(57)【要約】  本発明は、式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列を含む環状ペプチドに関するものである。本発明はまた、該環状ペプチドを含む、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防用医薬組成物等に関するものである。本発明によれば、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防において、より有用な医薬組成物の提供が可能になる。本発明により提供される医薬組成物は、特に関節炎やリウマチの治療に有効である。
2014148489.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2014148489.tif 000013
［ここで、Ｘ４およびＸ５は任意のアミノ酸である］
で表されるアミノ酸配列を含む環状ペプチド。
【請求項２】
Ｘ４およびＸ５の一方または両方が親水性アミノ酸である、請求項１に記載の環状ペプチド。
【請求項３】
Ｘ４およびＸ５の両方が親水性アミノ酸である、請求項１に記載の環状ペプチド。
【請求項４】
Ｘ４およびＸ５が独立してＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＳｅｒおよびＴｈｒからなる群より選択されるアミノ酸である、請求項３に記載の環状ペプチド。
【請求項５】
配列番号８〜１４のいずれかのアミノ酸配列を有する請求項１に記載の環状ペプチド。
【請求項６】
配列番号１１のアミノ酸配列を有する請求項１に記載の環状ペプチド。
【請求項７】
式（Ｉ）のアミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸（Ｇｌｙを除く）が対応するＤ−アミノ酸で置換されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
【請求項８】
式（Ｉ）のアミノ酸配列中の全てのアミノ酸（Ｇｌｙを除く）が対応するＤ−アミノ酸で置換されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
【請求項９】
Ｄ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅであるアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の環状ペプチド。
【請求項１０】
式（Ｉ）のアミノ酸配列を構成する１つまたは複数のアミノ酸残基に側鎖が結合したものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の環状ペプチドを有効成分として含む、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防用医薬組成物。
【請求項１２】
疾患が関節リウマチである、請求項１１に記載の医薬組成物；
【請求項１３】
疾患が全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糸球体腎炎、血管炎、関節炎などの免疫複合体病である、請求項１１に記載の医薬組成物；
【請求項１４】
投与方法が経口投与である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な環状ペプチドに関するものである。また本発明は、該環状ペプチドを含む、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防用医薬組成物などに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ１ｑは補体タンパク質の１つであり、補体活性化経路において作用することが知られている。例えば、古典経路の活性化は、Ｃ１ｑがイミュノグロブリン分子のＦｃ部分に結合することにより引き起こされるとされている。【０００３】
Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患には多くの種類があり、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糸球体腎炎、血管炎、関節炎などの免疫複合体病やリウマチが典型例として挙げられる。関節リウマチ（ＲＡ）患者の血中にはＣ１ｑが多く存在し、将来関節破壊に陥ることが報告されている（非特許文献１）。このような病態には上述のＣ１ｑによる活性化が関与していると考えられており、Ｃ１ｑとイミュノグロブリン分子との結合の阻害剤の開発が望まれている。【０００４】
現在、関節リウマチの治療薬としてメトトレキセート（ＭＴＸ）やレフルノミドが多く用いられている。しかし、これらの薬剤には骨髄抑制や間質性肺炎といった重篤なものを含む、多数の副作用がある。そのため、これらの薬剤は最適な投与量の設定が困難であり、また大量に投与することができない。【０００５】
Ｃ１ｑ由来のアミノ酸配列を有するペプチドＰｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ（配列番号１）が、関節リウマチなどのＣ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患において治療および予防効果を示すことが示されている（特許文献１、２）。また、上記ペプチド中の４番目および５番目のアミノ酸を親水性のアミノ酸により置換することによって、ペプチドの水溶性が改善され、しかも生物学的活性が有意に低下しないことが示されている（特許文献３）。またさらに、これらのペプチドを構成するアミノ酸を対応するＤ−アミノ酸に置換することによって、高い安定性および長い半減期を有するペプチドが開示されている（特許文献３）。【０００６】
また、上記配列番号１に示されるペプチドの１、２および６番目のアミノ酸を置換すると、生物学的活性が低下することも示されている。このことは、かかるペプチドの生物学的活性には、末端アミノ酸、すなわちＰｒｏ、ＧｌｙおよびＰｈｅが重要な役割を果たすことを示唆している（特許文献３）。【０００７】
一般的に、ペプチドは環状化されることにより、構造的に束縛され、その柔軟性が低下する。それにより、ペプチドの構造がコンパクトに固定され、ペプチドの安定性、選択性、作用強度、生物学的利用能、酵素分解耐性および膜透過性などが増加すると考えられている。例えば、バソプレシンやオピオイドのアナログに関して、環状ペプチドの経口投与が研究されている（非特許文献２）。【０００８】
環状ペプチドは、（１）ペプチド結合によって環状化したホモデチック（ｈｏｍｏｄｅｔｉｃ）環状ペプチドと、（２）ジスルフィド結合、エステル結合、エーテル結合またはチオエーテル結合によって環状化したヘテロデチック（ｈｅｔｅｒｏｄｅｔｉｃ）環状ペプチドの２つに分類される。ヘテロデチック環状ペプチドでは、２残基のシステイン間で形成されるジスルフィド結合を用いるのが一般的である。しかしながら、ペプチド配列中にシステイン残基が含まれない場合は、システインを新たに導入する必要がある。一方で、ホモデチック環状ペプチドは、ペプチド配列中に架橋構造の形成に必要な特定のアミノ酸が含まれていなくとも、ペプチド主鎖の頭部と尾部を結合させることで作製することができる。【０００９】
しかしながら、上述の通り、配列番号１のペプチドは６アミノ酸と短いペプチドであること、および末端アミノ酸が重要な役割を果たすことが示唆されることから、ヘテロデチック環状化は困難であり、ホモデチック環状化は生理学的活性の低下をもたらすことが予想される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００９／０２５３００号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１０／０８４８５１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２０１２／０４３３９７号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｏｃｈｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  １９８８  Ｊａｎ；  ３１（１）：  ３７−４３
【非特許文献２】Ａｄｅｓｓｉ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  −  Ｏｎｌｉｎｅ，  ２００４，  Ｖｏｌ．  １，  ５１３−５２８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の解決課題は、環状ペプチド、および該環状ペプチドを含む、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患を治療または予防するための、有効で安全な医薬組成物などを提供することである。さらには、従来の投与方法に加えて経口投与も可能な該医薬組成物などを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｘ４−Ｘ５−Ｐｈｅ（ここで、Ｘ４およびＸ５は任意のアミノ酸である）のアミノ酸配列を有するペプチドを環状化することによって、本発明を完成させた。【００１４】
すなわち、本発明は、以下のものを提供するものである：
（１）式（Ｉ）：
【化１】
2014148489.tif 000003
［ここで、Ｘ４およびＸ５は任意のアミノ酸である］
で表されるアミノ酸配列を含む環状ペプチド；
（２）Ｘ４およびＸ５の一方または両方が親水性アミノ酸である、（１）の環状ペプチド；
（３）Ｘ４およびＸ５の両方が親水性アミノ酸である、（１）の環状ペプチド；
（４）Ｘ４およびＸ５が独立してＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＳｅｒおよびＴｈｒからなる群より選択されるアミノ酸である、（３）の環状ペプチド；
（５）配列番号８〜１４のいずれかのアミノ酸配列を有する（１）の環状ペプチド；
（６）配列番号１１のアミノ酸配列を有する（１）の環状ペプチド；
（７）式（Ｉ）のアミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸（Ｇｌｙを除く）が対応するＤ−アミノ酸で置換されている、（１）〜（６）のいずれかの環状ペプチド；
（８）式（Ｉ）のアミノ酸配列中の全てのアミノ酸（Ｇｌｙを除く）が対応するＤ−アミノ酸で置換されている、（１）〜（６）のいずれかの環状ペプチド；
（９）Ｄ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅであるアミノ酸配列を有する、（８）の環状ペプチド；
（１０）式（Ｉ）のアミノ酸配列を構成する１つまたは複数のアミノ酸残基に側鎖が結合したものである、（１）〜（８）のいずれかの環状ペプチド；
（１１）（１）〜（１０）のいずれかの環状ペプチドを有効成分として含む、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防用医薬組成物；
（１２）疾患が関節リウマチである、（１１）の医薬組成物；
（１３）疾患が全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糸球体腎炎、血管炎、関節炎などの免疫複合体病である、（１１）の医薬組成物；
（１４）投与方法が経口投与である、（１１）の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、新規な環状ペプチドの提供が可能になる。また、該環状ペプチドを含む、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防においてより有用な医薬組成物などの提供が可能になる。また、酵素分解耐性および生物学的利用能が改善された本発明の環状ペプチドを上記医薬組成物に用いることで、従来の投与方法に加えて経口投与にも適した医薬組成物を提供することができる。【００１６】
これまで、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドの生物学的活性には、１、２および６番目のＰｒｏ、ＧｌｙおよびＰｈｅである「末端アミノ酸」が必須であり、末端アミノ酸同士を結合する環状化は、むしろその生物学的活性を低下させることが予想された。そのため、かかるペプチドの環状化によっても、生物学的活性が維持されるかまたはさらに向上し、また酵素分解耐性を獲得することで経口投与が可能となったことは、予想もできない驚くべき結果であった。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、１４Ｃで標識された鎖状ペプチドの単回投与後の血漿中放射能濃度の推移を示すグラフである。黒丸は腹腔内投与、白三角は経口投与（１ｍｇ／ｋｇ）、黒四角は経口投与（１０ｍｇ／ｋｇ）、菱形は経口投与（１００ｍｇ／ｋｇ）、白丸は静脈内投与（１０ｍｇ／ｋｇ）を示す。
【図２】図２は、モノクローナル抗体カクテル惹起関節炎モデルにおける、右後肢浮腫容積の推移を示すグラフである。黒三角は陰性対照群、白三角は関節炎（陽性）対照群、黒四角（破線）はペプチドＬ（腹腔内投与）群、黒丸（破線）はペプチドＣ（腹腔内投与）群、白丸（実線）はペプチドＣ低用量（経口投与）群、黒丸（実線）はペプチドＣ高用量（経口投与）群、×（破線）はメトトレキセート（腹腔内投与）群を示す。
【図３】図３は、モノクローナル抗体カクテル惹起関節炎モデルにおける、右後肢容積増加率を示すグラフである。黒三角は陰性対照群、白三角は関節炎（陽性）対照群、黒四角（破線）はペプチドＬ（腹腔内投与）群、黒丸（破線）はペプチドＣ（腹腔内投与）群、白丸（実線）はペプチドＣ低用量（経口投与）群、黒丸（実線）はペプチドＣ高用量（経口投与）群、×（破線）はメトトレキセート（腹腔内投与）群を示す。
【図４】図４は、モノクローナル抗体カクテル惹起関節炎モデルにおける、右後肢スコア合計を示すグラフである。黒三角は陰性対照群、白三角は関節炎（陽性）対照群、黒四角（破線）はペプチドＬ（腹腔内投与）群、黒丸（破線）はペプチドＣ（腹腔内投与）群、白丸（実線）はペプチドＣ低用量（経口投与）群、黒丸（実線）はペプチドＣ高用量（経口投与）群、×（破線）はメトトレキセート（腹腔内投与）群を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、１つの態様において、下記式（Ｉ）：
【化２】
2014148489.tif 000004
［ここで、Ｘ４およびＸ５は任意のアミノ酸である］
で表されるアミノ酸配列を含む環状ペプチドに関する。
【００１９】
１つの態様において、本発明のペプチドは、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅで表されるアミノ酸配列（配列番号１）を有する鎖状ペプチドよりも酵素分解耐性および生物学的利用能が改善された、経口投与においても有効性を示す環状ペプチドである。本発明の環状ペプチドの酵素分解耐性および生物学的利用能は、当該技術分野において公知の方法により調べることができる。
【００２０】
なお、本明細書において、アミノ酸を名称ではなく、３文字表記または１文字表記で表すことがあるが、３文字表記または１文字表記は当業者によく知られている。
【００２１】
本発明の環状ペプチドは、経口投与においても有効性を示す限り、式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列のいずれのアミノ酸が他のアミノ酸で置換されてもよく、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジンまたはプロリンなどの天然タンパク質を構成しているアミノ酸、あるいはβ−アラニン、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、５−アミノレブリン酸、５−アミノ吉草酸、ホモシステイン、オルニチン、５−ヒドロキシトリプトファン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ドーパ）、トリヨードチロニン、チロキシン、ホモリジン、ノルロイシン、クレアチン、デスモシン、ノルバリンまたはヨードチロシンなどの天然タンパク質を構成していないアミノ酸に置換されてもよい。また、環を構成するアミノ酸の側鎖が修飾されていてもよい。
【００２２】
式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列において１つまたは複数のアミノ酸を、親水性アミノ酸に、あるいは環状ペプチドの水溶性を高めるようなアミノ酸誘導体または修飾体などに置換することによって、該アミノ酸配列を含む環状ペプチドの水溶性を改善することができる。したがって、本発明の好ましい態様において、式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列中のアミノ酸は親水性アミノ酸あるいはペプチドの水溶性を高めるようなアミノ酸誘導体または修飾体などで置換されている。親水性アミノ酸の例としてはセリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）またはヒスチジン（Ｈｉｓ）が挙げられるが、これらのアミノ酸に限定されない。
【００２３】
本発明の好ましい態様において、式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列中のアミノ酸Ｘ４、Ｘ５は親水性アミノ酸である。さらに好ましくは、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）またはヒスチジン（Ｈｉｓ）などの親水性アミノ酸である。アミノ酸Ｘ４、Ｘ５として好ましいものとして、ペプチドの水溶性を高めるようなアミノ酸誘導体または修飾体であってもよい。Ｘ４、Ｘ５は同じ種類のアミノ酸であってもよく、互いに異なる種類のアミノ酸であってもよい。好ましい態様において、本発明の環状ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する鎖状ペプチドより高い酵素分解耐性および生物学的利用能を有するものであり、経口投与された場合でも有効性を示すものである。
【００２４】
好ましい本発明の環状ペプチドとして、配列番号８〜１４のいずれかのアミノ酸配列を有する環状ペプチドが挙げられる。これらの環状ペプチドも、高い酵素分解耐性および生物学的利用能を有する。
【００２５】
１つの態様において、本発明の環状ペプチドは、上記アミノ酸配列（Ｉ）中の１つまたは複数（例えば、２、３、４、５または６個）のアミノ酸が対応するＤ−アミノ酸でさらに置換されているアミノ酸配列を有するものであってもよい。本発明の好ましい態様において、式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列中の全てのアミノ酸は、対応するＤ−アミノ酸で置換されてもよい。式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列中のアミノ酸を対応するＤ−アミノ酸に置換することによって、本発明の環状ペプチドはさらにタンパク質分解を受けにくくなり、投与した対象の体内において高い安定性および長い半減期を有するようになる。
【００２６】
１つの態様において、本発明の環状ペプチドは、上記アミノ酸配列（Ｉ）からなるものであってもよく、あるいは、式（Ｉ）のアミノ酸配列を構成する１つまたは複数のアミノ酸残基に、ペプチドまたはアミノ酸、それらのアナログ、ポリエチレングリコール、糖、多糖、ヌクレオチドなどの種々の物質（これらに限定されない）からなる側鎖が結合したものであってもよい。また、アミノ酸またはペプチドを介して、あるいは利用可能な官能基を用いて、蛍光標識、ビオチン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、磁気ビーズ、ラテックスビーズ、金コロイドなどの物質（これらに限定されない）が結合していてもよい。例えば、上記アミノ酸配列（Ｉ）に別のペプチドが結合する場合、かかるペプチドは、１個〜５０個、例えば、１〜２０個、１〜１５個または１〜９個のアミノ酸からなるものであってもよい（上記アミノ酸の個数は例示であり、限定するものではない）。また、かかるペプチドが、ヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ、Ｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグまたはＥタグとしての機能を有するもの（これらに限定されない）であってもよい。
【００２７】
本発明の環状ペプチドはまた、上記したペプチドに加えて、上記ペプチドのアミノ酸配列において、１個または数個、例えば、２または３個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するペプチド、および上記ペプチドのアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上（例えば、９５、９７、９８または９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列を有するペプチドも包含する。アミノ酸配列の相同性は、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング（株）製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（（株）ジェネティクス製）を用いて測定することができる。あるいは、短鎖ペプチドの場合は単純に配列を比較し、計算することもできる。さらに、これらのアミノ酸のいずれかが適宜修飾されたものであってもよい。いずれのアミノ酸配列を有する場合であっても、本発明の環状ペプチドは、高い酵素分解耐性および生物学的利用能を有するものである。好ましい態様において、本発明の環状ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する鎖状ペプチドより高い酵素分解耐性および生物学的利用能を有するものであり、経口投与された場合でも有効性を示すものである。
【００２８】
本発明の環状ペプチドは、当業者に既知の種々の方法により製造および取得することができる。例えば、本発明の環状ペプチドの前駆体となるペプチドを適当な方法で製造し、次いで前駆体となるペプチドを結合させて環状化させることにより、製造することができる。
【００２９】
用語「前駆体となるペプチド」とは、式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列を含む環状ペプチドの環構造を構成する６つのペプチド結合のうち、１つまたは複数のペプチド結合が切断された際に得られる、直鎖ペプチドまたは分岐鎖ペプチドの構造と同じ構造を有するペプチドをさす。
【００３０】
前駆体となるペプチドは、固相法や液相法などに従って化学的に合成してもよい。固相法の場合、ペプチドは、Ｎ末端保護アミノ酸の活性化、カップリング、洗浄、脱保護基、活性化の操作を、所望のペプチドが完成するまで繰り返し、固相上で合成される。該産物は、固相から脱離され、ＨＰＬＣ等を用いて精製される。次いで、配列検定および生物学的試験のようなさらなる研究に移される。あるいは、前駆体となるペプチドは、無細胞翻訳系により合成してもよい。また、前駆体となるペプチドをコードするヌクレオチド配列に基づき、遺伝子工学的に製造してもよい。また、これらの方法を組み合わせて得てもよい。
【００３１】
ペプチドを環状化させる方法もまた、当業者に広く知られている。一般に、ペプチドの環化反応は、末端アミノ基を保護した鎖状ペプチドの他端のカルボキシル基を活性エステル化し、次いでアミノ基を脱保護し、得られた鎖状ペプチド活性エステルを大量の塩基性溶媒中に滴下することにより、行うことができる。
【００３２】
本発明の環状ペプチドが、上記アミノ酸配列（Ｉ）のアミノ酸配列を構成する１つまたは複数のアミノ酸残基に側鎖が結合したものである場合、環状のコア配列を製造し、次いで所望の位置へ側鎖を付加させてもよい。あるいは、側鎖が作製されるように前駆体となるペプチドを結合することで、側鎖を有する環構造を製造してもよい。
【００３３】
本発明の環状ペプチドはまた、前駆体となるペプチドを介さずに、固相法を用いて合成されてもよい。このような方法は、特許出願公開平５−２５１９６号公報に開示される。
【００３４】
本発明は、さらなる態様において、環状ペプチドの製造方法であって、
（ａ）該環状ペプチドの前駆体となるペプチドを製造する工程、および
（ｂ）前駆体となるペプチドを環状化させる工程
を含む方法に関するものである。ペプチドの製造および環状化は、上述した当業者に既知の手段および／または方法により行われ得る。
【００３５】
本発明は、別の態様において、環状ペプチドの製造方法であって、
（ａ）該環状ペプチドの前駆体となるペプチドをコードする核酸を含むベクターを用いて細胞を形質転換する工程、
（ｂ）該細胞を培養して、前駆体となるペプチドを産生させる工程、および
（ｃ）前駆体となるペプチドを環状化させる工程
を含む方法に関するものである。細胞の形質転換およびペプチドの環状化は、当業者に既知の手段および／または方法により行われ得る。
【００３６】
そのため、ある態様において本発明は、上記環状ペプチドの製造方法により得ることのできる環状ペプチドに関するものである。好ましい態様において、本発明は高い酵素分解耐性および生物学的利用能を有し、かつ経口投与においても有効性を示す環状ペプチドに関するものである。さらに好ましい態様において、本発明の環状ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する鎖状ペプチドより高い酵素分解耐性および生物学的利用能を有するものであり、経口投与された場合でも有効性を示すものである。
【００３７】
本発明は、別の態様において、本発明の環状ペプチドを有効成分として含む、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防用医薬組成物に関するものである。Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患とは、かかる結合により直接的または間接的に生じる疾患をいい、例えば、関節リウマチ、関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、血管炎症群、腎炎などの免疫複合体病、その他の炎症性疾患、乾癬症、および悪性腫瘍などが挙げられる。
【００３８】
なお、本発明の環状ペプチドは、元々ヒトの体内に存在するＣ１ｑに由来するペプチドを環状化したものであるので、本発明の環状ペプチドをヒトに投与することで生じる副作用は生じないか、あったとしても少ない。さらに、本発明の環状ペプチドは、経口投与された場合であっても、有効性を示す。
【００３９】
本発明の医薬組成物の有効成分として使用可能な本発明のペプチドは、環状ペプチドであって、
【化３】
2014148489.tif 000005
（ここで、Ｘ４およびＸ５は任意のアミノ酸である）
で表されるアミノ酸配列を含む環状ペプチドである。本発明の医薬組成物の有効成分として好ましい本発明の環状ペプチドの例は、上記アミノ酸配列（Ｉ）においてＸ４、Ｘ５がともに親水性アミノ酸であるものである。かかる親水性アミノ酸としてはＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＳｅｒおよびＴｈｒなどが挙げられる。本発明の医薬組成物の有効成分として、より好ましい本発明の環状ペプチドの例は、配列番号８〜１４のいずれかのアミノ酸配列を有する環状ペプチドである。さらに好ましくは、式（Ｉ）のアミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸（Ｇｌｙを除く）、あるいは全てのアミノ酸（Ｇｌｙを除く）が対応するＤ−アミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有するペプチドである。
【００４０】
本発明の医薬組成物の投与方法は、疾患の種類、対象の状態、および／または標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。当該方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経鼻投与、経口投与、経肺投与、座剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、本発明の医薬組成物の投与方法は経口投与である。
【００４１】
本発明の医薬組成物に含まれる環状ペプチドの量、医薬組成物の剤形、投与頻度などは、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択できる。例えば、１回あたりのペプチド投与量を０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇとしてもよいが、本発明の環状ペプチドの投与量はこれらに限定されるものではない。
【００４２】
本発明は、さらなる態様において、有効量の環状ペプチドを対象に投与することを含む、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防方法に関するものである。
【００４３】
本発明は、さらに別の態様において、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防に用いられる、環状ペプチドに関するものである。
【００４４】
本発明は、さらなる態様において、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防に用いられる医薬の製造のための、環状ペプチドの使用を提供する。
【００４５】
上記した態様を実施するために、配列番号１５〜２８のアミノ酸配列を有するペプチドを環状化させてもよい。配列番号１５〜２８のアミノ酸配列を有する環状ペプチドもまた、高い酵素分解耐性および生物学的利用能を有するものである。これらの環状ペプチドもまた、上記式（Ｉ）で表される環状ペプチドと同様に、Ｄ−アミノ酸への置換、側鎖の付加等の修飾を行ってもよい。
【００４６】
以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例】
【００４７】
比較例：鎖状ペプチドの経口投与の検討
配列番号１１のアミノ酸配列を有する鎖状ペプチドについて、静脈内投与、腹腔内投与および経口投与の比較を行った。【００４８】
１．材料および方法
１−１  ラット（Ｓｌｃ：Ｗｉｓｔａｒ、ＳＰＦ：日本エスエルシー株式会社より購入）を用い、静脈内投与、腹腔内投与および経口投与のそれぞれについて、１４Ｃで標識された鎖状ペプチドの単回投与後の血漿中放射能濃度の測定を行った。通常飼料を与えて投与直前まで馴化を継続してから試験に使用した。【００４９】
１−２  被験物質
試験に用いた鎖状ペプチドのアミノ酸配列は以下のものであった。
【表１】
2014148489.tif 000006
１４Ｃで標識されたペプチドＣを試験に用いた。比放射能は４４．２ｍＣｉ／ｍｍｏｌ（２．３７ＭＢｑ／ｍｇ）であった。ラジオＨＰＬＣ法による放射化学的純度は９８．３５％であった。【００５０】
１−３  試験群および投与方法
被験物質の調製および試験群は表２に説明する通りであった。各群雄１匹とし、絶食条件下で被験物質の投与を行った。使用する投与液は投与日に調製した。
【表２】
2014148489.tif 000007
【００５１】
１−４  実験概略
腹腔内投与については、注射針（２７Ｇ×１／２”あるいは２５Ｇ×５／８”、ニプロ株式会社）をディスポーザブル注射筒（１あるいは２．５ｍＬ、テルモ株式会社）に装着し、必要量の投与液を充填し、腹腔内に単回投与した。経口投与については、プラスチック製ディスポーザブル経口ゾンデ（有限会社フチガミ器械）をディスポーザブル注射筒（２．５ｍＬ、テルモ株式会社）に装着し、必要量の投与液を充填し、単回強制経口投与を行った。静脈内投与については、注射針（２７Ｇ×１／２”、ニプロ株式会社）をディスポーザブル注射筒（１ｍＬ、テルモ株式会社）に装着し、必要量の投与液を充填し、尾静脈内に単回投与した。腹腔内および経口投与の場合は、投与後０．２５、０．５、１、２、４、６、８、２４、４８、７２、１２０および１６８時間の時点で、静脈内投与の場合は、投与後０．０８３（５分）、０．２５、０．５、１、２、４、６、８、２４、４８、７２、１２０および１６８時間の時点で、無麻酔下で鎖骨下静脈から約２５０μＬを採血した。ヘパリンナトリウム溶液を処理したマイクロチューブに移し、軽く混和した。遠心分離（４℃、１２０００ｒｐｍ×５分、ＣＦ１５Ｄ２）により血漿を採取した。得られた血漿１００μＬ（各ｎ＝１）をバイアルに分取し、放射能濃度を測定した。【００５２】
１−５  結果
（ｉ）血漿中放射能濃度
血漿中放射能濃度の測定結果は表３に示す通りであった。放射能濃度推移のグラフを図１に示す。【００５３】
（ｉｉ）放射能の吸収率（Ｆ）
放射能の吸収率（Ｆ）を算出した。Ｆは、腹腔内および経口投与時のＡＵＣ０−ｉｎｆ／投与用量を、静脈内投与時のＡＵＣ０−ｉｎｆ／投与用量で除することにより求めた。結果は表３に示す通りであった。
【表３】
2014148489.tif 000008
【００５４】
１−６  考察
１０ｍｇ／ｋｇの用量における腹腔内投与後の吸収率（Ｆ）は、９１．３％であり、吸収は良好であることが示唆された。一方で、１、１０および１００ｍｇ／ｋｇの用量における経口投与後のＦは、それぞれ、２．１、３．４および２．７％と低値であった。これより、鎖状ペプチドは、経口吸収性は良好ではないが、静脈内投与および腹腔内投与には適していることが確認された。
【実施例１】
【００５５】
ペプチドの環状化の検討
本発明者らは、酵素分解耐性および生物学的利用能をさらに高めるために、以下の検討を行った。【００５６】
環状ペプチドの合成
配列番号１１のアミノ酸配列を有する環状ペプチドの合成を、ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  （ｓｈａｎｇｈａｉ）  Ｌｔｄ．にて実施した。一般的なＦｍｏｃ法により固相ペプチド合成法に従って鎖状のペプチドを合成した後、Ｎ末端のＰｒｏとＣ末端のＰｈｅの主鎖−主鎖間でペプチド結合を形成させ、環状ペプチドを作製した。まず、Ｃ末端アミノ酸のＦｍｏｃ−Ｐｈｅを２−クロロトリチルクロリド樹脂（ポリスチレン担体）に固定した。担体に固定されたＰｈｅのＮ末端のＦｍｏｃ基を脱保護し、そこに縮合剤を用いてＣ末端から２番目のアミノ酸のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）を結合させて、ペプチドを伸張した。なお、反応溶媒はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を使用し、担体の洗浄もＤＭＦを用いて３回行うことにより、未反応物質などの不純物を除去した。また、Ｆｍｏｃの脱保護にはピペリジンを、縮合剤にはＯ−ベンゾトリアゾリル−Ｎ，Ｎ，Ｎ‘，Ｎ’−テトラメチルウロニウム（ＴＢＴＵ）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）の混合溶液を用いた。さらに続くアミノ酸、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏについても同様の操作を繰り返すことによりペプチドを伸張し、担体上でＰｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｈｅを得た。続いて、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いてペプチドを担体から切り出すと同時に、ＯｔＢｕやＢｏｃなどの側鎖保護基を脱保護して、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅを得た。切り出した鎖状ペプチドに縮合剤を少しずつ添加していくことにより、Ｎ末端のＰｒｏとＣ末端のＰｈｅの主鎖−主鎖間でペプチド結合を形成させ、目的の環状ペプチドを得た。ＨＰＬＣおよびＭＳスペクトルにより、合成した環状ペプチドが９５％以上の純度であること、および目的のペプチドを支持する構造であることを確認した。
【実施例２】
【００５７】
モノクローナル抗体カクテル惹起関節炎マウスモデルにおける本発明のペプチドの関節炎抑制作用
１．材料および方法
１−１  マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、ＳＰＦ、７週齢：日本エスエルシー株式会社より購入）を用い、モノクローナル抗体カクテル誘発関節炎に対する本発明の環状ペプチドの関節炎抑制作用を検討した。通常飼料を与えて８日間馴化してから試験に使用した。【００５８】
１−２  試験に用いたペプチドのアミノ酸配列は以下のものであった。
【表４】
2014148489.tif 000009
【００５９】
１−３  モノクローナル抗体カクテル惹起関節炎モデルの作製
陰性対照群を除くマウス３０匹（７週齢）、関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテルを１．５ｍｇ／個体にて静脈内投与し（０日目）、その３日後にリポ多糖（ＬＰＳ）を５０μｇ／個体で腹腔内投与して、関節炎を惹起した。陰性対照群には生理食塩水を用いて同様に投与した。【００６０】
１−４  試験群および投与方法
被験物質の調製および試験群は表５に説明する通りであった。各群雄５匹とした。
【表５】
2014148489.tif 000010
【００６１】
１−５  ペプチド溶液の調製
使用するペプチド溶液は用時調製とした。必要量を正確に秤量した鎖状ペプチドおよび環状ペプチドを、７割程度の生理食塩水に徐々に添加して溶解させ、１ｍｇ／ｍｌとなるようにメスアップして調製したものを、腹腔内投与用の鎖状ペプチド溶液および環状ペプチド溶液とした。同様に、必要量を正確に秤量した環状ペプチドを、７割程度の蒸留水に徐々に添加して溶解させ、０．１ｍｇ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌとなるようにメスアップして調製したものを、経口投与用の低用量および高用量環状ペプチド溶液とした。【００６２】
１−６  メトトレキセート溶液の調製
必要量を正確に秤量したメトトレキセートを７割程度の生理食塩水に徐々に添加して溶解させ、０．０１５ｍｇ／ｍｌとなるようにメスアップして調製した。【００６３】
１−７  実験概略
ＬＰＳ投与翌日（４日目）より１３日目まで、被験物質を１回／日投与した。関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル投与日（惹起日）を０日目とし、０、３、５、７、１０、１２および１４日目に後肢の臨床スコアを観察し、後肢容積を測定した。【００６４】
１−８  観察および測定方法
（ｉ）体重測定および一般状態観察
動物の体重測定は、試験期間中、関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル投与日を０日目とし、０、３、５、７、１０、１２および１４日目の午前中に、生存例全例について体重を測定した。一般状態観察は、毎日実施した。【００６５】
（ｉｉ）足容積の測定
足容積の測定は、プレシスモメーター（ＵＮＩＣＯＭ  ＴＫ１０５）を用いて、右後肢を対象に測定した。足容積の増加率（足蹠腫脹率，ｐａｗ  ｓｗｅｌｌｉｎｇ  ％）は以下の計算式により算出した。
足蹠腫脹率（％）＝［（Ｖｔ−Ｖｏ）／Ｖｏ］ｘ１００
Ｖｔ：抗体投与後の足容積（ｍＬ）
Ｖｏ：抗体投与前の足容積（ｍＬ）（０日目に測定）【００６６】
（ｉｉｉ）関節炎スコアの観察
関節炎スコアの観察は、０、３、５、７、１０、１２および１４日目に以下に従って、右後肢を対照に観察した。
＜１．指関節の腫脹＞
０：  腫脹なし
１：  ２指以下の腫脹
２：  ３指の腫脹
３：  ４指の腫脹
４：  全指の腫脹
＜２．後肢の甲の腫脹＞
０：  腫脹なし
１：  軽度の腫脹
２：  中等度の腫脹
３：  やや重度の腫脹
４：  重度の腫脹
＜３．発赤の程度＞
０：  発赤なし
１：  軽度の発赤
２：  中等度の発赤
３：  やや重度の発赤
４：  重度の発赤【００６７】
１−９  統計学的解析処理方法
試験成績は平均値±標準誤差で表わした。コントロール群と関節炎（陽性）対照群、および関節炎（陽性）対照群とメトトレキセート群との検定は不等分散のため、Ａｓｐｉｎ−Ｗｅｌｃｈのｔ検定による有意差検定を行った。関節炎（陽性）対照群に対する各投与群の有意差検定は不等分散であったため、ノンパラメトリック手法を用いてＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定後のＤｕｎｎｅｔ型多重比較検定で比較した。Ｐ＜０．０５を有意差ありとした。【００６８】
２．結果
２−１  右後肢足容積およびその増加率（表６、図２〜３）
陰性対照群では、試験期間中の最大足容積増加率が認められたのは７日目であり、２０．３％であった。関節炎（陽性）対照群では、５、７、１０、１２および１４日目の容積増加率は、それぞれ３５．１、６９．５、６２．７、５７．４および５８．３％であった。ともに７日目で最大となった。７日目より試験終了まで、陰性対照群と比較して有意かつ顕著な足容積増加率の上昇が認められた。【００６９】
メトトレキセート群について、５、７、１０、１２および１４日目の容積増加率は、それぞれ２４．０、３９．９、３５．８、３０．８および２６．９％であった。陽性対照群に比べ、各時点での容積増加が抑制され、１４日目での抑制は有意であった。【００７０】
ペプチドＬ群について、５、７、１０、１２および１４日目の容積増加率は、それぞれ２２．１、５５．８、４７．３、５０．１および４３．６％であった。各測定時点で容積増加率は陽性対照群より低下傾向がみられたが、有意差は認められなかった。【００７１】
ペプチドＣ腹腔内投与群について、５、７、１０、１２および１４日目の容積増加率は、それぞれ７．６、３５．０、３７．１、３１．７および２６．０％であった。各測定時点で容積増加率が陽性対照群より低い傾向がみられ、容積増加抑制は１４日目に有意であった。【００７２】
ペプチドＣ低および高用量経口投与群について、投与後の容積増加率は、各測定時点での用量依存的な増加抑制が示された。高用量群での５、７、１０、１２および１４日目の容積増加率は、それぞれ１８．５、４３．５、４１．３、３４．４および２７．３％であった。特に１４日目で、陽性対照群に比べ有意な増加抑制が認められた。
【表６】
2014148489.tif 000011
【００７３】
２−２  右後肢のスコア合計（表７、図４）
陰性対照群では異常は認められなかった。陽性対照群では５、７、１０、１２および１４日目のスコア合計は、それぞれ３．４、７．４、７．０、６．８および５．６であった。７日目で最大に達した。５日目以降、陰性対照群と比べて有意かつ顕著な高値が認められた。【００７４】
メトトレキセート群においても７日目で最大スコアとなった。７日目より減少傾向がみられたものの、有意ではなかった。【００７５】
ペプチドＬ腹腔内投与群では、７日目で最大スコアとなった。それ以降、各測定時点でスコア減少傾向がみられた。【００７６】
ペプチドＣ腹腔内投与群でも、７日目で最大スコアとなった。各測定時点では陽性対照群より減少傾向がみられた。【００７７】
ペプチドＣ低および高用量経口投与群では、両群ともに７日目で最大スコアとなり、以降、用量依存的なスコア悪化抑制傾向が認められた。
【表７】
2014148489.tif 000012
【００７８】
３．考察
マウスを用いたコラーゲン抗体関節炎モデルにおけるペプチドＬおよびペプチドＣの抗炎症作用について、マウスの足容積浮腫量および関節炎症スコアを指標に、対照薬メトトレキセートのそれらと比較検討した。モノクローナル抗体カクテル１．５ｍｇ／個体を静脈内投与し（０日目）、その３日後（３日目）にＬＰＳ  ５０μｇ／個体を腹腔内投与することにより関節炎を惹起した。被験物質を、４から１３日目までの１回／日、計１０回投与した。各群には、ペプチドＬ、ペプチドＣの各１０ｍｇ／ｋｇあるいはメトトレキセートの０．１５ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与する３群ならびにペプチドＣの１または１０ｍｇ／ｋｇを経口投与する２群に加え、陰性対照と陽性対照を合わせた計７群を設けた。各群の０、３、５、７、１０、１２および１４日目に、右後肢の足容積浮腫量および関節炎スコアを測定評価した。【００７９】
試験期間中、陰性対照動物を除き、惹起した全動物で四肢腫脹および発赤が認められた。体重では陰性対照群で通常の発育に伴う体重推移を示したのに対し、関節炎惹起各群は５日目より急激な体重減少を示し、以降緩やかな体重回復を認めたが、試験終了時の平均体重は陰性対照群より低かった。【００８０】
試験期間中の最大足容積増加率において、陰性対照群では右肢２０．３％と成長に伴う変化であった。それに対し、陽性対照群では、７日目より、顕著かつ有意な足容積の増加が認められた。７日目では６９．５％と、最大増加率を示した。陽性対照群は、合計炎症スコアでも７日目で最大となり、５日目より終了までに陰性対照群に比べ有意な上昇が認められた。【００８１】
さらに、惹起動物について、指関節の腫脹、甲の腫脹および発赤の各スコアを比べると、指関節の腫脹の発症は軽微であり、群間に差がなかった。一方、発赤とそれに伴う甲の腫脹は重度に発症し、この二項目がスコア合計変動の主な指数となった。これらの結果より、全惹起動物で重篤な関節炎を発症していたことが確認され、本試験では各被験物質投与による関節炎発症初期から重篤後期までに対する評価が可能であることが明らかとなった。【００８２】
メトトレキセート群では、陽性対照群に対して各測定時点での足容積増加率が低いことが認められた。それは１０〜１４日目で明らかとなり、特に１４日目では、有意な増加抑制が認められた。スコア合計では７日目より陽性対照群に比べ減少傾向を示すとともに、経時的な症状改善作用が認められた。【００８３】
腹腔内投与のペプチドＬ群では、足容積増加率および炎症スコアは各測定時点で陽性対照群より低値傾向がみられた。５日目では増加率を約６３％に抑制した。【００８４】
腹腔内投与のペプチドＣ群でも、同様に各測定時点で足容積増加率および炎症スコアは低値傾向を示した。１４日目で、足容積増加率の有意な増加抑制が認められた。また有意ではないものの、５〜１４日目ではそれぞれ陽性対照群の増加率の約２２〜５９％まで抑制した。【００８５】
腹腔内投与のペプチドＬ群およびペプチドＣ群では、両群とも血中濃度の薬効域への立ち上がりが早かった。同用量のペプチドＬとペプチドＣの腹腔内投与比較においては、明らかにペプチドＣがやや強い抗炎症効果を有することが明らかとなった。【００８６】
経口投与のペプチドＣ低および高用量群では、両群の足容積増加率は各測定時点で増加抑制を認めた。この増加抑制は７日目以降で用量依存性がみられ、さらに高用量群の１４日目で有意な増加抑制が確認された。炎症スコアは両群ともに７日目以降に低値傾向を示した。明らかな用量依存性がみられた。【００８７】
腹腔内投与のペプチドＬ群およびペプチドＣ群では、血中濃度の薬効域への立ち上がりが早く、経口投与に比べ５日目での症状改善が経口投与群より良くなったことが想定される。これが、特にペプチドＣの経口投与群との差に繋がった可能性が考えられた。【００８８】
これらの試験結果より、ペプチドＣは腹腔内投与でメトトレキセートと同程度のリウマチ様炎症改善作用があることが明らかとなった。また、その効果は、鎖状ペプチドであるペプチドＬに比べ、明らかに高いことが明らかとなった。さらにペプチドＣは経口投与においても有効であることが示された。また、経口投与されたペプチドＣは同用量の腹腔内投与と同等の抗リウマチ様炎症作用を示すことも示された。これらの結果から、ペプチドＣはメトトレキセートよりも強い効能を有する可能性のある有用性の高い薬物であると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明によれば、Ｃ１ｑとイミュノグロブリンとの結合により引き起こされる疾患の治療または予防において、より有用な医薬組成物の提供が可能になる。酵素分解耐性および生物学的利用能が改善された本発明の環状ペプチドを上記医薬組成物に用いることで、従来の投与方法に加えて経口投与を行うことができる。本発明により提供される医薬組成物は、特に関節炎やリウマチの治療に有効である。したがって、本発明は、製薬分野、研究用試薬分野などにおいて利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００９０】
SEQ ID NO:1: Synthetic polypeptide
SEQ ID NO:2: Synthetic polypeptide
SEQ ID NO:3: Synthetic polypeptide
SEQ ID NO:4: Synthetic polypeptide
SEQ ID NO:5: Synthetic polypeptide
SEQ ID NO:6: Synthetic polypeptide
SEQ ID NO:7: Synthetic polypeptide
SEQ ID NO:8: Synthetic polypeptide
SEQ ID NO:9: Synthetic polypeptide
SEQ ID NO:10: Synthetic polypeptide
SEQ ID NO:11: Synthetic polypeptide
SEQ ID NO:12: Synthetic polypeptide
SEQ ID NO:13: Synthetic polypeptide
SEQ ID NO:14: Synthetic polypeptide
SEQ ID NO:15: Synthetic polypeptide
SEQ ID NO:16: Synthetic polypeptide
SEQ ID NO:17: Synthetic polypeptide
SEQ ID NO:18: Synthetic polypeptide
SEQ ID NO:19: Synthetic polypeptide
SEQ ID NO:20: Synthetic polypeptide
SEQ ID NO:21: Synthetic polypeptide
SEQ ID NO:22: Synthetic polypeptide
SEQ ID NO:23: Synthetic polypeptide
SEQ ID NO:24: Synthetic polypeptide
SEQ ID NO:25: Synthetic polypeptide
SEQ ID NO:26: Synthetic polypeptide
SEQ ID NO:27: Synthetic polypeptide
SEQ ID NO:28: Synthetic polypeptide
【図１】
2014148489.tif 000014
【図２】
2014148489.tif 000015
【図３】
2014148489.tif 000016
【図４】
2014148489.tif 000017
【配列表】
2014148489000001.app
【国際調査報告】
2014148489.tif 000018
2014148489.tif 000019
2014148489.tif 000020
2014148489.tif 000021