(57)【要約】  全培地に対して特定量の天然培地成分（ａ）と、全培地に対して特定量のフィチン酸等の成分（ｂ）及び全培地に対して特定量のペントース等の成分（ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１種と、を含有する培地で、２−デオキシ−シロ−イノソース生産大腸菌を培養し、２−デオキシ−シロ−イノソースを生成すること、及び生成した２−デオキシ−シロ−イノソースを培地から回収すること、を含む２−デオキシ−シロ−イノソースの生産方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
全培地に対して１．０ｗ／ｖ％以下の天然培地成分（ａ）と、
下記の成分（ｂ）及び成分（ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１種と、
を含有する培地で、２−デオキシ−シロ−イノソース生産大腸菌を培養し、２−デオキシ−シロ−イノソースを生成すること、及び
生成した２−デオキシ−シロ−イノソースを前記培地から回収すること、
を含む２−デオキシ−シロ−イノソースの生産方法：
（ｂ）全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸、全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸に等モル量のフィチン酸の加水分解物及び全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸に等モル量のフィチン酸の塩からなる群より選ばれるフィチン酸成分；
（ｃ）全培地に対して０．０１ｗ／ｖ％以上０．４５ｗ／ｖ％以下のペントース及び全培地に対して０．０１ｗ／ｖ％以上０．４５ｗ／ｖ％以下のペントースに等モル量のグルコン酸からなる群より選ばれる成分。
【請求項２】
前記培地が、ｐＨ５〜６である請求項１に記載の生産方法。
【請求項３】
前記ペントースが、大腸菌のペントースリン酸経路で代謝可能なペントースである請求項１又は請求項２に記載の生産方法。
【請求項４】
前記２−デオキシ−シロ−イノソース生産大腸菌が、２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素（ＢｔｒＣ）をコードする遺伝子が導入されたことにより２−デオキシ−シロ−イノソース生産能力が付与又は強化された請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の生産方法。
【請求項５】
前記２−デオキシ−シロ−イノソース生産大腸菌が、本来有しているホスホグルコースイソメラーゼ（Ｐｇｉ）及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）の活性が不活化又は低減化された請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の生産方法。
【請求項６】
前記２−デオキシ−シロ−イノソース生産大腸菌が、スクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）をコードする遺伝子を有する請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の生産方法。
【請求項７】
前記２−デオキシ−シロ−イノソース生産大腸菌が、グルコース輸送促進タンパク質（Ｇｌｆ）をコードする遺伝子を有する請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の生産方法。
【請求項８】
前記天然培地成分が、コーンスティープリカーである請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の生産方法。
【請求項９】
請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の生産方法により生産される２−デオキシ−シロ−イノソース。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２−デオキシ−シロ−イノソースの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２−デオキシ−シロ−イノソース（以下、「ＤＯＩ」ともいう。）は、医薬原料、化学工業資源等として用いられる有用な物質である。例えば、特開２０００−２３６８８１号公報によれば、２−デオキシ−シロ−イソノースは、大腸菌を用いて得られた組換えＤＯＩ合成酵素を使用して、グルコース−６−リン酸（Ｇ−６−Ｐ）から短工程で生産できることが明らかとなっている。さらに、例えば、国際公開第２００６／１０９４７９号によれば、ＤＯＩ合成酵素を発現させた大腸菌を用いて、Ｄ−グルコースから発酵プロセスによりＤＯＩを生産する方法も開発されている。これにより、植物由来資源より得られるＤ−グルコースからＤＯＩを生産することが可能になった。【０００３】
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２９，ｐｐ．５０２−５０９（２００７）によると、野生型の大腸菌にＤＯＩ合成酵素を発現させただけではＤＯＩの生産性は僅か１．５ｇ／Ｌであり、ＤＯＩの高い生産性（２９．５ｇ／Ｌ）を達成するためには、大腸菌が保有する３つの酵素遺伝子、ホスホグルコースイソメラーゼ遺伝子（ｐｇｉ）及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｚｗｆ）及びホスホグルコムターゼ遺伝子（ｐｇｍ）を同時に破壊して、グルコースの代謝を遮断することが必要であることが示されている。このため、別途解糖系に利用可能な糖（例えばマンニトール）が菌体の増殖／生育のために必要であると結論づけられている。また、同様な高いＤＯＩ生産性を得るためには、ｐｇｉとｚｗｆの２つを同時に破壊するだけでもよいが、この場合もＤ−グルコースを唯一の炭素源とすると菌体が増殖できなくなるため、菌体の増殖／生育用の炭素源としてＤ−マンニトールが必要であることが示されている。【０００４】
国際公開第２０１０／０５３０５２号によると、本来はスクロースを代謝できない大腸菌（大腸菌Ｋ１２由来株と大腸菌Ｂ由来株）のｐｇｉとｚｗｆの２つの遺伝子を破壊し、ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）とスクロース加水分解酵素遺伝子（ｃｓｃＡ）を導入することで、スクロースを加水分解し、生成するＤ−フルクトースとＤ−グルコースの内、Ｄ−フルクトースを菌体の増殖／生育用の炭素源として利用し、Ｄ−グルコースをＤＯＩ原料の炭素源として利用してＤＯＩを発酵生産できることが示されている。【０００５】
発酵は、微生物の培養と、培養により増殖した微生物を触媒とした物質生産とを含む。微生物の培養及び増殖には栄養源が必要となる。通常の微生物培養培地には、酵母エキス、コーンスティープリカー（以下、「ＣＳＬ」ともいう。）等といった、天然培地成分を利用することが多い。ＣＳＬは、コーンスターチ製造過程で、とうもろこし粒を亜硫酸液に浸漬して得られる副生物であり、とうもろこし粒から溶出された可溶性タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖類、ビタミン類がＣＳＬに含まれる。そのほか、ＣＳＬには、とうもろこし粒の亜硫酸液への浸漬中に生じる乳酸発酵によって生成される独特な成分も含まれるため、きわめて栄養価の高い天然培地成分である。ＣＳＬは、酵母エキス等と比べて安価なため、抗生物質、ビタミン、アミノ酸、酵素等の生産における微生物培養の重要な培地成分として広く利用されている。ＤＯＩ発酵生産でも、３０ｇ／ＬのＣＳＬ（３ｗ／ｖ％）を培地に添加することで、良好な生産性を得られる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、天然培地成分には、大腸菌の増殖や物質生産に必要ではない有機物も多く含まれる。ＤＯＩ生産大腸菌でＤＯＩを生産しようとする場合に、このような有機物が培養液中に大量に含まれていると、培養液の精製負荷が大きくなり、ＤＯＩを得るための精製回収工程が煩雑になるので、全培地中の天然培地成分量を例えば１ｗ／ｖ％以下に制限する必要が生じることが明らかになった。しかし、培養液の精製負荷を小さくする為に、天然培地成分の使用量を減らせば栄養源が減ることになり、微生物の増殖が制限されて生産性が悪化することが予想できる。【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、ＤＯＩ生産大腸菌を、全培地に対して１ｗ／ｖ％以下の天然培地成分を含む培地で培養することができ、培地中に蓄積したＤＯＩを回収する際の工程数を抑制でき、且つ全培地に対して３ｗ／ｖ％程度の天然培地成分を含む培地でＤＯＩ生産大腸菌を培養したときと同等のＤＯＩの生産性を維持し得るＤＯＩ生産方法及び当該生産方法により生産されるＤＯＩを提供することである。
なお、本発明者の知る限りにおいて、フィチン酸成分を培地に添加することでＤＯＩ生産大腸菌のＤＯＩの生産性が向上することを示す報告も、グルコン酸を培地に添加することでＤＯＩ生産大腸菌がＤＯＩを生産することを示す報告もない。また、生育炭素源とは別に特定量のペントースを添加することでＤＯＩ生産性が向上することを示す報告もない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ＣＳＬ使用量を低減しても、特定量のフィチン酸成分と、特定量のペントース及び／又はグルコン酸と、からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む培地を使用することで、ＣＳＬ使用量を低減しない場合と同等のＤＯＩ生産性を維持できる方法を見出した。【０００９】
本発明の態様は以下のとおりである。
［１］  全培地に対して１．０ｗ／ｖ％以下の天然培地成分（ａ）と、
下記の成分（ｂ）及び成分（ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１種と、
を含有する培地で、２−デオキシ−シロ−イノソース生産大腸菌を培養し、２−デオキシ−シロ−イノソースを生成すること、及び
生成した２−デオキシ−シロ−イノソースを培地から回収すること、
を含む２−デオキシ−シロ−イノソースの生産方法：
（ｂ）全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸、全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸に等モル量のフィチン酸の加水分解物及び全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸に等モル量のフィチン酸の塩からなる群より選ばれるフィチン酸成分；
（ｃ）全培地に対して０．０１ｗ／ｖ％以上０．４５ｗ／ｖ％以下のペントース及び全培地に対して０．０１ｗ／ｖ％以上０．４５ｗ／ｖ％以下のペントースに等モル量のグルコン酸からなる群より選ばれる成分。
［２］  前記培地が、ｐＨ５〜６である［１］に記載の生産方法。
［３］  前記ペントースが、大腸菌のペントースリン酸経路で代謝可能なペントースである［１］又は［２］に記載の生産方法。
［４］  前記２−デオキシ−シロ−イノソース生産大腸菌が、２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素（ＢｔｒＣ）をコードする遺伝子が導入されたことにより２−デオキシ−シロ−イノソース生産能力が付与又は強化された［１］から［３］のいずれか１つに記載の生産方法。
［５］  前記２−デオキシ−シロ−イノソース生産大腸菌が、本来有しているホスホグルコースイソメラーゼ（Ｐｇｉ）及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）の活性が不活化又は低減化された［１］から［４］のいずれか１つに記載の生産方法。
［６］  前記２−デオキシ−シロ−イノソース生産大腸菌が、スクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）をコードする遺伝子を有する［１］から［５］のいずれか１つに記載の生産方法。
［７］  前記２−デオキシ−シロ−イノソース生産大腸菌が、グルコース輸送促進タンパク質（Ｇｌｆ）をコードする遺伝子を有する［１］から［６］のいずれか１つに記載の生産方法。
［８］  前記天然培地成分が、コーンスティープリカーである［１］から［７］のいずれか１つに記載の生産方法。
［９］  ［１］から［８］のいずれか１つに記載の生産方法により生産される２−デオキシ−シロ−イノソース。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ＤＯＩ生産大腸菌を、全培地に対して１．０ｗ／ｖ％以下の天然培地成分を含む培地で培養することができ、培地中に蓄積したＤＯＩを回収する際の工程数を抑制でき、且つ全培地に対して３ｗ／ｖ％程度の天然培地成分を含む培地でＤＯＩ生産大腸菌を培養したときと同等のＤＯＩの生産性を維持し得るＤＯＩ生産方法及び当該生産方法により生産されるＤＯＩを提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の２−デオキシ−シロ−イノソース（ＤＯＩ）の生産方法は、全培地に対して１．０ｗ／ｖ％以下の天然培地成分（ａ）と、
下記の成分（ｂ）及び成分（ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１種と、
を含有する培地で、２−デオキシ−シロ−イノソース生産大腸菌を培養し、２−デオキシ−シロ−イノソースを生成すること（以下「ＤＯＩ生成工程」とも称する。）、及び生成した２−デオキシ−シロ−イノソースを培地から精製して回収すること（以下「ＤＯＩ精製回収工程」とも称する。）を含む。
（ｂ）全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸、全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸に等モル量のフィチン酸の加水分解物及び全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸に等モル量のフィチン酸の塩からなる群より選ばれるフィチン酸成分。
（ｃ）全培地に対して０．０１ｗ／ｖ％以上０．４５ｗ／ｖ％以下のペントース及び全培地に対して０．０１ｗ／ｖ％以上０．４５ｗ／ｖ％以下のペントースに等モル量のグルコン酸からなる群より選ばれる成分。
【００１２】
本発明のＤＯＩの生産方法は、ＤＯＩ生産大腸菌を、全培地に対して１．０ｗ／ｖ％以下の天然培地成分を含む培地で培養することができ、培地中に蓄積したＤＯＩを精製して回収する際の工程数を抑制でき、且つ全培地に対して３ｗ／ｖ％程度の天然培地成分を含む培地でＤＯＩ生産大腸菌を培養したときと同等のＤＯＩの生産性を維持し得る。
【００１３】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本発明において、組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
なお、「全培地」とは、回分培養の場合は培養容器内に入れた培地のことを指し、流加培養の場合は初発培地と流加培地を合わせたものを指し、連続培養の場合は培養槽中にある培地のことを指す。
【００１４】
本発明における「不活化」とは、既存のあらゆる測定系によって測定された酵素（特に断らない限り、本明細書において「酵素」には、単独では酵素活性を示さない「因子」も含まれる）の活性が不活化前のＤＯＩ生産大腸菌での活性を１００としたとき、その１／１０以下である状態を指す。
本発明における酵素活性の「低減」とは、当該酵素をコードする遺伝子の遺伝子組換え技術により、それらの処理を行う前の状態よりも有意に当該酵素の活性が低下している状態を指す。
【００１５】
本発明における「活性」の「強化」とは、強化前のＤＯＩ生産大腸菌での各種酵素活性が強化後に高まることを広く意味する。
強化の方法としては、ＤＯＩ生産大腸菌が有している各種酵素の活性が高まれば、特に制限はなく、細胞外から導入された酵素遺伝子による強化、細胞内の酵素遺伝子の発現増強による強化及びこれらの組み合わせを挙げることができる。
【００１６】
細胞外から導入された酵素遺伝子による強化としては、具体的には、宿主由来の酵素よりも高活性の酵素をコードする遺伝子を宿主微生物の細胞外から遺伝子組換え技術により細胞内に導入して、導入された酵素遺伝子による酵素活性を追加する、又は、この酵素活性に宿主が本来有する酵素活性と置換すること、更には宿主由来の酵素遺伝子又は細胞外からの酵素遺伝子の数を２以上に増加させること、及びこれらの組み合わせを挙げることができる。
微生物内の酵素遺伝子の発現増強による強化としては、具体的には、酵素遺伝子の発現を増強する塩基配列を宿主微生物の微生物外から微生物内に導入すること、宿主微生物がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーターを他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子の発現を強化させること、及びこれらの組み合わせを挙げることができる。
【００１７】
本発明における「活性」の「付与」とは、対象酵素遺伝子を見出せない微生物に対して、酵素遺伝子を外部から導入し、対象となる酵素の活性を与えることを広く意味する。付与の方法としては、微生物に対象となる酵素の活性が与えられれば、特に制限はなく、酵素遺伝子を保有するプラスミドによる形質転換、酵素遺伝子のゲノムへの導入、及びこれらの組み合わせを挙げることができる。
「活性」の「強化」又は「付与」で用いられるプロモーターとしては、遺伝子を発現できるものであれば特に制限はないが、構成型プロモーター又は誘導型プロモーターを使用することができる。
【００１８】
対象となる酵素遺伝子を、当該微生物が有しているか否かを判断する方法としては、たとえば、ＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／）又はＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／）等に登録されている、各菌株の遺伝子情報を参照して判断することが挙げられる。なお、本発明では、ＫＥＧＧ又はＮＣＢＩに登録されている、各菌株の遺伝子情報のみを用いることとする。
【００１９】
本発明における酵素活性の付与は、例えば酵素をコードする遺伝子を遺伝子組換え技術により宿主細菌の細胞外から細胞内に導入することにより行うことができる。このとき、導入される酵素遺伝子は、宿主細胞に対して同種又は異種の細胞のいずれの由来のものであってもよい。
【００２０】
細胞外から細胞内へ遺伝子を導入する際に必要なゲノムＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設計、合成等の方法は、当業者によく知られている通常の方法で行うことができる。これらの方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ”，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）などに記載されている。
【００２１】
本発明における「遺伝子組換え技術により」等との文言は、生来の遺伝子の塩基配列に対する別のＤＮＡの挿入、又は遺伝子のある部分の置換、欠失又はこれらの組み合わせによって塩基配列上の変更が生じているものであれば全て包含し、例えば、突然変異が生じた結果得られたものであってもよい。
【００２２】
本発明において因子又は酵素の活性が不活化された微生物とは、細胞外から細胞内への何らかの方法によって、生来の活性が損なわれた微生物を指す。これらの微生物は、例えば該蛋白質又は酵素をコードする遺伝子を破壊すること（遺伝子破壊）により作出することができる。
【００２３】
本発明における遺伝子破壊としては、ある遺伝子の機能が発揮できないようにするために、その遺伝子の塩基配列に変異を入れる、別のＤＮＡを挿入する、及び、遺伝子のある部分を欠失させることを挙げることができる。遺伝子破壊の結果、例えばその遺伝子がｍＲＮＡへ転写できなくなり、構造遺伝子が翻訳されなくなる。又は、転写されたｍＲＮＡが不完全なために翻訳された構造蛋白質のアミノ酸配列に変異又は欠失が生じて本来の機能の発揮が不可能になる。
【００２４】
遺伝子破壊株の作製は、当該酵素又は蛋白質が発現しない破壊株が得られればいかなる方法も用いることが可能である。遺伝子破壊の方法は種々の方法（自然育種、変異剤添加、紫外線照射、放射線照射、ランダム突然変異、トランスポゾン、部位特異的遺伝子破壊等）が報告されているが、ある特定の遺伝子のみ破壊できるという点で、相同組換えによる遺伝子破壊が好ましい。相同組換えによる手法はＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６１，１２１９−１２２１（１９８５）やＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７，１５１１−１５１９（１９９５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，９７，６６４０−６６４５（２０００）等に記載されており、これらの方法及びその応用によって同業技術者であれば容易に実施可能である。
以下、本発明について更に詳細に説明する。
【００２５】
≪ＤＯＩ生成工程≫
本発明のＤＯＩ生産方法は、全培地に対して１．０ｗ／ｖ％以下の天然培地成分（ａ）と、下記の成分（ｂ）及び成分（ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１種と、を含有する培地で、ＤＯＩ生産大腸菌を培養し、ＤＯＩを生成するＤＯＩ生成工程を有する：
（ｂ）全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸、全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸に等モル量のフィチン酸の加水分解物及び全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸に等モル量のフィチン酸の塩からなる群より選ばれるフィチン酸成分；
（ｃ）全培地に対して０．０１ｗ／ｖ％以上０．４５ｗ／ｖ％以下のペントース及び全培地に対して０．０１ｗ／ｖ％以上０．４５ｗ／ｖ％以下のペントースに等モル量のグルコン酸からなる群より選ばれる成分。
【００２６】
ＤＯＩ生産大腸菌の培養方法としては、ＤＯＩを良好に生成できる方法であれば特に制限はなく、例えば、回文培養、連続培養、流加培養等が挙げられる。
回文培養とは、菌を培地に植菌して培養を開始してから終了時まで培地を加えない培養方法を指す。
連続培養とは、培養中の培養容器に培地を連続的又は間欠的に流加しながら、培養容器から培地を抜き出す培養方法を指す。
流加培養とは、培養中の培養容器に培地を連続的又は間欠的に流加し、培養終了時まで培養容器から培地を抜き出さない培養方法を指す。
本発明におけるＤＯＩ生成工程においては、流加培養又は連続培養が、培養液中の糖濃度を低くすることでＤＯＩ生産大腸菌への浸透圧ストレスを低減させ、また、新鮮な培地を与え続けることで生産効率が向上可能な観点で好ましい。
【００２７】
培養条件は培養するＤＯＩ生産大腸菌の種類、量、培養装置等により適宜設定することができる。例えば、培養温度は２０℃以上４０℃以下が好ましく、２５℃以上３０℃以下がより好ましい。
【００２８】
培養時の培養槽の圧力は、常圧（０．１ＭＰａ）〜０．５ＭＰａであることが好ましく、常圧（０．１ＭＰａ）〜０．２ＭＰａであることがより好ましい。
【００２９】
培養時の培地のｐＨは、例えばｐＨ４〜７にすることができる。培地のｐＨをこの範囲にすることにより、ＤＯＩ生産大腸菌のＤＯＩ生成効率を向上することができる。より好ましくはｐＨ５〜６となるように培地のｐＨを調整することが好ましい。
ｐＨの測定は、特に限定されないが、例えば、ｐＨメータ（型番：ＨＭ−３０Ｖ、東亜ディーケーケー（株）製）により行うことができる。
【００３０】
培養に際しては通常は、温度、ｐＨ、通気条件、撹拌速度等を制御し得る培養槽を用いるのが一般的であるが、本発明のＤＯＩ生産方法においては、培養に際して培養槽を使用することに限定されるものではない。培養槽を用いて培養する場合には、必要により、予め前培養として種培養を行い、これを必要量予め調製しておいた培養槽内の培地に接種してもよい。
【００３１】
培養に際しては、通気を全く行わなくともよいが、ＤＯＩ生産大腸菌のＤＯＩ生成効率を向上させるためには通気を行った方がよい。通気とは、必ずしも培養液中を空気が通過する必要はなく、培養槽の形状によっては適度に培養液を撹拌しながら培養液上の空気層が換気されるような上面通気も含み、培養槽の内部に何らかの方法で酸素を含む気体が流入できるものであればよい。
【００３２】
培養液中に通気する場合は内圧、撹拌羽根位置、撹拌羽根形状、撹拌速度の組み合わせ等により溶存酸素濃度が変化するため、ＤＯＩの生産性及びＤＯＩ以外の有機酸量等を指標に次のように最適条件を求めることができる。
例えば、ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１等の比較的小型の培養槽で培養する場合は、３５０ｇの初発培地を使用した際、空気を常圧で０．００５Ｌ／分〜２Ｌ／分、撹拌速度５０ｒｐｍ〜２０００ｒｐｍ、より好ましくは、常圧で０．０５Ｌ／分〜１Ｌ／分、撹拌速度１００ｒｐｍ〜１０００ｒｐｍで達成し得る通気条件で好ましい結果を得ることができる。しかし、通気条件はこれに限定されるものではない。また、上述した通気条件を、培養初期から終了まで一定して保つ必要はなく、培養工程の一部で通気を行ってもよい。
【００３３】
培養方法として連続培養又は流加培養を採用する場合には、初発培地に流加培地を添加すればよい。
初発培地とは、菌を植菌して培養を開始する時に培養容器内に存在する培地を指す。
流加培地とは、培養中に培養容器等に流加される培地を指す。流加培地を添加する時期、量、流加速度等の条件は、特に限定されるものではない。例えば、初発培地に、前培養した菌を移して、本培養を開始した時から、初発培地の重量に対して１ｗ／ｗ％〜３００ｗ／ｗ％の流加培地を、毎時、初発培地の重量の０．１ｗ／ｗ％〜１０ｗ／ｗ％ずつ添加すればよい。
【００３４】
本発明のＤＯＩ生産方法において、培地は、
全培地に対して１．０ｗ／ｖ％以下の天然培地成分（ａ）と、
下記の成分（ｂ）及び成分（ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１種と、
を含有する。
（ｂ）全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸、全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸に等モル量のフィチン酸の加水分解物及び全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸に等モル量のフィチン酸の塩からなる群より選ばれるフィチン酸成分；
（ｃ）全培地に対して０．０１ｗ／ｖ％以上０．４５ｗ／ｖ％以下のペントース及び全培地に対して０．０１ｗ／ｖ％以上０．４５ｗ／ｖ％以下のペントースに等モル量のグルコン酸からなる群より選ばれる成分。
また、培地は、これらの成分の他に、ＤＯＩ生産大腸菌の生育に必要な水等の水性媒体、炭素源、窒素源、無機塩類等を含有してもよい。
【００３５】
培地は滅菌して培養に使用するのが好ましい。当該培地の滅菌方法は、培地を、増殖能力のある微生物等が存在しない無菌状態にすることができる方法であれば限定されない。滅菌方法としては、例えば、加圧滅菌（オートクレーブ；例えば１２１℃、２０分間の加熱滅菌）又はろ過滅菌（例えば孔径０．４５μｍ又は０．２μｍのフィルターによるろ過）等による滅菌方法等が挙げられる。加熱滅菌の際に培地成分同士の反応が懸念される場合には、１種類以上の培地成分を、それ以外の培地成分とは別に滅菌し、各々を滅菌後に混合してもよい。
【００３６】
＜天然培地成分（ａ）＞
本発明における培地は、全培地に対して１．０ｗ／ｖ％以下の天然培地成分（ａ）を含有する。
天然培地成分（ａ）とは、天然培地を調製する際に使用される成分のことを指す。具体的には、ペプトン（牛乳、獣肉、魚肉又は大豆タンパク質等由来）、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、トマトジュース、オートミール、果汁、野菜汁、豆乳、動物乳、スキムミルク、穀物、イモ、豆、海藻又はキノコの酵素消化物、廃糖蜜等の天然物に由来する成分が挙げられる。中でも、天然培地成分としてコーンスティープリカーを用いることにより、大腸菌の生育及びＤＯＩ生産性培養が効率よく行える。
【００３７】
培地に含まれる天然培地成分（ａ）が、全培地に対して、１．０ｗ／ｖ％以下であることが、ＤＯＩ精製回収工程の工程数を抑制できるという観点から好ましい。また、天然培地成分は、全培地に対して、０．６ｗ／ｖ％以下であることがより好ましい。
また、培地に含まれる天然培地成分が、全培地に対して、０．１ｗ／ｖ％以上であることが、良好なＤＯＩ生産性の観点から好ましい。また、天然培地成分は、全培地に対して、０．３ｗ／ｖ％以上であることがより好ましい。
培地に含まれる天然培地成分の含有率の範囲については、上限値と下限値とを組み合わせて、適宜設定することができる。
【００３８】
また、培地に含まれる天然培地成分（ａ）の量（本培養開始時点）は、０〜２．２ｗ／ｖ％であることが好ましく、０〜１．８ｗ／ｖ％であることがより好ましく、０〜１．０ｗ／ｖ％であることが更に好ましい。
なお、培地が、特に初発培地である場合には、培地に含まれる天然培地成分（ａ）の量（本培養開始時点）は、０．５ｗ／ｖ％〜１．８ｗ／ｖ％であることがより好ましい。
全培地中の天然培地成分（ａ）の量を２２ｇ／Ｌ以下とすることにより、精製負荷の低減された培養液を得ることができるため好ましい。
連続培養又は流加培養する際には、天然培地成分（ａ）は、初発培地及び流加培地のどちらか一方又は両方に添加することができる。
【００３９】
また、本発明における培地は、特定量の天然培地成分（ａ）の他に、下記のフィチン酸成分（ｂ）及び成分（ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１種を含有する。
フィチン酸成分（ｂ）：全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸、全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸に等モル量のフィチン酸の加水分解物及び全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸に等モル量のフィチン酸の塩からなる群より選ばれるフィチン酸成分。
成分（ｃ）：全培地に対して０．０１ｗ／ｖ％以上０．４５ｗ／ｖ％以下のペントース及び全培地に対して０．０１ｗ／ｖ％以上０．４５ｗ／ｖ％以下のペントースに等モル量のグルコン酸からなる群より選ばれる成分。
【００４０】
＜フィチン酸成分（ｂ）＞
本発明における培地は、全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸、全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸に等モル量のフィチン酸の加水分解物及び全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸に等モル量のフィチン酸の塩からなる群より選ばれるフィチン酸成分（ｂ）を含有することができる。
フィチン酸成分としては、フィチン酸、フィチン酸の加水分解物及びフィチン酸の塩が挙げられる。
フィチン酸は、ｍｙｏ−イノシトールの六リン酸エステルであり、イノシトールヘキサキスリン酸とも呼ばれる。また、フィチン酸のマグネシウム及びカルシウムの混合塩は極めて水に不溶性でありフィチンと呼ばれ、穀類などの植物種子や幼植物に多量に存在し、リン酸の主要貯蔵形物質であることが知られている。また、フィチン酸はホスファターゼの一種、フィターゼにより加水分解され、６個のリン酸が一つずつ遊離する６段階の反応を経て、ｍｙｏ−イノシトールと無機リン酸とを生成する。
【００４１】
フィチン酸の加水分解物とは、フィチン酸の加水分解物であれば特に制限はされないが、ＤＯＩの生産性向上の観点より、フィチン酸を加水分解して生成するｍｙｏ−イノシトールと遊離のリン酸との混合物であることが好ましい。また、１〜５個のリン酸が結合しているフィチン酸の部分加水分解物であってもよい。また、ｍｙｏ−イノシトールに１〜５個のリン酸が結合したｍｙｏ−イノシトールのリン酸エステルであれば、実際にはこれらが加水分解により得られたものでなく、化学合成又は穀物、豆類、果物、肉、魚等からの抽出物等から得られたものであってもよい。
本明細書においてフィチン酸に等モル量のフィチン酸の加水分解物とは、フィチン酸の加水分解物中のｍｙｏ−イノシトール又はそのリン酸エステルのモル数がフィチン酸モル数に等しいことを指す。
【００４２】
フィチン酸の塩とは、フィチン酸にカルシウム、マグネシウム、カリウム又はナトリウム等が結合したもの、及びその２種以上の混合塩を指す。フィチン酸の部分加水分解物との塩も本発明におけるフィチン酸の塩に含まれる。
フィチン酸成分（ｂ）は、フィチン酸、フィチン酸の加水分解物又はフィチン酸の塩を１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
フィチン酸成分（ｂ）は、フィチン酸、フィチン酸の加水分解物及びフィチン酸の塩からなる群より選ばれる１種であることが好ましい。
２種以上のフィチン酸成分（ｂ）を使用する場合、フィチン酸成分（ｂ）の総含有率は、全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下又は０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸と当モル量であることが好ましい。
【００４３】
フィチン酸の含有率は、全培地に対して、０．０２ｗ／ｖ％以上０．３０ｗ／ｖ％以下であることが好ましく、０．０３ｗ／ｖ％以上０．２０ｗ／ｖ％以下であることがより好ましく、０．０５ｗ／ｖ％以上０．１０ｗ／ｖ％以下であることがさらに好ましい。
フィチン酸の加水分解物の含有率は、全培地に対して、０．０２ｗ／ｖ％以上０．３０ｗ／ｖ％以下のフィチン酸に等モル量であることが好ましく、０．０３ｗ／ｖ％以上０．２０ｗ／ｖ％以下のフィチン酸に等モル量であることがより好ましく、０．０５ｗ／ｖ％以上０．１０ｗ／ｖ％以下のフィチン酸に等モル量であることがさらに好ましい。
フィチン酸の塩の含有率は、全培地に対して、０．０２ｗ／ｖ％以上０．３０ｗ／ｖ％以下のフィチン酸に等モル量であることが好ましく、０．０３ｗ／ｖ％以上０．２０ｗ／ｖ％以下のフィチン酸に等モル量であることがより好ましく、０．０５ｗ／ｖ％以上０．１０ｗ／ｖ％以下のフィチン酸に等モル量であることがさらに好ましい。
【００４４】
フィチン酸成分の含有量は、０．４ｍｍｏｌ／Ｌ以上５．０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上３．０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることがより好ましく、０．７４ｍｍｏｌ／Ｌ以上１．５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることがさらに好ましい。
フィチン酸成分の含有量は、全培地に含まれるフィチン酸、フィチン酸の加水分解物及びフィチン酸の塩の合計量を意味する。
フィチン酸成分の含有量が全培地に対して、０．７４ｍｍｏｌ／Ｌ以上であれば、ＤＯＩ生産性の向上効果があるので好ましく、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であれば、生産コストが高くなりすぎないので好ましい。なお、全培地に対して０．７４ｍｍｏｌ／Ｌ以上１．５ｍｍｏｌ／Ｌ以下のフィチン酸成分の含有量は、フィチン酸の含有率に換算すると、全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下に該当する。
【００４５】
実生産では複数の原料を調達するよりも、１種の原料を調達する方が簡単かつ低コストである。そのためフィチン酸成分としては、全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸、全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸に等モル量のフィチン酸の加水分解物、又は、全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸に等モル量のフィチン酸の塩のいずれか１種を含有することがより好ましい。
【００４６】
流加培養又は連続培養する際は、フィチン酸成分を初発培地及び流加培地のどちらか一方又は両方に添加してもよい。流加培養する際は、フィチン酸を初発培地及び流加培地のどちらか一方或いは両方に添加してもよいが、初発培地に添加することがより好ましい。
【００４７】
酵母にとって、フィチン酸は発酵促進剤となることが知られている。
酵母はフィターゼによりフィチン酸を加水分解し、生成したｍｙｏ−イノシトールを利用する。酵母にとってｍｙｏ−イノシトールはフォスファチジルイノシトールとして主要リン脂質を構成する不可欠の物質である。
Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．Ｖｏｌ．９８，Ｎｏ．２，１０７−１１３，２００４には、細胞内にｍｙｏ−イノシトールが蓄積すると、細胞膜のフォスファチジルイノシトール含量が上がり、エタノール耐性になることが示されている。しかし、大腸菌の膜にフォスファチジルイノシトールは含まれず、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｖｏｌ．１７７，Ｎｏ．１０，２９２６−２９２８，１９９５には、培地にｍｙｏ−イノシトールを添加しても野生型の大腸菌はフォスファチジルイノシトールを合成できないことが示されており、フィチン酸が酵母に与えるような効果を大腸菌が得られるとは考えられない。
【００４８】
＜ペントース及び／又はグルコン酸＞
本発明における培地は、全培地に対して０．０１ｗ／ｖ％以上０．４５ｗ／ｖ％以下のペントース及び全培地に対して０．０１ｗ／ｖ％以上０．４５ｗ／ｖ％以下のペントースに等モル量のグルコン酸からなる群より選ばれる成分（ｃ）を含有することができる。
本発明のＤＯＩ生産方法に使用し得るペントースとしては、大腸菌のペントースリン酸経路で代謝可能なペントースであれば特に制限はされない。具体的には、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−リボース等が挙げられる。
【００４９】
ペントースの全培地に対する含有率は、全培地に対して、０．０１ｗ／ｖ％以上０．４５ｗ／ｖ％以下であることが好ましく、０．０２ｗ／ｖ％以上０．１０ｗ／ｖ％以下であることがより好ましく、０．０２ｗ／ｖ％以上０．０５ｗ／ｖ％以下であることがさらに好ましい。
なお、ペントースの含有率は、全培地に含まれるＤ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−リボース等の合計量を意味する。
【００５０】
グルコン酸の全培地に対する含有率は、全培地に対して、０．０１ｗ／ｖ％以上０．４５ｗ／ｖ％以下のペントースに等モル量であることが好ましく、０．０２ｗ／ｖ％以上０．１０ｗ／ｖ％以下のペントースに等モル量であることがより好ましく、０．０２ｗ／ｖ％以上０．０５ｗ／ｖ％以下のペントースに等モル量であることがさらに好ましい。
また、本発明において「グルコン酸」としては、グルコン酸の他に、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カリウム及びグルコン酸カルシウム等のグルコン酸塩が含まれる。
なお、グルコン酸の含有率は、全培地に含まれるグルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カリウム、グルコン酸カルシウム等の合計量を意味する。
ペントース及び／又はグルコン酸は、いずれかの種類を１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
ペントース及びグルコン酸を併用する場合、ペントースとグルコン酸との総含有率は、全培地に対して０．０１ｗ／ｖ％以上０．４５ｗ／ｖ％以下であることが好ましく、０．０２ｗ／ｖ％以上０．１０ｗ／ｖ％以下であることがより好ましく、０．０２ｗ／ｖ％以上０．０５ｗ／ｖ％以下であることがさらに好ましい。
【００５１】
流加培養又は連続培養する際は、ペントース及び／又はグルコン酸を初発培地及び流加培地のどちらか一方或いは両方に添加してもよい。流加培養する際は、ペントース及び／又はグルコン酸を初発培地及び流加培地のどちらか一方或いは両方に添加してもよいが、流加培地に添加することがより好ましい。本発明で使用するペントースは、Ｄ−キシロースやＬ−アラビノースなど、大腸菌のペントースリン酸経路で代謝されるものを使用することができる。
流加培地中のペントース及び／又はグルコン酸の濃度は、ペントースの濃度に換算して、０．０２ｗ／ｖ％以上が好ましく、０．０３ｗ／ｖ％〜１．００ｗ／ｖ％の範囲がより好ましく、０．０４ｗ／ｖ％〜０．１０ｗ／ｖ％の範囲がさらに好ましい。
【００５２】
ＤＯＩ生産大腸菌は、Ｚｗｆの活性が低減化又は不活化されており、グルコースをペントースリン酸経路へ送ることができないが、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｖｏｌ．６，  ｐｐ１６４−１７４、２００４によれば、ｚｗｆ破壊大腸菌は、トリカルボン酸回路の活性化などにより、最少培地でも元の大腸菌と同等の生育が可能であることが明らかになっている。しかし、驚くべきことに、ＤＯＩ生産大腸菌では、流加培地に０．０５ｗ／ｖ％という低濃度でＤ−キシロース、Ｌ−アラビノース又はグルコン酸を添加して培養することで、ＤＯＩ生産性が大きく向上した。
【００５３】
本発明における培地は、特定量の天然培地成分（ａ）と、全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸、全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸に等モル量のフィチン酸の加水分解物及び全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸に等モル量のフィチン酸の塩からなる群より選ばれるフィチン酸成分（ｂ）と、全培地に対して０．０１ｗ／ｖ％以上０．４５ｗ／ｖ％以下のペントース及び全培地に対して０．０１ｗ／ｖ％以上０．４５ｗ／ｖ％以下のペントースに等モル量のグルコン酸からなる群より選ばれる成分（ｃ）と、を含有することが、ＤＯＩ生産性向上の観点から好ましい。
【００５４】
フィチン酸成分とペントースとを組み合わせる場合において、フィチン酸成分とペントースとの全培地における含有比率（フィチン酸成分：ペントース）は、質量基準で、０．９：１〜６．８：１であることがＤＯＩ生産性の観点より好ましい。また、フィチン酸成分とペントースとの全培地における含有比率（フィチン酸成分：ペントース）は、質量基準で、１：１〜４：１であることがより好ましく、１．２：１〜３．５：１であることがさらに好ましい。
【００５５】
フィチン酸成分とペントース及び／又はグルコン酸とを組み合わせる場合において、フィチン酸成分とペントース及び／又はグルコン酸との全培地における含有比率（フィチン酸成分：ペントース及び／又はグルコン酸）は、物質量基準で、０．２：１〜１．８：１であることがＤＯＩ生産性の観点より好ましい。また、フィチン酸成分とペントース及び／又はグルコン酸との全培地における含有比率（フィチン酸成分：ペントース及び／又はグルコン酸）は、物質量基準で、０．３：１〜１．６：１であることがより好ましく、０．４：１〜０．９：１であることがさらに好ましい。
【００５６】
＜その他の炭素源＞
通常、ＤＯＩの原料、大腸菌の生育等にもペントース又はグルコン酸以外の炭素源（以下「その他の炭素源」とも称する。）が必要である。本発明の製造方法に用いる培地は、上述の天然培地成分（ａ）並びにフィチン酸成分（ｂ）及び／又は成分（ｃ）に加えて、その他の炭素源を含むことができる。
その他の炭素源としては、スクロース、デンプン、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース等が挙げられる。中でも、その他の炭素源としては、ＤＯＩの原料となる糖という観点から、グルコースが好適である。スクロース加水分解酵素遺伝子（ｃｓｃＡ）を保有する菌を使用する場合は、スクロースも好適に使用できる。
【００５７】
＜その他の成分＞
本発明における培地は、上述の天然培地成分（ａ）並びにフィチン酸成分（ｂ）及び／又はペントース若しくはグルコン酸（成分（ｃ））の他に、ＤＯＩ生産大腸菌の生育に必要な水等の水性媒体、窒素源、無機塩類、ビタミン等、培養中の培地の発泡を防ぐための消泡剤等を含有してもよい。無機塩類、ビタミン等は、大腸菌の生育に好適であれば必要に応じて含まれていてもよい。無機塩類及びビタミン類を含有する培地としては、例えば公知のＭ９培地等の組成が例示されるが、これらに限定されない。
【００５８】
ＤＯＩ生産大腸菌を、流加培養又は連続培養する際は、炭素源となる糖は初発培地に添加してもよいし、流加培地に添加してもよい。
初発培地に糖を添加する場合は、大腸菌に浸透圧ストレスがかからない程度の濃度で添加するのが好ましい。又は、初発培地には添加せずに、流加培地中に、流加培地の２５ｗ／ｖ％から５０ｗ／ｖ％の濃度になるように糖を添加し、本培養開始と同時に流加を開始することが好ましい。流加培地に糖を添加することで、ＤＯＩ生産大腸菌にかかる浸透圧ストレスが低減され、良好な生産性を得られる。
【００５９】
窒素源としては、全培地に対し１．０ｗ／ｖ％以下である天然物（微生物、植物、動物乳又は動物肉等）に由来する窒素原子含有成分、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、アンモニア、その他アミノ酸や窒素化合物等を挙げることができる。
窒素源の種類及び量については、当業者が適宜設定することができる。
無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、硫酸塩等が使用される。例えば、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、モリブデン酸ナトリウム、ホウ酸、硫酸銅、ヨウ化カリウム、又は炭酸カルシウム等が挙げられる。これら無機塩は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。培地中の無機塩類の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常約０．００１〜１．０％（ｗｔ）である。
さらに必要に応じて、ビタミン類を含むこともできる。ビタミン類としては、例えば、ビオチン、チアミン（ビタミンＢ１）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、パントテン酸、ニコチン酸等が挙げられる。
【００６０】
培地に添加するその他の成分の種類及び量についても、当業者が適宜設定することができる。なお、数少ない成分を少量添加することで、ＤＯＩ回収時の精製負荷が小さくなると予測されるため好ましい。
【００６１】
＜２−デオキシ−シロ−イノソース（ＤＯＩ）生産大腸菌＞
本発明においてＤＯＩ生産大腸菌としては、炭素源からＤＯＩを発酵生産する能力を付与された大腸菌が挙げられる。ここで、炭素源としては、好ましくは糖が挙げられる。また、ＤＯＩ生産大腸菌としては、遺伝子組換えにより、大腸菌のＤＯＩ生産活性に関与する酵素活性の増強、不活性化、低減化又はこれらを組み合わせることにより、ＤＯＩ生産活性が向上した組換え大腸菌を用いることが好ましい。
【００６２】
ＤＯＩ生産活性を向上させた組換え大腸菌としては、例えば、国際公開第２０１０／０５３０５２号パンフレットに記載の組換え大腸菌等が挙げられる。
【００６３】
具体的には、ＤＯＩ生産大腸菌としては、下記（ｉ）の遺伝子組み換えと、下記（ｉｉ）〜（ｉｉｉ）より選択される１以上の遺伝子組換えと、を含む組換え大腸菌が好ましい。また、下記（ｉｖ）の遺伝子組換えをさらに含む組換え大腸菌は、スクロースからＤＯＩを生産可能にするためより好ましい。さらに、下記（ｖ）の遺伝子組換えをさらに含む組換え大腸菌は、グルコースの取り込みを促進してＤＯＩ生産性を向上できるため更に好ましい。
【００６４】
（ｉ）ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）活性を付与又は強化する遺伝子組換え。
（ｉｉ）大腸菌が本来保有しているホスホグルコースイソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性を不活化又は低減化する遺伝子組換え。
（ｉｉｉ）大腸菌が本来保有しているグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性を不活化又は低減化する遺伝子組換え。
（ｉｖ）スクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）活性が付与された遺伝子組換え。
（ｖ）グルコース輸送促進タンパク質（Ｇｌｆ）活性が付与された遺伝子組換え。
【００６５】
（ｉ）のＢｔｒＣとは、グルコース−６−リン酸からＤＯＩを生成する反応を触媒する酵素の総称を意味する。なお、本発明におけるＤＯＩ生産大腸菌においてＢｔｒＣは、バチルス属由来、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌由来、又はパエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のものが、高い酵素活性の観点で好ましい。
（ｉｉ）のＰｇｉとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ）酵素委員会報告に準拠した酵素番号５．３．１．９に分類され、グルコース−６−リン酸からフルクトース−６−リン酸への異性化反応を可逆的に触媒する酵素の総称を指す。
（ｉｉｉ）のＺｗｆとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．１．４９に分類され、ＮＡＤＰ＋を補酵素として、グルコース−６−リン酸から６−ホスホグルコノ−１，５−ラクトンへの脱水素反応を触媒する酵素の総称を指す。
（ｉｖ）のＣｓｃＡとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ）酵素委員会報告に準拠した酵素番号３．２．１．２６に分類され、スクロースからＤ−グルコースとＤ−フルクトースを生成する加水分解反応を触媒する酵素の総称を意味する。
（ｖ）のＧｌｆは、細胞外のＤ−グルコースを細胞内に輸送するザイモモナス属細菌に由来するグルコース輸送促進タンパク質（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を指す。
【００６６】
ＤＯＩ合成酵素（ＢｔｒＣ）活性を付与又は強化する遺伝子組換えは、具体的には、２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素（ＢｔｒＣ）をコードする遺伝子を大腸菌に導入する遺伝子組み換えであればよい。これにより、大腸菌のＤＯＩ生産能力が付与又は強化される。
【００６７】
また、スクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）活性が付与された遺伝子組換えは、具体的には、ＣｓｃＡをコードする遺伝子を大腸菌に導入する遺伝子組み換えであればよい。これにより、遺伝子組み換え大腸菌が利用可能な原料の種類が増えるため、大腸菌のＤＯＩ生産能力が強化されると推測される。
グルコース輸送促進タンパク質（Ｇｌｆ）活性が付与された遺伝子組換えは、具体的には、Ｇｌｆをコードする遺伝子を大腸菌に導入する遺伝子組み換えであればよい。これにより、大腸菌のＤＯＩ生産能力が強化される。
【００６８】
ＤＯＩ合成酵素は、グルコース−６−リン酸を基質としてＤＯＩを生成する酵素である。そのため、ＤＯＩ生産大腸菌が、本来有しているホスホグルコースイソメラーゼ（Ｐｇｉ）及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）の活性を不活化又は低減化するように遺伝子組換えをしたＤＯＩ生産大腸菌を利用することが、グルコースから効率よくＤＯＩを生産できるため好ましい。
この場合、当該ＤＯＩ生産大腸菌は、Ｄ−グルコースをエネルギー源としては利用できなくなる。そのため、Ｄ−グルコース以外にエネルギー源となる糖を培地に添加することで、ＤＯＩを良好に生産できる。Ｄ−グルコース以外にエネルギー源となる糖としては、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース等が挙げられる。
また、スクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）をコードする遺伝子を遺伝子組換えで導入することにより、ＤＯＩ生産大腸菌は、スクロースを加水分解できるようになるため好ましい。具体的には、スクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）をコードする遺伝子を有するＤＯＩ生産大腸菌は、スクロースの加水分解生成物であるＤ−グルコースをＤＯＩへ変換し、Ｄ−フルクトースをエネルギー源とすることが可能になるため好ましい。
スクロースは、サトウキビ、甜菜等から得られる糖であり、スクロースが含まれる粗糖又は廃糖蜜はバイオエタノールの原料となるなど、重要なバイオマス原料である。大腸菌Ｋ１２由来株、Ｂ由来株等は、本来はスクロースを加水分解できないが、スクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）をコードする遺伝子を導入した遺伝子組換え大腸菌は、粗糖や廃糖蜜を原料としてＤＯＩを生産可能になるため好ましい。
【００６９】
さらに、本発明におけるＤＯＩ生産大腸菌は、ＤＯＩ生産性向上及び粗糖、廃糖蜜等のスクロースを含む原料からも生産を可能にするＤＯＩ生産性向上の観点より、本来有しているホスホグルコースイソメラーゼ（Ｐｇｉ）及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）の活性が不活化又は低減化され、且つスクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）をコードする遺伝子を有しているＤＯＩ生産大腸菌であることがより好ましい。
また、グルコース輸送促進タンパク質（Ｇｌｆ）をコードする遺伝子を遺伝子組み換えでＤＯＩ生産大腸菌に組み込むことにより、グルコースを細胞内に取り込む際にホスホエノールピルビン酸を必要としなくなるので、グルコース取込みが促進され、ＤＯＩ生産性が向上するため好ましい。
なお、ＤＯＩ生産大腸菌の培地への接種量、接種方法等は、特に制限されない。
【００７０】
≪ＤＯＩ精製回収工程≫
本発明のＤＯＩ生産方法は、生成した２−デオキシ−シロ−イノソースを培地から精製して回収するＤＯＩ精製回収工程を有する。
【００７１】
精製回収工程は、ＤＯＩ生成工程で得られたＤＯＩを回収するものであり、一般に、培養物中に蓄積したＤＯＩを、培養物から精製して回収することにより行われる。
本発明における培養物とは、培養により得られる物であり、具体的には、培地、培養されたＤＯＩ生産大腸菌、ＤＯＩ生産大腸菌によって生成されたＤＯＩ等を含有する。
また、培養物の一例として、培養液等が挙げられる。
【００７２】
培養物からＤＯＩを精製して回収する方法は、例えば培養液からならば通常知られた方法が利用できる。例えば、菌体を遠心分離などで除去した後、培養上清を活性炭処理してタンパク質、高分子成分等を除き、処理液をイオン交換樹脂に添加し蒸留水で溶出を行う。また、屈折率、ｐＨ、伝導率等を測定しながら不純物を含まないフラクションを分取して、その水溶液を取り除いてＤＯＩを回収することができる。
本発明によれば精製負荷が低減されることで、ＤＯＩ精製回収工程において使用する活性炭量又はイオン交換樹脂量を削減することができる。
【００７３】
＜２−デオキシ−シロ−イノソース＞
本発明のＤＯＩは、全培地に対して１．０ｗ／ｖ％以下の天然培地成分（ａ）と、全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸、全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸に等モル量のフィチン酸の加水分解物及び全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸に等モル量のフィチン酸の塩からなる群より選ばれるフィチン酸成分（ｂ）、並びに、全培地に対して０．０１ｗ／ｖ％以上０．４５ｗ／ｖ％以下のペントース及び全培地に対して０．０１ｗ／ｖ％以上０．４５ｗ／ｖ％以下のペントースに等モル量のグルコン酸からなる群より選ばれる成分（ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１種と、を含有する培地で、２−デオキシ−シロ−イノソース生産大腸菌を培養し、２−デオキシ−シロ−イノソースを生成すること、及び生成した２−デオキシ−シロ−イノソースを培地から回収すること、を含む２−デオキシ−シロ−イノソースの生産方法により得られる。
ＤＯＩの各生産工程は、前述のＤＯＩの生産方法で説明した各工程についての説明を引用するものとする。
【実施例】
【００７４】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「％」はｗ／ｖ％を意味する。【００７５】
（製造例）
国際公開第２０１０／０５３０５２号パンフレットに記載の方法と同様にＤＯＩ生産大腸菌株、ＢΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ株を作製した。【００７６】
［製造例１］
＜エシェリヒア・コリｐｇｉ遺伝子の近傍領域のクローニング＞
エシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＣＰ０００８１９）、エシェリヒア・コリのホスホグルコースイソメラーゼをコードする遺伝子（以下ｐｇｉと呼ぶことがある）の塩基配列も報告されている。ｐｇｉ（１，６５０ｂｐ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ＣＡＧＧＡＡＴＴＣＧ  ＣＴＡＴＡＴＣＴＧＧ  ＣＴＣＴＧＣＡＣＧ（配列番号１）、ＣＡＧＴＣＴＡＧＡＧ  ＣＡＡＴＡＣＴＣＴＴ  ＣＴＧＡＴＴＴＴＧＡ  Ｇ（配列番号２）、ＣＡＧＴＣＴＡＧＡＴ  ＣＡＴＣＧＴＣＧＡＴ  ＡＴＧＴＡＧＧＣＣ（配列番号３）及びＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡ  ＴＣＡＴＣＣＧＴＣＡ  ＧＣＴＧＴＡＣＧＣ（配列番号４）の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号１のプライマーは５’末端側にＥｃｏＲＩ認識部位を、配列番号２及び３のプライマーは５’末端側にＸｂａＩ認識部位を、配列番号４のプライマーは５’末端側にＰｓｔＩ認識部位をそれぞれ有している。【００７７】
エシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡを、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）記載の方法により調製した。得られたゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１の塩基配列を有するプライマーと配列番号２の塩基配列を有するプライマーとの組み合わせ、及び配列番号３の塩基配列を有するプライマーと配列番号４の塩基配列を有するプライマーとの組み合わせで、通常の条件でＰＣＲを行うことにより、それぞれ約１．０ｋｂ（以下ｐｇｉ−Ｌ断片及びｐｇｉ−Ｒ断片と呼ぶことがある）のＤＮＡ断片を増幅した。これらのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収した。ｐｇｉ−Ｌ断片をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで、ｐｇｉ−Ｒ断片をＸｂａＩ及びＰｓｔＩでそれぞれ消化した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０１９６１０）のＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩ消化物とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社製）に形質転換して、ｐｇｉの５’上流近傍断片と３’下流近傍断片の２つの断片を含むプラスミドを得た。得られたプラスミドをｐＴＨΔｐｇｉと命名した。【００７８】
［製造例２］
＜エシェリヒア・コリＢΔｐｇｉ株の作製＞
製造例１で得たプラスミドｐＴＨΔｐｇｉをエシェリヒア・コリＢ株に形質転換し、細胞が温度感受性プラスミドを保持できる３０℃でクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレート上で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をＬＢ培地３０℃で３時間から一晩培養した。その後、ＬＢ液体培地又は生理食塩水で希釈して、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレート上に塗布した。このＬＢ寒天プレートを、温度感受性プラスミドを保持できない４２℃で培養し、生育した形質転換体を染色体外−染色体間相同組換えによりプラスミド全長がエシェリヒア・コリ染色体に組み込まれた株として得た。【００７９】
この株からゲノムＤＮＡを取得し、これを鋳型としたＰＣＲを実施して、ｐＴＨ１８ｃｓ１が有するクロラムフェニコール耐性遺伝子が染色体上に存在すること、並びにｐｇｉの５’上流近傍領域、及び３’下流近傍領域のそれぞれと相同な領域が染色体上に存在することをもって、プラスミド全長がエシェリヒア・コリ染色体に組み込まれた株であることを確認した。
プラスミド全長がエシェリヒア・コリ染色体に組み込まれた株を、クロラムフェニコールを含まないＬＢ液体培地２０ｍｌを入れた１００ｍｌ容のバッフル付きフラスコに植え、これを３０℃で４時間振とう培養した。この培養液を、クロラムフェニコールを含まないＬＢ液体培地で希釈し、クロラムフェニコールを含まないＬＢ寒天培地上に塗布した。これを４２℃で培養して生育したコロニーを無作為に９６個選抜し、それぞれを、クロラムフェニコールを含まないＬＢ寒天培地上、又はクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に生育させ、クロラムフェニコール感受性の株を選抜した。
さらに、選抜された株からゲノムＤＮＡを取得し、これを鋳型としたＰＣＲを実施してｐｇｉが欠損した株を選抜し、これをＢΔｐｇｉ株と命名した。  【００８０】
［製造例３］
＜エシェリヒア・コリｚｗｆ遺伝子の近傍領域のクローニング＞
エシェリヒア・コリのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（以下ｚｗｆと呼ぶことがある）の塩基配列も報告されている。ｚｗｆ（１，４７６ｂｐ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ＣＡＧＧＡＡＴＴＣＡ  ＴＧＣＧＴＴＧＣＡＧ  ＣＡＣＧＡＴＡＴＣ（配列番号５）、ＣＡＧＴＣＴＡＧＡＴ  ＡＡＣＣＣＧＧＴＡＣ  ＴＴＡＡＧＣＣＡＧ（配列番号６）、ＣＡＧＴＣＴＡＧＡＣ  ＴＧＣＧＣＴＴＡＴＣ  ＣＴＴＴＡＴＧＧＴ（配列番号７）及びＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴ  ＴＡＣＣＧＧＴＣＡＴ  ＧＣＧＴＧＴＡＡＣ（配列番号８）の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号５のプライマーは５’末端側にＥｃｏＲＩ認識部位を、配列番号６及び７のプライマーは５’末端側にＸｂａＩ認識部位を、配列番号８のプライマーは５’末端側にＰｓｔＩ認識部位をそれぞれ有している。【００８１】
エシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号５の塩基配列を有するプライマーと配列番号６の塩基配列を有するプライマーとの組み合わせ、及び配列番号７の塩基配列を有するプライマーと配列番号８の塩基配列を有するプライマーとの組み合わせで、通常の条件でＰＣＲを行うことにより、それぞれ約０．８５ｋｂ（以下ｚｗｆ−Ｌ断片と呼ぶことがある）のＤＮＡ断片及び約１．０ｋｂ（以下ｚｗｆ−Ｒ断片と呼ぶことがある）のＤＮＡ断片を増幅した。これらのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収した。ｚｗｆ−Ｌ断片をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで、ｚｗｆ−Ｒ断片をＸｂａＩ及びＰｓｔＩでそれぞれ消化した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１のＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩ消化物とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社製）に形質転換して、ｚｗｆの５’上流近傍断片と３’下流近傍断片の２つの断片を含むプラスミドを得た。得られたプラスミドをｐＴＨΔｚｗｆと命名した。【００８２】
［製造例４］
＜エシェリヒア・コリＢΔｐｇｉΔｚｗｆ株の作製＞
製造例３で得たプラスミドｐＴＨΔｚｗｆを、製造例２で得たエシェリヒア・コリＢΔｐｇｉ株に形質転換し、細胞が温度感受性プラスミドを保持できる３０℃で、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレート上で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をＬＢ培地３０℃で３時間から一晩培養後、ＬＢ液体培地又は生理食塩水で希釈して、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレート上に塗布した。このＬＢ寒天プレートを、温度感受性プラスミドを保持できない４２℃で培養し、生育した形質転換体を染色体外−染色体間相同組換えによりプラスミド全長がエシェリヒア・コリ染色体に組み込まれた株として得た。【００８３】
この株からゲノムＤＮＡを取得し、これを鋳型としたＰＣＲを実施して、ｐＴＨ１８ｃｓ１が有するクロラムフェニコール耐性遺伝子が染色体上に存在すること、並びにｚｗｆの５’上流近傍領域、及び３’下流近傍領域のそれぞれと相同な領域がゲノム上に存在することをもって、プラスミド全長がエシェリヒア・コリ染色体に組み込まれた株であることを確認した。
プラスミド全長がエシェリヒア・コリ染色体に組み込まれた株を、クロラムフェニコールを含まないＬＢ液体培地２０ｍｌを入れた１００ｍｌ容のバッフル付きフラスコに植え、これを３０℃で４時間振とう培養した。この培養液を、クロラムフェニコールを含まないＬＢ液体培地で希釈し、クロラムフェニコールを含まないＬＢ寒天培地上に塗布した。これを４２℃で培養して生育したコロニーを無作為に９６個選抜し、それぞれを、クロラムフェニコールを含まないＬＢ寒天培地上、又はクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に生育させ、クロラムフェニコール感受性の株を選抜した。
さらに選抜された株からゲノムＤＮＡを取得し、これを鋳型としたＰＣＲを実施してｚｗｆが欠損した株を選抜し、これをＢΔｐｇｉΔｚｗｆ株と命名した。【００８４】
［製造例５］
＜ＧＡＰＤＨプロモーター制御下、ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）発現ベクターの構築＞
エシェリヒア・コリのＧＡＰＤＨ遺伝子の塩基配列はすでに報告されている。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターを取得するため、ＣＧＡＧＣＴＡＣＡＴ  ＡＴＧＣＡＡＴＧＡＴ  ＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴ  ＣＣＧ（配列番号９）、及びＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴ  ＣＧＡＧＧＴＣＧＡＣ  ＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣ  ＴＣＡＧＣＴＡＴＴＴ  ＧＴＴＡＧＴＧＡＡＴ  ＡＡＡＡＧＧ（配列番号１０）の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーをそれぞれ合成した。配列番号９のプライマーはその５’末端側にＮｄｅＩ認識部位を、配列番号１０のプライマーはその５’末端側から順にＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｌＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ認識部位をそれぞれ有している。
上記２種のプライマーとともに、エシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡを鋳型に用い、通常条件でＰＣＲ法を行い、ＤＮＡフラグメントを増幅した。得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約１００ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターをコードするフラグメントを得た。次に上記のＤＮＡフラグメントと、ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した大腸菌用クローニングベクターｐＢＲ３２２（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｊ０１７４９）を混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社製）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３０℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。このプラスミドをｐＧＡＰと命名した。【００８５】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓが有するＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）の塩基配列はすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０９７１９６）。ｂｔｒＣ遺伝子を取得するために、ＣＡＣＴＧＧＡＧＣＴ  ＣＧＣＴＧＧＴＧＧＡ  ＡＴＡＴＡＴＧＡＣＧ  ＡＣＴＡＡＡＣＡＡＡ  ＴＴＴＧ（配列番号１１）、及びＣＡＧＧＡＴＣＣＴＴ  ＡＣＡＧＣＣＣＴＴＣ  ＣＣＧＧＡＴＣ（配列番号１２）の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーをそれぞれ合成した。配列番号１１のプライマーはその５’末端側から順にＳａｃＩ認識部位と１３塩基のＧＡＰＤＨ遺伝子のリボソーム結合配列を有している。配列番号１２のプライマーはその５’末端側にＢａｍＨＩ認識部位を有している。
上記２種のプライマーとともに、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓのゲノムＤＮＡを鋳型として通常条件でＰＣＲ法を行い、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化することで約１．１ｋｂｐのＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）フラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＧＡＰを制限酵素ＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社製）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３０℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ−ｂｔｒＣを回収して、ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）発現ベクターを構築した。【００８６】
［製造例６］
＜ＧＡＰＤＨプロモーター制御下でのＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）及びスクロース加水分解酵素遺伝子（ｃｓｃＡ）発現ベクターの構築＞
エシェリヒア・コリＯ−１５７株が有するスクロース加水分解酵素遺伝子（ｃｓｃＡ）の塩基配列はすでに報告されている。すなわち、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＥ００５１７４に記載のエシェリヒア・コリＯ−１５７株ゲノム配列の３２７４３８３−３２７５８１６に記載されている。ｃｓｃＡ遺伝子を取得するために、ＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣ  ＴＧＧＴＧＧＡＡＴＡ  ＴＡＴＧＡＣＧＣＡＡ  ＴＣＴＣＧＡＴＴＧＣ（配列番号１３）、及びＧＡＣＧＣＧＴＣＧＡ  ＣＴＴＡＡＣＣＣＡＧ  ＴＴＧＣＣＡＧＡＧＴ  ＧＣ（配列番号１４）の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーをそれぞれ合成した。配列番号１３のプライマーはその５’末端側から順にＢａｍＨＩ認識部位と１３塩基のＧＡＰＤＨ遺伝子のリボソーム結合配列を有している。配列番号１４のプライマーはその５’末端側にＳａｌＩ認識部位を有している。【００８７】
上記２種のプライマーとともに、エシェリヒア・コリＯ−１５７株のゲノムＤＮＡ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ：ＩＲＭＭ４４９）を鋳型として通常条件でＰＣＲ法を行い、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化することで約１．４ｋｂｐのスクロース加水分解酵素遺伝子（ｃｓｃＡ）フラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＧＡＰ−ｂｔｒＣを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社製）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３０℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡを回収して、ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）及びスクロース加水分解酵素遺伝子（ｃｓｃＡ）発現ベクターを構築した。【００８８】
［製造例７］
＜ＧＡＰＤＨプロモーター制御下でのＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）、スクロース加水分解酵素遺伝子（ｃｓｃＡ）及びグルコース輸送促進タンパク質遺伝子（ｇｌｆ）発現ベクターの構築＞
Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓが有するグルコース輸送促進タンパク質遺伝子（ｇｌｆ）の塩基配列はすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｍ６０６１５）。ｇｌｆ遺伝子を取得するために、ＣＣＴＧＴＣＧＡＣＧ  ＣＴＧＧＴＧＧＡＡＴ  ＡＴＡＴＧＡＧＴＴＣ  ＴＧＡＡＡＧＴＡＧＴ  ＣＡＧＧ（配列番号１５）、及びＣＴＡＣＴＣＧＡＧＣ  ＴＡＣＴＴＣＴＧＧＧ  ＡＧＣＧＣＣＡＣＡ（配列番号１６）の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーをそれぞれ合成した。配列番号１５のプライマーはその５’末端側から順にＳａｌＩ認識部位と１３塩基のＧＡＰＤＨ遺伝子のリボソーム結合配列を有している。配列番号１６のプライマーはその５’末端側にＸｈｏＩ認識部位を有している。【００８９】
上記２種のプライマーとともに、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓのゲノムＤＮＡを鋳型として通常条件でＰＣＲ法を行い、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩで消化することで約１．４ｋｂｐのグルコース輸送促進タンパク質遺伝子（ｇｌｆ）フラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡを制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社製）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３０℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆを回収して、ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）、スクロース加水分解酵素遺伝子（ｃｓｃＡ）及びグルコース輸送促進タンパク質遺伝子（ｇｌｆ）発現ベクターを構築した。【００９０】
［製造例８］
＜ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆのＢΔｐｇｉΔｚｗｆ株への導入＞
上記のプラスミドｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆをＢΔｐｇｉΔｚｗｆ株に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートで３７℃一晩培養することによりＢΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ株を得た。【００９１】
［比較例１］初発培地のＣＳＬ濃度が１％で流加培地のＣＳＬ濃度が０％の条件でＤＯＩ生産
前培養として５００ｍＬ容バッフル付三角フラスコにいれたＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，  Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）１００ｍＬにＢΔｐｇｉΔｚｗｆ／ｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ株を植菌し、２８℃、１２０ｒｐｍで１６時間撹拌培養を行った。
表１の組成よりなる初発培地（ＣＳＬ低減培地）３５０ｇの入った１Ｌ容の培養槽（ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１）を滅菌し、そこに前培養液２０ｍＬを移し、培養（本培養）を開始した。培養開始と共に、表２の組成よりなる流加培地を０．１ｇ／ｍｉｎの速度で流加した。流加培地は、グルコース溶液、フルクトース溶液、リン酸二水素カリウムと硫酸アンモニウムと塩化ナトリウムとを含有する溶液、硫酸マグネシウム溶液、塩化カルシウム溶液、及び塩酸チアミン溶液をそれぞれ別々に滅菌した後、表２の組成になるように混合して作製した。培養は大気圧下、通気量０．５Ｌ／ｍｉｎ、撹拌速度８００ｒｐｍ、培養温度２８℃、ｐＨ５．０（１２．５ｖ／ｖ％アンモニア溶液で調整）で４８時間行った。
培養終了後、得られた培養液中のＤＯＩ蓄積量をＨＰＬＣで定法に従って測定した（カラム：ＵＬＴＲＯＮ  ＰＳ−８０Ｈ（信和化工）、溶離液：過塩素酸水溶液（ｐＨ＝２．１）、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）。４８時間目のＤＯＩ蓄積濃度は４６ｇ／Ｌだった。【００９２】
【表１】
2015005451.tif 000002
【００９３】
【表２】
2015005451.tif 000003
【００９４】
［実施例１］フィチン酸を初発培地に添加してＤＯＩ生産
表１の組成の初発培地に０．１４ｗ／ｖ％（２．１１ｍｍｏｌ／Ｌ）となるようにフィチン酸を添加した以外は比較例１と同様に培養及びＤＯＩ蓄積量の測定を行った。４８時間目のＤＯＩ蓄積濃度は６６ｇ／Ｌだった。【００９５】
［実施例２］Ｄ−キシロースを流加培地に添加してＤＯＩ生産
表２の組成の流加培地に０．０５ｗ／ｖ％となるようにＤ−キシロース添加した以外は比較例１と同様に培養及びＤＯＩ蓄積量の測定を行った。４８時間目のＤＯＩ蓄積濃度は５８ｇ／Ｌだった。【００９６】
［実施例３］フィチン酸を初発培地に、Ｄ−キシロースを流加培地に添加してＤＯＩ生産
表１の組成の初発培地に０．１４ｗ／ｖ％となるようにフィチン酸を添加し、表２の組成の流加培地に０．０５ｗ／ｖ％となるようにＤ−キシロース添加した以外は比較例１と同様に培養及びＤＯＩ蓄積量の測定を行った。４８時間目のＤＯＩ蓄積濃度は７２ｇ／Ｌだった。【００９７】
［参考例１］初発培地と流加培地のＣＳＬ濃度が３ｗ／ｖ％の条件でＤＯＩ生産
表３の組成の初発培地と表４の組成の流加培地を使用し、培養をｐＨ５．４で行った以外は比較例１と同様に培養及びＤＯＩ蓄積量の測定を行った。４８時間目のＤＯＩ蓄積濃度は６８ｇ／Ｌだった。【００９８】
【表３】
2015005451.tif 000004
【００９９】
【表４】
2015005451.tif 000005
【０１００】
比較例１、実施例１〜３及び参考例１の結果を表５に示す。
ＣＳＬ濃度１ｗ／ｖ％の初発培地及びＣＳＬを使用しない流加培地でＤＯＩ生産大腸菌を流加培養した場合、ＤＯＩ生産性は低下したが、フィチン酸を初期培地に、又はＤ−キシロースを流加培地に添加することで、初期培地及び流加培地のＣＳＬ濃度を３ｗ／ｖ％として生産した場合と同等の生産性を得られることが確認された。【０１０１】
【表５】
2015005451.tif 000006
【０１０２】
［実施例４］フィチン酸を流加培地に添加してＤＯＩ生産
表２の組成の流加培地に０．１４ｗ／ｖ％となるようにフィチン酸を添加した以外は比較例１と同様に培養及びＤＯＩ蓄積量の測定を行った。４８時間目のＤＯＩ蓄積濃度は５５ｇ／Ｌだった。
フィチン酸は、流加培地に添加するよりも、初発培地に添加した方が大きい効果を得られることが確認された。【０１０３】
［実施例５］フィチン酸及びＤ−キシロースを初発培地に添加してＤＯＩ生産
表１の組成の初発培地に０．１４ｗ／ｖ％となるようにフィチン酸を及び０．０５ｗ／ｖ％となるようにＤ−キシロースを添加した以外は比較例１と同様に培養及びＤＯＩ蓄積量の測定を行った。４８時間目のＤＯＩ蓄積濃度は６８ｇ／Ｌだった。
Ｄ−キシロースは流加培地に添加した方が大きな効果が得られることが確認された。【０１０４】
［実施例６］流加培地にＬ−アラビノースを添加してＤＯＩ生産
表２の組成の流加培地に０．０５ｗ／ｖ％となるようにＬ−アラビノースを添加した以外は比較例１と同様に培養及びＤＯＩ蓄積量の測定を行った。４８時間目のＤＯＩ蓄積濃度は、５０ｇ／Ｌだった。
Ｄ−キシロースと同様にＬ−アラビノースでも生産性を向上させる効果が確認された。この結果より、Ｄ−リボース、Ｄ−リブロース等のペントースリン酸経路で代謝されるペントースを添加しても、同様の効果が得られると考えられる。【０１０５】
［実施例７］初発培地にフィチン酸を添加し、流加培地にＤ−キシロースを添加してＤＯＩ生産
表２の組成の流加培地に０．０２５ｗ／ｖ％となるようにＤ−キシロースを添加した以外は実施例１と同様に培養及びＤＯＩ蓄積量の測定を行った。４８時間目のＤＯＩ蓄積濃度は６６ｇ／Ｌだった。
より高い生産性を得るには流加培地のＤ−キシロース濃度は０．０２５ｗ／ｖ％より高い濃度が好ましいことが確認された。【０１０６】
［実施例８］初発培地にフィチン酸を添加し、流加培地にＤ−キシロースを添加してＤＯＩ生産
表１の組成の初発培地に０．０９ｗ／ｖ％（１．３５ｍｍｏｌ／Ｌ）となるようにフィチン酸を添加した以外は実施例２と同様に培養及びＤＯＩ蓄積量の測定を行った。４８時間目のＤＯＩ蓄積濃度は６５ｇ／Ｌだった。
より高い生産性を得るには初発培地のフィチン酸濃度は０．０９ｗ／ｖ％より高い濃度が好ましいことが確認された。【０１０７】
［実施例９］初発培地にｍｙｏ−イノシトールとリン酸塩を添加してＤＯＩ生産
表１の組成の初発培地に、０．１４ｗ／ｖ％（２．１１ｍｍｏｌ／Ｌ）になるように添加したフィチン酸と等モル濃度になるようにｍｙｏ−イノシトール、リン酸二水素カリウム、又はｍｙｏ−イノシトールとリン酸二水素カリウムとの組み合わせを添加した以外は比較例１と同様に培養及びＤＯＩ蓄積量の測定を行った。４８時間目のＤＯＩ蓄積濃度は、それぞれ４７ｇ／Ｌ、５４ｇ／Ｌ、６８ｇ／Ｌとなった。
ｍｙｏ−イノシトール及びリン酸二水素カリウムの両方添加した場合に、フィチン酸を添加した場合と同程度の効果を得られることが確認された。【０１０８】
［実施例１０］初発培地にフィチン酸カルシウムを添加し、流加培地にＤ−キシロースを添加してＤＯＩ生産
表１の組成の初発培地に、０．１４ｗ／ｖ％フィチン酸と等モル濃度になるようにフィチン酸カルシウムを添加した以外は実施例２と同様に培養及びＤＯＩ蓄積量の測定を行った。４８時間目のＤＯ蓄積濃度は７０ｇ／Ｌとなった。
フィチン酸カルシウムでもフィチン酸と同等の効果が得られることが確認された。【０１０９】
［実施例１１］初発培地にフィチン酸カルシウムを添加してＤＯＩ生産
表１の組成の初発培地に、０．１９ｗ／ｖ％（２．８４ｍｍｍｏｌ／Ｌ）、又は０．４８ｗ／ｖ％フィチン酸と等モル濃度（７．３５ｍｍｏｌ／Ｌ）になるようにフィチン酸カルシウムを添加した以外は比較例１と同様に行った。４８時間目のＤＯ蓄積濃度は、それぞれ６２ｇ／Ｌ、５７ｇ／Ｌだった。【０１１０】
［実施例１２］流加培地にＤ−キシロースを添加してＤＯＩ生産
表２の組成の流加培地に、０．５ｗ／ｖ％、又は１．０ｗ／ｖ％の濃度になるようにＤ−キシロースを添加した以外は比較例１と同様に培養及びＤＯＩ蓄積量の測定を行った。４８時間目のＤＯ蓄積濃度は、それぞれ６６ｇ／Ｌと５８ｇ／Ｌだった。【０１１１】
［実施例１３］流加培地にグルコン酸を添加してＤＯＩ生産
表２に示す流加培地に、０．０５ｗ／ｖ％Ｄ−キシロースと等モル濃度になるようにグルコン酸を添加した以外は比較例１と同様に培養及びＤＯＩ蓄積量の測定を行った。４８時間目のＤＯＩ蓄積濃度は６３ｇ／Ｌとなった。
Ｄ−キシロースとＬ−アラビノースと同じように、グルコン酸を用いた場合にも生産性を向上させる効果が確認された。【０１１２】
［実施例１４］初期培地にフィチン酸、流加培地にＤ−キシロースを添加して、スクロースからＤＯＩ生産
表６に示す組成の流加培地を使用し、流加培地に０．０５ｗ／ｖ％になるようにＤ−キシロースを添加し、培養のｐＨを５．５とした以外は実施例１と同様に培養及びＤＯＩ蓄積量の測定を行った。４８時間目のＤＯＩ蓄積濃度は５２ｇ／Ｌだった。
スクロースを原料とした場合でも、フィチン酸とＤ−キシロースを添加したＣＳＬ低減培地でＤＯＩの良好な生産が可能であることが確認された。【０１１３】
【表６】
2015005451.tif 000007
【０１１４】
［実施例１５］ＤＯＩの粗精製
ＤＯＩを安定化させるために、実施例３で得た培養液、又は参考例１で得た培養液に硫酸を加えてｐＨ３．０にした。菌体を除く為に、８０００×ｇで２０分間遠心分離した。脱色と粗精製のために、遠心分離上清の０．５ｗ／ｗ％活性炭を添加して攪拌した。活性炭を除く為に、ろ紙と０．４５μｍのメンブレンフィルターを使って濾過した。分光光度計における純水の４００ｎｍの波長の透過率を１００％とした場合、活性炭除去後のろ液の４００ｎｍの波長の透過率は、実施例３で得た培養液のろ液では４０％で、参考例１で得られた培養液のろ液では８％あった。
本発明によるＤＯＩ生産方法で得られた培養液は精製負荷が小さいことが確認された。【０１１５】
日本国特許出願２０１３−１４６８３２号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書の記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的に且つ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【配列表】
2015005451000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年11月10日(2016.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全培地に対して１．０ｗ／ｖ％以下の天然培地成分（ａ）と、
下記の成分（ｂ）及び成分（ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１種と、
を含有する培地で、２−デオキシ−シロ−イノソース生産大腸菌を培養し、２−デオキシ−シロ−イノソースを生成すること、及び
生成した２−デオキシ−シロ−イノソースを前記培地から回収すること、
を含む２−デオキシ−シロ−イノソースの生産方法：
（ｂ）全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸、全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸に等モル量のフィチン酸の加水分解物及び全培地に対して０．０５ｗ／ｖ％以上０．２７ｗ／ｖ％以下のフィチン酸に等モル量のフィチン酸の塩からなる群より選ばれるフィチン酸成分；
（ｃ）全培地に対して０．０１ｗ／ｖ％以上０．４５ｗ／ｖ％以下のペントース及び全培地に対して０．０１ｗ／ｖ％以上０．４５ｗ／ｖ％以下のペントースに等モル量のグルコン酸からなる群より選ばれる成分；
前記天然培地成分が、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、トマトジュース、オートミール、果汁、野菜汁、豆乳、動物乳、スキムミルク、穀物、イモ、豆、海藻又はキノコの酵素消化物、及び廃糖蜜からなる群より選択される少なくとも１種であり、
前記フィチン酸の加水分解物が、ｍｙｏ−イノシトールと遊離のリン酸との混合物である。
【請求項２】
前記培地が、ｐＨ５〜６である請求項１に記載の生産方法。
【請求項３】
前記ペントースが、大腸菌のペントースリン酸経路で代謝可能なペントースである請求項１又は請求項２に記載の生産方法。
【請求項４】
前記２−デオキシ−シロ−イノソース生産大腸菌が、２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素（ＢｔｒＣ）をコードする遺伝子が導入されたことにより２−デオキシ−シロ−イノソース生産能力が付与又は強化された請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の生産方法。
【請求項５】
前記２−デオキシ−シロ−イノソース生産大腸菌が、本来有しているホスホグルコースイソメラーゼ（Ｐｇｉ）及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）の活性が不活化又は低減化された請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の生産方法。
【請求項６】
前記２−デオキシ−シロ−イノソース生産大腸菌が、スクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）をコードする遺伝子を有する請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の生産方法。
【請求項７】
前記２−デオキシ−シロ−イノソース生産大腸菌が、グルコース輸送促進タンパク質（Ｇｌｆ）をコードする遺伝子を有する請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の生産方法。
【請求項８】
前記天然培地成分が、コーンスティープリカーである請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の生産方法。
【国際調査報告】
2015005451.tif 000008
2015005451.tif 000009
2015005451.tif 000010
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