(57)【要約】  （１）ＷＴ１抗原特異的Ｔ細胞受容体またはEpstein-Barrウイルス関連抗原特異的T細胞受容体を有するヒト多能性幹細胞を提供する工程、および（２）工程（１）の多能性幹細胞からT前駆細胞あるいは成熟Ｔ細胞を誘導する工程を含む、免疫細胞療法用Ｔ細胞を誘導する方法を提供する。多能性幹細胞としては特にｉＰＳ細胞が好適に用いられる。抗原特異的T細胞受容体を有するヒト多能性幹細胞は、所望の抗原特異性を有するＴ細胞からｉＰＳ細胞を誘導しても、ｉＰＳ細胞へ所望の抗原特異的Ｔ細胞受容体を導入して得てもよい。本願の方法で得られるＴ細胞は、がん、感染症をはじめ様々な免疫関連疾患の免疫細胞療法に用いることができる。
2016010155.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ＷＴ１抗原特異的Ｔ細胞受容体を有するヒト多能性幹細胞を提供する工程、および
（２）工程（１）の多能性幹細胞からT前駆細胞あるいは成熟Ｔ細胞を誘導する工程
を含む、免疫細胞療法用Ｔ細胞を誘導する方法。
【請求項２】
ＷＴ１抗原特異的Ｔ細胞受容体を有するヒト多能性幹細胞が、ＷＴ１抗原特異的ヒトＴ細胞から多能性幹細胞を誘導することによって得られる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＷＴ１抗原特異的ヒトＴ細胞が、免疫細胞療法対象者ではなく、ＷＴ１抗原を発現するがんに罹患しているあるいは同疾患の既往のあるヒトから得られたＴ細胞である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＷＴ１抗原特異的ヒトＴ細胞が、免疫細胞療法対象者ではなく、ＷＴ１抗原を発現するがんに罹患したことのないヒトから得られたＴ細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ＷＴ１抗原特異的Ｔ細胞受容体を有するヒト多能性幹細胞が、ヒト多能性幹細胞へWT1抗原特異的T細胞受容体遺伝子を導入することによって得られた多能性幹細胞である、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
（１）Epstein-Barrウイルス関連抗原特異的T細胞受容体を有するヒト多能性幹細胞を提供する工程、および
（２）工程（１）の多能性幹細胞からT前駆細胞あるいは成熟Ｔ細胞を誘導する工程
を含む、免疫細胞療法用Ｔ細胞を誘導する方法。
【請求項７】
Epstein-Barrウイルス関連抗原特異的T細胞受容体を有するヒト多能性幹細胞が、Epstein-Barrウイルス関連抗原特異的ヒトT細胞から多能性幹細胞を誘導することによって得られる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
Epstein-Barrウイルス関連抗原特異的ヒトT細胞が、免疫細胞療法対象者ではなく、Epstein-Barrウイルス関連疾患に罹患しているあるいは同疾患の既往のあるヒトから得られたＴ細胞である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
Epstein-Barrウイルス関連抗原特異的ヒトT細胞が、免疫細胞療法対象者ではなく、Epstein-Barrウイルス関連疾患に罹患したことのないヒトから得られたＴ細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
Epstein-Barrウイルス関連抗原特異的T細胞受容体を有するヒト多能性幹細胞が、Epstein-Barrウイルス関連抗原特異的T細胞受容体遺伝子をヒト多能性幹細胞へ導入することによって得られたものである、請求項６記載の方法。
【請求項１１】
Epstein-Barrウイルス関連抗原特異的ヒトT細胞が、LMP2抗原特異的T細胞である、請求項７〜９何れかに記載の方法。
【請求項１２】
抗原特異的Ｔ細胞受容体を有するヒト多能性幹細胞が、免疫細胞療法対象者のHLA型に完全に一致あるいは一部が一致するＨＬＡ型を有するヒト由来の多能性幹細胞である、請求項１〜１１いずれかに記載の方法。
【請求項１３】
抗原特異的Ｔ細胞受容体を有するヒト多能性幹細胞が、免疫細胞療法対象者のＨＬＡの何れか一方のハプロタイプをホモで有しているハプロタイプホモ接合型のＨＬＡを有しているヒトから得られたＴ細胞である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
さらに、多能性幹細胞から誘導されたＴ前駆細胞または成熟Ｔ細胞を、免疫細胞療法対象者由来のリンパ球と共培養して当該Ｔ細胞が患者に対するアロ反応性を有していないことを確認する工程を含む、請求項１〜１３何れかに記載の免疫細胞療法用Ｔ細胞を誘導する方法。
【請求項１５】
ヒト多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である請求項１〜１４何れかに記載の方法。
【請求項１６】
免疫細胞療法が、がん、感染症、自己免疫疾患およびアレルギーからなる群から選択される疾患を治療するためのものである、請求項１〜１５いずれかに記載の方法。
【請求項１７】
がんがＥＢウイルス関連のがんである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
感染症がＥＢウイルス関連である、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
がんがＷＴ１遺伝子を発現するがんである、請求項１６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は特定の抗原特異的Ｔ細胞受容体遺伝子を有する多能性幹細胞の製造方法に関する。本願また、当該多能性幹細胞からT細胞を誘導する方法に関する。本願はさらに、当該多能性幹細胞から誘導されたT細胞を用いる免疫細胞療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
WT1（Wilms tumor 1）抗原はがん抗原として研究が進められている抗原の一つで、多くの種類の固形がんのケースで高頻度に発現している。悪性腫瘍としての形質維持に関与していると考えられており、またがん幹細胞が発現していることが多いとされている。WT1をワクチンとして投与することによりWT1抗原特異的CTL（cytotoxic T Lymphocyte = 細胞障害性T細胞）を誘導する方法は、臨床試験が行われている。【０００３】
WT1抗原特異的Ｔ細胞受容体（TCR = T cell receptor）遺伝子が単離されており、それを患者の正常T細胞（多くのクローンの集合体）に発現させて患者の体内に戻す（自家移植）という遺伝子治療について臨床試験が実施されている。TCR発現の際に、患者の正常T細胞がもともと発現しているTCRをsiRNA等により抑制する。【０００４】
Epstein-Barr（EB）ウイルスは多様な病気の原因になるウイルスであるが、伝染性単核球症、悪性リンパ腫（バーキットリフォーマ）、上咽頭がんなどのがんの原因ともなる。EBウイルスに感染した細胞は、ウイルス由来のタンパク分子を発現するので、それらを抗原として用いることができる。すなわち、がんでありながら異物抗原を発現しており、免疫治療の対象としやすいという利点がある。【０００５】
EBウイルス関連抗原のうち、免疫細胞療法における標的抗原としてはLMP2(latent membrane protein 2)抗原がよく利用されている。LMP2抗原特異的T細胞レセプター（TCR = T cell receptor）遺伝子が単離されていて、それを患者の正常T細胞（多くのクローンの集合体）に発現させて患者の体内に戻す（自家移植）という遺伝子治療が計画されている。TCR発現の際に、患者の正常T細胞がもともと発現しているTCRはsiRNA等により抑制する。【０００６】
このTCR遺伝子療法には、少なくとも以下の3つの問題がある。1) レトロウイルスベクターを用いてTCR遺伝子の導入が行われるが、これはすなわち遺伝子治療であり、導入を受けた患者のT細胞ががん化する可能性がある。2)siRNAによる内因性TCRの抑制は完全ではなく、多様な内因性TCRa鎖やTCRb鎖と導入したTCRa鎖やTCRb鎖とのスワッピング等により、患者の組織を攻撃するような想定外の反応性が出現する危険性がある。3)患者ごとにT細胞の回収、遺伝子改変、投与を行う必要があり、事前準備ができず治療に時間がかかる。【０００７】
患者の末梢血からWT1特異的CTL等を採取してペプチドの存在下に増幅させ、自家移植を行う方法が提案されているが、かかる方法はIL-21の添加により相当効率よく行われるようになっている（Capuis et al, Science Translational Medicine, 5: 174ra27, 2013）。しかしながら、この方法においても４）WT1特異的CTLを大量に増やすのは技術的に困難である。５）増幅したクローンのTCRの親和性や特異性における能力が患者ごとに異なるので、安定した結果が得られず、また交叉反応性などの危険性が発生するが患者ごとの予測が困難である等の問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO2011/096482
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Chapuis et al, Sci Transl Med, 5:174ra27, 2013
【非特許文献２】Vizcardo et al., Cell Stem Cell. 12: 31-36. 2013.
【非特許文献３】Takahashi and Yamanaka, Cell 126, 663-673 (2006）
【非特許文献４】Takahashi et al., Cell 131, 861-872(2007)
【非特許文献５】Grskovic et al., Nat. Rev. Drug Dscov. 10,915-929(2011)
【非特許文献６】Anticancer Research 32(12); 5201-5209, 2012
【非特許文献７】Jurgens et al, Journal of Clinical Investigation, 26:22, 2006
【非特許文献８】Morgan R.A. et al, Science, 314:126. 2006
【非特許文献９】Timmermans et al., Journal of Immunology, 2009, 182: 6879-6888
【非特許文献１０】Blood 111:1318（2008）
【非特許文献１１】Nature Immunology 11: 585（2010）
【発明の概要】
【００１０】
本願は、特定の抗原、特にWT1抗原およびEBウイルス関連抗原に特異的なＴ細胞受容体遺伝子を有する多能性幹細胞を製造する方法を提供することを目的とする。本願はまた、当該多能性幹細胞からT細胞を誘導する方法を提供することを目的とする。本願はさらに、当該多能性幹細胞から誘導されたT細胞を用いる免疫細胞療法を提供することを目的とする。
【００１１】
本願はまた、特定の抗原、特にWT1抗原およびEBウイルス関連抗原に特異的なＴ細胞受容体遺伝子を有する多能性幹細胞を提供することを目的とする。
【００１２】
本願の第１の態様においては提供者からＷＴ１抗原特異的Ｔ細胞またはＥＢウイルス関連抗原特異的Ｔ細胞を単離または誘導し、当該Ｔ細胞から多能性幹細胞を誘導する方法を提供する。多能性幹細胞としてｉＰＳ細胞を誘導する場合、Ｔ細胞から誘導されたｉＰＳ細胞ををT-iPS細胞法という。WT1抗原特異的T細胞の提供者は健常人であっても、WT1抗原を有する癌患者であってもよい。EBウイルス関連抗原特異的T細胞の提供者は健常人であっても、EBウイルスが関連する疾患に罹患した患者であっても、発症はしていないがEBウイルスに感染経験のある健常人であってもよい。
【００１３】
本願の第２の態様においては、ＷＴ１抗原特異的Ｔ細胞受容体遺伝子またはＥＢウイルス関連抗原特異的Ｔ細胞受容体遺伝子を多能性幹細胞へ導入する工程を含む、特定の抗原特異的Ｔ細胞受容体遺伝子を有する多能性幹細胞を提供する方法に関する。なお、本明細書において、ｉＰＳ細胞にＴＣＲ遺伝子を導入した細胞をＴＣＲ−ｉＰＳ細胞といい、多能性幹細胞としてｉＰＳ細胞を用いる場合、かかる方法をＴＣＲ−ｉＰＳ細胞法という。
【００１４】
本願はさらに、WT1抗原特異的Ｔ細胞受容体遺伝子またはＥＢウイルス関連抗原を有する多能性幹細胞からT前駆細胞または成熟T細胞を誘導する工程を含む、免疫細胞療法用Ｔ細胞の製造方法を提供する。
【００１５】
本願の方法で得られるT前駆細胞または成熟T細胞は、細胞免疫療法に用いることができる。細胞免疫療法においては、本願の成熟T細胞は自家移植のみならず、HLAが一定以上一致した他人への他家移植による治療において特に好適に用いることができる。
【００１６】
他人由来のT細胞を移植するというアイデアは、従来よく知られている免疫細胞療法の常識に反するものでる。例えば血液系の悪性腫瘍（白血病など）では、造血幹細胞を移植する骨髄移植が行われるが、ドナーの骨髄がレシピエントによって拒絶されないように、通常はレシピエントと一致したHLA型のドナーから移植される。しかしながら他人間においては、HLA以外の多くのタンパク分子においてアミノ酸配列が不一致であり、ドナーT細胞はこれらの不一致を攻撃対象と認識し得る。その結果、移植したドナーT細胞の一部がレシピエントの体の細胞を攻撃する反応であるいわゆる移植片対宿主反応が生じる。HLAが一致していない場合は、この移植片対宿主反応はさらに強く起こる。これらは実際に骨髄移植後に高頻度に認められている。そのような背景から、医療関係者の間では「他人のT細胞を移植するのは危険」というのは常識である。
【００１７】
しかるに本願の発明により得られる特定の抗原特異的Ｔ細胞受容体遺伝子を有する多能性幹細胞から誘導されたT細胞を用いることにより、従来の技術認識における問題を予想外にも解決することができる。
【００１８】
すなわち、第１の態様であるT-iPS細胞法は遺伝子治療ではないので、遺伝子導入に起因する細胞癌化の危険性は生じない。またiPS細胞から再生されるCTLでは内在性のTCRの再構成が抑制され導入したTCRしか発現しないので、想定外の危険が生じることが無い。また、iPS段階で内在性TCR遺伝子の発現を制御すればより安全である。TCR-iPS細胞はクローンとして扱えるので、遺伝子挿入箇所を同定して安全なクローンを確定して用いることで遺伝子を傷つける危険性を回避できる。
【００１９】
本願においては、特定の抗原特異的Ｔ細胞受容体を有する多能性幹細胞をつくり、当該多能性幹細胞からT前駆細胞または成熟T細胞を誘導してこれを細胞免疫療法に用いる。かかる方法を採ることにより移植する細胞は単一の特異性を有するT細胞になるために移植片対宿主反応を起こす心配がなく、自家移植のみならず他家移植が可能になることを初めて見出した。すなわち、本願によってはじめて「T細胞を他人に移植する」ことが可能となる。
【００２０】
今まで提案されている種々のiPS細胞から分化誘導させたT細胞以外の細胞や組織を移植する治療法では、当該細胞が一生涯生着し続けることが期待されている。従って、他家移植を前提とするiPS細胞ストック事業においてiPS細胞から分化誘導される細胞を移植する際には、患者は免疫抑制剤を飲み続ける必要がある。この点は、自家iPS細胞と比して不利な点である。しかるに、本願におけるT-iPSまたはTCR−iPS細胞由来T細胞の場合、一定期間後に拒絶される。すなわちドナーとレシピエント間でHLAが一定以上一致するとはいえ、他人間ではマイナー組織適合抗原が一致しないのでいずれは拒絶される。この点で、iPS細胞を用いた他の細胞の他家移植とは全く異なり予想外の優れた効果が示される。
【００２１】
T-iPS細胞、TCR-iPS細胞ともに患者ごとにつくる必要はなく、あらかじめ多くの種類のT-iPS細胞やTCR−iPS細胞をつくっておくことができる。よってT-iPS細胞、TCR-iPS細胞レベル、またはかかる細胞から誘導したT前駆細胞もしくはT細胞レベルでバンク化することが可能である。すなわち、本願によってはじめて「T細胞を他人に移植する」を施行する体制の構築が大幅に加速されることになった。また、治療までの時間が短縮できるだけでなく、移植する前に移植細胞の品質の確認ができるというメリットもある。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施例１において健常人ボランティア由来Ｔ細胞からＬＭＰ２テトラマー陽性、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が誘導されたことを示すＦＡＣＳ解析結果。
【図２】実施例１においてHLA-A2402を有しかつEBウイルス既感染者でもある健常人ボランティアの末梢血よりＬＭＰ２ペプチドを用いて誘導されたＴ細胞が、ペプチド特異的キラー活性を有することを示す図。
【図３】ＬＭＰ２ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたｉＰＳ細胞コロニーの写真。
【図４】ＬＭＰ２ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ−ｉＰＳ細胞のＴ細胞への分化誘導過程（Ｄａｙ１３）の細胞のＦＡＣＳ解析結果。
【図５】ＬＭＰ２ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ−ｉＰＳ細胞のＴ細胞への分化誘導過程（Ｄａｙ３６）の細胞のＦＡＣＳ解析結果。
【図６】ＬＭＰ２ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ−ｉＰＳ細胞のＴ細胞への分化誘導過程（Ｄａｙ４１）の細胞のＦＡＣＳ解析結果。ＬＭＰ２特異的成熟Ｔ細胞（ＣＴＬ）が得られたことが確認された。
【図７】ＬＭＰ２ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ−ｉＰＳ細胞から再生した成熟Ｔ細胞（ＣＴＬ）のＬＭＰ２抗原特異的キラー活性を示す図。標的細胞としてＬＣＬを用い、ＬＭＰ２ペプチド存在（ｐ＋）、非存在（ｐ−）下でのＴ細胞のキラー活性を観察した。
【図８】ＬＭＰ２ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ−ｉＰＳ細胞から再生した成熟Ｔ細胞（ＣＴＬ）のナチュラルキラー細胞様キラー活性を観察した結果を示す図。
【図９】クローンＬＭＰ２＃１由来再生ＣＴＬのＬＣＬに対するペプチド特異的細胞傷害活性を示す図。
【図１０】実施例２において得られたクローンＬＭＰ２＃１３由来再生ＣＴＬのＬＣＬに対するペプチド特異的細胞傷害活性を示す図。
【図１１】実施例３において健常人ボランティア由来Ｔ細胞からＷＴ１テトラマー陽性、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が誘導されたことを示すＦＡＣＳ解析結果。
【図１２】ＷＴ１ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたｉＰＳ細胞コロニーの写真。
【図１３】ＷＴ１ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ−ｉＰＳ細胞のＴ細胞への分化誘導過程（Ｄａｙ１３）の細胞のＦＡＣＳ解析結果。
【図１４】ＷＴ１ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ−ｉＰＳ細胞のＴ細胞への分化誘導過程（Ｄａｙ３６）の細胞のＦＡＣＳ解析結果。
【図１５】実施例３で得たクローンWT1#9由来再生CTLのLCLに対するペプチド特異的細胞傷害活性を示す図。
【図１６】実施例4で得たクローンWT1#3-3由来再生CTLのLCLに対するペプチド特異的細胞傷害活性を示す図。
【図１７】クローンWT1#3-3由来再生CTLの白血病細胞株THP1に対する細胞傷害活性を示す。細胞傷害活性はHLAクラスIに対する抗体で完全にブロックされた。
【図１８】クローンWT1#3-3由来再生CTLの白血病細胞株HL60に対する細胞傷害活性を示す。細胞傷害活性はHLAクラスIに対する抗体で完全にブロックされた。
【図１９】pTA2ベクター。
【図２０】CS-UbC-RfA-IRES2-Venusベクター。
【図２１】WT1特異的TCR遺伝子をiPS細胞に導入することが出来たことを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書ならびに請求の範囲において「多能性幹細胞」とは、生体に存在する多くの細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、自己増殖能を併せもつ幹細胞である。多能性幹細胞には、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞、胚性生殖細胞（「ＥＧ細胞」）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などが例示される。本願では特に、多能性幹細胞は、好ましくは、哺乳動物の多能性幹細胞であり、より好ましくはヒト多能性幹細胞である。
【００２４】
本願明細書および請求の範囲において、「Ｔ細胞」とは表面にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と賞される抗原受容体を発現している細胞を意味する。Ｔ細胞からｉＰＳ細胞を誘導してもＴＣＲが維持されることは、例えばＷＯ２０１１／０９６４８２およびVizcardo et al., Cell Stem Cell 12、 31-36 2013に報告されている。
【００２５】
本願の第1の態様においては、所望の抗原特異的Ｔ細胞からｉＰＳ細胞を得る。ｉＰＳ細胞へと誘導されるＴ細胞としては、好ましくはＣＤ３を発現しており、且つＣＤ４及びＣＤ８からなる群から選択される少なくとも一の分子が発現しているＴ細胞である。このようなヒトＴ細胞としては、例えば、ＣＤ４陽性細胞であるヘルパー／制御性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性細胞である細胞傷害性Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞）、セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ−細胞）、及びターミナルエフェクターＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ−細胞）が挙げられる。
【００２６】
ヒトＴ細胞は、ヒトの組織から公知の手法により単離することができる。ヒトの組織としては、前記Ｔ細胞を含む組織であれば特に制限はないが、例えば、末梢血、リンパ節、骨髄、胸腺、脾臓、臍帯血、病変部組織が挙げられる。これらの中では、ヒトに対する侵襲性が低く、調製が容易であるという観点から、末梢血、臍帯血が好ましい。ヒトＴ細胞を単離するための公知の手法としては、例えば、後述の実施例に示すようなＣＤ４等の細胞表面マーカーに対する抗体と、セルソーターとを用いたフローサイトメトリーが挙げられる。また、サイトカインの分泌や機能性分子の発現を指標に、所望のＴ細胞を単離することも出来る。かかる場合、例えば、Ｔ細胞は、Ｔｈ１タイプかＴｈ２タイプかで分泌されるサイトカインが異なるので、そのようなサイトカインを指標に選別して、所望のＴｈタイプを有するＴ細胞を単離することができる。また、グランザイムやパーフォリンなどの分泌又は産生を指標として、細胞傷害性（キラー）Ｔ細胞を単離することが出来る。
【００２７】
WT1抗原特異的な細胞障害性T細胞は、ヒトより常法により取得したリンパ球を、WT1抗原またはそのエピトープペプチドにて刺激して得ることができる。WT1抗原のエピトープペプチドは複数が同定されており、WT1特異的細胞障害性T細胞を誘導する方法も良く知られている。または、WT1抗原を発現するがん細胞を用いてリンパ球を刺激してもよい。
【００２８】
WT1抗原特異的細胞傷害性T細胞は、WT1抗原を発現する癌に罹患している患者またはかかる癌の既往のある対象の細胞から誘導しても、健常人から誘導してもよい。
【００２９】
EBウイルス関連抗原特異的な細胞障害性T細胞は、ヒトより常法により取得したリンパ球を、EBウイルス関連抗原、例えばLMP2抗原またはそのエピトープペプチドにて刺激して得ることができる。EBウイルス関連抗原のエピトープペプチドは複数が同定されており、EBウイルス関連抗原特異的細胞障害性T細胞を誘導する方法も良く知られている。または、EBウイルス関連抗原を発現するがん細胞を用いてリンパ球を刺激してもよい。
【００３０】
EBウイルス関連抗原特異的細胞傷害性T細胞は、EBウイルス感染症やEBウイルス関連のがんを発症した患者の細胞から誘導しても、EBウイルスキャリアの健常人から誘導しても、EBウイルスに感染した経験のない健常人から誘導してもよい。
【００３１】
一般に抗原特異的なＴ細胞は感染症やがんの患者本人から採取することが考えられている。それは、抗原特異的Ｔ細胞は感染症やがん患者の体内で増幅されており、特定の反応性のＴ細胞を検出／採取しやすいと考えられているからである。本願ではそのように疾病を有する患者から疾病に関連する抗原に特異的なT細胞を採取し、それを他家移植用のT-iPS細胞の材料にする方法を提供する。一方で、本願においては健常人から抗原特異的T細胞を得る方法も提供する。健常人のＴ細胞から得たＴ−ｉＰＳ細胞を用いることにより、下記の効果が得られる：
１）健常人の細胞から種々の抗原特異的Ｔ細胞を誘導することができるため、予め多くの種類のＴＣＲ遺伝子を有するT-iPS細胞をつくっておくことができる。
２）健常人を対象とするので、Ｔ−ｉＰＳバンクを作製にあたってドナーを集めやすい。
【００３２】
特定の抗原特異的ヒトＴ細胞を単離する場合、「WT1抗原特異的またはＥＢウイルス関連抗原特異的なＴ細胞を含むヒト培養細胞またはヒトの組織より、目的の抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて精製する方法を採用することができる。また、所望の抗原を結合させたＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）を４量体化させたもの（いわゆる「ＭＨＣテトラマー」）を用いて、ヒトの組織より特定の抗原特異性、例えばＷＴ１抗原やＥＢウイルス関連抗原に特異性を有するＴ細胞を精製する方法も採用することができる。
【００３３】
上記のごとく得られるＷＴ１またはＥＢウイルス関連抗原特異的なＴ細胞から多能性幹細胞を誘導する。T細胞から多能性幹細胞細胞を得るには、例えばVizcardo et al., Cell Stem Cell 12、 31-36 2013に記載の方法を持ちいてもよい。例えば治療対象とする疾患に対する免疫を獲得した対象から所望の抗原特異的T細胞を得、この細胞へヤマナカ因子を導入してT-iPS細胞を得ることができる（Takahashi and Yamanaka, Cell 126, 663-673 (2006）, Takahashi et al., Cell 131, 861-872(2007) and Grskovic et al., Nat. Rev. Drug Dscov. 10,915-929(2011)) 。
【００３４】
人工多能性幹(iPS)細胞は、特定の初期化因子を、体細胞に作用させることによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；国際公開WO 2007/069666）。初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNAまたはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-coding RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotechnol., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する)
【００３５】
初期化因子は、その形態に応じた公知の方法にて体細胞へ接触、または体細胞内へ導入すればよい。
【００３６】
タンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、HIV由来のTATおよびポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。
【００３７】
DNAの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター(Science, 322, 945-949, 2008)、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（WO 2010/008054）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC、PAC)などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる(Science, 322:949-953, 2008)。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子(例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質(GFP)、βグルクロニダーゼ(GUS)、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞へ一旦導入して作用させた後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にLoxP配列を有してもよい。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する)
【００３８】
初期化因子がRNAの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良い。分解を抑制するため、5-メチルシチジンおよびpseudouridine (TriLink Biotechnologies)を取り込ませたRNAを初期化因子として用いても良い（Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7:618-630）。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する)
【００３９】
iPS細胞誘導のための培養液は、例えば、10〜15％FBSを含有するDMEM、DMEM/F12又はDME培養液（これらの培養液にはさらに、LIF、penicillin/streptomycin、puromycin、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）または市販の培養液[例えば、マウスES細胞培養用培養液(TX-WES培養液、トロンボＸ社)、霊長類ES細胞培養用培養液（霊長類ES/iPS細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（mTeSR、Stemcell Technology社）]などが例示される。
【００４０】
iPS細胞誘導の例としては、たとえば、37℃、5％CO2存在下にて、10％FBS含有DMEM又はDMEM/F12培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ約4〜7日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞(たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上にまきなおし、体細胞と初期化因子の接触から約10日後からbFGF含有霊長類ES細胞培養用培養液で培養することによって、該接触から約30〜約45日又はそれ以上ののちにES様コロニーを生じさせることができる。
【００４１】
あるいは、37℃、5% CO2存在下にて、フィーダー細胞(たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上で10％FBS含有DMEM培養液（これにはさらに、LIF、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で体細胞と初期化因子を接触させて培養し、約25〜約30日又はそれ以上ののちにES様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4:e8067またはWO2010/137746）、もしくは細胞外基質（例えば、Laminin-5（WO2009/123349）、Laminin-10（US2008/0213885）、その断片（WO2011/043405）およびマトリゲル（BD社））を用いる方法が例示される。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する)
【００４２】
この他にも、血清を含有しない培地を用いてiPS細胞を樹立する方法も例示される（Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:15720-15725）。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（0.1％以上、15％以下の酸素濃度）によりiPS細胞を樹立しても良い（Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:237-241またはWO2010/013845）。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する)
【００４３】
iPS細胞の樹立効率を高めるための成分として、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸 (VPA)、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool・ (Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、MEK阻害剤（例えば、PD184352、PD98059、U0126、SL327およびPD0325901）、Glycogen synthase kinase-3阻害剤（例えば、BioおよびCHIR99021）、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、5-azacytidine）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、BIX-01294 等の低分子阻害剤、Suv39hl、Suv39h2、SetDBlおよびG9aに対するsiRNAおよびshRNA等の核酸性発現阻害剤など）、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644)、酪酸、TGFβ阻害剤またはALK5阻害剤（例えば、LY364947、SB431542、616453およびA-83-01）、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA）、ARID3A阻害剤（例えば、ARID3Aに対するsiRNAおよびshRNA）、miR-291-3p、miR-294、miR-295およびmir-302などのmiRNA、Wnt Signaling（例えばsoluble Wnt3a）、神経ペプチドY、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンE2およびプロスタグランジンJ2）、hTERT、SV40LT、UTF1、IRX6、GLISl、PITX2、DMRTBl等が知られている。iPS細胞の樹立の際にはかかる樹立効率の改善目的にて用いられる成分を添加した培養液を用いてもよい。
【００４４】
上記培養の間には、培養開始2日目以降から毎日1回新鮮な培養液と培養液交換を行う。核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ100cm2あたり約5×103〜約5×106細胞の範囲である。
【００４５】
iPS細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Oct3/4、Nanog）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入し、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したiPS細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子として蛍光タンパク質遺伝子を導入し、蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、iPS細胞を選択することができる。誘導されたiPS細胞（T-iPS細胞）は由来するＴ細胞のT細胞受容体遺伝子を維持する。
【００４６】
本願の第２の態様においては、WT1遺伝子またはEBウイルス関連抗原特異的TCRの遺伝子を多能性幹細胞へ導入する。
種々のがんについてWT1やEBウイルスに対する抗原特異的ＴＣＲ遺伝子が報告されている(例えばAnticancer Research 32(12); 5201-5209, 2012 およびJurgens et al, Journal of Clinical Investigation, 26:22, 2006)。ＴＣＲ遺伝子はまた、所望の抗原特異的Ｔ細胞をがん患者や感染症患者から単離または誘導し、当該Ｔ細胞からＴＣＲの遺伝子を単離してもよい。本願においては、所望の抗原特異的ＴＣＲ遺伝子をドナー細胞から誘導された多能性幹細胞、例えばｉＰＳ細胞へ導入する。ＴＣＲ遺伝子のｉＰＳ細胞への導入は常套の方法で行えばよく、例えばMorgan R.A. et al, Science, 314:126. 2006に記載の方法に準じて行えば良い。具体的にはＴＣＲ遺伝子を適当なベクターに載せてｉＰＳ細胞へ導入すればよい。例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC、PAC)などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる。ベクターには、ＴＣＲが発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子(例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質(GFP)、βグルクロニダーゼ(GUS)、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。
【００４７】
所望のTCR遺伝子を有している多能性幹細胞を、T前駆細胞または成熟T細胞へと分化誘導する。多能性幹細胞からT細胞への分化誘導方法としては、例えばTimmermans et al., Journal of Immunology, 2009, 182: 6879-6888 に記載の方法が挙げられる。
【００４８】
本明細書ならびに請求の範囲において「T前駆細胞」とは、造血細胞の中の最も未分化な細胞である造血幹細胞に相当する段階から、正の選択/負の選択を受ける直前の細胞の段階に相当するまでを含む。T細胞の分化についてはBlood 111:1318（2008）およびNature Immunology 11: 585（2010）に説明されている。
【００４９】
T細胞には大きく分けてαβＴ細胞とγδＴ細胞があり、αβＴ細胞にはキラーT細胞とヘルパーT細胞が含まれる。本願は全てのT細胞を対象とする。Ｔ細胞はＴ前駆細胞およびＴ成熟細胞のいずれをも含むものとし、好ましくはＣＤ３を発現しており、且つＣＤ４及びＣＤ８からなる群から選択される少なくとも一の分子が発現しているＴ細胞を言うものとする。
【００５０】
いろいろな種類の固形がんや血液系のがんで高率にＷＴ１抗原の発現が確認されている。本願は、かかるＷＴ１抗原を発現する癌の免疫細胞療法へ応用することができる。
【００５１】
本願によって、WT1がん抗原やＥＢ関連抗原、例えばＬＭＰ２をターゲットとするT細胞製剤が提供される。具体例として、健常人のWT1抗原特異的T細胞やＬＭＰ２抗原特異的Ｔ細胞に由来するT-iPS細胞を作製し、そのT-iPS細胞から作製したT細胞を用いることができる。T-iPS細胞が由来する健常人の細胞を用いてそのT-iPS細胞から再生されたT細胞の機能を確認した上で、そのT-iPS細胞をバンク化して保存しておく。
治療対象とするのはWT1抗原を発現するがんに罹った患者のHLAを調べ、バンク化したT-iPS細胞から適合するHLA由来の細胞を選択し、当該T-iPS細胞から作製したT細胞を用いて細胞免疫治療が可能である。T-iPS細胞を予めT細胞まで分化誘導させた上で凍結保存しておけば、より多くの患者により迅速に投与できる。また投与した細胞はいずれ拒絶されるので投与細胞のがん化のリスクは考えなくてよい。
【００５２】
本願の免疫細胞療法においては、誘導されたT細胞を適当な媒体、例えば生理的食塩水やPBSに懸濁してHLAが一定以上一致する対象とする患者へ投与する。ドナーと患者とのHLA型は、完全に一致する場合、ドナーがHLAハプロタイプホモの場合には、少なくともその一方のHLAハプロタイプが一致する場合が例示される。患者への投与は経静脈的に行えばよい。投与量は限定的ではないが、成熟T細胞とする場合には106-107細胞/kgで、1回ないし複数回、患者へ経静脈投与する。T前駆細胞とする場合には、その10分の1-1000分の1程度の投与量でよい。
【００５３】
投与細胞数は特に限定されず、患者の年齢、性別、身長、体重、対象疾患、症状等に応じて適宜定めればよい。最適な投与細胞数は臨床試験により適宜決定すればよい。
T細胞は多様な抗原を攻撃対象とすることができ、本願の方法はがん、感染症、自己免疫疾患、アレルギーなどいろいろな疾患を対象とした免疫細胞療法への応用が可能である。
【００５４】
ＷＴ１遺伝子は、例えば、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌などの固形癌において天然型で高発現しており、ＷＴ１特異的なＴ−ｉＰＳ細胞またはＴＣＲ−ｉＰＳ細胞からＣＴＬ細胞を分化誘導した細胞を用いる場合には、ＷＴ１遺伝子を発現するこれら種々の癌の免疫細胞療法への応用が可能である。
【００５５】
また、Epstein-Barr（EB）ウイルスは多様な病気の原因になるウイルスであるが、伝染性単核球症、悪性リンパ腫（バーキットリフォーマ）、上咽頭がんなどのがんの原因ともなる。ＥＢウイルス関連抗原であるＬＭＰ２抗原特異的なＴＣＲを有するＴ−ｉＰＳ細胞またはＴＣＲ−ｉＰＳ細胞からＣＴＬ細胞を分化誘導した細胞を用いる場合には、ＥＢウイルス関連の感染症や癌、例えばホジキン病、バーキットリンパ腫、鼻咽頭癌、一部の胃癌、移植後の免疫療法への応用が可能である。
【実施例１】
【００５６】
ＥＢウイルス感染患者より得た末梢血単核球由来のＬＭＰ２抗原に特異性を有するＴ細胞よりＴ−ｉＰＳ細胞を誘導し（クローンLMP2#1）、当該Ｔ−ｉＰＳ細胞よりＬＭＰ２抗原特異的ＣＴＬ(再生LMP2-CTL#1)を誘導した。【００５７】
ＥＢウイルスは急性期には伝染性単核球症の原因となり、また時にバーキットリンパ腫などのがんの原因ともなるウイルスである。実施例でＴ細胞を提供しているのは、ＥＢウイルスに感染歴のある健常人である。このウイルスは、感染後リンパ球内に生涯にわたってとどまるので、この提供者はいわゆるＥＢウイルスキャリアーである。従ってこの提供者は、発症はしてないが、慢性ウイルス感染者とみなすことができる。【００５８】
1）LMP2抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の増幅
i)以下の培地を用いた。
樹状細胞用培地: CellGro (CellGenix)
【表１】
2016010155.tif 000003
ii) 以下のLMP2ペプチドを用いた。
LMP2: IYVLVMLVL（配列番号１）
LMP2テトラマーはMBLより購入した。
iii)以下のLCL(Lymphoblastoid cell line)を用いた。
京都大学病院血液腫瘍内科（日本国京都府京都市）にて健常人ボランティアＡから採取されたHLA-A2402を有するLCLを用いた。健常人ボランティアＡはEBウイルス既感染者であり、そのHLA型はHLA-A*02:06/24:02；B*39:01/40:02; C*07:02/15:02; DRB1*04:10/09:01である。【００５９】
A.ヒト末梢血より単球由来樹状細胞の誘導
1. HLA-A2402を有しかつEBウイルス既感染者でもある健常人ボランティアＡの末梢血よりCD14 microbeadsを用いて単球を単離した。洗浄後、樹状細胞用培地を加え、5 x 105/mLに調整した。
2. 最終濃度GM-CSF 800 U/mL （or 50 ng/mL）、IL-4 200 U/mL （or 40 ng/mL）になるようサイトカインを加えた。6-well plateに5 mL/wellでまく。37℃、5% CO2でインキュベートした。
3. インキュベートを3日間 (以下“Day 3”様に記載する) した後に、培養上清を2.5 mL/wellずつ、静かに取って捨てた。新しい樹状細胞用培地にGM-CSFを800 U/mL、IL-4を200 U/mLの濃度になるように加えた。
4. 各wellに3 mLずつ、新しい樹状細胞用培地を加えた。
5. Day 6に未成熟MoDCをプレートから回収し、少量の新しい樹状細胞用培地に浮遊させた。
6. 5 X 105/mLになるように細胞濃度を調整した。
7. GM-CSF （以下、最終濃度: 800 U/mL）、IL-4 （200 U/mL）、TNF-α （10 ng/mL）、PGE2 （1 μg/mL）を加え、24穴プレートに約5 X 105/1 mL/wellで細胞を播種した。
8. 37℃、5% CO2で24時間培養した。
9. 上記培養の最後の2時間にペプチドを加えた。ペプチドの最終濃度は10μｍとした。
DCを回収し、Ｔ細胞用培地で2回洗浄した。
10. DCの細胞数を数え、Ｔ細胞用培地で2 X 105/mLに調製した。【００６０】
B. ヒト末梢血よりＴ細胞の単離と樹状細胞との共培養
1. Aと同一の健常人ボランティアの末梢血より、CD3 microbeadsを用いてMACSにてＴ細胞を単離した。洗浄後、Ｔ細胞用培地を加え、2 x 106/mLに調整した。この時一部の細胞をフローサイトメトリー解析のために取り分けた。
2. 24穴プレートに、DC浮遊液（2 X 105/mL）を0.5mL/well、Ｔ細胞浮遊液（2 X 105/mL）を0.5mL/wellとなるように加えた。（DC: T = 1 X 105/well: 1 X 106/well = 1:10）
3. 3日目にIL-7（最終濃度5 ng/mL）、IL-15（最終濃度 10 ng/mL）を加えた。
4. 14日目に細胞を回収した。【００６１】
C.  LCLへのペプチド添加
1. LCLを培養中から回収し、35Gyの放射線照射を行った。
2. Ｔ細胞用培地に浮遊させ、5 X 105/mLとなるように調整した。
3. ペプチドを100nMで添加し2時間培養した。
4. LCLを回収し、Ｔ細胞用培地で洗浄後、2 X 105/mLとなるように調整した。【００６２】
D. LCLと樹状細胞で刺激したＴ細胞の共培養
1. 樹状細胞で刺激したＴ細胞をＴ細胞用培地に浮遊させ、2X106 cells/mLの濃度に懸濁した。
2. 24穴プレートに、ペプチドを加えて培養したLCL浮遊液（2X105/mL）を0.5mL/well、Ｔ細胞浮遊液（2 X 105/mL）を0.5mL/wellとなるように加えた（LCL:T = 1 X 105/well: 1 X 106/well = 1:10）。同時にペプチドを100nMとなるように添加した。
3.  3日目にIL-7（最終濃度5 ng/mL）、IL-15（最終濃度 1 ng/mL）を加えた。1週間ごとにサイトカインを添加したＴ細胞用培地で培地交換しながら2週間培養を行った。(LCLによるペプチド刺激1クール目)
4.   再度100nMのペプチドと加えた培地でLCLを2時間培養し、ここに CTLを加えた。
5.  3日目にIL-7（最終濃度5 ng/mL）とIL-15（最終濃度 1 ng/mL）を加えた。1週間ごとにサイトカインを添加したＴ細胞用培地で培地交換しながら2週間培養を行った。(LCLによるペプチド刺激2クール目)
6.  フローサイトメトリー解析により、CD8陽性Ｔ細胞中にCD8陽性LMP-2テトラマー陽性細胞が80%以上の割合で検出されることを確認した。結果を図１に示す。【００６３】
E. LMP2特異的CTLの抗原特異的キラー活性の測定
1. 標的細胞として用いるOUN-1白血病細胞株をCFSEラベルし、Ｔ細胞用培地に懸濁後、LMP2ペプチド1nM存在下で2時間培養を行った。
2.  96穴U底プレートに、ペプチド刺激によって増殖したLMP2特異的キラーＴ細胞とOUN-1白血病細胞株をそれぞれ0:1、1:9、1:3、1：1、3：1となるように混合し、ペプチド存在下もしくは非存在下において標的細胞の死細胞比率をCFSE陽性分画中に見られるAnnexinVとPI(Propidium Iodide)の比率によって検定した。結果を図２に示す。
3.  LMP2特異的キラーＴ細胞は標的細胞に対し、抗原特異的キラー活性を示すことを確認した。【００６４】
2) LMP2-T-iPS細胞の樹立
A.  LMP2特異的CTLの活性化
1. MACS beadsによりCD8陽性細胞を濃縮した。
2. 全ての細胞をＴ細胞用培地に浮遊させ、IL-7（最終濃度5 ng/mL）、IL-15（最終濃度 10 ng/mL）を加えた。さらにDynabeads Human T-Activator CD3/CD28をＴ細胞：beadsが1：1となるように添加し、2日間培養することでCD8陽性細胞を活性化した。【００６５】
B. センダイウィルスによる山中4因子とSV40の導入
1. 活性化させたLMP2特異的CTLをＴ細胞用培地に浮遊させ、山中4因子とSV40が組み込まれたセンダイウィルスを培地中に添加し、そのまま2日間培養した。
2. Ｔ細胞用培地で洗浄し、さらにIL-7（最終濃度5 ng/mL）、IL-15（最終濃度 1ng/mL）を加えたＴ細胞用培地で2日間培養した。
3. 全ての細胞を回収後、IL-7（最終濃度5 ng/mL）、IL-15（最終濃度 1ng/mL）を添加したＴ細胞用培地でＴ細胞を懸濁し、フィーダー細胞上に播種した。
4.  2日目にiPS細胞用培地にて半量交換し、翌日から毎日iPS細胞用培地への半量交換を行い続け、培養を続けた。【００６６】
C. iPS細胞コロニーのピックアップ
1. 培養3週間後にiPS細胞コロニーを目視により確認した。
2. 200ulチップによりコロニーを物理的に拾い上げた。
3. 各クローンを個別にｉＰＳ細胞として樹立した。得られたクローンの写真を図３に示す。【００６７】
3) LMP2-iPS細胞からＴ細胞への分化誘導
各培地として下記の組成を用いた。
【表２】
2016010155.tif 000004
*ペニシリン/ストレプトマイシン溶液は、ペニシリン10000U/mLおよびストレプトマイシン10000μg/mLからなり、それぞれの最終濃度を100U/mLおよび100μg/mLとした。【００６８】
【表３】
2016010155.tif 000005
*ペニシリン/ストレプトマイシン溶液は、ペニシリン10000U/mLおよびストレプトマイシン10000μg/mLからなり、それぞれの最終濃度を100U/mLおよび 100μg/mLとした。【００６９】
【表４】
2016010155.tif 000006
*ペニシリン/ストレプトマイシン溶液は、ペニシリン10000U/mLおよびストレプトマイシン10000μg/mLからなり、それぞれの最終濃度を100U/mLおよび100μg/mLとした。【００７０】
OP9細胞の準備
0.1% ゼラチン/PBS溶液6mlを10cm培養ディッシュに入れ、37℃で30分以上静置した。コンフルエントになったOP9細胞をトリプシン/EDTA溶液で剥がし、1/4相当量をゼラチンコートした10cm培養ディッシュに播種した。培地はmedium Aを10mlとなるように加えた。
4日後に播種したOP9細胞培養ディッシュに新たにmedium Aを10ml加え、全量が20mlとなるようにした。【００７１】
iPS細胞からの血球前駆細胞誘導
共培養に使用するOP9細胞の培地を吸引し、新しいmedium Aに交換した。またiPS細胞培養ディッシュの培地も同様に吸引し、新しいmedium Aを10ml加えた。EZ-passageローラーでiPS細胞塊を切った。カットしたiPS細胞塊を200ulピペットマンでピペッティングすることで浮遊させ、目視でおおよそ600個のiPS細胞塊をOP9細胞上に播種した。
iPS細胞1クローンあたり3枚以上のディッシュを用い、継代するときには細胞を一度一つに合わせてから同じ枚数に再分配することでディッシュ間のばらつきを減らした。【００７２】
Day 1 (培地交換)
iPS細胞塊が接着し分化し始めているかどうかを確認し、培地を新しいmedium A 20mlに交換した。
Day 5  (培地半量交換)
半量分の培地を新しいmedium A 10mlに交換した。
Day 9  (培地交換)
半量分の培地を新しいmedium A 10mlに交換した。
Day 13 (誘導した中胚葉細胞をOP9細胞上からOP9/DLL1細胞上へ移しかえる)
培地を吸引し、HBSS(+Mg+Ca)で細胞表面上の培地を洗い流した。その後250U  collagenase IV/HBSS(+Mg+Ca) 溶液10mlを加え、37℃で45分間培養した。【００７３】
Collagenase溶液を吸引し、PBS(-)10mlで洗い流した。その後5mlの0.05%トリプシン/EDTA溶液を加え、37℃で20分培養した。培養後、細胞が膜状に剥がれてくるのでピペッティングにより物理的に細かくした(接着細胞同士を離すため)。ここに新しいmedium Aを20ml加え、さらに37℃で45分間培養した。培養後、浮遊細胞を含む上清を、100μｍのメッシュを通して回収した。4℃、1200rpmで7分間遠心し、ペレットを10mlのmedium Bに懸濁させた。このうち1/10をFACS解析用にとりわけ、残りの細胞を新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。複数枚のディッシュから得た細胞をプールした場合、元々の枚数と同じ枚数になるように再分配して細胞を播き直した。【００７４】
得られた細胞に造血前駆細胞が含まれているかどうかを確かめるために抗CD34抗体、抗CD43抗体を用いてFACS解析した。結果を図４に示す。CD34lowCD43+細胞分画に十分な細胞数が確認できたことから、造血前駆細胞が誘導されていると確認した。【００７５】
C. 血球前駆細胞からのＴ細胞分化誘導
次いで細胞をOP9/DLL1細胞上に播種した。この工程において、CD34lowCD43+細胞分画の細胞のソーティングは行わなかった。(この分画をソーティングした場合、得られる細胞数が減少してしまうことやソーティングによる細胞へのダメージから、ソーティングしなかった場合に比べてＴ細胞への分化誘導効率が落ちることがある。)【００７６】
培養期間中に分化段階を確認するためにFACS解析を行うが、全ての期間において培養中に死細胞が多くみられた。そのためFACS解析時にはPI (Propidium Iodide)、7-AADなどを用い、死細胞除去したうえで解析を行った。【００７７】
Day 16 (細胞の継代)
OP9細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし、100μｍのメッシュを通して50mlコニカルチューブに回収した。4℃、1200rpmで7分間遠心し、ペレットを10mlのmedium Bに懸濁させた。これらの細胞を新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。【００７８】
Day 23 (細胞の継代): 血液細胞コロニーが見え始める。
OP9細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし、100μｍのメッシュを通して50mlコニカルチューブに回収した。4℃、1200rpmで7分間遠心し、ペレットを10mlのmedium Bに懸濁させた。【００７９】
Day 36: LMP2テトラマー陽性Ｔ細胞の確認。
ＬＭＰ２特異的Ｔ細胞が誘導されているかどうかを確かめるために抗ＣＤ３抗体、ＬＭＰ２テトラマーを用いてＦＡＣＳ解析した。
結果を図５に示す。Ｔ細胞マーカーであるＣＤ３＋細胞がみられるようになり、一部の細胞はＣＤ３＋ＬＭＰ２テトラマー＋にまで分化していることが確認された。【００８０】
D. 未熟Ｔ細胞段階から成熟キラーＴ細胞段階への誘導
Day36において、フローサイトメトリーでLMP2陽性Ｔ細胞を確認後、成熟キラーＴ細胞(CD8SP細胞)を誘導するためにここでIL-15を添加した。24穴プレートに新たにOP9/DLL1細胞を用意しておき、medium Cに懸濁したＴ細胞を3x105個/wellとなるように播種し。ここにIL-15（最終濃度10ng/mL）を添加した。【００８１】
Day41: 成熟キラーＴ細胞が現れる。
ＩＬ−１５添加の５日目に、ＦＡＣＳ解析した。結果を図６に示す。成熟ＣＤ８シングルポジティブ細胞が生成したことが確認された。【００８２】
4) 再生したLMP2特異的CTLの抗原特異的キラー活性の測定
1. 標的細胞として用いるLCLをCFSEラベルし、Ｔ細胞用培地に懸濁後、LMP2ペプチド1nM存在下で2時間培養を行った。
2. 96穴U底プレートに、再生したCD8Ｔ細胞と標的細胞として用いるLCLをれぞれ0:1、1:9、  1:3、  1：1、  3：1、10:1、30：1となるように混合し、ペプチド存在下（p+）もしくは非存在下（p-）において標的細胞の死細胞比率をCFSE陽性分画中に見られるAnnexinVとPI(Propidium Iodide)によって検定した。
3.  結果を図７に示す。LMP2特異的キラーＴ細胞は標的細胞として用いたLCL(HLA-A2402)に対し、抗原特異的キラー活性を示すことが確認された。【００８３】
5) 再生したLMP2特異的CTLのナチュラルキラー細胞様キラー活性の測定
1. 標的細胞としてHLAを表面に発現しないK562細胞株（アロ反応性）と健常人ボランティアＡの自己末梢単核球（MA p-）（オート反応性）を用いた。これらの細胞をCFSEにてラベルし、Ｔ細胞用培地に懸濁した。
2. 96穴U底プレートに、再生したCD8Ｔ細胞と標的細胞として用いるLCLをれぞれ0:1、1:9、  1:3、  1：1、  3：1となるように混合し、標的細胞の死細胞比率をCFSE陽性分画中に見られるAnnexinVとPI(Propidium Iodide)によって検定した。
3.  結果を図８に示す。LMP2特異的キラーＴ細胞は自己末梢単核球（MA p-）は傷害しなかったが、K562に対して高いキラー活性を示したことから、ナチュラルキラー様キラー活性を示すことを確認した。【００８４】
6) 再生したLMP2特異的CTLの抗原特異的キラー活性の測定
方法)
1. 標的細胞として用いるLCLをCFSEラベルし、T細胞用培地に懸濁後、LMP2ペプチド存在下で2時間培養を行った。
2. 96穴U底プレートに、再生したCD8シングルポジティブT細胞（再生LMP2-CTL(#1)）と標的細胞として用いるLCLをそれぞれ0:1、1:3、1：1、3：1、9:1となるように混合し、いろいろな濃度のLMP2ペプチド存在下もしくは非存在下において共培養を行った。6時間後に、標的細胞の死細胞比率をCFSE陽性分画中に見られるAnnexinV陽性細胞率によって検定した。結果を図９に示す。
３．再生LMP2-CTL(#1)はペプチドをロードした標的細胞に対して高い抗原特異的細胞傷害活性を示した。【００８５】
7) クローンLMP2＃1のTCRα鎖およびβ鎖の配列を決定した。
TCRα鎖     TRAV26-1*01-CIVTRFYTDKLIF-TRAJ34*01  (配列番号３)
TCRβ鎖     TRBV14*02-CASSSPGSRPYNEQFF-TRBJ2-1*01  (配列番号４)
【実施例２】
【００８６】
実施例１とは別の健常人ボランティアから、実施例１の手順に従いＬＭＰ２ペプチド特異的ＣＴＬを誘導し、当該ＣＴＬからＴ−ｉＰＳ細胞を誘導し(クローンLMP2#13)、更にＴ−ｉＰＳ細胞からＣＤ８シングルポジティブＴ細胞（再生LMP2-CTL(#13)）を得た。使用したＬＭＰ２ペプチドは実施例１と同じである。得られた再生LMP2-CTL(#13)のペプチド特異的ＣＴＬ活性を、ペプチドをロードしたＬＣＬ細胞を標的細胞として用いた細胞傷害活性により確認した。結果を図１０に示す。実施例２の健常人ボランティアはＥＢウイルス既感染者（EBNA抗体陽性）であり、下記ＨＬＡ型を有する：
HLA-A*02:10/24:02；B*07:02/40:06; C*07:02/08:01; DRB1*04:05/04:05【００８７】
再生LMP2-CTL（＃13）はペプチドをロードした標的細胞に対して高い抗原特異的細胞傷害活性を示した。【００８８】
また、常法によりクローンLMP2＃13のＴＣＲα鎖、β鎖のアミノ酸配列を特定した。
TCRα鎖     TRAV25*01-CAGERGSTLGRLYF-TRAJ18*01  (配列番号５)
TCRβ鎖     TRBV7-9*03-CASSPLSTGNYEQYF-TRBJ2-7*01  (配列番号６)
【実施例３】
【００８９】
健常人ボランティアの末梢血より誘導したＷＴ１抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）からＴ−ｉＰＳ細胞を誘導し（クローンWT1#9）、当該Ｔ−ｉＰＳ細胞よりＷＴ１抗原特異的成熟Ｔ細胞（再生WT1-CTL(#9)）を誘導した。【００９０】
実施例は、以下の構成である。
1）WT1抗原特異的CTLの増幅
2)  WT1-T-iPS細胞の樹立
3)  WT1-T-iPS細胞からCD8シングルポジティブＴ細胞（CTL）への分化誘導
4)  3)で得た再生WT1-CTLの抗原特異的細胞傷害活性の確認【００９１】
1）WT1抗原特異的CTLの増幅
i)用いた培地は以下の通りである。
【表５】
2016010155.tif 000007
ii) 用いたWT1ペプチドは以下の通りである。
WT1 (改変型：CYTWNQMNL(配列番号２)、 Cancer Immunol. Immunothera. 51: 614 (2002))
以下で使用しているWT1ペプチド、WT1テトラマーともに改変型を用いた。
iii) 用いたLCL(Lymphoblastoid cell line)は以下のとおりである
京都大学病院血液腫瘍内科（日本国京都府京都市）にて健常人ボランティアから採取されたHLA-A2402を有するLCLを用いた。【００９２】
A.ヒト末梢血からのＴ細胞の単離とペプチドによる刺激
1.  健常人ボランティアの末梢血より単核球をFicollによって精製し、Ｔ細胞培地で懸濁した。健常人ボランティアのHLA型はHLA-A*02:01/24:02；B*15:01/15:11; C*03:03/08:01; DRB1*12:01/12:02である。
2. 96穴U底プレートに1穴あたり2.5 x 105/mLとなるように細胞を播種し、ペプチドを10μｍ となるように添加した。
3.3日目にIL-2(最終濃度  12.5U/mL)、 IL-7（最終濃度5 ng/mL）、IL-15（最終濃度 1 ng/mL）を加え、1週間ごとにサイトカインを添加したＴ細胞用培地で培地交換しながら2週間培養を行った。【００９３】
B.  LCLへのペプチド添加
1.LCLを回収し、35Gyの放射線照射を行った。
2. Ｔ細胞用培地に浮遊させ、5 X 105/mLとなるように調整した。
3. ペプチドを100 nMで添加し2時間培養した。
4. LCLを回収し、Ｔ細胞用培地で洗浄後、2 X 105/mLとなるように調整した。【００９４】
C.ペプチドをパルスしたLCLとＴ細胞との共培養
1.ペプチド刺激を加えた後、2週間培養したＴ細胞を回収し、洗浄後にＴ細胞用培地に懸濁し、2 x 106/mLに調整した。この時一部の細胞をフローサイトメトリー解析のために取り分けた。
2.24穴プレートに、ペプチドを加えて培養したLCLの浮遊液（2 X 105/mL）を0.5mL/well、Ｔ細胞浮遊液（2 X 105/mL）を0.5mL/wellとなるように加えた（LCL: T = 1 X 105/well: 1 X 106/well = 1:10）。 
3.   3日目にIL-2(最終濃度  12.5U/mL)、 IL-7（最終濃度5 ng/mL）、IL-15（最終濃度 1 ng/mL）を加えた。1週間ごとにサイトカインを添加したＴ細胞用培地で培地交換しながら2週間培養を行った。(LCLによるペプチド刺激1クール目)
4. 再度100nMのペプチドと加えた培地でLCLを2時間培養し、ここに CTLを加えた。 
5. 3日目にIL-2(最終濃度  12.5U/mL)、 IL-7（最終濃度5 ng/mL）、IL-15（最終濃度 1 ng/mL）を加えた。1週間ごとにサイトカインを添加したＴ細胞用培地で培地交換しながら2週間培養を行った。(LCLによるペプチド刺激2クール目)
6. 再度100nMのペプチドと加えた培地でLCLを2時間培養し、ここに CTLを加えた。
7. 3日目にIL-2(最終濃度  12.5U/mL)、 IL-7（最終濃度5 ng/mL）、IL-15（最終濃度 1 ng/mL）を加えた。1週間ごとにサイトカインを添加したＴ細胞用培地で培地交換しながら2週間培養を行った。(LCLによるペプチド刺激3クール目)
8.  フローサイトメトリー解析を行った。結果を図11に示す。CD8陽性WT1テトラマー陽性分画がCD8陽性Ｔ細胞中に60%以上の割合で検出されることを確認した。【００９５】
2) WT1-T-iPS細胞の樹立
A.  WT1特異的CTLの活性化
1. MACS beadsによりCD8陽性細胞を濃縮した。
2. 全ての細胞をＴ細胞用培地に浮遊させ、IL-2 (最終濃度  12.5U/mL)、 IL-7（最終濃度5 ng/mL）、IL-15（最終濃度 1ng/mL）を加えた。さらにDynabeads Human T-Activator CD3/CD28をＴ細胞：beadsが1：1となるように添加し、2日間培養することでCD8陽性細胞を活性化した。【００９６】
B. センダイウィルスによる山中4因子とSV40の導入
1.活性化させたWT1特異的CTLをＴ細胞用培地に浮遊させ、山中4因子とSV40が組み込まれたセンダイウィルスを培地中に添加し、そのまま2日間培養した。
2.Ｔ細胞用培地で洗浄し、さらにIL-2 (最終濃度  12.5U/mL)、 IL-7（最終濃度5 ng/mL）、IL-15（最終濃度 1ng/mL）を加えたＴ細胞用培地で2日間培養した。
3.   全ての細胞を回収後、サイトカインを含まないＴ細胞用培地でＴ細胞を懸濁し、フィーダー細胞上に播種した。
4.  2日目にiPS細胞用培地に半量交換し、翌日から毎日iPS細胞用培地への半量交換を行い続け、培養を続けた。【００９７】
C. iPS細胞コロニーのピックアップ
1.3週間後にiPS細胞コロニーを目視により確認した。
2. 200ulチップによりコロニーを物理的に拾い上げた。
3. 各クローンを個別に樹立した。得られたクローンのコロニーを図１２に示す。【００９８】
3) WT1-T-iPS細胞からＴ細胞への分化誘導
各培地の組成を下記に示す。
【表６】
2016010155.tif 000008
*ペニシリン/ストレプトマイシン溶液は、ペニシリン10000U/mLおよびストレプトマイシン10000μg/mLからなり、それぞれの最終濃度を100U/mLおよび100μg/mLとした。【００９９】
【表７】
2016010155.tif 000009
*ペニシリン/ストレプトマイシン溶液は、ペニシリン10000U/mLおよびストレプトマイシン10000μg/mLからなり、それぞれの最終濃度を100U/mLおよび 100μg/mLとした。【０１００】
OP9細胞の準備
0.1% ゼラチン/PBS溶液6mlを10cm培養ディッシュに入れ，37℃で30分以上静置した。コンフルエントになったOP9細胞をトリプシン/EDTA溶液で剥がし，1/4相当量をゼラチンコートした10cm培養ディッシュに播種した。培地はmedium Aを10mlとなるように加えた。
4日後に播種したOP9細胞培養ディッシュに新たにmedium Aを10ml加え，全量が20mlとなるようにした。【０１０１】
iPS細胞からの血球前駆細胞誘導
共培養に使用するOP9細胞の培地を吸引し，新しいmedium Aに交換した。またiPS細胞培養ディッシュの培地も同様に吸引し，新しいmedium Aを10ml加えた。EZ-passageローラーでiPS細胞を切った。カットしたiPS細胞塊を200ulピペットマンでピペッティングすることで浮遊させ，目視でおおよそ600個のiPS細胞塊をOP9細胞上に播種した。
iPS細胞1クローンあたり3枚以上のディッシュを用い，継代するときには細胞を一度一つに合わせてから同じ枚数に再分配することでディッシュ間のばらつきを減らした。
Day 1 (培地交換)
iPS細胞塊が接着し分化し始めているかどうかを確認し，培地を新しいmedium A 20mlに交換した。
Day 5  (培地半量交換)
半量分の培地を新しいmedium A 10mlに交換した。
Day 9  (培地交換)
半量分の培地を新しいmedium A 10mlに交換した。
Day 13 (誘導した中胚葉細胞をOP9細胞上からOP9/DLL1細胞上へ移しかえる)
培地を吸引し、HBSS(+Mg+Ca)で細胞表面上の培地を洗い流した。その後250U  collagenase IV/HBSS(+Mg+Ca) 溶液10mlを加え、37℃で45分間培養した。
Collagenase溶液を吸引し、PBS(-)10mlで洗い流す。その後5mlの0.05%トリプシン/EDTA溶液を加え、37℃で20分培養した。培養後、細胞が膜状に剥がれてくるので、ピペッティングにより物理的に細かくした(接着細胞同士を離すため)。ここに新しいmedium Aを20ml加え、さらに37℃で45分間培養した。培養後、浮遊細胞を含む上清を、100μｍのメッシュを通して回収した。4℃、1200rpmで7分間遠心し、ペレットを10mlのmedium Bに懸濁させた。このうち1/10をFACS解析用にとりわけ、残りの細胞を新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。複数枚のディッシュから得た細胞をプールした場合、元々の枚数と同じ枚数になるように再分配して細胞を播き直した。【０１０２】
得られた細胞に造血前駆細胞が含まれているかどうかを確かめるために抗CD34抗体、抗CD43抗体を用いてFACS解析した。結果を図１３に示す。ＣＤ３４ｌｏｗＣＤ４３＋細胞分画に十分な細胞数が確認できたことから、造血前駆細胞が誘導されていると確認した。【０１０３】
C. 血球前駆細胞からのＴ細胞分化誘導
次いで細胞をOP9/DLL1細胞上に播種した。この工程において、ＣＤ３４ｌｏｗＣＤ４３＋細胞分画の細胞のソーティングは行わなかった。この分画をソーティングした場合、得られる細胞数が減少してしまうことやソーティングによる細胞へのダメージから、ソーティングしなかった場合に比べてＴ細胞への分化誘導効率が落ちることがある。
Day 16 (細胞の継代)
OP9細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし、100μｍのメッシュを通して50mlコニカルチューブに回収した。4℃、1200rpmで7分間遠心し、ペレットを10mlのmedium Bに懸濁させた。これらの細胞を新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。
Day 23 (細胞の継代): 血液細胞コロニーが見え始める。
OP9細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし、100μｍのメッシュを通して50mlコニカルチューブに回収した。4℃、1200rpmで7分間遠心し、ペレットを10mlのmedium Bに懸濁させた。
Day 36 : WT1テトラマー陽性Ｔ細胞の確認。
WT1特異的Ｔ細胞が誘導されているかどうかを確かめるために抗CD3抗体、WT1テトラマーを用いてFACS解析した。結果を図１４に示す。
Ｔ細胞マーカーであるＣＤ３＋細胞がみられるようになり、大部分の細胞はＣＤ３＋ＷＴ１テトラマー＋にまで分化していることが確認された。【０１０４】
上記のとおり、誘導されたＴ細胞が、元のＴ細胞と同じ抗原特異性を示すＴ細胞となることが確認された。また、得られたＴ細胞は成熟した細胞が出す表面抗原を発現していることから、機能的によく成熟していることが確認された。【０１０５】
また、クローンWT1＃9のＴＣＲα鎖およびβ鎖の配列を常法により決定した。
TCRα鎖     TRAV12-3*01-CAMIRGNTDKLIF-TRAJ34*01  (配列番号７)
TCRβ鎖     TRBV5-5*02-CASSFPSYEQYF-TRBJ2-7*01  (配列番号８)【０１０６】
４) WT1-T-iPS細胞分化誘導されたＴ細胞の抗原特異的細胞傷害活性
1.  標的細胞として用いるLCLをCFSEラベルし、T細胞用培地に懸濁後、WT1ペプチド(配列番号２)の存在下で2時間培養を行った。
2. 96穴U底プレートに、再生したCD8シングルポジティブT細胞と標的細胞として用いるLCLをれぞれ0:1、1:3、1：1、3：1、9:1となるように混合し、いろいろな濃度のペプチド存在下もしくは非存在下において共培養を行った。6時間後に、標的細胞の死細胞比率をCFSE陽性分画中に見られるAnnexinV陽性細胞率によって検定した。【０１０７】
再生WT1-CTL（＃9）はペプチドをロードした標的細胞に対して高い抗原特異的細胞傷害活性を示した(図１５)。
【実施例４】
【０１０８】
実施例３と同一の健常人ボランティアから、実施例３の手順に従いWT1ペプチド特異的ＣＴＬを誘導し、当該ＣＴＬからＴ−ｉＰＳ細胞（クローンWT1#3-3）を誘導し、更にＴ−ｉＰＳ細胞からＣＤ８シングルポジティブＴ細胞（再生WT1-CTL(#3-3)）を得た。使用したWT1ペプドは実施例３と同じである。得られた再生WT1-CTL(#3-3)のペプチド特異的ＣＴＬ活性を、当該ペプチドをロードしたＬＣＬ細胞を標的細胞として用いた細胞傷害活性試験により確認した。【０１０９】
結果を図１６に示す。再生WT1-CTL（＃3-3）はペプチドをロードした標的細胞に対して高い抗原特異的細胞傷害活性を示した。【０１１０】
また、再生WT1-CTL（＃3-3）のWT1抗原を発現する白血病細胞株THP1並びに同じくWT1抗原を発現する白血病細胞株HL60に対する細胞傷害活性、並びにHLAクラスIに対する抗体によってその細胞傷害活性がブロックできるかどうかを調べた。結果を図１７および図１８に示す。
再生WT1-CTL(#3-3)はWT1を発現するTHP-1およびHL60株両方に対して細胞傷害活性を示し、かかる細胞傷害活性はHLAクラスIに対する抗体で完全にブロックされた。この結果から、再生WT1-CTL(#3-3)はWT1抗原特異的に白血病細胞を殺傷していると考えられる。【０１１１】
クローンWT1＃3-3のＴＣＲのα鎖、β鎖の配列を決定した。
TCRα鎖     TRAV12-1*01-CVVRGGGFKTIF-TRAJ9*01  (配列番号９)
TCRβ鎖     TRBV20-1*01-CSARAGTGGANVLTF-TRBJ2-6*01  (配列番号１０)
【実施例５】
【０１１２】
クラスI拘束性ＷＴ１抗原特異的ＴＣＲを導入したHLAハプロタイプホモｉＰＳ細胞の作製
導入する対象の細胞としては実施例2と同じく京都大学再生医科学研究所再生免疫学分野（日本国京都府京都市）にて健常人末梢血単球より作製されたHLAハプロタイプホモ型iPS細胞を用いた。
導入したWT1特異的TCR遺伝子は、京都大学再生医科学研究所再生免疫学分野（日本国京都府京都市）にてClonn#9とClone#3-3からクローニングされたクラスI拘束性WT1特異的TCR遺伝子である。【０１１３】
1) RACE（rapid amplification of cDNA ends）法によるWT1特異的TCRのクローニング
クローンとなるように増幅したWT1特異的CTLもしくはWT1-T-iPS細胞から誘導されたCTLからRNAを調整する。SMARTer RACE cDNA増幅キット（クロンテック社）を用いて完全長cDNAを得、これを鋳型とした。 TCRα鎖の3’側からのプライマー（CACAGGCTGTCTTACAATCTTGCAGATC（配列番号１１））もしくはTCRβ鎖の3’側からのプライマー2種(CTCCACTTCCAGGGCTGCCTTCA(配列番号１２)またはTGACCTGGGATGGTTTTGGAGCTA(配列番号１３))を用い、PCR反応によってWT1-TCRの二本鎖cDNAを得た。得られた二本鎖cDNAをpTA2ベクター（東洋紡社、図１９）に組み込み、細胞株に導入することでWT1 TCRの特異性などの検定を行った。【０１１４】
2) WT1-TCRを組み込んだレンチウィルスベクターの作製
独立行政法人理化学研究所  バイオリソースセンター  細胞運命情報解析技術開発サブチーム（日本国茨城県つくば市）より提供されたCS-UbC-RfA-IRES2-Venusベクター(図２０)を用い、GatewayシステムによりWT1-TCRを導入したCS-UbC-RfA-IRES2-Venus/WT1-TCRを作製した。【０１１５】
3) WT1-TCRを組み込んだレンチウィルス上清の作製
CS-UbC-RfA-IRES2-Venus/WT1-TCRをX-treamGENE9（ロシュ社）を用いてパッケージング細胞LentiX-293Tに導入した。翌日に培地交換を行い，2日目にレンチウィルスを含む培養上清を回収し，レンチウィルス上清として用いた。【０１１６】
4) WT1-TCR transduced-T-iPS細胞の樹立
LMP2-T-iPS細胞をTrypLE Select (ライフテクノロジーズ社)を用いて完全な単一細胞とする。遠心後，ペレットをレンチウィルス上清で懸濁し，32℃,3000rpmで1時間遠心し，LMP2-T-iPS細胞に感染させることでWT1-TCRをLMP2-T-iPS細胞に導入した。【０１１７】
２.遺伝子導入後のiPS細胞を単個細胞懸濁液とし、フローサイトメトリーで解析した。結果を図２１に示す。Clonn#9とClone#3-3ともにWT1特異的TCR遺伝子がiPS細胞に導入されていることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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