(57)【要約】  配列番号１の７２位〜２３３位までのアミノ酸配列からなる酵素アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及び当該タンパク質をコードするアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子、該遺伝子を含む形質転換体、並びに該形質転換体を用いた脂質の製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｃ）の群から選ばれるいずれかのタンパク質。
（ａ）配列番号１の７２位〜２３３位までのアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
前記（ｂ）のタンパク質が、下記（ｂ）’のタンパク質である、請求項１に記載のタンパク質。
（ｂ）’  前記（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１以上１０個以下、好ましくは１以上５個以下、さらに好ましくは１以上３個以下のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項３】
前記（ｃ）のタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１の３２位〜２３３位までのアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１の５２位〜２３３位までのアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】
下記（ｄ）〜（ｆ）の群から選ばれるいずれかのＤＮＡからなる遺伝子。
（ｄ）配列番号２の２１４位〜６９９位までの塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ）（ｄ）のＤＮＡの塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）（ｄ）又は（ｅ）のＤＮＡの塩基配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項６】
請求項４又は５に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項７】
請求項４若しくは５に記載の遺伝子又は請求項６に記載の組換えベクターを、宿主に導入してなる形質転換体。
【請求項８】
前記宿主が微生物である、請求項７に記載の形質転換体。
【請求項９】
前記微生物が微細藻類である、請求項８に記載の形質転換体。
【請求項１０】
前記微細藻類がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類である、請求項９に記載の形質転換体。
【請求項１１】
前記微生物が大腸菌である、請求項８に記載の形質転換体。
【請求項１２】
請求項７〜１１のいずれか１項に記載の形質転換体を培地で培養する工程、及び得られた培養物から脂質を採取する工程、を含む脂質の製造方法。
【請求項１３】
前記脂質が、炭素原子数１２以上１４以下の脂肪酸及びその誘導体を含む、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
宿主に請求項４又は５に記載の遺伝子を導入する工程を含む、脂質中の脂肪酸組成を改変する方法。
【請求項１５】
宿主に請求項４又は５に記載の遺伝子を導入する工程を含む、脂質の生産性を向上させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及びそれをコードする遺伝子に関する。また、本発明は該アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を含有する形質転換体及びそれを用いた脂質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸は脂質の主要構成成分の１つであり、生体内においてグリセリンとエステル結合をしてトリアシルグリセロール等の脂質を構成し、多くの動植物においてエネルギー源として貯蔵され利用される物質である。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質（油脂）は、食用又は工業用として広く利用されている。
例えば、炭素数１２〜１８前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として、また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として、いずれも洗浄剤又は殺菌剤として利用されている。同じく高級アルコールの誘導体としてアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル４級アミン塩等のカチオン性界面活性剤は、繊維処理剤や毛髪リンス剤又は殺菌剤として、ベンザルコニウム型４級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤として日常的に利用されている。また、植物油脂はバイオディーゼル燃料の原料としても利用されている。【０００３】
このように脂肪酸や脂質の利用は多岐にわたり、そのため植物等において生体内での脂肪酸や脂質の生産性を向上させる試みがおこなわれている。さらに、脂肪酸の用途や有用性はその炭素数に依存するため、脂肪酸の炭素数、即ち鎖長を制御する試みも行われている。例えば、ゲッケイジュ（Umbellularia californica（California  bay））由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの導入により炭素数１２の脂肪酸を蓄積させる方法（特許文献１、非特許文献１）等が提案されている。【０００４】
近年、バイオ燃料生産に有用であるとして、藻類が注目を集めている。藻類は、バイオディーゼル燃料として利用可能な脂質を光合成によって生産でき、しかも食料と競合しないことから、次世代のバイオマス資源として注目されている。また、藻類は、植物に比べ、高い脂質生産・蓄積能力を有するとの報告もある。例えば、特許文献２には、シンビオディニウム（Symbiodinium）属に属する藻類から、油脂及び脂肪酸を回収する方法が提案されている。
藻類の脂質合成メカニズムやそれを応用した生産技術について研究が始まってはいるが、未解明な部分も多い。例えば、上述のアシル−ＡＣＰ型チオエステラーゼについても、現在のところ、藻類由来のものはほとんど報告されておらず、珪藻網等でわずかに報告例があるのみである（例えば、非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表平７−５０１９２４号公報
【特許文献２】国際公開第２０１１／１０８７５５号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Voelker  TA,  Worrell  AC,  Anderson  L,  Bleibaum  J,  Fan  C,  Hawkins  DJ,  Radke  SE,  Davies  HM.,  “Fatty  acid  biosynthesis  redirected  to  medium  chains  in  transgenic  oilseed  plants”,  Science.  1992  Jul  3;257(5066),  p.72-74.
【非特許文献２】Yangmin  Gong,  Xiaojing  Guo,  Xia  Wan,  Zhuo  Liang,  Mulan  Jiang,  “Characterization  of  a  novel  thioesterase  (PtTE)  from  Phaeodactylum  tricornutum”,  Journal  of  Basic  Microbiology,  2011  December,  Volume  51,  p.666-672.
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）の群から選ばれるいずれかのタンパク質（以下、「本発明のタンパク質」又は「本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ」ともいう）に関する。
（ａ）配列番号１の７２位〜２３３位までのアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
【０００８】
また、本発明は、前記本発明のタンパク質をコードする遺伝子（以下、「本発明の遺伝子」又は「本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子」ともいう）、好ましくは下記（ｄ）〜（ｆ）の群から選ばれるいずれかのＤＮＡからなる遺伝子に関する。
（ｄ）配列番号２の２１４位〜６９９位までの塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ）（ｄ）のＤＮＡの塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）（ｄ）又は（ｅ）のＤＮＡの塩基配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【０００９】
また、本発明は、前記本発明の遺伝子を宿主に導入してなる形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」ともいう）に関する。
また、本発明は、前記本発明の形質転換体を培地で培養する工程、及び得られた培養物から脂質を採取する工程、を含む脂質の製造方法（以下、「本発明の製造方法」ともいう）に関する。
また、本発明は、宿主に前記本発明の遺伝子を導入する工程を含む、脂質中の脂肪酸組成を改変する方法に関する。
さらに、本発明は、宿主に前記本発明の遺伝子を導入する工程を含む、脂質の生産性を向上させる方法に関する。
【００１０】
本発明の上記及び他の特徴及び利点は、下記の記載からより明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、藻類由来の新規アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及びこれをコードするアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の提供に関する。また、本発明は、当該遺伝子を含有する形質転換体の提供に関する。さらに、本発明は、当該形質転換体を用いた脂質の製造方法の提供に関する。
【００１２】
本発明者は、藻類由来の新たなアシル−ＡＣＰチオエステラーゼについて鋭意検討を行い、シンビオディニウム（Symbiodinium）属に属する藻類から、新規のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及びこれをコードするアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【００１３】
本発明によれば、新規アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及びこれをコードするアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を提供することができる。また、本発明によれば、該アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を含有する形質転換体を提供することができる。さらに、本発明によれば、該形質転換体を用いた脂質の製造方法を提供することができる。本発明の形質転換体及び製造方法は、脂質生産性に優れ、脂質又は脂肪酸の工業的生産に好適に用いることができる。
【００１４】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明において、脂質には、中性脂肪、ろう、セラミド等の単純脂質、リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等の複合脂質、脂肪酸、アルコール類、炭化水素類等の誘導脂質が含まれる。また、本明細書において中性脂肪とは、脂肪酸とグリセリンとのエステルを意味し、具体的には、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドを意味する。本明細書では、中性脂肪を油脂という場合もある。
【００１５】
１．アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ
本発明のタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列中の少なくとも７２位〜２３３位までのアミノ酸配列を有するタンパク質、及び当該タンパク質と機能的に均等なタンパク質である。具体的に、本発明のタンパク質には、以下の（ａ）〜（ｃ）のタンパク質が包含される。
（ａ）配列番号１の７２位〜２３３位までのアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
【００１６】
配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質は、シンビオディニウム属に属する藻類であるシンビオディニウム  ミクロアドリアチカム（Symbiodinium microadriaticum）由来の新規アシル−ＡＣＰチオエステラーゼである。シンビオディニウム  ミクロアドリアチカムは、慣用的にZooxanthella microadriatica又はGymnodinium microadriaticumとも呼称され、記載される場合がある。シンビオディニウム  ミクロアドリアチカムとしては、Symbiodinium microadriaticum  LB2281株（ＵＴＥＸ（The  culture  collection  of  algae  at  University  of  Texas  at  Austin）より入手可能）、又は当該LB2281株と実質的に同一の藻類学的性質を有する株が例示できる。LB2281株と実質的に同一の藻類学的性質を有する株としては、例えば、Symbiodinium  sp.  CCMP2948株、Symbiodinium  sp.  CCMP2592株、Symbiodinium microadriaticum  CCMP827株、Symbiodinium microadriaticum  CCMP2458株が挙げられる。
アシル−ＡＣＰ（アシルキャリヤープロテイン）チオエステラーゼは、脂肪酸やその誘導体（トリアシルグリセロール（トリグリセリド）等）の生合成系に関与する酵素である。当該酵素は、植物体や藻類では葉緑体等の色素体内において、細菌・真菌や動物体では細胞質内において、脂肪酸生合成過程の中間体であるアシル−ＡＣＰ（脂肪酸残基であるアシル基とアシルキャリヤープロテインとからなる複合体）のチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する。チオエステラーゼの作用によって、ＡＣＰ上での脂肪酸合成が終了し、切り出された脂肪酸はトリアシルグリセロール等の合成に供される。アシル−ＡＣＰチオエステラーゼには、基質であるアシル−ＡＣＰを構成するアシル基（脂肪酸残基）の炭素原子数や不飽和結合数によって異なる反応特異性を示す複数のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼが存在していることが知られており、生体内での脂肪酸組成を決める重要なファクターであると考えられている。
本発明において、「アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有する」とは、アシル−ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解する活性を有することをいう。
【００１７】
配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列の１つとして、配列番号２の塩基配列が挙げられる。配列番号２の塩基配列からなる遺伝子は、シンビオディニウム  ミクロアドリアチカム由来の遺伝子である。
本発明者らは、配列番号２の塩基配列からなる遺伝子がアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子であることを同定し、さらに、当該遺伝子がコードするアミノ酸配列において、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性に重要な領域を見出した。
後述の実施例で実証されているように、配列番号１の７２位〜２３３位までのアミノ酸配列を少なくとも含んでなる組換えタンパク質は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼとして機能する。すなわち、配列番号１のアミノ酸配列において、７２位〜２３３位までの領域がアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性にとって十分な領域であると考えられる。
【００１８】
前記（ｂ）において、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性の点から、アミノ酸配列の同一性は、７５％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがより好ましい。さらに好ましくは、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上である。
本発明においてアミノ酸配列及び塩基配列の同一性はLipman-Pearson法（Science，227，1435，（1985））によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（homology  search）プログラムを用いて、Unit  size  to  compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１９】
また、前記（ｂ）のタンパク質としては、下記（ｂ）’のタンパク質も好ましい。
（ｂ）’前記（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１又は数個（好ましくは１以上１０個以下、より好ましくは１以上５個以下、さらに好ましくは１以上３個以下）の変異が導入されたアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
変異としては、アミノ酸の欠失、置換、付加、又は挿入が挙げられる。アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。塩基配列に変異を導入する方法については後述する。
【００２０】
前記（ｃ）のタンパク質としては、前記(ａ)のタンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質が好ましく、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１の３２位〜２３３位までのアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１の５２位〜２３３位までのアミノ酸配列からなるタンパク質がより好ましい。これらのタンパク質は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有することが後述の実施例により確認されている。
また、前記（ｃ）のタンパク質として、前記(ａ)又は（ｂ）のアミノ酸配列にタンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチドが付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質も好ましい。シグナルペプチドの付加としては、葉緑体移行シグナルペプチドのＮ末端への付加等が挙げられる。
【００２１】
本発明のタンパク質がアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有することは、例えば、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を連結した融合遺伝子を脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子が発現する条件で培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析することにより、確認することができる。
また、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を連結した融合遺伝子を宿主細胞へ導入し、導入したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子が発現する条件で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、Yuanらの方法（Yuan  L,  Voelker  TA,  Hawkins  DJ.  “Modification  of  the  substrate  specificity  of  an  acyl-acyl  carrier  protein  thioesterase  by  protein  engineering”  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.  1995  Nov  7;92(23),  p.10639-10643）によって調製した各種アシル−ＡＣＰを基質とした反応を行うことにより、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を測定することができる。
【００２２】
本発明のタンパク質の取得方法については特に制限はなく、通常行われる化学的或いは遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、シンビオディニウム  ミクロアドリアチカムから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号１に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に合成等することもでき、化学合成によりタンパク質合成を行ってもよく、遺伝子組み換え技術により組換えタンパク質を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述する本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を用いることができる。
【００２３】
２．アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子
本発明の遺伝子は、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子である。
前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の具体例として、下記（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
（ｄ）配列番号２の２１４位〜６９９位までの塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ）（ｄ）のＤＮＡの塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）（ｄ）又は（ｅ）のＤＮＡの塩基配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００２４】
前記（ｅ）において、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性の点から、塩基配列の同一性は７５％以上であることが好ましく、８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがより好ましい。さらに好ましくは、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上である。なお、塩基配列の同一性の算出方法については、前述した。
【００２５】
また、前記（ｅ）のＤＮＡとしては、下記（ｅ）’のＤＮＡも好ましい。
（ｅ）’前記（ｄ）のＤＮＡの塩基配列において、１又は数個（好ましくは１以上１０個以下、より好ましくは１以上５個以下、さらに好ましくは１以上３個以下）の変異が導入された塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
変異としては、塩基の欠失、置換、付加、又は挿入が挙げられる。塩基配列に変異を導入する方法としては、例えば、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、Splicing  overlap  extension（SOE）PCR反応（Horton  et  al.，Gene  77，61−68，1989）を利用した方法、ＯＤＡ法（Hashimoto-Gotoh  et  al.，Gene，152，271-276，1995））、Kunkel法（Kunkel，T.  A.，Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA，1985，82，488）等が挙げられる。また、Site-Directed  Mutagenesis  System  Mutan-SuperExpress  Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer  TM  Site-Directed  Mutagenesisキット（Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis  Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
【００２６】
前記（ｆ）のＤＮＡとしては、前記(ｄ)のＤＮＡの塩基配列を有するＤＮＡが好ましく、配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号２の９４位〜６９９位までの塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号２の１５４位〜６９９位までの塩基配列からなるＤＮＡがより好ましい。これらのＤＮＡによりコードされるタンパク質は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有することが後述の実施例により確認されている。
また、前記（ｆ）のＤＮＡとして、前記(ｄ)又は（ｅ）の塩基配列に、タンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチドをコードする塩基配列が付加された塩基配列からなるＤＮＡも好ましい。付加されるシグナルペプチドとしては、前記（ｃ）で述べたものが挙げられる。
【００２７】
本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の取得方法としては、特に制限されず、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列又は配列番号２に示す塩基配列に基づいて、本発明のチオエステラーゼ遺伝子を人工合成により取得することができる。遺伝子の人工合成は、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、シンビオディニウム  ミクロアドリアチカムからクローニングによって取得することもでき、例えば、Molecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook，David  W.  Russell，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。
【００２８】
３．形質転換体
（１）第１の態様
本発明の形質転換体の第１の態様は、宿主に、本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子又は当該遺伝子を含有する組換えベクターを導入してなる形質転換体である。
宿主へのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の導入は、通常の遺伝子工学的方法によっておこなうことができる。具体的には、本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる発現ベクターや遺伝子発現カセットを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより本発明の形質転換体を得ることができる。
【００２９】
形質転換体の宿主として、微生物、植物体、動物体等を用いることができる。なお、本発明において微生物には微細藻類が含まれる。脂質の製造効率及び得られた脂肪酸の利用性の点から、宿主は微生物又は植物体であることが好ましく、微生物であることがより好ましい。
前記微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよく、エシェリキア（Escherichia）属に属する微生物やバシラス（Bacillus）属に属する微生物等の原核生物、又は酵母や糸状菌等の真核微生物を用いることができる。なかでも、脂質生産性の観点から、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、赤色酵母（Rhodosporidium toruloides）、又はモルチエレラ  エスピー（Mortierella  sp．）が好ましく、大腸菌がより好ましい。
また、前記微生物としては、微細藻類も好ましい。前記微細藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Chlamydomonas）属に属する藻類、クロレラ（Chlorella）属に属する藻類、ファエオダクティラム（Phaeodactylum）属に属する藻類、シンビオディニウム属に属する藻類、又はナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類が好ましい。脂質生産性の観点から、シンビオディニウム属に属する藻類、又はナンノクロロプシス属に属する藻類がより好ましく、ナンノクロロプシス属に属する藻類がさらに好ましい。シンビオディニウム属に属する藻類として具体的には、Symbiodinium microadriaticum、Symbiodinium goreaui、Symbiodinium linucheae、Symbiodinium bermudense、Symbiodinium meandrinae、Symbiodinium californium、Symbiodinium kawagutii、Symbiodinium corculorum、Symbiodinium consortia、Symbiodinium muscatinei、Symbiodinium freudenthal、Symbiodinium pulchrorum、Symbiodinium pilosum、等が挙げられる。ナンノクロロプシス属に属する藻類として具体的には、Nannochloropsis oculata、Nannochloropsis gaditana、Nannochloropsis salina、Nannochloropsis oceanica、Nannochloropsis atomus、Nannochloropsis maculata、Nannochloropsis granulata、又はNannochloropsis  sp．、等が挙げられる。なかでも、脂質生産性の観点から、Nannochloropsis oculata、又はNannochloropsis gaditanaが好ましく、Nannochloropsis oculataがより好ましい。
前記植物体としては、種子に脂質を高含有する観点から、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ナタネ、ココヤシ、パーム、クフェア、又はヤトロファが好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。
【００３０】
発現ベクターの母体となるベクターとしては、本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で当該遺伝子を発現可能なベクターであればよい。例えば、導入する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有する発現ベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
具体的なベクターとしては、微生物を宿主とする場合には、例えば、pBluescript  II  SK(-)（Stratagene社製）、pSTV系ベクター（タカラバイオ社製）、pUC119等のpUC系ベクター（宝酒造社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、pGEX系ベクター（GEヘルスケア社製）、pCold系ベクター（タカラバイオ社製）、pHY300PLK（タカラバイオ社製）、pUB110（Mckenzie，T.  et  al.,（1986）,Plasmid  15（2）；p.93-103）、pBR322（タカラバイオ社製）、pRS403（ストラタジーン社製）、又はpMW218/219（ニッポンジーン社製）が挙げられる。特に、宿主が大腸菌の場合は、pBluescript  II  SK(-)、又はpMW218/219が好ましく用いられる。
藻類を宿主とする場合には、例えば、pUC19（タカラバイオ社製）、P66（Chlamydomonas  Center）、P-322（Chlamydomonas  Center）、pPha-T1（前記非特許文献２参照）、又はpJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合は、pUC19（タカラバイオ社製）、pPha-T1、又はpJET1が好ましく用いられる。また、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合には、Oliver  Kilian,  et  al.,  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America,  Dec  27;108(52),  2011、の文献記載の方法を参考にして、本発明の遺伝子、プロモーター及びターミネーターからなるＤＮＡ断片（遺伝子発現カセット）を用いて宿主を形質転換することもできる。このＤＮＡ断片としては、例えば、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片や制限酵素切断ＤＮＡ断片が挙げられる。
植物細胞を宿主とする場合には、例えば、pRI系ベクター（タカラバイオ社製）、pBI系ベクター（クロンテック社製）、又はIN3系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）が挙げられる。特に、宿主がシロイヌナズナの場合は、pRI系ベクター又はpBI系ベクターが好ましく用いられる。
【００３１】
発現ベクターや遺伝子発現カセットに用いるプロモーターやターミネーター等の発現調節領域や選択マーカーの種類も特に限定されず、通常使用されるプロモーターやマーカー等を導入する宿主の種類に応じて適宜選択して用いることができる。
具体的なプロモーターとしては、例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、カリフラワーモザイルウイルス35SRNAプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター（例えば、チューブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等）、ナタネ由来Napin遺伝子プロモーター、植物由来Rubiscoプロモーター、又はナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーターが挙げられる。
また、選択マーカーとしては、抗生物質耐性遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、又はハイグロマイシン耐性遺伝子）等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することも可能である。
【００３２】
上記ベクターに本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を、制限酵素処理やライゲーション等の通常の手法によって組み込むことにより形質転換に用いる発現ベクターを構築することができる。
形質転換方法としては、宿主に目的遺伝子を導入しうる方法であれば特に限定されるものではない。例えば、カルシウムイオンを用いる方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法（J．Bacterial．93，1925（1967））、プロトプラスト形質転換法（Mol．Gen．Genet．168，111（1979））、エレクトロポレーション法（FEMS  Microbiol．Lett．55，135（1990））又はLP形質転換方法（T．Akamatsu及びJ．Sekiguchi，Archives  of  Microbiology，1987，146，p.353-357；T．Akamatsu及びH．Taguchi，Bioscience，Biotechnology，and  Biochemistry，2001，65，4，p.823-829）等を用いることができる。宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合、Randor  Radakovits,  et  al.,  Nature  Communications,  DOI:10.1038/ncomms1688,  2012、に記載のエレクトロポレーション法を用いて形質転換を行うこともできる。また、宿主がシンビオディニウム属に属する藻類の場合、Michael  R.  ten  Lohuis,  David  J.  Miller,  The  Plant  Journal,  1998,  13(3),  p.427-435に記載の炭化ケイ素ホイスカー法を用いて形質転換を行うこともできる。
【００３３】
目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、ベクター由来の薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的ＤＮＡ断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法等によって、目的ＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
【００３４】
本態様の形質転換体は、特定の炭素数（鎖長）及び不飽和結合数を有する脂肪酸を効率よく生産し、脂質の生産性を向上させることができる。なお、形質転換体の脂肪酸生産能については、後述する実施例に記載の方法によって測定することができる。
【００３５】
（２）第２の態様
本発明の形質転換体の第２の態様は、本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を有する宿主において、当該遺伝子が欠失、変異又は発現抑制された形質転換体である。当該形質転換体は、宿主中のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を、欠失、変異又は発現抑制することで得られる。
【００３６】
本態様の形質転換体の宿主としては、本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を有するものであればよく、微生物、植物体、又は動物体を用いることができる。なかでも、脂質の製造効率の点から、微生物が好ましく、微細藻類がより好ましい。
前記微細藻類としては、脂質生産性の観点から、シンビオディニウム属に属する藻類が好ましい。シンビオディニウム属に属する藻類として具体的には、Symbiodinium microadriaticum、Symbiodinium goreaui、Symbiodinium linucheae、Symbiodinium bermudense、Symbiodinium meandrinae、Symbiodinium californium、Symbiodinium kawagutii、Symbiodinium corculorum、Symbiodinium consortia、Symbiodinium muscatinei、Symbiodinium freudenthal、Symbiodinium pulchrorum、Symbiodinium pilosum等を挙げることができる。このうち、脂質生産性の観点から、Symbiodinium microadriaticumがより好ましい。
【００３７】
宿主ゲノムから本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を欠失、変異又は発現抑制する方法としては、標的遺伝子の一部若しくは全部をゲノム中から除去する又は他の遺伝子と置き換える、当該遺伝子中に他のＤＮＡ断片を挿入する、当該遺伝子の活性部位・基質結合部位又は転写・翻訳開始領域に変異を与える等の方法によって行うことができる。
【００３８】
上記の欠失・変異・発現抑制方法は、例えば、相同組換えを用いて行うことができる。具体的には、標的遺伝子の上流、下流領域を含むが標的遺伝子を含まない直鎖状のＤＮＡ断片をＰＣＲ等の方法によって構築し、これを宿主細胞内に取り込ませて宿主ゲノムの標的遺伝子上流側、下流側で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を欠失あるいは他の遺伝子断片と置換させることができる。また、塩基置換や塩基挿入等の変異を導入した標的遺伝子をＰＣＲ等の方法によって構築し、これを宿主細胞内に取り込ませて宿主ゲノムの標的遺伝子内の変異箇所の外側の２ヶ所で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子の機能を低下又は消失させることができる。また、標的遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを宿主細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって宿主ゲノム上の標的遺伝子を分断して、その機能を低下又は消失させることができる。
【００３９】
このような相同組換えによる標的遺伝子の欠失・変異・発現抑制方法は、例えば、Besher  et  al.,  Methods  in  molecular  biology  47，p.291-302,  1995等の文献を参考に行うことができる。
【００４０】
目的遺伝子が欠失等した形質転換体の選択は、形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出して、目的遺伝子部位を含む領域を対象としてＰＣＲを行う方法、又は目的遺伝子領域に結合するＤＮＡプローブを用いたサザンブロッティング法、等により行うことができる。
【００４１】
本態様の形質転換体は、本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子が機能しないため、産出される脂質の脂肪酸組成が宿主本来の組成から変化すると考えられる。すなわち、当該形質転換体は、脂質中の脂肪酸組成が改変された脂質を生産することができる。
【００４２】
４．脂質の製造方法
本発明の製造方法は、本発明の形質転換体を用いるもので、当該形質転換体を培地で培養する工程、及び得られた培養物から脂質を採取する工程を含む。なお、本発明において形質転換体を培養するとは、微生物、藻類、動植物やそれらの細胞・組織の培養はもちろん、植物体を土壌等で栽培することも含まれる。また、培養物には、培養液はもちろん、培養等した後の形質転換体そのものも含まれる。
【００４３】
培地及び培養条件は、形質転換体の宿主に応じて適宜選択することができ、その宿主に対して通常用いられる培地及び培養条件を使用できる。また、脂質の生産性向上の点から、培地中に、チオエステラーゼの基質或いは脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、マロン酸等を添加してもよい。
【００４４】
一例として、大腸菌を宿主として用いた形質転換体の場合、ＬＢ培地又はOvernight  Express  Instant  TB  Medium（Novagen社製）で、３０〜３７℃、０．５〜１日間培養を行うことが挙げられる。また、シロイヌナズナを宿主として用いた形質転換体の場合、土壌で温度条件２０〜２５℃、白色光を連続照射又は明期１６時間・暗期８時間等の光条件下で１〜２か月間栽培を行うことが挙げられる。
【００４５】
形質転換の宿主が藻類の場合、以下の培地及び培養条件を用いることができる。
培地は天然海水又は人工海水をベースにしたものを使用してもよいし、市販の培養培地を使用してもよい。具体的な培地としては、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、ダイゴＩＭＫ培地、Ｌ１培地、ＭＮＫ培地、等を挙げることができる。なかでも、脂質の生産性向上及び栄養成分濃度の観点から、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、又はダイゴＩＭＫ培地が好ましく、ｆ／２培地、又はダイゴＩＭＫ培地がより好ましく、ｆ／２培地がさらに好ましい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。
培地に接種する藻類の量は、生育性の点から、培地当り１〜５０％（vol/vol）が好ましく、１〜１０％（vol/vol）がより好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であればよく、通常、５〜４０℃の範囲である。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、好ましくは１０〜３５℃であり、より好ましくは１５〜３０℃である。
また、藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。光照射は、光合成が可能な条件であればよく、人工光でも太陽光でもよい。光照射時の照度としては、藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から、好ましくは１００〜５００００ルクスの範囲、より好ましくは３００〜１００００ルクスの範囲、さらに好ましくは１０００〜６０００ルクスの範囲である。また、光照射の間隔は、前記と同様の観点から、明暗周期で行うことが好ましく、２４時間のうち明期が好ましくは８〜２４時間、より好ましくは１０〜１８時間、さらに好ましくは１２時間である。
また、藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。気体中の二酸化炭素の濃度は、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０３（大気条件と同程度）〜１０％が好ましく、より好ましくは０．０５〜５％、さらに好ましくは０．１〜３％、よりさらに好ましくは０．３〜１％である。炭酸塩の濃度は、例えば炭酸水素ナトリウムを用いる場合、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０１〜５質量％が好ましく、より好ましくは０．０５〜２質量％、さらに好ましくは０．１〜１質量％である。
培養時間は、脂質を高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖できるように、長期間（例えば１５０日程度）行なってもよい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、培養期間は、好ましくは３〜９０日間、より好ましくは３〜３０日間、さらに好ましくは７〜３０日間である。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、振とう培養が好ましい。
【００４６】
形質転換体内において産生された脂質の単離、採取は、通常生体内の脂質成分等を単離する際に用いられる方法により行うことができる。例えば、培養物や形質転換体から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、エタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収する方法が挙げられる。より大規模な場合は、培養物や形質転換体より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法として具体的には、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。
【００４７】
本発明の製造方法は、炭素原子数８以上２２以下の脂肪酸及びその誘導体の製造に好適に用いることができる。なかでも、本発明の製造方法は炭素原子数１２以上２０以下の脂肪酸及びその誘導体の製造に用いることが好ましく、炭素原子数１２以上１６以下の脂肪酸及びその誘導体の製造に用いることがより好ましく、炭素原子数１２以上１４以下の脂肪酸及びその誘導体の製造に用いることがさらに好ましく、炭素原子数１２又は１４の脂肪酸及びそのエステルの製造に用いることがよりさらに好ましい。
【００４８】
本発明の製造方法又は形質転換体により得られる脂質は、食用として用いる他、化粧品等の乳化剤や、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。また、バイオディーゼル燃料の原料としても利用できる。
【００４９】
上述した実施形態に加えて、本発明はさらに以下のタンパク質、遺伝子、形質転換体、方法を開示する。
【００５０】
＜１＞  下記（ａ）〜（ｃ）の群から選ばれるいずれかのタンパク質。
（ａ）配列番号１の７２位〜２３３位までのアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
【００５１】
＜２＞  前記（ｂ）のタンパク質において、（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列との同一性が７５％以上、好ましくは８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上である、＜１＞項記載のタンパク質。
＜３＞  前記（ｂ）のタンパク質が、下記（ｂ）’のタンパク質である、＜１＞項記載のタンパク質。
（ｂ）’  前記（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１以上１０個以下、好ましくは１以上５個以下、さらに好ましくは１以上３個以下のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
＜４＞  前記（ｃ）のタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１の３２位〜２３３位までのアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１の５２位〜２３３位までのアミノ酸配列からなるタンパク質である、＜１＞〜＜３＞のいずれか１項記載のタンパク質。
【００５２】
＜５＞  ＜１＞〜＜４＞のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
＜６＞  下記（ｄ）〜（ｆ）の群から選ばれるいずれかのＤＮＡからなる遺伝子。
（ｄ）配列番号２の２１４位〜６９９位までの塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ）（ｄ）のＤＮＡの塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）（ｄ）又は（ｅ）のＤＮＡの塩基配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
＜７＞  前記（ｅ）のＤＮＡにおいて、（ｄ）のＤＮＡの塩基配列との同一性が７５％以上、好ましくは８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上である、＜６＞項記載の遺伝子。
＜８＞  ＜５＞〜＜７＞のいずれか１項に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【００５３】
＜９＞  ＜５＞〜＜７＞のいずれか１項に記載の遺伝子又は＜８＞項に記載の組換えベクターを、宿主に導入してなる形質転換体。
＜１０＞  ＜５＞〜＜７＞のいずれか１項に記載の遺伝子を有する宿主において、当該遺伝子が欠失、変異又は発現抑制された形質転換体。
＜１１＞  前記宿主が微生物である、＜９＞又は＜１０＞項に記載の形質転換体。
＜１２＞  前記微生物が微細藻類である、＜１１＞項に記載の形質転換体。
＜１３＞  前記微細藻類が、クラミドモナス（Chlamydomonas）属に属する藻類、クロレラ（Chlorella）属に属する藻類、ファエオダクティラム（Phaeodactylum）属に属する藻類、シンビオディニウム（Symbiodinium）属に属する藻類、又はナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類であり、好ましくはシンビオディニウム（Symbiodinium）属に属する藻類又はナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類であり、より好ましくはナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類である、＜１２＞項に記載の形質転換体。
＜１４＞  前記ナンノクロロプシス属に属する藻類が、Nannochloropsis oculata、Nannochloropsis gaditana、Nannochloropsis salina、Nannochloropsis oceanica、Nannochloropsis atomus、Nannochloropsis maculata、Nannochloropsis granulata、又はNannochloropsis  sp．であり、好ましくは、Nannochloropsis oculata、又はNannochloropsis gaditanaであり、より好ましくは、Nannochloropsis oculataである、＜１３＞項に記載の形質転換体。
＜１５＞  前記シンビオディニウム属に属する藻類が、Symbiodinium microadriaticum、Symbiodinium goreaui、Symbiodinium linucheae、Symbiodinium bermudense、Symbiodinium meandrinae、Symbiodinium californium、Symbiodinium kawagutii、Symbiodinium corculorum、Symbiodinium consortia、Symbiodinium muscatinei、Symbiodinium freudenthal、Symbiodinium pulchrorum、又はSymbiodinium pilosumであり、好ましくは、Symbiodinium microadriaticumである、＜１３＞項に記載の形質転換体。
＜１６＞  前記微生物が大腸菌である、＜１１＞項に記載の形質転換体。
【００５４】
＜１７＞  ＜９＞〜＜１６＞のいずれか１項に記載の形質転換体を培地で培養する工程、及び得られた培養物から脂質を採取する工程、を含む脂質の製造方法。
＜１８＞  前記脂質が、炭素原子数８以上２２以下、好ましくは炭素原子数１２以上２０以下、より好ましくは炭素原子数１２以上１６以下、さらに好ましくは炭素原子数１２以上１４以下の脂肪酸及びその誘導体を含む、＜１７＞項に記載の製造方法。
【００５５】
＜１９＞  宿主に＜５＞〜＜７＞のいずれか１項に記載の遺伝子を導入する工程を含む、脂質中の脂肪酸組成を改変する方法。
＜２０＞  宿主に＜５＞〜＜７＞のいずれか１項に記載の遺伝子を導入する工程を含む、脂質の生産性を向上させる方法。
＜２１＞  宿主中の＜５＞〜＜７＞のいずれか１項に記載の遺伝子を、欠失、変異又は発現抑制する工程を含む、脂質中の脂肪酸組成を改変する方法。
【実施例】
【００５６】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【００５７】
実施例１  シンビオディニウム由来アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を導入した大腸菌形質転換体の作製、及び形質転換体による脂質の生産
１．シンビオディニウム由来アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の取得
シンビオディニウム  ミクロアドリアチカムとして、The  culture  collection  of  algae  at  University  of  Texas  at  Austin(UTEX)より、渦鞭毛藻綱（Dinophyceae）に属するSymbiodinium microadriaticum  LB2281株を入手した。
シンビオディニウム  ミクロアドリアチカム（Symbiodinium microadriaticum）LB2281株の全ＲＮＡを抽出し、Roche  Genome  Sequencer  FLX+  システムを用いてＲＮＡシーケンスを行った。ＲＮＡシーケンスで得られた配列のうち、contig26515と名づけた遺伝子（配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子）について、下記の方法により機能の同定を行った。【００５８】
２．contig26515遺伝子の大腸菌発現用プラスミドの構築
シンビオディニウム  ミクロアドリアチカム  LB2281株の全ＲＮＡを鋳型として、SuperScriptTM  III  First-Strand  Synthesis  SuperMix  for  qRT-PCR（invitrogen社製）を用いて逆転写を行ってｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡを鋳型として、下記表１に示す配列番号３及び配列番号４のプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、配列番号２の９４位〜６９９位までの塩基配列からなる遺伝子断片を取得した。また、プラスミドベクターpBluescriptII  SK(-)（Stratagene社製）を鋳型として、下記表１に示す配列番号５及び６のプライマー対を用いたＰＣＲ反応によりpBluescriptII  SK(-)を増幅し、制限酵素DpnI（東洋紡株式会社製）処理により鋳型の消化を行った。これら２つの断片を、High  Pure  PCR  Product  Purification  Kit（Roche  Applied  Science社製)を用いて精製した後に、In-Fusion  HD  Cloning  Kit（Clontech社製）を用いて融合し、contig26515遺伝子発現用プラスミドcontig26515_94を構築した。なお、本発現プラスミドは、contig26515遺伝子がコードするアミノ酸配列（配列番号１）のＮ末端側１位〜３１位までのアミノ酸配列を除去し、さらにプラスミド由来のLacZタンパク質のＮ末端側１位〜２９位のアミノ酸配列と融合させた形で構築した。【００５９】
シンビオディニウム  ミクロアドリアチカム  LB2281株のｃＤＮＡを鋳型とし、下記表１に示す配列番号７〜８のいずれかのプライマーと、配列番号４のプライマーとを対としてＰＣＲ反応を行い、配列番号２の１５４位〜６９９位までの塩基配列からなる遺伝子断片、配列番号２の２１４位〜６９９位までの塩基配列からなる遺伝子断片をそれぞれ取得した。
得られた遺伝子断片を用いて、上記と同様にしてpBluescriptII  SK(-)ベクターに結合し、contig26515遺伝子発現用プラスミドcontig26515_154、contig26515_214をそれぞれ構築した。なお、これらの発現プラスミドは、contig26515遺伝子がコードするアミノ酸配列（配列番号１）のＮ末端側１位〜５１位、１位〜７１位までのアミノ酸配列をそれぞれ除去し、さらにプラスミド由来のLacZタンパク質のＮ末端側１位〜２９位のアミノ酸配列と融合させた形で構築した。【００６０】
【表１】
2015005139.tif 000002
【００６１】
３．contig26515遺伝子発現プラスミドの大腸菌への導入
前記２．で構築した各contig26515遺伝子発現プラスミドを用いて、大腸菌突然変異株であるK27株（fadD88）（Overath  et  al，  Eur．J．Biochem．7，559-574，1969）をコンピテントセル形質転換法により形質転換した。形質転換処理をしたK27株を３７℃で一晩静置し、得られたコロニーをLBAmp液体培地（Bacto  Trypton  1%，Yeast  Extract  0.5%，NaCl  1%，アンピシリンナトリウム50μg/mL）１ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。前記培養液２０μＬを、２ｍＬのOvernight  Express  Instant  TB  Medium（Novagen社）に接種し、３０℃で振とう培養した。培養１６時間後、培養液に含まれる脂質成分を、下記４．の方法にて解析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpBluescriptII  SK(-)で形質転換した大腸菌K27株についても同様に実験を行った。【００６２】
４．大腸菌培養液中の脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
培養液１ｍＬに、内部標準として１ｍｇ/ｍＬの７−ペンタデカノンを５０μＬ添加後、０．５ｍＬのクロロホルム、１ｍＬのメタノール及び１０μＬの２Ｎ塩酸を培養液に添加して激しく攪拌後３０分間放置した。その後さらに、０．５ｍＬのクロロホルム及び０．５ｍＬの１．５％ＫＣｌを添加して攪拌後、３，０００ｒｐｍにて１５分間間遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、０．５Ｎ水酸化カリウム／メタノール溶液０．７ｍＬを添加し、８０℃で３０分間恒温した。続いて１ｍＬの１４％三フッ化ホウ素溶液（SIGMA社製）を添加し、８０℃にて１０分間恒温した。その後、ヘキサン、飽和食塩水を各１ｍＬ添加し激しく撹拌し、室温にて３０分間放置後、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸エステルを得た。【００６３】
得られた脂肪酸エステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。測定条件を以下に示す。
キャピラリーカラム：ＤＢ−１  ＭＳ  ２０ｍ×１００μｍ×０．１０μｍ（J＆W  Scientific製）、
移動相：高純度ヘリウム、
カラム内流量：０．３ｍＬ／分、
昇温プログラム：１５０℃（０．５分間）→２０℃／分→３２０℃（２分間）、
平衡化時間：１分間、
注入口：スプリット注入（スプリット比：７５：１），
圧力６２．４ｐｓｉ，２４．５ｍＬ／分，
注入量５μＬ、
洗浄バイアル：メタノール・クロロホルム、
検出器温度：３００℃【００６４】
また、脂肪酸エステルの同定は、同サンプルを同条件でガスクロマトグラフ質量分析解析に供することにより行った。
ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。各ピーク面積を、内部標準である７−ペンタデカノンのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、培養液１リットルあたりの各脂肪酸量を算出した。さらに、各脂肪酸量の総和を総脂肪酸量とし、総脂肪酸量に占める各脂肪酸量の割合を算出した。
各脂肪酸の割合及び総脂肪酸量の測定結果を表２に示す。なお、以下の表中、脂肪酸組成においてＣｘ：ｙとあるのは、炭素原子数ｘで二重結合数ｙの脂肪酸を表す。また、「ＴＦＡ」は総脂肪酸量を、「脂肪酸組成（％ＴＦＡ）」は総脂肪酸の重量に対する各脂肪酸の重量を示す。【００６５】
【表２】
2015005139.tif 000003
【００６６】
表２から明らかなように、contig26515遺伝子断片を導入した形質転換体では、プラスミドベクターpBluescriptII  SK(-)を導入した形質転換体と比べ、総脂肪酸量の増加が観察された。また、当該形質転換体では、プラスミドベクターpBluescriptII  SK(-)を導入した形質転換体と比べ、脂肪酸組成が変化していた。特に、Ｃ１２：１、Ｃ１２：０、Ｃ１４：１、Ｃ１４：０、Ｃ１６：１脂肪酸の割合が増加した。これらの結果から、contig26515遺伝子によりコードされるタンパク質は、アシル−ＡＣＰから特定の脂肪酸を切り出すアシル−ＡＣＰチオエステラーゼであると考えられる。また、少なくとも配列番号１の７２位〜２３３位までのアミノ酸配列を有するタンパク質は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を示すことがわかった。【００６７】
実施例２  シンビオディニウム由来アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を導入したナンノクロロプシス形質転換体の作製、及び形質転換体による脂質の生産
１．contig26515遺伝子のナンノクロロプシス発現用プラスミドの構築
シンビオディニウム  ミクロアドリアチカム  LB2281株のｃＤＮＡを鋳型として、下記表３に示す配列番号９及び配列番号１０のプライマー対を用いてＰＣＲ反応を行い、配列番号２の１５４位〜６９９位までの塩基配列からなるcontig26515遺伝子断片を取得した。
GenBankに登録されているナンノクロロプシス  エスピー（Nannochloropsis  sp.）W2J3B株のVCP1（ビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質）遺伝子のcomplete  cds  配列（Accession  number:  JF957601.1）より、VCP1プロモーター配列（配列番号１１）、VCP1葉緑体移行シグナル配列（配列番号１２）、及びVCP1ターミネーター配列（配列番号１３）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、下記表３に示す配列番号１４及び配列番号１５のプライマー対、配列番号１６及び配列番号１７のプライマー対、配列番号１８及び配列番号１９のプライマー対を用いてＰＣＲ反応を行い、VCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、VCP1ターミネーター配列をそれぞれ取得した。また、プラスミドベクターpUC19（タカラバイオ社製）を鋳型として、下記表３に示す配列番号２０及び２１のプライマー対を用いたＰＣＲ反応を行い、プラスミドベクターpUC19を増幅した。
上記により得られたcontig26515遺伝子断片、VCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、及びVCP1ターミネーター配列を、実施例１の２．と同様の方法でプラスミドベクターpUC19に融合し、contig26515遺伝子のナンノクロロプシス発現用プラスミドcontig26515_154_Nannoを構築した。なお、本発現プラスミドは、VCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、contig26515遺伝子断片、及びVCP1ターミネーター配列の順に連結したインサート配列（配列番号２２；以下、contig26515遺伝子発現用断片）と、pUC19ベクター配列からなる。【００６８】
２．ゼオシン耐性遺伝子のナンノクロロプシス発現用プラスミドの構築
ゼオシン耐性遺伝子（配列番号２３）、及びRandor  Radakovits,  et  al.,  Nature  Communications,  DOI:10.1038/ncomms1688,  2012、に記載のナンノクロロプシス  ガディタナ（Nannochloropsis gaditana）CCMP526株由来チューブリンプロモーター配列（配列番号２４）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、配列番号２５及び配列番号２６のプライマー対、配列番号２７及び配列番号２８のプライマー対を用いてＰＣＲ反応を行い、ゼオシン耐性遺伝子及びチューブリンプロモーター配列をそれぞれ取得した。これらの増幅断片と、前記１．で取得したVCP1ターミネーター配列、及びプラスミドベクターpUC19の増幅断片を、実施例１の２．と同様の方法で融合し、ゼオシン耐性遺伝子発現プラスミドを構築した。なお、本発現プラスミドは、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、VCP1ターミネーター配列の順に連結したインサート配列（配列番号２９；以下、ゼオシン耐性遺伝子発現用断片）と、pUC19ベクター配列からなる。【００６９】
３．contig26515遺伝子発現用断片のナンノクロロプシスへの導入
発現用プラスミドcontig26515_154_Nannoを鋳型として、下記表３に示す配列番号３０と配列番号３１のプライマー対を用いてＰＣＲ反応を行い、当該プラスミド中のcontig26515遺伝子発現用断片（配列番号２２）を増幅した。また、ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、配列番号３１と配列番号３２のプライマー対を用いてＰＣＲ反応を行い、ゼオシン耐性遺伝子発現用断片（配列番号２９）を増幅した。増幅した両断片を、High  Pure  PCR  Product  Purification  Kit（Roche  Applied  Science社製)を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。
約１０９細胞のナンノクロロプシス  オキュラータ（Nannochloropsis oculata）NIES2145株を、３８４ｍＭのソルビトール溶液で洗浄して塩を完全に除去し、形質転換の宿主細胞として用いた。上記で増幅したcontig26515遺伝子発現用断片（配列番号２２）及びゼオシン耐性遺伝子発現用断片（配列番号２９）を、約５００ｎｇずつ宿主細胞に混和し、５０μＦ、５００Ω、２，２００ｖ／２ｍｍの条件でエレクトロポレーションを行った。ｆ／２液体培地（（７５ｍｇＮａＮＯ３、６ｍｇＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．５μｇビタミンＢ１２、０．５μｇビオチン、１００μｇチアミン、１０ｍｇＮａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ、４．４ｍｇＮａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ、３．１６ｍｇＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１２μｇＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、２１μｇＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１８０μｇＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、７μｇＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、７μｇＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ／人工海水１Ｌ））にて２４時間回復培養を行った後に、２μｇ／ｍＬのゼオシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、２５℃、０．３％ＣＯ２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて２〜３週間培養した。得られたコロニーの中から、contig26515遺伝子発現用断片（配列番号２２）を含むものをＰＣＲ法により選抜した。選抜した株を、ｆ／２培地の窒素濃度を１５倍、リン濃度を５倍に増強した培地（以下、Ｎ１５Ｐ５培地）２０ｍＬに播種し、２５℃、０．３％ＣＯ２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて４週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液２ｍＬを、１８ｍＬのＮ１５Ｐ５培地に植継ぎ、２５℃、０．３％ＣＯ２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて２週間振盪培養した。なお、陰性対照として、野生株であるNIES2145株についても同様に実験を行った。【００７０】
【表３】
2015005139.tif 000004
【００７１】
４．ナンノクロロプシス培養液中の脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
得られたナンノクロロプシス培養液について、実施例１の４.と同様の方法で、脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析を行った。
結果を表４に示す。なお、表４脂肪酸組成においてＣｘ：ｙとあるのは、炭素原子数ｘで二重結合数ｙの脂肪酸を表す。また、「ｎ」は、０〜５の整数を表し、例えば、Ｃ１８：ｎと記載した場合には、組成がＣ１８：０，Ｃ１８：１，Ｃ１８：２，Ｃ１８：３，Ｃ１８：４，及びＣ１８：５の脂肪酸の総和を表す。【００７２】
【表４】
2015005139.tif 000005
【００７３】
表４から明らかなように、contig26515遺伝子断片を導入したナンノクロロプシス形質転換体では、宿主であるナンノクロロプシスNIES2145株と比べ、総脂肪酸量の増加が観察された。また、当該形質転換体では、ナンノクロロプシスNIES2145株と比べ、脂肪酸組成が変化していた。特に、Ｃ１２：０、Ｃ１４：０、Ｃ１６：１脂肪酸の割合が増加した。【００７４】
実施例３  シンビオディニウム由来アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの変異体を導入した大腸菌形質転換体の作製、及び形質転換体による脂質の製造
１．シンビオディニウム由来アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ変異体発現プラスミドの構築
配列番号３３のタンパク質をコードする塩基配列として、配列番号３４に示す塩基配列からなる遺伝子を人工遺伝子合成により取得した。なお、配列番号３３のアミノ酸配列は、配列番号１の７２位〜２３３位までのアミノ酸配列と７５％の同一性を有する。
配列番号３４の遺伝子を鋳型として、下記表５に示す配列番号３５及び配列番号３６のプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、配列番号３４に示す塩基配列からなる遺伝子断片を増幅した。得られた遺伝子断片を用いて、実施例１の２．と同様の手法により、発現プラスミドSymbio317を構築した。なお、本発現プラスミドは、配列番号３３に示すアミノ酸配列のＮ末端側１位のアミノ酸を除去し、さらにプラスミド由来のLacZタンパク質のＮ末端側１位〜２９位のアミノ酸配列を融合させ構築した。【００７５】
【表５】
2015005139.tif 000006
【００７６】
２．発現プラスミドの大腸菌への導入、大腸菌培養液中の脂質の抽出、及び構成脂肪酸の分析
実施例１の３．と同様の方法で、発現プラスミドSymbio317を大腸菌へ導入し、実施例１の４．と同様の方法で脂質の解析を行った。結果を表６に示す。【００７７】
【表６】
2015005139.tif 000007
【００７８】
表６から明らかなように、Symbio317発現プラスミドを導入した形質転換体では、プラスミドベクターpBluescriptII  SK(-)を導入した形質転換体と比べ、総脂肪酸量が増加した。また、当該形質転換体では、プラスミドベクターpBluescriptII  SK(-)を導入した形質転換体と比べ、脂肪酸組成が変化していた。特に、Ｃ１２：１、Ｃ１２：０、Ｃ１４：１、Ｃ１４：０、Ｃ１６：１脂肪酸の割合が増加した。また、これらの結果から、配列番号３３のタンパク質はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有していることがわかった。【００７９】
本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明を説明のどの細部においても限定しようとするものではなく、添付の請求の範囲に示した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。【００８０】
本願は、2013年7月12日に日本国で特許出願された特願2013-146624に基づく優先権を主張するものであり、これはここに参照してその内容を本明細書の記載の一部として取り込む。
【配列表】
2015005139000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年11月26日(2015.11.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｃ）の群から選ばれるいずれかのタンパク質。
（ａ）配列番号１の７２位〜２３３位までのアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列との同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
前記（ｂ）のタンパク質が、下記（ｂ）’のタンパク質である、請求項１に記載のタンパク質。
（ｂ）’前記（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１以上１０個以下のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項３】
前記（ｃ）のタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１の３２位〜２３３位までのアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１の５２位〜２３３位までのアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号３３のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３３の２位〜１６７位までのアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】
下記（ｄ）〜（ｊ）の群から選ばれるいずれかのＤＮＡからなる遺伝子。
（ｄ）配列番号２の２１４位〜６９９位までの塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ）配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｆ）配列番号２の９４位〜６９９位までの塩基配列からなるＤＮＡ
（ｇ）配列番号２の１５４位〜６９９位までの塩基配列からなるＤＮＡ
（ｈ）配列番号３４の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｉ）前記ＤＮＡ（ｄ）〜（ｇ）からなる群より選ばれるいずれか１つの塩基配列との同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｊ）前記ＤＮＡ（ｄ）〜（ｉ）からなる群より選ばれるいずれか１つの塩基配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項６】
請求項４又は５に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項７】
請求項４若しくは５に記載の遺伝子又は請求項６に記載の組換えベクターを、宿主に導入してなる形質転換体。
【請求項８】
前記宿主が微生物である、請求項７に記載の形質転換体。
【請求項９】
前記微生物が微細藻類である、請求項８に記載の形質転換体。
【請求項１０】
前記微細藻類がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類である、請求項９に記載の形質転換体。
【請求項１１】
前記藻類がナンノクロロプシス・オキュラータ（Nannochloropsis  oculata）である、請求項１０に記載の形質転換体。
【請求項１２】
前記微生物が大腸菌である、請求項８に記載の形質転換体。
【請求項１３】
請求項７〜１２のいずれか１項に記載の形質転換体を培地で培養する工程、及び得られた培養物から脂質を採取する工程、を含む脂質の製造方法。
【請求項１４】
前記脂質が、炭素原子数１２以上１４以下の脂肪酸及びその誘導体を含む、請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
宿主に請求項４若しくは５に記載の遺伝子又は請求項６に記載の組換えベクターを導入する工程を含む、脂質中の脂肪酸組成を改変する方法。
【請求項１６】
宿主に請求項４若しくは５に記載の遺伝子又は請求項６に記載の組換えベクターを導入する工程を含む、脂質の生産性を向上させる方法。
【請求項１７】
請求項４若しくは５に記載の遺伝子又は請求項６に記載の組換えベクターを宿主に導入する工程を含む、炭素原子数１２以上１４以下の脂肪酸及びその誘導体の生産性を向上させる方法。
【請求項１８】
請求項４若しくは５に記載の遺伝子又は請求項６に記載の組換えベクターを宿主に導入する工程を含む、形質転換体の作製方法。
【請求項１９】
前記宿主が微生物である、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記微生物が微細藻類である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記微細藻類がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記藻類がナンノクロロプシス・オキュラータ（Nannochloropsis  oculata）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記微生物が大腸菌である、請求項１９に記載の方法。
【国際調査報告】
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