(57)【要約】  本発明による精製大豆オリゴ糖液の製造方法は、大豆および／または大豆加工物から精製大豆オリゴ糖液を製造する方法であって、大豆および／または大豆加工物と、極性有機溶媒および水を含む含水極性有機溶媒とを混合した後、生成した沈殿物を除去して、含水極性有機溶媒を含む大豆オリゴ糖液を得る工程（１）と、前記大豆オリゴ糖液から極性有機溶媒を除去して、大豆オリゴ糖懸濁液を得る工程（２）と、前記大豆オリゴ糖懸濁液にセルラーゼを混合して、セルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液を得る工程（３）と、前記セルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液を固液分離して、精製大豆オリゴ糖液を得る工程（４）と、を含むことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆および／または大豆加工物から精製大豆オリゴ糖液を製造する方法であって、
前記大豆および／または大豆加工物と、極性有機溶媒および水を含む含水極性有機溶媒とを混合した後、生成した沈殿物を除去して、前記含水極性有機溶媒を含む大豆オリゴ糖液を得る工程（１）と、
前記大豆オリゴ糖液から極性有機溶媒を除去して、大豆オリゴ糖懸濁液を得る工程（２）と、
前記大豆オリゴ糖懸濁液にセルラーゼを混合して、セルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液を得る工程（３）と、
前記セルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液を固液分離して、精製大豆オリゴ糖液を得る工程（４）と、
を含むことを特徴とする、精製大豆オリゴ糖液の製造方法。
【請求項２】
前記セルラーゼが、β−グルコシダーゼ、セロビオハイドロラーゼ、およびエンドグルカナーゼからなる群から選択される１種または２種以上を含む、請求項１に記載の精製大豆オリゴ糖液の製造方法。
【請求項３】
前記工程（２）において、前記大豆オリゴ糖液を加熱および／または減圧して、前記極性有機溶媒を除去する、請求項１または２に記載の精製大豆オリゴ糖液の製造方法。
【請求項４】
前記工程（３）において、前記セルラーゼの混合前に、前記大豆オリゴ糖懸濁液中の全固形物濃度を、１０〜３５％（ｗ／ｗ）の範囲に調整する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の精製大豆オリゴ糖液の製造方法。
【請求項５】
前記精製大豆オリゴ糖液を、精密濾過膜、限外濾過膜、ナノ濾過膜、および逆浸透膜からなる群から選択される１種または２種以上の分離膜を用いて、更に精製する工程（５）を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の精製大豆オリゴ糖液の製造方法。
【請求項６】
前記工程（４）において、前記セルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液のｐＨを、１．０〜６．０の範囲に調製する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の精製大豆オリゴ糖液の製造方法。
【請求項７】
前記工程（４）において、前記セルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液にアルカリ土類金属塩を混合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の精製大豆オリゴ糖液の製造方法。
【請求項８】
前記工程（３）において、さらにエステラーゼを前記大豆オリゴ糖懸濁液に混合する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の精製大豆オリゴ糖液の製造方法。
【請求項９】
前記極性有機溶媒として、エタノールを用いる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の精製大豆オリゴ糖液の製造方法。
【請求項１０】
前記工程（１）において、前記大豆および／または大豆加工物と前記含水極性有機溶媒とを混合した際に、下記式（Ｉ）により算出される極性有機溶媒の濃度が、５０〜９０％（ｗ／ｗ）の範囲である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の精製大豆オリゴ糖液の製造方法。
極性有機溶媒の濃度＝含水極性有機溶媒中の極性有機溶媒の質量／（大豆および／または大豆加工物に含まれる水分の質量＋含水極性有機溶媒の全質量）  ・・・（Ｉ）
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の精製大豆オリゴ糖液の製造方法を用いて得られた精製大豆オリゴ糖液を発酵原料として用いて化学品を製造することを特徴とする化学品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大豆または大豆抽出物から精製大豆オリゴ糖液を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大豆オリゴ糖とは、大豆に含まれるスクロース、ラフィノース、スタキオースなどのオリゴ糖類の総称であり、これらは腸内の有用菌を活性化させる作用を有することから、主に健康食品としての利用が注目されている。大豆オリゴ糖は、工業的な大豆の加工工程において大量に発生する大豆ホエー、大豆モラセスなどの廃棄物にも多く含まれるため、大豆ホエーや大豆モラセスなどの廃棄物を安価な糖原料として活用することも期待されている。【０００３】
大豆ホエーや大豆モラセスなどの廃棄物に含まれる大豆オリゴ糖を用いて単糖やアルコールを製造する方法として、例えば、大豆オリゴ糖にガラクトシダーゼを作用させて単糖を得る方法（非特許文献１参照）や、大豆モラセスを直接発酵し、エタノールやブタノールを生産する方法などが開示されている（非特許文献２参照）。【０００４】
また、従来の大豆オリゴ糖の製造方法としては、大豆ホエーや脱脂大豆を原料としたものが知られている。大豆ホエーとは、大豆を蒸煮した煮汁すなわち豆乳から、さらに酸の添加などによりタンパク質を沈殿・除去した後に残る廃液であり、大豆オリゴ糖や脂質、可溶性タンパク質などを含むことが知られている。大豆ホエーを原料とした大豆オリゴ糖の製造方法としては、例えば、大豆ホエーに水酸化カルシウムを加えて加熱した後、不純物を沈殿除去して、オリゴ糖を得る方法（特許文献１参照）や、大豆ホエーを加熱した後、リン酸の添加によりｐＨを下げ、不純物を沈殿除去して、オリゴ糖を得る方法（特許文献２参照）などが開示されている。【０００５】
また、脱脂大豆とは、大豆からヘキサンなどの溶媒によって脂質を除去した残渣である。脱脂大豆を原料とした大豆オリゴ糖の製造方法としては、例えば、脱脂大豆からアルコール類水溶液でビフィズス菌増殖物質を含む濃縮物を抽出して、オリゴ糖を得る方法（特許文献３参照）や、脱脂大豆に水を加えてオリゴ糖を抽出し、抽出液から大豆オリゴ糖を得る方法（特許文献４参照）などが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭５９−１７９０６４号公報
【特許文献２】特開平４−１８７６９５号公報
【特許文献３】特開昭６２−１５５０８２号公報
【特許文献４】特開平３−２８７５９４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｒａｚｉｌｉａｎ  ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０；５３（３）：７１９−７２９
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００１；２６（５）：２９０−２９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、従来のような方法により得られた大豆オリゴ糖液は、大豆オリゴ糖の純度が低かった。また、固液分離、膜処理、発酵などにおけるハンドリング性も著しく悪かった。すなわち、従来の大豆オリゴ糖の製造方法により得られた大豆オリゴ糖液には分離困難な懸濁物質を含んでいるため、分離膜などを用いて膜処理を行うことは困難であった。また、従来のような方法により得られた大豆オリゴ糖液を発酵原料（炭素源）として用いた場合、通常の液体培地を用いる場合に比べて攪拌し難く、発酵中に凝集沈殿物を生じたり、発酵産物の精製が困難となる可能性などが考えられる。【０００９】
本発明は、かかる状況を鑑み、高純度かつハンドリング性に優れた大豆オリゴ糖液を製造することができる精製大豆オリゴ糖液の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述した課題を解決するため、本発明者らは、大豆オリゴ糖の製造方法について鋭意検討を行った。その結果、大豆オリゴ糖懸濁液にセルラーゼを混合して大豆オリゴ糖懸濁液中に残留する懸濁物質の凝集沈殿を促進させた後、大豆オリゴ糖懸濁液中の懸濁物質を除去することで、高純度かつハンドリング性に優れた大豆オリゴ糖液を得ることができることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。【００１１】
すなわち、本発明による精製大豆オリゴ糖液の製造方法は、大豆および／または大豆加工物から精製大豆オリゴ糖液を製造する方法であって、前記大豆および／または大豆加工物と、極性有機溶媒および水を含む含水極性有機溶媒とを混合した後、生成した沈殿物を除去して、前記含水極性有機溶媒を含む大豆オリゴ糖液を得る工程（１）と、前記大豆オリゴ糖液から極性有機溶媒を除去して、大豆オリゴ糖懸濁液を得る工程（２）と、前記大豆オリゴ糖懸濁液にセルラーゼを混合して、セルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液を得る工程（３）と、前記セルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液を固液分離して、精製大豆オリゴ糖液を得る工程（４）と、を含むことを特徴とする。【００１２】
本発明においては、前記セルラーゼが、β−グルコシダーゼ、セロビオハイドロラーゼ、およびエンドグルカナーゼからなる群から選択される１種または２種以上を含むことが好ましい。【００１３】
本発明においては、前記工程（２）において、前記大豆オリゴ糖液を加熱および／または減圧して、前記極性有機溶媒を除去することが好ましい。【００１４】
本発明においては、前記工程（３）において、前記セルラーゼの混合前に、前記大豆オリゴ糖懸濁液中の全固形物濃度を、１０〜３５％（ｗ／ｗ）の範囲に調整することが好ましい。【００１５】
本発明においては、得られた前記精製大豆オリゴ糖液を、精密濾過膜、限外濾過膜精、ナノ濾過膜および逆浸透膜からなる群から選択される１種または２種以上の分離膜を用いて、更に精製する工程（５）を含むことが好ましい。【００１６】
本発明においては、前記工程（４）において、前記セルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液のｐＨを、１．０〜６．０の範囲に調製することが好ましい。【００１７】
本発明においては、前記工程（４）において、前記セルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液にアルカリ土類金属塩を混合することが好ましい。【００１８】
本発明においては、前記工程（３）において、さらにエステラーゼを前記大豆オリゴ糖懸濁液に混合することが好ましい。【００１９】
本発明においては、前記極性有機溶媒として、エタノールを用いることが好ましい。【００２０】
本発明においては、前記工程（１）において、前記大豆および／または大豆加工物と前記含水極性有機溶媒とを混合した際に、下記式（Ｉ）により算出される極性有機溶媒の濃度が、５０〜９０％（ｗ／ｗ）の範囲であることが好ましい。
極性有機溶媒の濃度＝含水極性有機溶媒中の極性有機溶媒の質量／（大豆および／または大豆加工物に含まれる水分の質量＋含水極性有機溶媒の全質量）  ・・・（Ｉ）【００２１】
本発明の別の態様による化成品の製造方法は、上記いずれかの精製大豆オリゴ糖液の製造方法を用いて得られた精製大豆オリゴ糖液を発酵原料として用いて化学品を製造することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２２】
本発明では、工程（３）において、大豆オリゴ糖懸濁液に残留する懸濁物質の凝集沈殿を促進させ、工程（４）において、セルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液中の懸濁物質を固液分離して、大豆オリゴ糖懸濁液中から懸濁物質を予め除去している。このため、本発明によれば、大豆および／または大豆加工物から、高純度かつハンドリング性に優れた大豆オリゴ糖液を製造することができる。これにより、得られた精製大豆オリゴ糖液は、膜分離を容易に行なうことができると共に、発酵原料として使用する場合には攪拌を容易に行なうことができ、かつ凝集沈殿を生じることがなく発酵産物の精製を更に容易に行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】エタノール濃度の経時変化を示す図である。
【図２】エタノール濃度の経時変化を示す図である。
【図３】エタノール濃度の経時変化を示す図である。
【図４】乳酸濃度の経時変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。
【００２５】
＜精製大豆オリゴ糖液の製造方法＞
本発明による精製大豆オリゴ糖液の製造方法の各工程について説明する。
【００２６】
［工程（１）：極性有機溶媒による大豆オリゴ糖の回収］
工程（１）では、大豆および／または大豆加工物を、極性有機溶媒および水を含む含水極性有機溶媒に添加して、大豆および／または大豆加工物と、極性有機溶媒および水を含む含水極性有機溶媒とを混合する。これにより、大豆および／または大豆加工物由来のタンパク質を主成分とする沈殿物が含水極性有機溶媒中に形成される。
【００２７】
なお、本明細書において、大豆とは、生大豆のことであり、皮付きの大豆、皮を除去した大豆のどちらであってもよい。また、予め粉砕してもよい。大豆加工物は、大豆オリゴ糖を含むものであればよく、例えば、大豆を水に浸漬したもの、大豆を熱水で抽出して得られる豆乳、大豆を熱水で抽出した際の固形残渣であるオカラ、豆乳から酸沈殿などによりタンパク質などを沈殿除去して得られる大豆ホエー、または大豆から溶媒抽出により脂質を抽出除去した残渣である脱脂大豆などが好ましく用いられる。また、オリゴ糖とは、２〜１０個の単糖がグリコシド結合によって結合した化合物である。また、大豆オリゴ糖とは、大豆に含まれるオリゴ糖の総称であり、主にスクロース、ラフィノース、スタキオースなどを含んで構成されている。大豆オリゴ糖液とは、大豆オリゴ糖を含む溶液をいう。
【００２８】
含水極性有機溶媒とは、上記極性有機溶媒と水との混合液である。極性有機溶媒は、大豆オリゴ糖を溶解でき、かつ大部分のタンパク質が溶解しないものであればよく、極性有機溶媒としては、例えば、エタノール、メタノール、アセトン、アセトニトリル、プロパノール、ブタノール、イソブタノール、プロパンジオール、ブタンジオールなどが使用できる。大豆オリゴ糖を食品用途などに使用することを考慮すると、極性有機溶媒としては、特にエタノールを用いることが好ましい。
【００２９】
大豆および／または大豆加工物と含水極性有機溶媒とを混合した際の、極性有機溶媒の濃度は、式（Ｉ）：
極性有機溶媒の濃度＝含水極性有機溶媒中の極性有機溶媒の質量／（大豆および／または大豆加工物に含まれた水分の質量＋含水極性有機溶媒の全質量）  ・・・（Ｉ）
により算出される。
【００３０】
上記式（Ｉ）により算出される、前記極性有機溶媒の濃度は、５０〜９０％（ｗ／ｗ）の範囲であることが好ましい。極性有機溶媒の濃度が９０％（ｗ／ｗ）以下の場合には、大豆オリゴ糖が析出して沈殿することを抑制でき、極性有機溶媒の濃度が５０％（ｗ／ｗ）以上の場合には、タンパク質を中心とする不純物の沈殿物が十分形成されるからである。
【００３１】
含水極性有機溶媒の添加量は、後述の、含水極性有機溶媒を含む大豆オリゴ糖液（以下、「極性有機溶媒含有オリゴ糖液」ともいう）中の大豆オリゴ糖濃度が１〜３０％（ｗ／ｗ）の範囲となる添加量であることが好ましく、１０〜２５％（ｗ／ｗ）の範囲となる添加量であることがより好ましい。極性有機溶媒含有オリゴ糖液中の大豆オリゴ糖濃度が、１％（ｗ／ｗ）以上の場合には、その後の工程において、大豆オリゴ糖を濃縮するためのエネルギーまたはコストを抑制できる。また、極性有機溶媒含有オリゴ糖液中の大豆オリゴ糖濃度が、３０％（ｗ／ｗ）以下の場合には、大豆オリゴ糖が析出して沈殿することを抑制でき、大豆オリゴ糖の収率が損なわれることを抑制できる。なお、大豆オリゴ糖濃度は、従来より公知の装置を用いて測定することができ、例えば、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ)を用いて標品との比較により定量し、求めることができる。
【００３２】
また、本明細書において、大豆オリゴ糖濃度とは、特に断りのない限り、スクロース、ラフィノース、およびスタキオースの濃度の和をいう。
【００３３】
大豆および／または大豆加工物と含水極性有機溶媒との混合時間は、１分〜１０時間が好ましく、１０分〜３時間であることが最も好ましい。混合時間が１分以上であれば、タンパク質を中心とする不純物の沈殿物が十分形成される。また、混合時間が１０時間あれば、タンパク質を中心とする不純物の沈殿量は最大となり、それ以上の余分な時間を抑制できる。
【００３４】
大豆および／または大豆加工物と含水極性有機溶媒との混合時の温度は、１０℃〜９０℃が好ましく、２０℃〜４０℃がより好ましい。混合時の温度が１０℃以上の場合には、大豆オリゴ糖が含水極性有機溶媒中に析出するのを抑制できる。また、混合時の温度が９０℃以下の場合には、オリゴ糖の分解が起きることを抑制することができる。また、混合時の温度が９０℃以下の場合には、メイラード反応により褐変を生じる可能性を低くすることができる。
【００３５】
次に、大豆および／または大豆加工物と含水極性有機溶媒とを混合した後、大豆オリゴ糖を含む含水極性有機溶媒と、含水極性有機溶媒中に形成された沈殿物とを固液分離し、沈殿物を除去する。
【００３６】
固液分離の方法は、特に限定されるものではなく、従来より公知の一般の固液分離の方法を使用することができる。固液分離の方法として、例えば、遠心分離、フィルタープレス、ベルトフィルター、自然沈降による分離、メッシュスクリーンによる濾過、不織布による濾過、濾紙による濾過などが挙げられる。極性有機溶媒と沈殿物との固液分離方法は、単独で用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。中でも、粒子状の固形物を効率よく除去でき、かつ除去した固形物を圧搾することで、より多くの極性有機溶媒含有オリゴ糖液を回収することができるという観点から、フィルタープレスを用いることが最も好ましい。
【００３７】
固液分離の方法を用いて、大豆オリゴ糖を含む極性有機溶媒から沈殿物を除去した後、極性有機溶媒を含むオリゴ糖液（極性有機溶媒含有オリゴ糖液）を回収する。
【００３８】
［工程（２）：極性有機溶媒の除去］
工程（２）では、上記工程（１）で回収した、極性有機溶媒含有大豆オリゴ糖液から極性有機溶媒を除去し、大豆オリゴ糖懸濁液を得る。
【００３９】
極性有機溶媒含有大豆オリゴ糖液から極性有機溶媒を除去する方法としては、極性有機溶媒含有オリゴ糖液を、加熱および／または減圧して、極性有機溶媒を蒸発させて除去する方法が好適に用いられる。極性有機溶媒を蒸発させて除去する方法に用いる装置は、特に限定されるものではなく、例えば、エバポレーター、加熱缶、効用缶、多重効用缶などを用いることができる。
【００４０】
極性有機溶媒を蒸発させる場合の温度は、１０〜６０℃が好ましい。１０℃以上であれば、極性有機溶媒の蒸発量は十分であり、また、６０℃以下であれば、メイラード反応による褐変を引き起こす可能性を低くすることができるためである。
【００４１】
大豆オリゴ糖懸濁液に残留する極性有機溶媒の濃度は、後述の工程（３）において酵素を阻害しないか、または失活させない濃度であればよく、例えば、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）以下が好ましく、１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）以下がさらに好ましい。
【００４２】
また、本工程において、蒸発により、極性有機溶媒を極性有機溶媒含有大豆オリゴ糖液から除去した場合、蒸発した極性有機溶媒は、冷却トラップなどに回収し、再び工程（１）の極性有機溶媒として再利用することができる。
【００４３】
本工程で得られる大豆オリゴ糖懸濁液は、大豆ホエーなどと比較してタンパク質や脂質が低減されており、大豆オリゴ糖の粗精製液ともいえる。しかし、依然として、大豆オリゴ糖純度が低く、また分離困難な懸濁物質を含むため、膜濾過などを用いて大豆オリゴ糖懸濁液を精製する方法や濃縮する方法を適用することは困難である。そこで、本発明では、下記工程（３）および工程（４）によって、さらに大豆オリゴ糖懸濁液中の懸濁物質を除去している。
【００４４】
なお、本発明において、大豆オリゴ糖純度とは、下記式（１）の通り、スクロース、ラフィノース、スタキオースなどの各オリゴ糖の質量の合計値（ｇ）を、水溶液中の全固形物（以下、ＴＳともいう。）の質量（ｇ）によって除した値とする。なお、全固形物は、蒸発残留物に相当する。
オリゴ糖純度（％）＝各オリゴ糖（スクロース、ラフィノース、スタキオース）の質量の合計値（ｇ）／全固形物の質量（ｇ）  ・・・（１）
【００４５】
［工程（３）：大豆オリゴ糖懸濁液のセルラーゼ処理］
工程（３）では、工程（２）で得られた大豆オリゴ糖懸濁液にセルラーゼを混合し、大豆オリゴ糖懸濁液にセルラーゼ処理を施したセルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液を得る。工程（３）において、大豆オリゴ糖懸濁液中の不純物にセルラーゼを作用させることにより、大豆オリゴ糖懸濁液に残留する懸濁物質の凝集沈殿を促進させることができる。なお、本明細書では、大豆オリゴ糖懸濁液にセルラーゼを混合し、大豆オリゴ糖懸濁液中の不純物にセルラーゼを作用させることを、セルラーゼ処理という。
【００４６】
上述の工程（２）で得られた大豆オリゴ糖懸濁液には、大豆オリゴ糖の他に様々な不純物が含まれる。不純物としては、脂質が最も多く含まれ、次いで、サポニン、イソフラボン、レシチンなどの両親媒性物質が含まれる。また、大豆オリゴ糖懸濁液は、さらに微量のタンパク質を含んでいる。脂質、両親媒性物質、およびタンパク質などのこれら不純物が複合的に作用し、大豆オリゴ糖懸濁液中に非常に安定なミセル状の懸濁物質を形成しているため、これら不純物とオリゴ糖とを分離することは困難である。本発明においては、本工程において、大豆オリゴ糖懸濁液にセルラーゼを添加して混合し、大豆オリゴ糖懸濁液中の不純物にセルラーゼを作用させることにより、大豆オリゴ糖懸濁液に残留する懸濁物質の凝集沈殿を促進させることができる。このため、大豆オリゴ糖懸濁液中の大豆オリゴ糖と懸濁物質との固液分離の性能を格段に向上させることができる。これは、セルラーゼにより、不純物中のサポニンやイソフラボン中の糖鎖が分解され、両親媒性物質としての性質を失うことなどが原因であると考えられる。
【００４７】
なお、本発明において、セルラーゼとは、糖鎖中のβ−グルコシド結合の加水分解を触媒する酵素の総称であり、β−グルコシダーゼ、セロビオハイドロラーゼ、およびエンドグルカナーゼからなる群から選択される１種または２種以上の成分が含まれる酵素また酵素剤のことをいう。
【００４８】
β−グルコシダーゼとは、セロビオースを加水分解する活性を有する酵素のことをいう。セロビオース分解活性（以下、「ＢＧＬ活性」ともいう）は、セロビオースを基質として酵素を作用させた際に遊離してくるグルコースの量より測定することができる。ＢＧＬ活性は、例えば、「Ｐｕｒｅ  ＆  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．、Ｖｏｌ．５９、Ｎｏ．２、２５７−２６８ページ」に記載の“Ｃｅｌｌｏｂｉａｓｅ  ａｓｓａｙ”の方法に従って測定することができる。具体的には、例えば、５０℃、ｐＨ５．０の反応条件において活性測定を行い、酵素液１ｍＬあたりのＢＧＬ活性（単位は、Ｕ／ｍＬ）などとして算出できる。なお、本発明においては、ＢＧＬ活性１単位（Ｕ）を、「セロビオース分解反応において、１分間に１μｍｏｌのセロビオースを分解する（または、１分間に２μｍｏｌのグルコースを生成する）酵素活性」と定義する。
【００４９】
また、本発明においては、β−ガラクトシダーゼなど他の酵素に一般に分類される酵素であっても、その酵素が上記ＢＧＬ活性を有する場合は、これをβ−グルコシダーゼの１種と見なすものとする。
【００５０】
セロビオハイドロラーゼとは、結晶性セルロースを末端から分解する活性を有する酵素のことをいう。結晶性セルロース分解活性は、結晶性セルロースを基質として酵素を作用させた際に遊離してくるグルコース量より測定することができる。結晶性セルロース分解活性の具体的な測定方法として、「Ｐｕｒｅ  ＆  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．、Ｖｏｌ．５９、Ｎｏ．２、２５７−２６８ページ」の“ＦＩＬＴＥＲ  ＰＡＰＥＲ  ＡＳＳＡＹ  ＦＯＲ  ＳＡＣＣＨＡＲＩＦＹＩＮＧ  ＣＥＬＬＵＬＡＳＥ”に記載の方法などを使用できる。
【００５１】
エンドグルカナーゼとは、非結晶性セルロースを中心から切断する活性を有する酵素のことをいう。非結晶性セルロース分解活性は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を基質として酵素を作用させた際に遊離してくる還元糖の量より測定することができる。非結晶性セルロース分解活性の具体的な測定方法として、例えば、「Ｐｕｒｅ  ＆  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．、Ｖｏｌ．５９、Ｎｏ．２、２５７−２６８ページ」の“ＣＡＲＢＯＸＹＬ  ＣＥＬＬＵＬＡＳＥ  ＡＳＳＡＹ  ＦＯＲ  ＥＮＤＯ−β−１，４−ＧＬＵＣＡＮＡＳＥ”に記載の方法などを使用できる。
【００５２】
本発明において使用するセルラーゼは、使用量をタンパク質量が等しくなるように統一した場合、β−グルコシダーゼ比活性（ＢＧＬ比活性）が高いものほど、懸濁物質の凝集沈殿の促進効果が高い。なお、ＢＧＬ比活性とは、酵素剤に含まれるタンパク質量当たりのＢＧＬ活性のことである。本発明においては、ＢＧＬ比活性は、ブラッドフォード法によって測定した酵素液中のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）の値で、酵素液１ｍＬ当たりのＢＧＬ活性の測定値（Ｕ／ｍＬ）を除した値として算出する（単位は、Ｕ／ｍｇ）。
【００５３】
本発明で使用するセルラーゼのＢＧＬ比活性は、例えば、１Ｕ／ｍｇ以上であることが好ましい。セルラーゼのＢＧＬ比活性が、１Ｕ／ｍｇ以上であれば、懸濁物質の凝集沈殿の促進効果を十分高くすることができる。
【００５４】
また、本発明において、β−グルコシダーゼのみを含む精製品と、β−グルコシダーゼに加えてセロビオハイドロラーゼ、エンドグルカナーゼなどの他の成分を含むセルラーゼ製剤とを比較した場合には、ＢＧＬ活性が同等であっても、β−グルコシダーゼと他の成分を含むセルラーゼ製剤の方が格段に懸濁物質の凝集沈殿の促進効果は高い。これは、工程（３）においては、β−グルコシダーゼとその他のセルラーゼ成分が協奏的に働き、効果を高めているためと推察される。
【００５５】
本発明において、セルラーゼ処理時のｐＨは、酵素の至適ｐＨにおいて最も懸濁物質の凝集沈殿の促進効果が高くなるため、セルラーゼ処理時のｐＨは酵素の至適ｐＨとすることが好ましい。なお、セルラーゼ製剤の至適ｐＨは、通常４〜６程度であり、上述のプロセスを経て得られる懸濁液のｐＨが通常４．５〜５．５程度であることから、ｐＨ調整は適宜必要な場合にのみ行うようにすればよい。
【００５６】
本発明において、セルラーゼ処理時の大豆オリゴ糖懸濁液の温度は、使用するセルラーゼの至適温度とすることが好ましい。セルラーゼの至適温度は、５０℃前後である場合が多く、使用するセルラーゼに応じて適宜調整することが好ましい。
【００５７】
本発明において、大豆オリゴ糖懸濁液中の全固形物濃度（ＴＳ濃度）は、セルラーゼの混合前に、１０〜３５％（ｗ／ｗ）の範囲に調整することが好ましい。全固形物濃度が３５％（ｗ／ｗ）以下の場合には、懸濁物質の凝集沈殿が十分に促進されるため、必要となるセルラーゼの添加量を抑えることができる。これは、全固形物濃度を３５％（ｗ／ｗ）以下とすることにより、大豆オリゴ糖懸濁液の水分活性が高められ、それによってセルラーゼの作用が向上するためと考えられる。また、全固形物濃度が１０％（ｗ／ｗ）以上の場合には、最終的に得られるオリゴ糖の濃度が低下することを抑制できる。
【００５８】
なお、ＴＳ濃度とは、水溶液中の全固形物（ＴＳ）の質量を、全水溶液の質量で除した値（単位は、％（ｗ／ｗ））である。また、水溶液中のＴＳの質量は、例えば、赤外式水分計（ＦＤ−７２０、Ｋｅｔｔ社製）など従来公知の装置を使用して測定することができる。
【００５９】
本発明において、セルラーゼの添加量、およびセルラーゼ処理の時間は、特に限定されず、懸濁物質の凝集沈殿が十分に促進されるように調節すればよい。一般に、セルラーゼ添加量を増やせば、セルラーゼのコストが増大するが、必要な処理時間は短くなり、設備コストが低減できる。一方、セルラーゼ添加量を減らせば、セルラーゼのコストは低減できるが、必要な処理時間は長くなり、設備コストが増大する。そのためセルラーゼの添加量および処理時間は、大豆オリゴ糖の生産スケジュールなどの状況に応じて適宜調節することが好ましい。
【００６０】
本発明の工程（３）において、セルラーゼ処理時に、さらにエステラーゼを大豆オリゴ糖懸濁液に混合することが好ましい。大豆オリゴ糖懸濁液にエステラーゼも加えることにより、更に著しく懸濁物質の凝集沈殿を促進することができる。これは、大豆オリゴ糖懸濁液に含まれるレシチン、またはサポニン、イソフラボンの糖鎖部分に存在するエステル結合がエステラーゼによって分解されるためであると推察される。エステラーゼの種類は、特に限定されないが、工業的に比較的安価に使用できるリパーゼなどが好適に用いられる。
【００６１】
［工程（４）：精製大豆オリゴ糖液の回収］
本発明の工程（４）では、上記工程（３）で得られたセルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液を固液分離して、工程（３）で大豆オリゴ糖懸濁液中に凝集沈殿させた懸濁物質を除去し、精製大豆オリゴ糖液を得る。この得られた精製大豆オリゴ糖液は、オリゴ糖の純度は高く、濁度は低く、かつ濾過膜に通した際の濾過速度は高いことから、精製大豆オリゴ糖液は、高純度かつハンドリング性に優れる。
【００６２】
固液分離の方法は、特に限定されず、上記工程（１）と同様の固液分離の方法を用いることができるが、中でも遠心分離が好ましく、特に、連続的にセルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液の上清の回収を行うことができる連続遠心機を用いることが最も好ましい。連続遠心機としては、例えば、スクリューデカンタやデラバル型の遠心機などが好適に用いられる。
【００６３】
セルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液を固液分離する時のセルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液のｐＨは、１．０〜６．０の範囲であることが好ましく、２．０〜３．０であることがさらに好ましい。セルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液のｐＨが１．０以上の場合には、オリゴ糖の加水分解が起こり難い。一方、セルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液のｐＨが６．０以下の場合には、セルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液の固液分離を良好に行うことができるため、好ましい。また、ｐＨ２〜３の範囲で固液分離を行なうことにより、さらに著しく清澄で膜濾過の容易なオリゴ糖液が得られるため、ｐＨは２〜３の範囲とすることが最も好ましい。なお、上記工程（３）で得られるセルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液のｐＨは、通常４．５〜５．５程度であるため、必要に応じてｐＨ調整を行えばよい。
【００６４】
セルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液のｐＨ調整に使用する酸またはアルカリは、特に限定されるものではない。酸としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などが挙げられ、好ましくは、発酵時の阻害が起こりにくいという観点から、硫酸、硝酸、リン酸であり、より好ましくは、経済性の観点から、硫酸である。アルカリとしては、好ましくは、経済性の観点から、アンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウムとそれらを含む水溶液であり、より好ましくは、膜ファウリングの観点から、１価イオンであるアンモニア、水酸化ナトリウムであり、さらに好ましくは、発酵時の阻害が起こり難いという観点から、アンモニアである。
【００６５】
セルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液のｐＨの調整は、固液分離を行う直前、または固液分離と同時に行ってもよいが、ｐＨの調整はセルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液の固液分離を行う前に行い、固液分離を開始するまで一定時間静置することにより、さらに効果を高めることができる。例えば、セルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液のｐＨ調整後、１時間静置した後、固液分離を行うなどの方法が挙げられる。
【００６６】
本発明においては、セルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液に、アルカリ土類金属塩を添加することが好ましい。セルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液の固液分離を行う前または同時に、アルカリ土類金属塩を混合することにより、更に清澄な精製大豆オリゴ糖液を得ることができる。これは、セルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液中の脂肪酸塩が、アルカリ土類金属とカチオンを交換し、不溶性の塩を形成するためと推察される。更に清澄な精製大豆オリゴ糖液を得ることで、精製大豆オリゴ糖液を膜濾過する際の濾過速度を更に向上させることができる。
【００６７】
アルカリ土類金属塩としては、炭酸カルシウム、塩化カルシウムなどが好ましく使用できる。また、添加するアルカリ土類金属の濃度は、特に限定されないが、アルカリ土類金属塩の添加後のセルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液中のアルカリ土類金属塩の終濃度が、５〜２０ｇ／Ｌの範囲であることが好ましい。セルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液中のアルカリ土類金属塩の終濃度が、５ｇ／Ｌ以上の場合には、不純物の除去が十分行われ、セルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液中の終濃度が、２０ｇ／Ｌ以下の場合には、アルカリ土類金属を添加した分の効果が十分得られると共に試薬コストの増大を抑制できるため、経済的に好ましい。
【００６８】
このように、本発明による精製大豆オリゴ糖液の製造方法は、上記工程（１）〜工程（４）を含んでおり、工程（３）において、大豆オリゴ糖懸濁液に残留する懸濁物質の凝集沈殿を促進させ、工程（４）において、セルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液中の懸濁物質を除去することにより、純度および清澄性の高い精製大豆オリゴ糖液を得ることができる。
【００６９】
工程（４）で得られる精製大豆オリゴ糖液は、懸濁物質をほとんど含まない清澄な大豆オリゴ糖液であるため、膜分離を容易に行なうことができる。また、工程（４）で得られる精製大豆オリゴ糖液を発酵原料として使用した場合、精製大豆オリゴ糖液の攪拌などを容易に行なうことができると共に、凝集沈殿を生じることもなく、更に発酵産物の精製も容易である。よって、本発明による精製大豆オリゴ糖液の製造方法によれば、大豆および／または大豆加工物から、高純度かつハンドリング性に優れた大豆オリゴ糖液を製造することができる。
【００７０】
また、工程（４）で得られる精製大豆オリゴ糖液は、工程（２）で得られる大豆オリゴ糖懸濁液または工程（３）で得られるセルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液を発酵原料として用いる場合よりも、微生物の増殖速度や化学品の生産速度、蓄積濃度を高くすることができる。これは、セルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液中の懸濁物質に含まれる、微生物の増殖や代謝を阻害する何らかの物質（以下、発酵阻害物質ともいう）が、工程（４）においてセルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液中から除去されるためと考えられる。
【００７１】
工程（４）で得られる精製大豆オリゴ糖液は、そのまま食品原料、医薬品原料、微生物による化学品などの発酵産物の発酵生産における発酵原料（炭素源）などのさまざまな用途に使用することができ、これら食品、医薬品、微生物による化学品などの発酵産物の製造の効率化を図ることができる。化学品としては、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類や、酢酸、乳酸、アミノ酸などが挙げられる。また、精製大豆オリゴ糖液は、精製大豆オリゴ糖液の水分を蒸発させることにより、粉末のオリゴ糖に加工することもできる。さらに、精製大豆オリゴ糖液は、膜濾過も容易に行なうことができるため、さらに高度に精製された大豆オリゴ糖を製造するための原料として用いることも可能である。
【００７２】
また、工程（４）で得られる精製大豆オリゴ糖液に、α−ガラクトシダーゼ、インベルターゼ、スクラーゼなどの酵素を作用させることにより、大豆オリゴ糖をガラクトース、グルコース、フルクトースの単糖に分解することができる。得られた単糖は、糖原料に使用することができる。糖原料は、食品、飼料、微生物による化学品の発酵生産における発酵原料などに好適に用いることができる。なお、上記微生物による化学品の発酵生産では、発酵生産の前または同時に上記酵素によるオリゴ糖から単糖への分解を行ってもよい。
【００７３】
［他の工程］
（工程（５）：膜濾過による精製大豆オリゴ糖液の更なる精製）
上述の通り、本発明においては、工程（４）で得られた精製大豆オリゴ糖液を、濾過して、さらに精製する工程（５）を含むことができる。精製大豆オリゴ糖液の更なる精製のための濾過に使用する分離膜として、精密濾過膜、限外濾過膜、ナノ濾過膜、および逆浸透膜などが用いられる。濾過に使用される膜としては、これらを１種単独で使用してもよいし、または２種以上を併用してもよい。精密濾過膜を使用した場合、精製大豆オリゴ糖液よりミクロンオーダーの大きさの粒子状の不純物を除去することができる。また、限外濾過膜を使用した場合、タンパク質などの高分子の不純物を除去することができる。また、ナノ濾過膜または逆浸透膜を使用した場合、低分子の不純物の一部を除去すると同時に、大豆オリゴ糖を濃縮することができる。
【００７４】
本発明の工程（２）で得られる大豆オリゴ糖懸濁液、および工程（３）で得られるセルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液は、膜濾過性が悪く、即座に上記各種濾過膜の目詰まりを引き起こすため、上記各種濾過膜を用いた膜濾過による精製は非常に困難である。これに対し、本発明で得られる精製大豆オリゴ糖液は、膜濾過性が良いため、上記分離膜に通して処理することにより、ミクロンオーダーの粒子や高分子、イオンなどが除去でき、更に精製された清澄性の高い精製大豆オリゴ糖液を得ることができる。
【００７５】
濾過の方法としては、圧濾過、真空濾過、遠心濾過などがあるが特に限定されるものではない。また濾過操作として、定圧濾過、定流量濾過、非定圧非定流量濾過に大別されるが特に限定されない。また濾過操作としては、上記分離膜のいずれかを２回以上使用する多段的な濾過でもよく、またその際使用する膜の素材および性状に関しても特に限定されるものではない。
【００７６】
また、精製大豆オリゴ糖液を、限外濾過膜、ナノ濾過膜、および逆浸透膜のいずれか１つ以上を用いて濾過する場合、精製大豆オリゴ糖液を予め精密濾過膜に通しておくことが好ましい。精製大豆オリゴ糖液を予め精密濾過膜に通して処理し、精製大豆オリゴ糖液に含まれるミクロンオーダーの大きさの粒子を除去しておくことにより、精製大豆オリゴ糖液を限外濾過膜、ナノ濾過膜、および逆浸透膜に通した際に、これらの膜の目詰まりを抑制することができる。
【００７７】
また、精製大豆オリゴ糖液を、ナノ濾過膜および／または逆浸透膜を用いて濾過する場合、精製オリゴ糖液を予め限外濾過膜に通しておくことが好ましい。精製大豆オリゴ糖液を予め限外濾過膜に通じて処理し、精製大豆オリゴ糖液に含まれるタンパク質などの高分子成分を除去しておくことにより、精製大豆オリゴ糖液をナノ濾過膜および／または逆浸透膜に通した際に、これらの膜の目詰まりを抑制することができる。
【００７８】
なお、本発明に使用する精密濾過膜とは、平均細孔径が０．０１μｍ〜１０μｍである膜のことであり、ＭＦ（Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）膜などと略称されるものである。また、本発明に使用する限外濾過膜とは、分画分子量が１，０００〜２００，０００となる膜のことであり、ＵＦ（Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）膜などと略称されるものである。ここで、限外濾過膜は、孔径が小さすぎて膜表面の細孔径を電子顕微鏡などで計測することが困難であり、平均細孔径の代わりに分画分子量という値を孔径の大きさの指標とすることになっている。分画分子量とは、日本膜学会編 膜学実験シリーズ 第ＩＩＩ巻 人工膜編 編集委員／木村尚史・中尾真一・大矢晴彦・仲川勤（１９９３ 共立出版） Ｐ９２に、『溶質の分子量を横軸に、阻止率を縦軸にとってデータをプロットしたものを分画分子量曲線とよんでいる。そして阻止率が９０％となる分子量を膜の分画分子量とよんでいる。』とあるように、限外濾過膜の膜性能を表す指標として当業者には周知のものである。
【００７９】
これら精密濾過膜または限外濾過膜の材質としては、上述した微粒子の除去という本発明の目的を達成できるものであれば、特に限定されるものではないが、セルロース、セルロースエステル、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、塩素化ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリフッ化ビニリデン、ポリ４フッ化エチレンなどの有機材料、ステンレスなどの金属、またはセラミックなどの無機材料が挙げられる。精密濾過膜または限外濾過膜の材質は、加水分解物の性状、またはランニングコストを鑑みて適宜選択すればよいが、有機材料であることが好ましく、塩素化ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホンであることが好ましい。
【００８０】
また、精密濾過膜および限外濾過膜を用いた濾過方法としては、例えば、国際公開第２０１０／０６７７８５号に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００８１】
本発明で使用するナノ濾過膜とは、ＮＦ膜とも呼ばれるものであり、「一価のイオンは透過し、二価のイオンを阻止する膜」と一般に定義される分離膜である。ナノ濾過膜は、数ナノメートル程度の微小空隙を有していると考えられる膜で、主として、水中の微小粒子や分子、イオン、塩類などを阻止するために用いられる。
【００８２】
ナノ濾過膜を形成する材料としては、酢酸セルロース系ポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ビニルポリマーなどの高分子素材を使用することができるが、前記１種類の素材で構成される膜に限定されず、複数の膜素材を含む膜であってもよい。また、ナノ濾過膜の膜構造は、膜の少なくとも片面に緻密層を持ち、緻密層から膜内部またはもう片方の面に向けて徐々に大きな孔径の微細孔を有する非対称膜や、非対称膜の緻密層の上に別の素材で形成された非常に薄い機能層を有する複合膜のどちらでもよい。複合膜としては、例えば、ポリスルホンを膜素材とする支持膜にポリアミドの機能層からなるナノフィルターを構成させた複合膜を用いることができる。このような複合膜としては、例えば、特開昭６２−２０１６０６号公報などに記載されている。
【００８３】
これらの中でも、高耐圧性、高透水性、および高溶質除去性能を兼ね備え、優れたポテンシャルを有する、ポリアミドを機能層とした複合膜が好ましい。操作圧力に対する耐久性と、高い透水性、阻止性能を維持できるためには、ポリアミドを機能層とし、それを多孔質膜や不織布からなる支持体で保持する構造のものが適している。また、ポリアミド半透膜としては、多官能アミンと多官能酸ハロゲン化物との重縮合反応により得られる架橋ポリアミドの機能層を支持体に有してなる複合半透膜が適している。
【００８４】
ポリアミドを機能層とするナノ濾過膜において、ポリアミドを構成する単量体の好ましいカルボン酸成分としては、例えば、トリメシン酸、ベンゾフェノンテトラカルボン酸、トリメリット酸、ピロメット酸、イソフタル酸、テレフタル酸、ナフタレンジカルボン酸、ジフェニルカルボン酸、ピリジンカルボン酸などの芳香族カルボン酸などが挙げられるが、製膜溶媒に対する溶解性を考慮すると、トリメシン酸、イソフタル酸、テレフタル酸、およびこれらの混合物がより好ましい。
【００８５】
前記ポリアミドを構成する単量体の好ましいアミン成分としては、ｍ−フェニレンジアミン、ｐ−フェニレンジアミン、ベンジジン、メチレンビスジアニリン、４，４’−ジアミノビフェニルエーテル、ジアニシジン、３，３’，４−トリアミノビフェニルエーテル、３，３’，４，４’−テトラアミノビフェニルエーテル、３，３’−ジオキシベンジジン、１，８−ナフタレンジアミン、ｍ（ｐ）−モノメチルフェニレンジアミン、３，３’−モノメチルアミノ−４，４’−ジアミノビフェニルエーテル、４，Ｎ，Ｎ’−（４-アミノベンゾイル）−ｐ（ｍ）−フェニレンジアミン−２，２’−ビス（４−アミノフェニルベンゾイミダゾール）、２，２’−ビス（４−アミノフェニルベンゾオキサゾール）、２，２’−ビス（４−アミノフェニルベンゾチアゾール）などの芳香環を有する一級ジアミン、ピペラジン、ピペリジンまたはこれらの誘導体などの二級ジアミンが挙げられる。中でも、ピペラジンまたはピペリジンを単量体として含む架橋ポリアミドを機能層とするナノ濾過膜は、耐圧性、耐久性の他に、耐熱性、耐薬品性を有していることから好ましく用いられる。より好ましくは、架橋ピペラジンポリアミドまたは架橋ピペリジンポリアミドを主成分とし、かつ、下記化学式（ｉ）で示される構成成分を含有するポリアミドである。さらに好ましくは、架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ、下記化学式（ｉ）で示される構成成分を含有するポリアミドである。また、下記化学式（ｉ）中、ｎ＝３のものが好ましく用いられる。架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ下記化学式（ｉ）で示される構成成分を含有するポリアミドを機能層とするナノ濾過膜としては、例えば、特開昭６２−２０１６０６号公報に記載のものが挙げられ、具体例として、架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ、下記化学式（ｉ）中、ｎ＝３のものを構成成分として含有するポリアミドを機能層とする、東レ株式会社製の架橋ピペラジンポリアミド系ナノ濾過膜のＵＴＣ６０が挙げられる。
【００８６】
【化１】
2015068769.tif 000002
【００８７】
ナノ濾過膜は一般にスパイラル型の膜モジュールとして使用されるが、本発明で用いるナノ濾過膜も、スパイラル型の膜モジュールとして好ましく使用される。好ましいナノ濾過膜モジュールの具体例としては、例えば、（ａ）酢酸セルロース系のナノ濾過膜であるＧＥ  Ｏｓｍｏｎｉｃｓ社製ナノ濾過膜のＧＥｓｅｐａ、（ｂ）ポリアミドを機能層とするアルファラバル社製ナノ濾過膜のＮＦ９９もしくはＮＦ９９ＨＦ、（ｃ）架橋ピペラジンポリアミドを機能層とするフィルムテック社製ナノ濾過膜のＮＦ−４５、ＮＦ−９０、ＮＦ−２００、ＮＦ−２７０もしくＮＦ−４００、または（ｄ）架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ前記化学式１で示される構成成分を含有するポリアミドを機能層とする、東レ株式会社製のＵＴＣ−６０を含む同社製ナノ濾過膜モジュールＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００もしくはＳＵ−６１０が挙げられる。より好ましくは上記（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）の膜であり、さらに好ましくは上記（ｄ）の膜である。
【００８８】
ナノ濾過膜に供する精製大豆オリゴ糖液のｐＨは、ｐＨ１〜５であることが好ましい。ｐＨが１以上の場合には、長期間使用した際に膜が変性してフラックス、透過率といった膜性能が著しく低下することを抑制でき、ｐＨが５以下の場合には、微生物の増殖や代謝を阻害する物質、すなわち発酵阻害物質の除去率が著しく低下することを抑制できる場合があるためである。そのため、精製大豆オリゴ糖液のｐＨを上記範囲内に調整してナノ濾過膜で濾過することで、発酵阻害物質の除去効率を向上させることができる。また、精製大豆オリゴ糖液のｐＨが上記範囲内の場合には、ナノ濾過膜のファウリングを抑制する効果があるため、ナノ濾過膜を長期間安定して使用することができる。
【００８９】
ナノ濾過膜を通過させる精製大豆オリゴ糖液の温度は、使用するナノ濾過膜の濾過時の発酵阻害物質の除去能を高める観点から適宜設定することができる。具体的には、ナノ濾過膜で濾過する場合、精製大豆オリゴ糖液の温度が４０℃〜８０℃であれば、ナノ濾過膜の発酵阻害物質の除去性能が高まるため、好ましい。ナノ濾過膜で濾過する場合の精製大豆オリゴ糖液の温度が４０℃以上の場合には、精製大豆オリゴ糖液に含まれる発酵阻害物質の除去性能が大きくなり、精製大豆オリゴ糖液の温度が８０℃以下の場合には、ナノ濾過膜が変性してしまうことを抑制できるため、膜特性を維持できる。そのため、精製大豆オリゴ糖液の温度を上記範囲内とすることで、ナノ濾過膜の発酵阻害物質の除去性能を向上させることができる。
【００９０】
また、ナノ濾過の方法としては、具体的には、例えば、国際公開第２０１０／０６７７８５号に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００９１】
ナノ濾過膜を用いて精製大豆オリゴ糖液を濾過する場合には、精製大豆オリゴ糖液に水を添加することにより、更に効率よく発酵阻害物質を除去することができる。また、水の添加量によって、ナノ濾過後の精製糖液に含まれる発酵阻害物質の含有量を調節することができる。具体的には、水の添加量が多ければ多いほど、ナノ濾過後の精製糖液に含まれる発酵阻害物質の含有量を少なくできる。
【００９２】
本発明で使用する逆浸透膜とは、ＲＯ膜とも呼ばれるものであり、「１価のイオンを含めて脱塩機能を有する膜」と一般的に定義される膜であり、数オングストローム〜数ナノメートル程度の超微小空隙を有していると考えられる膜で、主として海水淡水化や超純水製造などイオン成分除去に用いられる。
【００９３】
また、逆浸透膜を用いた濾過方法としては、例えば、国際公開第２０１０／０６７７８５号に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００９４】
このように、工程（４）で得られた精製大豆オリゴ糖液を、工程（５）において、上記分離膜の何れか１つ以上を用いてさらに精製することにより、更に精製された純度・清澄性の高い精製大豆オリゴ糖液を得ることが可能となる。
【実施例】
【００９５】
以下、本発明による精製大豆オリゴ糖液の製造方法に関し、さらに詳細に説明するために実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。【００９６】
以下の実施例および比較例において、糖濃度、オリゴ糖純度、濁度、オリゴ糖液の濾過性、タンパク質濃度、β−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）の活性、トリコデルマ由来セルラーゼの調製、エタノール濃度、および大豆オリゴ糖液を使用したエタノールおよび乳酸の発酵は、以下のようにして測定した。【００９７】
［参考例１：糖濃度の測定］
各実施例、比較例において得られた糖液（水溶液）に含まれる単糖（グルコース、ガラクトース、フルクトース、スクロース、ラフィノース、およびスタキオース）の各濃度は、下記に示す高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ)条件で分析し、標品との比較により定量した。
（ＨＰＬＣ条件）
機器：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  システム（Ｗａｔｅｒｓ社製）
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ａｍｉｄｅ  １．７μｍ  ２．１×１００ｍｍ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
移動相：Ａ液；８０％アセトニトリル＋０．２％ＴＥＡ、Ｂ液；３０％アセトニトリル＋０．２％ＴＥＡ
流速：０．１２ｍＬ／ｍｉｎ
温度：３５℃【００９８】
［参考例２：オリゴ糖純度の測定］
オリゴ糖純度（％）は、下記式（１）の通り、上記参考例１に記載の方法によって測定した各オリゴ糖（スクロース、ラフィノース、スタキオース）の質量（ｇ）の合計値を、水溶液中の全固形物（ＴＳ）の質量（ｇ）によって除した値とした。水溶液中の全固形物の質量は、赤外式水分計（ＦＤ−７２０、Ｋｅｔｔ社製）を使用して測定した。
オリゴ糖純度（％）＝各オリゴ糖（スクロース、ラフィノース、スタキオース）の質量の合計値（ｇ）／水溶液中のＴＳ質量（ｇ）  ・・・（１）【００９９】
［参考例３：濁度の測定］
水溶液の濁度は、濁度計（ポータブル濁度計、２１００Ｐ、Ｈａｃｈ社製）を使用して測定した（単位は、ＮＴＵ）。なお、本装置の濁度の測定上限は、１０００ＮＴＵであるため、以下の実施例および比較例では、濁度の測定上限を超えるものは全て「１０００（ＮＴＵ）以上」と記載した。【０１００】
［参考例４：オリゴ糖液の濾過性の評価］
以下の実施例および比較例で用いた各大豆オリゴ糖液に対して膜濾過プロセスが適用可能かどうか評価するため、ＭＦ濾過速度（ｍＬ／ｍｉｎ）を測定した。測定は、１００ｍＬのオリゴ糖液を、０．４５μｍの細孔径を有する、直径４７ｍｍの精密濾過膜（親水性デュラポア、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて、２５℃、−５０ｋＰａ（Ｇ）として吸引濾過を行った。その際に、濾過に要した時間（ｍｉｎ）を測定した。この値で液量（１００ｍＬ）を除した値を、ＭＦ濾過速度とした。なお、１００ｍＬのオリゴ糖液の濾過に要する時間が、３０分を超える場合、すなわち、濾過速度が３．３ｍＬ／ｍｉｎを下回る場合は、実用に適さないとみて「濾過不能」とみなした。
なお、参考として、純水を上記方法を用いて濾過を行った場合には、純水のＭＦ濾過速度は、３９０ｍＬ／ｍｉｎであった。【０１０１】
［参考例５：タンパク質濃度の測定］
水溶液中のタンパク質の濃度は、ブラッドフォード法による測定キット（Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を使用して測定した。【０１０２】
［参考例６：β−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）活性およびＢＧＬ比活性の測定］
水溶液中のＢＧＬ活性の測定は、「Ｐｕｒｅ  ＆  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．、Ｖｏｌ．５９、Ｎｏ．２、２５７−２６８ページ」に記載の“Ｃｅｌｌｏｂｉａｓｅ  ａｓｓａｙ”の方法に従って行った。反応条件は、５０℃、ｐＨ５．０とし、酵素液１ｍＬあたりのＢＧＬ活性として算出した（単位は、Ｕ／ｍＬ）。さらに、上記参考例５の方法により測定したタンパク質濃度より、タンパク質１ｍｇあたりのＢＧＬ活性を算出した（以下、これを“ＢＧＬ比活性”という。単位は、Ｕ／ｍｇ）。なお、ここでは、ＢＧＬ活性１単位（Ｕ）を、セロビオース分解反応において、１分間に１μｍｏｌのセロビオースを分解する（または、１分間に２μｍｏｌのグルコースを生成する）酵素活性と定義する。【０１０３】
［参考例７：トリコデルマ由来セルラーゼの調製］
トリコデルマ由来セルラーゼは、以下の方法で調製した。
（前培養）
コーンスティップリカー５％（ｗ／ｖｏｌ）、グルコース２％（ｗ／ｖｏｌ）、酒石酸アンモニウム０．３７％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸アンモニウム０．１４（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸二水素カリウム０．２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化カルシウム二水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化亜鉛０．０２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化鉄(ＩＩＩ)六水和物０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸銅(ＩＩ)五水和物０．００４％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化マンガン四水和物０．０００８％（ｗ／ｖｏｌ）、ホウ酸０．０００６％（ｗ／ｖｏｌ）、および七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００２６％（ｗ／ｖｏｌ）となるように蒸留水に添加した。その後、上記各成分を含む蒸留水１００ｍＬを５００ｍＬバッフル付き三角フラスコに張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別に、それぞれ１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌したＰＥ−ＭおよびＴｗｅｅｎ８０を、上記の５００ｍＬバッフル付き三角フラスコにそれぞれ０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）添加した。この前培養培地にトリコデルマ・リーセイＰＣ３−７を１×１０５個／ｍＬになるように植菌し、振とう装置（ＴＡＩＴＥＣ社製  ＢＩＯ−ＳＨＡＫＥＲ  ＢＲ−４０ＬＦ）を用いて、２８℃、７２時間、１８０ｒｐｍで振とう培養し、前培養とした。
（本培養）
コーンスティップリカー５％（ｗ／ｖｏｌ）、グルコース２％（ｗ／ｖｏｌ）、セルロース（アビセル）１０％（ｗ／ｖｏｌ）、酒石酸アンモニウム０．３７％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸アンモニウム０．１４％（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸二水素カリウム０．２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化カルシウム二水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化亜鉛０．０２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化鉄(ＩＩＩ)六水和物０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸銅(ＩＩ)五水和物０．００４％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化マンガン四水和物０．０００８％（ｗ／ｖｏｌ）、ホウ酸０．０００６％（ｗ／ｖｏｌ）、および七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００２６％（ｗ／ｖｏｌ）となるように蒸留水に添加した。その後、上記各成分を含む蒸留水２．５Ｌを５Ｌ容撹拌ジャー（ＤＰＣ−２Ａ、ＡＢＬＥ社製）容器に張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別にそれぞれ１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌したＰＥ−ＭおよびＴｗｅｅｎ８０を、上記の５００ｍＬバッフル付き三角フラスコにそれぞれ０．１％（ｗ／ｖｏｌ）添加し、あらかじめ前記の方法を用いて液体培地で前培養したトリコデルマ・リーセイＰＣ３−７を２５０ｍＬ接種した。その後、振とう装置（ＴＡＩＴＥＣ社製  ＢＩＯ−ＳＨＡＫＥＲ  ＢＲ−４０ＬＦ）を用いて、２８℃、８７時間、３００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍとして培養を行った。その後、３０００Ｇで１０分間、遠心分離した後、上清を膜濾過（ステリカップ−ＧＶ、材質：ＰＶＤＦ、ミリポア社製）した。この前述条件で調整した培養液をトリコデルマ由来セルラーゼとして、以下、実施例に使用した。【０１０４】
［参考例８：エタノール濃度の測定］
水溶液中のエタノール濃度は、下記に示すガスクロマトグラフィー（ＧＣ）条件で、水素塩イオン化検出器により検出・算出して、標品との比較により定量した。
機器：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＧＣ−２０１０（株式会社島津製作所製）
カラム：ＴＣ−１（内径０．５３ｍｍ、長さ１５ｍ、膜厚１．５０μｍ（ＧＬ  サイエンス株式会社製）
検出方法：水素塩イオン化検出器（ＦＩＤ）【０１０５】
［参考例９：乳酸濃度の測定］
水溶液中の乳酸濃度は、下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＳＰＲ−Ｈ（株式会社島津製作所製）
移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／分）
反応液：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ ビストリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／分）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃【０１０６】
［参考例１０：大豆オリゴ糖液を使用したエタノールおよび乳酸の発酵生産］
（前培養）
下記ＹＰＤ培地２ｍＬを試験管に投入し、１２１℃にて２０分間オートクレーブ殺菌した。放冷後、クリーンベンチ内にて、下記ＹＰＤ寒天培地でのプレート培養（３０℃、２４時間）して形成された酵母のコロニー１つを、白金耳を使用して植菌した。これを、振とう装置（ＴＡＩＴＥＣ社製  ＢＩＯ−ＳＨＡＫＥＲ  ＢＲ−４０ＬＦ）を用いて、３０℃、１２０ｒｐｍで２４時間振とう培養し、前培養液を得た。
ＹＰＤ培地：酵母エキス１％（ｗ／ｖｏｌ）、バクトペプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）２％（ｗ／ｖｏｌ）、グルコース２％（ｗ／ｖｏｌ）
ＹＰＤ寒天培地：上記ＹＰＤ培地組成に加え、寒天２％（ｗ／ｖｏｌ）を含む。
（本培養１：エタノールの発酵生産）
発酵原料となる大豆オリゴ糖液に、水酸化カリウム水溶液（５ｍｏｌ／Ｌ）を加えてｐＨ５．５となるように調整した。このうち１０ｍＬを、上記前培養液０．５ｍＬとともに試験管に投入・混合した。これを、３０℃、１２０ｒｐｍにて４３時間振とう培養した。
（本培養２：乳酸の発酵生産）
発酵原料となる大豆オリゴ糖液に、水酸化カリウム水溶液（５ｍｏｌ／Ｌ）を加えてｐＨ５．５となるように調整し、更に炭酸カルシウムを２％（ｗ／ｖｏｌ）の終濃度となるように添加した。このうち１０ｍＬを、上記前培養液０．５ｍＬとともに試験管に投入・混合した。これを３０℃、１２０ｒｐｍにて６８時間振とう培養した。【０１０７】
＜実施例１：精製大豆オリゴ糖液の製造＞
（工程（１）：極性有機溶媒による大豆オリゴ糖の回収）
市販の無調整豆乳と９６％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノールとを、液量比で３：７の割合で混合後、十分に攪拌した。これを、遠心分離装置を用いて８０００Ｇで１分間、遠心分離した後、上清として極性有機溶媒含有オリゴ糖液を回収した。【０１０８】
（工程（２）：極性有機溶媒の蒸発除去）
上記工程（１）で得られた上清のうちの６００ｍＬを、１Ｌ容積のナスフラスコに投入し、ロータリーエバポレータ（ＮＶＣ−２１００、ＥＹＥＬＡ社製）および湯浴（ＳＢ−１０００、ＥＹＥＬＡ社製）を使用して、５０℃、２３０ｈＰａとして減圧濃縮を行った。濃縮は、液量が１５０ｍＬになるまで行い、残った液を大豆オリゴ糖懸濁液として回収した。なお、必要量の大豆オリゴ糖懸濁液が得られるまで本工程を繰り返し行った。得られた大豆オリゴ糖懸濁液中の糖濃度、オリゴ糖純度、濁度、および全固形物濃度（ＴＳ濃度）を、参考例１〜３に記載の方法で測定した結果を、表１に示す。【０１０９】
【表１】
2015068769.tif 000003
【０１１０】
（工程（３）：大豆オリゴ糖懸濁液のセルラーゼ処理）
上記工程（２）で得られた大豆オリゴ糖懸濁液を水で希釈し、全固形物濃度が約３５％になるように調整した。硫酸（３ｍｏｌ／Ｌ）を使用してｐＨ５．０程度に調整してよく攪拌した後、液量１Ｌに対して市販のセルラーゼ製剤（Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ  ＤＵＥＴ（以下、ＤＵＥＴともいう。）、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社製）を約１ｍＬ添加して混合し、約５０℃で２４時間攪拌し、セルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液を得た。【０１１１】
（工程（４）：精製大豆オリゴ糖液の回収）
上記工程（３）で得られたセルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液を、硫酸（３ｍｏｌ／Ｌ）を使用してｐＨ２．５程度に調整してよく攪拌した後、遠心沈殿管に分注し、遠心沈殿管内で静置した。１時間後、遠心沈殿管をそのまま、遠心分離装置にセットし、８０００Ｇで１分間、遠心分離した。遠心分離後、上清として精製大豆オリゴ糖液を回収した。回収した精製大豆オリゴ糖液のオリゴ糖純度、濁度、およびＭＦ濾過速度を、参考例２〜４に従って測定した結果を、表２に示す。【０１１２】
＜比較例１：工程（３）（セルラーゼ処理）を行わない場合＞
実施例１の工程（３）のセルラーゼ処理を省略したこと以外、実施例１と同様の処理を行った。すなわち、実施例１の工程（４）において、セルラーゼ処理液の代わりに、工程（２）で得られた大豆オリゴ糖懸濁液を使用した（但し、全固形物濃度が約３５％となるように水で希釈して使用した）。その結果、工程（４）において大豆オリゴ糖懸濁液を遠心分離した後でもほとんど沈殿が生じず、懸濁物を分離できなかった。この懸濁物を含んだままの大豆オリゴ糖懸濁液のオリゴ糖純度、濁度、およびＭＦ濾過速度を、参考例２〜４に従って測定した結果を、表２に示す。【０１１３】
＜比較例２：アルコールの添加混合を行わない場合＞
工程（１）、（２）を省略したこと以外、実施例１と同様の処理を行った。すなわち、実施例１の工程（３）において、大豆オリゴ糖懸濁液を使用する代わりに、無調整豆乳をそのまま使用した。その結果、工程（４）における遠心分離後でもほとんど沈殿が生じず、懸濁物を分離できなかった。この懸濁物を含んだままの豆乳のオリゴ糖純度、濁度、およびＭＦ濾過速度を、参考例２〜４に従って測定した結果を、表２に示す。【０１１４】
【表２】
2015068769.tif 000004
【０１１５】
表２から明らかなように、工程（１）、（２）を実施せず、工程（３）、（４）を行った比較例２では、オリゴ糖純度が低く、また濁度は測定上限を超えており、ＭＦ濾過は不能であった。工程（１）、（２）、（４）を行い、工程（３）は行わなかった比較例１では、比較例２と比べてオリゴ糖純度は高かった。しかし、濁度は測定上限を超えており、ＭＦ濾過も不能であった。一方、工程（１）〜（４）を全て行った実施例１では、比較例２と比べてオリゴ糖純度はさらに高い上、濁度は格段に低減しており、ＭＦ濾過も可能であった。よって、本発明による精製大豆オリゴ糖液の製造方法を実施することにより、純度および清澄性が高く、膜濾過の容易な大豆オリゴ糖液を得ることができた。【０１１６】
＜実施例２：様々なセルラーゼ製剤を使用した場合＞
様々な成分を含むセルラーゼ製剤として、実施例１で用いたＤＵＥＴ、Ｎｏｖｏ１８８（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、トリコデルマ培養液（参考例７に記載）を使用した。まず、これらのタンパク質濃度と、タンパク質あたりのＢＧＬ活性を、参考例５、６に従ってそれぞれ測定した結果を、表３に示す。【０１１７】
【表３】
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【０１１８】
セルラーゼ製剤としてこれらを使用し、その添加量を、添加するタンパク質量として、実施例１と同等になるように、Ｎｏｖｏ１８８は１．４ｍＬ、トリコデルマ培養液は１．６ｍＬとしたこと以外、実施例１と同様の処理をそれぞれ行った。回収したそれぞれの精製大豆オリゴ糖液のオリゴ糖純度、濁度、およびＭＦ濾過速度を、参考例２〜４に従って測定した結果を、表４に示す。【０１１９】
【表４】
2015068769.tif 000006
【０１２０】
表２〜表４から明らかなように、いずれのセルラーゼ製剤を使用した場合も、オリゴ糖純度、濁度にはあまり差が見られなかった。一方、ＭＦ濾過速度はＢＧＬ比活性の高いセルラーゼ製剤を使用した場合ほど、より高くなっていた。よって、本発明による精製大豆オリゴ糖液の製造方法で使用するセルラーゼは、ＢＧＬ比活性がより高いものを用いることが好ましい。【０１２１】
＜実施例３：β−グルコシダーゼ（精製品）を使用した場合＞
β−グルコシダーゼのみを含むセルラーゼ製剤として、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来β−グルコシダーゼ（Ｅ−ＢＧＬＵＣ、Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）を使用した。まず、タンパク質濃度とＢＧＬ活性を、参考例５、６に従ってそれぞれ測定した結果を、表５に示す。【０１２２】
【表５】
2015068769.tif 000007
【０１２３】
表５で示されるＢＧＬ比活性を有するセルラーゼ製剤の添加量は、実施例１におけるＢＧＬ活性（絶対値）と同等（約５４０Ｕｎｉｔｓ、表３のＢＧＬ比活性値を基に算出。）になるように、２．０ｍＬとし、これをセルラーゼとして使用したこと以外、実施例１と同様の処理を行った。回収した精製大豆オリゴ糖液のオリゴ糖純度、濁度、およびＭＦ濾過速度を、参考例２〜４に従って測定した結果を、表６に示す。【０１２４】
【表６】
2015068769.tif 000008
【０１２５】
表２、表４、および表６から明らかなように、β−グルコシダーゼのみを含むセルラーゼ製剤（実施例３）であっても他のセルラーゼ製剤と比較してオリゴ糖純度と濁度はほぼ同等の結果が得られた。また、ＭＦ濾過速度も十分な速度が得られた。よって、本発明による精製大豆オリゴ糖液の製造方法の工程（３）においては、セルラーゼ中のβ−グルコシダーゼが主として懸濁物質の凝集沈殿を促進しており、ＭＦ濾過性の向上に寄与していると推察される。また、実施例１と比較すると、添加したＢＧＬ活性は同等であるにも関わらず、実施例３のＭＦ濾過速度の方が低かった。よって、ＭＦ濾過性の向上作用はその他のセルラーゼ成分によって協奏的に高められているということが推察される。したがって、本発明による精製大豆オリゴ糖液の製造方法において使用するセルラーゼは、さまざまな酵素成分を含むものがより好ましいと考えられる。【０１２６】
＜比較例３：セルラーゼ以外の酵素製剤を使用した場合＞
セルラーゼ以外の酵素製剤として、プロテアーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を使用した。まず、タンパク質濃度を参考例５に従って測定した結果、１１００ｇ／Ｌであった。酵素製剤として、ＤＵＥＴの代わりにこのプロテアーゼを使用し、またその添加量を、添加するタンパク質量として実施例１と同等になるように、３５μＬとしたこと以外、実施例１と同様の処理をそれぞれ行った。【０１２７】
その結果、工程（４）における遠心分離後でもほとんど沈殿が生じず、懸濁物を分離できなかった。この懸濁物を含んだままの大豆オリゴ糖液におけるオリゴ糖純度、濁度、およびＭＦ濾過速度を、参考例２〜４に従って測定した結果を、表７に示す。【０１２８】
【表７】
2015068769.tif 000009
【０１２９】
表７から明らかなように、セルラーゼの代わりにプロテアーゼを使用した場合、オリゴ糖純度、濁度、ＭＦ濾過速度のいずれも良好ではなかった。【０１３０】
＜実施例４：セルラーゼおよびエステラーゼの併用の場合＞
エステラーゼとして、リパーゼ１（リパーゼＡＳアマノ、和光純薬株式会社製）、リパーゼ２（Ｌｉｐａｓｅ，ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を使用した。まず、それぞれの粉末０．１ｇを、５０ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）０．５ｍＬに溶解した。それぞれのタンパク質濃度を参考例５に従って測定した結果、リパーゼ１、２のタンパク質濃度は、それぞれ９．３ｇ／Ｌ、８．７ｇ／Ｌであった。ＤＵＥＴに加えて、これらのエステラーゼをさらに添加したこと以外、実施例１と同様の処理をそれぞれ行った。なお、リパーゼ１およびリパーゼ２の添加量は、それぞれ、添加するＤＵＥＴのタンパク質量に対して１／１０となるように、リパーゼ１は４１０μＬ、リパーゼ２は４４０μＬとした。回収した精製大豆オリゴ糖液のオリゴ糖純度、濁度、ＭＦ濾過速度を、参考例２〜４に従って測定した結果を、表８に示す。【０１３１】
【表８】
2015068769.tif 000010
【０１３２】
表２、表８から明らかなように、セルラーゼに加えてさらにエステラーゼを添加した場合、セルラーゼのみを使用した場合と比較して、濁度は更に低減でき、ＭＦ濾過速度はさらに向上した。【０１３３】
＜実施例５：ｐＨの影響についての検討＞
工程（４）のセルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液のｐＨを、６．０、５．０、４．０、３．５、３．１、３．０、２．５、２．０としたこと以外、実施例１と同様の処理をそれぞれ行った（但し、ｐＨ２．５の場合は実施例１と同条件のため、実際には実施例１の結果を使用した。）。なお、ｐＨ調整は、１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム、または３ｍｏｌ／Ｌの硫酸の添加により行った。回収した精製大豆オリゴ糖液のオリゴ糖純度、濁度、およびＭＦ濾過速度を、参考例２〜４に従って測定した結果を、表９に示す。【０１３４】
【表９】
2015068769.tif 000011
【０１３５】
表２、表９から明らかなように、ｐＨに関わりなく、オリゴ糖純度は、実施例１と同等であった。一方、濁度は、比較例１、２と比較すると、セルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液のｐＨがいずれの場合でも大幅に低減されているが、ｐＨが３．０以下の場合にはさらに濁度が低減されることが分かった。同様に、ＭＦ濾過速度も、比較例１〜３と比較すると、いずれのｐＨでも大幅に向上しているが、ｐＨが３．０以下の場合には、ＭＦ濾過速度がさらに向上することが分かった。【０１３６】
＜実施例６：アルカリ土類金属塩の添加＞
工程（４）において硫酸を添加してｐＨ調整を行う代わりに、炭酸カルシウムまたは塩化カルシウムを１０ｇ添加したこと以外は、実施例１と同様の処理を行った。回収した精製大豆オリゴ糖液のオリゴ糖純度、濁度、およびＭＦ濾過速度を、参考例２〜４に従って測定した結果を、表１０に示す。【０１３７】
【表１０】
2015068769.tif 000012
【０１３８】
表１０から明らかなように、炭酸カルシウム、塩化カルシウムのいずれかを添加した場合でも、実施例１と同等のオリゴ糖純度、濁度、およびＭＦ濾過速度が得られた。【０１３９】
＜実施例７：全固形物濃度および酵素量の影響＞
工程（３）において水を添加した後の全固形物濃度として、４５％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、３５％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）の４通りに設定し、さらにそれぞれについてセルラーゼ製剤（ＤＵＥＴ）の添加量を０．１ｍＬ、１ｍＬ、および１０ｍＬの３通り設定した場合、すなわち合計１２通りの場合について、全固形物濃度とセルラーゼ添加量以外については、実施例１と同様の処理をそれぞれ行った（ただし、全固形物濃度が３５％（ｗ／ｗ）、セルラーゼ添加量１ｍＬの場合は、実施例１と同条件のため、実際には実施例１の結果を使用した。）。【０１４０】
回収した大豆オリゴ糖液のオリゴ糖純度、濁度、ＭＦ濾過速度を、参考例２〜４に従って測定した結果を表１１に示す。【０１４１】
【表１１】
2015068769.tif 000013
【０１４２】
表１１から明らかなように、全固形物濃度が３５％以下の場合、セルラーゼの使用量が０．１ｍＬ、１ｍＬ、１０ｍＬのいずれであっても、オリゴ糖純度、濁度、ＭＦ濾過速度はほとんど差がなかった。一方、全固形物濃度が４０％（ｗ／ｗ）を超える場合、セルラーゼの使用量は０．１ｍＬでは不十分であった。このことから、実施例１と同等の結果を得るためには、セルラーゼ使用量を１０ｍＬとする必要があることが分かった。よって、本発明による精製大豆オリゴ糖液の製造方法を用いれば、大豆オリゴ糖懸濁液の全固形物濃度を３５％以下に調整することにより、酵素使用量を大幅に削減することができるといえる。【０１４３】
＜実施例８：大豆オリゴ糖液を使用したエタノールの発酵生産＞
参考例８に記載のエタノールの発酵生産方法において、酵母としてサッカロマイセス・セレビシエＯＣ２株（ＡＴＣＣ ４６２７６）、キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株、キャンディダ・ユーティリスＮＢＲＣ０９８８株の３種用い、かつそれぞれについて原料として実施例１に記載の工程（２）で得られる大豆オリゴ糖懸濁液、工程（３）で得られるセルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液、工程（４）で得られる精製大豆オリゴ糖液の３種類をそれぞれ使用した場合、すなわち合計９通りの場合について、エタノールの発酵生産を行った。各反応液中のエタノール濃度の経時変化を図１〜図３に示す。なお、図１は、酵母としてサッカロマイセス・セレビシエＯＣ２株（ＡＴＣＣ ４６２７６）を用い、図２は、酵母として、キャンディダ・トロピカリスＮＢＲＣ０１９９株を用い、図３は、酵母として、キャンディダ・ユーティリスＮＢＲＣ０９８８株を用いた場合を示す。【０１４４】
図１〜図３から明らかなように、いずれの酵母を使用した場合も、原料として精製大豆オリゴ糖液を使用した場合のみエタノールの生産速度、最終的な蓄積濃度が共に高くなった。【０１４５】
＜実施例９：大豆オリゴ糖液を使用した乳酸の発酵生産＞
参考例８に記載の乳酸の発酵生産方法において、酵母として国際公開公報第２０１０／１４０６０２号に記載の方法で作製したＤ−乳酸生産酵母を使用し、大豆オリゴ糖液として、実施例１に記載の工程（２）で得られる大豆オリゴ糖懸濁液、工程（３）で得られるセルラーゼ処理大豆オリゴ糖懸濁液、および工程（４）で得られる精製大豆オリゴ糖液の三種類をそれぞれ使用した場合、すなわち合計３通りについて、乳酸の発酵生産を行った。各反応液中の乳酸濃度の経時変化を図４に示す。図４から明らかなように、原料として精製大豆オリゴ糖液を使用した場合のみ、乳酸の生産速度、最終的な蓄積濃度が共に高くなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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