【手続補正書】
【提出日】平成24年5月8日(2012.5.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
アポトーシスとは、個体の生命維持のために、不要な細胞または危険な細胞を自ら死なせる現象をいう。アポトーシスとはギリシャ語で“落ちる”ことを意味し、細胞が消失される過程を花から花びらが落ちることに例えて付けられた名称であり、１９７２年Ｋｅｒｒ等により初めて観察された（Kerr et al., Br J Cancer, 1972, 26: 239-257）。アポトーシスは細胞の発生、分化、免疫等の生理学的現象に重要な役割をする（Meier et al., Nature, 2000, 407: 796-801）。一方、多様な病理学的環境及び疾患でもアポトーシスは重要である。例えば、抗癌剤で成功的な治療をする場合、多量のアポトーシスが腫瘍組織内に発生する（Thomson, Science, 1995, 267: 1456-1462）。反面、腫瘍の発生にはアポトーシスの減少が原因として関与する。さらに、別の例としては、脳卒中及び心筋梗塞において、脳及び心臓に流れる血液供給の不足により、脳細胞及び心筋細胞がそれぞれ損傷を受け、アポトーシスが発生する（Du et al., J Cereb Blood Flow Metab, 1996, 16: 195-201; Narula et al., New Engl J Med, 1996, 335: 1182-1189）。さらに、臓器移植後拒否反応、自己免疫疾患、退行性脳神経疾患、動脈硬化及びウィルス感染等の疾患でもアポトーシスが容易に発生する（Thomson, Science, 1995, 267: 1456-1462; Kageyama et al., Ann Thorac Surg, 1998, 65: 1604-1609）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明の目的は、アポトーシス細胞を特異的に標的とするペプチド及びこれの用途を提供することにある。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は配列番号１〜１２からなる群より選ばれた配列で示されるアミノ酸を有するポリペプチドがアポトーシスが進行しているアポトーシス細胞に特異的に結合する点に着目して、配列番号１〜１２からなる群より選ばれた配列で示されるアミノ酸を有する、新たな配列のポリペプチドとこれの用途、前記ポリペプチドを含むアポトーシス細胞（apoptotic cell）検出用組成物等を提供することを特徴とする。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明のペプチドは、アポトーシスが進行しているアポトーシス細胞に特異的に結合し、配列番号１〜１２からなる群より選ばれた配列で示されるアミノ酸配列を有するペプチドをいう。本発明のペプチド断片は、全ての種類のペプチド、蛋白質、ペプチド模造物、化合物及び生物製剤を含み、アポトーシス細胞に特異的に結合できる活性を有するものをいう。本発明のペプチドは天然から由来することもあり、公知のペプチド合成方法を利用して合成することもできる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
また、本発明のペプチドは、天然型アミノ酸配列を持つペプチドだけでなく、そのアミノ酸配列変異体も本発明の範囲に含まれる。本発明のペプチドの変異体とは、配列番号１〜１２からなる群より選ばれたアミノ酸配列と一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保全的または保全的置換、アミノ酸アナログ置換またはこれらの組み合わせによって異なる配列を持つペプチドを意味する。分子の活性を全体的に変更させないアミノ酸交換は、当該分野に公知になっている（H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
前記ベクターで形質転換することは、当業者に公知の形質転換技術により実施できる。好ましくは、微細査出法（microprojectile bombardment）、電気衝撃遺伝子伝達法（electroporation）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ4）沈澱、塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）沈澱、ＰＥＧ−媒介融合法（PEG-mediated fusion）、微細注入法（microinjection）及びリポソーム媒介法（liposome-mediated method）を利用することができ、前記形質転換体は大腸菌（Escherichia coli）、バシルスサブチリス（Bacillus subtilis）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、シュドモナス（Pseudomonas）、プロテウスミラビリス（Proteus mirabilis）、スタフィロコクス（Staphylococcus）、アグロバクテリウムトメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の場合もあり得るものの、これに制限されるものではない。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本発明者等は、アポトーシス細胞に特異的に結合するものに選別された前記ペプチドの機能を確認するために多様な実験を行った結果、本発明のペプチドがアポトーシス過程にある培養状態の腫瘍細胞、正常上皮細胞及びマクロファージを特異的に認識することにより、前記細胞に結合する事実を確認した。さらに、本発明のペプチドが腫瘍組織内のアポトーシス細胞を標的してこれに対する生体内映像（in vivo imaging）及びモニタリングが可能であることが分かった。従って、本発明のペプチドをアポトーシス細胞の検出用組成物に利用できることが分かり、さらには、腫瘍組織内にアポトーシスを認識する診断または治療追跡用製剤、または別途の腫瘍治療用製剤と共に、腫瘍性疾患予防及び治療用薬学的組成物等として使用できることが分かった。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
本発明のさらに他の実施例では、ヌードマウス皮下に、異種移植された腫瘍部位に放射性同位元素が標識された本発明のペプチドを標的として、これを陽電子放出単層撮影（positron emission tomography、ＰＥＴ）で映像化できるか否かを確認した。その結果、ドキソルビシンを処理した後、Ｉ−１２３が標識された本発明のペプチドを血液内に注入した群では、腫瘍部位にＰＥＴ映像信号が増加することを通じて本発明のペプチドが標的されることを確認することができた。反面、現在ＰＥＴに多く使用されているＦ−１８が標識されたfluorodeoxy glucose（ＦＤＧ）を注入した群では薬剤を処理した後、腫瘍部位にＰＥＴ映像信号が減少した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
従って、本発明は、配列番号１〜１２からなる群より選ばれた配列で示されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含むアポトーシス細胞検出用組成物を提供する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
前記の通り、アポトーシスは多様な種類の腫瘍細胞ばかりでなく、脳卒中、心筋梗塞及び動脈硬化が進行される細胞で表れる（Thomson, Science, 1995, 67: 1456-1462; Du et al., J Cereb Blood Flow Metab, 1996, 16: 195-201; Narula et al., New Engl J Med, 1996, 335: 1182-1189）。従って、前記薬物伝達用組成物は、腫瘍性疾患、脳卒中、心筋梗塞または動脈硬化に特異的であり得る。腫瘍性疾患とは、悪性腫瘍により病理的症状を呈する疾患であり、その例は特に限定されるものではないが、大腸癌、肺癌、胃癌、食道癌、膵臓癌、胆嚢癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、絨毛癌、卵巣癌、乳房癌、甲状腺癌、脳癌、頭頸部癌、悪性黒色腫、皮膚癌、肝臓癌、白血病（leukemia）、リンパ腫（lymphoma）、複合骨髄腫（multiple myeloma）、慢性骨髄性白血病（chronic myelogenous leukemia）、神経芽腫（neuroblastoma）、再生不良性貧血が挙げられる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
さらに、本発明のペプチドはアポトーシス細胞と特異的に結合するので、腫瘍にのみ限定されずアポトーシスが大きく増加している脳卒中、心筋梗塞及び動脈硬化の場合でも本発明のペプチドは薬物伝達をすることができる。つまり、本発明は本発明のペプチド及びこれと結合した脳卒中治療剤を有効成分として含む脳卒中予防及び治療用薬学的組成物を提供する。従って、本発明は本発明のペプチド及びこれと結合した心筋梗塞治療剤を有効成分として含む心筋梗塞予防及び治療用薬学的組成物を提供する。従って、本発明は本発明のペプチド及びこれと結合した動脈硬化治療剤を有効成分として含む動脈硬化予防及び治療用薬学的組成物を提供する。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
本発明のペプチドを従来の脳卒中治療剤、心筋梗塞治療剤及び動脈硬化治療剤と連結して治療に利用すれば本発明のペプチドにより前記製剤が疾病部位の細胞にのみ選択的に伝達されるので、薬物の効能を増加させ、同時に正常組織に及ぼす副作用を大幅に減らし得る。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
実施例１：腫瘍組織の細胞に対する結合特異性を有するペプチドの探索
＜１−１＞ファージペプチドライブラリの製造
本発明者等は腫瘍組織を構成する各種細胞に、特異的なペプチドを探し出すために、ファージペプチドディスプレイ技術を利用した（Smith, Science, 228: 1315-1317, 1985）。ファージペプチドディスプレイとは数個〜数十個のアミノ酸で構成されたペプチドをバクテリオファージ表面にディスプレイすることである。最大１０9種類のペプチドを有するファージライブラリを製造できるので、一度に多くの種類のペプチドを探索して望む組織または腫瘍に標的されるペプチドを探し出すのに有用な技術である。
本発明に使用したファージペプチドライブラリは次のような方法により製造した。まず両末端にシステインがあって、その間に任意の７個アミノ酸を含むＣＸ7Ｃペプチドをコーディング（coding）するオリゴヌクレオチド（oligonucleotide）を無作為で合成した。前記オリゴヌクレオチドの合成はマクロゼン社（大韓民国）に依頼して行った。以降、合成されたオリゴヌクレオチドをノバゲン（Novagen，米国）社のＴ７Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）ファージクローニングキットを利用して製造社の指針に従い前記合成されたオリゴヌクレオチドをＴ７  ４１５−１ｂファージの表面を構成するカプシッド（capsid）蛋白質遺伝子内にクローニングしてファージペプチドライブラリを製造した。製造されたファージペプチドライブラリの多様性は約５×１０8ｐｆｕ程度に測定された。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
＜２−２＞腫瘍標的に対する組織学的分析
本発明で使用されるペプチドはＮ−末端にフルオレシン（fluorecein）が結合した形態にして、標準Ｆｍｏｃ方法により合成した後ＨＰＬＣ機器で分離した。本ペプチドの合成は専門会社（Peptron社）に依頼して施行した。
フルオレシンが標識された本発明のペプチド（ＡｐｏＰｅｐ−１）または対照群ペプチド（アミノ酸配列、ＮＳＳＶＤＫ）をイソフルラン麻酔（isoflurane anesthesia）下でマウスの尻尾静脈を介して最終５０μＭ濃度で投入した後、２時間循環させた。
組織学的実験のため、前記マウスを麻酔して開腹した。心臓を介してphosphate-buffered saline（ＰＢＳ）洗浄液及び４％パラホルムアルデヒド固定液を順次に灌流させ、腫瘍組織及び器官を除去した。各組織を凍結切断（Cryosections）した後、蛍光顕微鏡（fluorescence microscopy，Zeiss社）で本発明のペプチドを観察した。腫瘍組織におけるアポトーシスは製造会社（Chemicon社）の指針に従いＴＵＮＥＬ（in vitro terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling）分析法により確認した。フィブリノゲン（fibrinogen）染色は、これに対する抗体（Abcam社）及び赤色の蛍光試薬であるアレキサー５６８で標識された２次抗体を利用して免疫組織化学法（immunohistochemistry）で施行した。
その結果、図２に示した通り、Ｈ＆Ｅ染色を介して腫瘍が確認され（図２Ａ）、本発明のペプチド（ＡｐｏＰｅｐ−１）を注入した場合、腫瘍組織においてペプチドが観察され（図２Ｂ）、対照群ペプチドの場合、ほとんど観察されなかったことが分かった（図２Ｃ）。一方、図２Ａでアステリスクで表示した部位に対するペプチド蛍光（図２Ｄ）、ＴＵＮＥＬ染色（図２Ｅ）及びこれの映像合成（図２Ｆ）をすることにより、ＴＵＮＥＬ染色ができる細胞、つまり、アポトーシス細胞にペプチドが結合することが分かった。さらに、図２Ａにおいて三角形で表示した部位に対するペプチド蛍光（図２Ｇ）、ＴＵＮＥＬ染色（図２Ｈ）及びこれの映像合成（図２Ｉ）をすることにより、ＴＵＮＥＬ染色できない細胞にもペプチドが結合し、この部位に対するペプチド蛍光（図２Ｊ）、フィブリノゲン染色（図２Ｋ）及びこれの映像合成（図２Ｌ）を介して細胞の凝固壊死（coagulation necrosis）部位であることが分かった。
従って、配列番号２のペプチド（ＡｐｏＰｅｐ−２）を使用して前記と類似した実験をしてペプチド蛍光（図２Ｍ）、ＴＵＮＥＬ染色（図２Ｎ）及びこれの映像合成（図２Ｏ）をすることにより、腫瘍組織内アポトーシス細胞にペプチドが結合することが分かった。