(57)【要約】  本発明の光学活性フルオロ乳酸誘導体の製造方法は、フルオロピルビン酸誘導体（またはフルオロピルビン酸誘導体の水和体）に、α―ケト酸脱水素酵素またはα―ケト酸還元酵素を用いて不斉還元することを特徴とする。フルオロピルビン酸誘導体に対し、特定の酵素によって不斉還元反応を行い、穏和な条件の反応で、光学活性フルオロ乳酸誘導体を高い光学純度でもって得ることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式［１］で表されるフルオロピルビン酸誘導体、または式［５］で表されるフルオロピルビン酸誘導体の水和体に、α―ケト酸脱水素酵素またはα―ケト酸還元酵素を用いて不斉還元することを特徴とする、式［２］で表される光学活性フルオロ乳酸誘導体の製造方法。
【化７】
2015005341.tif 000013
［式中、ｎは１〜３の整数を採る。Ｒは水素原子または炭素数１〜１０の直鎖もしくは分岐鎖のアルキル基を表す。］
【化８】
2015005341.tif 000014
［式中、ｎおよびＲは式［１］に同じ。］
【化９】
2015005341.tif 000015
［式中、ｎおよびＲは式［１］に同じ。＊は不斉炭素を表す。］
【請求項２】
式［２］で表される光学活性フルオロ乳酸誘導体が、式［３］または式［４］で表される構造である、請求項１に記載の製造方法。
【化１０】
2015005341.tif 000016
［式中、ｎおよびＲは式［１］に同じ。］
【化１１】
2015005341.tif 000017
［式中、ｎおよびＲは式［１］に同じ。］
【請求項３】
式［１］で表されるフルオロピルビン酸誘導体におけるｎが２または３であり、かつ、Ｒが水素原子であることを特徴とする、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
α―ケト酸脱水素酵素またはα―ケト酸還元酵素の量が、反応液量に対し０．０２質量％〜２０質量％であることを特徴とする、請求項１乃至３の何れかに記載の製造方法。
【請求項５】
不斉還元反応をリン酸緩衝液の存在下で行い、該緩衝液の濃度が０．０１〜３ｍｏｌ／ｌであることを特徴とする、請求項１乃至４の何れかに記載の製造方法。
【請求項６】
アルコールの存在下で反応を行うことを特徴とする、請求項１乃至５の何れかに記載の製造方法。
【請求項７】
アルコールがメタノール、エタノールまたは２−プロパノールであることを特徴とする、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
不斉還元反応の温度が５℃〜６０℃であることを特徴とする、請求項１乃至７の何れかに記載の製造方法。
【請求項９】
不斉還元反応を、ｐＨが３．０〜１０．０の条件下で行うことを特徴とする、請求項１乃至８の何れかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学活性フルオロ乳酸誘導体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性フルオロ乳酸誘導体は種々の医農薬中間体として重要である。これまでに微生物を用いてフルオロ乳酸誘導体エステルの光学異性体の片方を選択的に加水分解することで光学分割する方法や触媒を用いて不斉還元する方法、またはラセミ体のフルオロ乳酸誘導体を光学分割剤によって光学分割する方法が検討されてきた。【０００３】
微生物を用いる方法については、例えば、特許文献１ではアルスロバクター属、アスペルギルス属、バチルス属、キャンディダ属等の微生物を起源とする酵素を用いて３，３，３−トリフルオロ乳酸誘導体のエステル類を不斉加水分解することで光学活性３，３，３−トリフルオロ乳酸誘導体を得ている。また、非特許文献１では３，３，３−トリフルオロピルビン酸エチルに対して酵母を作用させて収率６３％、光学純度５％ｅｅで３，３，３−トリフルオロ乳酸エチルを得ている。【０００４】
また、触媒を用いた化学的な方法では、例えば、特許文献２ではカルボニルのα位にパーフルオロアルキル基を持つ２−ケトパーフルオロアルカンアミドもしくはそのカルボニル水和物を原料とし、ロジウム錯体からなる遷移金属触媒を用いて不斉水素化反応を行い、その後に加水分解することで光学純度７５％ｅｅの３，３，３−トリフルオロ乳酸を得ている。【０００５】
一方、ラセミ体の３，３，３−トリフルオロ乳酸を光学分割することで光学活性体を製造する方法も古くから検討されており、例えば特許文献３において、ラセミ体の３，３，３−トリフルオロ乳酸に、光学分割剤である光学活性フェネチルアミン塩を作用させて再結晶させることで光学活性体を得ている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−１４３９７号公報
【特許文献２】特開２０１１−４２６６１号公報
【特許文献３】特開２００６−２３２７２６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Tetrahedoron Asymmetry, 21, p.1211-1215(2010)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１で開示している微生物を用いた反応では、目的物である光学活性３，３，３−トリフルオロ乳酸誘導体の光学純度が最高で３６．８％ｅｅであり、その変換率も６４．９％と、変換率、光学純度ともに不十分である。また、酵母を用いている非特許文献１も光学純度が５％ｅｅと低い。【０００９】
特許文献２で開示している触媒を用いた反応に関しても、得られた３，３，３−トリフルオロ乳酸の光学純度が７５％ｅｅと低いものであった。【００１０】
一般的にフルオロ乳酸誘導体の光学純度を高める方法として再結晶が知られているが、再結晶を繰り返すと回収率が低下する問題がある。【００１１】
一方、特許文献３の方法は、高い分割効率で光学異性体を得る好ましい方法であるが、原料からの生成物の回収率は最大５０％であることから生産性に問題があった。【００１２】
このように、光学活性フルオロ乳酸誘導体を製造するにあたり、反応〜生成物の回収までに多くの工程を必要とした。また、触媒を用いた化学的な方法を採用した場合も、高価な試薬の大量使用などの理由から工業的スケールでの製造において採用し難いという問題があった。【００１３】
本発明の課題は、光学活性フルオロ乳酸誘導体を、環境負荷をかけずに低コストで高収率、かつ高い光学純度で製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは上記の課題を解決すべく誠意検討した結果、式［１］で表されるフルオロピルビン酸誘導体、または式［５］で表されるフルオロピルビン酸誘導体の水和体に特定のα―ケト酸脱水素酵素またはα―ケト酸還元酵素を作用させることで、式［２］で表される光学活性フルオロ乳酸誘導体が得られることを見出した。
【化１】
2015005341.tif 000002
［式中、ｎは１〜３の整数を採る。Ｒは水素原子または炭素数１〜１０の直鎖もしくは分岐鎖のアルキル基を表す。］
【化２】
2015005341.tif 000003
［式中、ｎおよびＲは式［１］に同じ。］
【化３】
2015005341.tif 000004
［式中、ｎおよびＲは式［１］に同じ。＊は不斉炭素を表す。］【００１５】
また、反応系内に、アルコール類などの有機溶剤を添加することにより、収率が大幅に向上し、かつ高い光学純度で製造できる知見を見出し、本発明を完成した。【００１６】
本発明においては、フルオロピルビン酸類誘導体を特定の酵素で不斉還元することで、光学活性フルオロ乳酸誘導体を高収率で、かつ高い光学純度で製造することができる。このことは光学純度を高めることを目的とした再結晶操作が不要であることを意味し、製造工程を簡略化できるだけでなく、廃棄物の量も抑えることができる。反応後は有機溶媒による抽出と単離のための結晶化といった、有機化学の一般的な手法によって精製できることからも、本発明は、非常に優位性の高い方法である。【００１７】
すなわち、本発明では以下の［発明１］−［発明９］に記載する発明を提供する。【００１８】
［発明１］
式［１］で表されるフルオロピルビン酸誘導体、または式［５］で表されるフルオロピルビン酸誘導体の水和体に、α―ケト酸脱水素酵素またはα―ケト酸還元酵素を用いて不斉還元することを特徴とする、式［２］で表される光学活性フルオロ乳酸誘導体の製造方法。【００１９】
［発明２］
式［２］で表される光学活性フルオロ乳酸誘導体が、式［３］または式［４］で表される構造である、発明１に記載の製造方法。
【化４】
2015005341.tif 000005
［式中、ｎおよびＲは式［１］に同じ。］
【化５】
2015005341.tif 000006
［式中、ｎおよびＲは式［１］に同じ。］【００２０】
［発明３］
式［１］で表されるフルオロピルビン酸誘導体におけるｎが２または３であり、かつ、Ｒが水素原子であることを特徴とする、発明１または２に記載の製造方法。【００２１】
［発明４］
α―ケト酸脱水素酵素またはα―ケト酸還元酵素の量が、反応液量に対し０．０２質量％〜２０質量％であることを特徴とする、発明１乃至３の何れかに記載の製造方法。【００２２】
［発明５］
不斉還元反応をリン酸緩衝液の存在下で行い、該緩衝液の濃度が０．０１〜３ｍｏｌ／ｌであることを特徴とする、発明１乃至４の何れかに記載の製造方法。【００２３】
［発明６］
アルコールの存在下で反応を行うことを特徴とする、発明１乃至５の何れかに記載の製造方法。【００２４】
［発明７］
アルコールがメタノール、エタノールまたは２−プロパノールであることを特徴とする、発明６に記載の製造方法。【００２５】
［発明８］
不斉還元反応の温度が５℃〜６０℃であることを特徴とする、発明１乃至７の何れかに記載の製造方法。【００２６】
［発明９］
不斉還元反応を、ｐＨが３．０〜１０．０の条件下で行うことを特徴とする、発明１乃至８の何れかに記載の製造方法。【００２７】
本発明は酵素による不斉還元を行うことで、穏和な条件で光学活性フルオロ乳酸誘導体を高い光学純度で得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００２９】
本発明の基質である式［１］で表されるフルオロピルビン酸誘導体におけるｎは１〜３の整数であり、Ｒは水素原子または炭素数１〜１０の直鎖もしくは分岐鎖のアルキル基を表す。
【００３０】
ここで炭素数１〜１０の直鎖もしくは分岐鎖のアルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、１−メチルプロピル基、２−メチルプロピル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｉ−ペンチル基、１，１−ジメチルプロピル基、１−メチルブチル基、１，１−ジメチルブチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｉ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、ｉ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基等が挙げられる。
【００３１】
この中でも、ｎが２または３であり、かつＲが水素原子である化合物、すなわち３，３，３−トリフルオロピルビン酸もしくは２，２−ジフルオロピルビン酸は、本発明の不斉還元反応における反応性、立体選択性も良好となることから、特に好ましい。尚、式［１］で表されるフルオロピルビン酸誘導体は、従来技術を基に当業者が適宜調製しても良いし、市販されているものを用いても良い。
【００３２】
本発明において、原料である式［１］で表されるフルオロピルビン酸誘導体は、水と接触させると該誘導体のカルボニル基が求核的な反応を受け、式［５］で表されるフルオロピルビン酸誘導体の水和物となる。原料中の該水和物の比率は反応系中の水の量によって変化するが、本発明は原料である当該フルオロピルビン酸誘導体に該水和物が含まれていても不斉還元反応は十分に進行する。例えば、後述の実施例によれば、フルオロピルビン酸誘導体は、反応系内の水の影響を受け、実際にはフルオロピルビン酸誘導体の水和体の形でもって反応が進行している。したがって、本発明の原料はフルオロピルビン酸誘導体単独、フルオロピルビン酸誘導体と該水和物との混合、またはフルオロピルビン酸誘導体の水和物単独のものであっても良い。当然、フルオロピルビン酸誘導体を反応系内に加える前に、予め該水和体に調製して用いてもよい。
【００３３】
本発明における不斉還元反応については、式［１］で表されるフルオロピルビン酸誘導体に対し、酵素を作用させ、ケトン部位を還元することで対応する光学活性フルオロ乳酸誘導体を製造する工程を含む。具体的には、緩衝溶液中に出発原料であるフルオロピルビン酸誘導体を加えた後、各種酵素を加えてマグネチックスターラー等で攪拌しながら反応させる。
【００３４】
本発明の不斉還元反応に用いる酵素は、α−ケト酸脱水素酵素、またはα−ケト酸還元酵素である。これらの酵素は、本発明の原料である「ピルビン酸誘導体」等の「α−ケト酸誘導体」のα位（カルボキシル基の一つ隣の炭素部位を言う）のカルボニル基を電子受容体とし、ＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型）やＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型）を電子供与体としてヒドロキシル基に変換（このことを「還元」とも言う）する能力を持つものを言う。
【００３５】
尚、本発明のように、反応系に還元型のＮＡＤＨやＮＡＤＰＨを追加で(もしくは大量に)加えなくても、系内にグルコース、ギ酸もしくはギ酸の金属塩（ナトリウム塩など）などを添加することにより、補酵素脱水素酵素(グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素など)を用いて反応系内で還元型のＮＡＤＨやＮＡＤＰＨを再生することも可能である。
【００３６】
本発明の不斉還元反応に用いる酵素の具体的な例としては、例えば、株式会社ダイセルのＣｈｉｒａｌｓｃｒｅｅｎ ＯＨTM（以下略す）Ｅ０３８、Ｅ０７０、Ｅ０７１、Ｅ０８８、Ｅ０８９、Ｅ０９０、Ｅ０９３、Ｅ１２６、Ｅ１５２等が挙げられる。これらの酵素については、一般に市販されているものであり、当業者が容易に入手できる。また、これらの酵素はそれ自身、または該酵素の処理物も利用できる。
【００３７】
「酵素の処理物」とは、例えば、粗抽出液、凍結乾燥微生物体、アセトン乾燥微生物体、または破砕物等を意味する。さらに、酵素自体を架橋法、物理的吸着法等の公知の方法で固定化したものも意味する。
【００３８】
また、フルオロピルビン酸誘導体を不斉還元する酵素を保有する微生物全菌体、遺伝子組換え体、またはそれらの処理物も同様に利用できる。また、本発明における「遺伝子組換え体」とは、本発明で用いる酵素をコードする遺伝子が導入され、当該遺伝子が発現した組換え微生物の全てを言う。
【００３９】
使用する酵素の量は、反応時間の遅延や選択性の低下が起こらないような量であれば良く、通常は反応液量に対し０．０１質量％〜１００質量％、好ましくは０．０２質量％〜２０質量％である。使用する基質の量は、酵素反応が円滑に進む量であれば良く、好ましくは０．１質量％〜５０質量％、より好ましくは１質量％〜１０質量％である。反応溶媒は、通常イオン交換水、緩衝液等の水性媒体を使用することができる。
【００４０】
ｐＨに関しては、酵素反応が円滑に進むｐＨならば良く、好ましくはｐＨ３〜ｐＨ１０、より好ましくはｐＨ５〜ｐＨ８である。反応が進行するに従いｐＨが変化してくる場合があるが、適当な中和剤を添加して最適ｐＨに調整することが望ましい。
【００４１】
反応に用いる緩衝液に関しては上記のｐＨの範囲に最適なものであれば特に定めないが、例えば、カコジル酸ナトリウム−塩酸緩衝液、マレイン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液、イミダゾール−塩酸緩衝液、２、４、６−トリメチルピリジン−塩酸緩衝液、トリエタノールアミン・塩酸−水酸化ナトリウム緩衝液、ベロナール−塩酸緩衝液、Ｎ−エチルモルフォリン−塩酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシルグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液などｐＨ５〜９で緩衝作用を有する緩衝液が挙げられる。特にリン酸緩衝液は好ましいものの１つである。
【００４２】
緩衝液の濃度は、０．０１〜３ｍｏｌ／ｌの範囲で使用できるが、好ましくは０．２〜２ｍｏｌ／ｌである。尚、ここでいう「濃度」とは、リン酸根の濃度（以下に示す化学種の濃度）を指す。
【化６】
2015005341.tif 000007
【００４３】
一般的に有機溶媒は酵素失活の要因となりうるが、反応系中に基質の溶解性を上げる目的や酵素反応を円滑に進める目的でメタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、ブタノール、ジ−i−プロピルエーテル、テトラヒドロフラン、アセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどを、酵素反応を阻害しない程度添加することができる。これらの中でも、メタノール、エタノールまたは２−プロパノールが好ましい。添加量は、反応液量に対して通常１〜２０質量％、好ましくは３〜７質量％である。
【００４４】
また、還元反応に微生物を用いる場合、反応に付随してＮＡＤＨから生成するＮＡＤ+のＮＡＤＨへの補酵素再生は、微生物が持つＮＡＤ+還元能(代謝系)を用いて行なうことができる場合があり、このようなＮＡＤ+還元能は反応系にグルコースやエタノールを添加することで増強することが一般的に知られている。本発明のように、微生物を用いない酵素反応の場合でもエタノールを酵素反応の変換率向上のために用いることができる知見を得た。エタノールを反応系中に添加する場合、添加量に特に制限はないが、具体的には反応液量に対して１〜２０質量％であり、好ましくは３〜７質量％である。さらに、反応を効率的に進めるには、反応液を攪拌しながら行うことが好ましく、マグネチックスターラー、モーター駆動攪拌翼、振盪機などが使用できる。
【００４５】
反応温度は使用する酵素により至適温度が異なるが、通常５〜６０℃、好ましくは１０〜４０℃で行う。温度が高すぎる場合は、酵素が失活するので適宜、温度を加減すると良い。
【００４６】
反応時間は１時間〜１６８時間、好ましくは１〜７２時間であり、そのような時間で反応が終了する反応条件を選択することが好ましい。
【００４７】
以上のような基質濃度、酵素濃度、ｐＨ、温度、添加溶媒、反応時間等、各反応条件は反応収率、光学純度等を考慮して目的物であるフルオロ乳酸誘導体が最も多く採取できる条件を選択する。
【００４８】
生成した光学活性フルオロ乳酸誘導体を反応終了液から回収するには、有機合成における一般的な単離方法が採用できる。反応終了後、有機溶媒による抽出等の通常の後処理操作を行えばよい。反応液からの生成物の回収には抽出操作並びに結晶化操作を行う。
【００４９】
抽出操作に関しては水層と分離しやすく、かつ目的物が抽出し易い溶媒であれば良く、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、ｎ−ヘプタン等の脂肪族炭化水素系、ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、キシレン、メシチレン等の芳香族炭化水素系、塩化メチレン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素系、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジ−ｉ−プロピルエーテル、１，４−ジオキサン等のエーテル系、アセトン、メチルエチルケトン、メチル−ｉ−ブチルケトン等のケトン系、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル等のエステル系、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル系、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｉ−プロパノール、ｎ−ブタノール等のアルコール系等が挙げられる。このうち、フルオロ乳酸誘導体の溶解性を考慮しジ−ｉ−プロピルエーテル、酢酸エチル、メチル−ｉ−ブチルケトン、またはｔ−ブチルメチルエーテルが好ましい。抽出に用いる反応液は無機酸を用いてｐＨを酸性条件にして行なうことで抽出効率が向上する。抽出の際のｐＨはｐＨ３以下とすれば良く、好ましくはｐＨ２以下である。反応液のｐＨ調整に用いる無機酸には塩酸、硫酸、リン酸を用いることができる。無機酸の添加量は反応液のｐＨに応じて適宜調整すればよい。
【００５０】
結晶化操作における結晶化溶媒としては、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、ｎ−ヘプタン等の脂肪族炭化水素系、ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、キシレン、メシチレン等の芳香族炭化水素系、塩化メチレン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素系、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジ−ｉ−プロピルエーテル、１，４−ジオキサン等のエーテル系、アセトン、メチルエチルケトン、メチルｉ−ブチルケトン等のケトン系、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル等のエステル系、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル系、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｉ−プロパノール、ｎ−ブタノール等のアルコール系等が挙げられる。その中でも、トルエン、ジ−ｉ−プロピルエーテル、酢酸エチルが好ましく、特にトルエン、ジ−ｉ−プロピルエーテルの混合溶媒が好ましい。
【００５１】
このように、抽出操作並びに結晶化操作を行った後、粗生成物を得ることができる。該粗生成物は、必要に応じて遠心分離、脱水、活性炭、蒸留、再結晶、カラムクロマトグラフィー等の精製操作を行って化学純度を高めることも可能である。
【００５２】
式［１］で表されるフルオロピルビン酸誘導体におけるＲが「Ｒは炭素数１〜１０の直鎖もしくは分岐鎖のアルキル基」のものを用いた場合、本発明においてＲは反応に関与せず、得られる光学活性フルオロ乳酸誘導体については、反応直前と変わりはないが、必要に応じて加水分解反応を行うことにより、対応する光学活性フルオロ乳酸を製造することもできる。
【００５３】
一方、式［１］で表されるフルオロピルビン酸誘導体におけるＲが「Ｒが水素原子」のものを用いた場合、得られる光学活性フルオロ乳酸誘導体は「光学活性フルオロ乳酸」および／または「光学活性フルオロ乳酸の金属塩」として得られることがある。「光学活性フルオロ乳酸の金属塩（例えばナトリウム塩）」は、不斉還元反応に関連してＮＡＤＨから発生するＮＡＤ+のＮＡＤＨへの再生に用いる際のギ酸ナトリウム由来のものであり、該金属塩の生成は反応系内のｐＨの値に依存するが、前述したように通常の後処理操作を行うことにより、容易に対応する光学活性フルオロ乳酸に誘導できる。
【実施例】
【００５４】
次に実施例を示すが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。尚、ＴＭＳはトリメチルシリル基を表す。【００５５】
光学純度は以下の分析方法で実施した。
［光学純度分析条件］
[３，３，３−トリフルオロ乳酸]
３，３，３−トリフルオロ乳酸の反応液に塩酸を加えてｐＨ２以下に調整した後、酢酸エチルにより抽出した。抽出液に対し等量のメタノールを加えてからＴＭＳ−ジアゾメタンにより３，３，３−トリフルオロ乳酸のカルボキシル基をメチルエステル化した。得られた３，３，３−トリフルオロ乳酸メチルをキラルカラム（ＢＧＢ−１７４、ＡＮＡＬＹＴＩＫ社製、３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）を用いたガスクロマトグラフィー法により分析した。キャリアガスは窒素、流量は１ｍｌ／ｍｉｎ、注入口温度２００℃、カラム温度は５５℃(５ｍｉｎ)→１５０℃（５℃／ｍｉｎ）→１５０℃(２ｍｉｎ)、気化室・検出器（ＦＩＤ）温度は２３０℃の分析条件で得られるピークの面積により光学純度を算出した。３，３，３−トリフルオロ乳酸メチルのそれぞれのエナンチオマーの保持時間は、Ｓ体が１７．７６ｍｉｎ、Ｒ体が１７．９２ｍｉｎであった。
[３，３−ジフルオロ乳酸]
３，３―ジフルオロ乳酸に関しても３，３，３−トリフルオロ乳酸の場合と同様の方法でメチルエステル化後、キラルカラム（ＢＧＢ−１７４、ＡＮＡＬＹＴＩＫ社製、３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）を用いたガスクロマトグラフィー法により分析した。キャリアガスは窒素、圧力１６３ＫＰａ、注入口温度２３０℃、カラム温度は５０℃(５ｍｉｎ)→１５０℃（５℃／ｍｉｎ）→１５０℃（５ｍｉｎ）、気化室・検出器（ＦＩＤ）温度は２３０℃の分析条件で得られるピークの面積により光学純度を算出した。３，３−ジフルオロ乳酸の各エナンチオマーの保持時間は、Ｓ体が２１．２３ｍｉｎ、Ｒ体が２０．２４ｍｉｎであった。【００５６】
［実施例１］
［３，３，３−トリフルオロピルビン酸の不斉還元に最適な酵素のスクリーニング］
酵素反応の基質である３，３，３−トリフルオロピルビン酸は３，３，３−トリフルオロピルビン酸エチル１７ｇと３，３，３−トリフルオロピルビン酸エチル１モルに対して１．２当量の水酸化ナトリウムを一日反応させ変換率１００％で３，３，３−トリフルオロピルビン酸を得た。
２００ｍｍｏｌ／ｌに調製したリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５、２０６ｍｍｏｌ／ｌ ギ酸ナトリウム、２２２ｍｍｏｌ／ｌ グルコース、５ｍｍｏｌ／ｌ ＮＡＤ+（ＮＡＤ+:ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型、以下同じ）、５ｍｍｏｌ／ｌ ＮＡＤＰ+（ＮＡＤＰ+:ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型、以下同じ））１ｍｌに上記の方法で得た３，３，３−トリフルオロピルビン酸を１質量％〜１．５質量％になるよう添加し、表１に示すα−ケト酸脱水素酵素またはα−ケト酸還元酵素をそれぞれ５ｍｇ加えてマグネチックスターラーで攪拌しながら２５℃で２日間反応させた。
反応後の反応液を前述の分析条件により光学純度を測定した。その結果を３，３，３−トリフルオロ乳酸への変換率と共に表１に示した。
【表１】
2015005341.tif 000008
【００５７】
［実施例２］
［ＣｈｉｒａｌｓｃｒｅｅｎＯＨTM Ｅ０７０による３，３，３−トリフルオロピルビン酸の不斉還元、エタノール添加による変換率の向上］
表２の番号１、３は５００ｍｍｏｌ／ｌに調製したリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０、６００ｍｍｏｌ／ｌ ギ酸ナトリウム、２ｍｍｏｌ／ｌ ＮＡＤ+）５ｍｌに４質量％と６．４質量％となるように実施例１で得た３，３，３−トリフルオロピルビン酸を添加し、酵素ＣｈｉｒａｌｓｃｒｅｅｎＯＨTM Ｅ０７０を５ｍｇ／ｍｌになるように加えマグネチックスターラーを用いて攪拌しながら２５℃で反応させた。表２の番号２、４は番号１、３の基質のモル量と同モル量のエタノールを添加し、番号１、３と同条件で２日間反応させた。
反応後の結果を表２に示す。エタノールを添加することによって光学純度を維持したまま変換率が向上した。基質濃度４％の場合、７０．２％から９４．９％に、基質濃度が６．４％の場合は３５．７％から９９．３％に向上した。
【表２】
2015005341.tif 000009
【００５８】
［実施例３］
［３，３，３−トリフルオロピルビン酸の不斉還元２０ｍｌ反応］
５００ｍｍｏｌ／ｌに調製したリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０、６００ｍｍｏｌ／ｌ ギ酸ナトリウム、２ｍｍｏｌ／ｌ ＮＡＤ+）２０ｍｌに実施例１で得た３，３，３−トリフルオロピルビン酸を８質量％加え、表１に示した酵素の中からＣｈｉｒａｌｓｃｒｅｅｎＯＨTM Ｅ０７０を１００ｍｇ添加した。更にエタノールを基質とモル比で等量になるように加え、マグネチックスターラーで攪拌しながら２５℃で２日間反応させた。反応液を前述の方法で分析した結果、変換率９７．２％、光学純度＞９９％ｅｅであった。その後、反応液を精製し、３，３，３−トリフルオロ乳酸のＳ体を１．５５ｇ得た。【００５９】
［実施例４］
［光学活性３，３，３−トリフルオロ乳酸の精製］
実施例３で得られた反応液に対してｐＨ２以下になるまで塩酸を添加した。その後、酢酸エチルを反応液量の１／２、アセトンを酢酸エチルと等量添加し、分液・抽出した。抽出液をセライト濾過後、減圧濃縮し、トルエン／ジ−ｉ−プロピルエーテル系での結晶化によって光学活性３，３，３−トリフルオロ乳酸を精製した。得られた３，３，３−トリフルオロ乳酸の光学純度は９９％以上、生成物の純度は９４．８％であった。【００６０】
［実施例５］
［ジフルオロピルビン酸の不斉還元に最適な酵素のスクリーニング］
２００ｍｍｏｌ／ｌに調製したリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５、２０６ｍｍｏｌ／ｌ ギ酸ナトリウム、２２２ｍｍｏｌ／ｌ グルコース、５ｍｍｏｌ／ｌ ＮＡＤ+、５ｍｍｏｌ／ｌ ＮＡＤＰ+）１ｍｌにジフルオロピルビン酸を１質量％〜１．５質量％になるよう添加し、表３に示すα−ケト酸脱水素酵素またはα−ケト酸還元酵素をそれぞれ５ｍｇ加えてマグネチックスターラーで攪拌しながら２５℃で２日間反応させた。反応後の反応液を前述の分析条件により光学純度を測定した。その結果を３，３−ジフルオロ乳酸への変換率と共に表３に示した。
【表３】
2015005341.tif 000010
【００６１】
［比較例１］
［３，３，３−トリフルオロピルビン酸エチルのアルコール脱水素酵素またはカルボニル還元酵素による不斉還元］
２００ｍｍｏｌ／ｌに調製したリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５、２０６ｍｍｏｌ／ｌ ギ酸ナトリウム、２２２ｍｍｏｌ／ｌ グルコース、５ｍｍｏｌ／ｌ ＮＡＤ+、５ｍｍｏｌ／ｌ ＮＡＤＰ+）１ｍｌに３，３，３−トリフルオロピルビン酸エチルを１質量％〜１．５質量％になるように添加し、表４に示すアルコール脱水素酵素またはカルボニル還元酵素をそれぞれ５ｍｇ加えてマグネチックスターラーで攪拌しながら２５℃で２日間反応させた。反応後の反応液を前述の分析条件により光学純度を測定した。その結果を３，３，３−トリフルオロ乳酸エチルへの変換率と共に表４に示した。
【表４】
2015005341.tif 000011
【００６２】
［比較例２］
比較例１と同様の反応条件で、３，３，３−トリフルオロピルビン酸エチルを基質に表５に示すアルコール脱水素酵素またはカルボニル還元酵素を用いて反応させた。結果を表５に表す。
【表５】
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【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明で対象とする光学活性フルオロ乳酸誘導体は、医農薬中間体、液晶や界面活性剤等の機能性有機化合物、機能性膜等の原料などに利用できる。
【国際調査報告】
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