(57)【要約】【課題】熱安定性に優れたラクターゼ溶液を提供する。【解決手段】  ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が約１２０ｋＤａのラクターゼの画分の割合が、２０％以上であるラクターゼ溶液。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が約１２０ｋＤａのラクターゼの画分の割合が、２０％以上であることを特徴とするラクターゼ溶液。
【請求項２】
前記１２０ｋＤａのラクターゼの画分の割合と、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が約８０ｋＤａのラクターゼの画分の割合と、の和が、３０％以上であることを特徴とする請求項１に記載のラクターゼ溶液。
【請求項３】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が約５０ｋＤａのラクターゼの画分の割合が、７０％以下であることを特徴とする請求項１に記載のラクターゼ溶液。
【請求項４】
前記約１２０ｋＤａのラクターゼの画分の割合と、前記約８０ｋＤａのラクターゼの画分の割合と、の和を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が約５０ｋＤａのラクターゼの画分の割合で除した値が、０．５以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のラクターゼ溶液。
【請求項５】
乳製品製造用であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のラクターゼ溶液。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のラクターゼ溶液を含有する乳製品。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のラクターゼ溶液を原料乳に添加し、当該原料乳に含まれる乳糖を１〜６０℃で分解させることを特徴とする原料乳の処理方法。
【請求項８】
微生物を培養する培養工程と、
前記培養工程により得られた培養物からラクターゼを回収する回収工程と、
前記回収工程により回収したラクターゼを精製する精製工程と
を含むことを特徴とするラクターゼ溶液の製造方法であって、
前記精製工程が、
塩析処理及び脱塩処理を行う工程
を１又は複数回含むことを特徴とするラクターゼ溶液の製造方法。
【請求項９】
前記塩析処理が、
前記回収したラクターゼに、塩析剤を１０〜９０％飽和させる飽和工程と、
前記飽和工程後に、ラクターゼを４〜４０℃で１〜８０時間放置する放置工程と
を含むことを特徴とする請求項８に記載のラクターゼ溶液の製造方法。
【請求項１０】
前記塩析処理が、ｐＨ４〜９において行われることを特徴とする請求項８又は９に記載のラクターゼ溶液の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクターゼ溶液及びそれを用いた乳、乳製品などに関する。
【背景技術】
【０００２】
乳糖（ラクトース）不耐症は、先天的に乳糖をうまく分解することができないため、乳製品などの食品中の乳糖により腹痛や下痢などの諸症状を呈する状態をいう。乳糖は、ガラクトース及びグルコースから構成される二糖である。乳糖不耐症に対応するために、牛乳などに含まれる乳糖を、酵素ラクターゼによってガラクトースとグルコースとに予め分解することが食品製造業において行われている。【０００３】
牛乳などの乳糖を分解するために使用されるラクターゼ溶液は、従来、ラクターゼ産生微生物を培養し、細胞内からラクターゼを抽出し、培養物由来の夾雑物を除去して精製した後、安定剤を添加し、ろ過滅菌することによって製造されている。【０００４】
特許文献１（特公昭６０−１８３９４号公報）には、Kluyveromyces lactisのある株の培養物からラクターゼの製造法に係る発明が開示されている。この方法によれば、酵母菌体を自己消化させた後、得られた粗酵素溶液をＤＥＡＥセルロースカラムに通し、食塩濃度勾配による溶出を行うと、２つの活性区分（ラクターゼＡ及びラクターゼＢ）が得られる。これらの２つの活性区分は、ｐＨ安定性がわずかに異なること以外は、温度安定性を含む各種の性質にほとんど差異はなく、酵素製剤がこれらの混合物からなっていてもよいことが開示されている。
また、Kluyveromyces lactisのラクターゼの遺伝子解析によれば、このラクターゼは１０２５アミノ酸からなるポリペプチドであり、分子量は１１７，６１８と推定されている（非特許文献１）。【０００５】
さらに、特許文献１に記載されたラクターゼは至適温度が４０〜５０℃であること、ｐＨ７．０において５０℃、１０分間で４５％、５５℃、１０分間で１００％失活することが記載されている。しかし、この酵素を用いて実際に乳に含まれる乳糖を分解したことは記載されていない。したがって、ラクターゼを原料乳に添加した場合の活性低下、特に乳中での４０℃以上の熱負荷をかけた場合における酵素の失活の問題については、何ら記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特公昭６０−１８３９４号公報
【特許文献２】特表２００４−５３４５２７号公報
【特許文献３】特表２００９−５１７０６１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Poch et al., Gene 1992 Sep 1; 118(1):55-63
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、熱安定性に優れたラクターゼ溶液を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ラクターゼのうち、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において約１２０ｋＤａのバンドを形成する画分の割合を高めることで、ラクターゼが高い熱安定性を有することを見出し、本発明を完成した。【００１０】
したがって、本発明によれば、
〔１〕  ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が約１２０ｋＤａのラクターゼの画分の割合が、２０％以上であることを特徴とするラクターゼ溶液;
［２］  前記１２０ｋＤａのラクターゼの画分の割合と、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が約８０ｋＤａのラクターゼの画分の割合と、の和が、３０％以上であることを特徴とする［１］に記載のラクターゼ溶液；
［３］  ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が約５０ｋＤａのラクターゼの画分の割合が、７０％以下であることを特徴とする［１］に記載のラクターゼ溶液；
［４］  前記約１２０ｋＤａのラクターゼの画分の割合と、前記約８０ｋＤａのラクターゼの画分の割合と、の和を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が約５０ｋＤａのラクターゼの画分の割合で除した値が、０．５以上であることを特徴とする［１］〜［３］のいずれか一項に記載のラクターゼ溶液；
［５］  乳製品製造用であることを特徴とする［１］〜［４］のいずれか一項に記載のラクターゼ溶液；
［６］  ［１］〜［５］のいずれか一項に記載のラクターゼ溶液を含有する乳製品；
［７］  ［１］〜［５］のいずれか一項に記載のラクターゼ溶液を原料乳に添加し、当該原料乳に含まれる乳糖を１〜６０℃で分解させることを特徴とする原料乳の処理方法；
［８］  微生物を培養する培養工程と、
前記培養工程により得られた培養物からラクターゼを回収する回収工程と、
前記回収工程により回収したラクターゼを精製する精製工程と
を含むことを特徴とするラクターゼ溶液の製造方法であって、
前記精製工程が、
塩析処理及び脱塩処理を行う工程
を１又は複数回含むことを特徴とするラクターゼ溶液の製造方法；
［９］  前記塩析処理が、
前記回収したラクターゼに、塩析剤を１０〜９０％飽和させる飽和工程と、
前記飽和工程後に、ラクターゼを４〜４０℃で１〜８０時間放置する放置工程と
を含むことを特徴とする［８］に記載のラクターゼ溶液の製造方法；
［１０］  前記塩析処理が、ｐＨ４〜９において行われることを特徴とする［８］又は［９］に記載のラクターゼ溶液の製造方法；
が提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、原料乳に添加して４０℃以上の熱負荷をかけた場合にも乳糖分解活性が低下しにくいラクターゼ溶液が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、各種ラクターゼ溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。レーン１＝実施例１−１、レーン２＝実施例１−２、レーン３＝比較例１−１、レーン４＝比較例１−２、レーン５＝比較例２、レーン６＝比較例３、レーンＭ＝分子量スタンダードである。尚、レーン１及び２、レーン３及び４は、異なるＬｏｔによる結果を示している。
【図２】図２は、原料乳にラクターゼ溶液を添加して４３℃、２時間の乳糖分解反応後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（パネルＡ）及びウェスタンブロッティング（パネルＢ）の結果を示す図である。各パネルにおいて、レーン１＝実施例１−１、レーン２＝実施例１−２、レーン３＝比較例１−１、レーン４＝比較例１−２、レーン５＝比較例２、レーン６＝比較例３、レーンＭ＝分子量スタンダードである。
【図３Ａ】図３Ａは、原料乳にラクターゼ溶液を添加して３７、４０、４３、４６及び４９℃で反応させた場合の乳糖量の経時変化を示す図である。図中のプロットは、□が実施例１、○が比較例１、▲が比較例２、△が比較例３での結果を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、原料乳にラクターゼ溶液を添加して３７、４０、４３、４６及び４９℃で反応させた場合の乳糖分解率の経時的変化を示す図である。図中のプロットは、□が実施例１、○が比較例１、▲が比較例２、△が比較例３での結果を示す。
【図４】図４は、１２０ｋＤａ画分の割合の異なるラクターゼ溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。レーン１＝実施例１、レーン２＝実施例２、レーン３＝実施例３、レーン４＝実施例４、レーン５＝実施例５、レーン６＝比較例１、レーンＭ＝分子量マーカーである。
【図５】図５は、原料乳に１２０ｋＤａ画分の割合の異なるラクターゼ溶液を添加して４９℃で反応させた場合の乳糖量（パネルＡ）及び乳糖分解率（パネルＢ）の経時的変化を示す図である。図中のプロットは、□が実施例１、◇が実施例２、▲が実施例３、×が実施例４、＊が実施例５、○が比較例１での結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明において使用されるラクターゼは、酵母（Kluyveromyces属）由来のラクターゼである。これらのほとんどが、最適ｐＨをｐＨ＝６〜ｐＨ＝８とする、所謂、中性ラクターゼである。Kluyveromyces属のラクターゼ産生酵母としては、例えば、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces fragillis、Kluyveromyces marxianus等が挙げられる。
【００１４】
本発明のラクターゼ溶液は、１０〜１００，０００ＮＬＵ/gのラクターゼ活性を有することが望ましい。「ＮＬＵ」はＮｅｕｔｒａｌ Ｌａｃｔａｓｅ Ｕｎｉｔである。活性の測定方法は、以下のとおりである。基質ｏ−ニトロフェニル−β−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を、ｏ−ニトロフェノール及びガラクトースにする加水分解によって測定される。反応は、炭酸ナトリウムの添加によって終了する。形成されたｏ−ニトロフェノールは、アルカリ媒体中で黄色になり、吸光度の変化が酵素活性（ＮＬＵ／ｇで表される）を測定するのに使用される。この手順は、米国食品化学物質規格集（FCC； Food Chemicals Codex）第４版、１９９６年７月１日、第８０１〜８０２頁／ラクターゼ（中性）（β-ガラクトシダーゼ）活性で、公表されている。
【００１５】
本発明に使用されるラクターゼ溶液は、以下の方法で微生物から回収され、精製されたものであることができる。
本発明のラクターゼ溶液の製造方法は以下の４つの工程を経る。すなわち、
（１）微生物の培養工程、
（２）微生物からのラクターゼ回収工程、
（３）ラクターゼの精製工程、及び
（４）ラクターゼ活性の調整工程
である。
【００１６】
以下、上記４つの工程の詳細について説明する。
（１）微生物の培養工程については公知の培地を使用し、公知の菌株を使用すればよい。培養条件も公知であり、必要に応じて適宜選択することができる。
（２）微生物からのラクターゼ回収工程については、細胞内酵素である場合、ラクターゼを抽出する工程を含む必要がある。この抽出工程は、ラクターゼを細胞外に移行させることができる方法であれば特に限定されず、公知の抽出方法を使用することができる。他方、遺伝子導入、変異等によりラクターゼを細胞外に分泌される酵素とすれば、その培養液にラクターゼが含まれることになるため、本抽出工程は不要である。
（３）ラクターゼの精製工程は本発明のラクターゼ溶液を得るために重要である。特許文献１、特許文献２及び特許文献３は、いずれもクロマトグラフィーによってラクターゼ溶液を精製することが共通する。このクロマトグラフィーを行うことによって、ラクターゼの精製が進みラクターゼ活性を向上させることができる。しかし、後述するように、クロマトグラフィー（分配クロマトグラフィー又は分子篩クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーなど）を使用してラクターゼを精製すると、本来１２０ｋＤａであるラクターゼが、８０ｋＤａ及び５０ｋＤａのラクターゼにそれぞれ分解されることが判明した。いずれの分子量のラクターゼもラクターゼ活性を有するが、ラクターゼが分解を受けることによって、特に５０ｋＤａの画分の割合が増すと、ラクターゼの熱安定性が低下する結果、比較的高い温度で乳糖の分解が進みにくくなる問題が生じるものであった。
【００１７】
本発明のラクターゼは、精製工程に塩析と脱塩処理を使用することによって得ることができる。すなわち、塩析によってラクターゼを沈殿させた後、その沈殿物を回収・再溶解し、沈殿物に含まれる塩を脱塩することで、本発明のラクターゼが得られる。塩析、沈殿物の回収・再溶解及び脱塩は連続して行ってもよい。また、本発明のラクターゼが得られる限り、他の精製手段（クロマトグラフィーや活性炭処理を含む）を併用することも可能である。
【００１８】
１２０ｋＤａのラクターゼが塩析によって分解を受けない理由は、塩析によってラクターゼが高分子として析出し、不溶化するため、反応性が低くなることに起因するものと推測される。
【００１９】
塩析を行う塩析剤としては、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムが挙げられ、これらのうち１種又は２種以上を用いることができる。
ラクターゼを含む溶液に、塩析剤としての硫酸アンモニウムを添加する場合、１０〜９０％飽和とすることが好ましく、３０〜７０％飽和とすることがさらに好ましい。他の塩析剤を使用する場合、当該硫酸アンモニウムの添加量に相当する量を使用すればよい。
【００２０】
硫酸アンモニウム等の塩析剤を添加することでラクターゼを含む溶液からラクターゼを沈殿させることができる。塩析剤の添加からラクターゼを沈殿させるまでの条件は、１〜４０℃で１〜８０時間放置することが好ましい。このときのｐＨ条件は４〜９であることが好ましい。さらに好ましくは、４〜２５℃（室温）、１〜４８時間、ｐＨ５〜８である。なお、温度条件の下限値については、ラクターゼを含む溶液が凝固しない温度であればよい。濾過によってラクターゼを含んでいた液体とラクターゼを含む沈殿物とを固液分離した後、固体状のラクターゼを水や緩衝液等に再溶解させ、透析や限外濃縮によって脱塩処理を行う。
【００２１】
（４）ラクターゼ活性の調整工程は、ラクターゼの活性を調整することができるものであれば制限されない。例えば、水、塩類を含む水溶液の添加、安定剤の添加等である。
【００２２】
本発明のラクターゼ溶液は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量の画分の割合が所定の割合を満たす範囲において、市販のラクターゼ溶液と上述した方法で得られるラクターゼ溶液を混合することで得ることも可能である。
【００２３】
ラクターゼ溶液中のラクターゼの分子量は、１０％ポリアクリルアミドゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって概算することができる。たとえば、ラクターゼ溶液を精製水で必要に応じて希釈し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒと１：１に混合し、９５度、５分間の加熱処理により泳動用サンプルを調製する。１０％アクリルアミドゲルにスタンダード及び泳動用サンプルを供し、泳動する。スタンダードはＢＩＯ−ＲＡＤ＃１６１‐０３１３（プレステインド）などを使用する。泳動後のゲルは、ＣＢＢ染色液（ＡＰＲＯ ＳＰ−４０１０）によるタンパク染色を行う。
【００２４】
本発明のラクターゼ溶液は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣＢＢ染色後、ＴＥＦＣＯポリアクリルアミドゲル乾燥キット（商品名Ｃｌｅａｒ Ｄｒｙ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を使用して乾燥させた。乾燥後のゲルはＥＰＳＯＮ社製スキャナＧＴ‐Ｘ８２０でグレースケールの画像として取り込み、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ） により、各バンドの濃度（タンパク量）を測定する。
【００２５】
本発明のラクターゼ溶液は、上記の方法で測定した分子量が約１２０ｋＤａの画分の割合が高いことを特徴とする。本発明において、「ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が約１２０ｋＤａのラクターゼの画分」とは、上記の方法で電気泳動した後に、分子量スタンダードの移動度と比較して約１２０ｋＤａに相当する位置（約１００ｋＤａ〜約１５０ｋＤａの間）にバンドを形成する分子の画分を指す。
【００２６】
本発明のラクターゼ溶液は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣＢＢ染色後、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）により測定した約１２０ｋＤａの画分の割合が２０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上である。上限値は特に限定されないが、例えば１００％である。この割合は、下記の方法により算出する。
【００２７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣＢＢ染色後、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を用いることによって各バンドの濃度を定量化し、約１２０ｋＤａ（１００〜１５０ｋＤａ）、約８０ｋＤａ（８０〜１００ｋＤａ）約５０ｋＤａ（４９〜５４ｋＤａ）及び約３０ｋＤａ（２８〜３２ｋＤａ）に相当するバンドを含む主要なバンドの全体を１００％とした場合の約１２０ｋＤａのバンドの割合を算出する。本願の特許請求の範囲における記載は、特別の記載がない限り、上記４つのバンドの全体を１００％とした場合の値を記載している。
【００２８】
本発明のラクターゼ溶液は、上記と同様の方法により算出した約８０ｋＤａの画分の割合と、上記１２０ｋＤａの画分の割合と、の和が、好ましくは３０％以上であり、より好ましくは６０％以上であり、さらに好ましくは９０％以上である。上限値は特に限定されないが、例えば１００％である。
【００２９】
約１２０ｋＤａのラクターゼ（以下、ラクターゼＩという場合がある）が分解すると約８０ｋＤａのラクターゼ（以下、ラクターゼＩＩという場合がある）になり、ラクターゼＩ又はラクターゼＩＩが分解すると約５０ｋＤａのラクターゼ（以下、ラクターゼＩＩＩという場合がある）となる。
ラクターゼ溶液中のラクターゼＩ及びラクターゼＩＩは、いずれもラクターゼ活性及び耐熱性を有する。ラクターゼＩＩＩはラクターゼ活性を有するが耐熱性が不十分である。いずれの画分であってもラクターゼ活性は同等である。
【００３０】
ラクターゼＩＩはラクターゼＩの分解物であるため、耐熱性の観点からはラクターゼ溶液中のラクターゼＩの割合をラクターゼＩＩよりも多くすることが好ましい。
【００３１】
ラクターゼ溶液中のラクターゼＩＩＩの割合は、７０％以下であることが好ましく、４０％以下であることがより好ましく、１０％以下であることがさらに好ましい。下限値は特に限定されないが、例えば０％である。
【００３２】
ラクターゼＩの割合と、ラクターゼＩＩの割合と、の和を、ラクターゼＩＩＩの割合で除した値は、０．５以上とすることが好ましく、１．０以上がより好ましく、５．０以上がさらに好ましい。０．５未満であると、耐熱性が不足する傾向にある。ラクターゼ溶液にはラクターゼＩＩＩが全く含まれないこと、すなわちゼロであることが最も好ましいため、上限値は限定されない。
【００３３】
原料乳は、ラクターゼ溶液を添加する対象となるものである。本発明では、公知の原料乳を用いればよい。原料乳には、殺菌前のものも、殺菌後のものも含まれる。原料乳は乳を使用するものであればよい。原料乳を構成する材料としては、水、生乳、殺菌処理した乳、脱脂乳、全脂粉乳、脱脂粉乳、バターミルク、バター、クリーム、ホエータンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、ホエータンパク質単離物（ＷＰＩ）、α（アルファ）−Ｌａ、β（ベータ）−Ｌｇなどがあげられる。
【００３４】
本発明のラクターゼ溶液を原料乳に添加することで、当該原料乳に含まれる乳糖を分解させることができる。分解温度は１〜６０℃であり、分解時間は１０分間〜２４時間である。
【００３５】
ラクターゼ溶液の具体的な利用形態としては、例えば、発酵乳の製造において用いられる。乳糖分解した発酵乳の製造方法は、１．殺菌前の乳にラクターゼを添加して乳糖の分解を行なった後、乳の加熱殺菌と同時にラクターゼを失活させてから乳を発酵させる方法（特開平５−５０１１９７号公報）、２．殺菌乳にラクターゼを添加して乳糖の分解を行なった後、加熱処理によってラクターゼを失活させてから乳を発酵させる方法、３．固定化したラクターゼで乳中の乳糖を分解した後、乳を発酵させる方法（特開昭４６−１０５５９３号公報、特開昭５９−１６２８３３号公報）、４．予め乳糖分解もしくは乳糖除去した原材料を殺菌乳に用いて発酵させる方法等がある。
【００３６】
本発明に係るラクターゼ溶液は、乳製品製造用として特に適している。ここで、乳製品とは、アイス、ロングライフミルク等の牛乳類、ヨーグルト、生クリーム、サワークリーム、チーズ等をいう。特に、本発明に係るラクターゼ溶液は、４０℃以上の熱負荷をかける場合に好ましく利用することができる。このような用途としては、例えば、ヨーグルトがある。
【実施例】
【００３７】
１．  ラクターゼ溶液の製造
（実施例１）
コーン・スティープ・リカー７％、ラクトース２％を含有する液体培地を加圧殺菌後（殺菌後のｐＨ５．５）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓＮｏ．０１３−２（ＡＴＣＣ ８５８５株）を植菌し、３０℃にて２４時間、１２０００Ｌ／ｍｉｎの通気で培養した。培養終了後冷却しながら４時間放置後、タンク上部から上澄液を除き、タンク底部に凝集沈降した菌体１５００ｋｇを得た。次いでここに得られた菌体のうち１５００ｇを水道水で洗浄後、トルエン８０ｍｌを加え混和後、１５００ｍｌの０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加え撹拌均一化し、密栓を施して３０℃、１５時間放置し自己消化せしめた。
この消化液を遠心分離して得た上清２５００ｍｌに等容の冷アセトンを加え一夜放置した。生じた沈殿を遠心分離にて集め６００ｍｌの水道水に溶かし、濃縮前酵素溶液を得た。
この濃縮前酵素溶液６００ｍｌを４℃に冷却しながら、硫酸アンモニウム粉末を６０分間かけて少しずつ添加し、５０％飽和水溶液を得た。当該水溶液を８０時間４℃で放置（静置）しラクターゼを沈殿させた後、濾過によって固液分離し、固体状のラクターゼを回収した。当該ラクターゼを６００ｍｌの水道水に再溶解させた後、限外濃縮を行った。脱塩されたラクターゼに水道水を添加し、終濃度が５０％となるようにグリセリンを添加し実施例１のラクターゼ溶液（５，０００ＮＬＵ／ｇ）を得た。
（実施例２）
実施例１のラクターゼ溶液と下記比較例１とを、重量比が８０：２０となるように混合して、実施例２のラクターゼ溶液（５，０００ＮＬＵ／ｇ）を得た。
（実施例３）
実施例１のラクターゼ溶液と下記比較例１とを、重量比が６０：４０となるように混合して、実施例３のラクターゼ溶液（５，０００ＮＬＵ／ｇ）を得た。
（実施例４）
実施例１のラクターゼ溶液と下記比較例１とを、重量比が４０：６０となるように混合して、実施例４のラクターゼ溶液（５，０００ＮＬＵ／ｇ）を得た。
（実施例５）
実施例１のラクターゼ溶液と下記比較例１とを、重量比が２０：８０となるように混合して、実施例５のラクターゼ溶液（５，０００ＮＬＵ／ｇ）を得た。【００３８】
（比較例１）
市販のラクターゼ製剤である商品名「ＧＯＤＯ−ＹＮＬ２ＳＳ」（合同酒精社製、５０００ＮＬＵ／ｇ）を比較例１のラクターゼ溶液とした。
（比較例２）
市販のラクターゼ製剤である商品名「ＭＡＸＩＬＡＣＴ  ＬＧ５０００」（ＤＳＭ社製、５０００ＮＬＵ／ｇ）を比較例２のラクターゼ溶液とした。
（比較例３）
市販のラクターゼ製剤である商品名「ＭＡＸＩＬＡＣＴ  ＬＧＸ５０００」（ＤＳＭ社製、５０００ＮＬＵ／ｇ）を比較例３のラクターゼ溶液とした。【００３９】
２．  ラクターゼ溶液の電気泳動
ラクターゼ溶液をミリＱ水で１０ＮＬＵ／ｇに希釈し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ ｐＨ６．８、０．０１２５％ ブロモチモールブルー、２０％ グリセリン、２．５％ ＳＤＳ、２．５％ ２-メルカプトエタノール）と１：１に混合し、９５℃、５分間の加熱処理により泳動用サンプルを調製した。１０％アクリルアミドゲル（４％スタッキングゲル、ゲル厚１ｍｍ、泳動距離５０ｍｍ）に分子量スタンダード及び泳動用サンプルを供し、マリソル産業泳動漕にて、スタッキング１０ｍＡ定電流、セパレーティング２０ｍＡにて泳動前線がゲル下端付近に達するまで泳動した。分子量スタンダード（レーンＭ）にはＢＩＯ−ＲＡＤ＃１６１−０３１３（プレステインド）を使用した。泳動後のゲルは、ＣＢＢ染色液（ＡＰＲＯ  ＳＰ−４０１０）によるタンパク染色を１時間行った。【００４０】
結果を図１に示す。実施例１のラクターゼ溶液（レーン１及び２）は分子量約１２０ｋＤａのメインバンドのみが観察されたのに対し、比較例１（レーン３及び４）は分子量約１２０ｋＤａのバンドがほとんど消失しており、分子量約８０ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約３０ｋＤａの３本がメインバンドとして検出された。比較例２（レーン５）、比較例３（レーン６）ともに分子量約１２０ｋＤａのバンドに加え分子量約８０ｋＤａのバンドもほとんど観察されず、メインバンドは約５０ｋＤａ、約３０ｋＤａの２本であった。
ラクターゼ活性を有するのは、約１２０ｋＤａ、約８０ｋＤａ及び約５０ｋＤａのバンドであり、約３０ｋＤａのバンドはラクターゼ活性を有するものではなかった。【００４１】
３．各バンドの定量及び結果１
上述する方法により、泳動後のゲルについて、バンドの定量により割合を算出した。結果を表１に示す。表１は全てのバンドを含む値を記載した。さらに、表２には、主要な４つのバンドのみを全体としたそれぞれのバンドの割合を算出した結果を示した。表１〜表４において、各実施例、比較例等の値を合計しても１００にならないのは、得られた測定結果の小数点第２位を四捨五入したためである。
表１、２には示していないが、上記実施例１等と同様にして、特許文献１の実施例１を追試することによって得られたＡ区分及びＢ区分について、電気泳動を行ったところ、比較例２、３と同様の傾向を示した。
表１
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表２
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【００４２】
４．  乳糖分解反応後の電気泳動及びウエスタンブロット
ＵＨＴ殺菌（１３０℃、２秒）牛乳（商品名「明治おいしい牛乳」、株式会社明治製）に実施例１のラクターゼ溶液（レーン１及びレーン２）、比較例１（レーン３及びレーン４）、比較例２（レーン５）又は比較例３（レーン６）を、それぞれ終濃度０．０５％（W/V）となるように添加し、４３℃で２時間乳糖分解反応を行った。反応後の溶液を精製水で２０倍（W/V）に希釈して、上記と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥ用Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒと１：１に混合し、９５℃、５分間の加熱処理により泳動用サンプルを調製した。１０％アクリルアミドゲル２枚に分子量スタンダード及び泳動用サンプルを供し、同時に泳動した。分子量スタンダード（レーンＭ）はＢＩＯ−ＲＡＤ＃１６１−０３１３（プレステインド）を使用した。【００４３】
泳動後のゲルは、１枚は上記と同様にＣＢＢ染色液によるタンパク染色を行い、もう１枚はウエスタンブロットに供した。ウエスタンブロットの転写膜はニトロセルロースメンブレン（ＢＩＯ−ＲＡＤ＃１６２−０１１４）を使用し、ウェット方式により転写した。転写後のメンブランはブロックエース溶液（雪印乳業ブロックエース粉末４ｇ／精製水１００ｍＬ）でブロッキング操作を行った後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳにて洗浄した。
一次抗体としては以下の様に自家調製した抗ラクターゼポリクローナル抗体を使用した。実施例１で得られたラクターゼ溶液のＳＤＳ-ＰＡＧＥを行い、ゲルより１２０ｋＤａのバンドを切り出して細かく砕いた後にDifco社製アジュバント  コンプリート  フロイントと混合してエマルジョン化した。これをＢａｌｂ-Ｃマウスの尾部根元に計3回皮下注射し、血清中抗体価の上昇を確認後、採取した全血の遠心分離上清を抗ラクターゼポリクローナル抗体とした。この抗体でラクターゼの１２０、８０、５０ｋＤａのバンドが検出可能であった。
上記の抗ラクターゼ抗体をブロックエース希釈液（ブロックエース溶液を精製水で１０倍希釈）で１，０００倍に希釈した液中で、室温で２時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで４回洗浄した後、２次抗体（Ｇｏｒｔ  ａ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ；ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ  １０３４−０５）をブロックエース希釈液で５，０００倍に希釈した液中で、室温で２時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）による染色を行った。ＤＡＢ基質はＤＡＢ  ｂｕｆｆｅｒ  ｔａｂｌｅｔｓ（ＭＥＲＣＫ  １．０２９２４．０００１）を使用した。【００４４】
結果を図２に示す。ＣＢＢ染色像（パネルＡ）においては、ラクターゼ溶液に関わらず、ほぼ同様の結果が観察された。これに対し、ウェスタンブロッティングの結果（パネルＢ）では、反応前のラクターゼ溶液と同様に、ラクターゼ溶液による相違が見られた。すなわち、実施例１は分子量約１２０ｋＤａのメインバンドのみが観察されたのに対し、比較例１は分子量約１２０ｋＤａのバンドがほとんど消失し、分子量約８０ｋＤａ、約５０ｋＤａの２本がメインバンドとして検出された。比較例２又は比較例３は分子量約１２０ｋＤａのバンドに加え分子量約８０ｋＤａのバンドもほとんど観察されず、メインバンドは約５０ｋＤａであった。【００４５】
以上から、分解反応の前後で各ラクターゼ溶液に含まれるラクターゼの分子量及び各分子量の画分の割合に変化は見られなかった。【００４６】
５．乳糖分解試験１
ＵＨＴ殺菌牛乳（１３０℃、２秒）に実施例１のラクターゼ溶液、比較例１、比較例２及び比較例３をそれぞれ終濃度０．０５％（w/v）（２．５ＮＬＵ/１００ｍＬ牛乳）となるように添加し、４９℃、４６℃、４３℃、４０℃及び３７℃で乳糖分解反応を行った。乳糖分解反応前の乳糖の含量と、反応中の乳糖の含量を経時的にＨＰＬＣ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ  ＣＡＲＢＯＳｅｐ  ＣＨＯ６２０カラム）で測定した（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣシステム、カラム温度：８５℃、溶媒：Ｈ２Ｏ、流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、検出器：Ｗａｔｅｒｓ２４１４ＲＩディテクター）。乳糖分解率は、以下のように算出した。乳糖分解率（％）＝１００−（各実施例又は各比較例のラクターゼ溶液を用いた乳糖分解反応後の牛乳に含まれる乳糖含量／各実施例又は各比較例のラクターゼ溶液を用いた乳糖分解反応前の牛乳に含まれる乳糖含量）×１００）【００４７】
結果を図３に示す。図３Ａは乳糖量、図３Ｂは乳糖分解率の経時変化の結果を示している。２時間の反応により、３７℃では実施例１、比較例１、比較例２又は比較例３で分解率に差は見られなかったが、反応温度が上がるにつれて、実施例１の分解率が最も高く、次いで比較例１、もっとも分解率が低いものが比較例２又は比較例３という傾向が認められた。上記のように、本発明のラクターゼ溶液は、反応温度を高くした場合においてもラクターゼが失活せず、熱安定性が高いことが示された。実施例１のラクターゼ溶液は温度を高めることによって、短い反応時間でより効率的に乳糖を分解することも可能である。尚、異なるＬｏｔのラクターゼ溶液においても、その結果の再現性が確認された。【００４８】
各ラクターゼ溶液中の主要なラクターゼ画分の分子量が反応前後で変化していないことから、分解率の低下は、反応中にラクターゼの活性が低下したために生じたものと考えられる。また、４０℃以上での反応における分解率は、１２０ｋＤａ画分の含有量が高いほど高かった。【００４９】
６．混合ラクターゼ溶液における検討
実施例１のラクターゼ溶液と比較例１のラクターゼ溶液を上述する割合で混合して得たラクターゼ溶液、実施例２〜５について以下検討を行った。【００５０】
６−１．各バンドの定量及び結果２
実施例２〜５について、上述した方法により、電気泳動を行った後、各バンドの定量を行った。電気泳動の結果を図４、定量の結果を表３に示す。表３は全てのバンドを含む値を記載した。さらに表４には、主要な４つのバンドのみを全体としたそれぞれのバンドの割合を算出した結果を示した。尚、比較のため、実施例１及び比較例１についても同時に泳動及び定量を行った結果を示した。
表３
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表４
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【００５１】
乳糖分解試験２
実施例１〜５及び比較例１のラクターゼ溶液を用いて、上述した乳糖分解試験の方法により、４９℃で乳糖分解反応を行った。得られた結果を図５に示した。
パネルＡは乳糖量、パネルＢは乳糖分解率の経時変化の結果を示している。約１２０ｋＤａのバンドが増えるにつれ、乳糖分解が進むことを確認した。【００５２】
したがって、上記の結果より、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約１２０ｋＤａのメインバンドが２０％以上であるラクターゼ溶液は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分子量約８０ｋＤａ、約５０ｋＤａ及び約３０ｋＤａのメインバンドを有するラクターゼ溶液よりも耐熱性が高いといえる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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