(57)【要約】  外来遺伝子を導入することなく、エタノール産生効率の高い発酵菌を得ることを課題とする。さらに、発酵菌の増殖を妨げる有機酸等の増殖阻害物質に耐性のある発酵菌を得ることを課題とする。育種によって五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノール生産することができるMeyerozyma guilliermondiiを単離した。また、該発酵菌にMeyerozyma guilliermondii由来のトランスアルドラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することによって、耐性を付与した。
2016088272.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノールを産生する発酵菌であって、
特許微生物寄託センターに寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９６４として寄託されていることを特徴とする高効率エタノール発酵菌。
【請求項２】
請求項１に記載の高効率エタノール発酵菌に、
セルフクローニングしたトランスアルドラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、キシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、蟻酸デヒドロゲナーゼのうち少なくとも１つの遺伝子を導入したことを特徴とする高効率エタノール発酵菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
リグノセルロース系バイオマスを用いたバイオエタノール生産において、糖化溶液を発酵するための微生物に関する。【０００２】
特に、リグノセルロース系バイオマスを用いたバイオエタノール生産において、五炭糖（以下、Ｃ５ということもある。）、及び六炭糖（以下、Ｃ６ということもある。）から効率的にエタノール生産することができる微生物に関する。
【背景技術】
【０００３】
バイオエタノールは、バイオマスから産生される枯渇することのない再生可能資源として期待されている。また、バイオエタノールを燃焼させて発生する二酸化炭素はカーボンニュートラルであることから、バイオエタノールの利用が進むことによって、地球温暖化の主な原因である二酸化炭素の上昇を抑制すると考えられている。【０００４】
バイオエタノールは、バイオマスを発酵させ、蒸留してエタノールを精製する。バイオエタノールの収率を高めるために糖化溶液から多くのアルコールを生成する必要がある。バイオエタノール生産の過程で一般的に用いられている酵母は、キシロース、アラビノースなどの五炭糖をアルコールに変換できないため、発酵原料としては六炭糖のみが用いられてきた。【０００５】
原料によって異なるものの典型的なバイオマスには、３５〜４５％のセルロース、２５〜４０％のヘミセルロース、１５〜３０％のリグニンが含まれていると言われている。したがって、六炭糖が重合しているセルロースだけではなく、五炭糖であるキシロース等を主として含有するヘミセルロースを基質として利用することは効率的なエタノール産生につながることになる。【０００６】
キシロースはグルコースの次にバイオマス中に多く含まれている糖であると言われており、五炭糖を効率的に利用することはバイオエタノール生産において大きな課題となっている。【０００７】
これまでに、遺伝子組換えによるキシロース利用能の付与や、キシロースを利用してエタノールを産生する微生物の利用等により、キシロースを少しでも利用する技術が開示されている。【０００８】
特許文献１には、キシローストランスポーター活性を有する遺伝子を宿主細胞に導入することによって、キシロース（Ｃ５）をキシルロースに変換し、解糖系のペントースリン酸経路に組み入れ、発酵に利用する発明が開示されている。【０００９】
特許文献２には、アラビノーストランスポーターを付与した酵母によって、アルコールを生成する技術が開示されている。特許文献１と同様にアラビノース（Ｃ５）をアラビトール、キシルロースを経て解糖系のペントースリン酸経路に組み入れ、発酵に利用するものである。【００１０】
非特許文献１には、大腸菌由来のキシロース資化遺伝子をザイモモナスに組み込むことにより、キシロース資化能を付与することが開示されている。【００１１】
非特許文献２には、ピキア属酵母が、キシロースを利用してエタノールを生産することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開2012-170422号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第2013/189788号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Zhang, M., et al., Science, 1995. Vol. 267, pp. 240-243.
【非特許文献２】Bicho, P.A., et al., Appl. Environ. Microbiol., 1988, Vol. 54, pp. 50-54.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、特許文献１の発明は、Candida guilliermondii由来のキシローストランスポーター活性のあるタンパク質を宿主としてSaccharomyces cerevisiaeに導入している。すなわち外来遺伝子を導入することになる。【００１５】
また、特許文献２の発明もトランスポーター遺伝子は異なるものの、宿主に対して異なる種の遺伝子を導入する発明である。【００１６】
また、非特許文献１に記載の技術は、キシロース資化遺伝子を導入するものであり、上記特許文献１及び２とは技術思想は異なるが、外来遺伝子を導入することに変わりない。【００１７】
そのため、上記特許文献１及び２、非特許文献１はいずれも国連で採択された「生物の多様性に関する条約のバイオセーフティに関するカルタヘナ議定書」を実施するための封じ込め策を講じる必要がある。したがって、バイオセーフティを保証するための施設を必要とすることから、当該細菌を利用してエタノールを生産することはコストの面で不利である。【００１８】
また、非特許文献２に記載の技術によって、ピキア属酵母を利用することは、野生型のピキア属酵母のキシロース利用性が低いため、エタノール産生効率はさほど高くならない。【００１９】
本発明は、外来遺伝子を導入することなく、エタノール産生効率の高い発酵菌を得ることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノールを産生する発酵菌であって、特許微生物寄託センター（独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター  日本国  〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8  122号室）に受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９６４（以下、ＢＰ−０１９６４株ともいう。）として、２０１４年１１月１９日（受託日）付けで寄託されていることを特徴とする。【００２１】
野生型Meyerozyma guilliermondiはキシロース資化能を備えている。しかしながら、バイオエタノール生産に十分なキシロース利用能を備えているわけではない。ＢＰ−０１９６４株は、Meyerozyma guilliermondiを菌株育種により五炭糖の利用効率の高い菌を選択して得たものである。その結果、親株に対して約２倍のエタノール生産性を備えた菌を選択することができた。【００２２】
また、本発明は、前記Meyerozyma guilliermondii株に、セルフクローニングしたトランスアルドラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、キシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、蟻酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したことを特徴とする。【００２３】
Meyerozyma guilliermondii自身の酵素遺伝子を導入することはカルタヘナ法に則した封じ込め策を必要としない。したがって、バイオセーフティのための特別な施設を必要とせず、従来の設備を使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＢＰ−０１９６４株と親株（N株）のエタノール生成量を示す図。
【図２】スラリー発酵でのグルコース、キシロース資化能を示す図。
【図３】スラリー発酵、清澄液発酵での発酵収率を示す図。
【図４】ＢＰ−０１９６４株のコーンストーバー清澄液でのエタノール産生能を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
子嚢菌系酵母であるMeyerozyma guilliermondiはキシロース資化能を備えている。Meyerozyma guilliermondiのN株を親株として、変異を誘発させながら変異株を選択する育種によって、寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９６４の菌を得た。
【００２６】
一般に、変異の誘発には、紫外線や放射線の照射、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）などのアルキル化剤、ＢｒｄＵなどの塩基類似化合物、ニトロアミンやニトロソグアニジンなどのニトロソ化合物などを用いる。本発明では、ＵＶの照射やＥＭＳなどの化学薬品の添加により、変異を誘発している。
【００２７】
以下に菌株の取得方法を説明する。
【実施例】
【００２８】
１．菌株の単離
Meyerozyma guilliermondiの親株を稲わら由来の糖液を用い培養を行った。熊谷産の稲わらを、等量の２５％アンモニア水に８０℃３時間漬け込んだ後、アンモニアを放散させた。処理したバイオマスは、ｐＨを１０％ＮａＯＨで４に調整後、アクレモニウムセルラーゼ（Meiji Seika ファルマ社製）を添加して、５０℃で７２時間酵素糖化を行った。作成したスラリーはフィルタープレス法にて固液分離を行い液体を回収した。この液体（以下、清澄液ともいう。）を用いて、変異剤を加えながら１９ヶ月馴化培養を行い、発酵性能向上株を選抜した。選抜は一定時間後のエタノール量を基準に行った。発酵性能の高い菌株を独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに、寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９６４として寄託した。【００２９】
２．菌株の性質
２．１  エタノール産生能
図１は親株であるＮ株に対するＢＰ−０１９６４株のエタノール産生量を示す。コーンストーバーを希硫酸処理した糖化液をＮａＯＨ水溶液でｐＨを６に調整して用い、同株の培養液を培地のＯＤ６００が２．０となるように添加し、３０℃、９６時間培養した後の培養液中のエタノール量を示す。糖化溶液のグルコースは、６３．２ｇ／Ｌ、キシロースは３４．５ｇ／Ｌであった。エタノール測定はＧＣ−ＦＩＤ（ジーエルサイエンス社製：ＧＣ３９０Ｂ）を用いた。【００３０】
図１より明らかなように、野生型に対して２倍以上エタノールを産生する株を得ることができた。野生株に対してエタノール産生が向上していることから、Ｃ５であるキシロースの資化能が向上していると考えられる。そこで、この菌株のグルコース及びキシロース資化能を確認した。【００３１】
次に、稲わらをアンモニア水で前記アンモニア処理と同様に処理した後、アクレモニウムセルラーゼを添加して、５０℃７２時間酵素糖化を行い、作成したスラリーを用いて発酵を行った。【００３２】
スラリー発酵槽はジャケット構造になっており、温度はジャケット部に温水を循環させて調節を行った。また、底部には通気口を設けてあり、底部の通気口からは、フィルタを通した空気を所定量通気し続け、モータに連動したヘラで撹拌を行いながら発酵を行った。【００３３】
スラリー中に含まれるグルコース、キシロース、エタノールの量の経時的な変化の解析を行った。グルコース、キシロースはスラリーをサンプリングし、遠心により得た上清をＨＰＬＣ測定にかけて測定した。エタノールは上記と同様にＧＣ−ＦＩＤ（ジーエルサイエンス社製：ＧＣ３９０Ｂ）を用いた。結果を図２に示す。【００３４】
Ｃ６であるグルコースが先に消費されるが、その後、スラリー中のグルコースの減少とともにＣ５であるキシロースが消費され、エタノールが産生される。得られた菌は、Ｃ５、Ｃ６ともに資化能を備えていることから、効率よくエタノールを産生することができる。したがって、工業生産的にも有用な菌株である。【００３５】
２．２  スラリー発酵能、清澄液発酵能
バイオエタノール産生を行うときに、スラリー、清澄液、どちらを用いた場合であっても効率よく発酵する菌であることが望ましい。そこで、スラリー、清澄液を用いて発酵収率を比較した。発酵収率は以下の式により計算される。
発酵収率＝得られたエタノール量（ｇ／Ｌ）／発酵開始時の糖液に含まれていたグルコース＋キシロース量（ｇ／Ｌ）／０．５１１４【００３６】
図３に示すように、スラリー発酵であっても、清澄液発酵であっても、同等の性能を発揮することのできる菌株を得ることができた。【００３７】
２．３  コーンストーバー糖液でのエタノール産生能
稲わらと同様に、コーンストーバーもバイオエタノール産生に多用されるバイオマスである。本菌株は稲わらから製造した清澄液を用いて馴化を行い、単離した菌株であるが、コーンストーバーでも同様にバイオエタノールを効率よく産生する。【００３８】
米国アイオワ州産のコーンストーバーを２倍量の３．７重量％硫酸水溶液に浸して、１７０℃で１０分間処理した。常温に戻した後、４Ｍ水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ４に調製し、バイオマス糖化用酵素（アクレモニウムセルラーゼなど、Meiji Seika ファルマ社製）を添加して５０℃７２時間酵素糖化を行った。作成したスラリーは、遠心分離法にて固液分離を行い、液体(以下、コーンストーバー清澄液という。)を回収した。【００３９】
コーンストーバー清澄液をＮａＯＨ水溶液でｐＨ６に調整したものを用いて、本菌株を用いて発酵を行い、エタノール産生量を経時的に測定した。結果を図４に示す。野性型（N株）は４８時間後のエタノール産生がほぼ頭打ちになるのに対し、本菌株は７２時間後までエタノールを産生し続け、最終的に約１．５倍程度高い収量でエタノールを産生することができる。【００４０】
また、本発明で得られた菌株にさらにキシロースを利用しやすくするために、ペントースリン酸経路の酵素であるトランスアルドラーゼや、アセトアルデヒドからエタノールを生成する酵素であるアルコールデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼの基質となるアセトアルデヒドをピルビン酸から生成するピルビン酸デカルボキシラーゼを遺伝子導入することもできる。【００４１】
例えば、遺伝子導入にあたっては、次の手順を取ることができる。導入したい遺伝子及びそのターミネーター部（以下、遺伝子+ターミネーター部という。）をＰＣＲ増幅する。導入に用いたいプロモーター部をＰＣＲ増幅する。これらは何れも本発明で用いた菌株であるMeyerozyma guilliermondiの染色体からＰＣＲ増幅する。【００４２】
ＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片をプロモーター、遺伝子+ターミネーター部の順になるよう、インフュージョン法を用いて、大腸菌用の市販ベクターにクローニングする。クローニングされたベクターを大腸菌に形質転換し、ベクターを増幅する。増幅したベクターからプロモーター及び遺伝子＋ターミネーター部を制限酵素で切出す、あるいは増幅したベクターからＰＣＲ増幅することにより、相同組換用のＤＮＡ断片を得る。【００４３】
得られたＤＮＡ断片を菌株に相同組換えし、所望の菌株を得る。相同組換にはエレクトロポレーション法を用いた。この方法によって遺伝子を導入すると、染色体上に複数コピー導入することができるため、導入した酵素の活性を増強することができる。【００４４】
相同組換用ＤＮＡ断片としては、例えば、キシロースレダクターゼのプロモーター、トランスアルドラーゼ＋ターミネーターを用いると良い。キシロース資化の際に機能するキシロースレダクターゼのプロモーターを用いることによって、トランスアルドラーゼが効率良く作用すると考えられるからである。【００４５】
キシロースレダクターゼのプロモーターは具体的には下記配列番号１及び配列番号２のプライマー、トランスアルドラーゼ遺伝子及びターミネーター部分は下記配列番号３及び４のプライマーを用いて増幅する。
配列番号１：ＡＡＧＧＣＴＴＧＧＧＡＡＣＴＴＴＣＴＴＴ
配列番号２：ＡＧＣＡＡＴＴＧＡＴＧＡＴＴＡＡＴＴＴＴ
配列番号３：ＡＴＧＡＣＣＡＡＴＴＣＴＣＴＴＧＡＡＣＡ
配列番号４：ＡＡＡＴＴＧＴＧＣＣＧＴＧＴＣＡＡＡＣＴ【００４６】
また、ＧＡＰＤＨのプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ＋ターミネーターを用いると良い。ＧＡＰＤＨは解糖系に存在する強力なプロモーターであることから、解糖系の酵素であるアルコールデヒドロゲナーゼのプロモーターとして使用することにより、効率よく作用するものと考えられる。アルコールデヒドロゲナーゼはアセトアルデヒドをエタノールに変換する作用を持つとともに、ＮＡＤＨ依存の場合にはＮＡＤ＋を生産するため、ＮＡＤ＋依存のキシリトールデヒドロゲナーゼの作用を強化する作用がある。【００４７】
ＧＡＰＤＨのプロモーターは具体的には下記配列番号５及び配列番号６のプライマー、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びターミネーター部分は下記配列番号７及び８のプライマーを用いて増幅する。
配列番号５：ＧＴＴＧＴＡＧＣＧＧＡＧＧＣＴＣＡＡＴＴ
配列番号６：ＴＧＴＡＴＡＡＴＴＴＡＡＡＴＧＴＧＧＧＴ
配列番号７：ＡＴＧＴＣＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＴＣＣＡＴ
配列番号８：ＣＡＣＣＴＴＧＧＣＴＧＧＡＡＧＴＧＣＴＧ【００４８】
さらに、得られた菌株に糖液を作成の際に含まれる酢酸等の有機酸や、フルフラール等のアルデヒドに耐性を持たせるためにトランスアルドラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼの他に、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、キシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、蟻酸デヒドロゲナーゼなどの酵素を上記プロモーターのいずれかの下流にクローニングし導入してもよい。【００４９】
ピルビン酸デカルボキシラーゼ、キシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、蟻酸デヒドロゲナーゼは、下記のプライマーによって増幅することができる。
ピルビン酸デカルボキシラーゼ
配列番号９：ＡＴＧＡＣＡＧＡＡＡＴＴＡＣＴＴＴＧＧＧ
配列番号１０：ＡＣＡＡＡＣＡＡＡＴＧＣＴＧＡＡＡＡＣ
キシロースレダクターゼ（ＸＲ）
配列番号１１：ＡＴＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＴＴＧＡＡＣＴＣ配列番号１２：ＣＡＣＡＡＡＡＧＴＴＧＧＡＡＴＣＴＴＧＴ
キシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）
配列番号１３：ＡＴＧＡＣＴＣＣＣＡＡＣＣＣＡＴＣＴＴＴ配列番号１４：ＣＴＣＧＧＧＡＣＣＡＴＣＴＡＴＡＡＴＡＡ
トランスケトラーゼ（ＴＬＫ）
配列番号１５：ＡＴＧＡＣＣＡＣＣＧＡＣＧＡＣＴＡＣＧＡ配列番号１６：ＡＡＣＡＧＣＴＡＧＣＡＡＧＴＣＣＴＧＡ
蟻酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）配列番号１７：ＡＴＧＡＧＴＣＣＡＧＣＡＡＣＡＡＡＡＧＧ
配列番号１８：ＴＴＴＣＡＴＣＴＴＧＴＧＴＣＴＴＴＣＡＣ【００５０】
また、この方法により得られた菌株は、遺伝子を導入しているが、セルフクローニングであるため、カルタヘナ法上、非組換菌扱いになる範疇に属するものとなっている。【００５１】
ＢＰ−０１９６４株は、以上示してきたように、野生型Meyerozyma guilliermondiのキシロース資化能が育種によって強化されており、バイオマスとして稲わら、コーンストーバーどちらを用いた場合であっても効率的にエタノール産生を行うことができる。
【図１】
2016088272.tif 000003
【図２】
2016088272.tif 000004
【図３】
2016088272.tif 000005
【図４】
2016088272.tif 000006
【配列表】
2016088272000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年9月29日(2016.9.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノールを産生する発酵菌であって、
特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９６４として寄託されている高効率エタノール発酵菌に、セルフクローニングしたピルビン酸デカルボキシラーゼ、蟻酸デヒドロゲナーゼのうち少なくとも１つの遺伝子を導入したことを特徴とする高効率エタノール発酵菌。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
ローストランスポーター活性のあるタンパク質を宿主としてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに導入している。すなわち外来遺伝子を導入することになる。
［００１５］
また、特許文献２の発明もトランスポーター遺伝子は異なるものの、宿主に対して異なる種の遺伝子を導入する発明である。
［００１６］
また、非特許文献１に記載の技術は、キシロース資化遺伝子を導入するものであり、上記特許文献１及び２とは技術思想は異なるが、外来遺伝子を導入することに変わりない。
［００１７］
そのため、上記特許文献１及び２、非特許文献１はいずれも国連で採択された「生物の多様性に関する条約のバイオセーフティに関するカルタヘナ議定書」を実施するための封じ込め策を講じる必要がある。したがって、バイオセーフティを保証するための施設を必要とすることから、当該細菌を利用してエタノールを生産することはコストの面で不利である。
［００１８］
また、非特許文献２に記載の技術によって、ピキア属酵母を利用することは、野生型のピキア属酵母のキシロース利用性が低いため、エタノール産生効率はさほど高くならない。
［００１９］
本発明は、外来遺伝子を導入することなく、エタノール産生効率の高い発酵菌を得ることを課題とする。
課題を解決する手段
［００２０］
本発明は、五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノールを産生する発酵菌であって、特許微生物寄託センター（独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター  日本国  〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８１２２号室）に受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９６４（以下、ＢＰ−０１９６４株ともいう。）として、２０１４年１１月１９日（受託日）付けで寄託されている高効率エタノール発酵菌に、セルフクローニングしたピルビン酸デカルボキシラーゼ、蟻酸デヒドロゲナーゼのうち少なくとも１つの遺伝子を導入したことを特徴とする。
［００２１］
野生型Ｍｅｙｅｒｏｚｙｍａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉはキシロース資化能を備えている。しかしながら、バイオエタノール生産に十分なキシロース利用能を備えているわけではない。ＢＰ−０１９６４株は、Ｍｅｙｅｒｏｚｙｍａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉを菌株育種により五炭糖の利用効率の高い菌を選択して得たものである。その結果、親
【国際調査報告】
2016088272.tif 000007
2016088272.tif 000008
2016088272.tif 000009
2016088272.tif 000010