(57)【要約】  本開示は、ライソゾーム病を治療する方法を提供する。該方法は、関心対象の導入遺伝子を発現する、ベクターにより形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を産生することおよび治療の必要がある患者に該細胞を投与することを含む。
2021522278.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象にてライソゾーム病を治療する方法であって、
（ａ）対象または好適なドナー由来のＴ細胞を、ラパマイシンを用いてエクスビボで調整し、Ｔ−Ｒａｐａ細胞を生成する工程、
（ｂ）Ｔ−Ｒａｐａ細胞を、ライソゾーム病に関連する酵素をコードする関心対象の導入遺伝子（a transgene of interest）を含むベクターを用いてインビトロで形質導入する工程、及び
（ｃ）形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を対象に投与する工程であって、Ｔ−Ｒａｐａ細胞は、対象にてライソゾーム病に関連する酵素を発現し、かつライソゾーム病の１つまたは複数の症状を低減する工程、を含む、方法。
【請求項２】
工程（ｂ）の後、インビトロで培養することでベクターにより形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を増やす工程を含み、かつ
工程（ｃ）が、形質導入されかつ増やされたＴ−Ｒａｐａ細胞を、対象に投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）が、対象または好適なドナー由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を検出かつ単離することおよびＴ細胞を調整する前にインビトロでＴ細胞を培養することを更に含み、任意選択的には、ＣＤ４＋細胞の純度が少なくとも７５％である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）は、有効量のラパマイシンを含む合成培地内でＴ細胞を培養し、Ｔ−Ｒａｐａ細胞を生成することを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
有効量のラパマイシンは、約０．１〜２マイクロモルであり、好ましくは約１マイクロモルである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
合成培地が、組換えヒトＩＬ−４および組換えヒトＩＬ−２を更に含み、好ましくは約５〜２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２および約５００〜２０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−４を含む、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
方法が、ベクターにより形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞をインビトロ培養物中に維持し、かつ増やすこと、および対象への将来的な投与のため、ベクターにより形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞の一部を保存することを更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞は、将来的な使用のため、凍結保存によって保存される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｃ）が、形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を、有効量で対象へと輸血し、ライソゾーム病の１つまたは複数の症状を低減することを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞が、点滴静注によって投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ベクターは、デュアルプロモータレンチウイルスベクターであり、ベクターは、Ｔ−Ｒａｐａ細胞へと形質導入される場合に関心対象の導入遺伝子およびイノシン−５’−一リン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＭＰＤＨ２（ＩＹ））の突然変異形態を発現する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ベクターが配列番号１１を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
障害が、ファブリー病、ゴーシェ病、ファーバー病およびポンペ病からなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
障害がファブリー病であり、関心対象の導入遺伝子が、α−ガラクトシダーゼＡ（α−ｇａｌＡ）をコードする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
導入遺伝子が、配列番号１のＡＧＡ導入遺伝子、または配列番号１に対し、少なくとも７５％の配列相同性を有する配列であり、任意選択的には、ベクターが配列番号１または配列番号１に対し、少なくとも７５％の配列相同性を有する配列を含むレンチウイルスベクターである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ベクターが、配列番号２のレンチウイルスベクターである、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
ベクターがデュアルプロモータレンチウイルスベクターであり、Ｔ−Ｒａｐａ細胞へと形質導入される際に、α−ガラクトシダーゼＡおよびイノシン−５’−一リン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＭＰＤＨ２（ＩＹ））の突然変異形態を発現する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
方法が、対象内でレンチウイルスベクターにより形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞の集団を濃縮させるのに十分な量のミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）を、対象に投与することを更に含む、請求項１２または１８に記載の方法。
【請求項２０】
障害がゴーシェ病であり、導入遺伝子がβ−グルコセレブロシダーゼをコードする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
β−グルコセレブロシダーゼをコードしているベクターが、配列番号７の導入遺伝子配列または配列番号７に対し、少なくとも７５％の配列相同性を有する配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ベクターが、β−グルコセレブロシダーゼをコードしているレンチウイルスベクターであり、レンチウイルスベクターが、配列番号７の導入遺伝子配列または配列番号７に対し、少なくとも７５％の配列相同性を有する配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
レンチウイルスベクターの配列が配列番号４である、または配列番号４に対し、少なくとも７５％の配列相同性を有する配列である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
障害がファーバー病であり、導入遺伝子が酸性セラミダーゼをコードする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ベクターが酸性セラミダーゼをコードし、ベクターが配列番号８のＡＳＡＨ１導入遺伝子または配列番号８に対し、少なくとも７５％の相同性を有する配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ベクターがレンチウイルスベクターであり、ＡＳＡＨ１導入遺伝子を含み、好ましくはレンチウイルスベクターが配列番号５または配列番号５に対し、少なくとも７５％の相同性を有する配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
障害がポンペ病であり、導入遺伝子がＧＡＡである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ベクターがＧＡＡ導入遺伝子を含み、好ましくはベクターが配列番号９または配列番号９に対し、少なくとも７５％の相同性を有する配列を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ベクターがレンチウイルスベクターであり、好ましくはレンチウイルスベクターが配列番号６または配列番号６に対し、少なくとも７５％の相同性を有する配列を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ライソゾーム病を治療するため、関心対象の導入遺伝子によってコードされた酵素を発現する、形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞の集団を産生する方法であって、
（ａ）対象または好適なドナー由来のＴ細胞を、ラパマイシンを用いて調整し、Ｔ−Ｒａｐａ細胞の集団を産生すること、および
（ｂ）関心対象の導入遺伝子を含むベクターを用いてＴ−Ｒａｐａ細胞をインビトロで形質導入し、形質導入Ｔ−Ｒａｐａ細胞の集団を産生することを含む、方法。
【請求項３１】
方法が、（ｃ）培養物中でベクターにより形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞をインビトロで増やすことを更に含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
工程（ａ）が、対象または好適なドナー由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を検出かつ単離することおよび調整する前にインビトロでＴ細胞を培養することを含む、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
検出する工程が、ＣＤ４に対して特異的な抗体を用いてＣＤ４＋Ｔ細胞を検出することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
工程（ａ）におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の純度が、少なくとも約７５％である、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
方法が、（ｃ）培養物中の形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を維持するのに十分な量で組換えヒトＩＬ−４および組換えヒトＩＬ−２を更に含む合成培地中で、形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を培養することおよび増やすることを含む、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
方法が、（ｄ）ベクターにより形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞をインビトロ培養物中で維持かつ増やすこと、および対象に将来的に投与するため、ベクターにより形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞の一部を保存することを更に含む、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞は、将来的な仕様のため、凍結保存によって保存される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
細胞が−８０℃未満で保存される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項３０〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
ベクターがデュアルプロモータレンチウイルスベクターであり、Ｔ−Ｒａｐａ細胞へと形質導入される際に、α−ガラクトシダーゼＡおよびイノシン−５’−一リン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＭＰＤＨ２（ＩＹ））の突然変異形態を発現する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
導入遺伝子がＡＧＡである、請求項３０〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
導入遺伝子がＧＢＡである、請求項３０〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
導入遺伝子がＡＳＡＨ１である、請求項３０〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
導入遺伝子がＧＡＡである、請求項３０〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
請求項３０〜４４のいずれか一項に記載の方法によって作製された、形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞の集団。
【請求項４６】
ファブリー病を抱える対象を治療する方法であって、請求項４１に記載の方法によって作製された、有効量の形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を投与し、ファブリー病の１つまたは複数の症状を治療することを含む、方法。
【請求項４７】
ゴーシェ病を抱える対象を治療する方法であって、請求項４２に記載の方法によって作製された、有効量の形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を投与し、ゴーシェ病の１つまたは複数の症状を治療することを含む、方法。
【請求項４８】
ファーバー病を抱える対象を治療する方法であって、請求項４３に記載の方法によって作製された、有効量の形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を投与し、ファーバー病の１つまたは複数の症状を治療することを含む、方法。
【請求項４９】
ポンぺ病を抱える対象を治療する方法であって、請求項４１に記載の方法によって作製された、有効量の形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を投与し、ポンぺ病の１つまたは複数の症状を治療することを含む、方法。
【請求項５０】
ライソゾーム病を抱える対象を治療する方法であって、ライソゾーム病の１つまたは複数の症状を治療する有効量で請求項４５に記載の形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を投与することを含む、方法。
【請求項５１】
細胞が点滴静注によって導入される、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
対象がヒト対象である、請求項１〜２７または４６〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
対象が、ライソゾーム病を治療する１つまたは複数の方法によって以前に治療されたことがある、請求項１〜２７または４５〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年４月２７日に出願された米国仮特許出願第６２，６６３，７８６号の優先権を主張し、その仮特許出願の内容が参照により全体に組み入れられている。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、国立癌研究所によって授与された、プロジェクト番号第ＺＩＡ  ＢＣ０１１２１９号による政府の支援によってなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の技術分野は、ライソゾーム病（ＬＳＤ、ライソゾーム貯蔵疾患）の治療である。ＬＳＤは、単純タンパク質の調節不全もしくは欠乏（例えばファブリー病）または酵素の欠乏と共活性化タンパク質との組合せに関連している。
【０００４】
ライソゾームは、ほとんどの任意の生体分子を消化可能である、６０種類以上の異なる酵素を含む真核細胞中の膜結合細胞小器官である。ライソゾームは多くの重要な生物学的機能を実行しており、その中には、細胞外部からのものと、細胞内部の古くなった成分の両方といった細胞質内の望まれていない物質を消化することによる、細胞廃棄物の処理系としての機能を含む。ライソゾーム病（ＬＳＤ）は、ライソゾームの機能障害により生じ、通常は脂質、糖タンパク質または多糖類の細胞内消化に必要となる単純酵素が欠乏している結果として生じる、６０種類以上の希少な遺伝性代謝障害の群である。かかる欠乏の結果として、正常に分解されるべき分子が細胞内部に蓄積し、細胞の機能障害または細胞死を引き起こす。
【０００５】
ファブリー病は、グリコスフィンゴ脂質、特にグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）からのα−ガラクトースを加水分解する酵素である、α−ガラクトシダーゼＡ（ＡＧＡ導入遺伝子によりコードされたα−ｇａｌＡ）の欠乏により生じるＬＳＤである。
【０００６】
ファブリー病に対する標準的な管理治療は、酵素補充療法（ＥＲＴ）である。ＥＲＴの有効性は、Ｒｏｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｏｒｐｈａｎｅｔ  Ｊ  Ｒａｒｅ  Ｄｉｓ．８：４７−１０．１１８６／１７５０−１１７２−８−４７（２０１３））に概要が述べられている。恩典はいくつか得られているものの、疾患の進行を止めるものではない。ＥＲＴは、決まった週間隔で投与される組換えα−ｇａｌＡの長時間の点滴静注が必要となり、その多くは外来センターにて行われる。ファブリー病患者は、多くの場合疼痛、胃腸管系機能障害、不整脈および心臓に関する他の問題に対する治療を必要とし、更には腎臓機能を保護するために抗血栓薬と血圧用医薬品が必須となる。ファブリー病は比較的希少であるにも関わらず、米国内に約４０００人の患者がおり、治療コストは患者１人あたり年間３００，０００ドルほどである（米国の全患者に対しては年間１２億ドル）。
【０００７】
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、骨髄内に存在している「多分化能」細胞であり、最終的には全ての血液細胞の種類へと分化することができる。ＨＳＣの特徴は、ＣＤ３４と呼ばれる細胞表面糖タンパク質の発現であり、かかる細胞は時にＣＤ３４＋造血細胞、またはもっと単純にはＣＤ３４＋ＨＳＣと呼ばれる。臨床的には、ＨＳＣ上のＣＤ３４の存在を利用し、骨髄移植片に対してＨＳＣの選択濃縮を促進させることができる。加えて、ＣＤ３４＋ＨＳＣは、脊髄損傷、肝硬変、末梢血管疾患を含む、種々の非造血疾患を治療するために実験的に使用されている。ＨＳＣは骨髄から収集することができるが、ＨＳＣを「動員」するためのある特定の薬物で治療した後に末梢血から収集してもよい。したがって、ＨＳＣは血液から収集され得る（例えばアフェレーシスによる）。ＨＳＣはまた、「移動性」である。これは、ＨＳＣが血流に入って骨髄から体内の別の部位へと移動可能であることを意味している。ＨＳＣは、骨髄に再配置するために注射によって血流へと投与され得る。
【０００８】
発明者らは以前に、ファブリー病患者から収集したＨＳＣを使用してＨＳＣを遺伝子改変し、ファブリー病を抱える患者において欠乏している酵素であるα−ｇａｌＡを産生していた。患者が薬物投与計画によって「条件づけられた」後、これらの遺伝子改変されたＨＳＣを同じ患者に注入して戻し（自己移植片）、治療の成功を向上させるために内因性ＨＳＣを除去する。
【０００９】
患者へと戻される、患者の改変された細胞を再度導入した際、遺伝子改変されたＨＳＣは造血系の下流系統全てに定植し、次いで体内全体を循環する。改変された細胞は、患者内にて未修正の「バイスタンダー」細胞が、α−ｇａｌＡをライソゾーム中へと細胞内にて吸収かつ輸送することを可能にする、分子「標識」（マンニトース−６−ホスファート）を有するα−ｇａｌＡの形態を分泌する。この場合、この細胞は患者のα−ｇａｌＡ欠乏を補償し、蓄積されたグリコスフィンゴ脂質を効率的に分解する。この方法は、カナダにて実施中の治験である（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ＃ＮＣＴ０２８０００７０）。
【００１０】
先行するプロトコールの中心部分は、遺伝子改変されたＨＳＣが変化する可能性のある全ての血液細胞（造血）系統へと分化しかつ体内全体を循環するという点である。ただし、移植の非効率性から、血液除去によって移植患者の調整を行うことが必要となる。大半の場合には、除去の程度が移植効率を決定し得る。加えて、疾患を癒すために取得かつ使用され得る、形質導入された本物の幹細胞の数には限りがある。自己移植片を使用した場合であっても、移植を追加で繰り返すことが疾患を効率的に治療するのに必要になる場合がある。
【００１１】
したがって、治療に使用され得、かつ患者からの除去を最小限必要とするまたはまったく必要としない、対象内の細胞の再生可能な供給源を改良する必要性が存在している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ライソゾーム病を治療する方法を提供することにより、前述の課題点を克服する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一態様では、本開示は対象にてライソゾーム病を治療する方法を提供する。該方法は、（ａ）対象または好適なドナー由来のＴ細胞をラパマイシンを用いてエクスビボで調整し、Ｔ−Ｒａｐａ細胞を生成する工程、（ｂ）該Ｔ−Ｒａｐａ細胞を、ライソゾーム病に関連する酵素をコードする関心対象の導入遺伝子を含むベクターを用いてインビトロで形質導入する工程、および（ｃ）形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を、該患者へと投与し、該Ｔ−Ｒａｐａ細胞は、対象にてライソゾーム病に関連する酵素を発現し、ライソゾーム病の１つまたは複数の症状を低減する工程を含む。一部の態様では、工程（ｂ）後の該方法は、インビトロで培養することでベクターにより形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を増やすことを含み、工程（ｃ）は形質導入されかつ増やされたＴ−Ｒａｐａ細胞を対象に投与することを含む。
【００１４】
別の態様では、本開示は対象にてライソゾーム病を治療する方法を提供する。該方法は、（ａ）対象または好適なドナー由来のＴ細胞を得る工程、（ｂ）ラパマイシンを用いてエクスビボで調整し、Ｔ−Ｒａｐａ細胞を生成する工程、（ｃ）該Ｔ−Ｒａｐａ細胞を、Ｔ−Ｒａｐａ細胞内の関心対象の導入遺伝子を発現するベクターを用いてインビトロで形質導入する工程、（ｄ）培養物中でベクターにより形質導入Ｔ−Ｒａｐａ細胞をインビトロで増やす工程、および（ｅ）Ｔ−Ｒａｐａ細胞を該患者へと投与し、該Ｔ−Ｒａｐａ細胞は、対象内にて関心対象の導入遺伝子を発現し、ライソゾーム病の１つまたは複数の症状を低減する工程を含む。
【００１５】
一部の実施形態では、投与工程は輸血または点滴静注によるものである。
【００１６】
一部の態様では、該方法はベクターにより形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞をインビトロ培養物中で維持かつ増やすこと、および対象に将来的に投与するため、ベクターにより形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞の一部を保存することを更に含む。
【００１７】
別の態様では、本開示はライソゾーム病を治療するため、関心対象の導入遺伝子によってコードされた酵素を発現する、形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞の集団を産生する方法を提供する。該方法は、（ａ）対象または好適なドナー由来のＴ細胞をラパマイシンを用いて調整し、Ｔ−Ｒａｐａ細胞の集団を生成すること、および（ｂ）関心対象の導入遺伝子を含むベクターを用いてＴ−Ｒａｐａ細胞をインビトロで形質導入し、形質導入Ｔ−Ｒａｐａ細胞の集団を産生することを含む。この方法は、関心対象の導入遺伝子によってコードされたコードするタンパク質（例えば酵素）を発現可能である、形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を産生する。一部の態様では、該方法は、（ｃ）培養物中でベクターにより形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞をインビトロで増やすことを更に含む。
【００１８】
別の態様では、本開示はライソゾーム病を治療するため、関心対象の導入遺伝子を発現する、形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞の集団を産生する方法を提供する。該方法は、（ａ）対象または好適なドナー由来のＴ細胞を得ること、（ｂ）該Ｔ細胞をラパマイシンを用いて調整し、Ｔ−Ｒａｐａ細胞を生成すること、および（ｃ）Ｔ−Ｒａｐａ細胞内で関心対象の導入遺伝子を発現するベクターを用いてＴ−Ｒａｐａ細胞をインビトロで形質導入することを含む。一部の態様では、該方法は、（ｄ）培養物中でベクターにより形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞をインビトロで増やすことを更に含む。
【００１９】
更に別の態様では、本開示はファブリー病を抱える対象を治療する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載の方法によって作製され、α−ｇａｌＡを発現し、ファブリー病の１つまたは複数の症状を治療する、有効量の形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を投与することを含む。
【００２０】
別の態様では、本開示は関心対象の導入遺伝子によってコードされたタンパク質を発現する、形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞の集団を提供する。一態様では、本開示はα−ｇａｌＡを発現する形質導入Ｔ−Ｒａｐａ細胞の集団を提供する。別の態様では、本開示は、β−グルコセレブロシダーゼを発現する形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞の集団を提供する。別の態様では、本開示は酸性セラミダーゼを発現する形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞の集団を提供する。別の態様では、本開示は酸性α−グルコシダーゼを発現する形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞の集団を提供する。
【００２１】
更に別の態様では、本開示はゴーシェ病を抱える対象を治療する方法を提供し、該方法は、ゴーシェ病の１つまたは複数の症状を治療するため、ＧＢＡを発現する、有効量の形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を投与することを含む。
【００２２】
更に別の態様では、本開示はファーバー病を抱える対象を治療する方法を提供し、該方法は、ファーバー病の１つまたは複数の症状を治療するため、ＡＳＡＨ１を発現する、有効量の形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を投与することを含む。
【００２３】
更なる態様では、本開示はポンぺ病を抱える対象を治療する方法を提供し、該方法は、ポンぺ病の１つまたは複数の症状を治療するため、ＧＡＡを発現する、有効量の形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を投与することを含む。
【００２４】
更に別の態様では、本開示はライソゾーム病を抱える対象を治療する方法を提供し、該方法は、ライソゾーム病の１つまたは複数の症状を治療する有効量でライソゾーム病の治療に関連する導入遺伝子を発現する、形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を投与することを含む。
【００２５】
本発明の前述の態様、および他の態様、およびその優位性は、以下の説明より明らかになるだろう。以下の説明では、本明細書の一部を形成する添付の図面を参照し、図面中、例示を用いて本発明の好ましい実施形態が示されている。かかる実施形態は、必ずしも本発明の全範囲を表すものではないが、本発明の範囲を解釈するため、これにより特許請求の範囲および本明細書を参照する。
【００２６】
特許または特許出願書類は、着色された、実施された少なくとも１つの図面を含む。１つまたは複数の色を有する図面本特許または本特許出願公開は、申請し、必要な使用料を支払った場合に特許商標庁より提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】従来方法の造血幹細胞遺伝子治療の概略図である。
【図２】ビヒクルのみ（ＮＴ）またはα−ｇａｌＡ発現レンチウイルスベクター（ＬＶ／ＡＧＡ）を用いた、健常なドナーおよびファブリー病ドナーから単離されたＴ−Ｒａｐａ細胞の形質導入効率を表したグラフである。
【図３Ａ】健常なドナーおよびファブリー病ドナー由来の形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞におけるα−ｇａｌＡの発現を表している。α−ｇａｌＡの発現は、上清（Ｂ）または形質導入された細胞の細胞溶解液（Ａ）の両方について測定された。
【図３Ｂ】健常なドナーおよびファブリー病ドナー由来の形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞におけるα−ｇａｌＡの発現を表している。α−ｇａｌＡの発現は、上清（Ｂ）または形質導入された細胞の細胞溶解液（Ａ）の両方について測定された。
【図４】Ｗｅｓ（商標）Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  Ｓｙｓｔｅｍによって実施された、正常なドナー由来およびファブリー病ドナー由来の形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞における、α−ｇａｌＡタンパク質量の代表的なウェスタンブロットである。
【図５】Ｗｅｓ（商標）Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  Ｓｙｓｔｅｍによって定量化された、正常なドナーおよびファブリー病ドナーの形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞におけるα−ｇａｌＡの定量化である。
【図６】ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／Ａｇａ−／−ファブリー病マウスモデルにおける、形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞のインビボ試験を行うためのプロトコールの概要である。
【図７】正常なドナーまたはファブリー病ドナー由来の形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を用いて移植された、マウスの血漿中のα−ｇａｌＡの酵素活性レベルを表しているグラフである。
【図８】実施例５のマウス実験および図７からの生データである。
【図９】形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を産生する方法を概略的に示している。
【図１０】最新の発明に従い、ファブリー病を抱える患者を治療する方法の代表的な概略図を表している。使用される代替的なウイルスが企図されており、これは単なる例示である。
【図１１】本方法で使用するためのレンチウイルスベクターを作製する好適な方法の１つを、模式的に表した図である。
【図１２Ａ】本方法で使用可能である好適なレンチウイルスベクターの概略図である。図中、α−ｇａｌＡを発現するためのｐＤＹ／ＣＯ．α−ｇａｌＡ（すなわち、ＬＶ／ＡＧＡ）、ＬＴＲ（長い末端反復）、Ψ（ＨＩＶパッケージングシグナル）、ＳＤ（５’スプライスドナー部位）、ΔＧＡＧ（ＨＩＶ−１グループ特異型抗原遺伝子の切断部分）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）、ＳＡ（３’スプライスアクセプター部位）、ｃＰＰＴ（中央ポリプリン配列）、ＥＦ−１α（伸長因子１プロモータ）、ＣＯ．α−ｇａｌＡ（野生型α−ｇａｌＡ酵素をコードしているヒトＧＬＡ遺伝子のコドン最適化ｃＤＮＡ）、ＷＰＲＥ（ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御エレメント）、ＳＩＮ／ＬＴＲ（自己不活性化ＬＴＲ）である。
【図１２Ｂ】コドン最適化および変異導入ＩＭＰＤＨ２  ｃＤＮＡ配列（ＩＭＰＤＨ２（ＩＹ））コドン、および図１２Ａにて記載の導入遺伝子を最適化したＡＧＡコドンを含有する、デュアルプロモータレンチウイルスベクターの概略図である。
【図１２Ｃ】ＧＢＡ、ＡＳＡＨ１およびＧＡＡ遺伝子をそれぞれ含有するレンチウイルスベクターの代表的なスキームを示す。
【図１３Ａ】α−ｇａｌＡを発現しているレンチウイルスベクター（配列番号３）のプラスミドマップである。
【図１３Ｂ】突然変異ＩＭＰＤＨ２遺伝子（ＩＭＰＤＨ２（ＩＹ））およびＡＧＡコドン最適化遺伝子を含有しているデュアルプロモータレンチウイルスベクター（ベクター：配列番号４）のプラスミドマップである。
【図１３Ｃ】野生型コドン最適化ＧＢＡ導入遺伝子を含有しているレンチウイルスベクター（配列番号４）から作製されたプラスミドマップである。
【図１３Ｄ】野生型ＡＳＡＨ１導入遺伝子を含有しているレンチウイルスベクター（配列番号５）のプラスミドマップである。
【図１３Ｅ】野生型コドン最適化ＧＡＡ導入遺伝子を含有しているレンチウイルスベクター（配列番号６）のプラスミドマップである。
【図１４】形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞内の対応する酵素を発現および産生するＡＧＡ、ＧＢＡ、ＡＳＡＨ１またはＧＡＡをコードしている、レンチウイルスの能力を示している。
【図１５】形質導入されたジャーカット細胞内の対応する酵素を発現および分泌する導入遺伝子ＡＧＡ、ＧＢＡ、ＡＳＡＨ１またはＧＡＡの酵素をコードしている、レンチウイルスの能力を示している。
【図１６】Ｔ−Ｒａｐａ細胞（健常なドナー由来）へと形質導入されるＡＧＡ導入遺伝子またはＧＢＡ導入遺伝子のいずれかと関連する酵素をコードしているレンチウイルスベクターの能力、ならびに凍結保存およびその後の解凍を生存するＴ−Ｒａｐａ細胞の能力を表している。
【図１７】ファブリー病患者由来の形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞は形質導入後にα−ｇａｌＡを産生することができ（左パネル）、ファブリー病患者の形質導入Ｔ−Ｒａｐａ細胞から産生されたα−ｇａｌＡは、その分子「標識」に起因する患者の細胞によって吸収され得る（右パネル）ことを示している。
【図１８Ａ】調整後、免疫無防備状態のファブリー病マウスへと移植された場合、酵素をインビボで産生するヒト形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞の能力を示している。末梢血中のｈＣＤ３／ｈＣＤ４を検出することにより、移植を確認した。α−ｇａｌＡ活性は、血漿中および示された組織（肝臓、脾臓、心臓または腎臓）の可溶化液中の形質導入された健常なドナーのＴ−Ｒａｐａ（ｎ＝４〜５）を異種移植した４週間後に、インビボで検出可能であった。
【図１８Ｂ】調整後、免疫無防備状態のファブリー病マウスへと移植された場合、酵素をインビボで産生するヒト形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞の能力を示している。末梢血中のｈＣＤ３／ｈＣＤ４を検出することにより、移植を確認した。α−ｇａｌＡ活性は、血漿中および示された組織（肝臓、脾臓、心臓または腎臓）の可溶化液中の形質導入された健常なドナーのＴ−Ｒａｐａ（ｎ＝４〜５）を異種移植した４週間後に、インビボで検出可能であった。
【図１９Ａ】免疫無防備状態のファブリー病マウスへの移植後、基質グロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）（ファブリー病マウス内に蓄積する主要基質）を低下させる、レンチウイルスの形質導入されたヒトＴ−Ｒａｐａ細胞の能力を示している。
【図１９Ｂ】免疫無防備状態のファブリー病マウスへの移植後、基質グロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）（ファブリー病マウス内に蓄積する主要基質）を低下させる、レンチウイルスの形質導入されたヒトＴ−Ｒａｐａ細胞の能力を示している。
【図２０Ａ】インビボでα−ｇａｌＡを分泌可能なＡＧＡをコードしているレンチウイルスによって形質導入された、ファブリー病患者のＴ−Ｒａｐａ細胞の能力を示している。α−ｇａｌＡ活性は、示された組織中の形質導入されたファブリー病ドナーのＴ−Ｒａｐａ（ｎ＝４〜５）を異種移植した４週間後にインビボで検出可能である。
【図２０Ｂ】インビボでα−ｇａｌＡを分泌可能なＡＧＡをコードしているレンチウイルスによって形質導入された、ファブリー病患者のＴ−Ｒａｐａ細胞の能力を示している。α−ｇａｌＡ活性は、示された組織中の形質導入されたファブリー病ドナーのＴ−Ｒａｐａ（ｎ＝４〜５）を異種移植した４週間後にインビボで検出可能である。
【図２１Ａ】免疫無防備状態のファブリー病マウスへの移植後、基質グロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）（ファブリー病マウス内に蓄積する主要基質）を低下させる、レンチウイルスの形質導入されたファブリー病患者のＴ−Ｒａｐａ細胞の能力を示している。
【図２１Ｂ】免疫無防備状態のファブリー病マウスへの移植後、基質グロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）（ファブリー病マウス内に蓄積する主要基質）を低下させる、レンチウイルスの形質導入されたファブリー病患者のＴ−Ｒａｐａ細胞の能力を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
造血幹細胞（ＨＳＣ）特異的遺伝子治療を用いた従来方法は、単純酵素の欠乏によって引き起こされた、対象となるライソゾームの貯蔵欠乏において試験されている。一例として、発明者らは現在、ファブリー病（ＦＤ）を抱える患者に遺伝子導入することで治療を行うことを目的としている、遺伝子第Ｉ期治験（ＮＣＴ０２８０００７０）を実施している。ＦＤは、α−ガラクトシダーゼＡ（α−ｇａｌＡ）欠乏であり、この状態においてはグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）および他の代謝物が蓄積する。この従来のプロトコールにおいては、ＣＤ３４＋造血細胞は、α−ｇａｌＡを過剰に発現するよう操作された組換えレンチウイルス（ＬＶ）を用いてエクスビボで形質導入された。これらの細胞はその後、患者に戻されている。ベクターにより形質導入されたＨＳＣ由来の細胞には白血球が含まれているが、これはα−ｇａｌＡを分泌することができる。また、患者体内の未修正の細胞は分泌されたα−ｇａｌＡを吸収可能である。このプロセスは「クロスコレクション（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）」と名付けられている。効果的な移植のため、患者は問題となる可能性がある、条件をつけた投与計画（例えば除去）を受容する。加えて、ＨＳＣは薬物を用いて末梢血へと動員され、アフェレーシスによって収集されなければならない。取得し、移植するのにより容易である代替的な循環細胞集団は、治療カーゴで全身に輸送するために使用するのにより望ましい。
【００２９】
本開示はライソゾーム病、特にファブリー病（Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）ＩＤ＃３０１５００、ゴーシェ病（ＯＭＩＭ  ＩＤ＃２３０８００、２３０９００、２３１０００、２３１００５）、ファーバー病（ＯＭＩＭ  ＩＤ＃２２８０００）、およびポンペ病（ＯＭＩＭ  ＩＤ＃２３２３００）を治療する向上した方法を提供する。特に、本発明は、治療用導入遺伝子産物を全身に輸送するための、自己ＣＤ４＋Ｔ−Ｒａｐａ細胞またはドナー（非自己）ＣＤ４＋Ｔ−Ｒａｐａの使用を記載している。Ｔ−Ｒａｐａ細胞は、罹患した患者または正常なドナー（ＮＤ）の末梢血細胞から製造されることができ、例えば、ファブリー病については酵素α−ｇａｌＡ、ゴーシェ病についてはベータ−グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ、β−グルコセレブロシダーゼ、酸性β−グルコシダーゼ、Ｄ−グルコシル−Ｎ−アシルスフィンゴシングルコハイドロラーゼ、またはＧＣａｓｅであり、これらは互換的に使用可能である）、ファーバー病については酸性セラミダーゼ（ＡＳＡＨ１導入遺伝子によってコードされている）、およびポンペ病については酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ導入遺伝子によってコードされ、酸性マルターゼとして公知である）があるが、これに限定されない、疾患に欠損している導入遺伝子（例えば酵素をコードしている配列）を含むベクター（例えばレンチウイルスベクター）を用いて生産的に形質導入され得る。本開示は、末梢血から得られた細胞（例えばＴ細胞）を使用する改良された方法を提供し、必要な時に、循環している導入遺伝子により産生されたＴ−Ｒａｐａ細胞をインビボでブーストさせるため、任意の時に保存および注入され得る酵素を発現する、形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞の集団を提供することができる。更には、該方法は、対象にて効果的な移植を提供するために、もしあるのだとしても少量の除去を必要とする。
【００３０】
Ｔ細胞は、天然のタンパク質分泌装置であり、多くの治験で既に使用されている。ＨＳＣと異なり、Ｔ細胞は動員なしに末梢血（ＰＢ）から得ることが可能であり、培養物中で指数関数的に増やされ得る。ラパマイシンを用いたエクスビボでの治療は、Ｔ細胞（例えばＣＤ４＋Ｔ細胞）に多数の変化を誘発させる。まとめると、前駆移植片および抗アポトーシス表現型を用いてこうした変化を与える。これらはＴ−Ｒａｐａ細胞と名付けられている。Ｔ−Ｒａｐａ細胞の詳細はＦｏｗｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に見いだされ得（「Ｐｈａｓｅ  ２  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｄｏｎｏｒ  ＣＤ４＋Ｔｈ２／Ｔｈ１（Ｔ−Ｒａｐａ）ｃｅｌｌｓ  ａｆｔｅｒ  ｌｏｗ−ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」、Ｂｌｏｏｄ（２０１３）１１：１２１（１５）：２８６４−２８７４）、その内容が参照により全体に組み入れられている。ドナーＴ−Ｒａｐａ細胞の同種移植を成功させる上で、宿主の調整（リンパ球特異型、ミエロイド温存）はほとんど必要とされず、Ｔ細胞移植用の十分な免疫空間を生成させつつ、宿主のミエロイド細胞のディプリーションを最小限に抑える。この宿主の調整方法およびＴ細胞駆動遺伝子治療は、実質的にはＨＳＣ駆動遺伝子療法と異なるものである。これは典型的には相対的に強いミエロイド細胞のディプリーションが必要となる。いかなる理論にも縛られるものではないが、ミエロイド細胞のディプリーションによる低下が、ミエロイドのディプリーションに関連する感染性合併症を低減し、遺伝子治療が外来患者という条件で実施可能であるため、治療による病的状態および治療コストを低下させ、かつ遺伝子治療を繰り返し行うことで、最終的に有効性を向上させるという事実を含む複数の観点から、ＨＳＣよりもＴ細胞を用いた遺伝子治療を施すほうが有益である。
【００３１】
実施例にて示されているように、２週間のインビトロ増殖後、形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞は、インビトロでの刺激がない状態にて、導入遺伝子産物（例えば、α−ｇａｌＡといった酵素）を継続して分泌する。ＦＤ患者および正常なドナー由来の形質導入されたおよびコントロールＴ−Ｒａｐａ細胞は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／Ａｇａ−／−マウス（ＮＳＦ）へと異種移植された。血漿およびＬＶ改変された細胞を投与したマウスの臓器中には、高いα−ｇａｌＡ活性が検出された。ベクターコピー数解析は、安定した形質導入を示唆する。形質導入細胞を受け入れたＮＳＦマウスはまた、ＧＢ３レベルの低下を示している。これは更に、インビボ基質ターゲットを減少させる、形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞から発現されている酵素の能力を表している。
【００３２】
これらの実施例は、レンチウイルスにより形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞のインビトロでの発生を表しており、これにより酵素活性および細胞からの酵素の分泌の増加をもたらすことができる。こうした実施例はα−ｇａｌＡ活性を増加させるレンチウイルスにより形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞の使用を表し、ファブリー病の治療に使用され得る一方で、導入遺伝子であるＧＢＡ、ＡＳＡＨ１、およびＧＡＡに関する図１４および図１５に示されるように、レンチウイルス形質導入Ｔ−Ｒａｐａ細胞は他のライソゾーム病を治療する他の酵素を発現するために使用され得る。
【００３３】
一実施形態では、本開示は対象にてライソゾーム病を治療する方法を提供する。該方法は、（ａ）対象または好適なドナー由来のＴ細胞を、ラパマイシンを用いてエクスビボで調整し、Ｔ−Ｒａｐａ細胞を生成する工程、（ｂ）該Ｔ細胞を、ライソゾーム病に関連する酵素をコードする関心対象の導入遺伝子を含むベクターを用いてインビトロで形質導入する工程、および（ｃ）形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を、該患者に投与し、該Ｔ−Ｒａｐａ細胞は、対象にてライソゾーム病に関連する酵素を発現し、ライソゾーム病の１つまたは複数の症状を低減する工程を含む。一部の実施形態では、工程（ｂ）後の該方法は、工程（ｃ）にて形質導入かつ増やされたＴ−Ｒａｐａ細胞を投与する前に、インビトロで培養することによってベクターにより形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を増やすことを含む。
【００３４】
形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を投与する好適な方法は、当技術分野で公知であり、更に輸血および静脈内投与を含む。
【００３５】
一実施形態では、本開示は対象にてライソゾーム病を治療する方法を提供する。該方法は、（ａ）有効量のラパマイシンでＴ細胞をエクスビボで調整してＴ−Ｒａｐａ細胞を産生する工程、（ｂ）Ｔ−Ｒａｐａ細胞を、ライソゾーム貯蔵疾患に関連する酵素をコードする関心対象の対象遺伝子を含むベクターを用いて、インビトロで形質導入する工程、（ｃ）インビトロ培養物中でベクターにより形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を増やす工程、および（ｄ）Ｔ−Ｒａｐａ細胞を該患者へと投与し、該Ｔ−Ｒａｐａ細胞は、対象にて関心対象の導入遺伝子をコードするタンパク質を発現し、その後ライソゾーム病の１つまたは複数の症状を低減可能である工程を含む。
【００３６】
別の実施形態では、本開示は対象にてライソゾーム病を治療する方法を提供する。該方法は、（ａ）対象または好適なドナー由来のＴ細胞を得る工程、（ｂ）ラパマイシンを用いてエクスビボで調整し、Ｔ−Ｒａｐａ細胞を産生する工程、（ｃ）Ｔ−Ｒａｐａ細胞内に機能的に存在する場合、該Ｔ−Ｒａｐａ細胞を関心対象の導入遺伝子を発現するベクターを用いてインビトロで形質導入する工程、（ｄ）培養物内でベクターにより形質導入Ｔ−Ｒａｐａ細胞をインビトロ培養物で増やす工程、および（ｅ）形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を該患者へと投与し、該Ｔ−Ｒａｐａ細胞は、関心対象の導入遺伝子によってコードされたタンパク質を対象にて発現し、その後ライソゾーム病の１つまたは複数の症状を低減可能である工程を含む。
【００３７】
標準的な外来患者の採血またはアフェレーシスを含む対象からＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞）を得る好適な方法は、当技術分野で公知である。一実施形態では、Ｔ細胞を得ることは、対象または好適なドナーの末梢血サンプルからＣＤ４＋Ｔ細胞を検出および単離することを含む。末梢血からＣＤ４＋Ｔ細胞を検出および単離する好適な方法は当技術分野で公知であり、これは例えば、蛍光活性細胞分離（ＦＡＣＳ）を含むフローサイトメトリー細胞分離、または磁石補助細胞分離（ＭＡＣＳ）を含む、Ｔ細胞を認識する磁気ビーズを使用した磁気分離を含むがこれに限定されない。好適な実施形態では、ＣＤ４に対して特異的な抗体は、一部の例では磁気ビーズへと結合していてもよく、また末梢血内に見られる他の細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞を分離するために使用されている。代替的には、ネガティブセレクションは該ＣＤ４−細胞をディプリートさせるために使用され得、こうすることでＣＤ４＋細胞の濃縮が可能となる。最新技術の方法の利点は、該方法で使用されるＣＤ４＋Ｔ細胞が、外来患者の採血から得られる末梢血サンプルから得ることが可能であり、また、末梢血単離前に任意のプライミングまたは他の治療工程を必要としない点である。一部の実施形態では、該方法にて使用される単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、少なくとも約７０％のＣＤ４＋（７０％純粋）であり、より好ましくは少なくとも約７５％のＣＤ４＋（７５％純粋）、代替的には少なくとも約８０％のＣＤ４＋（８０％純粋）、代替的には少なくとも約８５％（８５％純粋）、少なくとも約９０％のＣＤ４＋（９０％純粋）、少なくとも約９５％のＣＤ４＋（９５％純粋）である。
【００３８】
一部の実施形態では、いったんＣＤ４＋Ｔ細胞が単離されると、該ＣＤ４＋Ｔ細胞はインビトロで培養され、細胞を増やす。
【００３９】
一部の実施形態では、いったん単離されると、単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞はラパマイシンを用いて条件づけ／治療され、Ｔ−Ｒａｐａ細胞を形成する。好適には、該Ｔ細胞は導入遺伝子（例えばＡＧＡ、ＧＡＡ、ＡＳＡＨ１、およびＧＢＡ導入遺伝子）または他の適切な治療構築物を含むベクターで形質導入する前に、ラパマイシンを用いて条件づけ／治療され得る。Ｔ−Ｒａｐａ細胞を形成するための、Ｔ細胞を調整する方法は当技術分野で公知であり、Ｆｏｗｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．によって２０１３年に記載されており、その内容が参照により全体に組み入れられている。好適には、単離されたＴ細胞は、Ｔ細胞をラパマイシン耐性Ｔ細胞（Ｔ−Ｒａｐａ細胞）へと形質転換するのに好適な量でサイトカインおよびラパマイシンを含む合成培地中で培養される。
【００４０】
Ｔ細胞をＴ−Ｒａｐａ細胞に形質転換するのに好適な量のラパマイシンは、約０．１〜２マイクロモル濃度（０．１〜２μＭ）、代替的には約０．８〜１．５マイクロモル濃度を含むがこれに限定されない。０．１マイクロモル濃度といった低濃度のラパマイシンが使用され得るが、ラパマイシンの濃度を低下させることで、ラパマイシン耐性Ｔ細胞を増やす能力を劣化させ得るため、これよりラパマイシンの好ましい濃度は約１マイクロモル濃度である。薬物はこの濃度より高い濃度の従来の培地には完全に溶解されないため、１マイクロモル濃度より大きいラパマイシン濃度が増加することで可能性を限定してしまう。したがって、ほぼ１マイクロモル濃度であることは、ラパマイシン耐性（Ｔ−Ｒａｐａ）表現型を獲得する上で最適である。
【００４１】
いったんＴ−Ｒａｐａ細胞が誘導されると、Ｔ−Ｒａｐａ細胞はベクターを用いてインビトロで形質導入され、これにより関心対象の導入遺伝子が発現可能である。関心対象の好適な導入遺伝子は、治療されているライソゾーム病によって変化することがある。
【００４２】
好適なベクターは当技術分野で公知であり、ベクター内にコードされる遺伝子が宿主細胞にて発現されるように、必要なエレメントを含有する。用語「ベクター」は、核酸分子または結合される別の核酸を輸送することができる遺伝子構築物を指す。ベクターの１種は「プラスミド」であり、これは中に追加のＤＮＡセグメントが結合され得る環状二本鎖ＤＮＡループ、すなわち標的とされたタンパク質をコードしている特異的な外因性ＤＮＡセグメントを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントはウイルスゲノム中へと結合され得る。ある特定のベクターは、ベクターが中へと導入されている宿主細胞にて自己複製することができる。他のベクターは、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムへと組み込まれ得るため、それによって宿主ゲノム（例えばレンチウイルスベクター）と共に複製される。加えて、ある一定のベクターは、ベクターが動作可能に結合されている外因性遺伝子の発現を誘導することができる。かかるベクターは、本明細書にて「組換え発現ベクター」（または単純に「発現ベクター」または「ベクター」）と呼ばれる。一般には、組換えＤＮＡ技術において有用なベクターは、多くの場合プラスミドの形態である。本明細書において「ベクター」は、ウイルスベクター（例えば、複製欠陥レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などの発現ベクターを含み、これらは同等の機能を果たす。細胞を形質導入するためのウイルスベクターを用いる方法は、細胞を感染または形質導入するためのウイルスを産生する方法と共に当技術分野で公知である。
【００４３】
ベクターは、２つ以上の異なる供給源由来の配列を含有する、異質の外因性構築物である。好適なベクターには、プラスミド、発現ベクター、レンチウイルス（レンチウイルスベクター）、特にアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）を含むがこれに限定されない。またこれは、関心対象の遺伝子（例えばＡＧＡ導入遺伝子）によってコードされたタンパク質を発現することのできる構築物を含む。好ましいベクターはレンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクター粒子を作製する好適な方法は当技術分野で公知であり、一実施形態は実施例に記載されている。特異的なレンチウイルスベクターは実施例にて使用されている一方、該ベクターはこれらの実施形態に限定されず、任意のレンチウイルスまたは関心対象の導入遺伝子を発現可能な他のベクターは、最新の発明の実施における使用に関して企図されている。
【００４４】
ベクターは好ましくは、細胞を形質導入、形質転換または感染させることが可能であるため、該ベクターによってコードされた核酸および／またはタンパク質を細胞に発現させる。
【００４５】
導入遺伝子または関心対象の導入遺伝子は、疾患または障害に関連する任意のタンパク質または酵素を発現することが可能であってよい。一部の例では、該導入遺伝子はライソゾーム病に関連する酵素またはタンパク質を発現する。
【００４６】
好適なライソゾーム病およびライソゾーム病を標的とする好適な関心対象の導入遺伝子は、表１にて見ることができる。一実施形態では、ライソゾーム病および導入遺伝子は表１から選択されている。
【表１】
2021522278.tif 000003
【００４７】
一実施形態では、ライソゾーム病は、ファブリー病、ゴーシェ病、ファーバー病およびポンぺ病からなる群から選択される。
【００４８】
一実施形態では、ベクターは、ファブリー病の治療のためのα−ガラクトシダーゼＡ（α−ｇａｌＡ）の発現を目的とする導入遺伝子を含有するレンチウイルスベクターである。本明細書にて使用する場合、用語アルファ−ｇａｌまたはα−ｇａｌＡは互換的に使用されており、α−ガラクトシダーゼＡ酵素（タンパク質）を指す。
【００４９】
ファブリー病
関心対象の導入遺伝子、例えばコドン最適化ＡＧＡ導入遺伝子（配列番号１）を外因性発現ベクター（例えばレンチウイルスベクター）へとクローニングする好適な方法は、当技術分野で公知であり、ファブリー病の治療のため、α−ｇａｌＡを発現するようにＴ−Ｒａｐａ細胞を操作する機能的ベクターを産生することを目的としている。好ましい実施形態では、好適な発現ベクターは、例えばレンチウイルスベクター、例えばｐＤＹ／ＣＯ．ａ−ｇａｌＡ（すなわちＬＶ／ＡＧＡ）（配列番号２）を含む。
【００５０】
好適には、ＡＧＡ導入遺伝子は、配列番号１に対して少なくとも８０％の類似度を有し、代替的には配列番号１に対して少なくとも８５％の配列類似度を有し、代替的には配列番号１に対して少なくとも９０％の配列類似度を有し、代替的には配列番号１に対して少なくとも９５％の配列類似度を有し、代替的には配列番号１に対して少なくとも９８％の配列類似度を有し、代替的には配列番号１に対して少なくとも９９％の配列類似度を有し、代替的には配列番号１に対して少なくとも１００％の配列類似度を有する。ファブリー病の治療に好適なレンチウイルスベクターは、配列番号２のベクターを含み、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列類似度を有し、代替的には配列番号２に対して少なくとも８５％の配列類似度を有し、代替的には配列番号２に対して少なくとも９０％の配列類似度を有し、代替的には配列番号２に対して少なくとも９５％の配列類似度を有し、代替的には配列番号２に対して少なくとも９８％の配列類似度を有し、代替的には配列番号２に対して少なくとも９９％の配列類似度を有し、代替的には配列番号２に対して少なくとも１００％の配列類似度を有するベクターを含む。
【００５１】
一部の実施形態では、デュアルプロモータのレンチウイルスベクターが使用され、これは関心対象の１つより多い遺伝子の発現を可能とする。例えば、デュアルプロモータのレンチウイルスベクターは、ある１つのライソゾーム病を治療するための関心対象の導入遺伝子および同じまたは異なる疾患を治療するための関心対象の別のタンパク質を発現することができる。代替的には、デュアルプロモータのレンチウイルスベクターは、インビトロまたはインビボのいずれかにて、関心対象の導入遺伝子および形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞の生存またはセレクションの促進の一助となる第２のタンパク質を発現することができる。代表的な目的のためだけに、仮特許出願番号第６２／５１６，０２２号に記載のある好適なデュアルプロモータのベクターは、ＬＶ／ＡＧＡ＋（ＩＹ）（配列番号３、図１３Ｂ）であり、その内容が参照により全体に組み入れられている。１つの好適な実施形態では、Ｔ−Ｒａｐａ細胞は図１２に表されているようにレンチウイルスベクターによって形質導入されている。別の実施形態では、Ｔ−Ｒａｐａ細胞はデュアルプロモータレンチウイルスベクターによって形質導入されており、これはα−ガラクトシダーゼＡおよびイノシン−５’−一リン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＭＰＤＨ２（ＩＹ））の突然変異形態（例えば、配列番号３によってコードされたベクター）を発現する。かかるレンチウイルスベクターを使用することで、対象内のレンチウイルスベクターの形質導入Ｔ−Ｒａｐａ細胞の集団を濃縮するのに十分である、有効量のミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）またはミコフェノール酸（ＭＰＡ）を用いて対象の治療を行うことにより、対象内の形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞をインビボで更に濃縮することが可能となる。
【００５２】
ＭＰＡ／ＭＭＦ投与の初期の結果は、Ｔ細胞とＢ細胞のディプリーションである。ＩＭＰＤＨ２（ＩＹ）を発現することにより、形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞は、ＭＰＡ／ＭＭＦに対して耐性がある。低用量のＭＭＦを用いた治療は、元々の移植に影響を与えることなく、その一方で毒性が最小限でまたは毒性をまったく生じることなく、治療Ｔ−Ｒａｐａの数を増加可能である。次いで、この増加によって例えばα−ガラクトシダーゼＡといった、導入遺伝子を発現および分泌している循環細胞の総数は増加する。これにより、疾患をより矯正することが可能となり得る。最新方法により、インビボで形質導入された細胞を濃縮するための方法が得られる。更にこれにより、こうした濃縮がいかに選択的かつ強力にＭＭＦの投与によって変化するかに応じ、一部のゲーティングが可能となる。最新方法により、このレンチウイルスベクターを宿している濃縮された細胞を数年先にわたって内部に宿し、関心対象の導入遺伝子を発現する修正細胞の集団を再生させることもできる。
【００５３】
好適な実施形態では、ＭＭＦは有効な投与量で投与される。「有効投与量」は、最小限の副作用を有するレンチウイルスベクターを用いて導入遺伝子を発現するＴ−Ｒａｐａ細胞が選択的に濃縮可能である投与量を指す。一実施形態では、有効投与量は低い投与量である。好適な低投与量としては、例えば０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重での所定のＴＩＤ（１日あたり３回）を含むがこれに限定されない。代替的には約０．１〜３ｍｇ／ｋｇ体重での所定のＴＩＤを含む。代替的には、有効量は、高い投与量のＭＭＦを含んでよい。本発明を実施するための、好適な高い投与量は、約５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重でのＴＩＤ（１日あたり３回）の量でＭＭＦを含み、代替的には１０００ｍｇの所定のＢＩＤ（１日あたり２回）を含む。好適には、「有効量」のＭＭＦにより、約０．４〜約２μＭの遊離ミコフェノール酸（ＭＰＡ）の、対象内部での血液濃度が生じる。この血液濃度を得るための好適な投与量は、対象を治療する医師によって容易に決定される。ＭＭＦはまた、ミコフェノール酸（ＭＰＡ）製剤（Ｍｙｆｏｒｔｉｃ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、または承認済ジェネリック）に替えられてもよい。
【００５４】
ゴーシェ病
一部の実施形態では、ライソゾーム病はゴーシェ病である。ゴーシェ病においては、ＧＢＡ遺伝子の突然変異はβ−グルコセレブロシダーゼの活性を大きく低下または除去させる。活性の低下または除去により、脂質に分類されているグルコセレブロシドと呼ばれるグリコスフィンゴ脂質といったロウ様の物質を、糖（グルコース）と、セラミドといった別のスフィンゴ脂質へと分解する。この酵素が十分存在しない場合、グルコセレブロシドと関連物質は、細胞内の毒性レベルを最大に引き上げることがある。組織および臓器は、こうした物質を異常に蓄積および貯蔵することで損傷を受け、ゴーシェ病の特徴的な特色を引き起こす。本発明の好適な実施形態は、ゴーシェ病の治療のためのＧＢＡを発現するＴ−Ｒａｐａ細胞を提供する。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、形質導入された細胞内で、β−グルコセレブロシダーゼ（例えば、配列番号７に見られるＧＢＡ導入遺伝子）の発現を可能とする導入遺伝子（例えばＧＢＡ導入遺伝子）を含む。好適には、ＧＢＡ導入遺伝子は、配列番号７に対して少なくとも８０％の類似度を有し、代替的には配列番号７に対して少なくとも８５％の配列類似度を有し、代替的には配列番号７に対して少なくとも９０％の配列類似度を有し、代替的には配列番号７に対して少なくとも９５％の配列類似度を有し、代替的には配列番号７に対して少なくとも９８％の配列類似度を有し、代替的には配列番号７に対して少なくとも９９％の配列類似度を有し、代替的には配列番号７に対して少なくとも１００％の配列類似度を有する。
【００５５】
一実施形態では、該ベクターは配列番号７または配列番号７に対し少なくとも８０％の相同性を有する配列の導入遺伝子ＧＢＡを含む、レンチウイルスベクターである。
【００５６】
ＧＢＡを含むレンチウイルスベクターに好適な配列は、配列番号４に見られおよび図１３Ｃに表されている。または、配列番号４に対して少なくとも７５％の配列類似度を有し、代替的には配列番号４に対して少なくとも８０％の配列類似度を有し、代替的には配列番号４に対して少なくとも８５％の配列類似度を有し、代替的には配列番号４に対して少なくとも９０％の配列類似度を有し、代替的には配列番号４に対して少なくとも９５％の配列類似度を有し、代替的には配列番号４に対して少なくとも９８％の配列類似度を有し、代替的には配列番号４に対して少なくとも９９％の配列類似度を有し、代替的には配列番号４に対して少なくとも１００％の配列類似度を有する配列に見られる。β−グルコセレブロシダーゼタンパク質の発現に対してコードしている他の好適なベクターは、本明細書にて企図されている。
【００５７】
ファーバー病
一部の実施形態では、ライソゾーム病はファーバー病（ファーバー脂肪肉芽腫症、セラミダーゼの欠乏、「線維芽細胞ムコ多糖異常症」（Ｆｉｂｒｏｃｙｔｉｃ  ｄｙｓｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ）、および「脂肪肉芽腫症」としても公知である）であり、導入遺伝子ＡＳＡＨ１は、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドハイドロラーゼ１または酸性セラミダーゼ（本明細書にて互換的に用いられる）を発現する。ファーバー病は、酵素である酸性セラミダーゼにおける欠乏により特徴づけられる、極めて稀である常染色体性の潜性ライソゾーム病である。これはスフィンゴ脂質として公知であるロウ様の脂質であり、特にセラミドの蓄積を生じ、関節、肝臓、咽頭、内臓組織および中枢神経系における異常がもたらされる。好適な実施形態は、ファーバー病の治療のためのＮ−アシルスフィンゴシンアミドハイドロラーゼ１を発現しているＴ−Ｒａｐａ細胞を提供する。好適なベクターは、好ましくはレンチウイルスベクターであるがこれは、Ｔ−Ｒａｐａ細胞内でＮ−アシルスフィンゴシンアミドハイドロラーゼ１を発現するために使用される。本明細書で使用される場合、好適なベクターは、好ましくはレンチウイルスベクターであるがこれは、Ｔ−Ｒａｐａ細胞にてＮ−アシルスフィンゴシンアミドハイドロラーゼ１を発現するために使用され得る。例えば、好適なベクターは配列番号８または配列番号８と８０％の類似度を有する配列のＡＳＡＨ１導入遺伝子を用いてＮ−アシルスフィンゴシンアミドハイドロラーゼ１を発現し得る。好適には、ＡＳＡＨ１導入遺伝子は、配列番号８に対して少なくとも８０％の類似度を有し、代替的には配列番号８に対して少なくとも８５％の配列類似度を有し、代替的には配列番号８に対して少なくとも９０％の配列類似度を有し、代替的には配列番号８に対して少なくとも９５％の配列類似度を有し、代替的には配列番号８に対して少なくとも９８％の配列類似度を有し、代替的には配列番号８に対して少なくとも９９％の配列類似度を有し、代替的には配列番号８に対して少なくとも１００％の配列類似度を有する。
【００５８】
好適なレンチウイルスベクターは、図１３Ｄに表されているまたは配列番号５中のベクターを含む。ＡＳＡＨ１導入遺伝子を含むレンチウイルスベクターに好適な配列は、配列番号５、または配列番号５に対して少なくとも７５％の配列類似度を有し、代替的には配列番号５に対して少なくとも８０％の配列類似度を有し、代替的には配列番号５に対して少なくとも８５％の配列類似度を有し、代替的には配列番号５に対して少なくとも９０％の配列類似度を有し、代替的には配列番号５に対して少なくとも９５％の配列類似度を有し、代替的には配列番号５に対して少なくとも９８％の配列類似度を有し、代替的には配列番号５に対して少なくとも９９％の配列類似度を有し、代替的には配列番号５に対して少なくとも１００％の配列類似度を有する配列に見られる。Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドハイドロラーゼ１タンパク質の発現のためにコードする他の好適なベクターは、本明細書にて企図されている。
【００５９】
ポンペ病
別の実施形態では、本発明は、ポンペ病の治療のためのベクターおよび酸α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ導入遺伝子によってコードされている）を発現しているＴ−Ｒａｐａ細胞を提供している。ポンペ病は、体の細胞であるライソゾームにおいて、グリコーゲンと呼ばれる複合型糖を分解することができないことで生じる遺伝性障害であり、これによりある特定の臓器および組織（特に筋肉）中でグリコーゲンの蓄積が生じ、正常に機能する能力を損なってしまう。ＧＡＡ遺伝子は酸性α−グルコシダーゼ（酸性マルターゼとしても公知である）と呼ばれている酵素を産生するための指示を提供することから、ＧＡＡ遺伝子内部での突然変異はポンペ病を引き起こす。この酵素はライソゾーム内で活性であり、細胞内でのリサイクルセンターとして機能する。この酵素は、ライソゾーム内で、グリコーゲンをグルコースと呼ばれている単純型糖へと分解する。これは大半の細胞にとって主要なエネルギー源である。一部の実施形態では、酸性α−グルコシダーゼを発現しているＴ−Ｒａｐａ細胞は、ポンペ病を有する対象を治療するために使用されている。上記のように、ベクター、好ましくはレンチウイルスベクターであるが、これは後の分泌のため、Ｔ−Ｒａｐａ細胞内でＧＡＡ導入遺伝子により酸性α−グルコシダーゼを発現するために使用され得る。一実施形態では、ベクター、好ましくはレンチウイルスベクターは、配列番号９または配列番号９に対して少なくとも８０％類似している配列のＧＡＡ導入遺伝子を含む。好適には、ＧＡＡ導入遺伝子は、配列番号９に対して少なくとも８０％の類似度を有し、代替的には配列番号９に対して少なくとも８５％の配列類似度を有し、代替的には配列番号９に対して少なくとも９０％の配列類似度を有し、代替的には配列番号９に対して少なくとも９５％の配列類似度を有し、代替的には配列番号９に対して少なくとも９８％の配列類似度を有し、代替的には配列番号９に対して少なくとも９９％の配列類似度を有し、代替的には配列番号９に対して少なくとも１００％の配列類似度を有する。
【００６０】
一実施形態では、好適なレンチウイルスベクターは図１３Ｅおよび配列番号６中に示されている。ＧＡＡを含むレンチウイルスベクターに好適な配列は、配列番号６、または配列番号６に対して少なくとも７５％の配列類似度を有し、代替的には配列番号６に対して少なくとも８０％の配列類似度を有し、代替的には配列番号６に対して少なくとも８５％の配列類似度を有し、代替的には配列番号６に対して少なくとも９０％の配列類似度を有し、代替的には配列番号６に対して少なくとも９５％の配列類似度を有し、代替的には配列番号６に対して少なくとも９８％の配列類似度を有し、代替的には配列番号６に対して少なくとも９９％の配列類似度を有し、代替的には配列番号６に対して少なくとも１００％の配列類似度を有する配列に見られる。酸性α−グルコシダーゼタンパク質の形態で発現するためにコードする他の好適なベクターは、本明細書にて企図されている。
【００６１】
表１に列挙した他のライソゾーム病は、本明細書に記載の方法によって治療されるよう、企図されている。
【００６２】
「配列相同性の比率」または「配列類似度」は、２つの最適に並べられた配列を比較ウインドウによって比較することで決定される。比較ウインドウ内のポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適なアラインメントに関して、参照配列（これは置換、追加または削除を含まない）と比較して、置換、または追加、または削除（すなわちギャップ）を含んでよい。比率は、一致した位置の数を得るため、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列内で生じている位置の数を決定することにより計算される。この一致した位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数で割り、更に得た結果に１００を掛けて配列相同性の比率を得る。
【００６３】
ポリヌクレオチド配列の用語「実質的な相同性」または「類似度」は、ポリヌクレオチドが少なくとも８０％の配列相同性を有する配列を含むことを意味する。好適な配列類似度は、導入遺伝子によって発現されているタンパク質の機能に影響しない、導入遺伝子の小さな変化を与える。代替的には、パーセント相同性は、７５〜１００％の任意の整数であり得る。より好ましい実施形態は、標準的なパラメータを用いるＢＬＡＳＴなどのプログラムを使用する参照配列と比較して、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を含む。コドン縮退、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置決めなどを考慮することにより、２つのヌクレオチド配列によってコードされた、対応するタンパク質の相同性を測定するため、こうした値が適切に調節され得る。
【００６４】
Ｔ−Ｒａｐａ細胞を形質導入することができる、好適な量のレンチウイルスは、例えば、１〜１００のＭＯＩ（感染多重度、ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、好ましくは１〜３０のＭＯＩ、代替的には１〜６０のＭＯＩを使用することを含む。該Ｔ−Ｒａｐａ細胞は、１０〜２４時間、好適には約１２〜１６時間の間、レンチウイルスに曝されてよい。該Ｔ−Ｒａｐａ細胞は、本明細書に列挙された曝露時間の間、連続して１〜３回、好適には１回形質導入されてよい。サイトカインは、形質導入中に培地に加えられてよい。形質導入後、細胞は患者へと戻して導入され得るか、または後の移植用に凍結保存され得るか、またはその両方の組合せのいずれかが行われ得る。一部の例では、形質導入された細胞は、導入または凍結保存される前にある程度の日数にわたって培養されてよい。凍結保存の好適な方法は、当技術分野で公知である。
【００６５】
他の好適なベクターは当技術分野で公知であり、これはＡＡＶベクターなどを含む細胞を形質導入するために使用され得る。関心対象の導入遺伝子によってコードされた酵素を安定して発現させることができる任意のベクターが、本明細書にて使用するために企図されている。
【００６６】
一部の実施形態では、形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞は培養物中で増やされ、培養物の種々の段階にて凍結保存される。凍結保存の好適な方法には、凍結保存培地に細胞を懸濁させることおよび−８０℃〜−１９６℃（好ましくは−８０℃未満）で細胞を保存することを含むがこれに限定されない。好適な凍結保存培地は当技術分野で公知であり、かつこれは基礎培地、凍結保存用保存剤（例えばＤＭＳＯ）およびタンパク質供給源の組合せをいくらか含むことができる。例えば、好適な凍結保存培地は、完全培地および１０％のグリセロール、１０％のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含有する完全培地、または４５％の新鮮な培地および１０％のグリセロールまたはＤＭＳＯを有する４５％の細胞で条件づけられた培地を含んでよい。代替的な実施形態では、凍結保存培地は血清フリーであり、例えば４６．２５パーセントの新鮮な血清フリー培地および７．５パーセントのＤＭＳＯを有する４６．２５％の細胞調整血清フリー培地を含む。
【００６７】
Ｔ細胞を培養するのに好適な合成培地は当技術分野で公知であり、市販のＸ−Ｖｉｖｏ２０などの栄養豊富な培地が含まれるがこれに限定されない。好適には、合成培地はサイトカインを更に追加されている。好ましくは、一実施形態では、組換えヒトＩＬ−２（ｒｈｕ  ＩＬ−２）および組換えヒトＩＬ−４（ｒｈｕ  ＩＬ−４）サイトカインは、培地に追加するために使用されている。組換えサイトカインの好適な量には、約１０〜１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２、好ましくは約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２および約５００〜２０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−４、好ましくは約１０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−４が挙げられる。
【００６８】
一部の実施形態では、形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞はインビトロで増やされる。増殖中、形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞は、本明細書に記載のサイトカインを追加した合成培地中に培養されてよい。好適には、形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞は少なくとも１日間培養されてよく、好適には少なくとも２週間培養されてよく、代替的には少なくとも約４週間、代替的には少なくとも約６週間培養されてよい。
【００６９】
形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞は、少なくとも５継代数にわたって培養物中にてインビトロで維持および増やされてよく、代替的には少なくとも１０継代数、代替的には１５継代数、代替的には２０継代数にわたって維持および増やされてよい。形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞は、形質導入後任意の継代数で凍結保存されてよい。
【００７０】
本開示は、関心対象の導入遺伝子によってコードされたタンパク質を発現する、形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞の集団およびその任意の使用方法を企図している。例えば、本開示は、関心対象の導入遺伝子によってコードされたタンパク質を発現する、形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞の集団を提供する。一実施形態では、本開示はα−ｇａｌＡを発現する形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞の集団を提供する。別の態様では、本開示はβ−グルコセレブロシダーゼを発現する形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞の集団を提供する。別の態様では、本開示は酸性セラミダーゼを発現する形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞の集団を提供する。別の態様では、本開示は酸性α−グルコシダーゼを発現する形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞の集団を提供する。
【００７１】
好適には、形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞は、ライソゾーム病（例えばファブリー病）の１つまたは複数の症状を低減するのに有効な量で、ライソゾーム病を有する対象へと投与される。形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を投与する好適な方法は、当技術分野で公知であり、点滴静注および輸血を含むがこれに限定されない。
【００７２】
形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞は、少なくとも１回投与されてよく、好適には、ライソゾーム病（例えばファブリー病）の１つまたは複数の症状を治療するため、関心対象の酵素またはタンパク質の発現（例えばα−ｇａｌＡの発現）の向上が必要とされる、それ以上の回数で投与される。ライソゾーム病に詳しい当業者は、酵素（例えばα−ｇａｌＡ）の産生のモニタリングおよび追加の投与の必要性を理解するであろう。
【００７３】
用語「対象」または「患者」は互換的に使用され、哺乳動物の対象は例えば、マウス、ラット、サル、ヒトなどを指す。好ましい実施形態では、対象はヒトである。対象または患者は、本明細書にて企図されている治療を行う前に、ライソゾーム病に対して１つまたは複数の治療で既に治療されていてもよいことが企図されている。例えば、外因性酵素で、または形質導入されたＨＳＣ細胞を用いた従来の方法によって治療されている患者は、本発明の使用対象である患者として企図されている。
【００７４】
宿主細胞は、好適にはＴ細胞であり、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞である。本明細書で提供された実施例はＣＤ４＋Ｔ細胞の使用について記載しているが、一部の実施形態では、治療タンパク質（関心対象の導入遺伝子）を分泌するＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の混合集団を製造するのに有益であり得る。更に、一実施形態では、Ｔ細胞はＴｈ２サイトカイン表現型に対して歪んでおり、一部の実施形態では、Ｔｈ１、Ｔｈ１７などの他の表現型または制御因子Ｔ細胞サブセットに対して歪んだＴ細胞を製造するのに有益であり得る。
【００７５】
形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞の集団を産生する好適な方法は、本明細書にて提供されている。
【００７６】
一部の実施形態では、形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞は薬学的に許容される担体または賦形剤と共に対象へと投与される。
【００７７】
「薬学的に許容される担体」は、任意の従来の薬学的に許容される担体、ビヒクル、または産生および対象に組成物を投与するため当技術分野で使用される賦形剤を意味する。薬学的に許容される担体は、典型的には非毒性であり、不活性であり、固形または生理学的に均衡な液体担体である。典型的には、緩衝整理食塩水または他の生理食塩水は、生理学的に許容される担体である。水は生理学的に許容される好適な担体であるとは企図されていない。一部の実施形態では、本発明のＴ−Ｒａｐａ細胞の構造および機能を保存するため、追加成分が加えられてよいが、これは対象への投与に関して生理学的に許容されるものである。
【００７８】
本発明は１つまたは複数の好ましい実施形態に関して記載されており、明確に言及されたものを除いて、多くの等価物、代替物、変更物、修飾が可能であり、かつこれらは発明の範囲内であると理解されるべきである。
【００７９】
既に記載したものに加え、多くの追加的な修飾は発明の概念から逸脱しない限り可能であることは、当業者には明白である。本開示を解釈する上で、全ての用語は文脈と一致する最大限広範な様式として解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の変形は、非排他的な様式の要素、成分または工程を指すものとして解釈されるべきである。そのため、言及された要素、成分、または工程は、明確に参照されていない他の要素、成分、または工程と組み合わせられてよい。ある特定の要素を「含む」と参照されている実施形態はまた、それらの要素「から本質的になる」およびそれらの要素「からなる」というように企図されている。値の範囲が設定されている場合、本開示は、明示的に記載されていない範囲の下限および上限の他の組合せを明示的に企図している。例えば、１〜１０または２〜９の間の値の列挙はまた、１〜９または２〜１０の間の値を企図している。２つの値の「間」にあると確認されている範囲は、その値の終点を包括するものである。例えば、１〜１０の間の値の列挙は、１〜１０の値を含む。
【００８０】
方法に関して記載されている本開示の態様は、本開示にて議論されている物質の組成物またはキットの文脈で使用され得る。同様に、物質の組成物に関して記載されている本開示の態様は、方法およびキットの文脈で使用され得、キットに関して記載されている本開示の態様は、方法および物質の組成物の文脈で使用され得る。
【００８１】
本発明は、以下の非限定的な実施例を考慮することで、より完全に理解されるだろう。
【実施例】
【００８２】
実施例１：レンチウイルスベクターの産生
【００８３】
ＬＶ構築物
α−ｇａｌＡをコードしているヒトＧＬＡ遺伝子のｃＤＮＡを含むＤＮＡフラグメントを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成した。ＧＬＡ遺伝子のｃＤＮＡは、ヒト細胞の増強した発現のため、コドン最適化された。合成されたＤＮＡフラグメントは、３’自己不活性化（３’ＳＩＮ）し、ＨＩＶ−１−ベースであり、予め発明者らのラボにて複数のクローニング部位（ＭＣＳ）中のＥｃｏＲＩとＸｍａＩ制限部位の間に生成した、レンチウイルス骨格プラスミドｐＤＹ．ｃＰＰＴ−ＥＦ１ａ−ＭＣＳ−ＷＰＲＥへとサブクローニングされた。この後、発明者らはＱ５−部位特異的変異導入キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて部位特異的な変異導入を行い、ｃＤＮＡの配列上流を編集し、最適なコザックコンセンサス配列を生成させた。これらの工程によりプラスミドｐＤＹ／ＣＯ．α−ｇａｌＡ（配列番号２）を生成し、これを発明者らの調査におけるＬＶ調製全てに使用した。プロウイルス領域を包含するプラスミド配列は、ＤＮＡシーケンシングによって検証された。この方法はＨｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．が２０１７年に記載され、注釈として利用しているものであり、その内容が参照により全体に組み入れられている。
機能的力価解析を伴う、研究グレードおよび準医療グレードのＬＶの調製
【００８４】
研究グレードのＬＶ／ＡＧＡは、以前の記載の通り、発明者らのラボにて調製された（Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｃ．，Ｆｅｌｉｚａｒｄｏ，Ｔ．Ｃ．，Ａｕ，Ｂ．Ｃ．，Ｆｏｗｌｅｒ，Ｄ．Ｈ．，Ｄｅｋａｂａｎ，Ｇ．Ａ．，ａｎｄ  Ｍｅｄｉｎ，Ｊ．Ａ．（２０１３）．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｖｉｒｏｌ．Ｊ．１０，２４０）。準医療グレードのＬＶ／ＡＧＡを産生した。これは臨床試験用の新医薬品（ＩＮＤ）の提案下で、期待されるヒト治験での使用に関する最新のＧＭＰ要件に合致していた。
【００８５】
ＬＶ粒子はＨＥＫ２９３Ｔパッケージング細胞を用いて産生された。パッケージング細胞を４Ｌの培養物量に増やし、これをＬＶパッケージングプラスミド（ｐＣＭＶΔＲ８．９１（パッケージングプラスミド）およびｐＭＤ．Ｇ（プラスミドをコードしているＶＳＶ−Ｇエンベロープ））ならびにトランスファープラスミド（ｐＤＹ／ＣＯ．ａ−ｇａｌ  Ａ）を用いて一時的に共遺伝子導入した。増やされた前述のプラスミドの配列は、ＤＮＡシーケンシングによって検証された。培養物の上清を２度収集し、総計で８Ｌの未濃縮のＬＶ含有上清を得た。ＬＶ含有上清は、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑイオン交換クロマトグラフィーによって更に精製され、タンジェンシャルフローフィルトレーションにより濃縮され、１００ｍＬのＧＭＰグレードＬｏｎｚａ  Ｘ  ｖｉｖｏ  ２０細胞増殖培地へとバッファ交換された。
【００８６】
水泡口炎ウイルス糖タンパク質シュードタイプレンチウイルス（ＶＳＶｇ−ＬＶ）を生成した。手短に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は１５ｃｍの培養皿に播種され、ＬＶパッケージングプラスミドおよびトランスファープラスミドを用いて２４時間後に遺伝子導入した。１６〜１７時間後、細胞が存在する培地を新鮮な培地へと交換した。２４時間後、培養物上清を収集し、新鮮な培地と交換した。更に２４時間後、２度目の収集を実施した。培養物上清を０．２２μｍの吸引フィルタを用いてろ過し、２時間半にわたり５０，０００ｇで超遠心分離にかけた。残留液体をウイルスペレットから除去し、次いでこれらをＬｏｎｚａ  Ｘ  ｖｉｖｏ  ２０中に再懸濁させ、使用するまで−８０℃で保存した。図１１に表されるように、２４時間後と４８時間後にウイルス上清を収集し、２時間超、５０，０００ｇで超遠心分離にかけることで濃縮させた。ウイルスの貯蔵物をリンパ球培地（Ｌｏｎｚａ  Ｘ  ｖｉｖｏ  ２０）中に再懸濁させ、使用するまで−８０℃で保存した。
【００８７】
最終濃縮ベクター産物のサンプルバイアルはＧＣ分析にかけられる。この分析にはサザンブロット解析によるベクターの相同性確認およびｐ２４  ＥＬＩＳＡによる力価確認が含まれており、これに加えて好気性菌の無菌性および嫌気性菌の無菌性、マイコプラズマレベル、エンドトキシンレベル、および残留ＤＮＡベンゾナーゼレベルが検査される。
【００８８】
発明者らは、ベクターの連続希釈を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質導入し、その後定量的リアルタイムＰＣＲ解析を用いて細胞あたりの平均ウイルスコピー数を測定することで、全てのＬＶ調製物の感染力価検査を実施した。
【００８９】
実施例２：形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞の製造
【００９０】
形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を作製する概略は図９に表されている。ドナーのリンパ球は、幹細胞の動員の前に実施された定常状態での１０リットルのアフェレーシスによって収集された。ＣＤ４細胞は陽性に選択され（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）デバイスまたはラボの同等のデバイス）、共刺激された（ＧＭＰグレードの抗−ＣＤ３［ＯＫＴ３、Ｏｒｔｈｏ］およびＧＭＰグレードの抗−ＣＤ２８  ９．３抗体［ビーズ：細胞の比が３：１］で抱合されたトシル化磁気ビーズ［Ｄｙｎａｌ］）。代替的には、ドナーのリンパ球は、ＣＤ３４＋ｃｌｉｎｉＭＡＣＳ法によるＣＤ３４−ディプリート通過画分としてドナーから動員された幹細胞から得られた。ＣＤ４＋細胞は、既に記載の磁気濃縮を用いて得られた。
【００９１】
精製されたＣＤ４＋細胞は、Ｘ−ＶＩＶＯ  ２０培地（Ｌｏｎｚａ）、５％のドナーの血清、組換えヒト（ｒｈｕ）ＩＬ−４（１０００Ｉ．Ｕ．／ｍＬ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）、ｒｈｕ  ＩＬ−２（２０Ｉ．Ｕ．／ｍＬ、Ｃｈｉｒｏｎ）およびＳｉｒｏｌｉｍｕｓ（登録商標）、経口液（Ｗｙｅｔｈ、１μＭ）および抗−ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（３：１）を用いてポリオレフィン製のバッグ（Ｂａｘｔｅｒ）にて培養する。３日後、Ｔ細胞を洗浄し、３０〜６０のＭＯＩにてα−ｇａｌＡを発現可能であるレンチウイルスベクターで形質導入する。１８時間後、Ｔ細胞を洗浄し、ラパマイシンを含まない追加のＸ−ＶＩＶＯ  ２０培地にて繁殖させる。６日目にはビーズを除去した。Ｔ細胞を洗浄してサイトカインを除去し、その後凍結保存した。注入された全てのＴ−Ｒａｐａ産物は放出基準と見合っていた。この基準には、ＣＤ４細胞純度＞７０％（中央値ＣＤ４純度は９９％だった）、生存度＞７０％（中央値生存度が９５％だった）、細菌および真菌増殖の不在、リムルスアッセイによるエンドトキシン含有量の不在、ネガティブマイコプラズマ検査、および３×１０６細胞ごとに＜１００の磁気ビーズというものが含まれる。Ｔ−Ｒａｐａ細胞は使用のために培養して増やし、凍結保存される。
【００９２】
図２に表されているように、健常なドナー（ＮＤ）およびファブリー病ドナー（ＦＤ）から誘導されたＴ−Ｒａｐａ細胞は、レンチウイルスベクターによって効率的に形質導入された。
【００９３】
実施例３：ＬＶによって形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞内でのα−ｇａｌＡの発現
【００９４】
α−ｇａｌＡのレベルは、健常なドナーおよびファブリー病ドナー由来の形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞に関して測定された。特異的なα−ｇａｌＡ活性は、既に記載の蛍光定量的アッセイによって測定された（Ｙｏｓｈｉｍｉｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．２００４，ＰＮＡＳ：９４２５４０−２５４４）。手短に、血漿または細胞／臓器タンパク質抽出物を、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ阻害剤、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下で４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（５ｍｍｏｌ／Ｌ）を用いてインキュベートした。酵素反応の産物は、公知の濃度の４−メチルウンベリフェロンと比較して定量化された。各測定は３通りで評価され、総タンパク質濃度へと標準化された（ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）。結果は図３Ａおよび図３Ｂに示され、細胞溶解液（Ａ）および上清（Ｂ）中のα−ｇａｌＡ含有量を表している。
【００９５】
α−ｇａｌＡのレベルはまた、図４および図５に示されているように、Ｗｅｓ（商標）Ｓｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｓｙｓｔｅｍにより検出された。
【００９６】
実施例４：ファブリー病のマウスモデルのインビボ治療
【００９７】
既に記載のα−ｇａｌＡ欠乏および免疫無防備状態のファブリー病マウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＡＧＡ−／−）（Ｐａｃｉｅｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）を使用し、ファブリー病の治療のため、形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞の使用に関するインビボでの有効性を検査した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＡＧＡ−／−マウスは、図６に表された健常なドナーまたはファブリー病ドナーのいずれか由来である、５×１０５の形質導入されたヒトＴ−Ｒａｐａ細胞を用いて移植された。移植された動物内のα−ｇａｌＡ活性は、異種移植した４週間後にアッセイされた。肝臓、脾臓、心臓、腎臓、血漿およびＰＢ−ＷＢＣを収集した。ＰＢ−ＷＢＣは、形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞の存在に関して、フローサイトメトリーおよびにＶＣＮよりアッセイされた。血漿はα−ｇａｌＡ活性に関して評価され、図７には結果を図８には生データを示している。図１８は、α−ｇａｌＡ活性は、形質導入された健常なドナーのＴ  Ｒａｐａ（ｎ＝４〜５）を異種移植した４週間後に、インビボにて収集された臓器内で検出可能であることを示す。
【００９８】
更に、形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞のインビボで基質を低下させる能力もまたアッセイした。グロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）、ファブリー病マウスに蓄積した主要基質、およびグロボトリアオシルスフィンゴシン（ｌｙｓｏ−Ｇｂ３）は、健常なドナーの形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を用いた治療後、ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって血漿および組織ホモジネート内で定量化した。図１９に示されるように、基質は形質導入された健常なドナーのＴ  Ｒａｐａ（ｎ＝４〜５）を移植した４週間後に、低下した。
【００９９】
健常なドナーおよびファブリー病ドナーから誘導された、ＬＶ／ＡＧＡベクターにより形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞は、インビボで活性酵素を産生および分泌した。
【０１００】
ファブリー病患者から誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞はまた、上記のα−ｇａｌＡをコードしているレンチウイルスベクターで形質導入された。最初に、発明者らは、図１７に示されるように、３人のファブリー病患者由来のＴ−Ｒａｐａ細胞がα−ｇａｌＡ活性を示し、細胞内部および細胞内上清の両方での酵素活性を測定したことを確認した。次いで発明者らは、１ｍＭの可溶性マンニトース−６−ホスファートの有無に関わらず、６時間にわたりＴ−Ｒａｐａ細胞で条件づけられた上清を用いて、不死化されたファブリー病患者由来の線維芽細胞を治療し、Ｔ−Ｒａｐａ細胞から産生された酵素が吸収され得るかどうかを確認した（図１７）。
【０１０１】
ファブリー病患者から誘導されたこれらの形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞はまた、免疫無防備状態のファブリー病マウスモデルへと移植され、α−ｇａｌＡ活性を測定した。図２０に示されるように、α−ｇａｌＡは形質導入されたファブリー病ドナーのＴ−Ｒａｐａ（ｎ＝４〜５）を異種移植した４週間後に、インビボで検出可能である。更に、これらのファブリー病のＴ−Ｒａｐａを形質導入した細胞は、図２１に表されるように、ファブリー病マウス内の基質（Ｇｂ３）を低下させることが可能であった。基質は形質導入されたファブリー病ドナーのＴ−Ｒａｐａ（ｎ＝４〜５）を移植した４週間後に低下した。
【０１０２】
この実施例は、形質導入されたＴ−Ｒａｐａがライソゾーム貯蔵疾患に対抗する必要な酵素（例えばα−ｇａｌＡおよびＧＣａｓｅ）を発現および分泌することを示す。更に、この実施例は、形質導入されたファブリー病患者のＴ−Ｒａｐａ細胞が製造可能であり、形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞が基質を低下させるためにインビボで機能可能であることを示している。
【０１０３】
実施例５：ファブリー病の治療
【０１０４】
図１０は、本明細書に記載の方法によって障害を治療するための全体のプロトコールの概略を示し、形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を用いてライソゾーム病（例えばファブリー病）を治療するための工程を特に示している。
【０１０５】
患者の末梢血は、当技術分野で公知の方法によって収集された。次いでＣＤ４＋Ｔ細胞は当技術分野で公知である方法を用いて末梢血から単離される。例えば、フローサイトメトリー細胞分離またはＣＤ４に対する抗体を用いる磁気細胞分離といったものである。代替的には、ＣＤ４＋細胞はアフェレーシス産物からも同様に単離されることができる。これは、当技術分野で公知である方法を用いて得ることができる。単離されたＣＤ４＋細胞は、ラパマイシン（例えば１マイクロモル）の存在下で、上記のサイトカイン（ＩＬ−２およびＩＬ−４）の存在下にて３日間培養される。Ｔ−Ｒａｐａ細胞は、１２〜１８時間の間、１〜３０または１〜６０のＭＯＩにてエクスビボでレンチウイルスを用いて形質導入される。この後、このＴ−Ｒａｐａ細胞は更に３日間（３日〜約１か月にわたって培養され得る）、サイトカイン含有培地にて培養される。
【０１０６】
Ｔ−Ｒａｐａ細胞を受け入れた患者は、骨髄非破壊的前処置で条件づけされない。むしろ、実施される化学療法の種類は、リンパ球特異的およびミエロイド温存であり得る。リンパ球特異的化学療法は、（他の投与計画が想起される場合もあり得るが）以下の投与計画：（１）フルダラビンおよび低用量の毎日のシクロホスファミド、または（２）ペントスタチンおよび低用量の毎日のシクロホスファミドからなる。
【０１０７】
患者には、約２〜１０×１０６／ｋｇの形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞を注入する。α−ｇａｌＡの発現に関して患者をモニタリングした。細胞投与は繰り返されてよく、細胞投与量は適切な医師によって推奨されるように調節されてよい。
【０１０８】
実施例６：本発明の方法で使用するためのデュアルプロモータレンチウイルスベクターの産生
【０１０９】
一部の実施例では、本発明はデュアルプロモータレンチウイルスベクターを使用して導入遺伝子（例えばＡＧＡ導入遺伝子）および薬物（例えばミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ））に対する耐性を付与する耐性遺伝子（例えば、ＩＭＰＤＨ２（ＩＹ））をターゲットＴ細胞へと導入してよい。デュアルプロモータ構築物（ｐＤＹ−ＤＰ（配列番号１０））を設計し、標準的な分子生物学的技術を使い、ｐＤＹを用いて骨格としてこれを構築した。ヒト由来であり、遍在性である常時発現プロモータは関心対象の導入遺伝子を発現する。濃縮目的のため、一方のプロモータから発現されたＩＭＰＤＨ２（ＩＹ）を用いたベクターを構築した。これはもう一方のプロモータ由来である、関心対象の別の導入遺伝子を挿入する能力を有していた（すなわち、ｐＤＹ−［ＭＣＳ］＋（ＩＹ）、（配列番号１１））。ＡＧＡ導入遺伝子を有するベクターを構築し、ファブリー病（配列番号３）を治療するのに使用した。このベクターの力価は、１×１０９感染性ウイルス粒子（ＩＶＰ）／ｍＬの範囲である。ＩＭＰＤＨ２（ＩＹ）の代わりに増強された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を有するベクターは、発現を測定するために使用され、また非濃縮コントロールとして使用するために使用された。図１３は本発明で使用されているレンチウイルスベクターのベクターマップを示している。
【０１１０】
レンチウイルスベクターを産生する好適な方法は当技術分野で公知である。好適なプロトコールは図１１に示されている。レンチウイルスの産生は、以下の工程を含む。すなわち、（ａ）３つのパッケージングプラスミドであるｐＣＭＶΔＲ８．９１（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：８７１−８７４，１９９７、参照により組み入れられる）、ｐＭＤ．Ｇ（Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：２６３−２６７，１９９６、参照により組み入れられる）およびｐＡｄＶ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を、関心対象のトランスファーベクターをコードしているプラスミドと適切な比で混合させるものである。これらはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と組み合わせられ、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へと遺伝子導入される。培地は１６時間後に交換した。（ｂ）ウイルス粒子を含有する培養物上清は、遺伝子導入後およそ４０〜６４時間で収集された。上清は０．２２μｍの膜フィルタでろ過され、混入物を除去する。（ｃ）収集された上清は示されるように超遠心分離にかけられ、ウイルスを濃縮する。（ｄ）ウイルスペレットは、元々の上清に比べて２０００倍未満の量で適切な培地中に再懸濁される。
【０１１１】
実施例７：デュアルプロモータレンチウイルスベクターを用いたファブリー病の代表的な治療
【０１１２】
ファブリー病患者は、例えば実施例６に記載のようなデュアルプロモータレンチウイルスベクターがα−ｇａｌＡを発現すると共にＩＭＰＤＨ２（ＩＹ）を発現することを除いては、実施例５に記載の通り治療される。これは、患者が低用量のＭＭＦで治療される場合に形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞に対し成長優位性を表す。
【０１１３】
ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ、ＣｅｌｌＣｅｐｔ、Ｒｏｃｈｅまたは承認済ジェネリック）を用いた治療によって必要とされる場合、濃縮が引き起こされ得る。形質導入されたＴ−Ｒａｐａ細胞は、この薬物の効果に対して耐性があり、成長優位性をそれらに提供する。低用量の経口ＭＭＦは有効（０．１〜５ｍｇ／ｋｇ  ＴＩＤ）であるが、患者によっては高用量（５〜１０ｍｇ／ｋｇ  ＴＩＤまたは１０００ｍｇ  ＢＩＤ）もまた許容されてよい。一般的なガイドラインとしては、０．４〜２μＭの遊離ミコフェノール酸（ＭＰＡ）の血液濃度が所望されている。ＭＭＦは、向上した酵素活性が所望される継続時間の間投与されてよく、用量を設定してその活性を設定してよい。ＭＭＦはまた、ＭＰＡ製剤（Ｍｙｆｏｒｔｉｃ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、または承認済ジェネリック）に替えられてもよい。
【０１１４】
各刊行物、特許および本開示に記載の特許公開は、本明細書に参照によりその全体が組み入れられている。本発明は前述の実施例を制限しようとするものではないが、添付の特許請求の範囲の範囲内にあるようなかかる修飾および変更を包含する。
【０１１５】
本出願はコンピュータにて読み取り可能な形式で同時提出されている配列表を含む。この配列表は本明細書に参照により組み入れられる。
【０１１６】
以下の配列は、図１３のプラスミドマップに対応する。
プラスミドおよびレンチウイルスベクターの遺伝的エレメント
ｆ１  ｏｒｉ：細菌におけるプラスミド複製の起点
Ａｍｐ（Ｒ）：アンピシリン耐性遺伝子（ベータ−ラクタマーゼ）
５’ＬＴＲ：ＨＩＶ１由来の５’長い末端反復：宿主ゲノムへの組込みに必要なウイルスエレメント
３’ＬＴＲ：宿主細胞内でのレトロ転写後、任意のウイルス複製のための能力を不活性化する１３３ｂｐ欠失を有する、ＨＩＶ１由来の３’長い末端反復
Ｐｓｉ配列：レトロウイルスＰｓｉパッケージングエレメント
５’Ｇａｇ（ｄｅｌ３ｒｄＧ）：プロウイルスのＲＮＡ転写のための第２世代レンチウイルス系にて必要とされるウイルスエレメント
ＲＲＥ：プロウイルスＲＮＡの核外輸送に必要なウイルスＲＥＶ応答エレメント
ｃＰＰＴ：中央ポリプリントラクト、ウイルスＲＮＡの核内への移入／排出を増強し、その結果、ウイルス力価と形質導入を増強するレンチウイルスエレメントである。
ＥＦ１ａ：ヒト伸長因子１アルファ遺伝子から誘導された、遍在性である常時発現プロモータ
ＷＰＲＥ：ウッドチャック肝炎の転写後制御エレメント、転写を強力に終結させ、かつｍＲＮＡを安定化させる。
ｈＰＧＫ：ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ１遺伝子から誘導された、遍在性である常時発現プロモータ
ＣＴＥおよびポリＡ：転写終結のためのＣ末端シグナル配列およびポリＡシグナル配列
ｃｏＩＭＰＤＨ２（ＩＹ）：ヒトイノシン−５’−一リン酸デヒドロゲナーゼ２のＴ３３３Ｉ、Ｓ３５１Ｙ突然変異体を発現する、コドン最適化導入遺伝子
ＡＧＡ／ＧＢＡ／ＡＳＡＨ１／ＧＡＡ：ヒトα−ガラクトシダーゼＡ、β−グルコセレブロシダーゼ、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドハイドロラーゼ１、または酸性α−グルコシダーゼをそれぞれコードしている、関心対象のコドン最適化導入遺伝子
配列
配列番号１（ＡＧＡ）
＞ｃｏ．ｈＡＧＡ
ＡＴＧＣＡＡＣＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＡＧＡＧＣＴＣＣＡＣＣＴＣＧＧＡＴＧＴＧＣＣＣＴＴＧＣＴＣＴＧＡＧＧＴＴＣＣＴＧＧＣＧＣＴＧＧＴＧＴＣＴＴＧＧＧＡＴＡＴＡＣＣＣＧＧＡＧＣＡＣＧＣＧＣＴＣＴＧＧＡＣＡＡＣＧＧＧＣＴＧＧＣＣＣＧＧＡＣＴＣＣＡＡＣＣＡＴＧＧＧＴＴＧＧＣＴＣＣＡＴＴＧＧＧＡＡＡＧＧＴＴＴＡＴＧＴＧＣＡＡＣＴＴＧＧＡＣＴＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＧＡＣＴＣＣＴＧＴＡＴＴＴＣＣＧＡＧＡＡＡＣＴＣＴＴＣＡＴＧＧＡＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＣＴＧＡＴＧＧＴＴＡＧＣＧＡＡＧＧＣＴＧＧＡＡＧＧＡＴＧＣＣＧＧＴＴＡＴＧＡＡＴＡＣＴＴＧＴＧＴＡＴＣＧＡＣＧＡＴＴＧＴＴＧＧＡＴＧＧＣＴＣＣＣＣＡＧＣＧＧＧＡＣＡＧＴＧＡＡＧＧＡＣＧＡＣＴＣＣＡＧＧＣＡＧＡＴＣＣＧＣＡＡＣＧＧＴＴＣＣＣＴＣＡＴＧＧＣＡＴＡＣＧＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＡＡＴＴＡＣＧＴＧＣＡＣＡＧＣＡＡＧＧＧＴＴＴＧＡＡＧＣＴＧＧＧＧＡＴＡＴＡＴＧＣＴＧＡＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＡＡＡＡＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴＴＴＣＣＣＣＧＧＣＡＧＣＴＴＣＧＧＣＴＡＣＴＡＴＧＡＴＡＴＡＧＡＴＧＣＡＣＡＡＡＣＣＴＴＣＧＣＴＧＡＴＴＧＧＧＧＣＧＴＧＧＡＣＣＴＧＣＴＴＡＡＡＴＴＴＧＡＣＧＧＣＴＧＴＴＡＣＴＧＣＧＡＣＡＧＣＴＴＧＧＡＡＡＡＣＣＴＣＧＣＣＧＡＴＧＧＡＴＡＴＡＡＡＣＡＣＡＴＧＡＧＣＣＴＴＧＣＡＣＴＣＡＡＴＣＧＧＡＣＴＧＧＣＣＧＧＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴＡＣＴＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧＧＣＣＡＴＴＧＴＡＣＡＴＧＴＧＧＣＣＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＣＣＴＡＡＣＴＡＴＡＣＧＧＡＧＡＴＴＡＧＡＣＡＧＴＡＴＴＧＴＡＡＴＣＡＣＴＧＧＡＧＡＡＡＣＴＴＴＧＣＡＧＡＴＡＴＣＧＡＣＧＡＣＴＣＡＴＧＧＡＡＧＴＣＣＡＴＣＡＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＴＴＣＡＴＴＣＡＡＴＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＴＣＧＴＣＧＡＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＣＣＡＧＧＴＧＧＡＴＧＧＡＡＣＧＡＣＣＣＴＧＡＣＡＴＧＣＴＣＧＴＡＡＴＴＧＧＧＡＡＴＴＴＣＧＧＡＣＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＴＣＡＧＣＡＧＧＴＣＡＣＡＣＡＧＡＴＧＧＣＴＴＴＧＴＧＧＧＣＴＡＴＣＡＴＧＧＣＡＧＣＣＣＣＡＣＴＣＴＴＴＡＴＧＴＣＴＡＡＣＧＡＴＴＴＧＣＧＧＣＡＴＡＴＴＴＣＡＣＣＡＣＡＧＧＣＣＡＡＡＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＡＡＧＡＴＡＡＧＧＡＣＧＴＣＡＴＡＧＣＧＡＴＴＡＡＣＣＡＧＧＡＣＣＣＡＣＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＧＧＧＣＴＡＣＣＡＧＣＴＧＡＧＡＣＡＧＧＧＣＧＡＣＡＡＴＴＴＴＧＡＧＧＴＣＴＧＧＧＡＡＡＧＡＣＣＴＣＴＴＡＧＣＧＧＧＣＴＧＧＣＧＴＧＧＧＣＣＧＴＡＧＣＣＡＴＧＡＴＴＡＡＴＣＧＣＣＡＧＧＡＡＡＴＴＧＧＣＧＧＣＣＣＴＣＧＣＴＣＴＴＡＣＡＣＴＡＴＣＧＣＧＧＴＣＧＣＣＡＧＴＣＴＧＧＧＣＡＡＧＧＧＡＧＴＣＧＣＴＴＧＴＡＡＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡＴＡＡＣＴＣＡＧＴＴＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＡＡＡＣＧＧＡＡＧＣＴＧＧＧＣＴＴＣＴＡＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＣＡＧＴＣＡＴＡＴＴＡＡＴＣＣＧＡＣＴＧＧＴＡＣＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴＧＴＣＡＣＴＴＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＴＧＴＧＡ
配列番号２
＞ｐＤＹ  ｃｏ．ｈＡＧＡ
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配列番号３
＞ｐＤＹ  ＡＧＡ＋（ＩＹ）（配列番号３）
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配列番号４
ゴーシェ病
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配列番号５
ファーバー病
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配列番号６
ポンペ病（ＧＡＡをコードしているベクター）
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配列番号７  ＧＢＡ導入遺伝子
＞ｃｏ．ｈＧＢＡ
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配列番号８  ＡＳＡＨ１導入遺伝子
＞ｈＡＳＡＨ１
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配列番号９（ＧＡＡ導入遺伝子）
＞ｃｏ．ｈＧＡＡ
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配列番号１０（デュアルプロモータベクター）
＞ｐＤＹ−ＤＰ
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配列番号１１
＞ｐＤＹ−［ＭＣＳ］＋（ＩＹ）
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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