(57)【要約】  家畜の乳汁を用いて乳房炎の原因菌がブドウ球菌であるか否かを検出するための溶菌方法、溶菌処理液およびイムノクロマト装置からなる検出方法および検出キットを提供することを課題とする。ブドウ球菌の溶菌方法であって、家畜から得た乳汁に、溶菌酵素および少なくとも一の両性界面活性剤、好ましくはさらに少なくとも一の非イオン界面活性剤を含有する溶菌剤を混合して乳汁中に存在するブドウ球菌を溶菌する工程を含む方法を提供する。溶菌酵素は、好ましくはリゾスタフィンである。
2015093544.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳汁中のブドウ球菌の溶菌方法であって
乳汁に、リゾスタフィン、イオン界面活性剤、および非イオン界面活性剤を含有する溶菌剤を混合して乳汁中に存在するブドウ球菌を溶菌する工程を含む、溶菌方法。
【請求項２】
該イオン界面活性剤が両性界面活性剤である、請求項１に記載の溶菌方法
【請求項３】
該両性界面活性剤が、ジメチルアンモニオプロパンスルホネイト、ドデシルジメチルアンモニオブチライト、ラウリル酸ベタイン、およびアミドプロピルベタインから選択されるいずれかであり；ならびに／または
該非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルから選択されるいずれかである、請求項２に記載の溶菌方法。
【請求項４】
乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在するブドウ球菌を溶菌する工程において、該両性界面活性剤の終濃度が、0.03％以上0.2％以下である、請求項２または３に記載の溶菌方法。
【請求項５】
乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在するブドウ球菌を溶菌する工程において、該リゾスタフィンの終濃度が、0.1mg/μl以上200mg/μl以下であり；および／または
乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在するブドウ球菌を溶菌する工程において、該非イオン界面活性剤の終濃度が、0.03％以上10％以下である、請求項４に記載の溶菌方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に定義した、乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在するブドウ球菌を溶菌する工程
を含み、
溶菌により放出されたブドウ球菌の菌体内由来の特定物質を検出する工程
をさらに含む、乳汁中のブドウ球菌の検出方法。
【請求項７】
検出方法が、イムノクロマトグラフ方法により実施される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該イムノクロマトグラフ方法が、
（1）特定物質を含む乳汁を、該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片に対して、該乳汁を該第3部分またはそれより上流部に接触させる工程；および
（2）該乳汁を該第2部分またはそれより下流部まで流し、該第2部分またはそれより下流部で該標識による検出可能な信号を得る工程
を含む、請求項７に記載の検出方法。
【請求項９】
該第1部分に、該特定物質に対する標識された第一の抗体が保持されている、請求項８に記載の検出方法。
【請求項１０】
第3部分がそれぞれ異なる粒子サイズの乳脂肪球を除去できる空隙を有する2種以上の部材より構成されている、請求項８または９に記載の検出方法。
【請求項１１】
第3部分が下流に配置された第一の部材、および上流に配置された第二の部材により構成され、第二の部材の保持粒子サイズが第一の部材の保持粒子サイズより大きい、請求項１０に記載の検出方法。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか１項に定義された、溶菌剤。
【請求項１３】
家畜の乳房炎を診断する方法において用いるための、請求項１２に記載の溶菌剤。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の溶菌剤と、
該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片を含む、乳汁中の特定物質を検出するためのイムノクロマトグラフ装置と
を含む、乳汁中のブドウ球菌の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、家畜の乳汁中から乳房炎原因菌であるブドウ球菌を検出するための溶菌方法および検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
牛、羊、ヤギに代表される家畜の乳汁は無菌的なものではなく、疾患や環境が原因で何らかの微生物が混入している場合がある。特に乳房への微生物の感染による疾患ではしばしば乳汁中に多くの微生物を排菌することが知られている。微生物の感染が原因で引き起こされる代表的な家畜の疾患に乳房炎がある。【０００３】
乳房炎とは、乳管系、乳腺組織の炎症であり、主に微生物が乳房内に侵入・定着し、増殖することによって引き起こされる。乳房炎は多くの動物が罹患するが、特に乳牛における牛乳房炎は乳牛全体の15〜40％が罹患すると言われ、酪農家にとって極めて重要な疾患の一つである。乳牛が乳房炎に罹患すると、乳汁の合成機能が阻害され、泌乳量の減少や場合によっては泌乳の停止が起こるだけでなく、治療費や、乳質低下による乳価のペナルティーなど多大な経済的損失を酪農家に与える。さらには、伝染防止のために乳房炎罹患分房を個別に搾乳するなど、酪農家にかかる労働負担も増加する。【０００４】
乳房炎は様々な微生物の感染によって引き起こされる。原因菌のなかでもブドウ球菌、特に黄色ブドウ球菌は難治性の乳房炎の原因菌として知られ、搾乳機等を介して他の乳牛に伝染することが知られている。【０００５】
乳汁からブドウ球菌の検出方法としては培養法が広く用いられている。培養法は結果がでるまでに数日間を要するため迅速な原因菌特定には適さない。一方、原因菌に特異的な成分に対する抗体を用いる抗原抗体反応による同定法、特にイムノクロマトグラフ法が、数10分で結果を判定できるため、迅速・簡便な検査方法として広く用いられている（例えば特許文献1）。本発明者らは、イムノクロマトグラフ法を、家畜の乳汁中の物質を検出するための方法としても検討してきた（特許文献2）。【０００６】
イムノクロマトグラフ法などの免疫測定法では、菌体を溶菌し、菌体内の抗原を菌体外に放出させる必要がある。他方、黄色ブドウ球菌を溶菌する方法としては溶菌酵素リゾスタフィンを用いる方法（特許文献1および特許文献3）、溶菌酵素および/または溶菌活性を持つバクテリオシンと界面活性剤とタンパク質変性剤とで処理する方法（特許文献4）、ならびに溶菌酵素、非イオン界面活性剤、およびキレート剤を含む溶菌試薬により処理する方法（特許文献5）が知られている。しかしながら、上記特許文献ではいずれも培養した菌液を用いており、乳汁のような高タンパク、高脂肪の溶液中で溶菌効果については記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平1-244370号公報
【特許文献２】特開2012-122921号公報
【特許文献３】特開平11-28099号公報
【特許文献４】国際公開WO2005/064016
【特許文献５】特開2006-246792号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Journal of Dairy Research (1997) 64 253-260
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
乳房炎は様々な微生物の感染によって引き起こされるが、原因菌によって効果を示す抗生物質が異なる。また、特定の微生物では他方の分房や個体に伝染するなど、性質やその後の対応が異なることから、乳汁中に存在する原因菌を迅速・簡便・高感度に同定することが極めて重要となる。特に難治性の乳房炎の原因となり、伝染性のある黄色ブドウ球菌に関しては、感染早期に発見することが乳房炎の被害拡大を防ぐために非常に重要となる。しかしながら感染早期の場合、乳汁中の黄色ブドウ球菌の菌数が少ない場合も多く、迅速にまた、高感度に検出できる方法が求められる。【００１０】
菌の検出方法として広く用いられている培養法は、結果が得られるのに数日間を要するという問題がある。一方、イムノクロマトグラフ法などの抗原抗体反応に基づく免疫測定法は、迅速・簡便に原因菌を検出することが可能となり早期の抗菌薬治療が可能となる利点がある。【００１１】
免疫測定法にて原因菌の菌体内の特定物質を高感度に検出するには、菌体を高効率に溶菌し、菌体内の抗原を菌体外に放出させる必要がある。しかしながら、乳汁を検体として用いた場合、乳汁中に多量に含まれるカゼインなどのタンパク質や乳脂肪球などの影響により従来技術では溶菌が十分に行われないことが多い。また黄色ブドウ球菌は乳汁中の乳脂肪球に吸着することが知られており（非特許文献１）、通常の手法による溶菌率がさらに低下しやすいことが分かっている。このように乳汁中のブドウ球菌を高効率に検出するための有効な溶菌方法は知られていなかった。【００１２】
本発明は、家畜の乳汁を用いて乳房炎の原因菌がブドウ球菌であるか否かを検出するための溶菌方法、溶菌処理液およびイムノクロマト装置からなる検出方法および検出キットを提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、乳汁中のブドウ球菌を検出するためには、高効率に菌体内の対象抗原を抽出する必要があると考え、乳汁中のブドウ球菌を高効率に溶菌するために溶菌酵素および複数の界面活性剤を同時に用いることで溶菌の効率が向上し、乳汁中のブドウ球菌を高感度に検出できることを見出し、本発明を完成するにいたった。【００１４】
すなわち、本発明は、以下を提供する。
[1]  ブドウ球菌の溶菌方法であって、家畜から得た乳汁に、溶菌酵素および少なくとも一の両性界面活性剤を含有する溶菌剤を混合して乳汁中に存在するブドウ球菌を溶菌する工程を含む、方法。
[2]  該溶菌酵素が、リゾスタフィンである、[1]に記載の方法。
[3]  溶菌剤が、さらに少なくとも一の非イオン界面活性剤を含む、[1]または[2]に記載の方法。
[4]  両性界面活性剤が、ジメチルアンモニオプロパンスルホネイト、ドデシルジメチルアンモニオブチレイト、ラウリル酸ベタイン、およびアミドプロピルベタインからなる群より選択されるいずれかである、[1]〜[3]のいずれか一に記載の方法。
[5]  非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルおよびポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルからなる群より選択されるいずれかである、[1]〜[4]のいずれか一に記載の方法。
[6]  家畜乳汁中のブドウ球菌の溶菌のために用いる、溶菌酵素および少なくとも一の両性界面活性剤を含有する溶菌剤。
[7]  家畜の乳房炎を診断する方法において用いるための、[6]に記載の溶菌剤。
[8]  [1]〜[5]のいずれか一に記載の方法を含み、溶菌により放出されたブドウ球菌の菌体内由来の特定物質を検出する工程をさらに含む、家畜乳汁中のブドウ球菌の検出方法。
[9]  特定物質の検出工程が、イムノクロマトグラフ方法により実施される、[8]に記載の方法。
[10]  イムノクロマトグラフ方法が、
（1）特定物質を含む乳汁を、該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片に対して、該乳汁を該第3部分またはそれより上流部に接触させる工程；および
（2）該乳汁を該第2部分またはそれより下流部まで流し、該第2部分またはそれより下流部で該標識による検出可能な信号を得る工程：を含む、[9]に記載の方法。
[11]  該第1部分に、該特定物質に対する標識された第一の抗体が保持されている、[10]に記載の方法。
[12]  第3部分がそれぞれ異なる粒子サイズの乳脂肪球を除去できる空隙を有する2種以上の部材により構成される、[10]または[11]に記載の方法。
[13]  第3部分が下流に配置された第一の部材、および上流に配置された第二の部材により構成され、第二の部材の保持粒子サイズが第一の部材の保持粒子サイズより大きい、[12]に記載の方法。
[14]   [6]または[7]に記載の溶菌剤と、  該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片を含む、乳汁中の特定物質を検出するためのイムノクロマトグラフ装置とからなる、家畜乳汁中のブドウ球菌検出用キット。【００１５】
本発明は、以下も提供する。
［1］  乳汁中のブドウ球菌の溶菌方法であって
乳汁に、リゾスタフィン、イオン界面活性剤、および非イオン界面活性剤を含有する溶菌剤を混合して乳汁中に存在するブドウ球菌を溶菌する工程を含む、溶菌方法。
［2］  該イオン界面活性剤が両性界面活性剤である、［1］に記載の溶菌方法
［3］  該両性界面活性剤が、ジメチルアンモニオプロパンスルホネイト、ドデシルジメチルアンモニオブチライト、ラウリル酸ベタイン、およびアミドプロピルベタインから選択されるいずれかであり；ならびに／または
該非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルから選択されるいずれかである、［2］に記載の溶菌方法。
［4］  乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在するブドウ球菌を溶菌する工程において、該両性界面活性剤の終濃度が、0.03％以上0.2％以下である、［2］または［3］に記載の溶菌方法。
［5］  乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在するブドウ球菌を溶菌する工程において、該リゾスタフィンの終濃度が、0.1mg/μl以上200mg/μl以下であり；および／または
乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在するブドウ球菌を溶菌する工程において、該非イオン界面活性剤の終濃度が、0.03％以上10％以下である、［4］に記載の溶菌方法。
［6］  ［1］〜［5］のいずれか一に定義した、乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在するブドウ球菌を溶菌する工程
を含み、
溶菌により放出されたブドウ球菌の菌体内由来の特定物質を検出する工程
をさらに含む、乳汁中のブドウ球菌の検出方法。
［7］  検出方法が、イムノクロマトグラフ方法により実施される［6］に記載の方法。
［8］  該イムノクロマトグラフ方法が、
（1）特定物質を含む乳汁を、該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片に対して、該乳汁を該第3部分またはそれより上流部に接触させる工程；および
（2）該乳汁を該第2部分またはそれより下流部まで流し、該第2部分またはそれより下流部で該標識による検出可能な信号を得る工程
を含む、［7］に記載の検出方法。
［9］  該第1部分に、該特定物質に対する標識された第一の抗体が保持されている、［8］に記載の検出方法。
［10］  第3部分がそれぞれ異なる粒子サイズの乳脂肪球を除去できる空隙を有する2種以上の部材より構成されている、［8］または［9］に記載の検出方法。
［11］  第3部分が下流に配置された第一の部材、および上流に配置された第二の部材により構成され、第二の部材の保持粒子サイズが第一の部材の保持粒子サイズより大きい、［10］に記載の検出方法。
［12］  ［1］〜［5］のいずれか一に定義された、溶菌剤。
［13］  家畜の乳房炎を診断する方法において用いるための、［12］に記載の溶菌剤。
［14］  ［12］または［13］に記載の溶菌剤と、
該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片を含む、乳汁中の特定物質を検出するためのイムノクロマトグラフ装置と
を含む、乳汁中のブドウ球菌の検出用キット。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、乳汁中のブドウ球菌を迅速・簡便・高感度に、かつその場で検出することができる。特に、牛乳房炎を診断する場合において、標識が視認できるものである場合には装置等を用いずに酪農場で実施することができ、病状の更なる悪化の前に迅速に原因菌を特定し、適切な抗生物質の選択などの的確な治療方針や、感染拡大防止のための措置を早期に決定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】酵素免疫測定法（ELISA）による黄色ブドウ球菌の検出における溶菌酵素および非イオン界面活性剤存在下での両性界面活性剤の効果を示す。
【図２】実施例2で用いたイムノクロマトグラフ装置の試験片の断面模式図を示す。1：標識抗体含浸部材（第1部分）、2：クロマト展開用膜担体（第2部分）、3：捕捉部位、4：試料添加用部材かつ脂肪球除去用部材（第3部分）、5：吸収用部材、6：基材、および7：脂肪球除去用部材（第3部分）
【図３】イムノクロマトグラフ法による黄色ブドウ球菌の検出における溶菌酵素および非イオン性界面活性剤存在下での両性界面活性剤の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明について更に詳細に説明する。なお、本発明において、数値範囲を「X〜Y」で表すときは、両端の値を含む。「％」は、特に記載した場合を除き、質量に基づく割合を示す。「Aおよび（ならびに）／またはB」は、AとBの少なくとも一方の意であり、Aのみである場合、Bのみである場合、並びにAおよびBである場合がある。
【００１９】
本発明は、乳汁中の細菌を溶菌するための溶菌剤を提供する。本発明の溶菌剤は、溶菌酵素および特定の界面活性剤を含む。
【００２０】
［溶菌酵素］
本発明における溶菌酵素の種類は特に限定されず、任意の2種以上の溶菌酵素を適宜組み合わせて用いてもよい。乳房炎の起炎菌として大腸菌(Escherichia coli)、クレブシエラ(Klebsiella)属に属する細菌、または黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)による感染が多発することから、これらの微生物に対して溶菌作用を発揮できる溶菌酵素を1種または2種以上組み合わせて用いることも好ましい。例えばリゾチーム、リゾスタフィン、ペプシン、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、アクロモペプチダーゼ、β-N-アセチルグルコサミニダーゼなどから選ばれる1種または2種以上の溶菌酵素を用いることができる。例えば、溶菌酵素としてリゾチームと細胞膜溶解剤とを用いる方法が提案されている（特開昭63-167799号公報）。
【００２１】
乳房炎の起炎菌としてブドウ球菌の存在が特に疑われる場合には、ブドウ球菌に対して特異的に溶菌作用を発揮するリゾスタフィンを単独で、または他の溶菌酵素と組み合わせて用いることが好ましい場合がある。リゾスタフィンにより黄色ブドウ球菌を溶菌する方法については特開平11-28099号公報に開示があり、当業者は溶菌酵素としてリゾスタフィンを容易に入手することができる。上記特許公報の開示の全てを参照により本明細書の開示として含める。
【００２２】
天然型リゾスタフィンは、Staphylococcus simulansが生産する亜鉛プロテアーゼであり、黄色ブドウ球菌またはその同属菌の細胞壁ペプチドグリカンのグリコペプチド鎖中のグリシルグリシン結合を加水分解することによりこれらの菌を溶菌することが知られている。本明細書において、リゾスタフィンの用語には、上記天然型リゾスタフィン以外に、上記加水分解活性を失わない範囲で、天然型リゾスタフィンのアミノ酸配列中の1または複数のアミノ酸に付加、欠失、および/または置換等の変異が導入された変異型リゾスタフィンが包含される。また、加水分解活性を失わない範囲で、該天然型リゾスタフィンまたは変異型リゾスタフィンに他の化合物、例えば、糖類やポリエチレングリコール等を結合させた修飾型リゾスタフィンも包含される。これらのリゾスタフィンは、特開平11-28099号公報に記載された培養方法または遺伝子工学的手法で得るか、市販品の購入により入手することが可能である。
【００２３】
溶菌剤中での溶菌酵素の含量（複数の溶菌酵素を用いる場合は、溶菌酵素総量としての含量を指す。）は、検出のために有効な溶菌率が確保される限り、特に限定されないが、下限は、3500 units/mg以上の活性の酵素剤（または酵素タンパク質）を用いた場合は、乳汁と混合した場合の酵素剤（または酵素タンパク質）の終濃度が0.03μg/ml以上となるようにすることができ、好ましくは0.15μg/ml以上であり、より好ましくは0.3μg/ml以上であり、さらに好ましくは1.5μg/ml以上であり、特に好ましくは1μg/ml以上である。また溶菌酵素の含量の上限は、経済的な観点等から適宜定けることができ、下限がいずれの場合であっても、200μg/ml以下とすることができ、好ましくは100μg/ml以下であり、より好ましくは75μg/ml以下であり、さらに好ましくは50μg/ml以下であり、特に好ましくは25μg/ml以下である。酵素活性では、下限は、乳汁と混合した場合の終濃度が0.105 units/ml以上となるようにすることができ、好ましくは0.525 units/ml以上であり、より好ましくは1.05 units/ml以上であり、さらに好ましくは5.25 units/ml以上であり、特に好ましくは10.5 units/ml以上である。また上限は、下限がいずれの場合であっても、700 units/ml以下とすることができ、好ましくは350 units/ml以下であり、より好ましくは262.5 units/ml以下であり、さらに好ましくは175 units/ml以下であり、特に好ましくは87.5 units/ml以下である。なお、本明細書で酵素活性をいうときは、次の定義による。
【００２４】
酵素活性の定義：  1 unitは、熱処理した対象菌（好ましくはStaphylococcus aureus、より好ましくはStaphylococcus aureus 8325-4）を基質とした懸濁液について、25℃、pH8.0、600nmで0.01 OD/minの濁度における減少を生じさせる量である（0.2 mol/Lトリス緩衝液1.0mL中、pH8.0、25℃、初期濁度1.0）。
【００２５】
［界面活性剤］
水に溶かしたときに、電離してイオンとなる界面活性剤をイオン界面活性剤またはイオン性界面活性剤といい、イオンにならない界面活性剤を非イオン（ノニオン）界面活性剤という。イオン界面活性剤はさらに、陰イオン（アニオン）界面活性剤、陽イオン（カチオン）界面活性剤および両性界面活性剤に分類される。
【００２６】
本発明においては、溶菌酵素と同時に、少なくとも一の両性界面活性剤、少なくとも一の陰イオン界面活性剤、もしくは少なくとも一の陽イオン界面活性剤、またはこれらのいずれかの組み合わせを用いる。好ましくは、溶菌酵素と同時に、少なくとも一の両性界面活性剤もしくは少なくとも一の非イオン界面活性剤、またはこれらの組み合わせを用いる。さらに好ましくは、溶菌酵素と同時に、少なくとも一の両性界面活性剤および非イオン界面活性剤を組み合わせて用いる。
【００２７】
両性界面活性剤としては、アミノ酸系（アルキルアミノ脂肪酸塩）、ベタイン系 （アルキルベタイン）、アミンオキシド系（アルキルアミンオキシド）等があげられるが、特に限定されない。より特定された例としては、ジメチルアンモニオプロパンスルホネイト、ドデシルジメチルアンモニオブチレイト、ラウリル酸ベタイン、およびアミドプロピルベタインがあげられる。より具体的な例としては、n-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate、n-Decyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate、n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate、n-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate、n-Hexadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate、N-Dodecyl-N,N-(dimethylammonio)butyrateがあげられる。
【００２８】
溶菌剤中での両性界面活性剤の含量（複数の両性界面活性剤を用いる場合は、両性界面活性剤総量としての含量を指す。）は、検出のために有効な溶菌率が確保される限り、特に限定されないが、下限値に関しては、溶菌酵素の含量がいずれの場合であっても、乳汁と混合した場合の終濃度が0.03％以上となるようにすることができ、好ましくは0.05以上であり、より好ましくは0.06％以上であり、さらに好ましくは0.07％以上であり、特に好ましくは0.08％以上である。また両性界面活性剤の含量の上限値は、溶菌酵素による反応や抗原抗体反応を著しく阻害しない程度であればよく、いずれの場合であっても、1％以下とすることができ、好ましくは0.75％以下であり、より好ましくは0.5％以下であり、さらに好ましくは0.3％以下であり、特に好ましくは0.2％以下である。
【００２９】
非イオン界面活性剤としては、エステルエーテル型、エステル型、エーテル型のいずれも好適に用いることができ、より具体的にはポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテル、ポリソルベート類（脂肪酸ソルビタンエステルにエチレンオキシドが数十分子縮合したもの）などがあげられるが、特に限定されない。特に好ましい例の一つは、ポリソルベート類、より特定すると、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン(60)ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン(65)ソルビタントリステアレート、およびポリオキシエチレン(80)ソルビタンモノオレエート等、ならびにポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、より特定するとポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル等である。
【００３０】
溶菌剤中での非イオン界面活性剤の含量（複数の非イオン界面活性剤を用いる場合は、非イオン界面活性剤総量としての含量を指す。）は、例えばイムノクロマトグラフ法を用いる場合は展開液の流れが確保される限り、特に限定されないが、いずれの場合であっても、下限は、乳汁と混合した場合の終濃度が0.03％以上となるようにすることができ、好ましくは0.05％以上であり、より好ましくは0.075％以上であり、さらに好ましくは0.1％以上であり、特に好ましくは0.3％以上である。また非イオン界面活性剤の含量の上限値は、溶菌酵素による反応や抗原抗体反応を著しく阻害しない程度であればよく、いずれの場合であっても、10％以下とすることができ、好ましくは7.5％以下であり、より好ましくは5％以下であり、さらに好ましくは3％以下であり、特に好ましくは2％以下である。
【００３１】
陰イオン界面活性剤としては、カルボン酸塩、スルホン酸塩、硫酸エステル塩、その他のいずれも好適に用いることができる。より具体的な例として、アルキルエーテルカルボン酸塩、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（LAS）、α−オレフィンスルホン酸塩（AOS）、ジアルキルスルホコハク酸塩、ナフタレンスルホン酸塩のホルムアルデヒド縮合物、アルキル硫酸エステル塩（AS）、高級アルコールにエチレンオキシドを付加して硫酸化したポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩（AES）、高級アルコールやそのエチレンオキシド付加物などのリン酸エステル塩等をあげることができる。さらに具体的な例として、ドデシル硫酸ナトリウム、ミリスチル硫酸ナトリウム等のアルキル硫酸ナトリウム、N-ラウロイルザルコシン酸ナトリウム、N-ミリストイルザルコシン酸ナトリウム等のN-アシルザルコシン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、水素添加ココナッツ脂肪酸モノグリセリドモノ硫酸ナトリウム、ラウリルスルホ酢酸ナトリウム、N-パルミトイルグルタミン酸ナトリウム等のN-アシルグルタミン酸塩、N-メチル-N-アシルアラニンナトリウム、α-オレフィンスルホン酸ナトリウムをあげることができる。
【００３２】
陽イオン界面活性剤としては、アミン塩型、第４級アンモニウム塩型のいずれも好適に用いることができ、より具体的な例として、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド等をあげることができる。
【００３３】
［配合例］
特に好ましい態様の一つにおいては、溶菌剤は、リゾスタフィン、両性界面活性剤、および非イオン界面活性剤を含有する。リゾスタフィン、両性界面活性剤、および非イオン界面活性剤を含有する溶菌剤において、好ましい両性界面活性剤は、ジメチルアンモニオプロパンスルホネイト、ドデシルジメチルアンモニオブチライト、ラウリル酸ベタイン、およびアミドプロピルベタインから選択されるいずれかであり；好ましい非イオン界面活性剤は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである。このような溶菌剤における各成分の濃度は、乳汁に溶菌剤を混合して乳汁中に存在する該菌を溶菌する工程において、リゾスタフィンの終濃度が、0.1mg/μl以上200mg/μl以下であり、両性界面活性剤の終濃度が、0.03％以上0.2％以下であり、かつ非イオン界面活性剤の終濃度が、0.03％以上10％以下であるようにするとよい。
【００３４】
［その他の成分］
本発明の溶菌剤は、溶菌酵素および界面活性剤以外に、意図した効果を著しく損なわない限り、一種またはそれ以上の他の成分を含むことができる。溶菌酵素および界面活性剤以外の成分の好ましい例は、溶菌を促進する効果を有する物質である。具体的には、グルタルアルデヒド、ハロゲン化合物、クロルヘキシジン、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、２−メチル−１−プロパノール、２−メチル−２−プロパノール）、フェノール、過酸化水素、アクリノール、グアニジンおよびその塩、キレート剤、有機酸およびその塩、多価アルコール類（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチレングリコール、グリセリン）、ならびに２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、シスチンおよびチオフェノールなどの還元剤をあげることができるが、これらに限定されない。
【００３５】
［溶菌条件、溶菌率］
本発明においては、溶菌剤は、乳汁に混合して用いることができる。乳汁と溶菌剤との混合比は、溶菌酵素等の終濃度が適切に維持され、十分な溶菌率が確保できる限り、特に限定されない。乳汁に対して比較的少量の溶菌剤を用いる場合は、乳汁が希釈されない。したがって、より高い感度で菌体を検出できると期待できる。また乳汁に対して比較的大量の溶菌剤を用いる場合は、乳汁中の脂肪球やタンパク質による影響が減じられ、より短時間で菌体を検出できると期待できる。乳汁と溶菌剤との混合物における乳汁の割合（乳汁／（乳汁＋溶菌剤）×100）は、高いほど検出感度を上げることができるとの観点からは、他の条件がいずれの場合であっても、例えば5％以上とすることができ、10％以上とすることが好ましく、20％以上とすることがより好ましく、30％以上とすることがさらに好ましい。上限値は、他の条件がいずれの場合であっても、乾燥等の手段によって固形化した溶菌剤を用いることにより、乳汁の割合を100％とすることができる。また、他の条件がいずれの場合であっても、乳汁の割合は90％以下とすることができ、80％以下、70％以下、60％以下、または50％以下とすることができる。上限値は、混合の容易さ、溶菌剤の溶液としての安定性等を考慮して決定してもよい。
【００３６】
本発明においては、乳汁は溶菌剤と単に混合すればよい。混合する際の温度、およびそれに続く酵素が作用するための処理時間は、用いる溶菌酵素が活性を発揮できる温度であれば特に限定されず、通常、室温でよい。混合後の処理時間のために必要な時間は、当業者であれば、溶菌率を考慮して、適宜設計することができる。本発明においては、ブドウ球菌に対して適切な組み合わせおよび濃度の溶菌酵素および界面活性剤を用いているので、処理時間を、溶菌酵素のみを用いる場合よりも大幅に短くすることができる。本発明における処理時間は、概ね数十分間〜数時間以内であり、より具体的には120分間以内とすることができ、60分以内とすることが好ましく、45分以内とすることがさらに好ましく、25分間以内とすることがさらに好ましく、20分以内とすることがさらに好ましく、15分以内とすることがさらに好ましい。処理時間を、実質0とする（乳汁と溶菌剤を混合して、直ちに測定に供する）こともできる。このような短時間であっても、本発明に依れば90%以上の溶菌率が確保され、高感度のブドウ球菌の検出が実施できる。
【００３７】
本発明者らの検討によると、本明細書の実施例に記載した条件では、黄色ブドウ球菌を約5×108 cells/mlで含む牛乳を本発明の溶菌剤により約30分間処理することにより100％の溶菌率を達成できることが確認できている。なお溶菌率は、対象となるブドウ球菌を含む液を、あらかじめ適切な濃度の非イオン界面活性剤で処理した後、さらに超音波処理し、必要に応じ十分な酵素処理を行ったものの溶菌率を100％とすることができる。
【００３８】
［検出手段］
本発明により溶菌されたブドウ球菌は、菌体由来の成分を抗原として、各種の免疫学的方法により検出することができる。免疫学的測定方法としては、例えば、イムノクロマトグラフ法、凝集反応法、酵素免疫測定法（ELISA法）、放射能免疫測定法（RIA法）、または蛍光免疫測定法（FIA法）などをあげることができるが、これらに限定されることはない。免疫学的方法の実施に際し、非特異吸着を防ぐためのブロッキングのための物質や、対象菌以外の菌との交差反応を防ぐための物質を用いてもよい。
【００３９】
イムノクロマトグラフ法を用いる場合、典型的には、次のように実施することができる。
【００４０】
［イムノクロマトグラフ法、イムノクロマトグラフ装置］
抗原抗体反応は、第1部分に保持されている「特定物質に対する標識された第一の抗体」と、第2部分に固定化された「特定物質に対する第二の抗体」を用いて、サンドイッチアッセイ法により検出することができる。あるいは抗原抗体反応は、第1部分に保持されている標識された特定物質と、第2部分に固定化された特定物質に対する抗体を用いて競合法にて検出してもよい。但し、本発明においては、検出感度が高く、陽性で抗体検出ラインが出現するサンドイッチアッセイ法が好ましい。
【００４１】
イムノクロマトグラフ装置は、イムノクロマトグラフ法によって乳汁中の特定物質を検出するための装置であって、該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第1部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第2部分と、該第1部分または該第2部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第3部分とを有する試験片を含む装置である。具体的な試験片の構成としては、図2に断面模式図を示した試験片があげられる。図2においては、脂肪球除去用部材（第3部分）7は、試料添加用部材4の下流、かつ標識抗体含浸部材（第1部分）1の上流に設置されている。
【００４２】
イムノクロマトグラフ装置は公知の方法にて市販の材料を用いて作製することができる。  第1部分に使用する材料は、イムノクロマトグラフを行えるものであれば特に限定されないが、好ましくは、セルロース誘導体等の繊維マトリックス、濾紙、ガラス繊維、布、綿等である。
【００４３】
第2部分に使用する材料は、イムノクロマトグラフを行えるものであれば特に限定されないが、好ましくは、ニトロセルロース、混合ニトロセルロースエステル、ポリビニリデンフロライド、ナイロン等である。
【００４４】
第3部分に使用する材料は、乳汁中に含まれる直径1〜10数μmの乳脂肪球を除去できる空隙を有していることが好ましい。第3部分は、試料溶液が孔径数10〜数100nmの多孔性のメンブレンからなる上記第2部分の上流側に配置されている必要があり、試料溶液が最初に接触・通過できる位置である、上記第1部分の上流側に配置されていることが好ましい。
【００４５】
第3部分が有する空隙は乳脂肪球を分離できる大きさであればよく、保持粒子サイズは好ましくは0.1から10μmであり、より好ましくは1から3.5μmである。材料は上記の範囲の空隙を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはセルロース誘導体等繊維マトリックス、濾紙、ガラス繊維、布、綿等である。保持粒子サイズとは、そのサイズ以上の粒子サイズを有する乳脂肪球が空隙を通過できずに第3部分に保持される乳脂肪球の粒子サイズのことであり、第3部分の空隙の平均ポアサイズに実質的に対応しているが、そのサイズ以上の粒子サイズを有する乳脂肪球の50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、特に好ましくは90％以上、最も好ましくは98％以上が空隙を通過できずに第3部分に保持される。保持される乳脂肪球の割合は当業者に周知の方法で測定することができる。例えば、GEヘルスケアバイオサイエンス社から提供されているGF/Bは保持粒子サイズ（保持効率98％の粒子直径のこと。本明細書で保持粒子サイズというときは、特に記載した場合を除き、この意味である。）が1.0μmであることが同製品カタログにおいて明らかにされているが、当業者に周知の方法で上記の粒子サイズを確認することが可能である。
【００４６】
上記第3部分は、特定の保持粒子サイズを有する材料のみを用いてもよく、乳脂肪球の分離効率を高めるために保持粒子サイズが大きいものから小さいものを段階的に張り合わせて用いてもよい。上記第3部分がそれぞれ異なる粒子サイズの乳脂肪球を除去できる空隙を有する2種以上の部材により構成される場合は本発明の好ましい態様であり、第3部分が下流に配置された第一の部材、および上流に配置された第二の部材により構成され、第二の部材の保持粒子サイズが第一の部材の保持粒子サイズより大きい場合は本発明のさらに好ましい態様である。第3部分を2種の部材により構成する場合には、下流に配置された第一の部材の保持粒子サイズが1.0〜2.0μmであり、上流に配置された第二の部材の保持粒子サイズが3.0〜3.5μmであることが好ましい。高濃度で広い粒径分布を有する乳脂肪球を含む乳汁、好ましくは搾乳後の未希釈の乳汁から特定物質を高感度に検出するためは、第3部分を保持粒子サイズの小さな部材と保持粒子サイズの大きな部材との組み合わせにより構成することが好ましい。
【００４７】
上記第1部分には、特定物質に対する標識された第一の抗体、または標識された特定物質が保持されている。第1部分に、特定物質に対する標識された第一の抗体が保持されている場合には、サンドイッチアッセイ法により特定物質を検出することができる。また、第1部分に標識された特定物質が保持されている場合には、競合法により特定物質を検出することができる。本発明においては、検出感度が高く、陽性で抗体検出ラインが出現するサンドイッチアッセイ法の方が好ましいことから、第1部分には、特定物質に対する標識された第一の抗体が保持されていることが好ましい。
【００４８】
第1部分に特定物質に対する標識された第一の抗体を保持させる場合には、特定物質に対する第一の抗体と、特定物質に対する第二の抗体の、2種類の抗体を用いる。サンドイッチアッセイ法により特定物質を検出することができるように、上記第一の抗体と上記第二の抗体は、当該特定物質に同時に結合できることができる抗体であり、上記第一の抗体が認識する当該特定物質のエピトープは、上記第二の抗体が認識する当該特定物質のエピトープとは異なることが好ましい。
【００４９】
本発明において、検出可能な信号を得るために、第1部分に保持される第一の抗体または特定物質は標識されている。本発明で用いる標識としては、着色粒子、酵素、ラジオアイソトープなどがあげられるが、特殊な設備不要で目視によって検出可能な着色粒子を使用することが好ましい。着色粒子としては、金や白金などの金属微粒子、非金属粒子、ラテックス粒子などがあげられるが、これらに限定されるものではない。着色粒子は、試験片の空隙内を通って下流に輸送されることができるサイズであればいかなるサイズでもよいが、直径が1nmから10μmが好ましい。より好ましくは、5nmから1μmであり、さらに好ましくは10nmから100nmである。
【００５０】
［検出対象］
本発明により、乳汁中のブドウ球菌を検出できる。本発明で「ブドウ球菌」というときは、特に記載した場合を除き、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属に属する細菌をいい、これにはStaphylococcus aureus（黄色ブドウ球菌）、それ以外のスタフィロコッカス属の細菌、およびCNS（Coagulase Negative Staphylococcus、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌）が含まれる。CNSには、Staphylococcus intermedius、Staphylococcus hyicus、Staphylococcus xylosus、Staphylococcus epidermidis（表皮ブドウ球菌）等が含まれる。本発明においては、溶菌酵素と界面活性剤が適切に配合された溶菌剤を用いることにより、牛等の家畜から得られた、脂肪球と高濃度のタンパク質を含有する乳汁そのものに含まれるブドウ球菌を検出することができる。
【００５１】
本発明で測定される特定物質は、イムノクロマトグラフ法等の免疫学的な方法で測定できる物質であれば何れでも可能であるが、細菌の成分または細菌が分泌する物質であることが好ましい。さらに好ましくは、細菌のL7/L12リボゾームタンパク質である。L7/L12リボソームタンパク質は、細胞内に多コピー存在するために検出感度が高い。
【００５２】
［抗体］
本発明に用いる抗体は、国際公開第00/06603号パンフレットに記載の方法で作製することができる。細菌リボゾームタンパク質L7/L12を抗原とする場合は、細菌リボゾームタンパク質L7/L12の全長タンパク質あるいはその部分ペプチドを抗原として用いて作製することができるが、全長タンパク質を抗原として作製することが好ましい。この部分ペプチドあるいは全長タンパク質をそのまま、またはキャリアタンパク質と架橋した後必要に応じてアジュバントとともに動物へ接種せしめ、その血清を回収することでL7/L12リボソームタンパク質を認識する抗体（ポリクローナル抗体）を含む抗血清を得ることができる。また抗血清より抗体を精製して使用することもできる。接種する動物としてはヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等であり、特にポリクローナル抗体作製にはヒツジ、ウサギなどが好ましい。また、抗体としてはハイブリドーマ細胞を作製する公知の方法により取得したモノクローナル抗体を適用することがより好ましいが、この場合はマウスが好ましい。当該モノクローナル抗体として、乳房炎の原因となる特定の細菌のリボゾームタンパク質L7/L12と反応し、前記特定の細菌以外の乳房炎の原因となる細菌のリボゾームタンパク質L7/L12とは反応しないモノクローナル抗体をスクリーニングすることにより、当該細菌による感染症にかかっているかどうかの診断に役立てることが可能となる。
【００５３】
抗体が乳房炎の原因となる特定の細菌の成分または該細菌が分泌する物質と反応し、前記特定の細菌以外の乳房炎の原因となる細菌の成分または該細菌が分泌する物質とは反応しないモノクローナル抗体であれば、リボゾームタンパク質L7/L12以外を抗原として認識する抗体であっても使用することができる。
【００５４】
また、モノクローナル抗体としては、乳汁中に含まれる特定物質以外の夾雑物により抗原抗体反応が阻害されないモノクローナル抗体を用いることが好ましい。例えば、乳汁中にはカゼインなどのタンパク質が大量に含まれており、特定物質とモノクローナル抗体との反応を阻害する場合がある。特定物質に対するモノクローナル抗体を常法により製造するにあたり、例えばカゼインなどにより抗原抗体反応が阻害を受けないモノクローナル抗体や、抗原抗体反応への影響が少ないモノクローナル抗体を適宜選択して用いることが好ましい場合がある。このようなモノクローナル抗体は、通常の方法に従って抗原に対して特異的に反応するモノクローナル抗体を製造した後に、カゼインなどの夾雑物の存在下で抗原抗体反応が阻害されるか否かを調べて、実質的に反応の阻害を受けないモノクローナル抗体を選択することにより容易に取得することができる。
【００５５】
［その他］
本発明においては、上述した試験片をそのまま使用してイムノクロマトグラフ装置としてもよいし、ケースに収納して、イムノクロマトグラフ装置としてもよい。前者の場合は、試料となる乳汁の量が多い場合に、容器に入った試料に直接試験片の一端を浸して使用することが好ましい。また、後者の場合は、試料となる乳汁の量が少ない場合に、ピペット等で所定量を計量して試験片に滴下して使用することが好ましい。後者の場合のケースの形状は、試験片を収納できればいかなる形状でもよい。ケースの材料はいかなる材料でもよく、ポリプロピレンやポリカーボネートなどが好ましいものとしてあげられる。
【００５６】
本発明のイムノクロマトグラフ装置は、容器、たとえばマイクロチューブ、および添加液、例えば細菌を溶菌させてリボゾームタンパク質L7/L12を溶液内に溶出させるための、溶菌酵素または界面活性剤を含む添加液を組合せたキットとして提供することもできる。
【実施例】
【００５７】
実施例1：酵素免疫測定法（ELISA）による黄色ブドウ球菌の検出における溶菌酵素および非イオン性界面活性剤存在下での両性界面活性剤の効果
（a）リボゾームタンパク質L7/L12に対するモノクローナル抗体の作製
金コロイド標識する抗体には、Staphylococcus aureus（黄色ブドウ球菌）リボソームタンパク質L7/L12モノクローナル抗体を使用した。国際公開WO00/06603号パンフレットの実施例5に記載の方法に準じて、黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureusのL7/L12リボゾームタンパク質を取得し、同タンパク質を用いてモノクローナル抗体を作製した。当該モノクローナル抗体は、上記L7/L12リボゾームタンパク質の別のサイトに同時に結合しうる2種（SA-1およびSA-2）の組合せを選択した。【００５８】
（b）ELISAによる溶菌酵素の効果の確認  溶菌酵素の効果については以下のように確認した。
10μg/mlのモノクローナル抗体SA-1とPBS溶液100μlを96穴ELISAプレート（Nunc社Maxsorp ELISAプレート）に分注し4℃で一晩吸着させた。上澄み除去後、1%牛血清アルブミン溶液（PBS中）200μlを添加し、室温で1時間反応させてブロッキングした。上澄み除去後、洗浄液（0.02％Tween20、PBS）で数回洗浄した。市販の牛乳に懸濁した黄色ブドウ球菌（約5×108cells/ml）を表1に記載の溶液で室温にて30分処理後、同牛乳にて100倍に希釈したものを100μl添加し、室温にて1時間反応させた。さらに上澄み除去後、パーオキシダーゼ標識したモノクローナル抗体SA-2を0.02% Tween20、PBSにて最終濃度1μg/mlになるように希釈してそれぞれ100μl添加し、室温にて1時間反応させた。上澄み除去後さらに洗浄液で数回洗浄したのち、TMB溶液（KPL社製）を100μlずつ加え室温10分間反応させた後1 mol/lの塩酸を100μl添加して反応を停止したのち450nmの吸光度を測定した。【００５９】
上記黄色ブドウ球菌を、あらかじめ終濃度1.0％TritonX-100にて終夜撹拌後、超音波処理（出力10、1min×10回）した菌液を、10（μg/ml）(35 units/ml)リゾスタフィン（和光純薬、3500 unit/mg。以下の実施例において、特に記載した場合を除き、同じ。）にて37℃にて60分間溶菌処理した菌液を用いた場合の溶菌率を100％とし、それぞれの条件における溶菌率を算出した。【００６０】
結果を図1に示す。両性界面活性剤を添加していない条件1の場合は溶菌率が55％であったのに対し、両性界面活性剤を添加した場合は、いずれも添加しない場合と比べて溶菌率が増大することが明らかとなった。さらに、非イオン性界面活性剤の種類を変えた条件10〜12においても同様に溶菌率が増大することが明らかとなった。【００６１】
【表１】
2015093544.tif 000003
【００６２】
実施例2：イムノクロマトグラフ法による黄色ブドウ球菌の検出における溶菌酵素および非イオン性界面活性剤存在下での両性界面活性剤の効果
（1）イムノクロマトグラフ装置の作製
イムノクロマトグラフ装置は以下のように作製した。
（a）金コロイド標識含浸部材  BBInternational社製金コロイド溶液(粒径60nm)0.9mLに0.1M リン酸カリウム pH7.0を混合し、金コロイド標識するモノクローナル抗体SA-2を100μg/mL加え室温で10分間静置し、この抗体を金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が1%となるようにウシ血清アルブミン（BSA）10%水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をBSAでブロッキングして、金コロイド標識したモノクローナル抗体SA-2（以下、「金コロイド標識抗体」と記す）溶液を調製した。この溶液を遠心分離（15000×rpm、5分間）して金コロイド標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得た。この金コロイド標識抗体を0.25%BSA、2.5%スクロース、35mm NaClを含有する20mmトリス塩酸緩衝液（pH8.2）に懸濁して金コロイド標識抗体溶液を得た。10mm×300mmの帯状のグラスファイバーパットに、金コロイド標識抗体溶液2mLを含浸せしめ、これを室温で減圧乾燥させて金コロイド標識抗体含浸部材1（第1部分）とした。【００６３】
（b）抗原および金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位
幅25mm、長さ300mmのニトロセルロース膜をクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体2（第2部分）として用意した。  モノクローナル抗体SA-1 1.5mg/mLが含有されてなる溶液を、このクロマト展開用膜担体2におけるクロマト展開開始点側の末端から10mmの位置に1μL/cmでライン状に塗布して、これを50℃で30分間乾燥し、その後、0.5％スクロース溶液に30分浸し、一晩室温で乾燥させた。Staphylococcus aureusリボソームタンパク質 L7/L12抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位3とした。【００６４】
（c）イムノクロマトグラフ装置の作製  イムノクロマトグラフ装置断面図を図2に示す。上記標識抗体含浸部材1、上記クロマト展開用膜担体2の他に、試料添加用部材と脂肪球除去用部材（第3部分）とを兼ねる部材として25mmのGF/DVA（GEヘルスケアバイオサイエンス製：ガラス繊維からなる、厚み776μm、保持粒子サイズ3.5μmのフィルター部材4）および20mmのGF/AVA（GEヘルスケアバイオサイエンス製：ガラス繊維からなる、厚み299μm、保持粒子サイズ1.7μmのフィルター部材7）を貼り合わせ、さらに、吸収用部材5として濾紙を用意した。そして、これらの部材を基材6（厚さ254μm、ポリスチレン製で部材を貼り合わせるための粘着材がついたもの）に貼り合せた後、5mm幅に切断し、イムノクロマトグラフ装置を作製した。【００６５】
（2）試験  イムノクロマトグラフ装置による牛乳汁の測定は以下のように行った。
マイクロチューブに終濃度1×105（cfu/ml）の黄色ブドウ球菌を添加した乳汁を100μl分取し、溶菌処理液（終濃度1％  Tween20、10μg/ml(35 units/ml)  リゾスタフィン、0.1M  MOPSO  pH7.5、濃度の異なるZwettergent 3-12、またはDDMAB）150μlを加えて混合し室温で30分間処理した。牛乳汁は市販の飲用品を用いた。同混合溶液に上記イムノクロマトグラフ装置を試料添加用部材4から浸漬して、室温で30分静置して展開後、上記補足部位3で補足されたリボソームタンパク質L7/L12抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉の有無を捕捉量に比例して増減する赤紫色のラインを装置C10066（浜松ホトニクス製）にて測定した。両性界面活性剤を濃度を変えて添加し、実施例1と同様の方法にてあらかじめ溶菌処理した菌液の溶菌率を100％として各濃度における溶菌率を算出した。結果を図3に示す。いずれの両性界面活性剤を用いた場合においても濃度に依存して溶菌率が大きく向上していることが明らかとなった。【００６６】
実施例3：イムノクロマトグラフ法による乳汁サンプルの測定
乳房炎の牛からの乳汁サンプルを対象としてイムノクロマトグラフ法を実施した。測定は実施例2に準じて行い（溶菌処理液：終濃度1％  Tween20、10μg/ml(35 units/ml)  リゾスタフィン、0.1M  MOPSO  pH7.5、終濃度0.1％  Zwettergent 3-12。室温で30分処理の後、室温で30分間展開。）、出現した赤紫色のラインを目視により判定した（陽性+、陰性-）。一方、乳汁中の黄色ブドウ球菌の数を確認するために、培養法にて定量を行った。トリプチケースソイII5％ヒツジ血液寒天培地（日本ベクトンデッキンソン社製）に乳汁を100μl播種後、37℃で24時間培養し、出現したコロニーを計数した。培養法によって算出した黄色ブドウ球菌の数およびイムノクロマト法による判定結果を表2に示す。Zettergent 3-12を添加することによって103 (cfu/ml)オーダーの場合も検出することが可能となった。【００６７】
【表２】
2015093544.tif 000004
【図１】
2015093544.tif 000005
【図２】
2015093544.tif 000006
【図３】
2015093544.tif 000007
【国際調査報告】
2015093544.tif 000008
2015093544.tif 000009
2015093544.tif 000010
2015093544.tif 000011