(57)【要約】配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質の６１番目のアルギニンが、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、スレオニン、プロリン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン及びアスパラギン酸からなる群から選ばれるアミノ酸へ置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質；試料中の糖化ヘモグロビンにプロテアーゼを反応させて糖化ヘキサペプチドを生成させ、生成された糖化ヘキサペプチドに前記蛋白質を反応させ、該反応により生成された物質又は消費された物質を測定することを特徴とする、試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質の６１番目のアルギニンが、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、スレオニン、プロリン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン及びアスパラギン酸からなる群から選ばれるアミノ酸へ置換されたアミノ酸配列からなる、蛋白質。
【請求項２】
請求項１に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、６１番目のアミノ酸以外の1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を有する、蛋白質。
【請求項３】
請求項１に記載の蛋白質のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を有する、蛋白質。
【請求項４】
請求項１に記載の蛋白質のアミノ酸残基が下記の（１）〜（１５）から選ばれる少なくとも１つの変異により改変された、蛋白質。
（１）６３番目のアルギニンが、グリシン、プロリン及びアラニンからなる群から選ばれるアミノ酸へ置換された変異
（２）６２番目のロイシンがグリシンへ置換された変異
（３）９３番目のグルタミンがグルタミン酸へ置換された変異
（４）２６７番目のフェニルアラニンがチロシンへ置換された変異
（５）７１番目のチロシンがセリン又はシステインに置換された変異
（６）１１５番目のアスパラギン酸が、アスパラギン及びアルギニンからなる群から選ばれるアミノ酸へ置換された変異
（７）１０８番目のメチオニンがリジン及びアルギニンからなる群から選ばれるアミノ酸へ置換された変異
（８）７５番目のロイシンがアラニン及びフェニルアラニンからなる群から選ばれるアミノ酸へ置換された変異
（９）３４番目のセリンがスレオニンへ置換された変異
（１０）５２番目のチロシンがヒスチジンへ置換された変異
（１１）５７番目のイソロイシンがバリンへ置換された変異
（１２）６６番目のプロリンがヒスチジンへ置換された変異
（１３）９５番目のアスパラギン酸がグルタミン酸へ置換された変異
（１４）１０５番目のリジンがアルギニンへ置換された変異
（１５）３５５番目のアラニンがセリンへ置換された変異
【請求項５】
請求項４に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、３４番目、５２番目、５７番目、６１番目、６２番目、６３番目、６６番目、７１番目、７５番目、９３番目、９５番目、１０５番目、１０８番目、１１５番目、２６７番目、３５５番目のアミノ酸以外の少なくとも１つのアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を有する、蛋白質。
【請求項６】
配列番号３〜３７のいずれかで表わされるアミノ酸配列からなる、蛋白質。
【請求項７】
配列番号３〜３７のいずれかで表わされるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を有する、蛋白質。
【請求項８】
配列番号６〜３７のいずれかで表わされるアミノ酸配列からなる、蛋白質。
【請求項９】
配列番号６〜３７のいずれかで表わされるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ糖化ヘモグロビンを直接酸化する活性を有する、蛋白質。
【請求項１０】
糖化ヘモグロビンがヘモグロビンＡ１ｃである、請求項９に記載の蛋白質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の蛋白質をコードするDNA。
【請求項１２】
配列番号４１〜７５のいずれかで表わされる塩基配列からなる、DNA。
【請求項１３】
請求項６に記載の蛋白質をコードする塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質をコードする、DNA。
【請求項１４】
配列番号４１〜７５のいずれかで表わされる塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質をコードする、DNA。
【請求項１５】
配列番号４４〜７５のいずれかで表わされる塩基配列からなる、DNA。
【請求項１６】
請求項８に記載の蛋白質をコードする塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖化ヘモグロビンを直接酸化する活性を有する蛋白質をコードする、DNA。
【請求項１７】
配列番号４４〜７５のいずれかで表わされる塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖化ヘモグロビンを直接酸化する活性を有する蛋白質をコードする、DNA。
【請求項１８】
糖化ヘモグロビンがヘモグロビンＡ１ｃである、請求項１６又は１７に記載のDNA。
【請求項１９】
請求項１１〜１８のいずれかに記載のDNAを含有する組換えDNA。
【請求項２０】
請求項１９に記載の組換えDNAを有する形質転換体。
【請求項２１】
請求項２０に記載の形質転換体を培養し、培養物中に請求項１〜１０のいずれかに記載の蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する、請求項１〜１０のいずれかに記載の蛋白質の製造方法。
【請求項２２】
試料中の糖化ヘモグロビンをプロテアーゼと反応させて糖化ヘキサペプチドを生成させ、生成された糖化ヘキサペプチドに請求項１〜１０のいずれかに記載の蛋白質を反応させ、該反応により生成された物質又は消費された物質を測定することを特徴とする、試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。
【請求項２３】
試料中の糖化ヘモグロビンを請求項８〜１０のいずれかに記載の蛋白質と反応させ、該反応により生成された物質又は消費された物質を測定することを特徴とする、試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。
【請求項２４】
糖化ヘモグロビンがヘモグロビンＡ１ｃである、請求項２２又は２３に記載の測定方法。
【請求項２５】
前記反応により生成された物質が過酸化水素である、請求項２２〜２４のいずれかに記載の測定方法。
【請求項２６】
プロテアーゼ、及び、請求項１〜１０のいずれかに記載の蛋白質を含む、糖化ヘモグロビン測定用試薬。
【請求項２７】
請求項８〜１０のいずれかに記載の蛋白質を含む、糖化ヘモグロビン測定用試薬。
【請求項２８】
過酸化水素測定用試薬をさらに含む、請求項２６又は２７に記載の試薬。
【請求項２９】
糖化ヘモグロビンがヘモグロビンＡ１ｃである、請求項２６〜２８のいずれかに記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするDNA、該蛋白質の製造方法、該蛋白質を用いる糖化ヘモグロビンの測定方法、及び、糖化ヘモグロビン測定用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖化蛋白質は、生体内の血液等の体液や毛髪等の生体試料中に含まれている。血液中に存在する糖化蛋白質の濃度は、血清中に溶解しているグルコース等の糖類の濃度に依存しており、臨床診断分野において、血液中の糖化蛋白質であるヘモグロビンA1c（以下HbA1c、非特許文献１）の濃度の測定が、糖尿病の診断やモニタリングに用いられている。ヘモグロビンは、α鎖及びβ鎖の２種類のサブユニットを各々２つ持つ、分子量６４，０００のヘム蛋白質である。HbA1cは特にβ鎖のＮ末端バリン残基が糖化されたものと定義されている。このHbA1cを測定する方法としては、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いる機器分析的方法（非特許文献２）、抗原抗体反応を用いる免疫測定法（例えば、非特許文献３）等が知られていたが、近年、酵素的測定法が開発されており、例えば、プロテアーゼと糖化ペプチドオキシダーゼとを用いる方法（特許文献１）が開発されている。酵素的測定法は、汎用性のある自動分析装置への適用が可能であり、また、操作も簡便なことから開発が盛んになっている。【０００３】
酵素的測定法で用いられる糖化ペプチドオキシダーゼは、グルコースのヘミアセタールとペプチドのＮ末端のアミノ基とが反応して生成されるグルコシルアミンがアマドリ転位して生成されるケトース誘導体におけるＣ−Ｎ結合を、酸素分子の存在下で酸化的に開裂し、糖オソン（α−ケトアルデヒド体）、ペプチド及び過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素である。【０００４】
酵素的測定法の場合、まずHbA1cをプロテアーゼで分解し、ヘモグロビンのβ鎖のＮ末端からα-糖化バリルヒスチジン(以下、α−FVHと記す)を生成させる。次に、生成されたα−FVHに糖化ペプチドオキシダーゼを作用させ、生成された過酸化水素によりパーオキシダーゼの存在下でキノン系色素を生成させ、その生成量を分光光度計で比色定量する方法が知られている（特許文献１）。【０００５】
しかしながら、プロテアーゼ処理によりリジンのε−アミノ基に糖が結合したε−糖化リジン(以下、ε-FKと記す)およびそれを含有する糖化ペプチドが副生し、糖化ペプチドオキシダーゼがそれらに作用すると、実際のHbA1c値よりも高い測定値となる危険性が指摘されている（特許文献２）。【０００６】
糖化ペプチドオキシダーゼは、細菌、真菌、植物から見出されている。例えば、アカエトミエラ属、カエトミウム属（特許文献３）、カーブラリア属（特許文献２）、バラ科、ブドウ科、セリ科（特許文献５）等由来の糖化ペプチドオキシダーゼが知られている。
しかしながら、これまでに報告されている糖化ペプチドオキシダーゼは、
(1)α−糖化アミノ酸（例えば、α−糖化バリン、以下α-FVと記す）に比べて、HbA1c由来のα−糖化ジペプチドであるα−糖化バリルヒスチジン（以下、α−FVHと記す）に対する活性は、必ずしも高くないこと、
(2)上述のように、Ｎ末端のα−糖化ジペプチド以外にも、ε−FKにも作用し、HbA1c測定における実測値を増加させること、
(3)酵素を用いる測定法の場合、測定時や保存時において酵素が不安定となること、
等の欠点があった。【０００７】
これらの欠点を克服するため、糖化ペプチドオキシダーゼに人為的に変異を導入することにより、ε-FKに対する反応性が低下した酵素（特許文献４）や、耐熱性が増加した酵素（非特許文献４）等が報告されている。さらに、上記(1)〜(3)の欠点を同時に克服した酵素も報告されている（特許文献6）。【０００８】
従来、IFCC(International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine)により定められたHbA1c測定法として、HbA1cβ鎖をＧｌｕ−Ｃプロテアーゼにより消化することによって糖化Ｎ末端アミノ酸を含む６アミノ酸からなるペプチド断片［α−糖化ヘキサペプチド：Fru-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu（以下、α-F6Pと記す）］を遊離させ、これをHPLC-CE（HPLC−キャピラリー電気泳動法）又はHPLC-MS（HPLC−質量分析法）を用いて測定することによりHbA1c濃度を決定する方法が知られている（非特許文献５）。この方法は特異性に優れた実用基準法として現在も広く用いられているが、検出時に特殊な装置を必要とし、煩雑な操作を必要とするという課題を有している。【０００９】
HbA1c測定における上述の実用基準法（HPLC-CE又はHPLC-MSによる）及び酵素的測定法を比較すると、前者は糖化ヘキサペプチドを測定対象としているのに対し、後者は主として糖化ジペプチドを測定対象としている。これは公知のほとんどの糖化ペプチドオキシダーゼが比較的短い糖化ペプチドに高い反応性を有することに起因する。HbA1cに由来する糖化ヘキサペプチドであるα-F6Pを測定し、それによりHbA1cを測定するという実用基準法と同じ原理に基づく酵素的測定法の開発は、両者の相関性をより高めるという観点からも産業上非常に有意義であると考えられる。【００１０】
HbA1cのβ鎖Ｎ末端に相当する糖化ヘキサペプチドα-F6Pに作用する糖化ヘキサペプチドオキシダーゼとしては、ショウガ科植物由来の糖化ペプチドオキシダーゼ（特許文献7）、バラ科、ブドウ科、セリ科植物由来の糖化ペプチドオキシダーゼ（特許文献5）や、微生物由来の糖化ペプチドオキシダーゼ（特許文献8）、2種類の微生物由来糖化ペプチドオキシダーゼ配列からなるキメラ酵素(非特許文献6)が知られているが、糖化ヘキサペプチドとの反応において長時間を要する、或いは、糖化ヘキサペプチドとの反応性が十分とは言えない等の問題がある。【００１１】
さらに、従来の糖化ペプチドオキシダーゼは上記の通り、６アミノ酸からなるペプチドまでしか作用できず、それよりも長いペプチド鎖や糖化ヘモグロビンに対してオキシダーゼ活性を有する酵素は知られていない。そのため、酵素的測定方法を用いて糖化ヘモグロビンを測定するに当っては、上記の通りプロテアーゼによりペプチド断片を遊離させた後に糖化ペプチドオキシダーゼを作用させなければならないが、自動分析装置等により糖化ヘモグロビンの測定以外の測定を同時に行う場合は、糖化ヘモグロビン測定試薬中のプロテアーゼが他試薬に作用し、測定値に影響を及ぼすおそれがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開2001-95598号公報
【特許文献２】国際公開第2004/104203号パンフレット
【特許文献３】特開2003-235585号公報
【特許文献４】特開2010-233502号公報
【特許文献５】国際公開第2004/038033号パンフレット
【特許文献６】国際公開第2010/041715号パンフレット
【特許文献７】国際公開第2004/038034号パンフレット
【特許文献８】国際公開第2008/108385号パンフレット
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Clin Chem Lab Med，第36巻，p.299-308 (1998).
【非特許文献２】Diabetes, 第27巻、第2号、p.102-107(1978)
【非特許文献３】日本臨床検査自動化学会会誌、第18巻、第4号、p.620 (1993).
【非特許文献４】Appl Microbiol Biotechnol, 第78巻、第5号、p.775-781 (2008).
【非特許文献５】Clin Chem Lab Med, 40, 78-89, (2002)
【非特許文献６】Mol Biotechnol, 54 (3) p.939-943 (2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、糖化ヘモグロビン由来の糖化ヘキサペプチドを酸化し過酸化水素を生成させる活性（以下、糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性という）を有する蛋白質を提供することにある。また、本発明の別の目的は、該蛋白質をコードするDNA、該DNAを含有する組換えDNA、該組換えDNAで形質転換された形質転換体、該形質転換体等を用いた糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質の製造方法、該蛋白質を用いる糖化ヘモグロビンの測定方法、及び、該蛋白質を含む糖化ヘモグロビン測定用試薬を提供することにある。さらに、本発明の別の目的としては、糖化ヘモグロビンを直接酸化する活性を有する蛋白質、該蛋白質を用いる糖化ヘモグロビンの測定方法、及び、該蛋白質を含む糖化ヘモグロビン測定用試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、以下の（１）〜（２９）に関する。
（１）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質の６１番目のアルギニンが、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、スレオニン、プロリン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン及びアスパラギン酸からなる群から選ばれるアミノ酸へ置換されたアミノ酸配列からなる、蛋白質。
（２）（１）に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、６１番目のアミノ酸以外の1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を有する、蛋白質。
（３）（１）に記載の蛋白質のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を有する、蛋白質。
（４）（１）に記載の蛋白質のアミノ酸残基が下記の［１］〜［１５］から選ばれる少なくとも１つの変異により改変された、蛋白質。
[１]６３番目のアルギニンが、グリシン、プロリン及びアラニンからなる群から選ばれるアミノ酸へ置換された変異
[２]６２番目のロイシンがグリシンへ置換された変異
[３]９３番目のグルタミンがグルタミン酸へ置換された変異
[４]２６７番目のフェニルアラニンがチロシンへ置換された変異
[５]７１番目のチロシンがセリン又はシステインに置換された変異
[６]１１５番目のアスパラギン酸が、アスパラギン及びアルギニンからなる群から選ばれるアミノ酸へ置換された変異
[７]１０８番目のメチオニンがリジン及びアルギニンからなる群から選ばれるアミノ酸へ置換された変異
[８]７５番目のロイシンがアラニン及びフェニルアラニンからなる群から選ばれるアミノ酸へ置換された変異
[９]３４番目のセリンがスレオニンへ置換された変異
[１０]５２番目のチロシンがヒスチジンへ置換された変異
[１１]５７番目のイソロイシンがバリンへ置換された変異
[１２]６６番目のプロリンがヒスチジンへ置換された変異
[１３]９５番目のアスパラギン酸がグルタミン酸へ置換された変異
[１４]１０５番目のリジンがアルギニンへ置換された変異
[１５]３５５番目のアラニンがセリンへ置換された変異
（５)（４）記載の蛋白質のアミノ酸配列において、３４番目、５２番目、５７番目、６１番目、６２番目、６３番目、６６番目、７１番目、７５番目、９３番目、９５番目、１０５番目、１０８番目、１１５番目、２６７番目、３５５番目のアミノ酸以外の少なくとも一つのアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を有する、蛋白質。
（６）配列番号３〜３７のいずれかで表わされるアミノ酸配列からなる、蛋白質。
（７）配列番号３〜３７のいずれかで表わされるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を有する、蛋白質。
（８）配列番号６〜３７のいずれかで表わされるアミノ酸配列からなる、蛋白質。
（９）配列番号６〜３７のいずれかで表わされるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ糖化ヘモグロビンを直接酸化する活性を有する、蛋白質。
（１０）糖化ヘモグロビンがHbA1cである、（９）に記載の蛋白質。
（１１）（１）〜（１０）のいずれかに記載の蛋白質をコードするDNA。
（１２）配列番号４１〜７５のいずれかで表わされる塩基配列からなる、DNA。
（１３）（６）に記載の蛋白質をコードする塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質をコードする、DNA。
（１４）配列番号４１〜７５のいずれかで表わされる塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質をコードする、DNA。
（１５）配列番号４４〜７５のいずれかで表わされる塩基配列からなる、DNA。
（１６）（８）に記載の蛋白質をコードする塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖化ヘモグロビンを直接酸化する活性を有する蛋白質をコードする、DNA。
（１７）配列番号４４〜７５のいずれかで表わされる塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖化ヘモグロビンを直接酸化する活性を有する蛋白質をコードする、DNA。
（１８）糖化ヘモグロビンがHbA1cである、（１６）又は（１７）記載のDNA。
（１９）（１１）〜（１８）のいずれかに記載のDNAを含有する組換えDNA。
（２０）（１９）に記載の組換えDNAを有する形質転換体。
（２１）（２０）に記載の形質転換体を培養し、培養物中に（１）〜（１０）のいずれかに記載の蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する、（１）〜（１０）のいずれかに記載の蛋白質の製造方法。
（２２）試料中の糖化ヘモグロビンをプロテアーゼと反応させて糖化ヘキサペプチドを生成させ、生成された糖化ヘキサペプチドに（１）〜（１０）のいずれかに記載の蛋白質を反応させ、該反応により生成された物質又は消費された物質を測定することを特徴とする、試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。
（２３）試料中の糖化ヘモグロビンを（８）〜（１０）のいずれかに記載の蛋白質と反応させ、該反応により生成された物質又は消費された物質を測定することを特徴とする、試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。
（２４）糖化ヘモグロビンがHbA1cである、（２２）又は（２３）に記載の測定方法。
（２５）前記反応により生成された物質が過酸化水素である、（２２）〜（２４）のいずれかに記載の測定方法。
（２６）プロテアーゼ、及び、（１）〜（１０）のいずれかに記載の蛋白質を含む、糖化ヘモグロビン測定用試薬。
（２７）（８）〜（１０）のいずれかに記載の蛋白質を含む、糖化ヘモグロビン測定用試薬。
（２８）過酸化水素測定用試薬をさらに含む（２６）又は（２７）に記載の試薬。
（２９）糖化ヘモグロビンがHbA1cである、（２６）〜（２８）のいずれかに記載の試薬。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするDNA、該DNAを含有する組換えDNA、該組換えDNAで形質転換された形質転換体、該形質転換体等を用いた糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質の製造方法、該蛋白質を用いる糖化ヘモグロビンの測定方法、該蛋白質を含む糖化ヘキサペプチド測定用試薬、糖化ヘモグロビンを直接酸化する活性を有する蛋白質、該蛋白質を用いる糖化ヘモグロビンの測定方法、及び、該蛋白質を含む糖化ヘモグロビン測定用試薬が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】V8プロテアーゼ及びFPOX-19を用いる本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法と、HPLC法(KO500法)及びヘモグロビン-SLS法を用いる糖化ヘモグロビンの測定方法との間の相関性を示すグラフである。
【図２】V8プロテアーゼ及びFPOX-32を用いる本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法と、HPLC法(KO500法)及びヘモグロビン-SLS法を用いる糖化ヘモグロビンの測定方法との間の相関性を示すグラフである。
【図３】V8プロテアーゼ及びFPOX-42を用いる本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法と、HPLC法(KO500法)及びヘモグロビン-SLS法を用いる糖化ヘモグロビンの測定方法との間の相関性を示すグラフである。
【図４】プロテアーゼを用いず、FPOX-19を用いる本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法と、HPLC法(KO500法)及びヘモグロビン-SLS法を用いる糖化ヘモグロビンの測定方法との間の相関性を示すグラフである。
【図５】プロテアーゼを用いず、FPOX-20を用いる本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法と、HPLC法(KO500法)及びヘモグロビン-SLS法を用いる糖化ヘモグロビンの測定方法との間の相関性を示すグラフである。
【図６】プロテアーゼを用いず、FPOX-32を用いる本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法と、HPLC法(KO500法)及びヘモグロビン-SLS法を用いる糖化ヘモグロビンの測定方法との間の相関性を示すグラフである。
【図７】プロテアーゼを用いず、FPOX-42を用いる本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法と、HPLC法(KO500法)及びヘモグロビン-SLS法を用いる糖化ヘモグロビンの測定方法との間の相関性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
１．本発明の蛋白質
本発明の蛋白質としては、
[１]配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質の６１番目のアルギニンが、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、スレオニン、プロリン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン及びアスパラギン酸からなる群から選ばれるアミノ酸へ置換されたアミノ酸配列からなる、蛋白質；
[２][１]の蛋白質のアミノ酸配列において、６１番目のアミノ酸以外の1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を有する、蛋白質；
[３][１]の蛋白質のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を有する、蛋白質；
[４][１]の蛋白質のアミノ酸残基が下記の（１）〜（１５）から選ばれる少なくとも１つの変異により改変された蛋白質；
（１）６３番目のアルギニンが、グリシン、プロリン及びアラニンからなる群から選ばれるアミノ酸へ置換された変異
（２）６２番目のロイシンがグリシンへ置換された変異
（３）９３番目のグルタミンがグルタミン酸へ置換された変異
（４）２６７番目のフェニルアラニンがチロシンへ置換された変異
（５）７１番目のチロシンがセリン又はシステインに置換された変異
（６）１１５番目のアスパラギン酸が、アスパラギン及びアルギニンからなる群から選ばれるアミノ酸へ置換された変異
（７）１０８番目のメチオニンがリジン及びアルギニンからなる群から選ばれるアミノ酸へ置換された変異
（８）７５番目のロイシンがアラニン及びフェニルアラニンからなる群から選ばれるアミノ酸へ置換された変異
（９）３４番目のセリンがスレオニンへ置換された変異
（１０）５２番目のチロシンがヒスチジンへ置換された変異
（１１）５７番目のイソロイシンがバリンへ置換された変異
（１２）６６番目のプロリンがヒスチジンへ置換された変異
（１３）９５番目のアスパラギン酸がグルタミン酸へ置換された変異
（１４）１０５番目のリジンがアルギニンへ置換された変異
（１５）３５５番目のアラニンがセリンへ置換された変異
[５][４]記載の蛋白質のアミノ酸配列において、３４番目、５２番目、５７番目、６１番目、６２番目、６３番目、６６番目、７１番目、７５番目、９３番目、９５番目、１０５番目、１０８番目、１１５番目、２６７番目、３５５番目のアミノ酸以外の少なくとも一つのアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を有する、蛋白質；
[６]配列番号３〜３７のいずれかで表わされるアミノ酸配列からなる、蛋白質；
[７]配列番号３〜３７のいずれかで表わされるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を有する、蛋白質；
[８]配列番号６〜３７のいずれかで表わされるアミノ酸配列からなる、蛋白質；
[９]配列番号６〜３７のいずれかで表わされるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ糖化ヘモグロビンを直接酸化する活性を有する、蛋白質；
[１０]糖化ヘモグロビンがヘモグロビンＡ１ｃである、[９]の蛋白質；
を挙げることができる。
【００１９】
上記において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNAに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
【００２０】
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
【００２１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質の６１番目のアルギニンが、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、スレオニン、プロリン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン及びアスパラギン酸からなる群から選ばれるアミノ酸へ置換されたアミノ酸配列において、６１番目のアミノ酸以外の１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたときは、同一配列中の６１番目のアミノ酸以外の任意の位置において、１個または複数個（例えば２〜数個）のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。
【００２２】
アミノ酸の欠失または付加が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質の６１番目のアルギニンが、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、スレオニン、プロリン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン及びアスパラギン酸からなる群から選ばれるアミノ酸へ置換されたアミノ酸配列のＮ末端側およびＣ末端側の１〜数個のアミノ酸を挙げることができる。
【００２３】
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
【００２４】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
【００２５】
また、本発明の蛋白質が糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を有するためには、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質の６１番目のアルギニンが、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、スレオニン、プロリン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン及びアスパラギン酸からなる群から選ばれるアミノ酸へ置換されたアミノ酸配列との相同性が９０％以上、例えば９４％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有していることが望ましい。
【００２６】
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００２７】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質の６１番目のアルギニンが、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、スレオニン、プロリン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン及びアスパラギン酸からなる群から選ばれるアミノ酸へ置換されたアミノ酸配列と９０％以上、例えば９４％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質もまた本発明の蛋白質である。
【００２８】
本発明の蛋白質としては、例えば、配列番号３〜３７のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質（それぞれ、FPOX-16、FPOX-17、FPOX-18、FPOX-18A、FPOX-18B、FPOX-18C、FPOX-18D、FPOX-19、FPOX-20、FPOX-21、FPOX-22、FPOX-23、FPOX-24、FPOX-25、FPOX-26、FPOX-27、FPOX-28、FPOX-29、FPOX-30、FPOX-31、FPOX-32、FPOX-33、FPOX-34、FPOX-35、FPOX-36、FPOX-37、FPOX-38、FPOX-39、FPOX-40、FPOX-41、FPOX-42、FPOX-43、FPOX-44、FPOX-45、FPOX-46と称する）を示すことができる。
【００２９】
本発明の蛋白質が糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質であることを確認する手段としては、例えばDNA組換え法を用いて本発明の蛋白質を発現する形質転換体を作製し、該形質転換体を用いて本発明の蛋白質を製造した後、α-F6Pを基質として用い、当該基質との反応により生成される物質又は消費される物質を測定することにより行なうことができる。ここで、当該基質との反応により生成される物質としては、過酸化水素が例示される。
【００３０】
本発明の蛋白質は、分子状酸素を用いて、糖化ヘモグロビン由来の糖化ヘキサペプチドまたは糖化ヘモグロビンの一種であるHbA1cを酸化して、糖オソン（α−ケトアルデヒド体）、ヘキサペプチドまたはヘモグロビン、及び、過酸化水素を生成させる。
【００３１】
本発明の蛋白質の糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性の至適pH及び安定pH範囲は、特に制限はないが、至適pHは6.0〜8.0付近が好ましく、安定pHは、40℃、10分間の処理で、pH6.0〜9.0が好ましい。
作用適温の範囲については、特に制限はないが、20〜50℃付近が好ましい。耐熱性は、高い方が好ましく、例えば、50℃、15分間の熱処理後の残存活性が、25%以上のものが好ましく用いられる。
【００３２】
（糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性測定方法）
糖化ヘキサペプチドオキシダーゼの活性の測定は、例えば下記の方法で行うことができる。ここで、α-F6Pが1分間に1μmolの過酸化水素を生成する酵素量を1単位(U)とする。
【００３３】
（活性測定用試薬）
A液: 50 mmol/L リン酸緩衝液(pH7.0)
B液:発色剤
24 mmol/L 10-（カルボキシメチルアミノカルボニル）-3,7-ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン ナトリウム塩（DA-67）のジメチルホルムアミド(DMF)溶液
C液:パーオキシダーゼ溶液
1 kU/L パーオキシダーゼの10 mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0)溶液
D液:基質溶液
1 mmol/L α-F6P 水溶液
E液: 精製酵素液
0.1〜10 mg/mL 糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ水溶液
【００３４】
(測定手順)
A液 10mLにB液 12.6μL、C液 35μLを添加し、得られた溶液を1試料当たり190μLずつ96穴マイクロプレートの各ウェルに分注する。D液20μL、E液10μLを加えて混合し、全自動マイクロプレートEIA分析装置で30℃または37℃、30〜120分間の反応前後の、660 nm(主波長)/750 nm(副波長)における吸光度を測定し、吸光度変化を算出する。基質溶液（D液）の代わりに蒸留水を用いた測定により得られたブランク値を差し引くことにより、測定値を算出する。
そして前記の測定系に、種々の量の過酸化水素を添加して、660 nm(主波長)/750 nm(副波長)における吸光度を測定し、過酸水素の量と吸光度の関係を表わす検量曲線を作成し、各精製酵素試料によるシグナル変化から単位時間に生成された過酸化水素量を換算する。
【００３５】
２．本発明のDNA
本発明のDNAとしては、
［ａ］上記[１]〜［１０］のいずれかに記載の本発明の蛋白質をコードするDNA；
［ｂ］配列番号４１〜７５のいずれかで表わされる塩基配列からなる、DNA；
［ｃ］上記［６］記載の蛋白質をコードする塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質をコードする、DNA；
［ｄ］配列番号４１〜７５のいずれかで表わされる塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質をコードする、DNA；
［ｅ］配列番号４４〜７５のいずれかで表わされる塩基配列からなる、DNA；
［ｆ］上記［８］記載の蛋白質をコードする塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖化ヘモグロビンを直接酸化する活性を有する蛋白質をコードする、DNA；
［ｇ］配列番号４４〜７５のいずれかで表わされる塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖化ヘモグロビンを直接酸化する活性を有する蛋白質をコードする、DNA；
［ｈ］糖化ヘモグロビンがHbA1cである、［ｆ］又は［ｇ］記載のDNA；
を挙げることができる。
【００３６】
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するDNAまたは該DNAの一部に対象のDNAがハイブリダイズすることを意味する。したがって、該特定の塩基配列を有するDNAまたは該DNAの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはPCR解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのDNAであってもよい。プローブとして用いるDNAとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のDNAを挙げることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のDNAであってもよい。
【００３７】
DNAのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Methods for General and Molecular Bacteriolgy, ASM Press (1994)、Immunology methods manual, Academic press(Molecular)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
【００３８】
上記のストリンジェントな条件とは、例えばDNAを固定化したフィルターとプローブDNAとを50％ホルムアミド、5×SSC（750 mmol/Lの塩化ナトリウム、75 mmol/Lのクエン酸ナトリウム）、50 mmol/Lのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20μg/Lの変性させたサケ精子DNAを含む溶液中で42℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する高ストリンジェント条件を挙げることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェントな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE（20×SSCEは、3 mol/Lの塩化ナトリウム、0.2 mol/Lのリン酸二水素ナトリウム、0.02 mol/LのEDTA、pH7.4）、0.5％のSDS、30％のホルムアミド、100μg/Lの変性させたサケ精子DNAを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベートした後、50℃の1×SSC、0.1％SDS溶液を用いて洗浄する条件を挙げることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば5×SSC）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件を挙げることができる。
【００３９】
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
【００４０】
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えば上記したBLASTおよびFASTA等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号４１〜７５のいずれかで表される塩基配列と少なくとも９０％以上、例えば９４％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列からなるDNAを挙げることができる。
【００４１】
上記したDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAが、糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAであることは、該DNAを発現する組換えDNAを作製し、該組換えDNAを宿主細胞に導入して得られる微生物を培養して得られる培養物から該蛋白質を精製し、該精製蛋白質を酵素源に用いて、α−F6Pを基質として用い、当該基質との反応により生成される過酸化水素を測定することにより行なうことができる。
【００４２】
本発明のDNAとしては、例えば、配列番号３〜３７のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA、配列番号４１〜７５のいずれかで表される塩基配列からなるDNA等を示すことができる。
【００４３】
３．本発明の形質転換体
本発明の形質転換体としては、上記２記載の本発明のDNAを含む組換えDNAを用い、宿主細胞を公知の方法で形質転換して得られる形質転換体を挙げることができ、宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞、好ましくは細菌、より好ましくは原核細胞、より好ましくはエシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物を挙げることができる。
【００４４】
４．本発明のDNAの調製
本発明のDNAは、例えば、配列番号41〜75のいずれかで表される塩基配列に基づき設計することができるプローブを用い、糸状菌等の微生物、好ましくはアスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属等に属する微生物、特に好ましくはEmericella nidulans等に属する微生物により取得することができる。
【００４５】
また、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号3〜37で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNAの塩基配列と９０％以上、例えば９４％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物の染色体DNA、cDNAライブラリー等から上記した方法により本発明のDNA、または本発明の製造法に用いられるDNAを取得することもできる。
【００４６】
取得したDNAをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換えDNAを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)]あるいは373A・DNAシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該DNAの塩基配列を決定することができる。
【００４７】
本発明のDNAを組み込むベクターとしては、pBluescriptII KS(+)（ストラタジーン社製）、pDIRECT[Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)]、pCR-Script Amp SK(+)（ストラタジーン社製）、pT7Blue（ノバジェン社製）、pCR II（インビトロジェン社製）およびpCR-TRAP（ジーンハンター社製）などを挙げることができる。
【００４８】
宿主細胞としては、エシェリヒア属に属する微生物などを挙げることができる。エシェリヒア属に属する微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli） XL1-Blue、エシェリヒア・コリ XL2-Blue、エシェリヒア・コリ DH1、エシェリヒア・コリ MC1000、エシェリヒア・コリ ATCC 12435、エシェリヒア・コリ W1485、エシェリヒア・コリ JM109、エシェリヒア・コリ HB101、エシェリヒア・コリ No.49、エシェリヒア・コリ W3110、エシェリヒア・コリ NY49、エシェリヒア・コリ MP347、エシェリヒア・コリ NM522、エシェリヒア・コリ BL21、エシェリヒア・コリ ME8415等を挙げることができる。
【００４９】
組換えDNAの導入方法としては、上記宿主細胞へDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等を挙げることができる。
【００５０】
塩基配列を決定した結果、取得されたDNAが部分長であった場合は、該部分長DNAをプローブに用いた、染色体DNAライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長DNAを取得することができる。
更に、決定されたDNAの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型DNA合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするDNAを調製することもできる。
上記のようにして取得されるDNAとして、例えば、配列番号41〜75のいずれかで表される塩基配列を有するDNAを挙げることができる。
【００５１】
５．本発明の製造法に用いられる形質転換体の製造法
本発明のDNAをもとにして、必要に応じて、本発明の蛋白質をコードするDNAを含む適当な長さのDNA断片を調製する。また、宿主の発現に最適なコドンとなるように、該蛋白質をコードするDNAの塩基配列を修飾し、当該塩基配列中の塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率が向上した形質転換体を取得することができる。
【００５２】
当該DNA断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えDNAを作製する。該組換えDNAを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自律複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のDNAを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００５３】
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のDNAを有する組換えDNAは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のDNA、転写終結配列より構成された組換えDNAであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００５４】
発現ベクターとしては、pColdI(タカラバイオ社製)、pCDF-1b、pRSF-1b（いずれもノバジェン社製）、pMAL-c2x（ニューイングランドバイオラブス社製）、pGEX-4T-1（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、pTrcHis（インビトロジェン社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-30（キアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200[Agric. Biol. Chem., 48, 669(1984)]、pLSA1[Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)]、pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)]、pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(-)（ストラタジーン社製）、pTrS30 [エシェリヒア・コリ JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製]、pTrS32 [エシェリヒア・コリ JM109/pTrS32(FERM BP-5408)より調製]、pPAC31 (WO98/12343)、pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)]、pSTV28(タカラバイオ社製)、pUC118（タカラバイオ社製）、pPA1（特開昭63-233798）、pTrc99aベクター（4,176-bp、ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）等を例示することができる。
【００５５】
プロモーターとしては、エシェリヒア・コリ等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター、及びＰSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、並びに、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、及びｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーター、及びlet Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００５６】
さらにバチルス属に属する微生物中で発現させるためのxylAプロモーター［Appl. Microbiol. Biotechnol., 35, 594-599 (1991)］やコリネバクテリウム（Corynebacterium）属に属する微生物中で発現させるためのP54-6プロモーター［Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)］なども用いることができる。
【００５７】
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば6〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明のDNAを発現ベクターに結合させた組換えDNAにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
このような組換えDNAとしては、例えばpET21-plu1440を挙げることができる。
【００５８】
原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア（Serratia）属、バチルス属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ミクロバクテリウム属（Microbacterium）、シュードモナス（Pseudomonas）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アリシクロバチルス属（Alicyclobacillus）、アナベナ（Anabena）属、アナシスティス（Anacystis）属、アスロバクター（Arthrobacter）属、アゾトバクター（Azotobacter）属、クロマチウム（Chromatium）属、エルビニア（Erwinia）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、フォルミディウム（Phormidium）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、ロドスピリウム（Rhodospirillum）属、セネデスムス（Scenedesmus）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、シネコッカス（Synechoccus）属、ザイモモナス（Zymomonas）属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリ XL1-Blue、エシェリヒア・コリ XL2-Blue、エシェリヒア・コリ DH1、エシェリヒア・コリ DH5α、エシェリヒア・コリ MC1000、エシェリヒア・コリ KY3276、エシェリヒア・コリ W1485、エシェリヒア・コリ JM109、エシェリヒア・コリ HB101、エシェリヒア・コリ No.49、エシェリヒア・コリ W3110、エシェリヒア・コリ NY49、エシェリヒア・コリ MP347 、エシェリヒア・コリ NM522、エシェリヒア・コリ BL21、バチルス・サチリス（Bacillus subtilis） ATCC33712、バチルス・メガテリウム（Batillus megaterium）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム・イマリオフィルム（Brevibacterium immariophilum） ATCC14068、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum） ATCC14066、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum） ATCC14067、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum） ATCC13869、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum） ATCC13032、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC14297、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Corynebacterium acetoacidophilum）ATCC13870、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム（Microbacterium ammoniaphilum） ATCC15354、セラチア・フィカリア（Serratia ficaria）、セラチア・フォンチコラ（Serratia fonticola）、セラチア・リケファシエンス（Serratia liquefaciens）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.） D-0110、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）、アグロバクテリウム・リゾジーンズ（Agrobacterium rhizogenes）、アグロバクテリウム・ルビ（Agrobacterium rubi）、アナベナ・シリンドリカ（Anabaena cylindrica）、アナベナ・ドリオルム（Anabaena doliolum）、アナベナ・フロスアクア（Anabaena flos-aquae）、アースロバクター・オーレッセンス（Arthrobacter aurescens）、アースロバクター・シトレウス（Arthrobacter citreus）、アースロバクター・グロブフォルミス（Arthrobacter globformis）、アースロバクター・ヒドロカーボグルタミカス（Arthrobacter hydrocarboglutamicus）、アースロバクター・ミソレンス（Arthrobacter mysorens）、アースロバクター・ニコチアナ（Arthrobacter nicotianae）、アースロバクター・パラフィネウス（Arthrobacter paraffineus）、アースロバクター・プロトフォルミエ（Arthrobacter protophormiae）、アースロバクター・ロセオパラフィナス（Arthrobacter roseoparaffinus）、アー��ロバクター・スルフレウス（Arthrobacter sulfureus）、アースロバクター・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafaciens）、クロマチウム・ブデリ（Chromatium buderi）、クロマチウム・テピダム（Chromatium tepidum）、クロマチウム・ビノサム（Chromatium vinosum）、クロマチウム・ワーミンギ（Chromatium warmingii）、クロマチウム・フルビアタティレ（Chromatium fluviatile）、エルビニア・ウレドバラ（Erwinia uredovora）、エルビニア・カロトバラ（Erwinia carotovora）、エルビニア・アナナス（Erwinia ananas）、エルビニア・ヘリコラ（Erwinia herbicola）、エルビニア・パンクタタ（Erwinia punctata）、エルビニア・テレウス（Erwinia terreus）、メチロバクテリウム・ロデシアナム（Methylobacterium rhodesianum）、メチロバクテリウム・エクソトルクエンス（Methylobacterium extorquens）、フォルミディウム・エスピー（Phormidium sp.） ATCC29409、ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、ロドシュードモナス・ブラスチカ（Rhodopseudomonas blastica）、ロドシュードモナス・マリナ（Rhodopseudomonas marina）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ロドスピリウム・リブラム（Rhodospirillum rubrum）、ロドスピリウム・サレキシゲンス（Rhodospirillum salexigens）、ロドスピリウム・サリナラム（Rhodospirillum salinarum）、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Streptomyces ambofaciens）、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Streptomyces aureofaciens） 、ストレプトマイセス・アウレウス（Streptomyces aureus）、ストレプトマイセス・フンジシディカス（Streptomyces fungicidicus）、ストレプトマイセス・グリセオクロモゲナス（Streptomyces griseochromogenes）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans、ストレプトマイセス・オリボグリセウス（Streptomyces olivogriseus）、ストレプトマイセス・ラメウス（Streptomyces rameus）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Streptomyces tanashiensis）、ストレプトマイセス・ビナセウス（Streptomyces vinaceus）、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）等を挙げることができる。
【００５９】
組換えDNAの原核生物への導入方法としては、上記宿主細胞へDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等を挙げることができる。
【００６０】
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEp13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS19、pHS15等を用いることができる。
【００６１】
プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、MFα1プロモーター、CUP 1プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
【００６２】
宿主細胞としては、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、シワニオマイセス（Schwanniomyces）属、ピチア（Pichia）属、またはキャンディダ（Candida）属等に属する酵母菌株を挙げることができ、具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulans）、シワニオマイセス・アルビウス（Schwanniomyces alluvius）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、キャンディダ・ウティリス（Candida utilis）等を挙げることができる。
【００６３】
組換えDNAの酵母への導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法[Methods Enzymol., 194, 182 (1990)]、スフェロプラスト法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)]、酢酸リチウム法[J. Bacteriol., 153, 163 (1983)]等を挙げることができる。
【００６４】
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pcDNAI、pcDM8（フナコシ社より市販）、pAGE107（特開平3-22979）、pAS3-3（特開平2-227075）、pCDM8[Nature, 329, 840 (1987)]、pcDNAI/Amp（インビトロジェン社製）、pREP4（インビトロジェン社製）、pAGE103[J. Biochem, 101, 1307 (1987)]、pAGE210、pAMo、pAMoA等を用いることができる。
【００６５】
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（CMV）のIE（immediate early）遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【００６６】
宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa）細胞またはナマルバ KJM-1細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞、HBT5637（特開昭63-299）等を挙げることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、SP2/0、NSO等、ラット・ミエローマ細胞としてはYB2/0等、ヒト胎児腎臓細胞としてはHEK293(ATCC CRL-1573)、ヒト白血病細胞としてはBALL-1等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはCOS-1、COS-7等を挙げることができる。
【００６７】
組換えDNAの動物細胞への導入方法としては、動物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法[Cytotechnology, 3, 133 (1990)]、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)]、Virology, 52, 456 (1973)に記載の方法等を挙げることができる。
【００６８】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばBaculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Molecular Biology, A Laboratory Manual、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、蛋白質を生産することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を生産させることができる。
【００６９】
当該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII（いずれもインビトロジェン社製）等を挙げることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 等を用いることができる。
【００７０】
昆虫細胞としては、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）の卵巣細胞、トリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）の卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。
スポドプテラ・フルギペルダの卵巣細胞としてはSf9、Sf21（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル）等、トリコプルシア・ニの卵巣細胞としてはHigh 5、BTI-TN-5B1-4（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはボンビクス・モリ（Bombyx mori）N4等を挙げることができる。
【００７１】
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)]等を挙げることができる。
【００７２】
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等を挙げることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモーター、イネアクチン１プロモーター等を挙げることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等を挙げることができる。
【００７３】
組換えベクターの植物細胞への導入方法としては、植物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）を用いる方法（特開昭59-140885、特開昭60-70080、WO94/00977）、エレクトロポレーション法（特開昭60-251887）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第2606856、特許第2517813）等を挙げることができる。
【００７４】
６．本発明の蛋白質の製造法
上記５の方法で得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明の蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物から採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
本発明の蛋白質を製造するための上記形質転換体の宿主としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等いずれであってもよいが、好ましくは細菌、より好ましくはエシェリヒア属に属する微生物、さらに好ましくはエシェリヒア・コリに属する微生物を挙げることができる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
上記形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【００７５】
エシェリヒア・コリ等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００７６】
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
【００７７】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
【００７８】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
【００７９】
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常5時間〜7日間である。培養中pHは3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００８０】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル  β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG)等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００８１】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地[J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)]、イーグル（Eagle）のMEM培地[Science, 122, 501 (1952)]、DMEM培地[Virology, 8, 396 (1959)]、199培地[Proc. Soc. Biol. Med., 73, 1 (1950)]またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常pH6〜8、25〜40℃、5％ＣＯ2存在下等の条件下で1〜7日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００８２】
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているTNM-FH培地(ファーミンジェン社製)、Sf-900 II SFM培地（ライフ・テクノロジーズ社製）、ExCell400、ExCell405[いずれもJRHバイオサイエンシーズ社製]、Grace's Insect Medium[Nature, 195, 788 (1962)]等を用いることができる。
培養は、通常pH6〜7、25〜30℃等の条件下で1〜5日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００８３】
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ(MS)培地、ホワイト(White)培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常pH5〜9、20〜40℃の条件下で3〜60日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００８４】
本発明の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、選択した方法に応じて、生産させる蛋白質の構造を変えることができる。
【００８５】
本発明の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法[J. Biol. Chem.，264, 17619 (1989)]、ロウらの方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288（1990)]、または特開平05-336963、WO94/23021等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の蛋白質の活性部位を含む蛋白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で生産させることにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
【００８６】
また、特開平2-227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
【００８７】
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて本発明の蛋白質を製造することもできる。
【００８８】
本発明の蛋白質を生産する形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該蛋白質を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
【００８９】
動物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば公知の方法[Am. J. Clin. Nutr., 63, 639S (1996)、Am. J. Clin. Nutr., 63, 627S (1996)、Bio/Technology, 9, 830 (1991)]に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に本発明の蛋白質を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、本発明のDNAまたは本発明の製造法に用いられるDNAを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、本発明の蛋白質を該動物中に生成、蓄積させ、該動物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。該動物中の該蛋白質を生成、蓄積させる場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭63-309192）、卵等を挙げることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で機能するものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
【００９０】
植物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば本発明の蛋白質をコードするDNAを導入したトランスジェニック植物を公知の方法[組織培養, 20 (1994)、組織培養, 21 (1995)、Trends Biotechnol., 15, 45 (1997)]に準じて栽培し、該蛋白質を該植物中に生成、蓄積させ、該植物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を生産する方法があげられる。
【００９１】
本発明の蛋白質を生産する形質転換体を用いて製造された本発明の蛋白質を単離・精製する方法としては、通常の酵素の単離、精製法を用いることができる。
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で生産された場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
【００９２】
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（DEAE）−セファロース、DIAION HPA-75（三菱化成社製)等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S−Sepharose FF（GEヘルスケアバイオサイエンス社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００９３】
また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して生産された場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。
該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
【００９４】
本発明の蛋白質またはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質またはその糖付加体等の誘導体を回収することができる。
即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号３〜３７のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を挙げることができる。
【００９５】
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288 （1990)]、特開平5-336963、WO94/23021に記載の方法に準じて、本発明の蛋白質をプロテインＡとの融合蛋白質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【００９６】
また、本発明の蛋白質をＦｌａｇペプチドとの融合蛋白質として生産し、抗Ｆｌａｇ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィー [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288（1990)]や、ポリヒスチジンとの融合蛋白質として生産し、ポリヒスチジンと高親和性を有する金属配位レジンを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製することもできる。更に、該蛋白質自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
【００９７】
上記で取得された蛋白質のアミノ酸配列情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブトキシカルボニル法）等の化学合成法により、本発明の蛋白質を製造することができる。また、Advanced ChemTech社、パーキン・エルマー社、Pharmacia社、Protein Technology Instrument社、Synthecell-Vega社、PerSeptive社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００９８】
７．本発明の蛋白質を用いる糖化ヘキサペプチドの測定方法
本発明の蛋白質は、糖化ヘモグロビンにプロテアーゼが作用して糖化ヘモグロビンより生成される糖化ヘキサペプチドに作用し、過酸化水素を生成させる性質を有することから、各種試料中の糖化蛋白質の測定に用いることができる。具体的には、試料をプロテアーゼと反応させて糖化ヘキサペプチドを生成させ、生成された糖化ヘキサペプチドと、本発明の蛋白質とを反応させ、当該糖化ヘキサペプチドと本発明の蛋白質との反応により生成される物質又は当該糖化ペプチドと本発明の蛋白質との反応において消費される物質を測定することにより、試料中の糖化ヘモグロビンを測定することができる。試料中の糖化ヘモグロビンの測定に係る反応は、後述の水性媒体中で行われてもよい。本発明における糖化ヘモグロビンとしては、例えばHbA1cが挙げられる。
以下、本発明の測定方法について説明する。
【００９９】
（試料及び測定対象物）
本発明の測定方法に用いられる試料としては、糖化ヘモグロビンを含む試料であれば特に制限はなく、例えば全血液、血漿、血清、血球、細胞試料、尿、髄液、汗、涙液、唾液、皮膚、粘膜、毛髪等の生体試料等が挙げられる。試料としては、全血液、血漿、血清、血球等が好ましく、全血液、血球等が特に好ましい。なお、全血液には、全血液由来の血球画分に血漿が混合している試料も含まれる。これらの試料は、溶血、分離、希釈、濃縮、精製等の前処理を施したものを用いてもよい。
【０１００】
ヘモグロビンのα鎖のＮ末端の３アミノ酸配列はバリン−ロイシン−セリンであり、β鎖のＮ末端の３アミノ酸配列はバリン−ヒスチジン−ロイシンである。HbA1cは、特にβ鎖のＮ末端バリン残基が糖化されたものと定義されているが、ヘモグロビンはα鎖のN末端を含め、分子内に複数の糖化部位を有することが知られている（The Journal of Biological Chemistry  (1980),  256,  3120-3127）。
【０１０１】
糖化ヘモグロビンを含む試料にプロテアーゼを作用させることにより、β鎖Ｎ末端のバリン残基が糖化された糖化ヘモグロビンに由来するα−FV、α−FVH、及びα−F6P、α鎖Ｎ末端のバリン残基が糖化された糖化ヘモグロビンに由来するα−FV、α−糖化バリルロイシン（以下、α−FVLと略記する）、及びα-Fructosyl Val- Leu- Ser- Pro- Ala- Asp、並びに、α鎖及び／又はβ鎖の内部のリジン残基のε−アミノ基の糖化に由来するε−FK等の糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドが生成される。
【０１０２】
さらに試料が全血液の場合、例えば糖化アルブミン等、全血液中の糖化ヘモグロビン以外の糖化蛋白質からも例えばε−FK等の糖化アミノ酸が生成される。
即ち、精製ヘモグロビンを含む試料又は全血液を含む試料にプロテアーゼを作用させると、例えばα−F6P、α−FVH、α−FV、ε−FK、α−FVL等が生成され、α−F6P、α−FVH及びα−FVLは糖化ヘモグロビンに由来し、α−F6P、α−FVHはHbA1cに特異的に由来する。
従って、HbA1cを測定する場合は、α−F6Pまたはα−FVHを特異的に測定すればよい。本発明の蛋白質は、α−F6Pに対する反応性が高いことから、HbA1cを効果的に測定することができる。
【０１０３】
国際臨床化学連合（IFCC:International federation of clinical chemistry）によるHbA1c基準測定操作法では、まずHbA1cからエンドプロテアーゼGlu-C(V8プロテアーゼ)により糖化されたN末端6ペプチド(α-F6P)を切り出し、HPLCによりα-F6Pを対象として分析することによりHbA1cを測定する。HbA1cの現行の酵素的測定法では、HbA1cをプロテアーゼで処理することにより生成される糖化ジペプチドを測定対象としているが、これは公知のほぼ全ての糖化ペプチドオキシダーゼが糖化ジペプチドより長い糖化ペプチドを認識しないためである。そこで、糖化ヘキサペプチドを測定対象とし、それによりHbA1cを測定するという原理に基づく酵素的測定法を開発することができれば、IFCC基準測定法に則した酵素的測定が可能になり、産業上非常に有意義であると考えられる。
【０１０４】
（プロテアーゼ）
本発明に使用しうるプロテアーゼは、試料中に含まれる測定すべき糖化ヘモグロビンに作用し、糖化ヘキサペプチドを生成させるものであればいかなるものを用いてもよく、例えば、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、Ｖ８プロテアーゼ、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＰ、プロナーゼ、サーモリシン、サチライシン、カルボキシペプチダーゼ、キモトリプシン、ディスパーゼ、パパイン、フィシン、ブロメライン、アミノペプチダーゼ等のプロテアーゼあるいはペプチダーゼ等が挙げられ、特に好ましくは、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、Ｖ８プロテアーゼが挙げられる。
試料のプロテアーゼ処理条件は、用いるプロテアーゼが測定対象の糖化ヘモグロビンに作用し、α−F6Pを短時間に効率よく遊離する条件であれば、いかなる条件でもよい。使用するプロテアーゼの量は、試料中に含まれるＨｂＡ１ｃの含量、あるいは処理条件等により適宜選択され、例えば、一例として、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ（例えば、ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を、終濃度が0.1〜50 U/mL、好ましくは1〜10 U/mLとなるように加える。さらに必要により適宜他のプロテアーゼを加えてもよい。プロテアーゼで処理する際のpHは、無調整でもよく、使用するプロテアーゼの作用に好適なpHとなるように、例えば、適当なpH調整剤、例えば、塩酸、酢酸、硫酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等により、pH2〜9、好ましくはpH3〜8に調整してもよい。処理温度は、例えば、20〜50℃で行ってもよく、用いる酵素によっては、より高温域の45〜70℃で行ってもよい。この際の処理時間は、HbA1cを分解するのに充分な時間であればよく、例えば、5秒間〜180分間、好ましくは1〜60分間で行うことができる。得られる処理液を、そのまま、あるいは必要により適宜、加熱、遠心分離、濃縮、希釈等を行ったのち、糖化ヘキサペプチドを含む試料として糖化ヘキサペプチドオキシダーゼの反応に供する。
【０１０５】
（測定方法）
本発明の試料中の測定すべき糖化ヘモグロビンの測定は、下記(i)〜(iii)の工程を順次行うことによって行うことができる。
(i)試料中の糖化ヘモグロビンをプロテアーゼと反応させて糖化ヘキサペプチドを生成させる工程、
(ii)生成された糖化ヘキサペプチドを本発明の蛋白質と反応させる工程、及び、
(iii)(ii)の工程で生成された物質、又は、消費された物質を測定する工程。
【０１０６】
上記工程(i)〜(iii)は、水性媒体中で行われても良い。水性媒体としては、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられるが、緩衝液が好ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤（トリス緩衝剤）、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。
【０１０７】
グッドの緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸(MES)、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン(Bis-Tris)、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸(ADA)、ピペラジン−Ｎ，Ｎ'−ビス（２−エタンスルホン酸）(PIPES)、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸(ACES)、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸(MOPSO)、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸(BES)、３−モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸(TES)、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸(HEPES)、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸(DIPSO)、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸(TAPSO)、ピペラジン−Ｎ，Ｎ'−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）(POPSO)、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸(HEPPSO)、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸[(H)EPPS]、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン(Tricine)、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン(Bicine)、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸(TAPS)、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸(CHES)、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸(CAPSO)、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸(CAPS)等が挙げられる。
【０１０８】
緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、0.001〜2.0 mol/Lが好ましく、0.005〜1.0 mol/Lがより好ましい。
各工程の反応の反応温度としては、例えば10〜50℃で、好ましくは20〜40℃であり、反応時間としては、1秒間〜60分間、好ましくは1〜10分間である。
【０１０９】
本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法においては、糖化ヘモグロビンを含む試料をプロテアーゼと反応させる工程において、糖化ヘモグロビンの変性剤、又は、酸化剤を共存させてもよい。或いは、糖化ヘモグロビンを含む試料を予め、当該変性剤、又は、当該酸化剤で処理した後、当該処理された試料をプロテアーゼと反応させてもよい。変性剤としては、本発明の測定方法を可能とする変性剤であれば特に制限はなく、例えば非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤等が挙げられる。また、酸化剤としては、本発明の測定方法を可能とする酸化剤であれば特に制限はなく、例えばヨウ素酸カリウム、過ヨウ素酸カリウム、臭素酸カリウム等が挙げられる。
【０１１０】
プロテアーゼは、工程(ii)の反応に影響を及ぼさなければ、工程（i）を行った後に、特に失活させなくともよいが、加熱、冷却、遠心分離、膜濾過、阻害剤の添加等によって該酵素が工程(ii)で作用することがないようにすることもできる。
【０１１１】
工程（ii）において、糖化ヘキサペプチドと、本発明の蛋白質との反応により反応液中に生じる生成物としては、過酸化水素、糖オソン（α−ケトアルデヒド体）、ペプチド等が挙げられる。また、工程(ii)において、糖化ヘキサペプチドと、本発明の蛋白質との反応により消費される物質としては、例えば酸素分子等が挙げられる。工程(ii)において消費される酸素分子は、例えば酸素電極を用いた電気化学的測定法により測定される。
【０１１２】
本発明の工程（ii）において生成される過酸化水素は、例えば光学的手法又は電気化学的手法を用いて測定することができる。光学的手法としては、例えば吸光度法、発光法等が挙げられる。具体的には、過酸化水素測定試薬を用いた光学的測定法、過酸化水素電極を用いた電気化学的測定法等が挙げられる。
過酸化水素測定試薬は、生成された過酸化水素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素、光等が挙げられるが、色素が好ましい。
【０１１３】
検出可能な物質が色素の場合には、過酸化水素測定試薬は、酸化発色型色原体及びパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含む。酸化発色型色原体としては、例えば後述の酸化カップリング型色原体や後述のロイコ型色原体が挙げられる。
【０１１４】
検出可能な物質が光の場合には、過酸化水素測定試薬は、化学発光物質を含む。化学発光物質としては、生物発光物質も含まれ、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル、シュウ酸エステル等が挙げられる。
【０１１５】
過酸化水素測定試薬として、酸化発色型色原体及びパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含む試薬を用いる場合には、過酸化水素を、過酸化活性物質の存在下に酸化発色型色原体と反応させ色素を生成させ、生成された色素を測定することにより、過酸化水素を測定することができる。また、化学発光物質を含む過酸化水素測定試薬を用いる場合には、過酸化水素を、化学発光物質と反応させフォトンを生じ、生じたフォトンを測定することにより、過酸化水素を測定することができる。
【０１１６】
酸化カップリング型色原体は、パーオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、過酸化水素と反応し、酸化カップリング反応により色素を生成する色原体である。酸化カップリング型色原体の具体例は、４−アミノアンチピリン等のカップラー、フェノール系又はアニリン系水素供与体等が挙げられる。カップラーとフェノール系又はアニリン系水素供与体化合物とは、過酸化水素及び過酸化活性物質の存在下、酸化カップリングし、色素を生成する。
【０１１７】
カップラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン(4-AA)、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン等が挙げられる。
【０１１８】
フェノール系水素供与体としては、フェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸(HTIB)等が挙げられる。
【０１１９】
アニリン系水素供与体としては、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン(TOOS)、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン(MAOS)、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン(DAOS)、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン(TOPS)、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン(HDAOS)、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ'−サクシニルエチレンジアミン(EMSE)、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ'−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン(F-DAOS)、Ｎ−［２−（サクシニルアミノ）エチル］−２−メトキシ−５−メチルアニリン(MASE)、Ｎ−エチル−Ｎ−［２−（サクシニルアミノ）エチル］−２−メトキシ−５−メチルアニリン(Et-MASE)等が挙げられる。
【０１２０】
ロイコ型色原体は、パーオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、過酸化水素と反応し、単独で色素を生成する色原体である。具体的には、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン(CCAP)、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン(MCDP)、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４'−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩(DA-64)、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン ナトリウム塩(DA-67)、４，４'−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン(BCMA)、Ｎ，Ｎ，Ｎ',Ｎ',Ｎ'',Ｎ''−ヘキサ−３−スルホプロピル−４，４'，４''−トリアミノトリフェニルメタン(TPM-PS)、ジアミノベンチジン、ヒドロキシフェニルプロピオン酸、テトラメチルベンチジン、オルトフェニレンジアミン等が挙げられる。
【０１２１】
過酸化水素の測定において、過酸化活性物質の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はないが、過酸化活性物質としてパーオキシダーゼを用いる場合は、1〜100 U/mLが好ましく、2〜50 U/mLがより好ましい。また、酸化発色型色原体の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、0.01〜10 g/Lが好ましく、0.02〜5 g/Lがより好ましい。
【０１２２】
過酸化水素を、過酸化水素電極を用いて測定する場合、使用する電極は過酸化水素との間で電子を授受する材料である限り特に制限されないが、例えば白金、金若しくは銀等が挙げられる。測定方法としてはアンペロメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリー等の公知の方法を用いることができる。オキシダーゼ又は基質と電極との間の反応に電子伝達体を介在させ、得られる酸化、還元電流或いはその電気量を測定することもできる。
【０１２３】
電子伝達体としては、電子伝達機能を有する任意の物質が使用可能であり、例えばフェロセン誘導体、キノン誘導体等の物質が挙げられる。またオキシダーゼ反応により生成される過酸化水素と電極の間に電子伝達体を介在させ得られる酸化、還元電流又はその電気量を測定することができる。
【０１２４】
工程（ii）においては、過酸化水素と共に糖オソン（α−ケトアルデヒド体）が生成されるので、生成された糖オソン（α−ケトアルデヒド体）を測定することによっても、試料中の糖化ヘモグロビンを測定することができる。α−ケトアルデヒド体にグルコースオキシダーゼを作用させて生成される過酸化水素を併せて測定することにより、高感度に測定することができる（特開２０００−３３３６９６）。
【０１２５】
（試料の調製方法）
測定すべき糖化蛋白質を含む試料は、必要に応じて生体試料から分離することができる。分離方法としては、遠心、濾過、血球分離膜を用いた方法等が挙げられる。例えば遠心による分離方法は、全血液を血球、血漿もしくは血清に分離することができる。必要に応じて、該血球を生理食塩水等の等張液で洗浄することで、血漿由来の成分を除去した洗浄血球を得ることもできる。
【０１２６】
試料として血球を用いる場合は、全血液、血球、洗浄血球等の血球を含む試料を低張液で希釈して溶血することができる。低張液としては、血球を溶血させることができれば如何なる溶液でもよいが、水、緩衝液等が挙げられ、界面活性剤等の添加剤を含むのが好ましい。界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤等が挙げられる。
【０１２７】
洗浄血球の調製方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
健常人及び糖尿病患者から血液を採取、転倒混和後、25℃で5分間、遠心分離(3,000 rpm)を行う。遠心分離後、上澄みの血漿は除去する。下層部分の血球層１容に対して、４容の生理食塩水を追加し、転倒混和後、25℃で5分間、遠心分離(3,000 rpm)を行う。遠心分離後、上澄みの生理食塩水を除去する。この洗浄操作を３回繰り返した後、洗浄された血球層１容に対して９容の蒸留水を添加し、洗浄血球を得ることができる。
【０１２８】
（糖化ヘモグロビン測定用試薬及び測定用キット）
本発明の糖化ヘモグロビン測定用試薬及び測定用キットは、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法に使用することができる。本発明の糖化ヘモグロビン測定用試薬は、保存、運搬、流通に適した形態として、キットの形態をとり得る。キットの形態としては、２試薬系、３試薬系等が挙げられる。
【０１２９】
本発明の糖化ヘモグロビン測定用試薬は、プロテアーゼ、及び、本発明の蛋白質を含む。さらに、本発明の糖化ヘモグロビン測定用試薬は、本発明の蛋白質と、糖化ヘモグロビンから生成される糖化ヘキサペプチドとの反応により生成される生成物を測定するための試薬を含んでもよい。本発明の蛋白質と、糖化ヘモグロビンから生成される糖化ヘキサペプチドとの反応により生成される生成物としては、過酸化水素、糖オソン（α−ケトアルデヒド体）、ペプチド（Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu）等が挙げられる。本発明の蛋白質と、糖化ヘモグロビンから生成される糖化ヘキサペプチドとの反応により生成される生成物を測定するための試薬としては、例えば過酸化水素測定用試薬、糖オソン（α−ケトアルデヒド体）測定用試薬、ペプチド（Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu）測定用試薬等が挙げられるが、過酸化水素測定用試薬が好ましい。
【０１３０】
本発明の測定すべき糖化ヘモグロビン測定用キットとしては、例えば以下の態様のキットが挙げられる。
・キット１（２試薬系キット）
以下の２つの試薬を含むキット。
（１）プロテアーゼを含む試薬；
（２）本発明の蛋白質を含む試薬。
【０１３１】
・キット２（２試薬系キット）
以下の２つの試薬を含むキット：
（１）プロテアーゼを含む試薬；
（２）本発明の蛋白質、及び、本発明の蛋白質と糖化ヘモグロビンから生成される糖化ヘキサペプチドとの反応により生成される生成物を測定するための試薬を含む試薬。
【０１３２】
・キット３（２試薬系キット）
以下の２つの試薬を含むキット：
（１）プロテアーゼ、及び、本発明の蛋白質と糖化ヘモグロビンから生成される糖化ヘキサペプチドとの反応により生成される生成物を測定するための試薬を含む試薬；
（２）本発明の蛋白質を含む試薬。
【０１３３】
・キット４（２試薬系キット）
以下の２つの試薬を含むキット：
（１）プロテアーゼ、及び、本発明の蛋白質と糖化ヘモグロビンから生成される糖化ヘキサペプチドとの反応により生成される生成物を測定するための試薬を含む試薬；
（２）本発明の蛋白質、及び、本発明の蛋白質と糖化ヘモグロビンから生成される糖化ヘキサペプチドとの反応により生成される生成物を測定するための試薬を含む試薬。
【０１３４】
・キット５（３試薬系キット）
以下の３つの試薬を含むキット：
（１）プロテアーゼを含む試薬；
（２）本発明の蛋白質を含む試薬；及び、
（３）本発明の蛋白質と糖化ヘモグロビンから生成される糖化ヘキサペプチドとの反応により生成される生成物を測定するための試薬。
【０１３５】
・キット６（３試薬系キット）
以下の３つの試薬を含むキット：
（１）プロテアーゼ、及び、本発明の蛋白質と糖化ヘモグロビンから生成される糖化ヘキサペプチドとの反応により生成される生成物を測定するための試薬を含む試薬；
（２）本発明の蛋白質を含む試薬；並びに、
（３）本発明の蛋白質と糖化ヘモグロビンから生成される糖化ヘキサペプチドとの反応により生成される生成物を測定するための試薬。
【０１３６】
・キット７（３試薬系キット）
以下の３つの試薬を含むキット：
（１）プロテアーゼを含む試薬；
（２）本発明の蛋白質、及び、本発明の蛋白質と糖化ヘモグロビンから生成される糖化ヘキサペプチドとの反応により生成される生成物を測定するための試薬を含む試薬；並びに、
（３）本発明の蛋白質と糖化ヘモグロビンから生成される糖化ヘキサペプチドとの反応により生成される生成物を測定するための試薬。
【０１３７】
・キット８（３試薬系キット）
以下の３つの試薬を含むキット：
（１）プロテアーゼ、及び、本発明の蛋白質と糖化ヘモグロビンから生成される糖化ヘキサペプチドとの反応により生成される生成物を測定するための試薬を含む試薬；
（２）本発明の蛋白質、及び、本発明の蛋白質と糖化ヘモグロビンから生成される糖化ヘキサペプチドとの反応により生成される生成物を測定するための試薬を含む試薬；並びに、
（３）本発明の蛋白質と糖化ヘモグロビンから生成される糖化ヘキサペプチドとの反応により生成される生成物を測定するための試薬。
【０１３８】
本発明の測定用試薬及び測定用キットにおいて使用されるプロテアーゼ、本発明の蛋白質、糖化ヘモグロビン、本発明の蛋白質と糖化ヘモグロビンから生成される糖化ヘキサペプチドとの反応により生成される生成物を測定するための試薬としては、それぞれ、前述のものが挙げられる。
【０１３９】
本発明の蛋白質と糖化ヘモグロビンから生成される糖化ヘキサペプチドとの反応により生成される生成物を測定するための試薬が過酸化水素測定用試薬である場合、過酸化水素測定用試薬としては、例えば前述の過酸化水素測定用試薬等が挙げられる。過酸化水素測定用試薬として、酸化カップリング型色原体を用いる場合、カップラーと、フェノール系若しくはアニリン系水素供与体とは、同一の試薬中に含まれてもよいが、別々の試薬に含まれることが好ましい。
【０１４０】
本発明の測定用試薬及び測定用キットには、さらに、標準蛋白質等の測定用標準物質が含有されてもよい。
本発明の測定用試薬及び測定用キットには、必要に応じて、それぞれ緩衝剤、安定化剤、防腐剤、影響物質除去剤、非特異反応抑制剤、界面活性剤等が含有されてもよい。緩衝剤としては、例えば前述の緩衝剤等が挙げられる。安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シュークロース、塩化カルシウム、アミノ酸類、アルブミン、デキストラン、酢酸カルシウム等の塩類等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等が挙げられる。影響物質除去剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を消去するためのアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。非特異反応抑制剤としては、デキストラン硫酸等の高分子化合物等が挙げられる。界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤等が挙げられる。
【０１４１】
本発明の測定用試薬及び測定用キットは、凍結乾燥された状態でも、反応液に溶解された状態でもよい。凍結乾燥された状態のキットを用いる場合には、当該キットは前述の水性媒体又は反応液に溶解して使用することができる。凍結乾燥された状態のキットを用いる場合には、必要に応じて、該キットに凍結乾燥試薬を溶解するための試薬等が含有されてもよい。
【０１４２】
本発明の測定用キットにおけるプロテアーゼの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.01〜1,000,000 U/mLとなる含量が好ましく、0.1〜100,000 U/mLとなる含量がより好ましい。
本発明の測定キットにおける本発明の蛋白質の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.01〜10,000 U/mLとなる含量が好ましく、0.1〜1,000 U/mLとなる含量がより好ましい。
過酸化水素測定試薬としてパーオキシダーゼと酸化カップリング型色原体を含む試薬を使用する場合のキットにおけるパーオキシダーゼ及び該酸化カップリング型色原体の含量としては、それぞれ、水性媒体で溶解された状態での濃度が1〜600 U/mL、0.5〜40 g/Lとなる含量が好ましく、2〜150 U/mL、1〜20 g/Lとなる含量がより好ましい。
【０１４３】
（糖化ヘモグロビンの直接測定方法）
本発明の蛋白質には、糖化ヘモグロビンを直接酸化して、過酸化水素を生成させる活性（以下、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ活性という）を有するものを包含する。該糖化ヘモグロビンオキシダーゼ活性を有する蛋白質（以下、糖化ヘモグロビンオキシダーゼという）を用いることにより、糖化ヘモグロビンにプロテアーゼを作用させることなく、直接、糖化ヘモグロビンに本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼを作用させることにより、過酸化水素を生成させることができ、この過酸化水素を測定することにより、糖化ヘモグロビンを直接測定することができる。
【０１４４】
本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼとしては、糖化ヘモグロビンを直接酸化させる能力を有する糖化ヘキサペプチドオキシダーゼであればいかなるものでもよいが、例えば、以下の糖化ヘキサペプチドオキシダーゼが挙げられる。
［１］配列番号６〜３７のいずれかで表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［２］配列番号６〜３７で表わされるアミノ酸配列と９０％以上、例えば９４％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ糖化ヘモグロビンオキシダーゼ活性を有する蛋白質等が挙げられる。
【０１４５】
本発明の糖化ヘモグロビンの直接測定方法においては、糖化ヘモグロビンを含む試料を、糖化ヘモグロビンオキシダーゼと反応させる工程において、変性剤、又は、酸化剤を共存させてもよい。或いは、糖化ヘモグロビンを含む試料を予め、変性剤、又は、酸化剤で処理した後、当該処理された試料を、糖化ヘモグロビンオキシダーゼと反応させてもよい。変性剤、酸化剤としては、例えばそれぞれ前述の変性剤、酸化剤等が挙げられる。
【０１４６】
（糖化ヘモグロビンオキシダーゼ活性測定方法）
糖化ヘモグロビンオキシダーゼ活性は、例えば以下の方法で測定することができる。
【０１４７】
（活性測定用試薬）
A液: 0.1 mol/L MOPS緩衝液(pH6.8)
B液: 24 mmol/L DA-67のDMF溶液
C液: 1 kU/ パーオキシダーゼの0.01 mol/Lリン酸緩衝液(pH7.0)溶液
D液: 10 g/L ヒト血球由来溶血試料
E液: 5 g/L ヨウ素酸カリウム及び50%(v/v) アンヒトール20N (両性界面活性剤)の水溶液
F液: 0.5〜1.0 U/mL 糖化ヘモグロビンオキシダーゼの10 mmol/L リン酸緩衝液(pH7.0)溶液
【０１４８】
(測定手順)
(i) D液20 μLにE液2μLを混合し、37℃にて10〜30分間インキュベーションする。
(ii) A液 10 mLにB液12.6 μL、C液 35 μLを添加し、得られた溶液を1試料当たり190μLずつ96穴マイクロプレートに分注した後、D液とE液の混合液 20 μL、F液20 μLを加えて混合した。全自動マイクロプレートEIA分析装置により、混合直後の溶液の吸光度を660 nm(主波長)/750 nm(副波長)で測定し、次いで、37℃、60〜120分間加温して酵素反応を行い、得られた溶液の吸光度を660 nm(主波長)/750 nm(副波長)で測定し、酵素反応前後の吸光度変化を測定する。
【０１４９】
上記工程は、水性媒体中で行われても良い。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体（好ましくは緩衝液）等が挙げられ、緩衝液の濃度としては、例えば前述の緩衝液濃度が挙げられる。
【０１５０】
各工程の反応の反応温度としては、例えば10〜50℃、好ましくは20〜40℃であり、反応時間としては、1秒間〜120分間、好ましくは1〜90分間、特に好ましくは1〜60分間である。
【０１５１】
（糖化ヘモグロビン直接測定用試薬及び直接測定用キット）
本発明の糖化ヘモグロビン測定用試薬は、糖化ヘモグロビン直接測定用試薬を包含する。本発明の糖化ヘモグロビン直接測定用試薬は、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法に使用することができる。本発明の糖化ヘモグロビン直接測定用試薬を用いることにより、プロテアーゼを用いることなく、糖化ヘモグロビンを直接酸化して生成された物質又は消費された物質を測定することにより、糖化ヘモグロビンを測定することができる。本発明の糖化ヘモグロビン直接測定用試薬は、保存、運搬、流通に適した形態として、キットの形態を取り得る。キットの形態としては、２試薬系、３試薬系等が挙げられる。
【０１５２】
本発明の糖化ヘモグロビン直接測定用試薬は、本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼを含む。さらに、本発明の糖化ヘモグロビン直接測定用試薬は、本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼと、糖化ヘモグロビンとの反応により生成される生成物を測定するための試薬を含んでもよい。本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼと、糖化ヘモグロビンとの反応により生成される生成物としては、過酸化水素、糖オソン（α−ケトアルデヒド体）、ヘモグロビン等が挙げられる。本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼと、糖化ヘモグロビンとの反応により生成される生成物を測定するための試薬としては、例えば過酸化水素測定用試薬、糖オソン（α−ケトアルデヒド体）測定用試薬、ヘモグロビン測定用試薬等が挙げられ、過酸化水素測定用試薬が好ましい。
【０１５３】
本発明の糖化ヘモグロビン直接測定用キットとしては、例えば以下の態様のキットが挙げられる。
以下の２つの試薬を含むキット：
（１）糖化ヘモグロビンオキシダーゼを含む試薬；
（２）糖化ヘモグロビンオキシダーゼと、糖化ヘモグロビンとの反応により生成される生成物を測定するための試薬。
【０１５４】
本発明の直接測定用試薬及び直接測定用キットにおいて使用される、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ、及び、糖化ヘモグロビンオキシダーゼと糖化ヘモグロビンとの反応により生成される生成物を測定するための試薬としては、それぞれ、前述のものが挙げられる。
【０１５５】
本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼと糖化ヘモグロビンとの反応により生成される生成物を測定するための試薬が過酸化水素測定用試薬である場合、過酸化水素測定用試薬としては、例えば前述の過酸化水素測定用試薬等が挙げられる。過酸化水素測定用試薬として、酸化カップリング型色原体を用いる場合、カップラーと、フェノール系若しくはアニリン系水素供与体とは、同一の試薬中に含まれてもよいが、別々の試薬に含まれることが好ましい。
【０１５６】
本発明の直接測定用試薬及び直接測定用キットには、さらに、標準蛋白質等の測定用標準物質が含有されてもよい。
【０１５７】
本発明の直接測定用試薬及び直接測定用キットには、必要に応じて、それぞれ前述の緩衝剤、安定化剤、防腐剤、影響物質除去剤、非特異反応抑制剤、界面活性剤等が含有されてもよい。
【０１５８】
本発明の直接測定用試薬及び直接測定用キットは、凍結乾燥された状態でも、反応液に溶解された状態でもよい。凍結乾燥された状態のキットを用いる場合には、当該キットは前述の水性媒体又は反応液に溶解して使用することができる。凍結乾燥された状態のキットを用いる場合には、必要に応じて、該キットに凍結乾燥試薬を溶解するための試薬等が含有されてもよい。
【０１５９】
本発明の直接測定用キットにおける、糖化ヘモグロビンオキシダーゼの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.01〜1,000,000 U/mLとなる含量が好ましく、0.1〜100,000 U/mLとなる含量がより好ましい。
【０１６０】
過酸化水素測定試薬としてパーオキシダーゼと酸化カップリング型色原体を含む試薬を使用する場合のキットにおけるパーオキシダーゼ及び該酸化カップリング型色原体の含量としては、それぞれ、水性媒体で溶解された状態での濃度が1〜600 U/mL、0.5〜40 g/Lとなる含量が好ましく、2〜150 U/mL、1〜20 g/Lとなる含量がより好ましい。
【０１６１】
なお、本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書内に組み入れられる。
【実施例】
【０１６２】
以下に、実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、本実施例においては、下記メーカーの試薬、酵素及び機器を使用した。
リン酸二水素カリウム（和光純薬工業）、リン酸一水素カリウム（和光純薬工業）、DA-67（和光純薬工業社製）、パーオキシダーゼ（東洋紡社製）、α−糖化バリン（ペプチド研究所社製）、α−糖化ヘキサペプチド（ペプチド研究所社製）、MOPS（同仁化学研究所社製）、ジメチルホルムアミド（和光純薬工業社製）、ヨウ素酸カリウム（和光純薬工業社製）、４−アミノアンチピリン(4-AA)（和光純薬工業社製）、ＥＭＳＥ（ダイトーケミックス社製）、塩化マンガン四水和物（和光純薬工業社製）、イソプロピル−β−チオガラクトシド(IPTG)（ナカライテスク社製）、塩化カリウム（和光純薬工業社製）、イミダゾール（和光純薬工業社製）、トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩(Tris・HCl)（和光純薬工業社製）、Luria-Bertani miller培地（LB培地）（ベクトンディキンソン社製）、アンピシリンナトリウム（和光純薬工業社製）、KOD-plus-（ＤＮＡポリメラーゼ；東洋紡社製）、Dpn I（制限酵素；ニューイングランドバイオラボ社製）、Bgl II（制限酵素；ロシュアプライドサイエンス社製）、Xho I（制限酵素；ロシュアプライドサイエンス社製）、Competent high DH5α（大腸菌コンピテントセル；東洋紡社製）。【０１６３】
〔実施例1〕FPOX-15発現プラスミド及び大腸菌発現株の造成
（pTrc-FPOX-9発現プラスミドの取得）
寄託番号FERM BP-11026として寄託されている糖化ペプチドオキシダーゼFPOX-9発現大腸菌株XL1-Blue MRF'株を、50 mg/L アンピシリンを含有したLB培地 3 mLに植菌し、37℃で終夜振盪培養した。培養液を8,000 rpm、2分間の遠心分離することにより菌体を集めた。得られた菌体から、Promega社製「Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification」を使用して大腸菌体内において、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を有する糖化ペプチドオキシダーゼFPOX-9を発現する発現プラスミドpTrc-FPOX-9を抽出した。【０１６４】
上記プラスミドpTrc-FPOX-9を用いて、国際公開第2010/041715号パンフレットに記載された方法により、糖化ヘキサペプチドの部分構造であるα-FVHに対する反応特異性及び熱安定性に優れる、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-15を発現するpTrc-FPOX-15発現プラスミドを造成した。【０１６５】
（部位特異的アミノ酸置換方法）
pTrc-FPOX-15発現プラスミドをテンプレートDNAとし、変異の標的とするアミノ酸のコドンを、置換するアミノ酸に対応するコドンに入れ替えたプライマー対を用いて、以下の試薬組成及びPCR条件により、PCR産物(変異を含む発現プラスミド)を増幅した。PCRは、東洋紡社製のPCRキット、DNA polymerase「KOD-plus」のプロトコルに基づいて実施した。
(試薬組成)
・反応バッファー 
・テンプレートDNA 1〜2 ng/μL
・フォワードプライマー 0.3 μmol/L
・リバースプライマー 0.3 μmol/L
・dNTP 混合液 各 0.2 mmol/L
・MgSO4 1 mmol/L
・DNA ポリメラーゼ     0.02 U/μL
・滅菌水添加により、50 μLとした。
(PCR条件)
1. 94℃ 2分
2. 98℃ 15秒
3. 60℃ 30秒
4. 68℃ 6分
5. 2〜4の繰り返し（全30サイクル）
6. 68℃ 10分【０１６６】
PCR産物50 μLにニューイングランドバイオラボ社製「制限酵素Dpn I」1μLを添加し、37℃、1時間インキュベーションすることでテンプレートDNAを分解した。制限酵素処理したPCR産物をPromega社製「Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System」を用いて精製し、一部試料を用いて東洋紡社製の大腸菌コンピテントセル「Competent high DH5α」に形質転換した。50 mg/L アンピシリンを含有したLB寒天培地上に生育したコロニーを選択し、Promega社製「Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification」を使用してプラスミドを抽出した。【０１６７】
抽出したプラスミドをDNAシークエンサーで配列解析することにより、FPOX-15をコードする、配列番号３９で表わされる塩基配列からなるDNAを含むプラスミドが造成されていることを確認した。配列解析には、pTrc99aベクターのマルチクローニングサイト直前、直後の塩基配列を反映した配列番号８７及び８８でそれぞれ表わされる塩基配列からなるDNAを有するプライマー及び、配列番号３９で表わされる塩基配列を有するFPOX-15の塩基配列のうち530〜548番目の塩基配列である、配列番号８９で表わされる塩基配列からなるDNAを有するプライマーを使用した。【０１６８】
〔実施例2〕FPOX-15及び本発明の蛋白質の製造、並びに、FPOX-15及び本発明の蛋白質の糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性の測定
酵素改変過程において、有意な活性を認めた変異体については、国際公開第2010/041715号パンフレットに記載の糖化ペプチドオキシダーゼ、FPOX-15の発現、精製方法に従い精製試料を調製し、活性評価に供した。【０１６９】
本発明の蛋白質である糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ、及び、糖化ヘモグロビンオキシダーゼは、補酵素としてフラビンアデニンジヌクレオチド(以下、FADと記す)を含有するため、FADに特異的に由来する波長452 nmの吸光度を測定する以下の方法により、当該蛋白質濃度を測定することができる。
市販の糖化ペプチドオキシダーゼFPOX-CE(キッコーマン社製)を、10 mmol/L リン酸緩衝液を用いて希釈し、0.7、1.4、2.8、5.6及び11.2 mg/mLの各濃度のFPOX-CE溶液を調製した。調製した各濃度のFPOX-CE溶液について、GEヘルスケア社製分光光度計「Ultrospec 2100 pro」を用いて452 nm（主波長）/600 nm（副波長）での吸光度を測定し、FPOX-CE濃度と吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。試料として、FPOX-CE(キッコーマン社製)の希釈系列溶液の代わりに、精製蛋白質を用いる以外は同様の方法により、精製蛋白質に対する吸光度を測定した。測定した、精製蛋白質に対する吸光度を前記の検量線に照らし合わせることにより、精製蛋白質における蛋白質濃度を決定した。【０１７０】
取得した糖化ヘモグロビンオキシダーゼの糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性は、以下の試薬を用い、下記の測定手順により評価した。
（活性測定用試薬）
A液: 50 mmol/L リン酸緩衝液（pH7.0）
B液: 24 mmol/L DA-67のDMF溶液
C液: 1 kU/L パーオキシダーゼの10 mmol/L リン酸緩衝液 (pH7.0)
D液: 1 mmol/l α-F6P水溶液
E液: 0.1 mg/mL 本発明の糖化ヘキサペプチドオキシダーゼの10 mmol/L リン酸緩衝液(pH7.0) 溶液【０１７１】
(測定手順)
A液 10mLにB液 12.6μL、C液 35μLを添加し、得られた溶液を1試料当たり190μLずつ96穴プレートに分注した。D液20μL、E液10μLを加えて混合し、30℃で30分間反応を行った。全自動マイクロプレートEIA分析装置（AP-96、協和メデックス社製）により、反応前の溶液の660 nm(主波長)/750 nm(副波長)における吸光度Abs（反応前）及び反応後の660 nm(主波長)/750 nm(副波長)における吸光度Abs（反応後）を測定した。吸光度Abs（反応後）から吸光度Abs（反応前）を差し引いて、反応吸光度変化Δ'Abs（反応）とした。E液（蛋白質溶液）の代わりに蒸留水を用いる以外は同様の方法により、ブランク吸光度変化Δ'Abs（ブランク）を測定した。反応吸光度変化Δ'Abs（蛋白質溶液）からブランク吸光度変化Δ'Abs（ブランク）を差し引くことにより、反応吸光度ΔAbs（反応）とした。
そして前記の測定系において、D液の代わりに、種々の濃度の過酸化水素を用いて同様の反応を行い、反応後と反応前の660 nm(主波長)/750 nm(副波長)での吸光度変化を測定し、過酸化水素の濃度と吸光度変化との間の関係を表わす検量線を作成した。D液（基質液）とE液（蛋白質溶液）とを用いて酵素反応を行い、酵素反応に伴う吸光度変化を前記の検量線に照らし合わせて、酵素反応で生成した過酸化水素濃度を決定した。α-F6Pを基質として行う酵素反応において、１分間に１μmolの過酸化水素を生成させる酵素活性を１Ｕと定義した。先に決定した精製蛋白質濃度と、前記の通り定義された酵素活性とから、用いた精製蛋白質の活性を、精製酵素1 mg当たりの持つ活性である比活性(U/mg)として表した。また、用いた精製酵素の活性を、前記の比活性(U/mg)に基づいて、精製蛋白質溶液1 mL当たりの総活性である比活性(U/mL)として表した。【０１７２】
（部位特異的アミノ酸置換）
pTrc-FPOX-15及びこれより誘導される発現プラスミドをテンプレートDNAとし、実施例1に記載の方法により部位特異的アミノ酸置換を導入した。部位特異的飽和変異は、実施例1に記載の部位特異的アミノ酸置換導入方法と同様の方法により実施し、配列番号９０、９１で表わされる塩基配列に例示されるように、標的とするアミノ酸位置をNNSに入れ替えたプライマーを用いた。NはA、T、G、Cのいずれかのヌクレオチドを、SはG、Cのいずれかのヌクレオチドをランダムに含むことを示す。【０１７３】
作製した変異体糖化ペプチドオキシダーゼ及び変異体糖化ペプチドオキシダーゼライブラリーは以下の方法で評価した。アンピシリン50 mg/Lを含有するLB寒天培地プレートでの終夜培養で生育したコロニー（形質転換体）を選択した。それらをアンピシリン50 mg/Lを含有するLB培地100 μLを含む96穴マイクロプレートを用いて37℃で12時間振盪培養した。培養液2 μLにNovagen社製「BugBuster（登録商標） Protein Extraction Reagent (以下BugBusterと記す)」 10 μLを添加して溶菌し、遠心分離後、その上清液を試料とした。【０１７４】
作製した変異体糖化ペプチドオキシダーゼライブラリーに含まれる、変異体糖化ペプチドオキシダーゼのα−FVオキシダーゼ活性は、以下の試薬、測定手順により評価した。
(活性評価用試薬)
・50 mmol/L リン酸緩衝液(pH7.0)                                 10 mL
・10 g/L 4-AA 水溶液                                           100 μL
・10 g/L EMSE 水溶液                                           100 μL
・1 kU/L パーオキシダーゼの10 mmol/L リン酸緩衝液（pH7.0）溶液  35 μL
・80 mmol/L α-FV                                               62.5 μL
(測定手順)
評価用の試薬を100 μLずつ96穴マイクロプレートの各ウェルに分注し、さらに試料10 μLを添加し、30℃、30分間インキュベートした。インキュベート前後の550 nm(主波長)/650 nm(副波長)を測定し、吸光度変化がより大きいクローンを選択した。【０１７５】
有意なα−FV活性を有するクローンの培養液2 μLを、アンピシリン50 mg/Lを含有するLB培地200 μLを含む96穴マイクロプレートに添加し、37℃で2時間振盪培養した。培養後、10 mmol/L IPTG(ナカライテスク社製) 2 μLを添加し、さらに37℃で5時間振盪培養した。培養後、遠心分離により集菌した。得られた菌体にBugBuster 20 μLを添加し、溶菌、遠心分離後、その上清液を試料として糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を測定した。【０１７６】
変異体スクリーニングにおいて、α−F6Pに対する糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性は、以下の試薬、測定手順を用いて評価した。
(活性評価用試薬)
・50 mmol/L リン酸緩衝液(pH7.0)                                 10 mL
・24 mmol/L DA-67のDMF溶液                                     12.6 μL
・1 kU/L パーオキシダーゼの10 mmol/L リン酸緩衝液（pH7.0）溶液  35 μL
・0.25 mmol/L α-F6P水溶液                                      720 μL
(測定手順)
活性評価用試薬を30 μLずつ384穴プレートに分注し、試料5 μLを添加し、30℃、1時間インキュベーションした。インキュベーション後に各ウェルを観察し、有意に発色が強いクローンを選択した。【０１７７】
一方、各形質転換体からプラスミドを調製し、FPOX遺伝子部分の塩基配列を、実施例1記載の方法に従ってDNAシークエンサーを用いて確認した。酵素活性の変化と塩基配列（アミノ酸配列）の変化を関連づけた。【０１７８】
FPOX-15を発現するプラスミドpTrc-FPOX-15に対して、配列番号９０及び９１で表される塩基配列からなるDNAを有するプライマー対を用いて部位特異的飽和変異を導入した。この部位特異的飽和変異が導入されたプラスミドを用いて、FPOX-15の61番目のアルギニンが、アルギニン以外の19種類のアミノ酸に置換された蛋白質からなる変異体群を作製した。作製した変異体群をα-FV及びα-F6P活性を指標に評価した結果、表１に示すように各変異体の糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性が顕著に向上することが分かった。変異体群の内、特に61番目がグリシンに置換された変異体(以下、FPOX-16と称する)でFPOX-15のα-F6P活性と比較して63.9倍、セリンに置換された変異体(以下、FPOX-17と称する)で67.7倍 、糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性が増加した。配列番号3、4にそれぞれFPOX-16、FPOX-17のアミノ酸配列を示す。【０１７９】
【表１】
2015005258.tif 000002
【０１８０】
次にFPOX-16において、63番目のアルギニンを標的として配列番号９２及び９３で表わされる塩基配列からなるDNAを有するプライマー対を用いた、部位特異的飽和変異導入により変異体ライブラリーを作製し、α-FV及びα-F6Pに対するオキシダーゼ活性を指標に評価した結果、アラニン、プロリンまたはグリシンに置換した変異体を得た。表２に示すように、上記変異体はα-F6Pに対する糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性がFPOX-16と比較して2〜2.7倍増加し、特にアラニンへの置換により糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性が最も増加した。【０１８１】
【表２】
2015005258.tif 000003
【０１８２】
FPOX-16における部位特異的飽和変異導入で作製された変異体ライブラリーを用いたスクリーニングにより、糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性の向上が確認された、63番目のアルギニンのアラニンへの置換を、配列番号９４及び９５で表わされる塩基配列からなるDNAを有するプライマー対を用いてFPOX-17に導入し、FPOX-17のアミノ酸配列の63番目のアルギニンがアラニンに置換された変異体を得た。次に糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性の増加に寄与することが明らかになった61、63番目アミノ酸の間に位置する６２番目のロイシンを配列番号９６及び９７で表わされる塩基配列からなるDNAを有するプライマー対を用いた飽和変異により、部位特異的飽和変異導入により変異体ライブラリーを作製し、α-FV及びα-F6Pに対するオキシダーゼ活性を指標に評価し、グリシンに置換した変異体（以下、FPOX-18と称する）を得た。表３に示すように以上の変異によりα-F6Pに対するオキシダーゼ活性がFPOX-17と比較して２．８倍増加した。配列番号4、5にそれぞれFPOX-17、FPOX-18のアミノ酸配列を示す。【０１８３】
【表３】
2015005258.tif 000004
【０１８４】
部位特異的アミノ酸置換により、FPOX-18の９３番目グルタミンを配列番号９８及び９９で表わされる塩基配列からなるDNAを有するプライマー対を用いて、グルタミン酸に置換した変異体を、２６７番目のフェニルアラニンを配列番号１００及び１０１で表わされる塩基配列からなるDNAを有するプライマー対を用いて、チロシンに置換した変異体を得た。表４に示すように、α-F6Pに対する糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性がFPOX-18と比較してそれぞれ1.3、1.5倍増加した。【０１８５】
【表４】
2015005258.tif 000005
【０１８６】
次に、pTrc-FPOX-18をテンプレートDNAとして、糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を指標としたランダム変異導入を検討した。【０１８７】
（ランダム変異検討用プラスミドの造成）
まずFPOX-18をコードするDNAを含むプラスミドpTrc-FPOX-18を実施例1と同様の方法により取得し、当該プラスミドをテンプレートDNAとし、実施例1の部位特異的アミノ酸置換導入と同様の方法により、配列番号１０２及び１０３で表わされる塩基配列からなるDNAを有するプライマー対を用いて、FPOX-18遺伝子の168番目のアデニンをグアニンに置換することにより、アミノ酸置換を伴わずにBgl II制限酵素サイトを導入した。得られた改変プラスミドをpTrc-FPOX-18'と称する。【０１８８】
ランダム変異はpTrc-FPOX-18'に含まれるFPOX遺伝子の、58から119番目のアミノ酸に相当する領域を増幅するように設計した配列番号１０２及び１０４で表わされる塩基配列からなるDNAを有するプライマー対を用いて、以下の試薬組成、PCR条件を用いたPCRにより、ランダムに塩基置換をおこなった。なお、PCRは、東洋紡社製のPCRキット「rTaq DNA polymerase」のプロトコルを一部改変して、Error Prone PCRにより行った。
(試薬組成)
・反応バッファー
・テンプレートDNA 0.2 ng/μL
・フォワードプライマー 1 μmol/L
・リバースプライマー 1 μmol/L
・MgCl2 7 mmol/L
・MnCl2 0.5 mmol/L 
・dATP 0.2 mmol/L
・dTTP 1 mmol/L
・dGTP 0.1 mmol/L
・dCTP 1 mmol/L
・DNA ポリメラーゼ 0.04 U/μL
(PCR条件)
1. 94℃ 3分
2. 94℃ 30秒
3. 50℃ 30秒
4. 72℃ 30秒
5. 2〜4の繰り返し（全45サイクル）
6. 72℃ 1分【０１８９】
ランダムな塩基置換を含むPCR産物を制限酵素Bgl IIとXho Iで切断後、「Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System」で精製し、消化産物を得た。同制限酵素で処理したpTrc-FPOX-18'に、前記消化産物を、タカラバイオ社製「DNA Ligation Kit Mighty Mix」を使用してライゲーションし、E. coli  DH5α株を形質転換した。【０１９０】
pTrc-FPOX-18'をテンプレートDNAとしてランダム変異を試みた結果、配列番号5で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-18のアミノ酸配列の71番目のチロシンがシステインに置換された、配列番号6で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-18Aを発現するプラスミドpTrc-FPOX-18Aを得た。また、pTrc-FPOX-18'をテンプレートDNAとして、配列番号１０５及び１０６で表わされる塩基配列からなるDNAを有するプライマー対を用いた部位特異的飽和変異導入により作製した変異体群を、α-FV及びα-F6Pに対するオキシダーゼ活性を指標として評価し、配列番号5で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-18のアミノ酸配列の71番目のチロシンがセリンに置換された、配列番号7で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-18Bを発現するプラスミドpTrc-FPOX-18Bを得た。【０１９１】
ランダム変異で糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性の増加が認められた、配列番号5で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-18のアミノ酸配列の115番目のアスパラギン酸を標的とし、pTrc-FPOX-18BをテンプレートDNAとして、配列番号１０７及び１０８で表わされる塩基配列からなるDNAを有するプライマー対を用いた部位特異的飽和変異導入により作製した変異体群を、α-FV及びα-F6Pに対するオキシダーゼ活性を指標として評価し、配列番号7で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-18Bのアミノ酸配列の115番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換された、配列番号8で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-18Cを発現するプラスミドpTrc-FPOX-18C、及び、配列番号7で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-18Bのアミノ酸配列の115番目のアスパラギン酸がアルギニンに置換された、配列番号9のアミノ酸配列で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-18Dを発現するプラスミドpTrc-FPOX-18Dを得た。【０１９２】
さらに、ランダム変異で糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性の増加が認められた、配列番号5で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-18のアミノ酸配列の108番目のメチオニンを標的とし、pTrc-FPOX-18DをテンプレートDNAとして、配列番号１０９及び１１０で表わされる塩基配列からなるDNAを有するプライマー対を用いた部位特異的飽和変異導入により作製した変異体群を、α-FV及びα-F6Pに対するオキシダーゼ活性を指標として評価し、配列番号9のアミノ酸配列で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-18Dのアミノ酸配列の108番目のメチオニンがリジンに置換された、配列番号10で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-19を発現するプラスミドpTrc-FPOX-19を得た。【０１９３】
また、pTrc-FPOX-19をテンプレートDNAとして、配列番号１１１及び１１２で表わされる塩基配列からなるDNAを有するプライマー対を用いた部位特異的アミノ酸置換導入により、配列番号10で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-19のアミノ酸配列の75番目のロイシンがアラニンに置換された、配列番号11で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-20を発現するプラスミドpTrc-FPOX-20を得た。【０１９４】
上記で得られた6種類の組換え蛋白質発現プラスミドを、大腸菌DH5α株に形質転換し、組換え蛋白質発現大腸菌株を作製した。
各組換え蛋白質発現大腸菌株を用い、国際公開第2010/041715号パンフレット記載の糖化ペプチドオキシダーゼFPOX-15の発現、精製方法に従って精製蛋白質を調製し、それぞれの蛋白質のα-F6Pに対する糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を評価した。【０１９５】
表５に示すように、FPOX-18A、FPOX-18B、FPOX-18C、FPOX-18D、FPOX-19及びFPOX-20それぞれの蛋白質の糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性は、FPOX-18の糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性に比較して、6.0〜38.0倍と増加しており、また、FPOX-15の糖化ヘキサププチドオキシダーゼ活性に比較して、190〜7240倍にまで増加した。【０１９６】
【表５】
2015005258.tif 000006
【０１９７】
〔実施例3〕アミノ酸変異導入による糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性の強化
実施例2で作製したpTrc-FPOX-19をテンプレートDNAとして、配列番号１１３及び１１４で表わされる塩基配列からなるDNAを有するプライマー対を用いた部位特異的アミノ酸置換導入により、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-19のアミノ酸配列の75番目のロイシンがフェニルアラニンに置換された、配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-21を発現するプラスミドpTrc-FPOX-21を得た。【０１９８】
pTrc-FPOX-21をテンプレートDNAとして、糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を指標としたError Prone PCRによるランダム変異導入を検討した。
Error Prone PCRによるランダム変異は、pTrc-FPOX-21に含まれる、蛋白質をコードする遺伝子の、1から１１９番目のアミノ酸に相当する領域を増幅するように設計した配列番号８７及び１０４で表わされる塩基配列からなるDNAを有するプライマー対を用いて行った。当該ランダム変異により、ランダムに変異が導入されたDNAを増幅産物として得た。ランダムに変異が導入されたDNAからなる当該増幅産物を制限酵素Nco I及びXho Iで処理し、得られたフラグメントを、前記制限酵素で処理したpTrc-FPOX-18'上の相当する領域に置換する操作の他は、実施例2と同様の方法により、変異が導入されたDNAを含有するプラスミドを得た。得られたプラスミドに対して、当該プラスミドから発現される変異体群を、α-FV及びα-F6Pに対するオキシダーゼ活性を指標として評価した。その結果、FPOX-21と比較して、α-F6Pに対するオキシダーゼ活性が向上している蛋白質を発現するプラスミドとして、以下のプラスミドを得た。【０１９９】
・配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-21のアミノ酸配列の３４番目のセリンがスレオニンに置換された、配列番号１３で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-22を発現するプラスミドpTrc-FPOX-22；
・FPOX-21のアミノ酸配列の５２番目のチロシンがヒスチジンに置換された、配列番号１４で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-23を発現するプラスミドpTrc-FPOX-23；
・FPOX-21のアミノ酸配列の５７番目のイソロイシンがバリンに置換された、配列番号１５で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-24を発現するプラスミドpTrc-FPOX-24；
・FPOX-21のアミノ酸配列の６６番目のプロリンがヒスチジンに置換された、配列番号１６で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-25を発現するプラスミドpTrc-FPOX-25；
・FPOX-21のアミノ酸配列の９５番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換された、配列番号１７で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-26を発現するプラスミドpTrc-FPOX-26；
・FPOX-21のアミノ酸配列の１０５番目のリジンがアルギニンに置換された、配列番号１８で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-27を発現するプラスミドpTrc-FPOX-27；
・FPOX-21のアミノ酸配列の１０８番目のリジンがアルギニンに置換された、配列番号１９で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-28を発現するプラスミドpTrc-FPOX-28；
・FPOX-21のアミノ酸配列の３５５番目のアラニンがセリンに置換された、配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-29を発現するプラスミドpTrc-FPOX-29；
・FPOX-21のアミノ酸配列の６６番目のプロリンがヒスチジンに、９５番目のアスパラギン酸がグルタミン酸にそれぞれ置換された、配列番号２１で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-30を発現するプラスミドpTrc-FPOX-30；
・FPOX-21のアミノ酸配列の６６番目のプロリンがヒスチジンに、９５番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に、１０５番目のリジンがアルギニンにそれぞれ置換された、配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-31を発現するプラスミドpTrc-FPOX-31；
・FPOX-21のアミノ酸配列の６６番目のプロリンがヒスチジンに、９５番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に、１０５番目のリジンがアルギニンに、１０８番目のリジンがアルギニンにそれぞれ置換された、配列番号２３で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-32を発現するプラスミドpTrc-FPOX-32；
・FPOX-21のアミノ酸配列の３４番目のセリンがスレオニンに、６６番目のプロリンがヒスチジンに、９５番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に、１０５番目のリジンがアルギニンに、１０８番目のリジンがアルギニンにそれぞれ置換された、配列番号２４で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-33を発現するプラスミドpTrc-FPOX-33；
・FPOX-21のアミノ酸配列の５２番目のチロシンがヒスチジンに、６６番目のプロリンがヒスチジンに、９５番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に、１０５番目のリジンがアルギニンに、１０８番目のリジンがアルギニンにそれぞれ置換された、配列番号２５で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-34を発現するプラスミドpTrc-FPOX-34；
・FPOX-21のアミノ酸配列の５７番目のイソロイシンがバリンに、６６番目のプロリンがヒスチジンに、９５番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に、１０５番目のリジンがアルギニンに、１０８番目のリジンがアルギニンにそれぞれ置換された、配列番号２６で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-35を発現するプラスミドpTrc-FPOX-35；
・FPOX-21のアミノ酸配列の６６番目のプロリンがヒスチジンに、１０８番目のリジンがアルギニンにそれぞれ置換された、配列番号２７で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-36を発現するプラスミドpTrc-FPOX-36；
・FPOX-21のアミノ酸配列の６６番目のプロリンがヒスチジンに、１０５番目のリジンがアルギニンに、１０８番目のリジンがアルギニンにそれぞれ置換された、配列番号２８で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-37を発現するプラスミドpTrc-FPOX-37；
・FPOX-21のアミノ酸配列の６６番目のプロリンがヒスチジンに、３５５番目のアラニンがセリンにそれぞれ置換された、配列番号２９で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-38を発現するプラスミドpTrc-FPOX-38；
・FPOX-21のアミノ酸配列の６６番目のプロリンがヒスチジンに、９５番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に、３５５番目のアラニンがセリンにそれぞれ置換された、配列番号３０で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-39を発現するプラスミドpTrc-FPOX-39；
・FPOX-21のアミノ酸配列の６６番目のプロリンがヒスチジンに、１０５番目のリジンがアルギニンに、３５５番目のアラニンがセリンにそれぞれ置換された、配列番号３１で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-40を発現するプラスミドpTrc-FPOX-40；
・FPOX-21のアミノ酸配列の６６番目のプロリンがヒスチジンに、１０８番目のリジンがアルギニンに、３５５番目のアラニンがセリンにそれぞれ置換された、配列番号３２で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-41を発現するプラスミドpTrc-FPOX-41；
・FPOX-21のアミノ酸配列の６６番目のプロリンがヒスチジンに、１０５番目のリジンがアルギニンに、１０８番目のリジンがアルギニンに、３５５番目のアラニンがセリンにそれぞれ置換された、配列番号３３で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-42を発現するプラスミドpTrc-FPOX-42；
・FPOX-21のアミノ酸配列の３４番目のセリンがスレオニンに、６６番目のプロリンがヒスチジンに、１０５番目のリジンがアルギニンに、１０８番目のリジンがアルギニンに、３５５番目のアラニンがセリンにそれぞれ置換された、配列番号３４で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-43を発現するプラスミドpTrc-FPOX-43；
・FPOX-21のアミノ酸配列の５２番目のチロシンがヒスチジンに、６６番目のプロリンがヒスチジンに、１０５番目のリジンがアルギニンに、１０８番目のリジンがアルギニンに、３５５番目のアラニンがセリンにそれぞれ置換された、配列番号３５で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-44を発現するプラスミドpTrc-FPOX-44；
・FPOX-21のアミノ酸配列の５７番目のイソロイシンがバリンに、６６番目のプロリンがヒスチジンに、１０５番目のリジンがアルギニンに、１０８番目のリジンがアルギニンに、３５５番目のアラニンがセリンにそれぞれ置換された、配列番号３６で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-45を発現するプラスミドpTrc-FPOX-45；及び、
・FPOX-21のアミノ酸配列の６６番目のプロリンがヒスチジンに、９５番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に、１０５番目のリジンがアルギニンに、１０８番目のリジンがアルギニンに、３５５番目のアラニンがセリンにそれぞれ置換された、配列番号３７で表わされるアミノ酸配列を有するFPOX-46を発現するプラスミドpTrc-FPOX-46。【０２００】
上記で得られた２６種類のプラスミドを大腸菌DH5α株に導入し、変異体発現大腸菌株を作製した。作製した前記大腸菌株を用いて、国際公開第2010/041715号パンフレットに記載されている糖化ペプチドオキシダーゼFPOX-15の発現及び精製方法に従って、各変異体を精製し、得られた各精製変異体について、α-F6Pに対する糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を評価した。その結果、表６に示す様に、FPOX-21〜46の各変異体の糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性は、FPOX-19の糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性に比較して1.3〜4.7倍であり、また、FPOX-15の糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性に比較して7,000〜25,500倍であり、糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性が顕著に向上していることが判明した。【０２０１】
【表６】
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【０２０２】
〔実施例4〕糸状菌Aspergillus oryzae由来FPOX(AoFPOX)と本発明の蛋白質の糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性の比較
国際公開第2008/108385号パンフレットにおいて、α-F6Pに対してオキシダーゼ活性を有すると記載されている、配列番号38で表わされるアミノ酸配列を有する、Aspergillus oryzae RIB40由来のFPOX  (DOGAN-Datebase of genomes analyzed at NITE、http://www.bio.nite.go.jp/dogan/project/view/AOに登録されているAO090023000307、以下AoFPOXと称する)の糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性と、本発明のFPOX-19、FPOX-20、FPOX-32及びFPOX-42の各蛋白質の糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性とを比較した。【０２０３】
AoFPOXをコードする、配列番号７６で表わされる塩基配列からなるDNAを合成し、合成したDNAをpUC57のマルチクローニングサイト(MCS)に導入し、当該DNAを含むベクターpUC-AoFPOXを作製した。【０２０４】
(AoFPOX発現大腸菌株の作製)
pUC-AoFPOXをテンプレートDNAとし、配列番号１３２で表わされる塩基配列からなるDNAを有する、AoFPOXのcDNA配列の5'末端に相当する配列にNco I制限酵素サイト及び4-ヒスチジンタグを付加したプライマー、及び、配列番号１３３に表わされる塩基配列からなるDNAを有する、3'末端に相当する配列にBam HI制限酵素サイトを付加したプライマーを使用し、東洋紡社製PCRキット、DNA polymerase「KOD-plus」を使用して以下のPCR条件の下でPCRを行い、「N末4-ヒスチジンタグ付加AoFPOX」DNA断片を得た。得られたDNA断片を制限酵素Nco I、及び、Bam HIで処理し消化産物を得た。同様に制限酵素Nco I、及び、Bam HIで処理した発現ベクターpTrc99aに、前記の消化産物を、タカラバイオ社製「DNA Ligation Kit Mighty Mix」を使用してライゲーションし、E. coli  DH5α株を形質転換した。50mg/L アンピシリン含有LB寒天培地上で生育したコロニーからプラスミドを抽出し、配列解析によりAoFPOX遺伝子を含むクローンをAoFPOX組換え発現大腸菌株とした。【０２０５】
(試薬組成 (終濃度))
・反応バッファー
・テンプレートDNA 1〜2 ng/μL
・フォワードプライマー 0.3 μmol/L
・リバースプライマー 0.3 μmol/L
・dNTP 混合液 各0.2 mmol/L
・ MgSO4                1 mmol/L 
・DNA ポリメラーゼ 0.02 U/L
(PCR条件)
1. 94℃ 2分
2. 98℃ 15秒
3. 60℃ 30秒
4. 68℃ 2分
5. 2〜4の繰り返し（全30サイクル）
6. 68℃ 5分【０２０６】
（AoFPOX精製酵素の調製）
50 mg/Lアンピシリンを含有する200 mL LB培地に、上記で得られたAoFPOX組換え蛋白質発現大腸菌株を植菌し、37℃で振盪培養した。濁度がO.D.600で0.5に達した後、0.1 mol/L イソプロピル-β-チオガラクトシド(IPTG)水溶液を200 μL添加し、さらに37℃、5時間振盪培養した。培養後、8,000 rpm、10分間遠心分離することで菌体を得た。
菌体を10 mmol/Lイミダゾール、及び、0.4 mol/L 塩化カリウムを含有する50 mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.4) 10 mLに懸濁し、超音波破砕した。8,000 rpm、１０分間遠心分離して得られた上清を、0.8μmフィルターでろ過した試料を粗酵素液とした。【０２０７】
ニッケルキレーティングカラムによる精製
カラムにキアゲン社製「Ni-NTA Agarose」5 mLを充填し、上記緩衝液で平衡化した。粗酵素液をカラムに通塔させることでレジンにAoFPOX吸着させ、3倍量の同緩衝液で洗浄した後、0.5 mol/Lイミダゾール、0.4 mol/L 塩化カリウム含有50 mmol/Lリン酸緩衝液（ｐH7.４）で溶出した。AoFPOX画分を分取し、10 mmol/L リン酸緩衝液(pH7.0)に対して透析した。【０２０８】
実施例２で得られたFPOX-19及びFPOX-20、実施例３で得られたFPOX-32及びFPOX-42、並びに、AoFPOXの濃度は、実施例1記載の方法に従い、FPOXに含有されるFADの特異的な吸収を測定することにより決定した。【０２０９】
FPOX-19、FPOX-20、FPOX-32、FPOX-42、及び、AoFPOXの各蛋白質を用いて、下記の試薬及び測定手順により、各蛋白質の糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を測定した。
(活性測定用試薬)
A液: 50 mmol/L リン酸緩衝液 (pH7.0)
B液: 24 mmol/L DA-67のDMF溶液
C液: 1 kU/L パーオキシダーゼの10 mmol/L リン酸緩衝液(pH7.0) 溶液
D液: 1 mmol/L α-F6P水溶液
E液: 0.1〜10 mg/mL 糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ (AoFPOX、FPOX-19、FPOX-20、FPOX-32又はFPOX-42)の10 mmol/L リン酸緩衝液 (pH7.0) 溶液【０２１０】
(測定手順)
A液 10 mLにB液 12.6 μL、C液 35 μLを添加し、得られた溶液を1試料当たり190μLずつ96穴マイクロプレートの各ウェルに分注した。D液20 μL、E液10 μLを加えて混合し、30℃で30分間反応を行った。全自動マイクロプレートEIA分析装置（AP-96、協和メデックス社製）により、反応前の溶液の660 nm(主波長)/750 nm(副波長)における吸光度Abs（反応前）及び反応後の溶液の660 nm(主波長)/750 nm(副波長)における吸光度Abs（反応後）を測定した。吸光度Abs（反応後）から吸光度Abs（反応前）を差し引いて、反応吸光度変化Δ'Abs（反応）とした。E液（蛋白質溶液）の代わりに蒸留水を用いる以外は同様の方法により、ブランク吸光度変化Δ'Abs（ブランク）を測定した。反応吸光度変化Δ'Abs（反応）からブランク吸光度変化Δ'Abs（ブランク）を差し引くことにより、蛋白質に対する反応吸光度ΔAbs（反応）とした。得られた吸光度ΔAbs（反応）から、実施例2記載の方法に従い、各蛋白質における糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性の比活性(U/mg)を算出した。【０２１１】
表７に示すように、AoFPOXの糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性はFPOX-20の糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性の0.5%程度であり、本発明のFPOX-19、FPOX-20、FPOX-32及びFPOX-42の糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性は国際公開公報2008/108385号パンフレット記載の糖化ペプチドオキシダーゼAoFPOXと比べて顕著に高かった。【０２１２】
【表７】
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【０２１３】
〔実施例5〕 V8プロテアーゼと本発明の蛋白質とを用いたHbA1cの測定
血球を試料とし、本発明の蛋白質、FPOX-19、FPOX-32又はFPOX-42と、V8プロテアーゼとを使用して、以下の方法により溶血試料中のHbA1cを測定した。【０２１４】
下記試薬及び測定手順により、試料中のHbA1cをV8プロテアーゼで処理し、生成されたα-F6Pと、FPOX-19、FPOX-32及びFPOX-42の各蛋白質との反応により得られる吸光度変化を測定した。
（活性測定用試薬）
A液: 0.1 mol/L MOPS緩衝液(pH6.8)
B液: 24 mmol/L DA-67のDMF溶液
C液: 1 kU/L パーオキシダーゼの10 mmol/L リン酸緩衝液(pH7.0) 溶液
D液: ヒト血球由来溶血試料［ヘモグロビン濃度が 10 mg/mLでHPLC法（KO500法）とヘモグロビン-SLS法とからHbA1c濃度が9.8、11.1、12.3、13.3、14.5、15.4、17.9、23.3 μmol/Lとそれぞれ値付けされているもの］。
E液: 8g/L ヨウ素酸カリウム及び10%(v/v)アンヒトール20Nの100 mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 溶液
F液: 80 U/mL V8プロテアーゼの20%グリセロール溶液
G液:10 mg/mL糖化ヘキサペプチドオキシダーゼの10 mmol/L リン酸緩衝液(pH7.0) 溶液
なお、ヘモグロビン-SLS法によるヘモグロビン濃度測定においては、ヘモグロビンB-テストワコーを使用した。【０２１５】
(測定手順)
(i) D液40μLにE液4μLを添加して混合し、次いで、F液4.4μLを添加し、37℃、15分間インキュベートした。
(ii) A液 10 mLにB液 12.6 μL、C液 35 μLを添加し、得られた溶液を1試料当たり190 μLずつ96穴マイクロプレートの各ウェルに分注した。上記(i)で調製した血球処理液20 μL、及び、G液10 μLを加えて混合し、37℃で15分間反応させた。
全自動マイクロプレートEIA分析装置（AP-96、協和メデックス社製）により、反応前の溶液の660 nm(主波長)/750 nm(副波長)における吸光度Abs（反応前）及び反応後の660 nm(主波長)/750 nm(副波長)における吸光度Abs（反応後）を測定した。吸光度Abs（反応後）から吸光度Abs（反応前）を差し引いて、反応吸光度変化Δ'Abs（反応）とした。D液（ヒト血球由来溶血試料）の代わりに蒸留水を用いる以外は同様の方法により、ブランク吸光度変化Δ'Abs（ブランク）を測定した。反応吸光度変化Δ'Abs（反応）からブランク吸光度変化Δ'Abs（ブランク）を差し引くことにより、ヒト血球由来溶血試料に対する反応吸光度ΔAbs（反応）とした。各ヒト血球由来溶血試料に対して同様の反応を行い、各ヒト血球由来溶血試料に対する反応吸光度ΔAbs（反応）を測定した。【０２１６】
その結果、図１〜図３に示す様に、HPLC法及びヘモグロビン-SLS法により決定されたHbA1c濃度と、上記測定により得られた各ヒト血球由来溶血試料に対する反応吸光度ΔAbs（反応）との間に良好な直線性が認められた。
この結果より、HbA1cからα-F6Pを切り出すV8プロテアーゼと本発明の蛋白質とを使用することにより、試料中のHbA1cを測定できることが分かった。【０２１７】
〔実施例6〕本発明の蛋白質の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ活性の測定
実施例2で得られたFPOX-18A、FPOX-18B、FPOX-19及びFPOX-20、実施例3で得られたFPOX-32及びFPOX-42、並びに、FPOX-15を用い、下記の試薬及び測定手順により糖化ヘモグロビンオキシダーゼ活性を測定した。
（活性測定用試薬）
A液: 0.1 mol/L MOPS緩衝液(pH6.8)
B液: 24 mmol/L DA-67のDMF溶液
C液: 1 kU/L パーオキシダーゼの10 mmol/L リン酸緩衝液(pH7.0)溶液
D液: ヒト血球由来溶血試料［ヘモグロビン濃度が10 mg/ mLで、 HPLC法（KO500法）とヘモグロビン-SLS法とからHbA1c濃度が84.2 μmol/Lと値付けされているもの］
E液: 5 g/L ヨウ素酸カリウム及び50%（v/v）アンヒトール20Nの水溶液
F液: 30 mg/mL糖化ヘモグロビンオキシダーゼ（FPOX-18A、FPOX-18B、FPOX-19、FPOX-20、FPOX-32、FPOX-42、FPOX-15）の10 mmol/L リン酸緩衝液(pH7.0) 溶液【０２１８】
(測定手順)
(i) D液20 μLにE液2μLを混合し、37℃にて10分間インキュベーションした。
(ii) A液 10 mLにB液12.6 μL、C液 35 μLを添加した溶液を、1試料当たり190 μLずつ96穴マイクロプレートの各ウェルに分注した後、D液とE液の混合液 20 μL、F液10 μLを加えて混合し、37℃で60分間反応させた。
全自動マイクロプレートEIA分析装置（AP-96、協和メデックス社製）により、反応前の溶液の660 nm(主波長)/750 nm(副波長)における吸光度Abs（反応前）及び反応後の660 nm(主波長)/750 nm(副波長)における吸光度Abs（反応後）を測定した。吸光度Abs（反応後）から吸光度Abs（反応前）を差し引いて、反応吸光度変化Δ'Abs（反応）とした。F液（酵素液）の代わりにpH7.0、10 mmol/Lリン酸緩衝液を用いる以外は同様の方法により、酵素液由来のブランクである吸光度変化Δ'Abs（酵素液ブランク）を測定した。また、D液（ヒト血球由来溶血試料）の代わりに蒸留水を用いる以外は同様の方法により、ヒト血球由来溶血試料由来のブランクである吸光度変化Δ'Abs（溶血試料ブランク）を測定した。
反応吸光度変化Δ'Abs（反応）からΔ'Abs（酵素液ブランク）とΔ'Abs（溶血試料ブランク）を差し引くことにより、蛋白質に対する反応吸光度ΔAbs（反応）を測定した。表８にFPOX-15、FPOX-18A、FPOX-18B、FPOX-19、FPOX-20、FPOX-32及びFPOX-42の各蛋白質に対する反応吸光度ΔAbs（反応）を示す。【０２１９】
表８に示す通り、FPOX-15ではΔAbsが検出限界以下であるのに対して、FPOX-18A、FPOX-18B、FPOX-19、FPOX-20、FPOX-32及びFPOX-42ではΔAbsがそれぞれ0.017、0.021、0.054、0.080、0.235及び0.246であり、FPOX-18A、FPOX-18B、FPOX-19、FPOX-20、FPOX-32及びFPOX-42を用いることにより、当該酵素とHbA1cとの反応が進行し、過酸化水素が発生することが分かった。【０２２０】
【表８】
2015005258.tif 000009
【０２２１】
〔実施例7〕本発明の蛋白質を用いる糖化ヘモグロビンの測定方法と、HPLC法及びヘモグロビン-SLS法を用いる糖化ヘモグロビンの測定方法との間の相関性
実施例2で得られたFPOX-19及びFPOX-20、並びに、実施例3で得られたFPOX-32及びFPOX-42の各蛋白質を用いる本発明のHbA1c測定方法と、HPLC法(KO500法)及びヘモグロビン-SLS法とを用いるHbA1c測定方法との間の相関性を、以下の試薬及び測定手順により確認した。【０２２２】
（活性測定用試薬）
A液: 0.1 mol/L MOPS緩衝液(pH6.8)
B液: 24 mmol/L DA-67のDMF溶液
C液: 1 kU/L パーオキシダーゼの10 mmol/L リン酸緩衝液(pH7.0)
D液: ヒト血球由来溶血試料［ヘモグロビン濃度が10mg/mLで、HPLC法（KO500法）とヘモグロビン-SLS法とからHbA1c濃度が9.8、11.1、12.3、13.3、14.5、15.4、17.9、23.3 μmol/Lと値付けされているもの］
E液: 5 g/L ヨウ素酸カリウム及び50%(v/v)アンヒトール20Nの水溶液
F液: 30 mg/mL 糖化ヘモグロビンオキシダーゼ（FPOX-19、FPOX-20、FPOX-32又はFPOX-42）の10 mmol/L リン酸緩衝液(pH7.0) 溶液【０２２３】
(測定手順)
(i) D液40μLにE液4μLを混合し、37℃にて10分間インキュベーションした。
(ii) A液 10 mLにB液12.6 μL、C液 35 μLを添加した溶液を、1試料当たり190 μLずつ96穴マイクロプレートの各ウェルに分注した後、D液とE液の混合液 20 μL、及び、F液10 μLを加えて混合し、37℃で60分間反応させた。
全自動マイクロプレートEIA分析装置（AP-96、協和メデックス社製）により、反応前の溶液の660 nm(主波長)/750 nm(副波長)における吸光度Abs（反応前）及び反応後の660 nm(主波長)/750 nm(副波長)における吸光度Abs（反応後）を測定した。吸光度Abs（反応後）から吸光度Abs（反応前）を差し引いて、反応吸光度変化Δ'Abs（反応）とした。
HbA1c濃度が既知である２つのヒト血球由来溶血試料（ヘモグロビン濃度が10 mg/mLで、HbA1c濃度がそれぞれ9.82μmol/L、24.2μmol/Lである試料）を用いて同様の測定を行い、HbA1c濃度と反応吸光度ΔAbs（反応）との間の関係を示す検量線を作成した。
各ヒト血球由来溶血試料に対する反応吸光度ΔAbs（反応）を前記の検量線に照らし合わせることにより、各ヒト血球由来溶血試料におけるHbA1c濃度を決定した。決定されたHbA1c濃度を、HPLC法(KO500法)及びヘモグロビン-SLS法を用いるHbA1c測定方法により決定されたHbA1c濃度と比較した。【０２２４】
図４〜７に示すように、本発明の測定方法により決定されたHbA1c濃度と、HPLC法(KO500法)及びヘモグロビン-SLS法を用いるHbA1c測定方法により決定されたHbA1c濃度との間に良好な相関性が認められた。従って、本発明の蛋白質であるFPOX-19、FPOX-20、FPOX-32及びFPOX-42の各蛋白質を用いる測定方法により、プロテアーゼを用いることなく、試料中のHbA1cを測定できることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０２２５】
本発明により、糖尿病等の生活習慣病の診断に有用な新規な蛋白質、該蛋白質をコードするDNA、該蛋白質の製造方法、並びに、該蛋白質を用いる糖化ヘモグロビンの測定方法、及び、該蛋白質を含む糖化ヘモグロビン測定用試薬が提供される。
【配列表フリーテキスト】
【０２２６】
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配列番号2−人工配列の説明：FPOX-9のアミノ酸配列
配列番号3−人工配列の説明：FPOX-16のアミノ酸配列
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【図１】
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【図２】
2015005258.tif 000011
【図３】
2015005258.tif 000012
【図４】
2015005258.tif 000013
【図５】
2015005258.tif 000014
【図６】
2015005258.tif 000015
【図７】
2015005258.tif 000016
【配列表】
2015005258000001.app
【国際調査報告】
2015005258.tif 000017
2015005258.tif 000018
2015005258.tif 000019
2015005258.tif 000020