(57)【要約】  本発明は、ＬＡＧ−３を標的とする抗体、その調製方法および用途を開示する。具体的に、本発明は、ＬＡＧ−３を標的とする新しいモノクローナル抗体を開示する。本発明は、前記モノクローナル抗体の調製方法をさらに開示する。本発明のモノクローナル抗体は、ＬＡＧ−３抗原に高い特異性で結合することができ、高い親和性を有し、有意な抗腫瘍などの活性を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体の重鎖可変領域であって、
前記重鎖可変領域は、
配列番号８ｎ＋２に示されるＣＤＲ１と、
配列番号８ｎ＋３に示されるＣＤＲ２と、および
配列番号８ｎ＋４または配列番号８５に示されるＣＤＲ３との３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
各ｎは独立して０、１、２、３、４または５であり、
前記アミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸が任意に追加、削除、修飾および／または置換され、ＬＡＧ-３の結合親和性を保持できる誘導体配列をさらに含むことを特徴とする、前記抗体の重鎖可変領域。
【請求項２】
抗体の重鎖であって、
前記重鎖は、請求項１に記載の重鎖可変領域を有することを特徴とする、前記抗体の重鎖。
【請求項３】
抗体の軽鎖可変領域であって、
前記軽鎖可変領域は、
配列番号８ｎ＋６に示されるＣＤＲ１’と、
配列番号８ｎ＋７または配列番号８４に示されるＣＤＲ２’と、および
配列番号８ｎ＋８に示されるＣＤＲ３’との３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
各ｎは独立して０、１、２、３、４または５であり、
前記アミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸が任意に追加、削除、修飾および／または置換され、ＬＡＧ-３の結合親和性を保持できる誘導体配列をさらに含むことを特徴とする、前記抗体の軽鎖可変領域。
【請求項４】
抗体の軽鎖であって、
前記軽鎖は、請求項３に記載の軽鎖可変領域を有することを特徴とする、前記抗体の軽鎖。
【請求項５】
抗体であって、
前記抗体は、
（１）請求項１に記載の重鎖可変領域と、および／または
（２）請求項３に記載の軽鎖可変領域とを有し、
または、前記抗体は、請求項２に記載の重鎖と、および／または請求項４に記載の軽鎖とを有し、
前記アミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸が任意に追加、削除、修飾および／または置換され、ＬＡＧ-３の結合親和性を保持できる誘導体配列をさらに含むことを特徴とする、前記抗体。
【請求項６】
前記抗体は、請求項１に記載の重鎖可変領域および請求項３に記載の軽鎖可変領域を有し、
前記重鎖可変領域は、
配列番号２に示されるＣＤＲ１と、
配列番号３に示されるＣＤＲ２と、および
配列番号４に示されるＣＤＲ３との３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
前記軽鎖可変領域は、
配列番号６に示されるＣＤＲ１’と、
配列番号７または配列番号８４に示されるＣＤＲ２’と、および
配列番号８に示されるＣＤＲ３’との３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
または
前記重鎖可変領域は、
配列番号１０に示されるＣＤＲ１と、
配列番号１１に示されるＣＤＲ２と、および
配列番号１２に示されるＣＤＲ３との３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
前記軽鎖可変領域は、
配列番号１４に示されるＣＤＲ１’と、
配列番号１５に示されるＣＤＲ２’と、および
配列番号１６に示されるＣＤＲ３’との３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
または
前記重鎖可変領域は、
配列番号１８に示されるＣＤＲ１と、
配列番号１９に示されるＣＤＲ２と、および
配列番号２０に示されるＣＤＲ３との３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
前記軽鎖可変領域は、
配列番号２２に示されるＣＤＲ１’と、
配列番号２３に示されるＣＤＲ２’と、および
配列番号２４に示されるＣＤＲ３’との３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
前記アミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸が任意に追加、削除、修飾および／または置換され、ＬＡＧ-３の結合親和性を保持できる誘導体配列をさらに含むことを特徴とする、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号８ｎ＋１、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２に示されるアミノ酸配列を含み、および／または前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号８ｎ＋５、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２に示されるアミノ酸配列を含み、各ｎは独立して０、１、２、３、４または５であることを特徴とする、請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、または
前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、前期抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含み、または
前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、または
前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号６４に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号７４に示されるアミノ酸配列を含み、または
前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号６４に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号７６に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項６に記載の抗体。
【請求項９】
組換えタンパク質であって、
（ｉ）請求項１に記載の重鎖可変領域、請求項２に記載の重鎖、請求項３に記載の軽鎖可変領域、請求項４に記載の軽鎖、または請求項５〜８のいずれか一項に記載の抗体と、および
（ｉｉ）発現および／または精製を支援する任意のタグ配列とを含むことを特徴とする、前記組換えタンパク質。
【請求項１０】
ポリヌクレオチドであって、
（１）請求項１に記載の重鎖可変領域、請求項２に記載の重鎖、請求項３に記載の軽鎖可変領域、請求項４に記載の軽鎖、または請求項５〜８のいずれか一項に記載の抗体と、および
（２）請求項９に記載の組換えタンパク質との群から選択されるポリペプチドをコードすることを特徴とする、前記ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号４９、５１、５３、５５、５７、５９、６５、６７、６９、７１または７３に示される前記重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、および／または、
５０、５２、５４、５６、５８、６０、７５、７７、７９、８１または８３に示される前記軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドである
請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号４９に示される前記重鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチド、配列番号５０に示される前記軽鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチド、または
配列番号５１に示される前記重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、配列番号５２に示される前記軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、または
配列番号５３に示される前記重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、配列番号５４に示される前記軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする
請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
担体であって、
本発明の請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、前記担体。
【請求項１４】
遺伝子操作された宿主細胞であって、
請求項１３に記載の担体を含むか、またはゲノムに請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドが組み込まれていることを特徴とする、前記遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項１５】
医薬組成物であって、
（ｉ）請求項１に記載の重鎖可変領域、請求項２に記載の重鎖、請求項３に記載の軽鎖可変領域、請求項４に記載の軽鎖、または請求項５〜８のいずれか一項に記載の抗体、請求項９に記載の組換えタンパク質、またはそれらの組み合わせの群から選択される有効成分と、および
（ｉｉ）薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする、前記医薬組成物。
【請求項１６】
有効成分の用途であって、
前記有効成分は、請求項１に記載の重鎖可変領域、請求項２に記載の重鎖、請求項３に記載の軽鎖可変領域、請求項４に記載の軽鎖、または請求項５〜８のいずれか一項に記載の抗体、請求項９に記載の組換えタンパク質、またはそれらの組み合わせの群から選択され、前記有効成分は、ＬＡＧ−３関連疾患の予防および／または治療の薬物を調製するために使用されることを特徴とする、前記有効成分の用途。
【請求項１７】
インビトロ検出サンプル中のＬＡＧ-３タンパク質の組成物であって、
請求項５〜８のいずれか一項に記載の抗体、請求項９に記載の組換えタンパク質、またはそれらの組み合わせを有効成分として含むことを特徴とする、前記インビトロ検出サンプル中のＬＡＧ-３タンパク質の組成物。
【請求項１８】
組換えポリペプチドの調製方法であって、
発現に適した条件下で、請求項１４に記載の宿主細胞を培養するステップ（ａ）と、
培養物から請求項５〜８のいずれか一項に記載の抗体または請求項９に記載の組換えタンパク質である組換えポリペプチドを分離するステップ（ｂ）とを含むことを特徴とする、前記組換えポリペプチドの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医学の分野に関し、具体的にＬＡＧ−３抗体およびその調製方法と応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌免疫療法は、免疫システムを介して癌に対抗することを目的とする治療方法を指す。近年、癌免疫療法が注目を集めており、手術、化学療法、放射線療法に加え、癌治療の新しい手段となっている。免疫チェックポイントとは、末梢組織における免疫応答の持続性と強度を調節することにより組織の損傷を防ぎ、自己抗原に対する耐性の維持に関与する、免疫系に存在するいくつかの抑制性シグナル経路を指す。免疫チェックポイントの抑制性シグナル伝達経路を使用してＴ細胞の活性を阻害することは、腫瘍が免疫による死を免れるための重要なメカニズムである。免疫チェックポイントの遮断は、抗腫瘍免疫を活性化する多くの効果的な戦略の１つである。
【０００３】
免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤は、さまざまな種類の腫瘍（転移性黒色腫、肺癌、乳癌、腎細胞癌など）を治療する可能性がある。最近、癌免疫治療方法に関する研究は、特に転移性癌の症例に対して、有望な結果を示している。さらに、癌免疫治療は、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫などの血液癌の治療に大きな可能性を有する。免疫チェックポイント阻害剤によって引き起こされる副作用は無視でき、可逆的で制御可能であり、効果的な免疫チェックポイント阻害剤は癌患者の全体的な生存を大幅に改善することができる。免疫チェックポイント阻害剤は、標的治療や従来の放射線療法や化学療法と組み合わせて使用することもでき、これらの組み合わせ療法は、さまざまな種類の癌を効果的に治療でき、さまざまな癌の治療または治癒の希望であり得る。
【０００４】
リンパ球活性化遺伝子（ＬＡＧ−３、ＣＤ２２３）は、５２５個のアミノ酸を有するＩ型膜タンパク質であり、既知の主要な免疫チェックポイント（Immune Checkpoint）の１つである。研究では、ＬＡＧ−３−／−Ｃ５７ＢＬ／６マウスが一定の時間内に比較的正常な表現型を示すことが示され、これは、ＬＡＧ−３が免疫系内での調節的役割が微妙であり、免疫応答に微調整された役割を果たす可能性があることを示している。生体内動物モデル実験では、抗ＬＡＧ−３抗体を使用したり、ＬＡＧ−３遺伝子を遺伝子的にノックアウトしたりすると、腫瘍部位の抗原特異的ＣＤ８ ＋ Ｔ細胞の活性を高め、腫瘍の成長を遮断できることが示されている。Grosso JFらの研究では、ＬＡＧ−３とヒトプログラムされた死受容体−１（ＰＤ−１）が耐性腫瘍浸潤リンパ球に同時発現し、腫瘍が誘導する免疫抑制効果を発揮するように連携していることを示している。マウスのＭＣ３８結腸腺癌とＳａ１Ｎ線維肉腫モデルにおける抗ＬＡＧ−３抗体と抗ＰＤ−１抗体の併用は、ほとんどのマウスを治癒できることが証明されており、その治療効果は単一の薬剤よりも優れていることが証明された。
【０００５】
現在研究されているＬＡＧ−３抗体の数が少ないことに基づいて、治療効果と検出効果をさらに改善するために、より優れた活性、幅広い適応症、および高収量のＬＡＧ−３抗体を開発することが急務である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
より優れた活性、幅広い適応症、および高収量のＬＡＧ−３抗体を開発するために、本発明は、高い親和性および強い特異性を有するＬＡＧ−３抗体およびその調製方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の態様では、抗体の重鎖可変領域であって、前記重鎖可変領域は、
配列番号８ｎ＋２に示されるＣＤＲ１と、
配列番号８ｎ＋３に示されるＣＤＲ２と、および
配列番号８ｎ＋４に示されるＣＤＲ３との３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
各ｎは独立して０、１、２、３、４または５であり、
前記アミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸が任意に追加、削除、修飾および／または置換され、ＬＡＧ−３の結合親和性を保持できる誘導体配列をさらに含む、前記抗体の重鎖可変領域を提供する。
【０００８】
別の好ましい例では、前記重鎖可変領域は、配列番号８ｎ＋１に示されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｎは、０、１、２、３、４または５である。
別の好ましい例では、前記重鎖可変領域は、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２に示されるアミノ酸配列を有する。
別の好ましい例では、前記重鎖可変領域は、配列番号８７、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３に示されるアミノ酸配列を有する。
【０００９】
本発明の第２の態様では、抗体の重鎖であって、前記重鎖は、本発明の第１の態様に記載の重鎖可変領域を有する、前記抗体の重鎖を提供する。
【００１０】
本発明の第３の態様では、抗体の軽鎖可変領域であって、前記軽鎖可変領域は、
配列番号８ｎ＋６に示されるＣＤＲ１’と、
配列番号８ｎ＋７に示されるＣＤＲ２’と、および
配列番号８ｎ＋８に示されるＣＤＲ３’との３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
各ｎは独立して０、１、２、３、４または５であり、
前記アミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸が任意に追加、削除、修飾および／または置換され、ＬＡＧ-３の結合親和性を保持できる誘導体配列をさらに含む、前記抗体の軽鎖可変領域を提供する。
【００１１】
別の好ましい例では、前記軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲ２は、配列番号８４に示されるアミノ酸配列（４０５Ｂ８Ｈ３−１（Ｄ→Ｅ）のＶＬ−ＣＤＲ２）を有する。
別の好ましい例では、前記軽鎖可変領域は、配列番号８ｎ＋５に示されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｎは、０、１、２、３、４または５である。
別の好ましい例では、前記軽鎖可変領域は、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０または配列番号８２に示されるアミノ酸配列を有する。
別の好ましい例では、前記軽鎖可変領域は、配列番号８９、配列番号９５に示されるアミノ酸配列を有する。
【００１２】
本発明の第４の態様では、抗体の軽鎖であって、前記軽鎖は、本発明の第３の態様に記載の軽鎖可変領域を有する、前記抗体の重鎖を提供する。
【００１３】
本発明の第５の態様では、抗体であって、前記抗体は、
（１）第１の態様に記載の重鎖可変領域と、および／または
（２）第３の態様に記載の軽鎖可変領域とを有し、
または、前記抗体は、第２の態様に記載の重鎖と、および／または第４の態様に記載の軽鎖とを有し、
前記アミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸が任意に追加、削除、修飾および／または置換され、ＬＡＧ−３の結合親和性を保持できる誘導体配列をさらに含む、前記抗体を提供する。
【００１４】
別の好ましい例では、前記任意のＣＤＲのアミノ酸配列は、１、２または３個のアミノ酸が追加、削除、修飾および／または置換した誘導体ＣＤＲ配列を含み、前記誘導体ＣＤＲ配列を含むＶＨとＶＬで形成された誘導体抗体がＬＡＧ−３の結合親和性を保持できるようにする。
別の好ましい例では、前記誘導体抗体およびＬＡＧ−３結合親和性Ｆ１と、対応する非誘導体化抗体およびＬＡＧ−３結合親和性Ｆ０の比率（Ｆ１／Ｆ０）は、０.５−２であり、好ましくは、０.７−１.５であり、より好ましくは、０.８−１.２である。
【００１５】
別の好ましい例では、前記追加、削除、修飾および／または置換されたアミノ酸の数は、１−５個（例えば、１−３個、好ましくは、１−２個、より好ましくは、１個）である。
別の好ましい例では、前記少なくとも１つのアミノ酸が追加、削除、修飾および／または置換され、ＬＡＧ−３の結合親和性を保持できる誘導体配列は、少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列である。
別の好ましい例では、前記抗体は、重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域をさらに含む。
別の好ましい例では、前記重鎖定常領域は、マウス由来のものであり、および／または前記軽鎖定常領域は、マウス由来のものである。
別の好ましい例では、前記重鎖定常領域は、ヒト由来であり、および／または前記軽鎖定常領域は、ヒト由来である。
【００１６】
別の好ましい例では、前記抗体の重鎖可変領域は、ヒト由来のフレームワーク領域をさらに含み、および／または前記抗体の軽鎖可変領域は、ヒト由来のフレームワーク領域さらに含む。
別の好ましい例では、前記抗体の重鎖可変領域は、マウス由来のフレームワーク領域をさらに含み、および／または前記抗体の軽鎖可変領域は、マウス由来のフレームワーク領域をさらに含む。
別の好ましい例では、前記抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、またはそれらの組み合わせの群から選択される。
別の好ましい例では、前記抗体は、突然変異ヒト化抗体である。
【００１７】
別の好ましい例では、前記抗体は、ＣＤＲ領域にＤ→Ｅ突然変異を有するヒト化抗体である。
別の好ましい例では、前記抗体は、ＶＬ−ＣＤＲ２またはＶＨ−ＣＤＲ３にＤ→Ｅ突然変異を有するヒト化抗体である。
別の好ましい例では、ヒトにおける完全ヒト抗体の免疫原性Ｚ１とヒトにおける非完全ヒト抗体（例えば、マウス抗体）の免疫原性Ｚ０の比率（Ｚ１／Ｚ０）は、０〜０.５であり、好ましくは、０〜０.２であり、より好ましくは、０〜０.０５（例えば、０.００１〜０.０５）である。
【００１８】
別の好ましい例では、前記抗体は、部分的または完全にヒト化された、または完全にヒトのモノクローナル抗体である。
別の好ましい例では、前記抗体は、二本鎖抗体、または一本鎖抗体である。
別の好ましい例では、前記抗体は、抗体全長タンパク質、または抗原結合断片である。
別の好ましい例では、前記抗体は、二重特異性抗体、または多重特異性抗体である。
別の好ましい例では、前記抗体は、以下の群から選択される１つまたは複数の特性を有する：
（ａ）腫瘍細胞の移動または転移を阻害し、
（ｂ）腫瘍の成長を阻害する。
【００１９】
別の好ましい例では、前記抗体は、本発明の第１の態様に記載の重鎖可変領域および本発明の第３の態様に記載の軽鎖可変領域を有し、ここで、
前記重鎖可変領域は、
配列番号２に示されるＣＤＲ１と、
配列番号３に示されるＣＤＲ２と、および
配列番号４に示されるＣＤＲ３との３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
前記軽鎖可変領域は、
配列番号６に示されるＣＤＲ１’と、
配列番号７または配列番号８４に示されるＣＤＲ２’と、および
配列番号８に示されるＣＤＲ３’との３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
または
前記重鎖可変領域は、
配列番号１０に示されるＣＤＲ１と、
配列番号１１に示されるＣＤＲ２と、および
配列番号１２に示されるＣＤＲ３との３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
前記軽鎖可変領域は、
配列番号１４に示されるＣＤＲ１’と、
配列番号１５に示されるＣＤＲ２’と、および
配列番号１６に示されるＣＤＲ３’との３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
または
前記重鎖可変領域は、
配列番号１８に示されるＣＤＲ１と、
配列番号１９に示されるＣＤＲ２と、および
配列番号２０に示されるＣＤＲ３との３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
前記軽鎖可変領域は、
配列番号２２に示されるＣＤＲ１’と、
配列番号２３に示されるＣＤＲ２’と、および
配列番号２４に示されるＣＤＲ３’との３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
ここで、前記アミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸が任意に追加、削除、修飾および／または置換され、ＬＡＧ−３の結合親和性を保持できる誘導体配列をさらに含む。
【００２０】
別の好ましい例では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号８ｎ＋１に示されるアミノ酸配列を含み、および／または前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号８ｎ＋５に示されるアミノ酸配列を含み、ここで、各ｎは独立して０、１、２、３、４または５である。
別の好ましい例では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例では、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例では、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例では、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含む。
【００２１】
別の好ましい例では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、または
前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含み、または
前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含む。
【００２２】
別の好ましい例では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号４１に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号６４に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号７４に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号６４に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号７６に示されるアミノ酸配列を含む。
【００２３】
別の好ましい例では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号７６に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号７８に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号６８に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号７８に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号７０に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号８０に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号７２に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号８０に示されるアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号７２に示されるアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号８２に示されるアミノ酸配列を含む。
【００２４】
別の好ましい例では、前記抗体は、４０５Ｂ８Ｈ３、５５６Ｆ６Ｂ８、１０５Ｆ１Ｅ１０、４０９Ｂ１１Ｅ１２、４０９Ｄ４Ｅ１０、５５３Ｇ８Ｇ８の群から選択される。
別の好ましい例では、前記抗体は、４０５Ｂ８Ｈ３−１（Ｄ→Ｅ）、４０５Ｂ８Ｈ３−１、４０５Ｂ８Ｈ３−２、４０５Ｂ８Ｈ３−６、４０５Ｂ８Ｈ３−７、５５６Ｆ６Ｂ８−３、５５６Ｆ６Ｂ８−７、５５６Ｆ６Ｂ８−３（Ｄ→Ｅ）の群から選択される。
別の好ましい例では、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表における配列番号１、配列番号９、配列番号１７、配列番号２５、配列番号３３、配列番号４１、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０または配列番号７２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性または同一性を有する。
別の好ましい例では、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表における配列番号５、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２９、配列番号３７、配列番号４５、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０または配列番号８２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性または同一性を有する。
【００２５】
本発明の第６の態様では、組換えタンパク質であって、
（ｉ）第１の態様に記載の重鎖可変領域、第２の態様に記載の重鎖、第３の態様に記載の軽鎖可変領域、第４の態様に記載の軽鎖、または第５の態様のいずれか一項に記載の抗体と、および
（ｉｉ）発現および／または精製を支援する任意のタグ配列とを含む、前記組換えタンパク質を提供する。
別の好ましい例では、前記タグ配列は、６Ｈｉｓタグを含む。
【００２６】
別の好ましい例では、前記組換えタンパク質（またはポリペプチド）は、融合タンパク質を含む。
別の好ましい例では、前記組換えタンパク質は、単量体、二量体、または多量体である。
別の好ましい例では、前記組換えタンパク質は、
（ｉ）本発明の第５の態様に記載の抗体と、および
（ｉｉ）発現および／または精製を支援する任意のタグ配列とを含む。
【００２７】
本発明の第７の態様では、ポリヌクレオチドであって、
（１）第１の態様に記載の重鎖可変領域、第２の態様に記載の重鎖、第３の態様に記載の軽鎖可変領域、第４の態様に記載の軽鎖、または第５の態様のいずれか一項に記載の抗体と、および
（２）第６の態様に記載の組換えタンパク質との群から選択されるポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチドを提供する。
別の好ましい例では、配列番号４９、５１、５３、５５、５７、５９、６５、６７、６９、７１または７３に示される前記重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、および／または、
５０、５２、５４、５６、５８、６０、７５、７７、７９、８１または８３に示される前記軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドである。
【００２８】
別の好ましい例では、配列番号４９に示される前記重鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチド、配列番号５０に示される前記軽鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチド、または
配列番号５１に示される前記重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、配列番号５２に示される前記軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、または
配列番号５３に示される前記重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、配列番号５４に示される前記軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドである。
別の好ましい例では、配列番号５５に示される前記重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、配列番号５６に示される前記軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドである。
別の好ましい例では、配列番号５７に示される前記重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、配列番号５８に示される前記軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドである。
別の好ましい例では、配列番号５９に示される前記重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、配列番号６０に示される前記軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドである。
【００２９】
本発明の第８の態様では、担体であって、本発明の第７の態様のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、前記担体を提供する。
別の好ましい例では、前記担体は、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、アデノウイルスなどの哺乳動物細胞ウイルス、レトロウイルス、または他の担体を含む。
【００３０】
本発明の第９の態様では、遺伝子操作された宿主細胞であって、
第８の態様に記載の担体を含むか、またはゲノムに第７の態様のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドが組み込まれている、前記遺伝子操作された宿主細胞を提供する。
【００３１】
本発明の第１０の態様では、医薬組成物であって、
（ｉ）第１の態様に記載の重鎖可変領域、第２の態様に記載の重鎖、第３の態様に記載の軽鎖可変領域、第４の態様に記載の軽鎖、または第５の態様のいずれか一項に記載の抗体、第６の態様に記載の組換えタンパク質、またはそれらの組み合わせの群から選択される有効成分と、および
（ｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む、前記医薬組成物を提供する。
別の好ましい例では、前記医薬組成物は、液体製剤である。
別の好ましい例では、前記医薬組成物は、注射剤である。
別の好ましい例では、前記医薬組成物は、０.０１〜９９.９９％の本発明の第５の態様のいずれか一項に記載の抗体、本発明の第６の態様に記載の組換えタンパク質、またはそれらの組み合わせおよび０.０１〜９９.９９％の薬用担体を含み、前記パーセンテージは前記医薬組成物に占める質量パーセンテージである。
【００３２】
本発明の第１１の態様では、有効成分の用途であって、前記有効成分は、第１の態様に記載の重鎖可変領域、第２の態様に記載の重鎖、第３の態様に記載の軽鎖可変領域、第４の態様に記載の軽鎖、または第５の態様のいずれか一項に記載の抗体、第６の態様に記載の組換えタンパク質、またはそれらの組み合わせの群から選択され、前記有効成分は、ＬＡＧ−３関連疾患の予防および／または治療の薬物を調製するために使用される、前記有効成分の用途を提供する。
【００３３】
別の好ましい例では、前記ＬＡＧ−３関連疾患は、黒色腫（転移性悪性黒色腫など）、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌（非小細胞肺癌）、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、胃癌、食道癌、小腸癌、肝臓癌、膀胱癌、口腔癌、脳癌、精巣癌、皮膚癌、内分泌系癌、卵管癌、慢性または急性白血病（急性または慢性骨髄性白血病、急性または慢性リンパ性白血病を含む）、リンパ球性リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、進行性固形腫瘍を含むが、これらに限定されない。
【００３４】
本発明の第１２の態様では、インビトロ検出サンプル中のＬＡＧ−３タンパク質の組成物であって、第５の態様のいずれか一項に記載の抗体、第６の態様に記載の組換えタンパク質、またはそれらの組み合わせを有効成分として含む、前記インビトロ検出サンプル中のＬＡＧ−３タンパク質の組成物を提供する。
【００３５】
本発明の第１３の態様では、組換えポリペプチドの調製方法であって、
発現に適した条件下で、第９の態様に記載の宿主細胞を培養するステップ（ａ）と、
培養物から第５の態様のいずれか一項に記載の抗体または第６の態様に記載の組換えタンパク質である組換えポリペプチドを分離するステップ（ｂ）とを含む、前記組換えポリペプチドの調製方法を提供する。
【００３６】
本発明の第１４の態様では、ＬＡＧ−３関連疾患の治療方法であって、本発明の第５の態様のいずれか一項に記載の抗体、本発明の第６の態様に記載の組換えタンパク質、本発明の第１０の態様に記載の医薬組成物、またはそれらの組み合わせを使用するステップを含む、前記ＬＡＧ−３関連疾患の治療方法を提供する。
別の好ましい例では、前記ＬＡＧ−３関連疾患は癌である。
別の好ましい例では、抗体２を使用するステップをさらに含む。
別の好ましい例では、前記抗体２は、ＰＤ−１抗体、ＣＴＬＡ−４抗体、ＰＤＬ−１抗体の群から選択される。
【００３７】
本発明の第１５の態様では、薬物の組み合わせであって、
（ｉ）本発明の第５の態様のいずれか一項に記載の抗体である第１の有効成分と、
（ｉｉ）抗体２を含む第２の有効成分とを含む、前記薬物の組み合わせを提供する。
【００３８】
本発明の第１６の態様では、ＬＡＧ−３関連疾患を治療するための薬物の調製における本発明の第５の態様のいずれか一項に記載の抗体、または本発明の第６の態様に記載の組換えタンパク質、または本発明の第１０の態様に記載の医薬組成物と別の抗体２の組み合わせの用途を提供する。
【発明の効果】
【００３９】
本発明の範囲内で、本発明の上記の技術的特徴及び以下に（例えば、実施例）具体的に説明する技術的特徴を互いに組み合わせて、新規または好ましい技術的解決策を形成できることを理解されたい。スペースの制限のため、ここでは繰り返さない。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ＬＡＧ−３−ｈＦｃタンパク質とそのリガンドＭＨＣＩＩの結合活性を示した。
【図２】ＬＡＧ−３−ｈＦｃタンパク質とそのリガンドＬＳＥＣｔｉｎの結合活性を示した。
【図３】ＬＡＧ−３遺伝子をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞のＦＡＣＳ検出結果を示した。
【図４】ＥＬＩＳＡでのＬＡＧ−３−ｈＦＣタンパク質で免疫した後のマウス血清抗体価の検出を示した。
【００４１】
【図５ａ】ＦＡＣＳでのＬＡＧ−３抗体とＨＥＫ２９３−ｈＬＡＧ−３の結合反応の検出を示した。
【図５ｂ】ＦＡＣＳでのＬＡＧ−３抗体とＨＥＫ２９３−ｈＬＡＧ−３の結合反応の検出を示した。
【図６ａ】ＦＡＣＳでのＬＡＧ−３抗体とＨＥＫ２９３−ｃＬＡＧ−３の結合反応の検出を示した。
【図６ｂ】ＦＡＣＳでのＬＡＧ−３抗体とＨＥＫ２９３−ｃＬＡＧ−３の結合反応の検出を示した。
【図７ａ】ＬＡＧ−３タンパク質とその受容体ＭＨＣ  ＩＩの結合に対するＬＡＧ−３抗体の阻害を示した。
【図７ｂ】ＬＡＧ−３タンパク質とその受容体ＭＨＣ  ＩＩの結合に対するＬＡＧ−３抗体の阻害を示した。
【００４２】
【図８ａ】抗原特異的Ｔリンパ球刺激試験におけるＩＬ−２分泌に対するＬＡＧ−３抗体の影響を示した。
【図８ｂ】抗原特異的Ｔリンパ球刺激試験におけるＩＬ−２分泌に対するＬＡＧ−３抗体の影響を示した。
【図９ａ】ＬＡＧ−３抗体１０５Ｆ１Ｅ１０重鎖可変領域タンパク質および遺伝子配列を示した。
【図９ｂ】ＬＡＧ−３抗体１０５Ｆ１Ｅ１０軽鎖可変領域タンパク質および遺伝子配列を示した。
【図１０ａ】ＬＡＧ−３抗体４０５Ｂ８Ｈ３重鎖可変領域タンパク質および遺伝子配列を示した。
【図１０ｂ】ＬＡＧ−３抗体４０５Ｂ８Ｈ３軽鎖可変領域タンパク質および遺伝子配列を示した。
【００４３】
【図１１ａ】ＬＡＧ−３抗体５５６Ｆ６Ｂ８重鎖可変領域タンパク質および遺伝子配列を示した。
【図１１ｂ】ＬＡＧ−３抗体５５６Ｆ６Ｂ８軽鎖可変領域タンパク質および遺伝子配列を示した。
【図１２ａ】ＬＡＧ−３抗体４０９Ｂ１１Ｅ１２重鎖可変領域タンパク質および遺伝子配列を示した。
【図１２ｂ】ＬＡＧ−３抗体４０９Ｂ１１Ｅ１２軽鎖可変領域タンパク質および遺伝子配列を示した。
【図１３ａ】ＬＡＧ−３抗体４０９Ｄ４Ｅ１０重鎖可変領域タンパク質および遺伝子配列を示した。
【図１３ｂ】ＬＡＧ−３抗体４０９Ｄ４Ｅ１０軽鎖可変領域タンパク質および遺伝子配列を示した。
【００４４】
【図１４ａ】ＬＡＧ−３抗体５５３Ｇ８Ｇ８重鎖可変領域タンパク質および遺伝子配列を示した。
【図１４ｂ】ＬＡＧ−３抗体５５３Ｇ８Ｇ８軽鎖可変領域タンパク質および遺伝子配列を示した。
【図１５】酵素結合免疫吸着実験におけるＬＡＧ−３マウス−ヒトキメラ抗体とヒトＬＡＧ−３細胞外ドメインタンパク質反応活性を示した。
【図１６】酵素結合免疫吸着実験におけるＬＡＧ−３マウス−ヒトキメラ抗体とサルＬＡＧ−３細胞外ドメインタンパク反応活性を示した。
【図１７】酵素結合免疫吸着実験におけるＬＡＧ−３マウス−ヒトキメラ抗体とマウスＬＡＧ−３細胞外ドメインタンパク反応活性を示した。
【００４５】
【図１８】ＦＡＣＳでのＬＡＧ−３マウス−ヒトキメラ抗体とＨＥＫ２９３−ｈＬＡＧ−３の結合反応の検出を示した。
【図１９】ＦＡＣＳでのＬＡＧ−３マウス−ヒトキメラ抗体とＨＥＫ２９３−ｃＬＡＧ−３の結合反応の検出を示した。
【図２０】ＬＡＧ−３タンパク質とその受容体ＭＨＣ  ＩＩに対するＬＡＧ−３マウス−ヒトキメラ抗体の阻害を示した。
【図２１】ＬＡＧ−３タンパク質とその受容体ＬＳＥＣｔｉｎに対するＬＡＧ−３マウス−ヒトキメラ抗体の阻害を示した。
【図２２】抗原特異的Ｔリンパ球刺激試験におけるＩＬ−２分泌に対するＬＡＧ−３マウス−ヒトキメラ抗体の影響を示した。
【図２３】ＳＥＢ依存性ＰＢＭＣ刺激試験におけるＩＬ−２に対するＬＡＧ−３マウス−ヒトキメラ抗体の影響を示した。
【００４６】
【図２４】ＦＡＣＳでの４０５Ｂ８Ｈ３ヒト化抗体とＨＥＫ２９３−ｈＬＡＧ−３の結合反応の検出を示した。
【図２５】ＦＡＣＳでの５５６Ｆ６Ｂ８ヒト化抗体とＨＥＫ２９３−ｈＬＡＧ−３の結合反応の検出を示した。
【図２６】ＦＡＣＳでのホットスポット変異抗体とＨＥＫ２９３−ｈＬＡＧ−３の結合反応の検出を示した。
【図２７】ＬＡＧ−３タンパク質とその受容体ＭＨＣ  ＩＩに対するホットスポット変異抗体の阻害を示し、ここで、縦座標は阻害率％（ｂｌｏｃｋｉｎｇ％）である。
【図２８】抗原特異的Ｔリンパ球刺激試験におけるＩＬ−２分泌に対するホットスポット変異抗体の影響を示した。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
広範囲にわたる詳細な研究を通じて、発明者らは免疫マウス／ハイブリドーマ技術を使用して、ヒトリンパ球活性化遺伝子（ＬＡＧ−３）に結合する高活性の特異的モノクローナル抗体（マウス由来抗体）を予期せずに取得した。実験結果では、本発明の抗体（マウス−ヒトキメラ抗体）が抗原タンパク質に対して高い親和性（例えば、４０５Ｂ８Ｈ３のＫＤは１.９６Ｅ−０９Ｍ）を有し、ＬＡＧ−３受容体の細胞外ドメインに結合でき、ＬＡＧ−３とリガンドＭＨＣクラスＩＩ、ＬＳＥＣｔｉｎとの結合をタンパク質レベルおよび細胞レベルで効果的にブロックでき、抗原特異的Ｔリンパ球刺激実験により、得られたＬＡＧ−３抗体が優れた生物活性を有することが証明された。本発明の抗体の用途は、ＬＡＧ−３／ＭＨＣ  ＩＩおよび／またはＬＡＧ−３／ＬＳＥＣｔｉｎ媒介シグナル伝達経路の負の調節の阻害、腫瘍特異的免疫応答の活性化、単独または抗ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体または他の抗腫瘍薬物との併用による腫瘍免疫治療を含むが、これらに限定されない。
【００４８】
本発明の抗体の可変領域およびヒト由来抗体定常領域は、マウス−ヒトキメラ抗体分子に組み合わされるか、ヒト化技術によりヒト化抗体分子に変換されるか、または特定の用途に応じて二重特異性抗体、多重特異性抗体、一本鎖抗体、単一断片抗体などの他の分子形態に構築される。
本発明における抗体は、全長タンパク質（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、またはＩｇＧ２ｃなど）であり得、または抗原−抗体結合ドメインを含むタンパク質断片（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、ｓｄＡｂ、ＳｃＦｖ断片など）でもあり得る。本発明における抗体は、野生型タンパク質であり得、例えば変異を使用して抗体のエフェクター機能を排除する特定の変異を通じて特定の効果を達成した変異タンパク質でもあり得る。
これに基づいて本発明を完成した。
【００４９】
用語
ＬＡＧ−３
リンパ球活性化遺伝子（ＬＡＧ−３、ＣＤ２２３）は、５２５個のアミノ酸を有するＩ型膜タンパク質であり、既知の主要な免疫チェックポイント（Immune Checkpoint）の１つである。ＬＡＧ−３は主に活性化Ｔリンパ球、ＮＫ細胞、および樹状細胞に発現する。ＬＡＧ−３は、免疫グロブリンスーパーファミリーの構造に属し、その細胞外に４つのＩｇＧ様ドメインが具備され、ＣＤ４に似て、どちらも、それらのリガンド−ＩＩ系主要組織適合性複合体（ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ）と結合して生物活性を発揮する必要があるが、ＭＨＣ  ＩＩに結合する能力はＣＤ４よりも強力である。ＬＡＧ−３とそのリガンドＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩの結合は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球の活性化と増殖を阻害し、関連するインビボ細胞性免疫応答をダウンレギュレートする。インビトロでの抗原特異的Ｔ細胞応答の研究では、抗ＬＡＧ−３抗体を追加してＬＡＧ−３／ＭＨＣ  ＩＩシグナル伝達経路の負の制御を遮断すると、Ｔ細胞の増殖につながり、サイトカインの分泌を促進し、免疫系を活性化できる。さらに、ＬＡＧ−３はＴｒｅｇ細胞の活性を促進することにより、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）でも発現する。次に、Ｔ細胞の活性化と増殖、および樹状細胞（ＤＣ細胞）の成熟を負に調節する（Workman et al, 2005, Immunol, 174:688-695）。
【００５０】
抗体
本明細書で使用される用語「抗体」または「免疫グロブリン」は、２つの同じ軽鎖（Ｌ）と２つの同じ重鎖（Ｈ）からなる、同じ構造特性を持つ約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に接続されており、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数は異なる。各重鎖と軽鎖には、規則的な間隔の鎖内ジスルフィド結合もある。各重鎖には、一端に可変領域（ＶＨ）があり、その後に複数の定常領域がある。各軽鎖には、一端に可変領域（ＶＬ）があり、他端に定常領域があり、軽鎖の定常領域は重鎖の最初の定常領域と対向し、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と対向する。特別なアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖の可変領域間の界面を形成する。
【００５１】
本明細書で使用される用語「可変」は、抗体の可変領域の特定の部分が配列上異なり、それらが特定の抗原に対する様々な特異的抗体の結合および特異性を形成することを意味する。ただし、可変性は抗体の可変領域全体に均一に分布していない。それは、軽鎖および重鎖可変領域における相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つの断片に集中している。可変領域のより保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖および軽鎖の可変領域には、それぞれ４つのＦＲ領域が含まれ、それらはおおよそβ−折りたたまれた構成で、接続ループを形成する３つのＣＤＲで接続されており、場合によっては部分的なβ折りたたみ構造を形成できる。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって密接に結合され、他の鎖のＣＤＲと一緒に抗体の抗原結合部位を形成する（Kabatら、NIH Publ. No. 91-3242, Volume I、647-669ページ（1991）を参照）。定常領域は、抗原への抗体の結合には直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性に関与するなど、さまざまなエフェクター機能を発揮する。
【００５２】
脊椎動物の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常領域のアミノ酸配列に基づいて、２つの異なるタイプ（κおよびλと呼ばれる）のいずれかに分類できる。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に従って、免疫グロブリンは異なるタイプに分類できる。免疫グロブリンには主に５つのタイプがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、それらのいくつかはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２などのサブタイプ（アイソタイプ）にさらに分類できる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、β、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるタイプのサブユニット構造および三次元配置は、当業者によく知られている。
【００５３】
一般に、抗体の抗原結合特性は、重鎖および軽鎖の可変領域にある３つの特定の領域によって記述でき、可変領域（ＣＤＲ）と呼ばれ、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）に分割され、４つのＦＲのアミノ酸配列は比較的保守的であり、結合反応に直接関与しない。これらのＣＤＲは環状構造を形成し、その間のＦＲを介して形成されるβ折り畳みは空間構造が近接しており、重鎖のＣＤＲと対応する軽鎖のＣＤＲは抗体の抗原結合部位を構成する。同じタイプの抗体のアミノ酸配列を比較して、ＦＲまたはＣＤＲ領域を構成するアミノ酸を決定できる。
本発明は、完全な抗体だけでなく、免疫学的に活性な抗体の断片または抗体および他の配列によって形成される融合タンパク質も含む。したがって、本発明はまた、抗体の断片、誘導体およびアナログを含む。
【００５４】
本発明において、抗体は、当業者に周知の技術によって調製されたマウス、キメラ、ヒト化、または完全ヒト抗体を含む。ヒトおよび非ヒト部分を含む、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体などの組換え抗体は、標準的なＤＮＡ組換え技術によって得ることができ、それらはすべて有用な抗体である。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、例えば、マウスモノクローナル抗体からの可変領域とヒト免疫グロブリンからの定常領域を有するキメラ抗体である（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号および米国特許第４，８１６，３９７号、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。ヒト化抗体は、非ヒト種に由来する抗体分子を指し、非ヒト種に由来する１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）およびヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域を含む（米国特許第５，５８５，０８９号を参照、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。これらのキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当技術分野で周知のＤＮＡ組換え技術を使用して調製することができる。
【００５５】
本発明において、抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、またはより多重特異性であり得る。
本発明において、本発明の抗体はまた、その保存的変異体を含み、これは、本発明の抗体のアミノ酸配列と比較して、多くとも１０、好ましくは多くとも８、より好ましくは多くとも５、最も好ましくは多くとも３つのアミノ酸が、類似または近い特性を持つアミノ酸に置き換えられて、ポリペプチドを形成することを意味する。これらの保存的変異ポリペプチドは、アミノ酸置換によって表Ａに従って最もよく生成される。これらの保存的変異ポリペプチドは、表Ａに従ってアミノ酸置換によって生成されるのが最適である。
【００５６】
【表Ａ】
2021526013.tif 000002
【００５７】
抗ＬＡＧ−３の抗体
本発明は、重鎖の可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列を含む重鎖と、および軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、ＬＡＧ−３に対する高特異性および高親和性抗体を提供する。
好ましくは、重鎖可変領域（ＶＨ）は、
配列番号２に示されるＣＤＲ１と、
配列番号３に示されるＣＤＲ２と、および
配列番号４に示されるＣＤＲ３との３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号６に示されるＣＤＲ１’と、
配列番号７または配列番号８４に示されるＣＤＲ２’と、および
配列番号８に示されるＣＤＲ３’との３つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
ここで、前記アミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸が任意に追加、削除、修飾および／または置換され、ＬＡＧ−３の結合親和性を保持できる誘導体配列をさらに含む。
【００５８】
別の好ましい例では、少なくとも１つのアミノ酸が追加、削除、修飾および／または置換あれて形成された配列は、相同性または配列同一性がこのましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％，最もさらに好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列である。
当業者に周知の配列相同性または同一性を決定するための方法には、これらに限定されないが、計算分子生物学（Computational Molecular Biology）、Lesk, A.M.編集、オックスフォード大学出版社、ニューヨーク、１９８８；バイオコンピューティング：バイオコンピューティング：情報学とゲノムプロジェクト（Biocomputing: Informatics and Genome Projects）Smith, D.W.編集、アカデミックプレス、ニューヨーク、１９９３；シーケンスデータのコンピューター分析（Computer Analysis of Sequence Data）、パート１、Griffin, A.M.とGriffin, H.G.編集、Humana Press、ニュージャージー、１９９４；分子生物学における配列分析（Sequence Analysis in Molecular Biology）、von Heinje, G.、アカデミックプレス、１９８７、およびシーケンス分析プライマー（Sequence Analysis Primer）、Gribskov, M.とDevereux, J.編集、M Stockton Press、ニューヨーク、１９９１、Carillo, H.とLipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)。同一性を測定するための好ましい方法は、試験された配列間の最大の一致を得ることである。同一性を測定する方法は、一般に入手可能なコンピュータープログラムにコンパイルされている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータープログラム方法には、ＧＣＧパッケージ（Devereux, J.ら、1984）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Altschul, S,F.ら、1990）が含まれるが、これらに限定されない。一般の人々は、ＮＣＢＩおよびその他のソースからＢＬＡＳＴＸプログラムを入手できる（ＢＬＡＳＴハンドブック、Altschul, S.ら、NCBI NLM NIH Bethesda,Md.20894；Altschul, S.ら、1990）。よく知られているSmith Watermanアルゴリズムを使用して、同一性を測定することもできる。
【００５９】
本発明の抗体は、二本鎖または一本鎖抗体であってよく、動物由来抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、より好ましくはヒト化抗体、ヒト−動物キメラ抗体、およびより好ましくは完全ヒト化抗体から選択することができる。
本発明の抗体誘導体は、一本鎖抗体および／または抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２または当該分野で公知の他の抗体誘導体、ならびにＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体、または他のサブタイプの抗体のいずれかの１つまたは複数であり得る。
ここで、前記動物は、マウスなどの哺乳動物であることが好ましい。
本発明の抗体は、ヒトＬＡＧ−３を標的とするキメラ抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ移植および／または修飾抗体であってよい。
【００６０】
本発明の上記の内容において、前記付加、削除、修飾および／または置換されたアミノ酸の数は、好ましくは最初のアミノ酸配列におけるアミノ酸の総数の４０％を超えず、より好ましくは３５％を超えず、より好ましくは１〜３３％であり、より好ましくは５〜３０％、より好ましくは１０〜２５％、より好ましくは１５〜２０％である。
本発明の上記の内容において、より好ましくは、前記付加、削除、修飾および／または置換されたアミノ酸の数は、１〜７、より好ましくは１〜５、より好ましくは１〜３、より好ましくは１−２であることができる。
別の好ましい例では、前記ＬＡＧ−３を標的とする抗体は、４０５Ｂ８Ｈ３、５５６Ｆ６Ｂ８、１０５Ｆ１Ｅ１０、４０９Ｂ１１Ｅ１２、４０９Ｄ４Ｅ１０または５５３Ｇ８Ｇ８である。
別の好ましい例では、前記抗体は、４０５Ｂ８Ｈ３−１（Ｄ→Ｅ）、４０５Ｂ８Ｈ３−１、４０５Ｂ８Ｈ３−２、４０５Ｂ８Ｈ３−６、４０５Ｂ８Ｈ３−７、５５６Ｆ６Ｂ８−３、５５６Ｆ６Ｂ８−７、５５６Ｆ６Ｂ８−３（Ｄ→Ｅ）の群から選択される。
【００６１】
別の好ましい例では、前記重鎖可変領域は、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、  配列番号７０、配列番号７２に示されるアミノ酸配列を有する。
別の好ましい例では、前記重鎖可変領域は、配列番号８７、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３に示されるアミノ酸配列を有する。
別の好ましい例では、前記軽鎖可変領域は、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０または配列番号８２に示されるアミノ酸配列を有する。
別の好ましい例では、前記軽鎖可変領域は、配列番号８９、配列番号９５に示されるアミノ酸配列を有する。
【００６２】
別の好ましい例では、前記抗体４０５Ｂ８Ｈ３の重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列である。
別の好ましい例では、前記抗体４０５Ｂ８Ｈ３の軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号：５に示されるアミノ酸配列である。
別の好ましい例では、前記抗体４０５Ｂ８Ｈ３−１（Ｄ→Ｅ）の重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列は、配列番号６４に示されるアミノ酸配列である。
別の好ましい例では、前記抗体４０５Ｂ８Ｈ３−１（Ｄ→Ｅ）の軽鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列は、配列番号７４に示されるアミノ酸配列である。
【００６３】
抗体の調製
本発明の抗体またはその断片のＤＮＡ分子の配列は、ＰＣＲ増幅またはゲノムライブラリースクリーニングなどの従来の技術によって得ることができる。さらに、軽鎖および重鎖のコード配列を互いに融合させて、一本鎖抗体を形成することができる。
関連する配列が得られたら、組換え法を使用して、関連する配列を大量に取得できる。これは通常、それを担体にクローニングし、次にそれを細胞に移し、次に従来の方法により増殖した宿主細胞から関連配列を単離することである。
さらに、特に断片の長さが短い場合は、人工的な合成方法を使用して関連配列を合成することもできる。通常、最初に複数の小さな断片を合成し、次にライゲーションして非常に長い断片を取得できる。
【００６４】
現在、本発明の抗体（またはその断片、またはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列は、化学合成により完全に得ることができる。次いで、ＤＮＡ配列は、当該分野で公知の様々な既存のＤＮＡ分子（または担体など）および細胞に導入され得る。さらに、化学合成により、本発明のタンパク質配列に変異を導入することもできる。
本発明はまた、前記適切なＤＮＡ配列および適切なプロモーターまたは制御配列を含む担体に関する。これらの担体は、適切な宿主細胞を形質転換して、タンパク質を発現させるために使用できる。
宿主細胞は、細菌細胞などの原核細胞；または酵母細胞などの下等真核細胞；または哺乳動物細胞などの高等真核細胞であり得る。好ましい動物細胞には（これらに限定されないが）、ＣＨＯ−Ｓ、ＨＥＫ−２９３細胞が含まれる。
【００６５】
一般に、形質転換された宿主細胞は、本発明の抗体の発現に適した条件下で培養される。次に、従来の免疫グロブリン精製ステップを使用して、プロテインＡ−セファロース（Protein A-Sepharose）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの当業者に周知の従来の分離および精製手段によって精製して本発明の抗体を得る。
得られたモノクローナル抗体は、常法により同定することができる。例えば、モノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ（ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など）によって測定することができる。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munsonら、Anal. Biochem.,107:220 (1980)のスキャッチャード（Scatchard）分析により測定することができる。
【００６６】
本発明の抗体は、細胞内、または細胞膜上で発現され得るか、または細胞から分泌され得る。必要に応じて、物理的、化学的、およびその他の特性を使用して、さまざまな分離方法で組換えタンパク質を分離および精製できる。これらの方法は当業者によく知られている。これらの方法の例には、従来の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧滅菌、超音波処理、超遠心分離、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着層、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、その他のさまざまな液体クロマトグラフィー技術、およびこれらの方法の組み合わせが含まれますが、これらに限定されない。
【００６７】
応用
本発明はまた、例えば、診断製剤を調製するため、またはＬＡＧ−３関連疾患を予防および／または治療するための薬物を調製するための、本発明の抗体の用途を提供する。前記ＬＡＧ−３関連疾患には、腫瘍の発生、成長、および／または転移関連疾患を含む関連疾患が含まれる。
本発明の抗体の用途は、
（ｉ）黒色腫（転移性悪性黒色腫など）、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌（非小細胞肺癌）、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、胃癌、食道癌、小腸癌、肝臓癌、膀胱癌、口腔癌、脳癌、精巣癌、皮膚癌、内分泌系癌、卵管癌、慢性または急性白血病（急性または慢性骨髄性白血病、急性または慢性リンパ性白血病を含む）、リンパ球性リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、進行性固形腫瘍の診断、予防および／または治療を含む（しかし、これらに限定されない）。
【００６８】
医薬組成物
本発明はまた、組成物を提供する。好ましい例において、前記組成物は、上記の抗体またはその活性断片または融合タンパク質、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。通常、これらの物質は、非毒性で不活性で薬学的に許容される水性担体媒体に製剤化でき、ｐＨは通常約５〜８、好ましくは約６〜８であるが、ｐＨは調製される物質の性質および治療される病症によって異なることができる。調製された医薬組成物は、腫瘍内、腹腔内、静脈内、または局所投与を含む（がこれらに限定されない）従来の経路によって投与することができる。
本発明の前記抗体は、ヌクレオチド配列を細胞内で発現させることにより、細胞治療にも利用でき、例えば、前記抗体はキメラ抗原受容体Ｔ細胞免疫療法（ＣＡＲ−Ｔ）などに利用される。
【００６９】
本発明の医薬組成物は、ＬＡＧ−３タンパク質分子を結合するために直接使用することができ、したがって、腫瘍などの疾患を予防および治療するために使用することができる。さらに、他の治療薬を同時に使用することもできる。
本発明の医薬組成物は、安全かつ有効な量（例えば、０.００１〜９９重量％、好ましくは０.０１〜９０重量％、より好ましくは０.１〜８０重量％）の本発明の前記モノクローナル抗体および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。そのような担体には、生理食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれる（これらに限定されない）。医薬品は投与方法に適合している必要がある。薬物製剤は投与方法に適合している必要がある。本発明の医薬組成物は、注射の形態で調製することができ、例えば、生理食塩水またはグルコースおよび他のアジュバントを含有する水溶液を用いて従来の方法により調製することができる。注射剤や溶液などの医薬組成物は、無菌条件下で製造する必要がある。有効成分の投与量は、治療有効量、例えば、約１マイクログラム／ｋｇ体重〜約５ｍｇ／ｋｇ体重／日である。さらに、本発明のポリペプチドはまた、他の治療剤と共に使用され得る。
【００７０】
医薬組成物を使用する場合、安全かつ有効な量の免疫複合体が哺乳動物に投与され、安全かつ有効な量は、通常、少なくとも約１０マイクログラム／ｋｇ体重であり、ほとんどの場合、約５０ｍｇ／ｋｇ体重以下であり、好ましくは、投与量は、約１０マイクログラム／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重である。もちろん、具体的な投与量は、投与経路、患者の健康状態など、熟練した医師のスキルの範囲内にある要因も考慮する必要がある。
【００７１】
本発明は以下の主な利点を含む。
（１）本発明の抗体は、一連の優れた特徴を有する：
ａ．可変領域配列は既存の抗体とは異なる（相同性＜９２％）；
ｂ．ＢＭＳ９８６０１６に結合するエピトープが異なる；
ｃ．本発明の抗体は、ＬＡＧ−３との親和性が強い（例えば、４０５Ｂ８Ｈ３のＫＤ値が１.９６ｎＭ）；
ｄ．本発明の抗体は、Ｔ細胞の活性化を刺激する優れた活性を有する。
（２）本発明は、ハイブリドーマ技術を採用して抗体を取得するため、ファージライブラリーから取得した抗体と比較して、親和性が高く、配列発現も良好である。
（３）本発明は、異なる配列を有する抗体を取得し、ＬＡＧ−３抗体に特異的に結合することができ、それらの結合活性がナノモル未満であり、ＬＡＧ−３とそのリガンドＭＨＣＩＩ／ＬＳＥＣｔｉｎの結合を遮断でき、Ｔ細胞活性化活性に対するＬＡＧ−３の阻害を逆転させ、それによりＴ細胞を活性化してＩＬ−２を分泌させ、各活性はより良好である。
（４）本発明の抗体は、対照抗体よりも細胞表面のサル（中国サルなど）のＬＡＧ−３タンパク質に結合する能力が強い。本発明の抗体は、サル抗原との交差結合反応を有し、霊長類におけるインビボ実験に適用することができ、前臨床毒性学研究および前臨床薬物動態研究に使用できる。
【００７２】
以下では具体的な実施例に結び合わせて、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。下記の実施例では、具体的な条件を明示していない実験方法は、一般に、例えば、米国Sambrook. Jら「分子クローニング実験室マニュアル」（黄培堂ら訳、北京：科学出版社、２００２年）に記載の条件、またはメーカーが提案する条件（例えば、商品取扱説明書）に従う。特に明記しない限り、パーセンテージと部は重量で計算される。特に明記しない限り、以下の実施例で使用される実験材料および試薬は、市販のチャネルから入手できる。
【００７３】
一般的な方法
本発明は、モノクローナル抗体を調製するために伝統的なハイブリドーマ技術を使用する。従来のハイブリドーマ調製技術は、４０年前にケーラー（Kohler）とミルスタイン（Milstein）によって構築され、現在、科学的研究、診断、および治療など多くの関連するモノクローナル抗体の調製および生産に広く使用されている。その基本的な方法は現在も使用されているが、遺伝子組み換え動物などの異なる系統の動物の使用、電気融合技術の導入、ＣｌｏｎｅＰｉｘ機器などの高効率スクリーニング技術機器の適用など、多くの面で変更、改善、革新が行われて、ハイブリドーマ技術の応用はより多様で効率的になった。マウスなどの従来の動物から調製されたモノクローナル抗体は、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域遺伝子をクローン化する従来の分子生物学的方法によってクローン化でき、可変領域遺伝子をヒト由来抗体定常領域遺伝子に移植してヒトマウスキメラ抗体を形成でき、人体の免疫原性を大幅に低下させる。さらに、マウス抗体の可変領域のＣＤＲドメインをヒト由来抗体のフレームワークに移植できるため、マウス抗体の組成が５％以下に抑えられ、人体内で使用される抗体の安全性が大幅に向上させる。このアプローチで得られた抗体はヒト化抗体と呼ばれ、現在抗体薬物市場の主力製品である。モノクローナル抗体技術の最新の進歩によれば、本発明は、最適化されたハイブリドーマ技術を採用して、必要な抗ＬＡＧ−３抗体を調製する。
【００７４】
実施例１  ＬＡＧ−３特異的抗体の調製
細胞外ドメインＬＡＧ−３タンパク質、ＬＡＧ−３組換え細胞株、ＬＡＧ−３  ＤＮＡベクターを含む発現プラスミドなど免疫原の調製。
免疫原１）、ヒト由来ＬＡＧ−３タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列２３−４５０（配列表配列番号６１に示される）をヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片（ｈＦｃ）を有するｐＣｐＣ担体（Ｖ０４４−５０、Invitrogenから購入）にクローニングし、確立された標準的な分子生物学の方法に従ってプラスミドを調製し、具体的な方法については、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis T.(1989). Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Second Edition(Plainview, New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)を参照してください。ＨＥＫ２９３細胞（Invitrogenから購入）を一過性にトランスフェクトし（ＰＥＩ、Polysciences）、FreeStyle（商標）293（Invitrogen）を使用して、３７℃で増殖培養した。４日後、細胞培養液を回収し、遠心分離により細胞成分を除去し、ＬＡＧ−３タンパク質の細胞外ドメインを含む培養上清液を得た。培養上清液をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（Mabselect Sure、GE Healthcareから購入）にロードし、紫外線（ＵＶ）検出器を使用して紫外線吸収（Ａ２８０ｎｍ）の変化を監視した。サンプルをロードした後、ＵＶ吸収値がベースラインに戻るまで、ＰＢＳリン酸緩衝液（ｐＨ  ７.２）でタンパク質アフィニティークロマトグラフィーカラムを洗浄し、０.１Ｍグリシン塩酸（ｐＨ  ２.５）で溶出して、プロテインＡアフィニティー層カラムから溶出したｈＦｃタグ（ＬＡＧ−３−ｈＦｃ）を含むＬＡＧ−３タンパク質を収集し、４℃の冷蔵庫でＰＢＳリン酸緩衝液（ｐＨ  ７.２）を用いて一晩透析した。透析したタンパク質を０.２２ミクロンで滅菌濾過し、−８０℃で保存して、精製された免疫原ヒトＬＡＧ−３−ｈＦｃタンパク質を得た。免疫原ＬＡＧ−３−ｈＦｃタンパク質は、そのタンパク質濃度、純度、分子量、生物活性など、使用前に一連の品質管理テストが必要である。
【００７５】
ここで、免疫原ＬＡＧ−３−ｈＦｃとＭＨＣ  ＩＩの結合活性は、ＦＡＣＳ検出を使用し、具体的に以下のとおりである。
Ｔ−１７５細胞培養フラスコでＭＨＣ  ＩＩを発現しているＲａｊｉ細胞を７５〜９０％のコンフルエンスまで拡大し、遠心分離して培養液を捨て、細胞をＰＢＳ緩衝液で１〜２回洗浄し、細胞をカウントした後、細胞をブロッキング溶液（ＰＢＳ、２％ウシ胎児血清）で１〜２×１０６細胞／ｍｌに希釈し、氷上で２０〜３０分間インキュベートし、ブロッキング溶液（ＰＢＳ、２％ウシ胎児血清）で２回洗浄した。収集した細胞をブロッキング溶液（ＰＢＳ、２％ウシ胎児血清）で２×１０６細胞／ｍｌに懸濁し、１００μｌ／ウェルに９６ウェルＦＡＣＳ反応プレート（ウェルあたり２×１０５細胞）に追加し、遠心分離して培地を捨て、ｈＦｃタグを有するＬＡＧ−３タンパク質を勾配希釈し、１００μｌ／ウェルにＲａｊｉ細胞に加え、氷上で１〜２時間インキュベートした。ブロッキング溶液（ＰＢＳ、２％ウシ胎児血清）で遠心分離して２回洗浄し、１００μｌ／ウェルの蛍光（Ａｌｅｘａ  ４８８）標識二次抗体を加え、氷上で０.５〜１.０時間インキュベートした。ブロッキング溶液（ＰＢＳ、２％ウシ胎児血清）で遠心分離して２〜３回洗浄し、１００μｌ／ウェルにＰＢＳを加えて細胞を懸濁し、ＦＡＣＳ（FACSVerse、BD）を使用して検出し、結果を分析した。
【００７６】
ここで、免疫原ＬＡＧ−３−ｈＦｃとＬＳＥＣｔｉｎの結合活性はＥＬＩＳＡ検出を使用し、具体的に以下のとおりである。
ｈＦｃタグを有するＬＡＧ−３タンパク質（ＬＡＧ−３−ｈＦｃ、即ち免疫原）をＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈し、１００μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡマイクロプレートに加え、４℃で一晩インキュベートした。ＥＬＩＳＡブロッキング溶液（１％ＢＳＡ、ｐＨ  ７.４  ＰＢＳリン酸緩衝液を含む、前記パーセンテージは質量パーセンテージである）で３７℃で２時間ブロッキングした後、勾配希釈されたＬＳＥＣｔｉｎ−Ｈｉｓタグを加え、３７℃で１時間インキュベートした。前記ＬＳＥＣｔｉｎ−ＨｉｓはＲ＆Ｄシステムから購入し、商品番号は２９４７−ＣＬである。抗Ｈｉｓタグのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから購入し、商品番号はＡ００６１２である）を加え、室温で３０分間インキュベートし、１００ｕｌ／ウェルのＴＭＢ発色液を加えた。室温で１５分間インキュベートした後、５０ｕｌの１Ｎ塩酸を加えて呈色反応を停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーでＯＤ４５０ｎｍの読み取り値を読み取った。各ステップの後にプレートを洗浄する必要がある。
結果は、図１、図２、表１、表２に示したとおりである。
【００７７】
【表１】
2021526013.tif 000003
【００７８】
【表２−１】
2021526013.tif 000004
【表２−２】
2021526013.tif 000005
【００７９】
結果は、細胞レベルでのＬＡＧ−３とＭＨＣＩＩの結合がＬＡＧ−３−ｈＦＣの濃度の変化により変化し、タンパク質レベルでのＬＡＧ−３とＬＳＥＣｔｉｎの結合がＬＡＧ−３−ｈＦＣの濃度の変化により変化することを示し、ここで、対照タンパク質は非ＬＡＧ−３融合タンパク質である。発現されたリガンドと受容体タンパク質は正しいコンフォメーションを持ち、免疫、受容体−リガンド結合ブロッキング検出法の確立、および抗体活性の同定に適する。
【００８０】
ＬＡＧ−３タンパク質免疫は、６〜８週齢のＢａｂＬ／ＣおよびＳＪＬマウス（Shanghai SLAC Animal Center Breeding提供）を使用し、マウスはＳＰＦ条件下で飼育された。ＬＡＧ−３タンパク質の最初の免疫はフロイントの完全アジュバントで乳化され、マウス１匹あたり０.２５ｍｌ、５０マイクログラムのタンパク質を腹腔内注射した。追加免疫ＬＡＧ−３タンパク質をフロイントの不完全アジュバントで乳化し、マウスあたり０.２５ｍｌ、５０マイクログラムのタンパク質を腹腔内注射した。最初の免疫と最初の追加免疫の間隔は２週間で、その後の各免疫の間隔は３週間である。各追加免疫の７日後に血液を採取し、血清中の抗体価と特異性をＥＬＩＳＡとＦＡＣＳで検出した。
【００８１】
免疫原２）、ヒト由来ＬＡＧ−３全長アミノ酸配列をｐＩＲＥＳ担体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入）にクローニングし、プラスミドを調製した。ＨＥＫ２９３細胞株とＣＨＯＫ１細胞株（どちらもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）のプラスミドトランスフェクション後（X-treme GENE HP DNA Transfection Reagentを使用したトランスフェクションし、Roche社から購入、製品番号Cat#06 366 236 001、および説明書に従って操作）、０.５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含む１０％（ｗ／ｗ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で選択的に２週間培養し、９６ウェル培養プレートに限界希釈法でサブクローニングし、３７℃に置き、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２で培養した。約２週間後、いくつかのモノクローナルウェルを選択し、６ウェルプレートに増幅した。増幅されたクローンを既知のＬＡＧ−３抗体で染色し、フローサイトメトリーでスクリーニングした。より良い成長、より高い蛍光強度、モノクローナル細胞株を選択してを培養を拡大し続け、液体窒素で凍結し、免疫原ＬＡＧ−３組換え細胞株を取得した。具体的な選択結果は、表３と図３に示したとおり、表３で、陽性細胞（％）は細胞総数における陽性細胞の割合を示し、ＭＦＩは測定された細胞集団の平均蛍光強度値である。
【００８２】
【表３】
2021526013.tif 000006
【００８３】
結果は、ＨＥＫ２９３細胞がより高いレベルのＬＡＧ−３発現を有し、免疫原としての使用および抗体結合活性の同定に適していることを示した。
【００８４】
ＬＡＧ−３細胞免疫は、６〜８週齢のＢａｂＬ／ＣおよびＳＪＬマウス（Shanghai Slack Animal Center Breeding提供）を使用し、マウスは接種された後、ＳＰＦ条件下で飼育された。ヒトＬＡＧ−３でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３安定細胞株をＴ−７５細胞培養フラスコで７５〜９０％コンフルエンスに拡大し、培地を吸引し、ＤＭＥＭ基礎培地で１〜２回洗浄した後、細胞を、酵素を含まない細胞解離溶液で処理して回収した。ＤＭＥＭ基礎培地で１〜２回洗浄し、細胞をカウントした後、細胞をＰＢＳで１〜２×１０７細胞／ｍｌに希釈した。各免疫化の間、各マウスに０.５ｍｌの細胞懸濁液を腹腔内注射した。１回目と２回目の免疫の間隔は２週間、その後の各免疫間隔は３週間である。各追加免疫の７日後に血液を採取し、血清中の抗体価と特異性をＦＡＣＳで検出した。
【００８５】
免疫原３）、ＬＡＧ−３完全長アミノ酸配列ｃＤＮＡをｐＣＤＮＡ３.１担体にクローニングし、１.０ｕｍ金コロイド弾にコーティングし、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子銃（Bio-rad）で免疫した。詳細な方法は、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子銃の説明書に従って行った。
６−８週齢のＢａｂＬ／ＣおよびＳＪＬマウス（Shanghai SLAC Animal Center Breeding提供）をＳＰＦ条件下で飼育した。すべてのマウスを腹部から遺伝子銃で３〜４回、毎回３〜４ショット免疫し、ｃＤＮＡの量は１ショットあたり１.０μｇである。最初の免疫と最初の追加免疫の間隔は２週間で、その後の各免疫の間隔は３週間である。各追加免疫の７日後に血液を採取し、血清中の抗体価をＥＬＩＳＡで検出した。通常、ほとんどのマウスのＥＬＩＳＡ力価は、２〜３回の免疫後に１：１０００以上に達することがある。表４および図４は、ＬＡＧ−３−ｈＦＣタンパク質免疫血清およびＥＬＩＳＡによる抗体価検出の結果を示している。
【００８６】
【表４】
2021526013.tif 000007
【００８７】
結果は、免疫原による免疫化、ほとんどのマウスＥＬＩＳＡ力価は３回の免疫化後に１：１０００００以上に達する可能性があり、マウスが免疫原に対してより優れた体液性免疫応答を示し、その脾臓細胞をハイブリドーマ細胞の調製に使用できることを示す。
【００８８】
力価が要件を満たしているマウスを、細胞融合およびハイブリドーマの準備用に選択できる。細胞融合の前に、最後の免疫化のために、マウスに５０〜１００マイクログラムの精製ＬＡＧ−３−ｈＦｃを腹腔内注射した。３〜５日後、マウスを犠牲にし、脾細胞を収集した。ＤＭＥＭ基礎培地で１０００回転／分で遠心分離して、細胞を３回洗浄し、生存細胞数と５：１の比率でマウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣから購入）と混合し、高効率の電気融合またはＰＥＧ法（METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL. 220を参照）を使用して、細胞を融合した。融合した細胞を２０％ウシ胎児血清と１×ＨＡＴを含むＤＭＥＭ培地に希釈し、前記パーセンテージは質量パーセンテージである。次に、１ウェルあたり１×１０５／２００ｕｌを９６ウェル細胞培養プレートに追加し、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーターに入れ、前記パーセンテージは体積パーセンテージである。１４日後、ＥＬＩＳＡおよびＡｃｕｍｅｎ（マイクロウェルプレート細胞検出法）を使用して、細胞融合プレートの上清をスクリーニングし、ＥＬＩＳＡでＯＤ４５０ｎｍ＞１.０、ＡｃｕｍｅｎでＭＦＩ値＞１００の陽性クローンを２４ウェルプレートに増幅し、１０％（ｗ／ｗ）ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（Invitrogen）培地で、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２で拡大培養した。培養３日後、２４ウェルプレートで拡大培養した培養液を遠心分離し、上清液を回収し、上清液の抗体サブタイプを解析した。ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳを使用してＬＡＧ−３タンパク質およびＬＡＧ−３陽性細胞への結合活性を決定し、リガンド受容体結合実験を使用してＬＡＧ−３受容体への抗体試料の遮断活性を決定した。
【００８９】
２４ウェルプレートのスクリーニング結果によると、ＥＬＩＳＡ実験ではＯＤ４５０ｎｍ＞１.０、ＦＡＣＳ実験ではＭＦＩ値＞５０、リガンド−受容体結合実験におけるＬＡＧ−３受容体に対するハイブリドーマ細胞培養上清のブロッキング阻害率が６０％に達するハイブリドーマ細胞は、適格な陽性クローンである。適格なハイブリドーマ細胞を選択し、９６ウェル培養プレートに限界希釈法でサブクローニングし、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２で１０％（ｗ／ｗ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（Invitrogenから購入）で培養した。サブクローニングの１０日後、ＥＬＩＳＡとＡｃｕｍｅｎを使用して予備スクリーニングを行い、陽性の単一クローンを選択して２４ウェルプレートに増幅し、培養を継続した。３日後、ＦＡＣＳを使用して陽性抗原結合を確認し、ＬＡＧ−３受容体リガンド結合実験を使用して生物活性を評価した（評価基準は、ＥＬＩＳＡ実験ではＯＤ４５０ｎｍ＞１.０、ＦＡＣＳ実験ではＭＦＩ値＞５０、リガンド受容体結合実験におけるＭＨＣＩＩリガンドに対するハイブリドーマ細胞培養上清のブロッキング阻害率は６０％に達した）。
【００９０】
２４ウェルプレートサンプルの検出結果によると、陽性クローンを１０％（ｗ／ｗ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（Invitrogenから購入）培地で、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２で拡大培養し、凍結溶液［２０％（ｗ／ｗ）ＦＢＳおよび１０％（ｗ／ｗ）ＤＭＳＯを含むＤＭＥＭ］に懸濁し、従来の方法に従って液体窒素で凍結保存して、後続の抗体の生産、精製、アミノ酸配列決定に使用できる本発明のハイブリドーマ細胞を得る。
【００９１】
実施例２  精製された抗体の同定
（一）フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で抗体とＬＡＧ−３発現細胞の結合を検出
実施例１で調製された免疫原２における前記ヒト由来ＬＡＧ−３をコードする全長ヌクレオチド配列を含むｐＩＲＥＳプラスミドを２９３Ｆ細胞株にトランスフェクトして、ヒトＬＡＧ−３を含む２９３Ｆ安定的にトランスフェクトされた細胞株（本明細書ではＨＥＫ２９３−ｈＬＡＧ−３安定細胞株と呼ぶ）を得、全長サル遺伝子を有するｐＩＲＥＳプラスミドをＨＥＫ２９３細胞株にトランスフェクトして、サルＬＡＧ−３を含むＨＥＫ２９３安定的にトランスフェクトされた細胞株（本明細書ではＨＥＫ２９３−ｃＬＡＧ−３安定細胞株と呼ぶ）を構築した。Ｔ−７５細胞培養フラスコ内でＨＥＫ２９３−ｈＬＡＧ−３安定細胞株とＨＥＫ２９３−ｃＬＡＧ−３安定細胞株を９０％コンフルエンスまで拡大培養し、培地を吸引し、ＨＢＳＳ（Hanks' Balanced Salt Solution）で１〜２回洗浄し、酵素を含まない細胞解離液（Versene solution：Life technology）を使用して、細胞を処理および収集した。細胞をＨＢＳＳ緩衝液で１〜２回洗浄し、細胞をカウントした後、細胞をＨＢＳＳで１〜２×１０６細胞／ｍｌに希釈し、１％ヤギ血清ブロッキング溶液を加え、氷上で２０〜３０分間インキュベートし、ＨＢＳＳで２回遠心分離して洗浄した。
【００９２】
収集した細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＨＢＳＳ＋１％ＢＳＡ）で２×１０６細胞／ｍｌに懸濁し、１００μｌ／ウェルに９６ウェルＦＡＣＳ反応プレートに追加し、検出する抗体サンプルを１００μｌ／ウェルに追加し、氷上で１〜２時間インキュベートした。ＦＡＣＳバッファーで２回遠心分離して洗浄し、１００μｌ／ウェルに蛍光（Ａｌｅｘａ  ４８８）標識二次抗体を追加し、氷上で０.５〜１.０時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２〜３回遠心分離して洗浄し、ウェルあたり１００μｌの固定液（４％パラホルムアルデヒド（Paraformaldehyde））を加えて細胞を懸濁し、５〜１０分後、ＦＡＣＳ緩衝液で１〜２回遠心分離して洗浄した。１００ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液で細胞を懸濁し、ＦＡＣＳ（FACSCalibur、BD）を使用して結果を検出および分析した。結果は表５および表６、図５ａ、図５ｂ、図６ａ、図６ｂに示したとおり、検出する抗体は、細胞表面のヒトまたはサルのＬＡＧ−３タンパク質に結合でき、各抗体の活性は同等であり、抗体がＬＡＧ−３に対して強い結合能力を持っていることを示す。ＩｇＧ対照はマウスＩｇＧであり、表のデータはＭＦＩによって測定された細胞集団の平均蛍光強度値である。
【００９３】
s
【表５−１】
2021526013.tif 000008
【表５−２】
2021526013.tif 000009
【００９４】
【表６】
2021526013.tif 000010
【００９５】
（二）ＬＡＧ−３受容体リガンド結合実験でＬＡＧ−３抗体がＬＡＧ−３とそのリガンドＭＨＣ  ＩＩの結合を遮断することを検出
Ｔ−７５細胞培養フラスコ内でＭＨＣ  ＩＩを発現するＲａｊｉ細胞を７５−９０％コンフルエンスまで拡大培養し、遠心分離して培地を捨て、ＰＢＳ緩衝液で細胞を１〜２回洗浄し、細胞をカウントした後、細胞をブロッキング溶液（ＰＢＳ、２％ウシ胎児血清）で１〜２×１０６細胞／ｍｌに希釈し、１００μｌ／ウェルに９６ウェルＦＡＣＳ反応プレートに加え（ウェル当たり１×１０５細胞）、氷上で２０〜３０分間インキュベートし、検出する抗体サンプルと１ ｕｇ／ｍｌのＬＡＧ−３−ｈＦｃタンパク質を等量混合し、室温で３０分間インキュベートした後、孵育Ｒａｊｉ細胞をインキュベートしたＦＡＣＳ反応プレートを遠心し、上清を捨て、１００μｌ／ウェルに前記混合物をＲａｊｉ細胞に加え、氷上で１〜２時間インキュベートした。ブロッキング溶液（ＰＢＳ、２％ウシ胎児血清）で２回遠心分離して洗浄し、１００μｌ／ウェルに蛍光（Ａｌｅｘａ  ４８８）標識二次抗体を加え、氷上で１.０時間インキュベートした。ブロッキング溶液（ＰＢＳ、２％ウシ胎児血清）で２〜３回遠心分離して洗浄し、１００μｌ／ウェルにＰＢＳ懸濁細胞を加え、ＦＡＣＳ（FACS Calibur、BD）で結果を検出および分析した。結果は、表７および図７ａ、図７ｂに示したとおり、ＩｇＧ対照はマウスＩｇＧであり、表のデータは阻害率（％）である。
【００９６】
【表７】
2021526013.tif 000011
【００９７】
結果は、得られた抗体がＬＡＧ−３タンパク質のそのリガンドＭＨＣＩＩへの結合をさまざまな程度に阻害でき、検出した抗体の活性が同等であることを示す。
【００９８】
（三）抗原特異的Ｔリンパ球刺激実験でリンパ球活性に対するＬＡＧ−３抗体の影響
抗原特異的Ｔリンパ球刺激実験では、ＬＡＧ−３抗体がＬＡＧ−３とＭＨＣ  ＩＩの結合を遮断し、Ｔリンパ球活性の阻害を緩和して、Ｔ細胞の増殖を刺激することを検出する。
１.抗原特異的Ｔリンパ球の取得、まず、マウスＣＤ４分離キットを使用し、免疫磁気ビーズ技術と組み合わせた抗体を使用して、ＯＶＡトランスジェニックマウスのリンパ球サンプルからＣＤ４＋Ｔ細胞をネガティブスクリーニングし、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔリンパ球を分離した。得られたＴ細胞をマウス胸腺腫細胞系ＢＷ５１４７.Ｇ.１.４と５：１の比率で混合し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）細胞融合法を用いて細胞融合した。融合細胞をヒポキサンチン、アミノプテリジンおよびチミジンを含む１×ＨＡＴ培地で選択的に培養し、得られた単一クローンを２４ウェルプレートに拡大培養し、２〜３日後に単一クローンをスクリーニングした。インビトロ抗原提示実験によってクローンをスクリーニングし、同じ系統のＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓細胞で特異的抗原ＯＶＡ３２３−３３９の混合物と混合して、モノクローナル細胞の培養培地に加え、モノクローナル細胞を一晩インキュベートして、上清を収集した（具体的な方法は、David Hら、Methods Mol Biol, 2013, 960:297-307を参照）。酵素結合免疫吸着アッセイで上清中のマウスインターロイキン２（mouse IL2、ｍＩＬ２）の含有量を検出し、細胞増殖状態の良好で、安定した継代（少なくとも数十世代）、およびｍＩＬ−２の分泌が高い最良のモノクローナル細胞を選択して、拡大培養し、液体窒素で凍結保存した。最後に、Ｔリンパ球ハイブリドーマ（８Ｂ２）が最良のクローンとして選択した。
【００９９】
免疫抑制因子を過剰発現する安定した細胞株を構築するために、ヒトＬＡＧ−３の全長遺伝子配列をｐＩＲＥＳ発現ベクターにクローニングし、レンチウイルス（Shanghai Jima）にパッケージ化した。Ｔリンパ球ハイブリドーマ細胞株８Ｂ２にレンチウイルスを感染させ、トランスフェクトされた細胞を抗生物質含有培地で選択的に培養し、２週間後、限界希釈により９６ウェル培養プレートにサブクローニングした。クローンが成長したら、モノクローナルウェル細胞を６ウェルプレートまたは培養フラスコに拡張した。増幅されたクローンを、抗ＬＡＧ−３特異的抗体を用いたフローサイトメトリーによりスクリーニングした。より優れた成長、より高い蛍光強度、およびモノクローナル細胞系を選択し、拡大培養し、液体窒素で凍結保存した。最後に、Ｔリンパ球ハイブリドーマ（８Ｂ２）＿ｈＬＡＧ−３（３Ｅ４）を最良のクローンとして選択した。
【０１００】
２.抗原特異的Ｔリンパ球刺激実験、Ｔ−１７５細胞培養フラスコでＴリンパ球ハイブリドーマ（８Ｂ２）＿ｈＬＡＧ−３（３Ｅ４）を７５−９０％コンフルエンスまで培養し、培地を捨て、ＰＢＳで１〜２回洗浄し、カウントした後、細胞を１−２Ｅ５細胞で５０ｕｌ／ウェルで９６ウェル細胞培養プレートに塗布し、最終濃度の２倍の検出する抗体希釈液を培養プレートに追加して、室温で３０分間インキュベートし、同時に、同じ系統の通常Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓細胞と、特異的抗原ＯＶＡ３２３−３３９を混合し、室温で３０分間インキュベートし、最後に、培養プレートに５０ｕｌの混合物を加えて、各反応ウェルの容量が２００ｕｌになるようにし、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで反応プレートを一晩インキュベートした後、上清を回収し、検出のために−２０℃以下で凍結保存した。
【０１０１】
３．細胞上清中のサイトカインインターロイキンＩＬ−２酵素結合免疫吸着検出。
細胞上清中のサイトカインインターロイキンＩＬ−２酵素結合免疫吸着検出は、Ｒ＆Ｄシステム関連の検出キットであるマウスＩＬ−２  ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ（ＤＹ４０２）を使用し、説明書に従って操作した。検出抗体を除くすべての試験試薬は、試験キットによって提供された。
【０１０２】
細胞上清中のサイトカインインターロイキンＩＬ−２含有量を測定する酵素結合免疫吸着検出は、二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡキット（R&D Systems、IL-2 Cat#DY402から購入）を使用した。実験操作は厳密にキットの説明書の要件に従っており、すべての検出試薬はキットによって提供された。具体的な実験は次のように簡単に説明される：ＩＬ−２ポリクローナル抗体をＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートにコーティングし、プラスチックフィルムで密封し、４℃で一晩インキュベートし、翌日、プレート洗浄液でプレートを４回洗浄し、ブロッキング溶液を加えて、室温で１〜２時間ブロックした。プレート洗浄液でプレートを４回洗浄し、ステップ２で得られた細胞上清液を検出サンプルとして使用し、標準品を加え、検出サンプルを室温で２時間インキュベートした。各ウェルに４００ｕｌの洗浄液を加え、プレートを４回繰り返して洗浄し、次に、抗ヒトＩＬ−２のホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗体を加え、室温で２時間インキュベートして、マイクロプレート上のＩＬ−２と免疫複合体を形成し、マイクロウェルを洗浄し、基質を加えて発色し、室温で３０分間光を避け、最後に停止液を加え、マイクロプレートリーダーでＡ４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１０３】
ステップ２で説明した抗原特異的Ｔリンパ球刺激実験における、ＩＬ−２分泌に対するＬＡＧ−３抗体の影響を検出した。結果は、図８ａ、図８ｂ、および表８に示したとおりであり、ｍＩｇＧ対照はマウスＩｇＧであり、表のデータはＩＬ−２値（ｐｇ／ｍＬ）である。
【０１０４】
【表８】
2021526013.tif 000012
【０１０５】
結果は、抗原特異的Ｔリンパ球刺激試験では、検出する抗体がＴリンパ球のＩＬ−２分泌を増強でき、活性化効果は濃度勾配に依存し、４０５Ｂ８Ｈ３の活性率は他の抗体よりも優れていることを示す。
【０１０６】
（四）抗原エピトープ予測
ヒトＬＡＧ−３タンパク質の細胞外ドメインには、以下のアミノ酸配列の露出した外部ループ（eatra loop）が含まれる：ＧＰＰＡＡＡＰＧＨＰＬＡＰＧＰＨＰ  ＡＡＰＳＳＷＧＰＲＰＲＲＹ。この領域への精製抗体の結合をテストし、各抗体が結合するエピトープを予測するために、この領域全体でペプチドスキャン実験を行った。
【０１０７】
完全長の外部ループ配列を含む１５個の重複ペプチドを調製し、ビオチンをＣ末端にカプリングした。酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、これらのペプチドに対する抗体の結合を検出し、ストレプトアビジン（sigma、Cat#M5432）をＰＢＳで希釈して、最終濃度を１.０μｇ／ｍｌにした後、１００μｌ／ウェルに９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに加えた。プラスチックフィルムで覆い、４℃で一晩インキュベートし、翌日、プレートをプレート洗浄液（ＰＢＳ＋０.０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で２回洗浄し、ブロッキング溶液（ＰＢＳ ＋ ０.０１％Ｔｗｅｅｎ２０ ＋ １％ＢＳＡ）を加えて、室温で１〜２時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を注ぎ捨て、ビオチン化ペプチドを最終濃度１ ｕｇ／ｍｌに加え、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに１００ｕｌ／ウェルで加え、３７℃で１〜２時間インキュベートし、プレート洗浄液（ＰＢＳ ＋ ０.０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で２〜３回洗浄した。次に、ウェルあたり１００μｌの抗体サンプルを３７℃で１〜２時間インキュベートし、プレートをプレート洗浄液（ＰＢＳ ＋ ０.０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で２〜３回洗浄した。ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識二次抗体を加え、３７℃で１〜２時間インキュベートし、プレートをプレート洗浄液（ＰＢＳ ＋ ０.０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で２〜３回洗浄した。ＴＭＢ基質１００μｌを各ウェルに加え、室温で１５〜３０分間インキュベートした後、各ウェルに１００μｌの停止液（１.０Ｎ  ＨＣｌ）を加えた。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（TiterMax 384plus、Molecular Device）を使用して、Ａ４５０ｎｍ値を読み取った。ペプチドスキャン実験の結果を以下の表９に要約する。
【０１０８】
【表９】
2021526013.tif 000013
【０１０９】
上記の表９の結果に基づいて、５５３Ｇ８Ｇ８と５５６Ｆ６Ｂ８は外部ループ配列を認識せず、４０５Ｂ８Ｈ３、４０９Ｂ１１Ｅ１２、および４０９Ｄ４Ｅ１０はアミノ酸配列ＳＳＷＧＰＲＰＲを含む外部ループ内の一領域を認識し、１０５Ｆ１Ｅ１０はアミノ酸配列ＡＰＳＳＷＧＰＲを含む外部ループ内の領域を認識すると判断できる。
結果は、本発明の抗体およびＢＭＳのＬＡＧ−３抗体ＢＭＳ９８６０１６が結合するエピトープは一致せず、本発明の抗体はＢＭＳの特許ＣＮ１０２１７６９２１Ａによって保護されるエピトープＨＰＡＡＰＳＳＷを侵害しないことを示している。
【０１１０】
実施例３  軽鎖および重鎖可変領域アミノ酸配列の測定
全ＲＮＡの単離：サブクローナル培養の上清が抗原結合について試験された後、遠心分離により１〜５×１０７のハイブリドーマ細胞を収集した。１ｍＬのトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）を加えて混合し、１.５ｍｌの遠沈管に移し、室温で５分間静置し、０.２ｍｌのクロロホルムを加え、１５秒間振とうし、２分間静置し、４℃、１２０００ｇで５分間遠心し、上清を取り、新しい１.５ｍｌの遠沈管に移し、０.５ｍｌのイソプロパノールを加え、チューブ内の液体を穏やかに混合し、室温で１０分間静置し、４℃、１２０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を捨て、１ｍｌの７５％エタノールを加え、沈殿物を静かに洗浄した。４℃、１２０００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てて乾燥させ、適量のＤＥＰＣ  Ｈ２Ｏを加えて溶解した（５５℃ウォーターバスで１０分）。
【０１１１】
逆転写とＰＣＲ：１μｇのｔＲＮＡを取り、２０ｕｌのシステムを構成し、逆転写酵素を加え、４２℃で６０分間反応させ、７０℃で１０分間反応させて反応を停止させた。１μｌのｃＤＮＡ、２５ｐｍｏｌの各プライマー、１μｌのＤＮＡポリメラーゼおよびマッチングバッファーシステム、２５０μｍｏｌのｄＮＴＰを含む５０μｌのＰＣＲシステムを構成し、ＰＣＲプログラムを設定し、９５℃で３分間の前変性、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３５秒間伸長、３５サイクル後、７２℃で５分間のさらに伸長した。注：伸長温度は実際の状況に応じて調整できる。
【０１１２】
クローニングとシークエンシング：５μｌのＰＣＲ産物を取ってアガロースゲル電気泳動検出し、カラム回収キットを使用して陽性サンプルを精製し、ライゲーション反応を実行した：５０ｎｇのサンプル、５０ｎｇのＴ担体、０.５μｌのリガーゼ、１μｌの緩衝液、１０μｌの反応システム、１６℃で３０分間反応させ；５μｌのライゲーション産物を１００μｌのコンピテントセルに加え、５分間氷浴し、次に４２℃ウォーターバスで１分間ヒートショックし、氷上に１分間戻し、抗生物質を含まない６５０μｌのＳＯＣ培地を加え、３７℃、２００ＲＰＭ、３０分間シェーカーで蘇生し、２００μｌを取り出して抗生物質を含むＬＢ固体培地に塗布し、３７℃インキュベーターで一晩培養し、翌日、Ｔ担体上でプライマーＭ１３ＦとＭ１３Ｒを使用して、３０μｌＰＣＲシステムを構成し、コロニーＰＣＲを実行し、ピペットチップを使用してコロニーをＰＣＲ反応システムとピペットに浸し、抗生物質を含む別のＬＢ固体ペトリ皿に０.５μｌを吸引して菌株を保存し、ＰＣＲ反応後、５μｌを取り出してアガロースゲル電気泳動し、陽性サンプルのシークエンシングを行った。ここで、シーケンシングのステップは、Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)を参照。
シークエンシングの結果：本発明の抗体産物の重鎖可変領域タンパク質および遺伝子（ＤＮＡ）配列、軽鎖可変領域タンパク質および遺伝子配列はいかのとおりである：
【０１１３】
抗体１０５Ｆ１Ｅ１０は図９ａ、図９ｂを参照；抗体４０５Ｂ８Ｈ３は図１０ａ、図１０ｂを参照；抗体５５６Ｆ６Ｂ８は図１１ａ、図１１ｂを参照；抗体４０９Ｂ１１Ｅ１２は図１２ａ、図１２ｂを参照；抗体４０９Ｄ４Ｅ１０は図１３ａ、図１３ｂを参照；抗体 ５５３Ｇ８Ｇ８は図１４ａ、図１４ｂを参照。
【０１１４】
実施例４  マウス−ヒトキメラ抗体の構築、抗体の生産および精製
プラスミドの構築と準備：ハイブリドーマ抗体重鎖可変領域配列をシグナルペプチドとヒト由来重鎖抗体ＩｇＧ４定常領域を含むｐＣＰ発現担体にクローニングし、軽鎖可変領域を、シグナルペプチドおよびヒト由来抗体軽鎖カッパ（ｌａｍｂｄａ）定常領域を含む発現ｐＣＰ担体に組み換え、シークエンシングにより検証した。アルカリ溶解キットを使用してプラスミドを抽出して純度を高め、トランスフェクション用に０.２２μｍフィルターメンブレンでろ過した。
【０１１５】
細胞トランスフェクション：Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞を使用し、培地はＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３発現培地（Freestyle 293 expression medium）であり、使用する場合は１０％Ｆ６８を最終濃度０.１％に追加した。トランスフェクション中、細胞密度が１〜１.５×１０６細胞／ｍｌになるまで培養し、シェーカーは３７℃、１３０ＲＰＭ、８％ＣＯ２濃度に設定した。５ｍｌの培地とＰＥＩを取り、混合し（２００μｇ／ｍｌ）、５ｍｌの培地と一定量のプラスミドを取り、混合し（プラスミドの量は１００μｇ／ｍｌである）、５分後に併合して混合し、１５分間放置し、ゆっくり細胞に加え、ＰＥＩの過剰な濃度を避けるために追加しながら振とうし、シェーカーで培養し、翌日、最終濃度０.５％になるようにペプトン（sigma）を追加し、５〜７日目に培養液の抗体価をテストし、６〜７日目に遠心（３５００ＲＰＭ、３０分間）し、ろ過して上清を収集して精製した。
【０１１６】
抗体の精製：エンドトキシンフリーのクロマトグラフィーカラムとプロテインＡフィラーの連続生産には、０.１Ｍ  ＮａＯＨで３０分間処理するか、または５カラム容量の０.５Ｍ  ＮａＯＨで洗浄し；長期間使用されていないカラム材料とクロマトグラフィーカラムには、少なくとも１Ｍ  ＮａＯＨを使用して１時間浸し、エンドトキシンフリーの水で中性になるまですすぎ、１０倍のカラム容量の１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００でカラム材料を洗浄した。５カラム容量のＰＢＳで平衡化し、ろ過した細胞上清をカラムに入れ、必要に応じてフロースルーを収集した。カラムをロードした後、５倍のカラム容量ＰＢＳで洗浄した。５倍カラム容量の０.１Ｍ  ｐＨ３.０のＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌで溶出を行い、溶出液を収集し、１／１０容量のｐＨ８.５の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１.５Ｍ  ＮａＣｌ）で中和した。抗体を取得した後、エンドトキシンの混入を避けるために、１×ＰＢＳで一晩透析した。透析後、分光光度計またはキットを使用して濃度を測定し、ＨＰＬＣ−ＳＥＣを使用して抗体の純度を測定し、エンドトキシン検出キットを使用して抗体エンドトキシンの含有量を検出した。
【０１１７】
実施例５  マウス−ヒトキメラ抗体の同定
（一）酵素結合免疫吸着実験（ＥＬＩＳＡ）により抗体とＬＡＧ−３タンパク質の結合を検出
実施例１で調製した免疫原１の前記ヒト由来ＬＡＧ−３タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列２３−４５０（配列表配列番号６１に示される）をヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片（ｈＦｃ）を有するｐＣｐＣ担体にクローン化し、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、細胞培養液を収集し、精製してｈＦｃタグを有するヒトＬＡＧ−３タンパク質（ここではｈＬＡＧ−３−ｈＦｃタンパク質と呼ばれる）を得；サルＬＡＧ−３タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列１８−４４９（配列表配列番号６２に示される）をヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片（ｈＦｃ）を有するｐＣｐＣ担体にクローン化し、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、細胞培養液を収集し、精製してｈＦｃタグを有するサルＬＡＧ−３タンパク質（ここではｃＬＡＧ−３−ｈＦｃタンパク質と呼ばれる）を得；マウスＬＡＧ−３タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列２４−４４２（配列表配列番号６３に示される）をヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片（ｈＦｃ）を有するｐＣｐＣ担体にクローン化し、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、細胞培養液を収集し、精製してｈＦｃタグを有するマウスＬＡＧ−３タンパク質（ここではｍＬＡＧ−３−ｈＦｃタンパク質と呼ばれる）を得た。
【０１１８】
精製されたヒト、サル、マウスＬＡＧ−３３細胞外ドメインのタンパク質（ｈＬＡＧ−３−ｈＦｃ、ｃＬＡＧ−３−ｈＦｃ、ｍＬＡＧ−３−ｈＦｃ）をＰＢＳで最終濃度１.０μｇ／ｍｌに希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／ウェルで加えた。プラスチックフィルムで覆い、４℃で一晩インキュベートし、翌日、プレートをプレート洗浄液（ＰＢＳ ＋ ０.０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で２回洗浄し、ブロッキング液（ＰＢＳ ＋ ０.０１％Ｔｗｅｅｎ２０ ＋ １％ＢＳＡ）を加え、室温で１〜２時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を注ぎ捨て、検出する抗体サンプルを５０〜１００μｌ／ウェルに加え、３７℃で１〜２時間インキュベートし、プレートをプレート洗浄液（ＰＢＳ ＋ ０.０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で２〜３回洗浄した。ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識二次抗体を加え、３７℃で１〜２時間インキュベートし、プレートをプレート洗浄液（ＰＢＳ ＋ ０.０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で２〜３回洗浄した。各ウェルに１００μｌのＴＭＢ基質を加え、室温で１５〜３０分間インキュベートした後、各ウェルに１００μｌの停止液（１.０Ｎ  ＨＣｌ）を加えた。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（TiterMax 384plus、Molecular Device）を使用して、Ａ４５０ｎｍ値を読み取った。結果は図１５、図１６、図１７、表１０、表１１、表１２に示されたとおりである。
【０１１９】
【表１０】
2021526013.tif 000014
【０１２０】
【表１１−１】
2021526013.tif 000015
【表１１−２】
2021526013.tif 000016
【０１２１】
【表１２】
2021526013.tif 000017
【０１２２】
結果は、本発明で得られたマウス−ヒトキメラ抗体がヒトおよびサルＬＡＧ−３細胞外ドメインタンパク質に結合でき、各抗体の活性が近く、マウスＬＡＧ−３タンパク質に結合できないことを示した。ここで、ＩｇＧ対照はヒトＩｇＧであり、表のデータはＡ４５０ｎｍ値である。
【０１２３】
（二）フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により抗体とＬＡＧ−３発現細胞の結合を検出
実験方法は実施例２（一）を参照し、得られたマウス−ヒトキメラＬＡＧ−３抗体と細胞発現ＬＡＧ−３の結合活性を同定し、結果は図１８および図１９、表１３および表１４に示されたとおりである。ここでＩｇＧ対照はヒトＩｇＧであり、表のデータはＭＦＩで測定された細胞集団の平均蛍光強度値である。
【０１２４】
【表１３】
2021526013.tif 000018
【０１２５】
【表１４−１】
2021526013.tif 000019
【表１４−２】
2021526013.tif 000020
【０１２６】
結果は、本発明で得られたマウス−ヒトキメラ抗体が細胞表面のヒトおよびサルＬＡＧ−３タンパク質に結合できることを示す。本発明の抗体が結合細胞表面のサルＬＡＧ−３タンパク質に結合する能力が対照抗体（ＢＭＳ９８６０１６）より強い。
実験におけるサルＬＡＧ−３の配列は、中国サルの組織サンプルから得られた。本発明の抗体は、サル抗原と交差結合反応を示し、将来的には前臨床毒性学研究や前臨床薬物動態研究のために霊長類のインビボ実験を行うことができる。
【０１２７】
（三）ＬＡＧ−３受容体リガンド結合実験によりＬＡＧ−３抗体遮断ＬＡＧ−３とそのリガンドＭＨＣ  ＩＩおよびＬＳＥＣｔｉｎの結合を検出
（１）ＬＡＧ−３受容体リガンド結合実験によりＬＡＧ−３抗体遮断ＬＡＧ−３とそのリガンドＭＨＣ  ＩＩの結合を検出
実験方法は実施例２（二）を参照し、得られたマウス−ヒトキメラＬＡＧ−３抗体の遮断活性を同定し、検出結果はそれぞれ図２０および表１５に示されたとおりである。
【０１２８】
【表１５】
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【０１２９】
結果は、本発明で得られたマウス−ヒトキメラ抗体ＬＡＧ−３抗体はＬＡＧ−３とリガンドＭＨＣＩＩの結合を様々な程度に遮断できることを示す。
【０１３０】
（２）ＬＡＧ−３受容体リガンド結合実験によりＬＡＧ−３抗体遮断ＬＡＧ−３とそのリガンドＬＳＥＣｔｉｎの結合を検出
ＬＡＧ−３細胞外ドメインタンパク質（ＬＡＧ−３−ｈＦｃ）をＰＢＳで１.０μｇ／ｍＬの最終濃度に希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／ウェルで加えた。プラスチックフィルムで覆い、４℃で一晩インキュベートし、翌日、プレートをプレート洗浄液（０.０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で２回洗浄し、ブロッキング液（０.０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０および１％（ｗ／ｗ）ＢＳＡを含むＰＢＳ）を加え、室温で２時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を注ぎ捨て、まず５０μｌ／ウェルに実施例２で得られた精製されたＬＡＧ−３抗体試験サンプルを加え、次に５０μｌ／ウェルにＬＳＥＣｔｉｎタンパク質（ＬＳＥＣｔｉｎ−Ｈｉｓ）を加え、よく混合して３７℃でインキュベートした。２時間後、プレートをプレート洗浄液［０.０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ］で３回洗浄した。１００μｌ／ウェルに抗ＨｉｓタグのＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）希釈液（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから購入）を加え、３７℃で２時間インキュベートした後、プレートをプレート洗浄液［０.０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ］で３回洗浄した。ＴＭＢ基質１００μｌを各ウェルに加え、室温で３０分間インキュベートした後、各ウェルに１００μｌの停止液（１.０Ｎ  ＨＣｌ）を加えた。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（TiterMax 384plus、Molecular Device）を使用して、Ａ４５０ｎｍ値を読み取った。ペプチドスキャン実験の結果はそれぞれ図２１および表１６に示されたとおりである。
【０１３１】
【表１６】
2021526013.tif 000022
【０１３２】
結果は、本発明で得られたマウス−ヒトキメラ抗体ＬＡＧ−３抗体がＬＡＧ−３とリガンドＬＳＥＣｔｉｎの結合を様々な程度に遮断できることを示す。
【０１３３】
（四）：抗原特異的Ｔリンパ球刺激実験によりリンパ球活性に対するＬＡＧ−３抗体の影響を検出
実験方法は実施例２（三）を参照し、結果は表１７および図２２に示したとおりであり、ここでＩｇＧ対照はヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）であり、表のデータはマウスＩＬ−２濃度である。
【０１３４】
【表１７】
2021526013.tif 000023
【０１３５】
結果は、本発明で得られたマウス−ヒトキメラ抗体が抗原特異的Ｔリンパ球刺激試験でＩＬ−２分泌を刺激でき、その活性に濃度勾配依存効果があることを示し、ＬＡＧ−３抗体がＬＡＧ−３のＴ細胞活性化阻害作用を逆転させることができ、測定結果から、本発明で得られた抗体の活性が同等であることを示す。
【０１３６】
（五）リンパ球刺激実験によりリンパ球活性に対するＬＡＧ−３抗体の影響を検出
リンパ球刺激実験によりＬＡＧ−３抗体遮断ＬＡＧ−３タンパク質とその受容体ＭＨＣ  ＩＩの結合によりＴリンパ球活性の阻害を緩和してＴ細胞の増殖刺激を検出する。
【０１３７】
１．Ｆｉｃｏｌｌで全血を分離して末梢血単核リンパ球ＰＢＭＣを取得した
新たに得られた全血をリン酸緩衝液ＰＢＳで１：１の容量比で希釈し、希釈した全血を取得し、滅菌したピペットを使用して、希釈した全血をＦｉｃｏｌｌ液面（GE Healthcareから購入）に広げ、Ｆｉｃｏｌｌと希釈した全血の容量比は３：４であり、振とう混合を避け、室温で４００ｇ、２０℃の勾配で３０分間遠心し、遠心後の遠沈管は３層に分かれ、上層は血漿で、中層は乳白色、即ち、単核リンパ球である。滅菌ピペットを使用して中層細胞を軽く吸引し、新しい遠心チューブにそれらを収集し、ＰＢＳリン酸緩衝液で容量の３倍に希釈し、室温、１００ｇで１０分間遠心分離し、上清を捨てた。ＰＢＳリン酸緩衝液でリンパ球を１０ｍＬに再懸濁し、前の手順を繰り返して血小板を除去した。最後に、リンパ球を１０ｍＬの１０％ウシ胎児血清の多成分ＲＰＭＩ１６４０培地（Invitrogenから購入）に再懸濁し、すなわち末梢血単核リンパ球ＰＢＭＣを使用した。前記パーセンテージは質量パーセンテージである。
【０１３８】
２．ＳＥＢ依存ＰＢＭＣ刺激実験
試験前に、等量比に希釈したマウス−ヒトキメラ抗体ＬＡＧ−３抗体を調製し、試験用試料液を取得した。
得られた末梢血単核球のＰＢＭＣを９６ウェル細胞培養プレートに１ウェルあたり１×１０５細胞１００ｕｌで広げ、前記試験用試料液を培養プレートに加え、室温で３０分間培養した。最後に、スーパー抗原ＳＥＢを加え、各反応ウェルには５０ｕｌの４００ｎｇ／ｍｌ  ＳＥＢが含まれ、各反応ウェルの容量は２００μＬを保証し、反応プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで７２時間培養した後、上清を収集し、−２０℃で凍結保存し、前記パーセンテージは体積パーセンテージである。
【０１３９】
３．細胞上清中のサイトカインインターロイキンＩＬ−２の酵素免疫吸着検出
細胞上清中のサイトカインインターロイキンＩＬ−２含有量の酵素結合免疫吸着検出は、Ｒ＆Ｄシステム関連の検出キットｈｕｍａｎ  ＩＬ−２  ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ（ＤＹ２０２）を使用し、説明書に従って操作した。検出抗体を除くすべての検出試薬は、検出キットによって提供された。
【０１４０】
細胞上清中のサイトカインインターロイキンＩＬ−２含有量を測定する酵素結合免疫吸着検出は、二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡキット（R&D Systemsから購入、IL-2 Cat#DY402）を使用した。実験操作は厳密にキットの説明書の要件に従っており、すべての検出試薬はキットによって提供された。具体的な実験は次のように簡単に説明される：ＩＬ−２ポリクローナル抗体をＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートでコーティングし、プラスチックフィルムで密封し、４℃で一晩インキュベートし、翌日、プレートをプレート洗浄液で４回洗浄し、ブロッキング溶液を加えて、室温で１〜２時間ブロックした。プレート洗浄液でプレートを４回洗浄し、ステップ２で得られた細胞上清液を検出サンプルとして使用し、標準品を加え、検出サンプルを室温で２時間インキュベートした。各ウェルに４００ｕｌの洗浄液を加え、プレートを４回繰り返して洗浄し、次に、抗ヒトＩＬ−２のホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗体を加え、室温で２時間インキュベートして、マイクロプレート上のＩＬ−２と免疫複合体を形成し、マイクロウェルを洗浄し、基質を加えて発色し、室温で３０分間光を避け、最後に停止液を加え、マイクロプレートリーダーでＡ４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１４１】
ステップ２．で説明したＳＥＢ依存ＰＢＭＣ刺激実験におけるＩＬ−２分泌に対するＬＡＧ−３抗体の影響を検出した。結果は図２３、および表１８に示されたとおりである。
【０１４２】
【表１８】
2021526013.tif 000024
【０１４３】
結果は、ＳＥＢ依存ＰＢＭＣリンパ球刺激試験において、本発明で得られた抗体がＰＢＭＣのＩＬ−２分泌を増強でき、その活性が濃度勾配に依存することを示し、ＬＡＧ−３抗体がＴ細胞活性化活性に対するＬＡＧ−３の阻害を逆転でき、検出結果から分かるように、本発明で得られた抗体の活性化の阻害は同等である。ここでｈＩｇＧ対照はヒトＩｇＧであり、表のデータはＩＬ−２値（ｐｇ／ｍＬ）である。
【０１４４】
（六）抗体親和性検出試験
まず、アミノカップリング法によりＦＣ１を参照チャネルとして、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｆｃ  ＩｇＧをＣＭ５チップの表面に６０００〜１００００  ＲＵに固定した。カップリングプロセスは次のとおりである：５０ｍＭ  ＮＨＳと２００ｍＭ  ＥＤＣの新鮮な１：１混合物で７分間活性化し、１０〜５０ｕｇ／ｍｌを注入して、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐｈ５.０緩衝液中のａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｆｃ  ＩｇＧを希釈した。残りの活性化部位を１Ｍエタノールアミンでブロックした。次に、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液を使用して、テストする抗体を５ｕｇ／ｍｌに希釈し（捕捉レベルに応じて調整可能）、１０ｕｌ／分の流速でチップに捕捉して、約１００〜３００ＲＵの応答値を取得した。次に、抗原タンパク質を１００ｎＭに希釈し（最高濃度は一時的に１００ｎＭとする）、チップ表面を３０ｕｌ／分の流速で流す。十分な信号値が得られた場合、抗原タンパク質比はいくつかの濃度勾配によって希釈され、それぞれチップ表面を流れる。各サイクルの後、チップの表面をｐＨ  １.５の１０ｍＭグリシンで再生した。速度定数はブランクコントロールから差し引く必要があり、データフィッティングのモデルと組み合わせて、グローバルフィット分析法１：１を使用した。解離平衡速度定数（ＫＤ）は、次の式で計算された：ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ。結果は表１９に示したとおりである。
【０１４５】
【表１９】
2021526013.tif 000025
【０１４６】
結果は、本発明で得られた抗体のＫＤ値がすべてナノモル（ｎＭ）レベルにあり、ツール抗体に匹敵することを示し、これらの抗体がヒトＬＡＧ−３  ＥＣＤに対して良好な親和性を持っていることを示す。ここで、４０５Ｂ８Ｈ３抗体はヒトＬＡＧ−３  ＥＣＤに対して最も良好な親和性を持っている。
【０１４７】
実施例６  ヒト化抗体の調製、同定およびホットスポット変異
（一）ヒト化抗体の調製
クローン４０５Ｂ８Ｈ３および５５６Ｆ６Ｂ８の重鎖、軽鎖可変領域を、ヒト化テンプレートとして使用した。
配列アラインメント（ＮＣＢＩ−Ｉｇｂｌａｓｔ）により、候補抗体４０５Ｂ８Ｈ３重鎖可変領域、軽鎖可変領域との相同性が最も高い生殖細胞系列遺伝子配列を可変領域移植スケルトンとして選択した：ＩＧＨＶ１−４６＊０１およびＩＧＫＶ１−１６＊０１。ヒト抗体スケルトンを選択した後、ホモロジーモデリングを使用して、マウス抗定常領域の構造を決定する可能性のある重要なアミノ酸を予測し、移植されたスケルトン領域を復帰突然変異用に設計した。
【０１４８】
上記の原則によれば、それぞれ４つの重鎖可変領域配列（４０５Ｂ８Ｈ３  ＶＨ＿ｇ０、４０５Ｂ８Ｈ３  ＶＨ＿ｇ１、４０５Ｂ８Ｈ３  ＶＨ＿ｇ２、４０５Ｂ８Ｈ３  ＶＨ＿ｇ３）（表２０を参照）および３つの軽鎖可変領域配列（４０５Ｂ８Ｈ３  ＶＬ＿ｇ０、４０５Ｂ８Ｈ＿ＢＶＬ８ｇ８Ｂ１Ｂ８Ｇ３Ｂ＿ＢＨ８Ｂ３ＢＨ８Ｇ＿ＢＨ８Ｇ＿ＢＨ８Ｇ＿ＢＨ８Ｇ＿ＢＨ８Ｇ＿ＢＨ８Ｇ＿ＢＨ８＿Ｂ０Ｇ＿ＢＨ８＿Ｇ＿ＢＨ８＿Ｇ０Ｂ３）（表２１を参照）を設計し、次に、クロスコンビネーションして発現させ、合計１２の発現組み合わせを作成します。表２２を参照してください。
【０１４９】
【表２０−１】
2021526013.tif 000026
【表２０−２】
2021526013.tif 000027
【０１５０】
【表２１】
2021526013.tif 000028
【０１５１】
【表２２−１】
2021526013.tif 000029
【表２２−２】
2021526013.tif 000030
【０１５２】
配列アラインメント（ＮＣＢＩ−Ｉｇｂｌａｓｔ）により、候補抗体５５６Ｆ６Ｂ８重鎖可変領域、軽鎖可変領域との相同性が最も高い生殖細胞系列遺伝子配列を可変領域移植スケルトンとして選択した：ＩＧＨＶ４−５９＊０１およびＩＧＫＶ１−９＊０１。ヒト抗体スケルトンを選択した後、ホモロジーモデリングを使用して、マウス抗定常領域の構造を決定する可能性のある重要なアミノ酸を予測し、移植されたスケルトン領域を復帰突然変異用に設計した。
【０１５３】
上記の原則によれば、それぞれ４つの重鎖可変領域配列（５５６Ｆ６Ｂ８  ＶＨ＿ｇ０、５５６Ｆ６Ｂ８  ＶＨ＿ｇ１、５５６Ｆ６Ｂ８  ＶＨ＿ｇ２、５５６Ｆ６Ｂ８  ＶＨ＿ｇ３）（表２３を参照）および３つの軽鎖可変領域配列（５５６Ｆ６Ｂ８  ＶＬ＿ｇ０、５５６Ｆ６Ｂ８  ＶＬ＿ｇ１、５５６Ｆ６Ｂ８  ＶＬ＿ｇ２）（表２４を参照）を設計し、次に、クロスコンビネーションして発現させ、合計１２の発現組み合わせを作成します。表２５を参照してください。
【０１５４】
【表２３】
2021526013.tif 000031
【０１５５】
【表２４】
2021526013.tif 000032
【０１５６】
【表２５】
2021526013.tif 000033
【０１５７】
担体の構築：実験方法は実施例４を参照し、重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列をシグナルペプチドとヒト由来抗体ＩｇＧ４定常領域を含むｐＣＰ発現担体にクローニングし、シークエンシングによって検証した。
【０１５８】
ヒト化抗体の調製：
細胞のトランスフェクション：実験方法は実施例４を参照し、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞を使用して、構築されたプラスミドを細胞にトランスフェクションし、６−７日間培養し、ろ過して、上清を収集して精製した。
抗体の精製：実験方法は実施例４を参照し、エンドトキシンフリーのＰｒｏｔｅｉｎ  Ａクロマトグラフィーカラムで細胞培養上清液を精製して、抗体を取得した。その後、エンドトキシンの混入を避けるため、１×ＰＢＳで一晩透析した。
得られた抗体を、タンパク質濃度および純度について試験し、分析した。すべての抗体の収量および純度分析は正常であった。
【０１５９】
（二）ヒト化抗体の同定
Ａ.フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により抗体とＬＡＧ−３発現細胞の結合を検出し、方法は実施例５と同じである。結果は表２６と図２４および表２７と図２５に示されたとおりであり、得られた抗体はすべて細胞表面のヒトＬＡＧ−３に結合できる。ここでＩｇＧ対照はヒトＩｇＧであり、表のデータはＭＦＩによって測定された細胞集団の平均蛍光強度値である。
【０１６０】
【表２６】
2021526013.tif 000034
【０１６１】
【表２７−１】
2021526013.tif 000035
【表２７−２】
2021526013.tif 000036
【０１６２】
Ｂ．ＬＡＧ−３抗体親和性定数の測定、方法は実施例５と同じである。
ヒト化形質転換後の抗体の親和性を評価し、結果を表２８に示した。結果は、本発明で得られた抗体のＫＤ値がすべてナノモル（ｎＭ）レベルであり、ヒト化形質転換後の抗体の親和性が対応するマウス−ヒトキメラ抗体と同等であることを示している。
【０１６３】
【表２８】
2021526013.tif 000037
【０１６４】
（三）ヒト化抗体のホットスポット変異
抗体４０５Ｂ８Ｈ３−１ホットスポットに点突然変異を加えた。４０５Ｂ８Ｈ３−１抗体には１つの可変部位があり、軽鎖の５６位のアスパラギンＤがグルタミン酸Ｅに変異した。
ホットスポット変異抗体の担体の構築および調製、方法は実施例６のヒト化抗体の担体の構築および調製と同じである。得られたホットスポット変異抗体を、タンパク質濃度および純度について試験し、分析した。すべての抗体の収量および純度分析は正常であった。
【０１６５】
ホットスポット変異抗体の活性同定
Ａ.フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で抗体とＬＡＧ−３発現細胞の結合を検出
方法は実施例５と同じである。結果は表２９おおび図２６に示されたとおりであり、ホットスポット変異抗体とキメラ抗体はすべて細胞表面のヒトＬＡＧ−３に結合できる。ここでＩｇＧ対照はヒトＩｇＧであり、表のデータはＭＦＩによって細胞集団の平均蛍光強度値である。
【０１６６】
【表２９】
2021526013.tif 000038
【０１６７】
Ｂ.ＬＡＧ−３受容体リガンド結合実験で抗体遮断ＬＡＧ−３とそのリガンドＭＨＣ  ＩＩの結合を検出
実験方法は実施例２（二）を参照し、検出結果は表３０および図２７に示されたとおりである。結果はホットスポット変異後の抗体とマウス−ヒトキメラ抗体がすべて、ＬＡＧ−３とリガンドＭＨＣＩＩの結合をブロックでき、それらの活性が同等であることを示す。
【０１６８】
【表３０】
2021526013.tif 000039
【０１６９】
Ｃ.抗原特異的Ｔリンパ球刺激実験でリンパ球活性に対するＬＡＧ−３抗体の影響を検出
実験方法は実施例２（三）を参照し、結果は表３１および図２８に示されたとおりであり、ここでＩｇＧ対照はヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）であり、表のデータはマウスＩＬ−２濃度である。
結果は、ホットスポット変異のヒト化抗体と対応するマウス−ヒトキメラ抗体はすべて抗原特異的Ｔリンパ球刺激試験でＩＬ−２分泌を刺激でき、濃度勾配依存効果を有し、活性が同等であることを示す。
【０１７０】
【表３１】
2021526013.tif 000040
【０１７１】
Ｄ．ＬＡＧ−３抗体の親和性定数の測定
方法は実施例５と同じである。ホットスポット変異抗体の親和性を評価し、結果は表３２に示したとおりである。
結果は、本発明で得られた抗体のＫＤ値がすべてナノモル（ｎＭ）レベルにあり、ホットスポット変異のヒト化抗体４０５Ｂ８Ｈ３−１（Ｄ→Ｅ）と対応するマウス−ヒトキメラ抗体４０５Ｂ８Ｈ３の親和性が１.５倍（３.１１／２.０３＝１.５）向上され、同時にヒト化抗体５５６Ｆ６Ｂ８−３をホットスポット変異させ（重鎖の１００位のアスパラギンＤからグルタミン酸Ｅへ変異）、対応するマウス−ヒトキメラ抗体４０５Ｂ８Ｈ３と比較して、親和性が元の１／１２.５（３３.５／２.６８＝１２.５）に低下したことを示す。
【０１７２】
【表３２】
2021526013.tif 000041
【０１７３】
討論
現在、ブリストル・マイヤーズ  スクイブ社のＬＡＧ−３抗体ＢＭＳ９８６０１６の臨床研究は主に悪性固形腫瘍の治療に使用されており、他の治療法や標的薬との併用に主に焦点を当てており、切除不能な転移性黒色腫、進行固形癌、乳癌、子宮内膜癌、卵巣癌、腎臓癌、膵臓癌、再発膠芽腫、頭頸部癌、膀胱癌、転移性結腸直腸癌、消化管間質腫瘍、腺房細胞癌、高悪性度固形腫瘍、非小細胞肺癌などの適用可能な臨床症状を拡大するために、幅広い適応症を持つ抗体を開発する。
【０１７４】
抗体自体の活性は、可変領域の配列や定常領域の構造に影響される。抗体の可変領域の配列は、抗原認識の決定基、結合親和性および体内での代謝率を決定し、これは、そのインビボ活性およびさまざまな患者の臨床効果にさえ影響を与える。
患者の治療コストを削減し、より多くの患者に利益をもたらすために、より高い収率でＬＡＧ−３抗体を開発することが当業界の緊務である。現在、腫瘍免疫療法は高価であり、コストを削減するために新しい抗体を発明および製造することが急務である。
【０１７５】
本発明で言及されるすべての文書は、あたかも各文書が個々に参照により組み込まれたかのように、本出願に参照により組み込まれている。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も本願に添付された特許請求の範囲によって定義される範囲内にあることを理解されたい。
【０１７６】
本発明の配列情報：
ＬＡＧ−３抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列および前記重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするヌクレオチド配列、ここでＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’、ＣＤＲ３’はそれぞれ下線を引いた：
【０１７７】
【化１】
2021526013.tif 000042
【０１７８】
【化２−１】
2021526013.tif 000043
【化２−２】
2021526013.tif 000044
【０１７９】
【化３】
2021526013.tif 000045
【０１８０】
【化４−１】
2021526013.tif 000046
【化４−２】
2021526013.tif 000047
【０１８１】
【化５】
2021526013.tif 000048
【０１８２】
【化６】
2021526013.tif 000049
【０１８３】
【化７−１】
2021526013.tif 000050
【化７−２】
2021526013.tif 000051
【０１８４】
【化８−１】
2021526013.tif 000052
【化８−２】
2021526013.tif 000053
【０１８５】
【化９−１】
2021526013.tif 000054
【化９−２】
2021526013.tif 000055
【０１８６】
【化１０−１】
2021526013.tif 000056
【化１０−２】
2021526013.tif 000057
【０１８７】
【表２０−１】
2021526013.tif 000058
【表２０−２】
2021526013.tif 000059
【表２０−３】
2021526013.tif 000060
【０１８８】
ここでＶＨは重鎖可変領域であり、ＶＬは軽鎖可変領域である。ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３はそれぞれ、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３であり、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、ＶＬ−ＣＤＲ３はそれぞれ、軽鎖可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’、ＣＤＲ３’である。
【０１８９】
【表３３】
2021526013.tif 000061
【０１９０】
【表３４−１】
2021526013.tif 000062
【表３４−２】
2021526013.tif 000063
【０１９１】
ヒトＬＡＧ−３タンパク質アミノ酸配列  配列番号６１
ＭＷＥＡＱＦＬＧＬＬＦＬＱＰＬＷＶＡＰＶＫＰＬＱＰＧＡＥＶＰＶＶＷＡＱＥＧＡＰＡＱＬＰＣＳＰＴＩＰＬＱＤＬＳＬＬＲＲＡＧＶＴＷＱＨＱＰＤＳＧＰＰＡＡＡＰＧＨＰＬＡＰＧＰＨＰＡＡＰＳＳＷＧＰＲＰＲＲＹＴＶＬＳＶＧＰＧＧＬＲＳＧＲＬＰＬＱＰＲＶＱＬＤＥＲＧＲＱＲＧＤＦＳＬＷＬＲＰＡＲＲＡＤＡＧＥＹＲＡＡＶＨＬＲＤＲＡＬＳＣＲＬＲＬＲＬＧＱＡＳＭＴＡＳＰＰＧＳＬＲＡＳＤＷＶＩＬＮＣＳＦＳＲＰＤＲＰＡＳＶＨＷＦＲＮＲＧＱＧＲＶＰＶＲＥＳＰＨＨＨＬＡＥＳＦＬＦＬＰＱＶＳＰＭＤＳＧＰＷＧＣＩＬＴＹＲＤＧＦＮＶＳＩＭＹＮＬＴＶＬＧＬＥＰＰＴＰＬＴＶＹＡＧＡＧＳＲＶＧＬＰＣＲＬＰＡＧＶＧＴＲＳＦＬＴＡＫＷＴＰＰＧＧＧＰＤＬＬＶＴＧＤＮＧＤＦＴＬＲＬＥＤＶＳＱＡＱＡＧＴＹＴＣＨＩＨＬＱＥＱＱＬＮＡＴＶＴＬＡＩＩＴＶＴＰＫＳＦＧＳＰＧＳＬＧＫＬＬＣＥＶＴＰＶＳＧＱＥＲＦＶＷＳＳＬＤＴＰＳＱＲＳＦＳＧＰＷＬＥＡＱＥＡＱＬＬＳＱＰＷＱＣＱＬＹＱＧＥＲＬＬＧＡＡＶＹＦＴＥＬＳＳＰＧＡＱＲＳＧＲＡＰＧＡＬＰＡＧＨＬＬＬＦＬＩＬＧＶＬＳＬＬＬＬＶＴＧＡＦＧＦＨＬＷＲＲＱＷＲＰＲＲＦＳＡＬＥＱＧＩＨＰＰＱＡＱＳＫＩＥＥＬＥＱＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰＥＱＬ
【０１９２】
サルＬＡＧ−３タンパク質アミノ酸配列配列番号６２
ＭＷＥＡＱＦＬＧＬＬＦＬＱＰＬＷＶＡＰＶＫＰＰＱＰＧＡＥＩＳＶＶＷＡＱＥＧＡＰＡＱＬＰＣＳＰＴＩＰＬＱＤＬＳＬＬＲＲＡＧＶＴＷＱＨＱＰＤＳＧＰＰＡＰＡＰＧＨＰＰＡＰＧＨＲＰＡＡＰＹＳＷＧＰＲＰＲＲＹＴＶＬＳＶＧＰＧＧＬＲＳＧＲＬＰＬＱＰＲＶＱＬＤＥＲＧＲＱＲＧＤＦＳＬＷＬＲＰＡＲＲＡＤＡＧＥＹＲＡＴＶＨＬＲＤＲＡＬＳＣＲＬＲＬＲＶＧＱＡＳＭＴＡＳＰＰＧＳＬＲＴＳＤＷＶＩＬＮＣＳＦＳＲＰＤＲＰＡＳＶＨＷＦＲＳＲＧＱＧＲＶＰＶＱＧＳＰＨＨＨＬＡＥＳＦＬＦＬＰＨＶＧＰＭＤＳＧＬＷＧＣＩＬＴＹＲＤＧＦＮＶＳＩＭＹＮＬＴＶＬＧＬＥＰＡＴＰＬＴＶＹＡＧＡＧＳＲＶＥＬＰＣＲＬＰＰＡＶＧＴＱＳＦＬＴＡＫＷＡＰＰＧＧＧＰＤＬＬＶＡＧＤＮＧＤＦＴＬＲＬＥＤＶＳＱＡＱＡＧＴＹＩＣＨＩＲＬＱＧＱＱＬＮＡＴＶＴＬＡＩＩＴＶＴＰＫＳＦＧＳＰＧＳＬＧＫＬＬＣＥＶＴＰＡＳＧＱＥＨＦＶＷＳＰＬＮＴＰＳＱＲＳＦＳＧＰＷＬＥＡＱＥＡＱＬＬＳＱＰＷＱＣＱＬＨＱＧＥＲＬＬＧＡＡＶＹＦＴＥＬＳＳＰＧＡＱＲＳＧＲＡＰＧＡＬＲＡＧＨＬＰＬＦＬＩＬＧＶＬＦＬＬＬＬＶＴＧＡＦＧＦＨＬＷＲＲＱＷＲＰＲＲＦＳＡＬＥＱＧＩＨＰＰＱＡＱＳＫＩＥＥＬＥＱＥＰＥＬＥＰＥＰＥＬＥＲＥＬＧＰＥＰＥＰＧＰＥＰＥＰＥＱＬ＊
【０１９３】
マウスＬＡＧ−３タンパク質アミノ酸配列配列番号６３
ＭＲＥＤＬＬＬＧＦＬＬＬＧＬＬＷＥＡＰＶＶＳＳＧＰＧＫＥＬＰＶＶＷＡＱＥＧＡＰＶＨＬＰＣＳＬＫＳＰＮＬＤＰＮＦＬＲＲＧＧＶＩＷＱＨＱＰＤＳＧＱＰＴＰＩＰＡＬＤＬＨＱＧＭＰＳＰＲＱＰＡＰＧＲＹＴＶＬＳＶＡＰＧＧＬＲＳＧＲＱＰＬＨＰＨＶＱＬＥＥＲＧＬＱＲＧＤＦＳＬＷＬＲＰＡＬＲＴＤＡＧＥＹＨＡＴＶＲＬＰＮＲＡＬＳＣＳＬＲＬＲＶＧＱＡＳＭＩＡＳＰＳＧＶＬＫＬＳＤＷＶＬＬＮＣＳＦＳＲＰＤＲＰＶＳＶＨＷＦＱＧＱＮＲＶＰＶＹＮＳＰＲＨＦＬＡＥＴＦＬＬＬＰＱＶＳＰＬＤＳＧＴＷＧＣＶＬＴＹＲＤＧＦＮＶＳＩＴＹＮＬＫＶＬＧＬＥＰＶＡＰＬＴＶＹＡＡＥＧＳＲＶＥＬＰＣＨＬＰＰＧＶＧＴＰＳＬＬＩＡＫＷＴＰＰＧＧＧＰＥＬＰＶＡＧＫＳＧＮＦＴＬＨＬＥＡＶＧＬＡＱＡＧＴＹＴＣＳＩＨＬＱＧＱＱＬＮＡＴＶＴＬＡＶＩＴＶＴＰＫＳＦＧＬＰＧＳＲＧＫＬＬＣＥＶＴＰＡＳＧＫＥＲＦＶＷＲＰＬＮＮＬＳＲＳＣＰＧＰＶＬＥＩＱＥＡＲＬＬＡＥＲＷＱＣＱＬＹＥＧＱＲＬＬＧＡＴＶＹＡＡＥＳＳＳＧＡＨＳＡＲＲＩＳＧＤＬＫＧＧＨＬＶＬＶＬＩＬＧＡＬＳＬＦＬＬＶＡＧＡＦＧＦＨＷＷＲＫＱＬＬＬＲＲＦＳＡＬＥＨＧＩＱＰＦＰＡＱＲＫＩＥＥＬＥＲＥＬＥＴＥＭＧＱＥＰＥＰＥＰＥＰＱＬＥＰＥＰＲＱＬ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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