【手続補正書】
【提出日】平成24年4月5日(2012.4.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚又は培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害処理して、タイトジャンクション傷害皮膚モデルを作製し、標識してなる皮膚関連成分を含む培地中で培養し、前記標識の分布状況を指標とすることを特徴とする、皮膚関連成分の分布又は輸送へのタイトジャンクションの関与の程度の鑑別法。
【請求項２】
対照として、タイトジャンクションの傷害処理を施さない皮膚又は培養皮膚三次元モデルを用いることを特徴とする、請求項１に記載の皮膚関連成分の分布又は輸送へのタイトジャンクションの関与の程度の鑑別法。
【請求項３】
前記鑑別法が、角層側の培地中に放出された、標識してなる皮膚関連成分を計測することを特徴とする、請求項１又は２に記載の皮膚関連成分の分布又は輸送へのタイトジャンクションの関与の程度の鑑別法。
【請求項４】
前記皮膚又は皮膚三次元モデルが、培養ヒト皮膚三次元モデルであることを特徴とする、請求項１〜３何れか１項に記載の皮膚関連成分の分布又は輸送へのタイトジャンクションの関与の程度の鑑別法。
【請求項５】
前記タイトジャンクションの傷害処理が、中鎖飽和直鎖脂肪酸処理であることを特徴とする、請求項１〜４の何れか１項に記載の皮膚関連成分の分布又は輸送へのタイトジャンクションの関与の程度の鑑別法。
【請求項６】
標識してなる皮膚関連成分は、蛍光標識されたセラミドであることを特徴とする、請求項１〜５の何れか１項に記載の皮膚関連成分の分布又は輸送へのタイトジャンクションの関与の程度の鑑別法。
【請求項７】
請求項１〜６の何れかに記載の方法において、培地中に含有させた場合に、皮膚関連成分を角層方向に分泌する表皮細胞の働きを早める効果を有する、ε，γ−グルタミルリジン及び／又はパルマリア抽出物を含む、傷害タイトジャンクションの回復促進剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
この様な状況に鑑みて、本発明者らは、皮膚生理学的に有用な、皮膚内の物質の輸送と分布に対してのタイトジャンクションの関与の程度を明らかにせしめる技術を求めて、鋭意研究努力を重ねた結果、皮膚又は培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害処理して、タイトジャンクション傷害皮膚モデルを作製し、標識してなる皮膚関連成分を含む培地中で培養し、前記標識の分布状況を指標とすることにより、この様な課題が解決できることを見出し、発明を完成させるに至った。即ち、本発明は、以下に示す通りである。
（１）皮膚又は培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害処理して、タイトジャンクション傷害皮膚モデルを作成し、標識してなる皮膚関連成分を含む培地中で培養し、前記標識の分布状況を指標とすることを特徴とする、皮膚関連成分の分布又は輸送へのタイトジャンクションの関与の程度の鑑別法。
（２）対照として、タイトジャンクションの傷害処理を施さない皮膚又は培養皮膚三次元モデルを用いることを特徴とする、（１）に記載の皮膚関連成分の分布又は輸送へのタイトジャンクションの関与の程度の鑑別法。
（３）前記鑑別法が、角層側の培地中に放出された、標識してなる皮膚関連成分を計測することを特徴とする、（１）又は（２）に記載の皮膚関連成分の分布又は輸送へのタイトジャンクションの関与の程度の鑑別法。
（４）前記皮膚又は皮膚三次元モデルが、培養ヒト皮膚三次元モデルであることを特徴とする、（１）〜（３）の何れかに記載の皮膚関連成分の分布又は輸送へのタイトジャンクションの関与の程度の鑑別法。
（５）前記タイトジャンクションの傷害処理が、中鎖飽和直鎖脂肪酸処理であることを特徴とする、（１）〜（４）の何れかに記載の皮膚関連成分の分布又は輸送へのタイトジャンクションの関与の程度の鑑別法。
（６）標識してなる皮膚関連成分は、蛍光標識されたセラミドであることを特徴とする、（１）〜（５）の何れかに記載の皮膚関連成分の分布又は輸送へのタイトジャンクションの関与の程度の鑑別法。
（７）（１）〜（６）の何れかに記載の方法において、培地中に含有させた場合に、皮膚関連成分を角層方向に分泌する表皮細胞の働きを早める効果を有する、ε，γ−グルタミルリジン及び／又はパルマリア抽出物を含む、傷害タイトジャンクションの回復促進剤。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明の皮膚関連成分の分布又は輸送へのタイトジャンクションの関与の程度の鑑別法は、皮膚又は培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害処理して、タイトジャンクション傷害皮膚モデルを作成し、標識してなる皮膚関連成分を含む培地中で培養し、前記標識の分布状況を指標とすることを特徴とする。前記の皮膚としては、所望により体毛を除去し、生体より採取した皮膚断片であって、角層などを除いた、表皮顆粒層、表皮基底層及び真皮部分からなるものが好ましく、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウサギの皮膚断片が好ましい。又、前記培養皮膚三次元モデルとしては、ヒト又はヒトを除く動物の皮膚より採取した、正常な（癌化していない）ケラチノサイト、フィブロブラストなどの皮膚細胞を培養し、三次元構造を構築し、皮膚の構造に疑似させたものが好ましく
、この様な形態の市販品を購入して使用することも出来る。好ましい市販品としては、例えば、倉敷紡績株式会社から販売されている「EFT-400」（正常培養ヒト三次元皮膚モデ
ル）などが好適に例示できる。特に表皮成分のみで構成される「EPI-200」や、USA MaTek社から販売されている「EpiDerm」などがさらに好適に例示できる。かかる皮膚又は培養
皮膚三次元モデルは、顆粒層側から傷害手段を講じてタイトジャンクション部分を傷害する。傷害手段としては、例えば、紫外線や化学物質などが好ましく例示でき、紫外線であれば、波長２８０〜３２０ｎｍの紫外線を７．５〜２００ｍJ／ｃｍ2、さらに好ましくは５０〜１６０ｍJ／ｃｍ2の単位あたりのエネルギー量で照射すればよく、化学的な処置であれば、カプリン酸、カプリル酸などの中鎖長（炭素数８〜１２）の脂肪族飽和直鎖脂肪酸またはその一価金属塩の０．１〜１０ｍM、さらに好ましくは０．５〜２ｍMの溶液を真皮側又は表皮基底層側から、５〜２４時間、さらに好ましくは１０〜１５時間作用させればよい。また、オクルディンやクローディンの細胞外ドメインを認識する中和抗体を使用することもできる。これらの傷害処置の内、特に好ましいものは化学的傷害処置であり、なかでもカプリン酸ナトリウムによる処理が特に好ましい。これはタイトジャンクションに対して均質な損傷がなしうるからである。この様な均質な傷害は、後記の傷害タイトジャンクションの回復促進剤のスクリーニングにおいては、そのメカニズムを的確に鑑別する上で非常に重要な因子となる。処置後傷害手段は直ちに皮膚又は培養皮膚三次元モデルより離脱させる。離脱は、紫外線照射であれば照射を終了することによりできるし、化学的傷害手段であれば、培地又はPBS（リン酸緩衝生理食塩水）などで洗浄することにより
なしうる。斯くして得られたタイトジャンクション傷害皮膚モデルを、標識してなる皮膚関連成分を含む培地中で培養し、しかる後に、タイトジャンクション傷害皮膚モデルに取り込まれなかった標識された皮膚関連成分を洗浄などによって除去した後に、暫く培養を続け、培養上清中に放出される、標識してなる皮膚関連成分を測定したり、組織片を切り出し、標本に加工し、標識を認識しうる観察手段によって標識の分布状況を観察する。