(57)【要約】  本発明は、βカテニンによって誘導され、癌で高発現している新規な長鎖非コードRNA（lncRNA）、該lncRNAの発現を抑制する核酸、該lncRNAまたは該核酸を用いた細胞の増殖促進または抑制手段等を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１５および配列番号３８〜４１のいずれかで表される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなるlncRNA。
【請求項２】
配列番号１〜１５および配列番号３８〜４１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするlncRNA。
【請求項３】
配列番号１〜１５および配列番号３８〜４１のいずれかで表される塩基配列からなるlncRNA。  
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか1項に記載のlncRNAに対して相補的な塩基配列からなる核酸。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか1項に記載のlncRNAと、該lncRNAの塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか1項に記載のlncRNAの発現を抑制する核酸。
【請求項７】
核酸がsiRNA、アンチセンス核酸、shRNAまたはmiRNAから選ばれる請求項６に記載のlncRNAの発現を抑制する核酸。
【請求項８】
配列番号４２〜５０のいずれかで表される塩基配列を標的配列とするsiRNAである、請求項６に記載のlncRNAの発現を抑制する核酸。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか1項に記載の核酸またはlncRNAを発現するベクター。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか1項に記載の核酸またはlncRNAを導入した細胞。
【請求項１１】
請求項９に記載のベクターを導入した細胞。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか1項に記載の核酸またはlncRNAを有効成分として含有する、細胞の増殖促進剤または増殖抑制剤。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか1項に記載の核酸またはlncRNAを有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
【請求項１４】
疾患が消化器癌、肝臓癌、腎癌、肺癌、皮膚癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌または頭頚部癌から選ばれる疾患である請求項１３に記載の診断薬または治療薬。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のlncRNAを用いることを特徴とするlncRNAの発現を検出する方法。
【請求項１６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のlncRNAを用いることを特徴とするlncRNAの変異を検出する方法。
【請求項１７】
請求項４〜８のいずれか１項に記載の核酸を用いることを特徴とするlncRNAの発現を抑制する方法。
【請求項１８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のlncRNAを用いることを特徴とするlncRNAの発現または機能を抑制させる物質をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌細胞においてβカテニンにより誘導され、核酸等による発現抑制により抗癌細胞活性を示す長鎖非コードＲＮＡ(long non-coding RNA; lncRNA)と発現抑制に用いる核酸等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｗｎｔシグナルは、細胞の発生分化や増殖に密接に関わること、Ｗｎｔリガンドにより刺激された細胞ではβカテニンが活性化され標的遺伝子の発現が制御されることが知られている。また、Ｗｎｔシグナルの異常は、細胞の癌化を引き起こし癌細胞の増殖分化や転移浸潤を促進することが広く知られている。
近年、HOTAIRなどのlncRNAの発現と悪性度の高い癌の治療予後不良等との相関が報告されている。HOTAIRは、乳癌などの癌細胞においてポリコーム複合体を介してヒストンのメチル化修飾を制御することが示唆されている（非特許文献１）。
ポリコーム複合体は、ヒストンメチル化修飾酵素EZH2を含む因子から構成され、細胞の発生分化や増殖制御に関わっている。またリンパ腫や乳癌ほか複数の癌種において、悪性度とEZH2発現の相関が示唆されている（非特許文献２）。
また、高速シーケンサーの発達に伴い新たなlncRNAの探索がヒト及びマウス細胞を中心に試みられている。最近では、マウスＥＳ細胞やヒト大腸癌細胞株においてポリコーム複合体と結合するlncRNA取得を目的とした大量シーケンス解析が報告されている（非特許文献３-５、特許文献１）。
しかし一方、これらのlncRNAは、in silicoでの構造予測に過ぎないものが殆どであり、癌細胞の増殖分化や転移との関連など機能については不明な点が多い。また、βカテニンにより誘導されるlncRNAはまだ知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】；国際公開第2012/065143号パンフレット
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Gupta et al. (2010) Nature 464, 1071-1076.
【非特許文献２】Chase and Cross. (2011) Clinical Cancer Research 17, 2613-2618.
【非特許文献３】Zhao et al. (2010) Molecular Cell 40, 939-953.
【非特許文献４】Chu et al. (2011) Molecular Cell 44, 667-678.
【非特許文献５】Guil et al. (2012) Nature Structural & Molecular Biology doi:10.1038/nsmb.2315
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
癌治療の観点からは、悪性度の高い癌の増殖転移および治療予後不良の改善効果が求められる。そのためには、優れた標的と該標的に対する特異性を高めることが有効な手段となる。
本発明は、癌の新規標的および癌を治療するための核酸を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、転移性癌細胞において、高速シーケンサーを用いた発現RNAの大量塩基配列解析によりβカテニンにより誘導される新規のlncRNAを取得し、核酸等を用いて上記lncRNAを発現抑制することにより強力に抗癌細胞活性を発揮できることを見出した。【０００７】
すなわち、本発明は、前記の課題を解決するものとして以下の発明を提供する。
（１）配列番号１〜１５および配列番号３８〜４１のいずれかで表される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなるlncRNA。
（２）配列番号１〜１５および配列番号３８〜４１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするlncRNA。
（３）配列番号１〜１５および配列番号３８〜４１のいずれかで表される塩基配列からなるlncRNA。  
（４）上記（１）〜（３）のいずれか1項に記載のlncRNAに対して相補的な塩基配列からなる核酸。
（５）上記（１）〜（３）のいずれか1項に記載のlncRNAと、該lncRNAの塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸。
（６）上記（１）〜（３）のいずれか1項に記載のlncRNAの発現を抑制する核酸。
（７）核酸がsiRNA、アンチセンス核酸、shRNAまたはmiRNAから選ばれる上記（６）に記載のlncRNAの発現を抑制する核酸。
（８）配列番号４２〜５０のいずれかで表される塩基配列を標的配列とするsiRNAである、上記（６）に記載のlncRNAの発現を抑制する核酸。
（９）上記（１）〜（８）のいずれか1項に記載の核酸またはlncRNAを発現するベクター。
（１０）上記（１）〜（８）のいずれか1項に記載の核酸またはlncRNAを導入した細胞。
（１１）上記（９）に記載のベクターを導入した細胞。
（１２）上記（１）〜（８）のいずれか1項に記載の核酸またはlncRNAを有効成分として含有する、細胞の増殖促進剤または増殖抑制剤。
（１３）上記（１）〜（８）のいずれか1項に記載の核酸またはlncRNAを有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
（１４）疾患が消化器癌、肝臓癌、腎癌、肺癌、皮膚癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌または頭頚部癌から選ばれる疾患である上記（１３）に記載の診断薬または治療薬。
（１５）上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載のlncRNAを用いることを特徴とするlncRNAの発現を検出する方法。
（１６）上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載のlncRNAを用いることを特徴とするlncRNAの変異を検出する方法。
（１７）上記（４）〜（８）のいずれか１項に記載の核酸を用いることを特徴とするlncRNAの発現を抑制する方法。
（１８）上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載のlncRNAを用いることを特徴とするlncRNAの発現または機能を抑制させる物質をスクリーニングする方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば標的lncRNAを発現する癌細胞の増殖や転移浸潤を抑制することができる。また、標的lncRNAの発現を指標として転移性癌細胞を特定し診断治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】(a)はSW480細胞にβカテニンに対するsiRNA（siRNA１〜３）を導入した時のlncRNA8Rの発現量を示し、(b)はSW480細胞にβカテニンに対するsiRNA（siRNA１〜３）を導入した時のlncRNA9Rの発現量を示し、(c)はSW480細胞にβカテニンに対するsiRNA（siRNA１〜３）を導入した時のlncRNA12Rの発現量を示し、(d)はSW480細胞にβカテニンに対するsiRNA（siRNA１〜３）を導入した時のlncRNA13Rの発現量を示し、(e)はSW480細胞にβカテニンに対するsiRNA（siRNA１〜３）を導入した時のβカテニンの発現量をそれぞれ示す。
【図２】正常大腸臨床検体、大腸癌細胞株検体および大腸癌臨床検体におけるlncRNA8Rのシグナル値を示す。
【図３】正常大腸臨床検体、大腸癌細胞株検体および大腸癌臨床検体におけるlncRNA9Rのシグナル値を示す。
【図４】正常大腸臨床検体、大腸癌細胞株検体および大腸癌臨床検体におけるlncRNA12Rのシグナル値を示す。
【図５】正常大腸臨床検体、大腸癌細胞株検体および大腸癌臨床検体におけるlncRNA13Rのシグナル値を示す。
【図６】SW480細胞にlncRNA8Rに対するsiRNAを導入した時の抗細胞活性を示す。点線はコントロールsiRNA、実線は8R1siRNA、破線は8R2siRNA導入細胞の抗細胞活性をそれぞれ示す。
【図７】SW480細胞にlncRNA12Rに対するsiRNAを導入した時の抗細胞活性を示す。点線はコントロールsiRNA、実線は12R#16siRNA、破線は12R#17siRNA導入細胞の抗細胞活性をそれぞれ示す。
【図８】SW480細胞およびSW620細胞にlncRNA12R、lncRNA13Rに対するsiRNAをそれぞれ導入した時の抗細胞活性を示す。
【図９】抗PRC2抗体（EZH2、SUZ12）を用いたSW480細胞のRNA免疫沈降を示す。編線はlncRNA9R、黒はlncRNA12R、白はTUG1、グレーはMALAT1、縦線はHOTAIR、斜線はACTB、網掛はSNORD15をそれぞれ示す。
【図１０】抗PRC2抗体（SUZ12）を用いたSW620細胞のRNA免疫沈降を示す。
【図１１】SW480細胞およびSW620細胞にlncRNA12Rに対するsiRNA、lncRNA13Rに対するsiRNAをそれぞれ導入した時のコロニー形成能を示す。
【図１２】SW480細胞にlncRNA12Rに対するsiRNAを導入した時の遊走能を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のlncRNAとは、βカテニンによって誘導される長鎖の一本鎖RNAであり、癌で高発現している新規lncRNAである。
【００１１】
本発明のlncRNAとしては、配列番号１〜１５および配列番号３８〜４１のいずれかで表される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなるlncRNA、より好ましくは９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるlncRNA、最も好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の同一性を有する塩基配列からなるlncRNAを挙げることができる。本発明における塩基配列の同一性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。
【００１２】
また、本発明のlncRNAとしては、配列番号１〜１５および配列番号３８〜４１のいずれかで表される塩基配列からなるlncRNAの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするlncRNAを挙げることができる。具体的には、配列番号１〜１５および配列番号３８〜４１のいずれかで表される塩基配列からなるlncRNAを挙げることができる。
本発明において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするlncRNAとは、例えば配列番号１〜１５および配列番号３８〜４１のいずれかで表される塩基配列を有するlncRNAまたはその一部の断片と相補的な核酸（cDNAやcRNA等の二本鎖核酸を含む）をプローブとして、20xSSC 7.5 mL、1M Na2HPO4(pH7.2) 0.6 mL、10%SDS 21 mL、50xDenhardt's solution 0.6 mL、10 mg/mL sonicated salmon sprem DNA 0.3 mLから成るHybridization bufferに、γ-32P-ATPで標識したプローブRNAを加え、50 ℃で一晩反応させた後、50 ℃で10分間、5xSSC/5%SDS液で洗浄し、更に50℃で10分間、1xSSC/1%SDS液で洗浄し、その後メンブレンを取り出し、X線フィルムに感光させることにより同定できるlncRNAを挙げることができる。
【００１３】
本発明のlncRNAの発現を抑制する核酸としては、該lncRNAの一部の塩基配列および／または該塩基配列に対して相補的な塩基配列を含み、かつlncRNAの発現を抑制する核酸であれば、一本鎖核酸、二本鎖核酸等、いずれの核酸も用いられるが、二本鎖核酸が好適に用いられる。ここで「発現を抑制する」とは、本発明のlncRNAの転写を抑制するか（例、アンチジーン）、lncRNAを切断するか（例、siRNA、shRNA、リボザイム）、あるいは機能的なlncRNAの形成を阻害する（例、アンチセンス核酸、miRNA）ことを包含する意味で用いられる。
本発明の核酸が標的配列とするlncRNAの部分塩基配列は特に制限されないが、例えば、siRNAおよび／またはshRNAの配列を設計する場合には、種々のwebサイト上で提供される検索ソフトを用いて検索が可能である。このようなサイトとしては、例えば、Ambionが提供するsiRNA Target Finder（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html）およびpSilencer（登録商標） Expression Vector用インサートデザインツール（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/psilencer_converter.html）、RNAi Codexが提供するGeneSeer（http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi）があるが、これらに限定されない。
【００１４】
本発明において二本鎖核酸とは、二本の鎖が対合し二重鎖形成部を有する核酸をいう。二重鎖形成部とは、二本鎖核酸を構成するヌクレオチドまたはその誘導体が塩基対を構成して二重鎖を形成している部分をいう。二重鎖形成部は、通常１５〜２７塩基対であり、１５〜２５塩基対が好ましく、１５〜２３塩基対がより好ましく、１５〜２１塩基対がさらに好ましく、１５〜１９塩基対が特に好ましい。
【００１５】
二本鎖核酸を構成する一本鎖の核酸は、通常１５〜３０塩基からなるが、１５〜２９塩基からなることが好ましく、１５〜２７塩基からなることがより好ましく、１５〜２５塩基からなることがさらに好ましく、１７〜２３塩基からなることが特に好ましく、１９〜２1塩基からなることが最も好ましい。
【００１６】
本発明の二本鎖核酸において、二重鎖形成部に続く３’側または５’側に二重鎖を形成しない追加のヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を有する場合には、これら突出部はリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはこれらの誘導体であってもよい。
突出部を有する二本鎖核酸としては、少なくとも一方の鎖の３’末端または５’末端に１〜４塩基、通常は１〜３塩基からなる突出部を有するものが用いられるが、２塩基からなる突出部を有するものが好ましく用いられ、ｄＴｄＴまたはＵＵからなる突出部を有するものがより好ましく用いられる。突出部は、アンチセンス鎖のみ、センス鎖のみ、およびアンチセンス鎖とセンス鎖の両方に有することができるが、アンチセンス鎖とセンス鎖の両方に突出部を有する二本鎖核酸が好ましく用いられる。ここで「センス鎖」とは、lncRNAの標的配列と相同な配列を有する鎖を意味し、「アンチセンス鎖」とは、該標的配列と相補的な配列を有する鎖を意味する。また、二重鎖形成部に続いて標的配列と一部または全てが一致する配列、または、二重鎖形成部に続いて標的配列の相補鎖の塩基配列と一致する配列を用いることもできる。さらに、本発明の二本鎖核酸としては、例えばDicer等のリボヌクレアーゼの作用により上記の二本鎖核酸を生成する核酸分子（WO2005/089287）や、３’末端や５’末端の突出部を有していない二本鎖核酸などを用いることもできる。
【００１７】
また、本発明の核酸としては、一本鎖の核酸を用いることもできる。これらの核酸において１〜３塩基、好ましくは１〜２塩基、より好ましくは１塩基が置換、欠失もしくは付加され、かつlncRNAの発現抑制活性を有する核酸も用いることができる。また、これらの核酸を含む、３０塩基以下、好ましくは２９塩基以下、より好ましくは２７塩基以下、さらに好ましくは２５塩基以下、特に好ましくは２３塩基以下の核酸を挙げることができる。
【００１８】
また、上記した二本鎖核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖を、スペーサー配列を介して連結して一本鎖核酸としたものであってもよい。該一本鎖核酸としては、ステムループ構造によって二重鎖形成部を有するshRNA等の一本鎖核酸であることが好ましい。ステムループ構造を有する一本鎖核酸は、通常５０〜７０塩基長である。
また、別の一本鎖核酸として、アンチセンス核酸が挙げられる。アンチセンス核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。アンチセンス核酸がDNAの場合、標的RNAとアンチセンスDNAとによって形成されるRNA:DNAハイブリッドは、内在性RNase Hに認識されて標的RNAの選択的な分解を引き起こすことができる。
【００１９】
本発明の核酸としては、リボヌクレアーゼ等の作用により上記の一本鎖核酸または二本鎖核酸を生成するように設計した、７０塩基長以下、好ましくは５０塩基長以下、さらに好ましくは３０塩基長以下の核酸であってもよい。
【００２０】
本発明の核酸を構成する分子としては、ヌクレオチドまたは該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子であればいかなる分子であってもよく、例えばリボヌクレオチドの重合体であるRNA、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるDNA、RNAとDNAとからなるキメラ核酸、およびこれらの核酸の少なくとも一つのヌクレオチドが該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子で置換されたヌクレオチド重合体が挙げられる。siRNA、sh（short hairpin）RNA、miRNAおよびこれらの核酸内にヌクレオチドと同等の機能を有する分子を少なくとも一つ含む誘導体も、本発明の核酸に含まれる。またRNA中のウラシル（Ｕ）は、DNAにおいてはチミン（Ｔ）に一義的に読み替えることができる。
【００２１】
ヌクレオチドと同等の機能を有する分子としては、例えばヌクレオチド誘導体等があげられる。ヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドに修飾を施した分子であればいかなる分子あってもよいが、例えばRNAまたはDNAと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上もしくは安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーをあげるため、細胞透過性をあげるため、または可視化させるために、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドに修飾を施した分子等が好適に用いられる。
【００２２】
ヌクレオチド誘導体としては、例えば糖部修飾ヌクレオチド、リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド、塩基修飾ヌクレオチド、ならびに糖部、リン酸ジエステル結合および塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド等があげられる。
【００２３】
糖部修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよいが、２’−修飾ヌクレオチドが好ましく用いられる。
２’−修飾ヌクレオチドとしては、例えばリボースの２’−ＯＨ基がＨ、ＯＲ、Ｒ、Ｒ’ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群（Ｒはアルキルまたはアリール、好ましくは炭素数１〜６のアルキルであり、Ｒ’はアルキレン、好ましくは炭素数１〜６のアルキレンである）から選択される置換基で置換された２’−修飾ヌクレオチド、好ましくは２’−ＯＨ基がＦまたはメトキシ基があげられる。また、2-(methoxy)ethoxy基、3-aminopropoxy基、2-[(N,N-dimethylamino)oxy]ethoxy基、3-(N,N-dimethylamino)propoxy基、2-[2-(N,N-Dimethylamino)ethoxy]ethoxy基、2-(methylamino)-2-oxoethoxy基、2-（N-methylcarbamoyl）etoxy基および2-cyanoetoxy基からなる群から選択される置換基で置換された２’−修飾ヌクレオチド等も挙げられる。
【００２４】
また、糖部修飾ヌクレオチドとしては、糖部に架橋構造を導入することにより２つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸（Bridged Nucleic Acid）(BNA)があげられ、具体的には、2'位の酸素原子と4'位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸（Locked Nucleic Acid）（LNA）、エチレン架橋構造型人工核酸（Ethylene bridged nucleic acid）（ENA）［Nucleic Acid Research, 32, e175(2004)］等があげられ、さらにペプチド核酸（PNA）[Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999)]、オキシペプチド核酸（OPNA）[J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)]、ペプチドリボ核酸（PRNA）[J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)]等も挙げられる。
【００２５】
リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、リン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロジチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がアルキルホスホネート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロアミデート結合に置換されたヌクレオチド等が挙げられる。
【００２６】
塩基修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの塩基の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、塩基内の酸素原子が硫黄原子で置換されたもの、水素原子が炭素数１〜６のアルキル基で置換されたもの、メチル基が水素もしくは炭素数２〜６のアルキル基で置換されたもの、アミノ基が炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルカノイル基等の保護基で保護されたものが挙げられる。
【００２７】
さらに、ヌクレオチド誘導体として、ヌクレオチドまたは糖部、リン酸ジエステル結合もしくは塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド誘導体に脂質、リン脂質、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、色素など、別の化学物質を付加したものもあげられ、具体的には、５’−ポリアミン付加ヌクレオチド誘導体、コレステロール付加ヌクレオチド誘導体、ステロイド付加ヌクレオチド誘導体、胆汁酸付加ヌクレオチド誘導体、ビタミン付加ヌクレオチド誘導体、Cy5付加ヌクレオチド誘導体、Cy3付加ヌクレオチド誘導体、6−FAM付加ヌクレオチド誘導体、およびビオチン付加ヌクレオチド誘導体等が挙げられる。
【００２８】
また、ヌクレオチド誘導体は、核酸内の他のヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体とアルキレン構造、ペプチド構造、ヌクレオチド構造、エーテル構造、エステル構造、およびこれらの少なくとも一つを組み合わせた構造等の架橋構造を形成してもよい。
【００２９】
本発明の核酸は、lncRNAの一部の塩基配列からなる核酸または該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸と同等な機能を有する核酸であれば、いずれのヌクレオチドまたはその誘導体から構成されていてもよい。すなわち、lncRNAの一部の塩基配列からなる核酸または該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸は、その塩基配列を構成するヌクレオチドが、該ヌクレオチドと同等の機能を有するリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはその誘導体に置換されたものであってもよい。
【００３０】
本発明の核酸を製造する方法としては、特に限定されず、公知の化学合成を用いる方法、あるいは、酵素的転写法等があげられる。公知の化学合成を用いる方法として、ホスホロアミダイト法、ホスホロチオエート法、ホスホトリエステル法、CEM法［Nucleic Acid Research, 35, 3287 (2007)］等をあげることができ、例えば、ABI3900ハイスループット核酸合成機（アプライドバイオシステムズ社製）により合成することができる。合成が終了した後は、固相からの脱離、保護基の脱保護および目的物の精製等を行う。精製により、純度９０％以上、好ましくは９５％以上の核酸を得るのが望ましい。二本鎖核酸の場合には、合成・精製したセンス鎖、アンチセンス鎖を適当な比率、例えば、アンチセンス鎖１当量に対して、センス鎖０．１〜１０当量、好ましくは０．５〜２当量、より好ましくは０．９〜１．１当量、さらに好ましくは等モル量で混合した後、アニーリングを行って用いてもよいし、または、混合したものをアニーリングする工程を省いて直接用いてもよい。アニーリングは、二本鎖核酸を形成できる条件であればいかなる条件で行ってもよいが、通常、センス鎖、アンチセンス鎖をほぼ等モル量で混合した後、９４℃程度で５分程度加熱したのち、室温まで徐冷することにより行われる。本発明の核酸を製造する酵素的転写法としては、目的の塩基配列を有したプラスミドまたはDNAを鋳型としてファージRNAポリメラーゼ、例えば、T7、T3、またはSP6RNAポリメラーゼを用いた転写による方法が挙げられる。
【００３１】
本発明の核酸を細胞内に導入する方法としては、トランスフェクション用の担体、好ましくはカチオン性リポソーム等のカチオン性担体を用いる方法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法またはマイクロインジェクション法などが挙げられる。
【００３２】
また、本発明の核酸の代わりに、細胞内に導入してこれらが発現されるようなベクターを用いてもよい。具体的には、本発明の核酸をコードする配列を発現ベクター内のプロモーター下流に挿入して発現ベクターを構築し、細胞に導入することにより該核酸等を発現させることができる。
発現ベクターとしては、本発明の核酸をコードする配列をウイルスベクター内のプロモーター下流に挿入し、該ベクターをパッケージング細胞に導入して生産した組換えウイルスベクターを用いることができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが挙げられる。
これらの一本鎖核酸または二本鎖核酸を細胞に導入することにより、lncRNAの発現を抑制することができる。
【００３３】
また、本発明の一本鎖核酸または二本鎖核酸によるlncRNAの発現抑制活性の評価は、該核酸等を培養系癌細胞などにカチオン性リポソームなどを用いてトランスフェクションし、一定時間培養した後、当該癌細胞におけるlncRNAの発現量をRT-PCRで定量することにより行うことができる。さらに細胞増殖を抑制する効果については、本発明の一本鎖核酸または二本鎖核酸を導入した細胞の生細胞数を算出することにより、評価することができる。
【００３４】
本発明のlncRNAの発現を検出する方法としては、検体中のlncRNAの存在が検出できる方法であれば、いかなる方法でもよく、例えば、（１）ノーザンハイブリダイゼーション[Science 294, 853-858 (2001)]、（２）ドットブロットハイブリダイゼーション[モレキュラー・クローニング第３版]、（３）in situハイブリダイゼーション[Methods in Enzymology, 254, 419 (1995)]、（４）定量的PCR[Nucleic Acids Research, 32, e43 (2004)]、（５）デファレンシャル・ハイブリダイゼーション[Trends Genet., 7, 314 (1991)]、（６）マイクロアレイ[Genome Res., 6, 639 (1996)]、（７）リボヌクレアーゼ保護アッセイ[mirVana miRNADetection Kit（Ambion社製）]等が挙げられる。
【００３５】
本発明のlncRNAの変異を検出する方法としては、検体中lncRNAの塩基配列の変異が検出できる方法であれば、いかなる方法でもよく、例えば、非変異型塩基配列を有する核酸と変異型塩基配列を有する核酸とのハイブリダイズにより形成されるヘテロ二本鎖を検出する方法や、あるいは、検体由来の塩基配列を直接、配列決定して変異の有無を検出する方法等をあげることができる。
ヘテロ二本鎖を検出する方法としては、（１）ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるヘテロ二本鎖検出法 [Trends genet., 7, 5 (1991)]、（２）一本鎖コンフォメーション多型解析法 [Genomics, 16, 325-332 (1993)]、（３）ミスマッチの化学的切断法 (CCM, chemical cleavage of mismatches) [Human Genetics (1996), Tom Strachan and Andrew P. Read, BIOS Scientific Publishers Limited]、（４）ミスマッチの酵素的切断法 [Nature Genetics, 9, 103-104 (1996)]、（５）変性ゲル電気泳動法 [Mutat. Res., 288, 103-112 (1993)]等の方法が挙げられる。
【００３６】
本発明のlncRNAを用いてlncRNAの発現または機能を促進または抑制させる物質をスクリーニングする方法としては、例えば、本発明のlncRNAの塩基配列から、スクリーニングの標的とする塩基配列を選択して、該塩基配列を有する核酸を発現する細胞を利用して、選択したlncRNAの発現または機能を促進または抑制させる物質をスクリーニングすることができる。
スクリーニングに用いる、lncRNAの塩基配列を有する核酸を発現する細胞としては、該塩基配列を有する核酸を発現するベクターを動物細胞などの宿主細胞に導入して得られる形質転換細胞や、該塩基配列を有する核酸をベクターを用いずに直接導入した細胞等を用いることもできる。
具体的なスクリーニング方法としては、スクリーニングの標的とするlncRNAの発現量の変化を指標にする方法を挙げることができる。
該塩基配列を有する核酸を発現する細胞に対し、試験物質を接触させ、選択した核酸の発現量の変化を指標に、lncRNAの発現を促進または抑制させる物質を得る。
【００３７】
本発明はまた、上記した本発明のlncRNAの発現を抑制する一本鎖核酸、二本鎖核酸等の核酸またはベクターを有効成分として含有する医薬組成物に関する。当該医薬組成物は、核酸を細胞内に移行させるのに有効な担体をさらに含むことができる。本発明の医薬組成物は癌疾患の治療または予防のために用いることができる。癌としては、例えば消化器癌、肝臓癌、腎癌、肺癌、皮膚癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌または頭頚部癌などの固形癌を挙げることができる。
【００３８】
核酸を細胞内に移行させるのに有効な担体としては、例えばカチオン性担体があげられる。カチオン性担体としては、カチオン性リポソームおよびカチオン性ポリマーなどがあげられる。また、核酸を細胞内に移行させるのに有効な担体として、ウイルスエンベロープを利用した担体を用いてもよい。カチオン性リポソームとしては、２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールを含有するリポソーム（以下リポソームＡともいう）、オリゴフェクトアミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、リポフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、リポフェクトアミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒ（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ社）、ＴｒａｎｓＩＴ ＴＫＯ（Ｍｉｒｕｓ社）などが好ましく用いられる。カチオン性ポリマーとしては、ＪｅｔＳＩ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社）、Ｊｅｔ−ＰＥＩ（ポリエチレンイミン；Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社）などが好ましく用いられる。ウイルスエンベロープを利用した担体としては、ＧｅｎｏｍｅＯｎｅ（ＨＶＪ−Ｅリポソーム；石原産業社）などが好ましく用いられる。
【００３９】
本発明の医薬組成物に含まれる一本鎖核酸、二本鎖核酸またはベクターに上記担体を含む組成物は、当業者に既知の方法により調製することができる。例えば、適当な濃度の担体分散液と一本鎖核酸、二本鎖核酸またはベクター溶液とを混合して調製することができる。カチオン性担体を用いる場合、一本鎖核酸、二本鎖核酸またはベクターは水溶液中で負電荷を帯びているため、常法により水溶液中で混合することによって容易に調製することができる。該組成物を調製するために用いる水性溶媒としては、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水などの電解質液、ブドウ糖液、マルトース液などの糖液などが挙げられる。
【００４０】
また、該組成物を調製する際のｐＨおよび温度などの条件は当業者が適宜選択できる。例えば、リポソームＡの場合、１０％マルトース水溶液中の１６ｍｇ／ｍｌのリポソーム分散液に、１０％マルトース水溶液中のオリゴ二本鎖ＲＮＡ溶液を、ｐＨ７．４、２５℃で撹拌しながら徐々に添加して調製することができる。
【００４１】
該組成物は、必要ならば超音波分散装置や高圧乳化装置などを用いて分散処理を行うことにより、均一な組成物とすることもできる。当業者であれば、担体と一本鎖核酸、二本鎖核酸またはベクターとを含む組成物の調製に最適な方法および条件は、用いる担体に依存するので、上記の方法にとらわれることなく、用いる担体に最適な方法を選択できる。
【００４２】
本発明の医薬組成物としては、一本鎖核酸、二本鎖核酸またはベクターとリード粒子とを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、該脂質膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含む液の中に、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在するリポソームも好適に用いられる。リード粒子としては、例えば、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等を構成成分とする微粒子があげられ、好ましくはリポソームを構成成分とする微粒子があげられる。本発明におけるリード粒子は、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等を2つ以上組み合わせた複合体を構成成分としていてもよく、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等と他の化合物(例えば糖、脂質、無機化合物等)とを組み合わせた複合体を構成成分としていてもよい。
【００４３】
該複合粒子を被覆する脂質膜としては、例えば中性脂質およびポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミン等を構成成分とするものがあげられる。
該リポソームは、例えばWO2006/080118等に記載の方法に従って調製することができる。
【００４４】
本発明の医薬組成物に含まれる一本鎖核酸、二本鎖核酸またはベクターと担体との配合比は、一本鎖核酸、二本鎖核酸またはベクターの１重量部に対して担体１〜２００重量部が適当である。好ましくは、一本鎖核酸、二本鎖核酸またはベクターの１重量部に対して担体２．５〜１００重量部、さらに好ましくは担体１０〜２０重量部である。
【００４５】
本発明の医薬組成物には、上記担体の他に、医薬的に許容できるキャリアーまたは希釈剤などを含んでいてもよい。医薬的に許容できるキャリアーまたは希釈剤などは、本質的に化学的に不活性および無害な組成物であり、本発明の医薬組成物の生物学的活性に全く影響を与えないものである。そのようなキャリアーまたは希釈剤の例は、塩溶液、糖溶液、グリセロール溶液、エタノールなどがあるが、これらに限定されない。
【００４６】
本発明の医薬組成物は、疾患の治療または予防に有効な量の該複合体を含み、かつ、患者に適切に投与できるような形態で提供される。本発明の医薬組成物の製剤形態は、例えば注射剤、点眼剤、吸入用などの液剤、例えば軟膏、ローション剤などの外用剤等であってもよい。
【００４７】
液剤の場合、本発明の医薬組成物の濃度範囲は通常、０．００１〜２５％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは０．０１〜５％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは０．１〜２％（ｗ／ｖ）である。本発明の医薬組成物は医薬的に許容される任意の添加剤、例えば、乳化補助剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調製剤等を適当量含有していてもよい。医薬的に許容される任意の添加剤は、該複合体の分散前でも分散後でも適当な工程で添加することができる。
【００４８】
凍結乾燥製剤は、一本鎖核酸、二本鎖核酸またはベクターと担体とを分散処理した後、凍結乾燥処理することにより調製することができる。凍結乾燥処理は、常法により行うことができる。例えば、上記の分散処理後の複合体溶液を無菌状態にて所定量をバイアル瓶に分注し、約−４０〜−２０℃の条件で予備乾燥を約２時間程度行い、約０〜１０℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約１５〜２５℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥することができる。そして、例えばバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓することにより、本発明の医薬組成物の凍結乾燥製剤を得ることができる。
【００４９】
本発明の医薬組成物は、任意の適当な溶液の添加によって再溶解し、使用することができる。このような溶液としては、注射用水、生理食塩水などの電解質液、ブドウ糖液、その他一般輸液などをあげることができる。この溶液の液量は、用途などによって異なり、特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の０．５〜２倍量、または５００ｍｌ以下が好ましい。
【００５０】
本発明の医薬組成物は、ヒトを含む動物に対し、例えば静脈内投与、動脈内投与、経口投与、組織内投与、経皮投与、経粘膜投与または経直腸投与することができるが、患者の症状に合わせた適切な方法により投与することが好ましい。特に静脈投与、経皮投与、経粘膜投与が好ましく用いられる。また、癌内局所投与など、局所投与をすることもできる。これらの投与方法に適した剤型としては、例えば各種の注射剤、経口剤、点滴剤、吸収剤、点眼剤、軟膏剤、ローション剤、坐剤等があげられる。
【００５１】
本発明の医薬組成物の用量は、薬物、剤型、年齢や体重などの患者の状態、投与経路、疾患の性質と程度などを考慮した上で決定することが望ましいが、通常は一本鎖核酸、二本鎖核酸またはベクターの質量として、成人に対して１日当たり、０．１ｍｇ〜１０ｇ／日、好ましくは１ｍｇ〜５００ｍｇ／日である。場合によっては、これ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とすることもある。また１日１回〜数回投与することもでき、１日〜数日の間隔をおいて投与することもできる。
【００５２】
以下に、本発明を実施例により説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５３】
実施例１  癌細胞においてβカテニンにより誘導される新規lncRNAの取得
1-1  新規lncRNAの同定方法
大腸癌細胞株SW480（3×105細胞）にβカテニンに対するsiRNA（ライフテクノロジー社、 Stealth RNAi 1299003) またはコントロールsiRNA（ライフテクノロジー社、 Stealth RNAiNegative control 12935-112)各20 nMをHiPerFect Transfection Reagent(キアゲン社)を用いて添付プロトコールに従い添加し、48時間後にトータルRNAをTRIzol（ライフテクノロジー社）を用いて回収した。それぞれのRNAサンプルをイルミナ社のDirectional mRNA-seq sample prepareation プロトコールに従い調製し、Genome Analyzer IIxを用いて解析し、全ゲノム領域のRNA発現を確認した。解析ソフトウェアはTOPHAT解析（Bioinformatics, 2009,25(9) p1105）を使用した。
その結果、βカテニンのsiRNAによりRNA発現量が減少する領域で、かつ、その領域の近傍5kb以内にβカテニンの結合が確認できる領域をβカテニンが制御する転写産物として同定した。βカテニンの結合はChIP-seqにより確認した。ChIPはサンタクルーズ社の抗βカテニン抗体を用いる方法(sc-7199およびCancer Sci.2008, 99(6) p1139）に従った。また、シークエンス解析はGenome Analyzer IIxおよびイルミナ社のChIP-seq Sample Prep kitを用いた。解析ソフトは、Model-based Analysis for ChIP-seq (MACS, Genome Biol (2008) vol. 9 (9) pp. R137)を使用した。【００５４】
1-2 新規lncRNAの全長塩基配列
クローンテック社のMarathon cDNA Amplification Kitを用いて、上記で同定したlncRNAの末端配列を同定した。また、イルミナ社のHiseq2000及びPaired-End mRNA-seq kitを用いてシーケンス解析を行い、TOPHAT解析によりcDNAをクローニングして、lncRNAの全長塩基配列（配列番号1〜１５および配列番号３８〜４１）を決定した。各配列番号に対応するスプライシングバリアントを以下のとおり命名した。
配列番号１：7F、配列番号２：8F Variant1、配列番号３：8F Variant2、配列番号４：8F Variant3、配列番号５：8F Variant4、配列番号６：8R Variant1、配列番号７：8R Variant2、配列番号８：9R、配列番号９：12R Variant1、配列番号１０：12R Variant2、配列番号１１：13R Variant1、配列番号１２：13R Variant2、配列番号１３：13R Variant3、配列番号１４：14R Variant1、配列番号１５：14R Variant2、配列番号３８：12R Variant3、配列番号３９：12R Variant4、配列番号４０：12R Variant5、配列番号４１：13R Variant3【００５５】
実施例２  β-カテニンによる新規lncRNAの誘導
実施例１で取得した新規lncRNAがβカテニンによって誘導されることを確認するため、実施例1-1の方法に従って、大腸癌細胞株SW480にβカテニンに対するsiRNAまたはコントロールsiRNAを添加して培養後トータルRNAを回収し、実施例１に示す新規lncRNAおよびβカテニンの発現量を定量的RT-PCR法でそれぞれ測定した。用いたプライマーを表１に示す。lncRNA8Rの検出にはプライマー8RFおよび8RR（配列番号１６、１７）、lncRNA9Rの検出にはプライマー9RFおよび9RR（配列番号１８、１９）、lncRNA12Rの検出にはプライマー12RFおよび12RR（配列番号２０、２１）、lncRNA13Rの検出にはプライマー13RFおよび13RR（配列番号２２、２３）をそれぞれ用いた。その結果、lncRNA8R、lncRNA9R、lncRNA12RおよびlncRNA13Rでβカテニンの発現低下に伴ってlncRNAの発現が低下した（図１）。【００５６】
【表１】
2014077354.tif 000002
【００５７】
実施例３  癌細胞、癌組織におけるlncRNA8R、lncRNA9R、lncRNA12RおよびlncRNA13Rの発現
アフィメトリックス社のHuman Exon 1.0 ST Arrayを用いた公開実験結果『GSE23768』『Series GSE16125』データをNational Center for Biotechnology and Information (NCBI)のGene Expression Omnibus （GEO)から取得して、癌細胞、癌組織におけるlncRNA8R、lncRNA9R、lncRNA12RおよびlncRNA13Rの発現を解析した。実施例１で得たlncRNA8Rのヒト染色体領域『第一染色体:3217233-3231768』のマイナス(-)鎖に設計されている17プローブに対するシグナル値の幾何平均、lncRNA9Rのヒト染色体領域『第十一染色体:2181184-2192608』のマイナス(-)鎖に設計されている4プローブに対するシグナル値の幾何平均、lncRNA12Rのヒト染色体領域『第二染色体:171178123-171264570』のマイナス(-)鎖に設計されている28プローブに対するシグナル値の幾何平均およびlncRNA13Rのヒト染色体領域『第二染色体:171264761-171277160』のマイナス(-)鎖に設計されている7プローブに対するシグナル値の幾何平均をそれぞれ算出した。その結果、いずれも大腸癌サンプルで発現が亢進していることを確認した(図２〜５)。【００５８】
実施例４  lncRNA8R、lncRNA12R およびlncRNA13Rの発現抑制による細胞増殖の抑制効果
実施例１で取得したlncRNA8R に対するsiRNA（stealth RNAi(8R1, 8R2)、ライフテクノロジー社)を大腸癌細胞株SW480へ実施例１と同様の方法により導入した。用いたsiRNAの配列およびその標的lncRNA8R配列を表２に示す（配列番号２４および４７、２５および４８）。コントロールsiRNAはStealth RNAi Negative Control Medium GC duplex#2 (ライフテクノロジー社、12935-112)を用いた。そして、siRNA導入後0日目から同仁化学のCell Counting Kit-8により細胞増殖を測定した。その結果、lncRNA8Rの発現を低下させることにより大腸癌細胞の増殖が抑制された(図６)。
また、アドジーン社のレンチウィルスベクターpLKO.1 puroレンチウィルスベクターを用いて、実施例1で取得したlncRNA12Rに対するshRNA（12R#16, 12R#17）をそれぞれ大腸癌細胞株SW480へ定法に従い導入した。用いたshRNAの設計に使用したオリゴDNAの配列およびその標的lncRNA12R配列を表３に示す（配列番号２６および４９、２７および５０）。導入後0日目から同仁化学のCell Counting Kit-8により細胞増殖を測定した。その結果、lncRNA12Rの発現を低下させることにより大腸癌細胞の増殖が抑制された(図７)。
さらに、lncRNA12R およびlncRNA13R に対する各種siRNA（カスタム合成siRNA、ジーンデザイン社)を大腸癌細胞株SW480、大腸癌由来リンパ節転移癌細胞株SW620（1.2×104細胞）へ終濃度50 nMとなるようにLipofectamine 2000(ライフテクノロジーズ社)を用いて添付プロトコールに従いそれぞれ導入した。用いたsiRNAの標的配列を表４に示す（配列番号４２−４６）。コントロールsiRNAはAllStars Negative Control siRNA (キアゲン社、1027281)を用いた。siRNA導入72時間後にCellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay kit（プロメガ社）を用いて生存細胞数を測定し、コントロールsiRNAに対する生存率を計算することで抗細胞活性を評価した。その結果、lncRNA12R、lncRNA13Rの発現を低下させることにより大腸癌細胞の増殖が抑制された(図８)。
以上より、lncRNA8R 、lncRNA12RおよびlncRNA13Rの発現抑制による細胞増殖の抑制効果を確認した。【００５９】
【表２】
2014077354.tif 000003
【００６０】
【表３】
2014077354.tif 000004
【００６１】
【表４】
2014077354.tif 000005
【００６２】
実施例５  癌細胞における新規lncRNAのPRC2結合
実施例１で取得した新規lncRNAがPolycomb Recessive Complex 2 (PRC2)と結合していることを示すために、PRC2の構成成分であるEZH2、SUZ12に対する抗体を用いたRNAクロマチン免疫沈降（RIP-ChIP）実験を行った。SW480細胞株から細胞抽出液を調製し、コントロールIgG（シグマアルドリッチ社、カタログ番号A-6154）、抗EZH2抗体（アクティブモチーフ社、カタログ番号39933)、抗SUZ12抗体（アブカム社、カタログ番号ab12073）を用いた。方法はNature Protocol 2006 vol1 NO12011.12.1に従った。
得られたRNAから、インビトロジェン社のSuperScript IIIを用いてcDNAを調製した。実施例１で得たlncRNA9R、lncRNA12Rおよび既知のlncRNAであるTUG1、MALAT1、HOTAIR、ACTB、SNORD15それぞれに対する特異的プライマーを用いて定量的RT-PCRを行った。用いたプライマー配列を表１に示す（配列番号１８−２１、２８−３７）。その結果、lncRNA9R、lncRNA12Rは、SUZ12抗体およびEZH2抗体と共沈しPRC2に結合することが示された(図９)。
さらに、癌細胞株でPRC2と結合するncRNAを網羅的に明らかにするために、PRC2の構成成分であるSUZ12に対する抗体を用いたRNAクロマチン免疫沈降-シーケンス（RIP-seq）実験を行った。SW620細胞株から核抽出液を調製し、コントロールIgG（シグマアルドリッチ社、カタログ番号A-6154）、抗SUZ12抗体（アブカム社、カタログ番号ab12073）を用いた。RIP手法はNature Protocol 2006 vol1 NO12011.12.1を一部改変したものに従った。
得られたRNAから、イルミナ社のTruSeq RNA Sample Preparation Kitsを用いてシーケンス用ライブラリを調製、イルミナ社シーケンサーHiseq2000による解読を実施した。TOPHAT解析後、ミトコンドリアにマップされたリード数で標準化した後、lncRNA領域内にマップされたリード数を計数し、コントロールIgGでのリード数に対する抗SUZ12抗体でのリード数の比を求めることでPRC2への結合能を評価した。ネガティブコントロールとしてGAPDH（Glyceraldehyde_3-phosphate_dehydrogenase 遺伝子）を、ポジティブコントロールとしてTUG1（Taurine upregulated gene 1 遺伝子）を用いた。その結果、lncRNA13RがPRC2に強く結合していることが示された（図１０）。【００６３】
実施例６  lncRNA12R 、lncRNA13R の発現抑制による癌細胞のコロニー形成能の抑制効果
lncRNA12RおよびlncRNA13R に対するsiRNA（カスタム合成siRNA、ジーンデザイン社)を大腸癌細胞株SW480、大腸癌由来リンパ節転移癌細胞株SW620（3×105細胞）へ終濃度50 nMとなるようにLipofectamine 2000(ライフテクノロジーズ社)を用いて添付プロトコールに従いそれぞれ導入した。用いたsiRNAの標的配列を表４に示す（配列番号４２、４５）。コントロールsiRNAはAllStars Negative Control siRNA (キアゲン社、1027281)を用いた。そして、siRNA導入から24時間後に軟寒天培地と細胞を混合して1.5×103細胞を播種し直し、8日後にIn Cell Analyzer 1000（GEヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて形成されたコロニーを撮影した。その結果、大腸癌細胞株SW480ではsiRNA 12R#506、13R#9443を、大腸癌由来リンパ節転移癌細胞株SW620ではsiRNA 12R#506を導入することによりコロニー形成能が抑制された（図１１）。
以上より、lncRNA12RおよびlncRNA13Rの発現抑制による癌細胞のコロニー形成能の抑制効果を確認した。【００６４】
実施例７  lncRNA12Rの発現抑制による癌細胞の遊走能の抑制効果
lncRNA12Rに対するsiRNA（カスタム合成siRNA、ジーンデザイン社)を大腸癌細胞株SW480へ実施例６と同様の方法で導入した。用いたsiRNAの標的配列を表４に示す（配列番号４２−４４）。コントロールsiRNAはAllStars Negative Control siRNA (キアゲン社、1027281)を用いた。そして、siRNA導入から24時間後に無血清培地に懸濁し、xCELLigence Real Time Cell Analyzer DP（ロシュダイアグノスティックス社）CIM plate 16のupper wellに4×104細胞を播種した。Lower wellに血清入りの培地を満たしてwellを連結し、血清を誘引物質とした遊走能の評価を行った。その結果、siRNA導入によりlncRNA12Rの発現を低下させることにより大腸癌細胞株の遊走能が抑制された（図１２）。
以上より、lncRNA12Rの発現抑制による癌細胞の遊走能の抑制効果を確認した。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明により、βカテニンにより誘導される新規のlncRNAが提供される。該lncRNAの発現を抑制する核酸、物質をスクリーニングすることにより、癌の診断または治療をすることができる。【００６６】
本出願は、２０１２年１１月１６日付で出願された米国仮特許出願第６１／７２７，１８５号を基礎としており、ここで言及することにより、その内容はすべて本願明細書に包含される。
【図１】
2014077354.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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