【手続補正書】
【提出日】平成24年9月7日(2012.9.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
供与体ＤＮＡと宿主ＤＮＡとの間で相同組み換えを行う工程を含む宿主ＤＮＡの対象領域を改変させる方法であって、
前記供与体ＤＮＡが、宿主ＤＮＡ中の、前記対象領域の外側の５’側領域、前記対象領域の外側の３’側領域及び前記対象領域の内側の第１相同組み換え領域に対応する相同領域をこの順で有し、更に前記３’側領域の相同領域及び前記第１相同組み換え領域の相同領域の間に第１選択マーカー遺伝子、発現誘導型プロモーター及び当該発現誘導型プロモーターの制御下に発現可能な第２選択マーカー遺伝子を有し、
前記供与体ＤＮＡと前記宿主ＤＮＡとの間において、前記５’側領域及び前記第１相同組み換え領域で相同組み換えを行う第１工程と、
上記相同組み換え後の宿主ＤＮＡにおいて、宿主ＤＮＡ由来の前記３’側領域と供与体ＤＮＡ由来の前記３’側領域との間で相同組み換えを行う第２工程とを含み、
上記第１工程では、前記供与体ＤＮＡを組み込んだ宿主を前記第１選択マーカー遺伝子の発現に基づいて選択し、
前記第２工程では、前記発現誘導型プロモーターの発現誘導条件下とすることで前記第２の選択マーカー遺伝子の発現に基づいて、宿主ＤＮＡ中の対象領域が改変された宿主を選択することを特徴とする、宿主ＤＮＡの対象領域の改変方法。
【請求項２】
供与体ＤＮＡと宿主ＤＮＡとの間で相同組み換えを行う工程を含む宿主ＤＮＡの欠失対象領域を欠失させる方法であって、
前記供与体ＤＮＡが、宿主ＤＮＡ中の、前記欠失対象領域の外側の５’側領域、前記欠失対象領域の外側の３’側領域及び前記欠失対象領域の内側の第１相同組み換え領域に対応する相同領域をこの順で有し、更に前記３’側領域の相同領域及び前記第１相同組み換え領域の相同領域の間に第１選択マーカー遺伝子、発現誘導型プロモーター及び当該発現誘導型プロモーターの制御下に発現可能な第２選択マーカー遺伝子を有し、
前記供与体ＤＮＡと前記宿主ＤＮＡとの間において、前記５’側領域及び前記第１相同組み換え領域で相同組み換えを行う第１工程と、
上記相同組み換え後の宿主ＤＮＡにおいて、宿主ＤＮＡ由来の前記３’側領域と供与体ＤＮＡ由来の前記３’側領域との間で相同組み換えを行う第２工程とを含み、
上記第１工程では、前記供与体ＤＮＡを組み込んだ宿主を前記第１選択マーカー遺伝子の発現に基づいて選択し、
前記第２工程では、前記発現誘導型プロモーターの発現誘導条件下とすることで前記第２の選択マーカー遺伝子の発現に基づいて、宿主ＤＮＡ中の欠失対象領域が欠失した宿主を選択することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第２工程において、第２の選択マーカー遺伝子の発現に基づいて、宿主ＤＮＡ中の欠失対象領域が欠失した宿主をポジティブセレクションによって選択することを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記第２選択マーカー遺伝子は、宿主細胞の致死を誘導するタンパク質をコードしていることを特徴とする請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
前記第２選択マーカー遺伝子はｃｈｐＡ遺伝子であることを特徴とする請求項２〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記発現誘導型プロモーターは、発現誘導物質の存在下に下流の遺伝子発現を誘導するものであることを特徴とする請求項２〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記第１選択マーカー遺伝子は薬剤耐性遺伝子であることを特徴とする請求項２〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
上記宿主が枯草菌であることを特徴とする、請求項２〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
供与体ＤＮＡと宿主ＤＮＡとの間で相同組み換えを行う工程を含む宿主ＤＮＡの置換対象領域を所望のＤＮＡ配列で置換する方法であって、
前記供与体ＤＮＡが、宿主ＤＮＡ中の、前記置換対象領域の外側の５’側領域、前記置換対象領域の外側の３’側領域及び前記置換対象領域の内側の第１相同組み換え領域に対応する相同領域をこの順で有し、前記５’側領域の相同領域と前記３’側領域の相同領域との間に所望のＤＮＡ配列を有し、更に前記３’側領域の相同領域及び前記第１相同組み換え領域の相同領域の間に第１選択マーカー遺伝子、発現誘導型プロモーター及び当該発現誘導型プロモーターの制御下に発現可能な第２選択マーカー遺伝子を有し、
前記供与体ＤＮＡと前記宿主ＤＮＡとの間において、前記５’側領域及び前記第１相同組み換え領域で相同組み換えを行う第１工程と、
上記相同組み換え後の宿主ＤＮＡにおいて、宿主ＤＮＡ由来の前記３’側領域と供与体ＤＮＡ由来の前記３’側領域との間で相同組み換えを行う第２工程とを含み、
上記第１工程では、前記供与体ＤＮＡを組み込んだ宿主を前記第１選択マーカー遺伝子の発現に基づいて選択し、
前記第２工程では、前記発現誘導型プロモーターの発現誘導条件下とすることで前記第２の選択マーカー遺伝子の発現に基づいて、宿主ＤＮＡ中の置換対象領域が所望のＤＮＡ配列で置換された宿主を選択することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記第２工程において、第２の選択マーカー遺伝子の発現に基づいて、宿主ＤＮＡ中の置換対象領域が置換された宿主をポジティブセレクションによって選択することを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記第２選択マーカー遺伝子は、宿主細胞の致死を誘導するタンパク質をコードしていることを特徴とする請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
前記第２選択マーカー遺伝子はｃｈｐＡ遺伝子であることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
前記発現誘導型プロモーターは、発現誘導物質の存在下に下流の遺伝子発現を誘導するものであることを特徴とする請求項９〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記第１選択マーカー遺伝子は薬剤耐性遺伝子であることを特徴とする請求項９〜１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
上記宿主が枯草菌であることを特徴とする、請求項９〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
前記第１選択マーカー遺伝子、前記発現誘導型プロモーター及び当該発現誘導型プロモーターの制御下に発現可能な前記第２選択マーカー遺伝子を有し、前記供与体ＤＮＡの３’側領域の相同領域と第１相同組み換え領域の相同領域との間に位置することを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法に用いられる選択マーカーカセット。
【請求項１７】
前記第２選択マーカー遺伝子は、宿主細胞の致死を誘導するタンパク質をコードしていることを特徴とする請求項１６記載の選択マーカーカセット。
【請求項１８】
前記第２選択マーカー遺伝子はｃｈｐＡ遺伝子であることを特徴とする請求項１６または１７記載の選択マーカーカセット。
【請求項１９】
前記発現誘導型プロモーターは、発現誘導物質の存在下に下流の遺伝子発現を誘導するものであることを特徴とする請求項１６〜１８のいずれか一項記載の選択マーカーカセット。
【請求項２０】
前記第１選択マーカー遺伝子は薬剤耐性遺伝子であることを特徴とする請求項１６〜１９のいずれか一項記載の選択マーカーカセット。
【請求項２１】
枯草菌ゲノム内に組み込まれていることを特徴とする請求項１６〜２０のいずれか一項記載の選択マーカーカセット。
【請求項２２】
請求項１記載の方法を用いて、宿主ＤＮＡの対象領域を改変させる工程を含む、対象領域が改変された宿主の作成方法。
【請求項２３】
請求項２〜８のいずれか一項記載の方法を用いて、宿主ＤＮＡから欠失対象領域を欠失させる工程を含む、欠失対象領域の欠失した宿主の作成方法。
【請求項２４】
請求項９〜１５のいずれか一項記載の方法を用いて、宿主ＤＮＡの置換対象領域を置換させる工程を含む、置換対象領域が置換された宿主の作成方法。