(57)【要約】  ベクターワクチン及び生ワクチンの併用による感染症の予防方法を提供する。遺伝子組み換え技術により、ウイルスや細菌等の動物感染因子由来の感染防御抗原をコードするDNA断片がウイルスゲノムに組み込まれた組換えベクターウイルス（ベクターワクチン）、該感染因子を弱毒化して得られる弱毒化感染因子（生ワクチン）、及び該ベクターワクチンと該生ワクチンとを併用することを特徴とするヒト以外の動物感染症を予防する方法、並びに該ベクターワクチン及び該生ワクチンを有効成分として用いることを特徴とするワクチン。【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染因子の感染防御抗原が組み込まれた組換えベクターウイルス（ベクターワクチン）及び弱毒化した該感染因子（生ワクチン）を併用することを特徴とする、ヒト以外の感染症の予防方法。
【請求項２】
前記ベクターワクチン及び前記生ワクチンが、混合された一つのワクチンである、請求項１に記載の予防方法。
【請求項３】
前記ベクターワクチン及び前記生ワクチンが、独立した二つのワクチンである、請求項１に記載の予防方法。
【請求項４】
前記ベクターワクチンと前記生ワクチンを混合して投与することを特徴とする、請求項３に記載の予防方法。
【請求項５】
前記ベクターワクチンを投与した後に、前記生ワクチンを投与することを特徴とする、請求項３に記載の予防方法。
【請求項６】
前記生ワクチンを、ベクターワクチン投与後、1-200日の間に投与することを特徴とする、請求項５に記載の予防方法。
【請求項７】
前記ベクターワクチンと前記生ワクチンの混合比が、１：1-10である、請求項２又は４に記載の予防方法。
【請求項８】
前記ベクターウイルスが、ヘルペスウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、ポックスウイルス及びアデノウイルスからなる群より選ばれる、請求項１ないし７のいずれか一項に記載の予防方法。
【請求項９】
前記ベクターウイルスが、マレック病ウイルスである、請求項１ないし７のいずれか一項に記載の予防方法。
【請求項１０】
前記感染因子が、鶏に感染する因子（鶏感染因子）である、請求項１ないし９のいずれか一項に記載の予防方法。
【請求項１１】
前記鶏感染因子の感染防御抗原が、ニューカッスル病ウイルスのFタンパク質又はHNタンパク質、鶏伝染性気管支炎由来のS1タンパク質、マレック病ウイルスのgBタンパク質、鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのVP2タンパク質、鶏伝染性喉頭気管炎ウイルスのgBタンパク質、七面鳥鼻気管炎ウイルスのFタンパク質、トリ白血病ウイルスのEnvタンパク質、細網内皮症ウイルスのEnvタンパク質、鶏貧血ウイルスのVP1+VP2タンパク質、トリインフルエンザウイルスのHAタンパク質、マイコプラズマ・ガリセプティカムのｐ29タンパク質、及びロイコチトゾーン・カウレリーのMSA1タンパク質からなる群より選ばれる、請求項１０に記載の予防方法。
【請求項１２】
前記鶏感染因子の感染防御抗原が、ニューカッスル病ウイルスのFタンパク質若しくはHNタンパク質、又は鶏伝染性気管支炎由来のS1タンパク質である、請求項１０に記載の予防方法。
【請求項１３】
感染因子の感染防御抗原が組み込まれた組換えベクターウイルス（ベクターワクチン）及び弱毒化した該感染因子（生ワクチン）を有効成分とすることを特徴とする、ワクチン。
【請求項１４】
前記ベクターワクチン及び前記生ワクチンが、混合された一つのワクチンである、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記ベクターワクチンと前記生ワクチンの混合比が、１：1-10である、請求項１４に記載のワクチン。
【請求項１６】
前記ベクターワクチン及び前記生ワクチンが、独立した二つのワクチンである、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１７】
前記ベクターウイルスが、ヘルペスウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、ポックスウイルス及びアデノウイルスからなる群より選ばれる、請求項１３ないし１６のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１８】
前記ベクターウイルスが、マレック病ウイルスである、請求項１３ないし１６のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１９】
前記感染因子が、鶏に感染する因子（鶏感染因子）である、請求項１３ないし１８のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２０】
前記鶏感染因子の感染防御抗原が、ニューカッスル病ウイルスのFタンパク質又はHNタンパク質、鶏伝染性気管支炎由来のS1タンパク質、マレック病ウイルスのgBタンパク質、鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのVP2タンパク質、鶏伝染性喉頭気管炎ウイルスのgBタンパク質、七面鳥鼻気管炎ウイルスのFタンパク質、トリ白血病ウイルスのEnvタンパク質、細網内皮症ウイルスのEnvタンパク質、鶏貧血ウイルスのVP1+VP2タンパク質、トリインフルエンザウイルスのHAタンパク質、マイコプラズマ・ガリセプティカムのｐ29タンパク質、及びロイコチトゾーン・カウレリーのMSA1タンパク質からなる群より選ばれる、請求項１９に記載のワクチン。
【請求項２１】
前記鶏感染因子の感染防御抗原が、ニューカッスル病ウイルスのFタンパク質若しくはHNタンパク質、又は鶏伝染性気管支炎由来のS1タンパク質である、請求項１９に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、ベクターワクチン及び生ワクチンの併用による感染症の予防方法に関する。詳細には、感染因子由来の感染防御抗原が組み込まれた組換えベクターウイルスからなるベクターワクチンと該感染因子の弱毒化生ワクチンを併用することを特徴とする、ヒト以外の感染症の予防方法、並びに該ベクターワクチン及び該弱毒化生ワクチンを有効成分とするワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンの有効性向上及びワクチネーションの省力化を達成する手段として、ワクチニアウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、等をベクターとしたウイルスベクターワクチンの研究が盛んに行われている。しかしながら、これらのウイルスベクターワクチンは、単独では十分な免疫効果を与えず、ワクチンの追加投与を必要とするケースがある。特に早期の免疫応答が必要な場合や、血清型の多い感染症に対しては、ウイルスベクター単独で十分なワクチン効果を示すことは容易ではなく、生ワクチンの追加接種が必要とされることが多い。【０００３】
例えば、ヒト用ワクチンにおいて一例をあげると、ワクチニアウイルスベクターで結核菌の防御抗原を発現するウイルスベクターは単独では十分な有効性を示さないため、従来のBCG（ウシ型結核菌）生ワクチンによるプライミングを必要とする（非特許文献１）。【０００４】
鶏のワクチンでは、マレック病ウイルス1型（MDV1）あるいは七面鳥ヘルペスウイルス（HVT）ベクターでニューカッスル病（ND）や伝染性ファブリキウス嚢病（IBD）の防御抗原を発現する組換えウイルス（特許文献１、非特許文献２）がワクチンとして実用化されている。こちらの場合、単独でも十分な有効性を発揮するが、免疫の立ち上がりに時間を要する。【０００５】
一方、鶏の伝染性気管支炎（IB）の場合、複数の血清型が存在するため、複数の生ワクチン株を投与していく必要がある（非特許文献３）。【０００６】
ウイルスベクターの開発により、従来よりも省力的なワクチネーションプログラムの設定が可能とはなったが、現状では依然として改善の余地が残されている状況にある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第3933689号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Beveridge NE et al, Eur J Immunol., Nov;37(11):3089-100, 2007.
【非特許文献２】Le Gros FX et al, Vaccine, Jan 22;27(4): 592-6. 2009
【非特許文献３】鶏病研究会報、42巻1号、p.1-14、2006年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本願発明の目的は、動物に感染症を引き起こす感染因子由来の感染防御抗原をベクターウイルスゲノムに組み込んで得られる組換えベクターウイルス（以下、「ベクターワクチン」と称することもある）、該感染因子を弱毒化して得られるワクチン（以下、「生ワクチン」と称することもある）及びこれらのワクチンの併用によるヒト以外の感染症の予防方法、並びに該ベクターワクチン及び該生ワクチンを有効成分とするワクチンを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、ウイルスベクターワクチンと生ワクチンを同時にあるいは混合して投与することで、ベクターワクチンによる抗体の立ち上がりを改善し、追加投与を必要としないワクチンあるいはワクチネーションプログラムを開発するに至った。また、複数の血清型を有する感染症に対しては、ベクターワクチンで一つの血清型に対する抗体を惹起し、さらに別の血清型を投与することで必要とされる複数の血清型に対する抗体を惹起し、より省力的なワクチネーションプログラムを確立するに至った。【００１１】
鶏感染症に対するワクチンを例にあげてその効果を以下に示す。すなわち、ニューカッスル病ウイルス（NDV）の感染防御抗原の一つであるFタンパク質が挿入された組換えマレック病ウイルス（ベクターワクチン）とニューカッスル病（ND）の生ワクチンの混合物を市販鶏の雛に１回投与することにより、該鶏体内に早期にNDVに対する感染防御抗体が上昇すること、且つ該抗体の力価が長期にわたり高く維持されることを発見した。また鶏伝染性気管支炎ウイルス（IBV）の感染防御抗原の一つであるS1タンパク質が挿入された組換えマレック病ウイルス（ベクターワクチン）を鶏雛に投与後、鶏伝染性気管支炎（IB）の生ワクチンを１回追加投与することにより、ベクターワクチン及び生ワクチン株とは異なる血清型の株を含む複数のIBVに対する感染防御抗体の上昇を認めることに加え、抗体価が長期に亘って維持されることを見出し、本願発明を完成するに至った。【００１２】
本願発明のベクターワクチン及び生ワクチン、並びにこれらのワクチンの併用による投与方法は、動物の感染症の予防に有効に利用され得るものである。したがって、本願発明は、以下の通りである。
〔１〕感染因子の感染防御抗原が組み込まれた組換えベクターウイルス（ベクターワクチン）及び弱毒化した該感染因子（生ワクチン）を併用することを特徴とする、ヒト以外の感染症の予防方法。
〔２〕前記ベクターワクチン及び前記生ワクチンが、混合された一つのワクチンである、〔１〕に記載の予防方法。
〔３〕前記ベクターワクチン及び前記生ワクチンが、独立した二つのワクチンである、〔１〕に記載の予防方法。
〔４〕前記ベクターワクチンと前記生ワクチンを混合して投与することを特徴とする、〔３〕に記載の予防方法。
〔５〕前記ベクターワクチンを投与した後に、前記生ワクチンを投与することを特徴とする、〔３〕に記載の予防方法。
〔６〕前記生ワクチンを、ベクターワクチン投与後、1-200日の間に投与することを特徴とする、〔５〕に記載の予防方法。
〔７〕前記ベクターワクチンと前記生ワクチンの混合比が、１：1-10である、〔２〕又は〔４〕に記載の予防方法。
〔８〕前記ベクターウイルスが、ヘルペスウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、ポックスウイルス及びアデノウイルスからなる群より選ばれる、〔１〕ないし〔７〕のいずれか一項に記載の予防方法。
〔９〕前記ベクターウイルスが、マレック病ウイルスである、〔１〕ないし〔７〕のいずれか一項に記載の予防方法。
〔１０〕前記感染因子が、鶏に感染する因子（鶏感染因子）である、〔１〕ないし〔９〕のいずれか一項に記載の予防方法。
〔１１〕前記鶏感染因子の感染防御抗原が、ニューカッスル病ウイルスのFタンパク質又はHNタンパク質、鶏伝染性気管支炎由来のS1タンパク質、マレック病ウイルスのgBタンパク質、鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのVP2タンパク質、鶏伝染性喉頭気管炎ウイルスのgBタンパク質、七面鳥鼻気管炎ウイルスのFタンパク質、トリ白血病ウイルスのEnvタンパク質、細網内皮症ウイルスのEnvタンパク質、鶏貧血ウイルスのVP1+VP2タンパク質、トリインフルエンザウイルスのHAタンパク質、マイコプラズマ・ガリセプティカムのｐ29タンパク質、及びロイコチトゾーン・カウレリーのMSA1タンパク質からなる群より選ばれる、〔１０〕に記載の予防方法。
〔１２〕前記鶏感染因子の感染防御抗原が、ニューカッスル病ウイルスのFタンパク質若しくはHNタンパク質、又は鶏伝染性気管支炎由来のS1タンパク質である、〔１０〕に記載の予防方法。
〔１３〕感染因子の感染防御抗原が組み込まれた組換えベクターウイルス（ベクターワクチン）及び弱毒化した該感染因子（生ワクチン）を有効成分とすることを特徴とする、ワクチン。
〔１４〕前記ベクターワクチン及び前記生ワクチンが、混合された一つのワクチンである、〔１３〕に記載のワクチン。
〔１５〕前記ベクターワクチンと前記生ワクチンの混合比が、１：1-10である、〔１４〕に記載のワクチン。
〔１６〕前記ベクターワクチン及び前記生ワクチンが、独立した二つのワクチンである、〔１３〕に記載のワクチン。
〔１７〕前記ベクターウイルスが、ヘルペスウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、ポックスウイルス及びアデノウイルスからなる群より選ばれる、〔１３〕ないし〔１６〕のいずれか一項に記載のワクチン。
〔１８〕前記ベクターウイルスが、マレック病ウイルスである、〔１３〕ないし〔１６〕のいずれか一項に記載のワクチン。
〔１９〕前記感染因子が、鶏に感染する因子（鶏感染因子）である、〔１３〕ないし〔１８〕のいずれか一項に記載のワクチン。
〔２０〕前記鶏感染因子の感染防御抗原が、ニューカッスル病ウイルスのFタンパク質又はHNタンパク質、鶏伝染性気管支炎由来のS1タンパク質、マレック病ウイルスのgBタンパク質、鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのVP2タンパク質、鶏伝染性喉頭気管炎ウイルスのgBタンパク質、七面鳥鼻気管炎ウイルスのFタンパク質、トリ白血病ウイルスのEnvタンパク質、細網内皮症ウイルスのEnvタンパク質、鶏貧血ウイルスのVP1+VP2タンパク質、トリインフルエンザウイルスのHAタンパク質、マイコプラズマ・ガリセプティカムのｐ29タンパク質、及びロイコチトゾーン・カウレリーのMSA1タンパク質からなる群より選ばれる、〔１９〕に記載のワクチン。
〔２１〕前記鶏感染因子の感染防御抗原が、ニューカッスル病ウイルスのFタンパク質若しくはHNタンパク質、又は鶏伝染性気管支炎由来のS1タンパク質である、〔１９〕に記載のワクチン。
【発明の効果】
【００１３】
本願発明に従えば、感染因子由来の感染防御抗原が組み込まれた組換えベクターウイルス（ベクターワクチン）及び弱毒化した該感染因子（生ワクチン）を併用することからなる、ヒト以外の感染症の予防方法、及び動物感染症の予防に用いるワクチンが提供される。【００１４】
例えば、鶏のNDV感染症（ND）に対するベクターワクチンと生ワクチンの混合物を鶏雛（又は鶏卵）に１回投与することにより、ベクターワクチンを単独投与したときよりも早期にNDVに対する中和抗体が誘導され、且つ該中和抗体は、高い力価で長期間維持される。したがって、本願発明の方法は、移行抗体が低下する期間のNDV感染の阻止に有用である。【００１５】
また、例えば、鶏のIBV感染症（IB）に対するベクターワクチンを鶏雛に皮下接種又は鶏卵へ接種し、その後、IBVの生ワクチンを1回点眼することにより、ワクチン株に対する感染防御抗体が早期に惹起され、長期に亘り維持されるだけでなく、該感染防御抗体は、血清型の異なる種々のウイルス株に対しても効力を有する。【００１６】
更に、マレック病ウイルスに対する抗体が惹起され二価ワクチンとしての効果を併せ持つので、ワクチン接種の回数を減らすなど、種々の鶏感染症に対する効率的なワクチン投与プログラムを策定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１−１】図１−１は、BAC配列をMDV1（CVI988株）に挿入するためのプラスミド（pUC-nTK-gpt-BAC）を構築する手順を示す図面である。
【図１−２】図１−２は、BAC配列をMDV1（CVI988株）に挿入するためのプラスミド（pUC-nTK-gpt-BAC）を構築する手順を示す図面である。
【図１−３】図１−３は、BAC配列をMDV1（CVI988株）に挿入するためのプラスミド（pUC-nTK-gpt-BAC）を構築する手順を示す図面である。
【図１−４】図１−４は、BAC配列をMDV1（CVI988株）に挿入するためのプラスミド（pUC-nTK-gpt-BAC）を構築する手順を示す図面である。
【図２−１】図２−１は、鶏伝染性気管支炎ウイルスのS1タンパク質(IBV-S1)遺伝子をMDV1ゲノムDNAに挿入するためのプラスミド（pKA4BPKmI-LgAsGC292Ftm）を構築する手順を示す図面である。
【図２−２】図２−２は、鶏伝染性気管支炎ウイルスのS1タンパク質(IBV-S1)遺伝子をMDV1ゲノムDNAに挿入するためのプラスミド（pKA4BPKmI-LgAsGC292Ftm）を構築する手順を示す図面である。
【図３−１】図３−１は、IBV-S1発現rMDV1の免疫試験における、IBV各株（TM86株、AK01株、練馬株、C78株）に対する中和抗体価の推移を示す図面である。（a）IBVのAK01株を追加投与した際の抗体応答。(b)IBVのAK01株を単独で投与した場合の抗体応答。
【図３−２】図３−２は、IBV-S1発現rMDV1の免疫試験における、IBV各株（TM86株、AK01株、練馬株、C78株）に対する中和抗体価の推移を示す図面である。（a）IBVの練馬株を追加投与した際の抗体応答。(b)IBVの練馬株を単独で投与した場合の抗体応答。
【図３−３】図３−３は、IBV-S1発現rMDV1の免疫試験における、IBV各株（TM86株、AK01株、練馬株、C78株）に対する中和抗体価の推移を示す図面である。（a）IBVのC78株を追加投与した際の抗体応答。(b)IBVのC78株を単独で投与した場合の抗体応答。
【図３−４】図３−４は、IBV-S1発現rMDV1の免疫試験における、IBV各株（TM86株、AK01株、練馬株、C78株）に対する中和抗体価の推移を示す図面である。（a）IBV-S1発現rMDV1のみを投与した場合の抗体応答を示す。(b) 非免疫群の抗体応答。
【図４】図４は、IBV−S1発現rMDV1の免疫試験における、rMDV1＋AK01株の投与群及びAK01株投与群のIBV（TM86株）に対する中和抗体価の推移を示す図面である。
【図５−１】図５−１〜図５−４は、IBV-S1発現rMDV1を投与した鶏における、IBV各株（TM86株、AK01株、練馬株、C78株）に対する中和抗体価の推移を示す図面である。図５−１は、IBV-S1発現rMDV1を投与後、4日齢時にIBVのAK01株を追加投与した際の中和抗体価の推移を示す。
【図５−２】図５−２は、IBV-S1発現rMDV1を投与後、21日齢時にIBVのAK01株を追加投与した際の中和抗体価の推移を示す。
【図５−３】図５−３は、IBV-S1発現rMDV1のみを投与した場合の中和抗体価の推移を示す。
【図５−４】図５−４は、IBV-S1発現rMDV1は投与せず、4日齢時にIBVのAK01株を単独で投与した場合の中和抗体価の推移を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本願発明は、感染症を予防するための方法及びワクチンを提供するものであり、動物に感染症を引き起こすウイルスや微生物等の感染因子由来の感染防御抗原をベクターウイルスに組み込んで得られる組換ベクターウイルス（ベクターワクチン）と、弱毒化した該感染因子（生ワクチン）を併用することに特徴がある。
【００１９】
本願発明における「併用」とは、該ベクターワクチン及び該生ワクチンを混合した一つのワクチンを投与する場合及び該ベクターワクチン及び該生ワクチンの独立した二つのワクチンを、該感染症予防のためのワクチネーションプログラムにおいて同時期又は異なる時期に投与する場合を意味する。
【００２０】
本願発明を構成するベクターワクチン及び生ワクチンは、以下の方法により取得できる。なお、以下、鶏感染症に対するワクチンを一例として説明するが、鶏感染症に何ら限定されるものではない。
【００２１】
（１）生ワクチンの調製
本願発明の生ワクチンには、鶏に対して毒性や副作用の弱い、弱毒化鶏感染因子（鶏感染症を引き起こす感染因子）が用いられる。鶏感染因子は、該鶏感染因子が感染した鶏から単離し、これを発育鶏卵、鶏初代細胞（例えば、CEF、腎細胞）、株化細胞（LMH、DT40）等に接種・培養して増殖させることにより得られる。発育鶏卵を用いる場合は、鶏感染因子を８-12日齢発育鶏卵に接種した後、34-37℃、２-４日間の培養が行われる。
【００２２】
細胞を用いる場合は、鶏感染因子を106-108の細胞に接種し、該鶏感染因子接種細胞の培養が行われる。細胞培養に用いる培地は、市販のM199-earle base（日水）、イーグルMEM（E-MEM）（日水）、ダルベッコMEM（D-MEM）（日水）、SC-UCM102（日水）、UP-SFM（GIBCO BRL）、EX-CELL302（ニチレイ）、EX-CELL293-S（ニチレイ）、TFBM-01（ニチレイ）、ASF104（味の素）等から選択される。必要に応じて、該培地に血清、アミノ酸、塩類、ビタミン、抗カビ・抗菌剤等が添加される。培養条件は、通常の細胞培養条件（培養温度30-37℃、培養期間２-５日間、pH6-8）と同じである。
【００２３】
上記の方法により得られる鶏感染因子として、例えば、ニューカッスル病ウイルス（NDV）、鶏伝染性気管支炎ウイルス（IBV）、マレック病ウイルス（MDV）、鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（IBDV）、鶏伝染性喉頭気管炎ウイルス（ILTV）、七面鳥鼻気管炎ウイルス（TRTV）、トリ白血病ウイルス（ALV）、細網内皮症ウイルス（REV）、鶏貧血ウイルス（CAV）、トリインフルエンザウイルス（AIV）、トリレオウイルス（ARV）、 鳩痘ウイルス（PPV）、鶏痘ウイルス（FPV）、七面鳥ヘルぺスウイルス（HVT）、EDS-76ウイルス（EDS）、鶏脳脊髄炎ウイルス（AEV）、EDS-76ウイルス（EDS）、サルモネラ・プローラム（SP）、サルモネラ・エンテリティーディス（SE）、アビバクテリウム・パラガリナルム（H.pg）、マイコプラズマ・ガリセプティカム（Mg）,マイコプラズマ・シノビエ（MS）、アイメリア属原虫、ロイコチトゾーン・カウレリー等が挙げられる。但し、鶏感染因子は、これらの例示に限定されるものではない。
【００２４】
上記の鶏感染因子を弱毒化して得られる弱毒化鶏感染因子の作出には、鶏感染因子接種細胞の継代を繰り返す方法、あるいは毒性を示すタンパク質をコードする遺伝子を変異又は除去する方法が取られる。細胞継代は、上記の細胞培養と同じ方法、条件が用いられるが、培養温度は、30-37℃の低温で行う場合が多い。感染因子の弱毒化の判定は、鶏への感染力、病気の減弱等により行うが、このとき感染因子の増殖における温度依存性、増殖力、制限酵素切断パターンやゲノムの塩基配列等のマーカーが指標にされる。病原性を担う遺伝子が明らかにされている場合は、後述の遺伝子組み換え技術により該遺伝子の変異や除去が行われる。
【００２５】
こうして病原性を減弱化した鶏感染因子や分離段階で弱毒化されているような鶏感染因子、病原性に関与する遺伝子を除去した鶏感染因子が生ワクチンの有効成分として用いられる。
【００２６】
作出された弱毒化鶏感染因子は以下の方法により製剤化・保存される。上記と同様の方法に従って弱毒化鶏感染因子を増殖・培養した後、培養物を破砕し、種々の遠心分離（粗遠心、超遠心）やろ過等を繰り返すことにより、細胞やその破砕物からの分離・回収操作が行われる。得られた弱毒化鶏感染因子は、その有効性を維持するために安定剤（例えば、乳糖）や緩衝剤を加え、凍結、あるいは真空下で凍結乾燥して製剤化・保存される。細胞依存性の強い弱毒化鶏感染因子（例えば、マレック病ウイルス）は、培養細胞で増殖後、その感染細胞をアンプルに封入し、細胞の生存性を保持した状態で凍結した製剤として保存される。
【００２７】
（２）ベクターワクチンの調製
本願発明のベクターワクチンには、ベクターウイルスに鶏感染因子由来の感染防御抗原が組み込まれた組換ベクターウイルスが用いられる。ベクターウイルスの弱毒化は、生ワクチンの弱毒化と同じ方法が取られる。ベクターウイルスに利用できるウイルスとして、MDV、鶏痘ウイルス及びトリアデノウイルス等が報告されているが（非特許文献２参照）、いずれのウイルスも本願発明に使用できる。好ましくは、弱毒化したMDV、例えば、CVI-988株、61-554株（特開平6-22757号）、Md11/75C株（R.L. Witter；AVIAN DISEASE 31：752-765、1987）が使用される。ベクターウイルスに鶏感染因子由来の感染防御抗原を組み込む場合は、該感染防御抗原をコードするDNA断片がベクターウイルスの複製に影響しないゲノム内の特定領域に挿入される。斯かる特定領域は、転写、翻訳のいずれにも関与しない非翻訳領域内であれば、特に限定されるものではない。オープンリーディングフレーム内に外来遺伝子が挿入される場合においても、例えば、MDVを使用する場合、US10遺伝子（特許第3428666号）、HVTを使用する場合、TK遺伝子（Ross、J Gen Virol., 1993）、等の領域を用いれば良い。
【００２８】
また、鶏感染因子由来の感染防御抗原については、NDVのFタンパク質やHNタンパク質、IBVのS1タンパク質、MDVのgBタンパク質、IBDVのVP2タンパク質、ILTVのgBタンパク質、TRTVのFタンパク質、ALVのEnvタンパク質、REVのEnvタンパク質、CAVのVP1+VP2タンパク質、AIVのHAタンパク質、マイコプラズマ・ガリセプティカムのｐ29タンパク質、ロイコチトゾーン・カウレリーのMSA1タンパク質等が報告されており（非特許文献２参照）、これらのタンパク質及びその一部は、いずれも本願発明の鶏感染因子由来の感染防御抗原として使用できる。したがって、上記の感染因子由来の感染防御抗原を発現する組換えベクターウイルス（ベクターワクチン）と該感染因子を弱毒化した生ワクチンとの組合せが本願発明に使用できる。好ましくは、IBVの生ワクチンとIBVのS1タンパク質が組み込まれた組換えベクターウイルス、及びNDVの生ワクチンとNDVのFタンパク質が組み込まれた組換えベクターワクチンの組合せである。
【００２９】
上記の組換えベクターウイルスは、Sambrookらが述べている一般的な遺伝子組換え技術（Molecular Cloning, A Laboratory Manual Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989）により調製される。実際には、核酸断片（DNA、RNA）の抽出及びクローニング、核酸断片への変異の導入、核酸断片の宿主内への導入・宿主の培養等は、当該技術に基づき開発された種々の遺伝子操作キットが市販されているので、これらの市販品を用いて行われる。
【００３０】
（ア）ベクターウイルスゲノムの調製
まず、生ワクチンと同様の方法によるベクターウイルスの調製、ウイルスゲノムの抽出、該ウイルスゲノムのBAC配列を有するプラスミド（BACmid；ニュー・イングランド・バイオラボ社）への挿入、及び大腸菌での該BACmidのクローニングと量産が行われる。次に、大腸菌から該BACmidを抽出し、これをBAC配列切断酵素産生細胞中で培養することにより、BAC配列が除去されたベクターウイルスゲノムが抽出される。この一連の操作は、添付のプロトコールに従って行われる。こうして得られたベクターウイルスゲノムは、組換えベクターウイルスの調製に使用される。本願発明のMDVゲノムは、より具体的には、Messerleら（Proc Natl Acad Sci U S A., 1997）、Wussowら（PLoS One, 2009）報告等に開示されている方法に従って調製される。
【００３１】
（イ）鶏感染因子由来の感染防御抗原をコードする遺伝子の調製
鶏感染因子由来の感染防御抗原をコードする遺伝子（以下、「感染防御遺伝子」と称することもある）は、ベクターウイルスゲノムの調製と同様の方法により、鶏感染因子のゲノムを抽出した後、例えば、該ゲノムを鋳型としてPCR法により感染防御遺伝子を増幅・クローニングすることにより得られる。このとき、感染防御抗原遺伝子が鶏体内で作用するように、例えば、SV40初期、SV40後期、サイトメガロウイルスIE、βアクチン等のプロモーターが付加され、更にベクターウイルスゲノム内で鶏感染因子由来の感染防御抗原遺伝子の相同組換えが行われるように、該感染防御抗原遺伝子の両末端にベクターウイルスゲノムの挿入部位の塩基配列（以下、「相同組換え配列領域」と称することもある）が付加される。また、発現量や組換え体構築の利便性を上げることを目的として、エンハンサー配列、シグナル配列、制限酵素認識配列、トランスメンブレン領域の付加や宿主依存性の塩基配列への置換が行われることもある。前記の塩基配列の置換（変異）には、サイトダイレクティドミュータジェネシス法を用いるのが一般的である。鶏感染因子の感染防御抗原遺伝子は、例えば、IBVのS1タンパク質は文献（Songら、J Gen Virol., 1998）、NDVのFタンパク質は文献（Morganら、Avian Disease, 1992）、等に開示されている方法に従ってプラスミド等にクローニングされる。目的のDNA断片の確認は、DNAシークエンサー（ABI Prism 377  アプライドバイオシステムズ社）により塩基配列を決定し、既存の塩基配列と比較することにより行われる。なお、ここでいう既存の配列は、NCBI（National Center for Biotechnology Information：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore）等のデータベースで検索を行うことにより、容易に入手することができる。
【００３２】
本願発明の組換えベクターウイルスは、上記のベクターウイルスゲノムと感染防御抗原遺伝子が挿入されたプラスミドとの間で相同組換えを起こすことにより得られる。例えば、MDVを接種したCEF細胞を、NDV-Fタンパク質が挿入されたプラスミドを含む培地で培養することにより、MDVゲノムの相同組換え配列領域で相同組換えが起こり、MDVゲノムにNDVのFタンパク質が組み込まれた組換えベクターウイルスが作出される。培養方法及び条件は、上記の鶏感染因子を取得するときに用いた方法及び条件が用いられる。また、組換えベクターウイルスは、生ワクチンと同様に組換えベクターウイルスの性状に合わせて凍結乾燥製剤又は凍結液状製剤として製剤化・保存される。このとき、ベクターワクチン及び生ワクチンの有効性や性状等が互いに影響されない場合は、両ワクチンを混合した形態で製剤化・保存しても良い。
【００３３】
こうして得られた感染因子由来の感染防御抗原がベクターウイルスに組み込まれた組換えベクターウイルスを有効成分とするベクターワクチン及び該弱毒化感染因子を有効成分とする生ワクチンは、あらゆる公知の方法、例えば、筋肉、腹腔内、皮内又は皮下等への注射、あるいは鼻腔、口腔又は肺からの吸入、点眼、経口投与により鶏体内に導入することができる。本願発明の生ワクチン及びベクターワクチンを鶏卵（in ovo）に投与する場合は、注射による奨尿膜、羊膜腔、胎児への接種が行われるが、該ワクチンを鶏雛に投与する場合は、点眼・点鼻、噴霧接種、飲水投与による方法が好ましい。
【００３４】
投与量としては、有効成分の種類、投与経路、投与対象、体重、症状その他の条件により適宜選択されるが、一回の投与量としては以下の通りである。本願発明の生ワクチンは、ワクチン株の種類によってそれぞれ異なり、各ワクチンの製剤基準に記載されている1ドーズの最小有効量以上において使用される。また、本願発明のベクターワクチンは、MDワクチンの製剤基準に記載されている1ドーズの最小有効量以上において使用され、具体的には、in ovoの場合に1000-10000PFU（plaque forming units）/羽、好ましくは、2000-6000PFU/羽の範囲、雛体内への接種の場合に1000-10000PFU/羽、好ましくは、2000-6000PFU/羽の範囲で使用される。
【００３５】
鶏感染因子には、血清型が異なる多種の亜型や変異株が存在する。例えば、IBVに関しては、C-78株、AK-01株、練馬株、TM86株等が分離されている。このような場合において本願発明の生ワクチン及びベクターワクチンを併用するときは、生ワクチンに使用した鶏感染因子と同一の株が組み込まれた組換えベクターウイルスを用いてもよく、異なる血清型の株が組み込まれた組換えベクターウイルスを用いても良い。また、生ワクチン及びベクターワクチンをそれぞれ複数併用して用いることもできる。
【００３６】
本願発明を対象（鶏卵、雛）に投与する場合、ベクターワクチン及び生ワクチンを同時に投与してもよく、時期を変えて別々に投与しても良い。両ワクチンを同時に投与する場合には、上述した混合ワクチンを使用しても良く、独立した二つの該ワクチンを使用直前に混合して投与しても良い。この場合、独立した二つのワクチンは、キットまたはセットとして提供される。独立した状態で同時期に投与する場合も本願発明では同時投与を意味するものとする。
【００３７】
両ワクチンを別々に投与する場合は、生ワクチンとベクターワクチンのいずれを先に投与しても良いが、好ましくは、ベクターワクチンを投与後に生ワクチンが投与される。この場合、生ワクチンは１回の投与で十分な効果を有するが、更に追加投与をしても良い。生ワクチンの投与は、ベクターワクチンを投与後、１-200日の間に行われる。好ましくは、４-126日の間である。
【００３８】
本願発明のワクチンとしての評価は、in vitroの系においては、免疫鶏から採血後、血清を分離し、当該血清中の本願発明の生ワクチンに対する抗体力価や鶏感染因子に対する中和抗体価を測定することにより、また、in vivoの系においては、前記免疫鶏に鶏感染因子の強毒株を投与し、その後免疫鶏の生死、病状等を観察することにより行われる。in vitroの系における抗体の測定には、ELISA法、PHA法、プラークアッセイ法などが常用される。
【００３９】
鶏に投与されるワクチンは、飼養場所ごとの状況（病原体の汚染状態、周囲の鶏病流行状況、採卵鶏又は肉用鶏、種鶏又は実用鶏）によって異なるので、それらの状況を考慮したワクチネーションプログラムが組まれる。本願発明の生ワクチンとベクターワクチンは、他の鶏感染症用ワクチンと一緒に投与するワクチネーションプログラムを策定しても良い。このような鶏感染症用ワクチンとして、生ワクチンの場合、ARV、NDV、IBV、IBDV、MDV及びAEVに対する生ワクチン群から選択される少なくとも１種類のワクチンと組み合わせることができる。不活化ワクチンの場合、ARV、NDV、IBV、EDS、IBDV、細菌（例えば、大腸菌及びサルモネラ菌、ヘモフィルス・パラガリナラム菌など）、マイコプラズマ（例えばマイコプラズマ・ガリセプティカム及びマイコプラズマ・シノビエなど）及び寄生虫（例えばアイメリア属）に対する不活化ワクチン群から選択される少なくとも１種類のワクチンと組み合わせることができる。
【００４０】
本願発明のベクターワクチン及び生ワクチンを併用することによる鶏感染症の予防方法は、広く一般に適用可能な方法であり、単に鶏に限らず、鶏以外の鳥類や動物の感染症に対しても同様の効果が期待される。したがって、本発明の予防方法は、ヒトを除く動物に使用することができ、また、本願発明のベクターワクチン及び生ワクチンを有効成分とするワクチンは広く動物に使用することができる。好ましくは、インフルエンザウイルス、マレック病ウイルス（ヘルペスウイルス）、ニューカッスル病ウイルス等は、鶏や七面鳥に限らず多く鳥類に感染することから、広く鳥類に対して使用される。鶏以外の鳥類としては、商用又は非商用目的で飼育されている鳥類が含まれ、その一例として、キジ目（例えば、ニワトリ、ウズラ類、シチメンチョウ）、カモ目（例えば、アヒル、ガチョウ）、チドリ目（例えば、カモメ、ミフウズラ、チドリ）、ハト目（例えば、ハト）、ダチョウ目（例えば、ダチョウ）、スズメ目（例えば、カラス、フィンチ、スズメ、スターリング、ツバメ）、オウム目（例えば、オウム）、タカ目（例えば、イーグル、タカ）、フクロウ目（例えば、フクロウ）、ペンギン目（例えば、ペンギン）、オウム目（例えば、インコ、オウム）が挙げられる。好ましくは、七面鳥、アヒル、ウズラ、カモである。
【００４１】
鶏以外の動物に適用する場合は、ベクターウイルスとして、ヘルペスウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、ポックスウイルス及びアデノウイルスなどが挙げられるが、何れを使用しても良い。また、狂犬病ウイルスのG蛋白遺伝子（Espositoら、Virus Genes, 1987）やインフルエンザウイルスのHA蛋白遺伝子（Tangら、Arch Virol., 2002）等の、鶏感染因子以外の動物感染因子の感染防御抗原をコードする遺伝子、該遺伝子が組み込まれたベクターワクチン、及び該動物感染因子を弱毒化して得られる生ワクチンは、種々の特許公報や技術文献に開示された情報に基づいて、鶏感染症に対するベクターワクチン及び生ワクチンを作製した方法と同様の方法により作製することができる。
【００４２】
以下、実施例に従い、本願発明を更に詳細に説明するが、下記の実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４３】
《BAC配列を有する組換えマレック病ウイルス１型ゲノムDNA（rMDV1-BACmid）の作製》
（１）BAC配列をMDV1（CVI988株）に挿入するためのプラスミドpUC-nTK-gpt-BACの構築
下記（イ）〜（ホ）の工程により、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子の下流にgpt（xanthine-guanine phosphoribosyl transferase）遺伝子、その下流にBAC配列をpUC119に挿入したプラスミドpUC-nTK-BACを構築した。【００４４】
（イ）MDV1ゲノムDNAを鋳型とし、配列番号1及び２のプライマーを用いたPCRによりチミジンキナーゼ（TK）遺伝子全長を含む断片を増幅した。
5'側：ATGGTGTTTTAAGCTTGGTGATTAC（下線部はHindIII認識配列）（配列番号1）
3'側：CCCAAGCTTCTCCCCGGCCAATCATACA（下線部はHindIII認識配列）（配列番号2）【００４５】
該断片をHindIIIで切断後、予め同じ制限酵素で切断したpUC119（タカラバイオ社、製品コード；3319）に挿入し、プラスミドpUC119-TKを得た。次いで、pUC119-TKを鋳型として、TK遺伝子のオープンリーディングフレームの直後の領域においてプラスミド全長を増幅するよう逆向きに設計した、配列番号3及び４のプライマーを用いたPCRを行い、末端のリン酸化処理及びself-ligationを行うことにより、PacIサイトを付加したプラスミドpUC-nTKを得た（図１−１）。
5'側：TTAATTAATACCCATTCATATCGCGCTTCTA（下線部はPacI認識配列）（配列番号3）
3'側：GTTTTACATAGCCATCTCTTTATTATAGG（配列番号4）【００４６】
（ロ）BAC配列を含むpBeloBAC11（ニュー・イングランド・バイオラボ社、製品コード；E4154）をNotIで切断後、予め同じ制限酵素で切断したpBlueScriptII KS+（Stratagene社）にクローニングし、プラスミドpBSII-BACを得た。  なお、BAC配列を封するプラスミドを「BACmid」と称することもある。【００４７】
（ハ）大腸菌ゲノムDNAを鋳型とし、配列番号5及び6のプライマーを用いてPCRを行い、gpt（xanthine-guanine phosphoribosyl transferase）遺伝子全長を含む断片を増幅した。
5'側：TGGGACACAGCTGATGAGCGAAAAATACATCGT（下線部はPvuII認識配列）（配列番号5）
3'側：CGGGATCCTTAGCGACCGGAGATTGGC（下線部はBamHI認識配列）（配列番号6）
該断片をPvuIIおよびBamHIで切断後、予め同じ制限酵素で切断したpCEP4（インビトロジェン社、製品コード；V044-50）に挿入し、プラスミドpCEP4-gptを得た（図１−２）。【００４８】
（二）前記（ハ）のpCEP4-gptをSalIで切断後に平滑末端処理して得た断片を、予めBamHIで切断後に平滑末端処理した前記（ロ）のpBSII-BACにクローニングし、プラスミドpBSII-gpt-BACを得た（図１−３）。【００４９】
（ホ）前記（二）のpBSII-gpt-BACを鋳型とし、配列番号７及び８のプライマーを用いてPCRを行い、gpt遺伝子およびBAC配列を含む約8.7kbpの断片を増幅した。
5'側：
2014077096.tif 000002
（下線部はSacII認識配列、二重下線部はloxP配列(34bp)）（配列番号7）
3'側：TCCCCGCGGCGCATCGAATATAACTTCGTA（下線部はSacII認識配列）（配列番号8）
該断片をSacIIで切断後に平滑末端処理を行い、予めPacIで切断後に平滑末端処理した前記（イ）のpUC-nTKに挿入し、gpt-BACの両末端にloxP配列を有するプラスミドpUC-nTK-gpt-BACを得た（図１−４）。【００５０】
（２）BAC配列のMDV1ゲノムDNAへの挿入
前記（１）で得たpUC-nTK-gpt-BACとMDV１感染細胞を用いて相同組換えを行うことにより、BAC配列が挿入された組換えMDV1ゲノムDNA（rMDV1-BACmid）を有する細胞を作製した（Messerleら、Proc Natl Acad Sci U S A., 1997）。具体的には、HindIIIで線状化したpUC-nTK-BACとMDV1(CVI988株)を感染させたCEF細胞をジーンパルサー用キュベット内で混合し、ジーンパルサー（バイオラッド社）を用いてパルスを行った後、該MDV1感染細胞を25μg/mLミコフェノール酸を含むGPT Selection Reagent（Chemicon International社）添加培地で培養し、環状のrMDV1-BACmidを保持する細胞を選択した。【００５１】
（３）rMDV1-BACmidの大腸菌へのクローニング
前記（２）で得たrMDV1-BACmid保持細胞からHirt法（Hirt、J Mol Biol., 1967）によりrMDV1-BACmidを抽出し、該DNAをエレクトロポレーション法により大腸菌DH10B（インビトロジェン社、製品コード；18290-015）に導入した。該大腸菌をクロラムフェニコール添加培地で培養し、rMDV1-BACmidを保持する大腸菌をクローニングした。rMDV1-BACmid中のMDV1ゲノムDNAは、該rMDV1-BACmidと親株MDV1のゲノムDNAの制限酵素（EcoRI、BamHI、HindIII）切断パターンを比較することにより同定した。その結果、BACmid挿入領域を除く両者の切断パターンが一致し、全長MDV1ゲノムのBACmidへの挿入が確認された。
【実施例２】
【００５２】
《鶏伝染性気管支炎ウイルスのS1タンパク質(IBV-S1)遺伝子及びBACmidが組み込まれたrMDV1ゲノムDNA（rMDV1-BACmid/S1）の作製》
（１）IBV-S1遺伝子を有するプラスミドpKA4BPKmI-LgAsGC292Ftmの構築
IBV-S1（TM86株）を発現するプラスミドpKA4BP-LgAsS1Ftm（特許4691495号参照）を用いて、配列番号9及び10のプライマーを用いたPCRを行い、IBV-S1遺伝子上のATリッチな領域におけるGC含量が高くなるようにコドンを最適化したDNA断片を得た。
5'側：ACATGCATGCGTGAACAACTATACATCTGTCTATTTGAATGG（下線部はSphI認識配列）（配列番号9）
3'側：CGAGCTCCGAGATACGTATATGATTCCGTGGAAC（下線部はSacI認識配列）（配列番号10）【００５３】
次いで、配列番号11及び12の合成オリゴヌクレオチドを混合し、94℃・1分、70℃・10分の反応を行った後に室温で冷却させることでアニールした二本鎖ヌクレオチド断片と、予めSphIおよびSacIで切断し、平滑末端処理を行った上記DNA断片を連結することにより、改変S1遺伝子を有するプラスミドpKA4BP-LgAsGC292Ftmを得た（図２−１）。
5'側：CTATGAAGAACGGCTCGCTGTTCTACAACCTGACGATCAGCGTGTCCAAGCACCCTAAGTTCAAGTCGTT CCAGTGCATG（配列番号11）
3'側：CACTGGAACGACTTGAACTTAGGGTGCTTGGACACGCTGATCGTCAGGTTGTAGAACAGCGAGCCGTTCT
TCATAGAGCT（配列番号12）【００５４】
該pKA4BP-LgAsGC292Ftmを予めSnaBIで部分切断したものに、pACYC177（ニッポンジーン社、製品コード；310-02191）を鋳型として、配列番号13及び14のプライマーを用いたPCRにより増幅し、末端リン酸化処理したカナマイシン耐性遺伝子配列を含む約1.0kbpの断片を挿入し、カナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドpKA4BPKmI-LgAsGC292Ftmを得た（図２−２）。
5'側：
2014077096.tif 000003
（下線部は挿入領域の5’末端の相同配列、二重下線部はI-SceI認識配列）（配列番号13）
3’側：CAACCAATTAACCAATTCTGATTAGA（配列番号14）【００５５】
（２）pKA4BPKmI-LgAsGC292FtmのrMDV1-BACmidへの挿入
実施例１-(３）で得たrMDV1-BACmidを保持する大腸菌（DH10B）からrMDV1-BACmidを抽出し、λ-Red組換え酵素および制限酵素I-SceI遺伝子が組み込まれたゲノムを有する大腸菌GS1783に導入し、rMDV1-BACmidを有する大腸菌GS1783（GS1783/rMDV1-BACmid）をクローニングした（Wussowら、PLoS One, 2009）。該GS1783/rMDV1-BACmidを増殖後、培養温度を32℃から42℃にシフトし、λ-Red組換え酵素を発現させた状態で定法に従ってコンピテントセルを調製した。【００５６】
該コンピテントセルに、予め制限酵素KpnIおよびBglIにより線状化した前記（１）のpKA4BPKmI-LgAsGC292Ftmを導入し、クロラムフェニコールおよびカナマイシン添加培地で培養し、IBV-S1発現プラスミドが挿入されたrMDV1-BACmidを保持する大腸菌（GS1783/rMDV1-BACmid/S1+Km）をクローニングした（Wussowら、PLoS One, 2009）。【００５７】
次いで、該GS1783/MDV1-BACmid/S1+Kmを終濃度1.6%のアラビノース添加培地で培養した後、培養温度を32℃から42℃へシフトして30分間保温した。続いて、クロラムフェニコール添加培地又はカナマイシン添加培地で培養し、クロラムフェニコール添加培地のみで増殖するクローンを選択した（Wussowら、PLoS One, 2009）。こうしてIBV-S1発現プラスミドがrMDV1-BACmidに挿入された組換えMDVゲノムDNA（rMDV1-BACmid/S1）を保持する大腸菌（GS1783/rMDV1-BACmid/S1）を得た。
【実施例３】
【００５８】
《IBV-S1発現MDV1の調製》
実施例２-（２）のMDV1-BACmid/S1からgpt-BAC配列を除くためにCre酵素処理を行った。具体的には、実施例２-（２）で得たGS1783/MDV1-BACmid/S1からPureYield Maxiprep Kit（プロメガ社、製品コード；A2393）を用いてrMDV1-BACmid/S1を 抽出し、この1μgをCre酵素を発現するプラスミドpCAGGS-Cre（Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Jan 3;92(1):160-4.）30ng、Fugene HD Transfection Reagent（プロメガ社、製品コード；E2311）3.3μLと混合し、CEF細胞に添加し、37℃、5%CO2条件下にてMDV1特有のプラークが出現するまで培養した。【００５９】
次いで、0.125%トリプシン処理したプラーク形成細胞を限外希釈し、未感染CEF細胞と共に培養し、単一のプラークが出現したウェルについてgpt+BAC配列の有無を確認するためにnested-PCRを行った。こうして、gpt-BAC配列が除かれたIBV-S1遺伝子のみを有するrMDV1ゲノムDNA（24/gBGC292Ftm）を得た。24/gBGC292FtmによるIBV-S1の発現は、IBV-S1に対するモノクローナル抗体を用いた蛍光抗体法により確認した。
【実施例４】
【００６０】
《IBV-S1発現MDV1の免疫試験》
実施例３で得た24/gBGC292Ftm（3200 PFU/羽）を有効成分とするベクターワクチン（以下、「rMDV1、rMDV1-S1」と称することもある。）を、孵化場より購入した19日齢発育鶏卵（ジュリア種、坪井種鶏孵化場、山鹿市）（各群5羽）に接種し、孵化後18週齢時の雛にIBV生ワクチン３株（AK01株；化学及血清療法研究所、練馬株；化学及血清療法研究所、C78株；日生研株式会社）をそれぞれ追加的に点眼接種した。コントロールとして、rMDV1-S1のみを卵内接種した群（1群5羽）、孵化後18週齢時の雛に生ワクチンのみを投与した群（各群4羽）、非免疫群（１群4羽）を設定した。生ワクチン接種時を0ウイーク（0W）として、経時的に採血し、IBV各株（TM86株、AK01株、練馬株、C78株）に対する中和抗体価を調べることで評価を行った。表１は、使用したIBVワクチン株と群編成を示す。【００６１】
【表１】
2014077096.tif 000004
【００６２】
ベクターワクチン（rMDV1-S1）を接種した後、追加的にIBV生ワクチンを投与した群では、いずれもベクターワクチン又はIBV生ワクチンの単独投与群には見られない、異なる血清型のIBV株に対して中和抗体を誘導した（図３−１〜図３−４）。特に、TM株のS1を発現するrMDV1にAK01株を投与した場合において、いずれの血清型に対しても高い抗体応答が惹起されることが確認された。また、追加投与群では、ベクターワクチン又はIBV生ワクチンの単独投与群に比較して、早期に高い中和抗体価が惹起され、かつ誘導された抗体価は長期亘って持続することが確認された。【００６３】
更に、rMDV1＋AK01株の投与群では、抗体価の持続を調べたTM株に対しては、追加免疫後、少なくとも22週間に亘って中和抗体価が維持された（図４）。
【実施例５】
【００６４】
《IBV-S1発現MDV1を接種後、雛にIBV生ワクチンを追加した場合の併用効果》
実施例３で得たrMDV1-S1（2040 PFU/羽）を、18日齢発育鶏卵（SPF、化学及血清療法研究所）（19羽）に接種し、孵化後4日齢または21日齢時の雛にIBV生ワクチンAK01株(化学及血清療法研究所)を追加的に点眼接種した（それぞれ1群5羽、1群4羽）。コントロールとして、rMDV1-S1のみを卵内接種した群、孵化後4日齢時の雛に生ワクチンのみを投与した群を設定した（各群5羽）。経時的に採血し、IBV各株（TM86株、AK01株、練馬株、C78株）に対する中和抗体価を調べることで評価を行った。【００６５】
ベクターワクチン（rMDV1-S1）を接種した後、追加的にIBV（AK01株）生ワクチンを投与した群では、いずれもベクターワクチン又はIBV（AK01株）生ワクチンの単独投与群には見られない、異なる血清型のIBV株に対して中和抗体を誘導した（図５−１〜図５−４）。また、追加投与群では、ベクターワクチン又はIBV生ワクチンの単独投与群に比較して、高い中和抗体価が惹起され、かつ誘導された抗体価は、少なくとも孵化後9か月間に亘って高いレベルで持続することが確認された。
【実施例６】
【００６６】
《NDV-F発現MDV1（207株）とND生ワクチンB1株の同時投与における免疫効果》
ニューカッスル病（ND）ウイルスのFタンパク質（NDV-F）がMDV1のUS10遺伝子領域に挿入された組換えベクターウイルス207株（Journal of Virology, 2000, 74, 3217-26）を有効成分とするベクターワクチンとND生ワクチンB1株（化学及血清療法研究所）を表２に記載の割合で混合して、この0.2ml／羽（一群21羽）を、孵化場より購入した一日齢ヒナ（イサブラウン、坪井種鶏孵化場、山鹿市）の頸部皮下に接種した。経時的に採血し、得られた血清についてELISAにより、NDV-Fに対する抗体価を測定した。【００６７】
具体的には、NDV石井株を1%オクチルゴルコシド（DOJINDO）で溶解した後、PBE(-)で希釈し、96 wellマイクロプレートに一穴あたり約100HA（赤血球凝集価）/100μLを分注し4℃一夜放置して固相化した。これに希釈液（PBS-に脱脂粉乳を5%、ポリソルベート20を0.5%添加）で100倍に希釈した鶏血清を室温で１時間反応させ、洗浄後、HRPで標識したNDV-Fに対するモノクローナル抗体（Journal of Virology, 1990, 71, 1189-1197）を適当濃度（OD値が1〜2程度になるように希釈液で調整）添加し、o-フェニレンジアミン二塩酸塩（片山化学）を基質として発色させた。ELISA値で20.0以上を示したものをNDV-F抗体陽性とした。【００６８】
その結果、ベクターワクチンとND生ワクチンを同時接種した群は、移行抗体の力価が低下する時期の4週齢以降において、ベクターワクチン（207株）を単独で投与した群より高い陽性率を示した（表２）。表２は、207株及びND生ワクチンB1株投与鶏群におけるNDV-F抗体陽性率（％）の推移を示す（n=21:ただし2群の2週齢のみn=20）。【００６９】
【表２】
2014077096.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本願発明の感染因子由来の感染防御抗原が組み込まれたベクターワクチン及び該感染因子の弱毒化生ワクチン、並びにこれらを併用する方法は、ヒト以外の感染症を阻止するためのワクチネーションに効果的に利用され得る。
【図１−１】
2014077096.tif 000006
【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
2014077096.tif 000014
【図３−４】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
2014077096.tif 000020
【配列表】
2014077096000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年6月16日(2016.6.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鶏伝染性気管支炎ウイルス（IBV）由来のS1タンパク質が組み込まれた組換えベクターウイルス（ベクターワクチン）及び弱毒化したIBV（生ワクチン）を併用することを特徴とする、IBV感染症の予防方法。
【請求項２】
前記ベクターワクチン及び前記生ワクチンに用いるIBV株が、互いに異なる血清型である、請求項１に記載の予防方法。
【請求項３】
前記ベクターワクチン及び前記生ワクチンが、混合された一つのワクチンである、請求項１または２に記載の予防方法。
【請求項４】
前記ベクターワクチン及び前記生ワクチンが、独立した二つのワクチンである、請求項１または２に記載の予防方法。
【請求項５】
前記ベクターワクチンと前記生ワクチンを混合して投与することを特徴とする、請求項４に記載の予防方法。
【請求項６】
前記ベクターワクチンを投与した後に、前記生ワクチンを投与することを特徴とする、請求項４に記載の予防方法。
【請求項７】
前記生ワクチンを、ベクターワクチン投与後、1-200日の間に投与することを特徴とする、請求項６に記載の予防方法。
【請求項８】
前記ベクターワクチンと前記生ワクチンの混合比が、１：1-10である、請求項３又は５に記載の予防方法。
【請求項９】
前記ベクターウイルスが、ヘルペスウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、ポックスウイルス及びアデノウイルスからなる群より選ばれる、請求項１ないし８のいずれか一項に記載の予防方法。
【請求項１０】
前記ベクターウイルスが、マレック病ウイルスである、請求項１ないし８のいずれか一項に記載の予防方法。
【請求項１１】
鶏伝染性気管支炎ウイルス（IBV）由来のS1タンパク質が組み込まれた組換えベクターウイルス（ベクターワクチン）及び弱毒化したIBV（生ワクチン）を有効成分とすることを特徴とする、IBVワクチン。
【請求項１２】
前記ベクターワクチン及び前記生ワクチンに用いるIBV株が、互いに異なる血清型である、請求項１１に記載のIBVワクチン。
【請求項１３】
前記ベクターワクチン及び前記生ワクチンが、混合された一つのワクチンである、請求項１１または１２に記載のIBVワクチン。
【請求項１４】
前記ベクターワクチンと前記生ワクチンの混合比が、１：1-10である、請求項１３に記載のIBVワクチン。
【請求項１５】
前記ベクターワクチン及び前記生ワクチンが、独立した二つのワクチンである、請求項１１または１２に記載のIBVワクチン。
【請求項１６】
前記ベクターウイルスが、ヘルペスウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、ポックスウイルス及びアデノウイルスからなる群より選ばれる、請求項１１ないし１５のいずれか一項に記載のIBVワクチン。
【請求項１７】
前記ベクターウイルスが、マレック病ウイルスである、請求項１１ないし１５のいずれか一項に記載のIBVワクチン。
【国際調査報告】
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