(57)【要約】本発明は、精子機能を定量化するためのバイオセンサおよびその用途に関する。雄不妊を診断するための方法およびツールも本明細書に開示される。【選択図】図なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
精子機能の検出かつ／または定量化のためのバイオセンサであって、基板とＪＵＮＯタンパク質またはその断片とを含み、前記ＪＵＮＯタンパク質またはその断片が、前記基板上に固定化される、バイオセンサ。
【請求項２】
透明帯１（ＺＰ１）、透明帯２（ＺＰ２）、透明帯３（ＺＰ３）および／または抗ＩＺＵＭＯ抗体またはそれらの断片をさらに含み、前記ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３、および／または前記抗ＩＺＵＭＯ抗体またはその断片が、前記基板上に固定化される、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記タンパク質ＪＵＮＯ、ＺＰ１、ＺＰ２およびＺＰ３が、哺乳動物タンパク質である、請求項１または２に記載のバイオセンサ。
前記タンパク質ＪＵＮＯ、ＺＰ１、ＺＰ２およびＺＰ３が、ヒト、ウマ、イヌまたはウシのタンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
前記ＪＵＮＯタンパク質が、配列番号１のタンパク質に対して少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性など、少なくとも９７％の配列同一性など、少なくとも９８％の配列同一性など、少なくとも９９％の配列同一性エンティティなど、約１００％の配列同一性などを有するポリペプチドまたはそのオルソログ、または前記タンパク質の断片を含むかまたはそれらからなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項５】
前記ＺＰ１が、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性など、少なくとも９７％の配列同一性など、少なくとも９８％の配列同一性など、少なくとも９９％の配列同一性エンティティなど、約１００％の配列同一性などを有するポリペプチドまたはそのオルソログ、または前記タンパク質の断片を含むかまたはそれらからなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項６】
前記ＺＰ２が、配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性など、少なくとも９７％の配列同一性など、少なくとも９８％の配列同一性など、少なくとも９９％の配列同一性エンティティなど、約１００％の配列同一性などを有するポリペプチドまたはそのオルソログ、または前記タンパク質の断片を含むかまたはそれらからなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項７】
前記ＺＰ３が、配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性など、少なくとも９７％の配列同一性など、少なくとも９８％の配列同一性など、少なくとも９９％の配列同一性エンティティなど、約１００％の配列同一性などを有するポリペプチドまたはそのオルソログ、または前記タンパク質の断片を含むかまたはそれらからなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項８】
前記ＪＵＮＯタンパク質、ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３、および抗ＩＺＵＭＯ抗体の少なくとも１つが、追加の部分に結合される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項９】
前記追加の部分が、ペプチドである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項１０】
前記追加の部分が、標識である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項１１】
前記精子機能が、前記センサ上に固定化されたタンパク質への精子細胞の少なくとも一部分の結合から決定され、前記タンパク質が、ＪＵＮＯタンパク質、ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３および／または前記抗ＩＺＵＭＯ抗体、またはその断片からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項１２】
精子の少なくとも一部分が、ＩＺＵＭＯ１表面抗原を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項１３】
前記基板が、マイクロビーズ、ディッシュ、チップまたは電極である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項１４】
前記基板が、ポリマーマイクロビーズである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項１５】
前記基板が、アガロースマイクロビーズ、セルロースマイクロビーズ、ニトロセルロースマイクロビーズまたはラテックスマイクロビーズである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項１６】
前記基板が、プラスチックディッシュ、セラミックディッシュまたはガラスディッシュなどの、ディッシュである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項１７】
前記基板が、ディッシュでありかつ前記ディッシュが、それが顕微鏡または光変換器に連結され得るように構成される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項１８】
前記基板が、マイクロビーズであり、前記マイクロビーズが、それらが顕微鏡、光変換器または測定回路に連結され得るように構成される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項１９】
チップが、ガラスチップである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項２０】
前記電極が、炭素、金または白金の電極である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項２１】
前記電極が、スクリーン印刷された電極である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項２２】
前記基板が、修飾表面を有する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項２３】
前記基板の少なくとも一部分が、金の層でコーティングされる、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項２４】
前記基板の少なくとも一部分が、金、銀、酸化銅、グラフェン、酸化鉄およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるナノ粒子で修飾される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項２５】
前記ＪＵＮＯタンパク質、ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３および／または前記抗ＩＺＵＭＯ抗体が、前記基板上に固定化される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項２６】
前記基板が顕微鏡、電気化学ワークステーション、表面プラズモン共鳴検出器、測定回路または光変換器に連結され得るように構成される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項２７】
前記基板が、ディッシュでありかつ前記ディッシュが、それが顕微鏡または光変換器に連結され得るように構成される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項２８】
前記基板が、ディッシュでありかつ前記ディッシュが、それが電気化学ワークステーションまたは測定回路に連結され得るように構成される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項２９】
前記基板が、チップでありかつ前記チップが、それが表面プラズモン共鳴検出器に連結され得るように構成される、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項３０】
前記バイオセンサが、精子機能の検出かつ／または定量化のために構成され、前記精子が、精液サンプル中にある、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項３１】
精子機能を検出するかつ／または定量化するための方法であって、
ａ．対象からの精液サンプルを提供するステップであって、前記精液サンプルが、１つ以上の精子細胞を含む、提供するステップと、
ｂ．前記精液サンプルを請求項１〜３０のいずれか一項に記載のバイオセンサと接触させるステップと、
ｃ．前記センサ上に固定化されたタンパク質への前記精子細胞の結合を決定するステップ、
を含み、それにより前記サンプルの前記精子機能を検出するかつ／または定量化する、方法。
【請求項３２】
雄不妊の診断のための方法であって、
ａ．対象からの精液サンプルを提供するステップと、
ｂ．前記精液サンプルを請求項１〜３１のいずれか一項に記載のバイオセンサと接触させるステップと、
ｃ．請求項３１に記載の方法に従い前記サンプルの前記精子機能を定量化するステップと、
ｄ．前記精子機能を使用して前記対象が不妊であるかを診断するステップ、
を含む、方法。
【請求項３３】
前記精液サンプルが、１つ以上の精子細胞を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記センサ上に固定化された前記タンパク質が、ＪＵＮＯタンパク質、ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３および／または前記抗ＩＺＵＭＯ抗体、またはそれらの断片からなる群から選択され、かつ前記結合が、顕微鏡分析、電気化学的検出および／または表面プラズモン共鳴により検出される、請求項３１〜３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記サンプルの前記精子機能が、顕微鏡分析、電気化学的検出および／または表面プラズモン共鳴により結合精子細胞対非結合精子細胞の割合を決定することにより定量化される、請求項３１または３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記サンプルの精子機能が、顕微鏡分析、電気化学的検出および／または表面プラズモン共鳴により前記精液サンプル中の前記精子細胞の先体状態を決定することにより定量化される、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
結合精子細胞対非結合精子細胞の前記割合および／または前記精子細胞の前記先体状態をそれぞれの基準値と比較することをさらに含む、請求項３１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記サンプルが、ステップｂの前に処理され、かつ前記処理が、前記精子の液化および任意により受精能獲得を含む、請求項３１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記サンプルの前記精子機能を定量化する前に前記サンプルに蛍光色素を添加するステップをさらに含む、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記精子機能が、前記固定化されたＪＵＮＯタンパク質に結合する精子の能力により決定される、請求項３１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記固定化されたＪＵＮＯタンパク質への精子の前記結合が、前記精子により発現されるＩＺＵＭＯ１タンパク質を介して起こる、請求項３１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記雄不妊を治療するステップをさらに含む、請求項３１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記治療が、治療上有効量での薬剤の投与および／または人工生殖技術（ＡＲＴ）を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記対象が、ヒト対象である、請求項３１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記ヒト対照が、小児または成人である、請求項３１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記対象が、ウマ、ウシ、バッファロ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ネコまたはイヌなどの哺乳動物である、請求項３１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
精子を選択する方法であって、
ａ．対象からの精液サンプルを提供することであって、精液サンプルが、１つ以上の精子細胞を含む、提供することと、
ｂ．前記精液サンプルを請求項１〜４６のいずれか一項に記載のバイオセンサと接触させることと、
ｃ．顕微鏡により前記バイオセンサに結合した精子を可視化することと、
ｄ．前記バイオセンサに結合した精子を選択すること、
を含む、方法。
【請求項４８】
請求項１に記載のＪＵＮＯタンパク質を含むバイオセンサを製造するための方法であって、
ａ．基板を提供することと、
ｂ．前記ＪＵＮＯタンパク質を提供することと、
ｃ．前記ＪＵＮＯタンパク質を前記基板上に固定すること、
を含み、それにより前記ＪＵＮＯタンパク質を含むバイオセンサを製造する、方法。
【請求項４９】
前記基板が、請求項１〜４８のいずれか一項に記載のとおりである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５０】
ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３および抗ＩＺＵＭＯ抗体の１つ以上を前記基板上に固定化することをさらに含む、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記タンパク質ＪＵＮＯ、ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３および前記抗ＩＺＵＭＯ抗体が、請求項１〜５２のいずれか一項に記載のとおりである、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
精子機能の検出かつ／または定量化のためのハンドヘルドデバイスであって、
ａ．サンプル用の注入口と、
ｂ．ＪＵＮＯタンパク質またはその断片を含むバイオセンサであって、前記ＪＵＮＯタンパク質が、前記バイオセンサ上に固定化され、かつ前記注入口が、前記センサと接触して前記サンプルを置くように構成される、バイオセンサと、
ｃ．前記センサから信号を受信しかつそれをユーザにより読み取り可能な形式に変換するように構成される検出器と、
ｄ．任意により、細胞成分を前記サンプルから分離するための手段、
を含む、デバイス。
【請求項５３】
前記バイオセンサが、請求項１〜５２のいずれか一項に記載のとおりである、請求項５３に記載のハンドヘルドデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精子機能の定量化および雄の受精の評価のためのバイオセンサおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界人口の約１５％が不妊の影響を受けており、男性不妊がこの症例全体の２０〜７０％を占めることが公知である（Ｒｅｐｒｏｄ  Ｂｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２０１５、１３：３７）。さらに、すべての男性の２．５〜１２％が不妊であると推定されている。欧州では出生率の低下および他の男性不妊に関連する要因があるために、この状況は憂慮すべきである。男性不妊の治療は正確な診断に依存するため、根本原因の分析および検出が重要である。解剖学的および内分泌学的分析に加えて、男性不妊の検査室診断における現在の傾向は、精子および精液の特徴にわたる（Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ）。男性不妊の症例の３０〜４０％は、未知の男性不妊関連要因に関連している（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ、２０１５）。これは特発性男性不妊として知られており、その治療には詳細な機能分析の調査を必要とする。
【０００３】
さらに、生殖補助医療（ＡＲＴ）は、この障壁にも直面する標準的な治療選択肢である。２０１５年には、米国の全乳児の１．６％がＡＲＴを介して受胎された。２０１５年のみで２３１，９３６のＡＲＴサイクルが米国で実施されたが、それらは６０，７７８の出生をもたらした（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ、２０１６）。２０１７年に、欧州ヒト生殖発生学会（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ）は、定期的な体外受精（ＩＶＦ）後の卵母細胞の受精失敗率（ＦＦＲ）を、ＡＲＴラボの重要業務評価指標として特定し、能力レベルは５％と非常に低くなっている（Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｏｐｅｎ．２０１７、２）。精子の形態はＩＶＦの成功／失敗と相関させることはできないが、受精の失敗は精子機能の問題に起因することに留意することが重要である（Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄ．２０００、１５（３）：７０２；Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ．２００３  Ｊａｎ；７９（１）：７４）。したがって、ＩＶＦの生存率を予測し、適切なＡＲＴ法をより適切に選択するために、精子細胞の受精能力を診断するための頑強な方法を開発する必要がある。
【０００４】
ＡＲＴの前に、典型的には、男性不妊に関連する要因が精査され、要因は精子の質の分析、精子の数、濃度、形態および運動性、精液中の非定型細胞型の識別、ならびに自己免疫抗体の存在を含む。追加の分析は、精子細胞と子宮頸管粘液との相互作用、先体反応、副性器機能の生化学的アッセイ、ならびに活性酸素種およびＤＮＡ損傷の推定を研究することを伴い得る（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、２０１０）。特発性男性不妊およびＩＶＦでの受精の失敗の場合、これらの値は不妊の根本原因に関する多くの情報を提供しない。卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）を用いることは、もっとも多くの場合、好ましい方法であるが、ＩＶＦの不要なステップは、健康な卵母細胞の浪費および経済的負荷をもたらす。
【０００５】
精子細胞の形態学的および速度論的特性は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはＩＶＦでの受精に重要であるが、受精の最終的なステップは、卵子との精子細胞の融合である。ヘミゾナアッセイ、ヒト精子−卵母細胞相互作用検査、およびヒト透明帯結合検査などの研究方法は、このステップの一部を模倣することができる。しかし、これらの方法は、容易に入手できないヒト卵母細胞またはその一部に依存するため、商品化することができない。透明帯非含有ハムスター卵母細胞侵入検査は、ヒト卵母細胞の代わりにハムスター卵母細胞を使用する目的で開発された。この検査では、ヒト卵母細胞の要件が不要となるが、いずれの授精濃度においてもＩＶＦ治療での受精の成功に関する予測値が低いため、この検査の使用は大幅に制限される。
【０００６】
２つの配偶子間の一次結合は、卵子を取り巻く透明帯（ＺＰ）糖タンパク質の細胞外層によって媒介される（Ｃｅｌｌ．２０１７、１６９（７）：１３１５；Ｒｅｐｒｏｄ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｏｎｌｉｎｅ．２００３、７（６）：６４１）。この相互作用は、精子細胞での先体反応を引き起こす原因である。さらに、ＺＰに遭遇する前に先体反応を開始していない精子細胞は、卵子を受精させることができない。次に、先体から放出された加水分解酵素はＺＰを消化する必要があり、それによって精子が卵子膜に進むことができるようになる。
【０００７】
この結合における重要なステップは、２０１４年に発見された。精子表面抗原ＩＺＵＭＯ１は、以前は葉酸受容体４として知られていた雌の対応するＪＵＮＯタンパク質に結合する（Ｎａｔｕｒｅ．５０８：４８３−４８７；Ｎａｔｕｒｅ．２０１６、５３４（７６０８）：５６６）。この生化学的事象は、２つの配偶子の融合に必須であることが発見された。生化学的不一致はいずれも、受精の失敗につながり得る。
【０００８】
したがって、ＪＵＮＯタンパク質に結合できる精液サンプル中の精子細胞の量を定量化できることは、受精の評価において重要である。
【０００９】
バイオセンサは、生体物質（例えば、微生物、酵素、抗体、ＤＮＡ、およびＲＮＡ）の分子識別機能を利用するセンサであり、分子識別要素としてそのような生体物質を用いる。換言すれば、バイオセンサは、固定化された生体物質が標的基板、微生物の呼吸によって消費される酸素、酵素反応、発光などを識別するときに起こる反応を利用する。バイオセンサの中でも、酵素センサの実用化が発展している。例えば、グルコース、乳酸、尿酸、およびアミノ酸の酵素センサは、医療機器および食品加工業界における用途を見出している。
【００１０】
例えば電極に結合したタンパク質と精子などの標的種との間の相互作用を追跡するために、異なる技術を使用してもよい。そのような技術のうちの１つは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に依存する。ＳＰＲでは、タンパク質などの１つの分子パートナが金属（チップ）上に固定化される。光は金属の表面プラズモンを励起し、結合パートナが固定化された分子に結合するときに、これが表面プラズモンシグナルの検出可能な変化を生じる。そのような技術の別のものは、生物学的事象の電子信号への直接変換によって生物学的サンプルの内容物が分析される、電気化学的変換に依存する。電気化学的バイオセンシングの最も一般的な技術には、サイクリックボルタンメトリ、クロノアンペロメトリ、クロノポテンシオメトリ、インピーダンス分光法、および電界効果トランジスタベースの方法、ならびにナノワイヤまたは磁性ナノ粒子ベースのバイオセンシングが含まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、精子細胞の受精能を識別するために、ＪＵＮＯタンパク質と精子表面抗原ＩＺＵＭＯ１との間の生化学的反応を利用する。不妊の根本原因を明らかにすることに加えて、これは、卵子の浪費を最小限に抑えながら、好適なＡＲＴ技術の選択、すなわち通常のＩＶＦとＩＣＳＩとの間での選択に特に有用であろう。本発明者らは、男性不妊を診断するために精子細胞の受精能を精査する電気化学的および／または光学的感知プラットフォーム（複数可）の開発および臨床的検証をさらに提唱する。男性不妊を診断し、精子の質を確認するための既存の商業的方法では、受精事象に必要な生化学的相互作用を監視（ｏｖｅｒｌｏｏｋｉｎｇ）しながら、精子細胞の物理的態様を調べる。提唱される方法は、精子細胞の生体受容体を利用する男性の受精を分析するための最初のバイオインスパイアードアッセイであり、この方法は、精子細胞による受精の重要なステップを模倣し、それによってそれらの受精能への直接的な洞察が得られるため、既存の診断方法に勝る利点を有する。これまでに、精子と卵母細胞との相互作用検査が開発されているが、それらはすべて、容易に入手できないヒト卵母細胞および透明帯を使用する必要があるか、または検査結果と様々な精液パラメータとの間において低い相関を有するために信頼性がないかのいずれかである。本発明は、卵母細胞を模倣する条件を作り出すことによって、特に精子−卵母細胞融合に関与する重要なタンパク質受容体の１つ以上を使用することによって、卵母細胞の利用可能性の問題を克服する。
【００１２】
精子機能を定量化するためのバイオセンサを提供することは、本開示の一態様であり、本バイオセンサは、基板と、ＪＵＮＯタンパク質またはその断片とを含み、ここで、ＪＵＮＯタンパク質またはその断片は、基板上に固定化される。
【００１３】
精子機能を検出するためのバイオセンサを提供することは、本開示のさらなる一態様であり、本バイオセンサは、基板と、ＪＵＮＯタンパク質またはその断片とを含み、ここで、ＪＵＮＯタンパク質またはその断片は、基板上に固定化される。
【００１４】
精子機能を検出するかつ／または定量化するための方法を提供することもまた、本開示の一態様であり、この方法は、
ａ．対象からの精液サンプルを提供するステップであって、精液サンプルが、１つ以上の精子細胞を含む、提供するステップと、
ｂ．精液サンプルを前述の請求項のいずれか一項に記載のバイオセンサと接触させるステップと、
ｃ．センサに固定化されたタンパク質への精子細胞の結合を決定するステップ、
を含み、
それにより、サンプルの精子機能を検出するかつ／または定量化する。
【００１５】
雄不妊を診断するための方法を提供するステップもまた、本開示の一態様であり、この方法は、
ａ．対象からの精液サンプルを提供するステップと、
ｂ．精液サンプルを本開示によるバイオセンサと接触させるステップと、
ｃ．本開示の方法に従って、サンプルの精子機能を定量化するステップと、
ｄ．精子機能を使用して、対象が不妊であるかを診断するステップ、
を含む。
【００１６】
雄不妊を診断するための方法を提供することもまた、本開示の一態様であり、この方法は、
ａ．対象からの精子サンプルを提供するステップと、
ｂ．精子サンプルを本開示によるバイオセンサと接触させるステップと、
ｃ．本開示の方法に従って、サンプルの精子機能を定量化するステップと、
ｄ．精子機能を使用して、対象が不妊であるかを診断するステップ、
を含む。
【００１７】
本開示の別の態様は、ＪＵＮＯタンパク質を含むバイオセンサを製造するための方法の提供であり、この方法は、
ａ．基板を提供することと、
ｂ．ＪＵＮＯタンパク質を提供することと、
ｃ．ＪＵＮＯタンパク質を基板に固定すること、
を含み、それにより、ＪＵＮＯタンパク質を含むバイオセンサを製造する。
【００１８】
精子を選択する方法を提供することは、本開示のさらなる一態様であり、この方法は、
ａ．対象からの精液サンプルを提供することであって、精液サンプルが、１つ以上の精子細胞を含む、提供することと、
ｂ．精液サンプルを本開示によるバイオセンサと接触させることと、
ｃ．顕微鏡によってバイオセンサに結合した精子を可視化すること、
を含み、それにより、精子を選択する。
【００１９】
精子を選択する方法を提供することは、本開示のさらなる一態様であり、この方法は、
ａ．対象からの精子サンプルを提供することと、
ｂ．精子サンプルを本開示によるバイオセンサと接触させることと、
ｃ．顕微鏡によってバイオセンサに結合した精子を可視化すること、
を含み、それにより、精子を選択する。
【００２０】
精子機能の検出かつ／または定量化のためのハンドヘルドデバイスを提供することもまた、本開示の一態様であり、本デバイスは、
ａ．サンプル用の注入口と、
ｂ．ＪＵＮＯタンパク質またはその断片を含むバイオセンサであって、ＪＵＮＯタンパク質がバイオセンサ上に固定化され、かつ注入口が、サンプルをセンサと接触させるように構成される、バイオセンサと、
ｃ．センサから信号を受信し、その信号をユーザが読み取り可能な形式に変換するように構成される検出器と、
ｄ．任意により、細胞成分をサンプルから分離するための手段、
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】以下のサイクリックボルタンメトリ応答を示す図である。ａ）バッファのみ添加後（実線）およびバッファで１．６７ｘ１０−２倍に希釈した精液サンプルの添加後（点線）の電極−金ナノ粒子−ＢＳＡブロッキング、ｂ）電極−金ナノ粒子−ＪＵＮＯ−ＢＳＡブロッキング（二点鎖線）、およびｃ）バッファで１．６７ｘ１０−２倍に希釈した精液サンプルを添加した後の電極−金ナノ粒子−ＺＰ３−ＢＳＡブロッキング応答（破線）。希釈係数は、初期容量／最終容量による。
【図２】６つの異なる精液サンプル（図２Ａ〜Ｆ）の３つの異なる希釈液（１．５６ｘ１０−５倍（点線）、１．６７ｘ１０−２倍（二点鎖線）、および２．５ｘ１０−２倍（破線））を添加後の電極−金ナノ粒子−ＺＰ３−ＢＳＡブロッキングのサイクリックボルタンメトリ応答を示す図である。実線はバッファのみ（精液サンプルなし）での電極応答を示す。
【図３】精液サンプルＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５およびＳ６（それぞれ図３Ａ〜Ｆ）の３つの異なる希釈液（１．５６ｘ１０−５倍（点線）、１．６７ｘ１０ー２倍（一点鎖線）および２．５ｘ１０−２倍（破線））の添加後の電極−金ナノ粒子−ＪＵＮＯ−ＢＳＡブロッキング、のサイクリックボルタンメトリ応答を示す図である。実線はバッファのみ（精液サンプルなし）での電極応答を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書に開示されるのは、雄不妊を評価するために精子機能を定量化するためのバイオセンサおよびその用途である。さらに、本開示は、対象から得られたサンプル中の精子細胞の精子機能を決定することを含む、対象における不妊を診断するための方法に関する。
精子機能
【００２３】
精子の主な機能は、卵子に到達して、卵子と融合して２つの細胞内構造：（ｉ）遺伝物質を含む雄の前核および（ｉｉ）微小管細胞骨格の組織化を助ける構造である中心体、を送達することにより受精を誘発することである。したがって、精子機能は、精子が卵子に到達しかつ受精を誘発する能力として理解され得る。
【００２４】
２つの配偶子間の一次結合は、卵子を取り巻く透明帯（ＺＰ）糖タンパク質の細胞外層によって媒介される（Ｃｅｌｌ．２０１７、１６９（７）：１３１５；Ｒｅｐｒｏｄ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｏｎｌｉｎｅ．２００３、７（６）：６４１）。この相互作用は、精子細胞の先体反応を引き起こす原因である。さらに、ＺＰに遭遇する前に先体反応を開始していない精子細胞は、卵子を受精させることができない。次に、先体から放出された加水分解酵素はＺＰを消化する必要があり、それによって精子が卵子膜に進むことができるようになる。
【００２５】
この結合における重要なステップは、２０１４年に発見された。精子表面抗原ＩＺＵＭＯ１は、以前は葉酸受容体４として知られていた雌の対応するＪＵＮＯタンパク質に結合する（Ｎａｔｕｒｅ．５０８：４８３−４８７；Ｎａｔｕｒｅ．２０１６、５３４（７６０８）：５６６）。この生化学的事象は、２つの配偶子の融合に必須であることが発見された。
【００２６】
本開示は、精子機能を定量化するためのバイオセンサに関するものであり、バイオセンサは、基板と、ＪＵＮＯタンパク質またはその断片とを含み、ＪＵＮＯタンパク質またはその断片は、基板上に固定化される。実際に、ＪＵＮＯタンパク質を含むバイオセンサへの精子細胞の結合を介して精子機能を精査することは、実行可能な戦略であり得、最終的には雄不妊の診断を可能にし、ヒトまたは動物の卵母細胞またはその一部分の必要性を克服する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本開示によるバイオセンサが提供され、精子機能は、タンパク質またはその断片への精子の少なくとも一部分の結合から決定され、これらのタンパク質またはその断片は、センサ上に固定化され、タンパク質（複数可）は、ＪＵＮＯタンパク質、ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３および／または抗ＩＺＵＭＯ抗体、またはそれらの断片である。いくつかの実施形態では、精子の少なくとも一部分は、ＩＺＵＭＯ１表面抗原を含む。
【００２８】
精子機能を検出するかつ／または定量化するための方法を提供することは、本開示の一態様であり、この方法は、
ａ．対象からの精液サンプルを提供するステップであって、精液サンプルが、１つ以上の精子細胞を含む、提供するステップと、
ｂ．精液サンプルを前述の請求項のいずれか一項に記載のバイオセンサと接触させるステップと、
ｃ．センサに固定化されたタンパク質への精子細胞の結合を決定するステップ、
を含み、それにより、サンプルの精子機能を検出するかつ／または定量化する。
【００２９】
雄不妊を診断するための方法を提供することもまた、本開示のさらなる一態様であり、この方法は、
ａ．対象からの精液サンプルを提供するステップと、
ｂ．精液サンプルを本開示によるバイオセンサと接触させるステップと、
ｃ．本明細書に開示される方法に従って、サンプルの精子機能を定量化するステップと、
ｄ．精子機能を使用して、対象が不妊であるかを診断するステップ、
を含む。
【００３０】
雄不妊を診断するための方法を提供することもまた、本開示の別の態様であり、この方法は、
ａ．対象からの精子サンプルを提供するステップと、
ｂ．精子サンプルを本開示によるバイオセンサと接触させるステップと、
ｃ．本明細書に開示される方法に従って、サンプルの精子機能を定量化するステップと、
ｄ．精子機能を使用して、対象が不妊であるかを診断するステップ、
を含む。
【００３１】
本明細書で使用される「精子機能」という用語は、精子の健康を指し、これは、精子が卵に受精能を獲得させ、受精させる能力である。精子機能検査は、精子細胞の生化学的特徴または分子的特徴を精査する診断または研究方法である。次の参照文献は、精子機能検査のいくつかの例を有する：Ｔａｌｗａｒ  ａｎｄ  Ｈａｙａｔｎａｇａｒｋａｒ  ２０１５．Ｊ  Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｓｃｉ．８（２）：６１−６９。本開示は、精子−卵母細胞相互作用検査とも呼ばれる精子機能検査に関するものであり、この検査は、卵母細胞を使用する代わりに、精子と卵母細胞との融合に関与する重要なタンパク質受容体の１つ以上を使用することによって精子−卵母細胞相互作用の条件を模倣する。
【００３２】
本開示の方法による一実施形態では、精液サンプルは、１つ以上の精子細胞を含むかまたは含むことが疑われる。
【００３３】
本開示の方法による一実施形態では、サンプルの精子機能は、センサ上に固定化されたタンパク質への精子細胞の結合を決定することによって検出され、タンパク質は、ＪＵＮＯタンパク質、ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３および／もしくは抗ＩＺＵＭＯ抗体、またはそれらの断片からなる群から選択され、この結合は、顕微鏡分析、電気化学的検出、および／または表面プラズモン共鳴によって検出される。
【００３４】
本開示の方法による一実施形態では、サンプルの精子機能は、センサ上に固定化されたタンパク質への精子細胞の結合を決定することによって定量化され、タンパク質は、ＪＵＮＯタンパク質、ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３および／もしくは抗ＩＺＵＭＯ抗体、またはそれらの断片からなる群から選択され、この結合は、顕微鏡分析、電気化学的検出、および／または表面プラズモン共鳴によって検出される。
【００３５】
本開示の方法による一実施形態では、精子機能は、ステップｃ）で、顕微鏡分析によって結合精子細胞対非結合精子細胞の割合を決定することによって定量化される。
【００３６】
本開示の方法による一実施形態では、精子機能は、ステップｃ）で、電気化学的検出によって結合精子細胞対非結合精子細胞の割合を決定することによって定量化される。
【００３７】
本開示の方法による一実施形態では、精子機能は、ステップｃ）で、表面プラズモン共鳴によって結合精子細胞対非結合精子細胞の割合を決定することによって定量化される。
【００３８】
本開示の方法による一実施形態では、精子機能は、ステップｃ）で、顕微鏡分析によって、精液サンプル中および／または精子サンプル中の精子細胞の先体状態を決定することによって定量化される。
【００３９】
本開示の方法による一実施形態では、精子機能は、ステップｃ）で、電気化学的検出によって、精液サンプル中および／または精子サンプル中の精子細胞の先体状態を決定することによって定量化される。
【００４０】
本開示の方法による一実施形態では、精子機能は、ステップｃ）で、表面プラズモン共鳴によって、精液サンプル中および／または精子サンプル中の精子細胞の先体状態を決定することによって定量化される。
【００４１】
本開示の方法による一実施形態では、本方法は、結合精子細胞対非結合精子細胞の割合および／または精子細胞の先体状態をそれぞれの基準値と比較することをさらに含み、ここで、基準値は、正の基準値（機能的精子を表す）および／または負の基準値（非機能的精子を表す）であり得る。基準値は、対照精液サンプルおよび／または対照精子サンプルを検査することによって得ることができる。基準値はまた、科学文献で入手可能なデータから得ることができる。
【００４２】
本開示の方法による一実施形態では、サンプルは、ステップｂの前に処理される。例えば、精液サンプル処理は、精子の液化を含み得る。精液サンプル処理は、任意により受精能を獲得することを含み得る。精子サンプル処理は、精子の液化を含み得る。精子サンプル処理は、任意により受精能を獲得することを含み得る。
【００４３】
本明細書に開示されるバイオセンサは、様々なレベルで精子機能を決定するために使用され得る。
【００４４】
例えば、本開示のバイオセンサは、精液サンプル中および／または精子サンプル中の精子細胞が透明帯タンパク質ＺＰ１、ＺＰ２および／またはＺＰ３に結合する能力を決定するために使用され得る。
【００４５】
本開示のバイオセンサは、精液サンプル中および／または精子サンプル中の精子細胞が先体反応を受ける能力を決定するために使用され得る。
【００４６】
透明帯タンパク質ＺＰ１、ＺＰ２および／またはＺＰ３への結合は、先体反応を受けるために精子細胞にとって必要なステップである。したがって、透明帯タンパク質ＺＰ１、ＺＰ２および／またはＺＰ３に結合できない精子細胞は、先体反応を受けない。
【００４７】
精子細胞が透明帯タンパク質ＺＰ１、ＺＰ２および／またはＺＰ３に結合し先体反応を受けることができるかを決定することは、使用可能な生殖補助医療を確立するために重要である。特に、透明帯タンパク質ＺＰ１、ＺＰ２および／またはＺＰ３に結合できない、および／または先体反応を受けない精子細胞は、透明帯コートが卵から除去されている場合には、ＩＶＦに好適であり得る。
【００４８】
本開示のバイオセンサは、精液サンプル中および／または精子サンプル中の精子細胞がＪＵＮＯタンパク質を結合する能力を決定するために使用され得る。
【００４９】
精子細胞は、透明帯タンパク質ＺＰ１、ＺＰ２および／またはＺＰ３に結合できず、かつ／または先体反応を受けない場合であっても、ＪＵＮＯタンパク質に結合できる可能性がある。これは、精子細胞が誘発されて、卵母細胞の細胞膜への結合のために必要な表面抗原を可能にし露出させ得るためである。
【００５０】
いくつかの実施形態では、精子機能は、固定化されたＪＵＮＯタンパク質またはその断片に結合する精子の能力によって決定される。この結合は、例えば、精子上にあるＩＺＵＭＯ１タンパク質またはその断片を介して起こり得る。この結合は、例えば、精子によって発現されるＩＺＵＭＯ１タンパク質またはその断片を介して起こり得る。
【００５１】
実際に、受精能獲得を受けた精子は、その表面にＩＺＵＭＯ１タンパク質もしくはその断片を提示し得、ＩＺＵＭＯ１タンパク質もしくはその断片は、その卵受容体対応物、例えば、ＪＵＮＯタンパク質もしくはその断片、または抗ＩＺＵＭＯ抗体もしくはその断片を結合できる。
【００５２】
いくつかの実施形態では、精子機能は、固定化されたＪＵＮＯタンパク質またはその断片へのＩＺＵＭＯ１タンパク質またはその断片の結合によって決定される。
【００５３】
特定の実施形態では、本開示による方法は、雄不妊を治療するステップをさらに含む。
【００５４】
本開示による方法の特定の実施形態では、治療は、治療有効量での薬剤の投与、および／または人工生殖技術（ＡＲＴ）によることを含む。例えば、精子機能の低下と診断された対象は、子宮内授精（ＩＵＩ）、体外受精（ＩＶＦ）、またはＩＶＦおよび卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）などのＡＲＴの助けにより、生殖を受け得る。
【００５５】
例えば、精子機能の低下、特に、
−透明帯タンパク質ＺＰ１、ＺＰ２および／またはＺＰ３に結合する能力の低下、
−先体反応を受ける能力の低下；
−ＪＵＮＯタンパク質を結合する通常の能力、
を特徴とする精子細胞を有すると診断された対象は、ＩＶＦの助けにより生殖を受け得る。
【００５６】
例えば、精子機能の低下、特に、
−透明帯タンパク質ＺＰ１、ＺＰ２および／またはＺＰ３に結合する能力の低下、
−先体反応を受ける能力の低下；
−ＪＵＮＯタンパク質を結合する能力の低下、
を特徴とする精子細胞を有すると診断された対象はＩＶＦおよびＩＣＳＩによる助けにより、生殖を受け得る。
【００５７】
本明細書で使用される「能力の低下」および「通常の能力」という用語は、陽性対照であり得る基準値に関連する。基準値は、受精能のある対象の精液サンプルの平均値を計算することによって得ることができる。基準値は、受精能のある対象の精子サンプルの平均値を計算することによって得ることができる。基準値は、科学的報告からも得ることができる。したがって、精子機能の低下および／または雄不妊を有する対象を診断するために、精液サンプルおよび／もしくは精子サンプルから採取された対象の精子細胞が透明帯タンパク質ＺＰ１、ＺＰ２および／もしくはＺＰ３に結合する能力、ならびに／または先体反応を受ける能力を、少なくとも陽性対照および／または陰性対照などの基準値と比較する。
【００５８】
当業者に公知である雄不妊の任意の治療を使用できる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、本開示によるバイオセンサは、精子機能の検出かつ／または定量化のために構成される。
【００６０】
本開示の方法による一実施形態では、精子機能は、ステップｃ）で、精液サンプル中および／または精子サンプル中の精子細胞の先体状態を決定することによって定量化され、これは、精子機能の測定値への先体反応性の程度の変換をもたらす。特定の実施形態では、蛍光色素がサンプルに添加され、その後に、ＳＰＲまたは顕微鏡法によってサンプルを分析して精子細胞の先体状態（すなわち、精子細胞が「先体反応」するか）を決定するステップを行う。いくつかの実施形態では、蛍光色素は、サンプルを基板と接触させた後にのみ、バイオセンサの注入口でサンプルに添加される。いくつかの実施形態では、蛍光色素は、先体反応が起こった後にのみ、バイオセンサの注入口でサンプルに添加される。蛍光色素の存在は、精子細胞の先体状態を決定するステップを容易にし得る。例えば、エンドウ（エンドウ豆凝集素）もしくはラッカセイ（ピーナッツレクチン）などの蛍光標識レクチン、または先体抗原ＣＤ４６に対するモノクローナル抗体を使用して、精子細胞の先体状態を評価できる。先体反応を検出するための方法は、ヒト精液の検査および処理に関するＷＨＯ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（ＷＨＯ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１０，ＩＳＢＮ９７８  ９２  ４  １５４７７８  ９）（特に第４章を参照のこと）に見出される。
【００６１】
本開示の方法によるいくつかの実施形態では、精子機能は、ステップｃ）で、精液サンプル中および／または精子サンプル中の精子細胞の先体状態を決定することによって定量化され、これは、精子機能の測定値への先体反応性の程度の変換をもたらし、精液サンプルおよび／または精子サンプルの先体反応性が、受精能のある雄個体から収集された精子の平均先体反応性と比較され、機能性精子は、受精能のある雄個体から収集された精子の平均先体反応性と同等であるかまたはそれを超える先体反応性を有し得る。受精能のある雄個体から収集された精子の平均先体反応性に関するデータは、科学文献および臨床報告に見出され得る。
【００６２】
本開示の方法によるいくつかの実施形態では、精子機能は、ステップｃ）で、先体反応性の程度を精子機能の測定値に変換することによって定量化され、１５％以上の先体反応性は、機能的精子を示し得る。
【００６３】
本開示の方法によるいくつかの実施形態では、精子機能は、ステップｃ）で、先体反応性の程度を精子機能の測定値に変換することによって定量化され、１０％以下の先体反応性は、非機能的精子を示し得る。
【００６４】
本開示の方法によるいくつかの実施形態では、精子機能は、ステップｃ）で、先体反応性の程度を精子機能の測定値に変換することによって定量化され、１０〜１５％の先体反応性は、異常な精子機能を示し得る。
先体反応
【００６５】
受精中に、精子は最初に原形質膜と融合し、次に雌の卵を受精させるために雌の卵に浸透する必要がある。精子細胞は、卵の硬い殻または細胞外マトリックスを貫通する前に、先体反応として知られているプロセスを受ける。先体反応は、精子が透明帯に結合した後に起こる細胞外プロセスであり、精子が卵母細胞の層（ｖｅｓｔｍｅｎｔ）に浸透し卵母細胞と融合できる前に起こる必要がある。先体は、精子の頭の前半分を覆うキャップ様構造である。精子が、先体反応を開始するために必要である卵の透明帯に近づくと、先体を取り巻く膜が精子の頭の原形質膜と融合し、先体の内容物を露出させる。内容物は、卵の細胞膜への結合に必要である表面抗原、および卵の頑強なコーティングを介して破壊しかつ受精の発生を可能にする多くの酵素を含む。例えば、先体の内容物は、ＩＺＵＭＯ１タンパク質またはその断片を含み得る。
バイオセンサ
【００６６】
精子機能を定量化するためのバイオセンサを提供することは、本開示の一態様であり、本バイオセンサは、基板と、ＪＵＮＯタンパク質またはその断片とを含み、ここで、ＪＵＮＯタンパク質またはその断片は、基板上に固定化される。
【００６７】
また、精子機能を検出するためのバイオセンサを提供することは、本開示のさらなる一態様であり、本バイオセンサは、基板と、ＪＵＮＯタンパク質またはその断片とを含み、ここで、ＪＵＮＯタンパク質またはその断片は、基板上に固定化される。
【００６８】
一実施形態では、本開示によるバイオセンサは、センサである。本開示のセンサまたはバイオセンサは、精子機能の検出かつ／または定量化のために構成される。
【００６９】
本明細書で使用される「バイオセンサ」は、「センサ」と呼ばれることもある。リガンド／受容体相互作用を検出するための様々なデバイスが公知である。これらの最も基本的なものは、検出可能な反応生成物を測定するかまたは定量化することによって分析物の存在または量を検出する純粋な化学的アッセイ／酵素的アッセイである。リガンド／受容体の相互作用は、放射性標識アッセイによって検出され、定量化されてもよい。
【００７０】
この種類の定量的結合アッセイは、２つの別個の構成部分：反応基板、例えば、固相試験ストリップ、ディッシュ、チップまたは電極、および別個の読み取り器または検出器、例えば、シンチレーションカウンタ、分光光度計、顕微鏡、または当技術分野で公知である他の検出器、を含む。基板は一般に、少量の体液サンプルからの複数の分析物アッセイを処理するための複数のアッセイまたは小型化には好適でない。
【００７１】
対照的に、バイオセンサでは、アッセイ基板および検出器表面を単一のデバイスへと一体化できる。１つの一般的な型のバイオセンサは、リガンド−受容体結合事象の存在に応答する電流またはインピーダンスの変化を検出するために、電流測定要素またはインピーダンス測定要素と組み合わせて電極表面を使用する。別の型のバイオセンサは、光学検出器と組み合わせて、例えば表面プラズモン共鳴と組み合わせて、チップ、例えばガラスチップを使用し得る。別の型のバイオセンサは、顕微鏡と組み合わせてディッシュを使用し得る。さらなる型のバイオセンサは、例えば、ラテックス凝集試験に好適である、光学的検出器または電気的検出器と組み合わせてマイクロビーズを使用し得る。さらに別の型のバイオセンサは、例えば横方向流動試験に好適である光学的検出器または電気的検出器と組み合わせて、セルロース紙またはニトロセルロース紙などのポリマー基板を使用し得る。
【００７２】
本明細書で使用される「ディッシュ」という用語は、ガラス、セラミック、プラスチック、セルロース、ニトロセルロースまたは他の任意の材料で作製された容器またはスライドを指し得、顕微鏡的または肉眼的光学的検出および選択を行うための基板として使用できる。例としては、スライドガラス、マイクロタイタプレート、マルチウェルプレート、ペトリディッシュ、ガラス時計皿などが挙げられる。ディッシュは、例えば、金の層でコーティングされた修飾され得る材料製であってもよい。
【００７３】
本明細書で使用される「マイクロビーズ」という用語は、１ｍｍ以下の直径を有する粒子を指す。マイクロビーズは、天然または合成の高分子材料で構成されてよい。マイクロビーズは、修飾可能な表面を有することを特徴とする材料から作製され得、例えば、金ナノ粒子などのナノ粒子、および／またはペプチドなどの分子に結合され得る表面を有し得る。
【００７４】
バイオセンサは、生物学的要素を含むセンサを指す。バイオセンサは、手間および費用を要し複雑でありかつｉｎ  ｓｉｔｕでの監視には適切でない可能性がある従来の分析技術の実質的な代替品である。バイオセンサは、生物学的要素を交換器と一体化する化学分析デバイスであり得る。このバイオセンサは、検出器にさらに搬送される単一の分析物に比例する信号を生成する交換器内のまたは交換器と密接に接触している生物学的要素を統合する。いくつかの実施形態では、分析物の結合から出力される信号は、顕微鏡検査によって可視化され得る。いくつかの実施形態では、分析物の結合から出力される信号は、光学検出器によって可視化され得る。
【００７５】
バイオセンサは、３つの基本的な構成部品、バイオ受容体（生物学的要素）、交換器、および電子回路を含む。生体受容体または生物学的要素は、酵素、ＤＮＡ、タンパク質、全細胞、抗体などのような、交換器に埋め込まれた生体分子である。本出願において、生体受容体は、ＪＵＮＯタンパク質であり得る。本開示のいくつかの実施形態では、バイオセンサは、２つ以上の種類のバイオ受容体を含み、例えば、一つの種類のバイオ受容体は、ＪＵＮＯタンパク質またはその断片であり得、別の種類のバイオ受容体は、ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３、および抗ＩＺＵＭＯ抗体からなる群から選択され得る。
【００７６】
本開示の方法に含まれる検出器は、表面プラズモン共鳴検出器、電気化学検出器、および測定回路などの光学検出器である。電子回路は、電気信号を処理可能な信号に変換する信号処理バイオセンサを含む。いくつかの実施形態では、検出器は顕微鏡であり得る。
【００７７】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）効果に基づくバイオセンサは、ＳＰＲインターフェースでの摂動（結合事象など）で発生するＳＰＲ表面反射角のシフトを活用する。最後に、バイオセンサはまた、バイオセンサ表面での光学特性の変化を利用し得る。
【００７８】
電気化学的バイオセンサは通常、電子を生成するかまたは消費する反応（レドックス酵素）の酵素触媒作用に基づく。センサ基板は通常、３つの電極（参照電極、作用電極、対極）を含む。標的分析物は、活性電極表面で起こる反応に関与し、この反応は、二重層を横切る電子移動を引き起こし（電流を生成する）得るか、または二重層電位に寄与する（電圧を生成する）可能性がある。電子の流量が固定電位での分析対象物の濃度に比例する電流を測定するか、ゼロ電流での電位を測定して対数応答を得ることができる。さらに、小さいペプチドおよびタンパク質の標識を使わない直接的な電気的検出が、生体機能化されたイオン感応性電界効果トランジスタを使用するそれらの固有電荷によって可能である。
【００７９】
ゼロ電流で電位が生成される電位差測定バイオセンサは、高いダイナミックレンジで対数応答を提供する。そうしたバイオセンサは多くの場合、導電性ポリマーでコーティングされたプラスチック基板上に電極パターンをスクリーン印刷し、次にタンパク質（酵素または抗体）を付着させることによって作製される。これらのセンサは、わずか２つの電極を有し、非常に高感度であり、かつ頑強である。これらは、以前はＨＰＬＣおよびＬＣ／ＭＳのみで達成可能であったレベルで、かつ厳密なサンプル前処理なく分析対象物の検出を可能にする。すべてのバイオセンサは通常、生物学的感知部品が関連する分析物に対して非常に選択的であるため、最小限のサンプル調製を伴う。信号は、センサの表面で発生する変化による導電性ポリマー層の電気化学的変化および物理的変化によって生成される。このような変化は、イオン強度、ｐＨ、水和、およびレドックス反応に起因し得る。ゲート領域が酵素または抗体で修飾されている電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）は、ＦＥＴのゲート領域への分析物の結合がドレインソース電流の変化を引き起こすため、非常に低濃度の様々な分析物を検出することもできる。
【００８０】
バイオセンサは、従来の結合アッセイを上回る複数の潜在的な利点を有する。重要な１つの利点は、マイクロチップ製造方法を使用して、小規模であるが再現性の高いバイオセンサユニットを製造できることである。
【００８１】
様々な種類のバイオセンサの多くの潜在的な用途がある。研究および商業的用途の観点から有益なバイオセンサアプローチの主な要件は、標的分子の同定、好適な生物学的認識要素の利用可能性、および状況によっては実験室ベースの高感度の技術よりも好ましい使い捨ての携帯型検出バイオセンサの可能性である。
【００８２】
一実施形態では、本開示によるバイオセンサは、透明帯１（ＺＰ１）、透明帯２（ＺＰ２）、透明帯３（ＺＰ３）、および／または抗ＩＺＵＭＯ抗体またはその断片をさらに含み、ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３、および／または抗ＩＺＵＭＯ抗体またはその断片は、基板上に固定化される。
【００８３】
一実施形態では、本開示によるバイオセンサは、タンパク質ＪＵＮＯおよびＺＰ３を含み、タンパク質は、基板上に固定化される。
【００８４】
一実施形態では、本開示によるバイオセンサは、タンパク質ＪＵＮＯおよびＺＰ２を含み、タンパク質は、基板上に固定化される。
【００８５】
一実施形態では、本開示によるバイオセンサは、タンパク質ＪＵＮＯおよびＺＰ１を含み、タンパク質は、基板上に固定化される。
【００８６】
一実施形態では、本開示によるバイオセンサは、タンパク質ＪＵＮＯおよび抗ＩＺＵＭＯ抗体を含み、タンパク質は、基板上に固定化される。
【００８７】
一実施形態では、本開示によるバイオセンサは、タンパク質ＪＵＮＯ、ＺＰ２およびＺＰ３を含み、タンパク質は、基板上に固定化される。
【００８８】
ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３および抗ＩＺＵＭＯ抗体の１つ以上と組み合わせたＪＵＮＯの存在は、バイオセンサの特異性を改善し得、分析された精液サンプルおよび／または分析された精子サンプルの精子機能のより正確な決定を可能にし得る。例えば、ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３、および抗ＩＺＵＭＯ抗体の１つ以上と組み合わせたＪＵＮＯの存在は、透明帯タンパク質に結合し、先体反応を受け、卵母細胞に結合する精子の能力のより正確な決定を可能にし得る。
【００８９】
一実施形態では、基板に固定化され得るタンパク質ＪＵＮＯ、ＺＰ１、ＺＰ２およびＺＰ３は、哺乳動物タンパク質である。例えば、タンパク質ＪＵＮＯ、ＺＰ１、ＺＰ２およびＺＰ３は、ヒトタンパク質またはその断片であり得る。例えば、タンパク質ＪＵＮＯ、ＺＰ１、ＺＰ２およびＺＰ３は、ウマタンパク質またはその断片であり得る。例えば、タンパク質ＪＵＮＯ、ＺＰ１、ＺＰ２およびＺＰ３は、イヌタンパク質またはその断片であり得る。例えば、タンパク質ＪＵＮＯ、ＺＰ１、ＺＰ２およびＺＰ３は、ウシタンパク質またはその断片であり得る。
【００９０】
さらなる実施形態では、本開示によるバイオセンサは、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性など、少なくとも９７％の配列同一性など、少なくとも９８％の配列同一性など、少なくとも９９％の配列同一性エンティティなど、約１００％の配列同一性などを有するポリペプチド、またはそのオルソログ、またはタンパク質の断片を含むかまたはそれらからなるＪＵＮＯタンパク質を含む。
【００９１】
一実施形態では、本開示によるバイオセンサが提供され、ＺＰ１は、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性など、少なくとも９７％の配列同一性など、少なくとも９８％の配列同一性など、少なくとも９９％の配列同一性エンティティなど、約１００％の配列同一性などを有するポリペプチド、またはそのオルソログ、またはタンパク質の断片を含むか、またはそれらからなる。
【００９２】
さらなる実施形態では、本開示によるバイオセンサが提供され、ＺＰ２は、配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性など、少なくとも９７％の配列同一性など、少なくとも９８％の配列同一性など、少なくとも９９％の配列同一性エンティティなど、約１００％の配列同一性などを有するポリペプチド、またはそのオルソログ、またはタンパク質の断片を含むか、またはそれらからなる。
【００９３】
さらなる実施形態では、本開示によるバイオセンサが提供され、ＺＰ３は、配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性など、少なくとも９７％の配列同一性など、少なくとも９８％の配列同一性など、少なくとも９９％の配列同一性エンティティなど、約１００％の配列同一性などを有するポリペプチド、またはそのオルソログ、またはタンパク質の断片を含むか、またはそれらからなる。
【００９４】
いくつかの実施形態では、ＪＵＮＯタンパク質、ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３、および抗ＩＺＵＭＯ抗体の少なくとも１つは、追加の部分に結合される。例えば、追加の部分は、ペプチドまたは標識であり得る。例えば、ＪＵＮＯタンパク質、ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３、および抗ＩＺＵＭＯ抗体の少なくとも１つは、ポリヒスチジンタグに結合される。
【００９５】
いくつかの実施形態では、本開示によるバイオセンサが提供され、基板は、マイクロビーズ、ディッシュ、チップ、または電極である。
【００９６】
一実施形態では、基板はポリマーマイクロビーズである。例えば、基板は、アガロースマイクロビーズ、セルロースマイクロビーズ、ニトロセルロースマイクロビーズ、またはラテックスマイクロビーズであり得る。いくつかの実施形態では、マイクロビーズは、顕微鏡、光変換器、または測定回路に連結できるように構成される。
【００９７】
一実施形態では、基板は、プラスチックディッシュ、セラミックディッシュ、またはガラスディッシュなどのディッシュである。さらなる実施形態では、ディッシュは、顕微鏡または光変換器に連結できるように構成される。
【００９８】
いくつかの実施形態では、チップはガラスチップである。
【００９９】
本明細書で使用される「ガラス」という用語は、石英またはシリカと同等であり、ＳｉＯ２の化学式全体を有する連続フレームワーク中にシリコンおよび酸素原子を含む。
【０１００】
特定の実施形態では、電極は、炭素、金、または白金の電極である。一実施形態では、電極はスクリーン印刷された電極である。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、基板は修飾された表面を有する。一実施形態では、基板の少なくとも１つの表面は、金の層でコーティングされる。いくつかの実施形態では、基板の少なくとも１つの表面は、金、銀、酸化銅、グラフェン、酸化鉄、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるナノ粒子で修飾される。
【０１０２】
特定の実施形態では、本開示によるバイオセンサは、基板が顕微鏡、電気化学ワークステーション、表面プラズモン共鳴検出器、測定回路または光変換器に連結され得るように構成される。
【０１０３】
一実施形態では、基板は電極であり、電気化学ワークステーションまたは測定回路に連結できるように構成される。
【０１０４】
一実施形態では、基板はチップであり、表面プラズモン共鳴検出器に連結できるように構成される。
タンパク質の固定化
【０１０５】
本開示は、バイオセンサに関する。
【０１０６】
精子機能の検出および定量化のために、本バイオセンサは、基板と、基板上に固定化されたタンパク質ＪＵＮＯまたはその断片とを含む。
【０１０７】
センサの表面（金属、ポリマー、ガラスなど）上の目的のタンパク質などの生物学的要素の固定化は、バイオセンサの設計において必要かつ重要なステップである。使用される基板に応じて異なる固定化技術が存在し、これらの技術は当業者に知られている。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本開示によるバイオセンサが提供され、ＪＵＮＯタンパク質、ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３、および抗ＩＺＵＭＯ抗体の少なくとも１つが追加の部分に結合される。いくつかの実施形態では、追加の部分はペプチドである。一実施形態では、追加の部分は標識である。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、追加の部分は、ペプチド、例えば、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）である。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、追加の部分は、蛍光タグまたはプローブとも呼ばれる、標識である。
【０１１１】
ポリヒスチジンタグは、金属表面上などの表面上の、例えば金、ニッケル、またはコバルトでコーティングされたマイクロタイタプレートまたはタンパク質アレイ上のタンパク質の固定化にうまく使用され得る。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、本開示によるバイオセンサが提供され、ＪＵＮＯタンパク質、ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３および／または抗ＩＺＵＭＯ抗体が基板上に固定化される。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、本開示によるバイオセンサが提供され、ＪＵＮＯタンパク質、ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３および／または抗ＩＺＵＭＯ抗体が、ナノ粒子を介して、例えば金ナノ粒子を介して基板上に固定化される。基板とタンパク質との間のナノ粒子の存在は、それがタンパク質のアンフォールディングを防ぎ、タンパク質が正しいコンフォメーションに留まるのを補助するため、有利である。
方法
【０１１４】
本明細書に開示されるバイオセンサなどの、ＪＵＮＯタンパク質を含むバイオセンサを製造するための方法を提供することは、本開示の一態様であり、この方法は、
ａ．基板を提供するステップと、
ｂ．ＪＵＮＯタンパク質を提供することと、
ｃ．ＪＵＮＯタンパク質を基板に固定すること、
を含み、それにより、ＪＵＮＯタンパク質を含むバイオセンサを製造する。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、バイオセンサを製造するための方法は、ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３および抗ＩＺＵＭＯ抗体の１つ以上を基板上に固定化することをさらに含む。
【０１１６】
精子を選択する方法を提供することは、本開示のさらなる態様であり、この方法は、
ａ．対象からの精液サンプルを提供することと、
ｂ．精液サンプルを本開示によるバイオセンサと接触させることと、
ｃ．顕微鏡によってバイオセンサに結合した精子を可視化することと、
ｄ．バイオセンサに結合した精子を選択すること、
を含む。
【０１１７】
精子を選択する方法を提供することは、本開示のさらなる態様であり、この方法は、
ａ．対象からの精子サンプルを提供することと、
ｂ．精子サンプルを本開示によるバイオセンサと接触させることと、
ｃ．顕微鏡によってバイオセンサに結合した精子を可視化することと、
ｄ．バイオセンサに結合した精子を選択すること
を含む。
【０１１８】
本開示の方法による一実施形態では、精液サンプルは、１つ以上の精子細胞を含むかまたは含むことが疑われる。
ホームデバイス
【０１１９】
精子機能の検出かつ／または定量化のためのハンドヘルドデバイスを提供することもまた、本開示の一態様であり、本デバイスは、
ａ．サンプル用の注入口と、
ｂ．ＪＵＮＯタンパク質またはその断片を含むバイオセンサであって、ＪＵＮＯタンパク質がバイオセンサ上に固定化され、かつ注入口が、サンプルをセンサと接触させるように構成される、バイオセンサと、
ｃ．センサから信号を受信し、その信号をユーザが読み取り可能な形式に変換するように構成される検出器と、
ｄ．任意により、細胞成分をサンプルから分離するための手段、
を含む。
【０１２０】
特定の実施形態では、本開示によるハンドヘルドデバイスは、本開示の実施形態のいずれか１つで画定されるバイオセンサを含む。
対象
【０１２１】
対象がヒト対象である、本開示による方法を提供することは、本開示の一態様である。特定の実施形態では、ヒト対象は小児または成人である。
【０１２２】
本開示による方法のさらなる実施形態では、対象は哺乳動物である。本開示による方法のさらなる実施形態では、対象は、ウマ、ウシ、バッファロ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ネコまたはイヌである。
【０１２３】
本開示のいくつかの実施形態では、対象はウマであり、バイオセンサは、基板上に固定化されたＪＵＮＯタンパク質またはその断片を含み、ＪＵＮＯタンパク質は、配列番号６のウマのＪＵＮＯタンパク質に対して少なくとも９５％の配列同一性、配列番号６のウマＪＵＮＯタンパク質に対して少なくとも９６％の配列同一性など、少なくとも９７％の配列同一性など、少なくとも９８％の配列同一性など、少なくとも９８％の配列同一性など、少なくとも９９％の配列同一性など、約１００％の配列同一性などを有する配列を有する。
【０１２４】
本開示のいくつかの実施形態では、対象はイヌであり、バイオセンサは、基板上に固定化されたＪＵＮＯタンパク質またはその断片を含み、ＪＵＮＯタンパク質は、イヌのＪＵＮＯタンパク質である。
【０１２５】
本開示のいくつかの実施形態では、対象はウシであり、バイオセンサは、基板上に固定化されたＪＵＮＯタンパク質またはその断片を含み、ＪＵＮＯタンパク質は、ウシのＪＵＮＯタンパク質である。
サンプル
【０１２６】
本開示による方法の特定の実施形態では、サンプルは精液サンプルであり、任意により、サンプルは分析の前に処理されている。
【０１２７】
本開示による方法の特定の実施形態では、サンプルは精子サンプルであり、任意により、サンプルは分析の前に処理されている。
【０１２８】
本開示の方法による一実施形態では、精液サンプルおよび／または精子サンプルは、１つ以上の精子細胞を含むかまたは含むことが疑われる。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、精液サンプルは分析の前に処理され、この処理は、精子を液化することを含む。
【０１３０】
本明細書では、精液サンプルは、精子サンプルおよび精液（ｓｅｍｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ）と同義的に使用され得る。精液サンプルおよび／または精子サンプルは、本明細書では、精子（ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ）を含み得る精液のサンプルとして定義される。精液サンプルはさらに、本開示の特定の実施形態において、精液／精子サンプルの希釈などの処理に好適な溶媒、培地、バッファおよび／または流体を使用することによって、処理（希釈など）されてよい。
【０１３１】
精液は、雄または雌雄同体の動物の生殖腺（性腺）および他の性器から分泌され、雌の卵子を受精させることができる。ヒトの場合、精液は精子に加えていくつかの構成成分を含む。タンパク質分解酵素および他の酵素、ならびにフルクトースは、精液の構成要素であり、精子の生存を促進し、それを通じて精子が移動するまたは「泳ぐ」ことができる媒体を提供する。精液は、骨盤内に存在する精嚢から生成され、発生する。
本明細書で使用されている「精子」という用語は、雄の生殖細胞を指し、「精子細胞」の同義語である。運動性のある単鞭毛精子細胞は精子と呼ばれ、運動性のない精子細胞は不動精子と呼ばれる。本開示において、「精子（ｓｐｅｒｍ）」および「精子（ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ）」という用語は同義的に使用される。
検出技術
【０１３２】
本開示による方法のいくつかの実施形態では、精子機能は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して検出される。特定の実施形態では、表面プラズモン共鳴の読み出しを使用して、甲状腺ホルモンの１つ以上の濃度を決定する。
【０１３３】
表面プラズモン共鳴は、入射光によって刺激された負および正の誘電率材料間の界面での伝導電子の共鳴振動である。ＳＰＲは、平面金属（金もしくは銀など）の表面上へのまたは金属ナノ粒子の表面上への材料の吸着を測定するための多くの標準ツールの基礎である。これは、多くのカラーベースのバイオセンサアプリケーション、様々なセンサ、珪藻光合成の背後にある基本原理である。ＳＰＲは、生体分子結合相互作用を検出するために使用され得る。ＳＰＲでは、タンパク質などの１つの分子パートナが金属膜上に固定化される。光は、金属の表面プラズモンを励起し、固定化された分子に結合パートナが結合するときに、これは表面プラズモンシグナルの検出可能な変化を引き起こす。
【０１３４】
本開示による方法のいくつかの実施形態では、精子機能は、電気化学的変換によって検出されるかまたは定量化される。
【０１３５】
電気化学的変換を利用するバイオセンサとも呼ばれる電気化学的バイオセンサは、電子信号への生物学的事象の直接変換のため、生物学的サンプルの内容物を分析するための魅力的な手段を提供する。電気化学的バイオセンシングの最も一般的な技術は、サイクリックボルタンメトリ、クロノアンペロメトリ、クロノポテンシオメトリ、インピーダンス分光法、および電界効果トランジスタベースの方法、ならびにナノワイヤまたは磁性ナノ粒子ベースのバイオセンシングを含む。電気化学的検出と組み合わせて有用な追加の測定技術は、表面プラズモン共鳴、光導波路光モード分光法、エリプソメトリ、水晶振動子微量天秤、および走査型プローブ顕微鏡法の電気化学的型をさらに含み得る。
雄不妊
【０１３６】
雄不妊とは、雄が受精能のある雌に妊娠を引き起こすことができないことを指す。ヒトでは、それは不妊の４０〜５０％を占める。それは、全男性の約７％に影響を及ぼす。男性不妊は一般的に精液における欠陥が原因であり、精液の質は男性の生殖能力の代理測定として使用される。
【０１３７】
雄不妊は、雄の個体が受精能のある雌の個体に妊娠を引き起こすことができないものとして定義される。雄不妊の原因は、機能しない精子の生成であり得る。
【０１３８】
雄不妊の診断は、一連の機能検査に、例えば、本明細書に開示される精子機能検査のいずれか１つに基づいてよい。これらの検査は、当業者に公知であるガイドライン、例えば、ＷＨＯ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｍｅｎ、ＷＨＯ、第５版、２０１０、ＩＳＢＮ  ９７８  ９２  ４  １５４７７８  ９（特に第４章を参照）に従って評価され得る。
配列
配列番号１：ＪＵＮＯ＿ヒト精子−卵融合タンパク質Ｊｕｎｏ
ＭＡＣＷＷＰＬＬＬＥＬＷＴＶＭＰＴＷＡＧＤＥＬＬＮＩＣＭＮＡＫＨＨＫＲＶＰＳＰＥＤＫＬＹＥＥＣＩＰＷＫＤＮＡＣＣＴＬＴＴＳＷＥＡＨＬＤＶＳＰＬＹＮＦＳＬＦＨＣＧＬＬＭＰＧＣＲＫＨＦＩＱＡＩＣＦＹＥＣＳＰＮＬＧＰＷＩＱＰＶＧＳＬＧＷＥＶＡＰＳＧＱＧＥＲＶＶＮＶＰＬＣＱＥＤＣＥＥＷＷＥＤＣＲＭＳＹＴＣＫＳＮＷＲＧＧＷＤＷＳＱＧＫＮＲＣＰＫＧＡＱＣＬＰＦＳＨＹＦＰＴＰＡＤＬＣＥＫＴＷＳＮＳＦＫＡＳＰＥＲＲＮＳＧＲＣＬＱＫＷＦＥＰＡＱＧＮＰＮＶＡＶＡＲＬＦＡＳＳＡＰＳＷＥＬＳＹＴＩＭＶＣＳＬＦＬＰＦＬＳ
配列番号２：ＺＰ１＿ヒト透明帯精子−結合タンパク質１
ＭＡＧＧＳＡＴＴＷＧＹＰＶＡＬＬＬＬＶＡＴＬＧＬＧＲＷＬＱＰＤＰＧＬＰＧＬＲＨＳＹＤＣＧＩＫＧＭＱＬＬＶＦＰＲＰＧＱＴＬＲＦＫＶＶＤＥＦＧＮＲＦＤＶＮＮＣＳＩＣＹＨＷＶＴＳＲＰＱＥＰＡＶＦＳＡＤＹＲＧＣＨＶＬＥＫＤＧＲＦＨＬＲＶＦＭＥＡＶＬＰＮＧＲＶＤＶＡＱＤＡＴＬＩＣＰＫＰＤＰＳＲＴＬＤＳＱＬＡＰＰＡＭＦＳＶＳＴＰＱＴＬＳＦＬＰＴＳＧＨＴＳＱＧＳＧＨＡＦＰＳＰＬＤＰＧＨＳＳＶＨＰＴＰＡＬＰＳＰＧＰＧＰＴＬＡＴＬＡＱＰＨＷＧＴＬＥＨＷＤＶＮＫＲＤＹＩＧＴＨＬＳＱＥＱＣＱＶＡＳＧＨＬＰＣＩＶＲＲＴＳＫＥＡＣＱＱＡＧＣＣＹＤＮＴＲＥＶＰＣＹＹＧＮＴＡＴＶＱＣＦＲＤＧＹＦＶＬＶＶＳＱＥＭＡＬＴＨＲＩＴＬＡＮＩＨＬＡＹＡＰＴＳＣＳＰＴＱＨＴＥＡＦＶＶＦＹＦＰＬＴＨＣＧＴＴＭＱＶＡＧＤＱＬＩＹＥＮＷＬＶＳＧＩＨＩＱＫＧＰＱＧＳＩＴＲＤＳＴＦＱＬＨＶＲＣＶＦＮＡＳＤＦＬＰＩＱＡＳＩＦＰＰＰＳＰＡＰＭＴＱＰＧＰＬＲＬＥＬＲＩＡＫＤＥＴＦＳＳＹＹＧＥＤＤＹＰＩＶＲＬＬＲＥＰＶＨＶＥＶＲＬＬＱＲＴＤＰＮＬＶＬＬＬＨＱＣＷＧＡＰＳＡＮＰＦＱＱＰＱＷＰＩＬＳＤＧＣＰＦＫＧＤＳＹＲＴＱＭＶＡＬＤＧＡＴＰＦＱＳＨＹＱＲＦＴＶＡＴＦＡＬＬＤＳＧＳＱＲＡＬＲＧＬＶＹＬＦＣＳＴＳＡＣＨＴＳＧＬＥＴＣＳＴＡＣＳＴＧＴＴＲＱＲＲＳＳＧＨＲＮＤＴＡＲＰＱＤＩＶＳＳＰＧＰＶＧＦＥＤＳＹＧＱＥＰＴＬＧＰＴＤＳＮＧＮＳＳＬＲＰＬＬＷＡＶＬＬＬＰＡＶＡＬＶＬＧＦＧＶＦＶＧＬＳＱＴＷＡＱＫＬＷＥＳＮＲＱ
配列番号３：ＺＰ２＿ヒト透明帯精子−結合タンパク質２
ＭＡＣＲＱＲＧＧＳＷＳＰＳＧＷＦＮＡＧＷＳＴＹＲＳＩＳＬＦＦＡＬＶＴＳＧＮＳＩＤＶＳＱＬＶＮＰＡＦＰＧＴＶＴＣＤＥＲＥＩＴＶＥＦＰＳＳＰＧＴＫＫＷＨＡＳＶＶＤＰＬＧＬＤＭＰＮＣＴＹＩＬＤＰＥＫＬＴＬＲＡＴＹＤＮＣＴＲＲＶＨＧＧＨＱＭＴＩＲＶＭＮＮＳＡＡＬＲＨＧＡＶＭＹＱＦＦＣＰＡＭＱＶＥＥＴＱＧＬＳＡＳＴＩＣＱＫＤＦＭＳＦＳＬＰＲＶＦＳＧＬＡＤＤＳＫＧＴＫＶＱＭＧＷＳＩＥＶＧＤＧＡＲＡＫＴＬＴＬＰＥＡＭＫＥＧＦＳＬＬＩＤＮＨＲＭＴＦＨＶＰＦＮＡＴＧＶＴＨＹＶＱＧＮＳＨＬＹＭＶＳＬＫＬＴＦＩＳＰＧＱＫＶＩＦＳＳＱＡＩＣＡＰＤＰＶＴＣＮＡＴＨＭＴＬＴＩＰＥＦＰＧＫＬＫＳＶＳＦＥＮＱＮＩＤＶＳＱＬＨＤＮＧＩＤＬＥＡＴＮＧＭＫＬＨＦＳＫＴＬＬＫＴＫＬＳＥＫＣＬＬＨＱＦＹＬＡＳＬＫＬＴＦＬＬＲＰＥＴＶＳＭＶＩＹＰＥＣＬＣＥＳＰＶＳＩＶＴＧＥＬＣＴＱＤＧＦＭＤＶＥＶＹＳＹＱＴＱＰＡＬＤＬＧＴＬＲＶＧＮＳＳＣＱＰＶＦＥＡＱＳＱＧＬＶＲＦＨＩＰＬＮＧＣＧＴＲＹＫＦＥＤＤＫＶＶＹＥＮＥＩＨＡＬＷＴＤＦＰＰＳＫＩＳＲＤＳＥＦＲＭＴＶＫＣＳＹＳＲＮＤＭＬＬＮＩＮＶＥＳＬＴＰＰＶＡＳＶＫＬＧＰＦＴＬＩＬＱＳＹＰＤＮＳＹＱＱＰＹＧＥＮＥＹＰＬＶＲＦＬＲＱＰＩＹＭＥＶＲＶＬＮＲＤＤＰＮＩＫＬＶＬＤＤＣＷＡＴＳＴＭＤＰＤＳＦＰＱＷＮＶＶＶＤＧＣＡＹＤＬＤＮＹＱＴＴＦＨＰＶＧＳＳＶＴＨＰＤＨＹＱＲＦＤＭＫＡＦＡＦＶＳＥＡＨＶＬＳＳＬＶＹＦＨＣＳＡＬＩＣＮＲＬＳＰＤＳＰＬＣＳＶＴＣＰＶＳＳＲＨＲＲＡＴＧＡＴＥＡＥＫＭＴＶＳＬＰＧＰＩＬＬＬＳＤＤＳＳＦＲＧＶＧＳＳＤＬＫＡＳＧＳＳＧＥＫＳＲＳＥＴＧＥＥＶＧＳＲＧＡＭＤＴＫＧＨＫＴＡＧＤＶＧＳＫＡＶＡＡＶＡＡＦＡＧＶＶＡＴＬＧＦＩＹＹＬＹＥＫＲＴＶＳＮＨ
配列番号４：ＺＰ３＿ヒト透明帯精子−結合タンパク質３
ＭＥＬＳＹＲＬＦＩＣＬＬＬＷＧＳＴＥＬＣＹＰＱＰＬＷＬＬＱＧＧＡＳＨＰＥＴＳＶＱＰＶＬＶＥＣＱＥＡＴＬＭＶＭＶＳＫＤＬＦＧＴＧＫＬＩＲＡＡＤＬＴＬＧＰＥＡＣＥＰＬＶＳＭＤＴＥＤＶＶＲＦＥＶＧＬＨＥＣＧＮＳＭＱＶＴＤＤＡＬＶＹＳＴＦＬＬＨＤＰＲＰＶＧＮＬＳＩＶＲＴＮＲＡＥＩＰＩＥＣＲＹＰＲＱＧＮＶＳＳＱＡＩＬＰＴＷＬＰＦＲＴＴＶＦＳＥＥＫＬＴＦＳＬＲＬＭＥＥＮＷＮＡＥＫＲＳＰＴＦＨＬＧＤＡＡＨＬＱＡＥＩＨＴＧＳＨＶＰＬＲＬＦＶＤＨＣＶＡＴＰＴＰＤＱＮＡＳＰＹＨＴＩＶＤＦＨＧＣＬＶＤＧＬＴＤＡＳＳＡＦＫＶＰＲＰＧＰＤＴＬＱＦＴＶＤＶＦＨＦＡＮＤＳＲＮＭＩＹＩＴＣＨＬＫＶＴＬＡＥＱＤＰＤＥＬＮＫＡＣＳＦＳＫＰＳＮＳＷＦＰＶＥＧＳＡＤＩＣＱＣＣＮＫＧＤＣＧＴＰＳＨＳＲＲＱＰＨＶＭＳＱＷＳＲＳＡＳＲＮＲＲＨＶＴＥＥＡＤＶＴＶＧＰＬＩＦＬＤＲＲＧＤＨＥＶＥＱＷＡＬＰＳＤＴＳＶＶＬＬＧＶＧＬＡＶＶＶＳＬＴＬＴＡＶＩＬＶＬＴＲＲＣＲＴＡＳＨＰＶＳＡＳＥ
配列番号５：ＩＺＵＭＯ１＿ヒトＩｚｕｍｏ精子−卵融合タンパク質１
ＭＧＰＨＦＴＬＬＣＡＡＬＡＧＣＬＬＰＡＥＧＣＶＩＣＤＰＳＶＶＬＡＬＫＳＬＥＫＤＹＬＰＧＨＬＤＡＫＨＨＫＡＭＭＥＲＶＥＮＡＶＫＤＦＱＥＬＳＬＮＥＤＡＹＭＧＶＶＤＥＡＴＬＱＫＧＳＷＳＬＬＫＤＬＫＲＩＴＤＳＤＶＫＧＤＬＦＶＫＥＬＦＷＭＬＨＬＱＫＥＴＦＡＴＹＶＡＲＦＱＫＥＡＹＣＰＮＫＣＧＶＭＬＱＴＬＩＷＣＫＮＣＫＫＥＶＨＡＣＲＫＳＹＤＣＧＥＲＮＶＥＶＰＱＭＥＤＭＩＬＤＣＥＬＮＷＨＱＡＳＥＧＬＴＤＹＳＦＹＲＶＷＧＮＮＴＥＴＬＶＳＫＧＫＥＡＴＬＴＫＰＭＶＧＰＥＤＡＧＳＹＲＣＥＬＧＳＶＮＳＳＰＡＴＩＩＮＦＨＶＴＶＬＰＫＭＩＫＥＥＫＰＳＰＮＩＶＴＰＧＥＡＴＴＥＳＳＩＳＬＱＰＬＱＰＥＫＭＬＡＳＲＬＬＧＬＬＩＣＧＳＬＡＬＩＴＧＬＴＦＡＩＦＲＲＲＫＶＩＤＦＩＫＳＳＬＦＧＬＧＳＧＡＡＥＱＴＱＶＰＫＥＫＡＴＤＳＲＱＱ
実施例
実施例１サイクリックボルタンメトリを使用する精子結合用の電気化学的バイオセンサ
【０１３９】
バイオセンサを、スクリーン印刷した金電極上に製造した。簡潔に説明すると、１０μＬの２ｍｇ／ｍＬシステアミン塩酸塩を金電極に加え、室温暗所で乾燥させた。電極を脱イオン水で洗浄した後、１０μＬのクエン酸塩でキャップした金ナノ粒子で修飾した。乾燥させ、脱イオン水で洗浄した後、１０μＬの５０ｍＭニトリロ三酢酸を添加し、室温で一晩インキュベートした。この後、ｐＨ７．４の０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水中の１％ウシ血清アルブミンでブロッキングした。１０μＬの１０ｍＭ硫酸ニッケルを添加し、室温で２時間インキュベートした。ｐＨ７．４の０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水で電極を洗浄した後、ポリヒスチジンタグを含む０．５μｇのＪＵＮＯまたはＺＰ３をバイオセンサ上に固定化した。
【０１４０】
精液サンプルを、標準手順に従って液化させ、精液調製培地において様々な希釈液に希釈した（＃１０７０／１０６９、Ｏｒｉｇｉｏ  Ａ／Ｓ  Ｄｅｎｍａｒｋ、ｈｔｔｐｓ：／／ｏｒｉｇｉｏ．ｍａｒｋｅｔｐｏｒｔ．ｎｅｔ／ＭａｒｋｅｔｉｎｇＺｏｎｅ／ＭＺＤｉｒｅｃｔ／Ｓｏｕｒｃｅ／５１０ｅ９６ｆ４−０７５ｂ−４６８４−９ａ９９−ｄ４７２ｃ１ｅ３ｄ３１ｂ）。バイオセンサを電気化学ステーションに接続し、希釈した精液サンプルをバイオセンサに添加し、固定化されたタンパク質と精液サンプル中に存在する精子との間の相互作用のサイクリックボルタンメトリ応答を記録した。
【０１４１】
結果を図１〜図３に示す。図１は、ａ）バッファのみ添加後（実線）およびバッファで１．６７ｘ１０−２倍に希釈した精液サンプルの添加後（点線）の電極−金ナノ粒子−ＢＳＡブロッキング、ｂ）電極−金ナノ粒子−ＪＵＮＯ−ＢＳＡブロッキング（二点鎖線）、およびｃ）バッファで１．６７ｘ１０−２倍に希釈した精液サンプルを添加した後の電極−金ナノ粒子−ＺＰ３−ＢＳＡブロッキング応答（破線）、のサイクリックボルタンメトリ応答を示す。希釈係数は、初期容量／最終容量による。
【０１４２】
図２は、電極−金ナノ粒子−６つの異なる精液サンプル（図２Ａ〜Ｆ）の３つの異なる希釈液（１．５６ｘ１０−５倍（点線）、１．６７ｘ１０−２倍（二点鎖線）、および２．５ｘ１０−２倍（破線））を添加後のＺＰ３−ＢＳＡブロッキングのサイクリックボルタンメトリ応答を示す。実線はバッファのみ（精液サンプルなし）での電極応答を示す。
【０１４３】
図３は、精液サンプルＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５およびＳ６（それぞれ図３Ａ〜Ｆ）の３つの異なる希釈液（１．５６ｘ１０−５倍（点線）、１．６７ｘ１０ー２倍（一点鎖線）および２．５ｘ１０−２倍（破線））の添加後の電極−金ナノ粒子−ＪＵＮＯ−ＢＳＡブロッキング、のサイクリックボルタンメトリ応答を示す。実線はバッファのみ（精液サンプルなし）での電極応答を示す。
結論：
【０１４４】
図１に示すとおり、精子は、ＪＵＮＯまたはＺＰ３が固定化されていないバイオセンサには結合しない。ＪＵＮＯまたはＺＰ３の存在下では、サイクリックボルタンメトリ曲線の明確な還元および／または酸化ピークから明らかなように、精子はバイオセンサと相互作用する。さらに、結合はサイクリックボルタンメトリを使用して定量化可能である。ＺＰ３−精子およびＪＵＮＯ−精子の双方の相互作用で、還元および酸化のピークは、それぞれ図２および図３に示すように、ＺＰ３およびＪＵＮＯとの結合に利用できる精子の数と一致する傾向でシフトする。さらに、信号は陰性対照についてゼロとゼロ以外の精子濃度の間で変化しないままなので、すなわち結合タンパク質の非存在下では（図１）、プローブされた相互作用はタンパク質特異的である。
実施例２電気インピーダンス分光法を使用して分析される精子結合のための電気化学的バイオセンサ
【０１４５】
スクリーン印刷した金電極を、１０μｌの２ｍｇ／ｍｌシステアミン塩酸塩（ＣｙＨＣｌ）を介して機能化し、室温暗所で２〜４時間インキュベートする。電極を脱イオン水で洗浄した後、５μｌのＡｓｎ−ＡｕＮＰを機能化電極に分注する。電極を室温で５時間インキュベートした後、脱イオン水で洗浄する。さらに、５μｌのＰＢ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）中のＪＵＮＯ  １６０μｇ／ｍｌおよびＺＰ３  １６０μｇ／ｍｌの５μｌを添加し、４℃で一晩インキュベートする。最後に、電極を４℃で５時間、１０μｌのＰＢＳ中の１％ＢＳＡでブロックする。
【０１４６】
修飾された電極を、電気化学ワークステーションに接続する。
【０１４７】
５〜５０μＬの前処理された精液サンプルを、作用電極に添加するか、または電極をサンプルバイアルに浸漬する。精子細胞を修飾電極に１〜１０分間結合させた後、脱イオン水で洗浄する。結合を、好適な濃度のレドックス媒体の存在下で電気インピーダンス分光法を介して分析する。
【０１４８】
同様の実験を、ＪＵＮＯのみ、ＺＰ２、およびＺＰ２、ＺＰ３、ＪＵＮＯの組み合わせを使用して実施する。
【０１４９】
本実施例および以下のすべての実施例について、精液サンプルを、次の手順に従って、分析する前に前処理（液化）する：
−実験室または診療所で収集された精液サンプルを、室温または３７℃のインキュベータ中で１５〜６０分間液化させる。これを穏やかな回転または撹拌によって支援して、不均質に液化される精液サンプルを防ぎ得る。
−この液化精液サンプルを、好適な精液調製培地で洗浄、再構成、または希釈し得る。
結論：
【０１５０】
ＪＵＮＯ、またはＪＵＮＯとＺＰ２およびＺＰ３のいずれか１つとの組み合わせ、またはそれらの組み合わせにより機能化されかつ修飾されたスクリーン印刷された金電極を含むセンサを使用して、電気化学ワークステーションを介して精子機能を検出し、かつ定量化することができる。
実施例３先体反応のための電気化学的バイオセンサ
【０１５１】
スクリーン印刷された金電極を、１０μｌの２ｍｇ／ｍｌシステアミン塩酸塩（ＣｙＨＣｌ）を介して機能化し、室温暗所で２〜４時間インキュベートする。電極を脱イオン水で洗浄した後、５μｌのＡｓｎ−ＡｕＮＰを機能化電極に分注する。次いで、電極を室温で５時間インキュベートした後、脱イオン水で洗浄する。さらに、５μｌのＰＢ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）中のＪＵＮＯ  １６０μｇ／ｍｌおよびＺＰ３  １６０μｇ／ｍｌの５μｌを添加し、４℃で一晩インキュベートする。最後に、電極を４℃で５時間、１０μｌのＰＢＳ中の１％ＢＳＡでブロックする。
【０１５２】
修飾された電極を、電気化学ワークステーションに接続する。
５〜５０μＬの前処理された精液サンプルを、作用電極に添加するか、または電極をサンプルバイアルに浸漬する。結合を電気インピーダンス分光法または電流測定によって電気化学的に分析する間、精子細胞を、修飾された電極に結合させる。
【０１５３】
同様の実験を、ＺＰ２およびＪＵＮＯ、ＺＰ３、ＺＰ２の組み合わせを使用して実施する。
結論：
【０１５４】
ＪＵＮＯ、またはＪＵＮＯとＺＰ２およびＺＰ３のいずれか１つとの組み合わせ、またはそれらの組み合わせにより機能化されかつ修飾されたスクリーン印刷された金電極を含むセンサを使用して、電気化学ワークステーションを介して精子機能を検出し、かつ定量化することができる。
実施例４表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による精子機能の検出／定量化
【０１５５】
ＳＰＲチップを、ＺＰ２、ＺＰ３、およびＪＵＮＯのいずれか１つ、またはそれらの組み合わせで化学的に機能化し、かつ修飾する。次に、チップを脱イオン水で洗浄し、コーティングされていない領域をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックする。チップを、ＳＰＲ検出器と組み合わせて使用する。前処理された精液サンプルを、チップの表面に流す。タンパク質コートと精子細胞との間の相互作用を、結合速度論および親和性の観点から質量変化として分析する。これにより、精子機能を検出し、定量化する。
結論：
【０１５６】
ＳＰＲチップを含むセンサは、ＺＰ２、ＺＰ３、ＪＵＮＯのいずれか１つ、またはそれらの組み合わせで化学的に機能化されかつ修飾され、ＳＰＲ検出器を介して精子機能を検出し、定量化するために使用され得る。
実施例５光交換器による精子結合の検出／定量化
【０１５７】
ガラスディッシュの全体または一部を、最初にＡｕＮＰにより化学的に機能化し、次にＺＰ２、ＺＰ３、ＪＵＮＯのいずれか１つ、またはそれらの組み合わせにより修飾する。ディッシュを脱イオン水で洗浄し、コーティングされていない領域をＢＳＡでブロックする。前処理された精液サンプルの液滴をコーティング領域に添加し、明視野または暗視野顕微鏡などの光変換器で結合を可視化する。これにより、精子機能を検出し、定量化する。
結論：
【０１５８】
ＡｕＮＰと結合されたＺＰ２およびＺＰ３のいずれか１つもしくはそれらの組み合わせ、またはＡｕＮＰにより修飾されたガラスディッシュまたはプラスチックディッシュを含むセンサを使用して、光交換器を介して精子機能を検出し、かつ定量化できる。
実施例６光交換器による先体反応の検出／定量化
【０１５９】
前処理した精液サンプルを、これまでにＡｕＮＰと結合されたＺＰ２とＺＰ３のいずれか１つ、またはそれらの組み合わせとインキュベートする。精子をタンパク質と５〜６０分間相互作用させた後、遠心分離により洗浄する。次に、精子をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（ＰＳＡ−ＦＩＴＣ）で標識したエンドウ凝集素（ＰＳＡ）により先体反応について染色し、次いで蛍光顕微鏡またはフローサイトメータなどの光交換器下で可視化する（セクション４．４．１を参照のこと、ｈｔｔｐ：／／ａｐｐｓ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｉｒｉｓ／ｂｉｔｓｔｒｅａｍ／ｈａｎｄｌｅ／１０６６５／４４２６１／９７８９２４１５４７７８９＿ｅｎｇ．ｐｄｆ；ｊｓｅｓｓｉｏｎｉｄ＝２ＥＦ９Ｆ９０３０７６０ＢＢ６０Ｂ８４Ｃ８３７０８９９９ＡＦ６４？ｓｅｑｕｅｎｃｅ＝１）。これにより、精子機能を検出し、定量化する。
【０１６０】
あるいは、前処理した精液サンプルを、これまでにＡｕＮＰ修飾ガラスディッシュまたはプラスチックディッシュと結合されたＺＰ２およびＺＰ３のいずれか１つまたはそれらの組み合わせと５〜６０分間インキュベートする。精子を表面から除去し、ＰＳＡ−ＦＩＴＣにより先体反応について染色し、次いで蛍光顕微鏡またはフローサイトメータなどの光交換器下で可視化する。これにより、精子機能を検出し、定量化する。
【０１６１】
あるいは、前処理した精液サンプルを、これまでにＡｕＮＰ修飾ガラスディッシュまたはプラスチックディッシュと結合されたＺＰ２およびＺＰ３のいずれか１つまたはそれらの組み合わせと５〜６０分間インキュベートする。次に、精子をｉｎ  ｓｉｔｕでまたは基板から除去した後に抗ＣＤ４６抗体により標識して、先体反応を受けた精子を検出する。検出を、蛍光顕微鏡またはフローサイトメータなどの光交換器により実施する。これにより、精子機能を検出し、定量化する。
結論：
【０１６２】
ＡｕＮＰと結合されたＺＰ２、ＺＰ３およびＪＵＮＯのいずれか１つもしくはそれらの組み合わせ、またはＡｕＮＰにより修飾されたガラスディッシュまたはプラスチックディッシュを含むセンサを使用して、光交換器を介して精子機能を検出し、かつ定量化できる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年3月23日(2021.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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