(57)【要約】遺伝子および／または細胞編集のための組成物および方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象中の細胞集団を選択的に増幅および／または増殖するための方法であって、
ａ）細胞中のチトクロームｐ４５０（ＣＹＰ）酵素、チトクロームｐ４５０レダクターゼ（ＰＯＲ）、および／またはβ―カテニン（ＣＴＮＮＢ１）を阻害する工程；ならびに
ｂ）工程ａ）によって産生される細胞を有する対象にプロトキシンを投与すること
を含み、
前記プロトキシンは、工程ａ）によって産生される細胞中で毒性代謝産物に変換されず、それによって、前記対象内の細胞の増幅および／または増殖を可能にする、方法。
【請求項２】
工程ｂ）の前に細胞にトランスジーンを導入することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が肝細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程ａ）がｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われ、細胞が工程ｂ）の前に対象に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程ａ）がｉｎ  ｖｉｖｏで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程ａ）が阻害性核酸分子または阻害性核酸分子をコードする核酸分子を細胞または対象に投与することを含み、前記阻害性核酸分子が、ＣＹＰ酵素、ＰＯＲ、またはＣＴＮＮＢ１に特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記阻害性核酸分子がｓｈＲＮＡである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程ａ）が、阻害性核酸分子をコードする核酸分子およびトランスジーンを含むベクターを前記細胞または対象に投与することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルスベクターがＡＡＶベクターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ベクターが組み込みベクターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記組み込みベクターがプロモーターを欠く、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程ａ）が、遺伝子編集によってＣＹＰ酵素、ＰＯＲ、および／またはＣＴＮＮＢ１を不活性化することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
工程ａ）がＣａｓ９およびＣＹＰ酵素、ＰＯＲ、またはＣＴＮＮＢ１遺伝子に特異的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または前記ｇＲＮＡをコードする核酸分子を細胞または対象に投与することを含み、前記ｇＲＮＡ配列が前記Ｃａｓ９と組み合わさり、前記ＣＹＰ酵素、ＰＯＲ、またはＣＴＮＮＢ１遺伝子の開裂をもたらす、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｇＲＮＡが自己開裂ガイドＲＮＡ（ｓｃｇＲＮＡ）であり、前記ｓｃｇＲＮＡが、５’末端および３’末端の両方に自己開裂リボザイムに隣接するｇＲＮＡを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｓｃｇＲＮＡがＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターから発現される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
工程ａ）が、ｇＲＮＡをコードする核酸分子およびトランスジーンを含むベクターを前記細胞または対象に投与することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ウイルスベクターがＡＡＶベクターである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ベクターが組み込みベクターである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記組み込みベクターがプロモーターを欠く、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記プロトキシンが、対象において軽度の肝毒性をもたらすのに十分な量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記プロトキシンが、対象において中等度の肝毒性をもたらすのに十分な量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記プロトキシンが、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼ、およびガンマ―グルタミルトランスペプチダーゼを含む群から選択される少なくとも１つの肝臓酵素の対象レベルを上昇させるのに充分な量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記プロトキシンが、アセトアミノフェン、レトロルシン、シクロホスファミド、タモキシフェン、ケトコナゾール、トラマドール、タクリン、ラシオカルピン、センキルキン、ダカルバジン、メトキシモルホリニルドキソルビシン（ＰＮＵ  １５２２４３）、イホスファミド、トロホスファミド、プラデフォビル、ＭＢ０７１３３、ブパルバコンヒドロキシルアミン、ナブメトンヒドロキシイミン、ＤＢ２８９、フラミジン、シブラフィビン、キシメラガトラン、グアノキサベンズ、ＡＱ４Ｎ、４−イポメアノール、クロピドグレル、Ｖ−ＰＹＲＲＯ／ＮＯ、Ｖ−ＰＲＯＬＩ／ＮＯ、およびテガフールからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
プロトキシンがアセトアミノフェンである、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記アセトアミノフェンが、連続する日に１日当たり６グラムの投与量で前記対象に投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
アセトアミノフェンが、１０グラムの単回投与で対象に投与される、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮特許出願第６２／６６４，９３０号（２０１８年４月３０日出願）及び米国仮特許出願第６２／６６４，９３２号（２０１８年４月３０日出願）に対する３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく優先権を主張する。前記の出願は、参照により本明細書に援用される。
国立衛生研究所の「R01 DK048252‐21」のもと、行政の支援を得て実施した。米国政府は、本発明においてある種の権利を有する。
【０００２】
電子的に提出されたテキストファイルの説明
本願に電子的に提出されたテキストファイルの内容は、その全体が記載により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ読み取り可能なフォーマットコピー（ファイル名：SEQLIST.txt；記録日：２０１９年４月２９日；ファイルサイズ：１１６ＫＢ）。
【０００３】
本発明は、遺伝子および／または細胞治療の分野に関する。具体的には、修飾に成功した細胞を選択することによる治療用遺伝子および／または細胞治療のための組成物および方法が開示される。
【背景技術】
【０００４】
本発明が関係する技術水準を説明するために、本明細書全体を通していくつかの刊行物および特許文献が引用されている。なお、これらの引用文献はすべて記載が、本明細書においては参照により援用される。
【０００５】
チトクロームｐ４５０（ＣＹＰ）タンパク質を発現する細胞に影響する多くの遺伝性および後天性疾患は、遺伝子治療および／または細胞治療に適用可能である。概念的には、遺伝子編集による疾患の原因となる突然変異の修正が遺伝子治療および／または細胞治療を達成するための最も巧妙で安全な方法である。現在、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターは優性遺伝子治療プラットフォームである。遺伝子編集用途のために、ｒＡＡＶベクターは、相同組換えを介して、治療的ペイロードを目的のゲノムローカスに組み込むように設計される。しかし、相同組換えｉｎ  ｖｉｖｏによる正確な遺伝子編集は効率が悪く、典型的には治療効果を上げるには足らず、非永久的な遺伝子編集をもたらす。実際、ｒＡＡＶベクターはほとんどエピソームにとどまり、細胞分裂で失われる。さらに、アデノ随伴ウイルスのランダムな組み込みは動物およびヒトの両方において肝臓がんと関連しており、肝細胞だけでなく他のあらゆる組織に対する有害性のリスクを示している。
【０００６】
ｒＡＡＶ戦略の限界に対処するための現在の方法の１つは、突然変異を直接修復することである。しかし、現在利用可能な方法を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子修復もまた、不十分な有効性を有する。もう一つのアプローチは、細胞プロモーターの下流にある自身のプロモーターを欠いた治療用トランスジーンを、発現された遺伝子の染色体座に組み込むことである。しかしながら、この方法は、効率が低いことも証明されている。
【０００７】
これらの方法の低い効率は、所望の遺伝子編集事象を有する細胞の選択的増幅によって克服され得る。例えば、アルブミンローカスを適切に標的とするヒト第９因子を発現する肝細胞はチロシン異化酵素４−ＯＨ−フェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＨＰＤ）をノックダウンするために、イントロン内のマイクロＲＮＡに埋め込まれたショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を用いることにより、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼの低分子阻害剤である４−［（２−カルボキシエチル）−ヒドロキシホスフィニル］−３−オキソ酪酸（ＣＥＨＰＯＢＡ）に対する薬物誘発毒性に対する耐性を付与することによって選択することができる(Nygaard, et al. (2016) Sci.Transl.Med., 8(342):342ra79)。しかし、ＣＥＨＰＯＢＡの使用および選択のためのチロシン異化経路の利用は、適用ｉｎ  ｖｉｖｏが限られている。
上記に鑑みて、遺伝子および／または細胞治療の優れた方法が必要であることは明らかである。
【発明の概要】
【０００８】
本発明によれば、細胞集団を増幅および／または増殖する方法が提供される。細胞または対象において目的の核酸（例えば、トランスジーン）を発現させる方法もまた提供される（例えば、改善された細胞および／または遺伝子治療方法）。いくつかの実施形態において、この方法は細胞中の１つ以上のＣＹＰ酵素、ＣＴＮＮＢ１、および／またはＣＹＰＯＲを阻害（例えば、ノックアウトまたはノックダウン）する工程、および細胞にプロドラッグ（プロトキシン）を投与する工程を包含する。この方法はプロドラッグでの選択の前に、目的の核酸（例えば、トランスジーン）を細胞に投与する工程をさらに包含し得る。投与されたプロドラッグ（プロトキシン）は未処置細胞において毒素に代謝されるが、処置細胞において毒素に代謝されず、それによって、所望の細胞集団の増幅および／または増殖および／または目的の核酸（例えば、トランスジーン）の発現を可能にする。該方法の工程は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができる。特定の実施形態では、１つ以上のＣＹＰ酵素、ＣＴＮＮＢ１、および／またはＣＹＰＯＲを阻害する工程は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができる。特定の実施形態に、プロドラッグ（プロトキシン）を投与する工程は、プロドラッグ（プロトキシン）を対象に投与することによって行われる。１つ以上のＣＹＰ酵素、ＣＴＮＮＢ１、および／またはＣＹＰＯＲを阻害する工程は、阻害性核酸分子を細胞に投与することによって、および／またはＣＲＩＳＰＲなどの遺伝子編集ツールを利用することによって実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、不活性プロドラッグ（プロトキシン）の毒性代謝産物への代謝を不活性化することによって薬物選択を達成する原理を示す一般的な概略図を提供する。プロドラッグ（プロトキシン）が毒性代謝産物に代謝される、細胞の正常状態を左側に示す。ＣＹＰ酵素、チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＹＰＯＲまたはＰＯＲ）、またはベータカテニン（Ｃｔｎｎｂ１）のノックダウンまたはノックアウトは細胞を保護し、細胞を増殖させる。
【図２】図２はｐＸ３３０−Ｃｙｐｏｒを注射し、アセトアミノフェンを処置したマウスにおける、肝障害の指標である血中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルの経時変化を示すグラフである。
【図３】図３は、ｐＸ３３０−Ｃｙｐｏｒで形質導入されたマウスからの肝臓サンプルのＣＹＰＯＲ免疫組織化学画像を提供する（上部画像）か、またはアセトアミノフェンで処置されたマウスからの肝臓サンプルのＣＹＰＯＲ免疫組織化学画像を提供する（下部画像）。破線はＣＹＰＯＲ−ｎｕｌｌ結節の輪郭を示す。
【図４】図４は、対照プラスミド（ｐＸ３３０）、アセトアミノフェン選択なしのｐＸ３３０―Ｃｙｐｏｒ、アセトアミノフェン注射を伴うｐＸ３３０―Ｃｙｐｏｒ、およびアセトアミノフェン食餌を伴うｐＸ３３０―Ｃｙｐｏｒを注射したマウスにおけるインデルのパーセンテージのグラフを提供する。
【図５】図５は、Ｃｙｐ１Ａ２／２Ｅ１  ＣＲＩＳＰＲノックアウトプラスミドを注入したマウスの肝臓サンプルの免疫組織化学画像で、未処置（左画像）またはアセトアミノフェンで処置（右画像）したものを示す。矢印はＣｙｐ２Ｅ１−ｎｕｌｌ結節を示す。
【図６】図６は、対照ｓｈＲＮＡ（上部パネル）またはＣｙｐｏｒ  ｓｈＲＮＡ（下部パネル）のいずれかを有するＧＦＰトランスポゾンで形質導入され、アセトアミノフェンで処置されたマウスからの肝臓サンプルのＣＹＰＯＲ免疫組織化学および蛍光画像を提供する。
【図７】図７は、自己開裂ガイドＲＮＡの概略図を提供する。ハンマーヘッド型リボザイムは配列番号５２１である。ＨＤＶリボザイムは配列番号５２２である。成熟ｇＲＮＡは配列番号５２３である。
【図８】図８はルシフェラーゼおよびＣｙｐｏｒに対する自己開裂誘導ＲＮＡを含むベクターを注射し、離乳時にｃａｓ９を注射し、続いてアセトアミノフェンを８週間注射した新生仔マウスの肝臓のルシフェラーゼ画像を提供する。生きたルシフェラーゼイメージングを、ベースラインで、および５、１１、および１６回投与後に、同じマウスで行った。
【図９】図９は生理食塩水またはＡＡＶ  ＧＲＣｙｐｏｒＦ９を新生仔のとき注射し、離乳時にＣａｓ９を単回投与したマウスの血液中のヒト第ＩＸ因子レベルのグラフである。次いで、マウスを未処置またはアセトアミノフェンで週２回処置した。アセトアミノフェンを０、３、９および１５回投与した後、ヒト第ＩＸ因子レベルを測定した。
【図１０】図１０は、ＡＡＶ  ＧＲＣｙｐｏｒＦ９を注射され、アセトアミノフェンで処置された成熟マウスの血液中のヒト第ＩＸ因子レベルのグラフを提供する。０、２、７、１３および１９回の投与後にヒト第ＩＸ因子レベルを測定した。
【図１１】図１１は、アセトアミノフェン処置後のＧＲＣｙｐｏｒＦ９投与マウス由来の組織試料のＣＹＰＯＲ（上部パネル）およびヒト第ＩＸ因子（下部パネル）免疫組織化学の画像を提供する。上部パネルにおいて、ＣＹＰＯＲ陰性組織は、点線および矢印によって示される。下のパネルにおいて、ヒト第ＩＸ因子について陽性のマウス肝細胞は、点線および矢印によって示される。
【００１０】
（発明の詳細な説明）
遺伝子および／または細胞療法で観察される障害は、以下の方法を使用することによって克服することができる：（１）ＣＹＰ酵素の代謝活性に必要とされる任意のローカスを利用および／または破壊するように設計された方法であって、薬物誘発毒性による耐性細胞集団の選択的増幅および／または拡大が毒素の広範なｉｎ  ｖｉｖｏ適用によってもたらされる方法、（２）選択的増幅および／または細胞増殖が特定の部位で起こる場合にのみ起こるように、所望の修飾をシスにおける選択可能な遺伝子破壊に連結するように設計された部位特異的遺伝子編集方法、（３）ＤＮＡを切断するためのエンドヌクレアーゼ酵素を必要としない所望の改変および選択的遺伝子破壊をもたらすように設計された部位特異的遺伝子編集方法、または、特定の部位で改変が起こった場合にのみ選択的増幅および／または細胞増殖が起こるように遺伝子発現を活性化するためのプロモーターの使用、（４）選択的増幅および／または細胞増殖が部位に関係なく組み込みが起こった場合にのみ起こるように、それ自体の内因性プロモーターを有するランダム組み込みベクターを使用して、所望の修飾および遺伝子破壊をもたらすように設計された部位中立遺伝子編集方法、（５）所望の細胞集団の選択的増幅および／または増殖が、遺伝子編集事象または修飾なしに起こる、ＣＹＰ酵素の代謝活性に必要なローカスをノックダウン、ノックアウト、または他の方法で破壊する方法、または（６）（１）〜（５）のいずれかの任意の組合せ。本発明は、上記を達成する方法を提供する。
【００１１】
本発明は、高効率、細胞および／または組織特異的、臨床的に有効、より高い永続性の遺伝子編集および／または治療を達成するためのチトクロームｐ４５０酵素（ＣＹＰ）系の利用を含む。本発明は、編集される細胞に既存の遺伝的欠点を必要としない。むしろ、いくつかの実施形態では、本発明が適切に編集された細胞に薬物誘発毒性に対する有利な耐性を付与することによって、編集されていない細胞に欠点をもたらす。この有利な耐性は、（１）ＣＹＰ酵素をコードする１つ以上のＣＹＰ遺伝子、（２）チトクロームｐ４５０レダクターゼ（ＣＹＰＯＲまたはＰＯＲ）遺伝子、（３）ＣＴＮＮＢ１（βカテニン）遺伝子、（４）ＣＹＰ酵素の代謝活性に必要な任意のローカス、または（５）  （１）−（４）のいずれかの任意の組合せ、をノックダウンするか、ノックアウトするか、または他の方法で破壊することによって、細胞に付与することができる。さらに、有利な耐性はまた、１つ以上のＣＹＰ酵素、ＣＴＮＮＢ１、および／またはＣＹＰＯＲを直接無効にするか、破壊するか、または他の方法で不活性化することによって付与され得る。適切な毒素（例えば、プロドラッグまたはプロトキシン）を投与すると、有利な耐性を有する（すなわち、ＣＹＰ活性の減少のために毒素を代謝および活性化することができない）細胞は、編集されなかった細胞よりも優先的に増殖する。
【００１２】
本発明の１つの態様によれば、細胞集団を増幅および／または増殖させる方法が提供される。いくつかの実施形態では方法が細胞中の１つ以上のＣＹＰ酵素、ＣＴＮＮＢ１、および／またはＣＹＰＯＲを阻害する（例えば、ノックアウトまたはノックダウンする）こと、およびプロドラッグ（プロトキシン）を細胞に投与することを含み、投与されたプロドラッグ（プロトキシン）が未処置細胞（例えば、ＣＹＰ酵素、ＣＴＮＮＢ１、および／またはＣＹＰＯＲが阻害されない細胞）において毒素に代謝されるが、処置細胞（例えば、ＣＹＰ酵素、ＣＴＮＮＢ１、および／またはＣＹＰＯＲが阻害される細胞）において毒素に代謝されない。本方法の工程はｅｘ  ｖｉｖｏ法を含む、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施され得る（例えば、対象由来の細胞（自家細胞）がｉｎ  ｖｉｔｒｏ処置され、次いで対象に投与される）。特定の実施形態では、１つ以上のＣＹＰ酵素、ＣＴＮＮＢ１、および／またはＣＹＰＯＲを阻害する工程は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができる。特定の実施形態において、プロドラッグ（プロトキシン）を投与する工程はｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができる（例えば、プロドラッグ（プロトキシン）は一般に、細胞を含む対象に投与するか、または細胞に直接的に投与することができる）。
【００１３】
本発明の別の態様によれば、細胞中で目的の核酸（例えば、トランスジーン）を発現させる方法が提供される。いくつかの実施形態において、該方法は細胞中の１つまたは複数のＣＹＰ酵素、ＣＴＮＮＢ１、および／またはＣＹＰＯＲを阻害する（例えば、ノックアウトする、またはノックダウンする）こと、目的の核酸（例えば、トランスジーン）を細胞中に導入すること、および細胞にプロドラッグ（プロトキシン）を投与することを含み、投与されたプロドラッグ（プロトキシン）は未処置細胞（例えば、ＣＹＰ酵素、ＣＴＮＮＢ１、および／またはＣＹＰＯＲが阻害されない細胞）において毒素に代謝されるが、処置された細胞（例えば、ＣＹＰ酵素、ＣＴＮＮＢ１、および／またはＣＹＰＯＲが阻害される細胞）において毒素には代謝されない。本方法の工程はｅｘ  ｖｉｖｏ  法を含む、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施され得る（例えば、対象由来の細胞（自家細胞）がｉｎ  ｖｉｔｒｏ処置され、次いで対象に投与される）。特定の実施形態において、１つ以上のＣＹＰ酵素、ＣＴＮＮＢ１、および／またはＣＹＰＯＲを阻害する、および／または目的の核酸（例えば、トランスジーン）を導入する工程は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ実施され得る。１つ以上のＣＹＰ酵素、ＣＴＮＮＢ１、および／またはＣＹＰＯＲの阻害、および目的の核酸（例えば、トランスジーン）の導入は両方の事象が同じ有利な耐性細胞内で起こるように、同時にまたはシスで行うことができる。特定の実施形態において、プロドラッグ（プロトキシン）を投与する工程はｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができる（例えば、プロドラッグ（プロトキシン）は一般に、細胞を含む対象に投与するか、または細胞に直接的に投与することができる）。
【００１４】
図１は、不活性プロドラッグの毒性代謝産物への代謝を不活性化することによって薬物選択を達成する原理を示す一般的な概略図を提供する。細胞の正常状態は左側に示されている。代謝酵素は正常細胞に発現し、代謝変換後に毒性を生じる。代謝活性に関与する遺伝子がノックダウンされるか（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）、またはノックアウトされるならば（例えば、標的ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ））、毒性代謝産物は、毒性前駆体の投与後に産生されない。ノックダウン細胞またはノックアウト細胞は保護されて増殖できるが、酵素陽性細胞は死滅する。図１に見られるように、ＣＹＰ酵素、チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＹＰＯＲまたはＰＯＲ）、またはβカテニン（Ｃｔｎｎｂ１）のノックダウンやノックアウトにより、アセトアミノフェンなどのプロドラッグ（プロトキシン）がその毒性代謝産物に変換されるのを防ぐことができる。特に、ＰＯＲはＮＡＤＰＨから全てのＣＹＰ酵素に電子を供与し、従って、それらの活性に必須である。ＰＯＲの非存在下では、全てのＣＹＰ酵素は不活性である。同様に、Ｃｔｎｎｂ１はＣｙｐ１Ａ２、２Ｅ１および３Ａ４を含むｚｏｎｅ  ３肝細胞で発現する遺伝子の転写に必須である。少なくともこれらのＣＹＰ酵素は、Ｃｔｎｎｂ１阻害細胞には存在しないこととなる。
本発明の方法の細胞は、任意の細胞型であり得る。いくつかの実施形態では、細胞はＣＹＰ活性を有する。いくつかの実施形態では、細胞は肝細胞である。
【００１５】
細胞における１つ以上のＣＹＰ酵素、ＣＴＮＮＢ１、および／またはＣＹＰＯＲの阻害（例えば、ノックアウトまたはノックダウン）は、当該分野で公知の任意の方法によって実施され得る。特定の実施形態では、阻害が１つ以上のＣＹＰ酵素、ＣＴＮＮＢ１、および／またはＣＹＰＯＲの阻害剤を細胞に投与することによって達成される。このような阻害剤は標的遺伝子および／またはタンパク質の活性を低下させる（例えば、基質相互作用を阻害または低下させる）、および／または標的遺伝子および／またはタンパク質の発現を低下させる化合物である。阻害剤の例としてはタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、小分子、および核酸分子が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、阻害剤は核酸ベースの阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤がアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡ分子などの阻害性核酸分子（または阻害性核酸分子をコードする核酸分子）である。いくつかの実施形態では、阻害剤が（例えば、所望の遺伝子を標的とするガイドＲＮＡを用いた）所望の遺伝子のＣＲＩＳＰＲベースの標的化などの遺伝子編集阻害剤である。
【００１６】
ＣＹＰ遺伝子は当該分野で周知であり、そして任意のチトクロームｐ４５０遺伝子を含む。ＣＹＰ遺伝子の例は、Nelson, D.R.(Human Genomics(2009)4:59―65；本明細書中に参照により援用される）に提供される。ＣＹＰ遺伝子の例としては限定されるものではないが、チトクロームｐ４５０遺伝子ファミリー１〜５１が挙げられる。ＣＹＰ遺伝子の例としては限定されないが、以下が挙げられる：ＣＹＰ１Ａ（例えば，ＣＹＰ１Ａ１，ＣＹＰ１Ａ２），ＣＹＰ１Ｂ（例えば，ＣＹＰ１Ｂ１），ＣＹＰ２Ａ（例えば，ＣＹＰ２Ａ６，ＣＹＰ２Ａ７，ＣＹＰ２Ａ１３），ＣＹＰ２Ｂ（例えば，ＣＹＰ２Ｂ６），ＣＹＰ２Ｃ（例えば，ＣＹＰ２Ｃ８，ＣＹＰ２Ｃ９，ＣＹＰ２Ｃ１８，ＣＹＰ２Ｃ１９），ＣＹＰ２Ｄ（例えば，ＣＹＰ２Ｄ６），ＣＹＰ２Ｅ（例えば，ＣＹＰ２Ｅ１），ＣＹＰ２Ｆ（例えば，ＣＹＰ２Ｆ１），ＣＹＰ２Ｊ（例えば，ＣＹＰ２Ｊ２），ＣＹＰ２Ｒ（例えば，ＣＹＰ２Ｒ１），ＣＹＰ２Ｓ（例えば，ＣＹＰ２Ｓ１），ＣＹＰ２Ｕ（例えば，ＣＹＰ２Ｕ１），ＣＹＰ２Ｗ（例えば，ＣＹＰ２Ｗ１），ＣＹＰ３Ａ（例えば，ＣＹＰ３Ａ４，ＣＹＰ３Ａ５，ＣＹＰ３Ａ７，ＣＹＰ３Ａ４３），ＣＹＰ４Ａ（例えば，ＣＹＰ４Ａ１１，ＣＹＰ４Ａ２２），ＣＹＰ４Ｂ（例えば，ＣＹＰ４Ｂ１），ＣＹＰ４Ｆ（例えば，ＣＹＰ４Ｆ２，ＣＹＰ４Ｆ３，ＣＹＰ４Ｆ８，ＣＹＰ４Ｆ１１，ＣＹＰ４Ｆ１２，ＣＹＰ４Ｆ２２），ＣＹＰ４Ｖ（例えば，ＣＹＰ４Ｖ２），ＣＹＰ４Ｘ（例えば，ＣＹＰ４Ｘ１），ＣＹＰ４Ｚ（例えば，ＣＹＰ４Ｚ１），ＣＹＰ５Ａ（例えば，ＣＹＰ５Ａ１）ＣＹＰ７Ａ（例えば，ＣＹＰ７Ａ１），ＣＹＰ７Ｂ（例えば，ＣＹＰ７Ｂ１），ＣＹＰ８Ｂ（例えば，ＣＹＰ８Ｂ１），ＣＹＰ１１Ａ（例えば，ＣＹＰ１１Ａ１），ＣＹＰ１１Ｂ（例えば，ＣＹＰ１１Ｂ１，ＣＹＰ１１Ｂ２），ＣＹＰ１７Ａ（例えば，ＣＹＰ１７Ａ１），ＣＹＰ１９Ａ（例えば，ＣＹＰ１９Ａ１），ＣＹＰ２０（例えば，ＣＹＰ２０Ａ１），ＣＹＰ２１Ａ（例えば，ＣＹＰ２１Ａ２），ＣＹＰ２４Ａ（例えば，ＣＹＰ２４Ａ１），ＣＹＰ２６Ａ（例えば，ＣＹＰ２６Ａ１），ＣＹＰ２６Ｂ（例えば，ＣＹＰ２６Ｂ１），ＣＹＰ２６Ｃ（例えば，ＣＹＰ２６Ｃ１），ＣＹＰ２７Ａ（例えば，ＣＹＰ２７Ａ１），ＣＹＰ２７Ｂ（例えば，ＣＹＰ２７Ｂ１），ＣＹＰ２７Ｃ（例えば，ＣＹＰ２７Ｃ１），ＣＹＰ３９Ａ（例えば，ＣＹＰ３９Ａ１），ＣＹＰ４６Ａ（例えば，ＣＹＰ４６Ａ１），ａｎｄＣＹＰ５１Ａ（例えば，ＣＹＰ５１Ａ１）。特定の実施形態において、ＣＹＰ遺伝子は、ＣＹＰ１、ＣＹＰ２、またはＣＹＰ３から選択されるサブファミリーに由来する。
【００１７】
チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＹＰＯＲまたはＰＯＲ；この用語は本明細書中で互換的に使用されている）は、ＦＡＤおよびＦＭＮ結合ドメインを有する小胞体膜オキシドレダクターゼタンパク質であり、これは、ＮＡＤＰＨからすべてのチトクロームｐ４５０酵素に直接的に電子を供与することを可能にする（Iyanagi, et al., (2012) Arch.Biochem.Biophys., 528:72-89)。ヒトにおいて、チトクロームＰ４５０レダクターゼ遺伝子はローカス：第７染色体、ｑアーム、領域１、バンド１、サブバンド２３（７ｑ１１．２３）に見出される（例えば、GenBank Accession NO. NC_000007.14を参照のこと）。ヒトＰＯＲのヌクレオチドおよびアミノ酸配列の例は例えば、GenBank Gene ID: 5447およびGenBank Accession Nos.NM_000941.3 およびNP_000932.3に見出すことができる。
【００１８】
カテニンβ‐１（ＣＴＮＮＢ１；β‐カテニンとしても知られる）は、細胞‐細胞接着と遺伝子転写の調節と協調に関与する二重機能タンパク質である。ヒトＣｔｎｎｂ１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の例は例えば、GenBank Gene ID: 1499およびGen Bank Accession Nos. NM_001098209.1およびNP_001091679.1に見出すことができる。
【００１９】
上述のように、細胞のゲノムを編集して、１つ以上のＣＹＰ酵素、ＣＴＮＮＢ１、および／またはＣＹＰＯＲを不活性化／阻害することができる。細胞のゲノムは限定するものではないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）、およびメガヌクレアーゼなどの、当技術分野で公知の任意の方法を使用して編集することができる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲが利用される。クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９（例えば、化膿連鎖球菌streptococcus pyogenes由来）技術および遺伝子編集は、当該技術分野において周知である（参照、例えば Shi et al. (2015) Nat. Biotechnol., 33(6):661-7; Sander et al. (2014) Nature Biotech., 32:347-355; Jinek et al. (2012) Science, 337:816-821; Cong et al. (2013) Science 339:819-823; Ran et al. (2013) Nature Protocols 8:2281-2308; Mali et al. (2013) Science 339:823-826; Sapranauskas et al. (2011) Nucleic Acids Res.39:9275-9282; Nishimasu et al. (2014) Cell 156(5):935-49; Swarts et al. (2012) PLoS One, 7:e35888; Sternberg et al. (2014) Nature 507(7490):62-7; addgene.org/crispr/guide)。ＲＮＡ誘導ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、ガイドＲＮＡ分子（ｇＲＮＡ）と共にＣａｓ９を発現することを含む。ｇＲＮＡを産生するためのガイドラインおよびコンピューター支援法が利用可能である（参照、例えば CRISPR Design Tool (crispr.mit.edu); Hsu et al. (2013) Nat. Biotechnol.31:827-832; addgene.org/CRISPR;およびCRISPR gRNA Design tool - DNA2.0 (dna20.com/eCommerce/startCas9)）。共発現されると、ｇＲＮＡはＣａｓ９と結合しての特異的ゲノム標的配列に動員し、そこで二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）切断を媒介する。２つ以上のｇＲＮＡ（例えば、２）を投与して、標的ＤＮＡ内で複数の切断を行ってもよい。二本鎖切断は、挿入および／または欠失を生じる非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路によって、またはドナー鋳型の存在下で、置換突然変異のための相同組換え修復（ＨＤＲ）経路によって修復することができる（Overballe-Petersen et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci., 110:19860-19865; Gong et al. (2005) Nat. Struct.Mol.Biol., 12:304-312)。ＣＲＩＳＰＲはＣａｓ９を利用するものとして本明細書に記載されているが、Ｃａｓ９変異体および相同体などの他のヌクレアーゼを使用することができる。他の例には、限定されないが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９、Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ、高忠実度Ｃａｓ９(Kleinstiver et al. (2016) Nature, 529:490-495; Slaymaker et al. (2016) Science, 351:84-88)，Ｃａｓ９ニッカーゼ(Ran et al. (2013) Cell, 154:1380-1389)，ＰＡＭ特異性が改変されたStreptococcus pyogenes Cas9（例えばSpCas9_VQR, SpCas9_EQRおよび SpCas9_VRER; Kleinstiver et al. (2015) Nature, 523:481-485)、Staphylococcus aureus Cas9, cas12a (Cpf1) (Rusk, N., Nat. Methods (2019) 16(3):215)、ＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系およびＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系が含まれる。
【００２０】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体の結合特異性は、２つの異なるエレメントに依存する。第１に、標的ゲノムＤＮＡ（ｇｅｎＤＮＡ）配列とｇＲＮＡの相補的認識配列との間の結合相補性（例えば、〜１８ー２２ヌクレオチド、特に約２０ヌクレオチド）。第二に、ｇｅｎＤＮＡ／ｇＲＮＡ相補領域に近接したプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の存在(Jinek et al. (2012) Science 337:816-821; Hsu et al. (2013) Nat. Biotech., 31:827-832; Sternberg et al. (2014) Nature 507:62-67)。S. Pyogenes Cas9のＰＡＭモチーフは完全に特徴付けられており、ＮＧＧまたはＮＡＧである(Jinek et al. (2012) Science 337:816-821; Hsu et al. (2013) Nat.Biotech., 31:827-832)。他のＣａｓ９タンパク質の他のＰＡＭもまた公知である（参照、例えばaddgene.org/crispr/guide/ #pam-table）。典型的には、ＰＡＭ配列がゲノム配列中のＤＮＡ標的配列の３’である。
【００２１】
ガイドＲＮＡは、別個の核酸分子を含み得る。例えば、１つのＲＮＡは標的配列（ｃｒＲＮＡ）に特異的にハイブリダイズすることができ、そして別のＲＮＡ（トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ））はｃｒＲＮＡと特異的にハイブリダイズする。好ましくは、ガイドＲＮＡが標的配列（ｃｒＲＮＡ；相補的配列）およびＣａｓ９によって認識される配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列；足場配列）と特異的にハイブリダイズする配列を含む単一分子（ｓｇＲＮＡ）である。ｇＲＮＡ足場配列の例は当技術分野でよく知られている（例えば  5’-GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGCUUUU （配列番号５１７））。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、用語「特異的にハイブリダイズする」は、核酸分子が標的配列に１００％相補的である必要があることを意味しない。むしろ、配列は標的配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％相補的であり得る（例えば、ｇＲＮＡとゲノムＤＮＡとの間の相補性）。相補性が高いほど、ゲノムの他の部位での望ましくない切断事象の可能性が減少する。特定の実施形態では相補性の領域（例えば、ガイドＲＮＡと標的配列との間）は少なくとも約１０、少なくとも約１２、少なくとも約１５、少なくとも約１７、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、またはそれ以上のヌクレオチドである。特定の実施形態において、相補性の領域（例えば、ガイドＲＮＡと標的配列との間）は、約１５〜約２５ヌクレオチド、約１５〜約２３ヌクレオチド、約１６〜約２３ヌクレオチド、約１７〜約２１ヌクレオチド、約１８〜約２２ヌクレオチド、または約２０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡが配列番号３４〜５１６のうちの１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性または同一性を有する配列を標的とするか、または配列（例えば、ＲＮＡバージョン）を含む。配列はＰＡＭとは反対の配列の末端（例えば、５’末端）で、１、２、３、４、または５ヌクレオチドだけ伸長または短縮され得る。配列が伸長される場合、付加されたヌクレオチドは、ゲノム配列に対応するべきである。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは自己開裂ガイドＲＮＡ（ｓｃｇＲＮＡ）である。自己開裂ｇＲＮＡは、単一のガイドＲＮＡの５’および３’末端にリボザイムを含む。ｓｃｇＲＮＡを発現すると、自己開裂リボザイムは細胞内にｇＲＮＡを放出し、Ｃａｓ９と作用する。いくつかの実施形態では、ｓｃｇＲＮＡがｇＲＮＡの５’にハンマーヘッド型リボザイムを含み、ｇＲＮＡの３’末端に肝炎デルタウイルスリボザイムを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃｇＲＮＡがｐｏｌ２プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、ｓｃｇＲＮＡが組織特異的プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態において、ｓｃｇＲＮＡはアルブミンプロモータの制御下にある。
【００２４】
いくつかの実施形態では、該方法が少なくとも１つのＣａｓ９（例えば、タンパク質および／またはＣａｓ９をコードする核酸分子）および少なくとも１つのｇＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡをコードする核酸分子）を細胞または対象に投与することを含む。特定の実施形態において、Ｃａｓ９は、S.pyogenes Cas9である。特定の実施形態では、標的ＰＡＭが５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、プロモーター、またはイントロン（例えば、第１のイントロン）中にある。本発明の核酸分子は、連続的に（前または後に）および／または同じ時に（共に）投与され得る。核酸分子は、同じ組成物または別々の組成物で投与することができる。特定の実施形態において、核酸分子は単一のベクター（例えば、ウイルスベクターまたはプラスミド）中で送達される。
【００２５】
上記のように、阻害性核酸分子（例えば、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡ分子（または阻害性核酸分子をコードする核酸分子））は、１つ以上のＣＹＰ酵素、ＣＴＮＮＢ１、および／またはＣＹＰＯＲを不活性化／阻害するために使用され得る。阻害性核酸分子（例えば、ｓｈＲＮＡ）が細胞または対象に送達される場合、阻害性核酸分子は、直接的に投与され得るか、または発現ベクターが使用され得る。阻害性核酸分子（例えば、ｓｈＲＮＡ）のための例示的な標的配列には配列番号２〜３３のいずれか１つが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、マイクロＲＮＡに埋め込まれる。
【００２６】
細胞への核酸分子の投与（対象への投与を含む）は、当該分野で公知の任意の方法によって達成され得る。いくつかの実施形態において、核酸分子は感染によって（例えば、ウイルスベクターが使用される場合）細胞に導入される。いくつかの実施形態において、核酸分子は注射、トランスフェクション、エレクトロポレーション、バイオリスティック粒子送達システム（例えば、遺伝子銃）、ソノポレーション（例えば、細胞透過性を増加させるための細胞超音波処理）、磁気切除（例えば、核酸を含む粒子を標的細胞にもたらすための磁場の使用）、流体力学的送達、ポリマーソーム送達、ポリプレックス送達、デンドリマー送達、ナノ粒子送達（例えば、無機ナノ粒子）、および／または細胞浸透性ペプチドの使用によって、細胞に送達される。
【００２７】
本発明の核酸分子はベクター（例えば、プラスミド、トランスポゾン、ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、およびレンチウイルス）など）内に含まれる場合がある。いくつかの実施形態において、所望の核酸配列は強力なプロモーター、構成的プロモーター、組織または細胞特異的プロモーター（例えば、肝細胞特異的プロモーター）、および／または調節されたプロモーターを含むベクター内の適切なプロモーターから発現される場合がある。プロモーターの例は当技術分野で周知であり、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、およびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含むが、これらに限定されない（例えば、Ｕ６およびＨ１；参照、例えば、 Myslinski et al. (2001) Nucl.Acids Res., 29:2502-09）。いくつかの実施形態において、所望の核酸配列は内因性プロモーター（例えば、細胞内のプロモーター）から発現される。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ベクターは組み込みベクターである。さらなる実施形態では、組み込みベクターがＤＮＡを切断するためのエンドヌクレアーゼ酵素、または遺伝子発現を活性化するためのプロモーターの使用を必要としない（例えば，ＧｅｎｅＲｉｄｅ（登録商標）技術(LogicBio Therapeutics, Cambridge, MA)を利用）。ＧｅｎｅＲｉｄｅ（登録商標）は、エンドヌクレアーゼ酵素を必要とせずに、遺伝物質を部位特異的にＤＮＡを切断したり、プロモーターを用いて遺伝子発現を活性化したりすることを可能にする、相同組換えを使用した遺伝子編集戦略である。さらなる実施形態では、該方法は、組み込みがランダムに起こるように、それら自体の内因性プロモーターと共にランダム組み込みベクターを利用する。いくつかの実施形態において、本発明は、非組み込みベクターを利用する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクター、特にｒＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターはプラスミドＤＮＡベクターである。いくつかの実施形態において、本発明は、合成オリゴヌクレオチドベクターを利用する。いくつかの実施形態では、本発明がフォーミーウイルス、オンコウイルス、および／またはレンチウイルスに基づくベクターなどのレトロウイルスベクターを利用する。別の実施形態では、ベクターはアデノウイルスに基づく。別の実施形態では、ベクターはＡＡＶに基づく。別の実施形態では、ベクターがウイルスベクターのエンベロープタンパク質シュードタイピングに基づく。別の実施形態では、ベクターが複製コンピテントベクターならびにシスおよびトランス作用性エレメントに基づく。別の実施形態では、ベクターは単純ヘルペスウイルスに基づく。
【００３０】
いくつかの実施形態では、細胞に投与されるプロドラッグ（プロトキシン）がＣＹＰ活性またはＣＹＰ活性に依存する活性によって代謝される化合物（例えば、小分子）である。細胞に投与されるプロドラッグ（プロトキシン）の毒性は編集された細胞において有利な耐性が達成され得るように、毒素代謝産物が十分に毒性であるかどうかを決定するために、細胞上で試験され得る。いくつかの実施形態において、毒素の致死性が測定され得、ここで、細胞死または未処置細胞へのアポトーシスを引き起こす毒素は、編集された細胞において有利な耐性が達成され得るように十分に毒性である。ある実施形態において、細胞内のバイオマーカーは、毒素が十分に毒性であるかどうかを決定するために測定され得る。例えば、肝細胞に関して、限定されないが、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、またはガンマグルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）を含む特定の肝酵素のレベルの上昇が検出された場合、毒素は十分に毒性であると決定され得る。これらの肝酵素の１つ以上の発現の増加は肝毒性の指標であることが知られており、ここで、少なくとも軽度から中等度の肝毒性の存在は、必要な毒性を示す。さらに、軽度から中等度の肝毒性を達成するための用量ガイドラインは、当技術分野で公知である（参照、例えばJaeschke, H. (2015) Dig.Dis., 33:464-471; Arafa, et al. (2018) Toxicol.Appl.Pharmacol., 346:37-44; Calvo, et al. (2017) Invest New Drugs, 36(3):476-486; Fashe et al. (2015) Chem. Res.Toxicol., 28:702-710; Huttunen et al. (2008) Curr.Med.Chem., 15:2346-2365; Maruyama et al. (1995) Dig.Dis.Sci., 40:2602-2607; McEneny-King et al. (2017) Bioorg.Med.Chem. Lett., 27:2443-2449)。
【００３１】
肝毒性は薬物性肝障害ネットワーク（Ｄｒｕｇ―Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｉｎｊｕｒｙ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＤＩＬＩＮ））によって開発された５点スケールを使用して等級付けすることができる（参照、例えばFontana, et al. (2009) Drug Safety, 32:55-68)。軽度の肝毒性（または１＋）は以下のように定義される：血清アミノトランスフェラーゼまたはアルカリホスファターゼレベルの上昇またはその両方があるが、総血清ビリルビンが２．５ｍｇ／ｄＬ未満で、凝固障害が検出される（ＩＮＲ＜１．５）。中等度の肝毒性（または２＋）は以下のように定義される：血清アミノトランスフェラーゼまたはアルカリホスファターゼレベルまたはその両方が上昇し、総血清ビリルビンレベルが２．５ｍｇ／ｄＬ以上または高ビリルビン血症を伴わない凝固障害（ＩＮＤ≧１．５）。中等度から重度の肝毒性（または３＋）は、以下のように定義される：血清アミノトランスフェラーゼまたはアルカリホスファターゼレベルの上昇、および総血清ビリルビンレベルが２．５ｍｇ／ｄＬ以上で、薬物性肝障害のために入院（または既存の入院が長期化する）。重度の肝毒性（または４＋）は、以下のように定義される：血清アミノトランスフェラーゼまたはアルカリホスファターゼレベルの上昇および血清ビリルビンレベルが２．５ｍｇ／ｄＬ以上で、以下の少なくとも１つを有する：ａ）３ヵ月を超えて長期にわたる黄疸および症状、（ｂ）肝代償不全の徴候（ＩＮＲ≧１．５、腹水、脳症）、または（ｃ）薬物性肝障害に関連すると考えられる他の臓器不全。
【００３２】
上記で説明したように、プロドラッグ（プロトキシン）は、対象に直接的に投与することができる。したがって、プロドラッグ（プロトキシン）の効果的な用量をヒトに投与する方法であって、軽度から中等度の肝毒性を示す血液中の肝機能検査の上昇または異常が、選択または編集された細胞を増幅するのに十分な用量を示す方法を提供する。いくつかの実施形態において、成体において選択的毒性を誘導するのに充分なアセトアミノフェンの用量は、（１）連続日における６グラム／日のアセトアミノフェン、または（２）１０グラムを超えるアセトアミノフェンの単回投与である。
【００３３】
本明細書で使用されるように、ＣＹＰ依存性毒素は、その毒性がＣＹＰ酵素、Ｃｙｐｏｒ（ＰＯＲ）タンパク質、またはその両方を含むチトクロームｐ４５０代謝による活性化に依存するプロドラッグ（プロトキシン）を指す。多くのＣＹＰ依存性毒素はチトクロームｐ４５０代謝によって代謝的に活性化される（参照、一般的に、 Jaeschke, H. (2015) Dig.Dis., 33:464-471; Huttunen et al. (2008) Curr.Med.Chem., 15:2346-2365)。しばしば、親化合物は不活性かつ非毒性（例えば、プロドラッグ）であるが、Ｃｙｐ媒介酵素変換によって生成されるその代謝産物は毒性であり、特に肝毒性である。例えば、アセトアミノフェンは３種類のＰＯＲ依存性ＣＹＰ酵素（ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｅ１、およびＣＹＰ３Ａ４）により肝毒性化合物Ｎ−アセチル−ｐ−ベンゾキノンイミン（ＮＡＰＱＩ）に代謝される。いくつかの実施形態では、Ｃｙｐ依存性毒素が遺伝子改変肝細胞または他の改変細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ選択に使用され、毒性代謝産物の産生に関与するＣｙｐ活性が不活性化されている。ＣＹＰ依存性毒素の実施例を表１に示す。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
ある態様では、ＣＹＰ依存性毒素にはＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰＡ４、またはＣＹＰ２Ｄ６のいずれかによって活性型薬物に変換されるプロドラッグとしてアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）が含まれてもよい。別の態様において、ＣＹＰ依存性毒素は、ＣＹＰ３Ａ４によって活性薬物に変換されるプロドラッグとしてレトロシンを含むことができる。別の態様では、ＣＹＰ依存性毒素はタングレチンを含むことができる。別の態様では、ＣＹＰ依存性毒素がＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、またはＣＹＰ３Ａ４のいずれかによって促進される水酸化によって活性薬剤ホスホラミドマスタードに変換されるプロドラッグとしてシクロホスファミドを含んでもよい。別の態様では、ＣＹＰ依存性毒素が水酸化によって活性薬剤イホスファミドマスタードに変換されるプロドラッグとしてイホスファミドを含み得る。別の態様において、ＣＹＰ依存性毒素はプロドラッグとしてトロホスファミドを含み得、これは水酸化によって活性薬物トロホスファミドマスタードに変換される。別の態様では、ＣＹＰ依存性毒素には水酸化によって活性薬物ＰＭＥＡ−三リン酸に変換されるプロドラッグとしてプラデホビル（ｐｒａｄｅｆｏｖｉｒ）が含まれる。別の態様において、ＣＹＰ依存性毒素はプロドラッグとしてＭＢ０７１３３を含み得、これは水酸化によって活性薬物ａｒａＣ―三リン酸に変換される。別の態様において、ＣＹＰ依存性毒素は、水酸化によって活性薬物ＭＢ０７３４４に変換されるプロドラッグとしてＭＢ０７８１１を含み得る。別の態様において、ＣＹＰ依存性毒素は、酸化によって活性薬物ブパルバコン（ｂｕｐａｒｖａｑｕｏｎｅ）マスタードに変換されるプロドラッグとしてブパルバコンヒドロキシイミンを含み得る。別の態様において、ＣＹＰ依存性毒素は、酸化によって活性薬物ナブメトンに変換されるプロドラッグとしてナブメトンヒドロキシイミンを含み得る。別の態様において、ＣＹＰ依存性毒素は、Ｏ―脱メチル化還元によって活性薬物フラミジン（ＤＢ７５）マスタードに変換されるプロドラッグとしてＤＢ２８９を含み得る。別の態様において、ＣＹＰ依存性毒素は、還元によって活性薬剤Ｒｏ  ４８―３８８８マスタードに変換されるプロドラッグとしてシブラフィバンを含み得る。別の態様において、ＣＹＰ依存性毒素は、還元によって活性薬物メラガルタンに変換されるプロドラッグとしてキシメラガトランを含み得る。別の態様では、ＣＹＰ依存性毒素が還元によって活性薬剤グアナベンズに変換されるプロドラッグとしてグアノキサベンズ（ｇｕａｎｏｘａｂｅｎｚ）を含むことができる。別の態様において、ＣＹＰ依存性毒素は、還元によって活性薬物ＡＱ４に変換されるプロドラッグとしてＡＱ４Ｎを含み得る。別の態様では、ＣＹＰ依存性毒素が水酸化によって活性薬物ＭＴＩＣに変換されるプロドラッグとしてダカルバジン（「ＤＴＩＣ」）を含みうる。別の態様ではＣＹＰ依存性毒素が水酸化によって活性薬物５−ＦＵに変換されるプロドラッグとしてテガフールを含みうる。別の態様ではＣＹＰ依存性毒素が酸化またはエポキシ化によって活性薬物に変換されるプロドラッグとして４−イポメアノールを含み得る。別の態様ではＣＹＰ依存性毒素が環化によって活���薬物ＰＮＵ−１５９６８２に変換されるプロドラッグとしてＤＤＭＸ（「ＰＮＵ−１５２２４３」）を含み得る。別の態様では、ＣＹＰ依存性毒素にはＣＹＰ３Ａ４により促進される水酸化により活性薬物４−ヒドロキシタモキシフェンに変換されるプロドラッグとしてタモキシフェンを含み得る。別の態様において、ＣＹＰ依存性毒素は、Ｎ−脱メチル化によって活性薬物Ｎ−デスメチルタモキシフェンに変換されるプロドラッグとしてタモキシフェンを含み得る。別の態様では、ＣＹＰ依存性毒素が水酸化またはＮ―脱メチル化によって活性薬剤エンドキシフェンに変換されるプロドラッグとしてタモキシフェンを含み得る。別の態様において、ＣＹＰ依存性毒素は、ＣＹＰ３Ａ４によって活性薬物に変換されるプロドラッグとしてケトコナゾールを含み得る。別の態様において、ＣＹＰ依存性毒素は、ＣＹＰ２Ｄ６によって活性薬物に変換されるプロドラッグとしてトラマドールを含み得る。別の態様において、ＣＹＰ依存性毒素は、ＣＹＰ１Ａ２によって活性薬物に変換されるプロドラッグとしてタクリンを含み得る。別の態様において、ＣＹＰ依存性毒素は、ＣＹＰ３Ａ４によって活性薬物に変換されるプロドラッグとしてラシオカルピンを含み得る。別の態様において、ＣＹＰ依存性毒素は、ＣＹＰ３Ａ４によって活性薬物に変換されるプロドラッグとしてセンキルキンを含み得る。別の態様では、ＣＹＰ依存性毒素として、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、またはＣＹＰ２Ｃ８のいずれかによって活性薬物に変換されるプロドラッグとしてダスカルバジン（ｄａｓｃａｒｂａｚｉｎｅ）が挙げられる。別の態様において、ＣＹＰ依存性毒素は、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ１Ａ２、またはＣＹＰ２Ｃ８のいずれかによって活性薬物に変換されるプロドラッグとしてテガフ−ルを含み得る。別の態様において、ＣＹＰ依存性毒素は、酸化によって活性薬物Ｒ―１３０９６４）に変換されるプロドラッグとしてクロピドグレルを含み得る。別の態様において、ＣＹＰ依存性毒素は、酸化またはエポキシ化によって活性薬物ＰＹＲＲＯ／ＮＯに変換されるプロドラッグとしてＶ−ＰＹＲＲＯ／ＮＯを含み得る。別の態様において、ＣＹＰ依存性毒素は、酸化またはエポキシ化によって活性薬物ＰＲＯＬＩ／ＮＯに変換されるプロドラッグとしてＶ−ＰＲＯＬＩ／ＮＯを含み得る。
【００３６】
いくつかの実施形態において、本方法は、以下の工程を含む、細胞集団を選択的に増幅および／または増殖するための方法を提供する：
ａ）以下を含むドナー分子を投与すること：
ｉ）ｇＲＮＡ（例えば、ｓｃｇＲＮＡ）、ここで、ｇＲＮＡ配列はｃａｓ９ヌクレアーゼと結合し、ＣＹＰ酵素、Ｃｙｐｏｒ遺伝子、またはＣｔｎｎｂ１遺伝子を切断、ノックダウン、ノックアウト、および／またはその他の方法で破壊するように設計された活性部位ヌクレアーゼを生じる；
ｉｉ）ポリメラーゼＩＩプロモーター（例えば、細胞および／または組織特異的プロモーター）；
ｉｉｉ）トランスジーン（任意選択）；
ｉｖ）所望のレシピエント細胞ローカスへの相同組み込みを容易にし、促進し、または他の方法で可能にするように設計された細胞および／または組織特異的相同性アーム配列；
ｂ）ｃａｓ９ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするタンパク質または核酸）を投与すること、ここで、ｃａｓ９ヌクレアーゼはｇＲＮＡと結合して、ＣＹＰ酵素、Ｃｙｐｏｒ遺伝子、またはＣｔｎｎｂ１遺伝子を切断、ノックダウン、ノックアウト、および／または他の方法で破壊するように設計された活性部位ヌクレアーゼを生じる；および
ｃ）プロドラッグ（プロトキシン）（例えば、ＣＹＰ依存性毒素）を投与すること。
【００３７】
ｓｃｇＲＮＡドナー分子は、機能的ｇＲＮＡ（ｃａｓ９に結合することができる）の発現を可能にする。ｓｃｇＲＮＡの発現は特異的な細胞および／または組織型（例えば、所望の遺伝子編集事象を受けたもの）に限定される。特定の実施形態において、哺乳動物細胞によって使用される細胞型特異的プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ２）プロモーターを使用する。また、これらのプロモーターによって駆動される転写は、ｃａｓｔ９  ｇＲＮＡの適切なプロセシングを可能にしないことが当技術分野で知られている。また、ＤＮＡドナー分子と埋め込まれたＰｏｌ２プロモーター配列との相同組換えを受けたレシピエント細胞のみが、ＤＮＡドナー分子配列（ｇＲＮＡおよびＤＮＡドナー分子が含むかあるいは含まない任意のトランスジーンを含む）を転写するであろうことも、当該技術分野において公知である。逆に、該相同ＤＮＡドナー分子のランダム組み込みは、機能的ｇｓＲＮＡまたはトランスジーン発現を生じないことが当該分野で公知である。ｇＲＮＡ配列を、ｇＲＮＡ配列から上流および下流の両方に埋め込まれた相同性アームを有するＤＮＡドナー分子に埋め込むことにより、細胞および／または組織特異的相同組換えおよびレシピエント細胞ゲノムへのＤＮＡドナー分子の組み込みが促進される。さらに、１つ以上のリボザイム配列がｇＲＮＡ配列（「左リボザイム」）の上流に埋め込まれ、１つ以上のリボザイム配列がｇＲＮＡ配列（「右リボザイム」）の下流に埋め込まれているＤＮＡドナー分子にｇＲＮＡ配列を埋め込むことによって、ｇＲＮＡ配列を含有する非スプライシングＰｏｌ２  ＲＮＡ転写物は、左リボザイムおよび右リボザイムによって組み合わされた切断によって適切にプロセシングされる。したがって、特異的な細胞型および／または組織型を標的とする機能的ｇＲＮＡおよびトランスジーンの非ランダムかつ同時に起こる同時発現が、ｓｃｇＲＮＡ分子によって可能になる。
【００３８】
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ配列は、トランスジーンのイントロンに埋め込まれる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターが利用される。他の実施形態では、ｐＸ３３０ベクターが利用される。いくつかの実施形態では、相同組み込みはＧｅｎｅＲｉｄｅ（登録商標）テクノロジーを用いて促進され、ここで、トランスジーンおよび選択カセットの両方がそれら自身のプロモーターを欠く；標的ローカスへの相同組換え後、トランスジーンおよびＣＹＰ毒素選択カセットの両方が細胞プロモーターによって発現される；標的組み込みのみが選択される。さらなる実施形態では、組み込みはランダム組み込みベクターを使用して促進される。いくつかの実施形態において、相同組み込みは、トランスジーンおよび選択カセットの両方がそれら自身のプロモーターを有するランダム組み込みベクターを用いて促進される；細胞染色体へのランダム組み込み後、トランスジーンおよびＣＹＰ毒素選択カセットの両方が発現される；任意の染色体組み込みを選択することができる。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ配列は、ｃａｓ９ヌクレアーゼと組み合わされて、個々のＣＹＰ酵素を切断、ノックダウン、ノックアウト、および／または他の方法で破壊する活性な部位特異的ヌクレアーゼを生じるように設計される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列がｃａｓ９ヌクレアーゼと組み合わされて、ＣＹＰ酵素の発現に必要な転写因子Ｃｔｎｎｂ１（Βカテニン）を切断、ノックダウン、ノックアウト、および／または他の方法で破壊する活性な部位特異的ヌクレアーゼを生じるように設計される。
【００３９】
１つの態様において、本発明は、（ａ）配列番号１の残基１〜４５および４，４０６〜４，５５０に記載されるコンカテマー形成を補助するための対応する逆位末端反復（「ＩＴＲ」）；（ｂ）配列番号１の残基２１２〜１，５１６および２，９７８〜３，０１２に記載の対応するマウスアルブミン相同アーム；（ｃ）配列番号１の残基１，５１７〜１５８２に記載のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター配列；（ｄ）配列番号１の残基１，５８９〜２，９７１に記載のヒト第ＩＸ因子配列の例；（ｅ）配列番号１の残基３，０２６〜３０６８に記載のハンマーヘッド型リボザイム配列の例；（ｆ）ｇＲＮＡの例であって、ここで、ｇＲＮＡは、配列番号１の残基３，０６７〜３，０８８に示されるようなヒトＰＯＲ遺伝子に相補的なＤＮＡ標的化セグメントを含む；および（ｇ）配列番号１の残基３，０８９〜３，２３６に記載のデルタ肝炎ウイルスリボザイムの例；コードするｓｃｇＲＮＡドナー分子配列（およびその全ての保存的に改変された変異体）を提供する。
【００４０】
いくつかの実施形態において、Ｃｙｐｏｒヒト第９因子ＧｅｎｅＲｉｄｅ（登録商標）は、ｒＡＡＶベクターとしてプラスミドに含まれる。１つの実施形態において、エレメント（ｅ）および（ｇ）はスプライシングされていないＰｏｌ２プロモーター生成ＲＮＡ転写物を切断し、それによって、適切にプロセシングされたｇＲＮＡを放出する。非限定的な例では、エレメント（ｅ）の配列の３’末端がエレメント（ｆ）の５’末端からすぐ上流（５’）に、間隔なしで最適に位置し、エレメント（ｇ）の５’末端はエレメント（ｆ）の３’末端からすぐ下流（３’）に、間隔なしで最適に位置する。いくつかの実施形態ではエレメント（ｅ）および（ｇ）がエレメント（ｆ）のすぐ上流およびすぐ下流には位置しないが、エレメント（ｅ）の場合、上流に１００塩基対以上（例えば、少なくとも５０、少なくとも７０、または少なくとも１００塩基対）まで位置してもよく、エレメント（ｇ）の場合、エレメント（ｆ）の下流に１００塩基対以上（例えば、少なくとも５０、少なくとも７０、または少なくとも１００塩基対）まで位置してもよい。いくつかの実施形態では、エレメント（ｆ）が配列番号３４〜５１６のうちの１つに記載のヒトＰＯＲ遺伝子に相補的な配列を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、以下の工程を含む、細胞集団を選択的に増幅および／または増殖するための方法を提供する：
ａ）以下を含むドナー分子を投与する工程：
ｉ）ポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６プロモーター配列）；
ｉｉ）ｇＲＮＡ配列がｃａｓ９ヌクレアーゼと結合し、ＣＹＰ酵素またはＣｙｐｏｒ遺伝子を切断、ノックダウン、ノックアウト、および／または他の方法で破壊するように設計された活性部位ヌクレアーゼを生じるｇＲＮＡ；
ｉｉｉ）プロモーター；
ｉｖ）発現されたｃａｓ９ヌクレアーゼがエレメント（ｂ）のｇｓＲＮＡと結合し、ＣＹＰ酵素、Ｃｙｐｏｒ遺伝子またはＣｔｎｎｂ１を切断、ノックダウン、ノックアウト、および／またはその他の方法で破壊するように設計された活性部位ヌクレアーゼを生じる、ＳｐＣＡＳ９配列；および／または、
ｂ）プロドラッグ（プロトキシン）（例えば、ＣＹＰ依存性毒素）を投与する工程。
【００４２】
１つの態様において、要素ｉｉ）のｇＲＮＡは配列番号３４〜５１６の１つに記載されるように、ヒトＰＯＲ遺伝子に相補的であることを含む。いくつかの実施形態では、ｐＸ３３０プラスミドベクターが利用される。いくつかの実施形態では相同組み込みはＧｅｎｅＲｉｄｅ（登録商標）テクノロジーを使用して促進され、ここで、トランスジーンおよび選択カセットの両方はそれら自身のプロモーターを欠く；標的ローカスへの相同組換え後、トランスジーンおよびＣＹＰ毒素選択カセットの両方が細胞プロモーターによって発現される；標的化組み込みのみが選択される。さらなる実施形態において、相同組み込みは、トランスジーンおよび選択の両方がそれら自身のプロモータを有するランダム組み込みベクターを使用して促進され；細胞染色体へのランダムな組み込みの後、トランスジーンおよびＣｙｐｏｒ選択カセットの両方が発現され；任意の染色体組み込みが選択され得る。
【００４３】
いくつかの実施形態において、本発明は、以下の工程を含む細胞集団を選択的に増幅および／または増殖するための方法を提供する：
ａ）以下を含むドナー分子を投与する工程：
ｉ）ポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６プロモーター配列）；
ｉｉ）レンチウイルス構築物、ｓｈＲＮＡｍｉｒ骨格、ここで、マイクロＲＮＡに埋め込まれたｓｈＲＮＡはＣｙｐｏｒ遺伝子に相同な配列を含む；および
ｂ）プロドラッグ（プロトキシン）（例えば、ＣＹＰ依存性毒素）を投与する工程。
【００４４】
いくつかの態様において、要素ｉｉ）のｓｈＲＮＡは、配列番号２〜３３の１つに示されるようなヒトＰＯＲ遺伝子に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターが利用される。他の実施形態では、ｐＸ３３０ベクターが利用される。いくつかの実施形態では相同組み込みはＧｅｎｅＲｉｄｅ（登録商標）テクノロジーを用いて促進され、ここで、トランスジーンおよび選択カセットの両方はそれら自身のプロモーターを欠く；標的ローカスへの相同組換え後、トランスジーンおよびＣＹＰ毒素選択カセットの両方が細胞プロモーターによって発現される；標的化組み込みのみが選択される。さらなる実施形態では、組み込みはランダム組み込みベクターを使用して促進される。いくつかの実施形態では、相同組み込みはトランスジーンおよび選択カセットの両方がそれら自身のプロモーターを有するランダム組み込みベクターを使用して促進される；細胞染色体へのランダム組み込み後、トランスジーンおよびＣＹＰ毒素選択カセットの両方が発現される；任意の染色体組み込みが選択され得る。
【００４５】
いくつかの実施形態では、方法がｍＲＮＡベースのドナー分子を細胞に投与することを含む。例えば、ＲＮＡ分子は、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９をコードするｍＲＮＡを含み得る。
【００４６】
本発明の別の態様によれば、対象における疾患または障害を治療、阻害、および／または予防する方法が提供される。特定の実施形態において、該方法はトランスジーンが治療されるべき疾患または障害に対して治療的である（例えば、治療タンパク質をコードする）本発明の方法を実施することを含む。特定の実施形態では、該方法がプロドラッグ（プロトキシン）を対象に投与することを含む。この方法は、遺伝子編集された細胞がｉｎ  ｖｉｖｏ増殖することができる任意のシステムにおいて使用することができる。標的組織の例には限定されるものではないが、肝臓（例えば肝細胞および／または胆管）、造血系（例えば幹細胞、Ｔ細胞、および／または前駆細胞）、皮膚（例えば皮膚および／または毛包幹細胞）、腎臓（例えば尿細管上皮）、腸管（例えば幹細胞）、肺、および膵臓が含まれる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、治療される疾患または障害は肝臓病である。肝疾患の例には肝硬変、線維症、肝細胞癌（ＨＣＣ）、および肝感染が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、治療されるべき疾患または障害は、クリグラー・ナジャー症候群（１型および２型）、家族性高コレステロール血症、メープルシロップ尿症、進行性家族性肝内胆汁うっ滞、フェニルケトン尿症、チロシン血症、ムコ多糖症ＶＩＩ型、α−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）欠損症、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、ウィルソン病、糖原病、フォン・ギールケ病、ポンペ病、高ビリルビン血症、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）、およびシトルリン血症１型を含む遺伝的肝障害の群から選択される。いくつかの実施形態では、治療される疾患または障害が血友病Ａ、血友病Ｂ、およびシュウ酸症の群から選択される。いくつかの実施形態において、治療される疾患または障害はＢ型肝炎またはＣ型肝炎であり、いくつかの実施形態において、治療される疾患または障害は、肝癌、胆管がん、肝臓の転移性腫瘍、および肝外腫瘍の群から選択される。いくつかの実施形態では、治療される疾患または障害が急性肝不全、同種移植片拒絶、および異種移植片拒絶の群から選択される。
【００４８】
本明細書に記載されるような成分は一般に、薬学的調製物として対象に投与される。本明細書で使用される「患者」または「対象」という語は、ヒトまたは動物対象を指す。本発明の成分は指示された疾患または障害の治療のために、医師のガイダンスのもとで、治療的に使用することができる。
【００４９】
本発明の成分を含む医薬製剤は水、緩衝食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、油、界面活性剤、懸濁剤またはそれらの適当な混合物などの許容可能な媒体（例えば、薬学的に許容される担体）と共に投与するために便利に製剤化することができる。選択された媒体中の薬剤の濃度は変化させることができ、媒体は、薬学的調製物の所望の投与経路に基づいて選択することができる。ただし、任意の従来の媒体または薬剤が投与される薬剤と不適合である限り、薬学的調製物中でのその使用が企図される。
【００５０】
適切な薬学的調製物の選択は、選択される投与方法に依存する。例えば、本発明の成分は任意の所望の組織（例えば、肝臓）または周囲領域への直接注入によって投与され得る。この場合、薬学的調製物は、血液または標的組織と適合性である媒体中に分散された成分を含む。
【００５１】
治療は例えば、非経口的に、血流中への注射（例えば、静脈内）によって、経口的に、または皮下、筋肉内もしくは腹腔内注射によって投与され得る。特定の実施形態において、治療は直接注入  （例えば、処置される組織への）によって、または経口的に投与される。注射のための薬学的調製物は、当該分野で公知である。治療を施すための一方法として注射が選択される場合、分子の充分な量がそれらの標的細胞に到達して生物学的作用を発揮することを確実にするために、工程が取られなければならない。
【００５２】
活性成分として本発明の化合物を薬学的担体と密接に混合して含有する医薬組成物は、従来の医薬配合技術に従って調製することができる。担体は投与、例えば、静脈内、経口または非経口のために所望される調製物の形態に依存して、多種多様な形態をとり得る。経口用量形態の調製において、例えば、水、ポリエチレングリコール、油、アルコール、香料、防腐剤、着色剤などの通常の医薬媒体のいずれか、または経口液状調製物（例えば、懸濁液、エリキシルおよび溶液など）の場合には担体、または経口固形調製物（例えば、粉末、カプセルおよび錠剤など）の場合には、デンプン、糖、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などの担体を使用することができる。注射可能な懸濁液を調製することができ、この場合、適切な液体担体、懸濁剤などを使用することができる。
【００５３】
投与を容易にし、用量を均一にするために、用量ユニット形態で製剤化することができる。用量単位形態は、本明細書中で使用される場合、処置を受ける患者に適切な薬学的調製物の物理的に別個の単位をいう。各々の用量は、選択された薬学的担体と関連して所望効果を生じるように計算された量の活性成分を含有すべきである。適切な用量単位を決定するための手順は、当業者に周知である。用量単位は、患者の体重に基づいて比例的に増減してもよい。特定の病理学的状態の緩和のための適切な濃度は当該分野で公知のように、用量濃度曲線計算によって決定され得る。
本発明の方法は方法の効力をモニタリングするために、本発明の組成物の投与後に対象中の疾患または障害をモニタリングすることをさらに含んでもよい。
【００５４】
本発明の別の態様に従って、ｇＲＮＡを発現する方法が提供される。この方法はｐｏｌ２プロモーター（例えば、組織または細胞特異的ｐｏｌ２プロモーター）の制御下で自己開裂ガイドＲＮＡ（ｓｃｇＲＮＡ）を発現する工程を包含する。自己開裂ｇＲＮＡは、単一のガイドＲＮＡの５’および３’末端にリボザイムを含む。ｓｃｇＲＮＡを発現すると、自己開裂リボザイムは細胞内のｇＲＮＡを放出し、Ｃａｓ９と作用する。いくつかの実施形態では、ｓｃｇＲＮＡがｇＲＮＡの５’にハンマーヘッド型リボザイムを含み、ｇＲＮＡの３’末端に肝炎デルタウイルスリボザイムを含む。ｓｃｇＲＮＡの発現は任意の遺伝子編集事象（例えば、相同組換え）とともに使用され得る。特定の実施形態において、ｓｃｇＲＮＡは本明細書中に記載される遺伝子編集と共に使用される（例えば、細胞中の１つ以上のＣＹＰ酵素、ＣＴＮＮＢ１、および／またはＣＹＰＯＲを阻害するために）。特定の実施形態において、ｓｃｇＲＮＡは実施例３に記載される遺伝子編集と共に使用される（例えば、特にフマリルアセトアセテートヒドロラーゼ（Ｆａｈ-/-）背景において、フェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（Ｈｐｄ）またはホモジェニック酸ジオキシゲナーゼ（Ｈｇｄ）を阻害するために）。ｐｏｌ２プロモーター（例えば、組織または細胞特異的ｐｏｌ２プロモーター）の制御下にあるｓｃｇＲＮＡを含むベクターもまた、本発明によって包含される。
【００５５】
＜定義＞
以下の定義は、本発明の理解を容易にするために提供される：
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「Ｔｈｅ」は文脈が明確に他のことを規定していない限り、複数の指示対象を含む。本明細書における「または」への任意の記載は文脈が明確に他のことを規定していない限り、「および／または」を包含することを意図する。
【００５６】
「薬学的に許容される」とは、動物、より詳細にはヒトにおける使用のための、連邦もしくは州政府の規制当局による承認、または米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に記載された承認を示す。
【００５７】
「担体」とは、例えば、希釈剤、補助剤、防腐剤（例えば、チメルソール、ベンジルアルコール）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ポリソルベート８０）、乳化剤、緩衝剤（例えば、トリスＨＣｌ、酢酸、リン酸）、抗菌剤、増量剤（例えば、ラクトース、マンニトール）、賦形剤、補助剤またはビヒクルをいい、これらを用いて本活性剤が投与される。薬学的に許容される担体は、石油、動物、植物または合成起源のものを含む、水および油のような滅菌液であり得る。水または水性生理食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液は、特に注射可能な溶液のための担体として使用されることが好ましい。適切な薬学的担体は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy(Lippincott, Williams and Wilkins); Libermanら編、pharmaceutical用量Forms, Marcel Decker, New York, NY;およびRoweら編、Handbook of pharmaceutical Excipients, Pr.に記載されている。
【００５８】
本明細書で使用される「治療する」という用語は、疾病に罹患した患者に利益を与える任意の種類の治療を指し、患者の状態（例えば、１つ以上の症状）の向上、症状の進行の遅延などを含む。
本明細書で使用される「予防する」という用語は、症状を発症する危険性がある対象の予防的治療を指し、対象が症状を発症する蓋然性を低下させる。
化合物または医薬組成物の「治療有効量」は、特定の障害または疾患および／またはその症状を予防、阻害、または治療するのに効果的な量を指す。
本明細書で使用される「対象」という用語は、動物、特に哺乳動物、特にヒトを指す。
【００５９】
用語「単離された」とは、その製造中に存在する他の成分から化合物を分離することを意味する。「単離された」とは他の化合物または材料との人工または合成混合物、または基本活性を実質的に妨害せず、例えば不完全な精製または安定剤の添加により存在し得る不純物の存在を排除することを意味するものではない。
【００６０】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上のリボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチド、好ましくは３つを超えるものからなる核酸分子を含む。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、様々な要因、ならびにオリゴヌクレオチドの特定用途および使用に依存する。
【００６１】
本明細書で使用される「核酸」または「核酸分子」は一本鎖または二本鎖のいずれかの任意のＤＮＡまたはＲＮＡ分子、および、一本鎖の場合、線状または環状のいずれかの相補的配列の分子を指す。
核酸分子の議論において、特定の核酸分子の配列または構造は、５’から３’の方向に配列を提供する通常の慣例に従って本明細書中に記載され得る。
本発明の核酸分子に関して、用語「単離された核酸分子」が時に使用される。
この用語は、ＤＮＡに適用される場合、それが由来する生物の天然に存在するゲノムにおいてそれが直接隣接する配列から分離されたＤＮＡ分子をいう。
【００６２】
例えば、「単離された核酸」は、プラスミドまたはウイルスベクターのようなベクターに挿入された、または原核細胞もしくは真核細胞もしくは宿主生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子を含み得る。
【００６３】
用語「ベクター」は核酸配列が例えば、それが発現および／または複製され得る宿主細胞への導入のために挿入され得るキャリア核酸分子（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）を指す。ベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであってもよく、一本鎖または二本鎖であってもよい。ベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入、または任意の他のモードの細胞浸透を介して、外因性物質をレシピエント細胞に送達するためのビヒクルとして使用され得る。「発現ベクター」は宿主細胞における発現に必要な機能的に連結された調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなど）を必要とする遺伝子または核酸配列を含む特殊なベクターである。「作動可能に連結された」という語は、コード配列の発現に必須の調節配列がコード配列の発現をもたらすように、コード配列に対して適切な位置でＤＮＡ分子中に配置されることを意味する。この同一の定義は発現ベクター中のコード配列および転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、および終結エレメント）の配置に適用されることがある。
【００６４】
本明細書で使用される場合、用語「低分子」は比較的低い分子量（例えば、４，０００未満、２，０００未満、特に１ｋＤａまたは８００Ｄａ未満）を有する物質または化合物を指す。典型的には低分子は有機分子であるが、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、または核酸ではない。
【００６５】
「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」という語句は、短い（典型的には３０ヌクレオチド長未満、特に１２〜３０または２０〜２５ヌクレオチド長）二本鎖ＲＮＡ分子を指す。典型的には、ｓｉＲＮＡがｓｉＲＮＡの標的となる遺伝子の発現を調節する。ｓｉＲＮＡ分子を同定および合成する方法は当該分野で公知である（例えば、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc.を参照のこと）。短ヘアピンＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）は典型的には小さいループ配列（例えば、６〜１５ヌクレオチド、特に７〜１０ヌクレオチド）によって分離された短い相補的配列（例えば、ｓｉＲＮＡ）からなり、ここで、配列の１つは、遺伝子標的に対して相補的である。ｓｈＲＮＡ分子は、典型的にはエンドヌクレアーゼによって細胞内でｓｉＲＮＡにプロセシングされる。ｓｉＲＮＡ分子に対する例示的な修飾は、米国特許出願公開第２００５００３２７３３号に提供されている。例えば、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ分子はヌクレアーゼ抵抗性修飾（例えば、ホスホロチオエート、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２’―Ｏ―メチル修飾、またはモルホリノ結合）で修飾され得る。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ分子の発現のための発現ベクターは、構成的または調節され得る強力なプロモーターを使用し得る。
【００６６】
「アンチセンス核酸分子」または「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は目的のタンパク質の発現を阻害するために、選択された配列（例えば、翻訳開始部位および／またはスプライシング部位）に対して標的化される（相補的な）核酸分子（例えば、一本鎖分子）を含む。このようなアンチセンス分子は典型的には約１５〜約５０ヌクレオチド長、より詳細には約１５〜約３０ヌクレオチド長であり、そしてしばしばｍＲＮＡ分子の翻訳開始部位にわたる。逆方向に標的核酸分子の配列全体を含有するアンチセンス構築物も作製することができる。任意の公知のヌクレオチド配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標準的な方法に従ってオリゴヌクレオチド合成によって調製することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ抵抗性修飾を含むように上記のように修飾され得る。
【００６７】
本明細書中で使用される場合、「下流」は参照ローカスに対して３’―末端のより近くに位置するローカスまたは配列位置を意味し、ここで、オリゴヌクレオチド配列は５’―末端で始まり、そして３’―末端で終わるまで「５’から３’」に走る。
【００６８】
本明細書中で使用される場合、「ドナー分子」は外因性分子を意味し、ここで、この分子は、レシピエント細胞に対して効果を引き起こすように設計される。
【００６９】
本明細書中で使用される「埋め込まれた」とは単一分子を形成する、より大きな合成オリゴヌクレオチド内の特定の所望のオリゴヌクレオチド配列の包含を意味し、ここで、該分子は埋め込まれた配列のものを超えるさらなる活性または用途を有しても有しなくてもよい。
【００７０】
本明細書中で使用される場合、「相同性アーム」はレシピエント細胞ゲノムへのドナー分子の相同組み込みを促進し、促進し、そして可能にするように設計された所望のローカスに対する相同性を有する標的配列を意味する。
【００７１】
本明細書中で使用される場合、「組み込みベクター」は、レシピエント細胞染色体またはゲノムに組み込まれるドナー分子、トランスジーン、または他の外因性ＤＮＡもしくはＲＮＡを送達するベクターを意味する。
【００７２】
本明細書中で使用される場合、「ノックアウト」は、生物の遺伝子が作動不能にされる技術を意味する。
【００７３】
本明細書中で使用される場合、「ノックダウン」は、生物の遺伝子の発現が低減される技術を意味する。
【００７４】
本明細書中で使用される場合、「プロドラッグ」は生物系に投与された場合に、自発的な化学反応、酵素触媒化学反応、光分解、および／または代謝化学反応の結果として、薬物物質、すなわち活性成分を生成する任意の化合物を意味する。したがって、プロドラッグは治療または毒性活性（例えば、プロトキシン）のいずれかを有する化合物の共有結合的に修飾された類似体または潜在形態である。
【００７５】
「リンカー」は、少なくとも２つの化合物を共有結合する原子鎖を含む化学部分を指す。リンカーは化合物の任意の合成的に実現可能な位置に連結することができるが、好ましくは所望の活性の化合物を遮断することを避けるような様式で連結することができる。リンカーは、当技術分野で一般に知られている。特定の実施形態では、リンカーが１〜約５０個の原子、１〜約１０個の原子、または約１〜約５個の原子を含有し得る。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「ｓｈＲＮＡｍｉｒ」は、マイクロＲＮＡ埋め込み型ｓｈＲＮＡ分子を意味する。
【００７７】
本明細書中で使用される場合、「非組み込みベクター」はドナー分子、トランスジーン、または他の外因性ＤＮＡもしくはＲＮＡを送達するベクターを意味し、ここで、このドナー分子はエピソームのままであり、そして／またはレシピエント細胞染色体もしくはゲノムに組み込まれない。
【００７８】
本明細書中で使用される場合、「合成オリゴヌクレオチド」は、ヒトによって作製され、そして既存の天然供給源から単離されないオリゴヌクレオチドを意味する。
本明細書で使用する「標的配列」とは、「標的部位」または「標的配列」を含むＤＮＡポリヌクレオチドを意味する
【００７９】
用語「標的部位」または「標的配列」は、本明細書中で互換的に使用され、結合のための十分な条件が存在することを条件として、ベクターのＤＮＡ標的セグメントが結合する標的ＤＮＡ中に存在する核酸配列を指す。適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件には、細胞中に通常存在する生理学的条件が含まれる。他の適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系における条件）は当該分野で公知である（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照のこと）。ガイドＲＮＡに相補的でハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖を「相補鎖」と呼び、「相補鎖」に相補的である標的ＤＮＡの鎖（したがって、ガイドＲＮＡに相補的ではない）を「非相補鎖」または「非相補鎖」と呼ぶ。「部位特異的修飾ポリペプチド」または「ＲＮＡ結合部位特異的ポリペプチド」または「ＲＮＡ結合部位特異的修飾ポリペプチド」または「部位特異的ポリペプチド」とは、ＲＮＡに結合し、特定のＤＮＡ配列を標的とするポリペプチドを意味する。本明細書に記載の部位特異的修飾ポリペプチドは、それが結合するＲＮＡ分子によって特定のＤＮＡ配列を標的とする。ＲＮＡ分子は標的ＤＮＡ内の標的配列に結合する、ハイブリダイズする、または相補的である配列を含み、したがって、結合したポリペプチドを標的ＤＮＡ内の特定の位置（標的配列）に標的化する。
【００８０】
本明細書で使用する「トランスジーン」とは、レシピエント細胞に導入されると、レシピエント細胞の表現型を変化させる可能性を有する非天然遺伝物質を意味する。
【００８１】
本明細書中で使用される場合、「上流」は参照ローカスに対して５’末端により近くに位置する遺伝的ローカスまたは配列位置を意味し、ここで、オリゴヌクレオチド配列は５’末端で始まり、３’末端で終わるまで「５’から３’」に走る。
【００８２】
以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を例示するために提供される。実施例は説明のためのものであり、決して本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００８３】
実施例１
材料及び方法
プラスミド構築：ＣＲＩＳＰＲ認識部位を、配列５’―ＴＣＧＴＧＧＧＧＧＴＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣ―３’（配列番号５１８）を有するオンライン設計ツール（www.crispr.mit.eduで入手可能）を用いてマウスＣｙｐｏｒ遺伝子のエキソン１内で同定した。この配列をコードするオリゴヌクレオチドをＢｂｓＩで切断したｐＸ３３０(Addgene cat.42230; Watertown, MA)にアニーリングし、連結した。ｐＸ３３０はヒトコドン最適化ＳｐＣａｓ９およびキメラガイドＲＮＡ発現プラスミドである（Ｃｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）３３９（６１２１）：８１９―２３）。簡単に述べると、プラスミドがＵ６プロモーターの制御下にあるｇＲＮＡおよびＣＢｈプロモーター（ハイブリッドニワトリβアクチンプロモーター）の制御下にあるＳｐＣａｓ９を含む。オリゴヌクレオチド配列は、５’−ＣＡＣＣＧＴＣＧＴＧＧＧＧＧＴＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣ−３’（配列番号５１９）および５’−ＡＡＡＣＧＴＡＧＧＴＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＡＣＧＡＣ−３’（配列番号５２０）であった。得られたプラスミド（ｐＸ３３０−Ｃｙｐｏｒ）を、Ｇｕｉｄｅ−Ｉｔ（登録商標）突然変異検出キット(Takara Bio USA, Inc., Mountain View, CA)を用いて標的配列を切断し検証した。
【００８４】
動物手順：７〜９週齢の雄１２９／ｓｖマウスに、生理食塩水で希釈した４０μｇのｐＸ３３０―Ｃｙｐｏｒプラスミドを、流体力学的尾静脈注射によって投与した。３週間後、マウスを２つのコホートに分けた：４匹のマウスに、ＩＰ注射によりアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ、生理食塩水中１３ｍｇ／ｍｌ）を週２回、全１６回注射した。３匹のマウスは対照として保存し、ＡＰＡＰを投与しなかった。最終の６回のＡＰＡＰ投与については、注射の１６時間前にマウスを絶食させた。アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）レベルを、ＡＬＴ試薬キット（ＢＫＫｉｔｓ．ｃｏｍで入手可能，ＢＱ  ００４Ａ−ＣＲ）を用いて伏在静脈穿刺から採取した１０μｌの血液からＡＰＡＰ注射の６〜２０時間後に測定し、マウスを最終ＡＰＡＰ注射の２週間後に屠殺し、肝臓を採取した。
【００８５】
免疫蛍光：肝切片をパラホルムアルデヒド中で５時間固定し、３０％スクロース中で一晩凍結防止し、最適切断温度（ＯＣＴ）化合物中に包埋した。７つのマイクロ切片をＰＢＳで洗浄し、０．１％トリトンＸ―１００を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１２分間浸透化し、０．３Ｍグリシンで３０分間ブロックし、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした（Ａｂｃａｍ  ａｂ１８０５９７（英国ケンブリッジ）；１０％正常ヤギ血清を含むＰＢＳ中１：２００）。ＰＢＳ中で３×５分間洗浄した後、切片を二次抗体（ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ．Ａ２７０３９（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、１／２０００に希釈）中で室温で１時間インキュベートした。切片をＤＡＰＩ  Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ（登録商標）（Southern Biotech, Inc., Birmingham, AL)にマウントし、Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡を用いて可視化した。
【００８６】
結果
図２にみられるように、ｐＸ３３０−Ｃｙｐｏｒを注射したマウスでは、血中ＡＬＴレベルとして測定した肝障害が経時的に減少した。投与マウスは約１０週後にＡＰＡＰ耐性を示した。ＣＹＰＯＲ免疫組織化学検査の結果を図３に示す。ＡＰＡＰ注射を受けたｐＸ３３０−Ｃｙｐｏｒ処置マウスでは、大きなＣＹＰＯＲ陰性結節を伴う分布が存在し、それによりＣｙｐｏｒ−ｎｕｌｌ肝細胞のクローン性増殖が示される（下段の画像；破線はＣｙｐｏｒ−ｎｕｌｌ結節の輪郭を示す）。大きなＣＹＰＯＲ陰性結節は、ＡＰＡＰで処置しなかったマウスには存在しない（上の画像）。
【００８７】
図４は、（左から右へ）対照プラスミド（ｐＸ３３０）、ＡＰＡＰ選択なしのｐＸ３３０―Ｃｙｐｏｒ、ＡＰＡＰ注射を伴うｐＸ３３０―Ｃｙｐｏｒ、およびＡＰＡＰ食餌を伴うｐＸ３３０―Ｃｙｐｏｒを注射されたマウスにおけるＣｙｐｏｒインデルの数を示す。ＡＰＡＰ投与マウスのインデル発生頻度は、注射または食餌のいずれかによってＡＰＡＰを投与されたマウスで有意に高く（ｐ＜０．０１）、それによりＣｙｐｏｒノックアウトによる肝細胞の選択が実証された。
【００８８】
上記に加えて、マウスにＣｙｐ１Ａ２／２Ｅ１  ＣＲＩＳＰＲノックアウトプラスミドも注射し、ＡＰＡＰで処置した。図５に見られるように、Ｃｙｐ１Ａ２／２Ｅ１  ＣＲＩＳＰＲノックアウトプラスミドを注入したマウスのＡＰＡＰ選択肝臓では、ＡＰＡＰ処置を行わなかったマウス（左の画像）と比較して、Ｃｙｐ２Ｅ１陰性結節（右の画像；破線はＣｙｐ２Ｅ１  ｎｕｌｌ  結節の輪郭）が認められた。ＡＰＡＰ投与により、Ｃｙｐ１Ａ２およびＣｙｐ２Ｅ１インデルの頻度は１から〜１２％（肝細胞の〜１７％）に増加した。これは、Ｃｙｐ１Ａ２およびＣｙｐ２Ｅ１のノックアウトがＣｙｐｏｒ熟練（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）肝臓においてさえ、ＡＰＡＰ耐性を達成するのに十分であることを実証する。
【００８９】
実施例２
Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン装置を用いて、ｓｈＲＮＡによるＣＹＰＯＲノックダウンを試験した。簡単に述べると、マウスに２つの別々のプラスミドを注射した。１つのプラスミドは、ＣＭＶプロモーターの制御下でＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼを含んでいた。第２のプラスミドは、ＧＦＰ発現カセットおよびＵ６駆動Ｃｙｐｏｒ  ｓｈＲＮＡを含むトランスポゾンカセットを含んでいた。処置後、注射したマウスを、３ヶ月のＡＰＡＰ選択に供した。
【００９０】
図６は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系およびＡＰＡＰで処置した実験におけるマウス由来の肝臓に対するＣＹＰＯＲ免疫組織化学およびＧＦＰ蛍光を提供する。上のパネルは、陰性対照（無関係なｓｈＲＮＡ）からの結果を示す。まれなＧＦＰ＋細胞がみられるが、結節は形成されていない。下のパネルは、ＧＦＰ―Ｃｙｐｏｒ  ｓｈＲＮＡトランスポゾンを注射したＡＰＡＰ処置マウスからの画像を示す。ＧＦＰ発現の大きなコンフルエントな領域は、Ｃｙｐｏｒ陰性領域に見られる。これはトランスポゾン陽性肝細胞の増殖の明確な証拠を提供する。
【００９１】
実施例３
自己開裂ガイドＲＮＡも試験した。自己開裂ガイドＲＮＡはガイドＲＮＡの両側にリボザイムを含み、ガイドＲＮＡがｐｏｌ  ＩＩプロモーターから駆動されるようにした。例えば、ハンマーヘッド（ＨＨ）リボザイムはガイドＲＮＡの５’にあってもよく、肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）リボザイムはガイドＲＮＡの３’末端にあってもよい。図７は、自己開裂ガイドＲＮＡの概略図を提供する。
【００９２】
１つの実験において、ハンマーヘッド型リボザイムおよび肝炎デルタウイルス型リボザイムに挟まれるガイドＲＮＡを含むｓｃｇＲＮＡを使用した。これらの実験に利用されるターゲティングベクターは、バイオマーカーとしてのヒト第ＩＸ因子およびマウスアルブミンローカスに対して相同的アーム間のｓｃｇＲＮＡを含む。アルブミン遺伝子は、細胞型特異的ローカスの例として選択された。ベクターは、４ーＯＨフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（Ｈｐｄ）のエキソン３、Ｈｐｄのエキソン４またはホモゲンチジン酸ジオキシゲナーゼ（Ｈｇｄ）のエキソン４のいずれかを標的とするｓｃｇＲＮＡを含むように設計した。簡単に述べると、ベクターが以下の順序で構成された：相同性の左アーム（アルブミン）―ｐ２Ａ（２Ａペプチド）―ヒト第ＩＸ因子遺伝子―相同性の領域（アルブミン）―ＨＨリボザイム―ｇＲＮＡ―ＨＤＶリボザイム―相同性の右アーム（アルブミン）。相同性アームは標的組み込み（相同組換え）を可能にし、ｓｃｇＲＮＡはイントロン内に埋め込まれた。これらのベクターから組換えアデノ随伴ウイルス血清型８が生成された。新生仔フマリルアセトアセテートヒドロラーゼノックアウト（Ｆａｈ-/-）マウスに、約４週間後に、ｓｃｇＲＮＡ遺伝子ライドベクターを含むｒＡＡＶ８に、３つのｇＲＮＡのうちの１つ、続いて、小さな肝臓特異的プロモーターによって駆動されるＳｐＣａｓ９を含むｒＡＡＶ８を与えた。マウスを、２―（２―ニトロ―４トリフルオロメチルベンゾイル）―１，３―シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）を投与して発育（ｃｙｃｌｅ）させ、標的化ベクターの正しい組み込みを有する肝細胞の選択を可能にし、したがって、選択可能な遺伝子を破壊することができるｇＲＮＡを発現させた。Ｆａｈ-/-マウスにおいて、ＨｐｄまたはＨｇｄの欠失は、肝細胞において選択的増殖利点を付与する。循環血液中のヒト第ＩＸ因子のレベルを５、９、１４および１８週齢で評価した。５週目および９週目に、すべてのマウスは、低レベルのヒト第ＩＸ因子を示した。１４週目に、Ｈｐｄのエキソン３に対するｇＲＮＡを有するｓｃｇＲＮＡベクターを投与されたマウスは、ｈＦ９レベルの増加を示し始めた。これらのレベルは１８週齢までに有意に増加したことから、正しく標的化された肝細胞の選択が実証された。さらに、ＨｐｄまたはＨｇｄのエキソン４を標的とするｇＲＮＡを有するｓｃｇＲＮＡベクターを投与されたマウスは、１８週齢までに高レベルのｈＦ９を示した。この知見は自己開裂リボザイムが実際にｐｏｌ  ２プロモーターから機能的ｇＲＮＡを産生することができ、肝臓ｉｎ  ｖｉｖｏにおける選択的遺伝子編集事象の作成に使用できることを明確に示している。
【００９３】
アルブミンローカスを、Ｃｙｐｏｒに対する自己開裂ガイドＲＮＡを組み込んだＧｅｎｅＲｉｄｅ（商標）ベクターで標的化した。最初の実験では、トランスジーンルシフェラーゼを利用した。簡単に述べると、ベクターが以下の順序で構成された：相同性の左アーム―ｐ２Ａ（２Ａペプチド）―ルシフェラーゼ遺伝子―相同性の領域―ＨＨリボザイム―ｇＲＮＡ―ＨＤＶリボザイム―相同性の右アーム。標的ローカス（アルブミン）に相同組換えが起こった後、トランスジーンと自己開裂ガイドＲＮＡが発現する。
【００９４】
新生仔マウスにこのベクターを注射し、離乳時にｃａｓ９を投与した後、ＡＰＡＰを８週間注射した。生きた状態のルシフェラーゼイメージングを、ベースラインおよび５、１１および１６回投与後に同じマウスで行った。ルシフェラーゼ発現は投与毎に増加し、５０倍に達した（図８参照）。屠殺時、Ｃｙｐｏｒ染色は大きな陰性領域を示し、インデル発生頻度は２１％であった。
【００９５】
さらなる実験において、ヒト第ＩＸ因子を、ルシフェラーゼの代わりに上記ベクター中のトランスジーンとして発現させた。ベクターをＧＲＣｙｐｏｒＦ９と命名した。新生仔としてＡＡＶ  ＧＲＣｙｐｏｒＦ９を注射し、離乳時にＣａｓ９を単回投与した。次いで、それらにＡＰＡＰを週２回注射した。図９は、ＡＰＡＰの０、３、９および１５回投与後の血液中のヒト第ＩＸ因子レベルを示す。ＡＰＡＰ注射に反応して、ヒト第ＩＸ因子レベルの明らかな増加が認められた。ＡＰＡＰを与えなかったＧＲＣｙｐｏｒＦ９注射マウスは増加を示さず、生理食塩水対照も陰性であった。
【００９６】
ＡＡＶ  ＧＲＣｙｐｏｒＦ９もＣａｓ９とともに成熟マウスに注射した。その後、マウスにＡＰＡＰを反復投与した。０、２、７、１３および１９回投与後のヒト第ＩＸ因子レベルを図１０に示し、明確なＡＰＡＰ依存性増加が認められた。１９回投与後にマウスを殺処分し、肝細胞中のＣｙｐｏｒ  インデル発生頻度を測定した。すべてのＡＰＡＰ選択マウスは〜２０％のインデル発生頻度を有し、有意な選択を示した。
【００９７】
図１１は、ＡＰＡＰ選択後のＧＲＣｙｐｏｒＦ９処置マウスにおけるＣＹＰＯＲ（上のパネル）およびヒト第ＩＸ因子（下のパネル）免疫組織化学を示す。３匹のマウスを示す。ＡＰＡＰ投与マウスはすべて、中心静脈周囲に広範なＣｙｐｏｒ陰性領域を示した（中央パネルの点線と矢印）。同じ動物は、同じ分布パターン（中央パネルの点線および矢印）でヒト第ＩＸ因子陽性マウス肝細胞の大きな領域を示した。これらのデーターは、選択されたＣｙｐｏｒ陰性肝細胞が治療用トランスジーンを発現することを示す。
【００９８】
以上、本発明の好ましい実施の特定について説明し、具体的に例示したが、本発明はかかる実施形態に限定されるものではない。以下の特許請求の範囲に記載されているように、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、様々な修正を行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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