【手続補正書】
【提出日】平成24年6月14日(2012.6.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
前記空孔が、対象となる１つの試料を保持可能であり、且つ２つ以上の前記試料は保持できない大きさであることを特徴とする請求項１に記載の試料観察システム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３】
前記試料に対する介入手段をさらに含むことを特徴とする請求項１または２に記載の試料観察システム。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本実施形態で取り扱う「試料」は、図４に示されるように液体１３中に保持されたときに重力によって上下方向が規定されるものであれば特に限定されない。前記試料内部の比重分布や、当該試料内に気体を保持していることによって液体中で上下方向が決まる非生体試料や、細胞群、組織、器官、卵母細胞、あるいは胚の個体、孵化後の個体、または胚から生育している個体、植物などの生体試料をも含む。
生体試料の個体としては、脊椎動物が受精卵から成体になるすべての過程を含む。また、胚とは、卵の受精時から孵化して成体となるまでの時期にある個体を指す。よって、胚の個体として、卵（受精卵）や、幼生、未成熟個体が好ましい。また、胚から生育している個体とは、例えば、受精卵の状態から孵化するまでの胚発生が進行している個体、さらには受精卵から孵化後、魚類であれば稚魚（成体型とみなす）、両生類であれば幼生になった状態で存在する個体を含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本実施形態で用いられる試料ホルダ２は、試料１４を空孔１２（図３を参照）に保持させる操作が容易であるため、本実施形態の試料観察システムから取り外しができるようにすることが好ましい。また、試料ホルダ２を複数用意して、観察時に付け替えることで、多くの試料１４を効率よく観察することが可能となる。試料ホルダ２は、常に一定の環境に維持できるようにチャンバー（不図示）で囲うことができる。前記チャンバーは、温度や湿度等の制御装置で内部の温度、湿度等を制御する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
角度調節を行う際の観察の容易さの観点から、カメラが接続され、カメラの画像をモニターに表示させて観察を行なうことが好ましい。観察手段７は、試料ホルダ２に対する距離を変化させることができるため、焦点を容易に合わせることができる。観察手段７と試料ホルダ２の距離を変化させる手段としては、観察手段７が動いてもよいし、試料ホルダ２が動いてもよい。焦点を調整するための、焦点調節ツマミ９を設けると、微妙な調整がやりやすくなるため、好ましい。
本実施形態には、光源１０を設けることが好ましい。角度調節手段６による観察角度の変化があっても光源とレンズ及び画像取得手段の角度関係は変化しないように、光源１０は支柱１側ではなく観察手段７側に接続され、観察手段７と一体になることが好ましい。また、光源１０は、落射光源でも透過光源でもよい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本発明の試料観察システムの第２実施形態は、第１実施形態に、試料１４に対する介入手段を追加する実施形態である。試料１４に対する介入とは、試料１４に対して全体または局所的に標識または侵襲的な処理を施す事である。試料１４に対する薬剤などの化合物の付与による化学的介入、レーザー照射などによる光学的介入、針刺しや試料１４の一部の切除や結紮などの機械的介入、温度変化による介入、電界による介入などが挙げられる。本試料観察システムは簡便に試料１４に対する観察の方向を変化させることができるため、それに介入手段を組み合わせることによって、観察できる任意の方向から試料１４の一部に対して介入を行い、その介入の効果を経時的に任意の方向から観察することができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
本試料観察システムは簡便に試料１４に対する観察の方向を変化させることができるため、それに介入手段を組み合わせることによって、観察できる任意の方向から試料１４の一部に対して介入を行い、その介入の効果を経時的に任意の方向から観察することができる。
よって、前記介入手段（不図示）は、単独に本試料観察システムに設けられることができるが、好ましくは、観察手段７となす相対角度が固定された状態で設けられる。よって、観察手段７と同様に、試料１４に作用する重力の方向に対する任意の方向から介入を行うことができる。また、前記介入手段は観察手段７との相対角度が固定されれば、試料１４に対し、介入及び観察を同時に行ってもよいし、時間差を設けて試料１４に対して介入及び観察を行ってもよい。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
以下に、本発明の試料観察システムで用いられる試料ホルダ２を詳細に説明する。図３に本発明の試料ホルダの例を示す。試料ホルダ２は、ベース（基体）１１に貫通した空孔１２を有する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
その一例として、試料１４が魚型で、空孔１２が楕円形である場合に試料１４が空孔１２内に液体１３と共に保持される様子を模式化した断面図と平面図を図４に示す。また、試料１４を観察する時に試料１４の重なりなどが起こらず、良好な画像を得ることができるため、空孔１２の大きさは、試料１４を１つのみ保持することができ、２つは保持できない大きさであることが好ましい。
本発明においては、空孔１２は、試料１４のサイズにより適当な開口面積を有し、かつ適当な厚みであることが好ましい。つまり、空孔１２に試料１４を１つ効率よく安定に保持させるには、空孔のサイズ（大きさ）、すなわち、開口面積と厚みとが大きく影響する。また、液体と共に前記試料１４を１つ空孔２に効率よく安定に保持させるための空孔２の開口面積を有すれば、その空孔２の形状は、図１で例示された円形以外の四角形等の多角形、楕円形、星型等いずれかの形状でも良い。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
また、２つ以上の試料１４が保持できない大きさとは、少なくとも空孔１２に対して２つの試料１４の最大断面を幾何学的に配置できない大きさを示す。空孔１２の開口面積が試料１４の最大断面積の１．０５倍未満であれば空孔１２に液体１３と共に試料１４が配置されにくく、２．６３倍を超えると液体１３の中に複数個の試料１４が配置される場合が多くなる。また、同一のべース１１に複数の異なる開口面積の空孔１２が設けられていてもよい。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
ベース１１の厚みは、特に均一である必要はない。しかし、空孔１２近傍の厚みは、試料１４を１つだけ配列させる目的では、それぞれ対象とする試料１４の最大の厚さの０．２倍から１．９倍の厚みであることが好ましい。試料１４の最大の厚さは、卵などの球及び略球体であれば最大の断面積の直径を指す。また、試料１４が稚魚や両生類の幼生である場合の最大の厚さとは、液体１３と共に保持される空孔１２中において安定して取り得る体勢における稚魚等の縦方向の厚さをいう。
例として、直径が１ｍｍ程度の卵細胞を保持する場合、空孔１２の厚さは０．２〜１．９ｍｍの範囲あることが好ましい。試料１４の最大の厚さ（球体の場合は直径）の０．２倍未満であれば試料１４に対して液体１３の保持量が少ないために安定に試料を保持できないため、配置の際に脱落する割合が増える。また、試料１４の最大の厚さ（球体の場合は直径）の１．９倍を超えると複数の試料が保持される割合が増えてしまう。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
また、試料ホルダ２は、ベース１１に複数の貫通した空孔１２を有する。その配置は、ベース１１のいかなる領域でもよいが、規則的に配列される方が後述する試料１４に対する試験や試料１４に対する処理の自動化にとって好ましい。また、１つのベース１１に設けられる空孔１２の個数や配置密度について何ら制限はない。操作上の観点からは、空孔１２の直径がおよそ１ｍｍ程度であれば、配置密度が１０個／ｃｍ２〜１００個／ｃｍ２の範囲にあることが好ましい。すなわち１０個／ｃｍ２未満であれば、空孔以外の面積が広く、その領域に水滴が孤立しやすくなる。従って当該水滴と共に空孔１２以外の領域に試料１４が配置され、配置の効率が低下する。また、１００個／ｃｍ２を超えると、空孔１２の間の距離が十分取れないために、その後の取り扱いで前記試料１４を保持する液体が隣の空孔１２で保持する液体と交じり合う等コンタミネーションがしやすくなる。すなわち、本発明の試料ホルダ２の面積と空孔１２の開口面積の比（開口率）は、７．９％〜７８．５％の範囲に入ることが好ましい。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
また、本発明では、試料ホルダ２の複数の空孔１２に、対象とする試料１４をそれぞれ１つずつ保持させることが好ましいが、必ずしも試料ホルダ２のすべての空孔１２内に試料１４を保持させなくても良い。但し、試料１４を保持させる空孔１２の割合が極端に低下すると、後で試料１４を観察する際に、効率が低下する。
本発明の試料観察システムで用いる試料ホルダは、貫通した空孔１２を有することを特徴とする。従来の底のあるウェルと比較して、ｉ)試料を配列することが容易である、ｉｉ)試料を取り出すことが容易である、ｉｉｉ)試料が底板に接触することはないので成育に底板からの刺激等の影響を受けない、ｉｖ)空孔内の液体が外気と接触する面積が大きくガス交換が行われやすい、ｖ)観察工程において、底板がないため底板による反射光や自家蛍光などのノイズ要因がない等の利点がある。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
また、前記増粘剤の例としては、例えば酸化変性澱粉、酵素変性澱粉、熱化学変性澱粉、カチオン性澱粉、両性澱粉及びエステル化澱粉等の澱粉類、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース及びエチルセルロース等のセルロース誘導体、カゼイン、ゼラチン及び大豆蛋白等の天然又は半合成高分子類、あるいは完全又は部分ケン化のポリビニルアルコール、アセトアセチル化ポリビニルアルコール、カルボキシ変性ポリビニルアルコール、オレフィン変性ポリビニルアルコール及びシリル変性ポリビニルアルコール等のポリビニルアルコール類などの水溶性高分子化合物が挙げられ、これらのうち少なくとも１種の水溶性高分子化合物を適宜選択して使用することができる。
本発明において、使用される液体１３の好ましい粘度は、０．１Ｐａ・ｓ（パスカル秒）以上であり、必要に応じて前記増粘剤を添加すれば良い。また、生体に適した塩濃度やｐＨに制御することも必要であれば、塩化ナトリウムのような塩類や各種ｐＨ調整剤を、また、防腐剤や抗菌剤を適宜に添加することもできる。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
本発明の第３実施形態である試料観察方法は、重力によって上下方向が規定される試料の観察方法である。少なくとも１つの貫通した空孔を有する試料ホルダの前記空孔に前記試料を含む液体を保持させるステップと、前記試料ホルダと前記試料を観察する観察手段との相対角度が固定された状態で、前記試料に作用する重力の方向に対して前記観察手段がなす任意の角度から前記試料を観察するステップからなる。
本実施形態でいう、試料ホルダや前記試料ホルダに設けられる貫通した空孔等は本発明の第１実施形態と共通のものを用いることができる。また、「相対角度を固定した状態」及び「相対角度」の定義も第１実施形態と同じ状態及び角度をいう。試料ホルダと観察手段との相対角度を固定した状態で、試料１４に作用する重力の方向に対する前記観察手段がなす任意の角度から前記試料を観察することは、重力によって上下方向が規定される試料を中心にして、３６０度の範囲で試料を自由に観察できることをいう。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
（実施例１）
次に、（生体）試料１４としてゼブラフィッシュの稚魚を用いた場合の試料観察システム、及び、試料観察方法について実施例を示して説明する。
（試料ホルダの作製）
厚み０．７ｍｍの１００ｍｍ×１５０ｍｍの大きさのテフロン（登録商標）シートを稚魚の輪郭に類似させた形状になるよう図３ｂに示すように打ち抜き加工した。空孔１２が等間隔になるように、６０個（縦１２列横５列）の空孔１２を形成した。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
（試料の観察）
前記試料を配置した試料ホルダ２を試料観察システムの可動性ホルダ４に設置し、試料ホルダストッパー３で固定した。可視光を試料ホルダ２に照射しながら観察手段７に具備したＣＣＤカメラ（ニコン製ＤＳ−２Ｍｖ）を用いて観察画像をモニターに表示させた。ＸＹ調節ツマミ５で観察する試料を選び、焦点を調節した。次に、角度調節手段６を操作して、重力方向に対して水平方向から、垂直方向まで角度を変えながら、明視野画像を撮影した。
重力によって姿勢を保っている稚魚に対して垂直方向から水平方向まで（図５のａ’からｄ’まで）の明視野画像を図５のａからｄまでの写真で示した。本発明の試料観察システムを用いることで、重力によって姿勢を保っているゼブラフィッシュ稚魚への観察方向を３６０度の範囲で簡便に調整しながら観察を行なうことができた。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
本発明は、生体機能の解明、疾病診断又は疾患に対する医薬品評価において、向きを有する生体試料、たとえば、臓器、組織又はガンなどを所定の状態で適切な方向から、生体試料にストレスを与えないで観察する試料観察方法と試料観察システムを提供する。また、試料を用いた迅速な創薬スクリーニングや化学物質の安全性評価の装置になる。