(57)【要約】  安定化したＰＧＦ２αを容易に入手でき、医療用ばかりでなく、養殖用飼料、家畜用飼料等に簡便且つ汎用的に応用できる材料を提供すること。  ＰＧＦ２αを含有するマクサ水性エタノール抽出物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＧＦ２αを含有するマクサ水性エタノール抽出物。
【請求項２】
水性エタノールのエタノール濃度が４０〜８０容量％である、請求項１に記載の抽出物。
【請求項３】
マクサを水性エタノールで抽出することを特徴とする、ＰＧＦ２αを含有するマクサ抽出物の製造方法。
【請求項４】
水性エタノールのエタノール濃度が４０〜８０容量％である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
マクサを水性エタノールで抽出することを特徴とする、ＰＧＦ２αの安定化方法。
【請求項６】
水性エタノールのエタノール濃度が４０〜８０容量％である、請求項５に記載の安定化方法。
【請求項７】
請求項１または２に記載のマクサ抽出物含有食品。
【請求項８】
請求項１または２に記載のマクサ抽出物含有飼料。
【請求項９】
請求項１または２に記載のマクサ抽出物含有医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は紅藻類テングサ科テングサ属マクサ抽出物に関し、特に詳細には、ＰＧＦ２α含有マクサエタノール抽出物に関する。
【背景技術】
【０００２】
マクサの学名はＧｅｌｉｄｉｕｍ  ａｍａｎｓｉｉと称し、紅藻類テングサ目テングサ科テングサ属に分類され（以下、マクサを「紅藻類テングサ属マクサ」と称することがある）、「ところてん」の食料原料として古くから使用されてきた。【０００３】
近年、マクサ抽出物を使用した医薬用途、飼料用途、機能性食品用途等への開発が行われている。例えば、マクサ常温水抽出物に体脂肪減少作用があることが見出された（特許文献１参照）。また、マクサメタノール抽出物に骨代謝を改善する作用があることが見出された（特許文献２参照）。【０００４】
一方、プロスタグランジンの１種であるジノプロスト（以下、ＰＧＦ２αと称する）は、下記のような構造を示す。【０００５】
【化１】
2015005301.tif 000002
【０００６】
ＰＧＦ２αは、脂肪蓄積抑制作用（非特許文献１参照）、子宮筋収縮作用や眼圧降下作用などの生理作用（非特許文献２、３参照）を持つことから医療分野に広く利用されている。また、近年、ＰＧＦ２αは、魚類における性フェロモン作用（非特許文献４〜６参照）、家畜動物おける発情同期化作用（非特許文献７〜９参照）を有することが報告されており、養殖や家畜の分野で種苗生産の効率化を目的として利用するための研究が行われている。したがって、今後、医療業界だけでなく様々な産業で広く利用される可能性が示唆されている。しかし、ＰＧＦ２αを含むプロスタグランジン類は、熱などで容易に分解されてしまうなど非常に不安定な物質であることから、安定化する技術が望まれ、幾つかの安定化方法が報告されている。例えば、シクロデキストリンで包摂する方法（特許文献３、４参照）や、アンモニオメタクリレートコポリマーと配合する方法（特許文献５参照）等が知られている。さらに、プロスタグランジン含有医薬品にポリエトキシ化ひまし油を配合し化学的安定性を増強させる方法（特許文献６参照）、ＰＧＦ２αを中鎖脂肪酸トリグリセリド、水溶性高分子、水と共に水中油型エマルションとする方法（特許文献７参照）が報告されている。【０００７】
しかし、これらの方法では依然として不充分であり、安定化したＰＧＦ２αを容易に入手でき、医薬用ばかりでなく、養殖用飼料、家畜用飼料等に簡便で且つ汎用的に応用できる材料が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−１６０５０５号公報
【特許文献２】特開２０１２−２０１６８１号公報
【特許文献３】特開平７−１０９２５４号公報
【特許文献４】特開平７−２９１８６５号公報
【特許文献５】特開平１１−３５４８８号公報
【特許文献６】特開２０１０−４３１３１号公報
【特許文献７】ＷＯ２００５／０４４２７６号再公表公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．２７３．Ｎｏ．４  ｐ１８５５−１８５８（１９９８）
【非特許文献２】第十六改正日本薬局方解説書第一部医薬品各条Ｃ−１９４２、ジノプロスト、２０１１年、廣川書店
【非特許文献３】Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  Ｖｉｓｕａｌ   Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．１６、１１２５−１１３４（１９７２）
【非特許文献４】魚類学会誌  ５４（２）、１０５−１２０（２００７）
【非特許文献５】Ｆｉｓｈ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：２２９−２３５（２００３）
【非特許文献６】Ｈａｉｙａｎｇ  ｙｕ  Ｈｕｚｈａｏ（海洋与湖沼）  Ｖｏｌ．３７，Ｎｏ．６，５４１−５４７（２００６）
【非特許文献７】農業研究機構ＨＰ：「偽妊娠誘起を応用したブタの発情同期化法」（http://www.naro.affrc.go.jp/project/results/laboratory/niah/2011/170c1_01_29.html）
【非特許文献８】社団法人畜産技術協会ＨＰ：「プロスタグランジンＦ２αを用いた雌豚の発情同期化技術」（http://jlta.lin.gr.jp/report/techinfo/houkoku/h13_120.html）
【非特許文献９】愛知農総試研報  ３８：１６１−１６６（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、安定化したＰＧＦ２αを容易に入手でき、医療用ばかりでなく、飲食品用、養殖用飼料、家畜用飼料等に簡便且つ汎用的に応用できる材料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、鋭意検討を行った結果、紅藻類テングサ属マクサの水性エタノール抽出物中に安定化されたＰＧＦ２αが含まれていることを見出し、本発明を完成した。【００１２】
すなわち、本発明は、ＰＧＦ２αを含有するマクサ水性エタノール抽出物にある。【００１３】
本発明の別の態様は、紅藻類テングサ属マクサを水性エタノールで抽出することを特徴とする、ＰＧＦ２αを含有するマクサ抽出物の製造方法にある。ここで、紅藻類テングサ属を抽出するためのエタノール濃度は４０〜８０容量％であることが好ましい。【００１４】
本発明のさらに別の態様は、紅藻類テングサ属を水性エタノールで抽出することを特徴とする、ＰＧＦ２αの安定化方法にある。【００１５】
本発明のさらに別の態様は、前記ＰＧＦ２αを含有するマクサ水性エタノール抽出物含有食品にある。【００１６】
本発明のさらに別の態様は、前記ＰＧＦ２αを含有するマクサ水性エタノール抽出物含有飼料にある。【００１７】
本発明のさらに別の態様は、前記ＰＧＦ２αを含有するマクサ水性エタノール抽出物含有医薬組成物にある。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のＰＧＦ２αを含有するマクサ水性エタノール抽出物は、ＰＧＦ２αが安定化されており、ＰＧＦ２α精製品と比較して顕著に安定であるため、簡便且つ汎用的に応用できる。例えばＰＧＦ２α精製品ではその不安定さから不可能であった、経口摂取が可能であって長期間保存しておくことの出来る薬剤や機能性食品、または養殖用飼料や家畜用飼料を簡便且つ容易に製造することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、様々な海藻抽出物を添加した場合のマウス由来３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の脂肪蓄積抑制活性評価試験の結果を脂肪蓄積率として表す図である。
【図２】図２は、ＰＧＦ２α含有マクサ抽出物を０．７５、７．５、７５μｇ／ｍｌの乾燥重量濃度となるように添加した場合のマウス由来３Ｔ３−Ｌ1脂肪細胞の細胞毒性評価試験の結果を細胞生存率で表す図である。
【図３】図３は、水または２０容量％、４０容量％、６０容量％、８０容量％の含水エタノール、１００容量％エタノールを用いて、マクサからＰＧＦ２α画分を抽出した抽出物を用いた場合のマウス由来３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の脂肪蓄積抑制活性評価試験の結果を脂肪蓄積率として表す図である。
【図４】図４は、ＰＧＦ２α含有紅藻類マクサ抽出物または精製ＰＧＦ２α標品をそのままの状態で２５℃に設定した室内で１４日間保存した場合の、保存を開始した日に各試料に含まれているＰＧＦ２α量を１００％とした場合のＰＧＦ２α保存安定率の経時的な変化を示す図である。
【図５】図５は、ＰＧＦ２α含有紅藻類マクサ抽出物を添加した飼料、精製ＰＧＦ２α標品をそのまま添加した飼料を２５℃に設定した室内で１４日間保存した場合の、保存を開始した日の各飼料に含まれているＰＧＦ２α量を１００％とした場合のＰＧＦ２α保存安定率の経時的な変化を示す図である。
【図６】図６は、高脂肪を添加した飼料、高脂肪に加えてＰＧＦ２α含有紅藻類マクサ抽出物を添加した飼料、高脂肪に加えて精製ＰＧＦ2α標品を添加した飼料をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに与えた場合の摂取カロリー当たりの体重の増加率の経時的な変化を示す図である。
【図７】図７は、高脂肪を添加した飼料、高脂肪に加えてＰＧＦ２α含有紅藻類マクサ抽出物を添加した飼料、高脂肪に加えて精製ＰＧＦ2α標品を添加した飼料をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに与えた場合の１００ｇ体重当たりの内臓脂肪量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、上述したように、紅藻類テングサ属マクサの水性エタノール抽出した安定化されたＰＧＦ２α抽出物に関するものである。以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
【００２１】
多くの海藻類、すなわち、褐藻類ホンダワラ属ヒジキ、褐藻類ホンダワラ属アカモク、褐藻類ホンダワラ属ノコギリモク、褐藻類ホンダワラ属オオバモク、褐藻類ワカメ属ヒロメ、褐藻類ワカメ属ワカメ、褐藻類カジメ属カジメ、褐藻類カジメ属クロメ、褐藻類トサカノリ属トサカノリ、褐藻類フクロノリ属フクロノリ、褐藻類カゴメノリ属カゴメノリ、褐藻類スジメ属スジメ、褐藻類アラメ属サガラメ、緑藻類アオサ属アナアオサ、紅藻類ムカデノリ属ムカデノリ、紅藻類アマノリ属スサビノリ、紅藻類テングサ属マクサをエタノール抽出したところ、マクサ抽出物のみにＰＧＦ２αが検出され、その含有量は実用に足る有意量含まれていることが分かった。すなわち、上記海藻類を、水を用いて攪拌しながら洗浄を繰り返し、塩分や多糖類を除去した後乾燥し、乾燥物を粉砕し、各海藻の乾燥粉末を得た。当該乾燥粉末を、エタノールを用いて抽出した後、蒸発乾固した。各海藻の抽出乾固物を、ＰＧＦ２αＥＬＩＳＡ測定キット（例えば、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を使用して、抽出乾固物中のＰＧＦ２αの含量を測定したところ、上記海藻中マクサ抽出物にのみにＰＧＦ２αが含まれていた。
【００２２】
得られたマクサ抽出物を、マウス由来３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を使用して、脂肪蓄積抑制作用を指標に評価したところ、ＰＧＦ２αが有する生理作用を確認することができた。また、ＰＧＦ２αを含有するマクサ抽出物に細胞毒性は確認されず、前記脂肪蓄積抑制作用は細胞毒性などではなくＰＧＦ２αの有する生理作用であることが確認された。
【００２３】
本発明のＰＧＦ２α含有マクサ抽出物を得るための抽出方法は、抽出溶媒としてエタノールまたは水性エタノールを使用して行うことができ、ＰＧＦ２αを有意量含有するマクサ抽出物を容易に得ることができる。例えば、抽出に用いるマクサ原料は、塩分や多糖類などのＰＧＦ２α以外の水溶性画分や水不溶性不純物を除去するための前処理を行う。例えば、水溶性画分や水不溶性の不純物を除去するのに足る量の水を使用して、数分間攪拌しながら洗浄を行い、同様の洗浄操作を数回繰り返した後、常温（例えば、２５℃）条件下で一晩乾燥させた後、ＰＧＦ２αを抽出しやすいように粉砕する。
【００２４】
水性エタノールの濃度は、４０％〜１００％であり、好ましくは、４０％〜８０％であり、最も好ましくは、６０％である。抽出温度は、例えば、４℃〜８０℃、好ましくは２５℃〜７８．２℃、さらに好ましくは２５℃である。抽出時間は、例えば、１時間〜２４時間、好ましくは１５時間である。
【００２５】
得られたＰＧＦ２α含有マクサ抽出物は所定の用途にそのまま原料として使用できる。
【００２６】
本発明の、ＰＧＦ２α含有マクサ抽出物そのものおよび該抽出物と飼料等との混合物双方ともＰＧＦ２α精製品と比較して、保存安定性が顕著に優れている。すなわち、ＰＧＦ２α精製品またはＰＧＦ２α含有マクサ抽出物を常温で２週間保存した後、残存しているＰＧＦ２α量を測定した。その結果、ＰＧＦ２α精製品は２週間でおよそ６割程度まで分解してしまったのに対してマクサ抽出物中のＰＧＦ２αは９割程度残存していることが確認された。また、ＰＧＦ２α精製品またはＰＧＦ２α含有マクサ抽出物を動物用飼料に混合すると、ＰＧＦ２α精製品含有飼料は２週間で３割程度まで分解してしまったのに対し、ＰＧＦ２α含有マクサ抽出物含有飼料は８割程度残存することが確認された。
【００２７】
上述したように、ＰＧＦ２αは下記のような種々の生理作用を示す。
ａ．脂肪蓄積抑制作用
脂肪細胞分化におけるマスターレギュレーターのＰＰＡＲγに作用して、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化を抑制することで脂肪蓄積を抑制する（非特許文献１）。
ｂ．眼圧降下作用および子宮筋収縮作用
子宮筋収縮作用を利用した心痛の誘発や促進、分泌促進の目的で注射液として利用されている（非特許文献２）。また、眼圧降下作用を利用した緑内障や高眼圧症治療の目的で点眼薬としても利用されている(非特許文献３)。
ｃ．魚類における性フェロモン作用
魚類において体内で成熟に関わったＰＧＦ２αが代謝されて尿中に排出され、成熟雄を誘引する性フェロモン（ホルモナルフェロモン）としての機能を示すという報告がある（非特許文献４および５）。また、Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｂｌａｃｋ  ｓｌｅｅｐｅｒ（Ｂｏｓｔｒｉｃｈｔｈｙｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）を用いたＰＧＦ２αによる産卵誘発作用（巣産卵率、産卵数および平均受精率）の検討が実施されている（非特許文献６）。
ｄ．家畜における発情同期化作用
家畜動物（特にブタ）において、生産効率の向上や飼育管理のシステム化のため、雄の個々の発情時期を同期化する技術開発が行われており、発情の同期化作用を持つＰＧＦ２αが用いられている（非特許文献７〜９）。
【００２８】
このようにＰＧＦ２αは多様の生理作用を示し、マクサ水性エタノール抽出により、ＰＧＦ２αは安定化されているので、多くの応用が期待できる。
【００２９】
すなわち、本発明のマクサ抽出物は、そのままの形態で、あるいは他の添加剤と混合して製剤化することにより様々な用途に応用することができる。
【００３０】
例えば、本発明のマクサ抽出物をそのまま、または当該抽出物を加工食品に添加することによって、当該食品を脂肪蓄積抑制作用、眼圧降下作用などを有する機能性飲食品にすることができるが、対象となる飲食品の種類は、活性成分であるＰＧＦ２αの脂肪蓄積抑制作用、眼圧降下作用などが阻害されないものであれば特に限定されない。
【００３１】
加工食品の例として、例えば、菓子・パン類；穀粉・麺類；水産加工品；農産・林産加工食品；畜産加工品；乳・乳製品；油脂・油脂加工品；酒類；飲料；調味料；調理冷凍食品；レトルト食品；インスタント食品；魚介せんべいなどの調味乾燥品；魚卵塩蔵品などの塩蔵品；甘露煮、しぐれ煮、角煮などの佃煮；焼き加工品；茹で加工品；魚介味噌などの調味加工品；蒸しかまぼこ、焼きかまぼこ、揚げかまぼこ、茹でかまぼこ、風味かまぼこ、包装かまぼこ、細工かまぼこ、燻製かまぼこなどのかまぼこ；醤油漬、味噌漬、粕漬、酢漬、麹漬などの漬け物；かつお塩辛、うに塩辛、いか塩辛などの塩辛；缶詰；瓶詰；魚醤油；エキス製品などが挙げられる。
【００３２】
本発明の飲食品は、健康飲食品、健康補助飲食品、特定保健用食品、栄養機能食品、等を含む。ここで、特定保健用食品とは、食生活において特定の保健の目的で摂取をし、その摂取により当該保健の目的が期待できる旨の表示をする飲食品をいう。これらの飲食品には、例えば、体脂肪を減少する、肥満症の症状を緩和する、体脂肪が気になる方の食品、眼圧を下げる、緑内障を改善するなどの表示が付されていてもよい。
【００３３】
本発明の組成物をそのまま、または当該組成物を家畜用飼料、魚類養殖用飼料またはペットフードに添加することによって、または、例えば、粉末剤、顆粒剤、錠剤、シロップ剤、注射剤、点滴剤、散剤、座剤、懸濁剤、軟膏剤等の剤型に製剤化して、当該飼料もしくはペットフードまたは製剤を、魚類繁殖用または家畜もしくはペット発情同期化作用を有する飼料もしくはペットフードまたは製剤にすることができるが、対象となる飼料またはペットフード等の種類は、活性成分であるＰＧＦ２αの生理作用が阻害されないものであれば特に限定されない。
【００３４】
本発明の飼料またはペットフードは、牛、豚、鶏等の家畜・家禽用飼料、甲殻類や魚介類等の養殖用飼料であってもよいし、犬、猫、ハムスター、リス等の愛玩動物用ペットフードであってもよく、特に限定されない。本発明の飼料またはペットフードの形態は特に限定されることはなく、例えばペレットタイプ、クランブルタイプ、フレークタイプ、バルキータイプ、ドライタイプ、ウェットタイプ、セミモイストタイプ、ビスケットタイプ、ソーセージタイプ、ジャーキータイプ、粉末タイプ、顆粒タイプ、カプセルタイプなどが挙げられる。
【００３５】
本発明のマクサ抽出物を医薬用途に使用するとき、当該医薬製剤の形態は特に限定されない。例えば、粉末剤、顆粒剤、錠剤、シロップ剤、注射剤、点滴剤、散剤、座剤、懸濁剤、軟膏剤などが挙げられる。本発明の組成物は、経口で投与してもよく、また静注、筋注、皮下投与、直腸投与、経皮投与等の非経口で投与してもよい。該組成物は、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、着色剤等の添加剤を含んでいても良い。賦形剤としては例えば乳糖、ブドウ糖、コーンスターチ、ソルビット、結晶セルロースなどが、崩壊剤としては例えばデンプン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン末、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、デキストリンなどが、結合剤としては例えばジメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが、滑沢剤としては例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、硬化植物油などがそれぞれ挙げられる。
【００３６】
本発明の医薬製剤は、その剤型に応じて異なるが、通常全製剤中にＰＧＦ２αが乾燥重量として０．０１〜１０ｍｇ程度含まれている。また、ＰＧＦ２αを活性成分として含むマクサ抽出物は、通常全製剤中に０．１〜１０重量％、好ましくは１〜３重量％程度含まれている。
【００３７】
投与量は患者の年齢、体重、性別、疾患の相違、症状の程度などを考慮して、個々の場合に応じて適宜決定され、1日1回又は数回に分けて投与すればよい。例えば、一日当たり、ＰＧＦ２αが乾燥重量として０．０１〜１０ｍｇ、ＰＧＦ２αを活性成分として含むマクサ抽出物は０．１ｇ〜１０ｇ、好ましくは１ｇ〜３ｇ程度摂取すればよい。
【実施例】
【００３８】
以下に実施例を記載して本発明をさらに具体的に説明する。ただし、これらの実施例によって、本発明の範囲は限定的に解釈されることはない。【００３９】
（実施例１）  海藻中のＰＧＦ2α含量測定
各海藻（褐藻類ホンダワラ属ヒジキ、褐藻類ホンダワラ属アカモク、褐藻類ホンダワラ属ノコギリモク、褐藻類ホンダワラ属オオバモク、褐藻類ワカメ属ヒロメ、褐藻類ワカメ属ワカメ、褐藻類カジメ属カジメ、褐藻類カジメ属クロメ、褐藻類トサカノリ属トサカノリ、褐藻類フクロノリ属フクロノリ、褐藻類カゴメノリ属カゴメノリ、褐藻類スジメ属スジメ、褐藻類アラメ属サガラメ、緑藻類アオサ属アナアオサ、紅藻類ムカデノリ属ムカデノリ、紅藻類アマノリ属スサビノリ、紅藻類テングサ属マクサ）から塩分や多糖類などのＰＧＦ２α以外の水溶性画分や水不溶性の不純物を除去する目的で、１５倍量の水を用いて３分間撹拌しながら洗浄を行い、同様の洗浄操作を３回繰り返した後、２５℃の条件下で一晩乾燥させたのち、ＰＧＦ２αを抽出しやすいように粉砕機を用いて粉砕し各海藻の乾燥粉末を作製した。【００４０】
次に、作製した各海藻乾燥粉末の乾燥重量の１５倍量の１００容量％のエタノールを用いて撹拌しながら、２５℃の条件下で一晩抽出した。その後、吸引濾過して不溶物を除去して得られた抽出液を、ロータリーエバポレーターを用いて乾固させることで、脂溶性成分を含む抽出乾固物を得た。この各海藻の抽出乾固物に含まれるＰＧＦ２α量をＰＧＦ２α ＥＬＩＳＡ測定キット（Ｃａｙｍａｎ社製）を用いて測定したところ、表１に示す通り、様々な海藻の中で紅藻類テングサ属マクサにのみＰＧＦ２αが含まれ、しかも実用的に有意な量で含有されていることが分かった。【００４１】
【表１】
2015005301.tif 000003
【００４２】
（実施例２)  脂肪蓄積抑制活性を指標にしたＰＧＦ２αが本来持つ生理作用の確認試験
マウス由来３Ｔ３−Ｌ1前駆脂肪細胞を３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度の条件下で培養した。培養培地は、１０％のウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ；以降ＦＢＳと記載する）を含むＤＭＥＭ培地（和光純薬工業（株）製）を用い、７０〜８０％のコンフルエント状態に達した細胞を、０．２５％トリプシン−１ｍＭＥＤＴＡ−４Ｎａ溶液(和光純薬工業（株）製)を用いて剥がし、培養培地を用いて１０倍に希釈したものを、表面にコラーゲンIが塗布された２４Ｗｅｌｌのプレート（日本ベクトン・ディッキンソン社製）に捲き込み、捲き込んだ２日後に培地交換して更に１日間培養した細胞を試験に用いた。脂肪蓄積抑制活性評価試験では、培養培地に０．５ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン、０．２５ｍＭのデキサメタゾン、１０μｇ／ｍｌのインスリンと実施例１と同様の操作で各海藻から抽出した抽出乾固物（以降被験サンプルと記載する）又はコントロール群には１００容量％のエタノールを添加して２日間培養し、マウス由来３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化誘導を行った。２日後、培養培地に１０μｇ／ｍｌのインスリンと被験サンプルまたはコントロール群には１００容量％のエタノールを添加して培地交換を行った。同様の培地交換操作を、分化誘導を行ってから８日目まで行い、８日間に３Ｔ３−Ｌ1脂肪細胞内に蓄積された中性脂肪を、プライマリーセル社製のリピットアッセイキットを用いて定量した。【００４３】
また、効果の評価に際して、分散分析を行い群間において統計学的に有意な差が認められた場合について、Ｄｕｎｎｅｔｔの方法を用いた多重比較の検定を行った。統計学的に有意な差がある群については、５％の有意水準において有意な差が認められた場合は図表中に記号「＊」を、１％の有意水準において有意な差が認められた場合は図表中に記号「＊＊」を付した。以降全ての実施例において同様の検定を行った。【００４４】
その結果、図１に示す通り、実施例１によって明らかとなったＰＧＦ２αを含有する紅藻類マクサ抽出物を添加した群のみ、ＰＧＦ２αが本来持つ脂肪蓄積抑制活性を示すこと明らかとなり、ＰＧＦ２α含有紅藻類マクサ抽出物中のＰＧＦ２αであってもＰＧＦ２αが本来持つ生理作用を発揮出来ることが明らかとなった。【００４５】
（実施例３）ＰＧＦ２α含有紅藻類マクサ抽出物の細胞生存率測定
実施例２と同様の濃度に希釈したマウス由来３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を９６ウェル培養プレートに０．１ｍｌ/ウェルずつ分注して３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度条件下で一晩培養した。培養上清を除去した後、１ｍｌ/ウェルのＰＢＳで細胞表面を洗浄したのち、実施例1と同様の操作で抽出したＰＧＦ２α含有紅藻類マクサ抽出乾固物を０．７５、７．５、７５μｇ／ｍｌの乾燥重量濃度で添加したＭＴ  Ｂｕｆｆｅｒを１００μｌ/ウェルずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度条件下で４０分間インキュベーションした。また、脂肪蓄積抑制を受けないコントロール群には０．５％のエタノールを含むＭＴ  Ｂｕｆｆｅｒを添加した。４０分のインキュベーション後、ＷＳＴ−１試薬（(株)同仁化学研究所製）を１０μｌ/ウェルずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度条件下で３０分間インキュベーションした。インキュベーション終了後、室温にて１０分間静置したのち４５０ｎｍの吸光度を測定することで細胞生存率を評価した。【００４６】
その結果、図２に示す通り、ＰＧＦ２α含有紅藻類マクサ抽出乾固物を添加したいずれの細胞群においても細胞生存率の低下は認められず、ＰＧＦ２α含有紅藻類マクサ抽出乾固物による脂肪蓄積抑制活性は細胞毒性によるものではなく、ＰＧＦ２αが本来持つ生理作用が発揮されたものであることが明確になった。【００４７】
（実施例４）ＰＧＦ２α抽出時の最適な含水エタノール濃度の選定
紅藻類マクサからＰＧＦ２αを効率的に抽出することの出来る含水エタノール濃度を選定するため、水または２０容量％または４０容量％または６０容量％または８０容量％の含水エタノールまたは１００容量％のエタノールを用いて実施例１と同様の操作により紅藻類マクサの乾燥粉末からＰＧＦ２α画分を抽出して乾固し、ＰＧＦ2α含有紅藻類マクサ抽出物を得た。この各抽出物について、実施例２と同様にして脂肪蓄積抑制活性を指標にＰＧＦ2αの本来持つ生理作用を確認した結果、図３に示す通り、水及び２０容量％含水アルコール抽出物には脂肪蓄積抑制活性はまったく認められず、４０容量％〜８０容量％の含水エタノールまたは１００容量％のエタノールを用いて抽出した紅藻類マクサ抽出物のみ脂肪蓄積抑制活性が認められた。【００４８】
更には、６０容量％の含水エタノールを用いて抽出した抽出物に最も強い脂肪蓄積抑制活性が認められた。よって、生理作用を持つＰＧＦ２αを効率的に抽出する抽出方法として、４０容量％〜１００容量％の含水エタノールを用いることが有効であり、更には６０容量％の含水エタノールを用いて抽出する場合が最も効率的にＰＧＦ２αを抽出出来ることが確認され、ＰＧＦ2αを含有した紅藻類マクサの乾燥粉末から、最も効率的にＰＧＦ２αを抽出したＰＧＦ２α含有紅藻類マクサ抽出物を製造した。【００４９】
（実施例５）ＰＧＦ２α含有紅藻類マクサ抽出物中のＰＧＦ２α及び精製ＰＧＦ２α標品の保存安定性確認試験
実施例４と同様の操作で紅藻類マクサから最も効率的にＰＧＦ２αを抽出したＰＧＦ２α含有紅藻類マクサ抽出物または精製ＰＧＦ２α標品（東京化成工業（株）社製）をそのまま２５℃に設定した室内で保存した。保存を開始した日から１、２、３、４、７、１１、１４日後、実施例１と同様の操作で保存したＰＧＦ２α含有紅藻類マクサ抽出物または精製ＰＧＦ２α標品に含まれるＰＧＦ２α量を測定し、保存を開始した日に含まれるＰＧＦ２α量を１００％とした時の、各保存日数経過後に残存しているＰＧＦ２α量を比較した。その結果、図４に示す通り、ＰＧＦ２α含有紅藻類マクサ抽出物中に含まれるＰＧＦ２αは２５℃で１４日間保存しても９０％以上残存しているのに対して、精製ＰＧＦ２α標品をそのままの状態で保存すると、６０％程度まで分解した。つまり、ＰＧＦ２α含有紅藻類マクサ抽出物に含まれるＰＧＦ２αは、精製ＰＧＦ２α標品をそのままの状態で保存するよりも１．５倍も安定していることが分かった。【００５０】
（実施例６）混合物中のＰＧＦ２α含有紅藻類マクサ抽出物中のＰＧＦ２α及び精製ＰＧＦ２α標品の保存安定性確認試験
実施例４と同様の操作で紅藻類マクサから最も効率的にＰＧＦ２αを抽出したＰＧＦ２α含有紅藻類マクサ抽出物を飼料（オリエンタル酵母（株）製）に１％（ｗ／ｗ）添加した混合物、または実施例４と同様の操作で最も効率的にＰＧＦ２αを抽出したＰＧＦ２α含有紅藻類マクサ抽出物１％（ｗ／ｗ）中に含まれるＰＧＦ２α量と同量の精製ＰＧＦ２α標品（東京化成工業（株）社製）をそのまま飼料（オリエンタル酵母（株）製）に１％（ｗ／ｗ）添加した混合物を２５℃に設定した室内で保存した。保存を開始した日から１、３、４、７日後、実施例１と同様の操作で保存したＰＧＦ２α含有紅藻類マクサ抽出物を含む混合物または精製ＰＧＦ２α標品を含む混合物に含まれるＰＧＦ２α量を測定し、保存を開始した日に含まれるＰＧＦ２α量を１００％とした時の、各保存日数経過後に残存しているＰＧＦ２α量を比較した。その結果、図５に示す通り、ＰＧＦ２α含有紅藻類マクサ抽出物を添加した混合物中に含まれるＰＧＦ２αは２５℃で７日間保存しても８０％以上残存しているのに対して、精製ＰＧＦ２α標品をそのまま添加した混合物中のＰＧＦ２αは３０％程度まで分解してしまった。つまり、ＰＧＦ２α含有紅藻類マクサ抽出物に含まれるＰＧＦ２αは混合物に添加した状態においても、精製ＰＧＦ２α標品をそのまま混合物に添加した状態よりも３倍以上安定していることが分かった。【００５１】
（実施例７）  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを用いた高脂肪食負荷試験
1週間の馴化を行った４週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスに高脂肪食飼料（オリエンタル酵母(株)製）を９週間自由摂取させた（以降コントロール群と記載する）。あるいは高脂肪食飼料に実施例４と同様の操作で最も効率的にＰＧＦ２αを抽出したＰＧＦ２α含有紅藻類マクサ抽出物を１％(ｗ／ｗ)添加した飼料を９週間自由摂取させた（以降ＰＧＦ２α含有マクサ抽出物摂取群と記載する）。あるいは高脂肪食飼料に実施例４と同様の操作で最も効率的にＰＧＦ２αを抽出したＰＧＦ２α含有紅藻類マクサ抽出物１％（ｗ／ｗ）中に含まれるＰＧＦ２α量と同量の精製ＰＧＦ２α標品を添加した飼料を９週間自由摂取させた（以降精製ＰＧＦ２α標品摂取群と記載する）。各群とも1週間毎に給餌を行い、同時に給餌量、残餌量、体重を測定した。９週間の自由摂取の後、解剖を行い、睾丸周りの内臓脂肪を採取し重量を測定した。【００５２】
その結果、図６に示す通り、ＰＧＦ２α含有紅藻類マクサ抽出物摂取群は、コントロール群または精製ＰＧＦ２α標品摂取群に比べて、試験を実施した９週間の期間中ずっと、継続して体重増加が抑えられており、ＰＧＦ２αの本来持つ生理作用がしっかりと発揮されていることが分かった。一方で、精製ＰＧＦ２α標品摂取群は、試験を開始してから９週間後になってようやく体重増加の抑制が確認され、実施例６で明らかになった通り、精製ＰＧＦ２α標品をそのままの状態で飼料に添加しても安定に存在できずに分解してしまうため、ＰＧＦ２αの本来持つ生理作用を効果的に発揮することが出来ないことが分かった。更に、図７に示す通り、ＰＧＦ２α含有紅藻類マクサ抽出物摂取群は試験を実施した９週間後の睾丸周りの内臓脂肪の蓄積が抑制され、ＰＧＦ２αの本来持つ生理作用をしっかりと発揮していることが確認されたが、一方で、精製ＰＧＦ２α標品摂取群はコントロール群と比べて睾丸周りの内臓脂肪の蓄積量に変化はなく、やはり精製ＰＧＦ２α標品をそのままの状態で飼料に添加しても安定に存在出来ずに分解してしまうため、ＰＧＦ２αの本来持つ生理作用をうまく発揮することが出来ないことが確かめられた。つまり、生体内において、精製ＰＧＦ２α標品をそのまま摂取するよりも、安定して存在しているＰＧＦ２αを含有する紅藻類マクサ抽出物を摂取した方が、ＰＧＦ２αが本来持つ脂肪蓄積抑制活性などの生理作用を効果的に発揮出来ることが明確となった。
【図１】
2015005301.tif 000004
【図２】
2015005301.tif 000005
【図３】
2015005301.tif 000006
【図４】
2015005301.tif 000007
【図５】
2015005301.tif 000008
【図６】
2015005301.tif 000009
【図７】
2015005301.tif 000010
【国際調査報告】
2015005301.tif 000011
2015005301.tif 000012
2015005301.tif 000013
2015005301.tif 000014