(57)【要約】電気的な作用により少量の細胞に効率的且つ低コストで外来物質を導入する装置および低コストで多様な外来物質導入細胞を製造し得る外来物質導入細胞の製造方法を提供すること。遺伝子等の外来物質を細胞に導入する際には、細胞と外来物質とが含まれる細胞懸濁液が、容器（２）の開口部（１７）から供給される。細胞懸濁液は、形成される液滴（Ｗ）が、一対の電極（５ａ、５ｂ）に同時に接触しないように調製された量で容器（２）内に供給される。細胞懸濁液は容器（２）に貯留される油（６）とは混和せず、油（６）中に液滴（Ｗ）が形成される。液滴（Ｗ）は、電極（５ａ、５ｂ）間に配置される。電源（９）から電極（５ａ、５ｂ）に直流電圧が供給されると、電極（５ａ、５ｂ）間を液滴（Ｗ）が移動し、液滴（Ｗ）が電極（５ａ、５ｂ）に接触する際の電気的な作用により、液滴（Ｗ）中において外来物質が細胞に導入される。
2014092164.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気的作用によって細胞外から細胞内に外来物質を導入する外来物質導入装置（１、１１、４１、６１、８１）において、
外部からの物質供給が可能な開口部（１７、１８、６８、８３）を有する１以上の貯留槽（２、１２、６２、８２）と、
前記１以上の貯留槽の各々の内に互いに離間して配置された、水平面に交差する方向に延設された一対の電極（５ａ、５ｂ、１５ａ、１５ｂ、２５ａ、２５ｂ、３５ａ、３５ｂ）を有する１以上の電極部（５、１５、２５、３５）と、
前記１以上の電極部に、所定時間、直流電圧を印加して電界を発生させるよう構成された電界発生手段であって、絶縁性液体が貯留された前記１以上の貯留槽の各々において、外来物質および細胞を含有し、前記絶縁性液体と混和しない細胞懸濁液を、前記一対の電極の間に供給することにより、前記絶縁性液体中に前記一対の電極の間隔よりも小径の前記細胞懸濁液の液滴を形成させた状態で、前記１以上の電極部に直流電圧を印加した場合に、前記一対の電極間に生じる電界によって、前記液滴を前記一対の電極のうちの前記液滴とは逆の極性を有する電極である逆極性電極に向かって移動させ、前記逆極性電極に前記液滴を接触させて前記液滴の移動方向の反転を引き起こすよう構成された電界発生手段（９）と
を備えることを特徴とする外来物質導入装置。
【請求項２】
前記一対の電極は、前記１以上の電極部の各々に直流電圧が印加された場合の前記絶縁性液体の液面に仮想的な複数の電気力線を引いた場合に、当該複数の電気力線の分布が局所的な集中を生じる形状に形成されていることを特徴とする請求項１に記載の外来物質導入装置。
【請求項３】
前記一対の電極のうちの一方の電極は、水平面に対して略垂直方向に展延された面状体であって、他方の電極に向き合う対向面側が凹となる略円弧形状に湾曲して形成された面状体である第一面状体を有していることを特徴とする請求項２に記載の外来物質導入装置。
【請求項４】
前記一対の電極のうちの他方の電極は、水平面に対して略垂直方向に展延された面状体であって、前記一方の電極に向き合う対向面側が凹となる略円弧形状に湾曲して形成された面状体である第二面状体を有していることを特徴とする請求項３に記載の外来物質導入装置。
【請求項５】
前記一対の電極の少なくとも一方は、凹部又は凸部を有することを特徴とする請求項１に記載の外来物質導入装置。
【請求項６】
前記一対の電極の前記間隔は、１ｃｍ以内であり、
前記電界発生手段は、前記一対の電極の間に形成された前記液滴を、前記逆極性電極に向かって移動させ、前記逆極性電極に前記液滴を接触させて前記液滴の移動方向の反転を引き起こすことを繰り返すことで、前記一対の電極の間を複数回往復移動させるよう構成されたことを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の外来物質導入装置。
【請求項７】
前記１以上の貯留槽の各々は底面部（４、１４、６４、８４）を有し、
前記絶縁性液体は、前記細胞懸濁液よりも低比重で且つ、前記電界発生手段による直流電圧の印加が終了した際の前記液滴の位置が、前記底面部と、前記絶縁性液体の液面との間の位置となる粘性を備えることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の外来物質導入装置。
【請求項８】
前記１以上の貯留槽は並列された複数の貯留槽（１２）であり、前記複数の貯留槽の各々には、上面に前記開口部（１７）が形成され、１の電極部（１５）が設けられており、
前記一対の電極は、各々少なくとも前記開口部まで延設されており、
前記複数の貯留槽の各々の前記一対の電極のうち一方を前記開口部において電気的に接続する第１接続部（４５ａ）と、
前記複数の貯留槽の各々の前記一対の電極のうち他方を前記開口部において電気的に接続する第２接続部（４５ｂ）とを更に備え、
前記電界発生手段は、前記第１接続部および前記第２接続部を介して、前記複数の貯留槽の各々の前記１の電極部に直流電圧を印加することを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の外来物質導入装置。
【請求項９】
前記１以上の貯留槽（６２）の各々は、互いに間隔をあけて配置された複数の電極部（３５）を収容し、
前記一対の電極は、各々少なくとも前記開口部（６８）まで延設されており、
前記１以上の貯留槽の各々の前記一対の電極のうち一方を前記開口部において電気的に接続する第１接続部（６５ａ）と、
前記１以上の貯留槽の各々の前記一対の電極のうち他方を前記開口部において電気的に接続する第２接続部（６５ｂ）とを更に備え、
前記電界発生手段は、前記第１接続部および前記第２接続部を介して、前記１以上の貯留槽の各々の前記複数の電極部に直流電圧を印加することを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の外来物質導入装置。
【請求項１０】
細胞と１種類以上の外来物質とを含む細胞懸濁液を、貯留槽に貯留され、該細胞懸濁液と混和しない絶縁性液体中へ供給して前記絶縁性液体中で液滴を形成させる第１工程（Ｓ３）と、
前記第１工程にて形成された前記液滴の両側に各々設けられ、前記絶縁性液体の液面に対して交差する方向に延びる一対の電極に所定時間直流電圧を印加して、前記一対の電極のうちの一方の電極と他方の電極との間を前記液滴を往復移動させ、前記液滴を電極に接触させることで、前記液滴中において前記１種類以上の外来物質を前記細胞に導入する第２工程（Ｓ４）と
を備えることを特徴とする外来物質導入細胞の製造方法。
【請求項１１】
前記第２工程は、前記１種類以上の外来物質を前記細胞の核に導入する工程であることを特徴とする請求項１０に記載の外来物質導入細胞の製造方法。
【請求項１２】
前記第１工程は、複数種類の外来物質を含む細胞懸濁液を前記絶縁性液体中へ供給して液滴を形成させる工程であり、
前記第２工程で前記所定時間直流電圧を印加することで、前記複数種類の外来物質を前記細胞に導入する工程であることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の外来物質導入細胞の製造方法。
【請求項１３】
前記第１工程に使用される前記細胞は、ヒト由来の体細胞およびヒト以外の動物由来の体細胞の少なくとも一方であることを特徴とする請求項１０から１２のいずれかに記載の外来物質導入細胞の製造方法。
【請求項１４】
前記絶縁性液体は、第一絶縁性液体と、前記第一絶縁性液体よりも比重が軽い第二絶縁性液体とを含み、
前記第１工程の前に、前記第一絶縁性液体と、前記第二絶縁性液体とを前記貯留槽に注入して、前記第一絶縁性液体の層の上に前記第二絶縁性液体の層を形成させる注入工程（Ｓ２）を更に備え、
前記第１工程は、前記第二絶縁性液体中で前記液滴を形成させる工程であり、
前記第２工程は、前記一対の電極に前記所定時間直流電圧を印加して、前記第二絶縁性液体中で、前記液滴を往復移動させる工程であることを特徴とする請求項１０から１３のいずれかに記載の外来物質導入細胞の製造方法。
【請求項１５】
電気的作用によって細胞外から細胞内に外来物質を導入する外来物質導入装置（１１、４１、８１）において、
外部からの物質供給が可能な開口部を有する貯留槽内に互いに離間して配置された場合に、水平面に交差する方向に延設され、且つ、直流電圧が印加された場合の仮想的な複数の電気力線の分布が局所的な集中を生じる形状に形成された一対の電極（１５ａ、１５ｂ）を有する電極部（１５）と、
前記電極部に、所定時間、直流電圧を印加して電界を発生させるよう構成された電界発生手段であって、絶縁性液体が貯留された前記貯留槽において、外来物質および細胞を含有し、前記絶縁性液体と混和しない細胞懸濁液を、前記一対の電極の間に供給することにより、前記絶縁性液体中に前記一対の電極の間隔よりも小径の前記細胞懸濁液の液滴を形成させた状態で、前記電極部に直流電圧を印加した場合に、前記一対の電極間に生じる電界によって、前記液滴を前記一対の電極のうちの前記液滴とは逆の極性を有する電極である逆極性電極に向かって移動させ、前記逆極性電極に前記液滴を接触させて前記液滴の移動方向の反転を引き起こすよう構成された電界発生手段（９）と
を備えることを特徴とする外来物質導入装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞に外来遺伝子等の外来物質を導入する外来物質導入装置および外来物質が導入された外来物質導入細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまで、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、および薬剤等の外来物質を、標的とする細胞内に導入するための様々な方法が開発されている。外来物質を標的細胞内に導入する手法には、大きく分けて生物学的手法、化学的手法、および物理的手法がある。生物学的手法としては、ウイルスを用いた方法が知られている。化学的方法としては、リン酸カルシウム法およびリポフェクション法が一般的に知られている。物理的手法にはエレクトロポレーション法、遺伝子銃(パーティクルガン)法、および超音波を使用する方法等がある。大腸菌等のバクテリアは、塩化カルシウム存在下でコンピテントセル化した細胞にヒートショックが与えられることで、簡便に細胞内にＤＮＡが導入されることが知られている。大腸菌の形質転換には、ヒートショックを与える方法が広く用いられている。【０００３】
ウイルスを用いた生物学的手法は、ウイルスの感染を封じ込めるための特殊な研究施設を必要とする。その上、ウイルスを用いた生物学的手法は、ウイルスが導入された細胞がウイルスのもつ毒性および抗原性等に起因して、癌化するという問題を有する。リン酸カルシウム法は、特別な装置を必要としない。リン酸カルシウム法の実施に必要な試薬類は安価である。しかしリン酸カルシウム法では、標的細胞へのダメージが比較的大きい上、導入効率が低い。リポフェクション法は、リン酸カルシウム法に比べて導入効率がよく、必要とされるＤＮＡ（外来物質）量が少ないという利点を有する。しかしリポフェクション法では、標的細胞によって検討すべきパラメータが比較的多く、高価な試薬が必要とされる。化学的手法では、試薬の毒性のため適用できる細胞が限られており、海馬神経細胞等の細胞種を標的細胞とする場合には良好な導入効率が得られ難い。【０００４】
物理的手法は、上述の生物学的手法および化学的手法に比べて、細胞に対する毒性を考慮する必要がなく、高価な試薬が不要であるといった利点を有する。遺伝子銃法では、外来遺伝子（例えば、ＤＮＡ）がコーティングされた金粒子が高圧ヘリウムガスによって標的細胞内へ打ち込まれ、標的細胞の核内に直接導入される。これによって、遺伝子銃法は、標的細胞へ外来遺伝子を導入し、発現させることを可能とする。即ち遺伝子銃法は、多数のＤＮＡ分子を標的細胞に打ち込む方法である。このため、遺伝子銃法では、単一細胞あたりの遺伝子発現量は高いが、多数の細胞を標的細胞として何個の細胞に遺伝子が導入されたかという意味での発現効率は低い。超音波を使用する方法は、細胞の種類毎に試行錯誤しながらの条件設定を要し、簡便ではない。【０００５】
エレクトロポレーション法（電気穿孔法）は、物理的手法の中で最も代表的な技法であり、細胞に高圧パルスを与え、細胞膜に外来物質が通過できる小孔を一過性に作ってＤＮＡ等を取り込ませる方法である。エレクトロポレーション法では、化学的手法と比較して高い導入効率が得られる上、操作が簡便で再現性および安全性が高く、様々な生物種（植物細胞も含む）および細胞種への適用が可能である。【０００６】
エレクトロポレーション法は、細胞と外来物質とを含む懸濁液に電極が浸漬された状態で処理を行う方法である。このため、エレクトロポレーション法では、同一の電極を用いて複数回の処理が行われると、電極に付着した古い懸濁液によって、新たな懸濁液に汚染が発生する可能性が高い。電極を一回の処理ごとに使い捨てとすれば汚染は回避されるが、処理にかかるコストが上昇する。【０００７】
更に、エレクトロポレーション法では、必要とされる試料体積が比較的大きいため、希少な細胞を多量に準備する必要がある。このためエレクトロポレーション法では、試料内の細胞が少量である場合、分析が困難となる可能性がある。必要な試料量を低減するべく、中空の毛細管又はチューブに試料を充填して電気穿孔を行う方法（特許文献１参照）、外来遺伝子の導入効率を向上させる方法（特許文献２参照）、およびピペットチップ式の電気穿孔装置（特許文献３参照）が提案されている。しかし、遺伝子治療および細胞移植等の臨床現場では、患者の負担軽減のため採取する細胞数は少ないほど良く、高価である外来遺伝子の使用量の更なる低減が求められている。【０００８】
加えて、エレクトロポレーション法では、高価なパルスジェネレータが必要とされ、外来物質導入のための最適条件の検討が煩雑になることが多い。【０００９】
本願発明者らは、オイルが満たされた容器と、容器内の底面に並列に固定された２の電極と、直流高電圧電源とを備え、一方の電極を高電圧電極、他方の電極を接地電極として直流高電圧電源から電圧を印加する装置を開発した。本願発明者らは、大腸菌のコンピテントセルとプラスミドＤＮＡとを含む親水性の液滴を電極間に配置した状態で電圧を印加することで、液滴を電極間で往復移動させ、２μｌという僅かな体積の試料で液滴中の大腸菌へプラスミドＤＮＡ（外来物質）を導入できることを見出した。本願発明者らは、高価なパルスジェネレータを不要とできる新たなエレクトロポレーションの技術を提案した（非特許文献１、２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１０−１７８７４６号公報
【特許文献２】特開２０１１−１４７３９９号公報
【特許文献３】特表２０１１−５１６０９６号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】浅田淳他、「電界中の油中液滴を用いる遺伝子導入法の開発」、第35回静電気学会全国大会講演論文集、東京理科大学、2011年9月13日、p.155-158
【非特許文献２】A. Asada, H. Aoki, H. Kurita, A. Antoniu, H. Yasuda, K. Takashima, and A. Mizuno, "A novel gene transformation technique using water-in-oil droplet in an electrostatic field", IEEE Transactions on Industry Applications, Jan 2013, vol. 49, p. 311-315
【発明の概要】
【００１２】
上記した方法では、上方に凸となる電気力線に沿って液滴が跳躍しながら電極間を往復運動する。このため、上記した方法は、液滴の運動が不安定であり、導入効率にばらつきが生じるという問題点がある。上記した方法は、液滴が電極から離反できず処理そのものが中断するという問題点がある。
【００１３】
加えて、上記の方法の試験結果は、ヒートショックで簡単に遺伝子を導入できる大腸菌を用いた結果であり、動物細胞等の導入障壁の高い他の細胞に適用できるかは未知である。
【００１４】
上記方法において、コンタミネーションを回避するための手段については考慮されておらず、未だ問題を残したままである。故に、標的細胞に対し外来物質を導入する技術において、多種多様な細胞に対し、最低限必要な細胞量および外来物質量を十分に低減でき、且つ、低コストで処理を行うことのできる技術は、未だ提供されないままである。このため、外来物質が導入された細胞（外来物質導入細胞又は導入細胞ともいう。）を低コストで得ることも困難である。
【００１５】
本発明は、電気的な作用により少量の細胞に効率的且つ低コストで外来物質を導入する装置および低コストで多様な外来物質導入細胞を製造し得る外来物質導入細胞の製造方法を提供することを目的としている。
【００１６】
本発明の第１態様によれば、電気的作用によって細胞外から細胞内に外来物質を導入する外来物質導入装置において、外部からの物質供給が可能な開口部を有する１以上の貯留槽と、前記１以上の貯留槽の各々の内に互いに離間して配置された、水平面に交差する方向に延設された一対の電極を有する１以上の電極部と、前記１以上の電極部に、所定時間、直流電圧を印加して電界を発生させるよう構成された電界発生手段であって、絶縁性液体が貯留された前記１以上の貯留槽の各々において、外来物質および細胞を含有し、前記絶縁性液体と混和しない細胞懸濁液を、前記一対の電極の間に供給することにより、前記絶縁性液体中に前記一対の電極の間隔よりも小径の前記細胞懸濁液の液滴を形成させた状態で、前記１以上の電極部に直流電圧を印加した場合に、前記一対の電極間に生じる電界によって、前記液滴を前記一対の電極のうちの前記液滴とは逆の極性を有する電極である逆極性電極に向かって移動させ、前記逆極性電極に前記液滴を接触させて前記液滴の移動方向の反転を引き起こすよう構成された電界発生手段とを備えることを特徴とする外来物質導入装置が提供される。
【００１７】
電界によって液滴を移動させるとは、少なくとも液滴の水平面の移動方向が、電界を表す電気力線に沿うように正極から負極、又は負極から正極へ移動することを意味する。水平方向と水平方向と直交する鉛直方向との両方向において、厳格に仮想的な電気力線に沿って移動することを意味するものではない。
【００１８】
第１態様の外来物質導入装置によれば、貯留槽に絶縁性液体が貯留され、外来物質と細胞とを含有し絶縁性液体と混和しない細胞懸濁液が、供給口より供給されると、絶縁性液体中に独立した液滴が形成される。電界発生手段によって貯留槽内の一対の電極に、所定時間、直流電圧が印加されると、一対の電極の間に電界が生じる。電圧の印加により、液滴表面に電荷が誘導され、液滴は、一対の電極の間に形成された電界を表す仮想的な電気力線に沿って、逆極性電極側へクーロン力により移動する。液滴は移動方向側に配設された逆極性電極に接触する。一対の電極との間の間隔よりも液滴の外径が小さいので、液滴は、両電極に同時には接触しない。液滴が逆極性電極に接触すると、それを契機として液滴の移動方向の反転が引き起こされ、反対側へ向かう液滴の移動が開始される。電極へ接触することで生じる液滴への電気的作用によって、液滴中において細胞内に外来物質を導入できると推定される。
【００１９】
第１態様の外来物質導入装置では、高価なパルスジェネレータは不要である。よって第１態様の外来物質導入装置は、従来のエレクトロポレーション法と比較して装置を簡略化でき、外来物質を細胞に導入するための装置を安価に提供できる。一対の電極は水平面に交差する方向に延設されているので、電圧が一対の電極間に印加されることにより生じる電界を示す電気力線は、水平方向に延びる電気力線を含む。電界の作用により液滴が上下動する場合、液滴の動作は不安定になりやすい。本装置では、電界の作用で液滴は水平方向に移動し、安定して移動するので、本装置は、重力の影響によって液滴が電極に接触したまま動かなくなることを抑制できる。このため、本装置にて円滑かつ効率的に外来物質の導入作業を行うことができる。
【００２０】
本装置によれば、良好な導入効率で外来物質を様々な細胞に導入でき、且つ導入後の細胞において良好な生存率を実現できる。処理を実行するために必要な細胞懸濁液の量は、微小な液滴を形成する量で足る。このため本装置は、例えば、外来遺伝子（ＤＮＡ）を細胞へ導入して形質転換を行う場合には、外来遺伝子と細胞とを含有する細胞懸濁液の使用量を、従来の手法に比べて圧倒的に低減でき、結果として、必要な細胞数および外来遺伝子量を格段に減らすことができる。
【００２１】
第１態様の外来物質導入装置において、前記一対の電極は、前記１以上の電極部の各々に直流電圧が印加された場合の前記絶縁性液体の液面に仮想的な複数の電気力線を引いた場合に、当該複数の電気力線の分布が局所的な集中を生じる形状に形成されてもよい。
【００２２】
この場合の外来物質導入装置によれば、電界発生手段にて印加される電圧を低くしても液滴を円滑に移動させることができる。
【００２３】
本装置は、絶縁性液体中において電気的引力によって液滴を移動させるため、電極部に印加される電圧が小さすぎると液滴の移動が困難となる。一方で、電極部に印加される電圧が高くなると、液滴が破裂したり、液滴が伸長して両導電体間を繋ぎ短絡が生じたりする。一対の電極が電気力線の分布に局所的な集中を生じる形状に形成されていると、一対の電極に印加される電圧が小さくとも局所的に電気的な作用を強めることができる。このため本装置は、印加電圧を低下させて液滴の破裂又は短絡を回避しつつ、液滴を円滑に移動させることができる。故に本装置は、外来物質を導入する処理の再現性および確実性を向上できる。
【００２４】
第１態様の外来物質導入装置において、前記一対の電極のうちの一方の電極は、水平面に対して略垂直方向に展延された面状体であって、他方の電極に向き合う対向面側が凹となる略円弧形状に湾曲して形成された面状体である第一面状体を有してもよい。
【００２５】
この場合の外来物質導入装置によれば、一方の電極は、第一面状体を有するので、液滴をより安定して移動させることができる。加えて本装置では、例えば、１枚の金属板又は金属箔が曲げ加工されることにより簡単に第一面状体が形成される。故に本装置は、装置の製造コストを抑制できる。
【００２６】
第１態様の外来物質導入装置において、前記一対の電極のうちの他方の電極は、水平面に対して略垂直方向に展延された面状体であって、前記一方の電極に向き合う対向面側が凹となる略円弧形状に湾曲して形成された面状体である第二面状体を有してもよい。
【００２７】
この場合の外来物質導入装置によれば、一対の電極のうち一方の電極は第一面状体を有し、他方の電極は第二面状体を有する。よって本装置は、他方の電極が第二面状体を有しない場合に比べ、更に安定して液滴を移動させることができる。更に本装置は、一対の電極の形状を同じとすれば、部品を共通化できるので一対の電極の加工コストを低廉化できる。
【００２８】
第１態様の外来物質導入装置において、前記一対の電極の少なくとも一方は、凹部又は凸部を有してもよい。
【００２９】
この場合の外来物質導入装置によれば、一対の電極の少なくとも一方には、凹部又は凸部が形成されているので、一対の電極に電圧が印加された場合に生じる電界を示す電気力線の分布に局所的な集中を生じさせることができる。よって本装置は、電界発生手段にて印加する電圧を低くしても液滴を円滑に移動させることができる。
【００３０】
第１態様の外来物質導入装置において、前記一対の電極の前記間隔は、１ｃｍ以内であり、前記電界発生手段は、前記一対の電極の間に形成された前記液滴を、前記逆極性電極に向かって移動させ、前記逆極性電極に前記液滴を接触させて前記液滴の移動方向の反転を引き起こすことを繰り返すことで、前記一対の電極の間を複数回往復移動させるよう構成されてもよい。
【００３１】
この場合の外来物質導入装置は、液滴に複数回電気的作用を及ぼすことができる。よって本装置は、液滴に十分に電気的作用を及ぼして、より確実に外来物質を細胞へ導入させ、外来物質の導入効率を向上できる。
【００３２】
第１態様の外来物質導入装置において、前記１以上の貯留槽の各々は底面部を有し、前記絶縁性液体は、前記細胞懸濁液よりも低比重で且つ、前記電界発生手段による直流電圧の印加が終了した際の前記液滴の位置が、前記底面部と、前記絶縁性液体の液面との間の位置となる粘性を備えてもよい。
【００３３】
貯留槽内の汚染は、貯留槽内に投入された物質が残存することで生じることが多い。本装置では貯留槽内に投入される細胞懸濁液は液滴を形成し、その内部に細胞と外来物質とが内包されるので、貯留槽内全体に細胞と外来物質とが広がり難い。更に、例えば、電界発生手段による電圧印加終了後、液滴を回収する際に、液滴への絶縁性液体の混合を回避するには、貯留槽へ供給した細胞懸濁液量よりも少ない量の液滴が回収されれば良い。その場合には、投入された細胞懸濁液の一部は貯留槽内に残留するが、細胞懸濁液と絶縁性液体との比重差によって残留した細胞懸濁液は沈降し、貯留槽底面部に絶縁性液体とは分離して滞留される。新たな液滴を用いた処理が実行される場合、電圧印加終了の際には、新たな液滴は貯留槽の底面部と絶縁性液体の液面との間にある。このため本装置では、貯留槽の上方から新たな液滴が回収されることで貯留槽底面部に滞留された古い細胞懸濁液が新たな液滴に混ざることが回避される。本装置によれば、絶縁性液体が回収された細胞懸濁液に混入することを回避するために、厳密で高精度の回収作業は不要である。従って本装置では、複数回、同じ貯留槽内で処理が実行されても、従来のエレクトロポレーション装置に比べて、外来物質を導入する細胞が汚染されることをより確実に抑制できる。
【００３４】
第１態様の外来物質導入装置において、前記１以上の貯留槽は並列された複数の貯留槽であり、前記複数の貯留槽の各々には、上面に前記開口部が形成され、１の電極部が設けられており、前記一対の電極は、各々少なくとも前記開口部まで延設されており、前記複数の貯留槽の各々の前記一対の電極のうち一方を前記開口部において電気的に接続する第１接続部と、前記複数の貯留槽の各々の前記一対の電極のうち他方を前記開口部において電気的に接続する第２接続部とを更に備え、前記電界発生手段は、前記第１接続部および前記第２接続部を介して、前記複数の貯留槽の各々の前記１の電極部に直流電圧を印加してもよい。
【００３５】
この場合の外来物質導入装置は、多数の貯留槽にて並列して処理できる。本装置は、貯留槽が絶縁性の材料で形成されれば、貯留槽に電流がほとんど流れないため、多数の貯留槽に対して同時に電圧を印加して操作をおこなっても安全性を確保できる。故に本装置は、安全性を担保しつつ、細胞へ外来物質を導入する処理を貯留槽の数だけ並行して行うことができる。
【００３６】
第１態様の外来物質導入装置において、前記１以上の貯留槽の各々は、互いに間隔をあけて配置された複数の電極部を収容し、前記一対の電極は、各々少なくとも前記開口部まで延設されており、前記１以上の貯留槽の各々の前記一対の電極のうち一方を前記開口部において電気的に接続する第１接続部と、前記１以上の貯留槽の各々の前記一対の電極のうち他方を前記開口部において電気的に接続する第２接続部とを更に備え、前記電界発生手段は、前記第１接続部および前記第２接続部を介して、前記１以上の貯留槽の各々の前記複数の電極部に直流電圧を印加してもよい。
【００３７】
この場合の外来物質導入装置は、１つの貯留槽内にて複数の処理を並列して実行できる。本装置は、貯留槽が絶縁性の材料で形成されれば、貯留槽に電流がほとんど流れないため、１つの貯留槽に設けられた複数の電極部に対して同時に電圧を印加して操作をおこなっても安全性を確保できる。故に本装置は、安全性を担保しつつ、細胞へ外来物質を導入する処理を電極部の数だけ並行して行うことができる。
【００３８】
本発明の第２態様によれば、細胞と１種類以上の外来物質とを含む細胞懸濁液を、貯留槽に貯留され、該細胞懸濁液と混和しない絶縁性液体中へ供給して前記絶縁性液体中で液滴を形成させる第１工程と、前記第１工程にて形成された前記液滴の両側に各々設けられ、前記絶縁性液体の液面に対して交差する方向に延びる一対の電極に所定時間直流電圧を印加して、前記一対の電極のうちの一方の電極と他方の電極との間を前記液滴を往復移動させ、前記液滴を電極に接触させることで、前記液滴中において前記１種類以上の外来物質を前記細胞に導入する第２工程とを備える外来物質導入細胞の製造方法が提供される。
【００３９】
第２態様の外来物質導入細胞の製造方法によれば、良好な導入効率で外来物質を細胞に導入でき、且つ導入後の細胞の生存率は良好である。その上本製造方法によれば、処理に必要な細胞懸濁液の量は、貯留槽の容量に規定されず、微小な液滴を形成する量で足る。このため本製造方法に従って、例えば、外来遺伝子（ＤＮＡ）を動物細胞へ導入して形質転換を行う場合には、外来遺伝子と動物細胞とを含有する細胞懸濁液の使用量を、従来の手法に比べて圧倒的に低減でき、結果として、必要な細胞数および外来遺伝子量を格段に低減できる。
【００４０】
第２態様の外来物質導入細胞の製造方法において、前記第２工程は、前記１種類以上の外来物質を前記細胞の核に導入する工程であってもよい。
【００４１】
この場合の外来物質導入細胞の製造方法によれば、第２工程は、外来物質を細胞核に導入するものである。本製造方法は、従来の外来物質導入方法に比べ、細胞核に外来物質を、簡便且つ確実に導入することができる。
【００４２】
第２態様の外来物質導入細胞の製造方法において、前記第１工程は、複数種類の外来物質を含む細胞懸濁液を前記絶縁性液体中へ供給して液滴を形成させる工程であり、前記第２工程で前記所定時間直流電圧を印加することで、前記複数種類の外来物質を前記細胞に導入する工程であってもよい。
【００４３】
第２態様の外来物質導入細胞の製造方法によれば、一回の第２工程で複数種類の外来物質を細胞に導入でき、優れた導入効率で複数種類の外来物質が導入され細胞を、良好な生存率で得ることができる。
【００４４】
第２態様の外来物質導入細胞の製造方法において、前記第１工程に使用される前記細胞は、ヒト由来の体細胞およびヒト以外の動物由来の体細胞の少なくとも一方であってもよい。
【００４５】
この場合の外来物質導入細胞の製造方法によれば、簡便且つ低コストで、ヒト由来の体細胞およびヒト以外の動物由来の体細胞の少なくとも一方に対し優れた導入効率で外来物質を導入でき、良好な生存率で形質転換された体細胞が得られる。
【００４６】
第２態様の外来物質導入細胞の製造方法において、前記絶縁性液体は、第一絶縁性液体と、前記第一絶縁性液体よりも比重が軽い第二絶縁性液体とを含み、前記第１工程の前に、前記第一絶縁性液体と、前記第二絶縁性液体とを前記貯留槽に注入して、前記第一絶縁性液体の層の上に前記第二絶縁性液体の層を形成させる注入工程を更に備え、前記第１工程は、前記第二絶縁性液体中で前記液滴を形成させる工程であり、前記第２工程は、前記一対の電極に前記所定時間直流電圧を印加して、前記第二絶縁性液体中で、前記液滴を往復移動させる工程であってもよい。
【００４７】
この場合の外来物質導入細胞の製造方法は、第二絶縁性液体中で、液滴を円滑に移動させることができる。本製造方法は、液滴が円滑に移動しない場合に比べ、優れた導入効率で細胞に外来物質を導入することができる。
【００４８】
第２態様の外来物質導入細胞の製造方法において、前記第１工程の前に、前記細胞と、前記１種類以上の外来物質とを、リン酸バッファーに懸濁して、細胞懸濁液を調製する調製工程を更に備え、前記第１工程は、前記調製工程で調製された前記細胞懸濁液を前記絶縁性液体中に供給して前記液滴を形成させる工程であってもよい。この場合の外来物質導入細胞の製造方法は、細胞と、１種類以上の外来物質とが、細胞を培養するための液体培地に懸濁されている場合に比べ、外来物質の導入効率が高い。
【００４９】
第２態様の外来物質導入細胞の製造方法において、前記絶縁性液体は、前記細胞懸濁液よりも低比重で且つ、前記所定時間直流電圧の印加が終了した際の前記液滴の位置が、前記貯留槽の底面部と、前記絶縁性液体の液面との間の位置となる粘性を備えてもよい。この場合の外来物質導入細胞の製造方法は、所定時間直流電圧の印加が終了した際の液滴の位置が、貯留槽の底面部と接触する位置となる場合に比べ、外来物質の導入効率が高い。
【００５０】
本発明の第３態様によれば、電気的作用によって細胞外から細胞内に外来物質を導入する外来物質導入装置において、外部からの物質供給が可能な開口部を有する貯留槽内に互いに離間して配置された場合に、水平面に交差する方向に延設され、且つ、直流電圧が印加された場合の仮想的な複数の電気力線の分布が局所的な集中を生じる形状に形成された一対の電極を有する電極部と、前記電極部に、所定時間、直流電圧を印加して電界を発生させるよう構成された電界発生手段であって、絶縁性液体が貯留された前記貯留槽において、外来物質および細胞を含有し、前記絶縁性液体と混和しない細胞懸濁液を、前記一対の電極の間に供給することにより、前記絶縁性液体中に前記一対の電極の間隔よりも小径の前記細胞懸濁液の液滴を形成させた状態で、前記電極部に直流電圧を印加した場合に、前記一対の電極間に生じる電界によって、前記液滴を前記一対の電極のうちの前記液滴とは逆の極性を有する電極である逆極性電極に向かって移動させ、前記逆極性電極に前記液滴を接触させて前記液滴の移動方向の反転を引き起こすよう構成された電界発生手段とを備える外来物質導入装置が提供される。
【００５１】
第３態様の外来物質導入装置によれば、一対の電極が貯留槽内に互いに離間して配置されて使用されることにより、第１態様の外来物質導入装置と同様の効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】第１実施の形態における外来物質導入装置１の概要を示した図である。
【図２】外来物質導入装置１内に生じる電界の電気力線を破線にて示した平面図である。
【図３】第２実施の形態における外来物質導入装置１１の容器１２と電極構造１５の概要を示した外観概略図である。
【図４】電極１５ａ、１５ｂ間に生じうる電界の電気力線を破線にて示した図である。
【図５】針状の電極２５ａ、２５ｂを有する電極部２５の斜視図と、電極２５ａ、２５ｂとの間に生じる電界の電気力線を破線にて示した平面図である。
【図６】電極１５ａと、針状の電極２５ｂとの斜視図と、電極１５ａと電極２５ｂとの間に生じる電界の電気力線を破線にて示した平面図である。
【図７】板状の電極３５ａと、針状の電極２５ｂとの斜視図と、電極３５ａと電極２５ｂとの間に生じる電界の電気力線を破線にて示した平面図である。
【図８】第３実施の形態における外来物質導入装置４１の概要を示した図である。
【図９】第３実施の形態における外来物質導入装置４１の、平面視での処理容器５０の部分拡大図である。
【図１０】第４実施の形態における外来物質導入装置６１の概要を示した図である。
【図１１】変形例における外来物質導入装置８１の概要を示した図である。
【図１２】変形例における外来物質導入細胞の製造工程のフローチャートである。
【図１３】第３実施例のヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞株の外来遺伝子導入操作から１日後の遺伝子導入効率評価結果を示すグラフである。
【図１４】第３実施例のヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞株の外来遺伝子導入操作直後の生存率の評価結果を示すグラフである。
【図１５】第３実施例の５分間直流電圧を印加してプラスミドＤＮＡ１遺伝子を導入させた操作から１日後に観察したヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞株の明視野における顕微鏡観察画像である（観察倍率１０倍）。
【図１６】第３実施例の５分間直流電圧を印加してプラスミドＤＮＡ１遺伝子を導入させた操作から１日後に観察したヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞株の蛍光画像である（観察倍率１０倍）。
【図１７】第３実施例の５分間直流電圧を印加してプラスミドＤＮＡ１遺伝子を導入させた操作から１日後に観察したヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞株の明視野の画像と蛍光視野の蛍光画像とのＭｅｒｇｅ画像である（観察倍率１０倍）。
【図１８】第４実施例の遺伝子導入操作から１日後に観察したｍｏｕｓｅ由来Ｎｅｕｒｏ２Ａ神経腫由来細胞株の蛍光画像である（観察倍率１０倍）。
【図１９】第４実施例の遺伝子導入操作から３日後に観察したｍｏｕｓｅ由来Ｎｅｕｒｏ２Ａ神経腫由来細胞株の蛍光画像である（観察倍率１０倍）。
【図２０】第４実施例の遺伝子導入操作から３日後に観察したｍｏｕｓｅ由来Ｎｅｕｒｏ２Ａ神経腫由来細胞株の蛍光画像である（観察倍率１０倍）。
【図２１】第５実施例の遺伝子導入操作を行った後、３日後に観察した高齢ヒト皮膚由来繊維芽細胞株の明視野における顕微鏡観察画像である（観察倍率６０倍）。
【図２２】第５実施例の遺伝子導入操作を行った後、３日後に観察した高齢ヒト皮膚由来繊維芽細胞株の蛍光画像である（観察倍率６０倍）。
【図２３】第５実施例の遺伝子導入操作を行った後、３日後に観察した高齢ヒト皮膚由来繊維芽細胞株の明視野の画像と蛍光視野の蛍光画像とのＭｅｒｇｅ画像である観察倍率６０倍）。
【図２４】第５実施例の遺伝子導入操作を行った後、３日後に観察した高齢ヒト皮膚由来繊維芽細胞株の明視野における顕微鏡観察画像である（観察倍率６０倍）。
【図２５】第５実施例の遺伝子導入操作を行った後、３日後に観察した高齢ヒト皮膚由来繊維芽細胞株の蛍光画像である（観察倍率６０倍）。
【図２６】第５実施例の遺伝子導入操作を行った後、３日後に観察した高齢ヒト皮膚由来繊維芽細胞株の明視野の画像と蛍光視野の蛍光画像とのＭｅｒｇｅ画像である（観察倍率６０倍）。
【図２７】第５実施例の遺伝子導入操作を行った後、３日後に観察した高齢ヒト皮膚由来繊維芽細胞株の明視野における顕微鏡観察画像である（観察倍率６０倍）。
【図２８】第５実施例の遺伝子導入操作を行った後、３日後に観察した高齢ヒト皮膚由来繊維芽細胞株の蛍光画像である（観察倍率６０倍）。
【図２９】第５実施例の遺伝子導入操作を行った後、３日後に観察した高齢ヒト皮膚由来繊維芽細胞株の明視野の画像と蛍光視野の蛍光画像とのＭｅｒｇｅ画像である観察倍率６０倍）。
【図３０】第６実施例の遺伝子導入操作から２日後に観察したｍｏｕｓｅ由来Ｎｅｕｒｏ２Ａ神経腫由来細胞株の緑色蛍光視野の蛍光画像である（観察倍率６０倍）。
【図３１】第６実施例の遺伝子導入操作から２日後に観察したｍｏｕｓｅ由来Ｎｅｕｒｏ２Ａ神経腫由来細胞株の赤色蛍光視野の蛍光画像である（観察倍率６０倍）。
【図３２】第６実施例の遺伝子導入操作から２日後に観察したｍｏｕｓｅ由来Ｎｅｕｒｏ２Ａ神経腫由来細胞株の明視野の画像と緑色蛍光視野の蛍光画像と赤色蛍光視野の蛍光画像とのＭｅｒｇｅ画像である（観察倍率６０倍）。
【図３３】第７実施例の装置を用いて、直流電圧が印加された場合の液滴の動きを経時的に撮影して得られた画像である（基準時）。
【図３４】第７実施例の装置を用いて、直流電圧が印加された場合の液滴の動きを経時的に撮影して得られた画像である（基準時から０．１ｓ後）。
【図３５】第７実施例の装置を用いて、直流電圧が印加された場合の液滴の動きを経時的に撮影して得られた画像である（基準時から０．２ｓ後）。
【図３６】第７実施例の装置を用いて、直流電圧が印加された場合の液滴の動きを経時的に撮影して得られた画像である（基準時から０．３ｓ後）。
【図３７】第８実施例において、直流電圧が印加された場合の液滴の動きを経時的に撮影して得られた画像である（基準時）。
【図３８】第８実施例において、直流電圧が印加された場合の液滴の動きを経時的に撮影して得られた画像である（基準時から０．１ｓ後）。
【図３９】第８実施例において、直流電圧が印加された場合の液滴の動きを経時的に撮影して得られた画像である（基準時から０．２ｓ後）。
【図４０】第８実施例において、直流電圧が印加された場合の液滴の動きを経時的に撮影して得られた画像である（基準時から０．３ｓ後）。
【図４１】第８実施例において、直流電圧が印加された場合の液滴の動きを経時的に撮影して得られた画像である（基準時から０．４ｓ後）。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
以下、本発明の好ましい実施の形態について、図面を参照して説明する。まず、図１および図２を参照して、本発明の第１実施の形態における外来物質導入装置１について説明する。
【００５４】
外来物質導入装置１（以下、装置１ともいう。）は、標的細胞内に目的の外来物質を電気的作用によって導入するよう構成された装置である。標的細胞は、外来物質を導入する対象となる細胞である。装置１では、パルスジェネレータは不要である。更に、装置１は、１回の処理に必要な細胞懸濁液量（標的細胞数および外来物質量）を極めて低用量化できるよう構成されている。
【００５５】
具体的には、外来物質導入装置１は、図１に示すように、絶縁性の油６が貯留される容器２と、電極部５と、電源９とを備える。容器２は、底面部４と、底面部４の周縁から立設された４つの側壁部３とを有し、全体として略直方体に形成されている。容器２の上面には開口部１７が形成されている。装置１は、容器２内部に液体を収容できる。容器２は、例えば、プラスチック、ガラス、およびセラミックス等の絶縁性の素材で形成されている。容器２の形状は、液体を収容できる形状であれば、如何なる形状であっても良い。本実施形態では、容器２として、底面部４が１ｃｍ角、側壁部３の高さが４.５ｃｍのプラスチック製の容器（例えば、３ｍｌ分光光度計用キュベット）が用いられている。
【００５６】
容器２の左右の側壁部３の内壁面側には、各々０.１ｍｍ厚の導電性のアルミテープが貼着され、電極部５が形成されている。電極部５は、左右一対の電極５ａ、５ｂを有する。電極５ａ、５ｂは、各々左右の側壁部３の内壁と略同寸で、側壁部３の内壁をほぼ覆う矩形状に形成されている。電極５ａ、５ｂの高さ方向の端部は各々、容器２の開口部１７に達している。このため、電極５ａ、５ｂは、鉛直方向（即ち、水平方向に交差する方向）に沿って延設された状態で、略１ｃｍの間隔を隔てて容器２内に対向して配置される。
【００５７】
電極５ａ、５ｂと各々電気的に接続された金属製のクリップ７ａ、７ｂが、容器２の開口部付近の左右両側の側壁部３を各々挟持している。電極５ａと電気的に接続されるクリップ７ａは、導線８を介して電源９の負極に接続されている。電極５ｂと電気的に接続されるクリップ７ｂは、導線８を介して電源９の正極に接続されている。
【００５８】
電源９は、直流高電圧電源である。電源９の最大出力電圧は５ｋＶ程度以上である。電源９の最大出力電流は０．５ｍＡ以上である。電源９は、導線８を介して容器２に設けられた電極５ａ、５ｂに電気的に接続される。電源９の負極側は接地されている。電源９から電圧が印加されると、容器２の内壁面側に貼られた一対の電極５ａ、５ｂ間に電界が発生する。図示を省略しているが、電源９は、電圧供給をオンとオフとに切り替えるためのスイッチと、供給される電圧を調整するためのダイヤルと、任意の時間をセットするためのタイマーとを備える。装置１は、作業者により、供給される電圧がダイヤルによって設定され、タイマーに任意の時間がセットされると、スイッチがオンとなって電圧供給が開始され、タイマーにセットされた時間が終了するとスイッチがオフとなって電圧出力が停止するよう構成されている。
【００５９】
電源９から供給される電圧は、使用される容器２の形状および容量に応じて変更される。電界強度が低すぎると液滴Ｗは電極５ａ、５ｂ間を往復運動せず、逆に電界強度が高すぎると液滴Ｗが変形して電極５ａ、５ｂ間を導通させること、又は液滴Ｗが破壊されるといったことが生じる。このため印加電圧は、容器２で形成される電界強度が１〜数ｋＶ／ｃｍとなるように調整される。
【００６０】
遺伝子等の外来物質を標的細胞に導入する処理を実行する際には、標的細胞と外来物質とが含まれる細胞懸濁液（液滴を形成する水系の親水性液体）が、容器２の開口部１７から供給される。細胞懸濁液は、細胞懸濁液にて形成される液滴Ｗが、両方の電極５ａ、５ｂに同時に接触しないように調整された量で容器２内に供給される。本実施形態では、細胞懸濁液の１回の供給量は約２〜５μｌである。細胞懸濁液は水系の液体であり、容器２に貯留される油６とは混和しない。１回の供給で１つの液滴Ｗ（油中液滴）が形成される。形成された液滴Ｗは電極５ａ、５ｂ間に配置される。詳細は後述するが、電源９から電極５ａ、５ｂに電圧が供給されると、電気的な作用により、液滴Ｗ中において外来物質が標的細胞に導入される。
【００６１】
容器２に貯留される油６は、水と相分離し、細胞懸濁液（水）よりも疎水性の物質であって、常温近傍で液体であり、絶縁性の性質を具有する。油６として、例えば、石油由来のアルカン類である鉱油、アルキルベンゼンを主成分とする絶縁油、ポリブテンを主成分とする絶縁油、アルキルナフタレンを主成分とする絶縁油、アルキルジフェニルアルカンを主成分とする絶縁油、およびシリコーンオイル等が例示される。油６として、これらの油を１種又は複数種を混合して用いられても良い。油６は、絶縁性であり、且つ、細胞懸濁液と混和しない疎水性液体であれば、これらの例示に限られない。
【００６２】
液滴Ｗを油６中に配置するために、液滴Ｗよりも低比重の絶縁油が油６として選択される。更に、液滴Ｗは油６中を沈降するが、比較的緩慢に液滴Ｗが沈降するように、適切な粘性を有する絶縁油が油６として選択される。好適には、電源９による電圧印加が終了した時点でも液滴Ｗが底面部４より上方に位置するように沈降速度を制御する粘度を備えた絶縁油が油６として選択される。液滴Ｗの比重は、厳密には、細胞懸濁液の比重であるが、細胞懸濁液に占める細胞および外来物質の量は僅かである。故に簡易的に、溶媒（分散媒）として用いられる水系の液体（後述する緩衝液等の溶液）の比重、又は水の比重が液滴Ｗの比重として代用されても良い。
【００６３】
上記したように細胞懸濁液（液滴Ｗ）と油６とは混和しない。このため、装置１で外来物質を導入するための電気的処理を行った後、液滴Ｗが回収されれば、引き続き新たな液滴を容器２内で形成させて外来物質の導入を行っても、新たな液滴にコンタミネーションが発生する可能性が抑制される。作業者が油６を滅菌フィルターを通してから使用し、一連の操作をクリーンベンチ内で行えば、コンタミネーションの発生を抑制できる。好適には、液滴Ｗが回収される際には、液滴Ｗへの油６の混入がないことが望ましい。供給量と同じ量で細胞懸濁液が厳密に回収されることが理想的である。作業者は厳密に供給量と同じ量の細胞懸濁液を回収する操作が困難である場合には、供給量よりも若干少ない量の液滴Ｗを回収することで液滴Ｗへの油６の混入を回避してもよい。この場合には、容器２内に細胞懸濁液が残存するが、装置１では、細胞懸濁液と、油６との比重差によって、残存した細胞懸濁液は沈降し、底面部４に滞留する。故に、電気的処理が終了した時点で液滴Ｗが底面部４より上方に位置するように油６の粘度が調整され、容器２の上面の開口部１７からピペット等で細胞懸濁液（即ち液滴Ｗ）が回収されればよい。このようにすれば、容器２における液滴Ｗの電気的処理が行われる位置及および回収が行われる位置には、残像した古い細胞懸濁液はない。このため、同じ容器２に新たに細胞懸濁液を供給して処理を行っても、新たな液滴にコンタミネーションが発生することがない。
【００６４】
外来物質としては、既存のエレクトロポレーション法で導入できる物質が含まれ、例えば、通常の状態では細胞膜を透過できない各種生理活性物質、薬剤、治療薬、核酸物質、ペプチド、およびタンパク質等が例示される。核酸物質は、例えば、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子(ｓｉＲＮＡを含む)、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー）、およびペプチド核酸であってよい。ＤＮＡとしては、標的細胞内に導入したい核酸配列を備えたＤＮＡが適宜選択され、例えば、遺伝子の全長配列（ｃＤＮＡ配列、ゲノム配列）、部分配列、調節領域、スペーサー領域、および変異を加えた配列等、目的に応じて設計されたＤＮＡが用いられる。ＤＮＡにコードされたポリペプチドは、導入細胞によって産生され得る。
【００６５】
標的細胞の種類は、特に制限されず、標的細胞として各種細胞を用いることができる。標的細胞として、例えば、植物細胞、ヒト由来細胞を含む動物細胞、およびバクテリア等が例示できる。装置１は、従来のエレクトロポレーション法にて外来物質を導入できる細胞に外来物質を導入可能である。従来のエレクトロポレーション法にて外来物質を導入できる細胞としては、例えば、ヒト由来およびヒト以外の動物由来の体細胞、胚細胞（ＥＳ細胞）、受精卵、および動物胎児組織細胞が例示される。装置１では、従来のエレクトロポレーション法に比べ、良好な導入効率で外来遺伝子が導入され、十分な生存率が得られる。故に装置１は、従来のエレクトロポレーション法にて外来物質を導入できる細胞の形質転換方法として有用である。特に、装置１にて、薬剤（レチノイン酸）添加で動物由来の神経細胞様細胞に分化させた神経細胞様細胞株に外来物質（外来遺伝子）が導入された場合にも、良好な導入効率および細胞生存率が得られる。また装置１は、マウス海馬初代細胞においても、同じ方法で、外来物質（外来遺伝子）を標的細胞に導入できる。このため、これまで外来遺伝子導入後の生存率に対して問題を有していた神経細胞の形質転換に装置１を適用した場合、良好な遺伝子導入効率と細胞生存率とを実現し得る。装置１は、付着細胞、浮遊細胞を問わず外来物質を導入可能である。
【００６６】
外来物質および標的細胞は、水系の溶液に懸濁される。水系の溶液は、油６と混和しない親水性を有し、外来物質および標的細胞に悪影響を及ぼさない溶液であれば特に限定されない。水系の溶液としては、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（Phosphate buffered saline、以下単に「ＰＢＳ緩衝液」と略す）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）等の通常のエレクトロポレーション法で用いることのできるバッファー、および通常の緩衝液が用いられる。標的細胞が動物細胞であれば、水系の溶液として、動物細胞の培養に使用できる液体培地（例えば、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｏｐｔｉ-ＭＥＭ培地、α-ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地、Ｗｉｌｌｉａｍｓ培地、ＥＳ培地等）を用いることができる。これらの液体培地は、血清濃度が低い方が導入効率の点で好ましく、特には無血清培地であることが望ましい。一般には、抗生物質を含まない液体培地の方が水系の溶液として好ましい。装置１による外来物質を導入する処理の後は、液体培地に血清又は抗生物質が自由に添加されてよい。導入効率および細胞への影響の観点からは、水系の溶液として、リン酸バッファーが用いられることが好ましい。水系の溶液ｐＨは、細胞への影響を考慮して調製されるのが好ましく、例えば、ｐＨ７．０〜７．６に調製されるのが好ましい。
【００６７】
溶液に含有させる外来物質の量は、従来のエレクトロポレーション法を実施可能な量であればよい。細胞懸濁液中の外来物質の濃度は、標的細胞の生存率と外来物質の導入効率との観点から好適には０．１〜３μｇ／μｌであり、更に好適には０．２〜３μｇ／μｌであり、外来物質によって適宜調整される。細胞懸濁液中に含まれる外来物質は１種類に限られず、細胞懸濁液中に複数種類の外来物質が含まれても良い。これにより装置１は、例えば、一度の処理で複数種類の外来遺伝子を標的細胞に導入できる。
【００６８】
作業者は、装置１を用いれば、上記したように標的細胞と複数の外来遺伝子とを細胞懸濁液中に含有させという簡便な操作で複数の外来遺伝子を標的細胞に導入させることができる。装置１を用いれば、複数の外来遺伝子を良好な導入効率で体細胞へ導入でき、且つ、処理後の標的細胞の細胞生存率が優れている。このため装置１は、例えば、ヒト繊維芽細胞等の分化した細胞に４つの初期化遺伝子（所謂山中因子Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ）を１回の処理で導入可能である。つまり、装置１は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）のような分化万能性と、分裂増殖を経ても分化万能性を維持できる自己複製能とを有する人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造に好適に適用される。装置１は、人工多能性幹細胞から、更に新たな分化細胞に分化させるための遺伝子の導入にも、使用され得る。更には、装置１は、細胞懸濁液中に含有される外来遺伝子を、標的細胞の細胞質のみならず細胞核に導入できる。このため装置１は、外来遺伝子を標的細胞の核に導入させることによって、外来遺伝子が標的細胞の細胞質に導入された場合に比べ、標的細胞に導入された外来遺伝子が、標的細胞の次の世代の細胞に引き継がれる確率を向上させることができる。
【００６９】
装置１は、油６の中で形成される数μｌの液滴Ｗ内で、標的細胞に外来物質の導入を実行できるので、処理に必要な標的細胞の数は、液滴Ｗ中に含まれる数だけあれば十分であり、例えば、１０３〜１０４ｃｅｌｌｓあれば良い。故に装置１は、例えば、ヒトから採取した希少サンプル（微量の標的細胞）を高い効率で形質転換させることができる。
【００７０】
電源９にて直流電圧が容器２に印加されると、一対の電極５ａ、５ｂ間に直流電界が形成される。容器２内には貯留される液体は絶縁性の油６であるため、油６に流れる電流は微小である。油６中に存在する液滴Ｗは水溶液であり、数ｋＶ／ｃｍの直流電界が電極５ａ、５ｂ間に生じると液滴Ｗの表面に電荷が誘導される。帯電した液滴Ｗは、一対の電極５ａ、５ｂのうち液滴Ｗが持つ極性と異なる極性を有する電極（逆極性電極）側へ移動し、移動方向に配置された逆極性電極に接触する。これによって液滴Ｗの極性が逆極性へ変わり、移動方向が反転して逆方向の電極側へ移動する。
【００７１】
直流電圧の印加時間は、外来物質の導入効率と標的細胞の生存率とを両立できる時間であり、例えば、１０秒〜１時間であり、好適には３０秒〜１５分である。更に好適には、直流電圧の印加時間は、容器２の高さ、油６の粘度（液滴Ｗの沈降速度）の点から、つまり、電源９による電圧印加が終了した時点でも液滴Ｗが底面部４より上方に位置することが考慮され、３０秒〜１分である。
【００７２】
装置１において一対の電極５ａ、５ｂ間に生じる電界を表す電気力線は、平面視で図２に破線で示される。電極５ａ、５ｂは、水平方向と垂直な鉛直方向に沿って平行に対向配置され、且つ同じ幅で形成されているため、電気力線は電極５ａ、５ｂに対し直角（即ち水平方向）に描かれ、均等に分布する。液滴Ｗは、電気力線の延伸方向に沿って電極５ａ、５ｂ間を移動する。電源９から直流電圧が供給されている間、液滴Ｗには電界の作用が及ぼされる。故に液滴Ｗは、電極５ａ、５ｂ間を繰り返し往復移動し、複数回電極部５に接触する。例えば、水平方向に延びる底面に沿って一対の電極が設置された場合には、液滴Ｗは底面に沿って移動せず、一対の電極間を結び、油６の液面に向かって凸の放物線状の電気力線に沿って移動する。故に、液滴Ｗが電極に接触する際の電気的引力の方向は、重力方向と重なる。一方、装置１では、電気力線が水平方向に延びる電界が生じ、電極部５が容器２の側壁部３に形成されているので、電極部５に液滴Ｗが接触する際に電気的引力の方向と重力方向とは一致しない。このため装置１は、液滴Ｗが電極部５と接触したまま移動を停止することを抑制し、水平方向に延びる底面に沿って一対の電極が形成された場合に比べて、安定して液滴Ｗを電極間で往復移動させることができる。液滴Ｗが電極に接触したままとなった場合、例えば、装置１は、印加電圧を高くして電極部５から液滴Ｗを離反させることも可能である。しかしこの場合、液滴Ｗが破裂する可能性が高くなる。液滴Ｗが破裂すれば、液滴を油６から回収することが困難となり、結果として容器２内が破損した液滴によって著しく汚染される。装置１のように、印加電圧をなるべく低くしつつ、液滴Ｗを円滑に移動させることは、液滴Ｗを油６中で破損させない観点から非常に重要である。
【００７３】
電極部５と液滴Ｗとが接触する際、電荷は液滴Ｗの表面を移動すると考えられる。その際に、液滴Ｗの表面付近に局所的な強電界が形成されると考えられ、その作用により、細胞膜に一過的に微小な孔が形成されて標的細胞に外来物質が導入されると推定される。
【００７４】
以上説明したように、第１実施の形態における外来物質導入装置１によれば、電気的作用によって良好な導入効率で外来物質を標的細胞に導入できる。装置１は、電気的作用を利用するため、特別な試薬を必要とせず、化学的手法と比較してランニングコストを抑制できる。更に装置１は、ウイルスを用いる生物学的手法のように標的細胞に対する毒性および抗原性に起因する癌化等の懸念がなく、良好な生存率で導入細胞を得ることができる。その上装置１では、汎用のエレクトロポレーション装置に必須のパルスジェネレータは不要である。装置１の構成は、簡素であるため、装置１は、低コストで製造される。
【００７５】
更に、装置１は、遺伝子を標的細胞に導入する場合に、必要な細胞懸濁液量を数μｌ程度に抑えることができる。結果として、装置１は、必要な標的細胞数およびＤＮＡ量（外来物質量）を既存の方法と比較して格段に低減できる。このため装置１は、例えば、ヒトから採取した希少サンプルを形質転換する装置として、非常に有用である。
【００７６】
図３を参照して、第２実施の形態の外来物質導入装置１１（以下、装置１１ともいう。）について説明する。第１実施の形態では、装置１は、全体として略直方体状に形成された容器２と、容器２の左右両側の側壁部３内側に矩形状の電極５ａ、５ｂとを備えていた。これに対し第２実施の形態の装置１１では、装置１において、貯留槽である容器１２は円筒状に形成され、容器１２の内周に沿って曲面状の電極１５ａ、１５ｂが配設されている。第１実施の形態と同一の部分は、同一の符号を付して以下の説明を省略する。図３において、導線８および電源９の図示は省略している。
【００７７】
容器１２は、第１実施の形態と同様に絶縁性素材で形成された貯留槽である。容器１２は、絶縁性の油６を貯留可能である。容器１２は、円形の底面部１４と、底面部１４周縁において上方に向かって立設する側壁部１３と、上面に形成された開口部１８とを有する有底円筒状に形成されている。本実施形態では、容器１２は、内径８ｍｍ、高さ１０ｍｍの形状に形成されている。
【００７８】
容器１２に配設される電極部１５は、左右一対の電極１５ａ、１５ｂを有する。一対の電極１５ａ、１５ｂは、互いに同じ形状である。
【００７９】
電極１５ａ、１５ｂは各々、矩形状の板状体を曲面に成形した面状体１５ａ１、１５ｂ１と、接続部１５ａ２、１５ｂ２とを備える。接続部１５ａ２、１５ｂ２は各々、各面状体１５ａ１、１５ｂ１の上端に連設されている。面状体１５ａ１、１５ｂ１は、側壁部１３の内側の高さと略同寸の高さを有する。面状体１５ａ１、１５ｂ１は、容器１２の内周の半分よりも短い幅の方形部材を、容器１２の内周に沿った曲率で加工された形状を有する。面状体１５ａ１、１５ｂ１の高さ方向と直交方向の断面形状は円弧状である。接続部１５ａ２、１５ｂ２は各々、面状体１５ａ１、１５ｂ１上端部において各面状体１５ａ１、１５ｂ１に対し直角に屈曲する方向に延設されており、クリップ７で挟持可能な大きさの矩形状に形成されている。
【００８０】
電極１５ａ、１５ｂは各々、容器１２内に挿入され、容器１２の内壁に面状体１５ａ１、１５ｂ１の外周面が接触するようにセットされる。このため、面状体１５ａ１、１５ｂ１は、容器１２の上下方向に沿って延設した状態で互いに対向する。面状体１５ａ１の幅方向の両端部は、面状体１５ｂ１の幅方向の両端部と接触しない間隙を隔てて位置する。本実施形態では電極１５ａ、１５ｂとして、裏面に粘着剤層を備えた０．０９ｍｍ厚のアルミテープが用いられている。アルミテープは容器１２内の予め定められた位置へ貼着され固定される。電極は、アルミテープに代えてアルミニウム箔又はアルミニウムの薄板を用いて形成されてもよい。更に電極は、電極として使用できる導電性素材であればアルミニウムに代えて他の材料（例えば、白金、金、およびカーボン電極等）を用いて形成されても良い。液滴Ｗを円滑に移動させる観点から、電極は、親水性であるよりは、アルミニウム程度の疎水性を有する材料で形成されることが好ましい。
【００８１】
電極１５ａの接続部１５ａ２は端子であり、クリップ７、および導線８を介して電源９の負極に接続される。電極１５ｂの接続部１５ｂ２も同様に端子であり、クリップ７、導線８を介して電源９の正極に接続される。
【００８２】
電源９から電圧が供給されると、電極１５ａ、１５ｂ間に不均一な電界が形成される。即ち、図４に破線で示すように、電極１５ａ、１５ｂ間には、平面視において電束密度に分布を有する電気力線によって表される電界が生じる。特に、電気力線の分布は、電極１５ａ、１５ｂの面状体１５ａ１、１５ｂ１の幅方向の端部（エッジ付近）で密になる。幅方向の端部は電極間距離が最短の場所であり、幅方向の端部では静電引力が局所的に強い。容器１２内の液滴Ｗは、局所的に強い静電引力の作用により、面状体１５ａ１、１５ｂ１の幅方向の端部間を結ぶ電気力線に沿って電極１５ａ、１５ｂ間を最短距離で円滑に往復運動できる。
【００８３】
装置１１は、不均一電界を形成させることで、液滴Ｗが電極１５ａ、１５ｂと接触したまま動かなくなる現象を著しく抑制でき、液滴Ｗの電極１５ａ、１５ｂへの接触と離反とを良好に遂行させ、安定した処理を実行できる。これによって装置１１は、電極間に均一な電界が形成される場合に比べ、液滴Ｗ中の標的細胞へ、より高い導入効率で外来物質を導入できる。
【００８４】
第２実施の形態の装置１１においては、電極部１５は、同じ構造を有する一対の電極１５ａ、１５ｂを有していた。各電極１５ａ、１５ｂは、曲面形状の面状体（面状体１５ａ１、１５ｂ１）と、面状体に連結された接続部（接続部１５ａ２、１５ｂ２）とを備えていた。第２実施の形態の装置１１は、不均一電界を形成させる電極であれば、上記電極に限られるものではなく、上記した構造の電極に代えて、図５から図７に示すような電極であっても良い。
【００８５】
例えば、装置１１の電極部は、図５に示すように、容器１２の内径に比して十分に小さな径を有する円柱状（針状）の一対の電極２５ａ、２５ｂを有する電極部２５であっても良い。一対の電極２５ａ、２５ｂは、容器１２内で容器１２の直径方向に十分に離間された位置で、一対の電極２５ａ、２５ｂの長手方向が上下方向（水平方向と交差する方向）となるように立設される。電極２５ａ、２５ｂは、容器１２上面に形成された開口部１８から上方に突出する長さに形成されている。開口部１８から突出した端部はクリップ７にて挟持される。装置１１が図５の電極部２５を備える場合、装置１１は、各電極２５ａ、２５ｂ近傍に電気力線が集中する不均一電界を形成させる。これにより、装置１１は、第２実施の形態と同様に、液滴Ｗを円滑に移動させることができる。
【００８６】
図６に示すように、第２実施の形態における一方の電極１５ａと、上記の電極２５ｂとによって一対の電極が形成されてもよい。装置１１が電極１５ａ、２５ｂを備える場合、図６に示す各電極１５ａ、２５ｂ近傍に電気力線が集中する不均一電界が形成され、第２実施の形態と同様に装置１１は、液滴Ｗを円滑に移動させることができる。
【００８７】
図７は、図６の電極１５ａの面状体形状を平板状に変更した板状の電極３５ａが用いられた場合である。図７に示す変形例では、一方の電極を電極３５ａ、他方の電極を電極２５ｂとして一対の電極が形成されている。電極３５ａは、平面状の面状体３５ａ１に対して９０度の方向で外方（電極２５ｂと対向する側の逆側）へ延設された接続部３５ａ２を有している。接続部３５ａ２は、平面視矩形状に形成され、接続部３５ａ２の長手方向長さは、面状体３５ａ１の幅よりも長い。接続部３５ａ２の端部は、電極部３５が容器１２内に配設された状態で容器１２の側壁部１３より外側にはみ出す。接続部３５ａ２は、クリップ７にて挟持される大きさと剛性を具有している。
【００８８】
面状体３５ａ１の幅は容器１２の内径よりも小さく、高さは容器１２の側壁部３の内壁高さと略同寸である。電極３５ａに対して、電極３５ａの幅方向（上下方向に直交する方向）の中心近傍に対向する位置において、電極３５ａと十分に離間させて電極２５ｂは配設される。
【００８９】
装置１１が図７に示す電極３５ａ、２５ｂを備える場合、装置１１は、電極２５ｂ近傍に電気力線が集中する不均一電界を形成させる。これにより、装置１１は、第２実施の形態と同様に、液滴Ｗを円滑に移動させることができる。
【００９０】
図８および図９を参照して、第３実施の形態の外来物質導入装置４１（以下、装置４１ともいう。）について説明する。第２実施の形態と同一の部分は、同一の符号を付して以下の説明を省略する。装置４１は、複数の容器（ウェル）１２で外来物質を導入する処理を一度に並行して実行できるよう構成されている。
【００９１】
図８に示すように、装置４１は、９６穴細胞培養プレートである処理容器５０を備えている。処理容器５０は、長方形の枠体４０ａと、枠体４０ａ上面に立設された４つの側壁面４０ｂと、側壁面４０ｂの上面端部に架設される天板４０ｃとが一体で成形された支持体４０とを備えている。複数の容器１２は各々、支持体４０によって保持されている。
【００９２】
天板４０ｃには、容器１２の内周と同寸の円形の貫通孔が形成されている。容器１２の開口部１８（図３参照）と天板４０ｃの貫通孔とが一致する位置で、容器１２の側壁部１３上面と天板４０ｃの下面とは接合されている。容器１２の高さは、側壁面４０ｂの高さと同じである。これにより、容器１２は、処理容器５０の設置面から枠体４０ａの高さ分浮き上がった状態で天板４０ｃに固定され、支持体４０に一体化されている。
【００９３】
処理容器５０には、９６個の容器１２が設けられている。９６個の容器１２は、８行１２列に整列されている。各容器１２には、電極部１５がセットされる。電極１５ａの面状体１５ａ１は容器１２内に挿入される。接続部１５ａ２は天板４０ｃの上面に載置されている。電極１５ａの面状体１５ａ１は、容器１２の側壁部１３の高さと略同寸の高さであるので、面状体１５ａ１の底面側端部は、底面部１４の内底から天板４０ｃの厚み分上方に位置して配設される。面状体１５ａ１の大きさは、容器１２内において液滴Ｗを良好に移動させることができる電界を形成可能な大きさであれば特に制限されるものではない。面状体１５ａ１の高さは、更に低くしても良い。面状体１５ａ１の高さは、天板４０ｃの厚み分の長さを面状体１５ａ１の高さに加えて、面状体１５ａ１の底面側端部が底面部１４に到達する高さとしても良い。電極１５ｂは、電極１５ａと所定の間隔をあけて、電極１５ａと同様に各容器１２にセットされる。所定の間隔は、例えば、電極間の最短距離を基準に設定される。
【００９４】
天板４０ｃには、容器１２の列を挟んで、細長い長方形の一対の板状体４５ａ、４５ｂを有する板状体部４５が載置されている。板状体部４５は、金属等の導電性部材で形成されている。板状体４５ａ、４５ｂの長手方向の長さは、天板４０ｃの幅方向（容器１２の列方向）の長さと略同寸である。板状体４５ａ、４５ｂの短辺方向の長さは、容器１２の隣り合う列と列との間隔と略同寸ある。板状体４５ａ、４５ｂの図８の裏側の端部には導線８との電気的接点が設けられている。一対の板状体４５ａ、４５ｂの一方（板状体４５ａ）は、電気的接点に接続される導線８を介して電源９の正極と接続されている。一対の板状体４５ａ、４５ｂの他方（板状体４５ｂ）は、電気的接点に接続される導線８を介して電源９の負極に接続されている。
【００９５】
図９に示すように、板状体４５ａ、４５ｂは各々、電極部１５の接続部１５ａ２、１５ｂ２に重ねて（接触するように）配置される。これにより、各電極１５ａ、１５ｂは、板状体４５ａ、４５ｂに電気的に接続される。各電極１５ａ、１５ｂに電源９から電圧が供給され得る。
【００９６】
処理容器５０は容器１２と同様に絶縁性素材で形成されている。電源９から直流高電圧が供給されても処理容器５０に流れる電流は微小である。このため、装置４１は、並列して複数の容器１２に電圧を印加可能である。装置４１は、油６が貯留された各容器１２に、細胞懸濁液の液滴Ｗが形成された状態で電源９から電圧を印加することによって、容器１２の一つの列に含まれる８個の容器１２全てにおいて、外来物質を導入する処理を並列して行うことができる。
【００９７】
板状体部４５は、天板４０ｃ上面において、容器１２の一つの列を挟んで設置され、装置４１は、一つの列に含まれる８個の容器１２に対し並列して処理を行う構成である。装置４１は、複数の容器１２に対して並列処理できれば、板状体部４５によって電圧が印加される容器１２の数、板状体部４５の形状に特に制限はない。板状体部４５は、処理容器５０に対して着脱可能に構成されていても良い。装置４１は、一つの列での処理が終了した後に板状体部４５を移動させ、別の列を挟むように板状体部４５をセットして、列毎に順次処理を行っても良い。
【００９８】
上記実施形態において、第１工程としては、標的細胞と外来物質とが含まれる細胞懸濁液を容器の開口部から油中に供給して液滴Ｗを形成する工程が該当する。第２工程としては、電源９から所定時間電圧を印加することで発生する電界の作用により液滴Ｗを電極間で往復移動させる工程が該当する。従って、上記各実施の形態において、動物細胞を標的細胞とし、遺伝子を外来物質として細胞懸濁液が調製され、細胞懸濁液が容器に供給されて電極間で液滴が形成される。その後に電源９から電極部に電圧が供給されることによって、遺伝子が導入された動物細胞（外来物質導入細胞）が製造される。
【００９９】
図１０を参照して、第４実施の形態の外来物質導入装置６１（以下、装置６１ともいう。）について説明する。第１から第３実施の形態と同一の部分は、同一の符号を付して以下の説明を省略する。装置６１では、１つの容器６２に複数の電極部３５が配置されている。装置６１は、複数の電極部３５の各々で外来物質を導入する処理を並行して実行できるよう構成されている。複数の電極部３５は各々、一対の電極３５ａ、３５ｂを有する。電極３５ｂは電極３５ａと同様の形状を有する。電極３５ｂは、電極３５ａの面状体３５ａ１に対応する面状体３５ｂ１と、接続部３５ａ２に対応する接続部３５ｂ２とを有する。
【０１００】
図１０に示すように、装置６１は、処理容器６０を備えている。処理容器６０は、平面視左右方向に長い直方体状の８個の容器６２を有する。容器６２は、底面部６４と、開口部６８とを備える。処理容器６０は、長方形の枠体７０ａと、枠体７０ａ上面に立設された４つの側壁面７０ｂと、側壁面７０ｂの上面端部に架設される天板７０ｃとが一体で成形された支持体７０とを備えている。複数の容器６２は支持体７０によって保持されている。
【０１０１】
天板７０ｃには、容器６２の開口部６８の内周と同寸の矩形状の貫通孔が形成されている。容器６２の開口部６８と天板７０ｃの貫通孔とが一致する位置で、容器６２の側壁部上面と天板７０ｃの下面とは接合されている。容器６２の高さは、側壁面７０ｂと同じ高さである。これにより、容器６２は、処理容器６０の設置面から枠体７０ａの高さ分浮き上がった状態で天板７０ｃに固定され、支持体７０に一体化されている。
【０１０２】
８個の容器６２は、８行に整列されている。各容器６２には、複数の電極部３５が所定の間隔（例えば、５ｍｍ）で配置されている。電極３５ａは、以下のように配置される。接続部３５ａ２は天板７０ｃの上面に載置されている。面状体３５ａ１の高さは、容器６２の側壁部６３の高さよりも短い。面状体３５ａ１の底面側端部は、容器６２の底面部６４よりも上方に位置する。面状体３５ａ１の大きさは、容器６２内において液滴Ｗを良好に移動させることができる電界を形成可能な大きさであれば特に制限されるものではない。面状体３５ａ１の幅は、例えば、５ｍｍである。電極３５ｂは、電極３５ａと所定の間隔をあけて、電極３５ａと同様に容器６２にセットされる。
【０１０３】
天板７０ｃには、容器６２の長手方向に沿って、細長い長方形の板状体６５ａ、６５ｂを有する板状体部６５が載置されている。板状体部６５は、金属等の導電性部材で形成されている。板状体６５ａ、６５ｂの長手方向の長さは、天板７０ｃの長手方向（容器６２の長手方向）と略同寸である。板状体６５ａ、６５ｂの短辺方向の長さは、容器６２の隣り合う行と行との間隔と略同寸ある。天板７０ｃの左端部および右端部の各々には、容器６２の短辺方向に沿って、細長い長方形の板状体６６ａ、６６ｂが載置されている。板状体６５ａ、６５ｂは各々、板状体６６ａ、６６ｂと連結している。板状体部６５と、板状体６６ａ、６６ｂとは、全体として、一対の櫛歯状をなしている。より具体的には、図１０の下側から数えて偶数個目の板状体６５ａは天板７０ｃの左端部に載置された板状体６６ａと連結されている。図１０の下側から数えて奇数個目の板状体６５ｂは板状体６６ａと離間している。板状体６５ｂは天板７０ｃの右端部に載置された板状体６６ｂと連結している。板状体６５ａは、板状体６６ｂと離間している。板状体６６ａ、６６ｂの各々には導線８との電気的接点が設けられている。板状体６６ａは、電気的接点に接続される導線８を介して電源９の正極と接続されている。板状体６６ｂは、電気的接点に接続される導線８を介して電源９の負極に接続されている。
【０１０４】
板状体６５ａ、６５ｂは各々、電極部３５の接続部３５ａ２、３５ｂ２に重ねて（接触するように）配置される。これにより、各電極３５ａ、３５ｂは各々、板状体６５ａ、６５ｂに電気的に接続される。各電極３５ａ、３５ｂの各々に電源９から電圧が供給され得る。
【０１０５】
処理容器６０と、容器６２とは、絶縁性素材で形成されている。電源９から直流高電圧が供給されても処理容器６０に流れる電流は微小である。このため、装置６１では、並列して複数対の電極に電圧を印加可能である。装置６１は、油６が貯留された各容器６２に、細胞懸濁液の液滴Ｗが形成された状態で電源９から電圧が印加することによって、処理容器６０の複数対の電極の間の各々に配置された全ての液滴において、外来物質を導入する処理を並列して行うことができる。
【０１０６】
装置６１において、処理容器６０が備える容器６２の形状および数は適宜変更されてよい。１つの容器６２に配置される電極の数および電極の形状は適宜変更されてよい。より具体的には、装置６１は、電気力線の分布が不均一である電界が形成される電極部、例えば、複数の電極部１５（図３参照）を備えてもよい。第３の実施形態と同様に、装置６１は、処理容器６０に対して着脱可能に構成された複数対の電極を用意し、一の容器６２の処理が終了した後に複数の電極を他の容器６２に移動させ、容器６２毎に順次処理を行っても良い。
【０１０７】
以上、各実施の形態に基づき本発明を説明したが、本発明は上記実施の形態に何ら限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲内で種々の改良変形が可能であることは容易に推察できるものである。例えば、上記各実施の形態で挙げた各電極（電極５ａ、５ｂ、１５ａ、１５ｂ、２５ａ、２５ｂ、３５ａ、３５ｂ）の表面部分は平滑な表面で形成されたが、これに限られるものではない。例えば外来物質導入装置は、電極部５、２５の表面部分又は電極部１５、電極部３５の面状体は、凹部および凸部の少なくとも一方を備えてもよく、凹部および凸部の少なくとも一方によって不均一な電界を電極間に形成させても良い。各電極は、必ずしも水平面に垂直な方向に沿って延設されている必要はなく、水平面に対して交差するように配設されていれば良い。使い捨ての容器又は汎用の容器が使用される場合等には、装置１、１１、４１および６１は各々、容器を備えなくてもよい。この場合の外来物質導入装置は、一対の電極が容器内に互いに離間して配置されて使用されることにより、装置１、１１、４１および６１と同様の効果を奏する。
【０１０８】
絶縁性液体として、２種類の比重の異なる絶縁性の液体が用いられてもよい。この変形例では、例えば、図１１に例示する外来物質導入装置８１（以下、装置８１ともいう。）で処理が実行される。第１から第４実施の形態と同一の部分は、同一の符号を付して以下の説明を省略する。変形例の装置８１は、容器８２、電極部１５、導線８、および電源９を備える。容器８２は、半球状の底面部８４を有する、開口部８３の直径が７ｍｍである有底筒状の容器である。容器８２は、絶縁性材料で形成される。容器８２は、絶縁性液体４６を貯留可能である。絶縁性液体４６は、第一絶縁性液体４６ａおよび第二絶縁性液体４６ｂを有する。第二絶縁性液体４６ｂの比重は、第一絶縁性液体４６ａの比重よりも軽い。第一絶縁性液体４６ａは、例えば、フルオロカーボン油（比重は１より大きい）である。第二絶縁性液体４６ｂは、例えば、動粘度が３０ｃＳｔであるシリコーン油（比重は０．９から１）である。電極部１５は、一対の電極１５ａ、１５ｂを有する。一対の電極１５ａ、１５ｂは、第二絶縁性液体４６ｂと接触するが、第一絶縁性液体４６ａとは接触しない。開口部８３から電極１５ａ、１５ｂの下端部までの距離は５ｍｍである。
【０１０９】
変形例では、例えば、図１２に示す工程によって処理が実行される。図１２に示すように、細胞と外来物質とを含む細胞懸濁液が調整される（Ｓ１）。第１工程の前に、第一絶縁性液体４６ａと、第二絶縁性液体４６ｂとが容器８２に注入される（Ｓ２）。Ｓ２では、比重差によって、第一絶縁性液体４６ａの層の上に第二絶縁性液体４６ｂの層が形成される。Ｓ１で調整された細胞懸濁液が、Ｓ２で第一絶縁性液体４６ａと、第二絶縁性液体４６ｂとが注入された容器８２に供給される（Ｓ３）。Ｓ３によって、第二絶縁性液体４６ｂの層中に、細胞懸濁液の液滴Ｗが形成される。電源９から一対の電極１５ａ、１５ｂに所定時間、直流電圧が印加される（Ｓ４）。Ｓ４において液滴Ｗは、一対の電極１５ａ、１５ｂ間に生じる電界の作用で第二絶縁性液体４６ｂ内において一対の電極１５ａ、１５ｂ間を往復移動する。液滴Ｗは、第一絶縁性液体４６ａの層と、第二絶縁性液体４６ｂの層との境界よりも上側（第二絶縁性液体４６ｂの液面側）において、図１１に示す如く境界面側に凸となる放物線に沿って移動する。電圧印加終了後、絶縁性液体４６（第二絶縁性液体４６ｂ）から液滴Ｗが回収される（Ｓ５）。回収された液滴中の細胞のうち、外来物質が導入された細胞が選別され、外来物質導入細胞が得られる（Ｓ６）。
【０１１０】
変形例の外来物質導入細胞の製造方法は、第二絶縁性液体４６ｂ中で、液滴Ｗを円滑に移動させることができる。本製造方法は、液滴が円滑に移動しない場合に比べ、優れた導入効率で細胞に外来物質を導入することができる。変形例の外来物質導入細胞の製造方法は、装置１、装置１１、装置４１、および装置６１のいずれかに適用されてもよい。Ｓ１の工程と、Ｓ２の工程とは順序が入れ替えられてもよい。同じ装置を用いて繰り返し処理が実行される場合には、複数回目のＳ２の処理は省略されてもよい。
【実施例１】
【０１１１】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。本発明は以下の実施例に限定されるものではない。実施例で使用した材料は以下のとおりである。【０１１２】
シリコーンオイル：信越シリコーンＫＦ−９６Ｌ−１００、信越化学工業（株）
ＰＢＳ緩衝液：Ｄ−ＰＢＳ、０．１ｍｏｌ／ｌリン酸緩衝生理食塩水、ｗａｋｏ
ＨＥＫ２９３細胞：ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞株、ＪＣＲＢ９０６８、ＪＣＲＢ細胞バンク
ｍｏｕｓｅ由来Ｎｅｕｒｏ２Ａ神経腫由来細胞株：ＩＦＯ５００８１、ＪＣＲＢ細胞バンク
高齢ｈｕｍａｎ（８１歳）由来繊維芽細胞株：ＪＣＲＢ０５３２  ＴＩＧ−１０７、ＪＣＲＢ細胞バンク
ｍｏｕｓｅ由来海馬神経初代細胞：ＭＢ−Ｘ０４０３、住友ベークライ株式会社
プラスミドＤＮＡ１： Ｖｅｎｕｓ、黄色（黄緑色）蛍光たんぱくをコードするプラスミドＤＮＡ、ＲＩＫＥＮ
プラスミドＤＮＡ２：ＥＧＦＰ、緑色蛍光たんぱくをコードするプラスミドＤＮＡ、ｃｌｏｎｔｅｃｈ
プラスミドＤＮＡ３：ｍｃｈｅｒｒｙ、赤色蛍光たんぱくをコードするプラスミドＤＮＡ、ｃｌｏｎｔｅｃｈ
トリパンブルー：Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ、０．４％  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  ＬＬＣ
レチノイン酸：ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ、ｗａｋｏ【０１１３】
下記の方法により外来遺伝子の導入結果の評価を行った。【０１１４】
（遺伝子導入効率評価）
外来遺伝子としてプラスミドＤＮＡ１が選択され、遺伝子導入操作後の油中液滴はマイクロピペットによって回収された。回収された液滴は、液体培地に移された後、３７℃、二酸化炭素５％の条件下で一晩培養された。蛍光顕微鏡（ＴＥ−２０００Ｕ、ニコン社）を用いて、明視野観察にて全細胞数が計測され、蛍光観察で蛍光を発する細胞数（外来遺伝子導入細胞）が計数された。蛍光する細胞数を全細胞数で除して遺伝子導入効率が算出された。【０１１５】
（生存率評価）
標的細胞の生存率の計測には、死細胞を特異的に染色する色素トリパンブルーが用いられた。遺伝子導入操作後（即ち、所定時間の電圧印加後）の油中液滴は、マイクロピペットによって回収され、ＰＢＳ緩衝液に懸濁された。その後、液滴内の細胞はトリパンブルーで染色され、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又は顕微鏡 (ＴＥ−２０００Ｕ、ニコン社)を用いて明視野で観察された。生細胞数 (染色されない細胞数)と死細胞数 (染色された細胞数)とが各々計数され、生細胞数を全細胞数（生細胞数と死細胞数との和）で除して生存率が算出された。【０１１６】
＜第１実施例＞
図１に示す装置１が以下の手順で作成された。幅１０ｍｍの分光光度計用ポリスチレン製ディスポーサブルセル（Ｍａｃｒｏ  ｃｕｖｅｔｔｅｓ、７５９００７、ＰＥＱＬＡＢ）が容器として用いられた。容器の向かい合う一対の内壁全面に、電極となるアルミテープ（古藤工業株式会社）が貼着された。容器上面の開口部が導電性のクリップで挟持され、アルミテープとクリップとが接触した。クリップと、直流高電圧電源（ＨＡＲ−３０Ｒ１０、松定プレシジョン）とが導線で接続され、直流高電圧電源とアルミテープとが電気的に接続された。動粘度１００ｃＳｔのシリコーンオイルが容器の７分目まで注がれ、静置された。超純水製造装置（ＭｉｌｌｉＱ、ミリポア社）を用いて製造された超純水が、容器にピペットにより３μｌ滴下され、シリコーンオイル中で直径約１．８ｍｍの球状の液滴が形成された。次いで、直流高電圧電源によって３．５ｋＶ（電界強度３．５ｋＶ／ｃｍ）の電圧が印加された。液滴の運動は、高速度カメラ（ＦＡＳＴＣＡＭ−１２８０ＰＣＩ、Ｐｈｏｔｒｏｎ）で撮影され、撮影動画が低速で再生され、液滴の往復回数が目視でカウントされた。その結果、アルミテープ間で１分間に約１００回、液滴が往復移動することおよびアルミテープに接触することが確認された。以下の実施例は、第１実施例と同様のアルミテープと、同様の直流高電圧電源とを用いて行った。【０１１７】
＜第２実施例＞
図８に示す装置４１が以下のように作成された。内径６．７ｍｍの有底円筒形の容器（ウェル）を９６個有する９６穴細胞培養プレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．９２６９６、ＴＰＰ）が処理容器として用いられた。処理容器の１列に含まれる８つの容器のうち、隣接する４つの容器において、幅５ｍｍの２枚のアルミテープ（電極）が容器の内周面に対向するように貼着された。２枚のアルミテープは、２枚のアルミテープのうちの一方が、周方向の両側端部で他方と接触しないように、隙間を形成して配置された。電極間距離は、最も狭いところ（アルミテープの端部間）で６ｍｍであった。各アルミテープは、容器の上方において容器の外側まで引き出され、容器の列間に形成された処理容器の天板に固定された。天板には、容器を挟んで、矩形状の金属箔が、容器の列方向に沿って配設された。各金属箔は、容器の外側に引き出されたアルミテープの上面（接触部）に接触した。一方の金属箔の端部は高電圧電源の正極に電気的に接続された。他方の金属箔の端部は高電圧電源の負極に電気的に接続された。これにより、各容器に電圧が印加され得る。【０１１８】
上記４つの容器の各々に動粘度１００ｃＳｔのシリコーンオイルが注がれ、静置された。超純水製造装置（ＭｉｌｌｉＱ、ミリポア社）を用いて製造された超純水は、各容器にピペットを用いて３μｌ滴下され、シリコーンオイル中に直径約１．８ｍｍの球状の液滴が形成された。直流高電圧電源から１ｋＶ（電界強度１．６７ｋＶ／ｃｍ）の電圧が印加された。４つの容器の各々において、容器内の電極間距離の最も短い箇所で、液滴がアルミテープ間を１分間に約３００回往復移動することが確認された。液滴の運動の確認は、第１実施例と同様の手法で行われた。第２実施例が、第１実施例の容器を用いた場合よりも液滴の往復回数が多いのは、電極の端部付近で局所的に電界強度が強くなっているためだと考えられる。【０１１９】
＜第３実施例＞
第２実施例で作製された装置４１にて、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞株への外来遺伝子導入試験が実施された。ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium High Glucose、ｗａｋｏ）、１０％ＦＢＳ（Fetal bovine serum）、およびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ｗａｋｏ）を含む培地（調製培地ともいう。）が調製された。調製培地は、直径１０ｃｍのプラスチックシャーレ（Ｏｒａｎｇｅ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、以下単にシャーレという。）に注入された。シャーレに、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞株が１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように添加され、３７℃、二酸化炭素５％の条件下で培養された。０．０５％トリプシン−０．５３ｍｍｏｌ／ｌＥＤＴＡ−４Ｎａ（ｗａｋｏ）にてシャーレからはがされたヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞株は、ＰＢＳ緩衝液に懸濁された。ＰＢＳ緩衝液中のヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞株の濃度は１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｄｒｏｐｌｅｔ（即ち、液滴３μｌ中に１．０×１０４ｃｅｌｌｓ）に調製された。更に、ＰＢＳ緩衝液にプラスミドＤＮＡ１を濃度が２５８ｎｇ／μｌとなるように加えられて、細胞懸濁液が調製された。絶縁油として動粘度１００ｃＳｔのシリコーンオイルが貯留された容器に、調製された細胞懸濁液が３μｌ滴下され、直径約１．８ｍｍの球状の液滴が形成された。液滴が形成された容器に、１．０〜４ｋＶ、０〜１５分（０．５分、１分、２分、３分、４分、５分、１５分）の条件で直流高電圧電源から電圧が印加された。生存率測定のため、印加時間３０分についても試験が実施された。試験結果は図１３および図１４に示される。【０１２０】
図１３の横軸は印加時間、縦軸は遺伝子導入効率を示す。印加時間に対する遺伝子導入効率は実線にて表示されている。図１３に示すように、０分を除くいずれの印加時間においても７０％〜９０％の遺伝子導入効率が得られ、第３実施例の方法が既存の手法に劣らない方法であることが示された。図１４の横軸は印加時間、縦軸は標的細胞の生存率である。印加時間に対する生存率は実線で表示されている。図１４に示すように、電圧印加時間が３０分に到達した場合にも生存率は８０％を下回らなかった。以上より、装置４１を用いて外来遺伝子を標的細胞に導入することによって、高い遺伝子導入効率と生存率とが両立されることが示された。【０１２１】
図１５に示す明視野画像は、白色透過光の下で観察された画像である。図１６に示す蛍光画像は、暗視野の下で、水銀ランプ光源が光源とされ、４９０ｎｍ波長付近の励起光がフィルターを介して標的細胞に照射されて、５１０ｎｍ波長付近の蛍光がフィルターを介して観察された画像である。図１７に示すＭｅｒｇｅ画像は、明視野画像と蛍光画像とが画像処理によって合成された画像である。図１６に示す蛍光画像から、プラスミドＤＮＡ１にコードされた蛍光タンパク質が標的細胞内で発現されたこと（白色および灰白色部分）が確認され、遺伝子導入に成功していることが示された。【０１２２】
＜第４実施例＞
調製培地が注入されたシャーレにｍｏｕｓｅ由来Ｎｅｕｒｏ２Ａ神経腫由来細胞株が１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように添加され、３７℃、二酸化炭素５％の条件下で培養された。その後更に、シャーレにレチノイン酸が終濃度５μｍｏｌ／ｌで添加され、３７℃、二酸化炭素５％の条件下で一晩培養され、ｍｏｕｓｅ由来Ｎｅｕｒｏ２Ａ神経腫由来細胞株が神経細胞様に分化された。ＰＢＳ緩衝液に、分化されたｍｏｕｓｅ由来Ｎｅｕｒｏ２Ａ神経腫由来細胞株が１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｒｏｐｌｅｔ（即ち、液滴３μｌ中に１．０×１０５ｃｅｌｌｓ）となるように添加され、プラスミドＤＮＡ１が濃度２６０ｎｇ／μｌとなるように加えられて、細胞懸濁液が調製された。第２実施例で作製された装置４１（図８参照）が用いられた。動粘度１００ｃＳｔのシリコーンオイルが貯留された容器に細胞懸濁液が３μｌ滴下され、シリコーンオイル中に液滴が形成された。一対の電極に、３．８ｋＶで５分間電圧が印加された。電圧印加後、調製培地が注入された６ｗｅｌｌ硝子ボトムプレート（ＥＺＶｉｅｗカバーガラスボトム、ＩＷＡＫＩ）に、油中から回収した液滴が添加され、３７℃、二酸化炭素５％の条件下で培養された。培養開始１日後、３日後の細胞が顕微鏡を用いて観察された。水銀ランプ光源が光源とされ、４９０ｎｍ波長付近の励起光がフィルターを介して標的細胞に照射されて、５１０ｎｍ波長付近の蛍光がフィルターを介して観察された。試験結果は図１８から図２０に示される。【０１２３】
図１８から図２０に示すように、外来遺伝子の導入が困難となり易い神経細胞様分化細胞に、良好に外来遺伝子（プラスミドＤＮＡ１）が導入されていることが、蛍光発光（白色および灰白色部分）によって確認された。【０１２４】
＜第５実施例＞
高齢ｈｕｍａｎ（８１歳）由来繊維芽細胞株が、ＤＭＥＭ（ｗａｋｏ）が注入されたシャーレに１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで添加され、３７℃、二酸化炭素５％の条件下で培養された。その後、ＰＢＳ緩衝液に、高齢ｈｕｍａｎ（８１歳）由来繊維芽細胞株が１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｄｒｏｐｌｅｔ（即ち、液滴３μｌ中に１．０×１０４ｃｅｌｌｓ）添加され、プラスミドＤＮＡ１が濃度が２６０ｎｇ／μｌとなるように加えられて、細胞懸濁液が調製された。第２実施例で作製された装置４１が用いられた。動粘度１００ｃＳｔのシリコーンオイルが貯留された容器に３μlの細胞懸濁液が滴下され、３．８ｋＶで５〜３０分間電圧が印加された。電圧印加後、調製培地が注入された６ｗｅｌｌ硝子ボトムプレートに、油中から回収された液滴が添加され、３７℃、二酸化炭素５％の条件下で培養された。培養開始３日後の細胞は顕微鏡を用いて観察された。水銀ランプ光源が光源とされ、４９０ｎｍ波長付近の励起光がフィルターを介して標的細胞に照射され、５１０ｎｍ波長付近の蛍光はフィルターを介して観察された。試験結果は図２１〜図２９に示される。【０１２５】
図２２、図２５および図２８に示すように、外来遺伝子が高齢ｈｕｍａｎ（８１歳）由来繊維芽細胞株にプラスミドＤＮＡ１が導入されていることが蛍光発光（白色および灰白色部分）によって確認された。このように、装置４１を用いて行った第５実施例の外来物質導入細胞の製造方法によれば、１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｄｒｏｐｌｅｔのような少量の細胞数であっても外来遺伝子（外来物質）が良好に導入されることが示された。つまり、希少サンプルへ優れた効率での形質転換が実現されることが示された。図２５および図２８の蛍光画像では、標的細胞の細胞質からの蛍光発光が観察された一方、図２２の蛍光画像では、標的細胞の中心にある核（略円形状の部分）における蛍光発光が観察された。このことから第５実施例の外来物質導入細胞の製造方法によれば、標的細胞の細胞質のみならず細胞核にも外来遺伝子（外来物質）が良好に導入されることが示された。このように、第５実施例の外来物質導入細胞の製造方法によれば、既存の方法に比べて、細胞核に対する外来遺伝子導入効率を向上させることができる。【０１２６】
＜第６実施例＞
ＤＭＥＭ（ｗａｋｏ）が注入されたシャーレに、ｍｏｕｓｅ由来Ｎｅｕｒｏ２Ａ神経腫由来細胞株が１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで添加され、３７℃、二酸化炭素５％の条件下で培養された。その後更に、シャーレにレチノイン酸が終濃度５μｍｏｌ／ｌで添加され、３７℃、二酸化炭素５％の条件下で一晩培養された。ＰＢＳ緩衝液に、神経細胞様に分化されたｍｏｕｓｅ由来Ｎｅｕｒｏ２Ａ神経腫由来細胞株が１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｄｒｏｐｌｅｔ（即ち、液滴３μｌ中に１．０×１０４ｃｅｌｌｓ）となるように添加され、２種類のプラスミドＤＮＡが次の濃度となるように加えられて、細胞懸濁液が調製された。即ち、緑色蛍光タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡ２は、濃度２００ｎｇ／μｌとなるよう添加された。赤色蛍光タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡ３は、６００ｎｇ／μｌとなるよう添加された。第２実施例で作製された装置４１（図８参照）が用いられた。動粘度１００ｃＳｔのシリコーンオイルが貯留された容器に３μlの細胞懸濁液が滴下され、液滴が形成された。一対の電極に、３．８ｋＶで５分間電圧が印加された。電圧印加後、調製培地が注入された６ｗｅｌｌ硝子ボトムプレートに、油中から回収された液滴が添加され、３７℃、二酸化炭素５％の条件下で培養された。培養開始２日後の細胞は顕微鏡（オリンパスＩＸ８１）を用いて観察された。水銀ランプ光源が光源とされ、４９０ｎｍ波長付近の励起光がフィルターを介して照射されて、５１０ｎｍ波長付近の緑蛍光シグナルがフィルターを介して観察された。水銀ランプ光源が光源とされ、５９０ｎｍ波長付近の励起光がフィルターを介して照射され、６１０ｎｍ波長付近の赤蛍光シグナルがフィルターを介して観察された。観察結果は図３０から図３２に示される。【０１２７】
同一細胞において、赤色蛍光（図３０における白色および灰白色部分）と緑色蛍光（図３１における白色および灰白色部分）との双方が観察された。このことから、装置４１を用いて行った第６実施例の外来物質導入細胞の製造方法により、一度の操作で複数の遺伝子を標的細胞に導入できることが確認された。このように装置４１を用いて行った外来物質導入細胞の製造方法によれば、複数種類の遺伝子を簡便な手法で標的細胞に導入できる。【０１２８】
＜第７実施例＞
図１０に示す装置６１が以下の手順で作成された。８レーンリザ−バー（Ｒ０８Ｒ０１Ｓ、ビーエム機器株式会社）が処理容器として用いられた。処理容器が備える容器の向かい合う一対の内壁に、電極となるアルミテープ（古藤工業株式会社）が５ｍｍ幅で貼着された。各電極部の間隔は５ｍｍとした。各アルミテープは、容器の上方において容器の外側まで引き出され、容器の列間に形成された処理容器の天板に固定された。天板には、容器を挟んで、矩形状の金属箔が、容器の行方向に沿って配設された。各金属箔は、容器の外側に引き出されたアルミテープの上面（接触部）に接触した。一方の金属箔の端部は高電圧電源の正極に電気的に接続された。他方の金属箔の端部は高電圧電源の負極に電気的に接続された。これにより、各容器に電圧が印加され得る。【０１２９】
８つの容器の各々に動粘度１００ｃＳｔのシリコーンオイルが注がれ、静置された。キシレンシアノール水溶液は、各容器の各電極部の電極間にピペットを用いて３μｌ供給され、シリコーンオイル中に直径約１．８ｍｍの球状の液滴が形成された。直流高電圧電源から２．５ｋＶ（電界強度３．６ｋＶ／ｃｍ）の電圧が印加された。液滴の運動の確認は、第１実施例と同様の手法で行われた。【０１３０】
液滴の移動状況を図３３から図３６に示す。図３３から図３６に示すように、複数の電極部の各々において、液滴（図３３から図３６において黒い円状部分）が電極間を往復移動していることが確認された。液滴が電極間を１分間に約２００回往復移動することが確認された。第７実施例によって、１つの容器内にて複数の処理が並列して実行され得ることが確認された。故に第７実施例の方法および装置は、安全性を担保しつつ、細胞へ外来物質を導入する処理を電極部の数だけ並行して行うことができることが示唆された。【０１３１】
＜第８実施例＞
第１実施例と同様の装置に、動粘度約５０ｃＳｔの菜種油 (ナカライテスク)が容器の７分目まで注がれ、静置された。ピペットによりキシレンシアノール水溶液３μｌが容器に供給され、菜種油中で直径約１．８ｍｍの球状の液滴が形成された。次いで、直流高電圧電源によって２．８ｋＶ（電界強度２．８ｋＶ／ｃｍ）の電圧が印加された。液滴の運動の確認は、第１実施例と同様の手法で行われた。【０１３２】
液滴の移動状況を図３７から図４１に示す。図３７から図４１中、液滴（図３７から図４１において濃い灰色の円状又は楕円状部分）の移動方向を矢印で示している。図３９の矢印は、液滴が右方に進んだ後、図中右側の電極と接触して、移動方向が反転されたことを示している。図３７から図４１に示すように、液滴が一対の電極間を往復移動していることが確認された。アルミテープ間で１分間に約１５０回、液滴が往復移動することおよびアルミテープに接触することが確認された。第８実施例の方法によって、第１実施例と同様の装置は、シリコーンオイル以外の絶縁油が絶縁性液体として用いられた場合にも細胞へ外来物質を導入する処理を行うことができることが示唆された。【０１３３】
＜第９実施例＞
図１１に示す装置８１が以下の手順で作成された。各容器（ウェル）の幅７ｍｍの８レーンリザ−バー（Ｒ０８Ｒ０１Ｓ、ビーエム機器株式会社）が容器として用いられた。容器の向かい合う一対の内壁に、電極となるアルミテープ（古藤工業株式会社）が５ｍｍ幅で貼着された。容器の開口部からアルミテープの下端までの距離は５ｍｍとした。容器の外側に引き出された一方のアルミテープの上面の端部は高電圧電源の正極に電気的に接続された。他方のアルミテープの上面の端部は高電圧電源の負極に電気的に接続された。これにより、容器に電圧が印加され得る。比重１．０以上のフルオロカーボン（フロリナートＦＣ−７５、スリーエム）と、比重０．９から１．０であり、動粘度が３０ｃＳｔのシリコーン油とが容器に注がれ、静置された。フルオロカーボン油と、シリコーン油との比重差によって、容器内にフルオロカーボン油の層の上に、シリコーン油の層が形成された。超純水製造装置（ＭｉｌｌｉＱ、ミリポア社）を用いて製造された超純水は、容器の電極間にピペットを用いて３μｌ供給され、シリコーン油中に直径約１．８ｍｍの球状の液滴が形成された。直流高電圧電源から２．５ｋＶ（電界強度約３．６ｋＶ／ｃｍ）の電圧が印加された。液滴の運動の確認は、第１実施例と同様の手法で行われた。【０１３４】
液滴が一対の電極間を往復移動していることが確認された。アルミテープ間で１分間に約２００回、液滴が往復移動することおよびアルミテープに接触することが確認された。第８実施例によって、絶縁性液体として、比重の異なる２種類の絶縁油が用いられる場合にも、装置８１は、細胞へ外来物質を導入する処理を行うことができることが示唆された。【０１３５】
＜第１０実施例＞
パパイン酵素主成分の組織分散液が注入されたシャーレに、ＩＣＲマウス（胎生１６日）海馬由来神経細胞（住友ベークライト）が１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌで添加され、分散された。海馬由来神経細胞の濃度は液滴２μｌ中に１．５×１０３ｃｅｌｌｓの濃度に調整された。シャーレに２種類のプラスミドＤＮＡが次の濃度となるように加えられて、細胞懸濁液が調製された。即ち、黄色（黄緑色）蛍光タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡ１は、濃度２００ｎｇ／μｌとなるよう添加された。赤色蛍光タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡ３は、１５０ｎｇ／μｌとなるよう添加された。第２実施例で作製された装置４１（図８参照）が用いられた。動粘度３０ｃＳｔのシリコーンオイルが貯留された容器に２μlの細胞懸濁液が滴下され、液滴が形成された。一対の電極に、２．１ｋＶで５分間電圧が印加された。電圧印加後、調製培地が注入された２４ｗｅｌｌ硝子ボトムプレート（ＥＺＶｉｅｗカバーガラスボトム、ＩＷＡＫＩ）に、油中から回収された液滴が添加され、３７℃、二酸化炭素５％の条件下で培養された。【０１３６】
培養開始７日後の細胞は顕微鏡（オリンパスＩＸ８１）を用いて観察された。水銀ランプ光源が光源とされ、４９０ｎｍ波長付近の励起光がフィルターを介して照射されて、５１０ｎｍ波長付近の緑蛍光シグナルがフィルターを介して観察された。水銀ランプ光源が光源とされ、５９０ｎｍ波長付近の励起光がフィルターを介して照射され、６１０ｎｍ波長付近の赤蛍光シグナルがフィルターを介して、観察された（観察倍率６０倍）。【０１３７】
図示は省略するが、培養開始７日後の同一細胞において、赤色蛍光と緑色蛍光との双方が観察された。このことから、装置４１を用いて行った第１０実施例の外来物質導入細胞の製造方法により、マウス海馬初代細胞においても、一度の操作で複数の遺伝子を標的細胞に導入できることが確認された。このように装置４１を用いて行った外来物質導入細胞の製造方法によれば、複数種類の遺伝子を簡便な手法で標的細胞に導入できる。
【符号の説明】
【０１３８】
１、１１、４１、６１、８１  外来物質導入装置
６、４６        油
２、１２、６２、８２  容器
５ａ、５ｂ、１５ａ、１５ｂ、２５ａ、２５ｂ、３５ａ、３５ｂ  電極
５、１５、２５、３５  電極部
９        電源
１５ａ１、１５ｂ１、３５ａ１  面状体
４５、６５  板状体部
４５ａ、４５ｂ、６５ａ、６５ｂ  板状体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【国際調査報告】
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