(57)【要約】  本発明は、炎症の予防、抑制、緩和、改善、又は治療に使用される幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤及びそれを有効成分として含む抗炎組成物を提供する。本発明の幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤又はそれを有効成分として含む抗炎組成物は、幹細胞由来のエキソソームを安定化させるとともに抗炎効果に優れており、特に幹細胞の培養液から分離・精製された幹細胞由来のエキソソームに比べてはるかに優れた抗炎効能を示す。したがって、本発明の幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤又はそれを有効成分として含む抗炎組成物は、炎症反応ないしは炎症性疾患を効果的に予防、抑制、緩和、改善、又は治療するために使用することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞由来のエキソソームと、
メチオニン、マンニトール、及びトレハロースとを有効成分として含む、炎症の予防、抑制、緩和、改善、又は治療のための幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤。
【請求項２】
アスコルビン酸及びレチノールをさらに含有する、請求項１に記載の幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤。
【請求項３】
幹細胞由来のエキソソームと、メチオニン、マンニトール、及びトレハロースとを有効成分として含む凍結乾燥製剤と、
希釈剤とを含む、抗炎組成物。
【請求項４】
前記希釈剤は、注射用水、生理的食塩水、リン酸緩衝溶液、精製水、又は脱イオン水であることを特徴とする、請求項３に記載の抗炎組成物。
【請求項５】
前記希釈剤は、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸塩をさらに含む、請求項４に記載の抗炎組成物。
【請求項６】
懸濁液である、請求項３〜５のいずれか一項に記載の抗炎組成物。
【請求項７】
マイクロニードリング、イオントフォレシス又は注射によって投与される、請求項３〜５のいずれか一項に記載の抗炎組成物。
【請求項８】
薬学組成物、化粧料組成物、又は皮膚外用剤である、請求項３〜５のいずれか一項に記載の抗炎組成物。
【請求項９】
注射剤であることを特徴とする、請求項８に記載の抗炎組成物。
【請求項１０】
（ａ）請求項３〜５のいずれか一項に記載の抗炎組成物を準備するステップと、（ｂ）前記抗炎組成物を炎症性疾患の部位に処理するステップとを含む、炎症性疾患を予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法。
【請求項１１】
前記抗炎組成物は、マイクロニードリング、イオントフォレシス又は注射によって皮膚に投与される、請求項１０に記載の炎症性疾患を予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法。
【請求項１２】
（ｃ）前記抗炎組成物が処理された哺乳動物の皮膚に微細電流を流すイオントフォレシス（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行うステップと、（ｂ）前記微細電流により前記抗炎組成物を哺乳動物の皮膚内部に伝達するステップとをさらに含む、請求項１０に記載の炎症性疾患を予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法。
【請求項１３】
前記抗炎組成物は、パッチ、マスクパック、シートマスク、クリーム、トニック、軟膏、懸濁液、乳濁液、ペースト、ローション、ゲル、オイル、パック、スプレー、エアゾール、ミスト、ファンデーション、パウダー、及び油紙から構成された群から選ばれた少なくとも１種の形態に適用することを特徴とする、請求項１２に記載の炎症性疾患を予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法。
【請求項１４】
前記抗炎組成物は、マスクパック、シートマスク又はパッチの少なくとも一面に塗布又は浸漬される、請求項１３に記載の炎症性疾患を予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法。
【請求項１５】
前記（ｂ）ステップは、（ｂ１）前記抗炎組成物を前記哺乳動物の皮膚に直接塗布すること、（ｂ２）前記抗炎組成物が塗布又は浸漬されたマスクパック、シートマスク又はパッチを前記哺乳動物の皮膚に接触又は付着すること、若しくは前記（ｂ１）及び（ｂ２）を順次進行することによって行われる、請求項１４に記載の炎症性疾患を予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法。
【請求項１６】
前記（ｃ）ステップは、イオントフォレシスデバイスを前記哺乳動物の皮膚に接触又は付着させて行われる、請求項１５に記載の炎症性疾患を予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法。
【請求項１７】
前記イオントフォレシスデバイスは、可撓性電池、リチウムイオン二次電池、アルカリ電池、乾電池、水銀電池、リチウム電池、ニッケルカドミウム電池、及び逆電気透析電池から構成された群から選ばれた少なくとも１種の電池を含む、請求項１６に記載の炎症性疾患を予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症の予防、抑制、緩和、改善、又は治療に用いられる幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤及びそれを有効成分として含む抗炎組成物に関する。
【０００２】
また、本発明は、前記抗炎組成物を用いて、炎症性疾患を予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
炎症は、物理的又は化学的外傷、細菌、真菌又はウイルスによる感染、各種アレルギー誘発物質などによって引き起こされる病理的状態に対応して表われる生体の防御反応である。炎症反応は、先天性免疫反応の一環として表われる。炎症反応には、様々な物質及び生理・化学的現象が関与するが、最近の研究によると、様々な炎症性サイトカインが炎症反応において重要な役割をすることが明らかになった。炎症反応に関与する主要なサイトカインとしては、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−βなどがあり、これらの発現量及び分泌量の増加と活性化は、炎症媒介物質の分泌、免疫細胞の浸潤、細胞の移動及び組織の破壊などの一連の複合的な生理的反応と紅斑、浮腫、発熱及び痛みなどの症状と関連がある。
【０００４】
一般的に、炎症反応は感染源を除去し、損傷した組織を再生すれば、大きな問題にはならず、疾患部位が正常に回復されるが、感染源が除去されなかったり、内部物質が原因となって炎症反応が過度又は持続的に起きれば、急性・慢性炎症性疾患を誘発するようになる。
【０００５】
炎症反応やそれによる炎症性疾患の緩和ないしは治療のために非ステロイド系抗炎剤、ステロイド系抗炎剤、神経ペプチド拮抗剤、ＣＯＸ阻害剤、抗ヒスタミン剤、及びシクロスポリンＡのような免疫抑制剤を使用するが、皮膚萎縮、血管拡張、色素脱失、過敏反応、耐性及び好中球減少症（ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ）などの副作用を起こす問題がある。また、これらの薬剤は、根本的な治療ではなく、症状を適切なレベルに調節するのを助けるという限界もある。
【０００６】
最近では、天然物を利用した炎症性疾患治療剤や機能性化粧品の開発に対する研究が活発である。このような天然物を原料とする炎症性疾患治療剤や機能性化粧品の場合、天然抽出物中の有効成分の含有量が少ない関係で抗炎効果を得るためには、大量の使用が必要であり、これらの大部分は、天然物素材という点をマーケティングに活用しているだけであり、実質的な抗炎効能については、科学的な研究がもっと必要な状況である。
【０００７】
一方、最近、細胞分泌物（ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）に細胞の行動（ｂｅｈａｖｉｏｒ）を調節する様々な生体活性因子が含まれているという研究が報告されており、特に細胞分泌物内には細胞間シグナル伝達機能を有する「エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）」が含まれており、その成分と機能に対する研究が活発に進められている。
【０００８】
細胞は、細胞外環境に様々な膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）タイプの小胞体を放出するが、通常、このような放出小胞体を細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ、ＥＶｓ）と呼んでいる。細胞外小胞は、細胞膜由来小胞体、エクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅｓ）、シェディング小胞体（ｓｈｅｄｄｉｎｇ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）、マイクロパーティクル（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、エキソソーム等と呼ばれており、場合によっては、エキソソームとは区別されて用いられることもある。
【０００９】
エキソソームは細胞膜の構造と同じ二重リン脂質膜からなる数十ないし数百ナノメートルの大きさの小胞体で内部にはエキソソームカーゴ（ｃａｒｇｏ）と呼ばれるタンパク質、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）などが含まれている。エキソソームカーゴには、広範囲のシグナル伝達要素（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ）が含まれており、これらのシグナル伝達要素は、細胞タイプに特異的で分泌細胞の環境に応じて異なるように調節されることが知られている。エキソソームは細胞が分泌する細胞間のシグナル伝達媒体で、これにより伝達された様々な細胞シグナルは、標的細胞の活性化、成長、移動、分化、脱分化、死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）、壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）を含む細胞の行動を調節すると知られている。エキソソームは由来した細胞の性質及び状態に応じて特異的な遺伝物質と生体活性因子が含まれている。増殖する幹細胞由来のエキソソームの場合、細胞の移動、増殖及び分化のような細胞行動を調節し、組織再生に関する幹細胞の特性が反映されている（非特許文献１）。
【００１０】
つまり、細胞のアバターと呼ばれるエキソソームは、細胞と同様に成長因子のような生体活性因子が含まれているが、エキソソームを室温で保管する場合、生体活性因子の活性が低下する安定性の問題が発生する。また、エキソソームを単純冷蔵保管する場合にも保管時間及び方法などにより、全体的なエキソソームの物性及び安定性に変化が生じ、エキソソームに含まれる生体活性因子の活性も低下することがある。
【００１１】
しかし、エキソソームを利用した特定の疾患の治療に対する可能性提示など、様々な研究が行われているにもかかわらず、エキソソームを安定的に維持・保管することができる新たな剤形の開発とエキソソームの使用便宜性及び効能の向上等のための医療ないしは美容技術との融合は相対的に注目されていない。
【００１２】
本発明者らは、幹細胞由来のエキソソームを安定的に維持・保管することができる新たな剤形の開発と医療ないしは美容技術との融合について鋭意研究を重ねていたところ、幹細胞由来のエキソソームを安定化させるとともに抗炎効果に優れた幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤及びそれを含む抗炎組成物を開発して、本発明を完成した。
【００１３】
一方、前記した背景技術として説明された事項は、あくまで本発明の背景に対する理解を進めるためのものであり、本発明の「先行技術」として利用されうるという承認として引用したものではないことを理解すべきである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００２（２）５６９−５７９
【非特許文献２】Ｖａｓｉｌｉｙ  Ｓ．  Ｃｈｅｒｎｙｓｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｓｈａｐｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｄｒａｔｅｄ  ａｎｄ  ｄｅｓｉｃｃａｔｅｄ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ”，Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，  （２０１５）  ＤＯＩ  １０．１００７／ｓ００２１６−０１５−８５３５−３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、炎症の予防、抑制、緩和、改善、又は治療に用いられる幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤及びそれを有効成分として含む抗炎組成物を提供することにある。
【００１６】
本発明の他の目的は、前記抗炎組成物を含む抗炎症薬学組成物、機能性化粧料組成物及び皮膚外用剤を提供することにある。
【００１７】
本発明のもう一つの目的は、前記抗炎組成物を用いて、炎症性疾患を予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法を提供することにある。
【００１８】
しかし、前述したような本発明の課題は例示的なものであり、これにより本発明の範囲が制限されるものではない。また、本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面によってより明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、炎症の予防、抑制、緩和、改善、又は治療に用いられる幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤及びそれを有効成分として含む抗炎組成物を提供する。
【００２０】
本明細書において、用語「エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅｓ）」は、細胞膜の構造と同じ二重リン脂質膜からなる数十ないし数百ナノメートル（好ましくは約３０〜２００ｎｍ）サイズの小胞体を意味する（ただし、分離対象となる細胞の種類、分離方法及び測定方法に従って、エキソソームの粒子サイズは可変でありうる）（非特許文献２）。エキソソームにはエキソソームカーゴ（ｃａｒｇｏ）と呼ばれるタンパク質、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）等が含まれている。エキソソームカーゴには広範囲のシグナル伝達要素（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ）が含まれており、これらのシグナル伝達要素は、細胞タイプに特異的で分泌細胞の環境に応じて異なるように調節されることが知られている。エキソソームは細胞が分泌する細胞間のシグナル伝達媒体であり、これにより伝達された様々な細胞シグナルは、標的細胞の活性化、成長、移動、分化、脱分化、死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）、壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）を含む細胞の行動を調節すると知られている。
【００２１】
一方、本明細書で使用される「エキソソーム」という用語は、幹細胞から分泌され、細胞外空間に放出されたナノサイズのベシクル構造を有しており、エキソソームと類似の組成を有するベシクル（例えば、エキソソーム様ベシクル）もすべて含むことを意味する。前記幹細胞の種類は限定されないが、本発明を限定しない一つの例として、好ましくは、間葉系幹細胞、例えば脂肪、骨髄、臍帯又は臍帯血由来の幹細胞であってもよく、より好ましくは、脂肪由来幹細胞であってもよい。前記脂肪由来幹細胞の種類は、病原体による感染の危険性がなく、免疫拒否反応を起こさないものであれば制限されないが、好ましくはヒト脂肪由来幹細胞であってもよい。
【００２２】
しかし、本発明で用いられる幹細胞由来のエキソソームは、抗炎効果があり、人体に不利な作用を起こさないものであれば、当業界で使用されているか、今後使用されうる様々な幹細胞由来のエキソソームを使用できることは言うまでもない。したがって、後述する実施例の分離方法によって分離された幹細胞由来のエキソソームは、本発明で使用することができるエキソソームの一例として理解されるべきであり、本発明はこれに限定されるものではないことを明らかにしておく。
【００２３】
本明細書において、用語「イオントフォレシス（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）」は、有効物質が適用された皮膚に微細電流を流して電位差を与え、皮膚の電気的環境を変化させることによりイオン化した有効成分を電気的反発力で皮膚を透過させる方法を意味する。本発明の一具体例に用いられるイオントフォレシス（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）は、皮膚上の電極パッチに外部電源からの電流が流れ込み、皮膚に微細電流が導入される方式、電極パッチ自体にバッテリーが装着されて、皮膚に微細電流が導入される方式、高濃度電解質溶液及び低濃度電解質溶液との間のイオン濃度差により電流を発生させる逆電気透析（Ｒｅｖｅｒｓｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ）手段が装着されたパッチを介して皮膚に微細電流が導入される方式などを含んでもよい。しかし、本発明はこれに限定されるものではなく、様々な方式のイオントフォレシスを用いることができるのは言うまでもない。
【００２４】
本発明の抗炎組成物は、炎症性疾患を予防、抑制、緩和、改善、又は治療するために使用され、炎症性疾患としては、本発明を限定しない一つの例として、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、湿疹、細菌感染、ウイルス感染又は真菌感染による炎症、火傷、火傷による炎症、傷、傷による炎症、潰瘍性大腸炎、関節炎、リウマチ性関節炎、肝炎、腎炎などが挙げられるが、これに制限されるものではない。
【００２５】
本発明の一具体例の炎症の予防、抑制、緩和、改善、又は治療のための幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤は、幹細胞由来のエキソソームと、メチオニン、マンニトール、及びトレハロースとを有効成分として含む。例えば、メチオニン、マンニトール、及びトレハロースの重量比は、１：１：１である。
【００２６】
本発明の一具体例の幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤は、アスコルビン酸及びレチノールをさらに含有してもよい。例えば、メチオニン、マンニトール、トレハロース、アスコルビン酸及びレチノールの重量比は、９：９：９：０．５：０．５である。
【００２７】
本発明の一具体例の抗炎組成物は、前記幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤と希釈剤を含む。例えば、前記希釈剤は、注射用水、生理的食塩水、リン酸緩衝溶液、精製水、又は脱イオン水であってもよい。また、前記希釈剤は、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸塩（例えば、ヒアルロン酸ナトリウム）をさらに含むことができる。一例として、前記抗炎組成物は懸濁液であってもよい。
【００２８】
本発明の一具体例の抗炎組成物は、マイクロニードリング、イオントフォレシス又は注射によって投与することができる。
【００２９】
本発明の一具体例の抗炎組成物は、抗炎症薬学組成物、化粧料組成物又は皮膚外用剤であってもよい。例えば、前記抗炎組成物は、注射剤として製造することができる。
【００３０】
本発明の一具体例の抗炎組成物が薬学組成物として使用される場合、薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤などを含むことができる。前記担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、トレハロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース（ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱物油などを挙げることができ、これに限定されない。また、本発明の一具体例の薬学組成物の有効量は、抗炎効果を期待するために投与に要求される量を意味する。
【００３１】
本発明の一具体例の薬学組成物の配合比率は、前述のような追加成分の種類や量、形態などに応じて適当に選択することができる。例えば、注射剤全量に対して、本発明の薬学組成物は、約０．１〜９９重量％、好ましくは約１０〜９０重量％程度含まれてもよい。また、本発明の一具体例の薬学組成物の適切な投与量は、炎症疾患の種類、炎症の軽重、剤形の種類、製剤化方法、患者の年齢、性別、体重、健康状態、食餌、排泄率、投与時間及び投与方法によって調節することができる。例えば、成人に本発明の一具体例の薬学組成物を投与する場合、一日に０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの用量で１回〜数回に分けて投与することができる。
【００３２】
一方、本発明の一具体例の抗炎組成物が皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物として製造される場合、本発明の効果を損なわない範囲内で、通常、化粧品や皮膚外用剤に用いられる成分、例えば保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、乳化剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色材、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００３３】
また、本発明の一具体例の皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物は、幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤又はそれを含む抗炎組成物以外に、その作用（例えば、抗炎効果など）を損なわない限度で、従来から使用された抗炎剤及び／又は消炎剤をともに混合して使用することができる。例えば、本発明の幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤又はそれを含む抗炎組成物は、ハイドロゲル、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩（例えば、ヒアルロン酸ナトリウム等）、又はヒアルロン酸ゲルのうち少なくとも１種に担持又は混合されてもよい。本発明の一具体例の皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物において、前記ハイドロゲルの種類は限定されないが、ゲル化ポリマーを多価アルコールに分散させて得られたハイドロゲルであることが好ましい。前記ゲル化ポリマーは、プルロニック、精製寒天、アガロース、ゲランガム、アルギン酸、カラギーナン、カシアガム、キサンタンガム、ガラクトマンナン、グルコマンナン、ペクチン、セルロース、グアーガム、及びローカストビーンガムからなる群から選ばれた少なくとも１種であってもよく、前記多価アルコールは、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、イソブチレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトール、キシリトール、及びグリセリンからなる群から選ばれた少なくとも１種であってもよい。
【００３４】
本発明の一具体例の皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物は、例えば、パッチ、マスクパック、シートマスク、クリーム、トニック、軟膏、懸濁液、乳濁液、ペースト、ローション、ゲル、オイル、パック、スプレー、エアゾール、ミスト、ファンデーション、パウダー、油紙などの様々な形態に適用することができる。例えば、前記皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物は、パッチ、マスクパック又はシートマスクの少なくとも一面に塗布又は浸漬することができる。
【００３５】
本発明の一具体例の化粧料組成物は、炎症の予防、抑制、緩和、又は改善等を目的として使用され、化粧品剤形は、当業界で通常的に製造されるいかなる剤形でも製造することができる。例えばパッチ、マスクパック、シートマスク、柔軟化粧水、栄養化粧水、収斂化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、アイクリーム、クレンジングクリーム、エッセンス、アイエッセンス、クレンジングローション、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、サンスクリーン、口紅、石鹸、シャンプー、界面活性剤含有クレンジング、入浴剤、ボディローション、ボディクリーム、ボディオイル、ボディエッセンス、ボディ洗浄剤、染毛剤、ヘアトニックなどに剤形化することができるが、これに限定されるものではない。
【００３６】
本発明の一具体例の皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物は、皮膚外用剤及び／又は化粧品に通常的に用いられる成分を含み、例えば抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料、及び香料のような通常の補助剤そして担体を含むことができる。また、皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物に対するそれぞれの剤形において、他の成分は、皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物の種類又は使用目的などによって、当業者が困難なく、適宜選定して配合することができる。
【００３７】
また、本発明は、前記抗炎組成物を用いて、炎症性疾患を予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法を提供する。
【００３８】
本発明の一具体例の炎症性疾患を予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法は、（ａ）前記抗炎組成物を準備するステップと、（ｂ）前記抗炎組成物を炎症性疾患の部位に処理するステップとを含む。
【００３９】
本発明の一具体例の炎症性疾患を予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法において、前記抗炎組成物は、マイクロニードリング、イオントフォレシス又は注射によって哺乳動物の皮膚に投与することができる。
【００４０】
本発明の一具体例の炎症性疾患を予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法は、（ｃ）前記抗炎組成物が処理された哺乳動物の皮膚に微細電流を流すイオントフォレシスを行うステップと、（ｂ）前記微細電流により前記抗炎組成物を哺乳動物の皮膚内部に伝達するステップとをさらに含む。
【００４１】
本発明の一具体例の炎症性疾患を予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法において、前記抗炎組成物は、例えば、パッチ、マスクパック、シートマスク、クリーム、トニック、軟膏、懸濁液、乳濁液、ペースト、ローション、ゲル、オイル、パック、スプレー、エアゾール、ミスト、ファンデーション、パウダー、油紙などの様々な形態に適用することができる。例えば、前記抗炎組成物は、マスクパック、シートマスク又はパッチの少なくとも一面に塗布又は浸漬することができる。
【００４２】
本発明の一具体例の炎症性疾患を予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法において、前記（ｂ）ステップは、（ｂ１）前記抗炎組成物を前記哺乳動物の皮膚に直接塗布すること、（ｂ２）前記抗炎組成物が塗布又は浸漬されたマスクパック、シートマスク又はパッチを前記哺乳動物の皮膚に接触又は付着すること、若しくは前記（ｂ１）及び（ｂ２）を順次進行することによって行うことができる。
【００４３】
本発明の一具体例の炎症性疾患を予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法において、前記マスクパック、シートマスク又はパッチの少なくとも一面にはハイドロゲル、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩（例えば、ヒアルロン酸ナトリウム等）、又はヒアルロン酸ゲルのうちの少なくとも１種が塗布されてもよい。前記ハイドロゲルの種類は限定されないが、ゲル化ポリマーを多価アルコールに分散させて得られたハイドロゲルであることが好ましい。前記ゲル化ポリマー及び多価アルコールは、先の説明で例示されたものであってもよい。
【００４４】
本発明の一具体例の炎症性疾患を予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法において、前記（ｃ）ステップは、イオントフォレシスデバイスを前記哺乳動物の皮膚に接触又は付着させて行うことができる。
【００４５】
本発明の一具体例の炎症性疾患を予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法において、前記イオントフォレシスデバイスは、可撓性電池、リチウムイオン二次電池、アルカリ電池、乾電池、水銀電池、リチウム電池、ニッケルカドミウム電池、及び逆電気透析電池から構成された群から選ばれた少なくとも１種の電池を含むことができる。
【発明の効果】
【００４６】
本発明の幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤又はそれを有効成分として含む抗炎組成物は、幹細胞由来のエキソソームを安定化させるとともに抗炎効果に優れており、特に幹細胞培養液から分離・精製された幹細胞由来のエキソソームに比べてはるかに優れた抗炎効能を示す。
【００４７】
したがって、本発明の幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤又はそれを有効成分として含む抗炎組成物は、炎症反応ないしは炎症性疾患を効果的に予防、抑制、緩和、改善、又は治療するために使用することができる。
【００４８】
一方、前述のような効果によって、本発明の範囲が制限されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１Ａ】本発明の一具体例により得られた幹細胞由来のエキソソームの物理的特性の分析結果を示したものであり、ＮＴＡ（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｔｒａｃｋｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）により得られた粒子サイズ分布と粒子数を示す。
【図１Ｂ】本発明の一具体例により得られた幹細胞由来のエキソソームの物理的特性の分析結果を示したものであり、ＴＥＭ（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）により撮影された粒子イメージの写真である。
【図１Ｃ】本発明の一具体例により得られた幹細胞由来のエキソソームの物理的特性の分析結果を示したものであり、本発明の一具体例により得られた幹細胞由来のエキソソームのポジティブマーカーに対するウエスタンブロットの結果を示す。
【図１Ｄ】本発明の一具体例により得られた幹細胞由来のエキソソームの物理的特性の分析結果を示したものであり、本発明の一具体例により得られた幹細胞由来のエキソソームのネガティブマーカーに対するウエスタンブロットの結果を示す。
【図１Ｅ】本発明の一具体例により得られた幹細胞由来のエキソソームの物理的特性の分析結果を示したものであり、本発明の一具体例により得られた幹細胞由来のエキソソームに対するマーカー分析においてＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１のフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図２】ヒト皮膚繊維芽細胞であるＨＳ６８細胞に本発明の一具体例による幹細胞由来のエキソソームを処理した後、細胞毒性がないことを確認した結果を示す。
【図３】本発明の一具体例の方法により凍結乾燥されたエキソソームの良好な性状を示す写真である。
【図４Ａ】凍結乾燥保護剤の成分の組み合わせを異なるようにして凍結乾燥を行った後、凍結乾燥保護剤の成分の組み合わせ別に凍結乾燥エキソソームの性状を撮影した写真である。
【図４Ｂ】凍結乾燥保護剤の成分の組み合わせを異なるようにして凍結乾燥を行った後、凍結乾燥保護剤の成分の組み合わせ別に凍結乾燥エキソソームの性状を撮影した写真である。
【図４Ｃ】凍結乾燥保護剤の成分の組み合わせを異なるようにして凍結乾燥を行った後、凍結乾燥保護剤の成分の組み合わせ別に凍結乾燥エキソソームの性状を撮影した写真である。
【図４Ｄ】凍結乾燥保護剤の成分の組み合わせを異なるようにして凍結乾燥を行った後、凍結乾燥保護剤の成分の組み合わせ別に凍結乾燥エキソソームの性状を撮影した写真である。
【図４Ｅ】凍結乾燥保護剤の成分の組み合わせを異なるようにして凍結乾燥を行った後、凍結乾燥保護剤の成分の組み合わせ別に凍結乾燥エキソソームの性状を撮影した写真である。
【図４Ｆ】凍結乾燥保護剤の成分の組み合わせを異なるようにして凍結乾燥を行った後、凍結乾燥保護剤の成分の組み合わせ別に凍結乾燥エキソソームの性状を撮影した写真である。
【図４Ｇ】凍結乾燥保護剤の成分の組み合わせを異なるようにして凍結乾燥を行った後、凍結乾燥保護剤の成分の組み合わせ別に凍結乾燥エキソソームの性状を撮影した写真である。
【図５】マルチプレックスパネルを用いた炎症性サイトカインの分析結果を示したグラフであり、ＲＡＷ２６４．７細胞に対してＬＰＳとともに実施例２で準備された幹細胞由来のエキソソーム（幹細胞培養液から分離・精製したエキソソーム）を濃度別（ｍＬ当たりの粒子数基準）で処理した場合、ＬＰＳによって誘導されるＩＬ−１βの生成量がエキソソームの濃度依存的に減少することを示す。
【図６】マルチプレックスパネルを用いた炎症性サイトカインの分析結果を示したグラフであり、ＲＡＷ２６４．７細胞に対してＬＰＳとともに実施例２で準備された幹細胞由来のエキソソーム（幹細胞培養液から分離・精製したエキソソーム）を濃度別（ｍＬ当たりの粒子数基準）で処理した場合、ＬＰＳによって誘導されるＩＬ−６の生成量がエキソソームの濃度依存的に減少することを示す。
【図７】マルチプレックスパネルを用いた炎症性サイトカインの分析結果を示したグラフであり、ＲＡＷ２６４．７細胞に対してＬＰＳとともに実施例２で準備された幹細胞由来のエキソソーム（幹細胞培養液から分離・精製したエキソソーム）を濃度別（ｍＬ当たりの粒子数基準）で処理した場合、ＬＰＳによって誘導されるＩＬ−２７の生成量がエキソソームの濃度依存的に減少することを示す。
【図８】マルチプレックスパネルを用いた炎症性サイトカインの分析結果を示したグラフであり、ＲＡＷ２６４．７細胞に対してＬＰＳとともに実施例２で準備された幹細胞由来のエキソソーム（幹細胞培養液から分離・精製したエキソソーム）を濃度別（ｍＬ当たりの粒子数基準）で処理した場合、ＬＰＳによって誘導されるＩＦＮ−βの生成量がエキソソームの濃度依存的に減少することを示す。
【図９】マルチプレックスパネルを用いた炎症性サイトカインの分析結果を示したグラフであり、ＲＡＷ２６４．７細胞に対してＬＰＳとともに実施例５−１で準備された幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤を培養培地と混合して希釈した水溶液を濃度別（ｍＬ当たりの粒子数基準）で処理した場合、ＬＰＳによって誘導されるＩＬ−１βの生成量が凍結乾燥製剤の濃度依存的に顕著に減少することを示す。
【図１０】マルチプレックスパネルを用いた炎症性サイトカインの分析結果を示したグラフであり、ＲＡＷ２６４．７細胞に対してＬＰＳとともに実施例５−１で準備された幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤を培養培地と混合して希釈した水溶液を濃度別（ｍＬ当たりの粒子数基準）で処理した場合、ＬＰＳによって誘導されるＩＬ−６の生成量が凍結乾燥製剤の濃度依存的に顕著に減少することを示す。
【図１１】マルチプレックスパネルを用いた炎症性サイトカインの分析結果を示したグラフであり、ＲＡＷ２６４．７細胞に対してＬＰＳとともに実施例５−１で準備された幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤を培養培地と混合して希釈した水溶液を濃度別（ｍＬ当たりの粒子数基準）で処理した場合、ＬＰＳによって誘導されるＩＬ−２７の生成量が凍結乾燥製剤の濃度依存的に顕著に減少することを示す。
【図１２】マルチプレックスパネルを用いた炎症性サイトカインの分析結果を示したグラフであり、ＲＡＷ２６４．７細胞に対してＬＰＳとともに実施例５−１で準備された幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤を培養培地と混合して希釈した水溶液を濃度別（ｍＬ当たりの粒子数基準）で処理した場合、ＬＰＳによって誘導されるＩＦＮ−βの生成量が凍結乾燥製剤の濃度依存的に顕著に減少することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
以下、本発明を下記の実施例でより詳細に記述する。ただし、下記の実施例は、本発明の内容を例示するものに過ぎず、本発明の権利範囲を制限したり限定するものではない。本発明の詳細な説明及び実施例から、本発明が属する技術分野の通常の技術者が容易に類推できることは本発明の権利範囲に属するものと解釈される。本発明に引用された参考文献は、本発明に参考として統合される。
【００５１】
明細書全体で、ある部分がある構成要素を「含む」とするとき、これは特に反対となる記載がない限り、他の構成要素を除外するのではなく、他の構成要素をさらに含みうることを意味する。
【実施例】
【００５２】
＜実施例１：細胞の培養＞
ヒト皮膚繊維芽細胞（ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）であるＨＳ６８細胞はＡＴＣＣから購入し、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）及び１％抗生剤−抗真菌剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）が含有されたＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）培地に５％ＣＯ２、３７℃の条件で継代培養した。
【００５３】
当該発明の属する技術分野で公知の細胞培養方法により、５％ＣＯ２、３７℃の条件で脂肪由来幹細胞を培養した。次に、リン酸緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）で洗浄した後、無血清、無フェノールレッド培地に交換して、１日〜１０日間培養し、その上清（以下、培養液）を回収した。
【００５４】
エキソソームの分離過程で粒子サイズ分布が均一で純度の高いエキソソームを得るために培養液にトレハロースを２重量％添加した。トレハロースを添加した後、培養液を０．２２μｍフィルタでろ過して細胞残骸物、老廃物及び巨大粒子等の不純物を除去した。ろ過された培養液は、すぐに分離過程を経てエキソソームを分離した。また、ろ過された培養液は、冷蔵庫（１０℃以下）で保管した後、エキソソーム分離に使用した。また、ろ過された培養液は、−６０℃以下の超低温冷凍庫で凍結保管してから解凍した後、エキソソームの分離を行った。その後、培養液からタンジェント流ろ過装置（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ；ＴＦＦ）を用いて、エキソソームを分離した。
＜実施例２：ＴＦＦ法によるエキソソームの分離及び精製＞
実施例１で０．２２μｍフィルタでろ過された培養液からエキソソームを分離、濃縮、脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）をするためにＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）法を使用した。ＴＦＦ法のためのフィルタとしては、カートリッジフィルタ（ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  ｆｉｌｔｅｒ、別名ｈｏｌｌｏｗ  ｆｉｂｅｒ  ｆｉｌｔｅｒ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入）、又はカセットフィルタ（ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｆｉｌｔｅｒ；Ｐａｌｌ又はＳａｒｔｏｒｉｕｓ又はＭｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入）を使用した。ＴＦＦフィルタは、様々な分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔｏｆｆ；ＭＷＣＯ）によって選択されてもよい。選択されたＭＷＣＯによって選別的にエキソソームを分離、濃縮し、ＭＷＣＯよりも小さい粒子やタンパク質、脂質、核酸、低分子化合物等は除去した。
【００５５】
エキソソームを分離、濃縮するためにＭＷＣＯ  １００，０００Ｄａ（Ｄａｌｔｏｎ）、３００，０００Ｄａ、又は５００，０００ＤａのＴＦＦフィルタを使用した。培養液をＴＦＦ法を用いて１／１００〜１／２５程度の体積になるまで濃縮し、ＭＷＣＯよりも小さい物質は除去してエキソソームを分離した。
【００５６】
分離、濃縮されたエキソソーム溶液はＴＦＦ法を用いて、さらに脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を行った。このとき、脱塩とバッファー交換は連続的に実行（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）又は断続的に実行（ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）し、開始体積（ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｖｏｌｕｍｅ）に対して少なくとも４倍、好ましくは６倍〜１０倍以上、より好ましくは１２倍以上の体積を有する緩衝溶液を用いて行った。緩衝溶液には、粒子サイズ分布が均一で純度の高いエキソソームを得るためにＰＢＳに溶かした２重量％のトレハロースを添加した。
＜実施例３：分離されたエキソソームの特性の分析＞
分離されたエキソソームは、ナノ粒子トラッキング解析（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｔｒａｃｋｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ：ＮＴＡ；Ｍａｌｖｅｒｎから購入）によって粒子の大きさと濃度を測定した。分離されたエキソソームの均一性と大きさは、透過型電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＴＥＭ）を用いて分析した。本発明の一具体例の分離方法により分離されたエキソソームのＮＴＡ、ＴＥＭ分析の結果は、図１Ａ及び図１Ｂに示した。
【００５７】
図１Ｃは、本発明の一具体例の分離方法によって分離されたエキソソームのポジティブマーカーに対するウエスタンブロットを行った結果であり、ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１、Ａｌｉｘ及びＴＳＧ１０１マーカーの存在を確認した。各マーカーに対する抗体には、それぞれ抗ＣＤ６３、抗ＣＤ９、抗ＣＤ８１、抗Ａｌｉｘ及び抗ＴＳＧ１０１を使用した。
【００５８】
図１Ｄは、本発明の一具体例の分離方法によって分離されたエキソソームのネガティブマーカーに対するウエスタンブロットを行った結果である。各マーカーに対する抗体には、それぞれ抗ＧＭ１３０及び抗カルネキシン（Ｃａｌｎｅｘｉｎ）を使用した。ＧＭ１３０及びカルネキシン（Ｃａｌｎｅｘｉｎ）は、エキソソームの特性分析時にエキソソームに存在してはならないネガティブマーカーである。図１Ｄに示すように、ＧＭ１３０及びカルネキシン（Ｃａｌｎｅｘｉｎ）は、脂肪幹細胞の破砕物には存在することが確認されたが、本発明の一具体例の分離方法によって分離されたエキソソームには存在しないことが確認された。したがって、図１Ｃ及び図１Ｄの結果を総合すると、本発明の一具体例の分離方法によって分離されたエキソソームは、ポジティブマーカー及びネガティブマーカーの特性分析を満足するエキソソームであることがわかる。
【００５９】
図１Ｅは、本発明の一具体例の分離方法によって分離されたエキソソームに対してフローサイトメトリーを用いて分析した結果としてＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１マーカーの存在を確認した。ＣＤ８１に対して陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）であるエキソソームを分離するためにエキソソームヒューマンＣＤ８１分離／検出キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）をメーカーの方法に従って使用し、ＰＥ―マウス抗ヒトＣＤ９（ＰＥ−Ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ９）（ＢＤから購入）、ＰＥ―マウス抗ヒトＣＤ６３（ＰＥ−ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ６３）（ＢＤから購入）及びＰＥ―マウス抗ヒトＣＤ８１（ＰＥ−ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ８１）（ＢＤから購入）を使用してマーカーを染色した後、フローサイトメトリー（ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
＜実施例４：エキソソーム処理による細胞毒性の測定＞
ヒト皮膚繊維芽細胞であるＨＳ６８細胞で本発明の一具体例の分離方法によって得られたエキソソームの毒性を評価するために、細胞に濃度別にエキソソームを処理し、細胞の増殖率を確認した。ＨＳ６８細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに懸濁させた後、８０〜９０％の密集度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）を有するように分株し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。２４時間後、培養液を除去し、実施例２で準備されたエキソソームを濃度別に処理して、２４〜７２時間培養しながら細胞生存率を評価した。細胞生存率をＷＳＴ−１試薬（ＷＳＴ−１  ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｔａｋａｒａから購入）、ＭＴＴ試薬（Ｓｉｇｍａから購入）、セルタイターグロ試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｐｒｏｍｅｇａから購入）、又はアラマールブルー試薬（ａｌａｍａｒＢｌｕｅ  ｒｅａｇｅｎｔ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）とマイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓから購入）を用いて測定した。
【００６０】
比較群はエキソソームが処理されていない一般の細胞培養培地で培養された細胞数を基準にしており、試験された濃度範囲内で、本発明のエキソソームによる細胞毒性が示されないことを確認した（図２）。
＜実施例５：エキソソームの凍結乾燥＞
＜実施例５−１：凍結乾燥条件＞
エキソソームの凍結乾燥のためにメチオニン、マンニトール、及びトレハロースを含む凍結乾燥保護剤を準備した。アスコルビン酸及びレチノールをそれぞれ０．５ｍｇ／ｍＬで含有している１ｍＬの水溶液［（株）バイオエフディエンシー（大韓民国全羅南道和順郡所在）で外注製作］に前記凍結乾燥保護剤を添加した水溶液を準備した。本実施例では、凍結乾燥保護剤をアスコルビン酸及びレチノールを含有している溶液に添加したが、注射用水、精製水、生理的食塩水、又は脱イオン水に凍結乾燥保護剤を添加して水溶液を準備することもできる。前記水溶液中のメチオニン、マンニトール、及びトレハロースの濃度は、それぞれ９ｍｇ／ｍＬになるようにした。
【００６１】
凍結乾燥保護剤を含有した水溶液に、実施例２で準備されたエキソソーム（５×１０８粒子）を混合した後、凍結乾燥装置（メーカー：ＶＩＲＴＩＳ、ＩＴＥＭ  Ｎｏ．：３４４４２４）を用いて、下記の表１の条件で凍結乾燥を行った。凍結乾燥は、下記の表１の条件１、２、３、４、５、６、７、及び８の順で行った。
【００６２】
【表１】
2021526155.tif 000003
【００６３】
メチオニン、マンニトール、及びトレハロースを含む凍結乾燥保護剤を処理してエキソソームを凍結乾燥した後、性状を確認した結果、色は乳白色であり、多孔性のスポンジ形状を維持する良好な性状を示すことが確認できた（図３）。すなわち、本発明のエキソソームの凍結乾燥方法では、減圧下での乾燥時間を長くして、凍結乾燥保護剤をメチオニン、マンニトール、及びトレハロースの組み合わせで構成することにより、優れた性状を示す凍結乾燥製品を得ることができた。
＜実施例５−２：凍結乾燥保護剤の成分による凍結乾燥エキソソームの性状比較＞
一方、メチオニン、マンニトール、及びトレハロース（以下、凍結乾燥保護剤成分という）のうちの少なくとも１種を含む、様々な凍結乾燥保護剤を使用してエキソソームを凍結乾燥した場合のエキソソームの性状を比較した。前記実施例５−１に記載された方法により凍結乾燥保護剤成分単独、２つの成分の組み合わせ、又は３つの成分の組み合わせを添加した７種類の水溶液を準備した。前記水溶液中で、各凍結乾燥保護剤成分の濃度は、９ｍｇ／ｍＬになるようにした。前記実施例５−１の凍結乾燥条件及び方法により、凍結乾燥保護剤成分の各組み合わせが含有された水溶液に、実施例２で準備されたエキソソーム（５×１０８粒子）を混合した後、凍結乾燥を行った。
【００６４】
凍結乾燥されたエキソソーム製品に対する外形性状を撮影して評価した（図４Ａ〜図４Ｇ）。凍結乾燥されたエキソソーム製品のケーキ形状の良し悪しにより最も良いものは５点とし、最も悪いものは１点として外形性状を相対評価した。凍結乾燥保護剤成分の組み合わせ別に、凍結乾燥エキソソーム製品の性状を評価した結果を下記の表２に示す。
【００６５】
【表２】
2021526155.tif 000004
【００６６】
図４Ａ〜図４Ｇ及び前記表２で確認されるように、本発明のメチオニン、マンニトール、及びトレハロースの組み合わせで構成された凍結乾燥保護剤を使用してエキソソームを凍結乾燥した場合が、製品の外形性状が最も良好であり、前記３つの成分のうち１つ又は２つの成分が抜けた組み合わせで凍結乾燥したエキソソームは、製品の外形性状が本発明の場合よりも良くないことがわかった。
＜実施例６：炎症性サイトカインの生成減少効果の確認＞
マウスマクロファージ細胞株であるＲＡＷ２６４．７細胞で実施例２の幹細胞由来のエキソソームと実施例５−１の幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤の炎症性サイトカインの生成減少効果を次のように確認した。
【００６７】
ＲＡＷ２６４．７細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンが添加されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）培地に懸濁させた後、９６ウェルプレートに２．５×１０４細胞／ウェルの密度で接種し、実施例２で準備された幹細胞由来のエキソソーム（幹細胞培養液から分離・精製されたエキソソーム）を濃度別（ｍＬ当たりの粒子数基準）で処理した後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。また、前述した幹細胞由来のエキソソーム処理方式と同じように、ＲＡＷ２６４．７細胞に実施例５−１の幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤（５×１０９粒子／ｖｉａｌ）を培養培地と混合して希釈した水溶液（本発明の一具体例の抗炎組成物）を濃度別（ｍＬ当たりの粒子数基準）で処理した後、処理されたＲＡＷ２６４．７細胞を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。一方、陽性対照群の物質としては、デキサメタゾンを使用した（図５〜図１２にＤＥＸと表記される）。
【００６８】
そして、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａから購入）を処理し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養してＲＡＷ２６４．７細胞の活性化を誘導した。
【００６９】
培養が終わったＲＡＷ２６４．７細胞の培養上清（Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を回収し、培養上清中のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−２７及びＩＦＮ−βの生成量をＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘＴＭビードベースの免疫測定法（ｂｅａｄ−ｂａｓｅｄ  ｉｍｍｎｎｏａｓｓａｙ）マウス炎症パネル（ｍｏｕｓｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｐａｎｅｌ）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入）及びノボサイトフローサイトメーター（ＮｏｖｏＣｙｔｅ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）（ＡＣＥＡから購入）を用いて測定して、抗炎効果を確認した。
【００７０】
また、幹細胞由来のエキソソームと、本発明の一具体例の抗炎組成物による細胞生存率の変化の測定と、それによるサイトカイン生成量補正のためにＭＴＴアッセイを行った。培養が終わったＲＡＷ２６４．７細胞の培養培地を０．５ｍｇ／ｍＬのチアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（Ｔｈｉａｚｏｌｙｌ  Ｂｌｕｅ  Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ）（Ｓｉｇｍａから購入）を含むＤＭＥＭ培地に交換し、１時間培養した。その後、細胞培養プレートの底に形成されたホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）が散らばらないように上清を除去し、ジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）（ＡＭＲＥＳＣＯから購入）に溶解させた後、５７０ｎｍで吸光度を測定して、細胞生存率を確認した。そして、それぞれのサイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−２７及びＩＦＮ−β）の生成量を細胞生存率に補正した。
【００７１】
図５〜図８に示すように、マルチプレックスパネルを用いた炎症性サイトカイン分析の結果、ＲＡＷ２６４．７細胞に対してＬＰＳとともに幹細胞由来のエキソソームを処理した場合、ＬＰＳによって誘導されるＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−２７及びＩＦＮ−βの生成量が、幹細胞由来のエキソソームの濃度依存的に減少することが確認できた。また、図９〜図１２に示されたように、マルチプレックスパネルを用いた炎症性サイトカイン分析の結果、ＲＡＷ２６４．７細胞に対してＬＰＳとともに、本発明の一具体例の抗炎組成物を処理した場合にも、ＬＰＳによって誘導されるＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−２７及びＩＦＮ−βの生成量が、抗炎組成物の濃度依存的に著しく減少することが確認できた。
【００７２】
このような結果から、本発明の一具体例の抗炎組成物は、有効成分として含有している幹細胞由来のエキソソームの抗炎効能を安定して維持しており、凍結乾燥、保管及び流通過程で幹細胞由来のエキソソームの物性変化がないことがわかる。特に、幹細胞由来のエキソソームの抗炎効能（図５〜図８）と、本発明の一具体例の抗炎組成物の抗炎効能（図９〜図１２）を比較すると、幹細胞由来のエキソソームは２．０×１０９粒子数／ｍＬの濃度で前記４種の炎症性サイトカインの生成を抑制できないか、又は約４０％程度のみ抑制するものの、本発明の一具体例の抗炎組成物は、同様の濃度である２．５×１０９粒子数／ｍＬの濃度で、前記４種の炎症性サイトカインの生成を約９０％以上抑制することが確認できた。したがって、本発明の抗炎組成物は、幹細胞由来のエキソソームを商業的に利用可能なように安定化させるとともに幹細胞由来のエキソソームよりもはるかに優れた抗炎効能を示し、炎症性疾患を予防、抑制、緩和、改善、又は治療するにおいて有用に使用することができる。
【００７３】
以上、本発明を前記実施例を挙げて説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者であれば、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく修正、変更をすることができ、このような修正と変更も本発明に属するものであることがわかるであろう。
【図１Ａ】
2021526155.tif 000005
【図１Ｂ】
2021526155.tif 000006
【図１Ｃ】
2021526155.tif 000007
【図１Ｄ】
2021526155.tif 000008
【図１Ｅ】
2021526155.tif 000009
【図２】
2021526155.tif 000010
【図３】
2021526155.tif 000011
【図４ａ】
2021526155.tif 000012
【図４ｂ】
2021526155.tif 000013
【図４ｃ】
2021526155.tif 000014
【図４ｄ】
2021526155.tif 000015
【図４ｅ】
2021526155.tif 000016
【図４ｆ】
2021526155.tif 000017
【図４ｇ】
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【図５】
2021526155.tif 000019
【図６】
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【図７】
2021526155.tif 000021
【図８】
2021526155.tif 000022
【図９】
2021526155.tif 000023
【図１０】
2021526155.tif 000024
【図１１】
2021526155.tif 000025
【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年5月19日(2020.5.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ１）二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞である幹細胞由来のエキソソームと、
（Ａ２）凍結乾燥保護剤であるメチオニン、マンニトール、及びトレハロースの組み合わせとを有効成分として含む、炎症の予防、抑制、緩和、改善、又は治療のための幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤。
【請求項２】
アスコルビン酸及びレチノールをさらに含有する、請求項１に記載の幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤。
【請求項３】
（Ａ１）二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞である幹細胞由来のエキソソームと、
（Ａ２）凍結乾燥保護剤であるメチオニン、マンニトール、及びトレハロースの組み合わせとを有効成分として含む幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤と、
（Ｂ）希釈剤とを含む、抗炎組成物。
【請求項４】
前記希釈剤は、注射用水、生理的食塩水、リン酸緩衝溶液、精製水、又は脱イオン水であることを特徴とする、請求項３に記載の抗炎組成物。
【請求項５】
前記希釈剤は、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸塩をさらに含む、請求項４に記載の抗炎組成物。
【請求項６】
懸濁液である、請求項３〜５のいずれか一項に記載の抗炎組成物。
【請求項７】
マイクロニードリング、イオントフォレシス又は注射によって投与される、請求項３〜５のいずれか一項に記載の抗炎組成物。
【請求項８】
薬学組成物、化粧料組成物、又は皮膚外用剤である、請求項３〜５のいずれか一項に記載の抗炎組成物。
【請求項９】
注射剤であることを特徴とする、請求項８に記載の抗炎組成物。
【請求項１０】
（ａ）請求項３〜５のいずれか一項に記載の抗炎組成物を準備するステップと、（ｂ）前記抗炎組成物をヒトを除く哺乳動物の炎症性疾患の部位に処理するステップとを含む、炎症性疾患を予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法。
【請求項１１】
前記抗炎組成物は、マイクロニードリング、イオントフォレシス又は注射によってヒトを除く哺乳動物の皮膚に投与される、請求項１０に記載の炎症性疾患を予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法。
【請求項１２】
（ｃ）前記抗炎組成物が処理されたヒトを除く哺乳動物の皮膚に微細電流を流すイオントフォレシス（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行うステップと、（ｂ）前記微細電流により前記抗炎組成物をヒトを除く哺乳動物の皮膚内部に伝達するステップとをさらに含む、請求項１０に記載の炎症性疾患を予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法。
【請求項１３】
前記抗炎組成物は、パッチ、マスクパック、シートマスク、クリーム、トニック、軟膏、懸濁液、乳濁液、ペースト、ローション、ゲル、オイル、パック、スプレー、エアゾール、ミスト、ファンデーション、パウダー、及び油紙から構成された群から選ばれた少なくとも１種の形態に適用することを特徴とする、請求項１２に記載の炎症性疾患を予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法。
【請求項１４】
前記抗炎組成物は、マスクパック、シートマスク又はパッチの少なくとも一面に塗布又は浸漬される、請求項１３に記載の炎症性疾患を予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法。
【請求項１５】
前記（ｂ）ステップは、（ｂ１）前記抗炎組成物を前記ヒトを除く哺乳動物の皮膚に直接塗布すること、（ｂ２）前記抗炎組成物が塗布又は浸漬されたマスクパック、シートマスク又はパッチを前記ヒトを除く哺乳動物の皮膚に接触又は付着すること、若しくは前記（ｂ１）及び（ｂ２）を順次進行することによって行われる、請求項１４に記載の炎症性疾患を予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法。
【請求項１６】
前記（ｃ）ステップは、イオントフォレシスデバイスを前記ヒトを除く哺乳動物の皮膚に接触又は付着させて行われる、請求項１５に記載の炎症性疾患を予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法。
【請求項１７】
前記イオントフォレシスデバイスは、可撓性電池、リチウムイオン二次電池、アルカリ電池、乾電池、水銀電池、リチウム電池、ニッケルカドミウム電池、及び逆電気透析電池から構成された群から選ばれた少なくとも１種の電池を含む、請求項１６に記載の炎症性疾患を予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法。
【国際調査報告】
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