(57)【要約】  本開示は、プレート培養の必要なしに抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）用の高品質インプット材料をもたらす患者からの微生物試料を調製するための、新規な方法を提供する。本開示のある特定の方法は、ＡＳＴで使用される微生物試料を精製する、多数の分離ステップを含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗菌剤感受性試験用の、患者由来の病原性微生物を含むことが疑われる試料を調製するための自動化方法であって、
ａ．１０００ＲＣＦ未満で遠心分離するステップ、
ｂ．ステップａからの第１の上澄みを収集するステップ、
ｃ．前記第１の上澄みを１種以上の溶解試薬で処理するステップ、
ｄ．ステップｃからの前記処理された第１の上澄みを１０００ＲＣＦ超で遠心分離するステップ、
ｅ．ステップｄからの上澄みを除去するステップ、
ｆ．前記微生物のペレットを生理食塩液又は適切な緩衝溶液中に再懸濁するステップ、
ｇ．任意選択的にステップｆのペレットの再懸濁後、任意選択的に、ステップｄ〜ｅを繰り返すことによって前記ペレットを１回以上洗浄するステップ、及び
ｈ．任意選択的に、５００〜７００ｎｍの１つ以上の波長で光学密度を測定することにより、細胞懸濁液を定量するステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記溶解試薬が、限定するものではないが、サポニン、トリトン、ｔｗｅｅｎ、塩化アンモニウム、ソルビタンエステル、非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶解試薬が、１種以上の水溶性化合物を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記水溶性化合物が、限定するものではないが、ポリアネトール硫酸ナトリウム（ＳＰＳ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及び塩化ナトリウムを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記溶解試薬が、サポニン、ＳＰＳ及びＰＰＧを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記溶解試薬が塩化アンモニウムを含み、重炭酸カリウムが溶解中に添加される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記溶解試薬が、塩化アンモニウム及び重炭酸カリウム及びＥＤＴＡ又はＥＤＴＡナトリウム塩を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記溶解試薬が、Ｂｒｉｊ  ９７及びＣＡＰＳを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ペレットが洗浄されない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペレットが１回洗浄される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記洗浄が、生理食塩液、中性緩衝液又は増殖培地により行なわれる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペレットが、洗浄溶液の添加後に再懸濁される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ペレットが、洗浄溶液の添加後に再懸濁されない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ペレットが２回洗浄される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記洗浄が、生理食塩液、中性緩衝液又は増殖培地により行なわれる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ペレットが、洗浄溶液添加後に再懸濁されない、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ペレットが、洗浄溶液添加後に再懸濁されない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペレットが、生理食塩液、中性緩衝液又は増殖培地中に再懸濁される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記再懸濁されたペレット中の細胞が、５００ｎｍ〜７００ｎｍの１つ以上の波長で光学的に定量される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が、分光計、分光光度計又は比濁計によって定量される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、１種以上の前駆体化合物で前記懸濁された細胞を処理した後に定量される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記前駆体化合物が、限定するものではないが、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、アクリジンオレンジ、ＲｅｄＳａｆｅ、４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール、臭化エチジウム、ＳＹＢＲグリーンＩ、ＳＹＢＲグリーンＩＩ、ルシフェリン及びレサズリンを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記前駆体化合物が、前記懸濁されたペレットの懸濁液の一定分量に添加され、次いでこの一定分量が測定される、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１の遠心分離が５００ＲＣＦである、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２の遠心分離が２３７０ＲＣＦである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記第３の遠心分離が２３７０ＲＣＦである、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記第４の遠心分離が２３７０ＲＣＦである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
１回以上の遠心分離が、９０°未満の固定角で行なわれる、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
１回以上の遠心分離が、回転軸に対して３０°、４５°、６０°の固定角で行なわれる、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
連続モニタリングシステムからの陽性血液培養物に対して行なわれる、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
連続モニタリング血液培養システムへの導入後、４８時間以内に陽性になる培養物に対して行なわれる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
尿試料に対して行なわれる、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記患者由来の試料の体積が、２０ｍＬ、１５ｍＬ、１０ｍＬ未満である、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
抗菌剤感受性試験用の、患者由来の病原性微生物を含むことが疑われる試料を調製するための自動化方法であって、
ａ．１０００×ｇ未満の相対遠心力（ＲＣＦ）を試料に加え、それによって微粒子が枯渇した上澄みを生成するステップ、
ｂ ．前記微粒子が枯渇した上澄み中の少なくとも１種の患者細胞又は血小板を溶解し、それによって患者細胞が枯渇した上澄みを生成するステップ、
ｃ．１０００×ｇ超のＲＣＦを前記患者細胞が枯渇した上澄みに加え、それによってペレットを形成するステップ、
ｄ．前記ペレットを収集し再懸濁するステップ、
ｅ．任意選択的に、ステップｃ及びｄを繰り返すことによって前記ペレットを１回以上洗浄するステップ、及び
ｆ．生理食塩液又は緩衝溶液中の微生物の密度を評価するステップ
を含む方法。
【請求項３５】
前記溶解が、限定するものではないが、サポニン、トリトン、ｔｗｅｅｎ、塩化アンモニウム、ソルビタンエステル、非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤を含む溶解試薬によって行なわれる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記溶解試薬が、前記１種以上の溶解剤に加えて、１種以上の水溶性化合物を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記水溶性化合物が、限定するものではないが、ポリアネトール硫酸ナトリウム（ＳＰＳ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、塩化ナトリウムを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記溶解試薬がサポニン、ＳＰＳ及びＰＰＧを含む、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記溶解試薬が、塩化アンモニウム及び重炭酸カリウムを含む、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記溶解試薬が、塩化アンモニウム及び重炭酸カリウム及びＥＤＴＡ又はＥＤＴＡナトリウム塩を含む、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記溶解試薬がＢｒｉｊ  ９７及びＣＡＰＳを含む、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ペレットが洗浄されない、請求項３４〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ペレットが１回洗浄される、請求項３４〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記洗浄が、生理食塩液、中性緩衝液又は増殖培地により行なわれる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ペレットが２回洗浄される、請求項３４〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記洗浄が、生理食塩液、中性緩衝液又は増殖培地により行なわれる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ペレットが、生理食塩液、中性緩衝液又は増殖培地に再懸濁される、請求項３４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記再懸濁されたペレット中の細胞が、５００ｎｍ〜７００ｎｍの１つ以上の波長で光学的に評価される、請求項３４〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞が、分光計、分光光度計又は比濁計によって評価される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞が、前記懸濁された細胞を１種以上の前駆体化合物で処理した後に評価される、請求項３４〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記前駆体化合物が、限定するものではないが、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、アクリジンオレンジ、ＲｅｄＳａｆｅ、４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール、臭化エチジウム、ＳＹＢＲグリーンＩ、ＳＹＢＲグリーンＩＩ、ルシフェリン及びレサズリンを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記前駆体化合物が、前記再懸濁されたペレットの懸濁液の一定分量に添加され、次いでこの一定分量が測定される、請求項５０〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
加えられる第１のＲＣＦが５００ＲＣＦである、請求項３４〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
加えられる第２のＲＣＦが２３７０ＲＣＦである、請求項３４〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
加えられる第３のＲＣＦが２３７０ＲＣＦである、請求項３４〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
加えられる第４のＲＣＦが２３７０ＲＣＦである、請求項３４〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
１つ以上のＲＣＦが、９０°未満の固定角で加えられる、請求項３４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
連続モニタリングシステムからの陽性血液培養物に対して行なわれる、請求項３４〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
連続モニタリング血液培養システムに導入後、４８時間以内に陽性になる培養物に対して行なわれる、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記患者由来の試料の体積が、２０ｍＬ、１５ｍＬ、１０ｍＬ未満である、請求項３４〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
抗菌剤感受性試験用の、患者由来の病原性微生物を含むことが疑われる試料を調製するための自動化方法であって、
ａ．第１の相対遠心力を試料に加え、それによって比較的清澄な上澄みを生成するステップ、
ｂ．前記比較的清澄な上澄み中の少なくとも１種の患者細胞又は血小板を溶解し、それによって患者細胞が枯渇した上澄みを生成するステップ、
ｃ．ステップｂからの試料に第２の相対遠心力を加え、それによってペレットを形成するステップ、
ｄ．前記上澄みを除去するステップ、
ｅ．任意選択的に、ステップｃ及びｄを繰り返すことによって前記ペレットを１回以上洗浄するステップ、
ｆ．前記ペレットを適切な生理食塩液又は緩衝溶液中に再懸濁するステップ、及び
ｇ．前記生理食塩液又は緩衝溶液中の微生物の密度を評価するステップ
を含む方法。
【請求項６２】
少なくとも１種の患者細胞を溶解するステップが、前記清澄な上澄みと、サポニン、トリトン、ｔｗｅｅｎ、塩化アンモニウム、ソルビタンエステル、非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤からなる群から選択される溶解試薬とを接触させることを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記溶解試薬が、１種以上の溶解剤に加えて、１種以上の水溶性化合物を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記水溶性化合物が、限定するものではないが、ポリアネトール硫酸ナトリウム（ＳＰＳ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、塩化ナトリウムを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記溶解試薬が、サポニン、ＳＰＳ及びＰＰＧを含む、請求項６１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記溶解試薬が、塩化アンモニウム及び重炭酸カリウムを含む、請求項６１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記溶解試薬が、塩化アンモニウム及び重炭酸カリウム及びＥＤＴＡ又はＥＤＴＡナトリウム塩を含む、請求項６１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記溶解試薬が、Ｂｒｉｊ  ９７及びＣＡＰＳを含む、請求項６１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記ペレットが洗浄されない、請求項６１〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記ペレットが１回洗浄される、請求項６１〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記洗浄が、生理食塩液、中性緩衝液又は増殖培地により行なわれる、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記ペレットが２回洗浄される、請求項６１〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記洗浄が、生理食塩液、中性緩衝液又は増殖培地により行なわれる、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記ペレットが、生理食塩液、中性緩衝液又は増殖培地中に再懸濁される、請求項６１〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記再懸濁されたペレット中の細胞が、５００ｎｍ〜７００ｎｍの１つ以上の波長で光学的に評価される、請求項６１〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記細胞が、分光計、分光光度計又は比濁計によって評価される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記細胞が、１種以上の前駆体化合物で前記懸濁された細胞を処理した後に評価される、請求項６１〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記前駆体化合物が、限定するものではないが、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、アクリジンオレンジ、ＲｅｄＳａｆｅ、４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール、臭化エチジウム、ＳＹＢＲグリーンＩ、ＳＹＢＲグリーンＩＩ、ルシフェリン及びレサズリンを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記前駆体化合物が、前記再懸濁されたペレットの懸濁液の一定分量に添加され、次いでこの一定分量が測定される、請求項６１〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
加えられる前記第１のＲＣＦが、加えられる前記第２のＲＣＦよりも低い、請求項６１〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
加えられる前記第１のＲＣＦが５００ＲＣＦである、請求項６１〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
加えられる前記第２のＲＣＦが２３７０ＲＣＦである、請求項６１〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
加えられる前記第３のＲＣＦが２３７０ＲＣＦである、請求項６１〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
加えられる前記第４のＲＣＦが２３７０ＲＣＦである、請求項６１〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
１つ以上のＲＣＦが、９０°未満の固定角°で加えられる、請求項６１〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
連続モニタリングシステムからの陽性血液培養物に対して行なわれる、請求項６１〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記連続モニタリング血液培養システムへの導入後、４８時間以内に陽性になる培養物に対して行なわれる、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記患者由来の試料の体積が、１０ｍＬ未満である、請求項６１〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
抗菌剤感受性試験用の、患者由来の病原性微生物を含むことが疑われる試料を、調製するための方法であって、
ａ．１０００×ｇ未満で遠心分離するステップ、
ｂ．ステップａからの上澄みを収集し、その後、１０００×ｇ超で遠心分離するステップ、
ｃ．ステップｂから得られたペレットを清浄化するステップ、
ｄ．前記ペレットを再懸濁するステップ、及び
ｅ．前記再懸濁したペレットからの微生物細胞を、ＡＳＴカセットの複数のウェルのそれぞれに接種するステップ
を含む方法。
【請求項９０】
微生物増殖を促進させる条件下で前記再懸濁された細胞をインキュベートするステップをさらに含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記ペレットが、反転遠心分離によって清浄化される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記ペレットが、再懸濁及びその後の追加の遠心分離ステップにより清浄化され、その後、上澄みが除去される、請求項８９〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記ペレットが、増殖培地中に再懸濁される、請求項８９〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記試料が、ペレットの再懸濁後、２つ以上の独立したリザーバー内に一定分量採取される、請求項８９〜９３のいずれか一項に記載される方法。
【請求項９５】
細胞濃度の測定が、吸光度又は比濁分析によって光学的に行なわれる、請求項８９〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記試料が、尿、血液、滑液、脳脊髄液、痰、気管支肺胞洗浄液、鼻スワブ又は創傷スワブである、請求項８９〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記試料が、液体増殖培地中で培養された血液である、請求項８９〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記微生物増殖を促進させる条件が、３３〜３７℃の温度を含む、請求項１〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記微生物増殖を促進させる条件が、撹拌を含む、請求項８９〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
抗菌剤感受性試験用の、患者由来の病原性微生物を含むことが疑われる試料を、調製するための方法であって、
ａ．試料を、分離膜が装備された遠心分離管内に配置するステップ、
ｂ．１０００×ｇ未満で遠心分離するステップ、
ｃ．前記膜を洗浄して、堆積された細菌を再懸濁させるステップ、及び
ｄ．前記再懸濁された細胞の濃度を測定するステップ
を含む方法。
【請求項１０１】
微生物増殖を促進させる条件下で前記再懸濁された細胞をインキュベートするステップをさらに含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記試料が、細菌の再懸濁後、２つ以上の独立したリザーバーに、一定分量採取される、請求項１００〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
細胞濃度の測定が、吸光度又は比濁分析によって光学的に行なわれる、請求項１００〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記試料が、尿、血液、滑液、脳脊髄液、痰、気管支肺胞洗浄液、鼻スワブ又は創傷スワブである、請求項１００〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記試料が、液体増殖培地で培養された血液である、請求項１００〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記微生物増殖を促進させる条件が、３３〜３７℃の温度を含む、請求項１００〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記微生物増殖を促進させる条件が、撹拌を含む、請求項１００〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
抗菌剤感受性試験用の、患者由来の病原性微生物を含むことが疑われる試料を、調製するための方法であって、
ａ．第１の相対遠心力を試料に加え、それによって第１のペレット及び第１の上澄みを形成するステップ、
ｂ．第２の相対遠心力を前記第１の上澄みに加え、それによって第２のペレット及び第２の上澄みを生成するステップ、
ｃ．ステップｂから得られた前記第２のペレットを清浄化するステップ、
ｄ．前記第２のペレットを緩衝溶液に再懸濁するステップ、及び
ｅ．前記緩衝溶液に再懸濁された微生物の濃度を測定するステップ
を含む方法。
【請求項１０９】
微生物増殖を促進させる条件下で前記再懸濁された微生物をインキュベートするステップをさらに含む、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記第１の相対遠心力が、前記第２の相対遠心力よりも低い、請求項１０８〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ペレットが、反転遠心分離によって清浄化される、請求項１０８〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記ペレットが、再懸濁及びその後の追加の遠心分離ステップにより清浄化され、その後、上澄みが除去される、請求項１０８〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記ペレットが、増殖培地に再懸濁される、請求項１０８〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記試料が、ペレットの再懸濁後、２つ以上の独立したリザーバー内に一定分量採取される、請求項１０８〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記細胞濃度の測定が、吸光度又は比濁分析によって光学的に行なわれる、請求項１０８〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記試料が、尿、血液、滑液、脳脊髄液、痰、気管支肺胞洗浄液、鼻スワブ又は創傷スワブである、請求項１０８〜１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記試料が、液体増殖培地で培養された血液である、請求項１０８〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記微生物増殖を促進させる条件が、３３〜３７℃の温度を含む、請求項１０８〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記微生物増殖を促進させる条件が、撹拌を含む、請求項１０８〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
増殖の決定が、請求項１０９〜１１９のいずれか一項の後に続く、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
抗菌剤感受性試験用の、患者由来の病原性微生物を含む試料を調製するための、インビトロ微生物分離システムであって、
前記試料への溶液の添加及び前記試料からの溶液の除去が可能になるように構成された流体操作モジュール、
遠心分離機の固定ローターを貫通する縦軸、前記縦軸に垂直な垂直軸、及び前記固定ローターの角度を有する遠心分離機、
前記試料を撹拌するように構成されたボルテクサー、及び
前記試料のメトリックを測定するように構成された細胞定量装置
を備えるシステム。
【請求項１２２】
前記角度が、前記垂直軸から約３０°、４５°、６０°である、請求項１２１に記載のシステム。
【請求項１２３】
抗菌剤感受性試験用の、患者由来の病原性微生物を含む試料を調製するための方法であって、
流体操作モジュールを介して前記試料を試料管に移すステップ、
前記試料管を、遠心分離機の縦軸に垂直な垂直軸に対する角度で固定ローターを有する前記遠心分離機内に配置するステップ、
前記遠心分離機をある期間にわたり作動させるステップ、
前記試料管から前記試料の流体の一部を取り出すステップ、
溶解試薬の一部を前記試料管に添加するステップ、
前記試料管を前記試料を撹拌するように構成されたボルテクサーに供するステップ、
生理食塩液又は緩衝溶液の一部を前記試料管に添加するステップ、
前記試料管内の前記流体の実質的に全てをキュベットに移すステップ、
５００ｎｍ〜７００ｎｍの１つ以上の波長で、光学細胞定量装置を使用して、前記試料のメトリックを測定するステップ、
前記懸濁液を所定レベルに希釈するステップ、
前記細胞定量装置を使用して、前記試料のメトリックを検証するステップ、及び
前記流体を、アウトプット管に移すステップ
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年３月２日に出願された、「Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ」という名称の米国仮出願第６２／６３７，７８６号の優先権を主張するものである。前述の出願を、その全体を全ての目的で参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
本開示は、臨床微生物学試料の調製及び試験に関する。
【背景技術】
【０００３】
抗菌剤耐性微生物感染は、増大する罹患率、死亡率及び感染患者の中での健康管理費も含めた、不十分な臨床成績を伴う。米国内でのこれらの生物の蔓延は、過去３０年にわたり着実に増大してきた。微生物の表現型抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）は、適切な療法レジメンを医師に知らせるのに極めて重要である。現行の方法を使用すると、ＡＳＴ決定は、典型的には最短で８時間を要することから、この決定は、多くの臨床微生物学研究室においては、シフト作業に起因して、一晩かかるプロセスとなる。現行のＡＳＴ法からの決定を待つ間、患者には広域スペクトル抗菌剤がしばしば投与され、それが患者の健康に著しく有害な影響を及ぼしかつ／又は増大する抗菌剤耐性伝染病に寄与する。さらに、正確な抗菌剤治療情報を得るこの時間遅延は、病院内での患者の滞在を長くし、それによってコスト及び患者の不快感が増大する。
【０００４】
この状況に対し、政府及び業界関係者は、病院での抗菌剤管理を促進させる規則を提案してきた。しかし抗菌剤管理努力は、現行のＡＳＴ法及び抗菌剤処方業務の制約によって複雑になり得る。本発明者らは、ＡＳＴ決定に要する時間を短縮しかつ抗菌剤管理を容易にすることができる、迅速なＡＳＴのための方法を、既に開示してきた。例えば、微生物表面を結合する蛍光プローブを利用するＡＳＴシステム及び方法が、共同所有の米国特許第９，８３４，８０８号及びＰＣＴ公開ＷＯ  ２０１８／１１９４３９に記載されている。これらのシステム及び方法は、費用効果のある手法でこのニーズに対処しかつ既存のアッセイハードウェア構成要素に適合可能であるので、有利である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第９，８３４，８０８号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１８／１１９４３９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来のＡＳＴ法は、一次試料から微生物を精製しかつ汚染物質を除去するために、プレートをベースにした培養試料調製を利用し、これは一晩培養を典型的には要するプロセスである。一晩のプレートベースの培養の必要性を低減させるか又は無くすことにより、処方者へのＡＳＴ結果の送出を潜在的に加速させることができ、このことが患者の転帰を改善する可能性がある。その結果、当分野では今日、血球などの細胞及び抗生剤などの可溶性種を除去しながら、ＡＳＴを行なうために適切な状態で微生物病原体を維持する迅速な試料調製プロセスが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本開示は、連続血液培養モニタリングなどの確立された方法によって微生物増殖に関して陽性であると決定された、患者の試料及び／又は培養した血液試料から直接、安定なＡＳＴインプット材料を得るための、システム及び方法を提供する。以下に記述するシステム及び方法は、ＡＳＴ用の患者試料の高速処理を可能にし、高速ＡＳＴアッセイをもたらすまでの時間を短縮する。本開示の様々な態様では、患者試料がヒト試料又は処理されたヒト試料であり、例えば尿、血液、滑液、脳脊髄液、痰、気管支肺胞洗浄液、鼻スワブ又は創傷スワブである。本開示の処理方法は、痰などに関しては試料母材を分解するのに酵素を、又はスワブなどに関しては試料を分散させるのに流体を利用してもよい。血液試料は、当業者に公知の液体培養又は「血液瓶」によって処理されてもよい。このような試料は、「陽性」血液培養物であってもよく又は３３〜３７℃で好ましくは４〜１０時間インキュベートされた瓶からの、まだ陽性と決定されていない試料であってもよい。
【０００８】
本開示のこれらの態様によれば、血液培養物から微生物を分離するための方法が提供される。本開示のある特定の実施形態で使用される血液培養物は、任意の適切な手法で、例えばＢＡＣＴＥＣ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ（登録商標）（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）及びＶｅｒｓａＴｒｅｋ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）などの連続モニタリング血液培養システムを使用して陽性であることが決定されている血液培養物から、調製されてもよい。初期遠心分離後に溶解試薬を利用することによって、本開示の例示的な方法は、容易に自動化されながら、光学測定に影響を及ぼす複数の溶血性凝塊、真核細胞及び真核細胞断片を、適切に除去することが可能である。特に、本明細書に記述される方法は、Ｌｕｐｅｔｔｉらにより記述される血清分離機管などのゲルをベースにしたフィルター、又はＭａｃｈｅｎらのＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ９（２）：ｅ８７８７０に記述される膜フィルターなどの固体フィルターであって現行の技術分野で標準的な方法を特徴付けるものの必要性を克服する。
【０００９】
一部の態様において本開示は、抗菌剤感受性試験用の、患者由来の病原性微生物を含むことが疑われる試料を、調製するための自動化方法であって、（ａ）１０００ＲＣＦ未満で遠心分離するステップ；（ｂ）ステップａからの第１の上澄みを収集するステップ；（ｃ）第１の上澄みを１種以上の溶解試薬で処理するステップ；（ｄ）ステップｃからの処理された第１の上澄みを１０００ＲＣＦ超で遠心分離するステップ；（ｅ）ステップｄからの上澄みを除去するステップ；（ｆ）微生物ペレットを生理食塩液又は適切な緩衝溶液中に再懸濁するステップ；（ｇ）任意選択的にステップｆのペレット再懸濁後、任意選択的に、ステップｄ〜ｅを繰り返すことによって、ペレットを１回以上洗浄するステップ；及び（ｈ）細胞懸濁液を定量するステップを含む方法について記述する。
【００１０】
さらに、溶解試薬は、限定するものではないが、サポニン、トリトン、ｔｗｅｅｎ、塩化アンモニウム、ソルビタンエステル、非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤を含んでいてもよい。溶解試薬は、１種以上の溶解試薬に加えて１種以上の水溶性化合物を含んでいてもよい。水溶性化合物は、限定するものではないが、ポリアネトール硫酸ナトリウム（ＳＰＳ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、塩化ナトリウムを含んでいてもよい。溶解試薬は、サポニン、ＳＰＳ及びＰＰＧを含んでいてもよい。溶解試薬は塩化アンモニウムを含んでいてもよく、重炭酸カリウムが溶解中に添加される。溶解試薬は、塩化アンモニウム及び重炭酸カリウム及びＥＤＴＡ又はＥＤＴＡナトリウム塩を含んでいてもよい。溶解試薬は、Ｂｒｉｊ  ９７及びＣＡＰＳを含んでいてもよい。
【００１１】
さらに、ペレットは洗浄されなくてもよい。ペレットは、１回洗浄されてもよい。洗浄は、生理食塩液、中性緩衝液又は増殖培地で行なってもよい。ペレットは、洗浄溶液の添加後に再懸濁されてもよい。ペレットは、洗浄溶液の添加後に再懸濁しなくてもよい。ペレットは、２回洗浄されてもよい。洗浄は、生理食塩液、中性緩衝液又は増殖培地で行なってもよい。ペレットは、洗浄溶液の添加後に再懸濁されてもよい。ペレットは、洗浄溶液の添加後に再懸濁されなくてもよい。再懸濁されたペレット中の細胞は、５００ｎｍ〜７００ｎｍの１つ以上の波長で光学的に定量されてもよい。細胞は、分光計、分光光度計又は比濁計によって定量されてもよい。細胞は、１種以上の前駆体化合物で、懸濁された細胞を処理した後に、定量されてもよい。前駆体化合物は、限定するものではないが、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、アクリジンオレンジ、ＲｅｄＳａｆｅ、４’，６’−ジアミジノ−２−フェニリンドール、臭化エチジウム、ＳＹＢＲグリーンＩ、ＳＹＢＲグリーンＩＩ、ルシフェリン及びレサズリンを含んでいてもよい。前駆体化合物は、再懸濁されたペレット懸濁液の一定分量に添加されてもよく、次いでこの一定分量を測定する。第１の遠心分離は５００ＲＣＦであってもよい。第２の遠心分離は２３７０ＲＣＦであってもよい。第３の遠心分離は２３７０ＲＣＦであってもよい。第４の遠心分離は２３７０ＲＣＦであってもよい。１回以上の遠心分離を、９０°未満の固定角で行なってもよい。１回以上の遠心分離を、回転軸に対して３０°、４５°、６０°の固定角で行なってもよい。
【００１２】
一部の態様では、方法は、連続モニタリングシステムからの陽性血液培養物で行なってもよい。方法は、連続モニタリング血液培養システムへの導入後、４８時間以内に陽性になった培養物で行なってもよい。方法は、尿試料で行ってもよい。患者からの試料の体積は、２０ｍＬ、１５ｍＬ、１０ｍＬ未満である。
【００１３】
一実施形態において、本開示は、抗菌剤感受性試験のための、患者由来の病原性微生物を含むことが疑われる試料を、調製するための自動化方法であって、（ａ）１０００×ｇ未満の相対遠心力（ＲＣＦ）を試料に加え、それによって微粒子が枯渇した上澄みを生成するステップ；（ｂ）微粒子が枯渇した上澄みに、少なくとも１種の患者細胞又は血小板を溶解し、それによって患者細胞が枯渇した上澄みを生成するステップ；（ｃ）１０００×ｇ超のＲＣＦを患者細胞が枯渇した上澄みに加え、それによってペレットを形成するステップ；（ｄ）ペレットを収集し再懸濁するステップ；（ｅ）任意選択的に、ステップｃ及びｄを繰り返すことによってペレットを１回以上洗浄するステップ；及び（ｆ）生理食塩液又は緩衝溶液中の微生物の密度を評価するステップを含む方法について論ずる。
【００１４】
この実施形態では、溶解試薬が、限定するものではないが、サポニン、トリトン、ｔｗｅｅｎ、塩化アンモニウム、ソルビタンエステル、非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤を含んでいてもよい。溶解試薬は、１種以上の溶解剤に加えて１種以上の水溶性化合物を含んでいてもよい。水溶性化合物は、限定するものではないが、ポリアネトール硫酸ナトリウム（ＳＰＳ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、塩化ナトリウムを含んでいてもよい。溶解試薬は、サポニン、ＳＰＳ及びＰＰＧを含んでいてもよい。溶解試薬は塩化アンモニウムを含んでいてもよく、重炭酸カリウムは溶解中に添加される。溶解試薬は、塩化アンモニウム及び重炭酸カリウム及びＥＤＴＡ又はＥＤＴＡナトリウム塩を含んでいてもよい。溶解試薬は、Ｂｒｉｊ  ９７及びＣＡＰＳを含んでいてもよい。
【００１５】
この実施形態では、ペレットは洗浄されなくてもよい。ペレットは、１回洗浄されてもよい。洗浄は、生理食塩液、中性緩衝液又は増殖培地で行なってもよい。ペレットは、２回洗浄されてもよい。洗浄は、生理食塩液、中性緩衝液又は増殖培地で行なってもよい。ペレットは、生理食塩液、中性緩衝液又は増殖培地に再懸濁させてもよい。再懸濁させたペレット中の細胞は、５００ｎｍ〜７００ｎｍの１つ以上の波長で、光学的に評価されてもよい。細胞は、分光計、分光光度計又は比濁計によって評価されてもよい。細胞は、１種以上の前駆体化合物で懸濁細胞を処理した後に、定量されてもよい。前駆体化合物は、限定するものではないが、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、アクリジンオレンジ、ＲｅｄＳａｆｅ、４’，６’−ジアミジノ−２−フェニリンドール、臭化エチジウム、ＳＹＢＲグリーンＩ、ＳＹＢＲグリーンＩＩ、ルシフェリン及びレサズリンを含んでいてもよい。前駆体化合物は、再懸濁ペレット懸濁液の一定分量に添加されてもよく、次いでこの一定分量を測定する。第１の遠心分離は５００  ＲＣＦであってもよい。第２の遠心分離は２３７０  ＲＣＦであってもよい。第３の遠心分離は２３７０  ＲＣＦであってもよい。第４の遠心分離は２３７０  ＲＣＦであってもよい。１回以上の遠心分離を、９０°未満の固定角で行なってもよい。１回以上の遠心分離を、回転軸に対して３０°、４５°、６０°の固定角で行なってもよい。
【００１６】
この実施形態では、方法は、連続モニタリングシステムからの陽性血液培養物で行なってもよい。方法は、連続モニタリング血液培養システムに導入後４８時間以内に陽性になった培養物で行なってもよい。方法は、尿試料で行なってもよい。患者由来の試料の体積は、２０ｍＬ、１５ｍＬ、１０ｍＬ未満である。
【００１７】
別の態様では、本開示は、抗菌剤感受性試験のための、患者由来の病原性微生物を含むことが疑われる試料を、調製するための自動化方法であって、（ａ）第１の相対遠心力を試料に加え、それによって比較的清澄な上澄みを生成するステップ；（ｂ）比較的清澄な上澄み中の少なくとも１種の患者細胞又は血小板を溶解し、それによって患者細胞が枯渇した上澄みを生成するステップ；（ｃ）ステップｂからの試料に第２の相対遠心力を加え、それによってペレットを形成するステップ；（ｄ）上澄みを除去するステップ；（ｅ）任意選択的に、ステップｃ及びｄを繰り返すことによってペレットを１回以上洗浄するステップ；（ｆ）ペレットを適切な生理食塩液又は緩衝溶液中に再懸濁するステップ；及び（ｇ）生理食塩液又は緩衝溶液中の微生物の密度を評価するステップを含む方法について記述する。
【００１８】
この態様において、少なくとも１種の患者細胞を溶解するステップは、清澄な上澄みと、サポニン、トリトン、ｔｗｅｅｎ、塩化アンモニウム、ソルビタンエステル、非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤からなる群から選択される溶解試薬とを接触させることを含んでいてもよい。溶解試薬は、１種以上の溶解剤に加え、１種以上の水溶性化合物を含んでいてもよい。水溶性化合物は、限定するものではないが、ポリアネトール硫酸ナトリウム（ＳＰＳ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、塩化ナトリウムを含んでいてもよい。溶解試薬は、サポニン、ＳＰＳ及びＰＰＧを含んでいてもよい。溶解試薬は塩化アンモニウムを含んでいてもよく、重炭酸カリウムは溶解中に添加される。溶解試薬は、塩化アンモニウム及び重炭酸カリウム及びＥＤＴＡ又はＥＤＴＡナトリウム塩を含んでいてもよい。溶解試薬は、Ｂｒｉｊ  ９７及びＣＡＰＳを含んでいてもよい。
【００１９】
この態様では、ペレットは洗浄されなくてもよい。ペレットは、１回洗浄されてもよい。洗浄は、生理食塩液、中性緩衝液又は増殖培地で行なってもよい。ペレットは、２回洗浄されてもよい。洗浄は、生理食塩液、中性緩衝液又は増殖培地で行なってもよい。ペレットは、生理食塩液、中性緩衝液又は増殖培地に再懸濁されてもよい。再懸濁されたペレット中の細胞は、５００ｎｍ〜７００ｎｍの１つ以上の波長で光学的に評価されてもよい。細胞は、分光計、分光光度計又は比濁計によって評価されてもよい。細胞は、１種以上の前駆体化合物での懸濁細胞の処理後に定量されてもよい。前駆体化合物は、限定するものではないが、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、アクリジンオレンジ、ＲｅｄＳａｆｅ、４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール、臭化エチジウム、ＳＹＢＲグリーンＩ、ＳＹＢＲグリーンＩＩ、ルシフェリン及びレサズリンを含んでいてもよい。前駆体化合物は、再懸濁ペレット懸濁液の一定分量に添加されてもよく、次いでこの一定分量が測定される。加えられた第１のＲＣＦは、加えられた第２のＲＣＦより低くてもよい。第１のＲＣＦは５００ＲＣＦであってもよい。第２のＲＣＦは２３７０ＲＣＦであってもよい。第３のＲＣＦは２３７０ＲＣＦであってもよい。第４のＲＣＦは２３７０ＲＣＦであってもよい。１つ以上のＲＣＦを、９０°未満の固定角で行なってもよい。
【００２０】
この実施形態では、方法は、連続モニタリングシステムからの陽性血液培養物で行なってもよい。方法は、連続モニタリング血液培養システムへの導入後、４８時間以内に陽性になった培養物で行なってもよい。患者由来の試料の体積は、１０ｍＬ未満であってもよい。
【００２１】
別の実施形態では、本開示は、抗菌剤感受性試験用の、患者由来の病原性微生物を含むことが疑われる試料を、調製するための方法であって、（ａ）１０００×ｇ未満で遠心分離するステップ；（ｂ）ステップａからの上澄みを収集し、その後、１０００×ｇ超で遠心分離するステップ；（ｃ）ステップｂから得られたペレットを清浄化するステップ；（ｄ）ペレットを再懸濁するステップ；及び（ｅ）再懸濁したペレットからの微生物細胞を、ＡＳＴカセットの複数のウェルのそれぞれに接種するステップを含む方法について記述する。方法は、微生物増殖を促進させる条件下で再懸濁された細胞をインキュベートするステップさらに含んでいてもよい。ペレットは、反転遠心分離によって清浄化されてもよい。ペレットは、再懸濁及びその後の追加の遠心分離ステップによって清浄化されてもよく、その後、上澄みが除去される。ペレットは、増殖培地に再懸濁されてもよい。試料は、ペレットの再懸濁後、２つ以上の独立したリザーバーに一定分量採取されてもよい。細胞濃度の測定は、吸光度又は比濁分析によって光学的に行なわれてもよい。試料は、尿、血液、滑液、脳脊髄液、痰、気管支肺胞洗浄液、鼻スワブ又は創傷スワブであってもよい。試料は、液体増殖培地で培養された血液であってもよい。微生物増殖を促進させる条件は、３３〜３７℃の温度を含んでいてもよい。微生物増殖を促進させる条件は、撹拌を含む。
【００２２】
また本開示では、抗菌剤感受性試験用の、患者由来の病原性微生物を含むことが疑われる試料を、調製するための方法であって、（ａ）試料を、分離膜が装備された遠心分離管内に配置するステップ；（ｂ）１０００×ｇ未満で遠心分離するステップ；（ｃ）膜を洗浄して、堆積された細菌を再懸濁させるステップ；及び（ｄ）再懸濁された細胞の濃度を測定するステップを含む方法の、実施形態もある。方法はさらに、微生物増殖を促進させる条件下で、再懸濁された細胞をインキュベートするステップを含む。試料は、細菌の再懸濁後、２つ以上の独立したリザーバーに一定分量採取されてもよい。細胞濃度の測定は、吸光度又は比濁分析によって光学的に行なわれてもよい。試料は、尿、血液、滑液、脳脊髄液、痰、気管支肺胞洗浄液、鼻スワブ又は創傷スワブであってもよい。試料は、液体増殖培地で培養された血液であってもよい。微生物増殖を促進させる条件は、３３〜３７℃の温度を含んでいてもよい。微生物増殖を促進させる条件は、撹拌を含んでいてもよい。
【００２３】
本開示はさらに、抗菌剤感受性試験用の、患者由来の病原性微生物を含むことが疑われる試料を、調製するための方法であって、（ａ）第１の相対遠心力を試料に加え、それによって第１のペレット及び第１の上澄みを形成するステップ；（ｂ）第２の相対遠心力を第１の上澄みに加え、それによって第２のペレット及び第２の上澄みを生成するステップ；（ｃ）ステップｂから得られた第２のペレットを清浄化するステップ；（ｄ）第２のペレットを緩衝溶液に再懸濁するステップ；及び（ｅ）緩衝溶液に再懸濁された微生物の濃度を測定するステップを含む方法について論じる。この方法はさらに、微生物増殖を促進させる条件下で、再懸濁された微生物をインキュベートするステップを含む。第１の相対遠心力は、第２の相対遠心力より低くてもよい。ペレットは、反転遠心分離によって清浄化されてもよい。ペレットは、再懸濁及びその後の追加の遠心分離ステップによって清浄化されてもよく、その後、上澄みが除去されてもよい。ペレットは、増殖培地に再懸濁されてもよい。試料は、ペレットの再懸濁後、２つ以上の独立したリザーバーに、一定分量採取されてもよい。細胞濃度の測定は、吸光度又は比濁分析によって光学的に行なわれてもよい。試料は、尿、血液、滑液、脳脊髄液、痰、気管支肺胞洗浄液、鼻スワブ又は創傷スワブであってもよい。試料は、液体増殖培地で培養された血液であってもよい。微生物増殖を促進させる条件は、３３〜３７℃の温度を含んでいてもよい。微生物増殖を促進させる条件は、撹拌を含んでいてもよい。
【００２４】
さらに別の実施形態では、本開示は、抗菌剤感受性試験用の、患者由来の病原性微生物を含む試料を調製するための、インビトロ微生物分離システムであって、試料への溶液添加及び試料からの除去が可能になるように構成された流体操作モジュール；遠心分離機の固定ローターを貫通する縦軸、縦軸に垂直な垂直軸、及び固定ローターの角度を有する遠心分離機；試料を撹拌するように構成されたボルテクサー；及び試料のメトリックを測定するよう構成された細胞定量装置を備えるシステムについて論じる。角度は、垂直軸から約３０°、４５°、６０°であってもよい。
【００２５】
本開示は、抗菌剤感受性試験用の、患者由来の病原性微生物を含む試料を調製するための方法であって、流体操作モジュールを介して試料を試料管に移すステップ；試料管を、遠心分離機の縦軸に垂直な、垂直軸に対する角度で固定ローターを有する遠心分離機内に配置するステップ；遠心分離機をある期間にわたり作動させるステップ；試料管から試料の流体の一部を取り出すステップ；溶解試薬の一部を試料管に添加するステップ；試料管を試料を撹拌するように構成されたボルテクサーに供するステップ；生理食塩液又は緩衝溶液の一部を試料管に添加するステップ；試料管内の流体の実質的に全てを、キュベットに移すステップ；５００ｎｍ〜７００ｎｍの１つ以上の波長で、光学細胞定量装置を使用して、試料のメトリックを測定するステップ；懸濁液を所定レベルに希釈するステップ；細胞定量装置を使用して、試料のメトリックを検証するステップ；及び流体を、アウトプット管に移すステップを含む方法についても論じる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】血液を調製するためのプロトコールを示す図である。
【図２】尿を調製するためのプロトコールを示す図である。
【図３】尿の代替調製のためのプロトコールを示す図である。
【図４】血液の代替調製のためのプロトコールを示す図である。
【図５】自動化プロセスに関するプロトコールを示す図である。
【図６】試料を収容するように構成された流体操作モジュールを含む、ＡＳＴ用の患者由来の病原体微生物を含む試料を調製するための装置の、従属部品を示す図である。
【図７】溶解試薬のないＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）試料１に関する代表的なデータを示す図である。
【図８】溶解試薬のないＥ．コリ試料２に関する代表的なデータを示す図である。
【図９】溶解試薬のないＫ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に関する代表的なデータを示す図である。
【図１０Ａ】ＲＣＦ、遠心分離時間及び細胞濃度の間の関係を示す、細菌遠心分離実験の結果を示す図である。
【図１０Ｂ】ＲＣＦ、遠心分離時間及び細胞濃度の間の関係を示す、細菌遠心分離実験の結果を示す図である。
【図１０Ｃ】ＲＣＦ、遠心分離時間及び細胞濃度の間の関係を示す、細菌遠心分離実験の結果を示す図である。
【図１０Ｄ】ＲＣＦ、遠心分離時間及び細胞濃度の間の関係を示す、細菌遠心分離実験の結果を示す図である。
【図１１】左から右に９０°、７５°、６０°、４５°、３０°及び１５°の、ローターの平面に対する様々な角度で観察された、微生物ペレットの形成を示す図である。
【図１２】溶解試薬を含むＥ．コリ試料１に関する代表的なデータを示す図である。
【図１３】溶解試薬を含むＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に関する代表的なデータを示す図である。
【図１４】溶解試薬のないＳ．アウレウスに関する代表的なデータを示す図である。
【図１５】溶解試薬のないＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）に関する代表的なデータを示す図である。
【図１６】ａ〜ｄが、分離の様々な方法を示す図である。
【図１７】図１６の方法に関する代表的なデータを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
患者の微生物学的試料の調製
本開示は、例えば血液培養物、尿試料、痰試料などの一次及び液体培養患者試料から微生物を分離するための、新しいシステム及び方法を提供する。本開示によるいくつかの分離方法は、初期低速遠心分離ステップとこの後に続く溶解試薬を用い、複数の溶血性凝塊、真核細胞及び真核細胞断片、並びに細胞濃度の光学測定及びＡＳＴ結果に影響を及ぼし得るその他の構成要素を、適切に除去することが可能である。方法はさらに、陽性血液培養物又は尿試料の２０ｍＬ以下から、好ましくは１０ｍＬ以下からＡＳＴを行なうため、十分な数及び濃度で複数の生存可能な微生物を含む、「清浄な」試料を生成する。同時に、本開示の方法は、容易に自動化されるよう十分に単純である。本開示の実施形態は、試料を濾過する必要性を取り除くことができ（例えば、Ｌｕｐｅｔｔｉらにより記載される血清分離機管、又はＭａｃｈｅｎら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ９（２）：ｅ８７８７０に記載されている膜フィルターなどの固体フィルターを使用して）、潜在的に自動化を容易にしかつ消耗品のコストを低下させる。
【００２８】
一部の実施形態では、本開示の方法は、ＢＡＣＴＥＣ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ（登録商標）（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）及びＶｅｒｓａＴｒｅｋ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）など、連続モニタリング血液培養システムを使用して陽性であることが決定されている、血液培養物に適用される。
【００２９】
特にＡＳＴ用の血液培養物又は尿試料を調製するとき、微生物細胞を、真核細胞及び真核細胞の断片並びに患者由来の大きい非細胞残滓から、並びに可溶性免疫ペプチド及び存在し得る抗生剤から、分離することが有利なことがある（Ｌｕｐｅｔｔｉら、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．２０１０；１６：９８６〜９９１）。細胞及び細胞断片は、ＡＳＴ結果の完全性を損なう可能性があり、ＡＳＴの開始前の正確な微生物の列挙を複雑にするか又は阻害する可能性がある。光学密度及び／又は比濁分析を通した正確な微生物の列挙は、溶血性凝塊及び血小板などの光学活性成分によって阻害され得る（Ｌｕｐｅｔｔｉら）。
【００３０】
文献は、溶解試薬が、低速遠心分離又はフィルターと同じことを実現すること、即ち真核細胞及び残滓（例えば、血小板、溶血凝塊など）が試料から除去されることを教示する。これらの研究は、溶解試薬及び遠心分離又は濾過の両方の使用が余分であることを示唆し、今日の当技術分野での主な見方は、陽性血液培養物に適用されるときには溶解試薬が単独で、真核細胞及び残滓を除去するのに十分であることである。
【００３１】
本開示の一部の実施形態は、陽性血液培養物での化学溶解を伴う低速遠心分離の後、光学測定を使用して正確な微生物列挙を可能にするのに十分に、真核細胞及び残滓が除去された最終微生物含有試料が生成され、それと共に下流のＡＳＴアッセイ用の高品質のインプット材料が得られるという、本発明者らの発見に基づく。特に、この手法は、ＡＳＴが可能になるよう、十分な数及び適切な量及び濃度の複数の生存可能な微生物を含む試料を生成するのに、１０ｍＬ以下の陽性血液培養物又は尿を必要とする可能性がある。より詳細には、本開示のある特定の実施形態は、プレートベース培養を介在させる必要がない、陽性血液培養物からのＭｃＦａｒｌａｎｄの読取りが約０．２〜０．６５である、濃縮微生物含有試料を生成するための自動化可能な方法に関する。ＣＬＳＩブロス微量希釈参照法は読取り０．５のＭｃＦａｒｌａｎｄを利用するが、これはＡＳＴ試験のために２００倍に希釈されているため、したがって、適切な体積が存在することを前提として、より低い接種材料濃度がＡＳＴに利用され得ることを、当業者なら理解しよう。
【００３２】
より一般的には、本開示の一部の実施形態は、プレートベース培養を介在させることによる追加の精製を必要とすることなく、患者試料から直接、臨床微生物接種物を調製するためのシステム及び方法に関する。
【００３３】
本開示の例示的な方法は、４つの主なステップを含む。第１の分離ステップ（低速遠心分離など）は、溶血凝塊及びこの他の光学干渉体を残りの試料材料（例えば、上澄み）から分離するのに（例えば、ペレット）利用される。第１の分離から得られる清澄な流体材料を溶解試薬で処理し、残りの真核細胞及び／又は真核細胞断片、血小板などを溶解し、それと共に、下流のアッセイ（例えば、ＡＳＴアッセイ）で調べられることになる微生物を無傷のままにする。本明細書で使用される「溶解試薬」という用語は、文献で「サポニンゴースト」と呼ばれるものであって細胞内に不可逆的細孔を創出し得るが細胞形状を無傷のままにすることができる、サポニンなどの洗浄剤の使用を包含する。次いで第２の分離ステップ（高速遠心分離など）は、処理された上澄みから微生物を分離し（例えば、ペレット）、その後、デカンテーション、吸引などによって上澄みを除去するのに利用される。任意選択的に、１つ以上の洗浄ステップを行なって、ペレットを清浄化しかつ望ましくない可溶性種を除去してもよい。最後に、問題となっている微生物を、生理食塩液、緩衝剤又は増殖培地に再懸濁し、細胞濃度を例えば光学測定によって決定する。
【００３４】
第１の分離は、微生物細胞密度の光学測定を妨げる汚染種を除去するように設計される。実際にこの分離は、ＡＳＴなどの下流のプロセスで調べられることになる微生物からの、真核細胞及び細胞断片及び不溶性材料（例えば、凝塊、真核細胞凝集体及び残滓）の分離（例えば、ペレット化、収集など）を含むことができる。様々な実施形態では、これらの分離は、例えば遠心分離によって実現される。
【００３５】
遠心分離が第１の分離で使用されるとき（「第１の遠心分離」と呼ぶ。）、第１の遠心分離の速度（即ち、相対遠心力又はＲＣＦ）は、複数の微生物及び細菌クラスター、例えばスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）により形成される細菌クラスターが懸濁液中に残ることができるよう十分に低い速度でありながら、真核細胞及び残滓を収集するのに十分高くなるように、優先的に設定される。一部の実施形態では、速度が好ましくは１０００ＲＣＦよりも下、例えば９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００又は１００ＲＣＦである。
【００３６】
溶解試薬は、例えば、下流のプロセスにより調べられることになる微生物を実質的に無傷のままにしながら、真核細胞及び真核細胞断片（例えば、血小板）を溶解することにより、非微生物汚染種の存在をさらに低減させるために第１の遠心分離後に任意選択的に使用されてもよい。溶解試薬という用語は、サポニン、塩化アンモニウム、トリトンＸ、ソルビタンエステル（例えば、Ｓｐａｎ）、ｔｗｅｅｎ及び非イオン性ポリオキシエチレン１０オレオイルエーテル界面活性剤（例えば、Ｂｒｉｊ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈにより商用化））を含むがこれらに限定されない１種以上の溶解試薬を包含することができる。溶解試薬はさらに、ポリアネトールスルホン酸ナトリウム（ＳＰＳ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、重炭酸カリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、エチレンジアミン四酢酸及びこの他の塩を含むがこれらに限定されない１種以上の追加の水溶性化合物を含んでいてもよい。溶解試薬による処理時間は、好ましくは２０分未満、最も好ましくは５分未満である。例示的な実施形態では、溶解剤は、サポニン、ＳＰＳ及びＰＰＧを含む。
【００３７】
第２の分離は、微生物種を、残りの汚染種並びに上述の任意選択的な溶解ステップの任意の副生成物から分離するように設計される。本開示の一部の実施形態では、第２の分離は、ＡＳＴなどの下流のアッセイ用の、微生物に富むインプット材料を生成し、この材料は、微生物密度の光学測定を妨げ得る又は微生物増殖に影響を及ぼし得る汚染種を実質的に含まない。遠心分離が第２の分離に使用されるとき、第２の遠心分離の速度は、微生物をペレット化するよう十分高くかつ最大限の微生物生存可能性を維持するよう十分に低く設定される。一部の実施形態では、速度は、１０００×ｇよりも大きい、例えば１１００、１２００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２３７０又は２５００×ｇのＲＣＦを生成する。
【００３８】
次いでペレットを、任意選択的に１回以上洗浄する。実用条件下での上澄みの除去は完全にすることができないので、洗浄は、血液培養物からの可溶性種並びに溶解試薬の濃度を減少させる。ペレットは、分離前に洗浄溶液に再懸濁されてもよい。洗浄溶液は、生理食塩液、緩衝剤又は増殖培地であってもよい。例示的な実施形態では、２回の洗浄が行なわれ、それぞれ、ペレットを再懸濁せずに１ｍＬの生理食塩液でなされる。第２の例示的な実施形態では、１回の洗浄が１ｍＬの生理食塩液で、洗浄緩衝剤にペレットを再懸濁して行なわれる。
【００３９】
遠心分離が使用されるとき、任意選択的な第３の及びさらなる遠心分離の速度は、第２の遠心分離の場合と任意選択的に同じである。
【００４０】
最終ペレットが、生理食塩液、緩衝剤、又は増殖培地中に再懸濁された後、細胞の定量を行なう。これは後続のＡＳＴが適切な細胞濃度で行なわれるのを、確実にするのに有益と考えられる。細胞は、光学密度又は比濁分析測定によって、好ましくは光学的に定量される。このような測定に十分な細胞の実現は、ＢＡＣＴＥＣ又はＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔボトルからのほとんどの陽性血液培養物からの出発試料体積２〜２０ｍｌ、好ましくは４〜１０ｍＬを必要とし得る。所望の最終細胞濃度は、当業者に公知のように、約０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄであると決定されてもよい。
【００４１】
例示的な実施形態では、第３又は第４の分離から得られるペレットが、１ｍＬの生理食塩液に再懸濁される。次いで光学密度（ＯＤ）測定を、５００ｎｍ〜７００ｎｍの１つ以上の波長で、分光光度計を使用して行なう。ＭｃＦａｒｌａｎｄ＞０．６５に対応する測定値が得られた場合、追加の生理食塩液を添加して試料を希釈してもよい。追加の生理食塩液の体積は、より大きい体積がより大きいＯＤ値のために添加されるように、ＯＤ測定によって決定されてもよい。次いで後続のＯＤ測定値が得られる。この測定及びその後の希釈プロセスは、１回以上行なわれてもよい。
【００４２】
例示的な実施形態では、０．５未満のＭｃＦａｒｌａｎｄに対応するＯＤ測定を希釈して０．２以下のＭｃＦａｒｌａｎｄ濃度を実現してもよい。次いでこの情報を、ＡＳＴプラットフォームに電子的に送って、適正な希釈がパネル接種中に実現されるのを確実にしてもよい。あるいは、０．５未満のＭａＦａｒｌａｎｄに対応するＯＤ測定値を、不十分な微生物が存在する使用者に対してフラグ付けしてもよい。
【００４３】
図５は、血液培養物からＭｃＦａｒｌａｎｄ懸濁液を生成する、例示的な方法の実用性を示す。
【００４４】
あるいは、再懸濁されたペレットの一定分量を作製し、その後に、細胞の定量を可能にする前駆体試薬で処理してもよい。このような試薬には、限定するものではないが、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、アクリジンオレンジ、ＲｅｄＳａｆｅ、４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール、臭化エチジウム、ＳＹＢＲグリーンＩ、ＳＹＢＲグリーンＩＩ、ルシフェリン及びレサズリンが含まれる。この実施形態では、溶解試薬の添加は必要でない可能性がある。
【００４５】
方法の重要性は、以下の同じステップでしかし異なる順序で得られた試料が、真核細胞及び残滓が十分に除かれたものではないという事実によって強調される：溶解試薬による試料処理、その後の低速スピン、その後に新鮮な管へ上澄みを移すこと、その後の、微生物をペレット化するための高速スピン、その後の任意選択的な洗浄及び細胞定量。結果を図１６Ｃに示す。
【００４６】
方法の重要性は、以下の同様のステップでしかし異なる順序で得られた試料が、真核細胞及び残滓が十分に除かれたものではないという事実によってさらに強調される：溶解試薬による試料処理、その後の、微生物をペレット化するための高速スピン、その後の上澄み除去及び洗浄溶液中でのペレット再懸濁、その後の低速スピン、その後に新鮮な管へ上澄みを移すこと、その後の、微生物のペレット化のための高速スピン、その後の任意選択的な洗浄及び細胞定量。結果を図１６Ｂに示す。
【００４７】
方法の重要性は、以下の同様のステップでしかし異なる順序で得られた試料が、真核細胞及び残滓が十分に除かれたものではないという事実によってさらに強調される：存在する全てのものを沈降させるための最高速度で試料をスピンさせ、異なる溶解試薬で処理し、その後の、微生物をペレット化するために高速スピン、その後の、上澄み除去及び洗浄溶液中でのペレット再懸濁、その後の、微生物をペレット化するための高速スピン、その後の、任意選択的な洗浄及び細胞定量。結果を図１６Ａに示す。
【００４８】
代替の実施形態では、試料を最初に、真核細胞を沈降させるのに十分なしかし微生物を沈降させるには不十分な速度、１０００ＲＣＦ未満で遠心分離する。上澄みを収集し、微生物を沈降するのに十分な速度、１０００ＲＣＦ超で遠心分離する。上澄みをデカンテーションし、管を反転させ、低速、１０００ＲＣＦ未満で遠心分離してペレットを乾燥させる。次いでペレットを、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス（ＭＨＢ）などの微生物増殖培地中に再懸濁し、「処理試料」を形成する。次いで光学密度、蛍光及び／又は比濁分析測定を行なって、細胞濃度を決定する。読取りが不十分な場合、追加のインキュベーションを行なってもよい。当技術分野で公知のように、十分な細胞濃度、例えば０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄ濃度が実現された後、試料の一定分量をカートリッジのウェルに採取してＡＳＴを行なってもよい。
【００４９】
代替の実施形態では、試料を最初に、全ての細胞を沈降させるのに十分な速度及び時間であって、より小さい細胞がより大きい細胞内の空間を通過してペレットの底部に至る速度及び時間、１０００ＲＣＦ超で５分超にわたり、遠心分離する。上澄みをデカンテーションし、大きい細胞ペレットを吸引する。残りのペレットを再懸濁し、真核細胞を沈降させるのに十分なしかし微生物を沈降させるのには不十分な速度、１０００ＲＣＦ未満で遠心分離する。上澄みを収集し、微生物を沈降させるのに十分な速度、１０００ＲＣＦ超で遠心分離する。次いでペレットを、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス（ＭＨＢ）などの微生物増殖培地に再懸濁し、処理試料を形成する。次いで光学密度、蛍光及び／又は比濁分析測定を行なって、細胞濃度を決定する。読取りが不十分である場合、追加のインキュベーションを行なってもよい。当業者に公知のように、十分な細胞濃度、例えば０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄ濃度が実現された後、試料の一定分量をカートリッジのウェルに採取してＡＳＴを行なってもよい。
【００５０】
代替の実施形態では、試料を、分離膜が取り付けられた管の内部に最初に置き、膜を通して試料を引き出すのに十分な速度で遠心分離し、細菌を膜の表面上に堆積する。次いで膜を、ＭＨＢなどの微生物増殖培地で洗浄して、堆積された細菌を再懸濁する。次いで光学密度、蛍光及び／又は比濁分析測定を行なって、細胞濃度を決定する。読取りが不十分な場合、追加のインキュベーションを行ってもよい。当業者に公知のように、十分な細胞濃度、例えば０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄ濃度が実現された後、試料の一定分量をカートリッジのウェルに採取してＡＳＴを行なってもよい。
【００５１】
本明細書又はそれ以外に記述される様々な実施形態において、ＡＳＴ用の患者由来の病原性微生物を含む試料を調製するための方法は、本明細書に記述される装置又はシステムを使用することによって、行なわれてもよい。図５を参照すると、自動化又は半自動化システムを使用して、方法のステップを行なってもよい。このシステムは、試料を収容するよう構成された試料管１００に、試料を移送するように構成された流体操作モジュール１０２を含んでいてもよい。流体操作構成要素は、自動化液体取扱い機又は同様のものであってもよい。流体操作構成要素は、流体、容器、管及び／又は試料が、操作者による取扱いをほとんど又は全く必要とせずに、自動的にシステム全体にわたって移動するよう構成されてもよい。この自動化は、労働時間及びエラーを低減させながら、スループットを増大させ得る。試料を含有する試料管１００は、遠心分離機１０４に移される。遠心分離機１０４は、遠心分離ローターの対称性に起因して平面が縦軸を含んでいるそのローターの平面に対して、９０°以外の角度で試料管を保持するように構成された、固定ローターを有する。角度は、ローターの平面に対して任意の角度、例えば約３０°、約４５°、約６０°などであってもよい。以下に記述されるように、本開示で利用される角度は、管の底部から離れて位置決めされた、十分画定されたペレットの形成をもたらし、問題となっている微生物材料の損失の過度なリスクなしに遠心分離後の流体の自動化吸引を可能にする。遠心分離機１０４は、所望の期間にわたって作動させる。遠心分離後、試料の流体の一部を試料管１００から取り出す。次いで溶解試薬の一部を試料管１００に添加する。次いで試料管１００をボルテクサー１０６に供して、試料管１００の内容物を撹拌し混合する。撹拌及び混合後、試料管１００を遠心分離機１０４に付加し、遠心分離に供する。分離後、試料管１００内に含有される流体の少なくとも一部を取り出す。次いで生理食塩液の一部を試料管１００に添加する。次いで試料管１００を遠心分離機１０４内に入れ、遠心分離に供する。分離後、試料管１００内に含有される流体の少なくとも一部を取り出す。次いで生理食塩液の一部を試料管１００に添加する。次いで試料管をボルテクサー１０６に供して、試料管１００の内容物を撹拌し混合する。撹拌及び混合後、試料管１００内の流体の実質的に全てをキュベット１０８に移す。次いで、細胞定量装置１１２、例えば分光計を使用して、キュベット１０８内の流体の吸光度メトリックを読み取る。次いでキュベット内の流体を、所望の希釈レベルに希釈する。次いでキュベット１０８内の流体を、細胞定量装置１１２によって測定して、キュベット１０８内の流体の濃度レベルを検証する。次いで流体を、キュベット１０８からアウトプット管１１０に移す。
【００５２】
本明細書又はそれ以外に記述される様々な実施形態では、ＡＳＴ用の患者由来の病原性微生物を含む試料を調製するための方法は、本明細書に記述される装置又はシステムを使用することによって、行なわれてもよい。図６は、試料を例えば試料管に移送するように構成された流体操作モジュール６０２を含む、ＡＳＴ用の患者由来の病原性微生物を含む試料を調製するための装置６００を示す。流体操作モジュール６０２は、遠心分離機６０６内に配置されてもよい。遠心分離機６０６は、その内部を貫通する縦軸ｌ及び縦軸に垂直な垂直軸ｎを備える固定ローターを有する。遠心分離機６０６は、垂直軸ｎに対して角度αで及び／又は縦軸ｌに対して別の角度βで、試料を受容する。角度α、βは任意の角度であってもよく、例えば約３０°、約６０°又は同様の角度である。ボルテクサー６１０は、軌道運動を与えて試料を振盪させるように、作動させてもよい。細胞定量装置６１２、例えば分光計を使用して、試料の吸光度メトリックを読み取ってもよい。
【００５３】
本開示の多くは、溶解試薬ステップを含む方法について論ずる。しかし本発明者らは、この溶解試薬ステップが省略される場合、得られる試料は例えば直接ＡＳＴ試験などの場合に適切となり得ることも見出しており、その場合、微生物濃度の光学定量を必要としない。そのような方法の例示的な実施形態では、遠心分離を使用して、ある特定の汚染種を分離してもよい（例えば、低速遠心分離ステップを使用して、凝塊材料又はその他の大きな細胞外残滓を低減させてもよく、かつ／又は高速遠心分離ステップを使用して、再懸濁用の微生物をペレット化してもよい。）。この場合、ラサズリンなどの１つ以上の実現可能なインジケーターで、ＡＳＴ用の細菌増殖を決定することが重要なことがある。例示的な方法は、参照により本明細書に組み込むＰＣＴ公開ＷＯ  ２０１８／１１９４３９、段落［０００８］〜［０１３４］に開示されている。
【００５４】
上述の例示的な実施形態は、一般に、分離のために遠心分離を利用している。しかし当業者なら、その他の分離手法が、本開示のある特定の実施形態に適合可能となり得ることを理解しよう。例えば本開示の一部の方法は、ＡＳＴによって調べられる微生物種を試料中の汚染種から分離するのに、濾過を利用してもよい。一部の実施形態では、第１の濾過ステップは、高い分子量カットオフを有していてもよい。ある場合には、第２の濾過ステップは、第１のものよりも低い分子量カットオフを有していてもよい。
【００５５】
前述の開示は、例えば患者試料からのＡＳＴのための微生物試料を調製するためのシステム及び方法の実施形態に焦点を当ててきた。当業者なら、上述の方法は、現在使用中のものに表面的には類似しているが、現行のＡＳＴ試料調製プロトコールに著しい遅れの一因となる技術的な難題を初めて克服する点で異なることを理解しよう。即ち本開示の方法は、プレート培養ステップを介在させる必要がない、迅速なＡＳＴのための高品質の定量可能なインプット材料をもたらす。重要なのは、一方で、同様にサイズが決められた真核細胞及び残滓から微生物及び細菌クラスターを分離することも可能になることである。第１の分離において、速度は、真核細胞及び残滓を収集するよう十分に高く、それと共に、微生物及び細菌クラスター、例えばスタフィロコッカス・アウレウスによって形成されたものが懸濁液中に残るよう十分に低い。スタフィロコッカス・アウレウスなどの細菌は凝集する傾向があり、したがってそのサイズは、望ましくない真核細胞又は断片（例えば、血小板）に類似し得る。したがって、初期低速遠心分離後に残る真核細胞の脂質膜を破壊することになる溶解試薬が導入され、第２のより速い分離ステップでそれらの除去が可能になり、ＡＳＴなどの下流のアッセイ用の微生物に富むインプット材料を生成することができ、これは微生物密度の光学測定を妨げ得る又は微生物増殖に影響を及ぼし得る汚染種を実質的に含まないものである。
【００５６】
上記にて論じたように、方法は、ステップ自体並びにそれらが行なわれる順序の両方で明確に区別される。このことは、これらの方法の独創的性質を強調するが、それはステップのこの組合せを通してのみ、プレート培養ステップを介在させる必要性を取り除くことができ、試料中に存在する微生物を培養するのに費やされる時間及び資源の必要性、類似のシステムの現行の障害がなくなるからである。
【００５７】
微生物
感染は、微生物由来の任意の感染因子、例えば細菌、真菌細胞、古細菌及び原生動物を含むことができる。一部の実施例では、感染因子は細菌、例えばグラム陽性菌、グラム陰性菌及び非定型細菌である。抗菌耐性微生物は、抗菌剤、即ち抗細菌薬、抗真菌薬、抗古細菌医薬及び抗原生動物薬に対して耐性のある微生物とすることができる。
【００５８】
微生物（例えば、微生物の液体懸濁液）は、微生物の１つの株を含んでいてもよい。微生物は、微生物の１種を含んでいてもよい。微生物は、微生物の１株よりも多くの株を含んでいてもよい。微生物は、微生物の１目を含んでいてもよい。微生物は、微生物の１綱を含んでいてもよい。微生物は、微生物の１科を含んでいてもよい。微生物は、微生物の１界を含んでいてもよい。
【００５９】
微生物（例えば、微生物の液体懸濁液）は、１株よりも多くの微生物の株を含んでいてもよい。微生物は、１種よりも多くの微生物の種を含んでいてもよい。微生物は、１属よりも多くの微生物の属を含んでいてもよい。微生物は、１目よりも多くの微生物の目を含んでいてもよい。微生物は、１綱よりも多くの微生物の綱を含んでいてもよい。微生物は、１科よりも多くの微生物の科を含んでいてもよい。微生物は、１界よりも多くの微生物の界を含んでいてもよい。
【００６０】
微生物は、細菌であってもよい。細菌の例には、限定するものではないが、アセトバクター・アウランティウス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｒａｎｔｉｕｓ）、アシネトバクター・ビチュメン（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂｉｔｕｍｅｎ）、アシネトバクター属種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、アクチノマイセス・イスラエリイ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ）、アクチノマイセス属種（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、アエロコッカス属種（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アナプラズマ（Ａｎａｐｌａｓｍａ）、アナプラズマ・ファゴシトフィリウム（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）、アゾリゾビウム・カウリノダンス（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ）、アゾトバクター・ヴィネランディイ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バシルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バシルス・ブレヴィス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バシルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バシルス・フシフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）、バシルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バシルス・ミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バシルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、バシルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、バクテロイデス・フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス・ギンギバリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、バクテロイデス・メラニノゲニカス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ）（プレボテラ・メラニノゲニカ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ）としても公知である。）、バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、バルトネラ・ヘンセラエ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ）、バルトネラ・クウィンタナ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｑｕｉｎｔａｎａ）、バルトネラ属種（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ボルデテラ・ペルタスシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボルデテラ属種（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、ブルセラ・アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉ��ｅｎｓｉｓ）、ブルセラ属種（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ブルセラ・スイス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ）、ブルクホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、ブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、ブルクホルデリア・マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ）、ブルクホルデリア・シュードマレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、カリマトバクテリウム・グラニュロマチス（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・フィータス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｔｕｓ）、カンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ピロリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、カンピロバクター属種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、クラミジア属種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｐ．）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミドフィラ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、クラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（以前はクラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と呼ばれた。）、クラミドフィラ・プシッタチ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）（以前はクラミジア・プシッタチ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）と呼ばれた。）、クラミドフィラ属種（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｓｐｐ．）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、クロストリジウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）（以前はクロストリジウム・ウェルチイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｗｅｌｃｈｉｉ）と呼ばれた。）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム・フシフォルメ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ）、コリネバクテリウム属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、コキシエラ・ブルネチイ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、エーリキア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、エーリキア属種（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）、エンテロバクター・クロアセ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター属種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス・アビウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｖｉｕｍ）、エテロコッカス・デュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｕｒａｎｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガルリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・マロラタス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｌｏｒａｔｕｓ）、エンテロコッカス属種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、フランシセラ属種（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ガルデネレラ属種（Ｇａｒｄｅｎｅｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ガルデネレラ・ヴァギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ヘモフィリウス属種（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｕｓ  ｓｐｐ．）、ヘモフィリウス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘモフィリウス・ダクレイイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）、ヘモフィリウス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィリウスパラインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィリウス・ペルタッシス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ヘモフィリウム・ヴァギナリス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、ヘリコバクター属種（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバシルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバシルス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバシルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバシルス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ラクトバシルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、レジオネラ属種（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、レプトスピラ属種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア属種（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐ．）、メタノバクテリウム・エクストロケンス（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｒｏｑｕｅｎｓ）、ミクロバクテリウム・マルチフォルメ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）、モラキセラ・カタラリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、マイ���バクテリウム・ジフテリエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、マイコバクテリウム・イントラセルラレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム・レプレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、マイコバクテリウム・レプレエムリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、マイコバクテリウム属種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、マイコバクテリウム・ツベルキュロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・ペネトランス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ属種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ナイセリア・ゴノリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ナイセリア属種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐｐ．）、ノカルディア属種（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐｐ．）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、パスツレラ属種（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、パスツレラ・ツラレンシス（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ポルフィロモナス・ギンギバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、プレボテラ・メラニノゲニカ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ）（以前はバクテロイデス・メラニノゲニカス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ）と呼ばれた。）、
プロテウス属種（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐｐ．）、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）、リゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、リケッツィア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、リケッツィア・プロワゼスキイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、リケッツイア・プシッタチ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、リケッツイア・クウィンタナ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｑｕｉｎｔａｎａ）、リケッツィア・リケッツィ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、リケッツィア属種（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ．）、リケッツィア・トラコーメ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｅ）、ロシャリメア（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）、ロシャリメア・ヘンセラ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ）、ロシャリメア・クウィンタナ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ  ｑｕｉｎｔａｎａ）、ロシア・デントカリオサ（Ｒｏｔｈｉａ  ｄｅｎｔｏｃａｒｉｏｓａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、サルモネラ・ティフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シゲラ・ディセンテリエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、シゲラ属種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、スピリルム・ボルタンス（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｖｏｌｕｔａｎｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス属種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、ステノトロホモナス属種（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・アビウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｖｉｕｍ）、ストレプトコッカス・ボヴィス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｕｓ）、ストレプトコッカス・ファセイウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｃｅｉｕｍ）、ストレプトコッカス・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・フェルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｒｕｓ）、ストレプトコッカス・ガリナルム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ストレプトコッカス・ラクティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ストレプトコッカス・ミチオル（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｏｒ）、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・オラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ラッタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｔｔｕｓ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・サングィス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ）、ストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、トレポネマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、トレポネマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、トレポネマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、トレポネマ属種（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐｐ．）、ウレアプラズマ属種（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・コンマ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｏｍｍａ）、ビブリオ・パラヘモリティカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ビブリオ属種（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．）、ビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、ビリダンス・ストレプトコッキ（ｖｉｒｉｄａｎｓ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ウォルバキア（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、エルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、エルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、エルシニア・シュードツベルキュロシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．）及びエルシニア属種（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐｐ．）が含まれる。
【００６１】
微生物は、真菌であってもよい。真菌の例には、限定するものではないが、アスペルキルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ブラストマイセス属種（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、カンジダ属種（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．）、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コッキジオイデス属種（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．）、クリプトコッカス属種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、エクセロイラム（Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ）、フサリウム（ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ヒストプラズマ属種（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）、イッサチェンキア属種（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｓｐｐ．）、ムコルマイセテス（ｍｕｃｏｒｍｙｃｅｔｅｓ）、ニューモシスティス属種（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐｐ．）、リングワーム（ｒｉｎｇｗｏｒｍ）、セドスポリウム（ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、スポロトリックス（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）及びスタキボトリス属種（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｓｐｐ．）が含まれる。微生物は、原生動物であってもよい。原生動物の例には、限定するものではないが、エントアメーバヒストリチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、プラスモジウム属種（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ジアルジア・ラムブリア（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）及びトリパノソマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）が含まれる。
【００６２】
抗菌剤
微生物が細菌である場合、例示的な抗菌剤には、アミカシン、アミノグリコシド、アミノグリコシドアモキシリン、アミノグリコシド、アモキシリン、アモキシリン／クラブラン酸、アムピシリン、アムピシリン／スルバクタム、アンチトキシン、アルスフェナミン、アジスロマイシン、アズロシリン、アズトレオナム、β−ラクタム、バシトラシン、カプレオマイシン、カルバペネム、カルベニシリン、セファクロル、セファドロキシル、セファレキシン、セファロシン、セファロチン、セファマンドール、セファゾリン、セフジニル、セフジトレン、セフェピム、セフィキシム、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフォキシチン、セフポドキシム、セフプロジル、セフタロリン、セフタロリンフォサミル、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトビプロール、セフトリアキソン、セフロキシム、セファロスポリン、クロラムフェニコール、クロラムフェニコール（Ｂｓ）、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、クロファジミン、クロキサシリン、コリスチン、コ−トリモキサゾール、シクロセリン、ダルババンシン、ダプソン、ダプトマイシン、デメクロシクリン、ジクロキサシリン、ジリスロマイシン、ドリペネム、ドキシシクリン、エノキサシン、エルタペネム、エリスロマイシン、エタムブトール、エタムブトール（Ｂｓ）、エチオナミド、フルクロキサシリン、フルオロキノロン、フルオロキノロンズ、ホスフォマイシン、フラゾリドン、フシジン酸、ガチフロキサシン、ゲルダナマイシン、ゲミフロキサシン、ゲンタマイシン、グレパフロキサシン、ハービマイシン、イミペネム／シラスタチン、イソニアジド、カナマイシン、レボフロキサシン、リンコマイシン、リネゾリド、ロメフロキサシン、ロラカルベフ、マクロライド、マフェニド、メロペネム、メチシリン、メトロニダゾール、メズロシリン、ミノサイクリン、モキシフロキサシン、ムピロシン、ナフシリン、ナフシリン、ナリジクス酸、ネオマイシン、ネチルマイシン、ニトロフラントイン（Ｂｓ）、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オリタバンシン、オキサシリン、オキシテトラサイクリン、パルモマイシン、ペニシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリン、ピペラシリン／タゾバクタム、プラテンシマイシン、ポリミキシンＢ、ポシゾリド、ピラジナミド、キヌプリスチン／ダルフォプリスチン、ラデゾリド、ラキシバクマブ、リファブチン、リファムピシン、リファムピン、リファペンチン、リファキシミン、ロキシスロマイシン、銀スルファジアジン、スパルフロキサシン、スペクチノマイシン、スペクチノマイシン（Ｂｓ）、スピラマイシン、ストレプトグラミン、ストレプトマイシン、スルバクタム、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジメトキシン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファニリミド、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、スルホンアミドクリソイジン、テジゾリド、テイコプラニン、テイキソバクチン、テラバンシン、テリスロマイシン、テマフロキサシン、テモシリン、テトラサイクリン、チアムフェニコール、チカルシリン、チカルシリン／クラブラン酸、チカルシリン／クラブラン酸、チゲサイクリン、チゲサイクリ���（Ｂｓ）、チニダゾール、ＴＭＰ／ＳＭＸ、トブラマイシン、トレゾリド、トリメトプリム（Ｂｓ）、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、トロレアンドマイシン、トロバフロキサシン、バンコマイシン及びこれらの属又はこれらの変種が含まれる。
【００６３】
微生物とのその相互作用が、微生物表面上の負電荷に影響を及ぼしかつ微生物表面上の負電荷によって影響を受ける、抗菌剤には：細胞表面に結合するとＭｇ２＋イオンを変位させ、脂質膜成分を架橋し、それによって外膜を破壊しかつ薬物の取込みを強化する、ポリカチオン性アミノクリコシド；微生物細胞とのその結合が膜の負電荷にも依存しかつ変異及びプラスミド媒介型耐性が共に膜の負電荷を低減させることによって生ずる、カチオン性ポリミキシン（コリスチン及びポリミキシンＢ）；及び宿主自然免疫応答カチオン性抗菌剤ペプチドに似ておりかつその膜破壊を生じる動作メカニズムにＣａ２＋及びホスファチジルグリセロールを必要とし、その耐性は細胞表面電荷の変化も伴うことがあるリポペプチドである、ダプトマイシンを、含めることができる。
【００６４】
微生物が真菌である場合、例示的な抗菌剤には、５−フルオロシトシン、アバフンジン、アルバコナゾール、アリルアミン、アムホテリシンＢ、アンコボン、アニデュラフンジン、アゾール、ペルーバルサム、安息香酸、ビフォナゾール、ブトコナゾール、カンジシジン、カスポフンジン、シクロピロックス、クロトリマゾール、クレセムバ、クリスタルバイオレット、ジフルカン、エキノキャンジン、エコナゾール、エフィナコナゾール、エポキシコナゾール、フェンチコナゾール、フィリピン、フルコナゾール、フルシトシン、グリフルビンＶ、グリセオフルビン、グリス−ペグ、ハロプロジン、ハマイシン、イミダゾール、イサブコナゾール、イサブコナゾニウム、イソコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ラミシル、ルリコナゾール、ミカフンジン、ミコナゾール、ナタマイシン、ノキサフィル、ナイスタチン、オモコナゾール、オンメル、オラビグ、オキシコナゾール、ポサコナゾール、プロピコナゾール、ラブコナゾール、リモシジン、セルタコナゾール、スポラノックス、スルコナゾール、テルビナフィン、テルコナゾール、チアゾール、チオカルバメート抗真菌剤、チオコナゾール、トルナフェート、トリアゾール、ウンデシレン酸、ブイフェンド、ボリコナゾール、及びこれらの属又はこれらの変種が含まれる。
【００６５】
微生物が原生生物の場合、例示的な抗菌剤には、８−アミノキノリン、アセタルゾル、アメーボゾアに対する薬剤、アイラントン、アモジアキン、アムホテリシンＢ、アムプロリウム、抗トリコモナス剤、アプラスモマイシン、アルスチノール、アルテリン酸、アルテメザー、アルテメザー／ルメファントリン、アルテミシニン、アルテモチル、アルテロラン、アルテスネート、アルテスネート／アモジアキン、アトバクオン、アトバクオン／プログアニル、アザニダゾール、アジスロマイシン、ベンズニダゾール、ブロキシキノリン、ブパルバクオン、カルバルゾン、カルニダゾール、キニオフォン、クロロキン、クロルプログアニル、クロルプログアニル／ダプソン、クロルプログアニル／ダプソン／アルテスネート、クロルキナルドール、クロマルベオレート抗寄生虫薬、シンコナ、シパルガミン、クラズリル、クレファミド、クリオキノール、コッキジオスタット、コジネオプシン、コトリファジド、クリプトレピン、シクログアニル、デヒドロメチン、ジフェタルゾン、ジヒドロアルテミシニン、ジロキサニド、ジミナゼン、ジスルフィラム、ドキシサイクリン、エフロルニチン、ＥＬＱ−３００、エメチン、エトファミド、エクスカバタ抗寄生虫薬、フマギリン、フラゾリドン、グリコビアルゾール、ＧＮＦ６７０２、ハロファントリン、ヒドロキシクロロキン、イミドカルブ、イプロニダゾール、キナノキ属の樹皮（Ｊｅｓｕｉｔ’ｓ  ｂａｒｋ）、ＫＡＦ１５６、ルメファントリン、マデュラマイシン、メフロキン、メガゾール、アンチモン酸メグルミン、メラルソプロール、メパクリン、メトロニダゾール、ミルテフォシン、ニューロレニンＢ、ニカルバジン、ニフルチモックス、ニモラゾール、ニタルゾン、ニチジン、ニトロフラール、オリバシン、オルニダゾール、オロイジン、パマキン、パルモマイシン、ペンタミジン、５価アンチモニアル、ファンキノン、フェナミジン、ピペラキン、プリマキン、プログアニル、プロジェクト５２３、プロペニダゾール、ピリメタミン、ピロナリジン、クィンファミド、キニン、ロニダゾール、スケジュラ・ロマナ（Ｓｃｈｅｄｕｌａ  Ｒｏｍａｎａ）、ＳＣＹＸ−７１５８、セクニダゾール、セマピモド、スチボグルコン酸ナトリウム、スピロインドロン、スルファドキシン、スルファドキシン−ピリメタミン、スルファレン、スラミン、タフェノキン、テクロザン、テノニトロゾール、チルブロキノール、チニダゾール、トリメトレキセート、殺トリマノソーマ剤、Ｗａｒｂｕｒｇのチンキ及びこれらの属又はこれらの変種が含まれる。
【００６６】
抗菌剤は、本明細書に列挙される薬物に類似のメカニズムによって動作する薬物であってもよい。当技術分野で公知のその他の抗菌薬が、本明細書に記述される方法で使用されてもよい。
【００６７】
液体懸濁液
液体は、カチオン調整されたＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎブロスなどの増殖培地を含んでいてもよい。この培地は、微生物増殖及び安定性を促進させることが当業者に公知の添加剤を含んでいてもよい。種々の抗菌剤に加え、種々の試験ウェルは、特定の抗菌剤に関してＡＳＴ精度を改善することがわかっている添加剤を含んでいてもよい。例えば、追加の塩化ナトリウムを、オキサシリンを含む試験薬に添加してもよく、追加のカルシウムを、ダプトマイシンを含む試験薬に添加してもよい。
【００６８】
生体試料
本明細書に記述される微生物は、生体試料から誘導されてもよい。一部の実施形態では、生体試料は、微生物、例えば細菌及び真菌細胞を含む任意の試料である。生体試料は、臨床試料から誘導されてもよい。
【００６９】
例示的な生体試料には、限定するものではないが、全血、血漿、血清、痰、尿、便、白血球、赤血球、バフィーコート、涙、粘液、唾液、精液、膣液、リンパ液、羊水、脊椎又は脳脊髄液、腹膜滲出液、胸膜滲出液、滲出液、穿刺液、上皮スメア、生検、骨髄試料、嚢胞又は膿瘍からの流体、滑液、硝子体又は房水、眼の洗浄液又は吸引液、気管支肺胞洗浄液、気管支洗浄液又は肺洗浄液、肺吸引液、並びに器官及び組織であって、限定するものではないが、肝臓、脾臓、腎臓、肺、腸、脳、心臓、筋肉及び膵臓などを含めたもの、スワブ（限定するものではないが、創傷スワブ、頬側スワブ、喉スワブ、鼻スワブ、膣スワブ、尿道スワブ、子宮頸スワブ、直腸スワブ、病変スワブ、膿瘍スワブ、鼻咽頭スワブ及び同様のものが含まれる。）及びこれらの任意の組合せを含めることができる。細菌培養物又は細菌単離物、真菌培養物又は真菌単離物も含まれる。当業者なら、単離物、抽出物、又は上記例示的な生体試料のいずれかから得られた材料も、本発明の範囲内にあることも理解し得る。
【００７０】
生体試料から得られた微生物は、培養されてもよく又は当技術分野で通常行なわれるように処理されてもよい。
【００７１】
ＡＳＴ法で使用される対照
対照は、微生物が影響を受け難い抗菌剤を含んでいてもよい。例として、アッセイがグラム陽性菌の感受性を決定するのに使用される場合、対照（及び試験のインキュベーション）は、グラム陰性菌を標的とする１種以上の抗菌剤を含んでいてもよく、アッセイが、真核微生物の感受性を決定するのに使用される場合、対照（及び試験のインキュベーション）は、１種以上の抗菌性の抗菌剤を含んでいてもよい。
【００７２】
一部の実施形態では、対照は、抗菌剤がないこと又は微生物が影響を受け難い１種以上の抗菌剤があること以外、その他の点では同一の条件下で微生物から測定された正の制御である。一部の実施形態では、対照は、栄養素がないこと以外、その他の点では同一の条件下で微生物から測定される。一部の実施形態では、対照は、微生物の増殖を阻害することが公知である１種以上の毒素がある、その他の点では同一の条件下で、微生物から測定される。
【００７３】
対照は、過去に得られた（ｈｉｓｔｏｒｉｃ）対照であってもよい。一部の実施形態では、試験のインキュベーションは、対照インキュベーションが行なわれた後に行なわれる。一部の実施形態では、対照は、試験インキュベーションを含むカートリッジとは区別されるカートリッジで行なわれる。
【００７４】
カートリッジ
カートリッジは、微生物の液体懸濁液を保持し増殖させることが可能な容器とすることができる。カートリッジの非限定的な例には、培養フラスコ、培養皿、ペトリ皿、バイオアッセイ皿、培養管、試験管、微量遠心管、瓶、マイクロチャンバープレート、多重チャンバープレート、マイクロタイタープレート、マイクロプレートを含めることができる。カートリッジは１つのチャンバーを含んでいてもよい。カートリッジは複数のチャンバーを含んでいてもよく、各チャンバーは、別の空間から物理的に単離された状態で液体懸濁液を保持することが可能な空間であってもよく；チャンバーの例は、マルチウェルプレート内のチャンバーである。カートリッジは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、４８、９６、１９２、３８４、１５３６又はそれよりも多くのチャンバー、及びそれらの間の任意の数のチャンバーを含んでいてもよい。カートリッジチャンバーの底部は、平らであっても、丸くても、Ｖ字形であってもよい。
【００７５】
カートリッジ上の複数のチャンバー内に存在する抗菌剤は、媒体に懸濁することができる。一部の実施形態では、抗菌剤は、抗菌被膜の形で存在する。ある特定の実施形態では、抗菌剤は固体形態にある。一部の実施形態では、固体抗菌剤は凍結乾燥されかつ／又は乾燥される。ある特定の実施形態は、微生物の懸濁液の導入前に、抗菌被膜として、固体形態で、凍結乾燥され又は乾燥させて、１つ以上のカートリッジチャンバーに存在する１種以上の抗菌剤を提供する。
【００７６】
抗菌希釈系列は、試料によるプレート接種前に、凍結されても、凍結乾燥されても、又は新鮮に調製されてもよい。ある場合には、カートリッジの接種は、手で又は自動化システムを使用して行なうことができる。新鮮な抗菌プレートの場合などの一部の実施例では、自動化液体取扱いシステムを使用して、抗菌剤希釈系列を持つカートリッジを調製してもよい。接種プロセスは、当技術分野で公知であり得る様々なプロセスのいずれかを含むことができる。
【００７７】
本明細書に記述されるように、カートリッジは、チェックポイントアッセイ及び複数の異なる増殖アッセイなど、多数の試験順序を実施するために、流体の様々な組合せを含有するのに使用することができる。一部の実施形態では、カートリッジは、１つ以上のチェックポイントアッセイを容易にするのに使用されるひと組のチャンバー、及び１つ以上の増殖アッセイを容易にするのに使用されるひと組のチャンバーを有する。例として、カートリッジは、行及び列に配置構成されたチャンバーのアレイを含むことができる。カートリッジは、ひと組の対照チャンバー及びひと組の抗菌剤試験チャンバーを含むことができる。対照チャンバーの組は２つのチャンバーを含むことができ、試験チャンバーの組は、プレートに沿ってチャンバーの残りを含むことができる。一部の実施形態では、対照チャンバーの組は少なくとも２つのチャンバーを含み、１つのチャンバーが増殖チャンバーであり別のチャンバーが非増殖チャンバーである。一部の実施形態では、増殖チャンバーは、患者試料中の微生物を、インキュベーション期間中にブロス内で増殖させることができるように、ブロスと患者試料との組合せを含み又は含むように接種される。ある特定の実施形態では、抗菌剤は、チェックポイントアッセイチャンバーに添加されない。それに対して、一部の実施形態では、非増殖チャンバーは、患者試料なしでブロスを含む又は含むように（即ち、患者試料からの微生物が不在のブロス）接種することができる。一部の実施形態では、抗菌剤も非増殖チャンバーに添加されない。したがってインキュベーション期間中、非増殖チャンバーは、微生物が増殖できる増殖チャンバーと比較して、ベースラインとして働くことができる。
【００７８】
一部の実施形態では、各カートリッジは、「試験パネル」、各抗菌剤に定められた希釈系列（例えば、２倍希釈系列、１０倍希釈系列など）で多数のウェル全体にわたり分布された複数の抗菌剤を含む。さらに、各カートリッジ又は試験パネルは、増殖対照チャンバー、非増殖（汚染）対照チャンバー及び／又は生理食塩液対照チャンバーなどの対照チャンバーを含有することができる。生理食塩液対照チャンバーは、接種物中の微生物の初期濃度にほぼ等しいＦＩＴ対照を表すことができる。カートリッジは、カバー（例えば、取外し可能な蓋）、及び抗生剤構成及び独自のコードを独自に定める識別子（例えば、バーコード）であってプレートを定めかつＨＩＰＡＡに準拠する独自の患者試料に関連付けることができる識別子を備えた、多数のチャンバー（例えば、９６チャンバーカートリッジ又は３８４チャンバーカートリッジ）を含むことができる。
【００７９】
試験チャンバーは、患者試料の様々な組合せのうちの任意の組合せ、並びに感受性を分析できる様々なタイプ及び濃度の抗菌剤を含むことができる。チャンバーの行は、特定の抗菌剤に特化させることができ、その抗菌剤の濃度は、同じ行の列同士の間で変えることができる。例えばカートリッジは、ペニシリンを含有するチャンバーの行を有することができ、各チャンバーは左から右に、増大する濃度のペニシリンを含有する。
【００８０】
当然ながら、その他の実施例が可能である。例えば、種々のチャンバー及びチャンバーの組を、カートリッジに沿った様々な場所のいずれかに位置決めすることができる。さらに、種々の組のチャンバー（例えば、対照チャンバー及び試験チャンバー）は、カートリッジに沿って、より多くの又はより少ない個々のチャンバーを含むことができる。さらに、場合によっては、全てではないチャンバーが試験中に使用され／占有される。
【００８１】
自動化ＡＳＴ法
本明細書に記述される方法は、市販の設備、特注された設備又はこれらの組合せを使用して、自動化された手法で行なうことができる。方法の自動化は、より多くの数のアッセイの性能並びにアッセイ間で増大した一貫性を可能にする。自動化は、これらの方法の速度及び分解能も増大させることができる。
【００８２】
表面結合プローブアッセイ
表面結合アッセイ（表面結合プローブアッセイとも呼ぶ。）は、シグナル生成剤を利用することができる。シグナル生成剤は、典型的には、微生物に結合することが可能な部分（例えば、微生物表面に結合する抗体及び／又はレクチン、微生物表面に非特異的に結合する荷電部分及び／又は機能的部分）、及びシグナルを提供すること又はシグナルの生成に寄与することが可能な化学的部分（例えば、酵素化学発光団及びランタニドキレート）を含む。例示的な酵素には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ラクタマーゼ及びこれらの組合せが含まれる。
【００８３】
シグナル発生物質には、１種以上の微生物受容体にコンジュゲートされた１種以上の化学部分を含めてもよい。シグナル発生物質には、限定するものではないが、１種以上の触媒（酵素、金属酸化物ナノ粒子、有機金属触媒、シグナル増幅のために設計されたナノ粒子（本出願が優先権を主張しかつ参照によりそれらの全体を本明細書に組み込む、米国仮出願に記載されたものなど）、シグナル発生要素を含むバクテリオファージ、蛍光団（有機蛍光団、ユーロピウム、又はルテニウム（ＩＩ）、レニウム（Ｉ）、白金（ＩＩ）、白金（ＩＩ）含有有機金属を含む。）、及び／又は比色性色素（有機染色を含む。））が含まれる。ナノ粒子、デンドリマー及び／又はその他のナノスケール構造であって酵素、蛍光団及び／又は有機金属分子を含むものなど、上記の組合せが使用されてもよい。
【００８４】
化学的部分は、シグナル生成剤を微生物に接触させる前に、シグナル生成剤にコンジュゲートされてもよく、一方、シグナル生成剤は、最初に微生物に接触され又はシグナル生成剤が微生物に接触した後に接触される。
【００８５】
シグナル生成剤が、微生物を含有するＡＳＴ希釈物に添加されるとき、シグナル生成剤受容体（例えば、特異的に又は非特異的に微生物に結合することができる部分）は、微生物表面に会合する可能性がある。このように微生物が、例えば溶液中にあるときにより無傷であるほど、これらの細菌に会合することになるシグナル生成剤の数は多くなる。その結果、無傷の細菌の数と、無傷の細菌に結合していないものとして定義される、溶液中で遊離しているシグナル生成剤の数との間には、逆の関係がある。遊離シグナル生成剤は、例えば抗菌処理に応答して微生物が溶解する場合、可溶性微生物成分に結合され得ることに留意されたい。
【００８６】
微生物表面に会合するかつ／又は微生物表面にインターカレートするシグナル生成剤の数は、微生物表面積に比例する。微生物表面積は、真に耐性のある微生物に強力に関連付けられる。特に、抗菌剤のＭＩＣ−及びサブ−ＭＩＣ濃度に応答して膨潤し又は延びる微生物の場合（例えば、フィラメント形成細菌）、代謝及び／又は体積による同定は、６時間未満のものと定義される、高速ＡＳＴ時点での偽感受性プロファイルを与えることがわかっている。この制約を克服するために、本発明は、微生物表面積（体積ではない）を、光シグナルなどの測定可能なシグナルに変換する。本明細書に記述される方法は、６時間未満で微生物耐性プロファイルを正確に決定することができる。
【００８７】
遊離シグナル生成剤から、微生物に会合したかつ／又は微生物にインターカレートされたシグナル生成剤を分離するために、１つ以上の分離及び／又は競合結合ステップを行なうことが必要なことがある。そのようなステップには、限定するものではないが、遠心分離（例えば、ｇ力が５００×ｇ超）、濾過（例えば、０．４５ミクロン以下の又は０．２ミクロン以下の細孔を有するフィルターを介する。）、電気泳動、及び／又は磁気捕捉が含まれ；そのようなステップは当業者に周知である。
【００８８】
シグナル生成剤の結合を促進させかつ／又はバックグラウンドを低減するために、シグナル生成剤を添加する前に、微生物を、インキュベーション中にそれらが懸濁された液体から分離することが、さらに有利なことがある。そのような分離には、限定するものではないが、遠心分離、濾過、電気泳動及び／又は磁気捕捉が含まれてもよい。
【００８９】
シグナル生成剤は、ＡＳＴインキュベーション期間の全体にわたってそれらが存在するように、微生物及び／又は抗菌剤と一緒に添加されてもよい。この全期間は、最長で２４時間、又は８時間以内、又は５時間以内であってもよい。あるいは、シグナル生成剤は、規定されたインキュベーション期間後に、微生物及び抗菌剤に添加されてもよい。この期間は、最長で２４時間、又は８時間以内、又は４時間以内であってもよい。
【００９０】
シグナル生成剤は、壁及び／又は膜を含む微生物表面に会合するようにかつ／又はインターカレートされるように設計される。会合のために設計されたシグナル生成剤は、１種以上の抗体、レクチン、その他のタンパク質、１つ以上の荷電化学基を持つ小分子、１つ以上の官能化学基を持つ小分子、ファージ、糖タンパク質、ペプチド、アプタマー、荷電小分子、固定電荷を持つ小分子、荷電ポリマー、固定電荷を持つ荷電ポリマー、疎水性小分子、荷電ペプチド、固定電荷を持つ荷電ペプチド、親水性領域と疎水性領域とが交互に配されたペプチド、及び／又は小分子リガンドであって、有機金属錯体であってもそうでなくてもよいものを含むが、これらに限定されない結合部分を含む。微生物との会合のために設計された分子は、当業者に周知である。シグナル生成剤は、微生物に結合したままであってもよく、かつ／又は内在化してもよく、したがって全ての会合が含まれる。インターカレーション用に設計されたシグナル生成剤には、小さい疎水性分子、疎水性ペプチド、及び／又は疎水性領域と親水性領域とが交互に配されたペプチドが含まれてもよいがこれらに限定するものではない。微生物のインターカレーション用に設計された分子は、当業者に周知である。シグナル生成剤はさらに、微生物の１つ以上のタイプに特異的であってもよい。シグナル生成剤は、多数の受容体を有していてもよい。これらは、結合を強化してもよく、かつ／又は２種以上の微生物との同時結合を可能にしてもよく、そのことがさらに、細菌を凝集させる働きをし得る。シグナル生成剤の添加の前に又は同時に、溶液ｐＨを調整することが有利なことがある。これは微生物とシグナル生成剤との間の電荷−電荷相互作用を強化するのに有益なことがある。微生物のアニオン電荷は、溶液ｐＨを中性よりも上（より塩基性）に滴定することによって増加され得る。したがって、１つ以上の固定されたカチオン電荷を持つ部分を利用することが有利なことがある。
【００９１】
シグナル生成剤が、微生物特異的に結合し得ること（例えば、微生物種又は微生物の株に特異的に結合する抗体）又は微生物に非特異的に結合し得ること（例えば、当技術分野で公知の、包括的な共有又は非共有結合の形成及び別の非特異的な化学的会合による。）は、注目に値する。
【００９２】
あるいは、シグナル生成剤に会合することが可能な化学物質及び／又は生化学物質が、微生物が増殖中に懸濁される液体に添加されてもよく、したがって化学物質及び／又は生化学物質は、インキュベーション中に微生物に組み込まれるようになる。これは微生物に対するシグナル生成剤の会合を強化する役割をすることができる。代替の実施形態では、シグナル生成剤そのものは、インキュベーション中に微生物が懸濁された液体中に存在してもよく、増殖中の微生物に組み込まれてもよい。
【００９３】
シグナル生成剤は増幅シグナル発生物質（増幅基）を含むことができ、したがってそれぞれの無傷の微生物からのシグナルは、各微生物に会合したシグナル生成剤の数を超えて増幅できるようになる。例えば、酵素ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、シグナルを１×１０４超倍増幅できることが公知である。したがって、１００個のＨＲＰ分子が各微生物表面に結合した場合、１０６の増幅が実現され得る。このことは、通常なら識別することができない微生物濃度の区別を可能にすることによって、ＡＳＴ決定がなされ得る速度を増大させ得る。欧州処方の使用は同様にシグナル増幅をもたらす。
【００９４】
あるいは、シグナル生成剤は、細胞膜など疎水性領域へのインターカレーションにより蛍光放出を大幅に増大させるよう設計された膜色素として、当業者に公知である光学色素前駆体を含んでいてもよい。これらのシグナル生成剤と共に設計されたアッセイは、容易に光学的に測定されるよう十分なシグナルを生成するために、平面に近付いた、より小さい体積に濃縮される微生物を必要とし得る。干渉種は、近ＩＲ蛍光団の使用を必要とし得る。
【００９５】
例示的な増幅基には、例えば、そのそれぞれの全体を参照により組み込む国際公開Ｎｏ．ＷＯ  ２０１６／０１５０２７及び国際出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ１６／４２５８９に記載されたものが含まれる。増幅基は、触媒、蛍光団、比色性色素、酵素、触媒又はナノ粒子を含むことができる。例示的な蛍光団は、その全体を参照により組み込む国際出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ１６／４２５８９の図７、表１に記載されるものを含む。増幅基は、ランタニド含むことができる。ランタニドには、限定するものではないが、ユーロピウム、ストロンチウム、テルビウム、サマリウム又はジスプロシウムが含まれる。
【００９６】
増幅基は、有機蛍光団、例えば配位錯体を含むことができる。配位錯体は、ユーロピウム配位錯体、ルテニウム配位錯体、レニウム配位錯体、パラジウム配位錯体、白金配位錯体とすることができる。増幅物質は、化学発光団、量子ドット、酵素、鉄配位触媒、ユーロピウム配位錯体、ルテニウム配位錯体、レニウム配位錯体、パラジウム配位錯体、白金配位錯体、サマリウム配位錯体、テルビウム配位錯体又はジスプロシウム配位錯体を含むことができる。
【００９７】
一部の実施形態では、増幅基は：
【００９８】
【化１】
2021514653.tif 000003
である部分を含む。
【００９９】
一部の実施形態では、増幅基は：
【０１００】
【化２】
2021514653.tif 000004
2021514653.tif 000005
である部分を含む。
【０１０１】
増幅基は、蛍光団又は比色性色素を含むことができる。適切な蛍光団及び比色性色素は、当業者に周知であり、それらの全体を参照により本明細書に組み込むＴｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）  Ｈａｎｄｂｏｏｋ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１版（２０１０）並びにＧｏｍｅｓ、Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ及びＬｉｍａ  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５（２００５）  ４５〜８０頁に記載されている。例示的な蛍光団は、例えば、そのそれぞれの全体を参照により組み込む国際公開Ｎｏ．ＷＯ  ２０１６／０１５０２７及び国際出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ１６／４２５８９に記載されたものも含む。
【０１０２】
適切な蛍光団又は比色性色素の例には、限定するものではないが、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、ＳＹＴＯＸグリーン、フェナントリジン、アクリジン、インドール、イミダゾール、シアニン、ＴＯＴＯ、ＴＯ−ＰＲＯ、ＳＹＴＯ、５−カルボキシ−２，７−ジクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、５−カルボキシナフトフルオレセイン、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、５−ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセイン）、５−ＨＡＴ（ヒドロキシトリプタミン）、５−ＲＯＸ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、６−カルボキシローダミン６Ｇ、７−アミノ−４−メチルクマリン、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン、９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン、ＡＣＭＡ（９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン）、アクリジン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ、アリザリン、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＡＭＣＡ（アミノメチルクマリン）、Ｂｏｄｉｐｙ、カルボキシ−Ｘ−ローダミン、カテコールアミン、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ヒドロキシクマリン、リサミンローダミン、モノブロモビマン、オレゴングリーン、フィコエリスリン、ＳＹＴＯ、チアジカルボシアニン（ＤｉＳＣ３）、チオフラビン、Ｘ−ローダミン、Ｃ、又はテトラメチルローダミンイソチオシアネートが含まれる。
【０１０３】
増幅基は、有機金属化合物、遷移金属錯体又は配位錯体を含むことができる。そのような増幅基の例には、限定するものではないが、それらの全体を参照により組み込むＥＰ  ０  １８０  ４９２、ＥＰ  ０  ３２１  ３５３、ＥＰ  ０  ５３９  ４３５、ＥＰ  ０  ５３９  ４７７、ＥＰ  ０  ５６９  ４９６、ＥＰ１３９６７５、ＥＰ６４４８４、米国特許第４，２８３，３８２号、米国特許第４，５６５，７９０号、米国特許第４，７１９，１８２号、米国特許第４，７３５，９０７号、米国特許第４，８０８，５４１号、米国特許第４，９２７，９２３号、米国特許第５，１６２，５０８号、米国特許第５，２２０，０１２号、米国特許第５，３２４，８２５号、米国特許第５，３４６，９９６号、米国特許第５，３７３，０９３号、米国特許第５，４３２，１０１号、米国特許第５，４５７，１８５号、米国特許第５，５１２，４９３号、米国特許第５，５２７，６８４号、米国特許第５，５３４，６２２号、米国特許第５，６２７，０７４号、米国特許第５，６９６，２４０号、米国特許第６，１００，３９４号、米国特許第６，３４０，７４４号、米国特許第６，５２４，７２７号、米国特許第６，７１７，３５４号、米国特許第７，０６７，３２０号、米国特許第７，３６４，５９７号、米国特許第７，３９３，５９９号、米国特許第７，４５６，０２３号、米国特許第７，４６５，７４７号、米国特許第７，６２５，９３０号、米国特許第７，８５４，９１９号、米国特許第７，９１０，０８８号、米国特許第７，９５５，８５９号、米国特許第７，９６８，９０４号、米国特許第８，００７，９２６号、米国特許第８，０１２，６０９号、米国特許第８，０１７，２５４号、米国特許第８，０１８，１４５号、米国特許第８，０４８，６５９号、米国特許第８，０６７，１００号、米国特許第８，１２９，８９７号、米国特許第８，１７４，００１号、米国特許第８，１８３，５８６号、米国特許第８，１９３，１７４号、米国特許第８，２２１，７１９号、米国特許第８，２８８，７６３号、米国特許第８，３６２，６９１号、米国特許第８，３８３，２４９号、米国特許第８，４９２，７８３号、米国特許第８，６３２，７５３号、米国特許第８，６６３，６０３号、米国特許第８，７２２，８８１号、米国特許第８，７５４，２０６号、米国特許第８，８９０，４０２号、米国特許第８，９６９，８６２号、米国特許第９，０１２，０３４号、米国特許第９，０５６，１３８号、米国特許第９，１１８，０２８号、米国特許第９，１３３，２０５号、米国特許第９，１８７，６９０号、米国特許第９，１９３，７４６号、米国特許第９，３１２，４９６号、米国特許第９，３３７，４３２号、米国特許第９，３４３，６８５号、米国特許第９，３９１，２８８号及び米国特許第９，５３７，１０７号に記載されるものが含まれる。例示的な有機金属化合物、遷移金属錯体又は配位錯体には、例えばそのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み込む国際公開Ｎｏ．ＷＯ  ２０１６／０１５０２７及び国際出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ１６／４２５８９に記載されるものも含まれる。
【０１０４】
一部の実施形態では、増幅基が、ランタニド（例えば、Ｅｕ又はＴｂ）と四座配位子又との間の錯体又はランタニド（例えば、Ｅｕ又はＴｂ）とクリプテート配位子との間の錯体などの、ランタニド配位錯体である。一部の実施形態では、増幅基は、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ネオジム（Ｐｍ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、ルテチウム（Ｌｕ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、パラジウム（Ｐｄ）、オスミウム（Ｏｓ）、イリジウム（Ｉｒ）又は白金（Ｐｔ）の配位錯体である。一部の実施形態では、増幅基は、原子番号５７を有するランタンから原子番号７１を有するルテニウム（ランタニド）の１５元素並びに原子番号２１を有するスカンジウム及び原子番号３９を有するイットリウムからなる２つのさらなる元素の群からなる１７元素をまとめて指す希土類金属の配位錯体である。希土類金属の特定の例には、ユーロピウム、テルビウム、ランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ガドリニウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム、ルテニウム、スカンジウム及びイットリウムが含まれる。一部の実施形態では、増幅基は、ランタニド（例えば、ユーロピウム又はテルビウム）とジエチレントリアミン四酢酸又はクリプテート配位子との配位錯体である。
【０１０５】
シグナル生成剤の特定の例には、限定するものではないが：
【０１０６】
【化３】
2021514653.tif 000006
2021514653.tif 000007
2021514653.tif 000008
2021514653.tif 000009
を含む部分が含まれる。
【０１０７】
シグナル生成剤は、高いルミネセンス量子効率及び長いルミネセンス減衰時間（１００ｎｓ超）を特徴とする発光団（ドナー）を含むことができる。例示的な発光団は、パラジウム、ロジウム、白金、ルテニウム、オスミウム、希土類（特に、ユーロピウム及びランタン）の、カチオン性金属有機錯体である。これらの金属有機錯体の有機部分は、例えばポルフィリン、ビピリジル、フェナントロリン又はその他の複素環式化合物の群からの配位子からなってもよい。
【０１０８】
一部の実施形態では、微生物表面に結合することが可能なシグナル生成剤は、抗体（例えば、モノクローナル又はポリクローナル）、修飾抗体（例えば、ビオチニル化モノクローナル抗体、ビオチニル化ポリクローナル抗体、ユーロピウムキレート抗体、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート抗体）、抗体変種（例えば、Ｆａｂ：断片、抗原結合（１つのアーム）；Ｆ（ａｂ’）２：断片、抗原結合、ヒンジ領域（両方のアーム）を含む；Ｆａｂ’：断片、抗原結合、ヒンジ領域（１つのアーム）を含む；ｓｃＦｖ：一本鎖可変断片；ジ−ｓｃＦｖ：ダイマー一本鎖可変断片；ｓｄＡｂ：一本鎖ドメイン抗体；二種特異性モノクローナル抗体；三官能性抗体；及びＢｉＴＥ：二種特異性Ｔ細胞エンゲージャー）、ＷＧＡ−ビオチン、ポリミキシンＢ−ビオチン、レクチン、天然ペプチド、合成ペプチド、合成及び／又は天然配位子、合成及び／又は天然ポリマー、合成及び／又は天然グリコポリマー、炭水化物結合タンパク質及び／又はポリマー、糖タンパク質結合タンパク質及び／又はポリマー、荷電小分子、その他のタンパク質、バクテリオファージ及び／又はアプタマーを含む。
【０１０９】
一部の実施形態では、微生物表面に結合することが可能なシグナル生成剤は、抗体、レクチン、天然ペプチド、合成ペプチド、合成及び／又は天然配位子、合成及び／又は天然ポリマー、合成及び／又は天然グリコポリマー、炭水化物結合タンパク質及び／又はポリマー、糖タンパク質結合タンパク質及び／又はポリマー、荷電小分子、その他のタンパク質、バクテリオファージ及び／又はアプタマーを含む構造を含み又はそのような構造から形成される。
【０１１０】
一部の実施形態では、微生物表面に結合することが可能なシグナル生成剤は、ランタニド配位錯体、及び／又は酵素及びストレプトアビジン及び／又は抗体及び／又はアプタマーを含む増幅基を含む。一部の実施形態では、微生物表面に結合することが可能なシグナル生成剤は、ポリクローナル及び／又はモノクローナル抗体を含む結合部分を含む。
【０１１１】
一部の実施形態では、微生物表面に結合することが可能なシグナル生成剤は、修飾抗体を含む結合部分を含む。例示的な修飾抗体には、ビオチニル化モノクローナル抗体、ビオチニル化ポリクローナル抗体、ユーロピウムキレート抗体及びホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート抗体が含まれる。一部の実施形態では、微生物表面に結合することが可能なシグナル生成剤は、抗体変種を含む結合部分を含む。例示的な抗体変種には、Ｆａｂ：断片、抗原結合（１つのアーム）；Ｆ（ａｂ’）２：断片、抗原結合、ヒンジ領域を含む（両方のアーム）；Ｆａｂ’：断片、抗原結合、ヒンジ領域を含む（１つのアーム）；ｓｃＦｖ：一本鎖可変断片；ｄｉ−ｓｃＦｖ：ダイマー一本鎖可変断片；ｓｄＡｂ：単一ドメイン抗体；二種特異性モノクローナル抗体；三官能性抗体；及びＢｉＴＥ：二種特異性Ｔ細胞エンゲージャー）が含まれる。
【０１１２】
一部の実施形態では、微生物表面に結合することが可能なシグナル生成剤は、ＷＧＡ−ビオチン又はポリミキシンＢ−ビオチンを含む。一部の実施形態では、微生物表面に結合することが可能なシグナル生成剤は、合成及び／又は天然配位子及び／又はペプチドを含む結合部分を含む。一部の実施形態では、配位子及び／又はペプチドは、ビス（亜鉛−ジピコリルアミン）、ＴＡＴペプチド、セリンプロテアーゼ、カテリシジン、カチオン性デキストリン、カチオン性シクロデキストリン、サリチル酸、リジン及びこれらの組合せから選択される。一部の実施形態では、微生物表面に結合することが可能なシグナル生成剤は、合成及び／又は天然ポリマー及び／又はグリコポリマーを含む結合部分を含む。実施形態では、天然及び／又は合成ポリマーは、直鎖状又は分枝状であり、アミロペクチン、ポリ（Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ［２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート］及びこれらの組合せから選択される。一部の実施形態では、天然及び／又は合成ポリマー及び／又はグリコポリマーは、限定するものではないが、キトサン、ゼラチン、デキストラン、トレハロース、セルロース、マンノース、カチオン性デキストラン及びシクロデキストラン、第四級アミン、三臭化ピリジニウム、ヒスチジン、リジン、システイン、アルギニン、スルホニウム、ホスホニウム又はこれらの組合せを含む部分であって、限定するものではないが、コブロック、グラフト及び交互ポリマーを含む部分を含む。一部の実施形態では、微生物表面に結合することが可能なシグナル生成剤は、マンノース結合レクチン、その他のレクチン、アネキシン及びこれらの組合せから選択される糖タンパク質を含む結合部分を含む。
【０１１３】
一部の実施形態では、微生物表面に結合することが可能なシグナル生成剤は：抗体；及びユーロピウム配位錯体を含む。一部の実施形態では、微生物表面に結合することが可能なシグナル生成剤は、ＮＨ２−ＰＥＧ−ビオチン（２Ｋ）、ＮＨ２−ＰＥＧ−ビオチン（４Ｋ）、スルホ−ＮＨＳ−ビオチン、ＷＧＡ−ビオチン又はポリミキシンＢ−ビオチンを含むリンカー基Ｌを含む。一部の実施形態では、微生物表面に結合することが可能なシグナル生成剤は：
【０１１４】
【化４】
2021514653.tif 000010
を含むユーロピウム錯体を含む。
【０１１５】
一部の実施形態では、微生物表面に結合することが可能なシグナル生成剤は：
【０１１６】
【化５】
2021514653.tif 000011
を含むユーロピウム錯体を含む。
【０１１７】
あるいは、シグナル生成剤は、ＦＲＥＴ／ＴＲ−ＦＲＥＴドナー及びアクセプター又は一重項酸素対であって光増感剤及び検出物質からなるものなどの、１対の部分であってもよい。これらのシグナル生成剤で設計されたアッセイは、初期増殖培地からの微生物の分離、その後の所望の反応緩衝剤への再懸濁、及びその後のシグナル生成試薬の添加を必要としてもよい。逆に、これらのシグナル生成剤で設計されたアッセイは、シグナルを発生させるのに必要な、必要とされる相対距離に起因して、分離ステップを必要としなくてもよい。
【０１１８】
ＦＲＥＴ／ＴＲ−ＦＲＥＴドナーの例には、限定するものではないが、ランタニド（Ｅｕ、Ｓｍ、Ｄｙ、又はＴｂ）含有クリプテート有機金属（ＣｉｓＢｉｏ）、ランスＥｕ−Ｗ１０２４（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、ランスＥｕ−Ｗ８０４４（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、任意の有機蛍光対ドナーも含まれる。
【０１１９】
ＦＲＥＴ／ＴＲ−ＦＲＥＴアクセプターの例には、限定するものではないが、マッチした有機色素、例えばＵＬｉｇｈｔ色素（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、ＳｕｒｅＬｉｇｈｔ  ＡＰＣ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、アロフィコシアニン、Ｃｙ５、ｄ２色素（ＣｉｓＢｉｏ）、任意の有機蛍光対アクセプターも含まれる。
【０１２０】
一重項酸素光増感剤の例には、限定するものではないが、メトセラグリーンカルボキシ（Ｕｒｓａ  Ｂｉｏ）、センシタイザーブルー（Ｕｒｓａ  Ｂｉｏ）、ローズベンガル、エリスロシンＢ、メチレンブルー、クロロフィル、アルファビードドナー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）が含まれる。
【０１２１】
一重項酸素検出物質の例には、限定するものではないが、一重項酸素検出物質グリーン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、トランス−１−（２’−メトキシビニル）ピレン、Ｓｉ−ＤＭＡ（Ｄｏｊｉｎｄｏ）、アルファビードアクセプター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）が含まれる。
【０１２２】
組込み物質の例には、限定するものではないが、エチニル−Ｄ−アラニン（ＥＤＡ）、アジド−Ｄ−アラニン（ＡＤＡ）、蛍光Ｄ−アラニンであって、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．  ２０１２年１２月７日；５１（５０）：１２５１９〜１２５２３に記載されたものが含まれる。
【実施例】
【０１２３】
［実施例１］
ヒト血液（５ｍＬ）及び細菌を、２０ｍＬのＢＡＣＴＥＣ増殖培地に添加して、１０００ｃｆｕ／ｍＬの細菌負荷を得た。細菌溶液１２ｍＬを、１５ｍＬのファルコン管に入れた。管を、５００ＲＣＦで５分間、回転させた。得られた上澄みを取り出し、清浄な１５ｍＬの管に入れた。上澄みが入っている管を、１３５０ＲＣＦで５分間回転し、細菌のペレットを生成した。上澄みを除去し、１５ｍＬの管を反転させて５０ｍＬの管に入れた。管を、この位置で、２００ＲＣＦで１分間回転させた。得られた細菌ペレットを、５００ｕＬのＭＨＢに再懸濁した。３つの１５０ｕＬの一定分量を、９６ウェルプレートに入れ、増殖を光学的にモニターした。６時間後、試料を１０倍に希釈し、ＡＳＴプレート全体にわたって接種した。ＡＳＴデータを２０時間後に読み取った。このプロセスを図１に例示する。
【０１２４】
［実施例２］
尿試料（２ｍＬ）を、２本の１０ｍＬ  ＬｅｕｃｏＳｅｐ遠心分離管に入れた。管を、５００ＲＣＦで５分間回転させた。生理食塩液２ｍＬを管に添加して、細菌を再懸濁した。２回目の、２ｍＬの添加を行って、膜を洗浄した。管の内容物を合わせ、光学的に測定した。試料を希釈し、２つのＡＳＴプレート全体にわたり接種した。プレートを、ＳｅＬｕｘアッセイ及びＣＬＳＩ指針を使用して読み取った。このプロセスを図２に例示する。
【０１２５】
［実施例３］
陽性血液培養物（ＰＢＣ）をその瓶から取り出した。９６ウェルプレートの１つの列に生理食塩液９０μＬを満たし、次いで１０μＬのＰＢＣを添加した。同時に、１０−３〜１０−８までの希釈物１０μＬを、寒天プレート上にスポットプレートし、一晩インキュベートした。ＰＢＣ  ４ｍＬを２５ｍＬのＳａｒｓｔｅｄｔスクリューキャップ管に添加した（溶解洗浄剤当たりのＰＢＣ当たり２本の管）。管を５００ＲＣＦで２分間遠心分離した。３ｍＬの上澄みを清浄な管に移し、１ｍＬの溶解洗浄剤（３％サポニン、１．５３％ポリアネトールスルホン酸ナトリウム、０．０００００８％ポリプロピレングリコール［４０００Ｍｎ］）を添加し、管をボルテックスした。管を２３７０ＲＣＦで５分間遠心分離した。上澄みを吸引し、１ｍＬの生理食塩液を添加し、管をボルテックスした。管を再び２３７０ＲＣＦで５分間遠心分離した。上澄みを再び吸引し、１ｍＬの生理食塩液を添加し、管をボルテックスし、次いで合わせて１本の管に入れた。管を２３７０ＲＣＦで５分間遠心分離した。上澄みを吸引し、１ｍＬの生理食塩液を添加し、管をボルテックスした。管を２３７０ＲＣＦで５分間遠心分離した。上澄みを吸引し、１ｍＬの生理食塩液を添加し、管をボルテックスした。再懸濁物をキュベットに移動させ、光学密度を得た。９６ウェルプレートの１本のカラムに９０ｕＬの生理食塩液を満たした。再懸濁物１０μＬを、行の第１のウェルに添加し、次いで１０−１〜１０−８の希釈物が調製されるまで１：１０希釈を行った。１０−３〜１０−８までの希釈物１０μＬを、寒天プレート上にスポットプレートし、一晩インキュベートした。
【０１２６】
［実施例４］
細菌を負荷した尿試料５ｍＬを、１５ｍＬのファルコン管に入れる。管を、５００ＲＣＦで５分間回転させる。この初期回転からの上澄みを取り出し、清浄な１５ｍＬの管に入れる。上澄みを含有する管を、１３５０ＲＣＦで５分間回転させて、細菌をペレット化する。上澄みの大部分をデカンテーションで除去した後に、１５ｍＬの管を反転させて５０ｍＬの管に入れ、次いで２００ＲＣＦで１分間回転させる。次いで得られた細菌ペレットを、５ｍｌの生理食塩液に再懸濁し、細菌濃度を光学的に決定する。試料を希釈して、ＡＳＴに適切な濃度を得、２つの個別のＡＳＴプレート全体にわたって接種する。１つのプレートは、ＳｅＬｕｘアッセイを使用して処理し、別のプレートは、インキュベーターに一晩入れて、ＣＬＳＩ指針に従い読み取る。このプロセスを図３に例示する。
【０１２７】
［実施例５］
陽性血液培養物（ＰＢＣ）を血液培養瓶から取り出す。９６ウェルプレートの１つの列（ＰＢＣ当たり）を、生理食塩液９０μＬで満たす。ＰＢＣ  １０μＬを、行の第１のウェルに添加し、次いで１０−１〜１０−８までの希釈物が調製されるまで、１：１０希釈を行なう。１０−３〜１０−８までの希釈物１０μＬを、寒天プレート上にスポットプレートし、一晩インキュベートする。ＰＢＣ  ４ｍＬを２．５ｍＬのＳａｒｓｔｅｄｔスクリューキャップ管に添加する（溶解洗浄剤当たりＰＢＣ当たり２本の管）。管を５００ＲＣＦで２分間遠心分離する。管当たり３ｍＬの上澄みを清浄な管に移す。１ｍＬの溶解洗浄剤を添加し、管をボルテックスする（Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  Ｉ２：３％サポニン、１．５３％ポリアネトールスルホン酸ナトリウム、８×１０−６％ポリプロピレングリコール［４０００Ｍｎ］）。管を２３７０ＲＣＦで５分間遠心分離する。上澄みを吸引し、１ｍＬの生理食塩液を添加し、管をボルテックスする。管を２３７０ＲＣＦで５分間遠心分離する。上澄みを吸引し、ペレットを１ｍＬの生理食塩液で再び洗浄し、管をボルテックスし、次いで合わせて１本の最終管に入れる。チューブを２３７０ＲＣＦで５分間遠心分離する。生理食塩液を吸引し、生理食塩液１ｍＬを添加し、管をボルテックスする。管を２３７０ＲＣＦで５分間遠心分離する。生理食塩液を吸引し、生理食塩液１ｍＬを添加し、管をボルテックスする。再懸濁物をキュベットに除去し、ＯＤを得る（最初に生理食塩液をブランクとした。）。９６ウェルプレートの１つの列（最終再懸濁物当たり）に、生理食塩液９０μＬを満たす。再懸濁物１０μＬを、行の第１のウェルに添加し、次いで１０−１〜１０−８までの希釈物が調製されるまで、１：１０希釈を行なう。１０−３〜１０−８までの希釈物１０μＬを、寒天プレート上にスポットプレートし、一晩インキュベートする。このプロセスを図５に示し、代表的なデータを図１２〜１３に示す。
【０１２８】
［実施例６］
ＢａｃＴｅｃ瓶からの血液２ｍＬを、５ｍＬの管に添加した。１００〜５００ＲＣＦで１〜５分間にわたり遠心分離した。遠心分離後、上澄み１ｍＬを引き出してＯＤ６００をチェックした。分光光度計に、２３７０ＲＣＦ（最大速度）で１０分間遠心分離した２ｍＬ管からの上澄みをブランクとした。このプロセスを図３に例示する。
【０１２９】
［実施例７］
陽性血液培養物（ＰＢＣ）を血液培養機から取り出した。ＰＢＣ  ４ｍＬを２．５ｍＬのＳａｒｓｔｅｄｔスクリューキャップ管に添加した（溶解洗浄剤当たりのＰＢＣ当たり２本の管）。管を、５００ＲＣＦで２分間遠心分離した。管当たり３ｍＬの上澄みを、清浄な管に移した。１ｍＬの溶解洗浄剤を添加し、管をボルテックスした（洗浄剤Ｉ２：３％サポニン、１．５３％ポリアネトールスルホン酸ナトリウム、８×１０−６％ポリプロピレングリコール［４０００Ｍｎ］）。管を２３７０ＲＣＦで５分間遠心分離した。上澄みを吸引し、１ｍＬの生理食塩液を添加し、管をボルテックスした。管を２３７０ＲＣＦで５分間遠心分離した。上澄みを吸引し、ペレットを１ｍＬの生理食塩液で再び洗浄し、管をボルテックスし、次いで合わせて１本の最終管に入れた。管を２３７０ＲＣＦで５分間遠心分離した。生理食塩液を吸引し、生理食塩液１ｍＬを添加し、管をボルテックスした。管を２３７０ＲＣＦで５分間遠心分離した。生理食塩液を吸引し、生理食塩液１ｍＬを添加し、管をボルテックスした。再懸濁物をキュベットに移動させ、ＯＤを得た（最初に生理食塩液をブランクとした。）。９６ウェルプレートの１つの列（最終再懸濁当たり）を、生理食塩液９０μＬで満たした。再懸濁物１０μＬを、行の最初のウェルに添加した。このプロセスを図４に例示する。
【０１３０】
［実施例８］
陽性血液培養物（ＰＢＣ）を、血液培養機から取り出した。ＰＢＣ  ６ｍＬを、１５ｍＬのコニカル管に添加した。管を２５０ＲＣＦで５分間、遠心分離した。５ｍＬの上澄みを、清浄な管に移した。管を、１３５０ＲＣＦで５分間、遠心分離した。上澄みを吸引し、５ｍＬの生理食塩液を添加し、管をボルテックスした。管を１３５０ＲＣＦで５分間遠心分離した。上澄みを吸引し、ペレットを０．５ｍＬの生理食塩液で再懸濁した。次いで再懸濁物を、０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄとして処理し、ＡＳＴアッセイを接種するのに使用した。このプロセスからの代表的なデータを、図１４〜１５に見ることができる。
【０１３１】
参照による組込み
本明細書で述べられる全ての刊行物、特許及び特許出願を、個々の刊行物、特許又は特許出願のそれぞれが参照により組み込まれるように具体的にかつ個々に示されるかのように、その全体を参照により本明細書に組み込む。矛盾がある場合には、本明細書の任意の定義を含む本出願が優先する。
【０１３２】
均等物
当業者なら、単なる通常の実験を使用するだけで、本明細書に記述される特定の実施形態に対する多くの均等物を理解し又は確かめることができよう。そのような均等物は、下記の特許請求の範囲により包含されるものとする。
【図１】
2021514653.tif 000012
【図２】
2021514653.tif 000013
【図３】
2021514653.tif 000014
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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