【手続補正書】
【提出日】平成24年1月27日(2012.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造を有するジベンゾローダミン化合物：
【化１】
2010159420.tif 000001
［式中、
Ｌ１およびＬ２は、それぞれ低級アルキル、フェニルおよびそれらの組合せから成る群より選択され、ここで、Ｌ１およびＬ２の少なくとも一方が低級アルキルとフェニルの組合せから選択され；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ水素、水可溶化基および結合基から成る群より選択され；
ここで、水可溶化基はカルボキシレート、スルホネート、ホスフェート、第４級アミン、スルフェート、ポリヒドロキシル、および水溶性ポリマーから成る群より選択され；そして
結合基はイソチオシアナート、塩化スルホニル、４，６−ジクロロトリアジニル、スクシンイミジルエステル、マレイミド、カルボキシルおよびヨードアセトアミドから成る群より選択される］。
【請求項２】
Ｃ−４およびＣ−５炭素またはＣ−９およびＣ−１０炭素を介して結合する縮合芳香族環を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｃ−４およびＣ−５炭素ならびにＣ−９およびＣ−１０炭素を介して結合する縮合芳香族環を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
エネルギー移動色素であって、以下：
第１の波長において光を吸収し得、そして応答の際に励起エネルギーを放出し得るドナー色素；
該ドナー色素によって放出される励起エネルギーを吸収し得、そして応答の際に第２の波長において蛍光を発し得る、アクセプター色素；ならびに
該ドナー色素と該アクセプター色素との間のエネルギーの効率的な移動を促進するために役立つ該ドナー色素および該アクセプター色素を連結するリンカーを含み；
ここで、少なくとも１つの該ドナー色素および該アクセプター色素が、請求項１に記載のジアゾベンゾローダミン化合物であり、
リンカーが式
【化２】
2010159420.tif 000002
［式中、
Ｚ１はＮＨ、硫黄および酸素から成る群から選択され；
Ｒ２１はドナー色素と結合する低級アルキルであり；
Ｒ２２はアルケン、ジエン、アルキン、少なくとも一つの不飽和結合およびカルボニル炭素と結合した縮合環構造を有する５員または６員環から成る群から選択される置換基であり；
Ｚ２はＮＨ、硫黄および酸素から成る群から選択され；
Ｒ２９は低級アルキルである］
の構造式を有し；そして
ドナーまたはアクセプター色素の一つがジベンゾローダミン色素はないとき、該ドナーまたはアクセプター色素の一つはシアニン、フタロシアニン、スクアレン、ｂｏｄｉｐｙまたはフルオレセイン色素である、
エネルギー移動色素。
【請求項５】
第１の波長が６００ｎｍを超える、請求項４に記載のエネルギー移動色素。
【請求項６】
Ｒ２２がシクロペンテン、シクロヘキセン、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン、フラン、チオフラン、ピロール、イソピロール、イソアゾール、ピラゾール、イソイミダゾール、ピラン、ピロン、ベンゼン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジンおよびオキサジンから成る群から選択される５員環または６員環であるか、またはインデン、ベンゾフラン、チオナフテン、インドールおよびナフタレンから成る群から選択される縮合環である、請求項４に記載のエネルギー移動色素。
【請求項７】
リンカーが式：
【化３】
2010159420.tif 000003
の構造を有する、請求項６に記載のエネルギー移動色素。
【請求項８】
以下の構造の一つを有する標識ヌクレオシド／チド：
【化４】
2010159420.tif 000004
［式中、
ＮＵＣはヌクレオシド／チドまたはヌクレオシド／チドアナログであり；
Ｄは請求項１に記載のジベンゾローダミン化合物または請求項４に記載のエネルギー移動色素であり；
該ジベンゾローダミン化合物のＲ１およびＲ２の少なくとも一つはカルボキシル基を含み；
ＮＵＣとＤとの間はリンカーにより連結され；
リンカーはＤに、Ｄに存在するカルボキシル基を介して結合しており；
ＮＵＣがプリン塩基を含む場合、この結合はこのプリンの８位に連結されており、ＮＵＣが７−デアザプリン塩基を含む場合、この結合はこの７−デアザプリンの７位に連結されており、そしてＮＵＣがピリミジン塩基を含む場合、この結合はこのピリミジンの５位に連結されており；
Ｘは
【化５】
2010159420.tif 000005
から成る群から選択され、ここで、
ｎは１〜５の整数であり、
Ｒ１は、Ｈおよび低級アルキルから成る群から選択され；そして
Ｒ３は、Ｈおよび低級アルキルから成る群から選択される］。
【請求項９】
ＮＵＣがウラシル、シトシン、デアザアデニンおよびデアザグアノシンから成る群から選択される塩基を含む、請求項８に記載の標識ヌクレオシド／シド。
【請求項１０】
以下の式：
【化６】
2010159420.tif 000006
の構造を有する、請求項８に記載の標識ヌクレオシド／シド。
【請求項１１】
Ｄが請求項１に記載のジベンゾローダミン化合物である、請求項８に記載の標識ヌクレオシド／シド。
【請求項１２】
Ｄが請求項４に記載のエネルギー移動色素である、請求項８に記載の標識ヌクレオシド／シド。
【請求項１３】
ドナーまたはアクセプター色素の一つが請求項１に記載のジベンゾローダミン化合物であり、残りの一つはシアニン、フタロシアニン、スクアレン、ｂｏｄｉｐｙまたはフルオレセイン色素である、請求項１２に記載の標識ヌクレオシド／シド。
【請求項１４】
ジベンゾローダミン化合物ではないドナーまたはアクセプター色素がフルオレセイン色素である、請求項１３の標識ヌクレオシド／シド。
【請求項１５】
ポリヌクレオチド配列決定方法であり、以下の工程：
第１クラス、第２クラス、第３クラス、および第４クラスのポリヌクレオチドの混合物を形成する工程であって、これによって：
(ａ)該第１クラスにおける各々のポリヌクレオチドが、３’−末端ジデオキシアデノシンを含み、そして第１の色素で標識され；
(ｂ)該第２クラスにおける各々のポリヌクレオチドが、３’−末端ジデオキシシチジンを含み、そして第２の色素で標識され；
(ｃ)該第３クラスにおける各々のポリヌクレオチドが、３’−末端ジデオキシグアノシンを含み、そして第３の色素で標識され；
(ｄ)該第４クラスにおける各々のポリヌクレオチドが、３’−末端ジデオキチミジンを含み、そして第４の色素で標識され；
ここで、該第１、該第２、該第３または該第４の色素の少なくとも１つが、請求項１から３のいずれかに記載のジベンゾローダミン化合物または請求項４から７のいずれかに記載のエネルギー移動色素であるジベンゾローダミン色素であり；
該色素のそれぞれは、該ジベンゾローダミン色素からおよび互いからスペクトル的に分解可能であり；
該ポリヌクレオチドを電気泳動的に分離し、それによって様似の大きさのポリヌクレオチドのバンドを形成させる工程；
該色素に蛍光を引き起こさせ得る照射光を用いて該バンドを照射する工程；そして、
該色素の蛍光スペクトルによる該バンドにおける該ポリヌクレオチドのクラスを同定する工程、
を含む、方法。
【請求項１６】
標識されたポリヌクレオチドを生成する方法であり、以下の工程：
テンプレートＤＮＡを変性する工程；
オリゴヌクレオチドプライマーをテンプレートＤＮＡにアニーリングする工程；
アニールしたプライマー／テンプレートＤＮＡをｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを含むデオキシヌクレオチド三リン酸混合物に添加する工程であって、該デオキシヌクレオチド三リン酸の各々が他の色素とスペクトル的に分解可能である色素で標識されており、該デオキシヌクレオチド三リン酸の少なくとも一つの少なくとも一画分が請求項１から３のいずれかに記載のジベンゾローダミン化合物または請求項４から７のいずれかに記載のエネルギー移動色素であるジベンゾローダミン色素で標識されている工程；
ポリメラーゼ酵素を、ポリメラーゼ酵素が活性である条件下で添加し、それにより標識したポリヌクレオチドがポリメラーゼ媒介鎖合成中に標識されたデオキシヌクレオチドを組み込むことによって生成される、工程、
を含む、方法。
【請求項１７】
標識されたポリヌクレオチドを生成する方法であり、以下の工程：
テンプレートＤＮＡを変性する工程；
第１のオリゴヌクレオチドプライマーとテンプレートＤＮＡを接触させる工程であって、該第１のオリゴヌクレオチドプライマーがテンプレートＤＮＡのプラス鎖に補足的である工程；
第２のオリゴヌクレオチドプライマーとテンプレートＤＮＡを接触させる工程であって、該第２のオリゴヌクレオチドプライマーがテンプレートＤＮＡのマイナス鎖に補足的である工程；
熱安定性のポリメラーゼを添加する工程；
アニールしたプライマー／テンプレートＤＮＡをｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを含むデオキシヌクレオチド三リン酸混合物に添加する工程であって、該デオキシヌクレオチド三リン酸の各々が他の色素とスペクトル的に分解可能である色素で標識されており、該デオキシヌクレオチド三リン酸の少なくとも一つの少なくとも一画分が請求項１から３のいずれかに記載のジベンゾローダミン化合物または請求項４から７のいずれかに記載のエネルギー移動色素であるジベンゾローダミン色素で標識されている工程；
反応温度を変性温度と伸長温度との間を循環させ、それによりテンプレートＤＮＡに対する標識された相補体合成する工程
を含む、方法。
【請求項１８】
ジベンゾローダミン色素が請求項４に記載のエネルギー移動色素である、請求項１５から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ドナーまたはアクセプター色素の一つが請求項１に記載のジベンゾローダミン化合物であり、残りの一つはシアニン、フタロシアニン、スクアレン、ｂｏｄｉｐｙまたはフルオレセイン色素である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ジベンゾローダミン化合物ではないドナーまたはアクセプター色素がフルオレセイン色素である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
フラグメント分析方法であり、以下の工程：
標識されたポリヌクレオチドフラグメントを形成する工程であり、該フラグメントが、請求項１から３のいずれかに記載のジベンゾローダミン化合物または請求項４から７のいずれかに記載のエネルギー移動色素であるジベンゾローダミン色素で標識される、工程；
該標識されたポリヌクレオチドフラグメントを、サイズ依存性分離プロセスに供する工程；そして
該分離プロセスに引き続いて、該標識されたポリヌクレオチドを検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項２２】
サイズ依存性分離プロセスが電気泳動であり、標識ポリヌクレオチドフラグメントを蛍光により検出する、請求項２１に記載の方法。