図８Ａ】放射性標識されたペプチドのみの対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）、放射性標識されたペプチド−薬物複合体ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、または放射性標識された薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘを摂取した動物における１時間、３時間、及び２４時間でのＱＷＢＡを使用した膝及びＩＶＤにおけるシグナルの定量化を示すグラフを示している。注射後１時間におけるＱＷＢＡを使用した膝及びＩＶＤにおけるペプチドのみの対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、または薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘから得られたシグナルの定量化を示している。
【図８Ｂ】放射性標識されたペプチドのみの対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）、放射性標識されたペプチド−薬物複合体ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、または放射性標識された薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘを摂取した動物における１時間、３時間、及び２４時間でのＱＷＢＡを使用した膝及びＩＶＤにおけるシグナルの定量化を示すグラフを示している。注射後３時間におけるＱＷＢＡを使用した膝及びＩＶＤにおけるペプチドのみの対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、または薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘから得られたシグナルの定量化を示している。
【図８Ｃ】放射性標識されたペプチドのみの対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）、放射性標識されたペプチド−薬物複合体ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、または放射性標識された薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘを摂取した動物における１時間、３時間、及び２４時間でのＱＷＢＡを使用した膝及びＩＶＤにおけるシグナルの定量化を示すグラフを示している。注射後２４時間におけるＱＷＢＡを使用した膝及びＩＶＤにおけるペプチドのみの対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、または薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘから得られたシグナルの定量化を示している。
【図９Ａ】放射性標識されたペプチドのみの対照（１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）、放射性標識されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、または放射性標識された薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘを摂取した動物における１時間、３時間、及び２４時間でのＱＷＢＡを使用した腎臓、肝臓、血液、筋肉、及び骨髄におけるシグナルの定量化を示すグラフを示している。注射後１時間におけるＱＷＢＡを使用した腎臓、肝臓、血液、筋肉、及び骨髄におけるペプチドのみの対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、または薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘから得られたシグナルの定量化を示している。
【図９Ｂ】放射性標識されたペプチドのみの対照（１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）、放射性標識されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、または放射性標識された薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘを摂取した動物における１時間、３時間、及び２４時間でのＱＷＢＡを使用した腎臓、肝臓、血液、筋肉、及び骨髄におけるシグナルの定量化を示すグラフを示している。注射後３時間におけるＱＷＢＡを使用した腎臓、肝臓、血液、筋肉、及び骨髄におけるペプチドのみの対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、または薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘから得られたシグナルの定量化を示している。
【図９Ｃ】放射性標識されたペプチドのみの対照（１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）、放射性標識されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、または放射性標識された薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘを摂取した動物における１時間、３時間、及び２４時間でのＱＷＢＡを使用した腎臓、肝臓、血液、筋肉、及び骨髄におけるシグナルの定量化を示すグラフを示している。注射後２４時間におけるＱＷＢＡを使用した腎臓、肝臓、血液、筋肉、及び骨髄におけるペプチドのみの対照１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、または薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘから得られたシグナルの定量化を示している。
【図１０】ＣＩＡモデルにおける０．２ｍｇ／ｋｇ処置群の動物について処置開始（１１日目）と安楽死（１３日目）との間の足首関節の直径のミリメートル（ｍｍ）での変化を示すグラフである（０．２ｍｇ／ｋｇは、投薬されたＤｅｘの質量を示し、ペプチドまたはリンカーの質量を含まない）。各データポイントは、処置群における１匹のラットについての足首直径の変化（中央値１３日目〜１１日目）を表す。バーは、群についての平均＋／−ＳＤを表す。「＊」は、片側ｔ検定に基づいてビヒクルよりも有意に異なっていた処置群を表す（ｐ＜０．０５）。４つすべてのペプチド薬物複合体（この図のＸ軸に列挙された異なるリンカーを有する複合体）は、ビヒクルと比較して疾患の進行を停止した。グラフのラベル「１，４−シクロヘキシル」は、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−トランス−１，４−シクロヘキシル−Ｄｅｘを指し；グラフのラベル「カルバメート」は、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−［シクロヘキシル−（Ｎ−４−アミノメチル−トランス−１−カルバモイル）］−Ｄｅｘを指し；グラフのラベル「グルタル酸」は、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−グルタル酸−Ｄｅｘを指し；グラフのラベル「ジメチルアジピン酸」は、ペプチド−薬物複合体ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘを指し；「Ｄｅｘ」は、デキサメタゾン単独（ペプチドに複合体化されていない）である。
【図１１Ａ】放射性標識されたペプチド１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）、１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０３）、及び１４Ｃ−ペプチド（配列番号１８４）の膝及びＩＶＤにおける関節保持時間を比較する一連のグラフである。関節保持は、３つすべてのペプチドについて示されたが、後者の２つのペプチドでは、試験した投薬レジメン及び使用した検出方法（Ｎ末端での放射性標識）を使用して、より長い関節保持が観察された。配列番号１０５、配列番号１０３、及び配列番号１８４に示されるアミノ酸配列をそれぞれ有する放射性標識されたペプチドの膝における関節保持時間を示している。
【図１１Ｂ】放射性標識されたペプチド１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）、１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０３）、及び１４Ｃ−ペプチド（配列番号１８４）の膝及びＩＶＤにおける関節保持時間を比較する一連のグラフである。関節保持は、３つすべてのペプチドについて示されたが、後者の２つのペプチドでは、試験した投薬レジメン及び使用した検出方法（Ｎ末端での放射性標識）を使用して、より長い関節保持が観察された。配列番号１０５、配列番号１０３、及び配列番号１８４に示されるアミノ酸配列をそれぞれ有する放射性標識されたペプチドのＩＶＤにおける関節保持時間を示している。
【図１２Ａ】疾患進行の様々な段階（「ＣＩＡ  ｄ１０」、「ＣＩＡ  ｄ１２」及び「ＣＩＡ  ｄ１４」とそれぞれ表記される１０日目、１２日目、または１４日目）で未処置のＣＩＡラットと比較した正常ラットにおけるグルココルチコイド曝露または曝露なし（ビヒクル対照、Ｄｅｘ×２＝２日間のデキサメタゾン投薬後、Ｄｅｘ×４＝４日間のデキサメタゾン投薬後）の全身マーカー（胸腺重量、脾臓重量、総白血球（ＷＢＣ）数、リンパ球数、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ））を示している（ビヒクル及び正常ラットの場合はｎ＝５、ＣＩＡラットの場合はｎ＝３〜４）。統計的有意性は、所定の群、例えば、Ｄｅｘ×２対ＣＩＡ１２日目及びＤｅｘ×４対ＣＩＡｄ１４についてのみ評価した。（＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊ｐ＝０．００１１、＊ｐ＝０．００３４、統計的優位性は両側ｔ検定に基づいていた）。試験された様々なコホートについての胸腺重量を示している。
【図１２Ｂ】疾患進行の様々な段階（「ＣＩＡ  ｄ１０」、「ＣＩＡ  ｄ１２」及び「ＣＩＡ  ｄ１４」とそれぞれ表記される１０日目、１２日目、または１４日目）で未処置のＣＩＡラットと比較した正常ラットにおけるグルココルチコイド曝露または曝露なし（ビヒクル対照、Ｄｅｘ×２＝２日間のデキサメタゾン投薬後、Ｄｅｘ×４＝４日間のデキサメタゾン投薬後）の全身マーカー（胸腺重量、脾臓重量、総白血球（ＷＢＣ）数、リンパ球数、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ））を示している（ビヒクル及び正常ラットの場合はｎ＝５、ＣＩＡラットの場合はｎ＝３〜４）。統計的有意性は、所定の群、例えば、Ｄｅｘ×２対ＣＩＡ１２日目及びＤｅｘ×４対ＣＩＡｄ１４についてのみ評価した。（＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊ｐ＝０．００１１、＊ｐ＝０．００３４、統計的優位性は両側ｔ検定に基づいていた）。試験された様々なコホートについての脾臓重量を示している。
【図１２Ｃ】疾患進行の様々な段階（「ＣＩＡ  ｄ１０」、「ＣＩＡ  ｄ１２」及び「ＣＩＡ  ｄ１４」とそれぞれ表記される１０日目、１２日目、または１４日目）で未処置のＣＩＡラットと比較した正常ラットにおけるグルココルチコイド曝露または曝露なし（ビヒクル対照、Ｄｅｘ×２＝２日間のデキサメタゾン投薬後、Ｄｅｘ×４＝４日間のデキサメタゾン投薬後）の全身マーカー（胸腺重量、脾臓重量、総白血球（ＷＢＣ）数、リンパ球数、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ））を示している（ビヒクル及び正常ラットの場合はｎ＝５、ＣＩＡラットの場合はｎ＝３〜４）。統計的有意性は、所定の群、例えば、Ｄｅｘ×２対ＣＩＡ１２日目及びＤｅｘ×４対ＣＩＡｄ１４についてのみ評価した。（＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊ｐ＝０．００１１、＊ｐ＝０．００３４、統計的優位性は両側ｔ検定に基づいていた）。試験された様々なコホートについての総ＷＢＣ数を示している。
【図１２Ｄ】疾患進行の様々な段階（「ＣＩＡ  ｄ１０」、「ＣＩＡ  ｄ１２」及び「ＣＩＡ  ｄ１４」とそれぞれ表記される１０日目、１２日目、または１４日目）で未処置のＣＩＡラットと比較した正常ラットにおけるグルココルチコイド曝露または曝露なし（ビヒクル対照、Ｄｅｘ×２＝２日間のデキサメタゾン投薬後、Ｄｅｘ×４＝４日間のデキサメタゾン投薬後）の全身マーカー（胸腺重量、脾臓重量、総白血球（ＷＢＣ）数、リンパ球数、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ））を示している（ビヒクル及び正常ラットの場合はｎ＝５、ＣＩＡラットの場合はｎ＝３〜４）。統計的有意性は、所定の群、例えば、Ｄｅｘ×２対ＣＩＡ１２日目及びＤｅｘ×４対ＣＩＡｄ１４についてのみ評価した。（＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊ｐ＝０．００１１、＊ｐ＝０．００３４、統計的優位性は両側ｔ検定に基づいていた）。試験された様々なコホートについてのリンパ球数を示している。
【図１２Ｅ】疾患進行の様々な段階（「ＣＩＡ  ｄ１０」、「ＣＩＡ  ｄ１２」及び「ＣＩＡ  ｄ１４」とそれぞれ表記される１０日目、１２日目、または１４日目）で未処置のＣＩＡラットと比較した正常ラットにおけるグルココルチコイド曝露または曝露なし（ビヒクル対照、Ｄｅｘ×２＝２日間のデキサメタゾン投薬後、Ｄｅｘ×４＝４日間のデキサメタゾン投薬後）の全身マーカー（胸腺重量、脾臓重量、総白血球（ＷＢＣ）数、リンパ球数、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ））を示している（ビヒクル及び正常ラットの場合はｎ＝５、ＣＩＡラットの場合はｎ＝３〜４）。統計的有意性は、所定の群、例えば、Ｄｅｘ×２対ＣＩＡ１２日目及びＤｅｘ×４対ＣＩＡｄ１４についてのみ評価した。（＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊ｐ＝０．００１１、＊ｐ＝０．００３４、統計的優位性は両側ｔ検定に基づいていた）。試験された様々なコホートについてのＡＬＴレベルを示している。
【図１３Ａ】ＣＩＡラットにおけるＤｅｘ曝露の足首関節直径（ミリメートルで測定された）及び全身マーカーに対するペプチド−薬物複合体の効果を示している（「＊」は、０．２ｍｇ／ｋｇコホートにおける片側ｔ検定（ｐ＜０．０５）に基づいて、ビヒクルよりも有意に異なっていた処置群を表す）。グラフのラベル「１，４−シクロヘキシル」は、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−トランス−１，４−シクロヘキシル−Ｄｅｘを指し；グラフのラベル「カルバメート」は、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−［シクロヘキシル−（Ｎ−４−アミノメチル−トランス−１−カルバモイル）］−Ｄｅｘを指し；グラフのラベル「グルタル酸」は、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−グルタル酸−Ｄｅｘを指し；グラフのラベル「ジメチルアジピン酸」は、２，５−ジメチルアジピン酸（ＤＭＡ）リンカーを含むペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘを指し；「Ｄｅｘ」は、デキサメタゾン単独（ペプチドに複合体化されていない）である。質量用量（０．２または０．５ｍｇ／ｋｇ）は、投薬されたＤｅｘの質量を指し、ペプチドの質量もリンカーの質量も含まない。０．２ｍｇ／ｋｇ及び０．５ｍｇ／ｋｇの用量処置アームにおけるラットについての経時的な足首直径の測定結果（ミリメートル）を示している。用量は、活性剤Ｄｅｘの投与の質量を表し、ペプチドを含まない。矢印は、処置が投与された日を示す。データは、群平均＋／−ＳＤで示されている。
【図１３Ｂ】ＣＩＡラットにおけるＤｅｘ曝露の足首関節直径（ミリメートルで測定された）及び全身マーカーに対するペプチド−薬物複合体の効果を示している（「＊」は、０．２ｍｇ／ｋｇコホートにおける片側ｔ検定（ｐ＜０．０５）に基づいて、ビヒクルよりも有意に異なっていた処置群を表す）。グラフのラベル「１，４−シクロヘキシル」は、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−トランス−１，４−シクロヘキシル−Ｄｅｘを指し；グラフのラベル「カルバメート」は、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−［シクロヘキシル−（Ｎ−４−アミノメチル−トランス−１−カルバモイル）］−Ｄｅｘを指し；グラフのラベル「グルタル酸」は、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−グルタル酸−Ｄｅｘを指し；グラフのラベル「ジメチルアジピン酸」は、２，５−ジメチルアジピン酸（ＤＭＡ）リンカーを含むペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘを指し；「Ｄｅｘ」は、デキサメタゾン単独（ペプチドに複合体化されていない）である。質量用量（０．２または０．５ｍｇ／ｋｇ）は、投薬されたＤｅｘの質量を指し、ペプチドの質量もリンカーの質量も含まない。ペプチド−薬物複合体の各々についての０．２ｍｇ／ｋｇ及び０．５ｍｇ／ｋｇそれぞれの処置群における動物についての処置開始（１１日目）と安楽死（１３日目）との間の足首関節の直径（ミリメートル）の変化を示している。各ラットについての足首直径の中央値を１１日目及び１３日目に計算した（１日当たり合計６回の足首測定）。各データポイントは、処置群における１匹のラットについての足首直径の変化（中央値１３日目〜１１日目）を表す。バーは、群についての平均＋／−ＳＤを表す。
【図１３Ｃ】ＣＩＡラットにおけるＤｅｘ曝露の足首関節直径（ミリメートルで測定された）及び全身マーカーに対するペプチド−薬物複合体の効果を示している（「＊」は、０．２ｍｇ／ｋｇコホートにおける片側ｔ検定（ｐ＜０．０５）に基づいて、ビヒクルよりも有意に異なっていた処置群を表す）。グラフのラベル「１，４−シクロヘキシル」は、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−トランス−１，４−シクロヘキシル−Ｄｅｘを指し；グラフのラベル「カルバメート」は、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−［シクロヘキシル−（Ｎ−４−アミノメチル−トランス−１−カルバモイル）］−Ｄｅｘを指し；グラフのラベル「グルタル酸」は、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−グルタル酸−Ｄｅｘを指し；グラフのラベル「ジメチルアジピン酸」は、２，５−ジメチルアジピン酸（ＤＭＡ）リンカーを含むペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘを指し；「Ｄｅｘ」は、デキサメタゾン単独（ペプチドに複合体化されていない）である。質量用量（０．２または０．５ｍｇ／ｋｇ）は、投薬されたＤｅｘの質量を指し、ペプチドの質量もリンカーの質量も含まない。０．２ｍｇ／ｋｇ及び０．５ｍｇ／ｋｇ処置群それぞれにおける動物についての１１日目と１３日目との間の総体重の変化率を示している。
【図１３Ｄ】ＣＩＡラットにおけるＤｅｘ曝露の足首関節直径（ミリメートルで測定された）及び全身マーカーに対するペプチド−薬物複合体の効果を示している（「＊」は、０．２ｍｇ／ｋｇコホートにおける片側ｔ検定（ｐ＜０．０５）に基づいて、ビヒクルよりも有意に異なっていた処置群を表す）。グラフのラベル「１，４−シクロヘキシル」は、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−トランス−１，４−シクロヘキシル−Ｄｅｘを指し；グラフのラベル「カルバメート」は、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−［シクロヘキシル−（Ｎ−４−アミノメチル−トランス−１−カルバモイル）］−Ｄｅｘを指し；グラフのラベル「グルタル酸」は、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−グルタル酸−Ｄｅｘを指し；グラフのラベル「ジメチルアジピン酸」は、２，５−ジメチルアジピン酸（ＤＭＡ）リンカーを含むペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘを指し；「Ｄｅｘ」は、デキサメタゾン単独（ペプチドに複合体化されていない）である。質量用量（０．２または０．５ｍｇ／ｋｇ）は、投薬されたＤｅｘの質量を指し、ペプチドの質量もリンカーの質量も含まない。０．２ｍｇ／ｋｇ及び０．５ｍｇ／ｋｇの処置群のそれぞれにおける動物についての安楽死時の胸腺重量を示している。
【図１３Ｅ】ＣＩＡラットにおけるＤｅｘ曝露の足首関節直径（ミリメートルで測定された）及び全身マーカーに対するペプチド−薬物複合体の効果を示している（「＊」は、０．２ｍｇ／ｋｇコホートにおける片側ｔ検定（ｐ＜０．０５）に基づいて、ビヒクルよりも有意に異なっていた処置群を表す）。グラフのラベル「１，４−シクロヘキシル」は、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−トランス−１，４−シクロヘキシル−Ｄｅｘを指し；グラフのラベル「カルバメート」は、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−［シクロヘキシル−（Ｎ−４−アミノメチル−トランス−１−カルバモイル）］−Ｄｅｘを指し；グラフのラベル「グルタル酸」は、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−グルタル酸−Ｄｅｘを指し；グラフのラベル「ジメチルアジピン酸」は、２，５−ジメチルアジピン酸（ＤＭＡ）リンカーを含むペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘを指し；「Ｄｅｘ」は、デキサメタゾン単独（ペプチドに複合体化されていない）である。質量用量（０．２または０．５ｍｇ／ｋｇ）は、投薬されたＤｅｘの質量を指し、ペプチドの質量もリンカーの質量も含まない。０．２ｍｇ／ｋｇ及び０．５ｍｇ／ｋｇの処置群のそれぞれにおける動物についての安楽死時の脾臓重量を示している。
【図１４Ａ】罹患していない雌のＬｅｗｉｓラットにおける（ｉ）ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘまたは（ｉｉ）非複合体化デキサメタゾンリン酸エステルナトリウム（図１４Ａ及び図１４Ｂにおいて「ＤｅｘＳＰ］と表記される）のいずれかの単回静脈内（ＩＶ）投薬後の経時的な血漿中のＤｅｘの濃度を示している。データは、平均＋／−ＳＤとして示されている。各動物は、０．２ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾン（ＤｅｘＳＰとしてまたはペプチド−薬物複合体としてのいずれか）の単回静脈内（ＩＶ）投薬を受け、ペプチド−薬物複合体またはＤｅｘＳＰから放出されたデキサメタゾン薬物（「遊離Ｄｅｘ」と表記される）の濃度を測定した。また、処置したラットから血漿を採取し、それをｅｘ  ｖｉｖｏでの強制加水分解に供して、遊離Ｄｅｘ及びペプチドに複合体化したＤｅｘの両方を測定することによってペプチド−薬物複合体について「総Ｄｅｘ」（すなわち、放出された遊離Ｄｅｘ＋ペプチド−薬物複合体に存在するＤｅｘ）も決定した。ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（遊離Ｄｅｘ）」と表記される）またはＤｅｘＳＰのいずれかで処置されたラットにおける各時点での血漿中で測定された遊離Ｄｅｘの濃度を示している。
【図１４Ｂ】罹患していない雌のＬｅｗｉｓラットにおける（ｉ）ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘまたは（ｉｉ）非複合体化デキサメタゾンリン酸エステルナトリウム（図１４Ａ及び図１４Ｂにおいて「ＤｅｘＳＰ］と表記される）のいずれかの単回静脈内（ＩＶ）投薬後の経時的な血漿中のＤｅｘの濃度を示している。データは、平均＋／−ＳＤとして示されている。各動物は、０．２ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾン（ＤｅｘＳＰとしてまたはペプチド−薬物複合体としてのいずれか）の単回静脈内（ＩＶ）投薬を受け、ペプチド−薬物複合体またはＤｅｘＳＰから放出されたデキサメタゾン薬物（「遊離Ｄｅｘ」と表記される）の濃度を測定した。また、処置したラットから血漿を採取し、それをｅｘ  ｖｉｖｏでの強制加水分解に供して、遊離Ｄｅｘ及びペプチドに複合体化したＤｅｘの両方を測定することによってペプチド−薬物複合体について「総Ｄｅｘ」（すなわち、放出された遊離Ｄｅｘ＋ペプチド−薬物複合体に存在するＤｅｘ）も決定した。（ｉ）ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘで処置されたラット（「ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（総Ｄｅｘ）」と表記される）または（ｉｉ）ＤｅｘＳＰで処置されたラットからの血漿中で測定された総Ｄｅｘ（放出された遊離Ｄｅｘ＋ペプチド−薬物複合体に存在するＤｅｘ、「遊離及びペプチド結合」と表記される）の濃度を示している。
【図１４Ｃ】罹患していない雌のＬｅｗｉｓラットにおける（ｉ）ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘまたは（ｉｉ）非複合体化デキサメタゾンリン酸エステルナトリウム（図１４Ａ及び図１４Ｂにおいて「ＤｅｘＳＰ］と表記される）のいずれかの単回静脈内（ＩＶ）投薬後の経時的な血漿中のＤｅｘの濃度を示している。データは、平均＋／−ＳＤとして示されている。各動物は、０．２ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾン（ＤｅｘＳＰとしてまたはペプチド−薬物複合体としてのいずれか）の単回静脈内（ＩＶ）投薬を受け、ペプチド−薬物複合体またはＤｅｘＳＰから放出されたデキサメタゾン薬物（「遊離Ｄｅｘ」と表記される）の濃度を測定した。また、処置したラットから血漿を採取し、それをｅｘ  ｖｉｖｏでの強制加水分解に供して、遊離Ｄｅｘ及びペプチドに複合体化したＤｅｘの両方を測定することによってペプチド−薬物複合体について「総Ｄｅｘ」（すなわち、放出された遊離Ｄｅｘ＋ペプチド−薬物複合体に存在するＤｅｘ）も決定した。ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘでの処置後の総Ｄｅｘ及び遊離Ｄｅｘの血漿濃度（ｎＭ）ならびに無傷のペプチド−薬物複合体（無傷のＰＤＣ）の計算された濃度を示している。
【図１５Ａ】ペプチド−薬物複合体であるペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ、またはＤｅｘＳＰの単回ＩＶ投与後のＤｅｘへの全身性曝露の測定を示している。データは、１つの時点当たりｎ＝４で平均＋／−ＳＤとして示されている。リンパ球数は、６時間及び１２時間でのＤｅｘ処置群、及び１２時間でのペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ処置群におけるそれぞれ１匹のラットについては、正確な差を認めるには細胞数が少なすぎたので利用できなかった。経時的な総白血球（ＷＢＣ）数を示している（＊ｐ＝０．０２９３）。
【図１５Ｂ】ペプチド−薬物複合体であるペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ、またはＤｅｘＳＰの単回ＩＶ投与後のＤｅｘへの全身性曝露の測定を示している。データは、１つの時点当たりｎ＝４で平均＋／−ＳＤとして示されている。リンパ球数は、６時間及び１２時間でのＤｅｘ処置群、及び１２時間でのペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ処置群におけるそれぞれ１匹のラットについては、正確な差を認めるには細胞数が少なすぎたので利用できなかった。経時的な絶対リンパ球数を示している（＊（２時間）ｐ＝０．０３１６、（１２時間）ｐ＝０．０２１０、対応のないｔ検定、両側、Ｄｅｘ（「ＤｅｘＳＰ」と表記される）対ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ複合体）。
【図１５Ｃ】ペプチド−薬物複合体であるペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ、またはＤｅｘＳＰの単回ＩＶ投与後のＤｅｘへの全身性曝露の測定を示している。データは、１つの時点当たりｎ＝４で平均＋／−ＳＤとして示されている。リンパ球数は、６時間及び１２時間でのＤｅｘ処置群、及び１２時間でのペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ処置群におけるそれぞれ１匹のラットについては、正確な差を認めるには細胞数が少なすぎたので利用できなかった。経時的な胸腺重量を示している。
【図１５Ｄ】ペプチド−薬物複合体であるペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ、またはＤｅｘＳＰの単回ＩＶ投与後のＤｅｘへの全身性曝露の測定を示している。データは、１つの時点当たりｎ＝４で平均＋／−ＳＤとして示されている。リンパ球数は、６時間及び１２時間でのＤｅｘ処置群、及び１２時間でのペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ処置群におけるそれぞれ１匹のラットについては、正確な差を認めるには細胞数が少なすぎたので利用できなかった。経時的な脾臓重量を示している。
【図１６Ａ】ペプチド−薬物複合体であるペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（２７）及びペプチド（配列番号１０５）−カルバメート−Ｄｅｘ（２８）の化学構造ならびにペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−カルバメート−Ｄｅｘ、薬物のみの対照ＤｅｘＳＰまたはビヒクルでの処置後のＣＩＡラットにおける足首直径及びＣＩＡラットにおける全身性Ｄｅｘ曝露のマーカーに対する効果の機能を示している。各点は単一の動物を表し、線は平均＋／−ＳＤを表す。（＊＊ｐ＝０．００７８（ＤｅｘＳＰ０．０５ｍｇ／ｋｇ）、ｐ＝０．００１４（ＤＭＡ０．０５）、＊ｐ＝０．０１１９（ＤｅｘＳＰ０．０５）、ｐ＝０．０１３２（ＤＭＡ０．０５）、ＮＳ＝非有意（対応のないｔ検定、両側））。矢印は、処置が投与された日を示す。足首の測定は、試験７日目まで記録したが、５〜７日目に重度に罹患した動物を安楽死させた結果、治療効果とは無関係な群の平均足首直径の変化が生じたので、６日目及び７日目はグラフから省略した。示された用量（０．２または０．０５ｍｇ／ｋｇ）は、投薬されたＤｅｘの質量を指し、ペプチドの質量もリンカーの質量も含まない。ペプチド−薬物複合体ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（２７）及びペプチド（配列番号１０５）−カルバメート−Ｄｅｘ（２８）の化学構造を示している。
【図１６Ｂ】ペプチド−薬物複合体であるペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（２７）及びペプチド（配列番号１０５）−カルバメート−Ｄｅｘ（２８）の化学構造ならびにペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−カルバメート−Ｄｅｘ、薬物のみの対照ＤｅｘＳＰまたはビヒクルでの処置後のＣＩＡラットにおける足首直径及びＣＩＡラットにおける全身性Ｄｅｘ曝露のマーカーに対する効果の機能を示している。各点は単一の動物を表し、線は平均＋／−ＳＤを表す。（＊＊ｐ＝０．００７８（ＤｅｘＳＰ０．０５ｍｇ／ｋｇ）、ｐ＝０．００１４（ＤＭＡ０．０５）、＊ｐ＝０．０１１９（ＤｅｘＳＰ０．０５）、ｐ＝０．０１３２（ＤＭＡ０．０５）、ＮＳ＝非有意（対応のないｔ検定、両側））。矢印は、処置が投与された日を示す。足首の測定は、試験７日目まで記録したが、５〜７日目に重度に罹患した動物を安楽死させた結果、治療効果とは無関係な群の平均足首直径の変化が生じたので、６日目及び７日目はグラフから省略した。示された用量（０．２または０．０５ｍｇ／ｋｇ）は、投薬されたＤｅｘの質量を指し、ペプチドの質量もリンカーの質量も含まない。０．２ｍｇ／ｋｇのペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−カルバメート−Ｄｅｘ（「カルバメート０．２ｍｇ／ｋｇ」と表記される）、または０．２ｍｇ／ｋｇのＤｅｘＳＰ（「ＤｅｘＳＰ０．２ｍｇ／ｋｇ」と表記される）、またはビヒクルでの処置後の経時的な足首直径の変化を示している。データは、１群当たりｎ＝５で平均＋／−ＳＥＭとして示されている。重度の関節炎を有する動物の安楽死により、ビヒクル群は３日目にｎ＝３に減少し、カルバメートは５日目にｎ＝３に減少した。
【図１６Ｃ】ペプチド−薬物複合体であるペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（２７）及びペプチド（配列番号１０５）−カルバメート−Ｄｅｘ（２８）の化学構造ならびにペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−カルバメート−Ｄｅｘ、薬物のみの対照ＤｅｘＳＰまたはビヒクルでの処置後のＣＩＡラットにおける足首直径及びＣＩＡラットにおける全身性Ｄｅｘ曝露のマーカーに対する効果の機能を示している。各点は単一の動物を表し、線は平均＋／−ＳＤを表す。（＊＊ｐ＝０．００７８（ＤｅｘＳＰ０．０５ｍｇ／ｋｇ）、ｐ＝０．００１４（ＤＭＡ０．０５）、＊ｐ＝０．０１１９（ＤｅｘＳＰ０．０５）、ｐ＝０．０１３２（ＤＭＡ０．０５）、ＮＳ＝非有意（対応のないｔ検定、両側））。矢印は、処置が投与された日を示す。足首の測定は、試験７日目まで記録したが、５〜７日目に重度に罹患した動物を安楽死させた結果、治療効果とは無関係な群の平均足首直径の変化が生じたので、６日目及び７日目はグラフから省略した。示された用量（０．２または０．０５ｍｇ／ｋｇ）は、投薬されたＤｅｘの質量を指し、ペプチドの質量もリンカーの質量も含まない。０．２ｍｇ／ｋｇのペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−カルバメート−Ｄｅｘ（「カルバメート０．２ｍｇ／ｋｇ」と表記される）、または０．２ｍｇ／ｋｇのＤｅｘＳＰ（「ＤｅｘＳＰ０．２ｍｇ／ｋｇ」と表記される）、またはビヒクル（１群当たりｎ＝３）の最後の投薬から２４時間後に安楽死させたラットにおける胸腺重量を示している。各点は単一の動物を表し、線は平均＋／−ＳＤを表す。（＊＊ｐ＝０．００１４（胸腺）、ｐ＝０．００１５（脾臓）、＊ｐ＝０．０１８７、ＮＳ＝非有意（対応のないｔ検定、両側）。
【図１６Ｄ】ペプチド−薬物複合体であるペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（２７）及びペプチド（配列番号１０５）−カルバメート−Ｄｅｘ（２８）の化学構造ならびにペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−カルバメート−Ｄｅｘ、薬物のみの対照ＤｅｘＳＰまたはビヒクルでの処置後のＣＩＡラットにおける足首直径及びＣＩＡラットにおける全身性Ｄｅｘ曝露のマーカーに対する効果の機能を示している。各点は単一の動物を表し、線は平均＋／−ＳＤを表す。（＊＊ｐ＝０．００７８（ＤｅｘＳＰ０．０５ｍｇ／ｋｇ）、ｐ＝０．００１４（ＤＭＡ０．０５）、＊ｐ＝０．０１１９（ＤｅｘＳＰ０．０５）、ｐ＝０．０１３２（ＤＭＡ０．０５）、ＮＳ＝非有意（対応のないｔ検定、両側））。矢印は、処置が投与された日を示す。足首の測定は、試験７日目まで記録したが、５〜７日目に重度に罹患した動物を安楽死させた結果、治療効果とは無関係な群の平均足首直径の変化が生じたので、６日目及び７日目はグラフから省略した。示された用量（０．２または０．０５ｍｇ／ｋｇ）は、投薬されたＤｅｘの質量を指し、ペプチドの質量もリンカーの質量も含まない。０．２ｍｇ／ｋｇのペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−カルバメート−Ｄｅｘ（「カルバメート０．２ｍｇ／ｋｇ」と表記される）、または０．２ｍｇ／ｋｇのＤｅｘＳＰ（「ＤｅｘＳＰ０．２ｍｇ／ｋｇ」と表記される）、またはビヒクル（１群当たりｎ＝３）の最後の投薬から２４時間後に安楽死させたラットにおける脾臓重量を示している。各点は単一の動物を表し、線は平均＋／−ＳＤを表す。＊＊ｐ＝０．００１４（胸腺）、ｐ＝０．００１５（脾臓）、＊ｐ＝０．０１８７、ＮＳ＝非有意（対応のないｔ検定、両側）。
【図１６Ｅ】ペプチド−薬物複合体であるペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（２７）及びペプチド（配列番号１０５）−カルバメート−Ｄｅｘ（２８）の化学構造ならびにペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−カルバメート−Ｄｅｘ、薬物のみの対照ＤｅｘＳＰまたはビヒクルでの処置後のＣＩＡラットにおける足首直径及びＣＩＡラットにおける全身性Ｄｅｘ曝露のマーカーに対する効果の機能を示している。各点は単一の動物を表し、線は平均＋／−ＳＤを表す。（＊＊ｐ＝０．００７８（ＤｅｘＳＰ０．０５ｍｇ／ｋｇ）、ｐ＝０．００１４（ＤＭＡ０．０５）、＊ｐ＝０．０１１９（ＤｅｘＳＰ０．０５）、ｐ＝０．０１３２（ＤＭＡ０．０５）、ＮＳ＝非有意（対応のないｔ検定、両側））。矢印は、処置が投与された日を示す。足首の測定は、試験７日目まで記録したが、５〜７日目に重度に罹患した動物を安楽死させた結果、治療効果とは無関係な群の平均足首直径の変化が生じたので、６日目及び７日目はグラフから省略した。示された用量（０．２または０．０５ｍｇ／ｋｇ）は、投薬されたＤｅｘの質量を指し、ペプチドの質量もリンカーの質量も含まない。０．０５ｍｇ／ｋｇのペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（「ＤＭＡ０．０５ｍｇ／ｋｇ」と表記される）、または０．０５ｍｇ／ｋｇのＤｅｘＳＰ（「ＤｅｘＳＰ０．０５ｍｇ／ｋｇ」と表記される）、またはビヒクルでの処置後の経時的な足首直径の変化を示している。データは、１群当たりｎ＝５で平均＋／−ＳＥＭとして示されている。ビヒクル群は、０．０２ｍｇ／ｋｇの実験で使用されたものと同じである（例えば、図１６Ｂを参照されたい）。
【図１６Ｆ】ペプチド−薬物複合体であるペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（２７）及びペプチド（配列番号１０５）−カルバメート−Ｄｅｘ（２８）の化学構造ならびにペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−カルバメート−Ｄｅｘ、薬物のみの対照ＤｅｘＳＰまたはビヒクルでの処置後のＣＩＡラットにおける足首直径及びＣＩＡラットにおける全身性Ｄｅｘ曝露のマーカーに対する効果の機能を示している。各点は単一の動物を表し、線は平均＋／−ＳＤを表す。（＊＊ｐ＝０．００７８（ＤｅｘＳＰ０．０５ｍｇ／ｋｇ）、ｐ＝０．００１４（ＤＭＡ０．０５）、＊ｐ＝０．０１１９（ＤｅｘＳＰ０．０５）、ｐ＝０．０１３２（ＤＭＡ０．０５）、ＮＳ＝非有意（対応のないｔ検定、両側））。矢印は、処置が投与された日を示す。足首の測定は、試験７日目まで記録したが、５〜７日目に重度に罹患した動物を安楽死させた結果、治療効果とは無関係な群の平均足首直径の変化が生じたので、６日目及び７日目はグラフから省略した。示された用量（０．２または０．０５ｍｇ／ｋｇ）は、投薬されたＤｅｘの質量を指し、ペプチドの質量もリンカーの質量も含まない。０．０５ｍｇ／ｋｇのペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（「ＤＭＡ０．０５ｍｇ／ｋｇ」と表記される）、または０．０５ｍｇ／ｋｇのＤｅｘＳＰ（「ＤｅｘＳＰ０．０５ｍｇ／ｋｇ」と表記される）、またはビヒクル（１群当たりｎ＝３）の最後の投薬から２４時間後に安楽死させたラットにおける胸腺重量を示している。
【図１６Ｇ】ペプチド−薬物複合体であるペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（２７）及びペプチド（配列番号１０５）−カルバメート−Ｄｅｘ（２８）の化学構造ならびにペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−カルバメート−Ｄｅｘ、薬物のみの対照ＤｅｘＳＰまたはビヒクルでの処置後のＣＩＡラットにおける足首直径及びＣＩＡラットにおける全身性Ｄｅｘ曝露のマーカーに対する効果の機能を示している。各点は単一の動物を表し、線は平均＋／−ＳＤを表す。（＊＊ｐ＝０．００７８（ＤｅｘＳＰ０．０５ｍｇ／ｋｇ）、ｐ＝０．００１４（ＤＭＡ０．０５）、＊ｐ＝０．０１１９（ＤｅｘＳＰ０．０５）、ｐ＝０．０１３２（ＤＭＡ０．０５）、ＮＳ＝非有意（対応のないｔ検定、両側））。矢印は、処置が投与された日を示す。足首の測定は、試験７日目まで記録したが、５〜７日目に重度に罹患した動物を安楽死させた結果、治療効果とは無関係な群の平均足首直径の変化が生じたので、６日目及び７日目はグラフから省略した。示された用量（０．２または０．０５ｍｇ／ｋｇ）は、投薬されたＤｅｘの質量を指し、ペプチドの質量もリンカーの質量も含まない。０．０５ｍｇ／ｋｇのペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（「ＤＭＡ０．０５ｍｇ／ｋｇ」）、または０．０５ｍｇ／ｋｇのＤｅｘＳＰ（「ＤｅｘＳＰ０．０５ｍｇ／ｋｇ」と表記される）、またはビヒクル（１群当たりｎ＝３）の最後の投薬から２４時間後に安楽死させたラットにおける脾臓重量を示している。
【図１７Ａ】ＤｅｘＳＰまたは合成的に生成されたペプチドを含むペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（「ＰＤＣ」とも表記される）の４つの異なる用量レベル（ＤｅｘＳＰ及びＰＤＣの各々について０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、及び０．０５ｍｇ／ｋｇ、ならびに組換え的に生成されたペプチドを含むＰＤＣ（「ｒＰＤＣ」と表記される）については０．０５ｍｇ／ｋｇの追加の用量レベル）でのＣＩＡラット関節炎モデルにおける足首の腫れに対する効果を示しており；質量用量は、投薬されたＤｅｘの質量を指し、ペプチドの質量もリンカーの質量も含まない。データは、群平均＋／−ＳＤとして示されている。ビヒクル群の平均は、比較のために各用量レベルで示されている（黒色実線）。ビヒクル群についての標準偏差は点線によって示されている。組換えペプチド−薬物複合体群についての平均＋／−ＳＤも０．０５ｍｇ／ｋｇで示されている。（＊ｐ＝０．０３５２対ビヒクル（対応のないｔ検定、両側））。ビヒクル群は、図１７Ａ及び図１７Ｂで同じである。データは、ｎ＝３を有していた組換え発現ペプチド−薬物複合体（ｒＰＤＣ）を除き、群平均＋／−ＳＥＭ（１群当たりｎ＝５）として示されている。片側性疾患の高い発生率のため、各ラットについて単一の足首を分析する。両側性疾患の場合は、経時的な足首直径の変化が最も小さいことを実証した足首を分析に含めた。７日間毎日投薬された４つの異なる用量レベルでのＤｅｘＳＰ（グラフラベル「デキサメタゾン」）での処置後の経時的な足首直径の測定結果を示している。
【図１７Ｂ】ＤｅｘＳＰまたは合成的に生成されたペプチドを含むペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（「ＰＤＣ」とも表記される）の４つの異なる用量レベル（ＤｅｘＳＰ及びＰＤＣの各々について０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、及び０．０５ｍｇ／ｋｇ、ならびに組換え的に生成されたペプチドを含むＰＤＣ（「ｒＰＤＣ」と表記される）については０．０５ｍｇ／ｋｇの追加の用量レベル）でのＣＩＡラット関節炎モデルにおける足首の腫れに対する効果を示しており；質量用量は、投薬されたＤｅｘの質量を指し、ペプチドの質量もリンカーの質量も含まない。データは、群平均＋／−ＳＤとして示されている。ビヒクル群の平均は、比較のために各用量レベルで示されている（黒色実線）。ビヒクル群についての標準偏差は点線によって示されている。組換えペプチド−薬物複合体群についての平均＋／−ＳＤも０．０５ｍｇ／ｋｇで示されている。（＊ｐ＝０．０３５２対ビヒクル（対応のないｔ検定、両側））。ビヒクル群は、図１７Ａ及び図１７Ｂで同じである。データは、ｎ＝３を有していた組換え発現ペプチド−薬物複合体（ｒＰＤＣ）を除き、群平均＋／−ＳＥＭ（１群当たりｎ＝５）として示されている。片側性疾患の高い発生率のため、各ラットについて単一の足首を分析する。両側性疾患の場合は、経時的な足首直径の変化が最も小さいことを実証した足首を分析に含めた。表記されているように４つの異なる用量レベルでのペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（グラフラベル「ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ」）（ペプチドは合成的に生成された）及び０．０５ｍｇ／ｋｇでのペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（「ｒＰＤＣ」）ペプチドは組換え的に生成された）で７日間毎日投薬されて処置された後の経時的な足首直径の測定結果を示している。
【図１７Ｃ】ＤｅｘＳＰまたは合成的に生成されたペプチドを含むペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（「ＰＤＣ」とも表記される）の４つの異なる用量レベル（ＤｅｘＳＰ及びＰＤＣの各々について０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、及び０．０５ｍｇ／ｋｇ、ならびに組換え的に生成されたペプチドを含むＰＤＣ（「ｒＰＤＣ」と表記される）については０．０５ｍｇ／ｋｇの追加の用量レベル）でのＣＩＡラット関節炎モデルにおける足首の腫れに対する効果を示しており；質量用量は、投薬されたＤｅｘの質量を指し、ペプチドの質量もリンカーの質量も含まない。データは、群平均＋／−ＳＤとして示されている。ビヒクル群の平均は、比較のために各用量レベルで示されている（黒色実線）。ビヒクル群についての標準偏差は点線によって示されている。組換えペプチド−薬物複合体群についての平均＋／−ＳＤも０．０５ｍｇ／ｋｇで示されている。（＊ｐ＝０．０３５２対ビヒクル（対応のないｔ検定、両側））。ビヒクル群は、図１７Ａ及び図１７Ｂで同じである。データは、ｎ＝３を有していた組換え発現ペプチド−薬物複合体（ｒＰＤＣ）を除き、群平均＋／−ＳＥＭ（１群当たりｎ＝５）として示されている。片側性疾患の高い発生率のため、各ラットについて単一の足首を分析する。両側性疾患の場合は、経時的な足首直径の変化が最も小さいことを実証した足首を分析に含めた。４つの異なる用量レベルのＤｅｘＳＰ（「ＤｅｘＳＰ」と表記される）またはペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（表記されているように合成的に（ＰＤＣ）及び組換え的に（ｒＰＤＣ）生成されたペプチドの両方を含む複合体について）での試験６日目と試験０日目との間の足首直径のミリメートルでの変化を示している。
【図１８Ａ】ＤｅｘＳＰまたはペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（「ＰＤＣ」）の４つの異なる用量レベル（ＤｅｘＳＰ及びＰＤＣについて０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、及び０．０５ｍｇ／ｋｇ、ならびに組換え的に生成されたペプチドを含むＰＤＣ（「ｒＰＤＣ」）については０．０５ｍｇ／ｋｇ）での７日間の処置後のＣＩＡラットにおけるＤｅｘ曝露及び全般的健康状態の全身指標を示しており；用量は、投薬されたＤｅｘの質量を指し、ペプチドの質量もリンカーの質量も含まない。ビヒクル群の平均＋／−ＳＤは、比較のために各用量レベルで示されている（黒色実線）。組換えＰＤＣ群の平均＋／−ＳＤは、０．０５ｍｇ／ｋｇの用量で示されている。最終投薬から３時間後に組織を採取した。Ｐ値をビヒクルと比較する。試験６日目の胸腺重量を示している。（＊ｐ＝０．０３４３、＊＊ｐ＝０．００５３、＊＊＊ｐ＝０．０００６（Ｄｅｘ０．０５）、ｐ＝０．０００２（ＰＤＣ０．０５））。
【図１８Ｂ】ＤｅｘＳＰまたはペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（「ＰＤＣ」）の４つの異なる用量レベル（ＤｅｘＳＰ及びＰＤＣについて０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、及び０．０５ｍｇ／ｋｇ、ならびに組換え的に生成されたペプチドを含むＰＤＣ（「ｒＰＤＣ」）については０．０５ｍｇ／ｋｇ）での７日間の処置後のＣＩＡラットにおけるＤｅｘ曝露及び全般的健康状態の全身指標を示しており；用量は、投薬されたＤｅｘの質量を指し、ペプチドの質量もリンカーの質量も含まない。ビヒクル群の平均＋／−ＳＤは、比較のために各用量レベルで示されている（黒色実線）。組換えＰＤＣ群の平均＋／−ＳＤは、０．０５ｍｇ／ｋｇの用量で示されている。最終投薬から３時間後に組織を採取した。Ｐ値をビヒクルと比較する。試験６日目の脾臓重量を示している。（＊ｐ＝０．０２０９、＊＊＊ｐ＝０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図１８Ｃ】ＤｅｘＳＰまたはペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（「ＰＤＣ」）の４つの異なる用量レベル（ＤｅｘＳＰ及びＰＤＣについて０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、及び０．０５ｍｇ／ｋｇ、ならびに組換え的に生成されたペプチドを含むＰＤＣ（「ｒＰＤＣ」）については０．０５ｍｇ／ｋｇ）での７日間の処置後のＣＩＡラットにおけるＤｅｘ曝露及び全般的健康状態の全身指標を示しており；用量は、投薬されたＤｅｘの質量を指し、ペプチドの質量もリンカーの質量も含まない。ビヒクル群の平均＋／−ＳＤは、比較のために各用量レベルで示されている（黒色実線）。組換えＰＤＣ群の平均＋／−ＳＤは、０．０５ｍｇ／ｋｇの用量で示されている。最終投薬から３時間後に組織を採取した。Ｐ値をビヒクルと比較する。試験６日目のリンパ球数を示している。（＊ｐ＝０．０４６９（ＰＤＣ０．００１）、ｐ＝０．０１５６（Ｄｅｘ０．０１）、ｐ＝０．０１７３（ｒＰＤＣ）、＊＊ｐ＝０．００７８、＊＊＊ｐ＝０．０００９、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、すべてがビヒクルと比較した場合の対応のない両側ｔ検定である）。
【図１８Ｄ】ＤｅｘＳＰまたはペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（「ＰＤＣ」）の４つの異なる用量レベル（ＤｅｘＳＰ及びＰＤＣについて０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、及び０．０５ｍｇ／ｋｇ、ならびに組換え的に生成されたペプチドを含むＰＤＣ（「ｒＰＤＣ」）については０．０５ｍｇ／ｋｇ）での７日間の処置後のＣＩＡラットにおけるＤｅｘ曝露及び全般的健康状態の全身指標を示しており；用量は、投薬されたＤｅｘの質量を指し、ペプチドの質量もリンカーの質量も含まない。ビヒクル群の平均＋／−ＳＤは、比較のために各用量レベルで示されている（黒色実線）。組換えＰＤＣ群の平均＋／−ＳＤは、０．０５ｍｇ／ｋｇの用量で示されている。最終投薬から３時間後に組織を採取した。Ｐ値をビヒクルと比較する。試験６日目の副腎重量を示している。
【図１８Ｅ】ＤｅｘＳＰまたはペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（「ＰＤＣ」）の４つの異なる用量レベル（ＤｅｘＳＰ及びＰＤＣについて０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、及び０．０５ｍｇ／ｋｇ、ならびに組換え的に生成されたペプチドを含むＰＤＣ（「ｒＰＤＣ」）については０．０５ｍｇ／ｋｇ）での７日間の処置後のＣＩＡラットにおけるＤｅｘ曝露及び全般的健康状態の全身指標を示しており；用量は、投薬されたＤｅｘの質量を指し、ペプチドの質量もリンカーの質量も含まない。ビヒクル群の平均＋／−ＳＤは、比較のために各用量レベルで示されている（黒色実線）。組換えＰＤＣ群の平均＋／−ＳＤは、０．０５ｍｇ／ｋｇの用量で示されている。最終投薬から３時間後に組織を採取した。Ｐ値をビヒクルと比較する。試験６日目と試験０日目との間の体重の変化率（％）を示している。
【図１９Ａ】無胸腺ヌードマウスにおける配列番号１０５、配列番号１０３、及び配列番号１８４に示されるアミノ酸配列を含む本開示のペプチド−薬物複合体で使用されたペプチドの組織蓄積及び保持を示している。１４ＣホルムアルデヒドでのＮ末端の還元的メチル化によって合成ペプチドを放射性標識した。１つの時点当たり２匹のマウスを１２．４μＣｉのペプチド（およそ１００ｎｍｏｌまたは１８ｍｇ／ｋｇ）でＩＶ注射し、次いで０．０８、０．５、１、３、８、２４、４８、７２、または９６時間で安楽死させ、続いて定量的全身オートラジオグラフィ分析をした。線形時間スケールを使用した膝における配列番号１０５、配列番号１０３、及び配列番号１８４に示されるアミノ酸配列を含むペプチドの蓄積及び保持を示している。
【図１９Ｂ】無胸腺ヌードマウスにおける配列番号１０５、配列番号１０３、及び配列番号１８４に示されるアミノ酸配列を含む本開示のペプチド−薬物複合体で使用されたペプチドの組織蓄積及び保持を示している。１４ＣホルムアルデヒドでのＮ末端の還元的メチル化によって合成ペプチドを放射性標識した。１つの時点当たり２匹のマウスを１２．４μＣｉのペプチド（およそ１００ｎｍｏｌまたは１８ｍｇ／ｋｇ）でＩＶ注射し、次いで０．０８、０．５、１、３、８、２４、４８、７２、または９６時間で安楽死させ、続いて定量的全身オートラジオグラフィ分析をした。対数時間スケールを使用した膝における配列番号１０５、配列番号１０３、及び配列番号１８４に示されるアミノ酸配列を含むペプチドの蓄積及び保持を示している。
【図１９Ｃ】無胸腺ヌードマウスにおける配列番号１０５、配列番号１０３、及び配列番号１８４に示されるアミノ酸配列を含む本開示のペプチド−薬物複合体で使用されたペプチドの組織蓄積及び保持を示している。１４ＣホルムアルデヒドでのＮ末端の還元的メチル化によって合成ペプチドを放射性標識した。１つの時点当たり２匹のマウスを１２．４μＣｉのペプチド（およそ１００ｎｍｏｌまたは１８ｍｇ／ｋｇ）でＩＶ注射し、次いで０．０８、０．５、１、３、８、２４、４８、７２、または９６時間で安楽死させ、続いて定量的全身オートラジオグラフィ分析をした。線形時間スケールを使用した椎間板（ＩＶＤ）における配列番号１０５、配列番号１０３、及び配列番号１８４に示されるアミノ酸配列を含むペプチドの蓄積及び保持を示している。
【図１９Ｄ】無胸腺ヌードマウスにおける配列番号１０５、配列番号１０３、及び配列番号１８４に示されるアミノ酸配列を含む本開示のペプチド−薬物複合体で使用されたペプチドの組織蓄積及び保持を示している。１４ＣホルムアルデヒドでのＮ末端の還元的メチル化によって合成ペプチドを放射性標識した。１つの時点当たり２匹のマウスを１２．４μＣｉのペプチド（およそ１００ｎｍｏｌまたは１８ｍｇ／ｋｇ）でＩＶ注射し、次いで０．０８、０．５、１、３、８、２４、４８、７２、または９６時間で安楽死させ、続いて定量的全身オートラジオグラフィ分析をした。対数時間スケールを使用したＩＶＤにおける配列番号１０５、配列番号１０３、及び配列番号１８４に示されるアミノ酸配列を含むペプチドの蓄積及び保持を示している。
【図２０Ａ】ペプチドのみの対照（ペプチド（配列番号１０５））、薬物のみの対照（Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）、ペプチド−薬物複合体（ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、またはビヒクルのいずれかでそれぞれ処置されたＣ５７Ｂｌ／６マウスから得られた膝切片での抗ペプチド（配列番号１０５）抗体または抗Ｄｅｘ抗体を使用した免疫組織化学の結果を示している。各処置群からの切片を抗ペプチド（配列番号１０５）抗体（第１のカラム）、抗Ｄｅｘ抗体（第２のカラム）、及びトルイジンブルー（第３のカラム）で染色した。抗原賦活化は、プロテアーゼ３エンドペプチダーゼ（Ｒｏｃｈｅ、７６０−２０２０）を使用して実施した。一次抗体をカゼインを有する抗体希釈液（Ｒｏｃｈｅ、７６０−２１９）に１：２００（Ｄｅｘ  Ａｂ）及び１：１００（抗ペプチド（配列番号１０５）−Ａｂ）の希釈率で希釈した。抗ウサギＨＱ（ハプテン）（Ｒｏｃｈｅ、７６０−４８１５）、抗ＨＱ−ＨＲＰ（ワサビペルオキシダーゼ）（Ｒｏｃｈｅ、７６０−４８２０）、及びＣｈｒｏｍｏＭａｐ  ＤＡＢ気質（Ｒｏｃｈｅ、７６０−１５９）を使用して抗原を検出した。ペプチドのみの対照のペプチド（配列番号１０５）の処置後の抗ペプチド（配列番号１０５）抗体での免疫組織化学を使用した膝切片を示しており、軟骨におけるペプチドの局在化を示している。
【図２０Ｂ】ペプチドのみの対照（ペプチド（配列番号１０５））、薬物のみの対照（Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）、ペプチド−薬物複合体（ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、またはビヒクルのいずれかでそれぞれ処置されたＣ５７Ｂｌ／６マウスから得られた膝切片での抗ペプチド（配列番号１０５）抗体または抗Ｄｅｘ抗体を使用した免疫組織化学の結果を示している。各処置群からの切片を抗ペプチド（配列番号１０５）抗体（第１のカラム）、抗Ｄｅｘ抗体（第２のカラム）、及びトルイジンブルー（第３のカラム）で染色した。抗原賦活化は、プロテアーゼ３エンドペプチダーゼ（Ｒｏｃｈｅ、７６０−２０２０）を使用して実施した。一次抗体をカゼインを有する抗体希釈液（Ｒｏｃｈｅ、７６０−２１９）に１：２００（Ｄｅｘ  Ａｂ）及び１：１００（抗ペプチド（配列番号１０５）−Ａｂ）の希釈率で希釈した。抗ウサギＨＱ（ハプテン）（Ｒｏｃｈｅ、７６０−４８１５）、抗ＨＱ−ＨＲＰ（ワサビペルオキシダーゼ）（Ｒｏｃｈｅ、７６０−４８２０）、及びＣｈｒｏｍｏＭａｐ  ＤＡＢ気質（Ｒｏｃｈｅ、７６０−１５９）を使用して抗原を検出した。ペプチドのみの対照のペプチド（配列番号１０５）での処置後の抗Ｄｅｘ抗体での免疫組織化学を使用した膝切片を示しており、抗Ｄｅｘ抗体がペプチドに結合しないことを確認している。
【図２０Ｃ】ペプチドのみの対照（ペプチド（配列番号１０５））、薬物のみの対照（Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）、ペプチド−薬物複合体（ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、またはビヒクルのいずれかでそれぞれ処置されたＣ５７Ｂｌ／６マウスから得られた膝切片での抗ペプチド（配列番号１０５）抗体または抗Ｄｅｘ抗体を使用した免疫組織化学の結果を示している。各処置群からの切片を抗ペプチド（配列番号１０５）抗体（第１のカラム）、抗Ｄｅｘ抗体（第２のカラム）、及びトルイジンブルー（第３のカラム）で染色した。抗原賦活化は、プロテアーゼ３エンドペプチダーゼ（Ｒｏｃｈｅ、７６０−２０２０）を使用して実施した。一次抗体をカゼインを有する抗体希釈液（Ｒｏｃｈｅ、７６０−２１９）に１：２００（Ｄｅｘ  Ａｂ）及び１：１００（抗ペプチド（配列番号１０５）−Ａｂ）の希釈率で希釈した。抗ウサギＨＱ（ハプテン）（Ｒｏｃｈｅ、７６０−４８１５）、抗ＨＱ−ＨＲＰ（ワサビペルオキシダーゼ）（Ｒｏｃｈｅ、７６０−４８２０）、及びＣｈｒｏｍｏＭａｐ  ＤＡＢ気質（Ｒｏｃｈｅ、７６０−１５９）を使用して抗原を検出した。ペプチドのみの対照のペプチド（配列番号１０５）での処置後のトルイジンブルーでの染色を使用した膝切片を示している。トルイジンブルーは、軟骨におけるプロテオグリカンを染色する。ａ
【図２０Ｄ】ペプチドのみの対照（ペプチド（配列番号１０５））、薬物のみの対照（Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）、ペプチド−薬物複合体（ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、またはビヒクルのいずれかでそれぞれ処置されたＣ５７Ｂｌ／６マウスから得られた膝切片での抗ペプチド（配列番号１０５）抗体または抗Ｄｅｘ抗体を使用した免疫組織化学の結果を示している。各処置群からの切片を抗ペプチド（配列番号１０５）抗体（第１のカラム）、抗Ｄｅｘ抗体（第２のカラム）、及びトルイジンブルー（第３のカラム）で染色した。抗原賦活化は、プロテアーゼ３エンドペプチダーゼ（Ｒｏｃｈｅ、７６０−２０２０）を使用して実施した。一次抗体をカゼインを有する抗体希釈液（Ｒｏｃｈｅ、７６０−２１９）に１：２００（Ｄｅｘ  Ａｂ）及び１：１００（抗ペプチド（配列番号１０５）−Ａｂ）の希釈率で希釈した。抗ウサギＨＱ（ハプテン）（Ｒｏｃｈｅ、７６０−４８１５）、抗ＨＱ−ＨＲＰ（ワサビペルオキシダーゼ）（Ｒｏｃｈｅ、７６０−４８２０）、及びＣｈｒｏｍｏＭａｐ  ＤＡＢ気質（Ｒｏｃｈｅ、７６０−１５９）を使用して抗原を検出した。薬物のみの対照のＣｙｓ−Ｄｅｘでの処置後の抗ペプチド（配列番号１０５）抗体での免疫組織化学を使用した膝切片を示しており、抗ペプチド抗体が薬物（すなわち、Ｄｅｘ）に結合しないことを確認している。
【図２０Ｅ】ペプチドのみの対照（ペプチド（配列番号１０５））、薬物のみの対照（Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）、ペプチド−薬物複合体（ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、またはビヒクルのいずれかでそれぞれ処置されたＣ５７Ｂｌ／６マウスから得られた膝切片での抗ペプチド（配列番号１０５）抗体または抗Ｄｅｘ抗体を使用した免疫組織化学の結果を示している。各処置群からの切片を抗ペプチド（配列番号１０５）抗体（第１のカラム）、抗Ｄｅｘ抗体（第２のカラム）、及びトルイジンブルー（第３のカラム）で染色した。抗原賦活化は、プロテアーゼ３エンドペプチダーゼ（Ｒｏｃｈｅ、７６０−２０２０）を使用して実施した。一次抗体をカゼインを有する抗体希釈液（Ｒｏｃｈｅ、７６０−２１９）に１：２００（Ｄｅｘ  Ａｂ）及び１：１００（抗ペプチド（配列番号１０５）−Ａｂ）の希釈率で希釈した。抗ウサギＨＱ（ハプテン）（Ｒｏｃｈｅ、７６０−４８１５）、抗ＨＱ−ＨＲＰ（ワサビペルオキシダーゼ）（Ｒｏｃｈｅ、７６０−４８２０）、及びＣｈｒｏｍｏＭａｐ  ＤＡＢ気質（Ｒｏｃｈｅ、７６０−１５９）を使用して抗原を検出した。Ｃｙｓ−Ｄｅｘでの処置後の抗Ｄｅｘ抗体での免疫組織化学を使用した膝切片を示しており、薬物単独では軟骨に蓄積しなかったことを示している。
【図２０Ｆ】ペプチドのみの対照（ペプチド（配列番号１０５））、薬物のみの対照（Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）、ペプチド−薬物複合体（ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、またはビヒクルのいずれかでそれぞれ処置されたＣ５７Ｂｌ／６マウスから得られた膝切片での抗ペプチド（配列番号１０５）抗体または抗Ｄｅｘ抗体を使用した免疫組織化学の結果を示している。各処置群からの切片を抗ペプチド（配列番号１０５）抗体（第１のカラム）、抗Ｄｅｘ抗体（第２のカラム）、及びトルイジンブルー（第３のカラム）で染色した。抗原賦活化は、プロテアーゼ３エンドペプチダーゼ（Ｒｏｃｈｅ、７６０−２０２０）を使用して実施した。一次抗体をカゼインを有する抗体希釈液（Ｒｏｃｈｅ、７６０−２１９）に１：２００（Ｄｅｘ  Ａｂ）及び１：１００（抗ペプチド（配列番号１０５）−Ａｂ）の希釈率で希釈した。抗ウサギＨＱ（ハプテン）（Ｒｏｃｈｅ、７６０−４８１５）、抗ＨＱ−ＨＲＰ（ワサビペルオキシダーゼ）（Ｒｏｃｈｅ、７６０−４８２０）、及びＣｈｒｏｍｏＭａｐ  ＤＡＢ気質（Ｒｏｃｈｅ、７６０−１５９）を使用して抗原を検出した。Ｃｙｓ−Ｄｅｘでの処置後のトルイジンブルーでの染色を使用した膝切片を示している。
【図２０Ｇ】ペプチドのみの対照（ペプチド（配列番号１０５））、薬物のみの対照（Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）、ペプチド−薬物複合体（ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、またはビヒクルのいずれかでそれぞれ処置されたＣ５７Ｂｌ／６マウスから得られた膝切片での抗ペプチド（配列番号１０５）抗体または抗Ｄｅｘ抗体を使用した免疫組織化学の結果を示している。各処置群からの切片を抗ペプチド（配列番号１０５）抗体（第１のカラム）、抗Ｄｅｘ抗体（第２のカラム）、及びトルイジンブルー（第３のカラム）で染色した。抗原賦活化は、プロテアーゼ３エンドペプチダーゼ（Ｒｏｃｈｅ、７６０−２０２０）を使用して実施した。一次抗体をカゼインを有する抗体希釈液（Ｒｏｃｈｅ、７６０−２１９）に１：２００（Ｄｅｘ  Ａｂ）及び１：１００（抗ペプチド（配列番号１０５）−Ａｂ）の希釈率で希釈した。抗ウサギＨＱ（ハプテン）（Ｒｏｃｈｅ、７６０−４８１５）、抗ＨＱ−ＨＲＰ（ワサビペルオキシダーゼ）（Ｒｏｃｈｅ、７６０−４８２０）、及びＣｈｒｏｍｏＭａｐ  ＤＡＢ気質（Ｒｏｃｈｅ、７６０−１５９）を使用して抗原を検出した。ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）での処置後の抗ペプチド（配列番号１０５）抗体での免疫組織化学を使用した膝切片を示しており、ペプチド−薬物複合体が軟骨に蓄積したことを示している。
【図２０Ｈ】ペプチドのみの対照（ペプチド（配列番号１０５））、薬物のみの対照（Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）、ペプチド−薬物複合体（ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、またはビヒクルのいずれかでそれぞれ処置されたＣ５７Ｂｌ／６マウスから得られた膝切片での抗ペプチド（配列番号１０５）抗体または抗Ｄｅｘ抗体を使用した免疫組織化学の結果を示している。各処置群からの切片を抗ペプチド（配列番号１０５）抗体（第１のカラム）、抗Ｄｅｘ抗体（第２のカラム）、及びトルイジンブルー（第３のカラム）で染色した。抗原賦活化は、プロテアーゼ３エンドペプチダーゼ（Ｒｏｃｈｅ、７６０−２０２０）を使用して実施した。一次抗体をカゼインを有する抗体希釈液（Ｒｏｃｈｅ、７６０−２１９）に１：２００（Ｄｅｘ  Ａｂ）及び１：１００（抗ペプチド（配列番号１０５）−Ａｂ）の希釈率で希釈した。抗ウサギＨＱ（ハプテン）（Ｒｏｃｈｅ、７６０−４８１５）、抗ＨＱ−ＨＲＰ（ワサビペルオキシダーゼ）（Ｒｏｃｈｅ、７６０−４８２０）、及びＣｈｒｏｍｏＭａｐ  ＤＡＢ気質（Ｒｏｃｈｅ、７６０−１５９）を使用して抗原を検出した。ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）での処置後の抗Ｄｅｘ抗体での免疫組織化学を使用した膝切片を示しており、抗Ｄｅｘ抗体が薬物に結合し、ペプチド−薬物複合体が軟骨に蓄積したことを示しており、ペプチドが薬物（すなわち、Ｄｅｘ）を軟骨に送達したことを示している。
【図２０Ｉ】ペプチドのみの対照（ペプチド（配列番号１０５））、薬物のみの対照（Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）、ペプチド−薬物複合体（ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、またはビヒクルのいずれかでそれぞれ処置されたＣ５７Ｂｌ／６マウスから得られた膝切片での抗ペプチド（配列番号１０５）抗体または抗Ｄｅｘ抗体を使用した免疫組織化学の結果を示している。各処置群からの切片を抗ペプチド（配列番号１０５）抗体（第１のカラム）、抗Ｄｅｘ抗体（第２のカラム）、及びトルイジンブルー（第３のカラム）で染色した。抗原賦活化は、プロテアーゼ３エンドペプチダーゼ（Ｒｏｃｈｅ、７６０−２０２０）を使用して実施した。一次抗体をカゼインを有する抗体希釈液（Ｒｏｃｈｅ、７６０−２１９）に１：２００（Ｄｅｘ  Ａｂ）及び１：１００（抗ペプチド（配列番号１０５）−Ａｂ）の希釈率で希釈した。抗ウサギＨＱ（ハプテン）（Ｒｏｃｈｅ、７６０−４８１５）、抗ＨＱ−ＨＲＰ（ワサビペルオキシダーゼ）（Ｒｏｃｈｅ、７６０−４８２０）、及びＣｈｒｏｍｏＭａｐ  ＤＡＢ気質（Ｒｏｃｈｅ、７６０−１５９）を使用して抗原を検出した。ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）での処置後のトルイジンブルーでの染色を使用した膝切片を示している。トルイジンブルーは、軟骨におけるプロテオグリカンを染色する。
【図２０Ｊ】ペプチドのみの対照（ペプチド（配列番号１０５））、薬物のみの対照（Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）、ペプチド−薬物複合体（ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、またはビヒクルのいずれかでそれぞれ処置されたＣ５７Ｂｌ／６マウスから得られた膝切片での抗ペプチド（配列番号１０５）抗体または抗Ｄｅｘ抗体を使用した免疫組織化学の結果を示している。各処置群からの切片を抗ペプチド（配列番号１０５）抗体（第１のカラム）、抗Ｄｅｘ抗体（第２のカラム）、及びトルイジンブルー（第３のカラム）で染色した。抗原賦活化は、プロテアーゼ３エンドペプチダーゼ（Ｒｏｃｈｅ、７６０−２０２０）を使用して実施した。一次抗体をカゼインを有する抗体希釈液（Ｒｏｃｈｅ、７６０−２１９）に１：２００（Ｄｅｘ  Ａｂ）及び１：１００（抗ペプチド（配列番号１０５）−Ａｂ）の希釈率で希釈した。抗ウサギＨＱ（ハプテン）（Ｒｏｃｈｅ、７６０−４８１５）、抗ＨＱ−ＨＲＰ（ワサビペルオキシダーゼ）（Ｒｏｃｈｅ、７６０−４８２０）、及びＣｈｒｏｍｏＭａｐ  ＤＡＢ気質（Ｒｏｃｈｅ、７６０−１５９）を使用して抗原を検出した。ビヒクルでの処置後の抗ペプチド（配列番号１０５）抗体での免疫組織化学を使用した膝切片を示しており、抗ペプチド抗体が軟骨に非特異的に結合しないことを示している。
【図２０Ｋ】ペプチドのみの対照（ペプチド（配列番号１０５））、薬物のみの対照（Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）、ペプチド−薬物複合体（ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、またはビヒクルのいずれかでそれぞれ処置されたＣ５７Ｂｌ／６マウスから得られた膝切片での抗ペプチド（配列番号１０５）抗体または抗Ｄｅｘ抗体を使用した免疫組織化学の結果を示している。各処置群からの切片を抗ペプチド（配列番号１０５）抗体（第１のカラム）、抗Ｄｅｘ抗体（第２のカラム）、及びトルイジンブルー（第３のカラム）で染色した。抗原賦活化は、プロテアーゼ３エンドペプチダーゼ（Ｒｏｃｈｅ、７６０−２０２０）を使用して実施した。一次抗体をカゼインを有する抗体希釈液（Ｒｏｃｈｅ、７６０−２１９）に１：２００（Ｄｅｘ  Ａｂ）及び１：１００（抗ペプチド（配列番号１０５）−Ａｂ）の希釈率で希釈した。抗ウサギＨＱ（ハプテン）（Ｒｏｃｈｅ、７６０−４８１５）、抗ＨＱ−ＨＲＰ（ワサビペルオキシダーゼ）（Ｒｏｃｈｅ、７６０−４８２０）、及びＣｈｒｏｍｏＭａｐ  ＤＡＢ気質（Ｒｏｃｈｅ、７６０−１５９）を使用して抗原を検出した。ビヒクルでの処置後の抗Ｄｅｘ抗体での免疫組織化学を使用した膝切片を示しており、抗Ｄｅｘ抗体が軟骨に非特異的に結合しないことを示している。
【図２０Ｌ】ペプチドのみの対照（ペプチド（配列番号１０５））、薬物のみの対照（Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）、ペプチド−薬物複合体（ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）、またはビヒクルのいずれかでそれぞれ処置されたＣ５７Ｂｌ／６マウスから得られた膝切片での抗ペプチド（配列番号１０５）抗体または抗Ｄｅｘ抗体を使用した免疫組織化学の結果を示している。各処置群からの切片を抗ペプチド（配列番号１０５）抗体（第１のカラム）、抗Ｄｅｘ抗体（第２のカラム）、及びトルイジンブルー（第３のカラム）で染色した。抗原賦活化は、プロテアーゼ３エンドペプチダーゼ（Ｒｏｃｈｅ、７６０−２０２０）を使用して実施した。一次抗体をカゼインを有する抗体希釈液（Ｒｏｃｈｅ、７６０−２１９）に１：２００（Ｄｅｘ  Ａｂ）及び１：１００（抗ペプチド（配列番号１０５）−Ａｂ）の希釈率で希釈した。抗ウサギＨＱ（ハプテン）（Ｒｏｃｈｅ、７６０−４８１５）、抗ＨＱ−ＨＲＰ（ワサビペルオキシダーゼ）（Ｒｏｃｈｅ、７６０−４８２０）、及びＣｈｒｏｍｏＭａｐ  ＤＡＢ気質（Ｒｏｃｈｅ、７６０−１５９）を使用して抗原を検出した。ビヒクルでの処置後のトルイジンブルーでの染色を使用した膝切片を示している。トルイジンブルーは、軟骨におけるプロテオグリカンを染色し、この図２０Ｌは、図２０Ｃ、図２０Ｉ、及び図２０Ｆと一緒に、すべての処置群からの膝切片における一貫したプロテオグリカン含有量を示している。
【図２１Ａ】ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）で処置された動物から得られた膝切片における染色の分布を示している。上の列（図２１Ａ）：抗ペプチド（配列番号１０５）−抗体染色；中段の列（図２１Ｂ）：抗Ｄｅｘ抗体染色；下の列（図２１Ｃ）：Ｈ＆Ｅ染色。抗ペプチド（配列番号１０５）抗体染色を使用して、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）で処置された動物から得られた膝切片における染色の生体内分布を示している。
【図２１Ｂ】ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）で処置された動物から得られた膝切片における染色の分布を示している。上の列（図２１Ａ）：抗ペプチド（配列番号１０５）−抗体染色；中段の列（図２１Ｂ）：抗Ｄｅｘ抗体染色；下の列（図２１Ｃ）：Ｈ＆Ｅ染色。抗Ｄｅｘ抗体染色を使用して、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）で処置された動物から得られた膝切片における染色の分布を示している。
【図２１Ｃ】ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）で処置された動物から得られた膝切片における染色の分布を示している。上の列（図２１Ａ）：抗ペプチド（配列番号１０５）−抗体染色；中段の列（図２１Ｂ）：抗Ｄｅｘ抗体染色；下の列（図２１Ｃ）：Ｈ＆Ｅ染色。Ｈ＆Ｅ染色を使用して、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）で処置された動物から得られた膝切片における染色の分布を示している。黒色矢印は、非石灰化及び石灰化軟骨間の境界を画定するＨ＆Ｅ切片で視認可能なタイドマークを示している。
【図２２Ａ】放射性標識されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）または放射性標識された薬物のみの対照の１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘの軟骨（膝及びＩＶＤ、図２２Ａ）及び他の組織（血液、筋肉、肝臓、腎臓、及び骨髄、図２２Ｂ）における「ｎｍｏｌ化合物／ｇ組織」として示される蓄積のＱＷＢＡ分析を示している。「＋」は、１匹の動物からのデータが、ＬＬＯＱよりも低い定量値、またはその動物からの切片における組織の不存在のいずれかにより、組織の分析において除外された場合を表す。＋＋は、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ処置群（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）における両方の動物が、ＬＬＯＱよりも低い定量値、またはその動物からの切片における組織の不存在により、組織の分析において除外された場合を表す。点線は、どの組織が１を超える組織対膝軟骨比を有するかを示すために挿入されている。薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘまたはペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）のＩＶ投与後１時間、３時間、及び２４時間での膝及びＩＶＤの軟骨における蓄積を示している。
【図２２Ｂ】放射性標識されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）または放射性標識された薬物のみの対照の１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘの軟骨（膝及びＩＶＤ、図２２Ａ）及び他の組織（血液、筋肉、肝臓、腎臓、及び骨髄、図２２Ｂ）における「ｎｍｏｌ化合物／ｇ組織」として示される蓄積のＱＷＢＡ分析を示している。「＋」は、１匹の動物からのデータが、ＬＬＯＱよりも低い定量値、またはその動物からの切片における組織の不存在のいずれかにより、組織の分析において除外された場合を表す。＋＋は、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ処置群（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）における両方の動物が、ＬＬＯＱよりも低い定量値、またはその動物からの切片における組織の不存在により、組織の分析において除外された場合を表す。点線は、どの組織が１を超える組織対膝軟骨比を有するかを示すために挿入されている。薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘまたはペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）のＩＶ投与後１時間、３時間、及び２４時間での様々な他の組織（血液、筋肉、肝臓、腎臓、骨髄）における蓄積を示している。
【図２２Ｃ】放射性標識されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）または放射性標識された薬物のみの対照の１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘの軟骨（膝及びＩＶＤ、図２２Ａ）及び他の組織（血液、筋肉、肝臓、腎臓、及び骨髄、図２２Ｂ）における「ｎｍｏｌ化合物／ｇ組織」として示される蓄積のＱＷＢＡ分析を示している。「＋」は、１匹の動物からのデータが、ＬＬＯＱよりも低い定量値、またはその動物からの切片における組織の不存在のいずれかにより、組織の分析において除外された場合を表す。＋＋は、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ処置群（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）における両方の動物が、ＬＬＯＱよりも低い定量値、またはその動物からの切片における組織の不存在により、組織の分析において除外された場合を表す。点線は、どの組織が１を超える組織対膝軟骨比を有するかを示すために挿入されている。投与後１時間、３時間、及び２４時間での薬物のみの対照１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘまたはペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の膝の軟骨における蓄積に対する様々な組織における蓄積の比（組織対膝軟骨）を示している。
【図２３Ａ】ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ複合体（４６）の合成及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ加水分解を示している。ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ（４６）の合成を示している。簡潔には、ジメチルエステルの水酸化リチウムでの加水分解によりジメチルアジピン酸（ＤＭＡ）を得た。これを、ジクロロメタン中でＮ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）及びＮ，Ｎ’−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下で一晩、ＬＣ−ＭＳモニタリングをしながらｄＣＩＣと反応させた。得られたカルボン酸をスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（スルホ−ＮＨＳ）として活性化してから、軽度の塩基性条件下でＤＭＳＯ中でペプチドのＮ末端と反応させて最終化合物を提供し、これを分取ＨＰＬＣによって精製し、凍結し、凍結乾燥させて、生成物を白色のフォームとして得た
【図２３Ｂ】ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ複合体（４６）の合成及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ加水分解を示している。ラット血漿におけるペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ複合体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ加水分解速度を示している。ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣをラット血漿中で３７℃でインキュベートした。サンプルを一定間隔で除去し、溶媒抽出によって処理し、ＬＣ／ＭＳによって分析して遊離ｄＣＩＣを定量化した。１つの時点当たり３連で５分〜５６時間で１１個の時点を測定した。アッセイは２回繰り返した。最初のアッセイは、ｄＣＩＣのアセトニトリル抽出を使用して、上記で図２に記載されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘについてのものと同じ加水分解手順を使用して行い、半減期は８．５時間として計算された。２番目のアッセイは、ｄＣＩＣの酢酸エチル抽出を用いた最適化された回収プロトコルを使用し、半減期は５時間として計算された。
【図２４】ＩＬ−１βを負荷したラットの膝関節におけるＰＤ炎症マーカーＩＬ−６の評価を示している。末端滑液をすべての動物から採取し、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ  ＭＡＰ  ラットサイトカイン／ケモカイン磁性パネル（ＲＥＣＹＴＭＡＧ−６５Ｋ）を使用してＩＬ−６サイトカイン濃度についてＬｕｍｉｎｅｘ２００によって分析した。ＩＬ−６レベルを、ブラッドフォードアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓアッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２３２３６）によって測定した総タンパク質レベル（総タンパク質（［μｇ］）に対するＩＬ−６（［ｐｇ］）として測定した）に正規化した。１回の用量でｄＣＩＣの関節内注射を受けた１つの群（「１２７４＃」と表記される）を除き、すべての処置を尾静脈を介して静脈内投与した（１．６７ｍｌ／ｋｇ）。処置群は、以下の試験品を含んでいた：（ｉ）ＩＬ−１βなし陰性対照（「ＩＬ−１ｂなし」と表記される）；（ｉｉ）ペプチド−薬物複合体についてのビヒクルのみの対照（「ビヒクル（ＰＤＣ）」と表記され、これはＰＢＳ中５％のＤＭＳＯであった）；（ｉｉｉ）ｄＣＩＣについてのビヒクルのみの対照（ＰＢＳ中に４０％のプロピレングリコール、５％のＤＭＳＯ、「ビヒクル（ｄＣＩＣ）」と表記される）；（ｉｖ）１２７４ｎｍｏｌ／ｋｇ及び１２７ｎｍｏｌ／ｋｇでの２つの用量レベルのデキサメタゾンリン酸エステルナトリウム、すなわち、ＤｅｘＳＰ（「Ｄｅｘ」と表記される）（「Ｄｅｘ」に関してそれぞれ「１２７４」及び「１２７」と表記される）；（ｖ）１２７４ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＡ、１２７４ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＶ、１２７ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＶの３つの用量レベルのｄＣＩＣ（「ｄＣＩＣ」に関してそれぞれ「１２７４＃」、「１２７４」及び「１２７」と表記される）；ならびに（ｖｉ）３つの用量レベルのペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ（１２７ｎｍｏｌ／ｋｇ、５１ｎｍｏｌ／ｋｇ、及び１３ｎｍｏｌ／ｋｇ）（「ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ」に関してそれぞれ「１２７」、「５１」及び「１３」と表記される）、（ｉ）〜（ｖｉ）の各々は１つの用量群当たりｎ＝５の動物を有していた。用量は、ｎｍｏｌ／ｋｇとして列挙されている。
【図２５Ａ】用量範囲試験の一部としてのラットの血液中のステロイド曝露のバイオマーカーの評価を示している。ｄＣＩＣの関節内注射を受けた１つの群（「１２７４＃」と表記される）を除き、すべての処置を尾静脈を介して静脈内投与した（１．６７ｍｌ／ｋｇ）。処置群は、以下の試験品を含んでいた：（ｉ）ＩＬ−１βなし陰性対照（「ＩＬ−１ｂなし」と表記される）；（ｉｉ）ペプチド−薬物複合体についてのビヒクルのみの対照（「ビヒクル（ＰＤＣ）」と表記され、これはＰＢＳ中５％のＤＭＳＯであった）；（ｉｉｉ）ｄＣＩＣについてのビヒクルのみの対照（ＰＢＳ中に４０％のプロピレングリコール、５％のＤＭＳＯ、「ビヒクル（ｄＣＩＣ）」と表記される）；（ｉｖ）１２７４ｎｍｏｌ／ｋｇ及び１２７ｎｍｏｌ／ｋｇでの２つの用量レベルのデキサメタゾンリン酸エステルナトリウム、すなわち、ＤｅｘＳＰ（「Ｄｅｘ」と表記される）（「Ｄｅｘ」に関してそれぞれ「１２７４」及び「１２７」と表記される）；（ｖ）１２７４ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＡ、１２７４ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＶ、１２７ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＶの３つの用量レベルのｄＣＩＣ（「ｄＣＩＣ」に関してそれぞれ「１２７４＃」、「１２７４」及び「１２７」と表記される）；ならびに（ｖｉ）３つの用量レベルのペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ（１２７ｎｍｏｌ／ｋｇ、５１ｎｍｏｌ／ｋｇ、及び１３ｎｍｏｌ／ｋｇ）（「ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ」に関してそれぞれ「１２７」、「５１」及び「１３」と表記される）、（ｉ）〜（ｖｉ）の各々は１つの用量群当たりｎ＝５の動物を有していた。用量は、ｎｍｏｌ／ｋｇとして列挙されている。それぞれの試験品での処置から２．７５時間後でのＣＢＣ分析によって測定されたリンパ球数を示している。
【図２５Ｂ】用量範囲試験の一部としてのラットの血液中のステロイド曝露のバイオマーカーの評価を示している。ｄＣＩＣの関節内注射を受けた１つの群（「１２７４＃」と表記される）を除き、すべての処置を尾静脈を介して静脈内投与した（１．６７ｍｌ／ｋｇ）。処置群は、以下の試験品を含んでいた：（ｉ）ＩＬ−１βなし陰性対照（「ＩＬ−１ｂなし」と表記される）；（ｉｉ）ペプチド−薬物複合体についてのビヒクルのみの対照（「ビヒクル（ＰＤＣ）」と表記され、これはＰＢＳ中５％のＤＭＳＯであった）；（ｉｉｉ）ｄＣＩＣについてのビヒクルのみの対照（ＰＢＳ中に４０％のプロピレングリコール、５％のＤＭＳＯ、「ビヒクル（ｄＣＩＣ）」と表記される）；（ｉｖ）１２７４ｎｍｏｌ／ｋｇ及び１２７ｎｍｏｌ／ｋｇでの２つの用量レベルのデキサメタゾンリン酸エステルナトリウム、すなわち、ＤｅｘＳＰ（「Ｄｅｘ」と表記される）（「Ｄｅｘ」に関してそれぞれ「１２７４」及び「１２７」と表記される）；（ｖ）１２７４ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＡ、１２７４ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＶ、１２７ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＶの３つの用量レベルのｄＣＩＣ（「ｄＣＩＣ」に関してそれぞれ「１２７４＃」、「１２７４」及び「１２７」と表記される）；ならびに（ｖｉ）３つの用量レベルのペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ（１２７ｎｍｏｌ／ｋｇ、５１ｎｍｏｌ／ｋｇ、及び１３ｎｍｏｌ／ｋｇ）（「ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ」に関してそれぞれ「１２７」、「５１」及び「１３」と表記される）、（ｉ）〜（ｖｉ）の各々は１つの用量群当たりｎ＝５の動物を有していた。用量は、ｎｍｏｌ／ｋｇとして列挙されている。安楽死時（ＩＬ−１βのＩＡ注射から４時間後、それぞれの試験品での処置から７時間後）のＣＢＣ分析によって測定されたリンパ球数を示している。
【図２６Ａ】実施例３１における表１６に示された用量レベルを使用して処置から２．７５時間後でのＣＢＣ分析によって測定された好中球数及び単球数を示している（＃はＩＡ注射を表す。他のすべての処置はＩＶで投与した）。ｄＣＩＣの関節内注射を受けた１つの群（「１２７４＃」と表記される）を除き、すべての処置を尾静脈を介して静脈内投与した（１．６７ｍｌ／ｋｇ）。処置群は、以下の試験品を含んでいた：（ｉ）ＩＬ−１βなし陰性対照（「ＩＬ−１ｂなし」と表記される）；（ｉｉ）ペプチド−薬物複合体についてのビヒクルのみの対照（「ビヒクル（ＰＤＣ）」と表記され、これはＰＢＳ中５％のＤＭＳＯであった）；（ｉｉｉ）ｄＣＩＣについてのビヒクルのみの対照（ＰＢＳ中に４０％のプロピレングリコール、５％のＤＭＳＯ、「ビヒクル（ｄＣＩＣ）」と表記される）；（ｉｖ）１２７４ｎｍｏｌ／ｋｇ及び１２７ｎｍｏｌ／ｋｇでの２つの用量レベルのデキサメタゾンリン酸エステルナトリウム、すなわち、ＤｅｘＳＰ（「Ｄｅｘ」と表記される）（「Ｄｅｘ」に関してそれぞれ「１２７４」及び「１２７」と表記される）；（ｖ）１２７４ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＡ、１２７４ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＶ、１２７ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＶの３つの用量レベルのｄＣＩＣ（「ｄＣＩＣ」に関してそれぞれ「１２７４＃」、「１２７４」及び「１２７」と表記される）；ならびに（ｖｉ）４つの用量レベルのペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ（５１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、１２７ｎｍｏｌ／ｋｇ、５１ｎｍｏｌ／ｋｇ、及び１３ｎｍｏｌ／ｋｇ）（「ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ」に関してそれぞれ「５１０」、「１２７」、「５１」及び「１３」と表記される）、（ｉ）〜（ｖｉ）の各々は１つの用量群当たりｎ＝５の動物を有していた。用量は、ｎｍｏｌ／ｋｇとして列挙されている。それぞれの試験品での処置から２．７５時間後でのＣＢＣ分析によって測定された好中球数を示している。
【図２６Ｂ】実施例３１における表１６に示された用量レベルを使用して処置から２．７５時間後でのＣＢＣ分析によって測定された好中球数及び単球数を示している（＃はＩＡ注射を表す。他のすべての処置はＩＶで投与した）。ｄＣＩＣの関節内注射を受けた１つの群（「１２７４＃」と表記される）を除き、すべての処置を尾静脈を介して静脈内投与した（１．６７ｍｌ／ｋｇ）。処置群は、以下の試験品を含んでいた：（ｉ）ＩＬ−１βなし陰性対照（「ＩＬ−１ｂなし」と表記される）；（ｉｉ）ペプチド−薬物複合体についてのビヒクルのみの対照（「ビヒクル（ＰＤＣ）」と表記され、これはＰＢＳ中５％のＤＭＳＯであった）；（ｉｉｉ）ｄＣＩＣについてのビヒクルのみの対照（ＰＢＳ中に４０％のプロピレングリコール、５％のＤＭＳＯ、「ビヒクル（ｄＣＩＣ）」と表記される）；（ｉｖ）１２７４ｎｍｏｌ／ｋｇ及び１２７ｎｍｏｌ／ｋｇでの２つの用量レベルのデキサメタゾンリン酸エステルナトリウム、すなわち、ＤｅｘＳＰ（「Ｄｅｘ」と表記される）（「Ｄｅｘ」に関してそれぞれ「１２７４」及び「１２７」と表記される）；（ｖ）１２７４ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＡ、１２７４ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＶ、１２７ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＶの３つの用量レベルのｄＣＩＣ（「ｄＣＩＣ」に関してそれぞれ「１２７４＃」、「１２７４」及び「１２７」と表記される）；ならびに（ｖｉ）４つの用量レベルのペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ（５１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、１２７ｎｍｏｌ／ｋｇ、５１ｎｍｏｌ／ｋｇ、及び１３ｎｍｏｌ／ｋｇ）（「ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ」に関してそれぞれ「５１０」、「１２７」、「５１」及び「１３」と表記される）、（ｉ）〜（ｖｉ）の各々は１つの用量群当たりｎ＝５の動物を有していた。用量は、ｎｍｏｌ／ｋｇとして列挙されている。それぞれの試験品での処置から２．７５時間後でのＣＢＣ分析によって測定された単球数を示している。
【図２７Ａ】ＰＤ試験の一部としてのラットの血中のステロイド曝露のバイオマーカーの評価を示している（＃は、ＩＡ注射によって投与された用量を表す。他のすべての処置はＩＶで投与された）。処置群は、以下の試験品を含んでいた：（ｉ）ＩＬ−１βなし陰性対照（「ＩＬ−１ｂなし」と表記される）；（ｉｉ）；ペプチド−薬物複合体についてのビヒクルのみの対照（「ビヒクル」と表記される）、これは（ＰＢＳ中５％のＤＭＳＯ）であった；（ｉｉｉ）１２７ｎｍｏｌ／ｋｇでのペプチドのみの対照ペプチド（配列番号１０５）（「ペプチド」に関して「１２７」と表記される）；（ｉｖ）１２７４ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＡ、１２７ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＶ、５１ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＶの３つの用量レベルのｄＣＩＣ（「ｄＣＩＣ」に関してそれぞれ「１２７４＃」、「１２７」及び「５１」と表記される）；ならびに（ｖ）２つの用量レベルのペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ（５１ｎｍｏｌ／ｋｇ、１３ｎｍｏｌ／ｋｇ）（「ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ」に関してそれぞれ「５１」及び「１３」と表記される）、（ｉ）〜（ｖ）の各々は、１つの用量群当たりｎ＝６の動物を有していたＩｌ−１βなし対照及びペプチドのみの対照アームを除き、１つの用量群当たりｎ＝１０の動物を有していた。用量は、ｎｍｏｌ／ｋｇとして列挙されている。統計分析は、Ｈｏｌｍ法を使用した多重比較のための補正を用いてウィルコクソンの順位和検定を使用して行った。（＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．００５、＊＊＊ｐ≦０．０００５、実施例３１を参照されたい）。それぞれの試験品での処置から２．７５時間後でのＣＢＣ分析によって測定された総白血球数を示している。
【図２７Ｂ】ＰＤ試験の一部としてのラットの血中のステロイド曝露のバイオマーカーの評価を示している（＃は、ＩＡ注射によって投与された用量を表す。他のすべての処置はＩＶで投与された）。処置群は、以下の試験品を含んでいた：（ｉ）ＩＬ−１βなし陰性対照（「ＩＬ−１ｂなし」と表記される）；（ｉｉ）；ペプチド−薬物複合体についてのビヒクルのみの対照（「ビヒクル」と表記される）、これは（ＰＢＳ中５％のＤＭＳＯ）であった；（ｉｉｉ）１２７ｎｍｏｌ／ｋｇでのペプチドのみの対照ペプチド（配列番号１０５）（「ペプチド」に関して「１２７」と表記される）；（ｉｖ）１２７４ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＡ、１２７ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＶ、５１ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＶの３つの用量レベルのｄＣＩＣ（「ｄＣＩＣ」に関してそれぞれ「１２７４＃」、「１２７」及び「５１」と表記される）；ならびに（ｖ）２つの用量レベルのペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ（５１ｎｍｏｌ／ｋｇ、１３ｎｍｏｌ／ｋｇ）（「ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ」に関してそれぞれ「５１」及び「１３」と表記される）、（ｉ）〜（ｖ）の各々は、１つの用量群当たりｎ＝６の動物を有していたＩｌ−１βなし対照及びペプチドのみの対照アームを除き、１つの用量群当たりｎ＝１０の動物を有していた。用量は、ｎｍｏｌ／ｋｇとして列挙されている。統計分析は、Ｈｏｌｍ法を使用した多重比較のための補正を用いてウィルコクソンの順位和検定を使用して行った。（＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．００５、＊＊＊ｐ≦０．０００５、実施例３１を参照されたい）。それぞれの試験品での処置から２．７５時間後でのＣＢＣ分析によって測定されたリンパ球数を示している。
【図２７Ｃ】ＰＤ試験の一部としてのラットの血中のステロイド曝露のバイオマーカーの評価を示している（＃は、ＩＡ注射によって投与された用量を表す。他のすべての処置はＩＶで投与された）。処置群は、以下の試験品を含んでいた：（ｉ）ＩＬ−１βなし陰性対照（「ＩＬ−１ｂなし」と表記される）；（ｉｉ）；ペプチド−薬物複合体についてのビヒクルのみの対照（「ビヒクル」と表記される）、これは（ＰＢＳ中５％のＤＭＳＯ）であった；（ｉｉｉ）１２７ｎｍｏｌ／ｋｇでのペプチドのみの対照ペプチド（配列番号１０５）（「ペプチド」に関して「１２７」と表記される）；（ｉｖ）１２７４ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＡ、１２７ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＶ、５１ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＶの３つの用量レベルのｄＣＩＣ（「ｄＣＩＣ」に関してそれぞれ「１２７４＃」、「１２７」及び「５１」と表記される）；ならびに（ｖ）２つの用量レベルのペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ（５１ｎｍｏｌ／ｋｇ、１３ｎｍｏｌ／ｋｇ）（「ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ」に関してそれぞれ「５１」及び「１３」と表記される）、（ｉ）〜（ｖ）の各々は、１つの用量群当たりｎ＝６の動物を有していたＩｌ−１βなし対照及びペプチドのみの対照アームを除き、１つの用量群当たりｎ＝１０の動物を有していた。用量は、ｎｍｏｌ／ｋｇとして列挙されている。統計分析は、Ｈｏｌｍ法を使用した多重比較のための補正を用いてウィルコクソンの順位和検定を使用して行った。（＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．００５、＊＊＊ｐ≦０．０００５、実施例３１を参照されたい）。それぞれの試験品での処置から２．７５時間後でのＣＢＣ分析によって測定された単球数を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
いくつかの場合では、本開示は、複合体（例えば、薬学的複合体）、その組成物、ならびに軟骨療法のための及び軟骨に近接した組織の中で、そのそばで、その近くで現れた疾患のための方法を提供する。いくつかの実施形態では、複合体は、薬学的複合体、治療的複合体であり得るか、または検出剤もしくは担体として使用され得る。いくつかの実施形態では、複合体の活性剤は、抗炎症剤などの抗関節炎剤、例えば、グルココルチコイドまたは非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）である。本明細書に開示されるような複合体は、活性剤または抗炎症剤などの抗関節炎剤単独の投与よりも多くの利点を有する。例えば、複合体の活性剤または抗炎症剤などの抗関節炎剤は、軟骨及び／または関節に標的化される。いくつかの例では、複合体の活性剤または抗炎症剤などの抗関節炎剤は、軟骨及び関節で放出され、蓄積する。活性剤は、単独で投与した場合よりも、複合体として投与した場合に、より高いレベルで蓄積し得るか、またはより長い時間枠にわたって存在し得る。また、例えば、ヒトにおいて広範囲の有害作用に関連し、用量レベル及び累積使用継続期間と共に有害作用の発生率が増加する従来のグルココルチコイド療法と比較して、ペプチド−グルココルチコイド複合体を含む複合体の投与は、有害作用の減少をもたらし得る。これは、より多い相対量の薬物または活性剤が標的組織（軟骨及び近くの構造）に送達され、より少ない相対量が身体全体にわたって非標的組織に送達され、及び／または循環中に存在するからであり得る。本明細書に記載の複合体は、単回全身注射（静脈内または皮下など）から複数の関節を治療することを可能にし得る一方で、活性剤を単独で投与することは、許容可能な副作用プロファイルを伴って関節内の治療レベルを達成するために関節への（関節内への）直接注射を必要とし得、複数の関節を治療するために複数の関節への直接注射を必要とする。また、ペプチド−グルココルチコイド複合体はまた、いくつかの関節が直接注射に適していない場合に有利であり得る。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される複合体は、グルココルチコイド単独の対応する投与によって提供されるものと比較して、発生及び／または強度においてグルココルチコイド関連有害作用の減少または予防を対象に提供する。有害作用は、体重減少、免疫抑制、皮膚菲薄化、紫斑病、クッシング外観、眼の白内障もしくは緑内障、骨粗鬆症もしくは骨折、視床下部−下垂体−副腎系軸の抑制、高血糖症及び糖尿病、重篤な心血管事象の発生率の増加、脂質異常症、ミオパシー、胃炎、胃腸潰瘍及び出血、精神障害、血糖値の上昇、血清コルチゾールもしくはコルチコステロンの減少、副腎、胸腺、もしくは脾臓の萎縮、脾臓もしくは胸腺の重量の減少、リンパ球もしくは単球を含む循環白血球の減少、骨髄の細胞性の低下、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、有害作用は、好中球、リンパ球、単球、マクロファージ、またはそれらの任意の組み合わせの機能または数の減少を特徴とする免疫抑制を含む。いくつかの実施形態では、有害作用は、Ｔ細胞欠損症、体液性免疫欠損症、好中球減少症、またはそれらの任意の組み合わせを特徴とする免疫抑制を含む。いくつかの実施形態では、有害作用は、対象の血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベル及び／またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルの変化を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される複合体は、活性剤または抗炎症剤などの抗関節炎剤単独と比較して、より少ない投薬量またはより少ない投薬頻度で治療的に有効である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される複合体は、活性剤または抗炎症剤などの抗関節炎剤単独の対応する投与と比較して、対象に対してより低い毒性を示すか、または毒性を示さない。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される複合体の活性剤または抗炎症剤などの抗関節炎剤は、それを必要とする対象への投与直後に放出され、数時間以内に標的軟骨または関節内に蓄積し得る。いくつかの実施形態では、複合体は、標的軟骨または関節内に蓄積し、蓄積した複合体は、化学的にまたは酵素によって切断、加水分解、または分解されて、標的軟骨または関節において活性剤または抗炎症剤などの抗関節炎剤及びペプチドを放出し得る。いくつかの実施形態では、複合体は、活性剤または抗炎症剤などの抗関節炎剤単独と比較して、より長い半減期を有する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、対象への投与の後に、軟骨にホーミングし、それを標的とし、それに誘導され、それによって保持され、それに蓄積し、それに移動し、及び／またはそれに結合するペプチドを利用する。いくつかの実施形態では、本開示の軟骨ホーミングペプチドは、活性剤または抗炎症剤などの抗関節炎剤を軟骨またはその組織もしくは細胞に送達するために使用される。活性剤または抗炎症剤などの抗関節炎剤は、軟骨またはその組織もしくは細胞に対して治療効果を発揮し得る。例えば、所定の実施形態では、複合体は、活性剤または抗炎症剤などの抗関節炎剤を軟骨またはその組織もしくは細胞に局在化送達することを可能にする。所定の実施形態では、ペプチド自体が、治療的反応を誘発させる。いくつかの実施形態では、滑膜、滑膜線維芽細胞、靭帯、または腱などの軟骨に近い他の組織が標的とされる。軟骨貯蔵体からの活性剤の放出は、これらの近くの組織における活性剤のより高い濃度化をもたらし得る。
【００２０】
軟骨障害は治療が特に困難である。薬物投与のための直接的経路は、静脈内、関節内、または経口であり得る。しかしながら、軟骨は無血管であり得るので、薬物の静脈内投与は、軟骨に到達することができない場合がある。変形性関節症などの軟骨疾患のための薬物は、罹患した領域に局所的に直接注射され得、例えば、関節に直接注射され得る。治療的に実行可能であることが証明されている軟骨障害を治療することを目的とした薬物はほとんどなく、標的組織へのアクセスの欠如が失敗の主な理由である。標的組織へのアクセスの欠如はまた、薬物が標的領域、組織、構造または細胞にホーミングし、それを標的とし、またはそれに誘導され、それによって保持され、及び／またはそれに結合し得る場合に必要となるであろうものよりも多い用量の投与につながり得る。よって、軟骨病態の治療はしばしば、グルココルチコイドまたはＮＳＡＩＤＳなどの高濃度の非特異的薬物の使用を必要とする。また、多数の治療剤が関節障害の治療において関心が持たれているが、薬物の全身投与によって引き起こされる副作用のレベルのため問題がある（Ｄａｎｃｅｖｉｃ  ａｎｄ  ＭｃＣｕｌｌｏｃｈ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ，１６：４２９（２０１４））。
【００２１】
軟骨に接触させることが可能な特異的で強力な薬物は、特定の領域、組織、細胞及び構造に化合物を選択的に標的化し、送達することによって多くの治療の非特異性を打ち消し得る。そのような薬物はまた、イオンチャネル、タンパク質−タンパク質相互作用、細胞外マトリックスリモデリング（すなわち、プロテアーゼ阻害）などを調節するために有用であり得る。そのような標的化療法により、より少ない投薬、副作用の減少、患者のコンプライアンスの改善、及び治療結果の改善を可能にし得、こらは、軟骨の急性疾患だけでなく、慢性病態でも同様に有利になるであろう。
【００２２】
本開示は、軟骨に効果的に接触及び／または蓄積し得、かつ軟骨病態を治療するための抗炎症剤などの抗関節炎剤と共に使用され得るシスチン高密度ペプチドに由来するクラスのペプチドを含む複合体を記載する。本開示の複合体は、様々な病態の症状を治療するために使用され得る。本開示の複合体のペプチドは、軟骨、軟骨細胞、細胞外マトリックス、コラーゲン、ヒアルロン酸、アグリカン（軟骨特異的プロテオグリカンコアタンパク質（ＣＳＰＣＰ）としても知られている）、または細胞外マトリックスの他の成分、または関節及び軟骨性組織中の他の成分に結合し得る。
【００２３】
また、慢性疾患もしくは軟骨負傷または本明細書に記載されるような他の治療適応症による疼痛（例えば、関節痛）の管理、低減、切除または軽減するのを助ける、軟骨の特定の領域、組織、構造または細胞に選択的にホーミングし、それを標的とし、それに誘導され、それに移動し、またはそれによって保持され、またはそれに蓄積し、及び／またはそれに結合するペプチドを含む複合体も本明細書に記載されている。軟骨の１つ以上の特定の領域、組織、構造または細胞にホーミングし、それを標的とし、それに移動し、それに誘導され、それによって保持され、またはそれに蓄積し、及び／またはそれに結合する複合体は、より少ない標的外効果及び潜在的に負の効果、例えば、疼痛薬の使用及び効力をしばしば制限する副作用を有し得る。また、そのようなペプチドは、軟骨の特定の領域、組織、構造または細胞にそれらを直接標的化すること、及び軟骨に接触するのを補助することまたは薬剤の局所濃度を上昇させることによって投薬量を減少させ、既存の薬物の有効性を増大させ得る。ペプチド自体は、疼痛を調節し得るか、またはそれは、疼痛を調節する薬剤に複合体化され得る。そのような疼痛の調節は、炎症、自己免疫反応、疼痛受容体に対する直接的または間接的な作用、細胞の殺傷、またはプログラム細胞死（罹患細胞または組織のアポトーシス及び／または非アポトーシス経路に関わらない）の調節などの様々なメカニズムによって作動し得る（Ｔａｉｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ，１２７（Ｐｔ  １０）：２１３５−４４（２０１４））。
【００２４】
軟骨の特定の領域、組織、構造または細胞にホーミングし、それを標的とし、それに誘導され、それに移動し、それによって保持され、それに蓄積し、またはそれに結合する本開示の複合体のペプチドは、異なる程度の効率でそれを行い得る。ペプチドは、血液、筋肉、骨髄、脾臓、胸腺、皮膚、膵臓、または他の器官などの他の場所よりも、軟骨中でより高い濃度を有し得る。ペプチドは、血中のシグナルの割合として軟骨中にシグナルを有するものとして記録され得る。ペプチドは、組織対軟骨比（例えば、血液対軟骨比）として軟骨中にシグナルを有するものとして記録され得る。
【００２５】
複合体のペプチドによる軟骨の特定の領域、組織、構造または細胞に選択的にホーミングすること、それを標的とすること、それに誘導すること、それに移動すること、それによって保持されること、またはそれに蓄積すること及び／またはそれに結合することは、対象への複合体の投与の後に生じ得る。対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。
【００２６】
本明細書に開示される複合体は、画像化のためのフルオロフォアなどの検出剤と共に、及び／または、抗関節炎剤、例えば、抗炎症剤などの活性剤を関節に送達して炎症を治療するために使用され得る。
【００２７】
本明細書に開示される複合体のペプチドは、ｅｘ  ｖｉｖｏでの軟骨外植片に結合させるために使用され得る。軟骨外植片は、ヒトまたは動物などの任意の対象に由来し得る。軟骨外植片へのペプチド結合の評価は、ｉｎ  ｖｉｖｏで軟骨に効率的にホーミングし得るペプチドをスクリーニングするために使用され得る。
【００２８】
本開示の追加の態様及び利点は、本開示の例示的な実施形態が示され、記載されている以下の詳細な説明からこの分野の当業者に明らかになる。理解されるように、本開示は、他の及び異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、すべてが本開示から逸脱することなく、様々な点での改変が可能である。したがって、図面及び明細書は、本質的に例示的なものとしてみなされるべきであり、限定的なものとしてみなされるべきではない。
【００２９】
本明細書で使用される場合、天然のＬ−エナンチオマーアミノ酸の略称は慣用のものであり、以下のとおりである：アラニン（Ａ、Ａｌａ）；アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）；アスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ）；システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）；グルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）；グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）；グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈ、Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）；ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）；リジン（Ｋ、Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ）；セリン（Ｓ、Ｓｅｒ）；スレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｗ、Ｔｒｐ）；チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ）；バリン（Ｖ、Ｖａｌ）。典型的には、Ｘａａは、任意のアミノ酸を示し得る。いくつかの実施形態では、Ｘは、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、またはアルギニン（Ｒ）であり得る。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「含む」及び「有する」は、互換的に使用され得る。例えば、用語「配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド」及び「配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド」は、互換的に使用され得る。
【００３１】
本開示のいくつかの実施形態は、任意の標準または非標準アミノ酸またはそのアナログのＤ−アミノ酸残基を企図している。アミノ酸配列が一連の３文字または１文字のアミノ酸略称で表される場合、標準的な用法及び慣例に従って、左手方向がアミノ末端方向であり、右手方向がカルボキシ末端方向である。
【００３２】
複合体のペプチド
シスチン高密度ペプチドは、しばしばコンパクトな構造に折り畳まれた通常は長さが約１３〜約８１個のアミノ酸の範囲のクラスのペプチドである。シスチン高密度ペプチドは典型的には、多数の分子内ジスルフィド（シスチン）架橋を特徴とし、かつベータストランド及び他の二次構造を含有し得る複雑な三次構造に構築される。ジスルフィド結合の存在は、シスチン高密度ペプチドに顕著な環境安定性を与え、それらは、極端な温度及びｐＨに耐え、血流のタンパク質分解酵素に抵抗することが可能となり得る。
【００３３】
シスチン高密度ペプチドの配列構造及び相同性のより広範な調査は、それらがあらゆる種類の動物及び植物の収束進化によって生じたことを明らかにした。動物では、それらは典型的には、毒液、例えば、クモ及びサソリの毒液に見られ、イオンチャネルの調節に関わっている。このクラスのペプチドの多くは、プロテアーゼ阻害剤であり得、そのようなものとして、軟骨にホーミングし得、コラゲナーゼまたは軟骨を分解するマトリックスメタロプロテアーゼ（例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ１３（ＭＭＰ１３））を阻害し得る。植物のシスチン高密度タンパク質は、動物のタンパク質分解酵素を阻害し得るか、または抗微生物活性を有し得、シスチン高密度ペプチドが植物の本来の防御において機能し得ることを示唆している。このクラスのペプチドの多くは、抗微生物活性を有し得、そのようなものとして、これらの１つは、軟骨にホーミングし得、微生物感染症を治療し得る。いくつかのシスチン高密度ペプチドは、イオンチャネルと相互作用し得、そのようなものとして、軟骨にホーミングし、イオンチャネル、例えば、増殖、メカノトランスダクション、及び他の機能をもたらすことが知られている軟骨細胞中のものと相互作用（結合、遮断、活性化）し得る（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｉｏｎ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｉｎ  Ａｒｔｉｃｕｌａｒ  Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ，Ａｌｉ  Ｍｏｂａｓｈｅｒｉ，ｉｎ  Ｍｅｃｈａｎｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｉｏｎ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  Ｍｅｃｈａｎｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  １，２００８，ｐｐ  １５７−１７８）。
【００３４】
本開示のシスチン高密度ペプチドは、所定の利点を提供する。例えば、ジスルフィド結合の存在は、シスチン高密度ペプチドに顕著な環境安定性を与え、それらは、極端な温度及びｐＨに耐え、血流、胃腸管、及び身体内の他の場所のタンパク質分解酵素に抵抗することが可能となり得る。シスチン高密度ペプチドの分解に対する抵抗性は、免疫原性を低下させるという点で有益であり得る。ノット（ｋｎｏｔｔｅｄ）ペプチドの剛性はまた、標的に結合する際に柔軟なペプチドが発生する「エントロピーペナルティ」を払うことなく、それらが標的に結合することを可能にし得る。ノットペプチドは、抗体のような親和性を有する標的に結合し得る。ノットペプチドは、複数の軟骨領域、組織、構造または細胞の活性を調節し得る。軟骨領域、組織、構造のいくつかは、（ａ）弾性軟骨；（ｂ）関節軟骨及び骨端軟骨などの硝子軟骨；（ｃ）線維軟骨；及び（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）におけるいずれかの細胞または細胞型を含む。シスチン高密度ペプチドが軟骨にホーミングし得る領域のいくつかには、膝、臀部、または指などの関節、鼻軟骨、脊椎軟骨、気管軟骨、及び肋骨軟骨が含まれる。様々な態様では、軟骨成分は、アグリカン及びＩＩ型コラーゲンを含む。また、いくつかの実施形態では、ノットペプチドは、細胞に侵入し得る。他の実施形態では、ノットペプチドは、他の種類の分子と比較して、より迅速なクリアランス及び細胞取り込みを示す。
【００３５】
本開示は、これらのシスチン高密度ペプチドを含むか、またはそれに由来するペプチドを提供する。いくつかの場合では、用語「シスチン高密度ペプチド」は、用語「ノットペプチド」、「ノッチン（ｋｎｏｔｔｉｎ）」及び「ペプチド」と、または用語「ヒチン（ｈｉｔｃｈｉｎ）」及び「ノッチン」と互換可能であると考えられる。
【００３６】
本開示の複合体のペプチドは、システインアミノ酸残基を含み得る。いくつかの場合では、ペプチドは、少なくとも４個のシステインアミノ酸残基を有する。いくつかの場合では、ペプチドは、少なくとも６個のシステインアミノ酸残基を有する。他の場合では、ペプチドは、少なくとも８個のシステインアミノ酸残基、少なくとも１０個のシステインアミノ酸残基、少なくとも１２個のシステインアミノ酸残基、少なくとも１４個のシステインアミノ酸残基または少なくとも１６個のシステインアミノ酸残基を有する。
【００３７】
ノットペプチドは、ジスルフィド架橋を含み得る。ノットペプチドは、残基の５％以上が分子内ジスルフィド結合を形成するシステインであるペプチドであり得る。ノットペプチドは、少なくとも３つのシスチン分子内二重結合が存在するペプチドであり得る。ジスルフィドが連結したペプチドは、薬物骨格であり得る。いくつかの実施形態では、ジスルフィド架橋は、阻害因子ノットを形成する。ジスルフィド架橋は、システイン残基間、例えば、システイン１と４、２と５、または、３と６の間で形成され得る。いくつかの場合では、１つのジスルフィド架橋が、例えば、他の２つのジスルフィド架橋によって形成されるループを通過して、阻害因子ノットを形成する。他の場合では、ジスルフィド架橋は、任意の２つのシステイン残基間に形成され得る。
【００３８】
本開示の複合体は、例えば、軟骨を標的とし、それにホーミングし得る追加のペプチドを生成するための出発点として使用され得るペプチド骨格をさらに含む。いくつかの実施形態では、これらの骨格は、様々なノットペプチドまたはシスチン高密度ペプチドに由来し得る。所定の実施形態では、ノットペプチドは、複雑な三次構造に構築され、これは多数の分子内ジスルフィド架橋を特徴とし、ベータストランド及びアルファヘリックスなどの他の二次構造を任意に含有する。例えば、ノットペプチドは、いくつかの実施形態では、ジスルフィドノットを介するジスルフィドによって特徴付けられる小さなジスルフィドに富むタンパク質を含む。このノットは、例えば、１つのジスルフィド架橋が、他の２つのジスルフィド及び相互接続主鎖によって形成される大員環を通過する場合に得られ得る。いくつかの実施形態では、ノットペプチドには、成長因子システインノットまたは阻害因子システインノットが含まれ得る。他の可能なペプチド構造には、βシートなしに２つのジスルフィド架橋によって連結される２つの平行らせんを有するペプチド（例えば、ヘフトキシン）が含まれ得る。いくつかの実施形態では、ノットは、どのシスチンがノットとなるシスチンであるかという点で異なるトポロジーを有し得る。いくつかの実施形態では、ノットは、どのシステイン残基が互いに結合するかという点で異なるジスルフィド接続性を有し得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも３つの分子内シスチン結合を有し得るが、それらはノットを形成しない。
【００３９】
複合体のノットペプチドは、Ｌ立体配置にある少なくとも１つのアミノ酸残基を含み得る。ノットペプチドは、Ｄ立体配置にある少なくとも１つのアミノ酸残基を含み得る。いくつかの実施形態では、ノットペプチドは、１５〜４０アミノ酸残基長である。他の実施形態では、ノットペプチドは、１１〜５７アミノ酸残基長である。さらなる実施形態では、ノットペプチドは、少なくとも２０アミノ酸残基長である。
【００４０】
これらの種類のペプチドは、毒素または毒液が存在するかまたはそれに関連することが知られているクラスのタンパク質に由来し得る。いくつかの場合では、ペプチドは、サソリまたはクモに関連する毒素または毒液に由来し得る。ペプチドは、様々な属及び種のクモ及びサソリの毒液及び毒素に由来し得る。例えば、ペプチドは、Ｌｅｉｕｒｕｓ  ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ  ｈｅｂｒａｅｕｓ、Ｂｕｔｈｕｓ  ｏｃｃｉｔａｎｕｓ  ｔｕｎｅｔａｎｕｓ、Ｈｏｔｔｅｎｔｏｔｔａ  ｊｕｄａｉｃｕｓ、Ｍｅｓｏｂｕｔｈｕｓ  ｅｕｐｅｕｓ、Ｂｕｔｈｕｓ  ｏｃｃｉｔａｎｕｓ  ｉｓｒａｅｌｉｓ、Ｈａｄｒｕｒｕｓ  ｇｅｒｔｓｃｈｉ、Ａｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ、Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ  ｎｏｘｉｕｓ、Ｈｅｔｅｒｏｍｅｔｒｕｓ  ｌａｏｔｉｃｕｓ、Ｏｐｉｓｔｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ、Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａ  ｓｃｈｍｉｄｔｉ、Ｉｓｏｍｅｔｒｕｓ  ｍａｃｕｌａｔｕｓ、Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ  ｒｏｓｅａまたは別の好適な属または種のサソリの毒液または毒素に由来し得る。いくつかの場合では、ペプチドは、Ｂｕｔｈｕｓ  ｍａｒｔｅｎｓｉｉ  Ｋａｒｓｈ（サソリ）毒素に由来し得る。
【００４１】
いくつかの実施形態では、複合体のペプチドは、ｐｆａｍ００４５１：ｔｏｘｉｎ＿２ファミリーのメンバーである。ｐｆａｍ００４５１：ｔｏｘｉｎ＿２構造クラスファミリーは、配列番号４６２〜配列番号５１０のいずれか１つのペプチドを含み得る。本開示の軟骨ホーミングペプチドは、ｐｆａｍ００４５１：ｔｏｘｉｎ＿２ファミリーの任意のペプチドメンバーのバリアントであり得る。いくつかの実施形態では、ｐｆａｍ００４５１：ｔｏｘｉｎ＿２構造クラスファミリーのバリアントである本開示の例示的な軟骨ホーミングペプチドは、配列番号２４のペプチドである。他の実施形態では、ｐｆａｍ００４５１：ｔｏｘｉｎ＿２構造クラスファミリーのバリアントである本開示の例示的な軟骨ホーミングペプチドは、配列番号１０５のペプチドである。他の実施形態では、バリアントペプチドは、構造クラスｐｆａｍ００４５１：ｔｏｘｉｎ＿２ファミリーのペプチドと少なくとも３０％同一である。いくつかの実施形態では、バリアントペプチドは、構造クラスｐｆａｍ００４５１：ｔｏｘｉｎ＿２ファミリーのペプチドと３０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％または９５％同一である。いくつかの実施形態では、バリアントペプチドは、構造クラスｐｆａｍ００４５１：ｔｏｘｉｎ＿２ファミリーのペプチドと少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一である。ｐｆａｍ００４５１：ｔｏｘｉｎ＿２ファミリーは、様々なサソリ毒の一部として見出されるペプチドファミリーメンバーを含み、しばしばカリウムチャネルを遮断するように機能する。ｐｆａｍ００４５１：ｔｏｘｉｎ＿２ファミリーの特徴には、少なくとも１２０のファミリーメンバーを有するシスチン高密度ペプチド１（ＣＬ００５４）族のメンバーに関連する特徴が含まれるがこれらに限定されない。例えば、平均ファミリーメンバーアミノ酸残基長は、３１．４アミノ酸残基で、コンセンサス配列に対するファミリーメンバー配列相同性の平均同一性は４６％であり、ファミリーメンバーは少なくとも次の生物に由来する：ティティウス・コスタツス（Ｔｉｔｙｕｓ  ｃｏｓｔａｔｕｓ）、セントルロイデス・ノキシウス（Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ  ｎｏｘｉｕｓ）、ティティウス・セルラツス（Ｔｉｔｙｕｓ  ｓｅｒｒｕｌａｔｕｓ）、メソブツス・ジボスス（Ｍｅｓｏｂｕｔｈｕｓ  ｇｉｂｂｏｓｕｓ）、セントルロイデス・エレガンス（Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ホッテントッタ・ジュダイクス（Ｈｏｔｔｅｎｔｏｔｔａ  ｊｕｄａｉｃｕｓ）、メソブツス・オイポイス（Ｍｅｓｏｂｕｔｈｕｓ  ｅｕｐｅｕｓ）、パラブツス・トランスバアリクス（Ｐａｒａｂｕｔｈｕｓ  ｔｒａｎｓｖａａｌｉｃｕｓ）、イソメトロイデス・ベスクス（Ｉｓｏｍｅｔｒｏｉｄｅｓ  ｖｅｓｃｕｓ）、ホッテントッタ・タムルス・シンジクス（Ｈｏｔｔｅｎｔｏｔｔａ  ｔａｍｕｌｕｓ  ｓｉｎｄｉｃｕｓ）、セントルロイデス・マルガリタツス（Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ  ｍａｒｇａｒｉｔａｔｕｓ）、セントルロイデス・スフスス・スフスス（Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ  ｓｕｆｆｕｓｕｓ  ｓｕｆｆｕｓｕｓ）、��ツス・オッシタヌス・イスラエリス（Ｂｕｔｈｕｓ  ｏｃｃｉｔａｎｕｓ  ｉｓｒａｅｌｉｓ）、セントルロイデス・リンピズス・リンピズス（Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ  ｌｉｍｐｉｄｕｓ  ｌｉｍｐｉｄｕｓ）、レイウルス・キンクエストリアツス・ヘブラオイス（Ｌｅｉｕｒｕｓ  ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ  ｈｅｂｒａｅｕｓ）、オドントブツス・ドリア（Ｏｄｏｎｔｏｂｕｔｈｕｓ  ｄｏｒｉａｅ）、メソブツス・タムルス（Ｍｅｓｏｂｕｔｈｕｓ  ｔａｍｕｌｕｓ）、ティティウス・スチグムルス（Ｔｉｔｙｕｓ  ｓｔｉｇｍｕｒｕｓ）、リカス・ムクロナツス（Ｌｙｃｈａｓ  ｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ）、アンドロクトヌス・アウストラリス（Ａｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、オルトキルス・スクロビクロスス（Ｏｒｔｈｏｃｈｉｒｕｓ  ｓｃｒｏｂｉｃｕｌｏｓｕｓ）、メソブツス・マルテンシイ（Ｍｅｓｏｂｕｔｈｕｓ  ｍａｒｔｅｎｓｉｉ）、アンドロクトヌス・マウレタニクス・マウレタニクス（Ａｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓ  ｍａｕｒｅｔａｎｉｃｕｓ  ｍａｕｒｅｔａｎｉｃｕｓ）、セントルロイデス・リンバツス（Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ  ｌｉｍｂａｔｕｓ）、イソメトルス・マクラツス（Ｉｓｏｍｅｔｒｕｓ  ｍａｃｕｌａｔｕｓ）、ティティウス・ジスクレパンス（Ｔｉｔｙｕｓ  ｄｉｓｃｒｅｐａｎｓ）、アンドロクトヌス・アモロイキシ（Ａｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓ  ａｍｏｒｅｕｘｉ）、ブツス・オッシタヌス・ツネタヌス（Ｂｕｔｈｕｓ  ｏｃｃｉｔａｎｕｓ  ｔｕｎｅｔａｎｕｓ）、ティティウス・トリビタツス（Ｔｉｔｙｕｓ  ｔｒｉｖｉｔｔａｔｕｓ）、及びティティウス・オブスクルス（Ｔｉｔｙｕｓ  ｏｂｓｃｕｒｕｓ）（アマゾンサソリ）。
【００４２】
いくつかの実施形態では、複合体の軟骨ホーミングペプチドは、配列ＧＳＸＶＸＸＸＶＫＣＸＧＳＫＱＣＸＸＰＣＫＲＸＸＧＸＲＸＧＫＣＩＮＫＫＸＣＫＣＹＸＸＸ（配列番号９）またはＸＶＸＸＸＶＫＣＸＧＳＫＱＣＸＸＰＣＫＲＸＸＧＸＲＸＧＫＣＩＮＫＫＸＣＫＣＹＸＸＸ（配列番号２５６）を有するファミリーのメンバーであり、この配列は、以下の配列に見られる最も一般的な要素に基づいている：
ＧＳＧＶＰＩＮＶＫＣＲＧＳＲＤＣＬＤＰＣＫＫＡ−ＧＭＲＦＧＫＣＩＮＳＫ−ＣＨＣＴＰ−−（配列番号２４）、
ＧＳ−ＶＲＩＰＶＳＣＫＨＳＧＱＣＬＫＰＣＫＤＡ−ＧＭＲＦＧＫＣＭＮＧＫ−ＣＤＣＴＰＫ−（配列番号２３）、
ＧＳＱＶＱＴＮＶＫＣＱＧＧＳ−ＣＡＳＶＣＲＲＥＩＧＶＡＡＧＫＣＩＮＧＫ−ＣＶＣＹＲＮ−（配列番号２７）、
ＧＳ−−−−−ＩＳＣＴＧＳＫＱＣＹＤＰＣＫＲＫＴＧＣＰＮＡＫＣＭＮＫＳ−ＣＫＣＹＧＣＧ（配列番号２６）、
ＧＳＥＶ−−−ＩＲＣＳＧＳＫＱＣＹＧＰＣＫＱＱＴＧＣＴＮＳＫＣＭＮＫＶ−ＣＫＣＹＧＣＧ（配列番号２８）、
ＧＳＡＶＣＶＹＲＴ−−−−−−ＣＤＫＤＣＫＲＲ−ＧＹＲＳＧＫＣＩＮＮＡ−ＣＫＣＹＰＹＧ（配列番号２５）、
ＧＳ−−−−ＧＩＶＣ−−−ＫＶＣＫＩＩＣＧＭＱ−ＧＫＫＶＮＩＣＫＡＰＩＫＣＫＣＫＫＧ−（配列番号２１）、及び
ＧＳＱＩＹＴＳＫＥＣＮＧＳＳＥＣＹＳＨＣＥＧＩＴＧＫＲＳＧＫＣＩＮＫＫ−ＣＹＣＹＲ−−（配列番号３０）（以下の残基は、独立して、配列において置き換えられ得る：Ｋ及びＲ；Ｍ、Ｉ、Ｌ、及びＶ；Ｇ及びＡ；Ｓ及びＴ；Ｑ及びＮ；Ｘは、独立して、任意の数の任意のアミノ酸であり得るか、またはアミノ酸が存在しない場合がある）。Ｎ末端のＧＳ配列は、本開示のペプチド間に含まれ得るか、または除外され得る。
【００４３】
他の実施形態では、複合体のペプチドは、配列ＧＳＸＸＸＧＣＶＸＸＸＸＫＣＲＰＧＸＫＸＣＣＸＰＸＫＲＣＳＲＲＦＧＸＸＸＸＫＫＣＫＸＸＸＸＸＸ（配列番号１０）またはＸＸＸＧＣＶＸＸＸＸＫＣＲＰＧＸＫＸＣＣＸＰＸＫＲＣＳＲＲＦＧＸＸＸＸＫＫＣＫＸＸＸＸＸＸ（配列番号２５７）を有するファミリーのメンバーであり、その配列は、以下の配列に見られる最も一般的な要素に基づいている：
ＧＳ−−−ＡＣＫＧＶＦＤＡＣＴＰＧＫＮＥＣＣ−ＰＮＲＶＣＳＤＫ−Ｈ−−−−ＫＷＣＫＷＫＬ−−−（配列番号２９）、
ＧＳ−−−ＧＣＬＥＦＷＷＫＣＮＰＮＤＤＫＣＣＲＰＫＬＫＣＳＫＬＦ−−−−−ＫＬＣＮＦＳＦＧ−−（配列番号３１）、
ＧＳＳＥＫＤＣＩＫＨＬＱＲＣＲ−ＥＮＫＤＣＣ−−ＳＫＫＣＳＲＲ−ＧＴＮＰＥＫＲＣＲ−−−−−−（配列番号２２）、及び
ＧＳ−−−ＧＣＦＧＹ−−ＫＣＤＹＹ−ＫＧＣＣＳＧＹＶ−ＣＳＰＴＷ−−−−−ＫＷＣＶＲＰＧＰＧＲ（配列番号３３）（以下の残基は、独立して、配列において置き換えられ得る：Ｋ及びＲ；Ｍ、Ｉ、Ｌ、及びＶ；Ｇ及びＡ；Ｓ及びＴ；Ｑ及びＮ；Ｘは、独立して、任意の数の任意のアミノ酸であり得るか、またはアミノ酸が存在しない場合がある）。Ｎ末端のＧＳ配列は、本開示のペプチド間に含まれ得るか、または除外され得る。
【００４４】
いくつかの実施形態では、複合体のペプチドは、配列ＧＳＧＶＸ１ＩＸ２Ｘ３ＫＣＸ４ＧＳＫＱＣＸ５ＤＰＣＫＸ６Ｘ７Ｘ８ＧＸ９ＲＸ１０ＧＫＣＸ１１ＮＫＫＣＫＣＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５（配列番号１）またはＧＶＸ１ＩＸ２Ｘ３ＫＣＸ４ＧＳＫＱＣＸ５ＤＰＣＫＸ６Ｘ７Ｘ８ＧＸ９ＲＸ１０ＧＫＣＸ１１ＮＫＫＣＫＣＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５（配列番号２４８）を含み、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４及びＸ１５は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸もしくはアミノ酸アナログであるか、または存在しない。いくつかの場合では、複合体のペプチドは、配列ＧＳＧＶＸ１ＩＸ２Ｘ３ＫＣＸ４ＧＳＫＱＣＸ５ＤＰＣＫＸ６Ｘ７Ｘ８ＧＸ９ＲＸ１０ＧＫＣＸ１１ＮＫＫＣＫＣＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５（配列番号２）またはＧＶＸ１ＩＸ２Ｘ３ＫＣＸ４ＧＳＫＱＣＸ５ＤＰＣＫＸ６Ｘ７Ｘ８ＧＸ９ＲＸ１０ＧＫＣＸ１１ＮＫＫＣＫＣＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５（配列番号２４９）を含み、Ｘ１は、ＰまたはＲから選択され、Ｘ２は、ＰまたはＮから選択され、Ｘ３は、ＶまたはＩから選択され、Ｘ４は、Ｓ、Ｔ、ＲまたはＫから選択され、Ｘ５は、ＹまたはＬから選択され、Ｘ６は、Ｑ、ＲまたはＫから選択され、Ｘ７は、Ａ、ＫまたはＲから選択され、Ｘ８は、ＴまたはＡから選択され、Ｘ９は、ＣまたはＭから選択され、Ｘ１０は、ＦまたはＮから選択され、Ｘ１１は、ＭまたはＩから選択され、Ｘ１２は、ＹまたはＴから選択され、Ｘ１３は、ＧまたはＰから選択され、Ｘ１４は、Ｃまたは存在しないことから選択され、Ｘ１５は、Ｇまたは存在しないことから選択される。
【００４５】
いくつかの実施形態では、複合体のペプチドは、配列ＧＳＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＩＸ５ＣＸ６ＧＳＫＱＣＹＸ７ＰＣＫＸ８Ｘ９ＴＧＣＸ１０Ｘ１１Ｘ１２ＫＣＸ１３Ｘ１４ＫＸ１５ＣＫＣＹＧＣＧ（配列番号３）またはＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＩＸ５ＣＸ６ＧＳＫＱＣＹＸ７ＰＣＫＸ８Ｘ９ＴＧＣＸ１０Ｘ１１Ｘ１２ＫＣＸ１３Ｘ１４ＫＸ１５ＣＫＣＹＧＣＧ（配列番号２５０）を含み、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、及びＸ１５は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸もしくはアミノ酸アナログであるか、または存在しない。いくつかの場合では、ペプチドは、配列ＧＳＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＩＸ５ＣＸ６ＧＳＫＱＣＹＸ７ＰＣＫＸ８Ｘ９ＴＧＣＸ１０Ｘ１１Ｘ１２ＫＣＸ１３Ｘ１４ＫＸ１５ＣＫＣＹＧＣＧ、（配列番号４）またはＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＩＸ５ＣＸ６ＧＳＫＱＣＹＸ７ＰＣＫＸ８Ｘ９ＴＧＣＸ１０Ｘ１１Ｘ１２ＫＣＸ１３Ｘ１４ＫＸ１５ＣＫＣＹＧＣＧ（配列番号２５１）を含み、Ｘ１は、Ｇまたは存在しないことから選択され、Ｘ２は、Ｓまたは存在しないことから選択され、Ｘ３は、Ｅ、Ｇまたは存在しないことから選択され、Ｘ４は、Ｖ、Ｓ、または存在しないことから選択され、Ｘ５は、ＲまたはＳから選択され、Ｘ６は、ＳまたはＴから選択され、Ｘ７は、ＧまたはＤから選択され、Ｘ８は、ＱまたはＲから選択され、Ｘ９は、ＱまたはＫから選択され、Ｘ１０は、ＴまたはＰから選択され、Ｘ１１は、ＮまたはＱから選択され、Ｘ１２は、ＳまたはＡから選択され、Ｘ１３は、ＭまたはＬから選択され、Ｘ１４は、ＮまたはＱから選択され、Ｘ１５は、ＶまたはＳから選択される。
【００４６】
いくつかの実施形態では、複合体のペプチドは、配列ＧＳＸ１Ｘ２Ｘ３ＶＸ４ＩＸ５ＶＸ６ＣＸ７Ｘ８ＳＸ９Ｘ１０ＣＬＸ１１ＰＣＫＸ１２ＡＧＭＲＦＧＫＣＸ１３ＮＸ１４ＫＣＸ１５ＣＴＰＸ１６（配列番号５）またはＸ１Ｘ２Ｘ３ＶＸ４ＩＸ５ＶＸ６ＣＸ７Ｘ８ＳＸ９Ｘ１０ＣＬＸ１１ＰＣＫＸ１２ＡＧＭＲＦＧＫＣＸ１３ＮＸ１４ＫＣＸ１５ＣＴＰＸ１６（配列番号２５２）を含み、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１６は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸もしくはアミノ酸アナログであるか、または存在しない。いくつかの場合では、複合体のペプチドは、配列ＧＳＸ１Ｘ２Ｘ３ＶＸ４ＩＸ５ＶＸ６ＣＸ７Ｘ８ＳＸ９Ｘ１０ＣＬＸ１１ＰＣＫＸ１２ＡＧＭＲＦＧＫＣＸ１３ＮＸ１４ＫＣＸ１５ＣＴＰＸ１６（配列番号６）またはＸ１Ｘ２Ｘ３ＶＸ４ＩＸ５ＶＸ６ＣＸ７Ｘ８ＳＸ９Ｘ１０ＣＬＸ１１ＰＣＫＸ１２ＡＧＭＲＦＧＫＣＸ１３ＮＸ１４ＫＣＸ１５ＣＴＰＸ１６（配列番号２５３）を含み、Ｘ１は、Ｇまたは存在しないことから選択され、Ｘ２は、Ｇ、Ｓまたは存在しないことから選択され、Ｘ３は、Ｇ、Ｓまたは存在しないことから選択され、Ｘ４は、ＰまたはＲから選択され、Ｘ５は、ＮまたはＰから選択され、Ｘ６は、ＫまたはＳから選択され、Ｘ７は、ＲまたはＫから選択され、Ｘ８は、ＧまたはＨから選択され、Ｘ９は、ＲまたはＧから選択され、Ｘ１０は、ＤまたはＱから選択され、Ｘ１１は、ＤまたはＫから選択され、Ｘ１２は、ＫまたはＤから選択され、Ｘ１３は、ＩまたはＭから選択され、Ｘ１４は、ＳまたはＧから選択され、Ｘ１５は、ＨまたはＤから選択され、Ｘ１６は、Ｋまたは存在しないことから選択される。
【００４７】
いくつかの実施形態では、複合体のペプチドは、配列ＧＳＸＶＸＶＫＣＸＧＳＫＱＣＸＰＣＫＲＸＧＸＲＸＧＫＣＩＮＫＫＸＣＫＣＹＸ（配列番号７）、ＸＶＸＶＫＣＸＧＳＫＱＣＸＰＣＫＲＸＧＸＲＸＧＫＣＩＮＫＫＸＣＫＣＹＸ（配列番号２５４）、ＧＳＸＧＣＶＸＫＣＲＰＧＸＫＸＣＣＸＰＸＫＲＣＳＲＲＦＧＸＫＫＣＫＸ（配列番号８）、またはＸＧＣＶＸＫＣＲＰＧＸＫＸＣＣＸＰＸＫＲＣＳＲＲＦＧＸＫＫＣＫＸ（配列番号２５５）を含み、各Ｘは、それぞれ独立して、任意のアミノ酸またはアミノ酸アナログであるか、またはアミノ酸が存在しないか、または１〜１０アミノ酸長のペプチドフラグメントであり、そのようなペプチドフラグメント内の各アミノ酸は、各場合において、任意のアミノ酸またはアミノ酸アナログであり得る。
【００４８】
いくつかの実施形態では、複合体のペプチドは、配列ＧＳＧＶＸ１ＩＸ２Ｘ３ＲＣＸ４ＧＳＲＱＣＸ５ＤＰＣＲＸ６Ｘ７Ｘ８ＧＸ９ＲＸ１０ＧＲＣＸ１１ＮＲＲＣＲＣＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５（配列番号１１）またはＧＶＸ１ＩＸ２Ｘ３ＲＣＸ４ＧＳＲＱＣＸ５ＤＰＣＲＸ６Ｘ７Ｘ８ＧＸ９ＲＸ１０ＧＲＣＸ１１ＮＲＲＣＲＣＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５（配列番号２５８）を含み、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４及びＸ１５は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸もしくはアミノ酸アナログであるか、または存在しない。いくつかの場合では、ペプチドは、配列ＧＳＧＶＸ１ＩＸ２Ｘ３ＲＣＸ４ＧＳＲＱＣＸ５ＤＰＣＲＸ６Ｘ７Ｘ８ＧＸ９ＲＸ１０ＧＲＣＸ１１ＮＲＲＣＲＣＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５（配列番号１２）またはＧＶＸ１ＩＸ２Ｘ３ＲＣＸ４ＧＳＲＱＣＸ５ＤＰＣＲＸ６Ｘ７Ｘ８ＧＸ９ＲＸ１０ＧＲＣＸ１１ＮＲＲＣＲＣＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５（配列番号２５９）を含み、Ｘ１は、ＰまたはＲから選択され、Ｘ２は、ＰまたはＮから選択され、Ｘ３は、ＶまたはＩから選択され、Ｘ４は、Ｓ、Ｔ、ＲまたはＫから選択され、Ｘ５は、ＹまたはＬから選択され、Ｘ６は、Ｑ、ＲまたはＫから選択され、Ｘ７は、Ａ、ＫまたはＲから選択され、Ｘ８は、ＴまたはＡから選択され、Ｘ９は、ＣまたはＭから選択され、Ｘ１０は、ＦまたはＮから選択され、Ｘ１１は、ＭまたはＩから選択され、Ｘ１２は、ＹまたはＴから選択され、Ｘ１３は、ＧまたはＰから選択され、Ｘ１４は、Ｃまたは存在しないことから選択され、Ｘ１５は、Ｇまたは存在しないことから選択される。
【００４９】
いくつかの実施形態では、複合体のペプチドは、配列ＧＳＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＩＸ５ＣＸ６ＧＳＲＱＣＹＸ７ＰＣＲＸ８Ｘ９ＴＧＣＸ１０Ｘ１１Ｘ１２ＲＣＸ１３Ｘ１４ＲＸ１５ＣＲＣＹＧＣＧ（配列番号１３）またはＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＩＸ５ＣＸ６ＧＳＲＱＣＹＸ７ＰＣＲＸ８Ｘ９ＴＧＣＸ１０Ｘ１１Ｘ１２ＲＣＸ１３Ｘ１４ＲＸ１５ＣＲＣＹＧＣＧ（配列番号２６０）を含み、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、及びＸ１５は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸もしくはアミノ酸アナログであるか、または存在しない。いくつかの場合では、ペプチドは、配列ＧＳＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＩＸ５ＣＸ６ＧＳＲＱＣＹＸ７ＰＣＲＸ８Ｘ９ＴＧＣＸ１０Ｘ１１Ｘ１２ＲＣＸ１３Ｘ１４ＲＸ１５ＣＲＣＹＧＣＧ、（配列番号１４）またはＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＩＸ５ＣＸ６ＧＳＲＱＣＹＸ７ＰＣＲＸ８Ｘ９ＴＧＣＸ１０Ｘ１１Ｘ１２ＲＣＸ１３Ｘ１４ＲＸ１５ＣＲＣＹＧＣＧ（配列番号２６１）を含み、Ｘ１は、Ｇまたは存在しないことから選択され、Ｘ２は、Ｓまたは存在しないことから選択され、Ｘ３は、Ｅ、Ｇまたは存在しないことから選択され、Ｘ４は、Ｖ、Ｓ、または存在しないことから選択され、Ｘ５は、ＲまたはＳから選択され、Ｘ６は、ＳまたはＴから選択され、Ｘ７は、ＧまたはＤから選択され、Ｘ８は、ＱまたはＲから選択され、Ｘ９は、Ｑ、Ｒ、またはＫから選択され、Ｘ１０は、ＴまたはＰから選択され、Ｘ１１は、ＮまたはＱから選択され、Ｘ１２は、ＳまたはＡから選択され、Ｘ１３は、ＭまたはＬから選択され、Ｘ１４は、ＮまたはＱから選択され、Ｘ１５は、ＶまたはＳから選択される。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列ＧＳＸ１Ｘ２Ｘ３ＶＸ４ＩＸ５ＶＸ６ＣＸ７Ｘ８ＳＸ９Ｘ１０ＣＬＸ１１ＰＣＲＸ１２ＡＧＭＲＦＧＲＣＸ１３ＮＸ１４ＲＣＸ１５ＣＴＰＸ１６（配列番号１５）またはＸ１Ｘ２Ｘ３ＶＸ４ＩＸ５ＶＸ６ＣＸ７Ｘ８ＳＸ９Ｘ１０ＣＬＸ１１ＰＣＲＸ１２ＡＧＭＲＦＧＲＣＸ１３ＮＸ１４ＲＣＸ１５ＣＴＰＸ１６（配列番号２６２）を含み、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１６は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸もしくはアミノ酸アナログであるか、または存在しない。いくつかの場合では、ペプチドは、配列ＧＳＸ１Ｘ２Ｘ３ＶＸ４ＩＸ５ＶＸ６ＣＸ７Ｘ８ＳＸ９Ｘ１０ＣＬＸ１１ＰＣＲＸ１２ＡＧＭＲＦＧＲＣＸ１３ＮＸ１４ＲＣＸ１５ＣＴＰＸ１６（配列番号１６）またはＸ１Ｘ２Ｘ３ＶＸ４ＩＸ５ＶＸ６ＣＸ７Ｘ８ＳＸ９Ｘ１０ＣＬＸ１１ＰＣＲＸ１２ＡＧＭＲＦＧＲＣＸ１３ＮＸ１４ＲＣＸ１５ＣＴＰＸ１６（配列番号２６３）を含み、Ｘ１は、Ｇまたは存在しないことから選択され、Ｘ２は、Ｇ、Ｓまたは存在しないことから選択され、Ｘ３は、Ｇ、Ｓまたは存在しないことから選択され、Ｘ４は、ＰまたはＲから選択され、Ｘ５は、ＮまたはＰから選択され、Ｘ６は、Ｒ、ＫまたはＳから選択され、Ｘ７は、ＲまたはＫから選択され、Ｘ８は、ＧまたはＨから選択され、Ｘ９は、ＲまたはＧから選択され、Ｘ１０は、ＤまたはＱから選択され、Ｘ１１は、Ｄ、Ｒ、またはＫから選択され、Ｘ１２は、Ｋ、Ｒ、またはＤから選択され、Ｘ１３は、ＩまたはＭから選択され、Ｘ１４は、ＳまたはＧから選択され、Ｘ１５は、ＨまたはＤから選択され、Ｘ１６は、Ｋ、Ｒ、または存在しないことから選択される。
【００５１】
いくつかの実施形態では、複合体のペプチドは、配列ＧＳＸＶＸＶＲＣＸＧＳＲＱＣＸＰＣＲＲＸＧＸＲＸＧＲＣＩＮＲＲＸＣＲＣＹＸ（配列番号１７）、ＸＶＸＶＲＣＸＧＳＲＱＣＸＰＣＲＲＸＧＸＲＸＧＲＣＩＮＲＲＸＣＲＣＹＸ（配列番号２６４）、ＧＳＸＧＣＶＸＲＣＲＰＧＸＲＸＣＣＸＰＸＲＲＣＳＲＲＦＧＸＲＲＣＲＸ（配列番号１８）、またはＸＧＣＶＸＲＣＲＰＧＸＲＸＣＣＸＰＸＲＲＣＳＲＲＦＧＸＲＲＣＲＸ（配列番号２６５）を含み、各文字は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸またはアミノ酸アナログであり、Ｘは、アミノ酸が存在しないか、または１〜１０アミノ酸長のペプチドフラグメントであり、そのようなペプチドフラグメント内の各アミノ酸は、各場合において、任意のアミノ酸またはアミノ酸アナログであり得る。
【００５２】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列ＧＳＸＶＸＸＸＶＲＣＸＧＳＲＱＣＸＸＰＣＲＲＸＸＧＸＲＸＧＲＣＩＮＲＲＸＣＲＣＹＸＸＸ（配列番号１９）、ＸＶＸＸＸＶＲＣＸＧＳＲＱＣＸＸＰＣＲＲＸＸＧＸＲＸＧＲＣＩＮＲＲＸＣＲＣＹＸＸＸ（配列番号２６６）、ＧＳＸＸＸＧＣＶＸＸＸＸＲＣＲＰＧＸＲＸＣＣＸＰＸＲＲＣＳＲＲＦＧＸＸＸＸＲＲＣＲＸＸＸＸＸＸ（配列番号２０）、またはＸＸＸＧＣＶＸＸＸＸＲＣＲＰＧＸＲＸＣＣＸＰＸＲＲＣＳＲＲＦＧＸＸＸＸＲＲＣＲＸＸＸＸＸＸ（配列番号２６７）を含み、Ｘは、アミノ酸が存在しないか、任意のアミノ酸、または任意のアミノ酸アナログである。
【００５３】
いくつかの実施形態では、複合体のペプチドは、以下のペプチドフラグメントのうちの１つ以上を含む：ＧＫＣＩＮＫＫＣＫＣ（配列番号２６８）；ＫＣＩＮ（配列番号２６９）；ＫＫＣＫ（配列番号２７０）；ＰＣＫＲ（配列番号２７１）；ＫＲＣＳＲＲ（配列番号２７２）；ＫＱＣ（配列番号２７３）；ＧＲＣＩＮＲＲＣＲＣ（配列番号２７４）；ＲＣＩＮ（配列番号２７５）；ＲＲＣＲ（配列番号２７６）；ＰＣＲＲ（配列番号２７７）；ＲＲＣＳＲＲ（配列番号２７８）；ＲＱＣ（配列番号２７９）；ＰＣＫＫ（配列番号２８０）；及びＫＫＣＳＫＫ（配列番号２８１）。
【００５４】
表１は、本開示による複合体のいくつかの例示的なペプチドを列挙している。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表１−１５】
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【表１−１６】
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【表１−１７】
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【表１−１８】
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【表１−１９】
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【表１−２０】
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【表１−２１】
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【表１−２２】
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【表１−２３】
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【００５５】
配列番号１〜配列番号５１０のいずれかまたはそのフラグメントにおいて、任意の１つ以上のＫ残基は、Ｒ残基によって置き換えられていてもよく、または任意の１つ以上のＲ残基は、Ｋ残基によって置き換えられていてもよい。配列番号１〜配列番号５１０のいずれかまたはその任意のフラグメントにおいて、任意の１つ以上のＭ残基は、Ｉ、Ｌ、またはＶ残基のいずれか１つによって置き換えられていてもよく、任意の１つ以上のＬ残基は、Ｖ、Ｉ、またはＭ残基のいずれか１つによって置き換えられていてもよく、任意の１つ以上のＩ残基は、Ｍ、Ｌ、またはＶ残基のいずれか１つによって置き換えられていてもよく、または任意の１つ以上のＶ残基は、Ｉ、Ｌ、またはＭ残基のいずれか１つによって置き換えられていてもよい。任意の実施形態では、アミノ酸単独または組み合わせの少なくとも１つは、ペプチドまたはペプチドフラグメントにおいて以下のように置き換えられ得る：Ｋ／Ｒ、Ｍ／Ｉ／Ｌ／Ｖ、Ｇ／Ａ、Ｓ／Ｔ、Ｑ／Ｎ、及びＤ／Ｅ（各文字は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸またはアミノ酸アナログである）。いくつかの例では、ペプチドは、１つのみのリジン残基を含有する場合があるか、またはジン残基を含有しない場合がある。配列番号１〜配列番号５１０のいずれかまたはその任意のフラグメントにおいて、Ｘは、独立して、任意の数の任意のアミノ酸であり得るか、またはアミノ酸が存在しない場合がある。いくつかの場合では、ペプチドは、配列番号１〜配列番号２４７のペプチドのように、最初の２つのＮ末端アミノ酸ＧＳを含み得るか、またはそのようなＮ末端アミノ酸（ＧＳ）は、任意の他の１つまたは２つのアミノ酸によって置換されていてもよい。他の場合では、ペプチドは、配列番号２４８〜配列番号５１０のペプチドのように、最初の２つのＮ末端アミノ酸ＧＳを含まない。いくつかの場合では、ペプチドのＮ末端は、アセチル基などによってブロックされており；他の例では、ペプチドのＣ末端は、アミド基などによってブロックされている。
【００５６】
いくつかの例では、複合体のペプチドは、配列番号１〜配列番号５１０のいずれか１つまたはその機能性フラグメントである。他の実施形態では、本開示の複合体のペプチドは、配列番号１〜配列番号５１０のいずれか１つと１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するペプチドをさらに含む。さらなる実施形態では、複合体のペプチドフラグメントは、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６残基長である配列番号１〜配列番号５１０のいずれか１つの連続フラグメントであって、そのペプチドフラグメントが、そのペプチドの任意の部分から選択されるものを含む。いくつかの実施形態では、そのようなペプチドフラグメントは、軟骨に接触し、ペプチド及びペプチド活性剤複合体について本明細書に記載のものの特性を示す。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本開示のシスチン高密度ペプチドは、配列番号１〜配列番号５１０、またはそのフラグメントのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のシスチン高密度ペプチドは、配列番号２１〜配列番号２４７もしくは配列番号２８２〜配列番号５１０、またはそのフラグメントのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、本開示のシスチン高密度ペプチドは、（ｉ）配列番号１〜配列番号５１０もしくはそのフラグメント、または（ｉｉ）配列番号２１〜配列番号２４７もしくは配列番号２８２〜配列番号５１０もしくはそのフラグメントのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００５８】
本開示の複合体のペプチドは、負のアミノ酸残基をさらに含み得る。いくつかの場合では、ペプチドは、２個以下の負のアミノ酸残基を有する。他の場合では、ペプチドは、４個以下の負のアミノ酸残基、３個以下の負のアミノ酸残基、または１個以下の負のアミノ酸残基を有する。負のアミノ酸残基は、任意の負に荷電したアミノ酸残基から選択され得る。負のアミノ酸残基は、ＥもしくはＤのいずれか、またはＥ及びＤの両方の組み合わせから選択され得る。
【００５９】
本開示の複合体のペプチドは、塩基性アミノ酸残基をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、塩基性残基は、生理的ｐＨで電荷を増加させるためにペプチド配列に付加される。付加される塩基性残基は、任意の塩基性アミノ酸であり得る。付加される塩基性残基は、ＫもしくはＲ、またはＫもしくはＲの組み合わせから選択され得る。
【００６０】
いくつかの実施形態では、複合体のペプチドは、酸性領域及び塩基性領域を含む電荷分布を有する。酸性領域は、塊であり得る。塊は、ペプチドの三次元構造から外に延びるペプチドの部分である。塩基性領域は、パッチであり得る。パッチは、ペプチドの三次元構造に特徴的ないかなる特定のトポロジーも指定しないペプチドの部分である。さらなる実施形態では、ノットペプチドは、６つ以上の塩基性残基及び２つ以下の酸性残基であり得る。
【００６１】
本開示の複合体のペプチドは、正に荷電したアミノ酸残基をさらに含み得る。いくつかの場合では、ペプチドは、少なくとも２個の正に荷電した残基を有する。他の場合では、ペプチドは、少なくとも３個の正に荷電した残基、少なくとも４個の正に荷電した残基、少なくとも５個の正に荷電した残基、少なくとも６個の正に荷電した残基、少なくとも７個の正に荷電した残基、少なくとも８個の正に荷電した残基または少なくとも９個の正に荷電した残基を有する。正に荷電した残基は、任意の正に荷電したアミノ酸残基から選択され得る。正に荷電した残基は、ＫもしくはＲのいずれか、またはＫ及びＲの組み合わせから選択され得る。
【００６２】
また、本明細書の複合体のペプチドは、少なくとも２個のシステイン残基、及び少なくとも２個または３個の正に荷電したアミノ酸残基（例えば、アルギニン、リジンもしくはヒスチジン、またはアルギニン、リジンもしくはヒスチジンの任意の組み合わせ）を含有する上記配列のいずれかの４〜１９アミノ酸残基フラグメントを含み得る。他の実施形態では、本明細書のペプチドは、少なくとも２個のシステイン残基、２個以下の塩基性残基、及び少なくとも２個または３個の正に荷電したアミノ酸残基（例えば、アルギニン、リジンもしくはヒスチジン、またはアルギニン、リジンもしくはヒスチジンの任意の組み合わせ）を含有する上記配列のいずれかの２０〜７０アミノ酸残基フラグメントである。いくつかの実施形態では、そのようなペプチドフラグメントは、軟骨に接触し、ペプチド及びペプチド−活性剤複合体について本明細書に記載のものの特性を示す。
【００６３】
いくつかの実施形態では、複合体のペプチドは、１つ以上のジスルフィド結合を含有し、中性ｐＨで正の正味電荷を有する。生理的ｐＨでは、ペプチドは、例えば、−５、−４、−３、−２、−１、０、＋１、＋２、＋３、＋４、または＋５の正味電荷を有し得る。正味電荷がゼロである場合、ペプチドは非荷電または双性イオン性であり得る。いくつかの例では、ペプチドは、生理的ｐＨで正の電荷を有し得る。いくつかの例では、ペプチドは、生理的ｐＨで≧＋２、生理的ｐＨで≧＋３．５、生理的ｐＨで≧＋４．５の電荷を有し得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、１つ以上のジスルフィド結合を含有し、中性ｐＨで正の正味の電荷を有し、その正味電荷は、＋０．５または＋０．５未満、＋１または＋１未満、＋１．５または＋１．５未満、＋２または＋２未満、＋２．５または＋２．５未満、＋３または＋３未満、＋３．５または＋３．５未満、＋４または＋４未満、＋４．５または＋４．５未満、＋５または＋５未満、＋５．５または＋５．５未満、＋６または＋６未満、＋６．５または＋６．５未満、＋７または＋７未満、＋７．５または＋７．５未満、＋８または＋８未満、＋８．５または＋８．５未満、＋９または＋９．５未満、＋１０または＋１０未満であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、生理的ｐＨで負の正味電荷を有し、その正味の電荷は、−０．５または−０．５未満、−１または−１未満、−１．５または−１．５未満、−２または−２未満、−２．５または−２．５未満、−３または−３未満、−３．５または−３．５未満、−４または−４未満、−４．５または−４．５未満、−５または−５未満、−５．５または−５．５未満、−６または−６未満、−６．５または−６．５未満、−７または−７未満、−７．５または−７．５未満、−８または−８未満、−８．５または−８．５未満、−９または−９．５未満、−１０または−１０未満であり得る。いくつかの場合では、ペプチド内に１つ以上の変異を操作することにより、生理的ｐＨで等電点、電荷、表面電荷、またはレオロジーが変化したペプチドが生成される。サソリまたはクモ由来のペプチドへのそのような変異の操作は、例えば、正味電荷を１、２、３、４、または５だけ減少させることによって、または正味電荷を１、２、３、４、または５だけ増加させることによって、結合体の正味電荷を変化させ得る。そのような場合、操作された変異は、ペプチドが軟骨に接触する能力を促進し得る。ペプチドのレオロジー及び効力を改善するための好適なアミノ酸修飾は、保存的または非保存的変異を含み得る。ペプチドは、ペプチドが誘導される毒液または毒素の配列と比較して、最大で１個のアミノ酸変異、最大で２個のアミノ酸変異、最大で３個のアミノ酸変異、最大で４個のアミノ酸変異、最大で５個のアミノ酸変異、最大で６個のアミノ酸変異、最大で７個のアミノ酸変異、最大で８個のアミノ酸変異、最大で９個のアミノ酸変異、最大で１０個のアミノ酸変異、または別の好適な数のアミノ酸変異を含み得る。他の場合では、ペプチド、またはその機能性フラグメントは、ペプチドが誘導される毒液または毒素の配列と比較して、少なくとも１個のアミノ酸変異、少なくとも２個のアミノ酸変異、少なくとも３個のアミノ酸変異、少なくとも４個のアミノ酸変異、少なくとも５個のアミノ酸変異、少なくとも６個のアミノ酸変異、少なくとも７個のアミノ酸変異、少なくとも８個のアミノ酸変異、少なくとも９個のアミノ酸変異、少なくとも１０個のアミノ酸変異、または別の好適な数のアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態では、変異は、生理的ｐＨで所望の電荷または安定性を有するペプチドを提供するためにペプチド内で改変され得る。
【００６４】
いくつかの実施形態では、電荷は、複合体のペプチドの軟骨ホーミングにおいて役割を果たし得る。溶液中及びｉｎ  ｖｉｖｏでの本開示のペプチドの相互作用は、シスチン高密度ペプチドの等電点（ｐＩ）及び／または溶液のｐＨまたはそれが存在する局所環境によって影響を受け得る。溶液中のペプチドの電荷は、タンパク質の溶解性ならびに生体内分布、バイオアベイラビリティ、及び全体的薬物動態などのパラメータに影響を及ぼし得る。また、正に荷電した分子は、負に荷電した分子と相互作用し得る。本明細書に開示されるペプチドなどの正に荷電した分子は、ヒアルロン酸及びアグリカンを含む軟骨中の負に荷電した細胞外マトリックス分子などの負に荷電した分子と相互作用し、結合し得る。正に荷電した残基はまた、受容体の負に荷電した残基または細胞表面上のイオンチャネル孔の電子陰性領域などの他のタンパク質及び分子の特定の領域と相互作用し得る。このように、ペプチドのｐＩは、本開示のペプチドが効率的に軟骨にホーミングし得るかどうかに影響を与え得る。ｐＩと軟骨ホーミングとの間の相関関係を同定することは、本開示のリードペプチド候補を同定する上で重要なストラテジーであり得る。ペプチドのｐＩは、Ｅｘｐａｓｙ  ｐＩ計算機及びＳｉｌｌｅｒｏ法を含む多数の異なる方法を使用して計算され得る。Ｅｘｐａｓｙ  ｐＩは、Ｂｊｅｌｌｑｖｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，に記載されているようにアミノ酸のｐＫａ値を計算することによって決定され得、１５℃または２５℃で９．２Ｍ及び９．８Ｍの尿素を添加した固定化ｐＨ勾配ゲル環境におけるｐＨ４．５〜ｐＨ７．３のポリペプチド移動を調べることによって定義された（Ｂｊｅｌｌｑｖｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．  １４（１０）：１０２３−３１  （１９９３））。ｐＩを計算するＳｉｌｌｅｒｏ法は、多項式の解と各アミノ酸の個々のｐＫａｓを伴い得る。この方法は、変性条件（尿素）を使用しない（Ｓｉｌｌｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．１７９（２）：３１９−３５（１９８９））。これらのｐＩ計算方法を使用して、対象への投与後におけるペプチドシグナルの軟骨対血液比を定量化することは、電荷及び軟骨ホーミングにおける傾向または相関関係を同定するためのストラテジーとなり得る。いくつかの実施形態では、生物学的ｐＨ（約ｐＨ７．４）を超えるｐＩを有するペプチドは、軟骨への効率的なホーミングを示し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、または少なくとも１１のｐＩを有するペプチドは、効率的に軟骨にホーミングし得る。他の実施形態では、１１〜１２のｐＩを有するペプチドは、最も効率的に軟骨にホーミングし得る。所定の実施形態では、ペプチドは、約９のｐＩを有し得る。他の実施形態では、ペプチドは、８〜１０のｐＩを有し得る。いくつかの実施形態では、より塩基性のペプチドは、より効率的に軟骨にホーミングし得る。他の実施形態では、高いｐＩ単独では、ペプチドの軟骨ホーミングを引き起こすのに十分ではない場合がある。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本開示の複合体のペプチドの三次構造及び静電学は、軟骨ホーミングに影響を及ぼし得る。構造分析及び電荷分布の分析は、軟骨ホーミングなどの生物学的機能に重要な残基を予測するためのストラテジーであり得る。例えば、軟骨にホーミングする本開示のいくつかのペプチドは、「ヒチン」として本明細書で定義される構造クラスに分類され得、Ｃ１−Ｃ４、Ｃ２−Ｃ５、及びＣ３−Ｃ６の間のジスルフィド結合の特性を共有し得る。３つのジスルフィド結合（Ｃ１−Ｃ４、Ｃ２−Ｃ５、及びＣ３−Ｃ６）を介して結ばれたペプチドの折り畳みトポロジーは、ジスルフィドの三次元配置に基づいて構造ファミリーに分解され得る。ノッチンは、Ｃ１−Ｃ４及びＣ２−Ｃ５ジスルフィド結合によって形成される大員環を通過するＣ３−Ｃ６ジスルフィド結合を有し得、ヒチンは、Ｃ１−Ｃ４及びＣ３−Ｃ６ジスルフィド結合によって形成される大員環を通過するＣ２−Ｃ５ジスルフィド結合を有し、さらに他の構造ファミリーは、Ｃ２−Ｃ５及びＣ３−Ｃ６ジスルフィド結合によって形成される大員環を通過するＣ１−Ｃ４ジスルフィド結合を有する。これらのシステイン残基における保持されたジスルフィド結合、一次配列同一性、及び／または構造相同性を有する「ヒチン」クラスペプチドのバリアントは、軟骨にホーミングし得るその他の潜在的シスチン高密度ペプチド候補を同定または予測する方法であり得る。また、カルシンファミリーのペプチドのメンバー及び関連メンバーもまた、「ヒチン」クラスのペプチドとは異なる三次構造を有するにもかかわらず、軟骨にホーミングし得る。カルシンペプチドは、構造的に、ノッチンジスルフィド接続性及びトポロジーを有するノッチンのサブセットであるが、リアノジン受容体（ＲｙＲ）に結合し、活性化する機能に基づいてさらに分類される。これらの受容体は、筋肉内のカルシウムの流入及び流出を調節するように作用するカルシウムチャネルである（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １５７（３）：３９２−４０３．（２００９））。保持された重要な残基を有するカルシンファミリーのペプチドのバリアントは、軟骨にホーミングし得る有望な候補を予測する１つの方法であり得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドの構造分析は、様々なプロテアーゼまたは還元剤による緩衝液中での分解に対する抵抗性について、ペプチドを評価することによって決定され得る。ペプチド表面の電荷密度の分布の構造分析はまた、軟骨にホーミングし得る有望な候補を予測するためのストラテジーであり得る。正の表面電荷の大きなパッチを有するペプチド（ｐＨ７．５の場合）は、軟骨にホーミングし得る。
【００６６】
関連する構造相同体のＮＭＲ溶液構造、Ｘ線結晶学、または結晶構造を使用して、複合体のペプチドが軟骨にホーミングする能力を維持しながら、折り畳み、安定性、及び製造可能性を改善し得る変異ストラテジーに関する情報を提供し得る。それらは、一群の構造的に相同的な骨格の３Ｄファーマコフォアを予測するため、及び関連タンパク質の可能な移植領域を予測して改善された特性を有するキメラを作製するために使用され得る。例えば、このストラテジーは、改善された特性を有する薬物を設計するために、またはペプチドの折り畳み及び製造可能性を複雑にする有害な変異を修正するために使用され得る重要なアミノ酸位置及びループを同定するために使用され得る。これらの重要なアミノ酸位置及びループが保持され得る一方で、ペプチド配列中の他の残基は変異されて、ペプチドの機能、ホーミング、及び活性が、改善、変更、除去、または別の様式で修飾され得る。
【００６７】
また、２つ以上のペプチドの一次配列と三次配列との比較を使用して、配列及び３Ｄ折り畳みパターンを明らかにし得て、それを活用してペプチドが改善され、これらのペプチドの生物学的活性が解析され得る。例えば、軟骨にホーミングする２つの異なるペプチド骨格を比較することは、改善された折り畳み特性を有するバリアントの設計などの工学的ストラテジーを導き得る保存されたファーマコフォアの同定につながり得る。例えば、重要なファーマコフォアは、結合にとって重要であり得る芳香族残基または塩基性残基を含み得る。
【００６８】
複合体の改善されたペプチドはまた、ＴＥＰＩＴＯＰＥ及びＴＥＰＩＴＯＰＥｐａｎによって予測される免疫原性情報などの免疫原性情報に基づいて改変され得る。ＴＥＰＩＴＯＰＥは、位置特異的重み行列を使用して、ペプチドが５１個の異なるＨＬＡ−ＤＲアレルに結合するかどうかの予測規則を提供する計算的アプローチであり、ＴＥＰＩＴＯＰＥｐａｎは、ポケットの類似性に基づいて、既知の結合特異性を有するＨＬＡ−ＤＲ分子から、未知の結合特異性を有するＨＬＡ−ＤＲ分子に外挿する、ＴＥＰＩＴＯＰＥを使用する方法である。例えば、ＴＥＰＩＴＯＰＥ及びＴＥＰＩＴＯＰＥｐａｎは、軟骨にホーミングするペプチドの免疫原性を決定するために使用され得る。高い免疫原性を有するペプチドと低い免疫原性を有するペプチドとの比較は、低下した免疫原性を有するバリアントを設計するための改変ストラテジーを導き得る。
【００６９】
本開示の複合体のペプチドは、ナトリウムチャネルに結合し得る。ペプチドは、カルシウムチャネルに結合し得る。ペプチドは、カリウムチャネル及び／またはナトリウムチャネルを遮断し得る。ペプチドは、カルシウムチャネルを遮断し得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、カリウムチャネル及び／またはナトリウムチャネルを活性化し得る。他の実施形態では、ペプチドは、カルシウムチャネルを活性化し得る。さらに他の実施形態では、ペプチドは、カリウムチャネルアゴニスト、カリウムチャネルアンタゴニスト、カリウムチャネルの一部、ナトリウムチャネルアゴニスト、ナトリウムチャネルアンタゴニスト、カルシウムチャネルアゴニスト、カルシウムチャネルアンタゴニスト、ハドルカルシン、セラフォトキシン、ヒューエントキシン、カリオトキシン、コバトキシンまたはレクチンであり得る。いくつかの実施形態では、レクチンは、ＳＨＬ−Ｉｂ２であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、イオンチャネルまたは塩化物チャネルと相互作用し、それに結合し、それを阻害し、それを不活性化し、またはその発現を変化させ得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、Ｎａｖ１．７イオンチャネルと相互作用し得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、Ｋｖ１．３イオンチャネルと相互作用し得る。さらに他の実施形態では、ペプチドは、プロテアーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼと相互作用し、がん細胞の遊走または転移を阻害し、抗微生物活性を有し、または抗腫瘍活性を有する。マトリックスメタロプロテイナーゼに作用することに加えて、ペプチドは、他の可能性のあるプロテアーゼ（例えば、エラスターゼ）と相互作用し得る。
【００７０】
いくつかの実施形態では、複合体のペプチドは、軟骨またはそのもしくはその近くの構造に対して他の治療効果を有する。関節軟骨におけるベータデフェンシンの発現は、免疫調節機能ならびに変形性関節症、全身性エリテマトーデス及び関節リウマチなどの自己免疫性リウマチ性障害と相関し得る（Ｖｏｒｄｅｎｂａｕｍｅｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ２０１１，Ｖａｒｏｇａ  ２００４  ａｎｄ  Ｖａｒｏｇａ  ２００５）。いくつかの実施形態では、ペプチドまたはそれらの変異体は、ベータデフェンシンを阻害し、ベータデフェンシンを補充し、ベータデフェンシンの競合阻害剤であり、ベータデフェンシン標的を活性化するかまたはその活性化を遮断し、免疫調節剤として使用され、または自己免疫、関節炎、感染症、及び他の関節障害を治療するために使用される。いくつかの場合では、病態は、軟骨形成異常、外傷性断裂もしくは剥離、軟骨を含有する身体領域における手術後疼痛、肋軟骨炎、ヘルニア、多発性軟骨炎、関節炎、変形性関節症、関節リウマチ、強直性脊椎炎（ＡＳ）、ループス疾患（例えば、全身性エリテマトーデス（本明細書では「ＳＬＥ」または「ループス」とも称される）、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、痛風、軟骨形成不全、または別の好適な病態である。いくつかの場合では、病態は、軟骨のがんまたは腫瘍に関連する。いくつかの場合では、病態は、転移性であるか否かにかかわらず軟骨腫または軟骨肉腫の一種、または別の好適な病態である。がんに関連するものなどのいくつかの実施形態では、画像化は、対象の罹患した領域、組織、構造または細胞の外科的除去に関連し得る。他の態様では、病態は、脊索腫である。いくつかの態様では、病態は、関節炎の一種である。いくつかの態様では、関節炎の一種は、関節リウマチである。いくつかの態様では、関節炎の一種は、変形性関節症である。いくつかの態様では、関節炎の一種は、ループス関節炎である。いくつかの態様では、病態は、全身性エリテマトーデスである。いくつかの態様では、病態は、軟骨形成不全である。いくつかの態様では、病態は、良性軟骨腫または悪性軟骨肉腫である。いくつかの態様では、病態は、滑液包炎、腱炎、痛風、偽痛風、関節症、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、または感染症である。いくつかの態様では、ペプチド活性剤結合体、ペプチド、または薬学的組成物は、負傷を治療するため、負傷によって損傷した組織を修復するため、または負傷によって引き起こされた疼痛を治療するために投与される。いくつかの態様では、ペプチド活性剤結合体、ペプチド、または薬学的組成物は、裂傷を治療するため、または裂傷によって損傷した組織を修復するために投与される。いくつかの態様では、ペプチド活性剤結合体、ペプチド、または薬学的組成物は、投与後に対象の腎臓にホーミングし、それを標的とし、またはそれに移動する。いくつかの態様では、病態は、腎臓に関連する。いくつかの態様では、病態は、ループス腎炎、急性腎障害（ＡＫＩ）、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）、高血圧性腎臓損傷、糖尿病性腎症、ループス腎炎、または腎線維症である。
【００７１】
本開示はまた、本明細書に記載の様々なペプチドの多量体を複合体に包含し得る。多量体の例には、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体などが含まれる。多量体は、複数の同一のサブユニットから形成されるホモマーまたは複数の異なるサブユニットから形成されるヘテロマーであり得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも１つの他のペプチド、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、もしくはそれを超える他のペプチドとの多量体構造で配置される。所定の実施形態では、多量体構造のペプチドはそれぞれ、同じ配列を有する。代替的な実施形態では、多量体構造のペプチドの一部または全部は、異なる配列を有する。
【００７２】
本開示の複合体は、例えば、追加のペプチドを生成するための出発点として使用され得るペプチド骨格をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、これらの骨格は、様々なノットペプチドまたはシスチン高密度ペプチドに由来し得る。骨格に好適ないくつかのペプチドには、クロロトキシン、ブラゼイン、サーキュリン、ステクリスプ、ハナトキシン、ミドカイン、ヘフトキシン、ポテトカルボキシペプチダーゼ阻害剤、バブルプロテイン、アトラクチン、α−ＧＩ、α−ＧＩＤ、μ−ＰＩＩＩＡ、ω−ＭＶＩＩＡ、ω−ＣＶＩＤ、χ−ＭｒＩＡ、ρ−ＴＩＡ、コナントキンＧ、コンツラキンＧ、ＧｓＭＴｘ４、マルガトキシン、ｓｈＫ、トキシンＫ、キモトリプシン阻害剤（ＣＴＩ）、及びＥＧＦエピレグリンコアが含まれ得るがこれらに限定されない。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本開示のペプチド配列は、追加のアミノ酸に隣接される。１つ以上の追加のアミノ酸は、例えば、所望のｉｎ  ｖｉｖｏ電荷、等電点、化学的共役部位、安定性、または生理的特性をペプチドに付与し得る。
【００７４】
配列相同性を同定することは、複合体のペプチドの軟骨ホーミング機能を保持する重要な残基を決定するために重要であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、保存された正に荷電した残基の同定は、作製される任意の相同性バリアントにおける軟骨ホーミングを保持する上で重要であり得る。他の実施形態では、塩基性または芳香族ダイアドの同定は、相同性バリアントにおけるＫｖイオンチャネルとの相互作用及び活性を保持する上で重要であり得る。
【００７５】
２つ以上のペプチドは、相同性の程度を共有し、ｉｎ  ｖｉｖｏで類似の特性を共有し得る。例えば、ペプチドは、本開示のペプチドと相同性の程度を共有し得る。いくつかの場合では、本開示のペプチドは、第２のペプチドと最大で約２０％の対相同性、最大で約２５％の対相同性、最大で約３０％の対相同性、最大で約３５％の対相同性、最大で約４０％の対相同性、最大で約４５％の対相同性、最大で約５０％の対相同性、最大で約５５％の対相同性、最大で約６０％の対相同性、最大で約６５％の対相同性、最大で約７０％の対相同性、最大で約７５％の対相同性、最大で約８０％の対相同性、最大で約８５％の対相同性、最大で約９０％の対相同性、最大で約９５％の対相同性、最大で約９６％の対相同性、最大で約９７％の対相同性、最大で約９８％の対相同性、最大で約９９％の対相同性、最大で約９９．５％の対相同性、または最大で約９９．９％の対相同性を有し得る。いくつかの場合では、本開示のペプチドは、第２のペプチドと少なくとも約２０％の対相同性、少なくとも約２５％の対相同性、少なくとも約３０％の対相同性、少なくとも約３５％の対相同性、少なくとも約４０％の対相同性、少なくとも約４５％の対相同性、少なくとも約５０％の対相同性、少なくとも約５５％の対相同性、少なくとも約６０％の対相同性、少なくとも約６５％の対相同性、少なくとも約７０％の対相同性、少なくとも約７５％の対相同性、少なくとも約８０％の対相同性、少なくとも約８５％の対相同性、少なくとも約９０％の対相同性、少なくとも約９５％の対相同性、少なくとも約９６％の対相同性、少なくとも約９７％の対相同性、少なくとも約９８％の対相同性、少なくとも約９９％の対相同性、少なくとも約９９．５％の対相同性、少なくとも約９９．９％の対相同性を有し得る。２つ以上のペプチド間の相同性を決定するために様々な方法及びソフトウェアプログラム、例えば、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ、ＡｌｉｇｎＭｅ、Ｐｒａｌｉｎｅ、または別の好適な方法もしくはアルゴリズムが使用され得る。
【００７６】
さらに他の例では、配列番号２１〜配列番号２４７または配列番号２８２〜配列番号５１０のいずれか１つのペプチドのバリアント核酸分子は、配列番号２１〜配列番号２４７または配列番号２８２〜配列番号５１０のいずれか１つのアミノ酸配列との、コードされたペプチドアミノ酸配列の配列同一性もしくは相同性の決定、または核酸ハイブリダイゼーションアッセイのいずれかによって同定され得る。そのようなペプチドバリアントは、（１）洗浄ストリンジェンシーが、５５〜６５℃で０．１％ＳＤＳを含む０．５×−２×ＳＳＣに相当するストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号２１〜配列番号２４７または配列番号２８２〜配列番号５１０（または先の配列の任意の相補体）のいずれか１つのヌクレオチド配列を有する核酸分子とハイブリダイズしたままであり、（２）配列番号２１〜配列番号２４７または配列番号２８２〜配列番号５１０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９５％を超える配列同一性または相同性を有するペプチドをコードする核酸分子を含み得る。代替的に、任意の配列番号２１〜配列番号２４７または配列番号２８２〜配列番号５１０のペプチドバリアントは、（１）洗浄ストリンジェンシーが、５０〜６５℃で０．１％ＳＤＳを含む０．１×−０．２×ＳＳＣに相当する高度にストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号２１〜配列番号２４７または配列番号２８２〜配列番号５１０（または先の配列の任意の相補体）のいずれか１つのヌクレオチド配列を有する核酸分子とハイブリダイズしたままであり、（２）配列番号２１〜配列番号２４７または配列番号２８２〜配列番号５１０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９５％を超える配列同一性または相同性を有するペプチドをコードする核酸分子として特徴付けられ得る。
【００７７】
配列同一性または相同性率は、従来の方法によって決定され得る。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｕｌｌ．  Ｍａｔｈ．  Ｂｉｏ．４８：６０３（１９８６）、及びＨｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９９２）を参照されたい。簡単には、２つのアミノ酸配列同士をアラインし、ギャップオープンペナルティ＝１０、ギャップ延長ペナルティ＝１、及びＨｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ（同上）の「ＢＬＯＳＵＭ６２」スコアリング行列を使用して、アラインメントスコアが最適化される。次いで、配列同一性または配列相同性を（［同一の一致の総数］／［長い方の配列の長さ＋２つの配列をアラインするために長い方の配列に導入されたギャップの数］）（１００）として計算する。
【００７８】
また、２つのアミノ酸配列をアラインするために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムが存在する。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの「ＦＡＳＴＡ」類似性検索アルゴリズムは、本明細書に開示されるペプチドのアミノ酸配列とペプチドバリアントのアミノ酸配列とによって共有される配列同一性または相同性のレベルを調べるうえで好適なタンパク質アラインメント法である。ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）、及びＰｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３  （１９９０）に記載されている。簡単には、ＦＡＳＴＡは最初に、保存的アミノ酸置換、挿入、または欠失は考慮せずに、クエリ配列（例えば、配列番号１）と、最も高い密度の一致（ｋｔｕｐ変数が１の場合）、または一致のペア（ｋｔｕｐ＝２の場合）を有する試験配列とによって共有される領域を同定することにより配列類似性を特徴付ける。次いで、一致の密度が最も高い１０個の領域を、ペアリングされたすべてのアミノ酸の類似性をアミノ酸置換行列を使用して比較することによって再スコアリングし、最も高いスコアに寄与する残基のみが含まれるように各領域の端部を「トリミング」する。スコアが「カットオフ」値（配列の長さとｋｔｕｐ値に基づいて既定の式によって計算される）よりも大きい複数の領域がある場合、そのときはトリミングされた最初の領域を調べて、各領域同士を連結してギャップを含むおおよそのアラインメントを形成し得るかどうかを決定する。最後に、アミノ酸を挿入及び欠失させることができるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ−Ｓｅｌｌｅｒｓアルゴリズムの改変を使用して２つのアミノ酸配列の最も高いスコアの領域同士をアラインする（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４（１９７０）；Ｓｅｌｌｅｒｓ，Ｓｉａｍ  Ｊ．Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．２６：７８７（１９７４））。ＦＡＳＴＡ分析のための例示的なパラメータは、ｋｔｕｐ＝１、ギャップオープンペナルティ＝１０、ギャップ延長ペナルティ＝１、及び置換行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２である。これらのパラメータは、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３（１９９０）の補遺２に説明されるようにして、スコアリング行列ファイル（「ＳＭＡＴＲＩＸ」）を改変することによりＦＡＳＴＡプログラムに導入され得る。
【００７９】
ＦＡＳＴＡはまた、上で開示されるような比を使用して核酸分子の配列同一性または相同性が決定するために使用され得る。ヌクレオチド配列の比較のために、ｋｔｕｐ値は、１〜６、例えば、３〜６の範囲、または例えば、３であり得、他のパラメータは上述したように設定される。
【００８０】
「保存的アミノ酸置換」である一般的なアミノ酸のいくつかの例は、以下の群のそれぞれの中のアミノ酸の間の置換によって例示される：（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、（３）セリン及びスレオニン、（４）アスパラギン酸及びグルタミン酸、（５）グルタミン及びアスパラギン、ならびに（６）リジン、アルギニン、及びヒスチジン。ＢＬＯＳＵＭ６２テーブルは、タンパク質配列セグメントの約２，０００の局所的な多数のアラインメントに由来する、５００を超える関連タンパク質群の高度に保存された領域を表すアミノ酸置換行列である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９９２））。したがって、ＢＬＯＳＵＭ６２置換頻度は、本開示のアミノ酸配列に導入され得る保存的アミノ酸置換を定義するために使用され得る。（上で論述されるように）化学的特性のみに基づいてアミノ酸置換を設計することも可能であるが、用語「保存的アミノ酸置換」は、−１より大きいＢＬＯＳＵＭ６２値によって表される置換を指し得る。例えば、アミノ酸置換は、置換が０、１、２、または３のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴付けられる場合、保存的である。このシステムによれば、いくつかの保存的アミノ酸置換は、少なくとも１（例えば、１、２または３）のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴付けられる一方で、いくつかの保存的アミノ酸置換は、少なくとも２（例えば、２または３）のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴付けられる。
【００８１】
構造的完全性を維持するために重要な領域またはドメイン内のアミノ酸残基の決定が決定され得る。これらの領域内で、変化に対するある程度の耐性があり、分子の全体的三次構造を維持し得る特定の残基を決定し得る。配列構造を分析するための方法には、アミノ酸またはヌクレオチドの同一性または相同性が高い複数の配列のアラインメント、及び利用可能なソフトウェア（例えば、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ．ＲＴＭビューア及び相同性モデリングツール；ＭＳＩ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を使用したコンピュータ分析、二次構造の傾向、バイナリパターン、相補的充填及び埋没極性相互作用が含まれるがこれらに限定されない（Ｂａｒｔｏｎ，Ｇ．Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．５：３７２−６  （１９９５）及びＣｏｒｄｅｓ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ６：３−１０（１９９６））。一般に、分子への修正を設計し、または特定のフラグメントを同定する場合、構造の決定は、典型的には、修飾分子の活性を評価することを伴い得る。
【００８２】
一対配列アラインメントは、２つの生物学的配列（タンパク質または核酸）間の機能的、構造的及び／または進化的関係を示し得る類似性の領域を同定するために使用される。対照的に、多重配列アラインメント（ＭＳＡ）は、３つ以上の生物学的配列のアラインメントである。ＭＳＡアプリケーションの出力から相同性が推定され、配列間の進化的関係が評価され得る。当業者は、本明細書で使用される場合、「配列相同性」及び「配列同一性」ならびに「配列同一率（％）」及び「配列相同率（％）」は、必要に応じて参照ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列に対する配列の関連性または変動を意味するために互換的に使用されていることを認識するであろう。
【００８３】
化学的修飾
複合体のペプチドは、様々な方法の１つ以上によって化学的に修飾され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、機能を追加し、機能を削除し、またはｉｎ  ｖｉｖｏ挙動を改変するために変異され得る。ジスルフィド結合間の１つ以上のループは、他のペプチドからの活性要素を含めるように修飾され得るか、または置き換えられ得る（例えば、Ｍｏｏｒｅ  ａｎｄ  Ｃｏｃｈｒａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，５０３，ｐ．２２３−２５１，２０１２に記載されている）。アミノ酸はまた、例えば、半減期を増加させ、ｉｎ  ｖｉｖｏでの結合挙動を修飾、付加もしくは欠失させ、新たな標的機能を追加し、表面電荷及び疎水性を変更し、または複合体化部位を可能にするために変異され得る。Ｎ−メチル化は、本開示の複合体のペプチドにおいて行われ得るメチル化の一例である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、遊離アミン上のメチル化によって修飾され得る。遊離アミンは、Ｎ末端アミノ基（複数可）及び／またはリジン等のアミノ酸側鎖のアミノ基であり得る。例えば、完全メチル化（例えば、アミノ基の各水素原子をメチル基で置き換えること）は、ホルムアルデヒド及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いた還元的メチル化により達成され得る。
【００８４】
化学的修飾は、例えば、複合体のペプチドの半減期を延長し得るか、または生体内分布もしくは薬物動態プロファイルを変化させ得る。化学的修飾は、ポリマー、ポリエーテル、ポリエチレングリコール、バイオポリマー、ポリアミノ酸、脂肪酸、デンドリマー、Ｆｃ領域、パルミテートもしくはミリストレートなどの単純な飽和炭素鎖、またはアルブミンを含み得る。Ｆｃ領域でのペプチドの化学的修飾は、融合Ｆｃ−ペプチドであり得る。ポリアミノ酸は、例えば、繰り返された単一のアミノ酸を有するポリアミノ酸配列（例えば、ポリグリシン）、及びパターンに従う場合があるか、または従わない場合がある混合ポリアミノ酸配列（例えば、ｇｌｙ−ａｌａ−ｇｌｙ−ａｌａ（配列番号５１１））を有するポリアミノ酸配列、または前述のいずれかの組み合わせを含み得る。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本開示の複合体のペプチドは、修飾がペプチドの安定性及び／または半減期を増加させるように修飾され得る。いくつかの実施形態では、Ｎ末端、Ｃ末端、または内部アミノ酸への疎水性部位の結合は、本開示のペプチドの半減期を延長するために使用され得る。他の実施形態では、本開示のペプチドは、例えば、血清半減期に影響を及ぼし得る翻訳後修飾（例えば、メチル化及び／またはアミド化）を含み得る。いくつかの実施形態では、単純な炭素鎖（例えば、ミリストイル化及び／またはパルミチル化による）が、融合タンパク質またはペプチドに複合体化され得る。いくつかの実施形態では、単純な炭素鎖は、非複合体化物質から融合タンパク質またはペプチドを容易に分離可能にし得る。例えば、非複合体化物質から融合タンパク質またはペプチドを分離するために使用され得る方法には、溶媒抽出及び逆相クロマトグラフィが含まれるがこれらに限定されない。親油性部位は、血清アルブミンと可逆的に結合することにより半減期を延長し得る。複合体化部位は、例えば、血清アルブミンに可逆的に結合することによりペプチドの半減期を延長する親油性部位であり得る。いくつかの実施形態では、親油性部位は、コレステン、コレスタン、コレスタジエン及びオキシステロールを含むコレステロールまたはコレステロール誘導体であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ミリスチン酸（テトラデカン酸）またはその誘導体に複合体化され得る。他の実施形態では、本開示のペプチドは、半減期修飾剤に結合（例えば、複合体化）される。半減期修飾剤の例には、ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン、ポリビニルアルコール、水溶性ポリマー、双性イオン性水溶性ポリマー、水溶性ポリ（アミノ酸）、プロリン、アラニン及びセリンの水溶性ポリマー、グリシン、グルタミン酸、及びセリンを含有する水溶性ポリマー、Ｆｃ領域、脂肪酸、パルミチン酸、またはアルブミンに結合する分子が含まれるがこれらに限定されない。
【００８６】
いくつかの実施形態では、配列番号１〜配列番号２４７の最初の２つのＮ末端アミノ酸（ＧＳ）は、別の分子への複合体化または融合を促進するために、及びそのような複合体化または融合分子からのペプチドの切断を促進するために、スペーサーまたはリンカーとして機能し得る。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質またはペプチドは、例えば、ペプチドの特性を修飾し得るか、または変化をもたらし得る他の部位に複合体化され得る。
【００８７】
活性剤複合体化
本開示による複合体のペプチドは、軟骨疾患、障害、または負傷の治療に使用するための活性剤に複合体化または融合され得る。一般に、本明細書に開示される任意のペプチドは、活性剤に複合体化され得る。そのようなペプチドは、配列番号１〜配列番号５１０に示されるアミノ酸配列、またはそのフラグメントの任意の１つ以上と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。そのようなペプチドが複合体化され得る活性剤は、本明細書に記載の任意の活性剤であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチド−活性剤複合体は、ペプチド（例えば、配列番号２１〜配列番号２４７または配列番号２８２〜配列番号５１０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するペプチド）、リンカー（例えば、表２に列挙されるリンカーのいずれか１つ）、及び本明細書に記載される活性剤を含み、そのリンカーは、ペプチドを活性剤に複合体化する。活性剤は、抗炎症剤などの抗関節炎剤であり得る。例えば、抗炎症剤は、グルココルチコイドまたはＮＳＡＩＤである。
【００８８】
本明細書に記載されているように、用語「ペプチド−活性剤複合体」、「ペプチド−薬物複合体」、及び「ＰＤＣ」は、本明細書において互換的に使用され得る。所定の非限定的な例示的な「ペプチド−活性剤複合体」、「ペプチド−薬物複合体」、及び「ＰＤＣ」は、薬剤薬物または薬物クラス、例えば、「ペプチド−グルココルチコイド複合体」、「ペプチド−デキサメタゾン複合体」、及び「ペプチド−デス−シクレソニド複合体」及び／または非限定的な例示的なリンカー、例えば、「ペプチド−ＤＭＡ−薬物複合体」、「ペプチド−ＤＭＡ−Ｄｅｘ」または「ペプチド−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ」に関して本明細書では注釈が付けられる。
【００８９】
一般に、ペプチド−薬物複合体の化学構造が示される場合、示されたペプチドと直接隣接するペプチド−リンカー結合（例えば、アミド結合）のアミン（例えば、「−ＮＨ−」）は、ペプチドの一部であることに留意される。図２３Ａは、例えば、「−ＮＨ−配列番号１０５」が、ペプチドのアミノ基（例えば、Ｎ末端）が、この場合では、アミド結合を介してペプチドをリンカー（この場合ではＤＭＡ）に結合させるのに使用されているペプチドを定義することを示している（このリンカーは、ｄＣＩＣ側にエステル結合及びペプチド側にアミド結合を含む）。
【００９０】
本明細書で使用される場合、例えば、命名「ペプチド（配列番号１０５）」は、略称であり、配列番号１０５に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを指す。この命名は、本明細書に開示される任意のペプチド及び任意のペプチド−薬物複合体（ＰＤＣ）に使用され得る。
【００９１】
所定の実施形態では、本明細書に記載される複合体のペプチドは、機能的性能を提供する活性剤などの別の分子に融合され得る。ペプチドは、活性剤の配列と共にペプチドの配列を含有するベクターの発現を介して活性剤と融合され得る。様々な実施形態では、ペプチドの配列及び活性剤の配列は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から発現される。様々な実施形態では、ペプチドの配列及び活性剤の配列は、連続した配列を含み得る。ペプチド及び活性剤はそれぞれ、別々に発現させた場合のそれらの機能的性能と比較して、融合ペプチドにおいて同様の機能的性能を保持し得る。
【００９２】
さらに、例えば、所定の実施形態では、本明細書に記載の複合体のペプチドは、機能的性能を提供する活性剤などの別の分子に結合され得る。いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の活性剤がペプチドに連結され得る。複数の活性剤は、複数のリジン残基及び／またはＮ末端に複合体化するような方法によって、または複数の活性剤をポリマーまたはデンドリマーなどの骨格に連結させ、次いでその活性剤−骨格をペプチドに結合させることによって結合され得る（例えば、Ｙｕｒｋｏｖｅｔｓｋｉｙ，Ａ．Ｖ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７５（１６）：３３６５−７２（２０１５）に記載されている。活性剤の例には、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣剤、ポリヌクレオチド、ポリリボヌクレオチド、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、抗体フラグメント、アプタマー、サイトカイン、インターフェロン、ホルモン、酵素、成長因子、チェックポイント阻害剤、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ４阻害剤、ＣＤ抗原、ケモカイン、神経伝達物質、イオンチャネル阻害剤、Ｇタンパク質共役型受容体阻害剤、Ｇタンパク質共役型受容体活性化剤、化学薬剤、放射線増感剤、放射線防護剤、放射性核種、治療用小分子、ステロイド、コルチコステロイド、抗関節炎剤、例えば、抗炎症剤、コルチコステロイド、例えば、ブデソニド（すなわち、ＢＵＤ）、デキサメタゾン（すなわち、Ｄｅｘ）、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド（すなわち、ＴＡＡ）、デス−シクレソニド（本明細書ではｄＣＩＣまたはデスイソブチリル−シクレソニドとも称され得る）、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブチキシコート、コルチゾール（ヒドロコルチゾン）、クロベタゾール、エストリオール、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、ヒドロコルチン、コルチゾン、デオキシコルチコステロン、フルチカゾン、フルチカゾンフロエート、フルチカゾンプロピオネート、フルオシノニド、フルドロコルチゾン、フルニソリド、フルオロメトロン、ヘキセストロール、メチマゾール、メチルプレドニゾロン、モメタゾン、モメタゾンフロエート、１７−モノプロピオネート、パラメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、もしくはそれらの薬学的に許容可能な塩、免疫修飾物質、補体結合ペプチドもしくはタンパク質、腫瘍壊死因子阻害剤、腫瘍壊死因子活性化剤、腫瘍壊死因子受容体ファミリーアゴニスト、腫瘍壊死受容体アンタゴニスト、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）可溶性受容体もしくは抗体、カスパーゼプロテアーゼ活性化剤もしくは阻害剤、ＮＦ−κＢａ、ＲＩＰＫ１及び／またはＲＩＰＫ３阻害剤もしくは活性化剤（例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）ＴＬＲ−３及び／またはＴＬＲ−４、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）などを通じた）、細胞死受容体リガンド（例えば、Ｆａｓリガンド）活性化剤もしくは阻害剤、ＴＮＦ受容体ファミリー（例えば、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、リンフォトキシンβ受容体／ＴＮＦＲＳ３、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６、デコイ受容体３���ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９、ＤＲ４（細胞死受容体４／ＴＮＦＲＳ１０Ａ）、ＤＲ５（細胞死受容体５／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）、デコイ受容体１／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、デコイ受容体２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＲＡＮＫ（ＮＦ−カッパＢ／ＴＮＦＲＳＦ１１Ａの受容体）、ＯＰＧ（オステオプロテゲリン／ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＤＲ３（細胞死受容体３／ＴＮＦＲＳＦ２５）、ＴＷＥＡＫ受容体／ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、ＴＡＣｌ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦ−Ｒ（ＢＡＦＦ受容体／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ）、ＨＶＥＭ（ヘルペスウイルス侵入媒介因子／ＴＮＦＲＳＦ１４）、神経成長因子受容体／ＴＮＦＲＳＦ１６、ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原／ＴＮＦＲＳＦ１７）、ＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘発性ＴＮＦ受容体／ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＴＡＪ（毒性及びＪＮＫ誘発物質／ＴＮＦＲＳＦ１９）、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＤＲ６（細胞死受容体６／ＴＮＦＲＳＦ２１）、ＴＮＦＲＳＦ２２、ＴＮＦＲＳＦ２３、エクトジスプラシンＡ２アイソフォーム受容体／ＴＮＦＲＳ２７、エクトジスプラシン１、及び無汗性受容体、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーリガンド（ＴＮＦアルファ、リンフォトキシン−α、腫瘍壊死因子膜型、腫瘍壊死因子脱落型、ＬＩＧＨＴ、リンフォトキシンβ２α１ヘテロ三量体、ＯＸ−４０リガンド、化合物１［ＰＭＩＤ：２４９３０７７６］、ＣＤ４０リガンド、Ｆａｓリガンド、ＴＬ１Ａ、ＣＤ７０、ＣＤ３０リガンド、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫリガンド、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ＴＬ６、エクトジスプラシンＡ２、エクトジスプラシンＡ１を含む）、ＴＩＭＰ−３阻害剤、ＢＣＬ−２ファミリー阻害剤、ＩＡＰ攪乱物質、プロテアーゼ阻害剤、アミノ糖、化学療法剤（アポトーシスまたは非アポトーシス経路を通じて作用するかどうかに関わりなく）（Ｒｉｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  １１（４）：３４２−５７（２００６））、細胞毒性化学物質、毒素、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、メシル酸イマチニブ）、プロトン、ベバシズマブ（抗血管剤）、エルロチニブ（ＥＧＦＲ阻害剤）、抗感染症剤、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、アミノグリコシド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、スタチン、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、生体高分子、多糖類、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ポリエチレングリコール、脂質、デンドリマー、脂肪酸、もしくはＦｃドメインもしくはＦｃ領域、またはその活性フラグメントもしくは修飾体が含まれるがこれらに限定されない。上記の活性剤の任意の組み合わせは、本開示の複合体と共に共送達され得る。また、いくつかの実施形態では、陽子線療法または切除放射線療法などの他の共療法が、本開示の複合体と一緒に、それを必要とする対象に適用され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、活性剤または抗炎症剤などの抗関節炎剤に、例えば、直接的にまたはリンカーを介して共有結合でまたは非共有結合で連結される。ＴＮＦブロッカーは、炎症を引き���こし、かつクローン病、潰瘍性大腸炎、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎及び尋常性乾癬などの免疫系疾患につながり得る体内の物質であるＴＮＦの活性を阻害することによって免疫系を抑制する。このクラスの薬物には、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（インフリキシマブ）、Ｅｎｂｒｅｌ（エタネルセプト）、Ｈｕｍｉｒａ（アダリムマブ）、Ｃｉｍｚｉａ（セルトリズマブペゴル）及びＳｉｍｐｏｎｉ（ゴリムマブ）が含まれる。本明細書に開示されるペプチドは、軟骨にホーミングし、それに分布し、それを標的とし、それに誘導され、それによって保持され、それに蓄積し、それに移動し、及び／またはそれに結合するために使用され得、よって、結合または融合した活性剤または抗炎症剤などの抗関節炎剤を局在化させるためにも使用され得る。さらに、ノットクロロトキシンペプチドは、細胞内に内在化され得る（Ｗｉｒａｎｏｗｓｋａ，Ｍ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔ．，１１：２７（２０１１））。それ故、活性剤ペプチド複合体または融合ペプチドの内在化後の細胞内在化、細胞内局在化、及び細胞内往来は、活性剤複合体または融合物における重要な要因であり得る。（Ｄｕｃｒｙ，Ｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  （２０１３）；及びＳｉｎｇｈ，Ｓ．Ｋ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．３２（１１）：３５４１−３５７１（２０１５））。本明細書の実施形態で使用するのに好適な例示的なリンカーは、以下でさらに詳細に論述されている。
【００９３】
本開示の複合体のペプチドまたは融合ペプチドはまた、組織または体液からペプチドを回収するための親和性ハンドル（例えば、ビオチン）を提供するなど、他の役割を果たし得る他の部位に複合体化され得る。例えば、本開示の複合体のペプチドまたは融合ペプチドはまた、ビオチンに複合体化され得る。半減期の延長に加えて、ビオチンはまた、組織または他の場所からペプチド、融合ペプチド、または複合体を回収するための親和性ハンドルとして作用し得る。いくつかの実施形態では、検出可能な標識及び親和性ハンドルの両方として作用し得る蛍光ビオチン複合体が使用され得る。市販の蛍光ビオチン複合体の非限定的な例には、Ａｔｔｏ４２５−ビオチン、Ａｔｔｏ４８８−ビオチン、Ａｔｔｏ５２０−ビオチン、Ａｔｔｏ−５５０ビオチン、Ａｔｔｏ５６５−ビオチン、Ａｔｔｏ５９０−ビオチン、Ａｔｔｏ６１０−ビオチン、Ａｔｔｏ６２０−ビオチン、Ａｔｔｏ６５５−ビオチン、Ａｔｔｏ６８０−ビオチン、Ａｔｔｏ７００−ビオチン、Ａｔｔｏ７２５−ビオチン、Ａｔｔｏ７４０−ビオチン、フルオレセインビオチン、ビオチン−４−フルオレセイン、ビオチン−（５−フルオレセイン）複合体、及びビオチン−Ｂ−フィコエリスリン、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ４８８ビオシチン、Ａｌｅｘａ  ｆｌｏｕｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４９、ルシファーイエローカダベリンビオチン−Ｘ、ルシファーイエロービオシチン、オレゴングリーン４８８ビオシチン、ビオチン−ローダミンならびにテトラメチルローダミンビオシチンが含まれる。いくつかの他の例では、複合体は、化学発光性化合物、コロイド金属、発光性化合物、酵素、放射性同位体、及び常磁性標識を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の複合体のペプチドは、別の分子に結合され得る。例えば、ペプチド配列はまた、別の活性剤（例えば、小分子、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、アプタマー、サイトカイン、成長因子、神経伝達物質、前述のいずれかの活性フラグメントもしくは修飾物、フルオロフォア、放射性同位体、放射性核種キレート剤、アシル付加体、化学リンカー、または糖など）に結合され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、活性剤と融合され得るか、または共有結合もしくは非共有結合で連結され得る。
【００９４】
また、毒素または毒液に由来する複数のペプチドアミノ酸配列は、複合体の特定のペプチド上に存在し得るか、またはそれと融合され得る。ペプチドは、様々な技術によって生体分子に組み込まれ得る。ペプチドは、アミド結合などの共有結合の形成などの化学変換によって組み込まれ得る。ペプチドは、例えば、固相または液相のペプチド合成によって組み込まれ得る。ペプチドは、生体分子をコードする核酸配列を調製することによって組み込まれ得、その核酸配列は、そのペプチドをコードする部分配列を含む。部分配列は、生体分子をコードする配列に加えられ得るか、または生体分子をコードする配列の部分配列に代えられ得る。
【００９５】
検出可能剤複合体化
複合体のペプチドは、画像化、研究、療法、セラノスティクス、化学療法、キレート療法、標的薬物送達、及び放射線療法で使用される薬剤に複合体化され得る。薬剤は、検出可能剤であり得る。一般に、本明細書に開示される任意のペプチドは、検出可能剤に複合体化され得る。そのようなペプチドは、配列番号１〜配列番号５１０に示されるアミノ酸配列、またはそのフラグメントの任意の１つ以上と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。そのようなペプチドが複合体化され得る検出可能剤は、本明細書に記載の任意の検出可能剤であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチド−検出可能剤複合体は、ペプチド（例えば、配列番号２１〜配列番号２４７または配列番号２８２〜配列番号５１０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するペプチド）、リンカー（例えば、表２に列挙されるリンカーのいずれか１つ）、及び本明細書に記載される検出可能剤を含み、そのリンカーは、ペプチドを検出可能剤に複合体化する。
【００９６】
いくつかの実施形態では、シスチン高密度ペプチドは、検出可能剤、例えば、金属、放射性同位体、色素、フルオロフォア、または画像化で使用され得る別の好適な物質に複合体化される。放射性同位体の非限定的な例には、アルファ放射体、ベータ放射体、陽電子放射体、及びガンマ放射体が含まれる。いくつかの実施形態では、金属または放射性同位体は、アクチニウム、アメリシウム、ビスマス、カドミウム、セシウム、コバルト、ユーロピウム、ガドリニウム、イリジウム、鉛、ルテチウム、マンガン、パラジウム、ポロニウム、ラジウム、ルテニウム、サマリウム、ストロンチウム、テクネチウム、タリウム、及びイットリウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、金属は、アクチニウム、ビスマス、鉛、ラジウム、ストロンチウム、サマリウム、またはイットリウムである。いくつかの実施形態では、放射性同位体は、アクチニウム−２２５または鉛−２１２である。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、６５０ｎｍ〜４０００ｎｍの波長で電磁放射線を放射する蛍光剤であり、そのような放射は、そのような薬剤を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、本開示における複合体化分子として使用され得、ＤｙＬｉｇｈｔ−６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ−７５０、ＶｉｖｏＴａｇ−７５０、ＤｙＬｉｇｈｔ−８００、ＩＲＤｙｅ−８００、ＶｉｖｏＴａｇ−６８０、Ｃｙ５．５、またはインドシアニングリーン（ＩＣＧ）を含む蛍光色素からなる群から選択される蛍光剤である。いくつかの実施形態では、近赤外色素はしばしば、シアニン色素を含む。本開示において複合体化分子として使用するための蛍光色素の追加の非限定的な例には、アクラジンオレンジまたはイエロー、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ及びその任意の誘導体、７−アクチノマイシンＤ、８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸、ＡＴＴＯ色素及びその任意の誘導体、オーラミン−ローダミン染色及びその任意の誘導体、ベンサントロン、ビマン、９−１０−ビス（フェニルエチニル）アントラセン、５，１２−ビス（フェニルエチニル）ナフタセン、ビスベンズイミド、ブレインボウ、カルセイン、カルボキシフルオレセイン及びその任意の誘導体、１−クロロ−９，１０−ビス（フェニルエチニル）アントラセン及びその任意の誘導体、ＤＡＰＩ、ＤｉＯＣ６、ＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒｓ及びその任意の誘導体、エピコッコノン、臭化エチジウム、ＦｌＡｓＨ−ＥＤＴ２、Ｆｌｕｏ色素及びその任意の誘導体、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅ及びその任意の誘導体、フルオレセイン及びその任意の誘導体、Ｆｕｒａ及びその任意の誘導体、ＧｅｌＧｒｅｅｎ及びその任意の誘導体、ＧｅｌＲｅｄ及びその任意の誘導体、蛍光タンパク質及びその任意の誘導体、例えばｍＣｈｅｒｒｙなどのｍアイソフォームタンパク質及びその任意の誘導体、ヘタメチン色素及びその任意の誘導体、ヘキスト染色、イミノクマリン、インディアンイエロー、ｉｎｄｏ−１及びその任意の誘導体、ラウルダン、ルシファーイエロー及びその任意の誘導体、ルシフェリン及びその任意の誘導体、ルシフェラーゼ及びその任意の誘導体、メルコシアニン及びその任意の誘導体、ナイル色素及びその任意の誘導体、ペリレン��フロキシン、フィコ色素及びその任意の誘導体、ヨウ化プロピウム、ピラニン、ローダミン及びその任意の誘導体、リボグリーン、ＲｏＧＦＰ、ルブレン、スチルベン及びその任意の誘導体、スルホローダミン及びその任意の誘導体、ＳＹＢＲ及びその任意の誘導体、シナプト−ｐＨｌｕｏｒｉｎ、テトラフェニルブタジエン、テトラナトリウムトリス、テキサスレッド、チタンイエロー、ＴＳＱ、ウンベリフェロン、ビオラントロン、黄色蛍光タンパク質ならびにＹＯＹＯ−１が含まれる。他の好適な蛍光色素には、フルオレセイン及びフルオレセイン色素（例えば、フルオレセインイソチオシアニンまたはＦＩＴＣ、ナフトフルオレセイン、４’、５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセインまたはＦＡＭなど）、カルボシアニン、メロシアニン、スチリル色素、オキソノール色素、フィコエリスリン、エリスロシン、エオシン、ローダミン色素（例えば、カルボキシテトラメチル−ローダミンまたはＴＡＭＲＡ、カルボキシローダミン６Ｇ、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、リサミンローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）など）、クマリン及びクマリン色素（例えば、メトキシクマリン、ジアルキルアミノクマリン、ヒドロキシクマリン、アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）など）、オレゴングリーン色素（例えば、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４など）、テキサスレッド、テキサスレッド−Ｘ、スペクトラムレッド、スペクトラムグリーン、シアニン色素（例えば、ＣＹ−３、Ｃｙ−５、ＣＹ−３．５、ＣＹ−５．５など）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ色素（例えば、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ３５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ４８８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ５４６、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ５６８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ５９４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ６３３、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ６６０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ６８０など）、ＢＯＤＩＰＹ色素（例えば、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５など）、ＩＲＤｙｅｓ（例えば、ＩＲＤ４０、ＩＲＤ７００、ＩＲＤ８００など）などが含まれるがこれらに限定されない。追加の好適な検出可能剤は、ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１７７に記載されている。放射性同位体の非限定的な例には、アルファ放射体、ベータ放射体、陽電子放射体、及びガンマ放射体が含まれる。いくつかの実施形態では、金属または放射性同位体は、アクチニウム、アメリシウム、ビスマス、カドミウム、セシウム、コバルト、ユーロピウム、ガドリニウム、ヨウ素、イリジウム、鉛、ルテチウム、マンガン、パラジウム、ポロニウム、ラジウム、ルテニウム、サマリウム、ストロンチウム、テクネチウム、タリウム、及びイットリウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、金属は、アクチニウム、ビスマ���、鉛、ラジウム、ストロンチウム、サマリウム、またはイットリウムである。いくつかの実施形態では、放射性同位体は、アクチニウム−２２５または鉛−２１２である。
【００９７】
本開示の他の実施形態は、放射線増感剤または光増感剤に複合体化されたペプチドを含む複合体を提供する。放射線増感剤の例には、ＡＢＴ−２６３、ＡＢＴ−１９９、ＷＥＨＩ−５３９、パクリタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、ゲムシタビン、エタニダゾール、ミソニダゾール、チラパザミン、及び核酸塩基誘導体（例えば、ハロゲン化プリンまたはピリミジン、例えば、５−フルオロデオキシウリジン）が含まれるがこれらに限定されない。光増感剤の例には、照射すると熱を生成する蛍光性分子またはビーズ、ポルフィリン及びポルフィリン誘導体（例えば、クロリン、バクテリオクロリン、イソバクテリオクロリン、フタロシアニン、及びナフタロシアニン）、金属ポルフィリン、金属フタロシアニン、アンゲリシン、カルコゲンアピリリウム色素、クロロフィル、クマリン、フラビン及び関連化合物、例えば、アロキサジン及びリボフラビン、フラーレン、フェオホルビド、ピロフェオホルビド、シアニン（例えば、メロシアニン５４０）、フェオフィチン、サフィリン、テキサフィリン、プルプリン、ポルフィセン、フェノチアジニウム、メチレンブルー誘導体、ナフタルイミド、ナイルブルー誘導体、キノン、ペリレンキノン（例えば、ヒペリシン、ヒポクレリン、及びセルコスポリン）、ソラレン、キノン、レチノイド、ローダミン、チオフェン、ベルジン、キサンテン色素（例えば、エオシン、エリスロシン、ローズベンガル）、ポルフィリンの二量体及びオリゴマー形態、ならびに５−アミノレブリン酸などのプロドラッグが含まれるがこれらに限定されない。有利には、このアプローチは、治療剤（例えば、薬物）及び電磁エネルギー（例えば、放射線または光）の両方を同時に使用して罹患細胞（例えば、がん細胞）を高度に特異的に標的化することを可能にする。いくつかの実施形態では、ペプチドは、薬剤に、例えば、直接的にまたはリンカーを介して共有結合でまたは非共有結合で連結される。本明細書の実施形態で使用するのに好適な例示的なリンカーは、以下でさらに詳細に論述されている。
【００９８】
複合体におけるリンカー
軟骨にホーミングし、それを標的とし、それに移動し、それによって保持され、それに蓄積し、及び／またはそれに結合し、またはそれに誘導される本開示による複合体のペプチドは、リンカーを介して、またはリンカーの非存在下で直接、別の部位（例えば、活性剤または抗炎症剤などの抗関節炎剤）、例えば、小分子、例えば、グルココルチコイド、第２のペプチド、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、フルオロフォア、放射性同位体、放射性核種キレート剤、ポリマー、生体高分子、脂肪酸、アシル付加物、化学リンカー、もしくは糖または本明細書に記載の他の活性剤に結合され得る。
【００９９】
複合体のペプチドは、共有結合によって別の分子に直接的に結合され得る。結合は、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、カルバメート結合、カルボネート結合、炭素−窒素結合、トリアゾール、大員環、オキシム結合、ヒドラゾン結合、アゾ結合、炭素−炭素単、二重もしくは三重結合、ジスルフィド結合、またはチオエーテル結合を介し得る。いくつかの実施形態では、開示されるペプチド（複数可）それ自体の同様の領域（アミノ酸配列の末端、リジン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン酸、非天然アミノ酸残基、またはグルタミン酸残基の側鎖などのアミノ酸側鎖、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、カルバメート結合、カルボネート結合、炭素−窒素結合、トリアゾール、大員環、オキシム結合、ヒドラゾン結合、炭素−炭素単、二重もしくは三重結合、ジスルフィド結合、もしくはチオエーテル結合、または本明細書に記載されるようなリンカーを介するなど）が、他の分子を連結するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、より大きなポリペプチドまたはペプチド分子のアミノ酸配列の末端に結合されるか、またはリジン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン酸、非天然アミノ酸残基、またはグルタミン酸残基の側鎖などの側鎖に結合される。
【０１００】
リンカーを介する結合は、他の分子（例えば、活性剤及び／または検出可能剤）とペプチド（例えば、配列番号２１〜配列番号２４７または配列番号２８２〜配列番号５１０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するペプチド）との間でのリンカー部位の組み込みを含み得る。ペプチド及び他の分子はいずれとも、リンカーに共有結合され得る。リンカーは、切断性、安定的、自己犠牲的、親水性、または疎水性であり得る。リンカーは、酵素、水、または他の化学物質の連結基へのアクセスを立体的に制限する嵩高い側基または鎖を有し得る。リンカーは、少なくとも２つの官能基（例えば、カルボン酸、カルバミン酸、炭酸、アミン、チオール、エステルなど）であって、一方がペプチドに結合し（例えば、アミド結合を形成するためなどのペプチドのアミンに結合したリンカーにおけるエステル）、他方が別の分子に結合した（例えば、エステル、カルバメート、またはカルボネート結合などの結合を形成するための他の分子におけるヒドロキシル基に結合したリンカー上のカルボン酸、カルバミン酸、炭酸など）、少なくとも２つの官能基及び２つの官能基の間の連結部分を有し得る。他の分子（複数可）は、活性剤（例えば、グルココルチコイド）及び／または検出可能剤であり得る。
【０１０１】
結合のための官能基の非限定的な例には、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、カルボネート結合、カルバメート結合、またはチオエーテル結合を形成することが可能な官能基が含まれ得る。そのような結合を形成することが可能な官能基の非限定的な例には、アミノ基；カルボキシル基；ヒドロキシル基；アルデヒド基；アジ化物基；アルキン及びアルケン基；ケトン；ヒドラジド；酸フッ化物、塩化物、臭化物、及びヨウ化物などの酸ハロゲン化物；対称性、混合、及び環状無水物を含む酸無水物；カルボネート；シアノ、スクシンイミジル、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミジルなどの脱離基に結合したカルボニル官能基；ヒドロキシル基；スルフヒドリル基；ならびに例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリル、もしくはベンジル脱離基を保有する分子、例えば、ハロゲン化物、メシレート、トシレート、ノシレート（例えば、パラ−ニトロフェニルスルホネート）、トリフレート、エポキシド、リン酸エステル、硫酸エステル、及びベシレートが含まれ得る。
【０１０２】
連結部分の非限定的な例には、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ポリエーテル、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシカルボン酸、ポリエステル、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリペプチド、切断可能ペプチド、バリン−シトルリン、アミノベンジルカルバメート、Ｄ−アミノ酸、及びポリアミンが含まれ得、これらのいずれも非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基、アミノ基、ニトロ基、ニトロソ基、シアノ基、アジド基、スルホキシド基、スルホン基、スルホンアミド基、カルボキシル基、カルボキサルデヒド基、イミン基、アルキル基、ハロ−アルキル基、アルケニル基、ハロ−アルケニル基、アルキニル基、ハロ−アルキニル基、アルコキシ基、アリール基、アリールオキシ基、アラルキル基、アリールアルコキシ基、ヘテロシクリル基、アシル基、アシルオキシ基、カルバメート基、アミド基、ウレタン基、エポキシド、及びエステル基などの置換基の任意の数で置換されている。
【０１０３】
いくつかの場合では、リンカーは、任意に環内に３〜１０個の炭素を有し、任意にカルボン酸
【化２７】
2021522172.tif 000051
から構築される有機非芳香族または芳香族環などの環状基、環状基、例えば、トランス−４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸、
【化２８】
2021522172.tif 000052
またはその置換アナログもしくは立体異性体を含み得る。このリンカーは任意に、カルバメート結合を形成するために使用され得る。いくつかの場合では、カルバメート結合は、エステル結合よりも、加水分解、エステラーゼなどの酵素、または他の化学反応による切断に対してより抵抗性であり得る。
【０１０４】
いくつかの場合では、リンカーは、環状カルボン酸、例えば、環状ジカルボン酸、例えば、以下の群：１，４−シクロヘキサンジカルボン酸、１，２−シクロヘキサンジカルボン酸、または１，３−シクロヘキサンジカルボン酸、１，１−シクロペンタン二酢酸、
【化２９】
2021522172.tif 000053
のうちの１つまたはその置換アナログもしくは立体異性体を含み得る。例えば、リンカーは、以下の群：
【化３０】
2021522172.tif 000054
のうちの１つを含む。いくつかの例では、リンカーは任意に、エステル結合を形成するために使用され得る。いくつかの場合では、環状エステル結合は、非環状または線状エステル結合よりも、水による加水分解、エステラーゼなどの酵素、または他の化学反応による切断に対してより立体的に抵抗性であり得る。
【０１０５】
いくつかの場合では、リンカーは、芳香族ジカルボン酸、例えば、テレフタル酸、イソフタル酸、フタル酸
【化３１】
2021522172.tif 000055
またはその置換アナログを含み得る。
【０１０６】
いくつかの場合では、リンカーは、天然または非天然アミノ酸、例えば、システイン、
【化３２】
2021522172.tif 000056
またはその置換アナログもしくは立体異性体を含み得る。いくつかの例では、リンカーは、アラニン（Ａ、Ａｌａ）；アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）；アスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ）；グルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）；グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）；グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈ、Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）；ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）；リジン（Ｋ、Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ）；セリン（Ｓ、Ｓｅｒ）；スレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｗ、Ｔｒｐ）；チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ）；バリン（Ｖ、Ｖａｌ）；またはその任意の複数または組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、機能性ハンドルとして使用され得る１つ以上の官能基、例えば、アルケンまたはアルキンを含み得る。
【０１０７】
いくつかの場合では、リンカーは、以下の群：
【化３３】
2021522172.tif 000057
のうちの１つまたはその置換アナログもしくは立体異性体を含み得る。いくつかの例では、リンカーは、以下の群：
【化３４】
2021522172.tif 000058
のうちの１つまたはその置換アナログもしくは立体異性体から選択される。
【０１０８】
いくつかの場合では、リンカーは、以下の群：
【化３５】
2021522172.tif 000059
のうちの１つまたはその置換アナログもしくは立体異性体を含み得る。いくつかの例では、リンカーは、以下の群：
【化３６】
2021522172.tif 000060
のうちの１つまたはその置換アナログもしくは立体異性体から選択される。
【０１０９】
いくつかの場合では、置換されたアナログまたは立体異性体は、本明細書に開示される化合物の構造的アナログであって、その化合物の１つ以上の水素原子が、ハロ（例えば、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ）、アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル）、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、またはそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上の基によって置換されていてもよいものである。いくつかの場合では、立体異性体は、エナンチオマー、ジアステレオマー、シスもしくはトランス立体異性体、ＥもしくはＺ立体異性体、またはＲもしくはＳ立体異性体であり得る。
【０１１０】
線状リンカーの非限定的な例には、
【化３７】
2021522172.tif 000061
；（各ｎ１、ｎ２またはｍは、独立して、０〜約１，０００；１〜約１，０００；０〜約５００；１〜約５００；０〜約２５０；１〜約２５０；０〜約２００；１〜約２００；０〜約１５０；１〜約１５０；０〜約１００；１〜約１００；０〜約５０；１〜約５０；０〜約４０；１〜約４０；０〜約３０；１〜約３０；０〜約２５；１〜約２５；０〜約２０；１〜約２０；０〜約１５；１〜約１５；０〜約１０；１〜約１０；０〜約５；または１〜約５である）が含まれる。いくつかの実施形態では、各ｎは、独立して、０、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、または約５０である。いくつかの実施形態では、ｍは、１〜約１，０００；１〜約５００；１〜約２５０；１〜約２００；１〜約１５０；１〜約１００；１〜約５０；１〜約４０；１〜約３０；１〜約２５；１〜約２０；１〜約１５；１〜約１０；または１〜約５である。いくつかの実施形態では、ｍは、０、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、または約５０である。いくつかの例では、リンカーは、線状ジカルボン酸、例えば、以下の群：コハク酸、２，３−ジメチルコハク酸、グルタル酸、アジピン酸、２，５−ジメチルアジピン酸、
【化３８】
2021522172.tif 000062
のうちの１つまたはその置換アナログもしくは立体異性体を含み得る。いくつかの場合では、リンカーは、カルバメート結合を形成するために使用され得る。いくつかの実施形態では、カルバメート結合は、エステル結合よりも、加水分解、エステラーゼなどの酵素、または他の化学反応による切断に対してより抵抗性であり得る。いくつかの場合では、リンカーは、線状エステル結合を形成するために使用され得る。いくつかの実施形態では、線状エステル結合は、環状エステルまたはカルバメート結合よりも、加水分解、エステラーゼなどの酵素、または他の化学反応による切断に対してより感受性であり得る。線状エステル結合上のメチル基などの側鎖は任意に、側鎖がない場合よりも、結合の切断に対する感受性を低下させ得る。
【０１１１】
いくつかの場合では、リンカーは、コハク酸リンカーであり得、薬物は、２つのメチレン炭素を挟んだエステル結合またはアミド結合を介してペプチドに結合され得る。他の場合では、リンカーは、ヒドロキシヘキサン酸または乳酸などの、水酸基及びカルボン酸の両方を有する任意のリンカーであり得る。
【０１１２】
いくつかの場合では、薬物は、以下の表２に示されるリンカーのうちの任意の１つ以上、またはその任意の異性体、立体異性体、もしくは誘導体を使用してペプチドに結合され得る。
【表２−１】
2021522172.tif 000063
【表２−２】
2021522172.tif 000064
【表２−３】
2021522172.tif 000065
【０１１３】
いくつかの場合では、薬物分子は、薬物分子の求核性官能基（例えば、ヒドロキシル基）が求核剤として作用し、リンカー部位上の脱離基を置き換え、それによって薬物をリンカーに結合させるリンカーに結合される。例えば、実施例５は、薬物分子（例えば、本明細書では「Ｄｅｘ」とも略されるデキサメタゾン）の第１級アルコール（例えば、水酸基）が、活性化剤ＤＭＡＰ及びＥＤＣの存在下で、リンカーのカルボン酸（例えば、本明細書では「ＤＭＡ」とも省略されるジメチルアジピン酸）と反応して、薬物をリンカーに結合させるエステル結合を形成することを示している。
【０１１４】
他の場合では、薬物分子は、リンカーの求核性官能基（例えば、チオール基、アミン基など）が薬物分子上の脱離基を置き換え、それによって薬物をリンカーに結合させるリンカーに結合される。例えば、実施例８は、リンカー（例えば、システイン、または１４Ｃ標識システイン）のチオール基が求核剤であり得、薬物分子デキサメタゾンの脱離基と反応し得ることを示している。そのような脱離基（または脱離基に変換され得る官能基）は、チオエーテル結合を形成するための第１級アルコールであり得、それによって薬物をリンカーに結合させる。第１級アルコールは、求核置換反応を促進するために、メシレート、トシレート、またはノシレートなどの脱離基に変換され得る。
【０１１５】
本開示のペプチド−薬物複合体は、本開示の薬物、リンカー、及び／またはペプチドを含み得る。これら３つの成分間の一般的接続性は、リンカーが薬物及びペプチドの両方に結合されるように、薬物−リンカー−ペプチドであり得る。ほとんどの場合、ペプチドは、アミド結合を介してリンカーに結合されている。アミド結合は、エステル、カルボネートなどの本明細書に記載の他の結合と比較して、（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏで）比較的安定であり得る。よって、ペプチドとリンカーとの間のアミド結合は、そのようなｉｎ  ｖｉｖｏでの切断後に薬物にリンカーが結合することなく、薬物がペプチド−薬物−複合体から切断されることが求められる場合、そのｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性のために有利な特性を提供し得る。よって、様々な場合では、薬物は、エステル、カルボネート、カルバメートなどの連結部を介してリンカー−ペプチド部位に結合されており、ペプチドは、アミド結合を介してリンカーに結合されている。これにより、薬物−リンカー結合の選択的な切断を可能にし得（リンカー−ペプチド結合とは対照的）、切断後にリンカー部位がそれに結合することなく、薬物を放出することが可能となる。そのような異なる薬物−リンカー結合または連結の使用は、例えば、標的外効果（例えば、循環中の薬物放出の減少）を最小にしつつ、治療機能を達成するために、ｉｎ  ｖｉｖｏでの薬物放出の調節を可能にし得る。
【０１１６】
いくつかの場合では、安定なリンカーの使用は、ペプチド−薬物複合体の特定の用途に好適である。他の場合では、切断可能なリンカーは、ペプチド−薬物複合体の特定の用途のため、例えば、標的部位、細胞、器官、または組織（例えば、軟骨）において活性剤及び／または検出可能剤を放出するために好適である。よって、本明細書に記載のペプチド−薬物複合体で使用されるリンカー部位は、切断可能なまたは安定なリンカーであり得る。切断可能なリンカーの使用により、例えば、軟骨に標的化した後、複合体化した部位（例えば、治療剤）をペプチドから放出することが可能になる。いくつかの場合では、リンカーは、酵素で切断可能であり、例えば、カテプシンによって切断可能であり得るバリン−シトルリンリンカー、またはエステラーゼによって切断可能であり得るエステルリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、自己犠牲部分を含有する。他の実施形態では、リンカーは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、トロンビン、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、またはカテプシン（例えば、カテプシンＫ）のための切断部位などの、特定のプロテアーゼのための１つ以上の切断部位を含む。
【０１１７】
よって、いくつかの場合では、本開示のペプチド−活性剤複合体は、酵素によって切断可能なアミノ酸配列を形成し得る１個以上、約２個以上、約３個以上、約５個以上、約１０個以上、または約１５個以上のアミノ酸を含み得る。そのような酵素は、プロテイナーゼを含み得る。ペプチド−薬物複合体は、カテプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、サブチリシン、トロンビンＩ、もしくはウロキナーゼ、またはそれらの任意の組み合わせによって切断され得るアミノ酸配列を含み得る。
【０１１８】
代替的にまたは組み合わせて、切断可能なリンカーは、他のメカニズムによって、例えば、ｐＨ、還元、または加水分解を介して切断、解離、または分解され得る。加水分解は、水の反応により直接生じ得るか、または酵素によって促進され得るか、または他の化学種の存在によって促進され得る。加水分解的に不安定なリンカー（本明細書に記載の他の切断可能なリンカーの中で）は、ペプチドから活性剤を放出するという点で有利であり得る。例えば、ペプチドとの複合体形態の活性剤は、活性ではない場合があるが、軟骨への標的化後に複合体から放出されると、その活性剤は活性となる。切断された活性剤は、切断前の本来の活性剤の化学構造を保持していてもよく、または修飾されていてもよい。いくつかの実施形態では、安定なリンカーは任意に、長期間（例えば、数時間、数日、または数週間）にわたって緩衝液中で切断しない場合がある。いくつかの実施形態では、安定なリンカーは任意に、長期間（例えば、数時間、数日、または数週間）にわたって血漿または滑液などの体液中で切断しない場合がある。いくつかの実施形態では、安定なリンカーは任意に、例えば、細胞（マクロファージなど）、細胞区画（エンドソーム及びリソソームなど）、身体の炎症領域（炎症を起こした関節など）、または組織もしくは身体区画に存在し得る酵素、活性酸素種、他の化学物質または酵素への曝露後に切断し得る。いくつかの実施形態では、安定なリンカーは任意に、ｉｎ  ｖｉｖｏでは切断しない場合があるが、ペプチドに複合体化された場合に依然として活性である活性剤を提供し得る。
【０１１９】
リンカー（例えば、ペプチド複合体のリンカー）の加水分解の速度は、調整され得る。例えば、非ヒンダードエステルを有するリンカーの加水分解の速度は、エステルカルボニルの隣に嵩高い基を有するリンカーの加水分解と比較して速い。嵩高い基は、メチル基、エチル基、フェニル基、環、もしくはイソプロピル基、または立体的な嵩高さを提供する任意の基であり得る。別の例では、加水分解の速度は、アルコール、酸、もしくはエーテルなどの親水性基を伴って、またはエステルカルボニルの近くでより速くなり得る。別の例では、側鎖として、またはより長い炭化水素リンカーを有することによって存在する疎水性基は、エステルの切断を遅延させ得る。いくつかの実施形態では、カルバメート基の切断はまた、障害、疎水性などによって調整され得る。別の例では、エステルではなくカルバメートなどの不安定性がより低いリンカーを使用することは、リンカーの切断速度を遅延させ得る。いくつかの場合では、立体的嵩高さは、そのカルボン酸を介して複合体化された場合に薬物自体によって、例えば、ケトロラクによって提供され得る。リンカーの加水分解の速度は、軟骨中の複合体の滞留時間に応じて、ペプチドがどのくらい急速に軟骨中に蓄積するかに応じて、または軟骨における活性剤への曝露のための所望の時間枠に応じて調整され得る。例えば、ペプチドが比較的急速に軟骨から排除される場合、リンカーは、迅速に加水分解するように調整され得る。対照的に、例えば、ペプチドが軟骨中でより長い滞留時間を有する場合、より遅い加水分解速度は、活性剤の延長送達を可能にし得る。これは、ペプチドが軟骨に薬物を送達するために使用される場合に重要であり得る。“Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｆｏｒ  ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ”Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ２０１５，５，１２０２３  Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，は、改変された加水分解速度の例を提供している。いくつかの実施形態では、切断速度は、種、身体区画、及び疾患状態によって変化し得る。例えば、エステラーゼによる切断は、カルボキシエステラーゼの異なるレベルなどにより、ヒト血漿中よりもラットまたはマウスの血漿中の方が迅速であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、異なる種における同様の切断速度について異なる切断速度のために調整され得る。
【０１２０】
リンカー（例えば、ペプチド複合体のリンカー）の加水分解の速度は、測定され得る。そのような測定は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、及び／またはｅｘ  ｖｉｖｏで緩衝液（例えば、ＰＢＳ）もしくは対象からの血漿（例えば、ラット血漿、ヒト血漿など）または滑液もしくは他の流体もしくは組織と共に本開示のリンカーまたはリンカーを含むペプチド複合体をインキュベートすることによって対象の血漿、もしくは滑液、または他の流体もしくは組織中の遊離活性剤を決定することを含み得る。加水分解速度を測定するための方法は、インキュベーション中または投与後にサンプルを採取することを含み得、遊離活性剤、遊離ペプチド、または加水分解の任意の他のパラメータを決定し、これは、総ペプチド、総活性剤、または複合体化活性剤−ペプチドを測定することも含む。次いでそのような測定の結果は、所与のリンカーまたはリンカーを含むペプチド複合体の加水分解半減期を決定するために使用され得る。リンカーの加水分解半減期は、そのような半減期を決定するために使用される血漿または体液または種または他の条件に応じてて異なり得る。これは、所定の血漿（例えば、ラット血漿）中に存在する所定の酵素または他の化合物に起因し得る。例えば、異なる体液（血漿または滑液など）は、異なる量のエステラーゼなどの酵素を含有し得、これらの化合物のこれらのレベルはまた、種（ラット対ヒトなど）及び疾患状態（正常対関節炎など）に応じて変化し得る。
【０１２１】
本開示の複合体は、様々な成分を含むモジュール構造を有するものとして記載され得、その場合、成分（例えば、ペプチド、リンカー、活性剤及び／または検出可能剤）の各々は、任意の他の成分に依存してまたはそれとは独立してされ得る。例えば、関節炎の治療に使用するための複合体は、本開示の軟骨標的化ペプチド（例えば、配列番号２１〜配列番号２４７または配列番号２８２〜配列番号５１０のいずれか１つのアミノ酸配列を有するもの）、リンカー（例えば、表２に記載の任意のリンカー）及び活性剤（例えば、グルココルチコイド）を含み得る。リンカーは、例えば、標的部位で（例えば、軟骨内で）、所定のメカニズムを介して（例えば、酵素及び／またはｐＨ依存性加水分解などの加水分解を介して）所定の活性剤放出（例えば、所定の放出速度）を達成するために、及び／または活性剤への全身性曝露を最小化するために選択及び／または修飾され得る。複合体の試験中に、複合体の成分の任意の１つ以上は、複合体の所定のｉｎ  ｖｉｖｏ特性、例えば、薬物動態特性（例えば、クリアランス時間、バイオアベイラビリティ、様々な器官における取り込み及び保持）及び／または薬力学的特性（例えば、標的係合）を達成するために改変及び／または変更され得る。よって、本開示の複合体は、副作用（例えば、そのような活性剤を単独（すなわち、ペプチドに複合体化していない）で投与した場合に生じる副作用）を低減しつつ、様々な疾患及び病態を予防、治療、及び／または診断するために調節され得る。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような複合体は、１つ以上の非天然アミノ酸及び／または１つ以上のリンカーを含む。そのような１つ以上の非天然アミノ酸及び／または１つ以上のリンカーは、官能性ハンドルとして使用され得る１つ以上の官能基、例えば、アルケンまたはアルキン（例えば、非末端アルケン及びアルキン）を含み得る。例えば、そのような官能基の多重結合は、１つ以上の分子を複合体に付加するために使用され得る。１つ以上の分子は、様々な合成ストラテジーを使用して付加され得、そのうちのいくつかは、付加及び／または置換化学反応、環化付加などを含み得る。例えば、多重結合を使用する付加反応は、臭化水素の使用（例えば、ヒドロハロゲン化反応を介する）を含み得、その場合、臭素置換基は、結合すると、脱離基として作用するので、求核性官能基を含む様々な部位、例えば、活性剤、検出可能剤、薬剤で置換され得る。別の例として、多重結合は、環化付加反応における機能性ハンドルとして使用され得る。環化付加反応は、１，３−双極性環化付加、［２＋２］−環化付加（例えば、光触媒される）、ディールス・アルダー反応、ヒュスゲン環化付加、ニトロン−オレフィン環化付加などを含み得る。そのような環化付加反応は、様々な官能基、官能性部位、活性剤、検出可能剤などを複合体に結合させるために使用され得る。例えば、１，３−双極性環化付加反応は、分子を複合体に結合させるために使用され得、その分子は、例えば、アルキンと反応して５員環を形成し、それによって前記分子を複合体に結合させ得る１，３−双極子を含む。
【０１２３】
そのような薬剤または分子の付加（例えば、求核または求電子性付加と、それに続く求核置換を介する）は、様々な適用を有し得る。例えば、そのような分子または薬剤を結合させることは、複合体の薬物動態的（例えば、血漿半減期、軟骨中での保持及び／または取り込みまたは生体内分布）及び／または薬力学的（例えば、酵素的加水分解速度などの加水分解速度）特性を改変または変化させ得る。そのような分子または薬剤を結合させることはまた、複合体の貯蔵体効果を変化させ得る（例えば、増加させる）か、または、例えば、蛍光または他の種類の検出可能剤を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏ追跡のための機能性を提供し得る。
【０１２４】
いくつかの場合では、本開示の複合体は、１つ以上の非末端アルケン及び／またはアルキンを含み得る。いくつかの場合では、本開示の複合体は、以下の群：
【化３９】
2021522172.tif 000066
のうちの１つ以上またはその置換アナログもしくは立体異性体（式中、各ｎ１及びｎ２は、独立して、１〜１０の値である）を含むリンカーを含み得る。そのような基は、例えば、複合体の薬物動態的（例えば、血漿半減期、軟骨内での保持及び／または取り込み）及び／または薬力学的特性を変化させるために、１つ以上の分子を複合体に結合させるためのハンドルとして使用され得る。そのような基の官能化は、基（例えば、非末端アルケン及びアルキン）の１つ以上の多重結合（例えば、二重結合、三重結合など）を使用して行われ得る。そのような官能化は、本明細書に記載されるような付加及び／または置換化学反応及び環化付加反応を含み得る。例えば、二重結合などのリンカーの官能基は、単結合に変換され得（例えば、求核／求電子付加反応などの付加反応を介する）、新たに形成された単結合の炭素原子の一方または両方は、それらに結合した脱離基（例えば、臭化物）を有し得る。次いでそのような脱離基は、特定の分子（例えば、活性剤、検出可能剤など）をリンカーのその炭素原子（複数可）に結合させるために（例えば、求核置換反応を介して）使用され得る。別の例として、多重結合は、環化付加反応における機能性ハンドルとして使用され得る。環化付加反応は、１，３−双極性環化付加、［２＋２］−環化付加（例えば、光触媒される）、ディールス・アルダー反応、ヒュスゲン環化付加、ニトロン−オレフィン環化付加などを含み得る。そのような環化付加反応は、様々な官能基、官能性部位、活性剤、検出可能剤などを複合体に結合させるために使用され得る。例えば、１，３−双極性環化付加反応は、分子を複合体に結合させるために使用され得、その分子は、例えば、アルキンと反応して５員環を形成し、それによって前記分子（例えば、活性剤、検出可能剤など）を複合体に結合させ得る１，３−双極子を含む。いくつかの場合では、分子は、例えば、半減期を調節するために、貯蔵体効果を増加させるために、または追跡のための蛍光などの複合体の新たな機能性を提供するために複合体に結合され得る。
【０１２５】
ペプチド安定性
本開示のペプチドまたは複合体は、様々な生物学的条件で安定であり得る。例えば、配列番号１〜配列番号５１０のいずれかのペプチドまたはそれを含む複合体は、還元剤、プロテアーゼ、酸化条件、または酸性条件に対して抵抗性を示し得る。
【０１２６】
いくつかの場合では、生物学的分子（ペプチド及びタンパク質など）は、治療機能を提供し得るが、そのような治療機能は、ｉｎ  ｖｉｖｏ環境によって引き起こされる不安定性によって低下するか、または阻害される。（Ｍｏｒｏｚ  ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  １０１：１０８−２１（２０１６），Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ１３（９）：６５５−７２（２０１４），Ｂｒｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅｒ  Ｄｅｌｉｖ（１１）：１４４３−６７（２０１３），Ｓｉｎｈａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．２４（１）：６３−９２（２００７），Ｈａｍｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏＤｒｕｇｓ  １９（３）：１６５−７７（２００５））。例えば、ＧＩ管は、低ｐＨ（例えば、ｐＨ約１）の領域、還元性環境、またはペプチド及びタンパク質を分解し得るプロテアーゼに富む環境を含有し得る。口、目、肺、鼻腔内、関節、皮膚、腟管、粘膜、及び血清などの身体の他の領域におけるタンパク質分解活性もまた、機能的に活性なペプチド及びポリペプチドの送達の障害となり得る。また、血清中のペプチドの半減期は、プロテアーゼに部分的に起因して非常に短い場合があるので、ペプチドは、合理的な投薬レジメンを投与する場合、持続的な治療効果を有するにはあまりにも急速に分解され得る。同様に、リソソームなどの細胞区画におけるタンパク質分解活性ならびにリソソーム及びサイトゾルにおける還元活性は、ペプチド及びタンパク質を分解し得、これによりそれらは、細胞内標的に対する治療機能を提供できなくなる場合がある。それ故、本明細書に開示される複合体は、還元剤、プロテアーゼ、及び低ｐＨ（例えば、ｐＨ１〜２またはｐＨ１〜３）に対して抵抗性であるペプチドを含み得る。いくつかの場合では、複合体は、増強された治療効果を提供すること、またはｉｎ  ｖｉｖｏで共形成または複合体化された活性剤の治療効力を増強することが可能であり得る。
【０１２７】
また、薬物の経口送達は、この投与方法によって提供される機能的に活性なペプチド及びポリペプチドの送達の障害にもかかわらず、身体の所定の領域を標的化するために望ましい場合がある。例えば、薬物の経口送達は、非経口送達と比較して、患者が服用するのにより好都合な投薬形態を提供することによってコンプライアンスを向上させ得る。経口送達は、大きな治療ウィンドウを有する治療レジメンにおいて有用であり得る。それ故、還元剤、プロテアーゼ、及び低ｐＨに対して抵抗性であるペプチドは、それらの治療機能を無効にすることなく、ペプチド及び複合体のペプチドの経口送達を可能にし得る。
【０１２８】
還元剤に対するペプチド抵抗性
本開示のペプチドは、ペプチドの折り畳まれた状態を保持するために不可欠であり得るジスルフィド架橋に加わり得る１つ以上のシステインを含有し得る。還元剤を有する生物学的環境にペプチドを曝露することは、ペプチドの展開ならびに機能性及び生物活性の損失をもたらし得る。例えば、グルタチオン（ＧＳＨ）は、身体の多くの領域及び細胞内に存在し得、ジスルフィド結合を減少させ得る還元剤である。別の例として、ペプチドは、経口投与後に胃腸管上皮を横切るペプチドの往来中に細胞内在化により還元され得る。ペプチドは、血液への曝露によって還元され得る。ペプチドは、ＧＩ管の様々な部分に曝露されると還元され得る。ＧＩ管は、ジスルフィド結合の還元により、ジスルフィド結合を有する治療分子が最適な治療効果を有する能力を阻害し得る還元性環境であり得る。ペプチドはまた、エンドソームまたはリソソームによる内在化後の細胞に、またはサイトゾル、もしくは他の細胞区画への侵入により還元され得る。ジスルフィド結合の還元及びペプチドの展開は、機能性の損失をもたらし得るか、またはバイオアベイラビリティ、ピーク血漿濃度、生物活性、ならびに軟骨のホーミング及び蓄積を含む半減期などの重要な薬物動態パラメータに影響を及ぼし得る。ジスルフィド結合の還元はまた、プロテアーゼによる後続の分解に対するペプチドの感受性の増加をもたらし得、その結果、投与後に無傷のペプチド（またはペプチド複合体）が迅速に損失する。いくつかの実施形態では、還元に対して抵抗性であるペプチドは、より容易に還元されるペプチドと比較して、身体の様々な区画及び細胞内で無傷を保持し、機能的活性をより長い期間付与し得る。
【０１２９】
所定の実施形態では、本開示の複合体のペプチドは、安定なペプチドを同定するために、還元剤に対する抵抗性の特徴について分析され得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、０．００００１Ｍ〜０．０００１Ｍ、０．０００１Ｍ〜０．００１Ｍ、０．００１Ｍ〜０．０１Ｍ、０．０１Ｍ〜０．０５Ｍ、０．０５Ｍ〜０．１Ｍなどの異なるモル濃度の還元剤に１５分以上曝露された後、無傷を保持し得る。いくつかの実施形態では、ペプチドの安定性を決定するために使用される還元剤は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌ（ＴＣＥＰ）、２−メルカプトエタノール、（還元）グルタチオン（ＧＳＨ）、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドの少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％、または少なくとも９０％〜１００％が、還元剤への曝露後に無傷を保持する。
【０１３０】
プロテアーゼに対するペプチド抵抗性
本開示の複合体のペプチドの安定性は、プロテアーゼによる分解に対する抵抗性によって決定され得る。ペプチダーゼまたはプロテイナーゼとも称されるプロテアーゼは、隣接するアミノ酸間の結合を切断することによってペプチド及びタンパク質を分解し得る酵素であり得る。特定のアミノ酸を標的とするための特異性を有するプロテアーゼのファミリーには、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、エステラーゼ（カルボキシエステラーゼを含む）、血清プロテアーゼ、及びアスパラギンプロテアーゼが含まれ得る。また、メタロプロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、シトクロムＰ４５０酵素、及びカテプシンもまた、ペプチド及びタンパク質を消化し得る。プロテアーゼは、血液中、粘膜、肺、皮膚、ＧＩ管、口、鼻、目内、及び細胞の区画内に高濃度で存在し得る。プロテアーゼの誤制御はまた、関節リウマチ及び他の免疫障害などの様々な免疫疾患で存在し得る。プロテアーゼによる分解は、治療分子のバイオアベイラビリティ、生体内分布、半減期、及び生理活性を低下させ得るので、それらはそれらの治療機能を発揮することができない。いくつかの実施形態では、プロテアーゼに対して抵抗性であるペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで合理的に忍容される濃度で治療活性をより良好に提供し得る。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本開示の複合体のペプチドは、任意のクラスのプロテアーゼによる分解に抵抗し得る。所定の実施形態では、本開示のペプチドは、ペプシン（胃に見られ得る）、トリプシン（十二指腸に見られ得る）、血清プロテアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせによる分解に抵抗する。所定の実施形態では、本開示のペプチドは、肺プロテアーゼ（例えば、セリン、システイニル、及びアスパルチルプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、好中球エラスターゼ、アルファ−１抗トリプシン、分泌性ロイコプロテアーゼ阻害剤、エラフィン）、またはそれらの任意の組み合わせによる分解に抵抗し得る。いくつかの実施形態では、ペプチドの安定性を決定するために使用されるプロテアーゼは、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドの少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％、または少なくとも９０％〜１００％が、プロテアーゼへの曝露後に無傷を保持する。配列番号１９６、配列番号２４、及び配列番号１０５のペプチドは、プロテアーゼ分解に対してより抵抗性のあるものとする特定の構造的性質を有し得る。例えば、配列番号２４及び配列番号１０６のペプチドは、プロテアーゼ及び化学的分解に対する抵抗性に関連し得る、前述したような「ヒチン」トポロジーを示す。
【０１３２】
酸性条件でのペプチド安定性
本開示のペプチドを含む複合体は、酸性の生物学的環境において投与され得る。例えば、経口投与後、複合体またはペプチドは、胃及び胃腸（ＧＩ）管の胃液中で酸性環境条件を経験し得る。胃のｐＨは、約１〜４の範囲であり得、ＧＩ管のｐＨは、上部ＧＩ管から結腸にかけて低下する酸性から正常な生理的ｐＨまでの範囲である。また、膣、後期エンドソーム、及びリソソームもまた、ｐＨ７未満などの酸性ｐＨ値を有し得る。これらの酸性条件は、ペプチド及びタンパク質の展開状態への変性をもたらし得る。ペプチド及びタンパク質の展開は、他の酵素による後続の消化に対する感受性の増加及びペプチドの生物学的活性の損失をもたらし得る。
【０１３３】
所定の実施形態では、本開示の複合体のペプチドは、酸性条件下及び酸性条件をシミュレートする緩衝液中での変性及び分解に抵抗し得る。所定の実施形態では、本開示のペプチドは、１未満のｐＨ、２未満のｐＨ、３未満のｐＨ、４未満のｐＨ、５未満のｐＨ、６未満のｐＨ、７未満のｐＨ、または８未満のｐＨを有する緩衝液中での変性及び分解に抵抗し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、１〜３のｐＨで無傷を保持する。所定の実施形態では、ペプチドの少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％、または少なくとも９０％〜１００％が、１未満のｐＨ、２未満のｐＨ、３未満のｐＨ、４未満のｐＨ、５未満のｐＨ、６未満のｐＨ、７未満のｐＨ、または８未満のｐＨを有する緩衝液への曝露後に無傷を保持する。他の実施形態では、ペプチドの少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％、または少なくとも９０％〜１００％が、１〜３のｐＨを有する緩衝液への曝露後に無傷を保持する。他の実施形態では、本開示のペプチドは、疑似胃液（ｐＨ１〜２）中での変性または分解に対して抵抗性であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドの少なくとも５〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％、または少なくとも９０〜１００％が、疑似胃液への曝露後に無傷を保持する。いくつかの実施形態では、疑似胃液またはクエン酸緩衝液などの低ｐＨ溶液は、ペプチドの安定性を決定するために使用され得る。
【０１３４】
高温でのペプチド安定性
本開示のペプチドを含む複合体は、高温を有する生物学的環境において投与され得る。例えば、経口投与後、複合体またはペプチドは、体内で高温を経験し得る。体温は、３６℃〜４０℃の範囲であり得る。高温は、ペプチド及びタンパク質の展開状態への変性をもたらし得る。ペプチド及びタンパク質の展開は、他の酵素による後続の消化に対する感受性の増加及びペプチドの生物学的活性の損失をもたらし得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、２５℃〜１００℃の温度で無傷を保持し得る。高温は、ペプチドのより速い分解をもたらし得る。より高い温度での安定性は、熱帯環境または冷蔵へのアクセスが制限されている地域でのペプチドの保存を可能にし得る。所定の実施形態では、ペプチドの５％〜１００％が、２５℃に６ヶ月〜５年間曝露した後に無傷を保持し得る。ペプチドの５％〜１００％が、７０℃に１５分〜１時間曝露した後に無傷を保持し得る。ペプチドの５％〜１００％が、１００℃に１５分〜１時間曝露した後に無傷を保持し得る。他の実施形態では、ペプチドの少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％、または少なくとも９０％〜１００％が、２５℃に６ヶ月〜５年間曝露した後に無傷を保持する。他の実施形態では、ペプチドの少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％、または少なくとも９０％〜１００％が、７０℃に１５分〜１時間曝露した後に無傷を保持する。他の実施形態では、ペプチドの少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％、または少なくとも９０％〜１００％が、１００℃に１５分〜１時間曝露した後に無傷を保持する。
【０１３５】
複合体の薬物動態
本開示の複合体の薬物動態は、異なる投与経路を介して複合体を投与した後に決定され得る。例えば、本開示の複合体の薬物動態パラメータは、静脈内、皮下、筋肉内、直腸、エアロゾル、非経口、点眼、肺、経皮、膣、眼、鼻、口、舌下、吸入、皮膚、髄腔内、鼻腔内、関節内、腹膜、頬部、滑液、または局所投与の後に定量化され得る。本開示の複合体は、放射性標識またはフルオロフォアなどの追跡剤を使用することによって分析され得る。例えば、本開示の放射性標識ペプチドを含む複合体は、様々な投与経路を介して投与され得る。血漿、尿、糞便、任意の器官、皮膚、筋肉、及び他の組織などの様々な生物学的サンプル中のペプチドまたは複合体の濃度または用量回収は、ＨＰＬＣ、蛍光検出技術（ＴＥＣＡＮ定量、フローサイトメトリー、ｉＶＩＳ）、または液体シンチレーション計数を含む様々な方法を使用して決定され得る。
【０１３６】
本明細書に記載の方法及び組成物は、対象に任意の経路を介して投与される複合体の薬物動態に関連し得る。薬物動態は、方法及びモデル、例えば、コンパートメントモデルまたはノンコンパートメント法を使用して記載され得る。コンパートメントモデルには、１コンパートメントモデル、２コンパートメントモデル、マルチコンパートメントモデルなどが含まれるがこれらに限定されない。モデルは、異なるコンパートメントに分割され得、対応するスキームによって記述され得る。例えば、１つのスキームは、吸収、分布、代謝及び排泄（ＡＤＭＥ）スキームである。別の例として、別のスキームは、遊離、吸収、分布、代謝及び排泄（ＬＡＤＭＥ）スキームである。いくつかの態様では、代謝及び排泄は、排出コンパートメントと称される１つのコンパートメントに分類され得る。例えば、遊離は、組成物の活性部分の送達システムからの遊離を含み得、吸収は、対象による組成物の活性部分の吸収を含み、分布は、血漿を介した異なる組織への組成物の分布を含み、代謝は、組成物の代謝または不活性化を含み、最後に、排泄は、組成物または組成物の代謝生成物の排泄または排出を含む。対象に静脈内投与される組成物は、組織分布及び代謝／排泄の態様を含み得るがこれらに限定されない多相薬物動態学的プロファイルの対象となり得る。このように、組成物の血漿または血清濃度の低下は、例えば、アルファ相及びベータ相を含む二相性であることが多く、時にはガンマ、デルタまたは他の相が観察される。
【０１３７】
薬物動態学には、対象への複合体の投与に関連する少なくとも１つのパラメータを決定することを含む。いくつかの態様では、パラメータには、少なくとも用量（Ｄ）、投薬間隔（τ）、曲線下面積（ＡＵＣ）、最大濃度（Ｃｍａｘ）、次の用量が投与される前に到達した最小濃度（Ｃｍｉｎ）、最小時間（Ｔｍｉｎ）、Ｃｍａｘに到達するまでの最大時間（Ｔｍａｘ）、分布体積（Ｖｄ）、定常状態の分布体積（Ｖｓｓ）、時間０における逆外挿濃度（Ｃ０）、定常状態濃度（Ｃｓｓ）、排出速度定数（ｋｅ）、注入速度（ｋｉｎ）、クリアランス（ＣＬ）、バイオアベイラビリティ（ｆ）、変動（％ＰＴＦ）及び排出半減期（ｔ１／２）が含まれる。
【０１３８】
所定の実施形態では、配列番号１〜配列番号５１０のいずれかのペプチドを含む複合体は、経口投与後に最適な薬物動態パラメータを示す。他の実施形態では、配列番号１〜配列番号５１０のいずれかのペプチドは、経口投与、吸入、鼻腔内投与、局所投与、静脈内投与、皮下投与、関節内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、またはそれらの任意の組み合わせなどの任意の投与経路の後に最適な薬物動態パラメータを示す。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、配列番号１〜配列番号５１０のいずれのペプチドにおいても、平均Ｔｍａｘは、０．５〜１２時間、または１〜４８時間であり（そこでＣｍａｘに到達する）、経口経路で対象に複合体を投与した後の対象の血清中平均バイオアベイラビリティは、０．１％〜１０％であり、ＧＩ管への送達のための対象への経口投与後の血清中平均バイオアベイラビリティは、０．１％未満であり、非経口投与後の血清中の平均バイオアベイラビリティは、１０〜１００％であり、対象への複合体の投与後の対象における平均ｔ１／２は、０．１時間〜１６８時間、または０．２５時間〜４８時間であり、対象への複合体の投与後の平均クリアランス（ＣＬ）は、複合体０．５〜１００Ｌ／時、または０．５〜５０Ｌ／時であり、対象に複合体を全身投与した後の、または場合により全身の取り込みがない場合の対象における平均分布体積（Ｖｄ）は、２００〜２０，０００ｍＬであり、またはこれらの任意の組み合わせである。
【０１４０】
本明細書に記載の任意のペプチド及び／またはペプチド複合体について、生体内分布、器官クリアランス及び／または循環からのクリアランス、ならびに器官分布、取り込み及び／または保持などの薬物動態パラメータが決定され得る。そのようなパラメータは、ｉｎ  ｖｉｖｏ及び／またはｅｘ  ｖｉｖｏでの様々な技術を使用して決定され得る。ペプチドまたはペプチド複合体の薬物動態パラメータは、例えば、ペプチドまたはペプチド複合体に結合した検出可能剤を使用して決定され得る。本明細書にさらに記載されているように、そのような検出可能剤は、フルオロフォアまたは放射性同位体であり得る。いくつかの場合では、ペプチドまたはペプチド複合体は、１つ以上の薬物動態パラメータを決定するために１４Ｃで標識される。そのような場合、薬物動態パラメータは、例えば、定量的全身オートラジオグラフィ（ＱＷＢＡ）及び／またはシンチレーション計数を使用してｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏでそれぞれ決定され得る。いくつかの場合では、ペプチドまたはペプチド複合体は、標識され及び／またはフルオロフォアに複合体化され、これによりｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏでの対象、器官、及び／または組織におけるペプチドまたはペプチド複合体の分布の決定が可能となる。
【０１４１】
製造方法
ペプチドの生成
様々な発現ベクター／宿主系が、本明細書に記載の複合体のペプチドの組換え発現の生成に利用され得る。そのようなシステムの非限定的な例には、本明細書に記載のペプチドまたはペプチド融合タンパク質／キメラタンパク質をコードする核酸配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）などの微生物、前述の核酸配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、ピキア）、前述の核酸配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）で感染された、または前述の核酸配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系、または二重微小染色体において安定して増幅される（例えば、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ、ＣＨＯ／グルタミンシンセターゼ）または不安定に増幅される（例えば、マウス型細胞株）のどちらかである、前述の核酸配列の複数コピーを含有するように改変された細胞株を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス）で感染された動物、例えば哺乳動物細胞系（例えば、ＣＨＯまたはＨＥＫ）が含まれる。ペプチドのジスルフィド結合の形成及び折り畳みは、発現中もしくは発現後、またはその両方で生じ得る。
【０１４２】
宿主細胞は、本明細書に記載の１つ以上のペプチドを発現するように適合され得る。宿主細胞は、原核、真核、または昆虫細胞であり得る。いくつかの場合では、宿主細胞は、挿入された配列の発現を調節すること、または所望の特定の様式で遺伝子またはタンパク質生成物を修飾及びプロセシングすることが可能である。例えば、所定のプロモーターからの発現は、所定の誘発物質（例えば、メタロチオニンプロモーターのための亜鉛及びカドミウムイオン）の存在下で増加され得る。いくつかの場合では、ペプチド生成物の修飾（例えば、リン酸化）及び処理（例えば、切断）は、ペプチドの機能にとって重要であり得る。宿主細胞は、ペプチドの翻訳後プロセシング及び修飾のための特徴的かつ特異的なメカニズムを有し得る。いくつかの場合では、ペプチドを発現するために使用される宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。
【０１４３】
いくつかの例では、ペプチドは、細胞から培地中に分泌され、採取され得る。細胞ベースまたはウイルスベースのサンプルの場合、生物を精製前に処理して、標的ポリペプチドを保持及び／または放出し得る。いくつかの実施形態では、細胞は、固定剤を使用して固定される。いくつかの実施形態では、細胞は溶解される。細胞物質は、有意な割合の細胞を破壊しないが、細胞物質の表面から、及び／または細胞間の隙間からタンパク質を除去する手法で処理され得る。例えば、細胞間スペース及び／または植物細胞壁中に位置するタンパク質を除去するために、細胞物質は、液体緩衝液に浸漬され得るか、または植物物質の場合では、真空に供され得る。細胞物質が微生物である場合、タンパク質は、微生物培養培地から抽出され得る。代替的に、ペプチドが封入体に充填され得る。封入体は、培地中の細胞成分からさらに分離され得る。いくつかの実施形態では、細胞は破壊されない。無傷の細胞またはウイルス粒子の結合及び／または精製のために、細胞またはウイルスによって提供される細胞またはウイルスペプチドが使用され得る。組換え系に加えて、ペプチドはまた、タンパク質及びペプチド合成に採用される様々な既知の技術を使用して無細胞系において合成され得る。
【０１４４】
いくつかの場合では、本開示のペプチドは、組換え的に単独でまたは融合ペプチドもしくは融合タンパク質として生成される。いくつかの実施形態では、より大きなタンパク質へのＣ末端融合物としてのペプチドを発現し得る方法が本明細書で開示される。いくつかの場合では、ペプチドは、追加のタンパク質としてシデロカリンを含むＣ末端融合タンパク質として発現される。いくつかの場合では、そのような融合物は、哺乳動物の分泌経路を介して融合ペプチドまたはタンパク質を誘導する。いくつかの場合では、そのようなプロセスは、本開示のシスチン高密度ペプチドのジスルフィド結合構造の適切な形成を確実にする。発現すると、Ｃ末端融合タンパク質（例えば、シデロカリン）は、最適化されたＴＥＶ酵素によってペプチドから切断され得る。いくつかの場合では、プロテアーゼの共発現または化学的切断が使用される。発現した融合タンパク質は、様々な方法を使用して精製され得る。そのような方法は、Ｃ末端融合タンパク質（例えば、シデロカリン）の上流にコードされたＨｉｓタグのＮｉ−ＮＴＡ捕捉と、これに続き得るＴＥＶ切断及び、例えば、クロマトグラフィ（例えば、サイズ排除クロマトグラフィ、逆相（ＲＰ）高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、及び／またはＲＰ−高速タンパク質液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ））を使用するペプチド精製を含み得る。Ｈｉｓタグが存在しない場合があり、有機溶媒の使用が使用されない場合がある製造には、異なる精製技術が有利であり得る。例として、配列番号１０５及び配列番号１８４に示されるアミノ酸配列を有する２つのペプチドは、一過性トランスフェクションによってＣＨＯ−Ｓ細胞で発現され得る。各ペプチドは、シデロカリン融合物としてまたはペプチド単独として発現され得る。ペプチドは、任意の予測されたグリコシル化部位または他の翻訳後修飾を含有する場合があるか、または含有しない場合がある。
【０１４５】
いくつかの場合では、宿主細胞は、薬物のための結合点を有するペプチドを生成する。結合点は、リジン残基、Ｎ末端、システイン残基、システインジスルフィド結合、または非天然アミノ酸を含み得る。ペプチドはまた、固相ペプチド合成、または液相ペプチド合成などによって、合成的に生成され得る。ペプチドは、合成中にもしくは合成後にまたはその両方で折り畳まれ得る（ジスルフィド結合の形成）。ペプチドフラグメントは、合成的にまたは組換え的に生成され、次いで合成的に、組換え的に、または酵素を介して一緒に結合され得る。
【０１４６】
いくつかの態様では、本開示の複合体のペプチドは、従来の固相化学合成技術によって、例えば、Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成法（“Ｆｍｏｃ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，”ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）またはＢｏｃ固相ペプチド合成にしたがって、または液相ペプチド合成によって調製され得る。ペプチドは、ペプチド合成中、ペプチド合成後、樹脂もしくはポリマーからの切断前もしくは切断後、またはその両方で段階的にジスルフィド結合を形成して折り畳まれ得る。ジスルフィド結合の形成は、空気、酸化剤、触媒、もしくは還元／酸化対、または緩衝液中に曝露することによって生じ得る。
【０１４７】
いくつかの態様では、化学合成は、官能基（例えば、アルケン、アルキン、脱離基など）を有する非天然アミノ酸を本開示のペプチドに組み込むために使用され得る。この官能基は、機能性ハンドルとして使用され得る。例えば、そのような官能基の多重結合は、１つ以上の分子を複合体に付加するために使用され得る。１つ以上の分子が様々な合成ストラテジー（いくつかは、付加及び／または置換化学を含み得る）を使用して付加され得る。例えば、多重結合を使用する付加反応は、臭化水素の使用を含み得、その場合、臭素は脱離基として作用し得るので、求核性官能基を含む様々な部位、例えば、活性剤、検出可能剤、複合体の薬物動態特性（例えば、血漿半減期、軟骨における保持及び／または取り込み）及び／または薬力学的特性を改変または変化させ得る薬剤、または他の好適な特性を有する分子で置換され得る。
【０１４８】
ペプチド−薬物複合体の合成
本開示のペプチド−薬物複合体（ＰＤＣ）は、本明細書に記載の任意のペプチド（例えば、表１に列挙されているもの及び／または配列番号１〜配列番号５１０に示されるアミノ酸配列を有するもの）、本明細書に記載の任意のリンカー（例えば、表２に列挙されているもの）、ならびに本明細書に記載の任意の活性剤及び／または検出可能剤のうちの１つ以上を含み得る。
【０１４９】
一般に、本明細書に記載されるようなペプチド−薬物複合体を生成するための合成方法は、薬物分子をリンカーに結合させ、続いてペプチドを薬物−リンカー複合体に結合させることを含み得る。合成中に使用される溶媒、反応条件、及び／または追加の試薬は、ＰＤＣに使用されるペプチド及び／または活性もしくは検出可能剤の生物学的活性を保持しつつ、収率及び純度が前臨床及び／または臨床試験のためのペプチド−薬物複合体（ＰＤＣ）の生成をスケーリングすることが可能となるように選択され得る。
【０１５０】
本開示のペプチド−薬物複合体（ＰＤＣ）は、様々な合成ストラテジーを使用して合成され得る。そのような合成ストラテジーの例は、実施例５〜実施例１９、及び実施例２９に示されている。本開示のＰＤＣは、様々な化学反応及び／または化学変換を使用して合成され得る。いくつかの実施形態では、ＰＤＣは、加水分解、エステル結合形成（複数可）、ＮＨＳエステル形成（複数可）、アミド形成（複数可）、ペプチド複合体化（複数可）、カルバメート形成（複数可）、メシレート形成（複数可）、硫黄アルキル化（複数可）、還元的アミノ化（複数可）、脱保護（複数可）、またはそれらの任意の組み合わせを使用して合成される。ペプチド複合体化反応には、アミド結合形成、カルバメート形成、カルボネート形成、エステル結合形成、またはそれらの組み合わせが含まれ得るがこれらに限定されない。ＰＤＣを生成するための合成アプローチは、１つ以上の保護基（例えば、Ｂｏｃ、Ｆｍｏｃ、ＭＯＭなど）の使用を含み得、そのようなものとして、１つ以上の保護及び／または脱保護工程を含み得る。いくつかの場合では、ＰＤＣ合成は、カルボン酸をＮＨＳエステルなどの活性化エステルに変換することなどの活性化カルボン酸の形成を含む。
【０１５１】
いくつかの場合では、ＰＤＣの合成は、放射性標識工程を含む。放射性標識は、１つ以上の放射性核種をＰＤＣ、例えば、リンカー、及び／またはペプチドに結合させることを含み得る。放射性核種は１４Ｃであり得る。１４Ｃを有するペプチドの放射性標識は、還元的アミノ化を含み得る。１４Ｃを使用するそのような放射性標識は、薬物、ペプチド、リンカー、またはＰＤＣなどの分子に１つ以上の１４ＣＨ３基を付加することを含み得る。例えば、システインリンカーは、その遊離アミノ基を介して１つまたは２つの１４ＣＨ３基で標識され得る。例えば、用語「１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ」は、システイン−Ｄｅｘ複合体であって、そのシステインが１つ以上の１４ＣＨ３基を含有するものを含み得る。よって、いくつかの場合では、１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘは、そのアミノ基に結合した２つの１４ＣＨ３基を含む。この原理は、本明細書に記載の任意の分子に適用可能である。
【０１５２】
本明細書に記載されるような他の放射性核種でのＰＤＣの放射性標識は、異なる合成ストラテジーの使用及び／またはキレート剤部位の使用を含み得る。いくつかの実施形態では、ペプチド及び／またはペプチド−薬物複合体は、放射性標識されている。ペプチド及び／またはペプチド−薬物複合体は、血漿半減期、器官及び／または組織取り込み及び／または保持、標的係合などの薬物動態及び／または薬力学的（ＰＤ）パラメータを決定するのに好適な様々な放射性核種で放射性標識され得る。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、２，５−ジメチルアジピン酸（ＤＭＡ）リンカー及びデキサメタゾン（本明細書では「Ｄｅｘ」とも称される）を含むペプチド複合体は、加水分解、エステル結合形成、ＮＨＳエステル形成、及びペプチド複合体化のうちの任意の１つ以上を使用して合成され得る。例えば、配列番号１０５に示されるアミノ酸配列を有するペプチド、（カルバメート）トランス−１−アミノメチル−シクロヘキシル−４−カルボン酸リンカー及びデキサメタゾンを含むペプチド複合体は、カルバメート形成、ＮＨＳエステル形成、ペプチド複合体化、またはそれらの任意の組み合わせのうちの任意の１つ以上を使用して合成され得る。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、本開示のＰＤＣの合成は、メシレート形成、硫黄アルキル化、ＮＨＳエステル形成、ペプチド複合体化、Ｂｏｃ脱保護、還元的アミノ化、またはそれらの任意の組み合わせのうちの任意の１つ以上を含む。例えば、システインリンカー及びトリアムシノロンアセトニド（ＴＡＡ）を含むペプチド−薬物複合体は、メシレート形成、硫黄アルキル化、ＮＨＳエステル形成、ペプチド複合体化、Ｂｏｃ脱保護、還元的アミノ化、またはそれらの任意の組み合わせを使用して合成され得る。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列が配列番号１〜配列番号５１０のいずれか１つに示されるペプチドのいずれか１つ、薬物（例えば、デキサメタゾン、ＴＡＡ、またはデスシクレソニドなどのグルココルチコイド）、及びグルタル酸リンカー、３，３−テトラメチレン−グルタル酸リンカー、トランス−１，２−シクロヘキシルリンカー、１，３−シクロヘキシルリンカー、テレフタル酸リンカー、２，３−ジメチル−コハク酸リンカー、コハク酸リンカー、アジピン酸リンカー、トランス−１，４−シクロヘキシルリンカーのいずれか１つを含むＰＤＣは、エステル結合形成、ＮＨＳエステル形成、ペプチド複合体化、またはそれらの任意の組み合わせのうちの任意の１つ以上を使用して生成され得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチド−薬物複合体は、リンカーを介してグルココルチコイドに連結された本開示のペプチドを含む。いくつかの場合では、ペプチドは、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１８４、または配列番号５０９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、グルココルチコイドは、デキサメタゾンまたはデス−シクレソニドである。いくつかの場合では、リンカーは、化合物番号１〜２２を有する表２に列挙された任意のリンカーである。システインリンカー（Ｃｙｓ）を介してデキサメタゾン（すなわち、Ｄｅｘ）に連結した配列番号１０５に示されるアミノ酸配列を有するペプチド（ペプチド（配列番号１０５））を含むＰＣＤ、すなわち、ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）は、メシレート形成、硫黄アルキル化、ＮＨＳエステル形成、ペプチド複合体化、Ｂｏｃ脱保護、還元的アミノ化のうちの任意の１つ以上を使用して合成され得る（例えば、実施例８を参照されたい）。別の例として、ＰＤＣペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ、ペプチド（配列番号１０３）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ、及び／またはペプチド（配列番号１８４）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣは、以下の３つの合成工程：本明細書に記載されるようなエステル結合形成、スルホ−ＮＨＳエステル形成、及びペプチド複合体化を使用して合成され得る。
【０１５６】
複合体の薬学的組成物
本開示の薬学的組成物は、本明細書に記載の任意の複合体と、他の化学成分、例えば、担体、安定化剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、酸化防止剤、可溶化剤、緩衝液、オスモライト、塩類、界面活性剤、アミノ酸、カプセル化剤、増量剤、凍結防止剤、及び／または賦形剤との組み合わせであり得る。薬学的組成物は、本明細書に記載の複合体の生物への投与を容易にする。薬学的組成物は、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、直腸、エアロゾル、非経口、点眼、肺、経皮、膣、眼、鼻、経口、舌下、吸入、皮膚、髄腔内、鼻腔内、関節内、及び局所投与を含む様々な形態及び経路によって薬学的組成物として治療的有効量で投与され得る。薬学的組成物は、局所的または全身的手法で、例えば、器官への直接注射を介して、任意にデポで投与され得る。
【０１５７】
非経口注射剤は、ボーラス注射または連続的注入のために製剤化され得る。薬学的組成物は、油性または水性ビヒクル中の無菌懸濁液、溶液またはエマルションとして非経口注射に好適な形態であり得るか、または懸濁剤、安定化剤及び／または分散剤などの製剤用薬剤を含有し得る。非経口投与のための薬学的製剤は、水溶性形態の本明細書に記載の複合体の水溶液を含む。本明細書に記載の複合体の懸濁液は、油性注射懸濁液として調製され得る。好適な親油性溶媒またはビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが含まれる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有し得る。懸濁液はまた、高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために、本明細書に記載のそのような複合体の溶解性を上昇させ、及び／またはその凝集を減少させる好適な安定化剤または薬剤を含有し得る。代替的に、本明細書に記載の複合体は、使用前に、好適なビヒクル、例えば、無菌パイロジェン非含有水で再構成するために凍結乾燥され得るか、または粉末形態であり得る。いくつかの実施形態では、精製された複合体は、静脈内投与される。
【０１５８】
本開示の複合体は、外科的処置中に、器官、または器官の組織もしくは細胞、例えば、脳または脳の組織もしくはがん細胞に直接適用され得る。本明細書に記載の複合体は、局所的に投与され得、溶液、懸濁液、ローション、ゲル、ペースト、薬用スティック、バーム、クリーム、及び軟膏などの様々な局所的に投与可能な組成物に製剤化され得る。そのような薬学的組成物は、可溶化剤、安定化剤、等張性向上剤、緩衝液及び防腐剤を含有し得る。
【０１５９】
本明細書で提供される治療または使用方法の実施において、治療的有効量の本明細書に記載の複合体は、免疫系に影響を及ぼす病態に罹患している対象に薬学的組成物で投与され得る。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトなどの哺乳動物である。治療的有効量は、疾患の重症度、対象の年齢及び相対的な健康状態、使用される化合物の効力、及び他の要因に応じて広範に変化し得る。
【０１６０】
薬学的組成物は、活性化合物を薬学的に使用され得る調製物へ処理することを容易にする賦形剤及び補助剤を含む１つ以上の生理的に許容可能な担体を使用して製剤化され得る。製剤化は、選択された投与経路に応じて改変され得る。本明細書に記載の複合体を含む薬学的組成物は、例えば、活性剤または抗炎症剤などの抗関節炎剤への複合体化前に、ペプチドを組換え系において発現させ、ペプチドを精製し、ペプチドを凍結乾燥させ、混合し、溶解し、顆粒化し、糖衣錠を作製し、粉末化し、乳化し、カプセル化し、封入し、または圧縮処理することによって製造され得る。薬学的組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤及び遊離塩基または薬学的に許容可能な塩の形態としての本明細書に記載の化合物を含み得る。
【０１６１】
本明細書に記載の化合物を含む本明細書に記載のペプチドを調製するための方法は、本明細書に記載の複合体を１つ以上の不活性で薬学的に許容可能な賦形剤または担体と共に製剤化して固体、半固体、または液体の組成物を形成することを含む。固体組成物には、例えば、粉末、錠剤、分散性顆粒、カプセル、カシェ、及び坐剤が含まれる。これらの組成物はまた、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、及び他の薬学的に許容可能な添加剤などの非毒性の補助物質を少量含有し得る。
【０１６２】
薬学的に許容可能な賦形剤の非限定的な例は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５）；Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ  Ｅ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  １９７５；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０；及びＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ１９９９）で見ることができ、これらの各々は、その全体が参照により組み込まれる。
【０１６３】
薬学的組成物の投与
様々な態様では、本開示は、本明細書に開示される複合体またはその塩のいずれか、及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物を提供する。
【０１６４】
さらなる態様では、薬学的組成物は、対象への投与のために製剤化される。またさらなる態様では、薬学的組成物は、吸入、鼻腔内投与、経口投与、局所投与、静脈内投与、皮下投与、関節内投与、筋肉内投与、腹膜内投与、またはそれらの組み合わせのために製剤化される。
【０１６５】
本開示の薬学的組成物は、本明細書に記載の任意の複合体と、他の化学成分、例えば、担体、安定化剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、及び／または賦形剤との組み合わせであり得る。薬学的組成物は、本明細書に記載の複合体の生物への投与を容易にする。薬学的組成物は、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、直腸、エアロゾル、非経口、点眼、肺、経皮、膣、眼、鼻、経口、吸入、皮膚、関節内、髄腔内、鼻腔内、及び局所投与を含む様々な形態及び経路によって薬学的組成物として治療的有効量で投与され得る。薬学的組成物は、局所的または全身的手法で、例えば、器官への直接注射を介して、任意にデポで投与され得る。
【０１６６】
非経口注射剤は、ボーラス注射または連続的注入のために製剤化され得る。薬学的組成物は、油性または水性ビヒクル中の無菌懸濁液、溶液またはエマルションとして非経口注射に好適な形態であり得るか、または懸濁剤、安定化剤及び／または分散剤などの製剤用薬剤を含有し得る。非経口投与のための薬学的製剤は、水溶性形態の本明細書に記載の複合体の水溶液を含む。本明細書に記載の複合体の懸濁液は、油性注射懸濁液として調製され得る。好適な親油性溶媒またはビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが含まれる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有し得る。懸濁液はまた、高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために、本明細書に記載のそのような複合体の溶解性を上昇させ、及び／またはその凝集を減少させる好適な安定化剤または薬剤を含有し得る。代替的に、本明細書に記載の複合体は、使用前に、好適なビヒクル、例えば、無菌パイロジェン非含有水で再構成するために凍結乾燥され得るか、または粉末形態であり得る。いくつかの実施形態では、精製された複合体は、静脈内投与される。本明細書に記載の複合体は、対象に投与され、器官、例えば、軟骨にホーミングし、それを標的とし、それに移動し、それによって保持され、及び／またはそれに結合し、またはそれに誘導され得る。
【０１６７】
本開示の複合体は、外科的処置中に、器官、または器官の組織もしくは細胞、例えば、軟骨または軟骨の組織もしくは細胞に直接適用され得る。本明細書に記載の複合体は、局所的に投与され得、溶液、懸濁液、ローション、ゲル、ペースト、薬用スティック、バーム、クリーム、及び軟膏などの様々な局所的に投与可能な組成物に製剤化され得る。そのような薬学的組成物は、可溶化剤、安定化剤、等張性向上剤、緩衝液及び防腐剤を含有し得る。
【０１６８】
本明細書で提供される治療または使用方法の実施において、治療的有効量の本明細書に記載の複合体は、病態に罹患している対象に薬学的組成物で投与される。いくつかの例では、薬学的組成物は、免疫系、炎症反応、または他の生理的影響などの動物の生理機能に影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトなどの哺乳動物である。治療的有効量は、疾患の重症度、対象の年齢及び相対的な健康状態、使用される化合物の効力、及び他の要因に応じて広範に変化し得る。
【０１６９】
薬学的組成物は、活性化合物を薬学的に使用され得る調製物へ処理することを容易にする賦形剤及び補助剤を含む１つ以上の生理的に許容可能な担体を使用して製剤化され得る。製剤化は、選択された投与経路に応じて改変され得る。本明細書に記載のペプチドを含む複合体を含む薬学的組成物は、例えば、ペプチドを組換え系において発現させ、ペプチドを精製し、ペプチドを凍結乾燥させ、混合し、溶解し、顆粒化し、糖衣錠を作製し、粉末化し、乳化し、カプセル化し、封入し、または圧縮処理することによって製造され得る。薬学的組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤及び遊離塩基または薬学的に許容可能な塩の形態としての本明細書に記載の化合物を含み得る。
【０１７０】
本明細書に記載の薬学的組成物を調製するための方法は、本明細書に記載の複合体を１つ以上の不活性で薬学的に許容可能な賦形剤または担体と共に製剤化して固体、半固体、または液体の組成物を形成することを含む。固体組成物には、例えば、粉末、錠剤、分散性顆粒、カプセル、カシェ、及び坐剤が含まれる。これらの組成物はまた、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、及び他の薬学的に許容可能な添加剤などの非毒性の補助物質を少量含有し得る。
【０１７１】
薬学的に許容可能な賦形剤の非限定的な例は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５）；Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ  Ｅ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  １９７５；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０；及びＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ１９９９）で見ることができ、これらの各々は、その全体が参照により組み込まれる。
【０１７２】
画像化及び外科的方法における複合体の使用
本開示は一般に、身体内の特定の領域、組織、構造、または細胞にホーミングし、それを標的とし、それに移動し、それによって保持され、それに蓄積し、及び／またはそれに結合し、またはそれに誘導される複合体及びそのような複合体を使用する方法に関する。これらの複合体は、軟骨に接触する能力を有し、これにより様々な用途に有用となる。特に、複合体は、ペプチドが誘導される生体分子の部位特異的調節における用途を有し得る。そのような複合体の最終的使用には、例えば、画像化、研究、療法、セラノスティクス、薬剤、化学療法、キレート療法、標的薬物送達、及び放射線療法が含まれ得る。いくつかの使用は、標的薬物送達及び画像化を含み得る。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、本開示は、がん、がん性組織、または腫瘍組織を検出するための方法であって、その方法は、対象となる組織を本開示の複合体と接触させる工程であって、その複合体は、検出可能剤にさらに複合体化されている、接触させる工程と、複合体のペプチドの結合レベルを測定する工程と、を含み、正常な組織と比べて上昇したレベルの結合は、組織ががん、がん性組織または腫瘍組織であることを示す、方法を提供する。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、本開示は、対象の器官もしくは身体領域または領域、組織もしくは構造を画像化する方法であって、その方法は、検出可能剤にさらに複合体化された複合体または本明細書に開示される薬学的組成物を対象に投与することと、対象を画像化することとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、そのような画像化は、軟骨の機能に関連する病態を検出するために使用される。いくつかの場合では、病態は、炎症、がん、分解、成長障害、遺伝的、裂傷もしくは負傷、または別の好適な病態である。いくつかの場合では、病態は、軟骨形成異常、外傷性断裂もしくは剥離、軟骨を含有する身体領域における手術後疼痛、肋軟骨炎、ヘルニア、多発性軟骨炎、関節炎、変形性関節症、関節リウマチ、強直性脊椎炎（ＡＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥまたは「狼瘡」）、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、痛風、軟骨形成不全、または別の好適な病態である。いくつかの場合では、病態は、軟骨のがんまたは腫瘍に関連する。いくつかの場合では、病態は、転移性であるか否かにかかわらず軟骨腫または軟骨肉腫の一種、または別の好適な病態である。がんに関連するものなどのいくつかの実施形態では、画像化は、対象の罹患した領域、組織、構造または細胞の外科的除去に関連し得る。
【０１７５】
さらに、本開示は、検出可能剤とさらに複合体化された本開示の複合体を使用して、罹患または炎症組織、がん、がん性組織、または腫瘍組織を手術中に画像化し、切除するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、罹患または炎症組織、がん、がん性組織、または腫瘍組織は、本開示の複合体を使用して、がん、がん性組織、または腫瘍組織を手術中に可視化することを可能にする蛍光画像化によって検出可能である。いくつかの実施形態では、本開示の複合体は、１つ以上の検出可能剤にさらに複合体化される。さらなる実施形態では、検出可能剤は、本明細書の複合体のペプチドに結合した蛍光部位を含む。別の実施形態では、検出可能剤は、放射性核種を含む。いくつかの実施形態では、画像化は、開腹手術中に達成される。さらなる実施形態では、画像化は、内視鏡検査または他の非侵襲性外科的技術を使用して達成される。
【０１７６】
軟骨障害の治療
様々な態様では、本開示は、病態の治療をそれを必要とする対象において行う方法であって、その方法は、本明細書に記載されるような複合体または上記の薬学的組成物のいずれかを対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０１７７】
いくつかの態様では、複合体または薬学的組成物は、吸入、鼻腔内、経口、局所、静脈内、皮下、関節内、筋肉内投与、腹腔内、またはそれらの組み合わせによって投与される。さらなる態様では、組成物は、投与の後に対象の軟骨にホーミングし、それを標的とし、またはそれに移動する。
【０１７８】
いくつかの態様では、病態は、軟骨の機能に関連する。いくつかの態様では、病態は、炎症、がん、悪化、成長障害、遺伝、裂傷、感染症、または負傷である。他の態様では、病態は、軟骨形成異常である。さらに他の態様では、病態は、外傷性断裂または剥離である。いくつかの態様では、病態は、肋軟骨炎である。他の態様では、病態は、ヘルニアである。さらに他の態様では、病態は、多発性軟骨炎である。
【０１７９】
他の態様では、病態は、脊索腫である。いくつかの態様では、病態は、関節炎の一種である。さらなる態様では、関節炎の一種は、関節リウマチである。他の態様では、関節炎の一種は、変形性関節症である。いくつかの態様では、病態は、軟骨形成不全である。他の態様では、関節炎の一種は、強直性脊椎炎または乾癬性関節炎である。いくつかの態様では、がんは、良性軟骨腫または悪性軟骨肉腫である。他の態様では、病態は、滑液包炎、腱炎、痛風、偽痛風、関節症、または感染症である。
【０１８０】
いくつかの態様では、複合体または薬学的組成物は、負傷を治療するため、負傷によって損傷した組織を修復するため、または負傷によって引き起こされた疼痛を治療するために投与される。さらなる態様では、複合体または薬学的組成物は、裂傷を治療するため、または裂傷によって損傷した組織を修復するために投与される。
【０１８１】
様々な態様では、本開示は、対象の器官または身体領域を画像化する方法であって、その方法は、前述されたような検出可能剤または薬学的組成物に複合体化された前述された複合体のいずれか１つの組成物を対象に投与することと、対象を画像化することと、を含む、方法を提供する。
【０１８２】
いくつかの態様では、方法は、がんまたは罹患した領域、組織、構造もしくは細胞を検出することをさらに含む。さらなる態様では、方法は、対象に対して手術を実施することをさらに含む。いくつかの態様では、方法は、がんを治療することをさらに含む。
【０１８３】
他の態様では、手術は、対象のがんまたは罹患領域、組織、構造または細胞を除去することを含む。さらに他の態様では、方法は、外科的除去後の対象のがんまたは罹患した領域、組織、構造、もしくは細胞を画像化することをさらに含む。
【０１８４】
用語「有効量」は、本明細書で使用される場合、治療されている疾患または病態の症状のうちの１つ以上をある程度緩和する活性剤、抗炎症剤などの抗関節炎剤、または投与されている化合物の十分な量を指し得る。結果は、疾患の徴候、症状、または原因の減少及び／または緩和、または生物学的システムの任意の他の所望の変更であり得る。そのような活性剤、抗炎症剤などの抗関節炎剤、または化合物を含有する組成物は、予防、増強、及び／または療法の治療のために投与され得る。任意の個々の場合における適切な「有効」量は、用量増大試験などの技術を使用して決定され得る。
【０１８５】
本開示の方法、組成物、及びキットは、病態の症状を予防、治療、停止、逆転、または改善するための方法を含み得る。治療は、対象（例えば、疾患または病態を患っている個体、家畜、野生動物または実験動物）を本開示の複合体で治療することを含み得る。疾患の治療において、複合体または複合体のペプチドは、対象の軟骨に接触し得る。対象は、ヒトであり得る。対象は、ヒト；チンパンジー、または他の類人猿もしくはサル種などの非ヒト霊長類；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの牧場動物；ウサギ、イヌ、及びネコなどの馴化動物；ラット、マウス、モルモットなどのげっ歯類を含む実験動物であり得る。対象は、任意の年齢であり得る。対象は、例えば、高齢者、成人、青年、前青年期、小児、幼児、乳児、または子宮内胎児であり得る。
【０１８６】
治療は、疾患の臨床的発症の前に対象に提供され得る。治療は、疾患の臨床的発症の後に対象に提供され得る。治療は、疾患の臨床的発症から１日後、１週間後、６ヶ月後、１２ヶ月後、または２年以上後に対象に提供され得る。治療は、疾患の臨床的発症後１日超、１週間超、１ヶ月超、６ヶ月超、１２ヶ月超、２年超の間、またはそれ以上対象に提供され得る。治療は、疾患の臨床的発症後１日未満、１週間未満、１ヶ月未満、６ヶ月未満、１２ヶ月未満、または２年未満の間、対象に提供され得る。治療はまた、臨床試験でヒトを治療することを含み得る。治療は、本開示全体を通して記載される複合体または薬学的組成物の１つ以上などの複合体または薬学的組成物を対象に投与することを含み得る。治療は、１日１回の投薬を含み得る。治療は、静脈内、皮下、筋肉内、吸入、皮膚、関節内注射、経口、髄腔内、経皮、鼻腔内、腹膜経路を介して、または、関節上もしくは関節内に直接、例えば、局所的関節内注射経路または適用の注射経路を介してのいずれかで、本開示の複合体または薬学的組成物を対象に送達することを含み得る。治療は、静脈内に、関節内注射で、非経口で、経口で、腹膜経路を介して、または軟骨上に、その近くにもしくはその中に直接、対象に複合体を投与することを含み得る。
【０１８７】
本開示の複合体で治療され得る軟骨の疾患または病態の種類には、炎症、疼痛管理、抗感染、疼痛緩和、抗サイトカイン、がん、負傷、悪化、遺伝的基礎、リモデリング、過形成、外科的負傷／外傷などが含まれ得る。本開示の複合体で治療され得る軟骨疾患または病態の例には、肋軟骨炎、椎間板ヘルニア、再発性多発性軟骨炎、関節軟骨の負傷、あらゆる様式のリウマチ性疾患（例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥまたは「ループス」）、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、変形性関節症、痛風など）、ヘルニア、軟骨形成不全、良性または非がん性の軟骨腫、悪性またはがん性の軟骨肉腫、軟骨異栄養症、膝蓋軟骨軟化症、肋軟骨炎、拇趾硬直症、股唇裂傷、離断性骨軟骨炎、骨軟骨異形成症、半月軟骨裂傷、鳩胸、漏斗胸、軟骨疾患、軟骨軟化症、多発性軟骨炎、再発性多発性軟骨炎、骨頭すべり症、離断性骨軟骨炎、軟骨異形成症、肋軟骨炎、軟骨膜炎、骨軟骨腫、膝変形性関節症、指変形性関節症、手関節変形性関節症、腰変形性関節症、脊椎変形性関節症、軟骨軟化症、変形性関節症易罹患性、足関節変形性関節症、脊椎症、二次性軟骨肉腫、変形性関節症に見られる小型の不安定結節、骨端症、原発性軟骨肉腫、軟骨障害、強皮症、コラーゲン障害、軟骨異形成症、ティーツェ症候群、フランソワの皮膚軟骨角膜ジストロフィ、多発性骨端異形成１、多発性骨端異形成２、多発性骨端異形成３、多発性骨端異形成４、多発性骨端異形成５、骨化耳軟骨−精神遅滞−筋力低下−骨変化、骨膜軟骨肉腫、手根足根骨軟骨腫症、軟骨形成不全、遺伝性軟骨腫症ＩＩ、遺伝性軟骨腫症、軟骨異形成症−−性的発達障害、軟骨腫、脊索腫、アテロオステオジェネシスＩ型、アテロオステオジェネシスＩＩＩ型、アテロオステオジェネシスＩＩ型、濃化軟骨無形成症、家族性指骨関節症、異軟骨骨症−腎炎、眼角隔離症を伴う鼻翼軟骨コロボーマ、鼻翼軟骨形成不全−コロボーマ−眼角隔離症、ピエール・ロバン症候群−胎児軟骨異形成症、異常脊椎軟骨内腫症、局所的軟骨形成不全−腹筋異形成症、離断性骨軟骨炎、家族性関節軟骨石灰化症、気管気管支軟化症、軟骨炎、異軟骨骨症、ジェキア・コズロウスキー骨格異形成症、軟骨形成異常、頭蓋−骨関節症、ティーツェ症候群、股関節形成不全−外軟骨腫、ベッセル・ハーゲン病、軟骨腫症（良性）、内軟骨腫症（良性）、アパタイト結晶沈着に起因する軟骨石灰化症、マイエンベルグ・アルトヘル・ユーリンガー症候群、内軟骨腫症−小人症−聴覚消失、早発性成長板閉鎖（例えば、小人症、負傷、思春期の座瘡に対するレチノイド療法などの治療、またはＡＣＬ修復に起因する）、アストレー・ケンダル症候群、滑液膜骨軟骨腫症、発達遅延及び黒色表皮腫を伴う重症軟骨形成不全、軟骨石灰化症、スタネスク症候群、家族性離断性骨軟骨炎、軟骨無形成症１Ａ型、軟骨無形成症２型、ランガー・サルディーノ型軟骨無形成症、軟骨無形成症１Ｂ型、軟骨無形成症１Ａ及び１Ｂ型、ＩＩ型軟骨無形成症−軟骨低発生症、軟骨無形成症、軟骨無形成症３型、軟骨無形成症４型、軟骨石灰化症１、軟骨石灰化症２、軟骨石灰化症家族性関節、捻曲性骨異形成症、線維性軟骨発生症、低軟骨形成症、ケテル症候群、マフッチ症候群、変形性関節症易罹患性６、変形性関節症易罹患性５、変形性関節症易罹患性４、変形性関節症易罹患性３、変形性関節症易罹患性２、変形性関節症易罹患性１、偽性軟骨形成不全、カリフラワー耳、肋軟骨炎、成長板破断、漏斗胸、敗血症関節炎、痛風、偽痛風（カルシウムピロリン酸沈着症またはＣＰＰＤ）、痛風性関節炎、関節中のまたはその付近の細菌またはウイルスまたは真菌感染症、滑液包炎、腱炎、関節症、または別の軟骨または関節疾患または病態が含まれる。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、本開示の複合体は、抗関節炎関節を標的とするために、対象に投与され得る。他の実施形態では、本開示のペプチドまたはペプチド複合体は、抗関節炎関節を治療するために、対象に投与され得る。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、本開示は、対象におけるペプチド複合体の治療効果を決定するための（例えば、用量発見、用量試験、及び／または用量増大試験のための）方法を提供する。そのような方法は、様々な器官及び／または組織のサイズ、直径、及び／または重量の測定を含む。例えば、関節炎に対するペプチド複合体の効果は、足首及び／または関節の直径及び重量を測定することによって決定され得る（例えば、対照コホートと比較した足首の炎症及び／または足首直径の減少の測定は、ペプチドまたはペプチド複合体の有効性を示し得る）。そのような方法はまた、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化または可視化法（例えば、オートラジオグラフィ、核画像化など）及び／またはｅｘ  ｖｉｖｏ組織染色（例えば、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色及び／または抗薬物（例えば、抗デキサメタゾン）及び／または抗ペプチド（例えば、抗ペプチド（配列番号１０５）抗体）での染色（顕微鏡法と組み合わされる）を使用して、そのような器官及び／または組織中のペプチドまたはペプチド複合体の取り込み及び／または保持を決定することを含む。治療的有効性及び／または副作用を決定するために測定され得る器官及び組織には、膝、椎間板（ＩＶＤ）、関節、足首、血液、筋肉、腎臓、肝臓、脾臓、骨、胸腺、及び骨髄が含まれ得る。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるような活性剤、ペプチドまたはペプチド複合体の効果的用量範囲を決定するための（例えば、用量発見、用量試験、及び／または用量増大試験のための）方法を提供する。そのような方法は、対象に異なる用量の活性剤、ペプチド、またはペプチド複合体を投与した後に、治療的効力（例えば、関節または足首の炎症及び／または腫れの減少、疼痛減少、可動性及び／または食欲の増加、全体的健康、ＩＬ−６などのサイトカインなどの炎症マーカー分泌の減少、受容体活性化、遺伝子活性化または抑制による転写因子の調節）を示し得る所定のパラメータを測定することを含む。測定される追加のパラメータには、活性剤への全身性及び／または長期の曝露を示すものが含まれ得る。そのようなパラメータには、血液細胞の生存性及び／または濃度（例えば、総白血球（ＷＢＣ）数、リンパ球数など）、器官重量（例えば、膝、ＩＶＤ、関節、足首、血液、筋肉、腎臓、肝臓、脾臓、骨、胸腺、及び／または骨髄のもの）、及び／または全身重量、ならびに可動性、食欲喪失、または関節及び足首の腫れなどの他の観察可能なパラメータが含まれ得る。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、本開示は、活性剤が単独でまたはペプチド複合体としてのいずれかで投与された場合の１つ以上の副作用を決定するための（例えば、用量発見、用量試験、及び／または用量増大試験のための）方法を提供する。そのような副作用は、活性剤（例えば、グルココルチコイド）への全身性曝露に起因し得る。本開示は、活性剤（例えば、グルココルチコイド）への全身性曝露を評価するために使用され得るマーカー、及びそのようなマーカーを決定するための方法を提供する。その方法は、血液細胞の生存性及び／または濃度（例えば、総白血球（ＷＢＣ）数、リンパ球数など）、器官重量（例えば、膝、ＩＶＤ、関節、足首、血液、筋肉、腎臓、肝臓、脾臓、骨、胸腺、及び／または骨髄のもの）、及び／または全身重量、ならびに可動性、食欲喪失、または関節及び足首の腫れなどの他の観察可能なパラメータを測定することを含み得る。活性剤への全身性曝露を決定するために測定され得る追加のマーカーには、酵素レベル、例えば、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及び／またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベル、またはホルモンもしくは他のシグナル伝達分子、例えば、ケモカイン（例えば、サイトカイン及びインターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０など）のレベルが含まれ得る。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、本開示は、ペプチドまたはペプチド複合体の免疫原性を決定するための方法を提供する。そのような方法は、ペプチドまたはペプチド複合体の結合アレル、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ結合アレルを決定することを含み得る。そのような方法には、例えば、コンピュータプログラム及び／またはニューラルネットワーク、例えば、ニューラルネットワークプログラムＮｅｔＭＨＣＩＩバージョン２．２を使用したｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスクリーニング方法が含まれる。これにより、各々の主要なＭＨＣアレル群に対して各配列中の可能性のあるすべての１５ｍｅｒペプチドの評価が可能となり得る。いくつかの場合では、ペプチドまたはペプチド複合体は、２つ以下の強力な結合アレルを有する。いくつかの場合では、ペプチドまたはペプチド複合体は、１つ以下の強力な結合アレルを有する。いくつかの場合では、ペプチドまたはペプチド複合体は、本明細書に記載の方法を使用して試験した場合、強力な結合アレルを有さない。他の方法は、任意の種（例えば、げっ歯類、ヒトなど）または動物モデルにおいてｅｘ  ｖｉｖｏでのＴ細胞活性化またはｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫原性を測定することを含む。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、本開示は、がんを治療するための方法であって、その方法は、それを必要とする対象に有効量の本開示の複合体を投与することを含む、方法を提供する。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、本開示は、がんを治療するための方法であって、その方法は、それを必要とする患者に有効量の本開示の複合体及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、本開示の複合体は、軟骨肉腫を治療するために使用され得る。軟骨肉腫は、軟骨生成細胞のがんであり、骨及び関節にしばしば見られる。それは、骨及び軟部組織肉腫のファミリーに入る。所定の実施形態では、本開示のペプチドまたはペプチド複合体の投与は、軟骨肉腫を有する対象を画像化し、診断し、または標的とし、治療するために使用され得る。本開示の複合体の投与は、軟骨肉腫を治療するための切除放射線療法または陽子線療法と組み合わせて使用され得る。対象は、ヒトまたは動物であり得る。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、本開示の複合体は、脊索腫を治療するために使用され得る。所定の実施形態では、本開示の複合体の投与は、脊索腫を有する対象を画像化し、診断し、または標的とし、治療するために使用され得る。本開示の複合体の投与は、脊索腫を治療するためのメシル酸イマチニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤、及び切除放射線療法または陽子線療法と組み合わせて使用され得る。本開示の複合体の投与は、脊索腫を治療するためのベバシズマブなどの抗血管剤及びエルロチニブなどの上皮成長因子受容体阻害剤と組み合わせて使用され得る。対象は、ヒトまたは動物であり得る。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞の侵襲的活性を阻害するための方法であって、その方法は、有効量の本開示の複合体を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、本開示の複合体は、１つ以上の治療剤にさらに複合体化される。さらなる実施形態では、治療剤は、抗関節炎剤、抗炎症剤、例えば、グルココルチコイド、コルチコステロイド、プロテアーゼ阻害剤、例えば、コラゲナーゼ阻害剤もしくはマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤（すなわち、ＭＭＰ−１３阻害剤）、アミノ糖、ビタミン（例えば、ビタミンＤ）、及び抗生物質、抗ウイルス剤、または抗真菌剤、スタチン、免疫修飾物質、放射性同位体、毒素、酵素、感作薬物、干渉ＲＮＡを含む核酸、抗体、抗血管新生剤、シスプラチン、代謝拮抗剤、有糸分裂阻害剤、成長因子阻害剤、パクリタキセル、テモゾロミド、トポテカン、フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、プロカルバジン、デカルバジン、アルトレタミン、メトトレキサート、メルカプトプリン、チオグアニン、リン酸フルダラビン、クラドリビン、ペントスタチン、シタラビン、アザシチジン、エトポシド、テニポシド、イリノテカン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、イダルビシン、プリカマイシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、タモキシフェン、フルタミド、ロイプロリド、ゴセレリン、アミノグルチミド、アナストロゾール、アムサクリン、アスパラギナーゼ、ミトキサントロン、ミトタン及びアミホスチン、及びそれらの同等物、ならびにフォトアブレーションから選択されるがこれらに限定されない化学療法剤、抗がん薬、または抗がん剤である。これらの活性剤のいくつかは、標的細胞におけるアポトーシスなどのプログラム細胞死を誘発させ、それによって症状を改善するか、または疾患を和らげる。アポトーシスは、例えば、化学療法剤、抗関節炎剤、抗炎症剤、コルチコステロイド、ＮＳＡＩＤＳ、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）調節剤、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリー調節剤を含む多くの活性剤によって誘発され得る。いくつかの実施形態では、本開示の複合体は、カスパーゼ、アポトーシス活性化因子及び阻害因子、ＸＢＰ−１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘｌ、Ｂｃｌ−ｗ、ならびに本明細書に開示される他のものなどの、細胞死または細胞殺傷の経路に活性剤を標的化するために使用され得る。他の実施形態では、治療剤は、任意の非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）である。ＮＳＡＩＤは、ケトロラク、インドメタシン、エトドラク、またはトレメチンなどの任意の複素環酢酸誘導体、ナプロキセンなどの任意のプロピオン酸誘導体、任意のエノール酸誘導体、任意のアントラニル酸誘導体、セレコキシブなどの任意の選択的ＣＯＸ−２阻害剤、任意のスルホアニリド、任意のサリチル酸塩、アセクロフェナク、ナブメトン、スリンダク、ジクロフェナク、またはイブプロフェンであり得る。他の実施形態では、治療剤は、デキサメタゾン、ブデソニド、トリアムシノロン、コルチゾン、プレドニゾン、レドニゾロン、トリアムシノロンヘキサセトニド、またはメチルプレドニゾロンなどの任意のステロイドである。他の実施形態では、治療剤は、アセトアミノフェン、オピオイド、局所麻酔剤、抗うつ剤、グルタミン酸受容体アンタゴニスト、アデノシン、または神経ペプチドなどの疼痛緩和剤である。いくつかの実施形���では、治療は、上記の治療剤のいずれかとペプチド複合体との組み合わせを投与することからなり、例えば、デキサメタゾン−ペプチド複合体及びＮＳＡＩＤの両方が患者に投与される治療である。軟骨を標的とする本開示の複合体は、本明細書に記載されるような疾患状態、例えば、裂傷、負傷（すなわち、スポーツ負傷）、遺伝的要因、悪化、菲薄化、炎症、がんまたは軟骨の任意の他の疾患もしくは病態を含む任意の疾患または病態を治療するために、または治療的に活性な物質をとりわけこれらの疾患を治療することに標的化するために使用され得る。他の場合では、本開示の複合体は、外傷性断裂、剥離、肋軟骨炎、脊椎板ヘルニア、再発性及び非再発性多発性軟骨炎、関節軟骨の負傷、変形性関節症、関節炎または軟骨形成不全を治療するために使用され得る。いくつかの場合では、ペプチドまたはペプチド−活性剤複合体は、軟骨細胞への拡散によって軟骨を接触させ、次いで抗腫瘍機能、標的化された毒性、転移の抑制などを有することによって軟骨におけるがん、例えば、良性軟骨腫または悪性軟骨肉腫を標的化するために使用され得る。同様に、そのようなペプチドまたはペプチド−活性剤複合体は、他の病変の中でも腫瘍及び転移を含む、そのような軟骨病変を標識、検出、または画像化するために使用され得、その軟骨病変は、様々な外科的技術により、またはプログラム細胞死を誘発させるか、または細胞を殺傷するペプチド−活性剤複合体で標的化することによって除去され得る。
【０１９９】
本明細書に記載の複合体は、予防的及び／または療法的治療のために投与され得る。療法的用途では、複合体は、疾患または病態に既に罹患している対象に、疾患または病態の症状を治癒するか、もしくは少なくとも部分的に停止させるために、または病態を治癒する、治す、改善する、もしくは和らげるために十分な量で投与され得る。本明細書に記載のそのような複合体はまた、病態の発症、罹患、または悪化の可能性を（全体的または部分的にのいずれかで）予防、軽減するために投与され得る。この使用に有効な量は、疾患または病態の重症度及び経過、先の療法、対象の健康状態、体重、薬物への反応、及び治療する医師の判断に基づいて変化し得る。本明細書に記載の複合体及び薬学的組成物は、ペプチドの標的化されたホーミング及び任意の複合体の局所送達を可能にし得る。例えば、ステロイドに複合体化したペプチドは、従来の全身性ステロイドよりも有意に効果的であり、毒性が低いステロイドの局所送達を可能にする。ＮＳＡＩＤに複合体化したペプチドは、別の例である。この場合、ＮＳＡＩＤに複合体化したペプチドは、ＮＳＡＩＤの局所送達を可能にし、これにより、より低いＮＳＡＩＤ用量の投与が可能となり、次いでより毒性が低くなる。活性剤を関節に送達することにより、疼痛緩和は、より迅速であり得、より長く持続し得、標的化せずに全身投薬する場合よりも、より少ない全身的用量及びオフサイトの望ましくない効果で得られ得る。
【０２００】
軟骨を標的とする本開示の複合体は、軟骨の負傷もしくは障害、または本明細書に記載されるような任意の他の軟骨もしくは関節の病態に関連する疼痛を治療または管理するために使用され得る。例えば、イオンチャネルは疼痛に関連し得、関節炎などの疾患状態で活性化され得るので、イオンチャネルと相互作用するペプチドを含む複合体は、疼痛を軽減するために直接使用され得る。別の実施形態では、複合体のペプチドは、抗関節炎または抗炎症活性を有する活性剤に複合体化され、ペプチドは、疼痛を軽減するための活性剤の局所送達のための担体として作用する。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の複合体は、対象の軟骨の病態を治療する方法であって、その方法は、抗炎症剤などの抗関節炎剤に複合体化した配列番号１の配列またはそのフラグメントを含む複合体の治療的有効量を対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の複合体は、対象の軟骨の病態を治療する方法であって、その方法は、抗炎症剤などの抗関節炎剤に複合体化した配列番号２〜配列番号５１０またはそのフラグメントのいずれか１つのペプチドを含む複合体を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、本開示は、対象における有害作用（例えば、薬物単独の投与に関連する有害作用）の発生及び／または強度を減少させ得るペプチド−薬物複合体を含む方法及び組成物を提供する。いくつかの場合では、本開示は、有害作用の発生及び／または強度またはその両方を少なくとも１０％〜５０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％減少させ得るペプチド−薬物複合体を含む方法及び組成物を提供する。
【０２０３】
本明細書に記載の複数の複合体は、任意の順序でまたは同時に投与され得る。同時の場合、本明細書に記載の複数の複合体は、静脈内注射剤などの単一の統一された形態で、または後続の複数の静脈内投薬量などの複数形態で提供され得る。
【０２０４】
複合体は、キットとしてパッケージ化され得る。いくつかの実施形態では、キットは、複合体の使用または投与に関する指示書を含む。
【０２０５】
方法
ペプチドの製造。いくつかの場合では、本開示のペプチドは、組換え的に単独でまたは融合ペプチドもしくは融合タンパク質として生成される。いくつかの実施形態では、より大きなタンパク質へのＣ末端融合物としてのペプチドを発現し得る方法が本明細書で開示される。いくつかの場合では、ペプチドは、追加のタンパク質としてシデロカリンを含むＣ末端融合タンパク質として発現される。いくつかの場合では、そのような融合物は、哺乳動物の分泌経路を介して融合ペプチドまたはタンパク質を誘導する。いくつかの場合では、そのようなプロセスは、本開示のシスチン高密度ペプチドのジスルフィド結合構造の適切な形成を確実にする。発現すると、Ｃ末端融合タンパク質（例えば、シデロカリン）は、最適化されたＴＥＶ酵素によってペプチドから切断され得る。いくつかの場合では、プロテアーゼの共発現または化学的切断が使用される。発現した融合タンパク質は、様々な方法を使用して精製され得る。そのような方法は、Ｃ末端融合タンパク質（例えば、シデロカリン）の上流にコードされたＨｉｓタグのＮｉ−ＮＴＡ捕捉と、これに続き得るＴＥＶ切断及び、例えば、クロマトグラフィ（例えば、サイズ排除クロマトグラフィ、逆相（ＲＰ）高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、及び／またはＲＰ−高速タンパク質液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ））を使用するペプチド精製を含み得る。Ｈｉｓタグが存在しない場合があり、有機溶媒の使用が使用されない場合がある製造には、異なる精製技術が有利であり得る。例として、配列番号１０５及び配列番号１８４に示されるアミノ酸配列を有する２つのペプチドは、一過性トランスフェクションによってＣＨＯ−Ｓ細胞で発現され得る。各ペプチドは、シデロカリン融合物としてまたはペプチド単独として発現され得る。ペプチドは、任意の予測されたグリコシル化部位または他の翻訳後修飾を含有する場合があるか、または含有しない場合がある。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、本開示のペプチド（例えば、シスチン高密度ペプチドに由来するもの）は、ｃＧＭＰガイドラインに従ってＦｍｏｃ固相ＳＰＰＳを使用して合成され得る。ＳＰＰＳの後に、ペプチドは、樹脂から切断され、続いて保護基が除去され得る。次いで各ペプチドの複数のジスルフィド結合は、溶液中で単一の酸化的折り畳み工程によって形成され得る。折り畳まれたペプチドは、任意の逆相クロマトグラフィ法を使用することによって精製され、凍結乾燥されたＴＦＡ塩として単離され得る。配列番号１０５、配列番号１０３、または配列番号１８４に示されるアミノ酸配列を有する合成された各ペプチドの同定は、質量分析（例えば、ＥＳＩ−ＭＳ）、クロマトグラフィ（例えば、ＲＰ−ＨＰＬＣ）、及び／または核磁気共鳴分光法（例えば、ＮＭＲ）によって検証され得る。
【０２０７】
コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）モデル。いくつかの実施形態では、関節炎の予防、治療、及び／または診断は、非ヒト動物におけるコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）モデル系において実施される。そのような非ヒト動物は、ラットまたはマウスなどのげっ歯類であり得る。いくつかの場合では、非ヒト動物は、ラットである。そのようなモデルでは、９週齢の雌のＬｅｗｉｓラット（ＥｎｖｉｇｏまたはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において０日目に４００ｕｇのウシＩＩ型コラーゲン（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ  Ｉｎｃ，Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＷＡ）を２回連続の２００ｕｌ（１ｍｇ／ｍｌ）の用量で麻酔中に皮内注射によって関節炎が誘発され得る。コラーゲンは、滅菌水中の０．０１Ｎ氷酢酸に２ｍｇ／ｍｌで溶解し、４℃で一晩揺動させ、次いでフロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）中で乳化することによって注射用に調製され得る。乳化するため、等しい体積のコラーゲン溶液及びＩＦＡが、３方向の栓によって結合された別々のシリンジに吸引され得る。氷上で、２つのシリンジの間で１０分間急速に押圧することによってコラーゲン及びＩＦＡが混合され得る。乳化の質は、少量の混合物を水に滴下することによって１０分間混合した後に試験される。適切に乳化された溶液は、離散した液滴として残存し得、水中に分散することができない。７日目に、ラットは、新たに調製されたＩＦＡ溶液１００ｕｌ中に１００ｕｇのコラーゲン、すなわち、１ｍｇ／ｍｌのコラーゲンの２回目の皮内注射で負荷される。関節炎の進行をモニターするために、例えば、体重及び足首直径の測定結果が７日目から試験終了まで毎日記録され得る。足首直径は、Ｆｏｗｌｅｒ  Ｄｉｇｉｔｒｉｘ２マイクロメーターを使用して１人の研究者によって測定され得る。各足首の３つの測定結果は、軽度の麻酔をかけたラットの足根における横方向の寸法から取得され得る。
【０２０８】
加水分解測定。加水分解速度を決定するために、複合体は、ＰＢＳ、ラット血漿、またはヒト血漿に希釈され、３７度でインキュベートされ得る。サンプルは、指定された時点（例えば、投与から１、２、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、４５、６０、または９０分及び／または時間後）で採取され得る。トリアムシノロンアセトニド（ＴＡＡ）などの内部標準が内部標準として添加され得、次いで活性剤／ＴＡＡが、例えば、アセトニトリルを使用して抽出され得る。サンプルは、乾燥され、再構成され、ＬＣ／ＭＳによって分析され得る。データは、Ｄｅｘ  ＡＵＣ／ＴＡＡ  ＡＵＣを使用して正規化され得る。加水分解率は、最大薬物放出の時点での活性剤ＡＵＣ／ＴＡＡ  ＡＵＣについての平均比を使用して計算され得る。例示的な加水分解の測定結果は、図２Ａ〜図２Ｅに示されている。一般的方法は、２０ｍｇ／ｍＬでストック溶液を生成するために、製造後にＤＭＳＯ中で再構成された凍結乾燥及び精製されたペプチド−薬物複合体を使用することを含み得る。各複合体ストックは、３連で各加水分解条件（１倍のＤＰＢＳ、ヒト血漿及びラット血漿）で０．２５ｍｇ／ｍＬとされ、３７℃で揺動され得る。遊離活性剤を定量化するために、１００μｌの加水分解した複合体溶液は、４℃で１ｍＬのアセトニトリルに移され、その時点ですべての血漿タンパク質及び無傷の複合体が沈殿し得る。これは、繰り返して実施されて一連の時点（０時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、２４時間、３２時間）を生成し得る。アセトニトリル溶液は、１７，０００ｇで５分間回転され、上清が除去され、９６ウェルブロックに添加され得る。次いでペレットは、５００μｌのアセトニトリルに再懸濁され、前述のように再ペレット化され得る。上清は、除去され、ブロック内の同じウェルに添加され得る。サンプルは、窒素流下で乾燥させ、続いて１１０μｌの４５：５５のＡＣＮ：クエン酸塩１０ｍＭ  ｐＨ５．５中で再構成することによって分析用に調製され得る。最適な回収を確実にするために、ブロックは、再構成工程中に７，０００ｒｐｍで５分間プレート振盪器により振盪され得る。ＬＣ／ＭＳの前に、サンプルは、９６ウェルプレートに移され、６，５００ｇで１５分間遠心分離され得る。分析は、ＩｎｆｉｎｉｔｙＬａｂ  Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  ＳＢ−Ｃ１８カラムでアセトニトリル、水（＋０．１％ＴＦＡ）勾配（以下に示される）を使用してインライン６１２０シングルクワッドＭＳを有するＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＩｎｆｉｎｉｔｙシリーズＨＰＬＣで実施され得る。遊離活性剤（または薬物）の定量化は、ＴＩＣの活性剤ピークの統合により達成され得る。
【０２０９】
ペプチド−活性剤複合体の合成。本開示のペプチド−活性剤複合体（またはペプチド−薬物複合体、すなわち、ＰＤＣ）は、本明細書に記載の任意のペプチド（例えば、表１に列挙されているもの及び／または配列番号１〜配列番号５１０に示されるアミノ酸配列を有するもの）のうちの１つ以上、本明細書に記載の任意のリンカー（例えば、表２に列挙されているもの）、ならびに本明細書に記載の任意の活性及び／または検出可能剤を含み得る。
【０２１０】
一般に、本明細書に記載されるようなペプチド−薬物複合体を生成するための合成方法は、薬物分子をリンカーに結合させ、続いてペプチドを薬物−リンカー複合体に結合させることを含み得る。合成中に使用される溶媒、反応条件、及び／または追加の試薬は、ＰＤＣに使用されるペプチド及び／または活性もしくは検出可能剤の生物学的活性を保持しつつ、収率及び純度が前臨床及び／または臨床試験のためのペプチド−薬物複合体（ＰＤＣ）の生成をスケーリングすることが可能となるように選択され得る。
【０２１１】
本開示のペプチド−薬物複合体（ＰＤＣ）は、様々な合成ストラテジーを使用して合成され得る。そのような合成ストラテジーの例は、実施例５〜実施例１９、及び実施例２９に示されている。本開示のＰＤＣは、様々な化学反応及び／または化学変換を使用して合成され得る。いくつかの実施形態では、ＰＤＣは、加水分解、エステル結合形成（複数可）、ＮＨＳエステル形成（複数可）、アミド形成（複数可）、ペプチド複合体化（複数可）、カルバメート形成（複数可）、メシレート形成（複数可）、硫黄アルキル化（複数可）、還元的アミノ化（複数可）、脱保護（複数可）、またはそれらの任意の組み合わせを使用して合成される。ペプチド複合体化反応には、アミド結合形成、カルバメート形成、カルボネート形成、エステル結合形成、またはそれらの組み合わせが含まれ得るがこれらに限定されない。ＰＤＣを生成するための合成アプローチは、１つ以上の保護基（例えば、Ｂｏｃ、Ｆｍｏｃ、ＭＯＭなど）の使用を含み得、そのようなものとして、１つ以上の保護及び／または脱保護工程を含み得る。いくつかの場合では、ＰＤＣ合成は、カルボン酸をＮＨＳエステルなどの活性化エステルに変換することなどの活性化カルボン酸の形成を含む。
【０２１２】
いくつかの場合では、ＰＤＣの合成は、放射性標識工程を含む。放射性標識は、１つ以上の放射性核種をＰＤＣ、例えば、リンカー、及び／またはペプチドに結合させることを含み得る。放射性核種は１４Ｃであり得る。１４Ｃを有するペプチドの放射性標識は、還元的アミノ化を含み得る。本明細書に記載されるような他の放射性核種でのＰＤＣの放射性標識は、異なる合成ストラテジーの使用及び／またはキレート剤部位の使用を含み得る。いくつかの実施形態では、ペプチド及び／またはペプチド−薬物複合体は、放射性標識されている。ペプチド及び／またはペプチド−薬物複合体は、血漿半減期、器官及び／または組織取り込み及び／または保持、標的係合などの薬物動態及び／または薬力学的（ＰＤ）パラメータを決定するのに好適な様々な放射性核種で放射性標識され得る。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、２，５−ジメチルアジピン酸（ＤＭＡ）リンカー及びデキサメタゾン（本明細書では「Ｄｅｘ」とも称される）またはデス−シクレソニド（本明細書では「ｄＣＩＣ」とも称される）を含むペプチド複合体は、加水分解、エステル結合形成、ＮＨＳエステル形成、及びペプチド複合体化のうちの任意の１つ以上を使用して合成され得る。例えば、配列番号１０５に示されるアミノ酸配列を有するペプチド、（カルバメート）トランス−１−アミノメチル−シクロヘキシル−４−カルボン酸リンカー及びデキサメタゾンを含むペプチド複合体は、カルバメート形成、ＮＨＳエステル形成、ペプチド複合体化、またはそれらの任意の組み合わせのうちの任意の１つ以上を使用して合成され得る。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、本開示のＰＤＣの合成は、メシレート形成、硫黄アルキル化、ＮＨＳエステル形成、ペプチド複合体化、Ｂｏｃ脱保護、還元的アミノ化、またはそれらの任意の組み合わせのうちの任意の１つ以上を含む。例えば、システインリンカー及びトリアムシノロンアセトニド（ＴＡＡ）を含むペプチド−薬物複合体は、メシレート形成、硫黄アルキル化、ＮＨＳエステル形成、ペプチド複合体化、Ｂｏｃ脱保護、還元的アミノ化、またはそれらの任意の組み合わせを使用して合成され得る。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列が配列番号１〜配列番号５１０のいずれか１つに示されるペプチドのいずれか１つ、薬物（例えば、デキサメタゾンまたはデス−シクレソニドなどのグルココルチコイド）、及びグルタル酸リンカー、３，３−テトラメチレン−グルタル酸リンカー、トランス−１，２−シクロヘキシルリンカー、１，３−シクロヘキシルリンカー、テレフタル酸リンカー、２，３−ジメチル−コハク酸リンカー、コハク酸リンカー、アジピン酸リンカー、トランス−１，４−シクロヘキシルリンカーのいずれか１つを含むＰＤＣは、エステル結合形成、ＮＨＳエステル形成、ペプチド複合体化、またはそれらの任意の組み合わせのうちの任意の１つ以上を使用して生成され得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチド−薬物複合体は、リンカーを介してグルココルチコイドに連結された本開示のペプチドを含む。いくつかの場合では、ペプチドは、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１８４、または配列番号５０９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、グルココルチコイドは、デキサメタゾンまたはデス−シクレソニドである。いくつかの場合では、リンカーは、化合物番号１〜２２を有する表２に列挙された任意のリンカーである。システインリンカー（Ｃｙｓ）を介してデキサメタゾン（すなわち、Ｄｅｘ）に連結された配列番号１０５に示されるアミノ酸配列を有するペプチド（ペプチド（配列番号１０５）を含むＰＤＣ、すなわち、ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）は、メシレート形成、硫黄アルキル化、ＮＨＳエステル形成、ペプチド複合体化、Ｂｏｃ脱保護、還元的アミノ化のうちの任意の１つ以上を使用して合成され得る（例えば、実施例８を参照されたい）。別の例として、ＰＤＣペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ（ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣとも称される）は、以下の３つの合成工程：本明細書に記載されるようなエステル結合形成、スルホ−ＮＨＳエステル形成、及びペプチド複合体化を使用して合成され得る。
【０２１６】
薬物動態、薬力学的、及び／または機能性試験。いくつかの実施形態では、本開示は、対象におけるペプチド複合体の治療効果を決定するための（例えば、用量発見、用量試験、及び／または用量増大試験のための）方法を提供する。そのような方法は、様々な器官及び／または組織のサイズ、直径、及び／または重量の測定を含む。例えば、関節炎に対するペプチド複合体の効果は、足首及び／または関節の直径及び重量を測定することによって決定され得る（例えば、対照コホートと比較した足首の炎症及び／または足首直径の減少の測定は、ペプチドまたはペプチド複合体の機能性または効果を示し得る）。そのような方法はまた、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化または可視化法（例えば、オートラジオグラフィ、核画像化など）及び／またはｅｘ  ｖｉｖｏ組織染色（例えば、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色及び／または抗薬物（例えば、抗デキサメタゾン）及び／または抗ペプチド（例えば、抗ペプチド（配列番号１０５）抗体）での染色（顕微鏡法（例えば、免疫組織化学）と組み合わされる）を使用して、そのような器官及び／または組織中のペプチドまたはペプチド複合体の取り込み及び／または保持を決定することを含む。機能性及び効果及び／または副作用を決定するために測定され得る器官及び組織には、膝、椎間板（ＩＶＤ）、関節、足首、血液、筋肉、腎臓、肝臓、脾臓、骨、胸腺、及び骨髄が含まれ得る。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるような活性剤、ペプチドまたはペプチド複合体の効果的用量範囲を決定するための（例えば、用量発見、用量試験、及び／または用量増大試験のための）方法を提供する。そのような方法は、対象に異なる用量の活性剤、ペプチド、またはペプチド複合体を投与した後に、治療機能性または効果（例えば、関節または足首の炎症及び／または腫れの減少、疼痛減少、可動性及び／または食欲の増加、全体的健康、ＩＬ−６などのサイトカインなどの炎症マーカーの減少）を示し得る所定のパラメータを測定することを含む。測定される追加のパラメータには、活性剤への全身性及び／または長期の曝露を示すものが含まれ得る。そのようなパラメータには、血液細胞の生存性及び／または濃度（例えば、総白血球（ＷＢＣ）数、リンパ球数など）、器官重量（例えば、膝、ＩＶＤ、関節、足首、血液、筋肉、腎臓、肝臓、脾臓、骨、胸腺、及び／または骨髄のもの）、及び／または全身重量、ならびに可動性、食欲喪失、または関節及び足首の腫れなどの他の観察可能なパラメータが含まれ得る。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、本開示は、活性剤が単独でまたはペプチド複合体としてのいずれかで投与された場合の１つ以上の副作用を決定するための（例えば、用量発見、用量試験、及び／または用量増大試験のための）方法を提供する。そのような副作用は、活性剤（例えば、グルココルチコイド）への全身性曝露に起因し得る。本開示は、活性剤（例えば、グルココルチコイド）への全身性曝露を評価するために使用され得るマーカー、及びそのようなマーカーを決定するための方法を提供する。その方法は、血液細胞の生存性及び／または濃度（例えば、総白血球（ＷＢＣ）数、リンパ球数など）、器官重量（例えば、膝、ＩＶＤ、関節、足首、血液、筋肉、腎臓、肝臓、脾臓、骨、胸腺、及び／または骨髄のもの）、及び／または全身重量、ならびに可動性、食欲喪失、または関節及び足首の腫れなどの他の観察可能なパラメータを測定することを含み得る。活性剤への全身性曝露を決定するために測定され得る追加のマーカーには、酵素レベル、例えば、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及び／またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベル、またはホルモンもしくは他のシグナル伝達分子、例えば、ケモカイン（例えば、サイトカイン及びインターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０など）のレベルが含まれ得る。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、副作用は、体重減少、免疫抑制、皮膚菲薄化、紫斑病、クッシング外観、眼の白内障もしくは緑内障、骨粗鬆症もしくは骨折、視床下部−下垂体−副腎系（ＨＰＡ）軸の抑制、高血糖症及び糖尿病、重篤な心血管事象の発生率の増加、脂質異常症、ミオパシー、胃炎、胃腸潰瘍及び出血、精神障害、血糖値の上昇、血清コルチゾールもしくはコルチコステロンの減少、副腎、胸腺、もしくは脾臓の萎縮、循環リンパ球の減少、骨髄の細胞性の低下、筋萎縮、筋機能の低下、疼痛、筋肉痛、関節炎痛、関節痛、関節変形、可動性の低下、関節における動作範囲の減少、柔軟性の低下、強度の低下、バランスの低下、耐糖能の低下、食欲喪失、骨代謝の低下、免疫の障害、ネフローゼ症候群、疲労感、真菌感染症、ウイルス感染症、細菌感染症、ＧＩ穿孔、行動及び気分の乱れ、二次性副腎皮質機能不全、水分保持、白内障、緑内障、血圧上昇、骨粗鬆症、小児の成長の抑制、インスリン要求量の増加、体重増加、吐き気、クッシング症候群、筋骨格系、消化器系、皮膚系、神経系、内分泌系、眼科系、代謝系、もしくは心血管系の機能不全、またはそれらの任意の組み合わせのいずれか１つであり得る。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、本開示は、ペプチドまたはペプチド複合体の免疫原性を決定するための方法を提供する。そのような方法は、ペプチドまたはペプチド複合体の結合アレル、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ結合アレルを決定することを含み得る。そのような方法には、例えば、コンピュータプログラム及び／またはニューラルネットワーク、例えば、ニューラルネットワークプログラムＮｅｔＭＨＣＩＩバージョン２．２を使用したｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスクリーニング方法が含まれる。これにより、各々の主要なＭＨＣアレル群に対して各配列中の可能性のあるすべての１５ｍｅｒペプチドの評価が可能となり得る。いくつかの場合では、ペプチドまたはペプチド複合体は、２つ以下の強力な結合アレルを有する。いくつかの場合では、ペプチドまたはペプチド複合体は、１つ以下の強力な結合アレルを有する。いくつかの場合では、ペプチドまたはペプチド複合体は、本明細書に記載の方法を使用して試験した場合、強力な結合アレルを有さない。免疫原性を評価するための他の方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏでのＴ細胞活性化、または任意の種への投薬後の抗体生成などのｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫原性を評価することを含み得る。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、本開示は、所定の受容体、酵素、または他のタンパク質に対するペプチドまたはペプチド複合体の結合を決定するための方法を提供する。そのような受容体は、イオンチャネルであり得る。イオンチャネル結合は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、及び／またはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで決定され得る。ペプチド結合について試験されるイオンチャネルには、ＫＣＮＱ１、ＨＣＮ４、Ｋｖ１．５、Ｋｉｒ２．１、ｈＥＲＧ、Ｃａｖ１．２、Ｋｖ４．３、及び／またはＮａｖ１．５が含まれ得る。いくつかの場合では、ペプチドまたはペプチド複合体は、上述したイオンチャネルのうちの２つ未満への結合を示す。いくつかの場合では、ペプチドまたはペプチド複合体は、上述したイオンチャネルのうちの１つ未満への結合を示す。いくつかの場合では、ペプチドまたはペプチド複合体は、上述したイオンチャネルのいずれにも結合を示さない。
【実施例】
【０２２２】
以下の実施例は、本開示のいくつかの実施形態をさらに説明するために含まれており、本開示の範囲を限定するために使用されるべきではない。
【０２２３】
実施例１
組換え発現を使用するペプチドの製造
この例は、シスチン高密度ペプチドを生成するための方法を提供する。シスチン高密度含有ペプチドに由来するペプチドを、公開された方法論を使用して哺乳動物細胞培養で生成した。（Ａ．Ｄ．Ｂａｎｄａｒａｎａｙｋｅ，Ｃ．Ｃｏｒｒｅｎｔｉ，Ｂ．Ｙ．Ｒｙｕ，Ｍ．  Ｂｒａｕｌｔ，Ｒ．Ｋ．Ｓｔｒｏｎｇ，Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ．２０１１  Ｄａｅｄａｌｕｓ：  ａ  ｒｏｂｕｓｔ，  ｔｕｒｎｋｅｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｃｉｇｒａｍ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｎｏｖｅｌ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．（３９）２１，ｅ１４３）。
【０２２４】
一般に、標準的な分子生物技術を使用して、ペプチド配列をＤＮＡに逆翻訳し、合成し、シデロカリンでインフレームでクローニングした。（Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．２０１２  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ．）。得られたコンストラクトをレンチウイルスにパッケージングし、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、増殖させ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）によって単離し、タバコエッチウイルスプロテアーゼで切断し、逆相クロマトグラフィによって均質に精製した。精製後、各ペプチドを凍結乾燥させ、凍結保存した。図１は、本開示のペプチドを製造する一般的方法を示している。
【０２２５】
ペプチドは、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ−Ｓ細胞などの様々な細胞株を使用して作製され得る。ペプチドは、それら自体によって、または切断可能な連結によってペプチドのＮ末端に融合したシデロカリンなどの上流のリーダーと共に発現され得る。様々な酵素切断可能な、または化学的に切断可能な連結が使用され得る。ペプチド（またはペプチド融合物）は、様々なリーダーペプチドの使用によって発現され得る。ＨｉｓタグもしくはＦＬＡＧタグなどの様々なタグ、または他の既知の方法も使用され得る。
【０２２６】
例として、シスチン高密度ペプチドのジスルフィド結合構造の適切な形成を確実にするために哺乳動物分泌経路を介して融合タンパク質を誘導するより大きなタンパク質（シデロカリン）へのＣ末端融合物としてペプチドを発現させたプロセスが本明細書に記載されている（ペプチドのＮ末端はシデロカリンのＣ末端に融合される）。発現後、最適化されたＴＥＶ酵素によってペプチドからシデロカリンを切断した。プロテアーゼの共発現または化学的切断の使用は、可能な代替手段である。また、シデロカリンの上流にコードされたＨｉｓタグのＮｉ−ＮＴＡ捕捉を介して融合タンパク質を精製し、次いで、ＴＥＶ切断後、ペプチドをＲＰ−ＦＰＬＣによって精製した。異なる精製技術も同様に使用され得る。代替的に、ペプチドは、リーダーペプチドと共に発現され得るが、追加のより大きな融合タンパク質と共に発現されない。
【０２２７】
配列番号１０５及び配列番号１８４に示されるアミノ酸配列を有する２つのペプチドの発現を一過性トランスフェクションによってＣＨＯ−Ｓ細胞で評価した。各ペプチドは、シデロカリン融合物としてまたはペプチド単独で発現させた。ペプチドは、予測されたグリコシル化部位または他の翻訳後修飾を含有していなかった。融合物は、プロセスで使用したリーダーペプチドと同じものを使用し、ペプチド単独では、所望の成熟ペプチドのすぐ上流で切断することがｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測されたリーダーペプチドを使用した。２５ｍＬの培養物を３２℃で２週間維持した。良好な生存性が培養全体を通して維持された。培養７日目及び１３日目でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、各融合タンパク質の予期された位置に移動する有意なバンドが明らかになったが、宿主タンパク質は、培養を通して同様の移動位置においてより低いレベルで存在しているようである。ペプチド単独の有意な発現は細胞上清中に検出されず、ペプチドが潜在的に分泌されなかったか、分解されたか、または有意なレベルで発現しなかったことを示している。融合タンパク質をＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィによって捕捉し、ＴＥＶ切断に供し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで予期された新たなバンドを生成した。この生成物のＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、還元型及び非還元型の両方で、予期された移動挙動で主要なピークを示した。この生成物のＭＳ分析も、従来の発現によって生成されたペプチドについて確認されたものと一致した予期されたｍ／ｚを示した。
【０２２８】
データは、本明細書に記載の組換え発現が、機能性ペプチドを生成することを示している。本明細書に記載の軟骨ホーミングペプチドは、本明細書に記載の他の生成方法（例えば、以下の実施例２におけるＳＰＰＳを参照されたい）で生成されたものと同等の生化学的特性を伴って組換えＣＨＯ発現によって成功裏に生成された。
【０２２９】
代替的に、化学合成は、官能基（例えば、アルキン）を有する非天然アミノ酸を本開示のペプチド、例えば、以下の実施例２に記載されているものに組み込むために使用され得る。この官能基は、本明細書に記載されるような機能性ハンドルとして使用される。
【０２３０】
実施例２
固相合成を使用するペプチドの製造
この例は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によるシスチン高密度ペプチドの合成及び製造のための方法を提供する。
【０２３１】
シスチン高密度ペプチド由来のペプチドは、Ｆｍｏｃ固相ＳＰＰＳを使用して合成した。ＳＰＰＳの後に、ペプチドを樹脂から切断し、続いて保護基を除去した。次いで各ペプチドの複数のジスルフィド結合を、溶液中で単一の酸化的折り畳み工程によって形成した。折り畳まれたペプチドを逆相クロマトグラフィによって精製し、凍結乾燥されたＴＦＡ塩として単離した。配列番号１０５、配列番号１０３、または配列番号１８４に示されるアミノ酸配列を有する合成された各ペプチドの同定をＥＳＩ−ＭＳによって検証し、ＲＰ−ＨＰＬＣによる純度は＞９５％であった。
【０２３２】
次いで合成的に生成されたペプチドを、実施例１において上述したように組換え発現系で生成されたペプチドと対比して分析した。ＬＣ−ＭＳ分析は、合成ペプチドが組換えペプチドと同じ保持時間及び観察された質量を呈したことを示した。また、配列番号１０５に示されるアミノ酸配列を有する合成（ＳＰＰＳ）ペプチドは、５０ｍＭのＤＴＴで室温で６０分間インキュベートした後にＬＣ−ＭＳでの新しいピークの形成がほとんどないことによって証明されるように、組換え体によって示された化学的還元に対して同様の抵抗性を示した。その上、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析はまた、合成ペプチドが、組換えペプチドと同等の移動パターン（還元型及び非還元型）を示した。
【０２３３】
このデータは、本明細書に開示されるような組換え的に発現したペプチド及び合成的に生成されたペプチドが同様の特性を有することを実証し、両方の方法論が、活性剤のための担体として使用され得る機能性ペプチドを生成することを示している。よって、本明細書に記載の合成アプローチは、本明細書に記載のペプチドの生成を可能にする。
【０２３４】
実施例３
ペプチドの放射性標識
この例は、シスチン高密度ペプチドの放射性標識を記載する。いくつかのシスチン高密度ペプチド（クモ及びサソリに由来するいくつかの配列）を、標準的な方法で１４Ｃホルムアルデヒド及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムに対する還元的アミノ化によって放射性標識した。Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２５４（１１）：４３５９−６５（１９７９）を参照されたい。配列は、アミノ酸「Ｇ」及び「Ｓ」をＮ末端に有するように修飾した。Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖ９１：１９８３  ｐ．５７０及びＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５４（１１）：１９７９  ｐ．４３５９を参照されたい。完全なメチル化（すべての遊離アミンのジメチル化）を確実にするために、過剰のホルムアルデヒドを使用した。標識されたペプチドを、Ｓｔｒａｔａ−Ｘカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ８Ｂ−Ｓ１００−ＡＡＫ）での固相抽出により単離し、５％メタノールを有する水でそそぎ、２％ギ酸を有するメタノール中に回収した。次に、溶媒を穏やかな熱及び窒素ガス流を用いてブローダウンエバポレーターにおいて除去した。
【０２３５】
実施例４
グルココルチコイド−ペプチド複合体の合成経路
配列番号１０５または配列番号５０９を含む以下の複合体を、実施例５〜１９において以下に記載されたプロトコルを用いて作製した。
【化４０】
2021522172.tif 000067
【化４１】
2021522172.tif 000068
【０２３６】
この実施例で使用されたペプチドまたは本明細書に開示される別のペプチド、例えば、配列番号１０５、配列番号５０９、配列番号１０３、または配列番号１８４に対する代替物が複合体化のためのペプチドとして使用される。デキサメタゾン、ブデソニド、トリアムシノロンアセトニド、デス−シクレソニドまたは本明細書に開示される他のグルココルチコイドに対する代替物が複合体化のための活性剤として使用される。
【０２３７】
実施例５
ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（２７）複合体の合成
この例は、以下に例示されたスキームに示されているように、ペプチド（配列番号１０５）−［ジメチルアジピン酸］−Ｄｅｘ（２７）の合成を実証する。
【０２３８】
材料：炭酸セシウム（Ｃｓ２ＣＯ３）；ジクロロメタン（ＤＣＭ）；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）；ピリジン；Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）；４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）；ジメチル２，５−ジメチルアジペート；Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）；リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）；トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）；水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）などはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製のものであった。デキサメタゾン（Ｄｅｘ）及びトリアムシノロンアセトニド（ＴＡＡ）は、ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓから購入した。ブデソニド（Ｂｕｄ）は、ＴＲＣ  Ｃａｎａｄａから購入した。
【化４２】
2021522172.tif 000069
【０２３９】
スキーム１
この例は、以下の一般的で非限定的な工程：
ｉ）加水分解
ｉｉ）エステル結合形成
ｉｉｉ）ＮＨＳエステル形成
ｉｖ）ペプチド複合体化
を使用して合成された２，５−ジメチルアジピン酸（ＤＭＡ）リンカー及びデキサメタゾンを含むペプチド複合体を実証する。
【０２４０】
これらの工程は、スキーム１に示されており、以下でさらに詳細に記載されている。
ｉ）加水分解−２，５−ジメチルアジピン酸の合成
２ｍＬの水中の水酸化リチウム（２３６ｍｇ、９．８９ｍｍｏｌ）を２ｍＬのＴＨＦ溶液中のジメチル２，５−ジメチルアジペート（１ｇ、４．９４ｍｍｏｌ）に添加した。反応混合物を室温で２日間撹拌した。ＴＨＦ及びＨ２Ｏ層を分離し、ＥｔＯＡｃ（３×２ｍＬ）でＨ２Ｏ部分を洗浄した。１２ＭのＨＣｌ溶液を、白色の沈殿物が溶液から出てくるまで水部分に滴下添加した。液体を除去し、次いで個体を乾燥させて０．８７８ｇの白色の固体を定量的に得た。得られた粗生成物を、さらなる精製をせずに次の工程に使用した。
ｉｉ）エステル結合形成−Ｄｅｘ−２，５−ジメチルアジピン酸の合成
デキサメタゾン（１０４ｍｇ、０．２６５ｍｍｏｌ）、２，５−ジメチルアジピン酸（１３８ｍｇ、０．７９５ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１５２ｍｇ、０．７９５ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（９７ｍｇ、０．７９５ｍｍｏｌ）を３ｍＬの無水ＤＣＭに溶解した。反応混合物を室温でおよそ２０時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。残渣をＨＰＬＣによって精製して５５％の収率で８０ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、質量５３１．３（Ｍ−１７）で９５％を超える純度を示した。
ｉｉｉ）ＮＨＳエステル形成−Ｄｅｘ−２，５−ジメチルアジピン酸ＮＨＳエステルの合成
Ｄｅｘ−２，５−ジメチル−アジピン酸（３０ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（３１．５ｍｇ、０．１６５ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１９ｍｇ、０．１６５ｍｍｏｌ）を１ｍＬの無水ＤＭＦに溶解した。反応混合物を室温でおよそ２０時間撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣによって精製して９５％の収率で３３．６ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、質量６６８．２（Ｍ＋２３）で９８％を超える純度を示した。
ｉｖ）ペプチド複合体化−ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（２７）複合体の合成
１ｍＬの無水ＤＭＳＯ中のアミノ酸配列配列番号１０５を有するペプチド（４０ｍｇ、０．００９３ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルモルホリン（１０．２３μＬ、０．０１４ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に、デキサメタゾン２，５−ジメチル−アジピン酸−ＮＨＳエステル（９．１ｍｇ、９９％の純度、０．０９３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で２日間撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣによって精製して白色の粉末を得た（２回の反応を組み合わせ、合計９０ｍｇのペプチドを使用し、６０．６ｍｇの生成物が６０％の収率で得られた）。ＬＣ−ＭＳは、ＭＳ：１２０９（Ｍ／４）、１６１１．３（Ｍ／３）で９６％の純度を示した。
【０２４１】
この実施例で使用されたペプチドまたは本明細書に開示される別のペプチド、例えば、配列番号１０３または配列番号１８４または配列番号５０９に対する代替物が複合体化のためのペプチドとして使用される。デキサメタゾン、ブデソニド、トリアムシノロンアセトニド、または本明細書に開示される他のグルココルチコイドに対する代替物が複合体化のための活性剤として使用される。
【０２４２】
実施例６
ペプチド（配列番号１０５）−［シクロヘキシル−（Ｎ−４−アミノメチル−トランス−１−カルバモイル）］−Ｄｅｘ（２８）の合成
この例は、以下に例示されたスキームに示されているように、ペプチド（配列番号１０５）−［シクロヘキシル−（Ｎ−４−アミノメチル−トランス−１−カルバモイル）］−Ｄｅｘ（２８）の合成を実証する。
【化４３】
2021522172.tif 000070
【０２４３】
スキーム２
この例は、（カルバメート）トランス−１−アミノメチル−シクロヘキシル−４−カルボン酸リンカー及びデキサメタゾンを組み込んだペプチド複合体の合成を、以下の一般的で非限定的な工程：
ｉ）Ｄｅｘ−ＣＯＰＮＰ形成
ｉｉ）カルバメート形成
ｉｉｉ）ＮＨＳエステル形成
ｉｖ）ペプチド複合体化
を使用して合成したことを記載する。
【０２４４】
これらの工程は、スキーム２に示されており、以下でさらに詳細に記載されている。
ｉ）Ｄｅｘ−ＣＯＰＮＰ形成−ｐ−ニトロフェニルＤｅｘ−ホルメートの合成
デキサメタゾン（３１１ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）を、セプタムで密封された反応バイアル内の無水ＤＣＭ８ｍＬ（懸濁液）に溶解した。その撹拌懸濁液に、ピリジン（１９１μＬ、２．３７ｍｍｏｌ）を添加した。次いで４−ニトロフェニルクロロホルメート（２０８ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ）をシリンジを介して反応混合物に添加した。反応混合物は透明になり、それを室温でおよそ４時間撹拌した。密封した反応物を２５ｍＬの氷水に注ぎ、層を単離した。有機層を１ｍＬの０．１ＭのＨＣｌ（水性）で洗浄し、続いて飽和ＮａＨＣＯ３及び次いでブラインで洗浄した。最後に、溶液をＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。混合物を濾過して濾液を得、溶媒を減圧下で除去して粗生成物（ｐ−ニトロフェニルＤｅｘ−ホルメート）を得た。粗混合物をＨＰＬＣによって精製して７２％の収率で３１５ｍｇの白色の固体を得た。ＬＣ−ＭＳは、９５％の純度及び質量５５８．２（Ｍ＋１）を示した。
ｉｉ）カルバメート形成−Ｄｅｘ−カルバメート−トランス−１−アミノメチル−シクロヘキシル−４−カルボン酸の合成
無水ＤＭＳＯ５ｍＬ中のＤｅｘ−ＣＯＰＮＰ（２２９ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）及びトランス−４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸（１９３ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ）（透明な溶液ではない）にＮ−メチルモルホリン（２７１μＬ、２．４６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を３０℃でおよそ２０時間撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣによって精製して７６％の収率で１８０．１ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、質量５７６．３（Ｍ＋１）で９５％の純度を示した。
ｉｉｉ）ＮＨＳエステル形成−Ｄｅｘ−カルバメート−トランス−１−アミノメチル−シクロヘキシル−４−カルボン酸ＮＨＳエステルの合成
Ｄｅｘ−カルバメート−トランス−１−アミノメチル−シクロヘキシル−４−カルボン酸（２６．３ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（２６ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２６ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の混合物に１ｍＬのＤＭＦを添加した。反応混合物を室温でおよそ２０時間撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣによって精製して７４％の収率で２２．８ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、質量６７３．３（Ｍ＋１）で９５％を超える純度を示した。
ｉｖ）ペプチド複合体化−ペプチド（配列番号１０５）−［シクロヘキシル−（Ｎ−４−アミノメチル−トランス−１−カルバモイル）］−Ｄｅｘ（２８）の合成
１ｍＬのＤＭＳＯ中のアミノ酸配列配列番号１０５を有するペプチド（４０ｍｇ、０．００９３ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルモルホリン（１０．２３μＬ、０．０９３ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に、Ｄｅｘ−カルバメート−トランス−１−アミノメチル−シクロヘキシル−４−カルボン酸ＮＨＳエステル（１２．５ｍｇ、９９％の純度、０．０１８６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で２日間撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣによって精製して５１％の収率で２３ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、質量１２１５．８（Ｍ／４）及び１６２０．３（Ｍ／３）で９９％の純度を示した。
【０２４５】
この実施例で使用されたペプチドまたは本明細書に開示される別のペプチド、例えば、配列番号１０３または配列番号１８４または配列番号５０９に対する代替物が複合体化のためのペプチドとして使用される。デキサメタゾン、ブデソニド、トリアムシノロンアセトニド、または本明細書に開示される他のグルココルチコイドに対する代替物が複合体化のための活性剤として使用される。
【０２４６】
実施例７
ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−ＴＡＡ（３６）（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）及びペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ（３８）（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の合成
この例は、以下に例示されたスキームに示されているように、ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−ＴＡＡ（３６）（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）及びペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ（３８）（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の合成を実証する。
【化４４】
2021522172.tif 000071
【０２４７】
スキーム３
この例は、以下の一般的で非限定的な工程：
ｉ）メシレート形成
ｉｉ）硫黄アルキル化
ｉｉｉ）ＮＨＳエステル形成
ｉｖ）ペプチド複合体化
ｖ）Ｂｏｃ脱保護
ｖｉ）還元的アミノ化
を使用して合成されたシステインリンカー及びトリアムシノロンアセトニドを含むペプチド複合体を実証する。
【０２４８】
これらの工程は、スキーム３に示されており、以下でさらに詳細に記載されている。
ｉ）メシレート形成−ＴＡＡメシレートの合成
トリアムシノロンアセトニド（４５３．１ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）を５ｍＬの無水ピリジンに溶解した（最初は完全に溶解しなかった、懸濁液）。反応バイアルを氷浴中でセプタムで密封した。次いでメタンスルホニルクロリド（１１６μＬ、２．０８ｍｍｏｌ）をシリンジを通してトリアムシノロンアセトニドの懸濁液に滴下添加した。反応混合物を０℃で３０分間撹拌した。後処理：反応混合物を２５ｍＬの氷水に注ぎ、生成物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機部分を１ｍＬの０．１ＭのＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３及びブラインで洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。混合物を濾過して濾液を得、溶媒を減圧下で除去して生成物を定量的に得た。
ｉｉ）硫黄アルキル化−ＴＡＡ−Ｂｏｃ−システインの合成
５ｍＬの無水ＤＭＳＯ中のＢｏｃ−Ｌ−システイン（８７３ｍｇ、４．１４ｍｍｏｌ）及びＣｓ２ＣＯ３（１６１０ｍｇ、４．９４ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に、２ｍＬの無水ＤＭＳＯ中のトリアムシノロンアセトニドメシレート（２７３．１ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温でおよそ２０時間撹拌した。反応物を濾過して固体を除去し、得られた溶液をＨＰＬＣによって精製して、５９％の収率で２００ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、質量６２０．２（Ｍ−１７）で９６％を超える純度を示した。
ｉｉｉ）ＮＨＳエステル形成−ＴＡＡ−Ｂｏｃ−システイン−ＮＨＳエステルの合成
１ｍＬの無水ＤＭＦの中のトリアムシノロンアセトニド−Ｂｏｃ−システイン（４６ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（２７．５ｍｇ、０．１４４ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１６．６ｍｇ、０．１４４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣによって精製して６５％の純度（３３％の出発酸）で４１．４ｍｇの白色の粉末を得た。
ｉｖ）ペプチド複合体化−ペプチド（配列番号１０５）−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の合成
アミノ酸配列配列番号１０５を有するペプチド（１０ｍｇ、０．００２３ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルモルホリン（０．５ｍＬの無水ＤＭＳＯ中に５０６μＬ；１００倍希釈；０．０４６ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に、トリアムシノロンアセトニド−Ｂｏｃ−システイン−ＮＨＳエステル（５．１ｍｇ、５０％の純度、０．００３５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣによって精製して５１％の収率で５．８ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、質量１２３１．１（Ｍ／４）及び１６４１．２（Ｍ／３）で９８％の純度を示した。
ｖ）Ｂｏｃ脱保護−ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−ＴＡＡ（３６）（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の合成
３０ｍＬの透明なバイアル内のトリアムシノロンアセトニド−Ｂｏｃ−システイン−ペプチド（１２ｍｇ、０．００２４４ｍｍｏｌ）の白色の粉末に、６００μＬのＴＦＡ（９９％の純度）を添加した。５分後、ＬＣ−ＭＳ分析は、反応が完了したことを明らかにした。２ｍＬのアセトニトリル及び水（１：１の比）を添加し、次いで−７８℃で凍結させ、続いて凍結乾燥させて１２ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、質量１２０６．３（Ｍ／４）、１６０８．７（Ｍ／３）で９６％を超える純度を示した。
ｖｉｉ）還元的アミノ化−１４Ｃ標識複合体（３８）の合成
５ｍＬの水中のペプチド（配列番号１０５）−システイン−トリアムシノロンアセトニド（５ｍｇ、０．００１４８ｍｍｏｌ）の溶液に、４７０μＬの１０倍のＰＢＳ及び２５μＬの１４Ｃ標識ホルムアルデヒド（８％水溶液）を放射性ヒュームフード内で添加した。ＮａＣＮＢＨ４（水性）溶液（１ｍＬ中に４．６ｍｇ）を添加した。反応混合物をボルテックスし、およそ２０時間放置した。反応混合物を、予め３ｍＬのメタノールで活性化し、３ｍＬの水で平衡化したＳｔｒａｔａ−Ｘカラムに通した。吸着した複合体を水（３ｍＬ）で洗浄し、メタノール中の２％ギ酸４ｍＬで溶出させた。メタノール／ギ酸を窒素流下で除去して４．７ｍｇの生成物を得た。
【０２４９】
実施例８
ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（２９）（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）及びペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（３０）（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の合成
この例は、以下に例示されたスキームに示されているように、ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（２９）及びペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（３０）（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の合成を実証する。
【化４５】
2021522172.tif 000072
【０２５０】
スキーム４
この例は、以下の一般的で非限定的な工程：
ｉ）メシレート形成
ｉｉ）硫黄アルキル化
ｉｉｉ）ＮＨＳエステル形成
ｉｖ）ペプチド複合体化
ｖ）Ｂｏｃ脱保護
ｖｉ）還元的アミノ化
を使用して合成されたシステインリンカー及びデキサメタゾンを含むペプチド複合体を実証する。
【０２５１】
これらの工程は、スキーム４に示されており、以下でさらに詳細に記載されている。
ｉ）メシレート形成−Ｄｅｘメシレートの合成
手順：デキサメタゾン（４５５．６ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）を５ｍＬの無水ピリジンに溶解した。反応バイアルを氷浴中でセプタムで密封した。メタンスルホニルクロリド（１８０μＬ、２．３２ｍｍｏｌ）をシリンジを通してデキサメタゾンの溶液に滴下添加した。反応混合物を０℃で３０分間撹拌した。後処理：反応混合物を２５ｍＬの氷水に注ぎ、生成物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機部分を１ｍＬの０．１ＭのＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３、及びブラインによって洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。混合物を濾過して濾液を得、溶媒を減圧下で除去して生成物を定量的に得た。ＬＣ−ＭＳは、質量４７１．２（Ｍ＋１）で９０％を超える純度を示した。
ｉｉ）硫黄アルキル化−Ｄｅｘ−Ｂｏｃ−システインの合成
２ｍＬの無水ＤＭＦ中のＢｏｃ−Ｌ−システイン（２７８ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）及びＣｓ２ＣＯ３（４４３ｍｇ、１．３６ｍｍｏｌ）の撹拌混合物にメシル酸デキサメタゾン（５８．５ｍｇ、０．１２４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌した。固体を濾過によって除去し、溶液をＨＰＬＣによって精製して２７％の収率で２０ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、ＭＳ５７８．３（Ｍ−１７）で９９％の純度を示した。
ｉｉｉ）ＮＨＳエステル形成−Ｄｅｘ−Ｂｏｃ−システイン−ＮＨＳエステルの合成
１ｍＬの無水ＤＭＦ中のデキサメタゾン−Ｂｏｃ−システイン（９７．３ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（９３．４ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１４７ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣによって精製して４６％の収率で５１ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、ＭＳ７１５（Ｍ＋２３）で８２％の純度（１５％の出発酸）を示した。
ｉｖ）ペプチド複合体化−ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘの合成（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）
０．５ｍＬのＤＭＳＯ中のアミノ酸配列配列番号１０５を有するペプチド（２５ｍｇ、０．００５８２ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルモルホリン（６４０μＬ、１００倍希釈、０．０５８２ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に０．５ｍＬのＤＭＳＯ中のデキサメタゾン−Ｂｏｃ−システイン−ＮＨＳエステル（７．４ｍｇ、８２％の純度、０．００８７２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣによって精製して３９％の収率で１１ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、９６％の純度を示した。ＭＳ、１２２１．０（Ｍ／４）、１６２７．１（Ｍ／３）。
ｖ）Ｂｏｃ脱保護−ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（２９）の合成（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）
３０ｍＬの透明なガラスバイアル内のデキサメタゾン−Ｂｏｃ−システイン−ペプチド（配列番号１０５）（７３．５ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）（「システイン−ペプチド（配列番号１０５）」は配列番号５１２として開示されている）の白色の粉末に５００μＬのＴＦＡ（９９％の純度）を添加した。反応はＬＣ−ＭＳによって終了した。アセトニトリル及び水（１：１の比）４ｍＬを添加し、−７８℃で凍結させ、次いで凍結乾燥機内で乾燥させて７１．６ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、ＭＳ、１１９５．５（Ｍ／４）で９６％の純度を示した。
ｖｉ）還元的アミノ化−１４Ｃ標識複合体（３０）の合成（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）
１６ｍＬの水中のペプチド（配列番号１０５）−システイン−デキサメタゾン（３６ｍｇ、０．００７４２ｍｍｏｌ）（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の溶液に、２．３５ｍＬのＰＢＳ（１０倍）及び０．１５ｍＬの８％の１４Ｃ標識ホルムアルデヒド（８％水溶液）を放射性ヒュームフード内で添加した。ＮａＣＮＢＨ４（水）溶液（３ｍＬ中１８ｍｇ）を添加した。反応混合物をボルテックスし、およそ２０時間放置した。反応混合物を、予め３ｍＬのメタノールで活性化し、３ｍＬの水で平衡化したＳｔｒａｔａ−Ｘカラムに通した。吸着した複合体を水（３ｍＬ）で洗浄し、メタノール中の２％ギ酸４ｍＬで溶出させた。メタノール／ギ酸を窒素流下で除去して２０．３ｍｇの生成物を得た。
【０２５２】
実施例９
ペプチド（配列番号１０５）−グルタル酸−Ｄｅｘ（２３）の合成
この例は、以下に例示されたスキームに示されているように、ペプチド（配列番号１０５）−グルタル酸−Ｄｅｘ（２３）の合成を実証する。
【化４６】
2021522172.tif 000073
【０２５３】
スキーム５
この例は、以下の一般的で非限定的な工程：
ｉ）エステル結合形成
ｉｉ）ＮＨＳエステル形成
ｉｉｉ）ペプチド複合体化
を使用して合成されたグルタル酸リンカー及びデキサメタゾンを含むペプチド複合体を実証する。
【０２５４】
これらの工程は、スキーム５に示されており、以下でさらに詳細に記載されている。
ｉ）エステル結合形成−Ｄｅｘ−グルタル酸の合成
デキサメタゾン（１０７４．４ｍｇ、２．７３ｍｍｏｌ）、無水グルタル酸（３９３．１ｍｇ、３．２８ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（４００．７ｍｇ、３．２８ｍｍｏｌ）を無水アセトン２５ｍＬに溶解した（最初は完全に溶解しなかったが、１時間後に透明になった）。反応混合物を室温でおよそ２０時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。残渣をＨＰＬＣによって精製して５７％の収率で７８７ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、質量４８９．１（Ｍ−１７）で９９％を超える純度を示した。
ｉｉ）ＮＨＳエステル形成−Ｄｅｘ−グルタル酸ＮＨＳエステルの合成
１ｍＬのＤＭＦ中のデキサメタゾン−グルタル酸（６８ｍｇ、０．１３４ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（７７ｍｇ、０．４０３ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（７７ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温でおよそ２０時間撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣによって精製して４９％の収率で４０ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、質量５８４．２（Ｍ−１９）で９８％を超える純度を示した。
ｉｉｉ）ペプチド複合体化−ペプチド（配列番号１０５）−グルタル酸−Ｄｅｘ（２３）の合成
１ｍＬのＤＭＳＯ中のアミノ酸配列配列番号１０５を有するペプチド（２０ｍｇ、０．００４６ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルモルホリン（５２２μＬ、１００倍希釈、０．０４６ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に、デキサメタゾン−グルタル酸−ＮＨＳエステル（４．２ｍｇ、０．００７０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温でおよそ２０時間撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣによって精製して５８％の収率で１３ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、ＭＳ：１１９８．４（Ｍ／４）で９９％の純度を示した。
【０２５５】
この実施例で使用されたペプチドまたは本明細書に開示される別のペプチド、例えば、配列番号１０３または配列番号１８４または配列番号５０９に対する代替物が複合体化のためのペプチドとして使用される。デキサメタゾン、ブデソニド、トリアムシノロンアセトニド、または本明細書に開示される他のグルココルチコイドに対する代替物が複合体化のための活性剤として使用される。
【０２５６】
実施例１０
ペプチド（配列番号１０５）−３，３，−テトラメチレン−グルタル酸−Ｄｅｘ（２６）の合成
この例は、以下に例示されたスキームに示されているように、ペプチド（配列番号１０５）−３，３，−テトラメチレン−グルタル酸−Ｄｅｘ（２６）の合成を実証する。
【化４７】
2021522172.tif 000074
【０２５７】
スキーム６
この例は、以下の一般的で非限定的な工程：
ｉ）エステル結合形成
ｉｉ）ＮＨＳエステル形成
ｉｉｉ）ペプチド複合体化
を使用して合成された３，３−テトラメチレン−グルタル酸リンカー及びデキサメタゾンを含むペプチド複合体を実証する。
【０２５８】
これらの工程は、スキーム６に示されており、以下でさらに詳細に記載されている。
ｉ）エステル結合形成−Ｄｅｘ−３，３−テトラメチレン−グルタル酸の合成
デキサメタゾン（９０．５ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）、３，３−テトラメチレン−無水グルタル酸（７９ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（３３．７ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を無水アセトン５ｍＬに溶解した（最初は完全に溶解しなかったが、５分後に透明になった）。反応混合物を室温でおよそ２０時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。残渣をＨＰＬＣによって精製して７０％の収率で９０．４ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、質量５４３．３（Ｍ−１７）で９５％を超える純度を示した。
ｉｉ）ＮＨＳエステル形成−Ｄｅｘ−３，３−テトラメチレン−グルタル酸ＮＨＳエステルの合成
デキサメタゾン−３，３−テトラメチレン−グルタル酸（９０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（５１ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（５１ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に１ｍＬのＤＭＦを添加した。反応混合物を室温でおよそ２０時間撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣによって精製して７８％の収率で８２ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、質量６３８．２（Ｍ−１９）で９５％を超える純度を示した。
ｉｉｉ）ペプチド複合体化ペプチド（配列番号１０５）−３，３，−テトラメチレン−グルタル酸−Ｄｅｘ（２６）の合成
１ｍＬのＤＭＳＯ中のアミノ酸配列配列番号１０５を有するペプチド（１０ｍｇ、０．００２３２ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルモルホリン（２６１μＬ、１００倍希釈、０．０２３２）の撹拌混合物にデキサメタゾン−３，３−テトラメチレン−グルタレート−ＮＨＳエステル（３．２ｍｇ、９５％の純度、０．００４６４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温でおよそ２０時間撹拌した。
【０２５９】
ＬＣ−ＭＳは、ＴＩＣシグナルによって１／３のペプチド及び２／３の生成物を示した。Ｎ−メチルモルホリン（５４μＬ、１００倍希釈、０．００４８）及びデキサメタゾン−３，３−テトラメチレン−グルタレート−ＮＨＳエステル（３．２ｍｇ、９５％の純度、０．００４６４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温でおよそ２４時間（さらに一晩）撹拌した。
【０２６０】
反応混合物をＨＰＬＣによって精製して３４％の収率で３．８ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、ＭＳ：１２１２．０（Ｍ／４）で９６％の純度を示した。
【０２６１】
実施例１１
ペプチド（配列番号１０５）−グルタル酸−ＴＡＡ（３５）の合成
この例は、以下に例示されたスキームに示されているように、ペプチド（配列番号１０５）−グルタル酸−ＴＡＡ（３５）の合成を実証する。
【化４８】
2021522172.tif 000075
スキーム７
【０２６２】
この例は、以下の一般的で非限定的な工程：
ｉ）エステル結合形成
ｉｉ）ＮＨＳエステル形成
ｉｉｉ）ペプチド複合体化
を使用して合成されたグルタル酸リンカー及びトリアムシノロンアセトニドを含むペプチド複合体を実証する。
【０２６３】
これらの工程は、スキーム７に示されており、以下でさらに詳細に記載されている。
ｉ）エステル結合形成−ＴＡＡ−グルタル酸の合成
トリアムシノロンアセトニド（１２０．７ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、無水グルタル酸（３７．７ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（３８．２ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を無水アセトン４ｍＬに溶解した（最初は完全に溶解しなかったが、２時間後に透明になった）。反応混合物を室温でおよそ２０時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、１０％のトリアムシノロンアセトニド出発物質、６６％の生成物及び２３％の二量体ＴＡＡ−グルタル酸−ＴＡＡを示した。
無水グルタル酸（１０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（９ｍｇ、０．０７ｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温でおよそ２０時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。残渣をＨＰＬＣによって精製して３２％の収率で５０ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、質量５３１．２（Ｍ−１７）で９５％を超える純度を示した。
ｉｉ）ＮＨＳエステル形成−ＴＡＡ−グルタル酸ＮＨＳエステルの合成
１ｍＬのＤＭＦ中のトリアムシノロンアセトニド−グルタル酸（５０ｍｇ、０．０９１ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（２６ｍｇ、０．１３７ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１６ｍｇ、０．１３７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温でおよそ２０時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、半分の出発物質及び半分の生成物を示した。
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（３８ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（３４ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物をＨＰＬＣによって精製して９９％の収率で５２ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、質量６６８．２（Ｍ＋２３）で９８％を超える純度を示した。
ｉｉｉ）ペプチド複合体化−ペプチド（配列番号１０５）−グルタル酸−ＴＡＡ（３５）の合成
０．５ｍＬのＤＭＳＯ中のアミノ酸配列配列番号１０５を有するペプチド（５ｍｇ、０．００１１６ｍｍｏｌ）及びトリアムシノロンアセトニド−グルタル酸−ＮＨＳエステル（０．７６ｍｇ、０．００１１６ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に、トリエチルアミン（０．９４ｍｇ、１２９μＬ、ＤＭＳＯ中に１００倍希釈、０．００９２８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温でおよそ４８時間（２日間）撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣによって精製して１８％の収率で１ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、ＭＳ：１２０８．９（Ｍ／４）で９０％を超える純度を示した。
【０２６４】
実施例１２
ペプチド（配列番号５０９）−トランス−１，２−シクロヘキシル−ＴＡＡ（３１）の合成
この例は、以下に例示されたスキームに示されているように、ペプチド（配列番号５０９）−トランス−１，２−シクロヘキシル−ＴＡＡ（３１）の合成を実証する。
【化４９】
2021522172.tif 000076
【０２６５】
スキーム８
この例は、以下の一般的で非限定的な工程：
ｉ）エステル結合形成
ｉｉ）ＮＨＳエステル形成
ｉｉｉ）ペプチド複合体化
を使用して合成されたトランス−１，２−シクロヘキシルリンカー及びトリアムシノロンアセトニドを含むペプチド複合体を実証する。
【０２６６】
これらの工程は、スキーム８に示されており、以下でさらに詳細に記載されている。
ｉ）エステル結合形成−ＴＡＡ−トランス−１，２−シクロヘキサン−カルボン酸の合成
トリアムシノロンアセトニド（６５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、トランス−１，２−シクロヘキサン−ジカルボン酸無水物（３０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（２４ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を無水アセトン３ｍＬに溶解した（最初は完全に溶解しなかったが、２時間後に透明になった）。反応混合物を室温でおよそ２０時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。残渣をＨＰＬＣによって精製して６９％の収率で６０．４ｍｇの白色の粉末を得た（同じ質量で２つのピーク）。ＬＣ−ＭＳは、質量５７１．３（Ｍ−１７）で９０％を超える純度を示した。
ｉｉ）ＮＨＳエステル形成−ＴＡＡ−トランス−１，２−シクロヘキサン−カルボン酸ＮＨＳエステルの合成
１ｍＬのＤＭＦ中のトリアムシノロンアセトニド−トランス−１，２−シクロヘキサン−カルボン酸（３０．４ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（１９．５ｍｇ、０．１０２ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１１．７ｍｇ、０．１０２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温でおよそ２０時間撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣによって精製して７１％の収率で２４．７ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、質量７０８．３（Ｍ＋２３）で９８％を超える純度（２つのピーク）を示した。
ｉｉｉ）ペプチド複合体化−ペプチド（配列番号５０９）−トランス−１，２−シクロヘキシル−ＴＡＡ（３１）の合成
１ｍＬのＤＭＳＯ中のアミノ酸配列配列番号５０９を有するペプチド（５ｍｇ、０．００１１４ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルモルホリン（１２５μＬ、１００倍希釈、０．０１１４）の撹拌混合物に、トリアムシノロンアセトニド−トランス−１，２−シクロヘキサン−カルボン酸−ＮＨＳエステル（１．５６ｍｇ、０．００２２８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温でおよそ４８時間（２日間）撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣによって精製して２１％の収率で１．２ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、ＭＳ：１２３８．８（Ｍ／４）及び１６５１．６（Ｍ／３）で９８％を超える純度を示した。
【０２６７】
実施例１３
ペプチド（配列番号５０９）−１，３−シクロヘキシル−ＴＡＡ（３２）の合成
この例は、以下に例示されたスキームに示されているように、ペプチド（配列番号５０９）−１，３−シクロヘキシル−ＴＡＡ（３２）の合成を実証する。
【化５０】
2021522172.tif 000077
【０２６８】
スキーム９
この例は、以下の一般的で非限定的な工程：
ｉ）エステル結合形成
ｉｉ）ＮＨＳエステル形成
ｉｉｉ）ペプチド複合体化を
使用して合成された１，３−シクロヘキシルリンカー及びトリアムシノロンアセトニドを含むペプチド複合体を実証する。
【０２６９】
これらの工程は、スキーム９に示されており、以下でさらに詳細に記載されている。
ｉ）エステル結合形成−ＴＡＡ−１，３−シクロヘキサン−カルボン酸の合成
トリアムシノロンアセトニド（５６ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）、１，３−シクロヘキサン−ジカルボン酸（２９ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（３２ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（２１ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を無水アセトン４ｍＬに溶解した。反応混合物を室温でおよそ２０時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、１／３のトリアムシノロンアセトニド出発物質を示した。１，３−シクロヘキサンジカルボン酸（２０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（１９ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（１７ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を再度添加した。反応混合物を室温でおよそ２４時間撹拌した。
溶媒を減圧下で除去した。残渣をＨＰＬＣによって精製して４１％の収率で３１ｍｇの白色の粉末を得た（同じ質量で複数のピーク）。ＬＣ−ＭＳは、質量５７１．２（Ｍ−１７）で９０％を超える純度を示した。
ｉｉ）ＮＨＳエステル形成−ＴＡＡ−１，３−シクロヘキサン−カルボン酸ＮＨＳエステルの合成
１ｍＬのＤＭＦ中のトリアムシノロンアセトニド−１，３−シクロヘキサン−カルボン酸（２４ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（１５ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（９．５ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温でおよそ２０時間撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣによって精製して８０％の収率で２２．３ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、質量７０８．２（Ｍ＋２３）で９８％を超える純度（複数のピーク）を示した。
ｉｉｉ）ペプチド複合体化−ペプチド（配列番号５０９）−１，３−シクロヘキシル−ＴＡＡ（３２）の合成
１ｍＬのＤＭＳＯ中のアミノ酸配列配列番号５０９を有するペプチド（５ｍｇ、０．００１１６ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルモルホリン（１２５μＬ、１００倍希釈、０．０１１４）の撹拌混合物に、トリアムシノロンアセトニド−１，３−シクロヘキサン−カルボン酸−ＮＨＳエステル（１．５６ｍｇ、０．００２２８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温でおよそ４８時間（２日間）撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣによって精製して７１％の収率で４ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、ＭＳ：１２３９．１（Ｍ／４）及び１６５１．８（Ｍ／３）で９８％を超える純度を示した。
【０２７０】
実施例１４
ペプチド（配列番号５０９）−テレフタル酸−ＴＡＡ（３３）の合成
これは、以下に例示されたスキームに示されているように、ペプチド（配列番号５０９）−テレフタル酸−ＴＡＡ（３３）の合成を実証する。
【化５１】
2021522172.tif 000078
【０２７１】
スキーム１０
この例は、以下の一般的で非限定的な工程：
ｉ）エステル結合形成
ｉｉ）ＮＨＳエステル形成
ｉｉｉ）ペプチド複合体化
を使用して合成されたテレフタル酸リンカー及びトリアムシノロンアセトニドを含むペプチド複合体を実証する。
【０２７２】
これらの工程は、スキーム１０に示されており、以下でさらに詳細に記載されている。
ｉ）エステル結合形成−ＴＡＡ−テレフタル酸の合成
トリアムシノロンアセトニド（５５．２ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）、テレフタル酸（２７．４ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（３１．６ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（２０．２ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を無水アセトン４ｍＬに溶解した。反応混合物を室温でおよそ２０時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、主要なトリアムシノロンアセトニド出発物質を示した。１ｍＬのＤＭＦ及び１ｍＬのＤＭＳＯに溶解したテレフタル酸（４２ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（４９ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（３１ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）をさらに添加した。反応混合物を室温でおよそ２４時間撹拌した。
溶媒を減圧下で除去した。残渣をＨＰＬＣによって精製して１２％の収率で８．５ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、質量５８３．２（Ｍ＋１）で９０％を超える純度を示した。
ｉｉ）ＮＨＳエステル形成−ＴＡＡ−テレフタル酸ＮＨＳエステルの合成
１ｍＬのＤＭＦ中のトリアムシノロンアセトニド−テレフタル酸（８．５ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（５．６ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（３．４ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温でおよそ４８時間（２日間）撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣによって精製してＬＣ−ＭＳによる２７％の純度で１．３ｇの白色の粉末及び７０％の純度で０．４ｍｇを得た。６％の収率で合計０．６３ｍｇの生成物。ＬＣ−ＭＳは、質量６８０．２（Ｍ＋１）を示した。
ｉｉｉ）ペプチド複合体化−ペプチド（配列番号５０９）−テレフタル酸−ＴＡＡ（３３）の合成
１ｍＬのＤＭＳＯ中のアミノ酸配列配列番号５０９を有するペプチド（３ｍｇ、０．０００６９ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルモルホリン（２２６μＬ、１００倍希釈、０．０２１）の撹拌混合物に、トリアムシノロンアセトニド−テレフタル酸−ＮＨＳエステル（０．６３ｍｇ、０．００９３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温でおよそ２０時間撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣによって精製して５３％の収率で１．８ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、ＭＳ：１２３７．３（Ｍ／４）及び１６４９．３（Ｍ／３）で９８％を超える純度を示した。
【０２７３】
実施例１５
ペプチド（配列番号１０５）−２，３−ジメチル−コハク酸−ＢＵＤ（３７）の合成
これは、以下に例示されたスキームに示されているように、ペプチド（配列番号１０５）−２，３−ジメチル−コハク酸−ＢＵＤ（３７）の合成を実証する。
【化５２】
2021522172.tif 000079
【０２７４】
スキーム１１
この例は、以下の一般的で非限定的な工程：
ｉ）エステル結合形成
ｉｉ）ＮＨＳエステル形成
ｉｉｉ）ペプチド複合体化
を使用して合成された２，３−ジメチル−コハク酸リンカー及びブデソニドを含むペプチド複合体を実証する。
【０２７５】
これらの工程は、スキーム１１に示されており、以下でさらに詳細に記載されている。
ｉ）エステル結合形成−ＢＵＤ−２，３−ジメチル−コハク酸の合成
ブデソニド（４６．５ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）、２，３−ジメチル−コハク酸（２０．２ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２５ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（１６ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン２ｍＬに溶解した。反応混合物を室温でおよそ２０時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。残渣をＨＰＬＣによって精製して３３％の収率で１９．７ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、質量５５９．３（Ｍ＋１）で９５％を超える純度を示した。
ｉｉ）ＮＨＳエステル形成−ＢＵＤ−２，３−ジメチル−コハク酸ＮＨＳエステルの合成
１ｍＬのＤＭＦ中のブデソニド−２，３−ジメチル−コハク酸（３２ｍｇ、０．０５７ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（２７．４ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１６ｍｇ、０．１３７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温でおよそ５時間撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣによって精製して５１％の収率で１８．９ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、質量６７８．１（Ｍ＋２３）で９５％を超える純度を示した。
ｉｉｉ）ペプチド複合体化−ペプチド（配列番号１０５）−２，３−ジメチル−コハク酸−ＢＵＤ（３７）の合成
１ｍＬのＤＭＳＯ中のアミノ酸配列配列番号１０５を有するペプチド（５ｍｇ、０．００１１６ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルモルホリン（１３１μＬ、１００倍希釈、０．０２３）の撹拌混合物に、ブデソニド−２，３−ジメチル−コハク酸ＮＨＳエステル（１．６ｍｇ、９５％の純度、０．００２３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温でおよそ２０時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＴＩＣシグナルによって８０％の未反応ペプチド及び２０％の生成物を示した。Ｎ−メチルモルホリン（１３１μＬ、１００倍希釈、０．０２３）及びブデソニド−２，３−ジメチル−コハク酸ＮＨＳエステル（２ｍｇ、９５％の純度、０．００２９ｍｍｏｌ）をさらに添加した。反応混合物を室温でさらに２４時間撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣによって精製して５０％の収率で１．８ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、ＭＳ：１２１１．８（Ｍ／４）で９０％を超える純度を示した。
【０２７６】
実施例１６
ペプチド（配列番号１０５）−コハク酸−Ｄｅｘ（３９）の合成
これは、以下に例示されたスキームに示されているように、ペプチド（配列番号１０５）−コハク酸−Ｄｅｘ（３９）の合成を実証する。
【化５３】
2021522172.tif 000080
【０２７７】
スキーム１２
この例は、以下の一般的で非限定的な工程：
ｉ）エステル結合形成
ｉｉ）ＮＨＳエステル形成
ｉｉｉ）ペプチド複合体化
を使用して合成されたコハク酸リンカー及びデキサメタゾンを含むペプチド複合体を実証する。
【０２７８】
これらの工程は、スキーム１２に示されており、以下でさらに詳細に記載されている。
ｉ）エステル結合形成−Ｄｅｘ−コハク酸の合成
デキサメタゾン（５０ｍｇ、０．１２７ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（１５ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（１９ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）を２ｍＬの無水アセトンに溶解した。反応混合物を室温でおよそ９６時間（４日間）撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。残渣をＨＰＬＣによって精製して７６％の収率で４８ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、質量４７３．１（Ｍ−１９）で９８％を超える純度を示した。
ｉｉ）ＮＨＳエステル形成−Ｄｅｘ−コハク酸ＮＨＳエステルの合成
Ｄｅｘ−コハク酸（４８ｍｇ、０．０９７５ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（６０ｍｇ、０．３１２ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（３６ｍｇ、０．３１２ｍｍｏｌ）を２ｍＬの無水ＤＭＳＯに溶解した。反応混合物を室温で２日間（４８時間）撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣによって精製して５４％の収率で３１．１ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、質量５９０．２で９８％を超える純度を示した。
ｉｉｉ）ペプチド複合体化−ペプチド（配列番号１０５）−コハク酸−Ｄｅｘ（３９）の合成
１ｍＬの無水ＤＭＳＯ中のアミノ酸配列配列番号１０５を有するペプチド（１０ｍｇ、０．００２３３ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルモルホリン（３１２μＬ、１００倍希釈、０．０２８４ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に、Ｄｅｘ−コハク酸ＮＨＳエステル（４．５ｍｇ、９９％の純度、０．００７６９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温でおよそ２０時間撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣ（２０分で１０から５０）によって精製して２９％の収率で３．２ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、ＭＳ：１１９５．０（Ｍ／４）、１５９２．２（Ｍ／３）で９８％を超える純度を示した。
【０２７９】
実施例１７
ペプチド（配列番号１０５）−アジピン酸−Ｄｅｘ（２４）の合成
これは、以下に例示されたスキームに示されているように、ペプチド（配列番号１０５）−アジピン酸−Ｄｅｘ（２４）の合成を実証する。
【化５４】
2021522172.tif 000081
【０２８０】
スキーム１３
この例は、以下の一般的で非限定的な工程：
ｉ）エステル結合形成
ｉｉ）ＮＨＳエステル形成
ｉｉｉ）ペプチド複合体化
を使用して合成されたアジピン酸リンカー及びデキサメタゾンを含むペプチド複合体を実証する。
【０２８１】
これらの工程は、スキーム１３に示されており、以下でさらに詳細に記載されている。
ｉ）エステル結合形成−Ｄｅｘ−アジピン酸の合成
デキサメタゾン（２５０ｍｇ、０．６３７ｍｍｏｌ）、アジピン酸（１１２ｍｇ、０．７６４ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（１４７ｍｇ、０．７６４ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（９３ｍｇ、０．７６４ｍｍｏｌ）を９ｍＬの無水アセトン及び１ｍＬの無水ＤＭＳＯに溶解した。反応混合物を室温でおよそ２０時間撹拌した。アセトンを減圧下で除去した。残渣をＨＰＬＣによって精製して２９％の収率で９８ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、質量５０３．１（Ｍ−１８）で９８％を超える純度を示した。
ｉｉ）ＮＨＳエステル形成−Ｄｅｘ−アジピン酸ＮＨＳエステルの合成
Ｄｅｘ−アジピン酸−カルボン酸（９８ｍｇ、０．１８８ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（８６ｍｇ、０．４５０ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（５２ｍｇ、０．４５０ｍｍｏｌ）を２ｍＬの無水ＤＭＳＯに溶解した。反応混合物を室温で２日間（４８時間）撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣによって精製して１１７ｍｇの白色の粉末を定量的に得た。ＬＣ−ＭＳは、質量６４０．２（Ｍ−２２）で９８％を超える純度を示した。
ｉｉｉ）ペプチド複合体化−ペプチド（配列番号１０５）−アジピン酸−Ｄｅｘ（２４）の合成
１ｍＬの無水ＤＭＳＯ中のアミノ酸配列配列番号１０５を有するペプチド（１０ｍｇ、０．００２３３ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルモルホリン（１００倍希釈、３１４μＬ、０．０２８６ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に、Ｄｅｘ−アジピン酸ＮＨＳエステル（２．６ｍｇ、９９％の純度、０．００４２１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で２日間（４８時間）撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣ（２０分で１０から５０）によって精製して４１％の収率で４．６ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、ＭＳ：１２０２．２（Ｍ／４）、１６０１．７（Ｍ／３）で９８％を超える純度を示した。
【０２８２】
実施例１８
ペプチド（配列番号１０５）−トランス−１，４−シクロヘキシル−Ｄｅｘ（２５）の合成
これは、以下に例示されたスキームに示されているように、ペプチド（配列番号１０５）−トランス−１，４−シクロヘキシル−Ｄｅｘ（２５）の合成を実証する。
【化５５】
2021522172.tif 000082
【０２８３】
スキーム１４
この例は、以下の一般的で非限定的な工程：
ｉ）エステル結合形成
ｉｉ）ＮＨＳエステル形成
ｉｉｉ）ペプチド複合体化
を使用して合成されたトランス−１，４−シクロヘキシルリンカー及びデキサメタゾンを含むペプチド複合体を実証する。
【０２８４】
これらの工程は、スキーム１４に示されており、以下でさらに詳細に記載されている。
ｉ）エステル結合形成−Ｄｅｘ−トランス−１，４−シクロヘキシル−カルボン酸の合成
デキサメタゾン（５００ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ）、トランス−１，４−シクロヘキサンジカルボン酸（２４１ｍｇ、１．４０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２６９ｍｇ、１．４０ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（１７１ｍｇ、１．４０ｍｍｏｌ）を３５ｍＬの無水アセトンに溶解した。反応混合物を室温で４日間（９６時間）撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。残渣をＨＰＬＣによって精製して９％の収率で６３ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、質量５２７．２（Ｍ−１９）で９８％を超える純度を示した。
ｉｉ）Ｉｉ）ＮＨＳエステル形成−Ｄｅｘ−トランス−１，４−シクロヘキシルＮＨＳエステルの合成
Ｄｅｘ−トランス−１，４−シクロヘキシル−カルボン酸（６３ｍｇ、０．１１５ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（２６．６ｍｇ、０．１３９ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１６ｍｇ、０．１３９ｍｍｏｌ）を１ｍＬの無水ＤＭＳＯに溶解した。反応混合物を室温でおよそ５時間撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣによって精製して７７％の収率で５７．１ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、質量６４４．２で９８％を超える純度を示した。
ｉｉｉ）ペプチド複合体化−ペプチド（配列番号１０５）−トランス−１，４−シクロヘキシル−Ｄｅｘ（２５）の合成
１．５ｍＬの無水ＤＭＳＯ中のアミノ酸配列配列番号１０５を有するペプチド（２０ｍｇ、０．００４６５ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルモルホリン（４．０μＬ、０．００３６３ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に、Ｄｅｘ−トランス−１，４−シクロヘキシルＮＨＳエステル（７．８ｍｇ、９９％の純度、０．０１２１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で２日間（４８時間）撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣ（２０分で１０から５０）によって精製して６７％の収率で１５．０ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、ＭＳ：１２０８．４（Ｍ／４）、１６１０．８（Ｍ／３）で９８％を超える純度を示した。
【０２８５】
この実施例で使用されたペプチドまたは本明細書に開示される別のペプチド、例えば、配列番号１０３または配列番号１８４または配列番号５０９に対する代替物が複合体化のためのペプチドとして使用される。デキサメタゾン、ブデソニド、トリアムシノロンアセトニド、または本明細書に開示される他のグルココルチコイドに対する代替物が複合体化のための活性剤として使用される。
【０２８６】
実施例１９
追加の複合体の合成
この例は、本開示の任意のペプチドまたは薬物に複合体化した環状基を有する追加のエステルリンカーを組み込んだ追加の複合体の非限定的な例を示す。
【化５６】
2021522172.tif 000083
【化５７】
2021522172.tif 000084
【０２８７】
この実施例で使用されたペプチドまたは本明細書に開示される別のペプチド、例えば、配列番号１０５、配列番号５０９、配列番号１０３、または配列番号１８４に対する代替物が複合体化のためのペプチドとして使用される。デキサメタゾン、ブデソニド、トリアムシノロンアセトニド、デス−シクレソニドまたは本明細書に開示される他のグルココルチコイドに対する代替物が複合体化のための活性剤として使用される。
【０２８８】
実施例２０
加水分解アッセイ
この例は、ＰＢＳ、ラット血漿、及びヒト血漿中での本開示のペプチド−薬物複合体（ＰＤＣ）の加水分解半減期及び／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性を決定するための加水分解アッセイを実証する。
【０２８９】
一般手順
凍結乾燥され、精製されたペプチド−薬物複合体を２０ｍｇ／ｍＬでストック溶液を生成するために製造後にＤＭＳＯ中で再構成した。各複合体ストックを、３連で各加水分解条件（１倍のＤＰＢＳ、ヒト血漿及びラット血漿）で０．２５ｍｇ／ｍＬとし、３７℃で揺動させた。
【０２９０】
遊離デキサメタゾン（Ｄｅｘ）を定量化するために、１００μｌの加水分解した複合体溶液を４℃で１ｍＬのアセトニトリルに移し、その時点ですべての血漿タンパク質及び無傷の複合体が沈殿した。これを繰り返して実施して一連の時点（０時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、２４時間、３２時間）を生成した。コルチコステロイドトリアムシノロンアセトニド（２５μｌ、４５：５５のＡＣＮ：クエン酸塩中０．１ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＭ、ｐＨ５．５）を内部標準としてアセトニトリル溶液に補填した。アセトニトリル溶液を１７，０００ｇで５分間回転させ、上清を除去し、９６ウェルブロックに添加した。ペレットを５００μｌのアセトニトリルに再懸濁し、前述のように再ペレット化した。上清を除去し、ブロック内の同じウェルに添加した。
【０２９１】
サンプルを、窒素流下で乾燥させ、続いて１１０μｌの４５：５５のＡＣＮ：クエン酸塩１０ｍＭ  ｐＨ５．５中で再構成することによって分析用に調製した。最適な回収を確実にするために、ブロックを再構成工程中に７，０００ｒｐｍで５分間プレート振盪器により振盪した。ＬＣ／ＭＳの前に、サンプルを９６ウェルプレートに移し、６，５００ｇで１５分間遠心分離した。分析は、ＩｎｆｉｎｉｔｙＬａｂ  Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  ＳＢ−Ｃ１８カラムでアセトニトリル（溶媒Ｂ）中０．１％のＴＦＡの勾配、及び０．１％ＴＦＡ（水溶液）（溶媒Ａ）勾配（以下に示す）を使用してインライン６１２０シングルクワッドＭＳを有するＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＩｎｆｉｎｉｔｙシリーズＨＰＬＣで実施した。遊離デキサメタゾンの定量化は、ＴＩＣのデキサメタゾン及びトリアムシノロンアセトニドのピークの統合により達成された。アセトニトリル（ＡＣＮ）：Ｐ．Ｎ．ＨＢ９８１３４。
【０２９２】
ＬＣ／ＭＳシステム：インライン６１２０シングルクワッドＭＳを有するＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＩｎｆｉｎｉｔｙシリーズＨＰＬＣ。
【０２９３】
カラム：ＩｎｆｉｎｉｔｙＬａｂ  Ｐｏｒｏｃｈｅｌｌ  １２０  ＳＢ−Ｃ１８  Ｐ．Ｎ．６８７９７５−９０２．
【０２９４】
【表３】
2021522172.tif 000085
【０２９５】
加水分解の結果
複合体を、ＰＢＳ、ラット血漿、またはヒト血漿に希釈し、３７度でインキュベートした。サンプルを指定された時点で採取し、ＴＡＡを内部標準として添加し、次いでＤｅｘ／ＴＡＡをアセトニトリルを使用して抽出した。サンプルを乾燥させ、再構成し、ＬＣ／ＭＳによって分析した。データをＤｅｘ  ＡＵＣ／ＴＡＡ  ＡＵＣを使用して正規化した。加水分解率を３２時間でのＤｅｘ  ＡＵＣ／ＴＡＡ  ＡＵＣについての平均比を使用して、最大薬物放出についての値として計算した。加水分解の測定結果は、図２Ａ〜図２Ｅ及び以下の表に示されている。この方法は、遊離の改変されていないデキサメタゾンの放出速度を測定する。それは、化学的加水分解によってもしくは血漿エステラーゼなどによる酵素的加水分解によってまたは他の手段によって放出され得る。他のプロテアーゼまたは分解生成物などの、活性を有し得る他の分子の存在の可能性は評価しなかった。
【０２９６】
結果は、複合体間及び異なる流体における可変する放出速度を示しており、より速いまたはより遅い放出速度を有する複合体が、活性剤または画像化剤の意図される結果のための所望の薬物動態プロファイルに応じて使用され得ることを示している。
【表４】
2021522172.tif 000086
【０２９７】
実施例２１
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験
この例は、１４Ｃ−Ｃｙｓ−デキサメタゾン（または１４Ｃ−ｃｙｓ−Ｄｅｘ）及びペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−デキサメタゾン（またはペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）のｉｎ  ｖｉｖｏ試験及び比較を実証する。
【０２９８】
プロトコル
コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）モデル
９週齢の雌のＬｅｗｉｓラット（ＥｎｖｉｇｏまたはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において０日目に４００ｕｇのウシＩＩ型コラーゲン（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ  Ｉｎｃ，Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＷＡ）を２回連続の２００ｕｌ（１ｍｇ／ｍｌ）の用量で麻酔中に皮内注射によって関節炎を誘発させた。コラーゲンを、滅菌水中の０．０１Ｎ氷酢酸に２ｍｇ／ｍｌで溶解し、４℃で一晩揺動させ、次いでフロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）中で乳化することによって注射用に調製する。乳化するため、等しい体積のコラーゲン溶液及びＩＦＡを、３方向の栓によって結合された別々のシリンジに吸引する。氷上で、２つのシリンジの間で１０分間急速に押圧することによってコラーゲン及びＩＦＡを混合する。少量の混合物を水に滴下することによって１０分間混合した後に乳化の質を試験する。適切に乳化された溶液は、離散した液滴として残存し、水中に分散しない。７日目に、ラットを、新たに調製されたＩＦＡ溶液１００ｕｌ中に１００ｕｇのコラーゲン、すなわち、１ｍｇ／ｍｌのコラーゲンの２回目の皮内注射で負荷する。体重及び足首直径の測定結果を７日目から試験終了まで毎日記録する。足首直径をＦｏｗｌｅｒ  Ｄｉｇｉｔｒｉｘ２マイクロメーターを使用して１人の研究者によって測定した。各足首の３つの測定結果を、軽度の麻酔をかけたラットの足根における横方向の寸法から取得した。報告された足首直径の測定結果は、３つの測定結果の平均である。
【０２９９】
ラットＣＩＡ生体内分布試験
関節炎の関節におけるＣＤＰ（シスチン高密度ペプチド）及びＣＤＰ−ステロイド複合体の蓄積を定量化するために、記載したように雌のラットに関節炎を誘発させた。１４Ｃ−ｃｙｓ−デキサメタゾン及びペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（３０）（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）（実施例８で調製された放射性標識された複合体）を最初のコラーゲン播種の後に１２日目に投与した。１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）（実施例３に従って放射性標識した）を、第１コホートについて１２日目に観察されたものと等しい足首における浮腫を認めたときに第２のコホートのラットに１４日目に投与した。５０ｕＣｉ、すなわち、４００ｎｍｏｌの各化合物を、尾静脈を通して静脈内（ＩＶ）に投与し、１時間、３時間、または２４時間循環させた。ラットをＣＯ２窒息によって安楽死させ、剃毛し、ドライアイスで冷やしたヘキサン中で凍結させた。ＱＷＢＡを記載されているように実施し、定量化した。
【０３００】
ＣＩＡ反応試験１
９週齢の雌のＬｅｗｉｓラットの４つのコホートにおいて関節炎を記載されているように誘発させた。ラットを、コホート間で化合物群と用量群とのバランスをとりながら、処置群に無作為に配置した。ペプチド−デキサメタゾン複合体または遊離デキサメタゾンを、２〜４匹のラットにそれぞれ５１０ｎｍｏｌ／ｋｇで投与した（記載されたすべての用量は、投与されたデキサメタゾンの質量に基づき、用量は、ペプチドの質量もリンカーの質量も含まない）。１１日目及び１２日目にラットに尾静脈注射によって投薬し、１３日目にＣＯ２窒息によって安楽死させた。呼吸運動の停止直後に、血液を心臓穿刺によって採取し、滑液を両膝から採取し、一方の後肢をホルマリン中に固定し、他方の足首をドライアイスで凍結した。胸腺、脾臓、肝臓、及び腎臓の重量を記録した。
【０３０１】
マウスにおける生体内分布
ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ（３８、実施例７で調製された放射性標識された複合体）（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）または１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡを水中５％ＤＭＳＯに再懸濁した。溶液１μｌ当たりの放射能量を液体シンチレーション計数（ＬＳＣ）を使用して測定した。各化合物を１２．４μＣｉ（１００ｎｍｏｌ）の用量でマウスに静脈内投与し、指定された時間間隔で循環させた。次いでマウスを人道的に安楽死させ、死骸をドライアイスで冷やしたヘキサン中で凍結させた。ＱＷＢＡを記載されているように実施し、定量化した。
【０３０２】
ＱＷＢＡ
凍結した死骸を、−２０℃で一晩、気体ヘキサンを除去し、次いで冷やした２％カルボキシメチルセルロース（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）内に埋め込み、Ｈ／Ｉ  Ｂｒｉｇｈｔ  ８２５０  Ｃｒｙｏｓｔａｔ（Ｈａｃｋｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で４０μｍの厚さで矢状に切断した。放射性コントロールガイドを各ブロックに穿孔して、切片の長さに沿う均一な切断深さを検証した。放射性ガイドは、ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）中の０．５ｕＣｉ／ｍｌの１４Ｃ−グリシン（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，「ＡＲＣ」）からなっていた。切片を４インチ幅のテープ（Ｓｃｏｔｃｈ８２１、ＵＬＩＮＥ）上に２〜４の深さで収集して、特に膝及び脊椎に焦点を当てておよそ３０個の組織をサンプリングした。採取した切片をクライオスタットで４８〜７２時間凍結乾燥させ、次いで頑丈な紙の上に載せ、セロファン（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  Ｆｏｏｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｆｉｌｍ）の単一保護層で覆った。載せた切片を、放射性標準曲線（１４６Ｓ−ＰＬ、ＡＲＣ）と共に蛍光体撮像プレート（Ｒａｙｔｅｓｔ）に７日間曝露し、Ｒａｙｔｅｓｔ  ＣＲ−３５で「２５μｍの感度」の設定でスキャンした。
【０３０３】
ＱＷＢＡデータ分析
ＷＢＡサンプルにおいて検出された放射能の定量化は、ＡＩＤＡ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ｖ５．１  Ｗｈｏｌｅ  Ｂｏｄｙ  Ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌソフトウェア（Ｒａｙｔｅｓｔ）を使用してピクセル密度／ｍｍ２（「ＳＩ」：シグナル強度／面積−バックグラウンド）を測定することによって評価した。切断したサンプルをオートラジオグラムに対して比較して、対象となる領域（ＲＯＩ）を可視組織全体の周りに手動で描いた。定量化のために、収集したすべての切片にわたって１匹のげっ歯類についてのすべての視認可能な膝またはＩＶＤ（椎間板）組織を測定し、一緒に平均化して動物１匹当たり１つの膝またはＩＶＤ値を生成した。典型的には、動物１匹あたり１〜２つの切片当たり１〜２つの膝の値（大腿骨及び脛骨の軟骨に由来する）、及び動物１匹当たり１〜２つの切片当たり３〜１０個のＩＶＤをサンプリングした。他の組織についての定量値を収集するために、組織が観察され、次いで平均化されて動物１匹当たり１つの組織当たり１つの値を生成したすべての切片における心臓の心室、棘突起筋、肝臓、または腎臓（皮質及び髄質を含む）中の血液の周りにＲＯＩを描いた。
【０３０４】
データは、組織１グラム当たりの化合物のｎｍｏｌとして示した。液体シンチレーション計数（ＬＳＣ）によって決定された組織１グラム当たりの１分間当たりの放射性カウント（ＣＰＭ）の既知の量が、１１個の標準ストリップ濃度データポイントで測定されたＷＢＡ  ＳＩに対応するように、各ＷＢＡサンプルセットと共曝露された市販の標準ストリップを校正した。ｌｏｇ１０変換されたＣＰＭ／ｇに対してプロットされたｌｏｇ１０変換されたＷＢＡシグナル強度の回帰直線により、６．３ｎＣｉ／ｇ〜３．３μＣｉ／ｇに対応する、１×１０５〜７．５×１０７ＷＢＡ  ＳＩの線形範囲が得られた。各組織における放射能のｌｏｇ１０濃度（ＣＰＭ／ｇ）を標準曲線から補間し、線形値に変換し、ＬＳＣ  ＣＰＭに対してμＣｉ標準曲線に補間することによってＣＰＭ／ｇからｕＣｉ／ｇに転換した。取り込み（化合物ｎｍｏｌ／組織ｇ）は、μＣｉ／ｇ組織をペプチドのμＣｉ／ｎｍｏｌ比活性で除算することによって決定した。
結果
マウスにおける生体内分布試験で安定なペプチド−ＴＡＡ複合体
【表５】
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【０３０５】
配列番号１０５に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを、システイン残基を含む安定なリンカーを使用してＴＡＡに複合体化した。システインリンカーを還元的メチル化を使用して放射性標識した。次いでペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−ＴＡＡ複合体（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の生体内分布を、全身オートラジオグラフィを使用してマウスで評価した。システインリンカーもＴＡＡに複合体化し、ＴＡＡの生体内分布を同様の手法で評価できるように放射性標識した。結果は、図３及び図４に示されている。ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）シグナルは、３時間及び２４時間の両方でこれらの切片において膝の軟骨、肋骨軟骨、椎間板（ＩＶＤ）、及び気管で視覚的に明らかであった（それぞれ放射性標識されたペプチドについての図３Ａ及び図３Ｂ及び対照としての放射性標識された薬物についての図３Ｃ及び図３Ｄ）。軟骨では１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡについての観察可能なシグナルはなかったが、椎骨及び長骨の骨髄では明らかなシグナルがあった（図３Ｃ及び図３Ｄ）。シグナルの定量化は、１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡと比較して、軟骨においておよそ１２倍高いレベルのペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−ＴＡＡ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）を実証した。このことは、活性剤ＴＡＡをペプチドに複合体化することが、ＴＡＡをマウスの軟骨に標的化し得る一方で、ペプチドを有さないＴＡＡの投与は、関節への送達の最小の標的化をもたらすことを示している（３時間については図４Ａ及び２４時間の時点については図４Ｂを参照されたい）。
関節炎を有するラットにおける生体内分布試験で安定なペプチド−Ｄｅｘ複合体
【表６】
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【０３０６】
ペプチド（配列番号１０５）を、システイン残基を含む安定なリンカーを使用してデキサメタゾンに複合体化した。システインリンカーを還元的メチル化を使用して放射性標識した。次いでペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ複合体（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の生体内分布を、全身オートラジオグラフィを使用して関節炎を有するラットで評価した。システインリンカーもデキサメタゾンに複合体化し、デキサメタゾンの生体内分布を同様の手法で評価できるように放射性標識した。関節炎ラットにおけるペプチド（配列番号１０５）の生体内分布を同じ実験で評価した。ペプチドを還元的メチル化を使用してＮ末端で放射性標識した。図５は、試験の全ての群における足首直径（ｍｍ）の増加を示しており、関節炎が誘発されたことを確認している。これらのデータ及び図６から、膝、肩、臀部、足首、肋骨軟骨、及び椎間板を含む、すべての時点において、１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５、図６Ａ及び図６Ｂ）またはペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）（図６Ｃ及び図６Ｄ）を摂取したラットの軟骨においてシグナルが検出され得る。１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（図６Ｅ及び図６Ｆ）を摂取したラットの軟骨における視覚的に検出可能なシグナルはなかった。１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘで処置されたラットにおいて、関節で明らかであったシグナルは、骨髄に局在化し、軟骨はシグナルを概ね欠いていた。ＱＷＢＡの結果は、図７〜図８に示されている。このことは、活性剤デキサメタゾンをペプチドに複合体化することが、関節炎を有するラットの軟骨にデキサメタゾンを標的化し得る一方で、ペプチドを有さないデキサメタゾンの投与は、関節への送達の標的化が最小となることを示している。
【０３０７】
追加の実験では、軟骨蓄積の評価のための主要な組織としての膝を、視覚的比較（図７）及び定量化（図８）の両方によって検査した。ＩＶＤを、すべての切片において容易に定量化可能な追加の軟骨性組織として使用した（図８）。複合体１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）及びペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）は、３つすべての時点（１時間（図８Ａ）、３時間（図８Ｂ）、及び２４時間（図８Ｃ）で軟骨において検出された；しかしながら、１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘについては、骨髄では視認可能であるものの、軟骨ではいずれの時点でもシグナルが最小であった。３時間では、１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）及びペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の両方についての平均濃度は、膝の軟骨ではおよそ２５μｇ相当量ペプチド／組織１ｇ（５〜６μＭのペプチド（配列番号１０５）またはペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている））であり、ＩＶＤの軟骨ではそれぞれおよそ１４〜１６μｇ相当量ペプチド／組織１ｇ（２〜３μＭの１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）またはペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）であった。代謝及び排泄の部位である可能性が高い肝臓及び腎臓を除き、身体のほとんどの他の組織において１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）及びペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の蓄積は最小であった（図９）。１４Ｃ−Ｃｙｓ−Ｄｅｘは、試験された時点においていずれの組織でも有意なレベルで検出されなかった（図９Ａ−図９Ｃ）。
【０３０８】
データは、ペプチド（配列番号１０５）及び複合体のペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の両方が、罹患した関節の軟骨において高レベルで蓄積し、残存する一方で、Ｄｅｘ単独は、試験されたいずれの時点でもこれらの関節において検出されず、本開示のペプチドが軟骨組織への薬物分子の効率的な送達が可能であることを実証していることを確認する。
【０３０９】
機能性試験における不安定なリンカーを有するペプチド−Ｄｅｘ複合体
ＣＩＡ反応試験設計。以下の表７における投薬（Ｄｅｘ、ｍｇ／ｋｇ）は、動物に投薬されたデキサメタゾンの量（ペプチドの重量もリンカーの重量も除く）に基づいて表示されている。
【表７】
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【０３１０】
試験の目的は、次のもの：疾患モデルにおける機能性及び潜在的治療効果を示すために関節に十分なデキサメタゾンを送達する能力を評価するためにＣＩＡラットにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの２つの異なる用量で様々なリンカーを有する４つの複合体を試験することであった。
【０３１１】
データ収集：生存段階：体重、足首直径
【０３１２】
安楽死：胸腺、脾臓、肝臓、腎臓の重量、血液（ＣＢＣ、化学的性質、凍結血漿）、滑液を両膝から採取し、一方の後肢をホルマリン中で固定し、片方の足首をドライアイスで凍結した。関節における機能性及び潜在的治療効果；動物モデルにおける疾患進行に対する複合体の効果。図１０は、足首直径の測定結果（ミリメートル）及び処置中の変化を示している。
【０３１３】
ビヒクルで処置された動物は、１１〜１３日目に足首直径の増加を示し、関節における関節炎の炎症及び腫れを示している。４つすべての複合体のいずれかを０．２ｍｇ／ｋｇで処置した動物は、ビヒクルと比べて足首直径の測定結果の減少を示した。このことは、４つすべての複合体が、関節内の疾患症状を減少させるのに十分なデキサメタゾンを送達することができたことを示している。
【０３１４】
ペプチド間の関節保持時間の比較
ペプチド（配列番号１０５）を５７〜６０ｎｍｏｌで投薬した。ペプチド（配列番号１０３）を１３０ｎｍｏｌで投薬した。ペプチド（配列番号１８４）を１５０ｎｍｏｌで投薬した。後者の２つのペプチドでは、試験した投薬レジメンでより長い関節保持が観察された。保持の検出は、試験された複合体の各々のＮ末端の放射性標識を検出するアッセイに基づいており、よって、経時的なシグナルの減少は、軟骨の外に戻るペプチドの拡散だけでなく、アミノペプチダーゼが媒介するＮ末端アミノ酸の除去、通常のペプチド切断、または他のメカニズムに起因し得ることが留意されるべきである。本明細書に記載のＱＷＢＡ法によって測定された結果は、以下の表６及び７ならびに図１１に示されている。
【表８】
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【表９】
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【０３１５】
実施例２２
グルココルチコイド曝露用の全身マーカーの測定
この例は、処置された正常ラットにおけるグルココルチコイド曝露のための、及び疾患進行の様々な段階における未処置ＣＩＡラットにおける比較のための全身マーカーの測定を示す（図１２）。
【０３１６】
正常ラットにおける全身性デキサメタゾン曝露のマーカーを評価するために、試験のための薬物投与をシミュレートするための時点を選択した（例えば、１０日目及び１１日目に投薬し、１２日目に安楽死させるか、または１１日目〜１４日目に投薬し、１４日目に安楽死させる）。全身性デキサメタゾンに対するベースライン反応を確立するために、正常な雌のＬｅｗｉｓラットにビヒクルまたは１ｍｇ／ｋｇ／日のデキサメタゾンリン酸エステルナトリウム（「ＤｅｘＳＰ」と省略され、図１２に「Ｄｅｘ」として示されている）を２日間または４日間投与した。ラットを２回目の投薬から２４時間後、または４回目の投薬から５時間後に安楽死させた。体重を毎日測定した。安楽死時、肝臓、脾臓、胸腺、及び腎臓の重量を記録し、ＣＢＣ及び血清化学分析のために血液を採取した。ＣＩＡモデルを確立するために、雌のＬｅｗｉｓラットに０日目にウシコラーゲンＩＩの皮内注射を播種し、７日目に負荷用量を投与した。足首及び膝の関節の直径を毎日測定した。ラットを１０日目、１２日目及び１４日目に安楽死させ、その時点で、肝臓、脾臓、胸腺、及び腎臓の重量を記録し、全血球計算（ＣＢＣ）／血液化学分析のために血液を採取した。足首の腫れは視覚的に明らかであり、ラットは疾患の誘発と一致した歩行の変化を有していた；しかしながら、関節の腫れの測定結果は、高い変動性のため、決定的ではなかった。
【０３１７】
図１２Ａ及び図１２Ｂは、胸腺及び脾臓の重量がそれぞれ、デキサメタゾンへの全身性曝露の安定なマーカーとなることが判明したことを示している。両器官の重量は、試験したすべての時点において、ビヒクル処置した正常ラット及びＣＩＡラットと比較して、デキサメタゾン処置群の両方で有意に減少した。体重は、ビヒクル及びＣＩＡラットと比較して、デキサメタゾン処置で減少したが、身体質量への影響は、給餌の変化から分離されなかった。
【０３１８】
図１２Ｃ及び図１２Ｄは、総白血球数（ＷＢＣ）及び絶対リンパ球数がそれぞれ、全身性デキサメタゾン曝露を評価するために使用され得る追加の測定であったことを示している。これらのパラメータは、様々な時点でビヒクル及びＣＩＡラットと比較して、２日間及び４日間投薬されたデキサメタゾンに反応していずれも低下した。赤血球（ＲＢＣ）数、ヘマトクリット数、好中球数、単球数、好酸球数に有意な変化はなかった。４つの用量のデキサメタゾンを摂取した５匹のラットのうち４匹で有核赤血球が検出された。
【０３１９】
血液化学スクリーンは、すべての時点でビヒクル処置及びＣＩＡと比較して、デキサメタゾン処置に反応してＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）酵素の有意な変化を実証した（図１２Ｅ）。デキサメタゾンに反応して他の肝臓酵素に有意な変化がなかったことは注目に値する。これは、ＡＬＴ及びＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）の両方のレベルの増加につながる可能性が高い肝細胞に対する毒性作用ではなく、糖新生のためにＡＬＴを増加させるための転写レベルでの薬物の効果を示し得る。
【０３２０】
このデータは、疾患の予防及び／または治療のために本明細書に記載のペプチド−薬物複合体を利用する方法において特に有用であり得るグルココルチコイドへの全身性曝露の影響を評価する場合に分析するために、脾臓及び胸腺重量ならびにリンパ球数、総ＷＢＣ数、及びＡＬＴ／ＡＳＴレベルが有用なマーカーであり得ることを実証する。
【０３２１】
実施例２３
Ｉｎ  ｖｉｖｏ用量範囲試験
この例は、関節における炎症を減少させた各ペプチド−薬物複合体の用量を同定するために、及びＤｅｘ曝露の全身マーカー（例えば、総体重、胸腺重量、脾臓重量など）に対する作用を測定するためにＣＩＡラットで行われた用量範囲試験を示している。総白血球（ＷＢＣ）数、総リンパ球数、及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルも分析したが、その理由は、これらが正常ラットにおける我々の事前試験においてＤｅｘへの全身性曝露のマーカーとして同定されたからである。
【０３２２】
雌のＬｅｗｉｓラットにおいてＣＩＡを誘発させた（上述したように、実施例２１を参照されたい）。体重及び足首関節の直径を０日目に測定し、次いで７日目から安楽死まで毎日測定した。ラットを、コホートにわたって化合物群及び用量群のバランスをとりながら、無作為に処置群に割り当て、１１日目及び１２日目にＤｅｘまたはＤｅｘ相当量のボーラスで次のようにすべてを処置した：ペプチド−薬物複合体または遊離Ｄｅｘを１１日目及び１２日目の両日に０．２、０．５、または１ｍｇ／ｋｇでＤｅｘ当量体を静脈内投与し、１３日目にラットを安楽死させた（すべての投薬は、投薬されたＤｅｘの質量に基づいて記載されており、リンカーの質量もペプチドの質量も含まない）。安楽死時に、滑液を両膝から採取し、一方の後肢をホルマリン中に固定し、他方の足首をドライアイスで凍結した。胸腺、脾臓、肝臓、及び腎臓の重量を記録した。血液サンプルをＣＢＣ／化学分析に供し、残りの血漿を凍結した。１ｍｇ／ｋｇのペプチド（配列番号１０５）−グルタル酸−Ｄｅｘ（「グルタル酸」と表記される）、ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（「ジメチルアジピン酸」と表記される）、及びペプチド（配列番号１０５）−［シクロヘキシル−（Ｎ−４−アミノメチル−トランス−１−カルバモイル）］−Ｄｅｘ（「カルバメート」表記される）が投薬されたいくつかのラットは、未知の原因により一晩で死亡し、他のいくつかは、昏睡及び麻酔からの長期化した回復を示し、そのようなものとして、残りの処置群を、コホートにわたって無作為に割り当て、化合物と用量のバランスをとって０．２及び０．５ｍｇ／ｋｇの用量レベルで再分配した。
【０３２３】
最終的な動物数は以下のとおりであった：ペプチド−薬物複合体１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝２（１，４−シクロヘキシル）、ｎ＝１（カルバメート）、ｎ＝２（グルタル酸）、及びｎ＝１（ジメチルアジピン酸））；ペプチド−薬物複合体０．５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３）；ペプチド−薬物複合体０．２ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝４）；Ｄｅｘ１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝２）；Ｄｅｘ０．５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝２）；Ｄｅｘ０．２ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝４）；ビヒクル（ｎ＝５）（その後、１３日目に安楽死させた）。
【０３２４】
このデータ（図１３）は、この試験で試験された４つすべてのペプチド−薬物複合体（ペプチド（配列番号１０５）−グルタル酸−Ｄｅｘ、ペプチド（配列番号１０５）−トランス−１，４−シクロヘキシル−Ｄｅｘ、ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ、及びペプチド（配列番号１０５）−［シクロヘキシル−（Ｎ−４−アミノメチル−トランス−１−カルバモイル）］−Ｄｅｘ）が、０．２ｍｇ／ｋｇ及び０．５ｍｇ／ｋｇの両方の用量レベルでビヒクルと比較して経時的に足首の腫れの減少を引き起こしたことを実証する（図１３Ａ）。１１日目と１３日目との間の足首直径の中央値の変化の比較は、試験された４つのペプチド−薬物複合体のうち３つ：ペプチド（配列番号１０５）−グルタル酸−Ｄｅｘ、ペプチド（配列番号１０５）−トランス−１，４−シクロヘキシル−Ｄｅｘ、及びペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘについて０．２ｍｇ／ｋｇの用量でビヒクルと比較して足首直径の統計的に有意な減少を実証した（図１３Ｂ）。足首直径の変化は、遊離Ｄｅｘまたは試験された残りのペプチド−薬物複合体：ペプチド（配列番号１０５）−［シクロヘキシル−（Ｎ−４−アミノメチル−トランス−１−カルバモイル）］−Ｄｅｘについては０．２ｍｇ／ｋｇの用量で統計的な有意性に至らなかった。この０．２ｍｇ／ｋｇ用量でのＤｅｘと４つのペプチド−薬物複合体であるペプチド（配列番号１０５）−グルタル酸−Ｄｅｘ、ペプチド（配列番号１０５）−トランス−１，４−シクロヘキシル−Ｄｅｘ、ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ、及びペプチド（配列番号１０５）−［シクロヘキシル−（Ｎ−４−アミノメチル−トランス−１−カルバモイル）］−Ｄｅｘのいずれかとの間に統計的に有意な差はなかった。０．５ｍｇ／ｋｇ用量群では、動物数が少ないため、足首直径の変化に対する統計分析は実施しなかった。その上、ペプチド（配列番号１０５）−グルタル酸−Ｄｅｘ、ペプチド（配列番号１０５）−トランス−１，４−シクロヘキシル−Ｄｅｘ、ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ及び遊離Ｄｅｘの群はすべて、０．２ｍｇ／ｋｇ及び０．５ｍｇ／ｋｇの両方の用量で総体重（図１３Ｃ）、胸腺重量（図１３Ｄ）、及び脾臓重量（図１３Ｅ）の減少を示した。胸腺重量の減少は、０．２ｍｇ／ｋｇ用量群においてビヒクルと比較してペプチド（配列番号１０５）−グルタル酸−Ｄｅｘ、ペプチド（配列番号１０５）−トランス−１，４−シクロヘキシル−Ｄｅｘ、及び遊離Ｄｅｘについて統計的に有意であった。体重及び脾臓重量の減少は、このような傾向であったが、おそらく試験した動物のコホートが少ないため、ビヒクルと比較して統計的な有意性に至らなかった。全体として、０．２ｍｇ／ｋｇのペプチド（配列番号１０５）−［シクロヘキシル−（Ｎ−４−アミノメチル−トランス−１−カルバモイル）］−Ｄｅｘで処置された動物は、他のＰＤＣ候補のいずれかまたはＤｅｘ単独と比較して、総体重及び組織重量をより良好に保持するようであった（図１３Ｃ〜図１３Ｅ）。
【０３２５】
まとめると、この初期投薬試験は、ＣＩＡのラットモデルにおいて試験された４つすべてのＰＤＣである（ペプチド（配列番号１０５）−グルタル酸−Ｄｅｘ、ペプチド（配列番号１０５）−トランス−１，４−シクロヘキシル−Ｄｅｘ、ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ、及びペプチド（配列番号１０５）−［シクロヘキシル−（Ｎ−４−アミノメチル−トランス−１−カルバモイル）］−Ｄｅｘ）による足首の炎症の減少を実証した。カルバメートリンカーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験では安定していたが、おそらく疾患に影響を及ぼすのに十分な活性Ｄｅｘを放出した。このデータは、本明細書に記載のペプチド−薬物複合体が、対象となる組織（例えば、関節における軟骨）に治療的に関連する薬物濃度を提供することが可能であることを実証する。
【０３２６】
実施例２４
ペプチド−薬物複合体の薬物単独との薬物動態比較
この例は、アミノ酸配列が、ジメチルアジピン酸（ＤＭＡ）リンカーを介してＤｅｘに複合体化した配列番号１０５に示されるペプチドを含むペプチド−薬物複合体、及びＤｅｘ単独の薬物動態（ＰＫ）プロファイルを評価する比較試験を実証する（図１４）。
【０３２７】
このＰＫ試験は、罹患していない１０週齢の雌のＬｅｗｉｓラットにおいて、ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘの静脈内投与後の血漿中のＤｅｘ濃度を測定し、プロファイルをＤｅｘＳＰ（Ｄｅｘの水溶性ＩＶ製剤であるデキサメタゾンリン酸エステルナトリウム）のものと比較することを第１の目的として行った。デキサメタゾン単独は、低い水溶解性を有する。ＤｅｘＳＰは、水溶解性がより高く、デキサメタゾンの非経口投薬に使用した。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＤｅｘＳＰは、迅速に加水分解して活性分子デキサメタゾンになる。第２の目的は、膝関節における遊離Ｄｅｘレベルを測定することであった。
【０３２８】
ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ＤｅｘまたはＤｅｘＳＰを０．２ｍｇ／ｋｇの用量（投薬されたＤｅｘのみの質量を指し、ペプチドの質量もリンカーの質量も含まない）で投与し、遊離Ｄｅｘの濃度を９つの時点（１５分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間）で１つの時点当たり４匹のラットについて血漿及び膝関節中で定量化した（図１４）。すべてのサンプルは安楽死時に採取した。血漿サンプルから遊離Ｄｅｘを抽出し、ＬＣ／ＭＳによって定量化した。アッセイは、０．４ｎｇ／ｍｌの定量下限（ＬＬＯＱ）及び４００ｎｇ／ｍｌの定量上限（ＵＬＯＱ）を有していた。ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘで処置したラットの血漿中の総Ｄｅｘ濃度（ｉｎ  ｖｉｖｏで放出された遊離Ｄｅｘ＋無傷のペプチド−薬物複合体に関連するＤｅｘ）を測定するために、別の血漿サンプルを強制加水分解に供し、続いて遊離Ｄｅｘを抽出した。デキサメタゾンの抽出は、血漿サンプルからのアセトニトリル沈殿よって達成された。強制加水分解プロトコルは、血漿に１０Ｕのブタエステラーゼを添加すること及び３７℃で２２時間インキュベートすることを含んでいた。総白血球数、絶対リンパ球数、ならびに胸腺及び脾臓の重量を測定して、Ｄｅｘ曝露の全身マーカーを時間経過とともに評価した。
【０３２９】
膝関節中の遊離Ｄｅｘの濃度を定量化するために、膝関節を採取し、関節包を開き、次いで膝関節を酢酸エチル中で４℃で１２時間振盪した。抽出物を遠心分離し、上清を窒素下で９６ウェルプレート内で乾燥させた。次いでサンプルを再構成し、血漿中の遊離Ｄｅｘを定量化するために開発された同じプロトコルを使用してＬＣ／ＭＳによって分析した。ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ及びＤｅｘＳＰの投与後の血漿中の遊離Ｄｅｘレベルの分析は、Ｄｅｘに複合体化したペプチドの形態で等しい用量を投与した場合、Ｄｅｘ単独としての投与に対して、Ｄｅｘへの曝露の減少を実証した。ＤｅｘＳＰの投与により、２２４ｎｇ／ｍｌのＣｍａｘに３０分で到達し、それは２．９９時間の半減期で経時的に着実に減少した（図１４Ａ）及び表（１４）。ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘを用いると、遊離ＤｅｘについてのＣｍａｘは６時間まで遅くなり、それは７１ｎｇ／ｍＬにすぎず、血漿中で経時的に徐々に加水分解するＤＭＡリンカーと一貫している。次いで遊離Ｄｅｘレベルは、ＤｅｘＳＰを用いた場合よりも徐々に時間とともに減少したが、排出半減期は、利用可能な時点の数では決定することができなかった。総曝露（ＡＵＣ）は、（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ対ＤｅｘＳＰ（７００対１０６０時＊ｎｇ／ｍｌ）で減少した（図１４Ａ、表１４）。
【表１４】
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血漿中に存在する総Ｄｅｘ（ｉｎ  ｖｉｖｏでの加水分解によって放出された遊離Ｄｅｘ＋無傷のペプチド−薬物複合体に存在するＤｅｘ）を測定するために、ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ血漿サンプルに対して強制加水分解分析を実施した。Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、及びＡＵＣは、ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘでの処置後の総ＤｅｘについてはＤｅｘＳＰに対して非常に類似しており、等しい用量のＤｅｘが投与されたこと、及び類似するレベルのＤｅｘが、両方の処置で関節への送達のためのシステムで利用可能であることを示している。ｔ１／２は、Ｄｅｘ投薬群と比較して、ペプチド群では総Ｄｅｘについてはわずかに長かった（それぞれ３．９３対２．９９時間）（図１４Ｂ、表１４）。
【０３３０】
各時点での無傷のペプチド−薬物複合体濃度の間接的推定は、総Ｄｅｘ濃度（強制加水分解からのもの）から遊離Ｄｅｘ濃度（直接抽出からのもの）を差し引くことによって行われ得る。この分析は、投薬直後において無傷のペプチド−Ｄｅｘ複合体のピーク濃度が総Ｄｅｘのものと類似していたが、ＤｅｘＳＰのものよりも速い速度で減少したことを実証した（図１４Ｃ）。無傷のペプチド−薬物複合体は、６時間後に検出可能とならず、無傷のペプチド−薬物複合体の見かけのｔ１／２は、およそ１．５時間であった。Ｄｅｘへの全身性曝露を複数のパラメータ：総白血球（ＷＢＣ）数；絶対リンパ球数；胸腺重量；及び脾臓重量によって評価した（図１５）。興味深いことに、ペプチドで処置された動物の血漿中の遊離Ｄｅｘの有意に低いレベルにもかかわらず、Ｄｅｘへの全身性曝露の測定は、両方の処置群における動物間でいくつかの類似性を有していた（図１５）。ＣＢＣデータは、ＤｅｘＳＰに対して、ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘに対するＷＢＣ（図１５Ａ）及びリンパ球（図１５Ｂ）反応の遅延を示し得るが、Ｄｅｘとペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘとの間の統計的に有意な差を有する時点は、血球数がＤｅｘＳＰと比較してペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ群においてより高い２時間の時点、及びリンパ球数がＤｅｘＳＰと比較してペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ群においてより低い１２時間の時点だけである（図１５Ａ及び図１５Ｂ）。胸腺重量（図１５Ｃ）及び脾臓（図１５Ｄ）重量は、いずれの時点でもＤｅｘＳＰとペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘとの間で有意に異なっておらず、これらの器官は、血漿ＷＢＣ数が正常に戻った２４時間でサイズの減少を保持していた（図１５Ｃ及び図１５Ｄ）。
【０３３１】
ＬＣ／ＭＳデータを含むデータは、ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ処置群において、最初の６時間にわたってＤｅｘＳＰと比較して血漿遊離Ｄｅｘレベルにおける実質的な差を実証するが、ＣＢＣ及び組織重量データは、両方の処置群において類似性を有しており、リンパ球再分布に対するＤｅｘの効果は、循環中の遊離Ｄｅｘの非常に低い濃度で飽和可能であり得ることを示唆している。
【０３３２】
実施例２５
ＣＩＡラットにおけるペプチド−薬物複合体のｉｎ  ｖｉｖｏ薬力学的反応
この例は、ラットＣＩＡモデルにおけるペプチド−薬物複合体の効果を評価する試験を実証する。この研究の一部では、ペプチド−カルバメート及びペプチド−ＤＭＡ複合体を単回用量レベルで試験した。第２の試験では、ペプチド−ＤＭＡ複合体を様々な用量で試験した。すべての用量は、Ｄｅｘ相当量として記述されているので、ペプチドのためのペプチドの質量もＤｅｘ  ＳＰのためのリン酸基の質量も組み込まれていない。
【０３３３】
ペプチド（配列番号１０５）−カルバメート−Ｄｅｘ及びペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ比較試験
事前ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ試験に基づいて、複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（２７）及びペプチド（配列番号１０５）−カルバメート−Ｄｅｘ（２８）（図１６Ａに示された構造）をＣＩＡラットにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでさらに調べた（図１６）。
【０３３４】
以下に取り組むためにＣＩＡラットにおいて試験を行った：１）０．２ｍｇ／ｋｇでのペプチド（配列番号１０５）−カルバメート−Ｄｅｘについての同じ用量でのＤｅｘ単独と比較した機能性及び効果の持続時間；２）０．０５ｍｇ／ｋｇでのペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘについての同じ用量でのＤｅｘ単独と比較した機能性及び効果の持続時間；３）各ＰＤＣ及びＤｅｘでそれらのそれぞれの用量で処置されたラットにおけるＤｅｘ曝露の全身マーカー（図１６Ｂ〜図１６Ｇ）。
【０３３５】
実施例２１で上述したようにＣＩＡを誘発させた。ラットを少なくとも一方の足首における関節炎の発症後に試験に登録し、１群当たり５匹のラットを有する５つの処置群（ビヒクル；ペプチド−カルバメート０．２ｍｇ／ｋｇ；Ｄｅｘ０．２ｍｇ／ｋｇ；ペプチド−ＤＭＡ複合体０．０５ｍｇ／ｋｇ；Ｄｅｘ０．０５ｍｇ／ｋｇ）のうちの１つに無作為に割り当てた。試験０日目及び試験１日目に処置を投与し、試験７日目にラットを安楽死させた。このコホートにおける主要な読み出しは、機能性及び効果の持続時間の指標としての、処置中または処置後の足首直径の変化であった。機能性試験のための登録が完了したら、Ｄｅｘ曝露の全身マーカーを評価するために、１群当たり３匹のラットを有する同じ５つの処置群に残りのラットを無作為に割り当てた。このコホートにおける１２匹のラットは関節炎を発症したのに対し、３匹は登録時では疾患を発症していなかった。試験０日目及び１日目に処置を投与し、最後の投薬から２４時間後にラットを安楽死させた。このコホートのための主要な読み出しは、胸腺重量、脾臓重量、総白血球数、リンパ球数、及び体重の変化を含む、Ｄｅｘへの全身性曝露の測定であった。
【０３３６】
０．２ｍｇ／ｋｇでのペプチド−カルバメート−Ｄｅｘは、ビヒクル処置と比較して、ＣＩＡラットにおける足首炎症に対する有意な効果はないことを実証した。等しい用量でのデキサメタゾンは、足首直径をベースラインレベルまで減少させるのに非常に有効であった（図１６Ｂ）。ペプチド（配列番号１０５）−カルバメート−Ｄｅｘは、ビヒクルと比べて、胸腺重量の統計的に有意な減少を引き起こしたが、脾臓重量に対する有意な効果を有さなかった；一方で、同様の用量でのＤｅｘは、胸腺及び脾臓重量の両方で有意な減少を有していた（図１６Ｃ〜図１６Ｄ）。ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘは、ビヒクルと比較して、足首直径の有意な減少を引き起こした。効果の大きさ及び持続時間は、同一用量で投与されたペプチド−ＤＭＡ−複合体とＤｅｘとの間で区別できなかった。（図１６Ｅ）。Ｄｅｘ曝露の全身マーカーの検査は、ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ及びＤｅｘが、ビヒクルと比較して、０．０５ｍｇ／ｇの用量で胸腺及び脾臓重量の同様の有意な減少を引き起こしたことを実証した（図１６Ｆ及び図１６Ｇ）。処置群間での総ＷＢＣ数、リンパ球数、または体重の変化における差はより有意ではなかった。
【０３３７】
このデータは、本開示のペプチド−薬物複合体（例えば、ペプチド−ＤＭＡ−Ｄｅｘ複合体）が、ＣＩＡモデルにおける関節炎症の用量依存的減少を提供することを実証する。
【０３３８】
ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ用量範囲試験
ＤｅｘＳＰと比較して、関節炎の関節及び全身性Ｄｅｘ曝露に対するペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘの効果を漸増するために、ＣＩＡラットにおいて用量範囲試験を行った（図１７）。
【０３３９】
実施例２１で上述したように雌のＬｅｗｉｓラットにおいてＣＩＡを誘発させた。足首直径の測定結果を、誘発９日目に開始して毎日記録し、試験の継続期間中継続した。ラットを少なくとも一方の足首における関節炎の発症後に試験に登録し、１０個の処置群（ビヒクル；ＤｅｘＳＰ０．００１ｍｇ／ｋｇ；ＤｅｘＳＰ０．００５ｍｇ／ｋｇ；ＤｅｘＳＰ０．０１ｍｇ／ｋｇ；ＤｅｘＳＰ０．０５ｍｇ／ｋｇ；ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ０．００１ｍｇ／ｋｇ；ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ０．００５ｍｇ／ｋｇ；ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ０．０１ｍｇ／ｋｇ；ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ０．０５ｍｇ／ｋｇ；組換え的に生成されたペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ０．０５ｍｇ／ｋｇ）のうちの１つに無作為に割り当てた。この試験は、実施例２に記載されているように、配列番号１０５に示されるアミノ酸配列を有する合成的に生成したペプチド、及び組換え的に生成したペプチド−ＤＭＡ−Ｄｅｘ複合体（「ｒＰＤＣ」と表記される）を使用し、その組換え的に生成したペプチド−ＤＭＡ−Ｄｅｘ複合体は、組換え的に生成され、かつ合成的に生成したペプチド及び組換え的に生成したペプチドが同等のｉｎ  ｖｉｖｏ挙動を示すことを確認するために対照として含まれていたＰＤＣを指す。登録日（試験０日目）に各処置を投与し、７日間（試験６日目）毎日繰り返した。最終投薬から３時間後にラットを安楽死させ、血液及び器官を試験のために採取した。
【０３４０】
ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ及びＤｅｘＳＰはいずれとも、０．０５ｍｇ／ｋｇの最高用量で足首炎症を減少させるのに有効であることが判明したが、より少ない用量ではビヒクルと区別できなかった（図１７Ａ〜図１７Ｃ）。試験６日目対０日目の足首直径を比較すると、ＤｅｘＳＰ０．０５ｍｇ／ｋｇのみがビヒクルと統計的に異なることが判明した。ＤｅｘＳＰは、合成ペプチド−ＤＭＡ複合体と統計的に異なる（ｐ＝０．０４５２）が、０．０５ｍｇ／ｋｇでは組換えバージョンである組換え的に生成したペプチド−ＤＭＡ複合体（「ｒＰＤＣ」と表記される、ｐ＝０．１５３８）はそうではないことが判明した。この用量では、合成ペプチドと組換えペプチドとの間に有意な差はなかった。
【０３４１】
Ｄｅｘへの全身性曝露は、胸腺、脾臓、副腎の重量、ならびに体重の変化及び処置群間のリンパ球数の変化を測定することによって評価した（図１８）。ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（ＰＤＣ）及びＤｅｘは、多数のこれらのパラメータに影響を及ぼしたが、それらの用量反応プロファイルには差があった。０．０５ｍｇ／ｋｇの最高用量では、胸腺重量（図１８Ａ）、脾臓重量（図１８Ｂ）、及び血漿リンパ球数（図１８Ｃ）は、ＤｅｘＳＰについてのビヒクル、ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ、及び組換え的に生成されたペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘ（「ｒＰＤＣ」と表記される）と比較して有意に減少したことが判明した（図１８Ａ〜図１８Ｃ）。しかしながら、脾臓重量及び血漿リンパ球数は、この用量レベルではＤｅｘＳＰと比較してＰＤＣ処置群で有意に高く（図１８Ｂ及び図１８Ｃ）、ペプチド−Ｄｅｘ複合体を摂取した動物における全身性Ｄｅｘ曝露のＤｅｘ単独に対する減少を示している。胸腺重量に関してペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ＤｅｘとＤｅｘＳＰとの間の差はより有意ではなかった（図１８Ａ）。また、いずれの処置においても、ビヒクルと比較して副腎重量における差はより有意ではなかった（図１８Ｄ）。
【０３４２】
ラットの全般的健康状態もモニターした。全体として、ラットは、総体重に有意な変化がなく、処置に良好に忍容し（図１８Ｅ）、存在する場合は、血清化学パラメータに軽度の変化が観察されただけであった。要約すると、本明細書に開示されるペプチド−ＤＭＡ−Ｄｅｘ複合体を使用したＤｅｘの送達は、関節炎モデルにおける足首の腫れを再現的に減少させながら、Ｄｅｘへの全身性曝露の減少及び遅延を実証した。血漿中のペプチド−ＤＭＡ−薬物の薬物動態プロファイルは、ＤＭＡリンカーがＤｅｘＳＰの投与と比較して遊離Ｄｅｘへの全身性曝露を減少させるように機能していることを実証する。よって、本明細書に記載のペプチド−薬物複合体は、薬物単独の投与と比較して、治療的及び潜在的な安全性上の利益を提供する。
【０３４３】
実施例２６
ｉｎ  ｖｉｖｏでのペプチドの生体内分布及び薬物動態
この例は、配列番号１０５、配列番号１０３、及び配列番号１８４に示されるアミノ酸配列をそれぞれ含むペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの生体内分布及び薬物動態を示している。
【０３４４】
そのために、１４Ｃ−標識ペプチドである１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）、１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０３）、及び１４Ｃ−ペプチド（配列番号１８４）の膝（図１９Ａ及び図１９Ｂ）及び椎間板（ＩＶＤ、図１９Ｃ及び図１９Ｄ）への生体内分布薬物動態をマウスにおいて評価した（図１９）。組織レベルは、Ｎ末端の還元的メチル化によって放射性標識されたペプチドの全身オートラジオグラフィによって定量化した。１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０５）及び１４Ｃ−ペプチド（配列番号１０３）はいずれとも、膝及びＩＶＤにおいておよそ１〜３時間でピークに達した一方で、１４Ｃ−ペプチド（配列番号１８４）は、より遅く８時間でピークに達した。２４時間後、すべてのペプチドは、両組織において緩やかに減少するプラトーを有し、ペプチド（配列番号１０３）及びペプチド（配列番号１８４）は、ペプチド（配列番号１０５）よりも実質的に高いレベルで検出された。すべてのペプチドは依然として、９６時間の最後の時点で観察可能なシグナルを有していた。結果は、膝及びＩＶＤにおいて９６時間を通して３つすべてのペプチドの持続的なレベルを示しているが、ペプチド（配列番号１０５）よりもペプチド（配列番号１０３）及びペプチド（配列番号１８４）から軟骨においてより高い持続的シグナルを示し、ペプチド（配列番号１０５）及びペプチド（配列番号１０３）よりもペプチド（配列番号１８４）の方がより遅いｔｍａｘを示している。ペプチドレベルは、ペプチドのＮ末端に結合された放射性標識に基づいているので、経時的なシグナルの減少は、ペプチドのＮ末端上のアミノペプチダーゼ活性（これは、薬物リンカーがＮ末端に結合されているＰＤＣ複合体では関係ないであろう）に起因し得るか、軟骨の外に戻るペプチドの拡散に起因し得るか、または通常のペプチド主鎖切断に起因し得る。例えば、軟骨におけるペプチドのより高い持続レベルは、薬物切断が、より遅い薬物動態を有する場合、及び反復投薬を使用する際にペプチド−薬物複合体が軟骨におけるペプチド結合部位を飽和させていない場合に所望であり得る。別の例として、血清中の複合体化薬物の早期切断を最小化するために、軟骨におけるより早いｔｍａｘが所望であり得る。
【０３４５】
このデータは、ペプチドであるペプチド（配列番号１０５）、ペプチド（配列番号１０３）、及びペプチド（配列番号１０３）が、全身投与後に膝及びＩＶＤに生体内分布し得、数日間保持され得ることを実証するよって、本明細書に記載のペプチドは、標的部位（例えば、膝、足首などの軟骨）における薬物レベルを増加させ、かつ治療的介入中に薬物の全身レベルを減少させるために、ペプチド−薬物複合体で使用され得る。
【０３４６】
実施例２７
ペプチド−Ｄｅｘ複合体を使用した膝及び足首関節における軟骨へのデキサメタゾンの送達
この例は、システインリンカーを介してＤｅｘに連結した配列番号１０５に示されるアミノ酸配列を含むペプチドを含むペプチド−Ｄｅｘ複合体、すなわち、ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）を使用した膝及び足首関節における軟骨へのデキサメタゾンの送達を実証する。
【０３４７】
定量的全身オートラジオグラフィ（ＱＷＢＡ）を先の実施例において使用して、安定なリンカーを有するペプチド−Ｄｅｘ複合体（例えば、ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている））が、ペプチド（配列番号１０５）と同様の様式で身体全体を通して関節の軟骨に分布すること、及びペプチド（Ｃｙｓ−Ｄｅｘ）を有さない安定なリンカーに複合体化されたＤｅｘが軟骨において最小の蓄積を有することを実証した（例えば、実施例２１を参照されたい）。ＱＷＢＡは、ペプチドまたは薬物を直接検出するのではなく、放射性標識の検出に依存しているので、これらの結果を確認するために直交アッセイを開発した。ウサギポリクローナル抗ペプチド（配列番号１０５）抗体及び市販の抗Ｄｅｘ抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ３５０００）を使用して関節の軟骨におけるペプチド（配列番号１０５）及びデキサメタゾンを検出するために免疫組織化学法を開発した。抗ペプチド（配列番号１０５）ポリクローナル抗体を生成するために、投薬された物質の免疫原性を増大させる標準的な免疫化方法を使用したが、これは未改変ペプチドまたは治療候補分子の潜在的な免疫原性を代表するものではない。ペプチド（配列番号１０５）抗体の生成のための免疫原を生成するために、ＩｍｊｅｃｔＴＭｍｃＫＬＨを使用してペプチド（配列番号１０５）をキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に複合体化した。ペプチド（配列番号１０５）−ＫＬＨを、フロイントの完全アジュバントで乳化した他のＫＬＨ複合体化ペプチドのプールの一部として投与し、標準的なスケジュールに従ってニュージーランド白ウサギに投与した。ポリクローナル抗体をＨｉＴｒａｐ（登録商標）ｍＡｂ  Ｓｅｌｅｃｔカートリッジ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して血清から精製した。ウェスタンブロットを使用してペプチドとの抗体結合を確認した。
【０３４８】
免疫組織化学のための組織を提供するために、４つの処置（ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（ｎ＝３）（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）；Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（ｎ＝３）；ペプチド（配列番号１０５）（ｎ＝２）；またはビヒクル（ｎ＝２））のうち１つを１００ｎｍｏｌの用量でＣ５７／Ｂｌ６マウスに静脈内投与し、安楽死前の３時間循環させた。後肢を採取し、ホルマリン中で固定し、脱石灰化し、切片化してから、抗ペプチド（配列番号１０５）抗体、抗Ｄｅｘ抗体、トルイジンブルー、またはＨ＆Ｅのいずれかで染色した。
【０３４９】
抗ペプチド（配列番号１０５）抗体での免疫染色は、ペプチド（配列番号１０５）（図２０Ａ）またはペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）（図２０Ｇ）のいずれかで処置されたマウスからの膝関節切片の関節軟骨及び成長板において強い陽性染色を実証した。しかしながら、Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（図２０Ｄ）またはビヒクル（図２０Ｊ）で処置されたマウスの軟骨における染色は最小であった。抗Ｄｅｘ抗体でのＩＨＣは、ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）（図２０Ｈ）で処置されたマウスの関節及び成長板軟骨における強い陽性染色を実証したが、任意の他の処置群（例えば、図２０Ｂ、図２０Ｅ、図２０Ｋ）では最小の軟骨染色を実証した。軟骨中のプロテオグリカンを染色するトルイジンブルー染色は、すべての処置群からの膝切片に同様のプロテオグリカン含有量があることを実証した。足首の切片でも同様の染色パターンが観察された。膝及び足首の切片の両方おいて、ｐｅｐ−ｃｙｓ−Ｄｅｘの投与後の抗ＤｅｘのＩＨＣ染色によって関節軟骨及び成長板軟骨に強い染色がある。染色は、細胞外マトリックス全体に拡散し、軟骨細胞を取り囲む裂孔まで広がっている。骨髄、腱、ならびに骨細胞及び軟骨細胞では細胞内にいくらかのシグナルがある。Ｃｙｓ−Ｄｅｘで処置したマウスからの膝切片では、軟骨の細胞外マトリックスにはシグナルがないが、骨髄、腱、骨細胞及び軟骨細胞にはシグナルがある。染色の分布は、Ｃｙｓ−Ｄｅｘ処置マウス及び未処置マウスからの膝切片の間で同様である。このことは、ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ複合体（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）が、ペプチド（配列番号１０５）及びＤｅｘの両方を関節における軟骨に送達している一方で、Ｃｙｓ−Ｄｅｘの投与は、軟骨におけるＤｅｘの最小レベルをもたらしたことの確認を提供する。
【０３５０】
抗ペプチド（配列番号１０５）及び抗Ｄｅｘ抗体での染色は、軟骨に限定されなかった。抗ペプチド（配列番号１０５）抗体染色は、すべての処置群において顕著な骨髄シグナルをもたらした；しかしながら、ペプチド（配列番号１０５）またはペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）で処置された切片では、Ｄｅｘまたはビヒクル処置と比較して、シグナルがより強く出現した。抗Ｄｅｘ抗体染色は、ペプチド（配列番号１０５）、Ｄｅｘ、またはビヒクルで処置された動物からの切片において弱〜中程度の骨髄シグナルを実証したが、ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）で処置された動物からの切片においてより強い染色を実証した。一般に、両方の抗体で染色されたペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）で処置された切片及び抗ペプチド（配列番号１０５）−Ａｂで染色されたペプチド（配列番号１０５）で処置された切片は、他の処置群と比較して、腱／靭帯、滑膜、骨膜及び骨細胞においてより高いシグナルを有するようであった。
【０３５１】
抗ペプチド（配列番号１０５）及び抗Ｄｅｘ抗体での染色の分布は、ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）で処置された動物の軟骨において非常に類似している（図２１）。複合体は、細胞外マトリックス全体に存在する。興味深いことに、軟骨細胞も両方の抗体で陽性に染色され、複合体がこれらの細胞内またはその表面上いに蓄積している可能性があることを示唆している。ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）で処置された動物における抗ペプチド（配列番号１０５）抗体での染色（図２１Ａ）、及びペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）で処置された動物における抗Ｄｅｘ抗体での染色（図２１Ｂ）は、軟骨の深さの一部だけを通って広がり、染色には鋭い境界があるようである（図２０及び図２１）。この境界は、Ｈ＆Ｅ切片で視認可能な軟骨の「タイドマーク」の位置と密接に一致している（図２１Ｃ）。タイドマークは、非石灰化軟骨と石灰化軟骨との間の移行を画定する。
【０３５２】
ＣＩＡラットにおけるＱＷＢＡデータをさらに分析して、軟骨及び他の組織におけるペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）及びＣｙｓ−Ｄｅｘの蓄積をモル濃度ベースで比較した（化合物ｎｍｏｌ／組織ｇ、図２２Ａ〜図２２Ｃ）。軟骨の蓄積がＤｅｘの治療ウィンドウに影響を及ぼし得る程度を決定するために、我々はまた、膝の軟骨中の濃度に対する他の組織中のＤｅｘの濃度の比を計算した（図２２Ｃ）。この分析は、非標的化Ｄｅｘが、膝におけるその濃度を有意に超える濃度で体内の多様な異なる組織に蓄積することを実証した。一方、組織におけるペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）の濃度を膝軟骨におけるその濃度と比較した場合、膝と同等以上の濃度を有する組織は比較的少ないことが判明する。ペプチド−薬物複合体の蓄積が最も多い組織には、膝、及びＩＶＤ及び足首のような他の軟骨性部位、ならびに肝臓及び腎臓などの代謝及び排泄の組織が含まれる（図２２Ｃ）。しかしながら、肝臓ならびに骨髄、脾臓、胸腺、血液、及び膵臓などの多くの他の非標的組織に送達されるＤｅｘのレベルは、非標的化Ｄｅｘとしての送達に対して、ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）によって送達された場合の軟骨レベルと比較して大幅に減少する。このことは、ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−Ｄｅｘ（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）を介する所望の軟骨性組織への薬物送達を標的化する治療ウィンドウの実質的な増加の潜在性を実証する。
【０３５３】
全体として、これらのデータは、ＱＷＢＡに対する直交法を使用して、安定なリンカーを使用する本明細書に記載のペプチド（例えば、ペプチド（配列番号１０５））へのＤｅｘの複合体化が、軟骨へのＤｅｘ及びペプチド（配列番号１０５）の両方の送達をもたらすこと、及びＤｅｘ単独の全身投与が、膝及び足首の関節における薬物の有意な蓄積をもたらさないことを確認する。よって、本明細書に開示されるペプチドは、薬物自体が治療的有効濃度を提供するためのアクセスがないか、または限られたアクセスしかない標的組織に薬物を送達するために使用され得る。
【０３５４】
実施例２８
ペプチド−薬物複合体に使用するための追加のリンカーの開発
この例は、本明細書に記載の方法及び組成物と組み合わせて使用され得る追加のリンカーの開発を示す。この例に記載のリンカーは、本明細書に記載の任意のペプチドと共に使用され得る。軟骨中のペプチド蓄積の局在化及び動態に基づいて、薬物（例えば、ステロイド）送達のための切断可能なリンカーを開発した。本明細書に記載のいくつかのペプチドは軟骨において細胞外に主に局在化し、よって、エステル、カルボネート、及びカルバメートリンカーを、化学的に及びエステラーゼを介して加水分解し、未改変形態のステロイドを放出するそれらの潜在性のために選択した。この試験の過程で合成されたいくつかのペプチド−Ｄｅｘ複合体の構造及び加水分解速度は、以下の表１５に示されている。
【０３５５】
以下の表１５に示されるペプチド−薬物複合体の加水分解時間は次のように決定された：ペプチド薬物複合体（ＰＤＣ）をＰＢＳ、ラット血漿、またはヒト血漿中で３７℃でインキュベートした。サンプルを一定間隔で除去し、溶媒抽出によって処理し、ＬＣ／ＭＳによって分析して遊離Ｄｅｘを定量化した。各アッセイは、少なくとも９つの時点（２分から３２時間までの範囲）からなり、１つの時点当たり３連のサンプルを用いた。ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−Ｄｅｘをヒト血漿中で最大５６時間モニターした。半減期は、モニターされた時間枠内での放出速度に基づいて計算したが、いくつかの複合体は、アッセイの終了時まで完全に加水分解しなかった可能性がある。
【表１５−１】
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【表１５−２】
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【表１５−３】
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【０３５６】
加水分解速度に対するリンカーの炭素鎖の長さ及び立体障害などの様々なパラメータの影響を評価した。一般に、脂肪族鎖の長さの増加及びエステル結合の周りの立体障害の増加は、複合体からのデキサメタゾン（Ｄｅｘ）のより遅い放出をもたらし得ることが判明した（表１５）。予期されたように、加水分解速度は一般に、ラット血漿中で最も速く、続いてヒト血漿であり、ＰＢＳ中では最も遅く、おそらく存在する血清カルボキシルテラーゼなどの酵素のレベルの低下に起因する。化学的多様性を増加させるため及びリンカーインベントリで利用可能な加水分解速度の範囲を広げるために、カルボネートリンカー及びカルバメートリンカーも調べた。カルボネートリンカーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで非常に迅速に加水分解し、しばしば１時間未満で完全な加水分解に達したのに対し、カルバメートリンカーは、非常に安定であり、試験された流体中で３２時間の観察期間内でＤｅｘを放出しなかったことが判明した。
【０３５７】
このデータは、本明細書に記載の合成されたペプチド薬物複合体（例えば、表１５で上に示されるもの）が、薬物（例えば、Ｄｅｘなどのグルココルチコイド）への全身性曝露を最小化しつつ、標的組織（複数可）（例えば、関節）への最適な薬物送達（例えば、Ｄｅｘ、デス−シクレソニド、または他の薬物）のために化学的及び酵素的加水分解に対して広範な不安定性を提供し得ることを示している。いかなる理論にも縛られることなく、炎症を起こした関節の化学的及び酵素的環境は、血漿中で測定されたものとは変化した局所切断速度を提供し得ることが想定された。切断速度はまた、滑液、血漿、及び尿などの様々な流体中で変化し得る。ラット対ヒト血漿中の切断速度の差は、エステラーゼのレベルの変化に起因し得る。
【０３５８】
実施例２９
ペプチド−デス−シクレソニド複合体の合成及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ加水分解
この例は、ペプチド−デス−シクレソニド（ペプチド−ｄＣＩＣ）複合体の合成及び加水分解特性を実証する（図２３）。
合成
複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ（４６）は、以下のスキーム１５及び図２３Ａに記載されているように、配列番号１０５−ＤＭＡ−ｄＣＩＣを生成するために以下の３つの合成工程：エステル結合形成、スルホ−ＮＨＳエステル形成、及びペプチド複合体化を使用して合成した。
【化５８】
2021522172.tif 000096
【０３５９】
スキーム１５
工程１：エステル結合形成−ｄＣＩＣ−２，５−ジメチルアジピン酸の合成
デス−シクレソニド（１２８．８ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）、２，５−ジメチルアジピン酸（２３５ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（５１８ｍｇ、２．７ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（３３０ｍｇ、２．７ｍｍｏｌ）を１０ｍＬの無水ジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解した。反応混合物を室温でおよそ２０時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。残渣をＨＰＬＣによって精製して７６％の収率で１２９ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、質量６０９．３（Ｍ−１７）で９７％を超える純度を示した。
【０３６０】
工程２：スルホ−ＮＨＳエステル形成−ｄＣＩＣ−２，５−ジメチルアジピン酸ＮＨＳエステルの合成
ｄＣＩＣ−２，５−ジメチル−アジピン酸（８６．４ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（８０．１ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩（１５２ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）を３ｍＬの無水ＤＭＳＯに溶解した。反応混合物を室温でおよそ１時間撹拌した。ＬＣＭＳは、６５％の生成物、７％のＥＤＣ尿素副生成物及び２５％の出発物質を示した。Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩（９０ｍｇ）及びＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（５１ｍｇ）を添加した。反応混合物を室温でおよそ２時間撹拌した。ＬＣＭＳは、８８％の生成物、７％のＥＤＣ尿素副生成物及び３％の出発物質を示した。反応混合物をＨＰＬＣによって精製して４５％の収率で５４．５ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、質量８０４．３（Ｍ＋１）で９３％を超える純度を示した。
【０３６１】
工程３：ペプチド複合体化−（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ（４６）の合成
１ｍＬの無水ＤＭＳＯ中の配列番号１０５に示されるアミノ酸配列を有するペプチド（５０ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルモルホリン（１３．２μＬ、０．１２ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に、デス−シクレソニド−２，５−ジメチル−アジピン酸−スルホ−ＮＨＳエステル（２２ｍｇ、９０％の純度、０．０２４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で２日間撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣによって精製して生成物であるペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣを白色の粉末として得た（２回の反応を組み合わせ、合計１００ｍｇのペプチドを使用し、８３．４ｍｇの生成物が４７％の収率で得られた）。ＬＣ−ＭＳは、ＭＳ：１２２８．４（Ｍ／４）、１６３７．６（Ｍ／３）で９９％の純度を示した。
【０３６２】
これらの工程はまた、グルココルチコイドのデキサメタゾン、ブデソニド、及びトリアムシノロンアセトニドと任意に組み合わせて、配列番号１０３、配列番号１８４及び配列番号５０９に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを使用して成功裏に実施した。
【０３６３】
複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣに加えて、ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−ｄＣＩＣ（４７）複合体（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）を調製し、その場合、システインリンカーを１４Ｃ含有メチル基を含むようにさらに改変して、複合体のペプチド（配列番号１０５）−１４Ｃ−Ｃｙｓ−ｄＣＩＣ（４８）（「ペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ」は配列番号５１２として開示されている）を提供した。使用したペプチドには、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１８４及び配列番号５０９に示されるアミノ酸配列を有するものが含まれるがこれらに限定されなかった。
【０３６４】
１４Ｃで標識されたペプチド−薬物複合体を得るための例示的な合成スキームが以下に示されている（スキーム１６）：
【化５９】
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【０３６５】
スキーム１６
上記に示される合成経路は、次の工程：メシレート形成（１）、硫黄アルキル化（２）、ＮＨＳ形成（３）、ペプチド複合体（４）、Ｂｏｃ基脱保護（５）、及び還元的アミノ化（６）を含み得る。
【０３６６】
工程１：メシレート形成−ｄＣＩＣメシレートの合成
デス−シクレソニド（８３．８ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を１ｍＬの無水ピリジンに溶解した（最初は完全に溶解しなかった、懸濁液）。反応バイアルを氷浴中でセプタムで密封した。次いでメタンスルホニルクロリド（２８μＬ、０．３６ｍｍｏｌ）をシリンジを通してデス−シクレソニドの懸濁液に滴下添加した。反応混合物を０℃で３０分間撹拌した。反応混合物の後処理を次のように実施した：反応混合物を２５ｍＬの氷水に注ぎ、生成物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機部分を１ｍＬの０．１ＭのＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３及びブラインで洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。混合物を濾過して濾液を得、溶媒を減圧下で除去して生成物を定量的に得た。
【０３６７】
工程２：硫黄アルキル化−ｄＣＩＣ−Ｂｏｃ−システインの合成
１ｍＬの無水ＤＭＳＯ中のＢｏｃ−Ｌ−システイン（３０４ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ）及びＣｓ２ＣＯ３（４６９ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に、１ｍＬの無水ＤＭＳＯ中のデス−シクレソニドメシレート（９８ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温でおよそ１．５時間撹拌した。反応物を濾過して固体を除去し、得られた溶液をＨＰＬＣによって精製して、６６％の収率で８０ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、質量６５６．３（Ｍ−１７）で９０％を超える純度を示した。
【０３６８】
工程３：ＮＨＳエステル形成−ｄＣＩＣ−Ｂｏｃ−システイン−ＮＨＳエステルの合成
２ｍＬの無水ＤＭＦ中のデス−シクレソニド−Ｂｏｃ−システイン（１８．８ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（４４ｍｇ、０．２２８ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（４４ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温でおよそ２０時間撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣによって精製して４７％の収率で１０．１ｍｇの白色の粉末を得た。純度は、質量６７１．３（Ｍ−１００）で９２％である。
【０３６９】
工程４：ペプチド複合体化合成
アミノ酸配列配列番号１０５を有するペプチド（２０ｍｇ、０．００４７ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルモルホリン（０．５２ｍＬの無水ＤＭＳＯ中５．２μＬ；１００倍希釈；０．０４７ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に、デス−シクレソニド−Ｂｏｃ−システイン−ＮＨＳエステル（７．２ｍｇ、０．００９３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣによって精製して６２％の収率で１４．８ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、質量１２４０．２（Ｍ／４）及び１６５３．３（Ｍ／３）で９７％の純度を示した。
【０３７０】
工程５：Ｂｏｃ脱保護合成
３０ｍＬの透明なバイアル内のデス−シクレソニド−Ｂｏｃ−システイン−ペプチド（１０ｍｇ、０．００２０ｍｍｏｌ）の白色の粉末に、１００μＬのＴＦＡ（９９％の純度）を添加した。５分後、ＬＣ−ＭＳ分析は、反応が完了したことを明らかにした。２ｍＬのアセトニトリル及び水（１：１の比）を添加し、次いで−７８℃で凍結させ、続いて凍結乾燥させて１２ｍｇの白色の粉末を得た。ＬＣ−ＭＳは、質量１２１５．２（Ｍ／４）、１６２０．０（Ｍ／３）で９７％を超える純度を示した。
【０３７１】
工程６：還元的アミノ化−Ｃ１４標識複合体の合成
５ｍＬの水中のペプチド（配列番号１０５）−Ｃｙｓ−ｄＣＩＣ（１０ｍｇ、０．００２０ｍｍｏｌ）の溶液に、４７０μＬの１０倍のＰＢＳ及び２５μＬの１４Ｃ標識ホルムアルデヒド（８％水溶液）を放射性ヒュームフード内で添加した。ＮａＣＮＢＨ４（水性）溶液（１ｍＬ中に４．６ｍｇ）を添加した。反応混合物をボルテックスし、およそ２０時間放置した。反応混合物を、予め３ｍＬのメタノールで活性化し、３ｍＬの水で平衡化したＳｔｒａｔａ−Ｘカラムに通した。吸着した複合体を水（３ｍＬ）で洗浄し、メタノール中の２％ギ酸４ｍＬで溶出させた。メタノール／ギ酸混合物を窒素流下で除去して６．９９ｍｇの生成物を得た。
【０３７２】
このデータは、治療的及び／または診断的用途で使用され得る本明細書に記載されるようなペプチド−薬物複合体（例えば、ペプチド−リンカー−グルココルチコイド複合体）を得るための安定で、再現可能であり、多用途の合成方法を実証する。
【０３７３】
以下のペプチド−デス−シクレソニド複合体は、ここで及び本開示の実施例５〜実施例１９で記載されている合成手順に従って調製した。
【化６０】
2021522172.tif 000098
【０３７４】
実施例３０
追加の疾患モデルの開発
この例は、本明細書に記載のペプチド及びペプチド−薬物複合体の機能及び治療効果を評価するための追加の疾患モデルの開発を実証する。
【０３７５】
そのために、急性関節内（ＩＡ）ＩＬ−１誘発性ＩＬ−６負荷ラットモデルにおけるＤｅｘＳＰの局所対全身投与を評価した。その試験のため、ＩＡまたはＩＶのいずれかで投薬された３０または３μｇのＤｅｘＳＰの注射に加えて、３０ｎｇのＩＬ−１ｂを雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの膝にＩＡで注射した。４時間後、同一の膝の滑液中のＩＬ−６レベルをＬｕｍｉｎｅｘによって測定し、膝洗浄液のタンパク質含有量に正規化した。ＩＡで投与されたＤｅｘ（ＩＬ−１ｂとの共注射）は、ＩＬ−６分泌の減少を引き起こさなかった一方で、ＩＶで投与されたＤｅｘは、滑液中のＩＬ−６分泌のいくらかの減少を引き起こした（Ｈｕｌｍｅ，ｅｔ  ａｌ（２０１７）。
【０３７６】
結果は、Ｄｅｘの全身的免疫抑制効果が非常に有意であり得ることを示している。このモデルはまた、このモデルでの試験のためにデス−シクレソニドペプチド薬物複合体（ＰＤＣ）の好適性を試験するために同様に使用され得る。
【０３７７】
実施例３１
ペプチド−ｄＣＩＣ複合体のｉｎ  ｖｉｖｏ薬力学的試験
この例は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのペプチド−ｄＣＩＣ複合体のｉｎ  ｖｉｖｏ薬力学的（ＰＤ）評価を示す。
【０３７８】
この例では、ＩＬ−１β負荷ラットモデルをペプチド−薬物複合体の評価に使用した。このモデルでは、関節洗浄液中のＩＬ−６レベルを測定することによって定量化され得る炎症状態を誘発させるために単一の膝関節に関節内（すなわち、ＩＡ）でＩＬ−１βを注射する（実施例３０）。このモデルを使用する主要な目標は、関節へのｄＣＩＣの局在化送達をステロイドの全身投与から差別化する方法として、他のモデルで誘導された全身性炎症とは対照的に、関節における局在化炎症状態を誘発させることであった。このモデルでの追加の利点は、それを迅速に実行でき、より早い意思決定プロセスを可能にすることである。グルココルチコイドへの全身性曝露の確立されたマーカーである様々な白血球レベルのあらゆる低下を評価するためにＣＢＣ数を使用した。
【０３７９】
この試験は、ペプチドによって送達されるｄＣＩＣが、治療レベルのｄＣＩＣを単独で投薬した場合に得られるものと比較して、ｄＣＩＣへの全身性曝露を減少させつつ、関節内の炎症の局所的抑制を可能にするかどうかを試験するために設計された。ｄＣＩＣ（非複合体化）の全身送達を可能にするために、それを４０％プロピレングリコール中で製剤化し、次いで分子を可溶化するために加熱した。ペプチド−ｄＣＩＣ−複合体は、ＰＢＳに可溶性であり、プロピレングリコールも加熱も必要としなかった。本開示のペプチド−薬物複合体は、複合体を全身送達用に製剤化することを可能にする水溶解性を有し得、ペプチド−薬物複合体で使用される薬物の少なくとも一部は、ペプチドに複合体化されていない場合には全身投与用に十分な水溶解性を有さない場合がある。それらの薬物を含む複合体は、対象の軟骨にホーミングし、それを標的とし、それに移動し、それに蓄積し、それに結合し、それによって保持され、またはそれに再誘導され得る。
【０３８０】
初期用量範囲試験
膝洗浄液中のＩＬ−６測定。関節内のＩＬ−６分泌レベルを低下させるペプチド−ｄＣＩＣ複合体（ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ）及びｄＣＩＣの両方の用量を同定するために、及びモデルにおけるステロイド曝露の全身マーカーに対する各処置の効果を理解するために、ＩＬ−１β負荷モデルにおいて用量範囲試験を行った。ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣをラットＣＩＡモデルにおいてペプチド−Ｄｅｘ複合体の有効用量レベルの０．１〜１０倍で試験した。試験０日目に、雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（最小２５０ｇ）を計量し、１３個の処置群のうちの１つに体重で無作為化した（図２４）。
【０３８１】
ＩＬ−６をＬｕｍｉｎｅｘアッセイを使用して膝の洗浄液中で測定し、レベルを洗浄液中の総タンパク質に正規化した（図２４）。ＩＬ−１βで負荷したラットの膝関節におけるＰＤ炎症マーカーＩＬ−６の評価を実施した。末端滑液をすべての動物から採取し、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ  ＭＡＰ  ラットサイトカイン／ケモカイン磁性パネル（ＲＥＣＹＴＭＡＧ−６５Ｋ）を使用してＩＬ−６サイトカイン濃度についてＬｕｍｉｎｅｘ２００によって分析した。ＩＬ−６レベルを、ブラッドフォードアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓアッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２３２３６）によって測定した総タンパク質レベル（総タンパク質（［μｇ］）に対するＩＬ−６（［ｐｇ］）として測定した）に正規化した。すべての処置は、ｄＣＩＣの関節内注射を１回の用量で受けた１つの群（「１２７４＃」と表記される）を除き、尾静脈を介して静脈内投与した（１．６７ｍｌ／ｋｇ）。処置群は、図２４に示されるように以下の試験品を含んでいた：（ｉ）ＩＬ−１βなし陰性対照（「ＩＬ−１ｂなし」と表記される）；（ｉｉ）ペプチド−薬物複合体についてのビヒクルのみの対照（「ビヒクル（ＰＤＣ）」と表記され、これはＰＢＳ中５％のＤＭＳＯであった）；（ｉｉｉ）ｄＣＩＣについてのビヒクルのみの対照（ＰＢＳ中に４０％のプロピレングリコール、５％のＤＭＳＯ、「ビヒクル（ｄＣＩＣ）」と表記される）；（ｉｖ）１２７４ｎｍｏｌ／ｋｇ及び１２７ｎｍｏｌ／ｋｇでの２つの用量レベルのデキサメタゾンリン酸エステルナトリウム、すなわち、ＤｅｘＳＰ（「Ｄｅｘ」と表記される）（「Ｄｅｘ」に関してそれぞれ「１２７４」及び「１２７」と表記される）；（ｖ）１２７４ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＡ、１２７４ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＶ、１２７ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＶの３つの用量レベルのｄＣＩＣ（「ｄＣＩＣ」に関してそれぞれ「１２７４＃」、「１２７４」及び「１２７」と表記される）；ならびに（ｖｉ）３つの用量レベルのペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ（１２７ｎｍｏｌ／ｋｇ、５１ｎｍｏｌ／ｋｇ、及び１３ｎｍｏｌ／ｋｇ）（「ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ」に関してそれぞれ「１２７」、「５１」及び「１３」と表記される）、（ｉ）〜（ｖｉ）の各々は１つの用量群当たりｎ＝５の動物を有していた。用量は、ｎｍｏｌ／ｋｇとして列挙されている。これらの用量の質量は、以下の表１６に提供されている。試験剤の投与から２時間４５分（すなわち、２．７５時間）後、動物を穏やかに加熱し、ＣＢＣ分析のために尾静脈から血液を吸引した。次いで動物を吸入イソフルランで麻酔し、３０ｎｇのＩＬ−１βを右膝に注射した（ＩＬ−１βなしの群を除く）。ＩＬ−１β投与から４時間後（試験剤の投与から７時間後）に動物を安楽死させた。２回目のＣＢＣ分析のために血液を吸引し、右膝をＬｕｍｉｎｅｘアッセイを使用して洗浄液中のＩＬ−６の検出のために洗浄した。胸腺及び脾臓を採取し、それらの器官重量を決定した。グラフは、中央値、第一四分位数及び第三四分位数を用いて箱ひげ図として示されており、点線として示されたビヒクル中央値と共に最大値及び最小値が示されている。
【表１６】
2021522172.tif 000099
【０３８２】
すべての用量（上記の表１６）は、ペプチド−ｄＣＩＣの最高用量レベルを除き、良好に忍容された。最高用量群（１２７４ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＶ）におけるすべての動物は、投薬から３０分以内に死亡し、２番目に高い用量群（５１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）では５匹の動物のうち３匹が、投薬から３０〜９０分以内に死亡した。その２番目に高い用量群（５１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）における他の２匹の動物は、安楽死まで生存した。試験における他のすべての動物は、安楽死するまで生存した。肉眼的検査では死因は明らかにならなかった。
【０３８３】
ＩＬ−１βを注射しなかった動物は、膝において無視できるＩＬ−６濃度を示したのに対し、両ビヒクル対照群は、実質的により高い中央値のＩＬ−６濃度を有していた（図２４）。Ｄｅｘのみを用いた陽性対照は、両方の用量レベルでビヒクルと比較してＩＬ−６レベルの実質的な低下を実証した（特に高用量のＤｅｘ群で、サイトカインレベルに変動性が観察されたが）。まとめると、これらのデータは、ＩＬ−１βの注射が、ビヒクル処置した動物における関節内のＩＬ−６レベルの増加によって測定され得る炎症を誘発するように機能していることを示唆している。その上、ＩＬ−６レベルは、Ｄｅｘなどの高効力ステロイドでの処置によって低下し得る。ペプチド−薬物複合体ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣでの処置は、分析した３つの用量（すなわち、１２７ｎｍｏｌ／ｋｇ、５１ｎｍｏｌ／ｋｇ、及び１３ｎｍｏｌ／ｋｇ）すべての投与後に、ＩＬ−６濃度の明らかな低下をもたらした（図２４）。これらの用量レベルでのｄＣＩＣの薬物質量は、０．００６〜０．０６ｍｇ／ｋｇであった。この試験では明らかな用量反応は観察されず、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣは、さらに低い用量で有効であり得ることを示唆している。ｄＣＩＣを単回薬剤として１２７４ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＡでの投与または１２７ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＶを介した投与はまた、ビヒクルと比べてＩＬ−６濃度の減少をもたらした。
【０３８４】
リンパ球数の測定（図２５）。ＩＬ−６分泌が測定された同じ動物において、初期の時点、すなわち、試験品の投与から２．７５時間後（図２５Ａ）、及び投与から７時間後の安楽死時（図２５Ｂ）にＣＢＣデータ（例えば、リンパ球数）も分析した（図２５）。ＩＬ−６分泌の測定のためにすべての処置を上述したように投与した。
【０３８５】
初期の時点である投与から２．７５時間後に測定されたリンパ球数は、各処置での全身性ステロイドへの曝露の程度についての洞察を提供した（図２５Ａ）。両方のビヒクル対照群は、ＩＬ−１βを摂取しなかった動物と比較して、リンパ球数はわずかに減少したものの、同様であった。陽性対照であるＤｅｘは、試験した両方の用量において、ビヒクル対照と比較して、リンパ球数の有意な減少をもたらした。同様に、ＩＡまたはＩＶのいずれかでのｄＣＩＣの投与も、ビヒクルと比較してリンパ球数の減少をもたらした。ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣの投与は、１２７ｎｍｏｌ／ｋｇの等価用量で投与した場合はＤｅｘ及びｄＣＩＣ単独と比較してリンパ球数に対する影響がより少ないように見え、５１ｎｍｏｌ／ｋｇ及び１３ｎｍｏｌ／ｋｇのより少ない用量で投与した場合はビヒクル対照と同様であるようであった。よって、関節における炎症のＰＤマーカー（複数可）の減少を引き起こすことが判明したペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣの用量は、観察されたステロイド曝露の全身マーカーに対して最小限の効果しか有さず、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ薬物が、薬物の有意な全身性曝露を引き起こさずに関節における炎症を低減することが可能であることを示唆している。
【０３８６】
また、安楽死時に収集されたＣＢＣデータ（例えば、リンパ球数）は、各処置での全身性ステロイド曝露の程度についての追加の洞察を提供した。リンパ球数は、Ｄｅｘの両方の用量レベルで処置された動物では、２．７５時間と比較して、７時間でより低いようであった（図２５Ｂ）。しかしながら、ｄＣＩＣをＩＡまたはＩＶで摂取した動物におけるリンパ球数は、２．７５時間と比較して、７時間で安定しているか、または回復し始めているようであった。ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣの３つすべての用量で処置された動物は、７時間の時点でビヒクルについて観察されたものと同様のリンパ球数を有していた（図２５Ｂ）。これにより、安楽死時に得られたデータは、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣが軟骨における炎症を減少させながら、ステロイド曝露の全身マーカーに対して最小限の影響を有するという知見を確認した。その上、そのデータは、ｄＣＩＣとＤｅｘＳＰとの間で観察された薬物動態（ＰＫ）の差のいくつかを強調した：より速いクリアランスは、Ｄｅｘと比較して、リンパ球数に対するｄＣＩＣのより短い持続時間及びより少ない影響の原因であり得、本開示のペプチド−薬物複合体におけるｄＣＩＣの使用を確認している。安楽死時の脾臓及び胸腺重量の比較は、ペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣまたはｄＣＩＣ単独での処置が、両方の器官の重量に対して最小の効果を有していたが、ＤｅｘＳＰ処置が、両方の器官の重量の減少をもたらしたことを示す所見を支持した。
【０３８７】
好中球数の測定（図２６）。５１０ｎｍｏｌ／ｋｇのペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣを摂取した追加の処置群を除き、すべての処置及び試験品を上述したように投与した。
【０３８８】
ＣＢＣからの好中球数及び単球数も分析した。より高い用量でのペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣでの処置後、及びビヒクル（ｄＣＩＣ）で処置された動物（図２６）において好中球（図２６Ａ）及び単球（図２６Ｂ）の用量依存的増加があった。試験したすべての用量レベルでＤｅｘまたはｄＣＩＣで処置された動物における単球の用量依存的減少があった。毒性を経験した群は、さらなる分析から排除した。ラットにおける高用量での毒性の原因は不明であるが、ペプチド−ｄＣＩＣ複合体のより低い有効用量（１３〜５１ｎｍｏｌ／ｋｇ）でのＣＢＣ数及びすべての観察結果は正常であった。
【０３８９】
このデータは、本明細書に開示されるペプチド−薬物複合体が、薬物単独の投与と比較した場合、全身性薬物曝露を低減しつつ、軟骨における炎症を低減することが可能であることを実証する。
【０３９０】
ＷＢＣ、リンパ球及び単球数のフォローアップ試験測定（図２７）。
この試験は、試験剤投与のタイミング、ＣＢＣのための血液の採取、ＩＬ−１βの注射、及び安楽死後の膝の洗浄に関してこの実施例においてさらに上述した用量範囲試験と同一の手法で行った。この試験では、安楽死時に採取した血液をＣＢＣと血清化学の両方に供し、胸腺及び脾臓の重量は、用量範囲試験でｄＣＩＣ及びペプチド−ｄＣＩＣのこれらの器官に対する治療効果の証拠がなかったので測定しなかった。図２７に示されるＰＤ試験の一部としてのラットの血液中のステロイド曝露のバイオマーカーの評価：＃は、ＩＡ注射によって投与された用量を表し、他のすべての処置はＩＶ投与した。処置群は、以下の試験品を含んでいた：（ｉ）ＩＬ−１βなし陰性対照（「ＩＬ−１ｂなし」と表記される）；（ｉｉ）；ペプチド−薬物複合体についてのビヒクルのみの対照（「ビヒクル」と表記される）、これは（ＰＢＳ中５％のＤＭＳＯ）であった；（ｉｉｉ）１２７ｎｍｏｌ／ｋｇでのペプチドのみの対照ペプチド（配列番号１０５）（「ペプチド」に関して「１２７」と表記される）；（ｉｖ）１２７４ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＡ、１２７ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＶ、５１ｎｍｏｌ／ｋｇのＩＶの３つの用量レベルのｄＣＩＣ（「ｄＣＩＣ」に関してそれぞれ「１２７４＃」、「１２７」及び「５１」と表記される）；ならびに（ｖ）２つの用量レベルのペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ（５１ｎｍｏｌ／ｋｇ、１３ｎｍｏｌ／ｋｇ）（「ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ」に関してそれぞれ「５１」及び「１３」と表記される）、（ｉ）〜（ｖ）の各々は、１つの用量群当たりｎ＝６の動物を有していたＩｌ−１βなし対照及びペプチドのみの対照アームを除き、１つの用量群当たりｎ＝１０の動物を有していた。用量は、ｎｍｏｌ／ｋｇとして列挙されている。統計分析は、Ｈｏｌｍ法を使用した多重比較のための補正を用いてウィルコクソンの順位和検定を使用して行った。関節洗浄液中のＩＬ−６レベルの測定は、用量範囲試験と同様の手法で行った；しかしながら、ビヒクル処置動物の関節中のＩＬ−６レベルの分析は、ＩＬ−６のＩＬ−１β媒介誘発がこの試験では準最適であったことを示唆していた。ビヒクル対照群では、４０％の動物が、関節内のＩＬ−６の無視できるレベルを有し、３０％が、成功したＩＬ−１β媒介誘発について予期されるレベル未満のＩＬ−６濃度を有し、この試験ではモデルＩＬ−６誘導の技術的問題を示唆している。
【０３９１】
２．７５時間で測定されたＣＢＣデータは、ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣの投与による血球数マーカーに対する影響の欠如を確認した一方で、ｄＣＩＣ投与は、ＷＢＣ、リンパ球、及び単球を有意に減少させた。２．７５時間のＣＢＣ測定結果は、ＩＬ−１β注射の前に血液を採取したので有効であり、正常な動物での試験の実行と類似している。総ＷＢＣ数（図２７Ａ）、リンパ球数（図２７Ｂ）及び単球数（図２７Ｃ）は、全身性ステロイド曝露に反応して減少することが予期されるＰＤバイオマーカーとして分析した（図２７）。ＩＬ−１βなし及びビヒクル対照群は、３つすべてのパラメータについて正常範囲内である。試験された両方の用量でのペプチド（配列番号１０５）単独及びペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣは、３つすべてのパラメータについて対照群と同様である。しかしながら、ＩＡ及びＩＶで投与されたｄＣＩＣは、ＷＢＣ数（図２７Ａ）、リンパ球数（図２７Ｂ）、及び単球数（図２７Ｃ）の実質的減少を引き起こした。これは、ｄＣＩＣのＩＡ注射が総ＷＢＣ数に関して統計的に有意ではなかったことを除き、３つのＣＢＣパラメータにわたってすべてのｄＣＩＣ処置についてビヒクルと比較して統計的に有意であることが判明した。安楽死後に行われたＣＢＣ及び血清化学分析は、処置群間に意味のある差を実証しなかった。
【０３９２】
全体として、この試験は、この実施例において上述した用量範囲試験からの血液学的知見を確認し、本明細書に記載されるようなペプチド（例えば、ペプチド（配列番号１０５））へのｄＣＩＣの複合体化が、ステロイドへの全身性曝露を有意に減少させることを実証する。また、ｄＣＩＣ単独は、水に溶解せず、可溶化するために４０％プロピレングリコール中での加熱を必要とした一方で、ペプチド配列番号１０５への複合体化によるｄＣＩＣの送達は、水性緩衝液中での可溶化及び送達を可能にした。本開示のペプチド−薬物複合体の溶解性を実証することは、そのようなＰＤＣが、対象の軟骨にホーミングし、それを標的とし、それに移動し、それに蓄積し、それに結合し、それによって保持され、またはそれに誘導され得る薬物（ｄＣＩＣなどの水溶解性ではないものを含む）の全身送達のために製剤化され得ることを示す。よって、まとめると、これらの試験は、ペプチド−薬物複合体（例えば、ペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ）の全身投薬が、全身性曝露及びステロイド投薬（例えば、ＤｅｘまたはｄＣＩＣ）単独に関連するＰＤ変化を有意に減少させ、同時に、関節における炎症マーカーの減少を示し得ることを確認する。
【０３９３】
実施例３２
ＣＩＡラットにおけるペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣについての用量発見試験
この例は、ＣＩＡラットにおけるペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣ（４４）についての例示的な用量発見試験を示す。
【０３９４】
この試験は、ラットにおける関節リウマチのＣＩＡモデルにおける足首の腫れを減少させる複合体であるペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣの用量を同定するために実施される。この試験の二次的目標は、治療後の全身性ステロイド曝露のバイオマーカーを評価することである。
【０３９５】
この試験のため、実施例２９で上述したように合成されたペプチド−薬物複合体のペプチド（配列番号１０５）−ＤＭＡ−ｄＣＩＣの５つの用量を尾静脈内にラットに摂取させる。最終投薬から３時間後に組織を採取する。表１７は、一般的試験設計を示している。
【表１７】
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【０３９６】
この試験のための手順は以下のとおりである：０日目に、ＩＦＡ中の２×２００ｕｇのウシＩＩ型コラーゲンをＩＤで注射することによって関節炎を開始させる。７日目に、関節炎の発症をＩＦＡ中の１×１００ｕｇのウシＩＩ型コラーゲンでＩＤで加速させる。１０日目に、足首直径の測定を開始する。１３〜１８日目の間に、ラットを、少なくとも１つの足首が７．２５ｍｍの直径に達した時に試験に登録する。１３〜２２日目の間に、ラットに配列番号１０５−ＤＭＡ−ｄＣＩＣをＩＶにより５日間毎日投与する。１７〜２２日目の間に、ラットを最終投薬から３時間後に安楽死させる。体重、血清及び血漿、後肢、胸腺、及び脾臓を採取し、分析する。
【０３９７】
実施例３３
ペプチド−薬物−検出可能剤複合体
この例は、治療及び／または診断（例えば、セラノスティック）剤として使用され得る検出可能剤（例えば、蛍光色素、ＰＥＴリガンド）でのペプチド−薬物複合体の標識を記載する。
【０３９８】
本開示のペプチド（例えば、配列番号１〜配列番号５１０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するペプチド）を、例えば、実施例１及び実施例２でそれぞれ本明細書に記載されているように組換え的に発現させるか、または化学的に合成する。次いで精製したペプチドをリンカー（例えば、表２、化合物１〜２０に記載の任意のリンカー）を介して薬物（例えば、グルココルチコイドなどの抗関節炎剤）に連結させる。ペプチド−薬物複合体を実施例５〜実施例１９、または実施例２９のいずれか１つに記載されているように合成する。ペプチドは、ＤまたはＬ構成の少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。
【０３９９】
次に、合成されたペプチド−薬物複合体を（例えば、ペプチドのＣ末端を介して）実施例５〜実施例１９、または実施例２９のいずれか１つに記載の合成ストラテジーのいずれかを使用して検出可能剤に結合して、ペプチド−薬物−検出可能剤複合体を生成する。検出可能剤は蛍光色素であり、その蛍光色素はＣｙ５．５またはＡｌｅｘａフルオロフォア、例えば、Ａｌｅｘａ４８８またはＡｌｅｘａ６４７である。
【０４００】
ペプチド−薬物−検出可能剤複合体を対象に投与する。投与は、経口投与、静脈内投与、皮下、筋肉内または患者の関節内への直接注射であり得、軟骨を標的とした。対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。投与後、ペプチド−薬物−検出可能剤複合体は、（例えば、関節または足首における）軟骨にホーミングし、それを標的とし、及び／またはそれに保持される。複合体の薬物動態（例えば、生体内分布）及び薬力学をｅｘ  ｖｉｖｏ及び／またはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで可視化する。ペプチド−薬物−検出可能剤複合体の血漿半減期、標的係合、組織取り込み及び／または組織保持をｉｎ  ｖｉｖｏで決定する。
【０４０１】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのペプチド−薬物−検出可能剤複合体の可視化は、関節炎、軟骨損傷、または任意の他の軟骨障害の診断で使用され、ｉｎ  ｖｉｖｏでの薬物送達の範囲及び潜在的な投薬レジメンに関する情報をさらに提供する。
【０４０２】
実施例３４
変形性関節症の治療
この例は、本開示のペプチド−活性剤（またはペプチド−薬物）複合体を使用して変形性関節症を治療するための方法を記載する。この方法は、変形性関節症に関連する急性及び／または慢性症状のための治療として使用される。
【０４０３】
本開示のペプチド（例えば、配列番号１〜配列番号５１０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するペプチド）を、例えば、実施例１及び実施例２でそれぞれ本明細書に記載されているように組換え的に発現させるか、または化学的に合成する。次いで精製したペプチドをリンカー（例えば、表２、化合物１〜２０に記載の任意のリンカー）を介して薬物（例えば、グルココルチコイドなどの抗関節炎剤）に連結させる。ペプチド−薬物複合体を実施例５〜実施例１９、または実施例２９のいずれか１つに記載されているように合成する。ペプチドは、ＤまたはＬ構成の少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。
【０４０４】
この試験では、トリアムシノロンアセトニド、ブデソニド、デキサメタゾン、デス−シクレソニドまたは疾患修飾性骨関節炎薬（ＤＭＯＡＤ）、例えば、ＡＤＡＭＴＳ４／５阻害剤、カテプシンＫ阻害剤、Ｗｎｔアンタゴニスト、またはＭＭＰ−１３阻害剤などの抗炎症薬を使用する。
【０４０５】
得られた複合体を薬学的組成物で皮下、静脈内、筋肉内、または経口で投与するか、または対象の関節に直接注射し、軟骨に標的化する。対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。製剤は、軟骨中での曝露時間を増加させるために物理的または化学的に改変され得る。ペプチド−薬物複合体は、軟骨に蓄積する。その後、患者における関節炎の病態は、疼痛レベルの低下及び／または可動性の増加によって示されるように改善する。
【０４０６】
実施例３５
軟骨負傷の治療
この例は、本開示のペプチド−薬物複合体を使用して軟骨負傷を治療するための方法を記載する。
【０４０７】
本開示のペプチド（例えば、配列番号１〜配列番号５１０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するペプチド）を、例えば、実施例１及び実施例２でそれぞれ本明細書に記載されているように組換え的に発現させるか、または化学的に合成する。次いで精製したペプチドをリンカー（例えば、表２、化合物１〜２０に記載の任意のリンカー）を介して薬物（例えば、グルココルチコイドなどの抗関節炎剤）に連結させる。ペプチド−薬物複合体を実施例５〜実施例１９、または実施例２９のいずれか１つに記載されているように合成する。この試験で使用される薬物は、トリアムシノロンアセトニド、ブデソニド、デス−シクレソニド及びデキサメタゾンを含むがこれらに限定されない本明細書に記載されているものなどの治療用化合物である。ペプチドは、ＤまたはＬ構成の少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。
【０４０８】
得られたペプチド−薬物複合体を薬学的組成物で皮下、静脈内、筋肉内、または経口で投与するか、または対象の関節に直接注射し、軟骨に標的化する。対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。製剤は、軟骨中での曝露時間を増加させるために物理的または化学的に改変され得る。ペプチド−薬物複合体は、軟骨に蓄積する。その後、対象における軟骨負傷の病態は、疼痛レベルの低下及び／または可動性の増加によって示されるように改善する。
【０４０９】
実施例３６
関節リウマチの治療
この例は、本明細書に開示される複合体で関節リウマチを治療するための方法を記載する。この方法は、関節リウマチに関連する急性及び／または慢性症状のための治療として使用される。
【０４１０】
本開示のペプチド（例えば、配列番号２１〜配列番号２４７または配列番号２８２〜配列番号５１０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するペプチド）を、例えば、実施例１及び実施例２でそれぞれ本明細書に記載されているように組換え的に発現させるか、または化学的に合成する。次いで精製したペプチドをリンカー（例えば、表２、化合物１〜２０に記載の任意のリンカー）を介して薬物（例えば、グルココルチコイドなどの抗関節炎剤）に連結させる。ペプチド−薬物複合体を実施例５〜実施例１９、または実施例２９のいずれか１つに記載されているように合成する。この試験で使用される薬物は、トリアムシノロンアセトニド、ブデソニド、デキサメタゾン、デス−シクレソニドなどの抗炎症剤またはメトトレキサートもしくはトファシチニブなどの疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）を含むがこれらに限定されない本明細書に記載されているものなどの治療用化合物である。ペプチドは、ＤまたはＬ構成の少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。ペプチドは、ＤまたはＬ構成の少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。
【０４１１】
得られたペプチド−薬物複合体を薬学的組成物で皮下、静脈内、または経口で、筋肉内に投与するか、または対象の関節に直接注射し、軟骨に標的化する。対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。製剤は、軟骨中での曝露時間を増加させるために物理的または化学的に改変され得る。ペプチド−薬物複合体は、軟骨に蓄積する。その後、対象における関節リウマチは、疼痛レベルの低下及び／または可動性の増加によって示されるように改善する。
【０４１２】
実施例３７
痛風の治療
この例は、本開示の複合体を使用して痛風を治療するための方法を記載する。この方法は、痛風に関連する急性及び／または慢性症状のための治療として使用される。
【０４１３】
本開示のペプチド（例えば、配列番号２１〜配列番号２４７または配列番号２８２〜配列番号５１０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するペプチド）を、例えば、実施例１及び実施例２でそれぞれ本明細書に記載されているように組換え的に発現させるか、または化学的に合成する。次いで精製したペプチドをリンカー（例えば、表２、化合物１〜２０に記載の任意のリンカー）を介して薬物（例えば、グルココルチコイドなどの抗関節炎剤）に連結させる。ペプチド−薬物複合体を実施例５〜実施例１９、または実施例２９のいずれか１つに記載されているように合成する。この試験で使用される薬物は、非ステロイド性抗炎症薬、コルヒチン、ステロイド、またはウリカーゼを含むがこれらに限定されない本明細書に記載されているものなどの治療用化合物である。ペプチドは、ＤまたはＬ構成の少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。
【０４１４】
得られたペプチド−薬物複合体を薬学的組成物で皮下、静脈内、筋肉内または経口で投与するか、または対象の関節に直接注射し、痛風に罹患した軟骨に標的化する。対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。製剤は、軟骨中での曝露時間を増加させるために物理的または化学的に改変され得る。ペプチド−薬物複合体は、標的部位、例えば、軟骨内に蓄積する。その後、対象の痛風の病態は、疼痛レベルの低下及び／または可動性の増加によって示されるように改善する。
【０４１５】
実施例３８
疼痛の治療または管理
この例は、本明細書に開示される複合体で軟骨負傷または障害に関連する疼痛を治療または管理するための方法を記載する。
【０４１６】
本開示のペプチド（例えば、配列番号２１〜配列番号２４７または配列番号２８２または配列番号５１０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するペプチド）を、例えば、実施例１及び実施例２でそれぞれ本明細書に記載されているように組換え的に発現させるか、または化学的に合成する。次いで精製したペプチドをリンカー（例えば、表２、化合物１〜２０に記載の任意のリンカー）を介して薬物（例えば、グルココルチコイドなどの抗関節炎剤）に連結させる。ペプチド−薬物複合体を実施例５〜実施例１９、または実施例２９のいずれか１つに記載されているように合成する。この試験で使用される薬物は、抗炎症剤、例えば、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド性抗炎症薬）、グルココルチコイド、またはＰＧＥ受容体アンタゴニスト、Ｔｒｋ阻害剤、ＴＲＰＶ１アンタゴニスト、もしくはＣＧＲＰ阻害剤、または関節において鎮痛活性を有する他の低分子を含むがこれらに限定されない本明細書に記載されているものなどの治療用化合物である。ペプチドは、ＤまたはＬ構成の少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。
【０４１７】
得られたペプチド−薬物複合体を薬学的組成物で皮下、静脈内、筋肉内、または経口で投与するか、または組織及び／または器官に直接、もしくは関節内に直接注射する。対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。製剤は、軟骨中での曝露時間を増加させるために物理的または化学的に改変され得る。ペプチド−薬物複合体は、標的部位、例えば、軟骨、関節、足首において蓄積し、疼痛に罹患した軟骨を標的とする。その後、対象の病態は、疼痛レベルの低下、可動性の増加、及び／または食欲の増加によって示されるように改善する。
【０４１８】
実施例３９
強直性脊椎炎の治療
この例は、本開示の複合体を使用して強直性脊椎炎を治療するための方法を記載する。この方法は、強直性脊椎炎に関連する急性及び／または慢性症状のための治療として使用される。
【０４１９】
本開示のペプチド（例えば、配列番号２１〜配列番号２４７または配列番号２８２〜配列番号５１０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するペプチド）を、例えば、実施例１及び実施例２でそれぞれ本明細書に記載されているように組換え的に発現させるか、または化学的に合成する。次いで精製したペプチドをリンカー（例えば、表２、化合物１〜２０に記載の任意のリンカー）を介して薬物（例えば、グルココルチコイドなどの抗関節炎剤）に連結させる。ペプチド−薬物複合体を実施例５〜実施例１９、または実施例２９のいずれか１つに記載されているように合成する。この試験で使用される薬物は、トリアムシノロンアセトニド、デキサメタゾン、デス−シクレソニドまたはブデソニドなどの抗炎症性化合物を含むがこれらに限定されない本明細書に記載されているものなどの治療用化合物である。ペプチドは、ＤまたはＬ構成の少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。
【０４２０】
得られた複合体を薬学的組成物で皮下、静脈内、筋肉内、または経口で投与するか、または対象の関節に直接注射し、軟骨に標的化する。対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。製剤は、軟骨中での曝露時間を増加させるために物理的または化学的に改変され得る。ペプチド−薬物複合体は、標的部位、例えば、軟骨、関節、足首などに蓄積する。その後、対象の硬直性脊椎炎の病態は、疼痛レベルの低下及び／または可動性の増加によって示されるように改善する。
【０４２１】
実施例４０
乾癬性関節炎の治療
この例は、本開示の複合体を使用して乾癬性関節炎を治療するための方法を記載する。この方法は、乾癬性関節炎に関連する急性及び／または慢性症状のための治療として使用される。
【０４２２】
本開示のペプチド（例えば、配列番号２１〜配列番号２４７または配列番号２８２〜配列番号５１０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するペプチド）を、例えば、実施例１及び実施例２でそれぞれ本明細書に記載されているように組換え的に発現させるか、または化学的に合成する。次いで精製したペプチドをリンカー（例えば、表２、化合物１〜２０に記載の任意のリンカー）を介して薬物（例えば、グルココルチコイドなどの抗関節炎剤）に連結させる。ペプチド−薬物複合体を実施例５〜実施例１９、または実施例２９のいずれか１つに記載されているように合成する。この試験で使用される薬物は、トリアムシノロンアセトニド、デキサメタゾン、デス−シクレソニドまたはブデソニドなどの抗炎症性化合物を含むがこれらに限定されない本明細書に記載されているものなどの治療用化合物である。ペプチドは、ＤまたはＬ構成の少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。
【０４２３】
得られた複合体を薬学的組成物で皮下、静脈内、筋肉内、または経口で投与するか、または対象の関節に直接注射し、軟骨に標的化する。対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。製剤は、軟骨中での曝露時間を増加させるために物理的または化学的に改変され得る。ペプチド−薬物複合体は、標的部位、例えば、軟骨、関節、足首などに蓄積する。その後、対象の乾癬性関節炎の病態は、疼痛レベルの低下及び／または可動性の増加によって示されるように改善する。
【０４２４】
実施例４１
ループス病態の治療
本開示のペプチド（例えば、配列番号２１〜配列番号２４７または配列番号２８２〜配列番号５１０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するペプチド）を、例えば、実施例１及び実施例２でそれぞれ本明細書に記載されているように組換え的に発現させるか、または化学的に合成する。次いで精製したペプチドをリンカー（例えば、表２、化合物１〜２０に記載の任意のリンカー）を介して薬物（例えば、グルココルチコイドなどの抗関節炎剤）に連結させる。ペプチド−薬物複合体を実施例５〜実施例１９、または実施例２９のいずれか１つに記載されているように合成する。この試験で使用される薬物は、トリアムシノロンアセトニド、デキサメタゾン、デス−シクレソニドまたはブデソニドなどの抗炎症性化合物を含むがこれらに限定されない本明細書に記載されているものなどの治療用化合物である。ペプチドは、ＤまたはＬ構成の少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。
【０４２５】
得られた複合体を薬学的組成物で皮下、静脈内、筋肉内、または経口で投与するか、または対象の関節に直接注射し、軟骨に標的化する。対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。製剤は、軟骨中での曝露時間を増加させるために物理的または化学的に改変され得る。ペプチド−薬物複合体は、標的部位、例えば、軟骨、関節、足首などに蓄積する。その後、対象のループスの病態は、疼痛レベルの低下及び／または可動性の増加によって示されるように改善する。
【０４２６】
実施例４２
デス−シクレソニド複合体を使用する治療
この例は、疾患の予防及び治療におけるデス−シクレソニド（すなわち、ｄＣＩＣ）複合体の使用を実証する。
【０４２７】
シクレソニドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで活性代謝物であるデス−シクレソニドに代謝されるプロドラッグである。エステルリンカー、ジカルボン酸リンカーまたは本明細書に記載の他の不安定なリンカーを介してデス−シクレソニドをペプチドに複合体化することによって、加水分解時に、複合体から放出される薬物は、シクレソニド単独の全身投与後と同様に、活性誘導体であるデス−シクレソニドである。
【０４２８】
デス−シクレソニドは、ジカルボン酸リンカーまたは本明細書に記載の他の不安定なリンカーを介して本明細書に開示される任意のペプチドと容易に統合し、複合体化し、または融合する。得られる薬物−ペプチド複合体におけるペプチドは、配列番号２１〜配列番号２４７または配列番号２８２〜配列番号５１０から選択されるアミノ酸配列を有する任意のペプチドであり得る。ペプチドは、配列番号１０５、配列番号１０３、または配列番号１８４に示されるアミノ酸配列を有するペプチドであり得る。そのようなペプチド−薬物複合体を、本明細書に記載されるような切断可能なまたは安定なリンカー（例えば、表２に示されているもの）を使用して、かつ本明細書に記載の合成方法のいずれか、例えば、実施例５〜実施例１９、または実施例２９に示されているものを使用して生成する。
【０４２９】
この例のＰＤＣで使用されるリンカーには、表２に示される任意のリンカー部位１〜２２、その異性体、立体異性体、またはその誘導体が含まれ得る。ジカルボン酸リンカーは、コハク酸などの線状ジカルボン酸、またはコハク酸無水物などの関連する環状無水物である。無水物との反応は、様々な条件下で進行し得る。例えば、デス−シクレソニドと５モル当量のグルタル酸無水物との反応を、室温で無水ピリジン中で行う。ジカルボン酸との反応は、カルボジイミドカップリング法を使用して行われ得る。例えば、デス−シクレソニドを、１モル当量のジメチルコハク酸、１モル当量の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（または別のカルボジイミド）、及び０．２モル当量の４−ジメチルアミノピリジンと反応させる。この例で使用される追加の複合体には、ＤＭＡリンカーまたはトランス−１−アミノメチル−シクロヘキシル−４−カルボン酸（すなわち、カルバメート）リンカーを含むものが含まれる。ＤＭＡリンカーを含む複合体は、類似化合物のためのものを含む、本明細書に記載されているようなストラテジー（例えば、本明細書に記載されているように、例えば、水酸化リチウムを使用した２，５−ジメチルアジピン酸の加水分解及び合成、ならびに例えば、実施例５に記載されているようなエステル結合形成−合成を含む）を使用して合成される。カルバメートリンカーを含む複合体は、例えば、実施例６に記載されているように、同様の複合体について本明細書に記載されているように合成される。
【０４３０】
ペプチド−デス−シクレソニド複合体は、それを必要とする対象に投与され、軟骨及び／または腎臓にホーミングし、それを標的とし、それに誘導され、それによって保持され、それに蓄積し、それに移動し、及び／またはそれに結合する。対象は、ヒトまたは動物であり、軟骨または腎臓組織において炎症を有する。任意に、対象は、変形性関節症、関節リウマチ、強直性脊椎炎、ループス関節炎、全身性エリテマトーデス、またはループス腎炎を有する。ペプチド−デス−シクレソニド複合体を投与すると、軟骨及び／または腎臓の炎症が緩和される。
【０４３１】
実施例４３
治療剤を用いたペプチドホーミング
この例は、シスチン高密度ペプチドに複合体化した治療剤を含む所定の例示的な複合
体を記載する。
【０４３２】
本開示のペプチド（例えば、配列番号２１〜配列番号２４７または配列番号２８２〜配列番号５１０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するペプチド）を、例えば、実施例１及び実施例２でそれぞれ本明細書に記載されているように組換え的に発現させるか、または化学的に合成する。次いで精製したペプチドをリンカー（例えば、表２、化合物１〜２０に記載の任意のリンカー）を介して薬物（例えば、グルココルチコイドなどの抗関節炎剤）に連結させる。ペプチド−薬物複合体を実施例５〜実施例１９、または実施例２９のいずれか１つに記載されているように合成する。この試験で使用される薬物は、上述した技術を使用して、パクリタキセル、デキサメタゾン、ブデソニド、デス−シクレソニド、またはトリアムシノロンアセトニドを含むがこれらに限定されない本明細書に記載されているものなどの治療用化合物である。１つのペプチド当たり１つ以上の薬物が複合体化されるか、または１つのペプチド当たり平均で１つ未満の薬物が複合体化される。
【０４３３】
配列番号２１〜配列番号２４７または配列番号２８２〜配列番号５１０のいずれかのペプチドにこれらの薬物を結合させることは、薬物を対象の軟骨へ標的化する。１つ以上の薬物−ペプチド複合体をヒトまたは動物に投与する。ペプチドは、ＤまたはＬ構成の少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。
【０４３４】
実施例４４
軟骨外植片への複合体の結合
この例は、培養中のヒト及び動物の軟骨外植片に結合する本開示の複合体のペプチドを示す。ペプチドは、配列番号２１〜配列番号２４７または配列番号２８２〜配列番号５１０のペプチドのいずれか１つから選択される。ペプチドは、ＤまたはＬ構成の少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。
【０４３５】
本開示のペプチド（例えば、配列番号２１〜配列番号２４７または配列番号２８２〜配列番号５１０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するペプチド）を、例えば、実施例１及び実施例２でそれぞれ本明細書に記載されているように組換え的に発現させるか、または化学的に合成する。次いで精製したペプチドをリンカー（例えば、表２、化合物１〜２０に記載の任意のリンカー）を介して薬物（例えば、グルココルチコイドなどの抗関節炎剤）に連結させる。ペプチド−薬物複合体を実施例５〜実施例１９、または実施例２９のいずれか１つに記載されているように合成する。この試験で使用される薬物は、パクリタキセル、デキサメタゾン、ブデソニド、デス−シクレソニド、またはトリアムシノロンアセトニドを含むがこれらに限定されない本明細書に記載されているものなどの治療用化合物である。
【０４３６】
次いでそのようなペプチド複合体をヒトまたは動物に由来する軟骨外植片と共にインキュベートする。複合体は、軟骨外植片に結合していることが判明する。結合は、液体シンチレーション計数、共焦点顕微鏡法、免疫組織化学、ＨＰＬＣ、またはＬＣ／ＭＳを含むがこれらに限定されない様々な方法を使用して確認される。
【０４３７】
実施例４５
軟骨細胞における複合体局在化
この例は、動物における軟骨内の軟骨細胞への本開示の複合体の結合を示す。染色及び画像化に利用可能な薄い凍結切片をもたらす動物全体の矢状切片を調製する。投薬期間の終了時に、動物を安楽死させ、軟骨を染色及び画像化手順で使用するために除去する。以下の軟骨成分のうちの１つ以上を標準的な染色技術を使用して薄い凍結切片または生存軟骨外植片において同定する：コラーゲン線維、グリコサミノグリカン、または軟骨細胞。本開示のペプチド複合体（例えば、上記で実施例５〜実施例１９、または実施例２９で示されているように記載され、合成されたもの）は、軟骨における軟骨細胞に局在化することが判明する。局在化は、顕微鏡法によって可視化され、確認される。ペプチドは、ＤまたはＬ構成の少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。
【０４３８】
実施例４６
軟骨細胞外マトリックスにおける複合体局在化
この例は、軟骨細胞外マトリックスにおける本開示の複合体のペプチドの局在化を示す。本開示の複合体のペプチドは、動物における軟骨内の細胞外マトリックスに結合する。薄い凍結切片または生存軟骨の外植片を、実施例２１に記載されているように取得し、染色し、可視化する。本開示のペプチド複合体（例えば、上記で実施例５〜実施例１９、または実施例２９で示されているように記載され、合成されたもの、例えば、化合物２３〜５６）は、軟骨における細胞外マトリックスに局在化することが判明する。局在化は、顕微鏡法によって可視化され、確認される。ペプチドは、ＤまたはＬ構成の少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。
【０４３９】
実施例４７
関節炎の関節への複合体のホーミング
この例は、関節炎を有するヒトまたは動物における軟骨への複合体のホーミングを示す。
【０４４０】
本開示のペプチド（例えば、配列番号２１〜配列番号２４７または配列番号２８２〜配列番号５１０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するペプチド）を、例えば、実施例１及び実施例２でそれぞれ本明細書に記載されているように組換え的に発現させるか、または化学的に合成する。次いで精製したペプチドをリンカー（例えば、表２、化合物１〜２２に記載の任意のリンカー）を介して薬物（例えば、グルココルチコイドなどの抗関節炎剤）に連結させる。ペプチド−薬物複合体を実施例５〜実施例１９、または実施例２９のいずれか１つに記載されているように合成する（例えば、化合物２３〜５６）。この試験で使用される薬物は、パクリタキセル、デキサメタゾン、ブデソニド、デス−シクレソニド、またはトリアムシノロンアセトニドを含むがこれらに限定されない本明細書に記載されているものなどの治療用化合物である。
【０４４１】
ペプチドは、ＤまたはＬ構成の少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。複合体をヒトまたは動物に皮下、静脈内、または経口で投与するか、または関節内に直接注射する。複合体は、軟骨（例えば、足首または関節の軟骨）にホーミングし、治療効果を引き出すのに好適な軟骨に保持される。
【０４４２】
実施例４８
非ヒト動物における軟骨への複合体のホーミング
この例は、非ヒト動物における軟骨にホーミングする本開示の複合体を示す。非ヒト動物には、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、非ヒト霊長類、ラット、マウス、及び他の非ヒト動物が含まれるがこれらに限定されない。
【０４４３】
本開示のペプチド（例えば、配列番号２１〜配列番号２４７または配列番号２８２〜配列番号５１０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するペプチド）を、例えば、実施例１及び実施例２でそれぞれ本明細書に記載されているように組換え的に発現させるか、または化学的に合成する。次いで精製したペプチドをリンカー（例えば、表２、化合物１〜２０に記載の任意のリンカー）を介して薬物（例えば、グルココルチコイドなどの抗関節炎剤）に連結させる。ペプチド−薬物複合体を実施例５〜実施例１９、または実施例２９のいずれか１つに記載されているように合成する。この試験で使用される薬物は、パクリタキセル、デキサメタゾン、ブデソニド、デス−シクレソニド、またはトリアムシノロンアセトニドを含むがこれらに限定されない本明細書に記載されているものなどの治療用化合物である。
【０４４４】
ペプチドは、ＤまたはＬ構成の少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。複合体を非ヒト動物に皮下、静脈内、または経口で投与するか、または関節内に直接注射する。生体内分布は、ＬＣ／ＭＳ、オートラジオグラフィ、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）、または蛍光画像化によって評価される。複合体は、非ヒト動物における軟骨にホーミングする。
【０４４５】
実施例４９
切断可能なリンカーを有する複合体
この例は、切断可能なリンカーを有する複合体の調製を記載する。
【０４４６】
本開示のペプチド（例えば、配列番号２１〜配列番号２４７または配列番号２８２〜配列番号５１０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するペプチド）を、例えば、実施例１及び実施例２でそれぞれ本明細書に記載されているように組換え的に発現させるか、または化学的に合成する。
【０４４７】
次いで精製されたペプチドを、標準的な１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）または他の好適な生体複合体化化学（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）をベースとする化学または塩化チオニルもしくは塩化リンをベースとする生体複合体化）を使用して、エステル結合などの切断可能なリンカーを介して抗炎症剤などの抗関節炎剤（例えば、デキサメタゾン、デス−シクレソニドなど）に複合体化する。リンカーは、エステラーゼ、ＭＭＰ、カテプシンＢ、プロテアーゼ、またはトロンビンによって切断される。ペプチドは、ＤまたはＬ構成の少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。
【０４４８】
得られた複合体をヒトまたは動物に皮下、静脈内、または経口で投与するか、または関節内に直接注射して疾患を治療する。ペプチドは、切断剤によって消化によって抗関節炎／抗炎症剤から切断され得る。
【０４４９】
実施例５０
複合体の関節内投与
この例は、本開示の複合体の関節内投与を示す。
【０４５０】
本開示のペプチド（例えば、配列番号２１〜配列番号２４７または配列番号２８２〜配列番号５１０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するペプチド）を、例えば、実施例１及び実施例２でそれぞれ本明細書に記載されているように組換え的に発現させるか、または化学的に合成する。次いで精製したペプチドをリンカー（例えば、表２、化合物１〜２２に記載の任意のリンカー）を介して薬物（例えば、グルココルチコイドなどの抗関節炎剤）に連結させる。ペプチド−薬物複合体を実施例５〜実施例１９、または実施例２９のいずれか１つに記載されているように合成する。この試験で使用される薬物は、パクリタキセル、デキサメタゾン、ブデソニド、デス−シクレソニド、またはトリアムシノロンアセトニドを含むがこれらに限定されない本明細書に記載されているものなどの治療用化合物である。ペプチドは、ＤまたはＬ構成の少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。
【０４５１】
複合体を、それを必要とする対象に関節内投与を介して投与する。複合体の小さなサイズ、及び複合体による軟骨成分の結合に起因して、軟骨は、複合体によって侵入される。複合体は軟骨と結合し、この結合により軟骨内での滞留時間がより長くなる。任意に、注射された物質は、凝集し、結晶化し、または結合体を形成し、貯蔵体効果をさらに延長し、より長い滞留時間に寄与する。
【０４５２】
実施例５１
全身性エリテマトーデスのための治療
この例は、本開示のペプチド−薬物複合体を使用する、ループス腎炎及び／またはループス関節炎として知られている疾患の形態を含む、全身性エリテマトーデスの治療を示す。本開示のペプチドは、組換え的に発現されるか、または化学的に合成され、デキサメタゾン、ブデソニド、デス−シクレソニド、またはトリアムシノロンアセトニドなどの例示的な薬物を含むグルココルチコイドなどの治療用化合物に複合体化または融合される。薬物−ペプチド複合体におけるペプチドは、アミノ酸配列が配列番号１０５、配列番号１０３、または配列番号１８４のいずれかに示されるペプチドであり得る。ペプチドは、配列番号２１〜配列番号２４７または配列番号２８２〜配列番号５１０から選択されるアミノ酸配列を有する任意のペプチドであり得る。そのようなペプチド−薬物複合体は、本明細書に記載されるような切断可能なまたは安定なリンカーのいずれかを使用して合成される。
【０４５３】
ペプチド−薬物複合体は、ループスのための治療剤として薬学的組成物で対象に投与される。ペプチドは、配列番号２１〜配列番号２４７または配列番号２８２〜配列番号５１０のペプチドのいずれか１つから選択される。本開示の１つ以上のペプチドまたはペプチド複合体は、対象に投与される。対象は、ヒトまたは動物であり得る。薬学的組成物は、皮下、静脈内、経口、または直接注射で投与される。ペプチドまたはペプチド複合体は、ループス腎炎に罹患した腎臓及び／またはループス関節炎に冒された軟骨を標的とする。対象のループスの病態は、遅延、軽減または改善される。
【０４５４】
実施例５２
非末端アルケンまたはアルキンを使用したペプチド−薬物複合体の官能化
この例は、非末端アルケン及び／またはアルキンを使用した本開示のペプチド−薬物複合体（ＰＤＣ）の官能化を実証する。
【０４５５】
本開示のペプチド（例えば、配列番号２１〜配列番号２４７または配列番号２８２〜配列番号５１０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するペプチド）を、例えば、実施例１及び実施例２でそれぞれ本明細書に記載されているように組換え的に発現させるか、または化学的に合成する。ペプチド−薬物複合体を実施例５〜実施例１９、または実施例２９のいずれか１つに記載されているように合成する。この試験で使用される薬物は、パクリタキセル、デキサメタゾン、ブデソニド、デス−シクレソニド、またはトリアムシノロンアセトニドを含むがこれらに限定されない本明細書に記載されているものなどの治療用化合物である。ペプチドは、ＤまたはＬ構成の少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。
【０４５６】
ヒドロハロゲン化と、それに続く求核置換によるＰＤＣの官能化
ＰＤＣの官能化は、活性剤（例えば、グルココルチコイド）、検出可能剤（例えば、蛍光色素）、ＰＤＣの半減期を変化させる薬剤、ＰＤＣの貯蔵体効果を変化させる薬剤、軟骨におけるＰＤＣの取り込み及び／または保持を変化させる薬剤、またはそれらの組み合わせなどの分子の付加を含む。
【０４５７】
精製されたペプチドをリンカーを介して分子に連結させる。そのようなリンカーは、以下の構造を有するアルケン官能性を含む：
【化６１】
2021522172.tif 000101
【０４５８】
臭化水素を使用してＰＤＣのリンカーのアルケン官能基をヒドロハロゲン化することにより分子をＰＤＣに結合させる。アルケンを含むＰＤＣを水性臭化水素と反応させて、一臭素化ＰＤＣ生成物を形成し、その後これを精製し、単離する。次いで臭化物置換基を含むＰＤＣを、求核性官能基を含み、かつ求核置換反応でＰＤＣ上で臭化物置換基に置き換わる分子（例えば、活性剤（例えば、グルココルチコイド）、検出可能剤（例えば、蛍光色素）、ＰＤＣの半減期を調節する薬剤、ＰＤＣの貯蔵体効果を調節する薬剤など）と反応させ、それによってその分子をＰＤＣに結合させる。次いで官能化したＰＤＣを精製し、特徴付ける。
【０４５９】
１，３−双極性環化付加によるＰＤＣの官能化
ＰＤＣの官能化は、活性剤（例えば、グルココルチコイド）、検出可能剤（例えば、蛍光色素）、ＰＤＣの半減期を変化させる薬剤、ＰＤＣの貯蔵体効果を変化させる薬剤、軟骨におけるＰＤＣの取り込み及び／または保持を変化させる薬剤、またはそれらの組み合わせなどの分子の付加を含む。
【０４６０】
精製されたペプチドをリンカーを介して分子に連結させる。そのようなリンカーは、以下の構造を有するアルキン官能性を含む：
【化６２】
2021522172.tif 000102
【０４６１】
ＰＤＣのリンカーのアルキン官能基及び１，３−双極子を含有する分子の１，３−双極性環化付加を介して分子をＰＤＣに結合させる。
【０４６２】
アルキン官能基を含むＰＤＣを、１，３−双極子を含有する分子と反応させて、置換５員環を形成し、それによって分子をＰＤＣに結合させて、官能化したＰＤＣを形成する。次いで官能化したＰＤＣを精製し、特徴付ける。
【０４６３】
官能化したＰＤＣは、関節内、全身、または経口投与を介してそれを必要とする対象に投与され、軟骨組織に蓄積する。
【０４６４】
結果は、ペプチド及び／またはＰＤＣの標的化、ホーミング、結合、または蓄積特性を損なうことなく、良好な化学的収率で、官能化したＰＤＣが合成され得ることを実証する。これらの官能化したＰＤＣは、治療機能を増加させ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＤＣを追跡し、ＰＤＣの血漿半減期を変化させ、貯蔵体効果を変化させ、及び／またはＰＤＣの加水分解特性を変化させるために使用され得る。
【０４６５】
本開示の好ましい実施形態が本明細書に示され、記載されているが、そのような実施形態は、例示のためだけに提供されていることは当業者には明らかである。本開示は、本明細書内に提供される特定の例によって限定されることは意図されていない。本開示は、前述の明細書を参照して説明されているが、本明細書における実施形態の説明及び例示は、限定的な意味で解釈されることを意味していない。多数の変形、変更、及び置換が今では、本開示から逸脱することなく、当業者が想起する。さらに、本開示のすべての実施形態は、様々な条件及び可変要素に依存する、本明細書に示された特定の図示、構成または相対的割合に限定されないことが理解されるべきである。本明細書に記載の本開示の実施形態の様々な代替手段が、本開示の実施において採用され得ることが理解されるべきである。それ故、本開示はまた、そのような代替手段、改変物、変形物、または均等物を包含するべきであることが企図される。以下の特許請求の範囲が本開示の範囲を定義すること、及びこれらの請求項の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの均等物がそれによって包含されることが意図されている。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
2021522172.tif 000199
【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０Ａ】
2021522172.tif 000202
【図２０Ｂ】
2021522172.tif 000203
【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
2021522172.tif 000205
【図２０Ｅ】
2021522172.tif 000206
【図２０Ｆ】
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【図２０Ｇ】
2021522172.tif 000208
【図２０Ｈ】
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【図２０Ｉ】
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【図２０Ｊ】
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【図２０Ｋ】
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【図２０Ｌ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021522172.tif 000231
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