【手続補正書】
【提出日】平成24年8月23日(2012.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
上記ＭＴ４２株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の全塩基配列（１４８４ｂｐ）は、配列番号１の通りである。得られたＭＴ４２株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を国際塩基配列データベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）の配列データと比較し相同性を調べた。その結果、ＭＴ４２菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列はＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｌａｕｔｉｉ  ＣＣＵＧ２８０９３Ｔ（ＡＴＣＣ２９８６３）と９９．７％、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｏｒｂｉｓｃｉｎｄｅｎｓ  ＤＳＭ６７４０Ｔ（ＡＴＣＣ４９５３１）と９９．５％の相同性を示した。以上の結果から本発明者らはＭＴ４２菌株がユウバクテリウム・プラウティ(Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｌａｕｔｉｉ)であると同定した。  
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
上記ＭＴ４ｓ−５株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の全塩基配列（１４６０ｂｐ）は、配列番号２の通りである。得られたＭＴ４ｓ−５株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を国際塩基配列データベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）の配列データと比較し相同性を調べた。その結果、ＭＴ４ｓ―５菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ  ｅｑｕｏｌｉｆａｃｉｅｎｓ  ＦＪＣ−Ｂ９Ｔと９９．９％、Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ  ｅｑｕｏｌｉｆａｃｉｅｎｓ  ＦＪＣ−Ｄ５３およびＡｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ  ｅｑｕｏｌｉｆａｃｉｅｎｓＦＪＣ−Ａ１０と９９．８％、Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ  ｅｑｕｏｌｉｆａｃｉｅｎｓ  ＦＪＣ−Ｂ２０と９９．５％の相同性を示した。以上の結果から、ＭＴ４ｓ−５菌株はアドラークルーツィア・エクオーリファシエンス(Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ  ｅｑｕｏｌｉｆａｃｉｅｎｓ)またはアサッカロバクター・セラタス（Ａｓａｃｃｈａｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｅｌａｔｕｓ）であると同定した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
式（IV）のカテキン類を式（I）に示されるカテキン誘導体に変換する微生物のスクリーニング
細菌の分離源としてＷｉｓｔａｒ系ラット（♂、日本チャールスリバー（株））を使用した。ラットから新鮮な糞便を採取し、採取直後に白金耳で糞を適量取り、ＧＡＭ寒天培地上に画線した。３７℃で４８時間嫌気培養して菌を充分生育させた後、培地上に生育したコロニー群を数十箇所から掻き取り、式（IV）で示されるエピガロカテキン（ＲはＯＨ（水酸基）を示す）を０．５ｍＭ含むＧＡＭブイヨン２ｍｌにそれぞれ植菌した。この培養液を３７℃で４８時間嫌気培養した後、高速遠心分離（１５０００×ｇ、１５分）し、得られた上清を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析し、式（I）のカテキン誘導体（Ｒ１、Ｒ２は水酸基（ＯＨ）を示す）を生成している培養液を選択した。ＨＰＬＣ分析は実施例１の段落００４６に示した条件と同じ条件で行った。目的のカテキン誘導体が生成されていた培養液から菌を取り、再度新たに調製したＧＡＭ寒天培地上に画線した。単菌になるまで上記と同様の操作を繰り返し行った。その結果、（I）のカテキン誘導体を生成する能力をもつアドラークルーツィア・エクオーリファシエンスＭＴ４ｓ−５（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ  ｅｑｕｏｌｉｆａｃｉｅｎｓ  ＭＴ４ｓ−５，ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７３８）株を単離した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｌｅｎｔａ  ＪＣＭ９９７９）株とユウバクテリウム・プラウティＡＴＣＣ２９８６３（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｌａｕｔｉｉ  ＡＴＣＣ２９８６３）株および大腸菌Ｋ１２（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２）株共存下での式（IV）で示される（Ｒは水素（Ｈ）を示す）エピカテキンからの５−（３’−ハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸ナトリウム塩の生産
（培養液）
ＪＣＭ９９７９株を１０ｍｌのＧＡＭブイヨンに植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養し、前培養液とした。大腸菌Ｋ１２株およびＡＴＣＣ２９８６３株は５ｍｌのＧＡＭブイヨンで２４時間嫌気培養し、前培養液とした。式（IV）で示されるエピカテキン（Ｒは水素（Ｈ）を示す）２００ｍｇを含む１００ｍｌのＧＡＭブイヨンにＪＣＭ９９７９株、大腸菌Ｋ１２株の前培養液を加え、３７℃で４８時間嫌気培養した。１ｍｌをサンプリングし、高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分）して、菌体を除去し、上清をＬＣ／ＭＳ分析に供した。式（I）で示されるカテキン誘導体（Ｒ１、Ｒ２は水素（Ｈ）を示す）が生成されているのを確認した後、さらにＡＴＣＣ２９８６３株の前培養液を加え、３７℃で４８時間嫌気培養を行い、５−（３’−ハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸および５−（３’−ハイドロキシフェニル）γ−バレロラクトンへの変換を行った。ＬＣ／ＭＳ分析は実施例２の段落００４８記載の条件で行った。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
実施例１０で得られた含有物を純水３０ｍｌに溶解後、２Ｍ塩酸を添加してｐＨ１．５に調整した。この水溶液を室温で２４時間放置し、５−（３’、４’−ジハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸を５−（３’、４’−ジハイドロキシフェニル）γ―バレロラクトンへ変換した。水溶液のｐＨを１Ｍ炭酸ナトリウムで４．０に調整後、５倍量の純水で平衡化した合成吸着剤ダイアイオンＨＰ−２０（１１０ｍｌ、三菱化学（株）社製）カラムに展開し、カラム容量の５倍量の純水で洗浄した後、吸着画分を５倍量の５０％メタノール水溶液で溶出した。この５０％メタノール溶出画分を減圧下で濃縮乾固し、凍結乾燥した結果、５−（３’、４’−ジハイドロキシフェニル）γ−バレロラクトン２７３ｍｇを得た。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｌｅｎｔａ  ＪＣＭ９９７９）株とユウバクテリウム・プラウティＭＴ４２（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｌａｕｔｉｉ  ＭＴ４２  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７６５）株の共存下での式（IV）で示される（Ｒは水酸基（ＯＨ）を示す）エピガロカテキンからの５−（３’、４’、５’−トリハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸および５−（３’、４’、５’−トリハイドロキシフェニル）γ―バレロラクトン含有物の生産
（培地中）
ＪＣＭ９９７９株を３０ｍｌのＧＡＭブイヨンに植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養し、前培養液とした。大腸菌Ｋ１２株およびＭＴ４２株は１０ｍｌのＧＡＭブイヨンで２４時間嫌気培養し、前培養液とした。式（IV）で示される（Ｒは水酸基（ＯＨ）を示す）エピガロカテキン２２１．４ｍｇを含む１０％メタノール水溶液１０ｍｌをフィルター滅菌（ＤＩＳＭＩＣ−２５ｃｓ  ０．２μｍ  アドバンテック東洋（株）社製）し、９．５ｍｌをＧＡＭブイヨン１００ｍｌに加えた。上記３菌株の前培養液を加え、３７℃で３日間嫌気培養を行った。高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分、１０℃）により菌体を除去した後、得られた上清にリン酸を添加してｐＨ１．５に調整した。この溶液に１００ｍｌの酢酸エチル：ブタノール（１：１、v/v）を加えてよく混合した。遠心分離機（５０００×ｇ、５分）で２相に分けた後、有機溶媒相を回収した。この抽出操作を３回繰り返し行った。有機溶媒相（３００ｍｌ）に１／２量（１５０ｍｌ）の０．１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液（０．１％アスコルビン酸ナトリウムを含む）を加えよく混合した後、遠心分離機（５０００×ｇ、５分）で２相に分け、水相を回収した。再度有機溶媒相に０．１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液を加え同様の操作を繰り返した。得られた水相（３００ｍｌ）のｐＨを７．０に調整後、約３０ｍｌになるまで減圧下で濃縮した。この濃縮液に５倍量のエタノールを添加し、高速遠心分離（１５０００×ｇ、１５分、４℃）で不溶物を除去した。得られた上清をさらに減圧下で約１ｍｌになるまで濃縮し、２ＭＨＣｌでｐＨ２.０−３．０に調整した。この溶液を分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣの条件は実施例７の段落００５５に記した方法と同じ条件で行った。但し、グラジエントはＡ８０％  Ｂ２０％のアイソクラティックとした。また得られた５−（３’、４’、５’−トリハイドロキシフェニル）γ−バレロラクトンの画分は実施例７の段落００５６に示した同様の方法で処理をした。その結果、５−（３’、４’、５’−トリハイドロキシフェニル）−４−ハイドロキシ吉草酸ナトリウム塩６５ｍｇを得た。