(57)【要約】  本発明は１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを有効成分として含有する抗癌剤、癌細胞死誘導剤、プロテインホスファターゼ２Ａ活性化増強剤、及びプロテインチロシンホスファターゼ１Ｂ活性化増強剤等を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを有効成分として含有する抗癌剤。
【請求項２】
治療対象となる癌が、神経膠芽腫、髄芽腫、舌癌、咽頭癌、喉頭癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、膵臓癌、腎臓癌、副腎癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、乳癌、甲状腺癌、肺癌、悪性胸膜中皮腫、皮膚癌、悪性黒色腫、悪性骨腫瘍、軟部肉腫、悪性リンパ腫、白血病、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の抗癌剤。
【請求項３】
１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを有効成分として含有する癌細胞死誘導剤。
【請求項４】
癌細胞が、神経膠芽腫、髄芽腫、舌癌、咽頭癌、喉頭癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、膵臓癌、腎臓癌、副腎癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、乳癌、甲状腺癌、肺癌、悪性胸膜中皮腫、皮膚癌、悪性黒色腫、悪性骨腫瘍、軟部肉腫、悪性リンパ腫、白血病、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される少なくとも１種の癌の細胞である、請求項３記載の剤。
【請求項５】
１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを有効成分として含有する、プロテインホスファターゼ２Ａ活性化増強剤。
【請求項６】
１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを有効成分として含有する、プロテインチロシンホスファターゼ１Ｂ活性化増強剤。
【請求項７】
抗癌剤である、請求項５又は６記載の剤。
【請求項８】
研究用試薬である、請求項５又は６記載の剤。
【請求項９】
有効量の１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを、それを必要とする対象に投与することを含む、癌の予防及び／又は治療方法。
【請求項１０】
癌が、神経膠芽腫、髄芽腫、舌癌、咽頭癌、喉頭癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、膵臓癌、腎臓癌、副腎癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、乳癌、甲状腺癌、肺癌、悪性胸膜中皮腫、皮膚癌、悪性黒色腫、悪性骨腫瘍、軟部肉腫、悪性リンパ腫、白血病、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンで癌細胞を処理することを特徴とする、癌細胞の細胞死を誘導する方法。
【請求項１２】
癌細胞が、神経膠芽腫、髄芽腫、舌癌、咽頭癌、喉頭癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、膵臓癌、腎臓癌、副腎癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、乳癌、甲状腺癌、肺癌、悪性胸膜中皮腫、皮膚癌、悪性黒色腫、悪性骨腫瘍、軟部肉腫、悪性リンパ腫、白血病、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される少なくとも１種の癌の細胞である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
癌の予防及び／又は治療に使用する１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン。
【請求項１４】
癌が、神経膠芽腫、髄芽腫、舌癌、咽頭癌、喉頭癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、膵臓癌、腎臓癌、副腎癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、乳癌、甲状腺癌、肺癌、悪性胸膜中皮腫、皮膚癌、悪性黒色腫、悪性骨腫瘍、軟部肉腫、悪性リンパ腫、白血病、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１３記載の１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌細胞増殖抑制作用を有するリン脂質化合物、特にジアシルホスファチジルエタノールアミンを有効成分として含有する抗癌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在癌は死亡原因のトップを占める疾病であり、その根本的な治療方法が求められている。そのため、ブレオマイシン、シスプラチン、ネオカルチノスタチン等の多くの抗癌剤が開発されてきた。しかしながら、これらの抗癌剤は毒性が高い上に癌への配向性が低いため、充分な抗癌効果を得ることができなかった。このことから、これら抗癌剤をより多く癌に配向せしめる試みが各種為されており、その一貫として抗癌剤をリポソーム内部に包含させて投与するリポソーム製剤が開発されている。リポソーム製剤とはリン脂質によって形成される二重膜構造からなる粒子の内部に薬物を内包せしめた製剤であり、癌細胞への標的化については詳細な解析が為されつつある。【０００３】
リン脂質は、生体膜系を構成する主要な脂質で、グリセロール骨格を持つグリセロリン脂質と、スフィンゴシン骨格を持つスフィンゴリン脂質とに分類される。さらにグリセロリン脂質は親水性部分の種類によりホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ホスファチジン酸等のリン脂質クラスに分類される。【０００４】
リン脂質の機能としては、細胞や細胞小器官を区分けする膜構成成分としての役割の他に、ホスホリパーゼＣによる細胞内情報伝達経路や蛋白質の膜へのアンカーとしての役割が知られているイノシトールリン脂質、血液凝固系蛋白質やプロテインキナーゼＣ等の活性調節を行なっているホスファチジルセリン、プロテインキナーゼＣの活性調節や細胞のアポトーシスに関与するスフィンゴミエリン経路、炎症性メディエーターであるアラキドン酸の保持やホスホリパーゼＤによる情報伝達経路に関与するホスファチジルコリン経路、血小板活性化、血管透過性、白血球遊走活性を持つアルキルエーテルリン脂質である血小板活性化因子等が報告され、そのクラスによって提供される機能は種々多様である。【０００５】
例えば１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンや１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンが、スコポラミンによって誘導された空間学習障害及び記憶障害、あるいは軽度の認知障害や痴呆を改善することが報告されている（非特許文献１、２）。【０００６】
また、ホスファチジルエタノールアミンは、生体膜の主要成分の１つであるリン脂質であり、ホスファチジルセリン等とともに健康食品として市販されているが、ホスファチジルエタノールアミンの中でも、特にジリノレオイル・ホスファチジルエタノールアミン（脂肪酸として２つのリノール酸を含む）が、細胞死誘導抑制活性、特に小胞体ストレス抑制活性を有すること、当該活性により、ジリノレオイル・ホスファチジルエタノールアミンが医薬用途、特に神経変性疾患の予防および／または治療のために使用され得ることが報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−２４７７２８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Yaguchi T, Nagata T, Nishizaki T. Dilinoleoylphosphatidylcholine ameliorates scopolamine-induced impairment of spatial learning and memory by targeting alpha-7 nicotinic ACh receptors. Life Sci 2009;84:263-6
【非特許文献２】Yaguchi T, Nagata T, Nishizaki T. 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine improves cognitive decline by enhancing long-term depression. Behav Brain Res 2009;204:129-32
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、新規な作用機序を有する抗癌剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、ホスファチジルエタノールアミンが優れたプロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）活性化増強作用、プロテインチロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）活性化増強作用を有することを見出した。さらに脂肪酸としてパルミチン酸を有するホスファチジルエタノールアミンの優れた抗癌作用を確認して本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、以下の通りである。
［１］１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを有効成分として含有する抗癌剤。
［２］治療対象となる癌が、神経膠芽腫、髄芽腫、舌癌、咽頭癌、喉頭癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、膵臓癌、腎臓癌、副腎癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、乳癌、甲状腺癌、肺癌、悪性胸膜中皮腫、皮膚癌、悪性黒色腫、悪性骨腫瘍、軟部肉腫、悪性リンパ腫、白血病、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される少なくとも１種である、上記［１］記載の抗癌剤。
［２−１］治療対象となる癌が、肺癌、悪性胸膜中皮腫、胃癌、大腸癌及び乳癌からなる群から選択される少なくとも１種である、上記［１］記載の抗癌剤。
［３］１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを有効成分として含有する癌細胞死誘導剤。
［４］癌細胞が、神経膠芽腫、髄芽腫、舌癌、咽頭癌、喉頭癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、膵臓癌、腎臓癌、副腎癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、乳癌、甲状腺癌、肺癌、悪性胸膜中皮腫、皮膚癌、悪性黒色腫、悪性骨腫瘍、軟部肉腫、悪性リンパ腫、白血病、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される少なくとも１種の癌の細胞である、上記［３］記載の剤。
［４−１］癌細胞が、肺癌、悪性胸膜中皮腫、胃癌、大腸癌及び乳癌からなる群から選択される少なくとも１種の癌の細胞である、上記［３］記載の剤。
［５］１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを有効成分として含有する、プロテインホスファターゼ２Ａ活性化増強剤。
［６］１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを有効成分として含有する、プロテインチロシンホスファターゼ１Ｂ活性化増強剤。
［７］抗癌剤である、上記［５］又は［６］記載の剤。
［８］研究用試薬である、上記［５］又は［６］記載の剤。
［９］有効量の１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを、それを必要とする対象に投与することを含む、癌の予防及び／又は治療方法。
［１０］癌が、神経膠芽腫、髄芽腫、舌癌、咽頭癌、喉頭癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、膵臓癌、腎臓癌、副腎癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、乳癌、甲状腺癌、肺癌、悪性胸膜中皮腫、皮膚癌、悪性黒色腫、悪性骨腫瘍、軟部肉腫、悪性リンパ腫、白血病、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される少なくとも１種である、上記［９］記載の方法。
［１０−１］癌が、肺癌、悪性胸膜中皮腫、胃癌、大腸癌及び乳癌からなる群から選択される少なくとも１種である、上記［１０］記載の方法。
［１１］１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンで癌細胞を処理することを特徴とする、癌細胞の細胞死を誘導する方法。
［１２］癌細胞が、神経膠芽腫、髄芽腫、舌癌、咽頭癌、喉頭癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、膵臓癌、腎臓癌、副腎癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、乳癌、甲状腺癌、肺癌、悪性胸膜中皮腫、皮膚癌、悪性黒色腫、悪性骨腫瘍、軟部肉腫、悪性リンパ腫、白血病、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される少なくとも１種の癌の細胞である、上記［１１］記載の方法。
［１２−１］癌細胞が、肺癌、悪性胸膜中皮腫、胃癌、大腸癌及び乳癌からなる群から選択される少なくとも１種の癌の細胞である、上記［１１］記載の方法。
［１３］癌の予防及び／又は治療に使用する１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン。
［１４］癌が、神経膠芽腫、髄芽腫、舌癌、咽頭癌、喉頭癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、膵臓癌、腎臓癌、副腎癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、乳癌、甲状腺癌、肺癌、悪性胸膜中皮腫、皮膚癌、悪性黒色腫、悪性骨腫瘍、軟部肉腫、悪性リンパ腫、白血病、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される少なくとも１種である、上記［１３］記載の１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン。
［１４−１］癌が、肺癌、悪性胸膜中皮腫、胃癌、大腸癌及び乳癌からなる群から選択される少なくとも１種である、上記［１３］記載の１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン。
【発明の効果】
【００１１】
ホスファチジルエタノールアミン、特に構成脂肪酸としてパルミチン酸を有するホスファチジルエタノールアミンは、優れた癌細胞死誘導作用を有する。また、ホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質化合物は本来生体に存在するものである。従って、本願発明は、より安全性に優れた抗癌剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、各種ホスファチジルエタノールアミンのプロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）及びプロテインチロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）の活性に及ぼす影響を示したグラフである。ＡはＰＰ２Ａの結果を、ＢはＰＴＰ１Ｂの結果を示す。縦軸は各ホスファターゼの活性を示す。DAPE: 1,2-diarachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DLPE: 1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DOPE: 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DPPE: 1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, Oka A: okadaic acid。グラフ中、各値は薬物処理していないコントロールのベースとなるホスファターゼ活性に対するパーセンテージの平均値（±SEM）を表している（各実験においてｎ＝４）。***P<0.0001（コントロールに対して），Dunnett's test.
【図２】図２は、細胞増殖におけるＰＰ２Ａ及びＰＴＰ１Ｂの作用部位を模式的に示したスキームである。RTK: receptor tyrosine kinase, MAPK: mitogen-activated protein kinase, MAPKK: mitogen-activated protein kinase kinase, MAPKKK: mitogen-activated protein kinase kinase kinase, GDP: guanosine diphosphate, GTP: guanosine triphosphate
【図３】図３は、１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）が濃度依存的にヒト悪性胸膜中皮腫細胞死を誘導することを示したグラフである。Ａはヒト非悪性中皮腫細胞であるMet5Aの結果を、Ｂはヒト悪性中皮腫細胞であるNCI-H28の結果を示す。○は24時間処理した結果を、●は48時間処理した結果をそれぞれ示す。縦軸は細胞の生存度を示し、横軸はＤＰＰＥの濃度を示す。グラフ中、各ポイントはＤＰＰＥ処理していない細胞のＭＴＴ強度に対するパーセンテージの平均値（±SEM）を表している（各実験においてｎ＝４）。
【図４】図４は、ＤＰＰＥがヒト悪性胸膜中皮腫細胞のアポトーシスを誘導することを示したグラフである。縦軸は全細胞におけるTUNEL染色された細胞の割合を示し、横軸はＤＰＰＥの濃度を示す。グラフ中、各カラムは全細胞におけるTUNEL染色された細胞のパーセンテージの平均値（±SEM）を表している（各実験においてｎ＝４）。P値はDunnett's testにより決定した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は有効成分としてホスファチジルエタノールアミンを用いる。本発明で有効成分として用いるホスファチジルエタノールアミンのうち、好ましくは１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）であり、該ホスファチジルエタノールアミンを有効成分として含有する抗癌剤を提供する。ＤＰＰＥは、ジパルミトレオイル・ホスファチジルエタノールアミンともいう。
【００１４】
リン脂質は、大別するとグリセリンを骨格とするグリセロリン脂質とスフィンゴシンを骨格とするスフィンゴリン脂質の２つが存在する。グリセリンやスフィンゴシンを中心骨格として２つの脂肪酸とリン酸が結合し、さらにリン酸にアルコールがエステル結合した構造を有する。ＤＰＰＥはグリセロリン脂質であり、中心骨格となるグリセリンに結合する２つの脂肪酸がパルミチン酸であり、リン酸にエステル結合するアルコールがエタノールアミンであるものをいう。
【００１５】
ＤＰＰＥは、不斉炭素原子や二重結合に起因する１以上の立体異性体（例えば、光学異性体、幾何異性体）を含んでいてもよいことに注意されるべきであり、このような異性体及びそれらの混合物の全てが本発明の範囲に含まれる。
【００１６】
ＤＰＰＥは、通常のホスファチジルエタノールアミンの合成方法に準じて製造することができる。又、ＤＰＰＥは商業的に入手可能であり、簡便に用いることができる点で好ましい。
【００１７】
ＤＰＰＥはまた、その塩として用いられてもよい。かかる塩は、特に限定されないが、医薬又は食品として許容され得る塩が好ましく、例えば無機塩基（例、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属；カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属；アルミニウム、アンモニウム）、有機塩基（例、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン）、無機酸（例、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸）、有機酸（例、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸）、塩基性アミノ酸（例、アルギニン、リジン、オルニチン）又は酸性アミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）との塩などが挙げられる。
【００１８】
ＤＰＰＥは、実施例にてデータで示されるように、（１）プロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）活性化増強作用、及び（２）プロテインチロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）活性化増強作用を有する。これらの優れた薬理作用により、癌細胞の増殖抑制作用を誘導し、抗癌剤等の医薬品として提供され得る。図２に、細胞増殖経路におけるＰＰ２Ａ及びＰＴＰ１Ｂの作用点を示す。ＰＰ２Ａ活性化を増強する、及び／又はＰＴＰ１Ｂ活性化を増強することで、各段階において、より下流にある因子がリン酸化によって活性化されるのを阻害することができ、それにより癌細胞の増殖が抑制される。
【００１９】
本発明において明らかになったＤＰＰＥの薬理作用としては以下のものが挙げられる。
（１）ＰＰ２Ａ活性化増強作用
プロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）は、セリン／スレオニンホスファターゼの１種であり、細胞周期、増殖、分化などの細胞内プロセシングに関わる生体内シグナル伝達に重要な役割を果たしている。
ＰＰ２ＡはＡｋｔ、ＭＥＫ、ＥＲＫ以外にｐ５３、ｃ−Ｍｙｃ、ｂ−Ｃａｔｅｎｉｎを脱リン酸化する作用があり、細胞増殖、シグナルトランスダクション、アポトーシス調節因子としても働くことが知られている。
参考文献：P. Seshacharyulu P et al., Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer. Cancer Lett 2013;335:9-18.
従って、ＰＰ２Ａ活性化増強剤は種々の医薬用途への可能性を有している。
（２）ＰＴＰ１Ｂ活性化増強作用
プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）１Ｂは、細胞質型のチロシンホスファターゼであり、チロシンキナーゼのリン酸化状態をコントロールすることによって、チロシンキナーゼの調整に関与している。
ＰＴＰ１Ｂは細胞増殖、分化、アポトーシス、細胞移動（ケモタキシス）を調節する働きを有することが知られている。
参考文献：Haj FG et al., Regulation of receptor tyrosine kinase signaling by protein tyrosine phosphatase-1B. J Biol Chem 2003;278:739-744.
従って、ＰＴＰ１Ｂ活性化増強剤は種々の医薬用途への可能性を有している。
【００２０】
さらに、ＤＰＰＥは、実施例にてデータで示されるように、癌細胞に対し細胞死を誘導し細胞増殖を抑制する作用を有する。かかる薬理作用は、ＤＰＰＥが、癌細胞死誘導剤（以下、単に本発明の剤と称する場合がある）として有用であり、また、抗癌剤（以下、本発明の医薬とも称する）や癌の予防・治療薬の開発に有用なツールとなり得る研究用試薬としても有用であることを示唆している。
また、ＤＰＰＥのかかる薬理作用により、本発明は、癌細胞の細胞死を誘導する方法、並びに癌の予防及び／又は治療方法（以下、単に本発明の方法とも称する）を提供することができる。
【００２１】
本明細書中で用いられる場合、被験体（対象）は哺乳動物であり得る。このような哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル、チンパンジー）、げっ歯類（例、マウス、ラット、モルモット）、ペット（例、イヌ、ネコ、ウサギ）、使役動物又は家畜（例、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ）が挙げられるが、ヒトが好ましい。
【００２２】
本発明の剤や医薬、方法が適用される癌（癌細胞）は、特に制限はなく、具体的には、神経膠芽腫、髄芽腫、舌癌、咽頭癌、喉頭癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、膵臓癌、腎臓癌、副腎癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、乳癌、甲状腺癌、肺癌、悪性胸膜中皮腫、皮膚癌、悪性黒色腫、悪性骨腫瘍、軟部肉腫、悪性リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫などが挙げられ、好ましくは悪性胸膜中皮腫、肺癌、胃癌、大腸癌及び乳癌に適用される。
【００２３】
同様に、本明細書中で用いられる場合、ＤＰＰＥで処理する対象となる癌細胞は、上記本発明の医薬等が適用される各種癌細胞であり、具体的には、神経膠芽腫、髄芽腫、舌癌、咽頭癌、喉頭癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、膵臓癌、腎臓癌、副腎癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、乳癌、甲状腺癌、肺癌、悪性胸膜中皮腫、皮膚癌、悪性黒色腫、悪性骨腫瘍、軟部肉腫、悪性リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫などが挙げられ、好ましくは悪性胸膜中皮腫、肺癌、胃癌、大腸癌及び乳癌の細胞である。
ここで「処理」とは、上記細胞とＤＰＰＥとを必要十分な時間接触させることであり、その時間は所望される効果や用いる細胞の種類によっても異なるが、通常０．５〜７６時間、好ましくは０．５〜４８時間程度である。又、より短い時間、例えば０．５〜２４時間、好ましくは０．５〜１２時間程度の処理であってもよい。簡便には、ＤＰＰＥを含有する培養液中で培養することによって実施される。
【００２４】
本発明の医薬は、投与対象の癌の種類、その重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、経口もしくは非経口のルートにより、通常、成人１日あたりの経口投与の場合で有効成分であるＤＰＰＥの量で０．１〜１０ｇ、好ましくは１〜４ｇが対象に投与され、非経口投与の場合で０．０１ｇ〜１ｇ、好ましくは０．１〜０．４ｇが対象に投与される。
【００２５】
本発明の医薬は、有効成分であるＤＰＰＥ以外に、任意の添加物、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されない。
【００２６】
一つの実施態様において、本発明の医薬は経口投与に好適な製剤として処方され得る。経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、顆粒剤、散剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
【００２７】
別の実施態様において、本発明の医薬は非経口的な投与に好適な製剤として処方され得る。非経口的な投与（例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００２８】
本発明の医薬は、該医薬の単位摂取量又はその分割量が個別に包装又は充填されたもの、あるいは多数の単位摂取量又はその分割量が包括的に包装又は充填されたものであり得る。
【００２９】
単位摂取量又はその分割量が個別に包装又は充填された医薬としては、例えば、単位摂取量又はその分割量を、通常の包装物（例えば、ＰＴＰ（press through packing）シート、紙容器、フィルム（例、プラスチックフィルム）容器、ガラス容器、プラスチック容器）中に別々に包装又は充填したものが挙げられる。このように個別に包装又は充填された医薬は、さらに組み合わされて、１つの容器（例えば、紙容器、フィルム（例、プラスチックフィルム）容器、ガラス容器、プラスチック容器）中に一緒に包装又は充填されていてもよい。多数の単位摂取量又はその分割量が包括的に包装又は充填された医薬としては、例えば、多数の錠剤又はカプセル剤が区分されることなく１つの容器（例えば、紙容器、フィルム（例、プラスチックフィルム）容器、ガラス容器、プラスチック容器）中に包装又は充填されたものが挙げられる。本発明の医薬はまた、単位摂取量又はその分割量を、長期間の摂取に十分な数で含み得るが、例えば食品の場合であれば３日以上、好ましくは７日、１０日、１４日又は２１日以上あるいは１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月以上の摂取に十分な数で含み得る。
【００３０】
本発明の医薬には、必須の有効成分であるＤＰＰＥに加え、１種類以上の他の抗癌剤を含めてもよい。他の抗癌剤としては、例えば、代謝拮抗剤（例、メソトレキセート、５−フルオロウラシル等）、アルキル化剤（例、サイクロフォスファミド、イフォスファミド等）、白金系抗癌剤（例、シスプラチン、カルボプラチン等）、トポイソメラーゼ阻害剤（例、エトポシド等）、抗癌性抗生物質（例、マイトマイシン、アドリアマイシン等）、植物由来抗癌剤（例、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール等）、チロシンキナーゼ阻害剤（例、ゲフィニチブ、イマニチブ等）、ヒト化抗体（例、ハーセプチン等）等が挙げられる。
【００３１】
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【００３２】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制限されるものではない。
【実施例】
【００３３】
実施例１：ＰＰ２Ａ活性化増強作用及びＰＴＰ１Ｂ活性化増強作用
（方法）
１．無細胞条件化でのＰＰ２Ａ及びＰＴＰ１Ｂ活性のアッセイ
無細胞条件下でのＰＰ２Ａ及びＰＴＰ１Ｂの測定は既報（Kanno T et al., Cell Physiol Biochem 2012;30:1014-1022.）に記載された方法に従って行った。ヒトリコンビナントＰＰ２ＡはMillipore (Billerica, MA, USA)から購入した。ヒトＰＴＰ１ＢをＮＨ２末端にＧＳＴタグを有するｐＧＥＸ−６Ｐ−３ベクターにクローニングし、形質転換及び蛋白質発現に適したコンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）中で発現させた。ＧＳＴ融合ＰＴＰ１Ｂをグルタチオンセファロース４Ｂ(GE Healthcare Bio-Science KK, Tokyo, Japan)を用いてアフィニティー精製した。基質としてｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐ−ＮＰＰ）(Sigma, St. Louis, MO, USA)と反応させて各ホスファターゼ活性を測定した。ＰＰ２Ａ（0.2 U/well）又はＰＴＰ１Ｂ（1 mg/well）を反応メディウム中３７℃で３０分間、ホスファターゼインヒビター（オカダ酸；2 nM、バナジン酸ナトリウム；1 μM）、ホスファチジルエタノールアミン（ＤＡＰＥ、ＤＬＰＥ、ＤＯＰＥ、ＤＰＰＥ；100 μM、いずれもAvanti Polar Lipids, Inc.( Alabaster, AL, USA)より入手）存在下及び非存在下でプレインキュベートした。
ＰＰ２Ａ用の反応メディウム：50 mM Tris-HCl, 0.1 mM EGTA, 0.1% (v/v) 2-mercaptoethanol, pH 7.0
ＰＴＰ１Ｂ用の反応メディウム：50 mM HEPES, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol, pH 7.2
次いで、ｐ−ＮＰＰ(ＰＰ２Ａの場合には0.5 mM、ＰＴＰ1Ｂの場合には10 mM)を反応メディウムに添加して60分間インキュベートした。反応は0.1N NaOHを添加することにより停止させた。脱リン酸化されたｐ−ＮＰＰ、即ちｐ−ＮＰをSpectraMax PLUS384 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)を用い４０５ｎｍの吸光度で定量した。【００３４】
（結果）
結果を図１に示す。この結果は、ＤＰＰＥが強力なＰＰ２Ａ活性化増強作用及びＰＴＰ１Ｂ活性化増強作用を有することを示している。ＤＰＰＥのかかる作用は図２の細胞増殖のシグナル経路に照らし合わせると、細胞増殖を抑制することを示唆している。【００３５】
実施例２：癌細胞死誘導作用
（材料と方法）
１．細胞培養
ヒト悪性胸膜中皮腫の細胞株であるＮＣＩ−Ｈ２８及びヒト非悪性中皮腫の細胞株であるＭｅｔ５Ａを用いた。これらの細胞はAmerican Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)から購入した。０．００３％（ｗ／ｖ）Ｌ−グルタミンを添加したRoswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640培地で細胞を培養した。培地には１０％（ｖ／ｖ）の熱非働化したウシ血清、ペニシリン(最終濃度, 100 U/ml)及びストレプトマイシン(最終濃度, 0.1 mg/ml)を添加し、５％ＣＯ２及び９５％空気の湿雰囲気下、３７℃でインキュベートした。【００３６】
２．細胞生存度のアッセイ
細胞生存度は３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を用い、既報（Nogi Y, et al., Cell Physiol Biochem 2012;30: 61-74.）に従って測定した。測定は、ヒト非悪性中皮腫細胞であるＭｅｔ５Ａ及びヒト悪性中皮腫細胞であるＮＣＩ−Ｈ２８を用い、ＤＰＰＥの濃度を0、1μM、10μM及び100μMと変え、24時間あるいは48時間処理にて行った。【００３７】
３．TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling)染色
アポトーシスの指標となるin situ DNA断片化を検出するために、In Situ Apoptosis Detection Kit (Takara Bio; Otsu, Japan)を用いてＴＵＮＥＬ染色を行った。固定し膜透過性にした細胞をターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ及びフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−デオキシウリジントリホスフェートと３７℃で９０分間インキュベートした。ＦＩＴＣシグナルを共焦点レーザー顕微鏡(LSM 510; Carl Zeiss Co., Ltd., Oberkochen, Germany)で可視化した。
細胞は、ヒト非悪性中皮腫細胞であるＭｅｔ５Ａ及びヒト悪性中皮腫細胞であるＮＣＩ−Ｈ２８を用い、ＤＰＰＥの濃度を0、30μM及び100μMと変え、48時間処理したものを用いた。【００３８】
（結果）
細胞生存度のアッセイ結果を図３に、ＴＵＮＥＬ染色の結果を図４に示す。図３の結果より、ＤＰＰＥが非悪性中皮腫細胞に対してはほとんど影響がないが、悪性中皮腫細胞に対しては濃度依存性細胞死を誘導することがわかる。さらに図４の結果よりＤＰＰＥが悪性中皮腫細胞のアポトーシスは誘導するが非悪性中皮腫細胞においてはアポトーシスを誘導しないことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
ＤＰＰＥは強力なＰＰ２Ａ活性化増強作用及びＰＴＰ１Ｂ活性化増強作用を有し、さらに優れた癌細胞死誘導作用を有することから抗癌剤としての用途が期待できる。また、リン脂質化合物は本来生体に存在するものであることから、本願発明は、より安全性に優れた抗癌剤を提供することができる。【００４０】
本出願は、日本で出願された特願２０１３−２６４７１４（出願日２０１３年１２月２１日）を基礎としておりその内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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