(57)【要約】新規なプロテアーゼを有する自動食器洗浄組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼを含む自動食器洗浄組成物であって、前記プロテアーゼが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する変異体であり、前記変異体が、３９位にグルタミン酸（Ｅ）残基を有し、
（ｉ）３Ｖ、４Ｔ、８Ｖ、９Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｗ／Ｙ、１０Ａ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｗ、１１Ａ／Ｉ／Ｓ／Ｔ、１２Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ、１４Ｄ、１５Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１６Ｌ／Ｍ／Ｓ、１７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１８Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｔ、１９Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ、２０Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｍ／Ｎ／Ｔ、２４Ａ／Ｅ／、２５Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ、２６Ａ／Ｉ、３３Ｔ、３６Ｃ／Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｔ／Ｖ、４２Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｑ、４３Ｌ、４４Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、４７Ｉ／Ｙ、５０Ｉ、５２Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｙ、５４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｔ／Ｖ、５５Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｎ／Ｓ／Ｙ、５７Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、５９Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、６０Ｓ、６９Ｓ、７６Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｒ／Ｔ／Ｙ、８２Ａ、８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｙ、９５Ａ／Ｎ、９６Ｍ／Ｑ、９７Ｅ／Ｈ／Ｋ、１０１Ｔ、１０２Ｌ／Ｍ、１０４Ａ／Ｄ／Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１０５Ｖ、１０７Ｋ／Ｍ、１１０Ｌ、１１３Ｔ／Ｖ、１１４Ｖ、１１５Ｅ／Ｈ／Ｑ、１１６Ｅ／Ｈ、１１８Ｄ／Ｅ／Ｎ、１２０Ｖ、１２８Ｇ、１２９Ａ／Ｈ／Ｎ／Ｙ、１３１Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｉ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｖ、１３３Ｍ、１３５Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１３６Ｍ、１３７Ｌ、１３９Ｅ／Ｓ、１４１Ｅ／Ｈ／Ｎ、１４２Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｑ、１４３Ｅ／Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｖ、１４４Ｅ／Ｎ、１４５Ｃ、１４７Ｃ、１４８Ｌ／Ｖ、１５０Ｍ、１５６Ｃ／Ｄ／Ｎ／Ｔ、１５７Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｎ／Ｑ、１５８Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１５９Ｌ、１６０Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｍ／Ｔ、１６１Ｗ、１６４Ａ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｙ、１６６Ｄ／Ｅ／Ｉ／Ｐ／Ｑ／Ｖ、１６７Ｅ、１７０Ｇ、１７４Ｖ、１７６Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｓ、１７７Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｓ／Ｗ／Ｙ、１７８Ｄ、１７９Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１８０Ｋ、１８２Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｐ／Ｑ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１８６Ｆ、１８８Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１８９Ｃ／Ｄ／Ｅ、１９０Ｍ、１９１Ｅ、１９２Ｃ／Ｍ、１９３Ａ／Ｍ、１９８Ｄ／Ｅ、２００Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｖ／Ｙ、２０７Ｋ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、２０９Ｐ、２１０Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｌ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｙ、２１１Ｅ／Ｌ／Ｑ／Ｒ、２１２Ａ／Ｃ／Ｑ、２１８Ｃ／Ｓ、２２７Ｍ／Ｑ、２２８Ｌ、２３０Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｍ／Ｎ、２３１Ｃ／Ｅ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ、２３２Ｆ／Ｈ／Ｑ／Ｒ／Ｗ、２３４Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｔ／Ｗ／Ｙ、２３６Ｇ／Ｓ／Ｔ、２３８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｖ、２３９Ｄ／Ｅ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｔ、２４２Ａ、２４５Ｅ、２４６Ａ／Ｌ、２４７Ｅ／Ｑ、２４９Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｓ／Ｙ、２５０Ｓ／Ｔ、２５３Ｅ、２５４Ｐ／Ｙ、２５５Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｉ／Ｍ／Ｖ／Ｗ、２５６Ｃ／Ｆ／Ｈ／Ｍ／Ｗ／Ｙ、２５７Ｃ／Ｍ、２５９Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ、２６２Ｌ、２６３Ｄ／Ｑ、２６４Ｔ、２６５Ａ／Ｍ／Ｎ／Ｑ、２６６Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｒ、２６８Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ、及び２６９Ｈ／Ｐ／Ｗから選択される１つ以上の位置に１つ以上のアミノ酸置換を更に含み、
前記変異体のアミノ酸位置が、配列番号１のアミノ酸配列に対応して番号付けされる、自動食器洗浄組成物。
【請求項２】
前記変異体が、３Ｖ、９Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｋ、１０Ａ／Ｍ／Ｎ／Ｑ、１１Ａ／Ｉ、１２Ｃ／Ｄ、１４Ｄ、１５Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｉ／Ｍ／Ｖ／Ｙ、１６Ｍ、１７Ｃ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｗ、１８Ｄ／Ｅ、１９Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｗ、２４Ａ／Ｅ、３６Ｃ／Ｅ、４２Ｃ／Ｄ／Ｅ、４４Ｃ／Ｅ／Ｗ／Ｙ、５２Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｈ、５４Ｌ／Ｍ、５５Ａ／Ｄ／Ｈ／Ｓ、５７Ｄ／Ｅ／、５９Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｎ、６０Ｓ、７６Ｅ／Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｔ、８４Ｈ／Ｙ、９５Ｎ、９６Ｑ、９７Ｅ、１０４Ａ／Ｄ、１０７Ｋ、１１０Ｌ、１１６Ｅ、１２９Ｈ／Ｎ／Ｙ、１３１Ｄ／Ｅ、１３５Ａ／Ｅ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１３６Ｍ、１４１Ｅ、１４２Ｅ、１４４Ｅ、１５６Ｃ／Ｄ、１５７Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ、１５８Ａ／Ｃ、１６０Ａ／Ｍ、１６４Ａ／Ｍ／Ｑ／Ｙ、１６６Ｄ／Ｅ、１７６Ｃ／Ｄ、１７７Ｃ／Ｄ／Ｍ／Ｓ／Ｙ、１７８Ｄ、１７９Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１８２Ｄ／Ｅ、１８８Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ、１８９Ｃ／Ｄ／Ｅ、１９３Ａ／Ｍ、１９８Ｄ／Ｅ、２００Ｉ／Ｙ、２０７Ｋ／Ｌ／Ｑ、２０９Ｐ、２１０Ｄ／Ｅ／Ｎ、２３８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｍ、２３９Ｄ／Ｅ、２４１Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｑ／Ｔ／Ｙ、２４５Ｅ、２４７Ｅ／  ２４９Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｙ、２５３Ｅ、２５５Ｃ／Ｄ／Ｅ、２５６Ｃ／Ｙ、２５９Ｄ／Ｅ、２６２Ｌ、２６８Ｄ／Ｅ、及び２６９Ｈ／Ｗから選択される１つ以上の位置に１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記プロテアーゼが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する変異体である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物がリン酸塩を含まない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、前記組成物の１０重量％〜５０重量％の有機錯化剤系を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物の１０重量％超の漂白剤を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
漂白活性化剤及び／又は漂白触媒、好ましくはマンガン触媒を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記錯化剤系が、クエン酸、メチルグリシン二酢酸、グルタミン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸、イミノジコハク酸、カルボキシメチルイヌリン、これらの塩、及びこれらの混合物からなる群から選択される錯化剤、好ましくは、メチルグリシン二酢酸の塩を含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記錯化剤系が、クエン酸及びメチルグリシン二酢酸を、好ましくは、約０．５：１〜約２：１の重量比で含む、請求項５〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記漂白剤が過炭酸塩である、請求項５〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、好ましくは配列番号１１における２０２と同等の位置に突然変異を有するα−アミラーゼを更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、分散剤ポリマー、好ましくはカルボキシル化／スルホン化ポリマーを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
ｉ）前記組成物の１０重量％〜５０重量％の有機錯化剤系と、
ｉｉ）前記組成物の少なくとも１０重量％の過炭酸塩、並びに任意に漂白活性化剤及び／又は漂白触媒を含む、漂白系と、
ｉｉｉ）非イオン性界面活性剤と、
ｉｖ）分散剤ポリマーと、
ｖ）アミラーゼと、
ｖｉ）任意であるが好ましくはガラスケア剤と、を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
汚れた食器を食器洗浄機において軟水で洗浄する方法であって、
ｉ）前記汚れた食器を提供する工程と、
ｉｉ）請求項１〜１３のいずれか一項に記載の洗浄組成物で前記食器を処理する工程と、
ｉｉｉ）任意に前記食器をすすぐ工程と、を含む、方法。
【請求項１５】
自動食器洗浄においてクレームブリュレを除去するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、洗剤の分野に属する。特に、本発明は、特定のプロテアーゼを含む自動食器洗浄洗剤に関する。本組成物は、従来のプロテアーゼを含む組成物と比べて、タンパク質汚れの改善された除去を提供する。
【背景技術】
【０００２】
自動食器洗浄組成物の性能及びそれらの環境特性を改善するための恒久的な要望が存在する。
【０００３】
環境への懸念により、リン酸塩は、次第に生分解性錯化剤に置き換えられている。これらの錯化剤は、金属に対する強い結合能を有することがあり、かつ／又は高濃度で使用されて、酵素の安定性に悪影響を及ぼす場合があり、特に、錯化剤は、プロテアーゼの構造的カルシウム金属イオンを抽出することによってプロテアーゼに悪影響を及ぼす場合がある。プロテアーゼは、製品中及び／又は使用時において影響を受け得る。高濃度の漂白剤を有する組成物は、良好な洗浄を提供することができるが、漂白剤はまた、酵素、具体的にはプロテアーゼの性能を損なう場合がある。この作用は、高濃度の錯化剤、高温及び長時間サイクルによって悪化する場合がある。
【０００４】
自動食器洗浄組成物は、特定の使用条件下で最適な性能を有するように設計されることができ、例えば、軟水サイクルにおいて最適な性能を有するように組成物を設計することができるが、軟水で最適な性能を有する組成物は、硬水サイクルでは最適な性能を有さない場合があり、逆もまた同様である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、タンパク質汚れをより良好に除去する食器洗浄組成物を提供することである。好ましくは、この除去は、組成物を、軟水中、好ましくは様々な水硬度条件下で使用したときに良好であるべきである。高温の長時間サイクルで洗浄されるひどく汚れた洗い物などのストレス条件下であっても、組成物が改善された安定性を有し、改善された性能を提供することもまた所望される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の態様によれば、特定のプロテアーゼを含む自動食器洗浄洗剤組成物が提供される。本組成物は、好ましくは、リン酸塩を含まない自動食器洗浄組成物である。より好ましくは、本組成物は、錯化剤系を含み、より好ましくは、本組成物は、錯化剤系及び高濃度の漂白系を含む。本組成物は、卵及び／又はクレームブリュレの除去において、改善された安定性及び／又は性能を示す。本発明の組成物は、軟水並びに／又は自動食器洗浄において使用される高温及び／若しくは長時間サイクルに好適であり得る。
【０００７】
本発明の第２の態様によれば、本発明の組成物を使用する自動食器洗浄方法が、提供される。自動食器洗浄においてクレームブリュレを除去するための、本発明の組成物の使用もまた提供される。
【０００８】
本発明の第１の態様に関連して説明される本発明の組成物の要素は、変更すべきところは変更して、本発明の他の態様にも適用される。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、特定のプロテアーゼを含む自動食器洗浄組成物を包含する。本組成物は、好ましくはリン酸塩を含まず、好ましくは錯化剤系を含む。本組成物は、従来のプロテアーゼを含む洗浄組成物と比べて、複数の条件下で改善された安定性を有し、改善された洗浄をもたらす。本組成物は、特に、卵及び／又はクレームブリュレの汚れに対して、良好なタンパク質洗浄を提供する。本発明はまた、自動食器洗浄方法も包含する。本発明の組成物は、高温の長時間サイクルにおいて、かつ軟水を使用する場合に、良好な洗浄を提供することができる。
【００１０】
「軟」水とは、本明細書において、約２ｇｐｇ（３４．３ｐｐｍ）未満の硬度を有する水を意味する。ガロン当たりのグレイン（ｇｐｇ）は、１米ガロンの水（３．７８５４１２Ｌ）に溶解した１グレイン（６４．８ミリグラム）の炭酸カルシウムとして定義される水の硬度の単位である。これは、１７．１百万分率（ｐｐｍ）に換算される。
【００１１】
「高温」サイクルとは、本明細書において、主サイクルが５０℃超、好ましくは５５℃超の温度で実施される食器洗浄プログラムとして理解される。
【００１２】
本明細書で「長時間」サイクルとは、主サイクルが少なくとも２５分間、好ましくは少なくとも３０分間及びより好ましくは少なくとも３５分間の期間を有する、食器洗浄プログラムとして理解される。
【００１３】
本発明の組成物は、変異型プロテアーゼを含み、変異型プロテアーゼは、基準プロテアーゼ（配列番号１のプロテアーゼ）に対して既定の割合の同一性を有する。
【００１４】
本発明の組成物のプロテアーゼは、本明細書において「本発明のプロテアーゼ」と称されることがある。配列番号１を有するプロテアーゼは、本明細書では「基準プロテアーゼ」又は「親プロテアーゼ」と称されることがある。
【００１５】
２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の関連性は、パラメータ「配列同一性」によって表される。
【００１６】
用語「変異体」は、基準プロテアーゼに対する１つ以上の（例えば、いくつかの）位置において突然変異、すなわち、置換、挿入及び／又は欠失を含むプロテアーゼを意味する。置換は、ある位置を占有するアミノ酸を異なるアミノ酸で置き換えることを意味し、欠失は、ある位置を占有するアミノ酸の除去を意味し、挿入は、ある位置を占有するアミノ酸に隣接しかつその直後に、アミノ酸を付加することを意味する。本発明の変異体は、基準プロテアーゼと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９５％及び特に９９％の同一性を有する。
【００１７】
配列番号１は、Ｓ０３９Ｅ置換を有するＢ．ギブソニイのサブチリシンＢｇｉ０２４４６に対応する。
【００１８】
用語「野生型」プロテアーゼは、自然界に見られる細菌、酵母菌又は糸状菌等の自然発生微生物によって発現されるプロテアーゼを意味する。
【００１９】
本発明は、配列番号１の３９位に対応する位置にグルタミン酸を有するアミノ酸配列を含み、１つ以上の追加のアミノ酸置換を更に含む、変異体を含む、組成物を提供する。本明細書に提供される変異体は、配列番号１のアミノ酸配列を有するプロテアーゼを含む組成物と比較して、改善された洗浄性能、又は改善された安定性、又は改善された洗浄性能及び改善された安定性の両方など、１つ以上の改善された特性を示す。
【００２０】
酵素関連の用語
アミノ酸修飾に関する命名法
本明細書の酵素変異体を説明する中で、参照しやすいように以下の命名法が用いられる：元のアミノ酸（複数可）：位置（複数可）：置換アミノ酸（複数可）。
【００２１】
この命名法に従うと、例えば、１９５位におけるグリシンの代わりにグルタミン酸に置換したものは、Ｇ１９５Ｅと示される。同じ位置でグリシンが欠失したものは、Ｇ１９５＊と示され、追加のアミノ酸残基、例えばリジンを挿入したものは、Ｇ１９５ＧＫと示される。特定の酵素が他の酵素と比較して「欠失」を含有し、このような位置で挿入が行われる場合、これは、３６位におけるアスパラギン酸の挿入については＊３６Ｄというように示される。複数の突然変異は、プラスにより分離され、すなわち、Ｓ９９Ｇ＋Ｖ１０２Ｎは、位置９９と１０２における突然変異が、それぞれ、セリンをグリシンに、バリンをアスパラギンに置換することを表す。ある位置（例えば、１０２位）のアミノ酸が、アミノ酸の群、例えば、Ｎ及びＩからなる群から選択される別のアミノ酸により置換され得る場合、これは、Ｖ１０２Ｎ、Ｉと示される。
【００２２】
全ての場合において、一般に認められたＩＵＰＡＣの一文字又は三文字アミノ酸略記を用いる。
【００２３】
プロテアーゼのアミノ酸番号付け
本特許で使用される番号付けは、配列番号１に対するものである。
【００２４】
アミノ酸の同一性
２つのアミノ酸配列の間の関連性は、パラメータ「同一性」により説明される。本発明の目的上、２つのアミノ酸配列のアラインメントは、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｏｒｇ）バージョン２．８．０からのＮｅｅｄｌｅプログラムを用いることによって決定される。Ｎｅｅｄｌｅプログラムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８、４４３〜４５３に記載のグローバルアラインメントアルゴリズムを実行する。用いられる置換マトリクスは、ＢＬＯＳＵＭ６２であり、ギャップオープニングペナルティは、１０であり、ギャップエクステンションペナルティは、０．５である。
【００２５】
本明細書で使用される酵素のアミノ酸配列（「本配列」）と、異なるアミノ酸配列（「異質配列」）との間の同一性の度合いは、２つの配列のアラインメントにおける完全一致の数を「本配列」の長さ又は「異質配列」の長さのいずれか短い方で除算して、計算される。この結果を同一性パーセントとして表す。完全一致は、「本配列」及び「異質配列」に、同一のアミノ酸残基が重複部分の同じ位置に備わっている場合に発生する。配列の長さは、配列中のアミノ酸残基の数である。
【００２６】
用語「サクシネート系化合物」及び「コハク酸系化合物」は、本明細書において互換的に使用される。
【００２７】
本明細書で使用するとき、特許請求の範囲において使用される「ａ」及び「ａｎ」などの冠詞は、特許請求又は記述されるものが１つ以上であることを意味すると理解される。
【００２８】
別途記載のない限り、全ての成分又は組成物の濃度は、当該成分又は組成物の活性部分に関するものであり、かかる成分又は組成物の市販の供給源に存在し得る不純物、例えば残留溶媒又は副生成物は除外される。
【００２９】
全ての百分率及び比率は、別途記載のない限り、重量基準で計算される。全ての百分率及び比率は、別途記載のない限り、全組成に基づいて計算される。
【００３０】
本発明のプロテアーゼ
本発明の変異体は、配列番号１のプロテアーゼと少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９５％及び特に少なくとも９９％の同一性を有する。変異体は、３９位にグルタミン酸（Ｅ）残基を有し、
（ｉ）３Ｖ、４Ｔ、８Ｖ、９Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｗ／Ｙ、１０Ａ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｗ、１１Ａ／Ｉ／Ｓ／Ｔ、１２Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ、１４Ｄ、１５Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１６Ｌ／Ｍ／Ｓ、１７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１８Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｔ、１９Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ、２０Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｍ／Ｎ／Ｔ、２４Ａ／Ｅ／、２５Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ、２６Ａ／Ｉ、３３Ｔ、３６Ｃ／Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｔ／Ｖ、４２Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｑ、４３Ｌ、４４Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、４７Ｉ／Ｙ、５０Ｉ、５２Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｙ、５４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｔ／Ｖ、５５Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｎ／Ｓ／Ｙ、５７Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、５９Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、６０Ｓ、６９Ｓ、７６Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｒ／Ｔ／Ｙ、８２Ａ、８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｙ、９５Ａ／Ｎ、９６Ｍ／Ｑ、９７Ｅ／Ｈ／Ｋ、１０１Ｔ、１０２Ｌ／Ｍ、１０４Ａ／Ｄ／Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１０５Ｖ、１０７Ｋ／Ｍ、１１０Ｌ、１１３Ｔ／Ｖ、１１４Ｖ、１１５Ｅ／Ｈ／Ｑ、１１６Ｅ／Ｈ、１１８Ｄ／Ｅ／Ｎ、１２０Ｖ、１２８Ｇ、１２９Ａ／Ｈ／Ｎ／Ｙ、１３１Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｉ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｖ、１３３Ｍ、１３５Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１３６Ｍ、１３７Ｌ、１３９Ｅ／Ｓ、１４１Ｅ／Ｈ／Ｎ、１４２Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｑ、１４３Ｅ／Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｖ、１４４Ｅ／Ｎ、１４５Ｃ、１４７Ｃ、１４８Ｌ／Ｖ、１５０Ｍ、１５６Ｃ／Ｄ／Ｎ／Ｔ、１５７Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｎ／Ｑ、１５８Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１５９Ｌ、１６０Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｍ／Ｔ、１６１Ｗ、１６４Ａ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｙ、１６６Ｄ／Ｅ／Ｉ／Ｐ／Ｑ／Ｖ、１６７Ｅ、１７０Ｇ、１７４Ｖ、１７６Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｓ、１７７Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｓ／Ｗ／Ｙ、１７８Ｄ、１７９Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１８０Ｋ、１８２Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｐ／Ｑ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１８６Ｆ、１８８Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１８９Ｃ／Ｄ／Ｅ、１９０Ｍ、１９１Ｅ、１９２Ｃ／Ｍ、１９３Ａ／Ｍ、１９８Ｄ／Ｅ、２００Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｖ／Ｙ、２０７Ｋ／Ｌ／Ｎ／Ｑ、２０９Ｐ、２１０Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｌ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｙ、２１１Ｅ／Ｌ／Ｑ／Ｒ、２１２Ａ／Ｃ／Ｑ、２１８Ｃ／Ｓ、２２７Ｍ／Ｑ、２２８Ｌ、２３０Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｍ／Ｎ、２３１Ｃ／Ｅ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ、２３２Ｆ／Ｈ／Ｑ／Ｒ／Ｗ、２３４Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｔ／Ｗ／Ｙ、２３６Ｇ／Ｓ／Ｔ、２３８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｖ、２３９Ｄ／Ｅ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｔ、２４２Ａ、２４５Ｅ、２４６Ａ／Ｌ、２４７Ｅ／Ｑ、２４９Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｓ／Ｙ、２５０Ｓ／Ｔ、２５３Ｅ、２５４Ｐ／Ｙ、２５５Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｉ／Ｍ／Ｖ／Ｗ、２５６Ｃ／Ｆ／Ｈ／Ｍ／Ｗ／Ｙ、２５７Ｃ／Ｍ、２５９Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ、２６２Ｌ、２６３Ｄ／Ｑ、２６４Ｔ、２６５Ａ／Ｍ／Ｎ／Ｑ、２６６Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｒ、２６８Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ及び２６９Ｈ／Ｐ／Ｗから選択される１つ以上の位置に１つ以上のアミノ酸置換を更に含み、
変異体のアミノ酸位置は、配列番号１のアミノ酸配列に対応して番号付けされる。
【００３１】
変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する。変異体は、
（ｉｉ）３Ｖ、４Ｔ、８Ｖ、９Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｗ／Ｙ、１０Ａ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｗ、１１Ａ／Ｉ／Ｓ／Ｔ、１２Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ、１４Ｄ、１５Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１６Ｌ／Ｍ／Ｓ、１７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１８Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｔ、１９Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ、２０Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｍ／Ｎ／Ｔ、２４Ａ／Ｅ／、２５Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ、２６Ａ／Ｉ、３３Ｔ、３６Ｃ／Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｔ／Ｖ、４２Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｑ、４３Ｌ、４４Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、４７Ｉ／Ｙ、５０Ｉ、５２Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｙ、５４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｔ／Ｖ、５５Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｎ／Ｓ／Ｙ、５７Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、５９Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、６０Ｓ、６９Ｓ、７６Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｒ／Ｔ／Ｙ、８２Ａ、８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｙ、９５Ａ／Ｎ、９６Ｍ／Ｑ、９７Ｅ／Ｈ／Ｋ、１０１Ｔ、１０２Ｌ／Ｍ、１０４Ａ／Ｄ／Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１０５Ｖ、１０７Ｋ／Ｍ、１１０Ｌ、１１３Ｔ／Ｖ、１１４Ｖ、１１５Ｅ／Ｈ／Ｑ、１１６Ｅ／Ｈ、１１８Ｄ／Ｅ／Ｎ、１２０Ｖ、１２８Ｇ、１２９Ａ／Ｈ／Ｎ／Ｙ、１３１Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｉ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｖ、１３３Ｍ、１３５Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１３６Ｍ、１３７Ｌ、１３９Ｅ／Ｓ、１４１Ｅ／Ｈ／Ｎ、１４２Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｑ、１４３Ｅ／Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｖ、１４４Ｅ／Ｎ、１４５Ｃ、１４７Ｃ、１４８Ｌ／Ｖ、１５０Ｍ、１５６Ｃ／Ｄ／Ｎ／Ｔ、１５７Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｎ／Ｑ、１５８Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１５９Ｌ、１６０Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｍ／Ｔ、１６１Ｗ、１６４Ａ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｙ、１６６Ｄ／Ｅ／Ｉ／Ｐ／Ｑ／Ｖ、１６７Ｅ、１７０Ｇ、１７４Ｖ、１７６Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｓ、１７７Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｓ／Ｗ／Ｙ、１７８Ｄ、１７９Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１８０Ｋ、１８２Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｐ／Ｑ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１８６Ｆ、１８８Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１８９Ｃ／Ｄ／Ｅ、１９０Ｍ、１９１Ｅ、１９２Ｃ／Ｍ、１９３Ａ／Ｍ、１９８Ｄ／Ｅ、２００Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｖ／Ｙ、２０７Ｋ／Ｌ／Ｎ／Ｑ、２０９Ｐ、２１０Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｌ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｙ、２１１Ｅ／Ｌ／Ｑ／Ｒ、２１２Ａ／Ｃ／Ｑ、２１８Ｃ／Ｓ、２２７Ｍ／Ｑ、２２８Ｌ、２３０Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｍ／Ｎ、２３１Ｃ／Ｅ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ、２３２Ｆ／Ｈ／Ｑ／Ｒ／Ｗ、２３４Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｔ／Ｗ／Ｙ、２３６Ｇ／Ｓ／Ｔ、２３８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｖ、２３９Ｄ／Ｅ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｔ、２４２Ａ、２４５Ｅ、２４６Ａ／Ｌ、２４７Ｅ／Ｑ、２４９Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｓ／Ｙ、２５０Ｓ／Ｔ、２５３Ｅ、２５４Ｐ／Ｙ、２５５Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｉ／Ｍ／Ｖ／Ｗ、２５６Ｃ／Ｆ／Ｈ／Ｍ／Ｗ／Ｙ、２５７Ｃ／Ｍ、２５９Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ、２６２Ｌ、２６３Ｄ／Ｑ、２６４Ｔ、２６５Ａ／Ｍ／Ｎ／Ｑ、２６６Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｒ、２６８Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ及び２６９Ｈ／Ｐ／Ｗからなる群から選択される少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つのアミノ酸置換（配列番号１の番号付けを使用）を含み、
変異体のアミノ酸位置は、配列番号１のアミノ酸配列に対応して番号付けされる。
【００３２】
本組成物は、卵、クレームブリュレの除去が非常に良好であり、かつ／又は良好な安定性を示す。
【００３３】
クレームブリュレの除去に関して、特に好ましい組成物は、プロテアーゼを含み、プロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する変異体であり、変異体は、３Ｖ、９Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｋ、１０Ａ／Ｍ／Ｎ／Ｑ、１１Ａ／Ｉ、１２Ｃ／Ｄ、１４Ｄ、１５Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｉ／Ｍ／Ｖ／Ｙ、１６Ｍ、１７Ｃ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｗ、１８Ｄ／Ｅ、１９Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｗ、２４Ａ／Ｅ、３６Ｃ／Ｅ、４２Ｃ／Ｄ／Ｅ、４４Ｃ／Ｅ／Ｗ／Ｙ、５２Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｈ、５４Ｌ／Ｍ；５５Ａ／Ｄ／Ｈ／Ｓ、５７Ｄ／Ｅ／、５９Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｎ、６０Ｓ、７６Ｅ／Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｔ、８４Ｈ／Ｙ、９５Ｎ、９６Ｑ、９７Ｅ、１０４Ａ／Ｄ、１０７Ｋ、１１０Ｌ、１１６Ｅ、１２９Ｈ／Ｎ／Ｙ、１３１Ｄ／Ｅ、１３５Ａ／Ｅ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１３６Ｍ、１４１Ｅ、１４２Ｅ、１４４Ｅ、１５６Ｃ／Ｄ、１５７Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ、１５８Ａ／Ｃ、１６０Ａ／Ｍ、１６４Ａ／Ｍ／Ｑ／Ｙ、１６６Ｄ／Ｅ、１７６Ｃ／Ｄ、１７７Ｃ／Ｄ／Ｍ／Ｓ／Ｙ、１７８Ｄ、１７９Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１８２Ｄ／Ｅ、１８８Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ、１８９Ｃ／Ｄ／Ｅ、１９３Ａ／Ｍ、１９８Ｄ／Ｅ、２００Ｉ／Ｙ、２０７Ｋ／Ｌ／Ｑ、２０９Ｐ、２１０Ｄ／Ｅ／Ｎ、２３８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｍ、２３９Ｄ／Ｅ、２４１Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｑ／Ｔ／Ｙ、２４５Ｅ、２４７Ｅ／  ２４９Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｙ、２５３Ｅ、２５５Ｃ／Ｄ／Ｅ、２５６Ｃ／Ｙ、２５９Ｄ／Ｅ、２６２Ｌ、２６８Ｄ／Ｅ及び２６９Ｈ／Ｗから選択される１つ以上の位置に１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００３４】
変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、好ましくは少なくとも３つの置換を有する。
【００３５】
本発明の組成物において使用するのに特に好ましい変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９５％及び特に少なくとも９９％の同一性を有する変異体からなる群から選択される。
【００３６】
一実施形態では、本明細書に提供される組成物は、プロテアーゼを含み、プロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号１の３９位に対応する位置にグルタミン酸残基（Ｅ）を有する、変異体であり、
（ｉｉｉ）３Ｖ、４Ｔ、８Ｖ、９Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｗ／Ｙ、１０Ａ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｗ、１１Ａ／Ｉ／Ｓ／Ｔ、１２Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ、１４Ｄ、１５Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１６Ｌ／Ｍ／Ｓ、１７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１８Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｔ、１９Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ、２０Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｍ／Ｎ／Ｔ、２４Ａ／Ｅ／、２５Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ、２６Ａ／Ｉ、３３Ｔ、３６Ｃ／Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｔ／Ｖ、４２Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｑ、４３Ｌ、４４Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、４７Ｉ／Ｙ、５０Ｉ、５２Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｙ、５４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｔ／Ｖ、５５Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｎ／Ｓ／Ｙ、５７Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、５９Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、６０Ｓ、６９Ｓ、７６Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｒ／Ｔ／Ｙ、８２Ａ、８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｙ、９５Ａ／Ｎ、９６Ｍ／Ｑ、９７Ｅ／Ｈ／Ｋ、１０１Ｔ、１０２Ｌ／Ｍ、１０４Ａ／Ｄ／Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１０５Ｖ、１０７Ｋ／Ｍ、１１０Ｌ、１１３Ｔ／Ｖ、１１４Ｖ、１１５Ｅ／Ｈ／Ｑ、１１６Ｅ／Ｈ、１１８Ｄ／Ｅ／Ｎ、１２０Ｖ、１２８Ｇ、１２９Ａ／Ｈ／Ｎ／Ｙ、１３１Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｉ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｖ、１３３Ｍ、１３５Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１３６Ｍ、１３７Ｌ、１３９Ｅ／Ｓ、１４１Ｅ／Ｈ／Ｎ、１４２Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｑ、１４３Ｅ／Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｖ、１４４Ｅ／Ｎ、１４５Ｃ、１４７Ｃ、１４８Ｌ／Ｖ、１５０Ｍ、１５６Ｃ／Ｄ／Ｎ／Ｔ、１５７Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｎ／Ｑ、１５８Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１５９Ｌ、１６０Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｍ／Ｔ、１６１Ｗ、１６４Ａ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｙ、１６６Ｄ／Ｅ／Ｉ／Ｐ／Ｑ／Ｖ、１６７Ｅ、１７０Ｇ、１７４Ｖ、１７６Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｓ、１７７Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｓ／Ｗ／Ｙ、１７８Ｄ、１７９Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１８０Ｋ、１８２Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｐ／Ｑ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１８６Ｆ、１８８Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１８９Ｃ／Ｄ／Ｅ、１９０Ｍ、１９１Ｅ、１９２Ｃ／Ｍ、１９３Ａ／Ｍ、１９８Ｄ／Ｅ、２００Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｖ／Ｙ、２０７Ｋ／Ｌ／Ｎ／Ｑ、２０９Ｐ、２１０Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｌ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｙ、２１１Ｅ／Ｌ／Ｑ／Ｒ、２１２Ａ／Ｃ／Ｑ、２１８Ｃ／Ｓ、２２７Ｍ／Ｑ、２２８Ｌ、２３０Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｍ／Ｎ、２３１Ｃ／Ｅ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ、２３２Ｆ／Ｈ／Ｑ／Ｒ／Ｗ、２３４Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｔ／Ｗ／Ｙ、２３６Ｇ／Ｓ／Ｔ、２３８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｖ、２３９Ｄ／Ｅ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｔ、２４２Ａ、２４５Ｅ、２４６Ａ／Ｌ、２４７Ｅ／Ｑ、２４９Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｓ／Ｙ、２５０Ｓ／Ｔ、２５３Ｅ、２５４Ｐ／Ｙ、２５５Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｉ／Ｍ／Ｖ／Ｗ、２５６Ｃ／Ｆ／Ｈ／Ｍ／Ｗ／Ｙ、２５７Ｃ／Ｍ、２５９Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ、２６２Ｌ、２６３Ｄ／Ｑ、２６４Ｔ、２６５Ａ／Ｍ／Ｎ／Ｑ、２６６Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｒ、２６８Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ及び２６９Ｈ／Ｐ／Ｗから選択される１つ以上の位置に１つ以上のアミノ酸置換を更に含み、
変異体のアミノ酸位置は、配列番号１のアミノ酸配列に対応して番号付けされる。いくつかの実施形態では、本組成物は、配列番号１のプロテアーゼを含む組成物と比べて、特に卵及び／又はクレームブリュレの除去において、改善された安定性及び改善された性能を示す。
【００３７】
別の実施形態は、プロテアーゼを含む組成物を対象とし、プロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し、配列番号１の３９位に対応する位置にグルタミン酸残基（Ｅ）を有し、
（ｉｖ）３Ｖ、４Ｔ、８Ｖ、９Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｗ／Ｙ、１０Ａ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｗ、１１Ａ／Ｉ／Ｓ／Ｔ、１２Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ、１４Ｄ、１５Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１６Ｌ／Ｍ／Ｓ、１７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１８Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｔ、１９Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ、２０Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｍ／Ｎ／Ｔ、２４Ａ／Ｅ／、２５Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ、２６Ａ／Ｉ、３３Ｔ、３６Ｃ／Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｔ／Ｖ、４２Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｑ、４３Ｌ、４４Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、４７Ｉ／Ｙ、５０Ｉ、５２Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｙ、５４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｔ／Ｖ、５５Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｎ／Ｓ／Ｙ、５７Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、５９Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、６０Ｓ、６９Ｓ、７６Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｒ／Ｔ／Ｙ、８２Ａ、８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｙ、９５Ａ／Ｎ、９６Ｍ／Ｑ、９７Ｅ／Ｈ／Ｋ、１０１Ｔ、１０２Ｌ／Ｍ、１０４Ａ／Ｄ／Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１０５Ｖ、１０７Ｋ／Ｍ、１１０Ｌ、１１３Ｔ／Ｖ、１１４Ｖ、１１５Ｅ／Ｈ／Ｑ、１１６Ｅ／Ｈ、１１８Ｄ／Ｅ／Ｎ、１２０Ｖ、１２８Ｇ、１２９Ａ／Ｈ／Ｎ／Ｙ、１３１Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｉ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｖ、１３３Ｍ、１３５Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１３６Ｍ、１３７Ｌ、１３９Ｅ／Ｓ、１４１Ｅ／Ｈ／Ｎ、１４２Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｑ、１４３Ｅ／Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｖ、１４４Ｅ／Ｎ、１４５Ｃ、１４７Ｃ、１４８Ｌ／Ｖ、１５０Ｍ、１５６Ｃ／Ｄ／Ｎ／Ｔ、１５７Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｎ／Ｑ、１５８Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１５９Ｌ、１６０Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｍ／Ｔ、１６１Ｗ、１６４Ａ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｙ、１６６Ｄ／Ｅ／Ｉ／Ｐ／Ｑ／Ｖ、１６７Ｅ、１７０Ｇ、１７４Ｖ、１７６Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｓ、１７７Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｓ／Ｗ／Ｙ、１７８Ｄ、１７９Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１８０Ｋ、１８２Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｐ／Ｑ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１８６Ｆ、１８８Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１８９Ｃ／Ｄ／Ｅ、１９０Ｍ、１９１Ｅ、１９２Ｃ／Ｍ、１９３Ａ／Ｍ、１９８Ｄ／Ｅ、２００Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｖ／Ｙ、２０７Ｋ／Ｌ／Ｎ／Ｑ、２０９Ｐ、２１０Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｌ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｙ、２１１Ｅ／Ｌ／Ｑ／Ｒ、２１２Ａ／Ｃ／Ｑ、２１８Ｃ／Ｓ、２２７Ｍ／Ｑ、２２８Ｌ、２３０Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｍ／Ｎ、２３１Ｃ／Ｅ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ、２３２Ｆ／Ｈ／Ｑ／Ｒ／Ｗ、２３４Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｔ／Ｗ／Ｙ、２３６Ｇ／Ｓ／Ｔ、２３８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｖ、２３９Ｄ／Ｅ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｔ、２４２Ａ、２４５Ｅ、２４６Ａ／Ｌ、２４７Ｅ／Ｑ、２４９Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｓ／Ｙ、２５０Ｓ／Ｔ、２５３Ｅ、２５４Ｐ／Ｙ、２５５Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｉ／Ｍ／Ｖ／Ｗ、２５６Ｃ／Ｆ／Ｈ／Ｍ／Ｗ／Ｙ、２５７Ｃ／Ｍ、２５９Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ、２６２Ｌ、２６３Ｄ／Ｑ、２６４Ｔ、２６５Ａ／Ｍ／Ｎ／Ｑ、２６６Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｒ、２６８Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ及び２６９Ｈ／Ｐ／Ｗから選択される１つ以上の位置に１つ以上のアミノ酸置換を更に含む、変異体であり、
変異体のアミノ酸位置は、配列番号１のアミノ酸配列に対応して番号付けされる。いくつかの実施形態では、本組成物は、配列番号１の３９位に対応する位置にグルタミン酸を有するプロテアーゼを含む組成物と比較して、特に卵及び／又はクレームブリュレの除去において、改善された安定性及び性能を示す。
【００３８】
別の実施形態は、プロテアーゼを含む組成物を対象とし、プロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する変異体であり、変異体は、配列番号１の３９位に対応する位置にグルタミン酸残基（Ｅ）を有し、３Ｖ、９Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｋ、１０Ａ／Ｍ／Ｎ／Ｑ、１１Ａ／Ｉ、１２Ｃ／Ｄ、１４Ｄ、１５Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｉ／Ｍ／Ｖ／Ｙ、１６Ｍ、１７Ｃ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｗ、１８Ｄ／Ｅ、１９Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｗ、２４Ａ／Ｅ、３６Ｃ／Ｅ、４２Ｃ／Ｄ／Ｅ、４４Ｃ／Ｅ／Ｗ／Ｙ、５２Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｈ、５４Ｌ／Ｍ；５５Ａ／Ｄ／Ｈ／Ｓ、５７Ｄ／Ｅ／、５９Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｎ、６０Ｓ、７６Ｅ／Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｔ、８４Ｈ／Ｙ、９５Ｎ、９６Ｑ、９７Ｅ、１０４Ａ／Ｄ、１０７Ｋ、１１０Ｌ、１１６Ｅ、１２９Ｈ／Ｎ／Ｙ、１３１Ｄ／Ｅ、１３５Ａ／Ｅ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１３６Ｍ、１４１Ｅ、１４２Ｅ、１４４Ｅ、１５６Ｃ／Ｄ、１５７Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ、１５８Ａ／Ｃ、１６０Ａ／Ｍ、１６４Ａ／Ｍ／Ｑ／Ｙ、１６６Ｄ／Ｅ、１７６Ｃ／Ｄ、１７７Ｃ／Ｄ／Ｍ／Ｓ／Ｙ、１７８Ｄ、１７９Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１８２Ｄ／Ｅ、１８８Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ、１８９Ｃ／Ｄ／Ｅ、１９３Ａ／Ｍ、１９８Ｄ／Ｅ、２００Ｉ／Ｙ、２０７Ｋ／Ｌ／Ｑ、２０９Ｐ、２１０Ｄ／Ｅ／Ｎ、２３８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｍ、２３９Ｄ／Ｅ、２４１Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｑ／Ｔ／Ｙ、２４５Ｅ、２４７Ｅ／  ２４９Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｙ、２５３Ｅ、２５５Ｃ／Ｄ／Ｅ、２５６Ｃ／Ｙ、２５９Ｄ／Ｅ、２６２Ｌ、２６８Ｄ／Ｅ及び２６９Ｈ／Ｗから選択される１つ以上の位置に１つ以上のアミノ酸置換を更に含み、
変異体のアミノ酸位置は、配列番号１のアミノ酸配列に対応して番号付けされる。いくつかの実施形態では、本組成物は、配列番号１の３９位に対応する位置にグルタミン酸を有するプロテアーゼを含む組成物と比較して、特に卵の除去において、改善された洗浄性能を示す。
【００３９】
別の実施形態は、プロテアーゼを含む組成物を対象とし、プロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する変異体であり、変異体は、配列番号１の３９位に対応する位置にグルタミン酸残基（Ｅ）を有し、９Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｍ／Ｎ／Ｙ、１０Ａ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｗ、１１Ａ／Ｔ、１２Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｍ、１４Ｄ、１５Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｉ／Ｍ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１６Ｌ／Ｍ、１７Ｃ／Ｅ、１８Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ、１９Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ、２０Ｃ／Ｄ、２４Ａ／Ｅ、２５Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ、２６Ａ、３６Ｃ／Ｅ／Ｑ／Ｖ、４２Ｃ／Ｄ／Ｅ、４３Ｌ、４４Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、５２Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｌ／Ｍ／Ｎ、５４Ａ／Ｃ／Ｌ／Ｍ／Ｖ、５５Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ、５７Ｄ／Ｅ、５９Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、６０Ｓ、７６Ｄ／Ｅ／Ｎ、８２Ａ、８４Ｄ、９６Ｑ、９７Ｅ／Ｈ、１０４Ａ／Ｄ／Ｈ／Ｎ／Ｖ／Ｙ、１１５Ｈ、１１６Ｅ、１２９Ｈ、１３１Ｄ／Ｅ、１３５Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１３９Ｅ、１４１Ｅ、１４２Ｄ／Ｅ、１４３Ｅ、１４４Ｅ、１４７Ｃ、１４８Ｌ、１５６Ｃ／Ｄ／Ｎ／Ｔ、１５７Ｃ／Ｄ／Ｅ、１５８Ｃ／Ｌ／Ｑ／Ｙ、１５９Ｌ、１６４Ａ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｙ、１６６Ｄ／Ｅ、１６７Ｅ、１７４Ｖ、１７６Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｎ、１７７Ｃ／Ｄ、１７８Ｄ、１７９Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１８２Ｃ／Ｄ／Ｅ、１８８Ｃ／Ｄ／Ｅ、１８９Ｃ／Ｄ／Ｅ、１９３Ａ／Ｍ、１９８Ｄ／Ｅ、２０７Ｋ／Ｌ／Ｑ、２０９Ｐ、２１０Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｌ／Ｎ／Ｙ、２１２Ｃ、２２８Ｌ、２３１Ｃ／Ｅ／Ｌ／Ｎ／Ｑ、２３２Ｆ、２３４Ｄ／Ｅ／Ｔ／Ｗ／Ｙ、２３６Ｔ、２３８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｖ、２３９Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ、２４１Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｑ／Ｔ／Ｙ、２４５Ｅ、２４６Ａ／Ｌ、２４７Ｅ／Ｑ、２４９Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｌ／Ｙ、２５３Ｅ、２５４Ｙ、２５５Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／、２５６Ｃ／Ｙ、２５７Ｃ、２５９Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ、２６２Ｌ、２６３Ｄ、２６８Ｃ／Ｄ／Ｅ及び２６９Ｈ／Ｐ／Ｗから選択される１つ以上の位置に１つ以上のアミノ酸置換を更に含み、変異体のアミノ酸位置は、配列番号１のアミノ酸配列に対応して番号付けされる。いくつかの実施形態では、本組成物は、配列番号１の３９位に対応する位置にグルタミン酸を有するプロテアーゼを含む組成物と比較して、改善された洗浄性能、特にクレームブリュレの除去を示す。
【００４０】
別の実施形態では、親プロテアーゼ（例えば、配列番号１）と比較して改善されたクレームブリュレ洗浄性能を有する、変異体を含む組成物が提供され、変異体は、９、１０、１２、１４、１５、１７、１８、１９、２０、２４、２５、３６、４２、４４、５２、５４、５５、５７、５９、７６、８４、９７、１０４、１１６、１３１、１３５、１３９、１４１、１４２、１４３、１４７、１５６、１５７、１５８、１６４、１６６、１６７、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８２、１８８、１８９、１９８、２０７、２１０、２１２、２３１、２３４、２３８、２３９、２４５、２４７、２４９、２５３、２５４、２５５、１５６、２５７、２５９、２６３、２６８及び２６９から選択される１つ以上の位置に１つ以上のアミノ酸置換を含み、これらの位置は、配列番号１に対応して番号付けされ、置換により、本出願における親サブチリシンに対して全体的な負の正味電荷が導入される。いくつかの実施形態では、変異体は、９Ｃ／Ｅ／Ｙ、１０Ａ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｗ、１２Ｃ／Ｄ、１４Ｄ、１５Ｄ／Ｅ／Ｙ、１７Ｃ／Ｅ、１８Ｃ／Ｄ／Ｅ、１９Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ、２０Ｃ／Ｄ、２４Ｅ、２５Ｃ／Ｄ／Ｅ、３６Ｃ／Ｅ、４２Ｃ／Ｄ／Ｅ、４４Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、５２Ｃ／Ｄ、５４Ｃ、５５Ｃ／Ｄ／Ｅ、５７Ｄ／Ｅ、５９Ｃ／Ｄ／Ｅ、７６Ｄ／Ｅ、８４Ｄ、９７Ｅ、１０４Ｄ／Ｙ、１１６Ｅ、１３１Ｄ／Ｅ、１３５Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１３９Ｅ、１４１Ｅ、１４２Ｄ／Ｅ、１４３Ｅ、１４７Ｃ、１５６Ｃ／Ｄ、１５７Ｃ／Ｄ／Ｅ、１５８Ｃ／Ｙ、１６４Ａ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｙ、１６６Ｄ／Ｅ、１６７Ｅ、１７６Ｃ／Ｄ、１７７Ｃ／Ｄ、１７８Ｄ、１７９Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１８０Ｋ、１８２Ｃ／Ｄ／Ｅ、１８８Ｃ／Ｄ／Ｅ、１８９Ｃ／Ｄ／Ｅ、１９８Ｄ／Ｅ、２０７Ｋ／Ｌ／Ｑ、２１０Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｙ、２１２Ｃ、２３０Ｄ、２３１Ｃ／Ｅ／Ｌ／Ｎ／Ｑ、２３４Ｄ／Ｅ／Ｙ、２３８Ｄ／Ｅ、２３９Ｄ／Ｅ、２４５Ｅ、２４７Ｅ、２４９Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｙ、２５３Ｅ、２５４Ｙ、２５５Ｃ／Ｄ／Ｅ、２５６Ｃ／Ｙ、２５７Ｃ、２５９Ｄ／Ｅ、２６３Ｄ、２６８Ｃ／Ｄ／Ｅ及び２６９Ｈ／Ｐ／Ｗから選択される、１つ以上の位置に１つ以上の負に荷電したアミノ酸置換を含むか、又はその１つ以上の位置で正に荷電したアミノ酸を置き換え、これらの位置は、配列番号１に対応して番号付けされる。
【００４１】
別の実施形態は、プロテアーゼを含む組成物を対象とし、プロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する変異体であり、変異体は、配列番号１の３９位に対応する位置にグルタミン酸残基（Ｅ）を有するアミノ酸配列を含み、９Ｎ、１１Ａ、１２Ａ／Ｍ、１５Ｉ／Ｖ、１６Ｌ／Ｍ、１９Ｃ／Ｋ／Ｌ／Ｑ、２０Ｄ、２４Ａ、２５Ａ／Ｄ／Ｎ、５２Ｄ、５４Ａ／Ｌ／Ｍ／Ｖ、５５Ａ／Ｄ、５９Ａ／Ｍ／Ｎ、６０Ｓ、９６Ｑ、１２９Ｈ、１５７Ｄ、１５８Ｑ、１５９Ｌ、１７７Ｄ、１７９Ａ／Ｋ、１８２Ｄ、２０７Ｌ、２１０Ｅ、２３２Ｆ、及び２５６Ｙから選択される１つ以上の位置に１つ以上のアミノ酸置換を更に含み、変異体のアミノ酸位置は、配列番号１のアミノ酸配列に対応して番号付けされる。いくつかの実施形態では、変異体は、配列番号１の３９位に対応する位置にグルタミン酸を有するプロテアーゼを含む組成物と比較して、卵及びクレームブリュレの除去において、改善された洗浄性能を示す。
【００４２】
別の実施形態は、プロテアーゼを含む組成物を対象とし、プロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する変異体であり、変異体は、配列番号１の３９位に対応する位置にグルタミン酸残基（Ｅ）を有するアミノ酸配列を含み、３Ｖ、４Ｔ、８Ｖ、９Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｋ／Ｎ／Ｑ／Ｗ／Ｙ、１０Ｑ、１１Ａ、１２Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｔ、１５Ｆ／Ｈ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｗ、１６Ｓ、１７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｌ／Ｍ／Ｑ、１９Ｃ／Ｄ／Ｙ、２０Ｃ／Ｄ／Ｍ／Ｎ、２４Ａ／Ｅ、２５Ｃ／Ｄ／Ｎ、２６Ｉ、３３Ｔ、３６Ｃ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｖ、４２Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｑ、４４Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、４７Ｉ／Ｙ、５０Ｉ、５２Ａ／Ｍ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｙ、５４Ｎ／Ｖ、５５Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｎ、５７Ｅ／Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、５９Ｎ、７６Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｒ／Ｔ／Ｙ、８２Ａ、８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｙ、９５Ａ／Ｎ、９６Ｍ、９７Ｋ、１０１Ｔ、１０２Ｌ／Ｍ、１０４Ｍ／Ｎ／Ｔ／Ｖ／Ｗ、１０５Ｖ、１０７Ｍ、１１３Ｖ、１１４Ｖ、１１５Ｑ、１１６Ｅ／Ｈ、１１８Ｄ／Ｅ、１３１Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｉ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｖ、１３３Ｍ、１３５Ａ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１３６Ｍ、１４２Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｑ、１４３Ｅ／Ｈ／Ｍ／Ｎ、１４７Ｃ、１４８Ｖ、１５０Ｍ、１５６Ｎ／Ｔ、１５７Ａ／Ｃ／Ｎ、１５８Ｃ／Ｆ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１５９Ｌ、１６０Ａ／Ｃ／Ｍ／Ｔ、１６６Ｄ／Ｅ／Ｐ／Ｑ、１７０Ｇ、１７６Ｃ／Ｍ、１７７Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｗ／Ｙ、１７９Ｍ／Ｑ、１８０Ｋ、１８２Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｐ／Ｑ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１８８Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１８９Ｄ、１９２Ｃ／Ｍ、１９３Ｍ、２００Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｖ／Ｙ、２０９Ｐ、２１０Ｅ／Ｆ／Ｐ、２１８Ｃ／Ｓ、２２８Ｌ、２３１Ｃ／Ｅ／Ｈ／Ｎ／Ｔ、２３２Ｆ／Ｈ、２３４Ｄ／Ｍ、２３６Ｇ／Ｓ／Ｔ、２３８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｖ、２３９Ｅ／Ｌ／Ｍ／Ｔ、２４２Ａ、２４６Ａ／Ｌ、２４９Ｅ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｓ／Ｙ、２５０Ｓ、２５３Ｅ、２５４Ｐ、２５５Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｉ／Ｍ／Ｖ／Ｗ、２５６Ｃ／Ｆ／Ｈ／Ｗ／Ｙ、２６４Ｔ、２６６Ｌ／Ｍ／Ｎ及び２６８Ｃから選択される１つ以上の位置に１つ以上のアミノ酸置換を更に含み、変異体のアミノ酸位置は、配列番号１のアミノ酸配列に対応して番号付けされる。いくつかの実施形態では、本組成物は、配列番号１の３９位に対応する位置にグルタミン酸を有するプロテアーゼを含む組成物と比較して、改善された安定性を示す。
【００４３】
別の実施形態は、プロテアーゼを含む組成物を対象とし、プロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する変異体であり、変異体は、配列番号１の３９位に対応する位置にグルタミン酸残基（Ｅ）を有するアミノ酸配列を含み、９Ａ／Ｅ／Ｈ／Ｋ／Ｎ／Ｗ／Ｙ、１０Ｑ、１１Ａ、１２Ａ／Ｃ／Ｍ／Ｎ、１５Ｆ／Ｈ／Ｍ／Ｗ、１７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｖ／Ｗ、１８Ｄ／Ｅ／Ｍ、１９Ｃ／Ｄ／Ｙ、２０Ｃ／Ｄ／Ｍ／Ｎ、２４Ａ／Ｅ、２５Ｃ／Ｄ／Ｎ、３６Ｃ／Ｌ／Ｑ／Ｖ、４２Ｃ／Ｄ／Ｅ、４４Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、５２Ａ／Ｍ／Ｎ、５４Ｖ、５５Ｃ／Ｄ／Ｅ、５７Ｅ／Ｓ、５９Ｎ、７６Ｄ／Ｅ／Ｋ／Ｌ／Ｎ、８２Ａ、８４Ｄ、９５Ｎ、９７Ｋ、１０２Ｌ／Ｍ、１０４Ｎ／Ｖ、１１６Ｅ、１１８Ｄ、１３１Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ／Ｐ、１３５Ａ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１３６Ｍ、１４２Ｄ／Ｅ、１４３Ｅ／Ｎ、１４７Ｃ、１５６Ｎ／Ｔ、１５７Ａ／Ｃ、１５８Ｃ／Ｌ／Ｑ／Ｙ、１５９Ｌ、１６０Ｍ、１６６Ｄ／Ｅ、１７０Ｇ、１７６Ｃ、１７７Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｌ／Ｍ／Ｙ、１７９Ｍ／Ｑ、１８０Ｋ、１８２Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｙ、１８８Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ、１８９Ｄ、１９３Ｍ、２０９Ｐ、２１０Ｅ、２１８Ｓ、２２８Ｌ、２３１Ｃ／Ｅ／Ｎ、２３２Ｆ、２３４Ｄ、２３６Ｔ、２３８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｖ、２３９Ｅ／Ｍ、２４６Ａ／Ｌ、２４９Ｅ／Ｌ／Ｙ、２５３Ｅ、２５５Ｃ／Ｄ／Ｅ、２５６Ｃ／Ｙ、及び２６８Ｃから選択される１つ以上の位置に１つ以上のアミノ酸置換を更に含み、変異体のアミノ酸位置は、配列番号１のアミノ酸配列に対応して番号付けされる。いくつかの実施形態では、本組成物は、特に卵又はクレームブリュレの除去において、改善された洗浄性能を示す。本組成物はまた、配列番号１の３９位に対応する位置にグルタミン酸を有するプロテアーゼを含む組成物と比較して、改善された安定性を示す。
【００４４】
いくつかの実施形態では、親プロテアーゼ又は変異体はまた、Ｑ０１２Ｅ、Ｑ０３７Ｅ、Ｎ０６０Ｄ、Ｎ０９７Ｄ、Ｑ１０７Ｅ、Ｎ１１５Ｄ、Ｎ１５４Ｄ、Ｎ１６７Ｄ、Ｑ１７６Ｅ、Ｑ１８５Ｅ、Ｑ２００Ｅ、Ｎ２０５Ｄ、Ｑ２３０Ｅ、Ｎ２３６Ｄ、Ｎ２４２Ｄ、Ｎ２５０Ｄ、Ｎ２５３Ｄ、Ｑ２５６Ｅ、Ｎ２５３Ｄ−Ｑ２５６Ｅ、Ｇ０２５Ｒ−Ｍ１１７Ｉ−Ｈ１１８Ｎ、Ａ１４９Ｓ、Ｒ０４４Ｐ−Ｄ１７５Ｎ−Ｙ２０８Ｎ−Ｑ２３０Ｈ、Ｌ０４１Ｆ−Ｇ０７８Ｄ−Ｐ０８４Ａ、Ｓ１０１Ｇ−Ｔ１７４Ａ、Ｉ０２１Ｖ−Ｎ１７７Ｉ、Ｉ０２１Ｖ−Ｓ１４２Ｇ−Ｔ１８８Ａ、Ｉ０２１Ｖ−Ｍ１２２Ｌ−Ａ２２２Ｓ、Ｑ０１２Ｌ−Ｉ０２１Ｖ−Ｍ１２２Ｌ−Ａ２２２Ｓ、Ｉ０２１Ｖ−Ｍ１２２Ｌ−Ｎ２５３Ｄ、Ｉ０２１Ｖ−Ｎ１７７Ｖ−Ｖ２２８Ｉ、Ｉ０２１Ｖ−Ｓ０３９Ｔ−Ｍ１２２Ｌ−Ｎ１７７Ｅ、Ｉ０２１Ｖ−Ｖ０７９Ｌ−Ｄ０８７Ｅ−Ａ２０９Ｎ−Ａ２２２Ｓ、Ｉ０２１Ｖ−Ｍ１２２Ｌ−Ａ２２２Ｓ−Ｔ２４７Ｎ、Ｉ０２１Ｖ−Ｍ１２２Ｌ、Ｓ０３９Ｅ−Ｎ０７４Ｄ−Ｄ０８７Ｅ、Ｎ２５３Ｐ、Ｓ０３９Ｅ−Ｎ０７４Ｄ−Ｄ０８７Ｅ−Ｎ２５３Ｄ、Ｉ０２１Ｖ−Ｓ０３９Ｅ−Ｎ０７４Ｄ−Ｄ０８７Ｅ−Ｎ２５３Ｄ、Ｓ０３９Ｅ−Ｎ０７４Ｄ−Ｄ０８７Ｅ−Ｍ１２２Ｌ−Ｎ２５３Ｄ、Ｉ０２１Ｖ−Ｓ０３９Ｅ−Ｎ０７４Ｄ−Ｄ０８７Ｅ−Ｍ１２２Ｌ−Ｎ２５３Ｄ、Ｉ０２１Ｖ、Ｍ１２２Ｌ、Ｍ２１１Ｓ、Ｐ２１２Ｎ、Ｑ０１２Ｌ、Ｎ１７７Ｖ、Ａ２２２Ｓ、Ｖ２２８Ｉ、Ｔ２７４Ｎ、Ｒ０９９Ｅ、Ｎ０９７Ｄ−Ｒ０９９Ｅ、Ｓ０９７Ｄ、Ｓ０９９Ｅ、Ｉ０４３Ｖ、Ｍ１２２Ｌ−Ｎ１４５Ｓ−Ｔ１５６Ａ、Ｍ２１１Ｎ−Ｐ２１２Ｄ、Ｍ２１１Ｌ−Ｐ２１２Ｄ、Ｇ１６０Ｓ、Ｄ１２７Ｐ−Ｍ２１１Ｌ−Ｐ２１２Ｄ、Ｐ２１２Ｈ、Ｑ０１２Ｌ−Ｍ１２２Ｌ−Ａ２２２Ｓ、Ｄ１２７Ｐ、Ｎ１４５Ｓ、Ｔ１５６Ａ、Ｍ２１１Ｎ及びＰ２１２Ｄから選択される少なくとも１つ、２つ、３つ又はそれ以上の追加の置換を含む。
【００４５】
本開示は、表面に露出されるアミノ酸に１つ以上の修飾を有する変異体を含む。酵素変異体における表面修飾は、洗浄性能に関する最小限の性能指数、洗剤組成物中の酵素の安定性及び酵素の熱安定性を有するが、これらの特性のうちの少なくとも１つは親サブチリシン酵素から改善されていることにより、洗剤組成物において有用であり得る。いくつかの実施形態では、表面修飾は、その位置におけるアミノ酸の疎水性及び／又は電荷を変化させる。疎水性は、Ｗｈｉｔｅ  ａｎｄ  Ｗｉｍｌｅｙ（Ｗｈｉｔｅ，Ｓ．Ｈ．ａｎｄ  Ｗｉｍｌｅｙ，Ｗ．Ｃ，．（１９９９）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２８：３１９−６５）に記載されているものなど、当該技術分野において公知の技法を使用して判定することができる。目的のｐＨにおけるアミノ酸の正味電荷は、Ｈａｓｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｄｅｒ（Ｈａｓｓ，Ｍ．Ａ．Ｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｄｅｒ，Ｆ．Ａ．Ａ（２０１５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．４４：５３−７５）に記載されているものなど、アミノ酸中の滴定可能な化学基のｐＫａ値を使用して計算することができる。
【００４６】
本明細書で使用するとき、「表面特性」は、静電荷、並びにタンパク質表面が示す疎水性及び親水性などの特性に関して使用することができる。本明細書に提供される変異体は、好適な修飾として、７６、８４、９７、１０４、１１６、１３１、１３５、１３９、１４１、１４２、１４３、１５７位を含む、表面修飾のうちの少なくとも１つを有し、変異体のアミノ酸位置は、配列番号１のアミノ酸配列と対応して番号付けされる。
【００４７】
酸化、キレート化剤、変性、界面活性剤、熱安定性及び／又はｐＨ安定性プロテアーゼの文脈において、用語「強化された安定性」又は「改善された安定性」は、基準プロテアーゼ、例えば、野生型プロテアーゼ又は親プロテアーゼと比較して、経時的により高度に保持されるタンパク質分解活性を指す。
【００４８】
更なる実施形態は、クレームブリュレの汚れを洗浄する方法であって、洗浄を必要とする表面又は物品を、１つ以上のプロテアーゼを含む組成物と接触させることを含む、方法を対象とし、プロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する変異体であり、変異体は、配列番号１のアミノ酸配列の３９位に対応する位置にグルタミン酸を有するアミノ酸配列を含み、９Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｍ／Ｎ／Ｙ、１０Ａ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｗ、１１Ａ／Ｔ、１２Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ、１４Ｄ、１５Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｉ／Ｍ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１６Ｌ／Ｍ、１７Ｃ／Ｅ、１８Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ、１９Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ、２０Ｃ／Ｄ、２４Ａ／Ｅ、２５Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ、２６Ａ、２７Ｋ、３６Ｃ／Ｅ／Ｑ／Ｖ、４２Ｃ／Ｄ／Ｅ、４３Ｌ、４４Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ、５２Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｌ／Ｍ／Ｎ、５４Ａ／Ｃ／Ｌ／Ｍ／Ｖ、５５Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ、５７Ｄ／Ｅ、５９Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、６０Ｓ、７６Ｄ／Ｅ／Ｎ、８２Ａ、８４Ｄ、９６Ｑ、９７Ｅ／Ｈ、１０４Ａ／Ｄ／Ｈ／Ｎ／Ｖ／Ｙ、１１５Ｈ、１１６Ｅ、１２９Ｈ、１３１Ｄ／Ｅ、１３５Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１３９Ｅ、１４１Ｅ、１４２Ｄ／Ｅ、１４３Ｅ、１４４Ｅ、１４７Ｃ、１４８Ｌ、１５４Ｄ、１５６Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｎ／Ｔ、１５７Ｃ／Ｄ／Ｅ、１５８Ｃ／Ｌ／Ｑ／Ｔ／Ｙ、１５９Ｌ、１６４Ａ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｙ、１６６Ｄ／Ｅ、１６７Ｅ、１６９Ｌ、１７４Ｖ、１７６Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｎ、１７７Ｃ／Ｄ／Ｅ、１７８Ｄ、１７９Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１８０Ｋ、１８２Ｃ／Ｄ／Ｅ、１８８Ｃ／Ｄ／Ｅ、１８９Ｃ／Ｄ／Ｅ、１９３Ａ／Ｍ、１９８Ｄ／Ｅ、２０６Ｄ、２０７Ｋ／Ｌ／Ｑ、２０９Ｐ、２１０Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｌ／Ｎ／Ｙ、２１１Ｋ／Ｌ、２１２Ｃ、２２８Ｌ、２３０Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｍ／Ｎ、２３１Ｃ／Ｅ／Ｌ／Ｎ／Ｑ、２３２Ｆ、２３４Ｄ／Ｅ／Ｔ／Ｗ／Ｙ、２３６Ｄ／Ｔ、２３８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｖ、２３９Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ、２４５Ｅ、２４６Ａ／Ｌ、２４７Ｅ／Ｑ、２４９Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｌ／Ｙ、２５０Ｄ、２５２Ａ／Ｑ、２５３Ｄ／Ｅ／Ｐ、２５４Ｙ、２５５Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ、２５６Ｃ／Ｅ／Ｙ、２５７Ｃ、２５９Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ、２６２Ｌ、２６３Ｄ、２６８Ｃ／Ｄ／Ｅ及び２６９Ｈ／Ｐ／Ｗ並びに組合せから選択される配列番号１に対応する１つ以上の位置に１つ以上の置換を更に含み、変異体のアミノ酸位置は、配列番号１のアミノ酸配列に対応して番号付けされる。また更なる実施形態は、クレームブリュレの汚れを洗浄する方法であって、洗浄を必要とする表面又は物品を、１つ以上の変異体を含む組成物と接触させることを含む、方法を対象とし、変異体は、配列番号１の３９位に対応する位置にグルタミン酸を有するアミノ酸配列を含み、９Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｍ／Ｎ／Ｙ、１０Ａ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｗ、１１Ａ／Ｔ、１２Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ、１４Ｄ、１５Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｉ／Ｍ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１６Ｌ／Ｍ、１７Ｃ／Ｅ、１８Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ、１９Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ、２０Ｃ／Ｄ、２４Ａ／Ｅ、２５Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ、２６Ａ、２７Ｋ、３６Ｃ／Ｅ／Ｑ／Ｖ、４２Ｃ／Ｄ／Ｅ、４３Ｌ、４４Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ、５２Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｌ／Ｍ／Ｎ、５４Ａ／Ｃ／Ｌ／Ｍ／Ｖ、５５Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ、５７Ｄ／Ｅ、５９Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、６０Ｓ、７６Ｄ／Ｅ／Ｎ、８２Ａ、８４Ｄ、９６Ｑ、９７Ｅ／Ｈ、１０４Ａ／Ｄ／Ｈ／Ｎ／Ｖ／Ｙ、１１５Ｈ、１１６Ｅ、１２９Ｈ、１３１Ｄ／Ｅ、１３５Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１３９Ｅ、１４１Ｅ、１４２Ｄ／Ｅ、１４３Ｅ、１４４Ｅ、１４７Ｃ、１４８Ｌ、１５４Ｄ、１５６Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｎ／Ｔ、１５７Ｃ／Ｄ／Ｅ、１５８Ｃ／Ｌ／Ｑ／Ｔ／Ｙ、１５９Ｌ、１６４Ａ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｙ、１６６Ｄ／Ｅ、１６７Ｅ、１６９Ｌ、１７４Ｖ、１７６Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｎ、１７７Ｃ／Ｄ／Ｅ、１７８Ｄ、１７９Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、１８０Ｋ、１８２Ｃ／Ｄ／Ｅ、１８８Ｃ／Ｄ／Ｅ、１８９Ｃ／Ｄ／Ｅ、１９３Ａ／Ｍ、１９８Ｄ／Ｅ、２０７Ｋ／Ｌ／Ｑ、２０９Ｐ、２１０Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｌ／Ｎ／Ｙ、２１１Ｋ／Ｌ、２１２Ｃ、２２８Ｌ、２３１Ｃ／Ｅ／Ｌ／Ｎ／Ｑ、２３２Ｆ、２３４Ｄ／Ｅ／Ｔ／Ｗ／Ｙ、２３６Ｄ／Ｔ、２３８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｖ、２３９Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ、２４５Ｅ、２４６Ａ／Ｌ、２４７Ｅ／Ｑ、２４９Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｌ／Ｙ、２５０Ｄ、２５３Ｄ／Ｅ／Ｐ、２５４Ｙ、２５５Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ、２５６Ｃ／Ｅ／Ｙ、２５７Ｃ、２５９Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ、２６２Ｌ、２６３Ｄ、２６８Ｃ／Ｄ／Ｅ及び２６９Ｈ／Ｐ／Ｗ並びに組合せから選択される配列番号１の位置に対応する１つ以上の位置に１つ以上の置換を更に含み、変異体のアミノ酸位置は、配列番号１のアミノ酸配列に対応して番号付けされる。
【００４９】
更なる実施形態は、卵の汚れを洗浄する方法であって、洗浄を必要とする表面又は物品を、１つ以上のサブチリシン変異体を含有する組成物と接触させることを含む、方法を対象とし、変異体は、９Ｈ／Ｋ／Ｎ／Ｗ、１１Ａ／Ｉ、１２Ａ／Ｍ／Ｎ／Ｒ／Ｓ／Ｖ、１５Ｆ／Ｉ／Ｋ／Ｖ、１６Ｌ／Ｍ、１７Ｆ／Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｖ／Ｗ、１８Ｆ、１９Ｃ／Ｋ／Ｌ／Ｑ、２０Ａ／Ｄ／Ｍ／Ｎ／Ｔ、２４Ａ、２５Ａ／Ｄ／Ｎ、３６Ｌ、５２Ｄ／Ｈ、５４Ａ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｖ、５５Ａ／Ｄ／Ｈ／Ｓ／Ｙ、５７Ｓ、５９Ａ／Ｍ／Ｎ、６０Ｓ、６９Ｓ、７６Ｋ／Ｌ、９５Ｎ、９６Ｑ、９７Ｋ、１０２Ｌ／Ｍ、１０７Ｋ、１１０Ｌ、１１３Ｔ、１１８Ｄ、１２０Ｖ、１２９Ａ／Ｈ／Ｎ／Ｙ、１３１Ｍ／Ｎ／Ｐ、１３６Ｍ、１４３Ｎ、１４４Ｎ、１４５Ｃ、１５７Ａ／Ｄ、１５８Ｑ、１５９Ｌ、１６０Ｍ、１６６Ｉ、１７０Ｇ、１７６Ｌ、１７７Ａ／Ｄ／Ｇ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｙ、１７９Ａ／Ｋ、１８２Ａ／Ｄ／Ｙ、１８８Ｍ、１９１Ｅ、２０７Ｌ、２１０Ｅ／Ｇ／Ｑ、２１１Ｒ、２１８Ｓ、２２７Ｍ、２３２Ｆ／Ｗ、２５６Ｙ、２６３Ｑ、２６５Ａ／Ｍ／Ｑ及び２６８Ａ並びに組合せから選択される配列番号１の位置に対応する１つ以上の位置に１つ以上の置換を有し、変異体のアミノ酸位置は、配列番号１のアミノ酸配列に対応して番号付けされる。また更なる実施形態は、卵の汚れを洗浄する方法であって、洗浄を必要とする表面又は物品を、１つ以上の変異体を含有する組成物と接触させることを含む、方法を対象とし、変異体は、配列番号１の３９位に対応する位置にグルタミン酸を有するアミノ酸配列を含み、９Ｈ／Ｋ／Ｎ／Ｗ、１１Ａ／Ｉ、１２Ａ／Ｍ／Ｎ／Ｒ／Ｓ／Ｖ、１５Ｆ／Ｉ／Ｋ／Ｖ、１６Ｌ／Ｍ、１７Ｆ／Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｖ／Ｗ、１８Ｆ、１９Ｃ／Ｋ／Ｌ／Ｑ、２０Ａ／Ｄ／Ｍ／Ｎ／Ｔ、２４Ａ、２５Ａ／Ｄ／Ｎ、３６Ｌ、５２Ｄ／Ｈ、５４Ａ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｖ、５５Ａ／Ｄ／Ｈ／Ｓ／Ｙ、５９Ａ／Ｍ／Ｎ、６０Ｓ、６９Ｓ、７６Ｋ／Ｌ、９５Ｎ、９６Ｑ、９７Ｋ、１０２Ｌ／Ｍ、１０７Ｋ、１１０Ｌ、１１３Ｔ、１１８Ｄ、１２０Ｖ、１２９Ａ／Ｈ／Ｎ／Ｙ、１３１Ｍ／Ｎ／Ｐ、１３６Ｍ、１４３Ｎ、１４４Ｎ、１４５Ｃ、１５７Ａ／Ｄ、１５８Ｑ、１５９Ｌ、１６０Ｍ、１６６Ｉ、１７０Ｇ、１７６Ｌ、１７７Ａ／Ｄ／Ｇ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｙ、１７９Ａ／Ｋ、１８２Ａ／Ｄ／Ｙ、１８８Ｍ、１９１Ｅ、２０７Ｌ、２１０Ｅ／Ｇ／Ｑ、２１１Ｒ、２１８Ｓ、２２７Ｍ、２３２Ｆ／Ｗ、２５６Ｙ、２６３Ｑ、２６５Ａ／Ｍ／Ｑ及び２６８Ａから選択される配列番号１の位置に対応する１つ以上の位置に１つ以上の置換を更に含み、変異体のアミノ酸位置は、配列番号１のアミノ酸配列に対応して番号付けされる。
【００５０】
本発明のプロテアーゼは、組成物が軟水で使用される場合でも、リン酸塩を含まない組成物において非常に良好に機能する。
【００５１】
本発明の組成物中のプロテアーゼの好ましい濃度は、組成物１グラム当たり約０．０４〜約５ｍｇ、より好ましくは約０．０５〜約２ｍｇの活性プロテアーゼを含む。
【００５２】
自動食器洗浄組成物
自動食器洗浄組成物は、任意の物理的形態であってよい。自動食器洗浄組成物は、ルース粉末であっても、ゲルであっても、単位用量形態で提示されてもよい。好ましくは、組成物は単位用量形態であり、単位用量形態としては、圧縮錠剤及び水溶性パックが挙げられる。本発明の自動食器洗浄組成物は、好ましくは、単位用量形態で提示され、固体、液体及びゲルの形態を含む任意の物理的形態であり得る。本発明の組成物は、多区画型パックの形態、より具体的には、異なる物理的形態の組成物を有する区画、例えば固体形態の組成物を含む区画と液体形態の組成物を含む別の区画とを含む多区画型パックでの提供に非常によく適している。組成物は、好ましくは、ポリビニルアルコールなどの水溶性フィルムに封入される。厚さ１００μｍ未満、好ましくは２０〜９０μｍのポリビニルアルコールフィルムに包まれた単位用量形態の組成物がとりわけ好ましい。本発明の洗剤組成物は、約８〜約２５グラム、好ましくは約１０〜約２０グラムの重量を有する。この重量範囲は、食器洗浄機のディスペンサーに余裕をもって収まる。この範囲は洗剤としては少ない量に相当するものであるが、洗剤は上記に述べたような効果の全てを提供するように配合されている。
【００５３】
組成物は、好ましくは、リン酸塩を含まない。本明細書において「リン酸塩を含まない」とは、組成物が、組成物の１重量％未満、好ましくは０．１重量％未満のリン酸塩を含むものとして理解される。
【００５４】
本発明の組成物は、好ましくは、リン酸塩を含まず、錯化剤系を含む。
【００５５】
錯化剤系
本発明の目的のために、「錯化剤」とは、カルシウム、マグネシウム、鉛、銅、亜鉛、カドミウム、水銀、マンガン、鉄、アルミニウム及び他のカチオン性多価イオンのような多価イオンと結合して水溶性の錯体を形成することが可能な化合物のことである。錯化剤は、Ｃａ２＋に対する対数安定性定数（［ｌｏｇＫ］）が少なくとも３である。安定性定数、ｌｏｇＫは、温度２５℃でイオン強度０．１の溶液中で測定される。本発明の組成物は、組成物の１０重量％〜５０重量％の錯化剤系を含む。好ましくは、組成物は、クエン酸、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、グルタミン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＧＬＤＡ）、イミノジコハク酸（ＩＤＳ）、カルボキシメチルイヌリン、Ｌ−アスパラギン酸Ｎ，Ｎ−二酢酸四ナトリウム塩（ＡＳＤＡ）及びこれらの混合物からなる群から選択される錯化剤を含む。本発明の目的のために、用語「酸」は、錯化剤を指すとき、酸及びその塩を含む。
【００５６】
好ましい実施形態では、組成物は、本発明物の１５重量％〜４０重量％のＭＧＤＡ、より好ましくはＭＧＤＡの三ナトリウム塩を含む。この高濃度のＭＧＤＡを含む組成物は、硬水の存在下において、また長時間及び／又は高温サイクルにおいても、良好に機能する。
【００５７】
好ましい実施形態では、組成物は、本発明物の１５重量％〜２８重量％のクエン酸、より好ましくはクエン酸ナトリウムを含む。クエン酸を含む組成物は、軟水の存在下において良好に機能する。
【００５８】
好ましい実施形態では、錯化剤系は、クエン酸及びＭＧＤＡを、好ましくは約０．５：１〜約２：１、より好ましくは約０．５：１〜約２．５：１の重量比で含む。
【００５９】
分散剤ポリマー
分散剤ポリマーは、組成物の約０．１〜約２０重量％、好ましくは０．２〜約１５重量％、より好ましくは０．３〜重量％の任意の好適な量で使用され得る。
【００６０】
分散剤ポリマーは、自動食器洗浄プロセスにおいてカルシウム又は炭酸カルシウムを懸濁させることができる。
【００６１】
分散剤ポリマーは、２５℃で、３０ｍｇ／ｇ〜２５０ｍｇ／ｇのＣａ／ｇの分散剤ポリマー、好ましくは３５ｍｇ／ｇ〜２００ｍｇ／ｇのＣａ／ｇの分散剤ポリマー、より好ましくは４０ｍｇ／ｇ〜１５０ｍｇのＣａ／ｇの分散剤ポリマーの範囲内で、カルシウム結合能を有する。ポリマーが本発明の意味において分散剤ポリマーであるかどうかを判定するために、以下の指示に従い、以下のカルシウム結合能の判定を行う。
【００６２】
カルシウム結合能試験方法
本明細書で言及されるカルシウム結合能は、Ｍｅｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＳｅｖｅｎＭｕｌｔｉ（商標）ベンチトップメータ及びＰｅｒｆｅｃｔＩＯＮ（商標）櫛形Ｃａ組合せ電極などのｐＨ／イオンメータを用いて、滴定によって決定される。結合能を測定するために、ビーカー又はターゴトメータポットに適した加熱撹拌装置を２５℃に設定し、メータ付イオン電極を製造元の指示に従って較正する。電極較正の標準濃度は試験濃度をブラケティングし、２５℃で測定しなければならない。脱イオン水１Ｌに３．６７ｇのＣａＣｌ２−２Ｈ２Ｏを添加することにより、１０００ｍｇ／ｇのＣａの原液を調製し、次いで希釈を行ってそれぞれ１００ｍｇ／ｇ、１０ｍｇ／ｇ、及び１ｍｇ／ｇ濃度のカルシウムを含む、それぞれ１００ｍＬの３つの作用液を調製する。１００ｍｇ  Ｃａ／ｇの作用液を、２５℃で実施される滴定中の初期濃度として使用する。各作用液のイオン強度は、２．５ｇ／ＬのＮａＣｌをそれぞれ添加することによって調節する。１００ｍｇ  Ｃａ／ｇの作用液１００ｍＬを加熱し、２５℃に達するまで撹拌する。カルシウムイオン濃度の初期測定は、イオン電極を使用して溶液が２５℃に達したときに行う。次いで、試験ポリマーをカルシウム作用液に徐々に加え（０．０１ｇ／Ｌ間隔で）、各増分の添加後に５分間攪拌した後に測定する。滴定は、溶液が１ｍｇ／ｇのカルシウムに達したら停止する。残りの２つのカルシウム濃度の作用液を用いて、滴定手順を繰り返す。試験ポリマーの結合能は、添加された試験ポリマーのグラム／Ｌに対する、測定されたカルシウム濃度の直線勾配として計算される。
【００６３】
分散剤ポリマーは、好ましくは、６を超えるｐＨを有する水溶液中に溶解した場合に、負の正味電荷を有する。
【００６４】
分散剤ポリマーは、より低いｐＨで負電荷を増加させ、硬水中でのその分散特性を改善するために、スルホン化カルボン酸エステル又はアミドもまた有し得る。好ましい分散剤ポリマーは、スルホン化／カルボキシル化ポリマー、すなわち、スルホン化モノマー及びカルボキシル化モノマーの両方を含むポリマーである。
【００６５】
好ましくは、分散剤ポリマーは、ポリカルボン酸のスルホン化誘導体であり、２、３、４又はそれ以上の異なるモノマー単位を含むことができる。好ましいコポリマーは、次のものを含む：
一般式（ＩＩＩ）を有するカルボン酸モノマーから誘導された少なくとも１つの構造単位：
【００６６】
【化１】
2021527413.tif 000002
式中、Ｒ１〜Ｒ３は、水素、メチル、２〜１２個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖飽和アルキル基、２〜１２個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のモノ又はポリ不飽和アルケニル基、−ＮＨ２若しくは−ＯＨ、又は−ＣＯＯＨ、又はＣＯＯＲ４で置換された前述のアルキル又はアルケニル基から独立して選択され、式中、Ｒ４は、水素、アルカリ金属又は２〜１２個の炭素を有する直鎖若しくは分枝鎖の飽和若しくは不飽和のアルキル若しくはアルケニル基であり、
好ましいカルボン酸モノマーは、アクリル酸、マレイン酸、無水マレイン酸、イタコン酸、シトラコン酸、２−フェニルアクリル酸、桂皮酸、クロトン酸、フマル酸、メタクリル酸、２−エチルアクリル酸、メチレンマロン酸又はソルビン酸のうちの１つ以上を含む。アクリル及びメタクリル酸がより好ましい。
【００６７】
任意に、一般式（ＩＶ）を有する少なくとも１つの非イオン性モノマーから誘導される１つ以上の構造単位：
【００６８】
【化２】
2021527413.tif 000003
【００６９】
式中、Ｒ５〜Ｒ７は、水素、メチル、フェニル又は１〜６個の炭素原子を含むヒドロキシアルキル基から独立して選択され、環状構造の一部であってもよく、Ｘは、−ＣＨ２−、−ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−又は−ＣＯＮＲ８−から選択される、任意に存在するスペーサ基であり、Ｒ８は、直鎖若しくは分枝鎖の、１〜２２個の炭素原子を有する飽和アルキル基又は６〜２２個の炭素原子を有する不飽和の好ましくは芳香族の基から選択される。
【００７０】
好ましい非イオン性モノマーは、ブテン、イソブテン、ペンテン、２−メチルペント−１−エン、３−メチルペント−１−エン、２，４，４−トリメチルペント−１−エン、２，４，４−トリメチルペント−２−エン、シクロペンテン、メチルシクロペンテン、２−メチル−３−メチル−シクロペンテン、ヘキセン、２，３−ジメチルヘキサ−１−エン、２，４−ジメチルヘキサ−１−エン、２，５−ジメチルヘキサ−１−エン、３，５−ジメチルヘキサ−１−エン、４，４−ジメチルヘキサ−１−エン、シクロヘキセン、メチルシクロヘキセン、シクロヘプテン、１０個以上の炭素原子を有する、デカ−１−エン、ドデカ−１−エン、ヘキサデカ−１−エン、オクタデカ−１−エン及びドコサ−１−エンなどのα−オレフィンのうちの１つ以上を含み、好ましい芳香族モノマーは、スチレン、α−メチルスチレン、３−メチルスチレン、４−ドデシルスチレン、２−エチル−４−ベジルスチレン（bezylstyrene）、４−シクロヘキシルスチレン、４−プロピルスチロール、１−ビニルナフタレン、２−ビニルナフタレンであり、好ましいカルボン酸エステルモノマーは、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メタ）アクリレート、ペンチル（メタ）アクリレート、ヘキシル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、オクチル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート及びベヘニル（メタ）アクリレートであり、好ましいアミドは、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−ｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−２−エチルヘキシルアクリルアミド、Ｎ−オクチルアクリルアミド、Ｎ−ラウリルアクリルアミド、Ｎ−ステアリルアクリルアミド、Ｎ−ベヘニルアクリルアミドである。
【００７１】
並びに一般式（Ｖ）及び（ＶＩ）を有する少なくとも１つのスルホン酸モノマーから誘導される少なくとも１つの構造単位：
【００７２】
【化３】
2021527413.tif 000004
式中、Ｒ７は、少なくとも１つのｓｐ２結合を含む基であり、Ａは、Ｏ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、アミド又はエステル結合であり、Ｂは、単環式又は多環式芳香族基又は脂肪族基であり、各ｔは、独立して０又は１であり、Ｍ＋は、カチオンである。一態様では、Ｒ７は、Ｃ２〜Ｃ６アルケンである。別の態様では、Ｒ７は、エテン、ブテン又はプロペンである。
【００７３】
好ましいスルホン化モノマーは、１−アクリルアミド−１−プロパンスルホン酸、２−アクリルアミド−２−プロパンスルホン酸、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸、２−メタクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸、３−メタクリルアミド−２−ヒドロキシ−プロパンスルホン酸、アリルスルホン酸、メタリルスルホン酸、アリルオキシベンゼンスルホン酸、メタリルオキシベンゼンスルホン酸、２−ヒドロキシ−３−（２−プロペニルオキシ）プロパンスルホン酸、２−メチル−２−プロペン−１−スルホン酸、スチレンスルホン酸、ビニルスルホン酸、３−スルホプロピル、３−スルホ−プロピルメタクリレート、スルホメタクリルアミド及び上述の酸又はそれらの水溶性塩の混合物のうちの１つ以上を含む。
【００７４】
好ましくは、このポリマーは、以下の濃度の各種モノマー、すなわち、ポリマーの約４０〜約９０重量％、好ましくは約６０〜約９０重量％の１種以上のカルボン酸モノマー、ポリマーの約５〜約５０重量％、好ましくは約１０〜約４０重量％の１種以上のスルホン酸モノマー、及び任意にポリマーの約１重量％〜約３０重量％、好ましくは約２〜約２０重量％の１種以上の非イオン性モノマーを含む。特に好ましいポリマーは、ポリマーの約７０重量％〜約８０重量％の少なくとも１種のカルボン酸モノマー及びポリマーの約２０重量％〜約３０重量％の少なくとも１種のスルホン酸モノマーを含む。
【００７５】
ポリマー中、カルボン酸基又はスルホン酸基の全て又はいくつかが中和形態で存在していてよく、すなわちいくつか又は全ての酸性基中のカルボン酸基及び／又はスルホン酸基の酸性水素原子が、金属イオン、好ましくはアルカリ金属イオン、特にナトリウムイオンと置き換えられ得る。
【００７６】
カルボン酸は、好ましくは（メタ）アクリル酸である。スルホン酸モノマーは、好ましくは２−アクリルアミド−２−プロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）である。
【００７７】
好ましい市販のポリマーとしては、Ａｌｃｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌにより供給されるＡｌｃｏｓｐｅｒｓｅ  ２４０、Ａｑｕａｔｒｅａｔ  ＡＲ５４０、及びＡｑｕａｔｒｅａｔ  ＭＰＳ、Ｒｏｈｍ  ＆  Ｈａａｓによって供給されるＡｃｕｍｅｒ  ３１００、Ａｃｕｍｅｒ  ２０００、Ａｃｕｓｏｌ  ５８７Ｇ及びＡｃｕｓｏｌ  ５８８Ｇ、ＢＦ  Ｇｏｏｄｒｉｃｈによって供給されるＧｏｏｄｒｉｃｈ  Ｋ−７９８、Ｋ−７７５及びＫ−７９７並びにＩＳＰ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．によって供給されるＡＣＰ１０４２が挙げられる。特に好ましいポリマーは、Ｒｏｈｍ＆Ｈａａｓによって供給されるＡｃｕｓｏｌ  ５８７Ｇ及びＡｃｕｓｏｌ  ５８８Ｇである。
【００７８】
適切な分散剤ポリマーには、低分子量のアニオン性カルボン酸ポリマーが含まれる。それらは、約２００，０００ｇ／ｍｏｌ以下、又は約７５，０００ｇ／ｍｏｌ以下、又は約５０，０００ｇ／ｍｏｌ以下又は約３，０００ｇ／ｍｏｌ〜約５０，０００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは約５，０００ｇ／ｍｏｌ〜約４５，０００ｇ／ｍｏｌの重量平均分子量を有するホモポリマー又はコポリマーであり得る。分散剤ポリマーは、１，０００〜２０，０００、特に２，０００〜１０，０００及び特に好ましくは３，０００〜５，０００の平均分子量を有するポリアクリレートの低分子量ホモポリマーであってもよい。
【００７９】
分散剤ポリマーは、７０，０００未満の分子量を有する、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマー、アクリル酸及び／又はメタクリル酸とマレイン酸のコポリマー並びにアクリル酸及び／又はメタクリル酸とフマル酸のコポリマーであってもよい。それらの分子量は、２，０００〜８０，０００、より好ましくは２０，０００〜５０，０００、特に３０，０００〜４０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲であり、（メタ）アクリレート対マレエート又はフマレートセグメントの比は３０：１〜１：２の範囲である。
【００８０】
分散剤ポリマーは、３，０００〜１００，０００、あるいは４，０００〜２０，０００の分子量を有するアクリルアミドとアクリレートとのコポリマーであってもよく、分散剤ポリマーの５０重量％未満、あるいは２０重量％未満のアクリルアミド含有量も使用され得る。あるいは、そのような分散剤ポリマーは、４，０００〜２０，０００の分子量及びポリマーの０重量％〜１５％のアクリルアミド含有量を有してもよい。
【００８１】
本明細書に好適な分散剤ポリマーには、イタコン酸ホモポリマー及びコポリマーも含まれる。
【００８２】
あるいは、分散剤ポリマーは、アルコキシル化ポリアルキレンイミン、アルコキシル化ポリカルボキシレート、ポリエチレングリコール、スチレンコポリマー、セルロースサルフェートエステル、カルボキシル化ポリサッカライド、両親媒性グラフトコポリマー及びそれらの混合物からなる群から選択され得る。
【００８３】
漂白系
本発明の組成物は、高濃度の漂白剤、好ましくは過炭酸塩を、漂白活性化剤又は漂白触媒又はその両方と組み合わせて含む、漂白系を含む。好ましくは、漂白活性化剤はＴＡＥＤであり、漂白触媒はマンガン漂白触媒である。
【００８４】
漂白剤
本発明の組成物は、好ましくは、組成物の約１０〜約２０重量％、より好ましくは約１２〜約１８重量％の漂白剤、好ましくは過炭酸塩を含む。
【００８５】
無機及び有機漂白剤が、本明細書における使用に好適である。無機漂白剤には、過ホウ酸塩、過炭酸塩、過リン酸塩、過硫酸塩及び過ケイ酸塩などの過水和塩が挙げられる。無機過水和塩は、通常、アルカリ金属塩である。無機過水和塩は、追加の保護なしの結晶性固体として含まれ得る。あるいは、塩はコーティングされていてもよい。好適なコーティングには、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム及びこれらの混合物が挙げられる。当該コーティングは、表面に塗布される混合物として塗布されるか、又は順次積層して塗布され得る。
【００８６】
アルカリ金属過炭酸塩、特に過炭酸ナトリウムは、本明細書における使用に好ましい漂白剤である。過炭酸塩は、最も好ましくは、製品内安定性を提供するコーティングされた形態で製品に組み込まれる。
【００８７】
過酸化モノ過硫酸カリウムは、本明細書で有用な別の無機過水和塩である。
【００８８】
典型的な有機漂白剤は、有機ペルオキシ酸、特にドデカンジペルオキシ酸、テトラデカンジペルオキシ酸及びヘキサデカンジペルオキシ酸である。モノ及びジペルアゼライン酸、モノ及びジペルブラシル酸も、本明細書において好適である。ジアシル及びテトラアシル過酸化物、例えば過酸化ジベンゾイル及び過酸化ジラウロイルは、本発明の関連において使用可能な他の有機過酸化物である。
【００８９】
更なる典型的な有機漂白剤としては、ペルオキシ酸が挙げられ、具体例は、アルキルペルオキシ酸及びアリールペルオキシ酸である。好ましい代表例は、（ａ）ペルオキシ安息香酸及びその環置換の誘導体、例えばアルキルペルオキシ安息香酸の他、ペルオキシ−α−ナフトエ酸及びモノペルフタル酸マグネシウム、（ｂ）脂肪族又は置換脂肪族ペルオキシ酸、例えばペルオキシラウリン酸、ペルオキシステアリン酸、ε−フタルイミドペルオキシカプロン酸［フタロイミノペルオキシヘキサン酸（ＰＡＰ）］、ｏ−カルボキシベンズアミドペルオキシカプロン酸、Ｎ−ノネニルアミドペルアジピン酸及びＮ−ノネニルアミドペルスクシネート、並びに（ｃ）脂肪族及び芳香脂肪族ペルオキシジカルボン酸、例えば１，１２−ジペルオキシカルボン酸、１，９−ジペルオキシアゼライン酸、ジペルオキシセバシン酸、ジペルオキシブラシル酸、ジペルオキシフタル酸、２−デシルジペルオキシブタン−１，４−二酸、Ｎ，Ｎ−テレフタロイルジ（６−アミノペルカプロン酸）である。
【００９０】
漂白活性化剤
漂白活性化剤は、一般的に、６０℃以下の温度での洗浄中の漂白活性を増強する有機過酸前駆体である。本明細書での使用に好適な漂白活性化剤には、過加水分解条件下で、好ましくは１〜１２個の炭素原子、特に２〜１０個の炭素原子を有する脂肪族ペルオキソカルボン酸（peroxoycarboxylic acid）、及び／又は任意に置換された過安息香酸を与える化合物が含まれる。好適な物質は、炭素原子の数が指定されているＯ−アシル基及び／若しくはＮ−アシル基並び／又は任意に置換されたベンゾイル基を有する。ポリアシル化アルキレンジアミン、特にテトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）、アシル化トリアジン誘導体、特に１，５−ジアセチル−２，４−ジオキソヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジン（ＤＡＤＨＴ）、アシル化グリコールウリル、特にテトラアセチルグリコールウリル（ＴＡＧＵ）、Ｎ−アシルイミド、特にＮ−ノナノイルスクシンイミド（ＮＯＳＩ）、アシル化フェノールスルホネート、特にｎ−ノナノイル−又はイソノナノイルオキシベンゼンスルホネート（ｎ−又はイソ−ＮＯＢＳ）、デカノイルオキシ安息香酸（ＤＯＢＡ）、無水カルボン酸、特に無水フタル酸、アシル化多価アルコール、特にトリアセチン、二酢酸エチレングリコール及び２，５−ジアセトキシ−２，５−ジヒドロフラン、並びにクエン酸トリエチルアセチル（ＴＥＡＣ）も好まれる。存在する場合、本発明の組成物は、組成物の０．０１〜５、好ましくは０．２〜２重量％の漂白活性化剤、好ましくはＴＡＥＤを含む。
【００９１】
漂白触媒
本明細書の組成物は、好ましくは、漂白触媒、好ましくは金属含有漂白触媒を含有する。より好ましくは、金属含有漂白触媒は、遷移金属含有漂白触媒、特にマンガン又はコバルト含有漂白触媒である。
【００９２】
本明細書での使用に好ましい漂白触媒としては、マンガントリアザシクロノナン及び関連する錯体、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｍｎ及びＦｅビスピリジルアミン及び関連する錯体、並びにペンタミン酢酸コバルト（ＩＩＩ）及び関連する錯体が挙げられる。本明細書での使用に特に好ましい漂白触媒は、１，４，７−トリメチル−１，４，７−トリアザシクロノナン（Ｍｅ−ＴＡＣＮ）及び１，２，４，７−テトラメチル−１，４，７−トリアザシクロノナン（Ｍｅ／Ｍｅ−ＴＡＣＮ）である。
【００９３】
好ましくは、本発明の組成物は、組成物の０．００１〜０．５重量％、より好ましくは０．００２〜０．０５重量％、より好ましくは０．００５〜０．０７５重量％の漂白触媒を含む。好ましくは、漂白触媒は、マンガン漂白触媒である。
【００９４】
無機ビルダー
本発明の組成物は、好ましくは、無機ビルダーを含む。好適な無機ビルダーは、炭酸塩、ケイ酸塩及びこれらの混合物からなる群から選択される。炭酸ナトリウムが、本明細書での使用に特に好ましい。好ましくは、本発明の組成物は、組成物の５〜６０重量％、より好ましくは１０〜５０重量％、特に１５〜４５重量％の炭酸ナトリウムを含む。
【００９５】
界面活性剤
本明細書での使用に好適な界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤が挙げられ、好ましくは、組成物は、いかなる他の界面活性剤も含まない。従来的には、表面修飾目的、特に非イオン性界面活性剤は、膜形成及び斑点形成を回避し、光沢を改善するためのシート化を目的として、自動食器洗浄において使用されてきた。非イオン性界面活性剤は、汚れの再堆積の防止にも寄与することができることが判明している。
【００９６】
好ましくは、本発明の組成物は、非イオン性界面活性剤又は非イオン性界面活性剤系を含み、より好ましくは、非イオン性界面活性剤又は非イオン性界面活性剤系は、蒸留水中１％の濃度で測定して、４０〜７０℃、好ましくは４５〜６５℃の転相温度を有する。「非イオン性界面活性剤系」とは、本明細書において、２つ以上の非イオン性界面活性剤の混合物を意味する。非イオン性界面活性剤系が、本明細書での使用に好適である。これらは、単一の非イオン性界面活性剤よりも、製品中で、改善された洗浄及び仕上がり特性並びに良好な安定性を有すると考えられる。
【００９７】
転相温度とは、それよりも低い温度では界面活性剤又はその混合物が油膨張ミセルとして水性相中に優先的に分配され、それよりも高い温度では水膨張逆ミセルとして油性相に優先的に分配される温度である。転相温度は、混濁が生じる温度を識別することによって視覚的に判断することができる。
【００９８】
非イオン性界面活性剤又は系の転相温度は、以下のように判断することができる：蒸留水中、溶液の１重量％の対応する界面活性剤又は混合物を含有する溶液を調製する。溶液を軽く撹拌した後、転相温度を分析して、プロセスが化学平衡で生じることを確実にする。転相温度は、７５ｍｍ密封ガラス試験管中に溶液を浸漬することによって熱安定性の浴槽内で測定する。漏れがないことを確実にするために、転相温度の測定の前後に試験管を秤量しておく。温度が事前予測した転相温度より数度下に達するまで、温度を１℃／分未満の速度で徐々に増加させる。転相温度は、濁りの最初の兆候があった時点で視覚的に判断される。
【００９９】
好適な非イオン性界面活性剤としては、ｉ）６〜２０個の炭素原子を有するモノヒドロキシアルカノール又はアルキルフェノール（alkyphenol）と、アルコール又はアルキルフェノール１モル当たり、好ましくは少なくとも１２モル、特に好ましくは少なくとも１６モル、更により好ましくは少なくとも２０モルのエチレンオキシドとの反応によって調製される、エトキシル化非イオン性界面活性剤、ｉｉ）６〜２０個の炭素原子及び少なくとも１つのエトキシ基及びプロポキシ基を有するアルコールアルコキシル化界面活性剤が挙げられる。界面活性剤ｉ）とｉｉ）との混合物が、本明細書での使用に好ましい。
【０１００】
別の好適な非イオン性界面活性剤は、次式で表されるエポキシで末端保護されたポリ（オキシアルキル化）アルコールであり、
Ｒ１Ｏ［ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ］ｘ［ＣＨ２ＣＨ２Ｏ］ｙ［ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）Ｒ２］  （Ｉ）
式中、Ｒ１は、４〜１８個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖の脂肪族炭化水素基であり、Ｒ２は、２〜２６個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖の脂肪族炭化水素基であり、ｘは、０．５〜１．５、より好ましくは約１の平均値を有する整数であり、ｙは、少なくとも１５、より好ましくは少なくとも２０の値を有する整数である。
【０１０１】
好ましくは、式Ｉの界面活性剤は、末端エポキシド単位［ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）Ｒ２］中に少なくとも約１０個の炭素原子を有する。本発明によれば、式Ｉの好適な界面活性剤は、例えば、Ｏｌｉｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによる１９９４年１０月１３日に公開された国際公開第９４／２２８００号に記載の、Ｏｌｉｎ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＰＯＬＹ−ＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）ＳＬＦ−１８Ｂ非イオン性界面活性剤である。
【０１０２】
酵素
他のプロテアーゼ
本発明の組成物は、本発明のプロテアーゼに加えてプロテアーゼを含むことができる。２つ以上のプロテアーゼの混合物は、特に再付着防止剤及び／又はスルホン化ポリマーと共に使用されるとき、より広い温度、サイクル持続時間及び／又は基質範囲にわたって洗浄の増強に貢献することができ、優れた光沢効果を提供することができる。
【０１０３】
本発明の変異型プロテアーゼと組み合わせての使用に好適なプロテアーゼとしては、メタロプロテアーゼ、及び中性又はアルカリ性セリンプロテアーゼを含むセリンプロテアーゼ、例えば、サブチリシン（ＥＣ３．４．２１．６２）が挙げられる。好適なプロテアーゼとしては、動物、植物又は微生物起源のものが挙げられる。一態様では、このような好適なプロテアーゼは、微生物起源のものであってもよい。好適なプロテアーゼとしては、前述の好適なプロテアーゼの化学的又は遺伝的に修飾された突然変異体が挙げられる。一態様では、好適なプロテアーゼは、アルカリ性微生物プロテアーゼ又は／及びトリプシン型プロテアーゼなどのセリンプロテアーゼであってよい。好適な中性又はアルカリ性プロテアーゼの例としては、以下が挙げられる。
（ａ）サブチリシン（ＥＣ  ３．４．２１．６２）、特に国際公開第２００４０６７７３７号、同第２０１５０９１９８９号、同第２０１５０９１９９０号、同第２０１５０２４７３９号、同第２０１５１４３３６０号、米国特許第６，３１２，９３６（Ｂ１）号、同第５，６７９，６３０号、同第４，７６０，０２５号、独国特許公開第１０２００６０２２２１６（Ａ１）号、同第１０２００６０２２２２４（Ａ１）号、国際公開第２０１５０８９４４７号、同第２０１５０８９４４１号、同第２０１６０６６７５６号、同第２０１６０６６７５７号、同第２０１６０６９５５７号、同第２０１６０６９５６３号、同第２０１６０６９５６９号に記載されている、バチルス種、Ｂ．レンタス、Ｂ．アルカロフィラス、Ｂ．ズブチリス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．プミルス、Ｂ．ギブソニイ及びＢ．アキバイなどのバチルス由来のもの。
（ｂ）国際公開第８９／０６２７０号に記載されているフサリウム属プロテアーゼ、並びに同第０５／０５２１６１号及び同第０５／０５２１４６号に記載されているセルロモナス属に由来するキモトリプシンプロテアーゼを含むトリプシン（例えば、ブタ又はウシ起源）などのトリプシン型又はキモトリプシン型プロテアーゼ。
（ｃ）メタロプロテアーゼ、特に国際公開第０７／０４４９９３（Ａ２）号に記載されているバチルス・アミロリケファシエンス由来のもの、国際公開第２０１４１９４０３２号、同第２０１４１９４０５４号及び同第２０１４１９４１１７号に記載されているバチルス、ブレビバチルス、サーモアクチノミセス、ゲオバチルス、パエニバチルス、リシニバチルス又はスプレプトミセス種由来のもの、国際公開第２０１５１９３４８８号に記載されているクリベラ・アルミノサ由来のもの並びに国際公開第２０１６０７５０７８号に記載されているストレプトミセス及びリソバクター由来のもの。
（ｄ）国際公開第９２／１７５７７号（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）に記載されているバチルス種ＴＹ１４５、ＮＣＩＭＢ  ４０３３９由来のサブチラーゼに対して少なくとも９０％の同一性を有するプロテアーゼ、同第２０１５０２４７３９号及び同第２０１６０６６７５７号に記載されているこのバチルス種ＴＹ１４５サブチラーゼの変異体を含む。
【０１０４】
本発明の洗剤に特に好ましい追加のプロテアーゼは、バチルス・レンタス由来の野生型酵素と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、更により好ましくは少なくとも９９％、特に１００％の同一性を示すポリペプチドであり、これは、参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第００／３７６２７号に示されるようなＢＰＮ番号付け方式及びアミノ酸略記を使用して、以下の位置の１つ以上、好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上に突然変異を有する：Ｖ６８Ａ、Ｎ７６Ｄ、Ｎ８７Ｓ、Ｓ９９Ｄ、Ｓ９９ＳＤ、Ｓ９９Ａ、Ｓ１０１Ｇ、Ｓ１０１Ｍ、Ｓ１０３Ａ、Ｖ１０４Ｎ／Ｉ、Ｇ１１８Ｖ、Ｇ１１８Ｒ、Ｓ１２８Ｌ、Ｐ１２９Ｑ、Ｓ１３０Ａ、Ｙ１６７Ａ、Ｒ１７０Ｓ、Ａ１９４Ｐ、Ｖ２０５Ｉ、Ｑ２０６Ｌ／Ｄ／Ｅ、Ｙ２０９Ｗ及び／又はＭ２２２Ｓ。
【０１０５】
最も好ましくは、追加のプロテアーゼは、ＰＢ９２野生型（国際公開第０８／０１０９２５号の配列番号２）又はサブチリシン３０９野生型（Ｎ８７Ｓの自然変異を含む以外はＰＢ９２主鎖による配列）のいずれかに対して以下の突然変異（ＢＰＮ番号付け方式）を含むプロテアーゼの群から選択される。
【０１０６】
（ｉ）Ｇ１１８Ｖ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ
（ｉｉ）Ｓ１０１Ｍ＋Ｇ１１８Ｖ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ
（ｉｉｉ）Ｎ７６Ｄ＋Ｎ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ＋Ｓ１８８Ｄ＋Ｎ２４８Ｒ
（ｉｖ）Ｎ７６Ｄ＋Ｎ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ＋Ｓ１８８Ｄ＋Ｖ２４４Ｒ
（ｖ）Ｎ７６Ｄ＋Ｎ８７Ｒ＋Ｇ１１８Ｒ＋Ｓ１２８Ｌ＋Ｐ１２９Ｑ＋Ｓ１３０Ａ
（ｖｉ）Ｖ６８Ａ＋Ｎ８７Ｓ＋Ｓ１０１Ｇ＋Ｖ１０４Ｎ
（ｖｉｉ）Ｓ９９ＡＤ
【０１０７】
好適な市販入手可能な追加のプロテアーゼ酵素としては、商品名Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）、Ｐｒｉｍａｓｅ（登録商標）、Ｄｕｒａｚｙｍ（登録商標）、Ｐｏｌａｒｚｙｍｅ（登録商標）、Ｋａｎｎａｓｅ（登録商標）、Ｌｉｑｕａｎａｓｅ（登録商標）、Ｌｉｑｕａｓｅ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）、Ｏｖｏｚｙｍｅ（登録商標）、Ｎｅｕｔｒａｓｅ（登録商標）、Ｅｖｅｒｌａｓｅ（登録商標）、Ｃｏｒｏｎａｓｅ（登録商標）、Ｂｌａｚｅ（登録商標）、Ｂｌａｚｅ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）及びＥｓｐｅｒａｓｅ（登録商標）（Ｄｅｎｍａｒｋ）としてＮｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ（Ｄｅｎｍａｒｋ）によって販売されているもの；商品名Ｍａｘａｔａｓｅ（登録商標）、Ｍａｘａｃａｌ（登録商標）、Ｍａｘａｐｅｍ（登録商標）、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ  Ｏｘ（登録商標）、ＦＮ３（登録商標）、ＦＮ４（登録商標）、Ｅｘｃｅｌｌａｓｅ（登録商標）、Ｕｌｔｉｍａｓｅ（登録商標）及びＰｕｒａｆｅｃｔ  ＯＸＰ（登録商標）としてＤｕｐｏｎｔによって販売されているもの；商品名Ｏｐｔｉｃｌｅａｎ（登録商標）及びＯｐｔｉｍａｓｅ（登録商標）としてＳｏｌｖａｙ  Ｅｎｚｙｍｅｓによって販売されているもの；並びにＨｅｎｋｅｌ／Ｋｅｍｉｒａから入手可能なもの、すなわち、ＢＬＡＰ（配列は米国特許第５，３５２，６０４号の図２９に示され、Ｓ９９Ｄ＋Ｓ１０１Ｒ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ１０４Ｉ＋Ｇ１５９Ｓの突然変異を有する、本明細書において以降ＢＬＡＰと称する）、ＢＬＡＰ  Ｒ（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｖ１９９Ｍ＋Ｖ２０５Ｉ＋Ｌ２１７Ｄを有するＢＬＡＰ）、ＢＬＡＰ  Ｘ（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｖ２０５Ｉを有するＢＬＡＰ）及びＢＬＡＰ  Ｆ４９（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ａ１９４Ｐ＋Ｖ１９９Ｍ＋Ｖ２０５Ｉ＋Ｌ２１７Ｄを有するＢＬＡＰ）；並びに花王製のＫＡＰ（突然変異Ａ２３０Ｖ＋Ｓ２５６Ｇ＋Ｓ２５９Ｎを有するバチルス・アルカロフィラスのサブチリシン）が挙げられる。
【０１０８】
Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）、Ｂｌａｚｅ（登録商標）、Ｕｌｔｉｍａｓｅ（登録商標）、Ｅｖｅｒｌａｓｅ（登録商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）、Ｅｘｃｅｌｌａｓｅ（登録商標）、Ｂｌａｚｅ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）、ＢＬＡＰ及びＢＬＡＰ変異体からなる群から選択される市販のプロテアーゼは、本発明の変異型プロテアーゼと組み合わせて本明細書に用いるのに特に好ましい。
【０１０９】
本発明の製品中のプロテアーゼの好ましい濃度としては、組成物１ｇ当たり約０．０５〜約１０ｍｇ、より好ましくは約０．５〜約７ｍｇ、特に約１〜約６ｍｇの活性プロテアーゼが挙げられる。
【０１１０】
アミラーゼ
好ましくは、本発明の組成物は、アミラーゼを含み得る。好適なα−アミラーゼとしては、細菌又は真菌起源のものが挙げられる。化学的又は遺伝的に修飾された突然変異体（変異体）が含まれる。好ましいアルカリ性α−アミラーゼは、バチルスの菌種、例えば、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ステロサーモフィラス、バチルス・ズブチリス又は他のバチルス種、例えば、バチルス種ＮＣＢＩ１２２８９、ＮＣＢＩ１２５１２、ＮＣＢＩ１２５１３、ＤＳＭ９３７５（米国特許第７，１５３，８１８号）、ＤＳＭ１２３６８、ＤＳＭＺ番号１２６４９、ＫＳＭ  ＡＰ１３７８（国際公開第９７／００３２４号）、ＫＳＭ  Ｋ３６又はＫＳＭ  Ｋ３８（欧州特許第１，０２２，３３４号）に由来する。好ましいアミラーゼとしては、以下が挙げられる。
（ａ）国際公開第９６／２３８７３号、同第００／６００６０号、同第０６／００２６４３号及び同第２０１７／１９２６５７号に記載されている変異体、特に、配列番号１１に対して以下の位置に１つ以上の置換を有する変異体：
２６、３０、３３、８２、３７、１０６、１１８、１２８、１３３、１４９、１５０、１６０、１７８、１８２、１８６、１９３、２０２、２１４、２３１、２４６、２５６、２５７、２５８、２６９、２７０、２７２、２８３、２９５、２９６、２９８、２９９、３０３、３０４、３０５、３１１、３１４、３１５、３１８、３１９、３３９、３４５、３６１、３７８、３８３、４１９、４２１、４３７、４４１、４４４、４４５、４４６、４４７、４５０、４６１、４７１、４８２、４８４、好ましくは、Ｄ１８３＊及びＧ１８４＊の欠失も含む変異体。
（ｂ）国際公開第０６／００２６４３号の配列番号４、バチルス属ＳＰ７２２由来の野生型酵素と少なくとも９０％の同一性を示す変異体、特に１８３及び１８４位に欠失を有する変異体並びに参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第００／６００６０号、同第２０１１／１００４１０号及び同第２０１３／００３６５９号に記載されている変異体。
（ｃ）バチルス種７０７（米国特許第６，０９３，５６２号の配列番号７）由来の野生型酵素と少なくとも９５％の同一性を示す変異体、特に以下の突然変異：Ｍ２０２、Ｍ２０８、Ｓ２５５、Ｒ１７２及び／又はＭ２６１のうちの１つ以上を含むもの。好ましくは、当該アミラーゼは、Ｍ２０２Ｌ、Ｍ２０２Ｖ、Ｍ２０２Ｓ、Ｍ２０２Ｔ、Ｍ２０２Ｉ、Ｍ２０２Ｑ、Ｍ２０２Ｗ、Ｓ２５５Ｎ及び／又はＲ１７２Ｑのうちの１つ以上を含む。Ｍ２０２Ｌ又はＭ２０２Ｔ突然変異を含むものが、特に好ましい。
（ｄ）国際公開第０９／１４９１３０号に記載されている変異体、好ましくは同第０９／１４９１３０号の配列番号１又は配列番号２、ゲオバチルス・ステロファーモフィラス（Geobacillus Stearophermophilus）由来の野生型酵素又はその切断版と少なくとも９０％の同一性を示すもの。
（ｅ）国際公開第２０１６０９１６８８号の配列番号１と少なくとも８９％の同一性を示す変異体、特にＨ１８３＋Ｇ１８４位での欠失並びに４０５、４２１、４２２及び／又は４２８位に１つ以上の突然変異を含むもの。
（ｆ）パエニバチルス・カードラノリティカスＹＫ９由来の「ＰｃｕＡｍｙｌ  α−アミラーゼ」（国際公開第２０１４０９９５２３号の配列番号３）と少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を示す変異体。
（ｇ）サイトファーガ種由来の「ＣｓｐＡｍｙ２アミラーゼ」（国際公開第２０１４１６４７７７号の配列番号１）と少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を示す変異体。
（ｈ）バチルス・ズブチリス由来のＡｍｙＥ（国際公開第２００９１４９２７１号の配列番号１）と少なくとも８５％の同一性を示す変異体。
（ｉ）受託番号ＡＢ０５１１０２を有するバチルス種ＫＳＭ−Ｋ３８由来の野生型アミラーゼと少なくとも９０％の同一性を示す変異体。
（ｊ）バチルス種由来のＡＡＩ１０の成熟アミノ酸配列（国際公開第２０１６１８０７４８号の配列番号７）と少なくとも８０％の同一性を示す変異体
（ｋ）アリシクロバチルス種アミラーゼの成熟アミノ酸配列（国際公開第２０１６１８０７４８号の配列番号８）と少なくとも８０％の同一性を示す変異体
【０１１１】
好ましくは、アミラーゼは、遺伝子操作を受けた酵素であり、漂白酸化を起こしやすいアミノ酸のうちの１つ以上が、より酸化しにくいアミノ酸で置換されている。特に、メチオニン残基は、任意の他のアミノ酸で置換されることが好ましい。特に、最も酸化しやすいメチオニンが置換されることが好ましい。好ましくは、配列番号２の２０２に相当する位置のメチオニンが置換される。好ましくは、この位置のメチオニンは、スレオニン又はロイシン、好ましくはロイシンで置換される。
【０１１２】
好適な市販のα−アミラーゼとしては、ＤＵＲＡＭＹＬ（登録商標）、ＬＩＱＵＥＺＹＭＥ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ  ＵＬＴＲＡ（登録商標）、ＮＡＴＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＳＵＰＲＡＭＹＬ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ  ＰＬＵＳ（登録商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）、ＡＴＬＡＮＴＩＣ（登録商標）、ＩＮＴＥＮＳＡ（登録商標）及びＢＡＮ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ））、ＫＥＭＺＹＭ（登録商標）ＡＴ  ９０００（Ｂｉｏｚｙｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｔｒａｄｉｎｇ  ＧｍｂＨＷｅｈｌｉｓｔｒａｓｓｅ  ２７ｂ  Ａ−１２００  Ｗｉｅｎ  Ａｕｓｔｒｉａ）、ＲＡＰＩＤＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＲＡＳＴＡＲ（登録商標）、ＥＮＺＹＳＩＺＥ（登録商標）、ＯＰＴＩＳＩＺＥ  ＨＴ  ＰＬＵＳ（登録商標）、ＰＯＷＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ  Ｓ（登録商標）シリーズ（ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ  Ｓ１０００（登録商標）及びＰＲＥＦＥＲＥＮＺ  Ｓ２０００（登録商標）を含む）並びにＰＵＲＡＳＴＡＲ  ＯＸＡＭ（登録商標）（ＤｕＰｏｎｔ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）並びにＫＡＭ（登録商標）（Ｋａｏ，１４−１０  Ｎｉｈｏｎｂａｓｈｉ  Ｋａｙａｂａｃｈｏ，１−ｃｈｏｍｅ，Ｃｈｕｏ−ｋｕ  Ｔｏｋｙｏ  １０３−８２１０，Ｊａｐａｎ）が挙げられる。一態様では、好適なアミラーゼとしては、ＡＴＬＡＮＴＩＣ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）、ＰＯＷＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＩＮＴＥＮＳＡ（登録商標）及びＳＴＡＩＮＺＹＭＥ  ＰＬＵＳ（登録商標）並びにこれらの混合物が挙げられる。
【０１１３】
好ましくは、本発明の製品は、組成物１ｇ当たり少なくとも０．０１ｍｇ、好ましくは約０．０５〜約１０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜約６ｍｇ、特に約０．２〜約５ｍｇの活性アミラーゼを含む。
【０１１４】
好ましくは、本発明の組成物のプロテアーゼ及び／又はアミラーゼは、粒状体の形態であり、この粒状体は、粒状体の２９重量％超の硫酸ナトリウムを含み、並びに／又は硫酸ナトリウム及び活性酵素（プロテアーゼ及び／若しくはアミラーゼ）は、３：１〜１００：１、又は好ましくは４：１〜３０：１、又はより好ましくは５：１〜２０：１の重量比である。
【０１１５】
結晶成長抑制剤
結晶成長抑制剤は、炭酸カルシウム結晶に結合して、アラゴナイト及び方解石などの種の更なる成長を防止することができる材料である。
【０１１６】
効果的な結晶成長抑制剤の例には、ホスホン酸塩、ポリホスホン酸塩、イヌリン誘導体、ポリイタコン酸ホモポリマー及び環状ポリカルボキシレートが挙げられる。
【０１１７】
好適な結晶成長抑制剤は、ＨＥＤＰ（１−ヒドロキシエチリデン１，１−ジホスホン酸）、カルボキシメチルイヌリン（ＣＭＩ）、トリカルバリル酸及び環状カルボキシレートを含む群から選択されてもよい。本発明の目的のため、用語カルボキシレートは、アニオン形態及びプロトン化したカルボン酸形態の両方を包含する。
【０１１８】
環状カルボキシレートは、少なくとも２つ、好ましくは３つ又は好ましくは少なくとも４つのカルボキシレート基を含み、環状構造は、単環若しくは二環アルカン又は複素環のいずれかに基づく。好適な環状構造には、シクロプロパン、シクロブタン、シクロヘキサン若しくはシクロペンタン若しくはシクロヘプタン、ビシクロ−ヘプタン若しくはビシクロ−オクタン、及び／又はテトラヒドロフランが挙げられる。好ましい結晶成長抑制剤の１つは、シクロペンタンテトラカルボキシレートである。
【０１１９】
少なくとも７５％、好ましくは１００％のカルボキシレート基を素環の三次元構造の同じ側か又は「シス」位に有する環状カルボキシレートは、本明細書での使用に好ましい。
【０１２０】
素環の同じ側にある２つのカルボキシレート基は、直接隣接しているか、又は「オルト」位にあることが好ましい。
【０１２１】
好ましい結晶成長抑制剤には、ＨＥＤＰ、トリカルバリル酸、テトラヒドロフランテトラカルボン酸（ＴＨＦＴＣＡ）及びシクロペンタンテトラカルボン酸（ＣＰＴＣＡ）が挙げられる。ＴＨＦＴＣＡは、好ましくは２ｃ，３ｔ，４ｔ，５ｃ配置であり、ＣＰＴＣＡは、シス，シス，シス，シス配置である。本明細書での使用に特に好ましい結晶成長抑制剤は、ＨＥＤＰである。
【０１２２】
部分的に脱炭酸したポリイタコン酸ホモポリマーもまた、本明細書での使用に好ましく、好ましくは脱炭酸のレベルは５０モル％〜９０モル％の範囲である。本明細書での使用に特に好ましいポリマーは、Ｉｔａｃｏｎｉｘにより供給されるＩｔａｃｏｎｉｘ  ＴＳＩ（登録商標）である。
【０１２３】
結晶成長抑制剤は、好ましくは、組成物の約０．０１〜約１０重量％、特に約０．０２〜約５重量％、特に０．０５〜３重量％の量で存在する。
【０１２４】
金属ケア剤
金属ケア剤は、アルミニウム、ステンレス鋼並びに銀及び銅などの非鉄金属を含む金属の曇り、腐食又は酸化を、防止又は低減することができる。好ましくは、本発明の組成物は、製品の０．１〜５重量％、より好ましくは０．２〜４重量％、特に０．３〜３重量％の金属ケア剤を含み、好ましくは、金属ケア剤はベンゾトリアゾール（ＢＴＡ）である。
【０１２５】
ガラスケア剤
ガラスケア剤は、食器洗浄プロセス中にガラス製品の外観を保護する。好ましくは、本発明の組成物は、組成物の０．１〜５重量％、より好ましくは０．２〜４重量％、特に０．３〜３重量％の金属ケア剤を含み、好ましくは、ガラスケア剤は亜鉛含有材料、特に水亜鉛土である。他の好適なガラスケア剤は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。特に好ましいＰＥＩは、ＢＡＳＦにより供給されるＬｕｐａｓｏｌ（登録商標）ＦＧである。
【０１２６】
本発明の自動食器洗浄組成物は、好ましくは、２０℃の蒸留水中１重量／体積％の水溶液中で測定した場合に、約９〜約１２、より好ましくは約１０〜約１１．５未満、特に約１０．５〜約１１．５のｐＨを有する。
【０１２７】
本発明の自動食器洗浄組成物は、好ましくは、２０℃において１００グラムの製品を含むＮａＯＨ中で測定した場合に、ｐＨ９．５で、約１０〜約２０、より好ましくは約１２〜約１８の予備アルカリ度を有する。
【０１２８】
本発明の好ましい自動食器洗浄組成物は、以下のものを含む：
ｉ）組成物の１０〜２０重量％の過炭酸ナトリウム、
ｉｉ）組成物の１０重量％〜５０重量％の有機錯化剤系（好ましくは、錯化剤系は、ＭＧＤＡを含む）、
ｉｉｉ）ＴＡＥＤ、
ｉｖ）アミラーゼ、
ｖ）任意であるが好ましくは組成物の５〜５０重量％の無機ビルダー、好ましくは炭酸ナトリウム、
ｖｉ）任意であるが好ましくは組成物の２〜１０重量％の非イオン性界面活性剤、
ｖｉｉ）他の任意の成分としては、結晶成長抑制剤、好ましくはＨＥＤＰ、及びガラスケア剤が挙げられる。
【０１２９】
本発明の好ましい自動食器洗浄組成物は、以下のものを含む：
ｉ）組成物の１０〜２０重量％の漂白剤、好ましくは過炭酸ナトリウム、
ｉｉ）組成物の１０重量％〜５０重量％の有機錯化剤系、
ｉｉｉ）マンガン漂白触媒及び任意にＴＡＥＤ、
ｉｖ）アミラーゼ、
ｖ）任意であるが好ましくは組成物の５〜５０重量％の無機ビルダー、好ましくは炭酸ナトリウム、
ｖｉ）任意であるが好ましくは組成物の２〜１０重量％の非イオン性界面活性剤、
ｖｉｉ）任意であるが好ましくはガラスケア剤。
【０１３０】
本明細書に開示される寸法及び値は、列挙された正確な数値に厳密に限定されるものとして理解されるべきではない。その代わりに、特に指示がない限り、このような寸法はそれぞれ、列挙された値とその値を囲む機能的に同等な範囲との両方を意味することが意図されている。例えば、「４０ｍｍ」と開示された寸法は、「約４０ｍｍ」を意味することが意図される。
【実施例】
【０１３１】
表１に示す組成物を使用した。各組成物３ｇを１リットルの脱イオン水に溶解し、ｐＨ１１の洗浄溶液を作製した。本発明のプロテアーゼを、０．２５〜０．７５ｐｐｍの濃度で洗浄溶液に添加する。良好なクレームブリュレ除去が得られる。
【０１３２】
【表１】
2021527413.tif 000005
【０１３３】
表１：自動食器洗浄（ＡＤＷ）組成物
アミラーゼ  Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社により供給
ＴＡＥＤ  テトラアセチルエチレンジアミン
ＭＧＤＡ  メチルグリシン二酢酸三ナトリウム、ＢＡＳＦ社により供給
漂白触媒  ＭｎＴＡＣＮ（マンガン１，４，７−トリアザシクロノナン）
スルホン化ポリマー  Ａｃｕｓｏｌ  ５８８、Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社により供給
Ｌｕｔｅｎｓｏｌ  ＴＯ７  非イオン性界面活性剤、ＢＡＳＦ社により供給
【０１３４】
洗剤中の洗浄性能
卵黄汚れ
本明細書に記載のプロテアーゼ変異体の自動食器洗浄（ＡＤＷ）の洗浄性能を、卵黄マイクロスウォッチ（ＰＡＳ−３８、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＢＶ，Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）及びＧＳＭ−Ｂ洗剤（下記の表１を参照）、ｐＨ１０．５を使用して、マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）において、配列番号１のアミノ酸配列を有する基準プロテアーゼと比べて試験した。（ＭＴＰに適合するように）予めパンチし、すすいだＰＡＳ−３８スウォッチ及びすすいでいないものを、このアッセイで使用した。すすいだスウォッチは、１８０μＬの１０ｍＭ  ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１１）を、ＰＡＳ−３８マイクロスウォッチを含むＭＴＰに添加し、６０℃及び１１００ｒｐｍで３０分間振盪させることによって、準備した。インキュベーションの後に、緩衝液を除去し、スウォッチを脱イオン水ですすいで、任意の残留緩衝液を除去し、ＭＴＰを空気乾燥させた後、アッセイで使用した。全てのマイクロスウォッチプレートには、酵素を添加する前に、３７４ｐｐｍの水硬度に調整した３ｇ／ＬのＧＳＭ−Ｂ洗剤を充填した。ＰＡＳ−３８スウォッチを洗剤及び酵素と共に４０℃で３０分間インキュベートした後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーを用いて４０５ｎｍで吸光度を読み取った。各サンプル値からブランク対照（酵素なし）の値を差し引くことにより、吸光度の結果を得た（以下「ブランク減算吸光度」）。各条件及び変異体について、ブランク減算吸光度を同濃度の基準プロテアーゼのブランク減算吸光度で除算することによって性能指数（ＰＩ）を計算した。基準プロテアーゼの値は、試験に含まれた、かつ適宜ラングミュア適合又はヒルシグモイド適合に適合した基準プロテアーゼの標準曲線から決定した。
【０１３５】
クレームブリュレ汚れ
本明細書に記載されるＶｌａａｒｄｉｎｇｅｎ（ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）のＣＦＴによって調製されたカスタム注文のメラミン食器洗浄機モニター（タイル）及び標識したＤＭ１０ｃを使用して、クレームブリュレ汚れに対する変異体の洗浄性能を試験した。この試験において使用したＤＭ１０ｃタイルは、市販のＤＭ１０モニター（クレームブリュレはＤｅｂｉｃ．ｃｏｍの製品）を調製するために使用される同じ材料２．７ｇを使用して調製されるが、１５０℃ではなく１４０℃で２時間焼成した。メラミンタイルを蓋として使用し、マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）上にしっかりと押し付けた。３ｇ／ＬのＧＳＭＢ又はＭＧＤＡ洗剤（それぞれ表１及び２）を、３７４ｐｐｍの水硬度に調整し、それぞれの酵素サンプルをＭＴＰに添加した後に、メラミンタイルの蓋をＭＴＰに取り付けた。ＭＴＰの体積容量、それ故に、ＭＴＰに添加される溶液の体積は変化してもよく、インキュベーション条件下で溶液と汚れ表面との間の接触を可能にする最小限の体積の溶液をＭＴＰに添加する必要がある。この例では、酵素を含有する３００μＬの体積の洗剤を、アルミニウム９６ウェルＭＴＰの各ウェルに添加した。ＭＴＰを、Ｉｎｆｏｒｓ熱振盪器において、４０℃、２５０ｒｐｍで、４５分間インキュベートした。インキュベーションの後に、タイルをＭＴＰから取り出し、空気乾燥させた。
【０１３６】
プレートを撮影し、カスタムソフトウェアを使用して各汚れの範囲からＲＧＢ値を測定することによって、汚れ除去を定量化した。洗浄したタイルの汚れ除去率（ＳＲＩ％）値を、以下の式においてＲＧＢ値を使用して計算した。
【０１３７】
ＳＲＩ％＝（ΔＥ／ΔＥ初期）×１００
式中、ΔＥ＝ＳＱＲ（（Ｒ洗浄後−Ｒ洗浄前）２＋（Ｇ洗浄後−Ｇ洗浄前）２＋（Ｂ洗浄後−Ｂ洗浄前）２）
式中、ΔＥ初期＝ＳＱＲ（（Ｒ白−Ｒ洗浄前）２＋（Ｇ白−Ｇ洗浄前）２＋（Ｂ白−Ｂ洗浄前）２）
【０１３８】
各サンプル値からブランク対照（酵素なし）の値を差し引くことにより、洗浄性能を得た（以下「ブランク減算洗浄」）。各条件及び変異体について、ブランク減算洗浄を同濃度の基準プロテアーゼ（アミノ酸配列番号１を有する）のブランク減算洗浄で除算することによって性能指数（ＰＩ）を計算した。親プロテアーゼのＰＩの値は、試験に含まれた、かつ適宜ラングミュア適合又はヒルシグモイド適合に適合した親プロテアーゼの標準曲線から決定した。
【０１３９】
【表２】
2021527413.tif 000006
【０１４０】
【表３】
2021527413.tif 000007
【０１４１】
ＡＡＰＦ活性アッセイ
（アミノ酸配列番号１を有する）基準プロテアーゼ及びその変異体のプロテアーゼ活性を、Ｎ−ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡの加水分解を測定することにより試験した。ＡＡＰＦ加水分解アッセイに使用した試薬溶液は、０．００５％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０を含有する１００ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．６）（トリス希釈緩衝液）、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２及び０．００５％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０を含有する１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．６）（トリス／Ｃａ緩衝液）、並びにＤＭＳＯ中１６０ｍＭ  ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ原液）（Ｓｉｇｍａ：Ｓ−７３８８）であった。１ｍＬのｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ原液を１００ｍＬのトリス／Ｃａ緩衝液に添加し、十分に混合することによって基質作用液を調製した。酵素サンプルを、１ｍｇ／ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ作用液を含むＭＴＰ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ７８１１０１）に添加し、室温（ＲＴ）でＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーを動的モードで使用して４０５ｎｍで３分間にわたって活性をアッセイした。プロテアーゼを含有しないブランクの吸光度を各サンプルの読み取り値から差し引いた。プロテアーゼ活性をｍＯＤ・分−１として表した。
【０１４２】
安定性アッセイ
変異体をストレス緩衝液で希釈し、上記のＡＡＰＦアッセイを使用して、加熱インキュベーション工程の前後に変異体のタンパク質分解活性を測定することによって、本明細書に記載の変異体の安定性を測定した。基準プロテアーゼが約３０〜４５％の残留活性を示すように、加熱インキュベーション工程の温度及び持続時間を選択した。サンプルを、３８４ウェルの熱サイクラーにおいて、５６℃で５分間インキュベートした。トリス−ＥＤＴＡ（５０ｍＭトリス、ｐＨ９、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０）緩衝化条件において、安定性を測定した。安定性ＰＩは、変異体の残留活性を基準プロテアーゼの残留活性で除算することによって得た。
【０１４３】
食器用途における変異体の性能
（配列番号１のアミノ酸配列を有する）基準プロテアーゼ及びその変異体の洗浄性能を、以下の洗浄アッセイにおいて評価した。ＰＡＳ−３８技術的汚れをＧＳＭ−Ｂ洗剤を使用して、クレームブリュレ汚れをＧＳＭ−Ｂ又はＭＧＤＡ洗剤のいずれかを使用して、上記の安定性アッセイにおいて評価した。基準プロテアーゼ及びその変異体のこれらの評価の結果を、基準プロテアーゼに対して計算した性能指数（ＰＩ）値として、表４に示す。
【０１４４】
【表４−１】
2021527413.tif 000008
【０１４５】
【表４−２】
2021527413.tif 000009
【０１４６】
【表４−３】
2021527413.tif 000010
【０１４７】
【表４−４】
2021527413.tif 000011
【０１４８】
【表４−５】
2021527413.tif 000012
【０１４９】
【表４−６】
2021527413.tif 000013
【０１５０】
【表４−７】
2021527413.tif 000014
【０１５１】
【表４−８】
2021527413.tif 000015
【０１５２】
【表４−９】
2021527413.tif 000016
【０１５３】
【表４−１０】
2021527413.tif 000017
【０１５４】
【表４−１１】
2021527413.tif 000018
【０１５５】
【表４−１２】
2021527413.tif 000019
【０１５６】
【表４−１３】
2021527413.tif 000020
【０１５７】
【表４−１４】
2021527413.tif 000021
【０１５８】
【表４−１５】
2021527413.tif 000022
【０１５９】
以下の変異体は、次のアッセイ：ＢＭＩ  ＨＤＬ洗浄、ＢＭＩ  ＨＤＤ洗浄、ＰＡＳ−３８  ＡＤＷ洗浄、クレームブリュレのＡＤＷ洗浄又はトリス−ＥＤＴＡ緩衝液中の安定性のうちの１つにおいて、基準プロテアーゼと比較して、改善された性能指数（ＰＩ値≧１．１）を示した。Ｔ００３Ｖ、Ｖ００４Ｔ、Ｉ００８Ｖ、Ｔ００９Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｗ／Ｙ、Ｒ０１０Ａ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｗ、Ｖ０１１Ａ／Ｉ／Ｓ／Ｔ、Ｑ０１２Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ、Ｐ０１４Ｄ、Ａ０１５Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｖ０１６Ｌ／Ｍ／Ｓ、Ｈ０１７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｎ０１８Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｔ、Ｒ０１９Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ、Ｇ０２０Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｍ／Ｎ／Ｔ、Ｓ０２４Ａ／Ｅ、Ｇ０２５Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ、Ｖ０２６Ａ／Ｉ、Ｒ０２７Ｋ、Ｓ０３３Ｔ、Ｓ０３６Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｔ／Ｖ、Ｎ０４２Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｑ、Ｉ０４３Ｌ、Ｒ０４４Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ａ０４７Ｉ／Ｙ、Ｖ０５０Ｉ、Ｇ０５２Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｙ、Ｐ０５４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｔ／Ｖ、Ｔ０５５Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｓ／Ｙ、Ａ０５７Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、Ｌ０５９Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、Ｎ０６０Ｓ、Ｔ０６９Ｓ、Ｓ０７６Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｒ／Ｔ／Ｙ、Ｖ０８２Ａ、Ｐ０８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｙ、Ｎ０８５Ｓ、Ｇ０９５Ａ／Ｎ、Ａ０９６Ｍ／Ｑ、Ｎ０９７Ｅ／Ｈ／Ｋ、Ｓ１０１Ｔ、Ｖ１０２Ｌ／Ｍ、Ｇ１０４Ａ／Ｄ／Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｉ１０５Ｖ、Ｑ１０７Ｋ／Ｍ、Ｅ１１０Ｌ、Ａ１１３Ｔ／Ｖ、Ｔ１１４Ｖ、Ｎ１１５Ｅ／Ｈ／Ｑ、Ｎ１１６Ｅ／Ｈ、Ｈ１１８Ｄ／Ｅ／Ｎ、Ａ１２０Ｖ、Ｍ１２２Ｌ、Ｆ１２８Ｇ、Ｐ１２９Ａ／Ｈ／Ｎ／Ｙ、Ｓ１３１Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｉ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｔ／Ｖ、Ｌ１３３Ｍ、Ｒ１３５Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ａ１３６Ｍ、Ｖ１３７Ｌ、Ｙ１３９Ｅ／Ｓ、Ｔ１４１Ｅ／Ｈ／Ｎ、Ｓ１４２Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｑ、Ｒ１４３Ｅ／Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｖ、Ｄ１４４Ｅ／Ｎ、Ｖ１４５Ｃ、Ｖ１４７Ｃ、Ｉ１４８Ｌ／Ｖ、Ａ１５０Ｍ、Ｎ１５４Ｄ、Ｓ１５６Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｎ／Ｔ、Ｇ１５７Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｎ／Ｑ、Ｓ１５８Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｖ１５９Ｌ、Ｇ１６０Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｙ１６１Ｗ、Ｒ１６４Ａ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｙ、Ａ１６６Ｄ／Ｅ／Ｉ／Ｐ／Ｑ／Ｖ、Ｎ１６７Ｅ、Ｍ１６９Ｌ、Ａ１７０Ｇ、Ｔ１７４Ｖ、Ｑ１７６Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｓ、Ｎ１７７Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｓ／Ｗ／Ｙ、Ｎ１７８Ｄ、Ｒ１７９Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｒ１８０Ｋ、Ｎ１８２Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｙ１８６Ｆ、Ｔ１８８Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｇ１８９Ｃ／Ｄ／Ｅ、Ｉ１９０Ｍ、Ｄ１９１Ｅ、Ｉ１９２Ｃ／Ｍ、Ｖ１９３Ａ／Ｍ、Ｎ１９８Ｄ／Ｅ、Ｑ２００Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｖ／Ｙ、Ｒ２０７Ｋ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、Ｖ２０９Ｐ、Ｓ２１０Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｌ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｙ、Ｍ２１１Ｅ／Ｋ／Ｌ／Ｑ／Ｒ、Ｎ２１２Ａ／Ｃ／Ｑ／Ｓ、Ｔ２１８Ｃ／Ｓ、Ａ２２４Ｖ、Ｌ２２７Ｍ／Ｑ、Ｖ２２８Ｌ、Ｑ２３０Ｅ、Ｒ２３１Ｃ／Ｅ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ、Ｙ２３２Ｆ／Ｈ／Ｑ／Ｒ／Ｗ、Ｓ２３４Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｔ／Ｗ／Ｙ、Ｎ２３６Ｄ／Ｇ／Ｓ／Ｔ、Ｔ２３８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｖ、Ｑ２３９Ｄ／Ｅ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｔ、Ｎ２４２Ａ、Ｋ２４５Ｅ、Ｎ２４６Ａ／Ｌ／Ｓ、Ｔ２４７Ｅ／Ｑ、Ｔ２４９Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｓ／Ｙ、Ｎ２５０Ｄ／Ｓ／Ｔ、Ｎ２５３Ｄ／Ｅ／Ｐ、Ｓ２５４Ｐ／Ｙ、Ｓ２５５Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｉ／Ｍ／Ｎ／Ｖ／Ｗ、Ｑ２５６Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｗ／Ｙ、Ｆ２５７Ｃ／Ｍ、Ｓ２５９Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ、Ｖ２６２Ｌ、Ｎ２６３Ｄ／Ｑ、Ａ２６４Ｔ、Ｅ２６５Ａ／Ｍ／Ｎ／Ｑ、Ａ２６６Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｒ、Ｔ２６８Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ及びＲ２６９Ｈ／Ｐ／Ｗ。
【０１６０】
以下の変異体は、ＰＡＳ−３８アッセイのうちの１つにおいて、基準プロテアーゼと比較して、改善されたＡＤＷ洗浄性能指数（ＰＩ値≧１．１）を示した。Ｔ００９Ｈ／Ｋ／Ｎ／Ｗ、Ｖ０１１Ａ／Ｉ、Ｑ０１２Ａ／Ｍ／Ｎ／Ｒ／Ｓ／Ｖ、Ａ０１５Ｆ／Ｉ／Ｋ／Ｖ、Ｖ０１６Ｌ／Ｍ、Ｈ０１７Ｆ／Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｖ／Ｗ、Ｎ０１８Ｆ、Ｒ０１９Ｃ／Ｋ／Ｌ／Ｑ、Ｇ０２０Ａ／Ｄ／Ｍ／Ｎ／Ｔ、Ｓ０２４Ａ、Ｇ０２５Ａ／Ｄ／Ｎ、Ｓ０３６Ａ／Ｌ、Ｇ０５２Ｄ／Ｈ、Ｐ０５４Ａ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｖ、Ｔ０５５Ａ／Ｄ／Ｈ／Ｓ／Ｙ、Ｌ０５９Ａ／Ｍ／Ｎ、Ｎ０６０Ｓ、Ｔ０６９Ｓ、Ｓ０７６Ｋ／Ｌ、Ｇ０９５Ｎ、Ａ０９６Ｑ、Ｎ０９７Ｋ、Ｖ１０２Ｌ／Ｍ、Ｑ１０７Ｋ、Ｅ１１０Ｌ、Ａ１１３Ｔ、Ｈ１１８Ｄ、Ａ１２０Ｖ、Ｍ１２２Ｌ、Ｆ１２８Ｇ、Ｐ１２９Ａ／Ｈ／Ｎ／Ｙ、Ｓ１３１Ｍ／Ｎ／Ｐ、Ａ１３６Ｍ、Ｒ１４３Ｎ、Ｄ１４４Ｎ、Ｖ１４５Ｃ、Ｇ１５７Ａ／Ｄ、Ｓ１５８Ｑ／Ｔ、Ｖ１５９Ｌ、Ｇ１６０Ｄ／Ｍ／Ｓ、Ａ１６６Ｉ、Ａ１７０Ｇ、Ｑ１７６Ｌ、Ｎ１７７Ａ／Ｄ／Ｇ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｙ、Ｒ１７９Ａ／Ｋ、Ｎ１８２Ａ／Ｄ／Ｓ／Ｙ、Ｔ１８８Ｍ、Ｄ１９１Ｅ、Ｒ２０７Ｌ、Ｓ２１０Ｅ／Ｇ／Ｑ、Ｍ２１１Ｅ／Ｑ／Ｒ、Ｔ２１８Ｓ、Ｌ２２７Ｍ、Ｙ２３２Ｆ／Ｗ、Ｑ２５６Ｌ／Ｙ、Ｎ２６３Ｑ、Ｅ２６５Ａ／Ｍ／Ｑ及びＴ２６８Ａ。
【０１６１】
以下の変異体は、クレームブリュレアッセイのうちの１つにおいて、基準プロテアーゼと比較して、改善されたＡＤＷ洗浄性能指数（ＰＩ値≧１．１）を示した。Ｔ００９Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｍ／Ｎ／Ｙ、Ｒ０１０Ａ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｗ、Ｖ０１１Ａ／Ｔ、Ｑ０１２Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ、Ｐ０１４Ｄ、Ａ０１５Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｉ／Ｍ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｖ０１６Ｌ／Ｍ、Ｈ０１７Ｃ／Ｅ、Ｎ０１８Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ、Ｒ０１９Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ、Ｇ０２０Ｃ／Ｄ、Ｓ０２４Ａ／Ｅ、Ｇ０２５Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ、Ｖ０２６Ａ、Ｒ０２７Ｋ、Ｓ０３６Ｃ／Ｅ／Ｑ／Ｖ、Ｎ０４２Ｃ／Ｄ／Ｅ、Ｉ０４３Ｌ、Ｒ０４４Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ、Ｇ０５２Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｌ／Ｍ／Ｎ、Ｐ０５４Ａ／Ｃ／Ｌ／Ｍ／Ｖ、Ｔ０５５Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ、Ａ０５７Ｄ／Ｅ、Ｌ０５９Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、Ｎ０６０Ｓ、Ｓ０７６Ｄ／Ｅ／Ｎ、Ｖ０８２Ａ、Ｐ０８４Ｄ、Ａ０９６Ｑ、Ｎ０９７Ｅ／Ｈ、Ｇ１０４Ａ／Ｄ／Ｈ／Ｎ／Ｖ／Ｙ、Ｎ１１５Ｈ、Ｎ１１６Ｅ、Ｆ１２８Ｇ、Ｐ１２９Ｈ、Ｓ１３１Ｄ／Ｅ、Ｒ１３５Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｙ１３９Ｅ、Ｔ１４１Ｅ、Ｓ１４２Ｄ／Ｅ、Ｒ１４３Ｅ、Ｄ１４４Ｅ、Ｖ１４７Ｃ、Ｉ１４８Ｌ、Ｎ１５４Ｄ、Ｓ１５６Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｎ／Ｔ、Ｇ１５７Ｃ／Ｄ／Ｅ、Ｓ１５８Ｃ／Ｌ／Ｑ／Ｔ／Ｙ、Ｖ１５９Ｌ、Ｒ１６４Ａ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｙ、Ａ１６６Ｄ／Ｅ、Ｎ１６７Ｅ、Ｍ１６９Ｌ、Ｔ１７４Ｖ、Ｑ１７６Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｎ、Ｎ１７７Ｃ／Ｄ／Ｅ、Ｎ１７８Ｄ、Ｒ１７９Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｒ１８０Ｋ、Ｎ１８２Ｃ／Ｄ／Ｅ、Ｔ１８８Ｃ／Ｄ／Ｅ、Ｇ１８９Ｃ／Ｄ／Ｅ、Ｖ１９３Ａ／Ｍ、Ｎ１９８Ｄ／Ｅ、Ｒ２０７Ｋ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、Ｖ２０９Ｐ、Ｓ２１０Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｌ／Ｎ／Ｙ、Ｍ２１１Ｅ／Ｋ／Ｌ／Ｑ、Ｎ２１２Ｃ／Ｑ、Ｖ２２８Ｌ、Ｑ２３０Ｅ、Ｒ２３１Ｃ／Ｅ／Ｌ／Ｎ／Ｑ、Ｙ２３２Ｆ、Ｓ２３４Ｄ／Ｅ／Ｔ／Ｗ／Ｙ、Ｎ２３６Ｄ／Ｔ、Ｔ２３８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｖ、Ｑ２３９Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ、Ｋ２４５Ｅ、Ｎ２４６Ａ／Ｌ、Ｔ２４７Ｅ／Ｑ、Ｔ２４９Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｌ／Ｙ、Ｎ２５０Ｄ、Ｎ２５３Ｄ／Ｅ／Ｐ、Ｓ２５４Ｙ、Ｓ２５５Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ、Ｑ２５６Ｃ／Ｅ／Ｙ、Ｆ２５７Ｃ、Ｓ２５９Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ、Ｖ２６２Ｌ、Ｎ２６３Ｄ、Ｔ２６８Ｃ／Ｄ／Ｅ及びＲ２６９Ｈ／Ｐ／Ｗ。
【０１６２】
以下の変異体は、少なくとも１つのＰＡＳ−３８アッセイ及び少なくとも１つのクレームブリュレアッセイにおいて、基準プロテアーゼと比較して、改善された洗浄性能指数（ＰＩ値≧１．１）を示した。Ｔ００９Ｎ、Ｖ０１１Ａ、Ｑ０１２Ａ／Ｍ、Ａ０１５Ｉ／Ｖ、Ｖ０１６Ｌ／Ｍ、Ｒ０１９Ｃ／Ｋ／Ｌ／Ｑ、Ｇ０２０Ｄ、Ｓ０２４Ａ、Ｇ０２５Ａ／Ｄ／Ｎ、Ｇ０５２Ｄ、Ｐ０５４Ａ／Ｌ／Ｍ／Ｖ、Ｔ０５５Ａ／Ｄ、Ｌ０５９Ａ／Ｍ／Ｎ、Ｎ０６０Ｓ、Ａ０９６Ｑ、Ｆ１２８Ｇ、Ｐ１２９Ｈ、Ｇ１５７Ｄ、Ｓ１５８Ｑ／Ｔ、Ｖ１５９Ｌ、Ｎ１７７Ｄ、Ｒ１７９Ａ／Ｋ、Ｎ１８２Ｄ、Ｒ２０７Ｌ、Ｓ２１０Ｅ、Ｍ２１１Ｅ／Ｑ、Ｙ２３２Ｆ及びＱ２５６Ｙ。
【０１６３】
以下の変異体は、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液中において、基準プロテアーゼと比較して、改善された安定性（ＰＩ値≧１．１）を示した。Ｔ００３Ｖ、Ｖ００４Ｔ、Ｉ００８Ｖ、Ｔ００９Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｋ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｗ／Ｙ、Ｒ０１０Ｑ、Ｖ０１１Ａ、Ｑ０１２Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｔ、Ａ０１５Ｆ／Ｈ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｗ、Ｖ０１６Ｓ、Ｈ０１７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｎ０１８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｌ／Ｍ／Ｑ、Ｒ０１９Ｃ／Ｄ／Ｙ、Ｇ０２０Ｃ／Ｄ／Ｍ／Ｎ、Ｓ０２４Ａ／Ｅ、Ｇ０２５Ｃ／Ｄ／Ｎ、Ｖ０２６Ｉ、Ｒ０２７Ｋ、Ｓ０３３Ｔ、Ｓ０３６Ａ／Ｃ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｖ、Ｎ０４２Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｑ、Ｒ０４４Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ａ０４７Ｉ／Ｙ、Ｖ０５０Ｉ、Ｇ０５２Ａ／Ｍ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｙ、Ｐ０５４Ｎ／Ｖ、Ｔ０５５Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｎ、Ａ０５７Ｅ／Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、Ｌ０５９Ｎ、Ｓ０７６Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｒ／Ｔ／Ｙ、Ｖ０８２Ａ、Ｐ０８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｙ、Ｎ０８５Ｓ、Ｇ０９５Ａ／Ｎ、Ａ０９６Ｍ、Ｎ０９７Ｋ、Ｓ１０１Ｔ、Ｖ１０２Ｌ／Ｍ、Ｇ１０４Ｍ／Ｎ／Ｔ／Ｖ／Ｗ、Ｉ１０５Ｖ、Ｑ１０７Ｍ、Ａ１１３Ｖ、Ｔ１１４Ｖ、Ｎ１１５Ｑ、Ｎ１１６Ｅ／Ｈ、Ｈ１１８Ｄ／Ｅ／Ｎ、Ｓ１３１Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｉ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｔ／Ｖ、Ｌ１３３Ｍ、Ｒ１３５Ａ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ａ１３６Ｍ、Ｓ１４２Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｑ、Ｒ１４３Ｅ／Ｈ／Ｍ／Ｎ／Ｑ、Ｖ１４７Ｃ、Ｉ１４８Ｖ、Ａ１５０Ｍ、Ｓ１５６Ｎ／Ｔ、Ｇ１５７Ａ／Ｃ／Ｎ、Ｓ１５８Ｃ／Ｆ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｖ１５９Ｌ、Ｇ１６０Ａ／Ｃ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ａ１６６Ｄ／Ｅ／Ｐ／Ｑ、Ａ１７０Ｇ、Ｑ１７６Ｃ／Ｍ、Ｎ１７７Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｗ／Ｙ、Ｒ１７９Ｍ／Ｑ、Ｒ１８０Ｋ、Ｎ１８２Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｔ１８８Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｇ１８９Ｄ、Ｉ１９２Ｃ／Ｍ、Ｖ１９３Ｍ、Ｑ２００Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｖ／Ｙ、Ｖ２０９Ｐ、Ｓ２１０Ｅ／Ｆ／Ｐ、Ｍ２１１Ｋ、Ｎ２１２Ｓ、Ｔ２１８Ｃ／Ｓ、Ｖ２２８Ｌ、Ｑ２３０Ｅ、Ｒ２３１Ｃ／Ｅ／Ｈ／Ｎ／Ｔ、Ｙ２３２Ｆ／Ｈ、Ｓ２３４Ｄ／Ｍ、Ｎ２３６Ｄ／Ｇ／Ｓ／Ｔ、Ｔ２３８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｖ、Ｑ２３９Ｅ／Ｌ／Ｍ／Ｔ、Ｎ２４２Ａ、Ｎ２４６Ａ／Ｌ／Ｓ、Ｔ２４９Ｅ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｓ／Ｙ、Ｎ２５０Ｄ／Ｓ、Ｎ２５３Ｄ／Ｅ、Ｓ２５４Ｐ、Ｓ２５５Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｉ／Ｍ／Ｖ／Ｗ、Ｑ２５６Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｗ／Ｙ、Ａ２６４Ｔ、Ａ２６６Ｌ／Ｍ／Ｎ及びＴ２６８Ｃ。
【０１６４】
以下の変異体は、少なくとも１つのＰＡＳ−３８アッセイ又は少なくとも１つのクレームブリュレアッセイでのＡＤＷ洗浄において、基準プロテアーゼと比較して、改善された性能指数（ＰＩ値≧１．１）を示し、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液中において、改善された安定性（ＰＩ値≧１．１）を示した。Ｔ００９Ａ／Ｅ／Ｈ／Ｋ／Ｎ／Ｗ／Ｙ、Ｒ０１０Ｑ、Ｖ０１１Ａ、Ｑ０１２Ａ／Ｃ／Ｍ／Ｎ、Ａ０１５Ｆ／Ｈ／Ｍ／Ｗ、Ｈ０１７Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｖ／Ｗ、Ｎ０１８Ｄ／Ｅ／Ｍ、Ｒ０１９Ｃ／Ｄ／Ｙ、Ｇ０２０Ｃ／Ｄ／Ｍ／Ｎ、Ｓ０２４Ａ／Ｅ、Ｇ０２５Ｃ／Ｄ／Ｎ、Ｒ０２７Ｋ、Ｓ０３６Ａ／Ｃ／Ｌ／Ｑ／Ｖ、Ｎ０４２Ｃ／Ｄ／Ｅ、Ｒ０４４Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ、Ｇ０５２Ａ／Ｍ／Ｎ、Ｐ０５４Ｖ、Ｔ０５５Ｃ／Ｄ／Ｅ、Ａ０５７Ｅ、Ｌ０５９Ｎ、Ｓ０７６Ｄ／Ｅ／Ｋ／Ｌ／Ｎ、Ｖ０８２Ａ、Ｐ０８４Ｄ、Ｇ０９５Ｎ、Ｎ０９７Ｋ、Ｖ１０２Ｌ／Ｍ、Ｇ１０４Ｎ／Ｖ、Ｎ１１６Ｅ、Ｈ１１８Ｄ、Ｓ１３１Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｎ／Ｐ、Ｒ１３５Ａ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ａ１３６Ｍ、Ｓ１４２Ｄ／Ｅ、Ｒ１４３Ｅ／Ｎ、Ｖ１４７Ｃ、Ｓ１５６Ｎ／Ｔ、Ｇ１５７Ａ／Ｃ、Ｓ１５８Ｃ／Ｌ／Ｑ／Ｔ／Ｙ、Ｖ１５９Ｌ、Ｇ１６０Ｍ／Ｓ、Ａ１６６Ｄ／Ｅ、Ａ１７０Ｇ、Ｑ１７６Ｃ、Ｎ１７７Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｌ／Ｍ／Ｙ、Ｒ１７９Ｍ／Ｑ、Ｒ１８０Ｋ、Ｎ１８２Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｓ／Ｙ、Ｔ１８８Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｍ、Ｇ１８９Ｄ、Ｖ１９３Ｍ、Ｖ２０９Ｐ、Ｓ２１０Ｅ、Ｍ２１１Ｋ、Ｔ２１８Ｓ、Ｖ２２８Ｌ、Ｑ２３０Ｅ、Ｒ２３１Ｃ／Ｅ／Ｎ、Ｙ２３２Ｆ、Ｓ２３４Ｄ、Ｎ２３６Ｄ／Ｔ、Ｔ２３８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｖ、Ｑ２３９Ｅ／Ｍ、Ｎ２４６Ａ／Ｌ、Ｔ２４９Ｅ／Ｌ／Ｙ、Ｎ２５０Ｄ、Ｎ２５３Ｄ／Ｅ、Ｓ２５５Ｃ／Ｄ／Ｅ、Ｑ２５６Ｃ／Ｅ／Ｙ及びＴ２６８Ｃ。
【０１６５】
負電荷変化を有する以下の変異体は、クレームブリュレアッセイのうちの少なくとも１つにおいて、基準プロテアーゼと比較して、改善された性能指数（ＰＩ値≧１．１）を示した。Ｔ００９Ｃ／Ｅ／Ｙ、Ｒ０１０Ａ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｗ、Ｑ０１２Ｃ／Ｄ／Ｅ、Ｐ０１４Ｄ、Ａ０１５Ｄ／Ｅ／Ｙ、Ｈ０１７Ｃ／Ｅ、Ｎ０１８Ｃ／Ｄ／Ｅ、Ｒ０１９Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ、Ｇ０２０Ｃ／Ｄ、Ｓ０２４Ｅ、Ｇ０２５Ｃ／Ｄ／Ｅ、Ｒ０２７Ｋ、Ｓ０３６Ｃ／Ｅ、Ｎ０４２Ｃ／Ｄ／Ｅ、Ｒ０４４Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ、Ｇ０５２Ｃ／Ｄ、Ｐ０５４Ｃ、Ｔ０５５Ｃ／Ｄ／Ｅ、Ａ０５７Ｄ／Ｅ、Ｌ０５９Ｃ／Ｄ／Ｅ、Ｓ０７６Ｄ／Ｅ、Ｐ０８４Ｄ、Ｎ０９７Ｅ、Ｇ１０４Ｄ／Ｙ、Ｎ１１６Ｅ、Ｓ１３１Ｄ／Ｅ、Ｒ１３５Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｙ１３９Ｅ、Ｔ１４１Ｅ、Ｓ１４２Ｄ／Ｅ、Ｒ１４３Ｅ、Ｖ１４７Ｃ、Ｎ１５４Ｄ、Ｓ１５６Ｃ／Ｄ、Ｇ１５７Ｃ／Ｄ／Ｅ、Ｓ１５８Ｃ／Ｙ、Ｒ１６４Ａ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｙ、Ａ１６６Ｄ／Ｅ、Ｎ１６７Ｅ、Ｑ１７６Ｃ／Ｄ／Ｅ、Ｎ１７７Ｃ／Ｄ／Ｅ、Ｎ１７８Ｄ、Ｒ１７９Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｒ１８０Ｋ、Ｎ１８２Ｃ／Ｄ／Ｅ、Ｔ１８８Ｃ／Ｄ／Ｅ、Ｇ１８９Ｃ／Ｄ／Ｅ、Ｎ１９８Ｄ／Ｅ、Ｒ２０７Ｋ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、Ｓ２１０Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｙ、Ｍ２１１Ｅ、Ｎ２１２Ｃ、Ｑ２３０Ｅ、Ｒ２３１Ｃ／Ｅ／Ｌ／Ｎ／Ｑ、Ｓ２３４Ｄ／Ｅ／Ｙ、Ｎ２３６Ｄ、Ｔ２３８Ｄ／Ｅ、Ｑ２３９Ｄ／Ｅ、Ｋ２４５Ｅ、Ｔ２４７Ｅ、Ｔ２４９Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｙ、Ｎ２５０Ｄ、Ｎ２５３Ｄ／Ｅ、Ｓ２５４Ｙ、Ｓ２５５Ｃ／Ｄ／Ｅ、Ｑ２５６Ｃ／Ｅ／Ｙ、Ｆ２５７Ｃ、Ｓ２５９Ｄ／Ｅ、Ｎ２６３Ｄ、Ｔ２６８Ｃ／Ｄ／Ｅ及びＲ２６９Ｈ／Ｐ／Ｗ。
【０１６６】
本明細書に開示される寸法及び値は、列挙された正確な数値に厳密に限定されるものとして理解されるべきではない。その代わりに、特に指示がない限り、このような寸法はそれぞれ、列挙された値とその値を囲む機能的に同等な範囲との両方を意味することが意図されている。例えば、「４０ｍｍ」として開示される寸法は、「約４０ｍｍ」を意味するものとする。
【配列表】
2021527413000001.app
【国際調査報告】
2021527413.tif 000023
2021527413.tif 000024
2021527413.tif 000025
2021527413.tif 000026
2021527413.tif 000027