(57)【要約】薬物がオーリスタチン類似体でありかつ低い平均薬物抗体比（ＤＡＲ）で抗体にコンジュゲートした、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、及び、ＨＥＲ２発現癌の治療にＡＤＣを使用する方法。本明細書に記載の低い平均ＤＡＲ（＜３．９）のＡＤＣでは、同じ毒素用量で投与された場合、ＤＡＲ≧３．９を有する対応するＡＤＣと比較して、忍容性が改善され、毒性が低下した。【選択図】図１
2021515793.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低い平均薬物抗体比（ＤＡＲ）でリンカー（Ｌ）を介してオーリスタチン類似体にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体を含む抗体−薬物コンジュゲートであって、
前記抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、第１のＨＥＲ２エピトープに結合する第１の抗原結合ポリペプチド構築物及び第２のＨＥＲ２エピトープに結合する第２の抗原結合ポリペプチド構築物を含み、前記第１及び第２のＨＥＲ２エピトープは異なるエピトープであり、
前記低い平均ＤＡＲは、３．９未満の平均ＤＡＲである、
前記抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２】
前記オーリスタチン類似体リンカーが、一般式（ＩＩ）
2021515793.tif 000121
を有し、
式中、
Ｘは−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｒ２）−であるか、またはＸは存在せず；
Ｒ１は、
2021515793.tif 000122
から選択され；
Ｌが、リンカーであり、
2021515793.tif 000123
は、前記抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体への前記オーリスタチン類似体−リンカーの付着点を表す、
請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項３】
Ｒ１が、
2021515793.tif 000124
である、請求項２に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項４】
Ｘが存在しない、請求項２に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項５】
Ｒ１が、
2021515793.tif 000125
である、請求項４に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項６】
Ｘが−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｒ２）−である、請求項２に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項７】
Ｒ１が、
2021515793.tif 000126
である、請求項６に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項８】
前記平均ＤＡＲが０．５〜３．５である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項９】
前記平均ＤＡＲが０．５〜２．５である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１０】
前記コンジュゲートが、ＤＡＲ０の種を５％以上含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１１】
前記コンジュゲートが、ＤＡＲ０の種を１５％以上含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１２】
前記コンジュゲートが、ＤＡＲ０の種を約５％〜約５０％含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１３】
前記コンジュゲートが、ＤＡＲ０の種を約１０％〜約３０％含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１４】
前記コンジュゲートが、ＤＡＲ０の種を約１０％〜約２５％含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１５】
前記コンジュゲートが、ＤＡＲ０の種を約１５％〜約２５％含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１６】
前記コンジュゲートが、ＤＡＲ６以上の種を２５％以下含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１７】
前記コンジュゲートが、ＤＡＲ６以上の種を１５％以下含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１８】
前記コンジュゲートが、ＤＡＲ６以上の種を０％〜約１５％含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１９】
前記コンジュゲートが、ＤＡＲ６以上の種を約０％〜約１０％含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２０】
Ｌが切断可能リンカーである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２１】
Ｌが、プロテアーゼ切断可能リンカーである、請求項２０に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２２】
Ｌが、一般式（ＶＩ）
2021515793.tif 000127
を有し、
式中、
Ｚは、前記抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体上の標的基と反応できる官能基であり、
Ｓｔｒは、ストレッチャーであり；
ＡＡ１及びＡＡ２は、それぞれ独立してアミノ酸であり、ＡＡ１−［ＡＡ２］ｍは、プロテアーゼ切断部位を形成し；
Ｘは、自壊性基であり；
Ｄは、前記オーリスタチン類似体への付着点であり；
ｓは、０または１であり；
ｍは、１〜４の整数であり、
ｏは、０、１、または２である、
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２３】
Ｌが、一般式（ＶＩＩＩ）：
2021515793.tif 000128
を有し、
式中、
Ａ−Ｓ−は、前記抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体への付着点であり；
Ｙは、１つ以上の追加のリンカー構成要素であるか、または存在せず、
Ｄは、前記オーリスタチン類似体への前記付着点である、
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２４】
Ｌが、一般式（ＩＸ）
2021515793.tif 000129
を有し、
式中、
Ａ−Ｓ−は、前記抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体への前記付着点であり；
Ｙは、１つ以上の追加のリンカー構成要素であるか、または存在せず、
Ｄは、前記オーリスタチン類似体への前記付着点である、
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２５】
前記オーリスタチン類似体リンカーが構造：
2021515793.tif 000130
を有し、
Ａ−Ｓ−は、前記抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体への前記付着点である、
請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２６】
前記平均ＤＡＲが０．５〜２．５である、請求項２５に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２７】
前記コンジュゲートが、ＤＡＲ０の種を５％以上含む、請求項２５または２６に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２８】
前記コンジュゲートが、ＤＡＲ０の種を約５％〜約５０％含む、請求項２５または２６に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２９】
前記コンジュゲートが、ＤＡＲ６以上の種を２５％以下含む、請求項２５または２６に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項３０】
前記コンジュゲートが、ＤＡＲ６以上の種を０％〜約１５％含む、請求項２５または２６に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項３１】
前記抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体が、対応する二価の単一特異性抗体と比較してより高い親和性でＨＥＲ２に結合する、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項３２】
前記抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体が、対応する二価の単一特異性抗体と比較して、ＨＥＲ２発現細胞へのより高い内在化を示す、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項３３】
前記第１及び第２の抗原結合ポリペプチド構築物が独立して、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはｓｄＡｂである、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項３４】
前記第１及び第２の抗原結合ポリペプチド構築物が独立して、ｓｃＦｖまたはＦａｂである、請求項３３に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項３５】
前記第１の抗原結合ポリペプチド構築物がｓｃＦｖであり、前記第２の抗原結合ポリペプチド構築物がＦａｂである、請求項３４に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項３６】
前記第１及び第２のＨＥＲ２エピトープが重複しないエピトープである、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項３７】
前記第１及び第２のＨＥＲ２エピトープがＨＥＲ２の異なるドメイン上にある、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項３８】
前記第１のＨＥＲ２エピトープがＨＥＲ２のＥＣＤ４にあり、前記第２のＨＥＲ２エピトープがＨＥＲ２のＥＣＤ２にある、請求項３７に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項３９】
前記第１の抗原結合ポリペプチド構築物が、ＨＥＲ２への結合についてトラスツズマブと競合する、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項４０】
前記第２の抗原結合ポリペプチド構築物が、ＨＥＲ２への結合についてペルツズマブと競合する、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項４１】
前記第１の抗原結合ポリペプチド構築物が、ｖ５０１９、ｖ５０２０、ｖ７０９１、ｖ１００００、ｖ６９０２、ｖ６９０３またはｖ６７１７のいずれか１つのＥＣＤ４結合アームからのＣＤＲ配列を含む、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項４２】
前記第２の抗原結合ポリペプチド構築物が、ｖ５０１９、ｖ５０２０、ｖ７０９１、ｖ１００００、ｖ６９０２、ｖ６９０３、ｖ６７１７、ｖ７１３３、ｖ１５０７９、ｖ１５０８０、ｖ１５０８１、ｖ１５０８２、ｖ１５０８３、ｖ１５０８４、またはｖ１５０８５のいずれか１つのＥＣＤ２結合アームからのＣＤＲ配列を含む、請求項１〜３８および４１のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項４３】
前記第２の抗原結合ポリペプチド構築物が、ｖ１００００の前記ＥＣＤ２結合アームからの前記ＣＤＲ配列を含む、請求項１〜３８および４１のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項４４】
前記第１の抗原結合ポリペプチド構築物が、ｖ１００００の前記ＥＣＤ４結合アームからの前記ＣＤＲ配列を含み、前記第２の抗原結合ポリペプチド構築物が、ｖ１００００の前記ＥＣＤ２結合アームからの前記ＣＤＲ配列を含む、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項４５】
前記第１の抗原結合ポリペプチド構築物が、ｖ１００００の前記ＥＣＤ４結合アームからのＣＤＲのセットに対して９０％以上の配列同一性を有する６つのＣＤＲのセットを含み、前記抗原結合ポリペプチド構築物が、ＥＣＤ４に結合する能力を保持している、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項４６】
前記第２の抗原結合ポリペプチド構築物が、ｖ１００００の前記ＥＣＤ２結合アームからのＣＤＲのセットに対して９０％以上の配列同一性を有する６つのＣＤＲのセットを含み、前記抗原結合ポリペプチド構築物が、ＥＣＤ２に結合する能力を保持している、請求項１〜３８および４５のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項４７】
前記第１の抗原結合ポリペプチド構築物が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、２８、２９、３９、４０及び４１に示されるＣＤＲ配列を含み、かつ第２の抗原結合ポリペプチド構築物が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７、６８、６９、７０、７１及び７２に示されるＣＤＲ配列を含む、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項４８】
前記抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体が足場をさらに含み、前記第１及び第２の抗原結合ポリペプチド構築物が、前記足場に作動可能に連結されている、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項４９】
前記足場が、ＩｇＧ  Ｆｃ領域である、請求項４８に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項５０】
前記ＩｇＧ  Ｆｃ領域が、修飾されたＣＨ３ドメインを含むヘテロ二量体Ｆｃ領域である、請求項４９に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項５１】
前記ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、
Ｆ４０５位及びＹ４０７位のアミノ酸修飾を含みかつ任意でＬ３５１位のアミノ酸修飾をさらに含む第１のポリペプチド配列と、
Ｔ３６６位及びＴ３９４位のアミノ酸修飾を含みかつ任意でＫ３９２位のアミノ酸修飾をさらに含む第２のポリペプチド配列と
を有する修飾ＣＨ３ドメインを含むヘテロ二量体Ｆｃ領域であり、
Ｆ４０５位の前記アミノ酸修飾は、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５ＴまたはＦ４０５Ｖであり、Ｙ４０７位の前記アミノ酸修飾は、Ｙ４０７ＩまたはＹ４０７Ｖであり、Ｔ３６６位の前記アミノ酸修飾は、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６ＬまたはＴ３６６Ｍであり、Ｔ３９４位の前記アミノ酸修飾は、Ｔ３９４Ｗであり、Ｌ３５１位の前記アミノ酸修飾はＬ３５１Ｙであり、Ｋ３９２位の前記アミノ酸修飾はＫ３９２Ｆ、Ｋ３９２ＬまたはＫ３９２Ｍである、
請求項４９に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項５２】
（ａ）前記修飾ＣＨ３ドメインの前記第１のポリペプチド配列は、前記アミノ酸修飾Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、前記修飾ＣＨ３ドメインの前記第２のポリペプチド配列は、前記アミノ酸修飾Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｍ及びＴ３９４Ｗを含む；または
（ｂ）前記修飾ＣＨ３ドメインの前記第１のポリペプチド配列は、前記アミノ酸修飾Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、前記修飾ＣＨ３ドメインの前記第２のポリペプチド配列は、前記アミノ酸修飾Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ及びＴ３９４Ｗを含む；または
（ｃ）前記修飾ＣＨ３ドメインの前記第１のポリペプチド配列は、前記アミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、前記修飾ＣＨ３ドメインの前記第２のポリペプチド配列は、前記アミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｍ及びＴ３９４Ｗを含む；
または
（ｄ）前記修飾ＣＨ３ドメインの前記第１のポリペプチド配列は、前記アミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、前記修飾ＣＨ３ドメインの前記第２のポリペプチド配列は、前記アミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ及びＴ３９４Ｗを含む；
または
（ｅ）前記修飾ＣＨ３ドメインの前記第１のポリペプチド配列は、前記アミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ４００Ｅ、Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、前記修飾ＣＨ３ドメインの前記第２のポリペプチド配列は、前記アミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｎ３９０Ｒ、Ｋ３９２Ｍ及びＴ３９４Ｗを含む、
請求項５１に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項５３】
請求項１〜５２のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート及び薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項５４】
ＨＥＲ２発現癌細胞を有効量の請求項１〜５２のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートと接触させることを含む、ＨＥＲ２発現癌細胞の成長を阻害する方法。
【請求項５５】
ＨＥＲ２発現癌を有する対象に、有効量の請求項１〜５２のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートを投与することを含む、ＨＥＲ２発現癌を治療する方法。
【請求項５６】
前記ＨＥＲ２発現癌が、乳癌、卵巣癌、肺癌または胃癌である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＨＥＲ２発現癌が乳癌である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＨＥＲ２発現癌が卵巣癌である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＨＥＲ２発現癌が免疫組織化学によりＨＥＲ２陰性としてスコア付けされる、請求項５５〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
治療に使用するための、請求項１〜５２のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項６１】
ＨＥＲ２発現癌の治療を必要とする対象においてＨＥＲ２発現癌を治療するために使用するための、請求項１〜５２のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項６２】
前記ＨＥＲ２発現癌が、乳癌、卵巣癌、肺癌または胃癌である、請求項６１に記載の使用のための抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項６３】
前記ＨＥＲ２発現癌が、乳癌である、請求項６１に記載の使用のための抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項６４】
前記ＨＥＲ２発現癌が、卵巣癌である、請求項６１に記載の使用のための抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項６５】
前記ＨＥＲ２発現癌が免疫組織化学によりＨＥＲ２陰性としてスコア付けされる、請求項６１〜６４のいずれか１項に記載の使用のための抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項６６】
ＨＥＲ２発現癌の前記治療のための医薬の製造における、請求項１〜５２のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートの使用。
【請求項６７】
前記ＨＥＲ２発現癌が、乳癌、卵巣癌、肺癌または胃癌である、請求項６６に記載の使用。
【請求項６８】
前記ＨＥＲ２発現癌が乳癌である、請求項６６に記載の使用。
【請求項６９】
前記ＨＥＲ２発現癌が卵巣癌である、請求項６６に記載の使用。
【請求項７０】
前記ＨＥＲ２発現癌が免疫組織化学によりＨＥＲ２陰性としてスコア付けされる、請求項６６〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
リンカー（Ｌ）を介してオーリスタチン類似体にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体を含む抗体−薬物コンジュゲート組成物であって、
前記オーリスタチン類似体−リンカーは、一般式（ＩＩ）：
2021515793.tif 000131
を有し、
式中、
Ｘは存在せず；
Ｒ１は、
2021515793.tif 000132
から選択され；
Ｌが、リンカーであり、
2021515793.tif 000133
は、前記抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体への前記オーリスタチン類似体−リンカーの付着点を表し；
前記抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、ＨＥＲ２のＥＣＤ４の第１のＨＥＲ２エピトープに結合する第１の抗原結合ポリペプチド構築物及びＨＥＲ２のＥＣＤ２の第２のＨＥＲ２エピトープに結合する第２の抗原結合ポリペプチド構築物を含み、
前記抗体−薬物コンジュゲート組成物は、０．５〜２．５の平均ＤＡＲを有し、かつＤＡＲ０の種を約１０％〜約３０％およびＤＡＲ６以上の種を０％〜約１５％有する、
前記抗体−薬物コンジュゲート組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、がん治療の分野に関し、特に、バイパラトピック抗ＨＥＲ２抗体及びオーリスタチン類似体を含む抗体−薬物コンジュゲートに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）は、膜貫通型表面結合型受容体チロシンキナーゼであり、受容体チロシンキナーゼのＥｒｂＢファミリーのメンバーであり、通常、細胞成長及び分化を導くシグナル伝達経路に関与している。ＨＥＲ２は、乳癌患者の約４分の１で過剰発現していることが判明しているため、乳癌治療の有望なターゲットである（Ｂａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７：５４８（２００１）（非特許文献1））。
【０００３】
ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ、米国特許第５，８２１，３３７号（特許文献1））は、ＨＥＲ２陽性乳癌の治療のために開発された最初のモノクローナル抗体であり、患者の生存期間が延長されたため、現在では、ＨＥＲ２陰性乳癌の患者に対するものと同じである。ペルツズマブ（パージェタ（登録商標）、米国特許第７，８６２，８１７号（特許文献2））は、細胞の表面でＨＥＲ２受容体が他のＨＥＲ受容体（ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４）とペアになる（二量体化する）のを防ぐように特別に設計されたヒト化モノクローナル抗体であり、腫瘍の成長及び生存において、ある役割を果たすと考えられているプロセスである。パージェタ、ハーセプチン、及び化学療法の組み合わせは、ＨＥＲシグナル伝達経路のより包括的な遮断をもたらすと考えられている。ペルツズマブは、二量体化に不可欠なＨＥＲ２のドメインＩＩに結合し、トラスツズマブは、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶに結合する。
【０００４】
Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，７３：６４７１−６４８３（２０１３））（非特許文献2）は、天然のトラスツズマブ及びペルツズマブ配列に基づいており、トラスツズマブ耐性を克服する、ＨＥＲ２に対する二重特異性二価抗体について記載している。他の二重特異性抗ＨＥＲ２抗体が記載されている（国際特許出願公開ＷＯ２０１５／０７７８９１号（特許文献3）及びＷＯ２０１６／１７９７０７号（特許文献4）；米国特許出願公開第２０１４／０１７０１４８（特許文献5）、同第２０１５／０２８４４６３号（特許文献6）、同第２０１７／００２９５２９号（特許文献7）、及び同第２０１７／０２９１９５５号（特許文献8）；米国特許第９，７４５，３８２号（特許文献9））。チューブリシン誘導体に部位特異的にコンジュゲートした、ＨＥＲ２を標的とするバイパラトピック抗体を含む抗体−薬物コンジュゲートも記載されている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，２９：１１７−１２９（２０１６）（非特許文献3））。
【０００５】
オーリスタチンは、抗がん活性を有する強力な微小管阻害剤であるドラスタチン１０の合成類似体である。モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）などのオーリスタチンペイロードを含む抗体−薬物コンジュゲートが記載されている（米国特許第７，４９８，２９８号（特許文献10）及び同第７，６５９，２４１号（特許文献11）；国際特許出願公開第ＷＯ２００２／０８８１７２号（特許文献12）及びＷＯ２０１６／０４１０８２（特許文献13））。国際特許出願公開第ＷＯ２１０６／０４１０８２号（特許文献14）には、Ｎ−アシルスルホンアミド修飾オーリスタチン及び抗体−薬物コンジュゲートペイロードとしてのそれらの使用について記載している。
【０００６】
この背景情報は、出願人が本開示に関連すると考える既知の情報を作成する目的で提供される。前述の情報のいずれかが、特許請求された発明に対する先行技術を構成することを認めることは必ずしも意図されておらず、そのように解釈されるべきでもない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，８２１，３３７号
【特許文献２】米国特許第７，８６２，８１７号
【特許文献３】国際特許出願公開ＷＯ２０１５／０７７８９１号
【特許文献４】ＷＯ２０１６／１７９７０７号
【特許文献５】米国特許出願公開第２０１４／０１７０１４８
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１５／０２８４４６３号
【特許文献７】米国特許出願公開第２０１７／００２９５２９号
【特許文献８】米国特許出願公開第２０１７／０２９１９５５号
【特許文献９】米国特許第９，７４５，３８２号
【特許文献１０】米国特許第７，４９８，２９８号
【特許文献１１】米国特許第７，６５９，２４１号
【特許文献１２】国際特許出願公開第ＷＯ２００２／０８８１７２号
【特許文献１３】ＷＯ２０１６／０４１０８２
【特許文献１４】国際特許出願公開第ＷＯ２１０６／０４１０８２号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７：５４８（２００１）
【非特許文献２】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，７３：６４７１−６４８３（２０１３）
【非特許文献３】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，２９：１１７−１２９（２０１６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本明細書に記載されているのは、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体−薬物コンジュゲート及び使用方法である。一態様では、本開示は、低い平均薬物抗体比（ＤＡＲ）でリンカー（Ｌ）を介してオーリスタチン類似体にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体を含む抗体−薬物コンジュゲートに関し、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、第１のＨＥＲ２エピトープに結合する第１の抗原結合ポリペプチド構築物及び第２のＨＥＲ２エピトープに結合する第２の抗原結合ポリペプチド構築物を含み、第１及び第２のＨＥＲ２エピトープは異なるエピトープであり、低い平均ＤＡＲは３．９未満の平均ＤＡＲである。
【００１０】
抗体−薬物コンジュゲートの特定の実施形態では、オーリスタチン類似体−リンカーは、一般式（ＩＩ）：
2021515793.tif 000003
を有し、式中、
Ｘは−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｒ２）−であるか、またはＸは存在せず；
Ｒ１は、
2021515793.tif 000004
から選択され；
Ｌが、リンカーであり、
2021515793.tif 000005
は、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体へのリンカー−毒素の付着点を表し、
抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、第１のＨＥＲ２エピトープに結合する第１の抗原結合ポリペプチド構築物及び第２のＨＥＲ２エピトープに結合する第２の抗原結合ポリペプチド構築物を含み、第１及び第２のＨＥＲ２エピトープは異なるエピトープであり、低い平均ＤＡＲは、３．９未満の平均ＤＡＲである。
【００１１】
特定の実施形態では、抗体−薬物コンジュゲートの低い平均ＤＡＲは、０．５〜３．５または０．５〜２．５である。
【００１２】
特定の実施形態では、抗体−薬物コンジュゲートは、ＤＡＲ０の種を５％以上またはＤＡＲ０の種を１５％以上含む。いくつかの実施形態では、抗体−薬物コンジュゲートは、ＤＡＲ０の種を約５％〜約５０％、またはＤＡＲ０の種を約１０％〜約３０％、またはＤＡＲ０の種を約１０％〜約２５％、またはＤＡＲ０の種を約１５％〜約２５％含む。
【００１３】
ある実施形態では、抗体−薬物コンジュゲートは、ＤＡＲ６以上の種を２５％以下、またはＤＡＲ６以上の種を１５％以下含む。いくつかの実施形態では、抗体−薬物コンジュゲートは、ＤＡＲ６以上の種を０％〜約１５％、またはＤＡＲ６以上の種を約０％〜約１０％含む。
【００１４】
本開示の別の態様は、本明細書に記載の抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体−薬物コンジュゲート及び薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物に関する。
【００１５】
別の態様は、ＨＥＲ２発現癌細胞の成長を阻害する方法に関し、この方法は、癌細胞を、本明細書に記載の有効量の抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体−薬物コンジュゲートと接触させることを含む。
【００１６】
別の態様は、ＨＥＲ２発現癌を有する対象に、本明細書に記載の有効量の抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体−薬物コンジュゲートを投与することを含む、ＨＥＲ２発現癌を治療する方法に関する。
【００１７】
別の態様は、治療に使用するための本明細書に記載の抗体−薬物コンジュゲートに関する。
【００１８】
別の態様は、それを必要とする対象におけるＨＥＲ２発現癌を治療するために使用するための、本明細書に記載の抗体−薬物コンジュゲートに関する。
【００１９】
別の態様は、ＨＥＲ２発現癌を治療するための医薬の製造における、本明細書に記載の抗体−薬物コンジュゲートの使用に関する。
【００２０】
別の態様は、リンカー（Ｌ）を介してオーリスタチン類似体にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体を含む抗体−薬物コンジュゲート組成物に関し、オーリスタチン類似体−リンカーは、一般式（ＩＩ）：
2021515793.tif 000006
を有し、式中、
Ｘは存在せず；
Ｒ１は、
2021515793.tif 000007
から選択され；
Ｌが、リンカーであり、
2021515793.tif 000008
は、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体へのオーリスタチン類似体−リンカーの付着点を表し、
抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、ＨＥＲ２のＥＣＤ４の第１のＨＥＲ２エピトープに結合する第１の抗原結合ポリペプチド構築物及びＨＥＲ２のＥＣＤ２の第２のＨＥＲ２エピトープに結合する第２の抗原結合ポリペプチド構築物を含み、
抗体−薬物コンジュゲート組成物は、０．５〜２．５の平均ＤＡＲを有し、かつＤＡＲ０の種を約１０％〜約３０％およびＤＡＲ６以上の種を０％〜約１５％有する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】（Ａ）ｖ１７５９７（ＤＡＲ４でリンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体）及び（Ｂ）ｖ２１２５２（ＤＡＲ２でリンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体）の非還元及び還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。それぞれを親抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体（ｖ１００００）と比較した。
【図２Ａ】（Ａ）親抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体ｖ１００００の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）トレース、（Ｂ）ｖ１７５９７（リンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体、平均ＤＡＲ３．９２を示す）、及び（Ｃ）ｖ２１２５２（リンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体、平均ＤＡＲ２．０７を示す）を示す図である。精製されたＡＤＣの平均ＤＡＲに対するＤＡＲ０、ＤＡＲ２、ＤＡＲ４、及びＤＡＲ６の種の個々の寄与を（Ｄ）及び（Ｅ）に示す。
【図２Ｂ】（Ａ）親抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体ｖ１００００の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）トレース、（Ｂ）ｖ１７５９７（リンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体、平均ＤＡＲ３．９２を示す）、及び（Ｃ）ｖ２１２５２（リンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体、平均ＤＡＲ２．０７を示す）を示す図である。精製されたＡＤＣの平均ＤＡＲに対するＤＡＲ０、ＤＡＲ２、ＤＡＲ４、及びＤＡＲ６の種の個々の寄与を（Ｄ）及び（Ｅ）に示す。
【図２Ｃ】（Ａ）親抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体ｖ１００００の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）トレース、（Ｂ）ｖ１７５９７（リンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体、平均ＤＡＲ３．９２を示す）、及び（Ｃ）ｖ２１２５２（リンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体、平均ＤＡＲ２．０７を示す）を示す図である。精製されたＡＤＣの平均ＤＡＲに対するＤＡＲ０、ＤＡＲ２、ＤＡＲ４、及びＤＡＲ６の種の個々の寄与を（Ｄ）及び（Ｅ）に示す。
【図２Ｄ】（Ａ）親抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体ｖ１００００の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）トレース、（Ｂ）ｖ１７５９７（リンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体、平均ＤＡＲ３．９２を示す）、及び（Ｃ）ｖ２１２５２（リンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体、平均ＤＡＲ２．０７を示す）を示す図である。精製されたＡＤＣの平均ＤＡＲに対するＤＡＲ０、ＤＡＲ２、ＤＡＲ４、及びＤＡＲ６の種の個々の寄与を（Ｄ）及び（Ｅ）に示す。
【図２Ｅ】（Ａ）親抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体ｖ１００００の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）トレース、（Ｂ）ｖ１７５９７（リンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体、平均ＤＡＲ３．９２を示す）、及び（Ｃ）ｖ２１２５２（リンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体、平均ＤＡＲ２．０７を示す）を示す図である。精製されたＡＤＣの平均ＤＡＲに対するＤＡＲ０、ＤＡＲ２、ＤＡＲ４、及びＤＡＲ６の種の個々の寄与を（Ｄ）及び（Ｅ）に示す。
【図３】（Ａ）親抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体ｖ１００００、（Ｂ）ｖ１７５９７（ＤＡＲ４でリンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体）、及び（Ｃ）ｖ２１２５２（ＤＡＲ２でリンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体）のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）トレースを示す図である。
【図４Ａ】抗原陽性細胞に対するフローサイトメトリー結合アッセイの結果（ｖ１７５９７（ＤＡＲ４でリンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体）ならびに（Ａ）ＪＩＭＴ−１乳癌細胞及び（Ｂ）ＲＴ−１１２膀胱癌細胞に結合したｖ１００００（親バイパラトピック抗ＨＥＲ２抗体）の比較、及び（Ｃ）ｖ２１２５２（ＤＡＲ２でリンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体）及びＪＩＭＴ−１乳癌細胞に結合したｖ１００００（親抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体）の比較）を示す図である。
【図４Ｂ】抗原陽性細胞に対するフローサイトメトリー結合アッセイの結果（ｖ１７５９７（ＤＡＲ４でリンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体）ならびに（Ａ）ＪＩＭＴ−１乳癌細胞及び（Ｂ）ＲＴ−１１２膀胱癌細胞に結合したｖ１００００（親バイパラトピック抗ＨＥＲ２抗体）の比較、及び（Ｃ）ｖ２１２５２（ＤＡＲ２でリンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体）及びＪＩＭＴ−１乳癌細胞に結合したｖ１００００（親抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体）の比較）を示す図である。
【図４Ｃ】抗原陽性細胞に対するフローサイトメトリー結合アッセイの結果（ｖ１７５９７（ＤＡＲ４でリンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体）ならびに（Ａ）ＪＩＭＴ−１乳癌細胞及び（Ｂ）ＲＴ−１１２膀胱癌細胞に結合したｖ１００００（親バイパラトピック抗ＨＥＲ２抗体）の比較、及び（Ｃ）ｖ２１２５２（ＤＡＲ２でリンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体）及びＪＩＭＴ−１乳癌細胞に結合したｖ１００００（親抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体）の比較）を示す図である。
【図５Ａ】ｖ１７５９７（ＤＡＲ４でリンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体）及びｖ２１２５２（ＤＡＲ２でリンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体）によりＨＥＲ２発現乳癌細胞株ＢＴ−４７４（Ａ）、ＳＫ−ＢＲ−３（Ｂ）、ＨＣＣ１９５４（Ｃ）、ＪＩＭＴ−１（Ｄ）及びＺＲ−７５−１（Ｅ）、及びＨＥＲ２陰性細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（Ｆ）を治療した結果を示す図である。
【図５Ｂ】ｖ１７５９７（ＤＡＲ４でリンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体）及びｖ２１２５２（ＤＡＲ２でリンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体）によりＨＥＲ２発現乳癌細胞株ＢＴ−４７４（Ａ）、ＳＫ−ＢＲ−３（Ｂ）、ＨＣＣ１９５４（Ｃ）、ＪＩＭＴ−１（Ｄ）及びＺＲ−７５−１（Ｅ）、及びＨＥＲ２陰性細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８  （Ｆ）を治療した結果を示す図である。
【図５Ｃ】ｖ１７５９７（ＤＡＲ４でリンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体）及びｖ２１２５２（ＤＡＲ２でリンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体）によりＨＥＲ２発現乳癌細胞株ＢＴ−４７４（Ａ）、ＳＫ−ＢＲ−３（Ｂ）、ＨＣＣ１９５４（Ｃ）、ＪＩＭＴ−１（Ｄ）及びＺＲ−７５−１（Ｅ）、及びＨＥＲ２陰性細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（Ｆ）を治療した結果を示す図である。
【図５Ｄ】ｖ１７５９７（ＤＡＲ４でリンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体）及びｖ２１２５２（ＤＡＲ２でリンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体）によりＨＥＲ２発現乳癌細胞株ＢＴ−４７４（Ａ）、ＳＫ−ＢＲ−３（Ｂ）、ＨＣＣ１９５４（Ｃ）、ＪＩＭＴ−１（Ｄ）及びＺＲ−７５−１（Ｅ）、及びＨＥＲ２陰性細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（Ｆ）を治療した結果を示す図である。
【図５Ｅ】ｖ１７５９７（ＤＡＲ４でリンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体）及びｖ２１２５２（ＤＡＲ２でリンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体）によりＨＥＲ２発現乳癌細胞株ＢＴ−４７４（Ａ）、ＳＫ−ＢＲ−３（Ｂ）、ＨＣＣ１９５４（Ｃ）、ＪＩＭＴ−１（Ｄ）及びＺＲ−７５−１（Ｅ）、及びＨＥＲ２陰性細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（Ｆ）を治療した結果を示す図である。
【図５Ｆ】ｖ１７５９７（ＤＡＲ４でリンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体）及びｖ２１２５２（ＤＡＲ２でリンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体）によりＨＥＲ２発現乳癌細胞株ＢＴ−４７４（Ａ）、ＳＫ−ＢＲ−３（Ｂ）、ＨＣＣ１９５４（Ｃ）、ＪＩＭＴ−１（Ｄ）及びＺＲ−７５−１（Ｅ）、及びＨＥＲ２陰性細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（Ｆ）を治療した結果を示す図である。
【図６Ａ】ＨＥＲ２を発現する（Ａ）卵巣癌細胞株ＳＫ−ＯＶ−３、及び（Ｂ）乳癌細胞株ＺＲ−７５−１及び（Ｃ）ＪＩＭＴ−１を様々な平均ＤＡＲでリンカー−毒素００１にコンジュゲートしたｖ１００００を含む抗体−薬物コンジュゲートにより治療した結果を示す図である。０．７、２．２、及び３．９の平均ＤＡＲを有するＡＤＣの平均ＤＡＲに対するＤＡＲ０、ＤＡＲ２、ＤＡＲ４、及びＤＡＲ６の種の個々の寄与を（Ｄ）に示す。
【図６Ｂ】ＨＥＲ２を発現する（Ａ）卵巣癌細胞株ＳＫ−ＯＶ−３、及び（Ｂ）乳癌細胞株ＺＲ−７５−１及び（Ｃ）ＪＩＭＴ−１を様々な平均ＤＡＲでリンカー−毒素００１にコンジュゲートしたｖ１００００を含む抗体−薬物コンジュゲートにより治療した結果を示す図である。０．７、２．２、及び３．９の平均ＤＡＲを有するＡＤＣの平均ＤＡＲに対するＤＡＲ０、ＤＡＲ２、ＤＡＲ４、及びＤＡＲ６の種の個々の寄与を（Ｄ）に示す。
【図６Ｃ】ＨＥＲ２を発現する（Ａ）卵巣癌細胞株ＳＫ−ＯＶ−３、及び（Ｂ）乳癌細胞株ＺＲ−７５−１及び（Ｃ）ＪＩＭＴ−１を様々な平均ＤＡＲでリンカー−毒素００１にコンジュゲートしたｖ１００００を含む抗体−薬物コンジュゲートにより治療した結果を示す図である。０．７、２．２、及び３．９の平均ＤＡＲを有するＡＤＣの平均ＤＡＲに対するＤＡＲ０、ＤＡＲ２、ＤＡＲ４、及びＤＡＲ６の種の個々の寄与を（Ｄ）に示す。
【図６Ｄ】ＨＥＲ２を発現する（Ａ）卵巣癌細胞株ＳＫ−ＯＶ−３、及び（Ｂ）乳癌細胞株ＺＲ−７５−１及び（Ｃ）ＪＩＭＴ−１を様々な平均ＤＡＲでリンカー−毒素００１にコンジュゲートしたｖ１００００を含む抗体−薬物コンジュゲートにより治療した結果を示す図である。０．７、２．２、及び３．９の平均ＤＡＲを有するＡＤＣの平均ＤＡＲに対するＤＡＲ０、ＤＡＲ２、ＤＡＲ４、及びＤＡＲ６の種の個々の寄与を（Ｄ）に示す。
【図７Ａ】ＨＢＣｘ−１３ｂ乳癌患者由来の異種移植マウスを、ｑ１４ｄｘ２にて記載した用量の（Ａ）ｖ１７５９７（ＤＡＲ４でリンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体）及び（Ｂ）ｖ２１２５２（ＤＡＲ２で抗リンカー−毒素００１にコンジュゲートしたＨＥＲ２バイパラトピック抗体）により治療した結果を示す図である。ｖ１５４９６＝ビヒクル。
【図７Ｂ】ＨＢＣｘ−１３ｂ乳癌患者由来の異種移植マウスを、ｑ１４ｄｘ２にて記載した用量の（Ａ）ｖ１７５９７（ＤＡＲ４でリンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体）及び（Ｂ）ｖ２１２５２（ＤＡＲ２で抗リンカー−毒素００１にコンジュゲートしたＨＥＲ２バイパラトピック抗体）により治療した結果を示す図である。ｖ１５４９６＝ビヒクル。
【図８Ａ】ＳＴ−９１０乳癌患者由来の異種移植マウスを、ｑｄｘ１にて、（Ａ）ｖ１７５９７（ＤＡＲ４でリンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体）及び（Ｂ）ｖ２１２５２（ＤＡＲ２で抗ＨＥＲ２リンカー−毒素００１にコンジュゲートしたバイパラトピック抗体）により治療した結果を示す図である。ｖ１５４９６＝ビヒクル。
【図８Ｂ】ＳＴ−９１０乳癌患者由来の異種移植マウスを、ｑｄｘ１にて、（Ａ）ｖ１７５９７（ＤＡＲ４でリンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体）及び（Ｂ）ｖ２１２５２（ＤＡＲ２で抗ＨＥＲ２リンカー−毒素００１にコンジュゲートしたバイパラトピック抗体）により治療した結果を示す図である。ｖ１５４９６＝ビヒクル。
【図９】雌カニクイザル（ｎ＝３）への９ｍｇ／ｋｇまたは１２ｍｇ／ｋｇのｖ２１２５２の単回投与後の（Ａ）平均（±ＳＤ）ｖ２１２５２血清濃度−時間プロファイル、（Ｂ）平均（±ＳＤ）全抗体血清濃度−時間プロファイルを示す図である。
【図１０】カニクイザル（ｎ＝６）に１２ｍｇ／ｋｇまたは９ｍｇ／ｋｇのいずれかでｖ２１２５２を隔週で注入した後、１日目（Ａ）及び２９日目（Ｂ）の平均（±ＳＤ）ｖ２１２５２血清濃度時間プロファイルを示す図である。
【図１１】カニクイザル（ｎ＝６）に１２ｍｇ／ｋｇまたは９ｍｇ／ｋｇのいずれかでｖ２１２５２を隔週で注入した後、１日目（Ａ）及び２９日目（Ｂ）の平均（±ＳＤ）全抗体血清濃度−時間プロファイルを示す図である。
【図１２】ｖ２１２５２及び１２ｍｇ／ｋｇまたは９ｍｇ／ｋｇのいずれかでカニクイザル（ｎ＝６）にｖ２１２５２を隔週で注入した後の全抗体（コンジュゲート及び非コンジュゲート）の両方の平均（±ＳＤ）血清濃度−時間プロファイルを示す図である。
【図１３】（Ａ）ｐＨＡｂコンジュゲートトラスツズマブ−リンカー−毒素００１及び陰性対照と比較した、ｐＨＡｂコンジュゲートｖ２１２５２のＳＫＢＲ３細胞及び（Ｂ）ＪＩＭＴ−１細胞への内在化を示す図である。
【図１４】ｐＨＡｂコンジュゲートトラスツズマブ−リンカー−毒素００１（Ｂ）と比較した、示されている様々な時点でのＳＫＢＲ３細胞へのｐＨＡｂコンジュゲートｖ２１２５２（Ａ）の内在化を示す図である。核は灰色で表示し、ｐＨＡｂは白で表示する。
【図１５】指定用量のｖ２１２５２により治療されたカニクイザル及びマウスでの曝露の比較：（Ａ）高ＨＥＲ２患者由来の腫瘍（ＨＢＣｘ−１３ｂ）を皮下移植されたカニクイザル及びマウスでの曝露、（Ｂ）低ＨＥＲ２患者由来の腫瘍（ＳＴ−９１０）を皮下移植されたカニクイザル及びマウスでの曝露を示す図である。
【図１６】ＬＴＬ−６５４卵巣癌患者由来の異種移植マウスをｑｗｋｘ４にて３ｍｇ／ｋｇのビヒクルまたはｖ２１２５２により治療した結果を示す図である。
【図１７】ビヒクル、対照コンジュゲート（リンカー−毒素００１にコンジュゲートした呼吸器多核体ウイルスに対するヒト化抗体）、ｖ２１２５２、ｖ７１５５（Ｔ−ＤＭ１、ＤＡＲ３．５）及びｖ２４０２９（ＤＡＲ８でエキサテカン誘導体トポイソメラーゼＩ阻害剤（ＤＸｄ）にコンジュゲートしたトラスツズマブ）を毎週静脈内投与した（毎週各６ｍｇ／ｋｇで合計１２回の注射）後の、ＢＴ−４７４乳房腫瘍細胞を頭蓋内移植されたマウスの生存結果を示す図である。
【図１８】ビヒクル、対照コンジュゲート（リンカー−毒素００１にコンジュゲートした呼吸器多核体ウイルスに対するヒト化抗体）、もしくはｖ７１５５（Ｔ−ＤＭ１、ＤＡＲ３．５）を毎週各６ｍｇ／ｋｇで合計１２回の注射、またはｖ２１２５２もしくはｖ２４０２９（ＤＡＲ８でエキサテカン誘導体トポイソメラーゼＩ阻害剤（ＤＸｄ）にコンジュゲートしたトラスツズマブ）を隔週各６ｍｇ／ｋｇで合計６回の注射によるｉ．ｖ．投与後のＢＴ−４７４乳房腫瘍細胞を頭蓋内移植されたマウスの生存結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
詳細な説明
本開示は、薬物がオーリスタチン類似体でありかつ低い平均薬物抗体比（ＤＡＲ）で抗体にコンジュゲートした、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に関する。本明細書に記載の低い平均ＤＡＲ（＜３．９）のＡＤＣでは、同じ毒素（オーリスタチン類似体）用量で投与された場合、ＤＡＲ≧３．９を有する対応するＡＤＣと比較して、忍容性が改善され、毒性が低下した。特に興味深いのは、約２．５以下、例えば約１．８〜２．５の平均ＤＡＲを有するＡＤＣである。
【００２３】
本開示はまた、ＨＥＲ２発現癌の治療において本明細書に記載のＡＤＣを使用する方法に関する。
【００２４】
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００２５】
本明細書で使用される「対象」という用語は、治療、観察または実験の対象である動物、いくつかの実施形態では哺乳動物を指す。動物は、ヒト、非ヒト霊長類、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）または実験室動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、非ヒト霊長類など）であってもよい。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。
【００２６】
本明細書で使用される「哺乳動物」という用語は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ネズミ、ウシ、ウマ及びブタを含むが、これらに限定されない。ある実施形態では、哺乳類はヒトである。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、所与の値からの変動がおよそ＋／−１０％であることを指す。こうした変動は、具体的に言及されているかにかかわらず、本明細書で提供される任意の所与の値に常に含まれることを理解されたい。
【００２８】
添付の特許請求の範囲及び／または明細書中で用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と組み合わせて使用する場合の用語「ａ」または「ａｎ」の使用は、「１つ」を意味し得るが、同時にある実施形態では、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、及び「１つまたは複数の」の意味とも矛盾しない。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語、ならびにそれらの文法的変形は、包括的または制限のないものであり、追加の列挙されていない要素及び／または方法ステップを除外するものではない。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語は、組成物、使用または方法に関連して本明細書で使用される場合、追加の要素及び／または方法ステップが存在し得るが、これらの追加は、列挙された組成物、方法、または使用が機能する方法に実質的な影響を与えることはない。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語は、組成物、使用または方法に関連して本明細書で使用される場合、追加の要素及び／または方法ステップが存在しないものとする。特定の要素及び／またはステップを含むものとして本明細書に記載の組成物、使用及び／または方法はまた、ある実施形態では、本質的にそれらの要素及び／またはステップからなり得、他の実施形態では、これらの実施形態が具体的に参照されているか否かにかかわらず、これらの要素及び／またはステップからなる。
【００３０】
本明細書で論じられるあらゆる実施形態は、本明細書で開示される任意の方法、使用、または組成物に関して実装できることが企図される。
【００３１】
本明細書に開示される実施形態に関連して記載されている特定の機能、構造及び／または特徴は、１つ以上のさらなる実施形態を提供するために、任意の好適な方法で本明細書に開示されている別の実施形態に関連して記載されている機能、構造及び／または特徴と組み合わせてもよい。
【００３２】
また、一実施形態における機能の明確な列挙は、代替的実施形態における特徴を除外するための基礎として機能することも理解されたい。例えば、選択肢のリストが所与の実施形態または請求項に対して提示される場合、こうした代替的実施形態が具体的について言及されるか否かにかかわらず、１つ以上の選択肢がリストから削除され、短縮リストが代替的実施形態を形成し得ることを理解されたい。
【００３３】
抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体−薬物コンジュゲート
本開示の抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、リンカーを介して低い平均薬物抗体比（ＤＡＲ）で毒素にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体を含み、毒素はオーリスタチンベースの毒素（または「オーリスタチン類似体」）である。オーリスタチンベースの毒素の例は、当技術分野で公知である。
【００３４】
特定の実施形態では、オーリスタチン類似体は、一般式（Ｉ）：
2021515793.tif 000009
の化合物であり、
式中、
Ｘは−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｒ２）−であるか、またはＸは存在せず；
Ｒ１は、
2021515793.tif 000010
から選択され、
Ｒ２は、フェニルである。
【００３５】
本明細書で使用される「低いＤＡＲ」は、３．９未満であるが０．５を超える平均ＤＡＲとして定義される。いくつかの実施形態では、ＡＤＣの平均ＤＡＲは３．５未満である。いくつかの実施形態では、ＡＤＣの平均ＤＡＲは、３．４未満、例えば、３．３未満、３．２未満、または３．１未満である。いくつかの実施形態では、ＡＤＣの平均ＤＡＲは３．０以下である。いくつかの実施形態では、ＡＤＣの平均ＤＡＲは、２．９以下、例えば、２．８以下、２．７以下、または２．６以下である。いくつかの実施形態では、ＡＤＣの平均ＤＡＲは、２．５以下、例えば、２．４以下、２．３以下、または２．２以下である。いくつかの実施形態では、ＡＤＣの平均ＤＡＲは約２．０である。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ＡＤＣの平均ＤＡＲは、０．５〜３．８、例えば、０．５〜３．５、または０．５〜２．５である。いくつかの実施形態では、ＡＤＣの平均ＤＡＲは、０．７〜３．８、例えば、０．７〜３．５、０．７〜３．０、または０．７〜２．５である。いくつかの実施形態では、ＡＤＣの平均ＤＡＲは、１．０〜３．８、例えば、１．０〜３．５、１．０〜３．０、または１．０〜２．５である。いくつかの実施形態では、ＡＤＣの平均ＤＡＲは、１．５〜３．８、例えば、１．５〜３．５、１．５〜３．０、または１．５〜２．５である。いくつかの実施形態では、ＡＤＣの平均ＤＡＲは、１．６〜３．８、例えば、１．６〜３．５、１．６〜３．０、または１．６〜２．５である。いくつかの実施形態では、ＡＤＣの平均ＤＡＲは、１．８〜２．８、例えば、１．８〜２．５である。
【００３７】
上記のように、本明細書に記載の低い平均ＤＡＲ（＜３．９）のＡＤＣでは、同じ毒素用量で投与された場合、ＤＡＲ≧３．９を有する対応するＡＤＣと比較して、忍容性が改善され、毒性が低下した。当技術分野で公知であるように、コンジュゲート法の大部分は、様々なＤＡＲの種を含むＡＤＣ組成物をもたらし、報告されているＤＡＲは個々のＤＡＲの種の平均である。特定の理論に限定されるものではないが、低いＤＡＲのＡＤＣの忍容性が高くなり、毒性が低下することについては、ＡＤＣ組成物中の高いＤＡＲ（６以上）の種の減少及び／またはＡＤＣ組成物におけるＤＡＲ０の種の増加の一方または両方が原因であり得る。
【００３８】
ある実施形態では、特定の閾値を超えるＤＡＲ０の種の割合を含むＡＤＣ組成物は、有利であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、低いＤＡＲのＡＤＣ組成物は、ＤＡＲ０の種を５％以上含み得る。いくつかの実施形態では、低いＤＡＲのＡＤＣ組成物は、ＤＡＲ０の種を１０％以上含み得る。いくつかの実施形態では、低いＤＡＲのＡＤＣ組成物は、ＤＡＲ０の種を１５％以上、例えば、ＤＡＲ０の種を２０％以上含み得る。いくつかの実施形態では、低いＤＡＲのＡＤＣ組成物は、ＤＡＲ０の種を約５％〜約５０％含み得る。いくつかの実施形態では、低いＤＡＲのＡＤＣ組成物は、ＤＡＲ０の種を約１０％〜約５０％、例えば、ＤＡＲ０の種を約１０％〜約４０％、ＤＡＲ０の種を約１０％〜約３０％、またはＤＡＲ０の種を約１０％〜約２５％含み得る。いくつかの実施形態では、低いＤＡＲのＡＤＣ組成物は、ＤＡＲ０の種を約１２％〜約２８％、例えば、ＤＡＲ０の種を約１２％〜約２８％、またはＤＡＲ０の種を約１５％〜約２５％含み得る。
【００３９】
特定の実施形態では、特定の閾値を下回る割合のＤＡＲ６以上の種を含むＡＤＣ組成物が有利であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、低いＤＡＲのＡＤＣ組成物は、ＤＡＲ６以上の種を約３５％未満含み得る。いくつかの実施形態では、低いＤＡＲのＡＤＣ組成物は、ＤＡＲ６以上の種を３０％以下含み得る。いくつかの実施形態では、低いＤＡＲのＡＤＣ組成物は、ＤＡＲ６以上の種を２５％以下、例えば、ＤＡＲ６以上の種を２０％以下、１５％以下、または１０％以下含み得る。いくつかの実施形態では、低いＤＡＲのＡＤＣ組成物は、ＤＡＲ６以上の種を９％以下、例えばＤＡＲ６以上の種を８％以下、７％以下、６％以下、または５％以下含み得る。いくつかの実施形態では、低いＤＡＲのＡＤＣ組成物は、ＤＡＲ６以上の種を０％〜約３５％含み得る。いくつかの実施形態では、低いＤＡＲのＡＤＣ組成物は、ＤＡＲ６以上の種を０％〜約３０％、例えば、ＤＡＲ６以上の種を０％〜約２５％、または０％〜約２０％含み得る。いくつかの実施形態では、低いＤＡＲのＡＤＣ組成物は、ＤＡＲ６以上の種を０％〜約１５％、例えば、ＤＡＲ６以上の種を約０％〜約１０％、約０％〜約８％、または０％〜約５％含み得る。
【００４０】
ある実施形態は、低い平均薬物抗体比（ＤＡＲ）でリンカー（Ｌ）を介してオーリスタチン類似体にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体を含むＡＤＣに関し、オーリスタチン類似体−リンカーは、一般式（ＩＩ）
2021515793.tif 000011
を有し、
式中、Ｘ及びＲ１は、一般式（Ｉ）として定義され；
Ｌが、リンカーであり、
2021515793.tif 000012
は、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体へのオーリスタチン類似体−リンカーの付着点を表す。
【００４１】
特定の実施形態は、一般式（ＩＩＩ）：
2021515793.tif 000013
を有するＡＤＣに関し、式中、Ｘ及びＲ１は、一般式（Ｉ）として定義され；
Ｌが、リンカーであり、
ｎは、平均薬物抗体比（ＤＡＲ）であり、３．９未満であり、
Ａｂは、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体である。
【００４２】
抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体
本明細書に記載のＡＤＣは、ＨＥＲ２の２つの異なるエピトープに結合する抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体を含む。
【００４３】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、一般に、免疫グロブリン様機能を有するタンパク質性結合分子を指す。抗体の典型的な例は、免疫グロブリン、ならびに依然として結合特異性を保持しているその誘導体または機能的断片である。抗体を産生するための技法は、当該分野で周知である。「抗体」という用語には、異なるクラスの免疫グロブリン（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥ）及びサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２など）も含み得る。抗体の例示的な例は、全抗体及びその抗原結合断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ドメイン抗体、及びそれらの組み合わせである。ドメイン抗体は、単一ドメイン抗体、単一可変ドメイン抗体または可変ドメインを１つのみ有する免疫グロブリン単一可変ドメインであってもよく、これらは、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインであり得、他の可変領域またはドメインとは関係なく、抗原またはエピトープに特異的に結合する。「抗体」という用語はまた、キメラ抗体、単鎖抗体、及びヒト化抗体などの実施形態を含む。
【００４４】
典型的な全抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続される少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、及びμ（ＩｇＭ）として公知である。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬを含む。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＷ）と称されるより保存された領域が散在している、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分化できる。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＷから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へと、次の順序：ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＣＤＲ２、ＦＷ３、ＣＤＲ３、ＦＷ４で配列される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメイン（パラトープ）を含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（エフェクター細胞など）及び補体系の構成要素であるＣ１ｑなどの宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介できる。
【００４５】
特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＤＣに含めるための抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、それぞれがＨＥＲ２の異なるエピトープに結合する２つの抗原結合ポリペプチド構築物を含む。本明細書で使用される「抗原結合ポリペプチド構築物」は、免疫グロブリンベースの構築物、例えば、抗体断片であってもよく、またはそれは、アンチカリン、ファイノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、アフィマー（ａｆｆｉｍｅｒ）、アルファボディ、ＤＡＲＰｉｎ、またはアビマー（ａｖｉｍｅｒ）などの非免疫グロブリンベースの抗体模倣フォーマットであってもよい。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体に含まれる抗原結合ポリペプチド構築物は、免疫グロブリンベースの構築物であり得る。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体に含まれる抗原結合ポリペプチド構築物は、抗体断片であり得る。
【００４６】
特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体に含まれる抗原結合ポリペプチド構築物はそれぞれ独立して、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂであり得る。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体に含まれる抗原結合ポリペプチド構築物はそれぞれ独立して、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖであり得る。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体に含まれる１つの抗原結合ポリペプチド構築物はＦａｂ断片であり得、また他の抗原結合ポリペプチド構築物は、ｓｃＦｖであり得る。
【００４７】
特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体に含まれる抗原結合ポリペプチド構築物のうちの少なくとも１つは、Ｆａｂ断片またはＦａｂ’断片であり得る。「Ｆａｂ断片」は、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）ならびに軽鎖及び重鎖の可変ドメイン（それぞれＶＬ及びＶＨ）を含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインなど、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端での数個のアミノ酸残基が付加していることがＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ断片はまた、単鎖Ｆａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖がペプチドリンカーによって連結されて単一のペプチド鎖を形成するＦａｂ分子であってもよい。例えば、Ｆａｂ軽鎖のＣ末端は、単鎖Ｆａｂ分子内のＦａｂ重鎖のＮ末端に連結され得る。
【００４８】
特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体に含まれる抗原結合ポリペプチド構築物のうちの少なくとも１つは、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であり得る。「ｓｃＦｖ」は、単一のポリペプチド鎖における抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。任意により、ｓｃＦｖは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、ｓｃＦｖが抗原結合にとって望ましい構造を形成できるようになる。例えば、ｓｃＦｖは、ポリペプチドリンカーによってそのＣ末端からＶＨのＮ末端に接続されたＶＬを含み得る。あるいは、ｓｃＦｖは、そのＣ末端を介してポリペプチド鎖またはリンカーによってＶＬのＮ末端に接続されたＶＨを含み得る（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）のレビューを参照されたい）。
【００４９】
特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体に含まれる抗原結合ポリペプチド構築物のうちの少なくとも１つは、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）フォーマットであり得る。ｓｄＡｂフォーマットは、単一の免疫グロブリンドメインを指す。ｓｄＡｂは、例えば、ラクダ科の起源であり得る。ラクダ科動物の抗体は軽鎖を有さず、その抗原結合部位は、「ＶＨＨ」と呼ばれる単一のドメインで構成されている。ｓｄＡｂは、抗原結合部位を形成する３つのＣＤＲ／超可変ループ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む。ｓｄＡｂはかなり安定しており、例えば抗体のＦｃ鎖との融合物として発現しやすい（例えば、Ｈａｒｍｓｅｎ＆Ｄｅ  Ｈａａｒｄ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７（１）：１３−２２（２００７）を参照されたい）。
【００５０】
抗体フォーマット
本明細書に記載されているＡＤＣに含めるための抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、様々なフォーマットを有し得る。抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の最小成分は、第１のＨＥＲ２エピトープに結合する第１の抗原結合ポリペプチド構築物、および、第２のＨＥＲ２エピトープに結合する第２の抗原結合ポリペプチド構築物であり、第１のＨＥＲ２エピトープと第２のＨＥＲ２エピトープとは異なる。異なるＨＥＲ２エピトープに結合する２つの抗原結合ポリペプチド構築物を含む抗体は、二価のバイパラトピック抗体であると見なされ得る。特定の実施形態は、二価の抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体に関する。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、それらのそれぞれが第１のＨＥＲ２エピトープまたは第２のＨＥＲ２エピトープのいずれかに結合する１つ以上の追加の抗原結合ポリペプチド構築物を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、三価または四価であってもよい。
【００５１】
いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、第１の抗原結合ポリペプチド構築物及び第２の抗原結合ポリペプチド構築物を連結するリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、足場をさらに含み、第１の抗原結合ポリペプチド構築物及び第２の抗原結合ポリペプチド構築物は、足場に作動可能に連結される。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」という用語は、記載されている構成要素が、それらの意図される様態で機能し得る関係にあることを指す。
【００５２】
したがって、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、２つの抗原結合ポリペプチド構築物モジュール、及び任意によりリンカーモジュール及び足場モジュールの一方または両方を含むモジュール式アーキテクチャを有すると考えられ得る。当業者は、これらのモジュールは、異なるフォーマットを有する抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体を提供するために、様々な方法で組み合わせ得ることを理解するであろう。これらのフォーマットは、一般に、当技術分野で公知である抗体フォーマットに基づく（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ＆Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，ＭＡＢＳ，９（２）：１８２−２１２（２０１７）、及びＭｕｌｌｅｒ＆Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ「Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．（２０１４）によるレビューを参照されたい）。
【００５３】
特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、足場に作動可能に連結された２つの抗原結合ポリペプチド構築物を含む。好適な足場は、以下に記載する。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、足場に作動可能に連結された２つの抗原結合ポリペプチド構築物を含み、抗原結合ポリペプチド構築物のうちの少なくとも１つは、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、足場に作動可能に連結された２つの抗原結合ポリペプチド構築物を含み、抗原結合ポリペプチド構築物のうちの少なくとも１つは、Ｆａｂである。
【００５４】
いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、３つまたは４つの抗原結合ポリペプチド構築物及び足場を含み得る。このフォーマットでは、少なくとも第１の抗原結合構築物及び第２の抗原結合構築物は、足場に作動可能に連結されている。第３及び任意の第４の抗原結合ポリペプチド構築物はそれぞれ独立して、足場または第１の抗原結合ポリペプチド構築物または第２の抗原結合ポリペプチド構築物に作動可能に連結され得る。
【００５５】
足場を有さない抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、典型的には、１つ以上のリンカーによって作動可能に連結された２つの抗原結合ポリペプチド構築物を含む。抗原結合ポリペプチド構築物は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｄＡｂ、またはそれらの組み合わせの形態であり得る。例えば、抗原結合ポリペプチド構築物としてｓｃＦｖを使用して、タンデムｓｃＦｖ（（ｓｃＦｖ）２またはｔａＦｖ）などのフォーマットが構築され得、ｓｃＦｖは、可撓性リンカーによって一緒に接続される。ｓｃＦｖは、短いリンカー（通常は、約５アミノ酸長）によって接続された２つのｓｃＦｖを含むダイアボディフォーマットを構築するためにも使用され得る。リンカーの長さが制限されているため、頭部から尾部への様態でｓｃＦｖが二量体化する。前述のいずれのフォーマットであっても、ドメイン間ジスルフィド結合を含めることにより、ｓｃＦｖがさらに安定化され得る。例えば、ジスルフィド結合は、各鎖に追加のシステイン残基を導入することにより、ＶＬとＶＨとの間に導入され得る（例えば、ＶＨにおいて４４位、ＶＬにおいて１００位）（例えば、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１０：１２２１−１２２５（１９９７）を参照されたい）か、またはジスルフィド結合は、２つのＶＨの間に導入して、ＤＡＲＴフォーマットを有する構造を提供し得る（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３９９：４３６−４４９（２０１０）を参照されたい）。
【００５６】
同様に、いくつかの実施形態では、好適なリンカーを介して一緒に接続された、ＶＨまたはＶＨＨなどの２つのｓｄＡｂを含むフォーマットを使用してもよい。
【００５７】
足場を含まない抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体フォーマットの他の例としては、Ｆａｂ断片がリンカーまたはＩｇＧヒンジ領域を介して接続されているＦａｂ断片、例えばＦａｂ２及びＦ（ａｂ’）２フォーマットに基づくものが挙げられる。
【００５８】
異なる形態の抗原結合ポリペプチド構築物の組み合わせを使用して、代替の足場を含まないフォーマットを生成してもよい。例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂは、Ｆａｂ断片の軽鎖及び重鎖の一方または両方のＣ末端に融合されて、二価（Ｆａｂ−ｓｃＦｖ／ｓｄＡｂ）を構築してもよい。
【００５９】
特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、２つの抗原結合ポリペプチド構築物及び１つ以上のリンカーを含んでもよく、足場は含まない。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｄＡｂ、またはそれらの組み合わせである２つの抗原結合ポリペプチド構築物、及び１つ以上のリンカーを含み、足場を含まない。
【００６０】
足場
足場を含む抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、２つの抗原結合ポリペプチド構築物を好適な足場に連結することにより構築され得る。抗原結合ポリペプチド構築物は、上記の形態の１つまたは組み合わせであり得る（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、及び／またはｓｄＡｂ）。好適な足場の例は、以下でより詳細に記載しており、これらに限定されないが、免疫グロブリンＦｃ領域、アルブミン、アルブミン類似体及び誘導体、ヘテロ二量化ペプチド（ロイシンジッパー、Ｊｕｎ及びＦｏｓ由来のヘテロ二量体形成「ジッパー」ペプチド、ＩｇＧ  ＣＨ１及びＣＬドメインまたはバルナーゼ−バルスター（ｂａｒｎａｓｅ−ｂａｒｓｔａｒ）毒素）、サイトカイン、ケモカインまたは成長因子などが挙げられる。他の例としては、ＩＢＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．及びＩｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．によって開発されたＤＯＣＫ−ＡＮＤ−ＬＯＣＫ（登録商標）（ＤＮＬ（商標））技術に基づく抗体が挙げられる（例えば、Ｃｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １３：５５８６ｓ−５５９１ｓ（２００７）を参照されたい）。
【００６１】
いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、２つ以上の抗原結合ポリペプチド構築物及び足場を含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、足場に作動可能に連結された２つの抗原結合ポリペプチド構築物を含む。
【００６２】
足場は、ペプチド、ポリペプチド、ポリマー、ナノ粒子または他の化学エンティティであってよい。足場がポリペプチドである場合、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の各抗原結合ポリペプチド構築物は、ポリペプチド足場のＮ末端またはＣ末端のいずれかに連結され得る。抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つ以上が、例えば、リンカーの有無にかかわらず、アミノ酸の側鎖を介して、ＮまたはＣ末端以外の領域に連結されているポリペプチド足場を含む抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体もまた、特定の実施形態において企図される。
【００６３】
足場がペプチドまたはポリペプチドである実施形態では、抗原結合ポリペプチド構築物は、遺伝子融合または化学的コンジュゲートによって足場に連結されてもよい。典型的には、足場がペプチドまたはポリペプチドである場合、抗原結合ポリペプチド構築物は、遺伝子融合によって足場に連結される。足場がポリマーまたはナノ粒子であるいくつかの実施形態では、抗原結合ポリペプチド構築物は、化学的コンジュゲートによって足場に連結されてもよい。
【００６４】
２つの異なるポリペプチドの選択的対を含む複数のタンパク質ドメインが当技術分野では公知であり、足場を形成するために使用され得る。一例は、Ｆｏｓ及びＪｕｎなどのロイシンジッパードメインであり、選択的にペアになっている（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４８：１５４７−５３（１９９２）；Ｗｒａｎｉｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８７：４３３３１−４３３３９（２０１２））。他の選択的にペアリングする分子ペアとしては、例えば、バルナーゼバースターペア（Ｄｅｙｅｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２１：１４８６−１４９２（２００３））、ＤＮＡ鎖ペア（Ｃｈａｕｄｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４５０（１−２）：２３−２６（１９９９））及びスプリット蛍光タンパク質ペア（国際特許出願公開第ＷＯ２０１１／１３５０４０号）が挙げられる。
【００６５】
タンパク質足場の他の例としては、免疫グロブリンＦｃ領域、アルブミン、アルブミン類似体及び誘導体、毒素、サイトカイン、ケモカイン及び成長因子が挙げられる。抗原結合部分と組み合わせたタンパク質足場の使用が記載されている（例えば、Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２８２：１２６５０−１２６６０（２００７）；ＭｃＤｏｎａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ，１１：５８２−５９３（２０１２）；Ｖａｌｌｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１１：３８７９−３８８８（２００５）；Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，４５：１４７−１５４（２００６）、及び米国特許出願公開第２００９／０２８５８１６号を参照されたい）。
【００６６】
例えば、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、または一本鎖ダイアボディなどの抗原結合部分をアルブミンに融合させると、抗原結合部分の血清半減期が改善されることが示されている（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，同書）。抗原結合部分は、任意でリンカーを介して、アルブミンのＮ末端及び／またはＣ末端に融合されてもよい。
【００６７】
トランスポーターポリペプチドが自己集合して準ネイティブアルブミンを形成するように、アルブミンタンパク質をセグメント化することによって得た２つのトランスポーターポリペプチドを含むヘテロマルチマーの形態のアルブミンの誘導体について記載されている（国際特許出願公開ＷＯ２０１２／１１６４５３及びＷＯ２０１４／０１２０８２を参照されたい）。アルブミンのセグメント化の結果として、ヘテロ多量体は４つの末端を含み、したがって、任意でリンカーを介して、最大４つの異なる抗原結合部分に融合され得る。
【００６８】
特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、タンパク質足場を含み得る。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、免疫グロブリンＦｃ領域、アルブミンまたはアルブミン類似体または誘導体に基づくタンパク質足場を含み得る。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、免疫グロブリンＦｃ領域、例えば、ＩｇＧ  Ｆｃ領域に基づくタンパク質足場を含み得る。
【００６９】
いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはアルブミン類似体もしくは誘導体に基づくタンパク質足場を含み得る。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、国際特許出願公開ＷＯ２０１２／１１６４５３またはＷＯ２０１４／０１２０８２に記載されているアルブミン誘導体に基づくタンパク質足場を含み得る。
【００７０】
Ｆｃ領域
本明細書で使用する場合、「Ｆｃ領域」、「Ｆｃ」または「Ｆｃドメイン」という用語は、定常領域の少なくとも一部分を含む、免役グロブリン重鎖のＣ末端領域を指す。この用語には、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域が含まれる。本明細書において別段明記されない限り、Ｆｃ領域または定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載されている、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵナンバリングシステムに従う。
【００７１】
特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、免疫グロブリンＦｃ領域に基づく足場を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は二量体であり得、２つのＦｃポリペプチドから構成され得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、単一のポリペプチドから構成されてもよい。
【００７２】
二量体Ｆｃの「Ｆｃポリペプチド」は、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドのうちの１つ、すなわち、安定した自己会合が可能な免疫グロブリン重鎖の１つ以上のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。「第１のＦｃポリペプチド」及び「第２のＦｃポリペプチド」という用語は、Ｆｃ領域が１つの第１のＦｃポリペプチド及び１つの第２のＦｃポリペプチドを含むという条件で同義的に使用され得る。
【００７３】
Ｆｃ領域は、ＣＨ３ドメインまたはＣＨ３ドメイン及びＣＨ２ドメインの両方を含む。例えば、二量体ＩｇＧ  Ｆｃ領域のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ  ＣＨ２及びＩｇＧ  ＣＨ３定常ドメイン配列を含む。ＣＨ３ドメインは、２つのＣＨ３配列を含み、１つは、二量体Ｆｃ領域の２つのＦｃポリペプチドのそれぞれに由来する。ＣＨ２ドメインは、２つのＣＨ２配列を含み、１つは、二量体Ｆｃ領域の２つのＦｃポリペプチドのそれぞれに由来する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、ＩｇＧ  Ｆｃ領域に基づく足場を含み得る。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、ヒトＦｃ領域に基づく足場を含み得る。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域、例えば、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域に基づく足場を含み得る。
【００７５】
特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、それぞれがＣＨ３配列、及び任意によりＣＨ２配列を含む第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドを含む、ヘテロ二量体Ｆｃ領域であるＩｇＧ  Ｆｃ領域に基づく足場を含み得る。
【００７６】
いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、第１及び第２のＦｃポリペプチドを含むＦｃ領域に基づく足場を含み得、第１の抗原結合ポリペプチド構築物は、第１のＦｃポリペプチドに作動可能に連結され、第２の抗原結合ポリペプチド構築物は、第２のＦｃポリペプチドに作動可能に連結されている。
【００７７】
いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、第１及び第２のＦｃポリペプチドを含むＦｃ領域に基づく足場を含み得、第１の抗原結合ポリペプチド構築物は、第１のＦｃポリペプチドに作動可能に連結され、第２の抗原結合ポリペプチド構築物は、第２のＦｃポリペプチドに作動可能に連結され、第１及び第２の抗原結合ポリペプチド構築物は独立して、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖである。
【００７８】
いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、２つのＣＨ３配列を含み、そのうちの少なくとも１つが１つ以上のアミノ酸修飾を含む、Ｆｃ領域に基づく足場を含み得る。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、２つのＣＨ３配列及び２つのＣＨ２配列を含むＦｃ領域に基づく足場を含み得、ＣＨ２配列のうちの少なくとも１つは、１つ以上のアミノ酸修飾を含む。
【００７９】
いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、修飾されたＣＨ３ドメインを含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を含み、修飾されたＣＨ３ドメインは、非対称的に修飾されたＣＨ３ドメインである。一般に、ヘテロ二量体Ｆｃの第１のＦｃポリペプチドは第１のＣＨ３配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは第２のＣＨ３配列を含む。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「非対称アミノ酸修飾」とは、第１のＣＨ３配列上の特定の位置のアミノ酸が同じ位置の第２のＣＨ３配列上のアミノ酸とは異なる修飾を指す。非対称アミノ酸修飾を含むＣＨ３配列の場合、第１及び第２のＣＨ３配列は、典型的に好ましくは、ホモ二量体というよりも、ヘテロ二量体を形成するために対になる。これらの非対称アミノ酸修飾は、各配列の同じそれぞれのアミノ酸位置にある２つのアミノ酸のうちの１つのみが修飾されているか、または第１の及び第２のＣＨ３配列のそれぞれの同じそれぞれの位置にある各配列の両方のアミノ酸の修飾が異なっている結果となり得る。ヘテロ二量体Ｆｃの第１及び第２のＣＨ３配列のそれぞれは、１つ以上の非対称アミノ酸修飾を含み得る。
【００８１】
いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、国際特許出願公開ＷＯ２０１２／０５８７６８またはＷＯ２０１３／０６３７０２に記載されているように、修飾Ｆｃ領域に基づく足場を含み得る。
【００８２】
表１には、全長ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸２３１から４４７に対応する、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ配列のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を提供する。ＣＨ３配列は、全長ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸３４１〜４４７を含む。
【００８３】
特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、ホモ二量体Ｆｃではなく、ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進する非対称アミノ酸修飾を含む修飾ＣＨ３ドメインを含むヘテロ二量体Ｆｃ足場を含み得る。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、以下の位置：Ｌ３５１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｔ３６６、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｔ３５０、Ｓ４００及び／またはＮ３９０（ＥＵナンバリングを使用）のうちの１つ以上に修飾を含むヘテロ二量体Ｆｃ足場を含み得る。
【００８４】
特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、Ｆ４０５位及びＹ４０７位のアミノ酸修飾を含みかつ任意でＬ３５１位のアミノ酸修飾をさらに含む第１のポリペプチド配列と、Ｔ３６６位及びＴ３９４位のアミノ酸修飾を含みかつ任意でＫ３９２位のアミノ酸修飾をさらに含む第２のポリペプチド配列とを有する修飾ＣＨ３ドメインを含むヘテロ二量体Ｆｃを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＣＨ３ドメインの第１のポリペプチド配列は、Ｆ４０５位及びＹ４０７位のアミノ酸修飾を含みかつ任意でＬ３５１位のアミノ酸修飾をさらに含み得、修飾ＣＨ３ドメインの第２のポリペプチド配列は、Ｔ３６６位及びＴ３９４位のアミノ酸修飾を含みかつ任意でＫ３９２位のアミノ酸修飾をさらに含み、Ｆ４０５位のアミノ酸修飾は、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５ＴまたはＦ４０５Ｖであり、Ｙ４０７位のアミノ酸修飾は、Ｙ４０７ＩまたはＹ４０７Ｖであり、Ｔ３６６位のアミノ酸修飾はＴ３６６Ｉ、Ｔ３６６ＬまたはＴ３６６Ｍであり、Ｔ３９４位のアミノ酸修飾はＴ３９４Ｗであり、Ｌ３５１位のアミノ酸修飾はＬ３５１Ｙであり、Ｋ３９２位のアミノ酸修飾はＫ３９２Ｆ、Ｋ３９２ＬまたはＫ３９２Ｍである。いくつかの実施形態では、Ｆ４０５位でのアミノ酸修飾は、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５ＴまたはＦ４０５Ｖである。
【００８５】
いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、Ｆ４０５位及びＹ４０７位のアミノ酸修飾を含みかつ任意でＬ３５１位のアミノ酸修飾をさらに含む第１のＦｃポリペプチド配列と、Ｔ３６６位及びＴ３９４位のアミノ酸修飾を含みかつ任意でＫ３９２位のアミノ酸修飾をさらに含む第２のＦｃポリペプチド配列とを有する修飾ＣＨ３ドメインを含むヘテロ二量体Ｆｃを含み得、Ｆ４０５位のアミノ酸修飾は、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５ＴまたはＦ４０５Ｖであり、Ｙ４０７位のアミノ酸修飾は、Ｙ４０７ＩまたはＹ４０７Ｖであり、Ｔ３６６位のアミノ酸修飾は、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６ＬまたはＴ３６６Ｍであり、Ｔ３９４位のアミノ酸修飾は、Ｔ３９４Ｗであり、Ｌ３５１位のアミノ酸修飾は、Ｌ３５１Ｙであり、Ｋ３９２位のアミノ酸修飾は、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２ＬまたはＫ３９２Ｍであり、第１及び第２のＦｃポリペプチド配列の一方または両方は、アミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖをさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｆ４０５位でのアミノ酸修飾は、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５ＴまたはＦ４０５Ｖである。
【００８６】
特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、上記のとおり、修飾ＣＨ３ドメインを含むヘテロ二量体Ｆｃを含み得る。第１のＦｃポリペプチド配列は、Ｆ４０５位及びＹ４０７位のアミノ酸修飾を含みかつ任意でＬ３５１位のアミノ酸修飾をさらに含み、第２のＦｃポリペプチド配列は、Ｔ３６６位及びＴ３９４位のアミノ酸修飾を含みかつ任意でＫ３９２位のアミノ酸修飾をさらに含み、第１のＦｃポリペプチド配列は、Ｓ４００位またはＱ３４７位の一方または両方にアミノ酸修飾をさらに含み、及び／または第２のＦｃポリペプチド配列は、Ｋ３６０位またはＮ３９０位の一方または両方にアミノ酸修飾をさらに含み、Ｓ４００位のアミノ酸修飾は、Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００ＲまたはＳ４００Ｋであり、Ｑ３４７位のアミノ酸修飾は、Ｑ３４７Ｒ、Ｑ３４７ＥまたはＱ３４７Ｋであり、Ｋ３６０位のアミノ酸修飾は、Ｋ３６０ＤまたはＫ３６０Ｅであり、Ｎ３９０位のアミノ酸修飾は、Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０ＫまたはＮ３９０Ｄである。いくつかの実施形態では、Ｆ４０５位でのアミノ酸修飾は、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５ＴまたはＦ４０５Ｖである。
【００８７】
いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、表１に示すとおり、バリアント１、バリアント２、バリアント３、バリアント４またはバリアント５のうちのいずれか１つの修飾を含む修飾ＣＨ３ドメインを有するヘテロ二量体Ｆｃ足場を含み得る。
【００８８】
（表１）ＩｇＧ１  Ｆｃ配列
2021515793.tif 000014
【００８９】
特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、
Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖから選択される１つ以上のアミノ酸修飾を含む第１のＣＨ３配列と、
アミノ酸修飾Ｔ３６６ＬまたはＴ３６６Ｉ；Ｋ３９２ＬまたはＫ３９２Ｍ、及びＴ３９４Ｗを含む第２のＣＨ３配列と
を有する修飾ＣＨ３ドメインを有するヘテロ二量体Ｆｃ足場を含み得、第１及び第２のＣＨ３配列の一方または両方は任意でアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖをさらに含み得る、
【００９０】
特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、ヘテロ二量体ＣＨ３ドメインが野生型ホモ二量体ＣＨ３ドメインに匹敵する安定性を有するヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進する、上記の非対称アミノ酸修飾を含む修飾ＣＨ３ドメインを有するヘテロ二量体Ｆｃ足場を含み得る。ＣＨ３ドメインの安定性は、例えば示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により、ＣＨ３ドメインの融解温度（Ｔｍ）を測定することにより評価され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の非対称アミノ酸修飾は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインの形成を促進し、ここでは、ＣＨ３ドメインは、対応する対称的な野生型ホモ二量体のＣＨ３ドメインについて観察される、約８℃、例えば、約７℃、約６℃、約５℃、または約４℃の範囲内である示差走査熱量測定試験における融解温度（Ｔｍ）を介して観察されるとおり、安定性を有する。
【００９１】
修飾ＣＨ３配列を含むヘテロ二量体Ｆｃは、発現産物中のホモ二量体Ｆｃと比較して、少なくとも約７５％の純度で形成され得る。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９５％超または約９７％超の純度を有するヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進する非対称アミノ酸修飾を含む修飾ＣＨ３ドメインを有するヘテロ二量体Ｆｃ足場を含み得る。
【００９２】
ヘテロ二量体Ｆｃ形成を促進するために単量体Ｆｃポリペプチドを修飾するための追加の方法は当技術分野で公知であり、例えば、国際特許出願公開ＷＯ９６／０２７０１１（ｋｎｏｂｓ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅｓ）；Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２８５，１９６３７−４６（２０１０）（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｄｅｓｉｇｎ  ｔｏ  ａｃｈｉｅｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ，２３（４）：１９５−２０２（２０１０）（ｓｔｒａｎｄ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｏｍａｉｎ（ＳＥＥＤ）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、及びＬａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１１０（１３）：５１４５−５０（２０１３）（Ｆａｂ−ａｒｍ  ｅｘｃｈａｎｇｅ）に記載されているものが挙げられる。
【００９３】
抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体がヘテロ二量体Ｆｃ足場を含むいくつかの実施形態では、ヘテロ二量体ＦｃもＣＨ２ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメインは、修飾ＣＨ２ドメインである。ＦｃのＣＨ２ドメインの一例は、表１に示される配列のアミノ酸２３１〜３４０である。いくつかのエフェクター機能は、抗体のＦｃに結合するＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって媒介される。
【００９４】
Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）としては、これらの受容体の対立遺伝子バリアント及び選択的スプライシングされた形態など、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体が挙げられる。ＦｃＲという用語はまた、特定の実施形態では、新生児受容体、ＦｃＲｎを含み得る。
【００９５】
ＣＨ２ドメインでの修飾は、ＦｃＲのＦｃへの結合に影響を与え得る。異なるＦｃγ受容体に対するＦｃの親和性を選択的に変更する場合には、Ｆｃ領域における複数のアミノ酸修飾が当該技術分野では公知である。抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体が修飾ＣＨ２ドメインを有するヘテロ二量体Ｆｃ足場を含むいくつかの実施形態では、修飾ＣＨ２ドメインは、Ｆｃγ受容体の選択的結合を促進するための１つ以上の修飾を含み得る。
【００９６】
ＦｃＲによるＦｃの結合を変化させる修飾の非限定的な例としては、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ及びＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ／Ｋ３２６Ａ（Ｌｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６５（１−２）：１３２−４１（２０１１））；Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ及びＦ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｌ２３５Ｖ／Ｐ３９６Ｌ（Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，６７（１８）：８８８２−９０（２００７）及びＮｏｒｄｓｔｒｏｍ  ＪＬ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１３（６）：Ｒ１２３（２０１１））；Ｆ２４３Ｌ（Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．２４（９）：６７１−８（２０１１））；Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ（Ｓｈｉｅｌｄｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７６（９）：６５９１−６０４（２００１））；Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ及びＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（Ｌａｚａｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１０３（１１）：４００５−１０（２００６））；Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２６７Ｅ及びＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ（Ｃｈｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，４５（１５）：３９２６−３３（２００８））が挙げられる。ＦｃＲによるＦｃ結合に影響を与える追加の修飾については、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｔｒｏｈｌ＆Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗｏｏｄｈｅａｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｎｏ  １１，ＩＳＢＮ  １  ９０７５６８  ３７  ９，Ｏｃｔ  ２０１２，ｐａｇｅ  ２８３）に記載されている。ＦｃＲによる結合に影響を与える非対称修飾を含むＦｃ領域は、国際特許公開ＷＯ２０１４／１９０４４１に記載されている。
【００９７】
エフェクター機能を媒介する能力を改善するために、Ｆｃ領域に追加の修飾を行ってもよい。こうした修飾は、当該技術分野で公知であり、非フコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、または活性化受容体、主にＡＤＣＣのためのＦｃγＲＩＩＩａに対する、及びＣＤＣのためのＣ１ｑに対するＦｃの親和性を操作することが挙げられる。特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、エフェクター機能を媒介するその能力を改善するように修飾されたＦｃ領域を含み得る。
【００９８】
アミノ酸配列を変えることなく、Ｆｃグリコシル化部位（Ａｓｎ２９７、ＥＵナンバリング）にフコースをほとんどまたはまったく含まない抗体を作製する方法は、当技術分野で周知である。例えば、ＧｌｙｍａＸ（登録商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ  ＡＧ）（ｖｏｎ  Ｈｏｒｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０（１２）：１６０７−１８（２０１０）及び米国特許第８，４０９，５７２号を参照のこと）。特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、グリコシル化されていないＦｃ領域を含み得る。この文脈において、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、完全にフコシル化されていない（すなわち、検出可能なフコースを含まない）か、または部分的に非フコシル化され得、その結果、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、哺乳動物発現系によって産生された類似の構築物について通常検出されるフコースの量の９５％未満、８５％未満、７５％未満、６５％未満、５５％未満、４５％未満、３５％未満、２５％未満、１５％未満または５％未満、またはそれらの間の任意の量を含む。
【００９９】
ＦｃγＲを減少させるＦｃ修飾及び／または補体結合及び／またはエフェクター機能は、当技術分野で公知であり、上記のものを含む。様々な刊行物において、エフェクター活性が減少されたかまたは抑制された抗体を操作するために使用されてきた戦略について記載されている（例えば、Ｓｔｒｏｈｌ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２０：６８５−６９１（２００９）及びＳｔｒｏｈｌ＆Ｓｔｒｏｈｌ「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｍａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ」Ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：Ｗｏｏｄｈｅａｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０１２），ｐｐ２２５−２４９を参照のこと）。これらの戦略には、グリコシル化修飾によるエフェクター機能の低下、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４足場の使用、またはＦｃのヒンジまたはＣＨ２領域への変異の導入（また、米国特許公開第２０１１／０２１２０８７号、国際特許公開ＷＯ２００６／１０５３３８、米国特許公開第２０１２／０２２５０５８号、米国特許公開第２０１２／０２５１５３１号及び、Ｓｔｒｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２０：２０４−２１９（２０１２）を参照のこと）。
【０１００】
ＦｃγＲまたはＦｃへの相補的結合を減少させるための既知のアミノ酸修飾の特定の非限定的な例としては、表２において特定されたものが挙げられる。
【０１０１】
（表２）ＦｃγＲまたはＦｃへの相補的結合を減少させるための修飾
2021515793.tif 000015
【０１０２】
いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、表２で特定される１つ以上の変異を有する修飾ＣＨ２ドメインを含むＦｃ領域を含み得る。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、Ｌ２３４位、Ｌ２３５位及び／またはＤ２６５位のアミノ酸修飾を有する修飾ＣＨ２ドメインを含むＦｃ領域を含み得る。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、アミノ酸修飾Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＤ２６５Ｓを有する修飾ＣＨ２ドメインを含むＦｃ領域を含み得る。
【０１０３】
ＨＥＲ２エピトープ
抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体に含まれる２つの抗原結合ポリペプチド構築物は、それぞれＨＥＲ２の異なるエピトープに結合する。すなわち、第１の抗原結合ポリペプチド構築物は第１のＨＥＲ２エピトープに結合し、第２の抗原結合ポリペプチド構築物は第２のＨＥＲ２エピトープに結合する。本開示の文脈において、抗原結合ポリペプチド構築物の各々は、その標的エピトープに特異的に結合する。
【０１０４】
「特異的に結合する」または「特異的結合」は、結合が抗原に対して選択的であり、望ましくない相互作用または非特異的相互作用から区別できることを意味する。特定のエピトープに結合する抗原結合ポリペプチド構築物の能力は、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ装置で分析）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｌｙｃｏ  Ｊ  １７，３２３−３２９（２０００））または従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｓ  ２８，２１７−２２９（２００２））で測定できる。いくつかの実施形態では、抗原結合ポリペプチド構築物の非関連タンパク質への結合の程度が、例えば、ＳＰＲによって測定されたとき、抗原結合ポリペプチド構築物のその標的エピトープへの結合の約１０％未満である場合、抗原結合ポリペプチド構築物は、その標的エピトープに特異的に結合していると見なされる。
【０１０５】
「ＨＥＲ２」（ＥｒｂＢ２としても公知である）は、例えば、Ｓｅｍｂａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），８２：６４９７−６５０１（１９８５）及びＹａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１９：２３０−２３４（１９８６）（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０３３６３）記載されているヒトＨＥＲ２タンパク質を指す。「ｅｒｂＢ２」及び「ｎｅｕ」という用語は、ヒトＨＥＲ２タンパク質をコードする遺伝子を指す。ｐ１８５またはｐ１８５ｎｅｕという用語は、ｎｅｕ遺伝子のタンパク質産物を指すためにも使用され得る。
【０１０６】
ＨＥＲ２は、典型的には、ＨＥＲリガンドと結合する細胞外ドメイン、親油性膜貫通ドメイン、保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン、及びリン酸化され得る複数のチロシン残基を有するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを含む。ＨＥＲ２の細胞外（エクト）ドメインは、ドメインＩ〜ＩＶの４つのドメインで構成されている。ＨＥＲ２の配列を表３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）に提供する。細胞外ドメイン（ＥＣＤ）境界は次のとおりである：ドメインＩ−アミノ酸約１〜１６５；ドメインＩＩ−アミノ酸約１６６〜３２２；ドメインＩＩＩ−アミノ酸約３２３〜４８８、ドメインＩＶ−アミノ酸約４８９〜６０７。
【０１０７】
（表３）ヒトＨＥＲ２のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
2021515793.tif 000016
【０１０８】
「エピトープ２Ｃ４」は、抗体２Ｃ４が結合するＨＥＲ２の細胞外ドメイン内の領域であり、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ２とも呼ばれる）のドメインＩＩからの残基を含む。２Ｃ４及びペルツズマブは、ドメインＩ、ＩＩ及びＩＩＩの結合部でＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合する（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：３１７−３２８（２００４））。
【０１０９】
「エピトープ４Ｄ５」は、抗体４Ｄ５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０４６３）及びトラスツズマブが結合するＨＥＲ２の細胞外ドメイン内の領域である。このエピトープは、ＨＥＲ２の膜貫通ドメインに近くにあり、ＨＥＲ２のドメインＩＶ内にある（ＥＣＤ４とも呼ばれる）。
【０１１０】
一般に、本開示の抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン内のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の第１及び第２の抗原結合ポリペプチド構築物によって結合される第１及び第２のＨＥＲ２エピトープは、重複しないエピトープである。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の第１及び第２の抗原結合ポリペプチド構築物によって結合される第１及び第２のＨＥＲ２エピトープは、ＨＥＲ２の異なる細胞外ドメイン上にある。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の第１の抗原結合ポリペプチド構築物は、ＨＥＲ２の第１のドメイン上の第１のＨＥＲ２エピトープに結合し、第２の抗原結合ポリペプチド構築物は、ＨＥＲ２の第２のドメイン上の第２のＨＥＲ２エピトープに結合する。いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２の第１のドメインはＥＣＤ２であり、ＨＥＲ２の第２のドメインはＥＣＤ４である。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体に含まれる抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、ＨＥＲ２への結合についてトラスツズマブと競合する。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体に含まれる抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、ＨＥＲ２への結合についてペルツズマブと競合する。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体に含まれる抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、ＨＥＲ２への結合についてトラスツズマブと競合し、他の抗原結合ポリペプチド構築物は、ＨＥＲ２への結合についてペルツズマブと競合する。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体に含まれる抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、ＦａｂまたはｓｃＦｖフォーマットであり、ＨＥＲ２への結合についてトラスツズマブと競合し、他の抗原結合ポリペプチド構築物は、ＦａｂまたはｓｃＦｖフォーマットであり、ＨＥＲ２への結合についてペルツズマブと競合する。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体に含まれる抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、Ｆａｂフォーマットであり、ＨＥＲ２への結合についてトラスツズマブと競合し、他の抗原結合ポリペプチド構築物は、ｓｃＦｖフォーマットであり、ＨＥＲ２への結合についてペルツズマブと競合する。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体に含まれる抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、トラスツズマブと同じＨＥＲ２上のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体に含まれる抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、ペルツズマブと同じＨＥＲ２上のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体に含まれる抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、トラスツズマブと同じＨＥＲ２上のエピトープに結合し、他の抗原結合ポリペプチド構築物は、ペルツズマブと同じＨＥＲ２上のエピトープに結合する。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体に含まれる抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、ＨＥＲ２結合を増加させることが知られている１つ以上の変異を含むトラスツズマブまたはそのバリアントのＣＤＲ配列を含み、他の抗原結合ポリペプチド構築物は、ＨＥＲ２結合を増加させることが知られている１つ以上の変異を含むペルツズマブまたはそのバリアントのＣＤＲを含む。トラスツズマブまたはペルツズマブによるＨＥＲ２結合を増強することが公知である文献での変異としては、以下の表４及び５に列挙されているものが挙げられる（ＨＣ＝重鎖；ＬＣ＝軽鎖）。これらの変異の組み合わせも企図される。
【０１１５】
（表４）ＨＥＲ２への結合を増加させるトラスツズマブ変異
2021515793.tif 000017
【０１１６】
（表５）ＨＥＲ２への結合を増加させるペルツズマブ変異
2021515793.tif 000018
【０１１７】
様々な抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体が当技術分野で公知であり、本明細書に記載されているＡＤＣに含めるために、好適である候補抗体であり得る。例としては、米国特許出願公開第２０１４／０１７０１４８号；同第２０１５／０２８４４６３号；同第２０１６／０２８９３３５号；同第２０１７／００２９５２９号；同第２０１７／０２９１９５５号、及び同第２０１８／００２２８２０号、及び国際特許出願公開ＷＯ２０１６／１７９７０７に記載されている抗体が挙げられる。
【０１１８】
特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、米国特許出願公開第２０１６／０２８９３３５号に記載されているバイパラトピック抗体のうちの１つである。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、ｖ５０１９、ｖ５０２０、ｖ７０９１、ｖ１００００、ｖ６９０２、ｖ６９０３またはｖ６７１７のうちの１つである（表６、６Ａ及び６Ｂ、ならびに配列一覧表を参照のこと）。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、ｖ５０１９、ｖ５０２０、ｖ７０９１、ｖ１００００、ｖ６９０２、ｖ６９０３またはｖ６７１７のうちの１つのＥＣＤ２結合アームからのＶＨ配列及びＶＬ配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、ｖ５０１９、ｖ５０２０、ｖ７０９１、ｖ１００００、ｖ６９０２、ｖ６９０３またはｖ６７１７のうちの１つのＥＣＤ２結合アームからのＶＨ配列及びＶＬ配列を含み、他の抗原結合ポリペプチド構築物は、ｖ５０１９、ｖ５０２０、ｖ７０９１、ｖ１００００、ｖ６９０２、ｖ６９０３またはｖ６７１７のうちの１つのＥＣＤ４結合アームからのＶＨ配列及びＶＬ配列を含む。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、ｖ５０１９、ｖ５０２０、ｖ７０９１、ｖ１００００、ｖ６９０２、ｖ６９０３またはｖ６７１７のうちの１つのＥＣＤ２結合アームからのＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、ｖ５０１９、ｖ５０２０、ｖ７０９１、ｖ１００００、ｖ６９０２、ｖ６９０３またはｖ６７１７のうちの１つのＥＣＤ２結合アームからのＣＤＲ配列、及び他の抗原結合ポリペプチド構築物は、ｖ５０１９、ｖ５０２０、ｖ７０９１、ｖ１００００、ｖ６９０２、ｖ６９０３、またはｖ６７１７のうちの１つのＥＣＤ４結合アームからのＣＤＲ配列を含む。
【０１２０】
当業者は、抗体がその標的に結合する能力を失うことなく、限られた数のアミノ酸置換を既知の抗体のＣＤＲ配列またはＶＨもしくはＶＬ配列に導入できることを理解するであろう。候補アミノ酸置換は、コンピューターモデリングによって、またはアラニンスキャニングなどの当技術分野において既知の技法によって同定することができ、得られたバリアントは、標準的技法によって結合活性について試験される。したがって、特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、ｖ５０１９、ｖ５０２０、ｖ７０９１、ｖ１００００、ｖ６９０２、ｖ６９０３、またはｖ６７１７のうちの１つのＥＣＤ２結合アームからのＣＤＲのセットと９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性を有するＣＤＲのセット（すなわち、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、ここで、抗原結合ポリペプチド構築物は、ＥＣＤ２に結合する能力を保持している。特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、例えば、ＣＤＲにおいて１〜７個のアミノ酸置換、１〜５個のアミノ酸置換、１〜４個のアミノ酸置換、１〜３個のアミノ酸置換、１〜２個のアミノ酸置換、または１個のアミノ酸置換など、６つのＣＤＲにおいて１〜１０個のアミノ酸置換を含むこれらのＣＤＲ配列のバリアントを含む（すなわち、ＣＤＲは、修飾されるＣＤＲの任意の組み合わせを有する最大１０個のアミノ酸置換を含めることによって修飾され得る）。バリアントは、ＥＣＤ２に結合する能力を保持している。典型的には、こうしたアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換となる。特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、ｖ１００００のＥＣＤ２結合アームからのＣＤＲのセットと９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性を有するＣＤＲのセット（すなわち、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。ここで、抗原結合ポリペプチド構築物は、ＥＣＤ２に結合する能力を保持している。
【０１２１】
特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、ｖ５０１９、ｖ５０２０、ｖ７０９１、ｖ１００００、ｖ６９０２、ｖ６９０３、またはｖ６７１７のうちの１つのＥＣＤ２結合アームからのＶＨ配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＶＨ配列を含む。ここで、抗原結合ポリペプチド構築物は、ＥＣＤ２に結合する能力を保持している。特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、ｖ５０１９、ｖ５０２０、ｖ７０９１、ｖ１００００、ｖ６９０２、ｖ６９０３、またはｖ６７１７のうちの１つのＥＣＤ２結合アームからのＶＬ配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＶＬ配列を含む。ここで、抗原結合ポリペプチド構築物は、ＥＣＤ２に結合する能力を保持している。
【０１２２】
特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、ｖ１００００のＥＣＤ２結合アームからのＶＨ配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＶＨ配列を含む。ここで、抗原結合ポリペプチド構築物は、ＥＣＤ２に結合する能力を保持している。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、ｖ１００００のＥＣＤ２結合アームからのＶＬ配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＶＬ配列を含む。ここで、抗原結合ポリペプチド構築物は、ＥＣＤ２に結合する能力を保持している。
【０１２３】
特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、ｖ５０１９、ｖ５０２０、ｖ７０９１、ｖ１００００、ｖ６９０２、ｖ６９０３、またはｖ６７１７のうちの１つのＥＣＤ４結合アームからＣＤＲのセットと９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性を有するＣＤＲのセット（すなわち、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、ここで、抗原結合ポリペプチド構築物は、ＥＣＤ４に結合する能力を保持している。特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、例えば、ＣＤＲにおいて１〜７個のアミノ酸置換、１〜５個のアミノ酸置換、１〜４個のアミノ酸置換、１〜３個のアミノ酸置換、１〜２個のアミノ酸置換、または１個のアミノ酸置換など、６つのＣＤＲにおいて１〜１０個のアミノ酸置換を含むこれらのＣＤＲ配列のバリアントを含む（すなわち、ＣＤＲは、修飾されるＣＤＲの任意の組み合わせを有する最大１０個のアミノ酸置換を含めることによって修飾され得る）。ここで、バリアントは、ＥＣＤ４に結合する能力を保持している。典型的には、こうしたアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換となる。特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、ｖ１００００のＥＣＤ４結合アームからのＣＤＲのセットと９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性を有するＣＤＲのセット（すなわち、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。ここで、抗原結合ポリペプチド構築物は、ＥＣＤ４に結合する能力を保持している。
【０１２４】
特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、ｖ５０１９、ｖ５０２０、ｖ７０９１、ｖ１００００、ｖ６９０２、ｖ６９０３、またはｖ６７１７のうちの１つのＥＣＤ４結合アームからのＶＨ配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＶＨ配列を含む。ここで、抗原結合ポリペプチド構築物は、ＥＣＤ４に結合する能力を保持している。特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、ｖ５０１９、ｖ５０２０、ｖ７０９１、ｖ１００００、ｖ６９０２、ｖ６９０３、またはｖ６７１７のうちの１つのＥＣＤ４結合アームからのＶＬ配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＶＬ配列を含む。ここで、抗原結合ポリペプチド構築物は、ＥＣＤ４に結合する能力を保持している。
【０１２５】
特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、ｖ１００００の１つのＥＣＤ４結合アームからのＶＨ配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＶＨ配列を含む。ここで、抗原結合ポリペプチド構築物は、ＥＣＤ４に結合する能力を保持している。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、ｖ１００００の１つのＥＣＤ４結合アームからのＶＬ配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＶＬ配列を含む。ここで、抗原結合ポリペプチド構築物は、ＥＣＤ４に結合する能力を保持している。
【０１２６】
（表６）例示的な抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体
2021515793.tif 000019
2021515793.tif 000020
＊ＫａｂａｔによるＦａｂまたは可変ドメインのナンバリング（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，ｐ．６４７，１９９１）。
§ＫａｂａｔなどＥＵインデックスによるＣＨ３ナンバリング（Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６９，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，６３：７８−８５）。
【０１２７】
（表６Ａ）バリアントｖ５０１９、ｖ５０２０、ｖ７０９１、ｖ１００００、ｖ６９０２、ｖ６９０３、及びｖ６７１７のＥＣＤ２結合アームのＣＤＲ配列
2021515793.tif 000021
【０１２８】
（表６Ｂ）バリアントｖ５０１９、ｖ５０２０、ｖ７０９１、ｖ１００００、ｖ６９０２、ｖ６９０３、及びｖ６７１７のＥＣＤ４結合アームのＣＤＲ配列
2021515793.tif 000022
【０１２９】
特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、国際特許出願公開ＷＯ２０１６／１７９７０７に記載されているバイパラトピック抗体のうちの１つである。本出願では、１つの抗原結合ドメインとして高親和性バリアントからの配列を含むバイパラトピック抗体など、抗ＨＥＲ２抗体のペルツズマブの高親和性バリアントについて記載している。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、ｖ７１３３、ｖ１５０７９、ｖ１５０８０、ｖ１５０８１、ｖ１５０８２、ｖ１５０８３、ｖ１５０８４、またはｖ１５０８５のうちの１つである（表７及び７Ａ、ならびに配列一覧表を参照のこと）。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、ｖ７１３３、ｖ１５０７９、ｖ１５０８０、ｖ１５０８１、ｖ１５０８２、ｖ１５０８３、ｖ１５０８４、またはｖ１５０８５のうちの１つのＥＣＤ２結合アームからのＶＨ配列及びＶＬ配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、ｖ７１３３、ｖ１５０７９、ｖ１５０８０、ｖ１５０８１、ｖ１５０８２、ｖ１５０８３、ｖ１５０８４、またはｖ１５０８５のうちの１つのＥＣＤ２結合アームからのＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、ｖ７１３３、ｖ１５０７９、ｖ１５０８０、ｖ１５０８１、ｖ１５０８２、ｖ１５０８３、ｖ１５０８４、またはｖ１５０８５のうちの１つのＥＣＤ２結合アーム由来のＶＨ配列及びＶＬ配列を含み、他の抗原結合ポリペプチド構築物は、トラスツズマブ由来のＶＨ配列及びＶＬ配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つは、ｖ７１３３、ｖ１５０７９、ｖ１５０８０、ｖ１５０８１、ｖ１５０８２、ｖ１５０８３、ｖ１５０８４、またはｖ１５０８５のうちの１つのＥＣＤ２結合アーム由来のＣＤＲ配列を含み、他の抗原結合ポリペプチド構築物は、トラスツズマブ由来のＣＤＲ配列を含む。
【０１３０】
（表７）追加の例示的な抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体
2021515793.tif 000023
2021515793.tif 000024
2021515793.tif 000025
＊ＫａｂａｔによるＦａｂまたは可変ドメインのナンバリング（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，ｐ．６４７，１９９１）
§ＫａｂａｔなどＥＵインデックスによるＣＨ３ナンバリング（Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６９，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，６３：７８−８５）。
【０１３１】
（表７Ａ）バリアントｖ７１３３、ｖ１５０７９、ｖ１５０８０、ｖ１５０８１、ｖ１５０８２、ｖ１５０８３、ｖ１５０８４、及びｖ１５０８５のＥＣＤ２結合アームのＣＤＲ配列
2021515793.tif 000026
【０１３２】
抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の特性
低いＤＡＲでの毒素のコンジュゲーションは、対応する二価の単一特異性抗体と比較して、ＨＥＲ２への結合の増加及び／またはＨＥＲ２発現細胞への高い内在化を示す抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体にとって特に有益である。対応する二価の単一特異性抗体は、バイパラトピック抗体に含まれる第１の抗原結合ポリペプチド構築物のうちの２つ、または第２の抗原結合ポリペプチド構築物のうちの２つを含み得る。
【０１３３】
特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、対応する二価の単一特異性抗体と比較して、ＨＥＲ２への結合の増加（すなわち、より高い親和性での結合）を示す。結合の増加は、例えば、解離定数の減少及び／または最大結合の増加によって示され得る。
【０１３４】
解離定数（ＫＤ）は、抗体−抗原相互作用などの特定のリガンド−タンパク質相互作用の平衡解離定数を指す。ＫＤは、２つのタンパク質（例えば、ＡＢ）がより小さい成分（Ａ＋Ｂ）に可逆的に解離する傾向を測定し、解離速度（「オフレート」またはｋｏｆｆとも呼ばれる）対会合速度（「オンレート」またはｋｏｎとも呼ばれる）の比率として定義される。したがって、ＫＤはｋｏｆｆ／ｋｏｎに等しく、モル濃度（Ｍ）として表される。したがって、ＫＤが小さいほど、結合の親和性は強くなる。抗体のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立されている方法を使用して決定することができる。そのような方法の例としては、典型的にはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、及び等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）が挙げられる。
【０１３５】
見かけのＫＤ、または見かけの平衡解離定数は、最大細胞結合の半分が観察される抗体濃度を表す。見かけのＫＤは、細胞に発現する様々な受容体レベル及びインキュベーション条件などの細胞結合実験の条件に依存する。したがって、見かけのＫＤは一般に、ＳＰＲ及びＩＴＣなどの無細胞分子実験から求められるＫＤ値とは異なる。しかし、一般に、異なる方法間には十分な合意点がある。
【０１３６】
最大結合（または「Ｂｍａｘ」）は、抗体の飽和濃度での細胞における最大抗体結合レベルを指す。このパラメータは、相対比較のために任意の単位ＭＦＩで報告されるか、または標準曲線を使用して、細胞に結合した抗体の数に対応する絶対値に変換できる。
【０１３７】
Ｂｍａｘ及び見かけのＫＤは、様々な技法で求めることができる。一例は、フローサイトメトリーにより、標的抗原発現細胞への結合を測定することである。典型的には、このような実験では、標的抗原発現細胞を様々な濃度で抗体と共にインキュベートし、洗浄し、抗体を検出するために二次試薬とインキュベートし、洗浄し、フローサイトメーターで分析して、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を測定する。この値は、細胞上での検出信号の強さを表し、細胞に結合した抗体の数に関連する。抗体濃度対ＭＦＩデータを飽和結合方程式に当てはめて、Ｂｍａｘ及び見かけのＫＤを求める。
【０１３８】
特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、対応する参照抗体と比較して、ＨＥＲ２を提示する標的細胞に対してＢｍａｘの増加を示す。本明細書に記載の第１の抗原結合ポリペプチド構築物及び第２の抗原結合ポリペプチド構築物を含む抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の場合、対応する参照抗体は、第１の抗原結合ポリペプチド構築物のうちの２つまたは第２の抗原結合ポリペプチド構築物のうちの２つを含む二価の単一特異性抗体である。特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体について決定されたＢｍａｘは、対応する参照抗体のＢｍａｘの少なくとも約１１０％である。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体について決定されたＢｍａｘは、対応する参照抗体のＢｍａｘの少なくとも約１２５％、例えば、対応する参照抗体のＢｍａｘの約１５０％、または対応する参照抗体のＢｍａｘの少なくとも約２００％である。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体について決定されたＢｍａｘは、参照抗体のＢｍａｘの１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９または２．０倍である。
【０１４０】
特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、対応する参照二価の単一特異性抗体よりもＨＥＲ２発現細胞へのより高い内在化を示す。抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、受容体ＨＥＲ２への結合を介してＨＥＲ２＋細胞に内在化される。したがって、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、ＨＥＲ２＋細胞において受容体の内在化を誘導できると考えることもできる。
【０１４１】
抗体の内在化は、当技術分野で既知の方法を使用して、例えば、Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，５７：１８７９−１８９０（２００８）に詳述されているプロトコルに従って、直接内部化法によって測定してもよい。当技術分野で公知であるように、がん細胞は、様々なレベルでＨＥＲ２を発現し得る。ＨＥＲ２発現細胞を分類する１つの方法は、ＨＥＲ２  １＋、２＋または３＋（それぞれ低、中、および高）である。特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、３＋レベルでＨＥＲ２を発現する細胞において、対応する二価の参照単一特異性抗体よりも高い内在化を示す。特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、２＋レベルでＨＥＲ２を発現する細胞において、対応する二価の参照単一特異性抗体よりも高い内在化を示す。特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、１＋レベルでＨＥＲ２を発現する細胞において、対応する二価の参照単一特異性抗体よりも高い内在化を示す。異なるレベルのＨＥＲ２を発現する細胞株の例は、以下により詳細に記載する。
【０１４２】
本開示の文脈において、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、ＨＥＲ２発現細胞に内在化された抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の量が、同じＨＥＲ２発現細胞に内在化された二価の参照単一特異性抗体の量よりも少なくとも１．２倍多い場合には、対応する二価の参照単一特異性抗体よりもＨＥＲ２発現細胞へのより高い内在化を示すと考えられる。特定の実施形態では、内在化された抗体の量は、Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，５７：１８７９−１８９０（２００８）で詳述されているプロトコルに従って、直接内在化法により決定される。いくつかの実施形態では、内在化された抗体の量は、２＋レベルでＨＥＲ２を発現するＨＥＲ２発現細胞において決定される。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、ＨＥＲ２発現細胞に内在化された抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の量が、同じＨＥＲ２発現細胞に内在化された二価の参照単一特異性抗体の量よりも少なくとも１．３倍多い場合には、対応する二価の参照単一特異性抗体よりもＨＥＲ２発現細胞へのより高い内在化を示すと考えられる。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、ＨＥＲ２発現細胞に内在化された抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体の量が、同じＨＥＲ２発現細胞に内在化された二価の参照単一特異性抗体の量よりも少なくとも１．４倍多い、例えば、少なくとも１．５倍多い、１．６倍多い、１．７倍多い、１．８倍多い、１．９倍多い、または２．０倍多い場合には、対応する二価の参照単一特異性抗体よりもＨＥＲ２発現細胞へのより高い内在化を示すと考えられる。特定の実施形態では、内在化された抗体の量は、Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，５７：１８７９−１８９０（２００８）で詳述されているプロトコルに従って、直接内在化法により決定される。いくつかの実施形態では、内在化された抗体の量は、２＋レベルでＨＥＲ２を発現するＨＥＲ２発現細胞において決定される。
【０１４４】
オーリスタチン類似体
本明細書に記載されるＡＤＣは、オーリスタチンベースの毒素（または「オーリスタチン類似体」）を含む。様々なオーリスタチン類似体が当技術分野において公知である。例としては、これらに限定されないが、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、オーリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、オーリスタチンＥＶＢ（ＡＥＶＢ）、及びオーリスタチンＦフェニレンジアミン（ＡＦＰ）が挙げられる。様々なオーリスタチン類似体の合成及び構造は、米国特許第６，８８４，８６９号、第７，０９８，３０８号；同第７，２５６，２５７号及び同第７，４９８，２９８号に記載されている。
【０１４５】
特定の実施形態では、本明細書に記載されるＡＤＣに含まれるオーリスタチン類似体は、国際特許出願公開ＷＯ２０１６／０４１０８２号に記載されているオーリスタチン類似体であり得る。特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＤＣを含むオーリスタチン類似体は、一般式（Ｉ）：
2021515793.tif 000027
の化合物であり、
式中、
Ｘは−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｒ２）−であるか、またはＸは存在せず；
Ｒ１は、
2021515793.tif 000028
から選択され、
Ｒ２は、フェニルである。
【０１４６】
特定の実施形態では、一般式（Ｉ）の化合物において、Ｒ１は、
2021515793.tif 000029
から選択される。
【０１４７】
特定の実施形態では、一般式（Ｉ）の化合物において、Ｘは存在しない。
【０１４８】
特定の実施形態では、一般式（Ｉ）の化合物は、一般式（ＩＶ）：
2021515793.tif 000030
を有し、
式中、Ｒ１は、一般式（Ｉ）について定義されたとおりである。
【０１４９】
特定の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物において、Ｒ１は、
2021515793.tif 000031
から選択される。
【０１５０】
特定の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物において、Ｒ１は：
2021515793.tif 000032
である。
【０１５１】
特定の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物において、Ｒ１は、
2021515793.tif 000033
である。
【０１５２】
特定の実施形態では、一般式（Ｉ）の化合物は、一般式（Ｖ）：
2021515793.tif 000034
を有し、
式中、Ｒ１は、一般式（Ｉ）について定義されたとおりである。
【０１５３】
特定の実施形態では、式（Ｖ）の化合物において、Ｒ１は、
2021515793.tif 000035
から選択される。
【０１５４】
特定の実施形態では、式（Ｖ）の化合物において、Ｒ１は：
2021515793.tif 000036
である。
【０１５５】
特定の実施形態では、式（Ｖ）の化合物において、Ｒ１は、
2021515793.tif 000037
である。
【０１５６】
一般式（Ｉ）の化合物は、市販の出発物質から標準的な合成有機化学プロトコルによって調製されてもよい。例示的な方法は、国際特許出願公開ＷＯ２０１６／０４１０８２号に提供されており、以下の「実施例」セクションに示す。
【０１５７】
本開示の他の全体における一般式（Ｉ）の化合物への言及は、様々な実施形態において、一般式（ＩＶ）及び（Ｖ）の化合物を、これらの式のそれぞれを個別に引用する実施形態が、具体的に引用された場合と同程度に含むことを理解されたい。
【０１５８】
特定の実施形態では、本開示のＡＤＣは、リンカー（Ｌ）を介してオーリスタチン類似体（毒素）にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体を含み、リンカー−毒素は一般式（ＩＩ）：
2021515793.tif 000038
を有し、
式中、
Ｘは−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｒ２）−であるか、またはＸは存在せず；
Ｒ１は、
2021515793.tif 000039
から選択され；
Ｒ２はフェニルであり；
Ｌが、リンカーであり、
2021515793.tif 000040
は、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体へのリンカー−毒素の付着点を表す。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、一般式（ＩＩ）のリンカー−毒素において、Ｒ１は、
2021515793.tif 000041
から選択される。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、一般式（ＩＩ）のリンカー−毒素において、Ｘは存在しない。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、一般式（ＩＩ）のリンカー−毒素において、Ｌは、切断可能リンカーである。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、一般式（ＩＩ）のリンカー−毒素において、Ｌは、ペプチド含有リンカーである。
【０１６３】
特定の実施形態では、一般式（ＩＩ）のリンカー−毒素は、一般式（Ｘ）：
2021515793.tif 000042
を有し、
式中、Ｒ１、Ｌ及び
2021515793.tif 000043
は、一般式（ＩＩ）について上記で定義したとおりである。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、一般式（Ｘ）のリンカー−毒素において、Ｒ１は、
2021515793.tif 000044
から選択される。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、一般式（Ｘ）のリンカー−毒素において、Ｒ１は：
2021515793.tif 000045
である。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、式（Ｘ）の化合物において、Ｒ１は：
2021515793.tif 000046
である。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、一般式（Ｘ）のリンカー−毒素において、Ｌは、切断可能リンカーである。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、一般式（Ｘ）のリンカー−毒素において、Ｌはペプチド含有リンカーである。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、一般式（Ｘ）のリンカー−毒素において、Ｌは、プロテアーゼ切断可能リンカーである。
【０１７０】
特定の実施形態では、一般式（ＩＩ）のリンカー−毒素は、一般式（ＸＩ）：
2021515793.tif 000047
を有し、
式中、Ｒ１、Ｌ及び
2021515793.tif 000048
は、一般式（ＩＩ）について上記で定義したとおりである。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、一般式（ＸＩ）のリンカー−毒素において、Ｒ１は、
2021515793.tif 000049
から選択される。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、一般式（ＸＩ）のリンカー−毒素において、Ｒ１は：
2021515793.tif 000050
である。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、一般式（ＸＩ）のリンカー−毒素において、Ｒ１は：
2021515793.tif 000051
である。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、一般式（ＸＩ）のリンカー−毒素において、Ｌは、切断可能リンカーである。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、一般式（ＸＩ）のリンカー−毒素において、Ｌは、ペプチド含有リンカーである。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、一般式（ＸＩ）のリンカー−毒素において、Ｌは、プロテアーゼ切断可能リンカーである。
【０１７７】
以下に示すとおり、リンカーが一般式（ＶＩＩＩ）または（ＩＸ）を有する一般式（ＩＩ）、式（Ｘ）または式（ＸＩ）のリンカー−毒素にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体を含むＡＤＣも本明細書で企図される。
【０１７８】
特定の実施形態では、ＡＤＣは、構造
2021515793.tif 000052
を有するリンカー−毒素を含み、
Ａ−Ｓ−は、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体への付着点である。
【０１７９】
特定の実施形態では、リンカー（Ｌ）を介してオーリスタチン類似体（毒素）にコンジュゲートした抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体を含む本開示のＡＤＣは、一般式（ＩＩＩ）：
2021515793.tif 000053
を有し、
式中、Ｘ及びＲ１は、一般式（ＩＩ）として定義されたとおりであり；
Ｌが、リンカーであり、
ｎは、平均薬物抗体比（ＤＡＲ）であり、３．９未満であり、
Ａｂは、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体である。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、一般式（ＩＩＩ）のＡＤＣにおいて、Ｒ１は、
2021515793.tif 000054
から選択される。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、一般式（ＩＩＩ）のＡＤＣにおいて、Ｘは存在しない。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、一般式（ＩＩＩ）のＡＤＣにおいて、Ｒ１は：
2021515793.tif 000055
であり、
Ｘは存在しない。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、一般式（ＩＩＩ）のＡＤＣにおいて、Ｒ１は：
2021515793.tif 000056
であり、
Ｘは存在しない。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、一般式（ＩＩＩ）のＡＤＣにおいて、Ｘは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｒ２）−である。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、一般式（ＩＩＩ）のＡＤＣにおいて、Ｒ１は：
2021515793.tif 000057
であり、
Ｘは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｒ２）−である。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、一般式（ＩＩＩ）のＡＤＣにおいて、Ｒ１は：
2021515793.tif 000058
であり、
Ｘは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｒ２）−である。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、一般式（ＩＩＩ）のＡＤＣにおいて、Ｌは、切断可能リンカーである。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、一般式（ＩＩＩ）のＡＤＣにおいて、Ｌは、ペプチド含有リンカーである。
【０１８９】
一部の実施形態では、一般式（ＩＩＩ）のＡＤＣにおいて、Ｌは、プロテアーゼ切断可能リンカーである。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、一般式（ＩＩＩ）のＡＤＣにおいて、ｎは、０．５〜３．８である。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、一般式（ＩＩＩ）のＡＤＣにおいて、ｎは、０．７〜３．８、０．７〜３．５、０．７〜３．０、または０．７〜２．５である。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、一般式（ＩＩＩ）のＡＤＣにおいて、ｎは、１．０〜３．８、１．０〜３．５、１．０〜３．０、または１．０〜２．５である。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、一般式（ＩＩＩ）のＡＤＣにおいて、ｎは、１．５〜３．８、１．５〜３．５、１．５〜３．０、または１．５〜２．５である。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、一般式（ＩＩＩ）のＡＤＣにおいて、ｎは、１．６〜３．８、１．６〜３．５、１．６〜３．０、または１．６〜２．５である。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、一般式（ＩＩＩ）のＡＤＣにおいて、ｎは、１．８〜２．８、または１．８〜２．５である。
【０１９６】
一般式（ＩＩＩ）の化合物についての前述の実施形態の組み合わせはいずれも企図され、各組み合わせは、本開示の目的のために別個の実施形態を形成する。
【０１９７】
リンカー
本明細書に記載のＡＤＣにおいて、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、リンカーによってオーリスタチン類似体（毒素）に連結される。リンカーは、１つ以上の毒素分子を抗体に連結できる二機能性部分または多機能性部分である。リンカーは、単一の薬物を抗体の単一の部位に連結するように二機能性（または一価）であっても、２つ以上の毒素分子を抗体の単一の部位に連結するように多機能性（または多価）であってもよい。１つの毒素分子を抗体上の２つ以上の部位に連結することができるリンカーもまた、多機能性であると見なされ得る。
【０１９８】
リンカーの抗体への付着は、抗体上の表面リジン、抗体の酸化された炭水化物への還元的カップリング、または鎖間ジスルフィド結合の還元により遊離した抗体のシステイン残基など、様々な方法で達成できる。あるいは、抗体へのリンカーの付着は、追加のシステイン残基（例えば、米国特許第７，５２１，５４１号、８，４５５，６２２号及び９，０００，１３０号を参照）または、セレノメチオニン、ｐ−アセチルフェニルアラニン、ホルミルグリシンまたはｐ−アジドメチル−Ｌ−フェニルアラニンなど、反応性ハンドルを提供する非天然アミノ酸を含むように抗体を修飾することにより達成して（例えば、Ｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８：１２０４７−１２０５７（２００９）；Ａｘｕｐ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０９：１６１０１−１６１０６（２０１２）；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０６：３０００−３００５（２００９）；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，２５：３５１−３６１（２０１４）を参照）、部位特異的コンジュゲーションが可能になる。
【０１９９】
リンカーは、抗体上の標的基（複数可）と反応することができる官能基、及び毒素上の標的基と反応し得る１つ以上の官能基を含む。好適な官能基は当技術分野において公知であり、例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，２０１３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）に記載されているものが挙げられる。
【０２００】
遊離システインまたはチオールと反応するための官能基の非限定的な例としては、マレイミド、ハロアセトアミド、ハロアセチルのほか、コハク酸イミドエステル、４−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステルなどの活性化エステル、無水物、酸塩化物、塩化スルホニル、イソシアン酸塩、及びイソチオシアン酸塩が挙げられる。この文脈においても有用であるのは、Ｌｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３２：１０５９−１０６２（２０１４）に記載されている「自己安定化」マレイミドである。
【０２０１】
抗体の表面リジン及び毒素の遊離アミンと反応するための官能基の非限定的な例としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド（ＮＨＳ）エステルなどの活性化エステル、スルホ−ＮＨＳエステル、トラウト試薬などのイミドエステル、イソチオシアネート、アルデヒド及びジエチレントリアミン五酢酸無水物（ＤＴＰＡ）などの酸無水物が挙げられる。他の例としては、スクシンイミド−１，１，３，３−テトラ−メチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＳＴＵ）及びベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）が挙げられる。
【０２０２】
抗体または毒素の求電子基（アルデヒド基またはケトンカルボニル基など）と反応できる官能基の非限定的な例としては、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート及びアリールヒドラジドが挙げられる。
【０２０３】
他のリンカーとしては、ＴｈｉｏＢｒｉｄｇｅ（商標）リンカー（Ｂａｄｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，２５：１１２４−１１３６（２０１４））、ジチオマレイミド（ＤＴＭ）リンカー（Ｂｅｈｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．，１２：３９８６−３９９８（２０１５））、ジチオアリール（ＴＣＥＰ）ピリダジンジオンベースのリンカー（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，７：７９９−８０２（２０１６））、ジブロモピリダジンジオンベースのリンカー（Ｍａｒｕａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，６：６６４５（２０１５））及び当技術分野で知られている他のものなど、抗体上の２つの鎖間システインの架橋を可能にする官能基を有するリンカーが挙げられる。
【０２０４】
リンカーは、１つ以上のリンカー構成要素を含んでもよい。典型的には、リンカーは２つ以上のリンカー構成要素を含む。例示的なリンカー構成要素としては、抗体と反応するための官能基、毒素と反応するための官能基、ストレッチャー、ペプチド構成要素、自壊性基（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ  ｇｒｏｕｐ）、自己脱離基、親水性部分などが挙げられる。様々なリンカー構成要素が当該技術分野で既知であり、このうちのいくつかが以下に記載される。
【０２０５】
特定の有用なリンカー構成要素は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（現在のＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏ．）などの様々な商用供給源から取得できるか、または当技術分野において記述されている手順に従って合成されてもよい（例えば、Ｔｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６７：１８６６−１８７２（２００２）；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３８：５２５７−６０（１９９７）；Ｗａｌｋｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６０：５３５２−５３５５（１９９５）；Ｆｒｉｓｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，７：１８０−１８６（１９９６）；米国特許第６，２１４，３４５号及び同第７，５５３，８１６号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ０２／０８８１７２号を参照されたい）。
【０２０６】
リンカー構成要素の例としては、これらに限定されないが、Ｎ−（β−マレイミドプロピルオキシ）−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、１，６−ヘキサン−ビス−ビニルスルホン（ＨＢＶＳ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロエート）（ＬＣ−ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）、スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）、スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノ安息香酸塩（ＳＴＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、スクシンイミジル６−［（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート］（ＳＭＰＨ）、イミノチオラン（ＩＴ）、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＰＢ及びスクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート（ＳＶＳＢ）が挙げられる。
【０２０７】
追加の例としては、ジチオビスマレイミドエタン（ＤＴＭＥ）、ビス−マレイミド−トリオキシエチレングリコール（ＢＭＰＥＯ）、１，４−ビスマレイミドブタン（ＢＭＢ）、１，４ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、ビスマレイミドエタン（ＢＭＯＥ）、ＢＭ（ＰＥＧ）２及びＢＭ（ＰＥＧ）３などのビスマレイミド試薬；イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣｌなど）、活性エステル（スベリン酸ジサクシニミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）が挙げられる。
【０２０８】
好適なリンカーは、典型的には、細胞内の条件よりも細胞外の条件に対して化学的に安定であるが、毒素が選択的または標的であり、正常細胞に対する毒性が低い場合など、特定の状況では安定性の低いリンカーが企図される。リンカーは、「切断可能リンカー」または「切断不可リンカー」であり得る。切断可能リンカーは、典型的には、例えば、リソソームプロセスを通じて、細胞内条件下で切断を受けやすい。例としては、プロテアーゼ感受性、酸感受性、還元感受性または光不安定性であるリンカーが挙げられる。対照的に、切断不可リンカーは、細胞内での抗体の分解に依存しており、これは典型的には、アミノ酸−リンカー−毒素部分の放出をもたらす。
【０２０９】
好適な切断可能リンカーとしては、例えば、２つ以上のアミノ酸を含み、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼなどの細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチド構成要素を含むリンカーが挙げられる。ペプチド構成要素には、自然発生アミノ酸残基及び／または微量アミノ酸、及び／またはシトルリンなどの非自然発生アミノ酸類似体を含んでもよい。ペプチド構成要素は、特定の酵素、例えば、腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ、もしくはＤ、またはプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断のために設計及び最適化され得る。
【０２１０】
特定の実施形態では、ＡＤＣに含まれるリンカーは、バリン−シトルリン（Ｖａｌ−Ｃｉｔ）またはフェニルアラニン−リジン（Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）を含むリンカーなどのジペプチド含有リンカーであり得る。リンカーに含めるのに好適であるジペプチドの他の例としては、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｍｅ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−ｈｏｍｏＬｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ｐｈｅ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ、Ａｓｎ−Ｌｙｓ、Ｉｌｅ−Ｐｒｏ、Ｉｌｅ−Ｖａｌ、Ａｓｐ−Ｖａｌ、Ｈｉｓ−Ｖａｌ、Ｍｅｔ−（Ｄ）Ｌｙｓ、Ａｓｎ−（Ｄ）Ｌｙｓ、Ｖａｌ−（Ｄ）Ａｓｐ、ＮｏｒＶａｌ−（Ｄ）Ａｓｐ、Ａｌａ−（Ｄ）Ａｓｐ、Ｍｅ３Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、ＰｈｅｎｙｌＧｌｙ−（Ｄ）Ｌｙｓ、Ｍｅｔ−（Ｄ）Ｌｙｓ、Ａｓｎ−（Ｄ）Ｌｙｓ、Ｐｒｏ−（Ｄ）Ｌｙｓ及びＭｅｔ−（Ｄ）Ｌｙｓが挙げられる。切断可能リンカーは、トリペプチド、テトラペプチド、またはペンタペプチドなどのより長いペプチド構成要素も含み得る。例としては、これらに限定されないが、Ｍｅｔ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ、（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ及び（Ｄ）Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、ならびにテトラペプチドＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ及びＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕが挙げられる。
【０２１１】
切断可能リンカーのさらなる例としては、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＢＤ）及びＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエート（スルホ−ＳＰＢＤ）などのジスルフィド含有リンカーが挙げられる。ジスルフィド含有リンカーは任意で、リンカーの細胞外安定性、例えばジェミナルジメチル基の包含を改善するために、ジスルフィド結合に隣接して立体障害をもたらす追加の基を含むことができる。他の好適なリンカーとしては、ヒドラゾンリンカーなど、特定のｐＨまたはあるｐＨ範囲内で加水分解可能なリンカーが挙げられる。これらの官能基の組み合わせを含むリンカーもまた有用であり得、例えば、ヒドラゾン及びジスルフィドの両方を含むリンカーが当該分野で公知である。
【０２１２】
切断可能リンカーのさらなる例としては、β−グルクロニドを含むリンカーであり、β−グルクロニダーゼによって切断され得、リソソーム及び腫瘍間質に存在する酵素である（例えば、Ｄｅ  Ｇｒａａｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．，８：１３９１−１４０３（２００２）を参照のこと）。
【０２１３】
切断可能リンカーは任意で、自壊性基及び自己脱離基、ストレッチャーまたは親水性部分などの１つ以上の追加の構成要素をさらに含むことができる。
【０２１４】
リンカーでの用途がわかっている自壊性及び自己脱離基としては、例えばｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）及びｐ−アミノベンジルエーテル（ＰＡＢＥ）基、メチル化エチレンジアミン（ＭＥＤ）などが挙げられる。自壊性基の他の例としては、これらに限定されないが、例えば、米国特許第７，３７５，０７８号に記載されている２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体などの複素環式誘導体など、ＰＡＢＣ基またはＰＡＢＥ基に電子的に類似した芳香族化合物が挙げられる。他の例としては、置換及び非置換４−アミノ酪酸アミド（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２：２２３−２２７（１９９５））及び２−アミノフェニルプロピオン酸アミド（Ａｍｓｂｅｒｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５５：５８６７−５８７７（１９９０））などの、アミド結合加水分解時に環化を受ける基が挙げられる。
【０２１５】
ＡＤＣのリンカーでの用途がわかっているストレッチャーとしては、例えば、アルキレン基、及び脂肪酸、二酸、アミンまたはジアミンに基づくストレッチャー、例えばジグリコレート、マロネート、カプロエート及びカプロアミドが挙げられる。他のストレッチャーとしては、例えば、グリシンベースのストレッチャー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ストレッチャー及びモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）ストレッチャーが挙げられる。ＰＥＧ及びｍＰＥＧストレッチャーも親水性部分として機能する。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、本開示のＡＤＣにおいて用途が見い出され得る切断可能リンカーにおいて一般的に見られる構成要素の例としては、これらに限定されないが、ＳＰＢＤ、スルホ−ＳＰＢＤ、ヒドラゾン、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、マレイドカプロイル（ＭＣまたはｍｃ）、ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、ｍｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、ｍｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ、マレイミドトリエチレングリコレート（ＭＴ）、ＭＴ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、ＭＴ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ及びアジピン酸（ＡＤ）が挙げられる。
【０２１７】
特定の実施形態では、本開示のＡＤＣに含まれるリンカーは、一般式（ＶＩ）
2021515793.tif 000059
を有するペプチドベースのリンカーであり、
式中、
Ｚは、抗体上の標的基と反応できる官能基であり；
Ｓｔｒは、ストレッチャーであり；
ＡＡ１及びＡＡ２はそれぞれ独立して、アミノ酸であり、ＡＡ１−［ＡＡ２］ｍは、プロテアーゼ切断部位を形成し；
Ｘは、自壊性基であり；
Ｄは、オーリスタチン類似体への付着点であり；
ｓは、０または１であり；
ｍは、１〜４の整数であり、
ｏは、０、１、または２である。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩ）において、Ｚは：
2021515793.tif 000060
である。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩ）において、Ｓｔｒは、
2021515793.tif 000061
、から選択され；
式中、
Ｒは、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
ｐは、２〜１０の整数であり、
ｑは、１〜１０の整数である。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩ）において、Ｓｔｒは：
2021515793.tif 000062
であり、
ｐ及びｑは、上記で定義したとおりである。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩ）において、Ｓｔｒは：
2021515793.tif 000063
であり、
ｐは、２〜６の整数であり、
ｑは、２〜８の整数である。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩ）において、ＡＡ１−［ＡＡ２］ｍは、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ｐｈｅ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ、Ａｓｎ−Ｌｙｓ、Ｉｌｅ−Ｐｒｏ、Ｉｌｅ−Ｖａｌ、Ａｓｐ−Ｖａｌ、Ｈｉｓ−Ｖａｌ、Ｍｅｔ−（Ｄ）Ｌｙｓ、Ａｓｎ−（Ｄ）Ｌｙｓ、Ｖａｌ−（Ｄ）Ａｓｐ、ＮｏｒＶａｌ−（Ｄ）Ａｓｐ、Ａｌａ−（Ｄ）Ａｓｐ、Ｍｅ３Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、ＰｈｅｎｙｌＧｌｙ−（Ｄ）Ｌｙｓ、Ｍｅｔ−（Ｄ）Ｌｙｓ、Ａｓｎ−（Ｄ）Ｌｙｓ、Ｐｒｏ−（Ｄ）Ｌｙｓ、Ｍｅｔ−（Ｄ）Ｌｙｓ、Ｍｅｔ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ、（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、（Ｄ）Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ及びＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕから選択される。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩ）において、ｍは１である（すなわち、ＡＡ１−［ＡＡ２］ｍは、ジペプチドである）。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩ）において、ＡＡ１−［ＡＡ２］ｍは、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ及びＴｒｐ−Ｃｉｔから選択されるジペプチドである。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩ）において、各Ｘは、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）、ｐ−アミノベンジルエーテル（ＰＡＢＥ）及びメチル化エチレンジアミン（ＭＥＤ）から独立して選択される。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩ）において、ｍは、１、２または３である。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩ）において、ｓは１である。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩ）において、ｏは０である。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩ）：
Ｚは、
2021515793.tif 000064
であり；
Ｓｔｒは、
2021515793.tif 000065
であり、
ｐは２〜６の整数であり、ｑは２〜８の整数であり；
ｍは１であり、ＡＡ１−［ＡＡ２］ｍは、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ及びＴｒｐ−Ｃｉｔから選択されるジペプチドであり；
ｓは、１であり；
ｏは、０である。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、リンカーはジスルフィド含有リンカーであり、ＡＤＣは一般式（ＶＩＩ）：
2021515793.tif 000066
（ＶＩＩ）を有し、
式中、
Ａは、抗体であり；
Ｄは、オーリスタチン類似体であり；
Ｙは、−（ＣＨ２）ｐ−または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｑ−であり、ｐ及びｑはそれぞれ独立して１〜１０の整数であり；
各Ｒは独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
ｒは、１、２、または３であり、
2021515793.tif 000067
は、リンカーと抗体上の表面リジンのε−アミノ基との間に形成されたアミド結合を表す。
【０２３１】
一般式（ＶＩＩ）のいくつかの実施形態では、ｐ及びｑはそれぞれ独立して、１〜４の整数である。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩＩ）において、Ｙは−（ＣＨ２）ｐ−であり、ｐは１〜４の整数である。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩＩ）においては、各Ｒは独立して、ＨまたはＭｅである。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、一般式（ＶＩＩ）においては、ｒは、１または２である。
【０２３５】
薬物を抗体に連結するための様々な切断不可リンカーは、当該技術分野で公知であり、特定の実施形態では、本開示のＡＤＣにおいて有用であり得る。切断不可リンカーの例としては、抗体との反応のためのＮ−スクシンイミジルエステルまたはＮ−スルホスクシンイミジルエステル部分、ならびに毒素との反応のためのマレイミドまたはハロアセチルベースの部分、またはその逆が挙げられる。そのような切断不可リンカーの例としては、スルホスクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシラート（スルホ−ＳＭＣＣ）をベースとする。こうしたリンカーの他の非限定的な例としては、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロエート）（「長鎖」ＳＭＣＣまたはＬＣ−ＳＭＣＣ）、κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）、及びＮ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）をベースとするものが挙げられる。他の例としては、Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテート（ＳＢＡ）、及びＮ−スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）などのハロアセチルベースの官能基を含むものが挙げられる。
【０２３６】
切断不可リンカーの他の例としては、マレイミドカプロイル（ＭＣ）などのマレイミドカルボン酸が挙げられる。
【０２３７】
所定のＡＤＣのための適切なリンカーの選択は、当技術分野の知識を有し、抗体への付着部位、毒素のあらゆる構造的制約及び毒素の疎水性などの関連要因を考慮に入れて、当業者によって容易に行われ得る（例えば、Ｎｏｌｔｉｎｇ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ５，Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１３，Ｄｕｃｒｙ（Ｅｄ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒのレビューを参照のこと）。
【０２３８】
特定の実施形態では、本開示のＡＤＣに含まれるリンカーは、一般式（ＶＩＩＩ）：
2021515793.tif 000068
を有し、
式中、
Ａ−Ｓ−は、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体への付着点であり；
Ｙは、１つ以上の追加のリンカー構成要素であるか、または存在せず、
Ｄは、オーリスタチン類似体への付着点である。
【０２３９】
特定の実施形態では、本開示のＡＤＣに含まれるリンカーは、一般式（ＩＸ）：
2021515793.tif 000069
を有し、
式中、
Ａ−Ｓ−は、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体への付着点であり；
Ｙは、１つ以上の追加のリンカー構成要素であるか、または存在せず、
Ｄは、オーリスタチン類似体への付着点である。
【０２４０】
抗体−薬物コンジュゲートの調製
本開示のＡＤＣは、当業者に公知である有機化学反応、条件、及び試薬を使用して、当技術分野で公知であるいくつかの経路のうちの１つによって調製することができる（例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，２０１３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ及び本明細書において提供されている実施例を参照のこと）。例えば、コンジュゲーションは、（１）抗体の求核基または求電子基と二官能性リンカーとの反応により共有結合を介して抗体−リンカー中間体Ａｂ−Ｌを形成し、その後活性化オーリスタチン類似体（Ｄ）と反応させることにより達成できるか、または（２）オーリスタチン類似体の求核基または求電子基とリンカーとの反応により共有結合を介してリンカー−毒素Ｄ−Ｌを形成し、その後抗体の求核基または求電子基と反応させることにより達成できる。コンジュゲーション方法（１）及び（２）は、本明細書に記載のＡＤＣを調製するために、様々な抗体、オーリスタチン類似体、及びリンカーと共に使用されてもよい。
【０２４１】
上記のように、オーリスタチン類似体は、適切なリンカーを介して抗体上の様々な基にコンジュゲートして、ＡＤＣをもたらすことができる。例えば、コンジュゲーションは、表面リジンを介して、酸化された炭水化物を介して、または１つ以上の鎖間ジスルフィド連結を還元することによって遊離されたシステイン残基を介してもよい。あるいは、抗体は、セレノメチオニン、ｐ−アセチルフェニルアラニン、ホルミルグリシンまたはｐ−アジドメチル−Ｌ−フェニルアラニンなどの反応性ハンドルを提供する追加のシステイン残基または非天然アミノ酸を含むように修飾されてもよい。こうした修飾は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第７，５２１，５４１号；同第８，４５５，６２２号及び同第９，０００，１３０号；Ｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８：１２０４７−１２０５７（２００９）；Ａｘｕｐ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０９：１６１０１−１６１０６（２０１２）；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０６：３０００−３００５（２００９）；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，２５：３５１−３６１（２０１４）を参照のこと）。
【０２４２】
特定の実施形態では、本開示のＡＤＣは、１つ以上の鎖間ジスルフィド連結を還元することによって遊離されたシステイン残基に適切なリンカーを介してコンジュゲートしたオーリスタチン類似体を含む。
【０２４３】
本明細書に記載のＡＤＣでは、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体は、低い平均薬物抗体比（ＤＡＲ）で、リンカーを介して、毒素にコンジュゲートしている。低いＤＡＲは、具体的には０．５を超え、３．９未満であり、例えば、特定の実施形態では、約１．５〜約２．５である。
【０２４４】
低い平均ＤＡＲでＡＤＣを調製するための様々な方法が当該技術分野では公知である（例えば、ＭｃＣｏｍｂｓ  ａｎｄ  Ｏｗｅｎによるレビュー、Ｔｈｅ  ＡＡＰＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１７（２）：３３９−３５１（２０１５）及びそれらの参照文献；Ｂｏｕｔｕｒｅｉｒａ＆Ｂｅｒｎａｒｄｅｓ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１１５：２１７４−２１９５（２０１５）を参照のこと）。
【０２４５】
例えば、システイン残基へのコンジュゲーションのために、抗体鎖間ジスルフィド結合の部分的な還元が行われ、その後、リンカー−毒素へのコンジュゲートが行われ得る。部分的な還元は、還元反応で使用される還元剤の量を制限することによって達成できる（例えば、Ｌｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，５０２：１２３−１３８（２０１２）、及びその中に記載の実施例、及び本明細書に記載の実施例を参照のこと）。好適な還元剤は、当該技術分野で公知であり、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、２−メルカプトエタノール、システアミン及び複数の水溶性ホスフィンが挙げられる。あるいは、またはさらに、低い平均ＤＡＲを得るために、より少ない当量のリンカー−毒素を使用することができる。
【０２４６】
あるいは、鎖間ジスルフィド結合を構成するシステイン残基のうちの１つ以上がセリン残基で置換され、コンジュゲーションに利用できるシステイン残基が少なくなるように、操作された抗体を使用してもよい（ＭｃＤｏｎａｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．ＰＥＤＳ，１９（７）：２９９−３０７を参照のこと）。次に、操作された抗体は、還元剤で処理し、リンカー−毒素にコンジュゲートさせることができる。
【０２４７】
別のアプローチでは、通常は鎖間ジスルフィド結合を構成する２つのシステインを架橋するビスチオールリンカーを使用する。毒素分子を１つのみ有するビスチオールリンカーを使用することで、４つの鎖間ジスルフィド結合がすべて還元されて、ビスチオールリンカーに置き換わると、フルサイズの抗体で最大ＤＡＲ４のＡＤＣが生成される。ＤＡＲをさらに減少させるために、鎖間ジスルフィド結合の部分的還元及び／またはより少ない当量のリンカーをビスチオールリンカーと組み合わせて使用することができる。様々なビスチオールリンカーが当技術分野で公知である（例えば、Ｂａｄｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，２５（６）：１１２４−１１３６（２０１４）；Ｂｅｈｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．，１２：３９８６−３９９８（２０１５）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，７：７９９−８０２（２０１６）；Ｍａｒｕａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，６：６６４５（２０１５）を参照されたい）。
【０２４８】
低い平均ＤＡＲを有するＡＤＣを生成するために、システイン操作アプローチを使用してもよい。こうしたアプローチは、コンジュゲーションのための部位特異的ハンドルを提供するために、溶媒にアクセス可能なシステインを抗体に対して操作することを伴う。システイン残基の導入に適切な複数の部位がＩｇＧ構造で同定されており、Ｊｕｎｕｔｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，３３２（１−２）：４１−５２（２００８）；Ｊｕｎｕｔｕｌａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６（８），９２５−９３２（２００８）、及び米国特許第９，３１５，５８１号；同第９，０００，１３０号；同第８，４５５，６２２号；同第８，５０７，６５４号及び同第７，５２１，５４１号のものが挙げられる。
【０２４９】
低い平均ＤＡＲのＡＤＣは、限られた量の活性化リンカー−毒素を用いたリジンコンジュゲーションによっても調製され得る。抗体のＮ末端アミノ酸での選択的反応も使用できる。例えば、Ｎ末端セリンは過ヨウ素酸塩でアルデヒドに酸化され、次にリンカー−毒素と反応し得る（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，２６（１０）：２０８５−２０９６（２０１５）を参照のこと）。同様に、Ｎ末端システイン残基は、アルデヒドと選択的に反応して、チアゾリジノンを得ることができる（例えば、Ｂｅｒｎａｒｄｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，８：２０７９−２０８９を参照のこと）。
【０２５０】
追加のアプローチとしては、ｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡｃＰｈｅ）またはセレノシステイン（Ｓｅｃ）などの１つ以上の非天然アミノ酸を含めるように抗体を操作することが挙げられる。ｐＡｃＰｈｅのケト基は、末端アルコキシアミンまたはヒドラジドを含むリンカー−毒素と反応して、オキシムまたはヒドラゾン結合を形成することができる（例えば、Ａｘｕｐ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，１０９：１６１０１−１６１０６（２０１２）を参照のこと）。Ｓｅｃ含有抗体は、マレイミドまたはヨードアセトアミドを含むリンカー−毒素と反応して、セレノエーテルコンジュゲートを形成することができる（例えば、Ｈｏｆｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８：１２０４７−１２０５７（２００９）を参照されたい）。
【０２５１】
抗体はまた、特定の酵素によって認識されるペプチドタグを含むように操作され、酵素触媒コンジュゲーションが可能になり得る。例えば、Ｓｏｒｔａｓｅ−Ａ（ＳｏｒｔＡ）は、ＬＰＸＴＧ配列を認識する。このペンタペプチドは、抗体のＮ末端またはＣ末端に操作して、ＳｏｒｔＡ媒介コンジュゲーションが可能になり得る（例えば、米国特許出願公開第２０１６／０１３６２９８号；Ｋｏｒｎｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，ｍＡｂｓ，６（２）：３５４−３６６（２０１４）を参照されたい）。トランスグルタミナーゼは、Ｎ２９７位で脱グリコシル化された抗体（酵素的結合のためにＱ２９５を露出させる）を使用するか、抗体を操作して「グルタミンタグ」（ＬＬＱＧ）を含めるようにすることによってＤＡＲ２のＡＤＣを生成するためにも使用されている（Ｊｅｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，４９：９９９５−９９９７（２０１０）；Ｓｔｒｏｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０（２）：１６１−１６７（２０１３））。別のアプローチでは、適切なコンセンサス配列を抗体に操作して、操作された抗体をホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）と共発現させることにより、ホルミルグリシン残基を抗体に導入することができる。導入されたホルミルグリシンのアルデヒド官能基は、毒素をコンジュゲートするためのハンドルとして使用されてもよい（例えば、Ｄｒａｋｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，２５（７）：１３３１−１３４１（２０１４）を参照のこと）。
【０２５２】
ＤＡＲ２のＡＤＣを生成するために使用される別のアプローチは、グリコシル化抗体に見られる天然の糖へのリンカー−毒素のコンジュゲーションによるものである。グリコシル化抗体へのコンジュゲーションは、例えば、末端糖残基を過ヨウ素酸酸化させてアルデヒドを生成し、次に適切なリンカー−毒素にコンジュゲートさせることによって、または天然糖を末端シアル酸残基で修飾し、次に、これを酸化してアルデヒドを生成し、リンカー−毒素とコンジュゲートさせることができる糖鎖工学的アプローチによって達成され得る（Ｚｈｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，２５（３）：５１０−５２０（２０１４））。
【０２５３】
抗体に対して活性部分をコンジュゲートするためのＵＶ架橋の使用も報告されている。この方法では、ヌクレオチド結合部位（ＮＢＳ）を使用して、反応性チオール部分を有する抗体の部位特異的共有官能化を行う。システインのインドール−３−酪酸（ＩＢＡ）コンジュゲート型を使用して、ＮＢＳにおいて反応性チオール部分を抗体に部位特異的に光架橋した。次に、チオール部分を使用して、チオール反応性基を有するリンカー−毒素をコンジュゲートさせてもよい（Ａｌｖｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，２５（７）：１１９８−１２０２（２０１４））。
【０２５４】
あるいは、低い平均ＤＡＲを有するＡＤＣは、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー分離法を使用して、ＤＡＲの種の混合物を含むＡＤＣ調製物から単離され得る（例えば、Ｈａｍｂｌｅｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１０：７０６３−７０７０（２００４）；Ｓｕｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ．，２８：１３７１−８１（２０１７）；米国特許出願公開第２０１４／０２８６９６８号を参照のこと）。
【０２５５】
低い平均ＤＡＲを有するＡＤＣ調製物は、非コンジュゲート（すなわち、ＤＡＲ０）抗体を平均ＤＡＲ≧３．９のＡＤＣ調製物に追加することによっても生成できる。当技術分野で知られているように、コンジュゲーション法の大部分は、様々なＤＡＲの種を含むＡＤＣ調製物をもたらし、報告されているＤＡＲは個々のＤＡＲの種の平均である。特定の実施形態では、ある割合のＤＡＲ０の種を含むＡＤＣ調製物が有利であり得る。いくつかの実施形態では、３．９未満の平均ＤＡＲを有するＡＤＣ調製物は、ＤＡＲ０の種を少なくとも５％含み得る。いくつかの実施形態では、ＡＤＣ調製物は、ＤＡＲ０の種を少なくとも１０％、例えば、ＤＡＲ０の種を少なくとも１５％またはＤＡＲ０の種を少なくとも２０％含み得る。いくつかの実施形態では、ＡＤＣ調製物は、ＤＡＲ０の種を約５％〜約５０％含み得る。いくつかの実施形態では、ＡＤＣ調製物は、ＤＡＲ０の種を約１０％〜約５０％、例えば、ＤＡＲ０の種を約１０％〜約４０％、または約１０％〜約３０％含み得る。
【０２５６】
ＡＤＣの平均ＤＡＲは、ＵＶ／ＶＩＳ分光分析、ＥＬＩＳＡベースの手法、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ＵＶ−ＭＡＬＤＩ質量分析（ＭＳ）、及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳなどのクロマトグラフィー技法などの標準的技法で決定され得る。さらに、薬物連結型（例えば、ＤＡＲ０、ＤＡＲ１、ＤＡＲ２などの種の分画）の分布は、ＭＳ（付随するクロマトグラフィー分離ステップの有無にかかわらず）、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣまたは等電点電気泳動ゲル電気泳動（ＩＥＦ）など、当技術分野で公知である様々な技法によって分析されてもよい（例えば、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ．，２８：１３７１−８１（２０１７）；Ｗａｋａｎｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ，３：１６１−１７２（２０１１）を参照のこと）。
【０２５７】
特定の実施形態では、ＡＤＣの平均ＤＡＲは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）法によって決定される。
【０２５８】
コンジュゲーション後に、ＡＤＣは、当該技術分野で既知の精製方法によって精製され、コンジュゲートしていない反応物質及び／またはあらゆるコンジュゲート凝集体から分離され得る。こうした方法としては、これらに限定されないが、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、クロマト分画、限外濾過、遠心限外濾過、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【０２５９】
テスト
ＨＥＲ２発現癌細胞におけるＡＤＣの抗癌活性は、標準的技法を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ  ｖｉｖｏで試験を行ってもよい。
【０２６０】
例えば、ＡＤＣの細胞毒性活性は、ＨＥＲ２発現癌細胞を細胞培養培地中でＡＤＣに曝露し、細胞を適切な期間（例えば、約６時間〜約７日間）培養し、その後、細胞生存率を測定することにより、測定することができる。非ＨＥＲ２発現細胞は、対照として含めることができる。
【０２６１】
ＡＤＣを試験するために使用され得る、ＨＥＲ２を様々なレベルで発現する様々な癌細胞株は、当技術分野で公知であり、その多くは市販されている（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ；Ａｄｄｅｘｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；ＤＳＭＺ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙから）。例えば、ＢＴ−４７４（３＋）、ＳＫ−ＢＲ−３（３＋）、ＨＣＣ１９５４（３＋）、ＪＩＭＴ−１（２＋）及びＺＲ−７５−１（１＋）細胞株が挙げられる。これら及び他の例を表８にまとめる。
【０２６２】
（表８）目的の細胞株におけるＨＥＲ２の相対的発現レベル
2021515793.tif 000070
【０２６３】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍成長を阻害するＡＤＣの能力は、当技術分野で公知の標準的技法を使用して適切な動物モデルで決定することができる（例えばＥｎｎａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照のこと）。一般に、抗腫瘍化合物をスクリーニングするための現在の動物モデルは異種移植モデルであり、このモデルでは、ヒト腫瘍が動物、典型的にはげっ歯類に移植されている。
【０２６４】
例えば、ＡＤＣは、腫瘍断片を皮下移植されたマウス、または適切な数の癌細胞が移植されたマウスを使用して、ＨＥＲ２発現腫瘍について、０日目に、ｉｎ  ｖｉｖｏで試験が行われてもよい。腫瘍は、所望のサイズまで成長させることができ、腫瘍の発達が不十分である動物は除去される。ＡＤＣ治療は一般に、腫瘍の種類に応じて、移植後３〜２２日に開始する。ＡＤＣは、例えば、静脈内（ｉｖ）注射によって動物に投与され得る。腫瘍は、所定の期間の後、または継続的に（例えば、週に２回または３回）本研究の所定のエンドポイントまで、例えば、腫瘍が所定のサイズまたは重量に到達したときに測定される。異種移植モデルでは、様々なレベルで、ＨＥＲ２を発現する腫瘍を使用できる。患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）は、特に有用である。
【０２６５】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＡＤＣの毒性作用は、最初はげっ歯類、例えばマウスまたはラットで、治療中の動物の体重へのそれらの作用を測定することによって評価できる。動物から採取した血液サンプルについて、血液学的プロファイル及び肝酵素分析を行うこともできる。
【０２６６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ毒性及び薬物動態は、標準プロトコルに従って、適切な動物モデル、例えば、ラットまたは非ヒト霊長類でさらに分析することができる。ヒト及びカニクイザルのＨＥＲ２は、９８％の配列相同性を共有するため、カニクイザルは、この点において特に有用である。
【０２６７】
本明細書に記載のＡＤＣは、同じ毒素用量で投与された場合、ＤＡＲ≧３．９を有する対応するＡＤＣと比較して、改善された忍容性及びより低い毒性を有する。特定の実施形態では、ＡＤＣは、同じ毒素用量で投与された場合、ＤＡＲ≧３．９を有する対応するＡＤＣの２倍を超える忍容性の改善を示す。いくつかの実施形態では、ＡＤＣは、同じ毒素用量で投与された場合、ＤＡＲ≧３．９を有する対応するＡＤＣの忍容性の２．２倍超、例えば２．３倍、２．４倍または２．５倍の忍容性の改善を示す。忍容性の改善は、例えば、本開示のＡＤＣ及びＤＡＲ≧３．９を有する対応するＡＤＣの最大耐量（ＭＴＤ）、無有害作用量（ＮＯＡＥＬ）または毒性が発現しない最高投与量（ＨＮＳＴＤ）の比較により決定され得る。ＭＴＤ、ＮＯＡＥＬ及び／またはＨＮＳＴＤは、適切な動物モデル、例えば、げっ歯類または非ヒト霊長類における標準的技法によって測定され得る。
【０２６８】
医薬組成物
治療的使用のために、ＡＤＣは、ＡＤＣ及び薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む組成物の形態で提供され得る。組成物は、周知の容易に入手できる成分を使用して、既知の手順によって調製することができる。
【０２６９】
医薬組成物は、例えば、経口（例えば、頬側または舌下など）、局所、非経口、直腸または膣経路によるか、または吸入またはスプレーによる対象への投与のために配合され得る。本明細書で使用される場合、「非経口」という用語としては、皮下注射、及び皮内、関節内、静脈内、筋肉内、血管内、胸骨内、髄腔内の注射または注入が挙げられる。医薬組成物は、典型的には、例えば、シロップ、エリキシル、錠剤、トローチ、ロゼンジ、ハードまたはソフトカプセル、ピル、坐剤、油性または水性懸濁液、分散性粉末または顆粒、エマルジョン、注射剤または溶液として、対象への投与に好適である形式で配合される。医薬組成物は、単位投与配合物として提供されてもよい。
【０２７０】
特定の実施形態では、ＡＤＣを含む医薬組成物は、例えば凍結乾燥配合物または水溶液として、単位投与量の注射可能な形態で、非経口投与用に配合される。
【０２７１】
薬学的に許容される担体は、一般に、用いられる投薬量及び濃度において、レシピエントにとって非毒性である。こうした担体の例としては、これらに限定されないが、緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸及びメチオニン；保存剤、例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルアルコール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチルまたはプロピルパラベンなど）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール及びｍ−クレゾール；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミンまたはゼラチン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン；単糖類、二糖類、及び他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース、またはデキストリン；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウム；金属複合体、例えば、亜鉛タンパク質複合体；ならびに非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
【０２７２】
特定の実施形態では、ＡＤＣを含む組成物は、無菌の注射可能な水性または油性の溶液または懸濁液の形態であってもよい。こうした懸濁液は、当技術分野で公知である好適な分散剤または湿潤剤及び／または懸濁剤を使用して配合してもよい。無菌の注射可能な溶液または懸濁液は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または担体中にＡＤＣを含んでもよい。使用できる許容可能な希釈剤及び担体としては、例えば、１，３−ブタンジオール、水、リンガー溶液または等張塩化ナトリウム溶液が挙げられる。さらに、無菌の固定油を担体として使用してもよい。本目的のために、合成モノまたはジグリセリドなど、様々な無刺激性固定油が利用されてもよい。加えて、オレイン酸などの脂肪酸が注入可能な調製物中で使用されることが分かっている。局所麻酔薬、防腐剤及び／または緩衝剤などのアジュバントもまた、注射可能な溶液または懸濁液として挙げることができる。
【０２７３】
特定の実施形態では、ＡＤＣを含む組成物は、ヒトへの静脈内投与のために配合され得る。典型的には、静脈内投与用の化合物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要な場合、組成物は可溶化剤及び／または注射部位での痛みを和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔剤を含んでもよい。概して、成分は、単位剤形で、例えば、活性剤の量を示すアンプルもしくはサシェなどの気密封止容器内に凍結乾燥粉末または水不含濃縮物として、別々に供給されるか、または一緒に混合されて供給される。本組成物は、注入によって投与される場合、例えば、薬学的グレードの無菌の水または食塩水を含む注入ボトルで分注され得る。本組成物を注射によって投与する場合、投与の前に成分を混合することができるように、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【０２７４】
他の医薬組成物及び医薬組成物を調製する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」（公式には「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」）；Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（２０００）に記載されている。
【０２７５】
使用方法
本明細書に記載のＡＤＣは、ＨＥＲ２発現腫瘍細胞の成長を阻害する方法で使用されてもよい。細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏであり得る。特定の実施形態では、ＡＤＣは、対象のＨＥＲ２発現癌または腫瘍を治療する方法において使用されてもよい。
【０２７６】
ＨＥＲ２発現癌の治療は、症状の緩和、腫瘍径の縮小、腫瘍の成長の阻害、疾患の１つ以上の直接的もしくは間接的な病理学的結果の減少、転移の防止、疾患進行速度の低下、病状の改善もしくは緩和、生存率の改善、無増悪生存期間の延長、寛解、及び／または予後の改善のうちの１つ以上をもたらし得る。
【０２７７】
特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＤＣによるＨＥＲ２発現癌の治療により、疾患の進行を遅らせる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＤＣによるＨＥＲ２発現癌の治療により、腫瘍退縮がもたらされる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＤＣによるＨＥＲ２発現癌の治療により、腫瘍成長の阻害がもたらされる。
【０２７８】
ＨＥＲ２発現癌は、典型的には、固形腫瘍である。ＨＥＲ２発現固形腫瘍の例としては、これらに限定されないが、乳癌、卵巣癌、肺癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、尿路上皮癌、膵癌、唾液腺癌及び脳癌が挙げられる。ＨＥＲ２発現乳癌としては、エストロゲン受容体ネガティブ（ＥＲ−）、及び／またはプロゲステロン受容体ネガティブ（ＰＲ−）乳癌及びトリプルネガティブ（ＥＲ−、ＰＲ−、低ＨＥＲ２）乳癌が挙げられる。ＨＥＲ２発現肺癌としては、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び小細胞肺癌が挙げられる。
【０２７９】
特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＤＣは、ＨＥＲ２発現乳癌、卵巣癌、肺癌または胃癌の治療に使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＤＣは、ＨＥＲ２発現乳癌の治療に使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＤＣは、エストロゲン受容体及びプロゲステロン受容体も陰性であるＨＥＲ２発現乳癌の治療に使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＤＣは、ＨＥＲ２発現トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）の治療に使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＤＣは、脳に転移したＨＥＲ２発現乳癌の治療に使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＤＣは、ＨＥＲ２発現卵巣癌の治療に使用され得る。
【０２８０】
当該技術分野で公知であるように、ＨＥＲ２発現癌は、それらが発現するＨＥＲ２のレベルによって（すなわち、「ＨＥＲ２状態」によって）特徴付けられ得る。ＨＥＲ２状態は、免疫組織化学（ＩＨＣ）、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、発色ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）などによって評価できる。
【０２８１】
ＩＨＣでは、細胞膜上でのＨＥＲ２タンパク質の発現を同定する。腫瘍生検からのパラフィン包埋組織片は、ＩＨＣアッセイに供され、以下のようなＨＥＲ２タンパク質染色強度基準に一致し得る：
スコア０：染色は観察されないか、または腫瘍細胞の１０％未満（典型的には、＜２０，０００受容体／細胞）において膜染色が観察される。
スコア１＋：わずかな／ほとんど認識不可能な膜染色が、腫瘍細胞の１０％超で検出される。細胞は、それらの膜の一部分が染色されるのみである。典型的には、約１００，０００受容体／細胞。
スコア２＋：弱〜中度の完全膜染色が、腫瘍細胞の１０％超（典型的には、約５００，０００受容体／細胞）で観察される。
スコア３＋：中〜強度の完全膜染色が、腫瘍細胞の１０％超（典型的には、約２，０００，０００受容体／細胞）で観察される。
【０２８２】
０または１＋のＨＥＲ２発現スコアを有する腫瘍は、ＨＥＲ２陰性の特徴であるが、２＋または３＋のスコアを有するこれらの腫瘍は、ＨＥＲ２陽性の特徴である。
【０２８３】
ＩＨＣを使用したＨＥＲ２検出に利用できるＦＤＡ承認の市販キットの例としては、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標）（Ｄａｋｏ  Ｄｅｎｍａｒｋ  Ａ／Ｓ）；ＰＡＴＨＷＡＹ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）；ＩｎＳｉｔｅ（商標）ＨＥＲ２／ＮＥＵキット（Ｂｉｏｇｅｎｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）及びＢｏｎｄ  Ｏｒａｃｌｅ  ＨＥＲ２  ＩＨＣシステム（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓが挙げられる。
【０２８４】
本明細書に記載のＡＤＣは、ＨＥＲ２を様々なレベルで発現するがんの治療に有用であり得る。特定の実施形態では、ＡＤＣは、高レベルのＨＥＲ２（ＩＨＣ３＋）を発現する癌の治療に使用することができる。いくつかの実施形態では、ＡＤＣは、高レベルのＨＥＲ２（３＋ＩＨＣ）または中程度レベルのＨＥＲ２（２＋ＩＨＣまたは２＋／３＋ＩＨＣ）を発現するがんの治療に使用することができる。いくつかの実施形態では、ＡＤＣは、高レベルのＨＥＲ２（３＋ＩＨＣ）、中程度レベルのＨＥＲ２（２＋ＩＨＣまたは２＋／３＋ＩＨＣ）、または低レベルのＨＥＲ２（１＋ＩＨＣまたは１＋／２＋ＩＨＣ）を発現する癌の治療に使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＤＣは、ＩＨＣによりＨＥＲ２陰性とスコア付けされた癌の治療に使用することができる。
【０２８５】
特定の実施形態では、ＡＤＣで治療される癌のＨＥＲ２レベルは、ＩＨＣによって決定される。いくつかの実施形態では、ＡＤＣで治療される癌のＨＥＲ２レベルは、Ｈｅｒｃｅｐｔｅｓｔ（商標）アッセイを使用して実施されるＩＨＣによって決定される。
【０２８６】
ＨＥＲ２発現癌は、本質的に均一であり得る（すなわち、腫瘍細胞の大部分がほぼ同じ量のＨＥＲ２を発現する）か、または本質的に不均一であり得る（すなわち、異なるレベルのＨＥＲ２を発現する異なる腫瘍細胞集団を含む）。ＡＤＣは、ＨＥＲ２レベルに関して同種または異種のいずれかであるＨＥＲ２発現癌を治療するために使用され得ることが企図される。
【０２８７】
特定の実施形態では、ＡＤＣは、他の標準治療法に耐性があるかまたは耐性を有するようになるＨＥＲ２発現癌を有する対象を治療するための方法に用途を見出す。いくつかの実施形態では、ＡＤＣは、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、ペルツズマブ（ペルジェタ（登録商標））、Ｔ−ＤＭ１（カドサイラ（登録商標））もしくはトラスツズマブエムタンシン）またはタキサン（パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセルなど）などの１つ以上の現在の治療法に応答しないＨＥＲ２発現癌を有する対象を治療する方法に用途を見出す。いくつかの実施形態では、ＡＤＣは、トラスツズマブに耐性であるＨＥＲ２発現癌を有する対象を治療するための方法に用途を見出す。いくつかの実施形態では、ＡＤＣは、ペルツズマブに耐性であるＨＥＲ２発現癌を有する対象を治療するための方法に用途を見出す。いくつかの実施形態では、ＡＤＣは、Ｔ−ＤＭ１に耐性であるＨＥＲ２発現癌を有する対象を治療するための方法に用途を見出す。いくつかの実施形態では、患者が以前の抗ＨＥＲ２療法で進行した場合、ＡＤＣは転移性癌の治療に用途を見出す。
【０２８８】
ＡＤＣが、耐性があるか、または難治性であるＨＥＲ２発現癌を有する対象の治療に使用される場合、及び／または別の治療剤による治療から再発した場合、ＡＤＣは、対象が受けた以前の治療の数に応じて、二次治療、または三次治療または四次治療の一部となり得る。
【０２８９】
特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＤＣは、ＨＥＲ２発現癌を有する対象の治療において、追加の抗腫瘍剤と併せて使用されてもよい。追加の抗腫瘍剤は、上記のものなどの治療用抗体、または化学療法剤であってよい。ＨＥＲ２発現癌の治療に一般的に使用される化学療法剤としては、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、アルブミン結合パクリタキセルアブラキサン（登録商標）、ドセタキセル、ゲムシタビン、ビノレルビン、イリノテカン、エトポシド、ビンブラスチン、ペメトレキセド、５−フルオロウラシル（フォリン酸を含むかまたは含まない）、カペシタビン、カルボプラチン、エピルビシン、オキサリプラチン、フォルフィリノックス、シクロホスファミド、及び当技術分野で公知であるこれらの剤の様々な組み合わせが挙げられる。追加の剤（複数可）は、ＡＤＣと同時にまたは逐次的に対象に投与することができる。
【０２９０】
特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＤＣを使用して、以前にいかなる抗癌治療も受けていないＨＥＲ２発現癌を有する対象を治療できることが企図される（すなわち、ＡＤＣを一次治療として使用してもよい）。
【０２９１】
特定の実施形態では、上記の方法においてＡＤＣにより治療される対象は、ヒト、非ヒト霊長類または他の哺乳動物であり得る。いくつかの実施形態では、上記の方法においてＡＤＣにより治療されている対象は、ヒト対象である。
【０２９２】
対象に投与されるＡＤＣの量は、治療される状態、選択された投与経路、投与される実際の化合物、個々の対象の年齢、体重、及び応答、ならびに対象の症状の重症度など、関連する状況を考慮して変化するが、治療有効量である。
【０２９３】
本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、列挙された方法の目的、例えば治療される疾患の症状の１つ以上の改善を達成するために投与する必要があるＡＤＣの量を指す。ＨＥＲ２発現癌の治療に有効であろう本明細書に記載のＡＤＣの量は、標準臨床技法によって決定することができる。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを任意で、最適な投薬量範囲の同定を補助するために使用してもよい。有効用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から誘導された用量反応曲線から外挿する。
【０２９４】
医薬キット
特定の実施形態は、本明細書に記載のＡＤＣを含む医薬キットを提供する。
【０２９５】
キットには、典型的には、容器、及び容器上のまたは容器と関連したラベル及び／または添付文書を含む。ラベルまたは添付文書には、治療薬の商業用パッケージに通例含まれる指示を指し、これには、かかる治療薬の適応症、使用、投薬量、投与、禁忌、及び／またはその使用に関する警告に関する情報が提供される。ラベルまたは添付文書には、医薬または生物学的産物の製造、使用、または販売を管轄する政府機関により規定された書式の説明書をさらに含み得、この説明書には、ヒトまたは動物の投与に関する製造、使用、または販売の政府機関による承認が織り込まれている。ラベルまたは添付文書には、ＡＤＣがＨＥＲ２発現癌の治療に使用されるためのものであることも示している。容器には、ＡＤＣを含む組成物を保持し、いくつかの実施形態では、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通され得るストッパーを有するバイアルであり得る）。
【０２９６】
ＡＤＣを含む組成物を含む容器に加えて、キットは、キットの他の成分を含む１つ以上の追加の容器を含み得る。例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液またはデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液、他の緩衝液または希釈剤。
【０２９７】
好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、静注液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成され得る。必要に応じて、キットの１つ以上の構成要素を凍結乾燥させるか、粉末または顆粒などの乾燥形態で提供し得る。キットには、凍結乾燥または乾燥構成要素（複数可）を再構成するための好適な溶媒を追加で含めることができる。
【０２９８】
このキットには、フィルター、針、及びシリンジなど、商業的及びユーザの立場から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
【０２９９】
以下の実施例は、例証目的のために提供されており、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０３００】
実施例１：リンカー−毒素の合成
次の例では、次のオーリスタチン類似体（化合物９）を含む例示的なリンカー−毒素（リンカー−毒素００１）の調製について記載する。
2021515793.tif 000071
【０３０１】
同様のプロトコルを使用して、以下の例示的な化合物など他のオーリスタチン類似体を含むリンカー−毒素を調製することができる（国際特許出願公開ＷＯ２０１６／０４１０８２も参照のこと）：
2021515793.tif 000072
【０３０２】
１．１  （２Ｒ，３Ｒ）−３−メトキシ−２−メチル−３−（（Ｓ）−ピロリジン−２−イル）プロパン酸塩（化合物１）
2021515793.tif 000073
（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパン酸（Ｂｏｃ−Ｄａｐ−ＯＨ、４．３１ｇ、１５．０ｍｍｏｌ）を含む無水エタノール（２７．０ｍＬ）に塩化チオニル（３．０ｍＬ）を０℃で滴下した。得られた溶液を室温まで加温し、進行をＨＰＬＣ−ＭＳでモニターした。１８時間後、残留している出発物質は検出されず、溶液を減圧下で濃縮乾固した。得られた油をトルエン（１０ｍＬ）に懸濁し、２回減圧濃縮し、次にジエチルエーテル（５ｍＬ）に懸濁し、２回減圧濃縮して、白色固体泡（３．７８ｇ、定量％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ｏｂｓ． ＝ ２１６．５ （Ｍ＋１）
【０３０３】
１．２  （３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタン酸（化合物３）
2021515793.tif 000074
化合物２は、国際特許出願公開ＷＯ２０１６／０４１０８２に記載されているように調製した。
【０３０４】
化合物２（６．９６５ｇ、１４．１４ｍｍｏｌ）を含むジクロロメタン（２０ｍＬ）撹拌溶液に、トリフルオロ酢酸（５．０ｍＬ）を加えた。反応の完了をＨＰＬＣ−ＭＳでモニターし、４０時間後、出発物質は残留していなかった。反応物を減圧濃縮し、トルエン（２ｘ１０ｍＬ）及びジクロロメタン（２ｘ１０ｍＬ）で共蒸発させて、泡状の白色固体（６．２ｇ、残留ＴＦＡを含む定量収率）を得た。この材料を２００ｍＬの高温の１：３のＥｔＯＡｃ：ヘキサンに溶解し、室温まで冷却した。冷却中に、いくつかの小さい結晶と同様に沈殿物が形成された。５ｍＬのＥｔＯＡｃを加え、懸濁液を再度加熱して、沈殿を完全に溶解させた。室温まで冷却するとさらに結晶が形成され、フラスコを−３０℃に一晩置いた。翌朝、母液をデカントし、結晶を２ｘ５０ｍＬヘキサンですすぎ、高真空下で乾燥した。結晶性生成物５．６７ｇを回収した。ＭＳ ｍ／ｚ ｏｂｓ． ＝ ４０５．７ （Ｍ＋１）
【０３０５】
１．３  エチル（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノエート（化合物４）
2021515793.tif 000075
化合物３（６．７１１ｇ、１５．３７ｍｍｏｌ、１．０２５当量）を含むジクロロメタン（５．０ｍＬ）及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５．０ｍＬ）の混合物の撹拌溶液に、室温で、ＨＡＴＵ（５．７３２ｇ、１５．０７ｍｍｏｌ、１．００５当量）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（７．８４ｍＬ、３当量）を加えた。室温で３０分撹拌後、化合物１（３．７７６ｇ、１５．００ｍｍｏｌ、１．０当量）を含むジクロロメタン（１．０ｍＬ）及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．０ｍＬ）の混合物の溶液を滴下し、追加の３ｍＬの１：１ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを含む残留化合物１ですすいだ。反応をＨＰＬＣ−ＭＳでモニターし、１５分後に残留化合物１は観察されなかった。反応物を減圧濃縮し、酢酸エチルで希釈し（約１２５ｍＬ）、有機相を１Ｍ  ＨＣｌ（２ｘ５０ｍＬ）、１ｘｄＨ２Ｏ（１ｘ５０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（３ｘ５０ｍＬ）、ブライン（２５ｍＬ）で抽出した。酸性及び塩基性の水性層を両方とも２５ｍＬのＥｔＯＡｃで洗浄した。次に、すべての有機物をプールし、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、赤い油を得た。残留物を最小量のジクロロメタン（約１０ｍＬ）に溶解し、精製するために（２０〜１００％ＥｔＯＡｃを含むヘキサン、１０カラム容量）、Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）ＳＮＡＰ  Ｕｌｔｒａ  ３６０ｇシリカゲルカラム（Ｉｓｏｌｅｒａ（商標）Ｆｌａｓｈ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｂｉｏｔａｇｅ  ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）にロードした。純粋な生成物を含有する画分をプールして、７．９ｇの泡状の白色固体を回収した。純粋でない画分を、Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）ＳＮＡＰ  Ｕｌｔｒａ  １００ｇシリカゲルカラムで第２の精製に供し、純粋な生成物と共にプールし、白色泡状固体（８．３９０ｇ、８８．３％）を回収した。ＭＳ ｍ／ｚ ｏｂｓ． ＝ ６３４．７ （Ｍ＋１）
【０３０６】
１．４  （２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパン酸（化合物５）
2021515793.tif 000076
化合物４（８．３９０ｇ、１３．２４ｍｍｏｌ）を含む１，４−ジオキサン（１５８ｍＬ）の撹拌溶液に、ｄＨ２Ｏ（３９．７ｍｌ）及び水酸化リチウム一水和物（Ｈ２Ｏ中１Ｍ、３９．７ｍＬ、３当量）を加えた。反応物を４℃で撹拌し、出発物質の消費についてＨＰＬＣ−ＭＳでモニターした。これは、微量の化合物４のみが残存するまで３日を要した。反応の過程で、望ましい材料に加えて、メタノールの損失に対応する新規生成物（β−脱離、＜２％）が小さい割合で形成された。反応物に１Ｍ  ＨＣｌ水溶液（５０ｍＬ）を加えて酸性化し、減圧濃縮してジオキサンを除去した。残りの反応混合物を酢酸エチル（４ｘ５０ｍＬ）で抽出し、有機相をプールし、ブライン（１５ｍＬ＋２ｍＬの２Ｍ  ＨＣｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧濃縮して、淡色の油を得た。油をジエチルエーテル（約５０ｍＬ）に再溶解し、減圧濃縮（３倍）して、残留ジオキサンの除去を促進し、硬い油として表題生成物（７．８１ｇ、収率９７％、若干の残留ジオキサン及び化合物４）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ｏｂｓ． ＝ ６０６．７ （Ｍ＋１）
【０３０７】
１．５  ベンジル（（Ｓ）−１−（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（４−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）フェニル）スルホンアミド）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）（メチル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）カルバメート（化合物７）
2021515793.tif 000077
化合物６は、国際特許出願公開ＷＯ２０１６／０４１０８２に記載されているように調製した。
【０３０８】
化合物５（７．１２ｇ、１１．７５４ｍｍｏｌ）を含むジクロロメタン（２０ｍＬ）撹拌溶液に、２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−（４−スルファモイルフェニル）アセトアミド（化合物６、４．０９５ｇ、１．３当量、３ｍＬ  ＤＭＦに溶解）、Ｎ，Ｎ−ジメチルピリジン（１．８６７ｇ、１．３当量）及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．５ｍＬ）を加え、淡黄色の懸濁液を生成した。５ｍＬのＤＭＦをさらに加えたが、溶液は浄化されなかった。Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）（２．８１７ｇ、１．２５当量）を一部加え、その反応をＨＰＬＣ−ＭＳによりモニターした。４８時間後、反応はそれ以上進行しなくなり、さらに４００ｍｇのＥＤＣＩを添加した。１８時間後、残留出発物質は観察されず、反応物を減圧濃縮して、黄色の油を得た。油を酢酸エチル（約１５０ｍＬ）及び１Ｍ  ＨＣｌ（２０ｍＬ）に溶解し、その有機相を冷２Ｍ  ＨＣｌ（２ｘ１０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（１ｘ１０ｍＬ）、ブライン（２０ｍＬ＋５ｍＬ  ２Ｍ  ＨＣｌ）で洗浄した。酸性及び塩基性の水性画分をＥｔＯＡｃ（１ｘ２０ｍＬ）で抽出し、すべての有機画分をプールし、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧濃縮して油状の粗固体（１３ｇ）を得た。残留物をジクロロメタン（約１０ｍＬ）に溶解し、Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）ＳＮＡＰ  Ｕｌｔｒａ  ３６０ｇシリカゲルカラムにロードし、５０％ＥｔＯＡｃで３カラム容量のプラトーを用いて、１２カラム容量でのヘキサングラジエント中の１０〜１００％ＥｔＯＡｃ（２％ＡｃＯＨ）で精製した。純粋な生成物を含む画分をプールし、減圧濃縮し、トルエン（２ｘ１０ｍＬ）及びジエチルエーテル（２ｘ１０ｍＬ）から溶解し、濃縮して、所望の生成物である泡状の白色固体７．１ｇを得た。不純な画分は、Ｉｓｏｌｅｒａ（商標）機器のＢｉｏｔａｇｅ（登録商標）ＳＮＡＰ  Ｕｌｔｒａ  １００ｇシリカゲルカラムを用いて浅いグラジエント条件下で繰り返し精製に供した。すべての純粋な画分をプールして、純粋な生成物を泡状の白色固体（８．６０ｇ、８６％）として回収した。ＭＳ ｍ／ｚ ｏｂｓ． ＝ ８５６．７ （Ｍ＋１）
【０３０９】
１．６  （Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（４−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）フェニル）スルホンアミド）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド（化合物７ａ）
2021515793.tif 000078
化合物７（３．７１ｇ、４．３３ｍｍｏｌ）を、マグネチックスターラーを備え、三方ガスラインアダプターを取り付けた丸底フラスコ内で１０％Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを含む酢酸エチル（３０ｍＬ）に溶解した。容器を２回減圧排気し、窒素ガスを充填した。１０％パラジウムカーボン（０．４６１ｇ、０．１当量）を一部添加し、三方アダプターをフラスコに取り付け、アダプターに水素バルーンを取り付け、容器を２回減圧排気し、水素を充填した。反応物を２日間撹拌し、その間、水素バルーンに時々再充填した。約４８時間後、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析により、出発物質が残留していないことが示された。反応物をメタノール（２０ｍＬ）で希釈して、セライトのプラグを介して濾過した。セライトをメタノール（２ｘ５０ｍＬ）で洗浄した。すべての濾液をプールし、減圧濃縮し、得られた油を溶解し、ジクロロメタンから濃縮した。減圧乾燥後、表題化合物が無色の粉末（３．１０ｇ、９９％）として単離された。ＭＳ ｍ／ｚ ｏｂｓ． ＝ ７２２．６ （Ｍ＋１）
【０３１０】
１．７  （Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（４−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）フェニル）スルホンアミド）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド（化合物８）
2021515793.tif 000079
Ｎ，Ｎ−（Ｌ）−ジメチルバリン（１．６９６ｇ、９．３５ｍｍｏｌ）を含むＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）の撹拌溶液に、ＨＡＴＵ（３．２１６ｇ、８．４６ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（３．１０ｍＬ、１７．８ｍｍｏｌ）を添加した。５分後に透明な黄色の溶液を得た。さらに１０分間撹拌を継続し、次いで化合物７ａ（３．２１３ｇ、４．４５ｍｍｏｌ）を一部添加した。さらに１時間撹拌後、ＨＰＬＣ−ＭＳにより、微量の化合物７ａが残留していることが示され、反応は１６時間であった。次に反応物を減圧濃縮し、酢酸エチル（１２０ｍＬ）及び４０ｍＬ  １：１  ＮａＨＣＯ３（飽和）：５％ＬｉＣｌで希釈し、分液漏斗に移した。水層を除去し、有機相をＬｉＣｌ（１ｘ２０ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３（飽和、２ｘ２０ｍＬ）で洗浄した。水層をプールし、ＥｔＯＡｃ（３ｘ５０ｍＬ）で抽出した。有機層をプールし、ブライン（１ｘ２０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して、ＤＭＦ含有油を得、これをロータリーエバポレーターで濃縮して残留ＤＭＦを除去し、ストロー色の粗油７ｇを得た。油を最小量の１０％メタノールを含むジクロロメタン（約１１ｍＬ）に溶解し、Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）ＳＮＡＰ  Ｕｌｔｒａ  ３６０ｇシリカゲルカラムにロードして、精製した（１５カラム容量で２〜２０％ＭｅＯＨを含むＣＨ２Ｃｌ２溶液、約１０〜１３％の溶出物）。所望の生成物を含有する画分をプールし、減圧濃縮して、表題化合物を無色の泡として得た。不純な画分を合わせ、蒸発させ、Ｉｓｏｌｅｒａ（商標）機器でのＢｉｏｔａｇｅ（登録商標）ＳＮＡＰ  Ｕｌｔｒａ  １００ｇシリカゲルカラム上で繰り返し精製に供し、最初のカラムからの純粋な生成物と組み合わせて、無色の泡状固体（３．７８ｇ）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ｏｂｓ． ＝ ８５０．６ （Ｍ＋１）
【０３１１】
１．８  （Ｓ）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（４−アミノフェニル）スルホンアミド）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド（化合物９）
2021515793.tif 000080
化合物８（０．９８０ｇ、１．１５４ｍｍｏｌ）を含む１，４−ジオキサン（１５ｍＬ）の撹拌溶液に、水（３．５ｍＬ）及び１Ｍ水酸化リチウム一水和物（３当量、３．４６ｍＬ）を添加した。得られた淡色の懸濁液を４℃で撹拌し、出発物質の消費についてＨＰＬＣ−ＭＳによりモニターした。変換が完了したら（約５日）、反応物を３．４６ｍＬの１Ｍ  ＨＣｌで中和し、減圧濃縮してジオキサンを除去した。得られた水相を６０ｍＬのＥｔＯＡｃ及び５ｍＬのブラインで希釈し、次いで酢酸エチル（２ｘ３０ｍＬ）で抽出した。有機画分をプールし、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、黄褐色の固体（０．９３０ｇ）として表題化合物を得た。Ｒｆ＝０．５（８％ＭｅＯＨを含むＣＨ２Ｃｌ２）。ＭＳ ｍ／ｚ ｏｂｓ． ＝ ７５３．７ （Ｍ＋１）
【０３１２】
１．９  ２，３，５，６−テトラフルオロフェニル３−（２−（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エトキシ）エトキシ）プロパノエート（化合物１５）
2021515793.tif 000081
乾燥させた５０ｍＬ三角フラスコに、３−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エトキシ）プロパン酸（化合物１４、１．０００ｇ、４．５２ｍｍｏｌ）及び無水マレイン酸（０．４４３ｇ、４．５２ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）で溶解させた。反応物をＮ２下で室温で６時間撹拌し、その時点で０℃まで冷却し、ｓｙｎ−コリジン（１．２６３ｍＬ、２．１当量）を滴下した。別の乾燥させた５０ｍＬ三角フラスコで、テトラフルオロフェノール（３．００２ｇ、４当量）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）に溶解させた。フラスコを氷浴で０℃まで冷却し、無水トリフルオロ酢酸（２．５４８ｍＬ、４当量）を滴下した。このフラスコを１５分間撹拌し、その時点で、ｓｙｎ−コリジン（２．４０７ｍＬ、４当量）を滴下した。フラスコをさらに１５分間撹拌し、その後内容物をシリンジを介して最初のフラスコに滴下した。反応物を室温まで加温し、撹拌をＮ２下で継続した。出発物質の消費について、反応をＨＰＬＣ−ＭＳによりモニターした。６日後、化合物１４がすべて消費して反応が完了し、化合物１５及び少量（約５％）のビス−ＴＦＰマレイン酸アミド中間体のみが残った。反応物を分液漏斗に移し、ジエチルエーテル（７５ｍｌ）で希釈し、５％  ＬｉＣｌ（１ｘ２０ｍＬ）、１Ｍ  ＨＣｌ（２ｘ２０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５ｘ２０ｍＬ）及びブライン（１ｘ２０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、残留ＤＭＦを含む褐色の粗油を得た。粗油を８ｍＬの１：１ＤＭＦ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡに溶解し、６０ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）ＳＮＡＰ  Ｕｌｔｒａ  Ｃ１８カラム（Ｂｉｏｔａｇｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）にロードして、８カラム容量でＡＣＮ／Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡの線形３０〜１００％グラジエントで精製した。純粋な画分をプールし、ブライン（２０ｍＬ）で希釈し、３ｘ５０ｍＬ  Ｅｔ２Ｏで抽出した。プールした有機物をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、淡黄色の油（１．３４ｇ、収率６６％）を回収した。
【０３１３】
１．１０  Ｔｅｒｔ−ブチル（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（Ｎ−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）スルファモイル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）カルバメート（化合物１２）
2021515793.tif 000082
化合物１１は、国際特許出願公開ＷＯ２０１６／０４１０８２に記載されているように調製した。
【０３１４】
空の２５ｍＬナシ型フラスコに、化合物１１（１．３４２ｇ、３．５８ｍｍｏｌ、３．０当量）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（０．６６４ｇ、３．４６ｍｍｏｌ、２．９当量）及び７−ヒドロキシ−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡＴ）（０．４７２ｇ、３．４６ｍｍｏｌ、２．９当量）を添加した。これらの固体を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．５ｍＬ）とジクロロメタン（４．５ｍＬ）との混合物に、室温で３０分間撹拌しながら溶解させた。別に、化合物９（０．９００ｇ、１．２０ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．２ｍＬ）とジクロロメタン（１．８ｍＬ）との混合物に溶解し、ナシ型フラスコに添加し、ジクロロメタン（１．０ｍＬ）ですすいだ。撹拌速度を１０００ｒｐｍに上げて、渦を生成した。化合物９を添加して２分以内に、塩化銅（ＩＩ）（０．５１４ｇ、３．８３ｍｍｏｌ、３．２当量）を、狭い粉末漏斗を介して直接渦の中心に一部を添加した。最初は淡黄色の溶液が暗褐色の懸濁液になって、１０分以上かけて濃い緑色の懸濁液に変化した。反応の完了をＨＰＬＣ−ＭＳによりモニターし、３０分及び１時間で採取したサンプル間で反応の進行にいかなる変化も観察されなかった（約９５％完了）。反応物を室温で一晩撹拌し、次に２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール（０．４８３ｍＬ、４．７８１ｍｍｏｌ、４当量）、ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）及びｄＨ２Ｏ（５ｍＬ）を撹拌懸濁液に添加、変色して濃い青色となった。懸濁した固体が徐々に溶解して、二相性混合物となるので、懸濁液を４時間激しく撹拌した。この混合物を分液漏斗に移し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）及びブライン（１０ｍＬ）で希釈し、水層を１０％ＩｐＯＨ／ＥｔＯＡｃ（４ｘ５０ｍＬ）で抽出した。有機層をプールし、ブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて、かすかに青色の粗固体を得た。この粗固体をメタノール（０．５ｍＬ）とジクロロメタン（６ｍＬ）との混合物に溶解し、Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）ＳＮＡＰ  Ｕｌｔｒａ  １００ｇシリカゲルカラム（１０カラム容量で２〜２０％ＭｅＯＨを含むＣＨ２Ｃｌ２、その後、２０％ＭｅＯＨでの８カラム容量のプラトー）で精製した。生成物は、約２０％ＭｅＯＨを含むＣＨ２Ｃｌ２で、１〜２カラム容量の後、幅広いピークとして溶出された。所望の材料を含有する画分をプールし、減圧濃縮して、表題化合物を白色固体として得た（１．１０５ｇ、８３％）。ＭＳ ｍ／ｚ ｏｂｓ． ＝ ５５５．９ （（Ｍ＋２）／２）， １１０９．８ （Ｍ＋１）．
【０３１５】
１．１１  （Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（４−（Ｎ−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）スルファモイル）フェニル）−５−ウレイドペンタンアミド（化合物１３）
2021515793.tif 000083
化合物１２（０．９２６ｇ、０．８３４ｍｍｏｌ）の溶液に、ジクロロメタン（１０ｍＬ）とトリフルオロ酢酸（２．０ｍＬ）との混合物を加えた。出発物質の消費について、反応物をＨＰＬＣ−ＭＳでモニターした（約４５分）。反応物を減圧下でアセトニトリル（２ｘ１０ｍＬ）及びジクロロメタン（２ｘ１０ｍＬ）と共蒸発させて、過剰のトリフルオロ酢酸を除去した。得られた残留物を最少量のジクロロメタン及びメタノール（３：１、ｖ／ｖ、約２ｍＬ）に溶解し、ジエチルエーテル（２００ｍＬ）及びヘキサン（１００ｍＬ）の撹拌溶液にピペットで滴下し、淡白色の固体の懸濁液を得た。固体を濾過し、真空乾燥させて、トリフルオロ酢酸塩として白色粉末の形態で表題化合物を得た（１．０４ｇ、いくつかの残留溶媒を用いた定量的収率）。ＭＳ ｍ／ｚ ｏｂｓ． ＝ ５０５．８ （（Ｍ＋２）／２）
【０３１６】
１．１２  （Ｓ）−Ｎ−（４−（Ｎ−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）スルファモイル）フェニル）−２−（（Ｓ）−１−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−１４−イソプロピル−１２−オキソ−３，６，９−トリオキサ−１３−アザペンタデカンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド（リンカー−毒素００１）
2021515793.tif 000084
化合物１３（０．７２２ｇ、０．５８４ｍｍｏｌ）を含むＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）の撹拌溶液に、化合物１５（０．３１４ｇ、１．２当量）及びジイソプロピルエチルアミン（０．３０５ｍＬ、３．０当量）を加えた。２時間でのＨＰＬＣ−ＭＳ分析は、出発物質が残留していないことを示した。反応物をＴＦＡ（３００μＬ）で酸性化し、次にｄｉＨ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ（９ｍＬ）で希釈した。得られた溶液を１２０ｇのＢｉｏｔａｇｅ（登録商標）ＳＮＡＰ  Ｕｌｔｒａ  Ｃ１８カラム（Ｂｉｏｔａｇｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）にロードし、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡグラジエント：１０カラム容量で２０〜６０％ＡＣＮ、５カラム容量で６０〜１００％ＡＣＮで精製した。生成物は、４０％ＡＣＮ付近で溶出した。ＬＣＭＳにより同定された純粋な画分をプールし、凍結乾燥した。凍結乾燥機から白色粉末固体を回収した。より高い濃度でバイアルに入れて凍結乾燥を繰り返し（約５０ｍｇ／ｍＬ、２：１  Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ）、より密度が高く、凝集性の低い凍結乾燥固体（７５４．２ｍｇ、９１％）を生成した。ＭＳ ｍ／ｚ ｏｂｓ． ＝ ６４７．４ （（Ｍ＋２）／２）， １２９２．８ （Ｍ＋１）
【０３１７】
実施例２：リンカー−毒素のバイパラトピック抗体へのコンジュゲート
バイパラトピック抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ、ｖ１００００、及びリンカー−毒素００１の抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、抗体の鎖間ジスルフィド結合を部分的に還元し、その後、リンカー−毒素のマレイミド成分との反応より遊離システイン残基をキャッピングすることによって生成した。抗体を還元するために使用されるＴＣＥＰの量を変化させることにより、平均薬物抗体比が０〜６であるＡＤＣを得ることができる。ＡＤＣを精製して汚染小分子を除去し、ＤＡＲ、純度、単量体含有量、エンドトキシンレベル、及び抗原陽性腫瘍細胞への結合を実証するために特徴を明らかにした。
【０３１８】
ｖ１００００の調製は、国際特許出願公開ＷＯ２０１５／０７７８９１に記載されている。この抗体の詳細を以下の表９に示す。配列は配列一覧表に提供する。
【０３１９】
（表９）
2021515793.tif 000085
＊ＫａｂａｔによるＦａｂまたは可変ドメインのナンバリング（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，ｐ．６４７，１９９１）
§ＫａｂａｔなどＥＵインデックスによるＣＨ３ナンバリング（Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６９，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，６３：７８−８５）。
【０３２０】
２．１  鎖間ジスルフィド結合の部分的還元による抗ＨＥＲ２抗体のコンジュゲート（ｖ１７５９７；ＤＡＲ３．９）
抗体ｖ１００００（２．０ｇ）を含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（１３８．９ｍＬ）、９％（ｗ／ｖ）スクロース、ｐＨ４．５は、新たに調製した２００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ８．９（１
５．４ｍＬ）、５ｍＭ  ＤＴＰＡ溶液（ＰＢＳ中３９．５ｍＬ、ｐＨ７．４）、及び１０ｍＭ  ＴＣＥＰ溶液（３．６８ｍＬ、２．３当量）混合物を添加することによって還元した。３７℃で９０分後、反応物を氷冷し、２０ｍＭ  ＤＭＳＯストック溶液からの過剰のリンカー−毒素００１（６．４１ｍＬ；８当量）を添加した。コンジュゲーション反応は、９０分後に過剰の２０ｍＭ  Ｎ−アセチルシステイン溶液（４．８１ｍＬ；６当量）を添加することによりクエンチさせた。
【０３２１】
２．２  鎖間ジスルフィド結合の部分的還元による抗ＨＥＲ２抗体のコンジュゲーション（ｖ２１２５２；ＤＡＲ２．１）
抗体ｖ１００００（２．０ｇ）を含む１０ｍＭ酢酸ナトリウムの溶液（１３８．９ｍＬ）、９％（ｗ／ｖ）スクロース、ｐＨ４．５は、２００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ８．９（１５．４ｍＬ）を添加してｐＨ調整した。ＤＴＰＡ溶液（ＰＢＳ中４４ｍＬ、ｐＨ７．４、最終濃度１．０ｍＭ）を添加後、１０ｍＭ  ＴＣＥＰ水溶液（１．６８ｍＬ、１．０５当量）を添加することにより、鎖間ジスルフィドの還元を開始した。３７℃で９０分後、反応物を氷冷し、２０ｍＭ  ＤＭＳＯストック溶液から過剰のリンカー−毒素００１（４．８１ｍＬ；６当量）を添加した。コンジュゲーション反応は、９０分後に過剰の２０ｍＭ  Ｎ−アセチルシステイン溶液（４．８１ｍＬ；６当量）を添加することによりクエンチさせた。
【０３２２】
２．３  抗体−薬物コンジュゲートｖ１７５９７及びｖ２１２５２の精製
クエンチさせた抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）溶液は、９〜１５ダイアボリュームの１０ｍＭ酢酸ナトリウム、９％（ｗ／ｖ）スクロース、ｐＨ４．５により、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）ＸＬ限外ろ過モジュール（Ｕｌｔｒａｃｅｌ（登録商標）３０ｋＤａ  ０．００５ｍ２；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａ）を使用して、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｌａｂｓｃａｌｅ（商標）タンジェンシャルフローろ過器で精製した。溶出されたＡＤＣを滅菌濾過した（０．２２ｕｍ）。小規模で生成されたＡＤＣは、ＰＢＳまたは１０ｍＭ酢酸ナトリウム、９％（ｗ／ｖ）スクロース、ｐＨ４．５により前処理した４０ＫＤａ  ＭＷＣＯ  Ｚｅｂａ（商標）カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で精製した。
【０３２３】
精製後、ＡＤＣの濃度は、ｖ１００００から作成した標準曲線を参照して、ＢＣＡアッセイによって決定した。あるいは、濃度は２８０ｎｍにおける吸収を測定することによって推定した（ε＝１９５０６５Ｍ−１ｃｍ−１）。
【０３２４】
ＡＤＣのサンプルは、非還元及び還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した（図１を参照）。外来のバンドは観察されなかった。
【０３２５】
２．４  疎水性相互作用クロマトグラフィー
抗体及びＡＤＣを疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）で分析して、薬物抗体比（ＤＡＲ）を推定した。クロマトグラフィーは、グラジエント８０％ＭＰＡ／２０％ＭＰＢから３５％ＭＰＡ／６５％ＭＰＢを使用したＰｒｏｔｅｏｍｉｘ（登録商標）ＨＩＣ  Ｅｔｈｙｌカラム（７．８ｘ５０ｍｍ、５μｍ）（Ｓｅｐａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）で、流量１ｍＬ／分で１３．５分かけて行った（ＭＰＡ＝１．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２５ｍＭ  ＮａｘＰＯ４、及びＭＰＢ＝７５％２５ｍＭ  ＮａｘＰＯ４、２５％イソプロパノール）。
【０３２６】
ＡＤＣの平均薬物抗体比（ＤＡＲ）は、抗体の還元中に遊離するジスルフィド結合の数によって変化し得る。特定の平均ＤＡＲを有するＡＤＣを生成する単一のコンジュゲーション反応物には、種の混合物を含む。ｖ１７５９７及びｖ２１２５２では、４種の混合物：非コンジュゲート抗体、ＤＡＲ２を有するＡＤＣ、ＤＡＲ４を有するＡＤＣ、及びＤＡＲ６を有するＡＤＣが生成された。
【０３２７】
ＨＩＣの結果を図２に示す。これは、ｖ１７５９７の平均ＤＡＲが３．９２（図２Ａ）であり、ｖ２１２５２の平均ＤＡＲが２．０７（図２Ｂ）であることを示している。
【０３２８】
精製されたＡＤＣの平均ＤＡＲに対するＤＡＲ０、ＤＡＲ２、ＤＡＲ４、及びＤＡＲ６の種の個々の寄与は、ＨＰＬＣ−ＨＩＣクロマトグラムを統合して評価した。ＨＩＣクロマトグラムの各ピークを分取クロマトグラフィーで分離し、ピークの同一性をＬＣ−ＭＳにより検証した。各バリアントの個々のＤＡＲの種の含有率％（ＨＩＣによって決定）を表１０及び図２Ｄに示す。表１０及び図２Ｄからわかるように、ｖ１７５９７はｖ２１２５２よりもはるかに多くのＤＡＲ６の種を含み、ｖ２１２５２は、ｖ１７５９７よりもはるかに多くのＤＡＲ０の種を含む。
【０３２９】
図２Ｅは、０．５〜６の範囲の平均ＤＡＲ値を有する一連のＡＤＣ調製物におけるｖ１００００−リンカー−毒素００１内のＤＡＲ０、２、４、及び６の種の相対量の変化を示している。
【０３３０】
（表１０）ｖ１７５９７及びｖ２１２５２のＤＡＲ分布
2021515793.tif 000086
【０３３１】
２．５  サイズ排除クロマトグラフィー
抗体及びＡＤＣの凝集の程度（約１５ｕｇ、５ｕＬの注射量）は、移動相（１５０ｍＭリン酸、ｐＨ６．８、及び流量４００ｕＬ／分）を用いてＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＢＥＨ  ＳＥＣカラム（２００オングストローム、１．７μｍ、４．６ｘ１５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により評価した。検出は２８０ｎｍでの吸光度によるものであった。
【０３３２】
これらの結果を図３に示し、表１１に要約する。ｍＡｂ  ｖ１００００は、ＳＥＣ分析によるとほとんどが単量体である。リンカー−毒素００１へのコンジュゲート時に、凝集の有意な増加は観察されなかった。ｖ２１２５２とｖ１７５９７とを比較すると、凝集の程度は、ＤＡＲが２から４に増加することによる影響はない。
【０３３３】
（表１１）ＳＥＣ結果の概要
2021515793.tif 000087
【０３３４】
２．６  ＬＣ−ＭＳ−ＭＳによる遊離毒素及びリンカー−毒素の定量
ＡＤＣ配合物中の遊離毒素（化合物９）、リンカー−毒素００１、及びクエンチされた薬物リンカーＮ−アセチルシステイン−リンカー−毒素００１の残留濃度は、各分析物の標準曲線を参照して、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分離及び質量検出によって評価した。分離は、ＰｏｌｙｍｅｒＸ（商標）ＲＰ−１カラム（３μｍ、１００オングストローム、５０ｘ４ｍｍ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）で流量０．４ｍＬ／分、７．８分にわたってカラム温度３０℃、グラジエント７５％ＭＰＡ／２５％ＭＰＢ〜６０％ＭＰＡ／４０％ＭＰＢ（ＭＰＡ＝０．１％ギ酸水溶液、及びＭＰＢ＝０．１％ギ酸を含むアセトニトリル）を用いて行った。ポジティブモードＥＳＩ−ＭＲＭ質量検出は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６４７０トリプル四重極質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で行った。
【０３３５】
すべてのサンプルが、コンジュゲートペイロード全体に対して０．１ｍｏｌ％未満の分析物を含んだ。
【０３３６】
２．７  抗原陽性細胞のフローサイトメトリー結合アッセイ
ＡＤＣと抗原陽性腫瘍細胞株ＪＩＭＴ−１（乳癌、Ａｄｄｅｘｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及びＲＴ−１１２／８４（膀胱癌、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の結合は、フローサイトメトリーによって親抗体（ｖ１００００）結合と比較した。細胞は、供給業者の指示に従って培養した。簡単に言えば、細胞（５０，０００細胞／ウェル）を抗体またはＡＤＣの連続希釈液と氷上で９０分間インキュベートした。このインキュベーション後、細胞を２回洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲート抗ｈＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｇｒｏｖｅ，ＰＡ）二次試薬と共に氷上で６０分間インキュベートした。次に細胞を２回洗浄し、フローサイトメトリー（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）Ｘ−２０フローサイトメーター、ＢＤ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で蛍光を分析した。
【０３３７】
これらの結果を図４に示す。ｖ１７５９７及びｖ２１２５２の抗原陽性細胞への結合は毒素への結合による影響を受けず、両方のＡＤＣが親抗体ｖ１００００に対して同様の結合を示している。
【０３３８】
２．８  エンドトキシン試験
配合されたＡＤＣのエンドトキシンレベルは、Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）ゲル化エンドポイントアッセイ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  ＴｏｘｉｎＳｅｎｓｏｒ（商標）Ｓｉｎｇｌｅ  Ｔｅｓｔ  Ｋｉｔ；ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を閾値０．１２５ＥＵ／ｍＬで使用して評価した。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験で使用されたすべてのＡＤＣ（下記）は、体重１キログラムあたり５エンドトキシン単位未満で投与した。
【０３３９】
実施例３：バイパラトピックＡＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性
ｖ１７５９７及びｖ２１２５２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力は、抗原陽性腫瘍細胞ＢＴ−４７４（乳管癌、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ（ＨＴＢ−２０））、ＳＫ−ＢＲ−３（乳癌、ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ（ＨＴＢ−３０））、ＨＣＣ−１９５４（乳癌、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ−２３３８））、ＪＩＭＴ−１（乳癌、Ａｄｄｅｘｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｃ０００６００５））、ＺＲ−７５−１（乳癌、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ−１５００））及び抗原陰性腫瘍細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（乳癌、Ａｄｄｅｘｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃ０００６００３））の細胞増殖アッセイによって測定した。細胞は、供給業者の指示に従って培養した。簡潔に述べると、ＡＤＣを添加する前日に、細胞（５０ｕＬ／細胞、１０００細胞／ウェル）を処理した無菌の組織培養（ＴＣ）（３８４ウェルプレート）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に添加し、３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートして、細胞をプレート表面に接着させた。Ｕ底の滅菌９６ウェルプレートで、ＡＤＣを完全成長培地において所望の最終最大濃度の４．３倍に希釈し、同じ培地で１：３に滴定し、１０点用量反応滴定とした。ＡＤＣを含まない対照ウェル（成長培地のみ）を各マイクロタイター９６ウェルプレートに含めた。１０点用量反応滴定の１５ｕＬは、三連で、播種細胞を含む３８４ウェルの各ウェルに添加し、そのプレートを３７℃／５％ＣＯ２で５日間インキュベートした。５日間のインキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）２０ｕＬ／ウェルを添加し、室温で３０分間インキュベートして、細胞生存率を定量した。発光は、マイクロプレート照度計を使用して測定した。収集された相対光量単位（ＲＬＵ）は、上記の成長培地のみの対照を使用して、細胞毒性％（細胞毒性％＝１−［ウェルＲＬＵ／平均媒体のみの対照ＲＬＵ］）に変換した。データは、Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で利用可能な非線形回帰法を使用して曲線に当てはめた。
【０３４０】
これらの結果を図５に示し、表１２にまとめる。これらの結果は、ｖ１７５９７及びｖ２１２５２の両方が選択的な細胞殺害を実証していることを示している。ＨＥＲ２発現細胞株ＢＴ−４７４、ＳＫ−ＢＲ−３、ＨＣＣ１９５４、ＪＩＭＴ−１、及びＺＲ−７５−１（図５Ａ〜Ｅ）は、ｖ１７５９７及びｖ２１２５２の両方に対して感受性があった。ｖ１７５９７及びｖ２１２５２はいずれも、ＨＥＲ２陰性乳癌細胞株に由来するＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（図５Ｆ）に対しては無効であった。
【０３４１】
（表１２）ｖ１７５９７及びｖ２１２５２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性
2021515793.tif 000088
【０３４２】
実施例４：異なる平均ＤＡＲでのｖ１００００−リンカー−毒素００１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖アッセイ
リンカー−毒素００１にコンジュゲートしたｖ１００００を含み、０．７〜３．９の範囲の平均ＤＡＲを有するＡＤＣは、還元反応で使用するＴＣＥＰの量（０．５〜１０モル当量）を変化させて調製した。コンジュゲーション反応は、実施例２に概説される手順に従って行い、得られたＡＤＣは、ＰＢＳｐＨ７．４で予め平衡化させた４０ｋＤａ  Ｚｅｂａ（商標）カラムを使用して精製した。
【０３４３】
ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力は、抗原陽性腫瘍細胞ＳＫ−ＯＶ−３（卵巣癌、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ（ＨＴＢ−７７））、ＪＩＭＴ−１（乳癌、ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ（ＡＣＣ５８９）））及びＺＲ−７５−１（乳癌、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ−１５００））での細胞増殖アッセイによって測定した。細胞は、供給業者の指示に従って培養した。簡潔に述べると、ＡＤＣを添加する前日に、細胞（１００ｕＬ／細胞、２５００細胞／ウェル）を処理した無菌の組織培養（ＴＣ）（９６ウェル不透明な壁のプレート）（Ｃｏｒｎｉｎｇ３９０４）に添加し、３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートして、細胞をプレート表面に接着させた。翌日、ＡＤＣを完全成長培地（Ｕ底の９６ウェルプレート）において所望の最終最大濃度の５倍に希釈し、同じ培地で１：３に滴定し、８ステップとした（合計９つの化合物滴定ポイント）。成長培地のみを含む対照滴定点も含まれ、合計で１０点の用量反応滴定を作成した。播種細胞を含む９６ウェルプレートの各ウェルに、１０点の用量反応滴定から２５ｕＬを３重に添加し、プレートを３７℃／５％ＣＯ２で５日間インキュベートした。インキュベーション後、２５ｕＬ／ウェルＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を添加し、３０分間室温でインキュベートすることによって細胞生存率を定量した。次に、マイクロプレートルミノメーターを使用して発光を測定し、収集した相対光量単位（ＲＬＵ）を実施例３に記載されている細胞毒性率％に変換した。
【０３４４】
これらの結果を図６に示す。平均ＤＡＲ３．９〜１．６を有するＡＤＣは、３つの細胞株で同等の効力を示したが、平均ＤＡＲ０．７のＡＤＣは、効力の大幅な低下を示した。ＤＡＲ０．７、ＤＡＲ２．２、及びＤＡＲ３．９のＡＤＣを構成する個々のＤＡＲの種のおおよその量を表１３及び図６Ｄに示す。ＤＡＲ０．７のＡＤＣには、ＤＡＲ１．９のＡＤＣの約３倍のＤＡＲ０の種が含まれていることが確認できる（約６５％対約２０％）。次に、ＤＡＲ２．２  ＡＤＣには、ＤＡＲ３．９の種よりもはるかに多くのＤＡＲ０の種が含まれている（約２０％対３％未満）が、ＤＡＲ２．２  ＡＤＣはＤＡＲ３．９  ＡＤＣに匹敵するｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力を示した。これらの結果は、ＡＤＣの効力が影響を受ける前に、ＡＤＣ調製物に含まれ得るＤＡＲ０の種の割合に閾値があり得ることを示唆している。
【０３４５】
（表１３）ＡＤＣのおおよそのＤＡＲ分布
2021515793.tif 000089
【０３４６】
実施例５：バイパラトピックＡＤＣのＨＥＲ２発現細胞への内在化
ｖ２１２５２の内在化を決定するために、ｐＨＡｂ染料（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）をｖ２１２５２のアミン残基、トラスツズマブ−リンカー−毒素００１及び陰性対照ＡＤＣに製造業者の推奨プロトコルに従って結合した。陰性対照ＡＤＣは、リンカー−毒素００１にコンジュゲートした抗ＲＳＶプロテインＦ抗体であった。
【０３４７】
ｐＨＡｂコンジュゲート抗体は、受容体を介した抗体の内在化をモニターするために使用できる。細胞膜の抗原に結合したｐＨＡｂ染料とコンジュゲートした抗体は、最小限の蛍光を呈するが、エンドソーム及びリソソーム系を介した受容体媒介内在化及び動員（ｔｒａｆｆｉｃ）の後、抗体−ｐＨＡｂコンジュゲートは、より酸性のｐＨにさらすことで、抗体−ｐＨＡｂコンジュゲートが蛍光を発するようになった。
【０３４８】
ｐＨＡｂコンジュゲートｖ２１２５２、ｐＨＡｂコンジュゲートトラスツズマブ−リンカー−毒素００１及びｐＨＡｂコンジュゲート対照を、ＨＥＲ２発現細胞株ＳＫＢＲ３及びＪＩＭＴ−１とインキュベートした。簡潔に述べると、ＳＫＢＲ３及びＪＩＭＴ−１  ＨＥＲ２＋腫瘍細胞を、アッセイ培地において、５，０００細胞／ウェルで、３８４ウェルの黒色の光学底プレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に播種した。プレートは、３７℃＋５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、ｐＨＡｂコンジュゲート抗体を、アッセイ培地において最終１０ｕｇ／ｍｌ及び１ｕｇ／ｍＬでプレートに添加した。Ｖｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＤｙｅＣｙｃｌｅ（商標）バイオレット染色を含む培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）は、核を視覚化するために２ｕＭ最終濃度で添加した。プレートは、時点間で３７℃＋５％ＣＯ２でインキュベートした。サンプルウェルは、様々な時点でＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（商標）ＣＸ５  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ（ＨＣＳ）Ｐｌａｔｆｏｒｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によりスキャンした。プレートは、２チャンネルを有するＳｐｏｔＡｎａｌｙｓｉｓ  Ｂｉｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎにおいて、２０ｘ対物レンズを使用してスキャンした。チャネル１（３８５ｎｍ、Ｖｙｂｒａｎｔ  Ｄｙｅ  Ｃｙｃｌｅ  Ｖｉｏｌｅｔ）をフォーカスチャネルとして使用し、チャネル２（５６０ｎｍ、ｐＨＡｂ）を使用して内在化データを得た。内在化ｐＨＡｂコンジュゲートの蛍光は、「平均総スポット強度（Ｍｅａｎ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｐｏｔ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）」パラメータを使用して測定した。
【０３４９】
これらの結果を図１３及び図１４に示す。ｖ２１２５２は、ＨＥＲ２発現細胞内のリソソームを内在化し、単一特異的トラスツズマブ−リンカー−毒素００１よりも高いレベルまで動員することを示している。
【０３５０】
実施例６：バイパラトピックＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ活性
６．１  ＡＤＣ  ｖ１７５９７及びｖ２１２５２は、ＨＢＣｘ−１３ｂ乳癌患者由来の異種移植片の成長を阻害する
雌の無胸腺マウス（Ｅｎｖｉｇｏ，Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）に２０ｍｍ３の腫瘍断片を皮下移植した（ｎ＝７／群）。腫瘍径が７５〜２００ｍｍ３に達すると、動物を治療群に割り当て、図７に示すように、ｖ１７５９７、ｖ２１２５２またはビヒクルに１日目及び１５日目（ｑ１４ｄｘ２）に合計２用量を静脈内注射した。腫瘍測定は、隔週でキャリパーを用いて行った。腫瘍径が１７６４ｍｍ３に達したときに、マウスを倫理的に屠殺した。腫瘍体積は、各群の平均±ＳＥＭとして報告している。
【０３５１】
図７Ａは、ビヒクルまたはｖ１７５９７の静脈内投与後にＨＢＣｘ−１３ｂ腫瘍断片を皮下移植されたマウスにおける腫瘍応答の結果を提供する。図７Ｂは、ビヒクルまたはｖ２１２５２の静脈内投与後にＨＢＣｘ−１３ｂ腫瘍断片を皮下移植されたマウスにおける腫瘍応答の結果を提供する。これらの結果は、ＨＢＣｘ−１３ｂ生着マウスをｖ１７５９７またはｖ２１２５２のいずれかで治療すると、腫瘍体積が用量依存的様態で減少することを示している。
【０３５２】
６．２  ＡＤＣ  ｖ１７５９７及びｖ２１２５２がＳＴ−９１０乳癌患者由来の異種移植片の成長を阻害する
雌の無胸腺ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）に約７０ｍｇ腫瘍断片（ｎ＝６／群）を皮下移植した。腫瘍径が１２５〜２５０ｍｍ３に達すると、動物を治療群に割り当て、図８に示すように、ｖ１７５９７、ｖ２１２５２またはビヒクルに、静脈内単回注入を行った。腫瘍測定は、隔週でデジタルキャリパーを用いて行った。腫瘍径が２０００ｍｍ３に達したときに、マウスを倫理的に屠殺した。腫瘍体積は、各群の平均±ＳＥＭとして報告している。
【０３５３】
図８Ａは、ビヒクルまたはｖ１７５９７の静脈内投与後に、ＳＴ−９１０腫瘍断片を皮下移植されたマウスにおける腫瘍応答の結果を提供する。図８Ｂは、ビヒクルまたはｖ２１２５２の静脈内投与後に、ＳＴ−９１０腫瘍断片を皮下移植されたマウスにおける腫瘍応答の結果を提供する。これらの結果は、ＳＴ−９１０生着マウスをｖ１７５９７またはｖ２１２５２のいずれかで治療すると、腫瘍体積が用量依存的様態で減少することを示している。
【０３５４】
ＳＴ−９１０は、ＨＥＲ２  １＋乳癌を表す患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）であり、ＨＢＣｘ−１３ｂ（実施例６．１で使用）は、ＨＥＲ２  ３＋乳癌を表すＰＤＸである。実施例６．１及び６．２は、ｖ１７５９７及びｖ２１２５２の両方がＨＥＲ２  ３＋及びＨＥＲ２  １＋腫瘍の両方で活性であることを示している。
【０３５５】
６．３  薬物動態分析
患者由来の異種移植片、ＨＢＣｘ−１３ｂ及びＳＴ−９１０のでは、全抗体（非コンジュゲート抗体及びコンジュゲート抗体）の薬物動態サンプルを事前に指定された時点で収集し、全抗体定量のために、ＥＬＩＳＡベースのアッセイを使用して評価した。ｖ２１２５２またはｖ１７５９７のいずれかの全抗体の血清濃度は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を含むＰＢＳ  ｐＨ７．４を含む最初のコーティング３８４ウェルＥＬＩＳＡプレートにより、４℃で一晩インキュベートして分析した。翌日、アッセイ希釈剤を使用してプレートを洗浄し、かつブロックして、ＲＴで１時間インキュベートした。ブロッキング後、標準曲線サンプル、対照、及び希釈血清サンプルをプレートに添加し、ＲＴで１時間インキュベートした。次に、検出抗体であるＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２コンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をプレートに添加し、ＲＴで１時間インキュベートした後、ＨＲＰ基質、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をプレートに添加した。ＨＣｌを使用してＴＭＢをクエンチし、吸光度は、プレートリーダーを使用して、４５０ｎｍで測定した。図１５には、ＨＢＣｘ−１３ｂ（Ａ）及びＳＴ−９１０（Ｂ）の全抗体血清濃度−時間プロファイルを示している。
【０３５６】
実施例７：カニクイザルにおけるｖ１７５９７及びｖ２１２５２の単回投与での薬物動態／忍容性の研究
本研究の目的は、単回静脈内（ＩＶ）注入投与後のカニクイザルにおけるｖ１７５９７及びｖ２１２５２の薬物動態（ＰＫ）及び忍容性の特徴を明らかにすることであった。カニクイザルは、配列相同性及び結合親和性に基づいて、ｖ１７５９７及びｖ２１２５２の両方の非臨床安全性評価のために選択した。ヒト及びカニクイザルのＨＥＲ２は、９８％の配列相同性を共有しているが、イヌ及びマウス／ラットＨＥＲ２の配列相同性は、それぞれ、９３％及び８８％である。さらに、ｖ１７５９７及びｖ２１２５２は、カニクイザルＨＥＲ２にヒトＨＥＲ２と同様の親和性で結合する（サルＫＤ＝０．５５ｘ１０−９；ヒトＫＤ＝０．８３ｘ１０−９）が、イヌ、マウス、またはラットＨＥＲ２には結合しない。
【０３５７】
この研究では、３ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、または９ｍｇ／ｋｇの用量でのｖ１７５９７の単回用量では、忍容性が良好であり、９ｍｇ／ｋｇまたは１２ｍｇ／ｋｇの用量でのｖ２１２５２の単回用量では、忍容性が良好であった。
【０３５８】
材料及び方法
忍容性
ｖ１７５９７の単回投与（３ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、もしくは９ｍｇ／ｋｇ）またはｖ２１２５２（９ｍｇ／ｋｇもしくは１２ｍｇ／ｋｇ）を雌カニクイザル（Ｎ＝３）に６０分かけてＩＶ注入により投与した。一般的な忍容性は、臨床所見、体重、摂食量、及び臨床病理学（血液学及び臨床化学）で評価した。ｖ１７５９７またはｖ２１２５２、全抗体、及び遊離毒素（化合物９）の生物学的分析のために、研究全体を通して血液を採取した。研究デザインは表１４にまとめる。
【０３５９】
（表１４）カニクイザルの単回投与による薬物動態及び一般忍容性試験のデザイン
2021515793.tif 000090
【０３６０】
生物学的分析法
ｖ１７５９７及びｖ２１２５２：ｖ１７５９７またはｖ２１２５２（ＤＡＲが１以上）の血清濃度は、捕捉剤として抗毒素マウスＩｇＧ、及び検出剤として抗ペルツズマブスルホタグを用いて、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ（ＥＣＬ／ＭＳＤ）を備えた電気化学発光アッセイを使用して分析した（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）。
【０３６１】
全抗体：全抗体生物学的分析アッセイでは、抗体成分ｖ１７５９７またはｖ２１２５２が毒素にコンジュゲートしているかに関係なく（すべてのＤＡＲにおいて）、抗体成分を測定した。全抗体の血清濃度は、捕捉剤として抗ペルツズマブ抗体、検出剤として抗トラスツズマブスルホタグを用いて、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ（ＥＣＬ／ＭＳＤ）を備えた電気化学発光アッセイを使用して分析した。
【０３６２】
毒素（化合物９）：毒素の血清濃度は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ方法を用いて分析した。血清サンプルをアセトニトリル／メタノールで沈殿させて（５０：５０、ｖ／ｖ）、その上澄みを分析した。使用した液体クロマトグラフィーシステムは、水／酢酸（１００／０．０５、ｖ／ｖ）及びアセトニトリルで構成されているグラジエントフローの逆相カラムであった。毒素及び内部標準（毒素−ｄ４；重水素化化合物９）は、ポジティブイオンモードで動作するエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ソースを備えたトリプル四重極質量分析計システムを使用して検出した。
【０３６３】
薬物動態分析
血清サンプルの生体分析結果の非コンパートメント分析を使用して、ＰＫパラメータ（最大血清濃度［Ｃｍａｘ］、終末半減期［Ｔ１／２］、クリアランス［ＣＬ］及び見かけの分布量［Ｖｓｓ］）を求めた。
【０３６４】
結果
薬物動態
ｖ１７５９７：ｖ１７５９７の曝露は、一般に３〜９ｍｇ／ｋｇの容量に比例した。Ｃｍａｘは、６０分の注入終了時に達成され（Ｔｍａｘ中央値）、用量比例様態で上昇した。全身曝露（ＡＵＣ０−∞）は、用量比例様態でわずかに増加した。暫定平均終末半減期（Ｔ１／２）は、一般に用量の増加に伴って延長するように見え、クリアランス（ＣＬ）は、一般に用量の増加に伴って減少するように見え、見かけの分布容積（Ｖｓｓ）は、一般に用量と共に変化するようには見えなかった。
【０３６５】
ｖ２１２５２：ｖ２１２５２への曝露は一般に９〜１２ｍｇ／ｋｇの用量に比例した。Ｃｍａｘは、６０分の注入終了時に達成され（Ｔｍａｘ中央値）、用量比例様態で上昇した。ｖ２１２５２血清濃度−時間プロファイルを図９Ａに示す。全身曝露（ＡＵＣ０−∞）は、用量比例様態でわずかに増加した。暫定平均終末半減期（Ｔ１／２）、クリアランス（ＣＬ）及び見かけの分布容積（Ｖｓｓ）は、一般に用量によって変化するとは考えられなかった。
【０３６６】
全抗体（コンジュゲート及び非コンジュゲート）：全抗体の最大血清濃度（Ｃｍａｘ）は、６０分の注入終了時に達成された（Ｔｍａｘ中央値）。ｖ２１２５２の全抗体血清濃度−時間プロファイルを図９Ｂに示す。非コンパートメントモデルを使用して、ＰＫパラメータを導出した。Ｃｍａｘは、用量比例様態で上昇したが、ＡＵＣ０−∞は、ｖ１７５９７及びｖ２１２５２の両方で用量比例様態でわずかに増加した。ｖ１７５９７の平均終末半減期は用量の増加に伴って延長したが、血清クリアランス（ＣＬ）及び全抗体の見かけの分布の総容積（Ｖｓｓ）は用量の増加に伴って減少した。ｖ２１２５２の平均終末半減期及び全抗体の見かけの総分布容積（Ｖｓｓ）は、用量の増加に伴って増加したが、全抗体の血清クリアランス（ＣＬ）、用量の増加に伴って減少した。
【０３６７】
毒素（化合物９）：ｖ１７５９７の単回投与後（３ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、もしくは９ｍｇ／ｋｇ）またはｖ２１２５２（９ｍｇ／ｋｇまたは１２ｍｇ／ｋｇ）、すべての毒素血清濃度は、定量下限（ＬＬＯＱ、＜５．００ｎｇ／ｍＬ）であった。
【０３６８】
忍容性
単回用量（３ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、もしくは９ｍｇ／ｋｇ）のｖ１７５９７または９ｍｇ／ｋｇもしくは１２ｍｇ／ｋｇの用量でのｖ２１２５２の忍容性は、良好であった。研究の過程で死亡はなかった。臨床観察、摂食量、または体重において、治療関連の影響は認められなかった。
【０３６９】
一部の動物では、治療に関連すると見なされた臨床病理学パラメータの最小から軽度の変化が観察された。いずれの治療群においても、血液学のエンドポイントに被験物質関連の影響はなかった。すべての変動は、個々の値間のいかなる明らかな差異にもかかわらず、生物学的関連及び／または手順関連の変動の予測範囲内であると考えられた。
【０３７０】
実施例８：カニクイザルにおけるｖ１７５９７の非ＧＬＰ毒性試験
カニクイザルにおけるｖ１７５９７の毒物動態及び毒性を調査するために、非ＧＬＰ毒性研究を行った。本研究は、雌カニクイザルにおける単回投与による薬物動態／忍容性研究の結果に基づいてデザインした（実施例６）。
【０３７１】
この研究では、雄及び雌のカニクイザルでは、用量２．２５ｍｇ／ｋｇ及び４．５ｍｇ／ｋｇで毎週、ならびに用量４．５ｍｇ／ｋｇ及び９ｍｇ／ｋｇで隔週ｖ１７５９７を投与して、忍容性が良好でなかったことを実証した。６週までの毎週または隔週の投与後のｖ１７５９７の無有害作用量（ＮＯＡＥＬ）及び毒性が発現しない最高投与量（ＨＮＳＴＤ）は、毎週投与した場合には２．２５ｍｇ／ｋｇ未満、または隔週投与した場合には４．５ｍｇ／ｋｇ未満と見なされた。
【０３７２】
材料及び方法
ビヒクルまたはｖ１７５９７は、１時間のＩＶ点滴により１日目、８日目、１５日目、２２日目、２９日目、及び３６日目に毎週０ｍｇ／ｋｇ、２．２５ｍｇ／ｋｇ、及び４．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、隔週１回、１日目、１５日目、及び２９日目に、４．５ｍｇ／ｋｇ及び９ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。すべての動物において、臨床徴候、摂食量、体重、血圧、心電図、呼吸数（視覚）、臨床病理学（血液学、臨床化学、凝固、尿検査）、臓器重量及び組織の肉眼／顕微鏡検査の変化について評価した。トキシコキネティクス分析及び抗薬物抗体（ＡＤＡ）分析のために血液を採取した。毎週投与された動物は４２日目に屠殺し、隔週投与された動物は３６日目に屠殺した。研究デザインを表１５に示す。
【０３７３】
（表１５）研究デザイン
2021515793.tif 000091
【０３７４】
結果
体重、臨床観察、及び臨床病理所見に基づいて、ｖ１７５９７は、この試験において試験されたすべての用量で有害であると見なした。動物９ｍｇ／ｋｇ／用量（隔週）での動物及び４．５ｍｇ／ｋｇ／用量での雌１匹（隔週）を早期に屠殺し、１日目及び１５日目にのみ投与を受けた。
【０３７５】
この試験の結果に基づいて、６週までの毎週または隔週の投与後のｖ１７５９７の無有害作用量（ＮＯＡＥＬ）及び毒性が発現しない最高投与量（ＨＮＳＴＤ）は、毎週投与では２．２５ｍｇ／ｋｇ未満、隔週投与では、４．５ｍｇ／ｋｇ未満であると見なした。
【０３７６】
実施例９：カニクイザルにおけるｖ２１２５２の非ＧＬＰ毒性試験
本研究の目的は、ｖ２１２５２のトキシコキネティクス及び毒性の特徴をさらに明らかにすることであった。
【０３７７】
本研究では、雄及び雌のカニクイザルにおいて、１２ｍｇ／ｋｇまでの用量で１日目、１５日目、及び２９日目にｖ２１２５２を投与したところ、臨床的に十分に忍容性を示すことが示された。無有害作用量（ＮＯＡＥＬ）は１２ｍｇ／ｋｇであり、毒性が発現しない最高投与量（ＨＮＳＴＤ）は、１２ｍｇ／ｋｇ超であった。
【０３７８】
材料及び方法
この研究では、ビヒクルまたはｖ２１２５２を、隔週１回、１日目、１５日目、２９日目に、０ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、及び１２ｍｇ／ｋｇの用量で、１時間のＩＶ注入によって雌及び雄のカニクイザルに投与した（各用量レベルで各性別３匹）。すべての動物において、臨床徴候、摂食量、体重、血圧、心電図、呼吸数（視覚）、臨床病理学（血液学、臨床化学、凝固、尿検査）、臓器重量及び組織の肉眼／顕微鏡検査の変化について評価した。トキシコキネティクス（ＴＫ）分析（ｖ２１２５２、全抗体、及び遊離毒素（化合物９））ならびに抗薬物抗体（ＡＤＡ）分析のために血液を採取し、３６日目に動物を屠殺した。動物の別の群は、１日目にｖ２１２５２  １２ｍｇ／ｋｇの単回用量の投与を受け、投与後４日目、８日目、１５日目に屠殺した（ｎ＝２／時点）した。研究デザインを表１６に示す。
【０３７９】
（表１６）非ＧＬＰ毒性試験デザイン
2021515793.tif 000092
【０３８０】
結果
薬物動態
ｖ２１２５２：薬物動態は、ｖ２１２５２の反復投与後に算出した。Ｃｍａｘは、６０分間注入の終了時または注入終了６０分後のいずれかで達成された（Ｔｍａｘ中央値）。ｖ２１２５２血清濃度−時間プロファイルを図１０に示す。１日目に、Ｃｍａｘ及び全身曝露（ＡＵＣ０−１６８ｈ）は、用量比例様態でわずかに増加した。２９日目に、Ｃｍａｘ及びＡＵＣ０−１６８ｈは、ほぼ用量比例様態で増加した。全身曝露及びＡＵＣ０−１６８ｈは、変化がないようであり、反復投与後も蓄積は示されなかった。平均消失半減期（Ｔ１／２）は、９ｍｇ／ｋｇ群から１２ｍｇ／ｋｇ群までで延長した。ｖ２１２５２の可飽和クリアランスメカニズムは、低用量（９ｍｇ／ｋｇ）群と高用量群（１２ｍｇ／ｋｇ）との間のＴ１／２及びクリアランスの差を説明し得る。
【０３８１】
全抗体（コンジュゲート及び非コンジュゲート）：全抗体は、ｖ２１２５２の反復投与後にカニクイザルにおいて測定した。全抗体のＣｍａｘは、６０分注入終了時に達成した（Ｔｍａｘ中央値）。全抗体血清濃度−時間プロファイルを図１１に示す。１日目に、Ｃｍａｘ及び全身曝露（ＡＵＣ０−１６８ｈ）は、用量比例様態でわずかに増加した。２９日目に、Ｃｍａｘ及びＡＵＣ０−１６８ｈは、ほぼ用量比例様態で増加した。全身曝露ＡＵＣ０−１６８ｈは変化せず、反復投与後の蓄積は認められなかった。ｖ２１２５２と同様に、全抗体の平均消失半減期（Ｔ１／２）は、９ｍｇ／ｋｇ群から１２ｍｇ／ｋｇ群まで延長した。
【０３８２】
ｖ２１２５２及び全抗体の血清濃度時間プロファイルで示されるｖ２１２５２の薬物動態では、ｉｎ  ｖｉｖｏでのｖ２１２５２からのリンカー−毒素の損失が最小限であることが示されている（図１２を参照のこと）。
【０３８３】
毒素（化合物９）：カニクイザルでのｖ２１２５２の反復投与後に遊離毒素を測定した。すべてのペイロード（化合物９）の血清濃度は、１日目の雌１匹の１２ｍｇ／ｋｇ、２９日目の雌１匹の９ｍｇ／ｋｇ、２９日目の雄１匹の１２ｍｇ／ｋｇを除いて、定量限界（＜０．５００ｎｇ／ｍＬ）未満であった。
【０３８４】
抗薬物抗体（ＡＤＡ）：抗ｖ２１２５２抗体は、カニクイザルにおいてｖ２１２５２の反復投与後にスクリーニングされた。ＡＤＡは、９ｍｇ／ｋｇ投与コホートにおいて１匹の雌の血清で検出された。
【０３８５】
毒性
全体として、ｖ２１２５２の投与は、試験を行ったすべての用量で臨床的に十分に忍容性を示した。尿検査、ＥＣＧパラメータ、または呼吸数の治療関連の変化は観察されなかった。
【０３８６】
１２ｍｇ／ｋｇ／用量でｖ２１２５２の反復投与を受けた動物では、個々の体重に対する散発的な最小限の影響が認められた。これらの動物はすべて、３５日目までに部分的にまたは完全に回復した。他のすべての動物は、研究全体を通じて体重が維持されたかまたは増加した。
【０３８７】
一部の動物では、臨床徴候、臨床病理学、臓器重量または組織の肉眼／顕微鏡検査の最小から軽度までの変化が観察された。ｖ２１２５２に関連して検討された肉眼観察は、対照を含むすべての動物の注入部位で観察された赤い変色に限定された。被験物質関連の臓器重量の変化は、脾臓に限定されていた。隔週３用量投与後３６日目に屠殺した動物では、顕微鏡による治療関連の影響には、胃腸管、肝臓、脾臓、リンパ節、膵臓、皮膚、及び静注部位での変化を含む。すべてが、最小または軽度に分類された。１２ｍｇ／ｋｇの単回投与後、様々な時点で屠殺した動物では、最小から軽度の被験物質関連の同様の影響が観察された。
【０３８８】
ＰＫ分析により、ｖ２１２５２で治療された動物の全身曝露が確認され、ｖ２１２５２及び全抗体の用量比例様態で、用量の増加に伴って平均全身曝露が増加したが、遊離毒素（化合物９）への曝露は、少数の動物でのみ低レベルで見られた。
【０３８９】
表１７〜２０には、ＰＫ／忍容性試験ならびにｖ１７５９７及びｖ２１２５２の非ＧＬＰ反復投与試験の結果を比較したものを示す。
【０３９０】
（表１７）カニクイザルにおけるｖ１７５９７及びｖ２１２５２の単回投与及び反復投与試験で観察された死亡率の比較
2021515793.tif 000093
【０３９１】
（表１８）カニクイザルでのｖ１７５９７及びｖ２１２５２の反復投与試験で決定されたＮＯＡＥＬ及びＨＮＳＴＤの比較
2021515793.tif 000094
【０３９２】
（表１９）ＡＤＣの生物学的分析
2021515793.tif 000095
＃ｖ１７５９７＠４．５ｍｇ／ｋｇとの比較
【０３９３】
（表２０）全抗体の生物学的分析
2021515793.tif 000096
＃ｖ１７５９７＠４．５ｍｇ／ｋｇとの比較
【０３９４】
結論
一般式（Ｉ）のオーリスタチン類似体は、マウスに投与された場合、良好なｉｎ  ｖｉｖｏ忍容性を有することが示されている。化合物９の平均ＤＡＲ４での単一特異性抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブへのコンジュゲーションにより、カニクイザルにおいて優れた忍容性を示し、毒性が発現しない最高投与量（ＨＮＳＴＤ）が１８ｍｇ／ｋｇであるＡＤＣが生成された。対照的に、平均ＤＡＲ４（ｖ１７５９７）で、抗ＨＥＲ２バイパラトピック抗体ｖ１００００にコンジュゲートした化合物９を含むＡＤＣでは、ＨＮＳＴＤが４．５ｍｇ／ｋｇ未満であり、忍容性が大幅に低下したことを示した（実施例８）。特定の理論に限定されるものではないが、ｖ１７５９７について観察された忍容性の低下は、以下が一部原因であり得ることが提唱されている；単一特異性トラスツズマブと比較して、オンターゲット結合及びバイパラトピック抗体の内在化が増加し、これによりオンターゲット毒性が増加する、及び／または平均ＤＡＲ２（ｖ２１２５２）と比較して、平均ＤＡＲ４（ｖ１７５９７）におけるＤＡＲ０もしくは裸の種の割合が減少し、これにより、より高いＤＡＲの種（ＤＡＲ２、ＤＡＲ４、及びＤＡＲ６）に関連する毒性が増加する、及び／または平均ＤＡＲ２と比較して、平均ＤＡＲ４におけるＤＡＲ６の種の割合が増加し、これにより最も高いＤＡＲの種に関連する毒性が増加する。
【０３９５】
しかし、驚くべきことに、平均ＤＡＲ２（ｖ２１２５２）においてｖ１００００にコンジュゲートした化合物９を含むＡＤＣは、はるかに改善された忍容性を示し、ＨＮＳＴＤが１２ｍｇ／ｋｇであった（実施例９）。モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはメイタンシノイドのいずれかを含むＡＤＣの毒性は、抗体に付着した薬物の総量と直接相関する、すなわち、ＡＤＣについて、ＤＡＲと最大耐量との関係は線形であることがこれまでに示されているため、この結果は予想外であった（Ｈａｍｂｌｅｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１０：７０６３−７０７０（２００４）；Ｓｕｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ．，２８：１３７１−８１（２０１７））。具体的には、抗体あたり８つの薬物分子を有するＡＤＣの最大耐量は５０ｍｇ／ｋｇであり、抗体あたり４つの薬物分子（すなわち、毒素の半分の量）を有するＡＤＣの最大耐量は１００ｍｇ／ｋｇであった（Ｈａｍｂｌｅｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，同書）。すなわち、同じ抗体用量で投与した場合、ＤＡＲ８  ＡＤＣの毒素の半分の量を有するＡＤＣは、ＤＡＲ８  ＡＤＣの２倍のＭＴＤを示した。
【０３９６】
ｖ２１２５２は、ＤＡＲ２を有するため、同じ抗体用量で投与した場合、毒素の量はｖ１７５９７の半分になる。したがって、ｖ１７５９７でのこれまでの研究に基づいて、許容されるｖ２１２５２の量は９ｍｇ／ｋｇ未満であると予想された（すなわち、ｖ１７５９７で許容される最大用量の２倍）。しかし、実施例９に示すように、９ｍｇ／ｋｇまたは１２ｍｇ／ｋｇのいずれかの用量で２週間ごとにｖ２１２５２を３回投与されたカニクイザルでは、忍容性を示し、１２ｍｇ／ｋｇは、無有害作用量（ＮＯＡＥＬ）として指定した。
【０３９７】
重要なことに、隔週で投与した場合、ｖ２１２５２の方が曝露量が多いにもかかわらず、ｖ２１２５２は、ｖ１７５９７と比較して毒性が低く、忍容性が高い。カニクイザルの非ＧＬＰ毒性学研究（実施例８）に基づいて、ｖ１７５９７は、隔週投与量４．５ｍｇ／ｋｇ及び９ｍｇ／ｋｇの両方で有害な所見を有すると見なされた。しかし、同様の非ＧＬＰ研究（実施例９）では、ｖ２１２５２は、９ｍｇ／ｋｇ及び１２ｍｇ／ｋｇの両方の隔週での投与において、４．５ｍｇ／ｋｇのｖ１７５９７と比較して曝露が約１．８〜４．６倍増加しているにもかかわらず、有害な所見を有するとは見なされなかった（初回投与後ＡＵＣ０−３３６ｈｒまたは最終投与ＡＵＣ０−１６８ｈｒ）（表１９及び２０にまとめる）。
【０３９８】
さらに、ｖ２１２５２について、カニクイザルにおいて忍容性があることが示されている曝露レベルでのｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性を実証した。具体的には、図１５に要約されているように、カニクイザルで忍容される曝露において高ＨＥＲ２腫瘍及び低ＨＥＲ２腫瘍の両方の患者由来異種移植片モデルにおいて完全な応答が得られた（実施例６も参照）。
【０３９９】
実施例１０：カニクイザルにおけるｖ２１２５２のＧＬＰ毒性試験
その後のＧＬＰ毒性試験では、ｖ２１２５２をカニクイザルに２週間ごとに４用量（０ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、及び１８ｍｇ／ｋｇ）で投与し、回復期を６週とした。非重篤毒性量の最大値（ＨＮＳＴＤ）は、１８ｍｇ／ｋｇに決定した。ｖ２１２５２は、すべての用量で忍容性が良好であった。このＧＬＰ研究では、臨床所見は有害とは見なされず、死亡は観察されなかった。一貫していた唯一の臨床所見は、下痢の増加であった。すべての用量において体重の変化は観察されず、臨床病理所見（肝機能−アスパラギン酸トランスアミナーゼ及びアラニントランスアミナーゼ及び血液学−好中球、血小板、ヘモグロビン、及びリンパ球）では有害と見なされなかった。ｖ２１２５２の曝露（Ｃｍａｘ及びＡＵＣ０−１６８ｈｒ）は、ｖ１００００（抗体のみ）の曝露と実質的に同一であった。本研究の詳細を以下に示す。
【０４００】
このＧＬＰ研究の目的は、カニクイザルに４回静脈内投与されたｖ２１２５２の毒物動態及び毒性の特徴をさらに明らかにすることであった。
【０４０１】
ＧＬＰ毒性試験では、雄、雌のカニクイザルに１日目、１５日目、２９日目、及び４３日目にｖ２１２５２が０ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、及び１８ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、回復期間を６週とした。無有害作用量（ＮＯＡＥＬ）は１２ｍｇ／ｋｇであり、毒性が発現しない最高投与量（ＨＮＳＴＤ）は１８ｍｇ／ｋｇであった。
【０４０２】
材料及び方法
本研究では、ビヒクルまたはｖ２１２５２は、隔週１回、１日目、１５日目、２９日目、及び４３日目に用量０ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、及び１８ｍｇ／ｋｇで１時間のＩＶ注入によって雄及び雌のカニクイザルに投与された（各用量レベルで性別ごとに動物４匹、及び回復評価用に０ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、及び１８ｍｇ／ｋｇで性別ごとにさらに動物２匹）。すべての動物において、臨床徴候、摂食量、体重、血圧、心電図、呼吸数（視覚）、臨床病理学（血液学、臨床化学、凝固、尿検査）、臓器重量及び組織の肉眼／顕微鏡検査の変化について評価した。トキシコキネティクス（ＴＫ）分析（ｖ２１２５２、全抗体、及び遊離毒素（化合物９））及び抗薬物抗体（ＡＤＡ）分析のために血液を採取し、５０日目、及び６週間の回復後９２日目に動物を屠殺した。研究デザインを表２１に示す。
【０４０３】
（表２１）ＧＬＰ毒性研究デザイン
2021515793.tif 000097
【０４０４】
結果
薬物動態
ｖ２１２５２：ｖ２１２５２血清濃度のピーク中央値は、１日目及び４３日目の注入開始（ＳＯＩ）後１時間までに観察された。ｖ２１２５２の隔週投与後、ｖ２１２５２のＣｍａｘ及びＡＵＣの平均値は、用量の増加と共に上昇した。Ｃｍａｘの上昇は、１日目の用量にほぼ比例した。１日目では、ｖ２１２５２用量が１：２：３倍増量することにより、Ｃｍａｘ値がほぼ１：２．３：３．３倍上昇し、平均ＡＵＣ０−１６８ｈｒ値がほぼ１：２．６：３．８倍上昇し、ＡＵＣ０−３３６ｈｒ値がほぼ１：２．９：４．５倍上昇した。４３日目では、Ｃｍａｘ及びＡＵＣ０−１６８ｈｒが、ほぼ用量比例様態であった。４３日目では、ｖ２１２５２用量が１：２：３倍増量することにより、Ｃｍａｘ値がほぼ１：２．５：３．５倍上昇し、ＡＵＣ０−１６８ｈｒ値がほぼ１：３．２：４．７倍上昇した。ｖ２１２５２への全身曝露は、隔週、６ｍｇ／ｋｇのＩＶ注入を繰り返しても変化しないようであったが、曝露は一般に、隔週、１２ｍｇ／ｋｇ及び１８ｍｇ／ｋｇのＩＶ注入を繰り返した後に増加するように見えた。平均ＡＵＣ０−１６８ｈｒ累積比は、６ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、及び１８ｍｇ／ｋｇでそれぞれ１．２０、１．４７、及び１．５０であった。個々のＡＵＣ０−１６８ｈｒの累積比は、６ｍｇ／ｋｇで１．０１〜１．６４、１２ｍｇ／ｋｇで１．１７〜１．９５、及び１８ｍｇ／ｋｇで０．９８３〜２．０８の範囲であった。
【０４０５】
全抗体（コンジュゲート及び非コンジュゲート）：全抗体のピークの中央値は、１日目及び４３日目にｖ２１２５２のＳＯＩの１時間後に観察された。ｖ２１２５２の隔週投与後、全抗体のＣｍａｘ及びＡＵＣ０−１６８ｈｒの平均値は、用量の増加と共に上昇した。１日目では、ｖ２１２５２の用量が１：２：３倍増量することにより、Ｃｍａｘ値がほぼ１：２．１：３．３倍上昇し、ＡＵＣ０−１６８ｈｒ値がほぼ１：２．４：３．８倍上昇し、平均ＡＵＣ０−３３６ｈｒ値がほぼ１：２．８：４．５倍上昇した。４３日目では、ｖ２１２５２の用量が１：２：３倍増量することにより、Ｃｍａｘ値がほぼ１：２．６：３．９倍上昇し、ＡＵＣ０−１６８ｈｒ値がほぼ１：３．１：４．８倍上昇した。全抗体への全身曝露は、隔週、６ｍｇ／ｋｇのｖ２１２５２のＩＶ注入を繰り返しても変化しないようであったが、曝露は一般に、隔週、１２ｍｇ／ｋｇ及び１８ｍｇ／ｋｇのｖ２１２５２のＩＶ注入を繰り返した後に増加するように見えた。平均ＡＵＣ０−１６８ｈｒ累積比は、６ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、及び１８ｍｇ／ｋｇでそれぞれ１．２０、１．４７、及び１．５０であった。
【０４０６】
毒素（化合物９）：ｖ２１２５２の反復投与後に遊離毒素を測定した。ほとんどの毒素（化合物９）の血清濃度は、定量限界（＜０．５００ｎｇ／ｍＬ）未満であった。以下の例外点に留意のこと：雌一匹、１２ｍｇ／ｋｇ、４３日目には、定量可能な単一の毒素（化合物９）濃度（投与後７２時間で０．５１３ｎｇ／ｍｌ）を有していた；雄一匹、１８ｍｇ／ｋｇ、２９日目には、定量可能な単一の毒素（化合物９）濃度（ＳＯＩ  １時間後で０．５３２ｎｇ／ｍＬ）を有していた；雄二匹及び雌二匹、１８ｍｇ／ｋｇ、４３日目には、それぞれ定量可能な単一の毒素（化合物９）濃度（それぞれ、ＳＯＩ  ２４時間後で０．５５５ｎｇ／ｍＬ、０．５０５ｎｇ／ｍＬ、０．５５６ｎｇ／ｍＬ、及び０．６５３ｎｇ／ｍＬ）を有していた；雄一匹、１８ｍｇ／ｋｇ、４３日目には、４つの連続した定量可能な毒素（化合物９）濃度を有し、ＡＵＣ０−１６８ｈｒ値は１２５ｈｒ＊ｎｇ／ｍＬであった。
【０４０７】
抗薬物抗体（ＡＤＡ）：すべての投薬コホートから合計１４４のサンプルをＡＤＡについてスクリーニングした。確認／免疫不全アッセイにおいて、１匹の対照動物及び治療された動物からの事前テストサンプルを含む７つのサンプルで陽性が確認された。これらの後者の２つのサンプルは、既存の反応性抗体によるものであり、ｖ２１２５２の曝露とは関係ないと見なされている。残りの５つの陽性サンプルについては、１８ｍｇ／ｋｇを投与された雌一匹が４３日目に検出可能な力価を有し、残りの四匹の動物（１２ｍｇ／ｋｇで投与された雌二匹ならびに１８ｍｇ／ｋｇで投与された雄一匹及び雌一匹）は、９２日目の回復点で検出可能な力価を有していた。実際の抗ｖ２１２５２抗体の結果は、ほとんどの動物において強い免疫原性反応を示唆するものではないが、循環ｖ２１２５２では、抗ｖ２１２５２抗体と結合している可能性があり、このアッセイフォーマット内での抗体の検出が制限される。しかし、投与１日目と比較して、投与４３日目に血清濃度時間データへの変更は観察されなかったため、ＡＤＡがｖ２１２５２のＰＫに有意に影響を与えることはないようである。
【０４０８】
毒性
ｖ２１２５２の反復投与（隔週４回）は、一般的に忍容性が良好であった。ｖ２１２５２関連の死亡はなく、眼科的評価及び心電図評価、視覚呼吸数、尿検査、またはトロポニンＩ評価ではいかなる影響も認めらなかった。ｖ２１２５２の投与後の治療期間または回復期間中に、ｖ２１２５２関連の体重パラメータの変化も見られなかった。
【０４０９】
軟便／水便の発生率の増加は、ｖ２１２５２を６ｍｇ／ｋｇ以上で反復投与された動物において認められた。さらに、１８ｍｇ／ｋｇにおいて、雄及び雌の動物に散発的な食欲不振が認められ、１８ｍｇ／ｋｇにおいて、雌の動物に散発的な姿勢の乱れが認められた。回復期間後、食欲不振及び姿勢の乱れは消失し、軟便／水便の発生は減少するかまたは解消されており、これは、ｖ２１２５２関連の影響が逆転していることを示唆している。研究中、動物には、繰り返し観察された軟便／水便の原因である、水分／栄養（ｆｒｏｚｅｎ  Ｇａｔｏｒａｄｅ及びＰｅｐｔｏＰｒｏ（登録商標）ｄｉｅｔ）サプリメントを提供した。ｖ２１２５２の反復投与を受けた雌は、４日目（６ｍｇ／ｋｇ及び１８ｍｇ／ｋｇ）または８日目（１２ｍｇ／ｋｇ）から治療期間の終わりまで水分及び／または栄養サプリメントを受けた。同様に、ｖ２１２５２の反復投与を受けた雄は、８日目（１２ｍｇ／ｋｇ）または７日目（１８ｍｇ／ｋｇ）から治療期間の終わりまで水分及び／または栄養サプリメントを受けた。回復中には、水分補給は行わなかった。
【０４１０】
臨床病理学的所見では、限定された重症度及び所見の可逆性のため、有害であるとは見なされなかった。被験物質に関連した血液学の変化としては、単球数の増加、好中球の形態学的変化、網赤血球数の減少、及び赤血球分布幅の増大に伴う赤血球量（ＲＢＣ、ヘモグロビン及びヘマトクリット）の減少が挙げられる。雄では１８ｍｇ／ｋｇ、雌では１２ｍｇ／ｋｇ以上において、８日目〜５０日目までに、ベースライン平均と比較して、平均フィブリノーゲン濃度の最小から軽度の増加があった。これらの変化は、被験物質関連であり、免疫または炎症刺激を示していた。これらの変化は９２日目に解消した。治療関連の変化は、ＡＳＴ、リン、総タンパク質、アルブミン、グロブリン、及びシトルリンで観察された。
【０４１１】
表２２〜２５は、ｖ１７５９７及びｖ２１２５２の非ＧＬＰ反復投与量研究ならびにｖ２１２５２のＧＬＰ研究の結果の比較を示している。
【０４１２】
（表２２）カニクイザルにおけるｖ１７５９７及びｖ２１２５２の隔週での反復投与試験で観察された死亡率の比較
2021515793.tif 000098
【０４１３】
（表２３）カニクイザルにおけるｖ１７５９７及びｖ２１２５２の隔週での反復投与試験で測定されたＮＯＡＥＬとＨＮＳＴＤとの比較
2021515793.tif 000099
【０４１４】
（表２４）ｖ１７５９７  ＤＡＲ４及びｖ２１２５２  ＤＡＲ２のＡＤＣ  ＰＫパラメータの比較（毒素用量は一致）
2021515793.tif 000100
＃ｖ１７５９７  ＤＡＲ４＠４．５及び９ｍｇ／ｋｇと比較
【０４１５】
（表２５）ｖ１７５９７  ＤＡＲ４及びｖ２１２５２  ＤＡＲ２の全抗体ＰＫパラメータの比較（毒素用量は一致）
2021515793.tif 000101
＃ｖ１７５９７＠４．５及び９ｍｇ／ｋｇと比較
【０４１６】
結論
ｖ２１２５２の毒性が発現しない最高投与量（ＨＮＳＴＤ）は１８ｍｇ／ｋｇと決定した。ｖ２１２５２では、すべての用量で忍容性は良好であった。このＧＬＰ研究では、臨床所見は有害とは見なされず、死亡は観察されなかった。一貫していた唯一の臨床所見は、下痢の増加であった。すべての用量において体重の変化は観察されず、臨床病理所見（肝機能−アスパラギン酸トランスアミナーゼ及びアラニントランスアミナーゼ及び血液学−好中球、血小板、ヘモグロビン、及びリンパ球）では有害と見なされなかった。これらのＧＬＰ毒物学の結果は、ヒトにおける予測された有効用量を超える臨床投薬をサポートするものである。
【０４１７】
驚くべきことに、平均ＤＡＲ２（ｖ２１２５２）でｖ１００００にコンジュゲートした化合物９を含むＡＤＣは、ＨＮＳＴＤが１８ｍｇ／ｋｇである平均ＤＡＲ４（ｖ１７５９７）を有するＡＤＣと比較して、忍容性の改善を示した。毒素用量０．３６ｍｇ／ｋｇで投与した場合、平均ＤＡＲ４（ｖ１７５９７）でｖ１００００にコンジュゲートした毒素化合物９が、急性投与（９ｍｇ／ｋの単回投与）または亜慢性（２週間で区切られた４．５ｍｇ／ｋｇの２回投与）のいずれかで投与された場合、死亡率と関連していたことが以前に示されているため（実施例８）、この結果は予想外である。対照的に、ｖ２１２５２（ＤＡＲ２）を、毒素（化合物９）０．３６ｍｇ／ｋｇの用量で４用量分（累積毒素用量１．４４ｍｇ／ｋｇ）を投与した場合、ｖ１７５９７と比較して、死亡はなく、毒性は大幅に減少した。例えば、累積毒素（化合物９）用量０．９６ｍｇ／ｋｇで投与されたｖ２１２５２では、有害所見には関連しなかったため、無有害作用量（ＮＯＡＥＬ）として指定された。さらに、１．４４ｍｇ／ｋｇの累積毒素用量（化合物９）は、４用量以上の１８ｍｇ／ｋｇのｖ２１２５２であり、忍容された。これは、死亡に関連していたｖ１７５９７の用量の４倍以上の用量（０．３６ｍｇ／ｋｇ）である。
【０４１８】
重要なことは、毒素に一致する用量で比較したときに、およそ２倍以上の曝露（最初の投与後ＡＵＣ０−３３６ｈｒ）及び最初の投与後２倍長い半減期を有していても（ｖ１７５９７  ４．５ｍｇ／ｋｇ対ｖ２１２５２  ９ｍｇ／ｋｇ及びｖ１７５９７  ９ｍｇ／ｋｇ対ｖ２１２５２  １８ｍｇ／ｋｇ）、２つずつ毎週投与したとき、ｖ２１２５２は、ｖ１７５９７と比較して低い毒性、より高い忍容性を有することである（表２４及び２５に要約）。
【０４１９】
実施例１１：ｖ２１２５２により、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて低いＨＥＲ２患者由来異種移植片成長が阻害される
ＬＴＬ−６５４は、卵巣漿液性腺癌患者の転移に由来し、免疫組織化学（ＩＨＣ）によりＨＥＲ２陰性とスコア付けされた。以前の生検は、ＨＥＲ２曖昧性としてＩＨＣによってスコア付けされた。
【０４２０】
雌のＮＯＤ  Ｒａｇガンマ（ＮＲＧ）マウスに、それぞれ約１５ｍｍ３の２つのＬＴＬ−６５４腫瘍断片が腎被膜を介して皮下移植された。平均腫瘍体積が７０．３〜７７．８ｍｍ３に達したときに、動物を２つの盲検治療群（６匹ずつ）のうちの１つにランダムに割り当てた。
【０４２１】
動物は、ビヒクルまたは３ｍｇ／ｋｇのｖ２１２５２のいずれかで週に１回静脈内投与され、合計４回の注射（ｑｗｘ４）を行った（表２１）。腫瘍径は、Ｖｅｖｏ（登録商標）３１００  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ  ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、三次元（３Ｄ）モードを使用して測定した。腫瘍全体の複数の画像（７０〜１００枚／腫瘍）を記録し、Ｖｅｖｏ（登録商標）ＬＡＢソフトウェアｖ２．１．０（ＦＵＪＩＦＩＬＭ  ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ、Ｉｎｃ．）を使用して分析した。腫瘍径は、無作為化後２４日目まで毎週１回測定した。個々の腫瘍のサイズが１５００ｍｍ３に達したときに、マウスを倫理的に屠殺した。腫瘍体積は、各群の平均±ＳＥＭとして報告される。
【０４２２】
図１６は、ビヒクルまたはｖ２１２５２のｉｖ投与後にＬＴＬ−６５４腫瘍断片を皮下移植されたマウスにおける腫瘍応答の結果を提供し、これはｖ２１２５２によるＬＴＬ−６５４移植マウスの治療により、ＬＴＬ−６５４腫瘍異種移植片の成長速度が阻害されたことを示すものである。
【０４２３】
この例は、ｖ２１２５２が患者由来の異種移植片に有効であり、ＨＥＲ２発現が、ＨＥＲ２陰性としてＩＨＣによってスコア付けされるほど十分に少ないことを示している。
【０４２４】
（表２１）ＬＴＬ−６５４卵巣癌ＰＤＸモデル研究デザイン
2021515793.tif 000102
Ｎ／Ａ＝該当なし。
【０４２５】
実施例１２：ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、ｖ２１２５２によるマウスの頭蓋内移植ヒト乳房腫瘍の生存期間の延長
この実施例で使用した構築物は、対照コンジュゲート（リンカー−毒素００１にコンジュゲートした呼吸器多核体ウイルスに対するヒト化抗体）、ｖ２１２５２、ｖ７１５５（Ｔ−ＤＭ１、ＤＡＲ３．５）、及びｖ２４０２９（ＤＡＲ８でエキサテカン誘導トポイソメラーゼＩ阻害剤（ＤＸｄ）にコンジュゲートしたトラスツズマブ）とした。この実施例で利用される頭蓋内移植ＢＴ−４７４ヒト乳房腫瘍は、ＨＥＲ２陽性乳癌脳転移モデルとして機能する。
【０４２６】
雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（ＣＢｙＪ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｊ）マウスにγ線源（２Ｇｙ、６０Ｃｏ、ＢｉｏＭｅｐ，Ｂｒｅｔｅｎｉｅｒｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を照射した。麻酔したマウスに、フェノールレッドを含まない２マイクロリットルのＲＰＭＩ  １６４０培地に１ｘ１０５ＢＴ−４７４細胞を定位固定法で注射した。動物をランダムに治療群に分け、８日目から開始して、ビヒクル、対照コンジュゲート、ｖ２１２５２、ｖ７１５５またはｖ２４０２９の注射を６ｍｇ／ｋｇで毎週、合計１２回静脈内投与した（表２６）。体重は、１８日目まで週２回、その後は毎日記録した。体重減少が３日間連続して２０％以上になると、倫理的にマウスを屠殺した。
【０４２７】
図１７には、ビヒクル、対照コンジュゲート、ｖ２１２５２、ｖ７１５５、またはｖ２４０２９のｉｖ投与後の、ＢＴ−４７４腫瘍細胞を頭蓋内移植されたマウスの生存結果を提供する。
【０４２８】
ＢＴ−４７４細胞を頭蓋内移植された動物の２つの追加コホートもランダムに治療群に分け、８日目から開始して、ｖ２１２５２またはｖ２４０２９のいずれかの注射を６ｍｇ／ｋｇで２週ごとに、合計６回静脈内投与した。体重は、１８日目まで週２回、その後は毎日記録した。体重減少が３日間連続して２０％以上になると、倫理的にマウスを屠殺した。
【０４２９】
図１８は、ビヒクル、対照コンジュゲートもしくはｖ７１５５を毎週（ｑｗ）ｉｖ投与後、またはｖ２１２５２もしくはｖ２４０２９のいずれかを２週間ごとに（ｑ２ｗ）ｉｖ投与後の、ＢＴ−４７４腫瘍細胞を頭蓋内移植されたマウスの生存結果を提供する。
【０４３０】
この実施例は、ｖ２１２５２が、ＢＴ−４７４乳房腫瘍細胞を頭蓋内移植されたマウスの生存を延長するのに効果的であることを示している。
【０４３１】
（表２６）頭蓋内移植されたＢＴ−４７４ヒト乳癌モデル研究デザイン
2021515793.tif 000103
Ｎ／Ａ＝該当なし。
【０４３２】
本明細書で参照されているすべての特許、特許出願、刊行物、及びデータベースエントリの開示は、これらの個々の特許、特許出願、刊行物、及びデータベースエントリが各々具体的かつ個別に、参照により組み込まれると示されているのと同じ程度に、その全体が参照により具体的に組み込まれる。
【０４３３】
本明細書に記載されている、当業者には明らかであろう特定の実施形態の修正は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
【０４３４】
配列一覧表
（表Ａ）バリアントｖ５０１９、ｖ５０２０、ｖ７０９１、ｖ１００００、ｖ６９０３、ｖ６９０２及びｖ６７１７のクローン番号
2021515793.tif 000104
【０４３５】
（表Ｂ）クローン番号別のバリアントｖ５０１９、ｖ５０２０、ｖ７０９１、ｖ１００００、ｖ６９０３、ｖ６９０２及びｖ６７１７の配列
2021515793.tif 000105
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【０４３６】
（表Ｃ）バリアントｖ７１３３、ｖ１５０８２、ｖ１５０８５、ｖ１５０８３、ｖ１５０８０、ｖ１５０７９、ｖ１５０８４及びｖ１５０８１のＶＨ及びＶＬ領域の配列
2021515793.tif 000119
2021515793.tif 000120
【図１】
2021515793.tif 000134
【図２Ａ】
2021515793.tif 000135
【図２Ｂ】
2021515793.tif 000136
【図２Ｃ】
2021515793.tif 000137
【図２Ｄ】
2021515793.tif 000138
【図２Ｅ】
2021515793.tif 000139
【図３】
2021515793.tif 000140
【図４Ａ】
2021515793.tif 000141
【図４Ｂ】
2021515793.tif 000142
【図４Ｃ】
2021515793.tif 000143
【図５Ａ】
2021515793.tif 000144
【図５Ｂ】
2021515793.tif 000145
【図５Ｃ】
2021515793.tif 000146
【図５Ｄ】
2021515793.tif 000147
【図５Ｅ】
2021515793.tif 000148
【図５Ｆ】
2021515793.tif 000149
【図６Ａ】
2021515793.tif 000150
【図６Ｂ】
2021515793.tif 000151
【図６Ｃ】
2021515793.tif 000152
【図６Ｄ】
2021515793.tif 000153
【図７Ａ】
2021515793.tif 000154
【図７Ｂ】
2021515793.tif 000155
【図８Ａ】
2021515793.tif 000156
【図８Ｂ】
2021515793.tif 000157
【図９】
2021515793.tif 000158
【図１０】
2021515793.tif 000159
【図１１】
2021515793.tif 000160
【図１２】
2021515793.tif 000161
【図１３】
2021515793.tif 000162
【図１４】
2021515793.tif 000163
【図１５】
2021515793.tif 000164
【図１６】
2021515793.tif 000165
【図１７】
2021515793.tif 000166
【図１８】
2021515793.tif 000167
【配列表】
2021515793000001.app
【国際調査報告】
2021515793.tif 000168
2021515793.tif 000169
2021515793.tif 000170