【手続補正書】
【提出日】平成24年4月4日(2012.4.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚又は培養皮膚三次元モデルを標識されたセラミドとともに培養し、しかる後に、皮膚又は培養皮膚三次元モデルにおける標識されたセラミドの存在状況を観察することを特徴とする、セラミドの組織内輸送の鑑別法。
【請求項２】
請求項１に記載のセラミドの組織内輸送の鑑別法において、検体が標識されたセラミドの組織内輸送に与える影響を鑑別し、セラミドの組織内輸送が、検体が存在しない条件に比して促進された場合には前記検体は、セラミドの欠乏による皮膚バリア機能を改善する作用を有すると鑑別することを特徴とする、皮膚バリア機能改善素材のスクリーニング法。
【請求項３】
更に前記検体が、皮膚又は培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害処理してなる、タイトジャンクション傷害皮膚モデルに対して、タイトジャンクションの傷害からの回復効果を有するか否かを鑑別し、タイトジャンクションの傷害からの回復効果を有する場合には、より好ましい皮膚バリア機能改善素材であると鑑別することを特徴とする、請求項２に記載の皮膚バリア機能改善素材のスクリーニング法。
【請求項４】
請求項２又は３に記載の方法により、皮膚バリア機能改善素材であると鑑別された、ε，γ−グルタミルリジン及び／又はパルマリア抽出物を含む、皮膚バリア機能改善素材。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
この様な状況に鑑みて、本発明者らは、因子の多い皮膚バリア機能の低下において、多角的視点に立って、その改善効果を鑑別できる皮膚バリア機能向上素材のスクリーニング法を求めて鋭意研究を重ねた結果、皮膚又は培養皮膚三次元モデルを標識されたセラミドとともに培養し、しかる後に、皮膚又は培養皮膚三次元モデルにおける標識されたセラミドの存在状況を観察することにより、セラミド分布への影響を知り、ほぼ同じ実験被験体である、皮膚又は培養皮膚三次元モデルについて、そのタイトジャンクションを傷害処理してなる、タイトジャンクション傷害皮膚モデルに対して、タイトジャンクションの傷害
からの回復効果を有するか否かを鑑別することにより、タイトジャンクションへの作用も鑑別でき、これらを総合することにより、多角的な皮膚バリア機能への検体の作用が鑑別できることを見出し、発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下に示すとおりである。
（１）皮膚又は培養皮膚三次元モデルを標識されたセラミドとともに培養し、しかる後に、皮膚又は培養皮膚三次元モデルにおける標識されたセラミドの存在状況を観察することを特徴とする、セラミドの組織内輸送の鑑別法。
（２）（１）に記載のセラミドの組織内輸送の鑑別法において、検体が標識されたセラミドの組織内輸送に与える影響を鑑別し、セラミドの組織内輸送が、検体が存在しない条件に比して促進された場合には前記検体は、セラミドの欠乏による皮膚バリア機能を改善する作用を有すると鑑別することを特徴とする、皮膚バリア機能改善素材のスクリーニング法。
（３）更に、前記検体が、皮膚又は培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害処理してなる、タイトジャンクション傷害皮膚モデルに対して、タイトジャンクションの傷害からの回復効果を有するか否かを鑑別し、タイトジャンクションの傷害からの回復効果を有する場合には、より好ましい皮膚バリア機能改善素材であると鑑別することを特徴とする、（２）に記載の皮膚バリア機能改善素材のスクリーニング法。
（４）（２）又は（３）に記載の方法により、皮膚バリア機能改善素材であると鑑別された、ε，γ−グルタミルリジン及び／又はパルマリア抽出物を含む、皮膚バリア機能改善素材。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
＜１＞本発明のセラミドの組織内輸送の鑑別法
本発明のセラミドの組織内輸送の鑑別法は、皮膚又は培養皮膚三次元モデルを標識されたセラミドとともに培養し、しかる後に、皮膚又は培養皮膚三次元モデルにおける標識の存在状況を観察することを特徴とする。前記の皮膚としては、所望により体毛を除去し、生体より採取した皮膚断片であって、角層などを除いた、表皮顆粒層、表皮基底層及び真皮部分からなるものが好ましく、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウサギの皮膚断片が好ましい。又、前記培養皮膚三次元モデルとしては、ヒト又はヒトを除く動物の皮膚より採取した、正常な（癌化していない）ケラチノサイト、フィブロブラストなどの皮膚細胞を培養し、三次元構造を構築し、皮膚の構造に疑似させたものが好ましく、この様な形態の市販品を購入して使用することも出来る。好ましい市販品としては、例えば、倉敷紡績株式会社から販売されている「EFT-400」（正常培養ヒト三次元皮膚モデル）などが好適に例示できる。特に表皮成分のみで構成される「EPI-200」や、USA MaTek社から販売されている「EpiDerm」などがさらに好適に例示できる。かかる皮膚又は培養皮膚三次元モデルは、標識されたセラミドを含む培地中で１〜１０時間、好ましくは３〜５時間培養し、標識されたセラミドを細胞内に取り込ませる。PBS(リン酸緩衝生理食塩水）や液体培地で洗浄した後、新鮮な培地に交換して培養を続ける。６〜２４時間後、好ましくは１２〜１８時間後に培地を回収し、その蛍光強度を計測したり、組織を切片に加工して、蛍光顕微鏡下観察して取り込まれたセラミドの量を蛍光として捉え、定量するとともにその存在位置を鑑別する。回収した培地中のセラミド量が多かったり、培養皮膚三次元モデルにおける、表皮細胞間の角層側を上部分とした場合にセラミドが上部分に多く輸送されたほうが角層形成が促進され、皮膚バリア機能改善作用を有する。切片においてはさらにその鑑別には、蛍光顕微鏡の観察像をコンピューターなどに取込み、アドビ社製の「フォトショップ」などの画像処理ソフトを用いて、二値化などの画像処理を行い、蛍光部位と非蛍光部位とを分けて、存在位置を二次元分布として把握することが出来る。又、白点と黒点の
面積比より、蛍光強度を鑑別することも出来る。かかるセラミドの組織内輸送状況は、後記の皮膚バリア機能改善素材のスクリーニング法の指標として使用することが出来る
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
皮膚又は培養皮膚三次元モデルを用い、カプリン酸などのタイトジャンクション傷害剤で処置することにより、前記のセラミドの組織内輸送の鑑別法とほぼ同じ条件でタイトジャンクションの傷害からの回復促進作用を鑑別できることから、かかる回復促進作用を加味して、皮膚バリア機能改善素材のスクリーニングを行うことが出来、この様なスクリーニングを行うことが好ましい。この様なタイトジャンクションの傷害回復に関するスクリーニングは以下のように行うことが出来る。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
まず、次に示す手順に従って、タイトジャンクション傷害皮膚モデルを用意する。タイトジャンクション傷害皮膚モデルは、皮膚バリア機能向上成分のスクリーニング用のものであって、皮膚又は培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害処理してなることを特徴とする。前記の皮膚としては、所望により体毛を除去し、生体より採取した皮膚断片であって、角層などを除いた、表皮顆粒層、表皮基底層及び真皮部分からなるものが好ましく、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウサギの皮膚断片が好ましい。又、前記培養皮膚三次元モデルとしては、ヒト又はヒトを除く動物の皮膚より採取した、正常な（癌化していない）ケラチノサイト、フィブロブラストなどの皮膚細胞を培養し、三次元構造を構築し、皮膚の構造に疑似させたものが好ましく、この様な形態の市販品を購入して使用することも出来る。好ましい市販品としては、例えば、倉敷紡績株式会社から販売されている「EPI-200」（正常培養ヒト三次元皮膚モデル）などが好適に例示できる。かかる皮膚又は培養皮膚三次元モデルは、顆粒層側から傷害手段を講じてタイトジャンクション部分を傷害する。傷害手段としては、例えば、紫外線や化学物質などが好ましく例示でき、紫外線であれば、波長２８０〜３２０ｎｍの紫外線を７．５〜２００ｍJ／ｃｍ2、さらに好ましくは５０〜１６０ｍJ／ｃｍ2の単位あたりのエネルギー量で照射すればよく、化学的な処置であれば、カプリン酸、カプリル酸などの中鎖長（炭素数８〜１２）の脂肪族飽和直鎖脂肪酸またはその一価金属塩の０．１〜１０ｍM、さらに好ましくは０．５〜２ｍMの溶液を真皮側又は表皮基底層側から、５〜２４時間、さらに好ましくは１０〜１５時間作用させればよい。また、オクルディンやクローディンの細胞外ドメインを認識する中和抗体を使用することもできる。これらの傷害処置の内、特に好ましいものは化学的傷害処置であり、なかでもカプリン酸溶液による処理が特に好ましい。これはタイトジャンクションに対して均質な損傷がなしうるからである。この様な均質な傷害は、後記の傷害タイトジャンクションの回復促進剤のスクリーニングにおいては、そのメカニズムを的確に鑑別する上で非常に重要な因子となる。処置後傷害手段は直ちに皮膚又は培養皮膚三次元モデルより離脱させる。離脱は、紫外線照射であれば照射を終了することにより出来るし、化学的傷害手段であれば、培地又はPBS（リン酸緩衝生理食塩水）などで洗浄することによりなしうる。斯くして得られたタイトジャンクション傷害皮膚モデルは、後記タイトジャンクション機能回復剤の鑑別法に用いられ、傷害されたタイトジャンクションの回復促進剤のスクリーニングに好適に使用される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
次に、タイトジャンクション機能トレーサーキットを用意する。タイトジャンクション機能トレーサーキットは、標識されていてもよいビオチンと、標識されていてもよいアビジンからなるタイトジャンクション機能トレーサーキットであって、前記ビオチン又はアビジンのどちらかは蛍光標識されていることを特徴とする。前記標識としては、例えば、フルオロセイン、ローダミン、フルオテトラメチルローダミン、ダンシルなどの蛍光標識、ルシフェリンなどの発光標識、ガリウムなどの放射性標識、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼなどの酵素標識などが例示でき、感度高く、視覚的にタイトジャンクション機能を鑑別するには、ビオチン又はアビジンのどちらかに蛍光標識を用いることが好ましい。タイトジャンクションの機能を鑑別するためには、本発明のキットでは、標識されていてもよいビオチンを、真皮側又は表皮基底層側から作用させ、表皮顆粒層に向かって作用させる。この時、タイトジャンクションの機能が正常であれば標識されていてもよいビオチンは表皮顆粒層側で食い止められ、角層側には移動しない。タイトジャンクションの機能が不全であれば、標識されていてもよいビオチンは角層側へと移動する。この様な皮膚組織中での標識されていてもよいビオチンの移動は、標識されていてもよいアビジンを作用させることにより、可視化できる。前記アビジンとしては、ビオチンとの不可逆的結合性を有するものであれば、何れも用いることが出来、例えば、ストレプトアビジン等が、その入手の容易性から好適に例示できる。かかるアビジンの標識としては、蛍光標識されていることが好ましい。本発明のキットについて、真皮側又は表皮基底層側より作用させる物質として標識されていてもよいアビジンを選択し、組織中の標識されていてもよいアビジンの可視化手段として標識されていてもよいビオチンを用いることも出来るが、タイトジャンクションの機能の正確な鑑別には、真皮側より作用させる物質として標識されていてもよいビオチンを用い、該ビオチンの可視化手段として標識されていてもよいアビジンを用いることがより好ましい。