(57)【要約】本発明は、腫瘍組織に特異的に集積して該組織を選択的に描出することができ、少ない使用量でコントラストが高く、かつ長時間の造影が可能であり、しかも副作用が少なく安全である高分子ナノ粒子複合体、及びこれを用いたＭＲＩ造影剤等を提供する。本発明に係る高分子ナノ粒子複合体は、非荷電性親水性のポリマー鎖セグメントとアニオン性のポリマー鎖セグメントとを含むブロックコポリマーと、ＭｎＣａＰとを含んでなることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非荷電性親水性のポリマー鎖セグメントとアニオン性のポリマー鎖セグメントとを含むブロックコポリマーと、ＭｎＣａＰとを含んでなる、高分子ナノ粒子複合体。
【請求項２】
前記アニオン性のポリマー鎖セグメントが、側鎖にアニオン性基を有するポリペプチドである、請求項１記載の複合体。
【請求項３】
前記非荷電性親水性のポリマー鎖セグメントが、ポリエチレングリコール、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−イソプロピル−２−オキサゾリン）、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ヒドロキシエチル及びポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）からなる群より選ばれる親水性ポリマーに由来するものである、請求項１又は２記載の複合体。
【請求項４】
前記アニオン性のポリマー鎖セグメントが、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）及びポリ（リンゴ酸）からなる群より選ばれるアニオン性ポリマーに由来するものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項５】
前記ブロックコポリマーの非荷電性親水性のポリマー鎖セグメントをシェル部分とし、アニオン性のポリマー鎖セグメントをコア部分として形成されたナノ粒子状粒子に、前記ＭｎＣａＰが内包された形態のものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項６】
前記ブロックコポリマーが、下記一般式（１−ａ）又は（２−ａ）で示されるものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の複合体。
2015025983.tif 000009
〔式（１−ａ）及び（２−ａ）中、Ｒ１は水素原子又は未置換若しくは置換された直鎖若しくは分枝のＣ１−１２アルキル基を表し、Ｌ１及びＬ２は連結基を表し、Ｒ２はそれぞれ独立してメチレン基又はエチレン基を表し、Ｒ３はそれぞれ独立して水素原子、アミノ基の保護基、疎水性基又は重合性基を表し、Ｒ４はヒドロキシル基又は開始剤残基を表し、Ｒ５はそれぞれ独立して水素原子又はアルカリ金属イオンを表し、ｍは５〜２０，０００の整数であり、ｎは２〜５，０００の整数である。〕
【請求項７】
水性媒体中における動的光散乱法により測定した平均分散粒子径が３０ｎｍ〜１５０ｎｍである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項８】
低ｐＨ条件下において、高分子ナノ粒子複合体からＭｎ２＋イオンが放出されるものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の複合体を含むことを特徴とする、ＭＲＩ造影用組成物。
【請求項１０】
腫瘍の検出用のものである、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
腫瘍が原発性腫瘍又は転移性腫瘍である、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
腫瘍の悪性度の評価用のものである、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
被験動物の体内に請求項１〜８のいずれか１項に記載の複合体を投与することを特徴とする、ＭＲＩ造影方法。
【請求項１４】
腫瘍の検出に用いられる、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
腫瘍が原発性腫瘍又は転移性腫瘍である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
腫瘍の悪性度の評価に用いられる、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の複合体を含むことを特徴とする、ＭＲＩ造影用キット。
【請求項１８】
腫瘍の検出用のものである、請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
腫瘍が原発性腫瘍又は転移性腫瘍である、請求項１８記載のキット。
【請求項２０】
腫瘍の悪性度の評価用のものである、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＲＩ造影能を有する物質を内包した高分子ナノ粒子複合体、並びに、それを用いたＭＲＩ造影用組成物、ＭＲＩ造影方法、及びＭＲＩ造影用キット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の累積罹患率、死亡率が増加の一途をたどる中、あらゆる部位において癌の早期発見は命題といえる。早期発見によって治療時の侵襲も低くなるほか、完治も期待できる。既に進行癌の診断が下された患者に対しては、遠隔転移の有無を的確に診断することは病期（ステージ）の決定、その後の治療方針の決定に非常に重要である。癌の治療には外科治療、放射線療法、化学療法が挙げられるが、外科治療に際しては転移病巣の的確な切除、あるいは焼灼を行うことで癌の根治が期待できる。また放射線療法でも腫瘍の部位を正確に判定し、重点的に照射を行うことで健常部位への照射を防ぎ、副作用を軽減することができる。これらの意味でもあらゆるステージでの癌患者にとって、癌の正確な部位診断、とりわけ悪性度の高い癌の正確な診断を行うことは非常に大きなメリットがある。
悪性腫瘍の画像診断法の代表例としては、Ｘ線ＣＴ、超音波、核磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）が挙げられる。これらの検査は普及率が高く、各々、利点と欠点を併せ持つ。中でも、ＭＲＩは、世界で最も急速に普及している画像診断技術であり、放射線被爆等の問題がなく、軟部組織の質的変化も可視化でき、客観性及び再現性が高いことから、近年その重要度が特に高まっている。しかしながら、ＭＲＩは、そのハードウェアのみでは小さな腫瘍が正常組織の複雑な信号に埋もれるため、その同定が困難であり、診断精度向上ためには、腫瘍組織を選択的に描出できるＭＲＩ造影剤の開発が大きな課題となっている。
これまで、腫瘍組織とその周囲組織とのコントラストを高めるための様々な造影剤が開発され、実用化されている。代表的な造影剤としては、Ｇｄ−ＤＴＰＡ（ガドリニウム−ジエチレントリアミン五酢酸）等の金属錯体が挙げられるが（例えば、非特許文献１：Ｗｅｓｂｅｙ  ＧＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓ  Ｍｅｄ  ＮＭＲ．１９８４；１６（２）：１４５−１５５．）、Ｇｄ−ＤＴＰＡは部位特異性に欠け、経静脈投与により、癌などの特定組織への標的性は無く、速やかに各臓器及び筋肉内に拡散するため、腫瘍において確定的な診断を下す事が困難であった。Ｇｄ−ＤＴＰＡはキレート化してその副作用はフリーのＧｄイオンよりも軽減されるが投与量および濃度（原液は５００ｍＭ）は大きく、例えば、腎障害患者等において血中滞留性が延長した場合、Ｇｄがイオン化し腎性全身線維症と呼ばれる深刻な症状を引き起こす危険性がある。一方、Ｍｎイオンは、Ｇｄ−ＤＴＰＡ等と同様にＭＲＩのコントラストを高める造影剤であるが、Ｇｄ−ＤＴＰＡと同じ濃度を単独に経静脈的に投与すると心毒性など深刻な副作用が生じる。一方、Ｍｎは生体必須元素の一つでもあり、また経口造影剤として臨床で認可されるなど、ごく少量が体内に留まっていても毒性は生じない。
ところで、近年、画像診断の分野では、単に癌組織を可視化するだけでなく、悪性度や細胞死などの癌の性質や状態を描出できる、スマート機能型プローブの開発が盛んに行われている（例えば、非特許文献２：Ｕｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００９  Ｊａｎ；１５（１）：１０４−１０９．）。しかしながら、そのほとんどは蛍光プローブであり、ＭＲＩ造影剤に関して、実用的な研究はほとんど無い。
【発明の概要】
【０００３】
このような状況下において、腫瘍組織に特異的に集積して当該組織を選択的に描出することができ、少ない使用量でコントラストが高く、かつ長時間の造影が可能であり、しかも長時間血液中を循環しても副作用が少なく安全であるＭＲＩ造影剤の開発が望まれていた。
本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、高分子ナノ粒子複合体、ＭＲＩ造影用組成物、ＭＲＩ造影方法、及びＭＲＩ造影用キット等を提供するものである。
（１）非荷電性親水性のポリマー鎖セグメントとアニオン性のポリマー鎖セグメントとを含むブロックコポリマーと、ＭｎＣａＰとを含んでなる、高分子ナノ粒子複合体。
上記（１）の複合体において、アニオン性のポリマー鎖セグメントは、例えば、側鎖にアニオン性基を有するポリペプチドが挙げられ、具体的には、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）及びポリ（リンゴ酸）からなる群より選ばれるアニオン性ポリマーに由来するものが挙げられる。
上記（１）の複合体において、非荷電性親水性のポリマー鎖セグメントは、例えば、ポリエチレングリコール、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−イソプロピル−２−オキサゾリン）、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ヒドロキシエチル及びポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）からなる群より選ばれる親水性ポリマーに由来するものが挙げられる。
上記（１）の複合体は、例えば、前記ブロックコポリマーの非荷電性親水性のポリマー鎖セグメントをシェル部分とし、アニオン性のポリマー鎖セグメントをコア部分として形成されたナノ粒子状粒子に、前記ＭｎＣａＰが内包された形態のものが挙げられる。
上記（１）の複合体において、前記ブロックコポリマーは、例えば、下記一般式（１−ａ）又は（２−ａ）で示されるものが挙げられる。
2015025983.tif 000002
〔式（１−ａ）及び（２−ａ）中、Ｒ１は水素原子又は未置換若しくは置換された直鎖若しくは分枝のＣ１−１２アルキル基を表し、Ｌ１及びＬ２は連結基を表し、Ｒ２はそれぞれ独立してメチレン基又はエチレン基を表し、Ｒ３はそれぞれ独立して水素原子、アミノ基の保護基、疎水性基又は重合性基を表し、Ｒ４はヒドロキシル基又は開始剤残基を表し、Ｒ５はそれぞれ独立して水素原子又はアルカリ金属イオンを表し、ｍは５〜２０，０００の整数であり、ｎは２〜５，０００の整数である。〕
上記（１）の複合体は、例えば、水性媒体中における動的光散乱法により測定した平均分散粒子径が３０ｎｍ〜１５０ｎｍであるものが挙げられる。
上記（１）の複合体は、例えば、低ｐＨ条件下において、高分子ナノ粒子複合体からＭｎ２＋イオンが放出されるものが挙げられる。
（２）上記（１）の複合体を含むことを特徴とする、ＭＲＩ造影用組成物。
上記（２）の組成物は、例えば、腫瘍の検出用のものが挙げられ、ここで当該腫瘍としては、原発性腫瘍又は転移性腫瘍が挙げられる。
上記（２）の組成物は、例えば、腫瘍の悪性度の評価用のものが挙げられる。
（３）被験動物の体内に上記（１）の複合体を投与することを特徴とする、ＭＲＩ造影方法。
上記（３）の方法は、例えば、腫瘍の検出に用いられる方法が挙げられ、ここで当該腫瘍としては、原発性腫瘍又は転移性腫瘍が挙げられる。
上記（３）の方法は、例えば、腫瘍の悪性度の評価に用いられる方法が挙げられる。
（４）上記（１）の複合体を含むことを特徴とする、ＭＲＩ造影用キット。
上記（４）のキットは、例えば、腫瘍の検出用のものが挙げられ、ここで当該腫瘍としては、原発性腫瘍又は転移性腫瘍が挙げられる。
上記（４）のキットは、例えば、腫瘍の悪性度の評価用のものが挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、本発明にかかる高分子ナノ粒子複合体の製造過程の概略を示す図である。
図２は、調製したＭｎＣａＰナノ粒子複合体とＭｎＣｌ２溶液の造影効果を評価した画像である。ＭｎＣａＰナノ粒子溶液の信号強度は、同濃度のＭｎＣｌ２溶液とほぼ同等、もしくはわずかに高信号を示した。
図３は、マウス由来大腸がん細胞Ｃｏｌｏｎ２６を皮下移植した腫瘍モデルマウスに対し、ＭｎＣａＰナノ粒子複合体の投与前後に取得した１Ｔ（テスラ）−ＭＲ画像である。
図４は、マウス由来大腸がん細胞Ｃｏｌｏｎ２６を皮下移植した腫瘍モデルマウスに対し、ＭｎＣａＰナノ粒子複合体の投与前後に取得した１Ｔ−ＭＲ画像の腫瘍領域の拡大図である。
図５は、マウス由来大腸がん細胞Ｃｏｌｏｎ２６を皮下移植した腫瘍モデルマウスに対し、ＭｎＣａＰナノ粒子複合体の投与後のＭＲ画像（左図）と、同一位置から取得したＰｉｍｏｎｉｄａｚｏｌｅを用いて取得した免疫組織染色像（右図）である。ＭＲ画像において特異的に白い領域と、組織染色像において茶色になった領域の範囲が一致した（白矢印）。
図６は、マウス由来大腸がん細胞Ｃｏｌｏｎ２６を皮下移植した腫瘍モデルマウスに対し、ＭｎＣａＰナノ粒子複合体の投与後に取得したＭＲ画像（左図）と、乳酸の化学シフト領域の信号強度を画像化した化学シフト画像を重畳した画像（右図）である。乳酸が多い領域（右図、白色）がＭＲ画像において白くなった領域と一致した（白矢印）。
図７は、肝転移モデルマウスに対し、ＭｎＣａＰナノ粒子複合体の投与前および投与１、２時間後のＭＲ画像と、摘出した肝臓写真である。ＭｎＣａＰナノ粒子複合体の投与後、転移した腫瘍が白く強調された（白矢印）。また摘出した肝臓内の腫瘍と一致した（白実線矢印）。加えて、投与１時間後には肝臓内の微小血管も描出された。
図８は、作製したリンパ節転移モデルマウス（腫瘍モデルマウス）の図である。（ａ）リンパ節に転移した腫瘍からのルシフェラーゼ発光をフォトンイメージャーで観察した写真、（ｂ）リンパ節に転移した腫瘍を解剖学的に観察した写真。
図９は、ＭｎＣａＰミセル複合体の投与前、並びに投与後４５分後及び６０分後の正常リンパ節（Ｎｏｒｍａｌ；黄色矢印）及びリンパ節転移部（Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ；赤色矢印）を含む１Ｔ−ＭＲ画像である。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２０１３−１７３８６６号明細書（２０１３年８月２３日出願）の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
１．高分子ナノ粒子複合体
本発明の高分子ナノ粒子複合体は、高い血中滞留性と腫瘍組織選択性（ＥＰＲ効果によるもの）を有する高分子ナノ粒子を利用したドラッグデリバリーシステムに着目して見出されたものである。本発明は、当該高分子ナノ粒子にＭＲＩ造影能を発揮し得る特定の化合物（ＭｎＣａＰ）を内包させた高分子ナノ粒子複合体を提供するものである。
本発明の高分子ナノ粒子複合体は、（１）非荷電性親水性のポリマー鎖セグメントとアニオン性のポリマー鎖セグメントとを含むブロックコポリマーと、（２）ＭＲＩ造影能を発揮し得る特定の化合物としてのＭｎＣａＰとを含んでなるものである。ここで、当該複合体の具体的な形態としては、上記ブロックコポリマーの非荷電性親水性のポリマー鎖セグメントをシェル部分とし、アニオン性のポリマー鎖セグメントをコア部分として形成されたナノ粒子状粒子に、上記ＭｎＣａＰが内包された形態のものであることが好ましい。
なお、本発明においては、便宜上、上記各ポリマー鎖セグメントには、いわゆるオリゴマー鎖の範疇に入るセグメントも包含されるものとする。
（１）ブロックコポリマー
前記ブロックコポリマー中、非荷電性親水性のポリマー鎖セグメントとしては、限定はされないが、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−イソプロピル−２−オキサゾリン）、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ヒドロキシエチル及びポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）からなる群より選ばれる水溶性ポリマーに由来するものが好ましく挙げられ、中でも、ＰＥＧに由来するものがより好ましい。当該非荷電性親水性のポリマー鎖セグメントは、親水性であることから優れた生体適合性を、高分子ナノ粒子複合体に付与することができる。
前記ブロックコポリマー中、アニオン性のポリマー鎖セグメントとしては、限定はされないが、例えば、側鎖にアニオン性基を有するポリペプチドが好ましく挙げられる。具体的には、例えば、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）及びポリ（リンゴ酸）からなる群より選ばれるアニオン性ポリマーに由来するものが好ましく挙げられ、中でも、ポリ（グルタミン酸）に由来するものがより好ましい。
本発明に用いるブロックコポリマーとしては、具体的には、下記一般式（１）又は（２）で示されるものが例示できる。
2015025983.tif 000003
また、本発明に用いるブロックコポリマーの、他の好ましい具体例としては、下記一般式（１−ａ）又は（２−ａ）で示されるものも例示できる。
2015025983.tif 000004
上記式（１）、（２）、（１−ａ）及び（２−ａ）中、Ｒ１は水素原子又は未置換若しくは置換された直鎖若しくは分枝のＣ１−１２アルキル基を表し、Ｌ１及びＬ２は連結基を表し、Ｒ２はそれぞれ独立してメチレン基又はエチレン基を表し、Ｒ３はそれぞれ独立して水素原子、アミノ基の保護基、疎水性基又は重合性基を表し、Ｒ４はヒドロキシル基又は開始剤残基を表し、Ｒ５はそれぞれ独立して水素原子又はアルカリ金属イオンを表す。また、ｍは５〜２０，０００（好ましくは１０〜５，０００、より好ましくは４０〜５００）の整数であり、ｎは２〜５，０００（好ましくは５〜１，０００、より好ましくは１０〜２００）の整数である。
また、上記式（１）、（２）、（１−ａ）及び（２−ａ）中の、ｍ個の繰り返し単位の部分が、非荷電性親水性のポリマー鎖セグメントに相当する。また、上記式（１）及び（２）中の、（ｎ−ｘ）個とｘ個の繰り返し単位の部分、及び上記式（１−ａ）及び（２−ａ）中の、ｎ個の繰り返し単位の部分が、アニオン性のポリマー鎖セグメントに相当する。
Ｒ１については、前述した未置換若しくは置換された直鎖若しくは分枝のＣ１−１２アルキル基としては、限定はされないが、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、デシル、ウンデシル等が挙げられ、置換された場合の置換基としては、例えば、アセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ２−７アシルアミド基、同一もしくは異なるトリ−Ｃ１−６アルキルシロキシ基、シロキシ基またはシリルアミノ基が挙げられる。置換基がアセタール化ホルミル基であるときは、酸性の温和な条件下で加水分解して他の置換基であるホルミル基（−ＣＨＯ：またはアルデヒド基）に転化できる。このようなホルミル基、または上記カルボキシル基もしくはアミノ基は、例えば、前記ブロックコポリマーを生成した後に、対応する保護された形態の基または部分から脱保護もしくは転換して生じさせることができ、次いで必要に応じ、適当な抗体もしくはその特異結合性を有する断片（Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）、または葉酸など）を共有結合し、そして該ブロックコポリマー（ひいては、本発明の高分子ナノ粒子複合体）に標的指向性を付与するために利用することもできる。このような官能基を片末端に有する非荷電性親水性のポリマー鎖セグメントは、例えば、ＷＯ９６／３２４３４、ＷＯ９６／３３２３３、ＷＯ９７／０６２０２に記載のブロック共重合体のＰＥＧセグメント部の製造法に準じて形成することができる。このように形成される非荷電性親水性のポリマー鎖セグメントと、アニオン性のポリマー鎖セグメントとは、前述した各ブロック共重合体の製造方法に応じて、どのような連結様式をとっていてもよく、どのような連結基で結合されていてもよい。当該製造方法は、特に限定はされないが、末端にアミノ基を有する非荷電性親水性のポリマー鎖セグメントを用いて、そのアミノ末端から、例えば、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート及び／又はγ−ベンジル−Ｌ−グルタメートのＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を重合させてブロック共重合体を合成し、その後、側鎖ベンジル基を他のエステル基に変換するか、または部分もしくは完全加水分解することにより目的のブロック共重合体を得る方法が挙げられる。この場合、得られた共重合体の構造は、一般式（１）又は（１−ａ）のブロックコポリマーを構成する共重合体の構造となり、連結基Ｌ１は、用いた非荷電性親水性のポリマー鎖セグメントの末端構造に由来する構造となり、好ましくは−（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−である（ここで、ｐは１〜５の整数であることが好ましい。）。また、アニオン性のポリマー鎖セグメント、又は該ポリマー鎖の誘導体を合成してから、予め用意した非荷電性親水性のポリマー鎖セグメントと結合させる方法でも、共重合体は製造可能である。この場合、結果的に上記の方法で製造したものと同一の構造となることもあるが、一般式（２）又は（２−ａ）のブロックコポリマーの構造となることもあり、連結基Ｌ２は、限定はされないが、好ましくは−（ＣＨ２）ｑ−ＣＯ−である（ここで、ｑは１〜５の整数であることが好ましい。）。
Ｒ３については、前述したアミノ基の保護基としては、例えば、ベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、アセチル基及びトリフルオロアセチル基等が挙げられる。また、疎水性基としては、例えば、ベンジルカルボニル基及びベンズヒドリルカルボニル基等が挙げられる。さらに、重合性基としては、例えば、アクリロイル及びメタクリルロイル基等が挙げられる。
Ｒ４については、前述した開始剤残基としては、例えば、ＮＣＡ重合の開始剤となり得る脂肪族または芳香族の１級アミン化合物残基（−ＮＨ−アルキル）等が挙げられる。
Ｒ５について、前述したアルカリ金属のイオンとしては、例えば、ナトリウム（Ｎａ）イオン、リチウム（Ｌｉ）イオン及びカリウム（Ｋ）イオン等が挙げられる。
（２）ＭＲＩ造影能を発揮し得る特定の化合物としてのＭｎＣａＰ
本発明の高分子ナノ粒子複合体に含まれるＭｎＣａＰは、特に、低ｐＨ環境下において分解（溶解）し、マンガンイオン（Ｍｎ２＋）を生じるものである。これにより、Ｍｎ２＋イオンが高分子ナノ粒子複合体から放出されることになる。前述のとおり、Ｍｎ２＋イオンは、周囲のタンパク質と結合した場合、その相互作用によって、緩和能がおよそ１０倍以上に増大する特性を有する。そのため、本発明の高分子ナノ粒子複合体をＭＲＩ造影剤として用いた場合、腫瘍組織内の低ｐＨ環境で選択的にＭｎ２＋イオンを放出し、腫瘍組織のタンパク質等と結合して造影剤の位置が不動化され、同時にＭＲＩ信号強度の増大効果をもたらすことができる（特に断りが無い場合、ＭＲＩ信号とは、Ｔ１強調画像法における信号強度をいう。）。また、ＭｎＣａＰは崩壊しない状態で、正常の肝組織に一定量集積することが可能で、その場合、横緩和時間の短縮効果によりＭＲＩ信号強度の低下をもたらす。同時に肝腫瘍では、その低いｐＨに応答して崩壊し、Ｍｎ２＋イオンを放出することでＭＲＩ信号強度の上昇をもたらし、より高い検出力を発揮する。
ＭｎＣａＰは、下記式に示す反応（概要）により生成され得るものである。
2015025983.tif 000005
ここで、ＭｎＣａＰのマウスに対する最大耐用量（ＭＴＤ：ｍａｘｉｍｕｍ  ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｄｏｓｅ）は、およそ１．５ｍｍｏｌ／ｋｇである。これに対し、ＭｎＣｌ２の最大耐用量（ＭＴＤ）はおよそ０．２２ｍｍｏｌ／ｋｇであり、ＭｎＣａＰの約１／７である。したがって、最大耐用量（ＭＴＤ）の点でも、ＭｎＣａＰを用いる本発明の高分子ナノ粒子複合体は、ＭＲＩ造影における実用性に極めて優れたものである。
（３）高分子ナノ粒子複合体
本発明の高分子ナノ粒子複合体の製造方法としては、限定はされないが、前述したブロックコポリマーと、ＭｎＣａＰの原料化合物とを、水性媒体中にて混合し、反応させる方法が好ましい。ＭｎＣａＰの原料化合物としては、ＨＰＯ４２−を含有する（を生じる）化合物、Ｃａ２＋を含有する（を生じる）化合物、Ｍｎ２＋を含有する（を生じる）化合物を、それぞれ用いることが好ましい。
また、反応条件としては、目的の高分子ナノ粒子複合体が得られる限り、いかなる条件を設定してもよいが、例えば、上記混合後、５０〜１８０℃で５〜１２０分加熱する（熱水合成する）ことが好ましく、より好ましくは８０〜１５０℃で１０〜２４０分加熱することであり、特に好ましくは１２０℃程度で２０分程度加熱することである。当該熱水加熱により、ＭｎＣａＰが合成される。なお、当該高分子ナノ粒子複合体の製造方法の概略は、例えば、図１に示すとおりである。
反応溶媒となる水性媒体としては、水（特に、脱イオン水）が好ましく、更に、各種無機もしくは有機緩衝剤、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、エタノール等の水混和有機溶媒を、本発明の高分子ナノ粒子複合体の形成反応に悪影響を及ぼさない範囲で含んでいてもよい。
製造された高分子ナノ粒子複合体の単離及び精製は、常法により、水性媒体中から回収することができる。典型的な方法としては、限外濾過法、ダイアフィルトレーション、透析方法が挙げられる。
本発明の高分子ナノ粒子複合体の形態としては、前述のとおり、例えば、前述したブロックコポリマーの非荷電性親水性のポリマー鎖セグメントをシェル部分とし、アニオン性のポリマー鎖セグメントをコア部分として形成されたナノ粒子状粒子に、ＭｎＣａＰが内包された形態のものが好ましく挙げられる。通常、水性媒体（水性溶媒）中においては、本発明の高分子ナノ粒子複合体は、凝集して、可溶化した高分子ナノ粒子状の形態を形成し得る。ＭｎＣａＰは、その生成過程において、ブロックコポリマーのアニオン性のポリマー鎖セグメントと、下記式（概略）のようにイオン結合をし得る。
2015025983.tif 000006
よって、最終的に、ＭｎＣａＰは、コア部分を構成するアニオン性のポリマー鎖セグメントとともに、ナノ粒子粒子の内部に内包された状態となる。
このような、本発明の高分子ナノ粒子複合体は、水性媒体中における平均分散粒子径（動的光散乱法により測定）が、例えば、３０ｎｍ〜１５０ｎｍであることが好ましく、より好ましくは３０ｎｍ〜１００ｎｍであり、さらに好ましくは３０ｎｍ〜８０ｎｍである。当該粒子径であることにより、ＥＰＲ効果が発揮され、腫瘍組織選択的に集積することができる。
本発明の高分子ナノ粒子複合体におけるＭｎＣａＰの含有割合は、当該複合体に対するＭｎイオンの含有割合でみたときに、例えば、１〜１５重量％であってもよいし、また０．０１〜５重量％や、０．３〜４．０重量％であってもよく、限定はされないが、ＭＲＩの地場強度や撮像条件に応じて、適宜最適な含有割合に調製することもできる。
２．ＭＲＩ造影用組成物、ＭＲＩ造影方法
本発明においては、上述した本発明の高分子ナノ粒子複合体を含むことを特徴とする、ＭＲＩ造影用組成物が提供される。本発明の組成物は、ＭＲＩ造影による癌（悪性腫瘍）の検出及び／又診断手段として使用することができる。なお、場合によっては、抗腫瘍活性を有する公知の各種化合物又は組成物を高分子ナノ粒子複合体に併せて内包することにより、ＭＲＩ造影用かつ抗腫瘍用医薬組成物として用いることもできる。
本発明のＭＲＩ造影用組成物を用いる場合、検出等の対象となる腫瘍の種類は、限定はされず、公知の各種癌種を挙げることができる。
前述のとおり、本発明のＭＲＩ造影用組成物は、治療抵抗性の癌細胞が存在する、腫瘍組織の中心部にある低酸素領域（Ｈｙｐｏｘｉａ）を明確にイメージングすることができるものであり、そのため腫瘍の悪性度を評価するために用いることもできる。
また、本発明のＭＲＩ造影用組成物は、従来では腫瘍特異的には検出困難であった微小癌（例えば約１ｍｍ程度の癌）をＭＲＩで検出することができるものであるため、各種癌の原発性腫瘍や転移性腫瘍、特に初期の原発性腫瘍や転移性腫瘍の検出及び診断も可能とするものである。
本発明のＭＲＩ造影用組成物において、前述した高分子ナノ粒子複合体の含有割合は、限定はされず、ＭＲＩ造影効果を勘案して適宜設定することができる。
本発明のＭＲＩ造影用組成物は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ等の各種動物に適用することができ、特に限定はされない。被験動物への投与方法は、通常、点滴静注などの非経口用法が採用され、投与量、投与回数及び投与期間などの各条件は、被験動物の種類及び状態等に応じて、適宜設定することができる。例えば、ヒトに静脈内投与をする場合の用量は、必要に応じて実験動物又はボランティアによる小実験を行い、それらの結果を考慮して、さらには患者の状態を考慮して専門医が決定するのが好ましいが、一般的には、１日１回、１．０〜１０，０００ｍｇ／ｍ２とすることができる。
本発明のＭＲＩ造影用組成物は、ＭＲＩ造影用という用途を勘案し、薬剤製造上一般に用いられる賦形材、充填材、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤及び等張化剤等を適宜選択して使用することができる。
本発明においては、被験動物の体内に本発明の高分子ナノ粒子複合体、又は本発明のＭＲＩ造影用組成物を投与することを特徴とする、ＭＲＩ造影方法（特に、腫瘍検出用のＭＲＩ造影方法や、原発性腫瘍や転移性腫瘍の検出用のＭＲＩ造影方法）を提供することもでき、また、当該方法を利用した腫瘍の悪性度の評価方法を提供することもできる。これらの方法においては、従来のＭＲＩ造影に関する知見及び技術水準に基づいて、適宜他の工程を含むことができる。例えば、前記投与後又は前記投与と同時に被験動物についてＭＲＩ検査を行う工程、当該検査で得られた結果（画像）に基づき腫瘍の有無を検出する工程等が挙げられる。
３．ＭＲＩ造影用キット
本発明のＭＲＩ造影用キットは、前述した本発明の高分子ナノ粒子複合体を含むことを特徴とする。当該キットは、前述したＭＲＩ造影方法や当該方法を利用した腫瘍の悪性度の評価方法に好ましく用いることができる。
当該キットにおいて、本発明の高分子ナノ粒子複合体の保存状態は、限定はされず、その安定性（保存性）及び使用容易性等を考慮して、溶液状又は粉末状等の状態を選択できる。
本発明のＭＲＩ造影用キットは、前記高分子ナノ粒子複合体以外に他の構成要素を含んでいてもよい。他の構成要素としては、限定はされないが、例えば、各種バッファー、防腐剤、分散剤、安定化剤、及び使用説明書（使用マニュアル）等を挙げることができる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
＜ＭｎＣａＰナノ粒子複合体（高分子ナノ粒子複合体）の製造＞
ＭｎＣａＰナノ粒子複合体は、下式に基づく化学反応を利用し、さらに図１（概略図）に示すような複合体形成と熱水処理の２段階の過程を得て製造した。
2015025983.tif 000007
はじめに、２５０ｍＭのＣａ２＋と２０ｍＭのＭｎ２＋をＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．６）に溶かした溶液Ａを調製した。次に、５ｍＭのポリエチレングリコール−ポリ（グルタミン酸）ブロックコポリマー（ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｇｌｕ））を６ｍＭのＨＰＯ４２＋を含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファーＳａｌｉｎｅ（ｐＨ７．１）に溶かした溶液Ｂを調製した。体積にして同量の溶液Ａと溶液Ｂをボルテックスミキサーを用いて５秒間撹拌、混合して、ＭｎＣａＰナノ粒子複合体を調製した。得られたＭｎＣａＰナノ粒子複合体の溶液を１２０℃に設定したオートクレーブを用いて２０分間の水熱処理を施した。得られたＭｎＣａＰナノ粒子複合体を２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファーＳａｌｉｎｅ（ｐＨ７．４）に対して透析した後、ＨＥＰＥＳバッファーを用いた限外濾過により精製した。
なお、上記ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｇｌｕ）の構造は、以下の通りである。
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【実施例２】
【０００７】
＜方法＞
１．ＭｎＣａＰナノ粒子複合体の緩和能の計測と既存のＭｎＣｌ２との溶液中での比較
製造したＭｎＣａＰナノ粒子複合体が有する緩和能の計測、および既存のＭｎＣｌ２単体との造影効果を比較するため、前臨床用永久磁石型１Ｔ（テスラ）ＭＲ装置（ＩｃｏｎＴＭ，Ｂｒｕｋｅｒ−Ｂｉｏｓｐｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、緩和能の計測ならびにＴ１強調画像を取得し比較した。計測には，濃度が０．１〜０．５ｍＭのＭｎＣａＰナノ粒子複合体および同濃度のＭｎＣｌ２を使用し、ＰＣＲ用のサンプルチューブに入れて計測した。希釈には，蒸留水を使用した。
緩和能の計測には，プロトン用ボリュームコイル（内径３５ｍｍ）を使用した。撮像法は反転パルスを導入した高速スピンエコー法（Ｒａｐｉｄ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ，ＲＡＲＥ）を使用した。撮像に使用したパラメータは以下の通りである。
エコータイム（Ｅｃｈｏ  Ｔｉｍｅ，ＴＥ）＝１０ｍｓ；
繰り返し時間（Ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ，ＴＲ）＝１６，０００ｍｓ；
反転時間（Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ，ＴＩ）＝４９．５９，７５，１００，１５０，２００，３００，４００，６００，８００，１０００，１２００，１６００，２４００，３２００，６４００ｍｓ；
ＲＡＲＥ  Ｆａｃｔｏｒ＝８；
撮像視野（Ｆｉｅｌｄ  Ｏｆ  Ｖｉｅｗ，ＦＯＶ）＝４８．０  ｘ  ４８．０ｍｍ２；
スライス厚＝２．０ｍｍ；
画素数＝２５６  ｘ  ２５６；
撮像方向＝水平断（Ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ）；
加算回数＝１；
１つのＴＩあたりの撮像時間＝８分３２秒（Ｔ１強調画像は、スピンエコー法を使用し、以下の撮像パラメータを使用して取得した：ＴＥ＝１０．０ｍｓ；ＴＲ＝４００ｍｓ）；
ＦＯＶ＝４８．０  ｘ  ４８．０ｍｍ２；
スライス厚＝２．０ｍｍ；
画素数＝２５６  ｘ  ２５６；
撮像方向＝水平断；
加算回数＝８；
撮像時間＝１３分３９秒
２．皮下腫瘍モデルマウスを用いた腫瘍集積性の検討
製造したＭｎＣａＰナノ粒子複合体の腫瘍集積性を検証するため、皮下に腫瘍細胞を移植したモデルマウスにＭｎＣａＰナノ粒子複合体を投与し、腫瘍におけるＭＲＩ画像の変化を可視化した。ＭＲＩは前述の前臨床用永久磁石型１Ｔ−ＭＲ装置、ならびにプロトン用ボリュームコイルを使用した。腫瘍モデルマウスは、メスのＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（日本ＳＬＣ）の臀部皮下にマウス由来大腸がん細胞Ｃｏｌｏｎ２６を１．０  ｘ  １０６ｃｅｌｌ／５０μｌを移植して作成した。実験には、移植後７〜９日目に、腫瘍サイズが５〜１０ｍｍ程度になったモデルマウスを使用した。
ＭＲ撮像は、スピンエコー法を用い、使用したパラメータは、以下のとおりである。
ＴＥ＝１１．５ｍｓ；
ＴＲ＝４００ｍｓ；
ＦＯＶ＝４４．０  ｘ  ４４．０ｍｍ２；
スライス厚＝１．０ｍｍ；
画素数＝２５６  ｘ  ２５６；
撮像方向＝横断面（Ｔｒａｎｓａｘｉａｌ）；
加算回数＝４；
撮像時間＝６分４９秒
撮像は、ＭｎＣａＰナノ粒子複合体投与前および投与後４時間後まで連続的に実施したＭｎＣａＰナノ粒子複合体は、０．２２ｍｍｏｌ／ｋｇ  Ｍｎ濃度になるように調整し、マウス尾静脈より投与した。撮像時には、撮像中にマウスが動かないようにイソフルラン吸引麻酔（１．０〜２．０％）を使用した。また、マウス直腸に熱電対温度計を挿入し、自作の温水還流システムを用いて、体温が３６〜３７℃に保った。
３．低酸素領域の検出する免疫組織染色像とＭＲ画像の比較
製造したＭｎＣａＰナノ粒子複合体が、ｐＨの低下に反応することを評価するため、腫瘍内においてｐＨが低い低酸素領域を検出する免疫組織染色像と、ＭｎＣａＰナノ粒子複合体の投与に取得したＭＲ画像を比較した。低酸素領域を検出するためのマーカーとして、２−ニトロイミダゾール（２−ｎｉｔｒｏｍｉｄａｚｏｌｅ）系の化合物であるピモニダゾール（Ｐｉｍｏｎｉｄａｚｏｌｅ）を含むＨｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅＴＭ−１（ＨＰＩ）を使用した。ＨｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅＴＭ−１は、腫瘍モデルマウスに対し、６０ｍｇ／ｋｇの濃度で、ＭｎＣａＰナノ粒子複合体の投与前にマウス尾静脈より投与した。ＭｎＣａＰナノ粒子複合体を投与した際のＭＲ画像は、上記２と同様の実験プロトコル・パラメータを用いて取得した。ＭｎＣａＰナノ粒子複合体投与４時間後まで連続的にＭＲ画像を取得した後、モデルマウス皮下に移植した腫瘍を切除し、４％パラフォルムアルデヒド・りん酸緩衝液を用いて組織固定した。パラフィン包埋を行い、抗Ｐｉｍｏｎｉｄａｚｏｌｅ抗体を用いた免疫組織染色を実施し、倒立実体顕微鏡を用いて取得した画像とＭＲ画像とを比較した。
４．化学シフト画像化法による乳酸高代謝領域画像と、ＭＲ画像の比較
腫瘍内の低酸素化が進んだ領域は、嫌気性代謝により、組織の乳酸（Ｌａｃｔａｔｅ）が増加する。乳酸は低いｐＨを持つため、高い乳酸量を示す組織は、低い血液循環に伴う低酸素および低ｐＨを示唆するマーカーとなる。そこで、ＭＲスペクトロスコピー（ＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｃｏｐｙ，ＭＲＳ）を利用し、乳酸の持つ化学シフト領域の信号強度を画像化した化学シフト画像化法（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｈｉｆｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ，ＣＳＩ）を用いて取得した乳酸の代謝画像と、ＭｎＣａＰナノ粒子複合体を投与して取得したＭＲ画像の信号強度の上昇領域が一致するかを調べた。
ＣＳＩ画像は、前臨床用超電導磁石型７．０Ｔ−ＭＲ装置（Ｂｉｏｓｐｅｃ，Ｂｒｕｋｅｒ−Ｂｉｏｓｐｉｎ）と、冷却コイル（ＣｒｙｏＰｒｏｂｅＴＭ，Ｂｒｕｋｅｒ−Ｂｉｏｓｐｉｎ）を用いて取得した。ＣＳＩ画像の撮像には、ＭＲＳで使用されるＰＲＥＳＳ（Ｐｏｉｎｔ−ＲＥＳｏｌｖｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）法を用いて、ＶＡＰＯＲ（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｐｕｌｓｅ  ｐｏｗｅｒ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  ｄｅｌａｙｓ）法を使用してプロトンから生じる信号を抑制した。撮像パラメータは以下の通りである。
ＴＥ＝２０ｍｓ；
ＴＲ＝３，０００ｍｓ；
ＦＯＶ＝１４．１  ｘ  １４．１ｍｍ２；
スライス厚＝１．５ｍｍ；
取得データ数：１０  ｘ  １０；
再構成画像の画素数：１６  ｘ  １６；
撮像時間：１２分４８秒（ＣＳＩ画像取得後、腫瘍モデルマウスを１Ｔ−ＭＲ装置に移動し、ＭｎＣａＰナノ粒子複合体の投与前後において、ＭＲ画像を取得した。撮像パラメータは上記２項の場合と同様であった。）
５．肝転移モデルマウスにおける微小腫瘍の検出
転移・微小腫瘍に対するＭｎＣａＰナノ粒子複合体の腫瘍検出能を検討するため、肝転移モデルマウスを使用し、肝転移腫瘍の検出を評価した。肝転移モデルは、メスのＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（日本ＳＬＣ）の脾臓にマウス由来大腸がん細胞Ｃｏｌｏｎ２６を１．０  ｘ  １０６ｃｅｌｌ／５０μｌを移植して作成した。実験には、移植後７〜９日目に実施した。ＭｎＣａＰナノ粒子複合体の投与量は、０．２２ｍｍｏｌ／ｋｇ  Ｍｎ濃度であり、マウス尾静脈より投与した。ＭＲ撮像は、上記２項と同様の方法で実施した。撮像に使用したパラメータは、以下のとおりである。
ＴＥ＝１１．５ｍｓ；
ＴＲ＝４００ｍｓ；
ＦＯＶ＝８５．０  ｘ  ８５．０ｍｍ２；
スライス厚＝１．０ｍｍ；
画素数＝２５６  ｘ  ２５６；
撮像方向＝水平面（Ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ）；
加算回数＝４；
撮像時間＝６分４９秒．
＜結果・考察＞
１．ＭｎＣａＰナノ粒子複合体の緩和能の計測と既存のＭｎＣｌ２との溶液中での比較
ＭｎＣａＰナノ粒子複合体とＭｎＣｌ２溶液のＴ１強調画像を図１に示す。ＭｎＣａＰナノ粒子複合体の信号強度は、同じＭｎ２＋濃度のＭｎＣｌ２溶液の信号強度とほぼ同等、またはわずかな高信号（約１０〜２７％）を示した。計測した縦緩和能ｒ１は、ＭｎＣａＰナノ粒子複合体が６．５〜１１．１０ｍＭ−１ｓ−１、ＭｎＣｌ２溶液が７．３０〜７．５８ｍＭ−１ｓ−１であり、製造したＭｎＣａＰナノ粒子複合体は、ＭｎＣｌ２溶液と同等、もしくはわずかに高い造影効果を有することが確認できた。この結果より、ＭｎＣａＰナノ粒子複合体が崩壊する前の状態においても、ＭｎＣｌ２溶液と同程度の信号強度をもつため、その集積した部位においてＭｎＣａＰナノ粒子複合体の動態に応じた中程度のＭＲ信号強度の上昇が期待できる。
２．皮下腫瘍モデルマウスを用いた腫瘍集積性の検証
ＭｎＣａＰナノ粒子複合体の投与前および投与後４時間までの、腫瘍領域を含むマウス体幹部、ならびに腫瘍領域を拡大した１Ｔ−ＭＲ画像を図２、３に示す。腫瘍領域における投与前の信号強度は、周囲の筋肉領域と同等であったのに対し、投与後、腫瘍内のＭＲ信号強度は、腫瘍内がほぼ均一に中程度に上昇した（投与前の信号比で約４５％上昇）。これは、投与したＭｎＣａＰナノ粒子複合体が腫瘍へ集積すると共に、毛細血管に存在するＭｎＣａＰナノ粒子複合体からの信号も寄与したためと考えられた。投与して２時間以降、腫瘍の一部領域において、極めて大きく信号が上昇した領域が観察された（投与前の信号比で約１２０％上昇）。これは、正常組織よりもｐＨが低い領域において、ＭｎＣａＰナノ粒子複合体が溶解することでＭｎ２＋が放出され、周囲のタンパク質等との相互作用により、造影効果が大きく増大したためと考えられた。Ｍｎ２＋は、タンパク質と結合することにより分子運動が制限され、緩和能が大きく向上することが報告されている（文献：Ｋｏｙｌｕ  ＭＺ，Ａｓｕｂａｙ  Ｓ，Ｙｉｌｍａｚ  Ａ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｏｎ  Ｒｅｌａｘｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｍｎ（ＩＩ），Ｃｕ（ＩＩ）ａｎｄ  Ｃｒ（ＩＩＩ）ａｄｄｅｄ  ｔｏ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｅｒｕｍ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００９；１４（４）：１５３７−１５４５．）。
３．低酸素領域の検出する免疫組織染色像とＭＲ画像の比較
ＭｎＣａＰナノ粒子複合体の投与後に取得したＭＲ画像、ならび低酸素領域を検出するためにＰｉｍｏｎｉｄａｚｏｌｅを用いて取得した免疫組織染色像を図４に示す。ＭＲ画像において、周囲よりも信号強度が上昇している領域と、ピモニダゾール免疫組織染色像において陽性（茶色）となった低酸素・低ｐＨ領域がよく一致した。このことから、低酸素領域においてｐＨが低下し、使用したＭｎＣａＰナノ粒子複合体が溶解し、Ｍｎ２＋による造影効果が増大したと考えられた。
４．化学シフト画像化法による乳酸高代謝領域画像と、ＭＲ画像の比較
ＭｎＣａＰナノ粒子複合体投与前に化学シフト画像化法により取得した乳酸の代謝領域画像と、ＭｎＣａＰナノ粒子複合体投与後に取得した１Ｔ−ＭＲ画像を図５に示す。化学シフト画像化法により取得した高い乳酸の分布を示す領域と、ＭｎＣａＰナノ粒子複合体投与後に取得した腫瘍内のＭＲ画像において信号強度が特異的に上昇した領域がよく一致した。このことから、嫌気性代謝により乳酸が多く生成される低酸素領域において、集積したＭｎＣａＰナノ粒子複合体が溶解することにより、Ｍｎ２＋による造影効果が増大したことが示唆された。
５．肝転移モデルマウスにおける微小腫瘍の検出
肝転移モデルマウスに対し、ＭｎＣａＰナノ粒子複合体を投与前後に取得した１Ｔ−ＭＲ画像ならびに、実験終了後に摘出した肝臓実質臓器を図６に示す。ＭｎＣａＰナノ粒子複合体投与後の１Ｔ−ＭＲ画像において、正常な肝臓領域の信号が低下するとともに、腫瘍領域の信号が増加した。信号が増加した領域は、摘出臓器において、腫瘍がある領域と一致した。
正常な肝臓領域の信号変化は、ＭｎＣａＰナノ粒子複合体が高集積することで、横緩和時間の短縮効果が大きくなり、Ｍｎ２＋が有する陽性造影効果が低下したと考えられる。一方、腫瘍領域に関しては、ＭｎＣａＰナノ粒子複合体が集積するとともに、ｐＨの変化に反応して、ＭｎＣａＰナノ粒子複合体が溶解し、Ｍｎ２＋による増大効果が生じたと考えられる。現在、臨床において使用されているＧｄ−ＥＯＢ−ＤＴＰＡは、正常肝臓領域が白く造影され、腫瘍領域はほとんど変化しないことを利用して、腫瘍を検出する。一方、ＭｎＣａＰナノ粒子複合体は、腫瘍領域が白く造影され、周囲の正常組織の信号が低下することにより、より大きいコントラストが生じたＭＲ画像が得られた。これらのことから、ＭｎＣａＰナノ粒子複合体は、微小な肝転移腫瘍の検出に有用であると考えられた。さらに、ＭｎＣａＰナノ粒子複合体は、長い血中半減期を有するため、血管造影効果を併せ持つ。この特徴は、腫瘍のみならず、腫瘍への栄養血管を造影し、腫瘍の特性や治療効果などを評価することに利用可能であると考えられた。
【実施例３】
【０００８】
＜方法＞
製造したＭｎＣａＰミセル複合体のリンパ節イメージングを検討するため、作製したリンパ節転移モデルマウス（腫瘍モデルマウス）（図８参照）に投与し、その信号変化を比較した。ＭＲＩは前臨床用永久磁石型１Ｔ−ＭＲ装置、及びプロトン用ボリュームコイルを使用した。
腫瘍モデルマウスは、メスのＢＡＬＢ／ｃマウスの左前脚裏にルシフェラーゼ遺伝子を導入したマウス乳癌細胞４Ｔ１−Ｌｕｃ細胞２．０×１０６／１０μｌを移植して作製した。実験は移植後１６日後に実施した。
ＭＲ撮像は、スピンエコー法を用い、使用したパラメータは、以下の通りである。
ＴＥ＝１０．６ｍｓ；
ＴＲ＝４００ｍｓ；
ＦＯＶ＝４０．０  ｘ  ４０．０ｍｍ２；
スライス厚＝１．０ｍｍ（スライスギャップなし）
画素数＝２５６  ｘ  ２５６；
撮像方向＝横断面（Ｔｒａｎｓａｘｉａｌ）；
加算回数＝４；
撮像時間＝６分４９秒
ＭＲ撮像は、ＭｎＣａＰミセル複合体投与前から投与後２時間後まで、連続的に実施した。ＭｎＣａＰミセル複合体は、０．２２ｍｍｏｌ／ｋｇ  Ｍｎ濃度になるように調整し、マウス尾静脈より投与した。撮像時には、撮像中にマウスが動かないように、イソフルラン吸引麻酔（１．０〜２．０％）を使用した。また、マウス直腸に熱電対温度計を挿入し、自作の温水還流システムを用いて、マウスの体温を３６〜３７℃に保った。
＜結果＞
ＭｎＣａＰミセル複合体の投与前、並びに投与後４５分後及び６０分後のリンパ節転移部を含む１Ｔ−ＭＲ画像を、図９に示す。腫瘍領域における投与前の信号が周囲の筋肉組織と同等であったのに対し、投与後のリンパ節転移部（Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ；赤色矢印）のＭＲ信号強度が上昇（白く変化）したことが分かった。これは、投与したＭｎＣａＰミセル複合体がリンパ節転移部へ集積し、放出されたマンガン造影剤ががん組織と結合し、信号増強を生じたためと考えられた。一方、正常リンパ節（Ｎｏｒｍａｌ；黄色矢印）においても、投与後にリンパ節のごく一部に限局した信号が観察されたが、受動的な流入による極めて限局した範囲（おそらく辺縁洞及び髄質リンパ洞）に留まった。
【産業上の利用可能性】
【０００９】
本発明によれば、腫瘍組織に特異的に集積して該組織を選択的に描出することができ、少ない使用量でコントラストが高く、かつ長時間のＭＲＩ造影が可能であり、しかも副作用が少なく安全であるＭＲＩ造影用組成物（ＭＲＩ造影剤）と、それに用いる高分子ナノ粒子複合体等を提供することができる。
本発明のＭＲＩ造影用組成物（ひいては高分子ナノ粒子複合体）は、ｐＨに応答して溶解する特性を有しており、低ｐＨ環境下においてマンガンイオン（Ｍｎ２＋）を放出し得るものである。ここで、放出されたＭｎ２＋イオンは、周囲のタンパク質との相互作用によって、緩和能がおよそ１０倍以上に増大する特性を有する。そのため、本発明のＭＲＩ造影用組成物は、腫瘍組織内の低ｐＨ環境で選択的にＭｎ２＋イオンを放出し、ＭＲＩ信号強度の増大効果をもたらすことができるものである。
具体的には、例えば、本発明のＭＲＩ造影用組成物は、投与後２時間程までに腫瘍組織全体のコントラストを上昇させ（ＭＲＩ信号強度を増大させ）、その後、特に腫瘍組織の中心部分のコントラストを著しく上昇させることができる。この中心部分は、アシドーシスによってｐＨが特に低下している低酸素領域（Ｈｙｐｏｘｉａ）であり（免疫染色によっても確認されている）、治療抵抗性の癌細胞が存在する悪性度の高い領域であることが知られている。よって、本発明のＭＲＩ造影用組成物は、少量の造影剤投与で、治療抵抗性の癌細胞が内部に存在する場合は、Ｈｙｐｏｘｉａを高いコントラストで明確にイメージングできる世界発のプローブとなるものであり、このことは、腫瘍の悪性度を評価し得ることも意味する。
また、本発明のＭＲＩ造影用組成物は、従来では検出困難であった微小癌（例えば約１ｍｍ程度の癌）をＭＲＩ検出することができるものであるため、初期の原発性腫瘍や転移性腫瘍の早期発見も可能とするものである。とりわけ、肝癌においては、正常の肝組織では横緩和時間の短縮による信号低下、肝癌の領域ではＭｎ放出による信号上昇をもたらし、さらに大きなコントラストを形成可能な特性を有する。
このように、本発明のＭＲＩ造影用組成物（ひいては高分子ナノ粒子複合体）は、従来にない高い癌に対する診断精度を有するＭＲＩ造影法を可能とする点で、極めて有用なものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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