(57)【要約】  目的の容器まで接続された管路内に液体培地を保留しないで目的の容量を高精度にポンプを用いて送液する送液装置およびそれを用いた細胞培養装置を提供する。送液装置において、液体導入口と液体排出口を有する送液管と、液体導入口から導入する液体を保持する収容容器と、送液管内の液体を液体排出口に向けて送液する送液機構部と、送液管へ気体を導入する気体導入部と、送液管内で送液される液体の進行液面を検知する液面検知部とを備え、気体導入部は、送液機構部の上流側の送液管に設けられた分岐部に接続され、液面検知部は、分岐部より下流側に設けられることを特徴とする。
2015025425.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体導入口と液体排出口を有する送液管と、
前記液体導入口から導入する液体を保持する収容容器と、
前記送液管内の前記液体を前記液体排出口に向けて送液する送液機構部と、
前記送液管へ気体を導入する気体導入部と、
前記送液管内で送液される前記液体の進行液面を検知する液面検知部と、
を備え、
前記気体導入部は、前記送液機構部の上流側の前記送液管に設けられた分岐部に接続され、
前記液面検知部は、前記分岐部より下流側に設けられる
ことを特徴とする送液装置。
【請求項２】
前記送液機構部と、前記気体導入部と、前記液面検知部とを制御する制御部をさらに、有し、
前記液面検知部が、前記送液機構部よりも下流側に設けられた場合に、
前記液面検知部は、該液面検知部と前記分岐点との間にある前記送液管内の液体量が予め設定された送液量となる位置に配置され、
前記制御部は、前記液面検知部が前記液体の進行液面を検知した時、前記送液機構部による送液を停止する
ことを特徴とする請求項１に記載の送液装置。
【請求項３】
前記送液機構部と、前記気体導入部と、前記液面検知部とを制御する制御部をさらに、有し、
前記液面検知部が、前記送液機構部よりも上流側に設けられた場合に、
前記液面検知部で前記液体の進行液面を検知した時点から前記液面検知部を通過する液体の送液量を積算し、前記積算した送液量に基づき予め設定された送液量となるように前記送液機構部は前記液体の送液を停止する
ことを特徴とする請求項１に記載の送液装置。
【請求項４】
前記送液機構部と、前記気体導入部と、前記液面検知部とを制御する制御部をさらに、有し、
前記送液機構部は、前記気体導入部の下流側の代わりに上流側に設けられ、
前記制御部は、前記送液機構部により前記収容容器内の液体を加圧し、前記液面検知部に到達した前記液体の液面を基準として該液面検知部と前記分岐点との間にある前記送液管内の液体を予め設定された送液量として送液する
ことを特徴とする請求項１に記載の送液装置。
【請求項５】
前記分岐部は、重力方向に対して前記収容容器より上方に配置されている
ことを特徴とする請求項１に記載の送液装置。
【請求項６】
前記気体導入部から前記気体が前記送液管に導入されることで、前記分岐部より上流側の前記送液管内にある液体は前記収容容器に落差により戻され、前記分岐部より下流側の前記送液管内にある液体は前記送液機構部により前記液体排出口に向けて送液される
ことを特徴とする請求項１に記載の送液装置。
【請求項７】
前記液面検知部は、複数の光源が前記送液管の流れ方向に沿って配列され、前記複数の光源に対応する位置に複数の受光部が配列されている
ことを特徴とする請求項１に記載の送液装置。
【請求項８】
前記液面検知部は、第１センサと該第１センサより下流側に設置された第２センサとで構成され、
前記制御部は、前記第１および第２センサの少なくともいずれか一方の液面位置が誤検知であると判定した時は、前記液体の送液を停止する
ことを特徴とする請求項１に記載の送液装置。
【請求項９】
前記液面検知部の代わりに、重量センサを用いて前記収容容器の重量の変化量を測定し、該変化量に基づいて前記液体の送液量を決定する
ことを特徴とする請求項１に記載の送液装置。
【請求項１０】
前記気体導入部には、気体以外の混入物を除去するフィルタが具備され、
前記気体は該フィルタを通過して導入される
ことを特徴とする請求項１に記載の送液装置。
【請求項１１】
液体導入口と液体排出口を有する送液管と、
前記液体導入口から導入する液体を保持する収容容器と、
前記送液管内の前記液体を前記液体排出口に向けて送液する送液機構部と、
前記送液管へ気体を導入する気体導入部と、
外気を前記送液管を介して前記収容容器に導入し該収容容器に外気圧を印加する外気導入部と、
前記送液機構部と前記気体導入部と前記外気導入部とを制御する制御部と、を有し、
前記制御部は、前記外気導入部から外気を導入し、導入した前記外気を前記送液機構部の送液方向とは逆方向に送気し、前記送液管中の液体の液面を前記液体導入口の位置に保持する
ことを特徴とする送液装置。
【請求項１２】
請求項１に記載の送液装置を有する細胞培養装置において、
培養される細胞を収納する細胞収納容器と、
前記細胞を培養する培養容器と、
前記細胞の培養に供する培地を収納する培地収納容器と、
前記培地及び前記細胞を排出する廃液容器と、を備え、
前記送液装置を用いて、前記培養容器から送液管を介して細胞収納容器へ前記細胞を送液し、前記培地収納容器から送液管を介して細胞収納容器へ培地を送液し、前記培地を前記廃液容器に排出する
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１３】
恒温槽と低温保管容器と、をさらに有し、
前記培地容器と前記廃液容器とは前記低温保管容器に収納されて低温状態に保持され、
前記培養容器と前記細胞収納容器と前記培地収納容器と前記送液装置とは前記恒温槽に収納されて恒温制御されている
ことを特徴とする請求項１２に記載の細胞培養装置。
【請求項１４】
炭酸ガスを導入するガス導入部と、加湿を行う加湿制御部とを、さらに有し、
前記培養容器に前記炭酸ガスを供給し、前記加湿制御部で加湿を制御しながら細胞の培養を行う
ことを特徴とする請求項１３に記載の細胞培養装置。
【請求項１５】
前記送液装置を用いて前記細胞及び培地を含む液体の送液不具合を防止する
ことを特徴とする請求項１２に記載の細胞培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、送液装置、およびそれを用いた細胞を培養する細胞培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
自分の細胞もしくは他人の細胞を用いて疾病の治療を行う再生医療では、生体から採取した細胞を培養して細胞数を増やす、あるいはしかるべき形に組織を構築させて移植治療に用いられる。治療に用いる細胞の培養は、細胞プロセシングセンタ（Cell Processing Center:ＣＰＣ）という細胞培養用クリーンルームの中で、ＧＭＰ（Good Manufacturing Practice）に準拠して行わなければならない。ここでの課題は、細胞培養は技術者の手作業によって行われるため、患者１名分の細胞の調製に対して労力とコストが非常にかかるという点であり、さらに、手動で実施することによる生物学的汚染リスクがあるという点である。【０００３】
これらの課題を解決する手段として、閉鎖系で細胞培養工程を自動化する装置が開発されてきた。これは、培養容器の蓋を開閉する操作が不要な閉鎖系培養容器を用いることで、細胞培養工程の自動化と生物学的汚染リスクの低減が達成されるものである。【０００４】
培養時に手動で行う主な操作は、細胞を懸濁した液体培地を培養皿に送液する細胞播種作業と、培養中に定期的に実施する液体培地の交換作業である。手操作では使い捨ての分注チップを装着して使用する分注器あるいはメスピペッタを使用し、所定量の液体を定量分取し、液体ボトルの液体培地から培養皿への添加を実施する。つまり分注とは、液体を定量して分取し、目的の場所に移送する２つの動作から成る。自動培養装置では、同様の分注器を機械化し手操作と同様の分取と移送の動作を連動して液体添加を行う方法があるが、装置全体を無菌環境に設置する必要から、自動培養装置は大型化する。一方で、分注操作にポンプを使用した場合、液体ボトルから培養皿までの空間を使い捨てのチューブで接続し、ポンプによる定量と送液を同時に行う方法がある。この場合液体が送液されるチューブ内部を無菌状態に維持できればよく、自動化装置は小型化できる。このような、自動培養装置において機械化分注器を使用したものには、以下の特許文献１に開示されており、ポンプ送液を使用したものには特許文献２に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−１４９２６８号公報
【特許文献２】特開２００７−２２２１２０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献２において分注にポンプを使用した場合、チューブ内部に培地または細胞懸濁液が通過し、ポンプを停止したとき、チューブ内部に液体が閉じ込められる。その状態が継続するとチューブ内で培地が乾燥し目詰まりするため、その対策として、チューブに空気を流入させることでチューブ内の薬品等の液体を速やかに移動させる方法が開示されている。しかしながら、培地を保持する容器と接続されたチューブの途中までは培地が満たされて滞留する構成であり、この培地を排出する記載はない。【０００７】
そこでポンプを使用する送液方法において、目的の容器まで接続された管路内に液体培地を保留しない送液方法および送液装置が考えられる。図３は液体の落差を利用した送液装置１である。２は液体を保持する液体ボトルであり、ふたにより内部を気密に保持できる。３はふたの一つに設けた気圧調整のための管路であり、４は開口端に設けられたメッシュサイズ０.２２μｍのフィルタであり外気に開放している。ふたに設けられた５は供給管であり一端は、液体ボトル２の内部に開口端を持ち、液体に接して液体排出口となる。６はポンプであり、一端は供給管５に接続され、もう一端は排出管７を接続する。８は送液の目的の受容器である。９はこの液体ボトル１の液面より上方に設けられた分岐点であり、１０は気体導入弁であり分岐点９とフィルタ１１に接続された管を開閉する。フィルタ１１はメッシュサイズ０.２２μｍのフィルタであり外気に接している。１２は上記のポンプ６と気体導入弁１０を制御するコントローラである。【０００８】
この送液装置１は以下のように定量と送液を行う。ポンプ６の流量をＱとする。気体導入弁１０を閉じたのち、ポンプ６を稼働させると、ポンプ６は供給管５内の気体を送気し、気体に連なった液体ボトル２内の液体が供給管５を通過して、送液が開始され、分岐点９を通過する。ポンプ６の作動時間は、目的の液量Ａおよび分岐点９から液体ボトル２内の液体の液面に相応する管の体積（以下戻り量とする）Ｂ、これらを足し合わせた総液量Ｃを流量Ｑで割った値（時間）である。所定時間後ポンプ６を停止すると、ポンプ６の内部構造により管は閉塞されており、液体は移動しない。その後、気体導入弁１０を開放すると、フィルタ１１より気体導入がされるとともに、分岐点９位置から液体ボトル側の供給管５にある液体（戻り量Ｂ）は、その落差エネルギによって液体ボトル２にまで戻る。分岐点９よりポンプ６側の液体は、前記のポンプ６の内部構造により停止状態を維持している。次いでポンプ６を所定時間作動させると、フィルタ１１より順次気体導入がされるとともに排出管７を液体が移動する。液体の先端は受容器８に到達し液体の添加が開始され、液体の後端が受容器８に到達すれば、ポンプ６を停止する。【０００９】
送液装置１によれば、特許文献２と同様に分注にポンプを使用しており、管路内部には液体培地または細胞懸濁液などの液体を通過させ、ポンプを停止したとき管路内部に液体が閉じ込められる。同様に培養容器の方向の管路に気体を通過させることで、管路内の液体培地を空にする。加えて本方法では液体培地等を保持する液体ボトルの方向にも気体を通過させるので、管路内に液体培地などの液体を保留しない。【００１０】
一方でこの送液方法および送液装置においては、送液量をポンプの流量から計算される時間制御で規定したとき、以下の３つの課題がある。【００１１】
第１の課題は、送液元となる液体ボトル２における液面位置の影響である。液体ボトル２内に保持された液量が、一定量のとき液面位置も一定となり、目的の液量Ａおよび戻り量Ｂを足し合わせた総液量Ｃの定量性が再現される。液量Ｃは液体ボトルに保持された液量よりも小さいことは必然であるが、過剰量を液体ボトルに保持したとき、ボトル内の液面は通常時よりも高い位置にあるので、戻り量Ｂは所定量より小さくなる。よって、目的の液量Ａは大きくなって、目的の液量の定量性が損なわれる。また、連続送液の場合では、保持量が次第に少なくなるため、総液量Ｃは次第に少なくなる。戻り量Ｂも保持する液量変化により変動するが、総じて液量Ａは減少する傾向となる。【００１２】
第２の課題は、戻り液の液面位置の影響である。液体ボトル２に保持された液量に対し、供給管５内の液面位置が一定位置のとき、目的の液量Ａおよび戻り量Ｂを足し合わせた総液量Ｃの定量が再現される。保持された液量の液面位置をＤと表し、供給管５内の液面位置をＥと表した時、常に一定位置であることが望ましいが、落差によって液戻しを行ったとき、Ｄ＜Ｅは必然であるが、ミリ単位で上下変動しており、その結果、送液量のばらつきが大きくなる。特に顕著であるのは、送液の初回の液体ボトルにふたをして供給管を液体に接する場合である。気体導入弁１０は閉止されており、ポンプ６は停止して閉塞しているため、供給管５は開口部以外閉止されている。この状態で液体ボトル２内の液体に供給管５を接した場合、液面位置は供給管の開口部付近に存在するが、保持する液量によって変動する水圧により、この液面位置を制御することは難しい。【００１３】
第３の課題は、ポンプ流量を規定することが困難である点である。液体の流れが安定した中では、ポンプの流量自体は変動することは無い。ここでの課題は、ローラーポンプの例で顕著であり、巻きつけるチューブの長さが変わるとポンプ流量が大きく変化することにある。伸縮するゴムチューブの長さを厳密に規定することは難しく、特に培養装置の送液用途ではチューブは使い捨てであるので、チューブ交換は頻繁に実施する必要がある。【００１４】
そこで、本発明は、目的の容器まで接続された管路内に液体培地を保留しないで目的の容量を高精度にポンプを用いて送液する送液装置およびそれを用いた細胞培養装置の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題を解決するために、本発明に係る送液装置は、以下の特徴を有する。【００１６】
液体導入口と液体排出口を有する送液管と、液体導入口から導入する液体を保持する収容容器と、送液管内の液体を液体排出口に向けて送液する送液機構部と、送液管へ気体を導入する気体導入部と、送液管内で送液される液体の進行液面を検知する液面検知部とを備え、気体導入部は、送液機構部の上流側の送液管に設けられた分岐部に接続され、液面検知部は、分岐部より下流側に設けられることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、目的の容器まで接続された管路内に液体培地を保留しないで目的の容量を高精度にポンプを用いて送液する送液装置およびそれを用いた細胞培養装置の提供できる。本発明に係る送液装置によれば、送液元の液体ボトルにおける液量変化に対する液面位置の影響が回避され、戻り液の液面位置の影響を回避され、加えてゴムチューブの長さ等の影響によるポンプ流量の変化を回避することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例１記載の送液装置の構成図である。
【図２】実施例１記載の送液装置の制御フローチャートである。
【図３】従来の送液装置の構成を示す図である。
【図４】実施例１記載の液面センサを示す図である。
【図５】実施例１記載の細胞培養装置および送液装置の構成図である。
【図６】実施例１記載の自動培養装置の制御フローである。
【図７Ａ】実施例１記載の制御フローチャートである。
【図７Ｂ】実施例１記載の制御フローチャートである。
【図８】実施例１記載の送液装置の送液データである
【図９】実施例２記載の送液装置の構成図である。
【図１０】実施例２記載の送液装置の制御フローチャートである。
【図１１】実施例３記載の送液装置の構成図である。
【図１２】実施例３記載の送液装置の制御フローチャートである。
【図１３】実施例４記載の送液装置の構成図である。
【図１４】実施例４記載の送液装置の制御フローチャートである。
【図１５】実施例５記載の送液装置の構成図である。
【図１６】実施例５記載の送液装置の重量測定データを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、添付図面を参照して本発明の種々の実施例について説明する。ただし、これらの実施例は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明の技術的範囲を限定するものではない。また、各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている。
【実施例１】
【００２０】
以下、本発明の送液装置およびそれを用いた細胞培養装置の第１の実施例を、図１〜図８を参照しながら説明する。
＜送液装置＞
図１は、実施例１における送液装置２０の構成を示す図であり、液体の落差を利用した従来装置と基本的な構成は同じである。【００２１】
２は液体を保持する液体ボトルであり、ふたにより内部を気密に保持できる。３はふたに設けた気圧調整のための気圧調整管路であり、４は気圧調整管路の開口端に設けられたメッシュサイズ０.２２μｍのフィルタであり外気に開放している。ふたに設けられた５は供給管であり一端は、液体ボトル２の内部に開口端を持ち、液体に接して液体排出口となる。６はポンプであり、一端は供給管５に接続され、もう一端は排出管７に接続される。８は送液の目的の受容器である。９はこの液体ボトル１に保持された液体の液面より上方に設けられた分岐点であり、１０は気体導入弁であり分岐点９とフィルタ１１に接続された管を開閉する。この気体導入弁１０に使用する弁機構は電磁弁が好適である。いわゆる電磁弁は電磁石の作用により開閉する部品にゴムチューブを挟み込んで取り付け、電磁弁のＯＮ／ＯＦＦによりゴムチューブを弾性変形させて管部を開放／閉止する機構である。以下、弁なるものは電磁弁を意味する。【００２２】
２１は排出管７内の液の有無を検知する液面センサである。液面センサ２１は管の断面積と目的の送液量に応じて分岐点９から計算された距離に設置される。フィルタ１１はメッシュサイズ０.２２μｍのフィルタであり外気に接している。１２は上述したポンプ６と気体導入弁１０と液面センサ２１を制御するコントローラである。【００２３】
この送気装置２０は以下のように定量と送液を行う。
ポンプ６の流量をおよそＱとする。気体導入弁１０を閉じたのち、ポンプ６を稼働させると、ポンプ６は供給管５内の気体を送気し、気体に連なった液体ボトル２内の液体が供給管５を通過して、送液が開始される。液体は分岐点９を通過し、液面センサ２１の設置位置に液面が到達した時点で、ポンプ６を停止する。ポンプ６の内部構造により管は閉塞されており、液体は移動しない。【００２４】
次いで、気体導入弁１０を開放すると、フィルタ１１より気体導入がされるとともに、分岐点９位置から液体ボトル側の供給管５にある液体（戻り量Ｂと呼ぶ）は、その落差エネルギによって液体ボトル２にまで戻る。分岐点９よりポンプ６側の液体は、前記のポンプ６の内部構造により停止状態を維持している。このポンプ側の液体が送液量となる。次いでポンプ６を所定時間作動させると、フィルタ１１より順次気体導入がされるとともに排出管７を液体が移動する。液体の先端は受容器８に到達し液体の添加が開始され、液体の後端が受容器８に到達すれば、ポンプ６を停止する。【００２５】
図２に本実施例１の制御フローチャートを示す。本チャートは、横方向に時間軸を取り、縦方向には図１で示す気体導入弁１０、ポンプ６、液面センサ２１のそれぞれのＯＮ／ＯＦＦ状態を示している。【００２６】
まず、「ＳＴＡＲＴ」でポンプ６を稼働させ、送液が開始される。液の先端が液面センサ２１に到達すると、液面センサからの信号をうけ、ポンプ６の稼働を速やかに停止させる。次いで、気体導入弁１０を開放する。ポンプ６を液体の後端が受容器８に到達するまでの時間より大きい時間を設定し稼働させ、任意時間後に気体導入弁１０を閉止する。【００２７】
本実施例１に記載の送液装置２０を使用すれば、送液元の液体ボトル２における液面位置が供給管５のいずれの位置であっても、ポンプ送液を行うことによって、液面センサ２１の位置に管理できる。その理由は、送液量は管の断面積と目的の送液量に応じて分岐点９から計算された距離に設置された液面センサ２１の距離の積による管理された体積に等しく、気体導入時に後端が分岐点９、先端が液面センサ２１となる液体が送液量となるからである。【００２８】
この送液装置２０を使用すれば、液体ボトル２における戻り液の液面位置がいずれの位置にあっても、ポンプ送液を行うことによって、液面を液面センサの位置に管理できるので、上記と同じ理由により送液量を制御でき、連続送液時の戻り液の液面位置の影響を回避することが出来る。【００２９】
この送液装置２０を使用すれば、送液量をポンプ流量から求められるポンプ稼働時間で制御するのではなく、送液量は管の断面積と目的の送液量に応じて分岐点９から計算された距離に設置された液面センサ２１の距離の積による管理された体積に等しく、気体導入時に後端が分岐点９、先端が液面センサ２１となる液体である。よってゴムチューブの長さ等の影響によるポンプ流量の変化を回避することが出来る。【００３０】
このポンプ６は、ローラーポンプが好適であるがダイヤフラムポンプ、ギヤポンプなど他の方式のポンプでも適用できる。いわゆるしごきポンプ、チューブポンプともいうローラーポンプは、モータ回転軸に取り付けたローラーにゴムチューブを巻きつけて、モータ回転によってゴムチューブを弾性変形させて内部の気体や液体を送液する機構である。細胞培養装置では送液のチューブの滅菌性を確保する必要があり、使用時にチューブを交換可能であるローラーポンプは有用である。使用時に内部を滅菌可能であれば、どの様な送液ポンプも使用可能である。【００３１】
また、ポンプの停止時には内部の液体が移動しない構成が必要であるが、液体が移動するポンプの使用時には、ポンプの前後いずれかに送液ボトル側への流れを制限する逆止弁を介して管路を構成すれば、本発明に適用できる。【００３２】
図４は、液面センサ２１と送液管７との構成図であり、本図の左側に上面図、右側に側面図を示す。この上面図、側面図を用いて以下に説明する。２２は液面センサ本体であり、液面センサ本体２２は複数備えた光源２３と光源２３に相応する受光窓２４、コントローラ１２（図１参照）と接続する信号線２５からなる。光源２３と受光窓２４は光が透過する送液管７と並行して設置される。さらに送液管７内の液面を再現性良く検出されるために、設置治具２６と設置ベース２７を備え、これらは取り外し可能であり、使用時はねじなどで固定する。設置治具２６は送液管７の検出部位を間にする２つの管固定部２８で保持し、かつ送液管を固定したとき、液面センサにおける光源２３から発する検出光２９と送液管７の管内壁からの反射光３０を受光する受光窓２４の受光量が最適となる距離に送液管７を保持する。７ａは送液管に設けられた目印であり、目的の液量に相当する位置に設置治具２６を設置するよう、予め計算された位置に取り付ける。【００３３】
液面センサ２１は、以下のように液体の有無を検出する。送液管７の内部に液体がないとき、検出光２９は管内壁と空気の屈折率の差が大きく、受光窓２４に多くの検出光２９が受光される。送液管内に送液されると、検出光２９は管内壁と液体の屈折率の差が小さくなり、液体中に進行し、受光窓２４での検出光２９が受光量は小さくなる。コントローラ１２では、受光量に応じた信号値を判定し、受光量が減少したとき送液管７内への送液の有無を検出することが出来る。【００３４】
光源２３と光源２３に相応する受光窓２４は複数備えた方が望ましい。それは送液されている液体の先端は、細かな気泡を含む場合があり、液体の有無を誤判定する可能性があるが、光源２３と光源２３に相応する受光窓２４を複数備え、管の長さ方向に並列設置すれば、気相（気泡）と気相（気泡）が混じった液相と液相のみからなる液体の流れを連続した光量変化で検出し、誤検知の可能性を低くする効果があるからである。【００３５】
さらに同じ送液管を使用して、別の受容器に送液する場合など、前回の液体のわずかな残留液が小さな液体の節になって流れる場合も考えられる。そして目的の送液量となる液体の流れの前方で節が発生すると液面を誤検知する可能が高くなる。その場合でも、光源２３と光源２３に相応する受光窓２４は複数備え、管の長さ方向に並列設置すれば、液体の節だけでは目的の液面の先端と判定する光量が得られず、誤検知の可能性を低くする効果がある。【００３６】
一方で液面センサ２１は送液管に対し複数である方が、送液装置の信頼性を向上するうえで望ましい。液面センサを２つ以上設置し、一つは、目的の送液量に応じて分岐点９から計算された距離に設置する定量用液面センサであり、もうひとつは誤検知液面センサである。誤検知液面センサは、定量用液面センサよりも送液元に近いほうに設置し、誤検知液面センサ単独では、ポンプ送液を停止することはないようにする。誤検知を引き起こす特殊な大きな節が発生した時、大きな節は誤検知液面センサを通過して、定量用液面センサに到達したとき、ポンプ送液は停止する。このとき節用液面センサには多くの場合、気相を検出しており、本来の液体通過状態を検出していない可能性が高い。即ち誤検知液面センサと定量用液面センサの両方が正常に液体を検出していなければ、誤送液として判定する。【００３７】
上記のような、誤検知が発生するような送液状態の時、液体ボトルの液体の保持量が不十分であるなどの場合が想定されるので、誤検知が生じた送液は中止することが望ましい。つまり、液面検知手段を使用すれば、作業者による設置ミスや送液装置自体の不具合のもとでの送液を防止する手段として有効である。例えば、ポンプに送液を開始した時間と、液面が到達する時間の情報を利用すれば、使用するポンプの流量の情報を得ることができる。あるいは、閉じるべき弁を開け、逆に閉じてはいけない弁を閉じてあるような異常な開始状態でも、想定される液面到達時間に液面が到達しなければ何らかの異常と捉えることができる。【００３８】
本送液装置では、２つ以上の送液量を送液したい場合は、目的の複数の送液量に応じて分岐点９から計算された距離に設置する液面センサを複数設置すればよい。また送液量の１回の最大量は送液管の長さを超えることは無いが、送液管の長さを超えるような大量の送液量の要求時は、送液操作を複数回に行えばよい。【００３９】
本実施例に使用する液面センサは、光の特性を利用したセンサが好適であるが、その他圧力、超音波、ひずみセンサなども利用でき、上記の限りでない。【００４０】
この送液装置では、複数の受容器に同じ液量を送液するときは、ポンプ６と受容器７の間に、受容器の数に応じた分岐点とその各々に対応する容器開閉弁を設け、送液したい容器開閉弁のみ開放し、上記の操作を繰り返し実行すれば、同じ液量を送液しつつ、かつこの間で管路内に液体培地を保留させないため、閉塞の恐れもない。【００４１】
さらに、この送液装置では、液体を撹拌しつつ送液することができる。これは気体導入によって戻り液が発生したとき、液体ボトル内の静止した保持液体に対し対流を発生させるからである。この効果は、送液対象として液体組成が不均一な液体の場合に顕著である。例えば、細胞を培地に懸濁した細胞懸濁液では、手操作では細胞播種前に分注器のピストンを押し引きすることで、液体に対流を起こさせ撹拌操作を行っている。本送液装置では複数の培養容器に播種するとき、送液の都度、戻り液が発生させ液体の撹拌を実行している。撹拌をより効果的に行いたい場合は、図１において気体導入弁１０を閉じたのち、ポンプ６を稼働させて液体ボトル２内の液体の先端を分岐点９の手前で停止させ、次いで、気体導入弁１０を開放すると、戻り液が発生し１回の撹拌工程が完了する。この工程を連続して複数行えばより効果的に撹拌を行うことができる。【００４２】
ポンプによる液体の送液方法では、しばしば管内の液体流れにおいて生じる液組成に由来する粘性抵抗や温度の影響、また管内の曲がりや、各容器間の上下位置関係に伴う落差の影響が、ポンプの流量を増減させ送液の定量性を損なわせている。この送液装置２０を使用すれば、上記説明した方法で送液量を規定するので、これらの液体流れの条件に伴うポンプ流量の変化を排除した送液が可能である。即ち、送液温度が変化しても、受容器の数が増加して分岐数や容器の配置が変化しても、一定の定量性を確保した送液を実現できる。
＜細胞培養容器と自動細胞培養装置の構成＞
図５は、第１の実施例の送液装置２０を用いた自動細胞培養装置３１の一例である。以下、細胞培養容器への液体培地の供給または排出する送液制御手段を備えた自動細胞培養装置において実施例を説明する。３２は恒温槽であり、細胞培養に最適な培養温度で細胞培養容器を保持する。３３は冷蔵庫であり、冷温保持する必要があるものを保持する。【００４３】
３４は第１の細胞懸濁液を保持する第１細胞ボトルであり、ふたにより内部を気密に保持できる。３５はふたの一つに設けた気圧調整のための管路であり、３６は開口端に設けられたメッシュサイズ０．２２μｍのフィルタであり恒温槽３２の外気に開放している。ふたに設けられた３７は供給管であり、一端は第１細胞ボトル３４の内部に開口端を持ち、細胞懸濁液に接して液体排出口となる。供給管３７は分岐点３８を介して２分岐され、一方は第１気体導入弁３９に接続され、もう一方の供給管３７は第１細胞開閉弁４０に接続される。分岐点３８は液体ボトル３４に保持される液体の液面より上方に設けられる。４１は開口端に設けられたメッシュサイズ０．２２μｍのフィルタであり恒温槽３２内の外気に開放している。【００４４】
第１細胞開閉弁４０は２分岐されて、一方は共通管４２に接続され（共通管４２については後述する）、もう一方は第１ガス開閉弁４３へと通じる２分岐に接続される。第１ガス開閉弁４３には加湿ボトル４４が接続され、加湿ボトル４４にはメッシュサイズ０．２２μｍのフィルタ４５が接続され、圧力制御弁４６の上流にはＣＯ２とＯ２含む混合ガスボンベ４７が接続されている。なお、ＣＯ２ガスは、最適ガス濃度で加圧されている。【００４５】
細胞培養中の液体培地はｐＨ値が径時的に変化することを防止するため、定期的にＣＯ２ガスで液体培地の表面よりガス交換を行う必要がある。加えて液体培地の蒸発による液体培地成分の濃縮を防止する必要がある。ボンベ４７より導出したＣＯ２ガスは加湿ボトル４４において最適湿度に加湿され待機される。【００４６】
第１ガス開閉弁４３へと通じる２分岐のもう一方の供給管３７は、第１ポンプ４８における吸引口と第２ガス開閉弁４９に２分岐される。第１ポンプ４８における吐出口と第２ガス開閉弁４９は統合されて排出管５０となる。即ち第２ガス開閉弁４９は、第１ポンプ４８のバイパスの役割をする。ここで、ポンプの吸引口から細胞ボトルの間の送液用の管は供給管とし、ポンプの吐出口から細胞培養を行う受容器の間の送液用の管は排出管とする。【００４７】
排出管５０の２分岐された一端は、第１排気開閉弁５１を介してフィルタ５２が接続され、フィルタ５２のもう一方の接続口は大気に解放されている。排出管５０のもう一端には、図４において説明した光センサ２１の構造である第１液面センサ５３が設けられており、第１の細胞懸濁液が所望の液量となる分岐点３８から計算された距離に設置される。次いで排出管５０は多分岐部５４で分岐され、第１培養容器５５用の第１容器開閉弁５６と、第２培養容器５７用の第１容器開閉弁５８に接続される。第１培養容器５５と第２培養容器５７の両者は同じ構成であるので、以下第１培養容器５５を用いて説明する。【００４８】
第１培養容器５５は、外観が本体部５９とふた部６０からなる気密な容器であり、内観は本体部５９の内底部に細胞を保持して培養可能な第２容器６１と、細胞を保持して培養可能な第１容器６２を保持できる。【００４９】
第１容器６２の培養面は物質透過膜からなり第２容器６１で培養する栄養細胞から産生される成長因子のみを透過して、第１容器で培養する細胞の成育を促進させる培養方法（共培養）を実施する培養容器である。ふた部６０には４つの貫通するポートが設けられており、６３は第１容器６２に液体を添加する第１ポートであり、６４は第１容器６２の底面近傍に接し液体を排出する第２ポートであり、６５は第２容器６１に液体を添加する第３ポートであり、６６は第２容器６１の底面近傍に接し液体を排出する第４ポートである。【００５０】
排出管５０は第１容器開閉弁５６を介して、第１ポート６３に接続されており、即ち第１細胞ボトル３４の細胞懸濁液は第１ポンプ４８の作用によって、第１培養容器５５または第２培養容器５７における第１容器６２に送液される配管の構成である。【００５１】
６７は第２の細胞懸濁液を保持する第２細胞ボトルである。ふた、気圧調整のための管路、フィルタおよび供給管６８は、第１細胞ボトル３４と同じであり省略する。同様に、供給管６８と分岐点６９、第２気体導入弁７０、第２細胞開閉弁７１の接続構成も同様である。【００５２】
第２細胞開閉弁７１を介して供給管６８は２分岐されて、一方は共通管４２に接続され、もう一方は第２ポンプ７２における吸引口に接続される。第２ポンプ７２の吐出口より延長する排出管７３は２分岐され、一方は第２排気開閉弁７４を介してフィルタ５２に接続され、排出管７３のもう一端には、第２液面センサ７５が設けられており、第２の細胞懸濁液が所望の液量となる分岐点６９から計算された距離に設置される。【００５３】
次いで排出管７３は多分岐部７６で分岐され、第１培養容器５５用の第２容器開閉弁７７と、第２培養容器５７用の第２容器開閉弁７８に接続される。第２容器開閉弁７７は第２容器６１に液体を添加する第３ポートに接続される。即ち第２細胞ボトル６７の細胞懸濁液は第２ポンプ７２の作用によって、第１培養容器５５または第２培養容器５７における第２容器６１に送液される配管の構成である。【００５４】
９５は交換用の液体培地を保持する培地ボトルであり、冷蔵庫３３内に保持される。ふた、気圧調整のための管路、フィルタおよび供給管９６は、第１細胞ボトル３４と同様のものである。同様に、供給管９６と分岐点９７、第３気体導入弁９８の接続構成も同様である。９９は第５ポンプであり、吸引口は供給管９６と接続されている。１００は交換用の液体培地を必要量だけ保持する培地予熱ボトルであり第５ポンプ９９の吐出口と分岐を介して、供給管１０１によって接続される。培地予熱ボトル１００は恒温槽３２の内部に保持される。即ち培地ボトル９５の液体培地は第５ポンプの作用によって、培地予熱ボトル１００に送液される配管の構成である。【００５５】
培地予熱ボトル１００に保持された液体培地は、ふた、気圧調整のための管路、フィルタおよび供給管１０１は、第１細胞ボトル３４と同じであり説明は省略する。同様に、供給管１０１と分岐点１０２、第４気体導入弁１０３、培地開閉弁１０４の接続構成も同様である。供給管１０１は共通管４２に接続されて分岐され、一方は第１細胞ボトル３４から延長する供給管３７と第１細胞開閉弁４０を介して接続され、もう一方は第２細胞ボトル６７から延長する供給管６８と第２細胞開閉弁７１を介して接続される。【００５６】
即ち、共通管４２は第１細胞開閉弁４０と第２細胞開閉弁７１と培地開閉弁１０４の３つの開閉弁に接続されている。第１ポンプ４８が作用するとき、第１細胞開閉弁４０だけが開放されていれば、第１細胞ボトル３４の液体を第１培養容器５５または第２培養容器５７における第１容器６２に送液し、第２ポンプが作用するとき、第２細胞開閉弁７１だけが開放されていれば、第２細胞ボトル６７の液体を第１培養容器５５または第２培養容器５７における第２容器６１に送液し、第１ポンプ４８が作用するとき、培地開閉弁１０４だけが開放されていれば、培地予熱ボトル１００に保持された液体培地を第１培養容器５５または第２培養容器５７における第１容器６２に送液し、第２ポンプが作用するとき培地開閉弁１０４だけが開放されていれば、培地予熱ボトル１００に保持された液体培地を、第１培養容器５５または第２培養容器５７における第２容器６１に送液する配管の構成である。【００５７】
図５において分岐点３８、分岐点６９、分岐点１０２と第１液面センサ５３、第２液面センサ７５の間は、第１ポンプ４８及び第２ポンプ７２と、その他の分岐から繋がる配管が有する体積を考慮する向きもある。しかしながらその他の分岐の延長上に電磁弁が設けられ閉止されていれば、実質的な液体の流れは発生しないため、送液量を規定する液面センサの距離は、通過すべき液体の分岐点と液面センサの最短距離を考慮すればよい。【００５８】
第１培養容器５５または第２培養容器５７より、保持されている液体を排出する構成を説明する。７９は第１排液ボトルであり、排液管８０が気密に接続されている。排液管８０は第１排出弁８１を介して第３ポンプ８２の吐出口に接続されている。第３ポンプ８２の吸引口には多分岐部８３によって分岐され、第１培養容器５５用の第１容器排出弁８４と、第２培養容器５７用の第１容器排出弁８５に接続される。第１容器排出弁８４は第１培養容器５５における第２ポート６４に接続される。即ち第１排液ボトル７９は第３ポンプ８２の作用によって、第１培養容器５５または第２培養容器５７における第１容器６２より液体が排出される配管の構成である。【００５９】
８６は第２排液ボトルであり、排液管８７が気密に接続されている。排液管８７は第２排出弁８８を介して第４ポンプ８９の吐出口に接続されている。第４ポンプ８９の吸引口には多分岐部９０によって分岐され、第１培養容器５５用の第２容器排出弁９１と、第２培養容器５７用の第２容器排出弁９２に接続される。第２容器排出弁９１は第１培養容器５５における第４ポート６６に接続される。即ち第２排液ボトル８５は第４ポンプ８９の作用によって、第１培養容器５５または第２培養容器５７における第２容器５９より液体が排出される配管の構成である。
＜細胞培養の操作、観察操作＞
図６は、図示しないコントローラで制御される細胞培養装置における細胞培養、観察の全体的な操作のフローチャートを示している。まず、培養容器の第１容器６２に細胞播種（第１細胞添加）を行い（Ｓ０１）、第２容器６１に細胞播種（第２細胞添加）を行う（Ｓ０２）。複数の細胞培養を行うときは、上記の操作を繰り返す。さらに、細胞培養容器にＣＯ２ガスを充填したのち（Ｓ０３）、培養・静置し（Ｓ０４）、顕微鏡による観察を行い（Ｓ０５）、液体培地の交換を開始するかの判定を行う（Ｓ０６）。液体培地の交換に当たっては、培地予熱ボトルへの送液（Ｓ０７）の後、第１容器培地排出（Ｓ０８）、第１容器培地添加（Ｓ０９）、第２容器培地排出（Ｓ１０）、第２容器培地添加（Ｓ１１）を行い、さらに、細胞培養容器にＣＯ２ガスを充填したのち（Ｓ１２）、培養・静置し（Ｓ１３）、顕微鏡による観察を行い（Ｓ１４）、細胞培養が終了したか否かの判定を行う（Ｓ１５）。細胞培養が終了したら、培養した細胞の取り出しを行う（Ｓ１６）。【００６０】
図７Ａ、７Ｂは、図示しないコントローラで制御される、第１培養容器５５における送液・送気のタイムチャートを表している。横軸は操作項目と時間軸を示し、縦方向には図５で明示した第１気体導入弁３９から培地開閉弁１０４の１９台の電磁弁、および第１ポンプ４８から第５ポンプ９９の５台のローラーポンプ、および第１液面センサ５３、第２液面センサ７５の動作タイミングを示している。初期状態では全ての弁がＯＦＦであるので閉止であり、全てのポンプがＯＦＦであるので、送液停止の状態である。なお、図示の都合上、図７Ａと７ＢとはＡ−Ａ’で分けて表示しているが、横軸の時間軸は図７Ａから７Ｂへ繋がっているものとする。【００６１】
細胞培養容器５５内の第１容器６２に細胞播種を行うとき（図６のＳ０１）は、第１細胞添加の動作に従う。初期状態から第１細胞開閉弁４０と、第１容器開閉弁５６と第２容器開閉弁７７と第２排気開閉弁７４をＯＮとし、これらの弁を開放すると、第１細胞ボトル３４から第１細胞開閉弁４０と第１容器開閉弁５６が通じて、第１ポート６３までの流路が通じる。また外気に連通するフィルタ５２から第２排気開閉弁７４と第２容器開閉弁７７が通じて、外気と接続されたフィルタから第３ポート６５までの管路が通じる。次いで第１ポンプ４８を所定時間ＯＮすると、第１細胞ボトル３４から細胞懸濁液の送液が開始され、第１液面センサ５３に細胞液懸濁液の先端が到達する。第１液面センサ５３より液面検出信号が出力されると、第１ポンプ４８の送液を停止する。次いで、第１気体導入弁３９を開放すると、供給管３７内に後端が分岐点３８、先端が第１液面センサ５３となる定量された細胞液懸濁液が作成される。続いて第１ポンプ４８の送液を開始すると、第１容器開閉弁５６を通じて細胞培養容器５５の第１ポート６３より、細胞液懸濁液が送液される。このとき第３ポート６５は外気に通じているので、細胞培養容器５５の内部の圧力は常圧に調整される。所定量の注入が為された後、第１ポンプ４８を停止し、開放されている各弁をＯＦＦとして閉止して送液を終了する。【００６２】
細胞培養容器が複数ある時は、予め第１細胞ボトル３４には複数の細胞培養容器に分配できる量の細胞懸濁液を保持し、上記の操作において第１容器開閉弁５６を閉止して、図５における第１容器開閉弁５８を開放し、第２容器開閉弁７７を閉止して、図５における第２容器開閉弁７８を開放して、上記動作を行えば、細胞培養容器５７に第１容器６２に細胞液懸濁液が同量送液される。【００６３】
次いで、細胞培養容器５５内の第２容器６１に細胞播種を行うとき（図６のＳ０２）は、第２細胞添加の動作に従う。初期状態から第２細胞開閉弁７１と、第１容器開閉弁５６と第２容器開閉弁７７と第１排気開閉弁５１をＯＮとし、これらの弁を開放すると、第２細胞ボトル６７から第２細胞開閉弁７１と第２容器開閉弁７７が通じて、第３ポート６５までの流路が通じる。また外気に連通するフィルタ５２から第１排気開閉弁５１と第１容器開閉弁５６が通じて、外気と接続されたフィルタから第１ポート６３までの管路が通じる。次いで第２ポンプ７２を所定時間ＯＮすると、第２細胞ボトル６７から細胞懸濁液の送液が開始され、第２液面センサ７５に細胞液懸濁液の先端が到達する。第２液面センサ７５より液面検出信号が出力されると、第２ポンプ７２の送液を停止する。次いで、第２気体導入弁７０を開放すると、供給管６８内に後端が分岐点６９、先端が第２液面センサ７５となる定量された細胞液懸濁液が作成される。続いて第２ポンプ７２の送液を開始すると、第２容器開閉弁７７を通じて細胞培養容器５５の第３ポート６５より、細胞液懸濁液が送液される。このとき第１ポート６３は外気に通じているので、細胞培養容器５５の内部の圧力は常圧に調整される。所定量の注入が為された後、第２ポンプ７２を停止し、開放されている各弁をＯＦＦとして閉止して送液を終了する。【００６４】
細胞培養容器が複数ある時は、予め第２細胞ボトル６７には複数の細胞培養容器に分配できる量の細胞懸濁液を保持し、上記の操作において第２容器開閉弁７７を閉止して、図５における第２容器開閉弁７８を開放し、第１容器開閉弁５６を閉止して、図５における第２容器開閉弁５８を開放して、上記動作を行えば、細胞培養容器５７の第２容器６１に細胞液懸濁液が同量送液される。【００６５】
次に細胞培養容器５５の内部をＣＯ２ガスで満たすとき（Ｓ０３）は、ＣＯ２ガス充填の操作に従う。初期状態から第１容器開閉弁５６と第２容器開閉弁７７と第２ガス開閉弁４９と第２排気開閉弁７４をＯＮとして各弁を開放すると、第１ガス開閉弁４３と第１容器開閉弁５６が通じて第１ポート６３までの流路が通じる。またフィルタ５２から第２排気開閉弁７４と第１容器開閉弁７７が通じて、第３ポート６５までの流路が通じる。次いで第１ガス開閉弁４３を所定時間ＯＮすると、ボンベ４７より加湿ボトル４４を通じて、第１容器開閉弁５６から第１ポート６３を経て細胞培養容器５５に最適に加湿されたＣＯ２ガスが到達する。細胞培養容器５５は密閉されているが、第３ポート６５から外気に通じるフィルタ５２までが開放されているので、細胞容器の内部の圧力は外気圧と調整された圧となる。所定量のＣＯ２ガスの注入が為された後、まず第１ガス開閉弁４３を閉止し、次いで第２ガス開閉弁４９を閉止し、培養容器内の圧力が大気圧と同等となった時、他の弁を閉止する。【００６６】
細胞培養容器が複数ある時は、上記の操作において第２容器開閉弁７７を閉止して、図５における第２容器開閉弁７８を開放し、第１容器開閉弁５６を閉止して、図５における第２容器開閉弁５８を開放して、上記動作を行えば、細胞培養容器５７にＣＯ２ガスが充填される。【００６７】
細胞培養は、第１細胞懸濁液が第１容器６２に保持され、第２細胞懸濁液が第２容器６１に保持され、細胞培養容器５５の内部空間が最適に加湿されたＣＯ２ガスで保持され、細胞培養容器５５が最適な培養温度に保持されているので、所定時間静置して保持することによって細胞培養が継続される（Ｓ０４）。なお、細胞懸濁液の細胞は第１容器６２の物質透過膜の上部、あるいは第２容器６１の内底面に接着して増殖するので、培養に伴い成分変化した液体培地は細胞と分離して排出できる。【００６８】
細胞培養中の細胞観察（Ｓ０５）は、培養静置の操作中に図示しない顕微観察ユニットを用いて実施する。顕微観察には位相差顕微鏡が好適であるが、倒立型などの光学顕微鏡であってもよい。撮像機能があればより培養中の細胞観察経過を記録でき細胞培養をより好適に実施できる。【００６９】
次に、細胞培養容器より液体培地の交換を行うとき（Ｓ０６）は、図６の動作タイムチャートにおける、培地予熱の送液と第１容器培地排出と第１容器培地培地添加、第２容器培地排出、第２容器培地添加の操作に従う。
液体培地を予熱するための培地予熱の送液を行うとき（Ｓ０７）は、初期状態において第５ポンプ９９を介して培地ボトル９５から培地予熱ボトル１００は通じている。培地予熱ボトル１００はふたから外気に通じるフィルタが接続されている。よって第５ポンプ９９を目的量および分岐点９７から培地ボトル９５における供給管９６の体積を加えた総送液量に相応するポンプ稼働時間を与えて送液を開始する。所定時間経過後、第３気体導入弁９８を開放すると、分岐点９７より下流の液体培地は培地ボトル９５に戻り、供給管９６内に後端が分岐点９７、先端が培地予熱ボトル１００となる定量された液体培地が作成される。続いて第５ポンプ９９の送液を開始すると、培地予熱ボトル１００内に液体培地が送液される。このとき培地予熱ボトル１００は外気に通じているので、培地予熱ボトル１００の内部の圧力は常圧に調整される。所定量の注入が為された後、第５ポンプ９９を停止し、開放されている各弁をＯＦＦとして閉止して送液を終了する。【００７０】
細胞培養容器が複数ある時は、予め培地予熱ボトル１００には複数の細胞培養容器に分配できる量の液体培地を保持するように、ポンプの送液量を調整する。また、細胞培養における培地の交換回数が複数予定されているときは、細胞培養容器が複数あるときに必要な液体培地量に培地の交換回数を掛け合わせた液体培地を送液できる量の液体培地を培地ボトルに保持しておけば、複数の細胞培養容器に、複数の培地の交換が可能である。【００７１】
細胞培養容器５５内の第１容器６２より培地排出を行うとき（Ｓ０８）は、図７の動作タイムチャートにおける第１容器培地排出動作に従う。初期状態から第１容器開閉弁５６と第１排気開閉弁５１をＯＮと、第１容器排出弁８４と第１排出弁８１とこれらの弁を開放すると、外気に連通するフィルタ５２から第１排気開閉弁５１と第１容器開閉弁５６が通じて、外気と接続されたフィルタから第１ポート６３までの管路が通じる。また第１排液ボトル７９から第１排出弁８１と第１容器排出弁８４が第３ポンプ８２を介して第２ポート６４までの流路が通じる。次いで第３ポンプ８２を細胞培養容器５５の第１容器６２に保持された液体量を排出するための排出時間を与えて所定時間ＯＮすると、第１容器６２から液体培地を吸引し送液が開始され、第１排液ボトル７９に到達する。このとき第１ポート６３は外気に通じているので、細胞培養容器５５の内部の圧力は常圧に調整される。所定量の排出が為された後、第３ポンプ８２を停止し、開放されている各弁をＯＦＦとして閉止して送液を終了する。【００７２】
細胞培養容器が複数ある時は、上記の操作において第１容器開閉弁５６を閉止して、図５における第１容器開閉弁５８を開放し、第１容器排出弁８４を閉止して、図５における第１容器排出弁８５を開放して、上記動作を行えば、細胞培養容器５７における第１容器６１より液体培地が排液される。【００７３】
第１容器６２に液体培地の添加を行うとき（Ｓ０９）は、第１容器培地添加の動作に従う。初期状態から培地開閉弁１０４と、第１容器開閉弁５６と第２容器開閉弁７７と第２排気開閉弁７４をＯＮとし、これらの弁を開放すると、培地予熱ボトル１００から培地開閉弁１０４と第１容器開閉弁５６が通じて、第１ポート６３までの流路が通じる。また外気に連通するフィルタ５２から第２排気開閉弁７４と第２容器開閉弁７７が通じて、外気と接続されたフィルタから第３ポート６５までの管路が通じる。次いで第１ポンプ４８を所定時間ＯＮすると、予熱ボトル１００から液体培地の送液が開始され、第１液面センサ５３に液体培地の先端が到達する。第１液面センサ５３より液面検出信号が出力されると、第１ポンプ４８の送液を停止する。次いで、第４気体導入弁１０３を開放すると、供給管１０１内に後端が分岐点１０２、先端が第１液面センサ５３となる定量された液体培地が作成される。続いて第１ポンプ４８の送液を開始すると、第１容器開閉弁５６を通じて細胞培養容器５５の第１ポート６３より、液体培地が送液される。このとき第３ポート６５は外気に通じているので、細胞培養容器５５の内部の圧力は常圧に調整される。所定量の注入が為された後、第１ポンプ４８を停止し、開放されている各弁をＯＦＦとして閉止して送液を終了する。【００７４】
細胞培養容器が複数ある時は、予め培地予熱ボトル１００には複数の細胞培養容器に分配できる量の液体培地を保持し、上記の操作において第１容器開閉弁５６を閉止して、図５における第１容器開閉弁５８を開放し、第２容器開閉弁７７を閉止して、図５における第２容器開閉弁７８を開放して、上記動作を行えば、細胞培養容器５７における第１容器６２に液体培地が同量送液される。【００７５】
細胞培養容器５５内の第２容器６１より培地排出を行うとき（Ｓ１０）は、図６の動作タイムチャートにおける第２容器培地排出動作に従う。初期状態から第１容器開閉弁５６と第１排気開閉弁５１をＯＮと、第２容器排出弁８８と第２排出弁９１とこれらの弁を開放すると、外気に連通するフィルタ５２から第１排気開閉弁５１と第１容器開閉弁５６が通じて、外気と接続されたフィルタから第１ポート６３までの管路が通じる。また第２排液ボトル８６から第２排出弁８８と第２容器排出弁９１が第４ポンプ８９を介して第３ポート６６までの流路が通じる。次いで第４ポンプ８９を細胞培養容器５５の第２容器６１に保持された液体量を排出するための排出時間を与えて所定時間ＯＮすると、第２容器６１から液体培地を吸引し送液が開始され、第２排液ボトル８６に到達する。このとき第１ポート６３は外気に通じているので、細胞培養容器５５の内部の圧力は常圧に調整される。所定量の排出が為された後、第４ポンプ８９を停止し、開放されている各弁をＯＦＦとして閉止して送液を終了する。【００７６】
細胞培養容器が複数ある時は、上記の操作において第１容器開閉弁５６を閉止して、図５における第１容器開閉弁５８を開放し、第２容器排出弁９１を閉止して、図５における第２容器排出弁９２を開放して、上記動作を行えば、細胞培養容器５７における第２容器６１より液体培地が排液される。【００７７】
第２容器６１に液体培地の添加を行うとき（Ｓ１１）は、第２容器培地添加の動作に従う。初期状態から培地開閉弁１０４と、第１容器開閉弁５６と第２容器開閉弁７７と第１排気開閉弁５１をＯＮとし、これらの弁を開放すると、培地予熱ボトル１００から培地開閉弁１０４と第２容器開閉弁７７が通じて、第３ポート６５までの流路が通じる。また外気に連通するフィルタ５２から第１排気開閉弁５１と第１容器開閉弁５６が通じて、外気と接続されたフィルタから第１ポート６３までの管路が通じる。次いで第２ポンプ７２を所定時間ＯＮすると、予熱ボトル１００から液体培地の送液が開始され、第２液面センサ７５に液体培地の先端が到達する。第２液面センサ７５より液面検出信号が出力されると、第２ポンプ７２の送液を停止する。次いで、第４気体導入弁１０３を開放すると、供給管１０２内に後端が分岐点１０２、先端が第２液面センサ７５となる定量された液体培地が作成される。続いて第２ポンプ７２の送液を開始すると、第２容器開閉弁７７を通じて細胞培養容器５５の第３ポート６５より、液体培地が送液される。このとき第１ポート６３は外気に通じているので、細胞培養容器５５の内部の圧力は常圧に調整される。所定量の注入が為された後、第２ポンプ７２を停止し、開放されている各弁をＯＦＦとして閉止して送液を終了する。【００７８】
細胞培養容器が複数ある時は、予め培地予熱ボトル１００には複数の細胞培養容器に分配できる量の液体培地を保持し、上記の操作において第２容器開閉弁７７を閉止して、図５における第２容器開閉弁７８を開放し、第１容器開閉弁５６を閉止して、図５における第１容器開閉弁５８を開放して、上記動作を行えば、細胞培養容器５７における第２容器６２に液体培地が同量送液される。【００７９】
次いで、細胞培養容器５５には大気が満たされているので、ＣＯ２ガスで満たすために、ＣＯ２ガス充填の操作（Ｓ１２）を上記に従って行う。【００８０】
細胞培養容器が複数ある時は、上記の操作において第１容器開閉弁５６を閉止して、図５における第１容器開閉弁５８を開放し、第２容器開閉弁７７を閉止して、図５における第２容器開閉弁７８を開放して、上記動作を行えば、細胞培養容器５７にＣＯ２ガスが充填される。【００８１】
以下に第１の実施例の細胞培養装置および送液装置を用いた、角膜上皮細胞培養による角膜上皮組織作製方法の具体例、およびその結果について説明する。
＜細胞培養装置および送液装置の構成＞
恒温槽には恒温培養器（東洋製作所社、型番ＴＶＨＡ６０ＷＡ１２Ａ）を使用し、庫内温度を３７°Ｃで運用し、冷蔵部には電子冷熱低温恒温器（東洋製作所社、型番ＴＨＳ０３０ＰＡ）を使用し、庫内温度を４°Ｃで運用した。【００８２】
電磁弁にはピンチバルブ（流体圧力０．１５ ＭＰａ，高砂電気工業社，型番ＰＳＫ−１６１５ＮＣ−９）を使用した。本電磁弁に対応する供給管にはシリコンゴムチューブ（内径１／１６インチ，外径１／８インチ  サンゴバン社，型番３３５０）を使用した。各ポンプにはチューブポンプ（吐出/吸入圧力  ＋／−０．１ＭＰａ, ウェルコ社，型番ＤＳＷ２−Ｓ１ＡＡ−ＷＰ）としごき用チューブとしてシリコンゴムチューブ（内径１／１６インチ，外径１／８インチ  サンゴバン社，型番３３５５Ｌ）を組み合わせて使用した。本品はローラー部が本体のモータ部から着脱可能であるので、１３ｃｍ長のシリコンゴムチューブをローラー部に巻きつけた状態で滅菌操作が可能である。本ポンプの流量は、ＤＣ１２Ｖ入力において、実測より０．１５ｍＬ/秒であり、最大１％相当量のばらつきを持っていた。【００８３】
細胞ボトルおよび培地予熱ボトルにはクローズドシステム  遠沈管（容量５０ｍＬ、コーニング社，型番＃１１７０５）を使用した。本品は予め滅菌された、容器部とふた部と、ふた部に設けられた気圧調整のための管路と、メッシュサイズ０．２２μｍのフィルタから成る。【００８４】
培地ボトルにはクローズドシステム三角フラスコ（容量１Ｌ、コーニング社，型番＃１１４４０）を採用した。本品は予め滅菌された、供給管（内径１／８インチ）、容器部とふた部と、ふた部に設けられた気圧調整のための管路と、メッシュサイズ０．２２μｍのフィルタから成る。【００８５】
排液ボトルにはＦｌｅｘｂｏｙバッグ（容量１Ｌ，ザルトリウス社，型番＃ＦＦＢ１０３５４７）を使用した。【００８６】
加湿ボトルには，ガス洗浄瓶（容量５００ ｍＬ，アズワン社，型番６−１２９−０２）と、ガス交換部にはケラミフィルター（フィルタサイズ１５×１５ｍｍ，アズワン社，型番２−５５４−１０）を組み合わせて使用した。【００８７】
気体導入弁あるいは加湿ボトルの外気に接するフィルタにはミディザルト２０００（メッシュサイズ０．２２μｍ、ザルトリウス社，型番＃１７８０５−Ｅ）を使用した。【００８８】
電磁弁およびポンプ部以外のチューブには材質が塩化ビニルであるタイゴンＳ−５０−ＨＬ（内径１／１６インチ，外径１／８インチ、サンゴバン社，型番６３０１０−３９０）を使用した。チューブの分岐、および接合部にはＳＭＣカップリング（ＣＰＣ社）シリーズを使用した。詳細には２分岐接合にＹ  Ｆｉｔｔｉｎｇ（接合径１／１６インチ、型番＃ＨＹ２９１）、直線連結にはＳｔｒａｉｇｈｔ  Ｆｉｔｔｉｎｇ（接合径１／１６インチ、型番＃ＨＳ２９１）を使用した。【００８９】
液面には液面センサ（１６光軸、キーエンス社、型番ＦＵ−９５Ｓ）および信号処理部アンプ（キーエンス社、型番ＦＳ−Ｎ１１ＭＮ）を接続して使用した。【００９０】
送液装置の構成について細胞培養容器における容器１への細胞懸濁液の送液工程より説明する。第１細胞ボトル３４には１０ｃｍ長の供給管（内径３．７ｍｍ）が設けられており、この供給管と分岐点３８の間は、２０ｃｍ長のシリコンゴムチューブ（内径１／１６インチ、１．５８ｍｍとする。以下同じ）で接続した。分岐点３８と第１ポンプ４８の吸引口までは１５ｃｍ長のシリコンゴムチューブで接続し、第１ポンプ４８内のしごき用チューブは１３ｃｍ長のシリコンゴムチューブで接続した。第１ポンプ４８の吐出口より多分岐部５４までは８０ｃｍ長のタイゴンＳ−５０−ＨＬチューブで接続し、うち第１ポンプ４８の吸引口より５０ｃｍの距離が液面センサ５３の検出部中心となるよう、液面センサ５３を設置し、細胞懸濁液１．５０ｍＬの送液量の構成とした。【００９１】
上記の細胞懸濁液の送液量は以下のように定めた。供給管と分岐点３８の間の管内体積は気体導入時に、液体ボトルに戻る最大液量である。これは実測から求めた結果１.０８８ｍＬであった。分岐点３８から液面センサの設置距離における管内体積は目的送液量に相当する。図８は本送液装置の送液量データである。実測値とは、第１ポンプ４８と多分岐部５４までの排出管５０における８０ｃｍ長のシリコンゴムチューブのうち、液面センサを１０ｃｍずつ延長したときの液体培地の送液量（各測定数１０回の平均値）であり、液体ボトルの保持液量は４０ｍＬから開始して、測定数に対して保持液量が減量してもそのまま測定を行った。一方で計算値とは、分岐点３８からポンプ吐出口までのチューブ長２８ｃｍ（１３ｃｍ＋１５ｃｍ）と、ポンプ吐出口から多分岐部までのチューブ長８０ｃｍの管内体積より計算される送液量である。【００９２】
その結果、実測値では液面センサの設置距離に対して送液量は相関しており、各測定数１０回の標準偏差はごく小さく、標準偏差値を測定平均値で割った値はいずれも０．３〜０．５％であった。また実測値は計算値に対してよく一致している。計算値より逆算される１．５０ｍＬの送液量は、液面センサの設置距離で５０.０ｃｍに相当したが、これを目安に液面センサの設置距離を最適化したところ５０.０ｃｍであるとき、最も目標値に近い実測値が再現性よく得られた。【００９３】
同様に、細胞培養容器における容器２への細胞懸濁液の送液目標値は、２ｍＬであったが、液面センサの設置距離を最適化したところ７４.０ｃｍであるとき、最も目標値に近い実測値が再現性よく得られた。【００９４】
この場合の送液時間に関して、第１ポンプの送液時間には３０秒を設定したところ、平均２０．４秒で液面センサに液体先端が到達し、自動的にポンプ停止がなされた。即時に気体導入弁３９を開放したのち、培養容器までの第１ポンプの送液時間として６０秒を設定したところ、約３２秒で容器１に全量到達した。
＜閉鎖系細胞培養容器の作製方法＞
図５に示した細胞培養容器のうち本体部５９、ふた部６０、第１ポート６３〜第４ポート６６はポリカーボネートを材料として射出成形により作製した。第１容器には、セルカルチャインサート（６ウェル）型番  ３５３０９０，ＢＤ社を使用し、物質透過膜９に温度応答性高分子モノマーであるN-イソプロピルアクリルアミドを電子線重合させることで、温度応答性培養表面を作製した。第２容器には３５ｍｍ細胞培養表面処理ディッシュ、型番４３０１６５、コーニング社を使用した。【００９５】
以上の構成部品を安全キャビネット内で無菌的に組み立て、細胞培養容器を作成した。次いで、細胞培養容器を滅菌バックに入れて封止した後、エチレンオキサイドガス滅菌器（型番ＥＣ−８００、サクラ精機社）庫内に設置して、装置取り扱い手順に従って滅菌処理を行った。
＜角膜上皮細胞の準備＞
角膜上皮細胞の培養方法について説明する。角膜上皮細胞を培養する前日に、フィーダー細胞として、マイトマイシンＣ（１０μｇ／ｍｌ）で３７°Ｃ、２時間処理したＮＩＨ−３Ｔ３細胞を２×１０４／ｃｍ２となるように培地で懸濁して、第２細胞ボトル６７に保持した。角膜上皮細胞はフナコシ社より購入したウサギ眼球の角膜輪部から常法に従って角膜上皮細胞を採取し、４×１０４／ｃｍ２となるように培地で懸濁して、第１細胞ボトル３４に保持した。上記を含め培地には、５％ＦＢＳを含むＫＣＭ培地を使用した。交換用培地はおなじくＫＣＭ培地５００ｍＬを培地ボトル９５に保持し、冷蔵庫３３に設置した。
＜角膜上皮細胞の培養開始＞
ＣＰＣ内に設置して内部を３７°Ｃに恒温保持を開始した細胞培養装置３１の内部に、上記準備した細胞培養容器を１０個設置した。各々の電磁弁と細胞培養容器をゴムチューブで接続したのち、自動培養操作を開始した。上層への送液量は１．５ｍＬ、下層への送液量は２.０ｍＬである。培地の送液量もこれと同様である。排出時は全量排出する目的から、上層からの排出量は３ｍＬ、下層からの排出量は４ｍＬとした。ＣＯ２ガスは湿度９５％Ｈに制御し、その送気量は送気流量０.１Ｌ／分であり、細胞培養容器の内容積２０ｃｍ３より、過剰に注入することとし電磁弁開放時間を１分（１００ｍＬ）とした。以上の動作タイムチャートは図６の概要に従った。【００９６】
培地の交換は、培養開始日より５日目、７日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目、１６日目に各１回実施した。ＣＯ２ガスの送気は１日に６回、４時間ごとに実施した。顕微鏡観察は５日目より、毎日１回、各細胞培養容器の第１細胞と第２細胞を各々１０エリア取得し、細胞育成状態の判断データとした。
＜角膜上皮組織の回収方法＞
培養１６日目において培地交換操作の後、細胞培養を終了し、上記に従って細胞培養容器を取り出した。安全キャビネット内に細胞培養容器を置き、室温（約２５°Ｃ）で３０分静置した。上記に従って第１容器を取り出し、その後、支持膜として、ドーナツ状にカットした親水性ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社製）を用いて、シート状の細胞を物質透過膜の表面より剥離回収した。
＜対照実験方法＞
培養皿として２インチ×３インチのプレートに６ウェル（ウェル内径３５ｍｍ）が構成されたセルカルチャインサートコンパニオンプレート、型番３５３５０２、ＢＤ社を使用し、上層容器には上記と同じものを使用した。温度環境およびＣＯ２ガス環境は、ＣＯ２インキュベータ、型番ＭＣＯ１９−ＡＩＣ、三洋電機社を使用し、３７°Ｃ設定、湿度９３％Ｈ設定、ＣＯ２濃度５％設定により、細胞培養を実施した。対照とした細胞は上記と同じものを使用した。【００９７】
細胞播種および培地交換は手操作により実施し、滅菌された分注器（ピペットマン，ＧＩＬＳＯＮ社、型番  Ｐ５０００）を使用して上記と同じ液量を添加した。培地の交換頻度および間隔は上記実施例と同じとし、ＣＯ２ガスの制御は培養を通して同じ設定とした。なお、培地交換時はコンパニオンプレートを３７°Ｃのホットプレート上に設置して作業実施して温度維持を図った。
＜培養実験結果＞
本実施例の細胞培養容器で作製した角膜上皮組織は、１０個のシート状細胞とも同等の大きさ、厚みを有しており、安定した剥離回収が可能であった。育成過程の顕微鏡画像の比較においても、１０個の細胞の育成に有意差はなかった。一方、対照実験により実施して回収された培養細胞とも形状としては同等であった。【００９８】
角膜上皮組織の切片を作成しヘマトキシリン―エオジン染色、および免疫組織染色によって培養細胞を観察した結果、本実施例群、対照実験群とも上皮細胞に発現するＣＫタンパク質ファミリは、全ての細胞で発現していた。分化した角膜上皮細胞に発現するＣＫ３は、基底層以外での細胞で発現し、上皮組織のバリア機能に必要な閉鎖結合タンパクであるクローディン１は、最表層に発現しており、これも２群において有意差は無かった。よって、本装置は手操作で使用する分注器と同等の送液精度を有すると考えられる。【００９９】
以上、本実施例１に記載の送液装置によれば第１の課題である、送液元の液体ボトルにおける液量変化に対する液面位置の影響が回避される。また、第２の課題である、戻り液の液面位置の影響を回避される。その理由は、液面位置が送液元の液体ボトルのいずれの位置であっても、ポンプ送液を行うことによって、液面の位置は送液管内を移動してやがて液面センサの位置で停止して既知の位置となる。送液量は管の断面積と目的の送液量に応じて分岐点９から計算された距離に設置された液面センサ２１の距離の積による管理された体積に等しく、気体導入時に後端が分岐点、先端が液面センサとなる液体であるからである。【０１００】
加えて第３の課題であるゴムチューブの長さ等の影響によるポンプ流量の変化を回避することが出来る。その理由は、送液量をポンプの流量から計算される時間制御で規定するのではなく、送液量は管の断面積と目的の送液量に応じて分岐点９から計算された距離に設置された液面センサ２１の距離の積による管理された体積に等しく、気体導入時に後端が分岐点、先端が液面センサとなる液体であるからである。【０１０１】
よって、本送液装置を備えた細胞培養装置によれば、管路内部には液体培地または細胞懸濁液などの液体を通過させたのち、培養容器の方向の管路に気体を通過させることで、管路内の液体培地を空にして、さらに液体培地等を保持する液体ボトルの方向にも気体を通過させるので、管路内に液体培地などの液体を保留せず、管路内を閉塞しない。また目的送液量に対する送液誤差が小さく、かつ繰返し送液量のばらつきが小さいので、複数の容器に対する送液量を一定にできる。よって細胞懸濁液を複数の培養容器に一定量で添加できるので、細胞培養の再現性が向上する。
【実施例２】
【０１０２】
本実施例による送液装置およびそれを用いた細胞培養装置によって、上述した本発明の課題は解決され、さらに、任意の目的液量を送液する場合にも適用可能とする。【０１０３】
その解決手段の要点は、液体を保持する液体ボトル２と、液体の導通する供給管５と、気体導入弁１０とポンプ６と液面検知手段２１とを備え、液面検知手段に液面が到達したときを基準として、目的の送液量に足る送液量を制御することにある。【０１０４】
図９は、実施例２における送液装置１１０の構成を示す図であり、液体の落差を利用した従来装置および実施例１と基本的な構成は同じである。液体ボトル２、気圧調整管路３、フィルタ４、供給管５、ポンプ６、排出管７、受容器８、分岐点９、気体導入弁１０、気体導入のためのフィルタ１１、コントローラ１２は実施例１の構成と同じである。【０１０５】
２１は排出管７内の液の有無を検知する液面センサであり、図９で示すように、分岐点９とポンプ６の間に液面センサ２１を設けた点が実施例１と異なる。【０１０６】
この送気装置１１０は、以下のように定量と送液を行う。ポンプ６の流量をＱとする。気体導入弁１０を閉じたうえで、ポンプ６を稼働させると、ポンプ６は供給管５内の気体を送気し、気体に連なった液体ボトル２内の液体が供給管５を通過して、送液が開始される。ポンプ６の作動時間は特に定めない。分岐点９を通過して液面センサ２１の設置位置に液面が到達した時点で、ポンプ６を停止する。ポンプ６の内部構造により管は閉塞されており、液体は移動しない。目的の送液量をＡ、分岐点９の位置から液面センサ２１の設置位置までの管内体積をＡ１とした場合、目的送液量に対して調整すべき量をＡ２とすると、Ａ２はＡ−Ａ1である。次にポンプ６を目的の送液量に足る調整量Ａ２に管内を満たすよう稼働時間を制御する。稼働時間は調整量Ａ２／Ｑ（ポンプ流量）で求めることができる。【０１０７】
次いで、気体導入弁１０を開放すると、フィルタ１１より気体導入がされるとともに、分岐点９位置から液体ボトル側の供給管５にある液体は、その落差エネルギによって液体ボトル２にまで戻る。分岐点９よりポンプ６側の液体は、前記のポンプ６の内部構造により停止状態を維持している。このポンプ側の液体が送液量となる。次いでポンプ６を所定時間作動させると、フィルタ１１より順次気体導入がされるとともに排出管７を液体が移動する。液体の先端は受容器８に到達し液体の添加が開始され、液体の後端が受容器８に到達すれば、ポンプ６を停止する。【０１０８】
図１０に本実施例２の制御フローチャートを示す。「ＳＴＡＲＴ」でポンプ６を稼働させ、送液が開始される。液の先端が液面センサ２１に到達すると、液面センサからの信号を受け、ポンプ６の稼働を速やかに停止させる。次に、ポンプ６を目的の送液量に足る調整量に相応する送液時間を与えて送液する（図中、ポンプ６のON-OFFの右側で二重線に見えるのは、液量を調整すべく短時間ONしていることを示す）。ポンプ停止後に気体導入弁１０を開放する。ポンプ６を液体の後端が受容器８に到達するまでの時間より大きい時間を設定し稼働させ、任意時間後に気体導入弁１０を閉止する。【０１０９】
液面センサ２１の設置位置は、分岐点９から管理された距離に設置すればよく、例えば、ポンプ６と受容器７の間でもよく、さらには分岐点９と液体ボトル２の間でもよい。即ち、分岐点９と液面センサ２１との設置距離から見積もられる管内体積が既知となっていれば、本送液装置は任意の送液量に適用できる。上記調整量とは、Ａ２を求めるためのＡ−Ａ1から導くものであり、図９とは異なって、分岐点９より液面センサ２１が液体ボトルに近い位置にある場合、Ａ１は負の値であるが、上記と同じ運用方法で適用できる。【０１１０】
本実施例２に記載の送液装置１１０を使用すれば、送液元の液体ボトル２における液面位置が供給管５のいずれの位置であっても、ポンプ送液を行うことによって、液面センサ２１の位置に液面を管理できる。これにより、液体ボトルの液量による液面変化の影響を回避できる。このときの液面の位置を基準として、目的の送液量に足る送液量をポンプ流量から見積もって、ポンプ稼働時間として制御することにより、送液量を一定に制御することができる。この場合、送液量にはポンプ自体の送液ばらつきが加味されるが送液の精度と再現性を損なうものでない。加えて、実施例１では目的送液量に応じて、液面検出手段の位置を固定して運用することで高い送液精度を得るものであったが、本実施例は任意の液量を送液する場合にも適用可能であり汎用性が高くなる。なお且つ、実施例１では１回の送液量の最大は、気体導入における分岐点から受容器までの管内体積であるが、本実施例は液体ボトルの保持量を最大として、基本的に１回の送液量に上限なく設定できる。【０１１１】
本実施例２に記載の送液装置１１０を備えた細胞培養装置によれば、液面センサの位置を変更することなく目的送液量を変更可能となり、例えば、細胞の培養状態によっては、自動培養中に培地交換における培地の添加量を増減する場合が生じたときも対応可能である。
【実施例３】
【０１１２】
本実施例による送液装置およびそれを用いた細胞培養装置によって、本発明の課題は解決され、さらに、任意の液量を送液しつつ、送液する細胞への物理ダメージの影響を小さくすることが可能となる。【０１１３】
その解決手段の要点は、液体を保持する液体ボトルと、液体の導通する送液管と、気体導入弁と液面検知手段と、該液体ボトルを加圧する加圧手段と、該液体ボトルへの気体導入手段と、を備え、液面検知手段に液面が到達したときを基準として、目的の送液量に足る送液量を制御し、定量された液体を送液する手段を設けることにある。【０１１４】
図１１は、実施例３における送液装置１１１の構成を示す図であり、液体の落差を利用した従来装置および実施例２と基本的な構成は同じであり、目的の送液量を規定する方法は実施例２と同じである。一方で送液手段であるポンプは液体ボトルと受容器との間の送液管に設けるのではなく、液体ボトル内の液体を加圧する手段として用いる点を特徴とする。即ち、実施例２を表す図９に対し、ポンプ６を除いた液体ボトル２、供給管５、排出管７、受容器８、分岐点９、気体導入弁１０、気体導入のためのフィルタ１１、コントローラ１２、液面センサ２１の構成は同じである。６はポンプであり、吸引口を外気に通じたフィルタ１５に接続し、吐出口は２分岐されて一方は、送気弁１７に接続され、もう一方は液体ボトルにおける気圧調整管路１３に接続される。また気圧調整管路１３には分岐が設けられ、ボトル圧調整弁１４を介して外気に通じたフィルタ４に接続される。液体ボトルの液体に接する供給管５は分岐点９で、気体導入弁１０と送気弁１７から延長された送気管１６に接続される。【０１１５】
この送気装置１１１は、以下のように定量と送液を行う。図１２に本実施例３の制御フローチャートを示す。「ＳＴＡＲＴ」でポンプ６を稼働させ、送液が開始される。液の先端が液面センサ２１に到達すると、液面センサからの信号をうけ、ポンプ６の稼働を速やかに停止させる。次にポンプ６を目的の送液量に足る調整量に相応する送液時間を与えて送液する。ポンプ停止後に気体導入弁１０とボトル圧調整弁１４を開放すれば、分岐点９より気体が導入され、落差により液体ボトル２へ液体が戻る。次いで、気体導入弁１０とボトル圧調整弁１４を閉止し、送液弁１７を開放する。このとき、後端を分岐点９とする目的の送液量となった管内液体に対して、送液弁１７を介してポンプ６の吐出口が開放されている。その後、ポンプに液体の後端が受容器８に到達するまでの時間より大きい時間を設定し稼働させ、任意時間後に送液弁１７を閉止する。【０１１６】
本実施例３記載の送液装置１１１を使用すれば、実施例２の効果に基づき、任意の送液量を、送液元の液体ボトル２における液面位置の影響によらず一定の再現性で送液することができる。さらに送液する細胞への物理ダメージの影響を小さくできる。その理由は、送液手段としてローラーポンプ、ダイヤフラムポンプ、ギヤポンプなど一般のポンプの送液方式では、送液構造として閉塞部位と開放部位をもち、ここを通過する細胞に直接圧力を与え、細胞培養への影響が懸念される。本実施例では、ポンプを液体ボトル内の液体を加圧する手段として用いており、ポンプ内部を細胞が通過することがないため、細胞への物理ダメージの影響を小さくできる効果がある。なお、送液・加圧手段にはポンプを用いて説明したが、液体を加圧出来れば手段はこれに限定されない。例えばピストンとシリンダとの組み合わせからなるシリンジポンプや、不活性ガスを高圧保持し液体への加圧力と加圧時間を制御するなどの方法であれば、送液構造として閉塞部位と開放部位がないので、より細胞培養への影響が小さい方法である。
【実施例４】
【０１１７】
本実施例による送液装置およびそれを用いた細胞培養装置によって、上述した液面検知の手段によらず、以下の方法でも本発明の課題を解決できる。【０１１８】
その解決手段の要点は、液体を保持する液体ボトルと、液体の導通する送液管と、気体導入弁とポンプと外気導入手段を備え、外気圧を送液管より液体ボトルに作用させることにある。【０１１９】
図１３は、実施例４における送液装置１１２の構成を示す図であり、液体の落差を利用した従来方法と基本的な構成は同じであり、目的の送液量を規定する方法は、ポンプ流量による時間制御であり従来方法と同じである。【０１２０】
一方で外気導入手段としてポンプを通常とは逆の送液方向で外気圧を送液管より液体ボトルに作用させる点を特徴とする。即ち、従来例を表す図３に対し、液体ボトル２、気圧調整管路３、フィルタ４、供給管５、ポンプ６、排出管７、受容器８、分岐点９、気体導入弁１０、気体導入のためのフィルタ１１、コントローラ１２は従来例の構成と同じである。１８は外気導入弁であり、一方は外気に通じたフィルタに接続し、もう一方は排出管７におけるポンプ６と受容器の管路の途中に接続される。なお、液体ボトル２の構成については拡大図で示し、供給管５の内部の液面位置として、１９ａは保持された液量に応じた液面位置を示している。液面位置１９ａは、「発明が解決しようとする課題」の項で記載したように、落差によって液体を戻したときや、送液に伴う液量の減少に応じて変化するものであり、一義に定義できない。１９ｂは供給管５の開口位置を示し、本実施例３によって制御された液面位置を示すものである。【０１２１】
この送液装置１１２は、以下のように定量と送液を行う。
図１４に本実施例４の制御フローチャートを示す。
「ＳＴＡＲＴ」で外気導入弁１８をＯＮとし弁を開放すると、外気導入弁１８とポンプ６と供給管５が通じる。
次いで、ポンプ６を送液とは逆の方向に送気させる。この送気量は供給管５の内部のいずれかにある液面を押し下げて、さらに液中に外気が液体ボトルの液中に放出されるよう実験的に求められる送気量である。
次いで、外気導入弁１８を閉止し、ポンプ６を通常の送液方向に送液する。以降は、従来方法と同じく、図３を用いて説明した送液装置１の使用方法と同じである。【０１２２】
送液手段としてローラーポンプ、ダイヤフラムポンプ、ギヤポンプなど一般のポンプの送液方式では、モータの正極と負極への通電極性を変更すれば、送液方向を標準方向と逆方向を任意に変更できる。本実施例では通常の送液とは逆の方向に気相を送気することで、液面を制御する。またポンプ以外の外気導入手段であっても本実施例では適用できる。例えば図５において、図１３と同様の構成は、フィルタ５２と第２排気開閉弁５１が外気導入弁１８と同じ機能を有し、また、第１ガス開閉弁４３、加湿ボトル４４、フィルタ４５、圧力制御弁４６、ガスボンベ４７からなるガス供給ラインは、送気方向を液体ボトルの方向に制御すれば、外気導入手段として利用できる。【０１２３】
本実施例４に記載の送液装置１１２を使用すれば、第１の課題である送液元の液体ボトルにおける液量変化に対する液面位置の影響が回避される。また、第２の課題である、戻り液の液面位置の影響を回避される。その理由は、液面位置が送液元の液体ボトルのいずれの位置であっても、外気導入手段により外気圧を送液管より液体ボトルに作用させることによって、液面の位置は送液管の開口部で停止して既知の位置となる。さらに余剰の外気および圧力は液体ボトル内の液体を通過し、気圧調整管路３よりフィルタ４を通過して外気に放出され液体ボトル内を常圧で維持できるからである。送液量の制御は、従来法と同じであるので、第３の課題であるゴムチューブの長さ等の影響によるポンプ流量の変化を回避できていないが、流量のばらつき要因は上記の２つの課題の方の影響が大きく、流量変化をポンプ自体の流量ばらつき以内に留めて送液できる効果がある。
【実施例５】
【０１２４】
本実施例による送液装置およびそれを用いた細胞培養装置によって、上述した液面検知の手段に加え、以下の方法によって送液量を確認しつつ本発明の課題を解決できる。【０１２５】
その解決手段の要点は、液体を保持する液体ボトルと、液体の導通する送液管と、気体導入弁とポンプと液体ボトルの重量測定手段を備えることにある。【０１２６】
図１５は、実施例５における送液装置１１３の構成を示す図であり、実施例１と基本的な構成は同じであるが、送液量を確認する方法として、液体ボトルの重量変化値を検出する方法である。即ち従来例を表す図３に対し、液体ボトル２、気圧調整管路３、フィルタ４、供給管５、ポンプ６、排出管７、受容器８、分岐点９、気体導入弁１０、気体導入のためのフィルタ１１、コントローラ１２、液面センサ２１は従来例の構成と同じである。１１４は、液体を保持した液体ボトル２と気圧調整管路３とフィルタ４の一組の重量を測定する重量センサである。１１５は、分岐部９を固定する固定治具である。供給管５に柔軟性が高いゴムチューブなどの管材を使用すれば、分岐点９以降に接続された構成品が重量測定を損なうことなく好適である。【０１２７】
この送液装置１１３は、以下のように送液と送液量の確認を行う。図１６に本実施例５の制御順番を横軸に記載し、縦軸はそれに相応して重量センサより得られる重量測定値を示すものである。【０１２８】
制御フローチャートは、図２に示した実施例１記載の送液装置の制御フローチャートに従う。ポンプ６により送液を開始する。次いで、液面センサ２１による液面検出が為されると、送液が停止され、総液量重量Ｃが得られる。【０１２９】
総液量重量Ｃは目的の液量に密度から求められる目的重量Ａと、分岐点９から液体ボトル２内の液体の液面に相応する管の体積（戻り量）を液体で満たしたときの液の密度から求められる重量（戻り重量）Ｂを足し合わせた重量である。【０１３０】
次いで、気体導入弁１０を開放すれば、フィルタ１１より気体導入がされるとともに、分岐点９位置から液体ボトル側の供給管５にある液体（戻り量Ｂ）は、その落差エネルギによって液体ボトル２にまで戻る。このとき重量測定値はＣよりも小さい値を示し、この重量指示値が目的重量Ａであり、Ｃ値との差分が戻り重量Ｂである。分岐点９よりポンプ６側の液体は、ポンプ６の内部構造により停止状態を維持している。【０１３１】
次いでポンプ６を所定時間作動させると、フィルタ１１より順次気体導入がされるとともに排出管７を液体が移動する。液体の先端は受容器８に到達し液体の添加が開始され、液体の後端が受容器８に到達すれば、ポンプ６を停止する。この間で重量測定値は変化しない。繰り返して送液するときは、上記の操作を実行することにより、順次減量する重量を送液重量として扱うことができる。【０１３２】
この送液装置は、図５に示した実施例１の送液装置を用いた細胞培養装置と組み合わせれば、細胞播種時における細胞懸濁液の送液量の定量と確認に利用できる。一般に細胞培養の工程では、作業者の熟練度と作業実施記録によって、こうした分注工程の実行を保証している。本実施例を用いれば、送液元となる細胞ボトルの重量が、目的の重量分減量したことを記録することで１回の分注の作業記録とし、細胞培養工程の確実な実行結果を保証することができる。【０１３３】
また、同様の重量センサ１１４は、図５に示した細胞培養装置における第１排液ボトル７９および第２排液ボトル８６に備えれば、排出元となる排液ボトルの重量が、目的の重量分増量したことを記録することで培養容器からの１回の送液の作業記録とし、培地交換工程の確実な実行結果を保証することができる。【０１３４】
このように、すべてのポンプを作動させた時間記録、ポンプへの印加電圧記録、液面センサの作動時間記録など、自動装置から得られる動作情報を整理すれば、送液および排出の実行結果を信頼性高く保証できる。
【産業上の利用可能性】
【０１３５】
本発明は、細胞を培養する細胞培養装置および送液装置として有用である。
【符号の説明】
【０１３６】
１…送液装置、２…液体ボトル、３…気圧調整管路、４…フィルタ、５…供給管、６…ポンプ、７…排出管、８…受容器、９…分岐点、１０…気体導入弁、１１…フィルタ、１２…コントローラ、２０…実施例１に係る送液装置、２１…液面センサ、２２…液面センサ本体、２３…光源、２４…受光窓、２５…信号線、２６…設置治具、２７…設置ベース、２８…管固定部、２９…検出光、３０…反射光、３１…自動細胞培養装置、３２…恒温槽、３３…冷蔵庫、３４…第１細胞ボトル、３５…気圧調整管路、３６…フィルタ、３７…供給管、３８…分岐点、３９…第１気体導入弁、４０…第１細胞開閉弁、４１…フィルタ、４２…共通管、４３…第１ガス開閉弁、４４…加湿ボトル、４５…フィルタ、４６…圧力制御弁、４７…ガスボンベ、４８…第１ポンプ、４９…第２ガス開閉弁、５０…排出管、５１…第１排気開閉弁、５２…フィルタ、５３…第１液面センサ、５４…多分岐部、５５…第１培養容器、５６…第１容器開閉弁、５７…第２培養容器、５８…第１容器開閉弁、５９…本体部、６０…ふた部、６１…第２容器、６２…第１容器、６３…第１ポート、６４…第２ポート、６５…第３ポート、６６…第４ポート、６７…第２細胞ボトル、６８…供給管、６９…分岐点、７０…第２気体導入弁、７１…第２細胞開閉弁、７２…第２ポンプ、７３…排出管、７４…第２排気開閉弁、７５…第２液面センサ、７６…多分岐部、７７、７８…第２容器開閉弁、７９…第１排液ボトル、８０…排液管、８１…第１排出弁、８２…第３ポンプ、８３…多分岐部、８４,８５…第１容器排出弁、８６…第２排液ボトル、８７…排液管、８８…第２、排出弁、８９…第４ポンプ、９０…多分岐部、９１,９２…第２容器排出弁、９５…培地ボトル、９６…供給管、９７…分岐点、９８…第３気体導入弁、９９…第５ポンプ、９６…供給管、１００…培地予熱ボトル、１０１…供給管、１０２…分岐点、１０３…第４気体導入弁、１０４…培地開閉弁、１１０…実施例２に係る送液装置、１１１…実施例３に係る送液装置、１３…気圧調整管路、１４…ボトル圧調整弁、１５…フィルタ、１６…送気管、１７…送気弁、１１２…実施例４に係る送液装置、１８…外気導入弁、１９ａ…従来法の液面位置、１９ｂ…制御された液面位置、１１３…実施例５に係る送液装置、１１４…重量センサ、１１５…固定治具。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年10月20日(2016.10.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体導入口と液体排出口を有する送液管と、
前記液体導入口から導入する培地である液体を保持する収容容器と、
前記送液管内の前記液体を前記液体排出口に向けて送液する送液機構部と、
前記送液管へ気体を導入する気体導入部と、
前記送液管内で送液される前記液体の進行液面を検知する液面検知部と、
前記送液機構部と、前記気体導入部と、前記液面検知部とを制御する制御部と、
を備え、
前記気体導入部は、前記送液機構部の上流側の前記送液管に設けられた分岐点に接続され、
前記液面検知部は、前記分岐点より下流側に設けられ、
前記気体導入部から前記気体が前記送液管に導入されることで、前記分岐点より上流側の前記送液管内にある前記液体は前記収容容器に落差により戻され、前記分岐点より下流側の前記送液管内にある前記液体は前記送液機構部により前記液体排出口に向けて送液される
ことを特徴とする送液装置。
【請求項２】
前記液面検知部が、前記送液機構部よりも下流側に設けられた場合に、
前記液面検知部は、該液面検知部と前記分岐点との間にある前記送液管内の液体量が予め設定された送液量となる位置に配置され、
前記制御部は、前記液面検知部が前記液体の進行液面を検知した時、前記送液機構部による送液を停止する
ことを特徴とする請求項１に記載の送液装置。
【請求項３】
前記液面検知部が、前記送液機構部よりも上流側に設けられた場合に、
前記液面検知部で前記液体の進行液面を検知した時点から前記液面検知部を通過する液体の送液量を積算し、前記積算した送液量に基づき予め設定された送液量となるように前記送液機構部は前記液体の送液を停止する
ことを特徴とする請求項１に記載の送液装置。
【請求項４】
前記送液機構部は、前記気体導入部の下流側の代わりに上流側に設けられ、
前記制御部は、前記送液機構部により前記収容容器内の前記液体を加圧し、前記液面検知部に到達した前記液体の液面を基準として該液面検知部と前記分岐点との間にある前記送液管内の前記液体を予め設定された送液量として送液する
ことを特徴とする請求項１に記載の送液装置。
【請求項５】
前記分岐点は、重力方向に対して前記収容容器より上方に配置されている
ことを特徴とする請求項１に記載の送液装置。
【請求項６】
前記液面検知部は、複数の光源が前記送液管の流れ方向に沿って配列され、前記複数の光源に対応する位置に複数の受光部が配列されている
ことを特徴とする請求項１に記載の送液装置。
【請求項７】
前記液面検知部は、第１センサと該第１センサより下流側に設置された第２センサとで構成され、
前記制御部は、前記第１および第２センサの少なくともいずれか一方の液面位置が誤検知であると判定した時は、前記液体の送液を停止する
ことを特徴とする請求項１に記載の送液装置。
【請求項８】
前記液面検知部の代わりに、重量センサを用いて前記収容容器の重量の変化量を測定し、該変化量に基づいて前記液体の送液量を決定する
ことを特徴とする請求項１に記載の送液装置。
【請求項９】
前記気体導入部には、気体以外の混入物を除去するフィルタが具備され、
前記気体は該フィルタを通過して導入される
ことを特徴とする請求項１に記載の送液装置。
【請求項１０】
液体導入口と液体排出口を有する送液管と、
前記液体導入口から導入する培地である液体を保持する収容容器と、
前記送液管内の前記液体を前記液体排出口に向けて送液する送液機構部と、
前記送液管へ気体を導入する気体導入部と、
外気を前記送液管を介して前記収容容器に導入し該収容容器に外気圧を印加する外気導入部と、
前記送液機構部と前記気体導入部と前記外気導入部とを制御する制御部と、を有し、
前記制御部は、前記外気導入部から外気を導入し、導入した前記外気を前記送液機構部の送液方向とは逆方向に送気し、前記送液管中の前記液体の液面を前記液体導入口の位置に保持する
ことを特徴とする送液装置。
【請求項１１】
請求項１に記載の送液装置を有する細胞培養装置において、
培養される細胞を収納する細胞収納容器と、
前記細胞を培養する培養容器と、
前記細胞の培養に供する培地を収納する培地収納容器と、
交換用の培地を収納する培地容器と、
前記培地及び前記細胞を排出する廃液容器と、を備え、
前記送液装置を用いて、前記細胞収納容器から送液管を介して前記培養容器へ前記細胞を送液し、前記培地収納容器から送液管を介して前記培養容器へ培地を送液し、前記培地を前記廃液容器に排出する
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１２】
恒温槽と低温保管容器と、をさらに有し、
前記培地容器と前記廃液容器とは前記低温保管容器に収納されて低温状態に保持され、
前記培養容器と前記細胞収納容器と前記培地収納容器と前記送液装置とは前記恒温槽に収納されて恒温制御されている
ことを特徴とする請求項１１に記載の細胞培養装置。
【請求項１３】
炭酸ガスを導入するガス導入部と、加湿を行う加湿制御部とを、さらに有し、
前記培養容器に前記炭酸ガスを供給し、前記加湿制御部で加湿を制御しながら細胞の培養を行う
ことを特徴とする請求項１２に記載の細胞培養装置。
【請求項１４】
前記送液装置を用いて前記細胞及び培地を含む液体の送液不具合を防止する
ことを特徴とする請求項１１に記載の細胞培養装置。
【請求項１５】
前記液面検知部の代わりに、重量センサを用いて前記収容容器の重量の変化量を測定し、該変化量に基づいて前記液体の送液量を決定する
ことを特徴とする請求項１１に記載の細胞培養装置。
【国際調査報告】
2015025425.tif 000020
2015025425.tif 000021
2015025425.tif 000022
2015025425.tif 000023