【手続補正書】
【提出日】平成24年8月7日(2012.8.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−グルコースのＬ−グルコースとの対比における細胞内への特異的な取り込みを評価するための方法であって、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体と、蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体を、評価対象とする細胞種の別個の細胞にそれぞれ接触させ、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光と、蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体が発する蛍光を比較し、両者の蛍光強度の差を、Ｄ−グルコースのＬ−グルコースとの対比における細胞内への特異的な取り込みとして評価することを特徴とする方法。
【請求項２】
蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を２位に結合せしめたＤ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項５】
Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を２位に結合せしめたＬ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を２位に結合せしめたＤ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項９】
２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を２位に結合せしめたＬ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
Ｄ−グルコースのＬ−グルコースとの対比における細胞内への特異的な取り込みを評価するための方法であって、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体と、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光の波長とは異なる波長の蛍光を発する蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体との混合物を評価対象とする細胞に接触させ、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光を検出することで行うことを特徴とする方法。
【請求項１１】
最大蛍光波長の差を少なくとも２０ｎｍとすることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を２位に結合せしめたＤ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を２位に結合せしめたＤ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光の波長とは異なる波長の蛍光を発する蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、スルホローダミンを結合せしめたＬ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする請求項１２または１４記載の方法。
【請求項１７】
蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光の波長とは異なる波長の蛍光を発する蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を２位に結合せしめたＬ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光の波長とは異なる波長の蛍光を発する蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項２０】
Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を２位に結合せしめたＬ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光の波長とは異なる波長の蛍光を発する蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、異なる蛍光発色団を分子内に有する２種類以上のＬ−グルコース誘導体を混合して用いることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項２２】
蛍光発色団を分子内に有してなることを特徴とするＬ−グルコース誘導体。
【請求項２３】
Ｌ−マンノースの５つの水酸基をアセチル化し、１位のアセトキシ基を臭素置換し、１，２位にオルトエステル基を導入し、３，４，５位のアセチル基をベンジル基に変換し、１，２位に導入したオルトエステル基を外して１位をメトキシ基に変換するとともに２位を水酸基とし、２位の水酸基をトリフルオロメタンスルホニル化またはメタンスルホニル化した後、アジド化し、アジド基を水素還元するとともに脱ベンジル化し、最後に１位のメトキシ基を水酸基に変換することで得られるＬ−グルコサミンまたはその塩の２位に蛍光発色団を導入することを特徴とする蛍光発色団を分子内に有してなるＬ−グルコース誘導体の製造方法。
【請求項２４】
Ｌ−マンノースの５つの水酸基をアセチル化し、１位のアセトキシ基を臭素置換し、１，２位にオルトエステル基を導入し、３，４，５位のアセチル基をベンジル基に変換し、１，２位に導入したオルトエステル基を外して１位をメトキシ基に変換するとともに２位を水酸基とし、２位の水酸基をトリフルオロメタンスルホニル化またはメタンスルホニル化した後、アジド化し、アジド基を水素還元するとともに脱ベンジル化し、最後に１位のメトキシ基を水酸基に変換することを特徴とするＬ−グルコサミンまたはその塩の製造方法。
【請求項２５】
蛍光発色団を分子内に有してなるＬ−グルコース誘導体を製造するためのＬ−グルコサミンまたはその塩の使用。
【請求項２６】
蛍光発色団が、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基、７−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）ベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基、スルホローダミンからなる群より選択されるいずれかであることを特徴とする請求項２２記載のＬ−グルコース誘導体。
【請求項２７】
蛍光発色団を２位に結合せしめたことを特徴とする請求項２２記載のＬ−グルコース誘導体。
【請求項２８】
Ｌ−グルコース誘導体が、２−［Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ］−２−デオキシ−Ｌ−グルコース、２−［Ｎ−７−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノスルホニル）ベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ］−２−デオキシ−Ｌ−グルコース、スルホローダミンを２位に結合せしめたＬ−グルコースからなる群より選択されるいずれかであることを特徴とする請求項２２記載のＬ−グルコース誘導体。
【請求項２９】
細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項１０乃至１３のいずれかに記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
上記の着想に基づく本発明のＤ−グルコースのＬ−グルコースとの対比における細胞内への特異的な取り込みを評価するための方法は、請求項１記載の通り、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体と、蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体を、評価対象とする細胞種の別個の細胞にそれぞれ接触させ、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光と、蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体が発する蛍光を比較し、両者の蛍光強度の差を、Ｄ−グルコースのＬ−グルコースとの対比における細胞内への特異的な取り込みとして評価することを特徴とする。
また、請求項２記載の方法は、請求項１記載の方法において、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする。
また、請求項３記載の方法は、請求項２記載の方法において、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を２位に結合せしめたＤ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする。
また、請求項４記載の方法は、請求項２記載の方法において、蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする。
また、請求項５記載の方法は、請求項４記載の方法において、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を２位に結合せしめたＬ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする。
また、請求項６記載の方法は、請求項１記載の方法において、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする。
また、請求項７記載の方法は、請求項６記載の方法において、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を２位に結合せしめたＤ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする。
また、請求項８記載の方法は、請求項６記載の方法において、蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする。
また、請求項９記載の方法は、請求項８記載の方法において、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を２位に結合せしめたＬ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする。
また、本発明のＤ−グルコースのＬ−グルコースとの対比における細胞内への特異的な取り込みを評価するための方法は、請求項１０記載の通り、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体と、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光の波長とは異なる波長の蛍光を発する蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体との混合物を評価対象とする細胞に接触させ、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光を検出することで行うことを特徴とする。
また、請求項１１記載の方法は、請求項１０記載の方法において、最大蛍光波長の差を少なくとも２０ｎｍとすることを特徴とする。
また、請求項１２記載の方法は、請求項１０記載の方法において、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする。
また、請求項１３記載の方法は、請求項１２記載の方法において、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を２位に結合せしめたＤ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする。
また、請求項１４記載の方法は、請求項１０記載の方法において、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする。
また、請求項１５記載の方法は、請求項１４記載の方法において、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を２位に結合せしめたＤ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする。
また、請求項１６記載の方法は、請求項１２または１４記載の方法において、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光の波長とは異なる波長の蛍光を発する蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、スルホローダミンを結合せしめたＬ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする。
また、請求項１７記載の方法は、請求項１２記載の方法において、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光の波長とは異なる波長の蛍光を発する蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする。
また、請求項１８記載の方法は、請求項１７記載の方法において、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を２位に結合せしめたＬ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする。
また、請求項１９記載の方法は、請求項１４記載の方法において、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光の波長とは異なる波長の蛍光を発する蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする。
また、請求項２０記載の方法は、請求項１９記載の方法において、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を２位に結合せしめたＬ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする。
また、請求項２１記載の方法は、請求項１０記載の方法において、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光の波長とは異なる波長の蛍光を発する蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、異なる蛍光発色団を分子内に有する２種類以上のＬ−グルコース誘導体を混合して用いることを特徴とする。
また、本発明のＬ−グルコース誘導体は、請求項２２記載の通り、蛍光発色団を分子内に有してなることを特徴とする。
また、本発明の蛍光発色団を分子内に有してなるＬ−グルコース誘導体の製造方法は、請求項２３記載の通り、Ｌ−マンノースの５つの水酸基をアセチル化し、１位のアセトキシ基を臭素置換し、１，２位にオルトエステル基を導入し、３，４，５位のアセチル基をベンジル基に変換し、１，２位に導入したオルトエステル基を外して１位をメトキシ基に変換するとともに２位を水酸基とし、２位の水酸基をトリフルオロメタンスルホニル化またはメタンスルホニル化した後、アジド化し、アジド基を水素還元するとともに脱ベンジル化し、最後に１位のメトキシ基を水酸基に変換することで得られるＬ−グルコサミンまたはその塩の２位に蛍光発色団を導入することを特徴とする。
また、本発明のＬ−グルコサミンまたはその塩の製造方法は、請求項２４記載の通り、Ｌ−マンノースの５つの水酸基をアセチル化し、１位のアセトキシ基を臭素置換し、１，２位にオルトエステル基を導入し、３，４，５位のアセチル基をベンジル基に変換し、１，２位に導入したオルトエステル基を外して１位をメトキシ基に変換するとともに２位を水酸基とし、２位の水酸基をトリフルオロメタンスルホニル化またはメタンスルホニル化した後、アジド化し、アジド基を水素還元するとともに脱ベンジル化し、最後に１位のメトキシ基を水酸基に変換することを特徴とする。
また、本発明は、請求項２５記載の通り、蛍光発色団を分子内に有してなるＬ−グルコース誘導体を製造するためのＬ−グルコサミンまたはその塩の使用である。
また、請求項２６記載のＬ−グルコース誘導体は、請求項２２記載のＬ−グルコース誘導体において、蛍光発色団が、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基、７−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）ベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基、スルホローダミンからなる群より選択されるいずれかであることを特徴とする。
また、請求項２７記載のＬ−グルコース誘導体は、請求項２２記載のＬ−グルコース誘導体において、蛍光発色団を２位に結合せしめたことを特徴とする。
また、請求項２８記載のＬ−グルコース誘導体は、請求項２２記載のＬ−グルコース誘導体において、Ｌ−グルコース誘導体が、２−［Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ］−２−デオキシ−Ｌ−グルコース、２−［Ｎ−７−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノスルホニル）ベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ］−２−デオキシ−Ｌ−グルコース、スルホローダミンを２位に結合せしめたＬ−グルコースからなる群より選択されるいずれかであることを特徴とする。
また、請求項２９記載の方法は、請求項１乃至５のいずれかに記載の方法において、細胞が大腸菌であることを特徴とする。
また、請求項３０記載の方法は、請求項１０乃至１３のいずれかに記載の方法において、細胞が大腸菌であることを特徴とする。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
褐色フラスコに4-クロロ-7-ニトロ-2,1,3-ベンゾオキサジアゾール(NBD-Cl)(483 mg)を入れ、メタノール(14.0 ml)に溶解した。アルゴン雰囲気下、L-グルコサミン塩酸塩(280 mg)を0.3M-NaHCO3水(5.57 ml)に溶解したものを加え、室温で攪拌した。24時間後に減圧濃縮によりメタノールを除き、生じた沈殿(NBD-Cl由来の不要物)を濾過した後、沈殿を水で洗浄した。濾液と洗浄液を合わせてHPLCで精製した。目的の画分を集めて凍結乾燥して目的物を得た(収量：102 mg、収率：23 %)。
1H-NMRスペクトル(400 MHz、重水、δ、ppm)：8.52 (d, 1H, J=9.1 Hz, H6’), 6.56 and 6.54 (d x 2, 0.5H x 2, J=9.1 Hz and J=9.1 Hz, H5’), 5.38 [d, 0.5H, J=2.8 Hz, H-1(α体)], 4.89 [d, 0.5H, J=8.1 Hz, H-1 (β体)], 3.50-4.02 (m, 6H, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6a, and H-6b(α体およびβ体)](図1参照)
ESI-MS：calcd for C12H15N4O8 [M+H]+343.1, found 343.1
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
１−３：急性単離神経細胞への２−ＮＢＤＧおよび２−ＮＢＤＬＧの適用（通常蛍光顕微鏡による画像取得）
（適用方法）
（Ａ）急性単離神経細胞の調製
(1)マウス脳スライスの作製
生後13-15日令(幼若期)もしくは33-45日令(成熟期)のC57BL/6Jマウスにウレタン深麻酔(i.p. 1.6g/kg)を施行し、常法に従い断頭後、脳を取り出し、冷リンガー液注1)中(0℃)に1-2分浸漬して冷やした後、マイクロスライサー(堂阪Zero1)にて厚さ400μmの冠状断脳スライスを作製した。次いで95%O2-5%CO2を通気したリンガー液が循環するチャンバー(ハーバード社製アクリルインキュベーションチャンバー)中にて室温で1時間回復させた。
(2)脳スライスの酵素処理
蛋白分解酵素Pronase(10mg/60mL)を上記リンガー液に溶解して作製した酵素液(31℃；95%O2-5%CO2通気によりpH7.4に保持したもの)に脳スライスを浸漬して酵素処理を行った(浸漬時間は幼若マウスの脳の場合には18-20分、成熟マウスの脳の場合には50-70分)。所定時間経過後、直ちに室温にて100mLの10mM glucose含有HEPES溶液注2)に脳スライスを浸漬して酵素反応を停止させた。
(3)中脳黒質網様部の分離
底部にシリコンを貼付した60mmプラスチックディッシュに10mM glucose含有HEPES溶液注2)(室温)を満たしておき、上記脳スライスを液中に浸漬した。二本の27G注射針で脳スライスを固定した上、顕微鏡下にて左右の中脳黒質網様部を18G注射針の先端を楕円形にしたものでパンチアウトし、室温で上記HEPES溶液注2)(35mmカルチャーディッシュ)中に保存した。
(4)黒質網様部神経細胞の単離
各種先端径に調整したガラスピペットにてtriturationにより神経細胞を単離し、poly-L-lysineコート注3)したガラスボトムカルチャーディッシュ注4)(35mm)に付着させた。
注1)単離用リンガー液
NaCl 124mM, NaHCO3 26mM, KCl 5mM, KH2PO4 1.24mM, CaCl2 2.4mM, MgSO4・7H2O 1.3mM, Glucose 10mM, 95%O2-5%CO2通気によりpH7.4に保持。
注2)HEPES溶液
NaCl 150mM, KCl 5mM, MgCl2 1mM, CaCl2 2mM, HEPES 10mM, 1M Tris(2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol)溶液にてpH7.4に調整。Glucose 濃度はサンプル調製時は10mM。2-NBDGおよび2-NBDLG溶液はglucose-free溶液を使用。
注3)カバースリップのpoly-L-lysineコート(神経細胞用)
5mgのpoly-L-lysine hydrobromide(SIGMA P6282)を50mLの0.15Mホウ酸(NaOHにてpH 8.4に調整)に溶解したものをストックし、冷蔵保存する。本ストック溶液を0.15Mホウ酸 で1/1000に希釈したものをカバースリップ(13mm x 22mm松浪No.0ガラス)の中心部に滴下し、室温にて20分放置した後、蒸留水ですすぎ、自然乾燥させる。
注4)ガラスボトムカルチャーディッシュの作製
上面をpoly-L-lysineコート注3)した上記ガラスカバースリップを、底部に楕円形穴に空いた35mmカルチャーディッシュ(松浪code D109501)の楕円形穴(5mm x 14mm)に、シリコングリース(Dow Corning111Sealant)を用いて裏面から張り、水が漏れないように固定する。
（Ｂ）2-NBDG溶液および2-NBDLG溶液の調製
(1)凍結乾燥品の調製
HPLCで精製して純度をNMRおよびHPLCで確認し、元素分析で含量を確認した2-NBDG(もしくは2-NBDLG)を秤量し、水に溶解し、1バイアルあたり正味0.5mgが含まれるように分注したものを凍結乾燥し、-20℃以下で遮光保存した。
(2)2-NBDG(もしくは2-NBDLG)溶液の作製
使用時は、上記2-NBDG(もしくは2-NBDLG)バイアル一本全量をglucose-free HEPES溶液注2)7.3mLに溶解することで、終濃度200μMの2-NBDG(もしくは2-NBDLG)溶液とした。
（Ｃ）通常型蛍光顕微鏡を使用した際の2-NBDG(もしくは2-NBDLG)溶液灌流装置および蛍光検出装置
Zeiss倒立型蛍光顕微鏡 Axiovert 135(100W Xenon光源)の加温式XYステージ上(Zeiss Tempcontrol37-2)に載せた自家製灌流チャンバー(非特許文献2)に35mmガラスボトムカルチャーディッシュ注4)をセットし、ディッシュ内にセットされているガラスカバースリップ((A)の方法で神経細胞を載せたもの)上に記録用HEPES溶液を1.3mL/分の速度で灌流した。
灌流液の導入は、メジウムビンから伸ばしたチューブ(ステンレス配管とPharmedチューブを組み合わせ、ガス分圧が変化しないようにした)をペリスタルティックポンプ(Ismatec社 MCPポンプ12 rollers)を用いて、35mmガラスボトムカルチャーディッシュ注4)に導入した。溶液の切り替えはペリスタルティックポンプ直前に配置した3方活栓を使用した。なお上記チューブは、チャンバーに導入する前のステンレス配管部分で温度調節用のニクロム線を通して、チャンバー中での灌流液の温度が36-37℃になるように灌流速度にあわせてあらかじめ直流電源により加温制御した。
35mmガラスボトムカルチャーディッシュ注4)に導入した灌流液は、圧力調整を行った真空ポンプを用いて緩やかに吸引し、吸引口の調整により細胞上にある溶液の液面高を調節し、また色素溶液および極細サーミスタープローブ(Physitemp社IT-23)を用いてあらかじめ流れの均一性と再現性、還流液温度を各実験前に確認した(非特許文献2)。
蛍光検出には、Zeiss社製の標準的な450-490nmの励起用バンドパスフィルター、510nmのダイクロイックミラー、515-565nmのエミッションフィルターを使用し、NDフィルターは使用せず、対物レンズはZeiss Plan Neofluar x20レンズ(NA 0.50)を使用した。コンデンサーにはlong working distanceタイプを使用し、透過光はNDフィルターで強度を調整した。画像取得には浜松ホトニクス社製SITカメラC2400-08および同カメラコントローラーC2400、画像取得ソフトウェアArgus50を使用した。
（Ｄ）2-NBDG溶液および2-NBDLG溶液の投与法および画像取得プロトコル
(1)2-NBDG溶液の投与法と画像取得プロトコル
SITカメラのシャッターを閉じた状態で画像(512X483, 16bit)を取得し、用いたSITカメラに特有のバックグラウンドノイズパターンを取得した(図は省略)。
次いでSITカメラへの光路のシャッターを開け、2-NBDG投与前の細胞の位相差像および自家蛍光像を取得した。
ペリスタルティックポンプ前の三方活栓を2-NBDG溶液側に倒し、200μMの2-NBDG溶液を1分間投与して2-NBDGを取り込ませた後、すみやかに2-NBDGを含まないHEPES溶液に戻して10分間および30分間洗い流した後の蛍光像を取得した。なおこの30分間に細胞形態に変化のないことを30分後に位相差像を取得して確認した。
蛍光画像データ処理法は以下の方法を採用した。
(a)バックグラウンド減算(Background subtraction)
SITカメラへの光路のシャッターを開けて取得した蛍光取得画像を表示する際には、シャッターを閉じた状態で取得したバックグラウンドノイズパターンを差し引いた画像として表示した。
(b)シェーディング補正(Shading Correction)
細胞の無いディッシュに200μMの2-NBDG溶液を流し、実験時と同一の画像取得条件で蛍光画像を取得したものを標準シェーディング補正用スタンダード画像とした。本画像は、光源ムラならびにレンズ・カメラを含めた光学システムの特性に起因する取得蛍光強度の二次元分布の様子を示す。2-NBDGの細胞への投与結果が、上記の光学ムラ等の影響を受けないように、各蛍光取得画像と、上記シェーディング補正用スタンダード画像とを、Argus50のシェーディング補正アルゴリズム注5)に適用し、補正後の蛍光画像をシェーディング補正済み蛍光画像として保存した。
(c)ディッシュ内位置の違いによる洗い流し(wash)の程度の補正
ディッシュのカバースリップ部分の大きさ(5mm x 14mm)は細胞の大きさの1000倍程度あり、観察に供する細胞がディッシュ内のどの位置に存在するかによって、2-NBDG溶液の灌流および洗い流し(wash)の時間経過に若干の差異を生じる。そこで細胞内への2-NBDGの取り込みの程度の評価に対するこうした灌流の部位的差異による影響を軽減するため、以下の補正を行った。すなわちSITカメラで観察している画面のほぼ中央(x,y)=(256, 242)に、30pixel x 30pixelの大きさのエリアを設定し、それぞれの蛍光取得画像について、このエリアの平均蛍光強度B0を検出した。ただし画面中央に細胞が来ないようあらかじめ画像取得時にはxyステージ位置を調整した。次いで各点の蛍光強度B(x,y)をこのB0で割った値B(x,y)/B0をそれぞれの(x,y)の地点における蛍光強度とした。
(d)蛍光強度のガンマによる強調(Enhance)
画像は32回の積算(duration 1sec)により取得した。また2-NBDGによる蛍光画像は、退色を最低限におさえるために光源のExcitation強度を下げているため、部位による強度差がわかりやすいようにガンマ0.3をかけて強調し、画像処理の目的で16bitから8bitに落として表示した。
注5)Argus50のシェーディング補正アルゴリズム
C(x,y) = A(x,y) x [Bmax / B(x,y)]
C(x,y) = 補正後の画像
A(x,y) = 補正前の画像
B(x,y) = シェーディングスタンダード画像
Bmax = B(x,y)の最大輝度
A, Bにはバックグラウンドノイズ分を差し引いた後の画像を使用する。
(2)2-NBDLG溶液の投与法と画像取得プロトコル
2-NBDG溶液の投与法と画像取得プロトコルと全く同じものとした。