(57)【要約】  本発明は、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストを、ヒトＣＤ２０に結合する特定の抗体と組み合わせて使用する併用療法と、がんの治療のためのこれらの併用療法の使用とに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストであって、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせて使用され、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト。
【請求項２】
４−１ＢＢアゴニスト及び抗ＣＤ２０抗体が同時に投与される、請求項１に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
【請求項３】
４−１ＢＢアゴニスト及び抗ＣＤ２０抗体が、単一の組成物において一緒に投与されるか、又は２つ以上の異なる組成物において別々に投与される、請求項１又は２に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
【請求項４】
４−１ＢＢアゴニストが、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
【請求項５】
４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
【請求項６】
４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、ここで、４−１ＢＢＬのエクトドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
【請求項７】
４−１ＢＢアゴニストが、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片とを含む抗原結合分子であり、ここで、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）
を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
【請求項８】
４−１ＢＢアゴニストが、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片とを含む抗原結合分子であり、ここで、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含むか、又は、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
【請求項９】
４−１ＢＢアゴニストが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
【請求項１０】
４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減させるか又は排除する１つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
【請求項１１】
４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
【請求項１２】
４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含むＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
【請求項１３】
４−１ＢＢアゴニストが、
ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号３９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｄ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｅ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｆ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号４５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号４６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｇ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｈ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号４９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号５０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｊ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｋ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；並びに
ｌ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号５１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子
からなる群から選択される抗原結合分子である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
【請求項１４】
４−１ＢＢアゴニストが、ＣＤ１９に特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
【請求項１５】
４−１ＢＢアゴニストが、抗ＣＤ１９／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
【請求項１６】
抗ＣＤ２０抗体が、Ｉ型抗ＣＤ２０抗体である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
【請求項１７】
抗ＣＤ２０抗体が、リツキシマブである、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
【請求項１８】
抗ＣＤ２０抗体が、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
【請求項１９】
抗ＣＤ２０抗体が、アフコシル化抗ＣＤ２０抗体である、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
【請求項２０】
抗ＣＤ２０抗体が、オビヌツズマブである、請求項１から１５、又は１８又は１９のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
【請求項２１】
抗ＣＤ２０抗体が、リツキシマブ又はオビヌツズマブである、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
【請求項２２】
４−１ＢＢアゴニストが、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせて使用され、この組み合わせが、約１週間から３週間の間隔で投与される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
【請求項２３】
ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはオビヌツズマブによる前治療が、併用治療の前に行われ、ここで、前治療と併用治療の間の期間は、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはオビヌツズマブに応答した、個体におけるＢ細胞の減少に十分である、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
【請求項２４】
疾患、特にがんの併用治療又は同時治療における使用のための、（Ａ）活性成分としての、腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト及び薬学的に許容される添加物を含む第１の組成物；及び（Ｂ）活性成分としての抗ＣＤ２０抗体及び薬学的に許容される添加物を含む第２の組成物を含む薬学的製品。
【請求項２５】
腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストと、薬学的に許容される添加物と、抗ＣＤ２０抗体を含む第２の医薬とを含む薬学的組成物。
【請求項２６】
医薬としての使用のための、請求項２５に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
Ｂ細胞増殖性疾患、特に、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）及びホジキンリンパ腫（ＨＬ）からなる群より選択される疾患の治療における使用のための、請求項２５又は２６に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
増殖性疾患、特にがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための医薬の製造における、腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストと抗ＣＤ２０抗体の組み合わせの使用。
【請求項２９】
腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストの有効量と、抗ＣＤ２０抗体の有効量を対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法。
【請求項３０】
腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストが、抗ＣＤ２０抗体と同時に投与される、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９標的化４−１ＢＢＬ抗原結合分子に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと、ヒトＣＤ２０に結合する特異的抗体とを使用する併用療法、がんの治療のためのこれらの併用療法の使用、及び併用療法を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
Ｂ細胞増殖性疾患は、白血病とリンパ腫の両方を含む悪性腫瘍の異種群を表す。リンパ腫は、リンパ細胞から生じ、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）という２つの主要カテゴリを含む。米国では、Ｂ細胞起源のリンパ腫は非ホジキンリンパ腫症例の約８０〜８５％を構成し、Ｂ細胞サブセット内には、起源のＢ細胞における遺伝子型及び表現型の発現パターンに基づくと、大きな不均一性がある。例えば、Ｂ細胞リンパ腫サブセットは、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）又は慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）といった進行の遅い無痛性及び難治性疾患と、それよりも攻撃的なサブタイプ、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を含む。Ｂ細胞増殖性疾患の治療のために様々な薬剤が利用可能であるものの、患者の寛解を延長し、かつ治癒率を向上させる、安全で効果的な治療法の開発が引き続き必要とされている。
【０００３】
現在研究されている戦略は、悪性Ｂ細胞に対するＴ細胞の関与である。悪性Ｂ細胞に対してＴ細胞を効果的に関与させるために、最近２つのアプローチが開発されている。これらの２つのアプローチは、１）腫瘍細胞を認識するようにｅｘ  ｖｉｖｏで操作されたＴ細胞の投与（キメラ抗原受容体修飾Ｔ細胞療法又はＣＡＲ−Ｔ細胞としても知られている）（Maude et al., N Engl J Med (2014) 371,1507-1517）；及び、２）内因性Ｔ細胞を活性化する薬剤、例えば二重特異性抗体などの投与（Oak and Bartlett, Expert Opin Investig Drugs (2015) 24, 715-724）である。最初のアプローチの例は、Ｍａｕｄｅらによる研究で報告されており、３０人の成人及び小児患者が、ＣＤ１９指向性キメラ抗原受容体レンチウイルスベクターで形質導入された自己Ｔ細胞（ＣＴＬ０１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞）により治療された。その結果、６ヶ月のイベントフリー生存率６７％、全生存率７８％に基づいた持続的寛解が得られた。ただし、すべての患者がサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）（腫瘍負荷に関連する）を有し、患者の２７％が重度のＣＲＳを有していた。原因不明の中枢神経系毒性も高頻度で認められた。第二のアプローチは、内因性Ｔ細胞を活性化して腫瘍標的を認識させることを含み、このスケーラビリティのハードルを回避し、競争力のある有効性、安全性データ、及び長期的な奏効期間の可能性を提供することもできる。異なるＣＤ２０＋血液悪性腫瘍において、このアプローチは、微小残存病変陽性の急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）の患者に対して最近承認された、ＣＤ１９  ＣＤ３標的化Ｔ細胞二重特異的分子であるブリナツモマブによって最もよく例示されている（Bargou et al., Science (2008) 321, 974-977）。この化合物は、２つの単鎖Ｆｖ断片（いわゆるＢｉＴＥ（登録商標）フォーマット）からなり、細胞溶解性Ｔ細胞によるＣＤ１９＋細胞の溶解を導く。ブリナツモマブの主な制約は、その短い半減期（約２時間）であり、４〜８週間にわたってポンプを介して持続的に注入する必要がある。さらに、重度のＣＲＳ及びＣＮＳ毒性も頻繁に観察されている（Klinger et al., Blood. 2012;119(26):6226-6233）。すべての臨床試験においてブリナツモマブを投与されている患者では、約５０％の患者で神経毒性が発生しており、観察された毒性の種類は添付文書で明確に定義されている。
【０００４】
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）は、活性化されたＴ細胞によって発現される誘導性分子として最初に同定された（Kwon and Weissman, Proc Natl Acad Sci U S A (1989) 86, 1963-1967）。その後の研究により、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、単球、好中球、マスト細胞、樹状細胞（ＤＣ）、及び内皮細胞や平滑筋細胞などの非造血起源の細胞を含む、他の多くの免疫細胞も４−１ＢＢを発現することが実証された（Vinay and Kwon, Cell Mol Immunol. (2011) 8, 281-284）。異なる細胞型における４−１ＢＢの発現は、大部分は誘導性であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＢ細胞受容体トリガーなどの様々な刺激シグナル、並びに共刺激分子又は炎症性サイトカインの受容体を通じて誘導されるシグナル伝達によって駆動される（Diehl et al., J Immunol (2002)168, 3755-3762; Zhang et al., J Immunol(2010) 184, 787-795）。
【０００５】
４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ又はＣＤ１３７Ｌ）は、１９９３年に同定された（Goodwin et al., Eur J Immunol. (1993) 23, 2631-2641）。４−１ＢＢＬの発現は、Ｂ細胞、ＤＣ及びマクロファージなどのプロフェッショナルな抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に制限されていることが示されている。４−１ＢＢＬの誘導性発現は、αβ及びγδ両方のＴ細胞サブセットを含むＴ細胞、並びに内皮細胞に特徴的である（Shao and Schwarz, J Leukoc Biol (2011) 89, 21-29）。
【０００６】
４−１ＢＢ受容体を通した共刺激（例えば４−１ＢＢＬのライゲーションによる）は、Ｔ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットの両方）内部において複数のシグナル伝達カスケードを活性化させ、Ｔ細胞活性化を強力に増強する（Bartkowiak and Curran, Front Oncol (2015) 5, 117）。ＴＣＲトリガーと組み合わせて、アゴニスト４−１ＢＢ特異的抗体は、Ｔ細胞の増殖を増強し、リンホカイン分泌を刺激し、活性化誘導細胞死に対するＴリンパ球の感受性を低下させる（Snell et al., Immunol Rev (2011) 244, 197-217）。このような機序は、がん免疫療法における概念の最初の実証としてさらに進歩した。前臨床モデルでは、腫瘍を有するマウスにおける４−１ＢＢに対するアゴニスト抗体の投与は、強力な抗腫瘍効果をもたらした（Melero et al., Nature Med (1997)3, 682-685）。その後、蓄積された証拠により、４−１ＢＢは通常、他の免疫調節化合物、化学療法剤、腫瘍特異的ワクチン接種又は放射線療法と組み合わせて投与されたときにのみ、抗腫瘍剤としてのその効力を示すことが示唆された（Bartkowiak and Curran, Front Oncol (2015) 5, 117）。
【０００７】
ＴＮＦＲスーパーファミリーのシグナル伝達は、受容体と係合するために三量体化リガンドの架橋を必要とし、野生型Ｆｃ結合を必要とする４−１ＢＢアゴニスト抗体も同様である（Li and Ravetch, Science (2011)333, 1030-1034）。しかしながら、機能的に活性なＦｃドメインを有する４−１ＢＢ特異的アゴニスト抗体の全身投与は、マウスにおいて機能的Ｆｃ受容体の非存在下では減少するか又は有意に改善される肝毒性に関連するＣＤ８＋  Ｔ細胞の流入をもたらした（Dubrot et al., Cancer Immunol Immunother (2010) 59, 1223-1233）。クリニックにおいて、Ｆｃコンピテント４−１ＢＢアゴニストＡｂ（ＢＭＳ−６６３５１３）（ＮＣＴ００６１２６６４）は、グレード４の肝炎を生じさせ、治験終了に至った（Simeone and Ascierto, J Immunotoxicol (2012) 9, 241-247）。したがって、効果的で安全な４−１ＢＢアゴニストが必要とされている。
【０００８】
４−１ＢＢリガンドの１つの細胞外ドメインと、単鎖抗体断片（Hornig et al., J Immunother (2012) 35, 418-429; Mueller et al., J Immunother. (2008) 31, 714-722）又は重鎖のＣ末端に融合した単一の４−１ＢＢリガンド(Zhang et al., Clin Cancer Res (2007) 13, 2758-2767）からなる融合タンパク質が作製されている。国際公開第２０１０／０１００５１号は、互いに連結され、抗体部分に融合された３つのＴＮＦリガンドエクトドメインからなる融合タンパク質の生成を開示している。本発明において、三量体、したがって生物学的に活性な４−１ＢＢリガンドと、腫瘍抗原ＣＤ１９特異的な抗原結合ドメインと、ＦｃγＲ結合を欠いたＦｃ領域とからなる抗原結合分子は、特に安定かつ強力であることが示されている（本明細書においてＣＤ１９−４−１ＢＢＬと命名する）。これらの構築物は、国際公開第２０１６／０７５２７８号に開示されており、ＣＤ１９標的化Ｂ細胞特異的架橋によって、Ｆｃ媒介毒性の原因となる非特異的ＦｃγＲ媒介架橋を置き換える。
【０００９】
ＣＤ１９は、Ｂ細胞の表面に発現され、これら細胞にほとんど特異性であるため、Ｂ細胞悪性腫瘍の免疫療法のための理想的な標的である。ＣＤ１９は、Ｂ細胞発生の間に、Ｂ細胞上においてＣＤ２０よりも広く発現されるため、通常ＣＤ２０陽性細胞もＣＤ１９を発現するだろう。Ｂ細胞が形質細胞（抗体分泌細胞）へと分化する間に、Ｂ細胞はＣＤ２０の発現をダウンレギュレートする。時に、Ｂ細胞リンパ腫もＣＤ２０の発現をダウンレギュレートするが、ＣＤ１９については陽性のままである。したがって、ＣＤ１９及びＣＤ２０の両方を標的とすることは、リンパ腫中の罹患Ｂ細胞を広くカバーし、また選択圧をＣＤ２０からＣＤ１９及びＣＤ２０の両方へと偏向させる可能性がある。ＣＤ１９がＢ細胞の発癌に直接寄与するかどうかは不明であるが、その発現は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）及びＢ細胞リンパ腫といった多くのＢ細胞腫瘍において高度に保存されている。急性白血病ＣＤ１９は、ほとんどすべてのサブタイプに安定的に、かつ継続的に発現されるが、少数の白血病のみがＣＤ２０を発現する。
【００１０】
したがって、ＮＨＬやＣＬＬなどのＢ細胞増殖性疾患の患者の治療に大きく貢献する可能性のある新しい化合物や組み合わせに対する必要性が依然として存在する。ＣＤ１９標的化４−１ＢＢＬ抗原結合分子を、ヒトＣＤ２０に結合する特異的抗体と組み合わせると、優れた抗腫瘍効果が得られることが見出されている。したがって、本発明者らはここに、Ｂ細胞悪性腫瘍を含むがんのための新規の併用療法を記載する。
【発明の概要】
【００１１】
発明の要旨
本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅延させるため、より具体的には、Ｂ細胞増殖性疾患を治療するため又はＢ細胞増殖性疾患の進行を遅延させるための方法における、腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、特に４−１ＢＢＬの３つのエクトドメインを含む抗原結合分子を含む４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと、ヒトＣＤ２０に結合する抗体、特にリツキシマブ又はオビヌツズマブと組み合わせたその使用とに関する。本明細書に記載される併用療法は、抗ＣＤ２０抗体単独での治療よりも、腫瘍増殖の阻害及び腫瘍細胞の除去においてより効果的であることが見出されている。
【００１２】
一態様では、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストを提供し、ここで、４−１ＢＢアゴニストは抗ＣＤ２０抗体と組み合わせて使用され、４−１ＢＢアゴニストは腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含み、特に、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む。
【００１３】
特に、４−１ＢＢアゴニストは、ＣＤ１９に特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子である。一態様では、４−１ＢＢアゴニストはＦｃドメインを含む抗原結合分子である。特定の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、Ｆｃγ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低減させるか好ましくは除去する修飾を有する好Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である。
【００１４】
一態様では、４−１ＢＢアゴニスト及び抗ＣＤ２０抗体は、同時に（concomitant）、又は同時に（simultaneously）投与される。さらなる態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニストが提供され、ここで、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト及び抗ＣＤ２０抗体は、単一の組成物において一緒に投与されるか、又は２つ以上の異なる組成物において別々に投与される、
【００１５】
一態様では、本発明は、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせてがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための、腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストを提供し、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む。さらなる態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニストが提供され、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む分子であり、ここで、４−１ＢＢＬのエクトドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む。より具体的には、４−１ＢＢＬのエクトドメインは配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【００１６】
一態様では、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストを提供し、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせて使用され、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む。
【００１７】
一態様では、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む抗原結合分子は、ＣＤ１９発現Ｂ細胞によって内部移行されないであろう。別の態様では、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせてがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニストが提供され、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片とを含む抗原結合分子であり、ここで、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）
を含む。
【００１８】
特定の態様では、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせてがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニストが提供され、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片とを含む抗原結合分子であり、ここで、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）とを含むか、又はＣＤ１９に特異的に結合できる抗原結合ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と、配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）とを含む。特定の態様では、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む。
【００１９】
一態様では、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせてがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニストが提供され、ここで、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインをさらに含む抗原結合分子である。特に、４−１ＢＢアゴニストは、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である。より具体的には、４−１ＢＢアゴニストは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である。特定の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。
【００２０】
本発明の別の態様では、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせてがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニストが提供され、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含む。
【００２１】
別の態様では、本発明は、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせてがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニストを提供し、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする。
【００２２】
一態様では、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせてがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニストが提供され、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含むＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【００２３】
特定の態様では、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせてがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニストが提供され、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、
ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号３９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｄ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｅ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｆ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号４５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号４６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｇ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｈ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号４９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号５０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｊ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｋ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；並びに
ｌ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号５１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子
からなる群から選択される抗原結合分子である。
【００２４】
別の態様では、本発明は、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせてがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニストを提供し、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である。
【００２５】
特定の態様では、本発明は、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせてがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニストを提供し、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子、
（ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子、
（ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子、及び
（ｄ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子
からなる群から選択される抗原結合分子である。
【００２６】
別の態様では、本発明は、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせてがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニストを提供し、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、抗ＣＤ１９／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である。
【００２７】
さらなる態様では、本発明は、がんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストを提供し、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせて使用され、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む。
【００２８】
一態様では、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせてがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニストが提供され、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片とを含む抗原結合分子であり、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む。
【００２９】
特定の態様では、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせてがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニストが提供され、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片とを含む抗原結合分子であり、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、配列番号１０９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含むか、又はＦＡＰに特異的に結合できる抗原結合ドメインは、配列番号１１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、配列番号１１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含む。特定の態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号１１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。
【００３０】
一態様では、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせてがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニストが提供され、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインをさらに含む抗原結合分子である。特に、４−１ＢＢアゴニストは、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である。より具体的には、４−１ＢＢアゴニストは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である。特定の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。
【００３１】
本発明の別の態様では、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせてがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニストが提供され、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含む。
【００３２】
別の態様では、本発明は、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせてがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニストを提供し、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする。
【００３３】
一態様では、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせてがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニストが提供され、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）配列番号１０８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号１０９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は配列番号１１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と配列番号１１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【００３４】
特定の態様では、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせてがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニストが提供され、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、
ａ）配列番号１１２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｂ）配列番号１１２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｃ）配列番号１１２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｄ）配列番号１１２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｅ）配列番号１１４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｆ）配列番号１１４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｇ）配列番号１１４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｈ）配列番号１１４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｆ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号４５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号４６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｇ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｈ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｉ）配列番号１１３のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号１１６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号１１７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；及び
ｊ）配列番号１１５のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号１１８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号１１９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子
からなる群から選択される抗原結合分子である。
【００３５】
別の態様では、本発明は、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせてがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニストを提供し、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である。
【００３６】
別の態様では、本発明は、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせてがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニストを提供し、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、抗ＦＡＰ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である。
【００３７】
これらのすべての態様では、本発明はさらに、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせてがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニストを提供し、ここで、抗ＣＤ２０抗体はＩ型抗ＣＤ２０抗体である。特に、抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブである。別の態様では、本発明はさらに、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせてがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニストを提供し、ここで、抗ＣＤ２０抗体はＩＩ型抗ＣＤ２０抗体である。特に、抗ＣＤ２０抗体は、オビヌツズマブである。一態様では、抗ＣＤ２０抗体は、アフコシル化抗ＣＤ２０抗体である。さらなる態様では、抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブ又はオビヌツズマブである。
【００３８】
別の態様では、本明細書で前に定義された抗ＣＤ２０抗体と組み合わせてがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニストが提供され、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストであり、ここで、組み合わせは、約１週間から３週間の間隔で投与される。
【００３９】
別の態様では、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせてがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢアゴニストが提供され、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストであり、ここで、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはオビヌツズマブによる前治療は、併用治療の前に行われ、ここで、前治療と併用治療の間の期間は、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはオビヌツズマブに応答した、個体におけるＢ細胞の減少に十分である。
【００４０】
別の態様では、本発明は、疾患、特にがんの併用治療又は同時治療における使用のための、（Ａ）活性成分としての、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト及び薬学的に許容される添加物を含む第１の組成物；及び（Ｂ）活性成分としての抗ＣＤ２０抗体及び薬学的に許容される添加物を含む第２の組成物を含む薬学的製品を提供する。
【００４１】
別の態様では、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストと、薬学的に許容される添加物と、抗ＣＤ２０抗体を含む第２の医薬とを含む薬学的組成物が提供される。一態様では、薬学的組成物は、医薬として使用するためのものである。特に、この薬学的組成物は、Ｂ細胞増殖性疾患、特に、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）及びホジキンリンパ腫（ＨＬ）からなる群より選択される疾患の治療における使用のためのものである。
【００４２】
さらなる態様では、本発明は、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるためのキットであって、（Ａ）活性成分としての、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト及び薬学的に許容される添加物を含む第１の組成物；及び（Ｂ）活性成分としての抗ＣＤ２０抗体及び薬学的に許容される添加物を含む第２の組成物、及び（Ｃ）併用療法において組成物を使用するための説明書を含むパッケージを含むキットを提供する。
【００４３】
さらなる態様では、本発明は、増殖性疾患、特にがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための医薬の製造における、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストと抗ＣＤ２０抗体の組み合わせの使用に関する。
【００４４】
特に、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）及びホジキンリンパ腫（ＨＬ）からなる群より選択される疾患を治療するための医薬の製造における、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストと抗ＣＤ２０抗体との組み合わせの使用が提供される。
【００４５】
別の態様では、本発明は、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストの有効量と、抗ＣＤ２０抗体の有効量を対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法を提供する。特に、本発明は、４−１ＢＢアゴニストが、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子である、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法に関する。一態様では、４−１ＢＢアゴニストはＦｃドメインを含む抗原結合分子である。特定の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、Ｆｃγ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低減させる修飾を有するＦｃドメインを含む抗原結合分子である。特定の態様では、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む抗原結合分子である。より具体的には、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である。
【００４６】
さらなる態様では、本発明は、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストの有効量、及び抗ＣＤ２０抗体の有効量を対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法を提供し、ここで、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト及び抗ＣＤ２０抗体は、単一の組成物において一緒に投与されるか、又は２つ以上の異なる組成物において別々に投与される。特に、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト、及び抗ＣＤ２０抗体は、静脈内又は皮下に投与される。さらなる態様では、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、抗ＣＤ２０抗体と同時に投与される。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１Ａ−Ｆ】図１は、実施例で使用される特定のＣＤ１９−４−１ＢＢＬ抗原結合分子を示す。これらの分子は、実施例１及び２においてそれぞれさらに詳細に記載される。太い黒色の点は、ノブ・イントゥー・ホール修飾を表している。図１Ａは、４−１ＢＢＬ二量体及び４−１ＢＢＬ単量体に隣接するＣＨ１及びＣＬドメインにアミノ酸修飾を有する一価ＣＤ１９  ４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を示す。これはＣＤ１９バインダー８Ｂ８−０１８を含んでいたため、本明細書においてｍｏｎｏ  ＣＤ１９（０１８）−４−１ＢＢＬと命名した。１Ｂに示す構築物は、ＣＤ１９バインダー８Ｂ８−２Ｂ１１を含むという点で１Ａとは異なり、したがってｍｏｎｏ  ＣＤ１９（２Ｂ１１）−４−１ＢＢＬと命名した。１Ｄは、ｂｉ  ＣＤ１９（０１８）−４−１ＢＢＬと命名されたバインダーＣＤ１９（０１８）を含む二価の構築物を示している。図１Ｃ及び１Ｅは、非標的化対照分子を示している（ＣＤ１９バインダーは、非結合性ＤＰ４７  Ｆａｂによって置換されている）。図１Ｆは、マウス４−１ＢＢＬ二量体及びマウス４−１ＢＢＬ単量体を含む抗原結合分子を含む一価ＣＤ１９  ４−１ＢＢＬ三量体を示し、本明細書ではハイブリッドＣＤ１９−４−１ＢＢＬ又はＣＤ１９−ｍｕ４−１ＢＢＬと命名される。
【図２Ａ−Ｂ】図２Ａは、ＣＤ１９標的化三量体スプリット４−１ＢＢＬのマウス４−１ＢＢ及びヒトＣＤ１９への同時結合を測定するアッセイのセットアップを示す（実施例２）。図２Ｂのグラフは、固定化されたマウス４−１ＢＢ及びヒトＣＤ１９（被分析物２）に対するハイブリッドサロゲートＣＤ１９−ｍｕ４−１ＢＢＬ（被分析物１）の同時結合を示す。
【図３Ａ−Ｂ】図３Ａから３Ｃでは、ＣＤ１９−４−１ＢＢＬは、ＮＨＬ細胞株、つまりＷＳＵ−ＤＬＣＬ２（ＣＤ１９＋  ＣＤ２０ｈｉｇｈ）（図３Ａ）、ＳＵ−ＤＨＬ−８（ＣＤ１９＋  ＣＤ２０ｌｏｗ）（図３Ｂ）、又はＮａｍｌ−６（ＣＤ１９＋  ＣＤ２０ｌｏｗ）（図３Ｃ）と結合すると、リツキシマブ又はオビヌツズマブ（Ｇａｚｙｖａ）によって活性化されたＮＫ細胞の活性化（ＩＦＮγ放出）を高める可能性があることが示されている。
【図３Ｃ】図３Ａから３Ｃでは、ＣＤ１９−４−１ＢＢＬは、ＮＨＬ細胞株、つまりＷＳＵ−ＤＬＣＬ２（ＣＤ１９＋  ＣＤ２０ｈｉｇｈ）（図３Ａ）、ＳＵ−ＤＨＬ−８（ＣＤ１９＋  ＣＤ２０ｌｏｗ）（図３Ｂ）、又はＮａｍｌ−６（ＣＤ１９＋  ＣＤ２０ｌｏｗ）（図３Ｃ）と結合すると、リツキシマブ又はオビヌツズマブ（Ｇａｚｙｖａ）によって活性化されたＮＫ細胞の活性化（ＩＦＮγ放出）を高める可能性があることが示されている。
【図４Ａ−Ｂ】図４Ａから４Ｃは、ＣＤ１９−４−１ＢＢＬをリツキシマブ又はオビヌツズマブ（Ｇａｚｙｖａ）と組み合わせることにより、ＮＨＬ細胞株、つまりＷＳＵ−ＤＬＣＬ２（ＣＤ１９＋  ＣＤ２０ｈｉｇｈ）（図４Ａ）、ＳＵ−ＤＨＬ−８（ＣＤ１９＋  ＣＤ２０ｌｏｗ）（図４Ｂ）、又はＮａｍｌ−６（ＣＤ１９＋  ＣＤ２０ｌｏｗ）（図４Ｃ）と結合すると、ＮＫ細胞の活性化（ＣＤ２５上方制御）が高められることを示している。
【図４Ｃ】図４Ａから４Ｃは、ＣＤ１９−４−１ＢＢＬをリツキシマブ又はオビヌツズマブ（Ｇａｚｙｖａ）と組み合わせることにより、ＮＨＬ細胞株、つまりＷＳＵ−ＤＬＣＬ２（ＣＤ１９＋  ＣＤ２０ｈｉｇｈ）（図４Ａ）、ＳＵ−ＤＨＬ−８（ＣＤ１９＋  ＣＤ２０ｌｏｗ）（図４Ｂ）、又はＮａｍｌ−６（ＣＤ１９＋  ＣＤ２０ｌｏｗ）（図４Ｃ）と結合すると、ＮＫ細胞の活性化（ＣＤ２５上方制御）が高められることを示している。
【図５Ａ−Ｂ】図５Ａから５Ｃでは、ＣＤ１９−４−１ＢＢＬとオビヌツズマブ（Ｇａｚｙｖａ）の組み合わせは、ＮＨＬ細胞株ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２（図５Ａ）、ＳＵ−ＤＨＬ−８（図５Ｂ）又はＮａｍｌ−６（図５Ｃ）と結合すると、ＮＫ細胞の活性化（ＣＤ２５上方制御）を高めるが、一方、ウレルマブとオビヌツズマブの組み合わせでは高めないことが示されている。
【図５Ｃ】図５Ａから５Ｃでは、ＣＤ１９−４−１ＢＢＬとオビヌツズマブ（Ｇａｚｙｖａ）の組み合わせは、ＮＨＬ細胞株ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２（図５Ａ）、ＳＵ−ＤＨＬ−８（図５Ｂ）又はＮａｍｌ−６（図５Ｃ）と結合すると、ＮＫ細胞の活性化（ＣＤ２５上方制御）を高めるが、一方、ウレルマブとオビヌツズマブの組み合わせでは高めないことが示されている。
【図６】図６は、ｈｕＣＤ１６Ｔｇ  Ｓｃｉｄマウスにおける、リツキシマブと組み合わせた一価ハイブリッドＣＤ１９−４−１ＢＢＬ分子（ｍｏｎｏ  ＣＤ１９−ｍｕ４−１ＢＢＬ）のｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性試験のプロトコールを示している。下の表では、異なる組み合わせ及び用量を投与されたマウスのサブグループが定義されている。実験は実施例４に記載されており、結果は図７Ａ及び７Ｂに示されている。リツキシマブと組み合わせたｍｏｎｏ  ＣＤ１９−ｍｕ４−１ＢＢＬの組み合わせは、リツキシマブによる単剤療法又はｍｏｎｏ  ＣＤ１９−ｍｕ４−１ＢＢＬによる単剤療法と比較して、試験したすべての用量でより強力かつ迅速な腫瘍増殖阻害を誘発した。図７Ｂに示すように、試験終了時の腫瘍重量は、これらの知見を確認するものであった。
【図７Ａ−Ｂ】図６は、ｈｕＣＤ１６Ｔｇ  Ｓｃｉｄマウスにおける、リツキシマブと組み合わせた一価ハイブリッドＣＤ１９−４−１ＢＢＬ分子（ｍｏｎｏ  ＣＤ１９−ｍｕ４−１ＢＢＬ）のｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性試験のプロトコールを示している。下の表では、異なる組み合わせ及び用量を投与されたマウスのサブグループが定義されている。実験は実施例４に記載されており、結果は図７Ａ及び７Ｂに示されている。リツキシマブと組み合わせたｍｏｎｏ  ＣＤ１９−ｍｕ４−１ＢＢＬの組み合わせは、リツキシマブによる単剤療法又はｍｏｎｏ  ＣＤ１９−ｍｕ４−１ＢＢＬによる単剤療法と比較して、試験したすべての用量でより強力かつ迅速な腫瘍増殖阻害を誘発した。図７Ｂに示すように、試験終了時の腫瘍重量は、これらの知見を確認するものであった。
【図８】図８は、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２を有する完全ヒト化ＮＳＧマウスにおける、オビヌツズマブ（Ｇａｚｙｖａ）と組み合わせた一価ＣＤ１９（２Ｂ１１）−４−１ＢＢＬ構築物のｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性試験のプロトコールを示している。下の表では、異なる組み合わせ及び用量を投与されたマウスのサブグループが定義されている。実験は実施例５に記載されており、結果は図９に示されている。ｍｏｎｏ  ＣＤ１９（２Ｂ１１）−４−１ＢＢＬとＧａｚｙｖａの組み合わせは、Ｇａｚｙｖａによる単剤療法と比較して、はるかに強力な腫瘍増殖阻害を誘発した。
【図９】図８は、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２を有する完全ヒト化ＮＳＧマウスにおける、オビヌツズマブ（Ｇａｚｙｖａ）と組み合わせた一価ＣＤ１９（２Ｂ１１）−４−１ＢＢＬ構築物のｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性試験のプロトコールを示している。下の表では、異なる組み合わせ及び用量を投与されたマウスのサブグループが定義されている。実験は実施例５に記載されており、結果は図９に示されている。ｍｏｎｏ  ＣＤ１９（２Ｂ１１）−４−１ＢＢＬとＧａｚｙｖａの組み合わせは、Ｇａｚｙｖａによる単剤療法と比較して、はるかに強力な腫瘍増殖阻害を誘発した。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
発明の詳細な説明
定義
特に定義されない限り、本明細書中で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野において一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語は複数形を含み、その逆もまた同様である。
【００４９】
本明細書において使用される用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体断片、及び足場抗原結合タンパク質である。
【００５０】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定しないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性及び多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００５１】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる突然変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の製造時に発生し、一般的に少量で存在している可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、かつ／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
【００５２】
本明細書で使用される用語「単一特異性」抗体とは、それぞれが同一の抗原の同一のエピトープに結合する１つ又は複数の結合部位を有する抗体を意味する。用語「二重特異性」は、抗原結合分子が少なくとも２つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は２つの抗原結合部位を含み、そのそれぞれは異なる抗原決定基に特異的である。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基、特に２つの別個の細胞上に発現した２つの抗原決定基に同時に結合することができる。
【００５３】
本出願内で使用される用語「価」は、抗原結合分子における特定数の結合部位の存在を意味する。このように、用語「二価」、「四価」及び「六価」は、抗原結合分子中、それぞれ２つの結合部位、４つの結合部位及び６つの結合部位の存在を意味する。「一価」は、抗原結合分子内の特定の標的に対してただ１つの結合ドメインが存在することを意味する。
【００５４】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然抗体構造と実質的に類似の構造を有する抗体を指す。「天然抗体」は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧクラスの抗体は、ジスルフィド結合している２つの軽鎖及び２つの重鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端にかけて、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、続いて重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端にかけて、各軽鎖は可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つの種類のうちの１つに割当てることができ、それらのいくつかはさらにサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）に分けられる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つの種類のうちの１つに割り当てることができる。
【００５５】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する、インタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｃｒｏｓｓ−Ｆａｂ断片；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び単一ドメイン抗体が挙げられる。特定の抗体断片の総説については、Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)を参照のこと。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照のこと；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片であり、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディもHudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む抗体断片である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６（Ｂ１）号を参照のこと）。抗体断片は、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含むがこれらに限定されない様々な技術により作製することができる。
【００５６】
インタクトな抗体のパパイン消化は、各々が重鎖及び軽鎖可変ドメインと、さらには軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を生成する。したがって、本明細書において使用される用語「Ｆａｂ断片」は、軽鎖（ＣＬ）のＶＬドメイン及び定常ドメインを含む軽鎖断片と、重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されている点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片である。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）とＦｃ領域の一部とを有するＦ（ａｂ’）２断片を生成する。
【００５７】
用語「ｃｒｏｓｓ−Ｆａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されているＦａｂ断片を指す。クロスオーバーＦａｂ分子の２つの異なる鎖組成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる。一方では、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されており、すなわちクロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖、及び重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるいるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも呼ばれる。また一方では、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている場合、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖を含む。このクロスオーバー分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。
【００５８】
「単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、ここで、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に次の順序：ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１又はｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬのうちの１つを有し；ここで前記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２〜５０アミノ酸のポリペプチドである。前記単鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合を介して安定化されている。加えて、これらの単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基（例えばＫａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）の挿入を介した鎖間ジスルフィド結合の生成により、さらに安定化される可能性がある。
【００５９】
「クロスオーバー単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｘ−ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、ここで前記抗体ドメイン及び前記リンカーはＮ末端からＣ末端方向に次の順序：ａ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１及びｂ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬのうちの１つを有し；ここでＶＨ及びＶＬは、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成し、前記リンカーは少なくとも３０アミノ酸のポリペプチドである。加えて、これらのｘ−ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基（例えばＫａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）の挿入を介した鎖間ジスルフィド結合の生成により、さらに安定化される可能性がある。
【００６０】
「単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、１０個から約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドにより連結された抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは通常、柔軟性のためにグリシンが豊富であり、溶解性のためにセリン又はスレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に連結するか、又はその逆に連結することができる。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の抗体の特異性を保持する。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96に記載されている。加えて、抗体断片は、ＶＨドメインの特性、すなわちＶＬドメインと一緒に機能的抗原結合部位へと組み立てられることが可能である特性、又はＶＬドメインの特性、すなわちＶＨドメインと一緒に機能的抗原結合部位へと組み立てられることが可能である特性を有し、それにより全長抗体の抗原結合特性を提供する単鎖ポリペプチドを含む。
【００６１】
「足場抗原結合タンパク質」は当技術分野で公知であり、例えば、フィブロネクチン及び設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）が、抗原結合ドメインのための代替足場として使用されている（例えば、Gebauer and Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeuticsを参照のこと）。Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009) and Stumpp et al., Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008)。本発明の一態様では、足場抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ−４（エビボディ（Ｅｖｉｂｏｄｙ））、リポカリン（アンチカリン）、プロテインＡのＺドメイン（アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）などのプロテインＡ由来分子、Ａ−ドメイン（アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）／マキシボディ（Ｍａｘｉｂｏｄｙ）、血清トランスフェリン（トランスボディ（ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｙ））；設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ、ａＶＨ）、ＶＮＡＲ断片、フィブロネクチン（アドネクチン（ＡｄＮｅｃｔｉｎ））、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン（Ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ））；新規抗原受容体β−ラクタマーゼの可変ドメイン（ＶＮＡＲ断片）、ヒトγ−クリスタリン又はユビキチン（アフィリン（Ａｆｆｉｌｉｎ）分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、ノッチンファミリー由来のタンパク質などのミクロボディー、ペプチドアプタマー及びフィブロネクチン（アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ））からなる群から選択される。
【００６２】
リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質などの小さな疎水性分子を輸送する細胞外タンパク質のファミリーである。それらは、異なる標的抗原に結合するように操作することができる円錐構造の開放端に多数のループを有する強固なβシート二次構造を有する。アンチカリンは、１６０−１８０アミノ酸のサイズであり、リポカリンに由来する。さらなる詳細は、Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)、米国特許第７２５０２９７（Ｂ１）号及び米国特許出願公開第２００７０２２４６３３号を参照のこと。
【００６３】
設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）は、内在性膜タンパク質の細胞骨格への付着を媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリン（Ａｎｋｙｒｉｎ）に由来する。単一のアンキリンリピートは、２つのαヘリックスとβターンとからなる３３残基のモチーフである。それらは、各リピートの第１のαヘリックス及びβターンの残基を無作為化することによって、異なる標的抗原に結合するように操作することができる。それらの結合面は、モジュールの数を増加させることによって増大させることができる（親和性成熟の方法）。さらなる詳細は、J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003)及びJ. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007)及び米国特許出願公開第２００４０１３２０２８（Ａ１）号を参照のこと。
【００６４】
単一ドメイン抗体は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。第１の単一ドメインは、ラクダ科の抗体重鎖の可変ドメインに由来するものであった（ナノボディ又はＶＨＨ断片）。さらに、単一ドメイン抗体という用語は、自律性ヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）又はサメ由来のＶＮＡＲ断片を含む。
【００６５】
参照分子と「同じエピトープに結合する抗原結合分子」とは、競合アッセイにおいて参照分子とその抗原との結合を５０％以上遮断する抗原結合分子を指し、逆に参照分子は、競合アッセイにおいて抗原結合分子のその抗原に対する結合を５０％以上遮断する。
【００６６】
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原に特異的に結合し、抗原の一部又は全部に相補的である領域を含む抗原結合分子の一部を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、エピトープと呼ばれる抗原の特定の部分にのみ結合することができる。抗原結合ドメインは、例えば、１つ又は複数の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）によって提供されてもよい。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００６７】
本明細書において使用される用語「抗原決定基」は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分−抗原複合体を形成するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続的区間又は非連続的アミノ酸の異なる領域から形成される立体構造配置）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面に、ウイルス感染細胞の表面に、他の疾患細胞の表面に、免疫細胞の表面に、血清中に遊離した状態で、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に見いだすことができる。本明細書の抗原として有用なタンパク質は、他に指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む、任意の脊椎動物源由来のタンパク質の任意の天然形態であり得る。特定の実施態様では、抗原はヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、その用語は「完全長」の未処理のタンパク質、並びに細胞内でのプロセシングから生じる任意の形態のタンパク質を包含する。その用語はまた、天然に存在するタンパク質の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。
【００６８】
「特異的結合」とは、結合が、抗原について選択的であり、望ましくない相互作用又は非特異的相互作用とは区別可能であることを意味する。抗原結合分子の、特定の抗原への結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ装置における解析）（Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)）、及び古典的結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）により測定することができる。
【００６９】
一実施態様では、抗原結合分子の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定した場合、抗原結合分子の抗原への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００７０】
「親和性」又は「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、通常、解離定数（ＫＤ）によって表され、この解離定数（Ｋｄ）は、解離速度定数と会合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。したがって、等価な親和性は、速度定数の比率が同じままである限り、異なる速度定数を含み得る。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当技術分野で公知である一般的な方法により測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【００７１】
本明細書において使用される「Ｂ細胞抗原」は、Ｂリンパ球、特に悪性Ｂリンパ球の表面上に存在する抗原決定基を指す（この場合、抗原は「悪性Ｂ細胞抗原」とも呼ばれる）。
【００７２】
用語「腫瘍関連抗原」は、腫瘍細胞によって又は腫瘍間質において高度に発現される任意の抗原を意味する。特定の腫瘍関連抗原は、ＣＤ１９又はＦＡＰである。
【００７３】
用語「ＣＤ１９」は、Ｂリンパ球抗原ＣＤ１９を指し、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ４又はＴ細胞表面抗原Ｌｅｕ−１２としても知られており、特に明記しない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＣＤ１９を含む。ヒトＣＤ１９のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ１５３９１（バージョン１６０、配列番号６２）に示されている。この用語は、「完全長」の未処理のヒトＣＤ１９並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のヒトＣＤ１９を、本明細書に報告される抗体がそれに結合する限りにおいて包含する。ＣＤ１９は、ヒトＢ細胞の表面に発現する構造的に異なる細胞表面受容体であり、このＢ細胞には、限定されないが、プレＢ細胞、早期発達期のＢ細胞（すなわち、未成熟Ｂ細胞）、形質細胞への終末分化を経た成熟Ｂ細胞、及び悪性Ｂ細胞が含まれる。ＣＤ１９は、ほとんどのプレＢ急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ性白血病、ヘアリー細胞白血病、一般的な急性リンパ性白血病、及び一部のＮｕｌｌ細胞型急性リンパ性白血病によって発現される。形質細胞におけるＣＤ１９の発現は、それが多発性骨髄腫などの分化したＢ細胞腫瘍に発現され得ることをさらに示唆している。したがって、ＣＤ１９抗原は、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病及び／又は急性リンパ性白血病の治療において免疫療法の標的である。
【００７４】
「ＣＤ２０」は、Ｂリンパ球抗原ＣＤ２０を指し、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ１又は白血球表面抗原Ｌｅｕ−１６としても知られており、特に明記しない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＣＤ２０を含む。ヒトＣＤ２０のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ１１８３６（バージョン１４９、配列番号６３）に示されている。ＣＤ２０は、プレＢ及び成熟Ｂリンパ球に発現される、約３５ｋＤの分子量を有する疎水性膜貫通タンパク質である。対応するヒト遺伝子は、膜貫通４ドメイン、サブファミリーＡ、メンバー１であり、ＭＳ４Ａ１としても知られる。この遺伝子は、膜貫通４Ａ遺伝子ファミリーのメンバーをコードする。この新生タンパク質ファミリーのメンバーは、共通の構造的特徴及び類似のイントロン／エクソンのスプライス境界により特徴づけられ、造血細胞及び非リンパ系組織の中に固有の発現パターンを示す。この遺伝子は、Ｂ細胞の発生及び形質細胞への分化に役割を果たすＢリンパ球表面分子をコードしている。このファミリーメンバーは、ファミリーメンバーのクラスターの中で、１１ｑ１２に局在する。この遺伝子の選択的スプライシングにより、同じタンパク質をコードする２つの転写変異体が生じる。用語「ＣＤ２０」は、「完全長」の未処理のＣＤ２０だけでなく、細胞内でのプロセシングから生じるあらゆる形態のＣＤ２０を包含する。その用語はまた、ＣＤ２０の天然に生じる変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を含む。
【００７５】
用語「抗ＣＤ２０抗体」及び「ＣＤ２０に結合する抗体」は、その抗体がＣＤ２０を標的とする際に診断薬及び／又は治療剤として有用であるように、十分な親和性でＣＤ２０に結合することができる抗体を指す。一実施態様では、抗ＣＤ２０抗体の、無関係な、非ＣＤ２０タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体のＣＤ２０への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、ＣＤ２０に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。特定の実施態様では、抗ＣＤ２０抗体は、異なる種からのＣＤ２０間で保存されているＣＤ２０のエピトープに結合する。
【００７６】
「ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体」は、Cragg et al., Blood 103 (2004) 2738-2743; Cragg et al., Blood 101 (2003) 1045-1052, Klein et al., mAbs 5 (2013), 22-33に記載され、以下の表１にまとめられたＩＩ型抗ＣＤ２０抗体の結合特性及び生物活性を有する抗ＣＤ２０抗体を意味する。
【００７７】
2021515782.tif 000002
【００７８】
ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体の例には、例えば、オビヌツズマブ（ＧＡ１０１）、トシツモマブ（Ｂ１）、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体ＩｇＧ１（国際公開２００５／０４４８５９号に開示されるようなキメラヒト化ＩｇＧ１抗体）、１１Ｂ８  ＩｇＧ１（国際公開２００４／０３５６０７号に開示）及びＡＴ８０  ＩｇＧ１が含まれる。
【００７９】
一態様では、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は、配列番号７３のＨＣＤＲ１、配列番号７４のＨＣＤＲ２、及び配列番号７５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域配列（ＶＨＣＤ２０）、並びに配列番号７６のＬＣＤＲ１、配列番号７７のＬＣＤＲ２、及び配列番号７８のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域配列（ＶＬＣＤ２０）を含む。別の態様では、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は、非操作抗体と比較して、Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の割合が増加するように操作されている。一態様では、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体のＦｃ領域において、少なくとも約４０％のＮ結合型オリゴ糖が非フコシル化されている。
【００８０】
特定の態様では、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体はオビヌツズマブである（推奨国際一般名、WHO Drug Information, Vol. 26, No. 4, 2012, p. 453）。本明細書で使用される場合、オビヌツズマブは、ＧＡ１０１と同義である。商品名は、ＧＡＺＹＶＡ（登録商標）又はＧＡＺＹＶＡＲＯ（登録商標）である。これは、すべての旧バージョン（例えば、Vol. 25, No. 1, 2011, p.75-76）を置き換え、以前はアフツズマブとして知られていたものである（推奨国際一般名、WHO Drug Information, Vol. 23, No. 2, 2009, p. 176; Vol. 22, No. 2, 2008, p. 124）。一態様では、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は、配列番号７９の重鎖可変領域配列及び配列番号８０の軽鎖可変領域配列を含む。一態様では、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は、トシツモマブである。
【００８１】
「Ｉ型抗ＣＤ２０抗体」とは、リツキシマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、オカラツズマブ、オクレリズマブ、ＰＲＯ１３１９２１、ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ、ＨＩ４７  ＩｇＧ３（ＥＣＡＣＣ、ハイブリドーマ）、２Ｃ６  ＩｇＧ１（国際公開第２００５／１０３０８１号に開示）、２Ｆ２  ＩｇＧ１  国際公開第２００４／０３５６０７号及び同第２００５／１０３０８１号に開示）及び２Ｈ７  ＩｇＧ１（国際公開第２００４／０５６３１２号に開示）からなる群から選択される抗ＣＤ２０抗体を意味する。特定のＩ型抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブである。
【００８２】
「リツキシマブ」は、ヒトＣＤ２０抗原に対する遺伝子操作キメラヒトガンマ１マウス定常ドメイン含有モノクローナル抗体である。このキメラ抗体は、ヒトガンマ１定常ドメインを含み１９９８年４月１７日に発行され、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに付与された米国特許第５７３６１３７号（Ａｎｄｅｒｓｅｎ等）の「Ｃ２Ｂ８」という名称で同定されている。リツキシマブは、再発性又は難治性の低悪性度又は濾胞性のＣＤ２０陽性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫の患者の治療に対して承認されている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ作用機序研究は、リツキシマブがヒト補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を呈することを示している（Reff, M.E., et. al., Blood 83 (1994) 435-445）。加えて、リツキシマブは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を測定するアッセイにおいて有意な活性を示す。リツキシマブはアフコシル化されていない。
【００８３】
用語「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、ＩｇＧ１由来のヒト定常ドメインとのキメラ化及びその後のヒト化によって、マウスモノクローナル抗ＣＤ２０抗体Ｂ−Ｌｙ１（マウス重鎖の可変領域（ＶＨ）：配列番号６４；マウス軽鎖の可変領域（ＶＬ）：配列番号６５）（Poppema, S. and Visser, L., Biotest Bulletin 3(1987) 131-139を参照）から得られた、国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号に開示されているようなヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体を指す（国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号参照）。これらの「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号に詳細に開示されている。
【００８４】
用語「線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）」は、プロリルエンドペプチダーゼＦＡＰ又はセプラーゼ（ＥＣ３．４．２１）としても知られ、特に明記しない限り、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＦＡＰを指す。その用語は、「完全長」の未処理のＦＡＰ並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＦＡＰを包含する。この用語は、天然に存在するＦＡＰの変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス及び／又はカニクイザルＦＡＰに特異的に結合することができる。ヒトＦＡＰのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）アクセッション番号Ｑ１２８８４（バージョン１４９、配列番号１２０）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿００４４５１に示されている。ヒトＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６０に及ぶ。Ｈｉｓタグ付きヒトＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列は、配列番号１２１に示されている。マウスＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ９７３２１（バージョン１２６、配列番号１２２）、又はＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿０３２０１２に示されている。マウスＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６１に及ぶ。配列番号１２３は、Ｈｉｓタグ付きマウスＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列を示している。配列番号１２４は、Ｈｉｓタグ付きカニクイザルＦＡＰ  ＥＣＤのアミノ酸配列を示している。好ましくは、本発明の抗ＦＡＰ結合分子はＦＡＰの細胞外ドメインに結合する。例示的な抗ＦＡＰ結合分子は、国際特許出願番号ＷＯ２０１２／０２０００６Ａ２に記載されている。
【００８５】
用語「減少／低減（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」（及びその文法的変形、例えば「減少する／低減する（ｒｅｄｕｃｅ／ｒｅｄｕｃｉｎｇ）」）、例えばＢ細胞の数の減少又はサイトカイン放出の低減は、当技術分野において公知の適切な方法によって測定される、それぞれの量の減少を指す。明確にするために、この用語には、ゼロ（又は分析方法の検出限界未満）への減少、すなわち完全な消失又は排除も含まれる。逆に、「増加／増大した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）とは、それぞれの量の増加を指す。
【００８６】
本明細書において使用される「Ｔ細胞抗原」は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の表面に提示される抗原決定基を指す。
【００８７】
本明細書において使用される「Ｔ細胞活性化治療剤」は、対象においてＴ細胞活性化を誘導することができる治療剤、特に対象においてＴ細胞活性化を誘導するために設計された治療剤を指す。Ｔ細胞活性化治療剤の例には、ＣＤ３などの活性化Ｔ細胞抗原、及びＣＤ２０又はＣＤ１９などの標的細胞抗原に特異的に結合する二重特異性抗体が含まれる。さらなる例には、Ｔ細胞活性化ドメインと、ＣＤ２０又はＣＤ１９といった標的細胞抗原に特異的に結合する抗原結合部分とを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が含まれる。
【００８８】
本明細書において使用される「活性化Ｔ細胞抗原」は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球によって発現される抗原決定基を指し、これは抗原結合分子との相互作用によりＴ細胞活性化を誘導又は増強することができる。具体的には、抗原結合分子と活性化Ｔ細胞抗原との相互作用は、Ｔ細胞受容体複合体のシグナル伝達カスケードをトリガーすることにより、Ｔ細胞活性化を誘導することができる。例示的な活性化Ｔ細胞抗原はＣＤ３である。
【００８９】
用語  「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗原結合分子の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は、一般的に類似の構造を有し、各ドメインは４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照のこと。抗原結合特異性を付与するためには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分な場合がある。
【００９０】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であり、かつ／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般に、天然の４鎖抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は相補性決定領域（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は最も高い配列可変性を有し、かつ／又は抗原認識に関与している。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）において生じる（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５及びＨ３の９５−１０２において生じる（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。超可変領域（ＨＶＲ）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して本明細書では互換的に使用される。この特定の領域は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」 (1983)及びChothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)に記載されており、ここでの定義には、互いに対して比較されたときのアミノ酸残基の重複又はサブセットが含まれる。それにもかかわらず、抗体又はその変異体のＣＤＲを指す定義のいずれかの適用は、本明細書で定義され、使用される用語の範囲内であることを意図している。上記で引用した参考文献のそれぞれによって定義されるＣＤＲを含む適切なアミノ酸残基を、比較として以下の表Ｂに示す。特定のＣＤＲを包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列及び大きさに応じて変わるであろう。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられれば、どの残基が特定のＣＤＲを構成するかを日常的に決定することができる。
【００９１】
2021515782.tif 000003
【００９２】
また、Ｋａｂａｔらは、任意の抗体に適用可能な可変領域配列のための番号付けシステムを定義した。当業者は、配列自体を超える実験データに依存することなく、この「Ｋａｂａｔ番号付け」のシステムを任意の可変領域配列に明確に割り当てることができる。ここで使用される「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, ”Sequence of Proteins of Immunological Interest” (1983)によって示された番号付けシステムを指す。特に明記しない限り、抗体可変領域内の特定のアミノ酸残基位置の番号付けへの参照は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従っている。
【００９３】
ＶＨのＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲはまた、抗原と接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」を含む。ＳＤＲは、短縮型（ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ−）ＣＤＲ又はａ−ＣＤＲと称されるＣＤＲの領域内に含まれている。例示的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８及びＨ３の９５−１０２において生じる（Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照）。特に明記しない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では上記のＫａｂａｔらに従って番号付けされている。
【００９４】
本明細書において抗原結合分子（例えば抗体）の文脈で使用される用語「親和性成熟」は、参照抗原結合分子に由来し、例えば変異により、参照抗体と同じ抗原に、好ましくは同じエピトープに結合し；参照抗原結合分子の抗原に対する親和性よりも高い親和性を有する抗原結合分子を指す。親和性成熟は一般に、抗原結合分子の１つ又は複数のＣＤＲにおける１つ又は複数のアミノ酸残基の修飾を含む。典型的には、親和性成熟抗原結合分子は、最初の参照抗原結合分子と同じエピトープに結合する。
【００９５】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は一般に、ＶＨ（又はＶＬ）の次の配列：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４に現れる。
【００９６】
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含み得るか、又はそれはアミノ酸配列の変化を含み得る。いくつかの実施態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【００９７】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。
【００９８】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体には５つの主要なクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００９９】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここではＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のすべて又は実質的にすべてが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲのすべて又は実質的にすべてがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定数領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。本発明により包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して本発明による特性を生成するように定常領域が追加的に修飾されているもの又は元の抗体から変更されているものである。
【０１００】
「ヒト」抗体は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリーや他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のものに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【０１０１】
本明細書の用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、ＩｇＧ  ＣＨ２及びＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基に及ぶ。一実施態様では、糖鎖がＣＨ２ドメインに結合している。本明細書のＣＨ２ドメインは、天然配列ＣＨ２ドメイン又は変異体ＣＨ２ドメインであり得る。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域のＣ末端からＣＨ２ドメインまでのひと続きの残基（すなわち、ＩｇＧの約３４１位のアミノ酸残基から約４４７位のアミノ酸残基まで）を含む。本明細書におけるＣＨ３領域は、天然配列のＣＨ３ドメイン又は変異体ＣＨ３ドメイン（例えば、一方の鎖に「隆起」（「ノブ」）が導入され、他方の鎖に対応する「空洞」（「ホール」）が導入されたＣＨ３ドメイン；参照により本明細書に明示的に組み込まれる米国特許第５８２１３３３号を参照）であり得る。そのような変異体ＣＨ３ドメインは、本明細書に記載されるように、２つの同一でない抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進するために使用され得る。一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端にまで及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても、存在しなくてもよい。本明細書に特に明記しない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従っている。
【０１０２】
ノブ・イントゥー・ホール技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；米国特許第７６９５９３６号；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載される。一般に、この方法は、第１のポリペプチドの接触面において隆起（「ノブ」）及び第２のポリペプチドの接触面において対応する空洞（「ホール」）を導入することを含み、その結果、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように、隆起が空洞内に配置することができる。隆起は、第１のポリペプチドの接触面から小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置換することによって構築される。隆起と同一か又は類似のサイズの相補的空洞が、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置換することによって、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的変異誘発により、又はペプチド合成により改変することにより作り出すことができる。特定の実施態様では、ノブ修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのもう一方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。さらなる特定の実施態様では、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃをさらに含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃをさらに含む。これら２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃ領域の２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、したがって二量体をさらに安定化する（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【０１０３】
「免疫グロブリンのＦｃ領域と同等の領域」は、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然に存在する対立遺伝子変異体、並びに置換、付加、又は欠失を生じさせるが、免疫グロブリンのエフェクター機能（抗体依存性細胞傷害など）の媒介能を実質的に低下させない改変を有する変異体を含むことを意図している。例えば、１つ又は複数のアミノ酸を、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から、生物学的機能を実質的に失うことなく欠失させることができる。そのような変異体は、活性に対する影響が最小限であるように、当技術分野で公知の一般的な規則に従って選択することができる（例えば、Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-10 (1990)を参照のこと）。
【０１０４】
用語「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプによって異なる、抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞の活性化が含まれる。
【０１０５】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域の結合に続いて、エフェクター機能を実行するように受容体保有細胞を刺激するシグナル伝達現象を生じさせるＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。特定の活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０８６３７、バージョン１４１を参照）。
【０１０６】
本明細書において使用される用語「エフェクター細胞」は、エフェクター部分受容体、例えばサイトカイン受容体、及び／又はＦｃ受容体を表面上に提示し、それによりエフェクター部分、例えばサイトカイン、及び／又は抗体のＦｃ領域に結合して標的細胞、例えば腫瘍細胞の破壊に寄与するリンパ球の集団を指す。エフェクター細胞は、例えば細胞傷害性又は食作用効果を媒介する。エフェクター細胞には、限定されないが、エフェクターＴ細胞、例えばＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞及びマクロファージ／単球が含まれる。
【０１０７】
「エクトドメイン」は、細胞外空間（すなわち標的細胞外の空間）中に延びる膜タンパク質のドメインである。エクトドメインは通常、表面との接触を開始するタンパク質の部分であり、シグナル伝達をもたらす。したがって、本明細書で定義される４−１ＢＢＬのエクトドメインは、細胞外空間（細胞外ドメイン）中に延びる４−１ＢＢＬの部分を指すが、三量体化及び対応する受容体４−１ＢＢへの結合に関与するそのより短い部分又はその断片も含まれる。したがって、用語「４−１ＢＢＬのエクトドメイン又はその断片」は、細胞外ドメインを形成する４−１ＢＢＬの細胞外ドメイン又は受容体に依然として結合することができるその部分（受容体結合ドメイン）を指す。
【０１０８】
「４−１ＢＢＬ」又は「４−１ＢＢリガンド」又は「ＣＤ１３７Ｌ」は、Ｔ細胞の増殖及びサイトカイン産生を共刺激することができる共刺激性ＴＮＦリガンドファミリーメンバーである。共刺激性ＴＮＦファミリーリガンドは、対応するＴＮＦ受容体と相互作用するとＴＣＲシグナルを共刺激することができ、それらの受容体との相互作用は、Ｔ細胞活性化をもたらすシグナル伝達カスケードを開始するＴＮＦＲ関連因子（ＴＲＡＦ）の動員につながる。４−１ＢＢＬはＩＩ型膜貫通タンパク質である。配列番号６６のアミノ酸配列を有する完全又は完全長４−１ＢＢＬは、細胞の表面上に三量体を形成することが記載されている。三量体の形成は、４−１ＢＢＬのエクトドメインの特定のモチーフにより可能になる。前記モチーフは、本明細書では、「三量体化領域」と命名される。ヒト４−１ＢＢＬ配列（配列番号６７）のアミノ酸５０−２５４は、４−１ＢＢＬの細胞外ドメインを形成するが、その断片も三量体を形成することができる。本発明の特定の実施態様では、用語「４−１ＢＢＬのエクトドメイン又はその断片」は、配列番号４（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸５２−２５４）、配列番号１（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸７１−２５４）、配列番号３（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８０−２５４）、配列番号２（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８５−２５４）、配列番号５（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸７１−２４８）、配列番号６（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８５−２４８）、配列番号７（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８０−２４８）及び配列番号８（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸５２−２４８）から選択されるアミノ酸を有するポリペプチドを指すが、三量体化が可能なエクトドメインの他の断片も本明細書に含まれる。
【０１０９】
本明細書で使用される用語「４−１ＢＢ」又は「ＣＤ１３７」は、特に明記しない限り、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然４−１ＢＢを指す。その用語は、「完全長」の未処理の４−１ＢＢだけでなく、細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態の４−１ＢＢを含む。その用語はまた、４−１ＢＢの天然に生じる変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を含む。例示的なヒト４−１ＢＢのアミノ酸配列は、配列番号６８（ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｑ０７０１１）に示されており、例示的なマウス４−１ＢＢのアミノ酸配列は配列番号６９（ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ２０３３４）に示されており、例示的なカニクイザル４−１ＢＢのアミノ酸配列（アカゲザル由来）は配列番号７０（ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｆ６Ｗ５Ｇ６）に示されている。
【０１１０】
用語「抗４−１ＢＢ抗体」、「抗４−１ＢＢ」、「４−１ＢＢ抗体」及び「４−１ＢＢに特異的に結合する抗体」は、その抗体が４−１ＢＢを標的とする際に診断薬及び／又は治療剤として有用であるように、十分な親和性で４−１ＢＢに結合することができる抗体を指す。一実施態様では、抗４−１ＢＢ抗体の、無関係な、非４−１ＢＢタンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって測定される場合、抗体の４−１ＢＢへの結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、４−１ＢＢに結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−６Ｍ以下、例えば１０−６８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−８Ｍから１０−１０Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。例えば、ウレルマブは抗体２０Ｈ４．９に由来する抗４−１ＢＢ抗体である。
【０１１１】
用語「ペプチドリンカー」は、１つ又は複数のアミノ酸、典型的には約２から２０個のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは当技術分野において公知であるか、又は本明細書に記載される。適切な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーであり、ここで「ｎ」は通常１から１０、典型的には２から４の数字、特に２であり、すなわち、ＧＧＧＧＳ（配列番号８１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８２）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号８３）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号８４）から成る群から選択されるペプチドであるが、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号８５）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号８６）、（Ｇ４Ｓ）４（配列番号８７）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号８８）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号８９）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号９０）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号９１）、ＧＧＳＧ（配列番号９２）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号９３）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号９４）及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号９５）も含む。特に興味深いペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）（配列番号８１）及び（Ｇ４Ｓ）２（配列番号８２）である。
【０１１２】
本出願の中で使用される場合、用語「アミノ酸」は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシαアミノ酸の群を意味する。
【０１１３】
「融合された」又は「連結された」とは、成分（例えば、４−１ＢＢＬのエクトドメイン及びポリペプチド）が、直接又は１つ又は複数のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合によって連結されることを意味する。
【０１１４】
参照ポリペプチド（タンパク質）配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、最大の配列同一性パーセントを得るように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の百分率として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ．ＳＡＷＩ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。また、ＡＬＩＧＮ−２は、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であるか、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）のＶ４．０Ｄを含むＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされていなければならない。すべての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Ａは、所与のアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して特定の％アミノ酸配列同一性を有するか又は含む所与のアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
１００×分率Ｘ／Ｙ
ここで、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、そのプログラムのＡとＢとの配列比較において、完全一致を記録したアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したように得られる。
【０１１５】
特定の実施態様では、本明細書に提供される抗原結合分子のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗原結合分子の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗原結合分子のアミノ酸配列変異体は、分子をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することにより、又はペプチド合成により調製することができる。そのような修飾には、例えば抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又はそれへの挿入、及び／又はそれの置換が含まれる。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを、最終構築物が所望の特性、例えば、抗原結合を有することを条件として、最終構築物に到達するために行うことができる。置換突然変異誘発のための目的の部位には、ＨＶＲ及びフレームワーク（ＦＲ）が含まれる。保存的置換は、表Ｃにおいて「好ましい置換」の見出しの下で提供され、アミノ酸側鎖クラス（１）〜（６）を参照して以下にさらに記載される。アミノ酸置換を目的の分子に導入することができ、その生成物を、所望の活性、例えば抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善についてスクリーニングすることができる。
【０１１６】
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【０１１７】
アミノ酸は共通の側鎖特性に従ってグループ分けすることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ．
【０１１８】
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを必要とするであろう。
【０１１９】
用語「アミノ酸配列変異体」は、親抗原結合分子（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ又は複数の超可変領域残基にアミノ酸置換が存在する実質的変異体を含む。一般に、さらなる研究のために選択された得られた変異体は、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性の修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、かつ／又は親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持するであろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載のものなどファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を使用して簡便に生成することができる。簡潔には、１つ又は複数のＣＤＲ残基が変異され、変異体抗原結合分子がファージ上に提示され、特定の生物活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングされる。特定の実施態様では、置換、挿入又は欠失は、そのような改変が抗原結合分子が抗原に結合する能力を実質的に低減させない限り、１つ又は複数のＣＤＲで起こり得る。例えば、実質的に結合親和性を低減させない保存的改変（例えば本明細書において提供される保存的置換）が、ＨＶＲにおいて行われ得る。突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085により記載されているように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基のうちの残基又は群（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）により置換される。そのアミノ酸位置にさらなる置換を導入して、最初の置換に対する機能的感受性を実証することができる。別法として又はそれに加えて、抗体と抗原との接触点を特定するための抗原−抗原結合分子複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされてもよいし、又は排除されてもよい。変異体は、所望の特性を含むかどうかを判定するためにスクリーニングされ得る。
【０１２０】
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗原結合分子が含まれる。分子の他の挿入変異体には、抗原結合分子の血清半減期を増加させるポリペプチドへのＮ末端又はＣ末端への融合が含まれる。
【０１２１】
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗原結合分子は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるように改変される。分子のグリコシル化変異体は、１つ又は複数のグリコシル化部位が生成又は除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって簡便に得ることができる。抗原結合分子がＦｃ領域を含む場合、それに結合している糖は改変され得る。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ結合によって通常結合している分枝状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖には、様々な糖、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの実施態様では、特定の改善された特性を有する変異体を作製するために、抗原結合分子中のオリゴ糖の修飾が行われ得る。一態様では、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）結合するフコースを欠いた糖鎖構造を有する抗原結合分子の変異体が提供される。そのようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Presta, L.）又は米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照のこと。本発明の抗原結合分子のさらなる変異体は、二分されたオリゴ糖を含むもの、例えば、Ｆｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されているものを含む。そのような変異体は、フコシル化が低減されている可能性があり、かつ／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有する可能性がある。例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Jean-Mairet等）；米国特許第６６０２６８４号（Umana等）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Umana等）を参照のこと。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を有する変異体も提供される。そのような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有してもよく、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Patel等）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Raju, S.）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Raju, S.）に記載されている。
【０１２２】
特に接頭辞「糖（ｇｌｙｃｏ）」を伴う「操作」、並びに用語「グリコシル化操作」は、細胞内で発現される糖タンパク質のグリコシル化の変化を達成するためのオリゴ糖合成経路の遺伝子操作を含む、細胞のグリコシル化機構の代謝操作を含む。さらに、グリコシル化操作には、グリコシル化に対する変異と細胞環境の影響が含まれる。一実施態様では、グリコシル化操作は、グリコシルトランスフェラーゼ活性の改変である。特定の実施態様では、操作は、グルコサミニルトランスフェラーゼ活性及び／又はフコシルトランスフェラーゼ活性の改変をもたらす。グリコシル化操作を使用して、「増加したＧｎＴＩＩＩ活性を有する宿主細胞」（例えば、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有する１つ又は複数のポリペプチドの増加したレベルを発現するように操作された宿主細胞）、「増加したＭａｎＩＩ活性を有する宿主細胞」（例えば、α−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）活性を有する１つ又は複数のポリペプチドの増加したレベルを発現するように操作された宿主細胞）、又は「低減したα（１，６）フコシルトランスフェラーゼ活性を有する宿主細胞」（例えば低減したレベルのα（１，６）フコシルトランスフェラーゼを発現するように操作された宿主細胞）を得ることができる。
【０１２３】
本明細書において使用される用語「ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチド」は、Ｎ結合型オリゴ糖のトリマンノシルコアのβ結合型マンノシドへのβ−１，４の結合中のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基の付加を触媒することができるポリペプチドを指す。これには、特定の生物学的アッセイで測定した場合に、用量依存性あり又はなしで、国際生化学分子生物学連合の命名委員会（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）によればβ−１，４−マンノシル−糖タンパク質４−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．１４４）としても知られる、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩの活性に必ずしも同一ではないが類似の酵素活性を示す融合ポリペプチドが含まれる。用量依存性が存在する場合、それはＧｎＴＩＩＩのものと同一である必要はなく、むしろＧｎＴＩＩＩと比較して所与の活性における用量依存性と実質的に類似している必要がある（すなわち、候補ポリペプチドは、ＧｎＴＩＩＩと比較して、より高い活性を示すか、又は約２５分の１以下、好ましくは約１０分の１以下の活性、最も好ましくは約３分の１以下の活性を示すであろう）。
【０１２４】
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクター細胞による抗体被覆標的細胞の溶解につながる免疫機構である。標的細胞は、一般にＦｃ領域のＮ末端であるタンパク質部分を介して、Ｆｃ領域を含む抗体又はその断片が特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される用語「増加した／減少したＡＤＣＣ」は、標的細胞を囲む媒質中の所定の抗体濃度において、上記に定義したＡＤＣＣの機構により所定の時間内に溶解する標的細胞数の増加／減少、及び／又はＡＤＣＣの機構により所定の時間内に所定の数の標的細胞を溶解させるために必要な、標的細胞を囲む媒質中の抗体濃度の低下／上昇のいずれかと定義される。増加した／減少したＡＤＣＣは、同じ標準的な生成、精製、製剤化、及び貯蔵方法（当業者に既知の）を用いて、但し改変されていない、同じ型の宿主細胞により産生される同じ抗体により媒介されるＡＤＣＣに対するものである。例えば、本明細書に記載の方法により、改変されたグリコシル化パターンを有するように（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、ＧｎＴＩＩＩ、又は他のグリコシルトランスフェラーゼを発現するように）操作された宿主細胞によって産生される抗体によって媒介されるＡＤＣＣの増加は、同じ種類の非操作宿主細胞によって産生された同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣに対するものである。
【０１２５】
特定の態様では、本発明は、すべてではないがいくつかのエフェクター機能を有し、それにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗体の半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能（例えば補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ））が不要又は有害である用途のための望ましい候補となる、抗体変異体を意図している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性アッセイを、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣの活性の低下／枯渇を確認するために実施することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、抗体が、ＦｃγＲ結合を欠く（したがっておそらくＡＤＣＣ活性を欠く）がＦｃＲｎ結合能力を保持することを確かめることができる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、一方単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)の４６４ページの表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの他の例が、米国特許第５５００３６２号；Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)及びHellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；米国特許第５８２１３３７号；Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えばフローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩを参照のこと）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは又はそれに加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998)に開示されるように、例えば動物モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで評価することができる。抗体がＣ１ｑに結合できず、したがってＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを実施することもできる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)；及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照のこと）。ＦｃＲｎ結合及びｉｎ  ｖｉｖｏでのクリアランス／半減期の決定も、当技術分野で公知の方法を用いて行うことができる（例えば、Petkova, S.B. et al., Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)；国際公開第２０１３／１２０９２９号を参照のこと）。
【０１２６】
エフェクター機能が低下した抗体は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９のうちの１つ又は複数の置換を伴うものを含む（米国特許第６７３７０５６号）。このようなＦｃ変異体には、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含め、アミノ酸２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７位のうちの２つ以上において置換を有するＦｃ変異体が含まれる（米国特許第７３３２５８１号）。ＦｃＲへの結合が改善又は減少した特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照）。特定の実施態様では、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えばＦｃ領域の２９８、３３３及び／又は３３４位（残基のＥＵ番号付け）における置換を有するＦｃ領域を含む。
【０１２７】
特定の態様では、抗体変異体は、ＦｃγＲ結合を減少させる１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２３４位及び２３５位での置換（残基のＥＵ番号付け）を有するＦｃ領域を含む。一態様では、置換はＬ２３４ＡとＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）である。特定の態様では、抗体変異体は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域内にＤ２６５Ａ及び／又はＰ３２９Ｇをさらに含む。一態様では、置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域内のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡ−ＰＧ）である（例えば、国際公開第２０１２／１３０８３１号を参照のこと）。別の態様では、置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域内のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＤ２６５Ａ（ＬＡＬＡ−ＤＡ）である。
【０１２８】
いくつかの実施態様では、Ｆｃ領域において、例えば米国特許第６１９４５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)に記載のように、改変された（すなわち改善されたか減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらす改変がなされる。
【０１２９】
半減期が延長され、胎児への母性ＩｇＧの移動を担う（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合性が改善された抗体が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号（Hinton等）に記述されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する１つ又は複数の置換を伴うＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体には、Ｆｃ領域残基２３８、２５２、２５４、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４のうちの１つ又は複数における置換を有するものが含まれる（例えば米国特許第７３７１８２６号；Dall’Acqua, W.F., et al. J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524を参照）。
【０１３０】
特定の態様では、抗体変異体は、ＦｃＲｎ結合を低減する１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２５３位、及び／又は３１０位、及び／又は４３５位（残基のＥＵ番号付け）における置換を含むＦｃ領域を含む。特定の態様では、抗体変異体は、２５３位、３１０位及び４３５位にアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。一態様では、置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域内のＩ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａである。例えば、Grevys, A., et al., J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508を参照のこと。
【０１３１】
別の態様では、抗体変異体は、ＦｃＲｎ結合を低減する１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の３１０位、及び／又は４３３位、及び／又は４３６位（残基のＥＵ番号付け）における置換を含むＦｃ領域を含む。特定の態様では、抗体変異体は、３１０位、４３３位及び４３６位にアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。一態様では、置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域内のＨ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａである（例えば、国際公開第２０１４／１７７４６０を参照のこと）。
【０１３２】
特定の態様では、抗体変異体は、ＦｃＲｎ結合を増大させる１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２５２位、及び／又は２５４位、及び／又は２５６位（残基のＥＵ番号付け）における置換を含むＦｃ領域を含む。特定の実施態様では、抗体変異体は、２５２位、２５４位及び２５６位にアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。一実施態様では、置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域内のＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅである（Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第５６４８２６０号；同第５６２４８２１号；及びＦｃ領域変異体の他の例については国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと）。
【０１３３】
特定の実施態様では、本発明の抗原結合分子のシステイン操作変異体（ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｖａｒｉａｎｔ）、例えば分子の１つ又は複数の残基がシステイン残基で置換された「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作成することが望ましい場合がある。特定の実施態様では、置換される残基は分子の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体の接近可能な部位に配置され、その反応性チオール基を使用して抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカー−薬物部分に結合させ、イムノコンジュゲートを作成することができる。特定の実施態様では、以下の残基のうちのいずれかの１つ又は複数がシステインで置換される：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作抗原結合分子は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。
【０１３４】
特定の態様では、本明細書に提供される抗原結合分子は、当技術分野で公知であり、容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むようにさらに修飾することができる。抗体の誘導体化に適した部分には、水溶性ポリマーが含まれるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマー）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール並びにこれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーは任意の分子量のものであってよく、分枝鎖又は非分枝鎖であってよい。抗体に付着するポリマーの数は変化してよく、１つを超えるポリマーが付着する場合、それらは同じ分子でも又は異なる分子でもよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、改善されるべき抗体の特定の特性又は機能、二重特異性抗体誘導体が限定条件下での治療に使用されるかどうかなどを含むが、これらに限定されない考慮事項に基づいて決定することができる。別の態様では、抗体と、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る非タンパク質性部分とのコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質性部分はカーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605）。放射線は、任意の波長であってよく、限定しないが、通常の細胞に害を与えないが抗体−非タンパク質部分の近位細胞を死滅させる温度に非タンパク質部分を加熱する波長を含む。別の態様では、本明細書に提供される４−１ＢＢＬ含有抗原結合分子のイムノコンジュゲートが得られる。「イムノコンジュゲート」は、細胞傷害性剤を含むがそれに限定されない、１つ又は複数の異種分子にコンジュゲートした抗体である。
【０１３５】
用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来ＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は非一般的な結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含み得る。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の１つ又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
【０１３６】
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドとは、その天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。例えば、ベクターに含まれるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを、本発明の目的のために単離することが考慮される。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞内に維持される組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の（部分的に又は実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外に、又は天然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏの本発明のＲＮＡ転写物、並びにプラス鎖型及びマイナス鎖型、及び二重鎖型を含む。本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成により生成されたそのような分子をさらに含む。さらに、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターなどの調節エレメントであり得るか、又はそれらを含み得る。
【０１３７】
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば、９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチド配列がその参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドごとに５個までの点突然変異を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列がその参照配列と同一であることを意味する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが削除され又は別のヌクレオチドで置換されても良く、又は参照配列に含まれるすべてのヌクレオチドの最大５％までの複数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてもよい。参照配列のこのような改変は、参照ヌクレオチド配列の５’若しくは３’末端位置で、又はこれら末端位置の間のどの位置で起こってもよく、参照配列中の残基間に個々に散在してもよいし、又は参照配列内に１つ若しくは複数の連続した群として散在してもよい。実際問題として、特定のポリヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上述したもの（例えばＡＬＩＧＮ−２）などの既知のコンピュータプログラムを用いて慣例的に判定することができる。
【０１３８】
用語「発現カセット」は、組換え的又は合成的に生成されたポリヌクレオチドであって、標的細胞における特定の核酸の転写を可能にする一連の指定された核酸要素を有するものを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片中に組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、他の配列の中でも、転写される核酸配列及びプロモーターが含まれる。特定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
【０１３９】
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞内においてそれが作動可能に結合する特定の遺伝子を導入し、その発現を誘導するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及びそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞の転写及び／又は翻訳機構により産生される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
【０１４０】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、それには初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一でなくてもよく、突然変異を含んでいてもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本明細書において含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するために使用することができる任意の種類の細胞系である。宿主細胞には、培養細胞、例えばいくつか例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞等の哺乳動物の培養細胞、又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞が含まれるだけでなく、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含まれる。
【０１４１】
薬剤の「有効量」は、それが投与される細胞又は組織中に生理的変化をもたらすために必要な量を指す。
【０１４２】
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、疾患の有害作用を、例えば、排除する、減少させる、遅延させる、最小化する、又は防止する。
【０１４３】
「個体」又は「対象」とは、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特に、個体又は対象はヒトである。
【０１４４】
用語「薬学的組成物」は、その中に含まれる活性成分の生物活性が有効であることを可能にするような形態であって、製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性である付加的成分を含まない調製物を指す。
【０１４５】
「薬学的に許容される添加物」は、薬学的組成物中の活性成分以外の成分で、対象に対して非毒性である成分を指す。薬学的に許容される添加物には、限定されないが、バッファー、安定剤又は保存剤が含まれる。
【０１４６】
用語「添付文書」は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、そのような治療製品の適応症、用法、用量、投与、併用療法、使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
【０１４７】
本明細書で用いられる場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など、その文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために行うことも、臨床病理の過程において行うこともできる。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様では、本発明の分子は、疾患の発症を遅延させるか、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
【０１４８】
本明細書において用いられる用語「がん」は、リンパ腫又はリンパ性白血病、又は黒色腫といった増殖性疾患を指す。
【０１４９】
「Ｂ細胞増殖性疾患」とは、健康な対象のＢ細胞の数と比較して、患者のＢ細胞の数が増加する疾患、特に、Ｂ細胞の数の増加が病気の原因又は特徴である疾患を意味する。「ＣＤ２０陽性Ｂ細胞増殖性疾患」は、Ｂ細胞、特に（通常のＢ細胞に加えて）悪性Ｂ細胞がＣＤ２０を発現するＢ細胞増殖性疾患である。例示的なＢ細胞増殖性疾患には、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、並びにいくつかの種類の多発性骨髄腫（ＭＭ）及びホジキンリンパ腫（ＨＬ）が含まれる。
【０１５０】
本発明における使用のための例示的４−１ＢＢアゴニスト
特に、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせて使用される、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬを含む分子である。特に、本発明で使用される４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む。
【０１５１】
特定の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む分子であり、ここで、４−１ＢＢＬのエクトドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【０１５２】
本明細書では、４−１ＢＢアゴニストが、腫瘍標的、特にＢ細胞上の標的に特異的な抗原結合ドメインを含む場合に特に有用であることが示されている。したがって、別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である。
【０１５３】
本明細書ではさらに、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストが、ＣＤ１９によりＢ細胞中に内部移行されず、したがって腫瘍微小環境と相互作用する能力を失わなかったことが示された。さらなる態様では、Ｂ細胞に内部移行されず、それによってその活性を維持する４−１ＢＢアゴニストが提供される。
【０１５４】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分とを含む抗原結合分子であり、ここで、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、ｃｙｎｏ−交差反応性であり、すなわち、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、ヒト及びカニクイザルＣＤ１９に特異的に結合する。
【０１５５】
さらなる態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分とを含む抗原結合分子であり、ここで、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む。
【０１５６】
特定の態様では、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
【０１５７】
さらなる態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ここで、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含むか、又は、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む。より具体的には、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む。
【０１５８】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインをさらに含む抗原結合分子である。一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である。特に、４−１ＢＢアゴニストは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である。特定の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である。
【０１５９】
一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含む。
【０１６０】
特定の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする。
【０１６１】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含むＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【０１６２】
特定の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号３９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｄ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｅ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｆ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号４５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号４６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｇ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｈ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号４９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号５０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｊ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｋ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；並びに
ｌ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号５１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子
からなる群から選択される抗原結合分子である。
【０１６３】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である。
【０１６４】
一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む抗原結合分子であり、ここで、ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドは、任意選択的にペプチドリンカーを介して、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方のＮ又はＣ末端アミノ酸に融合される。
【０１６５】
特定の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子、
（ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子、
（ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子、及び
（ｄ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子
からなる群から選択される抗原結合分子である。
【０１６６】
さらなる態様では、４−１ＢＢアゴニストは抗ＣＤ１９／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である。
【０１６７】
さらなる態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）
を含む。
【０１６８】
特定の態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。
【０１６９】
さらなる態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ここで、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１０９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むか、又は、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号１１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。より具体的には、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号１１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。
【０１７０】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインをさらに含む抗原結合分子である。一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である。特に、４−１ＢＢアゴニストは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である。特定の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である。
【０１７１】
一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含む。
【０１７２】
特定の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする。
【０１７３】
特定の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、配列番号１１２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖を含む分子、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖からなる群から選択される抗原結合分子である。
【０１７４】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である。
【０１７５】
特定の二重特異性抗体は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１６／０７５２７８Ａ１又はＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１６／１５６２９１Ａ１に記載されている。
【０１７６】
さらなる態様では、４−１ＢＢアゴニストは抗ＦＡＰ／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である。
【０１７７】
本発明における使用のための抗原結合分子の調製
特定の態様では、組み合わせで使用される治療剤は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体を含む。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の態様では、結合特異性は異なる抗原に対するものである。特定の態様では、結合特異性は、同じ抗原上の異なるエピトープに対するものである。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
【０１７８】
多重特異性抗体を作製するための技術には、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照）及び「ノブ・イン・ホール」エンジニアリング（例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照）が含まれる。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ−ヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４号）；２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４６７６９８０号、及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照）；二重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)を参照）；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照）；単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照）；及び、例えば、Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作製することができる。
【０１７９】
「オクトパス抗体」を含む３つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作抗体も本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６号を参照）。
【０１８０】
本明細書における抗体又は断片は、２つの異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用性ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」も含む（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号を参照）。本明細書には「Ｃｒｏｓｓｍａｂ」抗体も含まれる（例えば国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５２号、国際公開第２００９／０８０２５３号、又は国際公開第２００９／０８０２５４号を参照）。
【０１８１】
二重特異性抗体断片を作製するための別の技術は、「二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー」又はＢｉＴＥ（登録商標）手法である（例えば、国際公開第２００４／１０６３８１号、国際公開第２００５／０６１５４７号、国際公開第２００７／０４２２６１、及び国際公開第２００８／１１９５６７号を参照）。この手法は、単一のポリペプチド上に配置される２つの抗体可変ドメインを利用する。例えば、単一ポリペプチド鎖は、各々が、２つのドメイン間の分子内会合を可能にするために十分な長さのポリペプチドリンカーにより分離された可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを有する、２つの短鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片を含む。この単一ポリペプチドは、２つのｓｃＦｖ断片の間にポリペプチドスペーサー配列をさらに含む。各ｓｃＦｖは異なるエピトープを認識し、各ｓｃＦｖがその同族エピトープと結合したときに、２つの異なる細胞型の細胞が近接するか又は繋がるように、これらのエピトープは異なる細胞型に特異的であり得る。この手法の特定の一実施態様には、例えば、悪性細胞又は腫瘍細胞などの標的細胞によって発現される細胞表面抗原を認識する別のｓｃＦｖに結合した、Ｔ細胞上のＣＤ３ポリペプチドなどの、免疫細胞によって発現される細胞表面抗原を認識するｓｃＦｖが含まれる。
【０１８２】
それは単一のポリペプチドであるので、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、当技術分野で公知の任意の原核生物又は真核生物細胞発現系、例えばＣＨＯ細胞株を使用して発現させることができる。しかしながら、単量体の意図された活性以外の生物活性を有し得る他の多量体種から単量体二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを分離するために、特定の精製技術（例えば、ＥＰ１６９１８３３を参照）が必要な場合もある。１つの例示的な精製スキームでは、分泌されたポリペプチドを含む溶液は、最初に金属アフィニティークロマトグラフィーにかけられ、ポリペプチドはイミダゾール濃度の勾配を用いて溶出される。この溶出液は、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用してさらに精製され、ポリペプチドは、塩化ナトリウム濃度の勾配を用いて溶出される。最後に、この溶出液をサイズ排除クロマトグラフィーにかけ、多量体種から単量体を分離する。一態様では、本発明で使用される二重特異性抗体は、ペプチドリンカーによって互いに融合された２つの単鎖ＦＶ断片（ｓｃＦＶ）を含む単一のポリペプチド鎖を含む。
【０１８３】
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低減させるＦｃドメインの修飾
本発明の抗原結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは二量体であり、その各サブユニットはＣＨ２及びＣＨ３  ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定に会合することができる。
【０１８４】
Ｆｃドメインは、本発明の抗原結合分子に望ましい薬物動態特性を付与し、そのような薬物動態特性には、標的組織中への良好な蓄積に貢献する長い血清半減期、及び望ましい組織−血液分布比が含まれる。しかし同時に、Ｆｃドメインは、好ましい抗原保有細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞に対する、本発明の二重特異性抗体の望ましくない標的化をもたらす可能性があるしたがって、特定の態様では、本発明の抗原結合分子のＦｃドメインは、天然ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低減及び／又はエフェクター機能の低減を示す。一態様では、Ｆｃは、Ｆｃ受容体に実質的に結合せず、かつ／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、Ｆｃドメインはエフェクター機能を誘導しない。エフェクター機能の低減は、限定しないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性Ｔ細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞に対する結合の低減、マクロファージに対する結合の低減、単球に対する結合の低減、多形核細胞に対する結合の低減、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減のうちの１つ又は複数を含むことができる。
【０１８５】
特定の態様では、１つ又は複数のアミノ酸修飾を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入し、それによりＦｃ領域変異体を生成することができる。Ｆｃ領域変異体は、１つ又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含み得る。
【０１８６】
特定の態様では、本発明は、Ｆｃドメインが、特にＦｃ受容体に対するＦｃγ受容体への結合を低減させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む抗体を提供する。
【０１８７】
一態様では、本発明の抗体のＦｃドメインは、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれに同じ１つ又は複数のアミノ酸変異が存在する。特に、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の位置（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含む。特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ重鎖の２３４位及び２３５位（ＥＵ番号付け）及び／又は３２９位（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含む。より具体的には、ＩｇＧ重鎖においてアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」、ＥＵ番号付け）を有するＦｃドメインを含む本発明による抗体が提供される。アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａは、いわゆるＬＡＬＡ変異を指す。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」の組み合わせは、ヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほぼ完全に消失させるもので、国際公開第２０１２／１３０８３１（Ａ１）号に記載があり、同文献には、このような変異Ｆｃドメインを調製する方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能などのその特性を決定するための方法も記載されている。
【０１８８】
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能が低減したＦｃドメインは、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つ又は複数の置換を伴うものも含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。このようなＦｃ変異体には、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含め、アミノ酸２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７位のうちの２つ以上において置換を有するＦｃ変異体が含まれる（米国特許第７３３２５８１号）。
【０１８９】
別の態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低減及びエフェクター機能の低減を示す。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位（Ｋａｂａｔ番号付け）にアミノ酸置換を、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。このようなＩｇＧ４  Ｆｃドメイン変異及びそのＦｃγ受容体結合特性は、国際公開第２０１２／１３０８３１号にも記載されている。
【０１９０】
変異体Ｆｃドメインは、当技術分野で周知の遺伝学的又は化学的方法を用いたアミノ酸の欠失、置換、挿入、又は修飾により調製することができる。遺伝学的方法は、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的突然変異、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含み得る。正確なヌクレオチドの変化は、例えば配列決定により検証することができる。
【０１９１】
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えばＥＬＩＳＡにより、又はＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な装置を用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により容易に測定することができ、このようなＦｃ受容体は組換え発現により得ることができる。あるいは、Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む細胞活性化抗体の、Ｆｃ受容体に対する結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を使用して評価することができる。
【０１９２】
Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む本発明の抗体のエフェクター機能は、当技術分野で公知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは、本明細書に記載されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの他の例が、米国特許第５５００３６２号；Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)及びHellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；米国特許第５８２１３３７号；Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えばフローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照のこと）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは又はそれに加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998)に開示されるように、例えば動物モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで評価することができる。
【０１９３】
いくつかの態様では、補体成分に対するＦｃドメインの結合、特にＣ１ｑに対する結合が低減する。したがって、Ｆｃドメインがエフェクター機能を低減させるように操作されているいくつかの実施態様では、前記エフェクター機能の低減は、ＣＤＣの低減を含む。本発明の二重特異性抗原結合分子がＣ１ｑに結合することができ、それによりＣＤＣ活性を有するかどうかを決定するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを行うことができる（例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと）。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, et al., Blood 101:1045-1052 (2003)；及びCragg, and Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照のこと）。
【０１９４】
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインの修飾
本発明の二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方又は他方に融合した異なる抗原結合部位を含み、したがって、Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれ得る。これらのポリペプチドの組換え共発現とそれに続く二量体化は、２つのポリペプチドの複数の可能な組み合わせをもたらす。したがって、組換え産生における本発明の二重特異性抗体の収率及び純度を改善するために、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することが有利であろう。
【０１９５】
したがって、特定の態様では、本発明は、（ａ）腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含み、ここで、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって互いに連結されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの２つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片のみを含むことを特徴とする二重特異性分子に関し、該抗原結合分子はさらに（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含み、ここで該Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も広範なタンパク質−タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。したがって、一態様では、前記修飾はＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。
【０１９６】
特定の態様では、前記修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方に「ノブ」修飾を含み、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他方に「ホール」修飾を含む、いわゆる「ノブ・イントゥー・ホール」修飾である。したがって、本発明は、（ａ）腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含み、
ここで、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの２つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、前記４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片のみを含むことを特徴とする抗原結合分子に関し、該抗原結合分子はさらに（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含み、ここで、ノブ・イントゥー・ホール法に従って、Ｆｃドメインの第１のサブユニットはノブを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットはホールを含む。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、及びＹ４０７Ｖ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０１９７】
ノブ・イントゥー・ホール技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；米国特許第７６９５９３６号；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載される。一般に、この方法は、第１のポリペプチドの接触面において隆起（「ノブ」）及び第２のポリペプチドの接触面において対応する空洞（「ホール」）を導入することを含み、その結果、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように、隆起が空洞内に配置することができる。隆起は、第１のポリペプチドの接触面から小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置換することによって構築される。隆起と同一か又は類似のサイズの相補的空洞が、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置換することによって、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。
【０１９８】
したがって、一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、かつ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が生成される。隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的変異誘発により、又はペプチド合成により改変することにより作り出すことができる。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置換され（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置換される（Ｙ４０７Ｖ）。一態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置換され（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置換される（Ｌ３６８Ａ）。
【０１９９】
さらなる態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいてさらに、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置換され（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３４９位のチロシン残基がシステイン残基で置換される（Ｙ３４９Ｃ）。これらの２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、二量体をさらに安定化する（Carter (2001), J Immunol Methods 248, 7-15）。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、及びＹ４０７Ｖ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０２００】
別の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、例えば、国際公開第２００９／０８９００４号に記載されているような静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般に、この方法は、ホモ二量体形成は静電的に不利になるが、ヘテロ二量体は静電的に有利になるように、２つのＦｃドメインサブユニットの接触面において、荷電したアミノ酸残基による１つ又は複数のアミノ酸残基の置換を含む。
【０２０１】
本明細書で報告される二重特異性抗体の重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終端する完全なＣ末端であり得る。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端アミノ酸残基の１つ又は２つが除去された短縮されたＣ末端であり得る。好ましい一態様では、重鎖のＣ末端は、ＰＧで終端する短縮されたＣ末端である。本明細書中に報告されたすべての態様のうちの一態様では、本明細書中に特定されるようなＣ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、Ｃ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本明細書中に報告されたすべての態様のうちの一態様では、Ｃ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、本明細書で規定されるように、Ｃ末端グリシン残基（Ｇ４４６、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０２０２】
Ｆａｂドメインにおける修飾
一態様では、本発明は、（ａ）腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができるＦａｂ断片、（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含み、ここで、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの２つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片のみを含むことを特徴とする４−１ＢＢＬ含有抗原結合分子に関し、該抗原結合分子はさらに（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含み、ここで、Ｆａｂ断片の１つにおいて、可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬのいずれかが交換されている。二重特異性抗体は、Ｃｒｏｓｓｍａｂ技術に従って調製される。
【０２０３】
１つの結合アームにドメインの置換／交換を有する多重特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂ  ＶＨ−ＶＬ又はＣｒｏｓｓＭａｂ  ＣＨ−ＣＬ）は、国際公開第２００９／０８０２５２号及びSchaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191に詳細に記載されている。それらは、第１の抗原に対する軽鎖と第２の抗原に対する不適切な重鎖とのミスマッチによって引き起こされる副産物を（このようなドメイン交換のない手法と比較して）明らかに減少させる。
【０２０４】
一態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ１９に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片、（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含み、ここで、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの２つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片のみを含み、ここでそれらの各々が、ＣＨ１又はＣＬドメインに連結されていることを特徴とする二重特異性抗原結合分子に関し、該抗原結合分子はさらに（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含み、ここで、ＣＨ１ドメインが軽鎖の一部となり、ＣＬドメインが重鎖の一部となるように、４−１ＢＢＬに隣接する定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置換されている。
【０２０５】
別の態様では、本発明は、（ａ）共刺激性ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片とＦｃドメインとを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖、及び（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの追加のＦａｂ断片を含む二重特異性抗原結合分子に関し、ここで前記追加のＦａｂ断片は各々、ペプチドリンカーを介して（ａ）の重鎖のＣ末端に連結されている。特定の態様では、追加のＦａｂ断片は、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、ＶＨドメインが軽鎖の一部であり、かつ、ＶＬドメインが重鎖の一部であるように、互いに置換されているＦａｂ断片である。
【０２０６】
別の態様では、正しいペアリングをさらに改善するために、（ａ）ＣＤ１９に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片、（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含み、ここで、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの２つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片のみを含み、ここでそれらの各々が、ＣＨ１又はＣＬドメインに連結されていることを特徴とし、さらに（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子は、異なる荷電アミノ酸置換（いわゆる「荷電残基」）を含むことができる。これらの修飾は、交差又は非交差のＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインに導入される。特定の態様では、本発明は二重特異性抗原結合分子に関し、ここで、ＣＬドメインの１つにおいて、１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）で置換され、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）で置換されており、かつ、ＣＨ１ドメインの１つにおいて、１４７位（ＥＵ番号付け）及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）で置換されている。
【０２０７】
より具体的には、本発明はＦａｂを含む二重特異性抗原結合分子に関し、ここで、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＬドメインにおいて、１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）で置換され、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）で置換されており、かつ、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＨ１ドメインにおいて、１４７位（ＥＵ番号付け）及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）で置換されている。
【０２０８】
ポリヌクレオチド
本発明はさらに、本明細書に記載される二重特異性抗体又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０２０９】
本発明の抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドは、抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は共発現される複数（例えば、２つ以上）のポリヌクレオチドとして発現され得る。共発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合して、機能的抗原結合分子を形成し得る。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分とは別個のポリヌクレオチドによってコードされ得る。共発現されると、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合して免疫グロブリンを形成するであろう。
【０２１０】
いくつかの態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載される本発明による抗体全体をコードする。他の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載される本発明による抗体に含まれるポリペプチドをコードする。
【０２１１】
特定の実施態様では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは一本鎖又は二本鎖であり得る。
【０２１２】
組換え法
本発明において使用される二重特異性抗体は、例えば、固相ペプチド合成（例えば、メリフィールド固相合成）又は組換え産生によって得ることができる。組換え産生のために、例えば上述したように、抗体又はそのポリペプチド断片をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／又は発現のために１つ又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定され得る。本発明の一態様では、本発明のポリヌクレオチドの１つ又は複数を含むベクタ−、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用して、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに抗体（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ  ｖｉｖｏでの組換え／遺伝子組換えを含む。例えば、Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)；及びAusubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)に記載される技術を参照のこと。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であり得るか、又は核酸断片であり得る。発現ベクターは、抗体又はそのポリペプチド断片（すなわち、コード領域）をコードするポリヌクレオチドが、プロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に結合してクローニングされる発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード領域の一部と考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば別の（異なる）ベクター上に存在することができる。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断によって翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質に分離される１つ又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の抗体若しくはそのポリペプチド断片、又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合しているか、又は融合していない異種コード領域をコードし得る。異種コード領域は、限定されないが、分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインなどの特殊なエレメント又はモチーフを含む。作動可能に結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード領域が、遺伝子産物の発現を制御配列の影響下又は制御下に置くように、１つ又は複数の制御配列と結合している場合である。２つのＤＮＡ断片（ポリペプチドコード領域とそれに結合しているプロモーターなど）は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡ��転写をもたらす場合、及び２つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を指示する発現調節配列の能力を妨げないか又は転写されるべきＤＮＡテンプレートの能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合に、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合されているといえる。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーター以外に、他の転写調節エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を指示するポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。
【０２１３】
適切なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えばイントロン−Ａと連結した最初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）が含まれる。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子由来のもの、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギ−αグロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列を含む。さらなる適切な転写制御領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター（例えば、プロモーター誘導性テトラサイクリン）を含む。同様に、種々の翻訳調節エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、並びにウイルス系由来のエレメント（特に、配列内リボソーム進入部位、又はＣＩＴＥ配列とも呼ばれるＩＲＥＳ）が含まれる。また、発現カセットは、例えば複製起点及び／又はレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）若しくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の逆位末端配列（ＩＴＲ）などの染色体組み込みエレメントといった他の特徴を含んでいてもよい。
【０２１４】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌又はシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域と結合させることができる。例えば、抗体又はそのポリペプチド断片の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡが、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片をコードする核酸の上流に配置され得る。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質は、粗面小胞体上で成長するタンパク質鎖の排出が開始されると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが一般に、ポリペプチドのＮ末端に融合したシグナルペプチドを有し、それが翻訳されたポリペプチドから切断されて分泌又は「成熟」型のポリペプチドを産生することを知っている。特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、又はそれに作動可能に結合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド又はその機能的誘導体が使用され得る。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
【０２１５】
後の精製を容易にするため（例えばヒスチジンタグ）又は融合タンパク質の標識化の補助のために使用され得る短タンパク質配列をコードするＤＮＡは、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド又はそのポリペプチド断片の中又は末端に含まれ得る。
【０２１６】
本発明のさらなる態様では、本発明の１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の実施態様では、本発明の１つ又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれに関連して本明細書に記載される特徴のいずれかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。一態様では、宿主細胞は、本発明の抗体（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えばそのようなベクターで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書中で使用される場合、用語「宿主細胞」は、本発明の融合タンパク質又はその断片を生成するように操作され得る任意の種類の細胞系を指す。抗原結合分子の複製及び発現の補助に適切な宿主細胞は当技術分野で周知である。このような細胞は特定の発現ベクターで適切にトランスフェクト又は形質導入することができ、大量のベクター含有細胞を、臨床利用のための十分な量の抗原結合分子を得るために、大規模発酵槽に播種するために増殖させることができる。適切な宿主細胞には、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は種々の真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞等が含まれる。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要でない場合、細菌中で産生され得る。発現の後、ポリペプチドは可溶性画分において細菌細胞のペーストから単離することができ、さらに精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物は、グリコシル化経路が「ヒト化」され、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの産生をもたらす真菌及び酵母菌株を含む、ポリペプチドをコードするベクターの適切なクローニング宿主又は発現宿主である。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照のこと。
【０２１７】
（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用できる多数のバキュロウイルス株が同定されている。植物細胞培養もまた宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞も宿主として使用することができる。例えば、懸濁状態で増殖するように適合された哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251(1980)に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、（例えば、Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載される）ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照のこと。宿主細胞には、培養細胞、例えばいくつか挙げると、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が含まれ、さらにはトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含まれる。一実施態様では、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。これらの系において外来遺伝子を発現する標準的な技術は当技術分野で周知である。免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された生成物が重鎖及び軽鎖の両方を有する免疫グロブリンであるように、免疫グロブリン鎖の他方を発現するように操作することができる。
【０２１８】
一態様では、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片を生成する方法が提供され、この方法は、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片の発現に適した条件下で、本明細書に提供される本発明の抗体又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養すること、及び本発明の抗体又はそのポリペプチド断片を宿主細胞（又は宿主細胞培地）から回収することを含む。
【０２１９】
特定の実施態様では、抗原結合分子の一部を形成する、標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分（例えばＦａｂ断片）は、少なくとも、抗原に結合することができる免疫グロブリン可変領域を含む。可変領域は、天然又は非天然の抗体及びその断片の一部を形成することができ、かつそのような抗体及び断片から誘導することができる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を産生する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Harlow and Lane, ”Antibodies, a laboratory manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照）。天然に存在しない抗体は、固体相−ペプチド合成を使用して構築することができ、（例えば米国特許第４１８６５６７号に記載のように）組換え的に産生することができ、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙへの米国特許第５９６９１０８号を参照）。
【０２２０】
任意の動物種の免疫グロブリンを本発明において使用することができる。本発明において有用な非限定的免疫グロブリンは、マウス、霊長類又はヒト起源のものであり得る。融合タンパク質がヒトでの使用を意図している場合、免疫グロブリンの定常領域がヒト由来であるキメラ型の免疫グロブリンを使用することができる。ヒト化又は完全ヒト型の免疫グロブリンも、当技術分野で周知の方法に従って調製することができる（例えばＷｉｎｔｅｒへの米国特許第５５６５３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、それらの方法には、限定されないが、（ａ）非ヒト（例えばドナー抗体）のＣＤＲを、重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合アフィニティー又は抗体機能を維持するために重要であるもの）の保持を伴うか又は伴わない、ヒト（例えばレシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域の上に移植すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互作用に重要な残基）のみをヒトフレームワーク領域及び定常領域上に移植すること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置き換えによってヒト様切片でそれらを「クローキング」することが含まれる。ヒト化抗体及びその製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、さらに、例えば、Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)；米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号、及び同第７０８７４０９号；Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al.,  Methods 36, 25-34 (2005)（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）移植について記載）；Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991)（「リサーフェイシング」について記載）；Dall’Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005)（「ＦＲシャフリング」について記載）；Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005)及びKlimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000)（ＦＲシャフリングへの「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」アプローチについて記載）に記載されている。本発明による特定の免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当技術分野で公知の様々な技術を使用して生成することができる。ヒト抗体は、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に一般的に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成することができ、そのような抗体から由来することができる（例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することによっても調製することができる（例えば、Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変領域配��を単離することによっても生成することができる（例えば、Hoogenboom et al. Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)；及びMcCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)を参照）。ファージは、典型的には、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、又はＦａｂ断片として、抗体断片を提示する。
【０２２１】
特定の態様では、抗体は、例えば、国際公開第２０１２／０２０００６号（親和性成熟に関連する実施例を参照）又は米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号に開示された方法に従って、増強された結合親和性を有するように操作される。特定の抗原決定基に対する本発明の抗原結合分子の結合能は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（Liljeblad,et al.,Glyco.J.17:323-329(2000)）及び古典的な結合アッセイ（Heeley,R.P.,Endocr.Res.28:217-229(2002)）によって測定することができる。競合アッセイは、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗原結合分子を同定するために使用され得る。特定の実施態様では、このような競合抗原結合分子は、参照抗原結合分子によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗原結合分子が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的な方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）によるＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第６６巻の「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に提供されている。例示的な競合アッセイでは、固定化された抗原は、抗原に結合する第１の標識抗原結合分子と、抗原への結合について第１の抗原結合分子と競合するその能力について試験されている第２の非標識抗原結合分子とを含む溶液中でインキュベートされる。第２の抗原結合分子はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化抗原が、第１の標識抗原結合分子を含むが第２の非標識抗原結合分子を含まない溶液中でインキュベートされる。第１の抗体の抗原への結合を許容する条件下でのインキュベーション後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化された抗原に結合した標識の量が測定される。固定化抗原に結合した標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第２の抗原結合分子が、抗原への結合について第１の抗原結合分子と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies:  A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。
【０２２２】
本明細書で記載のように調製される本発明の抗体は、当技術分野で公知の技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどによって精製され得る。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性などの要因に依存し、当業者には明らかであろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用され得る。例えば、本発明の融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリックスが使用され得る。連続的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを、本質的に実施例に記載されるように抗原結合分子を単離するために使用することができる。抗原結合分子又はその断片の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む様々な周知の分析方法のいずれかによって決定することができる。例えば、実施例に記載されるように発現された４−１ＢＢＬ含有抗原結合分子は、還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって示されるようにインタクトであり、適切に組み立てられていることが示された。
【０２２３】
アッセイ
本明細書で提供される抗原結合分子は、当技術分野で公知の様々なアッセイによって、その物理的／化学的性質及び／又は生物活性について同定、スクリーニング又は特徴づけすることができる。
【０２２４】
１．親和性アッセイ
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子のその対応する受容体に対する親和性は、実施例に記載の方法に従って、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥヘルスケア）などの標準的装置と、組換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定することができる。標的細胞抗原に対する二重特異性抗原結合分子の親和性もまた、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的装置と、組換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定することができる。ＣＤ１９−４−１ＢＢＬ抗原結合分子に関して、本方法は、国際公開第２０１６／０７５２７８号にさらに詳細に記載されている。一態様によれば、ＫＤは、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる表面プラズモン共鳴により測定される。
【０２２５】
２．結合アッセイ及びその他のアッセイ
一態様では、本明細書で報告されるＣＤ１９−４−１ＢＢＬ抗原結合分子は、実施例２にさらに詳細に記載されるように、その抗原結合活性について試験される。
【０２２６】
３．活性のアッセイ
一態様では、ＣＤ１９−４−１ＢＢＬ抗原結合分子の生物活性を同定するためのアッセイが提供される。生物活性には、例えば、Ｂ細胞増殖の阻害又はＢ細胞の死滅が含まれ得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏでそのような生物活性を有する抗体も提供される。ＣＤ１９−４−１ＢＢＬ抗原結合分子に関して、特定の方法が、国際公開第２０１６／０７５２７８号にさらに詳細に記載されている。
【０２２７】
特定の実施態様では、本明細書に報告されるような抗体は、そのような生物活性について試験される。
【０２２８】
薬学的組成物、製剤、及び投与経路
さらなる態様では、本発明は、例えば、以下の治療法のいずれかにおける使用のための、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト、及び本明細書で提供される抗ＣＤ２０抗体を含む薬学的組成物を提供する。一態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストと、少なくとも１つの薬学的に許容される添加物と、抗ＣＤ２０抗体を含む第２の医薬を含む。別の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストと、少なくとも１つの薬学的に許容される添加物、抗ＣＤ２０抗体を含む第２の医薬、及び例えば以下に記載されるような少なくとも１つの追加の治療剤を含む。
【０２２９】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される添加物に溶解又は分散させた、本明細書に記載の１つ又は複数の抗原結合分子の治療的有効量を含む。「薬学的に許容される又は薬理学的に許容される」という語句は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに対して一般に無毒である、すなわち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー又は他の有害な反応を生じさせない分子実体及び組成物を指す。少なくとも１つの抗体と、任意選択的に追加的な活性成分とを含む薬学的組成物の調製物は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1990（参照により本明細書に包含される）によって例示されているように、本開示内容の見地から当業者には公知であろう。特に、組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容される添加物」には、当業者には既知であるように、任意の及びすべての溶媒、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、塩、安定剤及びそれらの組み合わせが含まれる。
【０２３０】
非経口組成物には、注射による投与、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内注射用に設計されたものが含まれる。注射の場合、本発明の抗原結合分子は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水バッファーなどの生理的に適合性のバッファー中において製剤化され得る。溶液は、懸濁化剤、安定剤、及び／又は分散剤などの調合剤を含有することができる。あるいは、融合タンパク質は、使用前に適切なビヒクル、例えば、発熱性物質除去蒸留水と構成するために、粉末形態であってもよい。滅菌注射用溶液は、本発明の融合タンパク質を、必要に応じて、以下に列挙する様々な他の成分を含む適切な溶媒中に必要量で組み込むことによって調製される。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成することができる。分散体は通常、基本的な分散媒及び／又は他の成分を含有する滅菌ビヒクルに、様々な滅菌活性成分を取り込むことにより調製される。滅菌注射用溶液、懸濁液又は乳濁液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過されたその液体媒質から、活性成分と任意の追加的所望成分の粉末を得る真空乾燥又は凍結乾燥技術である。場合によっては、液体媒質を適切に緩衝し、注射前にまず、その液体希釈剤を十分な生理食塩水又はグルコースで等張にする必要がある。組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシン汚染は、安全なレベル、例えばタンパク質１ｍｇあたり０．５ｎｇ未満で最小限に保たれるべきであることが理解されよう。薬学的に許容される適切な添加物には、限定されないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー類、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの、懸濁液の粘度を増加させる化合物を含有し得る。任意選択的に、懸濁液は、適切な安定剤、又は化合物の溶解度を上昇させて高濃度溶液の調製を可能にする薬剤も含有し得る。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製され得る。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ごま油のような脂肪油、又はエチルクリート若しくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、又はリポソームが含まれる。
【０２３１】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合法によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルに、コロイド薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入することができる。これらの技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences(18th Ed. Mack Printing Company, 1990)に開示されている。徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の適切な例は、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、そのマトリックスは、成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、注射可能な組成物の持続的吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン又はそれらの組み合わせなどの吸収を遅延させる薬剤を組成物に使用することによってもたらされ得る。
【０２３２】
本明細書における例示的な薬学的に許容される添加物には、間質性薬物分散剤（ｉｎｓｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）、例えば可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒｈｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質がさらに含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含む、特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法については、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ又は複数の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０２３３】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤には、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸バッファーを含む。
【０２３４】
上記の組成物に加えて、抗体は、持効性製剤として製剤化されていてもよい。そのような長時間作用する製剤は、埋め込み（例えば、皮下又は筋肉内）によって、又は筋肉内注射によって投与され得る。したがって、例えば、融合タンパク質は、適切なポリマー性又は疎水性物質を用いて（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）又はイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性誘導体として、例えば、難溶性の塩として製剤化することができる。
【０２３５】
本発明の抗原結合分子を含む薬学的組成物は、一般的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥プロセスにより製造することができる。薬学的組成物は、１つ又は複数の生理的に許容される担体、希釈剤、添加物、又はタンパク質の薬学的に使用可能な調製物への加工を容易にする補助剤を使用して、従来の方式で製剤化することができる。適切な製剤は、選択された投与経路に依存する。
【０２３６】
本明細書で提供されるＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、遊離の酸又は塩基、中性又は塩の形態の組成物に製剤化され得る。薬学的に許容される塩は、遊離酸又は遊離塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えばタンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、又は例えば塩酸若しくはリン酸といった無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸などの有機酸で形成されたものが含まれる。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム若しくは水酸化第二鉄などの無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン若しくはプロカインなどの有機塩基に由来し得る。薬学的塩は、対応する遊離塩基の形態よりも水性溶媒及び他のプロトン性溶媒に溶解しやすい傾向がある。
【０２３７】
本明細書中の組成物はまた、治療される特定の症状に必要な１つを超える活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含有し得る。そのような活性成分は、意図された目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。
【０２３８】
一態様では、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストと、薬学的に許容される添加物と、本明細書に記載の抗ＣＤ２０抗体を含む第２の医薬とを含む薬学的組成物が提供される。特定の態様では、薬学的組成物は、Ｂ細胞増殖性疾患、特に、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）及びホジキンリンパ腫（ＨＬ）からなる群より選択される疾患の治療における使用のためのものである。
【０２３９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成することができる。
【０２４０】
本明細書で提供されるＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト及び抗ＣＤ２０抗体の投与
ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストと抗ＣＤ２０抗体（両方とも本明細書では物質と呼ばれる）は両方とも、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所治療が望ましい場合は病巣内投与を含む、任意の適切な手段によって投与することができる。しかしながら、本発明の方法は、非経口、特に静脈内注入により投与される治療剤に関して特に有用である。
【０２４１】
非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与を含む。投薬は、その投与が短期間であるか長期間であるかに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば、静脈内注射又は皮下注射などの注射によって行うことができる。本明細書では、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投薬スケジュールが企図される。一実施態様では、治療剤は、非経口的に、特に静脈内に投与される。特定の実施態様では、物質は、静脈内注入によって投与される。別の態様では、物質は皮下投与される。
【０２４２】
腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト、及び抗ＣＤ２０抗体は両方とも、医学行動規範と一致した様式で製剤化され、用量分けされ、投与される。この文脈において考慮すべき要因には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与のスケジュール、及び医療従事者が知るその他の要因が含まれる。腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト、及び抗ＣＤ２０抗体は両方とも、そうである必要はないが、任意選択的に、問題の障害を予防又は治療するために現在使用されている１つ又は複数の薬剤とともに製剤化される。
そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する治療剤の量、障害又は治療の種類、及び上記で論じた他の要因に依存する。これらは一般に、本明細書に記載されているのと同じ投与量及び投与経路で、又は本明細書に記載の投与量の約１％〜９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の投与量及び経路で使用される。
【０２４３】
疾患の予防又は治療のために、本明細書で提供される、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト、及び抗ＣＤ２０抗体の適切な投与量は（それらの組み合わせで、又は１つ又は複数の他の追加的治療剤と併用して使用される場合）、治療される疾患の種類、４−１ＢＢ剤の種類、疾患の重症度及び経過、両薬剤が予防目的で又は治療目的で投与されるのか、治療歴、患者の病歴及び治療剤に対する応答、並びに主治医の判断によって決まるであろう。各物質は、患者に対して、一度に、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば単回又は複数回の個別投与によるか、連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の物質が対象への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な１日の投与量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲であろう。数日間以上にわたる反復投与の場合には、状態にもよるが、治療は一般に疾患症状の望ましい抑制が起こるまで持続されることになる。各物質の１つの例示的な投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０  ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はその任意の組み合わせ）のうちの１つ又は複数の用量が対象に投与され得る。このような用量は断続的に、例えば毎週、２週毎、又は３週毎に（例えば対象が約２から約２０用量、例えば約６用量の治療剤を受けるように）投与され得る。より高い初回負荷用量と、それに続く１つ又は複数のより低い用量、又はより低い初回用量と、それに続く１つ又は複数のより高い用量が投与されてもよい。例示的投与レジメンは、約１０ｍｇの初回用量に続いて、隔週約２０ｍｇの治療剤を投与することを含む。しかしながら、他の投与レジメンも有用であり得る。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイにより容易に監視される。
【０２４４】
一態様では、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストと抗ＣＤ２０抗体の両方の投与は、単回投与である。特定の態様では、物質の投与は２回以上の投与である。そのような一態様では、物質は、毎週、２週毎、又は３週毎、特に２週毎に投与される。一態様では、物質は治療的有効量で投与される。一態様では、物質は、約５０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約２００μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約４００μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約６００μｇ／ｋｇ、約７００μｇ／ｋｇ、約８００μｇ／ｋｇ、約９００μｇ／ｋｇ又は約１０００μｇ／ｋｇの用量で投与される。一実施態様では、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、抗ＣＤ２０抗体の投与なしの対応する治療レジメンにおける、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストの用量よりも高い用量で投与される。一態様では、本明細書で提供される、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストの投与は、抗ＣＤ２０抗体の第１の用量の初回投与、及び抗ＣＤ２０抗体の第２の用量の１回以上のその後の投与を含み、ここで、第２の用量は第１の用量よりも高い。一態様では、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストの投与は、抗ＣＤ２０抗体の第１の用量の初回投与、及び抗ＣＤ２０抗体の第２の用量の１回以上のその後の投与を含み、ここで、第１の用量は第２の用量より低くない。
【０２４５】
一態様では、本発明による治療レジメンにおいて、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストの投与は、対象へのＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストの第１の投与である（少なくとも同じ治療過程内で）。一態様では、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストの投与の前に、抗ＣＤ２０抗体の投与は対象に対して行われない。別の態様では、抗ＣＤ２０抗体は、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストの投与前に投与される。
【０２４６】
別の態様では、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせた使用のためのものであり、ここで、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはオビヌツズマブによる前治療は、併用治療の前に行われ、ここで、前治療と併用治療の間の期間は、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはオビヌツズマブに応答した、個体におけるＢ細胞の減少に十分である。
【０２４７】
Ｔ細胞の活性化は、重度のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を引き起こす可能性がある。ＴｅＧｅｎｅｒｏによって実施された第１相試験（Suntharalingam et al., N Engl J Med (2006) 355,1018-1028）では、６人の健常なボランティア全員が、不適切に投与されたＴ細胞刺激スーパーアゴニスト抗ＣＤ２８モノクローナル抗体の注入後すぐに、ほぼ致命的な重度のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を経験した。腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストなどのＴ細胞活性化治療剤の対象への投与に関連するサイトカイン放出は、オビヌツズマブなどのＩＩ型抗ＣＤ２０抗体による前記対象の前治療によって有意に低減することができる。ＧＡＺＹＶＡ（登録商標）前治療（Ｇｐｔ）の使用は、投薬開始から腫瘍細胞の排除を媒介するのに十分に高いＴ細胞活性化治療剤の曝露レベルを維持しつつ、Ｔ細胞活性化治療剤（例えばＣＲＳ）による強力な全身性Ｔ細胞活性化に由来する関連性の高い有害事象（ＡＥ）のリスクが軽減されるように、末梢血と二次リンパ器官の両方で、Ｂ細胞の急速な枯渇を助けるはずである。今日まで、オビヌツズマブの安全性プロファイル（サイトカイン放出を含む）は、進行中のオビヌツズマブ臨床治験において数百人の患者で評価及び管理されている。最後に、本明細書で提供される、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストの安全性プロファイルを維持することに加えて、Ｇｐｔは、これらのユニークな分子に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）の形成を防ぐのにも役立つはずである。
【０２４８】
本発明において、特に、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト、及び抗ＣＤ２０抗体は、治療において１つ又は複数のさらなる薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、少なくとも１つの追加の治療剤が共投与され得る。特定の態様では、追加の治療剤は、免疫療法剤である。
【０２４９】
上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一又は別々の製剤に含まれている）と、治療剤の投与が、追加の治療剤又は薬剤の投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に起こり得る分離投与とを包含する。一実施態様では、治療剤の投与及び追加の治療剤の投与は、互いに、約１か月以内、又は約１週間、２週間、若しくは３週間以内、又は１日、２日、３日、４日、５日、若しくは６日間以内に行われる。
【０２５０】
治療方法及び組成物
ＣＤ２０及びＣＤ１９は、幹細胞と形質細胞を除くほとんどのＢ細胞で発現し（ｐａｎ−Ｂ細胞マーカー）、例えば非ホジキンリンパ腫及び急性リンパ性白血病において、多発性骨髄腫を除くリンパ腫及び白血病といったほとんどのヒトＢ細胞悪性腫瘍で頻繁に発現する（腫瘍関連抗原）。
【０２５１】
異なる細胞集団上の２つの細胞表面タンパク質を認識する二重特異性分子は、病原性標的細胞の破壊のために細胞傷害性免疫細胞をリダイレクトすることが期待されている。
【０２５２】
一態様では、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストと抗ＣＤ２０抗体の有効量を対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法が提供される。
【０２５３】
このような一態様では、方法は、対象に少なくとも１つの追加の治療剤の有効量を投与することをさらに含む。さらなる態様では、本明細書において、本明細書で提供されるＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストと抗ＣＤ２０抗体の有効量を対象に投与することを含む、Ｂ細胞を枯渇させるための方法が提供される。上記のいずれの態様に記載の「個体」又は「対象」も、好ましくはヒトである。
【０２５４】
さらなる態様では、本明細書で提供されるＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト及び抗ＣＤ２０抗体を含む、がん免疫療法における使用のための組成物が提供される。特定の態様では、がん免疫療法の方法における使用のための、本明細書で提供されるＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト及び抗ＣＤ２０抗体を含む組成物が提供される。
【０２５５】
さらなる態様では、本明細書において、医薬の製造又は調製における、本明細書で提供されるＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト及び抗ＣＤ２０抗体を含む組成物の使用が提供される。一実施態様では、医薬は、Ｂ細胞増殖性疾患の治療用である。さらなる実施態様では、医薬は、Ｂ細胞増殖性疾患を有する個体に医薬の有効量を投与することを含む、Ｂ細胞増殖性疾患を治療する方法における使用のためのものである。このような一実施態様では、方法は、少なくとも１つの追加の治療剤の有効量を個体に投与することをさらに含む。さらなる実施態様では、医薬は、Ｂ細胞を枯渇させるためのものである。Ｂ細胞増殖性疾患は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）及びホジキンリンパ腫（ＨＬ）からなる群より選択される。特定の一態様では、Ｂ細胞がんは、非ホジキンリンパ腫又は急性リンパ性白血病である。
【０２５６】
さらなる態様では、本明細書において、Ｂ細胞がんを治療するための方法が提供される。一実施態様では、方法は、そのようなＢ細胞がんを有する個体に抗ヒトＣＤ２０抗体の有効量を投与することを含む。このような一実施態様では、方法は、以下に記載されるように、少なくとも１つの追加の治療剤の有効量を個体に投与することをさらに含む。上記の実施態様のいずれかによる「個体」は、ヒトであり得る。Ｂ細胞がんは、一実施態様では、Ｂ細胞リンパ腫又はＢ細胞白血病である。一実施態様では、Ｂ細胞がんは、非ホジキンリンパ腫又は急性リンパ性白血病である。
【０２５７】
上記の併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一又は別々の製剤に含まれている）と、本明細書に報告される抗体の投与が、追加の治療剤又は薬剤の投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に起き得る別々の投与とを包含する。一実施態様では、抗ヒトＣＤ２０抗体の投与及び追加の治療剤の投与は、互いに、約１か月以内、又は約１週間、２週間、若しくは３週間以内、又は１日、２日、３日、４日、５日、若しくは６日間以内に行われる。
【０２５８】
ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストと、本明細書で報告されている抗ＣＤ２０抗体（及び任意の追加の治療剤）は両方とも、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所治療が望ましい場合は病巣内投与を含む、任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与を含む。投薬は、その投与が短期間であるか長期間であるかに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば、静脈内注射又は皮下注射などの注射によって行うことができる。本明細書では、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投薬スケジュールが企図される。
【０２５９】
ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト、及び本明細書で報告されている抗ＣＤ２０抗体は両方とも、医学行動規範と一致した様式で製剤化され、用量分けされ、投与される。この文脈において考慮すべき要因には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与のスケジュール、及び医療従事者が知るその他の要因が含まれる。抗体は、必ずしもそうである必要はないが、任意選択的に、問題の障害を予防又は治療するために現在使用されている１つ又は複数の薬剤と共に製剤化される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類、及び上記で論じた他の要因に依存する。これらは一般に、本明細書に記載されているのと同じ投与量及び投与経路で、又は本明細書に記載の投与量の約１％〜９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の投与量及び経路で使用される。
【０２６０】
他の薬剤及び治療
本発明の抗原結合分子は、治療において１つ又は複数の他の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、本発明の融合タンパク質は、少なくとも１種の追加の治療剤と共投与され得る。用語「治療剤」は、このような治療を必要とする個体の症状又は疾患を治療するために投与され得る任意の薬剤を包含する。このような追加の治療剤は、治療される特定の適応症に適した活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含んでもよい。特定の実施態様では、追加の治療剤は別の抗がん剤である。
【０２６１】
このような他の薬剤は、意図した目的に有効な量で組み合わされて適切に存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用される融合タンパク質の量、障害又は治療の種類、及び上記で論じた他の要因に依存する。抗原結合分子は一般に、本明細書に記載されているのと同じ投与量及び投与経路で、又は本明細書に記載の投与量の約１％〜９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の投与量及び経路で使用される。
【０２６２】
上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一又は別々の組成物に含まれている）、及び本発明の抗原結合分子の投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に起こり得る分離投与を包含する。
【０２６３】
製造品（キット）
本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含有するキットが提供される。このキットは、少なくとも１つの容器、容器上又は容器に付随するラベル又は添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、状態の治療、予防、及び／又は診断に有効な、単独の又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈注射用の溶液のバッグ又はバイアルであってよい）。キットに含まれる少なくとも２つの活性剤は、本発明の、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体と、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストである。
【０２６４】
特定の態様では、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるためのキットであって、（Ａ）活性成分としての、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト及び薬学的に許容される添加物を含む第１の組成物；及び（Ｂ）活性成分としての抗ＣＤ２０抗体及び薬学的に許容される添加物を含む第２の組成物、及び（Ｃ）併用療法において組成物を使用するための説明書を含むパッケージを含むキットが提供される。
【０２６５】
ラベル又は添付文書は、選択された状態を治療するために組成物がどのように使用されるかを示し、併用療法において組成物を使用するための指示を提供する。さらに、キットは、（ａ）組成物がその中に含まれる第１の容器であって、該組成物が、本発明の、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストを含む第１の容器；及び（ｂ）組成物がその中に含まれる第２の容器であって、該組成物が抗ＣＤ２０抗体を含む、第２の容器を含み得る。加えて、キットは、組み合わせて使用できるさらなる活性成分を含む１つ又は複数のさらなる容器を含み得る。本発明のこの実施態様における製造品は、組成物が特定の状態を治療するために使用できることを示す添付文書をさらに含んでもよい。
【０２６６】
代替的に又は追加的に、キットは、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器をさらに含んでもよい。それは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
【０２６７】
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【０２６８】
ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は以下に与えられている：Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)。抗体鎖のアミノ酸は、上で定義されたＫａｂａｔによる番号付けシステム（Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）に従って番号が付けられ、参照される。
【０２６９】
発明の態様
以下に、本発明のいくつかの態様を列挙する。
１．  がんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法における使用のための４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストであって、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせて使用され、ここで、４−１ＢＢアゴニストは、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト。
２．  ４−１ＢＢアゴニスト及び抗ＣＤ２０抗体が同時に投与される、パラグラフ１に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
３．  ４−１ＢＢアゴニスト及び抗ＣＤ２０抗体が、単一の組成物において一緒に投与されるか、又は２つ以上の異なる組成物において別々に投与される、パラグラフ１又は２に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
４．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢアゴニストと同時に、その前に、又はその後に投与される、前述の態様の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
５．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む、前述の態様のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
６．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む分子であり、ここで、４−１ＢＢＬのエクトドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、前述の態様のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
７．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
８．  ４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片とＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子は、ＣＤ１９発現Ｂ細胞によって内部移行されないであろう、前述の態様のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
９．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分とを含む抗原結合分子であり、ここで、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む、前述の態様のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
１０．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ここで、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含むか、又は、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む、前述の態様のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
１１．  ４−１ＢＢアゴニストが、安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインをさらに含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
１２．  ４−１ＢＢアゴニストが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
１３．  ４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減させるか又は排除する１つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
１４．  ４−１ＢＢアゴニストが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
１５．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含む、前述の態様のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
１６．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする、前述の態様のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
１７．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含むＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、前述の態様のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
１８．  ４−１ＢＢアゴニストが、
ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号３９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｄ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｅ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｆ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号４５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号４６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｇ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｈ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号４９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号５０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｊ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｋ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；並びに
ｌ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号５１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子
からなる群から選択される抗原結合分子である、前述の態様のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
１９．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である、前述の態様のいずれかに記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
２０．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む抗原結合分子であり、ここで、ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドは、任意選択的にペプチドリンカーを介して、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方のＮ又はＣ末端アミノ酸に融合される、前述の態様のいずれかに記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
２１．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子、
（ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子、
（ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子、及び
（ｄ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子
からなる群から選択される抗原結合分子である、前述の態様に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
２２．  ４−１ＢＢアゴニストが、抗ＣＤ１９／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、態様１から３のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
２３．  抗ＣＤ２０抗体が、Ｉ型抗ＣＤ２０抗体である、態様１から１４のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
２４．  抗ＣＤ２０抗体が、リツキシマブである、前述の態様のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
２５．  抗ＣＤ２０抗体が、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体である、前述の態様の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
２６．  抗ＣＤ２０抗体が、アフコシル化抗ＣＤ２０抗体である、前述の態様の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
２７．  抗ＣＤ２０抗体が、オビヌツズマブである、請求項１から１４、又は１７又は１８のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
２８．  抗ＣＤ２０抗体が、リツキシマブ又はオビヌツズマブである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
２９．  抗ＣＤ２０抗体が、配列番号７３のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号７４のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号７５のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）、並びに／又は配列番号７６のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号７７のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号７８のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む、前述の態様のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
３０．  第２の抗原結合ドメインが、配列番号７９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）及び／又は配列番号８０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む、前述の態様のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
３１．  ４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む、前述の態様のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
３２．  ４−１ＢＢアゴニストが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む、前述の態様のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
３３．  ４−１ＢＢアゴニストが、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせて使用され、この組み合わせが、約１週間から３週間の間隔で投与される、前述の態様のいずれか一項に記載の方法における使用のための４−１ＢＢアゴニスト。
３４．  疾患、特にがんの併用治療、逐次治療又は同時治療における使用のための、（Ａ）活性成分としての、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト及び薬学的に許容される添加物を含む第１の組成物；及び（Ｂ）活性成分としての抗ＣＤ２０抗体及び薬学的に許容される添加物を含む第２の組成物を含む薬学的製品。
３５．  Ｂ細胞増殖性疾患、特に、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）及びホジキンリンパ腫（ＨＬ）からなる群より選択される疾患の治療における使用のための、態様３４に記載の薬学的製品。
３６．  腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストと、抗ＣＤ２０抗体を含む、薬学的組成物。
３７．  ４−１ＢＢアゴニストが、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含み、抗ＣＤ２０抗体が、単一の組成物において一緒に投与されるか、又は２つ以上の異なる組成物において別々に投与される、態様３６に記載の薬学的組成物。
３８．  ４−１ＢＢアゴニストが、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含み、抗ＣＤ２０抗体と同時に、その前に、又はその後に投与される、態様３６又は３７に記載の薬学的組成物。
３９．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む、態様３６から３８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
４０．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む分子であり、ここで、４−１ＢＢＬのエクトドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、態様３６から３９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
４１．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である、態様３６から４０のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
４２．  ４−１ＢＢアゴニストが、Ｂ細胞に内部移行されないであろう、態様３６から４１のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
４３．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分とを含む抗原結合分子であり、ここで、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む、態様３６から４２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
４４．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ここで、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含むか、又は、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む、態様３６から４３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
４５．  ４−１ＢＢアゴニストが、安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインをさらに含む抗原結合分子である、態様３６から４４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
４６．  ４−１ＢＢアゴニストが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、態様３６から４４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
４７．  ４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である、態様３６から４６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
４８．  ４−１ＢＢアゴニストが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、態様３６から４７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
４９．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含む、態様３６から４８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
５０．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする、態様３６から４９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
５１．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含むＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、態様３６から５０のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
５２．  ４−１ＢＢアゴニストが、
ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号３９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｄ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｅ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｆ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号４５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号４６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｇ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｈ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号４９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号５０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｊ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｋ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；並びに
ｌ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号５１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子
からなる群から選択される抗原結合分子である、態様３６から５１のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
５３．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である、態様３６から４８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
５４．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む抗原結合分子であり、ここで、ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドは、任意選択的にペプチドリンカーを介して、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方のＮ又はＣ末端アミノ酸に融合される、態様３６から４８、又は５３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
５５．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子、
（ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子、
（ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子、及び
（ｄ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子
からなる群から選択される抗原結合分子である、態様３６から４８、又は５３又は５４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
５６．  ４−１ＢＢアゴニストが、抗ＣＤ１９／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、態様３６から３８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
５７．  抗ＣＤ２０抗体が、配列番号７３のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号７４のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号７５のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）、並びに／又は配列番号７６のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号７７のＣＤＲ−Ｌ２配列及び配列番号７８のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む、態様３６から５６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
５８．  抗ＣＤ２０抗体が、配列番号７９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）及び／又は配列番号８０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む、態様３６から５７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
５９．  ４−１ＢＢアゴニストが、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含み、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせて使用され、この組み合わせが、約１週間から３週間の間隔で投与される、態様３６から５８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
６０．  増殖性疾患、特にがんを治療すること又はがんの進行を遅延させることにおける使用のための、態様３６から５９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
６１．  Ｂ細胞増殖性疾患、特に、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）及びホジキンリンパ腫（ＨＬ）からなる群より選択される疾患の治療における使用のための、態様３６から６０のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
６２．  対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるためのキットであって、（Ａ）活性成分としての、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニスト及び薬学的に許容される添加物を含む第１の組成物；及び（Ｂ）活性成分としての抗ＣＤ２０抗体及び薬学的に許容される添加物を含む第２の組成物、及び（Ｃ）併用療法において組成物を使用するための説明書を含むパッケージを含むキット。
６３．  増殖性疾患、特にがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための医薬の製造における、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストと抗ＣＤ２０抗体の組み合わせの使用。
６４．  医薬が、Ｂ細胞増殖性疾患、特に、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）及びホジキンリンパ腫（ＨＬ）からなる群より選択される疾患の治療のためのものである、医薬の製造における、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストと抗ＣＤ２０抗体の組み合わせの使用。
６５．  腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストと、抗ＣＤ２０抗体の有効量を対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法。
６６．  ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストと、抗ＣＤ２０抗体の有効量を対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅延させるための方法。
６７．  ４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、態様６５又は６６に記載の方法。
６８．  ４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃγ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低減させる修飾を有するＦｃドメインを含む抗原結合分子である、態様６５から６７のいずれか一項に記載の方法。
６９．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む抗原結合分子である、態様６５から６８のいずれか一項に記載の方法。
７０．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である、態様６５から６９のいずれか一項に記載の方法。
７１．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む分子であり、ここで、４−１ＢＢＬのエクトドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、態様６５から７０のいずれか一項に記載の方法。
７２．  ４−１ＢＢアゴニストが、Ｂ細胞に内部移行されないであろう、態様６５から７１のいずれか一項に記載の方法。
７３．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分とを含む抗原結合分子であり、ここで、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む、態様６５から７２のいずれか一項に記載の方法。
７４．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ここで、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含むか、又は、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む、態様６５から７３のいずれか一項に記載の方法。
７５．  ４−１ＢＢアゴニストが、安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインをさらに含む抗原結合分子である、態様６５から７４のいずれか一項に記載の方法。
７６．  ４−１ＢＢアゴニストが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、態様６５から７５のいずれか一項に記載の方法。
７７．  ４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である、態様６５から７６のいずれか一項に記載の方法。
７８．  ４−１ＢＢアゴニストが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、態様６５から７７のいずれか一項に記載の方法。
７９．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含む、態様６５から７８のいずれか一項に記載の方法。
８０．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに連結する４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して連結する４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする、態様６５から７９のいずれか一項に記載の方法。
８１．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含むＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、態様６５から８０のいずれか一項に記載の方法。
８２．  ４−１ＢＢアゴニストが、
ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号３９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｄ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｅ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｆ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号４５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号４６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｇ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｈ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号４９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号５０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｊ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｋ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；並びに
ｌ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号５１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子
からなる群から選択される抗原結合分子である、態様６５から８１のいずれか一項に記載の方法。
８３．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である、態様６５から８２のいずれか一項に記載の方法。
８４．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定に会合することができる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
を含む抗原結合分子であり、ここで、ペプチドリンカーにより互いに連結される４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドは、任意選択的にペプチドリンカーを介して、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方のＮ又はＣ末端アミノ酸に融合される、態様６５から８３のいずれか一項に記載の方法。
８５．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子、
（ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子、
（ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子、及び
（ｄ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子
からなる群から選択される抗原結合分子である、態様６５から８４のいずれか一項に記載の方法。
８６．  ４−１ＢＢアゴニストが、抗ＣＤ１９／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、態様６５から６８のいずれか一項に記載の方法。
８７．  抗ＣＤ２０抗体が、配列番号７３のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号７４のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号７５のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）、並びに／又は配列番号７６のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号７７のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号７８のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む、態様６５から８６のいずれか一項に記載の方法。
８８．  抗ＣＤ２０抗体が、配列番号７９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）及び／又は配列番号８０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む、態様６５から８７のいずれか一項に記載の方法。
８９．  抗ＣＤ２０抗体が、リツキシマブを含む、態様６５から８６のいずれか一項に記載の方法。
９０．  ４−１ＢＢアゴニストが、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含み、抗ＣＤ２０抗体と組み合わせて使用され、この組み合わせが、約１週間から３週間の間隔で投与される、態様６５から８９のいずれか一項に記載の方法。
９１．  腫瘍関連抗原、特にＣＤ１９又はＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストと、抗ＣＤ２０抗体が、単一の組成物において一緒に投与されるか、又は２つ以上の異なる組成物において別々に投与される、態様６５から９０のいずれか一項に記載の方法。
９２．  ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストと、抗ＣＤ２０抗体が、静脈内又は皮下に投与される、態様６５から９１のいずれか一項に記載の方法。
９３．  ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストが、抗ＣＤ２０抗体と同時に、その前に、又はその後に投与される、態様６５から９２のいずれか一項に記載の方法。
９４．  ４−１ＢＢアゴニストが、腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子である、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと抗ＣＤ２０抗体を含む組み合わせ。
９５．  ４−１ＢＢアゴニスト及び抗ＣＤ２０抗体が同時に投与される、態様９４に記載の組み合わせ。
９６．  ４−１ＢＢアゴニスト及び抗ＣＤ２０抗体が、単一の組成物において一緒に投与されるか、又は２つ以上の異なる組成物において別々に投与される、態様９４又は９５に記載の組み合わせ。
９７．  ４−１ＢＢアゴニストが、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む、態様９４から９６のいずれか一項に記載の組み合わせ。
９８．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む、態様９４から９７のいずれか一項に記載の組み合わせ。
９９．  ４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、ここで、４−１ＢＢＬのエクトドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、態様９４から９８のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１００．  ４−１ＢＢアゴニストが、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片とを含む抗原結合分子であり、ここで、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）
を含む、態様９４から９９のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１０１．  ４−１ＢＢアゴニストが、ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、４−１ＢＢＬの３つのエクトドメイン又はそれらの断片とを含む抗原結合分子であり、ここで、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含むか、又は、ＣＤ１９に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む、態様９４から１００のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１０２．  ４−１ＢＢアゴニストが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、態様９４から１０１のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１０３．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチドを含む抗原結合分子であり、
ここで、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに連結されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含む、態様９４から１０２のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１０４．  ４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含むＣＤ１９に特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに結合している第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、
ここで、該抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、態様９４から１０３のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１０５．  ４−１ＢＢアゴニストが、
ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号３９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｄ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｅ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｆ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号４５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号４６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｇ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｈ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号４９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号５０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｊ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｋ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；並びに
ｌ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号５１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子
からなる群から選択される抗原結合分子である、態様９４から１０４のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１０６．  ４−１ＢＢアゴニストが、ＣＤ１９に特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子である、態様９４から１０５のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１０７．  ４−１ＢＢアゴニストが、抗ＣＤ１９／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、態様９４から９７のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１０８．  抗ＣＤ２０抗体が、Ｉ型抗ＣＤ２０抗体である、態様９４から１０７のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１０９．  抗ＣＤ２０抗体が、リツキシマブである、態様９４から１０８のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１１０．  抗ＣＤ２０抗体が、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体である、態様９４から１０７のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１１１．  抗ＣＤ２０抗体が、アフコシル化抗ＣＤ２０抗体である、態様９４から１０７、又は１１０のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１１２．  抗ＣＤ２０抗体が、オビヌツズマブである、態様９４から１０７、又は１１１又は１１２のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１１３．  抗ＣＤ２０抗体が、リツキシマブ又はオビヌツズマブである、態様９４から１０７のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１１４．  医薬としての使用のための、態様９４から１１３のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１１５．  ４−１ＢＢアゴニスト及び抗ＣＤ２０抗体が、単一の組成物において一緒に投与されるか、又は２つ以上の異なる組成物において別々に投与される、態様９４から１１４のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１１６．  ４−１ＢＢアゴニスト及び抗ＣＤ２０抗体が、同時投与のため、又は逐次投与のためのものである、態様９４から１１５のいずれか一項に記載の組み合わせ。
１１７．  Ｂ細胞増殖性疾患、特に、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）及びホジキンリンパ腫（ＨＬ）からなる群より選択される疾患の治療における使用のための、態様９４から１１６のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【実施例】
【０２７０】
以下は本発明の方法及び組成物の例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
【０２７１】
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造者の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242に与えられている。
【０２７２】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定により決定された。
【０２７３】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、適切なテンプレートを用いるＰＣＲによって生成されたか、又は自動遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物からＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成された。正確な遺伝子配列が利用できない場合、オリゴヌクレオチドプライマーは最も近いホモログからの配列に基づいて設計され、遺伝子は適切な組織に由来するＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって単離された。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準的なクローニング／シーケンシングベクター中にクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にするために適切な制限部位を用いて設計された。すべてのコンストラクトは、真核細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする、５’末端ＤＮＡ配列を含むように設計された。
【０２７４】
細胞培養技術
Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Incに記載されているように、標準的な細胞培養技術を使用した。
【０２７５】
タンパク質の精製
標準的なプロトコールを参照して、濾過された細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡潔には、抗体を、プロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶出は、ｐＨ２．８で達成され、続いて試料を直ちに中和した。凝集したタンパク質を、ＰＢＳ中又は２０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０中でのサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、単量体抗体から分離した。単量体抗体画分をプールし、例えばＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（３０  ＭＷＣＯ）遠心濃縮器を使用して濃縮し（必要に応じて）、−２０℃又は−８０℃で凍結し、保存した。試料の一部が、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又は質量分析法によるその後のタンパク質分析及び分析的特徴づけのために提供された。
【０２７６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示に従って使用した。特に、１０％又は４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ビス−ＴＲＩＳ  Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）抗酸化剤ランニングバッファー添加剤を含む）又はＭＯＰＳ（非還元ゲル）ランニングバッファーを使用した。
【０２７７】
分析的サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態の決定のためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって行った。簡潔には、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １１００システム上の３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５の中のＴｏｓｏｈ  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷカラムに、又はＤｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣシステム上の２ｘＰＢＳ中のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。溶出したタンパク質を、ＵＶ吸光度及びピーク面積の積分によって定量化した。ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １５１−１９０１が標準として機能した。
【０２７８】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（ＢＩＡＣＯＲＥ）を使用した、それぞれの抗原に対する多重特異性抗体の結合及び結合親和性の決定
生成された抗体のそれぞれの抗原への結合は、ＢＩＡＣＯＲＥ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用した表面プラズモン共鳴によって調査される。簡潔には、親和性の測定のために、Ｇｏａｔ−Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ，ＪＩＲ  １０９−００５−０９８抗体を、それぞれの抗原に対する抗体の提示のためのアミンカップリングを介してＣＭ５チップ上に固定化する。結合は、ＨＢＳバッファー（ＨＢＳ−Ｐ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐｈ７．４）中において、２５℃（又は代替的に３７℃）で測定される。抗原（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ又は社内で精製）を溶液中に様々な濃度で添加した。８０秒から３分の抗原注入により会合を測定し；３〜１０分間にわたりＨＢＳバッファーでチップ表面を洗浄することにより解離を測定し、ラングミュア１：１結合モデルを使用してＫＤ値を測定した。システム固有のベースラインドリフトを補正するため及びノイズシグナル低減のために、陰性対照データ（例えば緩衝曲線）が試料曲線から差し引かれる。センサーグラムの分析のため及び親和性データの計算のために、それぞれのＢｉａｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅが使用される。
【０２７９】
実施例１
腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢＬ抗原結合分子の調製、精製及び特徴づけ
ＣＤ１９標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子を、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１６／０７５２７８Ａ１に記載されるように調製した。
【０２８０】
特に、以下の分子を作製した。
【０２８１】
ａ）一価のＣＤ１９標的化及び非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子
【０２８２】
ヒトＣＬドメインに融合した二量体４−１ＢＢリガンドをコードするＤＮＡ配列を、ノブ上のヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むフレーム内でサブクローニングした（Merchant, Zhu et al. 1998）。４−１ＢＢリガンドの１つのエクトドメインを含むポリペプチドを、ヒトＩｇＧ１−ＣＨ１ドメインに融合させた。構築物３．４において、正確なペアリングを向上させるために、以下の変異を交差ＣＨ−ＣＬに追加的に導入した（荷電変異体）。ヒトＣＬに融合した二量体４−１ＢＢリガンドにおいて、Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ、ヒトＣＨ１に融合した単量体４−１ＢＢリガンドにおいて、Ｋ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅ。
【０２８３】
ＣＤ１９に特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域、クローン８Ｂ８−０１８又はクローン８Ｂ８−２Ｂ１１を、ヒトＩｇＧ１のホールの定常重鎖又は定常軽鎖のいずれかとフレーム内でサブクローニングした。国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するため、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を、ノブ及びホール重鎖の定常領域に導入した。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む二量体リガンド−Ｆｃノブ鎖、単量体ＣＨ１融合、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む標的化抗ＣＤ１９−Ｆｃホール鎖及び抗ＣＤ１９軽鎖の組み合わせにより、組み立てられた三量体４−１ＢＢリガンド及びＣＤ１９結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体が生成される（図１Ａ及び１Ｂ）。これに基づき、生殖系列ＤＰ４７によってＣＤ１９バインダーを置換することにより非標的化バージョンが調製された（図１Ｃ）。
【０２８４】
2021515782.tif 000025
【０２８５】
ｂ）二価のＣＤ１９標的化及び非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子
【０２８６】
ＣＤ１９に特異的なバインダーに特異的な重鎖及び軽鎖の重鎖及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列、クローン８Ｂ８−０１８又はクローン８Ｂ８−２Ｂ１１を、ヒトＩｇＧ１のホール、ノブの定常重鎖又は定常軽鎖のいずれかとフレーム内でサブクローニングした。国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を導入した。さらに、４−１ＢＢリガンドの２つのエクトドメインを含むポリペプチドを、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃホール鎖のＣ末端に融合させ、４−１ＢＢリガンドの１つのエクトドメインを含むポリペプチドを、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃノブ鎖のＣ末端に融合させた。Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む抗ＣＤ１９  ｈｕＩｇＧ１ホール二量体リガンド重鎖、Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む抗ＣＤ１９  ｈｕＩｇＧ１ノブ単量体リガンド重鎖、及び抗ＣＤ１９軽鎖の組み合わせにより、組み立てられた三量体４−１ＢＢリガンド及び２つのＣＤ１９結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体が生成された（図１Ｄ）。これに基づき、生殖系列ＤＰ４７によってＣＤ１９バインダーを置換することにより非標的化バージョンが調製された（図１Ｅ）。
【０２８７】
2021515782.tif 000026
【０２８８】
ＣＤ１９標的化及び非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の生成及び特徴づけは、国際公開第２０１６／０７５２７８号、実施例７．４及び実施例８から１１のそれぞれに詳細に記載されている。
【０２８９】
ＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子も、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１６／０７５２７８Ａ１に記載されるように調製した。
【０２９０】
特に、以下の分子を作製した。
【０２９１】
ｃ）一価のＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子
【０２９２】
ＦＡＰに特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域、クローン２８Ｈ１又はクローン４Ｂ９を、ヒトＩｇＧ１のホールの定常重鎖又は定常軽鎖のいずれかとフレーム内でサブクローニングした。国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するため、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を、ノブ及びホール重鎖の定常領域に導入した。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む二量体リガンド−Ｆｃノブ鎖、単量体ＣＨ１融合、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む標的化抗ＦＡＰ−Ｆｃホール鎖及び抗ＦＡＰ軽鎖の組み合わせにより、組み立てられた三量体４−１ＢＢリガンド及びＦＡＰ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体が生成される（図１Ａに類似）。
【０２９３】
2021515782.tif 000027
【０２９４】
ｄ）二価のＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子
【０２９５】
ＦＡＰに特異的なバインダーに特異的な重鎖及び軽鎖の重鎖及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列、クローン２８Ｈ１又はクローン４Ｂ９を、ヒトＩｇＧ１のホール、ノブの定常重鎖又は定常軽鎖のいずれかとフレーム内でサブクローニングした。国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を導入した。さらに、４−１ＢＢリガンドの２つのエクトドメインを含むポリペプチドを、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃホール鎖のＣ末端に融合させ、４−１ＢＢリガンドの１つのエクトドメインを含むポリペプチドを、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃノブ鎖のＣ末端に融合させた。Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１ホール二量体リガンド重鎖、Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む抗ＦＡＰ  ｈｕＩｇＧ１ノブ単量体リガンド重鎖、及び抗ＦＡＰ軽鎖の組み合わせにより、組み立てられた三量体４−１ＢＢリガンド及び２つのＦＡＰ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体が生成された（図１Ｄ）。
【０２９６】
2021515782.tif 000028
【０２９７】
ＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の生成及び特徴づけは、国際公開第２０１６／０７５２７８号、実施例１から６のそれぞれに詳細に記載されている。
【０２９８】
実施例２
一価ＣＤ１９−ｍｕ４−１ＢＢＬ抗原結合分子（ハイブリッドサロゲート）の調製、精製、及び特徴づけ
ＣＤ１９標的化マウス４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子を、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１６／０７５２７８Ａ１に記載されるように調製した。マウス４−１ＢＢリガンドのエクトドメインの一部（アミノ酸１０４−３０９、Ｃ１６０Ｓ変異を含む）をコードするＤＮＡ配列は、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースのＱ３Ｕ１Ｚ９−１配列に従って合成された。
【０２９９】
ヒトＣＬドメインに融合した二量体マウス４−１ＢＢリガンドをコードするＤＮＡ配列を、ノブ上のヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むフレーム内でサブクローニングした（Merchant, Zhu et al. 1998）。マウス４−１ＢＢリガンドの１つのエクトドメインを含むポリペプチドを、ヒトＩｇＧ１−ＣＨ１ドメインに融合させた。ＣＤ１９に特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域、クローン８Ｂ８−０１８を、ヒトＩｇＧ１のホールの定常重鎖又は定常軽鎖のいずれかとフレーム内でサブクローニングした。国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するため、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を、ノブ及びホール重鎖の定常領域に導入した。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む二量体リガンド−Ｆｃノブ鎖、単量体ＣＨ１融合、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む標的化抗ＣＤ１９−Ｆｃホール鎖及び抗ＣＤ１９軽鎖の組み合わせにより、組み立てられた三量体マウス４−１ＢＢリガンド及びＣＤ１９結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体が生成される（図１Ｆ）。
【０３００】
ハイブリッドサロゲートＣＤ１９−ｍｕ４−１ＢＢＬのアミノ酸配列は、表５に示すとおりである。
【０３０１】
2021515782.tif 000029
【０３０２】
ハイブリッドサロゲートＣＤ１９−ｍｕ４−１ＢＢＬは、ｅｖｉＦｅｃｔ（Ｅｖｉｔｒｉａ  ＡＧ）を使用して、懸濁液中で増殖するＣＨＯ−Ｋ１細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって産生された。細胞は、対応する発現ベクターを、１：１：１：１の比率（「ベクターＦｃホール重鎖」：「ベクターＣＤ１９軽鎖」：「ベクター４−１ＢＢＬ  Ｆｃノブ重鎖」：「ベクターｍｕ４−１ＢＢＬ軽鎖」）でトランスフェクトされた。トランスフェクションのために、ＣＨＯ−Ｋ１細胞をｅｖｉＭａｋｅ（Ｅｖｉｔｒｉａ  ＡＧ）培地中の無血清懸濁液中で培養する。７日後、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター中において３７℃にて、培養上清を遠心分離による精製のために収集し、溶液を滅菌濾過し（０．２２ｍｍフィルター）、４℃に保った。分泌されたタンパク質を、プロテインＡを使用したアフィニティークロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、２０ｍＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化したプロテインＡ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。結合していないタンパク質を、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム含有バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。結合したタンパク質を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭグリシン、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０  ｐＨ３．０の塩化ナトリウムの線形ｐＨ勾配を使用して溶出させた。次にカラムを、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭグリシン、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ３．０で洗浄した。収集した画分のｐＨを、１／４０（ｖ／ｖ）の２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を加えることによって調整した。タンパク質を濃縮して濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０  ｐＨ６．０で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。
【０３０３】
精製された二重特異性構築物のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を使用して、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。二重特異性構築物の純度及び分子量を、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を使用して還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の存在下及び非存在下でＣＥ−ＳＤＳによって分析した。二重特異性構築物の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファー中で２５℃で平衡化したＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を使用して分析した。
【０３０４】
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【０３０５】
表面プラズモン共鳴によるハイブリッドサロゲートＣＤ１９−ｍｕ４−１ＢＢＬの機能的特徴づけ
マウス４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）とヒトＣＤ１９を同時に結合する能力を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。すべてのＳＰＲ実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、２５℃で行われた。ビオチン化マウス４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）を、ストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップのフローセルに直接結合させた。最大６００共鳴単位（ＲＵ）までの固定化レベルが使用された。ＣＤ１９標的化ｍｕ４−１ＢＢＬ構築物を、２００ｎＭの濃度範囲で３０μＬ／分の流速で９０秒間にわたってフローセルを通過させ、解離をゼロ秒に設定した。単量体ヒトＣＤ１９−Ｆｃ（ｋｉｈ）を、第２の被分析物として、５００ｎＭの濃度で３０μＬ／分の流速で９０秒間にわたってフローセルを通して注入した（図２Ａ）。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差は、タンパク質が固定化されていない基準フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正された。図２Ｂのグラフに見られるように、ハイブリッドサロゲートＣＤ１９−ｍｕ４−１ＢＢＬは、マウス４−１ＢＢとヒトＣＤ１９に同時に結合することができる。
【０３０６】
実施例３
ＣＤ１９−４−１ＢＢＬとリツキシマブ又はオビヌツズマブのｉｎ  ｖｉｔｒｏ併用療法
ＮＫ細胞の活性化
ＣＤ１９−４−１ＢＢＬは、ＣＤ１９を発現しているＮＨＬ細胞上で架橋することができる場合に活性となる。リツキシマブ及びオビヌツズマブ（Ｇａｚｙｖａ）などの抗体は、ＮＨＬ細胞上のＣＤ２０に結合し、それによってＮＫ細胞を活性化してＡＤＣＣを媒介することができる。活性化されたＮＫ細胞は４−１ＢＢを発現する。我々の仮説は、ＣＤ１９−４−１ＢＢＬが、ＮＫ細胞活性化のための抗ＣＤ２０ＡＤＣＣ媒介抗体と協同することができるというものである。これを試験するために、我々は、３つの異なるＮＨＬ細胞株、例えばＷＳＵ−ＤＬＣＬ２（ＣＤ１９＋ＣＤ２０ｈｉｇｈ）、ＳＵ−ＤＨＬ−８（ＣＤ１９＋ＣＤ２０ｌｏｗ）、及びＮａｍｌ−６（ＣＤ１９＋ＣＤ２０ｌｏｗ）を使用した。活性化ＮＫ細胞の生物活性を測定するために、ＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１９８０−０４８）＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１６１４０−０７１）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５０７０−０６３）中で、用量漸増リツキシマブ若しくはオビヌツズマブのみの存在下で、又は、ＥＣ５０濃度のリツキシマブ若しくはオビヌツズマブに加えて用量漸増ＣＤ１９−４−１ＢＢＬを追加して、それぞれのＮＨＬ細胞を新鮮な健常者血液から精製したＰＢＭＣと１：２５の比率で２４時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡ（ＤｕｏＳｅｔ  Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡキット、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹ２８５）によるＩＦＮ−γの測定のために、上清を収集した。図３は、試験した３つのＮＨＬ細胞株すべてにおいて、ＣＤ１９−４−１ＢＢＬが、リツキシマブ又はオビヌツズマブ（Ｇａｚｙｖａ）によって活性化された、ＩＦＮ−γ産生のためのＮＫ細胞のエフェクター機能を高める可能性があることを示している。ＳＵ−ＤＨＬ−８及びＮａｌｍ−６などのＣＤ２０ｌｏｗ細胞では、オビヌツズマブとの組み合わせは、リツキシマブとの組み合わせよりも高いＩＦＮ−γ産生を誘導した。
【０３０７】
ＣＤ１９−４−１ＢＢＬがＡＤＣＣ媒介抗体の添加後にのみＮＫ細胞を活性化できることを確認するために、（ＣＤ３−ＣＤ５６ｄｉｍでゲーティングされた）ＮＫ細胞上のＣＤ２５などの活性化マーカーを測定した。ＣＤ１９−４−１ＢＢＬは、ＩＦＮ−γ産生と一致して、リツキシマブ又はオビヌツズマブによってすでに活性化されているＣＤ２５を上方制御することによってのみ、ＮＫ細胞の活性化を高めることができた（図４）。対照的に、Ｔ細胞（ＣＤ４及びＣＤ８の両方）は、この共培養においてＣＤ２５又はＣＤ６９に関して活性化を示さなかった（データは示さず）。
【０３０８】
また、ＮＫ細胞のＡＤＣＣ機能をオビヌツズマブと協同させることにおいて、標的化ＣＤ１９−４−１ＢＢＬが４−１ＢＢアゴニスト抗体のウレルマブよりも優れているかどうかを調べた。上記と同様の実験で、ＣＤ１９−４−１ＢＢＬとオビヌツズマブの組み合わせのみがＮＫ細胞の活性化を高めるが（ＣＤ２５上方制御）、ウレルマブとオビヌツズマブの組み合わせは高めなかったことが観察された（図５）。
【０３０９】
実施例４
ハイブリッドＣＤ１９−４−１ＢＢＬとリツキシマブのｉｎ  ｖｉｖｏ併用療法
ハイブリッドＣＤ１９−４−１ＢＢＬ（一価ＣＤ１９−ｍｕ４−１ＢＢＬ）とリツキシマブの組み合わせの概念に関する最初の実証は、腫瘍を有するｈｕＣＤ１６ｔｇＳｃｉｄマウスで行われた。
【０３１０】
ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞（ヒトびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）は、もともとＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）から取得され、増殖後、Ｒｏｃｈｅ  ＧｌｙｃａｒｔＡＧの内部細胞バンクに寄託された。細胞を、１０％のＦＣＳ及び１ｘＧｌｕｔａｍａｘを含むＲＰＭＩ中で培養した。細胞は、５％ＣＯ２の水飽和雰囲気下で３７℃で培養した。動物１匹当たり１．５ｘ１０６個の細胞を、ＲＰＭＩ細胞培地（Ｇｉｂｃｏ）及びＧＦＲマトリゲル（１：１、総量１００ｕｌ）中において、生存率＞９５．０％で動物の右脇腹に皮下注射した。
【０３１１】
実験開始時８−１０週齢のヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６）トランスジェニックＳＣＩＤマウス（これは、エフェクターとしてマウスＦｃγＲＩＶ陽性マクロファージとヒトＦｃγＲＩＩＩａ陽性トランスジェニックマウスＮＫ細胞の両方を発現する）（フランスのチャールズリバーで飼育）は、コミットされたガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、特定の病原体フリーの条件下で毎日１２時間明／１２時間暗のサイクルで維持された実験研究プロトコールが地方自治体により審査され、承認された。動物は、到着後１週間、新しい環境への馴致及び観察のために保持された。継続的な健康モニタリングが定期的に実施された。
【０３１２】
プロトコール（図６）に従って、上記のように雌ｈｕＣＤ１６ＴｇＳｃｉｄマウスに腫瘍細胞を皮下注射し、腫瘍サイズがおよそ２００ｍｍ３（１３日目）に達したときに、化合物又はＰＢＳ（ビヒクル）で週１回治療した。すべてのマウスに、２００μｌの適切な溶液を週１回静脈内注射した。２００μｌあたりの適切な量の化合物を得るために、保存溶液（表５）を必要に応じてＰＢＳで希釈した。リツキシマブとハイブリッドＣＤ１９−４−１ＢＢＬ構築物との併用療法（群Ｄ、図６）については、治療薬は１日の間隔をあけて注射された。腫瘍の増殖をノギスを使用して週に２回測定し、腫瘍体積を以下のように計算した：
Ｔｖ：（Ｗ２／２）ｘＬ  （Ｗ：幅，Ｌ：長さ）
【０３１３】
化合物を８回注射した後、試験を終了してすべてのマウスを屠殺し（腫瘍細胞注射後６４日目）、腫瘍を外植して重量を測定した。図７Ａ及び７Ｂは、すべての治療群における腫瘍増殖動態（平均＋／−ＳＥＭ）、並びに試験終了時の腫瘍重量を示す。ハイブリッドＣＤ１９−４−１ＢＢＬの単剤療法では、腫瘍増殖阻害は明らかにならなかった。リツキシマブの単剤療法は、ビヒクルと比較してより遅い腫瘍増殖を誘導した。しかしながら、リツキシマブとハイブリッドＣＤ１９−４−１ＢＢＬの組み合わせは、統計的に有意な腫瘍増殖阻害を誘導し、他のすべての治療群と比較して、
試験終了時の腫瘍重量が有意に減少したことが明らかになった。
【０３１４】
2021515782.tif 000031
【０３１５】
実施例５
一価ＣＤ１９（２Ｂ１１）−４−１ＢＢＬとオビヌツズマブ（Ｇａｚｙｖａ）のｉｎ  ｖｉｖｏ併用療法
ｍｏｎｏ  ＣＤ１９（２Ｂ１１）−４−１ＢＢＬとＧＡＺＹＶＡの組み合わせの概念の実証は、完全にヒト化されたＮＳＧマウスで行われた。
【０３１６】
ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞（ヒトびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）は、もともとＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）から取得され、増殖後、Ｒｏｃｈｅ  ＧｌｙｃａｒｔＡＧの内部細胞バンクに寄託された。細胞を、１０％のＦＣＳ及び１ｘＧｌｕｔａｍａｘを含むＲＰＭＩ中で培養した。細胞は、５％ＣＯ２の水飽和雰囲気下で３７℃で培養した。動物１匹当たり１．５ｘ１０６個の細胞（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ継代１８）を、ＲＰＭＩ細胞培地（Ｇｉｂｃｏ）及びＧＦＲマトリゲル（１：１、総量１００μｌ）中において、生存率＞９５．０％で動物の右脇腹に皮下注射した。
【０３１７】
実験開始時に４−５週齢の雌のＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウス（デンマークのタコニックで飼育）は、コミットされたガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、特定の病原体フリーの条件下で毎日１２時間明／１２時間暗のサイクルで維持された。実験研究プロトコールが地方自治体により審査され、承認された（ＺＨ１９３／２０１４）。動物は、到着後１週間、新しい環境への馴致及び観察のために保持された。継続的な健康モニタリングが定期的に実施された。
【０３１８】
プロトコール（図８）に従って、雌のＮＳＧマウスに、１５ｍｇ／ｋｇのブスルファンが腹腔内注射され、１日後に臍帯血から単離された１ｘ１０５個のヒト造血幹細胞が静脈内注射された。幹細胞注射後１４−１６週目に、マウスの舌下から採血し、ヒト化を成功させるために、血液をフローサイトメトリーによって分析した。効率的に移植されたマウスは、ヒトＴ細胞の頻度に応じて、異なる治療群に無作為化された（図８、ｎ：１０／群）。その時、マウスに腫瘍細胞を皮下注射し、腫瘍サイズがおよそ４５０ｍｍ３（１１日目）に達したときに、化合物又はＰＢＳ（ビヒクル）で週１回治療した。すべてのマウスに２００μｌの適切な溶液を静脈内注射した。２００μｌあたりの適切な量の化合物を得るために、保存溶液（表６）を必要に応じてＰＢＳで希釈した。ＧＡＺＹＶＡとの併用療法（群Ｄ、図８）の場合、ＣＤ１９−４−１ＢＢＬ構築物が同時に注射された。腫瘍の増殖をノギスを使用して週に２回測定し、腫瘍体積を以下のように計算した：
Ｔｖ：（Ｗ２／２）ｘＬ  （Ｗ：幅，Ｌ：長さ）
【０３１９】
図９は、すべての治療群における腫瘍増殖動態（平均＋／−ＳＥＭ）を示す。ＣＤ１９−４−１ＢＢＬの単剤療法効果は検出できなかった。単剤としてのオビヌツズマブは、腫瘍増殖阻害をほとんど誘導しなかったが、ＣＤ１９−４−１ＢＢＬとの組み合わせは、すべての動物で完全な腫瘍退縮を誘導した（図９）。
【０３２０】
2021515782.tif 000032
【図１Ａ−Ｆ】
2021515782.tif 000033
【図２Ａ−Ｂ】
2021515782.tif 000034
【図３Ａ−Ｂ】
2021515782.tif 000035
【図３Ｃ】
2021515782.tif 000036
【図４Ａ−Ｂ】
2021515782.tif 000037
【図４Ｃ】
2021515782.tif 000038
【図５Ａ−Ｂ】
2021515782.tif 000039
【図５Ｃ】
2021515782.tif 000040
【図６】
2021515782.tif 000041
【図７Ａ−Ｂ】
2021515782.tif 000042
【図８】
2021515782.tif 000043
【図９】
2021515782.tif 000044
【配列表】
2021515782000001.app
【国際調査報告】
2021515782.tif 000045
2021515782.tif 000046
2021515782.tif 000047