(57)【要約】本発明は、種々の態様では、がんまたは他の感染性疾患の処置のために使用され得る、合成キメラポックスウイルス（ｓｃＰＶ）を含む幹細胞に関する。本発明は、ｓｃＰＶを送達するための方法であって、幹細胞にｓｃＰＶを感染させるステップ、および対象に、感染した幹細胞を投与するステップを含む、方法にも関する。本発明は、腫瘍溶解性ウイルスを送達し、細胞治療を受けている対象において腫瘍形成のリスクを低減させる細胞組成物を提供する。
2021522789.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成キメラポックスウイルス（ｓｃＰＶ）を含む単離された幹細胞またはその集団であって、前記ウイルスが、合成ＤＮＡに由来するＤＮＡから複製および再活性化され、前記ウイルスのウイルスゲノムが、１つまたは複数の改変を特徴とするという点で前記ウイルスの野生型ゲノムとは異なる、単離された幹細胞またはその集団。
【請求項２】
前記ポックスウイルスが、オルソポックスウイルスである、請求項１に記載の単離された幹細胞またはその集団。
【請求項３】
前記オルソポックスウイルスが、ラクダ痘ウイルス（ＣＭＬＶ）、牛痘ウイルス（ＣＰＸＶ）、奇肢症ウイルス（ＥＣＴＶ）、馬痘ウイルス（ＨＰＸＶ）、サル痘ウイルス（ＭＰＸＶ）、ウサギ痘ウイルス（ＲＰＸＶ）、アライグマ痘ウイルス、スカンク痘ウイルス、アレチネズミ痘ウイルス、ウアシンギシュー病ウイルス、ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）、痘瘡ウイルス（ＶＡＲＶ）またはハタネズミ痘ウイルス（ＶＰＶ）から選択される、請求項２に記載の単離された幹細胞またはその集団。
【請求項４】
前記ワクシニアウイルスの株が、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ、Ｃｌｏｎｅ  ３、Ｔｉａｎ  Ｔｉａｎ、Ｔｉａｎ  ＴｉａｎクローンＴＰ５、Ｔｉａｎ  ＴｉａｎクローンＴＰ３、ＮＹＣＢＨ、ＮＹＣＢＨクローンＡｃａｍｂｉｓ  ２０００、Ｗｙｅｔｈ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｌｉｓｔｅｒ  １０７、Ｌｉｓｔｅｒ−ＬＯ、Ｌｉｓｔｅｒ  ＧＬ−ＯＮＣ１、Ｌｉｓｔｅｒ  ＧＬ−ＯＮＣ２、Ｌｉｓｔｅｒ  ＧＬ−ＯＮＣ３、Ｌｉｓｔｅｒ  ＧＬ−ＯＮＣ４、Ｌｉｓｔｅｒ  ＣＴＣ１、Ｌｉｓｔｅｒ  ＩＭＧ２（Ｔｕｒｂｏ  ＦＰ６３５）、ＩＨＤ−Ｗ、ＬＣ１６ｍ１８、Ｌｅｄｅｒｌｅ、ＴａｓｈｋｅｎｔクローンＴＫＴ３、ＴａｓｈｋｅｎｔクローンＴＫＴ４、ＵＳＳＲ、Ｅｖａｎｓ、Ｐｒａｈａ、Ｌ−ＩＶＰ、Ｖ−ＶＥＴ１またはＬＩＶＰ６．１．１、Ｉｋｅｄａ、ＥＭ−６３、Ｍａｌｂｒａｎ、Ｄｕｋｅ、３７３７、ＣＶ−１、Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｅｒｒｏ  ２、ＣＭ−０１、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１３、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１５、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ２０、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１７、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ２１、ＶＡＣＶ−ＩＯＣ、漿尿膜ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＣＶＡ）、改変ワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）およびＭＶＡ−ＢＮから選択される、請求項３に記載の単離された幹細胞またはその集団。
【請求項５】
非がん幹細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離された幹細胞またはその集団。
【請求項６】
ヒト細胞である、請求項１から５のいずれか一項に記載の単離された幹細胞またはその集団。
【請求項７】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、神経幹細胞、血管幹細胞、表皮幹細胞または誘導多能性幹細胞から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の単離された幹細胞またはその集団。
【請求項８】
前記ＭＳＣが、骨髄、臍帯血または脂肪組織に由来する、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離された幹細胞またはその集団。
【請求項９】
自家または同種異系細胞から選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載の単離された幹細胞またはその集団。
【請求項１０】
前記１つまたは複数の改変が、１つもしくは複数の欠失、挿入、置換、またはそれらの組合せを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の単離された幹細胞またはその集団。
【請求項１１】
前記１つまたは複数の改変が、１つまたは複数の独自の制限部位を導入するまたは欠失させるための１つまたは複数の改変を含む、請求項１０に記載の単離された幹細胞またはその集団。
【請求項１２】
前記ウイルスゲノムが、異種末端ヘアピンループを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離された幹細胞またはその集団。
【請求項１３】
前記ウイルスゲノムが、ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）に由来する末端ヘアピンループを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の単離された幹細胞またはその集団。
【請求項１４】
前記ｓｃＰＶのウイルスゲノムが、同種または異種末端ヘアピンループを含み、タンデムリピート領域が、野生型ＰＶとは異なる数のリピートを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離された幹細胞またはその集団。
【請求項１５】
左および右末端ヘアピンループが、ａ）それぞれ、スロー形態およびファスト形態の前記ワクシニアウイルス末端ヘアピンループを含み、ｂ）それぞれ、ファスト形態およびスロー形態の前記ワクシニアウイルス末端ヘアピンループを含み、ｃ）共にスロー形態の前記ワクシニアウイルス末端ヘアピンループを含み、またはｄ）共にファスト形態の前記ワクシニアウイルス末端ループを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の単離された幹細胞またはその集団。
【請求項１６】
前記ウイルスが、前記ｓｃＰＶのウイルスゲノムの実質的に全てに対応する重複する化学的に合成されたＤＮＡ断片から複製および再活性化される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の単離された幹細胞またはその集団。
【請求項１７】
前記ウイルスが、レポリポックスウイルスにより触媒される組換えおよび再活性化を使用して再活性化される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の単離された幹細胞またはその集団。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の単離された幹細胞またはその集団および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１９】
前記ｓｃＰＶが不活性化されている、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記不活性化が、熱、ＵＶまたはホルマリンによって実施される、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
対象にｓｃＰＶを送達するための方法であって、請求項１から１７のいずれか一項に記載の幹細胞またはその集団に、前記ｓｃＰＶを感染させるステップ、および前記対象中に、前記ｓｃＰＶに感染した幹細胞を投与するステップを含む、方法。
【請求項２２】
対象においてがんを処置または予防する方法であって、前記対象に、請求項１から１７のいずれか一項に記載の幹細胞もしくはその集団または請求項１８から２０のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与し、それによって、前記対象のがん細胞を前記ｓｃＰＶと接触させるステップを含む、方法。
【請求項２３】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の幹細胞もしくはその集団または請求項１８から２０のいずれか一項に記載の医薬組成物が、単回の投与または複数回の投与で投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の幹細胞もしくはその集団または請求項１８から２０のいずれか一項に記載の医薬組成物が、静脈内、動脈内、腫瘍内、内視鏡的、病変内、筋肉内、真皮内、腹腔内、小胞内、関節内、胸膜内、経皮、皮下、経口、非経口、鼻腔内、気管内、吸入によって、頭蓋内、前立腺内、硝子体内、眼に、膣内、冠内、心筋内、経心内膜、経心外膜、脊髄内、線状体内、経皮的、直腸または表皮下で投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ウイルスが、治療的遺伝子産物をコードする、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記治療的遺伝子産物が、抗がん剤または抗血管新生剤である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記治療的遺伝子産物が、サイトカイン、ケモカイン、免疫調節分子、抗原、抗体もしくはその断片、アンチセンスＲＮＡ、プロドラッグ変換酵素、ｓｉＲＮＡ、血管新生阻害剤、毒素、抗腫瘍オリゴペプチド、有糸分裂阻害剤タンパク質、抗有糸分裂オリゴペプチド、抗がんポリペプチド抗生物質、トランスポータータンパク質または組織因子から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ｓｃＰＶが、遺伝子欠失を含む、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２９】
欠失された遺伝子が、タンパク質もしくはその断片をコードする遺伝子、転写を調節する遺伝子セグメント、ウイルス複製を調節する遺伝子セグメント、細胞有糸分裂に影響を与える遺伝子セグメント、細胞代謝に影響を与える遺伝子セグメント、アンチセンスＲＮＡをコードする遺伝子セグメント、ｓｉＲＮＡをコードする遺伝子セグメント、血管新生を調節する遺伝子セグメント、１つもしくは複数のトランスポータータンパク質を調節する遺伝子セグメント、または１つもしくは複数の組織因子を調節する遺伝子セグメントから選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記遺伝子欠失が、前記ウイルスの抗がんまたは抗血管新生効果を強化する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
痘瘡ウイルス感染を処置する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１から１７のいずれか一項に記載の幹細胞もしくはその集団または請求項１８から２０のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項３２】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の幹細胞もしくはその集団または請求項１８から２０のいずれか一項に記載の医薬組成物が、単回の投与または複数回の投与で投与される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の幹細胞もしくはその集団または請求項１８から２０のいずれか一項に記載の医薬組成物が、静脈内、動脈内、腫瘍内、内視鏡的、病変内、筋肉内、真皮内、腹腔内、小胞内、関節内、胸膜内、経皮、皮下、経口、非経口、鼻腔内、気管内、吸入によって、頭蓋内、前立腺内、硝子体内、眼に、膣内、冠内、心筋内、経心内膜、経心外膜、脊髄内、線状体内、経皮的、直腸または表皮下で投与される、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本開示の背景
本明細書と関連する配列表は、テキストフォーマットでＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子提出され、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、１０４５４５−００３２−ＷＯ１−ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔである。２０１９年５月２日に作成したこのテキストファイルは、サイズが８８２，６６３バイトである。
【０００２】
ポックスウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ科のメンバー）は、ヒトおよび動物の両方に感染できる二本鎖ＤＮＡウイルスである。ポックスウイルスは、宿主範囲に基づいて２つの亜科に分割される。脊椎動物宿主に感染するＣｈｏｒｄｏｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ亜科は、８つの属からなり、そのうち４つの属（Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ、ＭｏｌｌｕｓｃｉｐｏｘｖｉｒｕｓおよびＹａｔａｐｏｘｖｉｒｕｓ）は、ヒトに感染することが公知である。天然痘は、Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ（ＯＰＶ）属のメンバーである痘瘡ウイルス（ＶＡＲＶ）による感染によって引き起こされる。ＯＰＶ属は、ラクダ痘ウイルス（ＣＭＬＶ）、牛痘ウイルス（ＣＰＸＶ）、奇肢症ウイルス（ＥＣＴＶ、「マウス痘因子」）、馬痘ウイルス（ＨＰＸＶ）、サル痘ウイルス（ＭＰＸＶ）、ウサギ痘ウイルス（ＲＰＸＶ）、アライグマ痘ウイルス、スカンク痘ウイルス、アレチネズミ痘ウイルス、ウアシンギシュー病（Uasin  Gishu  disease）ウイルス、ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）、痘瘡ウイルス（ＶＡＲＶ）およびハタネズミ痘ウイルス（ＶＰＶ）を含む、いくつかの遺伝的に関連し形態学的に同一なウイルスを含む。ＶＡＲＶ以外では、ＶＡＣＶ、ＭＰＸＶおよびＣＰＸＶを含む少なくとも３つの他のＯＰＶが、ヒトに感染することが公知である。
【０００３】
腫瘍細胞を排除または低減させることが可能な治療薬についての進行中の研究では、腫瘍溶解性ウイルスが、前臨床研究において大きな可能性を示している。これらのウイルスは、典型的には、新生物細胞中でのみ複製しそれを死滅させるように、遺伝的に操作される、またはそのような、腫瘍細胞に対する天然のトロピズムを有する。治療的ウイルスのうちで、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、がん治療のための最も有望な候補の１つである。例として、ＪＸ−５９４は、ＴＫ遺伝子欠失およびＧＭ−ＣＳＦ（免疫系を刺激して腫瘍細胞を死滅させることができるサイトカイン）遺伝子挿入を有するワクシニアウイルスであり、現在第ＩＩＩ相試験を受けている（Park  SH  et  al.  Phase  1b  trial  of  biweekly  intravenous  Pexa-Vec  (JX-594),  an  oncolytic  and  immunotherapeutic  vaccinia  virus  in  colorectal  cancer.  Mol  Ther  (2015);  23(9):1532-40）。
【０００４】
ウイルス治療薬の送達を改善し、抗ウイルス免疫を回避するために、いくつかの研究が、腫瘍溶解性ウイルスのための送達ビヒクルとして感染細胞を使用することの可能性を探索してきた（Garcia-Castro,  J.,  et  al.,  Treatment  of  metastatic  neuroblastoma  with  systemic  oncolytic  virotherapy  delivered  by  autologous  mesenchymal  stem  cells:  an  exploratory  study.  Cancer  Gene  Ther,  2010.  17(7):  476-83；Coukos,  G.,  et  al.,  Use  of  carrier  cells  to  deliver  a  replication-selective  herpes  simplex  virus-1  mutant  for  the  intraperitoneal  therapy  of  epithelial  ovarian  cancer.  Clin  Cancer  Res,  1999.  5(6):  1523-37；Komarova,  S.,  et  al.,  Mesenchymal  progenitor  cells  as  cellular  vehicles  for  delivery  of  oncolytic  adenoviruses.  Mol  Cancer  Ther,  2006.  5(3):  755-66）。間葉系幹細胞は、これに関して大きな有望さを示している。
【０００５】
有望ではあるが、これらの研究は、腫瘍溶解性ウイルスを負荷した間葉系幹細胞の治療的有効性を探索することができないことによって制限されてきた。さらに、細胞治療、例えば、幹細胞の投与は、幹細胞治療を受けている対象における悪性がんの形成と関連付けられている。疾患、障害および傷害の処置における細胞治療の可能性は意義深いが、かかる処置の結果としての、テラトーマなどの腫瘍の形成は、容認できない転帰である。
従って、腫瘍溶解性ウイルスを送達し、細胞治療を受けている対象において腫瘍形成のリスクを低減させる細胞組成物を安全に投与する方法が、必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Park  SH  et  al.  Phase  1b  trial  of  biweekly  intravenous  Pexa-Vec  (JX-594),  an  oncolytic  and  immunotherapeutic  vaccinia  virus  in  colorectal  cancer.  Mol  Ther  (2015);  23(9):1532-40
【非特許文献２】Garcia-Castro,  J.,  et  al.,  Treatment  of  metastatic  neuroblastoma  with  systemic  oncolytic  virotherapy  delivered  by  autologous  mesenchymal  stem  cells:  an  exploratory  study.  Cancer  Gene  Ther,  2010.  17(7):  476-83
【非特許文献３】Coukos,  G.,  et  al.,  Use  of  carrier  cells  to  deliver  a  replication-selective  herpes  simplex  virus-1  mutant  for  the  intraperitoneal  therapy  of  epithelial  ovarian  cancer.  Clin  Cancer  Res,  1999.  5(6):  1523-37
【非特許文献４】Komarova,  S.,  et  al.,  Mesenchymal  progenitor  cells  as  cellular  vehicles  for  delivery  of  oncolytic  adenoviruses.  Mol  Cancer  Ther,  2006.  5(3):  755-66
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示の要旨
本発明は、一態様では、がんまたは他の感染性疾患の処置のために使用され得る、合成キメラポックスウイルス（ｓｃＰＶ）を含む幹細胞を提供する。化学的ゲノム合成は、天然の鋳型に依存しないので、ウイルスゲノムの大量の構造的および機能的改変が可能である。天然の鋳型が、従来の分子生物学の方法による遺伝的複製または改変に利用可能でない場合、化学的ゲノム合成は特に有用である。
【０００８】
従って、一態様では、本発明は、合成キメラポックスウイルス（ｓｃＰＶ）を含む単離された幹細胞またはその集団であって、ウイルスが、合成ＤＮＡに由来するＤＮＡから複製および再活性化され、前記ウイルスのウイルスゲノムが、１つまたは複数の改変を特徴とするという点で前記ウイルスの野生型ゲノムとは異なる、単離された幹細胞またはその集団に関する。
【０００９】
別の態様では、本発明は、本発明の単離された幹細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【００１０】
別の態様では、本発明は、対象に本発明のｓｃＰＶを送達するための方法であって、本発明の幹細胞を感染させるステップ、および対象中に、ｓｃＰＶに感染した幹細胞を投与するステップを含む、方法に関する。
【００１１】
別の態様では、本発明は、対象においてがんを処置または予防する方法であって、対象に、本発明の幹細胞または本発明の医薬組成物を投与し、それによって、対象のがん細胞をｓｃＰＶと接触させるステップを含む、方法に関する。
【００１２】
別の態様では、本発明は、痘瘡ウイルス感染を処置する方法であって、それを必要とする対象に、本発明の幹細胞または本発明の医薬組成物を投与するステップを含む、方法に関する。
【００１３】
本特許出願は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を伴う本特許出願のコピーは、請求および必要な手数料の納付により、特許庁によって提供される。
【００１４】
上述の要旨ならびに以下の本開示の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むと、より良く理解される。本発明の種々の態様を例示することを目的として、本発明で好ましい実施形態が図面に示される。しかし、本発明は、示された正確な配置および手段に限定されないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂ。直鎖ｄｓＤＮＡ  ＨＰＸＶゲノム（株ＭＮＲ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＤＱ７９２５０４）の模式図。Ａ．図１Ａは、個々のＨＰＸＶ遺伝子（紫色）ならびに天然に存在するＡａｒＩおよびＢｓａＩ部位が示された、ＨＰＸＶゲノムの未改変のゲノム配列を示す。Ｂ．図１Ｂは、重複するゲノムＤＮＡ断片（赤色で示される）を使用して化学的に合成された、改変された合成キメラＨＰＸＶ（ｓｃＨＰＸＶ）ゲノムを示す。ＶＡＣＶ末端ヘアピンループをＩＴＲにライゲートさせるために使用した操作されたＳａｐＩ制限部位もまた、左および右ＩＴＲ断片中の未改変のＢｓａＩ部位と共に示される。ＳａｐＩ部位は、プラスミドベクター部位中の、それぞれ左末端逆位配列（ＬＩＴＲ）および右末端逆位配列（ＲＩＴＲ）のすぐ左側終端および右側終端に位置した。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂ。直鎖ｄｓＤＮＡ  ＨＰＸＶゲノム（株ＭＮＲ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＤＱ７９２５０４）の模式図。Ａ．図１Ａは、個々のＨＰＸＶ遺伝子（紫色）ならびに天然に存在するＡａｒＩおよびＢｓａＩ部位が示された、ＨＰＸＶゲノムの未改変のゲノム配列を示す。Ｂ．図１Ｂは、重複するゲノムＤＮＡ断片（赤色で示される）を使用して化学的に合成された、改変された合成キメラＨＰＸＶ（ｓｃＨＰＸＶ）ゲノムを示す。ＶＡＣＶ末端ヘアピンループをＩＴＲにライゲートさせるために使用した操作されたＳａｐＩ制限部位もまた、左および右ＩＴＲ断片中の未改変のＢｓａＩ部位と共に示される。ＳａｐＩ部位は、プラスミドベクター部位中の、それぞれ左末端逆位配列（ＬＩＴＲ）および右末端逆位配列（ＲＩＴＲ）のすぐ左側終端および右側終端に位置した。
【００１６】
【図２】図２Ａ〜２Ｃ。改変されたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムおよびＶＡＣＶ（ＷＲ株）末端ヘアピンループの詳細な模式図。Ａ．図２Ａは、改変されたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムを示す。未改変のＢｓａＩ部位は、ゲノム上に青色の線として示される。ＨＰＸＶ０４４（ＶＡＣＶ  Ｆ４Ｌホモログ）中に創出された新規ＡｖａＩおよびＳｔｕＩ制限部位もマークされる（緑色の線）。断片＿３のＨＰＸＶ０９５遺伝子座（ＶＡＣＶ  Ｊ２Ｒホモログ）中の選択可能なマーカー黄色蛍光タンパク質／グアノシンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｙｆｐ／ｇｐｔ）の位置もまた示される（黄色）。Ｂ．図２Ｂは、Ｓ（配列番号１１）形態およびＦ（配列番号１２）形態の末端ヘアピンループのヌクレオチド配列を示し、色コード化は、（Ｃ）で説明される。Ｃ．図２Ｃは、ＶＡＣＶの直鎖ｄｓＤＮＡゲノムの末端終端に共有結合されるＦ形態およびＳ形態の末端ヘアピンループ（それぞれ、配列番号１２および１１）の二次構造予測を示す。末端ループ配列は、緑色で強調される。コンカテマー分割（concatamer  resolution）配列は、赤色で囲まれる。
【００１７】
【図３】図３。約７０ｂｐのＶＡＣＶ末端ヘアピンを、左および右ＨＰＸＶ  ＩＴＲ断片にライゲートした。図３は、ＳａｐＩによって切断された１４７２ｂｐのＩＴＲ断片への約７０ｂｐの末端ヘアピンのライゲーション後の、左および右ＩＴＲ断片のアガロースゲル電気泳動を示す。ライゲートされたＤＮＡを、ＰｖｕＩＩによって引き続いて切断して、ヘアピンの付加によって引き起こされた、サイズにおける小さい変化の検出を促進した。
【００１８】
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｂ。ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムのＰＣＲ分析および制限消化は、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の首尾よい再活性化を確認する。Ａ．図４Ａは、ＶＡＣＶ−ＷＲおよびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムＤＮＡのパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を示す。ウイルスＤＮＡを、ＢｓａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩによって消化し、または未処理のままにし、次いで、１〜１０秒の切り替え時間で、５．７Ｖ／ｃｍで１４℃で１４時間、１％Ｓｅａｋｅｍ  ｇｏｌｄアガロースゲル上で分離した。インタクトなＶＡＣＶとｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムとの間で、サイズにおける僅かな差異が観察された。アスタリスク（＊）でマークされたかすかなバンドは、不完全なＤＮＡ消化産物であるか、またはＶＡＣＶビリオン調製物にしばしば混入する切断されたミトコンドリアＤＮＡ断片であり得る。Ｂ．図４Ｂは、ＢｓａＩまたはＨｉｎｄＩＩＩによって消化したＶＡＣＶ−ＷＲおよびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムＤＮＡの従来のアガロースゲル電気泳動を示す。ＤＮＡ断片を、ＳｙｂｒＧｏｌｄ  ＤＮＡ染色でゲルを染色することによって可視化した。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｂ。ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムのＰＣＲ分析および制限消化は、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の首尾よい再活性化を確認する。Ａ．図４Ａは、ＶＡＣＶ−ＷＲおよびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムＤＮＡのパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を示す。ウイルスＤＮＡを、ＢｓａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩによって消化し、または未処理のままにし、次いで、１〜１０秒の切り替え時間で、５．７Ｖ／ｃｍで１４℃で１４時間、１％Ｓｅａｋｅｍ  ｇｏｌｄアガロースゲル上で分離した。インタクトなＶＡＣＶとｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムとの間で、サイズにおける僅かな差異が観察された。アスタリスク（＊）でマークされたかすかなバンドは、不完全なＤＮＡ消化産物であるか、またはＶＡＣＶビリオン調製物にしばしば混入する切断されたミトコンドリアＤＮＡ断片であり得る。Ｂ．図４Ｂは、ＢｓａＩまたはＨｉｎｄＩＩＩによって消化したＶＡＣＶ−ＷＲおよびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムＤＮＡの従来のアガロースゲル電気泳動を示す。ＤＮＡ断片を、ＳｙｂｒＧｏｌｄ  ＤＮＡ染色でゲルを染色することによって可視化した。
【００１９】
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｃ。ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５領域９６，０５０〜９６，５００中のＢｓａＩ部位を、正確に変異させた。図５Ａは、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）ゲノムの１つの領域にマッピングされたＩｌｌｕｍｉｎａ配列読み取りを示す。読み取りのごく一部のみが示される。９６，２３９位および９６４３７位における配列決定読み取りの矛盾は、それぞれ青色および黄色で強調される。図５Ｂは、９６２３９位近傍の、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）にマッピングされたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５からのＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定読み取りの拡大図を示す。ヌクレオチド置換（Ｔ９６２３９Ｃ）が検出された（表２を参照のこと）。図面は、出現順に、それぞれ、配列番号６８〜７０、６９、７１、７２、６９、７３〜７６、６９、７７〜７９、６９、６９、８０、８１、６９、８２、６９、８３、６９、８４、６９、８４、８５、６９、６９、８６、６９、６９、８７、６９、６９、６９、６９、８８、６９、６９、６９、８９および９０を開示している。図５Ｃは、９６４３７位における、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）にマッピングされたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５からのＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定読み取りの拡大図を示す。ヌクレオチド置換（Ａ９６４３７Ｃ）が検出された（表２を参照のこと）。これらの変異を、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５をアセンブルするのに使用するクローン中に導入して、望ましくないＢｓａＩ認識部位（ＧＧＴＣＴＣ）を欠失させた。図面は、出現順に、それぞれ、配列番号９１〜９４、９２、９５、９２、９２、９２、９６、９２、９７、９８、９２、９２、９２、９２、９２、９９〜１０１、９２、１０２、１０３、９２、１０４〜１０９、９２、１１０、９２、９２、１１１、１０３、１１２、９２、１１３、１１４、９２、９２、１１５および１１６を開示している。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｃ。ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５領域９６，０５０〜９６，５００中のＢｓａＩ部位を、正確に変異させた。図５Ａは、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）ゲノムの１つの領域にマッピングされたＩｌｌｕｍｉｎａ配列読み取りを示す。読み取りのごく一部のみが示される。９６，２３９位および９６４３７位における配列決定読み取りの矛盾は、それぞれ青色および黄色で強調される。図５Ｂは、９６２３９位近傍の、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）にマッピングされたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５からのＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定読み取りの拡大図を示す。ヌクレオチド置換（Ｔ９６２３９Ｃ）が検出された（表２を参照のこと）。図面は、出現順に、それぞれ、配列番号６８〜７０、６９、７１、７２、６９、７３〜７６、６９、７７〜７９、６９、６９、８０、８１、６９、８２、６９、８３、６９、８４、６９、８４、８５、６９、６９、８６、６９、６９、８７、６９、６９、６９、６９、８８、６９、６９、６９、８９および９０を開示している。図５Ｃは、９６４３７位における、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）にマッピングされたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５からのＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定読み取りの拡大図を示す。ヌクレオチド置換（Ａ９６４３７Ｃ）が検出された（表２を参照のこと）。これらの変異を、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５をアセンブルするのに使用するクローン中に導入して、望ましくないＢｓａＩ認識部位（ＧＧＴＣＴＣ）を欠失させた。図面は、出現順に、それぞれ、配列番号９１〜９４、９２、９５、９２、９２、９２、９６、９２、９７、９８、９２、９２、９２、９２、９２、９９〜１０１、９２、１０２、１０３、９２、１０４〜１０９、９２、１１０、９２、９２、１１１、１０３、１１２、９２、１１３、１１４、９２、９２、１１５および１１６を開示している。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｃ。ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５領域９６，０５０〜９６，５００中のＢｓａＩ部位を、正確に変異させた。図５Ａは、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）ゲノムの１つの領域にマッピングされたＩｌｌｕｍｉｎａ配列読み取りを示す。読み取りのごく一部のみが示される。９６，２３９位および９６４３７位における配列決定読み取りの矛盾は、それぞれ青色および黄色で強調される。図５Ｂは、９６２３９位近傍の、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）にマッピングされたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５からのＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定読み取りの拡大図を示す。ヌクレオチド置換（Ｔ９６２３９Ｃ）が検出された（表２を参照のこと）。図面は、出現順に、それぞれ、配列番号６８〜７０、６９、７１、７２、６９、７３〜７６、６９、７７〜７９、６９、６９、８０、８１、６９、８２、６９、８３、６９、８４、６９、８４、８５、６９、６９、８６、６９、６９、８７、６９、６９、６９、６９、８８、６９、６９、６９、８９および９０を開示している。図５Ｃは、９６４３７位における、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）にマッピングされたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５からのＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定読み取りの拡大図を示す。ヌクレオチド置換（Ａ９６４３７Ｃ）が検出された（表２を参照のこと）。これらの変異を、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５をアセンブルするのに使用するクローン中に導入して、望ましくないＢｓａＩ認識部位（ＧＧＴＣＴＣ）を欠失させた。図面は、出現順に、それぞれ、配列番号９１〜９４、９２、９５、９２、９２、９２、９６、９２、９７、９８、９２、９２、９２、９２、９２、９９〜１０１、９２、１０２、１０３、９２、１０４〜１０９、９２、１１０、９２、９２、１１１、１０３、１１２、９２、１１３、１１４、９２、９２、１１５および１１６を開示している。
【００２０】
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｃ。ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５は、ＢＳＣ−４０細胞において、他のオルソポックスウイルスのように増殖するが、小さいプラークの表現型を示す。Ａ．図６Ａは、ＢＳＣ−４０（左上パネル）、ＨｅＬａ（中央上パネル）、初代ＨＥＬ（右上パネル）およびＶｅｒｏ（左下パネル）細胞株におけるＶＡＣＶ−ＷＲ、ＤＰＰ１５、ＣＰＸＶおよびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の多段階増殖を示す。Ｂ．図６Ｂは、ＶＡＣＶ−ＷＲ、ＤＰＰ１５、ＣＰＸＶおよびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５間でのプラークサイズ比較を示す。ＢＳＣ−４０細胞に、示されたウイルスを感染させ、感染の４８時間後に、細胞を固定および染色した。３回の独立した実験を通じた２４個のプラークの面積（任意単位［Ａ．Ｕ．］）を、各ウイルスについて測定した。データは、平均プラーク直径として表される。＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。Ｃ．図６Ｃは、示されたウイルスを７２時間感染させたＢＳＣ−４０細胞のプラーク形態学を示す。細胞を固定し、染色し、可視化のためにスキャンした。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｃ。ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５は、ＢＳＣ−４０細胞において、他のオルソポックスウイルスのように増殖するが、小さいプラークの表現型を示す。Ａ．図６Ａは、ＢＳＣ−４０（左上パネル）、ＨｅＬａ（中央上パネル）、初代ＨＥＬ（右上パネル）およびＶｅｒｏ（左下パネル）細胞株におけるＶＡＣＶ−ＷＲ、ＤＰＰ１５、ＣＰＸＶおよびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の多段階増殖を示す。Ｂ．図６Ｂは、ＶＡＣＶ−ＷＲ、ＤＰＰ１５、ＣＰＸＶおよびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５間でのプラークサイズ比較を示す。ＢＳＣ−４０細胞に、示されたウイルスを感染させ、感染の４８時間後に、細胞を固定および染色した。３回の独立した実験を通じた２４個のプラークの面積（任意単位［Ａ．Ｕ．］）を、各ウイルスについて測定した。データは、平均プラーク直径として表される。＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。Ｃ．図６Ｃは、示されたウイルスを７２時間感染させたＢＳＣ−４０細胞のプラーク形態学を示す。細胞を固定し、染色し、可視化のためにスキャンした。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｃ。ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５は、ＢＳＣ−４０細胞において、他のオルソポックスウイルスのように増殖するが、小さいプラークの表現型を示す。Ａ．図６Ａは、ＢＳＣ−４０（左上パネル）、ＨｅＬａ（中央上パネル）、初代ＨＥＬ（右上パネル）およびＶｅｒｏ（左下パネル）細胞株におけるＶＡＣＶ−ＷＲ、ＤＰＰ１５、ＣＰＸＶおよびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の多段階増殖を示す。Ｂ．図６Ｂは、ＶＡＣＶ−ＷＲ、ＤＰＰ１５、ＣＰＸＶおよびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５間でのプラークサイズ比較を示す。ＢＳＣ−４０細胞に、示されたウイルスを感染させ、感染の４８時間後に、細胞を固定および染色した。３回の独立した実験を通じた２４個のプラークの面積（任意単位［Ａ．Ｕ．］）を、各ウイルスについて測定した。データは、平均プラーク直径として表される。＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。Ｃ．図６Ｃは、示されたウイルスを７２時間感染させたＢＳＣ−４０細胞のプラーク形態学を示す。細胞を固定し、染色し、可視化のためにスキャンした。
【００２１】
【図７】図７。マウスへの種々の組成物および用量の投与後の経時的な％体重減少のグラフ表示。示されたデータは、１０μｌのＰＢＳ中の、示された用量のｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５（ｓｃＨＰＸＶ（ΔＨＰＸＶ＿０９５／Ｊ２Ｒ）またはｓｃＨＰＸＶ（ｙｆｐ／ｇｐｔ）とも称する）、ｓｃＨＰＸＶ（野生型）、Ｄｒｙｖａｘ  ＤＰＰ１５またはＶＡＣＶ  ＷＲが接種された５匹の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの群から生成される。マウスを、２８日間にわたって毎日体重測定し、初期体重の＞２５％を失ったいずれのマウスも安楽死させる。データポイントは平均スコアを示し、エラーバーは標準偏差を示す。
【００２２】
【図８Ａ】図８Ａおよび８Ｂ。マウスへの種々の組成物および用量の投与後の経時的な％体重減少のグラフ表示。示されたデータは、先にワクチン接種され（図１０）、次いで、致死用量のＶＡＣＶ  ＷＲ（１０６ＰＦＵ）で鼻腔内抗原投与されるマウスから生成される。図８Ａは、１３日間にわたって毎日記録した、マウスにおける体重変化を示し、図８Ｂは、臨床スコアを示す。初期体重の＞２５％を失ったいずれのマウスも安楽死させる。マウスに、被毛の乱れ（ruffled  fur）、猫背の姿勢、呼吸困難および減少した運動性の出現に基づいて臨床スコアを割り当てた。データポイントは、体重またはスコアにおける平均差異を示し、エラーバーは標準偏差を示す。†は、所与の日にＶＡＣＶ感染で死亡するマウスの数を示す。
【図８Ｂ】図８Ａおよび８Ｂ。マウスへの種々の組成物および用量の投与後の経時的な％体重減少のグラフ表示。示されたデータは、先にワクチン接種され（図１０）、次いで、致死用量のＶＡＣＶ  ＷＲ（１０６ＰＦＵ）で鼻腔内抗原投与されるマウスから生成される。図８Ａは、１３日間にわたって毎日記録した、マウスにおける体重変化を示し、図８Ｂは、臨床スコアを示す。初期体重の＞２５％を失ったいずれのマウスも安楽死させる。マウスに、被毛の乱れ（ruffled  fur）、猫背の姿勢、呼吸困難および減少した運動性の出現に基づいて臨床スコアを割り当てた。データポイントは、体重またはスコアにおける平均差異を示し、エラーバーは標準偏差を示す。†は、所与の日にＶＡＣＶ感染で死亡するマウスの数を示す。
【００２３】
【図９】図９。マウスへの種々の組成物および用量の投与後の経時的な％生存のグラフ表示。示されたデータは、先にワクチン接種され（図７）、次いで、致死用量のＶＡＣＶ  ＷＲ（１０６ＰＦＵ）で鼻腔内抗原投与されるマウスから生成される。図９は、致死用量のＶＡＣＶ  ＷＲ（１０６ＰＦＵ）で鼻腔内抗原投与されるマウスの生存曲線を示す。†は、示された日にＶＡＣＶ感染で死亡するマウスの数を示す。
【００２４】
【図１０Ａ】図１０Ａおよび１０Ｂ。ＶＡＣＶ−ＨＰＸＶハイブリッドウイルスの特徴付け。図１０Ａ．ＶＡＣＶ株ＷＲ中のＨＰＸＶ挿入物。ウイルスゲノムを、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームを使用して配列決定し、アセンブルし、ＬＡＧＡＮおよび「Ｂａｓｅ−ｂｙ−Ｂａｓｅ」ソフトウェアを使用してアラインさせ、示されたマップを生成した。ＶＡＣＶ配列（白色）がＨＰＸＶ配列によって置き換えられた場所は、差異に従って色コード化する。図１０Ｂ．ハイブリッドおよび再活性化されたウイルスを同定するための、ＰＣＲベースのスクリーニングアプローチ。ＰＣＲ増幅後、産物をＢｓａＩによって消化して、ＨＰＸＶ（切断しない）からＶＡＣＶ配列（切断する）を区別する。ＶＡＣＶ／ＨＰＸＶハイブリッドは、ＢｓａＩ感受性部位および抵抗性部位のミックスを示すが、再活性化されたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５クローンは、完全にＢｓａＩ抵抗性である。
【図１０Ｂ】図１０Ａおよび１０Ｂ。ＶＡＣＶ−ＨＰＸＶハイブリッドウイルスの特徴付け。図１０Ａ．ＶＡＣＶ株ＷＲ中のＨＰＸＶ挿入物。ウイルスゲノムを、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームを使用して配列決定し、アセンブルし、ＬＡＧＡＮおよび「Ｂａｓｅ−ｂｙ−Ｂａｓｅ」ソフトウェアを使用してアラインさせ、示されたマップを生成した。ＶＡＣＶ配列（白色）がＨＰＸＶ配列によって置き換えられた場所は、差異に従って色コード化する。図１０Ｂ．ハイブリッドおよび再活性化されたウイルスを同定するための、ＰＣＲベースのスクリーニングアプローチ。ＰＣＲ増幅後、産物をＢｓａＩによって消化して、ＨＰＸＶ（切断しない）からＶＡＣＶ配列（切断する）を区別する。ＶＡＣＶ／ＨＰＸＶハイブリッドは、ＢｓａＩ感受性部位および抵抗性部位のミックスを示すが、再活性化されたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５クローンは、完全にＢｓａＩ抵抗性である。
【００２５】
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｃ。ｓｃＨＰＸＶ対ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の増殖特性。図１１Ａ．プラークサイズ測定。相同組換えを使用して、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５中のＹＦＰ−ｇｐｔ遺伝子座を、チミジンキナーゼ遺伝子配列で置き換えた。これは、ＨＰＸＶ遺伝子の完全に野生型の相補体を有するウイルス（ｓｃＨＰＸＶ）を産生した。ＢＳＣ−４０細胞に、示されたウイルスを感染させ、３日間培養した。培養皿を染色し、プラーク面積を、スキャンされたデジタル画像を使用して測定した。統計的有意差が注記される（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１１Ｂ．プラーク画像。図１１Ｃ．培養物における多段階ウイルス増殖。示された細胞株に、０．０１の感染多重度でｓｃＨＰＸＶまたはｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５を感染させ、示された時点でウイルスを収集し、ＢＳＣ−４０細胞に対して三連で力価決定した。これらのウイルスの増殖には、これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでは有意差は検出されなかった。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｃ。ｓｃＨＰＸＶ対ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の増殖特性。図１１Ａ．プラークサイズ測定。相同組換えを使用して、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５中のＹＦＰ−ｇｐｔ遺伝子座を、チミジンキナーゼ遺伝子配列で置き換えた。これは、ＨＰＸＶ遺伝子の完全に野生型の相補体を有するウイルス（ｓｃＨＰＸＶ）を産生した。ＢＳＣ−４０細胞に、示されたウイルスを感染させ、３日間培養した。培養皿を染色し、プラーク面積を、スキャンされたデジタル画像を使用して測定した。統計的有意差が注記される（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１１Ｂ．プラーク画像。図１１Ｃ．培養物における多段階ウイルス増殖。示された細胞株に、０．０１の感染多重度でｓｃＨＰＸＶまたはｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５を感染させ、示された時点でウイルスを収集し、ＢＳＣ−４０細胞に対して三連で力価決定した。これらのウイルスの増殖には、これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでは有意差は検出されなかった。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｃ。ｓｃＨＰＸＶ対ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の増殖特性。図１１Ａ．プラークサイズ測定。相同組換えを使用して、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５中のＹＦＰ−ｇｐｔ遺伝子座を、チミジンキナーゼ遺伝子配列で置き換えた。これは、ＨＰＸＶ遺伝子の完全に野生型の相補体を有するウイルス（ｓｃＨＰＸＶ）を産生した。ＢＳＣ−４０細胞に、示されたウイルスを感染させ、３日間培養した。培養皿を染色し、プラーク面積を、スキャンされたデジタル画像を使用して測定した。統計的有意差が注記される（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１１Ｂ．プラーク画像。図１１Ｃ．培養物における多段階ウイルス増殖。示された細胞株に、０．０１の感染多重度でｓｃＨＰＸＶまたはｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５を感染させ、示された時点でウイルスを収集し、ＢＳＣ−４０細胞に対して三連で力価決定した。これらのウイルスの増殖には、これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでは有意差は検出されなかった。
【００２６】
【図１２】図１２。直鎖ｄｓＤＮＡ  ＶＡＣＶゲノム株ＡＣＡＭ２０００；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ３１３８４７の模式図。図１２は、大きいｄｓＤＮＡ断片を化学的に合成するために使用した改変されたＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００ゲノムを示す。重複するｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００ゲノム断片は、青色で示される。左末端逆位配列（ＬＩＴＲ）および右末端逆位配列（ＲＩＴＲ）中の、サイレントに変異させなかった操作されたＢｓａＩ制限部位もまた示される。
【００２７】
【図１３Ａ】図１３Ａ〜１３Ｃ。（Ａ）ＶＡＣＶ  ＷＲ株および（Ｂ）ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００の公開されたゲノムの最初の約１５００〜３０００ｂｐの詳細な模式図。タンデムリピート領域は、赤色（７０ｂｐリピート）、青色（１２５ｂｐリピート）および緑色（５４ｂｐリピート）の四角で明確に示される。遺伝子Ｃ２３Ｌに対応するＯＲＦもまた、ゲノムの各々において示される。（Ｃ）ＶＡＣＶ  ＷＲ中の７０ｂｐリピート配列を含むダイレクトリピート領域の模式図。この配列は、ヘアピン／二重鎖小片およびＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００  ＩＴＲ断片をライゲートするために、それぞれ、５’末端にＳａｐＩ制限部位を含み、３’末端にＮｈｅＩ制限部を含むように合成した。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜１３Ｃ。（Ａ）ＶＡＣＶ  ＷＲ株および（Ｂ）ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００の公開されたゲノムの最初の約１５００〜３０００ｂｐの詳細な模式図。タンデムリピート領域は、赤色（７０ｂｐリピート）、青色（１２５ｂｐリピート）および緑色（５４ｂｐリピート）の四角で明確に示される。遺伝子Ｃ２３Ｌに対応するＯＲＦもまた、ゲノムの各々において示される。（Ｃ）ＶＡＣＶ  ＷＲ中の７０ｂｐリピート配列を含むダイレクトリピート領域の模式図。この配列は、ヘアピン／二重鎖小片およびＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００  ＩＴＲ断片をライゲートするために、それぞれ、５’末端にＳａｐＩ制限部位を含み、３’末端にＮｈｅＩ制限部を含むように合成した。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜１３Ｃ。（Ａ）ＶＡＣＶ  ＷＲ株および（Ｂ）ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００の公開されたゲノムの最初の約１５００〜３０００ｂｐの詳細な模式図。タンデムリピート領域は、赤色（７０ｂｐリピート）、青色（１２５ｂｐリピート）および緑色（５４ｂｐリピート）の四角で明確に示される。遺伝子Ｃ２３Ｌに対応するＯＲＦもまた、ゲノムの各々において示される。（Ｃ）ＶＡＣＶ  ＷＲ中の７０ｂｐリピート配列を含むダイレクトリピート領域の模式図。この配列は、ヘアピン／二重鎖小片およびＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００  ＩＴＲ断片をライゲートするために、それぞれ、５’末端にＳａｐＩ制限部位を含み、３’末端にＮｈｅＩ制限部を含むように合成した。
【００２８】
【図１４】図１４。最初の７０ｂｐリピート配列への、二重鎖ＤＮＡを有するワクシニアウイルス末端ヘアピンループのアセンブリ。二重鎖ＤＮＡ（レーン２）およびヘアピンＤＮＡ単独（レーン３）ならびにライゲーション後（レーン４）のゲル電気泳動が示される。ライゲートされた産物（矢印）を、引き続いてゲルから切り出し、精製して、野生型ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００配列の配列を模倣するように７０ｂｐリピート配列にそれをライゲートさせることができるようにした。
【００２９】
【図１５】図１５。ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖特性。サル腎臓上皮細胞（ＢＳＣ−４０）において測定した多段階増殖動態。細胞に、０．０３の感染多重度で感染させ、示された時点でウイルスを収集し、ウイルスを、ＢＳＣ−４０細胞に対して力価決定した。データは、３回の独立した実験を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。
【００３０】
【図１６】図１６。ＹＦＰ−ｇｐｔマーカーがＪ２Ｒ遺伝子配列で置き換えられた（ＶＡＣ＿ＷＲΔＪ２Ｒ）ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰおよびｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰ、ならびに野生型ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００と比較した、ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰおよびｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖特性。サル腎臓上皮細胞（ＢＳＣ−４０）において測定した多段階増殖動態。細胞に、０．０３の感染多重度で感染させ、示された時点でウイルスを収集し、ウイルスを、ＢＳＣ−４０細胞に対して力価決定した。エラーバーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。
【００３１】
【図１７】図１７。再活性化されたｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰクローンの制限エンドヌクレアーゼマッピング。パルスフィールドゲル電気泳動分析。２つの独立したｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰクローン、プラスＹＦＰ−ｇｐｔマーカーがＪ２Ｒ遺伝子配列で置き換えられたＶＡＣＶ  ＷＲ対照（ＶＡＣ＿ＷＲΔＪ２Ｒ）および野生型ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００対照（ＶＡＣ＿ＡＣＡＭ２０００）を、精製し、次いで、未消化のままにしたか、ＢｓａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、またはＮｏｔＩおよびＰｖｕＩによって消化した。ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００クローン中のほぼ全てのＢｓａＩ部位の予想された非存在が明らかであった。ＶＡＣＶ＿ＷＲΔＪ２ＲおよびＶＡＣＶ＿ＡＣＡＭ２０００と比較した、ＨｉｎｄＩＩＩ消化されたｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００ゲノムＤＮＡにおける軽微な差異が観察された。ＮｏｔＩおよびＰｖｕＩによって消化されたゲノムＤＮＡは、左および右ＩＴＲ配列において見出される７０ｂｐタンデムリピート断片を切り出す。ＶＡＣＶ＿ＷＲΔＪ２Ｒ中では、７０ｂｐリピートのおよそのサイズは、３．６ｋｂｐに近い。興味深いことに、２つの独立したｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００クローンにおいて、全長７０ｂｐタンデムリピートエレメントをＩＴＲ断片にライゲートさせた場合であっても、７０ｂｐタンデムリピートに対応する２つの異なるサイズのバンドが観察された（＊でマークされる）。ＡＣＡＭ２０００ゲノムＤＮＡをＮｏｔＩおよびＰｖｕＩによって消化した場合、約４．７ｋｂｐにおいて、ＡＣＡＭ２０００中の７０ｂｐリピートのサイズを示し得るバンドが観察された。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本開示の詳細な説明
一般技術
本明細書で特に定義しない限り、本出願で使用する科学用語および技術用語は、当業者が一般に理解する意味を有するものとする。一般に、本明細書に記載される薬理学、細胞および組織培養、分子生物学、細胞およびがん生物学、神経生物学、神経化学、ウイルス学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学と併せて使用される命名法、ならびにそれらの技術は、当技術分野で周知であり、一般に使用されるものである。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。
【００３３】
本発明の種々の態様の実施は、特記しない限り、当業者の技術範囲内の、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術を使用する。かかる技術は、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  second  edition  (Sambrook  et  al.,  1989)  Cold  Spring  Harbor  Press；Oligonucleotide  Synthesis  (M.J.  Gait,  ed.,  1984)；Methods  in  Molecular  Biology,  Humana  Press；Cell  Biology:  A  Laboratory  Notebook  (J.E.  Cellis,  ed.,  1998)  Academic  Press；Animal  Cell  Culture  (R.I.  Freshney,  ed.,  1987)；Introduction  to  Cell  and  Tissue  Culture  (J.P.  Mather  and  P.E.  Roberts,  1998)  Plenum  Press；Cell  and  Tissue  Culture:  Laboratory  Procedures  (A.  Doyle,  J.B.  Griffiths,  and  D.G.  Newell,  eds.,  1993-1998)  J.  Wiley  and  Sons；Methods  in  Enzymology  (Academic  Press,  Inc.)；Gene  Transfer  Vectors  for  Mammalian  Cells  (J.M.  Miller  and  M.P.  Calos,  eds.,  1987)；Current  Protocols  in  Molecular  Biology  (F.M.  Ausubel  et  al.,  eds.,  1987)；PCR:    The  Polymerase  Chain  Reaction,  (Mullis  et  al.,  eds.,  1994)；Sambrook  and  Russell,  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  3rd.  ed.,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring  Harbor,  NY  (2001)；Ausubel  et  al.,  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  John  Wiley  &  Sons,  NY  (2002)；Harlow  and  Lane  Using  Antibodies:  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring  Harbor,  NY  (1998)；Coligan  et  al.,  Short  Protocols  in  Protein  Science,  John  Wiley  &  Sons,  NY  (2003)；Short  Protocols  in  Molecular  Biology  (Wiley  and  Sons,  1999)などの文献中で完全に説明されている。
【００３４】
酵素反応および精製技術は、当技術分野で一般に達成されるように、または本明細書に記載されるように、製造業者の仕様書に従って実施される。本明細書に記載される分析化学、生化学、免疫学、分子生物学、合成有機化学ならびに医薬品化学および製薬化学と併せて使用される命名法、ならびにそれらの実験室手順および技術は、当技術分野で周知であり、一般に使用されるものである。標準的な技術が、化学的合成および化学的分析のために使用される。
【００３５】
本明細書および実施形態を通じて、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または変化形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、述べられた整数または整数の群を含むことを意味するが、任意の他の整数または整数の群を排除することを意味しないと理解される。
【００３６】
実施形態が言語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を用いて本明細書に記載される場合、「〜からなる」および／または「〜から本質的になる」で記載される、他の点では類似の実施形態もまた提供されることが理解される。
【００３７】
用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「〜が含まれるがこれらに限定されない」を意味するために使用される。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「〜が含まれるがこれらに限定されない」は、相互交換可能に使用される。
【００３８】
用語「例えば（ｅ．ｇ．）」または「例えば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）」の後の任意の例は、徹底的でも限定的でもないことを意味する。
【００３９】
文脈が他を要求しない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【００４０】
冠詞「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」は、その冠詞の文法的対象の１つまたは１つよりも多く（即ち、少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。例として、「１つの要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または１つよりも多い要素を意味する。本明細書の「約」値またはパラメーターに対する言及は、その値またはパラメーター自体に対する実施形態を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」の記載を含む。数的範囲は、その範囲を規定する数を含む。
【００４１】
本出願の広い範囲を示す数的範囲およびパラメーターは近似であるものの、具体例で示される数値は、可能な限り正確に報告される。しかし、任意の数値は、そのそれぞれの試験測定値において見出される標準偏差から必然的に生じるある特定の誤差を固有に含む。さらに、本明細書に開示される全ての範囲は、その中に含まれる任意のおよび全ての下位範囲を包含することを理解すべきである。例えば、「１〜１０」の述べられた範囲は、１の最小値と１０の最大値との間（それらを含む）の任意のおよび全ての下位範囲；即ち、１またはそれよりも大きい最小値、例えば、１〜６．１で始まり、１０またはそれ未満の最大値、例えば、５．５〜１０で終わる全ての下位範囲、を含むとみなすべきである。
【００４２】
例示的な方法および材料が本明細書に記載されるが、本明細書に記載される方法および材料と類似または等価な方法および材料もまた、本発明の実施または試験において使用され得る。材料、方法および例は、例示に過ぎず、限定を意図しない。
【００４３】
定義
以下の用語は、特記しない限り、以下の意味を有すると理解するものとする：
本明細書で使用する場合、用語「野生型ウイルス」、「野生型ゲノム」、「野生型タンパク質」または「野生型核酸」は、ある特定の集団（例えば、特定のウイルス種など）内に天然に存在するアミノ酸または核酸の配列を指す。
【００４４】
用語「キメラ」もしくは「操作された」もしくは「改変された」（例えば、キメラポックスウイルス、操作されたポリペプチド、改変されたポリペプチド、操作された核酸、改変された核酸）またはそれらの文法上の変化形は、ネイティブ配列と比較して１つまたは複数の変化を有するように操作された非ネイティブ配列を指すために、本明細書で相互交換可能に使用される。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「合成ウイルス」は、合成ＤＮＡ（例えば、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ、操作されたＤＮＡ、ヌクレオシドアナログを含むポリヌクレオチドなど、またはそれらの組合せ）に当初由来するウイルスを指し、その子孫を含み、この子孫は、天然の、偶発的なまたは計画的な変異に起因して、元の親合成ウイルスと必ずしも完全に同一（形態学において、またはゲノムＤＮＡ相補体において）でない場合がある。一部の実施形態では、合成ウイルスは、ウイルスゲノムの実質的に全てが合成ＤＮＡ（例えば、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ、操作されたＤＮＡ、ヌクレオシドアナログを含むポリヌクレオチドなど、またはそれらの組合せ）に当初由来するウイルスを指す。好ましい実施形態では、合成ウイルスは、化学的に合成されたＤＮＡに由来する。
【００４６】
本明細書の他の場所で概説したように、ウイルスゲノムのある特定の位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、変更され得る。「位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）」は、本明細書で使用する場合、ゲノム配列中の位置（ｌｏｃａｔｉｏｎ）を意味する。対応する位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、一般に、他の親配列とのアラインメントによって決定される。
【００４７】
本明細書で使用する場合、用語「残基」は、ポリペプチドに関して、直鎖ポリペプチド鎖中のアミノ酸単位を指す。これは、α−アミノ酸、即ち、ＮＨ２−ＣＨＲ−ＣＯＯＨからのポリペプチドの形成において水が除去された後の、各アミノ酸の残り、即ち、−ＮＨ−ＣＨＲ−Ｃ−である。
【００４８】
当技術分野で公知のように、「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書で相互交換可能に使用する場合、任意の長さのヌクレオチドの鎖を指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変されたヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらのアナログ、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによって鎖中に取り込まれ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、改変されたヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびそれらのアナログを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する改変は、鎖のアセンブリの前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列には、非ヌクレオチド成分が割り込み得る。ポリヌクレオチドは、重合後に、例えば、標識成分とのコンジュゲーションによって、さらに改変され得る。他の型の改変には、例えば、「キャップ」、アナログによる１つまたは複数の天然に存在するヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間改変、例えば、非荷電連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート（phosphoamidate）、カルバメートなど）によるもの、および荷電連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）によるものなど、例えばタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなど）などのペンダント部分を含むもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）によるもの、キレーター（例えば、金属、放射活性金属、ホウ素、酸化的金属など）を含むもの、アルキル化薬を含むもの、改変された連結によるもの（例えば、アルファアノマー核酸など）、ならびに未改変形態のポリヌクレオチドが含まれる。さらに、糖中に通常存在するヒドロキシル基のいずれかは、例えば、ホスホネート基、ホスフェート基によって置き換えられ得、標準的な保護基によって保護され得、またはさらなるヌクレオチドへのさらなる連結を調製するために活性化され得、あるいは固体支持体にコンジュゲートされ得る。５’および３’末端のＯＨは、リン酸化され得、またはアミン、もしくは１〜２０炭素原子の有機キャップ基部分で置換され得る。他のヒドロキシルは、標準的な保護基へと誘導体化されてもよい。ポリヌクレオチドはまた、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環式糖アナログ、アルファ−またはベータ−アノマー糖、エピマー糖、例えば、アラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログおよび脱塩基ヌクレオシドアナログ、例えばメチルリボシドを含む、当技術分野で一般に公知の類似の形態のリボースまたはデオキシリボース糖を含み得る。１つまたは複数のホスホジエステル連結は、代替的な連結基によって置き換えられ得る。これらの代替的な連結基には、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）によって置き換えられる実施形態が含まれるがこれらに限定されず、式中、各ＲまたはＲ’は、独立して���であるか、またはエーテル（−Ｏ−）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジル（araldyl）を任意選択で含む置換もしくは未置換アルキル（１〜２０Ｃ）である。ポリヌクレオチド中の全ての連結が同一である必要はない。先行する説明は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書で言及される全てのポリヌクレオチドに適用される。
【００４９】
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸の鎖を指すために、本明細書で相互交換可能に使用される。鎖は、直鎖でも分枝鎖でもよく、改変されたアミノ酸を含み得、および／または非アミノ酸によって中断され得る。これらの用語は、天然に改変された、あるいは介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは改変、例えば、標識成分とのコンジュゲーションによって改変されたアミノ酸鎖もまた包含する。アミノ酸の１つまたは複数のアナログ（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ならびに当技術分野で公知の他の改変を含むポリペプチドなどもまた、この定義内に含まれる。ポリペプチドは、単一の鎖または会合した鎖として存在できることが理解される。
【００５０】
「相同な」は、その全ての文法的形態およびつづりの変化形で、「共通の進化的起源」を有する２つのタンパク質間の関係を指し、このタンパク質には、同じ種の生物中のスーパーファミリー由来のタンパク質、ならびに異なる種の生物由来の相同なタンパク質が含まれる。かかるタンパク質（およびそれらをコードする核酸）は、パーセント同一性であれ、特定の残基またはモチーフおよび保存された位置の存在によってであれ、それらの配列類似性に反映される配列相同性を有する。「相同な」は、ウイルスにとってネイティブな核酸もまた指し得る。
【００５１】
しかし、一般的な用法および本出願では、用語「相同な」は、「高度に」などの副詞で修飾される場合、配列類似性を指し得、共通の進化的起源に関連していてもいなくてもよい。
【００５２】
「異種」は、その全ての文法的形態およびつづりの変化形で、ウイルスにとって非ネイティブなＤＮＡを指し得る。これは、ＤＮＡがそれにとって異種として記載される生物のＤＮＡとは異なる種または異なる株に由来することを意味する。非限定的な例では、ｓｃＰＶのウイルスゲノムは、異種末端ヘアピンループを含む。前記異種末端ヘアピンループは、異なるウイルス種または異なるウイルス株に由来し得る。
【００５３】
用語「配列類似性」は、その全ての文法的形態で、共通の進化的起源を共有していてもいなくてもよい核酸またはアミノ酸配列間の同一性または対応の程度を指す。
【００５４】
参照ポリペプチド（またはヌクレオチド）配列に関する「パーセント（％）配列同一性」または「〜に対して〜％同一な配列」は、配列をアラインし、最大のパーセント配列同一性を達成するために必要に応じてギャップを導入した後の、いずれの保存的置換も配列同一性の一部とはみなさない、参照ポリペプチド（ヌクレオチド）配列中のアミノ酸残基（または核酸）と同一である、候補配列中のアミノ酸残基（または核酸）の百分率として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定することを目的としたアラインメントは、例えば、公に利用可能なコンピューターソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して、当業者の技術範囲内の種々の方法で達成され得る。当業者は、比較されている配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメーターを決定できる。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「宿主細胞」は、ポリヌクレオチド挿入物の取り込みのためのベクターのレシピエントであり得るまたはレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞には、単一の宿主細胞の子孫が含まれ、この子孫は、天然の、偶発的なまたは計画的な変異に起因して、元の親細胞と必ずしも完全に同一（形態学において、またはゲノムＤＮＡ相補体において）でない場合がある。宿主細胞には、本開示の核酸でｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクトおよび／または形質転換された細胞が含まれる。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「ベクター」は、目的の１つまたは複数の遺伝子または配列を、宿主細胞に送達することが可能な、好ましくは、それらを宿主細胞において発現させることが可能な構築物を意味する。ベクターの例には、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤と関連するＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム中に封入されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、およびある特定の真核生物細胞、例えば産生細胞が含まれるがこれらに限定されない。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「単離された分子」（分子が、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはそれらの断片である場合）は、その起源または派生の供給源のおかげで、（１）そのネイティブ状態でそれに付随する１つもしくは複数の天然に関連する成分と関連しない、（２）同じ種由来の１つもしくは複数の他の分子を実質的に含まない、（３）異なる種由来の細胞によって発現される、または（４）天然に存在しない、分子である。従って、化学的に合成される、またはそれが天然に起源する細胞とは異なる細胞系において発現される分子は、その天然に関連する成分のうち１つまたは多くから「単離される」。分子はまた、当技術分野で周知の精製技術を使用する単離によって、天然に関連する成分のうち１つまたは多くを実質的に含まないようにされ得る。分子の純度または均一性は、当技術分野で周知のいくつかの手段によってアッセイされ得る。例えば、ポリペプチド試料の純度は、当技術分野で周知の技術を使用する、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびポリペプチドを可視化するためのゲルの染色を使用してアッセイされ得る。ある特定の目的のために、より高い解像度が、ＨＰＬＣ、または精製のための当技術分野で周知の他の手段を使用することによって提供され得る。
【００５８】
本明細書で使用する場合、用語「単離された」は、ウイルスに関して、単一の親ウイルスに由来するウイルスを指す。ウイルスは、プラーク精製および限界希釈に基づく方法が含まれるがこれらに限定されない、当業者に公知の慣用的な方法を使用して単離され得る。
【００５９】
本明細書で使用する場合、語句「感染多重度」または「ＭＯＩ」は、感染細胞当たりのウイルスの平均数である。ＭＯＩは、添加されたウイルスの数（添加したｍｌ×プラーク形成単位（ＰＦＵ））を、添加した細胞の数（添加したｍｌ×細胞／ｍｌ）によって除算することによって決定される。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「精製する」およびその文法上の変化形は、完全にであれ部分的にであれ、それによって組成物中のポリペプチドの純度のレベルを改善する（即ち、組成物中の不純物の量（ｐｐｍ）を減少させることによって）、ポリペプチドおよび１つまたは複数の不純物を含む混合物からの、少なくとも１つの不純物の除去を指す。本明細書で使用する場合、「精製された」は、ウイルスに関して、そのウイルスが由来する細胞または組織供給源由来の細胞性材料および培養培地を実質的に含まないウイルスを指す。言語「細胞性材料を実質的に含まない」は、ウイルスが、それが単離されるまたは組換え産生される細胞の細胞性成分から分離されている、ウイルスの調製物を含む。従って、細胞性材料を実質的に含まないウイルスは、約３０％、２０％、１０％または５％未満（乾燥重量）の細胞性タンパク質（本明細書で「混入タンパク質」とも呼ばれる）を有するタンパク質の調製物を含む。ウイルスはまた、培養培地を実質的に含まない、即ち、培養培地は、ウイルス調製物の体積の約２０％、１０％または５％未満を占める。ウイルスは、クロマトグラフィーおよび遠心分離が含まれるがこれらに限定されない、当業者に公知の慣用的な方法を使用して精製され得る。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「実質的に純粋」とは、少なくとも５０％純粋（即ち、混入物を含まない）、より好ましくは、少なくとも９０％純粋、より好ましくは、少なくとも９５％純粋、なおより好ましくは、少なくとも９８％純粋、最も好ましくは、少なくとも９９％純粋である材料を指す。
【００６２】
用語「患者」、「対象」または「個体」は、本明細書で相互交換可能に使用され、ヒトまたは非ヒト動物のいずれかを指す。これらの用語は、哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、家畜動物（ウシ、ブタ、ラクダなどを含む）、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコなど）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）を含む。
【００６３】
本明細書で使用する場合、用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」および「予防」は、治療（例えば、予防剤または治療剤）の投与の結果としての、対象における、疾患（例えば、ポックスウイルス感染）の再発もしくは発症の遅延、または疾患の１つもしくは複数の症状における低減を指す。例えば、感染について、対象への治療の投与に関して、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」および「予防」は、治療（例えば、予防剤または治療剤）の投与、または治療の組合せ（例えば、予防剤または治療剤の組合せ）の投与から生じる、対象における、感染（例えば、ポックスウイルス感染またはそれと関連する状態）の発達もしくは発症における阻害もしくは低減、または感染（例えば、ポックスウイルス感染またはそれと関連する状態）の１つもしくは複数の症状の再発、発症もしくは発達の予防を指す。
【００６４】
本明細書で使用する場合、用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置」は、状態または患者を処置することを指し、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのステップをとることを指す。感染（例えば、ポックスウイルス感染または痘瘡ウイルス感染）に関して、処置は、感染性因子（例えば、ポックスウイルスまたは痘瘡ウイルス）の複製の根絶もしくは制御、感染性因子の数における低減（例えば、ウイルスの力価における低減）、感染（例えば、ポックスウイルス／痘瘡感染またはそれと関連する状態もしくは症状）の進行、重症度および／もしくは持続時間の低減もしくは寛解、または１つもしくは複数の治療の投与（１つもしくは複数の予防剤もしくは治療剤の投与が含まれるがこれに限定されない）から生じる１つもしくは複数の症状の寛解を指す。がんに関して、処置は、本開示の１つまたは複数の治療剤の投与から生じる、原発性、限局性または転移性がん組織の根絶、除去、改変または制御を指す。ある特定の実施形態では、かかる用語は、かかる疾患を有する対象への本発明の１つまたは複数の治療剤の投与から生じる、がんの広がりの最小化または遅延を指す。他の実施形態では、かかる用語は、疾患を引き起こす細胞の排除を指す。
【００６５】
対象に物質、化合物もしくは薬剤を「投与する」または対象への物質、化合物もしくは薬剤「の投与」は、当業者に公知の種々の方法の１つを使用して実施され得る。例えば、化合物または薬剤は、舌下もしくは鼻腔内で、肺中への吸入によって、または直腸で投与され得る。投与することはまた、例えば、１回、複数回、および／または１つもしくは複数の延長された期間にわたって、実施され得る。一部の態様では、投与は、自己投与を含む直接的投与、および薬物を処方する行動を含む間接的投与の両方を含む。例えば、本明細書で使用する場合、薬物を自己投与するようにもしくは他者に薬物を投与してもらうように患者に指導する医師、および／または薬物の処方箋を患者に提供する医師は、患者に薬物を投与している。
【００６６】
本明細書に記載される各実施形態は、個々に、または本明細書に記載される任意の他の実施形態と組み合わせて使用され得る。
概要
【００６７】
ポックスウイルスは、感染細胞の原形質中で複製する大きい（約２００ｋｂｐ）ＤＮＡウイルスである。Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ（ＯＰＶ）属は、異なる宿主に感染する能力が大きく異なる、いくつかのポックスウイルスを含む。例えば、ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）は、広い群の宿主に感染できるが、天然痘の原因因子である痘瘡ウイルス（ＶＡＲＶ）は、ヒトにのみ感染する。全てではないが多くのポックスウイルスに共通する特色は、宿主内で非遺伝的に「再活性化する」能力である。非遺伝的再活性化は、１つのポックスウイルスが感染した細胞が、それ自体では非感染性である第２の「死」ウイルス（例えば、熱によって不活性化されたもの）の回復を促進できるプロセスを指す。
【００６８】
ウイルスのライフサイクルは、ビリオン中にパッケージングされるウイルスにコードされたＲＮＡポリメラーゼを介した初期遺伝子の転写を必要とするので、精製されたポックスウイルスＤＮＡは、感染性ではない。しかし、この欠陥は、ヘルパーポックスウイルスが先に感染した細胞中にウイルスＤＮＡがトランスフェクトされる場合には克服され得、トランスフェクトされたゲノムをｉｎ  ｔｒａｎｓに転写、複製およびパッケージングするために必要な因子を提供する（Sam  CK、Dumbell  KR.  Expression  of  poxvirus  DNA  in  coinfected  cells  and  marker  rescue  of  thermosensitive  mutants  by  subgenomic  fragments  of  DNA.  Ann  Virol  (Inst  Past).  １９８１年；１３２巻：１３５〜５０頁）。これは、混合ウイルス子孫を産生するが、この問題は、両方のウイルスの繁殖を支持する細胞株において再活性化反応を実施し、次いで、ウイルスの混合物を、ヘルパーウイルスの増殖を支持しない細胞上にプレーティングすることによって、ヘルパーウイルスを排除することによって克服できる（Scheiflinger  F、Dorner  F、Falkner  FG.  Construction  of  chimeric  vaccinia  viruses  by  molecular  cloning  and  packaging.  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America.  １９９２年；８９巻（２１号）：９９７７〜８１頁）。
【００６９】
以前に、ＹａｏおよびＥｖａｎｓは、Ｌｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓであるショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）によって高頻度組換えおよび複製反応が触媒される方法が、ウイルスＤＮＡの複数の重複する断片を使用して組換えワクシニア株を迅速にアセンブルするために、ＳＦＶ触媒される再活性化反応とカップリングされ得ることを記載した（Yao  XD,  Evans  DH.  High-frequency  genetic  recombination  and  reactivation  of  orthopoxviruses  from  DNA  fragments  transfected  into  leporipoxvirus-infected  cells.  Journal  of  Virology.  2003;77(13):7281-90）。
本開示の幹細胞
【００７０】
本発明の一態様は、がんおよび感染性疾患の処置のために使用され得る、合成キメラポックスウイルス（ｓｃＰＶ）を含む幹細胞を提供する。幹細胞内に含まれる機能的合成キメラポックスウイルス（ｓｃＰＶ）は、化学的に合成されたＤＮＡから当初複製およびアセンブルされる。ｓｃＰＶは、そのゲノムが大部分配列決定されたもしくは配列決定され得る、またはそれについての天然の単離体が入手可能な、任意のポックスウイルスであり得る。本発明の方法の種々の実施形態に従って産生され得るウイルスは、そのゲノムが大部分配列決定された、またはそれについての天然の単離体が入手可能な、任意のポックスウイルスであり得る。一部の態様では、本発明のｓｃＰＶは、天然に存在する株、バリアントもしくは変異体、変異誘発されたウイルスまたは遺伝的に操作されたウイルスのゲノム配列に基づき得る。一部の態様では、本発明のｓｃＰＶのウイルスゲノムは、前記ウイルスの野生型ゲノムまたは基本的ゲノム配列と比較して、１つまたは複数の改変を含む。改変は、例えば、１つもしくは複数の欠失、挿入、置換、またはそれらの組合せを含み得る。改変は、当技術分野で一般に公知のいくつもの方法で導入され得ることが理解される。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「幹細胞」は、複数の異なる型の細胞（例えば、高分化した細胞）へと分化する能力を有する任意の全能性、多能性または多分化能性細胞である。用語「幹細胞」は、本明細書で使用する場合、特定の状況下では、より特殊化したまたは分化した表現型へと分化する能力または潜在力を有し、ある特定の状況下では、実質的に分化することなしに増殖する能力を保持する、前駆体のサブセットを指す。一実施形態では、幹細胞という用語は、その子孫（descendant）（子孫（progeny））が、分化によって、例えば、胚細胞および組織の進行性の多様化において生じるような、個々の特徴を完全に獲得することによって、しばしば異なる方向で特殊化する、天然に存在する母細胞を一般に指す。細胞分化は、典型的には多くの細胞分裂を介して生じる、複雑なプロセスである。分化した細胞は、それ自体が多分化能性細胞に由来する多分化能性細胞に由来し得る、など。これらの多分化能性細胞の各々は、幹細胞とみなされ得るが、細胞型の各々の範囲は、大幅に変動し得る。一部の分化した細胞は、より高い発生潜在力の細胞を生じる能力もまた有する。かかる能力は、天然であり得る、または種々の因子による処理によって人工的に誘導され得る。多くの生物学的な例では、幹細胞は、１つよりも多くの別個の細胞型の子孫を生じ得るので、「多分化能性」でもあるが、これは、「幹細胞性」のためには要求されない。自己再生は、幹細胞の定義の他の古典的な一部であり、これは、本発明において使用される場合、本質的である。理論上、自己再生は、２つの主要な機構のいずれかによって生じ得る。幹細胞は、非対称に分裂し得、一方の娘は、幹状態を保持し、他方の娘は、一部の別個の他の特定の機能および表現型を発現する。あるいは、集団中の幹細胞の一部は、２つの幹へと対称的に分裂し得、そうして一部の幹細胞を全体として集団中に維持するが、集団中の他の細胞は、分化した子孫のみを生じる。公式には、幹細胞として始まる細胞は、分化した表現型に向かって進行するが、次いで、幹細胞表現型を「逆転」および再発現することが可能であり、この用語は、「脱分化」または「リプログラミング」または「逆分化（retrodifferentiation）」としばしば呼ばれる。
【００７２】
任意の幹細胞型が、本発明の種々の態様において使用され得る。幹細胞には、胚性幹細胞（ＥＳ）細胞、出生後幹細胞（例えば、臍帯および胎盤由来）、胎性幹細胞および成体幹細胞（即ち、体細胞性幹細胞）を含む任意の型の幹細胞が含まれる。他の型、例えば、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、ＥＳ特徴を発現するように成体細胞をリプログラミングすることによって、実験室で産生される。一実施形態では、成体幹細胞は、間葉系幹細胞である。一実施形態では、成体幹細胞は、組織または臓器特異的幹細胞、例えば、神経幹細胞、血管幹細胞または表皮幹細胞である。好ましい実施形態では、成体幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。
【００７３】
間葉系幹細胞は、種々の供給源、例えば、骨髄、臍帯血および脂肪組織（脂肪組織由来幹細胞）から得られ得る。幹細胞の一般的な供給源は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）および初代ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＣＭＥＣ）である。類似の非ヒト幹細胞もまた、同様の非ヒト供給源から得られ得る。本発明の一態様における使用のための幹細胞は、初代細胞、または延長された期間にわたって細胞培養物中で維持された細胞であり得る。幹細胞は、ヒトを含む任意の動物型から得られ得る。好ましい実施形態では、幹細胞は、ヒト細胞である。
【００７４】
本明細書で使用する場合、「胚性幹細胞」は、典型的には６週齢またはそれ未満である胚から得られた幹細胞である。全能性ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は一般に、５〜７日齢である胚から得られ得る。多能性ヒト始原生殖細胞（ｈＥＧ）は、典型的には、６週齢またはそれ未満である胚から得られ得る。本明細書で使用する場合、「胎性幹細胞」は、典型的には６週齢よりも大きい胎仔から出生前に得られる任意の幹細胞を指す。本明細書で使用する場合、「成体幹細胞」は、出生後対象から得られる任意の幹細胞を指す。典型的には、対象は、完全に成長した成体である。例示的な成体幹細胞には、臓器、例えば、脂肪、筋肉または骨髄から収集された細胞が含まれるがこれらに限定されない。
【００７５】
一実施形態では、幹細胞は、自家である、即ち、細胞は、対象自身の幹細胞から得られるまたはかかる幹細胞に由来する。一実施形態では、本発明の幹細胞は、細胞増殖障害（腫瘍またはがん）に対する治療的処置を必要とする対象から得られるまたはかかる対象に由来する。対象は、細胞増殖障害を既に有し得る、またはこの障害のリスクがあり得る。
【００７６】
別の実施形態では、幹細胞は、同種異系間である、即ち、細胞は、そのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が対象のものと許容されるマッチであるドナーから得られるまたはかかるドナーに由来する。
【００７７】
一態様では、本発明は、合成キメラポックスウイルス（ｓｃＰＶ）を含む単離された幹細胞またはその集団であって、ウイルスが、合成ＤＮＡに由来するＤＮＡから複製および再活性化され、前記ウイルスのウイルスゲノムが、１つまたは複数の改変を特徴とするという点で前記ウイルスの野生型ゲノムとは異なる、単離された幹細胞またはその集団に関する。
【００７８】
別の態様では、本発明は、合成キメラオルソポックスウイルスを含む単離された幹細胞またはその集団であって、ウイルスが、合成ＤＮＡに由来するＤＮＡから複製および再活性化され、前記ウイルスのウイルスゲノムが、１つまたは複数の改変を特徴とするという点で前記ウイルスの野生型ゲノムとは異なる、単離された幹細胞またはその集団に関する。
【００７９】
別の態様では、本発明は、合成キメラワクシニアウイルスを含む単離された幹細胞またはその集団であって、ウイルスが、合成ＤＮＡに由来するＤＮＡから複製および再活性化され、前記ウイルスのウイルスゲノムが、１つまたは複数の改変を特徴とするという点で前記ウイルスの野生型ゲノムとは異なる、単離された幹細胞またはその集団に関する。
【００８０】
一態様では、本発明は、合成キメラ馬痘ウイルスを含む単離された幹細胞またはその集団であって、ウイルスが、合成ＤＮＡに由来するＤＮＡから複製および再活性化され、前記ウイルスのウイルスゲノムが、１つまたは複数の改変を特徴とするという点で前記ウイルスの野生型ゲノムとは異なる、単離された幹細胞またはその集団に関する。
【００８１】
一実施形態では、本発明の幹細胞は、非がん幹細胞である。
本開示の合成キメラポックスウイルス
【００８２】
化学的ゲノム合成は、天然の鋳型が、従来の分子生物学の方法による遺伝的改変、増幅または複製に利用可能でない場合に、特に有用である。例えば、馬痘ウイルス（ＨＰＸＶ）の天然の単離体は、鋳型ＤＮＡを得るために容易に利用可能ではないが、ＨＰＸＶ（株ＭＮＲ−７６）のゲノム配列は記載されている。しかし、ＨＰＸＶゲノム配列は不完全である。末端ヘアピンループの配列は、決定されなかった。従って、機能的合成キメラＨＰＸＶ（ｓｃＨＰＸＶ）は、ＨＰＸＶ末端ヘアピンループ配列の代わりに、ＶＡＣＶテロメアに基づく末端ヘアピンループを使用することによって生成され得る。同様に、野生型ＶＡＣＶ（株ＮＹＣＢＨ、クローンＡＣＡＭ２０００）のゲノム配列は、完全ではないが、記載され公開されている。末端ヘアピンループの配列は決定されず、４つの５４ｂｐリピート配列のみが同定された。従って、機能的合成キメラＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００は、ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００末端ヘアピンループ配列の代わりに、異なる株のＶＡＣＶ（例えば、ＷＲ株）に基づく末端ヘアピンループを使用することによって生成され得る。他の実施形態では、末端ヘアピンループは、ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００末端ヘアピンループ配列に基づく。
【００８３】
一部の実施形態では、ポックスウイルスは、Ｃｈｏｒｄｏｐｏｘｖｉｒｉｎａｅ亜科に属する。一部の実施形態では、ポックスウイルスは、Ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｃａｐｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｃｅｒｖｉｄｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｃｒｏｃｏｄｙｌｉｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｌｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｍｏｌｌｕｓｃｉｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ、ＳｕｉｐｏｘｖｉｒｕｓまたはＹａｔａｐｏｘｖｉｒｕｓから選択されるＣｈｏｒｄｏｐｏｘｖｉｒｉｎａｅ亜科の属に属する。一部の実施形態では、ポックスウイルスは、Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓは、ラクダ痘ウイルス（ＣＭＬＶ）、牛痘ウイルス（ＣＰＸＶ）、奇肢症ウイルス（ＥＣＴＶ、「マウス痘因子」）、ＨＰＸＶ、サル痘ウイルス（ＭＰＸＶ）、ウサギ痘ウイルス（ＲＰＸＶ）、アライグマ痘ウイルス、スカンク痘ウイルス、アレチネズミ痘ウイルス、ウアシンギシュー病ウイルス、ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）、痘瘡ウイルス（ＶＡＲＶ）およびハタネズミ痘ウイルス（ＶＰＶ）から選択される。好ましい実施形態では、ポックスウイルスは、ＨＰＸＶである。別の好ましい実施形態では、ポックスウイルスは、ＶＡＣＶである。一部の実施形態では、ポックスウイルスは、Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓは、オルフウイルス（ＯＲＦＶ）、偽牛痘ウイルス（ＰＣＰＶ）、牛丘疹性口炎（bovine  popular  stomatitis）ウイルス（ＢＰＳＶ）、リスパラポックスウイルス（ＳＰＰＶ）、アカシカパラポックスウイルス、Ａｕｓｄｙｋウイルス、シャモア伝染性膿瘡（Chamois  contagious  ecythema)ウイルス、トナカイパラポックスウイルスまたはアザラシ痘ウイルス（sealpox  virus）から選択される。一部の実施形態では、ポックスウイルスは、Ｍｏｌｌｕｓｃｉｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、Ｍｏｌｌｕｓｃｉｐｏｘｖｉｒｕｓは、伝染性軟属腫（molluscum  contagiousum）ウイルス（ＭＣＶ）である。一部の実施形態では、ポックスウイルスは、Ｙａｔａｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、Ｙａｔａｐｏｘｖｉｒｕｓは、タナポックスウイルス（Tanapox  virus）またはヤバサル腫瘍ウイルス（ＹＭＴＶ）から選択される。一部の実施形態では、ポックスウイルスは、Ｃａｐｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、Ｃａｐｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓは、羊痘（sheepox）、山羊痘またはランピースキン病ウイルスから選択される。一部の実施形態では、ポックスウイルスは、Ｓｕｉｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、Ｓｕｉｐｏｘｖｉｒｕｓは、ブタポックスウイルスである。一部の実施形態では、ポックスウイルスは、Ｌｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、Ｌｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓは、粘液腫ウイルス、ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）、リス線維腫ウイルスまたは野兎線維腫ウイルスから選択される。新たなポックスウイルス（例えば、オルソポックスウイルス）が、なおも絶えず発見されている。本発明の種々の態様のｓｃＰＶは、かかる新たに発見されたポックスウイルスに基づき得ることが理解される。
【００８４】
一部の態様では、ｓｃＰＶは、そのゲノムが公開されたゲノム配列（例えば、株ＣＭＳ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ００９０８９．１））に基づくＣＭＬＶである。一部の態様では、ｓｃＰＶは、そのゲノムが公開されたゲノム配列（例えば、株Ｂｒｉｇｈｔｏｎ  Ｒｅｄ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ４８２７５８）、株ＧＲＩ−９０（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ９４３５５））に基づくＣＰＸＶである。一部の態様では、ｓｃＰＶは、そのゲノムが公開されたゲノム配列（例えば、株Ｍｏｓｃｏｗ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００４１０５））に基づくＥＣＴＶである。一部の態様では、ｓｃＰＶは、そのゲノムが公開されたゲノム配列（例えば、株Ｚａｉｒｅ−９６−１−１６（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ３８０１３８））に基づくＭＰＸＶである。一部の態様では、ｓｃＰＶは、そのゲノムが公開されたゲノム配列（例えば、株Ｕｔｒｅｃｈｔ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ４８４６６９））に基づくＲＰＸＶである。一部の態様では、ｓｃＰＶは、そのゲノムが公開されたゲノム配列（例えば、株Ｄａｈｏｍｅｙ  １９６８（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００８２９１））に基づくアレチネズミ痘ウイルスである。
【００８５】
化学的ウイルスゲノム合成は、得られたゲノムに、またはその特定の一部に、多数の有用な改変を導入する可能性も切り開く。改変は、ウイルスを生成するためのクローニングの容易さを改善し得、組換え遺伝子産物の導入のための部位を提供し得、再活性化されたウイルスクローンの同定の容易さを改善し得、および／または大量の他の有用な特色（例えば、所望の抗原を導入する、腫瘍溶解性ウイルスを産生するなど）を付与し得る。一部の実施形態では、改変は、１つまたは複数のビルレンス因子の弱毒化または欠失を含み得る。一部の実施形態では、改変は、１つまたは複数のビルレンス調節遺伝子、または遺伝子がコードする調節因子の付加または挿入を含み得る。
【００８６】
一態様では、本発明は、合成キメラ馬痘ウイルス（ｓｃＨＰＸＶ）を産生するためのポリヌクレオチドを提供する。具体的な実施形態では、ｓｃＨＰＸＶゲノムは、ＨＰＸＶ株ＭＮＲ−７６について記載されたゲノム配列（配列番号４９）に基づき得る（Tulman  ER,  Delhon  G,  Afonso  CL,  Lu  Z,  Zsak  L,  Sandybaev  NT,  et  al.  Genome  of  horsepox  virus.  Journal  of  Virology.  2006;80(18):9244-58）。このゲノム配列は、不完全であり、末端ヘアピンループの配列を含まないようである。ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）由来の末端ヘアピンループは、本発明の方法を使用して機能的ｓｃＨＰＸＶ粒子を産生するために、ＨＰＸＶゲノムの終端にライゲートされ得ることが、本明細書で示される。ＨＰＸＶゲノムは、本開示の実施例に記載され、表１に示されるように、１０個の重複する断片へと分割され得る。一部の実施形態では、ゲノムは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の重複する断片へと分割され得る。一部の実施形態では、ゲノム全体が、１つの断片として提供され得る。例示的な重複する断片のゲノム位置および断片サイズは、表１に示される。表２は、基礎的配列と比較してこれらの断片においてなされ得る改変の一部を示す。本発明の一態様のポリヌクレオチドは、配列番号１〜１０に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、これらの配列のバリアントを含み、かかるバリアントは、ミスセンス変異、ナンセンス変異、重複、欠失および／または付加を含み得る。配列番号１１および配列番号１２は、ＶＡＣＶ（ＷＲ株）末端ヘアピンループのヌクレオチド配列を示す。一部の実施形態では、末端ヘアピンループは、配列番号１１または配列番号１２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列を含む。
【００８７】
別の態様では、本発明は、合成キメラワクシニアウイルス（ｓｃＶＡＣＶ）を産生するためのポリヌクレオチドを提供する。具体的な実施形態では、ｓｃＶＡＣＶゲノムは、ＶＡＣＶ株ＮＹＣＢＨクローンＡＣＡＭ２０００について記載された公開されたゲノム配列に基づき得る（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ３１３８４７；Osborne  JD  et  al.  Vaccine.  2007;  25(52):8807-32）。このゲノム配列は、不完全であり、末端ヘアピンループの配列を含まないようであり、４つの５４ｂｐリピート配列のみが同定された。ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）株ＷＲ由来の末端ヘアピンループは、本開示の方法を使用して機能的ｓｃＶＡＣＶ粒子を産生するために、ＶＡＣＶゲノム株ＮＹＣＢＨクローンＡＣＡＭ２０００の終端にライゲートされ得ることが、本出願において示される。一部の実施形態では、ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）株ＡＣＡＭ２０００由来の末端ヘアピンループは、本開示の方法を使用して機能的ｓｃＶＡＣＶ粒子を産生するために、ＶＡＣＶゲノム株ＮＹＣＢＨクローンＡＣＡＭ２０００の終端にライゲートされ得る。ｓｃＶＡＣＶゲノムは、本開示の実施例に記載され、表４に示されるように、９個の重複する断片へと分割され得る。一部の実施形態では、ＶＡＣＶゲノムは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の重複する断片へと分割され得る。一部の実施形態では、ゲノム全体が、１つの断片として提供され得る。断片サイズは、表４に示される。本発明の一態様のポリヌクレオチドは、配列番号５４〜６２に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、これらの配列のバリアントを含み、かかるバリアントは、ミスセンス変異、ナンセンス変異、重複、欠失および／または付加を含み得る。配列番号１１および配列番号１２は、ＶＡＣＶ（ＷＲ株）末端ヘアピンループのヌクレオチド配列を示す。配列番号１１７および配列番号１１８は、ＶＡＣＶ（ＡＣＡＭ２０００株）末端ヘアピンループのヌクレオチド配列を示す。一部の実施形態では、末端ヘアピンループは、配列番号１１または配列番号１２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、末端ヘアピンループは、配列番号１１７または配列番号１１８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列を含む。
【００８８】
これまで、ポックスウイルスの末端ヘアピンは、クローニングおよび配列決定することが困難であり、従って、公開されたゲノム配列（例えば、ＶＡＣＶ、ＡＣＡＭ  ２０００およびＨＰＸＶ  ＭＮＲ−７６）の一部が不完全であることは意外ではない。ＨＰＸＶゲノムの公開された配列もまた、おそらくは末端終端から約６０ｂｐを欠いて、不完全である。従って、ＨＰＸＶヘアピンは、正確に複製できない。例示的な実施形態では、１２９ｎｔのｓｓＤＮＡ断片を、ＶＡＣＶ末端ヘアピンの公開された配列をガイドとして使用して化学的に合成し、ＨＰＸＶゲノムの左および右終端を含むｄｓＤＮＡ断片にライゲートさせた。同様に、野生型ＶＡＣＶ、株ＮＹＣＢＨ、クローンＡＣＡＭ２０００のゲノム配列は、完全ではないが、記載され公開されている。末端ヘアピンループの配列は決定されず、４つの５４ｂｐリピート配列のみが同定された。野生型ＶＡＣＶ株ＮＹＣＢＨ、クローンＡＣＡＭ２０００ゲノムの公開された配列は不完全であるので、ヘアピンは、正確に複製できない。例示的な実施形態では、ｓｓＤＮＡ断片を、野生型ＶＡＣＶ  ＷＲ株末端ヘアピンループの公開された配列をガイドとして使用して化学的に合成し、ＶＡＣＶ株ＮＹＣＢＨの左および右終端を含むｄｓＤＮＡ断片にライゲートさせた。
【００８９】
別の実施形態では、本開示のｓｃＰＶのウイルスゲノムは、同種または異種末端ヘアピンループ、およびヘアピンループの下流に位置するタンデムリピート領域（７０ｂｐ、１２５ｂｐおよび５４ｂｐのタンデムリピート）を含み、タンデムリピート領域は、野生型ＶＡＣＶ（即ち、天然に存在するウイルス）とは異なる数のリピートを含む。ＶＡＣＶウイルス、株ＷＲ中で見出される７０ｂｐ、１２５ｂｐおよび５４ｂｐのタンデムリピートのリピートの数は、それぞれ、２２、２および８であった。別の実施形態では、タンデムリピート領域の数は、異なるポックスウイルス、異なるワクシニアウイルスまたは異なるワクシニアウイルス株において変動する。用語「同種末端ヘアピンループ」は、前記末端ヘアピンループが、同じウイルス種／同じ株に由来していることを意味するが、用語「異種末端ヘアピンループ」は、前記末端ヘアピンループが、異なるウイルス種／異なる株に由来していることを意味する。
【００９０】
一部の実施形態では、本発明のｓｃＰＶの末端ヘアピンは、ＶＡＣＶに由来する。一部の実施形態では、末端ヘアピンは、ＣＭＬＶ、ＣＰＸＶ、ＥＣＴＶ、ＨＰＸＶ、ＭＰＸＶ、ＲＰＸＶ、アライグマ痘ウイルス、スカンク痘ウイルス、アレチネズミ痘ウイルス、ウアシンギシュー病ウイルスまたはＶＰＶに由来する。一部の実施形態では、末端ヘアピンループは、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ、Ｃｌｏｎｅ  ３、Ｔｉａｎ  Ｔｉａｎ、Ｔｉａｎ  ＴｉａｎクローンＴＰ５、Ｔｉａｎ  ＴｉａｎクローンＴＰ３、ＮＹＣＢＨ、ＮＹＣＢＨクローンＡｃａｍｂｉｓ  ２０００、Ｗｙｅｔｈ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｌｉｓｔｅｒ  １０７、Ｌｉｓｔｅｒ−ＬＯ、Ｌｉｓｔｅｒ  ＧＬ−ＯＮＣ１、Ｌｉｓｔｅｒ  ＧＬ−ＯＮＣ２、Ｌｉｓｔｅｒ  ＧＬ−ＯＮＣ３、Ｌｉｓｔｅｒ  ＧＬ−ＯＮＣ４、Ｌｉｓｔｅｒ  ＣＴＣ１、Ｌｉｓｔｅｒ  ＩＭＧ２（Ｔｕｒｂｏ  ＦＰ６３５）、ＩＨＤ−Ｗ、ＬＣ１６ｍ１８、Ｌｅｄｅｒｌｅ、ＴａｓｈｋｅｎｔクローンＴＫＴ３、ＴａｓｈｋｅｎｔクローンＴＫＴ４、ＵＳＳＲ、Ｅｖａｎｓ、Ｐｒａｈａ、Ｌ−ＩＶＰ、Ｖ−ＶＥＴ１またはＬＩＶＰ６．１．１、Ｉｋｅｄａ、ＥＭ−６３、Ｍａｌｂｒａｎ、Ｄｕｋｅ、３７３７、ＣＶ−１、Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｅｒｒｏ  ２、ＣＭ−０１、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１３、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１５、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ２０、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１７、ＮＹＣＢＨ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ２１、ＶＡＣＶ−ＩＯＣ、漿尿膜ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＣＶＡ）、改変ワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）およびＭＶＡ−ＢＮの群から選択される株に基づく。一実施形態では、末端ヘアピンループは、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ株（ＷＲ株）のＶＡＣＶに基づく。別の実施形態では、末端ヘアピンループは、ＡＣＡＭ２０００株に基づく。新たなＶＡＣＶ株が、なおも絶えず発見されている。本発明の種々の態様のｓｃＰＶは、かかる新たに発見されたポックスウイルスまたは新たに発見された株に基づき得ることが理解される。
【００９１】
一部の実施形態では、改変は、１つまたは複数の制限部位の欠失を含み得る。一部の実施形態では、改変は、１つまたは複数の制限部位の導入を含み得る。一部の実施形態では、ゲノムから欠失されるまたはゲノムに付加される制限部位は、例えば、ＡａｎＩ、ＡａｒＩ、ＡａｓＩ、ＡａｔＩ、ＡａｔＩＩ、ＡｂａＳＩ、ＡｂｓＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＡｃｃＩ、ＡｃｃＩＩ、ＡｃｃＩＩＩ、ＡｃｉＩ、ＡｃｌＩ、ＡｃｕＩ、ＡｆｅＩ、ＡｆｌＩＩ、ＡｆｌＩＩＩ、ＡｇｅＩ、ＡｈｄＩ、ＡｌｅＩ、ＡｌｕＩ、ＡｌｗＩ、ＡｌｗＮＩ、ＡｐａＩ、ＡｐａＬＩ、ＡｐｅＫＩ、ＡｐｏＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｅＩ、ＡｓｉＳＩ、ＡｖａＩ、ＡｖａＩＩ、ＡｖｒＩＩ、ＢａｅＧＩ、ＢａｅＩ、ＢａｍＨＩ  ＢａｎＩ、ＢａｎＩＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＣＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｃｌＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆａＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｆｕＣＩ、ＢｇｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｌｐＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｍｔＩ、ＢｐｍＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＪＩ、ＢｓａＷＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｅＹＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＨＫＡＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｌＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｏＢＩ、Ｂｓｐ１２８６Ｉ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｐＥＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＦαＩ、ＢｓｒＧＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｓＳαＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢｓｔＹＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＢｔｇＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓαＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩＭｕｔＩ、Ｃａｃ８Ｉ、ＣｌａＩ、ＣｓｐＣＩ、ＣｖｉＡＩＩ、ＣｖｉＫＩ−１、ＣｖｉＱＩ、ＤｄｅＩ、ＤｐｎＩ、ＤｐｎＩＩ、ＤｒａＩ、ＤｒｄＩ、ＥａｅＩ、ＥａｇＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ５３ｋＩ、ＥｃｏＮＩ、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＥｃｏＰ１５Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＦａｔＩ、ＦａｕＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＦｏｋＩ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＥＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｆＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩ、ＨｐｈＩ、Ｈｐｙ１６６ＩＩ、Ｈｐｙ１８８Ｉ、Ｈｐｙ１８８ＩＩＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＨｐｙＡＶ、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、ＫａｓＩ、ＫｐｎＩ、ＬｐｎＰＩ、ＭｂｏＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｆｅＩ、ＭｌｕＣＩ、ＭｌｕＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、ＭｓｃＩ、ＭｓｅＩ、ＭｓｌＩ、ＭｓｐＡ１Ｉ、ＭｓｐＩ、ＭｓｐＪＩ、ＭｗｏＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＮｃｉＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＮｈｅＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＮｌａＩＶ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｉＩ、ＮｓｐＩ、ＰａｃＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＰｃｉＩ、ＰｆｌＦＩ、ＰｆｌＭＩ、ＰｌｅＩ、ＰｌｕＴＩ、ＰｍｅＩ、ＰｍｌＩ、ＰｐｕＭＩ、ＰｓｈＡＩ、ＰｓｉＩ、ＰｓｐＧＩ、ＰｓｐＯＭＩ、ＰｓｐＸＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＲｓａＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｐＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、Ｓ���ｆＩ、ＳｃｒＦＩ、ＳｅｘＡＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｆｃＩ、ＳｆｉＩ、ＳｆｏＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｍｌＩ、ＳｎａＢＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＳｒｆＩ、ＳｓｐＩ、ＳｔｕＩ、ＳｔｙＤ４Ｉ、ＳｔｙＩ、ＳｗａＩ、ＴａｑαＩ、ＴｆｉＩ、ＴｓｅＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、ＴｓｐＭＩ、ＴｓｐＲＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、ＸｂａＩ、ＸｃｍＩ、ＸｈｏＩ、ＸｍａＩ、ＸｍｎＩまたはＺｒａＩであるがこれらに限定されない１つまたは複数の制限部位から選択され得る。任意の所望の制限部位または制限部位の組合せが、ゲノム中に挿入され得るもしくは変異され得る、および／またはゲノムから排除され得ることが理解される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡａｒＩ部位が、ウイルスゲノムから欠失される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＢｓａＩ部位が、ウイルスゲノムから欠失される。一部の実施形態では、１つまたは複数の制限部位が、ゲノムから完全に排除される（例えば、ウイルスゲノム中の全てのＡａｒＩ部位が排除され得る）。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡｖａＩ制限部位が、ウイルスゲノム中に導入される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＳｔｕＩ部位が、ウイルスゲノム中に導入される。一部の実施形態では、１つまたは複数の改変は、ｌｏｘＰまたはＦＲＴ部位が含まれるがこれらに限定されないリコンビニアリング（recombineering）標的の取り込みを含み得る。
【００９２】
一部の実施形態では、改変は、蛍光マーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度ＧＦＰ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン／青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、またはそれらのバリアントなどであるがこれらに限定されない；選択可能なマーカー、例えば、薬物耐性マーカー（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｏｎｉｇｅｒピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｃ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩ遺伝子（ｎｐｔＩ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子ＩＩ（ｎｐｔＩＩ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）、ｓｈ  ｂｌｅ遺伝子などであるがこれらに限定されない；タンパク質またはペプチドタグ、例えば、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）、ＣＢＤ（セルロース結合ドメイン）、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、ポリ（Ｈｉｓ）、ＦＬＡＧ、Ｖ５、ｃ−Ｍｙｃ、ＨＡ（ヘマグルチニン）、ＮＥ−タグ、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）、ＶＳＶ−Ｇ（水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質）、ルシフェラーゼ、プロテインＡ、プロテインＧ、ストレプトアビジン、Ｔ７、チオレドキシン、酵母ツーハイブリッドタグ、例えば、Ｂ４２、ＧＡＬ４、ＬｅｘＡまたはＶＰ１６であるがこれらに限定されない；局在化タグ、例えば、ＮＬＳ−タグ、ＳＮＡＰ−タグ、Ｍｙｒ−タグなど、の導入を含み得る。当技術分野で公知の他の選択可能なマーカーおよび／またはタグが使用され得ることが理解される。一部の実施形態では、改変は、再活性化されたウイルスクローンの選択を補助するための、再活性化されたクローンの選択を補助するための１つまたは複数の選択可能なマーカー（例えば、ＹＦＰなどの蛍光マーカー、ｇｐｔなどの薬物選択マーカーなど）を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の選択可能なマーカーは、選択ステップ後に、再活性化されたクローンから欠失される。
合成キメラポックスウイルスを産生する方法
【００９３】
本発明は、一部の態様では、ウイルスゲノムの化学的に合成された重複する二本鎖ＤＮＡ断片から、機能的合成キメラポックスウイルス（ｓｃＰＶ）を合成、再活性化および単離するためのシステムおよび方法を提供する。ウイルスゲノムの重複するＤＮＡ断片の組換えおよび機能的ｓｃＰＶの再活性化は、ヘルパーウイルスに先に感染した細胞において実施される。簡潔に述べると、ｓｃＰＶのウイルスゲノムの全てまたは実質的に全てを包含する重複するＤＮＡ断片は、化学的に合成され、ヘルパーウイルス感染細胞中にトランスフェクトされる。トランスフェクトされた細胞は、ヘルパーウイルスおよび再活性化されたｓｃＰＶを含む混合ウイルス子孫を産生するために培養される。次に、混合ウイルス子孫は、ヘルパーウイルスを排除し、合成キメラポックスウイルスを回収するために、ヘルパーウイルスの増殖を支持しないが合成キメラポックスウイルスを増殖させる宿主細胞上にプレーティングされる。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは、宿主細胞に感染しない。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは、宿主細胞に感染できるが、宿主細胞中ではあまり増殖しない。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは、ｓｃＰＶと比較して、宿主細胞においてより緩徐に増殖する。
【００９４】
一部の実施形態では、合成キメラポックスウイルスゲノムの実質的に全ては、化学的に合成されたＤＮＡに由来する。一部の実施形態では、合成キメラワクシニアウイルスゲノムの約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、９９％超、または１００％は、化学的に合成されたＤＮＡに由来する。一部の実施形態では、ポックスウイルスゲノムは、化学的に合成されたＤＮＡおよび天然に存在するＤＮＡの組合せに由来する。一部の実施形態では、ワクシニアウイルスゲノムを包含する断片の全てが、化学的に合成される。一部の実施形態では、１つまたは複数の断片が、化学的に合成され、１つまたは複数の断片が、天然に存在するＤＮＡに由来する（例えば、ＰＣＲ増幅によって、または十分確立された組換えＤＮＡ技術によって）。
【００９５】
本発明の方法の種々の実施形態において使用される重複するＤＮＡ断片の数は、ポックスウイルスゲノム、例えば、馬痘ウイルスまたはワクシニアウイルスのサイズに依存する。実務上の考慮事項、例えば、一方では断片の数が増加するにつれた、組換え効率における低減、および他方では断片の数が減少するにつれた、非常に大きいＤＮＡ断片を合成する際の困難もまた、本発明の方法において使用される重複する断片の数についての情報を与える。一部の実施形態では、合成キメラワクシニアウイルスゲノムは、単一の断片として合成され得る。一部の実施形態では、合成キメラワクシニアウイルスゲノムは、２〜１４個の重複するＤＮＡ断片からアセンブルされる。一部の実施形態では、合成キメラワクシニアウイルスゲノムは、４〜１２個の重複するＤＮＡ断片からアセンブルされる。一部の実施形態では、合成キメラワクシニアウイルスゲノムは、６〜１２個の重複するＤＮＡ断片からアセンブルされる。一部の実施形態では、合成キメラワクシニアウイルスゲノムは、８〜１１個の重複するＤＮＡ断片からアセンブルされる。一部の実施形態では、合成キメラワクシニアウイルスゲノムは、８〜１０、１０〜１２または１０〜１４個の重複するＤＮＡ断片からアセンブルされる。一部の実施形態では、合成キメラワクシニアウイルスゲノムは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の重複するＤＮＡ断片からアセンブルされる。例示的な実施形態では、合成キメラワクシニアウイルスゲノムは、９個の重複するＤＮＡ断片からアセンブルされる。一部の実施形態では、合成キメラ馬痘ウイルスゲノムは、２〜１４個の重複するＤＮＡ断片からアセンブルされる。一部の実施形態では、合成キメラ馬痘ウイルスゲノムは、４〜１２個の重複するＤＮＡ断片からアセンブルされる。一部の実施形態では、合成キメラ馬痘ウイルスゲノムは、６〜１２個の重複するＤＮＡ断片からアセンブルされる。一部の実施形態では、合成キメラ馬痘ウイルスゲノムは、８〜１１個の重複するＤＮＡ断片からアセンブルされる。一部の実施形態では、合成キメラ馬痘ウイルスゲノムは、８〜１０、１０〜１２または１０〜１４個の重複するＤＮＡ断片からアセンブルされる。一部の実施形態では、合成キメラ馬痘ウイルスゲノムは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の重複するＤＮＡ断片からアセンブルされる。本開示の例示的な実施形態では、合成ワクシニアウイルス（ｓｃＶＡＣＶ）は、９個の化学的に合成された重複する二本鎖ＤＮＡ断片から再活性化される。本開示の別の例示的な実施形態では、合成キメラ馬痘ウイルス（ｓｃＨＰＸＶ）は、１０個の化学的に合成された重複する二本鎖ＤＮＡ断片から再活性化される。一部の実施形態では、末端ヘアピンループは、別々に合成され、ワクシニアウイルスゲノムの左および右終端を含む断片にライゲートされる。一部の実施形態では、末端ヘアピンループは、天然に存在する鋳型に由来し得る。一部の実施形態では、本開示のｓｃＰＶの末端ヘアピンは、ＶＡＣＶに由来する。一部の実施形態では、末端ヘアピンは、ＣＭＬＶ、ＣＰＸＶ、ＥＣＴＶ、ＨＰＸＶ、ＭＰＸＶ、ＲＰＸＶ、アライグマ痘ウイルス、スカンク痘ウイルス、アレチネズミ痘ウイルス、ウアシンギシュー病ウイルスまたはＶＰＶに由来する。他の実施形態では、本発明のｓｃＶＡＣＶの末端ヘアピンは、野生型ＶＡＣＶに由来する。一部の実施形態では、末端ヘアピンは、ＶＡＣＶ自身の末端ヘアピンループ配列の代わりに、異なる株の野生型ＶＡＣＶ末端ヘアピンに由来する。一部の実施形態では、末端ヘアピンは、そのゲノムが完全に配列決定された、またはそれについての天然の単離体がゲノム配列決定のために入手可能な、任意の野生型ＶＡＣＶの末端ヘアピンに基づく。好ましい実施形態では、末端ヘアピンは、ＶＡＣＶに由来する。
【００９６】
本発明の方法の種々の実施形態において使用される重複する断片のサイズは、ポックスウイルスゲノムのサイズに依存する。断片サイズには広いバリエーションが存在し得、種々の実務上の考慮事項、例えば、非常に大きいＤＮＡ断片を化学的に合成する能力が、断片サイズの選択についての情報を与えることが理解される。一部の実施形態では、断片は、約２，０００ｂｐ〜約５０，０００ｂｐのサイズ範囲である。一部の実施形態では、断片は、約３，０００ｂｐ〜約４５，０００ｂｐのサイズ範囲である。一部の実施形態では、断片は、約４，０００ｂｐ〜４０，０００ｂｐのサイズ範囲である。一部の実施形態では、断片は、約５，０００ｂｐ〜３５，０００ｂｐのサイズ範囲である。一部の実施形態では、最も大きい断片は、約１８，０００ｂｐ、２０，０００ｂｐ、２１，０００ｂｐ、２２，０００ｂｐ、２３，０００ｂｐ、２４，０００ｂｐ、２５，０００ｂｐ、２６，０００ｂｐ、２７，０００ｂｐ、２８，０００ｂｐ、２９，０００ｂｐ、３０，０００ｂｐ、３１，０００ｂｐ、３２，０００ｂｐ、３３，０００ｂｐ、３４，０００ｂｐ、３５，０００ｂｐ、３６，０００ｂｐ、３７，０００ｂｐ、３８，０００ｂｐ、３９，０００ｂｐ、４０，０００ｂｐ、４１，０００ｂｐ、４２，０００ｂｐ、４３，０００ｂｐ、４４，０００ｂｐ、４５，０００ｂｐ、４６，０００ｂｐ、４７，０００ｂｐ、４８，０００ｂｐ、４９，０００ｂｐまたは５０，０００ｂｐである。本開示の例示的な実施形態では、ｓｃＶＡＣＶは、約１０，０００ｂｐ〜約３２，０００ｂｐのサイズ範囲の、９個の化学的に合成された重複する二本鎖ＤＮＡ断片から再活性化される（表４）。本開示の例示的な実施形態では、ｓｃＨＰＸＶは、約１０，０００ｂｐ〜約３２，０００ｂｐのサイズ範囲の、９個の化学的に合成された重複する二本鎖ＤＮＡ断片から再活性化される（表１）。
【００９７】
ヘルパーウイルスは、トランスフェクトされたＤＮＡからポックスウイルスを再活性化するために必要なトランス作用性の酵素機構を提供できる任意のポックスウイルスであり得る。ヘルパーウイルスは、産生されるｓｃＰＶとは異なるまたはそれよりも狭い宿主細胞範囲を有し得る（例えば、ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）は、オルソポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）またはＨＰＸＶと比較して、非常に狭い宿主範囲を有する）。ヘルパーウイルスは、産生されるｓｃＰＶと比較して、異なるプラーク表現型を有し得る。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは、Ｌｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、Ｌｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓは、ＳＦＶ、野兎線維腫ウイルス、ウサギ線維腫ウイルス、リス線維腫ウイルスまたは粘液腫ウイルスである。好ましい実施形態では、ヘルパーウイルスは、ＳＦＶである。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは、Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓは、ラクダ痘ウイルス（ＣＭＬＶ）、牛痘ウイルス（ＣＰＸＶ）、奇肢症ウイルス（ＥＣＴＶ、「マウス痘因子」）、ＨＰＸＶ、サル痘ウイルス（ＭＰＸＶ）、ウサギ痘ウイルス（ＲＰＸＶ）、アライグマ痘ウイルス、スカンク痘ウイルス、アレチネズミ痘ウイルス、ウアシンギシュー病ウイルス、ＶＡＣＶおよびハタネズミ痘ウイルス（ＶＰＶ）である。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは、Ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｃａｐｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｃｅｒｖｉｄｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｃｒｏｃｏｄｙｌｉｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｍｏｌｌｕｓｃｉｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ、ＳｕｉｐｏｘｖｉｒｕｓまたはＹａｔａｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは、鶏痘ウイルスである。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは、Ａｌｐｈａｅｎｔｏｍｏｐｏｘｖｉｒｕｓ、ＢｅｔａｅｎｔｏｍｏｐｏｘｖｉｒｕｓまたはＧａｍｍａｅｎｔｏｍｏｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは、ソラレンで不活性化されたヘルパーウイルスである。本開示の例示的な実施形態では、ｓｃＰＶは、ＳＦＶ感染ＢＧＭＫ細胞中にトランスフェクトされた重複するＤＮＡ断片から再活性化される。次いで、ＳＦＶは、ＢＳＣ−４０細胞上に混合ウイルス子孫をプレーティングすることによって排除される。
【００９８】
当業者は、ｓｃＰＶの再活性化ならびにｓｃＰＶの選択および／または単離に使用される適切な宿主細胞が、ヘルパーウイルスおよび本発明の方法によって産生されるキメラポックスウイルスの特定の組合せに依存することが理解される。ヘルパーウイルスおよびｓｃＰＶの両方の増殖を支持する任意の宿主細胞が、再活性化ステップに使用され得、ヘルパーウイルスの増殖を支持しない任意の宿主細胞が、ヘルパーウイルスを排除するため、ならびにｓｃＰＶを選択および／または単離するために使用され得る。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスはＬｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓであり、再活性化ステップに使用される宿主細胞は、ウサギ腎臓細胞（例えば、ＬＬＣ−ＲＫ１、ＲＫ１３など）、ウサギ肺細胞（例えば、Ｒ９ａｂ）、ウサギ皮膚細胞（例えば、ＳＦ１Ｅｐ、ＤＲＳ、ＲＡＢ−９）、ウサギ角膜細胞（例えば、ＳＩＲＣ）、ウサギ癌腫細胞（例えば、Ｏｃ４Ｔ／ｃｃ）、ウサギ皮膚／癌腫細胞（例えば、ＣＴＰＳ）、サル細胞（例えば、Ｖｅｒｏ、ＢＧＭＫなど）またはハムスター細胞（例えば、ＢＨＫ−２１など）から選択され得る。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスはＳＦＶである。
【００９９】
種々の態様では、本発明のｓｃＰＶは、本明細書に記載されるｓｃＰＶの使用を可能にする力価までウイルスを増殖させる任意の基質中で繁殖され得る。一実施形態では、基質は、対応する野生型ウイルスについて決定された力価と匹敵する力価まで、ｓｃＰＶを増殖させる。一部の実施形態では、ｓｃＰＶは、ポックスウイルスによる感染に対して感受性である細胞（例えば、トリ細胞、コウモリ細胞、ウシ細胞、ラクダ細胞、カナリア細胞、ネコ細胞、シカ細胞、ウマ細胞、野禽細胞、スナネズミ細胞、ヤギ細胞、ヒト細胞、サル細胞、ブタ細胞、ウサギ細胞、アライグマ細胞、アザラシ細胞、ヒツジ細胞、スカンク細胞、ハタネズミ細胞など）において増殖され得る。かかる方法は、当業者に周知である。代表的な哺乳動物細胞には、ＢＨＫ、ＢＧＭＫ、ＢＲＬ３Ａ、ＢＳＣ−４０、ＣＥＦ、ＣＥＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＣＶＩ、ＨａＣａＴ、ＨＥＬ、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３、ヒト骨骨肉腫細胞株１４３Ｂ、ＭＤＣＫ、ＮＩＨ／３Ｔ３、Ｖｅｒｏ細胞など）が含まれるがこれらに限定されない。ウイルス単離のために、ｓｃＰＶは、典型的には周知の清澄化手順、例えば、勾配遠心分離およびカラムクロマトグラフィーなどによって細胞培養物から取り出され、細胞性成分から分離され、当業者に周知の手順、例えばプラークアッセイを使用して、必要に応じてさらに精製され得る。
本開示の医薬組成物
【０１００】
一態様では、本発明は、本発明の単離された幹細胞またはその集団および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【０１０１】
用語「薬学的に許容される」は、動物、より詳細にはヒトにおける使用のために、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されていること、または米国薬局方もしくは他の一般に認識された薬局方に列挙されていることを意味する。用語「担体」は、医薬組成物（例えば、免疫原性またはワクチン製剤）がそれを用いて投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。食塩水溶液ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、液体担体として、特に注射用溶液のために使用され得る。適切な賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。適切な医薬担体の例は、E.  W.  Martinによる「Remington's  Pharmaceutical  Sciences」に記載されている。製剤は、投与の様式に適していなければならない。
【０１０２】
一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、標準的な投与経路によって投与され得る。多くの方法が対象中に製剤を導入するために使用され得、これらには、鼻腔内、気管内、経口、真皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、結膜および皮下経路が含まれるがこれらに限定されない。
例示的な使用
本開示の幹細胞によってｓｃＰＶを送達するための方法
【０１０３】
一態様では、本発明は、対象中への合成キメラポックスウイルス（ｓｃＰＶ）の送達のための方法であって、本発明の幹細胞に合成キメラポックスウイルスを感染させるステップ、および対象中に、ｓｃＰＶに感染した幹細胞を投与するステップを含む、方法に関する。
【０１０４】
本発明の幹細胞に合成キメラポックスウイルスを感染させるための方法は、当技術分野で公知である。当業者は、適切なパラメーター、例えば、幹細胞の数および感染多重度を決定できる。
【０１０５】
一実施形態では、幹細胞は自家であり、本発明は、対象中へのｓｃＰＶの送達のための方法であって、（ａ）前記対象から幹細胞を得るステップ；（ｂ）幹細胞に腫瘍溶解性ｓｃＰＶを感染させるステップ、および（ｃ）対象に、ｓｃＰＶに感染した幹細胞を投与し戻すステップを含む、方法に関する。別の実施形態では、幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。別の実施形態では、ＭＳＣは、対象の脂肪組織に由来する。
【０１０６】
別の実施形態では、幹細胞は同種異系間であり、本発明は、対象中へのｓｃＰＶの送達のための方法であって、（ａ）対象から幹細胞を得るステップ；（ｂ）幹細胞に腫瘍溶解性ｓｃＰＶを感染させるステップ、および（ｃ）対象に、ｓｃＰＶに感染した幹細胞を投与し戻すステップを含む、方法に関する。
【０１０７】
一部の実施形態では、本発明の幹細胞は、単回の投与または複数回の投与で投与される。
【０１０８】
幹細胞は、細胞損傷もしくは機能不全の部位に局所的に、または全身的にインプラントされ得る。幹細胞組成物の例示的な投与経路には、静脈内、筋肉内、真皮内、腹腔内、冠内、心筋内、経心内膜、経心外膜（trans-epicardial））、脊髄内、動脈内、線状体内（intra-striatum）、腫瘍内、外用、経皮的、直腸または表皮下経路が含まれるがこれらに限定されない。投与のための最も適切な経路は、処置される障害または状態、例えば、細胞損傷または機能不全の位置に依存して変動する。例えば、幹細胞は、脊髄傷害の処置のために、傷害の部位において動脈内または脊髄内投与され得る。他の例では、幹細胞組成物は、心血管疾患の処置のために、冠内、心筋内、経心内膜または経心外膜経路によって投与され得る。好ましい実施形態では、投与は、静脈内である。
【０１０９】
一実施形態では、幹細胞感染に使用されるｓｃＰＶの量は、１×１０５もしくは約１×１０５プラーク形成単位（ＰＦＵ）、５×１０５もしくは約５×１０５ＰＦＵ、少なくとも１×１０６もしくは約１×１０６ＰＦＵ、５×１０６もしくは約５×１０６ＰＦＵ、１×１０７もしくは約１×１０７ＰＦＵ、５×１０７もしくは約５×１０７ＰＦＵ、１×１０８もしくは約１×１０８ＰＦＵ、５×１０８もしくは約５×１０８ＰＦＵ、１×１０９もしくは約１×１０９ＰＦＵ、５×１０９もしくは約５×１０９ＰＦＵ、１×１０１０もしくは約１×１０１０ＰＦＵまたは５×１０１０もしくは約５×１０１０ＰＦＵである。
【０１１０】
一実施形態では、幹細胞感染に使用されるｓｃＰＶの感染多重度は、約０．５ＰＦＵ／細胞、または約１ＰＦＵ／細胞、または約２ＰＦＵ／細胞、または約３ＰＦＵ／細胞、または約４ＰＦＵ／細胞、または約５ＰＦＵ／細胞、または約６ＰＦＵ／細胞、または約７ＰＦＵ／細胞、または約８ＰＦＵ／細胞、または約９ＰＦＵ／細胞または約１０ＰＦＵ／細胞である。
本開示の例示的な幹細胞によって処置されることに感受性の状態
【０１１１】
幹細胞治療に適した状態には、１つまたは複数の細胞集団が欠損している、または枯渇もしくは破壊された、任意の状態が含まれる。かかる状態には、変性障害または状態および急性または慢性傷害が含まれる。例えば、細胞または組織の損傷または機能不全の位置において、幹細胞が患者中にインプラントまたは生着されると、幹細胞は、局所的細胞外微小環境中の物理的および化学的シグナルに基づいて、所望の細胞または組織型へと分化し、それによって、破壊されたまたは欠損した細胞を、機能的な健康な細胞で置き換えることができる。例示的な状態には、がん、心血管疾患、糖尿病、脊髄傷害、神経変性疾患、外傷性脳傷害、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、筋肉損傷または筋ジストロフィー、脳卒中、熱傷、肺疾患、網膜疾患、腎臓疾患、変形性関節症および関節リウマチが含まれるがこれらに限定されない。
がんを処置する方法
【０１１２】
本明細書で使用する場合、がんを処置または予防するための方法は、疾患を特徴付ける症状、例えば、腫瘍、その転移、腫瘍の血管新生化または他のパラメーターのいずれかが、低減される、寛解される、予防される、軽快状態に置かれる、または軽快状態で維持されることを意味する。これは、がんおよび転移の適応症が、処置によって排除、低減または予防され得ることもまた意味する。適応症の非限定的な例には、基底膜および近位細胞外基質の制御されない分解、新たな機能性の毛細血管への内皮細胞の遊走、分裂および組織化、ならびにかかる機能性の毛細血管の持続が含まれる。
【０１１３】
本発明の種々の態様の合成キメラポックスウイルス（ｓｃＰＶ）は、がん細胞中で選択的に複製しそれを死滅させる腫瘍溶解剤として使用され得る。迅速に分裂している細胞、例えばがん細胞は一般に、非分裂細胞よりも、ポックスウイルス感染に対して許容的である。ポックスウイルスの多くの特色、例えば、ヒトにおける安全性、高力価ストックの産生の容易さ、ウイルス調製物の安定性、および腫瘍細胞における複製後に抗腫瘍免疫を誘導する能力は、ポックスウイルスを望ましい腫瘍溶解剤にする。本発明の方法に従って産生されたｓｃＰＶは、それらをがんの処置にとって適切なものにする１つまたは複数の改変を含み得る。従って、一態様では、本開示は、がん細胞において死を誘導する方法であって、がん細胞を、単離されたｓｃＰＶ、または本発明のｓｃＰＶもしくは本発明の幹細胞を含む医薬組成物と接触させるステップを含む方法を提供する。一態様では、本開示は、がんを処置する方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の本発明の幹細胞または本発明の医薬組成物を投与するステップを含む方法を提供する。別の態様は、がん細胞などの新生物障害細胞において死を誘導するため、またはがんなどの新生物障害を処置するための、本発明の幹細胞または本明細書に記載される医薬組成物の使用を含む。一部の実施形態では、ポックスウイルス腫瘍溶解治療は、１つまたは複数の従来のがん治療（例えば、手術、化学療法、放射線療法、温熱療法および生物学的／免疫学的治療）と組み合わせて投与される。具体的な実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、本発明の合成キメラＶＡＣＶ（ｓｃＶＡＣＶ）である。一部の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、本発明の合成キメラ粘液腫ウイルスである。一部の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、本発明の合成キメラＨＰＸＶ（ｓｃＨＰＸＶ）である。一部の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、本発明の合成キメラアライグマ痘ウイルスである。一部の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、本発明の合成キメラヤバ様疾患ウイルスである。
【０１１４】
種々の態様では、本発明のがんの処置の方法を使用して、１つまたは複数の望ましい遺伝子が容易に導入され得、１つまたは複数の望ましくない遺伝子が、合成キメラポックスウイルスゲノムから容易に欠失され得る。一部の実施形態では、腫瘍溶解剤としての使用のための本発明のｓｃＰＶは、それらの免疫反応性、抗腫瘍標的化および／もしくは効力、細胞から細胞への広がりならびに／またはがん特異性を増強する導入遺伝子を発現するように設計される。一部の実施形態では、本発明のｓｃＰＶは、免疫調節遺伝子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＴＮＦ機能を遮断するウイルス遺伝子）を発現するように設計または操作される。一部の実施形態では、本開示のｓｃＰＶは、ビルレンスを弱毒化する因子を発現する遺伝子を含むように設計される。一部の実施形態では、本発明のｓｃＰＶは、治療剤（例えば、ｈＥＰＯ、ＢＭＰ−４、特異的腫瘍抗原に対する抗体またはその部分など）を発現するように設計または操作される。一部の実施形態では、本発明のｓｃＰＶは、弱毒化のために改変されている。一部の実施形態では、本発明のｓｃＰＶは、ウイルスＴＫ遺伝子を欠如するように設計または操作される。一部の実施形態では、本発明のｓｃＶＡＣＶは、ワクシニア増殖因子遺伝子を欠如するように設計または操作される。一部の実施形態では、本発明のｓｃＶＡＣＶは、ヘマグルチニン遺伝子を欠如するように設計または操作される。
【０１１５】
本発明の種々の実施形態の幹細胞は、種々の新生物障害および／またはがんを処置するために有用である。一部の実施形態では、がんの型には、骨がん、乳がん、膀胱がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、食道がん、神経膠腫、胃がん、胃腸がん、頭頸部がん、肝がん、例えば肝細胞癌、白血病、肺がん、リンパ腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎がん、皮膚がん、例えば黒色腫、精巣がんなど、または処置され得る任意の他の腫瘍もしくはプレ新生物病変が含まれるがこれらに限定されない。
【０１１６】
別の実施形態では、方法は、本明細書に記載される単離されたもしくは組換えウイルスまたは組成物が投与された対象由来の新生物障害もしくはがん細胞中および／または試料中の、投与されたｓｃＰＶの存在を検出するステップをさらに含む。例えば、対象は、例えば感染の進行を評価するために、本明細書に記載されるｓｃＰＶまたは組成物の投与前および／または投与後に試験され得る。一部の実施形態では、本開示のｓｃＰＶは、検出カセットを含み、投与されたキメラポックスウイルスの存在を検出するステップは、検出カセットにコードされたタンパク質を検出することを含む。例えば、検出カセットが蛍光タンパク質をコードする場合、対象または試料は、蛍光を可視化するための方法を使用して画像化される。
【０１１７】
一部の実施形態では、本発明の種々の実施形態の幹細胞は、単回の投与または複数回の投与で投与される。
【０１１８】
他の実施形態では、本発明の幹細胞は、がんを処置するための方法において使用されるように、細胞損傷もしくは機能不全の部位に局所的に、または全身的にインプラントされ得る。幹細胞組成物の例示的な投与経路には、静脈内、筋肉内、真皮内、腹腔内、冠内、心筋内、経心内膜、経心外膜、脊髄内、動脈内、線状体内、腫瘍内、外用、経皮的、直腸または表皮下経路が含まれるがこれらに限定されない。投与のための最も適切な経路は、処置される障害または状態、例えば、細胞損傷または機能不全の位置に依存して変動する。例えば、幹細胞は、脊髄傷害の処置のために、傷害の部位において動脈内または脊髄内投与され得る。他の例では、幹細胞組成物は、心血管疾患の処置のために、冠内、心筋内、経心内膜または経心外膜経路によって投与され得る。好ましい実施形態では、投与は、静脈内である。
【０１１９】
がんの処置の方法における使用のためのｓｃＰＶは、治療的遺伝子産物をコードし得る。一部の例では、治療的遺伝子産物は、抗がん剤または抗血管新生剤である。一実施形態では、治療的遺伝子産物は、サイトカイン、ケモカイン、免疫調節分子、抗原、抗体もしくはその断片、アンチセンスＲＮＡ、プロドラッグ変換酵素、ｓｉＲＮＡ、血管新生阻害剤、毒素、抗腫瘍オリゴペプチド、有糸分裂阻害剤タンパク質、抗有糸分裂オリゴペプチド、抗がんポリペプチド抗生物質、トランスポータータンパク質および組織因子から選択され得る。
【０１２０】
本発明の幹細胞を含む、がんの処置の方法は、抗がん剤を投与するステップもまた含む。例示的な抗がん剤には、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、感光剤、毒素、抗がん抗生物質、化学療法化合物、放射性核種、血管新生阻害剤、シグナル伝達モジュレーター、代謝拮抗薬、抗がんワクチン、抗がんオリゴペプチド、有糸分裂阻害剤タンパク質、抗有糸分裂オリゴペプチド、抗がん抗体、抗がん抗生物質、免疫療法剤、温熱または温熱治療、細菌、放射線治療およびかかる薬剤の組合せが含まれるがこれらに限定されない。一部の例では、抗がん剤は、シスプラチン、カルボプラチン、ゲムシタビン、イリノテカン、抗ＥＧＦＲ抗体または抗ＶＥＧＦ抗体である。一部の例では、抗がん剤は、ウイルスと、同時に、順次または間欠的に投与される。
【０１２１】
対象に腫瘍溶解性ウイルスを投与するための本明細書で提供される方法では、この方法は、治療の間またはその後にウイルスの複製を弱毒化するまたは対象からウイルスを排除するために、抗ウイルス剤を投与するステップもまた含み得る。例示的な抗ウイルス剤には、シドホビル、シドホビルのアルコキシアルキルエステル、Ｇｌｅｅｖｅｃ、ガンシクロビル、アシクロビルおよびＳＴ−２６が含まれるがこれらに限定されない。
【０１２２】
がんの処置の方法の一態様では、ｓｃＰＶは、遺伝子欠失を含む。遺伝子欠失は、遺伝子のＤＮＡ配列の喪失もしくは非存在、または染色体の一部もしくはＤＮＡの配列がＤＮＡ複製の間に失われる、遺伝子における欠損もしくは欠失変異であると理解される。一実施形態では、欠失された遺伝子は、タンパク質もしくはその断片をコードする遺伝子、転写を調節する遺伝子セグメント、ウイルス複製を調節する遺伝子セグメント、細胞有糸分裂に影響を与える遺伝子セグメント、細胞代謝に影響を与える遺伝子セグメント、アンチセンスＲＮＡをコードする遺伝子セグメント、ｓｉＲＮＡをコードする遺伝子セグメント、血管新生を調節する遺伝子セグメント、１つもしくは複数のトランスポータータンパク質を調節する遺伝子セグメント、または１つもしくは複数の組織因子を調節する遺伝子セグメントから選択される。別の実施形態では、遺伝子欠失は、ウイルスの抗がんまたは抗血管新生効果を強化する。用語「効果を強化する」は、本明細書で使用する場合、抗がんまたは抗血管新生化合物が、遺伝子欠失の後により有効またはより活性であることを意味し、これは、化合物の活性が、ｓｃＰＶ上で遺伝子欠失を実施した後に増進されることを意味する。
痘瘡ウイルス感染を処置する方法
【０１２３】
本発明の種々の態様の幹細胞は、痘瘡ウイルス感染を処置するために使用され得る。感染（例えば、ポックスウイルス感染または痘瘡ウイルス感染）に関して、処置は、感染性因子（例えば、ポックスウイルスまたは痘瘡ウイルス）の複製の根絶もしくは制御、感染性因子の数における低減（例えば、ウイルスの力価における低減）、感染（例えば、ポックスウイルス／痘瘡感染またはそれと関連する状態もしくは症状）の進行、重症度および／もしくは持続時間の低減もしくは寛解、または１つもしくは複数の治療の投与（１つもしくは複数の予防剤もしくは治療剤の投与が含まれるがこれに限定されない）から生じる１つもしくは複数の症状の寛解を指す。
【０１２４】
一部の実施形態では、本発明の幹細胞は、痘瘡感染の処置のために、単回の投与または複数回の投与で投与される。
【０１２５】
幹細胞組成物の例示的な投与経路には、静脈内、筋肉内、真皮内、腹腔内、冠内、心筋内、経心内膜、経心外膜、脊髄内、動脈内、線状体内、腫瘍内、外用、経皮的、直腸または表皮下経路が含まれるがこれらに限定されない。
【実施例】
【０１２６】
（実施例１）
合成キメラＨＰＸＶ（ｓｃＨＰＸＶ）
ウイルスゲノムの重複する断片の選択および設計
ｓｃＨＰＸＶゲノムの設計は、ＨＰＸＶについて先に記載されたゲノム配列に基づいた（株ＭＮＲ−７６；図１Ａ）［ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ７９２５０４］（Tulman  ER,  Delhon  G,  Afonso  CL,  Lu  Z,  Zsak  L,  Sandybaev  NT,  et  al.  Genome  of  horsepox  virus.  Journal  of  Virology.  2006;80(18):9244-58）。２１２，６３３ｂｐのゲノムを、１０個の重複する断片へと分割した（図１Ｂ）。相同組換えが全長ゲノムのアセンブリを駆動する部位を提供するために、これらの断片が各隣接断片と少なくとも１．０ｋｂｐの重複する配列（即ち、相同性）を共有するように、それらを設計した（表１）。これらの重複する配列は、共トランスフェクトされた断片間での組換えを正確に実施するのに十分な相同性を提供する（Yao  XD,  Evans  DH.  High-frequency  genetic  recombination  and  reactivation  of  orthopoxviruses  from  DNA  fragments  transfected  into  leporipoxvirus-infected  cells.  Journal  of  Virology.  2003;77(13):7281-90）。ＨＰＸＶゲノム配列由来の末端４０ｂｐ（５’−ＴＴＴＡＴＴＡＡＡＴＴＴＴＡＣＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＧＴＧＴＣＴＡＧＡＡＡＡＡＡＡ−３’）（配列番号５０）は、合成された末端逆位配列（ＩＴＲ）断片中には含まれなかった。その代わり、ＳａｐＩ制限部位が、ＩＴＲ断片の５’末端（ＧＡ＿ＬＩＴＲ）および３’末端（ＧＡ＿ＲＩＴＲ）において付加され、ＴＧＴ配列が後に続いた。これらのＳａｐＩ制限部位を使用して、ＶＡＣＶ末端ヘアピンをＩＴＲ断片にライゲートさせた（以下に記載される）。
【０１２７】
各断片を化学的に合成し、各断片上の末端ＳｆｉＩ制限部位を使用してプラスミド中にサブクローニングした。これらの断片のサブクローニングを補助するために、ＡａｒＩおよびＢｓａＩ制限部位を、２つのＩＴＲコード断片を除く全ての断片においてサイレントに変異させた（表２）。これらの領域が、効率的なＤＮＡ複製およびコンカテマー分割にとって重要なヌクレオチド配列特異的認識部位を含んだ場合、２つのＩＴＲコード断片中のＢｓａＩ制限部位は変異させなかった。
【０１２８】
ポックスウイルス初期後期プロモーターの制御下にあるｙｆｐ／ｇｐｔカセットを、ＧＡ＿断片＿３内のＨＰＸＶ０９５／Ｊ２Ｒ遺伝子座中に導入すると、ＨＰＸＶ（ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５）の再活性化を蛍光顕微鏡下で可視化することが容易になった。ｇｐｔ遺伝子座は、薬物選択を使用して再活性化されたウイルスを選択するための有望なツールも提供した。ＨＰＸＶ０９５は、非必須ＶＡＣＶ  Ｊ２Ｒ遺伝子のＨＰＸＶホモログをコードし、ＳＦＶ感染ＢＧＭＫ細胞中に、断片＿３および他のＨＰＸＶクローンをＶＡＣＶ  ＤＮＡと共に共トランスフェクトすることによって、種々のハイブリッドウイルスを回収して、選択戦略を検証した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。サイレント変異をＨＰＸＶ０４４（ＶＡＣＶＷＲＦ４Ｌ）配列（ＧＡ＿断片＿２）中にも導入して、ＧＡ＿断片＿２内に２つの独自の制限部位を創出した（表３）。一部の実施形態では、これらの独自の制限部位は、ＨＰＸＶの再活性化の前に、組換え遺伝子産物（例えば、選択可能なマーカー、蛍光タンパク質、抗原などであるがこれらに限定されない）をＧＡ＿断片＿２中に迅速に導入するために使用され得る。
【表１】
2021522789.tif 000003
【表２】
2021522789.tif 000004
【表３】
2021522789.tif 000005
ＶＡＣＶ（株ＷＲ）由来のスロー（Ｓ）形態およびファスト（Ｆ）形態の末端ヘアピンループの合成
【０１２９】
ＶＡＣＶ（株ＷＲ）由来のスロー（Ｓ）形態およびファスト（Ｆ）形態の末端ヘアピンループを、１５７ｎｔのｓｓＤＮＡ断片として合成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；図２Ｂ）。ＤＮＡ合成を介して、３ヌクレオチドから構成される５’オーバーハングが、各ヘアピンの終端に残された（５’−ＡＣＡ；図２Ｃ）。ＨＰＸＶ配列［ＤＱ７９２５０４］由来のコンカテマー分割部位もまた、末端ヘアピンループ中に合成した（図２Ｂ）。
ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５断片の消化および精製
【０１３０】
合成ＨＰＸＶ断片を、５０℃でＳｆｉＩで一晩消化した。ｓｃＨＰＸＶ  ＩＴＲ断片を、ＳａｐＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１時間個々に消化し、６５℃で１０分間不活性化し、その後、５０℃でＳｆｉＩで一晩消化した。およそ１ＵのＦａｓｔＡＰアルカリホスファターゼを、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５  ＩＴＲ消化物に添加し、３７℃でもう１時間インキュベートした。全てのｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５断片を、ＱｉａｅｘＩＩ  ＤＮＡ  ｃｌｅａｎｕｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して引き続いて精製した。全てのｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５断片を、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ中でＱｉａｅｘＩＩ懸濁液から溶出させた。ＤＮＡ濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して推定した。
【０１３１】
ポックスウイルスは、ウイルス複製のプロセスに密接に関連する非常に高頻度の相同組換え反応を触媒する。本明細書では、化学的に合成されたＨＰＸＶ二重鎖ＤＮＡの大きい断片を、機能的ｓｃＨＰＸＶゲノムを形成するために、ウイルスにより触媒される組換えおよび複製反応を使用して接合することができることが実証された。
【０１３２】
ＨＰＸＶゲノム（株ＷＮＲ−７６）の公開された配列を使用して、２１２，６３３ｂｐのゲノムを、１０個の重複する断片へと分割した（図２）。この領域内の配列特異的部位が効率的なゲノム複製およびコンカテマー分割のために偶然にも必要とされる場合、ＩＴＲを除く全ての断片中の全てのＢｓａＩおよびＡａｒＩ部位を変異させた。上記のように、ＶＡＣＶ由来の末端ヘアピンループ構造の、ＩＴＲの終端への付加を促進するために、ＳａｐＩ認識部位を、それぞれＬＩＴＲおよびＲＩＴＲ断片の両方の左側末端終端および右側末端終端の隣に含めた（図２Ａ）。これらのＳａｐＩ部位は、隣接するベクター配列内に包埋され、ＳａｐＩ酵素は、認識配列の外側かつＨＰＸＶ  ＤＮＡ中で、この部位の下流を切断する。従って、ＤＮＡをＳａｐＩで切断すると、ＨＰＸＶ配列からコピーされたＤＮＡ内に粘着終端が残り、従って、無関係な制限部位を含まない、正確な配列コピーの（引き続くライゲーションを介した）アセンブリが可能になった。ＬＩＴＲおよびＲＩＴＲ断片の他方の終端（ゲノムマップに関して内部終端）は各々、残りのＨＰＸＶ断片の両終端と同様、ＳｆｉＩ認識部位によって境界された。これらのＤＮＡは全て、容易な繁殖のためにプラスミド形態で供給された。ＳＦＶ感染細胞中へのトランスフェクションのための内部断片を調製するために、これらのプラスミドをＳｆｉＩで消化して、各ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５断片からプラスミドを放出させた（ＬＩＴＲおよびＲＩＴＲ断片をどのようにプロセシングするかについては、以下を参照のこと）。消化後、各反応を、いずれの混入酵素をも除去するために精製したが、プラスミドは、消化物から除去されず、各ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５断片と一緒に共トランスフェクトされた。これは、反応を妨害せず、ＤＮＡ操作の量、およびこれらの大きいＤＮＡ断片の可能な断片化を最小化するために実施した。
【０１３３】
反応効率は、トランスフェクトされた断片の数によって影響され得るが、１０個よりも多いまたは少ない重複する断片が、本開示の方法において使用され得る。理論に束縛されないが、約１５個の断片が、再活性化反応のさらなる最適化なしの実務的上限を示し得る。理想的な下限は単一のゲノム断片であるが、実務上、テロメアは、より控えめなサイズの断片（例えば、約１０ｋｂ）として最も容易に操作される。
ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５左および右ＩＴＲ断片へのＶＡＣＶ  Ｆ末端およびＳ末端ヘアピンループのライゲーション
【０１３４】
およそ１マイクログラムの末端ＶＡＣＶヘアピンループの各々を、９５℃で５分間インキュベートし、その後、氷上での「即座の」冷却によってヘアピン構造を形成させた。ヘアピンループを、それらの５’終端において引き続いてリン酸化し、その後ライゲートさせた。簡潔に述べると、１μｇのＶＡＣＶ  Ｆ−ヘアピンまたはＶＡＣＶ  Ｓ−ヘアピンのいずれか、２μｌの１０×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１ｍＭ  ＡＴＰ、および１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む別々の２０μｌ反応を、３７℃で１時間インキュベートした。反応を、７５℃での熱不活性化によって終結させた。
【０１３５】
およそ１マイクログラムの左ＩＴＲまたは右ＩＴＲのいずれかを、５％ＰＥＧ−４０００および５単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼの存在下で、２０倍モル過剰の各末端ヘアピンと共に、１６℃で一晩別々にインキュベートした。各ライゲーション反応を、６５℃で１０分間熱不活性化し、その後、細胞中にトランスフェクトする準備ができるまで、氷上でインキュベートした。
【０１３６】
オルソポックスウイルスは、ゲノムの各終端において変動する長さの末端逆位配列（ＩＴＲ）を保有する直鎖ｄｓＤＮＡゲノムをコードする。二重鎖ゲノムの２つの鎖をヘアピンループによって接続して、共有結合的に連続的なポリヌクレオチド鎖を形成させる。ループは、Ａ＋Ｔリッチであり、完全に塩基対合した構造を形成できず、配列が反転した形態および相補的な形態の２つの形態で存在する（Baroudy  BM,  Venkatesan  S,  Moss  B.    Incompletely  base-paired  flip-flop  terminal  loops  link  the  two  DNA  strands  of  the  vaccinia  virus  genome  into  one  uninterrupted  polynucleotide  chain.  Cell.  1982;28(2):315-24）（図２Ｂ）。これらは、それらの電気泳動特性に基づいてスロー［Ｓ］形態およびファスト［Ｆ］形態と呼ばれ、おそらくは、直鎖ｄｓＤＮＡゲノムの終端をキャップする、部分的に二重鎖のヘアピン構造へとフォールディングする（図２Ｃ）。ＨＰＸＶゲノムの公開された配列は不完全であり、おそらくは末端終端から約６０ｂｐを欠くために、ＨＰＸＶヘアピンを正確に複製することが不可能になっている。その代わり、１５７ｎｔのｓｓＤＮＡ断片を、ＶＡＣＶテロメアの公開された配列をガイドとして使用して化学的に合成し、各ヘアピンの終端に、３ヌクレオチドから構成される５’オーバーハングを残した（５’−ＡＣＡ；図２Ｃ）（Baroudy  BM,  Venkatesan  S,  Moss  B.  Incompletely  base-paired  flip-flop  terminal  loops  link  the  two  DNA  strands  of  the  vaccinia  virus  genome  into  one  uninterrupted  polynucleotide  chain.  Cell.  1982;28(2):315-24）。このオーバーハングは、クローニングされたＬＩＴＲおよびＲＩＴＲ断片をＳａｐＩで切断することによって生成された終端に対して相補的である。
【０１３７】
ＶＡＣＶに由来する配列を、ＨＰＸＶとＶＡＣＶとの間の近い共通の祖先を示唆するデータに基づいて使用した。異なるコードポックスウイルスのヘアピン終端間で共通して保存された配列特色が存在するので、他のポックスウイルス由来の他の末端ヘアピンを使用することが可能であり得る。例えば、ヘアピン終端中の分割部位は、配列および機能性の両方が高度に保存されている（これらは後期プロモーターと似ている）。
【０１３８】
これらの一本鎖オリゴヌクレオチドを９５℃に加熱し、次いで、氷上で迅速に冷却して、不完全に塩基対合した末端ヘアピンを形成させた（図２Ｃ）。次に、各オリゴヌクレオチドをリン酸化し、ＳａｐＩおよびＳｆｉＩの両方で先に消化した左または右ＩＴＲ断片のいずれかと、２０倍モル過剰で別々にライゲートさせた。これらの酵素によるＩＴＲの消化は、各ＩＴＲの５’末端に５’−ＴＧＴオーバーハングを生じ、これは、末端ヘアピンループ構造中の５’−ＡＣＡオーバーハングに対して相補的であった。これは、各ＩＴＲのヘアピン終結したコピーを生成した。
【０１３９】
ヘアピン終結した構造が両方のＩＴＲ断片に付加されたことを確認するために、ＩＴＲ断片のＰｖｕＩＩによる制限消化を実施した。約１０ｋｂのＩＴＲの末端への約７０ｂｐの末端ヘアピンの付加をゲル電気泳動によって可視化することは不可能であったので、少量の各ライゲーションを、ＰｖｕＩＩで消化した。ＩＴＲに末端ヘアピンがライゲートされなかった場合、ＰｖｕＩＩによる消化は、１４７２ｂｐの産物を生じた（図３、レーン２および５）。しかし、末端ヘアピンループがＨＰＸＶ  ＩＴＲに首尾よく付加された場合、ＩＴＲ断片のサイズにおける増加がアガロースゲル上で見られた（図３、レーン２を３および４と比較する；レーン５を６および７と比較する）。これらのデータは、これらの条件下で、ＨＰＸＶ  ＩＴＲのほぼ全てが、断片の一方の終端において末端ヘアピンループを含んだことを示唆した。
化学的に合成されたｄｓＤＮＡ断片からのｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の再活性化
【０１４０】
ＳＦＶ株ＫａｓｚａおよびＢＳＣ−４０は、元々Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た。バッファローミドリザル腎臓（ＢＧＭＫ）細胞は、Ｇ．ＭｃＦａｄｄｅｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｌｏｒｉｄａ）から得た。ＢＳＣ−４０およびＢＧＭＫ細胞を、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、抗生物質および抗真菌薬、ならびに５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充した最小必須培地（ＭＥＭ）中で、５％ＣＯ２中で３７℃で繁殖させる。
【０１４１】
バッファローミドリザル腎臓（ＢＧＭＫ）細胞を、およそ８０％の培養密度に達するまで、ＭＥＭ含有６０ｍｍ組織培養皿中で増殖させた。細胞に、０．５のＭＯＩで、３７℃で１時間、無血清ＭＥＭ中でショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）を感染させた。接種材料を、５％ＦＣＳを含む温ＭＥＭ  ３ｍｌで置き換え、もう１時間インキュベーターに戻した。一方で、トランスフェクション反応を以下のように設定した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ複合体を、１ｍｌ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中およそ５μｇの総合成ＨＰＸＶ  ＤＮＡ断片を、３：１の比（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００の総ＤＮＡに対する比）で、１ｍｌ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中に希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００と混合することによって調製した。複合体を室温で１０分間インキュベートし、次いで、先にＳＦＶを感染させたＢＧＭＫ細胞に滴下した。感染のおよそ１６時間後、培地を、５％ＦＣＳを含む新鮮なＭＥＭで置き換えた。細胞を、３７℃でさらに４日間（合計で５日間）培養した。感染細胞を細胞培養培地中に掻き取り、３サイクルの凍結および解凍を実施することによって、ウイルス粒子を回収した。粗製抽出物を、無血清ＭＥＭ中に１０−２希釈し、４ｍｌの接種材料を、ＢＳＣ−４０細胞の９〜１６枚の１５０ｍｍ組織培養プレート上にプレーティングして、再活性化されたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５を回収した。感染の１時間後、接種材料を、５％ＦＣＳおよび０．９％Ｎｏｂｌｅ  Ａｇａｒを含むＭＥＭで置き換えた。黄色蛍光プラークを、倒立顕微鏡下で可視化し、個々のプラークを、さらなる分析のためにピックした。ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５プラークを、黄色蛍光選択を用いて３回プラーク精製した。
【０１４２】
組換えワクシニアウイルスをアセンブルするための、オルソポックスウイルスＤＮＡのＳＦＶにより触媒される組換えおよび再活性化は、先に記載されている（Yao  XD,  Evans  DH.  High-frequency  genetic  recombination  and  reactivation  of  orthopoxviruses  from  DNA  fragments  transfected  into  leporipoxvirus-infected  cells.  Journal  of  Virology.  2003;77(13):7281-90；Construction  of  recombinant  vaccinia  viruses  using  leporipoxvirus-catalyzed  recombination  and  reactivation  of  orthopoxvirus  DNA.  Methods  Mol  Biol.  2004;269:51-64）。いくつかの生物学的特色が、これを魅力的なモデル系にしている。第１に、ＳＦＶは、狭い宿主範囲を有し、ウサギ細胞およびある特定のサル細胞株、例えばＢＧＭＫに生産的に感染する。これは、ＢＳＣ−４０などの細胞に感染できるが、そこでの増殖は非常に悪い。第２に、ＳＦＶは、オルソポックスウイルスと比較してより緩徐に増殖し、細胞の単層中に形質転換された「病巣」を形成するのにおよそ４〜５日間かかり、これは、培養物中で１〜２日以内にプラークを生じるオルソポックスウイルスとは非常に異なる特徴である。レポリポックスウイルスとオルソポックスウイルスとの間の増殖におけるこの差異により、ＢＧＭＫ細胞において再活性化アッセイを実施し、ＢＳＣ−４０細胞上に子孫をプレーティングすることによって、これらのウイルスを区別することが可能になる。一部の実施形態では、他のヘルパーウイルス（例えば鶏痘ウイルスであるがこれに限定されない）が使用され得る。一部の実施形態では、異なる細胞組合せが使用され得る。
【０１４３】
ＢＧＭＫ細胞に、０．５のＭＯＩでＳＦＶを感染させ、次いで、２時間後に５μｇの消化されたＧＡ＿ＨＰＸＶ断片をトランスフェクトした。トランスフェクションの５日後、全ての感染性粒子を細胞溶解によって回収し、ＨＰＸＶ（または他のオルソポックスウイルス）の増殖のみを効率的に支持するＢＳＣ−４０細胞上に再プレーティングした。得られた再活性化されたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５プラークを、蛍光顕微鏡下で可視化した。可視化は、断片＿３内のＨＰＸＶ０９５／Ｊ２Ｒ遺伝子座中のｙｆｐ／ｇｐｔ選択可能なマーカーによって可能になった（図２Ａ）。ウイルスプラークが、トランスフェクションの４８時間以内にＢＳＣ−４０単層において検出された。ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５を回収する効率は、ＤＮＡトランスフェクション効率を含むいくつかの因子に依存したが、最大で数ＰＦＵ／μｇのトランスフェクトされたＤＮＡまでの範囲であった。
ＰＣＲおよび制限断片分析によるｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノム配列の確認
ｓｃＨＰＸＶのＰＣＲおよび制限消化分析
【０１４４】
再活性化されたプラークピック中のｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の存在を迅速に確認するために、ＰＣＲプライマーを、ｓｃＨＰＸＶ中の変異された個々のＢｓａＩ部位に隣接するように設計した（表５）。ゲノムｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５  ＤＮＡを、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５に感染したＢＳＣ−４０細胞から単離し、鋳型として使用した。ＶＡＣＶ感染ＢＳＣ−４０細胞由来のゲノムＤＮＡを、各ＰＣＲ産物内のＢｓａＩ部位の存在を確認するための対照として使用した。ＰＣＲ増幅後、反応を、３７℃で１時間、ＢｓａＩで引き続いて消化した。ＰＣＲ反応を、ＳＹＢＲ（登録商標）ｓａｆｅ染色を含む１％アガロースゲル上で分離して、ＤＮＡバンドを可視化した。
【０１４５】
制限消化とその後のパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）によるｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムのさらなる分析を、スクロース勾配精製を使用して単離されたゲノムＤＮＡに対して実施した（Yao  XD,  Evans  DH.  Construction  of  recombinant  vaccinia  viruses  using  leporipoxvirus-catalyzed  recombination  and  reactivation  of  orthopoxvirus  DNA.  Methods  Mol  Biol.  2004;269:51-64）。簡潔に述べると、１００ｎｇの精製されたウイルスゲノムＤＮＡを、３７℃で２時間、５ＵのＢｓａＩまたはＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化されたＤＮＡを、１％  Ｓｅａｋｅｍ  Ｇｏｌｄアガロースゲルキャスト上で、０．５×トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ電気泳動（ＴＢＥ）緩衝液［１１０ｍＭトリス；９０ｍＭホウ酸；２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ］中で泳動した。ＤＮＡを、１〜１０秒の切り替え時間勾配、直線的傾斜因数および１２０°角度を使用して、１４℃で９．５時間、５．７Ｖ／ｃｍでＣＨＥＦ  ＤＲ−ＩＩＩ装置（ＢｉｏＲａｄ）で分離した。このプログラムは、１ｋｂｐ〜＞２００ｋｂｐのＤＮＡ種の分離を可能にする。７５ｂｐ〜５ｋｂｐの断片を分離するために、１．５％アガロースゲルキャスト上での、１．０×ＴＢＥ中で１１５Ｖで室温で２時間泳動する電気泳動を実施した。ＤＮＡを、ＳＹＢＲ（登録商標）ｇｏｌｄ染色で可視化した。消化されたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５  ＤＮＡ断片のサイズを、対照ＶＡＣＶゲノムＤＮＡと比較した。
【表５−１】
2021522789.tif 000006
【表５−２】
2021522789.tif 000007
【０１４６】
再活性化アッセイから増殖したプラークから単離されたウイルスのゲノム配列を、ＰＣＲ、制限消化および全ゲノム配列決定によって確認した。ＰＣＲ分析は、ＩＴＲ  ＨＰＸＶ断片を除いた全ての内部の変異されたＢｓａＩ部位に基づいた。プライマーセットを、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５中の各ＢｓａＩ部位に隣接するように設計した（表５）。これらのプライマーセットは、ＶＡＣＶ  ＷＲ内の類似の領域もまた増幅することが確認された。ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５内のこれらの変異されたＢｓａＩ部位を囲むおおよそ１ｋｂの領域のＰＣＲ増幅の後、各反応をＢｓａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、ゲル電気泳動によって分析した。ＶＡＣＶ（野生型）中には変異されたＢｓａＩ部位が存在しなかったので、酵素消化は、各ＰＣＲ産物を首尾よく消化し、より小さいＤＮＡ断片を生じた。ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムＤＮＡから生成されたＰＣＲ産物は、ＢｓａＩ消化に対して抵抗性であり、これは、ＢｓａＩ認識部位が、これらのゲノムにおいて首尾よく変異されたことを示唆している。プライマーセット７Ｃのプライマー産物は、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５  ＰＰ１およびＰＰ３試料において、ＤＮＡのいずれの増幅も生じなかった。このプライマーセットが非機能的であったかどうか、または断片７のこの領域が、得られたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムへとアセンブルしなかったかどうかを確認するために、ＰＣＲを元のＧＡ＿断片＿７プラスミドＤＮＡに対して実施したが、この反応もまた、産物の増幅において不首尾であった。
【０１４７】
次に、ゲノムＤＮＡを、スクロース勾配精製されたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムから単離し、ＢｓａＩまたはＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によって分離して、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５中のＢｓａＩ部位の大部分が首尾よく変異されたことを確認した。興味深いことに、３つの異なるｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５クローン由来の未消化のゲノムＤＮＡは、ＶＡＣＶと比較してゲル上で著しく緩徐に泳動し、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５のゲノム（２１３，３０５ｂｐ）がＶＡＣＶ−ＷＲ（１９４，７１１ｂｐ）よりも大きいことが確認される（図４Ａ、レーン２〜４をレーン５と比較する）。これらのｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５クローンは、ＢｓａＩ消化に対して抵抗性であり、ＰＦＧＥによる分離後に、１つの大きいＤＮＡ断片（約１９８０００ｂｐ）およびおよそ４０００ｂｐのより小さいＤＮＡ断片を生じた。これは、ＢｓａＩで消化した場合にゲル上で分離されるいくつかのＤＮＡ断片をもたらすＶＡＣＶ−ＷＲゲノムとは対照的である。ＢｓａＩによるｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムの消化後の予想されるＤＮＡサイズは比較的小さかったので、これらの消化産物を従来のアガロースゲル電気泳動によって分離したところ、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５が適切なサイズの断片を生成したことが確認された（図４Ｂ、レーン２〜４）。ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５が、ＨｉｎｄＩＩＩ消化後に正確なサイズのＤＮＡ断片を生じたことも確認され、これは、これらの認識が、大きいＤＮＡ断片の合成の間維持されることを示唆している（図４Ａ、レーン１２〜１４；図４Ｂ、レーン６〜８）。全体として、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析は、化学的に合成されたＤＮＡ断片からのＨＰＸＶの再活性化が首尾よかったことを示唆した。
【０１４８】
ＨＰＸＶ０９５は、非必須ＶＡＣＶ  Ｊ２Ｒ遺伝子のＨＰＸＶホモログをコードするので、ＳＦＶ感染ＢＧＭＫ細胞中に、断片＿３および他のＨＰＸＶクローンをＶＡＣＶ  ＤＮＡと共に共トランスフェクトすることによって、種々のハイブリッドウイルスを回収し、選択戦略を検証した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。最初のハイブリッドウイルス（「ＶＡＣＶ／ＨＰＸＶ＋断片３」）を、ＶＡＣＶ  ＤＮＡをＨＰＸＶ断片＿３と共にＳＦＶ感染細胞中に共トランスフェクトすることによって得た。緑色でタグ付けした挿入物は、ＹＰＦ−ｇｐｔ選択マーカーをコードする。クローン１〜３を、この最初のハイブリッドゲノムからＤＮＡを精製し、それをＨＰＸＶ断片２、４、５および７と共にＳＦＶ感染細胞中に再度トランスフェクトすることによって得た。ＨＰＸＶおよびＶＡＣＶの両方を標的化するように設計されたＰＣＲプライマー（表５）を使用して、ｓｃＨＰＸＶクローン中の変異されたＢｓａＩ部位にまたがるＤＮＡセグメントを増幅した。ＰＣＲ増幅後、産物をＢｓａＩで消化して、ＨＰＸＶ（切断しない）からＶＡＣＶ配列（切断する）を区別した。ＶＡＣＶ／ＨＰＸＶハイブリッドは、ＢｓａＩ感受性部位および抵抗性部位のミックスを示したが、再活性化されたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５クローンは、完全にＢｓａＩ抵抗性であった。
全ゲノム配列分析によるｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノム配列の確認
【０１４９】
ＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５クローン（プラークピック［ＰＰ］１．１、ＰＰ２．１およびＰＰ３．１］）のストックを調製し、スクロース勾配上で精製した。ウイルスＤＮＡを、プロテイナーゼＫ消化とその後のフェノール−クロロホルム抽出を使用して、各精製されたウイルス調製物から抽出した。ｄｓＤＮＡの量を、Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＨＳアッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した。各ウイルスゲノムを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＡｌｂｅｒｔａのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＭＢＳＵ）で配列決定した。配列決定ライブラリーを、Ｎｅｘｔｅｒａ  Ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎシステム（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して生成した。およそ５０ｎｇの各試料を剪断し、ゲノムにわたって３，１００読み取り／ｎｔならびにＦ−ヘアピンおよびＳ−ヘアピンにおいて約１９０読み取り／ｎｔの平均読み取り深度でＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑプラットフォームを使用するペアードエンド配列決定（２×３００ｂｐ）のためにライブラリーを調製した。
配列アセンブリ、分析およびアノテーション
【０１５０】
ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  ８．５ソフトウェアを使用して、生配列決定読み取りから低品質の配列スコアをトリミングし、ＨＰＸＶ参照配列［ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ７９２５０４］に最初にマッピングした。ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５配列内の全てのヌクレオチド挿入、欠失および置換を、ＨＰＸＶ参照配列に対して検証した。Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｕｔｉｌｉｔｙ（ＧＡＴＵ）（Tcherepanov  V,  Ehlers  A,  Upton  C.  Genome  Annotation  Transfer  Utility  (GATU):  rapid  annotation  of  viral  genomes  using  a  closely  related  reference  genome.  BMC  Genomics.  2006;7:150.  Epub  2006/06/15）を使用して、参照アノテーションをｓｃＨＰＸＶゲノム配列に移行させた。
【０１５１】
精製されたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムを、多重アプローチおよびＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑシーケンサーを使用して配列決定した。配列読み取りを、野生型ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）およびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５参照配列上にマッピングして、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノム中の具体的な改変の存在を確認した。ＶＡＣＶ末端リピート配列が左ＩＴＲの末端終端に正確にライゲートされたことを確認するために、ゲノムのこの領域中の配列決定読み取りを分析した。ＣのストリングをｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノム参照配列の先頭に付加して、この領域中のマッピングされた全ての配列読み取りを捕捉した。配列読み取りをアセンブルするために使用されるプログラムは、そうしなければ、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノム参照配列が終わるポイントにおいて配列の表示を短縮するので、これを実施した。
【０１５２】
ＳａｐＩ認識部位は、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５参照ゲノム中に存在したが、全ての配列決定読み取りがこの配列を欠いたことが、マッピングされた読み取りから明らかであった。これにより、本明細書に記載されるアプローチが、合成ヘアピンがＩＴＲの終端にライゲートされた部位において、信頼できるＨＰＸＶ配列を生じることが確認された。ＩＴＲ終端にライゲートされた合成ｓｓＤＮＡの配列に対して同一であることが判明した、ＶＡＣＶ  ＷＲ末端ヘアピンループの完全な配列もまた首尾よく得られた。全体として、これらのデータは、ＶＡＣＶ−ＷＲ末端ヘアピンループが、ＨＰＸＶ  ＩＴＲ配列に首尾よくライゲートされ、感染性ウイルスにおいて回復されたことを示唆した。さらに、５つのウイルスの各々におけるＦ−読み取りおよびＳ−読み取りの１：１分布は、両方の終端がウイルスを産生するために必要であったことを示唆した。
【０１５３】
次に、ＢｓａＩ部位をサイレントに変異させる各ヌクレオチド置換が、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノム中に正確に取り込まれたことを検証した。配列決定読み取りを、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）参照配列にマッピングした。領域９６，０５０〜９６，５００のｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５中のＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定読み取りカバレッジ全体が、図５Ａに示される。この領域中に参照ＨＰＸＶと正確にアラインしなかった２つの矛盾が存在したことが、本明細書から明らかであった（図５Ａ、青色および黄色の垂直線）。これらの領域の拡大図から、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノム中の９６，２３９位にＴからＣへの置換が存在し（図５Ｂ）、９６，４３７位にＡからＧへの置換が存在した（図５Ｃ）ことが明らかであった。選択されたＢｓａＩおよびＡａｒＩ認識部位を変異させるために導入したヌクレオチド置換が全て、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノム中に創出されたことが検証された（表２）。
【０１５４】
最後に、ＧＡ＿断片＿２中に独自の制限部位を創出するために設計されたＨＰＸＶ０４４中のヌクレオチド置換もまたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノム中に取り込まれたことが決定された。ＨＰＸＶ０４４（領域４４，４００〜４５，１００）にマッピングされる配列決定読み取りは、この領域内に、配列決定読み取りがＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５参照配列中の配列の配列決定読み取りと矛盾する２つの領域が存在したことを示した。これらの領域の拡大図から、ＴからＧへの置換２つが、４４，５１２位および４５，０６１位においてＨＰＸＶ０４４の非コード鎖中に導入され、そうして、断片＿２中にＡｖａＩおよびＳｔｕＩ制限部位を創出したことが明らかであった。全体として、配列決定データは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏゲノム分析データを裏付け、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５がＳＦＶ感染細胞において首尾よく再活性化されたことを確認した。
ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５は、ＨｅＬａ細胞において、他のポックスウイルスと比較して緩徐に複製する
【０１５５】
ＢＳＣ−４０、ＨｅＬａおよびＨＥＬ線維芽細胞は、元々Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た。ＢＳＣ−４０細胞を、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、抗生物質および抗真菌薬、ならびに５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充した最小必須培地（ＭＥＭ）中で、５％ＣＯ２中で３７℃で繁殖させる。ＨｅＬａおよびＨＥＬ細胞を、Ｌ−グルタミン、抗生物質および抗真菌薬、ならびに１０％ＦＣＳを補充したダルベッコ改変イーグル培地中で、５％ＣＯ２中で３７℃で繁殖させた。
【０１５６】
多段階増殖曲線およびプラークサイズ測定値を使用して、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５が、他のオルソポックスウイルスと同様にｉｎ  ｖｉｔｒｏで複製し広がったかどうかを評価した。天然のＨＰＸＶ単離体は入手不能であったので、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の増殖を、プロトタイプポックスウイルスであるＶＡＣＶ（株ＷＲ）、ＨＰＸＶと密接に関連するポックスウイルスである牛痘ウイルス（ＣＰＸ）、およびＤｒｙｖａｘウイルスのクローンであるＤＰＰ１５と比較した。サル腎臓上皮細胞（ＢＳＣ−４０）、Ｖｅｒｏ細胞、ヒト癌腫細胞株（ＨｅＬａ）および初代ヒト線維芽細胞（ＨＥＬ）に、低ＭＯＩでＶＡＣＶ  ＷＲ、ＣＰＸ、ＤＰＰ１５またはｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５を感染させ、感染細胞を、７２時間の時間経過にわたって収集した。ＢＳＣ−４０細胞では、ウイルスの複製および広がりの速度は、試験した全てのウイルス間で同等であった（図８Ａ）。重要なことに、試験した他のポックスウイルスのいずれかだけでなく、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５も複製した。ウイルスは、ＨＥＬ細胞およびＶｅｒｏ細胞上でいくらかより低い力価まで増殖し、ＨｅＬａ細胞上では最も増殖が低かった。ＨｅＬａ細胞では、ウイルス産生における最大で１．５ｌｏｇの減少が、他のオルソポックスウイルスと比較して見られた。
【０１５７】
次に、ＢＳＣ−４０細胞において増殖したｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５のプラークサイズを測定した。ＶＡＣＶ  ＷＲおよびさらには牛痘ウイルスと比較して、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５のプラークサイズにおける統計的に有意な減少（図６Ｂ）が観察された。興味深いことに、ＢＳＣ−４０細胞では、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５は、試験した全ての他のオルソポックスウイルスと比較した場合、最も小さいプラークを生じた（図６Ｃ）。また、異なるＶＡＣＶ株は、より小さい二次プラークを形成する細胞外ウイルスを生じたが、これらは、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５によっては生成されなかった（図６Ｃ）。全体として、これらのデータは、本明細書に記載される系を使用したｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の再活性化が、他のオルソポックスウイルスと比較した場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのウイルスの複製および広がりにおいて、いずれの明らかな欠陥も導入しなかったことを示唆した。さらに、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５のプラークサイズは牛痘ウイルス（ＣＰＸＶ）のものと類似しており、これは、合成ウイルスの再活性化が、他のＨＰＸＶ様クローンで先に観察された小さいプラークの表現型に対して、いずれの有害な影響も有さなかったことを示唆している（Medaglia  ML,  Moussatche  N,  Nitsche  A,  Dabrowski  PW,  Li  Y,  Damon  IK,  et  al.  Genomic  Analysis,  Phenotype,  and  Virulence  of  the  Historical  Brazilian  Smallpox  Vaccine  Strain  IOC:  Implications  for  the  Origins  and  Evolutionary  Relationships  of  Vaccinia  Virus.  Journal  of  Virology.  2015;89(23):11909-25）。
ｙｆｐ／ｇｐｔ選択マーカーの除去
【０１５８】
ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の再活性化後、ＨＰＸＶ０９５遺伝子座中のｙｆｐ／ｇｐｔ選択マーカーを除去した。これを行うために、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）中のヌクレオチド位置９１５７３〜９２９２１に対応する配列の１３４９ｂｐ領域を合成した（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（配列番号５１）。この断片は、野生型ＨＰＸＶ０９５／Ｊ２Ｒ遺伝子のいずれかの側に隣接する、およそ４００ｂｐの相同性を含んだ。ＤＮＡのこの配列を、ＧｅｎｅＡｒｔによって提供される市販のベクター中にクローニングした。ＨＰＸＶ０９５遺伝子配列でｙｆｐ／ｇｐｔカセットを置き換えるために、ＢＳＣ−４０細胞に、０．５のＭＯＩでｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５を感染させ、次いで、２時間後に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、野生型ＨＰＸＶ０９５配列を含む直鎖化されたプラスミド２μｇをトランスフェクトした。ウイルス組換え体を、感染の４８時間後に収集し、組換えウイルス（ｓｃＨＰＸＶ（野生型））を、寒天下での３ラウンドの非蛍光プラーク精製を使用して単離した。ＨＰＸＶ０９５遺伝子遺伝子座に隣接するプライマーを使用するＰＣＲを使用して、ｓｃＨＰＸＶ（野生型）の同一性を確認した。ＨＰＸＶ０９５遺伝子の正確な置き換えを確認するために使用されるプライマーは、ＨＰＸＶ０９５＿ｃｈｅｃｋ−ＦＷＤ  ５’−ＣＣＴＡＴＴＡＧＡＴＡＣＡＴＡＧＡＴＣＣＴＣＧＴＣＧ−３’（配列番号５２）およびＨＰＸＶ０９５＿ｃｈｅｃｋ−ＲＥＶ  ５’−ＣＧＧＴＴＴＡＴＣＴＡＡＣＧＡＣＡＣＡＡＣＡＴＣ−３’（配列番号５３）である。
ｓｃＨＰＸＶ（野生型）対ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の増殖特性
【０１５９】
上記したように実施した実験では、ｓｃＨＰＸＶ（野生型）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５と顕著には異ならない増殖特性を示す（図１１Ａ〜Ｃ）。ＶＡＣＶ  ＷＲと比較して、ｓｃＨＰＸＶ（野生型）のプラークサイズにおける統計的に有意な減少が観察された（図１１Ａ）。ｓｃＨＰＸＶ（野生型）は、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５と同様、細胞外ウイルスを産生せず（図１１Ｂ）、ＢＳＣ−４０細胞、ＨＥＬ細胞、ＨｅＬＡ細胞およびＶｅｒｏ細胞上でのｓｃＨＰＸＶ（野生型）およびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の増殖には、有意差は存在しなかった（図１１Ｃ）。ｓｃＨＰＸＶ（野生型）が細胞外ウイルスを産生しなかったという知見は、この特性がビルレンスに影響を与えることを考慮すると適切であった。
マウス鼻腔内モデルにおけるｓｃＨＰＸＶ（野生型）のビルレンスの決定
【０１６０】
ｓｃＨＰＸＶ（野生型）の毒性効果をこの研究で決定した。この実験のために、６群のＢａｌｂ／ｃマウスに、実施例に記載したｓｃＨＰＸＶ（ΔＨＰＸＶ＿０９５／Ｊ２Ｒ）またはｓｃＨＰＸＶ（野生型）の３つの異なる用量を投与し、ＰＢＳ対照群ならびにＶＡＣＶ（ＷＲ）対照群およびＶＡＣＶ（Ｄｒｙｖａｘ株ＤＰＰ１５）対照群と比較した（合計で９つの処置群）。研究の持続時間にわたっていずれの処置も受けなかった３匹のさらなるマウスを、この実験に含めた。全てのマウスから、実験を通じた所定の時点において血液を試料採取し、さらなるマウスが、血清分析のためのベースラインとして機能した。
【０１６１】
Ｂａｌｂ／ｃマウスの接種の前に、全てのウイルス株を、ＢＳＣ−４０細胞（アフリカミドリザル腎臓）中で増殖させ、トリプシン処理によって収集し、ＰＢＳ中で洗浄し、ダウンス型のホモジナイゼーションによって細胞から抽出し、３６％スクロースクッションを介した超遠心分離によって精製し、ＰＢＳ中に再懸濁し、最終濃度が以下になるように力価決定した：１）ＶＡＣＶ（ＷＲ）−５×１０５ＰＦＵ／ｍｌ；２）ＶＡＣＶ（ＤＰＰ１５）−１０９ＰＦＵ／ｍｌ；３）ｓｃＨＰＸＶ（ΔＨＰＸＶ＿０９５／Ｊ２Ｒ）−１０７ＰＦＵ／ｍｌ、１０８ＰＦＵ／ｍｌおよび１０９ＰＦＵ／ｍｌ、ならびに４）ｓｃＨＰＸＶ（野生型）−１０７ＰＦＵ／ｍｌ、１０８ＰＦＵ／ｍｌおよび１０９ＰＦＵ／ｍｌ。
【０１６２】
この研究のために選択されたｓｃＨＰＸＶ用量（１０５ＰＦＵ／用量、１０６ＰＦＵ／用量および１０７ＰＦＵ／用量）は、ＤｒｙｖａｘおよびＩＯＣを含む、ＶＡＣＶの公知のワクチン株を使用した以前の研究に基づいた（Medaglia  ML,  Moussatche  N,  Nitsche  A,  Dabrowski  PW,  Li  Y,  Damon  IK,  et  al.  Genomic  Analysis,  Phenotype,  and  Virulence  of  the  Historical  Brazilian  Smallpox  Vaccine  Strain  IOC:  Implications  for  the  Origins  and  Evolutionary  Relationships  of  Vaccinia  Virus.  Journal  of  Virology.  2015;89(23):11909-25；Qin  L,  Favis  N,  Famulski  J,  Evans  DH.  Evolution  of  and  evolutionary  relationships  between  extant  vaccinia  virus  strains.  Journal  of  Virology.  2015;89(3):1809-24）。
【０１６３】
体重減少を、マウスにおけるビルレンスの測定値として使用したので、ＶＡＣＶ（株ＷＲ）を、およそ２０〜３０％の体重減少をもたらす５×１０３ＰＦＵの用量で鼻腔内投与した。ＶＡＣＶ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１５もまた、この周知の天然痘ワクチンのビルレンスをｓｃＨＰＸＶ（野生型）と直接比較できるように、１０７ＰＦＵ／用量で鼻腔内投与した。マウスはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、受取り後、ウイルス投与の前に少なくとも１週間にわたって環境に順化させた。
【０１６４】
各マウスは、麻酔下での鼻腔内注射を介して投与した単一用量のウイルス（約１０ｕｌ）を受けた。マウスを、感染の徴候、例えば、腫脹、分泌（discharge）または他の異常について、３０日間の期間にわたって毎日モニタリングした。各マウスを、ウイルス投与後毎日、体重減少について具体的にモニタリングした。他の罹患率因子に加えて、体重の２５％よりも多くを失ったマウスは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｌｂｅｒｔａにおいて動物ヘルスケア施設プロトコールに従って安楽死に供した。
【０１６５】
試験した最も高い用量のｓｃＨＰＸＶでさえ、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける病気の明白な徴候が存在しない場合がある。ｓｃＨＰＸＶと最も密接に関連するＶＡＣＶ株である旧南アメリカウイルス（old  South  American  virus)は、一部の場合には、１０７ＰＦＵで疾患を生じなかった（Medaglia  ML,  Moussatche  N,  Nitsche  A,  Dabrowski  PW,  Li  Y,  Damon  IK,  et  al.  Genomic  Analysis,  Phenotype,  and  Virulence  of  the  Historical  Brazilian  Smallpox  Vaccine  Strain  IOC:  Implications  for  the  Origins  and  Evolutionary  Relationships  of  Vaccinia  Virus.  Journal  of  Virology.  2015;89(23):11909-25）。１０９ＰＦＵ／ｍＬを超える力価を有する精製されたストックを作製することは困難であるので、これよりもかなり高い用量を試験することは実用的ではなかった。
ｓｃＨＰＸＶが致死ＶＡＣＶ−ＷＲ抗原投与に対する免疫保護を付与するかどうかを決定する
【０１６６】
実施例に記載される初回ウイルス投与によって影響されなかったように見えたマウスは、実験を通じて正常に体重が増加し続けた。ウイルス接種の３０日後、マウスを、鼻腔内接種を介して致死用量のＶＡＣＶ−ＷＲ（１０６ＰＦＵ／用量）で引き続いて抗原投与した。マウスを、上記のように、感染の徴候について入念にモニタリングした。マウスを毎日体重測定し、他の罹患率因子に加えて、体重の２５％よりも多くを失ったマウスは、安楽死に供した。本発明者らは、致死用量のＶＡＣＶ−ＷＲの投与の前にＰＢＳを接種したマウスは、接種後７〜１０日以内に、顕著な体重減少および他の罹患率因子の徴候を示すと予想した。ＶＡＣＶ−ＷＲによる致死抗原投与のおよそ１４日後、全てのマウスを安楽死させ、血液を収集して、標準的なプラーク減少アッセイによって血清中のＶＡＣＶに特異的な中和抗体の存在を確認した。
（実施例２）
合成キメラＶＡＣＶ（ｓｃＶＡＣＶ）
ＶＡＣＶ  ＷＲ株ヘアピンおよび二重鎖配列を含む合成キメラＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００（ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰ）
【０１６７】
ｓｃＶＡＣＶゲノムの設計は、ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００について先に記載されたゲノム配列に基づいた［ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ３１３８４７］（Osborne  JD  et  al.  Vaccine.  2007;  25(52):8807-32）。ゲノムを、９個の重複する断片へと分割した（図１２）。相同組換えが全長ゲノムのアセンブリを駆動する部位を提供するために、これらの断片が各隣接断片と少なくとも１．０ｋｂｐの重複する配列（即ち、相同性）を共有するように、それらを設計した（表４）。これらの重複する配列は、共トランスフェクトされた断片間での組換えを正確に実施するのに十分な相同性を提供した（Yao  XD,  Evans  DH.  Journal  of  Virology.  2003;77(13):7281-90）。
【表４】
2021522789.tif 000008
【０１６８】
これらの断片のサブクローニングを補助するために、ＡａｒＩおよびＢｓａＩ制限部位を、２つのＩＴＲコード断片を除く全ての断片においてサイレントに変異させた。これらの領域が、効率的なＤＮＡ複製およびコンカテマー分割にとって重要なヌクレオチド配列特異的認識部位を含む場合、２つのＩＴＲコード断片中のＢｓａＩ制限部位は変異させなかった。
【０１６９】
ポックスウイルス初期後期プロモーターの制御下にあるＹＦＰ／ｇｐｔカセットを、チミジンキナーゼ遺伝子座中に導入すると、ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００（ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：１０５）の再活性化を蛍光顕微鏡下で可視化することが容易になった。ｇｐｔ遺伝子座は、薬物選択を使用して再活性化されたウイルスを選択するための有望なツールも提供した。
【０１７０】
これまで、末端ヘアピンは、クローニングおよび配列決定することが困難であり、従って、ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００ゲノムの公開された配列が完全でないことは意外ではない。公開されたＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００株のまさに末端領域の検査により、ＡＣＡＭ２０００と非常に良好に特徴付けられたＶＡＣＶ  ＷＲ株（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ２４３３１２）との間に、いくらかの差異が存在するように見受けられた（図１２）。ＷＲ株では、ＶＡＣＶゲノムの５’末端および３’末端に位置する共有結合的に閉じたヘアピンループのすぐ下流に、７０ｂｐタンデムリピート配列が存在する。これらの後ろに、２つの１２５ｂｐリピート配列および８つの５４ｂｐリピート配列が続く（図１３Ａ）。しかし、公開されたＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００配列中では、４つの５４ｂｐリピート配列のみが同定された。配列決定（Ｉｌｌｕｍｉｎａを使用する）後に、７０ｂｐ、１２５ｂｐおよび５４ｂｐのリピート配列の存在がＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００の野生型単離体において同定され、これは、ＡＣＡＭ２０００の現在の公開された配列が不完全であることを示している。Ｉｌｌｕｍｉｎａ読み取りの短い読み取り長さ（＜３００ヌクレオチド）に起因して、本発明者らは、実際のＡＣＡＭ２０００ゲノム配列がこの約３ｋｂｐ中に存在することを正確に決定することができなかった。その代わり、本発明者らは、末端ヘアピンからＣ２３Ｌ遺伝子の停止コドンの直前までのＶＡＣＶ  ＷＲと類似の配列を有するＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００ウイルスを再創出することを決定した（図１２）。これは、１２５ｂｐおよび５４ｂｐの両方のタンデムリピート配列を含み、これらのタンデムリピート配列は、公開されたＡＣＡＭ２０００配列中には含まれないが、野生型ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００の次世代Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定を実施した場合に検出された。改変されたＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００左および右ＩＴＲ断片の５’末端には、ＮｈｅＩ制限部位もまた含まれ、これにより、７０ｂｐタンデムリピート配列をＩＴＲ終端に直接結合させることが可能であった（上で議論した）。野生型ＶＡＣＶ  ＷＲ株のＦおよびＳ末端ヘアピンループ配列は、それぞれ配列番号１１および１２に示される。
ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００株ヘアピンおよび二重鎖配列を含む合成キメラＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００（ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰ）
【０１７１】
ｓｃＶＡＣＶゲノムの設計は、ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００について先に記載されたゲノム配列に基づいた［ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ３１３８４７］（Osborne  JD  et  al.  Vaccine.  2007;  25(52):8807-32）。ゲノムを、９個の重複する断片へと分割した（図１２）。相同組換えが全長ゲノムのアセンブリを駆動する部位を提供するために、これらの断片が各隣接断片と少なくとも１．０ｋｂｐの重複する配列（即ち、相同性）を共有するように、それらを設計した（表４）。これらの重複する配列は、共トランスフェクトされた断片間での組換えを正確に実施するのに十分な相同性を提供した（Yao  XD,  Evans  DH.  Journal  of  Virology.  2003;77(13):7281-90）。
【０１７２】
これらの断片のサブクローニングを補助するために、ＡａｒＩおよびＢｓａＩ制限部位を、２つのＩＴＲコード断片を除く全ての断片においてサイレントに変異させた。これらの領域が、効率的なＤＮＡ複製およびコンカテマー分割にとって重要なヌクレオチド配列特異的認識部位を含む場合、２つのＩＴＲコード断片中のＢｓａＩ制限部位は変異させなかった。
【０１７３】
ポックスウイルス初期後期プロモーターの制御下にあるＹＦＰ／ｇｐｔカセットを、チミジンキナーゼ遺伝子座中に導入すると、ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００（ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：１０５）の再活性化を蛍光顕微鏡下で可視化することが容易になった。ｇｐｔ遺伝子座は、薬物選択を使用して再活性化されたウイルスを選択するための有望なツールも提供した。
【０１７４】
野生型ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００のＦおよびＳ末端ヘアピンループ配列は、それぞれ、配列番号１１８および１１７に示される。
ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００右および左ＩＴＲ断片へのＶＡＣＶ  ＷＲ  ＦおよびＳ末端ヘアピンループのライゲーション
【０１７５】
ＶＡＣＶ  ＷＲ株と同一な７０ｂｐリピート断片を合成した（図１３Ａ；配列番号６３）。ＳａｐＩおよびＮｈｅＩ制限部位を、７０ｂｐタンデムリピート断片の５’および３’末端に含めて、ＶＡＣＶ  ＷＲヘアピン配列ならびにそれぞれＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００右および左ＩＴＲ断片へのライゲーションを促進した。ＶＡＣＶ  ＷＲ末端ヘアピンループを７０ｂｐタンデムリピート断片にライゲートさせる前に、ループを、ＩＤＴが合成した二重鎖配列を使用してさらに５８ｂｐ伸長させる必要があった。これは、ＶＡＣＶ  株ＷＲ中で見出される最初の７０ｂｐリピート配列の前の、コンカテマー分割部位のすぐ下流の余分な配列に起因した。一緒にアニーリングさせた場合に、５’末端に５’−ＴＧＴオーバーハングを有し３’末端に５’−ＧＧＴオーバーハングを有する二重鎖ＤＮＡ分子を生成する２つの一本鎖ＤＮＡ分子（配列番号６４および配列番号６５）を合成することによって、二重鎖配列を生成した。ＶＡＣＶ  ＷＲ  ＦおよびＳ末端ヘアピンループは、それらの末端ループにおいて３’−ＡＣＡオーバーハングを生成するので、５８ｂｐ二重鎖をヘアピンにライゲートさせて、７０ｂｐリピート配列の先頭までのＶＡＣＶ  ＷＲ株中で見出される配列と同一に見える約１３０ｂｐの末端ヘアピンループを生成した。このヘアピン／二重鎖断片をゲル精製し、次いで、７０ｂｐリピート断片のＳａｐＩ消化された終端に引き続いてライゲートさせた。７０ｂｐタンデムリピート断片をＳａｐＩで消化することで、末端ヘアピン／二重鎖構造中の５’ＧＧＴオーバーハングに対して相補的な３塩基オーバーハング（５’−ＣＣＡ）を創出した。７０ｂｐタンデムリピートを、ＤＮＡリガーゼの存在下で、７０ｂｐタンデムリピート断片と比較して約５倍モル過剰のＦ末端ヘアピン／二重鎖構造またはＳ末端ヘアピン／二重鎖構造のいずれかと混合した。これは、７０ｂｐのみの反応と比較して、ＤＮＡ電気泳動ゲルにおける上方へのシフトを生じ、末端ヘアピン／二重鎖が、７０ｂｐタンデムリピート断片に首尾よくライゲートされたことを示している。
【０１７６】
この末端ヘアピン／二重鎖／７０ｂｐタンデムリピート断片を、ＮｈｅＩ制限部位を含むようにそれらの末端終端において先に改変された７０ｂｐのＡＣＡＭ２０００左または右ＩＴＲ断片に引き続いてライゲートさせた。この断片を消化すると、５’−ＣＴＡＧオーバーハングがそれらの５’末端に残された。７０ｂｐタンデムリピート断片の３’末端において、ＮｈｅＩ部位を使用して、ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００  ＤＮＡ断片のＬＩＴＲおよびＲＩＴＲ領域にこの断片を直接ライゲートさせる。ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００左および右ＩＴＲ断片の消化後、Ｓ末端ヘアピン／二重鎖／７０ｂｐタンデムリピート断片またはＦ末端ヘアピン／二重鎖／７０ｂｐタンデムリピート断片を、ＤＮＡリガーゼを使用して、１：１の分子比で１６℃で一晩、左または右のいずれかのＩＴＲ断片に別々にライゲートさせた。ＤＮＡリガーゼを、６５℃で引き続いて熱不活性化し、その後、ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）感染ＢＧＭＫ細胞中にトランスフェクトした。
ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００右および左ＩＴＲ断片へのＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００  ＦおよびＳ末端ヘアピンループのライゲーション
【０１７７】
ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００株と同一な７０ｂｐリピート断片を合成した。ＳａｐＩおよびＮｈｅＩ制限部位を、７０ｂｐタンデムリピート断片の５’および３’末端に含めて、ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００ヘアピン配列ならびにそれぞれＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００右および左ＩＴＲ断片へのライゲーションを促進した。ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００末端ヘアピンループを７０ｂｐタンデムリピート断片にライゲートさせる前に、ループを、ＩＤＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが合成した二重鎖配列を使用してさらに５８ｂｐ伸長させる必要があった。これは、ＶＡＣＶ株ＡＣＡＭ２０００中で見出される最初の７０ｂｐリピート配列の前の、コンカテマー分割部位のすぐ下流の余分な配列に起因した。一緒にアニーリングさせた場合に、５’末端に５’−ＴＧＴオーバーハングを有し３’末端に５’−ＧＧＴオーバーハングを有する二重鎖ＤＮＡ分子を生成する２つの一本鎖ＤＮＡ分子（配列番号１１９および配列番号１２０）を合成することによって、二重鎖配列を生成した。ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００  ＦおよびＳ末端ヘアピンループは、それらの末端ループにおいて３’−ＡＣＡオーバーハングを生成するので、５８ｂｐ二重鎖をヘアピンにライゲートさせて、約１３０ｂｐの末端ヘアピンループを生成した。このヘアピン／二重鎖断片をゲル精製し、次いで、７０ｂｐリピート断片のＳａｐＩ消化された終端に引き続いてライゲートさせた。７０ｂｐタンデムリピート断片をＳａｐＩで消化することで、末端ヘアピン／二重鎖構造中の５’ＧＧＴオーバーハングに対して相補的な３塩基オーバーハング（５’−ＣＣＡ）を創出した。７０ｂｐタンデムリピートを、ＤＮＡリガーゼの存在下で、７０ｂｐタンデムリピート断片と比較して約５倍モル過剰のＦ末端ヘアピン／二重鎖構造またはＳ末端ヘアピン／二重鎖構造のいずれかと混合した。これは、７０ｂｐのみの反応と比較して、ＤＮＡ電気泳動ゲルにおける上方へのシフトを生じ、末端ヘアピン／二重鎖が、７０ｂｐタンデムリピート断片に首尾よくライゲートされたことを示している。
【０１７８】
この末端ヘアピン／二重鎖／７０ｂｐタンデムリピート断片を、ＮｈｅＩ制限部位を含むようにそれらの末端終端において先に改変されたＡＣＡＭ２０００左または右ＩＴＲ断片に引き続いてライゲートさせた。この左または右ＩＴＲ断片を消化すると、５’−ＣＴＡＧオーバーハングがそれらの５’末端に残された。７０ｂｐタンデムリピート断片の３’末端において、ＮｈｅＩ部位を使用して、ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００  ＤＮＡ断片のＬＩＴＲおよびＲＩＴＲ領域にこの断片を直接ライゲートさせる。ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００左および右ＩＴＲ断片の消化後、Ｓ末端ヘアピン／二重鎖／７０ｂｐタンデムリピート断片またはＦ末端ヘアピン／二重鎖／７０ｂｐタンデムリピート断片を、ＤＮＡリガーゼを使用して、１：１の分子比で１６℃で一晩、左または右のいずれかのＩＴＲ断片に別々にライゲートさせた。ＤＮＡリガーゼを、６５℃で引き続いて熱不活性化し、その後、ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）感染ＢＧＭＫ細胞中にトランスフェクトした。
ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００の重複するＤＮＡ断片の調製
【０１７９】
表４中のＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００の重複するＤＮＡ断片の各々を、制限酵素Ｉ−ＳｃｅＩを使用して、ＧｅｎｅＡｒｔから提供されたプラスミド中にクローニングした。ＢＧＭＫ細胞中へのこれらの合成ＤＮＡ断片のトランスフェクションの前に、プラスミドをＩ−ＳｃｅＩで消化し、産物をゲル上で泳動して、ＤＮＡ断片が首尾よく直鎖化されたことを確認した。３７℃で２時間の消化後、反応を、６５℃で引き続いて熱不活性化した。末端ヘアピン／二重鎖／７０ｂｐタンデムリピート／ＩＴＲ断片が創出されるまで、試料を氷上または４℃で貯蔵した（上記のとおり）。
ショープ線維腫ウイルス感染細胞におけるｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰまたはｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰの再活性化
【０１８０】
ＳＦＶ株ＫａｓｚａおよびＢＳＣ−４０は、元々Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た。バッファローミドリザル腎臓（ＢＧＭＫ）細胞は、Ｇ．ＭｃＦａｄｄｅｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｌｏｒｉｄａ）から得た。ＢＳＣ−４０およびＢＧＭＫ細胞を、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、抗生物質および抗真菌薬、ならびに５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充した最小必須培地（ＭＥＭ）中で、５％ＣＯ２中で３７℃で繁殖させる。
【０１８１】
バッファローミドリザル腎臓（ＢＧＭＫ）細胞を、およそ８０％の培養密度に達するまで、ＭＥＭ含有６０ｍｍ組織培養皿中で増殖させた。細胞に、０．５のＭＯＩで、３７℃で１時間、無血清ＭＥＭ中でショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）を感染させた。接種材料を、５％ＦＣＳを含む温ＭＥＭ  ３ｍｌで置き換え、もう１時間インキュベーターに戻した。一方で、トランスフェクション反応を以下のように設定した。３７℃でおよそ２時間の後、直鎖化されたＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００断片を、ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００ゲノムを構成する各断片の長さに基づくモル当量で、ＳＦＶ感染ＢＧＭＫ細胞中に（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を使用して）トランスフェクトした。異なる量の総ＤＮＡを試したところ、５、６および７．５μｇのＤＮＡが、これらの重複するＤＮＡ断片からＡＣＡＭ２０００を首尾よく再活性化することができた。複合体を室温で１０分間インキュベートし、次いで、先にＳＦＶを感染させたＢＧＭＫ細胞に滴下した。感染のおよそ２４時間後、培地を、５％ＦＣＳを含む新鮮なＭＥＭで置き換えた。細胞を、３７℃でさらに４日間（合計で５日間）培養した。
感染細胞を細胞培養培地中に掻き取り、３サイクルの凍結および解凍を実施することによって、ウイルス粒子を回収した。粗製抽出物を、無血清ＭＥＭ中に１０−２希釈し、４ｍｌの接種材料を、ＢＳＣ−４０細胞の９〜１６枚の１５０ｍｍ組織培養プレート上にプレーティングして、再活性化されたｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：１０５を回収した。感染の１時間後、接種材料を、５％ＦＣＳおよび０．９％Ｎｏｂｌｅ  Ａｇａｒを含むＭＥＭで置き換えた。黄色蛍光プラークを、倒立顕微鏡下で可視化し、個々のプラークを、さらなる分析のためにピックした。ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：１０５プラークを、黄色蛍光選択を用いて３回プラーク精製した。
４日後、ＳＦＶクローンおよびＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００クローンの両方を含む感染プレートを収集し、その後、３回の凍結解凍サイクルによってウイルスを放出させ、次いで段階希釈し、ＳＦＶウイルスと比較してＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００ウイルスの増殖を優先的に促進するＢＳＣ−４０細胞上にプレーティングした。３ラウンドのプラーク精製を実施し、その後１０〜１５０ｍｍ組織培養プレート中でウイルスストックを増大させた。引き続いて、ウイルスをこれらの細胞から溶解させ、３６％スクロースクッション上で分離し、その後２４％〜４０％のスクロース密度勾配でさらに精製した。ゲノムＤＮＡを、これらの精製されたゲノムから単離し、次世代Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定を実施して、合成ウイルスゲノムの配列を確認した。
野生型ＡＣＡＭ２０００ウイルスと比較した増殖特性
【０１８２】
単離された合成キメラＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰ、ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰおよび野生型ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００ウイルスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ多段階増殖曲線を、サル腎臓上皮（ＢＳＣ−４０）細胞において実施した。細胞を、感染多重度０．０３で感染させ、示された時点（３時間、６時間、１２時間、２１時間、４８時間および７２時間）においてウイルスを収集し、ウイルスを、ＢＳＣ−４０細胞に対して力価決定した。図１６に示されるデータは、３回の独立した実験を示す。図１６に示されるように、ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００および野生型ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰウイルスは、７２時間の期間にわたり、見分けのつかない増殖動態で増殖した。
【０１８３】
ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰ（ＹＦＰ−ｇｐｔマーカー）、ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰ（ＹＦＰ−ｇｐｔマーカー）、ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰ（マーカーなし）（ＹＦＰ−ｇｐｔマーカーがＪ２Ｒ遺伝子配列で置き換えられた）、ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰ（マーカーなし）（ＹＦＰ−ｇｐｔマーカーがＪ２Ｒ遺伝子配列で置き換えられた）および野生型ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００の増殖曲線間の比較は、野生型ＡＣＡＭ２０００  ＶＡＣＶと比較して、これらのウイルスの増殖特性において統計的に差異が存在しないことを示している（図１６）。
ＰＣＲおよび制限断片分析によるｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：１０５ゲノム配列の確認
【０１８４】
制限消化とその後のパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）によるｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：１０５ゲノムのさらなる分析を、スクロース勾配精製を使用して単離されたゲノムＤＮＡに対して実施した（Yao  XD,  Evans  DH.  Methods  Mol  Biol.  2004;269:51-64）。２つの独立したｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰクローン、プラスＪ２Ｒ遺伝子配列がＹＦＰ−ｇｐｔマーカーで置き換えられたＶＡＣＶ＿ＷＲΔＪ２Ｒ対照、および野生型ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００対照（ＶＡＣ＿ＡＣＡＭ２０００）を、精製し、次いで、未消化のままにしたか、ＢｓａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、またはＮｏｔＩおよびＰｖｕＩによって消化した。ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰおよび野生型ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００の両方から単離されたゲノムＤＮＡを、ＢｓａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００ゲノム中のＢｓａＩ部位のほとんどはサイレントに変異されているので、大部分はインタクトな約２００ｋｂｐの断片が、ＢｓａＩ消化後に観察された（図１７、レーン８および９）。これは、ＢｓａＩで処理した場合に広範に消化された野生型ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００および野生型ＶＡＣＶ  ＷＲ対照（ＶＡＣ＿ＷＲΔＪ２Ｒ）ゲノムとは異なっている（図１７、レーン６および７）。ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰゲノムが別の酵素でもやはり消化できることを確認するために、これらのゲノムをＨｉｎｄＩＩＩで消化したところ、ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰクローンから多くのバンドが生成された（図１７、レーン１２および１３）。ＩＴＲ領域内の７０ｂｐタンデムリピートエレメントの存在を確認するために、ゲノムＤＮＡをＮｏｔＩおよびＰｖｕＩで消化した（図１７、レーン１４〜１７）。
野生型ＶＡＣＶ  ＷＲ対照（ＶＡＣ＿ＷＲΔＪ２Ｒ）試料では、ＷＲ株のＶＡＣ中の７０ｂｐタンデムリピートの全てを包含する約３．６ｋｂｐのバンド（アスタリスクでマークされた）が検出された。ＩＴＲリピートエレメントの合成を設計するための鋳型として使用したＶＡＣＶ  ＷＲ株を考慮すると、株ＷＲにおいて見られたのと同じサイズに近い位置に、ＮｏｔＩ／ＰｖｕＩ処理したｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰクローンにおいていくつかのバンドが検出されると予想された。２つのｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰクローンを比較した場合、この領域のサイズにおける差異が観察され、これは、７０ｂｐリピートの全てが各再構成されたゲノム中に取り込まれたわけではないことを示唆している（図１７、レーン１６および１７）。これらのリピートエレメントが細胞培養物中で選択圧下で拡張および縮小できることを他の研究者らが示していたことを考慮すると、これは、予想外ではなかった（Paez  and  Esteban  1988）。
【０１８５】
全体として、ｓｃＶＡＣＶ−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰ  ＡＣＡＭ２０００  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：１０５ゲノムのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析は、化学的に合成されたＤＮＡ断片からのＶＡＣＶ−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰ  ＡＣＡＭ２０００の再活性化が首尾よかったこと、およびｓｃＶＡＣＶ−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰ  ＡＣＡＭ２０００ウイルスが野生型ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００ウイルスと同様にｉｎ  ｖｉｔｒｏで挙動したことを示唆した。
全ゲノム配列分析によるｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：１０５ゲノム配列の確認
【０１８６】
ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰの２つのクローンおよびｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰの２つのクローンを配列決定した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ読み取りを、３５または６１のワードサイズでＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（バージョン１１）を使用してｄｅ  ｎｏｖｏにアセンブルした。次いで、アセンブルしたコンティグを、Ｓｎａｐｇｅｎｅソフトウェア中にインポートし、ＧｅｎｅＡｒｔによって提供された合成断片に基づいて予想されたｓｃＡＣＡＭ２０００配列の参照配列に対してアラインした。
【０１８７】
ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰのクローン１について、コンティグ１は１６，３１７ｂｐであり、ＩＴＲ領域のほとんど（タンデムリピート配列を除く）に対応した。コンティグ２は１６７，０２０ｂｐであり、ゲノムの中央の保存された領域（ヌクレオチド位置１９，４６７〜１８６，４８６）とアラインした。ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰのクローン２について、コンティグ３は１６，３２２ｂｐであり、ＩＴＲ領域のほとんど（タンデムリピート配列を除く）に対応した。コンティグ１は１６７，０２０ｂｐであり、ゲノムの中央の保存された領域（ヌクレオチド位置１９，４６７〜１８６，４８６）とアラインした。クローン２のコンティグのヌクレオチド位置１３６７９１において、単一ヌクレオチド置換（ＣからＡ）が存在した。これは、ｓｃＡＣＡＭ２０００ゲノム配列中のヌクレオチド位置１５６，２５６に対応し、ＶＡＣ＿ＡＣＡＭ２０００＿１７７においてＡｓｐからＴｙｒへのアミノ酸変化（Ａ４１Ｌ）を生じた。
【０１８８】
ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰのクローン１について、コンティグ１は１６７，０２０ｂｐであり、ゲノムの中央の保存された領域（ヌクレオチド位置１９，４６９〜１８６，４８８）とアラインした。コンティグ２は１６，１５０ｂｐであり、ＩＴＲ領域のほとんど（タンデムリピート配列を除く）に対応した。このコンティグをＳｎａｐｇｅｎｅにおいて参照ゲノムにマッピングした場合、２６３３位〜３４１７位およびヌクレオチド位置１５，１７５〜１５２２０において、配列中のギャップが観察された。最初のギャップ領域は、５４ｂｐリピート領域に対応し、これは、ｄｅ  ｎｏｖｏアセンブリツールを使用してこれらの領域を正確にアセンブルできないことに起因する可能性が最も高い。参照ゲノムへの直接的な生Ｉｌｌｕｍｉｎａ読み取りのマッピングは、いずれの領域内にもギャップを生じなかった。ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００ＤＵＰ／ＨＰのクローン２について、コンティグ１は１６，０７５ｂｐであり、ＩＴＲ領域のほとんど（タンデムリピート配列を除く）に対応した。コンティグ２は１６７，０７８ｂｐであり、ゲノムの中央の保存された領域（ヌクレオチド位置１９，４６９〜１８６，５４６）とアラインした。ヌクレオチド位置１５，１７６〜１５，２２０のコンティグ２においてギャップが観察された。しかし、参照ゲノムへの直接的な生Ｉｌｌｕｍｉｎａ読み取りのマッピングは、この領域内にいずれのギャップも生じなかった。ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰの配列決定されたクローンのいずれも、ゲノム内の任意の位置において任意の他のヌクレオチド変異を示さなかった。
【０１８９】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ読み取りを、ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓにおいても参照マップにマッピングした。Ｉｌｌｕｍｉｎａ読み取りは、ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰのそれぞれクローン１および２について１９２５および２５３３の平均カバレッジで、ならびにｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰのそれぞれクローン１および２について２１９５および１６０２の平均カバレッジで、参照配列の全長をカバーした。
【０１９０】
全体として、配列決定データは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏゲノム分析データを裏付け、ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２００００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰおよびｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰがＳＦＶ感染細胞において首尾よく再活性化されたことを確認する。
ＹＦＰ／ｇｐｔ選択マーカーの除去
【０１９１】
ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：１０５の再活性化後、チミジンキナーゼ遺伝子座中のｙｆｐ／ｇｐｔ選択マーカーを除去することができる。
（実施例３）
合成キメラポックスウイルスを負荷したヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）
【０１９２】
初代ヒトＭＳＣを、Apel  A  et  al.  Exp  Cell  Res  2009;315:498-507に記載されるように、健康なドナーの骨髄から単離し、培養し、特徴付ける。
【０１９３】
ヒトＭＳＣに、合成キメラポックスウイルス、例えば、ｓｃＨＰＸＶ、ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰまたはｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰを感染させる。細胞を、細胞が沈降するのを防止するために常に回転させながら、無血清培地中で３７℃で２時間感染させる。細胞を、２または４の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させる。インキュベーション後、ＭＳＣを穏やかにペレット化し、上清を除去する。細胞をプレーティングし、３７℃で４８時間インキュベートする。感染細胞のパーセントを、フローサイトメトリーによって決定する。
【０１９４】
合成キメラポックスウイルスを負荷したＭＳＣの腫瘍溶解活性を、特定の高度にもしくは中程度に増殖している細胞株を使用して、またはｉｎ  ｖｉｖｏで決定する。
（実施例４）
合成キメラポックスウイルスを負荷した脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）
【０１９５】
脂肪組織は、間葉系幹細胞の理想的な供給源である。ヒト脂肪組織を、外来診療所において健康なドナーから脂肪生検として得る。２立方ｃｍの皮下脂肪を、筋膜の切開前に切除する。脂肪組織を、外科用メスで細かく切り、０．０７５％コラゲナーゼＩ型（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）中で３７℃で９０分間インキュベートする。消化された組織を、４００ｇで５分間遠心分離し、ペレットをＰＢＳ中で洗浄し、７０μｍセルストレーナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を通過させ、赤血球溶解緩衝液（１５４ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中でインキュベートする。細胞を、３７℃で５％ＣＯ２のインキュベーター中で３〜４日間、５％ＰＬＴｍａｘ（Ｍｉｌｌ  Ｃｒｅｅｋ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＭＮ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を補充したＡｄｖａｎｃｅｄ  ＭＥＭ中で１．０〜２．５×１０３細胞／ｃｍ２の濃度で、Ｔ−１７５  ｃｍ２フラスコ中で増殖させる。細胞が６０〜８０％の培養密度のときに、細胞を、ＴｒｙｐＬＥ（Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｌｉｋｅ  Ｅｎｚｙｍｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して継代する。
【０１９６】
細胞を、液体窒素中でアリコートで凍結させ、使用まで貯蔵する。
【０１９７】
ＡＤＳＣに、合成キメラポックスウイルス、例えば、ｓｃＨＰＸＶ、ｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＷＲ  ＤＵＰ／ＨＰまたはｓｃＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００−ＡＣＡＭ２０００  ＤＵＰ／ＨＰを感染させる。細胞を、細胞が沈降するのを防止するために常に回転させながら、無血清培地中で３７℃で２時間感染させる。細胞を、２または４の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させる。インキュベーション後、ＡＤＳＣを穏やかにペレット化し、上清を除去する。細胞をプレーティングし、３７℃で４８時間インキュベートする。感染細胞のパーセントを、フローサイトメトリーによって決定する。
【０１９８】
合成キメラポックスウイルスを負荷したＡＤＳＣの腫瘍溶解活性を、特定の高度にもしくは中程度に増殖している細胞株を使用して、またはｉｎ  ｖｉｖｏで決定する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
2021522789.tif 000013
【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年1月6日(2021.1.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021522789000001.app
【国際調査報告】
2021522789.tif 000038
2021522789.tif 000039
2021522789.tif 000040