【手続補正書】
【提出日】平成24年4月5日(2012.4.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４】
角層中におけるAGEs存在量の定量は、１）採取された角層を、AGEsを認識する標識抗体と反応させ、２）角層中における標識存在量を、免疫組織染色した角層の画像を用いた画像解析により推定することを特徴とする、請求項１〜３の何れか一項に記載の皮膚状態の評価方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項７】
化粧料選択のための皮膚状態の評価方法であることを特徴とする、請求項１〜６の何れか一項に記載の皮膚状態の評価方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１０】
前記AGEs分解剤は、モクセイ科に属する植物、ユキノシタ科に属する植物、バラ科に属する植物、マメ科に属する植物又はキク科に属する植物より得られる抽出物であることを特徴とする、請求項９に記載の化粧料の選択方法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１１】
前記モクセイ科に属する植物、ユキノシタ科に属する植物、バラ科に属する植物、マメ科に属する植物より得られる抽出物が、モクセイ科オリーブ属オリーブ、ユキノシタ科ユキノシタ属ユキノシタ、バラ科シモツケソウ属シモツケソウ（別名セイヨウナツユキソウ）、マメ科アスパラトゥス属ルイボス、バラ科ポテンチラ属トルメンチラより得られる植物抽出物であることを特徴とする、請求項１０に記載の化粧料の選択方法。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
この様な状況に鑑みて、本発明者等は、角層を用いた皮膚性状の鑑別において、その鑑別範囲を拡大し、化粧料の選択の確度を向上せしめる技術を求めて、鋭意努力・研究を重ねた結果、角層中におけるAGEs含有量を指標とする皮膚状態の評価方法、並びに、当該評価方法を用いた化粧料の選択方法を見出し、本発明を完成させるに至った。発明は、以下に示す通りである。
＜１＞ 角層中におけるAGEs（advanced glycation end products：AGEs）の存在態様を指標とする、皮膚状態の評価方法。
＜２＞ 前記AGEsの存在態様は、角層中におけるAGEsの存在量であることを特徴とする、＜１＞に記載の皮膚状態の評価方法。
＜３＞ 採取された角層中に存在するAGEsを定量し、該AGEsの存在量が多いほど皮膚の状態が好ましくない状態にあると鑑別することを特徴とする、＜１＞又は＜２＞に記載の皮膚状態の評価方法。
＜４＞ 角層中におけるAGEs存在量の定量は、１）採取された角層を、AGEsを認識する標識抗体と反応させ、２）角層中における標識存在量を、免疫組織染色した角層の画像を用いた画像解析により推定することを特徴とする、＜１＞〜＜３＞の何れか一項に記載の皮膚状態の評価方法。
＜５＞ 前記の皮膚状態の評価が、表皮弾力性及び／又は皮膚表面形態の評価であることを特徴とする、＜１＞〜＜４＞の何れか一項に記載の皮膚状態の評価方法。
＜６＞ 前記の皮膚表面形態の評価が、平均粗さ（Ra）の評価であることを特徴とする、＜５＞に記載の皮膚状態の評価方法。
＜７＞ 化粧料選択のための皮膚状態の評価方法であることを特徴とする、＜１＞〜＜６＞からの何れか一項に記載の皮膚状態の評価方法。
＜８＞ 採取された角層について、角層の形状の特徴、角層におけるメラニンの存在状況と共に＜１＞〜＜７＞の何れか一項に記載のAGEsの存在態様から求められる皮膚状態の評価値を因子として加え、化粧料を選択することを特徴とする、化粧料の選択方法。
＜９＞ ＜８＞に記載の化粧料の選択方法において、AGEsの存在態様より鑑別される皮膚状態の評価値が好ましいものではなかった場合、AGEs分解剤を含有する化粧料を勧めるステップを有することを特徴とする、＜８＞に記載の化粧料の選択方法。
＜１０＞ 前記AGEs分解剤は、モクセイ科に属する植物、ユキノシタ科に属する植物、バラ科に属する植物、マメ科に属する植物又はキク科に属する植物より得られる抽出物であることを特徴とする、＜９＞に記載の化粧料の選択方法。
＜１１＞ 前記モクセイ科に属する植物、ユキノシタ科に属する植物、バラ科に属する植物、マメ科に属する植物より得られる抽出物が、モクセイ科オリーブ属オリーブ、ユキノシタ科ユキノシタ属ユキノシタ、バラ科シモツケソウ属シモツケソウ（別名セイヨウナツユキソウ）、マメ科アスパラトゥス属ルイボス、バラ科ポテンチラ属トルメンチラより得られる植物抽出物であることを特徴とする、＜１０＞に記載の化粧料の選択方法。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明における採取された角層標本を用い角層中におけるAGEsの存在量を測定する方法としては、得られた角層標本をホモジネートし、これによりAGEsを抽出して、これを高速液体クロマトグラフ法などの化学的分析方法、又は、角層中におけるAGEsを特異的に認識する抗体を利用した直接又は間接法による免疫組織染色方法等の生化学的分析方法の何れかを単独で用いることも出来るし、それらを組み合わせて用いることも出来る。これらの内、好ましいものとしては、AGEsを特異的に認識する抗体によりAGEsを標識した後、発色試薬を用いて染色する免疫組織染色方法による生化学的分析方法を用いることが好ましい。具体的には、免疫組織染色方法に用いる一次抗体としては、Anti AGE monoclonal antibody（mouse、TransGenic社製）、二次抗体としては、Biotin−Rabbit Anti Mouse IGg conjugate、ZYMED社製）を用い、二次抗体を認識するABC試薬（R．Ｔ．U VＥＣＴＡＳＴＡＩＮ社製）、さらには、発色試薬として、ＡＥＣ基質を反応させ、免疫組織染色することが好適に例示出来る。また、前記の一次抗体以外に、一次抗体としてCML（carboxy
methyl lysine、TransGenic社製）及びペントシジン（TransGenic社製）、二次抗体として、蛍光ビオチンやFITC標識抗体等を使用することも可能である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
＜本発明の角層中におけるAGEsの存在量のスコア化による定量化検討＞
以下の手順に従い、角層中におけるAGEsの存在量をスコア化した。
１） 被験者
２００７年１０月に静岡県在住の健常成人女性４０名（２０〜５６歳、平均年齢３８．１歳）の顔頬部を対象に皮膚状態を評価した。
２） 角層中におけるAGEsの免疫組織染色
頬部よりセロハンテープで採取した角層をスライドガラスに転写し、一次抗体（anti AGE monoclonal antibody, mouse、TransGenic社製）、二次抗体（Biotin-Rabbit Anti Mouse IgG conjugate、ZYMED社製）で反応後、ABC試薬（R．Ｔ．U VECTASTAIN社製）で反応させてAEC基質（DAKO社製）で発色させた。
３） 角層中におけるAGEs存在量のスコア化検討
免疫組織染色した画像を用い、グレード１〜５までの角層AGEs標準標本を作製し、これらを基準にとして各角層AGEs標本の５段階によるスコア化を行った。角層AGEs標準標本におけるグレード１〜５は、標本中における角層AGEsの免疫組織染の色度合いを指標としてグレードを分類した（図１参照）。角層中におけるAGEs評価グレードを用い、４０名の角層中におけるAGEs含有量を評価した。
４） 角層中におけるAGEs存在量のImage Jを用いた画像解析検討
顕微鏡にて２０〜５０倍に拡大された染色された角層AGEs標本の拡大画像をデジタル式のマイクロスコープ等を利用して、コンピュータに取り込み、汎用的な画像解析ソフトウエアを用いて、手動又は自動処理を行い、AGEsの存在量を定量化することが出来る。デジタル式のマイクロスコープとしては、例えば、（株）モリテックスのコスメテック用マイクロスコープ、汎用的画像解析のソフトウエアとしては、例えば、三谷商事（株）のWinRooF（登録商標）が好適に例示出来る。画像処理は、一般的な手法によって行えばよく、例えば、角層AGEs標本の拡大イメージ画像であるカラー画像をモノクロ濃淡画像に変換後、当該モノクロ画像に必要に応じてフィルターを処理後、二値化処理を行い、統計処理によって角層AGEsの存在割合に相関する染色部の総面積を算出した。