(57)【要約】  検体中のＣ型肝炎ウイルスのＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する工程と、前記ｃＤＮＡを鋳型とし、サイクリングプローブ法を用いてリアルタイムＰＣＲを行う工程とを含み、前記リアルタイムＰＣＲに用いるプライマーセットが、特定のプライマーセットであり、前記リアルタイムＰＣＲに用いるプローブが、特定のプローブを含むＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出方法などである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中のＣ型肝炎ウイルスのＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成するｃＤＮＡ合成工程と、
前記ｃＤＮＡを鋳型とし、サイクリングプローブ法を用いてリアルタイムＰＣＲを行うリアルタイムＰＣＲ工程とを含み、
前記リアルタイムＰＣＲに用いるプライマーセットが、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする塩基配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットであり、
前記リアルタイムＰＣＲに用いるプローブが、
下記配列番号：１で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号：２で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：１８で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含むことを特徴とするＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出方法。
ａａｃｇｃａｔ［ａ］ｃａ（配列番号：１）
ａａｃｇｃａｃ［ａ］ｃａ（配列番号：２）
ａｃｇｃａｃ［ａ］ｃａ（配列番号：１８）
配列番号：１、２、及び１８中、［  ］内の塩基は、ＲＮＡであることを示す。
【請求項２】
リアルタイムＰＣＲに用いるプローブが、
下記配列番号：９で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号：１０で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：２２で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含む請求項１に記載のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出方法。
ａａｃｇｃｇｔ［ａ］ｃａ（配列番号：９）
ａａｃｇｃｇｃ［ａ］ｃａ（配列番号：１０）
ａｃｇｃｇｃ［ａ］ｃａ（配列番号：２２）
配列番号：９、１０、及び２２中、［  ］内の塩基は、ＲＮＡであることを示す。
【請求項３】
リアルタイムＰＣＲに用いるプローブが、
下記配列番号：３で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：１９で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含む請求項１から２のいずれかに記載のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出方法。
ａａｃｇｃａｔ［ａ］ｔａ（配列番号：３）
ａａｃｇｃａｃ［ａ］ｔａ（配列番号：４）
ａｃｇｃａｃ［ａ］ｔａ（配列番号：１９）
配列番号：３、４、及び１９中、［  ］内の塩基は、ＲＮＡであることを示す。
【請求項４】
リアルタイムＰＣＲに用いるプローブが、
（１）下記配列番号：５で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、下記配列番号：６で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：２０で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとからなる組合せ、及び
（２）下記配列番号：７で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、下記配列番号：８で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：２１で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとからなる組合せの少なくともいずれかを含む請求項１から３のいずれかに記載のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出方法。
ａａｔｇｃａｔ［ａ］ｃａ（配列番号：５）
ａａｔｇｃａｃ［ａ］ｃａ（配列番号：６）
ａｔｇｃａｃ［ａ］ｃａ（配列番号：２０）
ａａｔｇｃａｔ［ａ］ｔａ（配列番号：７）
ａａｔｇｃａｃ［ａ］ｔａ（配列番号：８）
ａｔｇｃａｃ［ａ］ｔａ（配列番号：２１）
配列番号：５、６、７、８、２０、及び２１中、［  ］内の塩基は、ＲＮＡであることを示す。
【請求項５】
リアルタイムＰＣＲに用いるプライマーセットが、
（１）下記配列番号：１１で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：１２で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、及び
（２）下記配列番号：１１で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：１２で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットのいずれかである請求項１から４のいずれかに記載のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出方法。
ｇｇｔｔｃｃａｔｇａｇｇａｔｃｇｔｔｇ（配列番号：１１）
ｃｃｇｔｃａｃｇｔａｇｔｇｇａａａｔｃ（配列番号：１２）
【請求項６】
下記配列番号：１で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号：２で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：１８で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含むことを特徴とするＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出用キット。
ａａｃｇｃａｔ［ａ］ｃａ（配列番号：１）
ａａｃｇｃａｃ［ａ］ｃａ（配列番号：２）
ａｃｇｃａｃ［ａ］ｃａ（配列番号：１８）
配列番号：１、２、及び１８中、［  ］内の塩基は、ＲＮＡであることを示す。
【請求項７】
下記配列番号：９で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号：１０で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：２２で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含む請求項６に記載のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出用キット。
ａａｃｇｃｇｔ［ａ］ｃａ（配列番号：９）
ａａｃｇｃｇｃ［ａ］ｃａ（配列番号：１０）
ａｃｇｃｇｃ［ａ］ｃａ（配列番号：２２）
配列番号：９、１０、及び２２中、［  ］内の塩基は、ＲＮＡであることを示す。
【請求項８】
下記配列番号：３で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：１９で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含む請求項６から７のいずれかに記載のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出用キット。
ａａｃｇｃａｔ［ａ］ｔａ（配列番号：３）
ａａｃｇｃａｃ［ａ］ｔａ（配列番号：４）
ａｃｇｃａｃ［ａ］ｔａ（配列番号：１９）
配列番号：３、４、及び１９中、［  ］内の塩基は、ＲＮＡであることを示す。
【請求項９】
（１）下記配列番号：５で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、下記配列番号：６で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：２０で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとからなる組合せ、及び
（２）下記配列番号：７で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、下記配列番号：８で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：２１で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとからなる組合せの少なくともいずれかを含む請求項６から８のいずれかに記載のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出用キット。
ａａｔｇｃａｔ［ａ］ｃａ（配列番号：５）
ａａｔｇｃａｃ［ａ］ｃａ（配列番号：６）
ａｔｇｃａｃ［ａ］ｃａ（配列番号：２０）
ａａｔｇｃａｔ［ａ］ｔａ（配列番号：７）
ａａｔｇｃａｃ［ａ］ｔａ（配列番号：８）
ａｔｇｃａｃ［ａ］ｔａ（配列番号：２１）
配列番号：５、６、７、８、２０、及び２１中、［  ］内の塩基は、ＲＮＡであることを示す。
【請求項１０】
（１）下記配列番号：１１で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：１２で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、及び
（２）下記配列番号：１１で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：１２で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットの少なくともいずれかを含む請求項６から９のいずれかに記載のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出用キット。
ｇｇｔｔｃｃａｔｇａｇｇａｔｃｇｔｔｇ（配列番号：１１）
ｃｃｇｔｃａｃｇｔａｇｔｇｇａａａｔｃ（配列番号：１２）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出方法、及びＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ；以下、「ＨＣＶ」と称することがある）は、輸血後非Ａ非Ｂ型肝炎の主たる原因ウイルスで、約９，５００塩基のプラス鎖ＲＮＡをゲノムとして持っている。厚生労働省の統計によると、２０００年における日本でのＨＣＶのキャリア数は、１５０万人以上であると推計されている。ＨＣＶに感染した場合は、一過性の急性肝炎を経た後に、慢性肝炎、肝硬変、肝癌への進展傾向が強く、日本における原発性肝癌のおよそ８０％がＨＣＶ関連肝癌であると考えられている。ＨＣＶは、塩基配列の相同性によって遺伝子型が分類され、全世界では３０種類程度に分類される。日本においては、日本人に感染が認められる遺伝子型及び日本国内で検出された遺伝子型として、１ａ型、１ｂ型、２ａ型、２ｂ型、３ａ型の５つの遺伝子型が確認されている。日本における前記５つの遺伝子型の割合としては、１ｂ型、２ａ型及び２ｂ型がほとんどを占めており、１ａ型及び３ａ型はわずかである。【０００３】
ＨＣＶによる慢性肝炎の治療には、主にインターフェロン（以下、「ＩＦＮ」と称することがある）が用いられている。また、直接作用型抗ウイルス剤（Ｄｉｒｅｃｔ−ａｃｔｉｎｇ  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ａｇｅｎｔ）も使用されている。
前記直接作用型抗ウイルス剤としては、例えば、ダクラタスビルがある。ダクラタスビルは、ＨＣＶのＮＳ５Ａ（ｎｏｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ５Ａ）タンパク質の阻害剤である。これまでに、ＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸（野生型は、チロシン）に変異が起こっているとダクラタスビルに対して耐性を示すことが知られている（例えば、非特許文献１参照）。そのため、ダクラタスビルを患者に投与する前に、ＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸に変異が起こっているか否かを、低コストで、簡便かつ迅速に確認できることが求められている。【０００４】
また、ＨＣＶは、ヒトの体内において、複数のバリエーションのＨＣＶが混在した形で存在していることが知られている。そのため、検体中のＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸に変異が起こっているか否かを確認する際には、変異の有無のみならず、前記変異を有するＨＣＶ及び前記変異を有さないＨＣＶの定量や変異率を測定することも求められる。【０００５】
前記変異の有無を確認する方法としては、ダイレクトシークエンスや、次世代シークエンサーなどを用いて塩基配列を解読することが考えられる。
しかしながら、ダイレクトシーケンスは、安価に実施可能だが、定量性はなく、野生型や変異型の定量や変異率を測定するのは不可能であるという問題がある。また、次世代シークエンサーは、定量性はあるものの、１ラン当たりの費用が莫大であり、臨床分野で少数のゲノムサイズが比較的小さいＨＣＶなどに使用することは事実上不可能であるという問題がある。【０００６】
また、ＨＣＶは、変異を起こしやすく、同一の遺伝子型であっても１塩基から数１００塩基の違いを有する多数のバリエーションが存在することが知られている。そのため、検体中のＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸に変異が起こっているか否かを確認する際には、ＨＣＶの変異やバリエーションによる影響を抑え、検体中における様々なＨＣＶに対して適用し得る方法が求められている。【０００７】
したがって、ＨＣＶの変異やバリエーションによる影響を抑え、検体中における様々なＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の有無を、低コストで、簡便かつ迅速に、定量的に測定することができる方法の速やかな開発が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｆｒｉｄｅｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．、  Ａｎｔｉｍｉｃｒｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ２０１０，  ５４，  ３６４１−５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、ＨＣＶの変異やバリエーションによる影響を抑え、検体中における様々なＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の有無を、低コストで、簡便かつ迅速に、定量的に測定することができるＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出方法、及びＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  検体中のＣ型肝炎ウイルスのＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成するｃＤＮＡ合成工程と、
前記ｃＤＮＡを鋳型とし、サイクリングプローブ法を用いてリアルタイムＰＣＲを行うリアルタイムＰＣＲ工程とを含み、
前記リアルタイムＰＣＲに用いるプライマーセットが、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする塩基配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットであり、
前記リアルタイムＰＣＲに用いるプローブが、
下記配列番号：１で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号：２で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：１８で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含むことを特徴とするＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出方法である。
ａａｃｇｃａｔ［ａ］ｃａ（配列番号：１）
ａａｃｇｃａｃ［ａ］ｃａ（配列番号：２）
ａｃｇｃａｃ［ａ］ｃａ（配列番号：１８）
配列番号：１、２、及び１８中、［  ］内の塩基は、ＲＮＡであることを示す。
＜２＞  下記配列番号：１で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号：２で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：１８で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含むことを特徴とするＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出用キットである。
ａａｃｇｃａｔ［ａ］ｃａ（配列番号：１）
ａａｃｇｃａｃ［ａ］ｃａ（配列番号：２）
ａｃｇｃａｃ［ａ］ｃａ（配列番号：１８）
配列番号：１、２、及び１８中、［  ］内の塩基は、ＲＮＡであることを示す。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、ＨＣＶの変異やバリエーションによる影響を抑え、検体中における様々なＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の有無を、低コストで、簡便かつ迅速に、定量的に測定することができるＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出方法、及びＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出用キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、試験例１におけるダイレクトシークエンスの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出方法）
本発明のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異（以下、「ＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  Ｙ９３変異」と称することがある）の検出方法は、ｃＤＮＡ合成工程と、リアルタイムＰＣＲ工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００１４】
前記Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１ａ型、１ｂ型、２ａ型、２ｂ型が好ましい。
【００１５】
＜ｃＤＮＡ合成工程＞
前記ｃＤＮＡ合成工程は、検体中のＣ型肝炎ウイルスのＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する工程である。
【００１６】
−検体−
前記検体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＨＣＶ感染を検査される患者（以下、「被検者」と称することがある）の血液、組織などが挙げられる。
前記被検者から血液、組織などを採取する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
【００１７】
−Ｃ型肝炎ウイルスのＲＮＡの調製−
前記Ｃ型肝炎ウイルスのＲＮＡの調製方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ＱＩＡａｍｐ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて調製する方法などが挙げられる。
【００１８】
−ｃＤＮＡの合成−
前記ｃＤＮＡの合成方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ株式会社製）、ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｍ−ＭＬＶ  Ｖｅｒｓｉｏｎ）（タカラバイオ株式会社製）を用いて合成する方法などが挙げられる。
【００１９】
＜リアルタイムＰＣＲ工程＞
前記リアルタイムＰＣＲ工程は、前記ｃＤＮＡを鋳型とし、サイクリングプローブ法を用いてリアルタイムＰＣＲを行う工程である。
【００２０】
＜＜サイクリングプローブ法＞＞
前記サイクリングプローブ法を用いたリアルタイムＰＣＲは、ＲＮＡとＤＮＡとからなるキメラプローブと、ＲＮａｓｅ  Ｈとの組合せにより、試料における塩基配列及びその量を測定する方法である。
前記プローブは、一方の末端が蛍光物質で修飾されており、他方の末端がクエンチャー物質で修飾されている。そのため、増幅産物の相補的な配列と、プローブとがハイブリッドを形成した後にＲＮａｓｅ  ＨによりＲＮＡ部分が切断されることにより、強い蛍光が生じる。前記蛍光強度を測定することで、増幅産物量を定量することができる。
前記蛍光物質としては、特に制限はなく、公知の蛍光物質を適宜選択することができ、例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＲＯＸなどが挙げられる。
前記クエンチャー物質としては、特に制限はなく、公知のクエンチャー物質を適宜選択することができ、例えば、Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ＢＨＱ１  Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＩＯＳＥＲＣＨ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）、ＢＨＱ２  Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＩＯＳＥＲＣＨ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）などが挙げられる。
【００２１】
−プローブ−
前記プローブは、下記配列番号：１で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、下記配列番号：２で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：１８で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを少なくとも含み、必要に応じて更にその他のプローブを含む。
【００２２】
前記ＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする塩基配列近傍の配列は、下記配列番号：１３で表されるとおりである。
５’−ａａ（ｙ）ｇｃ（ｎ）ｙａ（ｙ）−３’（配列番号：１３）
配列番号：１３は、ＮＳ５Ａタンパク質の９１番目から９３番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であり、下線部は、９３番目のアミノ酸をコードする部分に対応する。また、配列番号：１３中、「ｙ」は、チミン又はシトシンを示し、「ｎ」は、アデニン、グアニン、シトシン、又はチミンを示す。
後述する製造例１に示すように、ＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異は、主に２７７番目の塩基がｔからｃになることにより生じる。また、２７３番目、２７６番目、２７９番目の塩基（前記配列番号：１３において、（  ）を付した塩基）では、ＨＣＶ間にバリエーションが存在する。そのため、ＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の有無を、低コストで、簡便かつ迅速に、定量的に測定するためには、プローブの設計が非常に重要である。
【００２３】
−−配列番号：１で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ−−
前記配列番号：１で表される塩基配列からなるプローブ（以下、「Ｙｃａｃタイプ」と称することがある）の配列は、以下のとおりである。
５’−ａａｃｇｃａｔ［ａ］ｃａ−３’（配列番号：１）
前記配列番号：１中、［  ］内のａは、ＲＮＡであることを示し、下線部はＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記配列番号：１で表される塩基配列からなるプローブは、ＮＳ５Ａの９３番目のアミノ酸がチロシンであり、前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃａｃである配列である。
前記配列番号：１で表される塩基配列からなるプローブは、ＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異を引き起こす２７７番目の塩基をＲＮＡとするのではなく、その隣の２７８番目の塩基をＲＮＡとすることにより、前記Ｙｃａｃタイプの配列に加え、Ｙｃｇｃタイプの配列（前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃｇｃである配列）、Ｙｃｃｃタイプの配列（前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃｃｃである配列）、及びＹｃｔｃタイプの配列（前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃｔｃである配列）をも検出することができる。即ち、前記配列番号：１３で表される塩基配列における「ｎ」のバリエーションの影響を受けずにＮＳ５Ａの９３番目がチロシンであるか否か及びその量を測定することができる。
前記配列番号：１で表される塩基配列からなるプローブは、その相補的な塩基配列からなるプローブとしてもよい。
前記配列番号：１で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、１種単独で使用してもよいし、２種を併用してもよい。これらの中でも、前記配列番号：１で表される塩基配列からなるプローブが好ましい。
【００２４】
−−配列番号：２で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ−−
前記配列番号：２で表される塩基配列からなるプローブ（以下、「Ｈｃａｃタイプ」と称することがある）の配列は、以下のとおりである。
５’−ａａｃｇｃａｃ［ａ］ｃａ−３’（配列番号：２）
前記配列番号：２中、［  ］内のａは、ＲＮＡであることを示し、下線部はＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記配列番号：２で表される塩基配列からなるプローブは、ＮＳ５Ａの９３番目のアミノ酸がヒスチジンであり、前記配列番号：１３において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃａｃである配列である。
前記配列番号：２で表される塩基配列からなるプローブは、ＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異を引き起こす２７７番目の塩基をＲＮＡとするのではなく、その隣の２７８番目の塩基をＲＮＡとすることにより、前記Ｈｃａｃタイプの配列に加え、Ｈｃｇｃタイプの配列（前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃｇｃである配列）、Ｈｃｃｃタイプの配列（前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃｃｃである配列）、及びＨｃｔｃタイプの配列（前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃｔｃである配列）をも検出することができる。即ち、前記配列番号：１３で表される塩基配列における「ｎ」のバリエーションの影響を受けずにＮＳ５Ａの９３番目がヒスチジンであるか否か及びその量を測定することができる。
前記配列番号：２で表される塩基配列からなるプローブは、その相補的な塩基配列からなるプローブとしてもよい。
【００２５】
−−配列番号：１８で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ−−
前記配列番号：１８で表される塩基配列からなるプローブ（以下、「Ｈｃａｃタイプ」と称することがある）の配列は、以下のとおりである。
５’−ａｃｇｃａｃ［ａ］ｃａ−３’（配列番号：１８）
前記配列番号：１８中、［  ］内のａは、ＲＮＡであることを示し、下線部はＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記配列番号：１８で表される塩基配列からなるプローブは、ＮＳ５Ａの９３番目のアミノ酸がヒスチジンであり、前記配列番号：１３において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃａｃである配列である。
前記配列番号：１８で表される塩基配列からなるプローブは、ＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異を引き起こす２７７番目の塩基をＲＮＡとするのではなく、その隣の２７８番目の塩基をＲＮＡとすることにより、前記Ｈｃａｃタイプの配列に加え、Ｈｃｇｃタイプの配列（前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃｇｃである配列）、Ｈｃｃｃタイプの配列（前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃｃｃである配列）、及びＨｃｔｃタイプの配列（前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃｔｃである配列）をも検出することができる。即ち、前記配列番号：１３で表される塩基配列における「ｎ」のバリエーションの影響を受けずにＮＳ５Ａの９３番目がヒスチジンであるか否か及びその量を測定することができる。
前記配列番号：１８で表される塩基配列からなるプローブは、その相補的な塩基配列からなるプローブとしてもよい。
【００２６】
前記配列番号：２で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び前記配列番号：１８で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、前記配列番号：２で表される塩基配列からなるプローブ、又は前記配列番号：１８で表される塩基配列からなるプローブが好ましい。
【００２７】
−−その他のプローブ−−
前記その他のプローブとしては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記その他のプローブとしては、下記配列番号：９で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、下記配列番号：１０で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：２２で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含む態様が、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の有無をより高い精度で検出することができる点で、好ましい。
【００２８】
−−−配列番号：９で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ−−−
前記配列番号：９で表される塩基配列からなるプローブ（以下、「Ｙｃｇｃタイプ」と称することがある）の配列は、以下のとおりである。
５’−ａａｃｇｃｇｔ［ａ］ｃａ−３’（配列番号：９）
前記配列番号：９中、［  ］内のａは、ＲＮＡであることを示し、下線部はＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記配列番号：９で表される塩基配列からなるプローブは、ＮＳ５Ａの９３番目のアミノ酸がチロシンであり、前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃｇｃである配列である。
前記配列番号：９で表される塩基配列からなるプローブは、その相補的な塩基配列からなるプローブとしてもよい。
前記配列番号：９で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、１種単独で使用してもよいし、２種を併用してもよい。これらの中でも、前記配列番号：９で表される塩基配列からなるプローブが好ましい。
【００２９】
前記配列番号：１で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、前記配列番号：９で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブとを併用する場合の使用量の比としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分子数の比で、１：１とすることができる。
【００３０】
−−−配列番号：１０で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ−−−
前記配列番号：１０で表される塩基配列からなるプローブ（以下、「Ｈｃｇｃタイプ」と称することがある）の配列は、以下のとおりである。
５’−ａａｃｇｃｇｃ［ａ］ｃａ−３’（配列番号：１０）
前記配列番号：１０中、［  ］内のａは、ＲＮＡであることを示し、下線部はＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記配列番号：１０で表される塩基配列からなるプローブは、ＮＳ５Ａの９３番目のアミノ酸がヒスチジンであり、前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃｇｃである配列である。
前記配列番号：１０で表される塩基配列からなるプローブは、その相補的な塩基配列からなるプローブとしてもよい。
【００３１】
−−配列番号：２２で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ−−
前記配列番号：２２で表される塩基配列からなるプローブ（以下、「Ｈｃｇｃタイプ」と称することがある）の配列は、以下のとおりである。
５’−ａｃｇｃｇｃ［ａ］ｃａ−３’（配列番号：２２）
前記配列番号：２２中、［  ］内のａは、ＲＮＡであることを示し、下線部はＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記配列番号：２２で表される塩基配列からなるプローブは、ＮＳ５Ａの９３番目のアミノ酸がヒスチジンであり、前記配列番号：１３において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃｇｃである配列である。
前記配列番号：２２で表される塩基配列からなるプローブは、その相補的な塩基配列からなるプローブとしてもよい。
【００３２】
前記配列番号：１０で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び前記配列番号：２２で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、前記配列番号：１０で表される塩基配列からなるプローブ、又は前記配列番号：２２で表される塩基配列からなるプローブが好ましい。
【００３３】
前記配列番号：２で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び前記配列番号：１８で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかと、前記配列番号：１０で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び前記配列番号：２２で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを併用する場合の使用量の比としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分子数の比で、１：１とすることができる。
【００３４】
前記その他のプローブは、更に、下記配列番号：３で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、下記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：１９で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかと含んでもよく、更に、（１）下記配列番号：５で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、下記配列番号：６で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：２０で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとからなる組合せ、及び（２）下記配列番号：７で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、下記配列番号：８で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：２１で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとからなる組合せの少なくともいずれかを含んでもよい。
前記その他のプローブを用いることにより、更に多くの検体におけるＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異を検出することができる。
【００３５】
−−−配列番号：３で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ−−−
前記配列番号：３で表される塩基配列からなるプローブ（以下、「Ｙｃａｔタイプ」と称することがある）の配列は、以下のとおりである。
５’−ａａｃｇｃａｔ［ａ］ｔａ−３’（配列番号：３）
前記配列番号：３中、［  ］内のａは、ＲＮＡであることを示し、下線部はＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記配列番号：３で表される塩基配列からなるプローブは、ＮＳ５Ａの９３番目のアミノ酸がチロシンであり、前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃａｔである配列である。
前記配列番号：３で表される塩基配列からなるプローブは、その相補的な塩基配列からなるプローブとしてもよい。
前記配列番号：３で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、１種単独で使用してもよいし、２種を併用してもよい。これらの中でも、前記配列番号：３で表される塩基配列からなるプローブが好ましい。
【００３６】
−−−配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ−−−
前記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブ（以下、「Ｈｃａｔタイプ」と称することがある）の配列は、以下のとおりである。
５’−ａａｃｇｃａｃ［ａ］ｔａ−３’（配列番号：４）
前記配列番号：４中、［  ］内のａは、ＲＮＡであることを示し、下線部はＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブは、ＮＳ５Ａの９３番目のアミノ酸がヒスチジンであり、前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃａｔである配列である。
前記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブは、その相補的な塩基配列からなるプローブとしてもよい。
【００３７】
−−−配列番号：１９で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ−−−
前記配列番号：１９で表される塩基配列からなるプローブ（以下、「Ｈｃａｔタイプ」と称することがある）の配列は、以下のとおりである。
５’−ａｃｇｃａｃ［ａ］ｔａ−３’（配列番号：１９）
前記配列番号：１９中、［  ］内のａは、ＲＮＡであることを示し、下線部はＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記配列番号：１９で表される塩基配列からなるプローブは、ＮＳ５Ａの９３番目のアミノ酸がヒスチジンであり、前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃａｔである配列である。
前記配列番号：１９で表される塩基配列からなるプローブは、その相補的な塩基配列からなるプローブとしてもよい。
【００３８】
前記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び前記配列番号：１９で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、前記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブ、又は前記配列番号：１９で表される塩基配列からなるプローブが好ましい。
【００３９】
−−−配列番号：５で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ−−−
前記配列番号：５で表される塩基配列からなるプローブ（以下、「Ｙｔａｃタイプ」と称することがある）の配列は、以下のとおりである。
５’−ａａｔｇｃａｔ［ａ］ｃａ−３’（配列番号：５）
前記配列番号：５中、［  ］内のａは、ＲＮＡであることを示し、下線部はＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記配列番号：５で表される塩基配列からなるプローブは、ＮＳ５Ａの９３番目のアミノ酸がチロシンであり、前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｔａｃである配列である。
前記配列番号：５で表される塩基配列からなるプローブは、その相補的な塩基配列からなるプローブとしてもよい。
前記配列番号：５で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、１種単独で使用してもよいし、２種を併用してもよい。これらの中でも、前記配列番号：５で表される塩基配列からなるプローブが好ましい。
【００４０】
−−−配列番号：６で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ−−−
前記配列番号：６で表される塩基配列からなるプローブ（以下、「Ｈｔａｃタイプ」と称することがある）の配列は、以下のとおりである。
５’−ａａｔｇｃａｃ［ａ］ｃａ−３’（配列番号：６）
前記配列番号：６中、［  ］内のａは、ＲＮＡであることを示し、下線部はＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記配列番号：６で表される塩基配列からなるプローブは、ＮＳ５Ａの９３番目のアミノ酸がヒスチジンであり、前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｔａｃである配列である。
前記配列番号：６で表される塩基配列からなるプローブは、その相補的な塩基配列からなるプローブとしてもよい。
【００４１】
−−−配列番号：２０で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ−−−
前記配列番号：２０で表される塩基配列からなるプローブ（以下、「Ｈｔａｃタイプ」と称することがある）の配列は、以下のとおりである。
５’−ａｔｇｃａｃ［ａ］ｃａ−３’（配列番号：２０）
前記配列番号：２０中、［  ］内のａは、ＲＮＡであることを示し、下線部はＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記配列番号：２０で表される塩基配列からなるプローブは、ＮＳ５Ａの９３番目のアミノ酸がヒスチジンであり、前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｔａｃである配列である。
前記配列番号：２０で表される塩基配列からなるプローブは、その相補的な塩基配列からなるプローブとしてもよい。
【００４２】
前記配列番号：６で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び前記配列番号：２０で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、前記配列番号：６で表される塩基配列からなるプローブ、又は前記配列番号：２０で表される塩基配列からなるプローブが好ましい。
【００４３】
−−−配列番号：７で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ−−−
前記配列番号：７で表される塩基配列からなるプローブ（以下、「Ｙｔａｔタイプ」と称することがある）の配列は、以下のとおりである。
５’−ａａｔｇｃａｔ［ａ］ｔａ−３’（配列番号：７）
前記配列番号：７中、［  ］内のａは、ＲＮＡであることを示し、下線部はＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記配列番号：７で表される塩基配列からなるプローブは、ＮＳ５Ａの９３番目のアミノ酸がチロシンであり、前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｔａｔである配列である。
前記配列番号：７で表される塩基配列からなるプローブは、その相補的な塩基配列からなるプローブとしてもよい。
前記配列番号：７で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、１種単独で使用してもよいし、２種を併用してもよい。これらの中でも、前記配列番号：７で表される塩基配列からなるプローブが好ましい。
【００４４】
−−−配列番号：８で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ−−−
前記配列番号：８で表される塩基配列からなるプローブ（以下、「Ｈｔａｔタイプ」と称することがある）の配列は、以下のとおりである。
５’−ａａｔｇｃａｃ［ａ］ｔａ−３’（配列番号：８）
前記配列番号：８中、［  ］内のａは、ＲＮＡであることを示し、下線部はＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記配列番号：８で表される塩基配列からなるプローブは、ＮＳ５Ａの９３番目のアミノ酸がヒスチジンであり、前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｔａｔである配列である。
前記配列番号：８で表される塩基配列からなるプローブは、その相補的な塩基配列からなるプローブとしてもよい。
【００４５】
−−−配列番号：２１で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ−−−
前記配列番号：２１で表される塩基配列からなるプローブ（以下、「Ｈｔａｔタイプ」と称することがある）の配列は、以下のとおりである。
５’−ａｔｇｃａｃ［ａ］ｔａ−３’（配列番号：２１）
前記配列番号：２１中、［  ］内のａは、ＲＮＡであることを示し、下線部はＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記配列番号：２１で表される塩基配列からなるプローブは、ＮＳ５Ａの９３番目のアミノ酸がヒスチジンであり、前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｔａｔである配列である。
前記配列番号：２１で表される塩基配列からなるプローブは、その相補的な塩基配列からなるプローブとしてもよい。
【００４６】
前記配列番号：８で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び前記配列番号：２１で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、前記配列番号：８で表される塩基配列からなるプローブ、又は前記配列番号：２１で表される塩基配列からなるプローブが好ましい。
【００４７】
前記サイクリングプローブ法を用いたリアルタイムＰＣＲでは、前記プローブは、少なくとも下記（１）の組合せを用い、必要に応じて更に下記（２）、（３）、（４）、及び（５）の少なくともいずれかの組合せを用いる。これらの中でも、下記（１）の組合せと、下記（２）の組合せとを少なくとも含む態様が好ましい。
（１）  前記配列番号：１で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、前記配列番号：２で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び前記配列番号：１８で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとの組合せ
（２）  前記配列番号：９で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、前記配列番号：１０で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び前記配列番号：２２で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとの組合せ
（３）  前記配列番号：３で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、前記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び前記配列番号：１９で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとの組合せ
（４）  前記配列番号：５で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、前記配列番号：６で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び前記配列番号：２０で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとの組合せ
（５）  前記配列番号：７で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、前記配列番号：８で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び前記配列番号：２１で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとの組合せ
【００４８】
−プライマーセット−
前記プライマーセットとしては、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする塩基配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、検体中における様々なＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする塩基配列を含む領域を増幅可能である点で、下記配列番号：１１で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：１２で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、及び下記配列番号：１１に相補的な塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：１２に相補的な塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットのいずれかであることが好ましい。
【００４９】
−−配列番号：１１で表される塩基配列からなるプライマー若しくはその相補的な塩基配列からなるプライマー−−
前記配列番号：１１で表される塩基配列からなるプライマーは、ＮＳ５Ａタンパク質をコードする塩基配列の２０８番目から２２６番目に対応するものであり、その配列は、以下のとおりである。
５’−ｇｇｔｔｃｃａｔｇａｇｇａｔｃｇｔｔｇ−３’（配列番号：１１）
前記配列番号：１１で表される塩基配列からなるプライマーは、その相補的な塩基配列からなるプライマーであってもよいが、前記配列番号：１１で表される塩基配列からなるプライマーが好ましい。
【００５０】
−−配列番号：１２で表される塩基配列からなるプライマー若しくはその相補的な塩基配列からなるプライマー−−
前記配列番号：１２で表される塩基配列からなるプライマーは、ＮＳ５Ａタンパク質をコードする塩基配列の３７６番目から３９４番目に対応するものであり、その配列は、以下のとおりである。
５’−ｃｃｇｔｃａｃｇｔａｇｔｇｇａａａｔｃ−３’（配列番号：１２）
前記配列番号：１２で表される塩基配列からなるプライマーは、その相補的な塩基配列からなるプライマーであってもよいが、前記配列番号：１２で表される塩基配列からなるプライマーが好ましい。
【００５１】
前記リアルタイムＰＣＲは、前記組合せのプローブを同一の反応容器に入れて行ってもよいし、それぞれのプローブを異なる反応容器に入れて行ってもよいが、検出感度に優れる点で、異なる反応容器に入れて行うことが好ましい。
前記組合せのプローブを同一の反応容器に入れて行う場合には、それぞれのプローブを修飾する前記蛍光物質を異なるものとすればよい。前記それぞれのプローブを異なる反応容器に入れて行う場合は、同一の蛍光物質を用いてもよいし、それぞれ異なる蛍光物質を用いてもよい。
前記リアルタイムＰＣＲは、例えば、Ｃｙｃｌｅａｖｅ（登録商標）ＰＣＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（タカラバイオ株式会社製）を用いて行うことができる。
前記リアルタイムＰＣＲの反応条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記リアルタイムＰＣＲにより、検体中におけるＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の有無を定量的に測定することができ、ＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異を検出することができる。
【００５２】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記被検者から血液、組織などを採取する採取工程などが挙げられる。
【００５３】
（Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出用キット）
本発明のＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  Ｙ９３変異の検出用キットは、前記配列番号：１で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、前記配列番号：２で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び前記配列番号：１８で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
【００５４】
前記Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１ａ型、１ｂ型、２ａ型、２ｂ型が好ましい。
【００５５】
＜配列番号：１で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ＞
前記配列番号：１で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、上記した本発明のＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  Ｙ９３変異の検出方法の「配列番号：１で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
【００５６】
＜配列番号：２で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ＞
前記配列番号：２で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、上記した本発明のＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  Ｙ９３変異の検出方法の「配列番号：２で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
【００５７】
＜配列番号：１８で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ＞
前記配列番号：１８で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、上記した本発明のＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  Ｙ９３変異の検出方法の「配列番号：１８で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
【００５８】
＜その他の構成＞
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記配列番号：１で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、前記配列番号：２で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び前記配列番号：１８で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの以外のプローブ（以下、「その他のプローブ」と称することがある）、プライマーセット、ＰＣＲに用いる試薬などが挙げられる。
【００５９】
−その他のプローブ−
前記ＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  Ｙ９３変異の検出用キットにおけるその他のプローブとしては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記その他のプローブとしては、下記配列番号：９で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、下記配列番号：１０で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：２２で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含む態様が、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の有無をより高い精度で検出することができる点で、好ましい。
【００６０】
−−配列番号：９で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ−−
前記配列番号：９で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、上記した本発明のＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  Ｙ９３変異の検出方法の「配列番号：９で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
【００６１】
−−配列番号：１０で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ−−
前記配列番号：１０で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、上記した本発明のＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  Ｙ９３変異の検出方法の「配列番号：１０で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
【００６２】
−−配列番号：２２で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ−−
前記配列番号：２２で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、上記した本発明のＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  Ｙ９３変異の検出方法の「配列番号：２２で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
【００６３】
前記その他のプローブは、更に、下記配列番号：３で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、下記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：１９で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかと含んでもよく、更に、（１）下記配列番号：５で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、下記配列番号：６で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：２０で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとからなる組合せ、及び（２）下記配列番号：７で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、下記配列番号：８で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：２１で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとからなる組合せの少なくともいずれかを含んでもよい。
前記その他のプローブを用いることにより、更に多くの検体におけるＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異を検出することができる。
【００６４】
−−配列番号：３で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ−−
前記配列番号：３で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、上記した本発明のＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  Ｙ９３変異の検出方法の「配列番号：３で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
【００６５】
−−配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ−−
前記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、上記した本発明のＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  Ｙ９３変異の検出方法の「配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
【００６６】
−−配列番号：１９で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ−−
前記配列番号：１９で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、上記した本発明のＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  Ｙ９３変異の検出方法の「配列番号：１９で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
【００６７】
−−配列番号：５で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ−−
前記配列番号：５で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、上記した本発明のＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  Ｙ９３変異の検出方法の「配列番号：５で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
【００６８】
−−配列番号：６で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ−−
前記配列番号：６で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、上記した本発明のＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  Ｙ９３変異の検出方法の「配列番号：６で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
【００６９】
−−配列番号：２０で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ−−
前記配列番号：２０で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、上記した本発明のＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  Ｙ９３変異の検出方法の「配列番号：２０で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
【００７０】
−−配列番号：７で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ−−
前記配列番号：７で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、上記した本発明のＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  Ｙ９３変異の検出方法の「配列番号：７で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
【００７１】
−−配列番号：８で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ−−
前記配列番号：８で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、上記した本発明のＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  Ｙ９３変異の検出方法の「配列番号：８で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
【００７２】
−−配列番号：２１で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ−−
前記配列番号：２１で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、上記した本発明のＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  Ｙ９３変異の検出方法の「配列番号：２１で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
【００７３】
−プライマーセット−
前記プライマーセットとしては、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする塩基配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、検体中における様々なＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする塩基配列を含む領域を増幅可能である点で、下記配列番号：１１で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：１２で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、及び前記配列番号：１１に相補的な塩基配列からなるプライマーと、前記配列番号：１２に相補的な塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットのいずれかであることが好ましい。
【００７４】
−−配列番号：１１で表される塩基配列からなるプライマー若しくはその相補的な塩基配列からなるプライマー−−
前記配列番号：１１で表される塩基配列からなるプライマー若しくはその相補的な塩基配列からなるプライマーは、上記した本発明のＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  Ｙ９３変異の検出方法の「配列番号：１１で表される塩基配列からなるプライマー若しくはその相補的な塩基配列からなるプライマー」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
【００７５】
−−配列番号：１２で表される塩基配列からなるプライマー若しくはその相補的な塩基配列からなるプライマー−−
前記配列番号：１２で表される塩基配列からなるプライマー若しくはその相補的な塩基配列からなるプライマーは、上記した本発明のＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  Ｙ９３変異の検出方法の「配列番号：１２で表される塩基配列からなるプライマー若しくはその相補的な塩基配列からなるプライマー」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
【実施例】
【００７６】
以下、製造例、試験例などを挙げて、本発明を説明するが、本発明は、以下の製造例、試験例などに何ら限定されるものではない。【００７７】
（製造例１：プローブ）
＜プローブの設計＞
公開されているＤＮＡデータベースに登録されている６４７例のＨＣＶの塩基配列を調査した。ＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸（野生型は、チロシン）をコードする塩基配列近傍の塩基配列の調査結果を表１示す。なお、ＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする塩基配列近傍の配列は、下記配列番号：１３で表されるとおりである。
５’−ａａ（ｙ）ｇｃ（ｎ）ｙａ（ｙ）−３’（配列番号：１３）
配列番号：１３は、ＮＳ５Ａタンパク質の９１番目から９３番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であり、下線部は、９３番目のアミノ酸をコードする部分に対応する。また、配列番号：１３中、「ｙ」は、チミン又はシトシンを示し、「ｎ」は、アデニン、グアニン、シトシン、又はチミンを示す。【００７８】
【表１】
2015087945.tif 000002
【００７９】
表１の結果から、ＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異は、ｔ（２７７ｎｔ）ａ(２７８ｎｔ)ｃ（２７９ｎｔ）から、ｃａｃへの２７７ｎｔのｔがｃに変わる変異により引き起こされることがわかった。
サイクリングプローブ法では、変異箇所をプローブのＲＮＡ部分とすることが一般的である。そのため、２７７番目の位置の塩基をＲＮＡとしたプローブを設計することが考えられた。しかしながら、後述する試験例５に示すように、２７７番目の位置の塩基をＲＮＡとした場合、２７６番目の位置の塩基のバリエーションの影響を受けてしまい、様々なバリエーションのＨＣＶを検出するためには、それぞれのバリエーションに応じたプローブを用意しなければならないことがわかった。【００８０】
そこで、プローブのＲＮＡ部分を変異箇所の隣である２７８番目の塩基とした配列番号：１及び２のプローブセットを設計した。
−プローブセット−
・  Ｙｃａｃタイプ−１：
５’−ａａｃｇｃａｔ［ａ］ｃａ−３’（配列番号：１）
配列番号：１中、［  ］内のａは、ＲＮＡであることを示し、下線部はＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記Ｙｃａｃタイプ−１は、ＮＳ５Ａの９３番目のアミノ酸がチロシンであり、前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃａｃである配列である。
前記Ｙｃａｃタイプ−１のプローブは、５’末端が蛍光物質（ＦＡＭ）で修飾されており、３’末端がクエンチャー物質（Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製））で修飾されている。
・  Ｈｃａｃタイプ−１：
５’−ａａｃｇｃａｃ［ａ］ｃａ−３’（配列番号：２）
配列番号：２中、［  ］内のａは、ＲＮＡであることを示し、下線部はＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記Ｈｃａｃタイプ−１は、ＮＳ５Ａの９３番目のアミノ酸がヒスチジンであり、前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃａｃである配列である。
前記Ｈｃａｃタイプ−１のプローブは、５’末端が蛍光物質（ＦＡＭ）で修飾されており、３’末端がクエンチャー物質（Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製））で修飾されている。【００８１】
（製造例２：プライマー）
Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする塩基配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットとして、以下の配列番号：１１及び１２で表される塩基配列からなるプライマーセットを調製した。前記プライマーセットは、公開されているＤＮＡデータベースに登録されている約６００例のＨＣＶ塩基配列をもとに、リアルタイムＰＣＲに用いることができる、相同性の高い領域を見出し、設計した。
・  ＨＣＶ＿Ｙ９３−１Ｌ：
５’−ｇｇｔｔｃｃａｔｇａｇｇａｔｃｇｔｔｇ−３’（配列番号：１１）
前記配列番号：１１で表される塩基配列は、ＮＳ５Ａタンパク質をコードする塩基配列の２０８番目から２２６番目に対応する。
・  ＨＣＶ＿Ｙ９３−１Ｒ：
５’−ｃｃｇｔｃａｃｇｔａｇｔｇｇａａａｔｃ−３’（配列番号：１２）
前記配列番号：１２で表される塩基配列は、ＮＳ５Ａタンパク質をコードする塩基配列の３７６番目から３９４番目に対応する。【００８２】
（調製例１：人工合成遺伝子）
前記製造例１で設計したプローブ、又は後述する製造例３で設計したプローブと、前記製造例２で設計したプライマーとを用い、リアルタイムＰＣＲを行うことにより、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異を検出することができるか否かを確認するための人工合成遺伝子として、以下の人工合成遺伝子を調製した。なお、前記人工合成遺伝子は、遺伝子型が１ｂ型であるＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡの配列を参考に調製した。
・  人工合成遺伝子−１（野生型）：
ＮＳ５Ａタンパク質をコードする塩基配列の１９８番目から４０４番目に対応する塩基配列であって、９１番目から９３番目のアミノ酸をコードする塩基配列が、「ａａｃｇｃａｔａｃ」であるもの（配列番号：１４）と、その相補鎖からなる二本鎖ＤＮＡ。前記人工合成遺伝子−１は、前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃａｃである配列である。
・  人工合成遺伝子−２（変異型）：
前記配列番号：１４において、ＮＳ５Ａタンパク質の９１番目から９３番目のアミノ酸をコードする塩基配列が、「ａａｃｇｃａｃａｃ」であるもの（配列番号：１５）と、その相補鎖からなる二本鎖ＤＮＡ。前記人工合成遺伝子−２は、前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃａｃである配列である。
・  人工合成遺伝子−３（変異型）：
前記配列番号：１４において、ＮＳ５Ａタンパク質の９１番目から９３番目のアミノ酸をコードする塩基配列が、「ａａｃｇｃｇｃａｃ」であるもの（配列番号：１６）と、その相補鎖からなる二本鎖ＤＮＡ。前記人工合成遺伝子−３は、前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃｇｃである配列である。
・  人工合成遺伝子−４（野生型）：
ＮＳ５Ａタンパク質をコードする塩基配列の１９８番目から４０４番目に対応する塩基配列であって、９１番目から９３番目のアミノ酸をコードする塩基配列が、「ａａｃｇｃｇｔａｃ」であるもの（配列番号：２３）と、その相補鎖からなる二本鎖ＤＮＡ。前記人工合成遺伝子−４は、前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃｇｃである配列である。【００８３】
（試験例１）
＜人工合成遺伝子サンプルの調製＞
前記調製例１で調製した人工合成遺伝子−１（野生型：Ｙ９３）と、人工合成遺伝子−２（変異型：Ｙ９３Ｈ）とを表２のように混合し、人工合成遺伝子サンプルを調製した。【００８４】
【表２】
2015087945.tif 000003
【００８５】
＜リアルタイムＰＣＲ＞
前記サンプルＡ−１からＨ−１のそれぞれについて、プローブを前記製造例１で設計した各プローブとし、プライマーセットを前記製造例２で設計したプライマーセットとし、Ｃｙｃｌｅａｖｅ（登録商標）ＰＣＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（タカラバイオ株式会社製）を用いて、以下の反応液の組成（表３参照）、及び反応条件で、リアルタイムＰＣＲ（反応装置：ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０）を行った。
なお、前記リアルタイムＰＣＲでは、Ｙｃａｃタイプのプローブ（配列番号：１）と、Ｈｃａｃタイプのプローブ（配列番号：２）とを、それぞれ別のウェルに入れ、反応を行った。
−反応条件−
−−ホールド（初期変性）−−
サイクル数：１
条件：９５℃、３０秒間
−−３ステップＰＣＲ−−
サイクル数：４５
条件：９５℃、５秒間、次いで、５５℃、１０秒間、その後、７２℃、２５秒間【００８６】
【表３】
2015087945.tif 000004
【００８７】
前記リアルタイムＰＣＲの結果から、ＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異を定量し、変異率を算出した結果を表４に示す。【００８８】
【表４】
2015087945.tif 000005
【００８９】
＜ダイレクトシークエンス＞
前記サンプルＡ−１からＨ−１のそれぞれについて、シークエンサーとして、３７３０ｘｌ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、試薬として、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、サンガーデオキシ法によるダイレクトシークエンスを行った。結果を図１に示す。【００９０】
図１中、矢印で示す部分は、ＮＳ５Ａタンパク質をコードする塩基配列の２７７番目の塩基である。図１の結果から、前記サンプルＡ−１からＨ−１の塩基配列が確認された。【００９１】
前記ダイレクトシークエンスの結果から、前記リアルタイムＰＣＲの結果が正しいものであることが確認された。そのため、前記製造例１で設計した各プローブと、前記製造例２で設計したプライマーとを用い、サイクリングプローブ法によるリアルタイムＰＣＲを行うことにより、検体中におけるＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の有無を、低コストで、簡便かつ迅速に、定量的に測定することができることが示された。【００９２】
（試験例２）
＜リアルタイムＰＣＲ＞
遺伝子として、前記調製例１で調製した人工合成遺伝子−３（変異型：Ｙ９３Ｈ）を用いた以外は、前記試験例１のリアルタイムＰＣＲと同様に、前記製造例１で設計した各プローブ、及び前記製造例２で設計したプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。結果を表５に示す。【００９３】
【表５】
2015087945.tif 000006
【００９４】
表５の結果から、前記製造例１で設計したプローブを用いると、Ｈｃａｃタイプの配列（ａａ（ｃ）ｇｃ（ａ）ｃａ（ｃ）；前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃａｃである配列）に加え、予想外にも、Ｈｃｇｃタイプの配列（ａａ（ｃ）ｇｃ（ｇ）ｃａ（ｃ）；前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃｇｃである配列）をも検出可能であることが示された。
したがって、前記製造例１で設計したプローブセットを用いると、ＨＣＶの変異やバリエーションによる影響を抑え、検体中における様々なＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の有無を、低コストで、簡便かつ迅速に、定量的に測定することができることが示された。【００９５】
（試験例３）
＜検体＞
検体として、ＨＣＶ（遺伝子型：１ｂ型）に感染している患者の血清（ＳＰＩ研究会から入手）を１４検体用意した。【００９６】
＜ウイルスＲＮＡの調製＞
前記各検体について、ＱＩＡａｍｐ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、ウイルスＲＮＡを抽出し、精製した。【００９７】
＜ｃＤＮＡ合成工程＞
前記ウイルスＲＮＡを鋳型とし、ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｍ−ＭＬＶ  Ｖｅｒｓｉｏｎ）（タカラバイオ株式会社製）を用いて、二本鎖のｃＤＮＡを合成した。【００９８】
＜リアルタイムＰＣＲ工程＞
鋳型を前記ｃＤＮＡ合成工程で得られた二本鎖のｃＤＮＡとした以外は、前記試験例１のリアルタイムＰＣＲと同様にして、前記製造例１で設計した各プローブ、及び前記製造例２で設計したプライマーセットを用い、リアルタイムＰＣＲを行った。結果を表６に示す。【００９９】
＜ダイレクトシークエンス＞
前記ｃＤＮＡ合成工程で得られた二本鎖のｃＤＮＡを用いた以外は、前記試験例１と同様にして、ダイレクトシークエンスを行った。結果を表６に示す。【０１００】
【表６】
2015087945.tif 000007
【０１０１】
表６の結果から、前記リアルタイムＰＣＲの結果と、前記ダイレクトシークエンスの結果とが一致しており、前記リアルタイムＰＣＲの結果が正しいものであることが確認された。
前記ダイレクトシークエンスによれば、変異の有無を定性的に確認することはできるものの、変異の程度を定量的に確認することができず、また、検体からウイルスＲＮＡを調製するところから、シークエンスの結果を得るまでに１２時間程度の時間を要した。一方、本発明のサイクリングプローブ法によるリアルタイムＰＣＲによれば、変異の有無のみならず、変異の量を定量的に確認することができ、また、検体からウイルスＲＮＡを調製するところから、リアルタイムＰＣＲの結果を得るまでの時間が５時間程度であり、非常に迅速に結果が得られた。【０１０２】
また、前記検体１から１４に関し、配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基の情報を下記表７に示す。【０１０３】
【表７】
2015087945.tif 000008
【０１０４】
表７の検体６、１１、及び１４、並びに１０の結果から、前記製造例１で設計したプローブを用いると、Ｙｃａｃタイプの配列（前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃａｃである配列）に加え、予想外にも、Ｙｃｇｃタイプの配列（前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃｇｃである配列）、及びＹｃｃｃタイプの配列（前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃｃｃである配列）をも検出可能であることが示された。
また、前記試験例２の結果と同様に、検体１２の結果から、前記製造例１で設計したプローブを用いると、Ｈｃａｃタイプの配列（前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃａｃである配列）に加え、予想外にも、Ｈｃｇｃタイプの配列（前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃｇｃである配列）をも検出可能であることが示された。
したがって、前記製造例１で設計したプローブセットを用いると、ＨＣＶの変異やバリエーションによる影響を抑え、検体中における様々なＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の有無を、低コストで、簡便かつ迅速に、定量的に測定することができることが示された。【０１０５】
（試験例４）
＜検体＞
検体として、ＨＣＶ（遺伝子型：１ａ型）に感染している患者の血清、ＨＣＶ（遺伝子型：２ａ型）に感染している患者の血清、及びＨＣＶ（遺伝子型：２ｂ型）に感染している患者の血清（いずれもＳＰＩ研究会から入手）を、それぞれ１検体用意した。【０１０６】
＜ウイルスＲＮＡの調製＞
前記各検体について、ＱＩＡａｍｐ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、ウイルスＲＮＡを抽出し、精製した。【０１０７】
＜ｃＤＮＡ合成工程＞
前記ウイルスＲＮＡを鋳型とし、ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｍ−ＭＬＶ  Ｖｅｒｓｉｏｎ）（タカラバイオ株式会社製）を用いて、二本鎖のｃＤＮＡを合成した。【０１０８】
＜リアルタイムＰＣＲ工程＞
鋳型を前記ｃＤＮＡ合成工程で得られた二本鎖のｃＤＮＡとした以外は、前記試験例１のリアルタイムＰＣＲと同様にして、前記製造例１で設計した各プローブ、及び前記製造例２で設計したプライマーセットを用い、リアルタイムＰＣＲを行った。結果を表８に示す。【０１０９】
＜ダイレクトシークエンス＞
前記ｃＤＮＡ合成工程で得られた二本鎖のｃＤＮＡを用いた以外は、前記試験例１と同様にして、ダイレクトシークエンスを行った。結果を表８に示す。【０１１０】
【表８】
2015087945.tif 000009
【０１１１】
表８の結果から、前記リアルタイムＰＣＲの結果と、前記ダイレクトシークエンスの結果とが一致しており、前記リアルタイムＰＣＲの結果が正しいものであることが確認された。【０１１２】
（比較製造例１：プローブ）
ＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異に寄与する２７７番目の塩基をプローブのＲＮＡ部分とした以外は、配列番号：２と同様とした下記プローブを設計した。
−プローブ−
・  Ｈｃａｃタイプ−２：
５’−ａａｃｇｃａ［ｃ］ａｃａ−３’（配列番号：１７）
配列番号：１７中、［  ］内のｃは、ＲＮＡであることを示し、下線部はＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記Ｈｃａｃタイプ−２は、ＮＳ５Ａの９３番目のアミノ酸がヒスチジンであり、前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃａｃである配列である。
前記Ｈｃａｃタイプ−２のプローブは、５’末端が蛍光物質（ＦＡＭ）で修飾されており、３’末端がクエンチャー物質（Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製））で修飾されている。【０１１３】
（試験例５）
以下の組合せとした以外は、前記試験例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行った。なお、リアルタイムＰＣＲに用いた人工合成遺伝子量（分子数）は、２．００×１０６とした。結果を表９に示す。
＜試験例５−１＞
・  人工合成遺伝子  ：  人工合成遺伝子−３（配列番号：１６、変異型であり、前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃｇｃである配列である。）
・  プローブ  ：  Ｈｃａｃタイプ−２（配列番号：１７、ＲＮＡは２７７番目の塩基、変異型であり、前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃａｃである配列である。）
・  プライマー  ：  製造例２のプライマーセット
＜試験例５−２＞
・  人工合成遺伝子  ：  人工合成遺伝子−３（配列番号：１６、変異型であり、前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃｇｃである配列である。）
・  プローブ  ：  Ｈｃａｃタイプ−１（配列番号：２、ＲＮＡは２７８番目の塩基、変異型であり、前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃａｃである配列である。）
・  プライマー  ：  製造例２のプライマーセット
＜試験例５−３＞
・  人工合成遺伝子  ：  人工合成遺伝子−２（配列番号：１５、変異型であり、前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃａｃである配列である。）
・  プローブ  ：  Ｈｃａｃタイプ−２（配列番号：１７、ＲＮＡは２７７番目の塩基、変異型であり、前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃａｃである配列である。）
・  プライマー  ：  製造例２のプライマーセット
＜試験例５−４＞
・  人工合成遺伝子  ：  人工合成遺伝子−２（配列番号：１５、変異型であり、前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃａｃである配列である。）
・  プローブ  ：  Ｈｃａｃタイプ−１（配列番号：２、ＲＮＡは２７８番目の塩基、変異型であり、前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃａｃである配列である。）
・  プライマー  ：  製造例２のプライマーセット【０１１４】
【表９】
2015087945.tif 000010
【０１１５】
表９の結果から、通常のサイクリングプローブ法に沿って設計した前記比較製造例１のプローブ（Ｈｃａｃタイプ−２）では、ＮＳ５Ａタンパク質をコードする２７６番目の塩基のバリエーションの影響を受けてしまったのに対し、前記製造例１で設計した本発明のプローブ（Ｈｃａｃタイプ−１）は、予想外にもＮＳ５Ａタンパク質をコードする２７６番目の塩基のバリエーションの影響を受けずに変異の有無を検出できることが確認された。【０１１６】
したがって、前記製造例１で設計したプローブセット、及び前記製造例２で設計したプライマーセットを用い、サイクリングプローブ法によるリアルタイムＰＣＲを行うことにより、様々な遺伝子型のＨＣＶにおいて、ＨＣＶの変異やバリエーションによる影響を抑え、検体中における様々なＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の有無を、低コストで、簡便かつ迅速に、定量的に測定することができることが示された。【０１１７】
（製造例３：プローブ）
Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出率をより向上させるために、以下のプローブセットを設計した。【０１１８】
−プローブセット−
・  野生株検出用プローブ：
（１）５’−ａａｃｇｃａｔ［ａ］ｃａ−３’（配列番号：１）
（２）５’−ａａｃｇｃｇｔ［ａ］ｃａ−３’（配列番号：９）
配列番号：１、及び９中、［  ］内のａは、ＲＮＡであることを示し、下線部はＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。
前記配列番号：１、及び９で表される野生型検出用プローブは、５’末端が蛍光物質（ＦＡＭ）で修飾されており、３’末端がクエンチャー物質（Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製））で修飾されている。
前記野生株検出用プローブにおける、配列番号：１で表されるプローブと、配列番号：９で表されるプローブとの分子数の比は、１：１である。【０１１９】
・  変異株検出用プローブ：
５’−ａｃｇｃａｃ［ａ］ｃａ−３’（配列番号：１８）
５’−ａｃｇｃｇｃ［ａ］ｃａ−３’（配列番号：２２）
配列番号：１８、及び２２中、［  ］内のａは、ＲＮＡであることを示し、下線部はＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。
前記配列番号：１８、及び２２で表される変異株検出用プローブは、５’末端が蛍光物質（ＲＯＸ）で修飾されており、３’末端がクエンチャー物質（Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製））で修飾されている。
前記変異株検出用プローブにおける、配列番号：１８で表されるプローブと、配列番号：２２で表されるプローブとの分子数の比は、１：１である。【０１２０】
（試験例６）
＜人工合成遺伝子サンプルの調製＞
前記調製例１で調製した人工合成遺伝子−４（野生型：Ｙ９３）と、人工合成遺伝子−３（変異型：Ｙ９３Ｈ）とを表１０のように混合し、人工合成遺伝子サンプルを調製した。【０１２１】
【表１０】
2015087945.tif 000011
【０１２２】
＜リアルタイムＰＣＲ＞
前記サンプルＡ−２からＨ−２のそれぞれについて、プローブを前記製造例３で設計した各プローブとし、プライマーセットを前記製造例２で設計したプライマーセットとし、Ｃｙｃｌｅａｖｅ（登録商標）ＰＣＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（タカラバイオ株式会社製）を用いて、以下の反応液の組成（表１１参照）、及び反応条件で、リアルタイムＰＣＲ（反応装置：ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０）を行った。
なお、前記リアルタイムＰＣＲでは、野生株検出用プローブ（サイクリングプローブＹ）と、変異株検出用プローブ（サイクリングプローブＨ）とを同じウェルに入れ、反応を行った。
−反応条件−
−−ホールド（初期変性）−−
サイクル数：１
条件：９５℃、３０秒間
−−３ステップＰＣＲ−−
サイクル数：４５
条件：９５℃、５秒間、次いで、５５℃、１０秒間、その後、７２℃、２５秒間【０１２３】
【表１１】
2015087945.tif 000012
【０１２４】
前記リアルタイムＰＣＲの結果から、ＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異を定量し、変異率を算出した結果を表１２に示す。【０１２５】
【表１２】
2015087945.tif 000013
【０１２６】
前記リアルタイムＰＣＲの結果から、前記製造例１で設計したプローブセットを用いた場合と比較して、前記製造例３で設計したプローブセットを用いることにより、検体中におけるＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の有無をより高い精度で検出できることが示された。【０１２７】
（試験例７）
遺伝子として、前記調製例１で調製した人工合成遺伝子−２（変異型：Ｙ９３Ｈ）を用いた以外は、前記試験例６のリアルタイムＰＣＲと同様に、前記製造例３で設計した各プローブ、及び前記製造例２で設計したプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。結果を表１３に示す。【０１２８】
【表１３】
2015087945.tif 000014
【０１２９】
表１３の結果から、前記製造例３で設計したプローブセットを用いると、Ｈｃｇｃタイプの配列（ａａ（ｃ）ｇｃ（ｇ）ｃａ（ｃ）；前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃｇｃである配列）に加え、Ｈｃａｃタイプの配列（ａａ（ｃ）ｇｃ（ａ）ｃａ（ｃ）；前記配列番号：１３で表される塩基配列において（  ）を付した位置の塩基が５’側から順にｃａｃである配列）をも高い精度で検出可能であることが示された。
したがって、前記製造例３で設計したプローブセットを用いると、ＨＣＶの変異やバリエーションによる影響を抑え、検体中における様々なＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の有無を、より高い精度で測定することができることが示された。【０１３０】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞  検体中のＣ型肝炎ウイルスのＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成するｃＤＮＡ合成工程と、
前記ｃＤＮＡを鋳型とし、サイクリングプローブ法を用いてリアルタイムＰＣＲを行うリアルタイムＰＣＲ工程とを含み、
前記リアルタイムＰＣＲに用いるプライマーセットが、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする塩基配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットであり、
前記リアルタイムＰＣＲに用いるプローブが、
下記配列番号：１で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号：２で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：１８で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含むことを特徴とするＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出方法である。
ａａｃｇｃａｔ［ａ］ｃａ（配列番号：１）
ａａｃｇｃａｃ［ａ］ｃａ（配列番号：２）
ａｃｇｃａｃ［ａ］ｃａ（配列番号：１８）
配列番号：１、２、及び１８中、［  ］内の塩基は、ＲＮＡであることを示す。
＜２＞  リアルタイムＰＣＲに用いるプローブが、
下記配列番号：９で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号：１０で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：２２で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含む前記＜１＞に記載のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出方法である。
ａａｃｇｃｇｔ［ａ］ｃａ（配列番号：９）
ａａｃｇｃｇｃ［ａ］ｃａ（配列番号：１０）
ａｃｇｃｇｃ［ａ］ｃａ（配列番号：２２）
配列番号：９、１０、及び２２中、［  ］内の塩基は、ＲＮＡであることを示す。
＜３＞  リアルタイムＰＣＲに用いるプローブが、
下記配列番号：３で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：１９で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含む前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出方法である。
ａａｃｇｃａｔ［ａ］ｔａ（配列番号：３）
ａａｃｇｃａｃ［ａ］ｔａ（配列番号：４）
ａｃｇｃａｃ［ａ］ｔａ（配列番号：１９）
配列番号：３、４、及び１９中、［  ］内の塩基は、ＲＮＡであることを示す。
＜４＞  リアルタイムＰＣＲに用いるプローブが、
（１）下記配列番号：５で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、下記配列番号：６で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：２０で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとからなる組合せ、及び
（２）下記配列番号：７で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、下記配列番号：８で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：２１で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとからなる組合せの少なくともいずれかを含む前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出方法である。
ａａｔｇｃａｔ［ａ］ｃａ（配列番号：５）
ａａｔｇｃａｃ［ａ］ｃａ（配列番号：６）
ａｔｇｃａｃ［ａ］ｃａ（配列番号：２０）
ａａｔｇｃａｔ［ａ］ｔａ（配列番号：７）
ａａｔｇｃａｃ［ａ］ｔａ（配列番号：８）
ａｔｇｃａｃ［ａ］ｔａ（配列番号：２１）
配列番号：５、６、７、８、２０、及び２１中、［  ］内の塩基は、ＲＮＡであることを示す。
＜５＞  リアルタイムＰＣＲに用いるプライマーセットが、
（１）下記配列番号：１１で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：１２で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、及び
（２）下記配列番号：１１で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：１２で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットのいずれかである前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出方法である。
ｇｇｔｔｃｃａｔｇａｇｇａｔｃｇｔｔｇ（配列番号：１１）
ｃｃｇｔｃａｃｇｔａｇｔｇｇａａａｔｃ（配列番号：１２）
＜６＞  Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子型が、１ａ型、１ｂ型、２ａ型、及び２ｂ型のいずれかである前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出方法である。
＜７＞  下記配列番号：１で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号：２で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：１８で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含むことを特徴とするＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出用キットである。
ａａｃｇｃａｔ［ａ］ｃａ（配列番号：１）
ａａｃｇｃａｃ［ａ］ｃａ（配列番号：２）
ａｃｇｃａｃ［ａ］ｃａ（配列番号：１８）
配列番号：１、２、及び１８中、［  ］内の塩基は、ＲＮＡであることを示す。
＜８＞  下記配列番号：９で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号：１０で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：２２で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含む前記＜７＞に記載のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出用キットである。
ａａｃｇｃｇｔ［ａ］ｃａ（配列番号：９）
ａａｃｇｃｇｃ［ａ］ｃａ（配列番号：１０）
ａｃｇｃｇｃ［ａ］ｃａ（配列番号：２２）
配列番号：９、１０、及び２２中、［  ］内の塩基は、ＲＮＡであることを示す。
＜９＞  下記配列番号：３で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：１９で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含む前記＜７＞から＜８＞のいずれかに記載のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出用キットである。
ａａｃｇｃａｔ［ａ］ｔａ（配列番号：３）
ａａｃｇｃａｃ［ａ］ｔａ（配列番号：４）
ａｃｇｃａｃ［ａ］ｔａ（配列番号：１９）
配列番号：３、４、及び１９中、［  ］内の塩基は、ＲＮＡであることを示す。
＜１０＞  （１）下記配列番号：５で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、下記配列番号：６で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：２０で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとからなる組合せ、及び
（２）下記配列番号：７で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、下記配列番号：８で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：２１で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとからなる組合せの少なくともいずれかを含む前記＜７＞から＜９＞のいずれかに記載のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出用キットである。
ａａｔｇｃａｔ［ａ］ｃａ（配列番号：５）
ａａｔｇｃａｃ［ａ］ｃａ（配列番号：６）
ａｔｇｃａｃ［ａ］ｃａ（配列番号：２０）
ａａｔｇｃａｔ［ａ］ｔａ（配列番号：７）
ａａｔｇｃａｃ［ａ］ｔａ（配列番号：８）
ａｔｇｃａｃ［ａ］ｔａ（配列番号：２１）
配列番号：５、６、７、８、２０、及び２１中、［  ］内の塩基は、ＲＮＡであることを示す。
＜１１＞  （１）下記配列番号：１１で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：１２で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、及び
（２）下記配列番号：１１で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：１２で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットの少なくともいずれかを含む前記＜７＞から＜１０＞のいずれかに記載のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出用キットである。
ｇｇｔｔｃｃａｔｇａｇｇａｔｃｇｔｔｇ（配列番号：１１）
ｃｃｇｔｃａｃｇｔａｇｔｇｇａａａｔｃ（配列番号：１２）
＜１２＞  Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子型が、１ａ型、１ｂ型、２ａ型、及び２ｂ型のいずれかである前記＜７＞から＜１１＞のいずれかに記載のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出用キットである。
【産業上の利用可能性】
【０１３１】
本発明のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出方法によれば、ＨＣＶの変異やバリエーションによる影響を抑え、検体中における様々なＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の有無を、低コストで、簡便かつ迅速に、定量的に測定することができるので、前記検出方法は、前記ＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異を指標とする薬剤の薬効予測などに好適に利用可能である。
本発明のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出用キットは、本発明のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出方法などに好適に利用可能である。
【図１】
2015087945.tif 000015
【配列表】
2015087945000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年6月8日(2015.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中のＣ型肝炎ウイルスのＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成するｃＤＮＡ合成工程と、
前記ｃＤＮＡを鋳型とし、サイクリングプローブ法を用いてリアルタイムＰＣＲを行うリアルタイムＰＣＲ工程とを含み、
前記リアルタイムＰＣＲに用いるプライマーセットが、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸をコードする塩基配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットであり、
前記リアルタイムＰＣＲに用いるプローブは、前記ＮＳ５Ａタンパク質をコードする塩基配列の２７８番目の塩基に対応する塩基がＲＮＡであり、他の塩基がＤＮＡであり、
前記リアルタイムＰＣＲに用いるプローブが、
下記配列番号：１で表される塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号：２で表される塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：１８で表される塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含むことを特徴とするＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出方法。
ａａｃｇｃａｔ［ａ］ｃａ（配列番号：１）
ａａｃｇｃａｃ［ａ］ｃａ（配列番号：２）
ａｃｇｃａｃ［ａ］ｃａ（配列番号：１８）
配列番号：１、２、及び１８中、［  ］内の塩基は、ＲＮＡであることを示し、他の塩基は、ＤＮＡであることを示す。
【請求項２】
リアルタイムＰＣＲに用いるプローブが、
下記配列番号：９で表される塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号：１０で表される塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：２２で表される塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含む請求項１に記載のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出方法。
ａａｃｇｃｇｔ［ａ］ｃａ（配列番号：９）
ａａｃｇｃｇｃ［ａ］ｃａ（配列番号：１０）
ａｃｇｃｇｃ［ａ］ｃａ（配列番号：２２）
配列番号：９、１０、及び２２中、［  ］内の塩基は、ＲＮＡであることを示し、他の塩基は、ＤＮＡであることを示す。
【請求項３】
リアルタイムＰＣＲに用いるプローブが、
下記配列番号：３で表される塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：１９で表される塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含む請求項１から２のいずれかに記載のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出方法。
ａａｃｇｃａｔ［ａ］ｔａ（配列番号：３）
ａａｃｇｃａｃ［ａ］ｔａ（配列番号：４）
ａｃｇｃａｃ［ａ］ｔａ（配列番号：１９）
配列番号：３、４、及び１９中、［  ］内の塩基は、ＲＮＡであることを示し、他の塩基は、ＤＮＡであることを示す。
【請求項４】
リアルタイムＰＣＲに用いるプローブが、
（１）下記配列番号：５で表される塩基配列からなるプローブと、下記配列番号：６で表される塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：２０で表される塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとからなる組合せ、及び
（２）下記配列番号：７で表される塩基配列からなるプローブと、下記配列番号：８で表される塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：２１で表される塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとからなる組合せの少なくともいずれかを含む請求項１から３のいずれかに記載のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出方法。
ａａｔｇｃａｔ［ａ］ｃａ（配列番号：５）
ａａｔｇｃａｃ［ａ］ｃａ（配列番号：６）
ａｔｇｃａｃ［ａ］ｃａ（配列番号：２０）
ａａｔｇｃａｔ［ａ］ｔａ（配列番号：７）
ａａｔｇｃａｃ［ａ］ｔａ（配列番号：８）
ａｔｇｃａｃ［ａ］ｔａ（配列番号：２１）
配列番号：５、６、７、８、２０、及び２１中、［  ］内の塩基は、ＲＮＡであることを示し、他の塩基は、ＤＮＡであることを示す。
【請求項５】
リアルタイムＰＣＲに用いるプライマーセットが、下記配列番号：１１で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：１２で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットである請求項１から４のいずれかに記載のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出方法。
ｇｇｔｔｃｃａｔｇａｇｇａｔｃｇｔｔｇ（配列番号：１１）
ｃｃｇｔｃａｃｇｔａｇｔｇｇａａａｔｃ（配列番号：１２）
【請求項６】
サイクリングプローブ法に用いるプローブを含み、
前記プローブは、前記ＮＳ５Ａタンパク質をコードする塩基配列の２７８番目の塩基に対応する塩基がＲＮＡであり、他の塩基がＤＮＡであり、
前記プローブが、
下記配列番号：１で表される塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号：２で表される塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：１８で表される塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含むことを特徴とするＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出用キット。
ａａｃｇｃａｔ［ａ］ｃａ（配列番号：１）
ａａｃｇｃａｃ［ａ］ｃａ（配列番号：２）
ａｃｇｃａｃ［ａ］ｃａ（配列番号：１８）
配列番号：１、２、及び１８中、［  ］内の塩基は、ＲＮＡであることを示し、他の塩基は、ＤＮＡであることを示す。
【請求項７】
下記配列番号：９で表される塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号：１０で表される塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：２２で表される塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含む請求項６に記載のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出用キット。
ａａｃｇｃｇｔ［ａ］ｃａ（配列番号：９）
ａａｃｇｃｇｃ［ａ］ｃａ（配列番号：１０）
ａｃｇｃｇｃ［ａ］ｃａ（配列番号：２２）
配列番号：９、１０、及び２２中、［  ］内の塩基は、ＲＮＡであることを示し、他の塩基は、ＤＮＡであることを示す。
【請求項８】
下記配列番号：３で表される塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：１９で表される塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含む請求項６から７のいずれかに記載のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出用キット。
ａａｃｇｃａｔ［ａ］ｔａ（配列番号：３）
ａａｃｇｃａｃ［ａ］ｔａ（配列番号：４）
ａｃｇｃａｃ［ａ］ｔａ（配列番号：１９）
配列番号：３、４、及び１９中、［  ］内の塩基は、ＲＮＡであることを示し、他の塩基は、ＤＮＡであることを示す。
【請求項９】
（１）下記配列番号：５で表される塩基配列からなるプローブと、下記配列番号：６で表される塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：２０で表される塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとからなる組合せ、及び
（２）下記配列番号：７で表される塩基配列からなるプローブと、下記配列番号：８で表される塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号：２１で表される塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとからなる組合せの少なくともいずれかを含む請求項６から８のいずれかに記載のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出用キット。
ａａｔｇｃａｔ［ａ］ｃａ（配列番号：５）
ａａｔｇｃａｃ［ａ］ｃａ（配列番号：６）
ａｔｇｃａｃ［ａ］ｃａ（配列番号：２０）
ａａｔｇｃａｔ［ａ］ｔａ（配列番号：７）
ａａｔｇｃａｃ［ａ］ｔａ（配列番号：８）
ａｔｇｃａｃ［ａ］ｔａ（配列番号：２１）
配列番号：５、６、７、８、２０、及び２１中、［  ］内の塩基は、ＲＮＡであることを示し、他の塩基は、ＤＮＡであることを示す。
【請求項１０】
下記配列番号：１１で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：１２で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットを含む請求項６から９のいずれかに記載のＣ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質の９３番目のアミノ酸の変異の検出用キット。
ｇｇｔｔｃｃａｔｇａｇｇａｔｃｇｔｔｇ（配列番号：１１）
ｃｃｇｔｃａｃｇｔａｇｔｇｇａａａｔｃ（配列番号：１２）
【国際調査報告】
2015087945.tif 000016
2015087945.tif 000017
2015087945.tif 000018
2015087945.tif 000019