(57)【要約】  本出願で説明されている本発明は、（ヒト）多能性幹細胞からオリゴ皮質スフェロイドを生成する方法を提供する。そのように生成された皮質スフェロイドは、例えば、軸索のミエリン形成を生じ得、且つミエリン疾患及び薬物効果をモデル化し得る成熟オリゴデンドロサイトを産生する。【選択図】図１Ａ
2021521790.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞（ＰＳＣ）からオリゴ皮質スフェロイド（ＯＣＳ）を生成する方法であって、
ａ）前記多能性幹細胞の神経皮質パターン形成により神経皮質スフェロイド（ＮＣＳ）を生成する工程と、
ｂ）前記神経皮質スフェロイドを、規定されたオリゴデンドロサイト系統の増殖因子及び／又はホルモンに、定められたタイミングで曝露させて、前記神経皮質スフェロイド内の天然のオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）集団の増殖、生存、及び／又は拡大を促進し、それによりオリゴ皮質スフェロイドを生成する工程と
を含み、
前記オリゴ皮質スフェロイドは、軸索のミエリン形成を生じ得るミエリン形成オリゴデンドロサイト（ＯＤＣ）に分化し得るオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を含む、
方法。
【請求項２】
前記規定されたオリゴデンドロサイト系統の増殖因子及びホルモンは、血小板由来の増殖因子−ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ）及びインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
オリゴデンドロサイト分化を誘発するための追加の増殖因子及び／又はホルモンへの定められたタイミングでの曝露をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記追加の増殖因子及び／又はホルモンは、甲状腺ホルモン（Ｔ３）、クレマスチン、及び／又はケトコナゾールを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程ｂ）を、受胎の約１０週間後と同等の時点で実行するか、又は工程ａ）の開始の約５０〜６０日後に実行する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴデンドロサイト分化を誘発するための追加の増殖因子及び／又はホルモンへの定められたタイミングでの曝露を、受胎の約１４週間後と同等の時点で実行するか、又は工程ａ）の開始の約６０〜７０日後に実行する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞系統に由来するか、又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）系統に由来する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程ｂ）を、約１０日の期間にわたり実行する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程ａ）の終了時の前記神経皮質スフェロイドは、オリゴデンドロサイト系統細胞を実質的に含まない（例えば、転写因子ＯＬＩＧ２及びＳＯＸ１０等の１種又は複数種の標準的なＯＰＣマーカーの免疫染色の欠如又は最小限の免疫染色により証明される）、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｂ）の終了時の前記オリゴ皮質スフェロイドは、工程ｂ）により処理されていない同年齢の神経皮質スフェロイドと比較して実質的に増加しているＯＰＣを含む（例えば、１種又は複数種の標準的なＯＰＣマーカー、例えば、ＯＬＩＧ２及びＳＯＸ１０等の転写因子、プロテオリピドタンパク質１（ＰＬＰ１）等のオリゴデンドロサイト膜タンパク質、並びにＭＹＲＦ等のＣＮＳ中のオリゴデンドロサイトで特異的に発現される転写因子の免疫染色の増加により証明される）、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記多能性幹細胞は、疾患を有する対象から単離されたｉＰＳＣである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記疾患は、ミエリン産生の欠損を特徴とするか、又はミエリン若しくはその機能の喪失に起因する／関連する欠損を特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記疾患は、ペリツェウス・メルツバッヘル病（ＰＭＤ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＰＭＤは、ＰＬＰ１遺伝子座全体の欠失を特徴とするか、ＰＬＰ１遺伝子座全体の重複を特徴とするか、又はＰＬＰ１での点変異（ｃ．２５４Ｔ＞Ｇ）を特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法を使用して生成されているオリゴ皮質スフェロイド。
【請求項１６】
多能性幹細胞から発生したオリゴ皮質スフェロイドであって、軸索のミエリン形成を生じ得るミエリン形成オリゴデンドロサイトに分化し得るオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を含むオリゴ皮質スフェロイド。
【請求項１７】
軸索のミエリン形成を生じ得るミエリン形成オリゴデンドロサイトをさらに含む請求項１６に記載のオリゴ皮質スフェロイド。
【請求項１８】
ミエリン産生の欠損を特徴とする疾患を処置するのに有効な薬物をスクリーニングする方法であって、候補薬物のライブラリ由来の複数種の候補薬物をそれぞれ個別に、前記疾患を有する個体由来の多能性幹細胞から発生したオリゴ皮質スフェロイドと接触させる工程と、前記疾患を処置するのに有効であるとして、ミエリン産生の欠損を軽減する／ミエリンの量又は機能を回復させる／ミエリン喪失を予防する１種又は複数種の候補薬物を同定する工程とを含む方法。
【請求項１９】
前記疾患を有する動物に、有効であると同定された候補薬物を投与する工程をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
個体はヒトである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記動物は、前記疾患のモデルとしてのマウスである、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
この国際特許出願は、２０１８年４月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／６５８，９０１号明細書及び２０１８年７月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／７００，４７２号明細書に対する出願日の利益を主張し、上記出願のそれぞれの内容全体（あらゆる図面及び配列表を含む）は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府の支援
本発明は、国立衛生研究所から授与された助成金ＮＳ０９３３５７、ＮＳ０９５２８０、ＧＭ００７２５０、ＨＤ０８４１６７、及びＣＡ０４３７０３の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
ヒト皮質形成は、別々の細胞集団の協調した生成、遊走、及び成熟を必要とする複雑なプロセスである。多くのグループが、インビトロでの２Ｄ培養及び分化中の神経細胞の強制的な凝集によりオリゴデンドロサイトを生成しているが、ｈＰＳＣ由来の皮質スフェロイドは、内因性分化プログラムを利用して、発生中のヒト脳に存在する局部的な組織化及び皮質の層化を再現する。
【０００４】
インビトロでの３次元（３Ｄ）組織の生成の進歩は、ヒトの神経発達及び疾患を研究する能力を改善している。ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）由来の３Ｄ培養物は、「オルガノイド」又は「スフェロイド」と呼ばれており、複雑な発生プロセス、細胞間相互作用、微小環境、組織構造、及び従来のインビトロでの培養ではアクセスできない拡張された時間的力学を再現する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
複数のグループが、ヒト大脳皮質をパターン形成するのに必要な細胞の増殖、遊走、組織化、及び成熟の協調ラウンドをモデル化するためのプロトコールを開発している。この多能性幹細胞由来の「皮質スフェロイド」は、別々の皮質層に自己組織化し且つ機能する神経ネットワークを確立する複数の皮質細胞型（例えば、神経前駆細胞、成熟ニューロンサブタイプ、及びアストロサイト）を生成することが示されている。しかしながら、皮質スフェロイドの単一細胞分析により、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）の存在を示唆する転写プロファイルが同定されており、希なオリゴデンドロサイトが孤立した形で同定されているが、中枢神経系（ＣＮＳ）のミエリン形成グリア（ｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ  ｇｌｉａ）及び神経起源の３番目に主要な細胞型であるオリゴデンドロサイトの再現性のある生成及び成熟を実証したプロトコールは依然としてない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様では、本発明は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）からオリゴ皮質スフェロイド（ｏｌｉｇｏｃｏｒｔｉｃａｌ  ｓｐｈｅｒｏｉｄ）（ＯＣＳ）を生成する方法であって、ａ）前記多能性幹細胞の神経皮質パターン形成により神経皮質スフェロイド（ＮＣＳ）を生成する工程と、ｂ）前記神経皮質スフェロイドを、規定されたオリゴデンドロサイト系統の増殖因子及び／又はホルモンに、定められたタイミングで曝露させて、前記神経皮質スフェロイド内の天然のオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）集団の増殖、生存、及び／又は拡大を促進し、それによりオリゴ皮質スフェロイドを生成する工程とを含み、前記オリゴ皮質スフェロイドは、軸索のミエリン形成を生じ得るミエリン形成オリゴデンドロサイト（ＯＤＣ）に分化し得るオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を含む、方法を提供する。
【０００７】
ある特定の実施形態では、この規定されたオリゴデンドロサイト系統の増殖因子及びホルモンは、血小板由来の増殖因子（ＰＤＧＦ）（例えば、ＰＤＧＦ−ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ））、及びインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）を含む。
【０００８】
ある特定の実施形態では、この規定されたオリゴデンドロサイト系統の増殖因子及びホルモンは、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＦＧＦ−２、ＶＥＧＦ、又はこれらの組み合わせ、及びインスリン若しくはＩＧＦ−１、又はこれらの組み合わせを含む。
【０００９】
ある特定の実施形態では、この方法は、オリゴデンドロサイト分化を誘発するための追加の増殖因子及び／又はホルモンへの定められたタイミングでの曝露をさらに含む。
ある特定の実施形態では、この追加の増殖因子及び／又はホルモンは、甲状腺ホルモン（Ｔ３）、クレマスチン、及び／又はケトコナゾールを含む。
【００１０】
ある特定の実施形態では、工程ｂ）を、受胎の約１０週間後と同等の時点で実行するか、又は工程ａ）の開始の約５０〜６０日後に実行する。
ある特定の実施形態では、オリゴデンドロサイト分化を誘発するための追加の増殖因子及び／又はホルモンへの定められたタイミングでの曝露を、受胎の約１４週間後と同等の時点で実行するか、又は工程ａ）の開始の約６０〜７０日後に実行する。
【００１１】
ある特定の実施形態では、この多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞系統に由来するか、又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）系統に由来する。
ある特定の実施形態では、工程ｂ）を、約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５日の期間にわたり実行する。
【００１２】
ある特定の実施形態では、工程ａ）の終了時の神経皮質スフェロイドは、オリゴデンドロサイト系統細胞を実質的に含まない。オリゴデンドロサイト系統細胞の欠如は、オリゴデンドロサイト系統細胞の任意のマーカー（例えば、転写因子ＯＬＩＧ２及びＳＯＸ１０等の１種又は複数種の標準的なＯＰＣマーカー）により検証され得る。
【００１３】
ある特定の実施形態では、工程ｂ）の終了時のオリゴ皮質スフェロイドは、工程ｂ）により処理されていない同年齢の神経皮質スフェロイドと比較して実質的に増加しているＯＰＣを含む。ＯＰＣの増加は、例えば、１種又は複数種の標準的なＯＰＣマーカーの免疫染色の増加により検出され得、及び／又は定量され得る。適切なＯＰＣマーカーとして、ＯＰＣに特異的な転写因子（例えば、ＯＬＩＧ２及びＳＯＸ１０）、オリゴデンドロサイト膜タンパク質マーカー（例えばプロテオリピドタンパク質１（ＰＬＰ１））、並びにＣＮＳ中のオリゴデンドロサイトで特異的に発現される転写因子（例えばＭＹＲＦ）が挙げられ得る。
【００１４】
ある特定の実施形態では、この多能性幹細胞は、疾患を有する対象から単離されたｉＰＳＣである。この実施形態によれば、罹患した個体から単離されたｉＰＳＣから産生されたＯＣＳは、この疾患の処置に有用なモデルであり得る。
【００１５】
ある特定の実施形態では、この疾患は、ミエリン産生の欠損を特徴とするか、又はミエリンの喪失若しくはミエリン機能の喪失に起因する／関連する欠損を特徴とする。
ある特定の実施形態では、この疾患は、ペリツェウス・メルツバッヘル病（ＰＭＤ）である。例えば、ＰＭＤは、ＰＬＰ１遺伝子座全体の欠失を特徴とし得るか、ＰＬＰ１遺伝子座全体の重複を特徴とし得るか、又はＰＬＰ１での点変異（例えばｃ．２５４Ｔ＞Ｇ）を特徴とし得る。
【００１６】
本発明の別の態様は、本発明の方法のいずれかを使用して生成されたオリゴ皮質スフェロイドを提供する。
本発明の別の態様は、多能性幹細胞から発生したオリゴ皮質スフェロイドであって、軸索のミエリン形成を生じ得るミエリン形成オリゴデンドロサイトに分化し得るオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を含むオリゴ皮質スフェロイドを提供する。
【００１７】
ある特定の実施形態では、このオリゴ皮質スフェロイドは、軸索のミエリン形成を生じ得るミエリン形成オリゴデンドロサイトをさらに含む。
本発明の別の態様は、ミエリン産生の欠損又はミエリンの喪失若しくはミエリン機能の喪失に起因する／関連する欠損を特徴とする疾患を処置するのに有効な薬物をスクリーニングする方法であって、候補薬物のライブラリ由来の複数種の候補薬物をそれぞれ個別に、前記疾患を有する個体由来の多能性幹細胞から発生したオリゴ皮質スフェロイドと接触させる工程と、前記疾患を処置するのに有効であるとして、ミエリン産生の欠損を軽減するか、ミエリンの量及び／若しくは機能を回復させるか、又はミエリン喪失を予防する１種又は複数種の候補薬物を同定する工程とを含む方法を提供する。
【００１８】
ある特定の実施形態では、この方法は、この疾患を有する動物に、有効であると同定された候補薬物を投与する工程をさらに含む。例えば、この疾患を有する個体は、ヒトであり得、この動物は、この疾患のモデルとしてのマウスであり得る。
【００１９】
明確に否認されているか又は不適当でない限り、本明細書で説明されている任意の一実施形態を、実施例又は特許請求の範囲でのみ説明されている実施形態を含む１つ又は複数の他の実施形態と組み合わせ得ることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｆは、ヒト皮質スフェロイドでのオリゴデンドロサイトの生成を示す。図１Ａは、スフェロイド生成の概略である。神経皮質スフェロイド（ＮＣＳ）及びオリゴ皮質スフェロイド（ＯＣＳ）を生成するためのプロトコールは、８週目まで同一であり、その後、神経皮質スフェロイドを基本培地で増殖させたが、オリゴ皮質スフェロイドを、５０〜６０日目からＰＤＧＦ−ＡＡ／ＩＧＦ−１で処理し、６０〜７０日目からＴ３で処理した。１４週目に、オリゴデンドロサイトの分化を評価した。色は、ニューロン（赤紫色）、アストロサイト（赤色）、及びＯＰＣ／オリゴデンドロサイト（緑色）を示す。図１Ｂ及び１Ｃは、（ａ）神経皮質プロトコール又は（ｂ）オリゴ皮質プロトコールで生成された、１４週目のＨ７スフェロイドの代表的な蛍光画像である。それぞれに関して、４つの別々の株から生成されたスフェロイドの３の独立したバッチから、同様の結果が得られた。スケールバー、５０μｍ。図１Ｂは、神経皮質プロトコールスフェロイドが、ニューロン（神経フィラメント：赤紫色）及びアストロサイト（ＧＦＡＰ：赤色）を生成するが、オリゴデンドロサイト（ＰＬＰ１：緑色）を生成しないことを示す。図１Ｃは、オリゴ皮質プロトコールスフェロイドが、ニューロン（神経フィラメント：赤紫色）、アストロサイト（ＧＦＡＰ：赤色）、及びオリゴデンドロサイト（ＰＬＰ１：緑色）を生成することを示す。挿入図、より高倍率でのオリゴデンドロサイトの形態。図１Ｄは、神経皮質プロトコール又はオリゴ皮質プロトコールと、ＰＤＧＦ−ＡＡ及びＩＧＦ−１、又はＴ３のみとで生成された１４週目のスフェロイドでのオリゴデンドロサイト系統の核マーカーであるＭＹＲＦの定量を示す。ＭＹＲＦ陽性細胞を、株Ｈ７、Ｈ９、及びＣＷＲＵ１９１の細胞株からの各処理条件に関する４つ又は５つの個々のスフェロイド（ｎ＝４、ＰＤＧＦ／ＩＧＦ又はＴ３処理、ｎ＝５、ＮＣＳ及びＯＣＳ）からの４つの平面から計数して、平均化した（白枠）。エラーバー、標準偏差。同一のバッチからのｎ＝３のスフェロイドを、外部で検証される株ＲＵＥＳ１に使用した。図１Ｅは、神経皮質スフェロイド及びオリゴ皮質スフェロイドでの、ニューロン、アストロサイト、及びオリゴデンドロサイトの遺伝子発現を示す。ヒートマップは、各細胞型に関する１００個の最も細胞特異的な転写産物からなる。オリゴデンドロサイト特異的遺伝子及びアストロサイト特異的遺伝子は、神経皮質スフェロイドと比較してオリゴ皮質で上方制御されている。図１Ｆは、図１Ｅのデータからのニューロン特異的遺伝子発現、アストロサイト特異的遺伝子発現、及びオリゴデンドロサイト特異的遺伝子発現を示す。箱は、第１四分位及び第３四分位にまたがっており、平均で分割されており、ひげは、最大値及び最小値まで及んでいる。図１Ｅ及び１Ｆは、各条件に関する５つのスフェロイドからのＲＮＡ−ｓｅｑを示す。対応のあるノンパラメトリックＷｉｌｃｏｘｏｎマッチドペア符号付き順位検定（ｐａｉｒｅｄ  ｎｏｎ−ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  ｍａｔｃｈｅｄ  ｐａｉｒｓ  ｓｉｇｎｅｄ−ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ）を使用して、有意性を判定した。
【図１−２】図１Ａ〜１Ｆは、ヒト皮質スフェロイドでのオリゴデンドロサイトの生成を示す。図１Ｂ及び１Ｃは、（ａ）神経皮質プロトコール又は（ｂ）オリゴ皮質プロトコールで生成された、１４週目のＨ７スフェロイドの代表的な蛍光画像である。それぞれに関して、４つの別々の株から生成されたスフェロイドの３の独立したバッチから、同様の結果が得られた。スケールバー、５０μｍ。図１Ｂは、神経皮質プロトコールスフェロイドが、ニューロン（神経フィラメント：赤紫色）及びアストロサイト（ＧＦＡＰ：赤色）を生成するが、オリゴデンドロサイト（ＰＬＰ１：緑色）を生成しないことを示す。図１Ｃは、オリゴ皮質プロトコールスフェロイドが、ニューロン（神経フィラメント：赤紫色）、アストロサイト（ＧＦＡＰ：赤色）、及びオリゴデンドロサイト（ＰＬＰ１：緑色）を生成することを示す。挿入図、より高倍率でのオリゴデンドロサイトの形態。
【図１−３】図１Ａ〜１Ｆは、ヒト皮質スフェロイドでのオリゴデンドロサイトの生成を示す。図１Ｄは、神経皮質プロトコール又はオリゴ皮質プロトコールと、ＰＤＧＦ−ＡＡ及びＩＧＦ−１、又はＴ３のみとで生成された１４週目のスフェロイドでのオリゴデンドロサイト系統の核マーカーであるＭＹＲＦの定量を示す。ＭＹＲＦ陽性細胞を、株Ｈ７、Ｈ９、及びＣＷＲＵ１９１の細胞株からの各処理条件に関する４つ又は５つの個々のスフェロイド（ｎ＝４、ＰＤＧＦ／ＩＧＦ又はＴ３処理、ｎ＝５、ＮＣＳ及びＯＣＳ）からの４つの平面から計数して、平均化した（白枠）。エラーバー、標準偏差。同一のバッチからのｎ＝３のスフェロイドを、外部で検証される株ＲＵＥＳ１に使用した。図１Ｅは、神経皮質スフェロイド及びオリゴ皮質スフェロイドでの、ニューロン、アストロサイト、及びオリゴデンドロサイトの遺伝子発現を示す。ヒートマップは、各細胞型に関する１００個の最も細胞特異的な転写産物からなる。オリゴデンドロサイト特異的遺伝子及びアストロサイト特異的遺伝子は、神経皮質スフェロイドと比較してオリゴ皮質で上方制御されている。図１Ｆは、図１Ｅのデータからのニューロン特異的遺伝子発現、アストロサイト特異的遺伝子発現、及びオリゴデンドロサイト特異的遺伝子発現を示す。箱は、第１四分位及び第３四分位にまたがっており、平均で分割されており、ひげは、最大値及び最小値まで及んでいる。図１Ｅ及び１Ｆは、各条件に関する５つのスフェロイドからのＲＮＡ−ｓｅｑを示す。対応のあるノンパラメトリックＷｉｌｃｏｘｏｎマッチドペア符号付き順位検定（ｐａｉｒｅｄ  ｎｏｎ−ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  ｍａｔｃｈｅｄ  ｐａｉｒｓ  ｓｉｇｎｅｄ−ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ）を使用して、有意性を判定した。
【図２−１】図２Ａ〜２Ｌは、オリゴ皮質スフェロイドでのオリゴデンドロサイトの成熟を示す。図２Ａは、オリゴ皮質スフェロイド生成の概略である。図１Ａと同様の色。図２Ｂ〜２Ｄは、２０週目のＨ７オリゴ皮質スフェロイドの代表的な蛍光画像である。スフェロイドの２つの独立したバッチから、同様の結果が得られた。スケールバー、５０μｍ。図２Ｂは、オリゴデンドロサイト系統（ＭＹＲＦ：赤紫色）、ＣＴＩＰ２陽性（黄色）の初期に生じたニューロン、及びＳＡＴＢ２陽性（青緑色）の後期に生じたニューロンのロバストな生成を示す。図２Ｃは、成熟中のオリゴデンドロサイト（ＰＬＰ１：緑色）での線状突起形成を示す。図２Ｄは、成熟したミエリンのマーカーであるＭＢＰ（赤色）の免疫染色であり、成熟の初期段階を示す点状のＭＢＰ発現を示す。図２Ｅ〜２Ｇは、２０週目のＨ７オリゴ皮質スフェロイドの代表的なＥＭである。３種のスフェロイドの単一バッチから、ＥＭ結果が得られた。スケールバー、１μｍ。図２Ｅは、オリゴデンドロサイトによるミエリン形成を受けているニューロンのクラスターを示す。図２Ｆは、緩く圧縮されたミエリンの複数の層に囲まれた軸索を示す。図２Ｇは、軸索を囲む緩く圧縮されたミエリンのより広範な巻き付きを示す。図２Ｈ〜２Ｊは、３０週目のＨ９オリゴ皮質スフェロイドの代表的な蛍光画像である。オリゴ皮質スフェロイドの単一バッチからの４つのスフェロイドから、同様の結果が得られた。スケールバー、５０μｍ。図２Ｈは、ＳＡＴＢ２陽性（青緑色）の表層からのＣＴＩＰ２陽性（黄色）の深層の皮質の積層及び分離を示す。皮質層内には、ＭＹＲＦ陽性（赤紫色）のオリゴデンドロサイトが散在している。図２Ｉは、オリゴデンドロサイトの突起（ＰＬＰ１：赤紫色）トラック（矢印）ニューロン軸索（神経フィラメント：黄色）を示す。図２Ｊは、図２Ｉにおいて枠で囲まれた領域のより高倍率を示す。図２Ｋは、軸索の周りのコンパクトなミエリンを示す３０週目のＨ９オリゴ皮質スフェロイドの電子顕微鏡写真である。スフェロイドの単一バッチからの３つのスフェロイドから、ＥＭ結果が得られた。スケールバー、１μｍ。図２Ｌは、軸索の長さに沿って撮影されたブロック面ＥＭセクションからの３Ｄ再構成である。
【図２−２】図２Ａ〜２Ｌは、オリゴ皮質スフェロイドでのオリゴデンドロサイトの成熟を示す。図２Ｂは、オリゴデンドロサイト系統（ＭＹＲＦ：赤紫色）、ＣＴＩＰ２陽性（黄色）の初期に生じたニューロン、及びＳＡＴＢ２陽性（青緑色）の後期に生じたニューロンのロバストな生成を示す。図２Ｃは、成熟中のオリゴデンドロサイト（ＰＬＰ１：緑色）での線状突起形成を示す。図２Ｄは、成熟したミエリンのマーカーであるＭＢＰ（赤色）の免疫染色であり、成熟の初期段階を示す点状のＭＢＰ発現を示す。図２Ｅ〜２Ｇは、２０週目のＨ７オリゴ皮質スフェロイドの代表的なＥＭである。３種のスフェロイドの単一バッチから、ＥＭ結果が得られた。スケールバー、１μｍ。図２Ｅは、オリゴデンドロサイトによるミエリン形成を受けているニューロンのクラスターを示す。図２Ｆは、緩く圧縮されたミエリンの複数の層に囲まれた軸索を示す。図２Ｇは、軸索を囲む緩く圧縮されたミエリンのより広範な巻き付きを示す。
【図２−３】図２Ａ〜２Ｌは、オリゴ皮質スフェロイドでのオリゴデンドロサイトの成熟を示す。図２Ｈ〜２Ｊは、３０週目のＨ９オリゴ皮質スフェロイドの代表的な蛍光画像である。オリゴ皮質スフェロイドの単一バッチからの４つのスフェロイドから、同様の結果が得られた。スケールバー、５０μｍ。図２Ｈは、ＳＡＴＢ２陽性（青緑色）の表層からのＣＴＩＰ２陽性（黄色）の深層の皮質の積層及び分離を示す。皮質層内には、ＭＹＲＦ陽性（赤紫色）のオリゴデンドロサイトが散在している。図２Ｉは、オリゴデンドロサイトの突起（ＰＬＰ１：赤紫色）トラック（矢印）ニューロン軸索（神経フィラメント：黄色）を示す。図２Ｊは、図２Ｉにおいて枠で囲まれた領域のより高倍率を示す。図２Ｋは、軸索の周りのコンパクトなミエリンを示す３０週目のＨ９オリゴ皮質スフェロイドの電子顕微鏡写真である。スフェロイドの単一バッチからの３つのスフェロイドから、ＥＭ結果が得られた。スケールバー、１μｍ。図２Ｌは、軸索の長さに沿って撮影されたブロック面ＥＭセクションからの３Ｄ再構成である。
【図３】図３Ａ〜３Ｅは、オリゴ皮質スフェロイドでの皮質のパターン形成及び組織化を示す。図３Ａ及び３Ｂは、８週目のＨ７スフェロイドの代表的な蛍光画像である。図３Ａは、初期の神経皮質パターン形成の終わりに、スフェロイドが、脳室様帯へと組織化する神経前駆細胞（ＳＯＸ２：黄色、及びネスチン：青色）の明確な集団を生成することを示す。この細胞はまた、Ｋｉ６７（赤紫色）で標識した場合に、唯一活発に分裂している細胞でもある。図３Ｂは、ＴＢＲ２陽性（青色）の外側ＳＶ２様ゾーンがＳｏｘ２陽性（黄色）の脳室様帯に隣接して現れることを示す。図３Ｃは、ＰＤＧＦ−ＡＡ／ＩＧＦ−１処理までのオリゴ皮質プロトコールにより生成し、次いで、分裂細胞を標識するために９週目（５８日目及び６０日目）の間にＢｒｄＵ（赤紫色）の２回の用量を投与したＨ７スフェロイドの代表的な蛍光画像である。ＢｒｄＵ陽性細胞は、ＳＯＸ２陽性脳室帯に局在しており、このＳＯＸ２陽性脳室帯を初期胚中心と同定する。図３Ｄ及び３Ｅは、神経皮質プロトコール（図３Ｄ）又はオリゴ皮質プロトコール（図３Ｅ）で生成し、９週目（５８日目及び６０日目）の間にＢｒｄＵで処理し、次いで１４週目まで維持したＨ７スフェロイドの代表的な蛍光画像である。オリゴ皮質スフェロイドのみがオリゴデンドロサイト（ＭＹＲＦ：青緑色）を生成し、このオリゴデンドロサイトの多くは、ＢｒｄＵに対して二重陽性である（図３Ｅの箱状の領域の拡大図における矢印、右側に示す）。スケールバー、５０μｍ。
【図４】図４Ａ〜４Ｇは、ミエリン形成促進（ｐｒｏｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ）剤がオリゴ皮質スフェロイドでのオリゴデンドロサイトの生成を促進することを示す。図４Ａ〜４Ｄは、ＰＤＧＦ／ＩＧＦ−１（５０〜６０日目から）で処理し、且つ（図４Ａ）ＤＭＳＯ、（図４Ｂ）Ｔ３、（図４Ｃ）クレマスチン、又は（図４Ｄ）ケトコナゾール（６０〜７０日目から）で処理した１４週目のＨ７スフェロイドの代表的な蛍光画像である。ＤＭＳＯでは、得られたＭＹＲＦ陽性細胞が少ないのに対して、Ｔ３、クレマスチン、及びケトコナゾールでは、ロバストなＭＹＲＦシグナルが得られた。分析には、同一のバッチからの４つのスフェロイドを使用した。スケールバー、５０μｍ。図４Ｅは、図４Ａ〜４ＤからのＭＹＲＦの定量を示す。ＭＹＲＦ陽性細胞を、細胞系統毎にｎ＝４の個々のスフェロイドで計数して（着色された点）平均化した（白色のバー）。エラーバー、標準偏差。有意性を、Ｗｅｌｃｈの補正による両側不対ｔ検定を使用して決定した。図４Ｆ〜４Ｇは、１４週目のＨ７スフェロイドの代表的なＥＭ画像である。スケールバー、５００ｎｍ。図４Ｆは、標準的なオリゴ皮質プロトコール（Ｔ３）で生成されたスフェロイドがミエリンの非存在を示すことを示す。図４Ｇは、Ｔ３の代わりにケトコナゾールで生成されたスフェロイドが、複数の神経軸索を囲む非圧縮ミエリンのロバストな産生を示す。
【図５−１】図５Ａ〜５Ｎは、オリゴ皮質スフェロイドがヒトミエリン疾患の表現型を再現することを示す。図５Ａ〜５Ｌは、１４週目のオリゴ皮質スフェロイドの代表的な蛍光画像である。分析には、同一のバッチから５つ（図５Ａ及び５Ｂ）又は４つ（図５Ｃ〜５Ｌ）のスフェロイドを使用した。スケールバー、５０μｍ。図５Ａ及び５Ｂは、（図５Ａ）ＰＬＰ１：緑色又は（図５Ｂ）ＭＹＲＦ：赤色に関して免疫染色されたＣＷＲＵ１９８スフェロイドを示しており、豊富なオリゴデンドロサイト及びロバストなＰＬＰ１発現を明らかにする。図５Ｃ〜５Ｄは、（図５Ｃ）ＰＬＰ１：緑色又は（図５Ｄ）ＭＹＲＦ：赤色に関して免疫染色されたＰＬＰ１欠失スフェロイドを示しており、豊富なＭＹＲＦ陽性オリゴデンドロサイトにもかかわらずＰＬＰ１の予想される欠如を示す。図５Ｅ及び５Ｆは、（図５Ｅ）ＰＬＰ１：緑色又は（図５Ｆ）ＭＹＲＦ：赤色に関して免疫染色されたＰＬＰ１重複オリゴ皮質スフェロイドを示しており、ＭＹＲＦ陽性オリゴデンドロサイトの豊富さの減少にもかかわらずロバストなＰＬＰ１発現を示す。図５Ｇ及び５Ｈは、（図５Ｇ）ＰＬＰ１：緑色又は（図５Ｈ）ＭＹＲＦ：赤色に関して免疫染色されたＰＬＰ１  ｃ．２５４Ｔ＞Ｇスフェロイドを示しており、ＰＬＰ１の核周囲保持及びＭＹＲＦ陽性オリゴデンドロサイトの存在量の減少を示す。図５Ｉ及び５Ｊは、ＧＳＫ２６５６１５７で処理し且つ（図５Ｉ）ＰＬＰ１：緑色又は（図５Ｊ）ＭＹＲＦ：赤色に関して免疫染色されたＰＬＰ１  ｃ．２５４Ｔ＞Ｇオリゴ皮質スフェロイドを示しており、オリゴデンドロサイトの突起へのＰＬＰ１の動員及びＭＹＲＦ陽性オリゴデンドロサイトの存在量の救出を示す。図５Ｋ及び５Ｌは、（図５Ｋ）ＰＬＰ１：緑色又は（図５Ｌ）ＭＹＲＦ：赤色に関して免疫染色された、ＰＬＰ１  ＣＲＩＳＰＲで補正されたｃ．２５４ＴＧ＞Ｔオリゴ皮質スフェロイドを示しており、ＰＬＰ１の核周囲保持及びオリゴデンドロサイトの存在量の両方の救出を示す。図５Ｍは、図５Ａ〜５Ｌにおける１個のオルガノイド当たりのＭＹＲＦ陽性オリゴデンドロサイトの割合を示す。ＭＹＲＦ陽性細胞を、コントロール系統ＣＷＲＵ１９８のｎ＝５の個々のスフェロイド及び１つの細胞系統当たりｎ＝４の個々のスフェロイドから計数し（着色された点）、平均化した（白枠）。エラーバー、標準偏差。有意性を、Ｗｅｌｃｈの補正による両側不対ｔ検定を使用して決定した。図５Ｎは、３０週目の、ＰＬＰ１  ＣＲＩＳＰＲで補正されたｃ．２５４Ｇ＞Ｔオリゴ皮質スフェロイドの代表的なＥＭであり、軸索を囲むコンパクトなミエリンを示す。ＥＭ分析に、単一バッチからの３つのスフェロイドを使用した。スケールバー、１μｍ。
【図５−２】図５Ａ〜５Ｎは、オリゴ皮質スフェロイドがヒトミエリン疾患の表現型を再現することを示す。図５Ｍは、図５Ａ〜５Ｌにおける１個のオルガノイド当たりのＭＹＲＦ陽性オリゴデンドロサイトの割合を示す。ＭＹＲＦ陽性細胞を、コントロール系統ＣＷＲＵ１９８のｎ＝５の個々のスフェロイド及び１つの細胞系統当たりｎ＝４の個々のスフェロイドから計数し（着色された点）、平均化した（白枠）。エラーバー、標準偏差。有意性を、Ｗｅｌｃｈの補正による両側不対ｔ検定を使用して決定した。図５Ｎは、３０週目の、ＰＬＰ１  ＣＲＩＳＰＲで補正されたｃ．２５４Ｇ＞Ｔオリゴ皮質スフェロイドの代表的なＥＭであり、軸索を囲むコンパクトなミエリンを示す。ＥＭ分析に、単一バッチからの３つのスフェロイドを使用した。スケールバー、１μｍ。
【図６−１】図６Ａ〜６Ｅは、ヒト皮質スフェロイドでのオリゴデンドロサイト前駆体細胞の生成を示す。図６Ａは、スフェロイド生成の概略である。神経皮質スフェロイド（ＮＣＳ）及びオリゴ皮質スフェロイド（ＯＣＳ）を生成するためのプロトコールは、８週目まで同一であった。神経皮質スフェロイドを基本培地で増殖させたが、オリゴ皮質スフェロイドを、５０〜６０日目からＰＤＧＦ−ＡＡ／ＩＧＦ−１で処理してＯＰＣを生成した。ＯＰＣ数の増加を、９週目の最後に評価した。この概略中の色は、ニューロン（赤紫色）、アストロサイト（赤色）、及びＯＰＣ／オリゴデンドロサイト（緑色）を模倣する。図６Ｂ〜６Ｃは、神経皮質プロトコールで生成された８週目（図６Ｂ）及び９週目（図６Ｃ）のＨ７スフェロイドの代表的な蛍光画像である。これらのスフェロイドは、ＯＰＣ（ＯＬＩＧ２：黄色及びＳＯＸ１０：赤紫色）を生成しない。スケールバー、図６Ｂ〜６Ｄの場合は５０μｍ。図６Ｄは、ＰＤＧＡ−ＡＡ／ＩＧＦ−１による処理までのオリゴ皮質プロトコールで生成された９週目のＨ７スフェロイドの代表的な蛍光画像である。これらのスフェロイドは、ＯＰＣ（ＯＬＩＧ２：黄色及びＳＯＸ１０：赤紫色）を生成する。矢印は、ＯＬＩＧ２／ＳＯＸ１０二重陽性細胞を示す。図６Ｅは、神経皮質プロトコール又はオリゴ皮質プロトコールで生成された９週目のスフェロイドでのＯＬＩＧ２陽性ＯＰＣ及びＳＯＸ１０／ＯＬＩＧ２二重陽性ＯＰＣの定量を示す。細胞を、系統Ｈ７、Ｈ９及びＣＷＲＵ１９１の５つの個々のスフェロイド（着色された点）からの３つの平面それぞれから計数し、平均化した（白枠）。エラーバーは標準偏差であり、１つの系統当たり同一バッチからのｎ＝５のスフェロイド。
【図６−２】図６Ａ〜６Ｅは、ヒト皮質スフェロイドでのオリゴデンドロサイト前駆体細胞の生成を示す。図６Ｅは、神経皮質プロトコール又はオリゴ皮質プロトコールで生成された９週目のスフェロイドでのＯＬＩＧ２陽性ＯＰＣ及びＳＯＸ１０／ＯＬＩＧ２二重陽性ＯＰＣの定量を示す。細胞を、系統Ｈ７、Ｈ９及びＣＷＲＵ１９１の５つの個々のスフェロイド（着色された点）からの３つの平面それぞれから計数し、平均化した（白枠）。エラーバーは標準偏差であり、１つの系統当たり同一バッチからのｎ＝５のスフェロイド。
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、３つの追加のヒト多能性系統でのオリゴ皮質プロトコールの検証を示す。図７Ａは、Ｈ９、ＣＷＲＵ１９１、及びＲＵＥＳ１から生成された１４週目のオリゴ皮質スフェロイドでのＰＬＰ１の代表的な蛍光画像である。Ｈ９、ＣＷＲＵ１９１、及びＣＷＲＵ１９８の場合のスフェロイドの３つの独立したバッチ、並びにＲＵＥＳ１の１つのバッチから、同様の結果が得られた。スケールバー、５０μｍ。図７Ｂは、Ｈ９、ＣＷＲＵ１９１、及びＲＵＥＳ１から生成された１４週目のオリゴ皮質スフェロイドでのＭＹＲＦの代表的な蛍光画像である。Ｈ９、ＣＷＲＵ１９１、及びＣＷＲＵ１９８の場合のスフェロイドの３つの独立したバッチ、並びにＲＵＥＳ１の１つのバッチから、同様の結果が得られた。スケールバー、５０μｍ。図７Ｃは、Ｈ７から生成された単一の１４週目のオリゴ皮質スフェロイドでのＭＹＲＦの代表的な蛍光画像を伴う、図１ＤでのＭＹＲＦ定量の概略である。４つパネル（１〜４）は、撮像されており且つ１つのスフェロイド当たり計数された、４つの、等しく拡大されており、大きさが等しく、且つ一貫して分布している領域を示す。１つのスフェロイド当たりの報告された％ＭＹＲＦ陽性細胞は、これら４つの画像の平均である。スケールバー、５０μｍ。
【図８】図８Ａ〜８Ｃは、追加の多能性系統からのオリゴデンドロサイトの成熟を示す。図８Ａは、２０週目のＨ９、ＣＷＲＵ１９１、及びＲＵＥＳ１のオリゴ皮質スフェロイドでのＭＹＲＦ及びＰＬＰ１の発現の代表的な蛍光画像を示す。結果は、系統Ｈ９及びＣＷＲＵ１９１の２つの独立したバッチから生成されたスフェロイド、並びに系統ＲＵＥＳ１の１つのバッチから生成されたスフェロイドの代表である。スケールバー、５０μｍ。図８Ｂは、２０週目のＨ９及びＣＷＲＵ１９１のオリゴ皮質スフェロイドでの軸索周りの複数の緩く圧縮されたミエリンラップの代表的なＥＭ画像を示す。ＥＭ分析を、各系統に関する同一のバッチからの３つのスフェロイドに対して実施した。ＲＵＥＳ１のＥＭ分析は実施しなかった。スケールバー、１μｍ。図８Ｃは、１４週目及び２０週目のＨ７オリゴ皮質スフェロイドでのＳｏｘ１０及びＭＹＲＦの発現の代表的な蛍光画像を示す。結果は、２つの独立したバッチから生成されたスフェロイドの代表である。スケールバー、５０μｍ。
【図９】図９は、オリゴ皮質スフェロイドでのオリゴデンドロサイトのＢｒｄＵに基づく運命マッピングである。ＰＤＧＦ−ＡＡ／ＩＧＦ−１処理までのオリゴ皮質プロコトルで生成し、次いで分裂細胞を標識するために９週目（５８日目及び６０日目）にＢｒｄＵの２回の用量を投与した２つの追加のＨ７スフェロイド、及び２つのＨ９スフェロイド、及び２つのＣＷＲＵ１９１スフェロイドの代表的な蛍光画像を示す。２回目のＢｒｄＵパルスの後、ＢｒｄＵ陽性（赤紫色）細胞の大部分は、ＳＯＸ２陽性（黄色）細胞及びビメンチン陽性（青色）細胞と共に局在する。１４週目までに、ＢｒｄＵ標識細胞の一部は、オリゴデンドロサイトマーカーＭＹＲＦ（青緑色）に関して二重陽性である（高倍率挿入図中の矢印）。パルスチェイス実験を、各系統からのスフェロイドの単一バッチに対して実施し、１つの系統当たり４つのスフェロイドを分析した。スケールバー、５０μｍ。
【図１０】図１０は、１２週目のオリゴ皮質スフェロイドでの細胞集団の単一細胞分析である。示されているのは、Ｎｏｗａｋｏｗｓｋｉ他、２０１７年により生成された単一細胞ヒト胎児脳細胞と比較した、１２週目のＨ７オリゴ皮質スフェロイドからの単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑデータのクラスタリングである。一連の前駆細胞集団は、前駆細胞マーカーであるビメンチン、ＳＯＸ２、ネスチン、及びＳｏｘ６の可視化を通じて、両方のデータセットで明らかであるが、オリゴ皮質スフェロイドのみが、現れるオリゴデンドロサイトクラスター（ＰＬＰ１／ＤＭ２０及びＯＭＧ）の証拠を示す。単一バッチからの１０個のスフェロイドに対して単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑを実施した。
【図１１−１】図１１Ａ〜１１Ｃは、ＰＬＰ１点変異のＣＲＩＳＰＲ補正を示す。図１１Ａは、変異及び一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドドナーを重複するガイドＲＮＡを使用した、患者由来のｈｉＰＳＣでのＰＬＰ１点変異（ＰＬＰ１ｃ．２５４Ｔ＞Ｇ）の補正の概略である。図１１Ｂは、変異親（ＰＬＰ１ｃ．２５４Ｇ）系統のサンガーシークエンシングトレース及び核型である。図１１Ｃは、補正された（ＰＬＰ１ｃ．２５４Ｔ）系統のサンガーシークエンシングトレース及び核型である。
【図１１−２】図１１Ａ〜１１Ｃは、ＰＬＰ１点変異のＣＲＩＳＰＲ補正を示す。図１１Ｂは、変異親（ＰＬＰ１ｃ．２５４Ｇ）系統のサンガーシークエンシングトレース及び核型である。図１１Ｃは、補正された（ＰＬＰ１ｃ．２５４Ｔ）系統のサンガーシークエンシングトレース及び核型である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
大脳オルガノイドは、細胞の組成、相互作用、及び組織化を調べるのに利用可能なシステムを提供するが、中枢神経系のミエリン形成グリアであるオリゴデンドロサイトを欠いている。本明細書で説明されているのは、ヒト多能性幹細胞有来の「オリゴ皮質スフェロイド」においてオリゴデンドロサイト及びミエリンを再現性よく生成する方法である。成熟中のオリゴデンドロサイトと一致する分子的特徴は、培養２０週までに現れ、３０週までにさらなる成熟及びミエリン圧縮が起こる。
【００２２】
ミエリン形成促進剤は、オリゴデンドロサイトの生成及びミエリン形成の速度及び程度を増強し、遺伝的なミエリン障害を有する患者から生成されたスフェロイドは、ヒト疾患表現型を再現する。
【００２３】
そのため、本主題の方法及びそれにより生成されたオリゴ皮質スフェロイドは、発生中の中枢神経系のミエリン形成を研究するための多目的なプラットフォームを提供し、疾患のモデリング及び治療法の開発ための新たな機会を提供する。
【００２４】
本出願人は、先行するニューロンモデルで実証されている全体的な組織化及び局部的な特定を保存しつつ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ−１、及びＴ３等の増殖因子に曝露することにより、皮質スフェロイド中でオリゴデンドロサイト前駆細胞及びミエリン形成オリゴデンドロサイトを再現性よく誘導するための方法を開発した。これらのオリゴ皮質スフェロイド中での全ての主要なＣＮＳ系統の誘導は、ヒト皮質の発生及び疾患を観察するための及び撹乱させるための新たな機会を提供する。
【００２５】
そのため、一態様では、本発明は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）からオリゴ皮質スフェロイド（ＯＣＳ）を生成する方法であって、ａ）前記多能性幹細胞の神経皮質パターン形成により神経皮質スフェロイド（ＮＣＳ）を生成する工程と、ｂ）前記神経皮質スフェロイドを、規定されたオリゴデンドロサイト系統の増殖因子及び／又はホルモンに、定められたタイミングで曝露させて、前記神経皮質スフェロイド内の天然のオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）集団の増殖、生存、及び／又は拡大を促進し、それによりオリゴ皮質スフェロイドを生成する工程とを含み、前記オリゴ皮質スフェロイドは、軸索のミエリン形成を生じ得るミエリン形成オリゴデンドロサイト（ＯＤＣ）に分化し得るオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を含む、方法を提供する。
【００２６】
ある特定の実施形態では、オリゴ皮質スフェロイドは、好ましくは工程ａ）の開始後９、１４、又は２０週目の終了時に、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０％のオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）及び／又は分化したオリゴデンドロサイトを含む。ＯＰＣ及び／又はＯＤＣの割合を、ＯＰＣ／ＯＤＣマーカー（例えばＭＹＲＦ又はＰＬＰ１）を発現する細胞の計数に基づいて測定し得る。この細胞を、図１Ｄ又は図７Ｃで使用した方法に従って計数し得る（例えば、４つ又は５つの個々のスフェロイドからの４つの平面から計数し得る）。
【００２７】
ある特定の実施形態では、この規定されたオリゴデンドロサイト系統の増殖因子及びホルモンは、血小板由来の増殖因子（ＰＤＧＦ）（例えば、ＰＤＧＦ−ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ））、及びインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）を含む。
【００２８】
ある特定の実施形態では、この規定されたオリゴデンドロサイト系統の増殖因子及びホルモンは、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＦＧＦ−２、ＶＥＧＦ、又はこれらの組み合わせ、及びインスリン若しくはＩＧＦ−１、又はこれらの組み合わせを含む。
【００２９】
ある特定の実施形態では、この方法は、オリゴデンドロサイト分化を誘発するための追加の増殖因子及び／又はホルモンへの定められたタイミングでの曝露をさらに含む。
ＯＰＣからのオリゴデンドロサイト分化を誘発することが知られている任意の因子を、本発明のこの工程で使用し得る。ある特定の実施形態では、この追加の増殖因子及び／又はホルモンは、甲状腺ホルモン（Ｔ３）、クレマスチン、及び／又はケトコナゾールを含む。
【００３０】
ある特定の実施形態では、工程ｂ）を、受胎の約１０週間後と同等の時点で実行するか、又は工程ａ）の開始の約５０〜６０日後に実行する。
ある特定の実施形態では、オリゴデンドロサイト分化を誘発するための追加の増殖因子及び／又はホルモンへの定められたタイミングでの曝露を、受胎の約１４週間後と同等の時点で実行するか、又は工程ａ）の開始の約６０〜７０日後に実行する。
【００３１】
ある特定の実施形態では、この多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞系統に由来するか、又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）系統に由来する。
ある特定の実施形態では、工程ｂ）を、約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５日の期間にわたり実行する。
【００３２】
ある特定の実施形態では、工程ａ）の終了時の神経皮質スフェロイドは、オリゴデンドロサイト系統細胞を実質的に含まない。オリゴデンドロサイト系統細胞の欠如は、オリゴデンドロサイト系統細胞の任意のマーカーにより検証され得る。例えば、オリゴデンドロサイト系統細胞の欠如は、転写因子ＯＬＩＧ２及びＳＯＸ１０等の１種又は複数種の標準的なＯＰＣマーカーの欠如又は最小限の免疫染色により検証され得る。
【００３３】
ある特定の実施形態では、工程ｂ）の終了時のオリゴ皮質スフェロイドは、工程ｂ）により処理されていない同年齢の神経皮質スフェロイドと比較して実質的に増加しているＯＰＣを含む。ＯＰＣの増加は、例えば、１種又は複数種の標準的なＯＰＣマーカーの免疫染色の増加により検出され得、及び／又は定量され得る。適切なＯＰＣマーカーとして、ＯＰＣに特異的な転写因子（例えば、ＯＬＩＧ２及びＳＯＸ１０）、オリゴデンドロサイト膜タンパク質マーカー（例えばプロテオリピドタンパク質１（ＰＬＰ１））、並びにＣＮＳ中のオリゴデンドロサイトで特異的に発現される転写因子（例えばＭＹＲＦ）が挙げられ得る。
【００３４】
ある特定の実施形態では、この多能性幹細胞は、疾患を有する対象から単離されたｉＰＳＣである。この実施形態によれば、罹患した個体から単離されたｉＰＳＣから産生されたＯＣＳは、この疾患の処置に有用なモデルであり得る。
【００３５】
ある特定の実施形態では、この疾患は、ミエリン産生の欠損を特徴とするか、又はミエリンの喪失若しくはミエリン機能の喪失に起因する／関連する欠損を特徴とする。
ある特定の実施形態では、この疾患は、ペリツェウス・メルツバッヘル病（ＰＭＤ）である。例えば、ＰＭＤは、ＰＬＰ１遺伝子座全体の欠失を特徴とし得るか、ＰＬＰ１遺伝子座全体の重複を特徴とし得るか、又はＰＬＰ１での点変異（例えばｃ．２５４Ｔ＞Ｇ）を特徴とし得る。
【００３６】
本発明の別の態様は、本発明の方法のいずれかを使用して生成されたオリゴ皮質スフェロイドを提供する。
本発明の別の態様は、多能性幹細胞から発生したオリゴ皮質スフェロイドであって、軸索のミエリン形成を生じ得るミエリン形成オリゴデンドロサイトに分化し得るオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を含むオリゴ皮質スフェロイドを提供する。
【００３７】
ある特定の実施形態では、このオリゴ皮質スフェロイドは、軸索のミエリン形成を生じ得るミエリン形成オリゴデンドロサイトをさらに含む。
本発明の別の態様は、ミエリン産生の欠損又はミエリンの喪失若しくはミエリン機能の喪失に起因する／関連する欠損を特徴とする疾患を処置するのに有効な薬物をスクリーニングする方法であって、候補薬物のライブラリ由来の複数種の候補薬物をそれぞれ個別に、前記疾患を有する個体由来の多能性幹細胞から発生したオリゴ皮質スフェロイドと接触させる工程と、前記疾患を処置するのに有効であるとして、ミエリン産生の欠損を軽減するか、ミエリンの量及び／若しくは機能を回復させるか、又はミエリン喪失を予防する１種又は複数種の候補薬物を同定する工程とを含む方法を提供する。
【００３８】
ある特定の実施形態では、この方法は、この疾患を有する動物に、有効であると同定された候補薬物を投与する工程をさらに含む。例えば、この疾患を有する個体は、ヒトであり得、この動物は、この疾患のモデルとしてのマウスであり得る。
【００３９】
本発明が上記で概して説明されており、本発明のある特定の特徴を、下記のセクションでより詳細にさらに説明する。
神経皮質スフェロイド（ＮＣＳ）の生成
本発明の方法によれば、規定されたオリゴデンドロサイト系統の増殖因子及びホルモンへの定められたタイミングでの曝露により、（ヒト）多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から、神経皮質スフェロイドを生成し得る。
【００４０】
例示的な５０日間プロトコールが、（参照により本明細書に組み込まれるＰａｓｃａ他，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｎｄ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ３Ｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２，６７１−６７８（２０１５））で説明されている。そのため、一実施形態では、神経皮質スフェロイドを、Ｐａｓｃａ他で説明されているこの５０日間プロトコールに従って、（ヒト）多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から生成する。
【００４１】
別の実施形態では、神経皮質スフェロイドを、本明細書で簡単に説明されているように、Ｐａｓｃａ他で説明されているこの５０日間プロトコールの改変バージョンに従って、（ヒト）多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から生成する。
【００４２】
具体的には、多能性幹細胞コロニーを、ビトロネクチン（例えばＧｉｂｃｏ  ＃Ａ１４７００）上で培養する。この細胞コロニーを、１０分にわたり３７℃で、酵素（例えばディスパーゼ（例えばＧｉｂｃｏ  ＃１７１０５−０４１））を使用して回収する。次いで、インタクトなコロニーを、ロック阻害剤（例えばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ＃６８８００１の１０μＭ  Ｙ−２７６３２）、ＡＭＰ−キナーゼ阻害剤（例えばＳｉｇｍａ  ＃Ｐ５４９９の１０μＭ  Ｄｏｒｓｏｐｍｏｒｐｈｉｎ）、及びＴＧＦ−β阻害剤（例えばＳｉｇｍａ  ＃Ｓ４３１７の１０μＭ  ＳＢ−４３１５４２）を含むＳｐｈｅｒｏｉｄ  Ｓｔａｒｔｅｒ培地の適切な量（例えば２００μＬ）で、個々の低付着性組織培養表面（例えばＳ−Ｂｉｏ  Ｐｒｉｍｅ  ＃ＭＳ−９０９６ＶＺのＶ底９６ウェルプレート）に移す。
【００４３】
Ｓｐｈｅｒｏｉｄ  Ｓｔａｒｔｅｒ培地を、２０％  ノックアウト血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１２５８７−０１０）、非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１１１４００５０）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃３５０５００６１）、β−メルカプトエタノール、及び１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１１３２０−０３３）で作製し得る。
【００４４】
次いで、ロック阻害剤を含まない同一の培地を次の５日間にわたり使用し、その後、この培地を、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａベースのスフェロイド培地に交換する。Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａスフェロイド培地は、Ｂ−２７血清代替物が添加されており且つビタミンＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１２５８７）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃３５０５００６１）、及び１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン／ストレプトマイシンが添加されていないＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１０８８８０２２）である。
【００４５】
７〜２５日目から、この培地に、２０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃２３３−ＦＢ−２５／ＣＦ）及び１０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃２３６−ＥＧ−２００）を添加する。
【００４６】
スフェロイドを、培地の半分を毎日交換しつつ、２５日目まで９６ウェルプレート中で培養する。２５日目に、スフェロイドを、１つのウェル当たり８〜１０個のスフェロイドの密度で超低付着性組成培養表面（例えばＣｏｒｎｉｎｇ  ＃ＣＬＳ３４７１の６ウェルプレート）に移し、プロトコールの残り全体を通してこのように培養する。
【００４７】
また、この時点から、このＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａスフェロイド培地に、１％  Ｇｅｌｔｒｅｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ａ１５６９６−０１）を添加した。
Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａスフェロイド培地に、２０ｎｇ／ｍｌ  ＢＤＮＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃２４８−ＢＤ）及び２０ｎｇ／ｍｌ  ＮＴ−３（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃２６７−Ｎ）を補充することにより、２７〜４１日目の間に神経分化を誘発し得る。１７〜４１日目の間で一日おきに、培地の半分の交換を実施し得る。
【００４８】
オリゴ皮質スフェロイド（ＯＣＳ）の生成
オリゴ皮質スフェロイドを生成するために、ＮＣＳを、規定されたオリゴデンドロサイト系統の増殖因子及び／ホルモンに、定められたタイミングで曝露させて、神経皮質スフェロイド内の天然のオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）集団の増殖、生存、及び／又は拡大を促進する。
【００４９】
一実施形態では、５０日目に開始して、１０日にわたり交換する一日おきの培地に、１０ｎｇ／ｍＬ  血小板由来増殖因子−ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ、例えばＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃２２１−ＡＡ−０５０のもの）及び１０ｎｇ／ｍＬ  インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１、例えばＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃２９１−Ｇ１−２００のもの）を添加して、オリゴ皮質スフェロイドを生成する。
【００５０】
そうして生成されたＯＣＳは、軸索のミエリン形成を生じ得るミエリン形成オリゴデンドロサイト（ＯＤＣ）に分化し得るオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を含む。
そうして生成されたＯＣＳを、追加の増殖因子及び／又はホルモンにさらに曝露させて、オリゴデンドライト分割を誘発し得る。
【００５１】
一実施形態では、６０日目に、１０日にわたり交換する一日おきの培地に、４０ｎｇ／ｍＬ  ３，３’，５−トリヨードチロニン（Ｔ３、Ｓｉｇｍａ  ＃ＳＴ２８７７）を添加する。任意選択で、この期間中に低分子も補充し得る。例えば、Ｔ３の代わりに、４μＭ  ケトコナゾール及び２μＭ  クレマスチンを添加し得る。さらに、Ｔ３に加えて、ＧＳＫ２６５６１５７を添加してもよい。
【００５２】
例示的用途
本主題のシステムの検証において、本出願人は、遺伝病のモデル化及び前臨床薬物のスクリーニングでの用途を実証している。本主題のオリゴ皮質スフェロイドを使用して、白質ジストロフィーでの脱髄の理解から多発性硬化症を処置するための再ミエリン形成戦略の開発までの多くの未解決の問題を研究し得た。このシステムを利用して、様々なニューロンクラスでのミエリンの発生、ミエリンの圧縮、結節及び節間部のサイズの調節、並びに単一ニューロン及び全スフェロイドの電気生理の基本的な問題も探求し得る。
【００５３】
オリゴデンドロサイトの局部的な集団は、胚形成中の別々の時期に生じ、遊走し、成熟する。哺乳動物では、腹部由来のオリゴデンドロサイトは、生じる最初の集団の一つであるが、皮質の適切なミエリン形成には必要とされず、大部分は後の皮質由来のオリゴデンドロサイトに置き換えられる。非ヒト霊長類と比較しても、ヒトでのミエリン形成のタイミング及び持続期間は局部的に異なる。ヒトのオリゴ皮質スフェロイドは、ミエリンの発生のこれらの及び他の独自のヒトでの側面を探求するのに利用可能なシステムを提供する。
【実施例】
【００５４】
実施例１  オリゴ皮質スフェロイドの生成
ここで説明されているのは、規定されたオリゴデンドロサイト系統の増殖因子及びホルモンへの定められたタイミングでの曝露による、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）及びミエリン形成オリゴデンドロサイトを含む（ヒト）多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）由来の皮質スフェロイドを生成する例示的なプロトコールである。
【００５５】
まず、本出願人は、５０日間プロトコール（参照により本明細書に組み込まれるＰａｓｃａ他，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｎｄ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ３Ｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２，６７１−６７８（２０１５））の最適化バージョンを使用して、「神経皮質スフェロイド」を生成してパターン形成した。実施例７におけるバリエーションを参照されたい。
【００５６】
初期の神経皮質のパターン形成の後、本出願人は、天然ＯＰＣ集団の拡大を駆動するための血小板由来の増殖因子−ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ）及びインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）による処理（５０〜６０日目＝「９週目」）、続いてオリゴデンドロサイト分化を誘発するための甲状腺ホルモン（Ｔ３）による処理、並びに最終的なミエリン形成（６０〜７０日目＝「１０週目」）によって、「オリゴ皮質スフェロイド」を生成した（図１Ａ）。
【００５７】
ＰＤＧＦ−ＡＡ及びＩＧＦ−１は、ＯＰＣの増殖及び生存を促進する必須の発生マイトジェン（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｍｉｔｏｇｅｎ）であり、Ｔ３は、インビボでＯＰＣからのオリゴデンドロサイトの生成を調節して誘発する。処理期間を経験的に決定したが、受胎後１０週目及び１４週目それぞれでのヒト胎児脳でのＯＰＣ及びオリゴデンドロサイトの初期の特定を反映する。
【００５８】
系統間の変動性を評価して、このプロトコールがロバストであることを実証するために、本出願人は、ヒト胚性幹細胞系統Ｈ７（女性）を使用して、このプロコトルを最初に開発した。次いで、本出願人は、下記の２つの追加の独立したｈＰＳＣ系統を使用して、重要な実験を再現した：胚性幹細胞系統Ｈ９（女性）及びインハウス由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）系統ＣＷＲＵ１９１（男性）。
【００５９】
実施例２  ＯＰＣ及びオリゴデンドロサイトの誘導
８週目での神経皮質のパターン形成の終了までに、神経皮質スフェロイドは、２種の標準的なＯＰＣ転写因子であるＯＬＩＧ２及びＳＯＸ１０の最小限の免疫染色により証明されるように、オリゴデンドロサイト系統中に細胞をほとんど含んでいなかった（図６Ｂ〜６Ｃ）。しかしながら、１０日にわたる、ＰＤＧＦ−ＡＡ及びＩＧＦ−１による、パターン形成されたスフェロイドのその後の処理により、同年齢の未処理の神経皮質スフェロイドと比較して、オリゴ皮質スフェロイド内のＯＰＣの数が実質的に増加した（図６Ｃ〜６Ｅ）。
【００６０】
１４週目までに、神経皮質スフェロイドは、ニューロン及びアストロサイトのロバストな集団を生成していたが、オリゴデンドロサイトは生成しておらず（図１Ｂ）、オリゴ皮質スフェロイド（５０〜６０日目からＰＤＧＦ−ＡＡ／ＩＧＦ−１で処理し、６０〜７０日目からＴ３で処理した）は、最も豊富なオリゴデンドロサイト膜タンパク質であるプロテオリピドタンパク質１（ＰＬＰ１）、及びＣＮＳにおけるオリゴデンドロサイト中で特異的に発現される転写因子であるＭＹＲＦに関する免疫蛍光により実証されるように、３種全てのｈＰＳＣ系統にわたりオリゴデンドロサイトのロバストな集団を再現性よく生成した（図１Ｃ、図７Ａ〜７Ｃ）。
【００６１】
重要なことに、オリゴ皮質スフェロイドは、ＭＹＲＦ陽性オリゴデンドロサイトの産生において、下記の系統間の及びスフェロイド間の低い変動性を示した：Ｈ７、Ｈ９、及びＣＷＲＵ１９１に由来するオリゴ皮質スフェロイドそれぞれに関して総細胞の２１．５９％±４．９％、２０．５３％±３．９％、及び１８．４％±２．２％（定量の概略に関しては図７Ｃを参照されたい）、１つの系統当たりｎ＝５のスフェロイド（図１Ｄ）。
【００６２】
加えて、オリゴデンドロサイト系統のロバストな誘導は、ＰＤＧＦ−ＡＡ／ＩＧＦ−１及びＴ３の両方による連続的処理に依存しており、なぜならば、ＭＹＲＦ陽性オリゴデンドロサイトは、いずれかの個別の処理によってはほとんど産生されなかったからである（図１Ｄ）。
【００６３】
そのため、神経皮質のパターン形成により、オリゴデンドロ生成の構造的枠組み及び細胞的枠組みが確立されるが、この実験では、ＯＰＣ及びオリゴデンドロサイトの再現性のある誘導には、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＩＧＦ−１、及びＴ３が必要である。
【００６４】
このアプローチの再現性をさらに検証するために、このプロトコールを、独立した細胞系統、ヒト胚性幹細胞系統ＲＵＥＳ１（男性）、並びに別個の人員及び試薬を使用して、独立した研究室で再現し、ＭＹＲＦ陽性細胞は、ＲＵＥＳ由来のオリゴ皮質スフェロイド中の細胞の１８．３６％±３．３７％を構成していた（図１Ｄ、図７Ａ〜７Ｂ）。
【００６５】
最後に、バルクスフェロイドのＲＮＡ配列決定を使用して、ＰＤＧＦ−ＡＡ／ＩＧＦ−１処理及びＴ３処理が、同年齢の神経皮質スフェロイドと比較して、オリゴ皮質スフェロイド中でのニューロン遺伝子、アストロサイト遺伝子、及びオリゴデンドロサイト遺伝子の転写にどの程度影響を及ぼすかを包括的に評価した。各細胞型の１００種（ｂｒａｉｎｒｎａｓｅｑ．ｏｒｇからのマウス転写データを使用して定義されたもの）の最も特異的なｍＲＮＡ転写産物の発現に関する１４週目のスフェロイドの分析から、ニューロン遺伝子セットでは有意な変化が実証されなかったが、グリア遺伝性セット（特に、オリゴデンドロサイト系統のもの）の有意な上方制御が示された（図１Ｅ及び１Ｆ）。これらのデータから、オリゴ皮質スフェロイドを生成する方法は、包括的なオリゴデンドロサイト転写プログラムを活性化するが、スフェロイド中の他の細胞型（例えばニューロン）の発現プログラムを明白には変更しないことが実証される。
【００６６】
実施例３  オリゴデンドロサイトの成熟及びミエリン形成
初期のオリゴ皮質のパターン形成の後、数週間から数ヶ月にわたり、スフェロイドを基本培地で維持し得る。本出願人は、２０週目及び３０週目に、ニューロンの多様性及びオリゴデンドロサイトの成熟を分析した（図２Ａ）。２０週目のスフェロイドは、比較的未熟に見える。ＭＹＲＦ陽性オリゴデンドロサイトに加えて、このスフェロイドは、ＣＴＩＰ２で標識された、初期に生じた深層ニューロンの大きな集団、及びＳＡＴＢ２で標識された、後期に生じた表層ニューロンの別のより小さい集団を含んでおり、ＭＹＲＦ陽性オリゴデンドロサイトが全体的に分布していた（図２Ｂ、図８Ａ）。しかしながら、ニューロンの集団は、深層を通る比較的若いＳＡＴＢ２細胞の継続的な遊走と一致する実質的な重複を示した。
【００６７】
オリゴデンドロサイトが成熟するにつれて、隣接する軸索を追跡してそのミエリン形成を生じる細胞突起を伸ばす。ＰＬＰ１発現は、早くも１４週間の培養でロバストであり、ＰＬＰ１免疫蛍光は、２０週目までは別個の突起として解像されなかった（図２Ｃ、図８Ａ）。さらに、これらの突起のサブセットは、初期のミエリン形成のマーカーであるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、図２Ｄ）を発現し始めており、このことは、オリゴデンドロサイトの突起がニューロン軸索と会合していたことを示唆する。電子顕微鏡観察（ＥＭ）から、２０週目には、圧縮されていないミエリンの複数の層を有するヒト軸索の同心円状の（組織化されていないことが多い）巻き付きが明らかになった（図２Ｅ〜２Ｇ、図８Ｂ）。この初期のオリゴ皮質スフェロイドミエリンが組織化されていないことは、インビトロでの培養環境に部分的に起因し得るが、ヒト及びニワトリの両方のインビボでの胎児ミエリン形成の最初期段階に対する顕著な類似性を示す。重要なことに、Ｔ３処理及び広範なオリゴデンドロサイト成熟にもかかわらず、２０週目のオリゴ皮質スフェロイドはまた、ＳＯＸ１０陽性、ＭＲＹＦ陰性のＯＰＣのプールも維持した（図８Ｃ）。
【００６８】
３０週目に、スフェロイドは、別個の皮質層に組織化されているＣＴＩＰ２で標識されたニューロン集団及びＳＡＴＢ２で標識されたニューロン集団を含んでおり、ＳＡＴＢ２集団は大きく、ＣＴＲＰ２層はより小さかった。ＭＹＲＦ陽性オリゴデンドロサイトは、これらの層全体にわたり及びＣＴＩＰ２に隣接する別個の層としての両方で存在した（図２Ｈ）。加えて、オリゴデンドロサイトの突起は、神経フィラメントを発現するニューロン軸索と共局在化する別個のＰＬＰ１陽性のトラクトとしてさらに解像されていた（図２Ｉ〜２Ｊ）。３０週目のＥＭから、コンパクトなミエリンに囲まれたニューロン軸索が同定されており（図２Ｋ）、３Ｄ再構築による一連のブロック面の撮像から、軸索を囲むミエリンの長手方向の巻き付きが実証された（図２Ｌ）。しかしながら、３０週目の時点で、本出願人は、おそらくスフェロイドニューロンの未熟さの継続及び最小限のコヒーレントな電気的活動に部分的に起因して、Ｒａｎｖｉｅｒの結節等のさらなる構造的組織化の決定的な証拠を同定し得なかった（現在の全てのスフェロイド技術及びオルガノイド技術により指摘されている問題）。
【００６９】
まとめると、これらの結果から、ヒトオリゴデンドロサイトによるヒトニューロンの初期のミエリン形成は、わずか２０週間でオリゴ皮質スフェロイドにおいて起こり得、３０週間までに、ミエリンの成熟、精製、及び圧縮が起こることが実証される。このインビトロでのタイミングは、子宮内でのヒト胎児発生の第三期の後半におけるミエリンの出現、並びに齧歯動物ＣＮＳへの移植後のヒトＯＰＣの成熟及びミエリン形成のタイミングと類似しており、このことは、齧歯動物で提案されているようなヒトオリゴデンドロサイトの成熟のための細胞固有の発生時計の存在の可能性を示唆する。
【００７０】
実施例４  インビボでの皮質発生との関連性
本出願人は、次に、本主題のオリゴ皮質スフェロイド内での発生及び細胞の組織化を評価して、インビボでのヒト皮質発生との関連性を実証した。８週目までに、スフェロイドは、分裂するネスチン陽性の神経前駆細胞及びＳＯＸ２陽性の神経前駆細胞のロバストな集団を含んでおり、ＳＯＸ２陽性の脳室様帯及びＴＢＲ２陽性の外側脳室下帯に組織化された（図３Ａ及び図３Ｂ）。全てのＳＯＸ２集団が脳室様空隙を囲んでおらず、多くはスフェロイドの外表面に局在化していたが、ＳＯＸ２陽性の胚中心の配置は、皮質中の脳室帯を連想させた。９週目に、本出願人は、これらの胚中心の増殖中のＳｏｘ２陽性細胞を、チミジン類似体５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）で標識し（図３Ｃ及び図９Ａ）、これらの発生軌跡を追跡した。１４週目までに、ＢｒｄＵ標識細胞は、胚中心から離れて遊走しており、ＳＯＸ２陽性の胚帯とは異なる集団を形成した（図３Ｄ〜３Ｅ、図９Ａ）。この時点で、オリゴ皮質スフェロイドのみがＭＹＲＦ陽性のＯＰＣを含んでおり、この一部はＭＹＲＦ／ＢｒｄＵ二重陽性であった（図３Ｅ及び図９Ａ）。ＢｒｄＵと共局在化したＭＹＲＦは、これらの細胞が、オリゴ皮質スフェロイドの前駆細胞帯で見出されるＢｒｄＵで標識されたＳＯＸ２陽性前駆細胞に由来したことの強力な証拠である。
【００７１】
胚中心から離れるＢｒｄＵパルス前駆細胞（ＢｒｄＵ−ｐｕｌｓｅｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）の遊走は、オリゴ皮質スフェロイドが、増殖して分化する一連のオリゴデンドロサイトを含むことを示唆する。グリア成熟の細胞組成及びスペクトルの包括的な多様性を評価するために、本出願人は、全ての集団が表されるであろうＰＤＧＦ−ＡＡ／ＩＧＦ−１及びＴ３処理直後の初期の時点である１２週目のオリゴ皮質スフェロイドに対して、単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑを実施した。細胞クラスタリングにより、グリア集団とニューロン集団とが大まかに区別された。グリアクラスターは、初期前駆細胞（ビメンチン、ＳＯＸ２、及びネスチンにより標識されている）、ＯＰＣ（ＳＯＸ６により標識されている）、並びに成熟中のオリゴデンドロサイト（ＰＬＰ１及びオリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質により標識されている）を含んでおり、このクラスター全体を通して増殖マーカーが発現しており、成熟マーカーが段階的に明確な亜集団を定義した（図１０Ａ）。この単一細胞分析により、ヒト胎児皮質からの単一細胞トランスクリプトームデータと同様に、発生の複数の段階でのオリゴデンドロサイトの明確な集団がオリゴ皮質スフェロイド中に共存することが実証される（図１０Ａ）。このことは、オリゴ皮質スフェロイドが、ヒトグリアの発生のこれらのほとんどアクセスできない段階を調べるための手段を提供する可能性があることを示唆する。
【００７２】
実施例５  スフェロイドでのミエリン形成促進薬の試験
インビトロ系でヒト軸索のミエリン形成を生じ得るヒトオリゴデンドロサイトを生成する能力は、ヒトミエリンの発生、疾患、及び治療法を探求するための新たな機会を提供する。本出願人は、本主題のヒトオリゴ皮質スフェロイドが、既に同定されているミエリン形成促進薬の既知の効果を再現するかどうかを最初に試験した。
【００７３】
ＦＤＡにより承認されている２種の薬物であるクレマスチン及びケトコナゾールが、インビトロ及びインビボで齧歯動物オリゴデンドロサイトの生成及びミエリン形成の強力な刺激剤であることが分かっている。さらに、クレマスチンは、多発性硬化症患者の第２相の再利用臨床試験において、再ミエリン形成を増強することが最近報告された。ヒトオリゴデンドロサイト生成に対するこれらのミエリン形成促進薬の効果を評価するために、オリゴ皮質スフェロイドを、５０〜６０日目からＰＤＧＦ−ＡＡ／ＩＧＦ−１で処理し、次いで、６０〜７０日目からＤＭＳＯ、Ｔ３、クレマスチン、又はケトコナゾールのいずれかで処理し、続いて、４週にわたり基本培地に戻した。１４週目でのＭＹＲＦ陽性オリゴデンドロサイトの定量により、クレマスチン（１８．７％±２．９４％）及びケトコナゾール（２７．６１％±５．９４１％）はそれぞれ、ビヒクル（ＤＭＳＯ）コントロール（６．３４５％±１．４６％）と比較して、Ｔ３（２１．５９％±４．９％）と同程度までオリゴデンドロサイトの産生を増強することが明らかになった（図４Ａ〜４Ｅ）。注目すべきことに、ＥＭで調べた場合には、ケトコナゾールで処理したスフェロイドはまた、培養１４週目までにミエリン形成も示しており、Ｔ３で処理したスフェロイドと比べて２ヶ月早かった（図４Ｆ〜４Ｇ）。これらの結果から、クレマスチン及びケトコナゾールが、ヒトオリゴデンドロ生成及び成熟を増強して促進することが実証され、且つオリゴ皮質スフェロイドが、ヒト臨床試験前に候補のミエリン治療薬を評価するための生理学的な及び種に関して妥当な前臨床モデルを提供することが実証される。
【００７４】
実施例６  スフェロイドはミエリン障害の病理を再現する
オリゴ皮質スフェロイドは、ヒトミエリン形成とミエリン疾患につながる病理学的プロセスとのこれまでアクセスできなかった段階を研究するための、前例のない組織様の最小限に操作されたシステムを提供する。本出願人は、本主題のシステムが、既知の細胞病理及び機能障害を再現し得るかどうかを試験するために、一遺伝子性の白質ジストロフィーであるペリツェウス・メルツバッヘル病（ＰＭＤ［ＭＩＭ  ３１２０８０］）を調べた。
【００７５】
ＰＭＤは、ミエリン産生の欠損を有する希なＸ連鎖病である。軽度の運動遅滞及び痙縮から幼児期の死亡を伴う重度の筋緊張低下症までの範囲の重症度のスペクトルを示す患者では、原因遺伝子ＰＬＰ１での数百の変異が同定されている。
【００７６】
本出願人は、二次元（２Ｄ）培養を使用して、罹患している男性患者のパネルからＰＭＤ  ｉＰＳＣ由来のオリゴデンドロサイトを既に生成しており、様々な変異を有する個体での明確な細胞表現型及び収束した細胞表現型の両方を実証した。ここで、本出願人は、ＰＭＤ変異が異なる３種のｉＰＳＣ系統（ＰＬＰ１遺伝子座全体の欠失、ＰＬＰ１遺伝子座全体の重複、及びＰＬＰ１での点変異（ｃ．２５４Ｔ＞Ｇ））からオリゴ皮質スフェロイドを生成した。表現型的には、これらの患者は、軽度（欠失）、中程度（重複）、及び重度（点変異）の影響を受けた。起源の性別及び細胞型の両方を制御するために、本出願人は、ＭＹＲＦ（１８．４％±２．２０％）及びＰＬＰ１（図５Ａ〜５Ｂ）を、既に説明されているコントロール系統Ｈ７、Ｈ９、及びＣＷＲＵ１９１と同程度まで発現する健康なコントロール男性ｉＰＳＣ系統由来のインハウスのＣＷＲＵ１９８からスフェロイドを同時に生成した。
【００７７】
オリゴ皮質スフェロイドでは、ＭＹＲＦ陽性オリゴデンドロサイトの豊富さは、疾患の重症度と共に傾いたが、ＰＬＰ１発現の程度は、遺伝的状態と相関した（図５Ｃ〜５Ｈ）。ＰＬＰ１欠失系統は、ＰＬＰ１の予想される非存在にもかかわらず、豊富なＭＹＲＦ陽性オリゴデンドロサイト（１５．１４％±１．９６％）を産生した（図５Ｃ〜５Ｄ、図５Ｍ）。逆に、重複系統は、ＣＷＲＵ１９８（図５Ｆ、図５Ｍ）と比較したＭＹＲＦ陽性オリゴデンドロサイトの有意な減少（１１．８４％±２．２７％）にもかかわらず、豊富なＰＬＰ１シグナルを生じた（図５Ｅ）。
【００７８】
以前の２Ｄ培養では、ｃ．２５４Ｔ＞Ｇ点変異を有するオリゴデンドロサイトは、小胞体ストレス経路の化学的調節により消散されるＰＬＰ１の明確な核周囲保持を示した。オリゴ皮質スフェロイドはこの表現型を再現し、ＰＬＰ１の率直な核周囲保持（図５Ｇ）及びＭＹＲＦ陽性オリゴデンドロサイトの最も深刻な減少（９．６９％±１．８２％）が実証された（図５Ｈ、図５Ｍ）。プロテインキナーゼＲ様小胞体キナーゼ（ＰＥＲＫ）の阻害剤であるＧＳＫ２６５６１５７による、点変異オリゴ皮質スフェロイドのその後の処理により、小胞体から離れてオリゴデンドロサイトの突起へのＰＬＰ１の動員が改善され（図５Ｉ）、ＭＹＲＦ陽性細胞の割合が有意に増加した（１５．０４％±１．９６％）（図５Ｊ、図５Ｍ）。最後に、オリゴ皮質スフェロイド生成前のｉＰＳＣでの野生型配列への点変異のＣＲＩＳＰＲ補正（図１１Ａ〜１１Ｃ）により、オリゴデンドロサイトの突起へのＰＬＰ１動員を回復させた（図５Ｋ）だけでなく、ＭＹＲＦ陽性オリゴデンドロサイトの割合を健康なコントロールレベルまで増加させ（１７．２５±３．２２％）（図５Ｌ〜５Ｍ）、培養２０週間までミエリンの生成を可能にした（図５Ｎ）。
【００７９】
ＰＭＤの遺伝子型と表現型との間の機序的関係は、完全には特徴付けられていない。現在のデータは、過剰な（例えば重複した）ＰＬＰ１又は異常な／ミスフォールドした（例えばミスセンス変異した）ＰＬＰ１の蓄積が、ＥＲストレス、細胞死、及び重度の患者の表現型につながるが、ＰＬＰ１欠失は、より良好な耐性を示し、細胞の豊富さと、本主題のオリゴ皮質スフェロイドでのＰＬＰ１発現と間の二分は、この仮説と一致することを示唆する。ｈＰＳＣ由来の脳オルガノイド及び皮質スフェロイドを使用して、神経障害に関与する変異特異的な病理プロセスが詳細に分析されている。本主題のシステムを検証して、これらの努力を多種多様なミエリン疾患に拡張し得、且つオリゴデンドロサイトの誕生、成熟、ミエリン形成、及び死滅の過程にわたり患者特異的な病因の探求を始めることができる。
【００８０】
実施例７  種々の方法
多能性幹細胞系統
健康なｉＰＳＣ（ＣＷＲＵ１９１；ＣＷＲＵ１９８）及びＰＭＤ  ｉＰＳＣを、インフォームドコンセント及びＣａｓｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄの承認の後に、既に生成した。この研究では、承認されたＮＩＨ  ｈＥＳＣ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙからの２種のヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）系統（「Ｈ７」ＮＩＨｈＥＳＣ−１０−００６１；「Ｈ９」ＮＩＨｈＥＳＣ−１０−００６２）も使用した。
【００８１】
オリゴ皮質スフェロイド分化
神経皮質スフェロイドを、下記で言及されるバリエーションにより既に説明されているように（参照により本明細書に組み込まれるＰａｓｃａ他，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｎｄ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ３Ｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２，６７１−６７８（２０１５））、ヒト多能性幹細胞から生成した。
【００８２】
神経皮質スフェロイドをパターン形成するために、ビトロネクチン（Ｇｉｂｃｏ  ＃Ａ１４７００）上で培養した多能性幹細胞コロニーを、１０分にわたり３７℃でディスパーゼ（Ｇｉｂｃｏ  ＃１７１０５−０４１）を使用して持ち上げた。インタクトなコロニーを、１０μＭ  ロック阻害剤Ｙ−２７６３２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ＃６８８００１）、１０μＭ  Ｄｏｒｓｏｐｍｏｒｐｈｉｎ（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｐ５４９９）、及び１０μＭ  ＳＢ−４３１５４２（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｓ４３１７）を含むスフェロイドスターター培地２００μＬで、個々の低付着性Ｖ底９６ウェルプレート（Ｓ−Ｂｉｏ  Ｐｒｉｍｅ  ＃ＭＳ−９０９６ＶＺ）に移した。スフェロイドスターター培地は、２０％  ノックアウト血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１２５８７−０１０）、非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１１１４００５０）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃３５０５００６１）、β−メルカプトエタノール、及び１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１１３２０−０３３）であった。ロック阻害剤を含まない同一の培地を次の５日間にわたり使用し、その後、この培地を、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａベースのスフェロイド培地に交換した。Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａスフェロイド培地は、Ｂ−２７血清代替物が添加されており且つビタミンＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１２５８７）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃３５０５００６１）、及び１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン／ストレプトマイシンが添加されていないＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１０８８８０２２）であった。７〜２５日目から、この培地に、２０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃２３３−ＦＢ−２５／ＣＦ）及び１０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃２３６−ＥＧ−２００）を添加した。スフェロイドを、培地の半分を毎日交換しつつ、２５日目まで９６ウェルプレート中で培養した。２５日目に、スフェロイドを、１つのウェル当たり８〜１０個のスフェロイドの密度で、超低付着性６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＃ＣＬＳ３４７１）に移し、プロトコールの残り全体を通してこのように培養した。また、この時点から、このＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａスフェロイド培地に、１％  Ｇｅｌｔｒｅｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ａ１５６９６−０１）を添加した。Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａスフェロイド培地に、２０ｎｇ／ｍｌ  ＢＤＮＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃２４８−ＢＤ）及び２０ｎｇ／ｍｌ  ＮＴ−３（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃２６７−Ｎ）を補充することにより、２７〜４１日目の間に神経分化を誘発した。１７〜４１日目の間で一日おきに、培地の半分の交換を実施した。
【００８３】
オリゴ皮質スフェロイドを生成するために、５０日目に開始して、１０日にわたり交換する一日おきの培地に、１０ｎｇ／ｍＬ  血小板由来増殖因子−ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃２２１−ＡＡ−０５０）及び１０ｎｇ／ｍＬ  インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃２９１−Ｇ１−２００）を添加した。次に、６０日目に、１０日にわたり交換する一日おきの培地に、４０ｎｇ／ｍＬ  ３，３’，５−トリヨードチロニン（Ｔ３、Ｓｉｇｍａ  ＃ＳＴ２８７７）を添加した。使用した場合には、この期間中に低分子を補充した。Ｔ３の代わりに、４μＭ  ケトコナゾール及び２μＭ  クレマスチンを添加した。Ｔ３に加えて、ＧＳＫ２６５６１５７を添加した。
【００８４】
７０日目以降に、実験の完了まで一日おきに培地を交換して、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａスフェロイド培地でスフェロイドを成熟させて維持した。
独立した検証
承認されたＮＩＨ  ｈＥＳＣ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙからの１種のｈＥＳＣ系統「ＲＵＥＳ１」（ＮＩＨｈＥＳＣ−０９−００１２）を使用した。ＲＵＥＳ１を、ｍＴｅＳＲ１培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃８５８５０）中においてマトリゲル上で培養し、ＳｔｅｍＰｒｏ  Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  ＃Ａ１１１０５０１）を使用して持ち上げた。オリゴ皮質スフェロイド分化を、分化プロトコールの１〜７日目にＫＳＲの代わりにＮ２サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  ＃１７５０２０４８）及び２５ｍｇ／ｍＬ  ヒトインスリン溶液（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｉ９２７８）を使用することを除いて、上記で説明したように実施した。
【００８５】
低分子
ケトコナゾール（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｋ１００３）の４ｍＭストック溶液、フマル酸クレマスチン（Ｓｉｇｍａ  ＃ＳＭＬ０４４５）の２ｍＭストック溶液、及びＧＳＫ２６５６１５７（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃５０４６５１０００１）の１０ｍＭストック溶液を調製し、分注し、−２０℃で保存した。低分子を、２０分にわたり３７℃まで温めた後、予め温めた培地に添加した。凍結したアリコートを、廃棄する前に２回を超えないで解凍した。
【００８６】
ＢｒｄＵ標識
スフェロイド中の分裂細胞を標識するために、５８日目及び６０日目に、３μｇ／ｍＬの最終濃度で、培養培地にＢｒｄＵを添加した。９週目のサンプルを、６０日目のＢｒｄＵ投与の４時間後に採取した。系統追跡実験のために、ＢｒｄＵで標識されたスフェロイドを１４週目に採取し、免疫組織化学のために処理した。
【００８７】
ＰＬＰ１の遺伝子編集
ｉＰＳＣにおけるＰＬＰ１点変異（ｃ．２５４Ｔ＞Ｇ）のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９編集を、この変異を重複するガイドＲＮＡ（配列：ＣＣＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＣＣＣＣＡＴＡＡＡＧＧ）と、この変異を囲む２５個のヌクレオチドの相同性アームを有する一本鎖オリゴヌクレオチドとを使用して、セントルイスのワシントン大学にてＧｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｉＰＳＣ  Ｃｅｎｔｅｒにより実施した。受領時に、変異及び補正遺伝子座を再配列させ、両方の系統を核型にして（ｋａｒｙｏｔｙｐｅｄ）、編集プロセス中に大きな遺伝子型異常が生じていないことを確実にした（細胞系統遺伝学）。
【００８８】
免疫細胞化学
免疫組織化学のためのスフェロイドを、４５分にわたり４％氷冷パラホルムアルデヒドで最初に固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、一晩３０％スクロースで平衡化した。このスフェロイドをＯＣＴに埋め込み、１０μｍで薄片化した。
【００８９】
免疫組織化学を、既に説明されているように実施した（Ｎａｊｍ他，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８，９５７−９６２（２０１１））。簡潔に説明すると、切片をＰＢＳで３回洗浄し、次いで、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び０．２５％  正常ロバ血清を含むＰＢＳで３０分にわたりブロックした。次いで、この切片を、ブロッキング溶液中の一次抗体を使用して、４℃で一晩インキュベートした。以下の一次抗体を使用した：ラット抗ＰＬＰ１（１：５００、ＡＡ３、Ｗｅｎｄｙ  Ｍａｃｋｌｉｎからの寄贈）；ウサギ抗ＭＹＲＦ（１：１０００、Ｄｒ．Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｗｅｇｎｅｒにより提供された）；ヤギ抗ＳＯＸ１０（１：２５０  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＦ  ２８６４）；ウサギ抗ＯＬＩＧ２（１：２５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＡＢ９６１０；マウス抗ｐａｎ−軸索神経フィラメント（１：１０００，Ｃｏｖａｎｃｅ  ＃ＳＭＩ３１１）；マウス抗ＭＢＰ（１：２００、Ｃｏｖａｎｃｅ  ＃Ｓｍｉ９９）、マウス抗ｐａｎ−ニューロン神経フィラメント（ＮＦ、１：１０００、Ｃｏｖａｎｃｅ  ＃ＳＭＩ３１２）；ウサギ抗ＧＦＡＰ（１：１０００、Ｄａｋｏ  ＃Ｚ０３３４）；マウス抗ＳＡＴＢ２（１：２５０、Ａｂｃａｍ、＃ａｂ５１５２０）；ラット抗ＣＴＩＰ２（１：４００、Ａｂｃａｍ  ＃ａｂ１８４６５）；ヤギ抗ＳＯＸ２（１：２５０  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＡＦ２０１８）；ウサギ抗ＴＢＲ２（１：２５０、Ａｂｃａｍ、ａｂ２３３４５）；マウス抗Ｋｉ６７（１：２５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＢ４１９０）；マウス抗ネスチン（１：１０００  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ５３２６）；マウス抗ＢｒｄＵ（１：１０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ３５１０）；ニワトリ抗ビメンチン（１：１０００  Ａｂｃａｍ、ａｂ２４５２５）；ＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  ＃Ｄ８４１７）。
【００９０】
次いで、切片をＰＢＳで洗浄し、２時間にわたり二次抗体でインキュベートした。全ての二次抗体は、１：５００の希釈で使用したＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ共役二次抗体であった。
【００９１】
ＰＬＰ１の免疫組織化学の場合には、ブロッキング工程の前に、１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳでの２０分間の洗浄を最初に実施した。ＭＢＰの免疫組織化学の場合には、固定工程後に２０分間氷冷アセトンを使用した。抗原回収後にＢｒｄＵ免疫組織化学を実施し、これは、１００ｍＭ  クエン酸ナトリウムバッファーを沸騰させた密封コプリンジャーにスライドを入れて、１時間かけて室温にすることを伴った。
【００９２】
スフェロイド切片を、Ｃａｓｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ＣｏｒｅでＬｅｉｃａ  ＤＭｉ８蛍光顕微鏡又はＬｅｉｃａ  Ｓｐ８共焦点顕微鏡のいずれかを使用して撮像した。ＭＹＲＦ陽性核を計数するために、スフェロイド毎に４つの２０×フィールドを撮像した。スフェロイドの上部及び下部からの２つのフィールドと、スフェロイドの中心領域の端からの２つのフィールドとを定量した（概要に関して図６Ｃを参照されたい）。ＤＡＰＩ陽性細胞及びＭＹＲＦ陽性細胞の総数を、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ又はＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪで手動にて計数した。系統毎に及び処理条件毎に３〜５個のスフェロイドを分析し、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用してｔ検定を実施して、系統間の又は処理間の統計的有意性を評価した。
【００９３】
電子顕微鏡観察
スフェロイドを、既に説明されているように固定して処理した（Ｎａｊｍ他，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８，９５７−９６２（２０１１））。サンプルを、４％パラホルムアルデヒド（ＥＭＳ）、２％グルタルアルデヒド（ＥＭＳ）、及び０．１Ｍカコジル酸Ｎａ（ＥＭＳ）を含む固定溶液中で、室温にて１時間にわたり固定した。次いで、サンプルをオスミウム酸染色し（ｏｓｍｉｃａｔｅｄ）、酢酸ウラニルで染色し、ＥＭｂｅｄ  ８１２（ＥＭＳ）に埋め込んだ。各スフェロイドサンプルからの極薄切片（１２０ｎｍ）を、Ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃ（挿入可能）高エネルギー電子検出器を備えた超高分解能（ＸＨＲ）電界放射型走査電子顕微鏡を使用して、ＦＥＩ  Ｈｅｌｉｏｓ  ＮＡＮＯＬＡＢ（商標）６６０  ＦＩＢＳＥＭで観察し、全ての画像を、高倍率（１５０００〜３５０００×）にて４Ｋｖ及び０．２電流ランディング電圧を使用して撮影した。
【００９４】
一連のブロック面の撮像及び３Ｄ再構成
エポキシに埋め込まれたスフェロイドを整え、シリコンウエハ上にマウントし、導電性銀塗料で覆った。スパッタコーティング（Ｃｒｅｓｓｉｎｇｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、追加のイリジウム層約１ｎｍを堆積させ、サンプルを、撮像のためにＨｅｌｉｏｓ  Ｎａｎｏｌａｂ  ６６０ｉ二光束顕微鏡（ＦＥＩ  Ｃｏｍｐａｎｙ）にロードした。ユーセントリック高さ（傾斜５２°）でイオンカラム及びビームコインシデンスを設定した後、電子ビームのために２ｋＶ及び４０ｐＡの電流ランディングを使用し、次いで、低電流０．２３ｎＡを使用する横断面の後のミリングのために、イオンビーム（Ｇａ＋）支援白金を保護層として堆積させ、余分のブロック材料を、高イオンビーム電流（３０ｋＶ、６．５ｎＡ）を使用して除去した。
【００９５】
最終的な表面研磨／ミリングのために、還元イオン電流（ｒｅｄｕｃｅｄ  ｉｏｎ  ｃｕｒｒｅｎｔ）を使用した（３０ｋＶ、２．８ｎＡ）。撮像のために、４００ｐＡの電子ビーム電流、ＨＦＷ  １１．８４μｍでＡｕｔｏ  Ｓｌｉｃｅ  ａｎｄ  Ｖｉｅｗ  Ｇ３ソフトウェア（ＦＥＩ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を使用し、６１４４×４０９６の解像度、滞在時間６μ秒、ワーキング距離４．０４ｍｍでＴＬＤ検出器を使用して、１５４個の切片の画像ストック（ピクセルサイズ：１．９７、及びｚ＝５０ｎｍ）を得た。生画像を、Ｆｕｊｉ撮像処理パッケージでアラインさせ、画像の可視化及びミエリン束の３Ｄ再構成に、Ｉｍａｒｉｓ  ９．１ソフトウェア（Ｂｉｔｐｌａｎｅ  ＡＧ）を使用した。
【００９６】
バルクＲＮＡの配列決定及び分析
１つの系統当たり４つのスフェロイドを、ＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＃Ｒ２０５０−１−２００）に採取し、製造業者の指示に従ってＲＮＡを抽出した。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，＃７３４０４）を使用して、ＲＮＡをさらに精製した。イルミナライブラリ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｌｉｂｒａｒｙ）を調製し、ＣＷＲＵ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅ  ｆａｃｉｌｉｔｙでＨｉＳｅｑ  ２５００機器により５０ｂｐペアードエンドモードで配列決定した。参照トランスクリプトームを得ることなく、ＴｏｐＨａｔ  ｖ２．０．６を使用して、ｈｇ１９ゲノムに読み取り値をアラインさせた。ｉＧｅｎｏｍｅｓ  ｈｇ１９  ＲｅｆＳｅｑ参照からの転写産物の豊富さを、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ  ｖ２．０．２を使用して測定した。ＦＰＫＭを分位正規化した。ニューロン特異的遺伝子、アストロサイト特異的遺伝子、及びオリゴデンドロサイト特異的遺伝子を、それぞれの細胞での発現（ＦＰＫＭ＞１）及び他の２種の系統での非存在により定義した。各リストを、少なくとも１つのスフェロイドサンプルでも検出された倍数変化により、この細胞型に対して最も特異的な１００種の遺伝子まで削減した。遺伝子リストの発現の差異を、Ｇｒａｐｈｐａｄ  ＰｒｉｓｍでＷｉｌｃｏｘｏｎ検定を使用して評価した。
【００９７】
単一細胞ＲＮＡの配列決定及び分析
１０個の独立して生成された１２週目のスフェロイドをプールし、既に説明されているように解離させた（Ｍａｒｑｕｅｓ他，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５２，１３２６−１３２９（２０１６））。簡潔に説明すると、スフェロイドを、製造業者の指示に従ってＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｐａｐａｉｎ解離システム（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｌａｋｅｗｏｏｄ  ＮＪ，カタログ＃：ＬＫ００３１５０）を使用して解離させた。パパイン溶液を、解離の前に９５％  Ｏ２及び５％  ＣＯ２で酸素添加した。単一細胞懸濁液の細胞の計数を、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で実施し、細胞を、１，０００個の細胞／μＬの最終濃度で単一細胞の捕捉のためにロードした。
【００９８】
単一細胞の捕捉、ｃＤＮＡの合成、ｃＤＮＡのプレ増幅、及びライブラリの調製を、１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｈｒｏｍｉｕｍ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  ３’  Ｌｉｂｒａｒｙ  ａｎｄ  Ｂｅａｄキット  ｖ２（１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｉｎｃ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ  ＣＡ，カタログ＃：１２０２３７）を使用して実施した。３，８５０個の細胞を回収し、１個の細胞当たり１，８７０個の遺伝子中央値により、１個の細胞当たり３８，６１１個の読み取り値の深さで配列決定した。バーコード処理及び単一細胞３’遺伝子の計数にＣｅｌｌ  Ｒａｎｇｅｒ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ  ｖ２．１．０を使用し、読み取り値をｈｇ１９にマッピングした。ＰＣＡ次元削減及びｔＳＮＥ分析を、Ｃｅｌｌ  Ｒａｎｇｅｒ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ  ｖ２．１．０により実施し、１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｌｏｕｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｒｏｗｓｅｒ  ｖ２．０．０を使用してデータを可視化した。図２Ａ〜２Ｌのデータを、２クラスターの表現数（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｎｕｍｂｅｒ）でＫ−Ｍｅａｎｓクラスタリングを使用する１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｌｏｕｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｒｏｗｓｅｒ  ｖ２．０．０によりクラスタリングして、神経細胞及びグリア／前駆細胞の広範なクラスターを単離した。スフェロイドのクラスタリングを、発生中のヒト皮質からの及びＵＣＳＣ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（ｂｉｔ．ｌｙ／ｃｏｒｔｅｘＳｉｎｇｌｅＣｅｌｌ）で利用可能な、公的に利用可能な単一細胞データと比較した。図２のオリゴ皮質スフェロイド遺伝子発現クラスターヒートマップを、１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｌｏｕｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｒｏｗｓｅｒ  ｖ２．０．０を使用して作成し、このヒートマップは、全体としての集団における遺伝子の平均発現と比較して、各細胞での遺伝子発現のＬｏｇ２Ｆｏｌｄ変化を表す。発生中のヒト皮質の比較遺伝子発現クラスターヒートマップを、ＵＣＳＣ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｂｒｏｗｓｅｒから作成した。
【００９９】
ライフサイエンス報告の概要
実験計画のさらなる情報は、ライフサイエンス報告の概要で入手可能である。
データの入手可能性
全てのＲＮＡ−ｓｅｑデータは、アクセッション番号ＧＳＥ１１０００６でＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）データベースに寄託されている（参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１００】
統計
単一スフェロイドにおけるＭＹＲＦ陽性オリゴデンドロサイトの割合を定量するために、４つの領域（図７に示す）を撮像し、スフェロイド毎にＭＹＲＦ細胞の割合を平均化した。図１に示すデータの場合には、５つのスフェロイド（ｎ＝５）を、処置群毎に同様に分析した。図４に示すデータの場合には、各群で４つのスフェロイドを分析した（ｎ＝４）。図５Ｍで示されたデータを、系統ＣＷＲＵ１９８の５つ（ｎ＝５）のスフェロイドから得て、且つ各ＰＭＤ系統から４つのスフェロイドを得た（ｎ＝４）。Ｗｅｌｃｈの補正による両側不対ｔ検定を実施して、一度に２つの群を比較した。
【０１０１】
各条件から５つのスフェロイドを使用して、バルクＲＮＡ−ｓｅｑを実施した。対応のあるノンパラメトリックＷｉｌｃｏｘｏｎマッチドペア符号付き順位検定を使用して、統計的有意性を決定した。
【０１０２】
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本明細書で引用されている全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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