(57)【要約】  本発明は、リパーゼ活性を有するポリペプチドであって、配列番号１によるポリペプチドとアライメントされた場合に、少なくともアミノ酸置換Ｌ４１０Ｘと、任意にＳ３６５Ｑ、Ｓ３６５Ｎ、Ｌ４１３Ｍ、Ｇ４１４Ａ、Ｇ４１４Ｓ、Ｇ４１４Ｖ、Ｇ４１４Ｔ、Ｖ５３４Ｌ及びＶ５３４Ｉから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換と、を含み、アミノ酸位置の１０個の番号付けが、配列番号１に関して定義される、ポリペプチドに関する。本発明はさらに、本明細書に開示されるポリペプチドと、オイル又は脂肪を含む生成物の中間形態を接触させることを含む、オイル又は脂肪を含む生成物を製造するプロセス、並びにオイル又は脂肪中の飽和脂肪酸への本明細書に開示されるポリペプチドの使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１によるポリペプチドとアライメントされた場合に、少なくともアミノ酸置換Ｌ４１０Ｘと、任意にＳ３６５Ｑ、Ｓ３６５Ｎ、Ｌ４１３Ｍ、Ｇ４１４Ａ、Ｇ４１４Ｓ、Ｇ４１４Ｖ、Ｇ４１４Ｔ、Ｖ５３４Ｌ及びＶ５３４Ｉから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換と、を含み、アミノ酸位置の番号付けが、配列番号１又は相当する位置に関して定義される、ポリペプチド；
ｂ）配列番号１のアミノ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％％、又は９９％の同一性を有する、ａ）によるポリペプチド；
ｃ）配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する、核酸によってコードされるポリペプチドであって、配列番号２が、配列番号１によるポリペプチドの、アミノ酸置換Ｌ４１０Ｘと、任意に、Ｓ３６５Ｑ、Ｓ３６５Ｎ、Ｌ４１３Ｍ、Ｇ４１４Ａ、Ｇ４１４Ｓ、Ｇ４１４Ｖ、Ｇ４１４Ｔ、Ｖ５３４Ｌ及びＶ５３４Ｉから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換とを生じる、少なくとも１つの変異を含み、アミノ酸位置の番号付けが、配列番号１に関して定義される、ポリペプチド；及び
ｄ）配列番号２の配列の相補鎖と低、中及び／又は高ストリンジェントな条件下にて、ハイブリダイズする配列を含む核酸によってコードされるポリペプチドであって、配列番号２が、配列番号１によるポリペプチドの、アミノ酸置換Ｌ４１０Ｘと、任意に、Ｓ３６５Ｑ、Ｓ３６５Ｎ、Ｌ４１３Ｍ、Ｇ４１４Ａ、Ｇ４１４Ｓ、Ｇ４１４Ｖ、Ｇ４１４Ｔ、Ｖ５３４Ｌ及びＶ５３４Ｉから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換とを生じる、少なくとも１つの変異を含み、アミノ酸位置の番号付けが、配列番号１に関して定義される、ポリペプチド；
からなる群から選択される、リパーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
Ｘが、非極性アミノ酸、好ましくはＡ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、Ｗ、Ｆ、Ｐ及びＭからなる群から選択されるアミノ酸を表し、より好ましくはＸがＦを表す、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリペプチドの単離された、実質的に純粋な、純粋な、組換え、合成又はバリアントポリペプチドである、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
相当する野生型ポリペプチドのエイコサペンタエン酸に対する特異性と比べたミリスチン酸、パルミチン酸及びステアリン酸に対する特異性よりも、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）に対する特異性と比べたミリスチン酸、パルミチン酸及びステアリン酸に対する高い特異性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
相当する野生型ポリペプチドのオレイン酸又はリノール酸に対する特異性と比べたパルミチン酸に対する特異性よりも、オレイン酸又はリノール酸に対する特異性と比べたパルミチン酸に対する高い特異性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、組成物。
【請求項７】
請求項１又は５に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項８】
配列番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有し、配列番号２が、配列番号１によるポリペプチドの、アミノ酸置換Ｌ４１０Ｘと、任意にＳ３６５Ｑ、Ｓ３６５Ｎ、Ｌ４１３Ｍ、Ｇ４１４Ａ、Ｇ４１４Ｓ、Ｇ４１４Ｖ、Ｇ４１４Ｔ、Ｖ５３４Ｌ及びＶ５３４Ｉから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換と生じる、少なくとも１つの変異を含み、アミノ酸位置の番号付けが、配列番号１に関して定義される、請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
宿主細胞において前記ポリペプチドの発現を指示する少なくとも１つの制御配列に作動可能に連結された、請求項７又は８に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１０】
請求項７若しくは８に記載の核酸、又は請求項９に記載の発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項１１】
前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下にて、適切な発酵培地中で請求項１０に記載の宿主細胞を培養する工程と、任意に前記ポリペプチドを回収する工程と、を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチドを製造する方法。
【請求項１２】
オイル又は脂肪を含む生成物を製造するプロセスであって、オイル又は脂肪を含む前記生成物の中間形態を、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項６に記載の組成物と接触させる工程と、前記生成物を製造する工程と、を含むプロセス。
【請求項１３】
前記生成物が食品又は飼料製品である、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
脂肪酸を分離する工程をさらに含む、請求項１２又は１３に記載のプロセス。
【請求項１５】
オイル又は脂肪中の低級飽和脂肪酸又は一価不飽和脂肪酸への、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用であって、又は好ましくは前記オイルが魚油、ダイズ油、ヒマワリ油、サフラワー油、グレープシードオイル、アマニ油又はクルミオイルである、使用。
【請求項１６】
前記脂肪酸が、ラウリン酸（Ｃ１２：０）、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）、ミリストレイン酸（Ｃ１４：１）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、アラキジン酸（Ｃ２０：０）、１１−エイコセン酸又はゴンドウ酸（Ｃ２０：１）、ドコサン酸（Ｃ２２：０）及びエルカ酸又はブラシジン酸（Ｃ２２：１）からなる群から選択される、請求項１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、リパーゼ活性を有する組換えポリペプチド、そのポリペプチドを含む組成物、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクター、その発現ベクターを含む組換え宿主細胞、リパーゼ活性を有する組換えポリペプチドを製造する方法、及び食品又は飼料製品を製造するプロセスであって、リパーゼが使用される、プロセスに関する。
【０００２】
［背景］
魚油は、長鎖（ＬＣ）多価不飽和オメガ−３脂肪酸、特にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ；Ｃ２０：５）及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ；Ｃ２２：６）の貴重な源である。これらのＬＣオメガ−３脂肪酸は、健康的なライフスタイルに寄与することが示されており、ヒトによる魚油の消費は、過去十年間に増加を示している。しかしながら、魚油は健康的なＬＣ−オメガ−３脂肪酸のみを含有するわけではない。魚油の成分は、パルミチン酸（Ｃ１６：０）などの、あまり健康的ではない飽和脂肪酸からなる。したがって、パルミチン酸に対してＥＰＡ及びＤＨＡの濃度を高めるために、様々な方法が開発されている。
【０００３】
同様に、ダイズ油は、リノール酸及びオレイン酸の貴重な源である。しかしながら、ダイズ油も、パルミチン酸などの、あまり健康的ではない飽和脂肪酸を含有する。
【０００４】
例えば米国特許出願公開第２０１６／０２２９７８５号明細書に、粗製魚油からオメガ−３脂肪酸豊富なトリグリセリド生成物を直接抽出する連続プロセスであって、魚油を溶媒と混合し、極性相疑似移動床吸着ゾーンに通す、プロセスが開示されている。このプロセスの欠点は、抽出プロセスにおいて溶媒が適用されることである。
【０００５】
ＣＮ１０５３４９５８７Ａ号明細書には、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の凍結乾燥株を、基質の魚油及びエチルエステル魚油と接触させることによって、グリセリド型の魚油中のＥＰＡとＤＨＡの含有量を向上させる方法であって、エステル交換がコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）リパーゼによって触媒される、方法が開示されている。
【０００６】
代替方法として、魚油中のＥＰＡとＤＨＡの濃度を高めるためにリパーゼが使用される。Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｌｏｒｅｎｔ  ｅｔ．ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ａｍ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ８８：１１７３−１１７８には、リパーゼによるオメガ−３脂肪酸の放出に対する、リパーゼを固定化する様々な疎水性支持体の影響が開示されている。
【０００７】
リパーゼ（トリアシルグリセロールアシルヒドロラーゼ、ＥＣ３．１．１．３）はカルボン酸に作用するヒドロラーゼのファミリーの一部である。リパーゼは種々の微生物によって産生され得る。カンジダ・ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼは、産業で広く使用されており、５つの異なるリパーゼアミノ酸配列が同定されている。Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１５，ｎｏ．７，ｐｐ  ５９５−６０１には、異なる基質特異性を有する数種類のカンジダ・ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼ変異体が開示されている。
【０００８】
本発明は、生成物中のパルミチン酸などの飽和脂肪酸の含有量を下げることができるリパーゼに関する。
【０００９】
［概要］
リパーゼ活性を有するポリペプチドが本明細書において開示されており、そのポリペプチドは：
ａ）配列番号１によるポリペプチドとアライメントした場合に、少なくともアミノ酸置換Ｌ４１０Ｘ、及び任意に、Ｓ３６５Ｑ、Ｓ３６５Ｎ、Ｌ４１３Ｍ、Ｇ４１４Ａ、Ｇ４１４Ｓ、Ｇ４１４Ｖ、Ｇ４１４Ｔ、Ｖ５３４Ｌ及びＶ５３４Ｉから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換を含むポリペプチドであって、アミノ酸位置の番号付けが、配列番号１に関して定義される、ポリペプチド；
ｂ）配列番号１のアミノ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する、ａ）によるポリペプチド；
ｃ）配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する核酸によってコードされるポリペプチドであって、配列番号２が、配列番号１によるポリペプチドの、アミノ酸置換Ｌ４１０Ｘ、及び任意に、Ｓ３６５Ｑ、Ｓ３６５Ｎ、Ｌ４１３Ｍ、Ｇ４１４Ａ、Ｇ４１４Ｓ、Ｇ４１４Ｖ、Ｇ４１４Ｔ、Ｖ５３４Ｌ及びＶ５３４Ｉから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換を生じる少なくとも１つの変異を含み、アミノ酸位置の番号付けが、配列番号１に関して定義される、ポリペプチド；並びに
ｄ）配列番号２の配列の相補鎖と、低、中、及び／又は高ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズする配列を含む核酸によってコードされるポリペプチドであって、配列番号２が、配列番号１によるポリペプチドの、アミノ酸置換Ｌ４１０Ｘ、及び任意にＳ３６５Ｑ、Ｓ３６５Ｎ、Ｌ４１３Ｍ、Ｇ４１４Ａ、Ｇ４１４Ｓ、Ｇ４１４Ｖ、Ｇ４１４Ｔ、Ｖ５３４Ｌ及びＶ５３４Ｉから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換を生じる少なくとも１つの変異を含み、アミノ酸位置の番号付けが、配列番号１に関して定義される、ポリペプチド；
からなる群から選択される。
【００１０】
意外なことに、本明細書で開示されるポリペプチドのエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）へのリパーゼ活性に対するパルミチン酸へのリパーゼ活性の比が、相当する野生型ポリペプチドのこの比よりも高いことが判明した。好ましくは、本明細書で開示されるポリペプチドのエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）へのリパーゼ活性に対するパルミチン酸へのリパーゼ活性の比は、相当する野生型ポリペプチド、例えば配列番号１を含むポリペプチドのこの比よりも１．５〜２、１．５〜３、１．５〜４、１．５〜５、１．５〜６、１．５〜７、１．５〜８、１．５〜９、１．５〜１０倍又は１．５〜２０倍高い。
【００１１】
他の態様において、本発明は、本明細書で開示されるリパーゼ活性を有するバリアントポリペプチドを生成する方法を提供する。
【００１２】
本発明は、配列番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するリパーゼをコードする核酸も提供し、配列番号２は、配列番号１によるポリペプチドの、アミノ酸置換Ｌ４１０Ｘ、及び任意に、Ｓ３６５Ｑ、Ｓ３６５Ｎ、Ｌ４１３Ｍ、Ｇ４１４Ａ、Ｇ４１４Ｓ、Ｇ４１４Ｖ、Ｇ４１４Ｔ、Ｖ５３４Ｌ及びＶ５３４Ｉから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換を生じる少なくとも１つの変異を含み、アミノ酸位置の番号付けが、配列番号１に関して定義される。
【００１３】
他の態様において、本発明は、本明細書に開示されるポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターに関する。
【００１４】
他の態様において、本発明は、本明細書に開示される核酸又は発現ベクターを含む組換え宿主細胞に関する。
【００１５】
さらに他の態様において、本発明は、ポリペプチドの発現を可能にする条件下にて、本明細書で開示される宿主細胞を培養する工程と、ポリペプチドを作製する工程と、を含むポリペプチドの製造方法に関する。
【００１６】
一態様において、本発明は、本明細書に開示されるポリペプチドとオイル又は脂肪を接触させる工程を含む、オイル又は脂肪を含む生成物を製造するプロセスに関する。
【００１７】
他の態様において、本発明は、脂肪又はオイル中のパルミチン酸の濃度を低減するための、本明細書に開示されるポリペプチドの使用に関する。
【００１８】
［定義］
「相補鎖」という用語は「補体」という用語と区別なく使用することができる。核酸鎖の補体は、コード鎖の補体又は非コード鎖の補体であり得る。二本鎖核酸が言及される場合、ポリペプチドをコードする核酸の補体とは、アミノ酸配列をコードする鎖の相補鎖又はそれを含有するいずれかの核酸分子を意味する。
【００１９】
「制御配列」という用語は、「発現調節核酸配列」という用語と区別なく使用され得る。本明細書で使用される用語は、特定の宿主生物において、又は生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な、且つ／又は影響する核酸配列を意味する。２つの核酸配列が作動可能に連結された場合、その配列は通常、同じ向きにあり、また同じ読み枠にある。それらは通常、本質的に隣接するが、これは必要でないかもしれない。発現調節核酸配列、例えば特に、適切な転写開始、終結、プロモーター、リーダー、シグナルペプチド、プロペプチド、プレプロペプチド、又はエンハンサー配列；シャイン・ダルガーノ配列、リプレッサー又はアクチベータ配列；効率的ＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシング及びポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（例えば、リボゾーム結合部位）；タンパク質安定性を高める配列；所望の場合には、タンパク質分泌を高める配列が、選択される宿主生物において活性を示すいずれかの核酸配列であり得て、且つ宿主細胞に対して内因性若しくは異種であるタンパク質をコードする遺伝子に由来し得る。それぞれの制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して天然又は外来性であり得る。所望の場合には、特異的制限部位を導入する目的のために、制御配列にリンカーが与えられ、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域と制御配列のライゲーションが促進され得る。制御配列は、その特異的目的に対して最適化され得る。
【００２０】
「発現」という用語は、限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌などの、ポリペプチドの産生に関与するいずれかの工程を含む。
【００２１】
本明細書に記載の本発明の核酸は、前記遺伝子が過剰発現されない親細胞と比較して、本発明の宿主細胞において過剰発現され得る。ポリヌクレオチド配列の過剰発現は本明細書において、宿主細胞におけるポリペプチドの少なくとも１．１倍、少なくとも１．２５又は少なくとも１．５倍の活性である、宿主細胞において前記配列によってコードされるポリペプチドの活性が生じる、前記配列遺伝子の発現として定義され；好ましくは、前記ポリペプチドの活性は、親細胞におけるポリペプチドの活性の少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも４倍、より好ましくは少なくとも５倍、またより好ましくは少なくとも１０倍、最も好ましくは少なくとも２０倍の活性である。
【００２２】
「発現ベクター」は、生体外又は宿主細胞におけるポリヌクレオチドの発現及び／又は翻訳に適した制御配列（プロモーター、及び転写及び翻訳停止シグナルなど）に作動可能に連結された、本発明によるポリペプチドなどのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。発現ベクターはいずれかのベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）であり得て、便利なことに、それは組換えＤＮＡ手順にかけることができ、ポリヌクレオチドの発現を引き起こすことができる。ベクターの選択は一般に、ベクターが導入される細胞とベクターとの適合性に依存する。ベクターは直鎖状又は閉環状プラスミドであり得る。ベクターは自動的に複製するベクター、つまり、染色体外実体として存在するベクターであり得て、その複製は、染色体複製、例えばプラスミド、染色体外要素、微小染色体、又は人工染色体に依存しない。その代わりとして、ベクターは、宿主細胞に導入された場合に、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるベクターであり得る。組込みクローニングベクターは、宿主細胞の染色体においてランダムに、又は所定の標的座にて組み込み得る。ベクターシステムは、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡ又はトランスポゾンを共に含有する、単一のベクター若しくはプラスミド又は２つ以上のベクター若しくはプラスミドであり得る。本発明のベクターは、例えば過剰発現のために、本発明のポリヌクレオチドを１、２又はそれ以上、例えば３、４又は５つのポリヌクレオチドを含み得る。
【００２３】
本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖をコードする核酸分子のセグメントを意味し、それは、上記の遺伝子調節配列及び以下のコード配列、例えばプロモーター、エンハンサーなど、並びに個々のコーディングセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含み得る、又は含み得ない。遺伝子の定義は、ポリペプチドをコードしないが、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等の機能性ＲＮＡ分子の転写のための鋳型を提供する、核酸を含み得ることさらに理解されよう。
【００２４】
本明細書で定義される宿主細胞は、遺伝子操作に適した生物であり、本発明によるポリペプチドなど、標的生成物の工業的製造に有用な細胞密度で培養され得る。宿主細胞は、天然に見出される宿主細胞、或いは遺伝子操作又は古典的な突然変異生成後の親宿主細胞に由来する宿主細胞であり得る。有利なことには、宿主細胞は組換え宿主細胞である。宿主細胞は、原核生物、古細菌又は真核生物宿主細胞であり得る。原核生物宿主細胞は、限定されないが、細菌宿主細胞であり得る。真核生物宿主細胞は、限定されないが、酵母、真菌、アメーバ、藻類、植物、動物、又は昆虫宿主細胞であり得る。
【００２５】
本明細書で使用される「異種」という用語は、宿主細胞における天然ではない核酸又はアミノ酸配列を意味する。言い換えると、その核酸又はアミノ酸配列は、宿主細胞において天然に見出される配列と同一ではない。
【００２６】
「ハイブリダイゼーション」という用語は、核酸化合物などのオリゴマー化合物の実質的に相補的な鎖の対合を意味する。ハイブリダイゼーションは低、中、又は高ストリンジェントな条件下にて実施され得る。低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約４５℃の６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイズに続いて、少なくとも５０℃（洗浄の温度を低ストリンジェントな条件のために５５℃に上昇させることができる）の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で２回洗浄することを含む。中ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約４５℃の６×ＳＳＣ中でのハイブリダイズに続いて、６０℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回又は複数回洗浄することを含み、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約４５℃の６×ＳＳＣ中でのハイブリダイズに続いて、６５℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回又は複数回洗浄することを含む。
【００２７】
「単離核酸断片」は、断片として天然ではなく、且つ天然状態で見出されないと考えられる核酸断片である。
【００２８】
本明細書で使用される「単離ポリペプチド」という用語は、少なくとも１つの成分から除去されるポリペプチド、例えば、それが天然に結合している他のポリペプチド物質を意味する。単離ポリペプチドは、他のいずれかの不純物を含み得ない。単離ポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥよって、又はこの目的に適しており、且つ当業者に公知の他の分析方法によって決定される、少なくとも５０％の純度、例えば、少なくとも６０％の純度、少なくとも７０％の純度、少なくとも７５％の純度、少なくとも８０％の純度、少なくともの８５％純度、少なくとも８０％の純度、少なくとも９０％の純度、又は少なくとも９５％の純度、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％の純度であり得る。単離ポリペプチドは組換え宿主細胞によって産生され得る。
【００２９】
核酸又はポリヌクレオチド配列は、少なくとも５つのヌクレオチド又は核酸単位を含むヌクレオチドポリマーとして本明細書で定義される。ヌクレオチド又は核酸はＲＮＡ及びＤＮＡを意味する。「核酸」及び「ポリヌクレオチド配列」という用語は本明細書において区別なく使用される。
【００３０】
他のヌクレオチド配列と相補的な核酸分子は、他のヌクレオチド配列とハイブリダイズし、それによって安定な二重鎖が形成されるように、他のヌクレオチド配列と十分に相補的である核酸分子である。「ｃＤＮＡ」（相補的ＤＮＡ）という用語は、ｍＲＮＡ分子から逆転写によって製造することができるＤＮＡ分子として本明細書において定義される。原核生物において、ｍＲＮＡ分子は、細胞に存在する遺伝子のゲノムＤＮＡの転写から得られる。真核細胞において、遺伝子は、エクソン、つまりコード配列と、イントロン、つまりエクソン間に位置する介在配列との両方を含有する。したがって、真核細胞において、遺伝子のゲノムＤＮＡの転写から得られる最初の、一次ＲＮＡが、ｍＲＮＡとして現れる前に一連の工程を通してプロセシングされる。これらの工程は、スプライシングと呼ばれるプロセスによるイントロン配列の除去を含む。ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡはコード配列のみ含有し、相当するポリペプチド産物に直接翻訳され得る。
【００３１】
「ペプチド」とは、ペプチド（アミド）結合によって連結されたアミノ酸残基の短鎖を意味する。最も短いペプチド、ジペプチドは、単一ペプチド結合によって連結された２つのアミノ酸からなる。
【００３２】
「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基を含み、且つ５個を超えるアミノ酸残基を含有する分子を意味する。本明細書で使用される「タンパク質」という用語は、「ポリペプチド」という用語と同義であり、且つ２つ以上のポリペプチドも意味し得る。したがって、「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は区別なく使用することができる。ポリペプチドは任意に修飾され（例えば、グリコシル化、リン酸化、アシル化、ファルネシル化、プレニル化、スルホン化等）、官能性が付加され得る。特定の条件下にて特異的基質の存在下で活性を示すポリペプチドは酵素と呼ばれ得る。遺伝暗号の縮重の結果として、所定のポリペプチドをコードする多数のヌクレオチド配列が生成され得ることは理解されよう。
【００３３】
細胞、核酸、タンパク質又はベクターに関して使用される場合に「組換え」という用語は、細胞、核酸、タンパク質又はベクターが、異種核酸若しくはタンパク質の導入又は天然核酸若しくはタンパク質の変化によって修飾されていること、或いはその細胞が、そのように修飾された細胞に由来することを意味する。したがって、例えば組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）型内に見出されない遺伝子を発現し、又は異常に発現される、過小発現される、若しくは全く発現されない天然遺伝子を発現する。「組換え」という用語は、「遺伝子組換え」及び「遺伝子導入」と同義である。
【００３４】
「配列同一性」又は配列相同性は、本明細書で区別なく使用される。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の配列相同性又は配列同一性のパーセンテージを決定するために、最適な比較をする目的で配列がアライメントされることが本明細書において定義される。２つの配列間のアライメントを最適化するために、比較される２つの配列のいずれかにおいてギャップが導入され得る。かかるアライメントは、比較される配列の完全長にわたって行うことができる。代替方法として、アライメントは、より短い長さにわたって、例えば約２０、約５０、約１００又はそれ以上の核酸／塩基又はアミノ酸にわたって行われ得る。配列同一性は、報告されるアライン領域にわたって２つの配列間の同一マッチのパーセンテージである。２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の配列同一性パーセントは、２つの配列のアライメント用のＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して決定され得る。（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３）。アミノ酸配列とヌクレオチド配列の両方をアルゴリズムによってアライメントすることができる。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムは、コンピュータープログラムＮＥＥＤＬＥにおいて実行されている。本発明の目的のために、ＥＭＢＯＳＳパッケージからのＮＥＥＤＬＥプログラムが使用された（バージョン２．８．０以上、ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（２０００）Ｒｉｃｅ，Ｐ．Ｌｏｎｇｄｅｎ，Ｉ．ａｎｄ  Ｂｌｅａｓｂｙ，Ａ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６，（６）ｐｐ２７６−２７７，ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）。タンパク質配列のために、ＥＢＬＯＳＵＭ６２が置換行列に使用される。ヌクレオチド配列には、ＥＤＮＡＦＵＬＬが使用される。使用される任意のパラメーターはギャップオープンペナルティ１０及びギャップ伸長ペナルティ０．５である。これらのすべての異なるパラメーターによって、わずかに異なる結果が生じるが、２つの配列の全体的な同一性パーセンテージは、異なるアルゴリズムを使用した場合でも著しく変化しないことは当業者には理解されよう。
【００３５】
上述のプログラムＮＥＥＤＬＥによるアライメント後に、問い合わせ配列と本発明の配列との配列同一性のパーセンテージが以下のように計算される：両方の配列の同一アミノ酸又は同一ヌクレオチドを示すアライメントにおける相当する位置の数が、アライメントにおけるギャップの総数を引いた後に、アライメントの全長で割られる。本明細書で定義される同一性は、ＮＯＢＲＩＥＦオプションを使用してＮＥＥＤＬＥから得ることができ、「最長の同一性」としてプログラムのアウトプットで標識される。
【００３６】
本明細書で開示される核酸及びタンパク質配列はさらに、「問い合わせ配列」として使用され、例えば、他のファミリーメンバー又は関連配列を同定するために、データベースに対して検索を実施することができる。かかる検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン  ２．０）を用いて実施することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施され、本発明の核酸分子と相同性のヌクレオチド配列を得ることができる。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施し、本発明のタンパク質分子のアミノ酸配列相同性が得られる。比較のためにギャップ入りアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載のように、ギャップ入りＢＬＡＳＴを用いることができる。ＢＬＡＳＴ及びギャップ入りＢＬＡＳＴプログラムを用いた場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターが使用され得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのホームページを参照のこと。
【００３７】
ポリペプチドに関する「実質的に純粋な」という用語は、他のポリペプチド物質を最大で５０重量％含有するポリペプチド調製物（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）を意味する。本明細書で開示されるポリペプチドは好ましくは、実質的に純粋な形態である。特に、本明細書で開示されるポリペプチドは「本質的に純粋な形態」、つまりポリペプチド調製物は他のポリペプチド物質を本質的に含有しないことが好ましい。任意に、ポリペプチドは、核酸、脂質、培地成分等の非ポリペプチド物質も本質的に含有し得ない。本明細書において、「実質的に純粋なポリペプチド」という用語は、「単離ポリペプチド」及び「単離形態のポリペプチド」という用語と同義である。
【００３８】
ポリペプチド又は核酸に関して、本明細書で使用される「置換」は、異なるアミノ酸又はヌクレオチドそれぞれによる、ポリペプチド配列における１つ又は複数のアミノ酸の置換、或いはポリヌクレオチド配列における１つ又は複数のヌクレオチドの置換それぞれを意味する。例えば、置換は、配列番号１における上述の少なくとも１つの位置に相当する、バリアントポリペプチドなどの本明細書に開示されるポリペプチドにおける位置が、親ポリペプチド（例えば、親配列番号１）におけるその位置で出現しないアミノ酸残基を含むことを示す。
【００３９】
合成核酸又は合成ポリペプチドなどの「合成分子」は、生体外化学的又は酵素的合成によって産生される。それは、限定されないが、選択される宿主生物に対して最適なコドン使用頻度で作製されたバリアント核酸を含む。
【００４０】
参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２００６／０７７２５８号パンフレット及び／又は国際公開第２００８０００６３２号パンフレットに記載の方法に好ましくはしたがって、合成核酸がコドン使用頻度に対して最適化され得る。国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットでは、コドン対最適化に取り組んでいる。コドン対最適化は、そのコドン使用頻度に関して修飾されている、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、特に使用されるコドン対が最適化されて、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現が向上し、且つ／又はコードされたポリペプチドの産生が向上する、方法である。コドン対はコード配列における２つの後のトリプレット（コドン）の一組として定義される。コドン使用頻度は宿主種に応じて適応させる必要があり、おそらく配列番号２の有意な相同性逸脱を有するが、本発明によるポリペプチドをコードするバリアントが生じることは当業者には公知であるだろう。
【００４１】
本明細書で使用される、「バリアント」、「誘導体」、「変異体」又は「相同体」という用語は区別なく使用することができる。それらはポリペプチド又は核酸のいずれかを意味し得る。バリアントは、参照配列に対して１つ又は複数の位置にて、置換、挿入、欠失、切り詰め、塩基転換、及び／又は逆位を含む。バリアントは、例えば部位飽和変異生成、スキャニング変異生成、挿入突然変異、ランダム変異生成、部位特異的突然変異誘発、及び定方向進化、並びに当業者に公知の種々の他の組換えアプローチによって作製することができる。核酸のバリアント遺伝子は、当業者に公知の技術によって人工的に合成され得る。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】組込み発現ベクター、ｐＤ９０２−ＬＩＰ１の物理地図。ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位を使用して、ｌｉｐ１リパーゼ遺伝子を導入した。ＳａｃＩでの消化は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるＡＯＸ１部位への組込みを標的化する。形質転換体をゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）上で選択した。
【図２】ポリペプチドと接触させたダイズ油の加水分解度に対してプロットされたパルミチン酸放出の程度を示すグラフ図。
【００４３】
［配列］
配列番号１：カンジダ・ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）のＬｉｐ１の成熟アミノ酸配列。
配列番号２：ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に対する、カンジダ・ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）のＬｉｐ１のコドン最適化成熟コーディングヌクレオチド配列。
配列番号３：Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉ株ＡＴＣＣ７６２７３由来のＨＩＳ４遺伝子。
配列番号４：３４ｂｐ  ＦＲＴ組換え部位のヌクレオチド配列
配列番号５：グルタミンアラニンリピート
配列番号６：サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のα−接合因子に続いて、Ｋｅｘ２プロセッシング部位（ＫＲ）及びグルタミンアラニンリピート（配列番号５）
配列番号７：Ｋｅｘ２プロセッシング部位をコードする核酸配列に続いて、グルタミンアラニンリピート、並びに５’及び３’末端それぞれに更なるＸｈｏＩ部位及びＮｏｔＩ部位を有する、コドン最適化カンジダ・ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）５３４野生型リパーゼ（ＬＩＰ１）。
【００４４】
［詳細な説明］
一態様において、本発明は、リパーゼ活性を有するポリペプチドであって、
ａ）配列番号１によるポリペプチドとアライメントされた場合に、少なくともアミノ酸置換Ｌ４１０Ｘと、任意にＳ３６５Ｑ、Ｓ３６５Ｎ、Ｌ４１３Ｍ、Ｇ４１４Ａ、Ｇ４１４Ｓ、Ｇ４１４Ｖ、Ｇ４１４Ｔ、Ｖ５３４Ｌ及びＶ５３４Ｉから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換と、を含み、アミノ酸位置の番号付けが、配列番号１に関して定義される、ポリペプチド；
ｂ）配列番号１のアミノ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％％又は９９％の同一性を有する、ａ）によるポリペプチド；
ｃ）配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する、核酸によってコードされるポリペプチドであって、配列番号２が、配列番号１によるポリペプチドの、アミノ酸置換Ｌ４１０Ｘ、及び任意に、Ｓ３６５Ｑ、Ｓ３６５Ｎ、Ｌ４１３Ｍ、Ｇ４１４Ａ、Ｇ４１４Ｓ、Ｇ４１４Ｖ、Ｇ４１４Ｔ、Ｖ５３４Ｌ及びＶ５３４Ｉから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換を生じる、少なくとも１つの変異を含み、アミノ酸位置の番号付けが、配列番号１に関して定義される、ポリペプチド；並びに
ｄ）配列番号２の配列の相補鎖と低、中及び／又は高ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズする配列を含む核酸によってコードされるポリペプチドであって、配列番号２が、配列番号１によるポリペプチドの、アミノ酸置換Ｌ４１０Ｘ、及び任意に、Ｓ３６５Ｑ、Ｓ３６５Ｎ、Ｌ４１３Ｍ、Ｇ４１４Ａ、Ｇ４１４Ｓ、Ｇ４１４Ｖ、Ｇ４１４Ｔ、Ｖ５３４Ｌ及びＶ５３４Ｉから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換を生じる、少なくとも１つの変異を含み、アミノ酸位置の番号付けが、配列番号１に関して定義される、ポリペプチド；
からなる群から選択される、ポリペプチドに関する。
【００４５】
配列番号１において上述の位置に相当する、組換え、合成又はバリアントポリペプチドであり得る、本発明のポリペプチドにおけるそれらの位置が、例えばプログラムＮｅｅｄｌｅによるアライメントを用いて、配列番号１の配列と本発明のポリペプチドの配列をアライメントすることによって、Ｎｅｅｄｌｅプログラムによって見出された最も相同性の配列に、同定され得る（このプログラムの詳細については上記を参照）。上述の配列番号１における位置に相当する本発明のポリペプチドにおける位置はこのように同定され得て、配列番号１に関して定義される位置と呼ばれる。アミノ酸置換の位置は配列番号１と比較して示され、配列番号１における位置１でのＡｌａ（Ａ）は数字の１としてカウントされる。
【００４６】
本明細書に開示されるポリペプチドは、単離された、実質的に純粋な、純粋な組換え、合成又はバリアントポリペプチドであり得る。
【００４７】
本明細書で使用される、リパーゼ活性は、トリアシルグリセロール、リン脂質又はガラクトリピドなどの脂質を加水分解する酵素活性に関する。例えば、本明細書で開示されるリパーゼは、パルミチン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及び／又はドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）脂肪酸など、トリアシルグリセロールからの脂肪酸を加水分解し得る。本明細書で開示されるリパーゼは分類ＥＣ３．１．１．３の酵素に属し得る。
【００４８】
リパーゼ特異性は、脂質の、例えば側鎖としてパルミチン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）又はドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を有する脂質の脂肪酸側鎖に対して特定されるリパーゼ活性を有するポリペプチドに関する。例えば、パルミチン酸に対するリパーゼ特異性は、グリセロールのヒドロキシル基のうちの少なくとも１つがパルミチン酸でエステル化されている脂質に対する活性を有するリパーゼに関する。
【００４９】
パルミチン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）又はドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）という用語は、これらの脂肪酸の酸型を意味し、且つパルミチン酸、エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸は、これらの脂肪酸の塩及びエステル型を意味する。これらの用語は本明細書において区別なく使用され得る。
【００５０】
意外なことに、本明細書に開示されるポリペプチドのエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）へのリパーゼ活性に対するパルミチン酸へのリパーゼ活性の比が、相当する野生型ポリペプチドのこの比よりも高いことが判明した。好ましくは、本明細書に開示されるポリペプチドのエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）へのリパーゼ活性に対するパルミチン酸へのリパーゼ活性の比は、相当する野生型ポリペプチドのこの比よりも少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０倍又はそれ以上高い。
【００５１】
したがって、本明細書で開示されるリパーゼ活性を有するポリペプチドは、相当する野生型ポリペプチドのＥＰＡに対する特異性と比較したパルミチン酸に対する特異性よりも、ＥＰＡに対する特異性と比較したパルミチン酸に対する特異性が高い。
【００５２】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、相当する野生型ポリペプチドのエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）に対する特異性と比べたミリスチン酸、パルミチン酸及びステアリン酸に対する特異性よりも、エイコサペンタエン酸に対する特異性と比べたミリスチン酸、パルミチン酸及び／又はステアリン酸に対する高い特異性を有し、且つ／又はそのポリペプチドは、相当する野生型ポリペプチドのオレイン酸及び／又はリノール酸に対する特異性と比べたパルミチン酸に対する特異性よりも、オレイン酸及び／又はリノール酸に対する特異性と比べたパルミチン酸に対する高い特異性を有する。
【００５３】
本明細書に開示されるポリペプチドは好ましくは、相当する野生型ポリペプチドのＤＨＡに対する特異性よりも、ＤＨＡに対して低い特異性も有する。
【００５４】
相当する野生型ポリペプチドは、本開示内容によるポリペプチドとしてアミノ酸置換又はアミノ酸置換の組み合わせを含まないポリペプチド、例えば配列番号１を含む、又はからなるポリペプチドであると理解される。
【００５５】
好ましい実施形態において、アミノ酸置換Ｌ４１０ＸにおけるＸは、非極性アミノ酸、好ましくはＡ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、Ｗ、Ｆ、Ｐ及びＭからなる群から選択されるアミノ酸を表し、より好ましくは、ＸはＦを表す。
【００５６】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、少なくともアミノ酸置換：
−Ｌ４１０Ｆ；
−Ｌ４１０Ｆ＋Ｓ３６５Ｎ＋Ｇ４１４Ｔ
−Ｌ４１０Ｆ＋Ｓ３６５Ｑ；
−Ｌ４１０Ｆ＋Ｓ３６５Ｑ＋Ｇ４１４Ｔ；
−Ｌ４１０Ｆ＋Ｓ３６５Ｑ＋Ｇ４１４Ｓ；
−Ｌ４１０Ｆ＋Ｓ３６５Ｑ＋Ｇ４１４Ｖ；
−Ｌ４１０Ｆ＋Ｓ３６５Ｑ＋Ｇ４１４Ｔ＋Ｖ５３４Ｉ；
−Ｌ４１０Ｆ＋Ｓ３６５Ｑ＋Ｇ４１４Ｓ＋Ｖ５３４Ｉ；
−Ｌ４１０Ｆ＋Ｓ３６５Ｑ＋Ｇ４１４Ｔ＋Ｖ５３４Ｌ；
−Ｌ４１０Ｆ＋Ｓ３６５Ｑ＋Ｇ４１４Ｓ＋Ｖ５３４Ｌ；
−Ｌ４１０Ｆ＋Ｓ３６５Ｑ＋Ｌ４１３Ｍ＋Ｇ４１４Ｔ；
−Ｌ４１０Ｆ＋Ｓ３６５Ｑ＋Ｌ４１３Ｍ＋Ｇ４１４Ａ；
−Ｌ４１０Ｆ＋Ｓ３６５Ｑ＋Ｇ４１４Ｖ；
−Ｌ４１０Ｆ＋Ｓ３６５Ｑ＋Ｖ５３４Ｉ；
−Ｌ４１０Ｆ＋Ｓ３６５Ｑ＋Ｖ５３４Ｌ；
−Ｌ４１０Ｆ＋Ｇ４１４Ｔ；
−Ｌ４１０Ｆ＋Ｇ４１４Ａ；
−Ｌ４１０Ｆ＋Ｇ４１４Ｓ；又は
−Ｌ４１０Ｆ＋Ｇ４１４Ｖ；
を含む。
【００５７】
例えば、本明細書に開示されるポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸置換Ｌ４１０Ｘ、及び任意にＳ３６５Ｑ、Ｓ３６５Ｎ、Ｌ４１３Ｍ、Ｇ４１４Ａ、Ｇ４１４Ｓ、Ｇ４１４Ｖ、Ｇ４１４Ｔ、Ｖ５３４Ｌ及びＶ５３４Ｉから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換（アミノ酸位置の番号付けが、配列番号１に関して定義され、アミノ酸位置が配列番号１に関して定義される）を含み、且つ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２の更なるアミノ置換、欠失及び／又は挿入を有する、配列番号１のポリペプチドのバリアント又は成熟ポリペプチドであり得て、そのポリペプチドは、本発明のポリペプチドの活性又は機能を依然として有する。当業者であれば、本発明のポリペプチドにおけるこれらのアミノ酸の変更が存在し得て（例えば、天然に存在する変異）、又はタンパク質機能若しくは活性を失うことなく作製され得る（例えば、ｒ−ＤＮＡ技術を用いて）ことは理解されよう。これらの変異が、結合ドメイン、活性部位、又はポリペプチドの他の機能ドメインに存在する場合、ポリペプチドの性質は変化し得るが、ポリペプチドはその活性を維持し得る。活性部位、結合ドメイン、又は他の機能ドメイン付近ではない変異が存在する場合、期待され得る効果は少ない。
【００５８】
本発明によるポリペプチドは、いずれかの適切な真核生物又は原核細胞に由来し得る。真核細胞は哺乳動物、昆虫、植物、真菌、又は藻類細胞であり得る。原核細胞は細菌細胞であり得る。
【００５９】
本明細書に開示されるポリペプチドの起源に関する「由来する」又は「〜に由来し得る」という用語は、本発明によるポリペプチドについてＢＬＡＳＴ検索を実施した場合に、本発明によるポリペプチドが、微生物細胞などの天然源に由来し得て、その内因性ポリペプチドが、本明細書に開示されるポリペプチドと最も高い相同性又は同一性パーセンテージを示すことを意味する。
【００６０】
リパーゼ活性を有するポリペプチドは、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、クモノスカビ属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、又はペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、リゾムコール・ミーハイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｅｉｈｅｉ）、リゾープス・ミクロスポルス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ）又はペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）など、いずれかの適切な真菌に由来し得る。リパーゼ活性を有するポリペプチドは、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、又はサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、例えばカンジダ・ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、又はサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母にも由来し得る。リパーゼ活性を有するポリペプチドはカンジダ・ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）に由来し得る。
【００６１】
本明細書に開示されるポリペプチドは、天然ポリペプチド又は遺伝子改変若しくは組換えポリペプチドであり得る。
【００６２】
本明細書に開示されるポリペプチドは精製され得る。タンパク質の精製は当業者に公知である。タンパク質を精製する既知の方法は高性能液体クロマトグラフィーである。
【００６３】
他の態様において、本発明は、本明細書に開示されるポリペプチドを含む組成物を提供する。
【００６４】
本明細書で開示される組成物は、担体、賦形剤、補助酵素、又は他の化合物を含み得る。一般に、組成物又は配合物（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、リパーゼがそれと配合され得る化合物、例えば水を含む。
【００６５】
本明細書で使用される賦形剤は、本明細書に開示されるポリペプチドと共に配合される不活性物質、例えばスクロース又はラクトース、グリセロール、ソルビトール又は塩化ナトリウムである。本明細書に開示されるポリペプチドを含む組成物は、液体組成物又は固体組成物であり得る。液体組成物は通常、水を含む。液体組成物として配合される場合、組成物は通常、水分活性を下げる成分、例えばグリセロール、ソルビトール又は塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む。本明細書に開示されるポリペプチドを含む固体組成物は、酵素を含む顆粒を含み得て、又は組成物は、リポソームのような液体マトリックス中のカプセル化ポリペプチド又はアルジネート若しくはカラゲナンのようなゲルを含む。ポリペプチド又は酵素をカプセル化又は顆粒化する当技術分野で公知の多くの技術がある（例えば、Ｇ．Ｍ．Ｈ．Ｍｅｅｓｔｅｒｓ，“Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ｃｈａｐｔｅｒ  ９，ｉｎ  Ｎ．Ｊ．Ｚｕｉｄａｍ  ａｎｄ  Ｖ．Ａ．Ｎｅｄｏｖｉｃ（ｅｄｓ．）“Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｆｏｏｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ”２０１０参照）。
【００６６】
本明細書で開示される組成物は、本明細書に開示されるポリペプチドを含む担体も含み得る。本明細書に開示されるポリペプチドは、当技術分野で公知の技術によって担体に結合又は固定化され得る。
【００６７】
本明細書に開示されるポリペプチドを含む組成物を製造するプロセスであって、ポリペプチドを含む発酵培地を噴霧乾燥させる工程、又は本明細書に開示されるポリペプチドを顆粒化若しくはカプセル化する工程と、組成物を製造する工程と、を含み得るプロセスも本明細書に開示される。
【００６８】
さらに、本開示内容は、ポリペプチドを含む、又は本明細書に開示されるポリペプチドを含む組成物を含む、缶、樽又はバレルなどの包装に関する。
【００６９】
本明細書に開示されるポリペプチドは、
１．ランダム変異を導入するためのエラープローンＰＣＲに続いて、得られた（バリアント）ポリペプチドをスクリーニングし、向上した動力学的特性を有する（バリアント）ポリペプチドを単離すること；
２．本発明によるポリペプチドをコードする遺伝子の関連するバリアントのファミリーシャッフリングに続いて、得られたバリアントをスクリーニングし、向上した動力学的特性を有するバリアントを単離すること；
などの当業者に公知のいくつかの手順によって得られる。
【００７０】
ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの増加を生じ、その結果として活性が高くなる、本明細書に開示されるポリペプチドをコードする遺伝子のバリアントが、前記遺伝子のポリヌクレオチド配列を修飾することによって得られる。かかる修飾の中には：
１．親微生物宿主にコドンが（最適に）適応するような方法でコドン使用頻度を向上させること；
２．親微生物宿主にコドンが（最適に）適応するような方法でコドン対使用頻度を向上させること；
３．半減期の増加を有するｍＲＮＡ分子が生じる、本発明によるポリペプチドをコードする遺伝子情報への安定化配列の付加；
が含まれる。
【００７１】
向上した触媒特性を有する、又はｍＲＮＡ若しくはタンパク質のレベルが増加したバリアントを単離する方法が、国際公開第０３／０１０１８３号パンフレット及び国際公開第０３／０１３１１号パンフレットに記載されている。親微生物株におけるコドン使用頻度を最適化する方法は例えば、国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットに記載されている。本発明のポリペプチドをコードする遺伝子に安定化要素を付加する方法は国際公開第２００５／０５９１４９号パンフレットに記載されている。
【００７２】
したがって、一態様において、リパーゼ活性を有するバリアントポリペプチドを製造する方法であって、
−配列番号１によるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を含む親ポリペプチドを選択する工程；
−アミノ置換Ｌ４１０Ｘ、及び任意にＳ３６５Ｑ、Ｓ３６５Ｎ、Ｌ４１３Ｍ、Ｇ４１４Ａ、Ｇ４１４Ｓ、Ｇ４１４Ｖ、Ｇ４１４Ｔ、Ｖ５３４Ｌ及びＶ５３４Ｉから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換を置換する工程であって、アミノ酸位置の番号付けが配列番号１に関して定義される、工程；並びに
−バリアントポリペプチドを作製する工程であって、リパーゼ活性を有するポリペプチドが、相当する野生型ポリペプチドのＥＰＡに対する特異性と比較したパルミチン酸に対する特異性よりも、ＥＰＡに対する特異性と比較したパルミチン酸に対する高い特異性を有する、工程；
を含む方法が提供される。
【００７３】
本明細書に開示されるバリアントポリペプチドの作製は、適切な（組換え）宿主細胞においてバリアントポリペプチドをコードする遺伝子を発現させることと、宿主細胞を培養して、バリアントポリペプチドを産生することと、を含み得る。
【００７４】
他の態様において、本発明は、本明細書に開示されるポリペプチドをコードする核酸に関する。例えば、リパーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する核酸であり得て、配列番号２は、配列番号１によるポリペプチドの、アミノ酸置換Ｌ４１０Ｘ、及び任意に、Ｓ３６５Ｑ、Ｓ３６５Ｎ、Ｌ４１３Ｍ、Ｇ４１４Ａ、Ｇ４１４Ｓ、Ｇ４１４Ｖ、Ｇ４１４Ｔ、Ｖ５３４Ｌ及びＶ５３４Ｉから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換を生じる、少なくとも１つの変異を含み、アミノ酸位置の番号付けが配列番号１に関して定義される。
【００７５】
本明細書に開示される核酸配列は、特定の宿主細胞において本明細書に開示されるポリペプチドの最適な発現のために、コドン最適化、又はコドン対最適化された配列であり得る。
【００７６】
一実施形態において、本明細書で開示される核酸の単離された、実質的に純粋な、純粋な、組換え、合成若しくはバリアント核酸である核酸が開示される。
【００７７】
他の実施形態において、本発明の核酸分子は、配列番号２に示すヌクレオチド配列の逆相補配列である核酸分子を含み、配列番号２は、配列番号１によるポリペプチドの、アミノ酸置換Ｌ４１０Ｆ及びＳ３６５Ｑを生じる少なくとも１つの変異を含み、アミノ酸位置の番号付けは配列番号１に関して定義される。
【００７８】
配列番号２の成熟ポリペプチドコード配列の相補鎖と、中ストリンジェントな、好ましくは高ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズする核酸も開示され、配列番号２は、配列番号１によるポリペプチドの、アミノ酸置換Ｌ４１０Ｘ、及び任意に、Ｓ３６５Ｑ、Ｓ３６５Ｎ、Ｌ４１３Ｍ、Ｇ４１４Ａ、Ｇ４１４Ｓ、Ｇ４１４Ｖ、Ｇ４１４Ｔ、Ｖ５３４Ｌ及びＶ５３４Ｉから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換を生じる少なくとも１つの変異を含み、アミノ酸位置の番号付けは配列番号１に関して定義される。
【００７９】
一態様において、本開示内容は、宿主細胞においてポリペプチドの発現を指示する少なくとも１つの制御配列に作動可能に連結された、本明細書で開示される核酸を含む発現ベクターに関する。
【００８０】
核酸構築物又は発現ベクターへ核酸を挿入する、当業者に公知のいくつかの方法があり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１を参照のこと。プロモーター及びターミネーター配列などの制御配列を用いて、本発明のポリペプチドをコードする核酸を操作することが望ましいものであり得る。
【００８１】
プロモーターは、真核生物の又は原核生物の宿主細胞に適した、変異体、切断型、及びハイブリッドプロモーターなどの転写活性を示す、いずれかの適切なプロモーター配列であり得て、細胞に対して内因性（天然）又は異種（外来）のいずれかの細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから得られる。プロモーターは、構成又は誘導性プロモーターであり得る。好ましくは、プロモーターは誘導性プロモーター、例えばデンプン誘導性プロモーターである。糸状菌において適したプロモーターは、限定されないが、コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミーハイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ｇｐｄＡプロモーター、Ａ・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）天然α−アミラーゼ、Ａ・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）酸安定性α−アミラーゼ、Ａ・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）又はＡ・アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ａ・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）又はＡ・アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）エンドキシラナーゼ（ｘｌｎＡ）又はβ−キシロシダーゼ（ｘｌｎＤ）、Ｔ・リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドラーゼＩ（ＣＢＨＩ）、Ｒ・ミーハイ（Ｒ．ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）アルカリ性プロテアーゼ、コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）トリオースホスフェートイソメラーゼ、Ａ・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）アミログルコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）Ｄａｎｉａ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）Ｑｕｉｎｎ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号パンフレット）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）β−グルコシダーゼ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドラーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドラーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）β−キシロシダーゼをコードするポリヌクレオチドから得られるプロモーター、並びにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａ・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）天然α−アミラーゼ及びコウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）トリオースホスフェートイソメラーゼをコードするポリヌクレオチドからのプロモーターのハイブリッド）、及びその変異体、切断型、及びハイブリッドプロモーターを含む群から選択され得るプロモーターである。
【００８２】
本明細書で開示される細胞において機能的ないずれかのターミネーターが使用され得て、当業者には公知である。糸状菌における適切なターミネーター配列の例としては、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）遺伝子、例えば遺伝子コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）をコードする遺伝子、Ａ・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、Ａ・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、ｔｒｐＣ及び／又はフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子などからの、糸状真菌遺伝子のターミネーター配列が挙げられる。
【００８３】
他の態様において、本開示内容は、本明細書で開示される核酸又は発現ベクターを含む宿主細胞に関する。適切な宿主細胞は哺乳動物、昆虫、植物、真菌、又は藻類細胞、又は細菌細胞であり得る。適切な宿主細胞は、例えば、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、マイセリオソラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ラサムソニア属（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミケス属（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フェチダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、Ａ・ソーヤ（Ａ．ｓｏｊａｅ）、タラロマイセス・エメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、ラサムソニア・エメルソニイ（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、マイセリオソラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）又はトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）又は、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）に由来する真菌細胞であり得る。宿主細胞はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）であり得る。
【００８４】
宿主細胞は組換え又は遺伝子導入宿主細胞であり得る。宿主細胞は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１に開示されているエレクトロポレーション、プロトプラスト形質転換又は抱合など、当技術分野で公知の標準技術を用いて、本明細書で開示される核酸又は発現ベクターで遺伝子組換えされ得る。組換え宿主は、当技術分野で公知の技術によって、本開示内容に従ってポリペプチドが過剰発現され得る。
【００８５】
一態様において、本開示は、ポリペプチドの産生の助けとなる条件下にて適切な発酵培地で宿主細胞を培養することと、ポリペプチドを生成することと、を含む本明細書に開示されるポリペプチドを製造するプロセスに関する。使用される宿主細胞、例えばｐＨ、温度及び発酵培地の組成などに応じて、本明細書に開示されるポリペプチドを生成するプロセスをいかに実施するかは、当業者には理解されよう。宿主細胞は、マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）、振盪フラスコにおいて、或いは０．５若しくは１リットル又はそれ以上から、１０〜１００立方メートル又はそれ以上の容積を有する発酵槽において培養することができる。宿主細胞の必要条件に応じて、培養は好気的又は嫌気的に行われ得る。
【００８６】
有利なことに、本明細書に開示されるポリペプチドは、発酵培地から回収又は単離される。発酵培地からの回収又は単離は、例えば遠心分離、濾過、及び／又は限外濾過、又はクロマトグラフィーによって行われ得る。
【００８７】
一態様において、本開示内容は、本明細書で開示されるポリペプチド又は組成物と、オイル若しくは脂肪を含む生成物の中間形態を接触させる工程と、生成物を製造する工程と、を含む、オイル若しくは脂肪を含む生成物を製造するプロセスに関する。
【００８８】
本明細書で開示されるプロセスで製造され得る生成物は、食品又は飼料製品、例えば、魚油を含む食品又は飼料製品であり得る。本明細書で開示される食品又は飼料製品は魚油であり得る。本明細書で開示される魚油は、いずれかの適切な魚、例えばサケ、サバ、ニシン及び／又はイワシに由来するオイルであり得る。本明細書で開示される生成物及び／又は生成物の中間形態中のオイル又は脂肪、例えば魚油は、側鎖として少なくとも１つのパルミチン酸を含むトリアシルグリセロールなど、脂質を含む。本明細書で開示される生成物中のオイル又は脂肪は、側鎖としてエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及び／又はドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を含むトリアシルグリセロールをさらに含み得る。したがって、オイル又は脂肪は、パルミチン酸、エイコサペンタエン酸及び／又はドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を含み得る。
【００８９】
本明細書に開示されるポリペプチドと、オイル又は脂肪を含む生成物の中間形態を接触させる工程は、リパーゼ活性を有するポリペプチドをオイル又は脂肪と混合又は攪拌することを含み得る。本明細書で開示されるプロセスにおける生成物の中間形態は水を含み得る。
【００９０】
前記接触させる工程は、生成物の中間形態に水を添加することも含み得る。リパーゼ活性を有するポリペプチドとオイル又は脂肪を接触させる工程はさらに、適切な温度及びｐＨにてポリペプチドをオイル又は脂肪と共にインキュベートすることを含み得る。適切な温度は、例えば１０〜７０℃、例えば１５〜６５℃、例えば２０〜６０℃、例えば２５〜５０℃であり得る。適切なｐＨは、３．５〜９、例えば４〜８、例えば４．５〜７．５のｐＨであり得る。リパーゼ活性を有するポリペプチドとオイル及び又は脂肪を接触させる工程は、側鎖として少なくとも１つのパルミチン酸を含むトリアシルグリセロールを加水分解することを含み得る。
【００９１】
オイル又は脂肪を含む生成物を製造するプロセスはさらに、オイル又は脂肪を含む生成物から脂肪酸を分離する工程を含み得る。脂肪酸は脂肪酸を含む水相であり得る。脂肪酸はパルミチン酸であり得る。脂肪酸、例えば脂肪酸を含む水相を分離する工程は、遠心分離又は濾過を含み得る。本明細書で開示されるプロセスによって得られるオイル又は脂肪を含む生成物もまた、本明細書で開示される。
【００９２】
一態様において、本開示は、オイル又は脂肪中の低級飽和脂肪酸及び／又は単不飽和脂肪酸への本明細書に開示されるポリペプチドの使用に関する。好ましくは、そのオイルは、脂肪酸エステルオイル、トリグリセリドオイル及び脂肪酸エチルエステルオイルから選択される。好ましくは、脂肪酸は、ラウリン酸（Ｃ１２：０）、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）ミリストレイン酸（Ｃ１４：１）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、アラキジン酸（Ｃ２０：０）、１１−エイコセン酸又はゴンドウ酸（Ｃ２０：１）、ドコサン酸（Ｃ２２：０）及びエルカ酸又はブラシジン酸（Ｃ２２：１）からなる群から選択される。オイル又は脂肪中の低級単不飽和又は飽和脂肪酸は、オイル又は脂肪中の飽和脂肪酸の量が低減されていることを意味する。本明細書で開示されるリパーゼ活性を有するポリペプチドによって低減される飽和脂肪酸の量は、相当する野生型ポリペプチドによって低減される飽和脂肪酸の量よりも少ない。本明細書で使用されるオイルは魚油又はダイズ油であり得る。より好ましくは、オイルは、魚油、ダイズ油、ヒマワリ油、サフラワー油、グレープシードオイル、アマニ油及びクルミ油からなる群から選択される。
【００９３】
したがって、本明細書に開示されるリパーゼ活性を有するポリペプチドと共にオイル又は脂肪をインキュベートすることを含む、オイル又は脂肪中の飽和脂肪酸又は単不飽和脂肪酸の量を低減するプロセスが本明細書において開示される。本明細書に開示されるリパーゼ活性を有するポリペプチドと共にオイル又は脂肪をインキュベートする工程は、上記の本明細書に開示されるように実施され得る。
【００９４】
以下の実施例によって本発明を例証する。
【００９５】
［実施例］
［材料及び方法］
［株］
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉ）（株ＡＴＣＣ７６２７３／ＣＢＳ７４３５／ＣＥＣＴ１１０４７／ＮＲＲＬ  Ｙ−１１４３０／Ｗｅｇｎｅｒ  ２１−１）を使用した（Ｃｒｅｇｇ  ＪＭ，Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ  ＫＪ，Ｈｅｓｓｌｅｒ  ＡＹ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ  ＫＲ（１９８５）．Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ａｓ  ａ  ｈｏｓｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５，３３７６−３３８５）。
【００９６】
［分子生物学技術］
（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１）に従って、分子生物学技術を実施した。ＰＣＲは、例えばＩｎｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏに開示されている。製造元の説明書に従って、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ  ＯＹ、Ａｓｐｏｏ、フィンランド（Ｆｉｎｌａｎｄ））を用いて、サーモサイクラーでポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。
【００９７】
別段の指定がない限り、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載のように、標準ＤＮＡ手順を行った。ＤＮＡ配列はＤＮＡ  ２．０（カリフォルニア州（ＣＡ）、米国（ＵＳＡ））にて順に並べた。
【００９８】
［遊離脂肪酸の決定］
スプリットインジェクター及び炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を使用して、ガスクロマトグラフ（ＧＣ）で遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の量を決定した。Ｃ．ｄｅ  Ｊｏｎｇ，Ｈ．Ｔ．Ｂａｄｉｎｇｓ，（１９９０），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｖｏｌ  １３，ｐ．９４−９８、及びｏｆｆｉｃｉａｌ  ＡＯＣＳ  ｍｅｔｈｏｄ  Ｃｅ  １ｈ−０５，（２００９）Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｓ−，ｔｒａｎｓ−，Ｓａｔｕｒａｔｅｄ，Ｍｏｎｏｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  ｏｒ  Ｎｏｎ−Ｒｕｍｉｎａｎｔ  Ａｎｉｍａｌ  ｏｉｌｓ  ａｎｄ  Ｆａｔｓ  ｂｙ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＧＬＣに記載のように、この方法は、ミルク及びチーズ中のＦＦＡの分析に基づき、以下に記述されるように適応された。
【００９９】
Ａｇｉｌｅｎｔ  ７８９０  ＧＣはＳｕｐｅｌｃｏ  ＳＰ（商標）２５６０（シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））キャピラリーカラム（１００ｍ×０．２５ｍｍ、ｄｆ＝０．２μｍ）を備えた。一定流量１．３ｍＬ／分、スプリットフロー３２．５ｍｌ／分にてキャリアーガスとして水素を使用した。分析中、オーブン温度を最初は１７０℃に設定し、３０分後に速度５℃／分にて２４０℃に上げた。インジェクター温度を２５０℃に設定し、検出器温度を３２５℃に設定した。クロロホルム（２ｍｇ／ｍｌ）に溶解されたペンタデカン酸を内標準として使用した。ＦＦＡ外部標準を用いて、較正ラインを作成した。完全な試料（オイル４ｇ及び緩衝液）を内標準溶液１０ｍｌと混合した。遠心した後、ｎ−ヘプタン１０ｍｌでコンディショニングされたアミノプロピル固相抽出（ＳＰＥ）カラム（Ｂｏｎｄ  Ｅｌｕｔ、５００ｍｇ）にクロロホルム層０．２５ｍｌを適用した。ＳＰＥを５ｍｌクロロホルム／２−プロパノール（１：１）ですすいだ。ギ酸２％を含有するジエチルエーテル５ｍｌでＦＦＡを溶離した。続いて、Ｗ．Ｒ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈ，（１９６４），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．５，ｐｐ．６００−６０８に従って、ＦＦＡ画分を三フッ化ホウ素−メタノール溶液でメチルエステル化した。ｎ−ヘプタンで抽出した後、ｎ−ヘプタン層１μＬをＧＣ内に注入した。
【０１００】
ＦＦＡのピーク面積を内標準のピーク面積で正規化した。ＦＦＡの正規化ピーク面積を正規化外部標準の較正曲線で補間することによって、ＦＦＡの量を計算した。ＦＦＡの量をμｇ／ｇとして表した。
【０１０１】
［実施例１］
［１．１．ヒスチジン栄養要求性ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉ）株の作製］
ＦＬＰリコンビナーゼ及びＳ・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）２μｍサークル由来の２つの非対称性ＦＬＰ組換え標的（ＦＲＴ）を使用して、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＡＴＣＣ  ７６２７３由来のＨＩＳ４遺伝子（配列番号３）を欠失させた（Ｓｏｍ，Ｔ．，Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｋ．Ａ．，Ｖｏｌｋｅｒｔ，Ｆ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｂｒｏａｃｈ，Ｊ．Ｒ．（１９８８），Ｃｅｌｌ  ５２：ｐ．２７−３７；Ｂｒｏａｃｈ，Ｊ．Ｒ．（１９８１）Ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｐｌａｓｍｉｄ  ２μｍ  ｃｉｒｃｌｅ．Ｉｎ：Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｌｉｆｅ  ｃｙｒｃｌｅ  ａｎｄ  ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ．Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｎ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｅ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｂｒｏａｃｈ，Ｊ．Ｒ．（ｅｄｓ）．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ｐｐ．４５５−４７０）。この結果、２６８２ｂｐ  ＨＩＳ４オープンリーディングフレーム（配列番号３）が３４ｂｐ  ＦＲＴ組換え部位（配列番号４）で置き換えられたヒスチジン栄養要求性株ＤＳＭ１０１Ａが生じた。ＨＩＳ４欠失は、サザン解析によって、且つ表現型的に確認された。ヒスチジン栄養要求性株ＤＳＭ１０１Ａは、ヒスチジンを含まないＭＤ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ）で増殖することができなかったのに対して、この株は、ヒスチジン（４０μｇ／ｍｌ）を含むＭＤ培地で十分に増殖した。
【０１０２】
ＭＤは、寒天１５ｇ／Ｌ、Ｈ２Ｏ  ８００ｍＬを含有し、以下のフィルターをオートクレーブした後に滅菌溶液：１００ｍＬ  １０×ＹＮＢ（１３４ｇ／Ｌ  ＤｉｆｃｏＴＭ酵母ニトロゲンベースｗ／ｏアミノ酸）、２ｍＬ  ５００×Ｂ（０．０２％Ｄ−ビオチン）、１００ｍＬ  １０×Ｄ（２２０ｇ／Ｌ  α−Ｄ（＋）−グルコース一水和物）を添加した。
【０１０３】
［１．２バリアントリパーゼＤＮＡ構築物の作製］
成熟カンジダ・ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）５３４リパーゼポリペプチドバリアント（配列番号１のアミノ酸１〜５３４のバリアント）の発現に、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）発現ベクターｐＤ９０２（ＤＮＡ２．０、カリフォルニア州、米国）を使用した。Ｓ・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のα−接合因子の後に、リパーゼをコードする配列に続いて、リジン、アルギニン（ＫＲ）及びグルタミンアラニンリピート（ＥＡＥＡ）（配列番号５）で構成されるＫｅｘ２プロセッシング部位を融合した。その遺伝子は、上述の（Ｂｒｏｃｃａ  Ｓ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｄａｎｎｅｒｔ  Ｃ．，Ｌｏｔｔｉ  Ｍ．，Ａｌｂｅｒｇｈｉｎａ  Ｌ．，Ｓｃｈｍｉｄ  Ｒ．Ｄ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１９９８（６）：１４１５−１４２２）及び国際公開第９９１４３３８Ａ１号パンフレットに記載のように、メタノール誘導性ＡＯＸ１プロモーターの制御下に置かれた。カンジダ・ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）５３４野生型リパーゼポリペプチド配列（配列番号１）を使用して、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のコーディング使用（ｃｏｄｉｎｇ  ｕｓａｇｅ）とマッチするコドン使用頻度を有するリパーゼをコードするヌクレオチド配列をデザインした（配列番号２）。さらに、ＸｈｏＩ部位を５’末端に、ＮｏｔＩ部位を３’末端に置いた。カンジダ・ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）５３４野生型配列（ＬＩＰ１）をコードするコドン最適化遺伝子断片、Ｓ・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のα−接合因子に続いて、リジン、アルギニン（ＫＲ）及びグルタミンアラニンリピート（ＥＡＥＡ）で構成されるＫｅｘ２プロセッシング部位、並びに５’末端のＸｈｏＩ部位及び３’末端のＮｏｔＩ部位を含むヌクレオチド配列が配列番号７に示される。配列番号７を有するｐＤ９０２ベクターが図１に図示される。
【０１０４】
アミノ酸置換Ｌ４１０Ｘ及びＳ３６５Ｑ、Ｓ３６５Ｎ、Ｌ４１３Ｍ、Ｇ４１４Ａ、Ｇ４１４Ｓ、Ｇ４１４Ｖ、Ｇ４１４Ｔ、Ｖ５３４Ｌ及びＶ５３４Ｉから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換の組み合わせを有するＬＩＰ１タンパク質（配列番号１）のバリアントを作製した。アミノ酸置換の位置は配列番号１と比較して示されており、配列番号１における位置１のＡｌａ（Ａ）は数字の１としてカウントされる。
【０１０５】
野生型配列をコードするＬＩＰ１について上述の手順に従って、アミノ酸置換Ｌ４１０Ｆ及びＳ３６５Ｑを含有する遺伝子バリアントをコードするＬＩＰ１をベクターｐＤ９０２にクローニングした。ｌｉｐ１遺伝子バリアントを含有するｐＤ９０２ベクターが、ＳａｃＩによって消化され、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＤＳＭ１０１Ａに形質転換された。新たに調製された溶液を用いて、圧縮されたエレクトロポレーションプロトコルに従って、形質転換手順を実施した（Ｌｉｎ−Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ  Ｊ１，Ｗｏｎｇ  ＷＷ，Ｘｉｏｎｇ  Ｓ，Ｇｉａｎｇ  Ｗ，Ｌｕｏｎｇ  ＬＴ，Ｖｕ  Ｊ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＳＤ，Ｌｉｎ−Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ  ＧＰ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．（２００５）３８，（１）：４４−４８）。５００μｇ／ｍＬゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）（ＹＰＤＳ：１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％グルコース、１Ｍソルビトール、２％寒天）を有するＹＰＤＳ寒天平板上に形質転換体をプレーティングし、３０℃で７２時間インキュベートした。
【０１０６】
［実施例２］
［リパーゼバリアントの生成］
アミノ酸置換置換Ｌ４１０Ｘと、Ｓ３６５Ｑ、Ｓ３６５Ｎ、Ｌ４１３Ｍ、Ｇ４１４Ａ、Ｇ４１４Ｓ、Ｇ４１４Ｖ、Ｇ４１４Ｔ、Ｖ５３４Ｌ及びＶ５３４Ｉから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換の組み合わせを有する、ＬＩＰ１バリアントを含有するヒスチジン栄養要求性ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）クローンを、２４ディープウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ、カリフォルニア州、米国）において、ＢＭＤ１％培地１．５ｍＬ（０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液、１３．４ｇ／ｌ酵母ニトロゲンベース、０．４ｍｇ／ｍＬビオチン、１１ｇ／Ｌグルコース、濾過滅菌されている）中で培養した。これらの培養物を２８℃、５５０ｒｐｍ（Ｍｉｃｒｏｔｏｎインキュベータ振盪機（Ｉｎｆｏｒｓ  ＡＧ、Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ、スイス（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））にて６０時間インキュベートした。６０時間のインキュベート後、１．２５ｍＬ  ＢＭＭ２（０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液、１３．４ｇ／Ｌ酵母ニトロゲンベース、０．４ｍｇ／ｍｌビオチン、１％メタノール、濾過滅菌されている）を添加し、２８℃、５５０ｒｐｍにて増殖を続けた。８時間後に、２５０μＬ  ＢＭＭ１０（０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液、１３．４ｇ／Ｌ酵母ニトロゲンベース、０．４ｍｇ／ｍｌビオチン、５％メタノール、濾過滅菌されている）を添加してリパーゼ産生を誘導した。最初に添加して２４時間後、４８時間後及び７２時間後に、２５０μＬ  ＢＭＭ１０の添加を繰り返した。ＢＭＭ１０を最後に添加して１２時間後に、培養物を遠心分離し（５分、１０００ｇ）、上澄を収集し、−２０℃で保存した。
【０１０７】
［実施例３］
［ｐ−ＮＰ基質に対するリパーゼ活性のスクリーニング］
発色性基質：４−ニトロフェニルパルミチン酸（Ｓｉｇｍａ  Ｎ２７５２）、４−ニトロフェニルオレエート（Ｓｙｎｃｏｍによる受注生産）、４−ニトロフェニルリノール酸（Ｓｙｎｃｏｍによる受注生産）を使用したアッセイにおいて、ＬＩＰ１バリアントの活性が決定された。２−プロパノール中の発色性基質の８．０ｍＭ溶液を調製した。続いて、１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を含有する１００ミリモル／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）４６．５ｍＬに、この溶液３．５ｍＬを力強く攪拌しながら添加した。ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）ロボットを使用して、マイクロタイタープレートにおいて、上述のように調製されたブロス上澄の適切な希釈液２５μＬを基質溶液２２５μＬ（インキュベート中の基質濃度は０．５ｍＭ）と混合することによって、酵素反応を開始した。反応混合物２００μＬをハミルトンロボットによって空のマイクロタイタープレートに移し、ＴＥＣＡＮ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００マイクロタイタープレートリーダーに入れた。２５℃でインキュベートする間、混合物の吸収の変化を３４８ｎｍ（４−ニトロフェノールの等吸収点）にて２０〜６０分間測定した。曲線の直線部分の勾配（デルタＯＤ／分）を活性の尺度として用いる。
【０１０８】
試験の条件下にてｐ−ニトロフェノール１マイクロ／分を遊離する酵素の量として活性が表される。インキュベーション後に吸光度の増加が０．７未満であることを確実にするように、試料を希釈した。同じ緩衝液に希釈された４−ニトロフェノール標準溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｎ７６６０）を用いて較正を行う。
【０１０９】
表１は、基質ｐＮＰ−パルミチン酸、ｐＮＰ−オレイン酸及びｐＮＰ−リノール酸に対するＬＩＰ１バリアント及び野生型ＬＩＰ１リパーゼの活性の比を示し、株は振とうフラスコで増殖させる。変異体Ｌｉｐ１バリアントのオレイン酸及びリノール酸加水分解活性に対するパルミチン酸加水分解活性の比は、野生型酵素両方と比べて増加し、パルミチン酸の加水分解に対する向上した特異性が示された。野生型ＬＩＰ１リパーゼと比較したＰ／Ｏ比及びＰ／Ｌ比の増加は、パルミチン酸の加水分解に対する特異性の向上を意味する。
【０１１０】
【表１】
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【０１１１】
［実施例４］
［魚油中のリパーゼ活性］
魚油（半精製魚油、Ｏｃｅａｎ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、組成については表２参照）に対する、変異Ｌ４１０Ｆ及びＳ３６５Ｑを有するＬＩＰ１バリアントの活性を、アプリケーションタイプ：インキュベーションにおいて野生型ＬＩＰ１リパーゼの活性と比較した。ＬＩＰ１変異体及び野生型ＬＩＰ１の１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に希釈した酵素溶液２ｍＬを魚油２ｍｌに添加した。攪拌（５００ｒｐｍ）下にて３７℃の水浴中で１６時間インキュベーションした後、−１８℃にて反応混合物を保存することによって反応を停止させた。上記に開示される方法に従ってＦＡＭＥを用いて、試料をクロロホルムで抽出した後、放出された脂肪酸を分析した。
【０１１２】
【表２】
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【０１１３】
【表３】
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【０１１４】
表３のデータから、ＬＩＰ１バリアントＬ４１０Ｆ及びＳ３６５Ｑと共に魚油をインキュベートした結果、野生型ＬＩＰ１と比較して、ミリスチン酸（Ｃ１４：０、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）などの飽和脂肪酸の放出（ｍｏｌ％）が増加し、ＥＰＡ（Ｃ２０：５）の放出（ｍｏｌ％）が減少したことが分かる。ＬＩＰ１バリアント及び野生型ＬＩＰ１と共に魚油をインキュベートした後のＤＨＡ（Ｃ２２：６）の放出（ｍｏｌ％）は同様であった。＜ｄ．ｌ．＝検出限界未満。
【０１１５】
【表４】
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【０１１６】
表４から、未処理魚油と比較された、精製オイルの組成（物質収支から算出）に対する酵素処理の効果が分かる。変異Ｌ４１０Ｆ及びＳ３６５Ｑを有するバリアントで処理した結果、野生型ＬＩＰ１と比較すると、ＥＰＡの放出が明らかに減少したことと併せて、ＤＨＡ及びＥＰＡの含有率が増加したことがはっきりと分かる。
【０１１７】
［実施例５］
［ダイズ油におけるリパーゼ活性］
インキュベーション後に、ダイズ油に対するＬＩＰ１バリアントの活性を野生型ＬＩＰ１リパーゼの活性と比較した（Ｇｏｌｄｓｕｎ社からのサラダオイル、脂肪酸の組成については表５参照）。ＬＩＰ１変異体及び野生型ＬＩＰ１の１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に希釈した酵素溶液２ｍＬをダイズ油基質２ｍｌに添加した。攪拌（５００ｒｐｍ）下にて３７℃の水浴中で１６時間インキュベーションした後、−１８℃にて反応混合物を保存することによって反応を停止させた。上記に開示される方法に従ってＦＡＭＥを用いて、試料をクロロホルムで抽出した後、放出された脂肪酸を分析した。その結果を表６及び図２に示す。
【０１１８】
【表５】
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【０１１９】
以下の表６に振盪フラスコ中で生成された試料を用いたいくつかの実験の加水分解度（ＤＨ）及び放出されたパルミチン酸の量を示す。様々なタイプの基質を使用した：１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７と混合された５０％オイル、又は緩衝液と混合された１％オイル、又は同じ緩衝液中で混合された１％トリトンＸ−１００で乳化された１％オイル。
【０１２０】
放出されたパルミチン酸の量の比及び加水分解度が、野生型ＬＩＰ１リパーゼに関して見出される比と比べて高い場合に、ダイズ油トリグリセリド中のパルミチン酸加水分解に対するバリアントの向上した特異性が示される。Ｐ／Ｏ＝ｐＮＰ−パルミチン酸及びｐＮＰ−オレイン酸に対する活性の比。Ｐ／Ｌ＝ｐＮＰ−パルミチン酸及びｐＮＰ−リノール酸に対する活性の比。ＤＨ＝加水分解度（ｍｏｌ％）。Ｐ／ＤＨ＝放出されたパルミチン酸の量と加水分解度の比。野生型ＬＩＰ１リパーゼに関して見出される比と比較して、Ｐ／ＤＨ比が高い場合に、ダイズ油トリグリセリド中のパルミチン酸加水分解に対するバリアントの向上した特異性が示される。
【０１２１】
【表６】
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【０１２２】
【表７】
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【０１２３】
図２において、加水分解度（ＤＨ）が、放出されたパルミチン酸の量に対してプロットされる。向上したバリアントがパルミチン酸に対して１００％特異的である場合には、パルミチン酸放出に対するＤＨは、ラインＡに従うはずである。非特異的リパーゼの場合には、これはラインＣである。特異性５０％の場合には、これはラインＢである。ＷＴ  ＬＩＰ１（円）の結果はすべて、ラインＣを下回り、ダイズ油由来の不飽和脂肪酸の加水分解に対する優先（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）が示唆される。すべてのバリアントに関して、すべてのポイントがＢラインとＣラインの間にあり、野生型ＬＩＰ１と比較すると、パルミチン酸に対する特異性の向上が示されている。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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