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　平成　８年特許願第５２８６５３号「有機シアン化試薬により活性化された可溶性炭水化物を使用する免疫原性構築物の製造」拒絶査定不服審判事件〔平成　８年　９月２６日国際公開、ＷＯ９６／２９０９４、平成１１年　３月　９日国内公表、特表平１１−５０２８２０〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　手続の経緯
　本願は，平成８年３月２２日（パリ条約による優先権主張外国庁受理１９９５年３月２２日，１９９５年６月７日　米国）を国際出願日とする出願であって，平成１９年８月２２日付で拒絶査定がなされ，これに対して，同年１１月２６日に拒絶査定不服審判の請求がなされるとともに，同年１２月２５日付で明細書について手続補正がなされたものである。
　
第２　本願発明について
　本願に係る発明は，平成１９年１２月２５日付の手続補正書の特許請求の範囲の請求項１〜１６に記載された事項により特定されるものであって，そのうちの請求項１には，以下のように記載されている。
　
「【請求項１】　以下のステップ：
　（ａ）多糖，オリゴ糖，及び単糖から成る群より選ばれる少なくとも１つの第１成分を，１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ），Ｎ−シアノトリエチル−アンモニウムテトラフルオロボレート（ＣＴＥＡ），及びｐ−ニトロフェニルシアネート（ｐＮＰＣ）から成る群より選ばれる有機シアン化試薬で活性化して，活性化された炭水化物を形成し；
　（ｂ）タンパク質，ペプチド，及びハプテンから選ばれる第２成分を，スクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＰＤＰ），ヘキサンジアミンチオール（ＳＡＴＡ），及び１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルバジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）から成る群から選ばれるチオール求核基，又はＥ−マレイミドカプロン酸ヒドラジド−ＨＣｌ（ＥＭＣＨ），アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ），及び１−エチル−３−ジメチルアミノプロピル）カルバジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）から成る群から選ばれるヒドラジド求核基で誘導体化し；そして
　（ｃ）上記活性化された炭水化物を上記誘導体化第２成分に直接的又は間接的にカップリングして，免疫応答を刺激することができる免疫原性構築物を形成する；
を含む，免疫原性構築物の製造方法。」（以下，「本願発明」という。）
　
第３　当審の判断
１．　引用刊行物
刊行物Ａ：　特開平５−２６２６６８号公報（原審の引用文献１）
　原査定の拒絶の理由に引用され，本願の優先権主張の日前に頒布されたことが明らかな上記刊行物Ａには，以下の事項が記載されている。
　
（ａ１）第２頁左段落番号【０００１】〜【０００２】
「本発明は，多糖類−ジフテリア・トキソイド抱合体(conjugate)(ＰＲＰ−Ｄ)ワクチンおよび多糖類−破傷風トキソイド抱合体(ＰＲＰ−Ｔ)ワクチンで例示される新規なヘモフィルス・インフルエンザ(Ｈaemophilus influenzae)Ｂ多糖類−外毒素トキソイド製造用の多糖類ハプテンに関する。該多糖類は，加熱処理によって分子の大きさを主として２００,０００および２,０００,０００ダルトンの間に調整し，ほぼ等モル量のリボース，リビトールおよびリン酸塩からなり，ついで，活性化剤，典型的には臭化シアンで活性化した純粋なヘモフィルス・インフルエンザＢ多糖類である。・・・該活性化された多糖類を外毒素トキソイド，好ましくはジフテリア・トキソイドと均密に混合して抱合を行なう。好ましくは，該外毒素トキソイドはスペーサーとして４〜８個の炭素の橋を用いて，例えば，ジフテリア・トキソイド(Ｄ−ＡＨ)のアジピン酸ヒドラジド誘導体のように誘導体化される。・・・
　この方法を用いることにより，ヘモフィルス・インフルエンザＢからの多糖類に対するＴ−細胞依存性応答をもたらす抱合体ワクチンが得られる。」
　
（ａ２）第３頁左欄段落番号【００１１】
「かくして得られた，大きさを規制した多糖類を，ハロゲン化シアンまたは水素化ホウ素ナトリウムのような該多糖類上に親電子基を生じさせる活性化剤で活性化する。用いる典型的な活性化剤は臭化シアンである。・・・」
　
（ａ３）第５頁左欄段落番号【００３５】〜【００３８】
「参考例１：　ＰＲＰの活性化
　・・・
　Ｂ．得られた該多糖類の塩化ナトリウムの溶液のpＨを，１Ｎ水酸化ナトリウムの添加により１０.５〜１１.０に上昇させる。(より低いpＨでは臭化シアンとの反応が少なく，より高いpＨでは該多糖類が分解するので，この範囲を選択する。）
　Ｃ．乾燥臭化シアンをpＨ１０.５〜１１.０の０.００５Ｎ重炭酸ナトリウム緩衝液に溶解し，直ちに(調製後，１０分以内)，０.４mg／mgＰＲＰの割合で反応容器に加える。
　Ｄ．混合液のｐＨを，水酸化ナトリウムの添加によりｐＨ１０．５〜１１．０に調製し，６分間維持する。」
　
刊行物Ｂ：　KOHN, J. et al, FEBS Lett., 1983, Vol.154, No.1, pp.209-210（原審の引用文献８）（英文のため訳文にて記す。）
（ｂ１）第２０９頁左欄第２行〜同頁右欄第１行
「臭化シアン（ＣＮＢｒ）は多糖樹脂のための活性化試薬として広く用いられている［１−３］。水溶性溶媒中において数分以内で実施することができるＣＮＢｒによる活性化は，ＣＮＢｒが極めて有害な性質のものであることを除けば，非常に便利な手法である。したがって，われわれは，すべての実用上の目的のために，従来のＣＮＢｒ活性化樹脂と同一な活性化樹脂を産生する，代替となる有害でない活性化試薬を探索した。
　・・・同一の条件に基づいて，非常に安定な１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ，複合物２）を合成できた[７]。これらＮ−シアノ誘導体は，良好なシアノ化試薬であり［５，６］，・・・」
　
（ｂ２）第２０９頁右欄第７行〜第２１０頁左欄第３行
「われわれは，ここに，ＣＴＥＡ及びＣＤＡＰが，多糖樹脂のための非常に効果的な活性化試薬と判明したことを報告する。ＣＴＥＡ及びＣＤＡＰの活性化率（すなわち，カップリングしたリガンドのモル数／使用した活性化試薬のモル数）は，それぞれ，１５％及び５０％であった。（従来のＣＮＢｒ活性化の活性化率は，わずか１〜２％である。）ＣＴＥＡ又はＣＤＡＰによる多糖の処理は，活性化された樹脂におけるシアネートエステル誘導体（樹脂−Ｏ−Ｃ≡Ｎ）の形成をもたらす。これら樹脂はしたがって，カップリングの機構に関して，従来のＣＮＢｒ活性化樹脂［８，９］と同一である。ＣＴＥＡ又はＣＤＡＰを用いる活性化は，フードなしで安全に実施することができ，著しい健康上の危険を伴うことなく，‘臭化シアン’活性化樹脂を得ることを可能にする。」
　
刊行物Ｃ：　KOHN, J. et al, Appl. Biochem. Biotechnol., 1984, Vol.9, pp.285-305（原審の引用文献９）（英文のため訳文にて記す。）
（ｃ１）第２８５頁下から６行〜第２８６頁第１７行
「あらゆる既に知られた固定化方法とは逆に（４），リガンドのＣＮＢｒ活性化多糖へのカップリングは，水溶性溶媒で，かつ，生理学的条件に近いｐＨで，スムーズに進行した。この方法はしたがって，酵素や，抗体，ペプチドホルモン等の，脆弱な生物学的に活性な分子の固定化のために，卓越して適している。それらの生物学的活性の，認めうるほどの喪失を伴わない，手軽なやり方でのそのような分子の固定化の可能性は，明らかに，重要な飛躍的進歩を構築した。ゆえに，アフィニティー・クロマトグラフィーの導入（５），疎水性クロマトグラフィー（６），及び固型状酵素学の早急な拡大に伴い，ＣＮＢｒによる多糖の活性化が，現代生化学において最も広く用いられる手法の一つとなったことは，驚くに値しない。
　続いて，多くの様々な異なる活性化の手法が現れた。・・・第３のカテゴリーは，ＣＮＢｒの代わりに，様々なシアノ化試薬を用いる手法によるものである。それらの手法は，一般的に用いられるＣＮＢｒ活性化樹脂と，同一の（又は少なくとも類似の）樹脂を産生し，それを用いれば，有害なＣＮＢｒ自体の使用を回避する。」
　
（ｃ２）第２９６頁第１９〜２８行
「ＣＴＥＡは，非揮発性でありかつ強い毒性がないため，この化合物を扱う際には，特別な予防措置を要しない。ＣＴＥＡを用いた活性化反応は，したがって，フードなしで安全に実施することができる。反応速度論研究は，ＣＴＥＡがＣＮＢｒとＴＥＡの混合物の等モルと等価であることを明らかにした。この事実は，提示されたシアノ転移活性化（cyano-transfer activation）の機構を追認するものである。加えて，それは，ＣＴＥＡ活性化手法と，セクション３．２．１に記載したシアノ転移活性化手法との間の際だった類似性を説明する。ＣＴＥＡ活性化樹脂の詳細な解析は，それら樹脂が，シアノ転移活性化樹脂と全ての面で同一であることを，示した。」
　
（ｃ３）第２９７頁下から４行〜第２９８頁第９行
「ＣＤＡＰは，ＣＴＥＡと類似の化学的特性を有する芳香族Ｎ−シアノ複合物である。しかしながら，ＣＤＡＰ（図６）はＣＴＥＡよりも極めて安定である。・・・
　ＣＤＡＰは非常に便利な試薬である。それは，室温で長期間の保存が可能である非揮発性の固体である。・・・水溶液において，ＣＤＡＰの安定性はｐＨに強く依存する。ｐＨ１（０．１Ｎ　ＨＣｌ）では完全加水分解には数週間を要し，ｐＨ７（０．１Ｍ　リン酸）では完全加水分解には数時間を要し，そして，ｐＨ１４（０．１Ｎ　ＮａＯＨ）ではＣＤＡＰは即座に加水分解される。」
　
（ｃ４）第２９８頁末行〜第２９９頁第６行
「ＣＤＡＰの安定性及び選択制は，極めて高い活性化率を生じさせる。用いられる具体的な工程次第で，２０〜８０％の間での活性化率が得られる。この特徴は，ＣＤＡＰが，知られている限りで，最も効果的な活性化試薬であることを示す。」
　
（ｃ５）第３０２頁下から１４〜１１行
「ＣＴＥＡ，ＣＤＡＰ及びｐＮＰＣは，危険かつ不便なＣＮＢｒのための優れた代替物である。これらすべての試薬は，単純かつ勝手の良い手法により，高度に活性化された樹脂を得ることを可能にする。ＣＴＥＡ，ＣＤＡＰ及びｐＮＰＣの特性を表７に要約する。」
　
刊行物Ｄ：　特開平３−２２０１９８号公報（原審の引用文献１４）
（ｄ１）第５頁右下欄第８行〜第６頁左上欄第１４行
「実施例1：PMBのデキストランへの化学的複合
（方法A；カルバミン酸エステル結合）
  デキストラン（分子量79,000または200,000）2gを20mlの水に溶解させ，0℃に冷却し，テトラフルオロホウ酸１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウム（CDAP）5−300mgを添加し，30秒間混合する。トリエチルアミン（0.2M，CDAP5mgに対して0.04ml）を激しく撹拌しながら滴々添加し，全反応混合物を1mlの10N HClを含有する80mlの氷冷絶対エタノールに移す。デキストランが沈澱するので，この沈澱を0℃で5分間，1000×ｇで遠心して取り出し，20-50mlの0.25M炭酸水素Na緩衝液にpH9.0で再溶解させる。この混合物に600-100mgのPMB（粉末の，または水に予備溶解させた）を添加し，8℃で24時間撹拌する。ついで，全反応混合物を分子量50,000遮断（cut-off）の透析用チューブに移し，0.05Mの発熱性物質を含有しない（pyrogen-free）リン酸緩衝液に対して6-10日間透析する。透析した最終的な反応混合物のタンパク質含有量を分光法により，208nmにおける吸収で，またはブラッドフォード（Bradford）試薬（ビオラッド（Bio Rad,Richmond,CA,USA）を用いて595nmで測定する。」
　
刊行物Ｅ：　国際公開第９４／１３６９７号（英文のため訳文にて記す。）
（ｅ１）第４１頁第１１〜２３行
「Ｂ．ペプチドとヘタスターチの結合
  Ac-（配列番号：１１７）-NH2は，ヘタスターチに以下のようにして結合された：
  15mlのヘスパン  ヘタスターチ（分子量70,000）溶液を，氷浴で冷却し，50mgの１−シアノ−４−ジメチルアミノ−ピリジウム−テトラフッ化ホウ酸塩，次いで0.5mlのトリエチルアミン溶液を加えた。エタノール／塩酸（50ml/0.5ml）混合液をさらに加え，濾過して沈殿を回収し，これを35mlの飽和NaHCO3水溶液に溶解した。次に粉末状態のペプチドを反応溶液に加え，4℃にて一夜撹拌する。撹拌後，反応溶液を50,000  MWCOを使用して10lの水に4日間透析し，凍結乾燥した。」
　
２．　対比
　刊行物Ａには，上記（ａ１）の記載に照らし，
「ヘモフィルス・インフルエンザＢ多糖類を，臭化シアンで活性化して，次いでアジピン酸ヒドラジドで誘導体化されたジフテリア・トキソイドとを抱合させて，ヘモフィルス・インフルエンザＢ多糖類−ジフテリア・トキソイドからなる抱合体ワクチンを製造する方法。」
（以下，「引用発明」という。）が記載されている。
　
　そこで，本願発明と引用発明とを対比すると，引用発明の「ヘモフィルス・インフルエンザＢ多糖類」（以下，「インフルエンザ多糖」という。）は本願発明の「多糖」に，引用発明の「アジピン酸ヒドラジドでジフテリア・トキソイドを誘導体化する」ことは本願発明の「タンパク質をアジピン酸ジヒドラジドで誘導体化する」ことに，それぞれ相当することは明らかである。また，引用発明においては，インフルエンザ多糖と誘導体化ジフテリア・トキソイドとを反応させることを「抱合させる」と表現しているが，これは技術的にみて，本願発明の「カップリング」に相当することは明らかである。さらに，引用発明の「ヘモフィルス・インフルエンザＢ多糖類−ジフテリア・トキソイドからなる抱合体ワクチン」はワクチンであるから，本願発明の「免疫応答を刺激することができる免疫原性構築物」といえることも明らかである。そして，引用発明の臭化シアンも本願発明の特定の有機シアン化試薬も，ともに「シアン化試薬」といえるものである。
　したがって，本願発明と引用発明とは，両者は，
「以下のステップ：
　（ａ）多糖である第１成分を，シアン化試薬で活性化して，活性化された炭水化物を形成し；
　（ｂ）タンパク質である第２成分を，アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）で誘導体化し；そして
　（ｃ）上記活性化された炭水化物を上記誘導体化第２成分に直接的又は間接的にカップリングして，免疫応答を刺激することができる免疫原性構築物を形成する；
を含む，免疫原性構築物の製造方法。」
の点で一致し，以下の点で相違する。
　
［相違点］
　本願発明では，活性化された炭水化物を形成させるために使用されるシアン化試薬が，「１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ），Ｎ−シアノトリエチル−アンモニウムテトラフルオロボレート（ＣＴＥＡ），及びｐ−ニトロフェニルシアネート（ｐＮＰＣ）から成る群より選ばれる有機シアン化試薬」であるのに対して，引用発明では，「臭化シアン」である点。
　
３．　検討
　以下，相違点について検討する。
　
　臭化シアンは，従来多糖類の活性化試薬として広く使用されていたものである（上記（ｂ１），（ｃ１））が，その一方で，
（１）臭化シアンの利用に際しては，有害である等の問題があったこと（上記（ｂ１），（ｂ２），（ｃ１），（ｃ２）），及び，
（２）そのような臭化シアンに代えて１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウムテトラフルオロボレート（以下，「ＣＤＡＰ」という。）を使用することが，安全性の観点からも，また，活性化の効率の観点からも，有効であること（上記（ｂ２），（ｃ２），（ｃ３），（ｃ４），（ｃ５）），
が，いずれも本件優先権主張の日前において，当業者に周知の事項であった。
　また，このような臭化シアンに代えてＣＤＡＰを使用することによる多糖類の活性化方法は，生化学分野においても広く応用されていたものである（上記（ｄ１），（ｅ１））。
　したがって，このような周知事項を踏まえた当業者ならば，上記刊行物Ａの記載に触れた場合，引用発明における臭化シアン試薬に代えて，より安全性が高く，しかも活性化の効率が高いことが周知されていたＣＤＡＰを使用することは，ごく自然に想到することである。
　したがって，引用発明に係る方法において，そこで使用されているシアン化試薬である臭化シアンに代えて，ＣＤＡＰを使用することは，当業者が容易になし得ることであって，格別の困難が伴うものであるとすることができない。
　
　一方，本願発明により，当業者が予期し得ない効果が奏されたものとすることができない。
　
　なお，本願発明により，多糖の活性化効率が高まったとしても，それは，既に刊行物Ｂ及びＣにも記載されているように，臭化シアンに代えてＣＤＡＰを使用することに伴う効果として周知されていたものであるから，これを以て当業者が予期し得ない効果であるとすることができない。
　また，請求人は，平成２０年１月１０日付手続補正書により補正された審判請求の理由及び平成２１年６月１７日付回答書において，主として以下の２点について主張している。
（１）本願発明に係る有機シアン化試薬がタンパク質及び多糖類成分上の抗原性エピトープを保存し，かつ，免疫原性コンジュゲート産物を作り出すことについては，当業者が容易に想到することではないし，また，そのような効果は本願発明の有利な効果であること。
（２）刊行物Ｃ記載のＣＤＡＰを使用したプロトコールに基づいて本願発明と同様な免疫原性コンジュゲートの製造を試みたが成功しなかったのであるから，本願発明の進歩性は認められるべきものである。
　しかしながら，（１）については，本願発明は，上記したように，引用発明に対して，単に周知技術を適用したに過ぎないものであって，その際に実験条件や反応材料の選定などについて何らかの工夫が必要とされたものでもないことに加えて，少なくとも臭化シアンを使用した引用発明では，免疫原性を保持したままの合成ができていたのであるから，請求人の主張する効果が当業者が予期し得ない顕著な効果であるとすることができないし，また，（２）については，回答書の添付書類１に記載された実験条件は，本願発明とは，活性化多糖に対して反応させるタンパク質が，予めヒドラジド求核基等で誘導体化されていないものである点で相違するものと解せられ，仮に，そのような差異によって，本願発明の方法により初めて上記（１）の効果が奏せられたとしても，予めヒドラジド求核基で誘導体化されたタンパク質と反応させることについては，引用発明において既に組み込まれている手法であるから，このような構成を欠く実験についての不成功例や，仮に，そのような不成功例との構成の差に基づく効果があるとの主張がなされたとしても，引用発明に対して，本願発明との唯一の相違点であるシアン化試薬の置き換えが容易になし得たとした上記判断を覆す根拠とはなり得ないものである。
　なお，回答書の添付書類１に記載の実験条件は，本願請求項１の従属項である請求項６の方法に該当するものと解しうるものでもあるが，仮にこのように解したとしても，そのことは，請求項１に係る発明の一態様として含まれる方法について所望の効果が得られないことを意味するものであるから，そのようなことを根拠として，本願発明の進歩性を主張することは，（本願発明がさらに何らかの付加的条件が追加されているのならば，その点を以て進歩性を認めることはあり得るとしても）全く当を得ない主張であるとせざるを得ないし，さらに，そのように請求項１に係る方法において一部所望の効果を奏し得ない方法が含まれているならば，上記（１）で主張する効果は，本願発明の全範囲について奏する効果であるとすることができないものである（請求項において，本来特定事項として記載されるべき他の何らかの事項が欠けていることが考えられる。）。
　
　したがって，上記請求人の主張はいずれも採用できないものである。
　
第４　むすび
　以上のとおり，本願発明は，本願の優先権主張の日前に頒布された刊行物Ａ及び本願の優先権主張の日前の周知技術に基づいて，当業者が容易に発明をすることができたものであるから，特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであり，他の請求項に係る発明については検討するまでもなく，本願は拒絶すべきものである。
　
　よって，結論のとおり審決する。