(57)【要約】  （１）所望の抗原特異性Ｔ細胞受容体を有するヒト多能性幹細胞を提供する工程、および（２）工程（１）の多能性幹細胞からT前駆細胞あるいは成熟Ｔ細胞を誘導する工程を含む、免疫細胞療法用Ｔ細胞を誘導する方法を提供する。本願は特に、免疫細胞療法の対象者ではないヒトから取得された細胞由来の細胞を用いて免疫細胞療法用Ｔ細胞を誘導する方法に関する。本願の方法はさらに、多能性幹細胞から誘導されたＴ前駆細胞または成熟Ｔ細胞を、免疫細胞療法対象者由来のリンパ球と共培養して当該Ｔ細胞が患者に対するアロ反応性を有していないことを確認する工程を含んでいてもよい。かかる工程を含ませることにより、より安全な治療が可能となる。
2016010153.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）所望の抗原特異性Ｔ細胞受容体を有するヒト多能性幹細胞を提供する工程、および
（２）工程（１）の多能性幹細胞からT前駆細胞あるいは成熟Ｔ細胞を誘導する工程
を含む、免疫細胞療法用Ｔ細胞を誘導する方法。
【請求項２】
所望の抗原特異性Ｔ細胞受容体を有するヒト多能性幹細胞が、所望の抗原特異性を有するヒトＴ細胞から多能性幹細胞を誘導することによって得られる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
所望の抗原特異性を有するヒトＴ細胞が、治療対象とする疾患に罹患しているあるいは同疾患の既往のある、免疫細胞療法対象者ではないヒトから得られたＴ細胞である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
所望の抗原特異性を有するヒトＴ細胞が、治療対象とする疾患に罹患したことのない、免疫細胞療法対象者ではないヒトから得られたＴ細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
所望の抗原特異性を有するヒトＴ細胞が、免疫細胞療法対象者のHLA型に完全に一致あるいは一部が一致するＨＬＡ型を有するヒトから得られたＴ細胞である、請求項２〜４いずれかに記載の方法。
【請求項６】
所望の抗原特異性を有するヒトＴ細胞が、免疫細胞療法対象者のＨＬＡの何れか一方のハプロタイプをホモで有しているハプロタイプホモ接合型のＨＬＡを有しているヒトから得られたＴ細胞である、請求項４記載の方法。
【請求項７】
さらに、多能性幹細胞から誘導されたＴ前駆細胞または成熟Ｔ細胞を、免疫細胞療法対象者由来のリンパ球と共培養して当該Ｔ細胞が患者に対するアロ反応性を有していないことを確認する工程を含む、請求項１〜６何れかに記載の免疫細胞療法用Ｔ細胞を誘導する方法。
【請求項８】
ヒト多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である請求項１〜7何れかに記載の方法。
【請求項９】
免疫細胞療法が、がん、感染症、自己免疫疾患およびアレルギーからなる群から選択される疾患を治療するためのものである、請求項１〜８いずれかに記載の方法。
【請求項１０】
がんがＥＢウイルス関連のがんである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
感染症がＥＢウイルス関連である、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
がんがＷＴ１遺伝子を発現するがんである、請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は免疫細胞療法用Ｔ細胞の誘導方法に関する。本願は特に、所望の抗原特異性を有するＴ細胞を他家移植する免疫細胞療法における、免疫細胞療法用Ｔ細胞の誘導方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
個々のＴ細胞は異なる特異性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現している。感染症が生じた時、特定の特異性の細胞が増殖し、細胞集団（クローン）を形成して病原体の対処にあたる。これが獲得免疫系の基本型である。特定の特異性のＴ細胞を人為的に増殖（クローニングという）できれば治療に用いることができることが期待される。実際に、特定の特異性を示すＴ細胞を患者から採取し、増やして患者に戻す（自家移植）方法は臨床応用されている。ただしこのような試みの殆どはクローニングというほど純化されていないし、また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで何代も継代培養するうちに、がん細胞を殺す活性が低下するという問題もあった。【０００３】
Ｔ細胞を不死化することにより無限に増やす方法も提案されている。１つの細胞を不死化して増殖させ、クローニングする。細胞の不死化はがん細胞との融合による方法と、ＴＣＲ刺激とサイトカインの刺激による長期間培養などの方法が挙げられる。しかしながら、こうして不死化したＴ細胞は、いわばがん細胞であり、患者本人に戻す自家移植は危険である。また、クローニング工程において機能が低下するという問題もあった。【０００４】
今まで提案されているＴ細胞移植による免疫細胞療法について簡単に説明する。
Ａ．  初期化技術を用いたクローニング法
自家移植を目的としたＴ細胞のクローニングの問題を解決する技術が提案されている。初期化の技術を用いて特異的ＴＣＲ遺伝子の構造を有する幹細胞としてクローニングする方法である。具体的には核移植、ｉＰＳ細胞化などによりＴ細胞から多能性幹細胞を作製する方法であり、特許出願もされている（WO2008/038579、WO2011/096482）。また、かかる方法についての論文は2010年、2013年に発表されている。
1) Watarai H, A Rybouchkin, N Hongo, Y Nagata, S Sakata, E Sekine, N Dashtsoodol, T Tashiro, S-I Fujii, K Shimizu, K Mori, K. Masuda, H Kawamoto, H Koseki, and M Taniguchi. Generation of functional NKT cells in vitro from embryonic stem cells bearing rearranged invariant Vα14-Jα18 TCRα gene. Blood115:230-237, 2010.
2) Vizcardo R, Masuda K, Yamada D, Ikawa T, Shimizu K, Fujii S-I, Koseki H, Kawamoto H. Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPS cells derived from mature CD8+ T cells. Cell Stem Cell. 12: 31-36. 2013.
3) Nishimura T et al., Cell Stem Cell.12: 114-226. 2013.【０００５】
かかる方法は、患者本人のＴ細胞からＥＳ細胞あるいはｉＰＳ細胞を作製して増幅し、Ｔ細胞を再生して患者に戻す自家移植を前提としている。しかし、かかる方法には少なくとも以下の３つの問題がある。Ａ１）ｉＰＳ細胞を患者ごとに作製する必要があり、事前に準備しておくことができない、Ａ２）ｉＰＳ細胞を個別作製するため、その効果や安全性およびｉＰＳ細胞の質という点で作製の都度ばらつきが生じる、Ａ３）Ｔ−ｉＰＳ細胞から誘導されたＴ細胞ががん化する可能性がある。【０００６】
Ｂ．  TCR遺伝子導入T細胞療法
抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子を単離し、その遺伝子を患者の正常Ｔ細胞（多くのクローンの集合体）に発現させて患者の体に戻す（自家移植）という遺伝子治療の臨床試験が各地で行われている（Morgan R.A. et al, Science, 314:126. 2006, ）。この方法では患者の正常T細胞がもともと発現しているTCRを例えばsiRNAなどで発現を抑制し（Okamoto S et al, Cancer Res 69:9003, 2009, ）、特定のTCRのみが発現したT細胞を自家移植する。例えば、WT1抗原特異的T細胞受容体（TCR）遺伝子が単離されていて、ＷＴ１を発現するがんに対する遺伝子治療が行われている。【０００７】
Ｂの方法においても、治療に使うＴ細胞は患者本人のＴ細胞から作製することを前提としている。Ｂの方法には下記の３つの問題がある。Ｂ１）遺伝子治療なので、患者Ｔ細胞ががん化する可能性がある。Ｂ２）移植するＴ細胞の内因性ＴＣＲの抑制は完全ではなく、想定外の反応性が出現する危険性がある。Ｂ３）患者ごとの処置になるので事前準備ができない。【０００８】
Ｃ．  ドナーリンパ球輸注療法
白血病などの血液系の腫瘍に対して行われる骨髄移植は、免疫細胞療法としての側面をもつ。すなわち、移植されたドナーの骨髄細胞の中に含まれるＴ細胞がレシピエントの白血病細胞を攻撃することが期待されている。効果を高めるためにドナーのＴ細胞だけを後に追加して投与する、ドナーリンパ球輸注法も知られている。また近年、特定の抗原に対するクローンとして増幅させたＴ細胞を輸注するという方法が報告された（Chapuis et al, Sci Transl Med, 5:174ra27, 2013, ）。【０００９】
治療に使うＴ細胞は他人であるドナー由来の細胞とはいえ、骨髄移植を受けた後のレシピエントの造血系はドナーと同じになっており、効果を高めるためのドナーＴ細胞の追加投与部分については本質的には自家移植の一種とみなされる。本方法は、事前の骨髄移植を必須とするものであり、患者は生涯にわたり免疫抑制剤の投与を受けなければならない。【００１０】
Ｄ．  臍帯血中のリンパ球の他人への利用
臍帯血移植後に免疫力が低下した患者にウイルス感染症が発症することがある。そのようなケースを対象に移植に用いたドナー臍帯血ではなく他の臍帯血中のウイルス特異的ＣＴＬを輸注するという方法が提案されている（Blood, 116: 5045, 2010 ）。類似の発想で、ＨＬＡがある程度一致しているが完全には一致しないようなＣＴＬを移植するというアイデアの特許出願が出されている（WO2011/021503 ）。
）。しかしながら、臍帯血は多数のＴ細胞クローン、すなわち多種類のＴＣＲを有する細胞の集団であり、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を起こす危険性を完全には回避できない。【００１１】
上記のように、Ｔ細胞を用いる免疫細胞療法は種々提案されているが、Ｄを除いていずれも自家移植、または自家移植とみなされるような条件下でのＴ細胞の移植である。Ｔ細胞の他家移植は免疫細胞療法の常識に反するものである。例えば血液系の悪性腫瘍（白血病など）では、造血幹細胞を移植する骨髄移植が行われるが、ドナーの骨髄がレシピエントによって拒絶されないように、通常はレシピエントと一致したＨＬＡ型のドナーから移植される。しかしながら他人間においては、ＨＬＡ以外の多くのタンパク分子においてアミノ酸配列が不一致であり、ドナーＴ細胞はこれらの不一致を攻撃対象と認識し得る。その結果、移植したドナーＴ細胞の一部がレシピエントの体の細胞を攻撃する反応であるいわゆる移植片対宿主反応が生じ、レシピエントを死に至らしめ得ることが報告されている（Ito et al Lancet, 331: 413, 1988, ）。【００１２】
頻度の高いＨＬＡハプロタイプをホモで有するひとをドナーとして用いることにより、汎用性の高いｉＰＳ細胞バンクを構築するプロジェクトが日本において現在進行中である（CYRANOSKI, Nature vol. 488, 139(2012)）。しかしながら、上記の通りＴ細胞移植においては、ＨＬＡ型が完全に一致していたとしても移植片対宿主反応の恐れがあり、ＨＬＡが一致していない場合、この移植片対宿主反応がさらに強く起こることからｉＰＳストック事業はＴ細胞を用いた免疫細胞療法に適用することはできないと考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】WO2008/038579
【特許文献２】WO2011/096482
【特許文献３】WO2011/021503
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Watarai et al., Blood 115:230-237, 2010.
【非特許文献２】Vizcardo et al., Cell Stem Cell. 12: 31-36. 2013.
【非特許文献３】Nishimura T et al., Cell Stem Cell.12: 114-226. 2013.
【非特許文献４】Morgan R.A. et al, Science, 314:126. 2006
【非特許文献５】Okamoto S et al, Cancer Res 69:9003, 2009
【非特許文献６】Chapuis et al, Sci Transl Med, 5:174ra27, 2013
【非特許文献７】Blood, 116: 5045, 2010
【非特許文献８】Ito et al Lancet, 331: 413, 1988
【非特許文献９】CYRANOSKI, Nature vol. 488, 139(2012)
【非特許文献１０】Takahashi and Yamanaka, Cell 126, 663-673 (2006）
【非特許文献１１】Takahashi et al., Cell 131, 861-872(2007)
【非特許文献１２】Grskovic et al., Nat. Rev. Drug Dscov. 10,915-929(2011)
【非特許文献１３】Morgan R.A. et al, Science, 314:126. 2006
【非特許文献１４】Timmermans et al., Journal of Immunology, 2009, 182: 6879-6888
【非特許文献１５】Blood 111:1318（2008）
【非特許文献１６】Nature Immunology 11: 585（2010）  上記先行技術文献は引用により本願明細書の一部を構成する。
【発明の概要】
【００１５】
本願は、より効率的で有効かつ安全な免疫細胞療法を提供することを目的とする。
【００１６】
本願は所望の抗原特異性Ｔ細胞受容体遺伝子を有する多能性幹細胞からＴ前駆細胞あるいは細胞成熟Ｔ細胞を誘導し、当該Ｔ前駆細胞あるいは成熟Ｔ細胞を患者に他家移植することを含む免疫細胞療法に関する。
【００１７】
本願の免疫細胞療法において、所望の抗原特異性を有するＴ細胞からｉＰＳ細胞を誘導し、さらに誘導されたｉＰＳ細胞をＴ前駆細胞あるいは成熟Ｔ細胞へ誘導して、他家移植に供する。本願明細書において、Ｔ細胞から誘導されたｉＰＳ細胞をＴ−ｉＰＳ細胞という。
【００１８】
一般に抗原特異的なＴ細胞は感染症やがんの患者本人から採取することが考えられている。それは、抗原特異的Ｔ細胞は感染症やがん患者の体内で増幅されており、特定の反応性のＴ細胞を検出／採取しやすいと考えられているからである。本願ではそのように疾病を有する患者から疾病に関連する抗原に特異的なT細胞を採取し、それを他家移植用のT-iPS細胞の材料にする方法を提供する。一方で、本願においては健常人から抗原特異的T細胞を得る方法も提供する。健常人のＴ細胞から得たＴ−ｉＰＳ細胞を用いることにより、下記の効果が得られる：
１）健常人の細胞から種々の抗原特異性を有するＴ細胞を誘導することができるため、予め多くの種類のＴＣＲ遺伝子を有するT-iPS細胞をつくっておくことができる。
２）健常人を対象とするので、Ｔ−ｉＰＳバンクを作製にあたってドナーを集めやすい。
【００１９】
本願の免疫細胞療法に用いられるＴ細胞は、同一ＴＣＲを有するＴ細胞クローンであることから移植片対宿主反応を起こす可能性が格段に低く、自家移植のみならず他家移植に用いることができる。本願の方法はＴ細胞の他家移植は禁忌であるとの常識からは全く予測できない方法である。
【００２０】
本願の免疫細胞療法においては、Ｔ−ｉＰＳ細胞から再生したＴ前駆細胞または成熟Ｔ細胞をＨＬＡ型が一定以上共通する患者に投与する。本願の免疫細胞療法においては、患者に投与する前に患者由来のリンパ球と投与する再生Ｔ細胞とを共培養して再生Ｔ細胞の患者に対するアロ反応性の有無を確認することが好ましい。上述のとおり本願の免疫細胞療法にて用いる再生Ｔ細胞はクローンとして提供されることから、移植片対宿主拒絶反応を惹起して、再生Ｔ細胞が患者を攻撃する可能性は低いが、再生Ｔ細胞が投与された患者に対するアロ反応を惹起する可能性はゼロではない。よって、安全のために再生Ｔ細胞と患者由来のリンパ球とを共培養し、再生Ｔ細胞が患者のＨＬＡに対してアロ反応性を示さないことを予め確認することが好ましい。
【００２１】
本願はまた、（１）所望の抗原特異性Ｔ細胞受容体を有するヒト多能性幹細胞を提供する工程、および（２）工程（１）の多能性幹細胞からＴ前駆細胞またはＴ成熟細胞を誘導する工程
を含む、免疫細胞療法用Ｔ細胞を誘導する方法を提供する。
【００２２】
他の態様において、多能性幹細胞から誘導されたＴ細胞を、免疫細胞療法対象者由来のリンパ球と共培養して当該Ｔ細胞が患者に対するアロ反応性を有していないことを確認する工程を含む、免疫細胞療法用Ｔ細胞を誘導する方法を提供する。
本願においては、ヒト多能性幹細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞が好適に用いられる。
【発明の効果】
【００２３】
本願により、従来の技術認識における問題を予想外にも解決することができ、下記のごとき効果が得られる：
１）移植用Ｔ細胞を患者ごとに作製する必要がなく事前準備ができる、
２）事前に移植細胞の安全性および品質を確認した上での処理をすることができる、
３）たとえＨＬＡが一致していたとしてもマイナー抗原は一致しない他家移植であり、一定の期間の後には患者の免疫反応によって拒絶され、移入した細胞ががん化する恐れがない。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】実施例１において健常人ボランティア由来Ｔ細胞からＬＭＰ２テトラマー陽性、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が誘導されたことを示すＦＡＣＳ解析結果。
【図２】実施例１においてHLA-A2402を有しかつEBウイルス既感染者でもある健常人ボランティアの末梢血よりＬＭＰ２ペプチドを用いて誘導されたＴ細胞が、ペプチド特異的キラー活性を有することを示す図。
【図３】ＬＭＰ２ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたｉＰＳ細胞コロニーの写真。
【図４】ＬＭＰ２ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ−ｉＰＳ細胞のＴ細胞への分化誘導過程（Ｄａｙ１３）の細胞のＦＡＣＳ解析結果。
【図５】ＬＭＰ２ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ−ｉＰＳ細胞のＴ細胞への分化誘導過程（Ｄａｙ３６）の細胞のＦＡＣＳ解析結果。
【図６】ＬＭＰ２ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ−ｉＰＳ細胞のＴ細胞への分化誘導過程（Ｄａｙ４１）の細胞のＦＡＣＳ解析結果。ＬＭＰ２特異的成熟Ｔ細胞（ＣＴＬ）が得られたことが確認された。
【図７】ＬＭＰ２ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ−ｉＰＳ細胞から再生した成熟Ｔ細胞（ＣＴＬ）のＬＭＰ２抗原特異的キラー活性を示す図。標的細胞としてＬＣＬを用い、ＬＭＰ２ペプチド存在（ｐ＋）、非存在（ｐ−）下でのＴ細胞のキラー活性を観察した。
【図８】ＬＭＰ２ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ−ｉＰＳ細胞から再生した成熟Ｔ細胞（ＣＴＬ）のナチュラルキラー細胞様キラー活性を観察した結果を示す図。
【図９】クローンLMP2#1由来再生ＣＴＬのＬＣＬに対するペプチド特異的細胞傷害活性を示す図。
【図１０】実施例２において得られたクローンLMP#13由来再生ＣＴＬのＬＣＬに対するペプチド特異的細胞傷害活性を示す図。
【図１１】実施例３において健常人ボランティア由来Ｔ細胞からＷＴ１テトラマー陽性、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が誘導されたことを示すＦＡＣＳ解析結果。
【図１２】ＷＴ１ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたｉＰＳ細胞コロニーの写真。
【図１３】ＷＴ１ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ−ｉＰＳ細胞のＴ細胞への分化誘導過程（Ｄａｙ１３）の細胞のＦＡＣＳ解析結果。
【図１４】ＷＴ１ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ−ｉＰＳ細胞のＴ細胞への分化誘導過程（Ｄａｙ３６）の細胞のＦＡＣＳ解析結果。
【図１５】実施例３で得たクローンWT1#9由来再生CTLのLCLに対するペプチド特異的細胞傷害活性を示す図。
【図１６】実施例4で得たクローンWT1#3-3由来再生CTLのLCLに対するペプチド特異的細胞傷害活性を示す図。
【図１７】クローンWT1#3-3由来再生CTLの白血病細胞株THP1に対する細胞傷害活性を示す。細胞傷害活性はHLAクラスIに対する抗体で完全にブロックされた。
【図１８】クローンWT1#3-3由来再生CTLの白血病細胞株HL60に対する細胞傷害活性を示す。細胞傷害活性はHLAクラスIに対する抗体で完全にブロックされた。
【図１９】実施例５における非増殖コントロール。再生CTLをIL-7(5ng/ml)のみで培養したもの。
【図２０】実施例５における標的細胞無しのコントロール。標的細胞が無くても少し増殖しており、以後はこの増殖した部分をコントロールとする。
【図２１】再生CTLは自己HLAに対してはアロ反応性を示さない。
【図２２】再生CTLは一般に第３者HLAに対してもアロ反応性を示さない。
【図２３】再生CTLは第３者HLAに対してアロ反応性を示す場合がある。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本明細書ならびに請求の範囲において「多能性幹細胞」とは、生体に存在する多くの細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、自己増殖能を併せもつ幹細胞である。多能性幹細胞には、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞、胚性生殖細胞（「ＥＧ細胞」）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などが例示される。本願では特に、多能性幹細胞は、好ましくは、哺乳動物の多能性幹細胞であり、より好ましくはヒト多能性幹細胞である。ｉＰＳ細胞が好適に用いられる。本願明細書ならびに請求の範囲において、Ｔ細胞から誘導されるｉＰＳ細胞をＴ−ｉＰＳ細胞という。
【００２６】
本願明細書および請求の範囲において、「Ｔ細胞」とは表面にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と賞される抗原受容体を発現している細胞を意味する。Ｔ細胞からｉＰＳ細胞を誘導してもＴＣＲが維持されることは、例えばＷＯ２０１１／０９６４８２およびVizcardo et al., Cell Stem Cell 12、 31-36 2013 ()に報告されている。
【００２７】
ｉＰＳ細胞へと誘導されるＴ細胞としては、好ましくはＣＤ３を発現しており、且つＣＤ４及びＣＤ８からなる群から選択される少なくとも一の分子が発現しているＴ細胞である。このようなヒトＴ細胞としては、例えば、ＣＤ４陽性細胞であるヘルパー／制御性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性細胞である細胞傷害性Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞）、セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ−細胞）、及びターミナルエフェクターＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ−細胞）が挙げられる。
【００２８】
ヒトＴ細胞は、ヒトの組織から公知の手法により単離することができる。ヒトの組織としては、前記Ｔ細胞を含む組織であれば特に制限はないが、例えば、末梢血、リンパ節、骨髄、胸腺、脾臓、臍帯血、病変部組織が挙げられる。これらの中では、ヒトに対する侵襲性が低く、調製が容易であるという観点から、末梢血、臍帯血が好ましい。ヒトＴ細胞を単離するための公知の手法としては、例えば、後述の実施例に示すようなＣＤ４等の細胞表面マーカーに対する抗体と、セルソーターとを用いたフローサイトメトリーが挙げられる。また、サイトカインの分泌や機能性分子の発現を指標に、所望のＴ細胞を単離することも出来る。かかる場合、例えば、Ｔ細胞は、Ｔｈ１タイプかＴｈ２タイプかで分泌されるサイトカインが異なるので、そのようなサイトカインを指標に選別して、所望のＴｈタイプを有するＴ細胞を単離することができる。また、グランザイムやパーフォリンなどの分泌又は産生を指標として、細胞傷害性（キラー）Ｔ細胞を単離することが出来る。
【００２９】
「所望の抗原特異性を有するＴ細胞」あるいは「所望の抗原特異性ＴＣＲを有するＴ細胞」は、例えばドナー細胞から当該ＴＣＲを有する細胞傷害性Ｔ細胞を取得もしくは誘導することによって得ることができる。例えばがん抗原特異的な細胞障害性Ｔ細胞は、ドナーより常法により取得したリンパ球を、治療対象とするがんに特異的ながん抗原にて刺激して得ることができる。種々のがんについてがん抗原が特定されており、がん抗原あるいはそのエピトープペプチドを用いて細胞障害性Ｔ細胞を誘導する方法も良く知られている。または、治療対象とするがん細胞を用いてリンパ球を刺激してもよい。
【００３０】
あるいは、治療対象とするがんに罹患したドナーから得られた末梢血より、当該がんに特異的ながん抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導して用いてもよい。
【００３１】
「所望の抗原特異性を有するヒトＴ細胞」の単離においては、「所望の抗原特異性を有するＴ細胞」を含むヒト培養細胞またはヒトの組織より、所望の抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて精製する方法を採用することができる。また、所望の抗原を結合させたＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）を４量体化させたもの（いわゆる「ＭＨＣテトラマー」）を用いて、ヒトの組織より「所望の抗原特異性を有するＴ細胞」を精製する方法も採用することができる。
【００３２】
所望の抗原特異性を有するヒトＴ細胞から多能性幹細胞を誘導する。T細胞から多能性幹細胞細胞を得るには、例えばVizcardo et al., Cell Stem Cell 12、 31-36 2013 ()に記載の方法を持ちいてもよい。例えば治療対象とする疾患に対する免疫を獲得した対象から所望の抗原特異性を有するT細胞を得、この細胞へヤマナカ因子を導入してT-iPS細胞を得ることができる（Takahashi and Yamanaka, Cell 126, 663-673 (2006）, Takahashi et al., Cell 131, 861-872(2007) and Grskovic et al., Nat. Rev. Drug Dscov. 10,915-929(2011)) 。
【００３３】
人工多能性幹(iPS)細胞は、特定の初期化因子を、体細胞に作用させることによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；国際公開WO 2007/069666）。初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNAまたはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-coding RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotechnol., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する)
【００３４】
初期化因子は、その形態に応じた公知の方法にて体細胞へ接触、または体細胞内へ導入すればよい。
【００３５】
タンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、HIV由来のTATおよびポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。
【００３６】
DNAの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター(Science, 322, 945-949, 2008)、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（WO 2010/008054）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC、PAC)などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる(Science, 322:949-953, 2008)。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子(例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質(GFP)、βグルクロニダーゼ(GUS)、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞へ一旦導入して作用させた後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にLoxP配列を有してもよい。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する)
【００３７】
初期化因子がRNAの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良い。分解を抑制するため、5-メチルシチジンおよびpseudouridine (TriLink Biotechnologies)を取り込ませたRNAを初期化因子として用いても良い（Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7:618-630）。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する)
【００３８】
iPS細胞誘導のための培養液は、例えば、10〜15％FBSを含有するDMEM、DMEM/F12又はDME培養液（これらの培養液にはさらに、LIF、penicillin/streptomycin、puromycin、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）または市販の培養液[例えば、マウスES細胞培養用培養液(TX-WES培養液、トロンボＸ社)、霊長類ES細胞培養用培養液（霊長類ES/iPS細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（mTeSR、Stemcell Technology社）]などが例示される。
【００３９】
iPS細胞誘導の例としては、たとえば、37℃、5％CO2存在下にて、10％FBS含有DMEM又はDMEM/F12培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ約4〜7日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞(たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上にまきなおし、体細胞と初期化因子の接触から約10日後からbFGF含有霊長類ES細胞培養用培養液で培養することによって、該接触から約30〜約45日又はそれ以上ののちにES様コロニーを生じさせることができる。
【００４０】
あるいは、37℃、5% CO2存在下にて、フィーダー細胞(たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上で10％FBS含有DMEM培養液（これにはさらに、LIF、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で体細胞と初期化因子を接触させて培養し、約25〜約30日又はそれ以上ののちにES様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4:e8067またはWO2010/137746）、もしくは細胞外基質（例えば、Laminin-5（WO2009/123349）、Laminin-10（US2008/0213885）、その断片（WO2011/043405）およびマトリゲル（BD社））を用いる方法が例示される。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する)
【００４１】
この他にも、血清を含有しない培地を用いてiPS細胞を樹立する方法も例示される（Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:15720-15725）。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（0.1％以上、15％以下の酸素濃度）によりiPS細胞を樹立しても良い（Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:237-241またはWO2010/013845）。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する)
【００４２】
iPS細胞の樹立効率を高めるための成分として、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸 (VPA)、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool・ (Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、MEK阻害剤（例えば、PD184352、PD98059、U0126、SL327およびPD0325901）、Glycogen synthase kinase-3阻害剤（例えば、BioおよびCHIR99021）、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、5-azacytidine）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、BIX-01294 等の低分子阻害剤、Suv39hl、Suv39h2、SetDBlおよびG9aに対するsiRNAおよびshRNA等の核酸性発現阻害剤など）、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644)、酪酸、TGFβ阻害剤またはALK5阻害剤（例えば、LY364947、SB431542、616453およびA-83-01）、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA）、ARID3A阻害剤（例えば、ARID3Aに対するsiRNAおよびshRNA）、miR-291-3p、miR-294、miR-295およびmir-302などのmiRNA、Wnt Signaling（例えばsoluble Wnt3a）、神経ペプチドY、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンE2およびプロスタグランジンJ2）、hTERT、SV40LT、UTF1、IRX6、GLISl、PITX2、DMRTBl等が知られている。iPS細胞の樹立の際にはかかる樹立効率の改善目的にて用いられる成分を添加した培養液を用いてもよい。
【００４３】
上記培養の間には、培養開始2日目以降から毎日1回新鮮な培養液と培養液交換を行う。核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ100cm2あたり約5×103〜約5×106細胞の範囲である。
【００４４】
iPS細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Oct3/4、Nanog）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入し、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したiPS細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子として蛍光タンパク質遺伝子を導入し、蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、iPS細胞を選択することができる。誘導されたiPS細胞（T-iPS細胞）は由来するＴ細胞のT細胞受容体遺伝子を維持する。
【００４５】
次いで所望のT細胞受容体（TCR）遺伝子を有しているiPS細胞を、Ｔ前駆細胞または成熟T細胞へと分化誘導する。iPS細胞からT前駆細胞または成熟T細胞への分化誘導方法としては、例えばTimmermans et al., Journal of Immunology, 2009, 182: 6879-6888() に記載の方法が挙げられる。
【００４６】
本明細書ならびに請求の範囲において「T前駆細胞」とは、造血細胞の中の最も未分化な細胞である造血幹細胞に相当する段階から、正の選択/負の選択を受ける直前の細胞の段階に相当するまでを含む。T細胞の分化についてはBlood 111:1318（2008）, Nature Immunology 11: 585（2010）に説明されている。
【００４７】
T細胞には大きく分けてαβT細胞とγδT細胞があり、αβT細胞にはキラーT細胞とヘルパーT細胞が含まれる。本願は全てのT細胞を対象とする。本明細書ならびに請求の範囲において「iPS細胞からＴ細胞が誘導された」という場合には、Ｔ前駆細胞および成熟Ｔ細胞のいずれをも対象とするものとし、好ましくはＣＤ３を発現しており、且つＣＤ４及びＣＤ８からなる群から選択される少なくとも一の分子が発現しているＴ細胞を言うものとする。
【００４８】
所望の抗原特異的TCR遺伝子を有するiPS細胞から誘導されたT前駆細胞および成熟T細胞は、オリジナルのT細胞と同じ抗原特異性を維持したクローンとして得られる。投与するT細胞全てが単一の抗原特異性を示すことから、他家移植を行っても移植片宿主拒絶反応が誘導される可能性が低く、安全に免疫細胞療法を行うことができる。
【００４９】
本願の方法においては誘導されたT前駆細胞または成熟T細胞を適当な媒体、例えば生理的食塩水やPBSに懸濁して患者の治療に用いる。ドナーと患者とのHLA型は、完全に一致する場合、ドナーがHLAハプロタイプホモの場合には、少なくともその一方のHLAハプロタイプが一致する場合が例示される。
【００５０】
本発明の方法においては、誘導されたＴ前駆細胞または成熟Ｔ細胞を患者へ投与する前に好ましくは当該患者において移植片対宿主拒絶反応を誘導しないことを確認する。移植片対宿主拒絶反応を誘導しないことは、誘導されたＴ前駆細胞または成熟Ｔ細胞を、移植を受ける患者の何らかの組織の細胞、好ましくは患者のリンパ球細胞と混合して培養する混合リンパ球反応（Mixed Lymphocyte Reaction, ＭＬＲ）を事前に行うことによって確認することができる。MLRにおいてT-iPS細胞から分化誘導された再生T前駆細胞または再生成熟T細胞が患者のリンパ球のHLAをアロ抗原として認識すると、かかる細胞は活性化し、増殖する。かかる場合には当該患者の治療への当該再生T細胞の利用は危険である。一方、MLRにおいて再生T細胞が患者リンパ球のHLAをアロ抗原として認識しない場合には、再生T細胞は移植片対宿主拒絶反応を惹起せず、治療のために安全に投与することが可能である。
【００５１】
患者への投与は経静脈的に行えばよい。投与細胞数は特に限定されず、患者の年齢、性別、身長、体重、対象疾患、症状等に応じて適宜定めればよい。最適な投与細胞数は臨床試験により適宜決定すればよい。
【００５２】
T細胞は多様な抗原を攻撃対象とすることができ、本願の方法はがん、感染症、自己免疫疾患、アレルギーなどいろいろな疾患を対照とした免疫細胞療法への応用が可能である。例えば、ＷＴ１遺伝子は、例えば、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌などの固形癌において天然型で高発現しており、ＷＴ１特異的な細胞傷害活性を有するＣＴＬ細胞からＴ−ｉＰＳ細胞を誘導し、かかるＴ−ｉＰＳ細胞からＣＴＬ細胞を分化誘導した細胞を用いる場合には、ＷＴ１遺伝子を発現するこれら種々の癌の免疫細胞療法への応用が可能である。
【００５３】
また、Epstein-Barr（EB）ウイルスは多様な病気の原因になるウイルスであるが、伝染性単核球症、悪性リンパ腫（バーキットリフォーマ）、上咽頭がんなどのがんの原因ともなる。ＥＢウイルス関連抗原であるＬＭＰ２抗原特異的な細胞傷害性を有するＣＴＬ細胞からＴ−ｉＰＳ細胞を誘導し、かかるＴ−ｉＰＳ細胞からＣＴＬ細胞を分化誘導した細胞を用いる場合には、ＥＢウイルス関連の感染症や癌の免疫細胞療法への応用が可能である。
【００５４】
今まで提案されている種々のiPS細胞から分化誘導させたT細胞以外の細胞や組織を移植する治療法では、当該細胞が一生涯生着し続けることが期待されている。従って、他家移植を前提とするiPS細胞ストック事業においてiPS細胞から分化誘導される細胞を移植する際には、患者は免疫抑制剤を飲み続ける必要がある。この点は、自家iPS細胞と比して不利な点である。一方本願の方法を用いる場合、移植したT細胞は一定期間後に拒絶される。すなわちドナーと患者の間のHLAが一致する場合であっても、マイナー組織適合抗原が一致しないのでいずれは拒絶される。この点で、現在想定されているiPS細胞を用いた他家移植とは全く異なる、予想外の優れた効果が示される。
【００５５】
さらに、本願の方法では、患者毎の処置が不要であり、予め所望の抗原特異性を有するT-iPS細胞もしくは当該T-iPS細胞からT前駆細胞または成熟T細胞を再生したものをストックしておけば良い。よって、治療までの時間が短縮できるだけでなく、移植する前に移植細胞の品質の確認ができるというメリットもある。
【００５６】
例えばがん抗原を対象としたT細胞製剤の作製などがあげられる。具体例として、あるがん患者に対してがん抗原特異的T-iPS細胞を作製し、そのT-iPS細胞から作製したT細胞を元のがん患者に戻して効果を確認後にそのT-iPS細胞をバンク化して保存しておき、移植可能なHLA型の人が同じがん抗原を発現するがんに罹った場合バンク化したT-iPS細胞から作製したT細胞をその患者に投与することができる。あらかじめT細胞にして凍結保存しておけばよいので、事前準備ができより迅速に患者に投与して治療することができる。患者ごとにiPS細胞をつくらなくてよいので、その作製のための時間の必要がなく、また投与した細胞はいずれ拒絶されるので投与細胞のがん化のリスクは考えなくてよい。
【００５７】
なお、本願ではT細胞からiPS細胞を作製する方法を提示しているが、所望の抗原特異性を有するTCR遺伝子をiPS細胞の導入することによっても、同様の効果が得られると考えられる。
【実施例１】
【００５８】
ＥＢウイルス感染患者より得た末梢血単核球由来のＬＭＰ２抗原に特異性を有するＴ細胞よりＴ−ｉＰＳ細胞を誘導し（クローンLMP2#1）、当該Ｔ−ｉＰＳ細胞よりＬＭＰ２抗原特異的ＣＴＬ(再生LMP2-CTL#1)を誘導した。【００５９】
ＥＢウイルスは急性期には伝染性単核球症の原因となり、また時にバーキットリンパ腫などのがんの原因ともなるウイルスである。実施例でＴ細胞を提供しているのは、ＥＢウイルスに感染歴のある健常人である。このウイルスは、感染後リンパ球内に生涯にわたってとどまるので、この提供者はいわゆるＥＢウイルスキャリアーである。従ってこの提供者は、発症はしてないが、慢性ウイルス感染者とみなすことができる。【００６０】
1）LMP2抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の増幅
i)以下の培地を用いた。
樹状細胞用培地: CellGro (CellGenix)
【表１】
2016010153.tif 000003
ii) 以下のLMP2ペプチドを用いた。
LMP2: IYVLVMLVL（配列番号１）
LMP2テトラマーはMBLより購入した。
iii)以下のLCL(Lymphoblastoid cell line)を用いた。
京都大学病院血液腫瘍内科（日本国京都府京都市）にて健常人ボランティアＡから採取されたHLA-A2402を有するLCLを用いた。健常人ボランティアＡはEBウイルス既感染者であり、そのHLA型はHLA-A*02:06/24:02；B*39:01/40:02; C*07:02/15:02; DRB1*04:10/09:01である。【００６１】
A.ヒト末梢血より単球由来樹状細胞の誘導
1. HLA-A2402を有しかつEBウイルス既感染者でもある健常人ボランティアＡの末梢血よりCD14 microbeadsを用いて単球を単離した。洗浄後、樹状細胞用培地を加え、5 x 105/mLに調整した。
2. 最終濃度GM-CSF 800 U/mL （or 50 ng/mL）、IL-4 200 U/mL （or 40 ng/mL）になるようサイトカインを加えた。6-well plateに5 mL/wellでまく。37℃、5% CO2でインキュベートした。
3. インキュベートを3日間 (以下「Day 3」様に記載する) した後に、培養上清を2.5 mL/wellずつ、静かに取って捨てた。新しい樹状細胞用培地にGM-CSFを800 U/mL、IL-4を200 U/mLの濃度になるように加えた。
4. 各wellに3 mLずつ、新しい樹状細胞用培地を加えた。
5. Day 6に未成熟MoDCをプレートから回収し、少量の新しい樹状細胞用培地に浮遊させた。
6. 5 X 105/mLになるように細胞濃度を調整した。
7. GM-CSF （以下、最終濃度: 800 U/mL）、IL-4 （200 U/mL）、TNF-α （10 ng/mL）、PGE2 （1 μg/mL）を加え、24穴プレートに約5 X 105/1 mL/wellで細胞を播種した。
8. 37℃、5% CO2で24時間培養した。
9. 上記培養の最後の2時間にペプチドを加えた。ペプチドの最終濃度は10μｍとした。
DCを回収し、Ｔ細胞用培地で2回洗浄した。
10. DCの細胞数を数え、Ｔ細胞用培地で2 X 105/mLに調製した。【００６２】
B. ヒト末梢血よりＴ細胞の単離と樹状細胞との共培養
1. Aと同一の健常人ボランティアの末梢血より、CD3 microbeadsを用いてMACSにてＴ細胞を単離した。洗浄後、Ｔ細胞用培地を加え、2 x 106/mLに調整した。この時一部の細胞をフローサイトメトリー解析のために取り分けた。
2. 24穴プレートに、DC浮遊液（2 X 105/mL）を0.5mL/well、Ｔ細胞浮遊液（2 X 105/mL）を0.5mL/wellとなるように加えた。（DC: T = 1 X 105/well: 1 X 106/well = 1:10）
3. 3日目にIL-7（最終濃度5 ng/mL）、IL-15（最終濃度 10 ng/mL）を加えた。
4. 14日目に細胞を回収した。【００６３】
C.  LCLへのペプチド添加
1. LCLを培養中から回収し、35Gyの放射線照射を行った。
2. Ｔ細胞用培地に浮遊させ、5 X 105/mLとなるように調整した。
3. ペプチドを100nMで添加し2時間培養した。
4. LCLを回収し、Ｔ細胞用培地で洗浄後、2 X 105/mLとなるように調整した。【００６４】
D. LCLと樹状細胞で刺激したＴ細胞の共培養
1. 樹状細胞で刺激したＴ細胞をＴ細胞用培地に浮遊させ、2X106 cells/mLの濃度に懸濁した。
2. 24穴プレートに、ペプチドを加えて培養したLCL浮遊液（2X105/mL）を0.5mL/well、Ｔ細胞浮遊液（2 X 105/mL）を0.5mL/wellとなるように加えた（LCL:T = 1 X 105/well: 1 X 106/well = 1:10）。同時にペプチドを100nMとなるように添加した。
3.  3日目にIL-7（最終濃度5 ng/mL）、IL-15（最終濃度 1 ng/mL）を加えた。1週間ごとにサイトカインを添加したＴ細胞用培地で培地交換しながら2週間培養を行った。(LCLによるペプチド刺激1クール目)
4.   再度100nMのペプチドと加えた培地でLCLを2時間培養し、ここに CTLを加えた。
5.  3日目にIL-7（最終濃度5 ng/mL）とIL-15（最終濃度 1 ng/mL）を加えた。1週間ごとにサイトカインを添加したＴ細胞用培地で培地交換しながら2週間培養を行った。(LCLによるペプチド刺激2クール目)
6.  フローサイトメトリー解析により、CD8陽性Ｔ細胞中にCD8陽性LMP-2テトラマー陽性細胞が80%以上の割合で検出されることを確認した。結果を図１に示す。【００６５】
E. LMP2特異的CTLの抗原特異的キラー活性の測定
1. 標的細胞として用いるOUN-1白血病細胞株をCFSEラベルし、Ｔ細胞用培地に懸濁後、LMP2ペプチド1nM存在下で2時間培養を行った。
2.  96穴U底プレートに、ペプチド刺激によって増殖したLMP2特異的キラーＴ細胞とOUN-1白血病細胞株をそれぞれ0:1、1:9、  1:3、  1：1、  3：1となるように混合し、ペプチド存在下もしくは非存在下において標的細胞の死細胞比率をCFSE陽性分画中に見られるAnnexinVとPI(Propidium Iodide)の比率によって検定した。結果を図２に示す。
3.  LMP2特異的キラーＴ細胞は標的細胞に対し、抗原特異的キラー活性を示すことを確認した。【００６６】
2) LMP2-T-iPS細胞の樹立
A.  LMP2特異的CTLの活性化
1. MACS beadsによりCD8陽性細胞を濃縮した。
2. 全ての細胞をＴ細胞用培地に浮遊させ、IL-7（最終濃度5 ng/mL）、IL-15（最終濃度 10 ng/mL）を加えた。さらにDynabeads Human T-Activator CD3/CD28をＴ細胞：beadsが1：1となるように添加し、2日間培養することでCD8陽性細胞を活性化した。【００６７】
B. センダイウィルスによる山中4因子とSV40の導入
1. 活性化させたLMP2特異的CTLをＴ細胞用培地に浮遊させ、山中4因子とSV40が組み込まれたセンダイウィルスを培地中に添加し、そのまま2日間培養した。
2. Ｔ細胞用培地で洗浄し、さらにIL-7（最終濃度5 ng/mL）、IL-15（最終濃度 1ng/mL）を加えたＴ細胞用培地で2日間培養した。
3. 全ての細胞を回収後、IL-7（最終濃度5 ng/mL）、IL-15（最終濃度 1ng/mL）を添加したＴ細胞用培地でＴ細胞を懸濁し、フィーダー細胞上に播種した。
4.  2日目にiPS細胞用培地にて半量交換し、翌日から毎日iPS細胞用培地への半量交換を行い続け、培養を続けた。【００６８】
C. iPS細胞コロニーのピックアップ
1. 培養3週間後にiPS細胞コロニーを目視により確認した。
2. 200ulチップによりコロニーを物理的に拾い上げた。
3. 各クローンを個別にｉＰＳ細胞として樹立した。得られたクローンの写真を図３に示す。【００６９】
3) LMP2-iPS細胞からＴ細胞への分化誘導
各培地として下記の組成を用いた。
【表２】
2016010153.tif 000004
*ペニシリン/ストレプトマイシン溶液は、ペニシリン10000U/mLおよびストレプトマイシン10000μg/mLからなり、それぞれの最終濃度を100U/mLおよび100μg/mLとした。【００７０】
【表３】
2016010153.tif 000005
*ペニシリン/ストレプトマイシン溶液は、ペニシリン10000U/mLおよびストレプトマイシン10000μg/mLからなり、それぞれの最終濃度を100U/mLおよび 100μg/mLとした。【００７１】
【表４】
2016010153.tif 000006
*ペニシリン/ストレプトマイシン溶液は、ペニシリン10000U/mLおよびストレプトマイシン10000μg/mLからなり、それぞれの最終濃度を100U/mLおよび0μg/mLとした。【００７２】
OP9細胞の準備
0.1% ゼラチン/PBS溶液6mlを10cm培養ディッシュに入れ、37℃で30分以上静置した。コンフルエントになったOP9細胞をトリプシン/EDTA溶液で剥がし、1/4相当量をゼラチンコートした10cm培養ディッシュに播種した。培地はmedium Aを10mlとなるように加えた。
4日後に播種したOP9細胞培養ディッシュに新たにmedium Aを10ml加え、全量が20mlとなるようにした。【００７３】
iPS細胞からの血球前駆細胞誘導
共培養に使用するOP9細胞の培地を吸引し、新しいmedium Aに交換した。またiPS細胞培養ディッシュの培地も同様に吸引し、新しいmedium Aを10ml加えた。EZ-passageローラーでiPS細胞塊を切った。カットしたiPS細胞塊を200ulピペットマンでピペッティングすることで浮遊させ、目視でおおよそ600個のiPS細胞塊をOP9細胞上に播種した。
iPS細胞1クローンあたり3枚以上のディッシュを用い、継代するときには細胞を一度一つに合わせてから同じ枚数に再分配することでディッシュ間のばらつきを減らした。【００７４】
Day 1 (培地交換)
iPS細胞塊が接着し分化し始めているかどうかを確認し、培地を新しいmedium A 20mlに交換した。
Day 5  (培地半量交換)
半量分の培地を新しいmedium A 10mlに交換した。
Day 9  (培地交換)
半量分の培地を新しいmedium A 10mlに交換した。
Day 13 (誘導した中胚葉細胞をOP9細胞上からOP9/DLL1細胞上へ移しかえる)
培地を吸引し、HBSS(+Mg+Ca)で細胞表面上の培地を洗い流した。その後250U  collagenase IV/HBSS(+Mg+Ca) 溶液10mlを加え、37℃で45分間培養した。【００７５】
Collagenase溶液を吸引し、PBS(-)10mlで洗い流した。その後5mlの0.05%トリプシン/EDTA溶液を加え、37℃で20分培養した。培養後、細胞が膜状に剥がれてくるのでピペッティングにより物理的に細かくした(接着細胞同士を離すため)。ここに新しいmedium Aを20ml加え、さらに37℃で45分間培養した。培養後、浮遊細胞を含む上清を、100μｍのメッシュを通して回収した。4℃、1200rpmで7分間遠心し、ペレットを10mlのmedium Bに懸濁させた。このうち1/10をFACS解析用にとりわけ、残りの細胞を新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。複数枚のディッシュから得た細胞をプールした場合、元々の枚数と同じ枚数になるように再分配して細胞を播き直した。【００７６】
得られた細胞に造血前駆細胞が含まれているかどうかを確かめるために抗CD34抗体、抗CD43抗体を用いてFACS解析した。結果を図４に示す。CD34lowCD43+細胞分画に十分な細胞数が確認できたことから、造血前駆細胞が誘導されていると確認した。【００７７】
C. 血球前駆細胞からのＴ細胞分化誘導
次いで細胞をOP9/DLL1細胞上に播種した。この工程において、CD34lowCD43+細胞分画の細胞のソーティングは行わなかった。(この分画をソーティングした場合、得られる細胞数が減少してしまうことやソーティングによる細胞へのダメージから、ソーティングしなかった場合に比べてＴ細胞への分化誘導効率が落ちることがある。)【００７８】
培養期間中に分化段階を確認するためにFACS解析を行うが、全ての期間において培養中に死細胞が多くみられた。そのためFACS解析時にはPI (Propidium Iodide)、7-AADなどを用い、死細胞除去したうえで解析を行った。【００７９】
Day 16 (細胞の継代)
OP9細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし、100μｍのメッシュを通して50mlコニカルチューブに回収した。4℃、1200rpmで7分間遠心し、ペレットを10mlのmedium Bに懸濁させた。これらの細胞を新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。【００８０】
Day 23 (細胞の継代): 血液細胞コロニーが見え始める。
OP9細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし、100μｍのメッシュを通して50mlコニカルチューブに回収した。4℃、1200rpmで7分間遠心し、ペレットを10mlのmedium Bに懸濁させた。【００８１】
Day 36: LMP2テトラマー陽性Ｔ細胞の確認。
ＬＭＰ２特異的Ｔ細胞が誘導されているかどうかを確かめるために抗ＣＤ３抗体、ＬＭＰ２テトラマーを用いてＦＡＣＳ解析した。
結果を図５に示す。Ｔ細胞マーカーであるＣＤ３＋細胞がみられるようになり、一部の細胞はＣＤ３＋ＬＭＰ２テトラマー＋にまで分化していることが確認された。【００８２】
D. 未熟Ｔ細胞段階から成熟キラーＴ細胞段階への誘導
Day36において、フローサイトメトリーでLMP2陽性Ｔ細胞を確認後、成熟キラーＴ細胞(CD8SP細胞)を誘導するためにここでIL-15を添加した。24穴プレートに新たにOP9/DLL1細胞を用意しておき、medium Cに懸濁したＴ細胞を3x105個/wellとなるように播種し。ここにIL-15（最終濃度10ng/mL）を添加した。【００８３】
Day41: 成熟キラーＴ細胞が現れる。
ＩＬ−１５添加の５日目に、ＦＡＣＳ解析した。結果を図６に示す。成熟ＣＤ８シングルポジティブ細胞が生成したことが確認された。【００８４】
4) 再生したLMP2特異的CTLの抗原特異的キラー活性の測定
1. 標的細胞として用いるLCLをCFSEラベルし、Ｔ細胞用培地に懸濁後、LMP2ペプチド1nM存在下で2時間培養を行った。
2. 96穴U底プレートに、再生したCD8Ｔ細胞と標的細胞として用いるLCLをれぞれ0:1、1:9、  1:3、  1：1、  3：1、10:1、30：1となるように混合し、ペプチド存在下（p+）もしくは非存在下（p-）において標的細胞の死細胞比率をCFSE陽性分画中に見られるAnnexinVとPI(Propidium Iodide)によって検定した。
3.  結果を図７に示す。LMP2特異的キラーＴ細胞は標的細胞として用いたLCL(HLA-A2402)に対し、抗原特異的キラー活性を示すことが確認された。【００８５】
5) 再生したLMP2特異的CTLのナチュラルキラー細胞様キラー活性の測定
1. 標的細胞としてHLAを表面に発現しないK562細胞株（アロ反応性）と健常人ボランティアＡの自己末梢単核球（MA p-）（オート反応性）を用いた。これらの細胞をCFSEにてラベルし、Ｔ細胞用培地に懸濁した。
2. 96穴U底プレートに、再生したCD8Ｔ細胞と標的細胞として用いるLCLをれぞれ0:1、1:9、  1:3、  1：1、  3：1となるように混合し、標的細胞の死細胞比率をCFSE陽性分画中に見られるAnnexinVとPI(Propidium Iodide)によって検定した。
3.  結果を図８に示す。LMP2特異的キラーＴ細胞は自己末梢単核球（MA p-）は傷害しなかったが、K562に対して高いキラー活性を示したことから、ナチュラルキラー様キラー活性を示すことを確認した。【００８６】
6) 再生したLMP2特異的CTLの抗原特異的キラー活性の測定
方法)
1. 標的細胞として用いるLCLをCFSEラベルし、T細胞用培地に懸濁後、LMP2ペプチド存在下で2時間培養を行った。
2. 96穴U底プレートに、再生したCD8シングルポジティブT細胞（再生LMP2-CTL(#1)）と標的細胞として用いるLCLをそれぞれ0:1、1:3、1：1、3：1、9:1となるように混合し、いろいろな濃度のLMP2ペプチド存在下もしくは非存在下において共培養を行った。6時間後に、標的細胞の死細胞比率をCFSE陽性分画中に見られるAnnexinV陽性細胞率によって検定した。結果を図９に示す。
３．再生LMP2-CTL(#1)はペプチドをロードした標的細胞に対して高い抗原特異的細胞傷害活性を示した。
【実施例２】
【００８７】
実施例１とは別の健常人ボランティアから、実施例１の手順に従いＬＭＰ２ペプチド特異的ＣＴＬを誘導し、当該ＣＴＬからＴ−ｉＰＳ細胞を誘導し(クローンLMP#13)、更にＴ−ｉＰＳ細胞からＣＤ８シングルポジティブＴ細胞（再生LMP2-CTL(#13)）を得た。使用したＬＭＰ２ペプチドは実施例１と同じである。得られた再生LMP2-CTL(#13)のペプチド特異的ＣＴＬ活性を、ペプチドをロードしたＬＣＬ細胞を標的細胞として用いた細胞傷害活性により確認した。結果を図１０に示す。
実施例２の健常人ボランティアはＥＢウイルス既感染者（EBNA抗体陽性）であり、下記ＨＬＡ型を有する：
HLA-A*02:10/24:02；B*07:02/40:06; C*07:02/08:01; DRB1*04:05/04:05【００８８】
再生LMP2-CTL（＃13）はペプチドをロードした標的細胞に対して高い抗原特異的細胞傷害活性を示した
【実施例３】
【００８９】
健常人ボランティアの末梢血より誘導したＷＴ１抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）からＴ−ｉＰＳ細胞を誘導し（クローンWT1#9）、当該Ｔ−ｉＰＳ細胞よりＷＴ１抗原特異的成熟Ｔ細胞（再生WT1-CTL(#9)）を誘導した。【００９０】
実施例は、以下の構成である。
1）WT1抗原特異的CTLの増幅
2)  WT1-T-iPS細胞の樹立
3)  WT1-T-iPS細胞からCD8シングルポジティブＴ細胞（CTL）への分化誘導
4)  3)で得た再生WT1-CTLの抗原特異的細胞傷害活性の確認【００９１】
1）WT1抗原特異的CTLの増幅
i)用いた培地は以下の通りである。
【表５】
2016010153.tif 000007
ii) 用いたWT1ペプチドは以下の通りである。
WT1 (改変型：CYTWNQMNL(配列番号２), Cancer Immunol. Immunothera. 51: 614 (2002))
以下で使用しているWT1ペプチド，WT1テトラマーともに改変型を用いた。
iii) 用いたLCL(Lymphoblastoid cell line)は以下のとおりである
京都大学病院血液腫瘍内科（日本国京都府京都市）にて健常人ボランティアから採取されたHLA-A2402を有するLCLを用いた。【００９２】
A.ヒト末梢血からのＴ細胞の単離とペプチドによる刺激
1.  健常人ボランティアの末梢血より単核球をFicollによって精製し，Ｔ細胞培地で懸濁した。健常人ボランティアのHLA型はHLA-A*02:01/24:02；B*15:01/15:11; C*03:03/08:01; DRB1*12:01/12:02である。
2. 96穴U底プレートに1穴あたり2.5 x 105/mLとなるように細胞を播種し，ペプチドを10μｍ となるように添加した。
3.3日目にIL-2(最終濃度  12.5U/mL), IL-7（最終濃度5 ng/mL），IL-15（最終濃度 1 ng/mL）を加え，1週間ごとにサイトカインを添加したＴ細胞用培地で培地交換しながら2週間培養を行った。【００９３】
B.  LCLへのペプチド添加
1.LCLを回収し，35Gyの放射線照射を行った。
2. Ｔ細胞用培地に浮遊させ，5 X 105/mLとなるように調整した。
3. ペプチドを100 nMで添加し2時間培養した。
4. LCLを回収し，Ｔ細胞用培地で洗浄後，2 X 105/mLとなるように調整した。【００９４】
C.ペプチドをパルスしたLCLとＴ細胞との共培養
1.ペプチド刺激を加えた後，2週間培養したＴ細胞を回収し，洗浄後にＴ細胞用培地に懸濁し，2 x 106/mLに調整した。この時一部の細胞をフローサイトメトリー解析のために取り分けた。
2.24穴プレートに，ペプチドを加えて培養したLCLの浮遊液（2 X 105/mL）を0.5mL/well，Ｔ細胞浮遊液（2 X 105/mL）を0.5mL/wellとなるように加えた（LCL: T = 1 X 105/well: 1 X 106/well = 1:10）。 
3.   3日目にIL-2(最終濃度  12.5U/mL), IL-7（最終濃度5 ng/mL），IL-15（最終濃度 1 ng/mL）を加えた。1週間ごとにサイトカインを添加したＴ細胞用培地で培地交換しながら2週間培養を行った。(LCLによるペプチド刺激1クール目)
4. 再度100nMのペプチドと加えた培地でLCLを2時間培養し，ここに CTLを加えた。 
5. 3日目にIL-2(最終濃度  12.5U/mL), IL-7（最終濃度5 ng/mL），IL-15（最終濃度 1 ng/mL）を加えた。1週間ごとにサイトカインを添加したＴ細胞用培地で培地交換しながら2週間培養を行った。(LCLによるペプチド刺激2クール目)
6. 再度100nMのペプチドと加えた培地でLCLを2時間培養し，ここに CTLを加えた。
7. 3日目にIL-2(最終濃度  12.5U/mL), IL-7（最終濃度5 ng/mL），IL-15（最終濃度 1 ng/mL）を加えた。1週間ごとにサイトカインを添加したＴ細胞用培地で培地交換しながら2週間培養を行った。(LCLによるペプチド刺激3クール目)
8.  フローサイトメトリー解析を行った。結果を図11に示す。CD8陽性WT1テトラマー陽性分画がCD8陽性Ｔ細胞中に60%以上の割合で検出されることを確認した。【００９５】
2) WT1-T-iPS細胞の樹立
A.  WT1特異的CTLの活性化
1. MACS beadsによりCD8陽性細胞を濃縮した。
2. 全ての細胞をＴ細胞用培地に浮遊させ，IL-2 (最終濃度  12.5U/mL), IL-7（最終濃度5 ng/mL），IL-15（最終濃度 1ng/mL）を加えた。さらにDynabeads Human T-Activator CD3/CD28をＴ細胞：beadsが1：1となるように添加し，2日間培養することでCD8陽性細胞を活性化した。【００９６】
B. センダイウィルスによる山中4因子とSV40の導入
1.活性化させたWT1特異的CTLをＴ細胞用培地に浮遊させ，山中4因子とSV40が組み込まれたセンダイウィルスを培地中に添加し，そのまま2日間培養した。
2.Ｔ細胞用培地で洗浄し，さらにIL-2 (最終濃度  12.5U/mL), IL-7（最終濃度5 ng/mL），IL-15（最終濃度 1ng/mL）を加えたＴ細胞用培地で2日間培養した。
3.   全ての細胞を回収後，サイトカインを含まないＴ細胞用培地でＴ細胞を懸濁し，フィーダー細胞上に播種した。
4.  2日目にiPS細胞用培地に半量交換し，翌日から毎日iPS細胞用培地への半量交換を行い続け，培養を続けた。【００９７】
C. iPS細胞コロニーのピックアップ
1.3週間後にiPS細胞コロニーを目視により確認した。
2. 200ulチップによりコロニーを物理的に拾い上げた。
3. 各クローンを個別に樹立した。得られたクローンのコロニーを図１２に示す。【００９８】
3) WT1-T-iPS細胞からＴ細胞への分化誘導
各培地の組成を下記に示す。
【表６】
2016010153.tif 000008
*ペニシリン/ストレプトマイシン溶液は、ペニシリン10000U/mLおよびストレプトマイシン10000μg/mLからなり、それぞれの最終濃度を100U/mLおよび100μg/mLとした。【００９９】
【表７】
2016010153.tif 000009
*ペニシリン/ストレプトマイシン溶液は、ペニシリン10000U/mLおよびストレプトマイシン10000μg/mLからなり、それぞれの最終濃度を100U/mLおよび 100μg/mLとした。【０１００】
OP9細胞の準備
0.1% ゼラチン/PBS溶液6mlを10cm培養ディッシュに入れ，37℃で30分以上静置した。コンフルエントになったOP9細胞をトリプシン/EDTA溶液で剥がし，1/4相当量をゼラチンコートした10cm培養ディッシュに播種した。培地はmedium Aを10mlとなるように加えた。
4日後に播種したOP9細胞培養ディッシュに新たにmedium Aを10ml加え，全量が20mlとなるようにした。【０１０１】
iPS細胞からの血球前駆細胞誘導
共培養に使用するOP9細胞の培地を吸引し，新しいmedium Aに交換した。またiPS細胞培養ディッシュの培地も同様に吸引し，新しいmedium Aを10ml加えた。EZ-passageローラーでiPS細胞を切った。カットしたiPS細胞塊を200ulピペットマンでピペッティングすることで浮遊させ，目視でおおよそ600個のiPS細胞塊をOP9細胞上に播種した。
iPS細胞1クローンあたり3枚以上のディッシュを用い，継代するときには細胞を一度一つに合わせてから同じ枚数に再分配することでディッシュ間のばらつきを減らした。
Day 1 (培地交換)
iPS細胞塊が接着し分化し始めているかどうかを確認し，培地を新しいmedium A 20mlに交換した。
Day 5  (培地半量交換)
半量分の培地を新しいmedium A 10mlに交換した。
Day 9  (培地交換)
半量分の培地を新しいmedium A 10mlに交換した。
Day 13 (誘導した中胚葉細胞をOP9細胞上からOP9/DLL1細胞上へ移しかえる)
培地を吸引し，HBSS(+Mg+Ca)で細胞表面上の培地を洗い流した。その後250U  collagenase IV/HBSS(+Mg+Ca) 溶液10mlを加え，37℃で45分間培養した。
Collagenase溶液を吸引し，PBS(-)10mlで洗い流す。その後5mlの0.05%トリプシン/EDTA溶液を加え，37℃で20分培養した。培養後，細胞が膜状に剥がれてくるので、ピペッティングにより物理的に細かくした(接着細胞同士を離すため)。ここに新しいmedium Aを20ml加え，さらに37℃で45分間培養した。培養後，浮遊細胞を含む上清を，100μｍのメッシュを通して回収した。4℃，1200rpmで7分間遠心し，ペレットを10mlのmedium Bに懸濁させた。このうち1/10をFACS解析用にとりわけ，残りの細胞を新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。複数枚のディッシュから得た細胞をプールした場合，元々の枚数と同じ枚数になるように再分配して細胞を播き直した。【０１０２】
得られた細胞に造血前駆細胞が含まれているかどうかを確かめるために抗CD34抗体，抗CD43抗体を用いてFACS解析した。結果を図１３に示す。ＣＤ３４ｌｏｗＣＤ４３＋細胞分画に十分な細胞数が確認できたことから，造血前駆細胞が誘導されていると確認した。【０１０３】
C. 血球前駆細胞からのＴ細胞分化誘導
次いで細胞をOP9/DLL1細胞上に播種した。この工程において，ＣＤ３４ｌｏｗＣＤ４３＋細胞分画の細胞のソーティングは行わなかった。この分画をソーティングした場合，得られる細胞数が減少してしまうことやソーティングによる細胞へのダメージから，ソーティングしなかった場合に比べてＴ細胞への分化誘導効率が落ちることがある。
Day 16 (細胞の継代)
OP9細胞に緩く接着している細胞を，穏やかに複数回ピペッティングし，100μｍのメッシュを通して50mlコニカルチューブに回収した。4℃，1200rpmで7分間遠心し，ペレットを10mlのmedium Bに懸濁させた。これらの細胞を新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。
Day 23 (細胞の継代): 血液細胞コロニーが見え始める。
OP9細胞に緩く接着している細胞を，穏やかに複数回ピペッティングし，100μｍのメッシュを通して50mlコニカルチューブに回収した。4℃，1200rpmで7分間遠心し，ペレットを10mlのmedium Bに懸濁させた。
Day 36 : WT1テトラマー陽性Ｔ細胞の確認。
WT1特異的Ｔ細胞が誘導されているかどうかを確かめるために抗CD3抗体，WT1テトラマーを用いてFACS解析した。結果を図１４に示す。
Ｔ細胞マーカーであるＣＤ３＋細胞がみられるようになり，大部分の細胞はＣＤ３＋ＷＴ１テトラマー＋にまで分化していることが確認された。【０１０４】
上記のとおり、誘導されたＴ細胞が、元のＴ細胞と同じ抗原特異性を示すＴ細胞となることが確認された。また、得られたＴ細胞は成熟した細胞が出す表面抗原を発現していることから、機能的によく成熟していることが確認された。【０１０５】
４) WT1-T-iPS細胞分化誘導されたＴ細胞の抗原特異的細胞傷害活性
1.  標的細胞として用いるLCLをCFSEラベルし、T細胞用培地に懸濁後、WT1ペプチド(配列番号２)の存在下で2時間培養を行った。
2. 96穴U底プレートに、再生したCD8シングルポジティブT細胞と標的細胞として用いるLCLをれぞれ0:1、1:3、1：1、3：1、9:1となるように混合し、いろいろな濃度のペプチド存在下もしくは非存在下において共培養を行った。6時間後に、標的細胞の死細胞比率をCFSE陽性分画中に見られるAnnexinV陽性細胞率によって検定した。【０１０６】
再生WT1-CTL（＃9）はペプチドをロードした標的細胞に対して高い抗原特異的細胞傷害活性を示した(図１５)。
【実施例４】
【０１０７】
実施例３と同一の健常人ボランティアから、実施例３の手順に従いWT1ペプチド特異的ＣＴＬを誘導し、当該ＣＴＬからＴ−ｉＰＳ細胞（クローンWT1#3-3）を誘導し、更にＴ−ｉＰＳ細胞からＣＤ８シングルポジティブＴ細胞（再生WT1-CTL(#3-3)）を得た。使用したWT1ペプドは実施例３と同じである。得られた再生WT1-CTL(#3-3)のペプチド特異的ＣＴＬ活性を、当該ペプチドをロードしたＬＣＬ細胞を標的細胞として用いた細胞傷害活性試験により確認した。【０１０８】
結果を図１６に示す。再生WT1-CTL（＃3-3）はペプチドをロードした標的細胞に対して高い抗原特異的細胞傷害活性を示した。【０１０９】
また、再生WT1-CTL（＃3-3）のWT1抗原を発現する白血病細胞株THP1並びに同じくWT1抗原を発現する白血病細胞株HL60に対する細胞傷害活性、並びにHLAクラスIに対する抗体によってその細胞傷害活性がブロックできるかどうかを調べた。結果を図１７および図１８に示す。
再生WT1-CTL(#3-3)はWT1を発現するTHP-1およびHL60株両方に対して細胞傷害活性を示し、かかる細胞傷害活性はHLAクラスIに対する抗体で完全にブロックされた。この結果から、再生WT1-CTL(#3-3)はWT1抗原特異的に白血病細胞を殺傷していると考えられる。
【実施例５】
【０１１０】
再生CTLの、アロ第三者の末梢血単球に対するアロ反応性について調べた。
エフェクター細胞：実施例３で得た再生WT1-CTL(#9)
（HLA-A*02:01/24:02；B*15:01/15:11; C*03:03/08:01; DRB1*12:01/12:02のボランティア末梢血単球由来）
標的細胞：他の健常人ボランティア由来末梢血単球＋B細胞
ボランティアA：HLA-A*02:06/24:02；B*40:01/52:01; C*12:02/15:02; DRB1*08:02/15:02
ボランティアB：HLA-A*02:10/24:02；B*07:02/40:06; C*07:02/08:01; DRB1*04:05/04:05【０１１１】
エフェクター細胞は蛍光色素であるＣＳＦＥでラベルした。標的細胞としては、ボランティアＡおよびＢの末梢血からそれぞれ抗ＣＤ１４および抗ＣＤ１９マックスビーズを用いて濃縮して得た末梢血単球とＢ細胞を用いた。【０１１２】
エフェクター細胞の増殖は、CFSEの蛍光強度から細胞分裂の程度を調べることによって測定した。エフェクターが活性化されると細胞分裂が進みCFSEが低下する。【０１１３】
エフェクター細胞である再生WT1-CTL(#9)を標的細胞無し、IL-7(5ng/ml)のみを添加した培地にて6日間培養した。再生CTL細胞の増殖は認められず、細胞は活性化されなかった(非増殖コントロール、図１９)。【０１１４】
再生CTL細胞を標的細胞無し、IL-2(20U/ml)、IL-7(5ng/ml)、IL-15(10ng/ml)の存在下で6日間培養したところ、図１９と比較して細胞分裂が生じ、少し増殖したことがわかる(図２０)。以下の試験では、このデータを標的細胞無しのコントロールとして、標的細胞がある場合と比較する。【０１１５】
エフェクター細胞：８×１０４個、標的細胞２×１０５個を混合して６日間培養した後に、CFSEの蛍光強度を測定することにより、細胞分裂の程度を調べた。【０１１６】
標的細胞としてクローンWT#9の由来するボランティアの末梢血由来の単球とB細胞を用いた場合の結果を図２１に示す。標的細胞無しの場合とほとんど同じ、すなわちWT1-CTL(#9)は全く活性化されていないことがわかる。再生CTLは自己HLAに対してはアロ反応性を示さない。【０１１７】
標的細胞として、ボランティアA末梢血由来の細胞を用いた場合の結果を図２２に示す。再生CTLはHLAが全く相違するボランティアA由来の標的細胞に対してアロ反応性を示さないことが確認された。再生WT1-CTL(#9)はクローン化された細胞であり、クローン化によりアロ反応性T細胞の混入を防ぐことができたことが判明した。【０１１８】
標的細胞としてボランティアB末梢血由来の細胞を用いた場合の結果を図２３に示す。標的細胞がボランティアB由来の細胞である場合、再生WT1-CTL(#9)は活性化された。すなわち、クローンＷＴ１＃９とボランティアＢの組み合わせでの免疫細胞療法は危険であることがわかる。クローン化した場合であってもアロ反応性が惹起される可能性が完全に無くなるわけではない。よって、免疫細胞療法にあたっては、クローン化された再生ＣＴＬを患者へ投与する際に、予めスクリーニングすることが必要である。
【図１】
2016010153.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2016010153.tif 000016
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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