(57)【要約】  多数の細胞中の多数の遺伝子について遺伝子発現を行うためには細胞を分離してから遺伝子を抽出し、核酸増幅し配列解析によって遺伝子発現解析を行う必要があった。しかし、細胞の分離は細胞へのダメージを与え、高価なシステム用いる必要があった。  細胞トラッピング部と核酸トラッピング部の一対の構造を上下方向配置して細胞の個々の遺伝子を抽出し、核酸トラッピング部でcDNAを合成し、核酸を増幅し、次世代シーケンサで配列解析することによって高精度に個々の細胞中の遺伝子発現解析を行う。
2014141386.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれ１つの細胞を固定するための細胞トラッピング部と、
前記細胞から核酸を抽出するための核酸抽出液が前記細胞トラッピング部を通過して上から下へ流れる流路と、
前記流路を介して前記細胞トラッピング部と繋がり前記細胞トラッピング部より下方に配置され、抽出された核酸を固定する核酸トラッピング部と、
核酸抽出後の溶液を前記核酸トラッピング部から前記細胞トラッピング部とは反対側に排出する流路とを備え、
前記細胞トラッピング部と、前記２つの流路と、前記核酸トラッピング部が上下方向に対を形成し、この対が、平面方向に複数配置されている、ことを特徴とする核酸抽出デバイス。
【請求項２】
前記核酸トラッピング部が、核酸トラップのためのDNAが固定されたビーズを含むことを特徴とする請求項１記載の核酸抽出デバイス。
【請求項３】
前記核酸トラッピング部が、細孔に核酸トラップのためのDNAが固定された多孔質メンブレンを含むことを特徴とする請求項１記載の核酸抽出デバイス。
【請求項４】
前記細胞トラッピング部に、細胞表面の物質に化学的に結合する物質が固定されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸抽出デバイス。
【請求項５】
前記核酸トラップのためのDNAの一部がチップ上の位置を特定するための配列を含むことを特徴とする請求項２または３記載の核酸抽出デバイス。
【請求項６】
前記核酸トラップのためのDNAの一部がトラップした核酸分子ごとに異なる配列を含むことを特徴とする請求項２または３記載の核酸抽出デバイス。
【請求項７】
前記核酸トラッピング部にトラップしたRNAを逆転写するための酵素を導入する手段を有することを特徴とする請求項６記載の核酸抽出デバイス。
【請求項８】
前記細胞トラッピング部の直下が光学的に透明な材料で構成されていることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項記載の核酸抽出デバイス。
【請求項９】
前記細胞トラッピング部の直下に核酸トラッピング部を設けたことを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項記載の核酸抽出デバイス。
【請求項１０】
前記細胞トラッピング部の直下以外の領域に核酸トラッピング部を設けたことを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項記載の核酸抽出デバイス。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項記載の核酸抽出デバイスと、cDNAライブラリを構築するための試薬を導入する手段とを有することを特徴とする核酸処理装置。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項記載の核酸抽出デバイスと、cDNAライブラリを構築するための試薬と核酸増幅のための試薬を導入する手段とを有することを特徴とする核酸処理装置。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか１項記載の核酸抽出デバイスと、細胞トラッピング部にトラップした細胞を微分干渉顕微鏡、位相差顕微鏡、ラマン顕微鏡またはコヒーレントラマン顕微鏡で観察するための顕微鏡部とを有することを特徴とする核酸処理装置。
【請求項１４】
細胞トラッピング部と、前記細胞トラッピング部より下方に配置される核酸トラッピング部とを備えた核酸抽出デバイスにより、細胞から核酸を抽出する方法であって、
前記細胞トラッピング部に細胞を接触させて、それぞれ１つの細胞を前記細胞トラッピング部にトラップする工程と、
細胞から核酸を抽出するための核酸抽出液を、前記細胞トラッピング部を通過して上から下へ通じる流路を通して流す工程と、
前記核酸トラッピング部に抽出された核酸を固定する工程と、
核酸抽出後の溶液を、前記核酸トラッピング部から前記細胞トラッピング部とは反対側に流路を介して排出する工程とを含み、
前記核酸抽出デバイスにおいて、前記細胞トラッピング部と、前記２つの流路と、前記核酸トラッピング部が上下方向に対を形成し、この対が、平面方向に複数配置されていることを特徴とする前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子発現解析、細胞機能解析、生体組織の解析方法および病気の診断、創薬などに関するものである。詳しくは1細胞レベルでのmRNA解析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現解析では細胞群の中からmRNAを取り出し、相補鎖であるcDNAを作製してこれをPCRなどでコピー数を増幅し、DNAプローブアレー（DNAチップ）を用いてターゲットを対応するプローブ位置に捕獲して蛍光検出する方法が用いられている。しかし、PCR増幅やDNAチップを用いる方法は定量分析精度が低く、精度の高い遺伝子発現プロフィール分析方法が望まれていた。ヒトゲノム解析の終了に伴い遺伝子発現を定量的に調べる要求は強まりつつあるが、最近では1つの細胞からmRNAを抽出して定量分析を行う方法が望まれている。定量性の良い分析方法として定量PCRがあるが、これはターゲットと同じDNA配列を持つ標準試料を用意し、同じ条件下でPCR増幅して増幅の進行具合を蛍光プローブでモニターして比較することで定量分析を行う方法である。ターゲットが1細胞の場合にはもともとあったmRNAの数が少なく定量分析しにくい。また、複数の遺伝子発現の定量分析を行うには試料を分割してそれぞれ独立に定量分析を行うため、対象となる遺伝子の数が多く、発現量が少ない遺伝子が含まれる場合には試料分割により測定できない場合もある。【０００３】
このような状況下で発明者らは全てのmRNAをcDNAに変え、ビーズ上に保持したcDNAライブラリ（全てのcDNAを含んだcDNA集合体）を作製して定量分析に利用する方法を考案した。そこではcDNAライブラリを繰り返し利用することで試料分割による微量発現遺伝子の計測ミスを取り除き、1細胞中に含まれる複数遺伝子の発現量を正確に計測できることを示した（非特許文献１）。【０００４】
上記方法は、手作業によるサンプルを含む溶液への反応試薬の混合、精製等のプロセスをすべて手作業で行っている。そのため、分注精度と溶媒の蒸発の問題から反応溶液のボリュームは数百ナノリットル〜マイクロリットルオーダー以上に制限される。それゆえ、単一の細胞を解析する場合においても、適切な濃度の試薬を使わなければならないため、反応試薬量（モル数）が反応ボリュームに比例して増加し、それに比例して試薬コストが増加する。多数の細胞を計測しなければ統計的に有意なデータが得られない場合、その試薬コストは非常に大きな額となる。それゆえ、分注精度と蒸発の問題がない構造で反応ボリュームを低減する方法が求められている。【０００５】
この問題を解決するために従来は、マイクロフルイディクスと呼ばれる小さな流路を組み合わせたデバイスを用いる方法が採用されてきた。単一細胞解析のためにマイクロフルイディクスを応用した例は非特許文献２に記載されている。非特許文献２中の図1にデバイスの構造図が記載されている。ここに記載されているチップは300個の細胞を同時に処理できるように一つの単位構造が300個配置されている。この単位構造がチップ上に3×50個配置されており、単位構造は横長で、この長手方向にサンプル溶液が流れ、流れながら、逐次反応をする構造となっている。反応ボリュームについては、逆転写反応時は10nLでPCR反応時は50nLであり、ボリュームが低減されている。【０００６】
さらに、たくさんの細胞を同時に処理するためには、多数の細胞を一度に低コストで遺伝子発現解析する必要がある。これを実現するために、ビーズの代わりに多孔質メンブレンなどを利用してcDNAライブラリを構成する方法が特許文献１に開示されている。この方法では、遺伝子発現の２次元分布を得て多数の細胞中の遺伝子発現解析を実現できるデバイスを用いている。このデバイスを用いて単一細胞中の遺伝子を発現解析するときには、細胞を単離する必要がなく、生体組織の切片中の細胞から、直接mRNAを取り出し、遺伝子発現解析することもできる。しかし、解析可能な遺伝子の数を増やすために繰り返し、計測遺伝子数に比例して蛍光計測や化学発光計測を行う必要があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2009-276883号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ネーチャー  メソッド  ６巻  ７号  ２００９年  p. 503-506 (Nature Method vol. 6, no. 7, 2009, p.503-506)
【非特許文献２】プロシーディング  オブ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス  １０８巻、３４号  ２０１１年 p. 13999-14004 （Proceeding of the National Academy of Sciences vol. 108, no. 34, 2011 p. 13999-14004）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
再生医療、遺伝子を用いた診断、あるいは生命現象の基本的な理解には組織の平均としての遺伝子の発現量ばかりでなく、組織を構成する１つ１つの細胞の中味を定量的に分析することが重要視され始めている。これには細胞を１つずつ取り出して詳細に解析することとあわせて、統計的に有意なデータを取得するために多数の細胞について、細胞中の生体物質を定量することが望まれる。特に、種々遺伝子の発現量を定量的にモニターすることが望まれている。このとき、定量対象となる生体物質は細胞中のmRNAとなる。ここでは簡単のため、遺伝子とmRNAは１対１に対応しているものと考え、遺伝子発現定量することとmRNAを定量することは同じ意味であるとする。一般には、「遺伝子発現を測定する」という方が広い意味である。この場合には一つの遺伝子座から読みだされたmRNAのバリエーション（バリアント）が複数存在することや、mRNAの成熟過程や蛋白へ翻訳される過程で様々な制御を受けることも考慮された測定となり、測定対象物質が必要に応じて増えることとなるが、ここでは議論を簡略化するために成熟したmRNAを定量することを指すことにする。【００１０】
１細胞中に発現している遺伝子に対応するmRNAは、数分子数程度から数万分子まで分布している可能性がある。分子数の少ない遺伝子に対応するmRNAを精度良く定量するために、効率よく、定量可能な形に変換する必要がある。そのために、非特許文献１に記載のビーズ上表面に１細胞由来のcDNAライブラリを効率よく（80%以上）構築し、これを繰り返し計測することによって、精度良く複数遺伝子の遺伝子発現を定量することは可能となったが、この繰り返し回数は10〜20回程度に制限されてしまうため、計測可能遺伝子数も10〜20に制限されるという問題があった。同時に計測可能な細胞数は100細胞程度以下であり、必要な試薬の費用も非常に高価である。そのため、多数の細胞について、多数であるが、計測が必要な遺伝子数だけを計測するようにできることは、産業上重要な技術であると考えられる。【００１１】
また、単一細胞中の遺伝子発現解析を実行するためには、一度細胞を単離して、個別の反応ウェルに導入し、細胞破砕や逆転写さらにはPCR増幅のための試薬をこれらの反応ウェルに分注しなければならない。そのため、解析の自動化を行うためには、分注のためのロボットが必要となり、解析装置が大型化し高価になってしまう。【００１２】
さらに、ロボットによる分注を排除するために、マイクロフルイディクスを用いて細胞からmRNAを抽出し、核酸増幅する場合においては、反応液流路を列状に配列しなければならないため、並列数に比例してチップサイズが大きくなるため、マイクロフルィディックデバイスのサイズが大型化して、高価になってしまうという問題点があった。【００１３】
実際には、非特許文献２の図1の左下にあるように、解析対象である細胞を一番左の反応槽に導入し、細胞を破砕する。その次に、右側の反応槽にサンプル溶液を移動させ、逆転写反応を実行し、さらに右に移動してPCR反応を行うというように一方方向に平面内でサンプルを移動させながら、サンプル処理を実行する。最後に、一番右から処理済みのサンプルを回収する。マイクロフルイディクスを用いる場合には溶液は基板面内を移動する必要があるため、単位構造のフットプリントが大きくなってしまう。また、単位構造へのサンプルや試薬を導入する流路系の配置や処理後のサンプルの排出に必要な流路系の配置のためにチップ面積を消費するため単位構造の配列数を増やそうとするとチップ面積が増大しチップのコストが上がってしまうという問題があった。【００１４】
この非特許文献２では、細胞中のmRNAのうちのどの程度の割合がサンプルとして処理され、計測・定量できるようにされているかについては不明であるが、単一細胞解析中のmRNAなどの生化学物質を定量するためには、効率よく、ターゲット分子（特にmRNA）を計測できるようにすることは本質的な課題である。例えば、一細胞中に10分子程度以下しか存在しないmRNAも計測しなければならないが、計測できるように処理されたサンプルの分子数が少なくなると本質的な計測誤差（ポアソン分布に従うサンプリング誤差）が生じてしまう。【００１５】
また、多数の細胞を一度に低コストで遺伝子発現解析を実現するために、cDNAライブラリシートを用いる方法が特許文献１に開示されている。多数の細胞の一括計測が可能であるが、解析可能な遺伝子の数を増やすために繰り返し、cDNAライブラリを用いて蛍光計測する必要があった。そのため、解析遺伝子数に制限があった。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記課題、すなわち、一度に計測できる細胞数を増やすとともに細胞中の分子（ここではmRNA）を効率よくサンプル処理し、安価であるような計測デバイスまたは装置を提供するために、本発明では、以下のようなデバイスおよび装置構成をとる。【００１７】
細胞を所定の位置に固定し、定量対象分子であるmRNAを核酸から抽出し、逆転写してcDNAライブラリを構築するなどのサンプル処理を細胞ごとに実行できる単位構造を２次元平面状に配置する。細胞由来のサンプルが流れる方向は、平面状のデバイス面に垂直に対して、単位構造をチップ面状に配置することによって、単位構造がチップ上で締める面積の低減を図る。また、サンプル溶液の回収は平面上に配置された単位構造で処理済のサンプルを混合して回収しても、どの位置の単位構造で処理されたかがサンプルを解析することで判明するようなタグ配列（タグ分子）をサンプル処理の過程で導入する。これによって、単位構造ごとに個別にサンプル回収のための機構が不要となる。【００１８】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。【００１９】
(1)それぞれ１つの細胞を固定するための細胞トラッピング部と、
前記細胞から核酸を抽出するための核酸抽出液が前記細胞トラッピング部を通過して上から下へ流れる流路と、
前記流路を介して前記細胞トラッピング部と繋がり前記細胞トラッピング部より下方に配置され、抽出された核酸を固定する核酸トラッピング部と、
核酸抽出後の溶液を前記核酸トラッピング部から前記細胞トラッピング部とは反対側に排出する流路とを備え、
前記細胞トラッピング部と、前記２つの流路と、前記核酸トラッピング部が上下方向に対を形成し、この対が、平面方向に複数配置されている、ことを特徴とする核酸抽出デバイス。【００２０】
(2)前記核酸トラッピング部が、核酸トラップのためのDNAが固定されたビーズを含むことを特徴とする(1)記載の核酸抽出デバイス。【００２１】
(3)前記核酸トラッピング部が、細孔に核酸トラップのためのDNAが固定された多孔質メンブレンを含むことを特徴とする(1)記載の核酸抽出デバイス。【００２２】
(4)前記細胞トラッピング部に、細胞表面の物質に化学的に結合する物質が固定されていることを特徴とする(1)〜(3)のいずれかに記載の核酸抽出デバイス。【００２３】
(5)前記核酸トラップのためのDNAの一部がチップ上の位置を特定するための配列を含むことを特徴とする(2)または(3)記載の核酸抽出デバイス。【００２４】
(6)前記核酸トラップのためのDNAの一部がトラップした核酸分子ごとに異なる配列を含むことを特徴とする(2)または(3)記載の核酸抽出デバイス。【００２５】
(7)前記核酸トラッピング部にトラップしたRNAを逆転写するための酵素を導入する手段を有することを特徴とする(6)記載の核酸抽出デバイス。【００２６】
(8)前記細胞トラッピング部の直下が光学的に透明な材料で構成されていることを特徴とする(1)〜(7)のいずれかに記載の核酸抽出デバイス。【００２７】
(9)前記細胞トラッピング部の直下に核酸トラッピング部を設けたことを特徴とする(1)〜(8)のいずれかに記載の核酸抽出デバイス。【００２８】
(10)前記細胞トラッピング部の直下以外の領域に核酸トラッピング部を設けたことを特徴とする(1)〜(8)のいずれかに記載の核酸抽出デバイス。【００２９】
(11)(1)〜(10)のいずれかに記載の核酸抽出デバイスと、cDNAライブラリを構築するための試薬を導入する手段とを有することを特徴とする核酸処理装置。【００３０】
(12)(1)〜(10)のいずれかに記載の核酸抽出デバイスと、cDNAライブラリを構築するための試薬と核酸増幅のための試薬を導入する手段とを有することを特徴とする核酸処理装置。【００３１】
(13)(1)〜(10)のいずれかに記載の核酸抽出デバイスと、細胞トラッピング部にトラップした細胞を微分干渉顕微鏡、位相差顕微鏡、ラマン顕微鏡またはコヒーレントラマン顕微鏡で観察するための顕微鏡部とを有することを特徴とする核酸処理装置。【００３２】
(14)細胞トラッピング部と、前記細胞トラッピング部より下方に配置される核酸トラッピング部とを備えた核酸抽出デバイスにより、細胞から核酸を抽出する方法であって、
前記細胞トラッピング部に細胞を接触させて、それぞれ１つの細胞を前記細胞トラッピング部にトラップする工程と、
細胞から核酸を抽出するための核酸抽出液を、前記細胞トラッピング部を通過して上から下へ通じる流路を通して流す工程と、
前記核酸トラッピング部に抽出された核酸を固定する工程と、
核酸抽出後の溶液を、前記核酸トラッピング部から前記細胞トラッピング部とは反対側に流路を介して排出する工程とを含み、
前記核酸抽出デバイスにおいて、前記細胞トラッピング部と、前記２つの流路と、前記核酸トラッピング部が上下方向に対を形成し、この対が、平面方向に複数配置されていることを特徴とする前記方法。
【発明の効果】
【００３３】
単一細胞中の核酸などの生体分子を定量したり、配列決定したり、生体分子の種類を同定するデバイスにおいて、一度に計測できる細胞数を増やすとともに、細胞中の分子（例えばmRNA）を効率よくサンプル処理でき安価な計測デバイスまたは装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明の核酸抽出デバイスの一実施形態を示す概略図である。
【図２】本発明の核酸抽出デバイスの一実施形態を示す概略図である。
【図３】本発明の核酸抽出デバイスの一実施形態を示す概略図である。
【図４】本発明の核酸抽出デバイスの使用方法の一実施形態を示す概略図である。
【図５】本発明の核酸抽出デバイスの一実施形態を示す概略図である。
【図６】本発明の核酸抽出デバイスで用いる核酸の一実施形態を示す概略図である。
【図７】本発明の核酸抽出デバイスの一実施形態を示す概略図である。
【図８】本発明の核酸抽出デバイスの使用方法の一実施形態を示す概略図である。
【図９】本発明の核酸抽出デバイスの使用方法の一実施形態を示す概略図である。
【図１０】本発明の核酸抽出デバイスの一実施形態を示す概略図である。
【図１１】本発明の核酸抽出デバイスの一実施形態を示す概略図である。
【図１２】本発明の核酸抽出デバイスの一実施形態を示す概略図である。
【図１３】本発明の核酸処理装置の一実施形態を示す概略図である。
【図１４】本発明の核酸処理装置の一実施形態を示す概略図である。
【図１５】本発明の核酸処理装置の一実施形態を示す概略図である。
【図１６】本発明の核酸抽出デバイスの一実施形態を示す概略図である。
【図１７】本発明の核酸抽出デバイスの一実施形態を示す概略図である。
【図１８】本発明の核酸抽出デバイスの一実施形態を示す概略図である。
【図１９】本発明の核酸抽出デバイスの処理方法の一実施形態を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明の核酸抽出デバイスの具体的な構造は、例えば図1に例示できる。図1(a)は面状デバイスの面に垂直方向の断面図で、図1(b)は、面に並行で上の図の一点鎖線部分の位置での断面図である。デバイス中に導入された細胞1を1つずつ固定する細胞トラッピング部2（図1では、細胞トラッピング部は細胞を1つずつ固定する穴を有する）と、前記細胞から核酸を抽出するための核酸抽出液が前記細胞トラッピング部を通過して上から下へ流れる流路3と、前記流路を介して前記細胞トラッピング部と繋がり前記細胞トラッピング部より下方に配置され、抽出された核酸を固定する核酸トラッピング部4と、核酸抽出後の溶液を前記核酸トラッピング部から前記細胞トラッピング部とは反対側に排出する流路5とを備え、前記細胞トラッピング部と、前記２つの流路と、前記核酸トラッピング部が上下方向に対を形成し、この対が、平面方向に複数配置されている、ことを特徴とする核酸抽出デバイスが本発明の基本となる構造である。この構造は平面基板6上および内部に構成され、細胞を導入するための上部反応領域7と処理済の核酸を排出するための下部反応領域8も必要に応じて追加する。点線の矢印9は細胞の移動の軌跡の例であり、矢印10は細胞から抽出された核酸および処理されたサンプルの移動方向を示す。
【００３６】
非特許文献２に記載されているデバイスでは細胞トラップ部（cell capture chamber）と逆転写部（RT chamber）とPCR部（qPCR chamber）が面内に配置されている。細胞トラップに必要な面積よりも大きな面積を別に２種類の反応槽向けに配置しなければならず、さらに、液流を制御するためのバルブや流路も面内に配置しなければならない。そのため、１つの細胞を処理するための単位構造（非特許文献２の構造では細胞トラップ部と逆転写部とPCR部と流路系を含む一つの細胞処理にかかわる構造）を配置するためのデバイス上の面積が大きくなってしまう。デバイスコストは大雑把にはデバイスの面積に比例することから、同時処理細胞数を増やすとデバイスコストの上昇を招いてしまう。
【００３７】
図1の実施形態では、この問題を解決するために核酸トラッッピング部を細胞トラッピング部の直下に設け、抽出した核酸から核酸トラッピング部でcDNAライブラリを構築し、その後の処理をこのライブラリに対して実行することで複数の反応を１つの反応領域で実行できるようにしている。
【００３８】
核酸トラップの効率を上げるために、核酸トラッピング部は多数のビーズが詰め込まれた構造や多孔質構造が望ましい。このような単位容積中の反応場となる表面積を増やすことによって、小さな反応槽でも効率が高く、短時間での反応が可能となる。
【００３９】
さらに、構築されたcDNAを鋳型にして、PCRや転写反応などによる核酸増幅をデバイス上で実行後にサンプルを回収して、次世代シーケンサを用いたシーケンスによって定量するとき、構築されたcDNAの配列がトラップされた位置によって異なるようにすることで、回収されたサンプル溶液に対するシーケンシングがどの細胞由来の遺伝子発現量かを同定することが可能となる。
【００４０】
これによって、単位構造を隔離したり、サンプルの移動を制御するためのバルブ機構や流路が不要となる。
【００４１】
図1の構成では、核酸トラッピング部4に必要な試薬を上部反応領域7から供給することによって核酸トラッピング部でPCR反応させ、PCR増幅産物は下部反応領域8から回収する。このとき、デバイス全体の温度がPCR反応に適切な温度サイクルとなるような機構をデバイスの外側に設けることが好ましい。
【００４２】
さらに望ましい構造として、細胞の状態を事前に非侵襲顕微鏡を用いて計測し、同一の細胞について遺伝子発現解析などで細胞中の生体物質を定量できるようにするために、細胞を固定した直下には核酸トラッピング部を配置せず、周辺に配置する構造を取ることが例示できる。
【００４３】
具体的には図2に示すような構造である。図2(a)は面状デバイスの面に垂直方向の断面図で、図2(b)は、面に並行で上の図の一点鎖線部分の位置での断面図である。細胞1から核酸を抽出する前に顕微鏡観察を行うためにデバイス中の21、22、23の部分は光学的に透明な材料を用いる。顕微鏡観察には透過型顕微鏡、微分干渉顕微鏡、位相差顕微鏡、コヒーレント安置ストークスラマン顕微鏡(CARS顕微鏡)等を用いることができる。
【００４４】
顕微鏡観察終了後、核酸抽出および逆転写を行うために矢印10の方向にサンプルをおよび試薬を流す。サンプル処理の過程は顕微鏡観察をしない場合と同じである。
【実施例】
【００４５】
（実施例1）
本実施例は、ビーズ上に固定した核酸トラップのためのDNA（DNAプローブ）を多数パッキングすることによって核酸トラッピング部を構成した核酸抽出デバイスおよびサンプル処理装置に関する実施例である。【００４６】
本実施例の核酸抽出デバイスの単位構造の基本構成は図1に示したものと同じである。ただし、本実施例では、細胞から核酸を抽出し、mRNAを捕捉するだけでなく、cDNAライブラリを構築し、これを鋳型として、シーケンシング可能な末端に既知配列をもって、かつ十分量の核酸増幅産物が得られるようなデバイスの構成となっている。【００４７】
本実施例に対応する核酸抽出デバイスの中の一つの細胞を処理するための単位構造の断面図を図3(a)に記した。また、図3、図4の(b)〜(f)に、このデバイスで可能な細胞の捕捉後の各細胞から核酸抽出および核酸(mRNA)捕捉(b)、cDNAの合成(c)、核酸増幅(PCR)およびシーケンスに必要な既知の末端配列を導入した2ndストランドの合成(d)、(e)およびPCR増幅(f)のステップの概念図を記した。また、図5に核酸抽出デバイスの全体の構成図を記した。図5(a)は、図1(a)、図3(a)に対応する核酸抽出デバイスの断面の全体図であり、図5(b)は図5(a)のA-A’断面であり、図1(b)に対応する図面である。また、図5(c)は図5(a)のB-B’断面に対応する断面図である。【００４８】
次に、核酸抽出デバイスの動作について、処理順に説明する。図3(a)において、溶液に懸濁された細胞1をデバイス上の特定の位置（細胞トラッピング部（開口部））2に固定されるようにするために、上部反応領域7から下部反応領域8に向かって細胞トラッピング部を溶液が通って流れるようにする。細胞は溶液の流れに乗って移動し、細胞トラッピング部まで到達し、細胞トラッピング部の開口径が細胞の直径よりも小さいため、ここに細胞が固定される。捕捉された細胞は溶液流に対して栓の役割を果たすので、流れはまだ細胞を捕捉していない細胞トラッピング部に移動する。そのため、残りの細胞はまだ細胞が捕捉されていない部分へと移動し捕捉される。目的の数だけ細胞1が捕捉されたら、上部反応領域7に流す溶液は細胞を破壊するためのLysis bufferなどの核酸抽出液（例えばTween20などの表面活性剤と蛋白分解酵素の混合液）に交換される。同時に11の方向に電界を印加し、細胞中の核酸(mRNA)を核酸トラッピング部4まで電気泳動によって移動させる。核酸トラッピング部4は、細胞トラッピング部2との間の流路3と下部反応領域8との間の流路5の間の領域で、核酸をトラップするためのDNAプローブ31が固定されたビーズ12がパッキングされた領域である。【００４９】
図3(b)にはDNAプローブ31が固定されたビーズ12表面の拡大図を示している。細胞から抽出されたmRNA32は捕捉された細胞の直下にある核酸トラッピング部にあるビーズ上に捕捉されるように電界11が印加されている。捕捉したmRNAが元々存在していた細胞の位置の情報を配列情報として保存するために、ビーズに固定されたDNAプローブ31は、核酸トラッピング部の位置によって異なる配列、すなわち、細胞認識配列を含む。このDNAプローブ31の3’末端はポリＴ配列を持っており、mRNAの3’末端のポリA配列とハイブリダイズすることによってmRNAを捕捉する。図1(b)および図5(c)の4で示された2次元アレイ上に配置された核酸トラッピング部にはそれぞれ異なる細胞認識配列をもったDNAプローブ31が固定されたビーズがパッキングされている。【００５０】
このmRNA捕捉用DNAプローブ31は、本実施例ではもう少し複雑な配列構成となっており、図3(b)に示されているように、5’末端からDNAプローブ31として、30塩基のPCR増幅用共通配列（Forward方向）、5塩基の細胞認識用タグ配列、15塩基のランダム配列からなる分子認識用タグ配列、および18塩基のオリゴ(dT)配列＋2塩基のVN配列を含めた。PCR増幅用共通配列をDNAプローブ31へ導入する事で、後続のPCR増幅工程において共通プライマーとして利用する事ができる。また、細胞認識タグについては、例えば5塩基のランダム配列の場合、45=1024個の単一細胞を認識する事が可能となる。すなわち、1度に1024個の単一細胞からcDNAライブラリを調製する事ができ、上記に記したように最終的に得られる次世代シーケンサの配列データにおいて、どの細胞由来であるかを認識する事が可能となる。さらに、分子認識用タグ配列（例えば７塩基）をDNAプローブ31へ導入する事により、47=1.6x104分子を認識する事ができるため、次世代シーケンサで得られる増幅産物についてのDNA配列データから同じ細胞由来で同じ遺伝子の配列をもった増幅産物が、どの分子由来であるかを認識する事が可能となる。すわなち、増幅工程で生じた遺伝子間の増幅バイアスを修正する事ができるため、始めに試料中に存在していたmRNA量を高い精度で定量する事が可能となる。ただし、単一細胞中の同一遺伝子の発現量が分子認識タグ配列のバリエーションよりも多い場合には増幅バイアス補正の正確性が低下する。最も3’側に位置するオリゴ(dT)配列は、mRNA32の3’側に付加されているポリAテールとハイブリダイズし、mRNA32を捕捉するために利用される(図3(b))。【００５１】
本実施例ではmRNAを解析するために補足用DNAプローブ31の一部にポリT配列を用いたが、microRNAやゲノム解析を行うためにポリT配列の代わりにランダム配列は解析したい配列と相補的な配列の一部を用いてもよいことは言うまでもない。【００５２】
次にビーズ上のDNAプローブ31により捕捉したmRNA32を鋳型にして1st cDNA鎖33を合成する。本工程では逆転写酵素および合成基質を含む溶液でパックされたビーズの空隙部分を満たし、50℃にゆっくり昇温して50分ほど相補鎖合成反応を行う図3(c)。反応終了後RNaseを、ビーズがパッキングされた領域を通して流してmRNA32を分解除去する。次いでアルカリ変性剤を含む液および洗浄液をビーズの空隙部分に通して流し、残存物および分解物を除去する。ここまでのプロセスで核酸トラッピング部にパックされたビーズ上には、細胞トラッッピング部に捕捉された個々の細胞の位置を反映して図5(c)に示すようなcDNAライブラリアレイが構築される。【００５３】
次に細胞トラッピング部に残存する細胞の破片を取り除くためにLysis bufferを下部反応領域8から上部反応領域7に向かって流す。引き続きPCR増幅用共通配列(Reverse)が付加された複数（~100種）のターゲット遺伝子特異的配列プライマー41を1st cDNA鎖へアニールさせ（図4(d)）、相補鎖伸長反応により2nd cDNA鎖42を合成させる(図4(e))。すなわちマルチプレックス条件で2nd cDNA鎖合成を行う。これにより、複数のターゲット遺伝子について、増幅用共通配列(Forward/Reverse)を両端に持ち、細胞認識タグ、分子認識タグ、および遺伝子特異的配列がその中に含まれる2本鎖cDNA鎖が合成される。また本実施例では、一例として、20種類(ATP5B、GAPDH、GUSB、HMBS、HPRT1、RPL4、RPLP1、RPS18、RPL13A、RPS20、ALDOA、B2M、EEF1G、SDHA、TBP、VIM、RPLP0、RPLP2、RPLP27およびOAZ1)の遺伝子特異的配列にターゲット遺伝子のポリAテールから109±8塩基上流部分の20±5塩基を用いたが、これは、後続のPCR増幅工程において、PCR産物サイズを約200塩基に統一するためである。PCR産物サイズを統一する事で、煩雑なサイズフラクション精製の工程(電気泳動→ゲルの切り出し→PCR産物の抽出・精製)を除去する事ができ、1分子からの並列増幅（エマルジョンPCRなど）へ直接利用できる効果を持つ。続いて、増幅用共通配列(Forward/Reverse)を用いてPCR増幅を行い、複数種の遺伝子由来のPCR産物43を調製した（図4(f)）。この工程において遺伝子間、ないし分子間で増幅バイアスが生じたとしても、次世代シーケンサデータ取得後に、分子認識タグを利用して増幅バイアスの補正を行う事ができるため、高精度な定量データを得る事が出来る。【００５４】
1細胞当りのmRNAの数はおおよそ106個であり、このmRNAを補足するための核酸トラップ部分には1.1×105個の磁性ビーズ12をパックしている。磁性ビーズ表面にはストレプトアビジンが固定さてており、DNAプローブ31の5’末端にビオチンを修飾することによってストレプトアビジンを介して磁性ビーズ表面に固定される。【００５５】
ここまで、ビーズ表面で生成したcDNA(1st cDNA)にPCR増幅用の共通配列が付加されている数十種類の遺伝子特異的配列プライマーを用いて2nd cDNAを合成し、ここでは、PCR増幅する例を開示した。もちろんローリングサークル増幅(RCA)やNASBAやLAMP法など他の増幅法を用いても良い。【００５６】
次に、核酸抽出デバイスの作製方法について詳述する。磁性ビーズがパックされる核酸トラッピング部、細胞トラッッピング部およびこれらを結ぶ流路をPDMS(ポリジメチルシロキサン)製の基板6として半導体プロセスを用いて作製した。細胞トラッピング部は直径10μmの貫通孔を125μm間隔にアレイ状に配置する。基板の大きさは一辺が13mmの正方形であり、その中に細胞トラッピング部が104個配置されている。細胞トラッピング部の直下は貫通孔の直径が50μmに広くなっておりこの部分に磁性ビーズをパッキングする。この貫通孔がアレイ状に配置された基板6の下に細孔アレイシート(多孔質メンブレン)35を配置した。この細孔アレイシートの細孔の直径は磁性ビーズの直径である1μmよりも小さい。【００５７】
その後、個別にインクジェットプリンタヘッドに充填し、異なる配列が固定されたビーズを個別に核酸トラッピング部4に2nLずつ充填する。【００５８】
細孔の内壁は親水表面に加工されており、水を吸収するがビーズを核酸トラッピング部に保持することが可能である。細孔アレイシートとしては多孔質のガラスからなるモノリスシート、毛細管を束ねてスライスしたキャピラリープレート、ナイロンメンブレンあるいはゲル薄膜など種々のものを用いる可能性があるが、ここではアルミナを陽極酸化して得た細孔アレイシートを用いた。このようなシートは陽極酸化により自作することもできるが、孔径20nm〜200nm、直径25mmのものが市販品として入手可能である。これから、一辺13mmの正方形に切り出して使用した。シートに形成された細孔は核酸トラッピング部と下部反応領域をつなげる流路5である。【００５９】
上記PDMS製基板と細孔アレイシートはプラズマ接着によって接着した。【００６０】
ここで、PDMS製基板の代わりにナノインプリント技術や射出成型によって作製した樹脂（ポリカービネート、サイクリックポリオレフィン、ポリプロピレン）製の基板や、市販のナイロンメッシュやトラックエッチメンブレンを用いてもよい。細孔アレイシートとの接着は熱接着を用いることもできる。【００６１】
また、この反応層は半導体プロセスを用いて一体加工を行ってもよいことは言うまでもない。【００６２】
次に、5’ビオチン基修飾されたDNAプローブが固定された直径１μmの磁性ビーズ溶液（７×109個/mL）を核酸トラッピング部4にインクジェットプリンタと同じ技術によって、2nLずつ領域ごとに注入する。このとき、領域ごとに異なる細胞認識タグ配列（1024種類）をもつDNAプローブを吐出する。磁性ビーズの溶液は流路5を通して排出され、ビーズだけが残る。なお、異なる細胞認識用タグ配列をもったmRNA捕捉用DNAプローブが固定する方法は、別々の反応チューブ中で磁性ビーズとDNAプローブ溶液を混和し1.5M NaClを含むTris バッファ(pH 7.4)中で混和し、10分回転させながら結合反応させる。【００６３】
以下、これまで記述した、核酸抽出デバイスを作成し、次世代（大規模）シーケンサで遺伝子発現プロファイルを得るための装置システムを図5を用いて説明する。1000個程度以下の細胞を500μLの１×PBSで細胞を傷つけないように洗浄後、できる限りPBSが残らないように溶液を除去し、4℃に冷却された1×PBSバッファを50μL加えた。細胞は細胞インレット308から導入し、バッファを下部アウトレット307から排出することによって細胞を細胞トラップ部にアレイ状に配列させる。過剰な細胞は上部アウトレット306から排出する。次に上部インレット305からLysisバッファを導入し、PBSバッファを流路306および307から排出して、上部反応領域7をLysisバッファに置換する。核酸抽出デバイスの上下は透明な上基板301および下基板302で挟まれている。これらの基板内側に透明（ITO）電極をスパッタリングによって形成し、電界を印加して電気泳動によって核酸を細胞直下の核酸トラッピング部に移動させる。電極を透明にしている理由は、細胞を光学顕微鏡で観察できるようにするためであり、今回使用したITO透明電極は400-900nmの波長範囲で40％以上の透過特性を有する。【００６４】
Lysis Solution 495uL（TaqMan MicroRNA Cell-to-CT Kit; Applied Biosystems Inc.）とDNase I 5uLをインレット305から注入する。溶液が、ゲル化したことを確認し、温度を20℃まで上げて、8分間反応させた後、Stopping Solution（DNaseを失活させる溶液） 50uLをゲルの上に添加し、5分間反応させ、4℃に冷却した。次に、分子量60万、0.03％のPEO(ポリエチレンオキシド)と分子量100万、0.03％のPVP(ポリビニルピロリドン)および、0.1%のTween 20を含む10mMのTris Buffer (pH 8.0)0.5mLを加えた。このとき上部電極301と下部電極302間の距離は2mmとし、上部反応領域7および下部反応領域8は前記Tris bufferで完全に満たされている。溶液温度を4℃に維持したまま、上部電極301を陰極(GND)、下部電極302を陽極として、電源311を用いて+5Vを２分間印加し、負電荷を持つmRNAを細胞内部から下部反応領域8の方向へ電気泳動する。電気泳動条件はDC電圧印加の代わりにオンレベル10Ｖ，オフレベル0Ｖ、周波数100ｋHz，デューティー50％のパルス電気泳動を用いてもよい。この過程でmRNAはビーズに固定されたDNAプローブのオリゴ(dT)部分にほとんどトラップされる。しかし、一部のmRNAは2次構造によってトラップされずにビーズ下部の下部反応領域8に移動してしまう。mRNAを完全にDNAプローブにてトラップするために、溶液の温度を70℃まで上げて5分待った後、1分毎に下部電極302に印加する電圧の極性を反転させながら-0.1℃/secで4℃まで冷却した（最初は-5Vを１分間印加し、その後+5V→-5Vで１分ずつ10回繰り返し印加）。次にインレット305から上記tris bufferを導入し、アウトレット306から排出することによって、上部反応領域7中の溶液を交換しながら、溶液の温度を35℃まで上げてアガロースゲルを溶解させて、必要のない細胞組織とアガロースを洗浄、除去した。さらに、0.1%Tween20を含む10mM Tris Buffer (pH=8.0) 585μLと10mM dNTP 40μLと5xRT Buffer (SuperScript III, Invitrogen社) 225μLと0.1M DTT 40μLとRNaseOUT (Invitrogen社) 40μLとSuperscript III(逆転写酵素, Invitrogen社) 40μLを混和し、上部反応領域7および下部反応領域8を満たしている溶液をアウトレット306および307から排出し、直ちに逆転写酵素を含む上記溶液をインレット305から注入した。その後、溶液の温度を50℃に上げて、50分間保つことによって逆転写反応を完了させ、mRNAと相補的配列を持つ1st cDNAを合成した。【００６５】
細胞ごとに多くのビーズ表面に固定されたcDNAをライブラリとして得た。これはいわば１細胞cDNAライブラリアレイというべきものであり、これまでの多くの細胞から得られる平均化されたcDNAライブラリとは根本的に違うものである。【００６６】
このように得られたcDNAライブラリアレイから種々遺伝子について遺伝子ごとの発現量を定量的に計測する。１つの細胞当たり１万個の細孔があるので、１つの細孔当たりのcDNAの個数は平均で100個である。１種類のcDNAについて、１細胞当たりのcDNAコピー数が１万個以下の場合には、１つのビーズ当たり平均として１個以下となる。【００６７】
1st cDNA鎖を合成した後、85℃にて1.5分保ち逆転写酵素を失活させ、4℃に冷却後、RNaseおよび0.1%Tween20を含む10mM Tris Buffer (pH = 8.0) 10mLをインレット305から注入しアウトレット306、307から排出することによって、RNAを分解し、同量のアルカリ変性剤を同様に流して残存物および分解物を除去・洗浄した。続いて、滅菌水690μLと10 x Ex Taq Buffer (TaKaRa Bio社) 100μLと2.5mM dNTP Mix 100μLと各10μMのPCR増幅用共通配列(Reverse)が付加された20種の遺伝子特異的配列プライマー Mix100μLとEx Taq Hot start version (TaKaRa Bio社)10μLを混和し、デバイス中を満たしている溶液をアウトレット306および307から排出し、直ちに逆転写酵素を含む上記溶液をインレット305から注入した。その後、95℃3分間→44℃2分間→72℃6分間の反応を行い、1st cDNA鎖を鋳型としてプライマーの遺伝子特異的配列をアニールさせた後（図4(d)）、相補鎖伸長反応を行い、2nd cDNA鎖を合成させた（図4(e)）。【００６８】
続いて、滅菌水495μLと10 x High Fidelity PCR Buffer (Invitrogen) 100μLと2.5 mM dNTP mix 100μLと50mM MgSO4 40μLと10μMのPCR増幅用共通配列プライマー (Forward) 100μLと10μMのPCR増幅用共通配列プライマー(Reverse) 100μLとPlatinum Taq Polymerase High Fidelity (Invitrogen社) 15μLを混和し、上部反応領域7および下部反応領域8を満たしている溶液をアウトレット306および307から排出し、直ちに上記溶液をインレット305から注入した。その後、溶液を30秒間94℃に保ち、94℃30秒間→55℃30秒間→68℃30秒間の3段階工程を40サイクル繰り返し、最後に68℃3分間保った後、4℃に冷却してPCR増幅工程を行った(図4(f))。このような温度サイクルを実現するために、ヒーター付きヒートブロック（アルミ合金または銅合金）309と温度コントローラ310を追加してもよい。これにより、20種のターゲット遺伝子の目的部分が増幅されるが、いずれもPCR産物サイズは200±8塩基とほぼ均一である。溶液中に蓄積されたPCR増幅産物溶液を回収する。この溶液中に含まれるフリーのPCR増幅用共通配列プライマー（Forward/Reverse）や酵素などの残留試薬を除去する目的で、PCR PurificationKit(QIAGEN社)を用いて精製する。この溶液をemPCR増幅またはブリッジ増幅適用後、各社(Life Technologies(Solid/Ion Torrent)、Illumina(High Seq), Roche 454)の次世代シーケンサに適用して解析する。【００６９】
次に、分子認識タグを用いた増幅バイアスの低減方法について説明する。図6には分子認識領域以外は同じ配列としてシーケンシングされたデータが得られた状態を模式的に示している（得られたシーケンシングデータの関連部分を模式的に図示）。図6中で601、602、603、604、605はランダム配列である分子認識タグ配列も含めて同じ配列であり、それぞれ1、7、4、2、2リードが得られている場合を示している。これらの配列は、図4(e)で2ndストランドが合成された時点ではすべて１分子であり、その後のPCR増幅で分子数が増大すると同時に、異なる分子数になっている。それゆえ、分子認識タグの同じリードは同じ分子としてみなしてよく、すべて１分子とみなされる。その結果、2ndストランドが合成された後の工程のPCR増幅や、溶液を外部に取り出すときに細孔アレイシート内部への吸着による配列ごとに分子数の偏りは、上記同一視によって解消される。【００７０】
ここで、得られたデータとしては、1、7、4、2、2が見かけ上の（分子認識タグ以外は同一の配列の）カウント数になっている。細胞中の分子数はそれぞれ、1カウントと数えなおして合計で5カウント（1、7、4、2、2それぞれが1カウントに対応する）となる。すなわち、分子タグ以外の配列に相当する分子は、増幅前には5分子あったと推定される。実際にデータにおいては、分子認識タグ以外の配列が異なるリードもシーケンシング結果として得られる。このとき、分子認識タグが異なって、他の配列が同じリードをそれぞれ数えることによって、知りたい配列についてのカウントを実行することができる。もともとのサンプルの中には、このカウントに比例する分子数のmRNAが含まれていると推定できる。【００７１】
ここで作製したシートは繰り返し利用可能であり、発現量を知る必要がある遺伝子群については、PCR増幅用共通配列プライマー(Reverse)が付加された遺伝子特異的配列プライマーMix溶液を作製し、上記と同様に2nd cDNA鎖の合成、PCR増幅、およびemPCRを施し、次世代シーケンサにて解析を行えばよい。すなわち、cDNAライブラリを繰り返し利用することによって、高精度な発現分布測定を必要な種類の遺伝子について行うことが可能である。【００７２】
（実施例2）
本実施例は、アレイ状に配置された細胞群から、個々の細胞の中に含まれるmRNAを、どの細胞由来かについての情報を保持した状態でcDNAライブラリを構築するために、ビーズを用いた核酸トラッピング部を有する核酸抽出デバイスではなく、核酸トラッピング部としてDNAプローブを固定した細孔アレイシートを用いている。また、cDNAライブラリを構築後の核酸増幅としては、PCR増幅ではなくT7プロモータを用いている。【００７３】
本実施例での核酸抽出デバイスの構造とそれを用いた抽出・処理方法を図7、8、9に示した。【００７４】
図7(a)に核酸抽出デバイスの単位構造の断面図を示している。細胞1は上部反応領域7から下部反応領域8に細胞を含むバッファ溶液をデバイスを貫通するように流すことによって細胞トラッピング部2に捕捉される。細胞トラッピング部2はPDMS製のセルアレイデバイス6中である。この細胞捕捉部の直径は細胞の直径よりやや大きい16μmとしている。この直径の設定によって、この細胞トラッピング部に2つ以上の細胞が捕捉されることを防いでいる。核酸トラッピング部である細孔アレイシート71はシートを貫通するような細孔72が多数形成されており、細孔72の内壁にDNAプローブが固定されている。細胞トラップ用のPDMS製のセルアレイデバイス6と核酸トラップ用の細孔アレイシート(多孔質メンブレン)71が核酸抽出デバイスの基本要素である。これら2つの要素が直接重ねられており、両者をつなぐ流路はこれらの要素が役割をかねている。実施例1と同様に、細胞トラップ後、細胞を含むバッファをLysisバッファに置換し、デバイスと垂直方向に電界を印加しながら、細胞を破砕する。これによって、破砕された細胞中のmRNAは細胞トラップ位置の直下の細孔72内壁上のDNAプローブ73にハイブリダイゼーションによって捕捉される。【００７５】
細胞アレイシート内部に固定されたDNAプローブ73は、5’末端方向からT7プロモータ配列、emPCR増幅用共通配列 (Forward方向)、細胞認識用タグ配列、分子認識用タグ配列、およびオリゴ(dT)配列で構成される。T7プロモータ配列をDNAプローブへ導入する事で、後続のIVT (In Vitro Transcription)によるcRNA83増幅工程（図8(e)）によるターゲット配列の増幅が可能となる。【００７６】
後述するように、核酸増幅工程において、転写因子によるcDNAからcRNAへの転写反応を行う場合には、DNAプローブは、さらに転写因子のプロモータ配列を含むことが好ましい。そのようなプロモータ配列としては、T7を用いるが他にSP6、T3などが挙げられる。核酸の増幅にはT7RNAポリメラーゼの活性を用いる。【００７７】
本実施例では、T7プロモータ配列を用い、この配列はT7RNAポリメラーゼにより認識され、その下流配列から転写(cRNA83増幅)反応が開始される。【００７８】
転写因子のプロモータ配列を用いた核酸増幅は等温増幅なため、温度サイクルを加えるための温度制御器が不要になるだけでなく、高温時にデバイス表面に固定したプローブDNAが脱離する可能性を低減することができる。【００７９】
同様にPCR増幅用共通配列を導入する事で、後続のemPCR増幅工程において共通プライマーとして利用する事ができる。また、細胞認識タグを（例えば5塩基）DNAプローブへ導入する事によって、45=1024個の単一細胞を認識する事が可能となることは実施例1と同様である。さらに、分子認識用タグ配列（例えば7塩基）をDNAプローブへ導入する事により、47=1.6x104分子を認識する事ができるため、次世代シーケンサで得られる膨大な解読データが、どの分子由来であるかを認識する事が可能となることも実施例1と同様である。すわなち、IVT / emPCRなどの増幅工程で生じた遺伝子間の増幅バイアスを修正する事ができるため、始めに試料中に存在していたmRNA量を高い精度で定量する事が可能となる。最も3’側に位置するオリゴ(dT) 配列は、mRNAの3’側に付加されているポリAテールとハイブリダイズし、mRNAを捕捉するために利用される(図7(a))。【００８０】
次に、核酸トラッピング部を構成する細孔アレイシートの作製方法について記す。【００８１】
細孔アレイシートとしては、陽極酸化法によって作製した市販品を入手可能であり、ここでは孔径200nmで厚さが60μm、13mm角（直径25mmのシートから切断して利用）の細孔アレイシート71を用いた例について説明する。細孔アレイシート71に形成された細孔72は細孔アレイシート71の厚さ方向に貫通しており、細孔同士は完全に独立である。細孔72は流路5の機能もかねる。表面は親水性で、表面への蛋白質の吸着が極めて少なく、酵素反応が効率よく進む。まず、細孔アレイシート71の表面をシランカップリングなどの処理をしてDNAプローブ73を細孔表面に固定する。DNAプローブ73は平均30〜100nm2に一個の割合で表面に固定されるので、4〜10x106個のDNAプローブが1つの孔に固定される。次いで表面吸着を防止するために表面コート剤で表面をコートする。この表面コートはプローブ固定と同時に行ってもよい。このDNAプローブ密度はこの空間を通過するmRNAをほぼ100％の効率でDNAプローブに捕獲できる密度である。【００８２】
次に、細孔内部へのDNAプローブ固定化方法について詳細に説明する。細孔アレイシート内部の細孔の表面は、高密度にDNAプローブが固定化されると同時に、mRNAやPCR増幅用プライマーなどの核酸、そして逆転写酵素やポリメラーゼなどの蛋白質を吸着しない表面である必要がある。本実施例では、DNAプローブを固定化するためのシランカップリング剤と吸着を防止するシラン化されたMPCポリマーとを適切な割合で同時に細孔表面に共有結合にて固定して、DNAの高密度固定と核酸や蛋白質の安定した吸着抑制を実現した。実際には、まずアルミナ製の細孔アレイシートをエタノール溶液に3分浸漬後、UVO3処理を5分行い、超純水で3回洗浄する。次に平均分子量9700（重合度40）のシラン化MPCポリマーであるMPC0.8-MPTMSi0.2（MPC: 2-Methacryloyloxyethyl phosphorylcholine/MPTMSi: 3-Methacryloxypropyl trimethoxysilane）（例えば、Biomaterials 2009, 30:4930-4938、およびLab Chip 2007, 7:199-206）3mg/mlと0.3mg/mlのシランカップリング剤GTMSi（GTMSi：3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane信越化学）、および酸触媒である0.02％酢酸を含む80％エタノール溶液に2時間浸漬した。エタノールで洗浄後、窒素雰囲気で乾燥し、オーブンにて120℃で30分間加熱処理した。次にDNAを固定化するために、1μM 5’アミノ基修飾されたDNAプローブと7.5％グリセロールと0.15M NaClを含む0.05Mホウ酸バッファ（pH 8.5）を細孔アレイシート上にインクジェットプリンタと同じ技術によって、100pLずつ25μm×25μmの領域毎に異なる細胞認識用タグ配列（1024種類）を含むDNAプローブを吐出した。その後、加湿チャンバ内において25℃で2時間反応させた。最後に未反応グリシド基をブロックし、過剰なDNAプローブを除去するために、十分量の10mM Lysと0.01％SDSと0.15M NaClを含むホウ酸バッファ（pH 8.5）で5分間洗浄し、この洗浄液を除去した後、0.01％SDSと0.3M NaClを含む30mMクエン酸ナトリウムバッファ（2xSSC, pH 7.0）を用いて60℃にて洗浄し、過剰DNAを除去した。これによって、DNAプローブの固定と表面処理を完了した。【００８３】
次に、反応の各ステップを順に説明する。図7(a)に示すようにmRNA74は前実施例と同様にmRNA3’末端のポリA配列に相補的な配列である18塩基のポリT配列によって捕捉する。次に1st cDNA鎖79を合成し、cDNAライブラリを構築する（図7(b)）。次に定量したい遺伝子に対応する複数（~100種）のターゲット遺伝子特異的配列プライマー80を1st cDNA鎖79へアニールさせ（図8(c)）、相補鎖伸長反応により2nd cDNA鎖81を合成させる(図8(d))。すなわちマルチプレックス条件で2nd cDNA鎖合成を行う。これにより、複数のターゲット遺伝子について、増幅用共通配列(Forward/Reverse)を両端に持ち、細胞認識タグ、分子認識タグ、および遺伝子特異的配列がその中に含まれる2本鎖cDNAが合成される。また本実施例では、一例として、20種類(ATP5B、GAPDH、GUSB、HMBS、HPRT1、RPL4、RPLP1、RPS18、RPL13A、RPS20、ALDOA、B2M、EEF1G、SDHA、TBP、VIM、RPLP0、RPLP2、RPLP27、およびOAZ1)の遺伝子特異的配列にターゲット遺伝子のポリAテールから109±8塩基上流部分の20±5塩基を用いたが、これは、後続のIVTによる増幅工程において、増幅産物サイズを約200塩基に統一するためである。PCR産物サイズを統一する事で、煩雑なサイズフラクション精製の工程(電気泳動→ゲルの切り出し→PCR産物の抽出・精製)を除去する事ができ、1分子からの並列増幅（エマルジョンPCRなど）へ直接利用できる効果を持つ。続いて、T7RNAポリメラーゼを細孔中に導入し、cRNA83を合成する（図8(e)）。この過程によって、約1000コピー程度のcRNAが合成される。さらに、emPCRのための2本鎖DNAを合成するために、増幅されたcRNAを鋳型として、PCR増幅用共通配列(Reverse)が付加された複数（~100種）のターゲット遺伝子特異的配列プライマー91をハイブリさせ（図9(f)）、cDNAを合成する（図9(g)）。さらに、前実施例と同様に酵素を用いてcRNAを分解してから、Forward共通プライマーを用いて2ndストランド92を合成することによってemPCR用2本鎖DNA93が合成される（図9(h)）。この増幅産物は、長さがそろっており、そのまま、emPCR、次世代シーケンサにかけることができる。この工程において遺伝子間、ないし分子間で増幅バイアスが生じたとしても、次世代シーケンサデータ取得後に、分子認識タグを利用して増幅バイアスの補正を行う事ができるため、高精度な定量データを得る事が出来ることは前実施例と同様である。【００８４】
次に、図7に記載の核酸抽出デバイスの単位構造を有する図10に示した装置構成で、一連の工程の具体的に記す。図10(b)は図10(a)のA-A’断面であり、図10(c)は図10(a)のB-B’断面に対応する断面図である。細胞インレット308から細胞1を導入して、細胞トラッピング部2に細胞を捕捉し、1st cDNA鎖を合成するまでは実施例1と同様である。1st cDNA鎖を合成した後、85℃にて1.5分保ち逆転写酵素を失活させ、４℃に冷却後、RNaseおよび0.1%Tween20を含む10mM Tris Buffer (pH = 8.0) 10mLをインレット305から注入しアウトレット306、307から排出することによって、RNAを分解し、同量のアルカリ変性剤を同様に流して細孔内の残存物および分解物を除去・洗浄した。続いて、滅菌水690μLと 10 x Ex Taq Buffer (TaKaRa Bio社) 100μLと2.5mM dNTP Mix 100μLと各10μMのPCR増幅用共通配列(Reverse)が付加されたい20種の遺伝子特異的配列プライマー Mix100μLとEx Taq Hot start version (TaKaRa Bio社)10μLを混和し、上部反応領域7および下部反応領域8を満たしている溶液をアウトレット306および307から排出し、直ちに逆転写酵素を含む上記溶液をインレット305から注入した。その後、95℃3分間→44℃2分間→72℃6分間の反応を行い、1st cDNA鎖を鋳型としてプライマーの遺伝子特異的配列をアニールさせた後、相補鎖伸長反応を行い、2nd cDNA鎖を合成させた。【００８５】
続いて、0.1%Tween20を含む10mM Tris Buffer (pH = 8.0) 10mLをインレット305から注入しアウトレット306、307から排出することによって、細孔内の残存物および分解物を除去・洗浄した。さらに、滅菌水340μLとAmpliScribe 10 X Reaction Buffer（EPICENTRE社）100μLと100mM dATP 90μLと100mM dCTP 90μLと100mM dGTP 90μLと100mM dUTP 90μLと100mM DTT、およびAmpliScribe T7 Enzyme Solution（EPICENTRE社）100μLを混和し、上部反応領域7および下部反応領域8を満たしている溶液をアウトレット306および307から排出し、直ちに逆転写酵素を含む上記溶液をインレット305から注入した。その後、溶液の温度を37℃に上げて、180分間保つことによって逆転写反応を完了させ、cRNA増幅を行った。これにより、20種のターゲット遺伝子の目的部分が増幅されるが、いずれもcRNA増幅産物サイズは200±8塩基とほぼ均一である。メンブレンの細孔内部および外部の溶液中に蓄積されたcRNA増幅産物溶液を回収する。この溶液中に含まれる酵素などの残留試薬を除去する目的で、PCR PurificationKit(QIAGEN社)を用いて精製し、50μLの滅菌水に懸濁する。この溶液に、10mM dNTP mix 10μLと50ng/μLのランダムプライマー30μLを混和させ、94℃10秒加熱後0.2℃/秒で温度を30℃まで低下させ、30℃で5分間加熱し、さらに4℃まで低下させる。その後、5xRT Buffer (Invitrogen社)20μLと、0.1M DTT 5μLと、RNase OUT 5μLと、SuperScript III 5μLを混和させ、30℃で５分間加熱し、0.2℃/秒で温度を40℃まで上昇させる。この溶液中に含まれる酵素などの残留試薬を除去する目的で、PCR PurificationKit(QIAGEN社)を用いて精製し、emPCR増幅に適用後、各社(Life Technologies、Illumina, Roche)の 次世代シーケンサに適用して解析する。【００８６】
（実施例3）
１細胞ごとの遺伝子解析を実現する核酸抽出デバイスによって、細胞の個性／状態を識別することが可能である。一方、非侵襲顕微鏡観察では細胞を生かしたままで細胞の形態や化学組成を計測することが可能である。しかし、顕微鏡イメージのみの情報から細胞の状態を識別することは、細胞の個性／状態が多様で不安定であるため、極めて困難であった。本実施例では、１細胞ごとの遺伝子解析による細胞個性の識別と非侵襲イメージングを組み合わせるためのデバイスと装置構成を示す。図3(a)や図7(a)のようなデバイス構造をもったものを用いて細胞を捕捉した状態で顕微鏡観察する場合、ビーズや細孔シートが透明な材料でできていたとしても、その材料の屈折率が溶液の屈折率と一般に異なるため、励起光や照明光が散乱されて、解像度の低下や背景光レベルの上昇という問題が生じる。本実施例では図2の構成を典型例とした核酸抽出デバイスと光学顕微鏡を組み合わせた例を示す。【００８７】
図11に本実施例での核酸抽出デバイスの構造および装置を示す。図11(b)は図11(a)のA-A’断面であり、図11(c)は図11(a)のB-B’断面に対応する断面図である。本例ではPDMS製の基板6の形状を工夫して、細胞の下方ではあるが直下には核酸トラッピング部を配置せず、周辺のリング状の領域を設けこの部分に磁性ビーズ12をパッキングした。基板平面に垂直方向に電界を印加することによってmRNAなどの核酸はリング状にパッキングされたビーズ部分を電気泳導によって導かれビーズ表面のDNAプローブによって捕捉される。以下のプロセスは実施例1の場合と同様である。PDMSで作製した細胞トラッピング部の直径は16μm、細胞トラッピング部の直下の顕微鏡窓1101の直径は25μm高さは15μmとした。また、細孔アレイシート35についても、細胞トラッピング部直下に対応する部分は細孔が形成されないように、陽極酸化時にレジストマスクによって保護している。なお、陽極酸化のパターニングを行わず、顕微鏡窓1101の厚さを顕微鏡光学系のデバイス面に垂直方向の焦点深度よりも厚くすることによって、細孔アレイシートによる散乱の影響を小さくすることも可能である。【００８８】
また、図12に示すように、核酸トラッピング部を細胞の周囲ではなく、横に配置することも可能である。図12(b)は図12(a)のA-A’断面であり、図12(c)は図12(a)のB-B’断面に対応する断面図である。この例では1201が核酸トラッピング部である。この場合もビーズ上にDNAプローブを固定し、mRNAを捕捉する。他のデバイスの構成およびサンプル調整方法は実施例1と同様である。【００８９】
また、図11、12ではビーズをパッキングした領域を核酸トラッピング部としたが、細孔アレイシートを核酸トラッピング部とする実施例2と同様に、細孔を形成する部分を制限することによって、図11および12に示したものと同様の構成をビーズを用いずに作製することが可能であることもいうまでもない。【００９０】
このような核酸抽出デバイスを用いて、遺伝子発現解析のために細胞を破砕して詳細な遺伝子発現解析を行うまえに、高解像度な細胞が生きた状態での形状や蛍光染色による遺伝子や蛋白質の定量またはラマンイメージングを行い、これらのイメージングデータと遺伝子発現解析データを対応させることが可能となる。これを実現するためのシステム構成について以下で説明する。【００９１】
まず、図13に核酸抽出デバイスを構築するために平面状のデバイス（セルアレイ1320と細孔アレイシート1321など）の上に配置した細胞サンプルについて、光学顕微鏡による計測と上記デバイスを用いた遺伝子発現解析結果を個々の細胞のデータについて対応させることによって細胞の動態を詳細に計測するための最小のシステム構成を示す。【００９２】
1200は核酸抽出デバイスおよびそのデバイス上に配置された細胞サンプルを表している。1201は図11に代表される細胞からのmRNA抽出と核酸増幅を行うためのフローシステムである。このフローシステムの中で、細胞由来のmRNAを処理することによって、次世代（大規模）DNAシーケンサ1205で配列を決定するのに必要な量で一定の長さを持ち、末端に核酸処理前の情報を記したタグ配列を含む増幅産物を得る。ここでも、矢印1211は増幅産物の移動を示している。一方、デバイス上の細胞は事前に細胞のデバイス上での位置を特定した形で光学顕微鏡1203による観察を行う。ここで細い矢印は情報の移動を示す。光学顕微鏡1203としては位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡、蛍光顕微鏡、レーザ―走査共焦点蛍光顕微鏡、ラマン顕微鏡、非線形ラマン顕微鏡（CARS顕微鏡、SRS顕微鏡,RIKE顕微鏡）、IR顕微鏡等を含む。これらの光学顕微鏡で得られる情報は遺伝子情報に関する限り、得られる情報が少ない。しかし、基本的には細胞が生きた状態での計測が可能であり、細胞の経時変化を計測することができ、刺激に対する細胞の応答をリアルタイムに計測することができる。デバイス上での位置情報を保存したデバイスを利用することによって、遺伝子発現に関する詳細情報と顕微鏡による時間変化を含む情報を対応させることができる。このことを実現するためには、次世代（大規模）DNAシーケンサからの配列情報1212と光学顕微鏡像の情報1213とタグ配列と対応させた位置情報1214を統合する情報システム1206をシステム内に設ける必要がある。本発明において、上記で説明した細胞の計測情報を統合するシステムの最小の構成は次世代（大規模）DNAシーケンサ1205以外の部分のシステム1207であり、DNAシーケンサとの情報の入力とサンプル（核酸増幅産物）の出力を持っているものである。【００９３】
図13に光学顕微鏡として蛍光顕微鏡を組み合わせた場合のシステム構成例を示す。1203は蛍光顕微鏡である。細胞1中には計測したい蛋白室（例えばp53）にGFPを発現させるか、免疫染色によって、特定の蛋白に蛍光体を導入している。このようにして得られる個々の細胞中の発現蛋白質量のデータは、細胞破砕後核酸抽出デバイス中でサンプル処理されて、DNAシーケンシングによって定量されることによって得られる遺伝子発現データと細胞ごとに相関を取ることができる。このとき細胞を認識するために、DAPIによって核酸を染色し、細胞核を認識することによって、細胞位置を蛍光顕微鏡によって識別している。蛋白質量はGFPの発現で計測しているため、経時変化を追うことができるが、同時に計測可能な蛋白質の種類は数種類程度である。一方、シーケンシングによる遺伝子発現解析は一度に100程度は可能であり、プローブを用意すれば1000種類の解析も可能である。それゆえ、細胞内の詳細な遺伝子発現制御に関する情報が個々の細胞ごとに得られる。しかし、これについては経時変化をとらえることができない。しかし、両者を組み合わせることによって、どのような蛋白質発現のときにどのような遺伝子発現であるかというデータが事前に得られていれば、蛋白質の発現データのみから、遺伝子制御に関する情報を推定することが可能となる。このような、蛍光顕微鏡データと遺伝子発現データの対応付けと遺伝子制御に関する情報の推定を情報システム1206で実行する。【００９４】
次に蛍光顕微鏡1203の構成の詳細を示す。1300は光源であり、ここでは水銀ランプである。1301は励起波長を決める励起フィルタ、1302はダイクロイックミラー、1303は受光波長を選択するエミッションフィルタである。細胞に複数種類の蛍光体が導入されて、同時に計測するとき、1301、1302、1303を制御1304によって選択し、特定の蛍光体からの光のみを計測するようにする。細胞の蛍光イメージは対物レンズ1305、結像レンズ1306、CCDカメラ1307によって行う。これらを制御、画像データ取得を行う制御コンピュータは1308である。【００９５】
次にフローシステム1201の制御系について説明する。フローシステムの制御コンピュータは1309であり、これはＸＹステージ1310を制御して、顕微鏡像を移動させる。このとき、制御コンピュータ上には細孔アレイシート上の位置座標と細胞認識タグの配列データおよびＸＹステージ位置座標を用いて計算される、顕微鏡像上の位置座標を対応させることができる。この制御コンピュータ1309は細胞のフローセルシステムへの細胞導入を制御する細胞導入制御装置1311、細胞の状態を変化させる分化誘導剤や細胞の応答を調べたい薬剤や、細胞を破砕するためのライセートやサンプル処理のための試薬の導入を制御する試薬制御装置1312、細胞培養条件、PCR時の温度サイクルを制御する温度、CO2濃度制御装置1313、不要な試薬や、細胞、培地交換などに用いる上部試薬排出装置1314、調製された核酸増幅産物を排出するための下部試薬排出装置1315を適切に制御している。最終的に得られた核酸増幅産物は次世代（大規模）DNAシーケンシングシステム1205に渡され配列解析を行う。このときシーケンシングのためのemPCRやブリッジアンプはこのシステムの中で実行されるものとしている。制御コンピュータ上で照合された画像の位置情報と細胞認識タグ配列情報は統合情報システム1206に送られ、蛍光イメージから得られる蛋白量と遺伝子発現量の対応付けを行う。さらに同じシステムで遺伝子発現解析データの経時変化推定を実行する。これによって、遺伝子発現ネットワークのダイナミクスを計測することが可能となる。【００９６】
また、この蛍光顕微鏡は細胞内の計測のみならず、細孔アレイシート中に導かれ、抗体によって捕捉サイトカイン等の細胞から分泌される物質を免疫蛍光染色してその量を計測するために用いてもよい。もちろん、同様にして、破砕後の遺伝子発現量の解析に用いてもよい。【００９７】
図14に蛍光顕微鏡の代わりに微分干渉顕微鏡を組み合わせた例を示す。微分干渉顕微鏡像は蛍光試薬を用いず形状を計測するのみであるが、再生医療など体内に細胞を戻さなくてはならない場合にもっとも細胞への影響度が小さい計測方法の一つである。この画像から得られる細胞形状の変化と遺伝子発現の変化の間に対応が付けることができる場合はもっとも、細胞ダメージが少なく、詳細な細胞分類ができる計測システムとなる。【００９８】
1401は光源でここではハロゲンランプである。1402は偏光子、1403、1404はそれぞれWollastonフィルタおよびWollastonプリズムである。1405はコンデンサレンズ、1406は対物レンズである。【００９９】
図15に光学顕微鏡としてCARS顕微鏡を用いた例を示す。CARS顕微鏡はラマン顕微鏡やIR顕微鏡と同様にレーザ励起部分の化学種に対応したスペクトルが得られるため、微分干渉顕微鏡よりも細胞状態に対する情報量を増大させることができる。ただし、かつCARSは非線形過程で、ラマン信号にくらべて、信号強度が強く、比較的弱いレーザ励起強度で十分なシグナルを得ることができるため、細胞へのダメージが小さいというメリットがある。このようなCARSイメージと遺伝子発現解析データを対応させることによって、より詳細な細胞状態の判定が可能となる。【０１００】
1501は光源でここではパルスレーザ（マイクロチップレーザ）である。これをビームスプリッタ1502にて２つに分波し、一方を非線形ファイバ（フォトニッククリスタルファイバ）1503に導入し、ストークス光を生成する。もう一方の光はそのままポンプ光およびプローブ光として用いて、サンプル（細胞中）に水浸対物レンズ1504で集光してアンチストークス光を生成する。ハイパスフィルタ1505にてアンチストークス光のみを透過させて、分光器1506を通して、分光器用CCDカメラ1507でコヒーレントアンチストークスラマンスペクトルを取得する。【０１０１】
（実施例4）
本実施例は細胞トラッピング部が細胞と同程度の大きさの開口部で構成されているのではなく、細胞表面を化学的に捕捉する物質、すなわち細胞表面の物質に化学的に結合する物質を固定した領域で構成されている例を示す。実施例1（図1）に対応して細胞トラッピング部を変更した例を図16に示す。核酸トラッピング（捕捉）に用いたビーズの上の一部の領域に細胞表面と結合する抗体などの蛋白質を固定したビーズを配置している。ビーズ上の抗体は特定の種類の細胞を捕捉するという機能を付加することができる。例えばCD（cluster of differentiation）抗体と呼ばれる一群の抗体は白血球を中心とする細胞の膜蛋白の種類に対応する抗体群がある。この抗体をビオチン化してビーズ上のストレプトアビジンで固定化して、図16の細胞トラッピング部2上にインクジェットプリンタ技術を用いて打ち込むことによって、特定のCD分類の抗原を持つ細胞を捕捉することが可能となる。もちろん、CD抗体を直接ビーズ上に固定するのではなく、ビオチン修飾した2次抗体を介してビーズ上に固定してもよいことはいうまでもない。また、CD抗体以外の抗体をビーズ上に固定してもよいし、細胞上の受容体に結合する分子を固定してもよい。このような分子の例としてはフィブロネクチンがある。フィブロネクチンは細胞上のインテグリンと結合することが知られている。フィブロネクチンをビーズ上に固定することによって、接着性の細胞を捕捉することが可能となる。【０１０２】
細胞表面の物質に化学的に結合する物質のその他の例としては、細胞外マトリックス、例えば、コラーゲン、ラミニン、エラスチンなどが挙げられる。【０１０３】
次に、実施例3（図2）に対応するデバイス構成において細胞捕捉を化学的に行う例を示す。核酸抽出デバイスの透明領域の一部に細胞を捕捉するための物質を固定する例である。捕捉用物質は上記と同様抗体を用いてもよいし、他の物質を用いてもよい。図17に核酸抽出デバイスの構成例を示す。細胞補足用抗体1702を細胞トラッピング部2に固定している。固定方法はビオチン化した抗体とストレプトアビジンをこの領域に固定することによっている。抗体に対応する抗原1703を持つ細胞のみを捕捉することが可能となる。【０１０４】
さらに、実施例2（図7）に対応する例を示す。図18に示すように細孔アレイシート71上の細胞を捕捉するための領域1801に抗体を固定することによって、抗体に対応する抗原1802を有する細胞を補足することが可能な細胞トラッピング部を形成している。抗体を特定の位置に固定するために、インクジェットプリンタヘッドを用いて、ビオチン化した抗体を数十pL程度ずつ打ち込んだ。実施例3で示した方法によってデバイス表面全体はストレプトアビジンがコートされているので、特定の領域にのみ抗体が固定されることになる。【０１０５】
（実施例5）
実施例1〜4では2ndストランド形成の工程（図2(d)-(e)および図8(c)-(d)で示した工程）およびPCR増幅の工程（図2(f)および図8(e)）も図5、図10、図11または図12に示したような装置の中で行う例を示した。しかし、核酸抽出デバイス1901の全部または核酸抽出デバイスを複数のデバイスに分割したものを樹脂製のチューブ1902（一般に用いられる0.2mLや1.5mL容量などのチューブ）または96穴や384穴プレートにデバイスを図19のように挿入し、2ndストランド合成およびPCR増幅に必要な試薬1903をこのチューブの中に混和することによって行ってもよい。このような構成にすることによってこれらの工程の条件についてユーザーが自由に条件を変更することが可能であるばかりでなく、2ndストランド合成からチューブの中で行うことによって、細胞認識タグや分子認識タグを実施例1-4に示した位置とは反対側の末端に挿入することが可能となる。【０１０６】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明によって、生体分子の定量、配列決定、分子同定が、多数の培養細胞や多数の免疫細胞や（血中）がん細胞等に対して実行でき、どのような状態にある細胞群がどの程度の数だけ生体に存在するかを計測することが可能となる。これは、がんなどの早期の診断やiPS細胞のヘテロジェナイエティを計測することも可能となる。
【符号の説明】
【０１０８】
1：細胞
2：細胞トラッピング部
3：流路
4：核酸トラッピング部
5：流路
6：平面基板
7：上部反応領域
8：下部反応領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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