(57)【要約】  標的遺伝子複合体プ−ルを含む試料のシングルステップＰＣＲに用いる、遺伝子変異の元の比率を維持するとともに当該試料に共通して見られる標的遺伝子配列の多種多様な変異を増幅できる、組成物及び方法を開示する。本明細書に記載する組成物及び方法は、（１）標的配列の複合混合体を含む試料で生じ、混合体における増幅バイアスを生じさせ得る変異の増幅に必要な、複数の変異を含む遺伝子特異的プライマープ−ルと、（２）複数の遺伝子特異的プライマー変異を標的とし、増幅バイアスを排除するように設計された非特異的ＰＣＲプライマーと、を利用する。
2021521878.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的ＤＮＡ配列の比率を決定する複数プライマー分析方法であって、前記分析方法は、
（ａ）単一容器内で、複数のオリゴヌクレオチドプライマーを試料に接触させることであって、前記複数のオリゴヌクレオチドプライマーは、
（ｉ）前記標的ＤＮＡ配列の特定の連続塩基配列に相補する特異的ヌクレオチド配列に連結しているとともに、前記試料中のＤＮＡ配列にアニーリングしないように設計された非特異的ヌクレオチド配列を有する、１組以上のフォワード及びリバース特異的プライマーと、
（ｉｉ）前記（ｉ）の前記非特異的ヌクレオチド配列に相補するヌクレオチド配列を有する、１組以上のフォワード及びリバース非特異的プライマーと、を有する、ことと、
（ｂ）前記容器内で最低３サイクルの複数プライマー増幅反応を実施することであって、前記１組以上の非特異的プライマーは、前記増幅反応の第３サイクルまで前記増幅反応に関与しないことと、
（ｃ）前記標的ＤＮＡ配列に対応する増幅産物の存在を検出することであって、前記増幅産物の比率は、試料中の前記標的ＤＮＡ配列の比率を反映することと、
を有する、分析方法。
【請求項２】
前記１組以上のフォワード及びリバース特異的プライマーは、前記非特異的ヌクレオチド配列と前記特異的ヌクレオチド配列との間に、リンカー配列をさらに有する、請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記リンカー配列は、ヌクレオチド約５個から約２５個分の長さを有する、請求項２に記載の分析方法。
【請求項４】
前記リンカー配列は、前記試料を識別する特有のＤＮＡバーコード配列を有する、請求項３に記載の分析方法。
【請求項５】
前記標的配列は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ、２３Ｓ  ｒＲＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、ＩＴＳ１、ＩＴＳ２、ＨＳＰ６５、ｒｐｏＢ、ｒｅｃＡ、内部転写スペーサ（ＩＴＳ）、ヒトＨＬＡ、微生物毒素産生遺伝子、微生物病原性遺伝子、微生物プラスミド遺伝子、ヒト免疫系遺伝子、免疫系成分、リボソ−ムＲＮＡ遺伝子、及び非ヒト生物のほかの可変遺伝子領域からなる群から選択される遺伝子配列を有する、請求項１に記載の分析方法。
【請求項６】
前記１６Ｓ  ｒＲＮＡである前記標的配列は、Ｖ１Ｖ３、Ｖ３Ｖ４、Ｖ４−Ｖ５、及びＶ１Ｖ９からなる群から選択される領域を有する、請求項５に記載の分析方法。
【請求項７】
前記標的配列は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１Ｖ９領域の一部又は全部と、隣接する（ｉ）内部転写スペーサ遺伝子、及び（ｉｉ）２３Ｓ遺伝子の一部又は全部とを含む、Ｖ１Ｖ９−ＥＸＴ領域を含む、請求項１に記載の分析方法。
【請求項８】
前記フォワード特異的プライマーは、以下のヌクレオチド配列
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＡＴＡＴＧＣＧＣＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＡＧＲＧＴＴＹＧＡＴＹＣＴＧＧＣＴＹＡＧ
を含み、
ＹはＣ又はＴであり、ＲはＡ又はＧである、請求項１に記載の分析方法。
【請求項９】
前記リバース特異的プライマー は、以下のヌクレオチド配列
ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＣＴＧＡＴＣＧＴＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＴＹＡＣＣＧＣＲＲＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣ
を含み、
ＹはＣ又はＴであり、ＲはＡ又はＧである、請求項１に記載の分析方法。
【請求項１０】
前記フォワード非特異的プライマーは、以下のヌクレオチド配列
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＡＴＡＴＧＣＧＣＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡ
を含む、請求項１に記載の分析方法。
【請求項１１】
前記リバース非特異的プライマーは、以下のヌクレオチド配列
ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＣＴＧＡＴＣＧＴＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣ
を含む、請求項１に記載の分析方法。
【請求項１２】
前記試料中の前記標的ＤＮＡは、ヒト、動物、植物、又は環境試料から元来得られる、糞便、細胞溶解物、組織、血液、腫瘍、舌、歯、口腔内標本、痰、粘液、傷の標本、皮膚標本、膣標本、又は、ほかのあらゆる生体物質、生体組織、若しくは生体液からなる群から選択される原料に由来し、生試料、複合試料、混合体、及びマイクロバイオーム試料を含む、請求項１に記載の分析方法。
【請求項１３】
前記標的ＤＮＡは、芽胞、バイオフィルム、多細胞生物、単細胞生物、原核生物、真核生物、病原菌（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）、バクテリア、古細菌、プロトゾア、藻類、真菌類、及びウイルスからなる群から選択される生物に由来する、請求項１に記載の分析方法。
【請求項１４】
一般式５´−Ａ−Ｂ−Ｃ−３´で表される核酸増幅プライマーであって、
Ａは、長さがヌクレオチド数約１５から約１００個の、標的核酸にアニーリングしない非特異的ヌクレオチド配列を表し、
Ｂは、長さがヌクレオチド約５から約３０個のリンカーヌクレオチド配列を表し、
Ｃは、長さがヌクレオチド約１０から約３０個の、鋳型核酸の特定の連続塩基配列に相補的なヌクレオチド配列を表す、
核酸増幅プライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
例えばマイクロバイオーム試料などの標的遺伝子複合体プ−ルに対して、遺伝子変異の元の比率を維持しつつ、特異的及び非特異的プライマーを用いて標的配列を増幅し、プライマーの濃度に依存したポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）増幅バイアスを縮小又は排除するシングルステップＰＣＲを実施するのに有用な、組成物及び方法を開示する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロバイオームの調査には、存在する微生物の種類、及び、それぞれの種類の個数のカタログ化が含まれる。複合混合体中の微生物の特定には、１６Ｓ，１８Ｓ，２３Ｓ領域、内部転写スペーサ（ＩＴＳ）領域、又は、保存された遺伝子領域及び可変遺伝子領域の別の組み合わせを対象としたシーケンシングを用いることができる。最も標的とされる領域は、特定の生物特有の保存状態がより悪い可変領域に結合するＰＣＲプライマーの標的になり得る、生物の多くのドメインに存在する保存配列を含むため、当該生物の同定を確実にする。ＰＣＲアッセイの利点は、マイクロバイオームのプロファイリングに必要なシーケンシングの回数が、マイクロバイオームの完全シーケンシングに必要な回数の何倍も少ないことである。通常、１６Ｓ、２３Ｓ、又は別の標的ＤＮＡシーケンシング技術を用いるＰＣＲアッセイは、標的遺伝子の保存領域にアニーリングするプライマーの設計を含む。プライマーの位置が保存されることもあるが、複数の生物の間で十分な変異が存在するため、単一のプライマーセットで全ての変異遺伝子を獲得することは、通常は不可能である。プライマーの配列は変異遺伝子とは十分にアニーリングしないため、複数の生物は配列が不十分となるか、又は配列が欠損する。欠損した微生物変異の問題は、当該変異にアニーリングする付加的なプライマーを含めることで対応できる（Ａｐｐｒｉｌｌ，Ａ．他，Ａｑｕａｔ  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｅｃｏｌ，２０１５、及び、Ｃａｐｏｒａｓｏ，Ｊ．Ｇ．他，ＰＮＡＳ，２０１１）。しかしながら、この手法が、標的とＰＣＲプライマーとの相対的存在量に依存した差動増幅につながる可能性があり（Ｃａｓｔｅｌｉｎｏ，Ｍａｄｈｕｒａ他，「Ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓｋｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ４５４  ｖｅｒｓｕｓ  ＭｉＳｅｑ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ」  ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １７（２０１７）：２３．ＰＭＣ．Ｗｅｂ．１１  Ｆｅｂ．２０１８）、ＰＣＲバイアスを発生させる。説明すると、複数の標的を含むＰＣＲ反応の中で、存在量が高い標的は、存在量が低い標的よりも急速に対応するプライマーを枯渇させ、枯渇したプライマーは、ＰＣＲ反応が進むにしたがって、当該標的に対するＰＣＲをより非効率なものにする。存在量が低い標的は、同様の速さでプライマーを枯渇させることはない。したがって、存在量が低い標的のＰＣＲは、より長く効率性を保つ。ＰＣＲ中のプライマーの枯渇によって、（生物を構成する）標的遺伝子の元の個数比が崩れ、微生物混合体内の生物のうち、存在量が低い標的の提示を人工的に増大させて、且つ／又は、存在量が高い標的の提示を人工的に抑制して、マイクロバイオームデ−タの解釈を著しく複雑にする可能性がある。
【０００３】
欠損した微生物変異の問題は、ＰＣＲプライマー変異を含めることで解決できるが、これは、プライマーの濃度に依存したＰＣＲ増幅バイアスという新たな問題をもたらす。
【０００４】
本明細書に開示する組成物及び方法は、同一のＰＣＲ反応において、特異的及び非特異的プライマーを用いて、当初の試料に存在した標的配列の配列レベルに比例した割合で標的配列を増幅させ、結果として、例えばマイクロバイオームなどの標的遺伝子複合体プ−ルを含む試料における変異を獲得しつつ、プライマーの濃度に依存したＰＣＲ増幅バイアスの問題を縮小又は排除するものである。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書には、標的遺伝子複合体プ−ル（例えば、マイクロバイオーム試料の１６Ｓ  ｒＲＮＡ増幅）を含む試料のシングルステップポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）に用いられ遺伝子変異の元の比率を維持するとともに当該試料に共通して見られる標的遺伝子配列の多種多様な変異を増幅できる、組成物及び方法を開示する。本明細書に記載する組成物及び方法は、（１）標的配列（例えば、微生物遺伝子配列）の複合混合体を含む試料で生じ、混合体において増幅バイアスを生じさせ得る変異の増幅に必要な、複数の変異を含む遺伝子特異的プライマープ−ルと、（２）複数の遺伝子特異的プライマー変異を標的とし、増幅バイアスを排除するように設計された非特異的ＰＣＲプライマーと、を利用する。非特異的プライマーは、特異的ＰＣＲが２サイクル行われた後の、ＰＣＲの第３サイクルまで標的にアニーリングできないように設計されている。この方法の、以前の方法に対する主な利点は、２種類のプライマー（特異的、及び、非特異的）を同一のＰＣＲ反応において組み合わせることができ、複合試料混合体のＰＣＲ中に１つ又はそれ以上の標的遺伝子特異的プライマーが枯渇しても、以降のサイクルで非特異的プライマーが増幅を引き継ぐことができる点である。結果として、ＰＣＲ中の特異的プライマーの枯渇に起因するバイアスが縮小又は排除され、特異的プライマーに対応する標的遺伝子の、正確な比率の提示が維持される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１にプライマーの設計を示す。明確にするために、２つのストランドのうちの一方のみを示し、もう一方のプライマーは同様の方法で設計される。種々の保存部位配列を有するゲノムを標的とするために、ＰＣＲプライマーの生物特異的領域（白いボックス、例とする生物名を記載）は、標準的な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の配列とは異なる配列変異（小さなグレ−のボックス）を含んでもよい。プライマーの５´側の非特異的領域（白いボックスの５´側に位置する黒い「尾部」）は、各特異的プライマーで同一である。非特異的配列は、ゲノムＤＮＡにアニーリングしないように設計される。特異的ＰＣＲプライマーの生物特異的領域に相補的なゲノムＤＮＡを、ＰＣＲプライマーの特異的部分にアニーリングした細長いストランドで示す。特異的プライマーの５´側の非特異的部分は、全て互いに同一であり、且つ、非特異的プライマーの配列と同一である。非特異的プライマー配列は、図２に示すようにアニーリングした元の特異的プライマーのリバース相補ストランドが合成されるＰＣＲの第３サイクルまで、アニーリングする標的を有さない。
【図２】図２に、ＰＣＲの第３サイクルにおける、非特異的プライマーのアニーリングを示す。図１に示すようにプライマーセットを設計し、図２では、大腸菌の配列を用いた反応例を示す。ＰＣＲの第１サイクルでは、特異的ＰＣＲプライマーの特異的領域のみが標的ゲノムにアニーリングし、非特異的部分はアニーリングされないフラップ部として示される。第１サイクルの伸長では非特異的配列は複製されないため、特異的プライマーはＰＣＲの第２サイクルでも排他的に用いられる。第２サイクルの伸長では、相補的な非特異的プライマー配列が生成され、第３サイクルにおける非特異的プライマーのアニーリングが許容される。第３サイクル及び以降のサイクルでは、ＰＣＲに特異的、又は非特異的プライマープ−ルのいずれを用いることもでき、したがって、特異的プライマーが枯渇したとしても、反応を継続させる大量の余剰な非特異的プライマーが残っている。フォワードプライマー及びリバースプライマーでは、非特異的プライマーは同様でもよいし（簡略化のため、図示のとおり）又は、異なってもよい。
【図３】図３に、マイクロバイオーム試料における１６Ｓ遺伝子のＰＣＲ増幅を示す。Ｖ１Ｖ３  １６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅産物を含む、濃度０．８％のアガロ−スゲルである。Ｖ１Ｖ３増幅産物の寸法は、７００塩基対（ｂｐ）以下である。２レ−ンのＰＣＲ反応は、量を制限したＶ１Ｖ３特異的プライマーのみを用いて実施した。３レ−ンは非特異的プライマーのみ、４レ−ンは特異的プライマーと非特異的プライマーとの混合体を用いて実施した。２レ−ンの比較的淡い特異的なバンドは、特異的プライマーの量を制限したことによる直接的な結果であり、増幅産物の量を制限する。４レ−ンに示すように、追加された非特異的プライマーが、制限されたプライマーの代わりとなる。これは、特異的プライマー及び非特異的プライマーの両方を含む４レ−ンの鮮やかな７００ｂｐバンドから明らかである。
【０００７】
［反応の説明］ＰＣＲ反応の混合及びサ−モサイクリングプロトコルを、下記の変形を加えて、後述の例に記載のとおりに実施した。１レ−ンには非特異的プライマーが含まれなかった。２レ−ンには特異的プライマーが含まれなかった。３レ−ンには後述の例のとおり、両方のプライマーが含まれた。ＰＣＲが終了したとき、反応物２ｕｌを０．８％のアガロ−スゲルで、１時間、１００Ｖで電気泳動した。１レ−ン及び５レ−ンには、寸法基準として、５００塩基、１０００塩基、及び３０００塩基に鮮やかなバンドを有する２つのｌｏｇラダ−を入れた。
【図４】図４に、１６Ｓ遺伝子のｑＰＣＲ増幅を示す。８つの生物に由来するＤＮＡでマイクロバイオームのコミュニティを擬似し、ビフィドバクテリウム  アドレスセンティスを用いて、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１Ｖ３領域を標的としたｑＰＣＲ増幅における鋳型とした。Ｂ．アドレスセンティスに特異的なプライマーは、枯渇したプライマーの代わりに滴定された。特異的プライマーなしでは、Ｂ．アドレスセンティスのＰＣＲ産物は生成されなかった。Ｂ．アドレスセンティスｇＤＮＡの量は一定に保たれたため、ｑＰＣＲで得られるＣｑは各反応で同様になるはずであるが、特異的プライマー及び非特異的プライマーの濃度が結果に影響を及ぼせば、この限りではない。特異的プライマーの滴定は、固定量の非特異的プライマーを用いて、又は用いることなく行われた。滴定されたＢ．アドレスセンティスプライマーに加えて、ＰＣＲ反応物には、Ｂ．アドレスセンティス特異的蛍光ｑＰＣＲプロ−ブ、別の生物を標的としたＶ１Ｖ３プライマー、当該擬似マイクロバイオーム中の別の生物に由来するｇＤＮＡ、及び、Ｂ．アドレスセンティスｇＤＮＡも含まれた。結果は、Ｂ．アドレスセンティス特異的ｑＰＣＲプロ−ブの蛍光をモニタ−することで評価された。ｑＰＣＲ反応物のＣｑは、Ｂ．アドレスセンティス特異的プロ−ブから生成された蛍光の量と直接的に関係する。蛍光はＰＣＲ産物の増加によって強くなり、したがって、Ｃｑ値は小さく（つまり低く）なる。Ｂ．アドレスセンティス特異的プライマーが滴定され、非特異的プライマーが不在の反応（実線）において、８３ｎＭ未満のプライマーでは（蛍光）シグナルは見られない。つまり、プライマーの働きが低かったため、Ｂ．アドレスセンティスのＰＣＲが比例的な提示を維持しなかったことを意味する。これは、特異的プライマーが、存在量が高い標的によって枯渇され（反応中にプライマーが使い果たされ）て以降のＰＣＲサイクルで使用できなくなり、ＰＣＲ最終産物におけるＢ．アドレスセンティスの比率を大幅に減少させるシナリオの典型例である。このような事態によって、Ｂ．アドレスセンティスの比例的提示は、ｇＤＮＡ濃度よりもむしろプライマー濃度に基づいて減少又は排除されてしまう。しかしながら、非特異的プライマー（鎖線）の存在下では、Ｂ．アドレスセンティス特異的プライマーのレベルが元の５００分の１であっても、Ｂ．アドレスセンティスｇＤＮＡの増幅は検出可能である。これは、特異的プライマーが存在量が高い標的によって枯渇される一方で、非特異的プライマーの存在が増幅の継続を可能にし、その結果、コミュニティ中のＢ．アドレスセンティスの割合がより正確に提示されるシナリオを意味している。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、増幅の結果としてＰＣＲ中に生じるプライマー間の競合に起因する増幅バイアスを縮小しつつ、多様な生物にわたって標的遺伝子の変異を増幅するように設計された、特異的及び非特異的ＰＣＲプライマーを含む。特異的ＰＣＲプライマープ−ルは、多様な生物にアニーリングする配列変異を含み、それに加えて、どの標的生物のゲノムにも存在しない共通のプライマー「尾部」を採用する。非特異的プライマーは、特異的プライマーの共通プライマー「尾部」の配列と同一の、単一の配列からなる。非特異的プライマー配列は標的ゲノムを有しないため、ＰＣＲの第１サイクル及び第２サイクルではアニーリングしない。
【０００９】
複数の遺伝子特異的プライマーと非特異的人工配列プライマーとを組み合わせることで、ＰＣＲバイアスの可能性を減少させつつ、遺伝子変異を網羅することが可能になる。一反応中に特異的プライマー及び非特異的プライマーが含まれるが、非特異的プライマーは増幅の第３サイクルより前に関与することはできない。
【００１０】
ＰＣＲの第１サイクルにおいて、生物特異的ＰＣＲプライマーの特異的部分は、標的ゲノムが存在すれば結合する。特異的プライマーの非特異的５´部分（図１及び図２に、非特異的プライマープ−ル中のプライマーと同一の配列を有する、アニーリングされないフラップ部として示す）は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に相補的配列がないためアニーリングしない。
【００１１】
ＰＣＲの第１サイクルでは、相補的ｇＤＮＡストランドを合成するが、特異的プライマーの尾部における非特異的配列に合成される相補体はない。その結果、ＰＣＲの第２サイクル中も、再び生物特異的なアニーリングの標的のみが利用可能となる。ＰＣＲの第２サイクルにおいて、第１サイクルの産物は、プライマーの非特異的部分を全て含めたＰＣＲプライマー配列によって複製される。これ以降、各ＰＣＲサイクルは、（利用可能であれば）生物特異的プライマー、又は、（全ての鋳型において過剰に存在する）非特異的プライマーのいずれかの利用を継続できる。
【００１２】
したがって、本明細書では、試料中の標的ＤＮＡ配列の比率を以下の方法で決定する複数プライマーアッセイを開示する。
（ａ）単一容器内で、複数のオリゴヌクレオチドプライマーを試料に接触させることであって、複数のオリゴヌクレオチドプライマーは、（ｉ）標的ＤＮＡ配列の特定の連続塩基配列に相補する特異的ヌクレオチド配列に連結しているとともに、試料中のＤＮＡ配列にアニーリングしないように設計された非特異的ヌクレオチド配列を有する、１組以上のフォワード及びリバース特異的プライマーと、（ｉｉ）（ｉ）の非特異的ヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を有する１組以上のフォワード及びリバース非特異的プライマーと、を有することと；
（ｂ）容器内で最低３サイクルの複数プライマー増幅反応を実施することであって、１組以上の非特異的プライマーは、増幅反応の第３サイクルまで増幅反応に関与しないことと；
（ｃ）標的ＤＮＡ配列に対応する増幅産物の存在を検出することであって、増幅産物の比率は試料中の標的ＤＮＡ配列の比率を反映すること。
【００１３】
非特異的プライマーは、試料中のどのＤＮＡ配列にもアニーリングしないヌクレオチド配列を有するように設計され、増幅反応の第３サイクルまでは増幅産物を生成しない。プライマーは、当該技術分野で周知の方法を用いて設計できる。
【００１４】
いくつかの実施形態では、１組以上のフォワード及びリバース特異的プライマーは、非特異的ヌクレオチド配列と特異的ヌクレオチド配列との間にリンカー配列を有する。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、ヌクレオチド約５個から約２５個分の長さを有する。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、個々の試料を識別するために用いられる特有のバーコード配列を有する。個々の試料に特定のＤＮＡタグを用いてバーコードを付けることで、配列、ワークフローの合理化、ワークフローの複雑さの低減、結果を得るまでの時間短縮、及びコスト削減のために、多くの試料を組み合わせることを可能にする。ＤＮＡバーコードは、一般的な配列エラーを構成するのに十分な変異性を有する所望の数のバーコードを生成するのに十分な長さになるよう選択されることができ、その長さは概して塩基数約２個から約２０個の寸法にわたるが、これより長くても短くてもよい。
【００１５】
いくつかの実施形態では、標的配列は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ、２３Ｓ  ｒＲＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、ＩＴＳ１、ＩＴＳ２、ＨＳＰ６５、ｒｐｏＢ、ｒｅｃＡ、内部転写スペーサ（ＩＴＳ）、ヒトＨＬＡ、微生物毒素産生遺伝子、微生物病原性遺伝子、微生物プラスミド遺伝子、ヒト免疫系遺伝子、免疫系成分、リボソ−ムＲＮＡ遺伝子、及び、非ヒト生物のほかの可変遺伝子領域からなる群から選択される遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、標的配列１６Ｓ  ｒＲＮＡは、Ｖ１Ｖ３、Ｖ３Ｖ４、Ｖ４−Ｖ５、及び、Ｖ１Ｖ９からなる群から選択される領域を含む。いくつかの実施形態では、標的配列は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１Ｖ９領域の一部又は全部と、隣接する（ｉ）内部転写スペーサ遺伝子及び（ｉｉ）２３Ｓ遺伝子の一部又は全部とを含む、Ｖ１Ｖ９−ＥＸＴ領域を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、フォワード特異的プライマーは、以下のヌクレオチド配列
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＡＴＡＴＧＣＧＣＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＡＧＲＧＴＴＹＧＡＴＹＣＴＧＧＣＴＹＡＧ  を含み、
ＹはＣ又はＴであり、ＲはＡ又はＧである。
【００１７】
いくつかの実施形態では、リバース特異的プライマーは、以下のヌクレオチド配列
ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＣＴＧＡＴＣＧＴＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＴＹＡＣＣＧＣＲＲＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣ  を含み、
ＹはＣ又はＴであり、ＲはＡ又はＧである。
【００１８】
いくつかの実施形態では、フォワード非特異的プライマーは、以下のヌクレオチド配列
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＡＴＡＴＧＣＧＣＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡ  を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、リバース非特異的プライマーは、以下のヌクレオチド配列
ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＣＴＧＡＴＣＧＴＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣ  を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、試料中の標的ＤＮＡは、ヒト、動物、植物、又は環境試料（例えば土、水、若しくは空気）から元来得られる、糞便、細胞溶解物、組織、血液、腫瘍、舌、歯、口腔内標本、痰、粘液、傷の標本、皮膚標本、膣標本、又は、ほかのあらゆる生体物質、生体組織、若しくは生体液からなる群から選択される原料に由来し、生試料、複合試料、混合体、及びマイクロバイオーム試料を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、芽胞、バイオフィルム、多細胞生物、単細胞生物、原核生物、真核生物、病原菌（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）、バクテリア、古細菌、プロトゾア、藻類、真菌類、及びウイルスからなる群から選択される生物に由来する。
【００２２】
また、本明細書には、以下の一般式で表される核酸増幅プライマーを開示する。
【００２３】
５´−Ａ−Ｂ−Ｃ−３´、又は５´−Ａ−Ｃ−３´、又は５´−Ｂ−Ａ−Ｃ−３´、又は５´−Ａ−Ｃ−Ｂ−３´、又は５´−Ｃ−Ｂ−Ａ−３´、又は５´−Ｃ−Ａ−３´、又は５´−Ｂ−Ｃ−Ａ−３´、又は５´−Ｃ−Ａ−Ｂ−３´。ここで、「Ａ」は、長さがヌクレオチド数約１５から約１００個の、標的核酸にアニーリングしない非特異的ヌクレオチド配列を表し、「Ｂ」は、長さがヌクレオチド数約５から約３０個のリンカーヌクレオチド配列を表し、「Ｃ」は、長さがヌクレオチド数約１０から約３０個の、鋳型核酸の特定の連続塩基配列に相補的なヌクレオチド配列を表す。好適な実施形態では、核酸増幅プライマーは以下の一般式で表される。
【００２４】
５´−Ａ−Ｂ−Ｃ−３´
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡ配列は、ヒト、微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ）、動物、植物、又はウイルス遺伝子配列から選択される。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡ配列は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ、２３Ｓ  ｒＲＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、ＩＴＳ１、ＩＴＳ２、ＨＳＰ６５、ｒｐｏＢ、ｒｅｃＡ、内部転写スペーサ（ＩＴＳ）、ヒトＨＬＡ、微生物毒素産生遺伝子、微生物病原性遺伝子、微生物プラスミド遺伝子、免疫系遺伝子、免疫系成分、嗅覚受容体遺伝子、リボソ−ムＲＮＡ遺伝子、並びに、原核生物及び真核生物の関連遺伝子によるほかの変異からなる群から選択される遺伝子を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、特異的プライマーは、Ｖ１Ｖ３、Ｖ３Ｖ４、Ｖ４−Ｖ５、及びＶ１Ｖ９からなる群から選択される１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列の領域に相補的である。いくつかの実施形態では、特異的プライマーは、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１Ｖ９領域全部、並びに、隣接するＩＴＳ及び２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の一部又は全部を含む、Ｖ１Ｖ９−ＥＸＴ領域に相補的である。
【００２６】
また、本開示には、本明細書に記載の組成物及び方法のいずれかを利用するキットが含まれる。
【００２７】
本開示に記載の手法がもたらす利益は、単一ＰＣＲアッセイにおいて、標的に対する異なる濃度、配列、及び親和性を有する複数の特異的プライマーを組み合わせることができるということを含む。これら複数のプライマー間のＰＣＲプライマー競合の可能性は、全ての標的生物に対して同一の濃度、配列、及び親和性を有する非特異的プライマーの存在により、著しく減少する。これにより、幅広い種類の標的ゲノムと、全ての標的におけるより均一な増幅との両方を有する、複数のＰＣＲプライマーの使用が可能となる。非特異的プライマーは、第２サイクル（回）後の増幅を回収することができるため、全ての増幅産物全体のプライマープールは、ＰＣＲの間均一に維持される。非特異的配列は、ＰＣＲ後のシーケンシング用ライブラリーの作成に必要な配列を含むように選択されることができるため、試料のクロストーク及びインデックスホッピングが生じることが明らかになっている多くの手順を、アダプタ及びライブラリー処理から除外することができる（ＭａｃＣｏｎａｉｌｌ，Ｌ．Ｅ．，Ｂｕｒｎｓ，Ｒ．Ｔ．，Ｎａｇ  Ａ．，Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｈ．Ａ．，Ｓｌｅｖｉｎ，Ｍ．Ｋ．，Ｇｉｏｒｄａ，Ｋ．，Ｌｉｇｈｔ，Ｍ．，Ｌａｉ，Ｋ．，Ｊａｒｏｓｚ，Ｍ．，ＭｃＮｅｉｌｌ，Ｍ．Ｓ．，Ｄｕｃａｒ，Ｍ．Ｄ．，Ｍｅｙｅｒｓｏｎ，Ｍ．，Ｔｈｏｒｎｅｒ，Ａ．Ｒ．，Ｕｎｉｑｕｅ，ｄｕａｌ−ｉｎｄｅｘｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｄａｐｔｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ＵＭＩｓ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｅｌｉｍｉｎａｔｅ  ｉｎｄｅｘ  ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ  ａｎｄ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１８  Ｊａｎ  ８；１９（１）：３０）。
【実施例】
【００２８】
本明細書に記載の例は、本開示の組成物及び方法を、マイクロバイオーム試料由来のＤＮＡ配列の増幅に採用したものである。標的マイクロバイオーム内で細胞を溶解してＤＮＡを生成し、その後、得られたＤＮＡを、あらゆるバクテリア及び古細菌に存在する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を標的としたＰＣＲ増幅の鋳型として使用した。微生物は、その１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を利用して識別することができ、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列は、全てではないとしても、ほとんどのバクテリア及び古細菌で僅かに異なる。この１６Ｓ遺伝子配列の多様性は、つまり、バクテリア及び古細菌に属する個々の種が、その種の識別子、つまりフィンガープリントとして機能する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に特徴的なＤＮＡ変異を有することを意味する。Ｓｈｏｒｅｌｉｎｅ  Ｂｉｏｍｅ（コネチカット州ファーミントン）から入手できるキット、プロトコル、及びソフトウェアは、試料中の微生物の包括的フィンガープリンティング、及び、多くの試料の１６Ｓ  ｒＲＮＡ同時プロファイリングを、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子及び２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の両方に設計された増幅産物を利用して、一度に高い解像度で実施することを可能にする。既知の微生物は、１６Ｓ遺伝子のＤＮＡ配列を既知のリード（ＤＮＡ配列）のデータベースにマッピングすることでシーケンシングをすることで、識別が可能である。未知の微生物は、データベース上の全ての微生物とは異なる１６Ｓ  ＤＮＡ配列を含むが、その特異な１６Ｓ配列を利用して突き止めることができる。また、試料中の微生物毎に獲得されたリードの数によって、試料中の各微生物の相対的存在量を明らかにできる。相対的存在量は、個々のマイクロバイオーム毎の状態を表す重要な指標となり得る。微生物の相対的存在量を変化させる、又は、特定の微生物をまとめて除外する溶解手法又はＰＣＲ手法により、調査対象のマイクロバイオームの状態を誤って特性把握したシーケンシング結果を導き得る。本開示は、試料中からより豊富な種類の微生物の正しい相対的存在量を導き出す改良された方法である。
【００２９】
［詳細な手順］
手順１  Ｓｈｏｒｅｌｉｎｅ  Ｂｉｏｍｅ  ＤＮＡ準備キット
内容
１．例えば、１６Ｓ増幅産物（Ｖ１Ｖ３）などの特異的ＰＣＲプライマー
その他の増幅産物は、Ｖ３Ｖ４、Ｖ４−Ｖ５、Ｖ１Ｖ９、及び、Ｖ１Ｖ９−ＥＸＴ（Ｖ１Ｖ９の全部、並びに、隣接する内部転写スペーサ（ＩＴＳ）遺伝子及び２３Ｓ遺伝子の一部又は全部）を含む。
【００３０】
ａ．フォワード特異的プライマー配列（非特異的尾部は太字、Ｖ１  １６Ｓ遺伝子特異的配列は下線付きで示す。Ｙ＝Ｃ又はＴであり、Ｒ＝Ａ又はＧである１６個のプライマーの混合体。）
ｂ．
【００３１】
【化１】
2021521878.tif 000003
【００３２】
ｃ．リバース特異的プライマー配列（非特異的尾部は太字、Ｖ３  １６Ｓ遺伝子特異的配列は下線付きで示す。Ｙ＝Ｃ又はＴ，Ｒ＝Ａ又はＧである、８個のプライマーの混合体。）
ｄ．
【００３３】
【化２】
2021521878.tif 000004
【００３４】
２．非特異的プライマー配列
ａ．フォワード非特異的プライマー配列（太字） 
【００３５】
【化３】
2021521878.tif 000005
【００３６】
５´ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＡＴＡＴＧＣＧＣＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡ−３´
ｂ．リバース非特異的プライマー配列
【００３７】
【化４】
2021521878.tif 000006
【００３８】
３．ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ混合体
４．糞便マイクロバイオーム由来のゲノムＤＮＡ
ａ．皮膚、口腔、若しくは体のほかの部位；又は、土、水、若しくは空気（例えば、フィルターを通して）を含む環境ソース；微生物、微生物コミュニティ、若しくはほかの対象となる試料の住処となる組織、動物若しくは植物、若しくは他の試料；などの、多数のＤＮＡ源候補。
【００３９】
ｂ．Ｓｈｏｒｅｌｉｎｅ  Ｂｉｏｍｅ  ＤＮＡ準備方法を用いて準備する（しかしながら、ほかの準備方法が当該技術分野で公知であるか、若しくは、市販されており、Ｑｉａｇｅｎ／ＭｏＢｉｏ（メリーランド州ジャーマンタウン）、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（ウィスコンシン州マディソン）、及びＺｙｍｏ（カリフォルニア州アーバイン）などが提供する準備方法、又は、Ｚｙｍｏ，ＡＴＣＣ（バージニア州マナッサス）などが提供する精製マイクロバイオームＤＮＡが含まれる。）
手順２  ＰＣＲプロトコルのための手順
１．ＰＣＲ混合体２０ｕｌを準備する
ａ．７２ｎＭ  特異的プライマー混合体、フォワード及びリバースプライマー
ｂ．１５０ｎＭ  フォワード及びリバース非特異的プライマー、
ｃ．１ユニット  Ｔａｑポリメラーゼ
ｄ．１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣ１、ｐＨ８．３  
ｅ．５０ｍＭ  ＫＣｌ
ｆ．１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
ｇ．１０ｎｇ  糞便マイクロバイオームゲノムＤＮＡ
ｈ．最終容積が２０ｕｌとなる量のＨ２Ｏ
２．サ−モサイクリングプロトコル
９５℃、１分１０秒間の熱変性
９５℃で１０秒間、５７℃で１０秒間（ランプ速度０．５℃／秒）、７３℃で２１秒間を、３２回（３２サイクル）繰り返す。
【００４０】
７３℃、４５秒間の最終伸長
３．３つの個別の反応物２マイクロリットルを、１×ＴＢＥ中の０．８％アガロ−スゲルに添加し、１００Ｖで６０分間電気泳動した。特異的プライマーを含む反応物は、それぞれ、期待された７００塩基対のバンドを生成し、一方で、非特異的プライマーのみでは産物を生成しなかった（図３参照）。
【００４１】
本明細書に記載の実施例は、本開示の組成物及び方法を、ＤＮＡ配列の増幅に採用したものである。１６Ｓプライマーは、複合試料中のほとんどのバクテリアを検出することができるユニバーサルプライマーとして作用するため、マイクロバイオームの調査に有用である。また、この特性は、試料の複雑性を維持する一方で、プライマーの枯渇により特異的増幅バイアスの検出を困難にする。こうした問題を解決するために、マイクロバイオーム試料の一代表例として使用し、本明細書の実施例に記載のように非特異的プライマーがＰＣＲ反応物に添加された場合に、非常に限定的な特異的プライマーで増幅が生じ得ることを明らかにするために、モデルが生成された。
【００４２】
８生物擬似マイクロバイオームコミュニティ、及び追加の生物（ビフィドバクテリウム  アドレスセンティス）を用いて、マイクロバイオーム試料の代表とした。Ｂ．アドレスセンティスは、とりわけ、Ｖ１Ｖ３プライマーによって増幅されたものではないため、Ｂ．アドレスセンティスに特異的なプライマーの量を制限することによる増幅の検出に使用できることから選択された。
【００４３】
詳細な手順
手順１  Ｓｈｏｒｅｌｉｎｅ  Ｂｉｏｍｅ  ＤＮＡ準備キット
内容
５．例えば、１６Ｓ増幅産物（Ｖ１Ｖ３）などの特異的ＰＣＲプライマー
その他の増幅産物は、Ｖ３Ｖ４、Ｖ４−Ｖ５、Ｖ１Ｖ９、及び、Ｖ１Ｖ９−ＥＸＴ（Ｖ１Ｖ９の全部、並びに、隣接する内部転写スペーサ（ＩＴＳ）遺伝子及び２３Ｓ遺伝子の一部又は全部）を含む。
【００４４】
ａ．フォワード特異的プライマー配列（非特異的尾部は太字、Ｖ１  １６Ｓ遺伝子特異的配列は下線付きで示す。Ｙ＝Ｃ又はＴであり、Ｒ＝Ａ又はＧである１６個のプライマーの混合体。）
ｂ．
【００４５】
【化５】
2021521878.tif 000007
【００４６】
ｃ．リバース特異的プライマー配列（非特異的尾部は太字、Ｖ３  １６Ｓ遺伝子特異的配列は下線付きで示す。Ｙ＝Ｃ又はＴ、Ｒ＝Ａ又はＧである８個のプライマーの混合体。）
ｄ．
【００４７】
【化６】
2021521878.tif 000008
【００４８】
６．非特異的プライマー配列
ａ．フォワード非特異的プライマー配列（太字） 
【００４９】
【化７】
2021521878.tif 000009
【００５０】
ｂ．リバース非特異的プライマー配列
【００５１】
【化８】
2021521878.tif 000010
【００５２】
７．ビフィド特異的プライマー
ａ．フォワードビフィド特異的プライマー配列
【００５３】
【化９】
2021521878.tif 000011
【００５４】
ｂ．リバースビフィド特異的プライマー配列
【００５５】
【化１０】
2021521878.tif 000012
【００５６】
８．ポリメラーゼ、ｄＮＴＰＡ混合体
９．１０生物擬似マイクロバイオームコミュニティ由来のＤＮＡ、及びビフィドバクテリウム  アドレスセンティス
手順２  ＰＣＲプロトコルのための手順
４．ＰＣＲ混合体２０ｕｌを準備する
ａ．６００ｎＭ  Ｖ１Ｖ３特異的プライマー混合体、フォワード及びリバースプライマー
ｂ．４００ｎＭ  フォワード及びリバース非特異的プライマー、
ｃ．１−５００ｎＭ  フォワード及びリバースビフィド特異的プライマー混合体、
ｄ．１ユニット  Ｔａｑポリメラーゼ
ｅ．１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、  ｐＨ８．３
ｆ．５０ｍＭ  ＫＣｌ
ｇ．１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
ｈ．１０ｎｇ  擬似コミュニティＤＮＡ
ｉ．１ｎｇ  ビフィドＤＮＡ
ｊ．最終容積が２０ｕｌとなる量のＨ２Ｏ
５．サ−モサイクリングプロトコル
９５℃、３分間
９５℃で１０秒間、５７℃で１０秒間（ランプ速度０．５℃／秒）、７２℃で２１秒間を、３２回（３２サイクル）繰り返す。
【００５７】
７３℃、４５秒間の最終伸長
本開示の１つ又は１つ以上の実施形態を記載した。
【００５８】
しかしながら、本開示の主旨及び範囲を逸脱することなく、多様な変形があってよいことが理解されよう。従って、他の実施形態は、後述する請求項の範囲のものである。
【００５９】
［参考文献］
Ｖ１Ｖ３領域
Ｗａｌｋｅｒ，Ａｌａｎ  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．“１６Ｓ  ｒＲＮＡ  Ｇｅｎｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｆａｎｔ  Ｇｕｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  Ｉｓ  Ｓｔｒｏｎｇｌｙ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ  ｂｙ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｃｈｏｉｃｅ．”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ３  （２０１５）：２６．ＰＭＣ．Ｗｅｂ．１１  Ｆｅｂ．２０１８．
Ｖ１Ｖ３、Ｖ３Ｖ４、及びＶ４−Ｖ５の比較
Ｃａｓｔｅｌｉｎｏ，Ｍａｄｈｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．“Ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓｋｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ４５４  ｖｅｒｓｕｓ  ＭｉＳｅｑ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ．”ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １７（２０１７）：２３．ＰＭＣ．Ｗｅｂ．１１  Ｆｅｂ．２０１８．
Ｖ４Ｖ５領域
Ｒｉｎｔａｌａ，Ａｎｎｉｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．“Ｇｕｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ａｒｅ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ  Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｇｉｏｎ，  Ｗｈｅｒｅａｓ  ｔｈｅ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｉｓ  Ｍｉｎｏｒ．”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：ＪＢＴ  ２８．１（２０１７）：１９-３０．ＰＭＣ．Ｗｅｂ．１１  Ｆｅｂ．２０１８．
アースマイクロバイオームプロジェクト  Ｖ３Ｖ４参考文献
Ａｐｐｒｉｌｌ，Ａ．，  ＭｃＮａｌｌｙ，Ｓ．，Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｒ．＆  Ｗｅｂｅｒ，Ｌ．  Ｍｉｎｏｒ  ｒｅｖｉｓｉｏｎ  ｔｏ  Ｖ４  ｒｅｇｉｏｎ  ＳＳＵ  ｒＲＮＡ  ８０６Ｒ  ｇｅｎｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ｇｒｅａｔｌｙ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＡＲ１１  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｌａｎｋｔｏｎ．  Ａｑｕａｔ  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｅｃｏｌ  ７５，１２９-１３７（２０１５）．ｄｏｉ：１０．３３５４／ａｍｅ０１７５３．
Ｃａｐｏｒａｓｏ，Ｊ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｏｂａｌ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｔ  ａ  ｄｅｐｔｈ  ｏｆ  ｍｉｌｌｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｐｅｒ  ｓａｍｐｌｅ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０８，４５１６-４５２２（２０１１）．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１００００８０１０７．
プライマーバイアス
Ｔｒｅｍｂｌａｙ，Ｊｕｌｉｅｎ，  ｅｔ．  ａｌ．，Ｐｒｉｍｅｒ  ａｎｄ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ  ｔａｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５，７７１，１０．３３８９／ｆｍｉｃｂ．２０１５．００７７１．
手順及びアーチファクトの低減
ＭａｃＣｏｎａｉｌｌ，Ｌ．Ｅ．，Ｂｕｒｎｓ，Ｒ．Ｔ．，Ｎａｇ  Ａ．，Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｈ．Ａ．，Ｓｌｅｖｉｎ，Ｍ．Ｋ．，Ｇｉｏｒｄａ，Ｋ．，Ｌｉｇｈｔ，Ｍ．，Ｌａｉ，Ｋ．，Ｊａｒｏｓｚ，Ｍ．，ＭｃＮｅｉｌｌ，Ｍ．Ｓ．，Ｄｕｃａｒ，Ｍ．Ｄ．，Ｍｅｙｅｒｓｏｎ，Ｍ．，Ｔｈｏｒｎｅｒ，Ａ．Ｒ．，Ｕｎｉｑｕｅ，  ｄｕａｌ−ｉｎｄｅｘｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｄａｐｔｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ＵＭＩｓ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｅｌｉｍｉｎａｔｅ  ｉｎｄｅｘ  ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ  ａｎｄ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１８  Ｊａｎ  ８；１９（１）：３０．ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１２８６４−０１７−４４２８−５．
【図１】
2021521878.tif 000013
【図２】
2021521878.tif 000014
【図３】
2021521878.tif 000015
【図４】
2021521878.tif 000016
【配列表】
2021521878000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年12月21日(2020.12.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的ＤＮＡ配列の比率を決定する複数プライマー分析方法であって、前記分析方法は、
（ａ）単一容器内で、複数のオリゴヌクレオチドプライマーを試料に接触させることであって、前記複数のオリゴヌクレオチドプライマーは、
（ｉ）前記標的ＤＮＡ配列の特定の連続塩基配列に相補する特異的ヌクレオチド配列と、前記特異的ヌクレオチド配列に連結しているとともに、前記試料中のＤＮＡ配列にアニーリングしないように設計された非特異的ヌクレオチド配列とを有する、１組以上のフォワード及びリバース特異的プライマーと、
（ｉｉ）前記（ｉ）の前記非特異的ヌクレオチド配列に相補するヌクレオチド配列を有する、１組以上のフォワード及びリバース非特異的プライマーと、を有する、ことと、
（ｂ）前記容器内で最低３サイクルの複数プライマー増幅反応を実施することであって、前記１組以上の非特異的プライマーは、前記増幅反応の第３サイクルまで前記増幅反応に関与しないことと、
（ｃ）前記標的ＤＮＡ配列に対応する増幅産物の存在を検出することであって、前記増幅産物の比率は、試料中の前記標的ＤＮＡ配列の比率を反映することと、
を有する、分析方法。
【請求項２】
前記１組以上のフォワード及びリバース特異的プライマーは、前記非特異的ヌクレオチド配列と前記特異的ヌクレオチド配列との間に、リンカー配列をさらに有する、請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記リンカー配列は、ヌクレオチド５個から２５個分の長さを有する、請求項２に記載の分析方法。
【請求項４】
前記リンカー配列は、前記試料を識別する特有のＤＮＡバーコード配列を有する、請求項３に記載の分析方法。
【請求項５】
前記標的配列は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ、２３Ｓ  ｒＲＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、ＩＴＳ１、ＩＴＳ２、ＨＳＰ６５、ｒｐｏＢ、ｒｅｃＡ、内部転写スペーサ（ＩＴＳ）、ヒトＨＬＡ、微生物毒素産生遺伝子、微生物病原性遺伝子、微生物プラスミド遺伝子、ヒト免疫系遺伝子、免疫系成分、リボソ−ムＲＮＡ遺伝子、及び非ヒト生物のほかの可変遺伝子領域からなる群から選択される遺伝子配列を有する、請求項１に記載の分析方法。
【請求項６】
前記１６Ｓ  ｒＲＮＡである前記標的配列は、Ｖ１Ｖ３、Ｖ３Ｖ４、Ｖ４−Ｖ５、及びＶ１Ｖ９からなる群から選択される領域を有する、請求項５に記載の分析方法。
【請求項７】
前記標的配列は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１Ｖ９領域の一部又は全部と、隣接する（ｉ）内部転写スペーサ遺伝子、及び（ｉｉ）２３Ｓ遺伝子の一部又は全部とを含む、Ｖ１Ｖ９−ＥＸＴ領域を含む、請求項１に記載の分析方法。
【請求項８】
前記フォワード特異的プライマーは、以下のヌクレオチド配列
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＡＴＡＴＧＣＧＣＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＡＧＲＧＴＴＹＧＡＴＹＣＴＧＧＣＴＹＡＧ
を含み、
ＹはＣ又はＴであり、ＲはＡ又はＧである、請求項１に記載の分析方法。
【請求項９】
前記リバース特異的プライマー は、以下のヌクレオチド配列
ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＣＴＧＡＴＣＧＴＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＴＹＡＣＣＧＣＲＲＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣ
を含み、
ＹはＣ又はＴであり、ＲはＡ又はＧである、請求項１に記載の分析方法。
【請求項１０】
前記フォワード非特異的プライマーは、以下のヌクレオチド配列
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＡＴＡＴＧＣＧＣＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡ
を含む、請求項１に記載の分析方法。
【請求項１１】
前記リバース非特異的プライマーは、以下のヌクレオチド配列
ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＣＴＧＡＴＣＧＴＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣ
を含む、請求項１に記載の分析方法。
【請求項１２】
前記試料中の前記標的ＤＮＡは、ヒト、動物、植物、又は環境試料から元来得られる、糞便、細胞溶解物、組織、血液、腫瘍、舌、歯、口腔内標本、痰、粘液、傷の標本、皮膚標本、膣標本、又は、ほかのあらゆる生体物質、生体組織、若しくは生体液からなる群から選択される原料に由来し、生試料、複合試料、混合体、及びマイクロバイオーム試料を含む、請求項１に記載の分析方法。
【請求項１３】
前記標的ＤＮＡは、芽胞、バイオフィルム、多細胞生物、単細胞生物、原核生物、真核生物、病原菌（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）、バクテリア、古細菌、プロトゾア、藻類、真菌類、及びウイルスからなる群から選択される生物に由来する、請求項１に記載の分析方法。
【請求項１４】
一般式５´−Ａ−Ｂ−Ｃ−３´で表される核酸増幅プライマーであって、
Ａは、長さがヌクレオチド数１５から１００個の、標的核酸にアニーリングしない非特異的ヌクレオチド配列を表し、
Ｂは、長さがヌクレオチド５から３０個のリンカーヌクレオチド配列を表し、
Ｃは、長さがヌクレオチド１０から３０個の、鋳型核酸の特定の連続塩基配列に相補的なヌクレオチド配列を表す、
核酸増幅プライマー。
【国際調査報告】
2021521878.tif 000017