【事件の表示】
　特願２００３−　５２２２６「ＰＨＡの製造方法」拒絶査定不服審判事件〔平成１６年　９月１６日出願公開、特開２００４−２５４６６８〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
１．手続の経緯・本願発明
　本願は，平成１５年２月２８日を出願日とする特許出願であって，その請求項１に係る発明（以下，「本願発明」という。）は，平成２２年３月２４日付手続補正書の特許請求の範囲の請求項１に記載された事項により特定される以下のとおりのものである。　
「【請求項１】　廃食用油を炭素源として，前処理をせずにRalstonia eutrophaと混ぜ，該Ralstonia eutrophaの菌体内にＰＨＡを産生させることを特徴とするＰＨＡの製造方法。」
　
３．引用例
（１）引用例２
　当審による拒絶理由で引用文献２として引用された，本願出願日前に頒布された刊行物である，Appl.Microbiol.Biotechnol., 1998, Vol.49, No.3, p.333-336（以下，「引用例２」という。）には，以下の事項が記載されている。
　
ア．「Alcaligenes eutrophus及びその組換え株による植物油からのポリヒドロキシアルカン酸の効率的な生産」(第３３３頁，標題）
　
イ．「Alcaligenes eutrophusの植物油で生育し，ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）を生産する能力が評価された。オリーブ油，コーン油又はパーム油が唯一の炭素源として与えられると，A.eutrophusの野生型株は，よく生育し，定常成長期の間に，ポリ（３−ヒドロキシ酪酸）ホモポリマーを，細胞乾物重の約８０％（ｗ／ｗ）まで蓄積した。さらに，A.eutrophusの組換え菌株ＰＨＢ−４（ＰＨＡ陰性変異体）であって，Aeromonas cavie由来のＰＨＡ合成遺伝子を持つ菌株は，これらの植物油から３−ヒドロキシ酪酸及び３−ヒドロキシヘキサン酸のランダムコポリエステルを高い細胞内含有量（約８０％ｗ／ｗ）で生産することが明らかとなった。・・・これらの結果は，再生可能な費用のかからない植物油はA.eutrophus菌株を用いたＰＨＡの効率的な生産のために優れた炭素源であることを実証する。」（第３３３頁，要約）
　
ウ．「ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）は多くの細菌によって不均衡な成長条件下で合成される，細胞内の炭素及びエネルギーの貯蔵物質であり，近年，有用な生分解性プラスチックとして非常に注目されている（Anderson及びDawes 1990; Doi 1990; Steinbuchel 1996)。ポリ（３−ヒドロキシ酪酸）[P(3HB)]及びポリ（３−ヒドロキシ酪酸-共-３−ヒドロキシ吉草酸）コポリマー[P(3HB-co-3HV)]は，Alcaligenes eutrophusの流加培養を用いて，Monsantoによって生産され，市販されている。しかし，ＰＨＡの商業的応用はその高い価格（約ＵＳ＄１６／kg）によって制限されている。
　ＰＨＡ生産のコストを下げる一つの試みは，細菌成長とＰＨＡ生合成のために，費用のかからない炭素源を使用することである。脂肪と油は再生可能で費用のかからない農業副産物であるにも拘わらず，ＰＨＡ生産のための脂肪と油の使用を記述した報告はわずかしかなかった。Pseudomonas属菌株は，植物油（Eggink他 1995; Kato他 1996）及びタロー（Cromwick他 1996）から，中鎖長及び長鎖長の３−ヒドロキシアルカン酸ユニットからなるＰＨＡを生産する。土壌から単離されたAeromonas caviaeはオリーブ油から３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸のランダムコポリエステル，P(3HB-co-3HHx）を蓄積する(Shimamura他1994; Doi他 1995）。どちらの場合も，細胞内の比較的低いＰＨＡ含有量（３０％w/w未満）のため，脂肪及び油でのＰＨＡ生産性は高くない。」(第３３３頁，左欄下から６行〜右欄第２２行）
　
エ．「細菌株及びプラスミド
Alcaligenes eutrophus H16（ATCC 17699）及びＰＨＢ−４（ＤＳＭ５４１），Ｈ１６から派生したＰＨＡ陰性変異体（Schlegel他 1970）がこの研究で使用された。その本来のプロモーター領域と共にphaＣac（Aeromonas caviaeＰＨＡ合成酵素遺伝子）を含む組換えプラスミド構築物pJRDEE32d13（図１）及びこの組換えプラスミドを含むEscherichia coli S17-1を用いたＰＨＢ−４のトランス接合は以前報告されている（Fukui及びDoi 1997）。
ＰＨＡ生産
A.eutrophus菌株は１％（v/v）植物油及び０．０５％（w/v）ＮＨ４Ｃｌを含む１００ｍｌの窒素を制限された無機塩培地（Doi他 1995）で，３０℃７２時間培養された。A.eutrophusにおける広いホストの範囲を維持するために，培地に５０ｍｇｌ-1の濃度でカナマイシンが添加された。成長した細胞は採集され，蒸留水で二回洗浄し，凍結乾燥した。細胞内に蓄積したポリエステルはソックスレー装置内で熱クロロホルムで抽出し，メタノールで再沈殿して精製した。」（第３３３頁右欄下から６行〜第３３４頁左欄第１２行）
　
オ．「表２　A.eutrophus菌株による７２時間３０℃での様々な植物油及びオレイン酸（１．０％）からのポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）の生産。ポリエステル組成はＧＣ解析により決定した。３ＨＢ　３−ヒドロキシ酪酸；３ＨＨｘ　３−ヒドロキシヘキサン酸
」（第３３３頁）
　
カ．「A.eutrophusはＰＨＡ産生微生物の中で最もよく知られた細菌の一つである。我々の知る限りでは，A.eutrophus細胞中のＰ（３ＨＢ）の蓄積は，アルカン酸についても糖についても（Doi他 1988; Liebergesell他 1991），そしてオレイン酸についても（Eggink他 1993）研究されてきたが，脂肪と油は，A.eutrophusを用いたＰＨＡ生産のための炭素源として議論されていなかった。図２及び表２に示すように，Ｐ（３ＨＢ）ホモポリマーはA.eutrophus H16によって，オリーブ油，コーン油及びパーム油から効率的に合成することができた。・・・この結果は，糖と同様に，植物油が成長とA.eutrophus株によるＰＨＡ生合成の両方のための優れた炭素源であることがはっきりと示された。
　A.eutrophusは，オリーブ油を唯一の炭素源として与えられると，培養ブロス中にリパーゼを分泌した。細胞外リパーゼは培地中のトリグリセリドを加水分解し，脂肪酸は細胞へ取り込まれて，脂肪酸のβ酸化経路によってアセチル−ＣｏＡに代謝されたことが示唆される。」（第３３５頁右欄第１３行〜第３３６頁左欄第２行）
　
キ．「細菌ポリエステルの生産コストを下げるために，費用のかからない植物油をＰＨＡ生合成のための炭素源として適用することが予想される。」（第３３５頁下から７〜４行）
　
　引用例２の記載事項ア〜キによれば，引用例２には，食用油である植物油を炭素源としてAlcaligenes eutrophusを培養することにより，菌体内にＰＨＡを効率良く生産させ，ＰＨＡの生産コストを低減することが記載されている。
　
（２）引用例１
　当審による拒絶理由で引用文献１として引用された，本願出願日前に頒布された刊行物である，九州産業大学工学部研究報告，1996，No.33, p.129-132（以下，「引用例１」という。）には，以下の事項が記載されている。
　
ア．「生分解性プラスチックは，従来のプラスチックの欠点であった自然界での難分解性や，焼却による高熱，有毒ガスの発生などの諸問題を解決するプラスチックとして期待されている。水素細菌
Alcaligenes
eutrophus
　
イ．「焼酎蒸留廃液サンプルは，三和酒類（株）の好意により提供いただいた麦焼酎の減圧蒸留粕を使用した。廃液はまずガーゼでろ過し粗固形物を除去した。・・・固形物を除去したサンプル（以後廃液と称す）は使用するまで−４５℃で凍結保存した。使用に際しては，脱イオン水で希釈し，水酸化ナトリウムでｐＨを７．０に調整した。一方，廃食用油は本学近隣の飲食店より提供いただいた。廃油サンプルは静置して浮遊物を自然沈降させて除去し，室温で暗所に保存した（以後廃油と称す）。廃液と廃油は試験管あるいは発酵槽内で混合し，１２１℃で２０分間オートクレーブ殺菌した。使用した水素細菌は
Alcaligenes
eutrophus
　
ウ．「１）試験管規模での培養試験
　１０倍に希釈した廃液を５．０ｍｌと廃油０．５ｍｌを試験管に入れ，シリコ栓をして殺菌したものを測定に必要な本数準備した。接種直後および６時間おきにサンプリングし各測定項目について測定した。図１は，廃液と廃油を含む培地で本菌を培養したときの乾燥菌体重量の経時変化を示したものである。比較のため，廃液だけの培地で本菌を培養したときの経時変化も同時に示している。・・・図２は，廃液と廃油を含む培地で本菌を培養したときに菌体内に生産されたＰＨＢ量の経時変化を示した物である。比較のため，廃液だけの培地で本菌を培養したときに生産されたＰＨＢの経時変化も同時に示している。廃液のみの培地で培養した菌体には痕跡量のＰＨＢしか生産されなかったが，廃液に廃油を加えた培地で培養した菌体では，菌体の増殖に伴いＰＨＢの生産量も増大し，培養３６時間後には約６．０ｇ／ｌのＰＨＢが生産されることが明らかになった。培地成分の制限などは全く行わなかったにもかかわらず，廃液に廃油を加えて本菌を培養すると培養２０時間以降では菌体乾燥重量の約６０％以上のＰＨＢが菌体内に蓄積されることが明らかになった。」（第１３０頁右欄第２行〜第１３１頁左欄第１２行）
　
エ．「
」（第１３０頁，図１及び２）
　
オ．「２）ジャーファーメンタによる深部培養
　ｐＨスタット培養を行うため，全容１ｌのジャーファーメンタに脱イオン水で５倍に希釈した廃液を７００ｍｌと廃油７０ｍｌを仕込み，そこへシードを３５ｍｌ接種し培養を開始した。培養温度，培地ｐＨ，空気通気量はそれぞれ３０℃，７．０，１．０ｌ／ｍｉｎに設定した。ｐＨの調整には２Ｎの水酸化ナトリウムと硫酸を用いた。図４に溶存酸素濃度を６ｋＰａに設定して培養したときの乾燥菌体重量の経時変化を示す。培養３８時間までは未使用油，廃油共にほぼ同様の増殖曲線を示したが，培養３８時間以降では廃油の方が菌体の生産がよくなり，培養７０時間後には未使用油が１５ｇ／ｌ程度であるのに対し廃油では２１ｇ／ｌまで増加した。このとき菌体内に生産されたＰＨＢの経時変化を図５に示す。ＰＨＢの蓄積は，未使用油の方が廃油よりも早期に開始され，また培養中は常に蓄積量も高が培地成分，特に窒素源やミネラル分の枯渇くなることがわかった。これはＰＨＢの蓄積によって促進されることから，廃油には未使用油には含まれない本菌の増殖促進因子が含まれていることを示唆するものである。一方，培養７２時間ではほぼ同量の１０ｇ／ｌに達した。」（第１３１頁右欄第５行〜第１３２頁左欄第５行）
　
カ．「
」（第１３１頁，図４）
　
キ．「
」（第１３２頁，図５）
　
４．対比
　引用例２及び１に記載された「Alcaligenes eutrophus」は，Ralstonia eutrophaの別名であり（必要であれば，J. AOAC Int., 2002, Vol.85, No.4, p.917-924, http://www.dsmz.de/microorganisms/html/bacteria.species/cupriavidus.necator.html等を参照。），本願発明と引用例２に記載された発明は，「食用油を炭素源として，Ralstonia eutrophaと混ぜ，該Ralstonia eutrophaの菌体内にＰＨＡを産生させることを特徴とするＰＨＡの製造方法」である点で一致し，以下の点で相違する。
相違点：本願発明では，廃食用油を前処理せずに使用しているのに対し，引用例２に記載された発明では未使用の食用油を使用している点。
　
５．判断
　上記相違点について検討する。
　引用例１には，廃食用油をRalstonia eutropha（A.eutrophus）による，ＰＨＡの一種であるＰＨＢの生産のための炭素源として使用できることが記載され，ＰＨＢの生産効率は廃食用油は未使用油と同等かそれ以上であること（記載事項オ）が記載されている。
　そして，引用例２及び引用例１は，ともにRalstonia eutrophaを用いたＰＨＡの生産に関する技術であって，ＰＨＡの生産コストを低減するという共通の課題を有するものであり（引用例２記載事項ウ及びキ，引用例１記載事項ア），未使用の食用油よりも廃食用油の方が安価であることは明らかであるから，引用例２に記載された発明において，未使用油に代えて廃食用油をRalstonia　eutrophaの培養のための炭素源とすることは，当業者が容易に想到し得たものである。
　また，本願発明における「前処理をせずに」について，本願明細書には，従来技術である，植物油廃液からの生分解性プラスチックの製造方法では，植物油廃液を嫌気処理して有機酸に変換し，固形物を除去した濃縮有機酸液からＰＨＡを生産していたこと（【０００３】），従来技術の方法では工程が多段階でコストが高いので，本願発明では，簡易かつ低コストにてＰＨＡを製造する方法を提供するという課題が記載されている（【０００５】−【０００６】）。
　そして，廃食用油としては，大豆油，ごま油等の植物油の廃油を原料とすることが説明され（【００１０】），本願発明の実施例では，「ごま油の廃油を１ｍｌ加えて」培養を行ったことが記載されているが（【００１７】），この廃油が，どの程度使用され，使用後どのように保管されていたものかといった説明は記載されていない。
　以上のような，本願明細書における「廃食用油」に関する説明に基づけば，本願発明における「前処理をせずに」とは，従来技術のような処理工程を経てから培養に供されるものではないことを意味すると解され，引用例２でも，食用油を特別な処理を行わずに培地に添加しているから，前処理せずに使用しているといえる。
　また，引用例１の廃食用油は，使用前に醸造廃液とともに１２１℃で２０分間オートクレーブ殺菌処理を行っているものであるが，廃食用油の場合は，高温で使用された後のものであり，かかる条件のオートクレーブ処理では何ら影響を受けるものではなく，このオートクレーブ処理が前処理に相当するとしても，オートクレーブ処理をしないことは当業者が必要に応じて随時なし得ることである。
　そして，本願発明の奏する効果は，引用例２及び１から予測し得ない程の格別なものではない。
　
６．請求人の主張について
　請求人は，平成２２年３月２４日付意見書において，以下の点を主張している。
（１）引用例１のＰＨＡの製造方法では，廃食用油を静置して浮遊物を自然沈降させて除去し，室温で暗所に保存するという前処理を行うので，手間と時間がかかる。これに対し，本願発明では，あえて不純物を残存させることで，ＰＨＡの生産効率を向上させることを狙っている。
（２）さらに，引用例１のＰＨＡの製造方法は，オートクレーブ殺菌を行っており，油脂が加水分解してグリセリンと脂肪酸に分解し，微生物がこの脂肪酸からＰＨＡを産生しているので，脂肪酸により培養液のｐＨが減少して菌体の活性が落ち，ＰＨＡの産生効率が低くなっている。例えば，本願発明では，８．０ｇ／ｌのＰＨＡを産生することができるのに対し，引用例１の実験結果では約６．０ｇ／ｌのＰＨＡしか産生することができない。
（３）また，引用例２のＰＨＡの製造方法は，新油を炭素源としているので，コスト高となる。さらに，タイトルにもあるように，ＰＨＡを効果的に生産することに主眼点があるので，廃油を採用することは考えられない。一般に，油を加熱すると酸化して分子量が増加するが，分子量が大きくなると，微生物による分解性が悪くなるので，ＰＨＡの生産効率が低下すると考えられるからである。これに対し，本願発明は，実際に実験を行ったところ，新油よりも廃油のほうが生産効率が良いことを発見した。
　
　上記主張ついて検討する。
主張（１）について
　通常，一般家庭や食品産業，外食産業から廃棄される廃食用油をリサイクルする場合，天ぷらかすなどの固形物を濾した上で暗所に保管し回収するものであることは技術常識であるから（必要であれば，http://www.e-kanoya.net/htmbox/kankyou/haisyokuyu.html，http://www.city.matsue.shimane.jp/jumin/kankyou/gomi/abura.htm，http://www.y-yushi.com/service/howto.html等を参照。），引用例１に記載された「静置して浮遊物を除去し，室温で暗所に保管された廃食用油」は，通常のリサイクルのために回収される廃食用油に他ならない。
　一方，本願発明における「廃食用油」については，どのような状態で使用され，どのように回収されたものが含まれるのか，本願明細書において明確な定義はなされておらず，実施例においても，単に「ごま油の廃油」を用いたとしか説明されていないのは，上記５．で述べたとおりである。
　してみると，本願発明における「廃食用油」は，本願明細書に従来技術として記載された有機酸液に変換し，濃縮するといった前処理を行っていない廃食用油であると理解され，請求人の主張するような，引用例１の静置して浮遊物を除去し，室温で暗所に保管された廃食用油，すなわち，通常のリサイクルのために回収されるような廃食用油でないと解釈することはできない。
　したがって，請求人の主張（１）は，本願発明に基づかない主張であり，採用できない。
　なお，本願発明における「前処理をせずに」という特定事項が，引用例１の廃食用油のような静置して浮遊物を除去し，室温で暗所に保存するといった，通常の廃食用油の回収前に行われる処理がを行われていないことを意味する場合は，該「前処理をせずに」という特定事項を付加する補正は，出願当初の明細書等のすべての記載を総合することにより導かれる技術的事項との関係において，新たな技術的事項を導入するものとなる。
　
主張（２）について
　請求人は，オートクレーブ殺菌によって，油脂が脂肪酸とグリセリンに加水分解されると述べているが，一般家庭や食品産業で廃棄される油は，通常揚げ油である。
　そして，揚げ物をする際には，引用例１の１２１℃２０分というオートクレーブ処理よりも，高温（通常１８０〜２００℃程度）で長時間にわたって使用されるものであるから，廃棄される揚げ油は，オートクレーブ処理をしなくても，既に加水分解された脂肪酸とグリセリンを含むものである。
　この点については，請求人も上記意見書において，「廃食用油は，加熱使用され多くの不純物や加熱重合物，有臭成分，色素，遊離脂肪酸を含みます。（意見書（７）を参照。）」と認めている。
　そして，廃食用油に含まれる不純物の組成は，食用油の種類や使用回数，保管状態によっても変化するものであるが，上述のように，本願発明の廃食用油は，どのような状態で使用され，回収されたものが含まれるのか不明である。
　さらに，請求人は本願発明では，８．０ｇ／ｌのＰＨＡを生産することができると主張しているが，このようなデータは，本願明細書及び図面には開示されていない。
　してみると，本願発明の前処理をしない「廃食用油」が，引用例１に記載された「オートクレーブ処理された廃食用油」よりも脂肪酸含有量が少ないものとは認められず，また，本願発明はＰＨＡ生産効率が引用例１より高いという主張も，本願明細書に基づく主張ではないので，採用できない。
　
主張（３）について
　引用例２の記載事項ウにあるように，従来，Pseudomonas属菌株及びAeromonas属菌株を使用して植物油を炭素源として培養した場合には効率が悪かったが，引用例２に記載された発明では，R.eutrophaを使用して植物油を炭素源として培養したので，効率良くＰＨＡを生産できたことを特徴とするものであり，廃食用油では効率が悪くなるため使用できないといった廃食用油の使用を妨げる記載が含まれるものではない。
　また，請求人は，一般的に，油を酸化すると分子量が増加して分解性が悪くなり，ＰＨＡの生産効率が悪くなると考えられるという主張をしているが，本願出願日当時においてそのような技術常識があったというものではない。
　他方，本願明細書の従来技術や引用例２の記載事項カにもあるように，有機酸を炭素源にＰＨＡを生産できることは周知の事項であり，また，引用例２には，オレイン酸で効率良くＰＨＡを生産できること（記載事項オ），植物油を炭素源として培地に添加すると，R.eutrophaはリパーゼを分泌して植物油を分解して菌体内に取り込み，代謝することが記載され（記載事項カ），さらに，引用例１には，廃油には未使用油にはない増殖促進因子が含まれること，培養７２時間で，廃油と未使用油でのＰＨＢ蓄積量がほぼ同量となることが記載されている（記載事項オ）。
　このような引用例２及び１の記載並びに上記技術常識に鑑みれば，酸化されて遊離脂肪酸含有量が多くなった廃油を用いても，未使用油と同じように効率的にＰＨＡを生産できることは，当業者が予測し得るものである。
　また，本願の明細書及び図面には，未使用油と廃油との比較実験データは開示されていない上，本願出願日後に本願発明者らが発表したGreen Chemistry, 2003, Vol.5, p.545-548には，未使用のごま油の方が，廃ごま油よりもＰＨＡの生産量が多くなったことの報告（特にTable1を参照。）があるものであり，請求人の上記主張は採用できない。　
　
７．むすび
　したがって，本願の請求項１に係る発明は，引用例２及び１の記載に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであり，特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであるから，その他の請求項については検討するまでもなく，本願は拒絶すべきものである。
　よって，結論のとおり審決する。