【手続補正書】
【提出日】平成23年11月15日(2011.11.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
１）トリテルペン酸乃至はその誘導体と、２）次に示す特性を有するＹＡＣ化合物及び／又はその塩とを含有することを特徴とする、皮膚外用剤。
＜ＹＡＣ化合物の特性＞
（１）λmaxを４０５〜４１５ｎｍと、６６０〜６７０ｎｍとに有する。
（２）図１に示す1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有する。
（３）図２に示す13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを有する。
（４）以下の条件でのＨＰＬＣ分析において、１５分前後にシングルピークを示す。
移動相：９０％アセトニトリル
カラム：ＯＤＳ４．６×２５０ｍｍ
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ．
温度：４０℃
検知：紫外部２１０ｎｍ
（５）化学組成式はＣ34Ｈ40Ｏ9であり、質量分析スペクトルは５９３（Ｍ＋Ｈ）
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５】
前記キク科ヨモギ乃至はキク科カワラヨモギの地上部の抽出物における、ＹＡＣ化合物の含有量は、１０-6質量％〜１０-2質量％であることを特徴とする、請求項４に記載の皮膚外用剤。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
一方、皮膚老化現象においては、アドバンスド・グリケーション・エンドプロダクツ（以下、ＡＧＥｓと略することもある）が重要な役割を担っており、これを分解する成分としてはオリーブの葉の抽出物、ヨモギの葉の抽出物などが存することが知られている（例えば、特許文献７、特許文献８、特許文献９を参照）。本発明者らは、これらの内、ヨモギの抽出物中のＡＧＥｓ分解作用の有効成分を精製し、以下の化学特性を有するＹＡＣ化合物を見出している。この様な性状値を有する化合物は文献上は知られていない。
＜ＹＡＣ化合物の特性＞
（１）λmaxを４０５〜４１５ｎｍと、６６０〜６７０ｎｍとに有する。
（２）図１に示す1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有する。
（３）図２に示す13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを有する。
（４）以下の条件でのＨＰＬＣ分析において、１５分前後にシングルピークを示す。
移動相：９０％アセトニトリル
カラム：ＯＤＳ４．６×２５０ｍｍ
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ．
温度：４０℃
検知：紫外部２１０ｎｍ
（５）化学組成式はＣ34Ｈ40Ｏ9であり、質量分析スペクトルは５９３（Ｍ＋Ｈ）
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
この様な状況に鑑みて、本発明者らはくすみ改善効果を有する化粧料を求めて、鋭意研究努力を重ねた結果、１）トリテルペン酸乃至はその誘導体と、２）次に示す特性を有するＹＡＣ化合物及び／又はその塩とを含有する化粧料がその様な特性を有していることを見出し、発明を完成させるに至った。
＜ＹＡＣ化合物の特性＞
（１）λmaxを４０５〜４１５ｎｍと、６６０〜６７０ｎｍとに有する。
（２）図１に示す1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有する。
（３）図２に示す13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを有する。
（４）以下の条件でのＨＰＬＣ分析において、１５分前後にシングルピークを示す。
移動相：９０％アセトニトリル
カラム：ＯＤＳ４．６×２５０ｍｍ
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ．
温度：４０℃
検知：紫外部２１０ｎｍ
（５）化学組成式はＣ34Ｈ40Ｏ9であり、質量分析スペクトルは５９３（Ｍ＋Ｈ）
即ち、本発明は、以下に示すとおりである。
＜１＞１）トリテルペン酸乃至はその誘導体と、２）次に示す特性を有するＹＡＣ化合物及び／又はその塩とを含有することを特徴とする、皮膚外用剤。
＜ＹＡＣ化合物の特性＞
（１）λmaxを４０５〜４１５ｎｍと、６６０〜６７０ｎｍとに有する。
（２）図１に示す1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有する。
（３）図２に示す13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを有する。
（４）以下の条件でのＨＰＬＣ分析において、１５分前後にシングルピークを示す。
移動相：９０％アセトニトリル
カラム：ＯＤＳ４．６×２５０ｍｍ
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ．
温度：４０℃
検知：紫外部２１０ｎｍ
（５）化学組成式はＣ34Ｈ40Ｏ9であり、質量分析スペクトルは５９３（Ｍ＋Ｈ）
＜２＞前記トリテルペン酸は、ウルソール酸、オレアノール酸、アジア酸及びベツリン酸から選択されるものであることを特徴とする、＜１＞に記載の皮膚外用剤。
＜３＞前記トリテルペン酸の誘導体は、トリテルペン酸の脂肪族又は芳香族のエステル、トリテルペン酸のリン酸エステル及びそれらの塩から選択されるものであることを特徴とする、＜１＞又は＜２＞に記載の皮膚外用剤。
＜４＞前記ＹＡＣ化合物を、キク科ヨモギ乃至はキク科カワラヨモギの地上部の抽出物として含有することを特徴とする、＜１＞〜＜３＞何れかに記載の皮膚外用剤。
＜５＞前記キク科ヨモギ乃至はキク科カワラヨモギの地上部の抽出物における、ＹＡＣ化合物の含有量は、１０-6質量％〜１０-2質量％であることを特徴とする、＜４＞に記載の皮膚外用剤。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
（２）本発明の化粧料の必須成分であるＹＡＣ化合物
本発明の化粧料の必須成分であるＹＡＣ化合物は次に示す性状を有することを特徴とする。
（性状）
（１）λmaxを４０５〜４１５ｎｍと、６６０〜６７０ｎｍとに有する。
（２）図１に示す1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有する。
（３）図２に示す13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを有する。
（４）以下の条件でのＨＰＬＣ分析において、１５分前後にシングルピークを示す。
（５）化学組成式はＣ34Ｈ40Ｏ9であり、質量分析スペクトルは５９３（Ｍ＋Ｈ）
本発明の化粧料の必須成分であるＹＡＣ化合物の紫外・可視吸収スペクトルは図４に示す。この図より、４０５〜４１５ｎｍと、６６０〜６７０ｎｍとにλmaxが存する特徴が明確に判別できる。本発明の化粧料の必須成分であるＹＡＣ化合物を特定する場合、かかる紫外・可視部吸収特性は非常に有利である。即ち、多波長の検出器を備えたＨＰＬＣを用いて、２１０ｎｍの吸収で分析し、ピークについて４０５〜４１５ｎｍと、６６０〜６７０ｎｍとの吸収を確認し、同様に強い吸収が認められた場合には、本願発明のＹＡＣ化合物である蓋然性が非常に高い。この意味で有力な確認手段となる。本願発明のＹＡＣ化合物は、極性溶媒抽出物の非極性部分に存在する。この為、溶媒で抽出し、抽出溶媒を減圧濃縮などで除去した後に酢酸エチルと水で分液し、酢酸エチル相を採取することにより、濃縮することが出来る。このものをシリカゲルカラムクロマトグラフィーなどを用いて、クロロホルム／メタノール混液系で分画精製することにより単離することが出来る。単離したかどうかについては、以下の条件のＨＰＬＣ分析でシングルピーク（リテンションタイム１５分前後）であるか否かを判別することにより特定することが出来る。図３に分析例を示す。この場合のリテンションタイムは１４．７分である。
（ＨＰＬＣ条件）
移動相：９０％アセトニトリル
カラム：ＯＤＳ４．６×２５０ｍｍ
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ．
温度：４０℃
検知：紫外部２１０ｎｍ
（５）化学組成式はＣ34Ｈ40Ｏ9であり、質量分析スペクトルは５９３（Ｍ＋Ｈ）
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
斯くして得られたＹＡＣ化合物は、シリカゲルを担体とする薄層クロマトグラフィー（展開液、クロロホルム：メタノール＝９５：５〜８：２）においてシングルスポットを呈し、ＡＧＥｓ分解活性を示す。ＡＧＥｓ分解活性は、簡易的にはα−ジケトンの切断活性の強さを指標とし、定量化することが出来る。即ち、１−フェニル−１，２−プロパンジオンとともにインキュベートし、切断によって生じる安息香酸を吸光度で定量し、安息香酸の生成量が多いほどＡＧＥｓ分解能が高いと判別できる。これよりｖｉｖｏに近い評価としては、実際にグルコースと牛血清アルブミンとをインキュベートして作成したＡＧＥｓを分解せしめ、分解量を定量し、かかる分解量を指標にＡＧＥｓ分解能を定量する方法も存する。本発明の化粧料の必須成分であるＹＡＣ化合物はこの様な方法でＡＧＥｓ分解能を定量した場合、α−ジケトンの分解において４０〜６０％程度の分解率を呈し、牛アルブミンＡＧＥｓに対しては、１０-3質量％で６５〜８０％程度の分解率を呈する。この性質を利用して本発明の化粧料の必須成分であるＹＡＣ化合物はＡＧＥｓ分解剤として化粧料等に配合し、光照射などで生じたＡＧＥｓを速やかに分解し、この蓄積を防ぐことが出来る。以下に、これらの評価方法の手順を示す。本発明の化粧料に於いては、かかるＡＧＥｓ分解作用がくすみ改善、特にメラニン産生抑制剤で改善しにくいくすみの改善に有用であると考えられる。本発明の化粧料に於いてはかかるＡＧＥｓ分解作用を明確に発現するドーズでのＹＡＣ化合物の含有が好ましい。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
＜製造例１＞
キク科ヨモギ属ヨモギの全草の乾燥物１００ｇを、細切した後、５００ｍｌのメタノールを加えて３時間、加熱還流し、冷却後濾過にて不溶物を取り除いた後、減圧濃縮し、ついで凍結乾燥し、抽出物１を得た。しかる後に、抽出物１に２００ｍｌの水と２００ｍｌの酢酸エチルを加え、液液抽出を行い、酢酸エチル相をとり、減圧濃縮し、分画１を得た。分画１を減圧濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて分画精製した。即ち、シリカゲルをクロロホルムで濡らし、カラムに充填し、クロロホルムに溶解させた分画１の濃縮物をチャージし、クロロホルム、１％メタノール含有クロロホルム、５％メタノール含有クロロホルム、１０％メタノール含有クロロホルム次いで１５％メタノール含有クロロホルムを５０ｍｌ流し、流出分を減圧濃縮した。これらの分画を順に分画２、分画３、分画４、分画５、分画６とした。分画１〜６についてα−ジケトンの切断活性を調べたところ、分画３が最も高く４８％であった。分画３を更にクロロホルム・メタノール混液系を溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーで４回精製し（１回目 クロロホルム：メタノール＝１００：０→１：１、２回目 クロロホルム：メタノール＝１００：２→９：１、３回目 クロロホルム：メタノール＝１００：５→８：２、４回目 クロロホルム：メタノール＝１００：０→１００：５）、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（展開溶媒クロロホルム：メタノール＝９５：５）で、５０％硫酸水溶液焼付での呈色でシングルスポットであるアモルファスの分画７を得た。このもののＮＭＲを図１、図２に示す。ＨＰＬＣ（条件は下記の通り）でのチャートを図３に示す。又、紫外部吸収スペクトルは図４に示す。これらの結果より、構造そのものは不明であるものの、分画７は単一物質であることが推測される。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
＜分画７のグルコース−牛血清アルブミンＡＧＥｓ分解能の測定＞
上述の手技で予めグルコースと牛血清アルブミンより生成させたＡＧＥｓに対する分画７の種々の濃度でのＡＧＥｓ分解作用を測定した。結果をグラフとして図５に示す。これより、分画７の本発明の化合物が１０-5質量％存在すれば、そのＡＧＥｓ分解の有効性を発現することが判る。又、分画７の化合物をヨモギなどの植物の植物体の抽出物乃至はその精製物として含有させる場合、抽出物乃至はその精製物において、配合濃度において前記ＡＧＥｓの分解作用が存するか否かを確かめて、ＡＧＥｓ分解作用が認められた場合には、その抽出物乃至はその精製物の化粧料への含有を可とする様な簡易的な鑑別を行って、化粧料への含有を決定することも出来る。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
【図１】分画７の化合物の1Ｈ−ＮＭＲを示す図である。
【図２】分画７の化合物の13Ｃ−ＮＭＲを示す図である。
【図３】分画７の化合物のＨＰＬＣチャートを示す図である。
【図４】分画７の化合物の紫外吸収スペクトルを示す図である。
【図５】製造例１における分画７のグルコース−牛血清アルブミンＡＧＥｓ分解能を示す図である。
【図６】分画７の化合物の質量分析スペクトルを示す図である。