(57)【要約】  本発明は、鉄依存性細胞分解を阻害することによって免疫応答を低下させる方法を提供する。免疫応答の低下は、例えば、自己免疫障害、アレルギー、又は炎症性障害を含む、鉄依存性細胞分解に関連する障害の処置に使用することができる。本発明はまた、鉄依存性細胞分解を阻害し、且つ免疫抑制剤でもある化合物を同定するためのスクリーニングアッセイを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞、組織、又は対象における免疫活性を低下させる方法であって、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない細胞、組織、又は対象と比較して免疫活性を低下させるのに十分な量の前記鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤を前記細胞、組織、又は対象に投与することを含み、前記鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤が、フェロスタチン−１又はその誘導体又は類似体を含む、方法。
【請求項２】
前記フェロスタチン−１誘導体又はその類似体が、以下の式：
【化１】
2021527648.tif 000058
によって表されるか、又はそのＮ−オキシド、結晶形態、水和物、又は薬学的に許容される塩であり：
Ｒ１及びＲ２は独立に、原子なし、Ｈ、Ｄ、Ｏ、ハロ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキル−アリール、Ｃ１〜６アルキル−ヘテロアリール、Ｃ１〜６アルケニル、Ｃ１〜６アルケニル−アリール、及びＣ１〜６アルケニル−ヘテロアリールからなる群から選択され、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキル−アリール、Ｃ１〜６アルキル−ヘテロアリール、Ｃ１〜６アルケニル、Ｃ１〜６アルケニル−アリール、及びＣ１〜６アルケニル−ヘテロアリールは、任意選択により原子、又はハロ、重水素、Ｃ１〜４アルキル、ＣＦ３、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される基で置換することができ；且つ
Ｒ３は独立に、Ｈ、Ｃ１〜１２脂肪族、Ｃ１〜６−アルキル−アリール、及びＣ１〜６−アルキル−ヘテロアリールからなる群から選択されるが；
ただし、条件として：
Ｒ３がエチルの場合、Ｒ１及びＲ２は、両方がＨ、Ｏ、又は
【化２】
2021527648.tif 000059
ではあり得ず；且つ
Ｒ３がエチルであり、且つＲ１又はＲ２の少なくとも一方がＨである場合、Ｒ１又はＲ２は、
【化３】
2021527648.tif 000060
であり得ない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記フェロスタチン−１誘導体又はその類似体が、以下の式：
【化４】
2021527648.tif 000061
によって表されるか、又はその薬学的に許容される塩、エナンチオマー、ジアステレオマーであり、式中
ＸはＣＨ又はＮであり；
Ｙは、Ｈ、ハロ、又はＣ１〜４アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、ハロ、シクロアルキル、及びＮＲ４Ｒ５からなる群から選択され；
Ｒ２は、ＮＲ６Ｒ７及びＮＯ２からなる群から選択され；
Ｒ３は、Ｈ、
【化５】
2021527648.tif 000062
からなる群から選択され；
Ｒ４及びＲ５は独立に、Ｈ、Ｃ１〜１２アルキル、Ｃ３〜１２シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、シクロアルキルの環炭素の１つ又は複数は、任意選択により１つ又は複数のヘテロ原子で置換され、シクロアルキルは、任意選択により、Ｈ、Ｆ、ＮＲ１０Ｒ１１、Ｂｏｃ、ＣＯＯＲ１２、及びＣ１〜８アルキルからなる群から選択される１つ又は複数のペンダント基を含み；
Ｒ６及びＲ７は独立に、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、ＢＯＣ、Ｏ、ＣＯＯＲ１２、
【化６】
2021527648.tif 000063
、及びＣ１〜３アルキル−アリールからなる群から選択され、アルキルアリールの環炭素の１つ又は複数は、任意選択により１つ又は複数の窒素原子で置換され、アルキル−アリールは、任意選択により、Ｈ、ハロ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１〜４エーテル、Ｃ１〜４エステル、ＯＣＯＯＲ１２、及びＣ１〜８アルキルからなる群から選択される１つ又は複数のペンダント基を含み、Ｃ１〜８アルキルは、任意選択により、１つ又は複数のハロでさらに置換され；
Ｒ８及びＲ９は独立に、原子なし、Ｏ、Ｎ、ＮＨＲ１２、Ｃ１〜１０アルキル、及びＣ１〜１０エーテルからなる群から選択され、アルキル及びエーテルは、任意選択により、ＮＨ２、ＮＨＢＯＣ、又はＣ３〜１２シクロアルキルで置換され、シクロアルキルの環炭素の１つ又は複数は、任意選択により、１つ又は複数のヘテロ原子で置換され；
Ｒ１０及びＲ１１は独立に、Ｈ及びＢｏｃから選択され；且つ
Ｒ１２は、任意選択によりアリールで置換されたＣ１〜４アルキルであるが；
ただし、条件として：
Ｒ１がＨである場合、Ｒ３は、
【化７】
2021527648.tif 000064
であり得ず；
Ｒ１が、
【化８】
2021527648.tif 000065
であり、Ｒ２がＮＨ２である場合、Ｒ３は、
【化９】
2021527648.tif 000066
であり得ず；
Ｒ１が
【化１０】
2021527648.tif 000067
である場合、Ｒ３は
【化１１】
2021527648.tif 000068
であり得ず；
Ｒ１が
【化１２】
2021527648.tif 000069
である場合、Ｒ３は
【化１３】
2021527648.tif 000070
であり得ず；
Ｒ１がＣｌである場合、ＸはＮであり得ず、且つ
Ｒ１及びＹの両方はＦであり得ない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記対象が、免疫活性の低下を必要としている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤が、前記細胞、組織、又は対象において、ＮＦｋＢのレベル又は活性、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）又はインターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）のレベル又は活性、マクロファージのレベル又は活性、単球のレベル又は活性、樹状細胞のレベル又は活性、Ｔ細胞のレベル又は活性、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、又はＣＤ３＋細胞のレベル又は活性、及び免疫促進性サイトカインのレベル又は活性のうちの１つ又は複数を低下させるのに十分な量で投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
細胞、組織、又は対象の免疫活性を低下させる方法であって、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない細胞、組織、又は対象と比較して免疫活性を低下させるのに十分な量の鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤を前記細胞、組織、又は対象に投与することを含む、方法。
【請求項７】
前記対象が、免疫活性の低下を必要としている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤が、前記細胞、組織、又は対象において、ＮＦｋＢのレベル又は活性、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）又はインターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）のレベル又は活性、マクロファージのレベル又は活性、単球のレベル又は活性、樹状細胞のレベル又は活性、Ｔ細胞のレベル又は活性、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、又はＣＤ３＋細胞のレベル又は活性、及び免疫促進性サイトカインのレベル又は活性のうちの１つ又は複数を低下させるのに十分な量で投与される、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
細胞、組織、又は対象のＮＦｋＢのレベル又は活性を低下させる方法であって、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない細胞、組織、又は対象と比較してＮＦｋＢのレベル又は活性を低下させるのに十分な量の前記鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤を前記細胞、組織、又は対象に投与することを含む、方法。
【請求項１０】
前記対象が、ＮＦｋＢのレベル又は活性の低下を必要としている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＮＦｋＢのレベル又は活性が、前記鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない細胞、組織、又は対象と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９９％、又は少なくとも２分の１、４分の１、６分の１、８分の１、又は１０分の１低下する、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
細胞、組織、又は対象のＩＲＦ又はインターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）のレベル又は活性を低下させる方法であって、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない細胞、組織、又は対象と比較してＩＲＦ又はＳＴＩＮＧのレベル又は活性を低下させるのに十分な量の前記鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤を前記細胞、組織、又は対象に投与することを含む、方法。
【請求項１３】
前記対象が、ＩＲＦ又はＳＴＩＮＧのレベル又は活性の低下を必要としている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＩＲＦ又はＳＴＩＮＧのレベル又は活性が、前記鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない細胞、組織、又は対象と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９９％、又は少なくとも２倍、４倍、６倍、８倍、又は１０倍上昇する、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
組織又は対象のマクロファージ、単球、樹状細胞、又はＴ細胞のレベル又は活性を低下させる方法であって、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない組織又は対象と比較してマクロファージ、単球、樹状細胞、又はＴ細胞のレベル又は活性を高めるのに十分な量の前記鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤を前記組織又は対象に投与することを含む、方法。
【請求項１６】
前記対象が、マクロファージ、単球、樹状細胞、又はＴ細胞のレベル又は活性の低下を必要としている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記マクロファージ、単球、樹状細胞、又はＴ細胞のレベル又は活性が、前記鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない組織又は対象と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９９％、又は少なくとも２倍、４倍、６倍、８倍、又は１０倍低下する、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
組織又は対象のＣＤ４＋、ＣＤ８＋、又はＣＤ３＋細胞のレベル又は活性を低下させる方法であって、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない組織又は対象と比較してＣＤ４＋、ＣＤ８＋、又はＣＤ３＋細胞のレベル又は活性を低下させるのに十分な量の前記鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１９】
前記対象が、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、又はＣＤ３＋細胞のレベル又は活性の低下を必要としている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、又はＣＤ３＋細胞のレベル又は活性が、前記鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない組織又は対象と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９９％、又は少なくとも２倍、４倍、６倍、８倍、又は１０倍低下する、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
細胞、組織、又は対象の免疫促進性サイトカインのレベル又は活性を低下させる方法であって、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない細胞、組織、又は対象と比較して免疫促進性サイトカインのレベル又は活性を低下させるのに十分な量の前記鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤を前記細胞、組織、又は対象に投与することを含む、方法。
【請求項２２】
前記対象が、免疫促進性サイトカインのレベル又は活性の低下を必要としている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記免疫促進性サイトカインのレベル又は活性が、前記鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない細胞、組織、又は対象と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９９％、又は少なくとも２倍、４倍、６倍、８倍、又は１０倍低下する、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記免疫促進性サイトカインが、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７、及びＧＭＣＳＦから選択される、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
投与前に、ＮＦｋＢのレベル又は活性；マクロファージのレベル又は活性；単球のレベル又は活性；樹状細胞のレベル又は活性；ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、又はＣＤ３＋細胞のレベル又は活性；Ｔ細胞のレベル又は活性；及び免疫促進性サイトカインのレベル又は活性のうちの１つ又は複数について前記細胞、組織、又は対象を評価することをさらに含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
投与後に、ＮＦｋＢのレベル又は活性；マクロファージのレベル又は活性；単球のレベル又は活性；樹状細胞のレベル又は活性；ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、又はＣＤ３＋細胞のレベル又は活性；Ｔ細胞のレベル又は活性；及び免疫促進性サイトカインのレベル又は活性のうちの１つ又は複数について前記細胞、組織、又は対象を評価することをさらに含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫促進性サイトカインが、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７、及びＧＭＣＳＦから選択される、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
免疫活性の低下を必要とする対象を処置する方法であって、前記対象の免疫活性を低下させるのに十分な量の鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２９】
前記対象が、鉄依存性細胞分解に関連する障害を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記対象が、鉄依存性細胞分解が有害である障害を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
鉄依存性細胞分解について前記対象を評価することをさらに含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記対象が、炎症性疾患又は状態を有する、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記炎症性疾患又は状態が、炎症、急性臓器損傷、組織損傷、敗血症、アテローム性動脈硬化症、神経変性障害、及び免疫関連疾患又は状態からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記炎症が、無菌炎症、慢性炎症、及び疾患又は損傷に応答した急性炎症から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記免疫関連疾患又は状態が自己免疫疾患である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）、筋委縮性性側索硬化症（ＡＬＳ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、乾癬、及び潰瘍性大腸炎から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記免疫関連の疾患又は状態がアレルギー又は喘息である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記免疫関連疾患又は状態が自己炎症状態である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤が、脂質過酸化反応の阻害剤、グルタミノリシスの阻害剤、リポキシゲナーゼの阻害剤、システインジオキシゲナーゼ１（ＣＤＯ１）の阻害剤、及びＤＰＰ４の阻害剤から選択される、請求項６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤が、シクロヘキシミド、ベータ−メルカプトエタノール、ドーパミン、及びセレンから選択される、請求項６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記リポキシゲナーゼの阻害剤が、アラキドン酸リポキシゲナーゼ（ＡＬＯＸ）の阻害剤である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記アラキドン酸リポキシゲナーゼの阻害剤が、ＣＤＣ、バイカレイン、ＰＤ−１４６１７６、ＡＡ−８６１、及びジロイトンからなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記脂質過酸化反応の阻害剤が、ビタミンＥ、アルファ−トコフェロール、トロロックス、トコトリエノール、重水素化多価不飽和脂肪酸（Ｄ−ＰＵＦＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、フェロスタチン−１又はその誘導体又は類似体、リプロクススタチン−１（Ｌｉｐｒｏｘｓｔａｔｉｎ−１）又はその誘導体又は類似体、コエンザイムＱ１０、イデベノン、ＸＪＢ−５−１３１、デフェロキサミン、シクリピロックス（ｃｙｃｌｉｐｉｒｏｘ）、及びデフェリプロンから選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤が、フェロスタチン−１又はその誘導体又は類似体である、請求項６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記フェロスタチン−１誘導体又はその類似体が、以下の式：
【化１４】
2021527648.tif 000071
によって表されるか、又はそのＮ−オキシド、結晶形態、水和物、又は薬学的に許容される塩であり：
Ｒ１及びＲ２は独立に、原子なし、Ｈ、Ｄ、Ｏ、ハロ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキル−アリール、Ｃ１〜６アルキル−ヘテロアリール、Ｃ１〜６アルケニル、Ｃ１〜６アルケニル−アリール、及びＣ１〜６アルケニル−ヘテロアリールからなる群から選択され、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキル−アリール、Ｃ１〜６アルキル−ヘテロアリール、Ｃ１〜６アルケニル、Ｃ１〜６アルケニル−アリール、及びＣ１〜６アルケニル−ヘテロアリールは、任意選択により原子、又はハロ、重水素、Ｃ１〜４アルキル、ＣＦ３、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される基で置換することができ；且つ
Ｒ３は独立に、Ｈ、Ｃ１〜１２脂肪族、Ｃ１〜６−アルキル−アリール、及びＣ１〜６−アルキル−ヘテロアリールからなる群から選択されるが；
ただし、条件として：
Ｒ３がエチルの場合、Ｒ１及びＲ２は、両方がＨ、Ｏ、又は
【化１５】
2021527648.tif 000072
ではあり得ず；且つ
Ｒ３がエチルであり、且つＲ１又はＲ２の少なくとも一方がＨである場合、Ｒ１又はＲ２は、
【化１６】
2021527648.tif 000073
であり得ない、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記フェロスタチン−１誘導体又はその類似体が、以下の式：
【化１７】
2021527648.tif 000074
によって表されるか、又はその薬学的に許容される塩、エナンチオマー、ジアステレオマーであり、式中
ＸはＣＨ又はＮであり；
Ｙは、Ｈ、ハロ、又はＣ１〜４アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、ハロ、シクロアルキル、及びＮＲ４Ｒ５からなる群から選択され；
Ｒ２は、ＮＲ６Ｒ７及びＮＯ２からなる群から選択され；
Ｒ３は、Ｈ、
【化１８】
2021527648.tif 000075
からなる群から選択され；
Ｒ４及びＲ５は独立に、Ｈ、Ｃ１〜１２アルキル、Ｃ３〜１２シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、シクロアルキルの環炭素の１つ又は複数は、任意選択により１つ又は複数のヘテロ原子で置換され、シクロアルキルは、任意選択により、Ｈ、Ｆ、ＮＲ１０Ｒ１１、Ｂｏｃ、ＣＯＯＲ１２、及びＣ１〜８アルキルからなる群から選択される１つ又は複数のペンダント基を含み；
Ｒ６及びＲ７は独立に、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｂｏｃ、Ｏ、ＣＯＯＲ１２、
【化１９】
2021527648.tif 000076
、及びＣ１〜３アルキル−アリールからなる群から選択され、アルキルアリールの環炭素の１つ又は複数は、任意選択により１つ又は複数の窒素原子で置換され、アルキル−アリールは、任意選択により、Ｈ、ハロ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１〜４エーテル、Ｃ１〜４エステル、ＯＣＯＯＲ１２、及びＣ１〜８アルキルからなる群から選択される１つ又は複数のペンダント基を含み、Ｃ１〜８アルキルは、任意選択により、１つ又は複数のハロでさらに置換され；
Ｒ８及びＲ９は独立に、原子なし、Ｏ、Ｎ、ＮＨＲ１２、Ｃ１〜１０アルキル、及びＣ１〜１０エーテルからなる群から選択され、アルキル及びエーテルは、任意選択により、ＮＨ２、ＮＨＢｏｃ、又はＣ３〜１２シクロアルキルで置換され、シクロアルキルの環炭素の１つ又は複数は、任意選択により、１つ又は複数のヘテロ原子で置換され；
Ｒ１０及びＲ１１は独立に、Ｈ及びＢｏｃから選択され；且つ
Ｒ１２は、任意選択によりアリールで置換されたＣ１〜４アルキルであるが；
ただし、条件として：
Ｒ１がＨである場合、Ｒ３は、
【化２０】
2021527648.tif 000077
であり得ず；
Ｒ１が、
【化２１】
2021527648.tif 000078
であり、Ｒ２がＮＨ２である場合、Ｒ３は、
【化２２】
2021527648.tif 000079
であり得ず；
Ｒ１が
【化２３】
2021527648.tif 000080
である場合、Ｒ３は
【化２４】
2021527648.tif 000081
であり得ず；
Ｒ１が
【化２５】
2021527648.tif 000082
である場合、Ｒ３は
【化２６】
2021527648.tif 000083
であり得ず；
Ｒ１がＣｌである場合、ＸはＮであり得ず、且つ
Ｒ１及びＹの両方はＦであり得ない、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＤＰＰ４の阻害剤が、ビルダグリプチン、アログリプチン、及びリナグリプチンから選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４８】
前記鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤が、
【化２７】
2021527648.tif 000084
又はその薬学的に許容される塩である、請求項６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤が、
【化２８】
2021527648.tif 000085
又はその薬学的に許容される塩である、請求項６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤が、
【化２９】
2021527648.tif 000086
又はその薬学的に許容される塩である、請求項６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
免疫抑制剤をスクリーニングする方法であって：
（ａ）複数の試験薬を用意すること；
（ｂ）鉄依存性細胞分解を阻害する能力について前記複数の試験薬のそれぞれを評価すること；
（ｃ）候補免疫抑制剤として、鉄依存性細胞分解を阻害する試験薬を選択すること；及び
（ｄ）免疫応答を低下させる能力について前記候補免疫抑制剤を評価することを含む、方法。
【請求項５２】
前記評価するステップ（ｂ）が、細胞、組織、又は対象を、前記複数の試験薬と接触させることを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記評価するステップ（ｂ）が、細胞、組織、又は対象を、鉄依存性細胞分解を誘導する薬剤と接触させることを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記対象が動物である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記評価するステップ（ｂ）が、前記試験薬と接触した細胞又は組織における、脂質過酸化反応、活性酸素種（ＲＯＳ）、イソプロスタン、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）、鉄、グルタチオンペルオキシダーゼ４（ＧＰＸ４）、プロスタグランジン−エンドペルオキシドシンターゼ２（ＰＴＧＳ２）、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）、及びグルタチオン（ＧＳＨ）からなる群から選択されるマーカーのレベル又は活性を測定することをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記評価するステップ（ｂ）が、前記試験薬と接触した前記細胞、組織、又は対象におけるマーカーのレベル又は活性を、前記試験薬と接触していない対照細胞、対照組織、又は対照対象におけるマーカーのレベル又は活性と比較することをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
前記対照細胞、対照組織、又は対照対象が、鉄依存性細胞分解を誘導する薬剤と接触されている、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記試験薬と接触していない対照細胞、対照組織、又は対照対象における、脂質過酸化反応、イソプロスタン、活性酸素種（ＲＯＳ）、鉄、ＰＴＧＳ２、及びＣＯＸ−２からなる群から選択されるマーカーのレベル又は活性と比較した、試験薬と接触した細胞、組織、又は対象における前記マーカーのレベル又は活性の低下が、試験薬が、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤であることを示している、請求項５１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記試験薬と接触していない対照細胞、対照組織、又は対照対象における、ＧＰＸ４、ＭＤＡ、及びＧＳＨからなる群から選択されるマーカーのレベル又は活性と比較した、前記試験薬と接触した前記細胞、組織、又は対象における前記マーカーのレベル又は活性の上昇が、前記試験薬が鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤であることを示している、請求項５１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記候補免疫抑制剤を評価することが、前記選択された候補免疫抑制剤と接触した細胞と共に免疫細胞を培養するか、又は前記選択された候補免疫抑制剤と接触した細胞によって産生される後細胞シグナル伝達因子に免疫細胞を曝露すること、及び前記免疫細胞のＮＦκＢ、ＩＲＦ、若しくはＳＴＩＮＧのレベル又は活性を測定することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項６１】
前記免疫細胞がＴＨＰ−１細胞である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記候補免疫抑制剤を評価することが、前記選択された候補免疫抑制剤と接触した細胞と共にＴ細胞を培養するか、又は前記選択された候補免疫抑制剤と接触した細胞によって産生される後細胞シグナル伝達因子にＴ細胞を曝露すること、及び前記Ｔ細胞の活性化及び増殖を測定することを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記候補免疫抑制剤を評価することが、前記選択された候補免疫抑制剤と接触した細胞と共に培養されたか、又は前記選択された候補免疫抑制剤と接触した細胞によって産生される後細胞シグナル伝達因子に曝露された免疫細胞におけるＮＦκＢ、ＩＲＦ、又はＳＴＩＮＧのレベル又は活性を、前記選択された候補免疫抑制剤と接触しておらず、また前記選択された候補免疫抑制剤と接触した細胞によって産生される後細胞シグナル伝達因子に曝露もされていない対照免疫細胞におけるＮＦκＢ、ＩＲＦ、又はＳＴＩＮＧのレベル又は活性と比較することをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記選択された候補免疫抑制剤と接触した前記細胞が、鉄依存性細胞分解を誘導する薬剤にも接触している、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記鉄依存性細胞分解を誘導する薬剤が、アンチポーター系Ｘｃ−の阻害剤、ＧＰＸ４の阻害剤、及びスタチンからなる群から選択される、請求項５３、５７、及び６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記アンチポーター系Ｘｃ−の阻害剤が、エラスチン又はその誘導体又は類似体である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記エラスチンの類似体がＰＥ又はＩＫＥである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＧＰＸ４の阻害剤が、（１Ｓ，３Ｒ）−ＲＳＬ３又はその誘導体又は類似体、ＭＬ１６２、ＤＰＩ化合物７、ＤＰＩ化合物１０、ＤＰＩ化合物１２、ＤＰＩ化合物１３、ＤＰＩ化合物１７、ＤＰＩ化合物１８、ＤＰＩ化合物１９、ＦＩＮ５６、及びＦＩＮＯ２からなる群から選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記スタチンが、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、セリバスタチン、及びシンバスタチンからなる群から選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
前記鉄依存性細胞分解を誘導する薬剤が、ソラフェニブ又はその誘導体又は類似体、スルファサラジン、グルタミン酸塩、ＢＳＯ、ＤＰＩ２、シスプラチン、システイナーゼ、シリカベースのナノ粒子、ＣＣＩ４、クエン酸鉄アンモニウム、トリゴネリン、及びブルサトール（ｂｒｕｓａｔｏｌ）からなる群から選択される、請求項５３、５７、及び６４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、それぞれ内容がその全体の参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年６月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／６８５，７６３号明細書、及び２０１８年１２月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／７８１，８２２号明細書の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
多細胞生物では、細胞死は、組織の恒常性を維持し、且つ潜在的に有害な細胞を排除すると考えられている重要で活発なプロセスである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
特定の態様では、本開示は、細胞、組織、又は対象における免疫活性を低下させる方法に関し、この方法は、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない細胞、組織、又は対象と比較して免疫活性を低下させるのに十分な量の鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤を細胞、組織、又は対象に投与することを含み、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤は、フェロスタチン−１又はその誘導体又は類似体を含む。
【０００４】
いくつかの実施形態では、フェロスタチン−１誘導体又はその類似体は、以下の式：
【化１】
2021527648.tif 000002
によって表されるか、又はそのＮ−オキシド、結晶形態、水和物、又は薬学的に許容される塩であり、式中：
Ｒ１及びＲ２は独立に、原子なし、Ｈ、Ｄ、Ｏ、ハロ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキル−アリール、Ｃ１〜６アルキル−ヘテロアリール、Ｃ１〜６アルケニル、Ｃ１〜６アルケニル−アリール、及びＣ１〜６アルケニル−ヘテロアリールからなる群から選択され、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキル−アリール、Ｃ１〜６アルキル−ヘテロアリール、Ｃ１〜６アルケニル、Ｃ１〜６アルケニル−アリール、及びＣ１〜６アルケニル−ヘテロアリールは、任意選択により原子、又はハロ、重水素、Ｃ１〜４アルキル、ＣＦ３、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される基で置換することができ；且つ
Ｒ３は独立に、Ｈ、Ｃ１〜１２脂肪族、Ｃ１〜６−アルキル−アリール、及びＣ１〜６−アルキル−ヘテロアリールからなる群から選択されるが；
ただし、条件として：
Ｒ３がエチルの場合、Ｒ１及びＲ２は、両方がＨ、Ｏ、又は
【化２】
2021527648.tif 000003
ではあり得ず；且つ
Ｒ３がエチルであり、且つＲ１又はＲ２の少なくとも一方がＨである場合、Ｒ１又はＲ２は、
【化３】
2021527648.tif 000004
であり得ない。
【０００５】
いくつかの実施形態では、フェロスタチン−１誘導体又はその類似体は、以下の式：
【化４】
2021527648.tif 000005
によって表されるか、又はその薬学的に許容される塩、エナンチオマー、ジアステレオマーであり、式中
ＸはＣＨ又はＮであり；
Ｙは、Ｈ、ハロ、又はＣ１〜４アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、ハロ、シクロアルキル、及びＮＲ４Ｒ５からなる群から選択され；
Ｒ２は、ＮＲ６Ｒ７及びＮＯ２からなる群から選択され；
Ｒ３は、Ｈ、
【化５】
2021527648.tif 000006
からなる群から選択され；
Ｒ４及びＲ５は独立に、Ｈ、Ｃ１〜１２アルキル、Ｃ３〜１２シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、シクロアルキルの環炭素の１つ又は複数は、任意選択により、１つ又は複数のヘテロ原子で置換され、シクロアルキルは、任意選択により、Ｈ、Ｆ、ＮＲ１０Ｒ１１、Ｂｏｃ、ＣＯＯＲ１２、及びＣ１〜８アルキルからなる群から選択される１つ又は複数のペンダント基を含み；
Ｒ６及びＲ７は独立に、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｂｏｃ、Ｏ、ＣＯＯＲ１２、
【化６】
2021527648.tif 000007
、及びＣ１〜３アルキル−アリールからなる群から選択され、アルキルアリールの環炭素の１つ又は複数は、任意選択により、１つ又は複数の窒素原子で置換され、アルキル−アリールは、任意選択により、Ｈ、ハロ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１〜４エーテル、Ｃ１〜４エステル、ＯＣＯＯＲ１２、及びＣ１〜８アルキルからなる群から選択される１つ又は複数のペンダント基を含み、Ｃ１〜８アルキルは、任意選択により、１つ又は複数のハロでさらに置換され；
Ｒ８及びＲ９は独立に、原子なし、Ｏ、Ｎ、ＮＨＲ１２、Ｃ１〜１０アルキル、及びＣ１〜１０エーテルからなる群から選択され、アルキル及びエーテルは、任意選択により、ＮＨ２、ＮＨＢｏｃ、又はＣ３〜１２シクロアルキルで置換され、シクロアルキルの環炭素の１つ又は複数は、任意選択により、１つ又は複数のヘテロ原子で置換され；
Ｒ１０及びＲ１１は独立に、Ｈ及びＢｏｃから選択され；且つ
Ｒ１２は、任意選択によりアリールで置換されたＣ１〜４アルキルであるが；
ただし、条件として：
Ｒ１がＨである場合、Ｒ３は、
【化７】
2021527648.tif 000008
であり得ず；
Ｒ１が、
【化８】
2021527648.tif 000009
であり、Ｒ２がＮＨ２である場合、Ｒ３は、
【化９】
2021527648.tif 000010
であり得ず；
Ｒ１が
【化１０】
2021527648.tif 000011
である場合、Ｒ３は
【化１１】
2021527648.tif 000012
であり得ず；
Ｒ１が
【化１２】
2021527648.tif 000013
である場合、Ｒ３は
【化１３】
2021527648.tif 000014
であり得ず；
Ｒ１がＣｌである場合、ＸはＮであり得ず、且つ
Ｒ１及びＹの両方はＦであり得ない。
【０００６】
いくつかの実施形態では、対象は、免疫活性の低下を必要としている。いくつかの実施形態では、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤は、細胞、組織、又は対象において、ＮＦｋＢのレベル又は活性、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）又はインターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）のレベル又は活性、マクロファージのレベル又は活性、単球のレベル又は活性、樹状細胞のレベル又は活性、Ｔ細胞のレベル又は活性、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、又はＣＤ３＋細胞のレベル又は活性、及び免疫促進性サイトカインのレベル又は活性のうちの１つ又は複数を低下させるのに十分な量で投与される。
【０００７】
特定の態様では、本開示は、細胞、組織、又は対象の免疫活性を低下させる方法に関し、この方法は、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない細胞、組織、又は対象と比較して免疫活性を低下させるのに十分な量の鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤を細胞、組織、又は対象に投与することを含む。
【０００８】
一実施形態では、対象は、免疫活性の低下を必要としている。
【０００９】
一実施形態では、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤は、細胞、組織、又は対象において、ＮＦｋＢのレベル又は活性、ＩＲＦ又はＳＴＩＮＧのレベル又は活性、マクロファージのレベル又は活性、単球のレベル又は活性、樹状細胞のレベル又は活性、Ｔ細胞のレベル又は活性、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、又はＣＤ３＋細胞のレベル又は活性、及び免疫促進性サイトカインのレベル又は活性のうちの１つ又は複数を低下させるのに十分な量で投与される。
【００１０】
特定の態様では、本開示は、細胞、組織、又は対象のＮＦｋＢのレベル又は活性を低下させる方法に関し、この方法は、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない細胞、組織、又は対象と比較してＮＦｋＢのレベル又は活性を低下させるのに十分な量の鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤を細胞、組織、又は対象に投与することを含む。
【００１１】
一実施形態では、対象は、ＮＦｋＢのレベル又は活性の低下を必要としている。
【００１２】
一実施形態では、ＮＦｋＢのレベル又は活性は、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない細胞、組織、又は対象と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９９％、又は少なくとも２分の１、４分の１、６分の１、８分の１、又は１０分の１低下する。
【００１３】
特定の態様では、本開示は、細胞、組織、又は対象のＩＲＦ又はＳＴＩＮＧのレベル又は活性を低下させる方法に関し、この方法は、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない細胞、組織、又は対象と比較してＩＲＦ又はＳＴＩＮＧのレベル又は活性を低下させるのに十分な量の鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤を細胞、組織、又は対象に投与することを含む。
【００１４】
一実施形態では、対象は、ＩＲＦ又はＳＴＩＮＧのレベル又は活性の低下を必要としている。
【００１５】
一実施形態では、ＩＲＦ又はＳＴＩＮＧのレベル又は活性は、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない細胞、組織、又は対象と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９９％、又は少なくとも２倍、４倍、６倍、８倍、又は１０倍上昇する。
【００１６】
特定の態様では、本開示は、組織又は対象のマクロファージ、単球、樹状細胞、又はＴ細胞のレベル又は活性を低下させる方法に関し、この方法は、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない組織又は対象と比較してマクロファージ、単球、樹状細胞、又はＴ細胞のレベル又は活性を高めるのに十分な量の鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤を組織又は対象に投与することを含む。
【００１７】
一実施形態では、対象は、マクロファージ、単球、樹状細胞、又はＴ細胞のレベル又は活性の低下を必要としている。
【００１８】
一実施形態では、マクロファージ、単球、樹状細胞、又はＴ細胞のレベル又は活性は、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない組織又は対象と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９９％、又は少なくとも２倍、４倍、６倍、８倍、又は１０倍低下する。
【００１９】
特定の態様では、本開示は、組織又は対象のＣＤ４＋、ＣＤ８＋、又はＣＤ３＋細胞のレベル又は活性を低下させる方法に関し、この方法は、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない組織又は対象と比較してＣＤ４＋、ＣＤ８＋、又はＣＤ３＋細胞のレベル又は活性を低下させるのに十分な量の鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤を対象に投与することを含む。
【００２０】
一実施形態では、対象は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、又はＣＤ３＋細胞のレベル又は活性の低下を必要としている。
【００２１】
一実施形態では、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、又はＣＤ３＋細胞のレベル又は活性は、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない組織又は対象と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９９％、又は少なくとも２倍、４倍、６倍、８倍、又は１０倍低下する。
【００２２】
特定の態様では、本開示は、細胞、組織、又は対象の免疫促進性サイトカインのレベル又は活性を低下させる方法に関し、この方法は、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない細胞、組織、又は対象と比較して免疫促進性サイトカインのレベル又は活性を低下させるのに十分な量の鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤を細胞、組織、又は対象に投与することを含む。
【００２３】
一実施形態では、対象は、免疫促進性サイトカインのレベル又は活性の低下を必要としている。
【００２４】
一実施形態では、免疫促進性サイトカインのレベル又は活性は、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない細胞、組織、又は対象と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９９％、又は少なくとも２倍、４倍、６倍、８倍、又は１０倍低下する。
【００２５】
一実施形態では、免疫促進性サイトカインは、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７、及びＧＭＣＳＦから選択される。
【００２６】
一実施形態では、この方法は、投与前に、ＮＦｋＢのレベル又は活性；マクロファージのレベル又は活性；単球のレベル又は活性；樹状細胞のレベル又は活性；ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、又はＣＤ３＋細胞のレベル又は活性；Ｔ細胞のレベル又は活性；及び免疫促進性サイトカインのレベル又は活性のうちの１つ又は複数について細胞、組織、又は対象を評価することをさらに含む。
【００２７】
一実施形態では、この方法は、投与後に、ＮＦｋＢのレベル又は活性；マクロファージのレベル又は活性；単球のレベル又は活性；樹状細胞のレベル又は活性；ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、又はＣＤ３＋細胞のレベル又は活性；Ｔ細胞のレベル又は活性；及び免疫促進性サイトカインのレベル又は活性のうちの１つ又は複数について細胞、組織、又は対象を評価することをさらに含む。
【００２８】
実施形態では、免疫促進性サイトカインは、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７、及びＧＭＣＳＦから選択される。
【００２９】
一実施形態では、対象は、炎症性疾患又は状態を有する。
【００３０】
一実施形態では、炎症性疾患又は状態は、炎症、急性臓器損傷、組織損傷、敗血症、アテローム性動脈硬化症、神経変性障害、及び免疫関連疾患又は状態からなる群から選択される。
【００３１】
一実施形態では、炎症は、無菌炎症、慢性炎症、及び疾患又は損傷に応答した急性炎症から選択される。
【００３２】
一実施形態では、免疫関連の疾患又は状態は自己免疫疾患である。
【００３３】
一実施形態では、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）、筋委縮性性側索硬化症（ＡＬＳ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、乾癬、及び潰瘍性大腸炎から選択される。
【００３４】
一実施形態では、免疫関連疾患又は状態はアレルギー又は喘息である。
【００３５】
一実施形態では、免疫関連疾患又は状態は自己炎症状態である。
【００３６】
特定の態様では、本開示は、免疫活性の低下を必要とする対象を処置する方法に関し、この方法は、対象の免疫活性を低下させるのに十分な量の鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤を対象に投与することを含む。
【００３７】
一実施形態では、対象は、鉄依存性細胞分解に関連する障害を有する。
【００３８】
一実施形態では、対象は、鉄依存性細胞分解が有害である障害を有する。
【００３９】
一実施形態では、この方法は、鉄依存性細胞分解について対象を評価することをさらに含む。
【００４０】
一実施形態では、対象は、炎症性疾患又は状態を有する。
【００４１】
一実施形態では、炎症性疾患又は状態は、炎症、急性臓器損傷、組織損傷、敗血症、アテローム性動脈硬化症、神経変性障害、及び免疫関連疾患又は状態からなる群から選択される。
【００４２】
一実施形態では、炎症は、無菌炎症、慢性炎症、及び疾患又は損傷に応答した急性炎症から選択される。
【００４３】
一実施形態では、免疫関連疾患又は状態は自己免疫疾患である。
【００４４】
一実施形態では、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）、筋委縮性性側索硬化症（ＡＬＳ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、乾癬、及び潰瘍性大腸炎から選択される。
【００４５】
一実施形態では、免疫関連疾患又は状態はアレルギー又は喘息である。
【００４６】
一実施形態では、免疫関連疾患又は状態は自己炎症状態である。
【００４７】
一実施形態では、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤は、脂質過酸化反応の阻害剤、グルタミノリシスの阻害剤、リポキシゲナーゼの阻害剤、システインジオキシゲナーゼ１（ＣＤＯ１）の阻害剤、及びＤＰＰ４の阻害剤から選択される。
【００４８】
一実施形態では、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤は、シクロヘキシミド、ベータ−メルカプトエタノール、ドーパミン、及びセレンから選択される。
【００４９】
一実施形態では、リポキシゲナーゼの阻害剤は、アラキドン酸リポキシゲナーゼ（ＡＬＯＸ）の阻害剤である。
【００５０】
一実施形態では、リポキシゲナーゼの阻害剤は、ＣＤＣ、バイカレイン、ＰＤ−１４６１７６、ＡＡ−８６１、及びジロイトンからなる群から選択される。
【００５１】
一実施形態では、脂質過酸化反応の阻害剤は、ビタミンＥ、アルファ−トコフェロール、トロロックス、トコトリエノール、重水素化多価不飽和脂肪酸（Ｄ−ＰＵＦＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、フェロスタチン−１又はその誘導体又は類似体、リプロクススタチン−１（Ｌｉｐｒｏｘｓｔａｔｉｎ−１）又はその誘導体又は類似体、コエンザイムＱ１０、イデベノン、ＸＪＢ−５−１３１、デフェロキサミン、シクリピロックス（ｃｙｃｌｉｐｉｒｏｘ）、及びデフェリプロンから選択される。
【００５２】
特定の実施形態では、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤はフェロスタチン−１である。
【００５３】
一実施形態では、フェロスタチン−１誘導体又はその類似体は、以下の式：
【化１４】
2021527648.tif 000015
によって表されるか、又はそのＮ−オキシド、結晶形態、水和物、又は薬学的に許容される塩であり、式中：
Ｒ１及びＲ２は独立に、原子なし、Ｈ、Ｄ、Ｏ、ハロ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキル−アリール、Ｃ１〜６アルキル−ヘテロアリール、Ｃ１〜６アルケニル、Ｃ１〜６アルケニル−アリール、及びＣ１〜６アルケニル−ヘテロアリールからなる群から選択され、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキル−アリール、Ｃ１〜６アルキル−ヘテロアリール、Ｃ１〜６アルケニル、Ｃ１〜６アルケニル−アリール、及びＣ１〜６アルケニル−ヘテロアリールは、任意選択により原子、又はハロ、重水素、Ｃ１〜４アルキル、ＣＦ３、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される基で置換することができ；且つ
Ｒ３は独立に、Ｈ、Ｃ１〜１２脂肪族、Ｃ１〜６−アルキル−アリール、及びＣ１〜６−アルキル−ヘテロアリールからなる群から選択されるが；
ただし、条件として：
Ｒ３がエチルの場合、Ｒ１及びＲ２は、両方がＨ、Ｏ、又は
【化１５】
2021527648.tif 000016
ではあり得ず；且つ
Ｒ３がエチルであり、且つＲ１又はＲ２の少なくとも一方がＨである場合、Ｒ１又はＲ２は、
【化１６】
2021527648.tif 000017
であり得ない。
【００５４】
一実施形態では、フェロスタチン−１誘導体又はその類似体は、以下の式：
【化１７】
2021527648.tif 000018
によって表されるか、又はその薬学的に許容される塩、エナンチオマー、ジアステレオマーであり、式中
ＸはＣＨ又はＮであり；
Ｙは、Ｈ、ハロ、又はＣ１〜４アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、ハロ、シクロアルキル、及びＮＲ４Ｒ５からなる群から選択され；
Ｒ２は、ＮＲ６Ｒ７及びＮＯ２からなる群から選択され；
Ｒ３は、Ｈ、
【化１８】
2021527648.tif 000019
からなる群から選択され；
Ｒ４及びＲ５は独立に、Ｈ、Ｃ１〜１２アルキル、Ｃ３〜１２シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、シクロアルキルの環炭素の１つ又は複数は、任意選択により、１つ又は複数のヘテロ原子で置換され、シクロアルキルは、任意選択により、Ｈ、Ｆ、ＮＲ１０Ｒ１１、Ｂｏｃ、ＣＯＯＲ１２、及びＣ１〜８アルキルからなる群から選択される１つ又は複数のペンダント基を含み；
Ｒ６及びＲ７は独立に、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｂｏｃ、Ｏ、ＣＯＯＲ１２、
【化１９】
2021527648.tif 000020
、及びＣ１〜３アルキル−アリールからなる群から選択され、アルキルアリールの環炭素の１つ又は複数は、任意選択により、１つ又は複数の窒素原子で置換され、アルキル−アリールは、任意選択により、Ｈ、ハロ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１〜４エーテル、Ｃ１〜４エステル、ＯＣＯＯＲ１２、及びＣ１〜８アルキルからなる群から選択される１つ又は複数のペンダント基を含み、Ｃ１〜８アルキルは、任意選択により、１つ又は複数のハロでさらに置換され；
Ｒ８及びＲ９は独立に、原子なし、Ｏ、Ｎ、ＮＨＲ１２、Ｃ１〜１０アルキル、及びＣ１〜１０エーテルからなる群から選択され、アルキル及びエーテルは、任意選択により、ＮＨ２、ＮＨＢｏｃ、又はＣ３〜１２シクロアルキルで置換され、シクロアルキルの環炭素の１つ又は複数は、任意選択により、１つ又は複数のヘテロ原子で置換され；
Ｒ１０及びＲ１１は独立に、Ｈ及びＢｏｃから選択され；且つ
Ｒ１２は、任意選択によりアリールで置換されたＣ１〜４アルキルであるが；
ただし、条件として：
Ｒ１がＨである場合、Ｒ３は、
【化２０】
2021527648.tif 000021
であり得ず；
Ｒ１が、
【化２１】
2021527648.tif 000022
であり、Ｒ２がＮＨ２である場合、Ｒ３は、
【化２２】
2021527648.tif 000023
であり得ず；
Ｒ１が
【化２３】
2021527648.tif 000024
である場合、Ｒ３は
【化２４】
2021527648.tif 000025
であり得ず；
Ｒ１が
【化２５】
2021527648.tif 000026
である場合、Ｒ３は
【化２６】
2021527648.tif 000027
であり得ず；
Ｒ１がＣｌである場合、ＸはＮであり得ず、且つ
Ｒ１及びＹの両方はＦであり得ない。
【００５５】
特定の実施形態では、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤は、
【化２７】
2021527648.tif 000028
又はその薬学的に許容される塩である。
【００５６】
特定の実施形態では、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤は、
【化２８】
2021527648.tif 000029
又はその薬学的に許容される塩である。
【００５７】
特定の実施形態では、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤は、
【化２９】
2021527648.tif 000030
又はその薬学的に許容される塩である。
【００５８】
一実施形態では、ＤＰＰ４の阻害剤は、ビルダグリプチン、アログリプチン、及びリナグリプチンから選択される。
【００５９】
特定の態様では、本開示は、免疫抑制剤をスクリーニングする方法に関し、この方法は：
（ａ）複数の試験薬（例えば、試験薬のライブラリー）を用意すること；
（ｂ）鉄依存性細胞分解を阻害する能力について複数の試験薬のそれぞれを評価すること；
（ｃ）候補免疫抑制剤として、鉄依存性細胞分解を阻害する試験薬を選択すること；及び
（ｄ）免疫応答を低下させる能力について候補免疫抑制剤を評価することを含む。
【００６０】
一実施形態では、評価するステップ（ｂ）は、細胞、組織又は対象を複数の試験薬のそれぞれに接触させることを含む。
【００６１】
一実施形態では、評価するステップ（ｂ）は、細胞、組織、又は対象を、鉄依存性細胞分解を誘導する薬剤と接触させることを含む。
【００６２】
一実施形態では、対象は動物である。
【００６３】
一実施形態では、評価するステップ（ｂ）は、試験薬と接触した細胞又は組織における、脂質過酸化反応、活性酸素種（ＲＯＳ）、イソプロスタン、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）、鉄、グルタチオンペルオキシダーゼ４（ＧＰＸ４）、プロスタグランジン−エンドペルオキシドシンターゼ２（ＰＴＧＳ２）、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）、及びグルタチオン（ＧＳＨ）からなる群から選択されるマーカーのレベル又は活性を測定することをさらに含む。
【００６４】
一実施形態では、評価するステップ（ｂ）は、試験薬と接触した細胞、組織、又は対象におけるマーカーのレベル又は活性を、試験薬と接触していない対照細胞、対照組織、又は対照対象におけるマーカーのレベル又は活性と比較することをさらに含む。
【００６５】
一実施形態では、対照細胞、対照組織、又は対照対象は、フェロトーシスを誘導する薬剤と接触されている。
【００６６】
一実施形態では、試験薬と接触していない対照細胞、対照組織、又は対照対象における、脂質過酸化反応、イソプロスタン、活性酸素種（ＲＯＳ）、鉄、ＰＴＧＳ２、及びＣＯＸ−２からなる群から選択されるマーカーのレベル又は活性と比較した、試験薬と接触した細胞、組織、又は対象におけるマーカーのレベル又は活性の低下は、試験薬が、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤であることを示している。
【００６７】
一実施形態では、試験薬と接触していない対照細胞、対照組織、又は対照対象における、ＧＰＸ４、ＭＤＡ、及びＧＳＨからなる群から選択されるマーカーのレベル又は活性と比較した、試験薬と接触した細胞、組織、又は対象におけるマーカーのレベル又は活性の上昇は、試験薬が鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤であることを示している。
【００６８】
一実施形態では、候補免疫抑制剤を評価することは、選択された候補免疫抑制剤と接触した細胞を免疫細胞と共に培養するか、又は選択された候補免疫抑制剤と接触した細胞によって産生される後細胞シグナル伝達因子に免疫細胞を曝露して、免疫細胞のＮＦκＢ、ＩＲＦ、若しくはＳＴＩＮＧのレベル又は活性を測定することを含む。
【００６９】
一実施形態では、免疫細胞はＴＨＰ−１細胞である。
【００７０】
一実施形態では、候補免疫抑制剤を評価することは、選択された候補免疫抑制剤と接触した細胞と共にＴ細胞を培養するか、又は選択された候補免疫抑制剤と接触した細胞によって産生される後細胞シグナル伝達因子にＴ細胞を曝露して、Ｔ細胞の増殖及び活性化を測定することを含む。
【００７１】
一実施形態では、候補免疫抑制剤を評価することは、選択された候補免疫抑制剤と接触した細胞と共に培養されたか、又は選択された候補免疫抑制剤と接触した細胞によって産生される後細胞シグナル伝達因子に曝露された免疫細胞におけるＮＦκＢ、ＩＲＦ、又はＳＴＩＮＧのレベル又は活性を、選択された候補免疫抑制剤と接触していない、且つ選択された候補免疫抑制剤と接触した細胞によって産生される後細胞シグナル伝達因子に曝露されていない対照免疫細胞におけるＮＦκＢ、ＩＲＦ、又はＳＴＩＮＧのレベル又は活性と比較することをさらに含む。
【００７２】
一実施形態では、選択された候補免疫抑制剤と接触した細胞は、鉄依存性細胞分解を誘導する薬剤にも接触している。
【００７３】
一実施形態では、鉄依存性細胞分解を誘導する薬剤は、アンチポーター系Ｘｃ−（ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ  Ｘｃ−）の阻害剤、ＧＰＸ４の阻害剤、及びスタチンからなる群から選択される。
【００７４】
一実施形態では、アンチポーター系Ｘｃ−の阻害剤は、エラスチン又はその誘導体又は類似体である。
【００７５】
一実施形態では、エラスチンの類似体はＰＥ又はＩＫＥである。
【００７６】
一実施形態では、ＧＰＸ４の阻害剤は、（１Ｓ，３Ｒ）−ＲＳＬ３又はその誘導体又は類似体、ＭＬ１６２、ＤＰＩ化合物７、ＤＰＩ化合物１０、ＤＰＩ化合物１２、ＤＰＩ化合物１３、ＤＰＩ化合物１７、ＤＰＩ化合物１８、ＤＰＩ化合物１９、ＦＩＮ５６、及びＦＩＮＯ２からなる群から選択される。
【００７７】
一実施形態では、スタチンは、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、セリバスタチン、及びシンバスタチンからなる群から選択される。
【００７８】
一実施形態では、鉄依存性細胞分解を誘導する薬剤は、ソラフェニブ又はその誘導体又は類似体、スルファサラジン、グルタミン酸塩、ＢＳＯ、ＤＰＩ２、シスプラチン、システイナーゼ、シリカベースのナノ粒子、ＣＣＩ４、クエン酸鉄アンモニウム、トリゴネリン、及びブルサトール（ｂｒｕｓａｔｏｌ）からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１Ａ】図１Ａは、様々な濃度のエラスチンで処置されたＨＴ１０８０線維肉腫細胞を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、エラスチンで処置されたＨＴ１０８０細胞と共培養されたＴＨＰ１単球のＮＦｋＢ活性を示す。エラーバーは、３つの複製間の標準偏差を表す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＤＭＳＯ又は様々な濃度のエラスチン（ＥＲＡＳ）又はエラスチン類似体ピペラジンエラスチン（ＰＥ）又はイミダゾールケトエラスチン（ＩＫＥ）で処置されたＨＴ１０８０線維肉腫細胞を示す。ＤＭＳＯ対照は左端にある。エラスチン又はエラスチン類似体の濃度は左から右に上昇し、図１Ａに示されているものと同じである。
【図１Ｄ】図１Ｄは、エラスチン（ＥＲＡＳ）又はエラスチン類似体ピペラジンエラスチン（ＰＥ）又はイミダゾールケトエラスチン（ＩＫＥ）で処置されたＨＴ１０８０細胞と共培養されたＴＨＰ１単球のＮＦｋＢ活性を示す。ＤＭＳＯ対照は左端にある。エラスチン又はエラスチン類似体の濃度は左から右に上昇し、図１Ｂに示されているものと同じである。エラーバーは、３つの複製間の標準偏差を表す。
【図２Ａ】図２Ａは、様々な濃度のエラスチンで処置された膵臓癌細胞（ＰＡＮＣ１）を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、エラスチンで処置されたＰＡＮＣ１細胞と共培養されたＴＨＰ１単球のＮＦｋＢ活性を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、様々な濃度のエラスチンで処置された腎細胞癌細胞（Ｃａｋｉ−１）を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、エラスチンで処置されたＣａｋｉ−１細胞と共培養されたＴＨＰ１単球のＮＦｋＢ活性を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、様々な濃度のＲＳＬ３で処置された腎細胞癌細胞（Ｃａｋｉ−１）を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＲＳＬ３で処置されたＣａｋｉ−１細胞と共培養されたＴＨＰ１単球のＮＦｋＢ活性を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、様々な濃度のＲＳＬ３で処置されたＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞白血病細胞を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＲＳＬ３で処置されたＪｕｒｋａｔ細胞と共培養されたＴＨＰ１単球のＮＦｋＢ活性を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、様々な濃度のＲＳＬ３で処置されたＡ２０Ｂ細胞白血病細胞を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＲＳＬ３で処置されたＡ２０細胞と共培養されたＴＨＰ１単球のＮＦｋＢ活性を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＲＳＬ３で処置されたＡ２０細胞と共培養されたＴＨＰ１単球のＩＲＦ活性を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、様々な濃度のエラスチンのみで、又はフェロトーシス阻害剤（フェロスタチン−１（Ｆｅｒｒｏｓｔａｔｉｎ−１）、リプロクススタチン−１（Ｌｉｐｒｏｘｓｔａｔｉｎ−１）、又はトロロックス）と組み合わせて処置されたＨＴ１０８０線維肉腫細胞の生存率を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、エラスチンのみで、又はフェロトーシス阻害剤（フェロスタチン−１、リプロクススタチン−１、又はトロロックス）と組み合わせて処置されたＨＴ１０８０線維肉腫細胞と共培養されたＴＨＰ１単球のＮＦｋＢ活性を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、様々な濃度のエラスチンのみで、又はフェロトーシス阻害剤（フェロスタチン−１、β−メルカプトエタノール、又はデフェロキサミン）と組み合わせて処置されたＨＴ１０８０線維肉腫細胞の生存率を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、エラスチンのみで、又はフェロトーシス阻害剤（フェロスタチン−１、β−メルカプトエタノール、又はデフェロキサミン）と組み合わせて処置されたＨＴ１０８０線維肉腫細胞と共培養されたＴＨＰ１単球のＮＦｋＢ活性を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、ｓｉＲＮＡ対照（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）又はＡＣＳＬ４遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＡＣＳＬ４）と組み合わせられた様々な濃度のエラスチンで処置されたＨＴ１０８０線維肉腫細胞の生存率を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＤＭＳＯで、又はｓｉＲＮＡ対照（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）、ＡＣＳＬ４遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＡＣＳＬ４）、若しくはＣＡＲＳ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＡＲＳ）と組み合わせられたエラスチンで処置されたＨ１０８０線維肉腫細胞の生存率を示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ＤＭＳＯで、又はｓｉＲＮＡ対照（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）、ＡＣＳＬ４遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＡＣＳＬ４）、若しくはＣＡＲＳ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＡＲＳ）と組み合わせられたエラスチンで処置されたＨＴ１０８０線維肉腫細胞と共培養されたＴＨＰ１単球のＮＦｋＢ活性の倍率変化を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ＤＭＳＯ又は様々な濃度のＲＳＬ３のみで、又はフェロスタチン−１と組み合わせて処置されたＡ２０リンパ腫細胞の生存率を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＤＭＳＯ又は様々な濃度のＲＳＬ３のみで、又はフェロスタチン−１と組み合わせて処置されたＡ２０リンパ腫細胞と共培養されたＴＨＰ１単球のＮＦｋＢ活性を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＤＭＳＯ又は様々な濃度のＭＬ１６２のみで、又はフェロスタチン−１と組み合わせて処置されたＡ２０リンパ腫細胞の生存率を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＤＭＳＯ又は様々な濃度のＭＬ１６２のみで、又はフェロスタチン−１と組み合わせて処置されたＡ２０リンパ腫細胞と共培養されたＴＨＰ１単球のＮＦｋＢ活性を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ＤＭＳＯ又は様々な濃度のＭＬ２１０のみで、又はフェロスタチン−１と組み合わせて処置されたＡ２０リンパ腫細胞の生存率を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ＤＭＳＯ又は様々な濃度のＭＬ２１０のみで、又はフェロスタチン−１と組み合わせて処置されたＡ２０リンパ腫細胞と共培養されたＴＨＰ１単球のＮＦｋＢ活性を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ＤＭＳＯ又は様々な濃度のＲＳＬ３のみで、又はフェロスタチン−１と組み合わせて処置されたＣａｋｉ−１腎癌細胞の生存率を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ＤＭＳＯ又は様々な濃度のＲＳＬ３のみで、又はフェロスタチン−１と組み合わせて処置されたＣａｋｉ−１腎癌細胞と共培養されたＴＨＰ１単球のＮＦｋＢ活性を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ＤＭＳＯ又は様々な濃度のＭＬ１６２のみで、又はフェロスタチン−１と組み合わせて処置されたＣａｋｉ−１腎癌細胞の生存率を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ＤＭＳＯ又は様々な濃度のＭＬ１６２のみで、又はフェロスタチン−１と組み合わせて処置されたＣａｋｉ−１腎癌細胞と共培養されたＴＨＰ１単球のＮＦｋＢ活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
本開示は、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤を細胞、組織、又は対象に投与することを含む、細胞、組織、又は対象における免疫活性を低下させる方法に関する。本出願人は、驚くべきことに、免疫細胞のＮＦＫＢ及びＩＲＦ活性の上昇によって証明されるように、鉄依存性細胞分解（例えば、フェロトーシス）の誘導が免疫応答を高めることを示した。これらの結果に基づき、鉄依存性細胞分解の阻害は、鉄依存性細胞分解によって引き起こされる免疫刺激活性の誘導を防止することによって免疫応答を低下させることが期待される。従って、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤の投与を使用して、炎症性疾患などの免疫活性の低下から恩恵を受け得る障害を処置することができる。
【００８１】
Ｉ．定義
「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）」、「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」、又は「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」」という用語は、医薬組成物又は薬剤を対象の系に、又は対象の内部若しくは外部の特定の領域に送達するあらゆる方法を含む。
【００８２】
本明細書で使用される「フェロトーシス」は、鉄依存性であって、活性酸素種の産生を伴う調節された細胞死のプロセスを指す。
【００８３】
「細胞分解」とは、細胞内の物質を再配列し、散在させ、最終的には細胞死をもたらし得る動的プロセスを指す。細胞分解プロセスには、後細胞シグナル伝達因子の産生及びその細胞からの放出が含まれる。
【００８４】
本明細書で使用される「上昇する」（又は「活性化する」）及び「低下する」という用語はそれぞれ、参照と比較してパラメータの量、機能、又は活性をより上昇させる又はより低下させる調節を指す。例えば、本明細書に記載の調製物の投与に続いて、パラメータ（例えば、ＮＦｋＢ活性、マクロファージ又はＴ細胞の活性化）は、投与前のパラメータ量に対して少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％以上対象で上昇又は低下し得る。一般に、測定基準は、投与に続いて、投与の効果が現れた時点、例えば、治療計画が開始されてから少なくとも１日後、１週間後、１ヶ月後、３ヶ月後、６ヶ月後に測定される。同様に、前臨床パラメータ（インビトロでの細胞のＮＦｋＢ活性、及び／又はＴ細胞の活性及び増殖）は、投与前のパラメータの量と比較して少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％以上低下し得る。
【００８５】
「後細胞シグナル伝達因子」は、最終的に細胞から放出され、他の細胞の生物学的活性に影響を与える細胞分解（例えば、鉄依存性細胞分解）を受けている細胞によって生成される分子及び細胞断片である。後細胞シグナル伝達因子には、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、核酸、小分子、及び細胞断片（例えば、小胞及び細胞膜断片）が含まれ得る。
【００８６】
本発明の方法によって処置される「対象」は、ヒト又は非ヒト動物のいずれか、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを意味し得る。特定の実施形態では、対象は、発明の方法を使用する処置の開始前に、検出可能な自己免疫障害又は診断された自己免疫障害を有する。特定の実施形態では、対象は、本発明の方法を使用する処置の開始前に、検出可能なアレルギー又は診断されたアレルギーを有する。
【００８７】
「治療有効量」とは、疾患を処置するために患者に投与されると、その疾患のそのような処置を有効にするのに十分な化合物の量を意味する。疾患を予防するために投与される場合、その量は、疾患の発症を回避又は遅らせるのに十分である。「治療有効量」は、化合物、疾患及びその重症度、並びに処置される患者の年齢、体重などによって異なる。治療有効量は治癒的である必要はない。治療有効量は、疾患又は状態の発生を防ぐ必要はない。代わりに治療有効量は、疾患又は状態の発症、重症度、又は進行を少なくとも遅延又は軽減する量である。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、及びその同源語は、疾患、病的状態、又は障害を改善する、和らげる、安定化させる、予防する、又は治癒することを目的とした対象の医学的管理を指す。この用語には、積極的処置（疾患、病的状態、又は障害を改善することを目的とした処置）、原因処置（関連する疾患、病的状態、又は障害の原因を対象とした処置）、緩和処置（症状を軽減するように設計された処置）、予防的処置（関連する疾患、病的状態、又は障害の発症を最小限に抑えるか、又は部分的若しくは完全に阻害することを目的とした処置）；及び支援処置（別の療法を補完するために使用される処置）が含まれる。
【００８９】
ＩＩ．鉄依存性細胞分解
細胞分解は、細胞内の物質を再配列して散在させる動的なプロセスであり、その結果、他の細胞の生物活性に大きな影響を与え得る後細胞シグナル伝達因子、又は「エフェクター」が生成され、放出される。細胞分解は、調節された細胞死のプロセスで起こり、複数の分子メカニズムによって制御される。異なるタイプの細胞分解は、異なる後細胞シグナル伝達因子の産生をもたらし、それにより異なる生物学的効果を媒介する。例えば、本出願人は、驚くべきことに、鉄依存性細胞分解の誘導が、免疫細胞のＮＦＫＢ及びＩＲＦ活性の上昇によって証明されるよう、免疫応答を高めることができることを示した。これらの結果は、鉄依存性細胞分解の阻害が、鉄依存性細胞分解によって引き起こされる免疫刺激活性の誘導を防止することによって免疫応答を低下させることを示唆している。
【００９０】
いくつかの実施形態では、鉄依存性細胞分解はフェロトーシスである。フェロトーシスは、鉄依存性活性酸素種（ＲＯＳ）の生成を伴う調節された細胞死のプロセスである。いくつかの実施形態では、フェロトーシスは、致死レベルまでの脂質ヒドロペルオキシドの鉄依存性蓄積を伴う。フェロトーシスに対する感受性は、アミノ酸、鉄、及び多不飽和脂肪酸の代謝を含む多くの生物学的プロセス、並びにグルタチオン、リン脂質、ＮＡＤＰＨ、及びコエンザイムＱ１０の生合成に密接に関連している。フェロトーシスは、ミトコンドリアとは無関係であるが、いくつかの細胞環境においてＮＡＤＰＨオキシダーゼに依存する、細胞質及び脂質のＲＯＳの両方の産生をもたらす代謝機能障害を伴う（Ｄｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｃｅｌｌ  １４９（５）：１０６０−７２）。
【００９１】
鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤
鉄依存性細胞分解、例えば、フェロトーシスを阻害する広範囲の薬剤が当技術分野で公知であり、本発明によって提供される様々な方法に有用である。
【００９２】
鉄依存性細胞分解（例えば、フェロトーシス）は、致死レベルまでの脂質ヒドロペルオキシドの鉄依存性の蓄積を伴い、細胞死をもたらし得る。従って、一実施形態では、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤は、脂質過酸化反応の阻害剤である。いくつかの脂質過酸化反応の阻害剤が当技術分野で公知であり、このような阻害剤には、ビタミンＥ、アルファ−トコフェロール、トロロックス、トコトリエノール、重水素化多価不飽和脂肪酸（Ｄ−ＰＵＦＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、フェロスタチン−１又はその誘導体又は類似体、リプロクススタチン−１（Ｌｉｐｒｏｘｓｔａｔｉｎ−１）又はその誘導体又は類似体、コエンザイムＱ１０、イデベノン、ＸＪＢ−５−１３１、デフェロキサミン、メシル酸デフェロキサミン、デスフェリオキサミン、シクリピロックス、及びデフェリプロンが含まれる。特定の実施形態では、鉄依存性細胞分解の阻害剤（例えば、脂質過酸化反応の阻害剤）は、鉄キレート剤、例えば、デフェロキサミン、メシル酸デフェロキサミン、デスフェリオキサミン、シクリピロックス、又はデフェリプロンである。
【００９３】
特定の実施形態では、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤は、フェロスタチン−１又はその誘導体又は類似体である。
【００９４】
一実施形態では、フェロスタチン−１又はその誘導体又は類似体は、以下の式：
【化３０】
2021527648.tif 000031
によって表されるか、又はそのＮ−オキシド、結晶形態、水和物、又は薬学的に許容される塩であり、式中：
Ｒ１及びＲ２は独立に、原子なし、Ｈ、Ｄ、Ｏ、ハロ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキル−アリール、Ｃ１〜６アルキル−ヘテロアリール、Ｃ１〜６アルケニル、Ｃ１〜６アルケニル−アリール、及びＣ１〜６アルケニル−ヘテロアリールからなる群から選択され、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキル−アリール、Ｃ１〜６アルキル−ヘテロアリール、Ｃ１〜６アルケニル、Ｃ１〜６アルケニル−アリール、及びＣ１〜６アルケニル−ヘテロアリールは、任意選択により原子、又はハロ、重水素、Ｃ１〜４アルキル、ＣＦ３、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される基で置換することができ；且つ
Ｒ３は独立に、Ｈ、Ｃ１〜１２脂肪族、Ｃ１〜６−アルキル−アリール、及びＣ１〜６−アルキル−ヘテロアリールからなる群から選択されるが；
ただし、条件として：
Ｒ３がエチルの場合、Ｒ１及びＲ２は、両方がＨ、Ｏ、又は
【化３１】
2021527648.tif 000032
ではあり得ず；且つ
Ｒ３がエチルであり、且つＲ１又はＲ２の少なくとも一方がＨである場合、Ｒ１又はＲ２は、
【化３２】
2021527648.tif 000033
であり得ない。
【００９５】
一実施形態では、フェロスタチン−１又はその誘導体又は類似体は、以下の式：
【化３３】
2021527648.tif 000034
によって表されるか、又はその薬学的に許容される塩、エナンチオマー、ジアステレオマーであり、式中
Ｘは、ＣＨ又はＮであり；
Ｙは、Ｈ、ハロ、又はＣ１〜４アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、ハロ、シクロアルキル、及びＮＲ４Ｒ５からなる群から選択され；
Ｒ２は、ＮＲ６Ｒ７及びＮＯ２からなる群から選択され；
Ｒ３は、Ｈ、
【化３４】
2021527648.tif 000035
からなる群から選択され；
Ｒ４及びＲ５は独立に、Ｈ、Ｃ１〜１２アルキル、Ｃ３〜１２シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、シクロアルキルの環炭素の１つ又は複数は、任意選択により、１つ又は複数のヘテロ原子で置換され、シクロアルキルは、任意選択により、Ｈ、Ｆ、ＮＲ１０Ｒ１１、Ｂｏｃ、ＣＯＯＲ１２、及びＣ１〜８アルキルからなる群から選択される１つ又は複数のペンダント基を含み；
Ｒ６及びＲ７は独立に、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｂｏｃ、Ｏ、ＣＯＯＲ１２、
【化３５】
2021527648.tif 000036
、及びＣ１〜３アルキル−アリールからなる群から選択され、アルキルアリールの環炭素の１つ又は複数は、任意選択により、１つ又は複数の窒素原子で置換され、アルキル−アリールは、任意選択により、Ｈ、ハロ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１〜４エーテル、Ｃ１〜４エステル、ＯＣＯＯＲ１２、及びＣ１〜８アルキルからなる群から選択される１つ又は複数のペンダント基を含み、Ｃ１〜８アルキルは、任意選択により、１つ又は複数のハロでさらに置換され；
Ｒ８及びＲ９は独立に、原子なし、Ｏ、Ｎ、ＮＨＲ１２、Ｃ１〜１０アルキル、及びＣ１〜１０エーテルからなる群から選択され、アルキル及びエーテルは、任意選択により、ＮＨ２、ＮＨＢｏｃ、又はＣ３〜１２シクロアルキルで置換され、シクロアルキルの環炭素の１つ又は複数は、任意選択により、１つ又は複数のヘテロ原子で置換され；
Ｒ１０及びＲ１１は独立に、Ｈ及びＢｏｃから選択され；且つ
Ｒ１２は、任意選択によりアリールで置換されたＣ１〜４アルキルであるが；
ただし、条件として：
Ｒ１がＨである場合、Ｒ３は、
【化３６】
2021527648.tif 000037
であり得ず；
Ｒ１が、
【化３７】
2021527648.tif 000038
であり、Ｒ２がＮＨ２である場合、Ｒ３は、
【化３８】
2021527648.tif 000039
であり得ず；
Ｒ１が
【化３９】
2021527648.tif 000040
である場合、Ｒ３は
【化４０】
2021527648.tif 000041
であり得ず；
Ｒ１が
【化４１】
2021527648.tif 000042
である場合、Ｒ３は
【化４２】
2021527648.tif 000043
であり得ず；
Ｒ１がＣｌである場合、ＸはＮであり得ず、且つ
Ｒ１及びＹの両方はＦであり得ない。
【００９６】
特定の実施形態では、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤は、
【化４３】
2021527648.tif 000044
又はその薬学的に許容される塩である。
【００９７】
特定の実施形態では、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤は、
【化４４】
2021527648.tif 000045
又はその薬学的に許容される塩である。
【００９８】
特定の実施形態では、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤は、
【化４５】
2021527648.tif 000046
又はその薬学的に許容される塩である。
【００９９】
追加のフェロスタチン−１誘導体又は類似体は、例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１５／０８４７４９号パンフレット、同第ＷＯ２０１３／１５２０３９号パンフレット、同第２０１６／１９１５２０号パンフレット、ＪＡＣＳ（２０１４），１３６（１２），４５５１−４５５６  ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａ４１１００６ａ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２０１６），５９（５），２０４１−２０５３，ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｊｍｅｄｃｈｅｍ．５ｂ０１６４１、Ｂｉｏｏｒｇ．＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．（２０１５），２５（２２），５３１５−５３２０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｍｃｌ．２０１５．０９．０４１、及びＪ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．（２００９），２８４（２３），１５５１７−１５５２９，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ８０８８８９２００に開示されている。
【０１００】
鉄依存性細胞分解に関与する他の分子も、このプロセスを阻害するために使用することができる。フェロトーシスの誘発物質として、エラスチンは、グルタミン酸／シスチンアンチポーター（系Ｘｃ−）を抑制し、それによって細胞のシスチン取り込みを阻害し、酸化還元バランスを維持して酸化ストレスから防御する主要な細胞抗酸化物質であるグルタチオン（ＧＳＨ）を枯渇させる。脂質修復酵素グルタチオンペルオキシダーゼ４（ＧＰＸ４）は、脂質ヒドロペルオキシドレベルを制限することによってフェロトーシスを負に調節する。ＧＰＸ４は、ＧＳＨを使用して脂質を修復し、脂質ヒドロペルオキシドを無毒のアルコールに還元する。ＧＳＨレベルの低下は、ＧＰＸ４を不活化させる。その後、細胞は、有毒Ｌ−ＲＯＳからの保護に失敗し、最終的にフェロトーシスを引き起こす。従って、ＧＰＸ４又はＧＰＸ４アゴニストは、鉄依存性細胞分解の阻害剤としても使用することができる。
【０１０１】
非ヘム鉄金属酵素であるヒトシステインジオキシゲナーゼ１（ＣＤＯ１）は、システインのそのスルフィン酸への酸化を触媒することによってシステインをタウリンに変換する。タウリンへの変換に加えて、細胞システインは、グルタミン酸塩、システイン、及びグリシンからなるＧＳＨの合成に不可欠な基質でもある。細胞システインの欠乏は、ＧＳＨ合成を減少させ、細胞の抗酸化能力を低下させ、最終的にはＲＯＳレベルの上昇とフェロトーシスの誘導をもたらす。ＣＤＯ１のサイレンシングは、インビトロ及びインビボの両方でエラスチン誘導性フェロトーシスを阻害することが示されている。Ｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  １９（１２）：１０２２−１０３２を参照されたい。従って、ＣＤＯ１の阻害剤はまた、鉄依存性細胞分解（例えば、フェロトーシス）を阻害するために使用することができる。
【０１０２】
一実施形態では、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤は、リポキシゲナーゼ、例えばアラキドン酸リポキシゲナーゼ（ＡＬＯＸ）の阻害剤である。一実施形態では、リポキシゲナーゼの阻害剤は、ＣＤＣ、バイカレイン、ＰＤ−１４６１７６、ＡＡ−８６１、及びジロートンからなる群から選択される。一実施形態では、ＡＬＯＸの阻害剤はジロートンである。
【０１０３】
ジペプチジル−ジペプチダーゼ−４（ＤＰＰ４）は、一酸化窒素を介して脂質過酸化反応を促進する。従って、ＤＰＰ４の阻害剤を使用して、脂質過酸化反応の阻害を介して鉄依存性細胞分解を阻害することができる。一実施形態では、ＤＰＰ４の阻害剤は、ビルダグリプチン、アログリプチン、及びリナグリプチンから選択される。
【０１０４】
一実施形態では、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤は、グルタミノリシスの阻害剤である。グルタミノリシスは、アミノ酸のグルタミンが溶解してグルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、ＣＯ２、ピルビン酸塩、乳酸塩、アラニン、クエン酸塩になる一連の生化学反応である。グルタミンは、ヒトの組織及び血漿に高濃度で天然に存在し、（グルタミノリシスによる）その分解は、トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路の燃料、及び脂質生合成などの必須の生合成プロセスの構成要素を提供する。グルタミンが存在しない場合、又はグルタミノリシスが阻害される場合、シスチン欠乏及びシスチン移入のブロックは、ＲＯＳの蓄積、脂質過酸化反応、及びフェロトーシスを誘導することができない。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｃｅｌｌ  １７１：２７３−２８５を参照されたい。
【０１０５】
一実施形態では、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤は、脂質過酸化反応の阻害剤、グルタミノリシスの阻害剤、リポキシゲナーゼの阻害剤、システインジオキシゲナーゼ１（ＣＤＯ１）の阻害剤、及びＤＰＰ４の阻害剤から選択される。
【０１０６】
一実施形態では、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤は、シクロヘキシミド、ベータ−メルカプトエタノール、ドーパミン、及びセレンから選択される。
【０１０７】
一実施形態では、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤は、以下の特徴：
（ａ）インビトロで標的細胞の鉄依存性細胞分解及びその後の共培養細胞における免疫応答の活性化を阻害する；
（ｂ）インビトロでの標的細胞の鉄依存性細胞分解及びその後の共培養マクロファージ、例えばＲＡＷ２６４．７マクロファージの活性化を阻害する；
（ｃ）インビトロでの標的細胞の鉄依存性細胞分解及びその後の共培養単球、例えばＴＨＰ−１単球の活性化を阻害する；
（ｄ）インビトロでの標的細胞の鉄依存性細胞分解及びその後の共培養骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）の活性化を阻害する；
（ｅ）インビトロでの標的細胞の鉄依存性細胞分解及びその後の共培養細胞におけるＮＦｋＢ、ＩＲＦ、及び／又はＳＴＩＮＧのレベル又は活性の上昇を阻害する；
（ｆ）インビトロでの標的細胞の鉄依存性細胞分解及びその後の共培養細胞における免疫促進性サイトカインのレベル又は活性の上昇を阻害する；並びに
（ｇ）インビトロでの標的細胞の鉄依存性細胞分解及びその後の共培養されたＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及び／又はＣＤ３＋細胞の活性化を阻害する、のうちの１つ又は複数を有する。
【０１０８】
ＩＩＩ．免疫活性を低下させる方法
本明細書に記載の鉄依存性細胞分解（例えば、フェロトーシス）を阻害する薬剤を使用して、細胞、組織、又は対象、例えば、免疫活性の低下から恩恵を得るであろう対象における免疫活性を低下させることができる。例えば、いくつかの態様では、本開示は、細胞、組織、又は対象における免疫活性を低下させる方法に関し、この方法は、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない細胞、組織、又は対象と比較して免疫活性を低下させるのに十分な量の鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤を細胞、組織、又は対象に投与することを含む。
【０１０９】
一実施形態では、対象は、免疫活性の低下を必要としている。
【０１１０】
いくつかの態様では、本開示は、免疫細胞における免疫活性を低下させる方法に関し、この方法は：標的細胞又は標的細胞によって産生される後細胞シグナル伝達因子に曝露された免疫細胞における免疫活性を低下させるのに十分な量の鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤に標的細胞を接触させることを含み、この免疫細胞における免疫活性は、鉄依存性細胞分解を受けている、薬剤で処置されていない標的細胞に曝露された免疫細胞と比較して低下する。いくつかの実施形態では、薬剤と接触した標的細胞は、鉄依存性細胞分解を受けている、又は鉄依存性細胞分解が誘導された標的細胞である。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、標的細胞を薬剤と接触させるステップは、インビトロ、エクスビボ、又はインビボで行われる。いくつかの実施形態では、方法全体が、インビトロ、エクスビボ、又はインビボで行われる。
【０１１２】
鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤の投与は、鉄依存性細胞分解を受けている細胞による免疫刺激性後細胞シグナル伝達因子の産生を阻害することによって免疫活性を低下させることができる。鉄依存性細胞分解を受けている細胞によって生成されるこれらの後細胞シグナル伝達因子は、肥満細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好塩基球、好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞、好酸球、及びリンパ球（例えば、Ｂリンパ球（Ｂ細胞））、及びＴリンパ球（Ｔ細胞））を含む広範囲の免疫細胞との相互作用によって免疫活性を高めることができる。
【０１１３】
肥満細胞は、ヒスタミンと抗凝固剤であるヘパリンが豊富な顆粒を含む顆粒球の一種である。活性化されると、肥満細胞は、炎症性化合物を顆粒から局所微小環境に放出する。肥満細胞は、アレルギー、アナフィラキシー、創傷治癒、血管新生、免疫寛容、病原体に対する防御、及び血液脳関門機能において役割を果たす。
【０１１４】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、一切の事前の刺激も免疫化もなしに特定の腫瘍及びウイルス感染細胞を溶解する細胞傷害性リンパ球である。ＮＫ細胞はまた、様々なサイトカイン、例えば、ＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮγ）、ＴＮＦ−アルファ（ＴＮＦα）、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＩＬ−３の強力な産生細胞である。従って、ＮＫ細胞は、免疫系の制御性細胞としても機能し、他の細胞及び反応に影響を与えるとも考えられている。ヒトでは、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ３−リンパ球として広く定義されている。ＮＫ細胞の細胞毒性は、細胞表面の受容体からの活性化シグナルと抑制性シグナルのバランスによって厳密に制御されている。ＮＫ細胞の活性化を阻害する主な受容体群は、抑制性キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）である。標的細胞上の自己ＭＨＣクラスＩ分子を認識すると、これらの受容体は、シグナル伝達カスケードの活性化を停止する阻害シグナルを伝達し、正常なＭＨＣクラスＩ発現を示す細胞をＮＫ細胞溶解から保護する。活性化受容体には、標的細胞表面上の様々なリガンドとの結合を介して細胞溶解作用に向けてバランスを押し上げる天然の細胞毒性受容体（ＮＣＲ）及びＮＫＧ２Ｄが含まれる。従って、標的細胞のＮＫ細胞の認識は、複数の活性化及び抑制性受容体から送達されるシグナルの統合を含むプロセスによって厳密に制御される。
【０１１５】
単球は、組織に動員されるまで数時間／数日の間血中を循環する骨髄由来単核食細胞である。Ｗａｃｌｅｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｖｉｒｕｓｅｓ（１０）２：６５を参照されたい。単球の表面での様々なケモカイン受容体及び細胞接着分子の発現により、これらが、骨髄を出て血中に入り、その後、血液から組織内に動員されるのが可能となる。単球は、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、又は寄生虫感染に対する応答を提供する免疫系の生得的な武器（ｉｎｎａｔｅ  ａｒｍ）に属する。それらの機能には、食作用による病原体の死滅、活性酸素種（ＲＯＳ）、一酸化窒素（ＮＯ）、ミエロペルオキシダーゼ、及び炎症性サイトカインの産生が含まれる。特定の条件下では、単球は、癌並びに感染症及び自己免疫疾患の際にＴ細胞応答を刺激又は阻害し得る。単球はまた、組織の修復及び血管新生に関与する。
【０１１６】
マクロファージは、食作用と呼ばれるプロセスで、細胞残屑、異物、微生物、癌細胞などの物質を飲み込んで消化する。食作用に加えて、マクロファージは、非特異的防御（自然免疫）において重要な役割を果たし、リンパ球などの他の免疫細胞を動員することによって特定の防御機構（適応免疫）を開始するのにも役立つ。例えば、マクロファージは、Ｔ細胞への抗原プレゼンター（ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｅｒ）として重要である。マクロファージは、炎症を増加させ、免疫系を刺激するだけでなく、重要な抗炎症の役割も果たし、サイトカインの放出を介して免疫反応を低下させ得る。炎症を促進するマクロファージは、Ｍ１マクロファージと呼ばれ、炎症を軽減して組織の修復を促進するマクロファージは、Ｍ２マクロファージと呼ばれる。
【０１１７】
樹状細胞（ＤＣ）は、病原体に対する免疫応答を刺激し、無害な抗原に対する免疫恒常性を維持する上で重要な役割を果たす。ＤＣは、免疫応答の誘導及び調節に不可欠な、特殊な抗原感知細胞及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）の異種群を表す。末梢血では、ヒトＤＣは、Ｔ細胞（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８）、Ｂ細胞（ＣＤ１９、ＣＤ２０）、及び単球マーカー（ＣＤ１４、ＣＤ１６）を欠いているが、ＨＬＡ−ＤＲ及び他のＤＣ系統マーカー（例えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｃ）を高度に発現する細胞として特徴づけられる。Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊａｎｅｗａｙ'ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．８ｔｈ  ｅｄ．Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ：２０１２．８６８ｐを参照されたい。
【０１１８】
「リンパ球」という用語は、体全体のリンパ組織及び正常な成人で形成される小さな白血球を指し、疾患から体を防御するのに大きな役割を果たす、循環血液中の白血球の総数の約２２〜２８％を占める。個々のリンパ球は、（例えば、Ｔ細胞受容体とＢ細胞受容体を形成するために）それらの遺伝物質の組換えを介して、構造的に関連する抗原の限られたセットに応答することにコミットしているという点で特殊化されている。免疫系が所与の抗原と最初に接触する前に存在するこのコミットメントは、リンパ球の表面膜における抗原上の決定基（エピトープ）に特異的な受容体の存在によって表される。各リンパ球は、受容体のユニークな集団を有しており、そのすべてが同一の結合部位を有する。リンパ球の１つのセット又はクローンは、その受容体の結合領域の構造が別のクローンとは異なるため、認識できるエピトープが異なる。リンパ球は、それらの受容体の特異性だけでなく、それらの機能も互いに異なる（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ  １：Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ：ａｎ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９），ａｔ  ｐ．１０２）。
【０１１９】
リンパ球には、抗体分泌細胞の前駆細胞であるＢリンパ球（Ｂ細胞）、及びＴリンパ球（Ｔ細胞）が含まれる。
【０１２０】
Ｂリンパ球（Ｂ細胞）
Ｂリンパ球は、骨髄の造血細胞に由来する。成熟したＢ細胞は、その細胞表面によって認識されるエピトープを発現する抗原で活性化することができる。活性化プロセスは、抗原による膜Ｉｇ分子の架橋に依存し、直接的である（架橋依存性Ｂ細胞活性化）、又は同族支援（ｃｏｇｎａｔｅ  ｈｅｌｐ）と呼ばれるプロセスにおけるヘルパーＴ細胞との相互作用を介し、間接的であり得る。多くの生理学的状況では、受容体架橋刺激及び同族支援は、相乗作用を助けてより活発なＢ細胞応答を引き起こす（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ  １：Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ：ａｎ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９））。
【０１２１】
各Ｂ細胞は、同一の可変領域を有するＩｇ分子を発現するため、架橋依存性Ｂ細胞活性化には、抗原が細胞表面受容体の結合部位に相補的なエピトープの複数のコピーを発現する必要がある。このような要件は、微生物の莢膜多糖又はウイルスエンベロープタンパク質などの、反復エピトープを有する他の抗原によって満たされる。架橋依存性Ｂ細胞活性化は、これらの微生物に対して開始される主要な防御免疫応答である（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ  １：Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ：ａｎ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９））。
【０１２２】
同族支援により、Ｂ細胞は、受容体を架橋できない抗原に対する応答を開始することができ、同時に、弱い架橋事象によって刺激されたときにＢ細胞を不活化から救う共刺激シグナルを提供する。同族支援は、Ｂ細胞の膜免疫グロブリン（Ｉｇ）による抗原の結合、抗原のエンドサイトーシス、及び細胞のエンドソーム／リソソーム区画内のペプチドへのその断片化に依存する。得られたペプチドのいくつかは、クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子として知られている特殊な一連の細胞表面タンパク質の溝にロードされる。得られたクラスＩＩ／ペプチド複合体は、細胞表面で発現され、ＣＤ４＋  Ｔ細胞と呼ばれる一連のＴ細胞の抗原特異的受容体のリガンドとして機能する。ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、Ｂ細胞クラスＩＩ／ペプチド複合体に特異的な受容体をその表面に有する。Ｂ細胞活性化は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介したＴ細胞の結合に依存するだけでなく、この相互作用により、Ｔ細胞上の活性化リガンド（ＣＤ４０リガンド）が、Ｂ細胞活性化をシグナル伝達するＢ細胞（ＣＤ４０）上の受容体に結合することも可能になる。加えて、Ｔヘルパー細胞は、Ｂ細胞上のサイトカイン受容体に結合することによって、刺激されたＢ細胞の成長及び分化を調節するいくつかのサイトカインを分泌する（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ  １：Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ：ａｎ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，“Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９））。
【０１２３】
抗体産生の同族支援の間に、ＣＤ４０リガンドは、活性化されたＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞で一過性に発現され、抗原特異的Ｂ細胞上のＣＤ４０に結合し、それにより第２の共刺激シグナルを変換する。後者のシグナルは、抗原に遭遇した胚中心Ｂ細胞のアポトーシスを防止することによるＢ細胞の増殖及び分化並びにメモリーＢ細胞の生成に不可欠である。Ｂ細胞及びＴ細胞の両方でのＣＤ４０リガンドの過剰発現は、ヒトＳＬＥ患者の病原性自己抗体産生に関係している（Ｄｅｓａｉ−Ｍｅｈｔａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｙｐｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４０  ｌｉｇａｎｄ  ｂｙ  Ｂ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｐｕｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｖｏｌ．９７（９），２０６３−２０７３，（１９９６））。
【０１２４】
Ｔリンパ球（Ｔ細胞）
造血組織の前駆体に由来するＴリンパ球は、胸腺で分化し、末梢リンパ組織及びリンパ球の再循環プールに撒かれる。Ｔリンパ球又はＴ細胞は、幅広い免疫機能を仲介する。免疫機能には、Ｂ細胞が抗体産生細胞に成長するのを助ける能力、単球／マクロファージの殺菌作用を高める能力、特定のタイプの免疫応答の阻害、標的細胞の直接的な死滅、及び炎症反応の動員が含まれる。これらの効果は、特定の細胞表面分子のＴ細胞発現及びサイトカインの分泌に依存する（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ  １：Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ：ａｎ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９））。
【０１２５】
Ｔ細胞は、Ｂ細胞とは抗原認識のメカニズムが異なる。Ｂ細胞の受容体である免疫グロブリンは、可溶性分子又は粒子表面の個々のエピトープに結合する。Ｂ細胞受容体は、天然分子の表面に発現するエピトープを認識する。抗体及びＢ細胞受容体は、細胞外液中の微生物に結合して防御するように進化したが、Ｔ細胞は、他の細胞の表面にある抗原を認識し、これらの抗原提示細胞（ＡＰＣ）と相互作用してその挙動を変化させることによってそれらの機能を仲介する。Ｔ細胞を活性化できる末梢リンパ器官には、主要な３種類のＡＰＣ：樹状細胞、マクロファージ、及びＢ細胞が存在する。これらの中で樹状細胞が最も強力であり、その唯一の機能は外来抗原をＴ細胞に提示することである。未熟な樹状細胞は、皮膚、腸、気道を含む体全体の組織に存在する。未熟な樹状細胞は、これらの部位で侵入微生物に遭遇すると、病原体及びその産物を取り込み、リンパを介して局所リンパ節又は腸関連リンパ器官に輸送する。病原体との遭遇により、樹状細胞が、抗原捕捉細胞からＴ細胞を活性化できるＡＰＣに成熟するように誘導される。ＡＰＣは、Ｔ細胞を活性化してエフェクター細胞にする際に役割を果たす３種類のタンパク質分子：（１）Ｔ細胞受容体に外来抗原を提示するＭＨＣタンパク質；（２）Ｔ細胞表面の相補的受容体に結合する共刺激タンパク質；及び（３）活性化するまで十分に長くＴ細胞をＡＰＣに結合することを可能にする細胞間接着分子を表面に提示する（“Ｃｈａｐｔｅｒ  ２４：Ｔｈｅ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，（２００２））。
【０１２６】
Ｔ細胞は、それらが発現する細胞表面受容体に基づいて２つの異なるクラスに細分される。Ｔ細胞の大部分は、α鎖とβ鎖からなるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。Ｔ細胞の小群は、γ鎖とδ鎖からなる受容体を発現する。α／β  Ｔ細胞には、２つの亜系統：補助受容体分子ＣＤ４を発現するＴ細胞（ＣＤ４＋  Ｔ細胞）；及びＣＤ８を発現するＴ細胞（ＣＤ８＋  Ｔ細胞）が存在する。これらの細胞は、抗原を認識する方法と、エフェクター及び調節機能が異なる。
【０１２７】
ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、免疫系の主要な制御性細胞である。それらの制御機能は、Ｔ細胞が活性化されると発現が誘導されるＣＤ４０リガンドなどのそれらの細胞表面分子の発現、及び活性化されると分泌する様々なサイトカインの発現の両方に依存する。
【０１２８】
Ｔ細胞はまた、重要なエフェクター機能を媒介し、そのいくつかは、それらが分泌するサイトカインのパターンによって決定される。サイトカインは、標的細胞に対して直接的に毒性であり得、強力な炎症メカニズムを動員し得る。
【０１２９】
加えて、Ｔ細胞、特にＣＤ８＋  Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識される抗原を発現する標的細胞を効率的に溶解できるＣＴＬに成長し得る（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ  １：Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ：ａｎ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９））。
【０１３０】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、クラスＩＩ又はクラスＩ  ＭＨＣタンパク質の特殊な溝に結合した抗原のタンパク質分解によって得られるペプチドからなる複合体を認識する。ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、ペプチド／クラスＩＩ複合体のみを認識し、ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ペプチド／クラスＩ複合体を認識する（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ  １：Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ：ａｎ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９））。
【０１３１】
ＴＣＲのリガンド（即ち、ペプチド／ＭＨＣタンパク質複合体）はＡＰＣ内で生成される。一般に、クラスＩＩ  ＭＨＣ分子は、エンドサイトーシスプロセスを介してＡＰＣに取り込まれたタンパク質に由来するペプチドに結合する。次に、これらのペプチドがロードされたクラスＩＩ分子が細胞の表面に発現され、これらは、発現した細胞表面複合体を認識できるＴＣＲを有するＣＤ４＋  Ｔ細胞によって結合され得る。従って、ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、細胞外供給源に由来する抗原と反応するように特殊化されている（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ  １：Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ：ａｎ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９））。
【０１３２】
対照的に、クラスＩ  ＭＨＣ分子には、ウイルスタンパク質などの内部合成タンパク質に由来するペプチドが主にロードされている。これらのペプチドは、プロテオソームによるタンパク質分解によって細胞質タンパク質から生成され、粗面小胞体に移動する。このようなペプチドは、一般に、９アミノ酸長から構成されており、クラスＩ  ＭＨＣ分子に結合して細胞表面に運ばれ、適切な受容体を発現するＣＤ８＋  Ｔ細胞によって認識され得る。これにより、Ｔ細胞系、特にＣＤ８＋  Ｔ細胞に、生物の残りの細胞のタンパク質（例えば、ウイルス抗原）又は変異抗原（活性腫瘍遺伝子産物など）とは異なるタンパク質、又はこれらよりもはるかに大量に産生されるタンパク質を発現する細胞を、これらのタンパク質が無傷の形で細胞表面に発現も分泌もされなくても、検出する能力が付与される（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ  １：Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ：ａｎ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９））。
【０１３３】
Ｔ細胞はまた、機能に基づいてヘルパーＴ細胞；細胞性免疫の誘導に関与するＴ細胞；サプレッサーＴ細胞；及び細胞傷害性Ｔ細胞として分類することができる。
【０１３４】
ヘルパーＴ細胞
ヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞を刺激してタンパク質及びその他のＴ細胞依存性抗原に対する抗体反応を引き起こすＴ細胞である。Ｔ細胞依存性抗原は、個々のエピトープが１回のみ又は限られた回数しか出現しないため、Ｂ細胞の膜免疫グロブリン（Ｉｇ）を架橋できないか、非効率的にしか架橋できない免疫原である。Ｂ細胞は、それらの膜Ｉｇを介して抗原に結合し、この複合体は、エンドサイトーシスを受ける。エンドソーム及びリソソーム区画内で、抗原は、タンパク質分解酵素によってペプチドに断片化され、生成されたペプチドの１つ又は複数がクラスＩＩ  ＭＨＣ分子にロードされ、この小胞区画を通過する。次に、得られたペプチド／クラスＩＩ  ＭＨＣ複合体は、Ｂ細胞表面膜に輸送される。ペプチド／クラスＩＩ分子複合体に特異的な受容体を有するＴ細胞は、Ｂ細胞表面でこの複合体を認識する（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ  １：Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ：ａｎ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９９））。
【０１３５】
Ｂ細胞の活性化は、そのＴＣＲを介したＴ細胞の結合、及びＴ細胞ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）とＢ細胞上のＣＤ４０との相互作用の両方に依存する。Ｔ細胞は、ＣＤ４０Ｌを構成的に発現しない。むしろ、ＣＤ４０Ｌの発現は、Ｔ細胞のＴＣＲによって認識される同族抗原及びＣＤ８０又はＣＤ８６の両方を発現するＡＰＣとの相互作用の結果として誘導される。ＣＤ８０／ＣＤ８６は、一般に、Ｂ細胞の休止状態ではなく活性化によって発現されるため、活性化Ｂ細胞及びＴ細胞を伴うヘルパーの相互作用が、効率的な抗体産生をもたらし得る。しかしながら、多くの場合、Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌの最初の誘導は、樹状細胞などのＣＤ８０／８６を構成的に発現するＡＰＣの表面での抗原の認識に依存する。次に、このような活性化ヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞と効率的に相互作用して支援することができる。Ｂ細胞上の膜Ｉｇの架橋は、たとえ非効率的であっても、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０相互作用と相乗作用して、活発なＢ細胞の活性化をもたらし得る。増殖、Ｉｇの分泌、及び発現しているＩｇクラスのクラスの切り替えを含む、Ｂ細胞応答におけるその後の事象は、Ｔ細胞由来サイトカインの作用に依存するか、又はその作用によって増強される（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ  １：Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ：ａｎ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９））。
【０１３６】
ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、主にサイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、及びＩＬ−１０を分泌する細胞（ＴＨ２細胞）、又は主にＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、及びリンホトキシンを産生する細胞（ＴＨ１細胞）に分化する傾向がある。ＴＨ２細胞は、Ｂ細胞が抗体産生細胞に成長するのを助けるのに非常に効果的であり、ＴＨ１細胞は、単球及びマクロファージの殺菌活性の増強に関与し、結果として細胞内の小胞区画の微生物の溶解効率を向上させる、細胞免疫応答の効果的な誘導因子である。ＴＨ２細胞の表現型（即ち、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、及びＩＬ−１０）を有するＣＤ４＋  Ｔ細胞は効率的なヘルパー細胞であるが、ＴＨ１細胞はヘルパーになる能力も有する（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ  １：Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ：ａｎ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，“Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９））。
【０１３７】
細胞性免疫誘導へのＴ細胞の関与
Ｔ細胞はまた、単球及びマクロファージの能力を増強して、細胞内微生物を破壊するように作用し得る。特に、ヘルパーＴ細胞によって産生されるインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）は、単核食細胞が、一酸化窒素の生成及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）産生の誘導を含む、細胞内細菌及び寄生虫を破壊するいくつかのメカニズムを促進する。ＴＨ１細胞は、ＩＦＮ−γを産生するため、殺菌作用を高めるのに効果的である。対照的に、ＴＨ２細胞によって産生される２つの主要なサイトカインであるＩＬ−４及びＩＬ−１０は、これらの活性をブロックする（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ  １：Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ：ａｎ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９））。
【０１３８】
制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞
免疫恒常性は、免疫応答の開始とダウンレギュレーションとの間の制御されたバランスによって維持される。アポトーシス及びＴ細胞アネルギーの両方のメカニズム（抗原との遭遇後にＴ細胞が本質的に機能的に不活性化される耐性メカニズム（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｈ．，“Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｎｅｒｇｙ”，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．２１：３０５−３３４（２００３））は、免疫応答のダウンレギュレーションに寄与する。第３のメカニズムは、サプレッサー又は制御性ＣＤ４＋  Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞による活性化Ｔ細胞の能動的抑制によって提供される（Ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｉｎ  Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｂｙ  ｓｅｌｆ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ”，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４３５：５９８−６０４（２００５））。ＩＬ−２受容体アルファ（ＩＬ−２Ｒα）鎖を構成的に発現するＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）は、アネルギー性及び抑制性である天然に存在するＴ細胞のサブセットである（Ｔａａｍｓ，Ｌ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｕｍａｎ  ａｎｅｒｇｉｃ／ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ：ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｐｒｏｎｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ”，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．３１：１１２２−１１３１（２００１））。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋  Ｔｒｅｇの枯渇は、マウスの全身性自己免疫疾患を引き起こす。さらに、これらのＴｒｅｇの移動は、自己免疫疾患の発症を防止する。ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋  Ｔｒｅｇは、マウスの対応物と同様に胸腺で生成され、細胞間接触依存性メカニズムを介してレスポンダーＴ細胞の増殖を抑制する能力、ＩＬ−２を産生できないこと、及びインビトロでのアネルギー表現型によって特徴づけられる。ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋  Ｔ細胞は、ＣＤ２５の発現レベルに応じて抑制性（ＣＤ２５ｈｉｇｈ）細胞及び非抑制性（ＣＤ２５ｌｏｗ）細胞に分割することができる。転写因子のフォークヘッドファミリーのメンバーであるＦＯＸＰ３は、マウス及びヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋  Ｔｒｅｇで発現することが示され、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋  Ｔｒｅｇの発生を制御するマスター遺伝子であると考えられる（Ｂａｔｔａｇｌｉａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｒａｐａｍｙｃｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ”，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１７７：８３３８−８３４７，（２００６））。
【０１３９】
細胞傷害性Ｔリンパ球
標的細胞内で産生されたタンパク質からペプチドを認識するＣＤ８＋  Ｔ細胞は、標的細胞の溶解を引き起こすという点で細胞傷害性を有する。ＣＴＬ誘導性溶解のメカニズムには、標的細胞の膜に挿入してその細胞の溶解を促進できる分子であるパーフォリンのＣＴＬによる産生が含まれる。パーフォリンを介した溶解は、活性化されたＣＴＬによって産生される一連の酵素であるグランザイムによって促進される。多くの活性ＣＴＬはまた、それらの表面に大量のｆａｓリガンドを発現する。ＣＴＬの表面のｆａｓリガンドと標的細胞の表面のｆａｓとの相互作用は、標的細胞のアポトーシスを開始し、これらの細胞の死をもたらす。ＣＴＬを介した溶解は、ウイルスに感染した細胞を破壊するための主要なメカニズムであると考えられる。
【０１４０】
リンパ球の活性化
「活性化」又は「リンパ球の活性化」という用語は、ＲＮＡ、タンパク質、及びＤＮＡの合成及びリンホカインの産生をもたらし；その後、様々なエフェクター細胞及びメモリー細胞の増殖及び分化が生じる、特定の抗原、非特異的マイトジェン、又は同族異系細胞によるリンパ球の刺激を指す。Ｔ細胞の活性化は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体と、クラスＩ又はクラスＩＩ  ＭＨＣ分子の溝に結合したペプチドであるその同族リガンドとの相互作用に依存する。受容体の結合によって引き起こされる分子事象は複雑である。初期のステップでは、チロシンキナーゼの活性化が、いくつかのシグナル伝達経路を制御する一連の基質のチロシンリン酸化をもたらすと考えられる。これらには、ＴＣＲをｒａｓ経路に連結する一連のアダプタータンパク質、ホスホリパーゼＣγ１が含まれ、そのチロシンリン酸化は、その触媒活性を高め、イノシトールリン脂質代謝経路に関与し、細胞内遊離カルシウム濃度の上昇、並びにプロテインキナーゼＣと、細胞の成長及び分化を制御する他の一連の酵素の活性化をもたらす。Ｔ細胞の完全な応答性には、受容体の関与に加えて、アクセサリー細胞が提供する共刺激活性、例えば、ＡＰＣ上のＣＤ８０及び／又はＣＤ８６によるＴ細胞上のＣＤ２８の関与が必要である。
【０１４１】
Ｔメモリー細胞
適応免疫応答による病原体の認識と根絶に続いて、Ｔ細胞の大部分（９０〜９５％）が、残りの細胞と共にアポトーシスを受け、メモリーＴ細胞、指定セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）、及び常在メモリーＴ細胞（ＴＲＭ）のプールが形成される（Ｃｌａｒｋ，Ｒ．Ａ．，“Ｒｅｓｉｄｅｎｔ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ”，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，７，２６９ｒｖ１，（２０１５））。
【０１４２】
標準的なＴ細胞と比較して、これらのメモリーＴ細胞は、特定の表面マーカーの発現、様々なサイトカインプロファイルの迅速な産生、直接エフェクター細胞機能の能力、独自のホーミング分布パターンなどの異なる表現型で長寿命である。メモリーＴ細胞は、オフェンダー（ｏｆｆｅｎｄｅｒ）の再感染を排除し、それにより免疫系のバランスを迅速に回復するために、それぞれの抗原に再曝露されると迅速な応答を示す。自己免疫メモリーＴ細胞が自己免疫疾患の処置又は治癒のほとんどの試みを妨げることを実証する証拠が増えている（Ｃｌａｒｋ，Ｒ．Ａ．，“Ｒｅｓｉｄｅｎｔ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ”，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．７，２６９ｒｖ１，（２０１５））。
【０１４３】
鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤は、本明細書に記載の免疫細胞、例えば、マクロファージ、単球、樹状細胞、及びＣＤ４＋、ＣＤ８＋、又はＣＤ３＋細胞（例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、又はＣＤ３＋  Ｔ細胞）のレベル又は活性を高める後細胞シグナル伝達因子の産生を阻害することによって組織又は対象における免疫活性を低下させることができる。例えば、一実施形態では、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤は、組織又は対象において、マクロファージのレベル又は活性、単球のレベル又は活性、樹状細胞のレベル又は活性、Ｔ細胞のレベル又は活性、及びＣＤ４＋、ＣＤ８＋、又はＣＤ３＋細胞（例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、又はＣＤ３＋  Ｔ細胞）のレベル又は活性のうちの１つ又は複数を低下させるのに十分な量で投与される。
【０１４４】
鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤はまた、免疫促進性サイトカインのレベル又は活性を高める後細胞シグナル伝達因子の産生を阻害することによって細胞、組織、又は対象における免疫活性を低下させることもできる。例えば、いくつかの実施形態では、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤は、細胞、組織、又は対象において免疫促進性サイトカインのレベル又は活性を低下させるのに十分な量で投与される。一実施形態では、免疫促進性サイトカインは、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７、及びＧＭＣＳＦから選択される。
【０１４５】
鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤はまた、活性化Ｂ細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサー（ＮＦｋＢ）、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）、及びインターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）などの免疫応答の正の調節因子のレベル又は活性を高める後細胞シグナル伝達因子の産生を阻害することによって細胞、組織、又は対象における免疫活性を低下させることができる。例えば、いくつかの実施形態では、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤は、細胞、組織、又は対象におけるＮＦｋＢ、ＩＲＦ、及び／又はＳＴＩＮＧのレベル又は活性を低下させるのに十分な量で投与される。
【０１４６】
いくつかの態様では、本開示は、細胞、組織、又は対象のＮＦｋＢのレベル又は活性を低下させる方法に関し、この方法は、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない細胞、組織、又は対象に対してＮＦｋＢのレベル又は活性を低下させるのに十分な量の鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤を細胞、組織、又は対象に投与することを含む。
【０１４７】
一実施形態では、対象は、ＮＦｋＢのレベル又は活性の低下を必要としている。
【０１４８】
一実施形態では、ＮＦｋＢのレベル又は活性は、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない細胞、組織、又は対象に対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９９％、又は少なくとも２倍、４倍、６倍、８倍、若しくは１０倍低下する。
【０１４９】
いくつかの態様では、本開示は、細胞、組織、又は対象のＩＲＦ又はＳＴＩＮＧのレベル又は活性を低下させる方法に関し、この方法は、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない細胞、組織、又は対象に対してＩＲＦ又はＳＴＩＮＧのレベル又は活性を低下させるのに十分な量の鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤を細胞、組織、又は対象に投与することを含む。
【０１５０】
一実施形態では、対象は、ＩＲＦ又はＳＴＩＮＧのレベル又は活性の低下を必要としている。
【０１５１】
一実施形態では、ＩＲＦ又はＳＴＩＮＧのレベル又は活性は、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない細胞、組織、又は対象に対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９９％、又は少なくとも２倍、４倍、６倍、８倍、若しくは１０倍上昇する。
【０１５２】
いくつかの態様では、本開示は、組織又は対象のマクロファージ、単球、樹状細胞、又はＴ細胞のレベル又は活性を低下させる方法に関し、この方法は、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない組織、又は対象に対してマクロファージ、単球、樹状細胞、又はＴ細胞のレベル又は活性を高めるのに十分な量の鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤を組織又は対象に投与することを含む。
【０１５３】
一実施形態では、対象は、マクロファージ、単球、樹状細胞、又はＴ細胞のレベル又は活性の低下を必要としている。
【０１５４】
一実施形態では、マクロファージ、単球、樹状細胞、又はＴ細胞のレベル又は活性は、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない組織又は対象に対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９９％、又は少なくとも２倍、４倍、６倍、８倍、若しくは１０倍低下する。
【０１５５】
いくつかの態様では、本開示は、組織又は対象のＣＤ４＋、ＣＤ８＋、又はＣＤ３＋細胞のレベル又は活性を低下させる方法に関し、この方法は、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない組織、又は対象に対してＣＤ４＋、ＣＤ８＋、又はＣＤ３＋細胞のレベル又は活性を低下させるのに十分な量の鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤を対象に投与することを含む。
【０１５６】
一実施形態では、対象は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、又はＣＤ３＋細胞のレベル又は活性の低下を必要としている。
【０１５７】
一実施形態では、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、又はＣＤ３＋細胞のレベル又は活性は、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない組織又は対象に対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９９％、又は少なくとも２倍、４倍、６倍、８倍、若しくは１０倍低下する。
【０１５８】
いくつかの態様では、本開示は、細胞、組織、又は対象の免疫促進性サイトカインのレベル又は活性を低下させる方法に関し、この方法は、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない細胞、組織、又は対象に対して免疫促進性サイトカインのレベル又は活性を低下させるのに十分な量の鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤を細胞、組織、又は対象に投与することを含む。
【０１５９】
一実施形態では、対象は、免疫促進性サイトカインのレベル又は活性の低下を必要としている。
【０１６０】
一実施形態では、免疫促進性サイトカインのレベル又は活性は、鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤で処置されていない細胞、組織、又は対象に対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９９％、又は少なくとも２倍、４倍、６倍、８倍、若しくは１０倍低下する。
【０１６１】
一実施形態では、免疫促進性サイトカインは、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７、及びＧＭＣＳＦから選択される。
【０１６２】
一実施形態では、この方法は、投与前に、細胞、組織、又は対象を：ＮＦｋＢのレベル又は活性；マクロファージのレベル又は活性；単球のレベル又は活性；樹状細胞のレベル又は活性；ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、又はＣＤ３＋細胞のレベル又は活性；Ｔ細胞のレベル又は活性；及び免疫促進性サイトカインのレベル又は活性のうちの１つ又は複数について評価することをさらに含む。
【０１６３】
一実施形態では、この方法は、投与後に、細胞、組織、又は対象を：ＮＦｋＢのレベル又は活性；マクロファージのレベル又は活性；単球のレベル又は活性；樹状細胞のレベル又は活性；ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、又はＣＤ３＋細胞のレベル又は活性；Ｔ細胞のレベル又は活性；及び免疫促進性サイトカインのレベル又は活性のうちの１つ又は複数について評価することをさらに含む。
【０１６４】
ＮＦｋＢ、ＩＲＦ、又はＳＴＩＮＧのレベル又は活性；マクロファージのレベル又は活性；単球のレベル又は活性；樹状細胞のレベル又は活性；ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、又はＣＤ３＋細胞のレベル又は活性；Ｔ細胞のレベル又は活性；及び免疫促進性サイトカインのレベル又は活性を測定する方法は当技術分野で公知である。
【０１６５】
例えば、ＮＦｋＢ、ＩＲＦ、又はＳＴＩＮＧのタンパク質のレベル又は活性は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット又はインサイチューハイブリダイゼーションを含む当技術分野で公知の適切な技術によって測定することができる。ＮＦｋＢ、ＩＲＦ、又はＳＴＩＮＧをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）のレベルは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応、逆転写酵素ＰＣＲ分析、定量的リアルタイムＰＣＲ、一本鎖高次構造多型分析（ＳＳＣＰ）、ミスマッチ切断検出、ヘテロ二重鎖分析、ノーザンブロット分析、インサイチューハイブリダイゼーション、アレイ分析、デオキシリボ核酸配列決定、制限断片長多型分析、及びそれらの組み合わせ又は部分的な組み合わせを含む当技術分野で公知の適切な技術を用いて測定することができる。
【０１６６】
マクロファージのレベル及び活性を測定するための方法は、例えば、Ｃｈｉｔｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４：１−３３に記載されている。単球のレベル及び活性は、例えば、Ｈｅｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４２３：７８−８４に記載されているようにフローサイトメトリーによって測定することができる。樹状細胞のレベル及び活性は、例えば、Ｄｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．６９（７）：４３５１−４３５７に記載されているようにフローサイトメトリーによって測定することができる。これらの参考文献のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６７】
Ｔ細胞のレベル又は活性は、ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞ベースの増殖アッセイを使用して評価することができる。例えば、細胞は、蛍光色素５，６−カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識されている。増殖するこれらの細胞は、フローサイトメトリーによって直接測定されるＣＦＳＥ蛍光強度の低下を示す。別法では、放射性チミジンの取り込みを使用して、Ｔ細胞の増殖速度を評価することができる。
【０１６８】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、他の免疫細胞の活性を抑制するＣＤ４＋ＣＤ２５＋  Ｔ細胞のクラスである。Ｔｒｅｇは、免疫系の恒常性の中心であり、自己抗原に対する耐性の維持、及び外来抗原に対する免疫応答の調節において主要な役割を果たす。１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を含む複数の自己免疫疾患及び炎症性疾患は、Ｔｒｅｇ細胞数又はＴｒｅｇ機能が低下していることが示されている。Ｔｒｅｇ活性を決定するための１つのアッセイは、リン酸化タンパク質（ｐＳＴＡＴ５）に特異的な抗体を用いるフローサイトメトリーによって測定されるシグナル伝達タンパク質ＳＴＡＴ５のリン酸化を測定する。ＳＴＡＴ５は、Ｔｒｅｇの発生に不可欠であり、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞で発現するＳＴＡＴ５の構成的に活性化された形態は、ＩＬ−２の非存在下でのＴｒｅｇ細胞の産生に十分である（Ｍａｈｍｕｄ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ＪＡＫＳＴＡＴ  ２：ｅ２３１５４）。従って、Ｔｒｅｇ細胞におけるリン酸化ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）の測定は、これらの細胞の活性化を決定する方法を提供する。機能的活性化についての別のアッセイは、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を測定する。Ｔｒｅｇの増殖は、精製されたＴｒｅｇ細胞へのトリチウム化チミジンの取り込みによって、フローサイトメトリーにより測定される混合細胞集団におけるＴｒｅｇ細胞数の増加、及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋又はＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−マーカーの表現型の頻度によって、Ｋｉ−６７などの増殖関連細胞周期タンパク質のＴｒｅｇ細胞での発現の増加によって、又はＴｒｅｇ細胞でのフローサイトメトリーによるカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）などの生体蛍光色素の細胞分裂関連希釈の測定によって測定することができる。Ｔｒｅｇの機能的活性化についての別のアッセイは、Ｔｒｅｇの安定性の上昇である。ｐＴｒｅｇ細胞は、一部では不安定であると考えられており、Ｔｈ１及びＴｈ１７エフェクターＴ細胞に分化する可能性がある。Ｔｒｅｇの活性化は、Ｔｒｅｇを安定させ、この分化を防止することができる（Ｃｈｅｎ，Ｑ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８６：６３２９−３７）。Ｔｒｅｇの刺激の別の結果は、ＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＩＬ−１０、ＣＤ３９、及びＣＤ７３などのＴｒｅｇ機能性エフェクター分子のレベルの刺激であり、この刺激はＴｒｅｇの免疫抑制活性に寄与する。Ｔｒｅｇによるこれらのエフェクター分子の産生は、ＥＬＩＳＡなどの当技術分野で公知の方法によって決定することができる。
【０１６９】
免疫促進性サイトカインのレベル又は活性は、例えば、ＣＤ８＋  Ｔ細胞で定量することができる。実施形態では、免疫促進性サイトカインは、インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−４、ＩＬ−６、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、ＩＬ−１７、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）から選択される。定量は、抗原刺激に応答して所与のサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−α）を分泌するＴ細胞を検出するＥＬＩＳＰＯＴ（酵素結合免疫スポット）技術を使用して行うことができる。Ｔ細胞は、例えば抗ＩＦＮ−α抗体でコーティングされたウェル内で抗原提示細胞と共に培養される。分泌されたＩＦＮ−αは、コーティングされた抗体によって捕捉され、発色基質に結合した二次抗体で明らかになる。従って、局所的に分泌されたサイトカイン分子はスポットを形成し、各スポットは１つのＩＦＮ−α分泌細胞に対応する。スポットの数により、分析されたサンプル中の所与の抗原に特異的なＩＦＮ−α分泌細胞の頻度を決定することができる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、ＴＮＦ−α、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、及びＧＭＣＳＦの検出についても説明されている。
【０１７０】
ＩＶ．障害を処置する方法
本出願人は、鉄依存性細胞分解を誘導する薬剤での細胞の処置が、免疫活性を高める後細胞シグナル伝達因子の産生及び放出をもたらすことを示した。これらの結果は、鉄依存性細胞分解の阻害が免疫活性を低下させることを示唆している。従って、鉄依存性細胞分解を阻害して免疫活性を低下させる薬剤は、炎症、急性臓器損傷、組織損傷、敗血症、虚血、アテローム性動脈硬化症、神経変性障害、及び免疫関連疾患又は状態を含む炎症性障害又は状態などの免疫活性の低下から恩恵を受け得る障害の処置に使用することができる。
【０１７１】
特定の実施形態では、本開示の方法によって処置される対象は、鉄依存性細胞分解（例えば、フェロトーシス）に関連する障害を有する。いくつかの実施形態では、障害は、鉄依存性細胞分解（例えば、フェロトーシス）が有害である障害である。鉄依存性細胞分解は、対象からサンプル（例えば、血液又は組織サンプル）を採取して、当技術分野で公知の方法を使用して鉄依存性細胞分解の存在についてサンプルを分析することによって、対象において評価することができる。例えば、鉄依存性細胞分解は、致死的な過酸化脂質に起因し得るため、過酸化脂質を測定することによって、鉄依存性細胞分解に関連する障害を有する対象を特定する１つの方法を提供する。Ｃ１１−ＢＯＤＩＰＹ及びＬｉｐｅｒｆｌｕｏは、脂質ＲＯＳを検出するための迅速で間接的な手段を提供する親油性ＲＯＳセンサーである（Ｄｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｃｅｌｌ  １４９：１０６０−１０７２）。液体クロマトグラフィー（ＬＣ）／タンデム質量分析（ＭＳ分析）を使用して、特定の酸化脂質を直接検出することもできる（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ  Ａｎｇｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６：１１８０−１１９１；Ｋａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３：８１−９０）。イソプロスタン及びマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）を使用しても、過酸化脂質を測定することができる（Ｍｉｌｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２：２２１−２２６；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ６６（２）：４４９−４６５）。ＭＤＡを測定するためのキットは市販されている（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ，Ｈａｉｍｅｎ，Ｃｈｉｎａ）。
【０１７２】
対象における鉄依存性細胞分解を確認するための他の有用なアッセイには、鉄の存在量及びＧＰＸ４活性の測定が含まれる。鉄の存在量は、誘導結合プラズマＭＳ又はカルセインＡＭクエンチング、及びその他の特定の鉄プローブを使用して測定することができ（Ｈｉｒａｙａｍａ  ａｎｄ  Ｎａｇａｓａｗａ，２０１７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｎｕｔｒ．６０：３９−４８；Ｓｐａｎｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１２：６８０−６８５）、ＧＰＸ４活性は、ＬＣ−ＭＳを用いる細胞溶解物中のホスファチジルコリンヒドロペルオキシド還元を使用して検出することができる（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｃｅｌｌ  １５６：３１７−３３１）。加えて、鉄依存性細胞分解は、グルタチオン（ＧＳＨ）含有量を測定することによって対象で評価することができる。ＧＳＨは、例えば、市販のＧＳＨ−Ｇｌｏグルタチオンアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用することによって測定することができる。
【０１７３】
鉄依存性細胞分解はまた、１つ又は複数のマーカータンパク質の発現を測定することによって対象で評価することができる。適切なマーカータンパク質には、限定されるものではないが、グルタチオンペルオキシダーゼ４（ＧＰＸ４）、プロスタグランジン−エンドペルオキシドシンターゼ２（ＰＴＧＳ２）、及びシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）が含まれる。マーカータンパク質又はマーカータンパク質をコードする核酸の発現レベルは、限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応、逆転写酵素ＰＣＲ分析、定量的リアルタイムＰＣＲ、一本鎖高次構造多型分析（ＳＳＣＰ）、ミスマッチ切断検出、ヘテロ二重鎖分析、ノーザンブロット分析、ウェスタンブロット分析、インサイチューハイブリダイゼーション、アレイ分析、デオキシリボ核酸配列決定、制限断片長多型分析、及びそれらの組み合わせ又は部分的な組み合わせを含む当技術分野で公知の適切な技術を用いて測定することができる。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、鉄依存性細胞分解に関連する障害（例えば、鉄依存性細胞分解が有害である障害）の存在について対象を評価することは、例えば、過酸化脂質、活性酸素種（ＲＯＳ）、イソプロスタン、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）、鉄、グルタチオンペルオキシダーゼ４（ＧＰＸ４）、プロスタグランジン−エンドペルオキシドシンターゼ２（ＰＴＧＳ２）、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）、及びグルタチオン（ＧＳＨ）からなる群から選択されるマーカーなどの対象から採取されたサンプル中の鉄依存性細胞分解のマーカーのレベル又は活性を測定することを含む。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、鉄依存性細胞分解に関連する障害（例えば、鉄依存性細胞分解が有害である障害）の存在について対象を評価することは、対象から採取されたサンプル中のマーカーのレベル又は活性を対照サンプル中のマーカーのレベル又は活性と比較することを含む。対照サンプルは、例えば、健康な対象からのサンプル、又は鉄依存性細胞分解に関連する障害を有さない対象からのサンプルであり得る。
【０１７６】
一実施形態では、対照サンプルと比較した、対象のサンプル中の過酸化脂質、イソプロスタン、活性酸素種（ＲＯＳ）、鉄、ＰＴＧＳ２、及びＣＯＸ−２からなる群から選択されるマーカーのレベル又は活性の上昇、又はＧＰＸ４、ＭＤＡ、及びＧＳＨからなる群から選択されるマーカーのレベル又は活性の低下は、対象が鉄依存性細胞分解に関連する障害を有することを示す。
【０１７７】
一実施形態では、鉄依存性細胞分解に関連する障害の存在について対象を評価することは、対象から採取されたサンプル中の過酸化脂質を測定することを含む。
【０１７８】
一実施形態では、対照サンプルと比較した、対象のサンプル中の過酸化脂質のレベルの上昇は、対象が鉄依存性細胞分解に関連する障害を有することを示す。
【０１７９】
いくつかの態様では、本開示は、対象の鉄依存性細胞分解に関連する障害又は状態（例えば、鉄依存性細胞分解が有害である障害）を処置する方法に関し、この方法は、対象の障害又は状態を処置するのに十分な量の鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤を対象に投与することを含む。
【０１８０】
鉄依存性細胞分解に関連する障害又は状態を処置する方法は、上記の方法のいずれか１つ又は複数を使用して、鉄依存性細胞分解に関連する障害の存在について対象を評価することをさらに含み得る。
【０１８１】
炎症性疾患又は状態
いくつかの態様では、本開示は、炎症性疾患又は状態を処置する方法に関し、この方法は、対象の炎症性疾患又は状態を処置するのに十分な量の鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、炎症性疾患又は状態は、鉄依存性細胞分解（例えば、フェロトーシス）が有害である炎症性疾患又は状態である。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、炎症性疾患又は状態は、炎症（例えば、無菌炎症）、急性臓器損傷、組織損傷、敗血症、虚血、及びアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、炎症性疾患は、自己免疫疾患又は免疫関連疾患若しくは状態である。自己免疫疾患は、免疫系が自己のタンパク質、細胞、及び組織を攻撃する疾患である。自己免疫疾患には、心臓、腎臓、肝臓、肺、生殖器、消化器系、又は皮膚などの器官に影響を与える疾患が含まれる。自己免疫疾患には、内分泌腺、副腎腺、甲状腺、唾液及び外分泌腺、及び膵臓を含む腺に影響を与える疾患が含まれる。自己免疫疾患はまた、多腺性であり得る。自己免疫疾患は、１つ又は複数の組織、例えば、結合組織、筋肉、又は血液を標的にすることができる。自己免疫疾患は、神経系又は目、耳、若しくは血管系を標的にすることができる。自己免疫疾患はまた、全身性であり得、複数の臓器、組織、及び／又は系に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患又は状態は、炎症性疾患又は状態である。
【０１８４】
自己免疫又は免疫関連疾患若しくは状態の非限定的な例としては、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）、アレルギー、喘息、乾癬、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、臓器移植／移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、及び潰瘍性大腸炎が含まれる。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、免疫関連状態は、アレルギー又はアレルギー状態、例えば、鉄依存性細胞分解（例えば、フェロトーシス）が有害であるアレルギー又はアレルギー状態である。アレルギー又はアレルギー状態は、環境内のアレルゲン（脂質やタンパク質など）に対する過敏反応である。アレルゲンは、アトピー患者がＩｇＥ抗体反応に反応し、続いてアレルギー反応を引き起こす抗原である。アレルゲンには、環境アレルゲン（例えば、イエダニ、カバノキ花粉、草花粉、猫抗原、ゴキブリ抗原）、又は食物アレルゲン（例えば、牛乳、ピーナッツ、エビ、大豆）、又はそれらの組み合わせが含まれる。ＩｇＥ分子は、エフェクター細胞（肥満細胞、好塩基球、及び好酸球）の活性化に関与するため、アレルギー反応において重要である。アレルギー及びアレルギー状態には、限定されるものではないが、喘息、慢性閉塞性肺疾患、花粉症（季節性鼻炎）、じんましん、及び湿疹が含まれる。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、免疫関連状態は自己炎症状態である。自己炎症状態は、自然免疫系の機能不全に起因し、発熱、発疹、漿膜炎、リンパ節腫脹、及び筋骨格症状の主要な身体的症状を伴う全身性炎症の再発性発作を特徴とする広範囲の遺伝的に媒介される状態の一部である。通常は自然免疫系の何らかの調節不全を引き起こす遺伝子変異は、自己炎症状態の原因が根底にある。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、鉄依存性細胞分解に関連する障害は神経炎症に関連する。神経炎症は、神経系の慢性炎症であり、多くの場合、脳損傷及び神経変性障害に関連している。神経変性障害は、ニューロンの構造又は機能の進行性の喪失を伴い、ニューロンの死を伴い得る。いくつかの実施形態では、鉄依存性細胞分解に関連する障害は、神経変性障害、例えば、パーキンソン病、ハンチントン病、又はアルツハイマー病である。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９０：２８０９７−２８１０６を参照されたい。いくつかの実施形態では、鉄依存性細胞分解に関連する状態は、外傷性又は出血性脳損傷である。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｃｅｌｌ  １７１：２７３−２８５を参照されたい。いくつかの実施形態では、鉄依存性細胞分解に関連する障害は、神経変性障害（例えば、パーキンソン病、ハンチントン病、又はアルツハイマー病）、虚血、及び外傷性又は出血性脳損傷の１つ又は複数ではない。
【０１８８】
Ｖ．医薬組成物及び投与方式
本明細書に記載の医薬組成物は、任意の適切な製剤で対象に投与することができる。製剤には、例えば、液体、半固体、及び固体の剤形が含まれる。好ましい形態は、意図される投与方式及び治療用途によって決まる。
【０１８９】
特定の実施形態では、組成物は経口投与に適している。特定の実施形態では、製剤は、局所投与、並びに静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、及び皮下注射を含む非経口投与に適している。特定の実施形態では、組成物は静脈内投与に適している。
【０１９０】
非経口投与用の医薬組成物には、水溶性形態の活性化合物の水溶液が含まれる。静脈内投与の場合、製剤は水溶液であり得る。水溶液には、ハンクス液、リンゲル液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水緩衝液、又は非経口的に送達される製剤の適切なｐＨ及び浸透圧を達成する他の適切な塩又は組み合わせが含まれ得る。水溶液を使用して、投与用の製剤を所望の濃度に希釈することができる。水溶液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストランなどの、溶液の粘度を上昇させる物質を含み得る。いくつかの実施形態では、製剤は、二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸カリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、及び注射用水を含むリン酸緩衝生理食塩水を含む。
【０１９１】
局所投与に適した製剤には、塗布剤、ローション、クリーム、軟膏、又はペーストなどの皮膚への浸透に適した液体又は半液体の製剤、及び目、耳、又は鼻への投与に適した点滴剤が含まれる。経口投与に適した製剤には、不活性希釈剤又は同化可能な食用担体を含む製剤が含まれる。経口投与用の製剤は、ハードシェル又はソフトシェルのゼラチンカプセルに封入してもよいし、又は錠剤に圧縮してもよいし、又は飲食物の食品に直接含めてもよい。単位剤形がカプセルである場合、単位剤形は、上記のタイプの材料に加えて、液体担体を含み得る。様々な他の材料が、コーティングとして又は他の方法で投与単位の物理的形態を変更するために存在し得る。本発明での使用に適した医薬組成物には、その意図された目的を達成するために活性成分が有効量で含まれている組成物が含まれる。有効量の決定は、特に本明細書で提供される詳細な開示を考慮すると、当業者の能力の十分に範囲内である。活性成分に加えて、これらの医薬組成物には、薬学的に使用できる調製物への活性化合物の処理を容易にする賦形剤及び助剤を含む適切な薬学的に許容される担体が含まれ得る。
【０１９２】
当業者には容易に明らかであるように、投与される有用なインビボ投与量及び特定の投与方式は、年齢、体重、苦痛の重症度、及び処置される哺乳動物種、利用される特定の化合物、及びこれらの化合物が利用される特定の用途に応じて異なる。有効な投与量レベル、即ち、所望の結果を達成するために必要な投与量レベルの決定は、例えば、ヒト臨床試験、動物モデル、及びインビトロ試験などの日常的な方法を使用して当業者が行うことができる。
【０１９３】
特定の実施形態では、組成物は経口的に送達される。特定の実施形態では、組成物は非経口的に投与される。特定の実施形態では、組成物は、注射又は注入によって送達される。特定の実施形態では、組成物は、経粘膜を含めて局所的に送達される。特定の実施形態では、組成物は、吸入によって送達される。一実施形態では、本明細書で提供される組成物は、腫瘍に直接注射することによって投与することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、静脈内注射又は静脈内注入によって投与することができる。特定の実施形態では、投与は全身性である。特定の実施形態では、投与は局所的である。
【０１９４】
ＶＩ．鉄依存性細胞分解を阻害する免疫抑制剤の同定方法
当技術分野で公知であり、本明細書に記載される鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤に加えて、本開示はさらに、鉄依存性細胞分解を阻害し、且つ免疫活性を低下させる他の化合物を同定するための方法に関する。
【０１９５】
例えば、特定の態様では、本開示は、免疫抑制剤をスクリーニングする方法に関し、この方法は：
（ａ）複数の試験薬（例えば、試験薬のライブラリー）を用意すること；
（ｂ）鉄依存性細胞分解（例えば、フェロトーシス）を阻害する能力について、複数の試験薬のそれぞれを評価すること；
（ｃ）候補免疫抑制剤として、鉄依存性細胞分解（例えば、フェロトーシス）を低下させる試験薬を選択すること；及び
（ｄ）免疫応答を低下させる能力について候補免疫刺激剤を評価することを含む。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、鉄依存性細胞分解（例えば、フェロトーシス）を阻害する能力について試験薬を評価することは、細胞又は組織を複数の試験薬のそれぞれに接触させることを含む。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、鉄依存性細胞分解（例えば、フェロトーシス）を阻害する能力について試験薬を評価することは、複数の試験薬のそれぞれを対象、例えば動物に投与することを含む。
【０１９８】
試験薬は、別の化合物、すなわち鉄依存性細胞分解を誘導する薬剤による鉄依存性細胞分解の誘導を阻害する試験薬の能力を測定することによって、細胞、組織、又は対象において評価することができる。例えば、いくつかの実施形態では、鉄依存性細胞分解を阻害する能力について試験薬を評価することは、細胞又は組織を鉄依存性細胞分解を誘導する薬剤と接触させること、又は対象に鉄依存性細胞分解を誘導する薬剤を投与することをさらに含む。次に、細胞、組織、又は対象を、鉄依存性細胞分解を誘導する薬剤による鉄依存性細胞分解の誘導をブロックする試験薬の能力について評価することができる。鉄依存性細胞分解を誘導する薬剤は、試験薬の前、後、又は同時に細胞、組織、又は対象に投与することができる。
【０１９９】
いくつかの方法が当技術分野で公知であり、これらを利用して、鉄依存性細胞分解（例えば、フェロトーシス）を受けている細胞を同定し、特定のマーカーの検出を介して他のタイプの細胞分解及び／又は細胞死と区別することができる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｃｅｌｌ  １７１：２７３−２８５を参照）。例えば、鉄依存性細胞分解は致死的な過酸化脂質に起因し得るため、過酸化脂質の測定は、鉄依存性細胞分解を受けている細胞を特定する１つの方法を提供する。Ｃ１１−ＢＯＤＩＰＹ及びＬｉｐｅｒｆｌｕｏは、脂質ＲＯＳを検出するための迅速で間接的な手段を提供する親油性ＲＯＳセンサーである（Ｄｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｃｅｌｌ  １４９：１０６０−１０７２）。液体クロマトグラフィー（ＬＣ）／タンデム質量分析（ＭＳ）分析を使用して、特定の酸化脂質を直接検出することもできる（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ  Ａｎｇｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６：１１８０−１１９１；Ｋａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３：８１−９０）。イソプロスタン及びマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）を使用して、過酸化脂質を測定することもできる（Ｍｉｌｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２：２２１−２２６；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ６６（２）：４４９−４６５）。ＭＤＡを測定するためのキットが市販されている（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ，Ｈａｉｍｅｎ，Ｃｈｉｎａ）。
【０２００】
鉄依存性細胞分解を試験するための他の有用なアッセイには、鉄の存在量及びＧＰＸ４活性の測定が含まれる。鉄の存在量は、誘導結合プラズマＭＳ又はカルセインＡＭ消光、及びその他の特定の鉄プローブを使用して測定でき（Ｈｉｒａｙａｍａ  ａｎｄ  Ｎａｇａｓａｗａ，２０１７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｎｕｔｒ．６０：３９−４８；Ｓｐａｎｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１２：６８０−６８５）、ＧＰＸ４活性は、ＬＣ−ＭＳを使用した細胞溶解物中のホスファチジルコリンヒドロペルオキシドの還元を用いて検出することができる（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｃｅｌｌ  １５６：３１７−３３１）。さらに、鉄依存性細胞分解は、グルタチオン（ＧＳＨ）含量を測定することによって評価することができる。ＧＳＨは、例えば、市販のＧＳＨ−Ｇｌｏグルタチオンアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用することによって測定することができる。
【０２０１】
鉄依存性細胞分解はまた、１つ又は複数のマーカータンパク質の発現を測定することによって評価することができる。適切なマーカータンパク質には、限定されるものではないが、グルタチオンペルオキシダーゼ４（ＧＰＸ４）、プロスタグランジン−エンドペルオキシドシンターゼ２（ＰＴＧＳ２）、及びシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）が含まれる。マーカータンパク質又はマーカータンパク質をコードする核酸の発現レベルは、限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応、逆転写酵素ＰＣＲ分析、定量的リアルタイムＰＣＲ、一本鎖高次構造多型分析（ＳＳＣＰ）、ミスマッチ切断検出、ヘテロ二重鎖分析、ノーザンブロット分析、ウェスタンブロット分析、インサイチューハイブリダイゼーション、アレイ分析、デオキシリボ核酸配列決定、制限断片長多型分析、及びそれらの組み合わせ又は部分的な組み合わせを含む当技術分野で公知の適切な技術を使用して決定することができる。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、鉄依存性細胞分解を阻害する能力について試験薬を評価することは、試験薬と接触した細胞又は組織における鉄依存性細胞分解のマーカー、例えば、過酸化脂質、活性酸素種（ＲＯＳ）、イソプロスタン、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）、鉄、グルタチオンペルオキシダーゼ４（ＧＰＸ４）、プロスタグランジン−エンドペルオキシドシンターゼ２（ＰＴＧＳ２）、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）、及びグルタチオン（ＧＳＨ）からなる群から選択されるマーカーのレベル又は活性を測定することを含む。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、鉄依存性細胞分解を阻害する能力について試験薬を評価することは、試験薬と接触した細胞又は組織におけるマーカーのレベル又は活性を、試験薬と接触していない対照細胞又は組織におけるマーカーのレベル又は活性と比較することを含む。
【０２０４】
一実施形態では、過酸化脂質、イソプロスタン、活性酸素種（ＲＯＳ）、鉄、ＰＴＧＳ２及びＣＯＸ−２からなる群から選択されるマーカーのレベル又は活性の低下、又はＧＰＸ４、ＭＤＡ、及びＧＳＨからなる群から選択されたマーカーのレベル又は活性の上昇は、試験薬が鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤であることを示す。
【０２０５】
一実施形態では、鉄依存性細胞分解を阻害する能力について試験薬を評価することは、試験薬と接触した細胞又は組織における過酸化脂質を測定することを含む。
【０２０６】
一実施形態では、試験薬と接触した細胞又は組織における過酸化脂質のレベルの低下は、試験薬が鉄依存性細胞分解を阻害する薬剤であることを示す。
【０２０７】
一実施形態では、免疫応答を低下させる能力について候補免疫抑制剤を評価することは、免疫抑制活性について鉄依存性細胞分解を阻害する試験薬を評価することを含む。免疫応答を評価するための本明細書に記載のいずれかの方法を使用して、試験薬の免疫抑制活性を評価することができる。
【０２０８】
例えば、一実施形態では、候補免疫抑制剤を評価することは、選択された候補免疫抑制剤と接触した細胞と共に免疫細胞を培養するか、又は選択された候補免疫抑制剤と接触した細胞によって産生される後細胞シグナル伝達因子に免疫細胞を曝露して、免疫細胞におけるＮＦκＢ、ＩＲＦ、若しくはＳＴＩＮＧのレベル若しくは活性を測定することを含む。
【０２０９】
一実施形態では、免疫細胞はＴＨＰ−１細胞である。例えば、ＮＦκＢ及びＩＲＦ活性は、市販のＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で測定できる。ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞は、ＮＦＫＢ又はＩＲＦ経路のいずれかが活性化されるとレポータータンパク質を誘導するヒト単球細胞である。ＴＨＰ−１細胞は、選択された候補免疫抑制剤と接触した細胞と共に培養するか、又は選択された候補免疫抑制剤と接触した細胞によって産生される後細胞シグナル伝達因子に曝露し、次にＮＦＫＢ及びＩＲＦ活性の検出のために２００μｌのＱｕａｎｔｉＢｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）又は５０μｌのＱｕａｎｔｉＬｕｃと混合することができる。ＮＦＫＢ及びＩＲＦ活性は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダーで吸光度又は発光を測定することで定量することができる。
【０２１０】
一実施形態では、候補免疫抑制剤を評価することは、選択された候補免疫抑制剤と接触した細胞と共にＴ細胞を培養するか、又は選択された候補免疫抑制剤と接触した細胞によって産生される後細胞シグナル伝達因子にＴ細胞を曝露して、Ｔ細胞の活性化及び増殖を測定することを含む。
【０２１１】
一実施形態では、免疫細胞はマクロファージである。例えば、ＮＦκＢ及びＩＲＦ活性は、市販のＲａｗ−Ｄｕａｌ（商標）及びＪ７７４−Ｄｕａｌ（商標）マクロファージ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で測定することができる。Ｒａｗ−Ｄｕａｌ（商標）及びＪ７７４−Ｄｕａｌ（商標）細胞は、ＮＦＫＢ又はＩＲＦ経路のいずれかが活性化されるとレポータータンパク質を誘導するマウスマクロファージ細胞株である。マクロファージ細胞は、選択された候補免疫抑制剤と接触した細胞と共に培養するか、又は選択された候補免疫抑制剤と接触した細胞によって産生される後細胞シグナル伝達因子に曝露し、次にＮＦＫＢ及びＩＲＦ活性の検出のために２００μｌのＱｕａｎｔｉＢｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）又は５０μｌのＱｕａｎｔｉＬｕｃのいずれかと混合することができる。ＮＦＫＢ及びＩＲＦ活性は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダーで吸光度又は発光を測定することで定量することができる。
【０２１２】
一実施形態では、免疫細胞は樹状細胞である。例えば、ｃｏ刺激マーカー（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６）又は増強された抗原提示のマーカー（例えば、ＭＨＣＩＩ）は、フローサイトメトリーによって樹状細胞で測定することができる。樹状細胞は、選択された候補免疫抑制剤と接触した細胞と共に培養するか、又は選択された候補免疫抑制剤と接触した細胞によって産生される化合物に曝露し、次に活性化状態を示す細胞表面マーカーに特異的な抗体で染色することができる。続いて、これらのマーカーの発現レベルが、フローサイトメトリーによって決定される。
【０２１３】
候補免疫抑制剤はまた、マクロファージ及び／又は樹状細胞における免疫促進性サイトカインのレベルを測定することによって評価することができる。例えば、いくつかの実施形態では、候補免疫抑制剤を評価することは、マクロファージ細胞及び／又は樹状細胞を、選択された候補免疫抑制剤と接触した細胞と共に培養するか、又はマクロファージ細胞及び／又は樹状細胞を、選択された候補免疫抑制剤と接触した細胞によって産生される後細胞シグナル伝達因子と接触させて、免疫促進性サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７、及びＧＭＣＳＦ）のレベルを測定することを含む。免疫促進性サイトカインのレベルは、ＥＬＩＳＡなどの当技術分野で公知の方法によって決定することができる。
【０２１４】
鉄依存性細胞分解を誘導する薬剤
鉄依存性細胞分解、例えば、フェロトーシスを誘導する広範囲の薬剤が当技術分野で公知であり、このような薬剤は、本明細書に記載の鉄依存性細胞分解を阻害する免疫抑制剤を同定するための方法に有用である。例えば、Ｒａｓ及びＳＴ（エラスチン）の根絶剤と呼ばれる発癌性ＲＡＳ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｌｅｔｈａｌ（ＲＳＬ）小分子及び発癌性Ｒａｓ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｌｅｔｈａｌ  ３（ＲＳＬ３）の２つは、癌で一般的に変異している低分子量ＧＴＰアーゼのファミリーである発癌性変異ＲＡＳタンパク質を発現する細胞に選択的に致死的である小分子として最初に同定された（その全体が本明細書に組み込まれる、Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ７３：  ２１９５−２２０９を参照されたい）。具体的には、エンジニアリングされたヒト線維芽細胞株において、小分子エラスチンは、発癌性ＨＲＡＳを過剰発現する細胞において優先的致死を誘導することが見出された（その全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｏｌｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．３：２８５−２９６を参照されたい）。エラスチンは、シスチン−グルタミン酸アンチポーター系Ｘｃ−を機能的に阻害する。系Ｘｃ−は、ジスルフィド架橋によって１回膜貫通調節タンパク質ＳＬＣ３Ａ２（４Ｆ２ｈｃ、ＣＤ９８ｈｃ）に結合された１２回膜貫通トランスポータータンパク質ＳＬＣ７Ａ１１（ｘＣＴ）で構成されるヘテロ二量体細胞表面アミノ酸アンチポーターである。アンチポーター系Ｘｃ−は、細胞内グルタミン酸塩と引き換えに、システインの酸化型である細胞外シスチンを移入する（その全体が本明細書に組み込まれる、Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ７３：２１９５−２２０９を参照）。エラスチンで処置された細胞は、システインを奪われ、抗酸化グルタチオンを合成することができない。グルタチオンの枯渇は、最終的に、鉄依存性細胞分解を引き起こす過剰な脂質過酸化反応及びＲＯＳの増加をもたらす。エラスチン誘導性フェロトーシス細胞死は、形態学的、生化学的、及び遺伝的基準に基づき、アポトーシス、壊死、及び自食作用とは異なる（その全体が本明細書に組み込まれる、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｃｅｌｌ  １５６：３１７−３３１を参照）。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、鉄依存性細胞分解、例えば、フェロトーシスを誘導し、本明細書で提供される鉄依存性細胞分解を阻害する免疫抑制剤を同定するための方法に有用な薬剤は、アンチポーター系Ｘｃ−の阻害剤である。アンチポーター系Ｘｃ−の阻害剤には、アンチポーター系Ｘｃ−結合タンパク質（例えば、抗体又は抗体断片）、核酸阻害剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡ）、及びアンチポーター系Ｘｃ−を特異的に阻害する小分子が含まれる。例えば、いくつかの実施形態では、アンチポーター系Ｘｃ−の阻害剤は、ＳＬＣ７Ａ１１又はＳＬＣ３Ａ２を特異的に阻害する結合タンパク質、例えば、抗体又は抗体断片である。いくつかの実施形態では、アンチポーター系Ｘｃ−の阻害剤は、ＳＬＣ７Ａ１１又はＳＬＣ３Ａ２を特異的に阻害する核酸阻害剤である。いくつかの実施形態では、アンチポーター系Ｘｃ−の阻害剤は、ＳＬＣ７Ａ１１又はＳＬＣ３Ａ２を特異的に阻害する小分子である。抗体及び核酸阻害剤は、当技術分野で周知であり、本明細書に詳細に記載されている。アンチポーター系Ｘｃ−の小分子阻害剤には、限定されるものではないが、エラスチン、スルファサラジン、ソラフェニブ、及びそれらの類似体又は誘導体が含まれる（その全体が本明細書に組み込まれる、Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ７３：２１９５−２２０９、例えば、図２を参照）。
【０２１６】
特定の実施形態では、鉄依存性細胞分解、例えばフェロトーシスを誘導する薬剤は、エラスチン又はその類似体又は誘導体である。エラスチンの類似体には、限定されるものではないが、以下の表１に列挙されている化合物が含まれる。表１に列挙されている参考文献のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１７】
【表１】
2021527648.tif 000047
【０２１８】
いくつかの実施形態では、鉄依存性細胞分解（例えば、フェロトーシス）を誘導し、本明細書で提供される鉄依存性細胞分解を阻害する免疫抑制剤を同定するための方法に有用な薬剤は、グルタチオンペルオキシダーゼ４（ＧＰＸ４）の阻害剤である。ＧＰＸ４は、過酸化水素及び有機過酸化物の還元を触媒し、それによって細胞を膜脂質過酸化反応又は酸化ストレスから保護するリン脂質ヒドロペルオキシダーゼである。従って、ＧＰＸ４は、酸化環境で生き残る細胞の能力に寄与する。ＧＰＸ４の阻害は、フェロトーシスによる細胞死を誘導し得る（Ｙａｎｇ，Ｗ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｒｒｏｐｔｏｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｂｙ  ＧＰＸ４．Ｃｅｌｌ  １５６，３１７−３３１（２０１４）を参照）。ＧＰＸ４の阻害剤には、ＧＰＸ４結合タンパク質（例えば、抗体又は抗体断片）、核酸阻害剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡ）、及びＧＰＸ４を特異的に阻害する小分子が含まれる。ＧＰＸ４の小分子阻害剤には、限定されるものではないが、以下の表２に列挙されている化合物が含まれる。表２に列挙されている各参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１９】
【表２】
2021527648.tif 000048
【０２２０】
特定の実施形態では、ＧＰＸ４阻害剤は、
【化４６】
2021527648.tif 000049
又はその薬学的に許容される塩である。
【０２２１】
ＲＳＬ３は、ＧＰＸ４の既知の阻害剤である。ノックダウン研究では、ＲＳＬ３は、ＲＡＳ発現細胞の死を選択的に媒介し、脂質ＲＯＳ蓄積の増加として同定された。米国特許第８，５４６，４２１号明細書を参照されたい。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、ＧＰＸ４の阻害剤は、ＲＳＬ３のジアステレオ異性体である。
【０２２３】
特定の実施形態では、ＲＳＬ３のジアステレオ異性体は、
【化４７】
2021527648.tif 000050
又はその薬学的に許容される塩である。
【０２２４】
特定の実施形態では、ＲＳＬ３のジアステレオ異性体は、
【化４８】
2021527648.tif 000051
又はその薬学的に許容される塩である。
【０２２５】
特定の実施形態では、ＲＳＬ３のジアステレオ異性体は、
【化４９】
2021527648.tif 000052
又はその薬学的に許容される塩である。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、ＧＰＸ４の阻害剤は、限定されるものではないが、そのＮ−オキシド、結晶形態、水和物、塩、エステル、及びそれらのプロドラッグを含むＲＳＬ３の薬学的に許容される形態である。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、ＧＰＸ４の阻害剤は、ＲＳＬ３又はその誘導体又は類似体である。ＲＳＬ３の誘導体及び類似体は、当技術分野で公知であり、例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２００８／１０３４７０号パンフレット、同第２０１７／１２０４４５号パンフレット、同第２０１８１１８７１１号パンフレット、米国特許第８５４６４２１号明細書、及び中国特許第１０８４０９７３７号明細書に記載されている。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、ＲＳＬ３誘導体又は類似体は、構造式（Ｉ）：
【化５０】
2021527648.tif 000053
によって表される化合物、又はそのエナンチオマー、光学異性体、ジアステレオマー、Ｎ−オキシド、結晶形態、水和物、又は薬学的に許容される塩であり、式中
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ６は独立に、Ｈ、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ１〜８アルコキシ、Ｃ１〜８アラルキル、３〜８員炭素環、３〜８員複素環、３〜８員アリール、又は３〜８員ヘテロアリール、アシル、アルキルスルホニル、及びアリールスルホニルから選択され、各アルキル、アルコキシ、アラルキル、炭素環、複素環、アリール、ヘテロアリール、アシル、アルキルスルホニル、及びアリールスルホニルは、任意選択により少なくとも１つの置換基で置換され；
Ｒ４及びＲ５は独立に、Ｈ１Ｃ１〜８アルキル、Ｃ１〜８アルコキシ、３〜８員炭素環、３〜８員複素環、３〜８員アリール、又は３〜８員ヘテロアリール、カルボキシレート、エステル、アミド、炭水化物、アミノ酸、アシル、アルコキシ置換アシル、アルジトール、ＮＲ７Ｒ８、ＯＣ（Ｒ７）２ＣＯＯＨ、ＳＣ（Ｒ７）２ＣＯＯＨ、ＮＨＣＨＲ７ＣＯＯＨ、ＣＯＲ８、ＣＯ２Ｒ８、硫酸塩、スルホンアミド、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン、チオアルキル、チオエステル、及びチオエーテルから選択され、各アルキル、アルコキシ、炭素環、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシレート、エステル、アミド、炭水化物、アミノ酸、アシル、アルコキシ置換アシル、アルジトール、ＮＲ７Ｒ８、ＯＣ（Ｒ７）２ＣＯＯＨ、ＳＣ（Ｒ７）２ＣＯＯＨ、ＮＨＣＨＲ７ＣＯＯＨ、ＣＯＲ８、ＣＯ２Ｒ８、硫酸塩、スルホンアミド、スルホキシド、スルホン酸塩、スルホン、チオアルキル、チオエステル、及びチオエーテルは、任意選択により少なくとも１つの置換基で置換され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１〜８アルキル、炭素環、アリール、ヘテロアリール、複素環、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、及びアルキル複素環から選択され、各アルキル、炭素環、アリール、ヘテロアリール、複素環、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、及びアルキル複素環は、任意選択により少なくとも１つの置換基で置換することができ；
Ｒ８は、Ｈ、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ１〜８アルケニル、Ｃ１〜８アルキニル、アリール、炭素環、ヘテロアリール、複素環、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、アルキル複素環、及びヘテロ芳香族から選択され、各アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、炭素環、ヘテロアリール、複素環、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、アルキル複素環、及びヘテロ芳香族は、任意選択により少なくとも１つの置換基で置換することができ；且つ
Ｘは、それが結合している環上の０〜４個の置換基である。
【０２２９】
一実施形態では、ＲＳＬ３誘導体又は類似体は、構造式（ＩＩ）：
【化５１】
2021527648.tif 000054
によって表される化合物、又はそのＮ−オキシド、結晶形態、水和物、又は薬学的に許容される塩であり：
式中
Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、及び−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘＯＨからなる群から選択され；
Ｘは、１〜６の整数であり；且つ
Ｒ２、Ｒ２'、Ｒ３、及びＲ３'は独立に、Ｈ、Ｃ３〜８シクロアルキル、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、又はＲ２及びＲ２'は一緒になって、ピリジニル又はピラニルを形成することができ、且つＲ３及びＲ３'は一緒になって、ピリジニル又はピラニルを形成することができる。
【０２３０】
一実施形態では、ＲＳＬ３誘導体又は類似体は、構造式（ＩＩＩ）：
【化５２】
2021527648.tif 000055
によって表される化合物、又はその立体異性体、又はその薬学的に許容される塩であり；式中：
ｎは、２、３、又は４であり；Ｒは、置換若しくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、置換若しくは非置換Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル基、置換若しくは非置換Ｃ２〜Ｃ８ヘテロシクロアルキル基、置換若しくは非置換Ｃ６〜Ｃ１０芳香環基、又は置換若しくは非置換Ｃ３〜Ｃ８ヘテロアリール環基であり；置換は、各基の１つ又は複数の水素原子が：ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロゲン化Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロゲン化Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＣＯＯＨ（カルボキシ）、ＣＯＯＣ１〜Ｃ６アルキル、ＯＣＯＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択される基によって置換されることを意味する。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、ＧＰＸ４阻害剤は、
【化５３】
2021527648.tif 000056
又はその薬学的に許容される塩である。
【０２３２】
ＭＬ１６２は、フェロトーシスを誘導するＧＰＸ４の直接阻害剤として同定されている（Ｄｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．１０，１６０４−１６０９を参照）。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、ＧＰＸ４阻害剤は、限定されるものではないが、そのＮ−オキシド、結晶形態、水和物、塩、エステル、及びそれらのプロドラッグを含むＭＬ１６２の薬学的に許容される形態である。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、ＧＰＸ４の阻害剤は、ＭＬ１６２又はその誘導体又は類似体である。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、ＧＰＸ４阻害剤は、
【化５４】
2021527648.tif 000057
又はその薬学的に許容される塩である。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、ＧＰＸ４阻害剤は、限定されるものではないが、そのＮ−オキシド、結晶形態、水和物、塩、エステル、及びそれらのプロドラッグを含むＭＬ２１０の薬学的に許容される形態である。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、ＧＰＸ４の阻害剤は、ＭＬ２１０又はその誘導体又は類似体である。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、鉄依存性細胞分解（例えば、フェロトーシス）を誘導し、本明細書で提供される鉄依存性細胞分解を阻害する免疫抑制剤を同定するための方法に有用な薬剤はスタチンである。一実施形態では、スタチンは、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、セリバスタチン、及びシンバスタチンからなる群から選択される。
【０２３９】
一実施形態では、鉄依存性細胞分解（例えば、フェロトーシス）を誘導し、本明細書で提供される鉄依存性細胞分解を阻害する免疫抑制剤を同定するための方法に有用な薬剤は、グルタミン酸塩、ＢＳＯ、ＤＰＩ２（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｃｅｌｌ  １５６：３１７−３３１；図５及びＳ５を参照）、シスプラチン、システイナーゼ、シリカベースのナノ粒子、ＣＣＩ４、クエン酸鉄アンモニウム、トリゴネリン、及びブルサトールからなる群から選択される。
【０２４０】
鉄依存性細胞分解を誘導する追加の薬剤は、当技術分野で公知であり、例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８５１８９５９号明細書；同第８５３５８９７号明細書；同第８５４６４２１号明細書；同第９５８０３９８号明細書；同第９６９５１３３号明細書；米国特許出願公開第２０１０／００８１６５４号明細書；同第２０１５／００７９０３５号明細書；同第２０１５／０１７５５５８号明細書；同第２０１６／０２２９８３６号明細書；同第２０１６／０２９７７４８号明細書；同第２０１６／０３３２９７４号明細書；Ｃｅｌｌ．２０１２  Ｍａｙ  ２５；１４９（５）：１０６０−７２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１２．０３．０４２；
Ｃｅｌｌ．２０１４  Ｊａｎ  １６；１５６（１−２）：３１７−３３１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１３．１２．０１０；
Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２０１４  Ｍａｒ  ２６；１３６（１２）：４５５１−６．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａ４１１００６ａ；
Ｅｌｉｆｅ．２０１４  Ｍａｙ  ２０；３：ｅ０２５２３．ｄｏｉ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．０２５２３；
Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１４  Ｎｏｖ  ２５；１１１（４７）：１６８３６−４１．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１４１５５１８１１１；
Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１４  Ｄｅｃ；１６（１２）：１１８０−９１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｂ３０６４；
ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１５  Ｊｕｌ  １７；１０（７）：１６０４−９．ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓｃｈｅｍｂｉｏ．５ｂ００２４５；
Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．２０１５  Ｎｏｖ  １；２５（２１）：４７８７−９２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｍｃｌ．２０１５．０７．０１８；
Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２０１６  Ｍａｙ；１５（５）：３４８−６６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｄ．２０１５．６；
Ｃｅｌｌ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１６  Ｆｅｂ  １８；２３（２）：２２５−２３５．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｈｅｍｂｉｏｌ．２０１５．１１．０１６；
Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１６  Ｊｕｌ；１２（７）：４９７−５０３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｈｅｍｂｉｏ．２０７９；
Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１６  Ａｕｇ  ２３；１１３（３４）：Ｅ４９６６−７５．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１６０３２４４１１３；
ＡＣＳ  Ｃｅｎｔ  Ｓｃｉ．２０１６  Ｓｅｐ  ２８；２（９）：６５３−６５９；
Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１７  Ｊａｎ；１３（１）：８１−９０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｈｅｍｂｉｏ．２２３８；
Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７  Ｊａｎ  １５；４８２（３）：４１９−４２５．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂｒｃ．２０１６．１０．０８６；
Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１８  Ｍａｙ；１４（５）：５０７−５１５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８９−０１８−００３１−６；
Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２０１８  Ａｐｒ  ２４．ｐｉｉ：Ｓ０３０４−３８３５（１８）３０２８８−Ｘ．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃａｎｌｅｔ．２０１８．０４．０２１；
Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１８  Ａｐｒ  ２４．ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｊｍｅｄｃｈｅｍ．８ｂ００３１５；
Ｅｕｒ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１８  Ｍａｙ  １０；１５１：４３４−４４９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｊｍｅｃｈ．２０１８．０４．００５；
Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．２０１８  Ｍａｒ  １５；１３５：２４２−２５２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍ．２０１８．０３．０１５；
Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２０１８  Ｍａｒ  １４；１４０（１０）：３７９８−３８０８．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａｃｓ．８ｂ００９９８；
Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１８  Ｆｅｂ  ２６；４９７（１）：２３３−２４０．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂｒｃ．２０１８．０２．０６１；
Ｏｒｇ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１８  Ｆｅｂ  ２８；１６（９）：１４６５−１４７９．ｄｏｉ：１０．１０３９／ｃ７ｏｂ０３０８６ｊ；
Ａｒｃｈ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．２０１８  Ａｐｒ；９２（４）：１５０７−１５２４．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００２０４−０１８−２１７０−７；
Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ．２０１８  Ｍａｒ；５２（３）：１０１１−１０２２．ｄｏｉ：１０．３８９２／ｉｊｏ．２０１８．４２５９；
Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２０１８  Ａｐｒ  ２８；４２０：２１０−２２７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃａｎｌｅｔ．２０１８．０１．０６１．Ｆｅｂ  １；
Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．２０１８  Ｍａｒ；１１７：４５−５７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｆｒｅｅｒａｄｂｉｏｍｅｄ．２０１８．０１．０１９；
Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１８  Ｊａｎ  １２；８（１）：５７４．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９８−０１７−１８９３５−１；
Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２０１８  Ｍａｒ  １；４１６：１２４−１３７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃａｎｌｅｔ．２０１７．１２．０２５；
ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ．２０１８  Ｊａｎ  ２２；１３（２）：１６４−１７７．ｄｏｉ：１０．１００２／ｃｍｄｃ．２０１７００６２９；
Ｒｅｄｏｘ  Ｂｉｏｌ．２０１８  Ａｐｒ；１４：５３５−５４８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｒｅｄｏｘ．２０１７．１１．００１；
Ａｒｃｈ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．２０１８  Ｆｅｂ；９２（２）：７５９−７７５．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００２０４−０１７−２０６６−ｙ；
Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ．２０１７  Ｏｃｔ；９（１０）：１０２５−１０３３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｈｅｍ．２７７８；
Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．２０１７  Ｎｏｖ；１１２：５９７−６０７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｆｒｅｅｒａｄｂｉｏｍｅｄ．２０１７．０９．００２；
ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１７  Ｏｃｔ  ２０；１２（１０）：２５３８−２５４５．ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓｃｈｅｍｂｉｏ．７ｂ００７３０．２０；
ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１７  Ａｕｇ  ２１；１２（８）：ｅ０１８２９２１．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１８２９２１．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ２０１７；
Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７  Ｓｅｐ  ３０；４９１（４）：９１９−９２５．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂｒｃ．２０１７．０７．１３６；
Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１７  Ｓｅｐ  １５；１４０：４１−５２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｃｐ．２０１７．０６．１１２．２３；
Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ．２０１８  Ａｐｒ；５０（２）：４４５−４６０．ｄｏｉ：１０．４１４３／ｃｒｔ．２０１６．５７２；
Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓｃｏｖ．２０１７  Ｆｅｂ  ２７；３：１７０１３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｄｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．２０１７．１３．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ２０１７；Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６  Ｎｏｖ；１１（１１）：９７７−９８５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１６．１６４；
Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６  Ｎｏｖ  ２５；４８０（４）：６０２−６０７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂｒｃ．２０１６．１０．０９９；Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６  Ｎｏｖ  １５；７（４６）：７４６３０−７４６４７．ｄｏｉ：１０．１８６３２／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．１１８５８；
Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２０１６  Ｏｃｔ  １０；３８１（１）：１６５−７５．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃａｎｌｅｔ．２０１６．０７．０３３．２９；
Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓ．２０１６  Ｊｕｌ  ２１；７：ｅ２３０７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｄｄｉｓ．２０１６．２０８；
Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ．２０１６  Ａｕｇ；３６（２）：９６８−７６．ｄｏｉ：１０．３８９２／ｏｒ．２０１６．４８６７．３１；
Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６  Ｍａｙ  １３；４７３（４）：７７５−７８０．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂｒｃ．２０１６．０３．０５２；Ｍｏｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｇ．２０１７  Ｊａｎ；５６（１）：７５−９３．ｄｏｉ：１０．１００２／ｍｃ．２２４７４；
ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１６  Ｍａｙ  ２０；１１（５）：１３０５−１２．ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓｃｈｅｍｂｉｏ．５ｂ００９００；
Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１６  Ｍａｒ  １０；５９（５）：２０４１−５３．ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｊｍｅｄｃｈｅｍ．５ｂ０１６４１；
Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１５  Ｏｃｔ  １５；２２（１１）：１０４５−５４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｐｈｙｍｅｄ．２０１５．０８．００２；
Ｂｉｏｌ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ．２０１５；３８（８）：１２３４−９．ｄｏｉ：１０．１２４８／ｂｐｂ．ｂ１５−０００４８；
Ｏｎｃｏｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５  Ｍａｙ  ２；２（５）：５１７−３２．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ２０１５；
Ｐａｔｈｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｓ．２０１５  Ｓｅｐ；２１（４）：１１１５−２１．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１２２５３−０１５−９９４６−３；
Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１４  Ｎｏｖ；３４（１１）：６４１７−２２；及び
Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１３  Ｏｃｔ  １；１３３（７）：１７３２−４２．ｄｏｉ：１０．１００２／ｉｊｃ．２８１５９
に記載されている。
【実施例】
【０２４１】
実施例１：エラスチンで処置したＨＴ１０８０線維肉腫細胞によるヒト単球の活性化／刺激
薬剤／治療デザイン：
ＨＴ１０８０線維肉腫細胞を、対照（ＤＭＳＯ）又は様々な用量のエラスチン、ピペラジンエラスチン（ＰＥ）、又はイミダゾールケトエラスチン（ＩＫＥ）のいずれかで２４時間処置してから、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞とさらに２４時間共培養した。エラスチンはＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から購入し、ＤＭＳＯに溶解した。続いて、ＴＨＰ１の上清を、活性化Ｂ細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサー（ＮＦＫＢ）又はインターフェロン調節因子（ＩＲＦ）レポーターの活性について評価した。
【０２４２】
材料／方法：
ＨＴ１０８０細胞はＡＴＣＣから入手し、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞はＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した。ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞は、ＮＦＫＢ又はＩＲＦ経路のいずれかが活性化されるとレポータータンパク質を誘導するヒト単球細胞である。両方の細胞型は、アッセイの期間中、９６ウェルプレートで培養した。ＨＴ１０８０細胞は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで培養し、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞は、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩで培養した。エラスチン、ＰＥ、又はＩＫＥを投与する２４時間前に、０．５％の最終ＤＭＳＯ濃度で７，５００個のＨＴ１０８０細胞をプレーティングした。処置の２４時間後、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞（２５，０００細胞／ウェル）をＨＴ１０８０細胞に加えた。２４時間後、３０μｌの上清を２００μｌのＱｕａｎｔｉＢｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（ＮＦＫＢレポーター活性用）又は５０μｌのＱｕａｎｔｉＬｕｃ（ＩＲＦレポーター活性用）と混合し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダーで吸光度又は発光を記録した。
【０２４３】
結論：
図１Ａに示されているように、エラスチン処置は、ＨＴ１０８０細胞の生存率に悪影響を及ぼした。図１Ｂは、ビヒクル対照ＤＭＳＯではなくエラスチンで処置したＨＴ１０８０細胞が、ＴＨＰ１単球でＮＦＫＢシグナル伝達を誘発したことを示す。エラスチン類似体ＰＥ及びＩＫＥもまた、ＨＴ１０８０細胞の生存率に悪影響を及ぼし（図１Ｃ）、ＴＨＰ１単球でＮＦＫＢシグナル伝達を誘発した（図１Ｄ）。
【０２４４】
実施例２：エラスチンで処置したＰＡＮＣ１膵臓癌細胞によるヒト単球の活性化／刺激
薬剤／治療デザイン：
ＰＡＮＣ１膵臓癌細胞を、対照（ＤＭＳＯ）又は様々な用量のエラスチンのいずれかで２４時間処置してから、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞とさらに２４時間共培養した。エラスチンはＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から購入し、ＤＭＳＯに溶解した。続いて、ＴＨＰ１の上清を、ＮＦＫＢ又はＩＲＦレポーターの活性について評価した。
【０２４５】
材料／方法：
ＰＡＮＣ１細胞はＡＴＣＣから入手し、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞はＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した。両方の細胞型は、アッセイの期間中、９６ウェルプレートで培養した。エラスチンを投与する２４時間前に、０．５％の最終ＤＭＳＯ濃度で７，５００個のＰＡＮＣ−１細胞をプレーティングした。処置の２４時間後、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞（２５，０００細胞／ウェル）をＰＡＮＣ−１細胞に加えた。２４時間後、３０μｌの上清を２００μｌのＱｕａｎｔｉＢｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）又は５０μｌのＱｕａｎｔｉＬｕｃと混合し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダーで吸光度又は発光を記録した。
【０２４６】
結論：
図２Ａに示されているように、エラスチン処置は、ＰＡＮＣ１細胞の生存率に悪影響を及ぼした。図１Ｂは、ビヒクル対照ＤＭＳＯではなくエラスチンで処置したＰＡＮＣ１細胞がＴＨＰ１単球でＮＦＫＢシグナル伝達を誘発したことを示す。
【０２４７】
実施例３：エラスチンで処置したＣａｋｉ−１腎細胞癌細胞によるヒト単球の活性化／刺激
薬剤／治療デザイン：
Ｃａｋｉ−１腎細胞癌細胞を、対照（ＤＭＳＯ）又は様々な用量のエラスチンのいずれかで２４時間処置してから、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞とさらに２４時間共培養した。エラスチンは、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から購入し、ＤＭＳＯに溶解した。続いて、ＴＨＰ１の上清を、ＮＦＫＢ又はＩＲＦレポーターの活性について評価した。
【０２４８】
材料／方法：
Ｃａｋｉ−１細胞はＡＴＣＣから入手し、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞はＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した。両方の細胞型は、アッセイの期間中、９６ウェルプレートで培養した。エラスチンを投与する２４時間前に、０．５％の最終ＤＭＳＯ濃度で７，５００個のＣａｋｉ−１細胞をプレーティングした。処置の２４時間後、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞（２５，０００細胞／ウェル）をＣａｋｉ−１細胞に加えた。２４時間後、３０μｌの上清を２００μｌのＱｕａｎｔｉＢｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）又は５０μｌのＱｕａｎｔｉＬｕｃと混合し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダーで吸光度又は発光を記録した。
【０２４９】
結論：
図３Ａに示されているように、エラスチン処置はＣａｋｉ−１細胞の生存率に悪影響を及ぼした。図３Ｂは、ビヒクル対照ＤＭＳＯではなくエラスチンで処置したＣａｋｉ−１細胞がＴＨＰ１単球でＮＦＫＢシグナル伝達を誘発したことを示す。
【０２５０】
実施例４：ＲＳＬ３で処置したＣａｋｉ−１腎細胞癌細胞によるヒト単球の活性化／刺激
薬剤／治療デザイン：
Ｃａｋｉ−１腎細胞癌細胞を、対照（ＤＭＳＯ）又は様々な用量のＲＳＬ３のいずれかで２４時間処置してから、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞とさらに２４時間共培養した。ＲＳＬ３はＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍから購入し、ＤＭＳＯに溶解した。続いて、ＴＨＰ１の上清を、ＮＦＫＢ又はＩＲＦレポーターの活性について評価した。
【０２５１】
材料／方法：
Ｃａｋｉ−１細胞はＡＴＣＣから入手し、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞はＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した。両方の細胞型は、アッセイの期間中、９６ウェルプレートで培養した。ＲＳＬ３を投与する２４時間前に、０．５％の最終ＤＭＳＯ濃度で７，５００個のＣａｋｉ−１細胞をプレーティングした。処置の２４時間後、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞（２５，０００細胞／ウェル）をＣａｋｉ−１細胞に加えた。２４時間後、３０μｌの上清を２００μｌのＱｕａｎｔｉＢｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）又は５０μｌのＱｕａｎｔｉＬｕｃと混合し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダーで吸光度又は発光を記録した。
【０２５２】
結論：
図４Ａに示されているように、ＲＳＬ３処置は、Ｃａｋｉ−１細胞の生存率に悪影響を及ぼした。図４Ｂは、ビヒクル対照ＤＭＳＯではなくＲＳＬ３で処置したＣａｋｉ−１細胞がＴＨＰ１単球でＮＦＫＢシグナル伝達を誘発したことを示す。
【０２５３】
実施例５：ＲＳＬ３で処置したＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞白血病細胞によるヒト単球の活性化／刺激
薬剤／治療デザイン：
Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞白血病細胞を、対照（ＤＭＳＯ）又は様々な用量のＲＳＬ３のいずれかで２４時間処置してから、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞とさらに２４時間共培養した。ＲＳＬ３はＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から購入し、ＤＭＳＯに溶解した。続いて、ＴＨＰ１の上清を、ＮＦＫＢ又はＩＲＦレポーターの活性について評価した。
【０２５４】
材料／方法：
Ｊｕｒｋａｔ細胞はＡＴＣＣから入手し、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞はＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した。両方の細胞型は、アッセイの期間中、９６ウェルプレートで培養した。ＲＳＬ３を投与する２４時間前に、０．５％の最終ＤＭＳＯ濃度で１００，０００個のＪｕｒｋａｔ細胞をプレーティングした。処置の２４時間後、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞（２５，０００細胞／ウェル）をＪｕｒｋａｔ細胞に加えた。２４時間後、３０μｌの上清を２００μｌのＱｕａｎｔｉＢｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）又は５０μｌのＱｕａｎｔｉＬｕｃと混合し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダーで吸光度又は発光を記録した。
【０２５５】
結論：
図５Ａに示されているように、ＲＳＬ３処置は、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞白血病細胞の生存率に悪影響を及ぼした。図５Ｂは、ビヒクル対照ＤＭＳＯではなくＲＳＬ３で処置したＪｕｒｋａｔ細胞がＴＨＰ１単球でＮＦＫＢシグナル伝達を誘発したことを示す。
【０２５６】
実施例６：ＲＳＬ３で処置したＡ２０Ｂ細胞白血病細胞によるヒト単球の活性化／刺激
薬剤／治療デザイン：
Ａ２０  Ｂ細胞白血病細胞を、対照（ＤＭＳＯ）又は様々な用量のＲＳＬ３で２４時間処置してから、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞とさらに２４時間共培養した。ＲＳＬ３は、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から購入し、ＤＭＳＯに溶解した。続いて、ＴＨＰ１の上清を、ＮＦＫＢ又はＩＲＦレポーターの活性について評価した。
【０２５７】
材料／方法：
Ａ２０細胞はＡＴＣＣから入手し、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞はＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した。両方の細胞型は、アッセイの期間中、９６ウェルプレートで培養した。ＲＳＬ３を投与する２４時間前に、０．５％の最終ＤＭＳＯ濃度で５０，０００個のＡ２０細胞をプレーティングした。処置の２４時間後、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞（２５，０００細胞／ウェル）をＡ２０細胞に加えた。２４時間後、３０μｌの上清を２００μｌのＱｕａｎｔｉＢｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）又は５０μｌのＱｕａｎｔｉＬｕｃと混合し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダーで吸光度又は発光を記録した。
【０２５８】
結論：
図６Ａに示されているように、ＲＳＬ−３処置は、Ａ２０  Ｂ細胞白血病細胞の生存率に悪影響を及ぼした。ビヒクル対照ＤＭＳＯではなくＲＳＬ３で処置したＡ２０細胞は、ＴＨＰ１単球でＮＦＫＢ（図６Ｂ）及びＩＲＦ（図６Ｃ）シグナル伝達を誘発した。
【０２５９】
実施例７：エラスチンで処置したＨＴ１０８０線維肉腫細胞によって誘発される炎症促進性シグナル伝達の特異性
薬剤／治療デザイン：
ＨＴ１０８０線維肉腫細胞を、１μＭのフェロスタチンの存在下又は非存在下で、対照（ＤＭＳＯ）又は様々な用量のエラスチン（例えば、０．０９８μＭ、０．１９５μＭ、０．３９１μＭ、０．７８１μＭ、１．５６３μＭ、３．１２５μＭ、６．２５μＭ、１２．５μＭ、及び２５μＭ）のいずれかで２４時間処置してから、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞とさらに２４時間共培養する。フェロスタチンはＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から購入し、ＤＭＳＯに溶解する。続いて、ＴＨＰ１の上清を、ＮＦＫＢ又はＩＲＦレポーターの活性について評価する。ＨＴ１０８０細胞はＡＴＣＣから入手し、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞はＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手する。両方の細胞型は、アッセイの期間中、９６ウェルプレートで培養する。エラスチン処置ＨＴ１０８０細胞によって誘発されるＮＦＫＢシグナル伝達の誘導の特異性を、ＨＴ１０８０細胞の同時フェロスタチン処置によるその逆転によって評価する。エラスチン誘導性ＮＦＫＢ又はＩＲＦシグナル伝達のフェロスタチンでの逆転は、鉄依存性細胞分解の阻害剤が免疫応答を低下させることを示すことになる。
【０２６０】
実施例８：エラスチンで処置したＣａｋｉ−１細胞によって誘発される炎症促進性シグナル伝達の特異性
薬剤／治療デザイン：
Ｃａｋｉ−１腎癌細胞は、１μＭのフェロスタチン（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ；Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）の存在下又は非存在下で、対照（ＤＭＳＯ）又は様々な用量のエラスチン（例えば、０．０９８μＭ、０．１９５μＭ、０．３９１μＭ、０．７８１μＭ、１．５６３μＭ、３．１２５μＭ、６．２５μＭ、１２．５μＭ、及び２５μＭ）のいずれかで２４時間処置してから、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞とさらに２４時間共培養する。続いて、ＴＨＰ１の上清を、ＮＦＫＢ又はＩＲＦレポーターの活性について評価する。Ｃａｋｉ−１細胞はＡＴＣＣから入手し、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞はＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手する。両方の細胞型は、アッセイの期間中、９６ウェルプレートで培養する。エラスチン処置Ｃａｋｉ−１細胞によって誘発されるＮＦＫＢシグナル伝達の誘導の特異性を、Ｃａｋｉ−１細胞の同時フェロスタチン処置によるその逆転によって評価する。エラスチン誘導性ＮＦＫＢ又はＩＲＦシグナル伝達のフェロスタチンでの逆転は、鉄依存性細胞分解の阻害剤が免疫応答を低下させることを示すことになる。
【０２６１】
実施例９：ＲＳＬ３で処置したＣａｋｉ−１腎癌細胞によって誘発される炎症促進性シグナル伝達の特異性
薬剤／治療デザイン：
Ｃａｋｉ−１腎癌細胞を、１μＭのフェロスタチンの存在下又は非存在下で、対照（ＤＭＳＯ）又は様々な用量のＲＳＬ３（例えば、０．００２μＭ、０．００５μＭ、０．０１４μＭ、０．０４１μＭ、０．１２３μＭ、０．３７０μＭ、１．１１１μＭ、３．３３３μＭ、及び１０μＭ）のいずれかで２４時間処置してから、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞とさらに２４時間共培養する。続いて、ＴＨＰ１の上清を、ＮＦＫＢ又はＩＲＦレポーターの活性について評価する。Ｃａｋｉ−１細胞はＡＴＣＣから入手し、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞はＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手する。両方の細胞型は、アッセイの期間中、９６ウェルプレートで培養する。ＲＳＬ３処置Ｃａｋｉ−１細胞によって誘発されるＮＦＫＢシグナル伝達の誘導の特異性を、Ｃａｋｉ−１細胞の同時フェロスタチン処置によるその逆転によって評価する。ＲＳＬ３誘導性ＮＦＫＢ又はＩＲＦシグナル伝達のフェロスタチンでの逆転は、鉄依存性細胞分解の阻害剤が免疫応答を低下させることを示すことになる。
【０２６２】
実施例１０：ＲＳＬ３で処置したＡ２０細胞によって誘発される炎症促進性シグナル伝達の特異性
薬剤／治療デザイン：
Ａ２０リンパ腫細胞を、１μＭのフェロスタチンの存在下又は非存在下で、対照（ＤＭＳＯ）又は様々な用量のＲＳＬ３（例えば、０．００２μＭ、０．００５μＭ、０．０１４μＭ、０．０４１μＭ、０．１２３μＭ、０．３７０μＭ、１．１１１μＭ、３．３３３μＭ、及び１０μＭ）のいずれかで２４時間処置してから、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞とさらに２４時間共培養する。続いて、ＴＨＰ１の上清を、ＮＦＫＢ又はＩＲＦレポーターの活性について評価する。Ａ２０細胞はＡＴＣＣから入手し、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞はＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手する。両方の細胞型は、アッセイの期間中、９６ウェルプレートで培養する。ＲＳＬ３処置Ａ２０細胞によって誘発されるＮＦＫＢシグナル伝達の誘導の特異性を、Ａ２０細胞の同時フェロスタチン処置によるその逆転によって評価する。
【０２６３】
実施例１１
エラスチンで処置した上皮細胞によって誘発される炎症促進性シグナル伝達の特異性
薬剤／治療デザイン：
上皮細胞（例えば、初代腎近位尿細管上皮細胞又は初代腸上皮細胞）を、１μＭ  フェロスタチンの存在下又は非存在下で、対照（ＤＭＳＯ）又は様々な用量（例えば、０．０９８μＭ、０．１９５μＭ、０．３９１μＭ、０．７８１μＭ、１．５６３μＭ、３．１２５μＭ、６．２５μＭ、１２．５μＭ、及び２５μＭ）のエラスチンのいずれかで２４時間処置してから、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞とさらに２４時間共培養する。フェロスタチンは、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から購入し、ＤＭＳＯに溶解する。続いて、ＴＨＰ１の上清を、ＮＦＫＢ又はＩＲＦレポーターの活性について評価する。上皮細胞はＡＴＣＣから入手し、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞はＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手する。両方の細胞型は、アッセイの期間中、９６ウェルプレートで培養する。エラスチン処置上皮細胞によって誘発されるＮＦＫＢ又はＩＲＦシグナル伝達の誘導の特異性は、上皮細胞の同時フェロスタチン処置によるその逆転によって評価される。加えて、フェロスタチンによるＨＦＫＢ又はＩＲＦ誘発の阻害は、鉄依存性細胞分解の阻害剤が免疫応答を低下させ得ることを例示することになる。
【０２６４】
実施例１２：ＲＳＬ３で処置した上皮細胞によって誘発される炎症促進性シグナル伝達の特異性
薬剤／治療デザイン：
上皮細胞（例えば、初代腎近位尿細管上皮細胞又は初代腸上皮細胞）を、１μＭ  フェロスタチンの存在下又は非存在下で、対照（ＤＭＳＯ）又は様々な用量（例えば、０．００２μＭ、０．００５μＭ、０．０１４μＭ、０．０４１μＭ、０．１２３μＭ、０．３７０μＭ、１．１１１μＭ、３．３３３μＭ、及び１０μＭ）のＲＳＬ３のいずれかで２４時間処置してから、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞とさらに２４時間共培養する。フェロスタチンは、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から購入し、ＤＭＳＯに溶解する。続いて、ＴＨＰ１の上清を、ＮＦＫＢ又はＩＲＦレポーター活性について評価する。上皮細胞はＡＴＣＣから入手し、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞はＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手する。両方の細胞型は、アッセイの期間中、９６ウェルプレートで培養する。ＲＳＬ３処置上皮細胞によって誘発されるＮＦＫＢ又はＩＲＦシグナル伝達の誘導の特異性は、上皮細胞の同時フェロスタチン処置によるその逆転によって評価される。加えて、フェロスタチンによるＮＦＫＢ又はＩＲＦ誘発の阻害は、鉄依存性細胞分解の阻害剤が免疫応答を低下させ得ることを例示することになる。
【０２６５】
実施例１３：傷害及び再生のインビボモデルにおけるフェロトーシス阻害剤による炎症促進性シグナル伝達の阻害の試験
薬剤／治療デザイン：
Ｃ５７／ＢＬ６マウスを、ビヒクル又はフェロスタチン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）のいずれかで処置して、腎虚血再灌流障害を与える。簡単に説明すると、マウスを側腹切開で露出させて６０分間クランプする。クランプを解放した後、側腹切開部を縫合糸で閉じる。偽手術を同様の方法で行うが、腎血管をクランプしない。外髄質の炎症を、手術の２日後と７日後に評価する。フェロスタチンの抗炎症効果を、組織学（マクロファージのＦ４／８０染色及びナフトールＡＳ−Ｄクロロ酢酸エステラーゼ染色）及び／又はフローサイトメトリーによって評価するために、マクロファージ及び好中球の動員の減少をモニタリングすることによって評価する。
【０２６６】
実施例１４：フェロトーシス阻害剤によるマウスの潰瘍性大腸炎の抑制の試験
薬剤／治療デザイン：
Ｃ５７／Ｂ６マウスを、飲料水中、３〜４％デキストラン硫酸ナトリウムを５日間投与することによって大腸炎を誘発する前に、ビヒクル又はフェロスタチン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で処置する。ビヒクルと比較したフェロスタチンの抗炎症効果は、結腸の長さの減少、下痢の減少、及び体重減少の低下によって確認する。加えて、フェロスタチンによる好中球の動員（自然免疫応答）の阻害を、（ビヒクルと比較した）結腸におけるミエロペルオキシダーゼ活性の低下によって確認する。
【０２６７】
実施例１５：炎症促進性フェロトーシスを阻害する化合物をスクリーニングする方法
薬剤／治療デザイン：
３８４ウェルフォーマットのＣａｋｉ−１腎癌細胞を、エラスチン又はＲＳＬ３（又は他のフェロトーシス誘導物質）に曝露し、さらに化学スクリーニングライブラリーの化合物に２４時間曝露する。続いて、ＴＨＰ１  ｄｕａｌ細胞を、処置したＣａｋｉ−１細胞と共培養する。ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞の添加の２４時間後に、上清をレポーター活性について評価する。陽性ヒット化合物を、フェロトーシス誘導物質処置Ｃａｋｉ−１細胞との共培養によって引き起こされるＴＨＰ１  Ｄｕａｌ細胞におけるＮＦＫＢ又はＩＲＦ活性の誘導を阻害する能力で選択する。
【０２６８】
実施例１６：エラスチンで処置したＨＴ１０８０線維肉腫細胞によって誘発される炎症促進性シグナル伝達の特異性
薬剤／治療デザイン：
ＨＴ１０８０線維肉腫細胞を、様々な用量のエラスチン（例えば、０．８μＭ、０．１６μＭ、０．３１μＭ、０．６３μＭ、１．２５μＭ、２．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、又は２０μＭ）のみで、又はフェロトーシス阻害剤（１μＭ  フェロスタチン−１、１μＭ  リプロクススタチン−１、１００μＭ  トロロックス、２５μＭ  β−メルカプトエタノール、若しくは１００μＭ  デフェロキサミン）との組み合わせで２４時間処置してから、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞とさらに２４時間共培養する。フェロスタチン−１及びリプロクススタチン−１は、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から購入し、ＤＭＳＯに溶解した。トロロックスは、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃから購入し、ＤＭＳＯに再懸濁した。メシル酸デフェロキサミンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、水に再懸濁した。β−メルカプトエタノールはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。続いて、ＴＨＰ１の上清を、ＮＦＫＢ活性について評価した。ＨＴ１０８０細胞は、ＡＴＣＣから入手し、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞はＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した。両方の細胞型は、アッセイの期間中、９６ウェルプレートで培養した。
【０２６９】
結果：
図７Ａ及び図８Ａに示されているように、ＨＴ１０８０線維肉腫細胞のエラスチン処置により、細胞の生存率が用量依存的に低下し、この生存率の低下は、各フェロトーシス阻害剤によって弱められた。図７Ｂ及び図８Ｂに示されているように、ＨＴ１０８０線維肉腫細胞のエラスチン処置により、ＴＨＰ１細胞のＮＦＫＢ活性が用量依存的に上昇し、このＮＦＫＢ活性の上昇は、各フェロトーシス阻害剤によって無効にされた。これらの結果は、細胞死がエラスチン処置ＨＴ１０８０細胞によって誘発されるＮＦＫＢシグナル伝達の誘導に役割を果たすことを実証している。加えて、フェロトーシス阻害剤はエラスチン処置細胞によるＮＦＫＢ活性の誘導を低下させたため、これらの結果は、（例えば、フェロトーシス阻害剤による）鉄依存性細胞分解の阻害が免疫活性を低下させ得ることを実証している。
【０２７０】
実施例１７：ＡＣＳＬ４及びＣＡＲＳ遺伝子のノックダウンは、ＨＴ１０８０線維肉腫細胞におけるエラスチン媒介細胞死を阻害する
薬剤／治療デザイン：
ＨＴ１０８０細胞（５，０００個の細胞／ウェル）を、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ  Ｉトランスフェクション試薬（Ｃａｔａｌｏｇ  ＃  Ｔ−２００１）及び対照ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＃  Ｄ−００１８１０−１０−０５）又はＡＣＳＬ４を標的とするｓｉＲＮＡ［３７．５ｎＭ］（図９Ａ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＃  Ｌ−００９３６４−００−００５）又はＡＣＳＬ４（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＃'ｓ  ：ｓ５００１、ｓ５００１、ｓ５００２）若しくはＣＡＲＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＃'ｓ  ：Ｓ２４０４、ｓ２４０５、ｓ２４０６）に対するｓｉＲＮＡのプール（図９Ｂ／Ｃ）を用いて９６ウェルフォーマットで逆トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞培養培地を、様々な濃度のエラスチン（図９Ａ）又は固定濃度のエラスチン（１０μＭ、図９Ｂ／Ｃ）を含む新鮮な培地に交換した。加えて、５０，０００個のレポーターＴＨＰ１−ｄｕａｌ細胞をいくつかのプレートに追加した（図９Ｃ）。２４時間後、ＨＴ１０８０細胞の生存率を測定するか（図９Ａ／Ｂ）、又はＴＨＰ１の上清をＮＦＫＢ活性について評価した（図９Ｃ）。ＨＴ１０８０細胞はＡＴＣＣから入手し、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞はＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した。
【０２７１】
結果：
ＡＣＳＬ４遺伝子は、細胞内のアラキドン酸のレベルを制御し、細胞死の調節に関与するアシル−ＣｏＡシンテターゼである長鎖脂肪酸−ＣｏＡリガーゼ４をコードする。ＣＡＲＳ遺伝子は、システイニル−ｔＲＮＡシンテターゼをコードする。ＣＡＲＳのノックダウンは、脂質活性酸素種の誘導を防止することによってエラスチン誘導性フェロトーシスを阻害することが示されている。Ｈａｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２３（２）：２７０−２７８を参照されたい。図９Ａ及び図９Ｂに示されているように、ＨＴ１０８０細胞におけるＡＣＳＬ４又はＣＡＲＳのいずれかの遺伝子ノックダウンは、エラスチンの存在下で培養したＨＴ１０８０細胞の生存率をある程度助ける。加えて、ＨＴ１０８０細胞におけるＡＣＳＬ４又はＣＡＲＳのいずれかの遺伝子ノックダウンは、エラスチン処置ＨＴ１０８０細胞と共培養された単球のＮＦＫＢ活性を無効にする（図９Ｃ）。これらの結果は、細胞死がエラスチン処理ＨＴ１０８０細胞によって誘発されるＮＦＫＢシグナル伝達の誘導に役割を果たすこと、及び特定の細胞内タンパク質の欠如がフェロトーシスの炎症促進性を低下させることを実証している。加えて、これらの結果は、鉄依存性細胞分解（例えば、フェロトーシス）を阻害する薬剤が免疫活性（例えば、ＮＦＫＢ活性）を低下させ得ることを実証している。
【０２７２】
実施例１８：ＧＰＸ４阻害剤（ＲＳＬ３、ＭＬ１６２、又はＭＬ２１０）で処置したＡ２０細胞によって誘発される炎症促進性シグナル伝達の特異性
薬剤／治療デザイン：
Ａ２０リンパ腫細胞を、１μＭ  フェロスタチン−１の存在下又は非存在下で、様々な用量（例えば、０．００２μＭ、０．００５μＭ、０．０１４μＭ、０．０４１μＭ、０．１２３μＭ、０．３７０μＭ、１．１１１μＭ、３．３３３μＭ、及び１０μＭ）のＧＰＸ４阻害剤（ＲＳＬ３、ＭＬ１６２、又はＭＬ２１０）で２４時間処置した。ＭＬ１６２は、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃから購入し、ＤＭＳＯに再懸濁した。ＭＬ２１０は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、ＤＭＳＯに再懸濁した。Ａ２０リンパ腫細胞も、陰性対照としてＤＭＳＯで処置した。ＤＭＳＯ又はＧＰＸ４阻害剤での処置の２４時間後、Ａ２０リンパ腫細胞を、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞とさらに２４時間共培養した。続いて、ＴＨＰ１の上清を、ＮＦＫＢレポーターの活性について評価した。Ａ２０細胞はＡＴＣＣから入手し、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞はＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した。両方の細胞型は、アッセイの期間中、９６ウェルプレートで培養した。
【０２７３】
結果：
本明細書で論じられるように、ＲＳＬ３、ＭＬ１６２、及びＭＬ２１０などのＧＰＸ４阻害剤は、鉄依存性細胞分解（例えば、フェロトーシス）を誘導し得る。図１０Ａ、図１１Ａ、及び図１２Ａに示されているように、Ａ２０リンパ腫細胞の各ＧＰＸ４阻害剤（ＲＳＬ３、ＭＬ１６２、又はＭＬ２１０）での処置により、細胞の生存率が用量依存的に低下し、この生存率の低下は、フェロトーシス阻害剤であるフェロスタチン−１によって弱められた。図１０Ｂ、図１１Ｂ、及び図１２Ｂに示されているように、Ａ２０リンパ腫細胞のＧＰＸ４阻害剤での処置により、ＴＨＰ１細胞のＮＦＫＢ活性が用量依存的に上昇し、このＮＦＫＢ活性の上昇は、フェロトーシス阻害剤であるフェロスタチン−１によって弱められた。これらの結果は、細胞死が、ＧＰＸ−４阻害剤で処置したＡ２０リンパ腫細胞によって誘発されるＮＦＫＢシグナル伝達の誘導に役割を果たすことを実証している。加えて、フェロトーシス阻害剤であるフェロスタチン−１は、ＧＰＸ４阻害剤で処置された細胞によるＮＦＫＢ活性の誘導を低下させたため、これらの結果は、（例えば、フェロトーシス阻害剤による）鉄依存性細胞分解の阻害が免疫活性（例えば、ＮＦＫＢ活性）を低下させ得ることを実証している。
【０２７４】
実施例１９：ＧＰＸ４阻害剤（ＲＳＬ３又はＭＬ１６２）で処置したＣａｋｉ−１腎癌細胞によって誘発される炎症促進性シグナル伝達の特異性
薬剤／治療デザイン：
Ｃａｋｉ−１腎癌細胞を、１μＭ  フェロスタチンの存在下又は非存在下で、対照（ＤＭＳＯ）又は様々な用量（例えば、０．００２μＭ、０．００５μＭ、０．０１４μＭ、０．０４１μＭ、０．１２３μＭ、０．３７０μＭ、１．１１１μＭ、３．３３３μＭ、及び１０μＭ）のＧＰＸ４阻害剤（ＲＳＬ３又はＭＬ１６２）のいずれかで２４時間処置してから、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞とさらに２４時間共培養した。続いて、ＴＨＰ１の上清を、ＮＦＫＢレポーターの活性について評価した。Ｃａｋｉ−１細胞はＡＴＣＣから入手し、ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ細胞はＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した。両方の細胞型は、アッセイの期間中、９６ウェルプレートで培養した。
【０２７５】
結果：
図１３Ａ及び図１４Ａに示されているように、Ｃａｋｉ−１腎癌細胞のＧＰＸ４阻害剤（ＲＳＬ３又はＭＬ１６２）での処置により、細胞の生存率が用量依存的に低下し、この生存率の低下は、フェロトーシス阻害剤であるフェロスタチン−１によって弱められた。図１３Ｂ及び図１４Ｂに示されているように、Ｃａｋｉ−１腎癌細胞のＲＳＬ３又はＭＬ１６２での処置により、ＴＨＰ１細胞のＮＦＫＢ活性が用量依存的に上昇し、このＮＦＫＢ活性の上昇は、フェロトーシス阻害剤であるフェロスタチン−１によって弱められた。これらの結果は、細胞死が、ＧＰＸ−４阻害剤処置Ｃａｋｉ−１腎癌細胞によって誘発されるＮＦＫＢシグナル伝達の誘導に役割を果たすことを実証している。加えて、フェロトーシス阻害剤であるフェロスタチン−１は、ＧＰＸ４阻害剤で処置された細胞によるＮＦＫＢ活性の誘導を低下させたため、これらの結果は、（例えば、フェロトーシス阻害剤による）鉄依存性細胞分解の阻害が免疫活性（例えば、ＮＦＫＢ活性）を低下させ得ることを実証している。
【０２７６】
等価物
当業者は、本明細書に記載の特定の実施形態及び方法の多くの等価物を認識する、又は日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図されている。
【０２７７】
参照による組み込み
本出願で言及される各参考文献、特許、及び特許出願は、あたかも各参照が個別に組み込まれると述べられたかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
2021527648.tif 000087
【図１Ｂ】
2021527648.tif 000088
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
2021527648.tif 000093
【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
2021527648.tif 000095
【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
2021527648.tif 000097
【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
2021527648.tif 000099
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
2021527648.tif 000102
【図７Ｂ】
2021527648.tif 000103
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【国際調査報告】
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