(57)【要約】  遺伝子組換えシロイヌナズナには、CYO2遺伝子が導入されている。導入されるCYO2遺伝子としては、例えばシロイヌナズナCYO2遺伝子や他の植物及び藻類のCYO2遺伝子が挙げられる。CYO2遺伝子の導入には、アグロバクテリウムを用いることができる。
2015136856.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
CYO2遺伝子が導入された遺伝子組換え植物。
【請求項２】
前記CYO2遺伝子は、配列番号１のシロイヌナズナCYO2タンパク質をコードする遺伝子、前記シロイヌナズナCYO2タンパク質に一部のアミノ酸配列を付加、置換または欠失させたタンパク質をコードする遺伝子、及び配列番号１の６０番目から１３６番目までのアミノ酸配列に相当する配列において前記シロイヌナズナCYO2タンパク質と３０％以上の相同性を示すタンパク質をコードする、シロイヌナズナ以外の光合成生物のCYO2ホモログ遺伝子から選ばれたいずれか１つであることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子組換え植物。
【請求項３】
前記CYO2遺伝子がコードするタンパク質は、タンパクジスルフィドリダクターゼ活性を有することを特徴とする請求項１または２に記載の遺伝子組換え植物。
【請求項４】
前記遺伝子組換え植物は、シロイヌナズナ(A.thaliana)、トウモロコシ(Z.mays)、イネ(O.sativa)、ミヤマハタザオ(A.lyrata)、トウゴマ(R.communis)、ヨーロッパブドウ(V.vinifera)、トリコカルパドロ(P.trichocarpa)、ダイズ(G.max)、ウマゴヤシ(M.truncatula)、セイヨウヤマカモジ(B.distachyon)、モロコシ(S.bicolor)またはイヌカタヒバ(S.moellendroffii)であることを特徴とする請求項１〜３のうちいずれか１つに記載の遺伝子組換え植物。
【請求項５】
前記CYO2遺伝子は、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター又はユビキチンプロモーターの下流に配置されていることを特徴とする請求項１〜４のうちいずれか１つに記載の遺伝子組換え植物。
【請求項６】
CYO2遺伝子が導入されたアグロバクテリウムを作製するステップと、
前記アグロバクテリウムを植物に感染させるステップと、
前記アグロバクテリウムに感染した前記植物のうち、導入された前記CYO2遺伝子が発現する株を選抜するステップとを備えている遺伝子組換え植物の作製方法。
【請求項７】
前記CYO2遺伝子は、配列番号１のシロイヌナズナCYO2タンパク質をコードする遺伝子、または配列番号１の６０番目から１３６番目までのアミノ酸配列に相当する配列において前記シロイヌナズナCYO2タンパク質と３０％以上の相同性を示すタンパク質をコードする、シロイヌナズナ以外の光合成生物のCYO2ホモログ遺伝子であることを特徴とする請求項６に記載の遺伝子組換え植物の作製方法。
【請求項８】
前記アグロバクテリウムを作製するステップは、
カリフラワーモザイクウイルスプロモーター又はユビキチンプロモーターをバイナリーベクターに導入するステップと、
前記CYO2遺伝子を前記バイナリーベクター内の前記カリフラワーモザイクウイルスプロモーター又は前記ユビキチンプロモーターの下流に導入するステップと、
前記カリフラワーモザイクウイルスプロモーター又は前記ユビキチンプロモーター及び前記CYO2遺伝子が導入された前記バイナリーベクターを前記アグロバクテリウムに導入するステップとを含んでいることを特徴とする請求項６または７に記載の遺伝子組換え植物の作製方法。
【請求項９】
請求項１〜５のうちいずれか１つに記載の遺伝子組換え植物において、導入された前記CYO2遺伝子を発現させる植物バイオマスの増大方法。
【請求項１０】
植物のバイオマスを増大させる方法であって、前記植物においてCYO2タンパク質をコードする核酸の発現量を増大させることを特徴とする、前記方法。
【請求項１１】
CYO2タンパク質が、配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含み、配列番号１６または１７で表されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
CYO2タンパク質をコードする核酸を、植物に導入するステップを含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
植物に内在するCYO2遺伝子を制御するネイティブプロモーターを、前記ネイティブプロモーターよりも前記CYO2遺伝子を高発現するプロモーターに置換するステップを含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換え植物及びその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、地球温暖化の防止を目的として、排出される二酸化炭素の削減が求められており、二酸化炭素を吸収する手段の１つとして、二酸化炭素を吸収する植物を用いて、その植物バイオマス植物バイオマスを生産する方法が提案されている。例えば特許文献１では、糖生合成に関与する遺伝子構築物の導入により植物バイオマスを増大させることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２０１２−５０１６６２号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】島田裕士、「子葉と本葉において異なる葉緑体形成機構の解析」KAKEN FY2010 Annual Research Report, Research Project Number:20570032
【非特許文献２】Thomas p. Brutnell et al., "BUNDLE SHEATH DEFECTIVE2, a novel protein required for post-translational regulation of the rbcL gene of Maize" The plant Cell, Vol. 11, p.849-864, May 1999
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１では、前述の通り糖合成段階における遺伝子構築物の導入による植物バイオマスの増大を開示している。これに対し、本願発明者らは、吸収した二酸化炭素を同化する作用機構を有する光合成段階に着目して、植物バイオマスの増大を図ることができれば、効果的に植物バイオマスの増大を行うことが可能になるものと考えた。光合成に影響を与えるタンパク質については、これまでにいくつかの報告がある。【０００６】
例えば、非特許文献１により、シロイヌナズナのCYO1タンパク質が子葉における光合成に関与していることが明らかになっている。また、非特許文献２には、トウモロコシのBSD2と呼ばれる遺伝子の変異によって光合成において二酸化炭素を固定化する酵素（Ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase；以下「ルビスコ」（Rubisco)と称する）の量が減少することが開示されている。【０００７】
しかしながら、これらのタンパク質と植物バイオマスの増大との関係はこれらの文献では開示されていない。【０００８】
上記課題に鑑み、本発明は、二酸化炭素を吸収して同化を行う光合成段階に着目して、効果的にバイオマス植物及びその作製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一例は、CYO2遺伝子が導入された遺伝子組換え植物である。当該植物では、光合成反応が促進されうるので、バイオマス収量の増加を実現しうる。【００１０】
本発明のもう一つの例に係る遺伝子組換え植物の作製方法は、CYO2遺伝子が導入されたアグロバクテリウムを作製するステップと、前記アグロバクテリウムを植物に感染させるステップと、前記アグロバクテリウムに感染した前記植物のうち、導入された前記CYO2遺伝子が発現する株を選抜するステップとを備えている。【００１１】
本発明のさらに別の例に係る植物バイオマスの増大方法では、遺伝子組換え植物において、導入された前記CYO2遺伝子を発現させる。【００１２】
本発明は、好ましくは以下に記載するような態様により行われるが、これに限定されるものではない。
［態様１］
CYO2遺伝子が導入された遺伝子組換え植物。
［態様２］
前記CYO2遺伝子は、配列番号１のシロイヌナズナCYO2タンパク質をコードする遺伝子、前記シロイヌナズナCYO2タンパク質に一部のアミノ酸配列を付加、置換または欠失させたタンパク質をコードする遺伝子、及び配列番号１の６０番目から１３６番目までのアミノ酸配列に相当する配列において前記シロイヌナズナCYO2タンパク質と３０％以上の相同性を示すタンパク質をコードする、シロイヌナズナ以外の光合成生物のCYO2ホモログ遺伝子から選ばれたいずれか１つであることを特徴とする態様１に記載の遺伝子組換え植物。
［態様３］
前記CYO2遺伝子がコードするタンパク質は、タンパクジスルフィドリダクターゼ活性を有することを特徴とする態様１または２に記載の遺伝子組換え植物。
［態様４］
前記遺伝子組換え植物は、シロイヌナズナ(A.thaliana)、トウモロコシ(Z.mays)、イネ(O.sativa)、ミヤマハタザオ(A.lyrata)、トウゴマ(R.communis)、ヨーロッパブドウ(V.vinifera)、トリコカルパドロ(P.trichocarpa)、ダイズ(G.max)、ウマゴヤシ(M.truncatula)、セイヨウヤマカモジ(B.distachyon)、モロコシ(S.bicolor)またはイヌカタヒバ(S.moellendroffii)であることを特徴とする態様１〜３のうちいずれか１つに記載の遺伝子組換え植物。
［態様５］
前記CYO2遺伝子は、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター又はユビキチンプロモーターの下流に配置されていることを特徴とする態様１〜４のうちいずれか１つに記載の遺伝子組換え植物。
［態様６］
CYO2遺伝子が導入されたアグロバクテリウムを作製するステップと、
前記アグロバクテリウムを植物に感染させるステップと、
前記アグロバクテリウムに感染した前記植物のうち、導入された前記CYO2遺伝子が発現する株を選抜するステップとを備えている遺伝子組換え植物の作製方法。
［態様７］
前記CYO2遺伝子は、配列番号１のシロイヌナズナCYO2タンパク質をコードする遺伝子、または配列番号１の６０番目から１３６番目までのアミノ酸配列に相当する配列において前記シロイヌナズナCYO2タンパク質と３０％以上の相同性を示すタンパク質をコードする、シロイヌナズナ以外の光合成生物のCYO2ホモログ遺伝子であることを特徴とする態様６に記載の遺伝子組換え植物の作製方法。
［態様８］
前記アグロバクテリウムを作製するステップは、
カリフラワーモザイクウイルスプロモーター又はユビキチンプロモーターをバイナリーベクターに導入するステップと、
前記CYO2遺伝子を前記バイナリーベクター内の前記カリフラワーモザイクウイルスプロモーター又は前記ユビキチンプロモーターの下流に導入するステップと、
前記カリフラワーモザイクウイルスプロモーター又は前記ユビキチンプロモーター及び前記CYO2遺伝子が導入された前記バイナリーベクターを前記アグロバクテリウムに導入するステップとを含んでいることを特徴とする態様６または７に記載の遺伝子組換え植物の作製方法。
［態様９］
態様１〜５のうちいずれか１つに記載の遺伝子組換え植物において、導入された前記CYO2遺伝子を発現させる植物バイオマスの増大方法。
［態様１０］
植物のバイオマスを増大させる方法であって、前記植物においてCYO2タンパク質をコードする核酸の発現量を増大させることを特徴とする、前記方法。
［態様１１］
CYO2タンパク質が、配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含み、配列番号１６または１７で表されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含む、態様１０に記載の方法。
［態様１２］
CYO2タンパク質をコードする核酸を、植物に導入するステップを含む、態様１０または１１に記載の方法。
［態様１３］
植物に内在するCYO2遺伝子を制御するネイティブプロモーターを、前記ネイティブプロモーターよりも前記CYO2遺伝子を高発現するプロモーターに置換するステップを含む、態様１０または１１に記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る遺伝子組換え植物及びその作製方法によれば、バイオマスの収量を増加しうる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、シロイヌナズナのCYO2タンパク質、トウモロコシのBSD2タンパク質及びシロイヌナズナのCYO1タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図２】図２（ａ）は、CYO2タンパク質の構造を模式的に示す図であり、（ｂ）は、CYO2タンパク質のタンパクジスルフィドリダクターゼ（PDR)活性を表す図である。
【図３】図３は、PDRアッセイを説明する図である。
【図４】図４（ａ）、（ｂ）は、酸化状態及び還元状態でのルビスコの活性を示す図である。
【図５】図５は、BiFCアッセイを用いてCYO2タンパク質とルビスコを構成するサブユニットとの相互作用を調べた結果を示す図である。
【図６】図６は、野生型シロイヌナズナと遺伝子組換えシロイヌナズナの外観を比較した写真を示す図である。
【図７】図７は、種々の光合成生物におけるCYO2ホモログタンパク質のアミノ酸配列を示すアラインメントである。
【図８】図８は、種々の光合成生物の系統樹を示す図である。
【図９】図９は、本発明に係る遺伝子組換えシロイヌナズナの作製方法を示す図である。
【図１０】図１０は、光合成活性のパラメータを説明するための図である。
【図１１】図１１は、シロイヌナズナCYO2遺伝子の発現量の測定結果を示す図である。
【図１２】図１２（ａ）、（ｂ）は、遺伝子組換えシロイヌナズナ及び野生型のシロイヌナズナの湿重量及び乾燥重量をそれぞれ示す図である。
【図１３】図１３は、遺伝子組換えシロイヌナズナと野生型シロイヌナズナとでそれぞれ光合成活性を測定した結果を示す図である。
【図１４】図１４は、遺伝子組換えシロイヌナズナ、空ベクターが導入されたシロイヌナズナ及び野生型シロイヌナズナについてCO2の固定作用を測定した結果を示す図である。
【図１５】図１５（ａ）は、図１４に示す測定結果から算出された、ルビスコの最大カルボキシレーション効率（Vcmax）を示す図であり、（ｂ）は、（ａ）に示す各試料でのVcmaxの算出値を示す図である。
【図１６】図１６は、CYO2遺伝子が導入されたイネ用高発現ベクターの作製手順を示す図である。
【図１７】図１７は、CYO2遺伝子が導入されたイネ形質転換体とコントロールのイネ形質転換体の生育状態を示す写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
−発明に至る経緯−
本願発明者は、二酸化炭素(CO2)の同化を増強し、植物バイオマスの収量増加を図るため、植物の形質転換体を作製することを企図した。形質転換を行う植物としては、研究のしやすいシロイヌナズナを選択した。また、シロイヌナズナに導入する遺伝子を選定する際に、本願発明者らは、光合成を増進させることができれば、CO2の同化を増強し、植物の成長を早めることができるのではないかと考えた。本願発明者らは、光合成に関わる酵素としてCYO1タンパク質と、そのホモログであるCYO2タンパク質（配列番号１）とに注目し、特にCYO2タンパク質が光合成においてCO2の固定化反応を促進させるルビスコを活性化させることを後述の独自の研究により明らかにした。
【００１６】
この研究結果を踏まえて、本願発明者らはCYO2遺伝子を高発現させることで光合成が促進され、生育の良い植物が得られるものと予想し、遺伝子組換えシロイヌナズナを作製することとした。
【００１７】
− CYO2タンパク質の機能解析−
図１は、シロイヌナズナのCYO2タンパク質、トウモロコシのBSD2タンパク質及びシロイヌナズナのCYO1タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【００１８】
CYO1遺伝子は、シロイヌナズナにおいて子葉のみがアルビノでその後発生する本葉は野生型同様の緑色を示す変異体の原因遺伝子として同定されている遺伝子である。CYO1タンパク質は、本願発明者らの研究により光合成に関与することが分かっているので、本願発明者らは、CYO1タンパク質と配列類似性の高いタンパク質として、CYO2タンパク質に注目した。シロイヌナズナCYO2タンパク質とシロイヌナズナCYO1タンパク質との相同性(identity)は、２２．８％であり、類似性(similarity)は４１．２％である。なお、図１にアミノ酸配列が示されたBSD2タンパク質は、CYO2タンパク質のトウモロコシにおけるホモログと考えられる。
【００１９】
本願発明者らは、これまでの研究により、CYO1遺伝子は播種後７日後の子葉のみで遺伝子発現が観察されるのに対し、CYO2遺伝子は子葉を含む緑色組織全体で遺伝子発現が観察されるなど、CYO1タンパク質とCYO2タンパク質との間には酵素学的な機能分担があることを明らかにしていた（非特許文献１参照）。このため、CYO1の高発現が光合成反応の促進に有効であったとしても、CYO2の高発現が光合成反応を促進させるか否かは不明である。
そこで、本願発明者らは、まずCYO2タンパク質の詳細な機能を明らかにすることにした。
【００２０】
図２（ａ）は、CYO2タンパク質の構造を模式的に示す図であり、（ｂ）は、CYO2タンパク質のタンパクジスルフィドリダクターゼ（PDR)活性を表す図である。
【００２１】
図２（ａ）、（ｂ）に示すように、CYO2タンパク質には２つのジンクフィンガーがあり、各ジンクフィンガーは、N末端側から数えて７２番目、７５番目、１１８番目及び１２１番目のシステインと、８３番目、８６番目、１０７番目及び１１０番目のシステインとでそれぞれ構成されている。また、CYO2にアミノ酸配列が類似し、ジンクフィンガーを有するCYO1タンパク質は、タンパクジスルフィドイソメラーゼ(PDI)活性を有することが本願発明者らの研究によって既に明かになっている。このことから、CYO2タンパク質は、標的タンパク質のS-S結合を還元的に切断する活性があると推定された。
【００２２】
そこで、本願発明者らは、以下の手順でPDRアッセイを行って、CYO2タンパク質がPDR活性を有することを確認した。
【００２３】
図３は、PDRアッセイを説明する図である。これは、Raturi,Aらの論文（Free Radical Biology and Medicine (2007)43.1.62-70)に記載された方法であり、Eosin-5-isothiocyanate(以下「エオシン」と表記)で蛍光標識されたグルタチオン分子で構成された酸化型グルタチオン（GSSG)のジスルフィド構造が還元されるか否かでPDR活性を測定する方法である。
【００２４】
GSSGにおいては、２分子のエオシン同士の距離が近いために蛍光が打ち消し合って消光されている。これに対し、GSSGが還元されてジスルフィド結合が開裂すると、エオシン分子同士が離れて蛍光が観察される。すなわち、もしアッセイの対象物（ここではCYO2タンパク質）に還元能力があればGSSGが還元型グルタチオン(GSH)へと還元されてエオシンの蛍光が観測され、対象物に還元能力がなければ蛍光は観測されない。
【００２５】
本願発明者らは、配列番号１の５７番目から１３６番目までのアミノ酸配列を有するN末端欠失CYO2タンパク質を大腸菌内で産生させ、これを精製したものをCYO2タンパク質の測定用試料とした。ここで、CYO2タンパク質のN末端側部分は葉緑体への移行シグナルとして機能すると考えられるので、大腸菌内ではN末端側部分を欠失させた推定成熟CYO2タンパク質をPDR活性測定用の試料として用いた。
【００２６】
本試験では、エオシンで標識したGSSGを基質としてこの測定用試料のPDR活性の有無を調べた。励起波長を５２５．０ｎｍとして波長が５４５．０ｎｍの蛍光を測定したところ、CYO2タンパク質を加えた試料では蛍光が観測された。この結果から、CYO2タンパク質はPDR活性を有していることが確認できた。
【００２７】
次に、本願発明者らは、CYO2タンパク質が植物中でどのタンパク質を還元しているのかを検討した。
【００２８】
図４（ａ）、（ｂ）は、酸化状態及び還元状態でのルビスコの活性を示す図である。同図に示すデータは、Y. Marcusらの論文（"Dual Role of Cysteine 172 in Redox Regulation of Ribulose 1,5-Bisphosphate Carboxylase/Oxygenase Activity and Degradation" J. Bacteriol. 2003, 185(5):1509-1517)にて公表されたものである。
【００２９】
ルビスコには、図２（ｂ）に「Protein」として示すように、２つのシステイン残基のイオウ(S)同士がジスルフィド結合した「酸化型」（左上図）と、このジスルフィド結合が還元された状態の「還元型」が存在する。ルビスコは、カルビンサイクルにおいて、リブロース1,5-ビスリン酸(以下「RuBP」と表記)とCO2とから２分子の3-ホスホグリセリン酸を生成する反応を触媒する。図４（ａ）、（ｂ）は、RuBPとCO2の濃度をそれぞれ変化させた場合の還元型のルビスコ（「Red.」と表記）と酸化型のルビスコ(「Ox.」と表記)の酵素活性を調べた結果を示している。
【００３０】
図４（ａ）、（ｂ）に示すように、酸化型のルビスコは酵素活性をほとんど示さないのに対し、還元型のルビスコは基質の量に依存した酵素活性を示すことが分かっている。
【００３１】
本願発明者らは、上記論文の内容と、独自の研究によって得られた、CYO2タンパク質が光合成に関与しているという知見（非特許文献１参照）とに基づいて、CYO2タンパクが酸化型のルビスコを還元することで同タンパクを活性化しているのではないかと推定した。
【００３２】
次に、本願発明者らは、植物において実際にCYO2タンパク質がルビスコと相互作用することを確認するために、BiFCアッセイを行った。
【００３３】
図５は、BiFCアッセイを用いてCYO2タンパク質とルビスコを構成するサブユニットとの相互作用を調べた結果を示す図である。ここで、図５に示すYFPは蛍光タンパク質であるYellow Fluorescent Proteinの略である。 このBiFCアッセイでは、相互作用を調べたい二つのタンパク質の一方にYFPのN末端側部分を結合させ、タンパク質の他方にYFPのC末端側部分を結合させる。両タンパク質が相互作用する場合には、YFPが再構成されて蛍光が検出され、両タンパク質が相互作用しない場合には、YFPが再構成されず、蛍光は検出されない。
【００３４】
ルビスコは、８つのスモールサブユニット(RBC-S)と、８つのラージサブユニット(RBC-L)とで構成される多量体のタンパク質である。そのため、ここでは、CYO2タンパク質とRBC-Sとの間の相互作用及びCYO2タンパク質とRBC-Lとの相互作用を調べた。具体的には、YFPのN末端側部分を付加したRBC-S及びRBC-L、及びYFPのC末端側部分を付加したシロイヌナズナCYO2タンパク質を発現させるためのベクター(それぞれpGWnY/RBCS、pGWnY/RUCK、pGWcY/CYO2)を作製し、これらをポリエチレングリコール(PEG)を用いた公知の方法でシロイヌナズナのプロトプラストに導入した。
【００３５】
pGWnY/RBCS、pGWnY/RBCLは、文献(T.Nakagawa et al. Journal of Bioscience and Bioengineering, 103, 34-41 (2007))に記載されたベクター(pGWnY)に、公知のRT-PCR法を用いて作製したシロイヌナズナのRBC-S及びRBC-LのcDNAをそれぞれ組み込んだものである。pGWcY/CYO2は、上記文献に記載されたベクター(pGWcY)に公知のRT-PCR法を用いて作製したシロイヌナズナのCYO2 cDNAを組み込んだものである。ただし、生成されるRBC-LのN末端には、葉緑体への移行シグナル(ここではRBC-SのN末端配列)を結合し、RBC-Lが葉緑体へと移行するようにした。また、発現させたタンパク質が葉緑体内に存在することを確認するために、葉緑体が保持する葉緑素の自家蛍光を観察した。葉緑体内での蛍光の有無は、レーザー走査顕微鏡により確認した。
【００３６】
図５において、「YFP」と表された列はYFPの蛍光を観察した結果を示し、「Chlorophll」と表された列は標識された葉緑素の蛍光を観察した結果を示し、「Merge」と表された列はYFPの蛍光と葉緑素の蛍光とを観察した結果を重ねた結果を示す。
【００３７】
また、図５において、「CYO2＋RBC-L」の行は、CYO2タンパク質にYFPのC末端側部分を付加したタンパク質と、RBC-Lの全長に葉緑体への移行シグナル及びYFPのN末端側部分を付加したタンパク質とを発現させた試料を示す。「CYO2＋RBC-S」の行は、CYO2タンパク質にYFPのC末端側部分を付加したタンパク質と、RBC-SにYFPのN末端側部分を付加したタンパク質とを発現させた試料を示す。「RBC-L＋RBC-S」の行は、RBC-Lの全長に葉緑体への移行シグナル及びYFPのC末端側部分を付加したタンパク質と、RBC-SにYFPのN末端側部分を付加したタンパク質とを発現させた試料を示す。「Protoplast」の行は、YFPのC末端側部分のみとCYO2タンパク質とYFPのN末端側部分のみを発現させたネガティブコントロール試料を示す。
【００３８】
図５に示すYFP蛍光の観察結果から、CYO2タンパク質はシロイヌナズナの細胞内でRBC-L及びRBC-Sのそれぞれと相互作用することが確認できた。また、相互作用したCYO2とRBC-L、CYO2とRBC-S及びRBC-LとRBC-Sはいずれも葉緑体内に分布していることが確認できた。
【００３９】
そこで、本願発明者らがin vitroにて試験を行ったところ、シロイヌナズナCYO2タンパク質が酸化型のルビスコを還元型で活性化されたルビスコにすることを確認できた（図示せず）。
【００４０】
以上の結果から、CYO2は植物の葉緑体において、酸化型ルビスコを還元型ルビスコに変換することで活性化することが分かった。ルビスコが触媒する炭酸同化反応はカルビンサイクルの中でも律速段階であることから、本願発明者らは、CYO2を植物内で大量に発現させることで光合成を促進させることができるものと確信し、今般の発明をするに至った。
【００４１】
−本発明に係る遺伝子組換え植物の説明−
上記のとおり、CYO2は光合成に重要な役割を果たし、しかも酵素活性を有する領域（シロイヌナズナCYO2における配列番号１の６０番目から１３６番目までの領域）のアミノ酸配列は、高等植物から藻類まで光合成生物間でよく保存されている。以下では、本発明の一例として、シロイヌナズナのCYO2 cDNAが染色体内に導入された遺伝子組換えシロイヌナズナについて説明する。
【００４２】
本発明の一例に係るシロイヌナズナには、CYO2遺伝子が導入されている。導入されるCYO2遺伝子は、遺伝子が導入される植物と同じ植物(ここではシロイヌナズナ)のcDNA(配列番号２)であることが最も好ましい。ただし、シロイヌナズナのCYO2タンパク質に一部配列を付加、置換または欠失させたアミノ酸配列を有するCYO2タンパク質をコードするcDNA、または配列番号１の６０番目から１３６番目までのアミノ酸配列に相当する配列において前記シロイヌナズナCYO2タンパク質と３０％以上の相同性を示すタンパク質をコードする、シロイヌナズナ以外の光合成生物のCYO2ホモログ遺伝子のcDNAが導入されていてもよい。このようなCYO2ホモログ遺伝子は、例えばBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)等の検索ツールを用いて検索可能である。なお、後述のアグロバクテリウムを用いた遺伝子導入方法を用いる場合、CYO2遺伝子はシロイヌナズナの染色体内に導入される。
【００４３】
遺伝子組換えシロイヌナズナにおいて、CYO2遺伝子は、CYO2遺伝子の上流に配置された強力なプロモーターとともに導入されていることが好ましい。プロモーターとしては、例えばカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35Sプロモーターや、ユビキチンプロモーター（例えばトウモロコシ由来）等、遺伝子の発現を促進させる公知のプロモーターを用いることができる。この構成によれば、植物体内での遺伝子産物の発現を促進させることができる。なお、CYO2遺伝子の転写量を増やすために、上記以外のプロモーターが導入されていてもよい。
【００４４】
図６は、本発明の一例に係る遺伝子組換えシロイヌナズナ（下側の３株）と、野生型のシロイヌナズナ（上側の２株）とを示す写真図である。同図に示すように、本発明に係る遺伝子組換えシロイヌナズナでは、同じ条件で育成した野生型のシロイヌナズナに比べて地上部分のサイズが大きくなっており、乾燥重量及び湿重量が共に増加している。特に、本発明に係る遺伝子組換えシロイヌナズナでは、葉身、葉幅とも大きくなっている。
【００４５】
また、本発明に係る遺伝子組換えシロイヌナズナでは、光合成の電子伝達速度(ETR)が野生型のシロイヌナズナより大きく向上している。
【００４６】
以上のことから、本発明に係る遺伝子組換えシロイヌナズナでは、CYO2タンパク質の発現により、光合成活性が上昇しているものと考えられる。従って、本発明に係る遺伝子組換えシロイヌナズナによれば、野生型のシロイヌナズナに比べてより多くのCO2を吸収することが可能となる。
【００４７】
ここで、遺伝子組換えシロイヌナズナにおいて光合成活性が大きく上昇するのは、細胞内で大量に合成されるCYO2タンパク質が葉緑体内でルビスコの触媒作用を活性化させることに加え、ルビスコが還元型になることで、ルビスコの分解が抑えられるためと考えられる。これは、本願発明者らの研究と、酸化型のルビスコは還元型のルビスコに比べてプロテアーゼによる分解を受けやすいとの報告(J. Morenoら「Redox modulation of Rubisco conformation and activity through its cysteine residues」Journal of Experimental Botany, Vol.59, No.7, pp.1605-1614, 2008)とから導き出される。従って、本発明に係る遺伝子組換えシロイヌナズナでは、カルビンサイクルにおいて律速段階となっているCO2の固定化反応を大幅に促進することができるので、野生型と比べて短期間で高い収量を得ることが可能となっている。
【００４８】
図７は、種々の光合成生物におけるCYO2ホモログタンパク質のアミノ酸配列を示すアラインメントであり、図８は、図７に示す種々の光合成生物の系統樹を示す図である。図７に示すアミノ酸配列の相同性は、インターネット上にある相同性解析ソフト(BLAST)を用い、データベースとしてNon-redundant protein sequences (nr)（すなわち、公開されているデータベースの一部）を選択することで得られた。図７に示すように、シロイヌナズナ(A.thaliana)、ルベラナズナ(C. rubella)、ワサビ(E. salsugineum)、クワ(M. notabilis)、トウモロコシ(Z.mays；図１に示すBSD2と同じもの)、イネ(O.sativa)、ミヤマハタザオ(A.lyrata)、トウゴマ(R.communis)、ヨーロッパブドウ(V.vinifera)、トリコカルパドロ(P.trichocarpa)、ダイズ(G.max)、ウマゴヤシ(M.truncatula)、ミヤコグサ(L. laponicas)、ヒヨコマメ(C. arientimum)、インゲンマメ(P. vulgaris)、ポプラ(P. trichocarpa)、ヨーロッパグリ(C. sariva)、カカオ(T. cacao)、ジャガイモ(S. tuberosum)、トマト(S. lycoperisicum)、キュウリ(C. sativus)、オランダイチゴ(Fragaria vesca subsp vesca)、モモ(P. persica)、オオムギ(Hordemu vulgare subsp vulgare)、ブラキボディウム(B. distachyon)、アワ(S. italica)、トウヒ(P. sitchenis)、セイヨウヤマカモジ(B.distachyon)、モロコシ(S.bicolor)、イヌカタヒバ(S.moellendroffii)、プラシノ藻(O.lucimarinus CCE9901)、ピコプランクトン(M.pusilla)、またはプランクトンの一種(M.sp. RCC299、B. parasinos)等の植物及び光合成微生物間でCYO2タンパク質の活性部位が存在する部分(配列番号１の６０番目から１３６番目までの部分に相当する部分）はよく保存されている。特に、亜鉛結合構造を構成する８つのシステインは図７に示す光合成生物全てで共通している。
【００４９】
従って、いずれの光合成生物（特に高等植物）のCYO2ホモログ遺伝子がシロイヌナズナに導入されても光合成が促進される。また、いずれの光合成生物（特に高等植物）に同種または他種のCYO2遺伝子を導入しても当該光合成生物（特に高等植物）の収量を大幅に増加できるものと考えられる。なお、種間で配列の違いが大きいCYO2タンパク質のN端側部分は、葉緑体への移行シグナルとなっていると考えられる。
【００５０】
−遺伝子組換えシロイヌナズナ（CYO2高発現シロイヌナズナ）の作製方法−
図９は、本発明に係る遺伝子組換えシロイヌナズナの作製方法を示す図である。
【００５１】
まず、最初に、シロイヌナズナCYO2のcDNA配列を利用したReverse Transcription Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)によってシロイヌナズナCYO2のcDNAをクローニングする(Step1)。
【００５２】
具体的には、まず公知の方法にてシロイヌナズナから全RNAを抽出する。次いで、このRNAを鋳型としてPrimeScript RT reagent kit(タカラバイオ社製)を用いたRT-PCRを行い、cDNAを作製する。次に、作製されたcDNAをテンプレートとしてPCRを行う。この際に、例えば上流側（フォワード）のプライマーとして配列番号３のプライマー（CYO2-cDNA-5）を、下流側（リバース）のプライマーとして配列番号４のプライマー(CYO2-cDNA-3)を用いることができる。 
【００５３】
続いて、得られたPCR産物を用いてシロイヌナズナCYO2 遺伝子(cDNA)を公知の方法でクローニングして塩基配列を確認した後、以後のステップに用いる。
【００５４】
次に、以下のStep2及び3（図９参照）を行なうことで、CYO2遺伝子が導入されたアグロバクテリウムを作製する。
【００５５】
まず、公知の方法により、市販のバイナリーベクター（例えばpGWB2;GenBank:AB289765.1）内の、CaMV35Sプロモーターの下流に、Step1で得られたシロイヌナズナCYO2遺伝子を導入する（Step2）。
【００５６】
次に、CaMV35Sプロモーター及びシロイヌナズナCYO2遺伝子が導入されたバイナリーベクターを公知の方法でアグロバクテリウムに導入する（Step3）。なお、本ステップ以後の手順については、一例として、「改訂３版モデル植物の実験プロトコール」細胞工学別冊（学研メディカル秀潤社刊）に記載された方法を用いることができる。
【００５７】
次に、上記バイナリーベクターが導入されたアグロバクテリウムを、シロイヌナズナのカルスに感染させることで、シロイヌナズナCYO2遺伝子をシロイヌナズナに導入する（Step4）。
【００５８】
次に、アグロバクテリウムが感染したシロイヌナズナのうち、シロイヌナズナCYO2遺伝子が高レベル（少なくともCYO2遺伝子のｍRNAレベルでの発現量が野生型の２倍以上）で発現している株を選抜する。これにより、シロイヌナズナCYO2遺伝子が高レベルで発現している遺伝子組換えシロイヌナズナ（シロイヌナズナCYO2遺伝子高発現株）を得ることができる（Step5）。
【００５９】
なお、以上で説明した遺伝子組換えシロイヌナズナ及びその作製方法は本発明の実施形態の一例であって、用いられる植物の種類やCYO2遺伝子の由来、用いるプラスミドやPCR用プライマーの選択等は、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において適宜変更可能である。
【００６０】
例えば、上述のアグロバクテリウムを用いた方法を用いてシロイヌナズナ以外の植物にシロイヌナズナCYO2遺伝子またはそのホモログ遺伝子を導入することもできる。
【００６１】
植物以外の藻類等にCYO2遺伝子を導入する場合には、アグロバクテリウムを用いる方法ではなく、微生物に遺伝子導入を行うための公知の方法を用いることができる。
【００６２】
なお、任意の植物にCYO2遺伝子(cDNA)を導入する場合、当該植物のCYO2遺伝子を導入することが光合成促進効果を確実に得るという観点からは最も好ましい。ただし、当該植物のCYO2タンパク質と酵素活性を有する領域を含む部分（配列番号１の６０番目から１３６番目までのアミノ酸配列に相当する配列部分）において少なくとも３０％以上、より好ましくは５０％以上の相同性を有するCYO2ホモログタンパク質をコードする遺伝子であれば、導入することで光合成の促進効果を得ることができる。
【００６３】
また、イネのCYO2ホモログ遺伝子（以後、単に「イネCYO2遺伝子」と呼ぶ）がコードするタンパク質とシロイヌナズナのCYO2タンパク質とのアミノ酸配列の相同性は６６％であるが、本願発明者らは後述するように、イネCYO2 cDNAを高発現させたイネの形質転換体でもコントロールに比べて生育が促進されることを確認している。なお、本願明細書において、「相同性」と「同一性」は同じ意味を表す。
【００６４】
なお、図７に示すように、配列番号１の６０番目から１３６番目までのアミノ酸配列に相当する配列部分において、シロイヌナズナCYO2タンパク質との間で最も配列類似性が低いプラシノ藻CYO2タンパク質との相同性は２４／７７＝３１％程度であり、光合成への関与が確認されているトウモロコシCYO2タンパク質(図１に示すBSD2と同じもの）との相同性は４７／７７＝６１％程度となっている。
【００６５】
プラシノ藻のCYO2タンパクのように、N端側部分が無いタンパク質を植物内で発現させる場合には、適切な葉緑体への移行シグナルを付加させたタンパク質が植物内で発現するように遺伝子導入を行ってもよい。
【００６６】
また、上述のStep5では、CYO2遺伝子のmRNAレベルでの発現量が野生型の２倍以上である株を選抜したが、少なくとも野生型よりもCYO2遺伝子の発現量が大きい株であればバイオマスの収量増加を見込むことができる。
【００６７】
また、植物等に導入されるCYO2遺伝子は、配列番号２のシロイヌナズナCYO2 cDNAがコードするタンパク質と同じ、ルビスコのジスルフィド基を還元する機能(すなわちタンパクジスルフィドリダクターゼ活性)を有するタンパク質をコードしていればよく、シロイヌナズナCYO2 cDNAに一部配列を付加、置換及び欠失させたものであってもよい。
【００６８】
また、上記のアグロバクテリウムを用いた遺伝子導入方法に代えて、パーティクルガン法等、他の遺伝子導入方法を用いることも可能である。
【００６９】
なお、以上では、植物にCYO2遺伝子を導入することでバイオマスの収量増加を図れることを説明したが、植物がもともと有しているCYO2遺伝子の上流にユビキチンプロモーター等の強力なプロモーターを挿入することによってCYO2タンパク質の発現量を増加させることによっても外来のCYO2遺伝子を導入した場合と同様に、当該植物の生育を促進させることが可能である。このようなプロモーターの挿入又は改変は、相同組み換えを利用した公知の技術により容易に実施することができる。
【００７０】
−植物のバイオマスを増大させる方法−
本発明は、CYO2タンパク質の発現量を増大させることを特徴とする、植物のバイオマスを増大させる方法である。CYO2タンパク質が有する植物のバイオマスを増大させる活性を利用することにより、上記の方法が達成される。
【００７１】
本願明細書において植物の「バイオマス」とは、植物個体の全体、一部、個別器官、あるいはその組み合わせに係る量を意図する。植物個体の全体、一部、あるいは個別器官としては、例えば、全体、地上部、根、茎、葉、果実、種子、胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉、又は穂等が挙げられる。また、量としては、例えば、数、大きさ、長さ、幅、重量、面積、又は体積等が挙げられる。なお、重量の場合、乾燥重量であっても湿重量であってもよい。従って、バイオマスの例としては、全体重、地上部重、収量、茎径、茎数、稈長、葉面積、葉数、籾数、種子数、分げつ数、穂数、一穂粒数、穂長、最大穂長、又は全穂重等を挙げることができる。また、「増大」とは、上記に例示されるような植物のバイオマスのいずれかが単独で、又は複数が組み合わさって増大していればよい。
【００７２】
植物のバイオマスを増大させる活性は、例えば、増大の指標としてコントロール（親植物、非形質転換体、野生型等）のバイオマスを用い、植物の成熟体において当該コントロールと比較することにより評価を行うことができる。コントロールとの比較により増大が見られた場合には植物のバイオマスを増大させる活性を有すると判定することができる。当該バイオマスが数値化可能であれば、数値を比較した上で、例えば、１％以上、３％以上、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、又は７０％以上の増大が見られた場合に植物のバイオマスを増大させる活性を有すると判定することができる。
【００７３】
本発明においてCYO2タンパク質のアミノ酸配列は各種植物によって相違するが、下記の配列番号１５で表されるアミノ酸配列の共通モチーフを有している（図7参照）。
【００７４】
X1-X2-Lys-X3-X4-Ser-X5-X6-Cys-X7-X8-Cys-X9-Gly-X10-Gly-X11-X12-X13-Cys-X14-X15-Cys-X16-Gly-X17-Gly-Val-Asn-X18-X19-Asp-X20-Phe-X21-Gly-X22-Phe-Lys-X23-Gly-X24-X25-Cys-Trp-Leu Cys-Arg-Gly-X26-X27-X28-X29-Leu-Cys-Gly-X30-Cys-Asn-Gly-Ala-Gly-Phe-X31-Gly-Gly-X32-X33-Ser-Thr-X34-Asp-X35     ・・・（配列番号１５）
（上式中、X1は5個のアミノ酸残基、X2はThr、Val、Pro又はGln、X3はPro、Val、Ala又はGly、X4はAsn、Lys、Arg、Tyr又はSer、X5はLeu又はIle、X6はVal又はLeu、X7はAla、Ser又はGln、X8はAsn又はAsp、X9はGlu、Asp又はThr、X10はGlu又はAsn、X11はCys又はAla、X12はVal、Leu、Ile又はLys、X13はAla、Leu、Gln、Ser、GluまたはVal、X14はSer、Thr、Gly又はAsn、X15はGln又はLys、X16はLys、Gln又はGlu、X17はGly、Thr、Asp、Ser又はAsn、X18はLeuまたはSer、X19はIle、Val、Met又はGlu、X20はHis又はTyr、X21はAsn又はGlu、X22はGln又はArg、X23はAla又はGlu、X24はAla、Gly又はSer、X25はLeu又はMet、X26はLys又はArg、X27はLys又はArg、X28はGlu又はAsp、X29はVal又はIle、X30はAsp、Asn又はSer、X31はIle又はLeu、X32はPhe又はIle、X33はLeu又はMet、X34はPhe、Ala又はSer、X35はGlu、Asp又はSerを示す。）
本発明におけるCYO2タンパク質はまた、上記共通モチーフを含むことに加え、シロイヌナズナ又はイネの成熟CYO2タンパク質（シグナルペプチドを除いた、酵素活性を有する領域）を基準として、配列番号１の６０番目から１３６番目で表されるアミノ酸配列（以下「配列番号１６」）、又は配列番号１４ の５２番目から１２８番目で表されるアミノ酸配列（以下「配列番号１７」）と、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする。 本発明では、上記共通モチーフ（即ち、配列番号１５で表されるアミノ酸配列）は、配列番号１６又は１７で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列に包含される（換言すれば、上記共通モチーフ（即ち、配列番号１５で表されるアミノ酸配列）は、配列番号１６又は１７で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列の一部として含まれる（存在する））。
本願明細書においてアミノ酸配列の同一性とは、対象とする２つのタンパク質間のアミノ酸配列の同一性をいい、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて作成されたアミノ酸配列の最適なアラインメントにおいて一致するアミノ酸残基の割合（％）によって表される。アミノ酸配列の同一性は、視覚的検査及び数学的計算により決定することができ、当業者に周知のホモロジー検索プログラム（例えば、BLAST、FASTA）や配列整列プログラム（例えば、ClustalW） などを用いて算出することができる。例えば、アミノ酸配列の同一性は、具体的には、DDBJ（DNA Data Bank of Japan）のウェブサイトで公開されている系統解析プログラムClustalW（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/index.php?lang=ja）を用い、初期設定の条件（Version 2.1、Alignment type: slow、DNA Weight Matrix: Gonnet、GAP OPEN: 10、GAP EXTENSION: 0.1）で求めることができる。
【００７５】
シロイヌナズナの成熟CYO2タンパク質とダイズ、イネ、トウモロコシ及びモロコシの成熟CYO2タンパク質との間の同一性は、それぞれ６６％、６６％、６１％及び６４％である。そのため本発明におけるタンパク質は、好ましい一つの態様として、配列番号１６で表されるアミノ酸配列と６１％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７６】
イネの成熟CYO2タンパク質とトウモロコシ及びモロコシの成熟CYO2タンパク質との間の同一性は、それぞれ７３％及び７７％である。そのため本発明におけるタンパク質は、好ましい一つの態様として、配列番号１７で表されるアミノ酸配列と７３％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７７】
本願明細書においてアミノ酸配列の類似性とは、対象とする２つのタンパク質間のアミノ酸配列の類似性をいい、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて作成されたアミノ酸配列の最適なアラインメントにおいて一致するアミノ酸残基及び類似性を示すアミノ酸残基の割合（％）によって表される。アミノ酸残基の類似性は、物理化学的な性質が相互に類似するアミノ酸残基の関係により示され、例えば、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）、疎水性アミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、極性アミノ酸（Ａｓｎ、Ｇｌｎ）、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、ヒドロキシル基を含むアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ）などのグループにおいて、同一のグループに属するアミノ酸同士は、相互に類似するアミノ酸残基であると理解される。このような類似性を示すアミノ酸残基は、タンパク質の表現型に影響を及ぼさないことが予測される。アミノ酸配列の類似性は、同一性と同様に視覚的検査及び数学的計算により決定することができ、当業者に周知の配列類似性検索プログラム（例えば、BLAST、PSI-BLAST、HMMER）や、遺伝情報処理ソフトウェア（例えば、GENETYX［登録商標］）などを用いて算出することができる。例えば、アミノ酸配列の類似性は、GENETYX［登録商標］ネットワーク版ver. 11.1.3（株式会社ゼネティックス）を用い、Protein vs Protein Global Homologyを初期設定の条件（Unit size to compareを２に設定する）で求めることができる。
【００７８】
シロイヌナズナの成熟CYO2タンパク質とダイズ、イネ、トウモロコシ及びモロコシの成熟CYO2タンパク質との間の類似性は、それぞれ８１％、７７％、７３％及び７６％である。そのため本発明におけるCYO2タンパク質は、好ましい一つの態様として、配列番号１６で表されるアミノ酸配列と７３％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７９】
イネの成熟CYO2タンパク質とトウモロコシ及びモロコシの成熟CYO2タンパク質との間の類似性は、それぞれ９７％及び９７％である。そのため本発明におけるCYO2タンパク質は、好ましい一つの態様として、配列番号１７で表されるアミノ酸配列と９７％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８０】
本発明におけるCYO2タンパク質は、その一態様として、上記の共通モチーフを含み、且つ配列番号１６又は１７で表されるアミノ酸配列と所定の同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を含むことに加え、さらに植物のバイオマスを増大させる活性を有することを特徴とする。
【００８１】
また、本発明におけるCYO2タンパク質として、各種植物由来のCYO2タンパク質のホモログも利用可能であり、例えば、シロイヌナズナCYO2タンパク質（成熟タンパク質を含む）又はイネCYO2タンパク質（成熟タンパク質を含む）のホモログタンパク質を用いてもよい。
【００８２】
本発明ではまた、一つの態様として、各種植物由来のCYO2タンパク質（成熟タンパク質を含む）及びそのホモログのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ植物のバイオマスを増大させる活性を有するタンパク質も含まれる。ここで、数個のアミノ酸としては、例えば、２〜１０個、２〜７個、２〜５個、５個、４個、３個、２個のアミノ酸を意味する。アミノ酸の欠失、挿入、置換又は付加は、当該技術分野において公知の方法を用いて（例えば、核酸を改変することにより）行うことができる。置換されるアミノ酸は、類似性を示すアミノ酸であることが好ましい。また、このようなアミノ酸配列は、配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００８３】
核酸への変異の導入は、Kunkel法またはGapped duplex法等又はこれに準ずる方法により行うことができる。 また、EMS（エチルメタンスルホン酸）、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、ヒドロキシルアミン、N−メチル−N’−ニトロ−Ｎニトロソグアニジン、その他の発ガン性化合物のような化学的変異剤が使用可能であり、X線、アルファ線、ベータ線、ガンマ線、イオンビーム等の放射線又は紫外線も使用可能である。
【００８４】
本願明細書において核酸とは、ヌクレオチドがリン酸エステル結合で連結した高分子を意味し、ポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの用語と互換可能に使用される。核酸の構造は、特に限定されず、１本鎖及び２本鎖のいずれであってもよい。核酸には、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）及びこれらの混成物（例えば、DNA-RNAのハイブリッド２本鎖、DNA及びRNAが１本鎖に連結されたキメラ核酸）が含まれる。核酸の構成単位には、主としてアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）等のプリン塩基及びチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）等のピリミジン塩基が含まれるが、対象のタンパク質への翻訳を行う限り、これらの修飾物も含まれる。本発明で用いられる核酸は、好ましくは対象のタンパク質をコードするmRNA又はcDNAである。
【００８５】
本発明における核酸は、上記の本発明におけるCYO2タンパク質をコードする核酸である。配列番号２、配列番号２の１７８番目〜４１１番目、配列番号１３の１５４番目〜３８４番目のいずれかで表されるヌクレオチド配列を含む核酸については、そのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ植物のバイオマスを増大させる活性を有するタンパク質をコードする核酸も、本発明に用いることができる。
【００８６】
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的に、高程度のストリンジェントな条件は 、例えば核酸の長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、０．５％程度のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含み、約６５℃、０．２×SSCないし０．１×SSC、より好ましくは０．１×SSCのハイブリダイゼーション）及び／又は洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、及びおよそ６５℃、ないし６８℃、０．２×ないし０．１×SSC、０．１％  SDSの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、SSC（１×SSCは、０．１５M NaClおよび１５mMクエン酸ナトリウムである）にSSPE（１×SSPEは、０．１５M NaCl、１０mM NaH2PO4、および１．２５mM エデト酸ナトリウム（EDTA）、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間ないし１時間程度行う。
【００８７】
本発明ではまた、一つの態様として、配列番号２、配列番号２の１７８番目〜４１１番目、配列番号１３の１５４番目〜３８４番目のいずれかで表されるヌクレオチド配列と７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有し、且つ植物のバイオマスを増大させる活性を有するタンパク質をコードする核酸も含まれる。
【００８８】
なお、配列番号２、配列番号２の１７８番目〜４１１番目、配列番号１３の１５４番目〜３８４番目に記載の塩基配列との同一性は、FASTA検索やBLAST検索により決定することができる。ポリヌクレオチドの塩基配列は、Science, 214: 1205 (1981)に記載されたジデオキシ法により決定され得る。
【００８９】
本発明における核酸及びタンパク質は、植物のバイオマスを増大させる限り特に限定されないが、双子葉植物又は単子葉植物由来であることが好ましい。あるいは、トリコカルパドロ由来であってよい。双子葉植物としては、例えば、シロイヌナズナ、ミヤマハタザオ、ヨーロッパブドウ、ダイズ、ウマゴヤシ、ダイコン、ワタ、ナタネ、テンサイ、タバコ、トマトなどが挙げられ、これらのうち好ましくはシロイヌナズナ、ダイズであり、さらに好ましくはシロイヌナズナである。単子葉植物としては、イネ、トウモロコシ、モロコシ、セイヨウヤマカモジ、コムギ、オオムギ、サトウキビ、タマネギなどが挙げられ、これらのうち好ましくはイネ、トウモロコシ、モロコシであり、さらに好ましくはイネ、トウモロコシである。
【００９０】
本発明においてバイオマスを増大させる植物は、限定されるものではないが、双子葉植物又は単子葉植物である。双子葉植物としては、シロイヌナズナ、ミヤマハタザオ、ヨーロッパブドウ、ダイズ、ウマゴヤシ、ダイコン、ワタ、ナタネ、テンサイ、タバコ、トマトなどが挙げられ、これらのうち好ましくはシロイヌナズナ、ダイズ、ワタ、ナタネ、タバコ、トマトであり、さらに好ましくはシロイヌナズナ、ダイズ、ワタ、ナタネである。単子葉植物としては、イネ、トウモロコシ、モロコシ、セイヨウヤマカモジ、コムギ、オオムギ、サトウキビ、タマネギなどが挙げられ、これらのうち好ましくはイネ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、オオムギであり、より好ましくはイネ、トウモロコシである。
【００９１】
また、上記バイオマスを増大させる植物において、その種は、導入される核酸が由来する植物種と一致していてもよく、或いは相違していてもよい。即ち、本発明は、同一種の植物由来の核酸が導入された植物（核酸が導入された植物であって、該植物の種は、該核酸が由来する植物種と同一である、前記植物）、及び異なる種の植物由来の核酸が導入された植物（核酸が導入された植物であって、該植物の種は、該核酸が由来する植物種と異なる、前記植物）のいずれをも提供することができる。また、本発明において、核酸が由来する植物が双子葉植物の場合には、導入先の植物は双子葉植物であってよく、また、核酸が由来する植物が単子葉植物の場合には、導入先の植物は単子葉植物であってよい。
【００９２】
植物におけるCYO2タンパク質をコードする核酸の発現量の増加は、例えば、増大の指標としてコントロール（親植物、非形質転換体、野生型等）を用い、植物の成熟体において当該コントロールと比較することにより評価を行うことができる。コントロールとの比較により増加が見られた場合には、CYO2タンパク質をコードする核酸の発現量を増加していると判定することができる。
【００９３】
植物におけるCYO2タンパク質をコードする核酸の発現量の増加させるための方法の一つとして、CYO2タンパク質をコードする核酸を植物に導入する方法が挙げられる。すなわち本発明の一態様は、CYO2タンパク質をコードする核酸を植物に導入するステップを含む、植物のバイオマスを増大させる方法である。
【００９４】
より具体的には、本発明の方法は、CYO2タンパク質をコードする核酸及びこれと作動可能に連結されたプロモーターを含むベクターを作製するステップ、当該ベクターを植物細胞に導入するステップ、そして核酸が導入された植物細胞から植物体を再生するステップを含む、植物のバイオマスを増大させる方法である。
【００９５】
本発明の方法において、CYO2タンパク質をコードする核酸を含む組換え発現ベクターを使用することができる。ベクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用ベクターに、所望の核酸を常法により連結することによって、調製することができる。本発明における核酸を用いて植物のバイオマスを増大させる場合には、植物形質転換用ベクターが特に有用である。 例えば、ｐＢＩ系のベクター、pBluescript系のベクター、ｐＵＣ系のベクター等を使用できる。 ｐＢＩ系のベクター等のバイナリーベクターは、アグロバクテリウムを介して植物に目的の核酸を導入できるという点で好ましい。また、pBluescript系のベクター、ｐＵＣ系ベクターは、植物に核酸を直接導入することができるという点で好ましい。さらにはpGreenシリーズ（www.pgreen.ac.uk）、pCAMBIAシリーズ（www.cambia.org）などのバイナリーベクターや、pSB11（Komari et al, 1996, Plant J, 10: 165-174）、pSB200（Komori et al, 2004, Plant J, 37: 315-325）などのスーパーバイナリーベクターも好ましく使用することができる。
【００９６】
また、上記ベクターは、植物細胞で転写可能なプロモーター配列と転写産物の安定化に必要なポリアデニレーション部位を含む転写ターミネーター配列を含むことが好ましい。当業者は、このようなプロモーターや転写ターミネーター配列を適切に選択することができる。
【００９７】
本発明における核酸とプロモーターとは直接的に連結されている必要はなく、別種の核酸を介して間接的に連結されていてもよい。プロモーターは、本発明の核酸に作動可能に連結していることが好ましい。「作動可能に連結する」とは、プロモーターがその機能を発揮するように、即ち、対象とする核酸の転写を行うように連結することを意味する。
【００９８】
プロモーターは、対象とする核酸の転写を植物細胞内で行うことができる限り、特に限定されないが、対象とする核酸を構成的に高発現させるもの、又は、外的な刺激により誘導的に発現させるものが好ましい。また、部位特異的に発現させるものであってもよいが、子葉を含む緑色組織全体で発現させることが好ましい。対象とする核酸を構成的に高発現させるプロモーターとして、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（CaMV35S）、各種ユビキチンプロモーター、各種アクチンプロモーター、タバコPR1a遺伝子プロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子プロモーター、ナピン遺伝子プロモーター、オレオシン遺伝子プロモーター等が挙げられる。
【００９９】
また、上記組換え発現ベクターには、さらに他の核酸セグメントを含んでいてもよい。当該他の核酸セグメントは特に限定されるものではないが、形質転換体選抜マーカー、エンハンサー、翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。また、上記組換え発現ベクターは、さらにT-DNA領域を有していてもよい。T-DNA領域は特にアグロバクテリウムを用いて上記組換え発現ベクターを植物体に導入する場合に遺伝子導入の効率を高めることができる。
【０１００】
形質転換体選抜マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。かかる薬剤耐性遺伝子の具体的な一例としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる 。また、除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等も利用可能である。これにより、上記抗生物質や除草剤を含む培地中で生育する植物体を選択することによって、形質転換された植物体を容易に選別することができる。
【０１０１】
翻訳効率を高めるためのヌクレオチド配列としては、例えばタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を挙げることができる。
【０１０２】
また、エンハンサーとしては、CaMV35Sプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域があげられる。このように、上記組換え発現ベクターには、その目的に応じて、さまざまな核酸セグメントを含ませることができる。
【０１０３】
組換え発現ベクターの構築方法についても特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターに、本発明における核酸、プロモーター、及びターミネーター配列、並びに必要に応じて他のDNAセグメントを所定の順序となるように導入すればよい。核酸を母体となるベクターに挿入するには、常法にしたがい、精製された核酸を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入する方法などが用いられる（例えば、Molecular Cloning, 5.61-5.63）。
【０１０４】
本発明の方法における、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するステップにおいては、CYO2タンパク質をコードする核酸は 、形質転換の対象となる植物細胞へ導入される。当該植物細胞には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、植物体中の細胞等が含まれる。
【０１０５】
植物細胞としては、上記「本発明においてバイオマスを増大させる植物」に記載した植物の細胞を好適に用いることができる。
【０１０６】
植物細胞内で対象の核酸を発現させる方法としては、当該核酸を上記の適当なベクターに組み込み、例えば、ポリエチレングリコール法、アグロバクテリウム法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（エレクトロポレーション）（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9）、リポフェクション法（GIBCO-BRL社製）、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法等の当業者に公知の方法により生体内に導入する方法が挙げられる。本発明においては、アグロバクテリウム法を好ましく使用することができる。
【０１０７】
本発明の方法における、上記核酸が導入された植物細胞から植物体を再生するステップについては、植物細胞の種類により異なるが、例えばイネであればFujimuraら（Plant Tissue Culture Lett. 2:74 (1995)）の方法が挙げられ、トウモロコシであればShillitoら（Bio/Technology 7:581 (1989)）の方法やGorden-Kammら（Plant Cell 2:603(1990)）の方法が挙げられる。上記手法により再生され、かつ栽培した形質転換植物体中の導入された外来核酸の存在は、公知のPCR法やサザンハイブリダイゼーション法によって、又は植物体中のDNAの塩基配列を解析することによって確認することができる。
【０１０８】
以上のとおり、本発明は、CYO2タンパク質をコードする核酸及びこれと作動可能に連結されたプロモーターを含むベクターを作製するステップ、当該ベクターを植物細胞に導入するステップ、そして核酸が導入された植物細胞から植物体を再生するステップを含む、植物のバイオマスを増大させる方法を提供する。
【０１０９】
なお、一旦、ゲノム内に対象の核酸が導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖又は無性生殖によりバイオマスが増大した子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料を得て、それらを基にバイオマスが増大した植物体を量産することも可能である。すなわち、本発明の方法は更に、形質転換処理を施した再分化当代である「T0世代」及び／又はT0世代を交配した後代植物を、交配するステップを含んでよい。
【０１１０】
また、本発明の一態様は、植物に内在するCYO2遺伝子を制御するネイティブプロモーターを、当該ネイティブプロモーターよりも当該CYO2遺伝子を高発現させるプロモーターに部位特異的に置換するステップを含む、植物のバイオマスを増大させる方法である。上記のとおり、光合成を行う植物は、CYO2タンパク質及びCYO2タンパク質をコードする核酸（すなわちCYO2遺伝子）を有している。植物がもともと有しているCYO2遺伝子について、これを制御するネイティブプロモーターを、当該ネイティブプロモーターよりも高発現させるプロモーターに置換することによって、CYO2遺伝子の発現量が増加し、植物のバイオマスを増大させることができる。このことはCYO2のmRNA量が増大している植物がバイオマスを増大させていることからも明らかである（図１０）。従って、このような方法も本発明に含まれる。
【０１１１】
本発明の方法の対象となる植物は、上記「本発明においてバイオマスを増大させる植物」に記載した植物である。
【０１１２】
本発明に係るプロモーターは、対象植物が内在するCYO2遺伝子を制御するネイティブプロモーターよりも高発現するプロモーターであればよく、当該CYO2遺伝子を構成的に高発現させるプロモーターがより好ましい。また、部位特異的に発現させるものであってもよいが、子葉を含む緑色組織全体で発現することが好ましい。このようなプロモーターとして、限定するものではないが、上記の「対象とする核酸を構成的に高発現させるプロモーター」を適宜使用することができる。
【０１１３】
プロモーターを部位特異的に置換する方法としては、公知のゲノム編集技術を用いることができる。限定されるものではないが、そのような方法として、CRISPR法、ZFN法やTALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）法などを好ましく用いることができる。
【０１１４】
なお、一旦、CYO2遺伝子を制御するネイティブプロモーターを、CYO2遺伝子を高発現させるプロモーターに部位特異的に置換した植物体が得られれば、該植物体から有性生殖又は無性生殖によりバイオマスが増大した子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料を得て、それらを基にバイオマスが増大した植物体を量産することも可能である。すなわち、本発明の方法は更に、プロモーターを置換した再分化当代である「T0世代」及び／又はT0世代を交配した後代植物を、交配するステップを含んでよい。
【実施例】
【０１１５】
＜遺伝子組換えシロイヌナズナの作製＞
本願発明者らは、上述の方法によってシロイヌナズナCYO2のcDNA（配列番号２）をシロイヌナズナに導入し、シロイヌナズナCYO2遺伝子が高レベルで発現している遺伝子組換えシロイヌナズナを２株得た。【０１１６】
−シロイヌナズナ形質転換体の作製−
図９に示すStep1では、シロイヌナズナの植物体をすり潰し、パウダー状にした当該植物体からNucleoSpin（登録商標） RNA II（タカラバイオ社製）を用いてRNAを抽出した。次に、このRNAから、PrimeScript RT reagent kit(タカラバイオ社製)及びPCR装置（製品名iCycler、BIORAD社製）を用いたRT-PCRによってcDNAを得た。次いで、このシロイヌナズナcDNAをテンプレートとし、配列番号３及び配列番号４のプライマーを用いてPCRを行なうことで、シロイヌナズナCYO2のcDNAを得た。この際には、Pfx50(登録商標) DNA polymerase (ライフテクノロジー社製)を用いて、94℃ (5 min)の後94℃(30 sec) 、55℃(30 sec) 、68℃(30 sec) x 30回、68℃ (5 min)の条件でPCRを行なった。【０１１７】
次に、PCRで得られたDNA断片をアガロース電気泳動で分離・精製後、pENTR(登録商標) Directional TOPO Cloning Kits (ライフテクノロジー社製)を用いて pENTR(登録商標) /D-TOPOベクターへ導入した。ここで、CYO2 cDNAを組み込んだpENTR(登録商標) /D-TOPOベクターのシークエンス解析を行い，クローニングしたcDNA断片の配列にミスがないことを確認した。【０１１８】
次に、Step2では、上記のベクターを用いて調製したCYO2 cDNA断片を植物高発現用ベクターpGWB2 (GenBank: AB289765.1)に組み込んだ。具体的には、Gatewayクローニングテクノロジー、Gateway LR Clonase II Enzyme mix (ライフテクノロジー社製)を説明書に従って用いた。【０１１９】
この方法により、pGWB2においてCaMV35Sプロモーターの下流で且つNosターミネーター配列の上流にシロイヌナズナCYO2 cDNAが挿入されたベクター（pGWB2-CYO2）を得た。【０１２０】
次に、Step3〜5では、シロイヌナズナCYO2 cDNAの発現ベクター（pGWB2-CYO2）をシロイヌナズナに導入した。導入方法は、Bechtold, Nら、"In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. "、C. R. Acad. Sci. Paris, Life Sciences 316, 194-1199 (1993)の記載に従った。【０１２１】
すなわち、Step3では、アグロバクテリウムのコンピテントセルを、CaCl2を用いた常法により作製し、プラスミドの導入を行った。【０１２２】
具体的には、上記発現ベクター（pGWB2-CYO2）１００ngを、氷上で溶解した１００μLのアグロバクテリウム（EHA101株）に加え、穏やかに混和した。次いで、コンピテントセルを３７℃のウォーターバスに移して５分間インキュベートした。【０１２３】
次いで、液体培地を加え、２８℃で２〜４時間振盪培養した。次に、試料を３０００〜５０００rpm、４℃で５分間程度遠心分離し、菌体を沈殿させた。菌体を５０〜１００μLの新しい培地に懸濁した後、カナマイシンを含む寒天培地上にこの菌体を塗布し、至適温度（２８℃）で培養した。【０１２４】
次に、Step4では、Step3で得られたアグロバクテリウムを用いてシロイヌナズナにシロイヌナズナCYO2のcDNAを導入した。【０１２５】
具体的には、まずバクトペプトンを１％、イーストエクストラクトを１％、NaClを０．５％の濃度で含むYEP培地を調製し、このYEP培地の３mLを試験管に、２０mLを三角フラスコに、２００mLを坂口フラスコに、それぞれ分注した。この培地には、使用当日にリファンピシン、ゲンタマイシン、カナマイシン及びハイグロマイシンを１／１０００量加えた。また、２．５ｇのMS粉末、５０gのスクロース、１mLのハイポネックス（登録商標）、５００μLのsilwet L-77（界面活性剤）に純水を加えて１０００mLにすることで、サスペンドバッファを調製した。【０１２６】
次に、３mLのYEP培地にアグロバクテリウムを植菌し、２８℃で一晩振盪培養した。その後２００mLのYEP培地に菌液の全量を移し、１時間ごとに吸光度(OD600)を測定し、OD600＝１．０〜１．２になるように調整した。最終的にアグロバクテリウムの菌液のOD600は１．０２３となった。【０１２７】
この菌液を５００mL遠心管へ移し，遠心機（TOMY;RX-200）を用いて５０００rpm、１０分間室温で遠心後、上清を捨てて、サスペンドバッファを遠心した菌液と同量加えてディスポピペットで混合させた。【０１２８】
この菌液を３００mLビーカーに全量移し、2カ月間育てたシロイヌナズナをビーカーに入った菌液に浸してアグロバクテリウムに感染させた後、ペーパタオルで軽く水気を拭き取った。バットのまわりにラップをまいて３日後に外した。水は感染から４日後に与え始めた。その後１カ月間水を与え続け、アグロバクテリウムに感染させたつぼみが成熟した種になるまで育てて収穫した。【０１２９】
次に、収穫した種を１／２ MS培地（Murashige and Skoog培地、日本製薬株式会社製、ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類使用、カナマイシン２５μg/mL、カルベニシリン５０μg/mL、１．５％スクロース、０．７％寒天を含む）に植えて，２３℃、２４時間明期で生育し、CYO2遺伝子を導入したシロイヌナズナの選択を行った。【０１３０】
以上の方法により、得られたシロイヌナズナの形質転換体におけるシロイヌナズナCYO2遺伝子の発現量を後述の方法で確認した結果、CYO2遺伝子の発現量が野生型と比べて２倍以上となっている遺伝子組換えシロイヌナズナの株A、Bが得られた。そこで、これらの遺伝子組換えシロイヌナズナ及び野生型シロイヌナズナについて、種々の評価を行った。ここで、形質転換に用いたシロイヌナズナと同じ種類で、遺伝子導入を行っていないシロイヌナズナを野生型シロイヌナズナとした。【０１３１】
＜シロイヌナズナ形質転換体の評価方法＞
−シロイヌナズナCYO2遺伝子の発現量の測定−
遺伝子の発現量を調べる手段として、本願発明者らは、下記の方法でCYO2遺伝子の転写量の解析を行った。【０１３２】
まず、NucleoSpin RNA II（タカラバイオ社製）のキットを用いて後述の条件で生育させたシロイヌナズナからRNAを抽出した。この際に、液体窒素を入れながら乳鉢及び乳棒を用いて植物体をすり潰し、植物体のパウダーからRNAを抽出した。【０１３３】
次に、抽出されたRNAを、PrimeScript（登録商標） RT reagent Kit (Perfect Real Time)(タカラバイオ社製)を用いてcDNAに変換した。逆転写反応液は、Primer Script Buffer ２．０μL、Primer Script RT Enzyme Mix ０．５μL、Oligo dT primer ０．５μL、Random 6mers ０．５μL、Total RNA ６．５μLを混合して調製され、順に３７℃１５分、８５℃５秒、１６℃５分の条件で反応させた。【０１３４】
得られたcDNAを、Easy Dilution(for Real Time PCR)(タカラバイオ社製)で８倍希釈した後、KAPA SYBR（登録商標） FAST ABI Prism qPCR kit（KAPA  BIOSYSTEMS社製）を用いてReal-Time PCR(qPCR)を行った。１つの試料につき２回ずつこのPCRを行った。【０１３５】
このReal-Time PCRでは、KAPA Mix １０μL、１０μL Primer (Forward) ０．８μL、純水４．４μL、及び試料のcDNA ４．０μLを混合し、９５℃３分の後、９５℃１５秒と６０℃４０秒を１サイクルとして４０サイクル処理を繰り返した。ここでは、シロイヌナズナCYO2 cDNAの増幅用プライマーとして、配列番号５のS014と、配列番号６のS015とを用いた。【０１３６】
また、内在性コントロール遺伝子の増幅用プライマーとして、配列番号７のACT2-Fと、配列番号８のARC2-Rとを用いた。このACT2-FとARC2-Rとは、シロイヌナズナのアクチンタンパク質をコードするDNAを増幅するためのプライマーである。Real-Time PCR用の装置としては、Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR system（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた。【０１３７】
−植物体の湿重量及び乾燥重量の測定−
シロイヌナズナ種子を消毒および洗浄した後，１／２濃度の MS培地（Murashige and Skoog培地、日本製薬株式会社製、ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類使用、０．５％寒天）上に播種した。その後、２３℃  明期１６時間，暗期８時間，光量４０μmol photons m-2a-1のチャンバー内で３週間生育した。【０１３８】
次に、植物体の地上部分を回収し、その際に測定した重量を湿重量とした。次に、フリーズドライヤー（製品名：FREEZE DRYER (VD-800F)、TAITEC社製）を用いたフリーズドライにより完全に乾燥させてから、当該地上部分の重量を測定し、この測定値を乾燥重量とした。【０１３９】
なお、上述のReal-Time PCRで用いたシロイヌナズナの生育条件も本測定で用いたシロイヌナズナの生育条件と同じとした。【０１４０】
−光合成活性の測定（１）−
野生型シロイヌナズナ、及び遺伝子組換えシロイヌナズナの株A、Bについて、下記の方法で光合成活性を測定した。測定は、PAM（pulse amplitude modulation）を使用した常法により行った。すなわち、光合成測定装置（製品名JUNIOR-PAM；WALZ社製）を用いて土に植えられた状態の試料の葉にパルス変調された測定光を当て、蛍光を検出した。【０１４１】
図１０は、光合成活性のパラメータを説明するための図である。本実施例では、暗所に置いたシロイヌナズナの葉に測定光を当てた際に観察される蛍光をFoとして測定した。また、暗所で測定光を当てた状態から光合成が飽和する程度の強さのパルス光（図１０中の「フラッシュ」）を当てた際に測定された蛍光の最大値をFmとした。ここで見られる蛍光の上昇は、蛍光の収率の上昇を反映しており、Fv=Fm-Foとするとき、Fv/Fmは光化学系IIの最大量子収率を示すパラメータとなる。すなわち、植物において、光化学系IIの量子収率が高い程、原則としてFv/Fmの値は大きくなる。【０１４２】
また、暗順応させたシロイヌナズナの葉に励起光を当て続けた状態で飽和パルス光を当て、クロロフィルａを完全に還元させた状態で得られる蛍光をFm'として測定した。Fm'は、蛍光の収率に影響を与える因子のうち、非光化学消光の影響だけを受ける。また、図１０に示すFは、測定光と励起光を当て続けて、測定される蛍光が定常状態になった際の蛍光の測定値である。また、蛍光が定常状態になった後、励起光の照射を停止し、葉のクロロフィルａを完全に酸化させた時の蛍光をFo'として測定した。【０１４３】
次に、これらの測定値から、ある励起光照射によって、どれだけ蛍光収率が低下するのかを表すパラメータとして、下式（１）を用いてqN（非光化学消光）を求めた。【０１４４】
qN=1-(Fm'-Fo')/(Fm-Fo)=1-Fv'/Fv    ・・・（１）
ここで、Fv'=Fm'-Fo'である。qNは、０から１の間の値をとり、当たった光が熱になる反応が大きい時に値が大きくなる。【０１４５】
また、発明者らは、非光化学消光の指標となるパラメータとして、下式（２）を用いて、NPQも求めた。【０１４６】
NPQ=(Fm-Fm')/Fm'    ・・・（２）
NPQは、Fmがどれだけ励起光によって消光されてFm'になったのかを相対的に示すパラメータである。【０１４７】
次に、下式（３）を用いて、光化学消光の指標であるqPを求めた。【０１４８】
qP=(Fm'-F)/(Fm'-Fo')    ・・・（３）
qPは０から１の間の値をとり、クロロフィルａが酸化されているほど大きい値となる。【０１４９】
次いで、下式（４）を用いてY(II)を求めた。【０１５０】
Y(II)=qP×Fv'/Fm'
=(Fm'-F)/(Fm'-Fo')×Fv'/Fm'
=(Fm'-F)/Fm'    ・・・（４）
Y(II)は、上述のように、励起光下での光化学系IIの実効量子効率を表す。【０１５１】
また、Y(II)と、葉に吸収された光の光量子密度とを含む下式（５）を用いて電子伝達の速度（ETR）を求めた。【０１５２】
ETR=Y(II)×PAR×0.84×0.5    ・・・（５）
ここで、PARは光合成有効放射であり、クロロフィルが吸収できる範囲の波長の光量子束密度（面積当たりの光量子数；単位はmol quanta m-2S-1）である。式（５）では、葉の吸収係数として０．８４を用い、光化学系Iでの光吸収量と光化学系IIでの光吸収量とはほぼ１：１であるとした。PARを変化させた条件でそれぞれETRを求め、ETRとPARの関係をプロットした。【０１５３】
−光合成活性の測定（２）−
上述の方法を用いてシロイヌナズナCYO2のcDNA（配列番号２）を導入し、シロイヌナズナCYO2のcDNAを高発現するシロイヌナズナを得た。また、空ベクター（empty vector;CYO2遺伝子を含まないpGWB2）が導入されたシロイヌナズナを得た。【０１５４】
次に、上述のCYO2の高発現株、空ベクターが導入されたシロイヌナズナ、及び野生型のシロイヌナズナ（Columbia-0）のそれぞれについて、植物光合成総合解析システム（メイワフォーシス社製LI-6400XT）を用いて光合成によって植物体に固定されたCO2の量（具体的にはCO2の濃度）を測定した。この測定においては、生存しているシロイヌナズナの葉部をチャンバー内に固定し、チャンバー内のCO2濃度を制御した状態で葉に光を当て、光合成によるCO2濃度の減少を測定する。【０１５５】
測定対象のシロイヌナズナは、いずれも播種後３週間目のものを用いた。各個体の葉部で測定を行い、１つの株につき４箇所で測定した。【０１５６】
また、この方法で得られた測定結果から、Plant, Cell and Environment (2007) 30, 1035-1040に記載された方法を用いて各シロイヌナズナのルビスコの最大カルボキシレーション効率（Vcmax）を算出した。【０１５７】
具体的には、下式（６）を用いてVcmaxを算出する。
Vcmax=[{(Cc-Γ*)/(Cc+Kc(1+O/Ko)}-Rd]/A    ・・・（６）
式（６）において、CcはルビスコにおけるCO2の分圧であり、KcはCO2の固定反応についてのルビスコのミカエリス定数であり、Oはルビスコにおける酸素分圧であり、Koは酸素によるルビスコの阻害定数であり、Γ*は光呼吸の補償点であり、Rdは光呼吸以外の呼吸によるCO2の放出である（主にミトコンドリア呼吸）。Kcは２７．２３８（Pa)、Koは１６．５８２(kPa)、Γ*は３．７４３としてVcmaxを算出した。より具体的には、上記論文のSupporting information に記載されたACi Curve Fitting Model, PCE_1710_ACi curve fitting model.xls（マクロのExcel file）を用いて算出した。
＜評価結果＞
図１１は、シロイヌナズナCYO2遺伝子の発現量（すなわち転写量）の測定結果を示す図である。同図では、野生型シロイヌナズナにおけるCYO2遺伝子の転写量を１とした場合の、遺伝子組換えシロイヌナズナの株A、BでのCYO2遺伝子の転写量を示す。【０１５８】
図１１に示すように、遺伝子組換えシロイヌナズナ（CYO2高発現体）の株A、BにおけるシロイヌナズナCYO2遺伝子の転写量は、野生型シロイヌナズナ（コントロール）に比べてそれぞれ２．８倍及び３．０倍となっていた。【０１５９】
また、図１２（ａ）、（ｂ）及び表１は、遺伝子組換えシロイヌナズナ及び野生型のシロイヌナズナの湿重量及び乾燥重量をそれぞれ示す図である。同図では、各株ごとに５つの試料を測定した平均値を示している。【０１６０】
【表１】
2015136856.tif 000003
【０１６１】
図１２（ａ）、（ｂ）及び表１に示すように、遺伝子組換えシロイヌナズナの株Aでは、湿重量と乾燥重量のいずれでも野生型シロイヌナズナに比べて有意に大きいことが確認できた（ｔ検定、P＜０．０５）。なお、株Bでは、湿重量で野生型との有意差が見られなかったが、乾燥重量では有意差が見られた。【０１６２】
この結果から、遺伝子組換えシロイヌナズナの株A、Bでは、CYO2遺伝子の転写量の増加に対応して収量も増加することが確認できた。【０１６３】
図１３は、遺伝子組換えシロイヌナズナ(CYO2高発現体)の株Aと野生型シロイヌナズナ（コントロール）とでそれぞれ光合成活性を測定した結果を示す図である。同図では、それぞれ５例ずつの試料を測定した平均値を示している。図１３に示す結果から、光合成有効放射(PAR)の値が２００~１６００mol quanta m-2S-1の測定した全範囲で遺伝子組換えシロイヌナズナのETRが野生型のシロイヌナズナよりも大きかった。また、遺伝子組換えシロイヌナズナ及び野生型シロイヌナズナのいずれにおいてもPARが高くなるにつれてETRの値も大きくなっていた。【０１６４】
このように、遺伝子組換えシロイヌナズナでは、光合成活性も向上していることが確認できた。以上の結果から、CYO2遺伝子を植物に導入することで、光合成活性を増大させてCO2の吸収及び同化を促進し、植物バイオマスを効果的に増大させられることが確認できた。【０１６５】
図１４は、遺伝子組換えシロイヌナズナ、空ベクターが導入されたシロイヌナズナ及び野生型シロイヌナズナについてCO2の固定作用を測定した結果（すなわち、上述の光合成活性の測定（２）の結果）を示す図である。同図において、横軸は測定チャンバー内のCO2濃度を示し、縦軸はCO2の植物体への固定率（すなわち、チャンバ内のCO2濃度が減少する割合）を示す。横軸のCO2濃度はCO2の分圧で表され、単位はPaである。同じCO2濃度で見た場合、CO2の固定率が大きい程、光合成によって固定されたCO2量が多いことを意味する。【０１６６】
図１４に示す結果から、測定されたほぼ全ての濃度範囲で、遺伝子組換えシロイヌナズナ（図中のCYO2ox-2)は空ベクターが導入されたシロイヌナズナ及び野生型シロイヌナズナに比べ、光合成によって有意に多量のCO2を固定できることが確認できた。また、CO2濃度が高くなるにつれ、遺伝子組換えシロイヌナズナでのCO2固定量は多くなり、且つ空ベクターが導入されたシロイヌナズナ及び野生型シロイヌナズナにおけるCO2固定量との差も大きくなることが確認できた。【０１６７】
また、図１５（ａ）は、図１４に示す測定結果から算出された、ルビスコの最大カルボキシレーション効率（Vcmax）を示す図であり、（ｂ）は、（ａ）に示す各試料でのVcmaxの算出値を示す図である。【０１６８】
図１５（ａ）、（ｂ）から、空ベクターが導入されたシロイヌナズナ（図１５（ａ）、（ｂ）に示す「empty vector」)及び野生型シロイヌナズナ（図中に示す「wild type」)ではVcmaxがそれぞれ４５．００、４５．２５とほぼ同じ値であったのに対し、遺伝子組換えシロイヌナズナ（図１５（ａ）、（ｂ）に示すCYO2ox-2）ではVcmaxが７６．２５と、前二者に対して有意に高い値を示すことが分かった。このように、CYO2遺伝子が導入されたシロイヌナズナでは、ルビスコの活性が上昇することが確認できた。【０１６９】
＜遺伝子組換えイネの作製＞
次に、本願発明者らは、イネCYO2のcDNAが導入された遺伝子組換えイネを以下の手順で作製した。【０１７０】
−イネ用高発現ベクターの作製−
図１６は、CYO2遺伝子が導入されたイネ用高発現ベクターの作製手順を示す図である。同図に示すように、トウモロコシ由来のユビキチンプロモーターを有するベクター（pXHb7-SNFI-UBIL；VIB(Plant Systems Biology)製）をテンプレートとし、フォワードのプライマーとして、配列番号９のUBIL-5を、リバースのプライマーとして配列番号１０のUBIL-3を用いたPCRを行った。PCRは、９４℃５分間の熱処理を行った後、９４℃３０秒、５５℃３０秒、６５℃２分を１サイクルとして３０サイクル行い、６５℃で５分間保持した。得られたPCR産物をベクターに導入し、DNAシークエンシングによって変異が入っていないもの（D-TOPO UBIL）を選択した。【０１７１】
また、イネCYO2 cDNAのイネへの導入には、Gateway（登録商標）システムを用いた。具体的には、バイナリーベクターpGWB1（島根大学総合科学研究支援センター  中川強教授作製）を制限酵素（HindIII）で処理した後、HindIIIを用いてD-TOPO UBILから切り出されたユビキチンプロモーターを、ライゲーション反応によってpGWB1に導入した。ユビキチンプロモーターが導入されたpGWB1をpUbGW1と称する。【０１７２】
次に、ライゲーション反応後のプラスミドを大腸菌（DB3.1）に導入した後、カナマイシン及びハイグロマイシンを加えた培地内で培養した。次に、コロニーを形成した大腸菌に対し、UBIL-5及びUBIL-3をプライマーとして用いたコロニーPCRを行い、ユビキチンプロモーターが導入された大腸菌を選択した。選択された大腸菌をTY培地を用いて増殖させてから集菌し、プラスミド（pUbGW1）を抽出した。【０１７３】
また、イネから常法により全RNAを抽出し、この全RNAを用いて常法によりcDNAを作製した。次いで、得られたcDNAを鋳型とし、配列番号１１のフォワードプライマー（OsCYO2-5）及び配列番号１２のリバースプライマー（OsCYO2-3）を用いてPCRを行った。このPCRでは、Invitrogen社のPfx50 DNAポリメラーゼを用いた。なお、このPCRでは、イネCYO2タンパク質の全長をコードするcDNA（配列番号１３）が増幅される。【０１７４】
次に、アガロースゲルを用いた電気泳動によりPCR産物から増幅されたcDNAを分離し、精製した。次いで、Invitrogen社製のpENTR/T-TOPO Cloning Kitを用いてcDNAのクローニングを行った。得られた大腸菌のクローン（OsCYO2♯2,4）から常法によりプラスミドを生成し、塩基配列に誤りが生じていないことを確認した。【０１７５】
次に、抽出されたpUbGW1に先にクローニングされたイネCYO2のcDNA（stopコドンあり）と、Gateway LR clonaseII（Invitrogen社製）とを加え、室温で１６時間反応させた。続いて、反応液７５℃で１０分間加熱して反応を止めた。【０１７６】
次に、この反応液を用いて大腸菌（DH5α）を形質転換し、当該大腸菌をカナマイシン及びハイグロマイシンを含むLBプレート上に植菌して培養した。このLBプレート上に生じたコロニーに対してコロニーPCRを行った後、PCR産物のゲル電気泳動を行うことにより、イネCYO2 cDNAが導入されていることを確認した。以上の方法により、pUbGW1においてユビキチンプロモーターの下流で且つNos T配列の上流にイネCYO2 cDNAが挿入されたベクター（pUbPro-OsCYO2ox）を得た。【０１７７】
−イネ形質転換体の作製−
上述の方法により得られた２０ｎｇのイネ用高発現ベクター（pUbPro-OsCYO2ox）をアグロバクテリウムLBA4404に公知のエレクトロポレーション法により導入した。形質転換されたアグロバクテリウムは、カナマイシン及びハイグロマイシンを用いて選択した。一方で、ネガティブコントロールとしてT-DNA上に３５Ｓプロモーターで制御されるハイグロマイシン耐性遺伝子を有するがCYO2 cDNAが挿入されていないバイナリーベクターpSB4（Komari et al, Plant J. 10: 165-174,1996参照）を用いてアグロバクテリウムLBA4404の形質転換を行った。【０１７８】
次に、pUbPro-OsCYO2oxにより形質転換されたアグロバクテリウムと、pSB4により形質転換されたアグロバクテリウムをそれぞれイネ（品種名：ゆきひかり）の未熟胚に感染させ、それぞれの形質転換体を得た。この形質転換は、文献（Hiei and Komari, Nature Protocol 3: 824-834,2008）に記載された方法により行った。【０１７９】
具体的には、以下のとおりである。温室で栽培した開花後１０日前後のイネの穂を採集した。頴をピンセットで除去した未熟種子を殺菌した後、実体顕微鏡下で１．３‐１．８ｍｍ長の未熟胚を採集した。これらの未熟胚に、２０，０００ｘｇの遠心加速度で１０分間の遠心処理を行った。アグロバクテリウムは、菌株の薬剤耐性に応じた選抜薬剤を含むＡＢ培地上にて暗黒下で、例えば２８℃３日間培養した後、１．０ｍLのAA-inf培地（AA主要無機塩類、B5微量無機塩類、B5ビタミン、AAアミノ酸、０．１ｍM  アセトシリンゴン、２０ｇg/L  ショ糖、１０g/L  グルコース、０．５g/L  ビタミンアッセイカザミノ酸、ｐＨ５．２）中へ懸濁した。懸濁濃度は、６６０nmのOD値で約１．０に調整した。次に未熟胚を、共存培養用のN6-As培地（N6無機塩類およびビタミン、１mg/L  ２，４−D、０．５mg/L  ６BA、２０g/Lショ糖、１０g/L  グルコース、０．５g/L  プロリン、０．５g/L  ビタミンアッセイカザミノ酸、８g/L  アガロース  Type I、０．１mM  アセトシリンゴン、pH５．２）上に、胚盤側を上向きにして未熟胚を置床し、アグロバクテリウムの懸濁液を滴下した。共存培養は、暗黒下にて、例えば２５℃で７日間行った。【０１８０】
共存培養後、未熟胚を４‐６分割し、胚盤側を上向きにしてnN6C培地（N6無機塩類およびビタミン、１mg/L  ２，４−D、０．５mg/L  ６BA、２０g/L  ショ糖、５５g/L  ソルビトール、０．５g/L  プロリン、０．５g/L  ビタミンアッセイカザミノ酸、５g/L  ジェランガム、２５０mg/L  セフォタキシム、１００mg/L  カルベニシリン、pH５．８）へ置床し、光量３５μmol photons m-2S-1の２４時間明条件下にて、例えば３０℃で１０日間非選抜（resting）培養を行った。各々の未熟胚切片をさらに４‐５分割し、nN6CH30（N6無機塩類およびビタミン、１mg/L  ２，４−D、０．５mg/L  ６BA、２０g/L  ショ糖、５５g/L  ソルビトール、０．５g/L  プロリン、０．５g/L  ビタミンアッセイカザミノ酸、５g/L  ジェランガム、２５０mg/L  セフォタキシム、１００mg/L  カルベニシリン、３０mg/L  ハイグロマイシンB  、pH５．８）選抜培地へ置床し、光量３５μmol photons m-2S-1の２４時間明条件下にて、例えば３０℃、１０〜１４日間ハイグロマイシンによる選抜培養を行った。【０１８１】
増殖したカルスを、N6RH30再分化培地（N6微量無機塩類およびビタミン、１／２濃度N6主要無機塩類、AAアミノ酸、０．５mg/L  カイキネチン、２０g/L  ショ糖、３０g/L  ソルビトール、０．５g/L  ビタミンアッセイカザミノ酸、４g/L  ジェランガム、３０mg/L  ハイグロマイシンB、pH５．８）へ置床し、光量３５μmol photons m-2S-1の２４時間明条件下にて、例えば３０℃、１４日間培養した。再分化培地へ置床するカルスは、細分した未熟胚切片あたり１個とした。これにより、再分化培地上に置床した各々のカルスを、独立の形質転換イベントとして扱うことができる。再分化した幼植物をN6FH30発根培地  （N6微量無機塩類およびビタミン、１／２濃度N6主要無機塩類、AAアミノ酸  、２０g/L  ショ糖、０．５g/L  ビタミンアッセイカザミノ酸、４g/L  ジェランガム、３０mg/L  ハイグロマイシンB、pH５．８）へ移植し、光量３５μmol photons m-2S-1の２４時間明条件下にて、例えば３０℃で１０〜１４日間培養した。【０１８２】
次に、発根した植物体のシュートが十分な大きさになるまで成長したら、育苗用連結ポットへ移植し、日長調節のための光量４００μmol photons m-2S-1の補光を伴う自然光下で、明期１４．５時間２８℃、暗期９．５時間２０℃の条件下、温室で生育させた。１０日後、直径１２ｃｍポットに１個体づつ移植し、同条件下で栽培を継続した。【０１８３】
以上の方法により、CYO2遺伝子が導入されたイネ形質転換体と、選抜マーカー遺伝子のみが導入されたイネ形質転換体のT0世代が各４９個体ずつ得られた。【０１８４】
温室で２７日間栽培した後、CYO2遺伝子が導入されたイネ形質転換体と、選抜マーカー遺伝子のみが導入されたイネ形質転換体（ネガティブコントロール）との生育を比較したところ、図１７に示すように、CYO2遺伝子が導入されたイネ形質転換体はネガティブコントロールの形質転換体に比べて生育が旺盛となることが確認できた。【０１８５】
その後、栽培を継続した各３６個体の草丈を測定したところ、CYO2遺伝子が導入されたイネ形質転換体の平均は４７．１ｃｍ、標準偏差が３．９４であったのに対し、ネガティブコントロールの形質転換体では草丈の平均が４３．２ｃｍ、標準偏差が５．４７となった。この結果をｔ検定により解析したところ、P値は０．０００９となり、CYO2遺伝子が導入されたイネ形質転換体の草丈はコントロールの形質転換体に比べて有意に大きいことが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１８６】
本明細書に開示された遺伝子組換えシロイヌナズナ及びその作製方法は、植物バイオマスの生産性の向上に有用である。
【図８】
2015136856.tif 000004
【図９】
2015136856.tif 000005
【図１０】
2015136856.tif 000006
【図１３】
2015136856.tif 000007
【図１６】
2015136856.tif 000008
【図１】
2015136856.tif 000009
【図２】
2015136856.tif 000010
【図３】
2015136856.tif 000011
【図４】
2015136856.tif 000012
【図５】
2015136856.tif 000013
【図６】
2015136856.tif 000014
【図７】
2015136856.tif 000015
【図１１】
2015136856.tif 000016
【図１２】
2015136856.tif 000017
【図１４】
2015136856.tif 000018
【図１５】
2015136856.tif 000019
【図１７】
2015136856.tif 000020
【配列表】
2015136856000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年10月13日(2015.10.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＹＯ２遺伝子が導入された遺伝子組換え植物であって、
前記ＣＹＯ２遺伝子がコードするタンパク質は、タンパクジスルフィドリダクターゼ活性を有しており、酸化型ルビスコを還元型ルビスコに変換することを特徴とする遺伝子組換え植物。
【請求項２】
前記ＣＹＯ２遺伝子は、配列番号１のシロイヌナズナＣＹＯ２タンパク質をコードする遺伝子、前記シロイヌナズナＣＹＯ２タンパク質に一部のアミノ酸配列を付加、置換または欠失させたタンパク質をコードする遺伝子、及び配列番号１の６０番目から１３６番目までのアミノ酸配列に相当する配列において前記シロイヌナズナＣＹＯ２タンパク質と３０％以上の相同性を示すタンパク質をコードする、シロイヌナズナ以外の光合成生物のＣＹＯ２ホモログ遺伝子から選ばれたいずれか１つであることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子組換え植物。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
前記遺伝子組換え植物は、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）、トウモロコシ（Ｚ．ｍａｙｓ）、イネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）、ミヤマハタザオ（Ａ．ｌｙｒａｔａ）、トウゴマ（Ｒ．ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ヨーロッパブドウ（Ｖ．ｖｉｎｉｆｅｒａ）、トリコカルパドロ（Ｐ．ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）、ダイズ（Ｇ．ｍａｘ）、ウマゴヤシ（Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、セイヨウヤマカモジ（Ｂ．ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）、モロコシ（Ｓ．ｂｉｃｏｌｏｒ）またはイヌカタヒバ（Ｓ．ｍｏｅｌｌｅｎｄｒｏｆｆｉｉ）であることを特徴とする請求項１〜３のうちいずれか１つに記載の遺伝子組換え植物。
【請求項５】
前記ＣＹＯ２遺伝子は、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター又はユビキチンプロモーターの下流に配置されていることを特徴とする請求項１〜４のうちいずれか１つに記載の遺伝子組換え植物。
【請求項６】
ＣＹＯ２遺伝子が導入されたアグロバクテリウムを作製するステップと、
前記アグロバクテリウムを植物に感染させるステップと、
前記アグロバクテリウムに感染した前記植物のうち、導入された前記ＣＹＯ２遺伝子が発現する株を選抜するステップとを備えている遺伝子組換え植物の作製方法。
【請求項７】
前記ＣＹＯ２遺伝子は、配列番号１のシロイヌナズナＣＹＯ２タンパク質をコードする遺伝子、または配列番号１の６０番目から１３６番目までのアミノ酸配列に相当する配列において前記シロイヌナズナＣＹＯ２タンパク質と３０％以上の相同性を示すタンパク質をコードする、シロイヌナズナ以外の光合成生物のＣＹＯ２ホモログ遺伝子であることを特徴とする請求項６に記載の遺伝子組換え植物の作製方法。
【請求項８】
前記アグロバクテリウムを作製するステップは、
カリフラワーモザイクウイルスプロモーター又はユビキチンプロモーターをバイナリーベクターに導入するステップと、
前記ＣＹＯ２遺伝子を前記バイナリーベクター内の前記カリフラワーモザイクウイルスプロモーター又は前記ユビキチンプロモーターの下流に導入するステップと、
前記カリフラワーモザイクウイルスプロモーター又は前記ユビキチンプロモーター及び前記ＣＹＯ２遺伝子が導入された前記バイナリーベクターを前記アグロバクテリウムに導入するステップとを含んでいることを特徴とする請求項６または７に記載の遺伝子組換え植物の作製方法。
【請求項９】
請求項１〜５のうちいずれか１つに記載の遺伝子組換え植物において、導入された前記ＣＹＯ２遺伝子を発現させるＣＯ２固定量の増加方法。
【請求項１０】
ＣＯ２固定量の増加方法であって、前記植物においてＣＹＯ２タンパク質をコードする核酸の発現量を増大させることを特徴とする、前記方法。
【請求項１１】
ＣＹＯ２タンパク質が、配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含み、配列番号１６または１７で表されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＹＯ２タンパク質をコードする核酸を、植物に導入するステップを含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
植物に内在するＣＹＯ２遺伝子を制御するネイティブプロモーターを、前記ネイティブプロモーターよりも前記ＣＹＯ２遺伝子を高発現するプロモーターに置換するステップを含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子組換え植物は、単子葉植物であることを特徴とする請求項１または２に記載の遺伝子組換え植物。
【国際調査報告】
2015136856.tif 000021
2015136856.tif 000022