(57)【要約】本発明は、植物の光合成および生産量／成長を増加させる方法、ならびに該方法に使用する形質転換植物に関する。
2014142334.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＨＡ２遺伝子またはＡＨＡ２様遺伝子を過剰発現するトランスジェニック植物。
【請求項２】
孔辺細胞特異的に高発現する遺伝子のプロモーター、好ましくはＧＣ１プロモーターによってＡＨＡ２遺伝子を過剰発現する、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３】
双子葉植物である、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４】
アブラナ科に属する、請求項３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５】
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属またはＢｒａｓｓｉｃａ属に属する、請求項４に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６】
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｖａｒ．ｎｉｐｐｏ−ｏｌｅｉｆｅｒａ）、キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｃａｐｉｔａｔａ）、ブロッコリー（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｉｔａｌｉｃａ）、カリフラワー（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｂｏｔｒｙｔｉｓ）およびハクサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｖａｒ．ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される、請求項４に記載のトランスジェニック植物。
【請求項７】
単子葉植物である、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項８】
イネ科に属する、請求項７に記載のトランスジェニック植物。
【請求項９】
Ｏｒｙｚａ属、Ｚｅａ属、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ属またはＳｏｒｇｈｕｍ属に属する、請求項８に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１０】
モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、アフリカイネ（Ｏｒｙｚａ  ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）およびコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）からなる群から選択される、請求項８に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１１】
植物の生産量を増大させる方法であって、該植物に、ＡＨＡ２遺伝子を過剰発現させるための遺伝子改変を導入することを含む、前記方法。
【請求項１２】
植物における光合成を増大させる方法であって、該植物に、ＡＨＡ２遺伝子を過剰発現させるための遺伝子改変を導入することを含む、前記方法。
【請求項１３】
ＡＨＡ２遺伝子が孔辺細胞特異的に高発現する遺伝子のプロモーター、好ましくはＧＣ１プロモーターの制御下にある、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
植物が双子葉植物である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１５】
植物がアブラナ科に属する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
植物がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属またはＢｒａｓｓｉｃａ属に属する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
植物がシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｖａｒ．ｎｉｐｐｏ−ｏｌｅｉｆｅｒａ）、キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｃａｐｉｔａｔａ）、ブロッコリー（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｉｔａｌｉｃａ）、カリフラワー（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｂｏｔｒｙｔｉｓ）およびハクサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｖａｒ．ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
植物が単子葉植物である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１９】
植物がイネ科に属する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
植物がＯｒｙｚａ属、Ｚｅａ属、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ属またはＳｏｒｇｈｕｍ属に属する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
植物がモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、アフリカイネ（Ｏｒｙｚａ  ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）およびコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の光合成および生産量／成長を増加させる方法、ならびに該方法に使用する形質転換植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球規模の気候変動および食糧不足の危機が生じている現代においては、陸上植物によるＣＯ２の取り込みを向上させる方法を見出すことは益々重要な課題である。ＣＯ２の取り込みにおける主要器官である気孔は、表皮にある２つの特殊な細胞（孔辺細胞と呼ばれている）に囲まれた微細な孔であり、主に陸上植物においてその葉面上に見出される。葉面は空気および水を殆ど通さないので、周辺大気と葉の内部との間のＣＯ２、Ｏ２および水蒸気の拡散のための主要経路を気孔が提供する。気孔開口によるガス交換の促進は、植物の光合成および蒸散における最も不可欠な過程のうちの１つである（１、２）。近年の研究により、気孔蒸散がイネにおける光合成の制限要因であること（３）、および蒸散の減少が作物（例えばコムギ）の養分吸収の低下をもたらすこと（４）が示された。従って、気孔の開口／蒸散の増加は光合成を促進し、またそれによって植物成長を増加させると予想される。しかし、本発明者らの知る限り、植物成長の増加に関して気孔開度を操作する研究の成功例は報告されていない。考えられる理由の１つは、気孔は水門の役割も果たしている（５）ため、その気孔を介して水蒸気を失うと同時にＣＯ２を取り込むというジレンマのバランスを取るのは難しいということである。
光は気孔開口を刺激する主な因子の１つであり、また様々な機構が種々の光波長に応答した気孔開口の根底にある（６〜８）。赤色光は、葉肉および孔辺細胞葉緑体における光合成を介した気孔開口、ならびに細胞間隙ＣＯ２濃度（Ｃｉ）の低下を引き起こすと考えられている（５、９、１０）。しかし、赤色光に対する気孔応答の詳細な機構については議論中である（１１、１２）。対照的に、青色光はシグナルとして働き、気孔開口に対して最も顕著な効果を発揮する。青色光受容体フォトトロピン（ｐｈｏｔ１およびｐｈｏｔ２）は、カルボキシル末端から２番目のスレオニンのリン酸化とその後のリン酸化スレオニンへの１４−３−３タンパク質の結合を介して細胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅを活性化する（１３〜１５）。青色光により活性化された細胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅは細胞膜の過分極を引き起こし、それによって内向き整流性Ｋ＋チャネル（細胞膜Ｋ＋ｉｎチャネル）を介したＫ＋の取り込みが可能となる（１６〜２０）。Ｋ＋の蓄積は孔辺細胞の膨張および気孔開口を引き起こす。従って、これらの３つの因子（フォトトロピン、細胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅおよび細胞膜Ｋ＋ｉｎチャネル）は、青色光による気孔開口において重要な役割を果たしている。これらの因子に加えて、ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ  ＬＯＣＵＳ  Ｔ（ＦＴ）が気孔開口の正の調節因子であることが示唆されている（２１）。
【発明の概要】
【０００３】
植物表皮内の一対の孔辺細胞に囲まれた気孔の孔は、光、ＣＯ２、および植物ホルモンであるアブシジン酸（ＡＢＡ）に応答して植物と大気との間のガス交換を調節している。光による気孔開口は、少なくとも３つの主要因子：青色光受容体フォトトロピン、細胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅおよび細胞膜Ｋ＋ｉｎチャネルにより仲介される。気孔抵抗が植物に上るＣＯ２取り込みの主な制限因子と考えられるにもかかわらず、光合成および植物成長の増加を目標として気孔開口を増大させる試みは殆ど為されていない。
ここで、本発明者らは、孔辺細胞プロモーター、すなわち孔辺細胞特異的に高発現する遺伝子のプロモーター（ＧＣ１プロモーター）を使用して細胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ（ＡＨＡ２）を過剰発現するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属の形質転換植物が光による気孔開口、光合成および植物成長（植物の生産量）の増大を示すことを明らかにした。該形質転換植物は、生育開始２５日目には、野生型より大きくかつ増加した数のロゼット葉を生じ、その生重量および乾燥重量は約４２〜６３％大きかった。播種後４５日目の形質転換植物の、種子、長角果および花を含む全花茎の乾燥重量は、野生型の全花茎の乾燥重量より約３６〜４１％大きかった。加えて、該形質転換植物の気孔は暗黒条件およびアブシジン酸に応答して正常に閉じた。対照的に、孔辺細胞におけるフォトトロピンまたは細胞膜Ｋ＋ｉｎチャネルの過剰発現はこれらの表現型に影響を与えなかった。これらの結果は、気孔開度が光合成および植物成長における制限因子であること、また孔辺細胞において細胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅを過剰発現させることによる気孔開口の操作が植物成長の促進に非常に有用であることを証明するものである。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
［１］ＡＨＡ２遺伝子を過剰発現するトランスジェニック植物。
［２］孔辺細胞特異的に高発現する遺伝子のプロモーター、好ましくはＧＣ１プロモーターによってＡＨＡ２遺伝子を過剰発現する、［１］に記載のトランスジェニック植物。
［３］双子葉植物である、［１］に記載のトランスジェニック植物。
［４］アブラナ科に属する、［３］に記載のトランスジェニック植物。
［５］Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属またはＢｒａｓｓｉｃａ属に属する、［４］に記載のトランスジェニック植物。
［６］シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｖａｒ．ｎｉｐｐｏ−ｏｌｅｉｆｅｒａ）、キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｃａｐｉｔａｔａ）、ブロッコリー（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｉｔａｌｉｃａ）、カリフラワー（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｂｏｔｒｙｔｉｓ）およびハクサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｖａｒ．ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される、［４］に記載のトランスジェニック植物。
［７］単子葉植物である、［１］に記載のトランスジェニック植物。
［８］イネ科に属する、［７］に記載のトランスジェニック植物。
［９］Ｏｒｙｚａ属、Ｚｅａ属、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ属またはＳｏｒｇｈｕｍ属に属する、［８］に記載のトランスジェニック植物。
［１０］モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、アフリカイネ（Ｏｒｙｚａ  ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）およびコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）からなる群から選択される、［８］に記載のトランスジェニック植物。
［１１］植物の生産量を増大させる方法であって、該植物に、ＡＨＡ２遺伝子を過剰発現させるための遺伝子改変を導入することを含む、前記方法。
［１２］植物における光合成を増大させる方法であって、該植物に、ＡＨＡ２遺伝子を過剰発現させるための遺伝子改変を導入することを含む、前記方法。
［１３］ＡＨＡ２遺伝子が孔辺細胞特異的に高発現する遺伝子のプロモーター、好ましくはＧＣ１プロモーターの制御下にある、［１１］または［１２］に記載の方法。
［１４］植物が双子葉植物である、［１１］または［１２］に記載の方法。
［１５］植物がアブラナ科に属する、［１４］に記載の方法。
［１６］植物がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属またはＢｒａｓｓｉｃａ属に属する、［１５］に記載の方法。
［１７］植物がシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｖａｒ．ｎｉｐｐｏ−ｏｌｅｉｆｅｒａ）、キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｃａｐｉｔａｔａ）、ブロッコリー（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｉｔａｌｉｃａ）、カリフラワー（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｂｏｔｒｙｔｉｓ）およびハクサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｖａｒ．ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される、［１５］に記載の方法。
［１８］植物が単子葉植物である、［１１］または［１２］に記載の方法。
［１９］植物がイネ科に属する、［１８］に記載の方法。
［２０］植物がＯｒｙｚａ属、Ｚｅａ属、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ属またはＳｏｒｇｈｕｍ属に属する、［１９］に記載の方法。
［２１］植物がモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、アフリカイネ（Ｏｒｙｚａ  ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）およびコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）からなる群から選択される、［１９］に記載の方法。
本明細書は、本願の優先権の基礎である米国仮出願第６１／７７７，６５５号の明細書、特許請求の範囲および図面に記載された内容を参照により組み込むものとする。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＧＣ１プロモーターを利用したＡＨＡ２の過剰発現（ＧＣ１：：ＡＨＡ２）は気孔開口を促進させることを示す。ＧＣ１：：ＡＨＡ＃１及びＧＣ１：：ＡＨＡ＃２はそれぞれ独立して得られた形質転換植物を意味する。（Ａ）Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属植物の表皮における孔辺細胞Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅの免疫組織化学的検出の典型的な蛍光画像（免疫組織化学的条件の詳細については、材料および方法の項を参照されたい）。（Ｂ）野生型（ＷＴ）およびＧＣ１：：ＡＨＡ２におけるＡＨＡ２およびＴＵＢ２のＲＴ−ＰＣＲ解析。ＴＵＢ２（ＴＵＢＵＬＩＮ  ＢＥＴＡ  ＣＨＡＩＮ２）を対照遺伝子として使用した。（Ｃ）２．５時間の暗黒下、２．５時間の光照射（５０μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１の赤色光および１０μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１の青色光）下または２．５時間の光照射下かつ２０μＭ  ＡＢＡの存在下での気孔開度。（Ｄ）青色光を３０分間照射した表皮における典型的な気孔。光条件は（Ｃ）と同じであった。（Ｅ）暗黒下または３０分間の光処理後の気孔開度。光条件は（Ｃ）と同じとした。（Ｃ）および（Ｅ）の気孔開度は２５個の気孔に関する測定値の平均値であり；エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を表している。気孔開度の差はスチューデントのｔ−検定を用いて検出した（＊＊＊Ｐ＜０．００１）。（Ｆ）播種後４週目のＷＴおよびＡＨＡ２−形質転換植物から切り離したロゼット葉の生重量の変化の動態。葉の相対重量は、初期重量（植物体からの切断直後の各ロゼット葉の重量）に対する割合として示されている。データは１０枚の葉の平均値であり；エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表している。
図２は、ＡＨＡ２−形質転換植物のガス交換特性を示す。野生型（ＷＴ）およびＡＨＡ２形質転換植物における（Ａ）気孔コンダクタンスの光応答ならびに（Ｂ）ＣＯ２同化速度。測定は３８０μＬＬ−１のＣＯ２で行い；葉温およびリーフチャンバーの相対湿度はそれぞれ２４℃および４０〜５０％に維持した。（Ｃ）野生型およびＡＨＡ２−形質転換植物におけるＣＯ２同化速度と細胞間隙ＣＯ２濃度との関係。測定は約７５０μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１の白色光下で行った。葉温およびリーフチャンバー内の相対湿度はそれぞれ２４℃および４０〜５０％に維持した。データは３つの異なる植物体に関する測定値の平均値であり；エラーバーはＳＤを表しており、また記号よりも小さい場合は表示されていない。白い四角は野生型植物であり；ダークブルーの円およびライトブルーの三角はＡＨＡ２−形質転換植物である。
図３は、ＡＨＡ２−形質転換植物の表現型の特徴を示す。（Ａ）および（Ｂ）強光条件（２００μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１）下で２５日間生育させた野生型およびＡＨＡ２−形質転換植物の表現型。（Ｃ）強光条件下で生育させた野生型およびＡＨＡ２−形質転換植物のロゼット葉および幼葉。（Ｄ）播種後２５日目の植物体の相対的な地上部の生重量および乾燥重量。（Ｅ）強光条件下で５０日間生育させた野生型およびＡＨＡ２−形質転換植物の表現型。（Ｆ）播種後４５日目の植物の相対乾燥茎重。生重量および乾燥重量は６個体以上の植物体の測定値の平均値であり；エラーバーはＳＥＭを表している。差はスチューデントのｔ−検定により検出した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
図４は、ＧＣ１プロモーターを使用したＰＨＯＴ２−ＧＦＰ、ＡＫＴ１またはＫＡＴ１の過剰発現は気孔開口に影響を与えなかったことを示す。（Ａ）ＧＣ１：：ＰＨＯＴ２−ＧＦＰから得た典型的な気孔の明視野像および蛍光画像。（Ｂ）（Ｅ）（Ｆ）野生型（ＷＴ）および形質転換植物ＧＣ１：：ＰＨＯＴ２−ＧＦＰ、ＧＣ１：：ＡＫＴ１およびＧＣ１：：ＫＡＴ１におけるＰＨＯＴ２、ＡＫＴ１、ＫＡＴ１およびＴＵＢＵＬＩＮ  ＢＥＴＡ  ＣＨＡＩＮ２（ＴＵＢ２）のＲＴ−ＰＣＲ解析。ＴＵＢ２は対照として使用した。（Ｃ）（Ｇ）（Ｈ）２．５時間の暗黒下、２．５時間の光照射（５０μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１の赤色光および１０μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１の青色光）下または２．５時間の光照射下かつ２０μＭ  ＡＢＡの存在下での気孔開度。（Ｄ）暗黒下または２．５時間の光処理後のｐｈｏｔ１  ｐｈｏｔ２二重変異体およびＧＣ１：：ＰＨＯＴ２−ＧＦＰ／ｐｈｏｔ１  ｐｈｏｔ２形質転換植物の気孔開度。光条件は（Ｃ）と同じとした。気孔開度は２５個の気孔に関する測定値の平均値であり；エラーバーはＳＥＭを表している。気孔開度の差はスチューデントのｔ−検定を用いて検出した（＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
図５は、ＡＨＡ２−形質転換植物の生産性を示す。（Ａ）強光条件（２００μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１）下で４５日間生育させた野生型およびＡＨＡ２−形質転換植物の表現型。（Ｂ）野生型（ＷＴ）またはＡＨＡ２−形質転換植物（ＧＣ１：：ＡＨＡ２）各々の乾燥長角果。（Ｃ）１植物体当たりの長角果の相対値。（Ｄ）各植物体の長角果の全乾燥重量を各植物体の長角果数で割ったものとして算出した１植物体当たりの長角果の平均乾燥重量の相対値。長角果数および乾燥重量は、３個体の植物体の測定値の平均値であり；エラーバーはＳＤを表している。差はスチューデントのｔ−検定により検出した（＊Ｐ＜０．０５）。
図６は、ＧＣ１プロモーターを使用したＡＨＡ２−Ｐ６８Ｓの過剰発現は気孔開口を増加させるが植物成長は増加させないことを示す。（Ａ）２．５時間の暗黒下、光照射（５０μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１の赤色光および１０μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１の青色光）下または光照射下かつ２０μＭ  ＡＢＡの存在下での気孔開度。（Ｂ）強光条件（２００μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１）下で２５日間生育させた野生型（ＷＴ）およびＡＨＡ２−Ｐ６８Ｓ−形質転換植物（ＧＣ１：：ＡＨＡ２−Ｐ６８Ｓ）の表現型。（Ｃ）播種後２５日目の植物体の相対的な地上部の生重量および乾燥重量。生重量および乾燥重量は１０個体以上の植物体の測定値の平均値であり；エラーバーはＳＥＭを表している。差はスチューデントのｔ−検定により検出した。
図７の表１は、野生型（ＷＴ）およびＧＣ１：：ＡＨＡ２形質転換植物のガス交換パラメーターを示す。
図８の表２は、野生型（ＷＴ）およびＧＣ１：：ＡＨＡ２形質転換植物の気孔の密度、指数、および大きさを示す。
図９の表３は、野生型（ＷＴ）および形質転換植物の地上部のバイオマス生産性を示す。
図１０の表は、野生型（ＷＴ）に対する形質転換植物の遺伝子発現の比を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
本発明者らは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）において、孔辺細胞特異的に発現する遺伝子のプロモーター（ＧＣ１プロモーター）下で気孔開口をさらに促進させるために、気孔開口における主要成分の形質転換植物を作出しようと試みた（２２）。本発明者らは、孔辺細胞においてＨ＋−ＡＴＰａｓｅ（ＡＨＡ２）を過剰発現する形質転換植物が光による気孔開口、光合成および植物成長の増大を示すこと、ならびに気孔開度が光合成および植物成長における制限因子であることを見出した。
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＡＨＡ２遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。ＡＨＡ２遺伝子にはＡＨＡ２遺伝子の相同遺伝子またはオルソログが含まれる。すなわち、ＡＨＡ２遺伝子には、ＡＨＡ２遺伝子と機能的に等価な遺伝子、例えば、配列番号１の塩基配列と８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子が含まれる。
ＡＨＡ２遺伝子の相同遺伝子またはオルソログの具体例を以下に示す。
［表］
2014142334.tif 000003
2014142334.tif 000004
2014142334.tif 000005
＊「％同一性」は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ２（ＡＨＡ２）ｍＲＮＡ、完全長ｃｄｓとの％同一性を指す。
ＡＨＡ２を過剰発現する形質転換植物は、ＡＨＡ２遺伝子を過剰発現させるために植物に遺伝子改変を導入することにより作出してもよい。かかる遺伝子改変としては、好ましくはベクター（例えば、プラスミド）に含まれるＡＨＡ２遺伝子の、植物への導入が挙げられる。ＡＨＡ２遺伝子は、好ましくは孔辺細胞特異的に高発現する遺伝子のプロモーター、好ましくはＧＣ１プロモーターにより過剰発現される。ＡＨＡ２遺伝子は、好ましくは、植物に、孔辺細胞特異的に高発現する遺伝子のプロモーター、好ましくはＧＣ１プロモーターと共に導入される。言い換えると、ＡＨＡ２遺伝子は孔辺細胞特異的に高発現する遺伝子のプロモーターの制御下にある。遺伝子改変の導入は、植物のゲノムＤＮＡの相同的組換えにより行うこともできる。
ＡＨＡ２を過剰発現する形質転換植物は、気孔を閉じる能力を有する。形質転換植物の気孔を閉じるこの能力は、野生型植物の該能力と類似している。
導入するＡＨＡ２遺伝子は、好ましくは、該遺伝子を導入する植物と同一の科、属または種に由来する。しかし、ＡＨＡ２遺伝子を導入する植物の科、属または種とは異なる科、属または種に由来する該遺伝子を導入することもできる。
植物に遺伝子改変を導入する方法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１に記載されているように、当分野で周知である。
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＧＣ１プロモーターの塩基配列を配列番号２に示す。ＧＣ１プロモーターには、ＧＣ１プロモーターと機能的に等価なプロモーター、例えば、配列番号２の塩基配列と８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるプロモーターが含まれる。
ＧＣ１プロモーター以外の孔辺細胞特異的に高発現する遺伝子のプロモーターを使用することもできる。孔辺細胞特異的に高発現する遺伝子のプロモーターの具体例としては、ＭＹＢ６プロモーター（Ｍｅｙｅｒ，Ｓ．，Ｍｕｍｍ，Ｐ．，Ｉｍｅｓ，Ｄ．，Ｅｎｄｌｅｒ，Ａ．，Ｗｅｄｅｒ，Ｂ．，Ａｌ−Ｒａｓｈｅｉｄ，Ｋ．Ａ．Ｓ．，Ｇｅｉｇｅｒ，Ｄ．，Ｍａｒｔｅｎ，Ｉ．，Ｍａｒｔｉｎｏｉａ，Ｅ．およびＨｅｄｒｉｃｈ，Ｒ．（２０１０）．ＡｔＡＬＭＴ１２  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ  ａｎ  Ｒ−ｔｙｐｅ  ａｎｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｓｔｏｍａｔａｌ  ｍｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｇｕａｒｄ  ｃｅｌｌ．Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，６３：１０５４−１０６２；Ｂａｕｅｒ，Ｈ．，Ａｃｈｅ，Ｐ．，Ｌａｕｔｎｅｒ，Ｓ．，Ｆｒｏｍｍ，Ｊ．，Ｈａｒｔｕｎｇ，Ｗ．，Ｒａｓｈｅｉｄ，Ｋ．，Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ，Ｓ．，Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ，Ｕ．，Ｋｎｅｉｔｚ，Ｓ．，Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｎ．，Ｍｅｎｄｅｌ，Ｒ．，Ｂｉｔｔｎｅｒ，Ｆ．，Ｈｅｔｈｅｒｉｎｇｔｏｎ，Ａ．およびＨｅｄｒｉｃｈ，Ｒ．（２０１３）．Ｔｈｅ  ｓｔｏｍａｔａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｈｕｍｉｄｉｔｙ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｇｕａｒｄ  ｃｅｌｌ−ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  ＡＢＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２３：５３−５７）が挙げられる。
植物は特に限定されない。ある実施形態では、植物として双子葉植物が挙げられる。該双子葉植物としてはアブラナ科の植物が挙げられる。該植物は、好ましくはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属またはＢｒａｓｓｉｃａ属に属する。該植物は、好ましくは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｖａｒ．ｎｉｐｐｏ−ｏｌｅｉｆｅｒａ）、キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｃａｐｉｔａｔａ）、ブロッコリー（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｉｔａｌｉｃａ）、カリフラワー（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｂｏｔｒｙｔｉｓ）、およびハクサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｖａｒ．ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される。
Ｌｕらは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のＫＡＴ１プロモーターおよびＰＬＤ∂１遺伝子を用いてセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）を形質転換し、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のＫＡＴ１プロモーターおよびＰＬＤ∂１遺伝子を用いて形質転換したシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）において見られるものと類似のＰＬＤ∂１遺伝子の発現パターンおよび効果を得た（Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ，（２０１２），ｐｐ．１−１０，ＤＯＩ：１０．１１１１／ｐｂｉ．１２０２８）。従って、Ｂｒａｓｓｉｃａ属に属する植物の、ＡＨＡ２遺伝子およびＧＣ１プロモーターによる形質転換は、ＡＨＡ２遺伝子およびＧＣ１プロモーターを用いて形質転換したシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）において見られるものと類似の結果をもたらすと考えられる。
別の実施形態では、植物として単子葉植物が挙げられる。該単子葉植物としてはイネ科の植物が挙げられる。該植物は、好ましくはＯｒｙｚａ属、Ｚｅａ属、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ属またはＳｏｒｇｈｕｍ属に属する。該植物は、好ましくは、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、アフリカイネ（Ｏｒｙｚａ  ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）およびコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）からなる群から選択される。
また本発明は、植物の生産量を増加させる方法にも関する。該方法は、ＡＨＡ２遺伝子を過剰発現させるために遺伝子改変を植物に導入することを含む。植物の生産量を増加させるということは、形質転換植物の重量が野生型植物の重量より大きくなることを意味する。形質転換植物の重量には、地上部の重量、最終的な茎の重量、種子の重量などが含まれる。
また本発明は、植物における光合成を増加させる方法にも関する。該方法は、ＡＨＡ２遺伝子を過剰発現させるために遺伝子改変を植物に導入することを含む。植物における光合成のレベルは、気孔コンダクタンス、ＣＯ２同化速度などを測定することにより測定可能である。
光に応答して増大した気孔開口を示す形質転換植物を作出するため、本発明者らは、気孔開口の３つの主要因子：青色光受容体フォトトロピンのアイソフォームであるＰＨＯＴ２（１３）；細胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅの代表的なアイソフォームであるＡＨＡ２（２３）；ならびに細胞膜Ｋ＋ｉｎチャネルのアイソフォームであるＫＡＴ１およびＡＫＴ１（１９、２０）を孔辺細胞で高発現させることを試みた。これらのタンパク質を孔辺細胞特異的に過剰発現させるため、本発明者らは孔辺細胞特異的に高発現する遺伝子のプロモーター、すなわちＧＣ１プロモーター（２１、２２）を使用した。免疫組織化学的解析により、同じプロモーターを使用して作製したＡＨＡ２−形質転換植物（ＧＣ１：：ＡＨＡ２）の孔辺細胞におけるＡＨＡ２レベルが、野生型孔辺細胞におけるＡＨＡ２レベルより約１．５倍高いことが示された（図１ａ）。ＡＨＡ２−形質転換植物の孔辺細胞を含む表皮組織内のＡＨＡ２転写産物もまた、野生型におけるＡＨＡ２転写産物より約１．５倍多かった（図１ｂ）。そこで、本発明者らは、これらの植物における気孔開口の光応答性について調べた。２．５時間光照射に曝露した際、ＡＨＡ２−形質転換植物は野生型植物より約２５％大きい気孔開度を示したが、これらの気孔は暗黒下では野生型と同様に閉じた（図１ｅ）。また本発明者らは、ＡＨＡ２−形質転換植物の気孔が、３０分間の光照射下で野生型の気孔よりも急激に開口することも見出した（図１ｄ、ｅ）。対照的に、ＰＨＯＴ２−ＧＦＰ（ＧＣ１：：ＰＨＯＴ２−ＧＦＰ）、ＡＫＴ１（ＧＣ１：：ＡＫＴ１）およびＫＡＴ１（ＧＣ１：：ＫＡＴ１）の過剰発現は、これらの成分が孔辺細胞内または表皮内に増加したレベルで存在していたにもかかわらず、これらの条件下では気孔開口に影響を与えなかった（図４）。これらの結果は、フォトトロピンおよびＫ＋ｉｎチャネルではなくＨ＋−ＡＴＰａｓｅが光による気孔開口の制限因子であること、また孔辺細胞におけるＨ＋−ＡＴＰａｓｅの量の増加により気孔開口の規模と速度の両方が増大することを示している。
ＡＨＡ２−形質転換植物における光による気孔開口が、植物ホルモン・アブシジン酸（ＡＢＡ）により野生型において見られるのと同程度まで阻害されたことに注目されたい（図１ｃ）。ＡＨＡ２−形質転換植物における切断葉の重量減少もまた、野生型における重量減少と類似していた（図１ｆ）。これらの結果は、ＡＨＡ２−形質転換植物の乾燥ストレスに対する感受性が正常であることを示唆している。
そこで本発明者らは、ＡＨＡ２−形質転換植物の無傷葉における気孔コンダクタンスおよび光合成活性（ＣＯ２同化速度）について、ガス交換システムを利用して詳細に調べた。気孔コンダクタンスは、比較的高い光強度（＞２００μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１）下では、野生型よりもＡＨＡ２−形質転換植物において明らかに大きかった（図２ａ）。これと一致して、周囲ＣＯ２条件（３８０μＬＬ−１）下のＡＨＡ２−形質転換植物における光合成の速度（ＣＯ２同化速度）もまた野生型植物における光合成の速度より高かった（図２ｂ）。ＡＨＡ２−形質転換植物における気孔コンダクタンスは、植物に光合成飽和白色光を連続的に照射した場合、野生型における気孔コンダクタンスより約４４〜４９％高かった（図７の表１）。ＡＨＡ２−形質転換植物における光合成速度は、同じ飽和−光条件下では野生型における光合成速度より約１１〜１８％高かった（図７の表１）。結果、ＡＨＡ２−形質転換植物および野生型植物の水利用効率（光合成速度と蒸散速度との比）は有意な差を示さなかった（図７の表１）。ＡＨＡ２−形質転換植物の高い光合成速度がその大きな気孔開口程度に起因するものかどうかを判定するために、本発明者らはＣＯ２同化速度と葉内細胞間隙ＣＯ２濃度との応答曲線について調べた（図２ｃ）。これら２つの曲線は互いにほぼ一致しており、このことは、Ｒｕｂｉｓｃｏのカルボキシル化能力と電子伝達能力がいずれも野生型と形質転換植物の間で類似しており、気孔コンダクタンスだけがＡＨＡ２−形質転換植物でより大きいということを示している。これらの結果は、ＡＨＡ２−形質転換植物において、増大した気孔開口が増加した光合成速度に寄与しているということを明確に示している。
次に、本発明者らは、ＡＨＡ２−形質転換植物の成長について調べた（図３）。植物を２００μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１の光強度下で２５日間生育させた場合、ＡＨＡ２−形質転換植物が野生型より大きくかつ増加した数のロゼット葉を付け、その生重量および乾燥重量が約４２〜６３％大きかったことに留意されたい。さらに、播種後４５日目のＡＨＡ２−形質転換植物における種子、長角果および花を含む全花茎の乾燥重量は、同じ生育条件下では野生型の全花茎の乾燥重量より約３６〜４１％大きかった。ＡＨＡ２−形質転換植物における各長角果の乾燥重量は野生型植物の各長角果の乾燥重量と同程度であるにもかかわらず、各ＡＨＡ２−形質転換植物当たりの長角果の数は野生型植物の長角果の数よりずっと多かった（図５）。ＡＨＡ２−形質転換植物の気孔の密度、指数および大きさは野生型植物の気孔の密度、指数および大きさと同程度であった（図８の表２）。これらの結果は、増加した生産性は気孔の形態または分化の差に起因するものではないとうこと、また光による気孔開口の増大が植物成長を促進したということを明確に示している。
ＡＨＡ２−形質転換植物を８０μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１の光強度下で生育させた場合、ＡＨＡ２−形質転換植物と野生型植物との植物生産性の差が小さい（図９の表３）ということは特筆に値する。これらの光条件下では、気孔コンダクタンスではなく、光合成電子伝達速度が光合成における制限因子であることが示された（２４）。従って、ＡＨＡ２−形質転換植物は高い光強度（２００μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１）下で優れた成長を示した。対照的に、ＰＨＯＴ２−、ＫＡＴ１−およびＡＫＴ１−形質転換植物の成長は、２００μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１の光強度下でも野生型の成長と類似していた（図９の表３）。加えて、本発明者らは、第１膜貫通セグメント内のＰｒｏ６８のＳｅｒへの点突然変異により恒常的高活性−Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅを有すると推定されるＡＨＡ２−Ｐ６８Ｓ−形質転換植物（ＧＣ１：：ＡＨＡ２−Ｐ６８Ｓ）（２５）における気孔の表現型およひ植物成長について調べた。実際、ＡＨＡ２−Ｐ６８Ｓ−形質転換植物の気孔は明暗条件下で、さらにはＡＢＡの存在下でも、常に大きく開口することが示された（図６ａ）。しかし、ＡＨＡ２−Ｐ６８Ｓ−形質転換植物は増大した植物成長を示さなかった（図６ｂ、ｃ）。
本研究において、本発明者らは、光による気孔開口において重要な成分（例えば、細胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ、フォトトロピンおよびＫ＋ｉｎチャネル）を過剰発現するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）形質転換植物を、ＧＣ１プロモーターを使用して作出した。孔辺細胞における細胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅの量の増加だけが光による気孔開口に有意な影響を与え（図１）、このことは、細胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅが気孔開口過程の制限因子であることを示している。本発明者らは、この影響が細胞膜Ｋ＋ｉｎチャネルの電気的特性に起因しているのではないかと考えた。細胞膜Ｋ＋ｉｎチャネルの電圧−電流関係は、Ｋ＋ｉｎチャネルの活性が過分極−依存性であることを示している（１８）。従って、青色光に応答して細胞膜の過分極を促進する孔辺細胞Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅのレベルの増加（１６）は、気孔開口を効果的に誘導する。加えて、ＡＨＡ２−形質転換植物は増大した光合成活性および植物成長を示した（図２および３）。本発明者らの知る限り、これは植物成長への気孔開口の寄与を明確に示す最初の証拠である。本発明者らの結果は、細胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅの操作が、気孔開口を促進させるためだけでなく、光合成および植物成長を増大させるためにも非常に有用であることを示している。
近年、イネ変異体ｓｌａｃ１（乾燥−感受性開口−気孔変異体）が、増加した葉の光合成速度を有することが示された（３）。しかし、ｓｌａｃ１変異が乾燥ストレスに対する非感受性を理由に植物成長に影響を与えることはなかった。これと一致して、恒常的開口−気孔およびＡＢＡ−非感受性の表現型を示すＡＨＡ２−Ｐ６８Ｓ形質転換植物は、増大した植物成長を示さなかった（図６）。また本発明者らは、気孔開口の正の調節因子であるＦＬＯＷＥＲＩＮＧ  ＬＯＣＵＳ  Ｔ（ＦＴ）の孔辺細胞における発現（２１）を、ＧＣ１プロモーターを使用して人為的に増加させた。正常な乾燥応答を示すＦＴ−形質転換植物の気孔は、明暗条件下で常時より大きく開口していた。しかし、ＦＴ−形質転換植物の成長は野生型植物の成長と同程度であった。これらの結果は、乾燥耐性に対する感受性の欠如または夜間の水分損失の増加がバイオマスの蓄積において不利になりうることを明確に示している。従って、明所で増加した気孔開口を示すだけでなく、暗所で、およびＡＢＡに応答して正常に閉じるＡＨＡ２−形質転換植物の気孔（図１ｃ）は、炭素の固定および蓄積に良い影響を与える。さらに、ＡＨＡ２−形質転換植物の気孔は、高いＣＯ２濃度に応答して野生型植物の気孔よりも大きく開口すると思われる（図２ｃ）。高ＣＯ２濃度では蒸散の低下により作物の栄養減少が生じる（４）ことから、気孔を介してより多くの蒸散を行うＡＨＡ２−形質転換植物はＣＯ２濃度が高い環境で繁茂することができるだろう。この戦略の作物および燃料用植物への利用は、植物生産量の促進および持続可能な低炭素社会に大いに貢献することが期待される。
【実施例】
【０００６】
材料および方法
植物材料および生育条件
本明細書中で野生型（ＷＴ）として使用したシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ｇｌ１［ホモ接合型劣性ｇｌ１を持つＣｏｌｕｍｂｉａ（Ｃｏｌ）］は、全形質転換植物の背景植物のエコタイプである。遺伝子発現、気孔開度およびガス交換の実験に使用した植物は、生育室内で湿度５５〜７０％、２４℃にて１６時間蛍光灯（８０μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１）／８時間暗期のサイクル下、土壌で生育させた。バイオマス生産性測定に使用した植物は、光強度を約８０μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１（弱光条件）および２００μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１（強光条件）とした以外は同じ環境条件下で生育させた。
形質転換用ベクターの構築および植物の形質転換
植物の形質転換のために使用したプラスミドベクターは、従来の方法（２１）に従って構築した。手短に述べると、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位に挟まれたＧＣ１の開始コドンの１，７０２ｂｐ〜１ｂｐ上流のゲノムＤＮＡ断片（ＡＴ１Ｇ２２６９０）を使用することにより、ｐＰＺＰ２１１中のＣａＭＶ３５Ｓの対応領域を置き換えた（ｐＰＺＰ２１１−ＧＣ１）。ＨｉｎｄＩＩＩ消化の前に、単一ヌクレオチド置換（１，４５３位のＣをＧに置換）を部位特異的突然変異誘発によりこのＧＣ１断片に導入した。ＡＨＡ２（ＡＴ４Ｇ３０１９０）、ＰＨＯＴ２（ＡＴ５Ｇ５８１４０）、ＫＡＴ１（ＡＴ５Ｇ４６２４０）およびＡＫＴ１（ＡＴ２Ｇ２６６５０）のｃＤＮＡ断片を、次のオリゴヌクレオチドプライマー：５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＴＣＧＡＡＧＡＴＡＴＣＡＡＧＡＡＣ−３’  （配列番号３）および５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＡＣＡＣＡＧＴＧＴＡＧＴＧＡＣＴＧＧＧ−３’（ＡＨＡ２用）（配列番号４）、５’−ＧＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＴＡＴＧＧＧＧＡＴＧＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＧＡＧＣＣＣ−３’  （配列番号５）および５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＧＡＡＧＡＧＧＴＣＡＡＴＣＴＣＣＡＡＧＴＣＣＧ−３’（ＰＨＯＴ２用）（配列番号６）、５’−ＧＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＧＡＴＧＴＣＧＡＴＣＴＣＴＴＧＧＡＣＴＣＧ−３’  （配列番号７）および５’−ＧＣＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＴＴＴＧＡＴＧＡＡＡＡＡＴＡＣＡＡＡＴＧＡＴＣＡＣＣ−３’（ＫＡＴ１用）（配列番号８）、ならびに５’−ＧＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＧＡＴＧＡＧＡＧＧＡＧＧＧＧＣＴＴＴＧＴＴＡＴＧＣ−３’  （配列番号９）および５’−ＧＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＡＧＡＡＴＣＡＧＴＴＧＣＡＡＡＧＡＴＧＡＧＡＴＧＡＴＣ−３’（ＡＫＴ１用）（配列番号１０）を用いて増幅した。増幅したＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩまたはＮｃｏＩを使用してｐＰＺＰ２１１−ＧＣ１に挿入した。ｐＰＺＰ２１１−ＧＣ１：：ＰＨＯＴ２内のＰＨＯＴ２コード配列の終止コドンを、Ｓ６５Ｔ変異を有する合成緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子（ＧＦＰ）と置き換えた。単一アミノ酸置換（Ｐ６８Ｓ）を、次のプライマー：５’−ＧＧＧＧＴＴＴＡＴＧＴＧＧＡＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＴＧＧＧＴＣＡＴＧＧ−３’  （配列番号１１）および５’−ＣＣＡＴＧＡＣＣＣＡＴＧＡＡＡＧＴＧＡＡＴＴＣＣＡＣＡＴＡＡＡＣＣＣＣ−３’  （配列番号１２）を使用して部位特異的突然変異誘発によりｐＰＺＰ２１１−ＧＣ１：：ＡＨＡ２に導入した。ＧＣ１：：ＦＴ−ＧＦＰの構築については以前に記載した（２１）。全ての植物形質転換用プラスミドベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（ＧＶ３１０１）に導入し、これをその後、標準法を利用して植物を形質転換するために使用した。Ｆ３ホモ接合型植物を実験のために使用した。
ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ植物Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して表皮断片から抽出した。該表皮断片は、播種後４〜６週目の植物体の完全に展開したロゼット葉から以前に記載した通りに単離した（２６）。一本鎖ｃＤＮＡをＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用い、オリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｔａｋａｒａ）を使用して全ＲＮＡから合成した。ＡＨＡ２およびＴＵＢ２のｃＤＮＡ断片は、次のオリゴヌクレオチドプライマー：５’−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＧＡＧＴＣＴＣＧＡＡＧ−３’  （配列番号１３）および５’−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＣＡＣＡＧＴＧＴＡＧＴＧＡＣ−３’（ＡＨＡ２用）（配列番号１４）、ならびに５’−ＣＡＴＴＧＴＴＧＡＴＣＴＣＴＡＡＧＡＴＣＣＧＴＧ−３’  （配列番号１５）および５’−ＴＡＣＴＧＣＴＧＡＧＡＡＣＣＴＣＴＴＧＡＧ−３’（ＴＵＢ２用）（配列番号１６）を用いて増幅した。全てのＰＣＲを３０サイクル実施した。
孔辺細胞における細胞膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅの免疫組織化学的検出
免疫組織化学的検出を、従来の方法（２６）に従い、これに修正を加えて実施した。野生型およびＡＨＡ２−形質転換植物の完全に展開したロゼット葉を収穫した後、小片に切り分けた。該小片を、固定バッファー［５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０），５ｍＭ  ＭｇＳＯ４，５ｍＭ  ＥＧＴＡ］中室温で１時間、パラホルムアルデヒドから新たに調製した４％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒドを用いて固定した。この固定試料をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，２．６８ｍＭ  ＫＣｌ，１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）を用いて洗浄し、３７℃で１００％メタノールを用いて脱色した後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて室温で洗浄した。この脱色試料をスライドガラスに貼り付け、カバーガラスで封止してから、液体窒素を用いて５回冷凍および解凍した。カバーガラスを取り外した後、該試料を一晩かけて完全に乾燥させた。２日目に、該試料を、ＰＢＳ中の４％Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  Ｏｎｏｚｕｋａ  Ｒ−１０（Ｙａｋｕｌｔ）および０．５％Ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ  Ｒ−１０（Ｙａｋｕｌｔ）を用いて３７℃で１時間、スライドガラス上で消化した。消化後、該試料をＰＢＳで洗浄し、さらに３％（ｖ／ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０；ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）および１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｗａｋｏ）を用いて室温で３０分間透過処理した。該試料を次にＰＢＳで洗浄し、さらにＰＢＳ中の３％ウシ血清アルブミンＦｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ）を用いて室温で１時間ブロックした。その後、該試料を、３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳで１：５，０００に希釈した抗−Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ抗体と共に３７℃で６時間、または４℃で一晩インキュベートした。該試料をＰＢＳで洗浄し、さらに３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳで１：５００に希釈したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に３７℃で３時間暗所にてインキュベートした。ＰＢＳによる洗浄後、各標本を５０％（ｖ／ｖ）グリセロールを用いてカバーガラス下に封入した。該標本を、励起光源としてＨｇアークランプを使用し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８用の狭帯域励起バンドパスフィルターセットＢＰ４６０−４８０ＨＱ  ＢＡ４９５−５４０ＨＱ（Ｕ−ＭＧＦＰＨＱ；Ｏｌｙｍｐｕｓ）を備えた蛍光顕微鏡（ＢＸ５０；Ｏｌｙｍｐｕｓ）で観察した。蛍光画像はＣＣＤカメラシステム（ＤＰ７２；Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して収集し、さらにＤＰ２−ＢＳＷソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して処理した。蛍光強度を評価するために、全ての画像を同一露光時間で撮影した。気孔の蛍光強度はＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用して数値化した。
気孔開度の測定
気孔開度は従来の方法（２７）に従い、これに若干の修正を加えて測定した。一晩暗順応させた播種後３〜４週目の植物体から単離した表皮組織を、基礎バッファー（ｂａｓａｌ  ｂｕｆｆｅｒ）（５ｍＭ  ＭＥＳ−ＢＴＰ，ｐＨ６．５，５０ｍＭ  ＫＣｌ，および０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２）中でインキュベートした。光による気孔開口のＡＢＡによる阻害のために、表皮組織を、２０μＭ  ＡＢＡの存在下または非存在下２４℃で２．５時間、青色光／赤色光［５０μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１のバックグラウンド赤色光（ＬＥＤ−Ｒ；ＥＹＥＬＡ）に重ね合わせた１０μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１の青色光（Ｓｔｉｃｋ−Ｂ−３２；ＥＹＥＬＡ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）］下でインキュベートした。背軸側表皮における気孔開度を顕微鏡で測定した。気孔開度は２５個の気孔の平均値として標準誤差（ＳＥＭ）と共に示した。結果は、別の研究員による盲検的再評価（ｂｌｉｎｄ  ｒｅａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）により確認した。
ガス交換測定
ガス交換測定はＬＩ−６４００システム（Ｌｉ−Ｃｏｒ）を使用して実施し、またパラメーターは製造業者から提供されたソフトウェアを用いて算出した。白色光は、光源としてハロゲンプロジェクターランプ（１５Ｖ／１５０Ｗ；Ｍｏｒｉｔｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｊａｐａｎ）を備えた光ファイバー照明器により供給した。電源（ＭＨＡＢ−１５０Ｗ，ＡＣ１００Ｖ，２．２Ａ，５０／６０Ｈｚ；Ｍｏｒｉｔｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用してランプに電力を供給した。一連の光学クラウンガラス金属中性濃度フィルター（Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｊａｐａｎ，Ｈａｋｕｔｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｊａｐａｎ）を用いて光を減衰させた。流速、葉温および相対湿度は、それぞれ５００μｍｏｌ  ｓ−１、２４℃および４０〜５０％で一定に保った。光反応曲線に関しては、条件は同じとし、また最初の３０分間の暗順応後は、白色光の強度を２０分超の間隔で増加させた（安定状態（ｓｔａｂｌｅ  ｓｔａｔｕｅ））。ＣＯ２反応曲線に関しては、葉を先ず４００μＬ  Ｌ−１のＣＯ２に飽和白色光条件（約７５０μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１）下で４０分間順化させた後、ＣＯ２濃度を約２０分の間隔で５０μＬ  Ｌ−１  ＣＯ２から１，５００μＬ  Ｌ−１へと段階的に増加させた。
気孔の密度、指数および大きさ
異なる植物体から完全に展開した葉を選択した。ガス交換測定のために使用した葉の葉身の同一部位から無作為に３枚の顕微鏡写真を撮影した。気孔密度を算出するために、各顕微鏡写真中の気孔の数を数えた。気孔指数（Ｉ）はＩ＝［Ｓ／（Ｅ＋Ｓ）］×１００（式中のＳは気孔の数であり、かつＥは表皮細胞の数である）として算出した。気孔の長軸を該気孔の大きさとして使用した。
統計解析
有意性は、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を使用したスチューデントのｔ−検定に従って判定した。両側検定を等分散行列（ｈｏｍｏｓｃｅｄａｓｔｉｃ  ｍａｔｒｉｃｅｓ）について実施した。
参考文献
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１９．Ｋｗａｋ  ＪＭ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｇｕａｒｄ  ｃｅｌｌ  Ｋ＋  ｃｈａｎｎｅｌ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｒｅｄｕｃｅ  ｉｎｗａｒｄ−ｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ  Ｋ＋  ｃｕｒｒｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｔｏｍａｔａｌ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １２７：４７３−４８５．
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２７．Ｉｎｏｕｅ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｂｌｕｅ  ｌｉｇｈｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｔｏｔｒｏｐｉｎ  ｉｓ  ａ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｅｐ  ｆｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５：５６２６−５６３１．
配列番号１（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿００１２０３９４１．１）
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＡＨＡ２遺伝子の塩基配列
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）Ｈ（＋）−ＡＴＰａｓｅ  ２（ＨＡ２）ｍＲＮＡ、完全長ｃｄｓ
ＣＤＳ                  １３９．．３０８４
2014142334.tif 000006
2014142334.tif 000007
配列番号２（Ａｔ１ｇ２２６９０）プロモーター（−１，７０２ｂｐ〜−１ｂｐ）
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＧＣ１プロモーターの塩基配列
Ｙａｎｇ，Ｙ．，Ｃｏｓｔａ，Ａ．，Ｌｅｏｎｈａｒｄｔ，Ｎ．，Ｓｉｅｇｅｌ，Ｒ．Ｓ．，およびＳｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ｊ．Ｉ．（２００８）．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｔｒｏｎｇ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｇｕａｒｄ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｓ  ａ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄ．４，６．
Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，Ｔ．，Ｏｎｏ，Ｎ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｙ．，Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｓ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｓ．，Ｓｏｄａ，Ｍ．，Ｋａｔｏ，Ｙ．，Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｍ．，Ｎａｋａｎｏ，Ｔ．，Ｉｎｏｕｅ，Ｓ．，ら（２０１１）．ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ  ＬＯＣＵＳ  Ｔ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｓｔｏｍａｔａｌ  ｏｐｅｎｉｎｇ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．２１，１２３２−１２３８．
2014142334.tif 000008
2014142334.tif 000009
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願は、参照によりそれらの全内容が本明細書中に組み込まれるものとする。
［配列表］
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2014142334.tif 000020
【図１】
2014142334.tif 000021
【図２】
2014142334.tif 000022
【図３】
2014142334.tif 000023
【図４】
2014142334.tif 000024
【図５】
2014142334.tif 000025
【図６】
2014142334.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成26年9月17日(2014.9.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＣ１プロモーターの制御下でＡＨＡ２遺伝子を過剰発現し、気孔を閉じる能力を保持したトランスジェニック植物であって、ＡＨＡ２遺伝子が配列番号１の塩基配列からなる遺伝子又はそのオルソログである、トランスジェニック植物。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
双子葉植物である、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４】
アブラナ科に属する、請求項３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５】
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属またはＢｒａｓｓｉｃａ属に属する、請求項４に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６】
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｖａｒ．ｎｉｐｐｏ−ｏｌｅｉｆｅｒａ）、キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｃａｐｉｔａｔａ）、ブロッコリー（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｉｔａｌｉｃａ）、カリフラワー（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｂｏｔｒｙｔｉｓ）およびハクサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｖａｒ．ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される、請求項４に記載のトランスジェニック植物。
【請求項７】
単子葉植物である、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項８】
イネ科に属する、請求項７に記載のトランスジェニック植物。
【請求項９】
Ｏｒｙｚａ属、Ｚｅａ属、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ属またはＳｏｒｇｈｕｍ属に属する、請求項８に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１０】
モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、アフリカイネ（Ｏｒｙｚａ  ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）およびコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）からなる群から選択される、請求項８に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１１】
植物の生産量を増大させる方法であって、該植物に、ＧＣ１プロモーターの制御下にあるＡＨＡ２遺伝子を導入することにより、ＡＨＡ２遺伝子を過剰発現し、かつ気孔を閉じる能力を保持したトランスジェニック植物を作製することを含み、ここでＡＨＡ２遺伝子が、配列番号１の塩基配列からなる遺伝子又はそのオルソログである、前記方法。
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
植物が双子葉植物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
植物がアブラナ科に属する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
植物がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属またはＢｒａｓｓｉｃａ属に属する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
植物がシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｖａｒ．ｎｉｐｐｏ−ｏｌｅｉｆｅｒａ）、キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｃａｐｉｔａｔａ）、ブロッコリー（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｉｔａｌｉｃａ）、カリフラワー（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｂｏｔｒｙｔｉｓ）およびハクサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｖａｒ．ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
植物が単子葉植物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
植物がイネ科に属する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
植物がＯｒｙｚａ属、Ｚｅａ属、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ属またはＳｏｒｇｈｕｍ属に属する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
植物がモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、アフリカイネ（Ｏｒｙｚａ  ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）およびコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【国際調査報告】
2014142334.tif 000027
2014142334.tif 000028
2014142334.tif 000029
2014142334.tif 000030