(57)【要約】  本発明は、２個以上のペプチドループが足場への付着ポイントの間に張られるように分子足場に共有結合しているポリペプチドの多量体に関する。本発明はまた、ポリペプチド内の付着の異なる部位を使用した種々の長さおよび剛性の種々の化学リンカーおよび化学ヒンジを介した、ポリペプチドの多量体化について記載する。具体的には、本発明は、ＣＤ１３７の高親和性結合剤および活性化因子である、ペプチドの多量体について記載する。本発明はまた、１個もしくは複数のエフェクター基および／または官能基にコンジュゲートされた、前記ペプチドを含む薬物コンジュゲート、前記ペプチドリガンドおよび薬物コンジュゲートを含む医薬組成物、ならびにＣＤ１３７が媒介する疾患または障害の予防、抑制または処置における前記ペプチドリガンドおよび薬物コンジュゲートの使用を包合する。
2021514953.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
同一でも異なっていてもよい少なくとも２つの二環式ペプチドリガンドを含む多量体結合複合体であって、
前記二環式ペプチドリガンドのそれぞれは、
少なくとも２個のループ配列によって隔てられた少なくとも３個の反応基を含むポリペプチドと、
前記ポリペプチドの前記反応基と共有結合を形成する分子足場と、
を含み、その結果、少なくとも２個のポリペプチドループが前記分子足場上に形成されている、
多量体結合複合体。
【請求項２】
二環式ペプチドリガンドのそれぞれはスペーサー基によって中央のヒンジ部分に接続されている、請求項１に記載の多量体結合複合体。
【請求項３】
式（Ｉ）
【化１】
2021514953.tif 000089
（式中、
ＣＨＭは中央のヒンジ部分を表し；
Ｓ１はスペーサー基を表し；
二環は請求項１に記載の二環式ペプチドリガンドを表し；かつ
ｍは２〜１０から選択される整数を表す）
の化合物を含む、請求項１または請求項２に記載の多量体結合複合体。
【請求項４】
ｍは４を表し、ＣＨＭは式（Ａ）
【化２】
2021514953.tif 000090
（式中、
「
【化３】
2021514953.tif 000091
」は各Ｓ１基への付着ポイントを表す）。
【請求項５】
ｍは３を表し、ＣＨＭは式（Ｂ）、（Ｃ）または（Ｄ）
【化４】
2021514953.tif 000092
のモチーフから選択される、請求項３に記載の多量体結合複合体
（式中、
「
【化５】
2021514953.tif 000093
」は各Ｓ１基への付着ポイントを表す）
のモチーフである、請求項３に記載の多量体結合複合体。
【請求項６】
前記スペーサー（Ｓ１）は、スペーサーであるＳ１Ａ、Ｓ１Ｂ、Ｓ１Ｃ、Ｓ１Ｄ、Ｓ１Ｅ、Ｓ１Ｆ、Ｓ１ＧおよびＳ１Ｈ
【化６】
2021514953.tif 000094
（式中、
「
【化７】
2021514953.tif 000095
」はＣＨＭ基への付着ポイントを表し；かつ
「
【化８】
2021514953.tif 000096
」は二環式基への付着ポイントを表す）
のいずれか１つから選択される、
請求項３〜５のいずれか１項に記載の多量体結合複合体。
【請求項７】
前記スペーサー（Ｓ１）はＳ１Ａである、請求項６に記載の多量体結合複合体。
【請求項８】
前記ペプチドリガンドのそれぞれは、Ｔ細胞またはがん細胞上に存在するエピトープに特異的である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の多量体結合複合体。
【請求項９】
前記二環式ペプチドリガンドは同じ標的に特異的である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の多量体結合複合体。
【請求項１０】
少なくとも２つの同一の二環式ペプチドリガンドを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の多量体結合複合体。
【請求項１１】
少なくとも２つの異なる二環式ペプチドリガンドを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の多量体結合複合体。
【請求項１２】
前記二環式ペプチドリガンドは異なる標的に特異的である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の多量体結合複合体。
【請求項１３】
前記二環式ペプチドリガンドは結合対の片方にコンジュゲートされ、前記結合対の前記もう片方は前記二環式ペプチドのそれぞれを前記スペーサーに連結している、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の多量体結合複合体。
【請求項１４】
前記結合対はビオチンおよびストレプトアビジンを含む、請求項１３に記載の多量体結合複合体。
【請求項１５】
前記ペプチドリガンドの少なくとも１つはＣＤ１３７に特異的であり、例えば、前記ペプチドリガンドのそれぞれはＣＤ１３７に特異的である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の多量体結合複合体。
【請求項１６】
前記ループ配列は、５個または６個のアミノ酸を含み、例えば、ループ配列の両方が６個のアミノ酸からなる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の多量体結合複合体。
【請求項１７】
前記ペプチドリガンドは、
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ（配列番号２３）；
ＣｉＩＫＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ（配列番号２４）；
ＣｉＩＥＫＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ（配列番号２５）；
ＣｉＩＥＥ（Ｄ−Ｋ）ＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ（配列番号２６）；
ＣｉＩＥＥＧＫＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ（配列番号２７）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＫＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ（配列番号２８）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＫＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ（配列番号２９）；および
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹＫＣｉｉｉ（配列番号３０）
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉはそれぞれ第１、第２および第３のシステイン残基を表し、Ｎｌｅはノルロイシンを表す）、
から選択されるコアアミノ酸配列、またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項１５または請求項１６に記載の多量体結合複合体。
【請求項１８】
前記ペプチドリガンドは、Ｎ末端修飾およびＣ末端修飾を含み、
Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３１；本明細書では単量体１およびＢＣＹ３８１４と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ｄａｐ（配列番号３２；本明細書では単量体２およびＢＣＹ７７３２と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＫＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３３；本明細書では単量体３およびＢＣＹ７７３３と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＫＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３４；本明細書では単量体４およびＢＣＹ７７３４と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥ（Ｄ−Ｋ）ＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３５；本明細書では単量体５およびＢＣＹ７７３５と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＫＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３６；本明細書では単量体６およびＢＣＹ７７３６と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＫＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３７；本明細書では単量体７およびＢＣＹ７７３７と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＫＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３８；本明細書では単量体８およびＢＣＹ７７３８と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹＫＣｉｉｉ−Ａ（配列番号３９；本明細書では単量体９およびＢＣＹ７７３９と呼ぶ）；
Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦ［Ｄ−Ａ］ＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号５８；本明細書では単量体１０およびＢＣＹ８２１７と呼ぶ）；
Ａｃ−Ｃｉ［ｔＢｕＡｌａ］ＰＫ［Ｄ−Ａ］ＰＹＣｉｉＦＡＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号５９；本明細書では単量体１１およびＢＣＹ８９１９と呼ぶ）；
Ａｃ−Ｃｉ［ｔＢｕＡｌａ］ＰＥ［Ｄ−Ｋ］ＰＹＣｉｉＦＡＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号６０；本明細書では単量体１２およびＢＣＹ８９２０と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥ［Ｄ−Ｋ］ＧＱＹＣｉｉＦ［Ｄ−Ａ］ＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号６１；本明細書では単量体１３およびＢＣＹ８９１４と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥ［Ｄ−Ｋ］ＧＱＹＣｉｉＦ［Ｄ−Ａ］ＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号６２；本明細書では単量体１４およびＢＣＹ８９１５と呼ぶ）；および
［Ａｃ］−［Ｄ−Ａ］−［Ｄ−Ｃｉ］［Ｄ−Ｉ］［Ｄ−Ｅ］［Ｄ−Ｅ］Ｋ［Ｄ−Ｑ］［Ｄ−Ｙ］［Ｄ−Ｃｉｉ］［Ｄ−Ｆ］［Ｄ−Ａ］［Ｄ−Ｄ］［Ｄ−Ｐ］［Ｄ−Ｙ］［Ｄ−Ｎｌｅ］［Ｄ−Ｃｉｉｉ］−［Ｄ−Ａ］（配列番号６３；本明細書では単量体１５およびＢＣＹ１１０７２と呼ぶ）
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉはそれぞれ第１、第２および第３のシステイン残基を表し、ＡｃはＮ末端のアセチル基を表し、Ｄａｐはジアミノプロピオン酸を表し、ｔＢｕＡｌａはｔ−ブチルアラニンを表し、Ｎｌｅはノルロイシンを表す）、から選択されるアミノ酸配列、またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項１７に記載の多量体結合複合体。
【請求項１９】
前記ペプチドリガンドは、Ｎ末端、Ｃ末端または前記配列内のリジン残基にＰＹＡ部分の付着を含み、
（ＰＹＡ）−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号４０；本明細書では単量体１ＡおよびＢＣＹ７７４０と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ｄａｐ（ＰＹＡ）（配列番号４１；本明細書では単量体２ＡおよびＢＣＹ７７４１と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＫ（ＰＹＡ）ＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号４２；本明細書では単量体３ＡおよびＢＣＹ７７４２と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＫ（ＰＹＡ）ＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号４３；本明細書では単量体４ＡおよびＢＣＹ７７４３と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥ（Ｄ−Ｋ）（ＰＹＡ）ＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号４４；本明細書では単量体５ＡおよびＢＣＹ７７４４と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＫ（ＰＹＡ）ＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号４５；本明細書では単量体６ＡおよびＢＣＹ７７４５と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＫ（ＰＹＡ）ＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号４６；本明細書では単量体７ＡおよびＢＣＹ７７４６と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＫ（ＰＹＡ）Ｙ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号４７；本明細書では単量体８ＡおよびＢＣＹ７７４７と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹＫ（ＰＹＡ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号４８；本明細書では単量体９ＡおよびＢＣＹ７７４８と呼ぶ）；
（ＰＹＡ）−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦ［Ｄ−Ａ］ＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号６４；本明細書では単量体１０ＡおよびＢＣＹ８９３５と呼ぶ）；
Ａｃ−Ｃｉ［ｔＢｕＡｌａ］ＰＫ（ＰＹＡ）［Ｄ−Ａ］ＰＹＣｉｉＦＡＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号６５；本明細書では、単量体１１ＡおよびＢＣＹ８９２７と呼ぶ）；
Ａｃ−Ｃｉ［ｔＢｕＡｌａ］ＰＥ［Ｄ−Ｋ（ＰＹＡ）］ＰＹＣｉｉＦＡＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号６６；本明細書では単量体１２ＡおよびＢＣＹ８９２９と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥ［Ｄ−Ｋ（ＰＹＡ）］ＧＱＹＣｉｉＦ［Ｄ−Ａ］ＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号６７；本明細書では単量体１３ＡおよびＢＣＹ８９２５と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥ［Ｋ（ＰＹＡ）］ＧＱＹＣｉｉＦ［Ｄ−Ａ］ＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号６８；本明細書では単量体１４ＡおよびＢＣＹ８９２６と呼ぶ）；および
［Ａｃ］−［Ｄ−Ａ］−［Ｄ−Ｃｉ］［Ｄ−Ｉ］［Ｄ−Ｅ］［Ｄ−Ｅ］［Ｋ（ＰＹＡ）］［Ｄ−Ｑ］［Ｄ−Ｙ］［Ｄ−Ｃｉｉ］［Ｄ−Ｆ］［Ｄ−Ａ］［Ｄ−Ｄ］［Ｄ−Ｐ］［Ｄ−Ｙ］［Ｄ−Ｎｌｅ］［Ｄ−Ｃｉｉｉ］−［Ｄ−Ａ］（配列番号６９；本明細書では、単量体１５ＡおよびＢＣＹ１１５０６と呼ぶ）、
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉはそれぞれ第１、第２および第３のシステイン残基を表し、ＡｃはＮ末端のアセチル基を表し、Ｄａｐはジアミノプロピオン酸を表し、ＰＹＡはプロパルギル酸を表し、ｔＢｕＡｌａはｔ−ブチルアラニンを表し、Ｎｌｅはノルロイシンを表す）
から選択されるアミノ酸配列、またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項１７または請求項１８に記載の多量体結合複合体。
【請求項２０】
前記ペプチドリガンドは、Ｎ末端または前記配列内のリジン残基にＢＣＮ部分の付着を含み、
（ＢＣＮ）−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号４９；本明細書では、単量体１−ＢＣＮおよびＢＣＹ８１４１と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＫ（ＢＣＮ）ＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号５０；本明細書では、単量体３−ＢＣＮおよびＢＣＹ８０９５と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＫ（ＢＣＮ）ＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号５１；本明細書では、単量体４−ＢＣＮおよびＢＣＹ８１４２と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥ［（Ｄ−Ｋ）（ＢＣＮ）］ＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号５２；本明細書では単量体５−ＢＣＮおよびＢＣＹ８０９６と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＫ（ＢＣＮ）ＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号５３；本明細書では、単量体６−ＢＣＮおよびＢＣＹ８１４３と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＫ（ＢＣＮ）ＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号５４；本明細書では単量体７−ＢＣＮおよびＢＣＹ８１４４と呼ぶ）；および
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹＫ（ＢＣＮ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号５５；本明細書では、単量体９−ＢＣＮおよびＢＣＹ８０９７と呼ぶ）；
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉはそれぞれ第１、第２および第３のシステイン残基を表し、ＡｃはＮ末端のアセチル基を表し、Ｎｌｅはノルロイシンを表し、ＢＣＮは
【化９】
2021514953.tif 000097
を表す）
から選択されるアミノ酸配列、またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項１７から１９のいずれか１項に記載の多量体結合複合体。
【請求項２１】
前記反応基はシステインを含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の多量体結合複合体。
【請求項２２】
前記分子足場は、１，１’，１”−（１，３，５−トリアジナン−１，３，５−トリイル）トリプロパ−２−エン−１−オン（ＴＡＴＡ）である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の多量体結合複合体。
【請求項２３】
表１に列挙された三量体または表２に列挙された四量体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の多量体結合複合体。
【請求項２４】
ＢＣＹ７７４９、ＢＣＹ７７５０、ＢＣＹ７８３５およびＢＣＹ７８３９から選択される三量体、またはＢＣＹ７７５１、ＢＣＹ７７５２、ＢＣＹ７８４５、ＢＣＹ７８４６、ＢＣＹ７８２９、ＢＣＹ７８３８、ＢＣＹ７８４２、ＢＣＹ８９４５およびＢＣＹ８９４７から選択される四量体、例えば、ＢＣＹ７８３９である三量体、または例えば、ＢＣＹ７８４２、ＢＣＹ８９４５およびＢＣＹ８９４７から選択される四量体である、請求項２３に記載の多量体結合複合体。
【請求項２５】
前記薬学的に許容される塩は、遊離酸、またはナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム塩から選択される、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の多量体結合複合体。
【請求項２６】
前記ＣＤ１３７はヒトＣＤ１３７である、請求項１５〜２４のいずれか１項に記載の多量体結合複合体。
【請求項２７】
１個もしくは複数のエフェクター基および／または官能基にコンジュゲートされた、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の多量体結合複合体を含む薬物コンジュゲート。
【請求項２８】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の多量体結合複合体または請求項２７に記載の薬物コンジュゲートを、１または複数の薬学的に許容される賦形剤との組合せで含む医薬組成物。
【請求項２９】
ＣＤ１３７が媒介する疾患または障害を予防、抑制または処置に使用するための、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の多量体結合複合体または請求項２７に記載の薬物コンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２個以上のペプチドループが足場への付着ポイントの間に張られるように分子足場に共有結合しているポリペプチドの多量体に関する。本発明はまた、ポリペプチド内の付着の異なる部位を使用した種々の長さおよび剛性の種々の化学リンカーおよび化学ヒンジを介した、ポリペプチドの多量体化について記載する。具体的には、本発明は、ＣＤ１３７の高親和性結合剤および活性化因子である、ペプチドの多量体について記載する。本発明はまた、１個もしくは複数のエフェクター基および／または官能基にコンジュゲートされた、前記ペプチドを含む薬物コンジュゲート、前記ペプチドリガンドおよび薬物コンジュゲートを含む医薬組成物、ならびにＣＤ１３７が媒介する疾患または障害の予防、抑制または処置における前記ペプチドリガンドおよび薬物コンジュゲートの使用を包合する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質間相互作用は細胞機能の重要な調節因子である。これらの相互作用には通常、大きな表面積が関与し、したがって、それを通常の小分子治療薬を使用して阻害または模倣することはなかなかできない。加えて、重要な多数の受容体クラス（受容体チロシンキナーゼ、サイトカイン受容体、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体、Ｔ細胞受容体およびＧタンパク質共役受容体）は、受容体シグナル伝達経路を活性化するために、特定の配向での受容体単量体単位のオリゴマー化が必要である。モノクローナル抗体および融合タンパク質（例えばリガンドＦｃ融合）などの組換えタンパク質は、親和性が高くかつ相互作用表面積が広く、多価結合の能力があることから、かかる受容体に結合し、オリゴマー化を誘導することができる。しかし、大きなタンパク質は、組織への浸透の点で非効率的であり、受容体をモジュレートするのに、特に乏血管性である細胞または膵臓がんに見られる間質バリアなどの浸透に対するバリアに囲まれている細胞で見られる受容体をモジュレートするのに理想的な治療法ではない場合もある。小分子よりも相互作用表面が大きい、小さな合成およびモジュール式の治療法は、浸透バリアをバイパスし、オリゴマー化によって標的受容体を活性化するのに理想的であろう。
【０００３】
種々の種類のがんの処置における抗ＰＤ−１抗体および抗ＰＤ−Ｌ１抗体などの免疫チェックポイント阻害剤の最近の成功によって、Ｔ細胞上のＣＤ１３７を含めて、共刺激標的を活性化する分子への関心が高まってきた。ＣＤ１３７（４−１  ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９）はＴＮＦ受容体スーパーファミリーに属し、Ｔ細胞に共刺激シグナル伝達をもたらす。
【０００４】
誘導性ＣＤ１３７発現が、活性化Ｔ、Ｂ、樹状およびナチュラルキラー（ＮＫ）の各細胞に見られる。その天然リガンドであるＣＤ１３７Ｌによる、またはアゴニスト抗体によるＣＤ１３７の刺激は、活発なＴ細胞増殖を誘導し、活性化誘導細胞死を防止する。４−１  ＢＢは、ＴＲＡＦ−１との組合せで２つのＴＮＦ受容体関連因子ＴＲＡＦ−２複合体からなるヘテロ三量体複合体を形成する。白血球特異的タンパク質−１（ＬＳＰ−１）を介したこの相互作用によって、ＪＮＫ経路およびＥＲＫ経路を介した、ならびに、β−カテニンおよびＡＫＴを介したシグナル伝達が強まる。これらのシグナル伝達経路は、マスター転写因子ＮＦ−κＢに収束して、４−１  ＢＢシグナル伝達ならびにエフェクター免疫応答を調節する。
【０００５】
アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体は、マウスモデルにおいて強力で、しばしば治癒的な抗腫瘍活性を示してきた。その抗腫瘍活性は、抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体との組合せでさらにもっと増強される。これらの効果は細胞傷害性Ｔ細胞によって主に媒介され、持続する記憶応答を生みだす。２つのヒト抗ＣＤ１３７抗体が現在臨床試験を受けている。ウレルマブ（ｕｒｅｌｕｍａｂ）は黒色腫で単剤、部分応答を示したが、用量≧１ｍｇ／ｋｇで肝毒性が観察され、結果として、至適用量以下量（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ  ｄｏｓｅ）０．１ｍｇ／ｋｇでその他の免疫療法と併用されている。ウトリムマブ（ｕｔｏｌｉｍｕｍａｂ）も他の免疫療法との組合せで固形腫瘍でも評価されおり、肝臓毒性は５ｍｇ／ｋｇまで観察されなかったが、単剤活性はほとんどまたはまったくない。
【０００６】
環状ペプチドは、タンパク質標的に高い親和性および標的特異性で結合することができ、したがって治療法の開発にとって魅力的な分子クラスである。実際に、例えば、抗菌性ペプチドのバンコマイシン、免疫抑制薬のシクロスポリンまたは抗がん薬のオクトレオチドのような、いくつかの環状ペプチドが、診療所において既に首尾よく使用されている（Ｄｒｉｇｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ７（７），６０８−２４）。良好な結合特性は、ペプチドと標的との間に相対的に大きな相互作用表面が形成されること、ならびに、環状構造のコンホメーション上の柔軟性が低減すること、の結果である。通常、大員環は、例えば、環状ペプチドＣＸＣＲ４アンタゴニストＣＶＸ１５（４００Å２；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３０，１０６６−７１）、インテグリンαＶβ３に結合しているＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを有する環状ペプチド（３５５Å２）（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６（５５６５），１５１−５）またはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子に結合している環状ペプチド阻害剤ウパイン（ｕｐａｉｎ）−１（６０３Å２；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  １６０（１），１−１０）のように、数百平方オングストロームの表面に結合する。
【０００７】
Ｂｉｃｙｃｌｅｓ（登録商標）は、従来の小分子アプローチでは達成不可能な高親和性と絶妙なターゲット特異性とを有する、完全合成であり、制約された二環式ペプチドの新規な治療クラスである。Ｂｉｃｙｃｌｅ（登録商標）プラットフォームでは、ファージディスプレイを使用して結合剤を迅速に同定かつ最適化し、次いで、この結合剤を、容易に化学的に最適化して親和性および物理化学的特性を調整する。それが小サイズ（１．５〜２ｋＤａ）であることで、腫瘍浸透において利点がもたらされ、腎排泄が速やかであることによって、ある特定の抗体を含めて、他の薬物手法にしばしば伴う肝臓および消化管の毒性が回避される。腎クリアランスが速やかで、Ｆｃ受容体相互作用のないＢｉｃｙｃｌｅ（登録商標）ＣＤ１３７アゴニストは、肝臓毒性を回避しながら抗腫瘍活性を誘導する可能性がある。
【０００８】
広範囲の効力と効能を持ってその標的に結合しかつ活性化する、代替の二環式ペプチドを提供する必要がある。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の第１の態様によれば、同一でも異なっていてもよい少なくとも２つの二環式ペプチドリガンドを含む多量体結合複合体であって、二環式ペプチドリガンドのそれぞれは、少なくとも２個のループ配列によって隔てられた少なくとも３個の反応基を含むポリペプチドと、上記ポリペプチドの上記反応基と共有結合を形成する分子足場と、
を含み、その結果、少なくとも２個のポリペプチドループが上記分子足場上に形成されている、多量体結合複合体が提供される。
【００１０】
本発明のさらなる態様によれば、１個もしくは複数のエフェクター基および／または官能基にコンジュゲートされた、本明細書で定義の多量体結合複合体を含む薬物コンジュゲートが提供される。
【００１１】
本発明のさらなる態様によれば、本明細書で定義される多量体結合複合体または薬物コンジュゲートを、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤との組合せで含む医薬組成物が提供される。
【００１２】
本発明のさらなる態様によれば、ＣＤ１３７が媒介する疾患または障害などの、疾患または障害を予防、抑制または処置するのに使用するための、本明細書で定義の多量体結合複合体または薬物コンジュゲートが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＣＤ１３７Ｌと比較した、三量体であるＢＣＹ７８２７およびＢＣＹ７８２８、ならびに四量体であるＢＣＹ７８２９およびＢＣＹ７８３０について得られたレポーター細胞活性アッセイのデータである。
【図２】単量体ＢＣＹ５９２およびＣＤ１３７リガンドと比較した、三量体であるＢＣＹ７７４９およびＢＣＹ７７５０ならびに四量体であるＢＣＹ７７５１およびＢＣＹ７７５２について得られたレポーター細胞活性アッセイのデータである。
【図３】ＤＭＳＯ対照およびＣＤ１３７リガンドと比較した、四量体であるＢＣＹ７８４５およびＢＣＹ７８４６について得られたレポーター細胞活性アッセイのデータである。
【図４】ＢＣＹ７８２９の血漿安定性を示すデータである。
【図５Ａ】ＣＤ−１マウスにおける５ｍｇ／ｋｇ（６．３５ｍｇ／ｋｇ測定）のＩＶ投与後のＢＣＹ７８２９の平均血漿濃度を示すデータである。
【図５Ｂ】ＣＤ−１マウスにおけるＩＶ投与後のＢＣＹ７８３５およびＢＣＹ７８３８の平均血漿濃度を示すデータである。
【図６】マウス血漿におけるＣＤ１３７多量体の安定性を示すデータである。
【図７】ＭＣ３８同系腫瘍を保有するＣ５７ＢＬ／６Ｊ  Ｂ−ｈ４−１ＢＢヒト化マウスにＣＤ１３７多量体を投与した後の腫瘍体積のトレースである。データポイントは、群の平均腫瘍体積を表す。エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表す。
【図８】ＭＣ３８同系腫瘍を保有するＣ５７ＢＬ／６Ｊ  Ｂ−ｈ４−１ＢＢヒト化マウスに多量体二環式ペプチドを投与した後の腫瘍体積のトレースである。データポイントは、群の平均腫瘍体積を表す。エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表す。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、多重比較のためのダネット検定による２元配置ＡＮＯＶＡ。
【図９】２１日の処置期間にわたって、ＭＣ３８同系腫瘍を保有するＣ５７ＢＬ／６Ｊ  Ｂ−ｈ４−１ＢＢヒト化マウスに多量体二環式ペプチドを投与した後の腫瘍組織におけるＣＤ４５＋細胞のうちのＣＤ３＋細胞の百分率である。データポイントは、個々のマウスからの細胞集団の百分率を表し、ラインおよびエラーバーは平均および標準偏差（ＳＤ）を表す。＊＊ｐ＜０．０１、多重比較のためのダネット検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。
【図１０】２１日の処置期間にわたって、ＭＣ３８同系腫瘍を保有するＣ５７ＢＬ／６Ｊ  Ｂ−ｈ４−１ＢＢヒト化マウスに多量体二環式ペプチドを投与した後の腫瘍組織におけるＣＤ４５＋ＣＤ３＋細胞のうちのＣＤ８＋細胞の百分率である。データポイントは、個々のマウスからの細胞集団の百分率を表し、ラインおよびエラーバーは平均および標準偏差（ＳＤ）を表す。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、多重比較のためのダネット検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。
【図１１】２１日の処置期間にわたって、ＭＣ３８同系腫瘍を保有するＣ５７ＢＬ／６Ｊ  Ｂ−ｈ４−１ＢＢヒト化マウスに多量体二環式ペプチドを投与した後の腫瘍組織におけるＣＤ４５＋ＣＤ３＋細胞のうちのＣＤ４＋細胞の百分率である。データポイントは、個々のマウスからの細胞集団の百分率を表し、ラインおよびエラーバーは平均および標準偏差（ＳＤ）を表す。＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、多重比較のためのダネット検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。
【図１２】２つの黒色腫腫瘍の３Ｄスフェロイド培養中２日後の、未処理の対照に対して正規化された、細胞死の百分率である。フローサイトメトリーで決定された、（Ａ）腫瘍細胞はライブＣＤ４５陰性集団であり、（Ｂ）リンパ球はライブＣＤ４５陽性集団である。有意性については、二元配置ＡＮＯＶＡの多重比較を使用して、計算される、ｐ＜０．０５。
【図１３】ＣＤ１３７多量体がウォッシュアウト後も活性を維持している、図である。ＣＤ１３７レポーター細胞を、化合物のウォッシュアウト前に３０、６０、または１２０分間化合物に曝露し、活性をそれぞれ５．５、５、または４時間後に測定する。「ウォッシュアウト無し」の条件では、細胞を６時間の完全なインキュベーションの間、化合物に曝露する。
【図１４】ＣＤ１３７多量体が、初代Ｔ細胞アッセイでサイトカイン分泌の増加をもたらす、図である。ＣＤ１３７の発現が、抗ＣＤ３抗体を使用してＴ細胞（ヒトＰＢＭＣから分離）で誘導されている。次いで、Ｔ細胞をＣＤ１３７多量体、ＣＤ１３７単量体（陰性対照）、またはＣＤ１３７モノクローナル抗体アゴニストで４８時間処理し、ＨＴＲＦアッセイを使用して、上清中のＩＬ−２レベル（Ａ）およびＩＦＮγ（Ｂ）を測定した。
【図１５】ＢＣＹ７８３９、ＢＣＹ７８４２、ＢＣＹ８９４５およびＢＣＹ８９４７について得られたレポーター細胞活性アッセイのデータである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の第１の態様によれば、
同一でも異なっていてもよい少なくとも２つの二環式ペプチドリガンドを含む多量体結合複合体であって、
二環式ペプチドリガンドのそれぞれは、
少なくとも２個のループ配列によって隔てられた少なくとも３個の反応基を含むポリペプチドと、
上記ポリペプチドの上記反応基と共有結合を形成する分子足場と、
を含み、その結果、少なくとも２個のポリペプチドループが上記分子足場上に形成されている、多量体結合複合体が提供される。
【００１５】
本発明は、広範囲の効力と効能を持って、標的（ＣＤ１３７など）に結合しかつ活性化する前記二環式ペプチド内の付着の異なる部位を使用して、種々の長さおよび剛性を有する種々の化学リンカーおよび化学ヒンジを備える、一連の多量体化二環式ペプチドを開示する。
【００１６】
本発明の概念は、多重に配置された（多量体）二環式ペプチドによれば、単一の二環式ペプチドを含有する相応する単量体結合複合体と比較して、前記多量体結合複合体の結果として生じる特性の力で相乗的効果が提供されるという認識であることは当業者であれば理解されよう。例えば、本発明の多量体結合複合体は典型的には、それらの単量体相対物よりも大きなレベルの結合能または結合アビディティー（本明細書ではＫｄ値により測定）を有する。さらに、本発明の多量体結合複合体は、腎臓によって取り除かれるのに足るほどに十分に小さく設計されている。
【００１７】
本発明の複合体は、がんの処置において特定の有用性を見いだすものである。したがって、一実施形態では、前記ペプチドリガンドのうちの１つは、Ｔ細胞またはがん細胞上に存在するエピトープに特異的である。さらなる実施形態では、前記ペプチドリガンドのそれぞれは、Ｔ細胞またはがん細胞上に存在するエピトープに特異的である。
【００１８】
理論に拘泥するものではないが、多量体化二環式ペプチドは、同じ受容体の２つ以上をホモ架橋結合（ｈｏｍｏ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）することによって受容体を活性化することができると考えられる。したがって、一実施形態では、前記二環式ペプチドリガンドは同じ標的に特異的である。さらなる実施形態では、多量体結合複合体は、少なくとも２つの同一の二環式ペプチドリガンドを含む。「同一」とは、同じアミノ酸配列を有する二環式ペプチドを意味し、最も重要なことは、同じアミノ酸配列は、前記二環式ペプチドの結合部分を指す（例えば、配列は、付着位置においては異なる場合がある）。この実施形態では、多量体結合複合体内の二環式ペプチドのそれぞれは、同じ標的上の同じエピトープに正確に結合することになる。したがって、結果として生じる標的結合複合体は、ホモ二量体（多量体複合体が同一の２つの二環式ペプチドを含む場合）、ホモ三量体（多量体複合体が同一の３つの二環式ペプチドを含む場合）、またはホモ四量体（多量体複合体が同一の４つの二環式ペプチドを含む場合）等を創出することになる。
【００１９】
代替の実施形態では、多量体結合複合体は、少なくとも２つの異なる二環式ペプチドリガンドを含む。「異なる」とは、二環式ペプチドが異なるアミノ酸配列を有することを意味する。この実施形態では、多量体結合複合体内の異なる二環式ペプチドリガンドは、同じ標的上の異なるエピトープに結合することになる。したがって、結果として生じる標的結合複合体は、二重パラトピック（多量体複合体が異なる２つの二環式ペプチドを含む場合）、三重パラトピック（多量体複合体が異なる３つの二環式ペプチドを含む場合）、または四重パラトピック（多量体複合体が異なる４つの二環式ペプチドを含む場合）等を創出することになる。
【００２０】
理論に拘泥するものではないが、多量体化二環式ペプチドは、異なる標的受容体などの、異なる標的をヘテロ架橋結合することによって受容体を活性化することができると考えられる。したがって、一実施形態では、前記二環式ペプチドリガンドは、異なる標的に特異的である。この実施形態では、多量体結合複合体は、少なくとも２つの異なる二環式ペプチドリガンド（すなわち、異なるアミノ酸配列を有する二環式ペプチドリガンド）を含むことが理解されよう。この実施形態では、多量体結合複合体内の二環式ペプチドそれぞれは、異なる標的上の異なるエピトープに結合することになる。したがって、結果として生じる標的結合複合体は、二重特異性の多量体結合複合体（多量体複合体が異なる２つの二環式ペプチドを含む場合）、三重特異性の多量体結合複合体（多量体複合体が異なる３つの二環式ペプチドを含む場合）、または四重特異性の多量体結合複合体（多量体複合体が異なる４つの二環式ペプチドを含む場合）等を創出することになる。
【００２１】
本発明の多量体結合複合体は、受容体などの、ある範囲の異なる標的に結合することができるように設計できることが理解されよう。適切な例には、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（すなわちＣＤ１３７）のメンバー、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、Ｉｇドメイン受容体（免疫チェックポイント）のメンバーなどの、がんに関与するあらゆる標的（すなわち受容体）が含まれる。上で言及された二重特異性、三重特異性および四重特異性の多量体結合複合体の場合、二環式ペプチドは、少なくとも２つの異なる細胞（Ｔ、ＮＫまたはその他の免疫細胞など）上の標的に結合し得ることが理解されよう。
【００２２】
本発明の多量体結合複合体内の二環式ペプチドは、いくつかの異なるオプションによって組み立てることができる。例えば、そのそれぞれが二環式ペプチドを含有することになるスペーサーまたはアーム要素が中央のヒンジまたは分岐ポイントから四方に伸びている状態で、前記ヒンジまたは分岐部分は存在してもよい。あるいは、環状の支持メンバーが、内向きまたは外向きに突き出ているいくつかの二環式ペプチドを保持する場合もあることが想定し得る。
【００２３】
一実施形態では、各二環式ペプチドリガンドは、スペーサー基によって中央のヒンジ部分に接続されている。
【００２４】
スペーサー基は直鎖状とすることができ、単一の二環式ペプチドを中央のヒンジ部分と接続し得ることが理解されよう。したがって、一実施形態では、多量体結合複合体は、式（Ｉ）
【化１】
2021514953.tif 000003
の化合物
（式中、
ＣＨＭは中央のヒンジ部分を表し；
Ｓ１はスペーサー基を表し；
二環は本明細書で定義の二環式ペプチドリガンドを表し；かつ
ｍは２〜１０から選択される整数を表す）
を含む。
【００２５】
一実施形態では、ｍは３〜１０から選択される整数を表す。さらなる実施形態では、ｍは３または４から選択される整数を表す。三量体（ｍ＝３）および四量体（ｍ＝４）を用いて最適な結果が達成されたことを示すデータが本明細書で提示される。ｍが４を表す場合、中央のヒンジ部分には４つの付着ポイントが必要となること、が理解されよう。したがって、一実施形態では、ｍは４を表し、ＣＨＭは式（Ａ）
【化２】
2021514953.tif 000004
（式中、
「
【化３】
2021514953.tif 000005
」は各Ｓ１基への付着ポイントを表す）
のモチーフである。
【００２６】
ｍが３を表す場合、中央のヒンジ部分には３つの付着ポイントが必要になることが理解されよう。したがって、一実施形態では、ｍは３を表し、ＣＨＭは式（Ｂ）
【化４】
2021514953.tif 000006
（式中、
「
【化５】
2021514953.tif 000007
」は各Ｓ１基への付着ポイントを表す）
のモチーフである。
【００２７】
代替の実施形態では、ｍは３を表し、ＣＨＭは式（Ｃ）
【化６】
2021514953.tif 000008
（式中、
「
【化７】
2021514953.tif 000009
」は各Ｓ１基への付着ポイントを表す）
のモチーフである。
【００２８】
代替の実施形態では、ｍは３を表し、ＣＨＭは式（Ｄ）
【化８】
2021514953.tif 000010
（式中、
「
【化９】
2021514953.tif 000011
」は各Ｓ１基への付着ポイントを表す）
のモチーフである。
【００２９】
ｍの値に応じて、代替の中央のヒンジ部分を構築し得る方法は、当業者であれば容易に明らかであろう。
【００３０】
スペーサー（Ｓ１）は、二環式ペプチドの中央のヒンジ部分を二環式ペプチドに連結するのに適切な任意の構造とすることができることが理解されよう。一実施形態では、スペーサー（Ｓ１）はトリアゾリル部分を含む。この実施形態の利点は、トリアゾリル部分を、一般に利用可能な「クリック」ケミストリーを使用して合成中に導入し得ることである。適切なスペーサー（Ｓ１）基の例には、１つまたは複数のＰＥＧ部分、ペプチド配列、炭水化物、脂質等が含まれる。
【００３１】
さらなる実施形態では、スペーサー（Ｓ１）は、１つまたは複数のＰＥＧ部分を含む。本明細書での「ＰＥＧ」への言及は、一般構造、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−（式中、ｎは１〜３０などの任意の数を表す）の規則的な繰り返し単位を有する直鎖状ポリマーを指す。
【００３２】
したがって、さらなる実施形態では、スペーサー（Ｓ１）は、スペーサーであるＳ１Ａ、Ｓ１Ｂ、Ｓ１Ｃ、Ｓ１Ｄ、Ｓ１Ｅ、Ｓ１Ｆ、Ｓ１ＧおよびＳ１Ｈ
【化１０】
2021514953.tif 000012
（式中、
「
【化１１】
2021514953.tif 000013
」はＣＨＭ基への付着ポイントを表し；かつ
「
【化１２】
2021514953.tif 000014
」は二環式基への付着ポイントを表す）
のいずれか１つから選択される。
【００３３】
さらに別の実施形態では、スペーサー（Ｓ１）はＳ１Ａである。
【００３４】
代替の配置では、スペーサー基は分岐状とすることができ、したがって単一のスペーサー基が複数の二環式ペプチドを中央のヒンジ部分と接続することができる。したがって、代替の実施形態では、多量体結合複合体は、式（ＩＩ）
【化１３】
2021514953.tif 000015
（式中、
ＣＨＭは中央のヒンジ部分を表し；
Ｓ１はスペーサー基を表し；
二環式は本明細書で定義の二環式ペプチドリガンドを表し；かつ
ｍは２〜１０から選択される整数を表す）
の化合物を含む。
【００３５】
二環式ペプチドリガンドは、いくつかの手段によってスペーサーに付け得ることが理解されよう。一実施形態では、二環式ペプチドリガンドは結合対の片方にコンジュゲートされ、前記結合対の前記もう片方は二環式ペプチドのそれぞれをスペーサーに連結している。
【００３６】
一実施形態では、前記結合対はビオチンおよびストレプトアビジンを含む。したがって、各二環式ペプチドリガンドはビオチンにコンジュゲートされ、ストレプトアビジンを介してスペーサーに連結されている。
【００３７】
＜二環式ペプチド＞
本明細書の多量体結合複合体は、複数の単量体二環式ペプチドを含むことになることが理解されよう。一実施形態では、前記ペプチドリガンド（すなわち、単量体）のそれぞれは、ＣＤ１３７に特異的である。
【００３８】
ＣＤ１３７二環式ペプチド単量体
一実施形態では、前記ループ配列は、５個または６個のアミノ酸を含む。
【００３９】
さらなる実施形態では、前記ループ配列は、その両方が６個のアミノ酸からなる２個のループ配列によって隔てられた３個のシステイン残基を含む。
【００４０】
さらに別の実施形態では、
前記ペプチドリガンドは、
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ（配列番号２３）；
ＣｉＩＫＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ（配列番号２４）；
ＣｉＩＥＫＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ（配列番号２５）；
ＣｉＩＥＥ（Ｄ−Ｋ）ＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ（配列番号２６）；
ＣｉＩＥＥＧＫＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ（配列番号２７）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＫＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ（配列番号２８）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＫＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ（配列番号２９）；および
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹＫＣｉｉｉ（配列番号３０）、
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉはそれぞれ第１、第２および第３のシステイン残基を表し、Ｎｌｅはノルロイシンを表す）、
から選択されるコアアミノ酸配列、
またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００４１】
さらに別の実施形態では、
前記ペプチドリガンドはＮ末端修飾およびＣ末端修飾を含み、
Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３１；本明細書では単量体１およびＢＣＹ３８１４と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ｄａｐ（配列番号３２；本明細書では単量体２およびＢＣＹ７７３２と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＫＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３３；本明細書では単量体３およびＢＣＹ７７３３と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＫＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３４；本明細書では単量体４およびＢＣＹ７７３４と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥ（Ｄ−Ｋ）ＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３５；本明細書では単量体５およびＢＣＹ７７３５と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＫＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３６；本明細書では単量体６およびＢＣＹ７７３６と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＫＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３７；本明細書では単量体７およびＢＣＹ７７３７と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＫＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３８；本明細書では単量体８およびＢＣＹ７７３８と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹＫＣｉｉｉ−Ａ（配列番号３９；本明細書では単量体９およびＢＣＹ７７３９と呼ぶ）；
Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦ［Ｄ−Ａ］ＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号５８；本明細書では単量体１０およびＢＣＹ８２１７と呼ぶ）；
Ａｃ−Ｃｉ［ｔＢｕＡｌａ］ＰＫ［Ｄ−Ａ］ＰＹＣｉｉＦＡＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号５９；本明細書では単量体１１およびＢＣＹ８９１９と呼ぶ）；
Ａｃ−Ｃｉ［ｔＢｕＡｌａ］ＰＥ［Ｄ−Ｋ］ＰＹＣｉｉＦＡＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号６０；本明細書では単量体１２およびＢＣＹ８９２０と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥ［Ｄ−Ｋ］ＧＱＹＣｉｉＦ［Ｄ−Ａ］ＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号６１；本明細書では単量体１３およびＢＣＹ８９１４と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥ［Ｄ−Ｋ］ＧＱＹＣｉｉＦ［Ｄ−Ａ］ＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号６２；本明細書では単量体１４およびＢＣＹ８９１５と呼ぶ）；および
［Ａｃ］−［Ｄ−Ａ］−［Ｄ−Ｃｉ］［Ｄ−Ｉ］［Ｄ−Ｅ］［Ｄ−Ｅ］Ｋ［Ｄ−Ｑ］［Ｄ−Ｙ］［Ｄ−Ｃｉｉ］［Ｄ−Ｆ］［Ｄ−Ａ］［Ｄ−Ｄ］［Ｄ−Ｐ］［Ｄ−Ｙ］［Ｄ−Ｎｌｅ］［Ｄ−Ｃｉｉｉ］−［Ｄ−Ａ］（配列番号６３；本明細書では単量体１５およびＢＣＹ１１０７２と呼ぶ）
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉはそれぞれ第１、第２および第３のシステイン残基を表し、ＡｃはＮ末端のアセチル基を表し、Ｄａｐはジアミノプロピオン酸を表し、ｔＢｕＡｌａはｔ−ブチルアラニンを表し、Ｎｌｅはノルロイシンを表す）、
から選択されるアミノ酸配列、
またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００４２】
なおさらに別の実施形態では、
前記ペプチドリガンドはＮ末端修飾およびＣ末端修飾を含み、
Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３１；本明細書では単量体１およびＢＣＹ３８１４と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ｄａｐ（配列番号３２；本明細書では単量体２およびＢＣＹ７７３２と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＫＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３３；本明細書では単量体３およびＢＣＹ７７３３と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＫＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３４；本明細書では単量体４およびＢＣＹ７７３４と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥ（Ｄ−Ｋ）ＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３５；本明細書では単量体５およびＢＣＹ７７３５と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＫＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３６；本明細書では単量体６およびＢＣＹ７７３６と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＫＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３７；本明細書では単量体７およびＢＣＹ７７３７と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＫＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３８；本明細書では単量体８およびＢＣＹ７７３８と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹＫＣｉｉｉ−Ａ（配列番号３９；本明細書では単量体９およびＢＣＹ７７３９と呼ぶ）、
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉはそれぞれ第１、第２および第３のシステイン残基を表し、ＡｃはＮ末端のアセチル基を表し、Ｄａｐはジアミノプロピオン酸を表し、Ｎｌｅはノルロイシンを表す）
から選択されるアミノ酸配列、
またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００４３】
さらに別の実施形態では、
前記ペプチドリガンドは、Ｎ末端、Ｃ末端または前記配列内のリジン残基にＰＹＡ部分の付着を含み、
（ＰＹＡ）−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号４０；本明細書では単量体１ＡおよびＢＣＹ７７４０と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ｄａｐ（ＰＹＡ）（配列番号４１；本明細書では単量体２ＡおよびＢＣＹ７７４１と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＫ（ＰＹＡ）ＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号４２；本明細書では単量体３ＡおよびＢＣＹ７７４２と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＫ（ＰＹＡ）ＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号４３；本明細書では単量体４ＡおよびＢＣＹ７７４３と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥ（Ｄ−Ｋ）（ＰＹＡ）ＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号４４；本明細書では単量体５ＡおよびＢＣＹ７７４４と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＫ（ＰＹＡ）ＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号４５；本明細書では単量体６ＡおよびＢＣＹ７７４５と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＫ（ＰＹＡ）ＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号４６；本明細書では単量体７ＡおよびＢＣＹ７７４６と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＫ（ＰＹＡ）Ｙ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号４７；本明細書では単量体８ＡおよびＢＣＹ７７４７と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹＫ（ＰＹＡ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号４８；本明細書では単量体９ＡおよびＢＣＹ７７４８と呼ぶ）；
（ＰＹＡ）−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦ［Ｄ−Ａ］ＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号６４；本明細書では単量体１０ＡおよびＢＣＹ８９３５と呼ぶ）；
Ａｃ−Ｃｉ［ｔＢｕＡｌａ］ＰＫ（ＰＹＡ）［Ｄ−Ａ］ＰＹＣｉｉＦＡＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号６５；本明細書では、単量体１１ＡおよびＢＣＹ８９２７と呼ぶ）。
Ａｃ−Ｃｉ［ｔＢｕＡｌａ］ＰＥ［Ｄ−Ｋ（ＰＹＡ）］ＰＹＣｉｉＦＡＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号６６；本明細書では単量体１２ＡおよびＢＣＹ８９２９と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥ［Ｄ−Ｋ（ＰＹＡ）］ＧＱＹＣｉｉＦ［Ｄ−Ａ］ＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号６７；本明細書では単量体１３ＡおよびＢＣＹ８９２５と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥ［Ｋ（ＰＹＡ）］ＧＱＹＣｉｉＦ［Ｄ−Ａ］ＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号６８；本明細書では単量体１４ＡおよびＢＣＹ８９２６と呼ぶ）；および
［Ａｃ］−［Ｄ−Ａ］−［Ｄ−Ｃｉ］［Ｄ−Ｉ］［Ｄ−Ｅ］［Ｄ−Ｅ］［Ｋ（ＰＹＡ）］［Ｄ−Ｑ］［Ｄ−Ｙ］［Ｄ−Ｃｉｉ］［Ｄ−Ｆ］［Ｄ−Ａ］［Ｄ−Ｄ］［Ｄ−Ｐ］［Ｄ−Ｙ］［Ｄ−Ｎｌｅ］［Ｄ−Ｃｉｉｉ］−［Ｄ−Ａ］（配列番号６９；本明細書では、単量体１５ＡおよびＢＣＹ１１５０６と呼ぶ）、
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉはそれぞれ第１、第２および第３のシステイン残基を表し、ＡｃはＮ末端のアセチル基を表し、Ｄａｐはジアミノプロピオン酸を表し、ＰＹＡはプロパルギル酸を表し、ｔＢｕＡｌａはｔ−ブチルアラニンを表し、Ｎｌｅはノルロイシンを表す）、
から選択されるアミノ酸配列、
またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００４４】
なおさらに別の実施形態では、
前記ペプチドリガンドは、Ｎ末端、Ｃ末端または前記配列内のリジン残基にＰＹＡ部分の付着を含み、
（ＰＹＡ）−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号４０；本明細書では単量体１ＡおよびＢＣＹ７７４０と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ｄａｐ（ＰＹＡ）（配列番号４１；本明細書では単量体２ＡおよびＢＣＹ７７４１と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＫ（ＰＹＡ）ＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号４２；本明細書では単量体３ＡおよびＢＣＹ７７４２と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＫ（ＰＹＡ）ＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号４３；本明細書では単量体４ＡおよびＢＣＹ７７４３と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥ（Ｄ−Ｋ）（ＰＹＡ）ＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号４４；本明細書では単量体５ＡおよびＢＣＹ７７４４と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＫ（ＰＹＡ）ＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号４５；本明細書では単量体６ＡおよびＢＣＹ７７４５と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＫ（ＰＹＡ）ＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号４６；本明細書では単量体７ＡおよびＢＣＹ７７４６と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＫ（ＰＹＡ）Ｙ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号４７；本明細書では単量体８ＡおよびＢＣＹ７７４７と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹＫ（ＰＹＡ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号４８；本明細書では単量体９ＡおよびＢＣＹ７７４８と呼ぶ）、
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉはそれぞれ第１、第２および第３のシステイン残基を表し、ＡｃはＮ末端のアセチル基を表し、Ｄａｐはジアミノプロピオン酸を表し、ＰＹＡはプロパルギル酸を表し、Ｎｌｅはノルロイシンを表す）、
から選択されるアミノ酸配列、
またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００４５】
さらに別の実施形態では、
前記ペプチドリガンドは、Ｎ末端または前記配列内のリジン残基にＢＣＮ部分の付着を含み、
（ＢＣＮ）−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号４９；本明細書では、単量体１−ＢＣＮおよびＢＣＹ８１４１と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＫ（ＢＣＮ）ＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号５０；本明細書では、単量体３−ＢＣＮおよびＢＣＹ８０９５と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＫ（ＢＣＮ）ＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号５１；本明細書では、単量体４−ＢＣＮおよびＢＣＹ８１４２と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥ［（Ｄ−Ｋ）（ＢＣＮ）］ＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号５２；本明細書では単量体５−ＢＣＮおよびＢＣＹ８０９６と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＫ（ＢＣＮ）ＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号５３；本明細書では、単量体６−ＢＣＮおよびＢＣＹ８１４３と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＫ（ＢＣＮ）ＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号５４；本明細書では単量体７−ＢＣＮおよびＢＣＹ８１４４と呼ぶ）；そして
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹＫ（ＢＣＮ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号５５；本明細書では、単量体９−ＢＣＮおよびＢＣＹ８０９７と呼ぶ）、
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉはそれぞれ第１、第２および第３のシステイン残基を表し、ＡｃはＮ末端のアセチル基を表し、Ｎｌｅはノルロイシンを表し、ＢＣＮは
【化１４】
2021514953.tif 000016
を表す）、
から選択されるアミノ酸配列、
またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００４６】
代替の実施形態では、前記ループ配列は、その一方が５個のアミノ酸からなり、他方が６個のアミノ酸からなる２個のループ配列によって隔てられた３個のシステイン残基を含む。
【００４７】
本発明で使用できるさらなる単量体配列の例について、以下の実施形態において説明する。
【００４８】
一実施形態では、前記ペプチドリガンドは、
Ｃｉ−Ｉ−Ｅ−Ｅ−Ｇ−Ｑ−Ｙ−Ｃｉｉ−Ｘ１−Ｘ２−Ｄ−Ｘ３−Ｙ／Ｑ−Ｘ４−Ｃｉｉｉ（配列番号２０）；
Ｃｉ−Ｄ−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｐ−Ｙ−Ｃｉｉ−Ｙ−Ｒ／Ａ−Ｄ−Ｍ／Ｐ−Ｙ−Ｍ−Ｃｉｉｉ（配列番号２１）；
Ｃｉ−Ｄ−Ｅ−Ｗ−Ｇ−Ｌ−Ｆ／Ｙ−Ｃｉｉ−Ｉ／Ｆ−Ｐ／Ａ−Ｈ−Ｓ／Ｐ−Ｄ−Ｃｉｉｉ（配列番号２２）；および
ＣｉＩＥＰＧＰＦＣｉｉＹＡＤＰＹＭＣｉｉｉ（配列番号１９）、
（式中、Ｘ１〜Ｘ４は任意のアミノ酸残基を表し、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉはそれぞれ第１、第２および第３のシステイン残基を表す）、
から選択されるアミノ酸配列、
またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００４９】
一実施形態では、前記ループ配列は、その両方が６個のアミノ酸からなる２個のループ配列によって隔てられた３個のシステイン残基を含み、前記ペプチドリガンドは、
Ｃｉ−Ｉ−Ｅ−Ｅ−Ｇ−Ｑ−Ｙ−Ｃｉｉ−Ｘ１−Ｘ２−Ｄ−Ｘ３−Ｙ／Ｑ−Ｘ４−Ｃｉｉｉ（配列番号２０）；
Ｃｉ−Ｄ−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｐ−Ｙ−Ｃｉｉ−Ｙ−Ｒ／Ａ−Ｄ−Ｍ／Ｐ−Ｙ−Ｍ−Ｃｉｉｉ（配列番号２１）；および
ＣｉＩＥＰＧＰＦＣｉｉＹＡＤＰＹＭＣｉｉｉ（配列番号１９）、
（式中、Ｘ１〜Ｘ４は任意のアミノ酸残基を表し、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉはそれぞれ第１、第２および第３のシステイン残基を表す）、
から選択されるアミノ酸配列、
またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００５０】
一実施形態では、Ｘ１は、Ｙ、ＦおよびＨから選択される。
【００５１】
一実施形態では、Ｘ２は、Ｒ、ＡおよびＳから選択される。
【００５２】
一実施形態では、Ｘ３は、Ｍ、ＰおよびＨから選択される。
【００５３】
一実施形態では、Ｘ４は、Ｍ、Ｙ、ＬおよびＦから選択される。
【００５４】
一実施形態では、前記ループ配列は、その第１が６個のアミノ酸からなり、その第２が５個のアミノ酸からなる２個のループ配列によって隔てられた３個のシステイン残基を含み、前記ペプチドリガンドは、
Ｃｉ−Ｄ−Ｅ−Ｗ−Ｇ−Ｌ−Ｆ／Ｙ−Ｃｉｉ−Ｉ／Ｆ−Ｐ／Ａ−Ｈ−Ｓ／Ｐ−Ｄ−Ｃｉｉｉ（配列番号２２）
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉはそれぞれ第１、第２および第３のシステイン残基を表す）、
から選択されるアミノ酸配列、
またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００５５】
さらなる実施形態では、Ｃｉ−Ｉ−Ｅ−Ｅ−Ｇ−Ｑ−Ｙ−Ｃｉｉ−Ｘ１−Ｘ２−Ｄ−Ｘ３−Ｙ／Ｑ−Ｘ４−Ｃｉｉｉ（配列番号２０）のペプチドリガンドは、
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＹＲＤＭＹＭＣｉｉｉ（配列番号１）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＹＡＤＰＹＭＣｉｉｉ（配列番号２）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＹＡＤＰＹＹＣｉｉｉ（配列番号３）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＹＳＤＰＹＹＣｉｉｉ（配列番号４）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹＭＣｉｉｉ（配列番号５）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＹＡＤＨＱＬＣｉｉｉ（配列番号６）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＨＡＤＰＹＹＣｉｉｉ（配列番号７）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＨＡＤＰＹＦＣｉｉｉ（配列番号８）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＹＡＤＨＹＭＣｉｉｉ（配列番号９）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＹＡＤＰＹＬＣｉｉｉ（配列番号１０）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＹＳＤＰＹＬＣｉｉｉ（配列番号１１）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹＬＣｉｉｉ（配列番号１２）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＨＡＤＰＹＭＣｉｉｉ（配列番号１３）；および
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＨＡＤＰＱＭＣｉｉｉ（配列番号１４）
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉはそれぞれ第１、第２および第３のシステイン残基を表す）、
から選択されるアミノ酸配列、
またはその薬学的に許容される塩を含む
【００５６】
さらなる実施形態では、Ｃｉ−Ｉ−Ｅ−Ｅ−Ｇ−Ｑ−Ｙ−Ｃｉｉ−Ｘ１−Ｘ２−Ｄ−Ｘ３−Ｙ／Ｑ−Ｘ４−Ｃｉｉｉ（配列番号２０）のペプチドリガンドは、
Ａ−（配列番号１）−Ａ（本明細書では７４−０１−００−Ｎ００４と呼ぶ）；
Ａ−（配列番号２）−Ａ（本明細書では７４−０１−０１−Ｎ００１と呼ぶ）；
Ａ−（配列番号３）−Ａ（本明細書では７４−０１−０２−Ｎ００１と呼ぶ）；
Ａ−（配列番号４）−Ａ（本明細書では７４−０１−０３−Ｎ００１と呼ぶ）；
Ａ−（配列番号５）−Ａ（本明細書では７４−０１−０４−Ｎ００１と呼ぶ）；
Ａ−（配列番号６）−Ａ（本明細書では７４−０１−０５−Ｎ００１と呼ぶ）；
Ａ−（配列番号７）−Ａ（本明細書では７４−０１−０６−Ｎ００１と呼ぶ）；
Ａ−（配列番号８）−Ａ（本明細書では７４−０１−０７−Ｎ００１と呼ぶ）；
Ａ−（配列番号９）−Ａ（本明細書では７４−０１−０８−Ｎ００１と呼ぶ）；
Ａ−（配列番号１０）−Ａ（本明細書では７４−０１−０９−Ｎ００１と呼ぶ）；
Ａ−（配列番号１０）−ＳＶＧ（本明細書では７４−０１−０９−Ｔ０３−Ｎ００２と呼ぶ）；
Ａ−（配列番号１１）−Ａ（本明細書では７４−０１−１０−Ｎ００１と呼ぶ）；
Ａ−（配列番号１２）−Ａ（本明細書では７４−０１−１１−Ｎ００１と呼ぶ）；
Ａ−（配列番号１３）−Ａ（本明細書では７４−０１−１３−Ｎ００１と呼ぶ）；および
Ａ−（配列番号１４）−Ａ（本明細書では７４−０１−１４−Ｎ００１と呼ぶ）、
から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００５７】
さらなる実施形態では、Ｃｉ−Ｄ−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｐ−Ｙ−Ｃｉｉ−Ｙ−Ｒ／Ａ−Ｄ−Ｍ／Ｐ−Ｙ−Ｍ−Ｃｉｉｉ（配列番号２１）のペプチドリガンドは、
ＣｉＤＩＧＰＰＹＣｉｉＹＲＤＭＹＭＣｉｉｉ（配列番号１５）；および
ＣｉＤＩＧＰＰＹＣｉｉＹＡＤＰＹＭＣｉｉｉ（配列番号１６）
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉはそれぞれ第１、第２および第３のシステイン残基を表す）、
から選択されるアミノ酸配列、
またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００５８】
さらなる実施形態では、Ｃｉ−Ｄ−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｐ−Ｙ−Ｃｉｉ−Ｙ−Ｒ／Ａ−Ｄ−Ｍ／Ｐ−Ｙ−Ｍ−Ｃｉｉｉ（配列番号２１）のペプチドリガンドは、
Ａ−（配列番号１５）−Ａ（本明細書では７４−０１−１６−Ｎ００１と呼ぶ）；および
Ａ−（配列番号１６）−Ａ（本明細書では７４−０１−１７−Ｎ００１と呼ぶ）
から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００５９】
さらなる実施形態では、Ｃｉ−Ｄ−Ｅ−Ｗ−Ｇ−Ｌ−Ｆ／Ｙ−Ｃｉｉ−Ｉ／Ｆ−Ｐ／Ａ−Ｈ−Ｓ／Ｐ−Ｄ−Ｃｉｉｉ（配列番号２２）のペプチドリガンドは、
ＣｉＤＥＷＧＬＦＣｉｉＩＰＨＳＤＣｉｉｉ（配列番号１７）；および
ＣｉＤＥＷＧＬＹＣｉｉＦＡＨＰＤＣｉｉｉ（配列番号１８）
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉはそれぞれ第１、第２および第３のシステイン残基を表す）、
から選択されるアミノ酸配列、
またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００６０】
さらなる実施形態では、Ｃｉ−Ｄ−Ｅ−Ｗ−Ｇ−Ｌ−Ｆ／Ｙ−Ｃｉｉ−Ｉ／Ｆ−Ｐ／Ａ−Ｈ−Ｓ／Ｐ−Ｄ−Ｃｉｉｉ（配列番号２２）のペプチドリガンドは、
Ａｃ−Ａ−（配列番号１７）−Ａ（本明細書では７４−０２−００−Ｎ００４と呼ぶ）；および
Ａ−（配列番号１８）−Ａ（本明細書では７４−０２−０１−Ｎ００１と呼ぶ）
から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００６１】
一実施形態では、ＣｉＩＥＰＧＰＦＣｉｉＹＡＤＰＹＭＣｉｉｉ（配列番号１９）のペプチドリガンドは、
Ａ−（配列番号１９）−ＮＲＶ（本明細書では７４−１９−００−Ｔ０１−Ｎ００２と呼ぶ）
のアミノ酸配列を含む。
【００６２】
一実施形態では、分子足場は、１，１’，１”−（１，３，５−トリアジナン−１，３，５−トリイル）トリプロパ−２−エン−１−オン（ＴＡＴＡ）である。
【００６３】
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、ペプチド化学、細胞培養およびファージディスプレイ、核酸化学および生化学の技術分野などの当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学方法、遺伝学的方法および生化学的方法に対する標準的技法が使用され（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）４ｔｈ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照されたい）、これらは参照により本明細書の一部をなすものとする。
【００６４】
ナンバリング
本発明のペプチド内のアミノ酸残基の位置に言及する場合、システイン残基（Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉ）は、ナンバリングから省く。なぜなら、それらは不変であり、したがって、本発明のペプチド内のアミノ酸残基のナンバリングは、下の通り、
Ｃｉ−Ｉ−Ｅ−Ｅ−Ｇ−Ｑ−Ｙ−Ｃｉｉ−Ｙ−Ｒ−Ｄ−Ｍ−Ｙ−Ｍ−Ｃｉｉｉ（配列番号１）
とする。
【００６５】
本明細書の目的のために、すべての二環式ペプチドは、ＴＢＭＢ（１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン）または１，１’，１”−（１，３，５−トリアジナン−１，３，５−トリイル）トリプロパ−２−エン−１−オン（ＴＡＴＡ）と環化されて、三置換構造を生じることが想定されている。ＴＢＭＢおよびＴＡＴＡとの環化は、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉ上で生じる。
【００６６】
分子フォーマット
二環式コア配列へのＮ末端伸長またはＣ末端伸長は、ハイフンで区切られて、配列の左側または右側に加えられる。例えば、Ｎ末端のβＡｌａ−Ｓａｒ１０−Ａｌａテールは、
βＡｌａ−Ｓａｒ１０−Ａ−（配列番号Ｘ）
と記載される。
【００６７】
逆ペプチド配列
Ｎａｉｒ  ｅｔ  ａｌ（２００３）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０（３），１３６２−１３７３における開示に照らして、本明細書に開示のペプチド配列はまた、それらのレトロインベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）型においても有用性を見いだすものであることが予想される。例えば、配列が逆になり（すなわち、Ｎ末端がＣ末端になり、逆も同様である）、それらの立体化学も同様に逆になる（つまり、Ｄ−アミノ酸がＬ−アミノ酸になり、逆も同様である）。
【００６８】
＜ペプチドリガンド＞
本明細書で言及するペプチドリガンドとは、分子足場と共有結合したペプチドを指す。典型的には、そのようなペプチドは、足場と共有結合を形成することができる２個以上の反応基（すなわちシステイン残基）、および、ペプチドが足場と結合した際にループを形成することからループ配列と呼ばれる、前記反応基の間に張られた上記配列を含む。本事例において、ペプチドは、少なくとも３個のシステイン残基（本明細書ではＣｉ、Ｃｉｉ、およびＣｉｉｉと呼ぶ）を含み、足場上に少なくとも２個のループを形成する。
【００６９】
＜多量体結合複合体＞
三量体
一実施形態では、多量体結合複合体は、以下の表１
【００７０】
【表１−１】
2021514953.tif 000017
【表１−２】
2021514953.tif 000018
【表１−３】
2021514953.tif 000019
に記載の三量体結合複合体を含む。
【００７１】
表１の特定の三量体結合複合体がＣＤ１３７リガンドと比べてＥＣ５０の改善を発揮したことを実証するデータを本明細書で提示する（表４Ａを参照されたい）。
【００７２】
さらなる実施形態では、多量体結合複合体は、そのそれぞれが本明細書で定義のＢＣＹ７７４１である３個の二環式ペプチドを含む三量体を含み、これは、Ｃ末端ＤＡＰ（ＰＹＡ）部分を介してスペーサー分子（Ｓ１Ａ）に連結し、ここで、ｎは２３を表し、かつ（Ｓ１Ａ）は本明細書で定義の（Ｂ）である中央のヒンジ部分に連結している。この多量体結合複合体を、本明細書ではＢＣＹ７７４９と呼ぶ。アゴニズムを実証しなかった対応する単量体（ＢＣＹ７７４１）と比較して、ＣＤ１３７アゴニズムが高レベルであることを示すデータを、図２に本明細書で提示する。マウス血漿に対するＢＣＹ７７４９の安定性を示すデータも、図６に提示する。
【００７３】
代替のさらなる実施形態では、多量体結合複合体は、そのそれぞれが本明細書で定義のＢＣＹ７７４１である３個の二環式ペプチドを含む三量体を含み、これは、Ｃ末端ＤＡＰ（ＰＹＡ）部分を介してスペーサー分子（Ｓ１Ａ）に連結し、ここで、ｎは１０を表し、かつ（Ｓ１Ａ）は本明細書で定義の（Ｂ）である中央のヒンジ部分に連結している。この多量体結合複合体を、本明細書ではＢＣＹ７７５０と呼ぶ。アゴニズムを実証しなかった対応する単量体（ＢＣＹ７７４１）と比較して、ＣＤ１３７アゴニズムが高レベルであることを示すデータを、図２に本明細書で提示する。
【００７４】
代替のさらなる実施形態では、多量体結合複合体は、そのそれぞれが本明細書で定義のＢＣＹ７７４３である３個の二環式ペプチドを含む三量体を含み、これは、Ｌｙｓ（ＰＹＡ）３部分を介してスペーサー分子（Ｓ１Ａ）に連結し、ここで、ｎは１０を表し、かつ（Ｓ１Ａ）は本明細書で定義の（Ｂ）である中央のヒンジ部分に連結している。この多量体結合複合体を、本明細書ではＢＣＹ７８３５と呼ぶ。多量体二環式コンジュゲートＢＣＹ７８３５が、単量体の二環式ペプチドおよび二環式ペプチド薬物コンジュゲート（ＢＤＣ）にとって特徴的である速やかな全身性排泄という特性を保持することを実証したデータを、図５Ｂに提示する。マウス血漿に対するＢＣＹ７８３５の安定性を示すデータも、図６に提示する。ＣＤ１３７依存性抗腫瘍活性を誘発すると従来から示されているＣＤ１３７モノクローナル抗体アゴニストと比較して、ＢＣＹ７８３５は、ある範囲の抗腫瘍活性を誘発することがわかるデータも、図７に提示する。
【００７５】
さらなる代替の実施形態では、多量体結合複合体は、そのそれぞれが本明細書で定義のＢＣＹ７７４４である３個の二環式ペプチドを含む三量体を含み、これは、Ｄ−Ｌｙｓ（ＰＹＡ）４部分を介してスペーサー分子（Ｓ１Ａ）に連結し、ここで、ｎは１０を表し、かつ（Ｓ１Ａ）は本明細書で定義の（Ｂ）である中央のヒンジ部分に連結している。この多量体結合複合体を、本明細書ではＢＣＹ７８３９と呼ぶ。ＢＣＹ７８３９による処置に応答した有意な腫瘍細胞死が、黒色腫患者の一方の試料で生じるが、他方の試料では生じず（図１２Ａ）、処置間でリンパ球数に関して有意差はない（図１２Ｂ）ことを実証するデータを図１２に本明細書で提示する。ＢＣＹ７８３９が、三量体ＣＤ１３７受容体複合体に対する高いアビディティーを有する分子であることと一致する、ウォッシュアウト後での細胞活性を維持することを実証するデータも、図１３に本明細書で提示する。Ｔ細胞がＢＣＹ７８３９に応答して炎症誘発性サイトカインを分泌することを実証するデータも、図１４に本明細書で提示する。ＢＣＹ７８３９がＪｕｒｋａｔレポーター細胞の表面でＣＤ１３７を活性化することを実証するデータも、図１５に本明細書で提示する。
【００７６】
挙げることができる一実施形態では、多量体結合複合体は、ＢＣＹ７８３９などの、ＢＣＹ７７４９、ＢＣＹ７７５０、ＢＣＹ７８３５およびＢＣＹ７８３９から選択される三量体である。
【００７７】
四量体
一実施形態では、多量体結合複合体は、以下の表２
【００７８】
【表２−１】
2021514953.tif 000020
【表２−２】
2021514953.tif 000021
に記載の四量体結合複合体を含む。
【００７９】
表２の特定の四量体結合複合体がＣＤ１３７リガンドと比べて（表４Ａを参照）ＥＣ５０での改善を発揮したことを実証するデータを本明細書で提示する。
【００８０】
さらなる実施形態では、多量体結合複合体は、そのそれぞれが本明細書で定義のＢＣＹ７７４１である４個の二環式ペプチドを含む四量体を含み、これは、Ｃ末端ＤＡＰ（ＰＹＡ）部分を介してスペーサー分子（Ｓ１Ａ）に連結し、ここで、ｎは１０を表し、かつ（Ｓ１Ａ）は本明細書で定義の（Ａ）である中央のヒンジ部分に連結している。この多量体結合複合体を、本明細書ではＢＣＹ７７５１と呼ぶ。アゴニズムを実証しなかった対応する単量体（ＢＣＹ７７４１）と比較して、ＣＤ１３７アゴニズムが高レベルであることを示すデータを、図２に本明細書で提示する。
【００８１】
さらなる代替の実施形態では、多量体結合複合体は、そのそれぞれが本明細書で定義のＢＣＹ７７４１である４個の二環式ペプチドを含む四量体を含み、これは、Ｃ末端ＤＡＰ（ＰＹＡ）部分を介してスペーサー分子（Ｓ１Ａ）に連結し、ここで、ｎは２３を表し、かつ（Ｓ１Ａ）は本明細書で定義の（Ａ）である中央のヒンジ部分に連結している。この多量体結合複合体を、本明細書ではＢＣＹ７７５２と呼ぶ。アゴニズムを実証しなかった対応する単量体（ＢＣＹ７７４１）と比較して、ＣＤ１３７アゴニズムが高レベルであることを示すデータを、図２に本明細書で提示する。
【００８２】
さらなる代替の実施形態では、多量体結合複合体は、そのそれぞれが本明細書で定義のＢＣＹ７７４５である４個の二環式ペプチドを含む四量体を含み、これは、リジン５のアミノ酸残基を介してスペーサー分子（Ｓ１Ａ）に連結し、ここで、ｎは１０を表し、かつ（Ｓ１Ａ）は本明細書で定義の（Ａ）である中央のヒンジ部分に連結している。この多量体結合複合体を、本明細書ではＢＣＹ７８４５と呼ぶ。アゴニズムを実証しなかった対応する単量体（ＢＣＹ７７４１）と比較して、ＣＤ１３７アゴニズムが高レベルであることを示すデータを、図３に本明細書で提示する。マウス血漿に対するＢＣＹ７８４５の安定性を示すデータも、図６に提示する。
【００８３】
さらなる代替の実施形態では、多量体結合複合体は、そのそれぞれが本明細書で定義のＢＣＹ７７４５である４個の二環式ペプチドを含む四量体を含み、これは、リジン５のアミノ酸残基を介してスペーサー分子（Ｓ１Ａ）に連結し、ここで、ｎは２３を表し、かつ（Ｓ１Ａ）は本明細書で定義の（Ａ）である中央のヒンジ部分に連結している。この多量体結合複合体を、本明細書ではＢＣＹ７８４６と呼ぶ。アゴニズムを実証しなかった対応する単量体（ＢＣＹ７７４１）と比較して、ＣＤ１３７アゴニズムが高レベルであることを示すデータを、図３に本明細書で提示する。
【００８４】
さらなる代替の実施形態では、多量体結合複合体は、そのそれぞれが本明細書で定義のＢＣＹ７７４０である４個の二環式ペプチドを含む四量体を含み、これは、Ｎ末端ＰＹＡ部分を介してスペーサー分子（Ｓ１Ａ）に連結し、ここで、ｎは１０を表し、かつ（Ｓ１Ａ）は本明細書で定義の（Ａ）である中央のヒンジ部分に連結している。この多量体結合複合体を、本明細書ではＢＣＹ７８２９と呼ぶ。ＣＤ１３７アゴニズムが高レベルであることを示すデータを、図１に本明細書で提示する。ヒト、カニクイザル、ラットおよびマウスの各血漿に対するＢＣＹ７８２９の安定性を示すデータも、図４に本明細書で提示する。多量体二環式コンジュゲートＢＣＹ７８２９が、単量体の二環式ペプチドおよび二環式ペプチド薬物コンジュゲート（ＢＤＣ）にとって特徴的である速やかな全身性排泄という特性を保持することを実証したデータも、図５Ａに提示する。マウス血漿に対するＢＣＹ７８２９の安定性を示すデータも、図６に提示する。ＣＤ１３７依存性抗腫瘍活性を誘発すると従来から示されているＣＤ１３７モノクローナル抗体アゴニストと比較して、ＢＣＹ７８２９は、ある範囲の抗腫瘍活性を誘発することがわかるデータも、図７に提示する。
【００８５】
さらなる代替の実施形態では、多量体結合複合体は、そのそれぞれが本明細書で定義のＢＣＹ７７４３である４個の二環式ペプチドを含む四量体を含み、これは、Ｌｙｓ（ＰＹＡ）３部分を介してスペーサー分子（Ｓ１Ａ）に連結し、ここで、ｎは２３を表し、かつ（Ｓ１Ａ）は本明細書で定義の（Ａ）である中央のヒンジ部分に連結している。この多量体結合複合体を、本明細書ではＢＣＹ７８３８と呼ぶ。多量体二環式コンジュゲートＢＣＹ７８３８が、単量体の二環式ペプチドおよび二環式ペプチド薬物コンジュゲート（ＢＤＣ）にとって特徴的である速やかな全身性排泄という特性を保持することを実証したデータを、図５Ｂに本明細書で提示する。マウス血漿に対するＢＣＹ７８３８の安定性を示すデータも、図６に提示する。ＣＤ１３７依存性抗腫瘍活性を誘発すると従来から示されているＣＤ１３７モノクローナル抗体アゴニストと比較して、ＢＣＹ７８３８は、ある範囲の抗腫瘍活性を誘発することがわかるデータも、図７に提示する。ＢＣＹ７８３８による処置に応答した有意な腫瘍細胞死が、黒色腫患者の一方の試料では生じるが、他方の試料では生じず（図１２Ａ）、処置間でリンパ球数に関して有意差はない（図１２Ｂ）ことを実証するデータも図１２に本明細書で提示する。ＢＣＹ７８３８が、三量体ＣＤ１３７受容体複合体に対する高いアビディティーを有する分子であることと一致する、ウォッシュアウト後での細胞活性を維持することを実証するデータも、図１３に本明細書で提示する。Ｔ細胞がＢＣＹ７８３８に応答して炎症誘発性サイトカインを分泌することを実証するデータも、図１４に本明細書で提示する。
【００８６】
さらなる代替の実施形態では、多量体結合複合体は、そのそれぞれが本明細書で定義のＢＣＹ７７４４である４個の二環式ペプチドを含む四量体を含み、これは、Ｄ−Ｌｙｓ（ＰＹＡ）４部分を介してスペーサー分子（Ｓ１Ａ）に連結し、ここで、ｎは２３を表し、かつ（Ｓ１Ａ）は本明細書で定義の（Ａ）である中央のヒンジ部分に連結している。この多量体結合複合体を、本明細書ではＢＣＹ７８４２と呼ぶ。ＢＣＹ７８４２は同系マウスモデルにおいて抗腫瘍活性を誘発することがわかるデータを、図８に提示する。ＢＣＹ７８４２は、ＣＤ１３７モノクローナル抗体アゴニストと比較して、腫瘍組織中のＴ細胞百分率およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の百分率において一定の範囲の増加を誘発することがわかるデータも、それぞれ図９および１０に提示する。ＣＤ１３７依存性抗腫瘍活性を誘発すると従来から示されているＣＤ１３７モノクローナル抗体アゴニストと比較して、ＢＣＹ７８４２が腫瘍組織中のＴ細胞百分率において一定の範囲の低下を誘発することがわかるデータも、図１１に提示する。ＢＣＹ７８４２による処置に応答した有意な腫瘍細胞死が、黒色腫患者の一方の試料で生じるが、他方の試料では生じず（図１２Ａ）、処置間でリンパ球数に関して有意差はない（図１２Ｂ）ことを実証するデータも図１２に本明細書で提示する。ＢＣＹ７８４２が三量体ＣＤ１３７受容体複合体に対する高いアビディティーを有する分子であることと一致する、ウォッシュアウト後での細胞活性を維持することを実証するデータも、図１３に本明細書で提示する。Ｔ細胞がＢＣＹ７８４２に応答して炎症誘発性サイトカインを分泌することを実証するデータも、図１４に本明細書で提示する。ＢＣＹ７８４２がＪｕｒｋａｔレポーター細胞の表面でＣＤ１３７を活性化することを実証するデータも、図１５に本明細書で提示する。
【００８７】
さらなる代替の実施形態では、多量体結合複合体は、そのそれぞれが本明細書で定義のＢＣＹ８９２７である４個の二環式ペプチドを含む四量体を含み、これは、Ｌｙｓ（ＰＹＡ）３部分を介してスペーサー分子（Ｓ１Ａ）に連結し、ここで、ｎは２３を表し、かつ（Ｓ１Ａ）は本明細書で定義の（Ａ）である中央のヒンジ部分に連結している。この多量体結合複合体を、本明細書ではＢＣＹ８９４５と呼ぶ。ＢＣＹ８９４５は同系マウスモデルにおいて抗腫瘍活性を誘発することがわかるデータを、図８に提示する。ＢＣＹ８９４５は、ＣＤ１３７モノクローナル抗体アゴニストと比較して、腫瘍組織中のＴ細胞百分率およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の百分率において一定の範囲の増加を誘発することがわかるデータも、それぞれ図９および１０に提示する。ＣＤ１３７依存性抗腫瘍活性を誘発すると従来から示されているＣＤ１３７モノクローナル抗体アゴニストと比較して、ＢＣＹ８９４５が腫瘍組織中のＴ細胞百分率において一定の範囲の低下を誘発することがわかるデータも、図１１に提示する。ＢＣＹ８９４５が、三量体ＣＤ１３７受容体複合体に対する高いアビディティーを有する分子であることと一致する、ウォッシュアウト後での細胞活性を維持することを実証するデータも、図１３に本明細書で提示する。Ｔ細胞がＢＣＹ８９４５に応答して炎症誘発性サイトカインを分泌することを実証するデータも、図１４に本明細書で提示する。ＢＣＹ８９４５がＪｕｒｋａｔレポーター細胞の表面でＣＤ１３７を活性化することを実証するデータも、図１５に本明細書で提示する。
【００８８】
さらなる代替の実施形態では、多量体結合複合体は、そのそれぞれが本明細書で定義のＢＣＹ８９２８である４個の二環式ペプチドを含む四量体を含み、これは、Ｄ−Ｌｙｓ（ＰＹＡ）４部分を介してスペーサー分子（Ｓ１Ａ）に連結し、ここで、ｎは１０を表し、かつ（Ｓ１Ａ）は本明細書で定義の（Ａ）である中央のヒンジ部分に連結している。この多量体結合複合体を、本明細書ではＢＣＹ８９４７と呼ぶ。ＢＣＹ８９４７は同系マウスモデルにおいて抗腫瘍活性を誘発することがわかるデータを、図８に提示する。ＢＣＹ８９４７は、ＣＤ１３７モノクローナル抗体アゴニストと比較して、腫瘍組織中の、Ｔ細胞百分率およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の百分率において一定の範囲の増加を誘発することがわかるデータも、それぞれ図９および１０に提示する。ＣＤ１３７依存性抗腫瘍活性を誘発すると従来から示されているＣＤ１３７モノクローナル抗体アゴニストと比較して、ＢＣＹ８９４７が腫瘍組織中のＴ細胞百分率において一定の範囲の低下を誘発することがわかるデータも、図１１に提示する。ＢＣＹ８９４７が、三量体ＣＤ１３７受容体複合体に対する高いアビディティーを有する分子であることと一致する、ウォッシュアウト後での細胞活性を維持することを実証するデータも、図１３に本明細書で提示する。Ｔ細胞がＢＣＹ８９４７に応答して炎症誘発性サイトカインを分泌することを実証するデータも、図１４に本明細書で提示する。ＢＣＹ８９４７がＪｕｒｋａｔレポーター細胞の表面でＣＤ１３７を活性化することを実証するデータも、図１５に本明細書で提示する。
【００８９】
一実施形態では、多量体結合複合体は、ＢＣＹ７７５１、ＢＣＹ７７５２、ＢＣＹ７８４５、ＢＣＹ７８４６、ＢＣＹ７８２９、ＢＣＹ７８３８、ＢＣＹ７８４２、ＢＣＹ８９４５およびＢＣＹ８９４７から選択される四量体である。挙げることができる一実施形態では、多量体結合複合体は、ＢＣＹ７７５１、ＢＣＹ７７５２、ＢＣＹ７８４５、ＢＣＹ７８４６、ＢＣＹ７８２９、ＢＣＹ７８３８およびＢＣＹ７８４２から選択される四量体である。
【００９０】
さらなる実施形態では、多量体結合複合体は、ＢＣＹ７８４２、ＢＣＹ８９４５およびＢＣＹ８９４７から選択される四量体である。
【００９１】
＜薬学的に許容される塩＞
塩形態は、本発明の範囲内であり、ペプチドリガンドへの言及は前記リガンドの塩形態を含むことが理解されよう。
【００９２】
本発明の塩は、従来の化学的方法、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｕｓｅ，Ｐ．Ｈｅｉｎｒｉｃｈ  Ｓｔａｈｌ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｃａｍｉｌｌｅ  Ｇ．  Ｗｅｒｍｕｔｈ（Ｅｄｉｔｏｒ），ＩＳＢＮ：３−９０６３９−０２６−８，Ｈａｒｄｃｏｖｅｒ，３８８ｐａｇｅｓ，Ａｕｇｕｓｔ  ２００２に記載の方法によって、塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般に、こういった塩は、これらの化合物の遊離酸または遊離塩基の形態を、適当な塩基または酸と、水中もしくは有機溶媒中またはその２つの混合物中で、反応させることによって、調製することができる。
【００９３】
酸付加塩（単塩または二塩）は、無機および有機の両方の多種多様な酸と共に形成することができる。酸付加塩の例としては、酢酸、２，２−ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸（例えば、Ｌ−アスコルビン酸）、Ｌ−アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４−アセトアミド安息香酸、ブタン酸、（＋）ショウノウ酸、ショウノウ−スルホン酸、（＋）−（１Ｓ）−ショウノウ−１０−スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチシン酸、グルコヘプトン酸、Ｄ−グルコン酸、グルクロン酸（例えば、Ｄ−グルクロン酸）、グルタミン酸（例えば、Ｌ−グルタミン酸）、α−オキソグルタル酸、グリコール酸、馬尿酸、ハロゲン化水素酸（例えば、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸）、イセチオン酸、乳酸（例えば、（＋）−Ｌ−乳酸、（±）−ＤＬ−乳酸）、ラクトビオン酸、マレイン酸、リンゴ酸、（−）−Ｌ−リンゴ酸、マロン酸、（±）−ＤＬ−マンデル酸、メタンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ニコチン酸、硝酸、オレイン酸、オロチン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、リン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、Ｌ−ピログルタミン酸、サリチル酸、４−アミノ−サリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、タンニン酸、（＋）−Ｌ−酒石酸、チオシアン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ウンデシレン酸、および吉草酸からなる群から選択される酸、ならびにアシル化アミノ酸およびカチオン交換樹脂と共に形成される単塩または二塩が挙げられる。
【００９４】
塩の特定の一群は、酢酸、塩酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、クエン酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、リンゴ酸、イセチオン酸、フマル酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、硫酸、メタンスルホン酸（メシレート）、エタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、吉草酸、プロパン酸、ブタン酸、マロン酸、グルクロン酸およびラクトビオン酸から形成される塩からなる。特定の一塩は、塩酸塩である。別の特定の塩は、酢酸塩である。
【００９５】
化合物がアニオン性であるか、またはアニオン性であり得る官能基を有する（例えば、−ＣＯＯＨは、−ＣＯＯ−である場合もある）場合、適切なカチオンを生じる有機または無機塩基と塩を形成することができる。適切な無機カチオンの例には、これらに限定されないが、アルカリ金属イオン、例えば、Ｌｉ＋、Ｎａ＋およびＫ＋、アルカリ土類金属カチオン、例えば、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋、およびその他のカチオン、例えば、Ａｌ３＋またはＺｎ＋が含まれる。適切な有機カチオンの例には、これらに限定されないが、アンモニウムイオン（すなわち、ＮＨ４＋）および置換アンモニウムイオン（例えば、ＮＨ３Ｒ＋、ＮＨ２Ｒ２＋、ＮＨＲ３＋、ＮＲ４＋）が含まれる。一部の適切な置換アンモニウムイオンの例は、メチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、プロピルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン、およびトロメタミン、ならびにアミノ酸、例えば、リジンおよびアルギニンに由来するものである。一般の第四級アンモニウムイオンの例は、Ｎ（ＣＨ３）４＋である。
【００９６】
本発明のペプチドが、アミン官能基を含有する場合、これらは、当業者によく知られた方法によって、例えば、アルキル化剤との反応によって第四級アンモニウム塩を形成することができる。かかる第四級アンモニウム化合物は、本発明のペプチドの範囲内である。
【００９７】
＜修飾誘導体＞
本明細書に定義のペプチドリガンドの修飾誘導体は本発明の範囲内であることが理解されよう。かかる適切な修飾誘導体の例には、Ｎ末端および／またはＣ末端修飾；１個または複数個のアミノ酸残基の、１個または複数個の非天然のアミノ酸残基への交換（例えば、１個もしくは複数の極性アミノ酸残基の、１個もしくは複数の等配電子（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ）アミノ酸または等電子アミノ酸への交換；１個もしくは複数の非極性アミノ酸残基の、他の非天然の等配電子アミノ酸または等電子アミノ酸への交換）；スペーサー基の付加；１個もしくは複数の酸化感受性アミノ酸残基の、１個もしくは複数の酸化耐性アミノ酸残基への交換；１個もしくは複数のアミノ酸残基の、アラニンへの交換、１個もしくは複数のＬ−アミノ酸残基の、１個もしくは複数のＤ−アミノ酸残基への交換；二環式ペプチドリガンド内の１個もしくは複数のアミド結合のＮ−アルキル化；１個もしくは複数のペプチド結合の代用結合（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｂｏｎｄ）への交換；ペプチド骨格長の修飾；１個もしくは複数のアミノ酸残基のアルファ炭素上の水素の、別の化学基による置換、アミノ酸、例えば、システイン、リジン、グルタミン酸／アスパラギン酸およびチロシンを官能化するような、適切なアミン、チオール、カルボン酸およびフェノールの反応性試薬による前記アミノ酸の修飾、ならびに官能化に適した直交反応性を導入するアミノ酸、例えば、それぞれ、アルキン担持部分またはアジド担持部分による官能化を可能にするアジド基担持アミノ酸またはアルキン基担持アミノ酸の導入または交換、から選択される１つまたは複数の修飾が含まれる。
【００９８】
一実施形態では、修飾誘導体は、Ｎ末端および／またはＣ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、修飾誘導体は、適切なアミノ反応性化学を使用したＮ末端修飾、および／または適切なカルボキシ反応性化学を使用したＣ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、前記のＮ末端修飾またはＣ末端修飾は、これらに限定されないが、細胞障害剤、放射性キレート剤（ｒａｄｉｏｃｈｅｌａｔｏｒ）または発色団を含めて、エフェクター基の付加を含む。
【００９９】
さらなる実施形態では、修飾誘導体は、Ｎ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、Ｎ末端修飾は、Ｎ末端アセチル基を含む。この実施形態では、Ｎ末端システイン基（本明細書ではＣｉと呼ぶ基）は、無水酢酸またはその他の適切な試薬で、ペプチド合成の過程でキャップされて、Ｎ末端アセチル化されている分子をもたらす。この実施形態によって、アミノペプチダーゼの潜在的認識ポイントを排除するという利点が提供され、二環式ペプチドの分解の可能性が回避される。
【０１００】
代替的な実施形態では、Ｎ末端修飾は、エフェクター基のコンジュゲーションおよび二環式ペプチドのその標的に対する効力の保持を容易にする分子スペーサー基の付加を含む。
【０１０１】
さらなる実施形態では、修飾誘導体は、Ｃ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、Ｃ末端修飾は、アミド基を含む。この実施形態では、Ｃ末端システイン基（本明細書ではＣｉｉｉと称される基）は、ペプチド合成過程で、アミドとして合成されて、Ｃ末端アミド化されている分子をもたらす。この実施形態により、カルボキシペプチダーゼの潜在的な認識ポイントを排除するという利点が提供され、二環式ペプチドのタンパク質分解の可能性が低下する。
【０１０２】
一実施形態では、修飾誘導体は、１個または複数個のアミノ酸残基の１個または複数個の非天然のアミノ酸残基への交換を含む。この実施形態では、分解性のプロテアーゼによって認識もされず、標的効力になんら悪影響も有さない等配電子／等電側鎖を有する、非天然アミノ酸を選択することができる。
【０１０３】
あるいは、制約されたアミノ酸側鎖を有する非天然アミノ酸を使用することができ、その結果、近傍のペプチド結合のタンパク質分解加水分解が、立体構造的および立体的に妨害される。特に、これらは、プロリンアナログ、かさ高い側鎖、Ｃα−二置換誘導体（例えば、アミノイソ酪酸、Ａｉｂ）、およびシクロアミノ酸、単純な誘導体であるアミノ−シクロプロピルカルボン酸に関係している。
【０１０４】
一実施形態では、修飾誘導体は、スペーサー基の付加を含む。さらなる実施形態では、修飾誘導体は、Ｎ末端システイン（Ｃｉ）および／またはＣ末端システイン（Ｃｉｉｉ）へのスペーサー基の付加を含む。
【０１０５】
一実施形態では、修飾誘導体は、１個または複数個の酸化感受性アミノ酸残基の１個または複数個の酸化耐性アミノ酸残基への交換を含む。さらなる実施形態では、修飾誘導体は、トリプトファン残基のナフチルアラニン残基またはアラニン残基への交換を含む。この実施形態は、結果として生じる二環式ペプチドリガンドの医薬品安定性プロファイルが改善されるという利点を提供する。
【０１０６】
一実施形態では、修飾誘導体は、１個または複数個の荷電アミノ酸残基の１個または複数個の疎水性アミノ酸残基への交換を含む。別の実施形態では、修飾誘導体は、１個または複数個の疎水性アミノ酸残基の１個または複数個の荷電アミノ酸残基への交換を含む。荷電アミノ酸残基に対する疎水性アミノ酸残基の正しいバランスは、二環式ペプチドリガンドの重要な特徴である。例えば、疎水性アミノ酸残基は、血漿タンパク質結合の程度に対して影響を与え、したがって、血漿中の遊離した利用可能な画分の濃度に影響を与え、一方、荷電アミノ酸残基（特にアルギニン）は、細胞表面におけるリン脂質膜とペプチドとの相互作用に影響を与え得る。両者を組み合わせて、半減期、分布の体積およびペプチド薬物の曝露に影響を与えることができ、臨床エンドポイントに従って調整することができる。加えて、荷電アミノ酸残基に対する疎水性アミノ酸残基の正しい組合せおよび数によって、注射部位における刺激作用を低下させることができる（ペプチド薬物を皮下投与した場合）。
【０１０７】
一実施形態では、修飾された誘導体は、１個または複数個のＬ−アミノ酸残基の１個または複数個のＤ−アミノ酸残基への交換を含む。この実施形態によれば、立体障害によって、およびβターンコンホメーションを安定化させるＤ−アミノ酸の傾向によって、タンパク質分解安定性が高まると考えられる（Ｔｕｇｙｉ  ｅｔ  ａｌ（２００５）  ＰＮＡＳ，１０２（２），４１３−４１８）。
【０１０８】
一実施形態では、修飾誘導体は、任意のアミノ酸残基の除去、およびアラニンによる置換を含む。この実施形態によって、潜在的なタンパク質分解性攻撃部位を除去する利点が提供される。
【０１０９】
上述の修飾のそれぞれは、ペプチドの効力または安定性を計画的に改善するのに役立つことに留意されたい。修飾に基づくさらなる効力改善は、以下の機序を介して達成することができる。
−  より高い親和性が達成されるように、疎水性効果を活用し、より低いオフレート（ｏｆｆ  ｒａｔｅｓ）につながる疎水性部分を組み込むこと；
−  長距離イオン性相互作用を活用する荷電基を組み込み、より速いオンレート（ｏｎ  ｒａｔｅｓ）およびより高い親和性をもたらすこと（例えば、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｒａｐｉｄ，ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃａｌｌｙ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９９６），Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３，４２７−３１を参照されたい）；および
−  例えば、標的結合の際にエントロピーの損失が最小であるようにアミノ酸の側鎖を正確に制約すること、標的結合の際にエントロピーの損失が最小であるように骨格のねじれ角を制約すること、および同一の理由のために分子中に追加の環化を導入すること、
によってペプチドに追加的な制約を組み込むこと
（総説については、Ｇｅｎｔｉｌｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ，（２０１０），１６，３１８５−２０３，ａｎｄ  Ｎｅｓｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ（２００９），１６，４３９９−４１８を参照されたい）。
【０１１０】
＜同位体のバリエーション＞
本発明は、本発明の薬学的に許容される（放射性）同位体標識のペプチドリガンドであって、１個または複数個の原子が、同じ原子番号であるが自然に通常みられる原子質量または原子質量数とは異なる原子質量または原子質量数を有する原子によって交換されている、ペプチドリガンド、ならびに、本発明のペプチドリガンドであって、当該の（放射性）同位体を保持できる金属キレート基が付いている（「エフェクター」と名付けられている）、ペプチドリガンド、ならびに、本発明のペプチドリガンドであって、ある特定の官能基が、当該の（放射性）同位体または同位体で標識された官能基に共有結合で交換されている、ペプチドリガンドをすべて包含する。
【０１１１】
本発明のペプチドリガンド中に包含するのに適した同位体の例は、水素の同位体、例えば、２Ｈ（Ｄ）および３Ｈ（Ｔ）、炭素の同位体、例えば、１１Ｃ、１３Ｃおよび１４Ｃ、塩素の同位体、例えば、３６Ｃｌ、フッ素の同位体、例えば、１８Ｆ、ヨウ素の同位体、例えば、１２３Ｉ、１２５Ｉおよび１３１Ｉ、窒素の同位体、例えば、１３Ｎおよび１５Ｎ、酸素の同位体、例えば、１５Ｏ、１７Ｏおよび１８Ｏ、リンの同位体、例えば、３２Ｐ、硫黄の同位体、例えば、３５Ｓ、銅の同位体、例えば、６４Ｃｕ、ガリウムの同位体、例えば、６７Ｇａまたは６８Ｇａ、イットリウムの同位体、例えば、９０Ｙ、およびルテチウムの同位体、例えば、１７７Ｌｕ、ならびにビスマスの同位体、例えば、２１３Ｂｉを含む。
【０１１２】
本発明のある特定の同位体標識ペプチドリガンド、例えば、放射性同位体を組み込んでいるものは、薬物および／または基質の組織分布研究において有用であり、ならびに疾患組織上のＣＤ１３７標的の有無を臨床的に評価するのに有用である。本発明のペプチドリガンドにはさらに、標識化合物と他の分子、ペプチド、タンパク質、酵素または受容体との間の複合体の形成を検出または同定するのに使用し得るという、価値高い診断特性があるとしてよい。検出または同定方法では、放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光性物質（例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、エクオリンおよびルシフェラーゼ）等などの標識試薬で標識されている化合物を使用することができる。放射性同位体であるトリチウム、すなわち３Ｈ（Ｔ）、および炭素１４、すなわち１４Ｃは、その一体化の容易さ、およびすぐ検出できる手段であるという観点で、この目的に特に有用である。
【０１１３】
より重い同位体、例えば、重水素、すなわち２Ｈ（Ｄ）による置換は、より大きな代謝安定性、例えば、インビボでの半減期の延長または投与必要量の低減に起因するある特定の治療上の利点を与えることができ、したがって、一部の状況では好ましい場合がある。
【０１１４】
ポジトロン放出同位体、例えば、１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏおよび１３Ｎなどによる置換は、標的占有率を検査するのに、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）研究で有用とすることができる。
【０１１５】
本発明のペプチドリガンドの同位体標識の化合物は一般には、当業者に知られている従来の技法によって、または従来から用いられている非標識試薬の代わりに適切な同位体標識試薬を使用して、添付の実施例に記載の方法に類似した方法によって、調製することができる。
【０１１６】
＜分子足場＞
分子足場は、例えば、ＷＯ２００９／０９８４５０ならびにそこに引用されている参考文献、特に、ＷＯ２００４／０７７０６２およびＷＯ２００６／０７８１６１において記載されている。
【０１１７】
前述の文書に記述の通り、分子足場は、有機小分子などの、小分子であってもよい。
【０１１８】
一実施形態では、分子足場は巨大分子であってもよい。一実施形態では、分子足場は、アミノ酸、ヌクレオチドまたは炭水化物から構成される巨大分子である。
【０１１９】
一実施形態では、分子足場は、ポリペプチドの官能基（複数可）と反応して共有結合を形成することができる反応基を含む。
【０１２０】
分子足場は、ペプチドと連結を形成する化学基、例えば、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、アルキン、アジド、無水物、スクシンイミド、マレイミド、ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化アシルを含むことができる。
【０１２１】
一実施形態では、分子足場は、ヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジン、特に１，３，５−トリアクリロイルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジン（「ＴＡＴＡ」）、またはその誘導体を含むことができ、またはそれからなることができる。
【０１２２】
一実施形態では、分子足場は２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレンである。この分子は、１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン（ＴＢＭＢ）に類似であるが、ベンゼン環に付いた追加の３個のメチル基を含有する。このことには、追加のメチル基は、ポリペプチドとのさらなる接触を形成し、したがって追加の構造的制約を加えることができるという利点がある。
【０１２３】
本発明の分子足場は、本発明のコード化ライブラリのポリペプチドの官能基が分子足場と共有結合の連結を形成することを可能とする化学基を含有する。前記化学基は、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、アルキン、無水物、スクシンイミド、マレイミド、アジ化物、ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化アシルを含めて広範囲の官能基から選択される。
【０１２４】
システインのチオール基と反応するように分子足場上で使用可能な足場反応基は、ハロゲン化アルキル（またはハロゲノアルカンもしくはハロアルカンとも称される）である。
【０１２５】
例としては、ブロモメチルベンゼンまたはヨードアセトアミドが含まれる。化合物をタンパク質中のシステインと選択的にカップリングさせるのに使用されるその他の足場反応基はマレイミド、αβ不飽和カルボニル含有化合物、およびα−ハロメチルカルボニル含有化合物である。本発明において分子足場として使用できるマレイミドの例には、トリス−（２−マレイミドエチル）アミン、トリス−（２−マレイミドエチル）ベンゼン、トリス−（マレイミド）ベンゼンが含まれる。αβ不飽和カルボニル含有化合物の例は、１，１’，１”−（１，３，５−トリアジナン−１，３，５−トリイル）トリプロパ−２−エン−１−オン（ＴＡＴＡ）である（Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１４），５３（６），１６０２−１６０６）。α−ハロメチルカルボニル含有化合物の例は、Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−（ベンゼン−１，３，５−トリイル）トリス（２−ブロモアセトアミド）である。セレノシステインもシステインと類似の反応性を有しており、同じ反応に使用することができる天然アミノ酸である。したがって、システインが記述される場合はいつでも、文脈が他に示唆しない限り、セレノシステインを代わりに使うことは通常は許容される。
【０１２６】
＜エフェクター基および官能基＞
本発明のさらなる態様によれば、１個もしくは複数のエフェクター基および／または官能基にコンジュゲートされた、本明細書に定義のペプチドリガンドを含む薬物コンジュゲートが提供される。
【０１２７】
エフェクター基および／または官能基を、例えば、ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に、ポリペプチド内のアミノ酸に、または分子足場に、付けることができる。
【０１２８】
適切なエフェクター基は、抗体およびその部分または断片を含む。例をあげると、エフェクター基は、１種または複数種の定常領域ドメインに加えて、抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）、抗体ＣＨ１重鎖ドメイン、抗体ＣＨ２重鎖ドメイン、抗体ＣＨ３重鎖ドメインまたはそれらの任意の組合せを含むことができる。エフェクター基は、抗体のヒンジ領域（ＩｇＧ分子のＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間に通常みられる領域のような）も含むこともできる。
【０１２９】
本発明のこの態様のさらなる実施形態では、本発明によるエフェクター基は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域である。有利には、本発明によるペプチドリガンド−エフェクター基は、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上または７日以上のｔβ半減期を有するペプチドリガンドＦｃ融合体を含む、またはこれからなる。最も有利には、本発明によるペプチドリガンドは、１日以上の半減期を有するペプチドリガンドＦｃ融合体を含む、またはこれからなる。
【０１３０】
官能基には、一般に、結合基、薬物、他の実体を付けるための反応基、細胞への大員環ペプチドの取り込みを助ける官能基等が含まれる。
【０１３１】
細胞へと浸透するペプチドの能力によって、細胞内標的に対してペプチドを有効なものとすることができる。細胞へと浸透する能力を備えたペプチドによりアクセスすることができる標的には、転写因子、チロシンキナーゼといった細胞内シグナル伝達分子およびアポトーシス経路に関与する分子が含まれる。細胞の浸透を可能にする官能基には、ペプチドまたは分子足場のいずれかに付加されたペプチドまたは化学基が含まれる。例えば、Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ（２００７）Ｖｏｌｕｍｅ  ３５，ｐａｒｔ  ４，ｐ８２１；Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（２００４）  Ｖｏｌｕｍｅ  ５７  ９６３７に記載されている、ＶＰ２２、ＨＩＶ−Ｔａｔ、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のホメオボックスタンパク質（アンテナペディア）などに由来するものなどのペプチド。原形質膜を通したトランスロケーションで効率的であることが示された短いペプチドの例には、ショウジョウバエアンテナペディアタンパク質由来の１６アミノ酸のペネトラチン（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）ペプチド（Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）  Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌｕｍｅ  ２６９  ｐ１０４４４）、１８アミノ酸の「モデル両親媒性ペプチド」（Ｏｅｈｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  １４１４  ｐ１２７）およびＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質のアルギニンリッチ領域が含まれる。非ペプチド性アプローチには、生体分子に容易に付けることができる小分子模倣物またはＳＭＯＣの使用が含まれる（Ｏｋｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ（２００７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  ４  ｐ１５３）。分子にグアニジウム基を付加する他の化学的戦略によっても、細胞浸透が増強される（Ｅｌｓｏｎ−Ｓｃｗａｂ  ｅｔ  ａｌ（２００７）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２８２  ｐ１３５８５）。ステロイドといった低分子量の分子を分子足場に付加して、細胞への取り込みを増強することができる。
【０１３２】
ペプチドリガンドに付けることのできる官能基の一クラスには、抗体およびその結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆｖまたはシングルドメイン断片、が含まれる。特に、インビボでペプチドリガンドの半減期を延長することができるタンパク質に結合する抗体を使用することができる。
【０１３３】
一実施形態では、本発明によるペプチドリガンド−エフェクター基は、１２時間以上、２４時間以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上、１４日以上、１５日以上または２０日以上からなる群から選択されるｔβ半減期を有する。有利には、本発明によるペプチドリガンド−エフェクター基または組成物は、１２〜６０時間の範囲内のｔβ半減期を有することになる。さらなる実施形態では、それは、１日以上のｔβ半減期を有することになる。なおさらなる実施形態では、それは、１２〜２６時間の範囲内となる。
【０１３４】
本発明の特定の一実施形態では、官能基は、医薬関連の複合金属放射性同位体に適した金属キレーターから選択される。
【０１３５】
可能なエフェクター基にはまた、例をあげると、酵素／プロドラッグ療法での使用向けのカルボキシペプチダーゼＧ２などの酵素が含まれ、この場合、ペプチドリガンドは、ＡＤＥＰＴにおいて抗体に取って代わるものである。
【０１３６】
一実施形態では、本発明の多量体結合複合体は、ジスルフィド結合またはプロテアーゼ感受性結合などの、切断可能な結合を含有する。理論に拘泥するものではないが、かかる切断可能な部分は、複合体が腫瘍の微小環境に到達するまでに、複合体を不活性化すると考えられる。この実施形態の効果は、標的への結合に続いて複合体のサイズ減少をもたらすことである。さらなる実施形態では、ジスルフィド結合に隣接する基は、ジスルフィド結合における障害を制御するように、そしてこれにより、結合剤の切断および同時放出の速度を制御するように、修飾される。
【０１３７】
公開の研究によって、ジスルフィド結合のいずれかの側に立体障害を導入することによって、還元に対するジスルフィド結合の感受性を改変する可能性が確立された（Ｋｅｌｌｏｇｇ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２，７１７）。立体障害の程度が大きいと、細胞内グルタチオンおよびまた細胞外（全身性）還元剤による還元の速度は低下し、結果として、毒素が、細胞の内側および外側の両方で放出されにくくなる。したがって、循環中のジスルフィド安定性における最適条件（毒素の望ましくない副作用を最小限にする）に対する細胞内環境における効率的な放出（治療効果を最大にする）の選択は、ジスルフィド結合のいずれかの側にある障害の程度を注意深く選択することによって達成することができる。
【０１３８】
ジスルフィド結合のいずれかの側にある障害は、標的化実体（ここでは、二環式ペプチド）上に１個または複数個のメチル基を導入することによってモジュレートされる。
【０１３９】
合成
本発明のペプチドは、標準的な技法によって、続いてインビトロでの分子足場との反応によって、合成的に製造することができる。これを行う場合、標準的な化学反応を使用することができる。これによって、さらなる下流の実験またはバリデーション用に可溶性材料の迅速な大規模調製が可能になる。このような方法は、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎら（上述）に開示されるものといった従来の化学反応を使用して行うことができる。
【０１４０】
したがって、本発明はまた、本明細書に記載の通りに選択されるポリペプチドまたはコンジュゲートの製造であって、下で説明する任意選択のさらなるステップを含む、製造に関する。一実施形態では、これらのステップは、化学合成によって作製された最終生成物のポリペプチド／コンジュゲート上で行われる。
【０１４１】
任意選択で、目的のポリペプチド中のアミノ酸残基は、コンジュゲートまたは複合体を製造する場合に置換することができる。
【０１４２】
ペプチドはまた、伸長して、例えば、別のループを組み込み、したがって複数の特異性を導入することができる。
【０１４３】
ペプチドを伸長するために、ペプチドを、標準の固相化学または液相化学を使用して、直交的に保護されたリジン（およびアナログ）を使用して、そのＮ末端もしくはＣ末端においてまたはループ内で化学的に、単に伸長することができる。標準の（バイオ）コンジュゲーション技法を使用して、活性化されたもしくは活性化可能なＮ末端またはＣ末端を導入することができる。あるいは、例えば（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７７６−７７９）に記載のように、断片縮合もしくは天然の化学ライゲーションにより、または、例えば（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９４  Ｄｅｃ２０；９１（２６）：１２５４４−８  ｏｒ  ｉｎ  Ｈｉｋａｒｉ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  １８，Ｉｓｓｕｅ  ２２，１５  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００８，Ｐａｇｅｓ  ６０００−６００３）に記載のようにサブチリガーゼを使用して、酵素により、付加を行うことも可能である。
【０１４４】
あるいは、ペプチドを、ジスルフィド結合を介したさらなるコンジュゲーションによって伸長または修飾することができる。これには、いったん細胞の還元環境内に入ると、第１および第２のペプチドが互いに解離することができるという追加の利点がある。この場合、３個のシステイン基と反応するように、分子足場（例えば、ＴＡＴＡ）を第１のペプチドの化学合成の過程で添加することが可能である；次いで、さらなるシステインまたはチオールを、第１のペプチドのＮ末端またはＣ末端に添えることが可能で、その結果、このシステインまたはチオールのみを第２のペプチドの遊離のシステインまたはチオールと反応させて、ジスルフィド連結された二環式ペプチド−ペプチドコンジュゲートを形成する。
【０１４５】
同様の技法を、２つの二環式で二重特異性の大員環の合成／カップリングに等しく適用して、可能性としては四重特異的な分子を創出する。
【０１４６】
さらに、他の官能基またはエフェクター基の付加は、適切な化学反応を使用して、同じ方式で行うことができ、Ｎ末端もしくはＣ末端で、または側鎖を介してカップリングする。一実施形態では、このカップリングは、いずれの実体の活性もブロックしないような方式で、行われる。
【０１４７】
＜医薬組成物＞
本発明のさらなる態様によれば、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤との組合せで、本明細書に定義の多量体結合複合体または薬物コンジュゲートを含む医薬組成物が提供される。
【０１４８】
概して、本ペプチドリガンドは、薬理学的に適切な賦形剤または担体と一緒に精製された形態で利用される。典型的には、これらの賦形剤または担体には、生理食塩水および／または緩衝媒体を含めて、水性溶液もしくはアルコール性／水性の溶液、乳濁液または懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖加リンゲル液（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、ブドウ糖と塩化ナトリウム、ならびに乳酸加リンゲル液が含まれる。適切な生理学的に許容されるアジュバントは、ポリペプチド複合体を懸濁液中に維持することが必要であれば、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギネートといった増粘剤から選択することができる。
【０１４９】
静脈内ビヒクルには、ブドウ糖加リンゲル液をベースとするものなどの、液体および栄養補給物（ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）、電解質補給物（ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）が含まれる。抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどの、保存剤およびその他の添加剤もまた存在してよい（Ｍａｃｋ（１９８２）  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）。
【０１５０】
本発明のペプチドリガンドは、別々に投与される組成物として、または他の薬剤と併せて使用することができる。これらは、抗体、抗体断片および種々の免疫治療薬、例えば、シクロスポリン、メトトレキサート、アドリアマイシンまたはシスプラチンおよび免疫毒素を含むことができる。医薬組成物は、それらが投与の前にプールされるかどうかに関わらず、本発明のタンパク質リガンドと併せた、またはさらには様々な特異性を有する本発明による選択されたポリペプチドの組合せと、例えば、様々な標的リガンドを使用して選択されるポリペプチドの組合せと併せた、種々の細胞障害剤または他の薬剤の「カクテル」を含むことができる。
【０１５１】
本発明による医薬組成物の投与経路は、当業者であれば一般に知られているもののいずれかとしてよい。治療の場合、本発明のペプチドリガンドは、標準的な技法に従って任意の患者に投与することができる。投与は、非経口的、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮的であること、肺の経路を介すること、または、適切に、カテーテルによる直接の注入によることも含めて、適当な任意のモードによるものとしてよい。好ましくは、本発明による医薬組成物は、吸入により投与されることになる。投与量および投与の頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬物の併行投与、禁忌および臨床医が考慮に入れるべきその他のパラメーターによって変わることになる。
【０１５２】
本発明のペプチドリガンドを、保存向けに凍結乾燥し、使用前に適切な担体中で復元することができる。この技法は、有効であることが示されてきており、技術上知られている（ａｒｔ−ｋｎｏｗｎ）凍結乾燥および復元技法を用いることができる。凍結乾燥および復元は、様々な程度の活性喪失となる可能性があり、そのレベルについては、不足を補うために上方に調整しなければならない場合もあることを当業者であれば理解されよう。
【０１５３】
本ペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物は、予防的および／または治療的処置向けに投与することができる。ある特定の治療的用途では、選択された細胞の集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、モデュレーション、殺滅、またはその他のいくつかの測定可能なパラメーターを果たす適当な量が、「治療有効用量」として定義される。この投与量を達成するのに必要とされる量は、疾患の重症度および患者自身の免疫系の全身状態によって左右されるが、一般に、体重１キログラム当たり選択されたペプチドリガンド０．００５から５．０ｍｇの範囲であるが、０．０５〜２．０ｍｇ／ｋｇ／用量の用量がより一般に使用される。予防的用途の場合、本ペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物はまた、同様の投与量で投与しても、僅かにより低い投与量で投与してもよい。
【０１５４】
本発明によるペプチドリガンドを含有する組成物は、哺乳動物において選択された標的細胞集団の改変、不活性化、殺滅または排除を助けるために、予防的および治療的設定において利用することができる。加えて、本明細書に記載のペプチドリガンドは、細胞の異種集合からの標的細胞集団を殺滅させる、枯渇させる、またはそうでなければ効果的に排除するために、体外でまたはインビトロで選択的に使用することができる。哺乳動物由来の血液を、選択されたペプチドリガンドと体外で混合することができ、これにより、標準的な技法に従って、当該哺乳動物へと戻すために、望ましくない細胞を殺滅するか、またはそうでなければ血液から排除する。
【０１５５】
＜治療上の使用＞
本発明の二環式ペプチドは、ＣＤ１３７結合剤として特定の有用性を有する。
【０１５６】
ＣＤ１３７は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーのメンバーである。その代替の名称は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９）、４−ＩＢＢであり、リンパ球活性化（ＩＬＡ）によって誘導される。ＣＤ１３７は、活性化されたＴ細胞によって発現されるが、ＣＤ４＋  Ｔ細胞におけるよりもＣＤ８＋  Ｔ細胞においてより大きく発現し得る。加えて、ＣＤ１３７の発現は、樹状細胞、濾胞性樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、顆粒球および炎症部位の血管壁細胞に見いだされる。ＣＤ１３７の特徴付けられた活性の１つは、活性化されたＴ細胞に対するその共刺激活性である。ＣＤ１３７の架橋結合によって、Ｔ細胞増殖、ＩＬ−２分泌、生存および細胞溶解活性が増強される。さらに、このことによって、マウスでは、免疫活性を増強して腫瘍を排除することができる。
【０１５７】
ＣＤ１３７は、ＴＣＲ活性化で誘導されるＴ細胞共刺激受容体である（Ｎａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，５：３５７−３６３  （２００５）；Ｗａｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３：２３−６８（２００５））。活性化されたＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞でのその発現に加えて、ＣＤ１３７はまた、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＮＫ−Ｔ細胞、単球、好中球および樹状細胞でも発現する。その天然のリガンドであるＣＤ１３７Ｌは、Ｂ細胞、単球／マクロファージ、および樹状細胞を含めて抗原提示細胞で記載されている（Ｗａｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２３：２３−６８（２００５））。そのリガンドと相互作用すると、ＣＤ１３７によって、ＴＣＲ誘導性のＴ細胞増殖の増加、サイトカイン産生、機能的成熟、およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の生存の延長がもたらされる（Ｎａｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，５：３５７−３６３  （２００５），Ｗａｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２３：２３−６８（２００５））。
【０１５８】
ＣＤ１３７ＬまたはＣＤ１３７に対するアゴニスト性モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のいずれかによるＣＤ１３７を介するシグナル伝達によって、ＴＣＲ誘導性のＴ細胞増殖の増加、サイトカイン産生および機能的成熟、ならびにＣＤ８＋  Ｔ細胞の生存の延長がもたらされる。これらの効果は、（１）ＮＦ−κＢ、ｃ−Ｊｕｎ  ＮＨ２末端キナーゼ／ストレス活性化プロテインキナーゼ（ＪＮＫ／ＳＡＰＫ）、およびｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路の活性化、ならびに（２）抗アポトーシスおよび細胞周期関連遺伝子発現の制御に起因する。
【０１５９】
ＣＤ１３７欠損マウスとＣＤ１３７Ｌ欠損マウスの両方において実施された実験では、完全にコンピテントなＴ細胞応答の発生におけるＣＤ１３７共刺激の重要性がさらに実証されている。
【０１６０】
ＩＬ−２およびＩＬ−１５により活性化されたＮＫ細胞はＣＤ１３７を発現し、アゴニスト性ｍＡｂによるＣＤ１３７のライゲーションは、ＮＫ細胞増殖およびＩＦＮ−γ分泌を刺激するが、その細胞溶解活性は刺激しない。
【０１６１】
さらに、ＣＤ１３７により刺激されたＮＫ細胞は、インビトロで活性化Ｔ細胞の増殖を促進する。
【０１６２】
それらの共刺激機能によれば、ＣＤ１３７に対するアゴニストｍＡｂは、心臓および皮膚の同種移植片の拒絶を促進し、定着腫瘍を根絶し、一次抗ウイルスＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を拡げ、Ｔ細胞の細胞溶解能を高めることが示されている。これらの研究は、ＣＤ１３７シグナル伝達が、腫瘍および感染に対する免疫を増強し得るＴ細胞機能を促進するという見解を裏付ける。
【０１６３】
本発明の方法に従って選択されたポリペプチドリガンドは、インビボでの治療的および予防的用途、インビトロおよびインビボでの診断用途、インビトロでのアッセイや試薬用途等において用いることができる。選択されたレベルの特異性を有するリガンドは、交差反応性が望ましい、非ヒトの動物における試験を伴う用途において、または、相同体もしくはパラログとの交差反応性を注意深く制御する必要がある診断用途において有用である。ワクチン用途などの一部の用途では、所定の範囲の抗原に対して免疫応答を誘発する能力を活用して、特定の疾患および病原体に対してワクチンを調整することができる。
【０１６４】
少なくとも９０〜９５％の均質性の実質的に純粋なペプチドリガンドは、哺乳動物への投与向けに好ましく、９８〜９９％またはそれ超の均質性は、特に、哺乳動物がヒトである場合、製薬学的使用向けに最も好ましい。所望の通り部分的にまたは均質性となるまで精製したら、選択されたポリペプチドを、診断的にもしくは治療的に（体外を含めて）使用してもよく、またはアッセイ手順、免疫蛍光染色等を開発および実施する際に使用してもよい（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｅ  ａｎｄ  Ｐｅｒｎｉｓ，（１９７９  ａｎｄ  １９８１）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）。
【０１６５】
本発明のさらなる態様によれば、ＣＤ１３７によって媒介される疾患または障害を予防、抑制または処置するのに使用するための、本明細書で定義の多量体結合複合体または薬物コンジュゲートが提供される。
【０１６６】
本発明のさらなる態様によれば、ＣＤ１３７によって媒介される疾患または障害を予防、抑制または処置する方法が提供され、これは、それを必要とする患者に、本明細書で定義の多量体結合複合体のエフェクター基および薬物コンジュゲートを投与するステップを含む。
【０１６７】
一実施形態では、ＣＤ１３７は哺乳動物のＣＤ１３７である。さらなる実施形態では、哺乳動物のＣＤ１３７はヒトＣＤ１３７（ｈＣＤ１３７）である。
【０１６８】
一実施形態では、ＣＤ１３７によって媒介される疾患または障害は、がん、感染症および炎症から選択される。さらなる実施形態では、ＣＤ１３７によって媒介される障害または疾患は、がんから選択される。
【０１６９】
処置（または阻害）し得るがん（およびそれらの良性の対応物）の例には、これらに限定されないが、上皮由来の腫瘍（腺癌、扁平上皮癌、移行上皮癌およびその他の癌腫を含めて様々なタイプの腺腫および癌腫）、例えば、膀胱および尿路、乳房、胃腸管（食道、胃（胃の）、小腸、結腸、直腸および肛門を含めて）、肝臓（肝細胞癌）、胆嚢および胆管系、膵外分泌部、腎臓，肺（例えば、腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、気管支肺胞上皮癌および中皮腫）、頭頸部（例えば、舌、口腔、喉頭、咽頭、上咽頭、扁桃、唾液腺、鼻腔および副鼻腔のがん）、卵巣、輪卵管、腹膜、膣、外陰部、陰茎、子宮頸部、子宮筋層、子宮内膜、甲状腺（例えば、甲状腺濾胞腺癌）、副腎、前立腺、皮膚および付属器（例えば、黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、角化棘細胞腫、異形成母斑）の各癌腫；
血液学的悪性腫瘍（すなわち、白血病、リンパ腫）、ならびに前悪性血液障害およびボーダーライン悪性腫瘍の障害、これには、血液学的悪性腫瘍、およびリンパ球系統の関連する状態（例えば、急性リンパ球性白血病［ＡＬＬ］、慢性リンパ球性白血病［ＣＬＬ］、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫［ＤＬＢＣＬ］、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫および白血病、ナチュラルキラー［ＮＫ］細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、毛様細胞白血病、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症、形質細胞腫、多発性骨髄腫、および移植後のリンパ増殖性障害）、ならびに血液学的悪性腫瘍および骨髄細胞系統の関連する状態（例えば、急性骨髄性白血病［ＡＭＬ］、慢性骨髄性白血病［ＣＭＬ］、慢性骨髄単球性白血病［ＣＭＭＬ］、好酸球増加症候群、骨髄増殖性障害、例えば、真性多血症、本態性血小板血症および原発性骨髄線維症、骨髄増殖性症候群、骨髄異形成症候群、および前骨髄球性白血病）があり；間葉起源の腫瘍、例えば、軟部組織、骨または軟骨の肉腫、例えば、骨肉腫、線維肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、滑膜肉腫、類上皮肉腫、胃腸間質腫瘍、良性および悪性の組織球腫、ならびに隆起性皮膚線維肉腫；中枢または末梢神経系の腫瘍（例えば、星状細胞腫、神経膠腫および神経膠芽腫、髄膜腫、上衣腫、松果体腫瘍およびシュワン細胞腫）；内分泌腫瘍（例えば、下垂体腫瘍、副腎腫瘍、島細胞腫瘍、副甲状腺腫瘍、カルチノイド腫瘍および甲状腺の髄様癌）；目および付属器腫瘍（例えば、網膜芽細胞腫）；生殖細胞および絨毛性腫瘍（例えば、奇形腫、精上皮腫、未分化胚細胞腫、胞状奇胎および絨毛癌）；ならびに小児および胎児性腫瘍（例えば、髄芽細胞腫、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、および原始神経外胚葉性腫瘍）；または患者を悪性腫瘍に迫りやすくさせる先天性もしくはそれ以外の症候群（例えば、色素性乾皮症）が含まれる。
【０１７０】
さらなる実施形態では、がんは、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、Ｂ慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、ＢおよびＴ急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）から選択されるなどの、造血器悪性腫瘍から選択される。
【０１７１】
本明細書において用語「予防」への言及は、疾患の誘発の前の保護的組成物の投与を含む。「抑制」とは、誘導的事象の後であるが、疾患の臨床所見の前の組成物の投与を指す。「処置」は、病徴が発現した後の保護的組成物の投与を含む。
【０１７２】
疾患から保護するまたは疾患を処置する上で、ペプチドリガンドの有効性をスクリーニングするのに使用することができる動物モデル系が利用可能である。ヒト標的および動物標的と交差反応することができるリペプチドリガンドを開発することを可能にする本発明によって動物モデル系の使用が促進され、その結果、動物モデルの使用が可能となる。
【０１７３】
本発明を、以下の実施例を参照して下でさらに説明する。
【実施例】
【０１７４】
［材料および方法］
ペプチド合成
ペプチド合成は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓによって製造されたＳｙｍｐｈｏｎｙペプチドシンセサイザー、およびＭｕｌｔｉＳｙｎＴｅｃｈ製のＳｙｒｏ  ＩＩシンセサイザーを使用して、Ｆｍｏｃケミストリーをベースとした。適当な側鎖保護基を有する標準的なＦｍｏｃ−アミノ酸を用いた（Ｓｉｇｍａ、Ｍｅｒｃｋ）。ここで、いずれの場合も、適用可能な標準カップリング条件を使用し、これに続いて、標準の方法論を使用して脱保護を行った。ペプチドを、ＨＰＬＣを使用して精製し、単離に続いて、１，３，５−トリアクリロイルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジン（ＴＡＴＡ、Ｓｉｇｍａ）で修飾した。このために、直鎖状ペプチドをおよそ３５ｍＬまで５０：５０  ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏで希釈し、１００ｍＭ  ＴＡＴＡのアセトニトリルおよそ５００μＬを添加し、反応を１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３のＨ２Ｏ  ５ｍＬで開始した。反応をＲＴでおよそ３０〜６０分間進行させ、反応が完了したら（ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより判断）凍結乾燥した。完了したら、１Ｍ  Ｌ−システイン塩酸塩一水和物（Ｓｉｇｍａ）のＨ２Ｏ  １ｍｌを反応物に添加してＲＴでおよそ６０分間おき、過剰な任意のＴＡＴＡをクエンチした。
【０１７５】
凍結乾燥に続いて、修飾ペプチドを上の通りに精製したが、一方、Ｌｕｎａ  Ｃ８をＧｅｍｉｎｉ  Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）に交換し、酸を０．１％トリフルオロ酢酸に変更した。正確なＴＡＴＡ−修飾材料を含有する純粋な画分を、プールし、凍結乾燥し、保存のために−２０℃にて維持した。
【０１７６】
特に記載がない限り、すべてのアミノ酸をＬ−立体配置で使用した。
【０１７７】
多量体の合成
＜化合物３の調製のための一般手順＞
【０１７８】
【化１５】
2021514953.tif 000022
【０１７９】
化合物１（５００ｍｇ、５．１０ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＤＣＭ溶液（２５ｍＬ）に、化合物２（６４５．２ｍｇ、５．６１ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）およびＥＤＣＩ（１．９５ｇ、１０．１９ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ）を添加した。混合物を２０℃で１時間撹拌した。ＴＬＣ（ＰＥ：ＤＣＭ＝０：１、Ｒｆ＝０．４３、発色試薬：ブロモクレゾールグリーン）は、化合物１が完全に消費され、新しい１つのスポットが形成されたことを示した。ＴＬＣによると、反応物はクリーンであった。反応混合物を減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、石油エーテル／酢酸エチル＝２／１〜１：１）によって精製して、化合物３（６２０ｍｇ、３．１８ｍｍｏｌ、６２．３３％の収率）を白色の固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ：４００ＭＨｚ  ＣＤＣｌ３
δ２．８０〜２．９５（ｍ，６Ｈ）、２．５５〜２．７０（ｍ，２Ｈ）、２．０５〜２．１０（ｔ，１Ｈ）
【０１８０】
＜化合物５の調製のための一般手順＞
【０１８１】
【化１６】
2021514953.tif 000023
【０１８２】
【化１７−１】
2021514953.tif 000024
【化１７−２】
2021514953.tif 000025
【化１７−３】
2021514953.tif 000026
【化１７−４】
2021514953.tif 000027
【０１８３】
化合物５：
【０１８４】
【化１８−１】
2021514953.tif 000028
【化１８−２】
2021514953.tif 000029
【化１８−３】
2021514953.tif 000030
【化１８−４】
2021514953.tif 000031
【０１８５】
単量体１Ａ：
単量体１（３５０．０ｍｇ、１６３．２２μｍｏｌ、１．０ｅｑ）と化合物３（６３．７１ｍｇ、３２６．４３μｍｏｌ、２．０ｅｑ）とのＤＭＡ溶液（１０ｍＬ）に、ＤＩＰＥＡ（１０５．４７ｍｇ、８１６．０８μｍｏｌ、１４２．１５μＬ、５．０ｅｑ）を添加した。混合物を２０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、単量体１が完全に消費され、所望のＭＳのメインピークが１つ検出されたことを示した。混合物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により精製して、単量体１Ａ（２５４ｍｇ、６９．９６％の収率）を白色の固体として得た。
【０１８６】
単量体２Ａ：
単量体２（３５０ｍｇ、１５８．９９μｍｏｌ、１ｅｑ）と化合物３（６２．０ｍｇ、３１７．９７μｍｏｌ、２ｅｑ）とのＤＭＡ溶液（３ｍＬ）に、ＤＩＰＥＡ（１０３．０ｍｇ、７９４．９３μｍｏｌ、１３８．４６μＬ、５ｅｑ）を添加した。混合物を２０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、単量体２が完全に消費され、所望のＭＳのメインピークが１つ検出されたことを示した。混合物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により精製して、単量体２Ａ（３０４ｍｇ、１３０．５８μｍｏｌ、８２．１３％の収率、９８％の純度）を白色の固体として得た。
【０１８７】
単量体３Ａ：
単量体３（０．３ｇ、１３７．２７μｍｏｌ、１．０ｅｑ）と化合物３（５４ｍｇ、２７６．６８μｍｏｌ、２．０ｅｑ）とのＤＭＡ溶液（３ｍＬ）に、ＤＩＰＥＡ（８９ｍｇ、６８８．６３μｍｏｌ、１１９．９５μＬ、５．０ｅｑ）を添加した。混合物を２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣは、単量体３が完全に消費され、所望のＭＳのメインピークが１つ検出されたことを示した。混合物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により精製して、単量体３Ａ（２７２ｍｇ、１１０．２１μｍｏｌ、８０．２９％の収率、９１．８％の純度）を白色の固体として得た。
【０１８８】
単量体４Ａ：
単量体４（０．３ｇ、１３７．２７μｍｏｌ、１ｅｑ）と化合物３（５４ｍｇ、２７６．６８μｍｏｌ、２．０２ｅｑ）とのＤＭＡ溶液（３ｍＬ）に、ＤＩＰＥＡ（８９ｍｇ、６８８．６３μｍｏｌ、１１９．９５μＬ、５．０２ｅｑ）を添加した。混合物を２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣは、単量体４が完全に消費され、所望のＭＳのメインピークが１つ検出されたことを示した。混合物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により精製して、単量体４Ａ（２０４ｍｇ、８５．３６μｍｏｌ、６２．１９％の収率、９４．８％の純度）を白色の固体として得た。
【０１８９】
単量体５Ａ：
単量体５（０．３ｇ、１３２．８９μｍｏｌ、１ｅｑ）と化合物３（５２．０ｍｇ、２６６．４３μｍｏｌ、２．０ｅｑ）とのＤＭＡ溶液（３ｍＬ）に、ＤＩＰＥＡ（８６．０ｍｇ、６６５．４１μｍｏｌ、１１５．９０μＬ、５．０ｅｑ）を添加した。混合物を２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣは、単量体５が完全に消費され、所望のＭＳのメインピークが１つ検出されたことを示した。混合物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により精製して、単量体５Ａ（１９４ｍｇ、７４．６９μｍｏｌ、５６．２１％の収率、９０．０％の純度）を白色の固体として得た。
【０１９０】
単量体６Ａ：
単量体６（０．３ｇ、１３７．２１μｍｏｌ、１．０ｅｑ）と化合物３（５４ｍｇ、２７６．６８μｍｏｌ、２．０ｅｑ）とのＤＭＡ溶液（３ｍＬ）に、ＤＩＰＥＡ（８９ｍｇ、６８８．６３μｍｏｌ、１１９．９５μＬ、５．０２ｅｑ）を添加した。混合物を２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣは、単量体６が完全に消費され、所望のＭＳのメインピークが１つ検出されたことを示した。混合物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により精製して、単量体６Ａ（２０４ｍｇ、８３．２５μｍｏｌ、６０．６８％の収率、９２．５％の純度）を白色の固体として得た。
【０１９１】
単量体７Ａ：
単量体７（０．３ｇ、１３８．４１μｍｏｌ、１．０ｅｑ）と化合物３（５４．００ｍｇ、２７６．８２μｍｏｌ、２．０ｅｑ）とのＤＭＡ溶液（３ｍＬ）に、ＤＩＰＥＡ（８９ｍｇ、６８８．６３μｍｏｌ、１１９．９５μＬ、５．０ｅｑ）を添加した。混合物を２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣは、単量体７が完全に消費され、所望のＭＳのメインピークが１つ検出されたことを示した。混合物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により精製して、単量体７Ａ（１８３ｍｇ、７３．６９μｍｏｌ、５３．２４％の収率、９０．５％の純度）を白色の固体として得た。
【０１９２】
単量体８Ａ：
ＤＭＳＯＡ（５ｍＬ）に含まれる、単量体８（４００ｍｇ、１８０．３８μｍｏｌ、１．０ｅｑ）、化合物３（７０．４１ｍｇ、３６０．７７μｍｏｌ、２．０ｅｑ）およびＤＩＰＥＡ（１１８．７２ｍｇ、９１８．５８μｍｏｌ、１６０．００μＬ、５．０ｅｑ）の混合物を脱気し、Ｎ２で３回パージした。次いで、混合物をＮ２雰囲気下で３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣは、単量体８が完全に消費され、所望のＭＳのメインピークが１つ検出されたことを示した。混合物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により精製して、単量体８Ａ（３００ｍｇ、１１８．８２μｍｏｌ、６５．８７％の収率、９１．７４％の純度）を白色の固体として得た。
【０１９３】
単量体９Ａ：
単量体９（０．３ｇ、１３６．２７μｍｏｌ、１．０ｅｑ）と化合物３（５３．０ｍｇ、２７２．５５μｍｏｌ、２．０ｅｑ）とのＤＭＡ溶液（３ｍＬ）に、ＤＩＰＥＡ（８８．０ｍｇ、６８１．３７μｍｏｌ、１１８．６８μＬ、５．０ｅｑ）を添加した。混合物を２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣは、単量体９が完全に消費され、所望のＭＳのメインピークが１つ検出されたことを示した。混合物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により精製して、単量体９Ａ（２４９ｍｇ、１００．４１μｍｏｌ、７３．６８％の収率、９２．０％の純度）を白色の固体として得た。
【０１９４】
単量体１０Ａ（２６０ｍｇ、９０％の純度）、単量体１１Ａ（１２３ｍｇ、９７．１０％の純度）、単量体１２Ａ（１３１ｍｇ、９７．５％の純度）、単量体１３Ａ（７８０ｍｇ、９８．０％の純度）、単量体１４Ａ（７１０ｍｇ、９２．４０％の純度）および単量体１５Ａ（８２０ｍｇ、９６．９％の純度）を上記の通りに合成し、分取ＨＰＬＣを使用して精製して、白色の固体を得た。
【０１９５】
＜化合物７の調製のための一般手順＞
【０１９６】
【化１９】
2021514953.tif 000032
【０１９７】
化合物６：
【０１９８】
【化２０】
2021514953.tif 000033
【０１９９】
化合物７：
【０２００】
【化２１】
2021514953.tif 000034
【０２０１】
化合物７Ａ：
単量体２（１２０ｍｇ、５４．５１μｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＤＭＡ溶液（４ｍＬ）に、化合物６Ａ（４０．３８ｍｇ、５４．５１μｍｏｌ、１．０ｅｑ）およびＤＩＰＥＡ（３５．２２ｍｇ、２７２．５５μｍｏｌ、４７．４７μＬ、５ｅｑ）を添加した。混合物を２０℃で１２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、単量体２が残存していないことを示した。新しいいくつかのピークがＬＣ−ＭＳ上に示され、所望の化合物およそ８０％が検出された。混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、化合物７Ａ（８９ｍｇ、３１．４８μｍｏｌ、５７．７５％の収率）を白色の固体として得た。
【０２０２】
化合物７Ｂ：
単量体２（７５．０ｍｇ、３４．０７μｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＤＭＡ溶液（３ｍＬ）に、化合物６Ｂ（４３．２５ｍｇ、３４．０７μｍｏｌ、１．０ｅｑ）およびＤＩＰＥＡ（２２．０２ｍｇ、１７０．３４μｍｏｌ、２９．６７μＬ、５．０ｅｑ）を添加した。混合物を２０℃で１２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、単量体２が残存していないことを示した。新しいいくつかのピークがＬＣ−ＭＳ上に示され、所望の化合物およそ８０％が検出された。混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、化合物７Ｂ（約７３ｍｇ、２１．７５μｍｏｌ、６３．８５％の収率）を白色の固体として得た。
【０２０３】
＜二量体二環式コンジュゲートの調製のための一般手順＞
【０２０４】
【化２２】
2021514953.tif 000035
【０２０５】
化合物７：
【０２０６】
【化２３】
2021514953.tif 000036
【０２０７】
化合物５：
【０２０８】
【化２４−１】
2021514953.tif 000037
【化２４−２】
2021514953.tif 000038
【０２０９】
化合物８：
【０２１０】
【化２５】
2021514953.tif 000039
【０２１１】
化合物８Ａ：
化合物７Ａ（１２ｍｇ、４．２４μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体１Ａ（９．４４ｍｇ、４．２４μｍｏｌ、１ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（１ｍＬ）にＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（０．４Ｍ、３１．８３μＬ、３ｅｑ）とアスコルビン酸（０．４Ｍ、１０６．１１μＬ、１０ｅｑ）とを、窒素下で添加した。混合物を２０℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物７Ａが残存していないことを示した。新しいいくつかのピークがＬＣ−ＭＳ上に示され、所望の化合物およそ８０％が検出された。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、化合物８Ａ（８．１ｍｇ、１．４９μｍｏｌ、３５．１１％の収率、９２．９４％の純度）を白色の固体として得た。
【０２１２】
化合物８Ｂ：
化合物７Ｂ（１４ｍｇ、４．１７μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体１Ａ（９．２８ｍｇ、４．１７μｍｏｌ、１ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（１ｍＬ）に、ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（０．４Ｍ、３１．２９μＬ、３ｅｑ）とアスコルビン酸（０．４Ｍ、１０４．３０μＬ、１０ｅｑ）とを、窒素下で添加した。混合物を２０℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物７Ｂが残存していないことを示した。新しいいくつかのピークがＬＣ−ＭＳ上に示され、所望の化合物およそ８０％が検出された。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、化合物８Ｂ（５．２ｍｇ、０．８６μｍｏｌ、２０．６２％の収率、９２．３１％の純度）を白色の固体として得た。
【０２１３】
化合物８Ｃ：
化合物７Ａ（１０ｍｇ、３．５４μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体３Ａ（１２．０２ｍｇ、５．３１μｍｏｌ、１．５ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（１ｍＬ）にＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（０．４Ｍ、２６．５３μＬ、３ｅｑ）とアスコルビン酸（０．４Ｍ、８８．４３μＬ、１０ｅｑ）とを、窒素下で添加した。混合物を２０℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物７Ａが残存していないことを示した。新しいいくつかのピークがＬＣ−ＭＳ上に示され、所望の化合物およそ４０％が検出された。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、化合物８Ｃ（２．８ｍｇ、５．０４ｅ−１μｍｏｌ、１４．２４％の収率、９１．６％の純度）を白色の固体として得た。
【０２１４】
化合物８Ｄ：
化合物７Ａ（１０ｍｇ、３．５４μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体４Ａ（１２．０２ｍｇ、５．３１μｍｏｌ、１．５ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（１ｍＬ）にＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（０．４Ｍ、２６．５３μＬ、３ｅｑ）とアスコルビン酸（０．４Ｍ、８８．４３μＬ、１０ｅｑ）とを、窒素下で添加した。混合物を２０℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物７Ａが残存していないことを示した。新しいいくつかのピークがＬＣ−ＭＳ上に示され、所望の化合物およそ４０％が検出された。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、化合物８Ｄ（２．１ｍｇ、３．７６ｅ−１μｍｏｌ、１０．６２％の収率、９１．１％の純度）を白色の固体として得た。
【０２１５】
化合物８Ｅ：
化合物７Ａ（１０ｍｇ、３．５４μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体５Ａ（１２．４０ｍｇ、５．３１μｍｏｌ、１．５ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（１ｍＬ）にＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（０．４Ｍ、２６．５３μＬ、３ｅｑ）とアスコルビン酸（０．４Ｍ、８８．４３μＬ、１０ｅｑ）とを、窒素下で添加した。混合物を２０℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物７Ａが残存していないことを示した。新しいいくつかのピークがＬＣ−ＭＳ上に示され、所望の化合物およそ２０％が検出された。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、化合物８Ｅ（１．２ｍｇ、２．０１ｅ−１μｍｏｌ、５．６９％の収率、８６．６％の純度）を白色の固体として得た。
【０２１６】
化合物８Ｆ：
化合物７Ａ（１０ｍｇ、３．５４μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体６Ａ（１２．０３ｍｇ、５．３１μｍｏｌ、１．５ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（１ｍＬ）にＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（０．４Ｍ、２６．５３μＬ、３ｅｑ）とアスコルビン酸（０．４Ｍ、８８．４３μＬ、１０ｅｑ）とを、窒素下で添加した。混合物を２０℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物７Ａが残存していないことを示した。新しいいくつかのピークがＬＣ−ＭＳ上に示され、所望の化合物およそ４０％が検出された。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、化合物８Ｆ（３．４ｍｇ、３．９３ｅ−１μｍｏｌ、１１．１２％の収率、５８．９％の純度）を白色の固体として得た。
【０２１７】
化合物８Ｇ：
化合物７Ａ（１０ｍｇ、３．５４μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体７Ａ（１１．９２ｍｇ、５．３１μｍｏｌ、１．５ｅｑ）とのＤＭＳＯ溶液（１ｍＬ）にＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（０．４Ｍ、２６．５３μＬ、３ｅｑ）とアスコルビン酸（０．４Ｍ、８８．４３μＬ、１０ｅｑ）とを、窒素下で添加した。混合物を２５〜３０℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物７Ａが残存していないことを示した。新しいいくつかのピークがＬＣ−ＭＳ上に示され、所望の化合物およそ４０％が検出された。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、化合物８Ｇ（７．２ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ、３７．７８％の収率、９４．２％の純度）を白色の固体として得た。
【０２１８】
化合物８Ｈ：
化合物７Ａ（１０ｍｇ、３．５４μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体８Ａ（１１．１９ｍｇ、５．３１μｍｏｌ、１．５ｅｑ）とのＤＭＳＯ溶液（１ｍＬ）にＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（０．４Ｍ、２６．５３μＬ、３ｅｑ）とアスコルビン酸（０．４Ｍ、８８．４３μＬ、１０ｅｑ）とを、窒素下で添加した。混合物を２５〜３０℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物７Ａが残存していないことを示した。新しいいくつかのピークがＬＣ−ＭＳ上に示され、所望の化合物およそ４０％が検出された。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、化合物８Ｈ（９．０ｍｇ、１．７３ｍｍｏｌ、４９．１５％の収率、９９．０％の純度）を白色の固体として得た。
【０２１９】
化合物８Ｉ：
化合物７Ａ（１０ｍｇ、３．５４μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体９Ａ（１２．１１ｍｇ、５．３１μｍｏｌ、１．５ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（１ｍＬ）にＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（０．４Ｍ、２６．５３μＬ、３ｅｑ）とアスコルビン酸（０．４Ｍ、８８．４３μＬ、１０ｅｑ）とを、窒素下で添加した。混合物を２０℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物７Ａが残存していないことを示した。新しいいくつかのピークがＬＣ−ＭＳ上に示され、所望の化合物およそ４０％が検出された。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、化合物８Ｉ（３．８ｍｇ、６．８１ｅ−１μｍｏｌ、１９．２４％の収率、９１．５％の純度）を白色の固体として与えた。
【０２２０】
＜三量体アジドリンカーの調製のための一般手順＞
【０２２１】
【化２６】
2021514953.tif 000040
【０２２２】
化合物９Ｃ：ｃ（ＫＧＫＧＫＧ）（環状（配列番号５７））
直鎖状ペプチドＮＨ２−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＣＯＯＨ（ＮＨ２−（配列番号５７）−ＣＯＯＨ）を、標準Ｆｍｏｃケミストリーを使用して、２−Ｃｌ−Ｔｒｔクロリドレジン（ＣＴＣレジン）で合成した。次いで、ペプチドをＤＣＭ中に含まれる２０％ＨＦＩＰで処理することにより（３０分×２）切断し、溶液を合わせ、真空下で蒸発させ、凍結乾燥して乾燥させ、その結果、直鎖状の粗生成物がもたらされた。次いで、粗ペプチドをＤＭＦに溶解し、これに続いて、カップリング試薬（ＤＩＣおよびＨＯＡｔ、それぞれ１ｅｑおよび１ｅｑ）を添加した。ＬＣＭＳが直鎖状ペプチドは残存していないことを示すまで、混合物を室温で１６時間撹拌した。その後、環化粗製物を真空下で乾燥させ、Ｃ１８フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。次いで、精製した環状ペプチドを凍結乾燥し、すべての保護基をＨＣｌ／ジオキサン（４Ｍ、１時間、室温）での処理により取り外した。沈殿物を収集し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで洗浄し、真空下で乾燥させて、白色の固体として最終生成物を得た（ＨＣｌ塩）。
【０２２３】
化合物１０：
【０２２４】
【化２７】
2021514953.tif 000041
【０２２５】
化合物１０Ｄ：
【０２２６】
【化２８】
2021514953.tif 000042
【０２２７】
化合物１（７００．０ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）（固相ペプチド合成から得た）、３−アジドプロパン−１−アミン（化合物２、１１７．７ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、ＨＯＢｔ（１９０．６ｍｇ、１．４１ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）、ＥＤＣＩ（２７０．４ｍｇ、１．４１ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）の混合物を、ＤＣＭ（２０ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で２時間、撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１が完全に消費され、所望のｍ／ｚ（理論ＭＷ：６７７．７５、観測ｍ／ｚ：６７８．２（［Ｍ＋Ｈ］＋））のメインピークが１つ検出されたことを示した。反応混合物を数滴の１Ｍ  ＨＣｌで処理し、有機層を収集し、蒸発させて溶媒を除去した。化合物３（６００．０ｍｇ、粗製）を白色の固体として得た。化合物３（６００．０ｍｇ、８８５．３μｍｏｌ、１．０ｅｑ）をＤＭＦ（３ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ピペリジン（１．２９ｇ、１５．１９ｍｍｏｌ、１．５０ｍＬ、１７．２ｅｑ）を添加し、混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費され、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：４５５．５１、観測ｍ／ｚ：４５６．３（［Ｍ＋Ｈ］＋））のメインピークが１つ検出されたことを示した。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製した。化合物１０Ｄ（４００．０ｍｇ、８７９．１μｍｏｌ）を無色の油として得た。
【０２２８】
化合物１０Ｅ：
【０２２９】
【化２９】
2021514953.tif 000043
【０２３０】
化合物１（１ｇ、１．６８ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、化合物２（４１１．５ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ、０．８ｅｑ）およびＤＩＥＡ（２１７．０ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ、２９２．４μＬ、１．０ｅｑ）の混合物をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、これに続いて、ＨＡＴＵ（６３８．４ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）を２５℃で一度に添加した。混合物を２５℃で３０分間撹拌した。ＴＬＣ（ＤＣＭ：ＣＨ３ＯＨ＝１０：１、Ｒｆ＝０．１８）は、化合物１が完全に消費され、新しいスポットが１つ形成されたことを示した。溶媒を蒸発させて、化合物３（１ｇ、１．１３ｍｍｏｌ、６７．３８％の収率）を白色の固体として製造し、これを、さらに精製することなく次の段階で直接使用した。化合物３（１ｇ、１．１３ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）を、ＤＭＦ（８ｍＬ）に溶解し、これに続いてピペリジン（２ｍＬ）を添加した。混合物を２５℃で１５分間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費され、所望のｍ／ｚ（理論ＭＷ：６６１．７５、観測ｍ／ｚ：６６３．１（［Ｍ＋Ｈ］＋））のメインピークが１つ検出されたことを示した。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製した。化合物１０Ｅ（８００ｍｇ、１．０９ｍｍｏｌ、９６．１８％の収率）を無色の油として得た。
【０２３１】
化合物１０Ｆ：
【０２３２】
【化３０】
2021514953.tif 000044
【０２３３】
化合物１（７００．０ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、３−アジドプロパン−１−アミン（１１７．７ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、ＨＯＢｔ（１９０．６ｍｇ、１．４１ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）、ＥＤＣＩ（２７０．４ｍｇ、１．４１ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）の混合物をＤＣＭ（２０ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１が完全に消費され、所望のｍ／ｚ（理論ＭＷ：６７７．７５、観測ｍ／ｚ：６７８．２（［Ｍ＋Ｈ］＋））のメインピークが１つ検出されたことを示した。反応混合物を数滴の１Ｍ  ＨＣｌで処理し、有機層を収集し、減圧下で蒸発させた。化合物２（６００．０ｍｇ、粗製）を白色の固体として得た。化合物２（６００．０ｍｇ、８８５．２μｍｏｌ、１．０ｅｑ）をＤＭＦ（３ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ピペリジン（１．２９ｇ、１５．１９ｍｍｏｌ、１．５０ｍＬ、１７．２ｅｑ）を添加し、混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費され、所望のｍ／ｚ（理論ＭＷ：４５５．５１、観測ｍ／ｚ：４５６．３（［Ｍ＋Ｈ］＋））のメインピークが１つ検出されたことを示した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製し、化合物３（４００．０ｍｇ、８７９．１μｍｏｌ）を無色の油として得た。
【０２３４】
化合物３（２５０．０ｍｇ、５４８．８３μｍｏｌ、１．０ｅｑ）、化合物４（２８４．１ｍｇ、５４８．８３μｍｏｌ、１ｅｑ）、ＨＡＴＵ（２２９．６ｍｇ、６０３．７２μｍｏｌ、１．１ｅｑ）、ＤＩＥＡ（１４１．９ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ、１９１．１９μＬ、２．０ｅｑ）の混合物を、ＤＣＭ（２０ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費され、所望のｍ／ｚ（理論ＭＷ：９５５．０６、観測ｍ／ｚ：９５５．６（［Ｍ＋Ｈ］＋））のメインピークが１つ検出されたことを示した。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製した。化合物５（４００．０ｍｇ、４１９．１μｍｏｌ）を白色の固体として得た。化合物５（４００．０ｍｇ、４１８．８２μｍｏｌ、１．０ｅｑ）の混合物をＤＭＦ（４ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ピペリジン（８６２．２ｍｇ、１０．１３ｍｍｏｌ、１ｍＬ、２４．２ｅｑ）を添加し、混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物５が完全に消費され、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：７３２．８３、観測ｍ／ｚ：７３３．３（［Ｍ＋Ｈ］＋））のメインピークが１つ検出されたことを示した。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製した。化合物１０Ｆ（２００ｍｇ、２７２．９μｍｏｌ）を無色の油として得た。
【０２３５】
化合物１０Ｇ：
【０２３６】
【化３１】
2021514953.tif 000045
【０２３７】
化合物１（７００．０ｍｇ、７３６．０４μｍｏｌ、１．０ｅｑ）（固相ペプチド合成から得た）、３−アジドプロパン−１−アミン（７３．７ｍｇ、７３６．０４μｍｏｌ、１．０ｅｑ）、ＥＤＣｌ（２８２．２ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ）、ＨＯＢｔ（１１９．４ｍｇ、８８３．２５μｍｏｌ、１．２ｅｑ）の混合物をＤＣＭ（５ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１が完全に消費され、所望の（理論ＭＷ：１０３３．１４、観測ｍ／ｚ：１０３３．２（［Ｍ＋Ｈ］＋））のメインピークが１つ検出されたことを示した。反応混合物を数滴の１Ｍ  ＨＣｌで処理し、有機層を収集し、減圧下で蒸発させて溶媒を除去した。化合物３（７００．０ｍｇ、粗製）を白色の固体として得た。
【０２３８】
化合物３（７００．０ｍｇ、６７７．６μｍｏｌ、１．０ｅｑ）、Ｎ−エチルエタンアミン（２．４８ｇ、３３．８８ｍｍｏｌ、３．４９ｍＬ、５０．０ｅｑ）の混合物をＤＣＭ（５ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で２時間、撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費され、所望のｍ／ｚ（理論ＭＷ：８１０．９０、観測ｍ／ｚ：８１１．１（［Ｍ＋Ｈ］＋））のメインピークが１つ検出されたことを示した。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去した。化合物１０Ｇ（４００．０ｍｇ、粗製）を白色の固体として得た。
【０２３９】
化合物１０Ｈ：
【０２４０】
【化３２】
2021514953.tif 000046
【０２４１】
化合物１（１ｇ、１．０５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）（固相ペプチド合成から得た）、化合物２（５５３．７ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）の混合物をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、これに続いて、ＨＡＴＵ（３９９．８ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）およびＤＩＥＡ（１３５．９ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ、１８３．２μＬ、１．０ｅｑ）を添加した。混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＴＬＣ（ジクロロメタン：メタノール＝１０：１、Ｒｆ＝０．２８）は、化合物１が完全に消費されたことを示した。次いで、粗生成物を精製することなく次の段階で直接使用した。化合物３（１ｇ、６８５．１１μｍｏｌ、１ｅｑ）のＤＭＦ溶液（８ｍＬ）に、ピペリジン（２ｍＬ、７１４．０５μｍｏｌ、２４ｅｑ）を２５℃で一度に添加した。混合物を２５℃で１５分間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費され、所望のｍ／ｚ（理論ＭＷ：１２３７．４、観測ｍ／ｚ：１２３８．４（［Ｍ＋Ｈ］＋））のメインピークが１つ検出されたことを示した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製した。化合物１０Ｈ（７５７ｍｇ、６１１．７７μｍｏｌ、８９．３０％の収率）を白色の固体として得た。
【０２４２】
化合物１０Ｉ：
【０２４３】
【化３３】
2021514953.tif 000047
【０２４４】
化合物１（１．４ｇ、１．４７ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、３−アジドプロパン−１−アミン（１６２．１ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）、ＥＤＣＩ（３３８．６ｍｇ、１．７７ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）、ＨＯＢｔ（２３８．７ｍｇ、１．７７ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）の混合物を、ＤＣＭ（５ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、混合物をＮ２雰囲気下で２０〜２５℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１が完全に消費され、所望のｍ／ｚ（理論ＭＷ：１０３３．１４、観測ｍ／ｚ：１０３３．２（［Ｍ＋Ｈ］＋））のメインピークが１つ検出されたことを示した。反応混合物を数滴の１Ｍ  ＨＣｌで処理し、有機層を減圧下で蒸発させて溶媒を除去した。化合物２（１．１ｇ、粗製）を黄色の油として得た。
【０２４５】
化合物２（１．１ｇ、１．０６ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、Ｎ−エチルエタンアミン（３．８９ｇ、５３．２４ｍｍｏｌ、５．４８ｍＬ、５０ｅｑ）の混合物をＤＣＭ（５ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、混合物をＮ２雰囲気下で２０〜２５℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費され、所望のｍ／ｚ（理論ＭＷ：８１０．９０、観測ｍ／ｚ：８１０．９（［Ｍ＋Ｈ］＋））のメインピークが１つ検出されたことを示した。反応混合物を減圧下で蒸発させ、化合物３（８１０ｍｇ、粗製）を白色の固体として得た。
【０２４６】
化合物３（８１０．０ｍｇ、９９８．９μｍｏｌ、１．０ｅｑ）、化合物４（８１０．７ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）、ＨＡＴＵ（４５５．８ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）、ＤＩＥＡ（２５８．２ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ、３４８．０μＬ、２．０ｅｑ）の混合物を、ＤＭＦ（２ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費され、所望のｍ／ｚ（理論ＭＷ：１５３０．７２、観測ｍ／ｚ：７６５．５（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））のメインピークが１つ検出されたことを示した。反応混合物を数滴の１Ｍ  ＨＣｌで処理し、有機層を収集し、減圧下で蒸発させて溶媒を除去した。化合物５（１．１ｇ、粗製）を黄色の固体として得た。
【０２４７】
化合物５（１ｇ、６５３．２９μｍｏｌ、１ｅｑ）をＤＣＭ（１０ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、これに続いて、ピペリジン（２．３９ｇ、３２．６６ｍｍｏｌ、３．３６ｍＬ、５０ｅｑ）を添加し、次いで、混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物５が完全に消費され、所望のｍ／ｚ（理論ＭＷ：１３０８．４７、観測ｍ／ｚ：１３０８．４（［Ｍ＋Ｈ］＋））のメインピークが１つ検出されたことを示した。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製した。化合物１０Ｉ（７００ｍｇ、４６３．７２μｍｏｌ、７０．９８％の収率）を黄色の固体として得た。
【０２４８】
【化３４−１】
2021514953.tif 000048
【化３４−２】
2021514953.tif 000049
【０２４９】
化合物１１Ａ：
化合物９Ａ（１００ｍｇ、２４８．８６μｍｏｌ、１ｅｑ、ＨＣｌ）のＤＭＦ溶液（１ｍＬ）に、ＥＤＣＩ（１６０ｍｇ、８３４．６３μｍｏｌ、３．３５ｅｑ）およびＨＯＢｔ（１１０ｍｇ、８１４．０７μｍｏｌ、３．２７ｅｑ）およびＤＩＰＥＡ（１９２．９８ｍｇ、１．４９ｍｍｏｌ、２６０．０８μＬ、６．０ｅｑ）を添加し、次いで、化合物１０Ａ（４００ｍｇ、７５９．５６μｍｏｌ、３．０５ｅｑ）のＤＭＦ（１ｍＬ）を滴下添加した。混合物を２５〜３０℃で１２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、反応物１が完全に消費され、所望のｍ／ｚのメインピークが１つ検出されたことを示した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、化合物１１Ａ（１２８ｍｇ、６４．３０μｍｏｌ、２５．８４％の収率、９５％の純度）を無色の油として得た。
【０２５０】
化合物１１Ｂ：
化合物９Ａ（５０ｍｇ、１２４．４３μｍｏｌ、１．０ｅｑ、ＨＣｌ）のＤＭＦ溶液（１ｍＬ）に、ＨＯＢｔ（５６ｍｇ、４１４．４４μｍｏｌ、３．３３ｅｑ）、ＥＤＣＩ（８０ｍｇ、４１７．３１μｍｏｌ、３．３５ｅｑ）およびＤＩＰＥＡ（９６．４９ｍｇ、７４６．５７μｍｏｌ、１３０．０４μＬ、６．０ｅｑ）を添加し、次いで、化合物１０Ｂ（４２０ｍｇ、３８２．０６μｍｏｌ、３．０７ｅｑ）のＤＭＦ（１ｍＬ）を滴下添加した。混合物を２５〜３０℃で１２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、反応物１が完全に消費され、所望のｍ／ｚのメインピークが１つ検出されたことを示した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、化合物１１Ｂ（２５７ｍｇ、６７．６５μｍｏｌ、５４．３７％の収率、９５．０％の純度）を無色の油として得た。
【０２５１】
化合物１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１１Ｇ、１１Ｈおよび１１Ｉは、化合物９Ａならびに化合物１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ、１０Ｆ、１０Ｇ、１０Ｈおよび１０Ｉのうちの１つを出発物質として、ＥＤＣＩをカップリング試薬として、そしてＤＩＰＥＡを塩基として使用して、化合物１１Ｂについて上記した方法に類似した方法で合成した。
【０２５２】
化合物１１Ｋ：
化合物９Ｂ（２０．０ｍｇ、９５．２μｍｏｌ、１．０ｅｑ）、化合物１０Ａ（３２０．０ｍｇ、２９１．１μｍｏｌ、３．０６ｅｑ）のＤＭＦ溶液（５ｍＬ）に、ＥＤＣＩ（６０．０ｍｇ、３１３．０μｍｏｌ、３．２９ｅｑ）、ＨＯＢｔ（４０．０ｍｇ、２９６．０μｍｏｌ、３．１１ｅｑ）、ＤＭＡＰ（１０．０ｍｇ、８１．８μｍｏｌ、０．８６ｅｑ）およびＤＩＥＡ（４４．５ｍｇ、３４４．５μｍｏｌ、６０μＬ、３．６２ｅｑ）を添加した。混合物を３０℃で１２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物９Ｂが完全に消費され、所望のｍ／ｚ（理論ＭＷ：３４５４．０１、観測ｍ／ｚ：１１６８．４０００（［Ｍ／３＋Ｈ２０］＋））のメインピークが１つ検出されたことを示した。反応混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去し、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製した。化合物１１Ｋ（２００．０ｍｇ、５７．９μｍｏｌ、６０．８４％の収率、１００％の純度）を白色の固体として得た。
【０２５３】
化合物１１Ｊは、化合物９Ｂおよび化合物１０Ｊを出発物質として、ＥＤＣＩをカップリング試薬として、そしてＤＩＰＥＡを塩基として使用して、化合物１１Ｋについて上記した方法に類似した方法で合成した。
【０２５４】
化合物１１Ｌ：
化合物９Ｂ（２０．０ｍｇ、９５．２μｍｏｌ、１．０ｅｑ）、化合物１０Ｂ（１５２．０ｍｇ、２８８．６μｍｏｌ、３．０３ｅｑ）のＤＭＦ溶液（５ｍＬ）に、ＥＤＣＩ（６０．０ｍｇ、３１３．０μｍｏｌ、３．２９ｅｑ）、ＨＯＢｔ（４０．０ｍｇ、２９６．０μｍｏｌ、３．１１ｅｑ）、ＤＭＡＰ（１２．０ｍｇ、９８．２μｍｏｌ、１．０３ｅｑ）およびＤＩＥＡ（４１．６ｍｇ、３２１．５μｍｏｌ、５６μＬ、３．３８ｅｑ）を添加した。混合物を３０℃で１２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物９Ｂが完全に消費され、所望のｍ／ｚ（理論ＭＷ：１７３５．９６、観測ｍ／ｚ：８６７．８７（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））のメインピークが１つ検出されたことを示した。反応混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去し、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製した。化合物１１Ｌ（１４０．０ｍｇ、７９．８μｍｏｌ、８３．８６％の収率、９８．９７％の純度）を無色の油として得た。
【０２５５】
化合物１１Ｍは、化合物９Ｃおよび化合物１０Ｍを出発物質として、ＥＤＣＩをカップリング試薬として、そしてＤＩＰＥＡを塩基として使用して、化合物１１Ｎについて下に記載する方法に類似した方法で合成した。
【０２５６】
化合物１１Ｎ：
化合物９Ｃ（２０．０ｍｇ、３６．０μｍｏｌ、１．０ｅｑ）、化合物１０Ｍ（４０．０ｍｇ、１１９．３μｍｏｌ、３．３ｅｑ）のＤＭＦ溶液（２ｍＬ）に、ＥＤＣＩ（２６．０ｍｇ、１３５．６μｍｏｌ、３．８ｅｑ）、ＨＯＢｔ（１８．０ｍｇ、１３３．２μｍｏｌ、３．７ｅｑ）、ＤＭＡＰ（４．４ｍｇ、３６．０μｍｏｌ、１．０ｅｑ）およびＤＩＥＡ（２３．７ｍｇ、１８３．７μｍｏｌ、３２μＬ、５．１ｅｑ）を添加した。混合物を３０℃で１２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物９Ｃが完全に消費され、所望のｍ／ｚ（理論ＭＷ：１５０７．６８、観測ｍ／ｚ：７５３．７７（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））のメインピークが１つ検出されたことを示した。反応混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去し、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製した。化合物１１Ｎ（４０．０ｍｇ、２６．５μｍｏｌ、７３．７１％の収率、１００％の純度）を無色の油として得た。
【０２５７】
化合物１１Ｏ：
化合物９Ｃ（１０．０ｍｇ、１８．０μｍｏｌ、１．０ｅｑ）、化合物１０Ｌ（３０．０ｍｇ、５４．０μｍｏｌ、３．０ｅｑ）のＤＭＦ溶液（２ｍＬ）に、ＥＤＣＩ（２８．０ｍｇ、１４４．０μｍｏｌ、８．０ｅｑ）、ＨＯＢｔ（１３．０ｍｇ、９０．０μｍｏｌ、５．０ｅｑ）、ＤＭＡＰ（５．０ｍｇ、３６．０μｍｏｌ、２．０ｅｑ）およびＤＩＥＡ（１９ｍｇ、１４４．０μｍｏｌ、２５μＬ、８．０ｅｑ）を添加した。混合物を３０℃で１２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物９Ｃが完全に消費され、所望のｍ／ｚ（理論ＭＷ：２１６８．４７、観測ｍ／ｚ：１１８３．８８（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））のメインピークが１つ検出されたことを示した。反応混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去し、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製した。化合物１１Ｏ（１７．８ｍｇ、８．２μｍｏｌ、４５．６１％の収率、１００％の純度）を白色の油として得た。
【０２５８】
＜四量体アジドリンカーの調製のための一般手順＞
【０２５９】
【化３５】
2021514953.tif 000050
【０２６０】
化合物１０：
【０２６１】
【化３６】
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【０２６２】
化合物１０Ｎ：
【０２６３】
【化３７】
2021514953.tif 000052
【０２６４】
化合物１（９００ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）および化合物２（１．０ｇ、３．２１ｍｍｏｌ、２．６ｅｑ）の混合物をＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解し、これに続いてＥＤＣＩ（２８４．０ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）、ＨＯＢｔ（２００．２ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）を添加した。混合物を２５℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１が完全に消費され、所望のｍ／ｚ（理論ＭＷ：１０２１．４９、観測ｍ／ｚ：１０２２．２（［Ｍ＋Ｈ］＋））のピークが１つが検出されたことを示した。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去した。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物３（０．９００ｇ、８８０．５３μｍｏｌ、７１．３０％の収率）を白色の固体として得た。
【０２６５】
化合物３（５００．０ｍｇ、４８９．１９μｍｏｌ、１．０ｅｑ）、化合物４（２５７．６ｍｇ、４８９．１９μｍｏｌ、１．０ｅｑ）の混合物をＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解し、これに続いて、ＨＯＢｔ（１３２．２ｍｇ、９７８．３７μｍｏｌ、２．０ｅｑ）、ＥＤＣＩ（１８７．６ｍｇ、９７８．３７μｍｏｌ、２．０ｅｑ）を添加した。混合物を２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費され、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：１５２９．８０、観測ｍ／ｚ：７６５．９（［Ｍ／２＋Ｈ］＋）のメインピークが１つ検出されたことを示した。反応混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去し、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）により精製した。化合物３（４２０ｍｇ、２４６．９４μｍｏｌ、５０．４８％の収率）を無色の油として得た。
【０２６６】
化合物５（４２０ｍｇ、２７４．３８μｍｏｌ、１．０ｅｑ）をＤＭＦ（４ｍＬ）に溶解し、これに続いて、ピペリジン（８６５．２ｍｇ、１０．１６ｍｍｏｌ、１ｍＬ、３７ｅｑ）を添加した。混合物を２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物５が完全に消費され、所望のｍ／ｚ（理論ＭＷ：１３０８．４８、観測ｍ／ｚ：６５４．８（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））のメインピークが１つ検出されたことを示した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物１０Ｎ（３８６ｍｇ、２６５．５０μｍｏｌ、９６．７６％の収率）を無色の油として得た。
【０２６７】
化合物１４：
【０２６８】
【化３８−１】
2021514953.tif 000053
【化３８−２】
2021514953.tif 000054
【化３８−３】
2021514953.tif 000055
【０２６９】
化合物１４Ａ：
化合物１３（１００ｍｇ、２３５．６３μｍｏｌ、１ｅｑ）のＤＭＦ溶液（１ｍＬ）に、ＥＤＣＩ（２００ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ、４．４３ｅｑ）およびＨＯＢｔ（１４０ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ、４．４ｅｑ）およびＤＩＰＥＡ（１８５．５０ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ、０．２５ｍＬ、６．０９ｅｑ）を添加し、次いで、化合物１０Ａ（５００ｍｇ、９４９．４５μｍｏｌ、４．０３ｅｑ）のＤＭＦ（１ｍＬ）を滴下添加した。混合物を２５〜３０℃で１２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、反応物１が残存していないことを示した。新しいいくつかのピークがＬＣ−ＭＳ上に示され、所望の化合物およそ５０％が検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、化合物１４Ａ（３８５ｍｇ、１４８．７５μｍｏｌ、６３．１３％の収率、９５％の純度）を淡黄色の油として得た。
【０２７０】
化合物１４Ｂ：
化合物１３のＤＭＦ溶液（１ｍＬ）に、ＨＯＢｔ（５６ｍｇ、４１４．４５μｍｏｌ、４．４０ｅｑ）およびＥＤＣＩ（８０ｍｇ、４１７．３２μｍｏｌ、４．４３ｅｑ）およびＤＩＥＡ（７３．０９ｍｇ、５６５．５１μｍｏｌ、９８．５０μＬ、６．０ｅｑ）を添加し、次いで、化合物１０Ｂ（４２０ｍｇ、３８２．０６μｍｏｌ、４．０５ｅｑ）のＤＭＦ（１ｍＬ）を滴下添加した。混合物を２０℃で１２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１３が残存していないことを示した。新しいいくつかのピークがＬＣ−ＭＳ上に示され、所望の化合物５０％が検出された。混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、化合物１４Ｂ（２２５ｍｇ、４７．３７μｍｏｌ、５０．２６％の収率、１００％の純度）を白色の固体として得た。
【０２７１】
化合物１４Ｃ、１４Ｄ、１４Ｅ、１４Ｆ、１４Ｇ、および１４Ｈは、化合物１３ならびに化合物１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ、１０Ｆ、１０Ｇ、および１０Ｎのうちの１つを出発物質として、ＥＤＣＩをカップリング試薬として、そしてＤＩＰＥＡを塩基として使用して、化合物１４Ｂについて上記した方法に類似した方法で合成した。
【０２７２】
＜三量体二環式コンジュゲートである化合物の調製のための一般手順＞
【０２７３】
【化３９】
2021514953.tif 000056
【０２７４】
化合物１１：
【０２７５】
【化４０−１】
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【化４０−２】
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【０２７６】
化合物５：
【０２７７】
【化４１−１】
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【化４１−２】
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【化４１−３】
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【化４１−４】
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【０２７８】
化合物１２：
【０２７９】
【化４２−１】
2021514953.tif 000063
【化４２−２】
2021514953.tif 000064
【化４２−３】
2021514953.tif 000065
【化４２−４】
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【化４２−５】
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【化４２−６】
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【０２８０】
ＢＣＹ７８２７：
化合物１１Ａ（４ｍｇ、２．１２μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体１Ａ（２８．２ｍｇ、１２．６９μｍｏｌ、６．０ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（１ｍＬ）に、ＣｕＳＯ４（０．８Ｍ、２３．７９μＬ、９．０ｅｑ）と（２Ｒ）−２−［（１Ｓ）−１，２−ジヒドロキシエチル］−３，４−ジヒドロキシ−２Ｈ−フラン−５−オン（０．８Ｍ、１５８．６３μＬ、６０ｅｑ）との溶液を添加した。混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７８２７（９．１ｍｇ、０．９６μｍｏｌ、４５．３７％の収率、９０．３％の純度）を白色の固体として得た。
【０２８１】
ＢＣＹ７８２８：
化合物１１Ｂ（４ｍｇ、１．１１μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体１Ａ（１５ｍｇ、６．７４μｍｏｌ、６．０８ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（１ｍＬ）に、ＣｕＳＯ４（０．８Ｍ、１２．４７μＬ、９．０ｅｑ）と（２Ｒ）−２−［（１Ｓ）−１，２−ジヒドロキシエチル］−３，４−ジヒドロキシ−２Ｈ−フラン−５−オン（０．８Ｍ、８３．１２μＬ、６０ｅｑ）との溶液を添加した。混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７８２８（５．７ｍｇ、５．０５ｅ−１μｍｏｌ、４５．６０％の収率、９１．１７％の純度）を白色の固体として得た。
【０２８２】
ＢＣＹ７７５０：
化合物１１Ａ（４ｍｇ、２．１２μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体２Ａ（３０ｍｇ、１３．１５μｍｏｌ、６．２２ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（１ｍＬ）に、ＣｕＩ（６．００ｍｇ、３１．７３μｍｏｌ、１５ｅｑ）を添加した。混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７７５０（７．３ｍｇ、６．８５ｅ−１μｍｏｌ、３２．４１％の収率、８２．０２％の純度）を白色の固体として得た。
【０２８３】
ＢＣＹ７７４９：
化合物１１Ｂ（４８ｍｇ、１３．３０μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体２Ａ（１３６．５４ｍｇ、５９．８５μｍｏｌ、４．５ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（６ｍＬ）に、ＣｕＩ（３８．０ｍｇ、１９９．４９μｍｏｌ、１５ｅｑ）を添加した。混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７７４９（２２．４ｍｇ、１．３９μｍｏｌ、１０．４３％の収率、６４．７２％の純度）を白色の固体として得た。
【０２８４】
ＢＣＹ７８３１：
化合物１１Ａ（４ｍｇ、２．１２μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体３Ａ（２１．５６ｍｇ、９．５２μｍｏｌ、４．５ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（１ｍＬ）に、ＣｕＩ（６．００ｍｇ、３１．７３μｍｏｌ、１５ｅｑ）を添加した。混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７８３１（１．４ｍｇ、１．４８ｅ−１μｍｏｌ、６．９８％の収率、９１．６％の純度）を白色の固体として得た。
【０２８５】
ＢＣＹ７８３２：
化合物１１Ｂ（４ｍｇ、１．１１μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体３Ａ（１１．３０ｍｇ、４．９９μｍｏｌ、４．５ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（１ｍＬ）に、ＣｕＩ（３．１７ｍｇ、１６．６２μｍｏｌ、１５ｅｑ）を添加した。混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７８３２（１．５ｍｇ、９．４０ｅ−２μｍｏｌ、８．４９％の収率、６５．２４％の純度）を白色の固体として得た。
【０２８６】
ＢＣＹ７８３５：
化合物１１Ａ（３２ｍｇ、１６．９２μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体４Ａ（１７２．５１ｍｇ、７６．１４μｍｏｌ、４．５ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（４ｍＬ）に、ＣｕＩ（４８．３４ｍｇ、２５３．８１μｍｏｌ、１５ｅｑ）を添加した。混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７８３５（１９．８ｍｇ、２．０８μｍｏｌ、１２．２８％の収率、９１．１６％の純度）を白色の固体として得た。
【０２８７】
ＢＣＹ７８３６：
化合物１１Ｂ（４ｍｇ、１．１１μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体４Ａ（１５．０７ｍｇ、６．６５μｍｏｌ、６．０ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（１ｍＬ）に、ＣｕＳＯ４（０．８Ｍ、１２．４７μＬ、９．０ｅｑ）と（２Ｒ）−２−［（１Ｓ）−１，２−ジヒドロキシエチル］−３，４−ジヒドロキシ−２Ｈ−フラン−５−オン（０．８Ｍ、８３．１２μＬ、６０ｅｑ）との溶液を添加した。混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７８３６（２ｍｇ、１．１５ｅ−１μｍｏｌ、１０．４０％の収率、５９．９７％の純度）を白色の固体として得た。
【０２８８】
ＢＣＹ７８３９：
化合物１１Ａ（０．２ｇ、１０５．７５μｍｏｌ、１ｅｑ．）、単量体５Ａ（７５０ｍｇ、３２０．８μｍｏｌ、３．０３ｅｑ．）、およびＴＨＰＴＡ（０．４Ｍ、２６４．４μＬ、１ｅｑ．）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、１２ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、２６５μＬ、１ｅｑ．）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、５２９μＬ、２ｅｑ．）をＮ２下で添加した。この溶液のｐＨを、０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴下添加することにより８に調整し、溶液は淡黄色に変わった。反応混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で１２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１１Ａが完全に消費され、所望のｍ／ｚ［ＭＷ：８９０４．１１、観測ｍ／ｚ：１２７１．９２（［Ｍ／７＋Ｈ＋］）、１１１３．０７（［Ｍ／８＋Ｈ＋］）、および９８９．６５（［Ｍ／９＋Ｈ＋］）］のメインピークが１つ検出されたことを示した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により直接精製した。ＢＣＹ７８３９（２８３．７ｍｇ、３０．４０μｍｏｌ、２８．７４％の収率、９５．４０％の純度）を白色の固体として得た。
【０２８９】
ＢＣＹ７８４０：
化合物１１Ｂ（４ｍｇ、１．１１μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体５Ａ（１１．６６ｍｇ、４．９９μｍｏｌ、４．５ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（０．５ｍＬ）に、ＣｕＩ（３．１７ｍｇ、１６．６２μｍｏｌ、１５ｅｑ）を添加した。混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７８４０（２．９ｍｇ、２．５４ｅ−１μｍｏｌ、２２．９１％の収率、９３．００％の純度）を白色の固体として得た。
【０２９０】
ＢＣＹ７７４３：
化合物１１Ａ（４ｍｇ、２．１２μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体６Ａ（１９．１８ｍｇ、８．４６μｍｏｌ、４．５ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（１ｍＬ）に、ＣｕＩ（６．０４ｍｇ、３１．７３μｍｏｌ、１５ｅｑ）を添加した。混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７７４３（４ｍｇ、３．８５ｅ−１μｍｏｌ、１８．１９％の収率、８３．５６％の純度）を白色の固体として得た。
【０２９１】
ＢＣＹ７７４４：
化合物１１Ｂ（４ｍｇ、１．１１μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体６Ａ（１１．３０ｍｇ、４．９９μｍｏｌ、４．５ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（１ｍＬ）に、ＣｕＩ（３．１７ｍｇ、１６．６２μｍｏｌ、１５ｅｑ）を添加した。混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７７４４（４．２ｍｇ、１．７９ｅ−１μｍｏｌ、１６．１７％の収率、４４．４０％の純度）を白色の固体として得た。
【０２９２】
ＢＣＹ７８４７：
化合物１１Ａ（４ｍｇ、２．１２μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体７Ａ（２８．５２ｍｇ、１２．６９μｍｏｌ、６ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（１ｍＬ）に、ＣｕＳＯ４（０．８Ｍ、２３．７９μＬ、９．０ｅｑ）と（２Ｒ）−２−［（１Ｓ）−１，２−ジヒドロキシエチル］−３，４−ジヒドロキシ−２Ｈ−フラン−５−オン（０．８Ｍ、１５８．６３μＬ、６０ｅｑ）との溶液を添加した。混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７８４７（１．３ｍｇ、５．６３ｅ−２μｍｏｌ、２．６６％の収率、３７．４％の純度）を白色の固体として得た。
【０２９３】
ＢＣＹ７８４８：
化合物１１Ｂ（４ｍｇ、１．１１μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体７Ａ（１４．９５ｍｇ、６．６５μｍｏｌ、６．０ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（１ｍＬ）に、ＣｕＳＯ４（０．８Ｍ、１２．４７μＬ、９．０ｅｑ）と（２Ｒ）−２−［（１Ｓ）−１，２−ジヒドロキシエチル］−３，４−ジヒドロキシ−２Ｈ−フラン−５−オン（０．８Ｍ、８３．１２μＬ、６０ｅｑ）との溶液を添加した。混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７８４８（２．７ｍｇ、２．４６ｅ−１μｍｏｌ、２２．２３％の収率、９４．４７％の純度）を白色の固体として得た。
【０２９４】
ＢＣＹ７８５１：
化合物１１Ａ（４ｍｇ、２．１２μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体８Ａ（２１．８７ｍｇ、９．５２μｍｏｌ、４．５ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（１ｍＬ）に、ＣｕＩ（６．０ｍｇ、３１．７３μｍｏｌ、１５ｅｑ）を添加した。混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７８５１（２．５ｍｇ、８．６４ｅ−２μｍｏｌ、４．０８％の収率、３０．３５％の純度）を白色の固体として得た。
【０２９５】
ＢＣＹ７８５２：
化合物１１Ｂ（４ｍｇ、１．１１μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体８Ａ（１５．２８ｍｇ、６．６５μｍｏｌ、６．０ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（１ｍＬ）に、ＣｕＳＯ４（０．８Ｍ、１２．４７μＬ、９．０ｅｑ）と（２Ｒ）−２−［（１Ｓ）−１，２−ジヒドロキシエチル］−３，４−ジヒドロキシ−２Ｈ−フラン−５−オン（０．８Ｍ、８３．１２μＬ、６０ｅｑ）との溶液を添加した。混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７８５２（１．２ｍｇ、９．８５ｅ−２μｍｏｌ、８．８９％の収率、８６．２％の純度）を白色の固体として得た。
【０２９６】
ＢＣＹ７８５５：
化合物１１Ａ（４ｍｇ、２．１２μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体９Ａ（２１．７２ｍｇ、９．５２μｍｏｌ、４．５ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（１ｍＬ）に、ＣｕＩ（６．０４ｍｇ、３１．７３μｍｏｌ、１５ｅｑ）を添加した。混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７８５５（３．８ｍｇ、０．２８μｍｏｌ、１３．２５％の収率、６４．４５％の純度）を白色の固体として得た。
【０２９７】
ＢＣＹ７８５６：
化合物１１Ｂ（４ｍｇ、１．１１μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体９Ａ（１５．１７ｍｇ、６．６５μｍｏｌ、６．０ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（１ｍＬ）に、ＣｕＳＯ４（０．８Ｍ、１２．４７μＬ、９．０ｅｑ）と（２Ｒ）−２−［（１Ｓ）−１，２−ジヒドロキシエチル］−３，４−ジヒドロキシ−２Ｈ−フラン−５−オン（０．８Ｍ、８３．１２μＬ、６０ｅｑ）との溶液を添加した。混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７８５６（５．７ｍｇ、５．０５ｅ−１μｍｏｌ、４５．６０％の収率、９１．１７％の純度）を白色の固体として得た。
【０２９８】
ＢＣＹ８９５８（１５．８ｍｇ、９３．９％の純度、２２．７％の収率）、ＢＣＹ８９５７（１５．１ｍｇ、９０．４％の純度、１８％の収率）、ＢＣＹ８９６１（３．１ｍｇ、９３．３％の純度、５．４％の収率）、ＢＣＹ８９６２（１２．８ｍｇ、８９．６％の純度、２０．６％の収率）、ＢＣＹ８９６５（１７．８ｍｇ、９２．９％の純度、４１．４％の収率）、ＢＣＹ９５７３（６．２ｍｇ、９２．５０％の純度、５．５０％の収率）、ＢＣＹ９５９５（５．４ｍｇ、９５．５０％の純度、６．６０％の収率）、ＢＣＹ１１３８２（８１ｍｇ、８９．０４％の純度、２６．１％の収率）、ＢＣＹ９７７５（５５．１ｍｇ、９５．０１％の純度、５１．９３％の収率）、ＢＣＹ９７７６（１１．５ｍｇ、９９．７０％の純度、１８．９２％の収率）、ＢＣＹ１１３８３（５．１ｍｇ、８５．４６％の純度、８．９７％の収率）、ＢＣＹ１００４６（１２．６ｍｇ、９５．１０％の純度、１０．５９％の収率）、ＢＣＹ１００４７（１９．５ｍｇ、９４．６９％の純度、２５．６５％の収率）はそれぞれ、化合物１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１１Ｇ、１１Ｈ、１１Ｉ、１１Ｊ、１１Ｋ、１１Ｌ、１１Ｍ、１１Ｎおよび１１Ｏのうちの１つを使用して；ならびに単量体４Ａ、単量体５Ａのうちの１つを使用して；ならびにＣｕＳＯ４、（２Ｒ）−２−［（１Ｓ）−１，２−ジヒドロキシエチル］−３，４−ジヒドロキシ−２Ｈ−フラン−５−オンおよびＴＨＰＴＡを使用して、ＢＣＹ７８３９について上記した方法に類似した方法で合成した。
【０２９９】
ＢＣＹ１１１９４：
化合物１１Ａ（３０ｍｇ、１５．８６μｍｏｌ、１ｅｑ）、単量体１２Ａ（３１．６ｍｇ、１４．２８μｍｏｌ、０．９ｅｑ）およびＴＨＰＴＡ（８．０ｍｇ、１ｅｑ）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、２ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、これに続いて、ＣｕＳ０４（０．４Ｍ、４０．０μＬ、１ｅｑ）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、８０．０μＬ、２ｅｑ）をＮ２下で添加した。この溶液のｐＨを、０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴下添加することにより８に調整し、溶液は淡黄色に変わった。反応混合物をＮ２雰囲気下で２５℃で４時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、単量体１２Ａが完全に消費され、所望のｍ／ｚ（ＭＳ：４１０８．７７、観測ｍ／ｚ：１３６９．８（［Ｍ／３＋Ｈ］＋））のメインピークが１つ検出されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、所望の画分を合わせ、凍結乾燥し、その結果、中間体１（９．２ｍｇ、２．１６μｍｏｌ、１３．６３％の収率、９６．５６％の純度）が白色の固体としてもたらされた。
中間体１（５ｍｇ、１．２２μｍｏｌ、１ｅｑ）、単量体５Ａ（５．７ｍｇ、２．４３μｍｏｌ、２ｅｑ）、およびＴＨＰＴＡ（１．１ｍｇ、２ｅｑ）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、２ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、６．１μＬ、２ｅｑ）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、１２．２μＬ、４ｅｑ）をＮ２下で添加した。この溶液のｐＨを、０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴下添加することにより８に調整し、溶液は淡黄色に変わった。反応混合物をＮ２雰囲気下で２５℃で４時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、単量体５Ａが完全に消費され、所望のｍ／ｚ（理論ＭＷ：８７８４．０５、観測ｍ／ｚ：１２３６．５（［Ｍ／７−Ｈ２Ｏ＋Ｈ＋］）、１０７７．８（［Ｍ／８−Ｈ２Ｏ＋Ｈ＋］））のメインピークが１つ検出されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製した。ＢＣＹ１１１９４（３．４ｍｇ、２９．０１％の収率、９１．２％の純度）を白色の固体として得た。
【０３００】
＜化合物１５の調製のための一般手順＞
【０３０１】
【化４３】
2021514953.tif 000069
【０３０２】
化合物１４：
【０３０３】
【化４４−１】
2021514953.tif 000070
【化４４−２】
2021514953.tif 000071
【化４４−３】
2021514953.tif 000072
【０３０４】
化合物５：
【０３０５】
【化４５−１】
2021514953.tif 000073
【化４５−２】
2021514953.tif 000074
【化４５−３】
2021514953.tif 000075
【化４５−４】
2021514953.tif 000076
【０３０６】
化合物１５：
【０３０７】
【化４６−１】
2021514953.tif 000077
【化４６−２】
2021514953.tif 000078
【化４６−３】
2021514953.tif 000079
【化４６−４】
2021514953.tif 000080
【化４６−５】
2021514953.tif 000081
【化４６−６】
2021514953.tif 000082
【０３０８】
ＢＣＹ７８２９
ＤＭＦ（３ｍＬ）に含まれる、化合物１４Ａ（２４ｍｇ、９．７６μｍｏｌ、１ｅｑ）、単量体１Ａ（１３０．２８ｍｇ、５８．５６μｍｏｌ、６ｅｑ）、ＣｕＩ（３７．１８ｍｇ、１９５．２２μｍｏｌ、２０ｅｑ）の混合物を脱気し、Ｎ２で３回パージし、次いで、混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７８２９（３９．４ｍｇ、３．１９μｍｏｌ、３２．６４％の収率、９１．８３％の純度）を白色の固体として得た。
【０３０９】
ＢＣＹ７８３０：
化合物１４Ｂ（４ｍｇ、８．４２ｅ−１μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体１Ａ（１４．９９ｍｇ、６．７４μｍｏｌ、８ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（１ｍＬ）に、ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（０．８Ｍ、１２．６３μＬ、１２ｅｑ）とアスコルビン酸（０．８Ｍ、８４．２２μＬ、８０ｅｑ）とをＮ２雰囲気下で添加した。混合物を３０℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７８３０（６ｍｇ、３．６９ｅ−１μｍｏｌ、３６．７９％の収率、７０．４８％の純度）を白色の固体として得た。
【０３１０】
ＢＣＹ７７５１：
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）に含まれる、化合物１４Ａ（４ｍｇ、１．６３μｍｏｌ、１ｅｑ）、単量体２Ａ（２９．６７ｍｇ、１３．００μｍｏｌ、７．９９ｅｑ）の混合物に、ＣｕＩ（６．２ｍｇ、３２．６μｍｏｌ、２０ｅｑ）を添加し、混合物を脱気し、Ｎ２で３回パージし、次いで、混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で１時間、撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７７５１（５ｍｇ、１．７４ｅ−１μｍｏｌ、２２．８５％の収率、８６．１％の純度）を白色の固体として得た。
【０３１１】
ＢＣＹ７７５２：
ＤＭＦ（３ｍＬ）に含まれる、化合物１４Ｂ（２４ｍｇ、５．０５μｍｏｌ、１ｅｑ）、単量体２Ａ（６９．１７ｍｇ、３０．３２μｍｏｌ、６ｅｑ）、ＣｕＩ（１１．５５ｍｇ、６０．６４μｍｏｌ、１２ｅｑ）の混合物を脱気し、Ｎ２で３回パージし、次いで、混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７７５２（２１．７ｍｇ、１．４１μｍｏｌ、２７．９７％の収率、９０．３８％の純度）を白色の固体として得た。
【０３１２】
ＢＣＹ７８３３：
ＤＭＦ（１ｍＬ）に含まれる、化合物１４Ａ（４ｍｇ、１．６３μｍｏｌ、１ｅｑ）、単量体３Ａ（４４．２３ｍｇ、１９．５２μｍｏｌ、１２．０ｅｑ）の混合物に、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、４８．８０μＬ、１２．０ｅｑ）と（２Ｒ）−２−［（１Ｓ）−１，２−ジヒドロキシエチル］−３，４−ジヒドロキシ−２Ｈ−フラン−５−オン（０．４Ｍ、１６２．６８μＬ、４０．０ｅｑ）との溶液を添加し、混合物を脱気し、Ｎ２で３回パージし、次いで、混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７８３３（４．２ｍｇ、１．８６ｅ−１μｍｏｌ、１１．４３％の収率、５１．００％の純度）を白色の固体として得た。
【０３１３】
ＢＣＹ７８３４：
ＤＭＦ（１ｍＬ）に含まれる、化合物１４Ｂ（４ｍｇ、８．４２ｅ−１μｍｏｌ、１ｅｑ）、単量体３Ａ（２２．９０ｍｇ、１０．１１μｍｏｌ、１２．０ｅｑ）の混合物に、ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（０．４Ｍ、１８．９５μＬ、９．０ｅｑ）と（２Ｒ）−２−［（１Ｓ）−１，２−ジヒドロキシエチル］−３，４−ジヒドロキシ−２Ｈ−フラン−５−オン（０．４Ｍ、８４．２２μＬ、４０ｅｑ）とのＨ２Ｏ溶液（０．１１ｍＬ）を添加し、混合物を脱気し、Ｎ２で３回パージし、次いで、混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７８３４（２．３ｍｇ、１．４０ｅ−１μｍｏｌ、１６．６４％の収率、８４．１４％の純度）を白色の固体として得た。
【０３１４】
ＢＣＹ７８３７：
ＤＭＦ（１ｍＬ）に含まれる、化合物１４Ａ（４ｍｇ、１．６３μｍｏｌ、１ｅｑ）、単量体４Ａ（２２．１１ｍｇ、９．７６μｍｏｌ、６ｅｑ）の混合物に、ＣｕＩ（６．２０ｍｇ、３２．５４μｍｏｌ、２０ｅｑ）を添加し、混合物を脱気し、Ｎ２で３回パージし、次いで、混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７８３７（１１．４ｍｇ、６．１６ｅ−１μｍｏｌ、３７．８６％の収率、６２．２５％の純度）を白色の固体として得た。
【０３１５】
ＢＣＹ７８３８：
ＤＭＦ（５ｍＬ）に含まれる、化合物１４Ｂ（４０ｍｇ、８．４２μｍｏｌ、１ｅｑ）、単量体４Ａ（１１４．４８ｍｇ、５０．５３μｍｏｌ、６ｅｑ）、ＣｕＩ（３２．０８ｍｇ、１６８．４４μｍｏｌ、２０ｅｑ）の混合物を脱気し、Ｎ２で３回パージし、次いで、混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７８３８（５１ｍｇ、３．３３μｍｏｌ、３９．４９％の収率、９０．０８％の純度）を白色の固体として得た。
【０３１６】
ＢＣＹ７８４１：
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）に含まれる、化合物１４Ａ（４ｍｇ、１．６３μｍｏｌ、１ｅｑ）、単量体５Ａ（２３ｍｇ、９．８４μｍｏｌ、６．０５ｅｑ）、ＣｕＩ（３０９．８２μｇ、１．６３μｍｏｌ、１ｅｑ）の混合物を脱気し、Ｎ２で３回パージし、次いで、混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７８４１（８．３ｍｇ、４．４７ｅ−１μｍｏｌ、２７．４５％の収率、６３．５４％の純度）を白色の固体として得た。
【０３１７】
ＢＣＹ７８４２
クリック反応を３つの容器で並行して行った。各反応容器に、化合物１４Ｂ（１７０．０ｍｇ、３５．８μｍｏｌ、１．０ｅｑ）、単量体５Ａ（３４０．０ｍｇ、１４５．４μｍｏｌ、４．０６ｅｑ）、およびＴＨＰＴＡ（０．４Ｍ、８９．５μＬ、１．０ｅｑ）の混合物を、ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、６ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、８９．５μＬ、１．０ｅｑ）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、１７９．０μＬ、２．０ｅｑ）をＮ２下で添加した。この溶液のｐＨを、０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴下添加することにより８に調整し、溶液は淡黄色に変わった。反応混合物をＮ２雰囲気下で４０℃で１６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１４Ｂが完全に消費され、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：１４１００．１１、観測ｍ／ｚ：１００７．５４００（［Ｍ／１４＋Ｈ＋］））のメインピークが１つ検出されたことを示した。反応混合物を合わせ、濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。次いで、粗生成物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、その結果、ＢＣＹ７８４２（１．０３ｇ、６９．２５μｍｏｌ、６４．４９％の収率、９４．３４％の純度）を白色の固体として得た。
【０３１８】
ＢＣＹ７８４５：
ＤＭＦ（４ｍＬ）に含まれる、化合物１４Ａ（４０ｍｇ、１６．２７μｍｏｌ、１ｅｑ）、単量体６Ａ（２２１．２３ｍｇ、９７．６１μｍｏｌ、６ｅｑ）、ＣｕＩ（６２ｍｇ、３２５．３６μｍｏｌ、２０ｅｑ）の混合物を脱気し、Ｎ２で３回パージし、次いで、混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７８４５（４９ｍｇ、３．０２μｍｏｌ、１８．５７％の収率、７１．０６％の純度）を白色の固体として得た。
【０３１９】
ＢＣＹ７８４６：
化合物１４Ｂ（４ｍｇ、８．４２ｅ−１μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体６Ａ（１５．２７ｍｇ、６．７４μｍｏｌ、８．０ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（１ｍＬ）に、ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（０．８Ｍ、１２．６３μＬ、１２ｅｑ）およびアスコルビン酸（０．８Ｍ、８４．２２μＬ、８０ｅｑ）を添加した。混合物を脱気し、Ｎ２で３回パージし、次いで、混合物をＮ２雰囲気下で３０℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７８４６（４．８ｍｇ、１．５２ｅ−１μｍｏｌ、１８．０３％の収率、４３．７％の純度）を白色の固体として得た。
【０３２０】
ＢＣＹ７８４９：
化合物１４Ａ（４ｍｇ、１．６３μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体７Ａ（２９．２５ｍｇ、１３．０１μｍｏｌ、８ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（１ｍＬ）に、ＣｕＳＯ４（０．８Ｍ、２４．４０μＬ、１２ｅｑ）および（２Ｒ）−２−［（１Ｓ）−１，２−ジヒドロキシエチル］−３，４−ジヒドロキシ−２Ｈ−フラン−５−オン（０．８Ｍ、８１．３４μＬ、４０ｅｑ）を添加した。混合物を３０℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７８４９（８．５ｍｇ、４．７２ｅ−１μｍｏｌ、２９．０３％の収率、６３．６％の純度）を白色の固体として得た。
【０３２１】
ＢＣＹ７８５０：
化合物１４Ｂ（４ｍｇ、８．４２ｅ−１μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体７Ａ（１５．１４ｍｇ、６．７４μｍｏｌ、８ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（１ｍＬ）に、ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（０．８Ｍ、１２．６３μＬ、１２ｅｑ）とアスコルビン酸（０．８Ｍ、８４．２２μＬ、８０ｅｑ）とをＮ２雰囲気下で添加した。混合物を３０℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７８５０（２．５ｍｇ、０．１８μｍｏｌ、２１．４１％の収率、９９．０９％の純度）を白色の固体として得た。
【０３２２】
ＢＣＹ７８５３：
化合物１４Ａ（４ｍｇ、１．６３μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体８Ａ（２９．９０ｍｇ、１３．０１μｍｏｌ、８ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（１ｍＬ）にＣｕＳＯ４（０．８Ｍ、２４．４０μＬ、１２ｅｑ）および（２Ｒ）−２−［（１Ｓ）−１，２−ジヒドロキシエチル］−３，４−ジヒドロキシ−２Ｈ−フラン−５−オン（０．８Ｍ、８１．３４μＬ、４０ｅｑ）を添加した。混合物をＮ２雰囲気下で３０℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７８５３（０．７ｍｇ、４．２０ｅ−２μｍｏｌ、２．５８％の収率、６９．８８２％の純度）を白色の固体として得た。
【０３２３】
ＢＣＹ７８５４：
化合物１４Ｂ（４ｍｇ、８．４２ｅ−１μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体８Ａ（１５．４８ｍｇ、６．７４μｍｏｌ、８ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（１ｍＬ）にＣｕＳＯ４（０．８Ｍ、１２．６３μＬ、１２ｅｑ）およびアスコルビン酸（０．８Ｍ、８４．２２μＬ、８０ｅｑ）を添加した。混合物をＮ２雰囲気下で３０℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７８５４（０．６ｍｇ、３．０２ｅ−２μｍｏｌ、３．５９％の収率、７０．２２７％の純度）を白色の固体として得た。
【０３２４】
ＢＣＹ７８５７：
化合物１４Ａ（４ｍｇ、１．６３μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体９Ａ（２２．２７ｍｇ、９．７６μｍｏｌ、６ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（１ｍＬ）に、ＣｕＩ（６．２０ｍｇ、３２．５４μｍｏｌ、２０ｅｑ）を添加した。混合物をＮ２雰囲気下で２５〜３０℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７８５７（１．３ｍｇ、８．２８ｅ−２μｍｏｌ、５．０９％の収率、７３．８０％の純度）を白色の固体として得た。
【０３２５】
ＢＣＹ７８５８：
化合物１４Ｂ（４ｍｇ、８．４２ｅ−１μｍｏｌ、１ｅｑ）と単量体９Ａ（１５．３７ｍｇ、６．７４μｍｏｌ、８ｅｑ）とのＤＭＦ溶液（１ｍＬ）に、ＣｕＳＯ４（０．８Ｍ、１２．６３μＬ、１２ｅｑ）とアスコルビン酸（０．８Ｍ、８４．２２μＬ、８０ｅｑ）とをＮ２雰囲気下で添加した。混合物を３０℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳおよびＨＰＬＣは、反応物１が完全に消費されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製して、ＢＣＹ７８５８（２．０ｍｇ、１．１９ｅ−１μｍｏｌ、１４．１３％の収率、８２．５５％の純度）を白色の固体として得た。
【０３２６】
ＢＣＹ８９４５：
化合物１４Ｂ（１０５ｍｇ、２２．１１μｍｏｌ、１ｅｑ．）、単量体１１Ａ（２００ｍｇ、９２．６１μｍｏｌ、４．２ｅｑ．）、およびＴＨＰＴＡ（９．６ｍｇ、１ｅｑ．）の混合物を、ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、６ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、５５μＬ、１ｅｑ．）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、１１０μＬ、２ｅｑ．）をＮ２下で添加した。この溶液のｐＨを、０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴下添加することにより８に調整し、溶液は淡黄色に変わった。反応混合物をＮ２雰囲気下で２５℃で２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１４Ｂが完全に消費され、所望のｍ／ｚ（ＭＳ：１３３７８．６６、観測ｍ／ｚ：１０３０．６（［Ｍ／１３＋Ｈ＋］）、９５６．９（［Ｍ／１４＋Ｈ＋］））のメインピークが１つ検出されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製した。ＢＣＹ８９４５（１２０ｍｇ、８．３７μｍｏｌ、３７．８６％の収率、９１．１１％の純度）を白色の固体として得た。
【０３２７】
ＢＣＹ８９４７：
化合物１４Ａ（１５０．０ｍｇ、６１．０μｍｏｌ、１．０ｅｑ）、単量体１２Ａ（５４３．８ｍｇ、２４５．２μｍｏｌ、４．０２ｅｑ）、およびＴＨＰＴＡ（２６．５ｍｇ、６１．０μｍｏｌ、１．０ｅｑ）の混合物を、ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、６ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳ０４（９．８ｍｇ、６１．０μｍｏｌ、１．０ｅｑ）およびＶｃＮａ（２４．２ｍｇ、１２２．０μｍｏｌ、２．０ｅｑ）をＮ２下で添加した。この溶液のｐＨを、０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴下添加することにより８に調整し、溶液は淡黄色に変わった。反応混合物をＮ２雰囲気下で４０℃で１６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１４Ａが完全に消費され、所望のｍ／ｚ（理論ＭＷ：１１３２９．１２、観測ｍ／ｚ：１１３３．６（［Ｍ／１０＋Ｈ＋］）、１０２９．２（［Ｍ／１１＋Ｈ＋］）、ｍ／ｚ＝１１０９はエキストラ化合物４に対応する）のメインピークが１つ検出されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）により精製し、その結果、ＢＣＹ８９４７（２３０ｍｇ、１８．２８μｍｏｌ、２９．９６％の収率、９５．８２％の純度）を白色の固体として得た。さらに、２００ｍｇをナトリウム塩交換に供し、１５０．３ｍｇ（９７．１６％の純度）を得た。
【０３２８】
ＢＣＹ８９６０（１２２．１ｍｇ、９１．９０％の純度、１６．８０％の収率）、ＢＣＹ８９５９（２１．３ｍｇ、９１．４９％の純度、２５．１４％の収率）、ＢＣＹ８９６６（２０．５ｍｇ、９０．０４％の純度、４５．９０％の収率）、ＢＣＹ８９６３（１７．１ｍｇ、９６．７０％の純度、９．４％の収率）、ＢＣＹ８９６４（２７．８ｍｇ、９０．４１％の純度、１１．５％の収率）およびＢＣＹ９７６７（６．１ｍｇ、８９．４０％の純度、６．１２％の収率）は、化合物１４Ｃ、１４Ｄ、１４Ｅ、１４Ｆ、１４Ｇまたは１４Ｈのうちの１つを使用して；単量体４Ａを使用して；ならびに、ＣｕＳＯ４、（２Ｒ）−２−［（１Ｓ）−１，２−ジヒドロキシエチル］−３，４−ジヒドロキシ−２Ｈ−フラン−５−オンおよびＴＨＰＴＡを使用して、ＢＣＹ８９４５について上記した方法に類似した方法で合成した。
【０３２９】
＜ＣＤ１３７モノクローナル抗体アゴニストの作製＞
本明細書に提示された実験においてＣＤ１３７多量体との比較に使用されたＣＤ１３７モノクローナル抗体アゴニストの配列は、米国特許第７，２８８，６３８号に開示されたものである。ＩｇＧ４アイソタイプ抗体を、ＤＮＡ発現構築物の一過性トランスフェクションに続いて、ＥｘｐｉＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して発現させた。抗体を、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーによって精製し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）ｐＨ７．２中で製剤化した。ＨＰＬＣ−ＳＥＣ（カラムＧＦ−２５０、Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用する純度分析では、ＣＤ１３７モノクローナル抗体の単量体率は約９５％であることが指示された。結合活性分析では、１μｇ／ｍｌよりも高濃度のＣＤ１３７モノクローナル抗体はＣＤ１３７を発現するＣＨＯ細胞に結合できることが指示された。ＴｏｘｉｎＳｅｎｓｏｒ（商標）Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ＬＡＬ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を使用するエンドトキシン分析では、ＣＤ１３７モノクローナル抗体調製物はエンドトキシン＜７ＥＵ／ｍｇを含有することが指示された。
【０３３０】
［生物学的データ］
＜１．ＣＤ１３７  Ｂｉａｃｏｒｅの実験内容＞
Ｂｉａｃｏｒｅの実験を行って、ヒトＣＤ１３７タンパク質に結合する単量体ペプチドのｋａ（Ｍ−１ｓ−１）、ｋｄ（ｓ−１）、ＫＤ（ｎＭ）の各値を決定した。組換えヒトＣＤ１３７（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）をＰＢＳに再懸濁し、製造元の推奨プロトコルに従って、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してビオチン化した。タンパク質を脱塩し、スピンカラムを使用して未結合のビオチンをＰＢＳに除去した。
【０３３１】
ペプチド結合の解析については、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００またはＢｉａｃｏｒｅ  ３０００機器をＸａｎＴｅｃ  ＣＭＤ５００Ｄチップとともに使用した。ストレプトアビジンを、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−Ｎ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用い、２５°Ｃで標準のアミンカップリングケミストリーを使用してチップ上に固定化した。要約すると、０．４Ｍ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）／０．１Ｍ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を１：１の比で、１０μｌ／分の流量で、７分注入することで、カルボキシメチルデキストラン表面を活性化した。ストレプトアビジンを捕捉する場合、タンパク質を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中で０．２ｍｇ／ｍｌに希釈し、活性化したチップ表面に１２０μｌを注入することによって捕捉した。残りの活性化基については、１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．５）を７分注入することでブロックし、ビオチン化ＣＤ１３７を２７０〜１５００ＲＵのレベルへと捕捉した。バッファーをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０に変更し、ペプチドの希釈系列を最終ＤＭＳＯ濃度０．５％を持ってこのバッファーで調製した。最高のペプチド濃度は５００ｎＭで、さらに２倍または３倍の６つの希釈とした。ＳＰＲ分析を、２５℃で９０μｌ／分の流量で、６０秒の会合および９００秒の解離で行った。各サイクルの後、再生段階（１０ｍＭ  グリシン１０μｌ、ｐＨ２）を用いた。必要に応じ、ＤＭＳＯ排除体積効果に対してデータを補正した。すべてのデータは、標準的な処理手順を使用して、ブランク注入とレファレンス面に対して二重に基準化され、データ処理と速度論的フィッティングは、Ｓｃｒｕｂｂｅｒソフトウェア、２．０ｃ版（ＢｉｏＬｏｇｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して実行した。データは、必要な場合は、マストランスポート（ｍａｓｓ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）効果を可能にする単純な１：１結合モデルを使用してフィッティングを行った。
【０３３２】
ある特定の単量体ペプチドをこのアッセイで試験したが、結果を表３
【０３３３】
【表３】
2021514953.tif 000083
に示す。
【０３３４】
＜２．ＣＤ１３７  Ｐｒｏｍｅｇａアッセイの実験内容＞
Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＣＤ１３７活性化の読み取り値としてＮＦ−κＢルシフェラーゼ発光を使用するレポーター細胞活性アッセイを使用して、ＣＤ１３７結合多量体をＣＤ１３７について評価した。ＦＢＳを解凍すること、およびＲＰＭＩ−１６４０（ＰｒｏｍｅｇａキットＣＳ１９６００５）に１％ＦＢＳを添加することによって、培地を調製した。最大の誘導倍率（ｆｏｌｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）を与えると予想される濃度に試料を希釈し、次いで、これから、滅菌９６ウェルプレートで１／３希釈系列または１／１０希釈系列を作製して、濃度を下降させるタイトレーションを行った。ＣＤ１３７  Ｊｕｒｋａｔ細胞を水浴で解凍し、次いで、細胞５００μｌを予熱した１％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ−１６４０培地９．５ｍｌに添加した。ウェルあたり細胞５０μｌを白血球培養プレートに添加した。二連の試料として試料２５μｌ、またはバックグラウンド対照として１％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ−１６４０のみを、添加した。
【０３３５】
細胞をアゴニストと一緒に３７℃、５％ＣＯ２で６時間、コインキュベートした。６時間後、Ｂｉｏ−Ｇｌｏ（商標）を解凍し、室温でアッセイを展開した。ウェル毎にＢｉｏ−Ｇｌｏ（商標）７５ｕｌを添加し、５〜１０分間インキュベートした。ＭＡＲＳプログラムを使用して、Ｐｈｅｒａｓｔａｒプレートリーダーでルシフェラーゼシグナルを読み取った。データをｘ＝ｌｏｇ（Ｘ）に変換し、次いで、ｌｏｇ（アゴニスト）に対して応答変数の傾き（ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｓｌｏｐｅ）（４つのパラメーター）をプロットしてＥＣ５０値を計算することにより、データを解析した。
【０３３６】
ＣＤ１３７の活性化について天然リガンド（ＣＤ１３７Ｌ）と比較した場合、多価ＣＤ１３７二環式ペプチドはある範囲の特性を呈することを示すデータを、図１〜３に提示する。図１では、Ｎ末端およびＣ末端のコンジュゲート三量体、ならびにそれらのコンジュゲート四量体を比較している。単量体ＣＤ１３７結合二環式ペプチド（ＡＣＩＥＥＧＱＹＣＦＡＤＰＹＭＣＡ（配列番号５６）；ＢＣＹ５９２）が含まれているが、アッセイで検出可能な活性はない。図２では、様々なＰＥＧ鎖長を有する多量体の活性を比較している。多量体の種々の付着ポイントについて探ったが、図３に、ＣＤ１３７Ｌと比較したＬｙｓ５コンジュゲート四量体の活性化データを示す。試料ストックにＤＭＳＯを含有させても、観察される活性にはまったくに影響がないことを証明するために、ＤＭＳＯ対照が組み込まれている。表４に、ＣＤ１３７Ｌと比べた、各多量体の平均の誘導倍率およびＥＣ５０での倍率改善を詳述する。
【０３３７】
【表４−１】
2021514953.tif 000084
【表４−２】
2021514953.tif 000085
【０３３８】
【表５】
2021514953.tif 000086
【０３３９】
＜３．血漿安定性解析＞
血漿中の多量体安定性を、ヒト、カニクイザル、ラットおよびマウスの各血漿で以下のように評価した。
【０３４０】
血漿源
【０３４１】
【表６】
2021514953.tif 000087
【０３４２】
実験
実験の前に、プールした凍結血漿を３７℃の水浴で解凍した。血漿を４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、もしあれば血餅を除去した。必要に応じてｐＨを７．４±０．１に調整した。試験化合物の１ｍＭ中間溶液をＤＭＳＯで調製した。陽性対照のプロパンテリンの場合、ストック溶液５μＬを超純水４５μＬで希釈することによって、１ｍＭ中間溶液を調製した。中間溶液（１ｍＭ）２０μＬをＤＭＳＯ１８０μＬで希釈することにより１００μＭ投与溶液を調製した。陽性対照のプロパンテリンの場合、ストック溶液２０μＬを１８０μＬの４５％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏで希釈することにより１００μＭ中間溶液を調製した。ブランク血漿１９６μＬに投与溶液（１００μＭ）４μＬを添加して、二連で２μＭの最終濃度を得、試料を３７℃で水浴でインキュベートした。各時点（０、１、２、４、６、および２４時間）で、停止液（トルブタミド、ラベタロール、デキサメタゾン、プロプラノロール、ジクロフェナック、セレコキシブ、１０Ｏｎｇ／ｍＬの１００％ＭｅＯＨ）８００μＬを添加してタンパク質を沈殿させ、徹底的に混合した。試料プレートを４，００Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄みの一定分量（２００μＬ）を各ウェルから移し、その後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供した。
【０３４３】
データ解析：
血漿中でのインキュベーション後の試験化合物の残存％を、以下の式を使用して計算した。
残存％＝１０Ｏｘ（指定されたインキュベーション時間でのＰＡＲ／Ｔ０時間でのＰＡＲ）
（式中、ＰＡＲは、検体と内部標準（ＩＳ）とのピーク面積比である）
指定されたインキュベーションの時点は、Ｔ０（０時間）、Ｔｎ（ｎ＝０，１、２、４、６、２４時間）である。
【０３４４】
図４に、ヒト、カニクイザル、ラットおよびマウスの各血漿に対するＢＣＹ７８２９の安定性を示す。
図６に、マウス血漿に対するいくつかの多量体および単量体１Ａ（ＢＣＹ７７４１）の安定性を示す。
【０３４５】
＜４．Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  Ｂ−ｈ４−１ＢＢヒト化マウスのＭＣ３８同系腫瘍の処置におけるＣＤ１３７を標的とする二環式多量体のインビボ効能試験＞
実験方法および手順
ＭＣ３８マウス結腸癌細胞株を、Ｓｈｕｎｒａｎ  Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄから購入した。細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬおよびストレプトマイシン１０Ｏμｇ／ｍＬを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、５％ＣＯ２の雰囲気下３７°Ｃで、単層培養としてインビトロで維持することができる。腫瘍細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡ処理により週２回ルーチン的に継代培養すればよい。指数増殖期で増殖している細胞を採取し、腫瘍接種向けにカウントをする。６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  Ｂ−ｈ４−１ＢＢヒト化マウスに、腫瘍発生のためにＰＢＳ０．１ｍＬと共にＭＣ３８腫瘍細胞（５×１０５）を皮下注射した（側腹部に）。平均腫瘍サイズが約１１３ｍｍ３（研究１）または１０７ｍｍ３（研究２）に達したときに、腫瘍保有動物を６つの研究群にランダムに登録した。下に示すように、所定のレジメンに従って、試験物質および陽性対照物質を腫瘍保有マウスに投与した。
【０３４６】
試験物質を水性ビヒクル（２５ｍＭヒスチジン、１０％ショ糖、ｐＨ＝７）で製剤化し、静脈内または腹腔内に投与した。ＣＤ１３７モノクローナル抗体アゴニストを０．９％生理食塩水で腹腔内注射によって投与した。
【０３４７】
腫瘍体積を、キャリパーを使用して２次元で週に３回計測し、体積を、式：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２（式中、ａおよびｂは、それぞれ、腫瘍の長径および短径とした）を使用してｍｍ３で表した。結果を平均および標準偏差（平均±ＳＤ）で表す。
【０３４８】
研究２では、処置開始の２１日後にマウスを殺処分し、フローサイトメトリーによるＴ細胞解析用に腫瘍を採取した。腫瘍を小片に切断し、７０マイクロメートルのフィルターを通して濾過した。リンパ球を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０８３を使用して分離し、１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ  １６４０に再懸濁した。リンパ球を細胞生存率色素（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｄｙｅ）（Ｚｏｍｂｉｅ  ＮＩＲ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃４２３１０６）、および抗マウスＣＤ４５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃１０３１３８）、抗マウスＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃１００３２８）、抗マウスＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃１００４３８）、抗マウスＣＤ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃１００７５９）を含めて抗体のパネルで染色した。染色細胞をＡｔｔｕｎｅ  ＮｘＴ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで解析した。Ｔ細胞の結果を、ＣＤ４５＋細胞のうちのＣＤ３＋細胞の％として表す。ＣＤ８＋  Ｔ細胞の結果を、ＣＤ４５＋  ＣＤ３＋細胞のうちのＣＤ８＋細胞の％として表す。ＣＤ４＋  Ｔ細胞の結果を、ＣＤ４５＋  ＣＤ３＋細胞のうちのＣＤ４＋細胞の％として表す。結果を、平均および標準偏差（平均±ＳＤ）ならびに個々の値で表す。
【０３４９】
統計学的解析：二元配置ＡＮＯＶＡまたは通常の一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、多重比較のためのダネット検定でデータを解析し、Ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。統計学的解析および生物学的観察の双方が考慮されている。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【０３５０】
実験計画
【０３５１】
【表７】
2021514953.tif 000088
【０３５２】
ＣＤ１３７モノクローナル抗体アゴニストと比較して、多量体二環式ペプチドはある範囲の抗腫瘍活性を誘発することがわかる、研究１の結果を図７に示す。ＣＤ１３７モノクローナル抗体アゴニストと比較して、多量体二環式ペプチドはある範囲の抗腫瘍活性を誘発することがわかる、研究２の結果を図８に示す。ＣＤ１３７モノクローナル抗体アゴニストと比較して、多量体二環式ペプチドは、腫瘍組織中のＴ細胞百分率において一定の範囲の増加を誘発することがわかる、研究２の腫瘍Ｔ細胞の解析結果を図９に示す。ＣＤ１３７モノクローナル抗体アゴニストと比較して、多量体二環式ペプチドは、腫瘍組織中のＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率において一定の範囲の増加を誘発することが理解される、研究２のＣＤ８＋腫瘍Ｔ細胞の解析結果を図１０に示す。ＣＤ１３７依存性抗腫瘍活性を誘発すると従来から示されているＣＤ１３７モノクローナル抗体アゴニストと比較して、多量体二環式ペプチドが腫瘍組織中のＴ細胞百分率において一定の範囲の低下を誘発することがわかる、研究２のＣＤ４＋腫瘍Ｔ細胞の解析結果を図１１に示す。
【０３５３】
＜５．ＣＤ−１マウスにおける二環式多量体の薬物動態＞
雄ＣＤ−１マウスに、２５ｍＭヒスチジンＨＣｌ、１０％ショ糖ｐＨ７で製剤化された各二環式多量体５ｍｇ／ｋｇを尾静脈注射で投薬した。各時点で、顎下静脈または伏在静脈を介して、連続採血（約８０μＬの血液／時点）を行った。すべての血液試料を、抗凝固剤としてＫ２−ＥＤＴＡ（０．５Ｍ）２μＬを含有する予冷したマイクロ遠心チューブに即座に移し、湿った氷の上に置いた。血液試料を、約４℃、３０００ｇでの遠心分離により、血漿向けに即座に処理した。内部標準を含む沈殿剤を血漿に即座に添加し、よく混合し、１２，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。上清を予め標識したポリプロピレン製マイクロ遠心チューブに移し、次いで、ドライアイス上で急速冷凍した。試料を、分析まで、必要に応じて７０℃以下で保存した。陽イオンモードでＯｒｂｉｔｒａｐ  Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅを使用したＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために上澄み試料７．５μＬを直接注入して、二環式多量体の濃度を決定した。血漿濃度対時間データを、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  ６．３ソフトウェアプログラムを使用して、ノンコンパートメントアプローチによって解析した。Ｃ０、Ｃｌ、Ｖｄｓｓ、Ｔ1/2、ＡＵＣ（０−ｌａｓｔ）、ＡＵＣ（０−ｉｎｆ）、ＭＲＴ（０−ｌａｓｔ）、ＭＲＴ（０−ｉｎｆ）および血漿濃度対時間プロファイルのグラフが報告された。
【０３５４】
多量体二環式コンジュゲート（特にＢＣＹ７８２９、ＢＣＹ７８３５およびＢＣＹ７８３８）が、単量体の二環式ペプチドおよび二環式ペプチド薬物コンジュゲート（ＢＤＣ）にとって特徴的である速やかな全身性排泄という特性を、保持することを薬物動態データが示すことがわかる、雄ＣＤ−１マウスの血漿濃度解析の結果を図５Ａおよび５Ｂに示す。
【０３５５】
＜６．Ｅｘ  Ｖｉｖｏヒト腫瘍細胞殺滅（Ｔｕｍｏｕｒ  Ｃｅｌｌ  Ｋｉｌｌ）アッセイ＞
凍結した、黒色腫患者の解離腫瘍試料２つをＦｏｌｉｏ  Ｃｏｎｖｅｒｓａｎｔから購入した。細胞を３７℃で速やかに解凍し、ＤＮａｓｅＩ（１ｍｇ／ｍＬ）がフレッシュで添加されている洗浄培地［ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１×ペニシリン／ストレプトマイシン＋５０μｇ／ｍＬ  ゲンタマイシン＋１００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８＋１００μｇ／ｍＬ  ハイグロマイシン＋１×インスリン−トランスフェリン−セレニウム（ＩＴＳ）＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ］１０ｍＬにピペッティングした。血球計算板および０．０４％トリパンブルーによる１：２希釈を使用して、細胞カウントを行った。細胞を、遠心沈殿し、５×１０５細胞／ｍＬで、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ［ＥｍｂｒｙｏＭａｘ  ＤＭＥＭ＋１０％熱不活性化ＦＢＳ＋１×ペニシリン／ストレプトマイシン＋５０μｇ／ｍＬ  ゲンタマイシン＋１×ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム＋１×ＩＴＳ＋０．４％ＢＳＡ＋４．５ｇ／Ｌグルコース＋２．３ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋１０ｎｇ／ｍＬ  塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）＋２０ｎｇ／ｍＬ上皮成長因子（ＥＧＦ）］に再懸濁させた。Ｎ３Ｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製造元のプロトコルに記載の通りに、細胞を磁化した。要約すると、ＮａｎｏＳｈｕｔｔｌｅ（ＮＳ）を１μＬで１ｘ１０４細胞に添加し、ピペッティングにより混入する。細胞とＮＳを１００×ｇで５分間遠心沈殿し、ピペッティングにより混合し、細胞ペレットが均一な茶色を得るまで再度遠心沈殿する（約３〜５サイクルの遠心沈殿および混合）。次いで、細胞を、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ１００μＬ中の５０，０００細胞／ウェルで、セルリペレント９６ウェルプレートに添加した（５０，０００細胞の１分量を０日目フローサイトメトリーパネル用に確保した）。ＣＤ１３７多量体（ＢＣＹ７８３８、ＢＣＹ７８３９、およびＢＣＹ７８４２）と対照化合物を、ここでもＧｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ中の２×最終濃度１００μＬで、プレーティングした細胞に添加した。次いで、セルリペレントディッシュを磁性スフェロイドプレートの上に置き、３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間の終わりに、細胞を採取し、適切なフローサイトメトリー抗体とｆｉｘａｂｌｅ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｓｔａｉｎ（ＢＤ）で染色し、２％パラホルムアルデヒドで固定し、その後、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃｅｌｅｓｔａでランさせた。ＦｌｏｗＪｏ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ、およびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータ解析を行った。この実験で使用したフローサイトメトリーパネルによって、０日目および２日目に存在するリンパ球および腫瘍細胞の数を解析した。腫瘍細胞殺滅を、未処理の対照と対比して、処理したウェル内のＣＤ４５陰性細胞の数の減少によって決定した（図１２）  −  有意性については二元配置ＡＮＯＶＡを使用して計算した。
【０３５６】
図１２に提示するデータが実証するところによると、ＣＤ１３７多量体処置（ＢＣＹ７８３８、ＢＣＹ７８３９、およびＢＣＹ７８４２）に応答した有意な腫瘍細胞死が黒色腫患者の一方の試料で生じたが、他方の試料では生じなかった（図１２Ａ）。０日目から２日目までに細胞数が変化したが（データは示さず）、処置間でリンパ球数に関して有意差はなかった（図１２Ｂ）。
【０３５７】
＜７．ＣＤ１３７レポーター細胞活性のウォッシュアウトアッセイ＞
ＣＤ１３７を過剰発現し、ＮＦ−κＢプロモーター下でルシフェラーゼ遺伝子を発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ細胞を、Ｐｒｏｍｅｇａから購入した。レポーター細胞を、１％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０培地中、３７℃で指示された時間、１０ｎＭ  ＣＤ１３７アゴニストとインキュベートした。３０、６０、または１２０分のいずれかの後、細胞を過剰な培養培地で洗浄し、新鮮な培地７５μＬに再懸濁させた。ウォッシュアウト無しの条件も含めた。すべてのウォッシュアウト条件を二連で行った。次いで、細胞を合計６時間（曝露時間に応じてさらなる５．５、５、または４時間）引き続きインキュベートした。インキュベーション後、Ｂｉｏ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）７５μＬを各ウェルに添加し、室温で１０分間平衡化させた。発光をＣｌａｒｉｏｓｔａｒプレートリーダー（ＢＭＧ  ＬａｂＴｅｃｈ）で読み取った。誘導倍率を、発光シグナルをバックグラウンドウェル（アゴニスト無添加のレポーター細胞）で割ることによって計算した。最大誘導倍率のパーセントを、ウォッシュアウト時間の誘導倍率をウォッシュアウト無しの条件の誘導倍率で割り、１００を掛けることによって計算した。データをＰｒｉｓｍでグラフ化し、標準偏差エラーバーと共に反復試料の平均値の棒グラフとして表示する。
【０３５８】
図１３に提示するデータが実証するところによると、ＣＤ１３７多量体（ＢＣＹ７８３８、ＢＣＹ７８３９、およびＢＣＹ７８４２）は、三量体ＣＤ１３７受容体複合体に対する高い親和性と一致して、ウォッシュアウト後での細胞活性を維持する。
【０３５９】
＜８．Ｔ細胞サイトカイン放出アッセイ＞
健康なヒトのバフィーコートを、Ｓｙｌｖａｎ  Ｎ．  Ｇｏｌｄｍａｎ  Ｏｋｌａｈｏｍａ  Ｂｌｏｏｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから購入した（新鮮な状態で発送されたものである）。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコール密度勾配遠心分離によって分離した。赤血球をＡＣＫ（Ａｍｍｏｎｉｕｍ−Ｃｈｌｏｒｉｄｅ−Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ）溶解バッファーで溶解した。次いで、ネガティブ磁気ビーズセレクション（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＭＡＣＳ  ｈｕｍａｎ  Ｐａｎ−Ｔ細胞分離キット）を使用して、Ｐａｎ  Ｔ細胞を全ＰＢＭＣから分離した。次いで、化合物有り無しの培養培地（１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０）中で抗ＣＤ３コーティング９６ウェルプレート（０．５μｇ／ｍＬ）に、Ｐａｎ  Ｔ細胞をプレーティングした。培養物からの上清を２４時間後および４８時間後に収集した。上清中のサイトカイン［すなわち、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）］放出を、キットの指示書に従ってＨＴＲＦアッセイ（ＣｉｓＢｉｏ）によって測定した。ＨＴＲＦアッセイプレートを、６６５ｎｍおよび６２ＯｎｍでＣｌａｒｉｏｓｔａｒプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）で読み取った。ＰｒｉｓｍのＨＴＲＦキットおよびＥｘｃｅｌの指示書に従って、データを解析し、標準曲線に外挿した。サイトカイン放出の倍率変化を、検出されたサイトカインのｐｇ／ｍＬを放出されたバックグラウンドサイトカイン（ＣＤ３刺激のみ）で割ることによって計算した。データを、標準偏差エラーバーと共に反復試料の平均値としてＰｒｉｓｍでグラフ化した。
【０３６０】
図１４に提示するデータが実証するところによると、ＣＤ１３７多量体、ＢＣＹ７８３８、ＢＣＹ８９４５、ＢＣＹ７８４１、ＢＣＹ８９４７、ＢＣＹ７８３９、ＢＣＹ７８４２、ＢＣＹ８９６０、ＢＣＹ８９６４およびＢＣＹ８９５８に応答して、Ｔ細胞は炎症誘発性サイトカインを分泌するが、単量体対照ＢＣＹ０５９２では分泌しない。
【図１】
2021514953.tif 000098
【図２】
2021514953.tif 000099
【図３】
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【図４】
2021514953.tif 000101
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
2021514953.tif 000104
【図７】
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【図８】
2021514953.tif 000106
【図９】
2021514953.tif 000107
【図１０】
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【図１１】
2021514953.tif 000109
【図１２】
2021514953.tif 000110
【図１３】
2021514953.tif 000111
【図１４】
2021514953.tif 000112
【図１５】
2021514953.tif 000113
【配列表】
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【国際調査報告】
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