(57)【要約】  本発明に係るコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子は、中心より表面の平衡膨潤倍率が高く、中心から表面に向けた平衡膨潤倍率の変化曲線に変曲点が存在するコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子であって、表面から深さ８００ｎｍまでのプローブ押込み力が２０ｎＮ以下である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
中心より表面の平衡膨潤倍率が高く、中心から表面に向けた平衡膨潤倍率の変化曲線に変曲点が存在するコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子であって、
表面から深さ８００ｎｍまでのプローブ押込み力が２０ｎＮ以下である、コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子。
【請求項２】
前記変曲点から前記表面までの平衡膨潤倍率が４０以上である、請求項１に記載のコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子。
【請求項３】
中心より表面の平衡膨潤倍率が高く、中心から表面に向けた平衡膨潤倍率の変化曲線に変曲点が存在するコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子であって、
変曲点から表面までの平衡膨潤倍率が６５以上である、コアシェル型ヒアルロン酸ゲル粒子。
【請求項４】
前記変曲点から前記表面までの距離が５μｍ以上である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を製造する製造方法であって、架橋ヒアルロン酸ゲル粒子と塩基性物質とを接触させることにより、当該ゲル粒子にコアシェル構造を形成させることを含む、製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を製造する製造方法であって、架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の表面に、当該架橋ヒアルロン酸ゲル粒子よりもヒアルロン酸の架橋密度の低い架橋ヒアルロン酸ゲルのシェルを形成させることを含む、製造方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を含む医用材料。
【請求項８】
関節注入剤、薬理活性物質の担体、創傷被覆剤、組織置換型生体組織修復剤、癒着防止剤、止血剤、人工細胞外マトリクス及びダーマルフィラーから選ばれるいずれかである、請求項７に記載の医用材料。
【請求項９】
関節注入剤である、請求項７又は８に記載の医用材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子、その製造方法及び医用材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンとβ−Ｄ−グルクロン酸が交互に結合した直鎖状の高分子多糖である。ヒアルロン酸は、優れた生体適合性及び粘弾性を示すことから、医用分野への展開が進んでいる。例えば、変形性膝関節症のための粘性補充剤として各種溶液製剤が市販されている。【０００３】
ヒアルロン酸は、脊椎動物の硝子体・関節液・皮膚などに広く分布しており、眼下手術補助剤・関節注入剤等の医薬品、医療機器、化粧品及び健康食品に広く応用されている。ヒアルロン酸は、本来の生体成分として組織や器官中に高濃度で存在していることから、本質的に安全性が極めて高い。【０００４】
ヒアルロン酸としては、架橋ヒアルロン酸ゲルも知られている。例えば、自己架橋したヒアルロン酸粒子を用いた粘性補充剤が特許文献１に開示されおり、ヒアルロン酸を高濃度にゲル化することにより薬効が高まるとされている。【０００５】
一方、生体貯留性が向上した各種架橋ヒアルロン酸ゲルも市販されている（例として、シンビスク（Ｓｙｎｖｉｓｃ）：登録商標、デュロレイン（Ｄｕｒｏｌａｎｅ）：登録商標、モノビスク（Ｍｏｎｏｖｉｓｃ）：登録商標、ゲル・ワン（Ｇｅｌ−Ｏｎｅ）：登録商標）。【０００６】
しかし、架橋ヒアルロン酸ゲルは、生体貯留性が向上するという特性を持つ一方で、ヒアルロン酸溶液と比較して、弱い異物反応があることも知られている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第１２／０２６４６８号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，Ｖｏｌ．２０，ｐ．４４５−４５４（２００２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ヒアルロン酸溶液と同程度にまで異物反応が低減され、生体親和性の高い架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を提供することを目的とする。【００１０】
また、本発明は、当該ゲル粒子の製造方法及び当該ゲル粒子を含む医用材料を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、中心より表面の平衡膨潤倍率が高く、中心から表面に向けた平衡膨潤倍率の変化曲線に変曲点が存在するコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子であって、表面から深さ８００ｎｍまでのプローブ押込み力が２０ｎＮ以下である、コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を提供する。【００１２】
本発明のコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子は、その表面がヒアルロン酸溶液に近い軟らかさを有しており、分子構造はほとんど変わらないにもかかわらず、異物反応を低減させることができ、高い生体親和性が得られる。【００１３】
コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子は、変曲点から表面までの平衡膨潤倍率が４０以上の粒子であることが好ましい。すなわち、コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の重心から表面方向への長さを横軸（Ｘ）に、所定の横軸位置での平衡膨潤倍率を縦軸（Ｙ）にプロットして得られた、平衡膨潤倍率の変化曲線において、変曲点が存在する横軸位置（Ｘｃ）から、表面に対応する横軸位置（Ｘｓ）までの間の、平衡膨潤倍率の値（Ｙ）が４０以上であることが好ましい。【００１４】
コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子における表面部分の平衡膨潤倍率が上記範囲であることにより、粒子の表面が、ヒアルロン酸溶液にさらに近い軟らかさを確保できるため、コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子は、ヒアルロン酸溶液と同程度にまで異物反応が低減された、高い生体親和性を有する粒子となる。【００１５】
本発明はまた、中心より表面の平衡膨潤倍率が高く、中心から表面に向けた平衡膨潤倍率の変化曲線に変曲点が存在するコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子であって、変曲点から表面までの平衡膨潤倍率が６５以上である、コアシェル型ヒアルロン酸ゲル粒子を提供する。【００１６】
上記コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子は、その表面がヒアルロン酸溶液に近い軟らかさを有しており、分子構造はほとんど変わらないにもかかわらず、異物反応を低減させることができ、高い生体親和性が得られる。【００１７】
コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子は、変曲点から表面までの距離が５μｍ以上であることが好ましい。すなわち、横軸位置（Ｘｃ）から横軸位置（Ｘｓ）までの長さが、コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子において、５μｍ以上であることが好ましい。【００１８】
変曲点から表面までの距離が上記範囲であることから、粒子の表面の軟らかい部分の厚みを確保することができ、粒子の投与後に関節内等において表面が分解しても、内部から新たに平衡膨潤倍率の高い表面部分が現れると考えられ、長期的にヒアルロン酸溶液と同程度にまで異物反応が低減され、高い生体親和性を保持することができる。【００１９】
本発明は、上述したコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を製造する製造方法であって、架橋ヒアルロン酸ゲル粒子と塩基性物質とを接触させることにより、当該ゲル粒子にコアシェル構造を形成させることを含む、製造方法を提供する。【００２０】
このような製造方法で得られるコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子は、表面がヒアルロン酸溶液に近い軟らかさを有し、生体内で架橋ヒアルロン酸ゲル粒子と認識されにくいため、ヒアルロン酸溶液と同程度にまで異物反応が低減され、生体親和性が高い。【００２１】
本発明はまた、コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を製造する製造方法であって、架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の表面に、当該架橋ヒアルロン酸ゲル粒子よりもヒアルロン酸の架橋密度が低い架橋ヒアルロン酸ゲルのシェルを形成させることを含む、製造方法を提供する。【００２２】
このような製造方法で得られるコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子もまた、表面がヒアルロン酸溶液に近い軟らかさを有し、生体内で架橋ヒアルロン酸ゲル粒子と認識され難いため、ヒアルロン酸溶液と同程度にまで異物反応が低減され、生体親和性が高い。【００２３】
本発明はさらに、上記コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を含む医用材料を提供する。【００２４】
このようなコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を含む医用材料は、例えば当該医用材料を生体内に投与した場合でも、生体内で異物と認識され難くなることから炎症作用等が起こりにくく、ヒアルロン酸溶液を含む医用材料と同様に高い生体親和性を確保することができる。【００２５】
医用材料は、関節注入剤、薬理活性物質の担体、創傷被覆剤、組織置換型生体組織修復剤、癒着防止剤、止血剤、人工細胞外マトリクス、及びダーマルフィラーから選ばれるいずれかとして適用可能である。【００２６】
このような医用材料は、生体内等で異物として認識され難くなることから炎症作用等が起こりにくく、ヒアルロン酸溶液を含む医用材料と同様に高い生体親和性を確保することができる。以上のような観点から、特に関節注入剤として用いた場合に、顕著な効果が発揮されることからより好ましい。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、ヒアルロン酸溶液と同程度にまで異物反応が低減され、生体親和性の高い架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を提供することが可能になる。
また、当該ゲル粒子の製造方法及び当該ゲル粒子を含む医用材料を提供することも可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の一実施形態に係るコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子のメチレンブルー染色後に、ニグロシン水溶液で陰性染色した時の顕微鏡写真である。
【図２】本発明の一実施形態に係るコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子からなる関節注入剤と、ヒアルロン酸製剤との疼痛抑制効果を比較して示すグラフである。
【図３】本発明の一実施形態に係るコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子からなる関節注入剤と、ヒアルロン酸製剤との疼痛抑制効果を比較して示すグラフである。
【図４】本発明の一実施形態に係るコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の平衡膨潤倍率の変化曲線を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明の好適な実施形態について説明するが、本発明は、これらの実施形態に何ら限定されるものではない。
【００３０】
先ず、コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子について説明する。実施形態に係るコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子は、中心から表面に向けた平衡膨潤倍率の変化曲線に変曲点が存在する粒子である。ここで、コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子は、ゲルの状態で粒子形状を有していればよく、必ずしも球状のものに限られない。また、コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の中心とは、当該粒子の重心をいい、その位置は顕微鏡イメージ等で特定可能である。「中心から表面に向けた平衡膨潤倍率の変化曲線に変曲点が存在する」とは、縦軸を平衡膨潤倍率とし、横軸を中心から粒子表面に向けた直線距離として（中心を横軸０とする）、平衡膨潤倍率をプロットして得られる変化曲線に変曲点が存在することを意味する。なお、プロットは横軸０．２〜１５μｍごと（好ましくは、横軸０．５〜５μｍごと）に行うことが好ましく、プロットの近似曲線として変化曲線を得ることが好ましい。
【００３１】
変化曲線における変曲点は複数存在してもよいが、変曲点は１つ存在することが好ましい。変化曲線の形状としては、横軸の特定の領域において、平衡膨潤倍率の線が急峻に立ち上がった形状が好ましく（立ち上がりの前後は、平衡膨潤倍率はなだらかな変化を示すことが好ましい。すなわち、変曲点が１つ存在し、この変曲点の前後において、変化曲線の傾きの変化率が正から負に変化することが好ましい）、この特定領域の間に変曲点が存在する。そしてこの変曲点よりも内側の粒子部分を「コア」、外側の粒子部分を「シェル」と呼ぶことができる。なお、コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の中心から表面までの直線は複数観念できるが、その直線の一つを選んでそれを横軸とし、平衡膨潤倍率が上述のとおり変化すればよい。
【００３２】
架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の平衡膨潤倍率は、共焦点顕微レーザーラマン分光法により算出することができる。共焦点顕微レーザーラマン分光法により、ゲル粒子内の特定の微小範囲におけるヒアルロン酸濃度を分析し、平衡膨潤倍率が既知のサンプルを指標とすることで、当該特定の微小範囲における平衡膨潤倍率を算出することができる。また、ゲル粒子内の任意の特定の微小範囲における平衡膨潤倍率を算出することができることから、共焦点顕微レーザーラマン分光法による平衡膨潤倍率の算出、及び一定の微小範囲の移動を繰り返すことで、ゲル粒子内部における平衡膨潤倍率の挙動変化を観察することもできる。
【００３３】
測定は二段階に分けられる。一段階目は、水系溶媒中（緩衝液中）で平衡膨潤状態にあるゲル粒子内部の特定の微小範囲を分析することで得られる水に由来するピークのラマン強度と、ヒアルロン酸に由来するピークのラマン強度の比率から、ヒアルロン酸濃度と相関のある数値を算出する段階である。二段階目は、平衡膨潤倍率が既知のサンプルを用いて、平衡膨潤倍率とヒアルロン酸濃度と相関のある数値の検量線を作成し、架橋ヒアルロン酸ゲル粒子内の特定の微小範囲におけるヒアルロン酸濃度と相関のある数値を基に、平衡膨潤倍率を算出する段階である。より具体的には、光学顕微鏡像から架橋ヒアルロン酸ゲル粒子における０．５〜５μｍの範囲の測定部分を指定し、得られたスペクトル図より水のＯ−Ｈ結合に由来する波数（３４２０ｃｍ−１）に対するヒアルロン酸のＣ−Ｈ結合に由来する波数（２９４０ｃｍ−１）のラマン強度比を求め、下記式（１）により算出することができる。
【００３４】
平衡膨潤倍率の計算値＝[（ＨＯ−Ｈ／ＨＣ−Ｈ）−検量線の切片]／検量線の傾き
・・・（１）
（ＨＯ−Ｈ：３４２０ｃｍ−１のラマン強度、ＨＣ−Ｈ：２９４０ｃｍ−１のラマン強度）
【００３５】
架橋ヒアルロン酸ゲル粒子全体の平衡膨潤倍率は、水系溶媒中（緩衝液中）で平衡膨潤状態にあるゲル粒子を濾過によって取り出した際のゲル粒子の体積と、当該ゲル粒子をさらに乾燥させた際の体積の倍率により表される。
【００３６】
上記平衡膨潤倍率は、濾過によって水系溶媒中（緩衝液）を除去した際の架橋ヒアルロン酸ゲルの湿潤重量と、さらに乾燥させた際の架橋ヒアルロン酸ゲルの重量の比（Ｑｗ）と密度を用いて、下記式（２）により算出することができる。
【００３７】
平衡膨潤倍率＝１＋（ρ／ρ０）×（Ｑｗ−１）・・・（２）
（ρ：架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の密度、ρ０：水系溶媒（緩衝液）の密度）
【００３８】
濾過によって水系溶媒（緩衝液）を除去する方法は特に限定されないが、例えば遠心式フィルタユニットを用いた遠心濾過法、メンブランフィルタを用いた減圧濾過法等を適宜用いることができる。
【００３９】
平衡膨潤倍率は、溶媒の塩濃度やｐＨ、温度、膨潤時間等により影響を受けるため、１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．０）で、ＮａＣｌ濃度は０．９ｗｔ％のものを用い、５℃で１日間膨潤させ、平衡膨潤状態に到達した後に測定する。
【００４０】
なお、コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の組成及び平衡膨潤倍率の測定法によれば、変曲点における平衡膨潤倍率は、２０〜８０の範囲（特には、４０〜６０の範囲であり、５０程度）となり得る。
【００４１】
コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子においては、表面から深さ８００ｎｍまでのプローブ押込み力が２０ｎＮ以下である。ここで、深さ方向は、表面から中心（重心）に向けた方向とすることが好ましい。また、プローブ押込み力とは、走査型プローブ顕微鏡を用いて測定される弾性として測定される。すなわち、水系溶媒中（緩衝液中）で平衡膨潤状態にある架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を試料台におき、上方より、先端に１０μｍ径の（球形）ガラス粒子を取り付けたコロイダルプローブを、架橋ヒアルロン酸ゲル表面から深さ８００ｎｍまで押込んで、プローブにかかる力（プローブ押込み力）として測定される。
【００４２】
押込み力は１０ｎＮ以下であることが好ましい。押込み力が２０ｎＮ以下ということは、コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子表面の弾性が低いことを意味し、生体内に投与した場合でも、生体内で異物として認識されにくくなることから、炎症作用が抑制され、ヒアルロン酸溶液と同様に高い生体親和性を確保することができる。
【００４３】
変曲点から表面における点まで、すなわちシェルの平衡膨潤倍率は４０以上であることが好ましく、５０以上であることがより好ましく、６５以上であることがさらに好ましい。コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子のシェルの平衡膨潤倍率が上記範囲であることによって、当該粒子の表面がヒアルロン酸溶液に近い軟らかさを確保できるため、生体内で異物と認識され難く、ヒアルロン酸溶液と同程度にまで異物反応が低減された、高い生体親和性を有する粒子を得ることができる。以上のような観点からすれば、上記平衡膨潤倍率は、７５以上であることが特に好ましい。なお、シェルの平衡膨潤倍率は、上述した変曲点における平衡膨潤倍率よりも高い値を示す。
【００４４】
変曲点から前記表面における点までの、コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子における厚み方向の距離が５μｍ以上であることが好ましい。当該距離は、コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子における少なくとも１か所以上について、中心から表面に向けて特定の微小範囲における平衡膨潤倍率を順次測定した場合の、前記変曲点から前記表面における点までの移動距離であればよい。シェルの厚みが上記範囲であることによって、コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子が生体内で異物として認識されにくくなり、ヒアルロン酸溶液と同様に高い生体親和性を確保できる。また、当該ゲル粒子を投与した後に、関節内等で平衡膨潤倍率の高いシェル表面部分が分解しても、内部から新たに平衡膨潤倍率の高いシェル表面部分が生成するため、長期的にヒアルロン酸溶液と同様に高い生体親和性を維持することができる。以上のような観点からすれば、上記シェルの厚みは、１０μｍ以上であることがより好ましい。
【００４５】
コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子のシェルの厚みは、コアのみを染色したコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の顕微鏡観察により、外殻の透明部分の厚み方向の長さとしても測定することができる。具体的には、染色されたコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲルの画像をデジタルマイクロスコープで撮影し、当該ゲル粒子表面からコアとシェルの境界までの距離を、ゲル粒子１個あたり１点以上測定する。この測定をゲル粒子１００個に対して行い、その平均値からシェルの厚みを算出することができる。
【００４６】
染色は、ヒアルロン酸を染色できる公知のいずれの方法でも可能であるが、メチレンブルー又はアクリジンオレンジによる染色が好ましい。さらに、透明なシェルと水系溶媒の境界を判断しやすくするため、水系溶媒のみをニグロシン等で陰性染色することがより好ましい。具体的には、水系溶媒中（緩衝液中）で平衡膨潤状態にあるコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子に、メチレンブルー水溶液を添加し、十分撹拌することで染色を行う。続いて、サンプルを試料台に乗せ、デジタルマイクロスコープによる観察の直前に、ニグロシン水溶液を添加することで陰性染色を行うことができる。
【００４７】
続いて、コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を製造する方法について説明する。
【００４８】
本発明の実施形態において、ヒアルロン酸は、動物組織から抽出したものでも、醗酵法で製造したものでも、その起源を問うことなく使用することができる。
【００４９】
醗酵法で使用する菌株は、自然界から分離されるストレプトコッカス属等のヒアルロン酸生産能を有する微生物、又は特開昭６３−１２３３９２号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄第９０２７号）、特開平２−２３４６８９号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ−３００（微工研菌寄第２３１９号）のような高収率で安定したヒアルロン酸を生産する変異株が望ましい。
【００５０】
ヒアルロン酸は、例えばナトリウム、カリウム、又はリチウム塩のような、本技術分野において許容される塩の形態で使用することもできる。
【００５１】
架橋ヒアルロン酸ゲル粒子は、ヒアルロン酸の自己架橋であるエステル構造を有する自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を使用することができる。
【００５２】
自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子は、ヒアルロン酸と、ヒアルロン酸濃度を５質量％以上にする水、及びヒアルロン酸のカルボキシル基と等モル以上の酸成分とを共存させ、該共存状態を低温で保持することにより得られる。
【００５３】
ヒアルロン酸に共存させる酸は特に限定されず、公知のいずれの酸も使用できるが、ヒアルロン酸よりも強い酸であることが好ましく、無機酸であることがより好ましい。さらに好ましくは、塩酸、硝酸、又は硫酸であり、その中でも、ハンドリング等に優れた硝酸が特に好ましい。共存させる酸の量は特に限定されないが、ヒアルロン酸のカルボキシル基と等モル以上の酸成分の量とすることができる。ヒアルロン酸に共存させる酸は、ヒアルロン酸が全体の１５質量％以上、好ましくは、２０質量％以上４０質量％以下で含まれるような量で保持することが好ましい。この保持は、−３０℃以上２５℃以下の温度で、１時間〜２０日間のいずれの期間でもよい。特に好ましくは、−２５℃以上―５℃以下の温度で、１日〜１５日間である。ヒアルロン酸と、ヒアルロン酸に共存させる酸との混合は、共存させる酸にヒアルロン酸を全体の１５質量％以上、好ましくは２０質量％以上となるように加え、共存させる酸を均一な状態にすることで行うことが好ましい。このほか、ヒアルロン酸に共存させる酸を全体の１５質量％以上、好ましくは２０質量％以上となるよう含浸させることもでき、さらに、低濃度で調整したヒアルロン酸の酸性水溶液を、ヒアルロン酸が、全体の１５質量％以上、好ましくは２０質量％以上となるように濃縮することもできる。
【００５４】
得られた自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の懸濁液中での濃度は、例えば、以下のように定量することができる。まず、自己架橋ヒアルロン酸ゲル懸濁液を蒸留水で希釈し、水酸化ナトリウム水溶液を添加し、室温にて静置することで、自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子のエステル結合を加水分解し溶解する。次に、この溶液に塩酸を添加し中和した後、当業者に既知のカルバゾール硫酸法によりグルクロン酸濃度を定量する。このグルクロン酸濃度と、既知濃度のヒアルロン酸を標準物質として、自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の懸濁液中での濃度を算出することができる。
【００５５】
コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の製造方法としては、架橋ヒアルロン酸ゲル粒子における表面部分の架橋構造を一部分解して軟らかくシェル化する表面処理法、又は当該粒子の表面に軟らかいシェルを形成させるシェル合成法が挙げられる。このような製造方法によって得られるコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子は、生体内で異物として認識されにくくなることから炎症作用を抑制させることができ、ヒアルロン酸溶液と同様に高い生体親和性を確保できる。
【００５６】
上記表面処理法は、ヒアルロン酸の架橋構造を特異的に分解できる化学処理によって架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の表面部分の架橋を一部切断し、ヒアルロン酸の架橋密度を低下させることで、平衡膨潤倍率を増加させる、すなわち軟らかくシェル化させる方法である。これにより、架橋ヒアルロン酸ゲル粒子にコアシェル構造を形成させることができる。ヒアルロン酸の架橋構造と、特異的に分解できる化学処理との組合せは任意であるが、例えばヒアルロン酸の自己架橋であるエステル構造と塩基性物質による処理の組合せが挙げられる。この組合せによるコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の製造方法は、自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を原料とし、酸性溶液で膨潤させた後、水と水溶性有機溶媒との混合液中で、該ゲル粒子の表面と塩基性物質とを接触させる方法である。塩基性物質は、自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の表面から内部へ浸透すると同時に、エステル結合を分解し、浸透した部分の平衡膨潤倍率を増加させる。
【００５７】
自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を膨潤させる酸性溶液は特に限定されず、公知のいずれの酸も使用することができるが、水溶性の酸であることが好ましく、無機酸の強酸であることがより好ましい。また、酸性溶液の濃度は特に限定されるものではないが、好ましくは自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子のカルボキシル基の等モル以上の濃度である。酸性溶液の量も特に限定されるものではないが、例えば、自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子のカルボキシル基に対して、０．１〜２０倍モルであることが好ましく、０．３〜５倍モルであることがより好ましい。
【００５８】
混合液における水溶性有機溶媒は、特に限定されず、公知のいずれの水溶性有機溶媒も使用できるが、グリセリン、ジメチルスルホキシド、エタノール、メタノール、エチレングリコール、ポリエチレングリコールが好ましく、その中でもグリセリンが特に好ましい。
【００５９】
混合液における上記水溶性有機溶媒の比率は、特に限定されないが、５０％以上であることが好ましく、６０〜９０％であることがより好ましく、７０〜８０％であることが特に好ましい。
【００６０】
塩基性物質は、特に限定されず、公知のいずれの塩基性物質も使用できるが、水と水溶性有機溶媒との混合液に溶解する塩基性物質であることが好ましく、４級アンモニウムヒドロキシドであることがより好ましい。このような塩基性物質としては、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムヒドロキシド、ジメチルジステアリルアンモニウムヒドロキシド、テトラブチルアンモニウムヒドロキシドがさらに好ましく、その中でも、両親媒性であるヘキサデシルトリメチルアンモニウムヒドロキシドであることが特に好ましい。塩基性物質の量は特に限定されないが、自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を膨潤させる酸性溶液の１〜３０倍モルの量であることが好ましく、２〜１０倍モルであることがより好ましい。
【００６１】
上記シェル合成法は、架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の表面に、当該架橋ヒアルロン酸ゲル粒子よりもヒアルロン酸の架橋密度の低い架橋ヒアルロン酸ゲルのシェルを形成させる方法である。形成されるシェルの合成方法は、特に限定されず、公知のいずれの架橋ヒアルロン酸ゲルの合成法でもコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を製造することができる。
【００６２】
具体的には、架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の存在下で、ヒアルロン酸溶液、架橋基を有する化合物、及び架橋剤を混合する、又は架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の存在下で、架橋基で修飾されたヒアルロン酸溶液、及び架橋剤を混合することで、該ゲル粒子の表面に当該架橋ヒアルロン酸ゲル粒子よりもヒアルロン酸の架橋密度の低い架橋ヒアルロン酸ゲルのシェルを形成させる。
【００６３】
ヒアルロン酸、又は架橋基で修飾されたヒアルロン酸を溶解する溶液は、特に限定されないが、水と水溶性有機溶媒との混合液が好ましく、この場合、特に水溶性有機溶媒がＴＨＦ、ジオキサン、アセトン、エタノール等であることがより好ましい。
【００６４】
架橋基で修飾されたヒアルロン酸とは、両端にヒアルロン酸と結合する能力を有する構造を持つ架橋基の一方が、ヒアルロン酸と結合した構造を持つ修飾ヒアルロン酸のことで、さらに架橋基を有する化合物を追加しなくとも、単独で架橋剤によりゲル化する能力を有する修飾ヒアルロン酸のことである。
【００６５】
架橋基を有する化合物は、特に限定されず、ヒアルロン酸を架橋することができる公知のいずれの架橋基を有する化合物でも使用できるが、穏やかな中性の反応条件で架橋反応を進行させることが可能な化合物が好ましい。
【００６６】
架橋剤は、特に限定されず、ヒアルロン酸を架橋できる公知のいずれの架橋剤でも使用できるが、穏やかな中性の反応条件で架橋反応を進行させることが可能な架橋剤が好ましい。
【００６７】
コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子は、一般の医用材料及びヒアルロン酸が用いられる分野であれば特に制限なく用いることができるが、例示するとすれば、例えば、関節注入剤、薬理活性物質の担体、創傷被覆剤、組織置換型生体組織修復剤、癒着防止剤、止血剤、人工細胞外マトリクス、ダーマルフィラー、その他診断又は治療に用いる医療器具、医療用具等の生物医学的製品又は医薬組成物への使用等が挙げられる。その中でも特に、関節注入剤として使用した場合に、顕著な効果が発揮される。
【００６８】
コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子は、生体内で異物として認識されにくくなることから炎症作用を抑制することができ、ヒアルロン酸溶液と同様に高い生体親和性を確保できる。本発明の実施形態に係るコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の高い生体親和性とは、より具体的には、ウサギ膝関節内で当該ゲル粒子の局所刺激性により増加する白血球数を指標として分析した場合、回収した膝関節液サンプル希釈液６ｍＬにおいて、１００×１０４個／ｍＬを越さない程度の白血球数であることが好ましく、１０×１０４個／ｍＬ以下の白血球数であることがより好ましい。
【実施例】
【００６９】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００７０】
（比較例１）
２Ｎの硝酸７５ｇを自公転型混練り装置（プライミクス社製）に入れ、−１０℃に冷却し、シャーベット状の硝酸凍結物を得た。この硝酸凍結物に、粘度平均分子量２２０万のヒアルロン酸ナトリウム粉末２２．５ｇ（水分含量１０％）を投入し、−１０℃、１００ｒｐｍで均一なゴム状になるまで１時間練り混ぜた（ヒアルロン酸ナトリウム２０．８質量％）。得られたヒアルロン酸と硝酸の混合物を−２０℃に設定した冷凍庫に１０日間保存した。その後、５℃の純水１Ｌにこの混合物を投入し、１時間ごとに２回純水を交換した。その後さらに、５℃、５０ｍＭのリン酸緩衝液１Ｌにこの混合物を投入し、１時間ごとに５回５０ｍＭのリン酸緩衝液を交換し、硝酸が完全になくなるまで中和洗浄を行い、自己架橋ヒアルロン酸ゲルを得た。【００７１】
上記で得られた自己架橋ヒアルロン酸ゲルを中和後３０分間静置し、上清をデカンテーションで除き、沈降した自己架橋ヒアルロン酸ゲルに対して、９倍重量の５０ｍＭリン酸緩衝液を加えた。この自己架橋ヒアルロン酸ゲル懸濁液を高速回転装置に投入し、破砕することで、自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の懸濁液を得た。【００７２】
上記で得られた自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の懸濁液を３０分間静置し、上清をデカンテーションで除いた。残った自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の懸濁液に対して、９倍重量の生理食塩水を加え、１０分ごとに１０回生理食塩水を交換した。次に、目開きの大きい順にふるい（試験用：鉛フリー、直径：１５０ｍｍ、深さ：６０ｍｍ、目開き：５００μｍ、３５５μｍ、２１２μｍ、１２５μｍ、５３μｍ）で分級し、粒径の異なる６種類の自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の懸濁液（＞５００μｍ、５００〜３５５μｍ、３５５〜２１２μｍ、２１２〜１２５枚μｍ、１２５〜５３μｍ、＜５３μｍ）を得た。【００７３】
上記で得られた自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の懸濁液を、蒸留水及びエタノールで洗浄し、減圧乾燥させることで乾燥した自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を得た。【００７４】
また、自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の平衡膨潤倍率は以下のように算出した。自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の懸濁液０．４ｍｌ（溶媒：１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．０）、塩化ナトリウム濃度０．９ｗｔ％）を、遠心式フィルタユニット（０．４５マイクロメートル孔径、ミリポア社製）を用いて５℃、２０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離して溶媒を除去し、溶媒除去した自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の重量を測定した。さらに当該粒子を２０時間乾燥させ、乾燥した自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の重量を測定した。両測定値から、平衡膨潤倍率を算出したところ、得られた自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の平衡膨潤倍率は５．９であった。【００７５】
（実施例１）
比較例１で得られた乾燥した自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子（０．１ｇ、５００〜３５５μｍ）を０．５Ｍ塩酸（０．７ｍＬ）で、室温（２０〜２５℃）下、３分間膨潤させた。２５％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムヒドロキシド／メタノール溶液（１．６５ｍＬ）と８０％グリセリン水溶液（４５ｍＬ）の混合液を添加し、８分間撹拌後、６Ｍ塩酸（０．５ｍＬ）を添加し中和した。【００７６】
７０％エタノール及び生理食塩水で各５回洗浄し、コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を生理食塩水懸濁液の状態で得た。【００７７】
得られたコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の収率は以下の通り行った。得られたコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の懸濁液全量の上清を除き、蒸留水で薄めた。１Ｎ水酸化ナトリウム（２ｍＬ）を加え、２分間撹拌をすることで溶解させ、１Ｎ塩酸（２ｍＬ）を加えて中和した。得られたヒアルロン酸溶液のヒアルロン酸濃度をカルバゾール硫酸法で算出し、ヒアルロン酸溶液量と自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子原料の量から収率を算出したところ、９２％であった。【００７８】
（実施例２）
８０％グリセリン水溶液を８０％ジメチルスルホキシド水溶液に変更し、撹拌時間を８分間から３分間に変更した以外は実施例１と同様の方法でコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を得た。収率は８２％であった。【００７９】
（実施例３）
８０％グリセリン水溶液を７０％エタノール水溶液に変更し、撹拌時間を８分間から３分間に変更した以外は実施例１と同様の方法でコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を得た。収率は６１％であった。【００８０】
（実施例４）
０．５Ｍ塩酸を０．５Ｍ酢酸に変更した以外は、実施例３と同様の方法でコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を得た。収率は３％であった。【００８１】
（実施例５）
撹拌時間を８分間から１２分間に変更した以外は、実施例１と同様の方法でコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を得た。収率は８９％であった。【００８２】
（実施例６）
２５％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムヒドロキシド／メタノール溶液を２５％ジメチルジステアリルアンモニウムヒドロキシド／メタノール溶液に変更した以外は、実施例３と同様の方法でコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を得た。収率は７７％であった。【００８３】
（比較例２）
７０％エタノール水溶液を１０％エタノール水溶液に変更した以外は、実施例３と同様の方法でコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を得た。収率は５４％であった。【００８４】
（比較例３）
０．５Ｍ塩酸による膨潤を行わなかった以外は、実施例３と同様の方法でコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を得た。収率は７０％であった。【００８５】
（参考例１）
ヒアルロン酸関節製剤「スベニール」（中外製薬（株）製；粘度平均分子量２００万、ヒアルロン酸濃度１ｗ／ｖ％、商品名）を用いた。【００８６】
（試験例１）
実施例１〜６並びに比較例２〜３のコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の表面の弾性は、走査型プローブ顕微鏡による表面のプローブ押込み力から分析した。なお、測定条件を以下のとおりとした。
走査型プローブ顕微鏡：ＳＰＭ−９７００型（島津製作所社製、商品名）
プローブ：１０μｍ径の（球形）ガラス質粒子を取り付けたコロイダル型プローブ（ＣＰ−ＣＯＮＴ−ＢＳＧ−Ｂ、東陽テクニカ社製）
押込み距離：８００ｎｍ
測定回数：３回
測定温度：２３±２℃【００８７】
各架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の生理食塩水懸濁液を装置内の試料台に採取し、装置のステージ上においた。光学顕微鏡で架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を観察しながら、プローブを測定位置の上方にセットし、真下へプローブを３０００ｎｍ程度移動させながら、フォースカーブを取得した。測定で得られたフォースカーブより、粒子表面から押込み距離８００ｎｍまでの間にプローブがたわんだ距離に、プローブのバネ定数を乗じて力の大きさを算出し、弾性とした。【００８８】
（試験例２）
実施例１〜６並びに比較例２〜３のコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子における平衡膨潤倍率は、ヒアルロン酸濃度を指標とした共焦点顕微レーザーラマン分光装置を用いて架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の平衡膨潤倍率に相当する計算値として分析した。【００８９】
各架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の生理食塩水懸濁液をスライドガラス上に採取し、カバーガラスで懸濁液表面を覆い、測定用試料とした。試料を共焦点顕微レーザーラマン分光装置内のＸＹＺ３軸自動ステージ上に乗せ、光学顕微鏡を用いて架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の外部近傍に観測開始点をセットした。粒子の重心に向かって、水平方向又は垂直方向に直線的に移動と測定を繰り返す自動測定機能を用いて、０．５〜５μｍの微小範囲におけるラマンスペクトルを順次取得した。なお、測定条件を以下のとおりとした。
共焦点顕微レーザーラマン分光装置：Ａｌｍｅｇａ−ＸＲ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、商品名）
レーザ波長：５３２ｎｍ
露光時間：１．０秒
露光回数：８回
測定波数：４２３２〜１１６ｃｍ−１
測定温度：２５±２℃【００９０】
ラマンスペクトルから以下に示す式（３）を用いて、０．５〜５μｍの微小範囲の平衡膨潤倍率を算出した。平衡膨潤倍率の計算値を順次プロットし、シグモイド関数による近似曲線を導き出し、その近似曲線における変曲点の位置、すなわちコアとシェルの境界から、表面（上記ラマンスペクトルにより算出された平衡膨潤倍率に大きな変化（ノイズ）が出始め、平衡膨潤倍率の移動平均値が一定となった点としても判断できる。）までの平均値を、シェルの平衡膨潤倍率として算出した。【００９１】
平衡膨潤倍率の計算値＝[（ＨＯ−Ｈ／ＨＣ−Ｈ）−３．１５９８]／０．２９４７
・・・（３）
（ＨＯ−Ｈ：３４２０ｃｍ−１のラマン強度、ＨＣ−Ｈ：２９４０ｃｍ−１のラマン強度）【００９２】
なお、平衡膨潤倍率のプロットから、シグモイド関数による近似曲線を導き出し、それを平衡膨潤倍率の変化曲線とした。得られた変化曲線のグラフを図４に示す。この変化曲線において変曲点を求めた。また、表面の位置については、上述したとおりの手法により判断した。【００９３】
さらに、シェルと外部の境界の判断が難しい場合、試料から生理食塩水を除き、代わりに水のＯ−Ｈ結合に由来する波数（３４２０ｃｍ−１）にピークを持たない非水溶性液体（例えば、パラフィン等の炭化水素化合物）で懸濁することで、シェルと外部との平衡膨潤倍率の計算値を大きく変化させ、平衡膨潤倍率を算出した。【００９４】
（試験例３）
実施例１〜６並びに比較例２〜３のコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子、及び比較例１の自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の生理食塩水懸濁液５００μＬに対して、メチレンブルー１％水溶液５μＬを添加した。室温にて１５分以上静置した後、スライドガラス上に７０μＬ採取し、さらにニグロシン１％水溶液１μＬを加え、デジタルマイクロスコープ（ＶＨＸ−５００Ｆ；キーエンス社製、商品名）を用いて架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の顕微鏡画像を撮影した。得られた画像を図１に示す。【００９５】
得られた顕微鏡画像から、メチレンブルーの染色可否境界をコアとシェルの境界、ニグロシンの染色可否境界をシェルと生理食塩水の境界として、１粒子につき一か所のシェルの厚みを測定した。計１００個のゲル粒子のシェルの厚みの平均値を算出し、この値をシェルの厚みとした。【００９６】
上記の方法において、メチレンブルー１％水溶液をアクリジンオレンジ塩酸塩１％水溶液に変更して同様の方法によってシェルの厚みを算出した。【００９７】
（試験例４）
実施例１〜６並びに比較例２〜３のコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子、及び比較例１の自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子について、試験例２と同様に平衡膨潤倍率を算出し、コアとシェルの境界から、シェル表面と外部である生理食塩水の境界までの分析移動距離を、シェルの厚みとして算出した。【００９８】
（試験例５）
実施例１〜６並びに比較例２〜３のコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子、比較例１の自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子、及び参考例１のヒアルロン酸溶液について、組織親和性を評価するため、ウサギ膝関節内で各試料による局所刺激性により増加する白血球数を指標として分析を行った。【００９９】
動物評価のための注射剤用コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を含む組成物の調整は以下のようにして行った。【０１００】
実施例１〜６及び比較例２〜３で得られたコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の懸濁液を、全体積に対する架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の乾燥重量（濃度）が３ｗ／ｖ％になるように以下のように調整した。【０１０１】
コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の濃度の定量は、サンプル５０ｍｇを蒸留水１．５５ｍｌで希釈し、そこに１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を０．２ｍｌ添加し、室温にて３０分静置することで、コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子のエステル架橋を加水分解し、コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を溶解した。さらに、１Ｎ塩酸０．２ｍｌを添加し、中和した後、カルバゾール硫酸法により、既知濃度のヒアルロン酸（粘度平均分子量１９０万）を標準物質として、コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の濃度を計算した。この定量結果をもとに、コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の濃度が、３ｗ／ｖ％となるように調整し、コアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の動物評価用の組成物を得た。【０１０２】
動物評価のための注射剤用自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を含む組成物の調整は以下のようにして行った。【０１０３】
比較例１で得られた自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の懸濁液を、５℃、ｐＨ７．０の１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水に投入し、一時間おきに１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水を交換することを２回繰り返した。この架橋ヒアルロン酸組成物の全体積に対する、自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の乾燥重量（濃度）が３ｗ／ｖ％になるように以下のように、上述したコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の濃度の定量と同様の方法で行った。【０１０４】
１日以上の馴化期間を置いた後、実施例１〜６又は比較例２〜３の注射剤０．１ｍＬ／ｋｇを片側の膝関節腔内に、比較例１又は参考例１の注射剤０．１ｍＬ／ｋｇを反対側の膝関節腔内に１ｍＬ注射筒（（株）テルモ製；テルモシリンジ１ｍＬツベルクリン用）及び２０又は２１Ｇ注射針（（株）テルモ製；テルモ注射針２０Ｇ又は２１Ｇ）を用いて投与した。投与液量は投与日に測定した体重に基づく液量換算により個別に算出した。【０１０５】
膝関節液回収のため投与１日後に、ウサギを放血致死法により屠殺した。その後、生理食塩水を膝関節腔内に１ｍＬ注射筒及び１８Ｇ注射針を用いて注入した。膝関節をよく動かした後に、１ｍＬ注射筒及び１８Ｇ注射針を用いて膝関節液を回収した。この操作を４回繰り返し、約２ｍＬの膝関節液サンプルを得た。【０１０６】
回収した膝関節液サンプルを生理食塩水で３倍に希釈し、よく振り均一に懸濁後１００μＬ採取し、染色液（（株）武藤化学；ラボステイン、商品名）２μＬを添加し白血球を染色した。染色した関節液１５μＬをノイバイエル血球計算盤に採取し、顕微鏡を用いて１×１×０．１ｍｍ領域内の白血球数を測定した。４区画の平均値を各膝関節の白血球数とし、生体親和性の指標となる各注射剤の白血球数は、上記膝関節数３以上の平均白血球数として求めた。【０１０７】
表１に示すように、実施例１〜６のコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子は、比較例１の自己架橋ヒアルロン酸ゲル粒子及び比較例２〜３のコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子よりも生体親和性が向上しているのが分かり、参考例１のヒアルロン酸溶液と同様であることが分かった。これにより、ゲル粒子におけるシェルの有無、シェルの厚み及び軟らかさは、生体親和性に重要であることが分かった。【０１０８】
【表１】
2015005345.tif 000003
【０１０９】
（試験例６）
実施例３〜４のコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子及び参考例１のヒアルロン酸溶液の関節腔内注射が疼痛に及ぼす作用を、ウサギの膝関節半月板部分切除による実験的変形性関節症モデル動物を用いて確認した。【０１１０】
動物としては、１３週齢のＫｂｌ：ＪＷ（ＳＰＦ）系ウサギ（雄）を準備し、評価装置に対する馴化として、小動物用鎮痛評価装置Ｉｎｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ  Ｔｅｓｔｅｒ（Ｌｉｎｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製、商品名）の本体容器（ホルダー）に入れ、５秒間静止させる操作を行った。【０１１１】
動物は、可動式ラックに装着したブラケット式金属製金網床ケージ（３５０Ｗ×５００Ｄ×３５０Ｈｍｍ）に個別に収容し、温度２５±３℃、湿度５０±２０％、換気回数１２〜１８回／時間、照明時間８：００〜２０：００（明１２時間、暗１２時間）の環境下で飼育した。試料は、ステンレス製給餌器により、実験動物用固形資料ＲＣ４（オリエンタル酵母工業社製）を１５０ｇ／日の制限給餌として与え、飲料水はポリプロピレン製給水瓶（先管ステンレス製）により水道水を自由に与えた。動物の個体識別は耳介にマジックで個体識別番号を記入して識別し、ケージには群分け前は性別及び個体識別番号を記入したカードを、群分け後は試験番号、投与群、性別、動物番号、手術日、投与日、部検日及び個体識別番号を記入したカードを付けた。【０１１２】
半月板部分切除手術日の前日に、群分けを行った。群分け日に、全例の体重と両後足重量配分を測定した。測定した両後足重量配分より左後足重量配分比（（左荷重／両側合計荷重）×１００（％））を算出した。左後足重量配分比を基準とし、個体値が平均値に近い順に選択した。選択した動物は、左後ろ脚重量配分比による層別連続無作為化法を用いて各群に割り付けた。左後足重量配分比の平均値が各群で同様の値を示し、群間に差がないことを確認後、耐重についても平均値が各群で同様の値を示し、群間に差がないことを確認した。【０１１３】
半月板部分切除手術は群分け日の翌日に行い、半月板部分切除手術日を術後０日と定義した。１４〜１５週齢の動物を用い、参考文献１〜３に記載の方法を参考にして、半月板部分切除変形性関節症モデル動物を作製した。【０１１４】
例えば参考文献１にはＫＢＬ：ＪＷ家兎（１３週齢、雌）３２羽を用意し、ケタミン及びキシラジン麻酔下に、左側膝関節の外側側副靭帯及び種子骨靭帯を切離し、半月板を３．０〜４．０ｍｍ部分切除し、２６Ｇの注射針を用いて、膝関節内に２週間に５回の割合で、Ａ及びＢ群の各８羽には高分子量ＨＡ溶液を注入し、対照のＣ群８羽には生理食塩水を注入し、Ｃ群及びＤ群にはロキソニンを毎日経口投与し、疼痛抑制効果および軟骨変性防止効果を評価することが記載されている。また、参考文献２には、ニュージーランド白色家兎（耐重２〜３ｋｇ）７２羽を用意し、麻酔下に、左側膝関節の靭帯を切断し、半月板を３〜４ｍｍ部分切除し、膝関節内に週２回の割合で期間２及び４週間で、Ａ群の４８羽には分子量１９０万の１〜０．０１％ＨＡ溶液を注入し、Ｂ群の１２羽には分子量８０万の１〜０．０１％ＨＡ溶液を注入し、Ｃ群の１２羽には生理食塩水を注入し、屠殺後、膝関節を採取し薬効を評価することが記載されている。また、参考文献３には、日本白色家兎（雌、２．５ｋｇ）１５羽をペントバルビタールナトリウム麻酔下に、左側膝関節の外側側副靭帯及び種子骨靭帯を切断し、半月板を３．０〜４．０ｍｍ部分切除し、２５Ｇの注射針を用いて膝関節内に週２回の割合で注入し、対照として生理食塩水を同量注入し、屠殺後、膝関節を採取し薬効を評価することが記載されている。【０１１５】
参考文献１：Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．５，ｐ．５４３−５４９（２００７）
参考文献２：Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．２，ｐ．９９−１１０（１９９６）
参考文献３：関節外科、第１５巻、第３号、ｐ．９２−９８（１９９６）
参考文献４：薬理と治療、第２３巻、ｐ．８３３−８４１（１９９５）
参考文献５：薬理と治療、第３３巻、ｐ．３０３−３１２（２００５）
参考文献６：整形外科基礎科学、第９巻、ｐ．７７−７９（１９８２）
参考文献７：整形外科基礎科学、第１１巻、ｐ．１２５−１２７（１９８４）
参考文献８：Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，Ｖｏｌ．４８，Ｎｏ．７，ｐ．１９２３−１９２９（２００３）【０１１６】
塩酸ケタミン（三共エール薬品社製；ケラタール筋注用５００ｍｇ、製品名）及びキシラジン（インターベット社製；スキルペ２％注射液、製品名）の大腿部筋肉内注射による併用麻酔下でウサギの左膝関節部を除毛し、北島式固定器（夏目製作所社製）に背位固定した。無菌的に膝蓋の外側直下皮膚に約２ｃｍの切開を加え、外側側副靭帯を露呈させた後、この靭帯を切除した。さらに、膝窩筋起始部の腱を切除することにより外側半月板を露呈させ、半月板のほぼ中央部を３．０−４．０ｍｍに渡り切除した。その後、皮下筋層と皮膚をそれぞれ結節縫合し、アンピシリン（明治製菓社製；ビクシリンゾル−１５％、製品名）約０．２ｍＬを大腿部筋肉内に注射した。【０１１７】
術後４日（疼痛発症日）の両後足重量配分測定後に１回、実施例３〜４及び参考例１の注射剤０．１ｍＬ／ｋｇを、手術側（左側）膝関節腔内に１ｍＬ注射筒及び２３Ｇ注射針を用いて投与した。投与液量は投与日に測定した体重に基づく液量換算により個別に算出した。【０１１８】
両後足重量配分の測定には小動物用鎮痛評価装置Ｉｎｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ  Ｔｅｓｔｅｒを用いた。本装置は、本体容器に入れた動物の左右の脚への重量配分を、容器底面に設置したデュアルチャンネルのセンサーパッドにより、左右それぞれの重量をグラム単位で正確に検出し、その値を試験者が設定した時間にて平均化した。本体容器はウサギ用のものを使用した。測定設定時間は動物の静止状態で５秒とした。【０１１９】
動物をウサギ用本体容器（ホルダー）内に移動し、動物の静止状態で測定し（１度目）、次に動物をホルダーから出し、再度入れて静止状態で測定し（２度目）、この操作を再度繰り返した（３度目）。３度測定した両後足重量配分のそれぞれについて、左右重量（荷重）から左後足重量配分比（％）を下記式（４）により算出した。【０１２０】
左後足重量配分比（％）＝｛左荷重（ｇ）／（右荷重（ｇ）＋左荷重（ｇ））×１００}・・・（４）【０１２１】
３度算出した左後足重量配分比（％）の平均値を、測定１回当たりの左後足重量配分比（％）と定義した。この結果を図２及び図３に示す。【０１２２】
図２及び図３に示すように、実施例３〜４のコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲルを投与したウサギは、参考例１のヒアルロン酸溶液を投与したウサギよりも疼痛抑制効果が長く保持されていることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０１２３】
本発明によれば、ヒアルロン酸溶液と同程度にまで異物反応が低減され、生体親和性の高いコアシェル型架橋ヒアルロン酸ゲル粒子を提供することができる。また、当該ゲル粒子の製造方法及び当該ゲル粒子を含む医用材料を提供することもできる。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１】
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【国際調査報告】
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