(57)【要約】  本発明は、Xkr8の機能を調節する物質のスクリーニング方法であって、（１）Xkr8発現細胞とXkr8の機能を調節する物質の候補物質とを接触させる工程、および（２）該細胞の細胞膜におけるリン脂質の分布を変化させる候補物質を選択する工程を含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Xkr8の機能を調節する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法：
（１）Xkr8発現細胞と、Xkr8の機能を調節する物質の候補物質とを接触させる工程、および
（２）該細胞の細胞膜におけるリン脂質の分布を変化させる候補物質を選択する工程。
【請求項２】
リン脂質が、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、およびスフィンゴミエリンから選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ホスファチジルセリンの細胞膜外葉における分布を増加させる候補物質がXkr8の機能を亢進する物質として選択され、ホスファチジルセリンの細胞膜外葉における分布を減少させる候補物質がXkr8の機能を抑制する物質として選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ホスファチジルエタノールアミンの細胞膜外葉における分布を増加させる候補物質がXkr8の機能を亢進する物質として選択され、ホスファチジルエタノールアミンの細胞膜外葉における分布を減少させる候補物質がXkr8の機能を抑制する物質として選択される、請求項２記載の方法。
【請求項５】
ホスファチジルコリンの細胞膜内葉における分布を増加させる候補物質がXkr8の機能を亢進する物質として選択され、ホスファチジルコリンの細胞膜内葉における分布を減少させる候補物質がXkr8の機能を抑制する物質として選択される、請求項２記載の方法。
【請求項６】
スフィンゴミエリンの細胞膜内葉における分布を増加させる候補物質がXkr8の機能を亢進する物質として選択され、スフィンゴミエリンの細胞膜内葉における分布を減少させる候補物質がXkr8の機能を抑制する物質として選択される、請求項２記載の方法。
【請求項７】
アポトーシスが関与する疾患の治療または予防のための薬剤のスクリーニング方法である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
アポトーシスが関与する疾患が自己免疫疾患である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
アポトーシスが関与する疾患ががんである、請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Xkr8の機能を調節する物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物において、細胞膜を構成するリン脂質は外葉と内葉で非対称的に分布している。ホスファチジルセリン（PtdSer）およびホスファチジルエタノールアミン（PtdEtn）は細胞膜の内葉に存在し、ホスファチジルコリン（PtdCho）とスフィンゴミエリン（SM）は主に外葉に存在する。細胞膜におけるPtdSerとPtdEtnの非対称的分布はアミノリン脂質トランスロカーゼ（aminophospholipid translocase）によりATP依存的に維持されている。リン脂質の非対称的分布は様々な生物学的プロセスで破壊され、細胞表面のPtdSerはシグナル分子として機能する。例えば、アポトーシスを起こした細胞の表面に露出されたPtdSerは、マクロファージに対する「eat me」シグナルとして機能する。また、活性化された血小板では、細胞表面に露出されたPtdSerは、血液凝固因子を活性化し、血液凝固を誘発する。【０００３】
細胞表面へのPtdSerの露出は、リン脂質スクランブラーゼの作用によるものである。しかしながら、これまでリン脂質スクランブラーゼの実態は不明であった。最近、活性化した血小板におけるホスファチジルセリンの露出に関与する分子として、Ca2+依存的なリン脂質スクランブラーゼとしてTMEM16Fが同定された。しかしながら、TMEM16F欠損細胞は、アポトーシスの刺激に対して野生型の細胞と同様にホスファチジルセリンを露出したことから、TMEM16Fはアポトーシスの際のホスファチジルセリンの露出には関与しないと考えられた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０２９８５５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、鋭意研究の末、アポトーシスのときのPtdSerの露出に関与するタンパク質としてXkr8を同定し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下を提供する：
Xkr8の機能を調節する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法：
（１）Xkr8発現細胞と、Xkr8の機能を調節する物質の候補物質とを接触させる工程、および
（２）該細胞の細胞膜におけるリン脂質の分布を変化させる候補物質を選択する工程。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、Xkr8の機能を調節する物質のスクリーニング方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１ａ】Xkr8の分子クローニングおよび特徴決定（a）。Cy5-Annexin Vで染色したBa/F3およびそのサブラインであるLD-PS5-2-2細胞。
【図１ｂ】Xkr8の分子クローニングおよび特徴決定（b）。FasLで処理しCy5-Annexin Vで染色した、WR-FasおよびそのmXkr8-GFPまたはmTMEM16F-GFP発現形質転換体。下の写真は、細胞溶解物を抗カスパーゼ3抗体および抗α-チューブリン抗体により解析したものである。
【図１ｃ】Xkr8の分子クローニングおよび特徴決定（c）。mXkr8 shRNAまたはスクランブルshRNAを有するレトロウイルスにより形質転換したWR-FasクローンにおけるmXkr8についてのリアルタイムRT-PCR。
【図１ｄ】Xkr8の分子クローニングおよび特徴決定（d）。WR-Fas、そのmXkr8 shRNA発現形質転換体、およびhXkr8でさらに形質転換した細胞（それぞれ２クローン）をFasLで処理し、Cy5-Annexin Vで染色した。右の写真は、細胞溶解物を抗カスパーゼ3抗体および抗α-チューブリン抗体により解析したものである。
【図１ｅ】Xkr8の分子クローニングおよび特徴決定（e）。hXkr8-GFPによる293T細胞形質転換体を蛍光顕微鏡により観察した。スケールバー, 10μm。
【図２ａ】PLB-985細胞またはRaji細胞でのXkr8の非発現（a）。Jurkat、Namalwa、PLB-985、およびRaji細胞をスタウロスポリン (STS)、UV、またはFasLで処理し、Cy5-Annexin Vで染色した。
【図２ｂ】PLB-985細胞またはRaji細胞でのXkr8の非発現（b）。リアルタイムRT-PCRにより決定したJurkat、Namalwa、PLB-985、およびRaji細胞におけるXkr8 mRNAレベル。
【図２ｃ】PLB-985細胞またはRaji細胞でのXkr8の非発現（c）。PLB-985細胞およびRaji細胞、並びにそれらのhXkr8形質転換体をSTS、UV、またはFasLで処理し、Cy5-Annexin Vおよびヨウ化プロピジウム(PI)で染色した。アポトーシス細胞における活性型カスパーゼ3の染色プロファイルを、増殖中の細胞のもの（白抜き部分）と共に示した。
【図３ａ】Xkr8遺伝子発現のエピジェネティックな制御（a）。hXkr8 遺伝子プロモーターにおけるCpGアイランド。上：エクソン１をボックスで示す。白抜き部分および黒塗り部分はそれぞれ5’非コード領域およびコード領域を示す。矢印は転写開始部位を示す。各CpG部位は垂直線で、CpGアイランドは水平線で示す。下： hXkr8遺伝子の-239から+7のヌクレオチド配列。23個のCpGを網掛けで示し、転写認識部位を下線で示す。
【図３ｂ】Xkr8遺伝子発現のエピジェネティックな制御（b）。各円はCpG部位を示し、メチル化の程度は、黒：75-100%、灰色：26-75%、白：0-25%である。
【図３ｃ】Xkr8遺伝子発現のエピジェネティックな制御（c）。PLB-985細胞をDACで処理し、Xkr8 mRNAをリアルタイムRT-PCRにより測定した。
【図３ｄ】Xkr8遺伝子発現のエピジェネティックな制御（d）。5日間DACで処理したPLB-985細胞をUVに暴露し、Cy5-Annexin VおよびPIにより染色した。
【図４ａ】hXkr8によるスクランブリング活性の特徴決定（a）。PLB-985細胞およびそのhXkr8発現形質転換体をSTSで処理し、細胞溶解物を抗ICADによるウェスタンブロットにより解析した。
【図４ｂ】hXkr8によるスクランブリング活性の特徴決定（b）。PLB -985細胞およびそのhXkr8発現形質転換体をSTSで処理し、ビオチン-ROペプチドおよびストレプトアビジン-APC並びにPIにより染色し、FACSにより解析した。
【図４ｃ】hXkr8によるスクランブリング活性の特徴決定（c）。PLB-985細胞およびhXkr8発現形質転換体をSTSで処理し、NBD-PCとともにインキュベートした。各時間において、取り込まれなかった脂質を抽出し、FACSAriaにより解析した。SytoxBlue陰性画分における蛍光強度を組み込まれたNBD-PCとして任意単位（arbitrary units）で示す。
【図４ｄ】hXkr8によるスクランブリング活性の特徴決定（d）。図４ｃと同様にして、細胞をNBD-SMとともにインキュベートした
【図５ａ】アポトーシス性PtdSer露出を誘発するカスパーゼによるXkr8の活性化（a）。各種生物種のXkr8のアミノ酸配列。推定膜貫通領域を灰色で示す。カスパーゼ認識部位を枠でかこみ、二塩基性または二芳香族性のER移行シグナルを二重下線で示す。
【図５ｂ】アポトーシス性PtdSer露出を誘発するカスパーゼによるXkr8の活性化（b）。Xkr8の構造。
【図５ｃ】アポトーシス性PtdSer露出を誘発するカスパーゼによるXkr8の活性化（c）。野生型、カスパーゼ抵抗性 (2DA)および切断型 (D)のGFP融合hXkr8およびmXkr8。TM, 膜貫通領域; RR/FF, ER排出のための推定二塩基性または二芳香族性配列。
【図５ｄ】アポトーシス性PtdSer露出を誘発するカスパーゼによるXkr8の活性化（d）。PLB-985細胞並びにそのGFP発現形質転換体および野生型または変異体hXkr8とGFPとの融合タンパク質発現形質転換体をSTSに暴露し、Cy5-Annexin Vにより染色した (d)。
【図５ｅ】アポトーシス性PtdSer露出を誘発するカスパーゼによるXkr8の活性化（ｅ）。図５ｄの細胞溶解物を抗GFP及び抗ICADにより解析した。
【図５ｆ】アポトーシス性PtdSer露出を誘発するカスパーゼによるXkr8の活性化（f）。WR-FasおよびそのGFP、mXkr8-GFP、またはmXkr8 2DA-GFP発現形質転換体をFasLで処理した。細胞溶解物を抗GFPによるウェスタンブロッティングにより解析した。
【図５ｇ】アポトーシス性PtdSer露出を誘発するカスパーゼによるXkr8の活性化（g）。hXkr8-GFP (W) またはhXkr8 2DA-GFP (DA)を発現するPLB-985形質転換体の膜画分を、図中に示すヒト組換カスパーゼ (C1-C10: カスパーゼ 1-カスパーゼ 10)とインキュベートし、抗GFPによるウェスタンブロッティングにより解析した。
【図５ｈ】アポトーシス性PtdSer露出を誘発するカスパーゼによるXkr8の活性化（h）。hXkr8-GFPまたはhXkr8D-GFPを発現する293T細胞形質転換体を蛍光顕微鏡で観察した。スケールバー, 10μm。
【図６ａ】マウスXkr8-/-胎児胸腺細胞の樹立（a）。図中に示すマウス組織におけるXkr8 mRNAレベルをRT-PCRにより測定し、Gapdh mRNAとの比較として示した。
【図６ｂ】マウスXkr8-/-胎児胸腺細胞の樹立（b）。野生型、floxed、および欠失型のmXkr8染色体遺伝子およびそのターゲティングベクターの構造。
【図６ｃ】マウスXkr8-/-胎児胸腺細胞の樹立（c）。Xkr8flox/flox IFET細胞、Xkr8-/- IFET細胞、およびXkr8で形質転換したXkr8-/- IFET細胞およびTMEM16F-/- IFET細胞をFasLで処理し、Cy5-Annexin VおよびPI、または抗活性型カスパーゼ3により染色した。
【図６ｄ】マウスXkr8-/-胎児胸腺細胞の樹立（d）。野生型、Xkr8-/- およびTMEM16F-/- IFET細胞を、Cy5-Annexin Vの存在下、A23187で処理し、細胞に対するAnnexin Vの結合をフローサイトメトリーによりモニターした。
【図７ａ】Ba/F3細胞におけるFasL誘導性PtdSer露出に対するXkr8のノックダウンの効果（a）。mXkr8 shRNAまたはスクランブルshRNAを有するレトロウイルスにより形質転換したBa/F3-FasクローンにおけるmXkr8についてのリアルタイムPCR。
【図７ｂ】Ba/F3細胞におけるFasL誘導性PtdSer露出に対するXkr8のノックダウンの効果（b）。Ba/Fas-FasおよびそのmXkr8 shRNA発現形質転換体（それぞれ２クローン）をFasLで処理し、Cy5-Annexin Vにより染色した。
【図８】Ca依存性PdtSer露出に対するhXkr8の作用。PLB-985およびそのhXkr8形質転換体を20℃で1.0μM A23187およびCy5標識Annexin Vで処理し、細胞へのAnnexin Vの結合をフローサイトメトリーにより10分間モニターした。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
Xkr8は、６回膜貫通領域を有する膜タンパク質である。ヒトおよびマウスのXkr8の塩基配列は、GenBank NM_018053およびGenBank NM_201368に開示されている。マウス、ラット、ヒト、フグ、メダカ、XenopusのXkr8のアミノ酸配列（配列番号１〜６）を図５ａに示す。
【００１０】
「Xkr8の機能を調節する物質の候補物質」は、天然物質であっても合成物質であってもよく、低分子化合物、タンパク質、核酸分子、ペプチド、抗体、微生物、植物、または動物の細胞抽出物または培養上清などが挙げられる。候補物質は、低分子化合物、ペプチド、または抗体のライブラリーなどの、ライブラリーの形態で提供されてもよい。
【００１１】
本明細書において、「Xkr8発現細胞」には、Xkr8をそのゲノムから天然に発現する細胞、および細胞に導入されたXkr8をコードする遺伝子からXkr8を発現する細胞が含まれる。細胞は、ヒト、サル、マウス、またはウサギ由来の細胞であってよく、またこれらに限定はされない。本発明においては、例えば、ヒトHeLa、ヒトEBV (Epstein Barr Virus)形質転換B細胞株、マウスMEF (胚性線維芽細胞)、およびマウスプロB細胞株であるBa/F3などを使用することができる。Xkr8をコードする遺伝子を細胞に導入し、Xkr8発現細胞を作製する方法は、当業界にて周知である（Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
【００１２】
「Xkr8の機能を調節する物質」には、「Xkr8の機能を亢進する物質」と「Xkr8の機能を抑制する物質」が含まれる。本明細書において、「Xkr8の機能を亢進する（または抑制する）」とは、細胞または動物におけるXkr8のリン脂質スクランブラーゼとしての機能を増強する（または阻害する）ことを意味する。「Xkr8の機能を調節する物質」は、Xkr8の機能に直接的または間接的に影響する物質であっても、Xkr8の発現を増加または減少させる物質であってもよい。「Xkr8の発現を増加または減少させる物質」には、Xkr8をコードする遺伝子からのmRNAの発現を増加または減少させる物質、およびXkr8のタンパク質発現を増加または減少させる物質が含まれる。それゆえ、「Xkr8の機能を調節する物質」には、Xkr8をコードする遺伝子の、プロモーターまたはエンハンサーなどの調節配列に作用する物質、およびXkr8をコードする遺伝子の配列に基づき調製されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（DNAまたはRNA）、siRNA、miRNA、およびリボザイムなどが含まれる。また、Xkr8はカスパーゼにより切断され活性化されることから、「Xkr8の機能を調節する物質」には、Xkr8のカスパーゼによる切断を増加または減少させる物質が含まれる。
【００１３】
本発明の方法では、Xkr8のリン脂質スクランブラーゼとしての酵素活性を測定する。リン脂質は、ホスファチジルセリン（PtdSer）、ホスファチジルエタノールアミン(PtdEtn)、ホスファチジルコリン（PtdCho）、およびスフィンゴミエリン（SM）から選択される。通常の状態では、PtdSerおよびPtdEtnは細胞膜の内葉に分布し、PtdChoおよびSMは細胞膜外葉に分布する。Xkr8は、PtdSerおよびPtdEtnを細胞膜外葉へ移動させ（すなわち、PtdSerおよびPtdEtnを露出させ）、PtdChoおよびSMを細胞膜内葉に移動させる（すなわち、PtdChoおよびSMを取り込む）。Xkr8の酵素活性は、細胞膜における脂質の分布を調べることにより、測定することができる。
【００１４】
対照と比較してPtdSerまたはPtdEtnの細胞膜外葉における分布を増加させる（露出を増加させる）候補物質は、「Xkr8の機能を亢進する物質」として選択され、対照と比較してPtdSerまたはPtdEtnの細胞膜外葉における分布を減少させる（露出を減少させる）候補物質は、「Xkr8の機能を抑制する物質」として選択される。対照と比較してPtdChoまたはSMの細胞膜内葉における分布を増加させる（取り込みを増加させる）候補物質は、「Xkr8の機能を亢進する物質」として選択され、対照と比較してPtdChoまたはSMの細胞膜内葉における分布を減少させる（取り込みを減少させる）候補物質は、「Xkr8の機能を抑制する物質」として選択される。
【００１５】
本明細書における「対照」とは、Xkr8発現細胞の同じ細胞膜層（外葉または内葉）における同じ脂質の、候補物質の非存在下での分布を意味する。
【００１６】
「（１）Xkr8発現細胞と、Xkr8の機能を調節する物質の候補物質とを接触させる工程」において、典型的には、候補物質は、アポトーシス誘導性刺激の存在下、Xkr8発現細胞の培養培地に添加される。アポトーシス誘導性刺激としては、FasL、スタウロスポリンなどのアポトーシス誘導性分子、およびUV照射が挙げられる。アポトーシス誘導性刺激は、候補物質の培地への添加前に、添加と同時に、または添加後に、細胞に与えることができる。
【００１７】
細胞膜におけるPtdSerの分布は、細胞表面に露出するPtdSerと、PtdSerに対する結合性を有する物質（例えば、AnnexinVまたはMFG-E8 (ラクトアドヘリンともいう)）との間の結合を検出することにより、調べることができる。例えば、Xkr8発現細胞を蛍光標識したAnnexinVで処理し、細胞表面に結合したAnnexinVの量を測定する。
【００１８】
細胞膜におけるPtdSerの分布は、血液凝固反応に基づき調べることもできる。例えば、アポトーシス誘導性刺激の存在下、Xkr8発現細胞を候補物質および血液凝固に必要とされる物質（例えば、Xa因子、Va因子、またはプロトロンビン）と混合し、そしてトロンビンの生成を測定する。 あるいは、フィブリノーゲンをさらに培地に添加して、フィブリンの生成を測定してもよい。
【００１９】
細胞膜におけるPtdEtnの分布は、細胞表面に露出するPtdEtnと、PtdEtnに対する結合性を有する物質（例えば、PtdEtn結合ペプチドであるRO09-0198)との間の結合を検出することにより、調べることができる。例えば、Xkr8発現細胞をビオチン化したRO09-0198で処理し、蛍光標識したストレプトアビジンで染色して、細胞表面に結合したRO09-0198の量を測定する。
【００２０】
細胞膜におけるPtdChoおよびSMの分布は、蛍光標識した脂質により測定することができる。蛍光標識としては、NBDおよびTopFluorなどを使用することができる。例えば、蛍光標識脂質をXkr8発現細胞の培養培地に添加すると、蛍光標識脂質がXkr8発現細胞の細胞膜外葉に取り込まれる。Xkr8が脂質スクランブラーゼとして機能すると、蛍光標識脂質は細胞膜内葉に移動する（すなわち、取り込まれる）。よって、NBD-PCまたはNBD-SMのような蛍光標識脂質の存在下、Xkr8発現細胞をアポトーシス誘導性刺激とともに候補物質で処理し、次いで、細胞をBSAで処理して取り込まれなかった蛍光標識脂質を除去し、細胞に取り込まれた蛍光標識脂質をフローサイトメトリーにより測定すればよい。
【００２１】
Xkr8は、アポトーシスを起こした細胞におけるPtdSerの露出に関与する。それゆえ、本発明の方法は、アポトーシスが関与する疾患の治療薬の開発に有用である。「アポトーシスが関与する疾患」には、自己免疫疾患、がん、AIDS、アルツハイマー病などの脳疾患が含まれる。
【００２２】
本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
【実施例１】
【００２３】
１．方法
（１）細胞株、組換タンパク質、抗体、および材料
マウスインターロイキン(IL-3)依存性Ba/F3細胞50は、RPMI（10%ウシ胎児血清(FCS, Gibco)、45 単位/ml マウスIL-3、および50μM β-メルカプトエタノール含有）で維持した。ヒトPLB-98551、Jurkat (ATCC TIB152)、Namalwa (ATCC CRL-1432)、およびRaji (ATCC CCL-86) 細胞は、RPMI1640 （10% FCSおよび50μMβ-メルカプトエタノール含有）にて増殖させた。Plat-Eパッケージング細胞52は、DMEM （10% FCS含有）にて増殖させた。組換マウスIL-353およびヒトFasL54は、既報のとおり調製した。ウサギ抗活性型カスパーゼ3 mAbは、Cell Signalingから入手した。マウス抗ヒトICAD mAbはMedical & Biological Laboratories (MBL)から入手し、Alexa 488- およびAlexa 568- 標識ヤギ抗ウサギIgGはInvitrogenから入手した。スタウロスポリンは協和発酵キリンより提供を受けた。【００２４】
（２）cDNAライブラリーの構築およびXkr8の同定
Ba/F3-PS19細胞由来のポリ(A) RNAを用いて、ランダムヘキサマーをプライマーとして使用して二本鎖cDNAを合成し、BstXIアダプターを既報のとおり連結した55。長さ1.0-2.5 kbのDNA断片を1%アガロースゲルでの電気泳動によりサイズ分画し、Bst XIで消化したpMXsベクター56にライゲートした。E. coli DH10B細胞 (ElectroMax DH10B; Invitrogen) をエレクトロポレーションにより形質転換して、約1.3 x 106 クローンを得た。cDNAライブラリー由来のプラスミドDNAを用いて、Plat-E細胞においてレトロウイルスを産生し、遠心分離により濃縮し、既報のとおりBa/F3細胞に感染させた55。A23187で処理した細胞を、氷上で、Cy5-Annexin V (Biovision)により１5分間、および5μg/ml ヨウ化プロピジウム (PI)により2分間、染色し、FACSAria (BD Biosciences)でソートした。レトロウイルスベクターに組み込まれたcDNAは、Ba/F3細胞形質転換体由来のDNAを用いて、既報のとおりPCRにより同定した55。【００２５】
（３）マウスおよびヒトXkr8のための発現プラスミドおよびその変異体
mXkr8 (GenBank NM_201368) およびhXkr8 (GenBank NM_018053) の全長コーディング配列を、それぞれBa/F3細胞およびNamalwa細胞からRT-PCRにより調製した。使用したプライマーは以下のとおりである(各プライマーにおいて、Bam HIまたはEco RI 認識配列を下線で示す。)：
mXkr8: 5’-ATATGGATCCATCATGCCTCTGTCCGTGCACCA-3’ （配列番号７）および 5’-ATATGAATTCGAGGACTCCATTCAGCTGCA-3’ （配列番号８）
hXkr8: 5’-ATATGGATCCGCCATGCCCTGGTCGTCCCGCGG-3’ （配列番号９）および5’-ATATGAATTCTCCCTTCACTGGCGAAGCAG-3’ （配列番号１０）
GFP配列をpMXs puroのEco RI部位とXho I部位の間に挿入することにより、pMXs puro c-GFPを構築した。次いで、Xkr8 cDNAをpMXs puro c-FLAG55またはpMXs puro c-GFPのBam HI/Eco RI部位に挿入し、C末端にFLAGタグまたはGFPタグを有するタンパク質を発現させた。mXkr8のD351A/D354A (2DA)変異体およびhXkr8のD352A/D355A (2DA) 変異体を作成するため、マウスおよびヒトXkr8 cDNAを、変異ヌクレオチドを有する以下の30ヌクレオチドのプライマーを用いた組換PCR57により変異させた: 
mXkr8 2DA: 5’-GGGACCCTGCCCTCGTGGCTGGGACCCTAG-3’, （配列番号１１）および 5’-CTAGGGTCCCAGCCACGAGGGCAGGGTCCC-3’ （配列番号１２）
hXkr8 2DA: 5’-AAGCCCGACCCTGCCCAGGTAGCCGGGGCC-3’ （配列番号１３）および5’-GGCCCCGGCTACCTGGGCAGGGTCGGGCTT-3’ （配列番号１４）
hXkr8のC末端欠失変異体を構築するため、以下の変異型リバースプライマー: 5’-CGAGATCTGAATTCTCAGTCTACCTGGTCAGGGTCGG-3’ （配列番号１５）(Eco RI認識配列を下線で示す)を用いてPCRを行い、pMXs puroベクターに挿入した。【００２６】
（４）shRNA
mXkr8のための、ピューロマイシン抵抗性遺伝子を有するpRS shRNAベクターにおけるshRNA発現プラスミド4種類は、OriGeneより購入した。4つの配列のうち、shRNAに最適な標的配列は5’-GAATCTGTGCCATCGCCTTGTTCTCAGCT-3’ （配列番号１６）であった。pRSにおけるスクランブルshRNAもまた、OriGeneより購入した。Ba/F3にshRNAを含むレトロウイルスを感染させ、WR19Lにはエレクトロポレーションにより導入した。1.0μg/mlピューロマイシンを含む培地中で培養することにより安定な形質転換体を限界希釈によりクローニングした。Xkr8 mRNAはリアルタイムRT-PCRにより定量した。【００２７】
（５）Xkr8コンディショナルノックアウトマウスの樹立
Xkr8をコンディショナルに標的化したマウスは、Unitechに特別注文して作成した。 説明すると、FRT配列で挟まれたホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK) プロモーター誘導性ネオマイシン耐性(neo) 遺伝子を有するneo-loxP カセットをXkr8遺伝子のイントロン3に挿入した。エクソン3を含む1.0-kbのDNAフラグメントを対応する配列とP1 (loxP)配列において交差する遺伝子座を有するフラグメントと置き換えた。チミジンキナーゼ (tk) プロモーターに誘導されるジフテリア毒素A断片 (DT-A)をベクターの5’末端に挿入した。マウスBruce-4ｈ胚性幹 (ES) 細胞58にターゲティングベクターを導入し、G418耐性クローンをPCRにより相同組換についてスクリーニングした。陽性クローンを胚盤胞に注射し、Xkr8+/NeoFRTマウスを作成した。Xkr8+/NeoFRT マウスを、サイトメガロウイルスエンハンサー−トリβ-アクチンハイブリットプロモーター(CAG)誘導性のフリッパーゼ変異体 (FLPe) 遺伝子(CAG-FLPe)59を有するトランスジェニックマウスと交配し、得られたマウスをC57BL/6に戻し交配して、Xkr8+/floxマウスを得た。いずれのマウスも京都大学における特定の飼育室（SPF, 特定された微生物や寄生虫が存在しない飼育室）で飼育し、動物実験は全て京都大学に認可されたプロトコールにしたがって実施した。【００２８】
（６）胎児胸腺細胞株の樹立
不死化胎児胸腺細胞株  (IFET) は、胎児胸腺細胞を既報のとおりH-rasV12およびc-mycにより不死化することで樹立した60, 61。説明すると、Xkr8+/floxマウス同士を交配し、胎児胸腺細胞を胎生 (E) 14.5日で得た。H-rasV12 およびc-mycの遺伝子を有するレトロウイルスを pCX4ベクター62を用いてPlat-E細胞で産生し、RetroNectinコートプレート (Takara Bio) に、室温で2,000 x gにて2-3時間遠心分離することにより結合させた。400 x gにて5分間遠心分離することにより、レトロウイルスをコートしたプレートに胸腺細胞を接着させ、DMEM（10% FCS、1 x 非必須アミノ酸、10 mM Hepes-NaOHバッファー (pH 7.4)、50μM β-メルカプトエタノール、5 ng/ml マウスIL-763 (PeproTech)、およびGlutaMax（商標） (Gibco)含有）にて培養した。得られたIFET細胞にAdeno-Cre (Adenovirus Cre/loxP, Takara Bio)を感染させ、限界希釈によりクローニングした。Xkr8-/-アリルを有するクローンを、以下のプライマーを用いたPCRにより選択した (野生型特異的センスプライマー: 5’-CTCATTGCTGATGTGGGTGACAATA-3’ （配列番号１７）; 変異型特異的センスプライマー: 5’-AGGCTTTTCTCTACTTTTGATGGAG-3’ （配列番号１８）; および共通のアンチセンスプライマー: 5’-CATTATCTTCCTCACTGGCTGAATC-3’ （配列番号１９）)。【００２９】
（７）ヒトおよびマウス細胞の形質転換
pMX-puroベクターをPlat-E細胞に導入することにより、マウスおよびヒトXkr8cDNAを有するレトロウイルスを作製し、遠心分離により濃縮し、Ba/F3細胞およびXkr8-/- IFET細胞に感染させた。安定な形質転換体を、ピューロマイシン含有培地(Ba/F3細胞について1.0μg/ml、IFET細胞について2.0μg/ml)にて選択し、組換タンパク質の発現を抗Flag (Clone M2, Sigma)または抗GFP (Clone JL8, Clontech)によるウェスタンブロッティングにより確認した。レトロウイルスによる形質転換によってマウスFas cDNA64をIFET細胞に導入し、その発現を抗マウスFas mAb (Jo2)65によるフローサイトメトリーにより確認した。ヒトPLB-985およびマウスWR19L細胞を両種性レトロウイルスエンベロープまたはVSVγエンベロープによるレトロウイルス感染により形質転換した。説明すると、pMXsレトロウイルスベクター、pGP (Takara Bio) （gag-pol融合タンパク質用）、およびpE-ampho (Takara Bio)またはpCMV-VSV-G-RSV-Rev (理化学研究所三好博士より供与)を一緒に293T細胞に導入することにより、レトロウイルスを産生した。培養上清中のウイルス粒子を遠心分離により濃縮し、細胞株を形質転換した。Xkr8-GFPを293T細胞で発現させるため、Fugene 6 (Promega)を用いたリポフェクションにより、293T細胞にpMXs puroXkr8-GFPを導入した。安定な形質転換体は、1.0μg/ml ピューロマイシンを含む培地で選択した。【００３０】
（８）アポトーシスの誘導、Ca2+イオノフォアによる処理、およびフローサイトメトリー
細胞にFasLまたはスタウロスポリンを処理し、あるいはUV照射し、アポトーシスを誘導した。説明すると、5 x 105細胞（培養培地500μl中）を、37℃で、10-400単位/ml hFasLと1.2-2.0時間、あるいは10μM スタウロスポリンと1.5-4.0時間、インキュベートした。UV照射では、StrataLinker UVオーブン (Stratagene)において、1 x 106細胞（PBS2 ml中）に500-2000 J/m2 (254 nm)にてUV照射し、10% FCS含有RPMI1640（4 ml）中で37℃にて1.5-2.0時間インキュベートした。Ca2+イオノフォア誘発PtdSer露出をモニターするため、細胞 (5 x 105細胞)をAnnexin V染色バッファー (10 mM Hepes-NaOHバッファー [pH7.4]、140 mM NaClおよび2.5 mM CaCl2含有) 500μl中で20℃にて3分間インキュベートし、3.0-10μM A23187で処理し、FACSAriaで20℃にて解析した。【００３１】
細胞における活性型カスパーゼ3を検出するため、細胞 (1 x 106細胞)を1%パラホルムアルデヒド(PFA)含有PBS中で37℃にて10分間インキュベートして固定でした。冷却した0.5% BSA含有PBSで洗浄後、細胞を-20℃にて90%メタノール中で一晩インキュベートすることにより透過処理した。次いで、細胞を200倍希釈のウサギ抗活性型カスパーゼ3と室温で30分間インキュベートし、続いて1,000倍希釈のAlexa 488-またはAlexa 568標識ヤギ抗ウサギIgGと30分間インキュベートした。0.5% BSA含有PBSで洗浄後、細胞をFACSチューブに濾過し、FACSAriaにより解析した。【００３２】
（９）リン脂質スクランブリング活性の評価
細胞表面に露出するPtdSerおよびPtdEtnを検出するため、細胞を氷上で2500-5000倍希釈のCy5-Annexin V (Biovision)または800倍希釈のビオチン-Ro09-019866で15分間染色し、続いて1.0μg/ml APC-ストレプトアビジン (Annexin V染色バッファー中)により5μg/mlヨウ化プロピジウム(PI)の存在下染色し、FACSAriaまたはFACSCalibur (BD Biosciences)により解析した。PtdChoおよびSMの取り込みを評価するため、1 x 106細胞 (1 mM CaCl2含有HBSS (HBSS-Ca) 0.5 ml 中）を氷上で7分間インキュベートした。等量の200 nM 1-オレイル-2-{6-[(7-ニトロ-2-1,3-ベンゾオキサジアゾール-4-イル)アミノ]ヘキサノイル}-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(NBD-PC)(Avanti Polar Lipids)またはN-[6-[(7-ニトロ-2-1,3-ベンゾオキサジアゾール-4-イル)アミノ]ヘキサノイル]-スフィンゴシン-1-ホスホコリン(NBD-SM) (Avanti Polar Lipids) （HBSS-Ca中）を添加し、20℃でインキュベートした。一部(150μl)を150μl HBSS (5μg/ml 脂肪酸不含BSA (Sigma-Aldrich)および500 nM Sytoxblue (Molecular Probes)含有)と混合し、FACSAriaにより解析した。【００３３】
（１０）5-アザ-2’-デオキシシチジンによる処理およびバイサルファイト（bisulfite）ゲノムシークエンス
ヒトPLB-985細胞を5-アザ-2’-デオキシシチジン (DAC, Sigma-Aldrich)で処理するため、1.0 x 106細胞（10% FCS含有RPMI10 ml中）を0.5 mM DACと7日間インキュベートした。DACは不安定な化合物であるため、DAC含有培地は24時間毎に交換した。DAC処理後、細胞を3つに分けた。1つはPtdSer露出の解析のためのFACS用、1つはXkr8遺伝子発現のためのリアルタイムRT-PCR 用、1つはメチル化特異的PCR解析用である67。バイサルファイトゲノムシークエンスのため、キット(MethyEasy Xceed, Human Genetic Signatures)を用いてDNAを亜硫酸水素塩で修飾した。説明すると、3μgのDNAを37℃で15分間0.3 M NaOH中でインキュベートすることにより変性させ、インキュベーション時間を90分に変更した点を除き供給元のプロトコールにしたがい亜硫酸水素ナトリウムで処理した。修飾したDNAを95℃で20分間変性させ、処理したDNAに特異的なプライマー(TTAGGGATTAGAATGTGTTT （配列番号２０）および CCTATACAAATAACCCAACT （配列番号２１）)を用いてPCRにより増幅した。EpiTaq HSポリメラーゼ (Takara Bio) を用いてPCRを7-40サイクル実施し、配列決定のため生成物をpGEM-Teasyベクターにクローニングした。【００３４】
（１１）リアルタイムRT-PCR
ヒトおよびマウス細胞株並びに様々なマウス組織に由来する全RNAを、Superscript III 逆転写酵素 (Invitrogen) またはHigh Capacity RNA-to-cDNA（商標） キット (Applied Biosystems)を用いて逆転写した。生成物の一部を、LightCycler（商標）480 SYBR Green I Master (Roche Diagnostics)を含む反応混合物中で増幅した。リアルタイムRT-PCR用のプライマーは以下のとおりである: 
mXkr8: 5’-GCGACGCCACAGCTCACACT-3’ （配列番号２２）および 5’-CCCCAGCAGCAGCAGGTTCC-3’ （配列番号２３）
mGapdh: 5’-AGCAGGCATCTGAGGGCCCA-3’ （配列番号２４）および 5’-GAGAGCAATGCCAGCCCCGG-3’ （配列番号２５）
hXkr8: 5’-AGGCCGGGCCATCATCCACT-3’ （配列番号２６）および 5’-TGCGCCTGTTCTGAGGCAGC-3’ （配列番号２７）
ヒトβ-アクチン: 5’-GCATCCTCACCCTGAAGTAC-3’ （配列番号２８）および5’-CTTAATGTCACGCACGATTTC-3’ （配列番号２９）
特異的mRNAは、LightCycler Systemが参照としてのそれぞれの直線化プラスミドDNAについてPCRによる集積の対数期の立ち上がりを検出した時点で、定量した。【００３５】
（１２）カスパーゼによる細胞溶解物の処置
hXkr8-GFPまたはhXkr8 2DA-GFPを発現するPLB-985細胞形質転換体から、既報のとおり膜画分を調製した53。次いで、膜を溶解バッファー (20 mM Tris-HCl [pH 7.2]、140 mM NaCl、1% Triton X-100、10% グリセロール、および1 mM (p-アミノフェニル) メタンスルホニルフルオリド (APMSF))に懸濁することにより可溶化した。不溶性物質を遠心分離により除去した後、膜タンパク質 (20μg) を、37℃で1時間、3単位の各組換ヒトカスパーゼ (Biovision)と、50 mM Hepes-NaOH (pH 7.4)、50 mM NaCl、5% (v/v) グリセロール、5 mM DTT、10 mM EDTA、0.1 mM APMSF、および0.1% CHAPS（100μl）中でインキュベートし、ウェスタンブロッティングにより解析した。【００３６】
（１３）ウェスタンブロッティング
RIPAバッファー (50 mM Hepes-NaOH バッファー [pH 8.0]、1% NP-40、0.1% SDS、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、150 mM NaCl、および10%プロテアーゼ阻害剤カクテル)中で細胞を溶解した。溶解物を5 x SDSサンプルバッファー (200 mM Tris-HCl [pH 6.8]、10% SDS、25% グリセロール、5% β-メルカプトエタノール、および0.05% ブロモフェノールブルー)と混合し、Xkr8-GFPの検出のため室温で1時間インキュベートし、あるいは他のタンパク質の検出のため5分間煮沸した。タンパク質を10-20%勾配SDS-PAGE (Bio Craft)上の電気泳動により分離し、PVDF メンブレン (Millipore)に転写した。メンブレンに3000倍希釈マウス抗GFP mAb、3000倍希釈マウス抗ヒトICAD mAb、または3000倍希釈ウサギ抗活性型カスパーゼ3 mAbを結合させ、続いて1,000倍希釈HRP結合ヤギ抗マウスまたはウサギ免疫グロブリン (Dako)とともにインキュベートした。ペルオキシダーゼ活性は、Western Lightning（商標）-ECL システム (PerkinElmer)により検出した。【００３７】
２．結果
（１）マウスXkr8のクローニング
本発明者らは以前に、PtdSerを多く露出する細胞をFACSによりソーティングし増殖させることを繰り返すことで、PtdSerを高レベルに発現するマウスBa/F3細胞のサブライン(Ba/F3-PS19)を樹立している15。Ca2+依存性リン脂質スクランブラーゼであるTMEM16Fは、2.5 kb以上のcDNAで構築したBa/F3-PS19のcDNAライブラリーから単離した。アポトーシス性のPtdSer露出に関与するスクランブラーゼを探索するため、長さ1.0〜2.5 kbのBa/F3-PS19 cDNAによりcDNAライブラリーを調製し、Ba/F3細胞に導入した。PtdSerを効率的に露出する細胞のFACSによる選別と増殖を5回繰り返し、選別した細胞を限界希釈した。この工程により、恒常的にPtdSer を露出する細胞株(LD-PS5-2-2)を樹立した（図１ａ）。LD-PS5-2-2細胞には、複数の膜貫通領域を有する401アミノ酸のタンパク質であるマウスXkr8をコードするcDNAのみが組み込まれていた。【００３８】
Xkr8がアポトーシス性のPtdSerの露出に関与するかを調べるため、マウスFasを発現するBa/F3およびマウスT細胞株 (WR19L)を樹立した (BaF-FasおよびWR-Fas)。Fasリガンド (FasL)は、カスパーゼ-3の活性化およびPtdSerの露出を伴うWR-Fas細胞のアポトーシスを効率的に誘導した。このFasL誘導性PtdSer露出は、マウス(m)Xkr8-GFPにより細胞を形質転換することで非常に増強されたが、mTMEM16F-GFPでは増強されなかった（図１ｂ）。次いで、Xkr8ショートヘアピンRNA (shRNA)を発現させることにより、BaF-FasおよびWR-Fasにおける内因性のmXkr8遺伝子の発現をノックダウンした。shRNAを発現する形質転換体におけるmXkr8のmRNA発現レベルは、コントロールのshRNA を発現するWR-FasおよびBaF-Fas細胞におけるレベルの18-24%に減少した（図１ｃおよび図７ａ）。すなわち、FasL誘導性PtdSer露出はこれら形質転換体では遅延したが、 カスパーゼ3は親細胞と同様に活性化された（図１ｄ）。shRNAに対応する配列がmXkr8とは異なるヒト(h)Xkr8 cDNAは、mXkr8 shRNAの阻害効果から完全に回復させた（図１ｄ、図７ｂ）。mXkr8-GFPを発現するヒト293T細胞形質転換体の観察（図１ｅ）により、hXkr8は細胞膜に存在することが示唆された。これらの結果は、細胞膜のXkr8がアポトーシス性の刺激により活性化されるリン脂質スクランブラーゼであることを示唆する。【００３９】
（２）ヒトXkr8発現のエピジェネティックな制御
以前の報告と一致して17,18、ヒトPLB-985白血病株およびRajiリンパ腫株は、スタウロスポリン、UV、またはFasLなどのアポトーシス性刺激によってPtdSerを発現せず、スタウロスポリンに応答してPtdSerを発現するヒトNamalwa細胞およびJurkat細胞とは非常に対照的であった（図２ａ）。リアルタイムRT-PCR解析によれば、PLB-985細胞およびRaji細胞におけるXkr8 mRNAレベルは、それぞれNamalwa細胞の8%および9%であった（図２ｂ）。PLB-985細胞またはRaji細胞にhXkr8発現プラスミドを導入すると、これらの形質転換体は、効率的にスタウロスポリン、UV照射、またはFasLに応答してPtdSerを露出し、カスパーゼ活性化は増強しなかった（図２ｃ）。これらの結果は、PLB-985細胞およびRaji細胞がPtdSerを露出できないのはXkr8遺伝子の発現の欠如によることを示唆する。【００４０】
PCR解析では、PLB-985細胞のhXkr8のゲノム構造に全体的な異常は見られなかった。しかしながら、CpGアイランドの存在について南カリフォルニア大学のプログラム「CpG island searcher」 (http://cpgislands.usc.edu/) を用いてhXkr8遺伝子を解析すると、hXkr8遺伝子の転写開始部位付近の1.2-kb の領域に2つのCpGアイランドが示された（図３ａ）。2番目のアイランドはプロモーター領域に存在し、そこには転写因子Sp1およびNF-kBの認識部位が数多く認められた。【００４１】
hXkr8遺伝子の-239と+7の間の各CpG部位のメチル化状態を調べるため、PLB-985、Raji、およびNamalwa細胞、並びに健常人由来の末梢血白血球からDNAを調製し、バイサルファイト（bisulfite）DNAシークエンスにより解析した19。末梢血白血球、Jurkat細胞、またはNamalwa細胞由来のDNAにおいては、23個のCpG部位はいずれもメチル化されていなかった（図３ｂ）。これに対して、PLB-985細胞およびRaji細胞では、全てのCpG部位が重度に、あるいは90%以上の確率で、メチル化されていた。PLB-985細胞を脱メチル化剤である5-アザ-2’-デオキシシチジン(DAC)で処理すると、そのXkr8 mRNAレベルが徐々に上昇した（図３ｃ）。7日目、PLB-985における-239と+7の間の23個全てのCpG部位が高度に脱メチル化された（図３ｂ）、Xkr8 mRNAレベルはNamalwa細胞の約91%に達した（図３ｃ）。そして、DAC処理PLB-985細胞は、UV照射に応答してPtdSerを露出する能力を獲得した（図３ｄ）。これらの結果から、PLB-985細胞およびRaji細胞ではhXkr8遺伝子のプロモーター領域のCpGアイランドが高度にメチル化されており、それによりXkr8遺伝子の発現が阻害され、アポトーシスの際にPtdSerを露出できないことがわかる。【００４２】
（３）Xkr8を介するスクランブラーゼ活性
リン脂質スクランブラーゼは、細胞膜において非特異的にリン脂質を移動させることができる酵素として定義される20。Xkr8を介するスクランブラーゼ活性について調べるため、ヒトPLB-985およびhXkr8を発現するその形質転換体をスタウロスポリンで処理した。4時間後、ICAD (ICAD-LおよびICAD-S)はPLB-985およびそのhXkr8発現形質転換体において同様に十分に切断されていた（図４ａ）。PtdSer露出で観察されたように、親PLB-985細胞およびhXkr8形質転換体をPtdEtn結合ペプチドであるRO09-019821 (ROペプチド)を用いて解析すると、どちらの細胞も増殖中はPtdEtnを露出しなかった（図４ｂ）。一方、スタウロスポリン処理hXkr8発現PLB-985細胞は、ROペプチドにより染色されPtdEtnの発現が示されたが、親細胞では染色されなかった。PtdChoおよびSMについてのスクランブル活性は、1-オレオイル-2-{6-[(7-ニトロ-2-1,3-ベンゾオキサジアゾール-4-イル)アミノ]ヘキサノイル}-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (NBD-PC)、またはN-[6-[(7-nitro-2-1,3- ベンゾオキサジアゾール-4-イル)アミノ] ヘキサノイル]-スフィンゴシン-1-ホスホコリン (NBD-SM)の取り込みにより調べた。図４ｃおよび４ｄに示されるように、NBD-PCおよびNBD-SMは増殖中のPLB-985細胞またはhXkr8形質転換体では取り込まれなかった。一方、NBD-PCおよびNBD-SMは、スタウロスポリンを処理したhXkr8形質転換体では取り込まれたが、親細胞では取り込まれなかった。これらの結果は、Xkr8がアポトーシス細胞死の間に活性化され、非特異的スクランブラーゼとして機能することを示す。このXkr8の非特異的スクランブリング活性は、Ca2+依存性リン脂質スクランブラーゼであるTMEM16Fと類似していた15。しかしながら、アポトーシス誘導性のPtdSer露出とは異なり、PLB-985細胞およびhXkr8形質転換体におけるCa2+誘導性のPtdSer露出は同じ速度で生じ（図８）、このことはXkr8がCa2+依存性のPtdSer露出には影響しないことを示唆する。【００４３】
カスパーゼによるXkr8の活性化
Xkr8はXKファミリーのメンバーであり22、そのホモログは哺乳類、魚類、および両生類に存在する（図５ａ）。TMpred (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)およびTMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)を含むトポロジー予測プログラムを用いて、各種由来のXkr8のアミノ酸配列の解析により、6つから8つの膜貫通領域という予測の不一致が生じた。Xkr8タンパク質の全体構造が種間で保存されているとすれば、Xkr8は6つの膜貫通領域を有し、N末端およびC末端が細胞質内に存在すると考えられる（図５ｂ）。オンラインサーチツール(CASVM, http://www.casbase.org/casvm/index.html)により、ヒト、マウス、ラット、フグ、メダカ、およびXenopusのXkr8のC末端細胞内領域に、よく保存された カスパーゼ3認識配列23が同定された（図５ａ）。【００４４】
アポトーシス性のPtdSer露出は、多くの場合カスパーゼ依存性である24。Xkr8におけるカスパーゼ認識配列の存在は、Xkr8がカスパーゼ3の直接の標的でありうることを示唆する。Xkr8の当該位置での切断がそのスクランブリング活性に必要であるかを調べるため、hXkr8の355位のアミノ酸のPDQVDG配列を、PAQVAG (2DA)に変異させた（図５ｃ）、そのC末端でGFPに融合させ、PLB-985細胞に導入した。野生型のhXkr8-GFPを発現するPLB-985形質転換体とは対照的に、2DA変異体のhXkr8-GFPにより形質転換された細胞は、スタウロスポリンに応答したPtdSer露出をほとんど示さなかった（図５ｄ）。hXkr8がアポトーシスの際に切断されることを確認するため、hXkr8-GFPを発現するPLB-985細胞をスタウロスポリンで処理し、抗GFP抗体によるウェスタンブロッティングにより解析した（図５ｅ）。増殖中の細胞において、hXkr8-GFPは、hXkr8-GFP融合タンパク質のサイズである52 kDaのバンドを示した。細胞をスタウロスポリンで処理すると、52 kDaのバンドは29 kDaへシフトし、これは本来のGFPより少し大きかった。一方、hXkr8の2DA変異体は、スタウロスポリン処理によりわずかに切断されるのみであった。内因性のICADは、野生型hXkr8を発現するPLB-985形質転換体においてもカスパーゼ抵抗性hXkr8を発現するPLB-985形質転換体においても同様に切断され、このことはカスパーゼ3がこれら形質転換体で同様に活性化されていることを示す。アポトーシス細胞死の際のカスパーゼ認識部位 (354位のPDLVDG)におけるmXkr8のプロセシングが、野生型mXkr8-GFP融合タンパク質を発現するWR-Fas細胞をFasLで処理した場合に観察された（図５ｆ）。次いで、GFP融合タンパク質発現細胞よりTriton X-100-可溶化膜画分を調製し、各種の組換ヒトカスパーゼとともにインキュベートした。抗GFP抗体によるウェスタンブロット解析により、カスパーゼ3およびカスパーゼ7は野生型hXkr8を切断するが、2DA変異体hXkr8は切断しないことが示された（図５ｇ）。これらの結果は、C末端におけるAsp-355でのhXkr8の切断またはAsp-354でのmXkr8の切断により、これら分子がリン脂質スクランブラーゼとして機能することを示す。【００４５】
次に、hXkr8をAsp-355で切断し（図５ｃ）、GFPと融合して、またはGFPとは融合せず、PLB-985細胞に導入して、この切断型hXkr8が構成的な活性型として作用するかを調べた。しかしながら、切断型hXkr8は増殖中の細胞においても、アポトーシス細胞においても、PtdSer露出を仲介しなかった（図５ｄ）。切断型hXkr8-GFP融合タンパク質を発現するヒト293T細胞の蛍光顕微鏡観察により、このタンパク質は細胞質に（おそらくは小胞体に）存在することが示された（図５ｈ）。各種の膜貫通タンパク質に存在する二塩基性アミノ酸のモチーフ（R/K(X)R/K）または二芳香族性アミノ酸のモチーフ(FF、FYまたはYY)は、小胞体外移行シグナルとして機能する25,26。図５ａに示す全ての種のXkr8の細胞質末端にこれらのモチーフが２つまたは３つ存在する。これらモチーフはhXkr8のカスパーゼ認識部位の下流に位置するため、切断型hXkr8は細胞膜へ輸送されないものと考えられる。【００４６】
Xkr8-/-胎児胸腺細胞株
PtdSerはアポトーシスを起こしたほとんどの細胞で細胞表面に暴露される。それゆえ、mXkr8 mRNAは、精巣で非常に高く発現し、心臓および筋肉での発現が低い点を除き、様々なマウス組織で普遍的かつほぼ同程度に発現している（図６ａ）。リン脂質スクランブリングにおけるXkr8の役割を調べ、またそのリン脂質スクランブリング活性をTMEM16Fと比較するため、Xkr8欠損胎児胸腺細胞株 (IFET) を樹立した（図６ｂ）。FasLに応答して、Xkr8flox/flox IFET細胞およびTMEM16F-/- IFET細胞は迅速にPtdSerを露出した（図６ｃ）。これに対して、Xkr8-/- IFET細胞はこの処理に対してPtdSerを露出しなかったが、カスパーゼ3 は同様に活性化されていた。Xkr8-/- IFET細胞にmXkr8 cDNAを有するレトロウイルスを感染させると、この形質転換体はFasLに応答してPtdSerを露出した。一方、Ca2+ イオノフォアはXkr8flox/flo IFET細胞およびXkr8-/- IFET細胞においてPtdSerの露出を誘導したが、TMEM16F-/- IFET細胞では誘導しなかった（図６ｄ）。これらの結果から、Xkr8はアポトーシス性のPtdSer露出に関与し、TMEM16FはCa2+誘導性のPtdSer露出に関与することがわかる。【００４７】
参考文献
1. Jacobson, M. D., Weil, M., & Raff, M. C., Programmed cell death in animal development. Cell 88, 347-354 (1997).
2. Vaux, D. L. & Korsmeyer, S. J., Cell death in development. Cell 96, 245-254 (1999).
3. Nagata, S., Apoptosis by death factor. Cell 88, 355-365 (1997).
4. Strasser, A., O'Connor, L., & Dixit, V. M., Apoptosis signaling. Annu. Rev. Biochem. 69, 217-245 (2000).
5. Nagata, S., DNA degradation in development and programmed cell death. Annu. Rev. Immunol. 23, 853-875 (2005).
6. Enari, M. et al., A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature 391, 43-50 (1998).
7. Coleman, M. et al., Membrane blebbing during apoptosis results from caspase-mediated activation of ROCK I. Nat. Cell Biol. 3, 339-345 (2001).
8. Sebbagh, M. et al., Caspase-3-mediated cleavage of ROCK I induces MLC phosphorylation and apoptotic membrane blebbing. Nat. Cell Biol. 3, 346-352 (2001).
9. Fadok, V. A. et al., Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. J. Immunol. 148, 2207-2216 (1992).
10. Leventis, P. A. & Grinstein, S., The Distribution and Function of Phosphatidylserine in Cellular Membranes. Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010).
11. Ravichandran, K. S. & Lorenz, U., Engulfment of apoptotic cells: signals for a good meal. Nat. Rev. Immunol. 7, 964-974 (2007).
12. Nagata, S., Hanayama, R., & Kawane, K., Autoimmunity and the clearance of dead cells. Cell 140, 619-630 (2010).
13. Zwaal, R., Comfurius, P., & Bevers, E., Lipid-protein interactions in blood coagulation. Biochim. Biophys. Acta 1376, 433-453 (1998).
14. Bevers, E. & Williamson, P., Phospholipid scramblase: an update. FEBS Lett. 584, 2724-2730 (2010).
15. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., & Nagata, S., Calcium-dependent phospholipid scrambling by TMEM16F. Nature 468, 834-838 (2010).
16. Williamson, P. et al., Phospholipid scramblase activation pathways in lymphocytes. Biochemistry 40, 8065-8072 (2001).
17. Fadeel, B. et al., Phosphatidylserine exposure during apoptosis is a cell-type-specific event and does not correlate with plasma membrane phospholipid scramblase expression. Biochem. Biophys. Res. Commun. 266, 504-511 (1999).
18. Fadok, V. A., de Cathelineau, A., Daleke, D. L., Henson, P. M., & Bratton, D. L., Loss of phospholipid asymmetry and surface exposure of phosphatidylserine is required for phagocytosis of apoptotic cells by macrophages and fibroblasts. J. Biol. Chem. 276, 1071-1077 (2001).
19. Herman, J. G., Graff, J. R., Myohanen, S., Nelkin, B. D., & Baylin, S. B., Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 9821-9826 (1996).
20. Balasubramanian, K. & Schroit, A., Aminophospholipid asymmetry: A matter of life and death. Annu. Rev. Physiol. 65, 701-734 (2003).
21. Emoto, K., Toyama-Sorimachi, N., Karasuyama, H., Inoue, K., & Umeda, M., Exposure of phosphatidylethanolamine on the surface of apoptotic cells. Exp. Cell Res. 232, 430-434 (1997).
22. Calenda, G. et al., Identification of two new members, XPLAC and XTES, of the XK family. Gene 370, 6-16 (2006).
23. Timmer, J. C. & Salvesen, G. S., Caspase substrates. Cell Death Differ. 14, 66-72 (2007).
24. Martin, S. J., Finucane, D. M., Amarante-Mendes, G. P., O'Brien, G. A., & Green, D. R., Phosphatidylserine externalization during CD95-induced apoptosis of cells and cytoplasts requires ICE/CED-3 protease activity. J. Biol. Chem. 271, 28753-28756 (1996).
25. Giraudo, C. G. & Maccioni, H. J. F., Endoplasmic reticulum export of glycosyltransferases depends on interaction of a cytoplasmic dibasic motif with Sar1. Mol. Biol. Cell. 14, 3753-3766 (2003).
26. Barlowe, C., Signals for COPII-dependent export from the ER: what's the ticket out? Trends Cell Biol. 13, 295-300 (2003).
27. Ho, M. et al., Isolation of the gene for McLeod syndrome that encodes a novel membrane transport protein. Cell 77, 869-880 (1994).
28. Russo, D., Redman, C., & Lee, S., Association of XK and Kell blood group proteins. The Journal of biological chemistry 273, 13950-13956 (1998).
29. Schoenwaelder, S. M. et al., Two distinct pathways regulate platelet phosphatidylserine exposure and procoagulant function. Blood 114, 663-666 (2009).
30. Ricci, J.-E. et al., Disruption of mitochondrial function during apoptosis is mediated by caspase cleavage of the p75 subunit of complex I of the electron transport chain. Cell 117, 773-786 (2004).
31. Gleiss, B., Gogvadze, V., Orrenius, S., & Fadeel, B., Fas-triggered phosphatidylserine exposure is modulated by intracellular ATP. FEBS Lett. 519, 153-158 (2002).
32. Fadeel, B. & Orrenius, S., Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in human disease. J. Inter. Med. 258, 479-517 (2005).
33. Sandilos, J. K. et al., Pannexin 1, an ATP Release Channel, Is Activated by Caspase Cleavage of Its Pore-associated C-terminal Autoinhibitory Region. J. Biol. Chem. 287, 11303-11311 (2012).
34. Chekeni, F. B. et al., Pannexin 1 channels mediate 'find-me' signal release and membrane permeability during apoptosis. Nature 467, 863-867 (2010).
35. Bratton, D. et al., Appearance of phosphatidylserine on apoptotic cells requires calcium-mediated nonspecific flip-flop and is enhanced by loss of the aminophospholipid translocase. J. Biol. Chem. 272, 26159-26165 (1997).
36. Hampton, M., Vanags, D., Porn-Ares, M., & Orrenius, S., Involvement of extracellular calcium in phosphatidylserine exposure during apoptosis. FEBS Lett. 399, 277-282 (1996).
37. van den Eijnde, S. et al., Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved. Apoptosis 3, 9-16 (1998).
38. Venegas, V. & Zhou, Z., Two alternative mechanisms that regulate the presentation of apoptotic cell engulfment signal in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol. Cell 18, 3180-3192 (2007).
39. Ellis, R. E., Jacobson, D. M., & Horvitz, H. R., Genes required for the engulfment of cell corpses during programmed cell death in Caenorhabditis elegans. Genetics 129, 79-94. (1991).
40. Stanfield, G. & Horvitz, H., The ced-8 gene controls the timing of programmed cell deaths in C. elegans. Mol. Cell 5, 423-433 (2000).
41. Munoz, L. E., Lauber, K., Schiller, M., Manfredi, A. A., & Herrmann, M., The role of defective clearance of apoptotic cells in systemic autoimmunity. Nat. Rev. Rheumatol. 6, 280-289 (2010).
42. Franks, A. L. & Slansky, J. E., Multiple associations between a broad spectrum of autoimmune diseases, chronic inflammatory diseases and cancer. Anticancer Res. 32, 1119-1136 (2012).
43. Yoshida, H. et al., Phosphatidylserine-dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells. Nature 437, 754-758 (2005).
44. Connor, J., Pak, C. C., & Schroit, A. J., Exposure of phosphatidylserine in the outer leaflet of human red blood cells. Relationship to cell density, cell age, and clearance by mononuclear cells. J. Biol. Chem. 269, 2399-2404 (1994).
45. Stowell, S. R. et al., Galectin-1 induces reversible phosphatidylserine exposure at the plasma membrane. Mol. Biol. Cell 20, 1408-1418 (2009).
46. van den Eijnde, S. et al., Transient expression of phosphatidylserine at cell-cell contact areas is required for myotube formation. J. Cell Sci. 114, 3631-3642 (2001).
47. Gadella, B. & Harrison, R., Capacitation induces cyclic adenosine 3',5'-monophosphate-dependent, but apoptosis-unrelated, exposure of aminophospholipids at the apical head plasma membrane of boar sperm cells. Biol. Reprod. 67, 340-350 (2002).
48. Marguet, D., Luciani, M. F., Moynault, A., Williamson, P., & Chimini, G., Engulfment of apoptotic cells involves the redistribution of membrane phosphatidylserine on phagocyte and prey. Nat. Cell Biol. 1, 454-456 (1999).
49. Imao, T. & Nagata, S., Apaf-1- and Caspase-8-independent apoptosis. Cell Death Differ, in press (2012).
50. Palacios, R. & Steinmetz, M., Il-3-dependent mouse clones that express B-220 surface antigen, contain Ig genes in germ-line configuration, and generate B lymphocytes in vivo. Cell 41, 727-734 (1985).
51. Tucker, K. A., Lilly, M. B., Heck, L., & Rado, T. A., Characterization of a new human diploid myeloid leukemia cell line (PLB-985) with granulocytic and monocytic differentiating capacity. Blood 70, 372-378 (1987).
52. Morita, S., Kojima, T., & Kitamura, T., Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Ther. 7, 1063-1066 (2000).
53. Fukunaga, R., Ishizaka-Ikeda, E., & Nagata, S., Purification and characterization of the receptor for murine granulocyte colony-stimulating factor. J. Biol. Chem. 265, 14008-14015 (1990).
54. Shiraishi, T. et al., Increased cytotoxicity of soluble Fas ligand by fusing isoleucine zipper motif. Biochem. Biophys. Res. Commun. 322, 197-202 (2004).
55. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., & Nagata, S., Calcium-dependent phospholipid scrambling by TMEM16F. Nature 468, 834-838 (2010).
56. Kitamura, T. et al., Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Exp. Hematol. 31, 1007-1014 (2003).
57. Higuchi, R., Recombinant PCR in PCR protocols: A guide to methods and applications (Academic Press, San Diego, 1990), pp. 177-188.
58. Kontgen, F., Suss, G., Stewart, C., Steinmetz, M., & Bluethmann, H., Targeted disruption of the MHC class II Aa gene in C57BL/6 mice. Int. Immunol. 5, 957-964 (1993).
59. Kanki, H., Suzuki, H., & Itohara, S., High-efficiency CAG-FLPe deleter mice in C57BL/6J background. Exp. Anim. 55, 137-141 (2006).
60. Cattermole, J. A. et al., Isolation of murine fetal thymus cell lines after infection with recombinant retroviruses containing the v-myc and v-Ha-ras oncogenes. J. Immunol. 142, 3746-3753 (1989).
61. Imao, T. & Nagata, S., Apaf-1- and Caspase-8-independent apoptosis. Cell Death Differ, in press (2012).
62. Akagi, T., Sasai, K., & Hanafusa, H., Refractory nature of normal human diploid fibroblasts with respect to oncogene-mediated transformation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 13567-13572 (2003).
63. Watson, J. D., Morrissey, P. J., Namen, A. E., Conlon, P. J., & Widmer, M. B., Effect of IL-7 on the growth of fetal thymocytes in culture. J. Immunol. 143, 1215-1222 (1989).
64. Watanabe-Fukunaga, R. et al., The cDNA structure, expression, and chromosomal assignment of the mouse Fas antigen. J. Immunol. 148, 1274-1279 (1992).
65. Ogasawara, J. et al., Lethal effect of the anti-Fas antibody in mice. Nature 364, 806-809 (1993).
66. Aoki, Y., Uenaka, T., Aoki, J., Umeda, M., & Inoue, K., A novel peptide probe for studying the transbilayer movement of phosphatidylethanolamine. J. Biochem. 116, 291-297 (1994).
67. Herman, J. G., Graff, J. R., Myohanen, S., Nelkin, B. D., & Baylin, S. B., Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 9821-9826 (1996).
【配列表フリーテキスト】
【００４８】
配列番号７：合成プライマー
配列番号８：合成プライマー
配列番号９：合成プライマー
配列番号１０：合成プライマー
配列番号１１：合成プライマー
配列番号１２：合成プライマー
配列番号１３：合成プライマー
配列番号１４：合成プライマー
配列番号１５：合成プライマー
配列番号１６：shRNAの標的配列
配列番号１７：合成プライマー
配列番号１８：合成プライマー
配列番号１９：合成プライマー
配列番号２０：合成プライマー
配列番号２１：合成プライマー
配列番号２２：合成プライマー
配列番号２３：合成プライマー
配列番号２４：合成プライマー
配列番号２５：合成プライマー
配列番号２６：合成プライマー
配列番号２７：合成プライマー
配列番号２８：合成プライマー
配列番号２９：合成プライマー
【図１ａ】
2014077279.tif 000002
【図１ｂ】
2014077279.tif 000003
【図１ｃ】
2014077279.tif 000004
【図１ｄ】
2014077279.tif 000005
【図１ｅ】
2014077279.tif 000006
【図２ａ】
2014077279.tif 000007
【図２ｂ】
2014077279.tif 000008
【図２ｃ】
2014077279.tif 000009
【図３ａ】
2014077279.tif 000010
【図３ｂ】
2014077279.tif 000011
【図３ｃ】
2014077279.tif 000012
【図３ｄ】
2014077279.tif 000013
【図４ａ】
2014077279.tif 000014
【図４ｂ】
2014077279.tif 000015
【図４ｃ】
2014077279.tif 000016
【図４ｄ】
2014077279.tif 000017
【図５ａ】
2014077279.tif 000018
【図５ｂ】
2014077279.tif 000019
【図５ｃ】
2014077279.tif 000020
【図５ｄ】
2014077279.tif 000021
【図５ｅ】
2014077279.tif 000022
【図５ｆ】
2014077279.tif 000023
【図５ｇ】
2014077279.tif 000024
【図５ｈ】
2014077279.tif 000025
【図６ａ】
2014077279.tif 000026
【図６ｂ】
2014077279.tif 000027
【図６ｃ】
2014077279.tif 000028
【図６ｄ】
2014077279.tif 000029
【図７ａ】
2014077279.tif 000030
【図７ｂ】
2014077279.tif 000031
【図８】
2014077279.tif 000032
【配列表】
2014077279000001.app
【国際調査報告】
2014077279.tif 000033
2014077279.tif 000034
2014077279.tif 000035