(57)【要約】バイオロジカルペースメーカーとして機能しうる新たな三次元組織片の製造方法を提供する。多能性幹細胞に由来するペースメーカー細胞が積層された三次元組織片を形成することを含む、ペースメーカー組織片の製造方法であって、前記三次元組織片は、ペースメーカー細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、前記三次元組織片の形成は、ペースメーカー細胞の表面が細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞を積層して培養すること、又は前記ペースメーカー細胞の細胞層と前記細胞外マトリックス成分を含む層とを交互に積層して培養することを含む、ペースメーカー組織片の製造方法に関する。
2015025958.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペースメーカー細胞が積層された三次元組織片を形成することを含む、ペースメーカー組織片の製造方法であって、
前記三次元組織片は、ペースメーカー細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、
前記三次元組織片の形成は、ペースメーカー細胞の表面が細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞を積層して培養すること、又はペースメーカー細胞の細胞層と細胞外マトリックス成分を含む層とを交互に積層して培養することを含む、ペースメーカー組織片の製造方法。
【請求項２】
前記ペースメーカー細胞は、多能性を有する幹細胞に由来するペースメーカー細胞である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記三次元組織片の形成は、前記被覆細胞を容器内に播種すること、及び前記容器内で積層された状態の前記被覆細胞を培養することを含む、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記被覆細胞を調製することを含み、
前記被覆細胞の調製は、ペースメーカー細胞の細胞塊をトリプシン処理すること、及び前記トリプシン処理により細胞塊から分散させたペースメーカー細胞の表面に細胞外マトリックス成分を含む被膜を形成することを含む、請求項１から３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記細胞塊は、ＨＣＮ遺伝子が導入された多能性幹細胞を分化誘導させて得られた胚様体を無糖乳酸添加培地で培養し、ペースメーカー細胞を選別することにより得られた細胞塊である、請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
前記三次元組織片は、前記ペースメーカー細胞を１×１０5個以上含む、請求項１から５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
ペースメーカー細胞と、細胞外マトリックス成分とを含み、
前記ペースメーカー細胞が前記細胞外マトリックス成分を介して積層され三次元組織化された、ペースメーカー組織片。
【請求項８】
請求項１から６のいずれかに記載の製造方法によって製造される、請求項７記載のペースメーカー組織片。
【請求項９】
バイオロジカルペースメーカーとして利用可能な、請求項７又は８記載のペースメーカー組織片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ペースメーカー組織片の製造方法及びペースメーカー組織片に関する。
【背景技術】
【０００２】
徐脈性不整脈とは、心臓の洞結節の機能不全又は機能停止等によって脈が非常に遅くなったり途切れたりする不整脈のことをいう。徐脈性不整脈によって十分な拍出量を維持できないと、めまいや心不全等といった様々な症状が引き起こされる。徐脈性不整脈に対する一般的な治療方法としては、心臓ペースメーカー機器の移植がある。しかしながら、ペースメーカー機器の移植は、低い生体適合性、電池寿命による再移植の必要性、破損、感染及び他機器との干渉等といった様々な問題を有している。【０００３】
このため、ペースメーカー機器に代わる新たな技術が求められ、例えば、心筋への筋芽細胞や心筋細胞等の移植といった研究が行われている。しかしながら、これらの移植は、細胞の心筋への生着率が低く、また移植した細胞が心筋から流出して炎症を引き起こすという問題がある。例えば、非特許文献１には、筋芽細胞をマウスの心臓に移植したところ、移植３０分後では細胞の３９．２％程度が生存していたにもかかわらず、７２時間後になると生着率が７％程度にまで減少することが開示されている。【０００４】
一方、近年、ｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞を様々な細胞に分化誘導させ、それらを医療に用いるための研究が行われている。例えば、多能性幹細胞をペースメーカー細胞に分化誘導させ、得られたペースメーカー細胞を用いてバイオロジカルペースメーカーを作製することが試みられている。特許文献１には、胚性幹細胞にペースメーカー電流発生を担うＨＣＮ４遺伝子を導入して心筋細胞へ分化誘導させることによって胚性幹細胞由来のペースメーカー細胞を作製することが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２０１１／０４０４６９
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋ．Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １８，１１５３（２００４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の通り、心臓ペースメーカー機器に代わりうるバイオロジカルペースメーカーの研究が行われているが、いまだ実用可能なレベルにまでは至っていない。そこで、本開示は、バイオロジカルペースメーカーとして機能しうる新たなペースメーカー組織片の製造方法及びペースメーカー組織片を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、一又は複数の実施形態において、ペースメーカー細胞が積層された三次元組織片を形成することを含むペースメーカー組織片の製造方法であって、前記三次元組織片は、ペースメーカー細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、前記三次元組織片の形成は、ペースメーカー細胞の表面が細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞を積層して培養すること、又は前記ペースメーカー細胞の細胞層と前記細胞外マトリックス成分を含む層とを交互に積層して培養することを含む、ペースメーカー組織片の製造方法に関する。【０００９】
本開示は、一又は複数の実施形態において、ペースメーカー細胞と、細胞外マトリックス成分とを含み、前記ペースメーカー細胞が前記細胞外マトリックス成分を介して積層され三次元組織化された、ペースメーカー組織片に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本開示によれば、例えば、バイオロジカルペースメーカーとして機能しうる新たな三次元組織片及びその製造方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、実施例１で作製したペースメーカー組織片の位相差写真の一例である。
【図２】図２は、実施例１で作製したペースメーカー組織片の薬剤添加前後の１分間あたりの拍動数の変化を示すグラフの一例である。
【図３】図３は、実施例４における心筋細胞の層数と拍動数との関係を示すグラフの一例である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本開示は、ペースメーカー細胞を細胞外マトリックス成分を介して積層した状態で培養すると、ペースメーカー細胞が細胞層として三次元組織化され、一律な拍動を示すペースメーカー組織片が得られる、との知見に基く。また、本開示は、ペースメーカー細胞を細胞外マトリックス成分を介して積層することによって、細胞シートの形成や保持に用いる足場材料の排除が可能となり、また、細胞間の細胞外マトリックスの厚みを容易に制御できる、との知見に基く。
【００１３】
本開示の製造方法によって得られるペースメーカー組織片が一律な拍動を示す作用機構は明らかではないが、以下のように推察される。すなわち、ペースメーカー細胞を、細胞外マトリックスを介して積層させた状態で培養すると、ペースメーカー細胞の細胞間接着が強くなり、それにより組織片を構成する個々のペースメーカー細胞がペースメーカー細胞同士が同期して１つの組織として機能し、一律な拍動を示すと考えられる。但し、本開示はこのメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。
【００１４】
本開示において「三次元組織片」とは、ペースメーカー細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、ペースメーカー細胞が三次元的に積層された細胞の構造体をいう。
【００１５】
本開示において「ペースメーカー組織片」とは、自発拍動を示すことができる三次元組織片のことをいい、好ましくは多能性幹細胞に由来するペースメーカー細胞と、細胞外マトリックス成分とを含み、細胞外マトリックスを介して積層されたペースメーカー細胞が三次元的に組織化されたものをいう。本開示のペースメーカー組織片は、さらに、ペースメーカー細胞以外の細胞を含んでいてもよい。本開示において「細胞外マトリックス成分を介してペースメーカー細胞を積層する」とは、ペースメーカー細胞の表面が細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞を積層して培養すること、又はペースメーカー細胞の細胞層と細胞外マトリックス成分を含む層とを交互に積層して培養することによって行うことができる。
【００１６】
本開示において「ペースメーカー細胞」とは、ペースメーカー機能を有する細胞であり、一又は複数の実施形態において、多能性を有する幹細胞を分化誘導させて得られたペースメーカー機能を有する細胞であって、活動電位を発生し、自発拍動可能な心筋細胞をいう。また、ペースメーカー細胞は、一又は複数の実施形態においてＨＣＮチャネルが発現した心筋細胞、好ましくはＨＣＮ４チャネルが発現した心筋細胞をいう。
【００１７】
本開示において、「細胞外マトリックス成分」とは、生体内で細胞の外の空間を充填して骨格的役割、足場を提供する役割、及び又は生体因子を保持する役割等の機能を果たす物質をいう。また、細胞外マトリックス成分は、さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養において骨格的役割、足場を提供する役割及び又は生体因子を保持する役割等の機能を果たしうる物質を含んでいてもよく、また人工的に合成された物質やその一部を含んでもよい。
【００１８】
本開示において「多能性を有する幹細胞（以下、「多能性幹細胞」ともいう）」としては、一又は複数の実施形態において、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が挙げられる。本開示において、これらの由来は特に限定されず、ヒト及びマウス等が挙げられる。
【００１９】
［ペースメーカー組織片の製造方法］
本開示は、一又は複数の実施形態において、ペースメーカー細胞が積層された三次元組織片を形成することを含むペースメーカー組織片の製造方法（以下、「本開示の製造方法」ともいう）に関する。本開示の製造方法において、三次元組織片は、ペースメーカー細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、三次元組織片の形成は、ペースメーカー細胞の表面が細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞を積層して培養すること、又はペースメーカー細胞の細胞層と細胞外マトリックス成分を含む層とを交互に積層して培養することを含む。本開示の製造方法によれば、一又は複数の実施形態において、単にペースメーカー細胞を集合させた細胞塊ではなく、ペースメーカー細胞が細胞外マトリックス成分を介して三次元組織化したペースメーカー組織片を製造することができる。
【００２０】
本開示の製造方法は、一又は複数の実施形態において、ペースメーカー細胞を調製することを含んでいてもよい。ペースメーカー細胞は、一又は複数の実施形態において、ＨＣＮチャネルを発現可能となる処理を行った多能性幹細胞をペースメーカー細胞に分化誘導させること、及び得られたペースメーカー細胞の細胞塊を個々のペースメーカー細胞に分散させることによって調製できる。ＨＣＮチャネルを発現可能となる処理としては、一又は複数の実施形態において、ＨＣＮ遺伝子の導入が挙げられる。ＨＣＮ遺伝子としては、一又は複数の実施形態において、ＨＣＮ１遺伝子、ＨＣＮ２遺伝子、ＨＣＮ３遺伝子、及びＨＣＮ４遺伝子が挙げられ、ＨＣＮ４遺伝子が好ましい。ＨＣＮ遺伝子の多能性幹細胞への導入及びペースメーカー細胞への分化誘導は、従来公知の方法及び／又は今後開発される方法によって行うことができ、例えば、Ｍｏｒｉｋａｗａ  Ｋ．，  Ｐａｃｉｎｇ  Ｃｌｉｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌ，  ２０１０  Ｍａｒ  ３３（３）  ２９０−３０３及び特許文献１に記載の方法を参酌して行うことができる。
【００２１】
多能性幹細胞を分化誘導させて得られる胚様体は、ペースメーカー細胞の他に、未分化な幹細胞及び心筋細胞以外の細胞を含みうる。よって、本開示の製造方法は、一又は複数の実施形態において、分化誘導して得られた胚様体からペースメーカー細胞を選別することを含む。これにより、実質的にペースメーカー細胞のみによって構成される細胞塊を得ることができる。ペースメーカー細胞の選別は、従来公知の方法及び／又は今後開発される方法によって行うことができ、一又は複数の実施形態において、心筋細胞のみ生存可能な培地で胚様体を培養することにより行うことが好ましい。心筋細胞のみ生存可能な培地としては、一又は複数の実施形態において、無糖乳酸添加培地等が挙げられる。ペースメーカー細胞の選別は、例えば、Ｔｏｈｙａｍａ，Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．  １２，１２７−１３７（２０１３）に記載の方法を参酌して行うことができる。
【００２２】
本開示の製造方法において、細胞塊から個々のペースメーカー細胞への分散は、一又は複数の実施形態において、細胞解離剤を用いて行うことができる。細胞解離剤としては、一又は複数の実施形態において、トリプシン等が挙げられる。
【００２３】
本開示の製造方法において、培養時におけるペースメーカー細胞の組織構築を向上させる点から、細胞塊から分散させたペースメーカー細胞を分散を維持した状態で三次元組織片の形成に用いることが好ましい。同様の点から、一又は複数の実施形態において、分散させたペースメーカー細胞を接着培養することなく三次元組織片の形成に用いることが好ましく、分散後のペースメーカー細胞に剥離処理を行うことなく三次元組織片の形成に用いることがより好ましい。
【００２４】
本開示の製造方法は、三次元組織片を形成することを含む。三次元組織片の形成は、ペースメーカー細胞の表面が細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞を積層して培養すること、又はペースメーカー細胞の細胞層と細胞外マトリックス成分を含む層とを交互に積層して培養することによって行う。これにより、ペースメーカー細胞が細胞外マトリックスを介して三次元的に積層される。
【００２５】
本開示の製造方法は、ペースメーカー組織片の機能の安定性を向上し、その機能を長期間維持させる点から、三次元組織の形成において、三次元組織内に血管網を形成することを含んでいてもよい。血管網の形成は、一又は複数の実施形態において、血管内皮細胞を上述の被覆細胞又はペースメーカー細胞の細胞層で挟んだ状態で培養することにより行うことができる。このように、細胞層間に挟まれた状態で血管内皮細胞を培養することにより、ヒトの生体内により近い緻密な血管網が形成されうる。血管内皮細胞は、細胞表面を細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆したものを使用してもよいし、そのまま使用してもよい。また、本開示の製造方法は、血管網以外にバイオロジカルペースメーカーとしての機能安定性を向上させる点から、一又は複数の実施形態において、その他の器官を形成することを含んでいてもよい。
【００２６】
＜被覆細胞を用いた三次元組織片の形成＞
本開示の製造方法において、三次元組織片の形成は、ペースメーカー細胞の表面が細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞を積層して培養することによって行うことができる。被覆細胞の培養は、一又は複数の実施形態において、被覆細胞を容器内に播種すること、及び容器内で積層された状態の被覆細胞を培養することを含む。本開示の製造方法は、一又は複数の実施形態において、後述する被覆細胞の調製工程を含んでいてもよい。
【００２７】
被覆細胞は、ペースメーカー細胞と、ペースメーカー細胞を覆う細胞外マトリックス成分を含む被膜とを含む。細胞外マトリックス成分を含む被膜は、物質Ａを含む膜と、前記物質Ａと相互作用する物質Ｂを含む膜とを含むことが好ましい。物質Ａと物質Ｂとの組み合わせとしては、一又は複数の実施形態において、ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子（以下、「ＲＧＤ配列を有する物質」ともいう）と前記ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子（以下、「相互作用を有する物質」ともいう）との組み合わせ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子（以下、「正の電荷を有する物質」ともいう）と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子（以下、「負の電荷を有する物質」ともいう）との組み合わせである。
【００２８】
細胞外マトリックス成分を含む被膜の厚みは、一又は複数の実施形態において、１ｎｍ〜１×１０3ｎｍ、又は２ｎｍ〜１×１０2ｎｍが好ましく、被覆細胞がより密に積層された三次元組織片が得られるという理由から、３ｎｍ〜１×１０2ｎｍがより好ましい。細胞外マトリックス成分を含む被膜の厚みは、例えば、被膜を構成する膜の数によって適宜制御することができる。細胞外マトリックス成分を含む被膜は、特に制限されず、１層であってもよいし、一又は複数の実施形態において、例えば、３、５、７、９、１１、１３、１５層又はそれ以上の多層であってもよい。
【００２９】
被覆細胞の播種は、一又は複数の実施形態において、被覆細胞が少なくとも２層以上積層されるように行えばよい。播種時の被覆細胞の密度は、一又は複数の実施形態において、目的とするペースメーカー組織片の大きさ及び厚み、培養する容器の大きさならびに積層される細胞の数等に応じて適宜決定でき、一又は複数の実施形態において、１×１０2個／ｃｍ3〜１×１０9個／ｃｍ3、１×１０4個／ｃｍ3〜１×１０8個／ｃｍ3、又は１×１０5個／ｃｍ3〜１×１０7個／ｃｍ3である。
【００３０】
培地は、特に制限されず、細胞に応じて適宜決定でき、例えば、Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＤＭＩ、ＧｌｕｔａＭａｘ培地、又は無血清培地等が挙げられる。
【００３１】
培養温度は、一又は複数の実施形態において、４〜６０℃、２０〜４０℃、又は３０〜３７℃である。培養時間は、特に限定されるものではなく、一又は複数の実施形態において、１〜１６８時間、３〜２４時間、又は３〜１２時間である。
【００３２】
容器としては、取扱が容易となるという理由から、メンブレンフィルタが挙げられ、好ましくはメンブレンフィルタを備える培養プレート、より好ましくはハウジング部と基底部とを備え、基底部がメンブレンフィルタである培養プレートが挙げられる。ハウジング部は、透明であることが好ましい。該培養プレートは、市販品を使用してもよい。市販品としては、例えば、トランスウェル（登録商標）、セルカルチャーインサート（商品名）等が挙げられる。容器の大きさは、製造するペースメーカー組織片の大きさに応じて適宜決定できる。
【００３３】
メンブレンフィルタの孔径は、培養した細胞がメンブレンフィルタ上に保持可能な範囲であれば特に制限されず、一又は複数の実施形態において、０．１μｍ〜２μｍ、又は０．４μｍ〜１．０μｍである。また、メンブレンの材質は、一又は複数の実施形態において、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、又はポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）等が挙げられる。
【００３４】
＜交互積層による三次元組織片の形成＞
本開示の製造方法において、三次元組織片の形成は、ペースメーカー細胞の細胞層と細胞外マトリックス成分を含む層とを交互に積層して培養することによって行うことができる。
【００３５】
細胞層の形成は、一又は複数の実施形態において、容器にペースメーカー細胞を播種し、一定時間培養することにより行うことができる。培地、培養温度及び培養時間は被覆細胞を用いた三次元組織片の形成と同様である。
【００３６】
細胞外マトリックス成分を含む層の形成は、一又は複数の実施形態において、細胞層上に溶液Ａと溶液Ｂとを配置することが挙げられ、好ましくは溶液Ａと溶液Ｂとを交互に配置する。細胞外マトリックス成分を含む層の形成は、一又は複数の実施形態において、溶液Ａと溶液Ｂとを交互に配置することを１セットとして、これを２セット、又は３セット以上繰返し行うことが好ましい。溶液Ａ及び溶液Ｂは、被覆細胞を用いた三次元組織片の形成と同様である。
【００３７】
細胞層の形成後及び／又は細胞外マトリックスの形成後に洗浄液を配置し洗浄操作を行ってもよい。洗浄操作を行うことにより、細胞外マトリックスの形成に用いられなかった細胞外マトリックス成分や、細胞層の形成に用いられなかった細胞等を除去することができ、効率よく所望の細胞層及び／又は細胞外マトリックスを形成することができる。洗浄操作は、一又は複数の実施形態において、細胞層の形成後と細胞外マトリックスの形成後との双方に行うことが好ましい。また、同様の観点から、溶液Ａの導入後及び／又は溶液Ｂの導入後に洗浄操作を行ってもよい。洗浄液は、被覆細胞を用いた三次元組織片の形成と同様である。
【００３８】
細胞層の形成及び細胞外マトリックス成分を含む層の形成等は、一又は複数の実施形態において、特開２００７−２２８９２１号公報（特許第４９１９４６４号）に開示された方法を参酌して行うことができる。
【００３９】
［ペースメーカー組織片］
本開示は、一又は複数の実施形態において、ペースメーカー細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、ペースメーカー細胞が細胞外マトリックス成分を介して積層され三次元組織化されたペースメーカー組織片（以下、「本開示のペースメーカー組織片」ともいう。）に関する。本開示のペースメーカー組織片は、一又は複数の実施形態において、単にペースメーカー細胞を集合させて細胞塊としたものではなく、ペースメーカー細胞を細胞外マトリックス成分を介して積層して三次元組織化したものであるため、個々の細胞がペースメーカー機能を発揮するのみならず、１つの組織として一律な拍動を示すことができる。また、ペースメーカー細胞が三次元マトリックス成分を介して細胞層として組織化されていることから、ペースメーカー組織片を構成するペースメーカー細胞の多くがその機能を保持した状態で生存可能であり、その結果、本開示のペースメーカー組織片は、長期間機能することができる。本開示のペースメーカー組織片は、本開示のペースメーカー組織片の製造方法により製造できる。
【００４０】
本開示のペースメーカー組織片は、ペースメーカー細胞及び細胞外マトリックス成分以外に、心筋細胞、洞房結節に含まれる器官を構成しうる細胞を含んでいてもよい。器官としては、例えば、血管、リンパ管、神経等が挙げられる。器官を構成する細胞としては、例えば、血管内皮細胞、脂肪細胞、筋芽細胞、線維芽細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経細胞、癌細胞等が挙げられる。
【００４１】
本開示のペースメーカー組織片は、一又は複数の実施形態において、ペースメーカー細胞を１×１０5個以上、５×１０5個以上、又は１×１０6個以上含みうる。本開示のペースメーカー組織片の大きさは、特に限定されるものではなく目的に応じて適宜決定できるが、一又は複数の実施形態において、０．２ｃｍ2以上、０．５ｃｍ2以上、１ｃｍ2以上、又は４ｃｍ2以上、また５０ｃｍ2以下、２５ｃｍ2以下、又は１５ｃｍ2以下である。また、ペースメーカー組織片の大きさは、一又は複数の実施形態において、洞房結節をカバーできる大きさがあればよく、また通常のペースメーカー機器と同程度の大きさであればよい。
【００４２】
本開示のペースメーカー組織片におけるペースメーカー細胞の密度は、一又は複数の実施形態において、１×１０5個／ｍｍ3以上、５×１０5個／ｍｍ3以上、１×１０6個／ｍｍ3以上、５×１０6個／ｍｍ3以上、又は１×１０7個／ｍｍ3以上であり、また、１×１０10個／ｍｍ3以下、５×１０9個／ｍｍ3以下、又は１×１０9個／ｍｍ3以下である。
【００４３】
本開示のペースメーカー組織片は、一又は複数の実施形態において、トロポニン、コネキシン４３、アクチン、ミオシン、及びＥ−カドヘリンの少なくとも一つが発現している。本開示のペースメーカー組織片は、一又は複数の実施形態において、トロポニンとアクチンとがほぼ同じ位置に発現している。これらの発現は、一又は複数の実施形態において、免疫蛍光染色により確認できる。
【００４４】
本開示のペースメーカー組織片は、一又は複数の実施形態において、バイオロジカルペースメーカーとして利用可能である。本開示のペースメーカー組織片は、一又は複数の実施形態として、心筋内部又は心筋表面に移植することによってペースメーカーとして使用することができる。本開示のペースメーカー組織片は、一又は複数の実施形態において、ペースメーカー細胞が三次元組織化されているため、移植が容易であり、また心筋に移植後の心筋からの流出を低減できる。本開示のペースメーカー組織片の移植部位は、一又は複数の実施形態において、心臓ペースメーカー機器と同様であり、洞房結節等が挙げられる。
【００４５】
＜被覆細胞の調製＞
以下に、本開示の製造方法において用いられる被覆細胞の製造方法の一例について説明する。
被覆細胞は、物質Ａを含む溶液と、物質Ｂを含む溶液とを、ペースメーカー細胞に交互に接触させることにより調製することができる。物質Ａと物質Ｂとの組み合わせとしては、上記の通り、ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用を有する物質との組み合わせ、又は、正の電荷を有する物質と負の電荷を有する物質との組み合わせが挙げられる。
【００４６】
（ＲＧＤ配列を有する物質）
ＲＧＤ配列を有する物質とは、細胞接着活性を担うアミノ酸配列である「Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ」（ＲＧＤ）配列をするタンパク質又は高分子をいう。本明細書において「ＲＧＤ配列を有する」とは、元来ＲＧＤ配列を有するものでもよいし、ＲＧＤ配列が化学的に結合されたものでもよい。ＲＧＤ配列を有する物質は、生分解性であることが好ましい。
【００４７】
ＲＧＤ配列を有するタンパク質としては、一又は複数の実施形態において、従来公知の接着性タンパク質、又はＲＧＤ配列を有する水溶性タンパク質等が挙げられる。接着性タンパク質としては、一又は複数の実施形態において、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、又はコラーゲン等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する水溶性タンパク質としては、一又は複数の実施形態において、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン、ゼラチン、アルブミン、グロブリン、プロテオグリカン、酵素、又は抗体等が挙げられる。
【００４８】
ＲＧＤ配列を有する高分子としては、一又は複数の実施形態において、天然由来高分子、又は合成高分子が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する天然由来高分子としては、一又は複数の実施形態において、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、α−ポリリジン又はε−ポリリジン等のポリアミノ酸、キチン又はキトサン等の糖等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する合成高分子としては、一又は複数の実施形態において、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のＲＧＤ配列を有するポリマー又は共重合体が挙げられる。ポリマー又は共重合体としては、一又は複数の実施形態において、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリアミド、又はこれらの共重合体、ポリエステル、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−ポリアクリル酸）、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリエチレンオキサイド、ポリε−カプロラクタム、ポリアクリルアミド、又はポリ（メタクリル酸メチル−γ−ポリメタクリル酸オキシエチレン）等が挙げられる。
【００４９】
ＲＧＤ配列を有する物質は、これらの中でも、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、ポリリジン、エラスチン、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン、ＲＧＤ配列を結合させたゼラチン、キチン、又はキトサンが好ましく、より好ましくはフィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ポリリジン、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン、又はＲＧＤ配列を結合させたゼラチンである。
【００５０】
（相互作用する物質）
相互作用する物質とは、ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用するタンパク質若しくは高分子をいう。本明細書において「相互作用する」とは、一又は複数の実施形態において、静電的相互作用、疎水性相互作用、水素結合、電荷移動相互作用、共有結合形成、タンパク質間の特異的相互作用、及び又はファンデルワールス力等によって化学的及び又は物理的にＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する物質とが結合、接着、吸着又は電子の授受が可能な程度に近接することを意味する。相互作用する物質は、生分解性であることが好ましい。
【００５１】
ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用するタンパク質としては、一又は複数の実施形態において、コラーゲン、ゼラチン、プロテオグリカン、インテグリン、酵素、又は抗体等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する高分子としては、一又は複数の実施形態において、天然由来高分子、又は合成高分子が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する天然由来高分子としては、一又は複数の実施形態において、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリアミノ酸、エラスチン、ヘパリン、ヘパラン硫酸又はデキストラン硫酸等の糖、及びヒアルロン酸等が挙げられる。ポリアミノ酸としては、一又は複数の実施形態において、α−ポリリジン又はε−ポリリジン等のポリリジン、ポリグルタミン酸、又はポリアスパラギン酸等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する合成高分子としては、一又は複数の実施形態において、上述のＲＧＤ配列を有する合成高分子として例示したものが挙げられる。
【００５２】
相互作用する物質は、これらの中でも、ゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、グロブリン、アルブミン、ポリグルタミン酸、コラーゲン、又はエラスチンが好ましく、より好ましくはゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、又はコラーゲン、さらに好ましくはゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、又はヒアルロン酸である。
【００５３】
ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する物質との組み合わせは、特に制限されず、相互作用する異なる物質の組み合わせであればよく、いずれか一方がＲＧＤ配列を含む高分子又はタンパク質であり、他方がこれと相互作用する高分子又はタンパク質であればよい。ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用を有する物質との組み合わせとしては、一又は複数の実施形態において、フィブロネクチンとゼラチン、フィブロネクチンとε−ポリリジン、フィブロネクチンとヒアルロン酸、フィブロネクチンとデキストラン硫酸、フィブロネクチンとヘパリン、フィブロネクチンとコラーゲン、ラミニンとゼラチン、ラミニンとコラーゲン、ポリリジンとエラスチン、ビトロネクチンとコラーゲン、ＲＧＤ結合コラーゲン又はＲＧＤ結合ゼラチンとコラーゲン又はゼラチン等が挙げられる。中でも、フィブロネクチンとゼラチン、フィブロネクチンとε−ポリリジン、フィブロネクチンとヒアルロン酸、フィブロネクチンとデキストラン硫酸、フィブロネクチンとヘパリン、又はラミニンとゼラチンが好ましく、より好ましくはフィブロネクチンとゼラチンである。なお、ＲＧＤ配列を有する物質及び相互作用を有する物質は、それぞれ一種類ずつでもよいし、相互作用を示す範囲で二種類以上をそれぞれ併用してもよい。
【００５４】
（正の電荷を有する物質）
正の電荷を有する物質とは、正の電荷を有するタンパク質又は高分子をいう。正の電荷を有するタンパク質としては、一又は複数の実施形態において、水溶性タンパク質が好ましい。水溶性タンパク質としては、一又は複数の実施形態において、塩基性コラーゲン、塩基性ゼラチン、リゾチーム、シトクロムｃ、ペルオキシダーゼ、又はミオグロビン等が挙げられる。正の電荷を有する高分子としては、一又は複数の実施形態において、天然由来高分子及び合成高分子が挙げられる。天然由来高分子としては、一又は複数の実施形態において、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリアミノ酸、キチン又はキトサン等の糖等が挙げられる。ポリアミノ酸としては、一又は複数の実施形態において、ポリ（α−リジン）、ポリ（ε−リジン）等のポリリジン、ポリアルギニン、又はポリヒスチジン等が挙げられる。合成高分子としては、一又は複数の実施形態において、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のポリマー又は共重合体が挙げられる。前記ポリマー又は共重合体としては、一又は複数の実施形態において、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、又はこれらの共重合体、ポリエステル、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド（ＰＤＤＡ）、ポリアリルアミンハイドロクロライド、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、又はポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。
【００５５】
（負の電荷を有する物質）
負の電荷を有する物質とは、負の電荷を有するタンパク質又は高分子をいう。負の電荷を有するタンパク質としては、一又は複数の実施形態において、水溶性タンパク質が好ましい。水溶性タンパク質としては、一又は複数の実施形態において、酸性コラーゲン、酸性ゼラチン、アルブミン、グロブリン、カタラーゼ、β−ラクトグロブリン、チログロブリン、α−ラクトアルブミン、又は卵白アルブミン等が挙げられる。負の電荷を有する高分子としては、天然由来高分子及び合成高分子が挙げられる。天然由来高分子としては、一又は複数の実施形態において、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリ（βリジン）等のポリアミノ酸、又はデキストラン硫酸等が挙げられる。合成高分子としては、一又は複数の実施形態において、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のポリマー又は共重合体が挙げられる。前記ポリマー又は共重合体としては、一又は複数の実施形態において、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、及びこれらの共重合体、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミドメチルプロパンスルホン酸、末端カルボキシ化ポリエチレングリコール、ポリジアリルジメチルアンモニウム塩、ポリアリルアミン塩、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、又はポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。
【００５６】
正の電荷を有する物質と負の電荷を有する物質との組み合わせとしては、一又は複数の実施形態において、ε−ポリリジン塩とポリスルホン酸塩、ε−ポリリジンとポリスルホン酸塩、キトサンとデキストラン硫酸、ポリアリルアミンハイドロクロライドとポリスチレンスルホン酸塩、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリスチレンスルホン酸塩、又はポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリアクリル酸塩等が挙げられ、好ましくはε−ポリリジン塩とポリスルホン酸塩、又はポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリアクリル酸塩である。ポリスルホン酸塩としては、一又は複数の実施形態において、ポリスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳ）等が挙げられる。なお、正の電荷を有する物質及び負の電荷を有する物質は、それぞれ、一種類ずつでもよいし、相互作用を示す範囲で二種類以上をそれぞれ併用してもよい。
【００５７】
以下に、被覆細胞の調製方法を好適な実施形態として、細胞に、まずＲＧＤ配列を有する物質を含有する溶液Ａを接触させた後、ＲＧＤ配列を有する物質に相互作用を有する物質を含有する溶液Ｂと接触させることにより被覆細胞を調製する方法を、例にとり説明する。但し、本開示は以下の実施形態に限定して解釈されるものではない。
【００５８】
まず、細胞を溶液Ａと接触させる。これにより、細胞表面にＲＧＤ配列を有する物質を含む膜が形成され、細胞表面がＲＧＤ配列を有する物質を含む膜によって被覆される。細胞と溶液Ａとの接触は、一又は複数の実施形態において、溶液Ａを細胞に塗布又は添加すること、溶液Ａに細胞を浸漬させること、溶液Ａを細胞に滴下又は噴霧すること等により行うことができる。中でも、操作が容易であるという理由から、溶液Ａに細胞を浸漬させることにより、細胞と接触させることが好ましい。
【００５９】
接触条件は、一又は複数の実施形態において、接触方法、ＲＧＤ配列を有する物質及び又は細胞の種類、及び含有液の濃度等に応じて適宜決定できる。接触時間は、一又は複数の実施形態において、３０秒〜２４時間、１分〜６０分、１分〜１５分、１分〜１０分、又は１分〜５分が好ましい。接触時の雰囲気温度及び又は溶液Ａの温度は、一又は複数の実施形態において、４〜６０℃、２０〜４０℃、又は３０〜３７℃が好ましい。
【００６０】
溶液Ａは、ＲＧＤ配列を有する物質を含んでいればよく、好ましくはＲＧＤ配列を有する物質と溶媒又は分散媒体（以下、単に「溶媒」ともいう）とを含む。溶液ＡにおけるＲＧＤ配列を有する物質の含有量は、一又は複数の実施形態において、０．０００１〜１質量％、０．０１〜０．５質量％、又は０．０２〜０．１質量％が好ましい。溶媒としては、一又は複数の実施形態において、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び緩衝液等の水性溶媒が挙げられる。緩衝液としては、一又は複数の実施形態において、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等のＴｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液、グリシルグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液、又はＧＴＡ緩衝液等が挙げられる。溶媒のｐＨは、特に制限されず、一又は複数の実施形態において、３〜１１、６〜８、又は７．２〜７．４が好ましい。
【００６１】
溶液Ａは、一又は複数の実施形態において、塩、細胞成長因子、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、生理活性ペプチド、又は医薬組成物等をさらに含有してもよい。医薬組成物としては、一又は複数の実施形態において、疾患の治療剤、予防剤、抑制剤、抗菌剤、又は抗炎症剤等が挙げられる。塩としては、一又は複数の実施形態において、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素ナトリウム、硫酸マグネシウム、コハク酸ナトリウム等が挙げられる。塩は、一種類でもよいし二種類以上含有していてもよい。溶液Ａ及び溶液Ｂの双方が塩を含有していてもよいし、いずれか一方が塩を含有していてもよい。溶液Ａ中の塩濃度は、特に制限されないが、一又は複数の実施形態において、１×１０-6Ｍ〜２Ｍであり、好ましくは１×１０-4Ｍ〜１Ｍ、より好ましくは１×１０-4Ｍ〜０．０５Ｍである。
【００６２】
ついで、ＲＧＤ配列を有する物質を含む膜の形成に使用されなかった物質を除去する。除去は、一又は複数の実施形態において、遠心分離又は濾過等により行うことができる。遠心分離による除去は、一又は複数の実施形態において、溶液Ａに細胞を分散させた状態で遠心分離し、ついで上澄みを除去することにより行うことができる。遠心分離条件は、細胞の種類、細胞の濃度、及び溶液Ａに含まれる含有物の組成によって適宜決定できる。
【００６３】
上記除去に加えて、洗浄操作を行うことが好ましい。洗浄は、一又は複数の実施形態において、遠心分離又は濾過等により行うことができる。遠心分離による洗浄は、一又は複数の実施形態において、上澄みを除去された細胞に溶媒を添加し、遠心分離及び上澄みの除去をすることにより行うことができる。洗浄に用いる溶媒は、溶液Ａの溶媒と同じであることが好ましい。
【００６４】
ついで、ＲＧＤ配列を有する物質を含む膜で被覆された細胞を溶液Ｂと接触させる。これにより、ＲＧＤ配列を有する物質を含む膜表面に相互作用をする物質を含む膜が形成され、ＲＧＤ配列を有する物質を含む膜で被覆された細胞表面が相互作用をする物質を含む膜によって被覆される。溶液Ｂとの接触は、ＲＧＤ配列を有する物質に代えて相互作用する物質を使用する以外は、溶液Ａとの接触と同様に行うことができる。
【００６５】
溶液Ａ又は溶液Ｂと細胞との接触とを交互に繰り返し行うことにより、細胞表面全体に、ＲＧＤ配列を有する物質を含む膜と相互作用をする物質を含む膜とが交互に積層された細胞外マトリックス成分を含む被膜を形成することができる。溶液Ａ又は溶液Ｂと細胞との接触を行う回数は、形成する細胞外マトリックス成分を含む被膜の厚み等に応じて適宜決定できる。
【００６６】
なお、被覆細胞及び被覆細胞の培養は、一又は複数の実施形態において、特開２０１２−１１５２５４号公報に開示された方法を参酌して行うことができる。
【００６７】
本開示は、以下の一又は複数の実施形態に関しうる。
［１］  ペースメーカー細胞が積層された三次元組織片を形成することを含む、ペースメーカー組織片の製造方法であって、
前記三次元組織片は、ペースメーカー細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、
前記三次元組織片の形成は、ペースメーカー細胞の表面が細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞を積層して培養すること、又は前記ペースメーカー細胞の細胞層と前記細胞外マトリックス成分を含む層とを交互に積層して培養することを含む、ペースメーカー組織片の製造方法。
［２］  前記ペースメーカー細胞は、多能性を有する幹細胞に由来するペースメーカー細胞である、［１］記載の製造方法。
［３］  前記三次元組織片の形成は、前記被覆細胞を容器内に播種すること、及び前記容器内で積層された状態の前記被覆細胞を培養することを含む、［１］又は［２］記載の製造方法。
［４］  前記被覆細胞を調製することを含み、
前記被覆細胞の調製は、ペースメーカー細胞の細胞塊をトリプシン処理すること、及び前記トリプシン処理により細胞塊から分散させたペースメーカー細胞の表面に細胞外マトリックス成分を含む被膜を形成することを含む、［１］から［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］  前記細胞塊は、ＨＣＮ遺伝子が導入された多能性幹細胞を分化誘導させて得られた胚様体を無糖乳酸添加培地で培養し、ペースメーカー細胞を選別することにより得られた細胞塊である、［４］記載の製造方法。
［６］  前記三次元組織片は、前記ペースメーカー細胞を１×１０5個以上含む、［１］から［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］  ペースメーカー細胞と、細胞外マトリックス成分とを含み、
前記ペースメーカー細胞が前記細胞外マトリックス成分を介して積層され三次元組織化された、ペースメーカー組織片。
［８］  ［１］から［６］のいずれかに記載の製造方法によって製造される、［７］記載のペースメーカー組織片。
［９］  バイオロジカルペースメーカーとして利用可能な、［７］又は［８］記載のペースメーカー組織片。
【００６８】
以下に、実施例を用いて本開示をさらに説明する。但し、本開示は以下の実施例に限定して解釈されない。
【００６９】
なお、本明細書の記載において、以下の略語を使用する。
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）：ＨＣｌ（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ社製）でｐＨ７．４に調整した５０ｍＭ  Ｔｒｉｓを、０．２μｍ  γ−ｒａｙ  ｓｔｅｒｉｌｅ  ｆｉｌｔｅｒ（倉敷紡績株式会社製）で滅菌濾過したもの
ＢＦＮ：Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｐｌａｓｍａ（ＳＩＧＭＡ製）
ＢＦＮ溶液：０．２ｍｇ  ＢＦＮ／１ｍｌ  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）
ＤＭＥＭ：１０％  ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＳＩＧＭＡ社製）
Ｇｅｌａｔｉｎ溶液：０．２ｍｇ  Ｇｅｌａｔｉｎ／１ｍｌ  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を、０．２μｍ  γ−ｒａｙ  ｓｔｅｒｉｌｅ  ｆｉｌｔｅｒ（倉敷紡績株式会社製）で滅菌濾過したもの
【実施例】
【００７０】
（実施例１）
［ｍＥＳ細胞由来心筋細胞の作製］
マウスＥＳ細胞にＲｏｓａ２６−ＨＣＮ４−ＩＲＥＳ−ＡｃＧＦＰ１／ＡＡＶＳ１−Ｈｃｎ４−ＩＲＥＳ−ＡｃＧＦＰ１をエレクトロポレーションにより導入し、Ｈｃｎ４過剰発現マウスＥＳ細胞を作製した。作製したＨｃｎ４過剰発現マウスＥＳ細胞を４日間浮遊培地して胚様体を形成させた後、分化用培地で１０日間培養し、ペースメーカー機能を有する心筋細胞に分化誘導させた。分化誘導させた細胞を無糖乳酸添加培地で５日間培養することによって、Ｈｃｎ４過剰発現マウスＥＳ細胞（以下、「ｍＥＳ細胞由来心筋細胞」ともいう）を選別し、選択的にｍＥＳ細胞由来心筋細胞を細胞塊として取得した（Ｔｏｈｙａｍａ，  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．  ２０１２）。得られたｍＥＳ細胞由来心筋細胞は、１分間当たり２５２回の拍動を示した。細胞の拍動数は、位相差顕微鏡観察により測定した。【００７１】
［被覆細胞の作製］
得られた細胞塊をトリプシン処理（０．２５％トリプシン、０．０２％ＥＤＴＡ）（３７℃、５分間）し、細胞塊から個々の細胞（ｍＥＳ細胞由来心筋細胞）に分散させた。得られたｍＥＳ細胞由来心筋細胞をフラスコ等に接着させることなく、細胞の表面に細胞外マトリックス成分を含む被膜を形成した。被膜の形成は、以下の手順で行った。ｍＥＳ細胞由来心筋細胞を１×１０6ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度で０．２ｍｇ／ｍｌのフィブロネクチンを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）溶液に分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら１分間分散状態を保った後、２，５００ｒｐｍの回転数で１分間の遠心分離を行った（ＦＮ浸漬操作）。ついで、上澄みを除き、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）溶液を加え、細胞を分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら１分間分散状態を保った後、２，５００ｒｐｍの回転数で１分間の遠心分離を行った（洗浄操作）。上澄みを除き、０．２ｍｇ／ｍｌのゼラチンを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）溶液に細胞を分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら、１分間分散状態を保った後、２，５００ｒｐｍの回転数で１分間の遠心分離を行い（Ｇ浸漬操作）、ついで洗浄操作を行った。そして、ＦＮ浸漬操作、洗浄操作、Ｇ浸漬操作、及び洗浄操作をこの順番で行った。ＦＮ浸漬操作及びＧ浸漬操作は洗浄操作とそれぞれセットで１ステップとし、最終的に、ＦＮ浸漬操作を５回、Ｇ浸漬操作を４回、計９ステップ行うことによって被覆細胞を作製した（コーティング層の厚み：７ｎｍ）。【００７２】
［ペースメーカー組織片の作製］
２４ウェル培養プレートに配置したトランスウェル（コーニング社製；ポアサイズ：０．４μｍ、表面積：０．３３ｃｍ2）のメンブレンフィルタ上に４×１０5個の被覆細胞を播種し、１０重量％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を添加して３７℃で５日間培養した。これによりペースメーカー細胞が４層積層されたペースメーカー組織片（厚み：およそ３０μｍ）が得られた。得られたペースメーカー組織片におけるペースメーカー細胞の密度は４×１０7個／ｍｍ2であった。図１に得られたペースメーカー組織片の位相差写真を示す。得られたペースメーカー組織片は、組織片に含まれるペースメーカー細胞が同期して心筋細胞組織として一律な拍動が確認された（拍動数：約２５０回／分）。【００７３】
参考例として、メンブレンフィルタ上に播種した被覆細胞の数を１×１０5個とした以外は、実施例１と同様に、１層のペースメーカー細胞層を作製した。得られたペースメーカー細胞層は、５０回／分程度の拍動を示したが、細胞層として一律な拍動は見られなかった。【００７４】
［ペースメーカー組織片の評価］
得られたペースメーカー組織片を通常の培地（１２ｍＬ）で５日間培養後、拍動数を測定し、ついで１．０μＭイソプロテレノールを添加して３０分間培養した。拍動数を測定した後、ＰＢＳで３回洗浄した後通常の培地（１２ｍＬ）で１日間培養して拍動数を測定し、３．０μＭイバブラジンを添加して３０分間培養した。拍動数を測定した後、３０μＭイバブラジンを添加してさらに３０分間培養して拍動数を測定した。ＰＢＳで３回洗浄した後通常の培地（１２ｍＬ）で３０分間培養し、拍動数を測定した。その結果を図２に示す。なお、培地は、１０重量％ＦＢＳ及び１％抗菌剤を含むＤＭＥＭ培地を用いた。【００７５】
図２は、薬剤添加前後のペースメーカー組織片の１分間あたりの拍動数の変化を示すグラフの一例である。図２において左から順に、イソプロテレノール添加前（Ｎｏｒｍａｌ）、イソプロテレノール添加３０分後、通常の培地への交換後（Ｎｏｒｍａｌ）、３．０μＭイバブラジン添加３０分後、３０μＭイバブラジン添加３０分後、通常の培地への交換後（Ｎｏｒｍａｌ）における拍動数を示す。図２に示すように、実施例１のペースメーカー組織片は、拍動促進剤であるイソプロテレノールを添加すると拍動数が大幅に上昇し、一方、Ｈｃｎ４遺伝子阻害剤であるイバブラジンを添加すると拍動数が減少した。また、参考例として、Ｈｃｎ４遺伝子を導入することなく心筋細胞に分化誘導させた細胞を用いた以外は実施例１と同様の手順で作製した組織片を使用して同様の実験を行ったところ、拍動数の変化はほとんど見られなかった。よって、実施例１のペースメーカー組織片に含まれるペースメーカー細胞は、Ｈｃｎ４チャネルが発現し、機能していることが確認できた。【００７６】
（実施例２）
［マウスへの移植実験］
実施例１と同様にしてペースメーカー移植片（大きさ：０．３３ｃｍ2、細胞の密度：４×１０7個／ｍｍ3）を作製し、それをＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの皮下に移植した。移植１週間後、特に強い炎症反応などは観察されず、良好な生着が確認された。【００７７】
（実施例３）
被覆細胞の細胞数を１×１０6個とし、播種後の培養期間を２０日にとした以外は実施例１と同様にしてペースメーカー組織片を作製した。ホルマリン固定後、免疫蛍光染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡（ＣＬＳＭ）を用いた測定を行った。その結果を、筋細胞に特異的なトロポニンであるトロポニンＴの発現、細胞間のイオン伝達をつかさどるギャップジャンクションを構成するタンパク質であるコネキシン４３の発現が確認できた。また、アクチン及びミオシンの発現が確認できると共に、トロポニンとアクチンとがほぼ同じ位置に発現しており、生体における心筋組織に類似する染色パターンが確認できた。細胞間接着に関与するＥ−カドヘリンの発現も確認できた。【００７８】
（実施例４）
被覆細胞の細胞数を１×１０5個、３×１０5個又は５×１０5個とし、播種後の培養期間を７日間とした以外は実施例１と同様にして細胞層の異なる３種類のペースメーカー組織片（細胞層：１層、３層又は５層）を作製し、その拍動数を計測した。また、参考例としてＨｃｎ４遺伝子を導入することなく心筋細胞に分化誘導させた細胞を用いた以外は実施例４と同様の手順で作製し、拍動数の計測を行った。それらの結果を図３に示す。
図３に示すように、細胞層数が５層のペースメーカー組織片（厚み：１７±５．０μｍ）の拍動数が最も多く、次に３層（厚み：１１±０．５μｍ）及び１層（厚み：４．９±1.7μｍ）の順番で拍動数の減少が見られた。つまり、細胞層の数及び／又は厚みが多ければ多いほど、拍動数が上昇した。
【図２】
2015025958.tif 000003
【図３】
2015025958.tif 000004
【図１】
2015025958.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成27年10月19日(2015.10.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペースメーカー細胞が積層された三次元組織片を形成することを含む、ペースメーカー組織片の製造方法であって、
前記三次元組織片は、ペースメーカー細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、
前記三次元組織片の形成は、ペースメーカー細胞の表面が細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞を積層して培養すること、又はペースメーカー細胞の細胞層と細胞外マトリックス成分を含む層とを交互に積層して培養することを含む、ペースメーカー組織片の製造方法。
【請求項２】
前記ペースメーカー細胞は、多能性を有する幹細胞に由来するペースメーカー細胞である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記三次元組織片の形成は、前記被覆細胞を容器内に播種すること、及び前記容器内で積層された状態の前記被覆細胞を培養することを含む、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記被覆細胞を調製することを含み、
前記被覆細胞の調製は、ペースメーカー細胞の細胞塊をトリプシン処理すること、及び前記トリプシン処理により細胞塊から分散させたペースメーカー細胞の表面に細胞外マトリックス成分を含む被膜を形成することを含む、請求項１から３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記細胞塊は、ＨＣＮ遺伝子が導入された多能性幹細胞を分化誘導させて得られた胚様体を無糖乳酸添加培地で培養し、ペースメーカー細胞を選別することにより得られた細胞塊である、請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
前記三次元組織片は、前記ペースメーカー細胞を１×１０５個以上含む、請求項１から５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
ペースメーカー細胞と、細胞外マトリックス成分とを含み、
前記ペースメーカー細胞が前記細胞外マトリックス成分を介して積層され三次元組織化された、ペースメーカー組織片。
【請求項８】
請求項１から６のいずれかに記載の製造方法によって製造される、請求項７記載のペースメーカー組織片。
【請求項９】
バイオロジカルペースメーカーとして利用可能な、請求項７又は８記載のペースメーカー組織片。
【請求項１０】
ペースメーカー組織片の製造方法であって、
ペースメーカー細胞の表面が細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞を積層すること、及び
前記積層した被覆細胞を培養することにより、積層された前記ペースメーカー細胞と前記細胞外マトリックス成分とを含む三次元組織片を形成することを含む、ペースメーカー組織片の製造方法。
【請求項１１】
前記被覆細胞を１×１０５個／ｃｍ３〜１×１０７個／ｃｍ３の密度で前記ペースメーカー細胞を含む細胞の層が３層以上積層されるように配置することを含む、請求項１０記載の製造方法。
【請求項１２】
前記ペースメーカー組織片におけるペースメーカー細胞の密度は、１×１０６個／ｍｍ３以上５×１０９個／ｍｍ３以下である、請求項１０又は１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記ペースメーカー細胞を含む細胞の層が４層以上積層されるように前記被覆細胞を配置して培養することを含む、請求項１０から１２のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１４】
請求項１０から１３のいずれかに記載の製造方法に製造されるペースメーカー組織片であって、
ペースメーカー細胞が１×１０６個／ｍｍ３以上５×１０９個／ｍｍ３以下の密度で細胞外マトリックス成分を介して積層され三次元組織化された、ペースメーカー組織片。
【請求項１５】
前記ペースメーカー細胞を含む細胞の層を３層以上含む、請求項１４記載のペースメーカー組織片。
【国際調査報告】
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