(57)【要約】  本発明は、アレルギー性気道炎症を治療または予防するための新たな手段を提供することを課題とする。本発明に係る医薬品は、抗真菌剤を有効成分として含有し、真菌の異常増殖が起きているもしくは起きるおそれがある対象に投与されることを特徴とする、アレルギー性気道炎症の治療または予防のための医薬品、あるいは、プロスタグランジン抑制剤を有効成分とし、異常増殖した真菌からプロスタグランジンＥ2が過剰に産生されているまたは産生されるおそれがある対象に投与されることを特徴とする、アレルギー性気道炎症の治療または予防のための医薬品である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗真菌剤を有効成分として含有し、真菌の異常増殖が起きているもしくは起きるおそれがある対象に投与されることを特徴とする、アレルギー性気道炎症の治療または予防のための医薬品。
【請求項２】
プロスタグランジン抑制剤を有効成分とし、異常増殖した真菌からプロスタグランジンＥ2が過剰に産生されているまたは産生されるおそれがある対象に投与されることを特徴とする、アレルギー性気道炎症の治療または予防のための医薬品。
【請求項３】
前記プロスタグランジン抑制剤がシクロオキシゲナーゼ−１（ＣＯＸ−1）阻害剤またはシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤である、請求項２に記載の医薬品。
【請求項４】
前記真菌が腸内の真菌である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真菌の異常増殖（腸内毒素症など）およびアレルギー性気道炎症に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類の腸内には、細菌、ウイルスおよび真菌を含む多数の微生物が棲み着いている。ヒトでは、１０００種より多くの、１００兆を超える細菌が密集して、それぞれ独立した集団で生息している。このような微生物叢は栄養の摂取、腸の免疫システムの発達および維持、外来性の病原体に対する防御などに貢献している（非特許文献１）。けれども、宿主の遺伝的特徴、生活習慣、微生物への曝露、医学的処置などによって、腸内微生物叢のインバランス、すなわち腸内毒素症〔dysbiosis〕が引き起こされる。たとえば、抗生物質を用いる処置は腸内微生物叢の数および組成に重大な変化をもたらし（非特許文献２）、健全な微生物叢を破壊して真菌の異常増殖を許すことが知られている（非特許文献３，４）。腸管でのカンジダの異常増殖は、抗生物質処理と同様、糖または炭水化物の過剰な日常的摂取によっても引き起こされる（非特許文献５）。このような腸内毒素症は、腸炎に関係している（非特許文献６，７）のみならず、腸外の多くの疾患、たとえばアトピー性皮膚炎、肥満症、糖尿病などに関係している（非特許献８−１１）。また、最近の研究では、腸内真菌が炎症性疾患に影響しているかもしれないことが示唆されている（非特許文献１２，１３）。共生する細菌に由来するシグナルが免疫細胞を全身的に刺激しており、抗生物質で処理することにより抗ウイルス性が低下することも報告されている（非特許文献１４）。しかしながら、腸内微生物叢が宿主の腸外の免疫性をどのように制御しているかはほとんど知られていない。【０００３】
いくつかの文献には、多くの真菌がプロスタグランジン類を新たに〔de novo〕または外部のアラキドン酸の変換を介して分泌していることが記載されている（非特許文献１５，１６）。また、プロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）などのプロスタグランジン類は、マクロファージのＭ２への分化を歪めまたは増強し（非特許文献１７，１８）、アレルギー性の炎症を拡大させる（非特許文献１９）可能性があることが断片的に示唆されている。Ｍ２マクロファージがアレルギー性気道炎症を強めるという報告もある（非特許文献２０，２１）。しかしながら、腸内真菌の異常増殖により産生されるプロスタグランジン類がマクロファージに作用してアレルギー性気道炎症を悪化させるという個体レベルでの一連の作用機序は、これまでに仮説の提唱も立証もされておらず、また腸内真菌やプロスタグランジン類を制御することによってアレルギー性気道炎症を改善させたとする具体的な報告もない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】D. A. Hill, D. Artis. Intestinal bacteria and the regulation of immune cell homeostasis. Annu Rev Immunol 28, 623-667 (2010).
【非特許文献２】J. L. Round, S. K. Mazmanian. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol 9, 313-323 (2009).
【非特許文献３】G. Samonis, E. J. Anaissie, G. P. Bodey. Effects of broad-spectrum antimicrobial agents on yeast colonization of the gastrointestinal tracts of mice. Antimicrob Agents Chemother 34, 2420-2422 (1990).
【非特許文献４】M. Giuliano, M. Barza, N. V. Jacobus, S. L. Gorbach. Effect of broadspectrum parenteral antibiotics on composition of intestinal microflora of humans. Antimicrob Agents Chemother 31, 202-206 (1987).
【非特許文献５】S. L. Vargas, C. C. Patrick, G. D. Ayers, W. T. Hughes. Modulating effect of dietary carbohydrate supplementation on Candida albicans colonization and invasion in a neutropenic mouse model. Infect Immun 61, 619-626 (1993).
【非特許文献６】E. Elinav. et al. NLRP6 inflammasome regulates colonic microbial ecology and risk for colitis. Cell 145, 745-757 (2011).
【非特許文献７】S. K. Mazmanian, J. L. Round, D. L. Kasper. A microbial symbiosis factor prevents intestinal inflammatory disease. Nature 453, 620-625 (2008).
【非特許文献８】M. Arumugam et al. Enterotypes of the human gut microbiome. Nature 473, 174-180 (2011).
【非特許文献９】J. Henao-Mejia et al. Inflammasome-mediated dysbiosis regulates progression of NAFLD and obesity. Nature 482, 179-185 (2012).
【非特許文献１０】M. Vijay-Kumar et al. Metabolic syndrome and altered gut microbiota in mice lacking Toll-like receptor 5. Science 328, 228-231 (2010).
【非特許文献１１】J. Penders et al. Gut microbiota composition and development of atopic manifestations in infancy: the KOALA Birth Cohort Study. Gut 56, 661-667 (2007).
【非特許文献１２】I. D. Iliev et al. Interactions between commensal fungi and the C-type lectin receptor Dectin-1 influence colitis. Science 336, 1314-1317 (2012).
【非特許文献１３】S. J. Ott et al. Fungi and inflammatory bowel diseases: Alterations of composition and diversity. Scand J Gastroenterol 43, 831-841 (2008).
【非特許文献１４】M. C. Abt et al. Commensal bacteria calibrate the activation threshold of innate antiviral immunity. Immunity 37, 158-170 (2012).
【非特許文献１５】M. C. Noverr, S. M. Phare, G. B. Toews, M. J. Coffey, G. B. Huffnagle. Pathogenic yeasts Cryptococcus neoformans and Candida albicans produce immunomodulatory prostaglandins. Infect Immun 69, 2957-2963 (2001).
【非特許文献１６】M. C. Noverr, G. B. Toews, G. B. Huffnagle. Production of prostaglandins and leukotrienes by pathogenic fungi. Infect Immun 70, 400-402 (2002).
【非特許文献１７】H. Oshima et al. Prostaglandin E(2) signaling and bacterial infection recruit tumor-promoting macrophages to mouse gastric tumors. Gastroenterology 140, 596-607 (2011).
【非特許文献１８】M. Heusinkveld et al. M2 macrophages induced by prostaglandin E2 and IL-6 from cervical carcinoma are switched to activated M1 macrophages by CD4+ Th1 cells. J Immunol 187, 1157-1165 (2011).
【非特許文献１９】R. J. Church, L. A. Jania, B. H. Koller. Prostaglandin E(2) produced by the lung augments the effector phase of allergic inflammation. J Immunol 188, 4093-4102 (2012).
【非特許文献２０】A. Q. Ford et al. Adoptive transfer of IL-4Rα+ macrophages is sufficient to enhance eosinophilic inflammation in a mouse model of allergic lung inflammation. BMC Immunol 13, 6 (2012).
【非特許文献２１】A. P. Moreira et al. Serum amyloid P attenuates M2 macrophage activation and protects against fungal spore-induced allergic airway disease. J Allergy Clin Immunol 126, 712-721 (2010).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、アレルギー性気道炎症を治療または予防するための新たな手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明者らは、抗生物質を用いた処置により、腸内毒素症のような真菌の異常増殖によってアレルギー性気道炎症が悪化すること、そのような状況は抗真菌剤を用いた処置により抑制することができることを立証した。さらに、上記のような真菌の異常増殖は、血清中のプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）を増加させ、マクロファージをＭ２マクロファージに分化させることにより、上記のようにアレルギー性気道炎症を悪化させていること、そのような状況は真菌に対するプロスタグランジンの産生阻害剤を用いた処置により抑制することができることを立証し、本発明を完成させるに至った。【０００７】
すなわち、本発明は、それぞれ異なる物質を有効成分とする、アレルギー性気道炎症の治療または予防のための２種類の医薬品を提供する。このような本発明の医薬品に係る発明は、下記の実施形態を包含する。
［１］  抗真菌剤を有効成分として含有し、真菌の異常増殖が起きているもしくは起きるおそれがある対象に投与されることを特徴とする、アレルギー性気道炎症の治療または予防のための医薬品。
［２］  プロスタグランジン抑制剤を有効成分とし、異常増殖した細菌からプロスタグランジンＥ２が過剰に産生されているまたは産生されるおそれがある対象に投与されることを特徴とする、アレルギー性気道炎症の治療または予防のための医薬品。
［３］  前記プロスタグランジン抑制剤がシクロオキシゲナーゼ−１（ＣＯＸ−1）阻害剤またはシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤である、［２］に記載の医薬品。
［４］  前記真菌が腸内の真菌である、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の医薬品。【０００８】
なお、当業者であれば、本発明は他の側面において、上記の医薬品に係る発明の変換により、真菌の異常増殖を抑制するステップを含む、または異常増殖した真菌によるプロスタグランジンの産生を抑制するステップを含む、アレルギー性気道炎症を治療または予防する方法や、抗真菌剤またはプロスタグランジン抑制剤のアレルギー性気道炎症を治療または予防する医薬品の有効成分としての利用方法などを提供することを理解する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、腸内真菌、特にカンジダの異常増殖により引き起こされるアレルギー性気道炎症の悪化を治療または予防することができるようになる。従来のアレルギー性気道炎症に対する医薬品としては、気管支拡張剤や副腎皮質ホルモン剤などが知られているが、これらの医薬品では十分な効果が得られない（抵抗性の）アレルギー性気道炎症に対して、それが腸内真菌の異常増殖によってもたらされているものであれば、本発明の医薬品による治療効果を期待することができる。このように、本発明は、アレルギー性気道炎症の治療または予防にとって、従来とは異なる作用機序に基づく新たな手段を提供するものとして貢献する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実験例１の結果に関する顕微鏡写真およびグラフ。抗生物質処理はアレルギー性気道炎症を悪化させる（Ａ−Ｄ）。抗生物質（クリンダマイシン＋セフォペラゾン）処理した（+）または無処理の（-）マウスの鼻腔内に、パパインで３日毎に合計５回（Ａ−Ｄ）チャレンジした。最終のチャレンジから１日後、ＢＡＬ細胞の形態（ライト染色、オリジナル倍率×１０００）（Ａ）、ＢＡＬ中の全細胞および分化した細胞の数（Ｂ）、肺の組織像（ＨＥまたはＰＡＳ染色）（スケールバー：１００μｍ）（Ｃ）、およびＢＡＬ液中のサイトカイン濃度（Ｄ）について分析した。Ａ（ｎ＝７または８）、Ｃ（ｎ＝４〜６）、各群における代表的な結果を示している。エラーバーは標準偏差〔ＳＤ〕を示す（Ｄ）（ｎ＝７）。結果は３回の独立した実験の代表的なものである（Ｂ，Ｄ）。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。Ｎ．Ｓ．は有意差なしを表す。
【図２】実験例２の結果に関するグラフ。抗生物質処理はＭ２マクロファージの分極化を引き起こす。（Ａ）マウスに、無処理（-）または抗生物質処理した（+）マウスから精製した肺胞マクロファージ（ＡＭφ）を養子移入し、図１で述べたように、ＢＡＬ細胞の分析のためにパパインでチャレンジした。（Ｂ）無処理（-）または抗生物質で処理した（+）マウスから精製したＡＭφを、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにかけた（ｎ＝５）。（Ｃ）マウスは、無処理のままか（-）、抗生物質で処理し（+）、３日毎、合計５回のチャレンジのために、ＰＢＳ（-）またはＳＡＰを鼻腔内に投与した。最終のＳＡＰ処理から１日後、マウスは肺胞マクロファージのＭ２マクロファージマーカーの発現について、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析した。（Ｄ）マウスは、無処理のままか（-）、抗生物質で処理し（+）、３日毎、合計５回、パパインでチャレンジした。マウスには、ＰＢＳ（-）またはＳＡＰ（+）を、３日毎、合計５回のチャレンジのための各パパイン吸入の１日前に鼻腔内に投与した。最終のパパインチャレンジから１日後、図１で述べたように、マウスのＢＡＬ細胞数について分析した。（Ｅ）マウスに骨髄由来の培養マクロファージ（Ｍ０）、Ｍ１マクロファージ、またはＭ２マクロファージを養子移入し、次いで、図１で述べたように、鼻腔内にパパインでチャレンジ，ＢＡＬ細胞の分析を行った。結果は３回の独立した実験の代表的なものである。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｎ．Ｓ．は有意差なしを表す。エラーバーは標準偏差〔ＳＤ〕を示す。
【図３】実験例３の結果に関する顕微鏡写真およびグラフ。抗生物質処理は腸における真菌の異常増殖を引き起こし、Ｍ２マクロファージの分極化を引き起こす。（Ａ−Ｃ）マウスは２週間、無処理のままか、経口で抗生物質処理をし（CLM：クリンダマイシン；CPZ：セフォペラゾン；ABPC：アンピシリン；MNZ：メトロニダゾール；STM：ストレプトマイシン）、糞中の真菌のコロニーを分析した（Ａ）。次いでマウスをパパインでチャレンジし、図１（Ｂ）で述べたように、ＢＡＬ細胞について分析した。真菌のコロニー形成とＢＡＬの全細胞数の相関を分析した（Ｃ）。（Ｄ，Ｅ）２週間、無処理のままか（-）、抗生物質処理をした（クリンダマイシン＋セフォペラゾン）（+）マウスの盲腸切片を、ＰＡＳ（Ｄ）またはＤＡＢ（Ｅ）で染色した。矢印は固有層中のカンジダを指す。スケールバー：１０μｍ。（Ｆ−Ｈ）マウスは２週間、無処理のままか、経口で抗生物質（クリンダマイシン＋セフォペラゾン）または抗生物質＋５−ＦＣで処理し、糞中の真菌のコロニーを分析した（Ｆ）。ＡＭφを、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにかけた（ｎ＝５）（Ｇ）。次いでマウスの鼻腔内をパパインでチャレンジし、図１（Ｈ）で述べたように、ＢＡＬ細胞の数を分析した（Ｈ）。結果は３回の独立した実験の代表的なものである。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。Ｎ．Ｓ．は有意差なしを表す。
【図４】実験例４の結果に関するグラフ。腸内真菌の過剰増殖に伴うプロスタグランジンＥ2の増加はＭ２マクロファージを分極化させ、アレルギー性気道炎症が誘発する細胞の浸潤を増加させる。（Ａ）無処理（-）または抗生物質（クリンダマイシン＋セフォペラゾン）処理した（+）マウスから精製した末梢血単球をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにかけた（ｎ＝５）。（Ｂ）500 μMのアラキドン酸（AA）の存在下または非存在下で、４８時間、マウスの糞から単離したCandida parapsilosis（Cp）を培養したか、培養しないで、培養上清中のプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）代謝物（ＰＧＥＭ）の分析を行った。（Ｃ）マウスは２週間、無処理のままか、または経口で抗生物質（Abx）、抗生物質＋５−ＦＣで処理し、血清ＰＧＥＭレベルを分析した。（Ｄ）無処理のままか（-）、抗生物質で処理したマウスの鼻腔内を、パパインあるいはＰＢＳで３日毎、合計５回チャレンジした。最終のチャレンジから１日後、ＢＡＬ液中のＰＧＥＭレベルを分析した。（Ｅ−Ｇ）Ptges+/+（Ｅ−Ｇ）またはPtges-/-マウスを無処理のままか（-）、抗生物質またはアスピリンのどちらか、あるいはその両方で経口処理し、血清ＰＧＥＭレベルを分析した（Ｅ）。さらにＡＭφにおけるＭ２マクロファージマーカー遺伝子の発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで分析した（ｎ＝５）（Ｆ）。次いでマウスの鼻腔内を、パパインでチャレンジし、図１で述べたように分析を行った（Ｇ）。（Ｈ）無処理のままか（-）、抗生物質またはセレコキシブ〔Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ〕のどちらか、あるいはその両方で2週間経口処理したマウスの鼻腔内にパパインでチャレンジを行い、図１で述べたように分析を行った。（Ｉ）マウスにジメチルＰＧＥ2（Dm-PGE2）またはＰＢＳを毎日、合計５回、腹腔内注射した。最終のチャレンジから１日後、ＡＭφにおけるＭ２マクロファージマーカー遺伝子の発現について、マウスを分析した（ｎ＝５）。（Ｊ）マウスの鼻腔内を３日間、合計５回、パパインでチャレンジした。ジメチルＰＧＥ2（Dm-PGE2）またはＰＢＳも、３日毎、合計５回の各パパイン投与の１日前に腹腔内注射した。最終のパパイン投与から１日後、図１で述べたように、ＢＡＬ細胞について分析した。（Ｋ）ナイーブマウスから精製したＡＭφを、ＰＧＥ2の存在下または非存在下で２４時間培養し、鼻腔内に移入した。次いでマウスの鼻腔内をパパインでチャレンジし、図１で述べたように、ＢＡＬ細胞について分析した。結果は３回の独立した実験の代表的なものである。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。Ｎ．Ｓ．は有意差なしを表す。エラーバーは±ＳＤを示す。
【図５】抗生物質処理はアレルギー性気道炎症性の細胞浸潤を悪化させることを示した、図１に関連する顕微鏡写真およびグラフ。野生型マウス（Ａ，Ｂ），またはＲａｇ１-/-（Ｃ）を、２週間、無処理のままか（-）、抗生物質（クリンダマイシン＋セフォペラゾン）で処理した（+）。続いて、ハウスダストダニ（ＨＤＭ）抽出物で１週間に５回、４週間にわたって鼻腔内にチャレンジするか（Ａ，Ｂ）、パパインで３日毎に合計５回（Ｃ）鼻腔内にチャレンジした。最終のチャレンジから１日後、マウスについて、ＢＡＬ細胞の形態（ライト染色、オリジナル倍率×１０００）（Ａ）、ＢＡＬ中の全細胞および分化した細胞の数（Ｂ、Ｃ）について解析を行った。平均値±ＳＤを示す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。Ｎ．Ｓ．は有意差なしを表す。
【図６】肺胞内のＭ２マクロファージが抗生物質誘導性のアレルギー性気道炎症に関与することを示す、図２に関連する図およびグラフ。（Ａ）マウスは無処理のままか（-）、抗生物質処理をし（+）、マウスに３日毎、合計５回パパインでチャレンジし、１日後に鼻腔内にクロドロネート−リポソーム（Cl2MBP）またはＰＢＳリポソームを投与し、次いで最後のチャレンジから１日後に図１で述べたようにＢＡＬ細胞の分析を行った。(Ｂ)ＢＡＬ液から単離した上皮細胞を抗ＣＤ１１ｃモノクローナル抗体および抗Ｆ４／８０モノクローナル抗体で染色し、フローサイトメトリーを用いて解析を行った。肺胞内のマクロファージ数（ＣＤ１１ｃ+Ｆ４／８０+）を測定し、ライト染色（オリジナル倍率×１０００）を用いて形態についての解析を行った。（Ｃ）マウスは、無処理のままか（-）、抗生物質（クリンダマイシン＋セフォペラゾン）で処理し（+）、３日毎、合計５回のチャレンジのために、ＰＢＳ（-）またはＳＡＰ（+）を鼻腔内に投与した。最終のＰＢＳ（-）またはＳＡＰの処理から１日後、末梢血単球をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにかけた（ｎ＝５）。結果は３回の独立した実験の代表的なものである。平均値±ＳＤを示す。＊ｐ＜０．０１；＊＊ｐ＜０．００１。Ｎ．Ｓ．は有意差なしを表す。
【図７】腸管内の真菌の異常増殖は抗生物質誘導性のアレルギー性気道炎症に関わっていることを示す、図３に関連する顕微鏡写真およびグラフ。（Ａ）無処理のままか（-）、クリンダマイシン＋セフォペラゾン（ＣＬＭ＋ＣＰＺ）またはメトロニダゾール（ＭＮＺ）で2週間処理したマウスの糞中から細菌のＤＮＡを抽出し、各細菌の１６ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲにかけることで、全ての細菌数及び各種の細菌数の解析を行った。（Ｂ，Ｃ）無処理のままか（-）、抗生物質（クリンダマイシン＋セフォペラゾン）で２週間処理したマウスの、盲腸内、口腔内、および肺における真菌数の解析を、ＩＴＳ１−２ｒＤＮＡに対する定量ＲＴ−ＰＣＲによって行い、平均値を示した（Ｂ）。また各組織を、ＤＡＢまたはＨＥで染色することで組織的解析をも行った。矢印は粘膜固有層中のカンジダを指す。スケールバー：１０μｍ（Ｃ）。（Ｄ）商業的サプライヤー（日本クレア）から入手したマウスを抗生物質（クリンダマイシン＋セフォペラゾン）で処理したあと、無処理のままか（-）、C. parapsilosis（Cp）で処理をした（+）。次いで、マウスに３日毎、合計５回のチャレンジのために、パパイン（150 μg/マウス）を鼻腔内吸入させた。最終のチャレンジから１日後、ＢＡＬ液中の全細胞数を計測した（左図）。商業的サプライヤー（日本クレア）から入手したマウスを抗生物質（クリンダマイシン＋セフォペラゾン）で処理したあと、無処理のままか（-）、ヒトから単離したカンジダ種（Ca：C. albicans；Cg：C. glabrata；Ct：C. tropicalis）を経口で投与した（+）。カンジダのコロニー形成は、糞のCFU/gとして測定した(中央図)。次いで、上記と同様にパパインを鼻腔内吸入させ、ＢＡＬ液中の全細胞数を計測した。（Ｅ）商業的サプライヤー（日本クレア）から入手したマウスを抗生物質（クリンダマイシン＋セフォペラゾン）で、または抗生物質＋５−ＦＣで２週間処理し、鼻腔内にパパインでチャレンジし、上記と同様にＢＡＬ液中の全細胞数を計測した。結果は３回の独立した実験の代表的なものである＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｎ．Ｓ．は有意差なしを表す。
【図８】腸内真菌の過剰増殖に伴うプロスタグランジンＥ2は抗生物質誘導性のアレルギー性気道炎症に関わっていることを示す、図４に関連する顕微鏡写真およびグラフ。（Ａ）無処理（-）または１４日間抗生物質（クリンダマイシン＋セフォペラゾン）処理した（+）マウスから取得した血清40％存在下で、ナイーブマウスから単離した肺胞マクロファージを３日間培養して、リアルタイム−ＰＣＲにかけた（ｎ＝４）。平均値±ＳＤを示す。（Ｂ）商業的サプライヤー（日本クレア）から入手したマウスを抗生物質（クリンダマイシン＋セフォペラゾン）で処理したあと、無処理のままか（-）、ヒトから単離したカンジダ種（Ca：C. albicans；Cg：C. glabrata；Ct：C. tropicalis）を経口で投与した。真菌投与から２週間後、血清ＰＧＥＭレベルを分析した。（Ｃ−Ｅ）Ptges+/+またはPtges-/-マウスを、無処理のままか（-）、抗生物質（クリンダマイシン＋セフォペラゾン）または抗生物質＋アスピリンで２週間経口処理した。糞中の真菌のコロニーを分析し（Ｃ）、さらにPtges-/-マウス由来のＡＭφにおけるＭ２マクロファージマーカー遺伝子の発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで分析した（ｎ＝５）（Ｄ）。次いでPtges-/-マウスの鼻腔内をパパインでチャレンジし、上記と同様にＢＡＬ液中の全細胞数を計測した（Ｅ）。平均値±ＳＤを示す。（Ｆ）ＰＧＥ2またはＰＢＳの存在下で２４時間培養したナイーブマウスから単離したＡＭφを、抗生物質（クリンダマイシン＋セフォペラゾン）のみ、または抗生物質＋５−ＦＣで２週間処理したマウスの鼻腔内に移入した。上記と同様にマウスの鼻腔内をパパインでチャレンジし、ＢＡＬ液中の全細胞数を計測した。結果は３回の独立した実験の代表的なものである。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。Ｎ．Ｓ．は有意差なしを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明に係る医薬品は２つの実施形態に大別される。第１の実施形態は抗真菌剤を有効成分とするものであり、第２の実施形態はプロスタグランジン抑制剤を有効成分とするものである。
【００１２】
本発明に係る第１の医薬品の有効成分として用いられる抗真菌剤は、プロスタグランジン類を産生する真菌の異常増殖を抑制する効果を有するものであれば、特に限定されるものではない。
【００１３】
プロスタグランジン類を産生する真菌の代表例としては、哺乳動物の体内に平常時でも一定数生息している、Candida属の真菌が挙げられる。動物集団や生活環境により存在ないし優占する種は変動する場合があるが、たとえば、マウスであればC. parapsilosisなどが、ヒトであればC. albicans, C. glabrata, C. tropicalisなどが腸内に生息している。したがって、Candida属またはその他の真菌の腸内における異常増殖を抗真菌剤によって抑制することは、本発明の好適な実施形態の一つとして挙げられる。
【００１４】
しかしながら、本発明は上記の実施形態によって限定されるものではなく、プロスタグランジン類を産生する真菌の腸内以外の部位における異常増殖を抗真菌剤によって抑制する実施形態も含む。たとえば、Candida属の真菌によって引き起こされるカンジダ症（口腔カンジダ症、皮膚カンジダ症等）、Aspergillus属の真菌によって引き起こされるアスペルギルス症、Cryptococcus属の真菌によって引き起こされるクリプトコッカス症、Trichophyton属の真菌によって引き起こされる白癬などにおいて、それらの真菌の腸外での異常増殖を抗真菌剤によって抑制する実施形態によっても、同様の作用効果が期待される。
【００１５】
抗真菌剤としては、たとえば内服薬であれば、細胞膜のエルゴステロールに結合して細胞膜を破壊するポリエン系抗真菌剤（アムホテリシン、アムホテリシンＢ等）、真菌内のシトシンデアミナーゼにより変換されて核酸合成を阻害するフルオロピリミジン系抗真菌剤（５−フルオロシトシン等）、細胞膜のエルゴステロールの合成過程を阻害するトリアゾール系抗真菌剤（フルコナゾール、イトラコナゾール、ボリコナゾール等）、同じく細胞膜のエルゴステロールの合成過程を阻害するイミダゾール系抗真菌剤（ミコナゾール等）、細胞壁のβ-D-グルカン合成を阻害するキャンディン系抗真菌剤（ミカファンギン等）などが挙げられる。このような抗真菌剤の分類名称は化合物の骨格構造に基づくものであり、当業界において一般的である。たとえば、フルオロピリミジン系（５−フルオロシトシン等）およびトリアゾール系（ボリコナゾール等）の抗真菌剤は、カンジダ属の真菌に対する有効性が高いため好ましい。
【００１６】
一方、外用薬の抗真菌剤としては、たとえば、イソコナゾール、ビホナゾール、ラノコナゾール、ケトコナゾール、ルリコナゾール、クロトリマゾール、塩酸テルビナフィン、塩酸ブテナフィン、塩酸ネチコナゾール、硝酸ミコナゾール、トルナフタートなどが挙げられる。
【００１７】
なお、これらの抗真菌剤は、従来は本発明とは異なる局面において、たとえばカンジダ症などの真菌症を治療するための有効成分として用いられていた薬剤である。本発明では、このような抗真菌剤を、真菌の異常増殖を抑制することを通じて、アレルギー性気道炎症を治療または予防するための有効成分として用いる。
【００１８】
本発明に係る第２の医薬品の有効成分として用いられるプロスタグランジン抑制剤は、真菌によるプロスタグランジン類、具体的にはプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）の産生を抑制する効果を有するものであれば、特に限定されるものではない。
【００１９】
たとえば、Candida属およびその他の真菌は、アラキドン酸カスケードにより、アラキドン酸からＰＧＥ2を産生することができる。一般的には、生体膜のリン脂質のｓｎ２位にエステル結合しているアラキドン酸がホスホリパーゼＡ2（ＰＬＡ2）により切り出されて遊離したアラキドン酸を出発原料として、（１）シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）によりアラキドン酸をプロスタグランジンＧ2（ＰＧＧ2）に代謝され（シクロオキシゲナーゼ反応）、（２）同じくＣＯＸによりＰＧＧ2からプロスタグランジンＨ2（ＰＧＨ2）に代謝され（ヒドロペルオキシダーゼ反応）、（３）プロスタグランジンＥ合成酵素（ＰＧＥＳ）によりＰＧＨ2からＰＧＥ2に代謝される、という生合成経路をたどる。ここで、ＣＯＸには３つのアイソザイムがあり、それぞれＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２、ＣＯＸ−３と呼ばれる。このうちＣＯＸ−１は、ヒト等の宿主の全身の組織に広く分布し、小胞体に発現している酵素であるが（構成型）、Candida属などの真菌もＣＯＸ−１を有している。一方、ＣＯＸ−２は脳や腎臓など一部の組織を除いて普段は発現が低いが、炎症や癌などの病的症状において誘導される酵素であり（誘導型）、この際、滑膜細胞、マクロファージ、単球などに発現が見られる。ＣＯＸ−３は近年、脳内に多く存在することが見出されたものである。
【００２０】
本発明では、上記のような生合成経路に関与しているいずれかの酵素を阻害することにより、真菌によるＰＧＥ2の産生を抑制することが可能であるが、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、特にＣＯＸ−１阻害剤またはＣＯＸ−２阻害剤がプロスタグランジン抑制剤として好適である。このようなプロスタグランジン抑制剤（ＣＯＸ阻害剤）としては、たとえば、アスピリン（アセチルサリチル酸）、インドメタシン（1-(4-クロロベンゾイル)-5-メトキシ-2-メチル-1-H-インドール-3-酢酸）、イブプロフェン（(RS)-2-(4-イソブチルフェニル)プロピオン）、セレコキシブ、ロフェコキシブ、ブフェキサマック、ピロキシカム、エトドラク、ケトプロフェンなどが挙げられる。
【００２１】
なお、これらのプロスタグランジン抑制剤は、従来は本発明とは異なる局面において、たとえば、真菌ではなく宿主の細胞に作用することを想定した、鎮痛、抗炎症、解熱などのための有効成分として用いられていた薬剤である。本発明では、このようなプロスタグランジン抑制剤を、異常増殖した真菌に作用させ、過剰なプロスタグランジンＥ2の産生を抑制することを通じて、アレルギー性気道炎症を治療または予防するための有効成分として用いる。
【００２２】
本発明に係る医薬品は、前述したような特定の有効成分のいずれか一方を含有していてもよいし、両方を含有していてもよい。さらに、必要に応じて他の成分、たとえば剤型に応じた製薬学的に許容される担体または添加剤や、アレルギー性気道炎症の治療または予防にとって有効な前記特定の有効成分以外の成分などをさらに含有していてもよい。すなわち、本発明に係る医薬品は、それらの成分を含有する医薬組成物として調製することができる。
【００２３】
医薬品の剤型は、本発明では真菌の異常増殖やそれによるプロスタグランジンの過剰産生を抑制することができるようであれば特に限定されるものではない。たとえば、抗真菌剤等を他の用途（たとえばカンジダ症の治療）のために用いる場合と同様、本発明の医薬品は、特に腸内真菌に対して作用させる場合は経口投与される内服薬として調製することが好適である。一方で、腸内以外の真菌に対して作用させる場合は、座剤、外用剤などの外用薬として調製することも可能である。このような剤型の医薬品は一般的な製造方法により製造することができ、たとえば、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、懸濁化剤、等張化剤、乳化剤、甘味料、香料、着色料などから選ばれる担体または添加剤と、前述したような有効成分とを混合して成形することにより製造することができる。
【００２４】
アレルギー性気道炎症の治療または予防にとって有効な、前記特定の有効成分（抗真菌剤およびプロスタグランジン抑制剤）以外の成分としては、たとえば、活性化することによってアレルギー性気道炎症の症状を重くする肺胞マクロファージを減少させるための薬剤通常の（Ｍ０）肺胞マクロファージから誘導されるＭ２マクロファージの活性化を抑制するための薬剤（血清アミロイドＰ等）が挙げられる。このような有効成分を含有する製剤を、前記特定の有効成分（抗真菌剤およびプロスタグランジン抑制剤）を含有する製剤とは別個のものとして調製しつつ、これら複数の製剤を併用する医薬品、いわゆる組み合わせ製剤を構築することも可能である。
【００２５】
本発明に係る医薬品は、アレルギー性気道炎症を治療または予防するために処方・投与されるものである。すなわち、本発明に係る医薬品の処方・投与対象は、真菌の異常増殖が起きているまたは起きるおそれがあるか（第１の医薬品）、異常増殖した真菌からプロスタグランジンＥ2が過剰に産生されているまたは産生されるおそれがあり（第２の医薬品）、かつアレルギー性気道炎症を発症しているまたは発症するおそれがあることを前提とする。真菌の異常増殖の代表例は、抗生物質を投与したときに腸内細菌が減少することによって、あるいは糖または炭水化物の過剰摂取によって、腸内で引き起こされるものであるが、これに限定されるものではなく、たとえば、日和見感染症による真菌症の発症など、他の原因により引き起こされるものであってもよい。また、アレルギー性気道炎症は、アレルゲンによって誘発されて起きる気道（気管支など）の炎症性疾患であり、喘息（アトピー型）などの症状を含む。
【００２６】
したがって、本発明に係る医薬品は、たとえば、アレルギー性気道炎症を発症していて、かつその症状への関与がうかがわれる、真菌の異常増殖またはそれに伴うプロスタグランジンＥ2の過剰産生が認められる患者に対して、アレルギー性気道炎症を治療するために処方・投与することができる。あるいは、他の医学的目的で抗生物質を投与する必要があるため、腸内細菌が減少し、腸内真菌の異常増殖またはそれに伴うプロスタグランジンＥ2の過剰産生が起きるおそれがあり、かつアレルギー性気道炎症を発症しているまたは発症するおそれのある患者に対して、アレルギー性気道炎症を治療または予防するために処方・投与することもできる。なお、「治療」には、症状の緩和または軽減、回復、進行や悪化の抑制などが含まれ、「予防」には、疾患の新規発症の予防および再発の予防が含まれる。
【００２７】
真菌の異常増殖が起きているかどうかは、たとえば腸内真菌については、糞便中の真菌数（ＣＦＵ／ｇ）を一般的な手法を用いて測定してそれが平常時（健常者の測定値）よりも統計学的に有意に高いか否かを判定するなど、公知の手法によって決定することができる。また、プロスタグランジンＥ2が細菌によって過剰に産生されているかどうかは、たとえば、プロスタグランジンＥ2代謝物（ＰＧＥＭ）の血液（血清）中の濃度を一般的な手法を用いて測定し、それが平常時（健常者の測定値）よりも統計学的に有意に高いか否かを判定することによって決定することができる。
【００２８】
医薬品の処方・投与対象となる動物種には、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物が包含される。ヒト以外の哺乳動物としては、たとえば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ネコ、イヌ、ブタ、サルなど、ヒトの疾患のモデル動物として一般的に用いられている哺乳動物や、愛玩用の哺乳動物（ペット）が挙げられる。したがって、医薬品は、ヒトに投与するために製剤化されたものであってもよいし、ヒト以外の哺乳動物に投与するために製剤化されたものであってもよい。
【００２９】
医薬品の投与形態は、目的とする治療または予防の効果が得られるようであれば特に限定されるものではない。すなわち、１回あたりの有効成分の投与量、投与回数および投与期間（頻度）は、用いる有効成分の種類やアレルギー性気道炎症の容態のほか、投与対象の年齢、体重、投与経路、薬物動態などを考慮しながら、適切に調整することができる。特に本発明では、腸内真菌の数ないしそれを反映する糞便中の真菌の数や、ＰＧＥ2ないしその代謝物の血中濃度などの情報を把握しながら投与形態を調節してもよい。ヒトに対する有効成分量等の投与形態は、モデル動物に対する投与実験などを通じて適切に調整することが可能であり、本発明とは異なる医薬用途における有効成分量等の投与形態を参考にすることも可能である。たとえば、抗生物質処理によって腸内真菌が異常増殖したモデル動物としてのマウス（体重約１７〜２１ｇ）に対しては、５−ＦＣ（抗真菌剤）であれば１日あたり６〜８ｍｇ、アスピリン（プロスタグランジン抑制剤）であれば１日あたり１００〜２００ｍｇを、セレコキシブであれば１日あたり１００〜４００ｍｇを、それぞれ腸内真菌が異常増殖している期間中、経口で投与することにより、アレルギー性気道炎症の症状を緩和することができる。
【００３０】
以上のようなアレルギー性気道炎症の治療用または予防用の医薬品に係る発明は、アレルギー性気道炎症を治療または予防するための方法に係る発明や、抗真菌剤またはプロスタグランジン抑制剤のアレルギー性気道炎症を治療または予防する医薬品の有効成分としての利用方法に転換することができる。
【００３１】
すなわち、本発明に係る第１の方法は、真菌の異常増殖を抑制するステップを含む、アレルギー性気道炎症を治療または予防するための方法として規定することができる。具体的には、本発明に係る第１の医薬品、特にその有効成分である抗真菌剤を、アレルギー性気道炎症を治療または予防するべき対象に投与する行為が行われる。
【００３２】
本発明に係る第２の方法は、異常増殖した真菌によるプロスタグランジンの産生を抑制するステップを含む、アレルギー性気道炎症を治療または予防するための方法として規定することができる。具体的には、本発明に係る第２の医薬品、特にその有効成分であるプロスタグランジン抑制剤を、アレルギー性気道炎症を治療または予防するべき対象に投与する行為が行われる。
【００３３】
また、本発明に係る第１の利用方法は、抗真菌剤を、アレルギー性気道炎症を治療または予防する医薬品の有効成分としての利用する方法として規定することができる。具体的には、本発明に係る第１の医薬品の製造工程において、有効成分として抗真菌剤を添加する操作を行う操作が行われる。
【００３４】
本発明に係る第２の利用方法は、プロスタグランジン抑制剤を、アレルギー性気道炎症を治療または予防する医薬品の有効成分としての利用する方法として規定することができる。具体的には、本発明に係る第２の医薬品の製造工程において、有効成分としてプロスタグランジン抑制剤を添加する操作を行う操作が行われる。
【００３５】
このような本発明に係る方法または利用方法の構成要件、たとえば抗真菌剤、プロスタグランジン抑制剤、医薬品、投与方法、製造方法等の詳細については、本発明に係る医薬品に関して前述した通りである。
【実施例】
【００３６】
＜材料および方法＞
・マウス
大部分の実験では、筑波大学動物実験センター（日本）で飼育されていた集団の、メスのC57BL/6マウスを用い、いくつかの実験では、日本クレア（東京，日本）から購入したメスのC57BL/6マウスを用いた。Rag-1-/-マウスはジャクソン研究所〔The Jackson Laboratories〕（Bar Harbor, Maine）から購入し、筑波大学動物実験センターで飼育した。Ptges+/+及びPtges-/-マウスは、バンダービルト大学 [Vanderbilt University]のLeslie Croffordから提供された Ptges+/- (C57BL/6 background) マウス由来であり、ミシガン大学 [The University of Michigan]において繁殖したものである (Mason et al. (2013). Intrauterine group A streptococcal infections are exacerbated by prostaglandin E2. J. Immunol. 191, 2457-2465.2013)。全ての実験は、筑波大学動物実験センターおよびミシガン大学の倫理委員会のガイドラインに従って行った。【００３７】
・抗生物質、５−フルオロシトシン、アスピリン、セレコキシブおよびＳＡＰ
抗生物質としてのクリンダマイシン（0.5 mg/mL，東京化成工業株式会社，東京，日本）、セフォペラゾン（0.4 mg/mL，トロントリサーチケミカルズ〔Toronto Research Chemicals〕，トロント，カナダ）、アンピシリン（1 mg/mL，シグマ−アルドリッチ，東京，日本）、メトロニダゾール（1 mg/mL，シグマ−アルドリッチ）、ストレプトマイシン（5 mg/mL，和光純薬工業株式会社，大阪，日本）、抗真菌剤としての５−フルオロシトシン（2 mg/mL，東京化成工業株式会社）、またはプロスタグランジン抑制剤としてのアスピリン（50 μg/mL，東京化成工業株式会社）もしくはセレコキシブ（1 μg/mL，東京化成工業株式会社）は、これらを補ったオートクレーブ済みの飲料水を与えることでマウスに摂取させた。抗生物質処理はアレルゲンを吸入させる２〜４週間前から開始し、実験期間中継続した。また、マウスを、ＳＡＰ（マウス１匹当たり100 μg，ＰＢＳに溶解，カルバイオケム〔Calbiochem〕，ラホヤ，カリフォルニア州，米国）の液滴による経鼻投与で、３日毎、合計５回処理した。【００３８】
・パパイン誘発性気道炎症
３日毎に、マウスに、パパイン（マウス１匹あたり150 μg，リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解，和光純薬工業株式会社，>0.5 units/g）の液滴を鼻腔内に置いて鼻腔内吸入させ、全部で５回チャレンジした。ＢＡＬは３回、１ｍＬのＰＢＳを気管カニューレで滴下注入して行った。白血球百分率は、ライト染色液（武藤化学株式会社，東京，日本）で染色してサイトスピンで計測した。【００３９】
・ハウスダストダニ誘発性気道炎症
マウスを、ハウスダストダニ（ＨＤＭ）抽出物（マウス１匹当たり10 μg，ＰＢＳに溶解，ＬＳＬ，東京，日本）を含む生理食塩水、または生理食塩水単独で、１週間当たり５回、連続する４週間にわたって処理した。【００４０】
・糞中／肺中の真菌数
個々のマウスから糞粒及び肺を回収し、冷却したＰＢＳでホモジナイズし、50 μg/mlのゲンタマイシンおよび50 μg/mlのクロラムフェニコールを含有するサブロー〔Sabouraud〕デキストロース寒天培地にプレーティングした。37℃で一晩インキュベーションした後、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を計測した。検出限界は102 CFU/g糞である。【００４１】
・Candida 接種
それぞれのCandida種はヒトまたはマウスのサンプルをサブローデキストロースＧＣ寒天培地にプレーティングし、得られたシングルコロニーから単離したものである。マウスの糞から単離したCandida parapsilosisまたは患者から単離したC. albicans，C. glabrataおよびC. tropicalisを、振盪したサブローデキストロースブロス中、37℃で定常期まで（48時間）培養した。マウスへの感染のために、培地を洗い、滅菌したＰＢＳで5 × 107 CFU/mLに稀釈した。抗生物質処理の１日目に、マウス用給餌針を用いて経口経管栄養法によりCandida（200 μL中107 CFU）を接種した。【００４２】
・サイトカイン、ケモカインおよびプロスタグランジンＥ2レベル
マウスのサイトカインおよびケモカインは、ELISA（enzyme-linked immunosorben assay）キット（R&D Systems，ミネアポリス，ミネソタ州，米国）を用いて測定した。13,14-ジヒドロ-15-ケトプロスタグランジンＥ2（プロスタグランジンＥ2代謝物：ＰＧＥＭ）の血清レベルは、プロスタグランジンＥ代謝物ＥＩＡキット（Cayman Chemicals，アナーバー，ミシガン州，米国）を用いて、製造者の指示に従って測定した。【００４３】
・肺胞マクロファージのin vivoでの減少
肺胞マクロファージを減少させるためのクロドロネートリポソーム（リポソームカプセル化ジクロロメチレン二リン酸：Cl2MBP）またはコントロールのＰＢＳリポソーム（Encapsula NanoSciences，ナッシュビル，テネシー州，米国）は、次の文献に記載されているようにして調製した：N. Van Rooijen. The liposome-mediated macrophage 'suicide' technique. J Immunol Methods 124, 1-6 (1989)。マウスは、３日毎、合計５回のパパイン処理それぞれの１日前に、30 μLのリポソームで鼻腔内を処理した。【００４４】
・ｃＤＮＡ合成およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡをTotal RNA Kit I（OMEGA Bio-Tek. Inc.，ノークロス，ジョージア州，米国）を用いて抽出し、ｃＤＮＡをHigh Capacity RNA-to-cDNA Kit（アプライドバイオシステム，東京，日本）を用いて合成した。リアルタイムＰＣＲは、SYBR Green master mix（アプライドバイオシステム）を用いて行った。各標的遺伝子の発現はβ−アクチンに対して標準化した。【００４５】
・ＰＧＥ2処理
ジメチルプロスタグランジンＥ2（ｄｍ−ＰＧＥ2，Calbiochem，マウス１匹あたり50 μg/mL）を１日１回、５日間にわたって腹腔内に投与した。最終のｄｍ−ＰＧＥ2処理から１日後、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲのために肺胞マクロファージを精製した。Ｄｍ−ＰＧＥ2（マウス１匹当たり50 μg/mL，ＰＢＳに溶解）も、３日毎、合計５回のチャレンジのパパイン処理それぞれの１日前に、腹腔内に投与した。養子移入のため、ナイーブマウスから精製した肺胞マクロファージをＰＧＥ2（50 ng/mL，東京化成工業株式会社）で２４時間処理した。【００４６】
・マクロファージの養子移入
肺胞マクロファージをナイーブマウスまたは抗生物質（クリンダマイシン＋セフォペラゾン）処理マウスから、ＰＢＳを用いたＢＡＬ後に入手した。骨髄由来培養マクロファージ（ＢＭＭ）は次の文献に記載されているようにして産生した。：A. Celada, P. W. Gray, E. Rinderknecht, R. D. Schreiber. Evidence for a gamma-interferon receptor that regulates macrophage tumoricidal activity. J Exp Med 160, 55-74 (1984)。産生されたＢＭＭはさらに、37℃で24時間、IFN-γ (20 ng/mL)か、IL-4 (10 ng/mL)，IL-13 (10 ng/mL)およびIL-10 (20 ng/mL)のどちらかの存在下で（いずれももR&D Systems）、それぞれＭ１マクロファージまたはＭ２マクロファージに分化させるために培養した。マクロファージ（2 × 105個）をナイーブマウスの鼻腔内に、最初のパパイン吸入の８時間前に移入した。【００４７】
・真菌のrDNA遺伝子解析
盲腸、口腔内（舌、頬嚢）およびに肺のサンプルを、1mMのEDTA、0.2％のβ-メルカプトエタノール（Sigma）および1000U/mlのリティカーゼ（Sigma）を含有した50ｍMのTrisバッファー（PH 7.5）内において３７℃３０分培養し、QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen)を用いて、製造者が指定した通りの方法で、組織および真菌のゲノムDNAを単離した。組織内の真菌の検出のために、組織から単離したDNAを鋳型として真菌特異的なプライマーを用いて、以下の文献に記載された方法で定量PCRを行った：Iliev, I.D et al., Interactions between commensal fungi and the C-type lectin receptor Dectin-1 influence colitis. Science 336, 1314-1317 (2012)。当該文献に記載された方法で、PCR 増幅産物の相対量をΔCt 法を用いて算出し、β−アクチンに対して標準化した。【００４８】
・細菌の１６S rDNA 遺伝子解析
糞中における細菌のDNAはMagtration（登録商標） System 12GC（株式会社テクノスルガ・ラボ，静岡，日本）を用いて抽出した。Clostridium clusters IV and XIVab, Lactobacillus genus, Enterococcus genus, Bacteroides, and Enterobacteriaceae、および全細菌のコピー数をそれぞれ解析するために、それぞれの１６S rDNA に特異的なプライマー（株式会社テクノスルガ・ラボ）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。【００４９】
・In vitro における血清処理
１４日間抗生物質（クリンダマイシン＋セフォペラゾン）処理したマウスから取得した血清40％存在下で、ナイーブマウスから単離した肺胞マクロファージを3日間培養した。【００５０】
・統計処理
群間の統計学的な有意差はMann-Whitney検定で決定した。in vivoおよびin vitroのmRNA発現は、不等分散の下での両側t-test（Aspin-Welch's t-test）で分析した。P値が<0.05の場合に有意差があるとみなした。【００５１】
［実験例１］
腸内毒素症が宿主の腸外の免疫性に与える影響を直接的に検証するために、アレルゲンとしてのパパインを、コントロールマウスと、抗生物質であるクリンダマイシンおよびセフォペラゾンで処理したマウス（抗生物質処理マウス）とに鼻腔内吸引させることにより、アレルギー性気道炎症を誘発させた。抗生物質で前処理し、パパインでチャレンジしたマウスは、コントロールマウスよりも、気道における全細胞、好酸球およびマクロファージの数が有意に多かったうえ（図１Ａおよび１Ｂ）、胚細胞の過形成および気管支周辺の炎症性細胞の浸潤も多かった（図１Ｃ）。次に、ＩＬ−１３、ＩＬ−５，ＣＣＬ１１およびＣＣＬ２４は、２型免疫応答および好酸球動員、ならびに喘息の原因に関係している重要な分子であるが（J. Penders et al. Gut microbiota composition and development of atopic manifestations in infancy: the KOALA Birth Cohort Study. Gut 56, 661-667 (2007); J. E. Pease Asthma, allergy and chemokines. Curr Drug Targets 7, 3-12 (2006)）、それらのサイトカイン産生について調べた。パパインでのチャレンジがないときは、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中のＩＬ−１３、ＩＬ−５，ＣＣＬ１１およびＣＣＬ２４のレベルは、コントロールマウスと抗生物質処理マウスとでは同等であったが、パパイン吸入後においてはコントロールマウスに比べて抗生物質処理マウスのほうが、いずれも高いレベルで検出された（図１Ｄ）。また、ハウスダストであるダニ抽出物の鼻腔内吸入後においても、ＢＡＬ液中の全細胞および好酸球の数は、抗生物質処理マウスの方がコントロールマウスよりも有意に多かった（図５Ａおよび５Ｂ）。これらの結果はともに、抗生物質処理がアレルゲン誘発性の気道炎症を悪化させることを示唆している。【００５２】
［実験例２］
獲得免疫応答はアレルギー性気道炎症の進行にとって重要であるため、抗生物質によるパパイン誘発性気道炎症の悪化が獲得免疫系を必要とするかを調査した。この問題に対処するため、分化能の破壊により成熟したＢリンパ球およびＴリンパ球を欠損したRag-1-/-マウスを、抗生物質で処理し、パパインでチャレンジした。パパイン誘発性気道炎症は、抗生物質で処理したRag-1-/-マウスでもコントロールマウスより有意に悪化した。これは、宿主に獲得免疫系がなくても、腸内の真菌の異常増殖が宿主の免疫応答に影響を与えることを示唆している（図５Ｃ）。肺胞マクロファージ（ＡＭφ）は、感染性物質および他の免疫性傷害に対する、肺における最初の防衛の重要な役割を担っている。クロドロネートリポソーム（リポソームカプセル化ジクロロメチレン二リン酸：Cl2MBP）を用いてＡＭφを減少させたときには、パパイン吸入後のＢＡＬ液中の全細胞、好酸球およびマクロファージの数は、コントロールマウスおよび抗生物質処理マウスのいずれにおいても減少した（図６Ａ）。さらに抗生物質処理マウス由来のＡＭφを受け取ったマウスは、コントロールマウス由来のＡＭφを受け取ったマウスよりも、パパイン吸入下におけるＢＡＬ液中の細胞数が有意に多く、パパイン吸入による気道炎症が引き起こされていた（図２Ａ）。これらの結果は、抗生物質による処理が肺での炎症を刺激するいくつかの経路においてマクロファージの機能を改変することを示している。【００５３】
多様性および柔軟性は、単球−マクロファージ系列の細胞の特徴である。様々な環境要因（たとえば、微生物産生物、損傷を受けた細胞、サイトカイン）に応答して、マクロファージは、Ｍ１マクロファージになる古典的活性化、またはＭ２マクロファージになる選択的活性化を経て、独特の機能的な表現型を獲得する。コントロールマウスから精製したＡＭφに比べて、抗生物質処理マウスから精製したＡＭφは、選択的活性化によるＭ２マクロファージのマーカーであるarg1, chi3l3およびretnlaの発現が有意に高かった（図２Ｂ，図６Ｂ）。Ｍ２マクロファージの活性化を弱める血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）の経鼻投与により、肺におけるＭ２マクロファージの活性化は抑制されるが、末梢血においてはこの活性化は抑制されない（図２Ｃ，図６Ｃ）。また、抗生物質およびＰＢＳで処理したマウス（コントロールマウス）と比べて抗生物質およびＳＡＰで処理したマウスはＢＡＬ液中の全細胞数が有意に減少していることから、ＳＡＰ処理がパパイン誘発性の気道炎症を軽くすることがわかる。（図２Ｄ）。骨髄由来マクロファージ（Ｍ０マクロファージ）から産生されたＭ２マクロファージを養子移入することにより、Ｍ０マクロファージを養子移入した場合と比べて、パパイン誘発性気道炎症は有意に強まったが、Ｍ１マクロファージを養子移入した場合はそうではなかった（図２Ｅ）。これらの結果は肺胞におけるＭ２マクロファージがパパイン誘発性のアレルギー性気道炎症に関わっていることを示唆している。【００５４】
［実験例３］
次に、抗生物質による処置が腸内の真菌のコロニー形成に与える影響を調べた。抗生物質（クリンダマイシン＋セフォペラゾン）を用いた治療法は、真菌のコロニー形成を著しく増加させた（およそ１０8）。抗生物質による処置を受けなかったマウスの糞からは真菌は検出されなかった（図３Ａ）。クリンダマイシン＋セフォペラゾンで処理することにより、腸内における真菌の異常増殖は有意に促進され、セフォペラゾン、アンピシリンまたはストレプトマイシンの投与でも同様に腸内の真菌の異常増殖は有意に促進された。しかしクリンダマイシンまたはメトロニダゾール処理では真菌の異常増殖は見られなかった（図３Ａ）。また、抗生物質（クリンダマイシン＋セフォペラゾン）処理ではClostridium clusters IV and XIVab, Lactobacillus genus and Bacteroides genusなどのいくつかの種の細菌数が減少したが、真菌を増殖させない抗生物質であるメトロニダゾール処理では細菌数の減少はおきなかった（図７Ａ）。これは腸内での真菌の異常増殖の抑制がこの微生物相の変化に関与していることを示唆している。しかし、糞内または盲腸内とは異なり、口腔内及び肺では抗生物質処理による真菌の異常増殖は確認されなかった（図３Ａ，図７Ｂ）。興味深いことに、腸内の真菌の異常増殖のレベルは、パパイン誘発性の、ＢＡＬ液中への炎症性細胞の流入の促進と相関していた（図３Ｂおよび３Ｃ）。抗生物質処理マウスの糞から単離された真菌は、16S rDNA配列よりCandida parapsilosis（C. parapsilosis）と同定された（データ示さず）。抗生物質投与後のマウスの腸内の真菌の分布を調べるために、Candida属の真菌に対して陽性となる過ヨウ素酸シッフ試薬（ＰＡＳ）または３，３'−アミノベンジジン（ＤＡＢ）で腸管組織切片を染色した。Candida属の真菌の浸潤は、盲腸組織の粘膜固有層においては普遍的であったが、小腸組織または結腸組織においては稀であった（図３Ｄ，３Ｅおよび図７Ｃ）。また抗生物質処理を行ったマウスの消化管組織において炎症の兆候は確認できなかった(図７Ｃ)。【００５５】
ところで、サプライヤー（日本クレア，東京）から市販されている同種のマウスについては、抗生物質処置後も腸内での真菌の異常増殖が観察されなかった。これは、抗生物質処置による真菌の異常増殖がマウスの集団に依存するものであることを示唆している。それでも、前記市販マウスの腸に外来性のCandida parapsilosisを播種すると、パパインによる炎症性気道炎症が強められた（図７Ｄおよび未表示データ）。さらに、抗生物質で処理した前記市販マウスを、ヒトから単離したカンジダ（C. albicans, C. glabrata, またはC. tropicalis）で経口経管栄養法によって処理すると、腸内で真菌が異常増殖し（図７Ｄ）、パパインによって誘発される気道炎症を有意に悪化させた（図７Ｄ）。抗真菌剤５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）を投与することにより、抗生物質処理マウスの糞に含まれる真菌の数は有意に減少した（図３Ｆ）。さらに、５−ＦＣの処理により、抗生物質処理マウス由来のＡＭφにおけるＭ２マクロファージマーカーの発現の上昇は抑制された（図３Ｇ）。また、５−ＦＣを投与することにより、C. parapsilosis陽性の抗生物質で処理したマウス群では、パパインでチャレンジした後のＢＡＬ液中の全細胞、好酸球およびマクロファージの数は有意に減少したが、C. parapsilosis陰性の抗生物質で処理した市販マウス群では、ＢＡＬ液中の細胞数に変化は見られなかった（図３Ｈ、７Ｅ）。これらの結果は、抗生物質によって引き起こされる真菌の異常増殖が、マクロファージをＭ２型に分極化させることによって、パパイン誘発性の気道炎症を悪化させることを示している。【００５６】
［実験例４］
腸内真菌の異常増殖が末梢血単球の機能に影響するかどうかを調べた。抗生物質処理マウスでは、末梢血単球においてもＡＭφと同様にＭ２マーカーであるarg1, chi3l3およびretnlaの発現が上昇していた（図４Ａ）。さらに、抗生物質処理した後のマウスから取得した血清下でナイーブマウスのＡＭφを3日間培養することによりＭ２マーカーが上昇した(図８Ａ)。これらの結果は真菌成分が肺のマクロファージをＭ２型へ改変するように全身的に働くことを示唆している。しかしながら、カンジダの２つの主要な細胞壁成分であるβ-D-グルカンおよびマンナンは、抗生物質処理マウスの血清中からは検出されなかった（データ示さず）。【００５７】
プロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）をはじめとするプロスタグランジン類はアレルギー性の炎症を誘発する。腸内の真菌類の異常増殖がＰＧＥ2を介した免疫反応に影響を与える可能性についての検証を行った。C. parapsilosisが、外部のアラキドン酸をプロスタグランジン類に変換することが見出された（図４Ｂ）。さらに、血清のＰＧＥ2代謝物（ＰＧＥＭ）のレベルは、抗生物質処理マウスの方がコントロールマウスよりも有意に高かったが、５−ＦＣ処理により抗生物質処理マウスのＰＧＥＭレベルは低下した（図４Ｃ）。また、ＢＡＬ液中のＰＧＥＭのレベルも、抗生物質処理マウスの方がコントロールマウスよりも高かった。パパインの吸入により抗生物質処理マウスのＢＡＬ液中ＰＧＥＭレベルはさらに上昇するが、５−ＦＣで処理することでこのパパインによるＰＧＥＭレベルの上昇はなくなった（図４Ｄ）。また抗生物質処理を行った前記市販マウスにヒトから単離したカンジダ種を接種することによっても血清中のＰＧＥＭレベルは上昇する(図８Ｂ)。これらの結果は、腸内真菌の異常増殖が全身的に、また局所的にＰＧＥ2のレベルを増加させることを示している。【００５８】
ミクロソームプロスタグランジンE合成酵素-１（mPGES-1）は炎症を起こした細胞におけるＰＧＥ2の増加に関与している。Ptges-/-マウスはそのmPGES-1を欠損している。抗生物質で処理したPtges+/+マウス（野生型）およびPtges-/-マウスのどちらにも真菌の異常増殖は観察されなかったので、それらのマウスに外来のC. parapsilosisを経口で摂取させた。その結果、Ptges-/-マウスにおいても野生型マウスとおなじように腸内の真菌は増殖した（図８Ｃ）。重要なことに、野生型マウスに比べて上昇率は小さいものの、Ptges-/-マウスにおいても抗生物質処理による血清内ＰＧＥＭレベルは有意に上昇した(図４Ｅ)。これらの結果は、宿主であるマウスの細胞ではなく、腸内の真菌によって抗生物質によるＰＧＥＭレベルの上昇がひきおこされるのではないかということを示唆している。また、抗生物質で処理したどちらのマウスにおいても、シクロオキシゲナーゼ（アラキドン酸をＰＧＧ2に変換する）阻害剤であるアスピリン処理によりＰＧＥ2の合成を阻害することで、血清中のＰＧＥＭレベルは低下し、ＡＭφでのＭ２マクロファージマーカーの発現は抑制されるが（図４Ｆ，図８Ｄ）、抗生物質による真菌の異常増殖には影響を及ぼさない(図４Ｅ，図８Ｃ)。さらに、いずれのマウスにおいても、アスピリンまたはシクロオキシゲナーゼ-２抑制剤であるセレコキシブでの処理によりによりパパイン誘発性の気道炎症が弱まった（図４Ｇ、図４Ｈおよび図８Ｅ）。これらの結果は、ＰＧＥ2の合成を抑制することで抗生物質誘発性のアレルギー性炎症を抑制することができることを示唆している。【００５９】
ＰＧＥ2の腹腔内注射はＡＭφのＭ２マクロファージマーカーの発現を有意に高め（図４Ｉ）、パパイン誘発性の気道炎症を強めた（図４Ｊ）。最後に、in vitroにおいてＰＧＥ2により刺激されたＡＭφをナイーブマウスの鼻腔内に養子移入することは、無処理のＡＭφの養子移入に比べて、パパイン誘発性の気道炎症を有意に強めた（図４Ｋ）。また、無処理のＡＭφの養子移入を行った抗生物質処理マウスにおけるパパイン誘発性の気道炎症は５−ＦＣによって抑制されるが、ＰＧＥ2により刺激されたＡＭφの養子移入を行った抗生物質処理マウスにおいては抑制されない（図８Ｆ）。これらの結果は、腸内真菌の異常増殖によって産生されたＰＧＥ2は、ＡＭφの表現型をＭ２に改変することにより、好酸球介在性の気道炎症を悪化させることを示唆している。【００６０】
以上の知見により、抗生物質処理による腸内毒素症が腸内真菌の数を増やし、これが腸外のＭ２マクロファージの炎症性応答を強めることが明らかになった。真菌の異常増殖の制御は、アレルギー性炎症性疾患の治療または予防にとって重要だと考えられる。
【図１】
2015005248.tif 000002
【図２】
2015005248.tif 000003
【図３】
2015005248.tif 000004
【図４】
2015005248.tif 000005
【図５】
2015005248.tif 000006
【図６】
2015005248.tif 000007
【図７】
2015005248.tif 000008
【図８】
2015005248.tif 000009
【国際調査報告】
2015005248.tif 000010
2015005248.tif 000011
2015005248.tif 000012
2015005248.tif 000013
2015005248.tif 000014