(57)【要約】【課題】  光学測定において効果的にノイズを除去して微小な信号を感度よく検出する。【解決手段】  光学測定装置は、試料を励起するポンプ光を照射する第１光源と、前記励起された試料の変化を測定するプローブ光を照射する第２光源と、前記プローブ光を検出プローブ光と参照プローブ光に分割するビームスプリッタと、前記励起された試料を透過した前記検出プローブ光を受光する第１入力ポート、前記励起された試料を透過しない前記参照プローブ光を受光する第２入力ポート、及び前記検出プローブ光と前記参照プローブ光の差分を表わす電気信号を出力する出力端を有するバランス検出器と、前記バランス検出器の出力から所定のロックイン周波数で所望の信号を検出するロックイン増幅器と、を有する。
2015030202.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を励起するポンプ光を照射する第１光源と、
前記励起された試料の変化を測定するプローブ光を照射する第２光源と、
前記プローブ光を検出プローブ光と参照プローブ光に分割するビームスプリッタと、
前記励起された試料を透過した前記検出プローブ光を受光する第１入力ポートと、前記励起された試料を透過しない前記参照プローブ光を受光する第２入力ポートと、前記検出プローブ光と前記参照プローブ光の差分を表わす電気信号を出力する出力端と、を有するバランス検出器と、
前記バランス検出器の出力から、所定のロックイン周波数で所望の信号を検出するロックイン増幅器と、
を有する光学測定装置。
【請求項２】
前記プローブ光は、第１変調周波数で変調されており、
前記ポンプ光は、第２変調周波数で変調されており、
前記ロックイン増幅器は、前記第１変調周波数と前記第２変調周波数の差周波数の参照信号と、前記バランス検出器の出力とを入力として、前記差周波数で前記信号をロックイン検出することを特徴とする請求項１に記載の光学測定装置。
【請求項３】
前記第２光源は白色光源から所定の波長の光を選択して前記プローブ光として照射し、
前記第１光源は、前記白色光源から前記所定の波長以外の光を選択して前記ポンプ光として照射し、
前記ロックイン増幅器は、前記ポンプ光の強度を変調する光強度変調信号の変調周波数の参照信号と、前記バランス検出器の出力とを入力として、前記変調周波数で前記信号をロックイン検出することを特徴とする請求項１に記載の光学測定装置。
【請求項４】
前記バランス検出器は、前記参照プローブ光を光電変換して得られる参照光電流を所定の分割比で分割し、前記分割された一方の電流成分と、前記検出プローブ光を光電変換して得られる検出光電流との差分を電圧信号に変換して出力し、
前記所定の分割比は、前記電圧信号に含まれる直流成分が最小となるようにフィードバック制御されることを特徴とする請求項１に記載の光学測定装置。
【請求項５】
前記フィードバック制御の上限周波数は、前記ポンプ光と前記検出プローブ光で前記試料を走査する速度よりも大きく、前記ロックイン増幅器の前記ロックイン周波数よりも小さいことを特徴とする請求項４に記載の光学測定装置。
【請求項６】
前記ポンプ光と前記プローブ光を円環ビームに成形するビーム成形器と、
前記円環ビームに成形された前記ポンプ光と前記プローブ光を前記試料に入射させる第１光学系と、
をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の光学測定装置。
【請求項７】
前記ポンプ光と前記プローブ光を同軸に重畳する第２光学系、
をさらに有し、
前記ビーム成形器は、前記第１光学系と前記第２光学系の間に挿入されることを特徴とする請求項６に記載の光学測定装置。
【請求項８】
前記第１光源及び前記第２光源は、近赤外領域よりも短波長の可視領域のレーザー光を出射する半導体レーザーであることを特徴とする請求項１に記載の光学測定装置。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の光学測定装置と、
前記ポンプ光及び前記プローブ光に対して前記試料を相対的に走査する走査機構と、
前記ロックイン増幅器により前記試料上の各走査点で検出された前記信号を収集し、処理する演算処理部と、
を有することを特徴とする顕微イメージングシステム。
【請求項１０】
ポンプ光で試料を照射して前記試料を励起し、
プローブ光を検出プローブ光と参照プローブ光に分割して、前記検出プローブ光で、前記ポンプ光の照射と同時に前記試料を照射し、
前記試料を透過した検出プローブ光をバランス検出器の第１入力ポートで受光し、
前記試料を透過しない前記参照プローブ光を前記バランス検出器の第２入力ポートで受光し、
前記バランス検出器から、前記検出プローブ光と前記参照プローブ光の差分を表わす電気信号を出力し、
前記バランス検出器の出力から、所定のロックイン周波数で所望の信号を検出する、
ステップを含むことを特徴とする光学測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポンプ光とプローブ光を用いて高感度、高解像の光学測定を行う光学測定技術と、これを利用した顕微イメージングシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
光学顕微鏡は、原子間力顕微鏡と異なり、非接触で対象物を観察することができる。また、電子顕微鏡と異なり、生体の活動を生きたまま観察することができる。【０００３】
光学測定のひとつに、ポンプ光とプローブ光を用いたポンプ−プローブ測定法がある。ポンプ光を試料に入射して試料中の分子を励起し、別のレーザー光（プローブ光）を試料に入射してその透過率（または反射率）の変化を検出する。ポンプ−プローブ測定法は、分子の光励起状態のダイナミクスを高い時間分解能で測定することができ、光学材料や生体試料などの測定に広く適用されている。【０００４】
ポンプ−プローブ測定を顕微鏡下のナノスケールの空間分解能で行なう測定が、ポンプ−プローブ顕微測定である。この方法では、ビーム位置を試料上で走査し、各点でデータを取得することでポンプ−プローブ信号の顕微イメージを得ることができる。【０００５】
たとえば測定対象の分子が光を吸収する場合、その分子の誘導放出、励起状態吸収、励起に伴う基底状態にある分子の減少によるブリーチング、温度上昇による分子近傍の屈折率変化などがプローブ光の透過率変化に寄与する。このプローブ光強度の変化量は一分子あたり１０-６から１０-７である。光学顕微鏡の対物レンズを通したレーザービームの焦点面の体積は１０-１３ｃｍ３であり、その中に存在する分子数は限られているため、ポンプ−プローブ顕微測定で得られる信号は非常に小さい。【０００６】
微弱な信号を測定する方法に、ロックイン検出法がある。この方法は、設定したある周波数（ロックイン周波数）の三角関数と信号の積をとり、その周波数の信号を低周波に変換したあと、ローパルフィルタによって信号成分を取り出す。この点で、ロックイン検出は実効的に狭帯域のバンドパスフィルタとして働く。すなわちロックイン周波数と異なる周波数で観測されるノイズを除去し、ロックイン周波数付近にある信号を検出することによって、信号対ノイズ比を向上させる。また、ローパルフィルタの時定数を長く取ることにより、帯域幅を狭め、ノイズをより効果的に除去することができる。ポンプ−プローブ測定法では主にポンプ光強度をロックイン周波数で変調し、ポンプ光照射によるプローブ光の変調を、ロックイン増幅器を用いて検出する。【０００７】
しかしながら、ロックイン周波数付近で観測されるノイズは原理的に除去できない。また、ローパスフィルタの時定数を長くすると、信号の変化に対する応答が遅くなり、試料を走査しながら各点で測定して画像を得るために長時間の測定が必要となる。ノイズに埋もれたポンプ−プローブ顕微測定の微弱信号を検出するにはロックイン検出法に加えて、より根本的な対策が必要である。【０００８】
ポンプ−プローブ法では、試料を透過させた後のプローブ光の微弱な変化を検出するためプローブ光強度の揺らぎの影響を除去することが信号対ノイズ比の向上に有効である。一般に、レーザーの光強度の揺らぎは低周波領域が支配的であり、高周波ほどその影響が少ない。このため、数メガヘルツ（ＭＨｚ）から数十メガヘルツ（ＭＨｚ）の高周波のロックイン周波数でポンプ−プローブ顕微測定を行ってノイズの影響を軽減することが提案されている（たとえば、非特許文献１及び２参照）。【０００９】
ロックイン周波数を高く設定して信号対ノイズ比を向上させる方法には、以下の問題点あるいは限界がある。
（１）ロックイン周波数（ポンプ光の変調周波数）に試料の分子の応答が追従しないと、検出信号は測定できない。例えば蛍光分子の誘導放出信号を測定する場合、ロックイン周波数の上限は蛍光寿命の値により決まる。さらに蛍光分子の三重項状態を考慮した場合、その寿命はマイクロ秒であるため、数ＭＨｚ以上での光強度の変調は信号強度の低下を招く。そのため、生体の機能解析、医療や材料科学などの分野で必要とされる、反応中間体、三重項励起状態、ナノ構造体の熱拡散過程、高分子や蛋白質の構造変化などに起因するマイクロ秒からミリ秒の比較的遅い時間スケールの光励起ダイナミクスは測定できない。
（２）光源にパルス光を用いる場合、パルスの繰り返し周波数はロックイン周波数に比べて大きくなくてはならない。また、パルス間の強度の安定性が高い光源に限られるため、実際に用いることのできる光源の種類が制約される。現在、ポンプ−プローブ顕微鏡で用いられる光源は、主に近赤外の波長で数十ＭＨｚの繰り返し周波数を持つチタンサファイア発振器に限られており、特定の波長の光を得るには光パラメトリック増幅器等の波長変換のための大掛かりな装置が外部に必要となる。特に可視光全域の白色光源であるスーパーコンティニウム光はパルス間の強度揺らぎが大きいため、高周波ロックイン検出法でもノイズを除去することができない。
（３）半導体レーザーは小型、高効率で、近年さまざまな発振波長をもつ素子が開発されており、レーザー顕微鏡の連続発振光源として最適である。しかし、ノイズを低減するために光学系の戻り光の影響を抑える必要がある。また、動作電流や温度などの動作条件を安定化して、レーザー発振の縦モードが不安定に変動するモードホップを抑える必要がある。このような安定化機構を備えるにはコストがかかる。また、レーザー作用に本質的な量子雑音はギガヘルツ（ＧＨｚ）帯で共鳴状のピークを持ち、半導体レーザーで量子雑音を抑制するには光フィードバックなど特別な機構が必要である。【００１０】
なお、ポンプ−プローブ測定ではなく、気体試料のレーザー測定にバランス検出器を用いる構成が知られている（たとえば、特許文献１参照）。【００１１】
一方、通常の光学顕微鏡で観察できる構造の大きさは光の回折限界により決まり、波長の半分程度であるが、近年、光の回折限界を超えた様々な超解像光学顕微鏡が提案されている。１９９４年に提案されたＳＴＥＤ（stimulated emission depletion）顕微鏡では、励起された蛍光分子のうち焦点辺縁にある分子の発光を抑制するため、焦点面で円環状の強度分布をもつ一本のレーザー光（誘導放出光）を入射して超解像を実現する。ＳＴＥＤ顕微鏡では、回折限界値の４〜５倍程度（５０ｎｍ以下）の解像度で生体試料の観察が可能であるが、効率的に誘導放出を引き起こすためには数１００ｍＷ以上の高強度のレーザーが必要である。【００１２】
また、超短パルスレーザーを光源に用いて円環ビームと二光子励起法（蛍光顕微法、電流測定顕微法）を組み合わせてサイドローブを抑制し、解像度を向上する方法が報告されている（たとえば、非特許文献３及び４参照）。しかし、二光子励起では一光子励起の２倍の波長を有する近赤外の光源が必要となり、可視光源と比べ解像度向上に難がある上、高コストで実用化が困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第５１３４２７６号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】W. Min, S. Lu, S. Chong, R. Roy, G.R. Holtom, and X.S. Xie, “Imaging chromophores with undetectable fluorescence by stimulated emission microscopy”, Nature, 461, 1105-1109 (2009).
【非特許文献２】L. Tong, Y. Lie, B.D. Dolash, Y. Jung, M.N. Slipchenko, D.E. Bergstrom and J.X. Cheng, Nature nanotechnology 7 (1), 56-61 (2012)
【非特許文献３】S. W. Hell, et al. “Annular aperture two-photon excitation microscopy”, Optics Communications 117 (1995), 20-24
【非特許文献４】K. A. Serrels, et al. “70 nm resolution in subsurface optical imaging of silicon integrated-circuit using pupil-funcion engineering“, Applied Phyusics Letter 94, 073113 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
そこで、光源の種類を問わず、簡易な構造でノイズを低減し、高感度かつ高解像のポンプ−プローブ測定技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記課題を解決するために、任意の光源からのポンプ光とプローブ光を用いる光学測定において、バランス型ホモダイン検出を行ったあとにロックイン検出することで、光励起に起因する微弱な信号を高感度で検出する。【００１７】
また、ポンプ光とプローブ光を円環ビームとすることで、回折限界を超える高解像の測定を実現する。【００１８】
具体的には、本発明のひとつの側面における光学測定装置は、
試料を励起するポンプ光を照射する第１光源と、
前記励起された試料の変化を測定するプローブ光を照射する第２光源と、
前記プローブ光を検出プローブ光と参照プローブ光に分割するビームスプリッタと、
前記励起された試料を透過した前記検出プローブ光を受光する第１入力ポートと、前記試料を透過しない前記参照プローブ光を受光する第２入力ポートと、前記検出プローブ光と前記参照プローブ光の差分を表わす電気信号を出力する出力端と、を有するバランス検出器と、
前記バランス検出器の出力から、所定のロックイン周波数で所望の信号を検出するロックイン増幅器と、
を有する。【００１９】
好ましい構成例として、プローブ光を第１変調周波数で変調し、ポンプ光を第２変調周波数で変調し、ロックイン増幅器は、第１変調周波数と第２変調周波数の差周波数の参照信号と、バランス検出器の出力とを入力として前記差周波数で前記信号をロックイン検出する。【００２０】
別の好ましい構成例として、第１波長のポンプ光と、前記第１波長と異なる第２波長のプローブ光とを円環ビームに成形し、円環ビームに成形されたポンプ光とプローブ光を試料に入射して、試料を透過したプローブ光と試料を透過しない参照プローブ光とをバランス検出してから、前記所定のロックイン周波数で所望の信号をロックイン検出する。
【発明の効果】
【００２１】
光源の種類を問わずレーザーノイズを効率的に除去して、微小な光励起信号を感度よく検出することができる。さらに、ポンプ光とプローブ光に円環ビームを用いることで、回折限界を超える高解像の測定を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】第１実施形態の光学測定装置の概略構成図である。
【図２】図１の装置に適用される光源の構成例を示す図である。
【図３】図１の装置に適用される光源の別の構成例を示す図である。
【図４】バランス検出器によるノイズキャンセル効果を示す図である。
【図５】バランス検出器によるノイズキャンセル効果を示す図である。
【図６】第１実施形態の光学測定装置によるポンプ−プローブ顕微画像を示す図である。
【図７】第２実施形態の光学測定装置の概略構成図である。
【図８】円環ビームの焦点面での強度分布とポンプ−プローブ信号の点広がり関数を説明する図である。
【図９】第２実施形態のサイドローブ抑制効果を、ポンプ光による二光子励起の場合と比較して示す図である。
【図１０】金ナノ粒子のポンプ−プローブ顕微画像である。
【図１１】図１０の画像の横方向（ｘ方向）と縦方向（ｙ方向）の断面強度を示す図である。
【図１２】円環ビームを用いたときの蛍光ビーズのポンプ−プローブ顕微画像を、円形ビームを用いたポンプ−プローブ顕微画像と比較して示す図である。
【図１３】図１２の蛍光ビーズを標識するナイルレッドの励起スペクトル及び蛍光スペクトルと、図１２のＩ−Ｉ’ラインの断面強度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
図面を参照して、実施形態の光学測定の手法と構成を説明する。
＜第１実施形態＞
図１は、第１実施形態の光学測定装置１の概略構成図である。光学測定装置１は、ポンプ光源１１と、プローブ光源１２と、オートバランス検出器２０と、ロックイン増幅器３８を有する。ポンプ光源１１は、試料１０を光励起するためのポンプ光（Ｌ１）を照射する。プローブ光源１２は、光励起による試料１０の透過率変化を検出するためのプローブ光（Ｌ２）を照射する。ポンプ光とプローブ光は、空間モードを整え、且つビーム径を拡大するため、対物レンズとピンフォールで構成される空間フィルタ１３、１４にそれぞれ導かれる。プローブ光Ｌ２は、ビームスプリッタ１５により分割される。
【００２４】
分割された一方のプローブ光は、参照光（Ｌ２ref）として、減光フィルタ１７を通してオートバランス光検出器２０の参照光検出ポート２１に入射する。もう一方のプローブ光は検出光（Ｌ２det）として、ダイクロイックミラー１８を介してポンプ光と空間的に重ね合わせられて、対物レンズ３１を介して試料１０に入射する。対象とする分子が光を吸収する場合、分子の誘導放出、励起状態吸収、励起に伴う基底状態の分子の減少によるブリーチングなどが検出プローブ光の透過率変化に寄与する。試料１０からの透過光は集光レンズ３２によりコリメートされる。
【００２５】
試料１０を透過した後のポンプ光と試料１０から発生する蛍光は、色ガラスフィルターまたは狭帯域干渉フィルタ３３によりブロックされ、検出情報をのせたプローブ光（検出信号光Ｌ２det）のみがオートバランス検出器２０の信号光検出ポート２２に入射する。参照光検出ポート２１で、参照光Ｌ２refは図示しないフォトダイオードに入射し、電流に変換される。同様に、信号光検出ポート２２で、検出信号光Ｌ２detは図示しない別のフォトダイオードに入射し、電流に変換される。
【００２６】
オートバランス検出器２０の内部で、参照光電流は２つに分割され、一方の参照光電流と検出信号光電流の間で引き算が行われる。参照光電流の分割比は、引き算後の電流のＤＣ成分がゼロになるようにフィードバック制御される。参照光電流と検出信号光電流の引き算により、２つのチャンネル間のコモンモードノイズ（レーザーノイズ）はキャンセルされる。また、参照光電流の分割比を、引き算後のＤＣ成分がゼロになるように制御することで、検出信号光と参照光の強度比のアンバランスをキャンセルすることができる。すなわち、ビーム走査中の透過光は、試料１０の屈折率や定常吸収の不均一等に起因して変動し、検出信号光と参照光の強度比のアンバランスを引き起こすが、このアンバランスを分割比のフィードバック制御によりキャンセルすることができる。
【００２７】
オートバランス検出器２０からの出力は、ロックイン増幅器３８に接続され、試料１０の光励起に起因する情報を乗せた信号が検出される。試料１０を可動ステージ３５に取り付け、試料位置を走査して各点でデータを検出することで試料１０のイメージを構築することができる。光学測定装置１は、走査を制御するために、コンピュータ３６およびステージ制御器３４を備える。コンピュータ３６はロックイン増幅器３８の汎用出力ポートまたはＤＡ変換器３７を介してステージ制御器３４に接続され、可動ステージ３５のアクチュエータ（不図示）を制御する。またコンピュータ３６はロックイン増幅器３８を制御して、測定データを収集する。
【００２８】
ロックイン増幅器３８には、ロックイン参照信号が入力される。後述するように、実施形態のロックイン参照信号は、プローブ光の変調信号と、ポンプ光の変調信号の差周波成分（｜ω1−ω2｜）により生成される。オートバランス検出器２０において、参照光電流の分割比のフィードバック制御回路の上限周波数は、試料走査速度（１ピクセルあたりの測定時間）より大きく、かつ、ロックイン増幅器３８に入力されるロックイン参照信号の周波数より小さく設定される。これにより、オートバラインス検出器２０にて、レーザーノイズと、試料スキャン中の検出信号光と参照光の強度比アンバランスを同時にキャンセルし、ロックイン増幅器３８で光励起に起因するポンプ−プローブ信号のみを検出することができる。
【００２９】
図２は、図１の光学測定装置１で用いられる光源システム２を示す。図２の例では、連続発振レーザーを用いてポンプ−プローブ顕微システムを実現する。
【００３０】
ポンプ光とプローブ光の光源として、波長の異なる２つの連続発振半導体レーザー７４および６４を用いる。ロックイン検出を行うために、半導体レーザー６４の光強度を変調する信号発生器４１と、半導体レーザー７４の光強度を変調する信号発生器４２が配置される。
【００３１】
信号発生器４１からの変調信号は、分配器４３、増幅器６２、バイアス・ティー６３を通して半導体レーザー６４に入力される。増幅器６２、バイアス・ティー６３および半導体レーザー６４は、シールドケース６１内に収容され、バイアス・ティー６３にレーザー電源６５が接続される。同様に、信号発生器４２からの変調信号は、分配器４４、増幅器７２、バイアス・ティー７３を通して半導体レーザー７４に入力される。増幅器７２、バイアス・ティー７３および半導体レーザー７４は、シールドケース７１内に収容され、バイアス・ティー７３にレーザー電源７５が接続される。シールドケース６１，７１を用いることで、不要輻射による半導体レーザー６４と半導体レーザー７４の間の電気的干渉を抑える。
【００３２】
信号発生器４１で生成される変調信号に同期して、プローブ光用の半導体レーザー６４を駆動するバイアス電流に、外部から変調信号が印加される。バイアス電流はレーザー電源６５からバイアス・ティー６３を介して半導体レーザー６４に印加される。信号発生器４２で生成される変調信号に同期して、ポンプ光用の半導体レーザー７４を駆動するバイアス電流に、外部から変調信号が印加される。バイアス電流はレーザー電源７５からバイアス・ティー７３を介して供給される。この構成でキロヘルツ（ｋＨｚ）からギガヘルツ（ＧＨｚ）の広帯域にわたって変調することができる。
【００３３】
分配器４３から分岐されて出力と分配器４４から分岐された出力は、ロックイン増幅器３８のロックイン参照信号の生成のために用いられる。分配器４３は、信号発生器４１からの信号を、３０ｄＢ減衰器４５、増幅器４７を通して周波数ミキサー４９に接続する。分配器４４は、信号発生器４２からの信号を、３０ｄＢ減衰器４６、増幅器４８を通して周波数ミキサー４９に接続する。減衰器４６は、信号発生器４２によるω２成分を減衰させて信号発生器４１の変調信号（ω１）に対する影響を除去する。減衰器４５は、信号発生器４１によるω１成分を減衰させて信号発生器４２の変調信号（ω２）に対する影響を除去する。低周波フィルタ５１により、周波数ミキサー４９の出力から差周波成分（｜ω１−ω２｜）が取り出されロックイン増幅器３８の参照信号入力ポート３９に接続される。
【００３４】
このように、プローブ光とポンプ光をそれぞれ異なる周波数（ω１，ω２）で変調し、試料１０を透過後のプローブ光強度変化の差周波成分（｜ω１−ω２｜）をロックイン検出する。ポンプ光とともにプローブ光を変調することで、差周波を固定した状態でそれぞれの変調周波数を変えることができ、高速検出器や高速ロックイン増幅器を用いなくても、試料分子の応答を広い周波数領域にわたって測定することができる。またプローブ光を変調することで、発振縦モードをマルチモード化し、ノイズを軽減することができる。
【００３５】
図３は、図１の光学測定装置１で用いられる別の光源システム３の概略図である。図３の例では、スーパーコンティニウム光源８１を使用する。スーパーコンティニウム光源８１は、約４５０ｎｍから２μｍの広帯域の波長が得られる白色パルス光源８１である。白色パルス光源８１に含まれる赤外光は、赤外カットフィルタ８２により除去される。また白色パルス光源８１の偏光はランダムであるため、偏光プリズム８３を用いて特定の直線偏光の光のみを取り出す。さらに、ダイクロイックミラー８４を使って、５０５ｎｍ以上の波長の光を透過してプローブ光に用い、それ以下の波長の光を反射してポンプ光に用いる。
【００３６】
ダイクロイックミラー８４の透過光は、干渉フィルタ８５により特定の波長帯の光のみが選択されて、プローブ光として出射される。ダイクロイックミラー８４の反射光は、ミラー８６により光強度変調器８７に導かれ、ポンプ光の光強度が変調される。光強度変調器８７は、光強度変調制御器８８を介して信号発生器８９により制御される。信号発生器８９から分配される信号が、ロックイン増幅器３８のロックイン参照信号として用いられる。
【００３７】
図３の例では、白色パルス光源８１、ダイクロイックミラー８４、及び干渉フィルタ８５でプローブ光源を構成する。また、白色パルス光源８１、ダイクロイックミラー８４及び光強度変調器８７でポンプ光源を構成する。ロックイン参照信号は、ポンプ光の変調周波数を有する。
【００３８】
図４は、図１の光学測定装置１に組み込まれたオートバランス検出器２０のレーザーノイズのキャンセリング効果を示す。図４（Ａ）は、図２の連続発振半導体レーザー６４、７４を含む光源システム２を用いたときのプローブ光のノイズスペクトルを、図４（Ｂ）は、図３のスーパーコンティニウム（白色パルス）光源８１を含む光源システム３を用いたときのプローブ光のノイズスペクトルを示す。
【００３９】
図４（Ａ）で、上側のスペクトルがバランス前のスペクトル、下側のスペクトルがバランス後のスペクトルである。連続発振半導体レーザー６４として、発振波長が６５５ｎｍの半導体レーザーを用い、オートバランス検出器２０の信号光検出ポート２２に入射するプローブ光の強度は６４０μＷである。レーザーノイズは０から２００ｋＨｚの領域で約２０ｄＢ低減される。
【００４０】
図４（Ｂ）で、上側のスペクトルがバランス前のスペクトル、下側のスペクトルがバランス後のスペクトルである。図３の干渉フィルタ８５を用いて６４０±５ｎｍの波長のプローブ光のみを検出している。スーパーコンティニウム光源８１のパルスの繰り返し周波数は４０ＭＨｚである。オートバランス検出器２０の信号光検出ポート２２に入射するプローブ光の強度は６４０μＷである。スーパーコンティニウム光源８１はパルス間の揺らぎが非常に大きい（最大２０％（ｒｍｓ））不安定な光源であり、オートバランス検出器２０を作動させない場合は、レーザーノイズは、−５０ｄＢｍ程度である。一方、オートバランス検出器２０を作動させた場合、レーザーノイズは−８５ｄＢｍにまで低減する。このときの光強度対雑音比は、最大でも１０−６である。光励起によるプローブ信号の強度変化は一分子あたり１０−７から１０−６であり、ビーム焦点内の微小体積にある少数分子からの信号を測定することができる。ビーム走査中の透過率変動の影響も、オートバランス検出器２０での自動調整機構（参照光電流の分割比のフィードバック制御）でキャンセルされ、光励起に起因した信号のみを高感度で検出できることがわかる。
【００４１】
図５は、実施形態の光学測定装置１を用いた試料１０の測定結果である。図５（Ａ）はオートバランス検出器２０を動作させたときの顕微画像、図５（Ｂ）はオートバランス検出器２０を動作させない場合の顕微画像である。図５（Ｃ）は、図５（Ａ）と図５（Ｂ）のＸ−Ｘ’ラインに沿った信号強度を示す図である。
【００４２】
試料１０には、オートバランス処理の有無にかかわらず、６５０ｎｍにピーク蛍光波長を持つＣｄＳｅ／ＺｎＳ量子ドットで標識したマウスＴ細胞を用いた。光源として、図２に示した連続発振半導体レーザーを有するポンプ光源１１とプローブ光源１２を用いた。ポンプ光とプローブ光は、それぞれ４８８ｎｍと６６０ｎｍの発振波長を持つ。ポンプ光で量子ドットを光励起する。プローブ光の波長は量子ドットの蛍光スペクトルにオーバーラップしており、検出されるポンプ-プローブ信号は主に誘導放出に起因している。ポンプ光とプローブ光を、それぞれ３ＭＨｚと３．１２ＭＨｚで変調し、ロックイン参照信号の周波数を二つの差周波（１２０ｋＨｚ）に設定する。
【００４３】
試料１０へ入射したポンプ光とプローブ光の出力は、それぞれ１ｍＷと２１０μＷである。ロックイン増幅器３８の時定数は５ｍｓ、ピクセルサイズは０．４μｍ×０．４μｍ、画像サイズは２０μｍ×２０μｍである。図５（Ｂ）でオートバランス検出器２０を動作させない場合は、信号光ポート２２の出力を直接ロックイン増幅器３８に接続した。
【００４４】
図５（Ａ）でオートバランス検出器２０を動作させた場合は、細胞の表面に標識された量子ドットの鮮明なイメージが得られるが、図５（Ｂ）では、細胞を視覚的に認識することができない。図５（Ｃ）のＸ−Ｘ’断面の信号強度を比較すると、画像のバックグラウンドノイズは、オートバランス機能を用いた場合１．５×１０−６（ｒｍｓ）であるのに対し、バランス機能を用いない場合は９．８×１０−６（ｒｍｓ）である。このことから、特別な安定化機構を備えない連続発振半導体レーザーを光源に用いた場合でも、従来はバックグラウンドノイズに埋もれて検出できなかった微小な信号を高感度で検出できることがわかる。
【００４５】
図６は、光学測定装置１による顕微画像の空間分解能を評価するためのポンプ−プローブ画像である。実施形態のポンプ−プローブ光学測定装置１では、信号強度がポンプ光とプローブ光の積で決まる。この非線形特性により、二つのレーザービームが重なり合わさったとき、光強度の強い焦点中心部分にある分子からの信号が選択的に検出される。すなわち試料１０からの検出領域を狭い範囲に限定することができ、光の回折限界を超えた超解像が実現できる。
【００４６】
実施形態の光学測定装置１の空間分解能を評価するために、非発光性の金ナノ粒子のポンプ−プローブ顕微画像を測定した。金ナノ粒子にレーザーを入射すると、プラズモン共鳴により光は吸収され、その際の基底状態の分布の減少がプローブ光の透過率を変化させる。試料１０として、サイズが２０ｎｍの金ナノ粒子水溶液をガラス基板上に滴下し乾燥させた試料を用いて、ポンプ−プローブ顕微画像を取得した。
【００４７】
図６（Ａ）は、試料１０を光軸と垂直な面（ｘ-ｙ平面）に走査したときの画像、図６（Ｂ）は光軸に対して平行な面（ｘ-ｚ平面)に走査した時の（深さ方向の）画像である。図６（Ａ）の矢印で示す明るい点が個々の金ナノ粒子であり、そのサイズは半値全幅で２８４ｎｍ±３２ｎｍである。回折理論により計算されるビーム径のサイズは、ポンプ光とプローブ光でそれぞれ３１３ｎｍ、３４１ｎｍであるから、実施形態のポンプ−プローブ測定で超解像が実現されていることが確認される。
【００４８】
一方、図６（Ｂ）から光軸方向（深さ方向）の分解能は１．１±０．１μｍである。回折理論により計算される光軸方向のスポットサイズは、ポンプ光とプローブ光でそれぞれ１．０８μｍ、１．１８μｍであり測定値とほぼ同等である。ビームのコリメート方法の改善、特に対物レンズの後焦点面でのビーム強度の均一性を向上させることで、面内方向の分解能のさらなる向上と、光軸方向（深さ方向）での超解像が得られると期待できる。
【００４９】
以上述べたように、オートバランス検出器を用いることで、汎用半導体レーザーや白色光源を用いた場合でも、レーザーノイズや光源のバックグラウンドノイズを相殺するとともに、試料や走査機構の不均一に起因する参照光と検出信号光の強度のアンバランスを低減する。この構成により、特別な光源や光源安定化機構を用いなくても、ポンプ−プローブ測定において微小な情報信号を高感度で取り出すことができる。
【００５０】
さらに、ポンプ光とプローブ光の差周波を一定にして変調周波数を変えることで、広い周波数領域にわたって試料の応答を測定することができる。また、ポンプ光とプローブ光の差周波成分をロックイン参照信号とすることで、高周波ロックイン検出法に頼らずに低ノイズの信号を検出することができる。
＜第２実施形態＞
図７は、第２実施形態の光学測定装置１０１の概略構成図である。第２実施形態では、ポンプ光とプローブ光に円環ビームを用いて回折限界を超える高解像の測定を実現する。図７（Ａ）に示すように、光学測定装置１０１は、試料１３０を光励起するポンプ光Ｌ１を照射する第１の光源１１１と、光励起による試料１３０の変化を検出するプローブ光Ｌ２を照射する第２の光源１１２と、バランス検出器１２３と、ロックイン増幅器１２４を含む。
【００５１】
第２実施形態では、ポンプ光Ｌ１の光源１１１として波長４８８ｎｍの半導体レーザーを用い、プローブ光Ｌ２の光源１１２として波長６４０ｎｍの半導体レーザーを用いる。光源１１１、１１２はともに可視光を出力する安価な連続波の半導体レーザーである。
【００５２】
ポンプ光Ｌ１とプローブ光Ｌ２は、それぞれ空間フィルタ１１３、１１４を通過してその空間モードが整えられ、ダイクロイックミラー１１７で同軸に重ね合わせられる。ダイクロイックミラー１１７は、ポンプ光Ｌ１を全反射し、プローブ光Ｌ２を透過させる。ダイクロイックミラー１１７へ導かれるプローブ光Ｌ２の一部はビームスプリッタ１１５で分割され、参照光として、マルチモードファイバ（ＭＭＦ）１２２を介してバランス検出器１２３の参照光ポート１２１ｂに入力される。
【００５３】
ダイクロイックミラー１１７で重畳されたポンプ光Ｌ１とプローブＬ２は、円環アパーチャを有するフィルタ１２０を通過する。フィルタ１２０は、円環ビームを生成するビーム成形器として機能する。第２実施形態では、図７（Ｂ）に示すように、反射防止コーティング付き円形ガラス板２０１に直径φが６ｍｍの円形アルミシール２０２を張り付けて、環状部を有するフィルタ１２０を作製する。ポンプ光Ｌ１とプローブ光Ｌ２を通す環状部の厚さは、一例として１．２ｍｍとする。円環ビームを生成するフィルタ１２０を、ダイクロイックミラー１１７と後述する対物レンズ１２８の間の光路上の任意の位置に挿入するのが望ましいが、ポンプ光Ｌ１とプローブ光Ｌ２のそれぞれを円環ビームに成形した後に同軸に重畳してもよい。
【００５４】
フィルタ１２０で生成された円環ビームは、偏光ビームスプリッタ１２５を介して対物レンズ１２８に入射し、試料１３０へ導かれる。試料１３０を透過したポンプ−プローブ光は、コンデンサレンズ１２９で集光され、バンドパスフィルタ１３２およびレンズ１３３を介して、プローブ光Ｌ２のみがバランス検出器１２３の他方のポート１２１ａに入射する。
【００５５】
バランス検出器１２３は、レーザーノイズをキャンセルし、ショット雑音限界の高感度で測定するために、第１実施形態で用いたのと同様のオートバランス検出器であるのが望ましい。バランス検出器１２３では、ポート１２１ｂに入力される参照光（プローブ光の一部）と、ポート１２１ａに入力される試料１３０透過後の検出光が、それぞれ電流に変換される。参照光電流は２つに分割され、一方の参照光電流と検出光電流の引き算が行われる。参照光電流の分割比は、引き算後の電流のＤＣ成分がゼロになるようにフィードバック制御される。参照光電流と検出信号光電流の引き算により、２つのチャンネル間のコモンモードノイズ（レーザーノイズ）はキャンセルされて、ポンプ光Ｌ１の励起によって試料１３０に生じた変化の成分が出力される。参照光電流の分割比を、引き算後のＤＣ成分がゼロになるように制御することで、検出信号光と参照光の強度比のアンバランスをキャンセルすることができる。ビーム走査中の透過光は、試料１３０の屈折率や定常吸収の不均一等に起因して変動し、検出光と参照光の強度比のアンバランスを引き起こすが、このアンバランスを分割比のフィードバック制御によりキャンセルすることができる。
【００５６】
バランス検出器１２３の出力は、ロックイン増幅器１２４の入力に接続される。ポンプ光Ｌ１とプローブ光Ｌ２の強度は、それぞれω１、ω２で変調されており、ポンプ−プローブ信号である透過光の差周波成分｜ω１−ω２｜が、ロックイン増幅器１２４によりヘテロダイン的に検出される。本実施形態ではω１を１ＭＨｚ、ω２を１．０１５ＭＨｚとする。光源１１１および１１２に用いられるレーザダイオードへの注入電流を変調することで、光源１１１の光強度と光源１１２の光強度を変調する。
【００５７】
ロックイン増幅器１２４で検出されるのは、周波数｜ω１−ω２｜のビート信号である。このビート信号、すなわちポンプ−プローブ信号は、試料１３０でのポンプフィールドとプローブフィールドの相互作用によって生成され、試料１３０における光励起に起因する情報を乗せている。ロックイン検出に用いられる参照信号は、光源１１１の強度変調に用いた変調周波数ω１と、光源１１２の強度変調に用いた変調周波数ω２の差周波から生成される信号である。
【００５８】
試料１３０をピエゾステージ１３１に固定し、試料１３０を走査しながら各点でのポンプ−プローブ信号を検出・収集し、図示しない演算装置（図１の制御コンピュータ３７参照）でマッピング等の処理を行うことで、顕微画像を得ることができる。試料位置を確認するためにＣＭＯＳカメラ１２６が用いられ、バンドバスフィルタ１２７によりＣＭＯＳカメラ１２６へプローブ光Ｌ２だけが入射される。
【００５９】
図８と図９を参照して、動作原理を説明する。図８（Ａ）は円環ビームの模式図、図８（Ｂ）は焦点面での強度分布とポンプ−プローブ信号の点広がり関数（ＰＳＦ：point spreading function）を示す図である。
【００６０】
光学顕微鏡の空間解像度は、光ビームが対物レンズに入射したときの焦点面でのスポットサイズ（回折限界値）で決まり、その強度分布は入射ビームの形状に依存する。円環ビームが対物レンズ１２８に入射すると、焦点面での光強度分布の主ピークは、通常の円形ビームの場合と比べて鋭くなるが、主ピーク周辺に現れるサイドローブも強くなる。この現象は、図８（Ｂ）の太い実線（円環ポンプ光）と破線（円環プローブ光）で示されるとおりである。発明者らは、このサイドローブからの寄与を抑えることで、空間解像度を向上させることができることに思い至った。
【００６１】
図８（Ａ）において、ポンプ光Ｌ１とプローブ光Ｌ２の瞳面での円環の外径をＤ、内径をεＤ、レンズの焦点距離をｆとする。このとき、焦点面での動径方向ｒの強度分布はスカラー回折理論から式（１）及び式（２）で与えられる。
【００６２】
【数１】
2015030202.tif 000003
ここで、Ｉｃ(r)は円形ビーム（ε＝０）を入射したときの焦点での強度分布であり、ベッセル関数Ｊ１(x)を使って、式（３）で表現される。
【００６３】
【数２】
2015030202.tif 000004
式（２）のＮＡはレンズの開口数であり、試料３０中の屈折率をｎとすると、ＮＡ＝ｎＤ／ｆで与えられる。λは入射光の波長である。
【００６４】
一方、ポンプ−プローブ信号のＰＳＦは、ポンプ光とプローブ光の強度分布の積となる。図８（Ｂ）では、ポンプ光Ｌ１とプローブ光Ｌ２の波長をそれぞれ４８８ｎｍと６６０ｎｍ、ＮＡ＝０．９５に設定し、円形ビームの場合（ε＝０）と円環ビームの場合（ε＝０．８）の双方について、焦点面での強度分布とＰＳＦをシミュレーションしている。
【００６５】
個別の円環ビームに着目すると、中心部の主ピークは円形ビームの場合と比較して鋭くなるが、サイドローブも同時に大きくなる。その強度比ＳＬＲ（side lobe ratio）は約１５％であり、通常の蛍光顕微鏡ではこのサイドローブが像の解像度に悪影響をもたらす。
【００６６】
これに対し、ポンプ−プローブ信号のＰＳＦ（図８（Ｂ）の太い一点鎖線）は２つのビームの強度の積であるため、強度の強い部分が支配的になってＳＬＲが１％に減少し、かつ主ピークはさらに鋭くなる。その半値全幅は１６４ｎｍであり、円形プローブビームの回折限界値０．５１λ／ＮＡ＝３４４ｎｍと比べて１／２．１倍となる。また、円形ビームの場合のポンプ−プローブＰＳＦ（図８（Ｂ）の細い点線）の半値全幅の２１２ｎｍと比べて、１／１．３倍となり、解像度は向上する。
【００６７】
なお、円環ポンプ光Ｌ１と円環プローブ光Ｌ２の波長をそれぞれ５００ｎｍと６４０ｎｍにしたときの分解能は１１０ｎｍ、４００ｎｍと５２０ｎｍにしたときの分解能は９０ｎｍにまで向上する。実施形態の光学測定方法は、観察対象に応じて、最適な波長を選択することができ、測定の自由度が高い。
【００６８】
図９は、二色のポンプ光及びプローブ光を用いたときの効果を説明する模式図である。図９（Ａ）に示すように、ポンプ−プローブ法では、観測される信号はポンプ光Ｌ１とプローブ光Ｌ２との強度の積に比例し、強度の強い主ピークの中心部分に存在する分子から優先的に信号が検出される。また、サイドローブピークの位置は波長に依存するため、波長の異なる２色をポンプ光Ｌ１とプローブ光Ｌ２に用いることで、異なる位置にサイドローブが現れる。ポンプ光Ｌ１とプローブ光Ｌ２の波長を異ならせた場合（たとえばポンプ光Ｌ１の波長を４８８ｎｍ、プローブ光Ｌ２の波長を６６０ｎｍ）、２つの円環ビームを重ね合わせたときのサイドローブの寄与を、単一波長の場合と比べて約半分に抑制できる。
【００６９】
これに対し、図９（Ｂ）の従来の二光子励起測定法では、二光子を励起するポンプ光が照射され、同じ位置に現れるサイドローブピークが乗算されるため、ＳＬＲは２．３％になる。そもそも二光子励起法は、近赤外波長の超短パルス（フェムト秒〜ピコ秒）の照射による蛍光検出であることから、本発明とは構成も測定原理も異なる。二光子励起法は、チタンサファイヤレーザー等の高価で高い技術を持つ技術者によるメンテナンスの必要な光源を要し、解像度は可視光光源より低く実用化、商業化が困難である。
【００７０】
第２実施形態では、波長の異なる可視領域の円環ビームを用いてポンプ−プローブ信号を観測することで、低コストかつ簡易な構成で、焦点面でのサイドローブの影響を１／１０以下に抑制し、解像度を約２倍に向上する。
【００７１】
図１０および図１１は、第２実施形態の測定例１を示す。測定例１では、図７の光学測定装置１０１で試料中の金ナノ粒子を観察する。図１０（Ａ）は、ガラス基板上に分散させた金ナノ粒子のポンプ−プローブ顕微画像、図１０（Ｂ）は円環のポンプ−プローブビームを入射したときの単一の金ナノ粒子の顕微画像、図１０（Ｃ）は、円形のポンプ−プローブビームを入射したときの単一の金ナノ粒子の顕微画像である。
【００７２】
試料として、２０μｍの厚さのポリビニルアルコール（ＰＶＡ）中に、金ナノ粒子を３次元的に分散させものを用意する。円環のポンプ−プローブ光をスキャンした平面の近傍に位置する金ナノ粒子ほど、ポンプ−プローブ信号の強度が強くなる。
【００７３】
金ナノ粒子は、サイズ２０ｎｍでポンプ光Ｌ１の波長（４８８ｎｍ）でプラズモン共鳴により光を吸収する。このとき、金ナノ粒子近傍の温度上昇にともなう屈折率の微小な変化が、プローブ光Ｌ２を散乱・屈折させて光透過率の変化を引き起こし、ポンプ−プローブ信号に寄与する。
【００７４】
試料に入射するポンプ光の強度は０．７ｍＷ、プローブ光の強度は０．３ｍＷである。ロックイン増幅器の時定数は０．５ｍｓ、１ピクセル当たりの滞在時間は１ｍｓ、画像の解像度は３００×３００ピクセルである。
【００７５】
図１０（Ｂ）の円環ビームによる１個の金ナノ粒子のポンプ−プローブ顕微画像と、図１０（Ｃ）の円形ビームによる１個の金ナノ粒子のポンプ−プローブ顕微画像を比較すると、バランス検出後のロックイン検出により、図１０（Ｃ）でも金ナノ粒子を明確に観察することができるが、図１０（Ｂ）で円環ビームを用いることにより、金ナノ粒子の輪郭がより鮮明になっている。これは、異なる波長の円環ビームの重ね合わせにより主ピークが鋭くなる一方で、サイドローブが相殺され、解像度とコントラストの両方が向上するためである。
【００７６】
図１１（Ａ）は、図１０（Ｂ）と図１０（Ｃ）の顕微画像の横方向（ｘ方向）の断面強度を、図１１（Ｂ）は、図１０（Ｂ）と図１０（Ｃ）の顕微画像の縦方向（ｙ方向または入射光の偏光方向）の断面強度を示す。黒丸は、円環ビームを用いた場合（図１０（Ｂ））の断面強度、三角マークは、円形ビームを用いた場合（図１０（Ｃ））の断面強度である。データ点をつなぐ実線はガウシアンフィットを示す。
【００７７】
開口数が１に近い収束ビームのため、ｘ方向での解像度が、ｙ方向（入射光の偏光方向）と比べて、約５％高い。ガウス関数を使ったフィッティングから、図１１（Ａ）では、円環ポンプ−プローブビームを用いた場合の半値全幅は、１６２±４ｎｍ、円形ポンプ−プローブビームを用いた場合の半値全幅は、２３２±３ｎｍである。図１１（Ｂ）では、円環ポンプ−プローブビームを用いた場合の半値全幅は、１９６±６ｎｍ、円形ポンプ−プローブビームを用いた場合の半値全幅は、２４５±７ｎｍである。この測定結果によると、バランス型ホモダイン検出後のロックイン検出により、円形ポンプ−プローブビームでも十分に高い解像度が得られるが、円環ビームを用いることで円形ビームよりも解像度がさらに２０〜３０％向上する。この値は、上述の理論計算とほぼ一致する。
【００７８】
また、プローブ光の回折限界値（焦点面でのスポットサイズの半値全幅）は３４４ｎｍであるため、第２実施形態のように円環ポンプ−プローブビームを用いることで、通常の走査型光学顕微鏡の約２倍、解像度が向上する。
【００７９】
図１２および図１３は、第２実施形態の測定例２を示す。測定例２では、図７の光学測定装置１０１で試料中の蛍光ビーズを観察する。図１２（Ａ）は、円環ビームを入射した場合のガラス基板上に分散させた蛍光ビーズのポンプ−プローブ顕微画像、図１２（Ｂ）は、比較例として、ガラス基板上の同じ領域に円形ビームを入射した場合の蛍光ビーズのポンプ−プローブ顕微画像である。
【００８０】
蛍光ビーズのサイズは１μｍであり、６００ｎｍに蛍光スペクトルピークをもつナイルレッドで標識されている。ナイルレッドの励起スペクトルは、図１３（Ａ）の左側のカーブ、蛍光スペクトルは図１３（Ａ）の右側のカーブである。図１３（Ａ）に示すように、プローブ光の波長は蛍光スペクトルの長波長側と重なっている。この場合、誘導放出利得によるプローブ光の強度変化が主としてポンプ−プローブ信号に寄与する。
【００８１】
図１３（Ｂ）は、図１２（Ａ）と図１２（Ｂ）のＩ−Ｉ’ラインでの断面強度を示す図である。黒丸が図１２（Ａ）の円環ビームを用いた場合のポンプ−プローブ信号強度、三角マークが図１２（Ｂ）の円形ビームを用いた場合のポンプ−プローブ信号強度である。バランス型ホモダイン検出後にロックイン検出することで、円形ビームでも十分に鋭いスペクトルが得られるが、円環ビームを用いることで、立ち上がりがさらにシャープになっている。円環ビームを用いた場合、円形ビームを用いる場合と比較して解像度がさらに向上することがわかる。
【００８２】
測定例１、２の結果から、第２実施形態の光学測定方法は、金ナノ粒子のような非蛍光性物質にも、蛍光性物質にも適用可能であることがわかる。可視領域でのレーザー光を用いて非接触で微小な状態変化を測定できることから、生体内の観察、測定にも適用することができる。
【００８３】
第２実施形態の構成、手法は、２色のレーザー光を試料に入射し、試料からのポンプ−プローブ信号を測定することで、収束円環ビームの焦点近傍のサイドローブを抑制して、解像度を向上することができる。ビーム位置を走査しながらイメージング測定を行うことで、空間解像度を通常の光学顕微鏡と比べて２倍に向上することができる。
【００８４】
バランス型ホモダイン検出後のロックイン検出により低ノイズ、高感度の測定ができることは第１実施形態と同様である。また、第１実施形態、第２実施形態を通して、近赤外領域より短波長の２色の光を用いるので、低コスト、省スペースで維持管理の容易な連続発振半導体レーザーを光源として利用できる。第２実施形態では、さらに以下の利点を有する。
（１）超超解像イメージを得るための複雑な画像演算処理が不要なためアーティファクトを軽減できる。
（２）特別な蛍光色素を必要とせず、公知の超解像法では測定困難な金属ナノ粒子のような弱蛍光・非蛍光性の物質でも測定可能である。
（３）光励起分子のダイナミクス（電子エネルギー緩和、光励起キャリアの再結合、熱拡散など）の超解像測定が可能である。
【００８５】
本出願は、２０１３年８月３０日に出願された日本国特許出願第２０１３−１７８９５３号、及び２０１４年６月２４日に出願された日本国特許出願第２０１４−１２８９２０号に基づきその優先権を主張するものであり、同日本国特許出願の全内容を参照することにより本願に援用する。
【符号の説明】
【００８６】
１，１０１  光学測定装置
２、３  光源システム
１０、１３０  試料
１１、１１１  ポンプ光源（第１光源）
１２、１１２  プローブ光源（第２光源）
２０、１２３  バランス検出器
２１、１２１ｂ  参照光検出ポート
２２、１２１ａ  信号光検出ポート
３８、１２４  ロックイン増幅器
１２０  円環アパーチャを有するフィルタ（ビーム成形器）
【図１】
2015030202.tif 000005
【図２】
2015030202.tif 000006
【図３】
2015030202.tif 000007
【図４】
2015030202.tif 000008
【図７】
2015030202.tif 000009
【図８】
2015030202.tif 000010
【図９】
2015030202.tif 000011
【図１１】
2015030202.tif 000012
【図１３】
2015030202.tif 000013
【図５】
2015030202.tif 000014
【図６】
2015030202.tif 000015
【図１０】
2015030202.tif 000016
【図１２】
2015030202.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成27年1月28日(2015.1.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を励起するポンプ光を照射する第１光源と、
前記励起された試料の変化を測定するプローブ光を照射する第２光源と、
前記プローブ光を検出プローブ光と参照プローブ光に分割するビームスプリッタと、
前記励起された試料を透過した前記検出プローブ光を受光する第１入力ポートと、前記励起された試料を透過しない前記参照プローブ光を受光する第２入力ポートと、前記検出プローブ光と前記参照プローブ光の差分を表わす電気信号を出力する出力端と、を有するバランス検出器と、
前記バランス検出器の出力から、所定のロックイン周波数で所望の信号を検出するロックイン増幅器と、
を有し、
前記バランス検出器は、前記参照プローブ光を光電変換して得られる参照光電流を所定の分割比で分割し、前記分割された一方の電流成分と、前記検出プローブ光を光電変換して得られる検出光電流との差分を電圧信号に変換して出力し、
前記所定の分割比は、前記電圧信号に含まれる直流成分が最小となるようにフィードバック制御され、
前記フィードバック制御の上限周波数は、前記ポンプ光と前記検出プローブ光で前記試料を走査する速度よりも大きく、前記ロックイン増幅器の前記ロックイン周波数よりも小さいことを特徴とする光学測定装置。
【請求項２】
前記プローブ光は、第１変調周波数で変調されており、
前記ポンプ光は、第２変調周波数で変調されており、
前記ロックイン増幅器は、前記第１変調周波数と前記第２変調周波数の差周波数の参照信号と、前記バランス検出器の出力とを入力として、前記差周波数で前記信号をロックイン検出することを特徴とする請求項１に記載の光学測定装置。
【請求項３】
前記第２光源は白色光源から所定の波長の光を選択して前記プローブ光として照射し、
前記第１光源は、前記白色光源から前記所定の波長以外の光を選択して前記ポンプ光として照射し、
前記ロックイン増幅器は、前記ポンプ光の強度を変調する光強度変調信号の変調周波数の参照信号と、前記バランス検出器の出力とを入力として、前記変調周波数で前記信号をロックイン検出することを特徴とする請求項１に記載の光学測定装置。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
前記ポンプ光と前記プローブ光を円環ビームに成形するビーム成形器と、
前記円環ビームに成形された前記ポンプ光と前記プローブ光を前記試料に入射させる第１光学系と、
をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の光学測定装置。
【請求項７】
前記ポンプ光と前記プローブ光を同軸に重畳する第２光学系、
をさらに有し、
前記ビーム成形器は、前記第１光学系と前記第２光学系の間に挿入されることを特徴とする請求項６に記載の光学測定装置。
【請求項８】
前記第１光源及び前記第２光源は、近赤外領域よりも短波長の可視領域のレーザー光を出射する半導体レーザーであることを特徴とする請求項１に記載の光学測定装置。
【請求項９】
請求項１、２、３、６、７、８のいずれか１項に記載の光学測定装置と、
前記ポンプ光及び前記プローブ光に対して前記試料を相対的に走査する走査機構と、
前記ロックイン増幅器により前記試料上の各走査点で検出された前記信号を収集し、処理する演算処理部と、
を有することを特徴とする顕微イメージングシステム。
【請求項１０】
ポンプ光で試料を照射して前記試料を励起し、
プローブ光を検出プローブ光と参照プローブ光に分割して、前記検出プローブ光で、前記ポンプ光の照射と同時に前記試料を照射し、
前記試料を透過した検出プローブ光をバランス検出器の第１入力ポートで受光し、
前記試料を透過しない前記参照プローブ光を前記バランス検出器の第２入力ポートで受光し、
前記バランス検出器から、前記検出プローブ光と前記参照プローブ光の差分を表わす電気信号を出力し、
前記バランス検出器の出力から、所定のロックイン周波数で所望の信号を検出する、
ステップを含み、
前記バランス検出器において、前記参照プローブ光を光電変換して得られる参照光電流を所定の分割比で分割し、前記分割された一方の電流成分と、前記検出プローブ光を光電変換して得られる検出光電流との差分を電圧信号に変換して出力し、
前記所定の分割比は、前記電圧信号に含まれる直流成分が最小となるようにフィードバック制御され、
前記フィードバック制御の上限周波数は、前記ポンプ光と前記検出プローブ光で前記試料を走査する速度よりも大きく、前記ロックイン増幅器の前記ロックイン周波数よりも小さいことを特徴とする光学測定方法。
【国際調査報告】
2015030202.tif 000018
2015030202.tif 000019
2015030202.tif 000020
2015030202.tif 000021