(57)【要約】【課題】生体への毒性が低く、小粒子径で標的部位に移送され易く、標的部位での発現効率が高い核酸複合体を形成することができる界面活性剤様化合物を提供すること。【解決手段】親水性基と疎水性基とそれらの間に位置する１〜５個の含窒素基とを具備し、  上記親水性基が下記式（１）で表されるエチレングリコール基であり、上記疎水性基が炭素数１〜１８の直鎖又は分岐鎖のアルキル基又は、コレステロール基であり、上記含窒素基がアミド基又はイミダゾリウム基である界面活性剤様化合物。Ｒ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−  ・・・・・（１）（式中、ｎは４０〜１２０の整数を表す。Ｒは炭素数１〜１８の炭化水素基を示す。）【選択図】図１０
2014148378.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性基と疎水性基とそれらの間に位置する１〜５個の含窒素基とを具備することを特徴とする界面活性剤様化合物。
【請求項２】
上記親水性基が
非イオン性の親水性基である
請求項１に記載の界面活性剤様化合物。
【請求項３】
上記親水性基が
下記式（１）で表されるエチレングリコール基である
請求項１または２に記載の界面活性剤様化合物。
Ｒ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−  ・・・・・（１）
（式中、ｎは４０〜１２０の整数を表す。Ｒは炭素数１〜１８の炭化水素基を示す。）
【請求項４】
上記疎水性基が
炭素数１〜１８の直鎖又は分岐鎖のアルキル基又は、コレステロール基である
請求項１〜３のいずれかに記載の界面活性剤様化合物。
【請求項５】
上記疎水性基が、その一部に疎水性ではない置換基を有する、
請求項１〜４記載のいずれかに記載の界面活性剤様化合物。
【請求項６】
上記置換基が、水素結合性官能基含有置換基である
請求項５に記載の界面活性剤様化合物。
【請求項７】
上記置換基が、上記疎水性基の末端に位置する
請求項６に記載の界面活性剤様化合物。
【請求項８】
上記疎水性基が、下記式１に示す１−アミド−アルキル基、１−ヒドロキシ−アルキル基、１−チミン−アルキル基である
請求項７に記載の界面活性剤様化合物。
【化１】
2014148378.tif 000020
式中、ｎは１〜２０の整数である。
【請求項９】
上記含窒素基がアミド基又はイミダゾリウム基である
請求項１〜８のいずれかに記載の界面活性剤様化合物。
【請求項１０】
上記疎水性基と上記含窒素基との間にカチオン性基を有する
請求項１〜９のいずれかに記載の界面活性剤様化合物。
【請求項１１】
上記カチオン性基がイミダゾリウム基である
請求項１０に記載の界面活性剤様化合物。
【請求項１２】
核酸複合体形成用である請求項１〜１１のいずれかに記載の界面活性剤様化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、界面活性剤様化合物に関し、さらに詳しくは、生体適合性及び血液中での安定性が高く、カチオン過剰による毒性が低く、小粒子径で標的部位に移送され易く、標的部位での発現効率が高い核酸複合体を形成することができる界面活性剤様化合物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、プラスミドＤＮＡやアンチセンスＤＮＡなどの核酸を用いる遺伝子治療が注目されている。遺伝子治療の重要な要素として、核酸を効率よく標的部位へ送る薬物伝達システム（ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ））が挙げられる。
従来の核酸のドラッグデリバリーシステムでは、核酸デリバリーのために、核酸と核酸キャリアとの複合体が用いられてきた。
その複合体は、生体内の毒性が低く、核酸を核酸分解酵素から保護し、効率的に標的部位へ輸送することが求められており、複合体の形成には分子内に数多くのカチオン性基を有する核酸キャリアと核酸複合体とのポリイオンコンプレックス形成などの手法が用いられてきた。
たとえば、特許文献１には、ｓｉＲＮＡとも生理的条件下で安定な会合体を提供する共重合体として、親水性ポリマー鎖ブロックが該ポリアミノ酸鎖ブロックの主鎖のいずれか一方の末端に共有結合を介して結合しており、かつ、該ポリアミノ酸鎖ブロックにおけるアミノ酸反復単位１０パーセント以上から７０パーセント以下の側鎖に疎水性基が共有結合を介して結合している共重合体が提案されている。
特許文献２には、インビボでの肝臓への核酸のターゲティングの効率および取込の効率を高めるための製剤として、核酸とカチオン化プルラン誘導体から形成されるポリイオンコンプレックスを含み、前記カチオン化プルラン誘導体のカチオン化率が１０−２７％であることを特徴とする、肝臓デリバリー用製剤が提案されている。
特許文献３には、二本鎖リボ核酸と、多数の含窒素基を有するブロック共重合体とが静電結合されてなる非高分子ミセル形態のポリイオンコンプレックスであって、動的光散乱測定法で測定した場合に１００ｎｍ未満の平均粒径を有するポリイオンコンプレックスが提案されている。
特許文献４には、血清中において光増感性物質を十分に保持し構造安定性に優れたポリイオンコンプレックス、及びその構成成分である核酸ポリプレックスとして、複数の窒素含有カチオン性基を含むカチオン性ポリマーを含むポリイオンコンプレックスが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開２００９／１１３６４５号公報
【０００４】
【特許文献２】特開２００６−０２８０６１号公報
【０００５】
【特許文献３】特開２０１０−２３３４９９号公報
【０００６】
【特許文献４】特表２００７−９９６６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１〜４にかかる提案では、生体への毒性があるという問題や、イオンコンプレックスの粒子径が大きいため血管から標的部位への移送効率が悪く、標的部位での発現効率が悪いという問題があった。
このため、生体への毒性が低く、小粒子径で標的部位に移送され易く、標的部位での発現効率が高い核酸複合体を形成できる化合物の開発が要望されている。【０００８】
したがって、本発明の目的は、生体への毒性が低く、小粒子径で標的部位に移送され易く、標的部位での発現効率が高い核酸複合体を形成することができる界面活性剤様化合物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解消すべく鋭意検討した結果、核酸と複合体を形成させる化合物の構造においてカチオン性基や窒素含有基の数をコントロールすることにより、当該化合物と核酸との複合体の物理的性質及び生物学的性質が変わることを知見し、さらに検討した結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の各発明を提供するものである。
１．親水性基と疎水性基とそれらの間に位置する１〜５個の含窒素基とを具備することを特徴とする界面活性剤様化合物。
２．上記親水性基が
非イオン性の親水性基である
１に記載の界面活性剤様化合物。
３．  上記親水性基が
下記式（１）で表されるエチレングリコール基である
１または２に記載の界面活性剤様化合物。
Ｒ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−  ・・・・・（１）
（式中、ｎは４０〜１２０の整数を表す。Ｒは炭素数１〜１８の炭化水素基を示す。）
４．上記疎水性基が
炭素数１〜１８の直鎖又は分岐鎖のアルキル基又は、コレステロール基である
１〜３のいずれかに記載の界面活性剤様化合物。
５．上記疎水性基が、その一部に疎水性ではない置換基を有する、
１〜４記載のいずれかに記載の界面活性剤様化合物。
６．上記置換基が、水素結合性官能基含有置換基である
５に記載の界面活性剤様化合物。
７．上記置換基が、上記疎水性基の末端に位置する
６に記載の界面活性剤様化合物。
８．上記疎水性基が、下記式１に示す１−アミド−アルキル基、１−ヒドロキシ−アルキル基、１−チミン−アルキル基である
７に記載の界面活性剤様化合物。
【化１】
2014148378.tif 000003
式中、ｎは１〜２０の整数である。
９．上記含窒素基が
アミド基又はイミダゾリウム基である
１〜８のいずれかに記載の界面活性剤様化合物。
１０．上記疎水性基と上記含窒素基との間にカチオン性基を有する
１〜９のいずれかに記載の界面活性剤様化合物。
１１．上記カチオン性基がイミダゾリウム基である
１０に記載の界面活性剤様化合物。
１２．核酸複合体形成用である
１〜１１のいずれかに記載の界面活性剤様化合物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の界面活性剤様化合物は、生体適合性及び血液中での安定性が高く、生体への毒性が低く、小粒子径で標的部位に移送され易く、標的部位での発現効率が高い核酸複合体を形成することができる界面活性剤様化合物で、核酸複合体形成用に好ましく用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、実施例１で得られた界面活性剤様化合物とＤＮＡとの複合体のアガロースゲル電気泳動結果を示す図面代用写真である。
【図２】図２は、実施例２で得られた界面活性剤様化合物とＤＮＡとの複合体のアガロースゲル電気泳動結果を示す図面代用写真である。
【図３】図３は、実施例３で得られた界面活性剤様化合物とＤＮＡとの複合体のアガロースゲル電気泳動結果を示す図面代用写真である。
【図４】図４は、実施例４で得られた界面活性剤様化合物とＤＮＡとの複合体のアガロースゲル電気泳動結果を示す図面代用写真である。
【図５】図５は、実施例５で得られた界面活性剤様化合物とＤＮＡとの複合体のアガロースゲル電気泳動結果を示す図面代用写真である。
【図６】図６は、実施例１で得られた界面活性剤様化合物とＤＮＡとの複合体のＣＤスペクトルのチャート図である。
【図７】図７は、実施例３で得られた界面活性剤様化合物とＤＮＡとの複合体のマウス投与時における生体内での遺伝子発現をルシフェラーゼアッセイにより測定した結果を示す図である。
【図８】図８は、実施例１及び３で得られた界面活性剤様化合物とＤＮＡとの複合体のマウス投与時における生体内での遺伝子発現をルシフェラーゼアッセイにより測定した結果を示す図である。
【図９】図９は、実施例６で得られた界面活性剤様化合物の１Ｈ−ＮＭＲ測定結果を示すチャートである。
【図１０】図１０は、実施例６で得られた界面活性剤様化合物とＤＮＡとの複合体のアガロースゲル電気泳動結果を示す図面代用写真である。
【図１１】図１１は、実施例６で得られた界面活性剤様化合物とＤＮＡとの複合体の安定性評価におけるアガロースゲル電気泳動結果を示す図面代用写真である。
【図１２】図１２は、実施例６で得られた界面活性剤様化合物とＤＮＡとの複合体のマウス投与時における生体内での遺伝子発現をルシフェラーゼアッセイにより測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の界面活性剤様化合物は、親水性基と疎水性基とそれらの間に位置する特定個数の含窒素基とを具備することを特徴とする。
【００１３】
＜親水性基＞
上記親水性基としては、特に非イオン性の親水性基が好ましく挙げられる。
上記非イオン性の親水性基としては、エチレングリコール基、デキストラン基、ポリアクリルアミド基などが挙げられ、下記式（１）で表されるエチレングリコール基が好ましく挙げられる。
Ｒ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−  ・・・・・（１）
（式中、ｎは４０〜１２０の整数を表す。Ｒは炭素数１〜１８の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を示す。）
これにより、生体適合性が付与され、核酸と複合体を形成した場合における複合体の水に対する溶解性を高め、且つ、血中などの生理条件下での血清タンパク質や細胞表面などとの非特異的な相互作用を抑制し血中での安定性が高くなる。
具体的には以下に示すエチレングリコール基が好ましく挙げられる。
ＣＨ３−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−、
Ｃ２Ｈ５−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−、
Ｃ３Ｈ７−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−、
Ｃ４Ｈ９−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−、
Ｃ５Ｈ１１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−、
なお、これらの例示の基において重合度を示すｎは４０〜１２０となる範囲である。
【００１４】
＜疎水性基＞
上記疎水性基としては、疎水性の炭化水素基、直鎖又は分岐鎖のアルキル基、アリール基、コレステロール基、ポルフィリン基、脱プロトン化したイミダゾール基などが挙げられ、炭素数１〜１８の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が好ましく挙げられる。
具体的には以下の疎水性基などが挙げられる。
直鎖又は分岐鎖のアルキル基：メチル基、エチル基、ブチル基、プロピル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デキル基、ラウリル基、ステアリル基、イソプロピル基、ｔｅｒｔ−ブチル基
アリール基：フェニル基、ベンジル基、ナフチル基、アルキルフェニル基、ピレニル基
コレステロール基：下記化式に示すコレステロール基
ポルフィリン基：下記化式に示すポルフィリン基
脱プロトン化したイミダゾール基：下記化式に示すイミダゾール基
これにより、ＤＮＡと疎水性の相互作用をすることができ、核酸と安定した複合体を形成することができる。
【化２】
2014148378.tif 000004
【００１５】
また、上記疎水性基は、その一部に疎水性ではない置換基を有していてもよい。
上記疎水性ではない置換基としては、水素結合性官能基含有置換基などが好ましく挙げられ、中でも、アミド基、ヒドロキシル基、核酸塩基（チミン、シトシン、アデニン、グアニン、ウラシル）、修飾核酸塩基（５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン）等の水素結合性官能基含有置換基であるのが好ましい。
上記疎水性基が、その一部に疎水性ではない置換基を有する場合、該置換基の位置は、上記疎水性基の末端に位置するのが好ましい。
このような一部に疎水性ではない置換基を有する疎水性基としては、上述のアルキル基等の基に上記疎水性ではない置換基が導入されてなる疎水性基であれば特に制限なく用いることができるが、下記化式に示す１−アミド−アルキル基、１−ヒドロキシ−アルキル基、１−チミン−アルキル基等を特に好ましく挙げることができる。
これにより、核酸と、より安定した複合体を形成することができる。
【化３】
2014148378.tif 000005
式中、ｎは１〜２０の整数であり、望ましくは３〜２０の整数である。
具体的には以下の疎水性基を挙げることができる。
【化４】
2014148378.tif 000006
【００１６】
＜含窒素基＞
上記含窒素基は、分子中に１つ以上の窒素を含有する基であり、具体的には、アミド基、イミド基、ウレア基、イミダゾリウム基などが挙げられ、アミド基、イミダゾリウム基が好ましく挙げられる。
これにより、ＤＮＡグルーブの間と水素結合することができ、ＤＮＡと安定した複合体を形成することができる。
また、上記含窒素基の上記特定個数は、１〜５個であり、１個であるのが好ましい。この範囲内とすることにより、生体への毒性が低く、小粒子径な核酸複合体を形成することができる。
アミド基の具体例としては、下記する置換基などが挙げられる。
【化５】
2014148378.tif 000007
【００１７】
＜カチオン性基＞
また、本発明の界面活性剤様化合物は、上記疎水性基と上記含窒素基との間にカチオン性基を有するのが好ましい。
上記カチオン性基としては、イミダゾリウム基、４級アミノ基、グアニジウム基、下記の置換基などが挙げられ、イミダゾリウム基が好ましく挙げられる。
これにより、核酸のリン酸基と静電相互作用で核酸同士の架橋を抑制し結合することができ、安定した複合体を形成することができる。また、モノカチオンであるためカチオン過剰による毒性がない複合体を形成できる。
上記カチオン性基の具体例としては、下記に示す基（イミダゾリウム基）等を好ましく挙げることができる。
【００１８】
【化６】
2014148378.tif 000008
【００１９】
本発明の界面活性剤様化合物の具体例としては、以下の化合物などが挙げられる。
なお、本発明の界面活性剤様化合物は、界面活性剤と同様に親水性基と疎水性基とを分子の両末端に有する化合物という意味であり、必ずしも界面活性剤としての機能を有する意味ではない。
以下の式中ｎは上述の範囲のとおりである。
【化７】
2014148378.tif 000009
【００２０】
＜製造方法＞
本発明の界面活性剤様化合物の製造方法を説明する。
本発明の界面活性剤様化合物は、上記カチオン性基を具備しない場合、上記親水性基の末端をアミノ化した化合物と、上記疎水性基を具備するカルボン酸無水物、カルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸アジドまたは活性エステルなどとを反応させ、アミド結合を形成させることなどにより製造することができる。
また、上記カチオン性基を具備する場合、上記カチオン性基のカルボン酸化合物をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と反応させることで活性化エステルを合成し、該活性化エステルと上記親水性基の末端をアミノ化した化合物とを反応させることでアミド結合させた化合物を合成し、該化合物に上記疎水性基を具備するハロゲン化物を反応させることなどで上記疎水性基を結合させるなどして製造することができる。なお、当該ハロゲン化物としては市販品を用いることもできる。
【００２１】
本発明の界面活性剤様化合物は、核酸複合体形成用として好ましく用いることができる。
ここで、本発明の界面活性剤様化合物が複合体を形成しうる「核酸」としては、各種疾患の治療や予防の効果をもつＤＮＡやＲＮＡ、例えば、タンパク質をコードするＤＮＡやＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡやＲＮＡ等のＤＮＡやＲＮＡ及びいわゆる人工核酸などが挙げられ、部分的に修飾されたものや、これらのキメラなどでもよい。
核酸複合体形成用として用いる場合、本発明の界面活性剤様化合物とＤＮＡやＲＮＡ等とを混合することで、本発明の界面活性剤様化合物とＤＮＡやＲＮＡ等の核酸との複合体を調製することができる。
本発明の界面活性剤様化合物と核酸との複合体は、粒子径が小さく且つ安定した複合体となる。これにより、体内における対象核酸の標的部位への輸送効率及び遺伝子発現効率が高くなるので、ドラッグデリバリーシステムとして好適である。
上記複合体を形成する際の本発明の界面活性剤様化合物と上記核酸との配合比は、核酸リン酸基の数に対する界面活性剤様化合物の分子数の比で界面活性剤様化合物：核酸＝０．１〜６４：１とするのが好ましく、０．１〜２：１とするのがさらに好ましい。
上記複合体を形成する際の上記核酸の鎖長は、２本鎖ＤＮＡの場合４０００〜６０００ｂｐ、１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの場合２０〜３０ｂａｓｅであるのが好ましい。
また、複合体は、各種溶媒の存在下で形成することができ、この際用いることができる溶媒としては、任意の緩衝液（ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ等）等を挙げることができる。また、複合体の形成は、公知の手法を特に制限なく用いて行うことができる。
また、本発明の界面活性剤様化合物を用いて形成された上記複合体はカチオン過剰による毒性がなく、且つ、ポリエチレングリコール基など生体適合性を有する親水性基を具備することで生体適合性及び血液中での安定性が高く、ドラッグデリバリー用として好ましい。
ドラッグデリバリー用の用途としては、核酸を用いた遺伝子治療、ＲＮＡ干渉、ｍＲＮＡデリバリーなどの用途を挙げることができ、これらの用途には上記複合体を投与することで対応することができる。
上記複合体の投与は、皮下、皮内、静脈、動脈または筋肉内への注射、経粘膜（口腔、鼻、肺、眼、直腸、子宮など）投与、脳内投与、腫瘍内投与などにより行うことができる。その際、必要に応じて、希釈剤やゲルなどの添加物も用いることができる。
上記複合体の投与量および期間などは特に限定されず、有効成分としての核酸の種類や投与対象の体重、年齢など種々の条件により適宜選択することが可能である。
また、投与に際しては、物理的エネルギーとの併用により、デリバリー効率や標的組織の選択性を与えることも可能である。この際の物理的エネルギーとは、磁場、光、超音波、電気、圧力を意味する。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明について実施例及び比較例を示してさらに具体的に説明するが本発明はこれらに何ら制限されるものではない。【００２３】
〔実施例１〕ＢｕＩｍ−ＰＥＧの合成
（イミダゾールＮＨＳ活性化エステルの合成）
１−イミダゾール酢酸１２６ｍｇと、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）１１５ｍｇとをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍＬで溶解させて溶液を得た。該溶液に、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）２０６ｍｇをＤＭＦ３ｍＬに溶解させたＤＣＣ溶液３ｍＬを加え、混合し、５０℃で１６時間反応させＮＨＳエステル化して活性化エステルを得た。
反応の説明図を以下に示す。
【化８】
2014148378.tif 000010
【００２４】
（ＮＨＳエステルとＰＥＧ−ＮＨ２のカップリング反応によるＩｍ−ＰＥＧの合成）
ＮＨＳエステル化反応後の反応液に、以下に示すＰＥＧ−ＮＨ２（ＭＷ２０００、日油社製）４００ｍｇを直接加え混合し、５０℃で２４時間反応させた。反応を完全に行うため、該溶液に上記のＮＨＳ活性化エステル８９．２ｍｇを直接加え混合し、５０℃、２４時間の反応を繰り返し行いＩｍ−ＰＥＧ（アミド結合させた化合物）を得た。
反応の説明図を以下に示す。
【化９】
2014148378.tif 000011
【００２５】
（Ｉｍ−ＰＥＧの部分アルキル化によるＢｕＩｍ−ＰＥＧの合成
上記のカップリング反応後の反応後、単離したＩｍ−ＰＥＧ１００ｍｇをＤＭＦ７ｍＬで溶解させ、１−ブロモブタン（疎水性基を有するハロゲン化物）５３．７μＬ（６８．５ｍｇ）を加え混合し、２４時間、５０℃で反応させた。この１−ブロモブタンの添加を２回繰り返し行った。反応後の生成物を再沈殿及び透析により精製し、本発明の界面活性剤様化合物としてのＢｕＩｍ−ＰＥＧ５９．６ｍｇ（収率５５％）を得た。
反応の説明図を以下に示す。
【化１０】
2014148378.tif 000012
【００２６】
〔実施例２〕ＯｃＩｍ−ＰＥＧの合成
実施例１のＩｍ−ＰＥＧの部分アルキル化に用いた１−ブロモブタンを１−ブロモオクタン８６．４μＬ（９６．６ｍｇ）に変えた以外は実施例１と同様にして、本発明の界面活性剤様化合物としてのＯｃＩｍ−ＰＥＧ７０．０ｍｇ（収率６３％）を得た。
反応の説明図を以下に示す。
【化１１】
2014148378.tif 000013
【００２７】
〔実施例３〕Ｃｈｏｌ−ＰＥＧの合成
ＰＥＧ−ＮＨ２（ＭＷ２０００、日油社製、親水性基の末端をアミノ化した化合物）１２０ｍｇ及びクロロぎ酸コレステリル（疎水性基にコレステロール基が導入されたもののカルボン酸ハロゲン化物）５３．９ｍｇ、をクロロフォルム１０ｍＬに溶解させ、該溶液にトリエチルアミン（ＴＥＡ）８．３６μＬ（６．０７ｍｇ）を加え、４０℃で４８時間反応させた。反応後の生成物をろ過及び透析により精製し、本発明の界面活性剤様化合物としての下記式に示すＣｈｏｌ−ＰＥＧ１４３ｍｇ（収率９９％）を得た。
反応の説明図を以下に示す。
【化１２】
2014148378.tif 000014
【００２８】
〔実施例４〕Ｏｃ−ＰＥＧの合成
ＰＥＧ−ＮＨ２（ＭＷ２０００、日油社製）１２０ｍｇ、ノナン酸無水物３９．４μＬ（３５．８ｍｇ）、をＤＭＦ１０ｍＬに溶解させ、該溶液にトリエチルアミン（ＴＥＡ）８．３６μＬ（６．０７ｍｇ）を加え、５０℃で４８時間反応させた。反応後の生成物を透析により精製し、本発明の界面活性剤様化合物としてのＯｃ−ＰＥＧ４２ｍｇ（収率３５％）を得た。
反応の説明図を以下に示す。
【化１３】
2014148378.tif 000015
【００２９】
〔実施例５〕Ｓｔ−ＰＥＧの合成
実施例４のノナン酸無水物をステアリン酸無水物１００ｍｇ、及び、反応温度を４０℃に変えた以外は実施例４と同様にして、本発明の界面活性剤様化合物としてのＳｔ−ＰＥＧ６６．８ｍｇ（収率５９％）を得た。
反応の説明図を以下に示す。
【化１４】
2014148378.tif 000016
【００３０】
〔実施例６〕ＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧ（「ＡＰｅ−Ｉｍ−ＰＥＧ」と略記することもある）の合成
実施例１のＩｍ−ＰＥＧの部分アルキル化に用いた１−ブロモブタンを６‐ブロモヘキサンアミド５４．３ｍｇに変えた以外は実施例１と同様にして、疎水性基としてヘキサンアミド基（ＨｅＡ）（「１-アミド-ペンチル基（ＡＰｅ）」と同義）を有する本発明の界面活性剤様化合物としてのＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧ（ＡＰｅ−Ｉｍ−ＰＥＧ）５０ｍｇ（収率８０％）を得た。
反応の説明図を以下に示す。
【化１５】
2014148378.tif 000017
なお、得られたＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧは、ＮＭＲ装置（装置名：ＡＶ５００、Ｂｒｕｋｅｒ社製）を用い、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定して合成の確認を行った。
その結果を図９に示す。【００３１】
〔試験例１〕ＢｕＩｍ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体の評価
（界面活性剤様化合物・ＤＮＡ複合体の調製）
ＤＮＡとして市販のプラスミドであるｐＧＬ３（プロメガ社）０．３μｇと、実施例１で得られた本発明の界面活性剤様化合物としてのＢｕＩｍ−ＰＥＧとをＤＮＡのリン酸基の数１に対しＢｕＩｍ−ＰＥＧの分子数が０．１，０．５，１，２，４，８，１６，３２及び６４の量になるようにリン酸緩衝液（組成５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４＋５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４）で最終液量が１５μＬになるように用いて溶解させた。溶解後、３７℃で２４時間インキュベーションし、界面活性剤様化合物・ＤＮＡ複合体としてのＢｕＩｍ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体を調製した。【００３２】
（界面活性剤様化合物・ＤＮＡ複合体のアガロースゲル電気泳動による分析）
ＢｕＩｍ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体をアガロースゲル電気泳動により分析し、ＤＮＡ複合体形成を確認した。
得られたＢｕＩｍ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体溶液を、ピペッティングにより混合し、全量をエチジウムブロマイド１μｇ／ｍＬ含有アガロースゲルにロードし、下記の条件で電気泳動を行った。
条件：
アガロースゲル：  アガロース１重量％、緩衝液リン酸緩衝液（組成５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４＋５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４）
電圧：５０ｍＶ
電気泳動時間：３０分
電気泳動終了後のアガロースゲルを、ＵＶトランスイルミネーターで発色させ、ゲル撮影装置（装置名ＧｅｌＤｏｃ２０００、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）にて画像を取得した。
なお、比較サンプルとして、界面活性剤様化合物を含まないＤＮＡのみのサンプルも合わせて試験した。
その結果を図１に示す。
なお、図中のＰＥＧ／Ｐは界面活性剤様化合物・ＤＮＡ複合体におけるＤＮＡのリン酸基とＰＥＧの分子数の比を意味し、ＤＮＡのリン酸基の数を１とした場合のＰＥＧの分子数を表す。また、図中のＤＮＡは界面活性剤様化合物を含まないＤＮＡのみのサンプルを意味する。【００３３】
（結果及び考察）
図１に示す結果からＰＥＧ／Ｐが０．１以上において矢印で示すように陰極方向へのバンドのシフトがみられ、８及び１６ではシフトしたバンドの量が多くなり、３２及び６４においてはバンドの消失が見られた。
バンドのシフトは、ＢｕＩｍ−ＰＥＧとＤＮＡとが複合体を形成し分子量が大きくなり、且つ、ＤＮＡ電荷の部分的な打消しが起こり、泳動距離が短い方向にシフトすることを意味する。
バンドの消失は、ＢｕＩｍ−ＰＥＧとＤＮＡとが複合体を形成し且つＤＮＡが凝集状態になることでエチジウムブロマイドをインターカレーションできずＤＮＡが染色されないことを意味する。
これらの結果から、ＢｕＩｍ−ＰＥＧとＤＮＡとは、複合体を形成し、ＤＮＡが凝集しており特に３２及び６４においてはＢｕＩｍ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体の安定性が高いことが判る。【００３４】
〔試験例２〕ＯｃＩｍ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体の評価
（界面活性剤様化合物・ＤＮＡ複合体のアガロースゲル電気泳動による分析）
界面活性剤様化合物として実施例２で得られたＯｃＩｍ−ＰＥＧを用いた以外は、試験例１と同様にして、ＯｃＩｍ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体を調製し、アガロースゲル電気泳動により分析した。
その結果を図２に示す。【００３５】
（結果及び考察）
図２に示す結果からＰＥＧ／Ｐが０．１以上において矢印で示すように陰極方向へのバンドのシフトがみられ、８以上でシフトしたバンドの量が多くなった。
このことから、ＯｃＩｍ−ＰＥＧとＤＮＡとは、複合体を形成しているのがわかる。【００３６】
〔試験例３〕Ｃｈｏｌ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体の評価
界面活性剤様化合物として実施例３で得られたＣｈｏｌ−ＰＥＧを用い、Ｃｈｏｌ−ＰＥＧをＤＮＡのリン酸基の数１に対しＰＥＧの分子数が１，４，８，１６，３２，６４及び９６の量になるようにリン酸緩衝液（組成５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４＋５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４）で最終液量が１５μＬになるように溶解させた以外は、試験例１と同様にして、Ｃｈｏｌ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体を調製し、アガロースゲル電気泳動により分析した。
その結果を図３に示す。【００３７】
（結果及び考察）
図３に示す結果からＰＥＧ／Ｐが１以上において矢印で示すように、ＤＮＡの電荷の打消しが起こらないにもかかわらず、陰極方向へのバンドのシフトがみられ、８、１６及び３２においてシフトしたバンドの量が多くなり、６４及び９６ではバンドの消失が見られた。
このことから、Ｃｈｏｌ−ＰＥＧとＤＮＡとは複合体を形成し、ＤＮＡが凝集しており、特に６４及び９６ではＣｈｏｌ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体の安定性が高いことが判る。【００３８】
〔試験例４〕Ｏｃ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体の評価
界面活性剤様化合物として実施例４で得られたＯｃ−ＰＥＧを用いた以外は、試験例３と同様にして、Ｏｃ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体を調製し、アガロースゲル電気泳動により分析した。
その結果を図４に示す。【００３９】
（結果及び考察）
図４に示す結果からＰＥＧ／Ｐが１以上において矢印で示すように陰極方向へのバンドのシフトがみられ、６４以上においてシフトしたバンドの量が多くなった。
このことから、Ｏｃ−ＰＥＧとＤＮＡとは、複合体を形成していることが分かる。【００４０】
〔試験例５〕Ｓｔ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体の評価
界面活性剤様化合物として実施例５で得られたＳｔ−ＰＥＧを用いた以外は、試験例３と同様にして、Ｓｔ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体を調製し、アガロースゲル電気泳動により分析した。
その結果を図５に示す。【００４１】
（結果及び考察）
図５に示す結果からＰＥＧ／Ｐが１以上において矢印で示すように陰極方向へのバンドのシフトがみられ、１６以上においてシフトしたバンドの量が多くなった。
このことから、Ｓｔ−ＰＥＧとＤＮＡとは、複合体を形成していることが分かる。【００４２】
〔試験例６〕界面活性剤様化合物・ＤＮＡ複合体の粒子径測定
ＤＮＡとして市販のプラスミドであるｐＧＬ３  ０．７μｇと、実施例１〜５で得られた本発明の界面活性剤様化合物をＤＮＡのリン酸基の数１に対しＰＥＧの分子数が６４の量になるように、リン酸緩衝液（組成５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４＋５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４＋１３０ｍＭ  ＮａＣｌ）１００μＬで調製し、３７℃で２４時間インキュベーションし、界面活性剤様化合物・ＤＮＡ複合体を調製した。
得られた界面活性剤様化合物・ＤＮＡ複合体を動的光散乱法により粒子径を測定した。
動的光散乱法による粒子径の測定は、以下の条件で散乱光強度を測定し、散乱光強度から粒子径を算出することで行った。
条件：
装置：装置名ＥＬＳＺ２（大塚電子社製）
なお、比較サンプルとして、界面活性剤様化合物を含まないＤＮＡのみのサンプル、及び、界面活性剤様化合物の変わりにＰＥＧ−ＮＨ２を用いて調製したサンプルも合わせて試験した。
その結果を表１に示す。
なお、表中のＰＥＧ／Ｐは、界面活性剤様化合物・ＤＮＡ複合体におけるＤＮＡのリン酸基とＰＥＧの分子数の比を意味し、ＤＮＡのリン酸基の数を１とした場合のＰＥＧの分子数を表し、Ｎ．Ｄは粒子径の測定が不可能であったことを示す。【００４３】
【表１】
2014148378.tif 000018
【００４４】
（結果及び考察）
実施例１〜５で得られた本発明の界面活性剤様化合物とＤＮＡとの複合体の粒子径は、１３．０±１．１〜１３７．５±２８．７ｎｍと小さい粒子径であった。
この結果は、本発明の界面活性剤様化合物とＤＮＡとの複合体は、生体投与時において血管から細胞へ移行することができる大きさであり静脈注射に適した粒子径であることを示している。
また、カチオン性基を具備する実施例１及び２の界面活性剤様化合物とＤＮＡとの複合体の粒子径は、それぞれ１３．０±１．１ｎｍ及び８７．３±１．１ｎｍであった。
この結果は、カチオン性基を具備する本発明の界面活性剤様化合物は、粒子径が小さいＤＮＡ複合体を形成でき、これにより、生体投与時における血管から細胞へ移行効率が上昇することを示す。【００４５】
〔試験例７〕界面活性剤様化合物・ＤＮＡ複合体の円偏光二色性スペクトル測定
実施例１で得られた本発明の界面活性剤様化合物（ＢｕＩｍ−ＰＥＧ）をＤＮＡ（ｐＧＬ３）のリン酸基の数１に対しＰＥＧの分子数が６４の量になるように、純水１０００μＬで調製し、３７℃で２４時間インキュベーションし、界面活性剤様化合物・ＤＮＡ複合体を調製し、以下の条件で円偏光二色性スペクトル（ＣＤスペクトル測定）を測定した。
条件：ＤＮＡ量：１２μｇ
装置：Ｊ−８２０（日本分光社製）
なお、比較サンプルとして、界面活性剤様化合物を含まないＤＮＡのみのサンプルも合わせて試験した。
その結果を図６（チャート図）及び、表２（最大モル楕円率を示す波長（λｍａｘ）および３００ｎｍにおけるモル楕円率（［θ］３００））に示す。【００４６】
【表２】
2014148378.tif 000019
【００４７】
（結果及び考察）
表２の［θ］３００と図６の図中の１で示した部分の結果から界面活性剤様化合物・ＤＮＡ複合体中のＤＮＡに負のコットン効果が出現するのがわかり、表２のλｍａｘと図６の図中の２で示した部分の結果からブルーシフトが見られることがわかる。
これらの結果から、界面活性剤様化合物・ＤＮＡ複合体中のＤＮＡが脱水和によりコンフォーメーションの変化を起こしているのが判る。【００４８】
〔試験例８〕遺伝子導入効率の評価試験１
実施例３で得られた本発明の界面活性剤様化合物（Ｃｈｏｌ−ＰＥＧ）を用いて作成した界面活性剤様化合物・ＤＮＡ複合体の遺伝子導入効率の評価試験を行った。
（界面活性剤様化合物・ＤＮＡ複合体の調製）
ＤＮＡとして市販のプラスミドでＳＶ４０プロモーターの下流に改変型ルシフェラーゼ遺伝子を連結させたｐＧＬ３（プロメガ社）３．５μｇと、実施例３で得られた本発明の界面活性剤様化合物としてのＣｈｏｌ−ＰＥＧをＤＮＡのリン酸基の数１に対しコレステロール基の分子数が０．１，０．５，１．０及び２．０の量になるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、組成１３７ｍＭ  ＮａＣｌ＋２．７ｍＭ  ＫＣｌ＋１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４＋１．７６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）で最終液量が３５μＬになるように溶解させた。溶解後、３７℃で２４時間インキュベーションし、界面活性剤様化合物・ＤＮＡ複合体としてのＣｈｏｌ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体を調製した。
（マウスへの投与）
調製したＣｈｏｌ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体をろ過滅菌し、３５μＬをマウス（系統ＩＣＲ、５週令、体重２０〜２５ｇ）の背皮内部位に皮内注射した。
なお、比較サンプルとして、ＰＢＳのみを注射したサンプル、界面活性剤様化合物を含まないＤＮＡのみのサンプルの試験も行った。
（組織の摘出）
投与から２日後、動物実験の倫理指針に従ってマウスを麻酔した後に解剖し、皮膚を摘出した。
摘出後の皮膚は、ルシフェラーゼアッセイまで−８０℃で保存した。
（タンパク質抽出〜ルシフェラーゼアッセイ）
皮膚からのタンパク質抽出は、ホモジネートにより行った。
ルシフェラーゼアッセイは、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いて、ルミノメータ−（装置名ＬＢ９６Ｖ、ベルトールド社製）で発光の定量をすることで行い、発光量は、サンプルのタンパク質量で標準化した。
なお、サンプルのタンパク質量の測定は、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いてＢＣＡ法により行った。
その結果を図７に示す。
なお、図中Ｃｈｏｌ／Ｐは、界面活性剤様化合物・ＤＮＡ複合体におけるＤＮＡのリン酸基とコレステロール基の分子数の比を意味し、ＤＮＡのリン酸基の数を１とした場合のコレステロール基の分子数を表し、ＰＢＳはＰＢＳのみを投与したサンプルを表し、ＤＮＡは界面活性剤様化合物を含まないＤＮＡのみのサンプルを表す。
（結果及び考察）
図７から、本発明の界面活性剤様化合物（Ｃｈｏｌ−ＰＥＧ）を用いて作成したＣｈｏｌ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体の投与はＰＥＧ／Ｐが１において、ＤＮＡのみの投与よりも、生体内のルシフェラーゼによる発光が高かった。
この結果から、本発明の界面活性剤様化合物（Ｃｈｏｌ−ＰＥＧ）を用いて作製したＣｈｏｌ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体の投与は、臨床応用例があるＤＮＡのみの投与より、生体内での遺伝子発現が高いことがわかる。【００４９】
〔試験例９〕遺伝子導入効率の評価試験２
実施例１及び３で得られた本発明の界面活性剤様化合物（ＢｕＩｍ−ＰＥＧ及びＣｈｏｌ−ＰＥＧ）を用いて作成した界面活性剤様化合物・ＤＮＡ複合体の遺伝子導入効率の評価試験を行った。
（界面活性剤様化合物・ＤＮＡ複合体の調製）
実施例１で得られた本発明の界面活性剤様化合物としてのＢｕＩｍ−ＰＥＧをＤＮＡ（ｐＧＬ３）の負電荷（リン酸基の電荷）数１に対しＢｕＩｍ−ＰＥＧの正電荷（カチオン基の電荷）数が０．５の量になるように混合し、また、実施例３で得られた本発明の界面活性剤様化合物としてのＣｈｏｌ−ＰＥＧをＤＮＡ（ｐＧＬ３）のリン酸基の数１に対しコレステロール基の分子数が１．０の量になるように混合した以外は、試験例８と同様にして、界面活性剤様化合物・ＤＮＡ複合体としてのＢｕＩｍ−ＰＥＧ及びＣｈｏｌ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体を調製した。
（マウスへの投与）
調製したＢｕＩｍ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体及びＣｈｏｌ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体を試験例８と同様にしてマウスに投与した。マウスへの投与は１サンプルについて２匹のマウスに行った。
なお、比較サンプルとして、界面活性剤様化合物を含まないＤＮＡのみのサンプルの試験も行った。
（組織の摘出）
試験例８と同様にして皮膚を摘出し、保存した。
（タンパク質抽出〜ルシフェラーゼアッセイ）
試験例８と同様にして行い、発光量を測定した。
その結果を図８に示す。
（結果及び考察）
図８から、本発明の界面活性剤様化合物（ＢｕＩｍ−ＰＥＧ）を用いて作成したＢｕＩｍ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体の投与は、ＤＮＡのみの投与よりも、生体内のルシフェラーゼによる発光が約７倍と顕著に高く、本発明の界面活性剤様化合物（Ｃｈｏｌ−ＰＥＧ）を用いて作成したＣｈｏｌ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体の投与においても、ＤＮＡのみの投与よりも、生体内のルシフェラーゼによる発光が高かった。
この結果から、本発明の界面活性剤様化合物（ＢｕＩｍ−ＰＥＧ及びＣｈｏｌ−ＰＥＧ）を用いて作製したＢｕＩｍ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体及びＣｈｏｌ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体の投与は、臨床応用例があるＤＮＡのみの投与より、生体内での遺伝子発現が高いことがわかり、特にＢｕＩｍ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体の投与では生体内での遺伝子発現が顕著に高いことがわかる。【００５０】
〔試験例９〕ＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体の評価１
（界面活性剤様化合物・ＤＮＡ複合体のアガロースゲル電気泳動による分析）
界面活性剤様化合物として実施例６で得られたＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧを用い、ＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧをＤＮＡのリン酸基の数１に対しＰＥＧの分子数（ＰＥＧ／Ｐ）が０．５，１，２，４，８，１６，３２，６４の量になるようにリン酸緩衝液（組成５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４＋５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４）で最終液量が１５μＬになるように溶解させた以外は、試験例１と同様にして、ＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体溶液を調製し、アガロースゲル電気泳動により分析した。
その結果を図１０に示す。
なお、ＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧをＤＮＡのリン酸基の数１に対しＰＥＧの分子数が０．５，１，２，４，８，１６，３２，６４の量に混合した場合、ＤＮＡのリン酸基の数１に対するＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧの正電荷（カチオン基の電荷）数（電荷比）も、上記リン酸基に対するＰＥＧの分子数と同じ値になる。
（結果及び考察）
図１０に示す結果からＰＥＧ／Ｐが０．５以上において矢印で示すように陰極方向へのバンドのシフトがみられ、４においては陽極方向へスメアしたバンドがみられ、８以上においてはＮａｋｅｄ  ＤＮＡバンドの消失が見られた。スメアのバンドは、正味負に帯電した微小粒径のＤＮＡ複合体の形成を示唆している。さらに、８で見られたＮａｋｅｄ  ＤＮＡバンドより陽極方向へシフトしたバンドは、正味負に帯電した超微小粒径のＤＮＡ複合体の形成を示唆しており、周辺研究で既存しない新概念のＤＮＡ複合体であると考えられる。
これらの結果から、ＰＥＧ／Ｐが０．５以上においてＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧはＤＮＡと複合体を形成することがわかる。特にＰＥＧ／Ｐが８以上において、ＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体は、安定性が高いことがわかる。
また、ＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧにおいては、実施例１〜５の界面活性剤様化合物の結果と比較したときに、ＰＥＧ／Ｐが０．５以上という低い電荷比においてで陰極方向へのバンドのシフト（ＤＮＡとの複合体形成）が見られた。
また、ＤＮＡが凝集状態でありＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体の安定性が高いことを示すバンドの消失もＰＥＧ／Ｐが１６以上という低い電荷比でみられた。
これらの結果から、ＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧは、実施例１〜５の界面活性剤様化合物よりも、ＤＮＡとの複合体形成能、及びＤＮＡの凝集能がさらに高いものであることがわかる。【００５１】
〔試験例１０〕ＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体の評価２
（界面活性剤様化合物・ＤＮＡ複合体のポリアニオンに対する安定性評価）
界面活性剤様化合物・ＤＮＡ複合体の安定性の評価を行った。安定性の評価は、ポリアニオンによる、界面活性剤様化合物・ＤＮＡ複合体の置換反応に対する安定性を指標として行った。
（界面活性剤様化合物・ＤＮＡ複合体の調整）
実施例６で得られた本発明の界面活性剤様化合物としてのＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧをＤＮＡのリン酸基の数１に対しＰＥＧの分子数（ＰＥＧ／Ｐ）が１、または８の量（それぞれ電荷比：１、電荷比：８）になるようにそれぞれ混合した以外は、試験例１と同様にして、ＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体溶液を調製した。
（ポリアニオン処理）
調整したＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体溶液に、ポリアニオンとしてのデキストランサルフェート（型番：Ｄ４９１１、ＳＩＧＭＡ-ＡＬＤＲＩＣＨ社製）溶液を、ＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体に混合添加し、３７℃、６０分の条件でインキュベートし反応させた。なお、ＰＥＧ／Ｐが１の試料については、デキストランサルフェート溶液を最終濃度が１、２、３ｍＭになるように混合添加し、ＰＥＧ／Ｐが８の試料については、デキストランサルフェートを最終濃度が１、２、３、８ｍＭになるように混合添加した。
（アガロースゲル電気泳動による分析）
ＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体とデキストランサルフェートを反応させた後、該混合物を、試験例１と同様にしてアガロース電気泳動により分析した。
その結果を図１１に示す。【００５２】
（結果及び考察）
図１１に示す結果から、ＰＥＧ／Ｐが１のＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体においては、デキストランサルフェートの濃度が２ｍＭ以下においてはＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体の形成を示すメインバンドがみられ、３ｍＭの濃度においてメインバンドの下（陽極側）にスーパーコイル由来のマイナーバンドがみられた。この結果は、ＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体は、２ｍＭという高濃度のデキストランサルフェートに対しも安定であり、３ｍＭのデキストランサルフェートに対してはＤＮＡがリリースされることを意味する。
一方、ＰＥＧ／Ｐが８のＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体においては、デキストランサルフェートの濃度が１〜８ｍＭにおいて、バンドの変化が見られなかった。この結果は、ＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体は、８ｍＭという高濃度のデキストランサルフェートに対しも安定であり、極めて安定な複合体を形成していることがわかる。さらに、この時、〔試験例１０〕で記した通り、Ｎａｋｅｄ  ＤＮＡバンドより陽極方向へシフトしたバンドが維持されているため、正味負に帯電した超微小粒径のＤＮＡ複合体の安定性が示唆された。
また、これらの結果からもわかるように、本発明の界面活性剤様化合物としてのＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧとＤＮＡとの複合体は、ＰＥＧ／Ｐ比（電荷比）を変えることにより、その複合体の特性を制御することができるものである。これにより、ドラッグデリバリー特性を制御することができる。例えば、ドラッグデリバリー目的が培養細胞などに短時間で遺伝子導入する場合などにおいては、複合体の安定性を高くしすぎないように制御したり、また、生体内において消化酵素等が多くデリバリー効率が低い細胞や組織などにドラッグデリバリーを行う場合においては、複合体の安定性を高くするように制御する等の制御をすることができ、その制御はＰＥＧ／Ｐ比（電荷比）を変えるなどして簡単に行うことができる。以上から、本発明の界面活性剤様化合物は、核酸複合体形成用、ドラッグデリバリー用として好適に用いることができることがわかる。【００５３】
〔試験例１１〕遺伝子導入効率の評価試験３
実施例６で得られた本発明の界面活性剤様化合物（ＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧ）を用いて作成した界面活性剤様化合物・ＤＮＡ複合体の遺伝子導入効率の評価試験を行った。
（界面活性剤様化合物・ＤＮＡ複合体の調製）
実施例６で得られた本発明の界面活性剤様化合物としてのＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧをＤＮＡのリン酸基の数１に対しＰＥＧの分子数（ＰＥＧ／Ｐ）が０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．５になるようにそれぞれ混合した以外は、試験例８と同様にして、ＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体溶液を調製した。
（マウスへの投与）
調製したＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体溶液を、頸骨筋内投与（３５μＬ）に変えた以外は、試験例８と同様にしてマウスに投与した。マウスへの投与は１サンプルについて２匹のマウスに行った。
なお、比較サンプルとして、界面活性剤様化合物を含まないＤＮＡのみのサンプル、リン酸緩衝液のみのサンプル、本発明の界面活性剤様化合物の代わりに陽イオン性の水溶性ポリマーである直鎖状のポリエチレンイミンをベースにした市販品のｉｎ  ｖｉｖｏ用核酸導入試薬（商品名：ｊｅｔＰＥＩ、Polyplus  transfection社製）を用いて調整したサンプルの試験（以下、市販品を用いた群と呼ぶこともある。）も行った。なお、ｊｅｔＰＥＩによるサンプル調整は、添付のマニュアルに従って行った。
（組織の摘出、タンパク質抽出〜ルシフェラーゼアッセイ）
投与後の組織の摘出、及びタンパク質抽出〜ルシフェラーゼアッセイの工程は、組織の摘出を投与から６日後に行った以外は、試験例８と同様にして行った。
その結果を図１２に示す。【００５４】
（結果及び考察）
図１２から、本発明の界面活性剤様化合物（ＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧ・ＤＮＡ）を用いて作成したＨｅＡ−Ｉｍ−ＰＥＧ・ＤＮＡ複合体の投与群はすべての群において、比較実験群（ＰＢＳのみの投与群、ＤＮＡのみの投与群よりも、市販品を用いた群）よりも、生体内のルシフェラーゼによる発光量が高いものであった。特に、ＰＥＧ／Ｐが０．６〜１．０において発光量が高く、中でもＰＥＧ／Ｐが０．８の群においては、ＤＮＡのみの投与群の１０倍以上、且つ市販品を用いた群より１０００倍以上の極めて高い発光量を示した。
以上の結果から、本発明の界面活性剤様化合物は、核酸複合体形成用、ドラッグデリバリー用として好適に用いることができることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の界面活性剤様化合物は、核酸複合体形成用として有用であり核酸治療薬のドラッグデリバリー用途に好ましく用いることができる。
本発明の界面活性剤様化合物とＤＮＡとの複合体は、粒子径が小さく且つ安定した複合体である。これにより、体内における対象ＤＮＡの標的部位への移送効率及び遺伝子発現効率が高い。
また、本発明の界面活性剤様化合物はポリエチレングリコール基など生体適合性を有する置換基を含有するため血液中での安定性が高く、且つカチオン過剰による毒性がない。これらの機能を有するためドラッグデリバリー用途に有用である。
【図６】
2014148378.tif 000021
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年8月12日(2014.8.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性基と疎水性基とそれらの間に位置する１〜５個の含窒素基とを具備し、
上記親水性基が、非イオン性の親水性基であり、
上記疎水性基が、炭素数１〜１８の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、コレステロール基、ポルフィリン基、または脱プロトン化したイミダゾール基であり、
上記含窒素基が、アミド基、またはイミダゾリウム基である
ことを特徴とする界面活性剤様化合物。
【請求項２】
上記含窒素基は、親水性基とは直接又はアルキレン基を介して結合されており且つ疎水性基とは直接又はカチオン性基を介して結合されていることを特徴とする請求項１に記載の界面活性剤様化合物。
【請求項３】
上記非イオン性の親水性基が下記式（１）又は（２）で表されるエチレングリコール基である
請求項１または２に記載の界面活性剤様化合物。
Ｒ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−  ・・・・・（１）
ＣＨ３Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−  ・・・・・（２）
（式中、ｎは４０〜１２０の整数を表す。Ｒは炭素数１〜１８の炭化水素基を示す。）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
上記疎水性基が、その一部に疎水性ではない水素結合性官能基含有置換基を有し、
上記水素結合性官能基含有置換基は、アミド基、ヒドロキシル基、核酸塩基、または修飾核酸塩基である
請求項１〜４のいずれかに記載の界面活性剤様化合物。
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
上記疎水性基が、下記式１に示す１−アミド−アルキル基、１−ヒドロキシ−アルキル基、１−チミン−アルキル基である
請求項５に記載の界面活性剤様化合物。
【化１】
2014148378.tif 000033
式中、ｎは１〜２０の整数である。
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
上記カチオン性基がイミダゾリウム基、４級アミノ基、またはグアニジウム基である
請求項２に記載の界面活性剤様化合物。
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
上記界面活性剤様化合物は、下記式２に示すいずれかの化合物である請求項２に記載の界面活性剤様化合物。
【化２】
2014148378.tif 000034
（式中、ｎは４０〜１２０の整数を表す。）
【請求項１４】
核酸複合体形成用である請求項１〜１３のいずれかに記載の界面活性剤様化合物。
【請求項１５】
核酸複合体形成用である請求項１３に記載の界面活性剤様化合物。
【国際調査報告】
2014148378.tif 000035
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