(57)【要約】  高速かつ短時間のレーザ照射処理を通じて、培養容器上で培養された細胞のうちの特定の細胞を致死させるべく、容器本体にレーザ光の照射を受けてこれを吸収する材料を含む層である被照射層が設けられた培養容器の被照射層の表面上で細胞を培養するとともに、当該被照射層における、致死させるべき特定の細胞の直下の箇所にレーザ光を照射するようにした。
2016194454.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器本体にレーザ光の照射を受けてこれを吸収する材料を含む層である被照射層が設けられた細胞培養容器の被照射層の表面上で培養された細胞のうちの特定の細胞を致死させる方法であって、
前記被照射層における致死させるべき細胞の直下の箇所にレーザ光を照射する細胞処理方法。
【請求項２】
前記被照射層における致死させるべき細胞の直下の箇所に、当該細胞が即死せずある程度の時間が経過した後に致死するような出力またはエネルギ量を持つレーザ光を照射する請求項１記載の細胞処理方法。
【請求項３】
前記被照射層における致死させるべき細胞の直下の箇所に、当該細胞が即死しないような出力またはエネルギ量を持つレーザ光を複数回照射する請求項１記載の細胞処理方法。
【請求項４】
前記細胞培養容器で培養した細胞群を複数の部分に分割するための方法であり、
前記被照射層における、培養した細胞をある部分と他の部分とに切り分ける境界線の直下の箇所にレーザ光を照射する請求項１、２または３記載の細胞処理方法。
【請求項５】
容器本体にレーザ光の照射を受けてこれを吸収する材料を含む層である被照射層が設けられた細胞培養容器の被照射層の表面上で培養された細胞のうちの特定の細胞を致死させるレーザ加工機であって、
前記被照射層における致死させるべき細胞の直下の箇所にレーザ光を照射するレーザ加工機。
【請求項６】
前記被照射層における致死させるべき細胞の直下の箇所に、当該細胞が即死せずある程度の時間が経過した後に致死するような出力またはエネルギ量を持つレーザ光を照射する請求項５記載の細胞処理方法。
【請求項７】
前記被照射層における致死させるべき細胞の直下の箇所に、当該細胞が即死しないような出力またはエネルギ量を持つレーザ光を複数回照射する請求項５記載の細胞処理方法。
【請求項８】
前記細胞培養容器で培養した細胞群を複数の部分に分割するためのものであり、
前記被照射層における、培養した細胞をある部分と他の部分とに切り分ける境界線の直下の箇所にレーザ光を照射する請求項５、６または７記載のレーザ加工機。
【請求項９】
容器本体にレーザ光の照射を受けてこれを吸収する材料を含む層である被照射層が設けられ、その被照射層の表面上で細胞が培養される細胞培養容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養容器上で培養された細胞のうちの特定の細胞を致死させる方法、並びにその方法の実施に使用されるレーザ加工機及び細胞培養容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
近時、体性幹細胞や胚性幹細胞、人工多様性幹細胞人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）を用いた再生医療技術及び創薬の研究開発が勃興している。この種の研究開発においては、必要となる目的細胞や組織を効率よく量産できることが極めて重要となる。【０００３】
細胞培養の過程では、培地で増殖した細胞集合体（コロニー）の一部をクランプとして切り出し、そのクランプを新しい培地に移して再び培養する継代培養を行うことが通例である。現状、増殖した細胞を複数のクランプに分割する作業は専ら人の手によってなされているが、これには手間を要する上、クランプの大きさが不揃いとなって継代後の細胞の生育状態にばらつきを生ずる原因ともなる。【０００４】
また、患者の傷ついた組織や臓器を補う再生医療の目的で患者に移植する細胞または組織中に、分化に失敗した不要細胞が残存していると、腫瘍化その他の患者の健康に悪影響を及ぼすリスクを招く。不要細胞が混入している培養容器を丸ごと廃棄することは、目的細胞または組織の収率（歩留まり）の低下につながり、再生医療のコストを高騰させる。目的細胞または組織の収率を改善するためには、培養容器内に存在する不要細胞を死滅させまたは除去して、残りの細胞を無駄にせず利用することが望ましい。【０００５】
下記特許文献１には、培養容器内の不要細胞を選択的に死滅させる方法が開示されている。即ち、可視光や紫外線、赤外線、放射線といった活性エネルギ線の照射を受けて酸性物質を生じる光酸発生剤を予め培養容器の表面に塗布しておき、この培養容器上で培養した細胞のうち死滅させるべき細胞の存在する箇所に活性エネルギ線を１０秒ないし１０分間程度照射することにより、酸性物質を発生させて対象の細胞を死に至らしめる。活性エネルギ線を照射する領域の制御には、ＤＭＤ（ｄｉｇｉｔａｌ  ｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒ  ｄｅｖｉｃｅ）、液晶シャッタアレイ、光空間変調素子、フォトマスク等を使用する。【０００６】
下記特許文献１に開示された方法は、対象の細胞を死滅させるために活性エネルギ線を照射する時間が長く、来たるべき再生医療用細胞の大量生産の実現に向けてなお改善の余地があるといえる。加えて、ＤＭＤ等を使用するマイクロプロジェクションシステムでは、活性エネルギ源（光源）から供給されるエネルギの大部分を無為に捨ててしまう。しかも、光酸発生剤に照射する活性エネルギ線の強度分布を均一に保つことも難しい。【０００７】
不要細胞の死滅処理の高速化を企図して、高エネルギのパルスレーザのような活性エネルギ線を直接不要細胞に照射することも考えられる。しかしながら、照射する活性エネルギ線を細胞核に命中させなくてはならず、対象の細胞に対して複数回の照射を実行しないと当該細胞の確実な死滅が見込めない。さらには、活性エネルギ線の直射を受ける不要細胞の周辺にある目的細胞への熱影響が避けがたいという本質的な問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１１／１２５６１５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、高速かつ短時間のレーザ照射処理を通じて、培養容器上で培養された細胞のうちの特定の細胞を致死させることを所期の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係る細胞処理方法は、容器本体にレーザ光の照射を受けてこれを吸収する材料を含む層である被照射層が設けられた細胞培養容器の被照射層の表面上で培養された細胞のうちの特定の細胞を致死させる方法であって、前記被照射層における致死させるべき細胞の直下の箇所にレーザ光を照射するものである。【００１１】
致死させる細胞以外の細胞への熱影響を最小限に抑制するためには、前記被照射層における致死させるべき細胞の直下の箇所に、当該細胞が即死せずある程度の時間が経過した後に致死するような出力またはエネルギ量を持つレーザ光を照射することが好ましい。【００１２】
または、致死させる細胞以外の細胞への熱影響を最小限に抑制するために、前記被照射層における致死させるべき細胞の直下の箇所に、当該細胞が即死しないような出力またはエネルギ量を持つレーザ光を複数回照射することも好ましい。さすれば、レーザ光の照射から対象の細胞の死滅までに要する時間を短縮することができる。【００１３】
本発明に係る細胞処理方法は、前記細胞培養容器で培養した細胞群（複数個の細胞からなる）を複数の部分に分割する目的で用いることができる。その場合、前記被照射層における、培養した細胞をある部分と他の部分とに切り分ける境界線の直下の箇所にレーザ光を照射する。【００１４】
本発明に係るレーザ加工機は、容器本体にレーザ光の照射を受けてこれを吸収する材料を含む層である被照射層が設けられた細胞培養容器の被照射層の表面上で培養された細胞のうちの特定の細胞を致死させるものであり、前記被照射層における致死させるべき細胞の直下の箇所にレーザ光を照射する。【００１５】
特に、前記被照射層における致死させるべき細胞の直下の箇所に、当該細胞が即死せずある程度の時間が経過した後に致死するような出力またはエネルギ量を持つレーザ光を照射するレーザ加工機を構成することが好ましい。【００１６】
前記被照射層における致死させるべき細胞の直下の箇所に、当該細胞が即死しないような出力またはエネルギ量を持つレーザ光を複数回照射するレーザ加工機を構成することも好ましい。【００１７】
本発明に係るレーザ加工機は、前記細胞培養容器で培養した細胞群を複数の部分に分割する目的で用いることができる。その場合、前記被照射層における、培養した細胞をある部分と他の部分とに切り分ける境界線の直下の箇所にレーザ光を照射するものとする。【００１８】
本発明に係る細胞培養容器は、容器本体にレーザ光の照射を受けてこれを吸収する材料を含む層である被照射層が設けられているものであり、その被照射層の表面上で細胞が培養される。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、高速かつ短時間のレーザ照射処理を通じて、培養容器上で培養された細胞のうちの特定の細胞を致死させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の一実施形態におけるレーザ加工機の概要を示す斜視図。
【図２】同レーザ加工機のハードウェア資源構成を示す図。
【図３】同レーザ加工機の機能ブロック構成図。
【図４】同実施形態の細胞処理方法を説明する側断面図。
【図５】細胞培養容器の容器本体及び被照射部のそれぞれの光透過率及び光吸収率を示すグラフ。
【図６】被照射部の有無による細胞の死滅／生存の結果の違いを示す写真画像。
【図７】細胞がレーザ照射時に即死せずある程度の時間が経過した後に死に至ることを示す写真画像。
【図８】レーザの出力及び単位面積あたりのエネルギ量と細胞の死滅／生存の結果との関係を示す写真画像。
【図９】レーザの走査速度及びレーザ出力の好適値を概念的に示すグラフ。
【図１０】同実施形態の細胞処理方法により細胞コロニーを複数の部分に分割した結果を示す写真画像。
【図１１】同実施形態の細胞処理方法により細胞コロニーを複数の部分に分割した結果を示す写真画像。
【図１２】レーザ光を一回照射した場合の細胞の死滅／生存の結果を示す写真画像。
【図１３】レーザ光を二回照射した場合の細胞の死滅／生存の結果を示す写真画像。
【図１４】レーザ光を四回照射した場合の細胞の死滅／生存の結果を示す写真画像。
【図１５】レーザ光を六回照射した場合の細胞の死滅／生存の結果を示す写真画像。
【図１６】ビーム径を２０μｍに絞ったレーザの照射によっても細胞が死に至ることを示す写真画像。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の一実施形態を、図面を参照して説明する。本実施形態のレーザ加工機は、細胞培養容器１上で培養された細胞のうちの特定の細胞を致死させるレーザ照射処理を実行するものである。図１に示すように、本レーザ加工機は、一または複数の細胞培養容器１を支持する支持体２と、支持体２に支持させた細胞培養容器１にレーザビームＬを照射するレーザ照射装置３と、細胞培養容器１に対するレーザビームＬの照射位置を操作する変位機構４と、レーザ照射装置３及び変位機構４を制御する制御部５とを主要な構成要素とする。
【００２２】
細胞培養容器１及び支持体２は、ＣＯ２インキュベータ（図示せず）内に配置されることが好ましい。ＣＯ２インキュベータは、その内部の雰囲気のＣＯ２濃度及び温度を調節することのできる周知のものであり、レーザ照射処理中における細胞の培養環境、例えば細胞培養容器１に充填されている培地のｐＨ等を好適な状態に維持する役割を担う。
【００２３】
レーザ照射装置３は、レーザ光源３１と、レーザ光源３１から供給されたレーザ光Ｌを細胞培養容器１に向けて出射させる加工ノズル３３と、レーザ光源３１と加工ノズル３３との間に介在しレーザ光源３１が出力するレーザ光Ｌを加工ノズル３３へと導く光学系３２とを備える。
【００２４】
レーザ光源３１は、連続波レーザまたはパルスレーザ（連続波に近い、パルス幅の長い高周波レーザでもよい）Ｌを発振する装置である。使用するレーザＬの波長は一意に限定されず、例えば４０５ｎｍ、４５０ｎｍ、５２０ｎｍ、５３２ｎｍ、８０８ｎｍ等の可視光レーザや赤外線レーザを採用することができる。尤も、後述する細胞培養容器１の被照射層１２がそのレーザＬのエネルギを吸収できるような波長を選択する必要がある。また、波長が３８０ｎｍ以下の紫外線レーザは、ＤＮＡやタンパク質に吸収される可能性があり細胞への影響が懸念される。故に、レーザＬの波長は３８０ｎｍよりも長いことが好ましい。本実施形態では、レーザ光源３１として、波長が４０５ｎｍ近傍にある最大出力５Ｗの連続波ダイオードレーザを想定している。
【００２５】
加工ノズル３３は、細胞培養容器１の被照射層１２に照射するべきレーザ光Ｌを集光するためのレンズや、レーザ光Ｌの出射のＯＮ／ＯＦＦを切り替えるためのシャッタまたはミラー等を内蔵する。加工ノズル３３は、支持体２に支持される細胞培養容器１の下方に位置し、上方に向かってレーザＬを出射させる。加工ノズル３３から出射するレーザビームＬの光軸は、細胞培養容器１の被照射層１２に対して略直交する。
【００２６】
レーザ光源３１から加工ノズル３３に向けてレーザＬを伝搬させる光学系３２は、光ファイバ、ミラー、レンズ等の任意の光学要素を用いて構成できる。
【００２７】
変位機構４は、支持体２に支持させた細胞培養容器１に対してレーザ照射装置３の加工ノズル３３を相対的に変位させるＸＹステージを主体とする。ＸＹステージ４は、リニアモータ台車等を介して対象物をＸ軸方向（左右方向）及びＹ軸方向（前後方向）に沿って高速かつ精密に移動させ得る既知のものである。本実施形態では、加工ノズル３３をＸＹステージ４に支持させ、加工ノズル３３を支持体２及び細胞培養容器１に対して移動させることとしている。だが、支持体２をＸＹステージ４に支持させ、支持体２及び細胞培養容器１を加工ノズル３３に対して移動させるようにしても構わない。何れにせよ、変位機構４により、細胞培養容器１の被照射層１２とレーザビームＬの光軸とが交わる角度を略一定に保ちながら、細胞培養容器１の被照射層１２に対するレーザＬの照射位置を変位させることができる。
【００２８】
図２に示すように、制御部５は、プロセッサ５ａ、メインメモリ５ｂ、補助記憶デバイス５ｃ、操作入力デバイス５ｄ、Ｉ／Ｏインタフェース５ｅ等を有し、これらがコントローラ（システムコントローラやＩ／Ｏコントローラ等）によって制御されて連携動作するものである。補助記憶デバイス５ｃは、フラッシュメモリ、ハードディスクドライブ、その他である。操作入力デバイス５ｄは、手指で操作可能なタッチパネル、トラックパッド、マウス等のポインティングデバイスや、キーボード、押下ボタン等である。Ｉ／Ｏインタフェース５ｅは、サーボドライバ（サーボコントローラ）を含むことがある。また、制御部５は、汎用的なパーソナルコンピュータ、サーバコンピュータ、ワークステーション等により構成されることがある。
【００２９】
制御部５が実行するべきプログラムは、補助記憶デバイス５ｃに記憶されており、プログラム実行の際に、メインメモリ５ｂに読み込まれ、プロセッサ５ａによって解読される。そして、制御部５は、プログラムに従い、図３に示す照射位置座標取得部５１、出力制御部５２及び機構操作部５３としての機能を発揮する。
【００３０】
照射位置座標取得部５１は、細胞培養容器１に対するレーザ光Ｌの照射位置を指し示す一または複数のＸＹ座標を取得する。ここに言うＸＹ座標とは即ち、細胞培養容器１内に存在している培養細胞のうちの致死させるべき細胞の位置を指し示す座標である。致死させるべき細胞とは、例えば、培養したい細胞または組織に混入した不要細胞や、継代培養の目的で細胞培養容器１内の細胞コロニーを複数の細胞クランプに分割する際の複数のクランプの境界線上にある細胞等である。レーザ光Ｌの照射位置の座標は、予めメインメモリ５ｂまたは補助記憶デバイス５ｃに格納されていることもあれば、ユーザの手によって指定されることもある。照射位置座標取得部５１は、メインメモリ５ｂまたは補助記憶デバイス５ｃに格納されている照射位置の座標を読み出すか、ユーザによる照射位置の座標の指定を操作入力デバイス５ｄを介して受け付ける。
【００３１】
細胞培養容器１内の細胞コロニーをＣＣＤやＣＭＯＳ等のカメラセンサを用いて撮影し、得られた画像を解析して不要細胞その他の致死させるべき細胞の位置を特定するという形で、レーザ光Ｌの照射位置の座標を得ることもできる。画像解析を通じた致死させるべき細胞の位置の検出、即ちレーザ光Ｌの照射位置の座標の決定は、制御部５自身が実行してもよく、制御部５と通信可能に接続している外部の装置またはコンピュータ（図示せず）により実行してもよい。前者の場合、照射位置座標取得部５１は、カメラセンサが撮影した画像をＩ／Ｏインタフェース５ｅを介して取得し、その画像を解析して照射位置の座標を取得する。後者の場合、照射位置座標取得部５１は、外部の装置またはコンピュータからもたらされる照射位置の座標をＩ／Ｏインタフェース５ｅを介して受信することにより、照射位置の座標を取得する。
【００３２】
出力制御部５２は、加工ノズル３３から細胞培養容器１の被照射層１２に向けたレーザＬの出射のＯＮ／ＯＦＦ、及び被照射層１２に照射するレーザＬの出力強度つまりはレーザＬの持つエネルギ量を制御する。具体的には、加工ノズル３３からのレーザＬの出射のＯＮ／ＯＦＦを指令する信号をＩ／Ｏインタフェース５ｅを介して加工ノズル３３に与えるとともに、レーザＬの出力を制御する信号をＩ／Ｏインタフェース５ｅを介して加工ノズル３３またはレーザ光源３１に与える。
【００３３】
機構操作部５３は、加工ノズル３３を支持しているＸＹステージ４を操作することで、加工ノズル３３を照射位置座標取得部５１において取得した照射位置の座標に向けて移動させ、加工ノズル３３から出射するレーザビームＬの光軸を当該照射位置の座標に位置づける。具体的には、照射位置座標取得部５１において取得した照射位置の座標に対応する指令の信号を、Ｉ／Ｏインタフェース５ｅを介してＸＹステージ４に与える。加工ノズル３３から連続波レーザＬまたは連続波に近い高周波数パルスレーザＬを出射させつつ、照射位置の座標の時系列に従って加工ノズル３３ひいてはレーザビームＬを移動させれば、レーザＬを細胞培養容器１の被照射層１２に照射しながらその照射位置を連続的に移動させる走査を実行することができる。
【００３４】
なお、細胞培養容器１（の被照射層１２）における一定の領域を加工ノズル３３の光軸によってラスタスキャンするように、加工ノズル３３を細胞培養容器１に対して相対的に移動させながら、加工ノズル３３の光軸が死滅させるべき細胞の直下に到達するタイミングで、加工ノズル３３からレーザＬを出射させるようにしてもよい。
【００３５】
図４に示すように、本実施形態の細胞培養容器１は、加工ノズル３３から出射するレーザ光Ｌを透過させ得る容器本体１１に、レーザ光Ｌの照射を受けて熱及び／または酸を発生させる光応答性材料を含む層である被照射層１２を設けたものである。
【００３６】
容器本体１１は、加工ノズル３３から出射するレーザＬが属する波長帯の光を透過させる透明性または透光性を有する、プラスチックやガラス等の材料により構成する。プラスチックの例としては、ポリスチレン系ポリマー、アクリル系ポリマー（ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）等）、ポリビニルピリジン系ポリマー（ポリ（４−ビニルピリジン）、４−ビニルピリジン−スチレン共重合体等）、シリコーン系ポリマー（ポリジメチルシロキサン等）、ポリオレフィン系ポリマー（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン等）、ポリエステルポリマー（ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）等）、ポリカーボネート系ポリマー、エポキシ系ポリマー等を挙げることができる。既製の培養容器を、そのまま容器本体１１として用いてもよい。容器本体１１の形状は、既製の培養容器と同様、ディッシュ（シャーレ）形、マルチディッシュ形、フラスコ形等とすることができる。
【００３７】
図５に、ポリスチレン系樹脂を用いて作製した、ある大きさ及び形状の容器本体１１の光透過率を実線で表している。当該容器本体１１の光透過率は、光波長約３８０ｎｍ以上では８５％以上と非常に高い。一方で、光波長約３８０ｎｍ以下では、光波長が短くなるほど光透過率が低下、即ち容器本体１１による光の吸収が増大してゆく。これは、ポリスチレン材料に含まれる不純物に起因するものと思われる。
【００３８】
被照射層１２は、加工ノズル３３から出射するレーザＬが属する波長帯の光を吸収する色素構造（発色団）を含んだポリマー（高分子）により構成することが好ましい。このような材料は、容器本体１１へのコーティングが容易であり、必要な細胞の接着性を確保でき、かつ細胞への移行も起こりにくいものとなるからである。レーザ光Ｌを吸収する色素構造の例としては、アゾベンゼン、ジアリールエテン、スピロピラン、スピロオキサジン、フルギド、ロイコ色素、インジゴ、カロチノイド（カロテン等）、フラボノイド（アントシアニン等）、キノイド（アントラキノン等）等といった有機化合物の誘導体を挙げることができる。並びに、ポリマーを構成する骨格の例としては、アクリル系ポリマー、ポリスチレン系ポリマー、ポリオレフィン系ポリマー、ポリ酢酸ビニルやポリ塩化ビニル、ポリオレフィン系ポリマー、ポリカーボネート系ポリマー、エポキシ系ポリマー等を挙げることができる。
【００３９】
被照射層１２の材料となる色素構造含有ポリマーの一具体例として、ポリ［メチルメタクリラート−ｃｏ−（ジスパースイエロー  ７  メタクリラート）］（化１、（Ｃ５Ｈ８Ｏ２）ｍ（Ｃ２３Ｈ２０Ｎ４Ｏ２）ｎ）を示す。但し、このアゾポリマーにおけるアゾベンゼンの構造については、無置換のアゾベンゼンの他、ニトロ基やアミノ基、メチル基等で修飾した様々なバリエーションが考えられる。
【００４０】
【化１】
2016194454.tif 000003
【００４１】
上述の色素構造含有ポリマーを含む原料液、または当該色素構造含有ポリマーを溶剤（１，２−ジクロロエタン、メタノール等）に溶解させた原料液を、スピンコート法やキャスト法等により容器本体１１の上向面即ちウェル１０の底に塗布して硬化させれば、レーザ光Ｌの照射を受けて熱を生じさせる被照射層１２を形成することができる。なお、レーザ光Ｌを吸収する色素を容器本体１１の構成材料に含有させることで、または色素構造含有ポリマーを材料として容器本体１１を作製することにより、レーザ光Ｌの照射を受けて熱を生じさせる被照射層１２を形成しても構わない。
【００４２】
図５に、色素構造としてアゾベンゼンを有するポリマーを容器本体１１にコーティングして構成した、所定の厚みを有する被照射層１２の光透過率及び光吸収率を破線で表している。当該被照射層１２の光吸収率は、光波長が約３６０ｎｍのときにピークとなり、光波長が約３６０ｎｍから長くなるほど低下してゆく。この被照射層１２の光吸収率は、光波長が約４２５ｎｍ以上の領域で２０％を切る。だが、光波長が長くなってもある程度以上の光吸収性が存在しており、４０５ｎｍ、４５０ｎｍ、５２０ｎｍまたは５３２ｎｍの波長のレーザ光Ｌを当該被照射層１２に十分に吸収させることが可能である。
【００４３】
被照射層１２の材料として、上述の色素構造含有ポリマーとともに、またはこれに代えて、レーザ光Ｌの照射を受けて酸性物質を発生させる光酸発生剤を用いることも考えられる。上掲の特許文献１にも開示されている通り、光酸発生剤は、加工ノズル３３から出射するレーザＬが属する波長帯の光を吸収する色素構造（発色団）と、分解後に酸性物質となる酸前駆体とを備えた構造を有するものとすることが好ましい。スルホン酸誘導体、カルボン酸エステル類、オニウム塩類、ニトロベンズアルデヒド構造を有する光酸発生基等は、このような光酸発生剤に該当する。
【００４４】
特に、光酸発生剤となるスルホン酸誘導体の例として、チオキサントン系スルホン酸誘導体（スルホン酸１，３，６−トリオキソ−３，６−ジヒドロ−１Ｈ−１１−チア−アザシクロペンタ［ａ］アントラセン−２−イルエステル等）及びナフタレンイミド系スルホン酸誘導体（スルホン酸１，８−ナフタルイミド等）を挙げることができる。これら以外に、ジスルホン類、ジスルホニルジアゾメタン類、ジスルホニルメタン類、スルホニルベンゾイルメタン類、イミドスルホネート類、ベンゾインスルホネート類等のスルホン酸誘導体も採用することが可能である。
【００４５】
また、カルボン酸エステルの例として、１，８−ナフタレンジカルボン酸イミドメチルスルホネートや１，８−ナフタレンジカルボン酸イミドトシルスルホネート等を挙げることができ、オニウム塩の例として、テトラフルオロボレート（ＢＦ４−）、ヘキサフルオロホスフェート（ＰＦ６−）、ヘキサフルオロアンチモネート（ＳｂＦ６−）等のアニオンを有するスルホニウム塩またはヨードニウム塩を挙げることができる。
【００４６】
上述の光酸発生剤をプラスチック（特に、ＰＭＭＡのようなアクリル系ポリマーやポリスチレン系ポリマー等）に含ませた原料液、または当該光酸発生剤を溶剤（１，２−ジクロロエタン、メタノール等）に溶解させた原料液を、スピンコート法やキャスト法等により容器本体１１の上向面即ちウェル１０の底に塗布して硬化させれば、レーザ光Ｌの照射を受けて熱とともに酸を生じさせる被照射層１２を形成することができる。なお、光酸発生剤を容器本体１１の構成材料に含有させることにより、レーザ光Ｌの照射を受けて熱及び酸を生じさせる被照射層１２を形成しても構わない。
【００４７】
図５に、色素構造としてチオキサントン骨格を有し、酸前駆体としてスルホン酸類を有するチオキサントン系スルホン酸誘導体を含んだポリマーを容器本体１１にコーティングして構成した、所定の厚みを有する被照射層１２の光透過率及び光吸収率を鎖線で表している。当該被照射層１２の光吸収率は、光波長が約３７５ｎｍから約４６０ｎｍの範囲に亘って分布する。この範囲外の波長の光を当該被照射層１２が吸収することはできない。従って、４０５ｎｍまたは４５０ｎｍの波長のレーザ光Ｌであれば、当該被照射層１２に吸収させることが可能である。尤も、当該被照射層１２の光吸収率は、色素構造としてアゾベンゼンを有するポリマーを用いて構成した被照射層１２の光吸収率（破線）よりは小さくなる。即ち、この被照射層１２の光吸収率は、光波長が約４００ｎｍから約７００ｎｍの可視光領域で２０％（さらに言えば、１０％）を切る。
【００４８】
被照射層１２は、レーザ光Ｌの照射を受けて蛍光を発しない材料を用いて構成することが好ましい。また、被照射層１２の厚みは、１０μｍ以下とすることが好ましい。
【００４９】
なお、細胞培養容器１の被照射層１２の表面に、細胞の接着性を高めるための材料、例えばラミニンやマトリゲル等のＥＣＭ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）をコーティングしてもよい。
【００５０】
細胞を培養する際には、細胞培養容器１の容器本体１１に成形されているウェル１０内に培地（特に、液体培地）１３を充填する。その培地１３は、ウェル１０の底に敷設されている被照射層１２の直上に所在することとなる。そして、培養される細胞は、当該被照射層１２の表面に接着しつつ増殖して細胞コロニーを形成する。
【００５１】
図４に示すように、細胞培養容器１のウェル１０内に存在している細胞のうちの不要細胞のみを致死させるレーザ照射処理では、レーザ照射装置３の加工ノズル３３から出射するレーザ光Ｌを、支持体２に支持させた細胞培養容器１の被照射層１２における、致死させるべき細胞の直下の箇所に照射する。本実施形態では、加工ノズル３３を細胞培養容器１の下方に配置しており、加工ノズル３３から打ち上げたレーザ光Ｌを容器本体１１を透過させた上、被照射層１２に裏面側から照射する。加工ノズル３３に内蔵されているレンズは、加工ノズル３３から出射するレーザ光Ｌの焦点を細胞培養容器１の被照射層１２に合わせる。被照射層１２におけるレーザ光Ｌの照射を受けた箇所は、レーザ光Ｌのエネルギを吸収して熱及び／または酸を生じ、その熱によって当該箇所の直上に存在する不要細胞を死に至らしめる。
【００５２】
図６は、細胞培養容器１の容器本体１１の上向面即ちウェル１０の底に被照射層１２を敷設する領域Ｒ１と敷設しない領域Ｒ２とを設け、そのウェル１０内でＭＤＣＫ細胞（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ  ｃａｎｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ）を培養し、そのウェル１０の底に向けてレーザ照射装置３の加工ノズル３３から連続波レーザＬを照射して、しかる後（数時間経過後）トリパンブルー溶液による死細胞の染色を行った結果である。使用したレーザＬの波長は４０５ｎｍ、レーザＬ出力は５．０８Ｗ、レーザビームＬ径は５０μｍであり、連続波レーザＬを出射する加工ノズル３３即ちレーザビームＬを細胞培養容器１に対して５００ｍｍ／秒の速さで直線的に移動させる走査を一回実行している。レーザ光Ｌの照射箇所においてレーザ光Ｌが与える単位面積あたりのエネルギ量（エネルギ密度）は、約２５．９Ｊ／ｃｍ２となる。被照射層１２の構成材料は、色素構造としてアゾベンゼンを有しているポリマーである。
【００５３】
図６から明らかな通り、被照射層１２を敷設した領域Ｒ１内では、レーザ光Ｌの照射箇所の直上に存在していた細胞が死滅している。これに対し、被照射層１２を敷設していない領域Ｒ２内では、容器本体１１を透過したレーザ光Ｌの直射を受けたにもかかわらず細胞が生存している。
【００５４】
さらに、被照射層１２の構成材料に光酸発生剤を用いているならば、被照射層１２におけるレーザ光Ｌの照射を受けた箇所で酸性物質が発生し、その酸性物質が当該箇所の直上に存在する不要細胞の死または被照射層１２からの剥離を促す。光酸発生剤がスルホン酸誘導体である場合、発生する酸性物質はスルホン酸類である。
【００５５】
上記のように、レーザ光Ｌの波長、出力及びエネルギ量を、細胞に直射しても細胞が死に至らないような大きさに設定したとしても、被照射層１２の働きにより、不要な細胞を的確に死に至らしめることができる。
【００５６】
その上で、致死させるべき不要細胞以外の細胞への熱影響を最小限に抑えるためには、細胞培養容器１の被照射層１２に照射するレーザ光Ｌの波長、出力及びエネルギ量を、不要細胞が即死せずレーザ光Ｌの照射からある程度の時間が経過した後（例えば、数十分後、一時間後ないし数時間後）に致死するような大きさに調整することが好ましい。
【００５７】
図７は、被照射層１２を敷設した細胞培養容器１のウェル１０内でＭＤＣＫ細胞を培養し、そのウェル１０の底にある被照射層１２に向けて加工ノズル３３から連続波レーザＬを照射した後、所定の時間の経過を待ってトリパンブルー溶液による死細胞の染色を行った結果である。使用したレーザＬの波長は４０５ｎｍ、レーザＬ出力は５Ｗ、レーザビームＬ径は５０μｍである。この図示例では、０．５ｍｍ間隔で互いに平行な四本の筋を描画するように、レーザビームＬを細胞培養容器１に対して１５００ｍｍ／秒の速さで直線的に移動させる走査を、各筋毎に一回実行している。レーザ光Ｌの照射箇所においてレーザ光Ｌが与える単位面積あたりのエネルギ量は、約８．７Ｊ／ｃｍ２となる。被照射層１２の構成材料は、色素構造としてアゾベンゼンを有しているポリマーである。図７（Ａ）はレーザＬの照射から３分経過後にトリパンブルー染色したもの、図７（Ｂ）はレーザＬの照射から５６分経過後にトリパンブルー染色したもの、図７（Ｃ）はレーザＬの照射から１２２分経過後にトリパンブルー染色したものである。これらの図から明らかな通り、照射から３分後の時点ではレーザ光Ｌの照射箇所の直上に存在する細胞が生存しているが、５６分経過後にはレーザ光Ｌの照射箇所の直上に存在する細胞の少なくとも一部が死滅し、１２２分経過後にはレーザ光Ｌの照射箇所の直上に存在する細胞の殆どまたは全てが死滅していることが分かる。このように、レーザ光Ｌの照射直後は不要細胞が生存しており、その照射からある程度の時間が経過した後に不要細胞が死滅するという状況を作り出すことは可能である。そして、これにより、致死させるべき不要細胞以外の細胞、換言すれば不要細胞の周辺にある目的細胞または組織への熱影響を最小限に抑制することができるのである。
【００５８】
図８は、被照射層１２を敷設した細胞培養容器１のウェル１０内でＭＤＣＫ細胞を培養し、そのウェル１０の底にある被照射層１２に向けて加工ノズル３３から連続波レーザＬを照射して、所定時間が経過した後トリパンブルー溶液による死細胞の染色を行った結果である。使用したレーザＬの波長は４０５ｎｍ、レーザビームＬ径は５０μｍで統一しているが、レーザＬ出力及びレーザビームＬを細胞培養容器１に対して移動させる走査の速度の条件は、以下のように様々に変化させている：
（Ｉ）出力５Ｗ、走査速度２０００ｍｍ／秒、エネルギ密度約６．５Ｊ／ｃｍ２
（II）出力３．８６Ｗ、走査速度１６００ｍｍ／秒、エネルギ密度約６．１Ｊ／ｃｍ２
（III）出力２．４４Ｗ、走査速度１０００ｍｍ／秒、エネルギ密度約６．２Ｊ／ｃｍ２
（IV）出力１．８９Ｗ、走査速度８００ｍｍ／秒、エネルギ密度約６．０Ｊ／ｃｍ２
（Ｖ）出力１．６Ｗ、走査速度６４０ｍｍ／秒、エネルギ密度約６．４Ｊ／ｃｍ２
（VI）出力１．１１Ｗ、走査速度４００ｍｍ／秒、エネルギ密度約７．１Ｊ／ｃｍ２
（VII）出力０．８６Ｗ、走査速度３２０ｍｍ／秒、エネルギ密度約６．８Ｊ／ｃｍ２
（VIII）出力０．４Ｗ、走査速度２００ｍｍ／秒、エネルギ密度約５．１Ｊ／ｃｍ２
（IX）出力０．６Ｗ、走査速度５０ｍｍ／秒、エネルギ密度約３０．６Ｊ／ｃｍ２
（Ｘ）出力０．４Ｗ、走査速度５０ｍｍ／秒、エネルギ密度約２０．４Ｊ／ｃｍ２
（XI）出力０．４Ｗ、走査速度５０ｍｍ／秒、エネルギ密度約２０．４Ｊ／ｃｍ２
（XII）出力０．４Ｗ、走査速度５０ｍｍ／秒、エネルギ密度約２０．４Ｊ／ｃｍ２
レーザビームＬによる走査は、それぞれ一回ずつ実行している。被照射層１２の構成材料は、色素構造としてアゾベンゼンを有しているポリマーである。
【００５９】
レーザ光Ｌの照射箇所においてレーザ光Ｌが与える単位面積あたりのエネルギ量は、レーザＬ出力が大きいほど大きくなり、また走査速度が遅いほど大きくなる。レーザＬ出力が小さくとも、走査速度が遅ければ、つまりはレーザ光Ｌの照射箇所においてレーザ光Ｌを照射する時間が長ければ、当該照射箇所における被照射層１２が吸収するエネルギの量は大きくなる。だが、図８の（VII）及び（VIII）から明らかな通り、レーザＬ出力が小さいと、たとえ照射箇所に与えられるエネルギの量が一定以上あったとしても、当該照射箇所に所在する細胞は殆どまたは全く死滅しない。出力の小さいレーザＬを用いて不要細胞を確実に死滅させるためには、図８の（IX）ないし（XII）に示されるように、レーザビームＬによる走査の速度を十分に遅くして、照射箇所に与えられるエネルギの量をより大きくしなければならない。逆に、レーザＬ出力が大きければ、走査速度を高速化しても、照射箇所に所在する細胞を死滅させることができる。
【００６０】
加えて、図８の（IX）と（Ｘ）ないし（XII）との比較から明らかな通り、レーザＬの出力または単位面積あたりのエネルギ量の調整を通じて、致死させる細胞の幅または範囲の大きさを拡縮させることも可能である。即ち、レーザＬの出力及び／または単位面積あたりのエネルギ量が大きいほど、細胞が死滅する幅または範囲が拡大する。
【００６１】
図９に、細胞が死滅する幅または範囲がある一定の大きさとなるような、レーザビームＬの走査速度とレーザＬの出力との関係を概念的に示している。図９に示している線よりもレーザＬの走査速度を速め、またはレーザＬの出力を弱めると、細胞が死滅する幅または範囲が狭まる。レーザＬの走査速度が極端に速いか、レーザＬの出力が極端に小さくなれば、細胞は死ななくなる。逆に、図９に示している線よりもレーザＬの走査速度を遅め、またはレーザＬの出力を強めると、細胞が死滅する幅または範囲が拡がる。即ち、不要細胞に隣接する目的細胞または組織が受ける熱影響が大きくなる。
【００６２】
また、レーザＬの照射から不要細胞が死に至るまでの所要時間も、レーザＬの出力及び／または単位面積あたりのエネルギ量が大きいほど短くなると考えられる。
【００６３】
レーザ照射処理に用いるレーザＬの出力及び／または単位面積あたりのエネルギ量の好適な条件は、細胞培養容器１に設ける被照射層１２の構成材料や厚み等の影響を受ける。レーザ光Ｌの照射を受けた被照射層１２がレーザ光Ｌのエネルギを吸収して発生させる単位面積あたりの熱量は、被照射層１２に照射されるレーザ光Ｌの持つ単位面積あたりエネルギ量に、単位面積の被照射層１２が当該レーザ光Ｌのエネルギを吸収して利用できる割合である光利用率を乗じたものとなる。この光利用率は、被照射層１２の構成材料の性質即ち光吸収率に依存するのは勿論のこと、レーザ光Ｌを吸収して熱を発する光熱反応に寄与する材料が被照射層１２の単位面積あたりどれくらいの量存在しているかによっても変化する。容器本体１１に被照射層１２を形成するために塗布する構成材料の塗布厚みを増せば、光熱反応に寄与する材料の量が増加して、単位面積の被照射層１２の光利用率も増大する。従って、被照射層１２において発生する単位面積あたりの熱量が増し、その分細胞が死に至りやすくなる。よって、細胞培養容器１に設ける被照射層１２の光利用率に応じて、不要細胞の死滅処理に適したレーザＬの出力及び／または単位面積あたりのエネルギ量を実験的に求める必要がある。
【００６４】
本実施形態のレーザ加工機及び細胞培養容器１は、培養した細胞コロニーを複数の部分に分割する作業に好適に利用できる。図１０及び図１１に、ＥＣＭの一種であるマトリゲルを被照射層１２にコートした細胞培養容器１上でフィーダーレス培養したヒトｉＰＳ細胞をレーザ照射処理により多数の細胞クランプに分割し、得られた細胞クランプを新しい培地に移して再び培養する継代培養実験の結果を示す。使用したレーザＬの波長は４０５ｎｍ（実測されたスペクトル分布は３９９ｎｍから４０３ｎｍ）、レーザＬ出力は５Ｗ、レーザビームＬ径は５０μｍである。図示例では、レーザビームＬを細胞培養容器１に対して格子を描くように移動させる走査を行い、被照射層１２における、レーザＬの照射を受ける格子の部分の直上に存在する不要細胞を死滅させることにより、格子目の部分に存在する不要細胞以外の細胞の塊をクランプとして取り出そうとしている。つまり、細胞培養容器１上で培養した細胞コロニーを、格子に沿って切断している。レーザＬの照射を受ける格子の部分は、あるクランプと他のクランプとを隔てる境界線に相当する。
【００６５】
図１０に示している例では、０．４ｍｍ間隔で上記の格子の要素となる互いに平行な多数の筋を描画するように、レーザビームＬを細胞培養容器１に対して１０００ｍｍ／秒の速さで直線的に移動させる走査を、各筋毎に一回実行している。被照射層１２の構成材料は、色素構造としてアゾベンゼンを有しているポリマーである。そして、このポリマーを７μｇ／ｃｍ２の密度で容器本体１１の上向面即ちウェル１０の底に塗布することで、平均の厚みが７０ｎｍの被照射層１２をウェル１０の底に敷設している。図１０（Ａ）は、レーザＬの照射から不要細胞の死滅に要する時間が経過した後、細胞培養容器１の被照射層１２の表面に接着する細胞をその表面から剥離させるための酵素をウェル１０内に注入したものである。図１０（Ｂ）は、図１０（Ａ）の拡大である。生細胞である細胞クランプは、細胞培養容器１から剥離して丸まっている。図１０（Ｃ）は、レーザ照射処理を通じて得られた細胞クランプである。並びに、図１０（Ｄ）は、その細胞クランプを新しい培地に移して一日が経過した後の状態である。図１０（Ｄ）からは、元の細胞培養容器１から切り出した細胞クランプが順調に成長を始めていることが見て取れる。
【００６６】
図１０（Ａ）及び（Ｂ）において格子状をなしている細胞群は、レーザ照射処理により死滅した細胞である。図１０に示した例では、レーザＬの出力及び／または単位面積あたりのエネルギ量が最適値よりも大きかった可能性があり、レーザＬの出力及び／または単位面積あたりのエネルギ量をさらに低減させても適切に細胞クランプの切り出しを遂行できるものと思われる。
【００６７】
図１１に示している例では、０．４ｍｍ間隔で上記の格子の要素となる互いに平行な多数の筋を描画するように、レーザビームＬを細胞培養容器１に対して５００ｍｍ／秒の速さで直線的に移動させる走査を、各筋毎に一回実行している。被照射層１２の構成材料は、色素構造としてチオキサントン骨格を有し、酸前駆体としてスルホン酸類を有するチオキサントン系スルホン酸誘導体を含んだポリマーである。そして、このポリマーを２００μｇ／ｃｍ２の密度で容器本体１１のウェル１０の底に塗布することで、平均の厚みが２μｍの被照射層１２をウェル１０の底に敷設している。図１１（Ａ）は、レーザＬの照射から不要細胞の死滅に要する時間が経過した後、細胞培養容器１の被照射層１２の表面に接着する細胞をその表面から剥離させるための酵素をウェル１０内に注入したものである。図１１（Ｂ）は、図１１（Ａ）の拡大である。生細胞である細胞クランプは、細胞培養容器１から剥離して丸まる。図１１（Ｃ）は、レーザ照射処理を通じて得られた細胞クランプである。並びに、図１１（Ｄ）は、その細胞クランプを新しい培地に移して一日が経過した後の状態である。図１１（Ｄ）からは、元の細胞培養容器１から切り出した細胞クランプが順調に成長を始めていることが見て取れる。
【００６８】
図１０（Ａ）及び（Ｂ）と比べて、図１１（Ａ）及び（Ｂ）では、レーザ照射処理により死滅した細胞を明確に視認できない。また、一部の細胞クランプ同士が完全に切断されずに繋がっているようにも見受けられる。図１１に示した例では、レーザＬの出力及び／または単位面積あたりのエネルギ量が最適値よりも小さかった可能性があり、レーザＬの出力及び／または単位面積あたりのエネルギ量をより増大させることでさらによい結果を得られる余地があるように思われる。
【００６９】
本実施形態の細胞処理方法は、容器本体１１にレーザ光Ｌの照射を受けてこれを吸収する材料を含む層である被照射層１２が設けられた細胞培養容器１の被照射層１２の表面上で培養された細胞のうちの特定の細胞を致死させる方法であって、前記被照射層１２における致死させるべき細胞の直下の箇所にレーザ光Ｌを照射するものである。
【００７０】
本細胞処理方法、並びに本実施形態のレーザ加工機及び細胞培養容器１によれば、高速かつ短時間のレーザ照射処理を通じて、細胞培養容器１上で培養された細胞のうちの特定の細胞を致死させることが可能である。細胞培養容器１上の細胞コロニーのうち、所望の細胞に分化しなかった不要細胞のみをピンポイントで死滅させることができるだけでなく、細胞培養容器１（の被照射層１２）における一定の領域をレーザビームＬによりラスタスキャンすることで、当該領域に所在する細胞をおしなべて死滅させることもできる。
【００７１】
また、細胞培養容器１で培養した細胞群をある部分と他の部分とに切り分ける境界線の直下にあたる被照射層１２にレーザＬを照射すれば、培養した細胞をある部分と他の部分とに分割することができる。これは、継代培養のために均一な大きさの細胞クランプを簡便に抽出するために有効である。
【００７２】
上掲の特許文献１に開示されている方法では、対象の細胞を死滅させるために活性エネルギ線を照射する時間が長い。例えば、直径３５ｍｍの培養容器たるディッシュの全域を処理しようとすれば、約８時間かかる計算となる。これに対し、本実施形態の細胞処理方法では、レーザビームＬを細胞培養容器１に対して５００ｍｍ／秒以上の速度で走査しても不要細胞を的確に死滅させることができるため、レーザビームＬ径が５０μｍであれば直径３５ｍｍのディッシュ形の細胞培養容器１の全域を処理するのに約２．７分しかかからない。レーザビームＬの走査速度を１５００ｍｍ／秒とすれば、所要時間は１分を切る。本実施形態によれば、一定時間内に多数個の細胞処理容器に対してレーザＬ照射を実行し、当該処理容器内に存在する不要細胞を致死させる高速処理を実現でき、来たるべき再生医療用細胞の大量生産の実現に大きく寄与する。
【００７３】
細胞培養容器１に照射するレーザビームＬの径は５０μｍ以下に絞ることが可能であり、一個の細胞の寸法が２０μｍ以下であるヒトｉＰＳ細胞のような小形の細胞に対しても的確に処理を施すことができる。
【００７４】
さらに、細胞培養容器１の被照射層１２における致死させるべき細胞の直下の箇所に、当該細胞が即死せずある程度の時間が経過した後に致死するような出力またはエネルギ量を持つレーザ光Ｌを照射するようにすれば、致死させるべき細胞以外の細胞への熱影響を最小限に抑制でき、目的細胞または組織の収率をより一層向上させることができる。
【００７５】
なお、本発明は以上に詳述した実施形態に限られるものではない。上記実施形態では、細胞培養容器１の被照射層１２における致死させるべき細胞の直下の箇所に、当該細胞が即死せず（レーザ光Ｌの照射から数分程度では死に至らず）ある程度以上の時間が経過した後に致死するような出力またはエネルギ量を持つレーザ光Ｌを一回照射することで、対象の細胞を死滅させていた。これに対し、致死させる細胞以外の細胞への熱影響を最小限に抑制しながら、対象の細胞が死に至るまでの所要時間を短縮したいのであれば、上記実施形態と同様のレーザ加工機及び細胞培養容器１を用いて、細胞培養容器１の被照射層１２における致死させるべき細胞の直下の箇所に、一回照射しただけでは当該細胞が即死しないような出力またはエネルギ量を持つレーザ光Ｌを複数回照射すればよい。
【００７６】
図１２ないし図１５は、レーザ光Ｌの照射を受けて熱を生じさせる被照射層１２を敷設した細胞培養容器１のウェル１０内でｉＰＳ細胞を培養し、そのウェル１０の底にある被照射層１２に向けて加工ノズル３３から連続波レーザＬを照射した後、できるだけ間を置かずに（実際には、染色作業のために数分ないし十数分程度を要する）トリパンブルー溶液による死細胞の染色を行った結果である。なお、トリパンブルー染色前の洗浄及びトリパンブルー染色時に、一部細胞がウェル１０から剥がれ落ちている。使用したレーザＬの波長は４０５ｎｍ、レーザＬ出力は１Ｗ、レーザビームＬ径は５０μｍである。被照射層１２の構成材料は、色素構造としてアゾベンゼンを有しているポリマーである。図示例では、０．２ｍｍ間隔で互いに平行な複数本の筋を描画するように、レーザビームＬを細胞培養容器１に対して１００ｍｍ／秒の速さで直線的に移動させる走査を、各筋毎に一回ないし複数回実行している。レーザビームＬによる走査回数、即ちレーザ光Ｌの照射回数に関して、図１２は対象の細胞の直下の箇所に一回照射後すぐにトリパンブルー染色を実施した結果を示し、図１３は対象の細胞の直下の箇所に二回照射後すぐにトリパンブルー染色を実施した結果を示している。並びに、図１４は対象の細胞の直下の箇所に四回照射後すぐにトリパンブルー染色を実施した結果を示し、図１５は対象の細胞の直下の箇所に六回照射後すぐにトリパンブルー染色を実施した結果を示している。
【００７７】
図１２では、細胞が殆ど染色されていない。これは、レーザ光Ｌを一回照射してから数分ないし十数分後の時点では、照射箇所の直上に存在する細胞が生存していることを示している。これに対し、図１３ないし図１５では、細胞が染色されている。即ち、レーザ光Ｌの照射回数を二回以上に増やすことで、その照射から短い時間しか経過していなくとも、照射箇所の直上に存在する細胞が死に至るということが分かる。また、レーザ光Ｌの照射回数を二回から四回に増やすことで、レーザＬの照射直後の時期におけるトリパンブルー染色の強度が増している。つまり、レーザ光Ｌの照射回数を増やすほど細胞が短時間で死滅する、特にレーザ光Ｌを四回照射することで照射箇所の直上に存在する細胞がほぼ即死状態となることが明らかとなる。その一方で、図１３ないし図１５において、染色された細胞の幅はレーザビームＬの径である５０μｍ程度に抑えられている。このように、細胞が即死しないような出力またはエネルギ量を持つレーザ光を複数回照射する手法により、細胞が死に至るまでの所要時間を短縮しながら、致死させるべき細胞の周辺にある細胞への熱影響を最小限に抑制することが可能である。
【００７８】
しかして、図１４と図１５とを比較すると、レーザ光Ｌの照射回数を五回以上に増やしても、対象の細胞を短時間で死滅させる効果に違いは生じないことが分かる。
【００７９】
不要細胞を致死させるためのレーザ照射処理に使用するレーザＬの波長は、４０５ｎｍに限定されないことは言うまでもない。他の波長のレーザＬを採用する場合には、その波長の光を吸収することができる色素構造を含んだ材料（特に、ポリマー）を用いて細胞培養容器１の被照射層１２を構成することが求められる。例えば、波長が８０８ｎｍや１０６４ｎｍ等の近赤外線レーザＬを使用するのであれば、フタロシアニン類（フタロシアニン誘導体、フタロシアニン系近赤外線吸収色素）を材料として用いることが一案である。但し、その場合には、細胞に移行しないよう、ポリマーの側鎖に化学結合により固定されることが望ましい。また、配位錯体は、金属イオンが遊離することから、ポリマー化するものでも避けた方がよいと思われる。
【００８０】
レーザビームＬの径を、５０μｍよりもさらに小さく絞ってもよい。例えば、コア径の小さい光ファイバを加工ノズル３３に接続し、レーザ光源３１から供給されるレーザ光Ｌをこの光ファイバを通じて加工ノズル３３に入力するようにすれば、加工ノズル３３から出射するレーザビームＬの径を２５μｍ以下に絞ることができ、その分単位面積あたりのレーザＬのエネルギ量（エネルギ密度）が増す。これにより、レーザ光源３１の最大出力が大きくなくとも、レーザＬの照射箇所即ち不要細胞の存在する箇所に多量のエネルギをピンポイントに与えることが可能となる。
【００８１】
図１６は、レーザ光Ｌの照射を受けて熱を生じさせる被照射層１２を敷設した細胞培養容器１のウェル１０内でｉＰＳ細胞を培養し、そのウェル１０の底にある被照射層１２に向けて加工ノズル３３から連続波レーザＬを一回照射した後、一時間半経過後にトリパンブルー溶液による死細胞の染色を行った結果である。使用したレーザＬの波長は４０５ｎｍ、レーザＬ出力は０．１８Ｗ、レーザビームＬ径は２０μｍである。被照射層１２の構成材料は、色素構造としてアゾベンゼンを有しているポリマーである。図示例では、０．２ｍｍ間隔で互いに平行な複数本の筋を描画するように、レーザビームＬを細胞培養容器１に対して３００ｍｍ／秒の速さで直線的に移動させる走査を、各筋毎に一回実行している。
【００８２】
図１６において、染色された細胞の幅はレーザビームＬの径である２０μｍないし２５μｍ程度に抑えられている。これは、致死させるべき細胞の周辺にある細胞への熱影響を最小限に抑制できていることを示している。因みに、この幅は、ｉＰＳ細胞約二個分に相当する。レーザ光Ｌのビーム径を絞ることで、細胞の致死範囲が狭まり、収率の向上を期待できる。図１６に示す例では、レーザ光Ｌを一回だけ照射して一時間半経過後の細胞の死滅を確認しているが、ビーム径を２５μｍないし２０μｍ以下に絞ったレーザ光Ｌであっても同一箇所に複数回照射すれば、当然、対象の細胞が死滅するまでの所要時間をより短縮できると考えられる。
【００８３】
レーザビームＬを被照射層１２に照射したときの投影形状は、点状または円形状には限られない。レーザビームＬの投影形状を、所定方向に引き延ばした棒状のラインビームに成形しても構わない。ラインビームを用いれば、細胞培養容器１（の被照射層１２）における一定の領域をラスタスキャンするのに要する時間をより短縮できる。
【００８４】
上記実施形態では、継代培養のための細胞クランプを切り出す目的で、レーザビームＬを細胞培養容器１に対して格子を描くように移動させる走査を行っていたが、レーザビームＬによる走査の軌跡は格子状には限定されない。例えば、被照射層１２に複数の正六角形が隙間なく配列された六角網状（または、ハニカム構造）を描くように、即ち六角網状に細胞を死滅させるように、レーザビームＬを細胞培養容器１に対して移動させる走査を実行することが考えられる。その場合、六角形の内に残る生細胞が細胞クランプとなる。
【００８５】
上記実施形態では、支持体２に支持させた細胞培養容器１に向けてレーザＬを照射する加工ノズル３３をＸＹステージ４に搭載し、加工ノズル３３をＸ軸方向及びＹ軸方向に移動させるようにしていたが、細胞培養容器１を支持する支持体２をＸＹステージ等の変位機構４に搭載して、細胞培養容器１をＸ軸方向及びＹ軸方向に移動させるようにしても構わない。あるいは、加工ノズル３３と支持体２とのうち一方をＸ軸方向に走行可能なリニアモータ台車等に搭載し、他方をＹ軸方向に走行可能なリニアモータ台車等に搭載することにより、加工ノズル３３から出射するレーザビームＬを細胞培養容器１の被照射層１２に対して相対的にＸ軸方向及びＹ軸方向の両方向に変位させ得るようにすることも考えられる。
【００８６】
細胞培養容器１の被照射層１２に対するレーザＬの照射位置を変位させるための変位機構４として、ガルバノスキャナを採用してもよい。周知の通り、ガルバノスキャナは、レーザ光源３１から供給されるレーザ光Ｌを反射するミラーをサーボモータやステッピングモータ等によって回動させるもので、ミラーを介してレーザＬの光軸を高速に変化させることが可能である。尤も、ガルバノスキャナを採用する場合、細胞培養容器１の被照射層１２に対してレーザ光Ｌの光軸が交わる角度を厳密には一定に保つことができない。また、レーザ光源が半導体レーザ等であり、当該レーザ光源が発振するレーザを光ファイバ等を用いてガルバノスキャナまで伝送する場合、被照射層１２に照射されるレーザビームＬの径若しくは投影形状の寸法を極小に絞ることも容易でない。レーザビームＬの径若しくは投影形状の寸法を極小に絞ってエネルギ密度を高めるためには、ＸＹステージ４やリニアモータ台車のような、レーザビームＬの光軸を細胞培養容器１の被照射層１２に対して相対的に平行移動させ得る機構を用いることが好ましい。但し、ファイバーレーザをレーザ光源として採用することにより、被照射層１２に照射されるレーザビームＬの径若しくは投影形状の寸法を極小に絞ることができるようになる。
【００８７】
細胞培養容器１内の細胞を撮影するカメラセンサを、加工ノズル３３に付設することも考えられる。
【００８８】
細胞培養容器１内の細胞を撮影する際の照明光源として、加工ノズル３３から出射するレーザ光Ｌを利用することも考えられる。無論、その場合に加工ノズル３３から細胞培養容器１に照射するレーザＬの出力は、不要細胞を死滅させるために細胞培養容器１に照射するレーザＬの出力よりも十分に弱める必要がある。
【００８９】
上記実施形態では、細胞培養容器１の容器本体１１に成形されているウェル１０の底に被照射層１２の材料となるポリマーを塗布して被照射層１２を構成していた。だが、複数のウェルを包有するマルチディッシュ形の容器本体に、スピンコート等によりポリマーを塗布して被照射層を形成することは困難を伴う。そこで、レーザ光Ｌの照射を受けて熱を生じさせる材料を含有する板状体を作製し、この板状体を容器本体の各ウェルの底に設置または接着することにより、細胞培養容器の被照射層を構成するようにすることが考えられる。板状体は、レーザ光Ｌを透過させる透明性または透光性を有するプラスチックやガラス等の材料により構成した薄板にレーザ光Ｌを吸収する色素を塗布したものであってもよく、そのような薄板の構成材料にレーザ光Ｌを吸収する色素を含有させたものであってもよい。上記実施形態において述べた色素構造含有ポリマーや光酸発生剤を、レーザ光Ｌを吸収する色素として用いることも当然に可能である。
【００９０】
上記実施形態では、レーザ光Ｌを細胞培養容器１の下方から容器本体１１を透過させた上で被照射層１２に照射していたが、レーザ光Ｌを上方即ち被照射層１２の表面側から（容器本体１１を透過させずに）被照射層１２に直接照射することも考えられる。この場合、容器本体１１がレーザ光Ｌを透過させる透明性または透光性を有している必要はない。照射するレーザ光Ｌの焦点は、被照射層１２の上にある細胞に合わせるのではなく、被照射層１２に合わせることが好ましい。
【００９１】
細胞培養容器１を用いてｉＰＳ細胞その他の細胞を培養する場合に、フィーダー細胞を併用してもよい。本発明に係るレーザ加工機は、細胞培養容器１内の不要となったフィーダー細胞を死滅処理するためにも利用できる。
【００９２】
その他、各部の具体的構成は、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々変形が可能である。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明は、細胞培養容器上で培養された細胞のうちの特定の細胞を致死させる処理に用いることができる。
【符号の説明】
【００９４】
１…培養容器
１１…容器本体
１２…被照射層
３…レーザ照射装置
３３…加工ノズル
４…変位機構（ＸＹステージ）
５…制御部
Ｌ…レーザ光
【図１】
2016194454.tif 000004
【図２】
2016194454.tif 000005
【図３】
2016194454.tif 000006
【図４】
2016194454.tif 000007
【図５】
2016194454.tif 000008
【図６】
2016194454.tif 000009
【図７】
2016194454.tif 000010
【図８】
2016194454.tif 000011
【図９】
2016194454.tif 000012
【図１０】
2016194454.tif 000013
【図１１】
2016194454.tif 000014
【図１２】
2016194454.tif 000015
【図１３】
2016194454.tif 000016
【図１４】
2016194454.tif 000017
【図１５】
2016194454.tif 000018
【図１６】
2016194454.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成28年11月4日(2016.11.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器本体にレーザ光の照射を受けてこれを吸収し細胞を死に至らしめる熱を生じさせる材料を含む層である被照射層が設けられた細胞培養容器の被照射層の表面上で培養された細胞のうちの特定の細胞を致死させる方法であって、
前記被照射層における致死させるべき細胞の直下の箇所にレーザ光を照射する細胞処理方法。
【請求項２】
前記被照射層における致死させるべき細胞の直下の箇所に、当該細胞が即死せずある程度の時間が経過した後に致死するような出力またはエネルギ量を持つレーザ光を照射する請求項１記載の細胞処理方法。
【請求項３】
前記被照射層における致死させるべき細胞の直下の箇所に、当該細胞が即死しないような出力またはエネルギ量を持つレーザ光を複数回照射する請求項１記載の細胞処理方法。
【請求項４】
前記細胞培養容器で培養した細胞群を複数の部分に分割するための方法であり、
前記被照射層における、培養した細胞をある部分と他の部分とに切り分ける境界線の直下の箇所にレーザ光を照射する請求項１、２または３記載の細胞処理方法。
【請求項５】
容器本体にレーザ光の照射を受けてこれを吸収し細胞を死に至らしめる熱を生じさせる材料を含む層である被照射層が設けられた細胞培養容器の被照射層の表面上で培養された細胞のうちの特定の細胞を致死させるレーザ加工機であって、
前記被照射層における致死させるべき細胞の直下の箇所にレーザ光を照射するレーザ加工機。
【請求項６】
前記被照射層における致死させるべき細胞の直下の箇所に、当該細胞が即死せずある程度の時間が経過した後に致死するような出力またはエネルギ量を持つレーザ光を照射する請求項５記載の細胞処理方法。
【請求項７】
前記被照射層における致死させるべき細胞の直下の箇所に、当該細胞が即死しないような出力またはエネルギ量を持つレーザ光を複数回照射する請求項５記載の細胞処理方法。
【請求項８】
前記細胞培養容器で培養した細胞群を複数の部分に分割するためのものであり、
前記被照射層における、培養した細胞をある部分と他の部分とに切り分ける境界線の直下の箇所にレーザ光を照射する請求項５、６または７記載のレーザ加工機。
【請求項９】
請求項１、２、３または４記載の細胞処理方法の実施のために、あるいは請求項５、６、７または８記載のレーザ加工機とともに用いられるものであって、
容器本体にレーザ光の照射を受けてこれを吸収し細胞を死に至らしめる熱を生じさせる材料を含む層である被照射層が設けられ、その被照射層の表面上で細胞が培養される細胞培養容器。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明に係る細胞処理方法は、容器本体にレーザ光の照射を受けてこれを吸収し細胞を死に至らしめる熱を生じさせる材料を含む層である被照射層が設けられた細胞培養容器の被照射層の表面上で培養された細胞のうちの特定の細胞を致死させる方法であって、前記被照射層における致死させるべき細胞の直下の箇所にレーザ光を照射するものである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明に係るレーザ加工機は、容器本体にレーザ光の照射を受けてこれを吸収し細胞を死に至らしめる熱を生じさせる材料を含む層である被照射層が設けられた細胞培養容器の被照射層の表面上で培養された細胞のうちの特定の細胞を致死させるものであり、前記被照射層における致死させるべき細胞の直下の箇所にレーザ光を照射する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
本発明に係る細胞培養容器は、容器本体にレーザ光の照射を受けてこれを吸収し細胞を死に至らしめる熱を生じさせる材料を含む層である被照射層が設けられているものであり、その被照射層の表面上で細胞が培養される。
【国際調査報告】
2016194454.tif 000020
2016194454.tif 000021
2016194454.tif 000022
2016194454.tif 000023