(57)【要約】  本発明は、以下のステップ、  レンチウイルスゲノム配列中にテロメラーゼ逆転写酵素（TERT）遺伝子プロモーターの制御下にある導入遺伝子を含む、1つ以上の構造タンパク質遺伝子を欠損したレンチウイルスベクターを用いて導入遺伝子をインビトロで導入した細胞を培養して、導入遺伝子産物及び／又は導入遺伝子を含むレンチウイルスRNAを含む微小胞を、細胞外に放出させるステップ、及び  放出された微小胞を回収するステップを含む、導入遺伝子産物、及び／又は導入遺伝子を含むレンチウイルスRNAを含む微小胞の製造方法、並びにその方法によって得られる微小胞及びその使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ、
レンチウイルスゲノム配列中にテロメラーゼ逆転写酵素（TERT）遺伝子プロモーターの制御下にある導入遺伝子を含む、1つ以上の構造タンパク質遺伝子を欠損したレンチウイルスベクターを用いて導入遺伝子をインビトロで導入した細胞を培養して、導入遺伝子産物及び／又は導入遺伝子を含むレンチウイルスRNAを含む微小胞を、細胞外に放出させるステップ、及び
放出された微小胞を回収するステップ
を含む、導入遺伝子産物、及び／又は導入遺伝子を含むレンチウイルスRNAを含む、微小胞の製造方法。
【請求項２】
前記細胞が、前記1つ以上の構造タンパク質遺伝子を有しない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レンチウイルスベクターが、env遺伝子を欠損している、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記テロメラーゼ逆転写酵素（TERT）遺伝子プロモーターが、ヒトTERT遺伝子プロモーターである、請求項１〜３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒトTERT遺伝子プロモーターが、配列番号１に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１に示されるヌクレオチド配列に90％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記レンチウイルスベクターが：
(i)  レンチウイルスゲノム配列を含むRNAベクター、
(ii)  レンチウイルスゲノム配列を含むRNAをコードするDNAベクター、又は
(iii)  レンチウイルスゲノム配列を含むRNAを担持するウイルス粒子
である、請求項１〜５のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
前記レンチウイルスゲノム配列がHIVゲノム配列である、請求項１〜６のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
前記レンチウイルスベクターが、腫瘍抑制遺伝子である前記導入遺伝子を含む、請求項１〜７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
前記腫瘍抑制遺伝子がPTEN又はp16遺伝子である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記レンチウイルスベクターが、shRNAをコードする前記導入遺伝子を含む、請求項１〜７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
前記shRNAが細胞増殖制御因子をコードする遺伝子を標的とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞増殖制御因子がCDC6である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が腎臓由来細胞である、請求項１〜１２のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか1項に記載の方法によって製造される、導入遺伝子産物、及び／又は導入遺伝子を含むレンチウイルスRNAを含む、微小胞。
【請求項１５】
導入遺伝子産物、及び／又は導入遺伝子を含むレンチウイルスRNAを含む、請求項１４に記載の微小胞を、標的細胞に接触させて両者を融合させ、それにより導入遺伝子を細胞内に導入することを含む、遺伝子導入方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の微小胞を含む組成物。
【請求項１７】
請求項１４に記載の微小胞を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
癌の治療用の、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
製薬上許容される担体をさらに含む、請求項１７又は１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１４に記載の微小胞を、前記導入遺伝子又は前記遺伝子導入産物の導入が必要な患者に投与することを含む、患者の治療方法。
【請求項２１】
前記患者が、癌に罹患している、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微小胞及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内の様々な細胞は、小型の膜小胞である微小胞、例えばエキソソームを分泌又は放出することが知られている。微小胞の役割の一つは不要な細胞内成分を細胞外に放出することであると考えられてきた。しかし近年、微小胞は、分泌細胞とその標的細胞の間でタンパク質や脂質等の物質を伝達するための情報伝達媒体であり、細胞間相互作用において機能している可能性が示されている。【０００３】
またこれまでに、微小胞、とりわけエキソソームの多様な臨床用途が提案されている。例えば、特許文献１には、プラスモジウム種抗原を含む網状赤血球から単離されたエキソソームのマラリア防御における使用が記載されている。特許文献２には、B細胞由来のエキソソームを用いた癌の治療が記載されている。特許文献３には、幹細胞由来の微小胞の内皮／上皮再生における使用が記載されている。【０００４】
レンチウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）は、細胞に感染し、分裂及び非分裂細胞の両方のゲノムに組み込まれる特性を有する。そのため、レンチウイルスゲノム配列を利用したレンチウイルスベクターは、遺伝子導入のためのツールとして広く利用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開WO2011/080271
【特許文献２】国際公開WO2011/000551
【特許文献３】国際公開WO2009/057165
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、微小胞及びその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、テロメラーゼ逆転写酵素（TERT）遺伝子プロモーターの制御下にある導入遺伝子を含むレンチウイルスベクターを用いて導入遺伝子を細胞に導入すると、宿主ゲノムへの導入遺伝子の組み込み及び発現が活発に生じること、そして細胞が産生する、導入遺伝子産物等を有する微小胞の細胞外への放出が増強されることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は以下を包含する。【０００９】
[1] 以下のステップ、
レンチウイルスゲノム配列中にテロメラーゼ逆転写酵素（TERT）遺伝子プロモーターの制御下にある導入遺伝子を含む、1つ以上の構造タンパク質遺伝子を欠損したレンチウイルスベクターを用いて導入遺伝子をインビトロで導入した細胞を培養して、導入遺伝子産物及び／又は導入遺伝子を含むレンチウイルスRNAを含む微小胞を、細胞外に放出させるステップ、及び
放出された微小胞を回収するステップ
を含む、導入遺伝子産物、及び／又は導入遺伝子を含むレンチウイルスRNAを含む微小胞の製造方法。【００１０】
[2] 前記細胞が、前記1つ以上の構造タンパク質遺伝子を有しない、[1]に記載の方法。【００１１】
[3] 前記レンチウイルスベクターが、env遺伝子を欠損している、[1]又は[2]に記載の方法。【００１２】
[4] 前記テロメラーゼ逆転写酵素（TERT）遺伝子プロモーターが、ヒトTERT遺伝子プロモーターである、[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。【００１３】
[5] 前記ヒトTERT遺伝子プロモーターが、配列番号１に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１に示されるヌクレオチド配列に90％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、[4]に記載の方法。【００１４】
[6] 前記ヒトTERT遺伝子プロモーターが、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に95％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、[5]に記載の方法。【００１５】
[7] 前記レンチウイルスRNAが、導入遺伝子の上流にあるTERT遺伝子プロモーター配列を含む、[1]〜[6]のいずれかに記載の方法。【００１６】
[8] 前記レンチウイルスベクターが：
(i)  レンチウイルスゲノム配列を含むRNAベクター、
(ii)  レンチウイルスゲノム配列を含むRNAをコードするDNAベクター、又は
(iii)  レンチウイルスゲノム配列を含むRNAを担持するウイルス粒子
である、[1]〜[7]のいずれかに記載の方法。【００１７】
[9] 前記レンチウイルスゲノム配列が、前記TERT遺伝子プロモーターと前記導入遺伝子との間にTERT転写領域の少なくとも一部を含む、[1]〜[8]のいずれかに記載の方法。【００１８】
[10] 前記TERT転写領域の少なくとも一部が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号２に示されるヌクレオチド配列に90％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む[9]に記載の方法。【００１９】
[11] 前記レンチウイルスゲノム配列がHIVゲノム配列である、[1]〜[10]のいずれかに記載の方法。【００２０】
[12] 前記HIVゲノム配列がHIV-1ゲノム配列である、[11]に記載の方法。【００２１】
[13] 前記HIV-1ゲノム配列が、5' LTR；パッケージングシグナルψ；gag遺伝子；pol遺伝子；vif遺伝子；vpr遺伝子；tat遺伝子；rev遺伝子；vpu遺伝子；及び3' LTRを含む、[12]に記載の方法。【００２２】
[14] 前記導入遺伝子がタンパク質又はRNAをコードする、[1]〜[13]のいずれかに記載の方法。【００２３】
[15] 前記レンチウイルスベクターが、腫瘍抑制遺伝子である前記導入遺伝子を含む、[1]〜[14]のいずれかに記載の方法。【００２４】
[16] 前記腫瘍抑制遺伝子がPTEN又はp16遺伝子である、[15]に記載の方法。【００２５】
[17] 前記レンチウイルスベクターが、shRNAをコードする前記導入遺伝子を含む、[1]〜[14]のいずれかに記載の方法。【００２６】
[18] 前記shRNAが細胞増殖制御因子をコードする遺伝子を標的とする、[17]に記載の方法。【００２７】
[19] 前記細胞増殖制御因子がCDC6である、[18]に記載の方法。【００２８】
[20] 前記細胞がヒト細胞である、[1]〜[19]のいずれかに記載の方法。【００２９】
[21] 前記細胞が腎臓由来細胞である、[1]〜[20]のいずれかに記載の方法。【００３０】
[22] 前記細胞がヒト胎児腎臓293T細胞である、[1]〜[21]のいずれかに記載の方法。【００３１】
[23] [1]〜[22]のいずれかに記載の方法によって製造される、導入遺伝子産物、及び／又は導入遺伝子を含むレンチウイルスRNAを含む微小胞。【００３２】
[24] 導入遺伝子産物、及び／又は導入遺伝子を含むレンチウイルスRNAを含む、[23]に記載の微小胞を、標的細胞に接触させて両者を融合させ、それにより導入遺伝子を細胞内に導入することを含む、遺伝子導入方法。【００３３】
[25] 前記標的細胞にインビトロで微小胞を接触させる、[24]に記載の方法。【００３４】
[26] [23]に記載の微小胞を含む組成物。【００３５】
[27] [23]に記載の微小胞を含む、医薬組成物。【００３６】
[28] 癌の治療用の、[27]に記載の医薬組成物。【００３７】
[29] 前記癌が、大腸癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、胃癌、前立腺癌、甲状腺癌及び悪性リンパ腫からなる群から選択される、[28]に記載の医薬組成物。【００３８】
[30] 前記癌が、CDC6発現上昇を伴う、[28]又は[29]に記載の医薬組成物。【００３９】
[31] 製薬上許容される担体をさらに含む、[27]〜[30]のいずれかに記載の医薬組成物。【００４０】
[32] [23]に記載の微小胞を、前記導入遺伝子又は前記遺伝子導入産物の導入が必要な患者に投与することを含む、患者の治療方法。【００４１】
[33] 前記患者が、癌に罹患している、[32]に記載の方法。【００４２】
[34] 前記癌が、大腸癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、胃癌、前立腺癌、甲状腺癌及び悪性リンパ腫からなる群から選択される、[33]に記載の方法。【００４３】
[35] 前記癌が、CDC6発現上昇を伴う、[33]又は[34]に記載の方法。【００４４】
本明細書は本願の優先権主張の基礎となる米国仮出願US 61/779,556及びUS 61/894,563の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００４５】
本発明により、微小胞及びその製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】HIV-1骨格を有するプラスミドのHIV-1ゲノム領域の模式図である。図１Aは、pNL4-3のHIV-1ゲノム領域の模式図である。図１Bは、pTHTKのHIV-1ゲノム領域の模式図である。
【図２】組換えレンチウイルスプラスミドベクターpRBL0213T及びpTHTNを示す図である。図２Aは、pRBL0213T及びpTHTNのプラスミドDNAマッピングを示すアガロースゲル写真である。レーン1：pRBL0213T, EcoR I；レーン2：pRBL0213T, Mlu I + Xho I；レーン3：pRBL0213T, Nhe I；レーン4：pTHTN, EcoR I；レーン5：pTHTN, Mlu I + Xho I；レーンM：1 kbラダー。図２Bは、pRBL0213TのHIV-1ゲノム領域の模式図である。図２Cは、pTHTNのHIV-1ゲノム領域の模式図である。
【図３】組換えレンチウイルスプラスミドベクターpRBL001を示す図である。図３Aは、pRBL001のプラスミドDNAマッピングを示すアガロースゲル写真である。レーン1：pRBL001, EcoR I；レーン2：pRBL001, EcoR I + Nhe I；レーン3：pRBL001, Mlu I + Xho I；レーン4：pRBL001, Sal I；レーン5：pRBL0213T, Nhe I；レーンM：1 kbラダー。図３Bは、pRBL001のHIV-1ゲノム領域の模式図である。制限酵素部位は、RI：EcoR I、Sal: Sal I、Mlu：Mlu I、Nhe: Nhe I、及びXho: Xho Iを表す。
【図４】組換えレンチウイルスプラスミドベクターのHIV-1ゲノム領域の模式図である。図４AはpNL4-3（HIV-1野生型）、図４Bは、HIV-1インテグラーゼに突然変異を有し、HIV-1ウイルスゲノムDNAの宿主ゲノムへの組み込みに欠損があるpD64V、図４CはpTHTK、図４DはpTHTN、図４Eは、hTERTプロモーターの5'部分が欠失しているpTHTH、図４Fは、プロモーター配列がヒトサイトメガロウイルス（CMV）に由来するpTHTCのHIV-1ゲノム領域の模式図である。
【図５】LTR-Tagを検出するための、BpmI部位の作製を示す模式図である。図５Aは、pTHTKのHIV-1ゲノム領域の5' LTRにおいて作製した新規BpmI部位を示す模式図である。図５Bは、HIV-1の3' LTRにコピーされたBpmI部位に隣接する組み込み部位（14ヌクレオチド）にてBpmI制限酵素が宿主染色体DNAを切断することを示す模式図である。図５Cは、レンチウイルスゲノムの末端構造の模式図である。
【図６】LM-PCR（ライゲーション介在性PCR）を介したLTR-Tagの生成を示す模式図である。
【図７】LTR-Tagを検出するための、LM-PCRのゲル写真である。
【図８】ウイルスRNAのスプライシングを調べた図である。図８A及びBは、RT-PCR反応物を1 x TAE中で2.2％アガロースゲルを用いて泳動した結果を示す写真である。図８Aは、プライマー5' LTRU5及び3' NL8960を用いたPCR産物を示すゲル写真である。図８Bは、プライマー5' LTRU5及び3' NL5850を用いたPCR産物を示すゲル写真である。図８Bの右側に、スプライシングされたRNA断片a（E1+A1/3’NL5850）、b（E1+A2/3’NL5850）、c1（E1+E2+E3+A3/3’NL5850）、c2（E1+E2+A3/3’NL5850）及びc3（E1+E3+A3/3’NL5850）のバンドの位置を示す。図８Cは、スプライシングされていない転写産物を示す模式図である。図８Dは、スプライシングされたRNAを示す模式図である。図８D中、A1〜A3は3'スプライスアクセプター、E1〜E3はエキソンである。
【図９】p24アッセイの結果を示すグラフである。
【図１０】PTENアッセイで用いたプラスミドベクターの構成の模式図である。図１０AはPTEN遺伝子導入のネガティブコントロールとしてのpGL3-1375（Empt.；プラスミドサイズ約7kb）、図１０BはPTEN遺伝子導入のポジティブコントロールとしてのpcDNA3.1/CMV-hPTEN（Regul.；プラスミドサイズ約7.5kb）、図１０CはPTEN遺伝子導入のためのレトロウイルスベクターpRBL016Bn（Retro.；プラスミドサイズ約7.9kb）、図１０DはPTEN遺伝子導入のための組換えレンチウイルスベクターpRBL0213T（Lenti.；プラスミドサイズ約15kb）を示す。ベクター内の制限酵素部位は: BamH, BamH I; Bgl: Bgl II; RI: EcoR I; RV, EcoR V; Hd3, Hind III; Mlu, Mlu I; Nco, Nco I; Nde, Nde I; Sal, Sal I; Stu, Stu I; 及びXho, Xho Iを表す。
【図１１】プラスミドベクターの一過的トランスフェクションにおけるPTENアッセイの結果を示すグラフである。
【図１２】図１１に示すmv溶解物におけるPTEN活性の、細胞溶解物におけるPTEN活性に対する比率を示すグラフである。
【図１３】組換えレンチウイルス粒子RBL0213T感染におけるPTENアッセイの結果をを示すグラフである。
【図１４】組換えレンチウイルスプラスミドベクターpRBL0213Tをトランスフェクトした細胞又は組換えレンチウイルス粒子RBL0213Tに感染した細胞の、mv溶解物におけるPTEN活性の、細胞溶解物におけるPTEN活性に対する比率を示すグラフである。
【図１５】mvにおける又はmvとインキュベートした細胞におけるウイルスタンパク質又は内因性若しくは外来性タンパク質に対するウエスタンブロットの結果を示す写真である。図１５Aは抗Vpu抗体、図１５Bは抗RT抗体、図１５Cは抗FEN-1抗体を用いた結果を示す。
【図１６】c-myc-FEN-1が封入されたmvによる細胞への内容物の送達を示す顕微鏡写真である。図１６Aは抗c-myc抗体染色像、図１６BはDAPI染色像、図１６Cは両者を重ね合わせた像を示し、図１６Dは重ね合わせた像からPhotoshop（登録商標）（Adobe Systems Inc.）のイメージ「調整」法における色カーブプログラムによって作製した像を示す。
【図１７】Lenti-mv2010/CDC6 shRNAによる癌細胞増殖抑制効果を示すグラフである。
【図１８】細胞性タンパク質抽出物及びmv溶解物におけるウェスタンブロット解析の結果を示す写真である。
【図１９】各試験群の腫瘍について病理検査で観察された典型的形態を示す写真である。A:陰性対照群、B：インターフェロン(IFN) α-2b注入群、C：Cytomox PTEN注入群、D：Cytomox p53注入群。
【図２０】各試験群の腫瘍について病理検査で観察された典型的形態を示す写真である。A:低用量Cytomox EX注入群、B：高用量Cytomox EX注入群、C：低用量Cytomox HD注入群、D：高用量CytomoxHD注入群。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００４８】
1. 微小胞の製造方法
本発明は微小胞の製造方法に関する。本方法は、以下のステップ、
レンチウイルスゲノム配列中にテロメラーゼ逆転写酵素（TERT）遺伝子プロモーターの制御下にある導入遺伝子を含む、1つ以上の構造タンパク質遺伝子を欠損したレンチウイルスベクターを用いて導入遺伝子をインビトロで導入した細胞を培養して、導入遺伝子産物及び／又は導入遺伝子を含むレンチウイルスRNAを含む微小胞を、細胞外に放出させるステップ、及び
放出された微小胞を回収するステップ
を含む。
【００４９】
本方法により製造される微小胞は、導入遺伝子産物、及び／又は導入遺伝子を含むレンチウイルスRNAを含む。本方法によれば、導入遺伝子産物及び／又は導入遺伝子を含むレンチウイルスRNAを含む微小胞を、効率的に製造することができる。
【００５０】
本発明においてレンチウイルスベクターとは、レンチウイルスゲノム配列を基本骨格とした、遺伝子導入用ベクターをいう。レンチウイルスは、逆転写酵素を有するRNAウイルスの1つである。レンチウイルスは、分裂細胞だけでなく非分裂細胞においても宿主染色体にウイルスゲノムDNA（プロウイルスDNA）を組み込み、宿主細胞にウイルス由来遺伝子を発現させることができる。レンチウイルスベクターは、レンチウイルスのこのような特性を利用したものである。
【００５１】
本発明においてレンチウイルスベクターは：
(i)  レンチウイルスゲノム配列を含むRNAベクター、
(ii)  レンチウイルスゲノム配列を含むRNAをコードするDNAベクター、又は
(iii)  レンチウイルスゲノム配列を含むRNAを担持するウイルス粒子
であり得る。(i)のRNAベクターは、例えばレンチウイルスゲノム配列を含む発現ベクター又は発現カセットからのインビトロ転写により作製することができる。(ii)のDNAベクターは、プラスミドベクターを含み得る。プラスミドベクターは通常、レンチウイルスゲノム配列を含むRNAをコードするDNA配列の他に、そのDNA配列の転写をもたらすためのプロモーター及びターミネーター、複製起点、並びに組換え体選抜のためのマーカー遺伝子等を含む。このようなDNAベクターは、遺伝子組換え技術等を用いた当技術分野で公知の方法によって作製することができる。(iii)のウイルス粒子は、他のウイルスのエンベロープタンパク質、例えば水疱性口内炎ウイルス（VSV）のエンベロープ糖タンパク質G（VSV-G）により偽型化されたウイルス粒子であってもよい。偽型化ウイルス粒子は、例えば、レンチウイルスゲノム配列を含むRNAをコードするDNAベクターと、他のウイルスのエンベロープタンパク質（例えばVSV-G）をコードするプラスミドとを培養細胞に共トランスフェクションし、培地中に放出されたウイルス粒子を回収、精製することによって作製してもよい。
【００５２】
本発明において使用されるレンチウイルスベクターは、そのレンチウイルスゲノム配列において1つ以上のウイルス構造タンパク質遺伝子を欠損している。そのようなレンチウイルスゲノム配列は、全長レンチウイルスゲノム配列中の1つ以上のウイルス構造タンパク質遺伝子が（例えば一部若しくは全部の欠失又は核酸分子挿入により）破壊したものであってもよい。本発明において遺伝子が「欠損している」とは、その遺伝子全体が欠失しているか、又は機能的なタンパク質を発現できないように遺伝子が破壊若しくは変異していることをいう。欠損するウイルス構造タンパク質遺伝子はgag、pol及びenv遺伝子からなる群から選択される1つ以上であってよい。gag遺伝子はウイルス粒子形成に関与するタンパク質をコードする。pol遺伝子は逆転写酵素（RT）等の酵素をコードする。env遺伝子は宿主細胞への吸着及び侵入に関与する外被（エンベロープ）タンパク質をコードする。例えば、レンチウイルスベクターはenv遺伝子を欠損していてもよい。例えば、HIV-1 env遺伝子の欠損をもたらすように、配列番号４の6344位〜7611位に相当する領域がレンチウイルスベクターから欠失していてもよい。一実施形態において、細胞は、レンチウイルスベクターにおいて欠損している1つ以上のウイルス構造タンパク質遺伝子をゲノム中又は染色体外に有さない。レンチウイルスベクターを用いて導入遺伝子が導入されたこのような細胞は感染性レンチウイルス粒子を製造しないため、製造される微小胞は安全性が高い。
【００５３】
本発明においてレンチウイルスベクターが基本骨格としているレンチウイルスゲノム配列としては、限定するものではないが、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、サル免疫不全ウイルス（SIV）、ネコ免疫不全ウイルス（FIV）及びイヌ免疫不全ウイルス（CIV）のゲノムに由来する配列が挙げられる。本発明におけるレンチウイルスゲノム配列としては、HIVゲノム配列が好ましい。より具体的には、HIVゲノム配列は、HIV-1又はHIV-2ゲノム配列であってよい。好ましくは、HIVゲノム配列は、HIV-1ゲノム配列であってよい。HIVは、HIV-1グループM、N、O又はPに属する株であってよい。より具体的には、HIVは、HIV-1 IIIb、HIV-1 SF2、HIV-1 SF162、HIV-1 BRU、HIV-1 NY5、HIV-1L AI、HIV-1 NL4-3等を含む任意のHIV株であってもよい。例示的なHIVゲノム配列は、Genbankアクセッション番号EU541617、K03455及びK02013等で入手できる。レンチウイルスゲノム配列は、RNAであってもDNAであってもよい。
【００５４】
レンチウイルスベクター中のレンチウイルスゲノム配列は、5' LTR及び3' LTR、並びに場合により、パッケージングシグナルψ、gag遺伝子、pol遺伝子、vif遺伝子、vpr遺伝子、tat遺伝子、rev遺伝子、vpu遺伝子若しくはvpx遺伝子、nef遺伝子、及びenv遺伝子からなる群から選択される1つ以上を含んでよい。好ましい実施形態において、レンチウイルスベクター中のHIV-1のレンチウイルスゲノム配列は、5' LTR、パッケージングシグナルψ、gag遺伝子、pol遺伝子、vif遺伝子、vpr遺伝子、tat遺伝子、rev遺伝子、vpu遺伝子、及び3' LTRを含んでよい。別の好ましい実施形態において、レンチウイルスベクター中のHIV-2のレンチウイルスゲノム配列は、5' LTR、パッケージングシグナルψ、gag遺伝子、pol遺伝子、vif遺伝子、vpr遺伝子、tat遺伝子、rev遺伝子、vpx遺伝子、及び3' LTRを含んでよい。そのようなレンチウイルスゲノム配列は、典型的には1以上のスプライスドナー（SD）及びスプライスアクセプター（SA）を含む。一実施形態において、レンチウイルスベクター中のレンチウイルスゲノム配列は、vpu遺伝子、tat遺伝子及びrev遺伝子を含んでもよい。レンチウイルスベクター中のレンチウイルスゲノム配列はnef遺伝子を欠損していてもよい。
【００５５】
本発明においてレンチウイルスベクターは、レンチウイルスゲノム配列中にテロメラーゼ逆転写酵素（TERT）遺伝子プロモーターの制御下にある導入遺伝子を含む。TERTは、DNA複製の際、テロメアリピートを合成する酵素である。本発明において使用されるテロメラーゼ逆転写酵素（TERT）遺伝子プロモーターは、限定するものではないが、ヒトTERT遺伝子プロモーターであってよい。好ましくは、ヒトTERT遺伝子プロモーターは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１に示されるヌクレオチド配列に90％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでよい。より好ましくは、ヒトTERT遺伝子プロモーターは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に95％、97％、99％、99.5％又は99.9％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでよい。
【００５６】
一実施形態において、本発明に係るレンチウイルスベクターは、配列番号５に示されるヌクレオチド配列又はそれに対して90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは99％以上、例えば99.8％以上の配列同一性を有する配列をレンチウイルスゲノム配列として含み、かつその内部（好ましくはnef遺伝子内）にTERT遺伝子プロモーター及びその制御下にある導入遺伝子を含む配列がさらに挿入されているものであることも好ましい。
【００５７】
本発明において「導入遺伝子がTERT遺伝子プロモーターの制御下にある」とは、導入遺伝子の転写がTERT遺伝子プロモーターの活性によって開始されることをいう。好ましくは、TERT遺伝子プロモーターの下流に導入遺伝子が配置される。
【００５８】
レンチウイルスゲノム配列中に挿入されたTERT遺伝子プロモーターと導入遺伝子との間にTERT転写領域の少なくとも一部が存在してもよい。TERT転写領域の少なくとも一部は、TERT遺伝子の少なくとも第1エキソンを含んでよい。TERT転写領域の少なくとも一部は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号２に示されるヌクレオチド配列に90％、95％、97％、99％若しくは99.5％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでよい。
【００５９】
本発明において使用される導入遺伝子は、任意のタンパク質又はmiRNA（microRNA）、siRNA（small interfering RNA）及びshRNA（short hairpin RNA）等のRNAをコードし得る。一実施形態において、導入遺伝子は、腫瘍抑制遺伝子であってよい。腫瘍抑制遺伝子としては、限定するものではないが、p53、BRCA1、Rb、PTEN及びp16遺伝子等の当業者に公知の腫瘍抑制遺伝子が挙げられる。好ましくは、腫瘍抑制遺伝子はPTEN又はp16遺伝子であってよい。PTENタンパク質は、ホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸（PtdIns(3,4,5)P3）の脱リン酸化を触媒するホスファターゼである。PTEN遺伝子は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列又はそれに対して90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは99％以上、例えば99.5％又は99.9％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでよい。PTEN遺伝子は、配列番号２２に示されるアミノ酸配列（GenBankアクセッション番号AAD13528及びNP_000305)、又はそれに対して90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは99％以上、例えば99.5％又は99.7％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるPTENタンパク質をコードする核酸であってもよい。p16タンパク質（p16INK4aとも称される）は、サイクリン依存性キナーゼ（CDK）阻害因子として知られている。例えばp16遺伝子は、配列番号２３に示されるヌクレオチド配列（GenBankアクセッション番号L27211）又はそれに対して80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは99％以上、例えば99.5％又は99.9％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでよい。p16遺伝子は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列、又はそれに対して90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸であってもよい。p16遺伝子は、好ましくはCDK阻害活性を有するタンパク質をコードする。p16遺伝子の例としては、配列番号２５の434位〜480位のヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。またp53遺伝子は、配列番号２６に示されるヌクレオチド配列（GenBankアクセッション番号BC003596）又はそれに対して80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは99％以上、例えば99.5％又は99.9％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでよい。p53遺伝子は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列、又はそれに対して90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸であってもよい。p53遺伝子は、好ましくは転写因子活性を有するタンパク質をコードする。本発明に関して核酸はDNAであってもRNAであってもよく、修飾塩基を含んでもよい。
【００６０】
別の実施形態において、導入遺伝子は、shRNAをコードしてもよい。shRNAは、標的配列に相補的なアンチセンス配列と、それに対して相補的なセンス配列（典型的には3'末端にポリUオーバーハングを有する）がリンカーによって結合されている一本鎖RNAであり、分子内で二本鎖を形成してヘアピン状構造をとる。そのようなshRNAは、細胞内で二本鎖部分が切り出されてsiRNAとなり、RNAiを引き起こして標的配列を含む標的遺伝子の発現を抑制することができる。本明細書では、shRNA前駆体が導入遺伝子から転写され、次いで、エディティング及びプロセシングを受けてshRNAを生成する場合も、そのような導入遺伝子はshRNAをコードするものとする。shRNAは、限定するものではないが、細胞増殖制御因子をコードする遺伝子を標的としてもよい。細胞増殖制御因子としては、CDC6、サイクリンE、CDK2、CDT1、ORC2及びMCM7等のDNA複製及び細胞周期の制御に関与するタンパク質が挙げられる。好ましくは、細胞増殖制御因子は、CDC6であってよい。CDC6は、DNA複製の開始において中心的役割を果たすタンパク質である。CDC6ノックダウンはヒト癌細胞のアポトーシスをもたらすことが見出されている（Feng, et al., Cancer Res., 2003, Vol. 63, p. 7356-7364; Lau et al., EMBO Rep., 2006, Vol. 7, p. 425-430; Feng et al., Mol. Cell. Biochem., 2008, Vol. 311, p. 189-197）。CDC6遺伝子は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列又はそれに対して90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは99％以上、例えば99.5％又は99.9％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでよい。CDC6 shRNAをコードする導入遺伝子は、配列番号１０に示すヌクレオチド配列からなるDNA配列又はそれに対して90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでよい。典型的には、CDC6 shRNAは、配列番号１９に示すヌクレオチド配列からなるCDC6 shRNAのアンチセンス配列又はそれに対して90％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列と、配列番号２０に示すヌクレオチド配列又はそれに対して80％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなるリンカーと、アンチセンス配列に相補的な配列及び2塩基以上の3'ポリUオーバーハングからなるセンス配列とを含む。導入遺伝子産物は、上記のような導入遺伝子に由来するRNA又は導入遺伝子に由来するRNAから翻訳されたタンパク質を含み得る。
【００６１】
1種のレンチウイルスベクターは、1つ以上の導入遺伝子を含んでよい。2種以上の導入遺伝子がレンチウイルスベクターを用いて細胞に導入される場合、1種のレンチウイルスベクターによって導入されても、2種以上のレンチウイルスベクターによって導入されてもよい。例えばレンチウイルスベクターはshRNAをコードする導入遺伝子と腫瘍抑制遺伝子である導入遺伝子を含んでもよい。好ましい一実施形態において、レンチウイルスベクターは、CDC6 shRNAをコードする導入遺伝子及び／又はp16タンパク質をコードする導入遺伝子を含む。
【００６２】
本発明において導入遺伝子はレンチウイルスベクターを用いてインビトロで細胞に導入される。本発明において使用される細胞の生物種は、製造される微小胞を投与する対象と同種であることが好ましい。細胞は、限定するものではないが、哺乳動物細胞、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、マウス、ラット又はサル若しくはヒト等の霊長類の細胞であってよいが、ヒトの細胞であることが好ましい。また好ましくは、細胞は腎臓由来細胞、子宮由来細胞、リンパ球由来細胞又は線維芽細胞であってよい。細胞としては、ヒト胎児腎臓293T細胞、ヒト子宮頸癌HeLa細胞、ヒトリンパ球CEM細胞、N144線維芽細胞、及び他のヒト細胞株を含み得る。好ましくは、細胞は、ヒト胎児腎臓293T細胞又はヒト子宮頸癌HeLa細胞であってよい。
【００６３】
レンチウイルスベクターを用いた導入遺伝子の細胞への導入は、当技術分野で公知の方法により行うことができる。レンチウイルスベクターがRNAベクター又はDNAベクターの場合、導入遺伝子の細胞への導入は、公知のリン酸カルシウム法、リポフェクション法、DEAEデキストラン法又はエレクトロポレーション法等により行ってよく、Lipofectamine（登録商標）2000（Invitrogen）及びFuGene（登録商標）6（Roche）等の市販のトランスフェクション試薬を用いて行ってもよい。レンチウイルスベクターがウイルス粒子の場合、導入遺伝子の細胞への導入は、細胞の培養培地中にウイルス粒子を添加してウイルスを細胞に感染させることにより行うことができる。
【００６４】
上記レンチウイルスベクターに加えて、別の発現ベクターも細胞に導入してもよい。そのような発現ベクターは、微小胞にさらに封入すべきタンパク質又はRNAをコードする導入遺伝子をプロモーターの制御下に含み得る。上記のようにして導入遺伝子を導入した細胞は、その後培養される。培養は、細胞に応じて適切な方法で行ってよい。例えば、培養は、10％ウシ胎児血清及び適切な抗生物質を補充した、DMEM／高グルコース完全培地中で、1〜5日間、例えば2〜4日間、具体的には36時間〜96時間又は36時間〜72時間行ってよい。レンチウイルスベクターを用いて導入遺伝子を導入した細胞内では、（例えばレンチウイルスRNAから逆転写酵素により生成された）レンチウイルスDNAが、インテグラーゼ等の働きにより細胞内ゲノムに組み込まれプロウイルスDNAとなる。このプロウイルスDNAから細胞内のRNAポリメラーゼIIによってレンチウイルスRNAが転写により生成される。生成されたレンチウイルスRNAから、通常はRNAスプライシング及び／又はタンパク質の翻訳等を経て導入遺伝子産物が生成される。このように細胞内で生成された導入遺伝子産物及び／又はレンチウイルスRNAは微小胞に取り込まれる。培養中に細胞はこのような微小胞を細胞外に放出し、培地中に微小胞が蓄積する。好ましくは本発明では、レンチウイルスベクターが構造タンパク質遺伝子を欠損していることにより、ウイルス様粒子が生成されず、培地中にウイルス様粒子が蓄積することがない。
【００６５】
本発明に係る微小胞の製造方法は、放出された微小胞を回収するステップを含む。微小胞の回収は、細胞培養培地を回収することによって行うことができる。回収された微小胞はさらに精製してもよい。例えば1,000〜10,000 x g（好ましい例では9,000 x g）の遠心分離により、より大きな小胞を沈殿させ除去することによって、回収された微小胞を精製することができる。このような遠心分離は一回又は複数回（好ましくは異なる遠心力で）行ってもよい。あるいは又は加えて、例えば分子量カットオフ1,000 kDaの膜を用いた限外ろ過により微小胞を精製することができる。さらに、PEG/NaCl溶液との混合及び遠心分離により微小胞を沈殿させることによって、微小胞を精製することもできる。このように精製した後、微小胞をPEG化してもよい。微小胞のPEG化は、各種PEG化試薬を用いて行うことができるが、例えばmPEG-NHS（メトキシ化PEGスクシンイミジルカルボネートNHS）を用いて行うことができる（Croyle et al., J. Virol., 2004, Vol. 78, p. 912-921）。例えば、微小胞を含む溶液にmPEG-NHS（メトキシ化PEGスクシンイミジルカルボネートNHS, m.w. 10K (NANOCS, USA)）を添加し、室温にて回転プラットフォーム上で60分間インキュベートすることにより、微小胞をPEG化することができる。PEG化した又はPEG化していない微小胞は、次いで、透析（例えば1 x PBSを用いた）によるバッファー交換、限外ろ過による濃縮、及びシリンジフィルター（例えば0.45μm孔径）によるろ過等に供してもよい。
【００６６】
本方法により製造された微小胞は、導入遺伝子産物、及び／又は導入遺伝子を含むレンチウイルスRNAを含む。レンチウイルスRNAは、導入遺伝子の上流にあるTERT遺伝子プロモーター配列を含んでよい。TERT遺伝子プロモーター配列を含むレンチウイルスベクターを用いて導入遺伝子を細胞に導入すると、宿主ゲノムへの導入遺伝子の組み込み及び発現が促進され、さらに、細胞からの微小胞の放出が増強されるため、微小胞を効率的に製造することができる。
【００６７】
一実施形態において、本発明は:
レンチウイルスゲノム配列中にテロメラーゼ逆転写酵素（TERT）遺伝子プロモーターの制御下にある導入遺伝子を含む、1つ以上の構造タンパク質遺伝子を欠損したレンチウイルスベクターを用いて導入遺伝子を細胞にインビトロで導入するステップ、
前記細胞を培養して、導入遺伝子産物及び／又は導入遺伝子を含むレンチウイルスRNAを含む微小胞を、細胞外に放出させるステップ、及び
放出された微小胞を回収するステップ
を含む、導入遺伝子産物、及び／又は導入遺伝子を含むレンチウイルスRNAを含む微小胞の製造方法にも関する。
【００６８】
2. 本発明の方法によって製造された微小胞
本発明はまた、本発明の方法によって製造された、導入遺伝子産物、及び／又は導入遺伝子を含むレンチウイルスRNAを含む微小胞に関する。
【００６９】
本発明において微小胞（microvesicle, mv）は、細胞で産生され、細胞外に放出又は脱落される5nm〜5μm、好ましくは10nm〜1μm、より好ましくは20nm〜500nmのサイズの膜小胞をいう。微小胞のサイズは電子顕微鏡法により決定できる。微小胞としては、一般に、エキソソーム、シェディングマイクロベシクル（shedding microvesicle）及びアポトーシス小体（apoptotic body）が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、本発明の微小胞は、エキソソームである。エキソソームは、脂質二重膜で形成された膜小胞である。エキソソームは、150nm以下、典型的には20〜120nm又は40〜100nmのサイズを有する。エキソソームは、エンドソーム膜の内向きの出芽を介して形成される多胞体（MVB）が細胞膜と融合することにより細胞外に開口分泌され、生成される。
【００７０】
本発明における微小胞は、導入遺伝子産物及び／又は導入遺伝子を含むレンチウイルスRNA等の、宿主細胞から輸送され封入されたタンパク質及び／又はRNAを含み得る。微小胞が含み得るRNAとしては、mRNA、miRNA、shRNA、siRNA、レンチウイルスRNA（レンチウイルスRNAの種々のスプライシングバリアントを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。微小胞が含み得るタンパク質としては、ウイルスタンパク質（例えばHIV-1のVpuタンパク質及びRT（逆転写酵素）タンパク質）、細胞内在性タンパク質（例えば細胞骨格タンパク質、シグナル伝達タンパク質及び酵素）並びに外来性導入遺伝子産物等が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、エキソソームは一般に、細胞骨格タンパク質（例えばチューブリン、アクチン及びアクチン結合タンパク質）、膜輸送関連タンパク質（例えばアネキシン及びRabタンパク質）、シグナル伝達タンパク質（例えばプロテインキナーゼ及び14-3-3）、代謝酵素（例えばGAPDH、ATPase及びエノラーゼ）、テトラスパニンファミリー（例えばCD9、CD63、CD81及びCD82）、ヒートショックタンパク質（例えばHSP90及びHSP70）、MVB生合成タンパク質（例えばAlix及びTSG101）、免疫調節分子（例えばMHCI及びMHCII）等を含み得る。
【００７１】
本発明の方法により細胞に導入された上述の導入遺伝子を含むレンチウイルスゲノム配列を含むレンチウイルスDNA（プロウイルスDNA）は宿主ゲノムに組み込まれる。本発明の微小胞に含まれるレンチウイルスRNAは、このプロウイルスDNAから転写される。レンチウイルスRNAは、導入遺伝子の5'上流にあるTERT遺伝子プロモーター（例えばhTERTプロモーター）のRNA配列を含んでよい。
【００７２】
本発明の微小胞は、特に好ましい例では、導入遺伝子産物として、PTEN及びp16タンパク質等の腫瘍抑制タンパク質、並びに／又はCDC6 shRNA等のshRNA若しくはその前駆体RNAを含んでよい。
【００７３】
本発明の微小胞は、他の細胞に取り込まれ、微小胞に含まれる導入遺伝子産物、及び／又は導入遺伝子を含むレンチウイルスRNAをその細胞内に送達することができる。
【００７４】
3. 本発明の微小胞を用いた遺伝子導入方法
本発明はまた、本発明の方法により製造された、導入遺伝子産物、及び／又は導入遺伝子を含むレンチウイルスRNAを含む微小胞を、標的細胞に接触させて両者を融合させ、それにより導入遺伝子を細胞内に導入することを含む、遺伝子導入方法に関する。一実施形態において、標的細胞はインビトロ又はインビボで微小胞と接触させることができる。
【００７５】
微小胞、特にエキソソームは、周辺の他の細胞に侵入でき、細胞間相互作用に関与する。微小胞は、膜融合を介して又はエンドサイトーシス様方法を通して標的細胞の内部に到達できると考えられているが、本発明はこの原理に拘束されない。本発明の遺伝子導入方法において、微小胞の標的細胞との接触は、当業者に公知のいかなる方法で行ってもよい。例えば、微小胞の標的細胞とのインビトロでの接触は、細胞培養培地中に微小胞を添加することによって行ってもよい。微小胞の標的細胞とのインビボでの接触は、例えば微小胞の経口投与により、又は微小胞の標的部位（肝臓内、関節内、心室内、鼻腔内等）への直接の塗布若しくは注射等の非経口投与により行ってもよい。その他の使用し得るインビボでの投与方法及び投与部位については、医薬組成物の投与方法及び投与部位に関して後述する。
【００７６】
本発明の遺伝子導入方法により、微小胞に含まれる導入遺伝子産物、及び／又は導入遺伝子を含むレンチウイルスRNAを標的細胞内に効率的に送達することができる。
【００７７】
4. 本発明の微小胞を含む組成物
本発明はまた、本発明の方法により製造された微小胞を含む組成物に関する。組成物は、その使用目的に応じて微小胞以外の任意の成分を含むことができる。例えば、遺伝子導入用組成物として使用する場合、組成物は、遺伝子導入を促進する薬剤及び／又は核酸を安定化する薬剤等を含み得る。
【００７８】
5. 本発明の微小胞を含む医薬組成物及び治療方法
本発明はまた、本発明の方法により製造された微小胞を含む医薬組成物に関する。
【００７９】
一実施形態において、医薬組成物は、例えば癌、糖尿病、神経変性疾患、免疫機能障害、炎症、肝硬変、動脈硬化、血栓及び感染等の疾患の治療用であってよい。好ましくは、医薬組成物は、癌の治療用であってよい。より具体的には、癌は、例えば大腸癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、胃癌、前立腺癌、甲状腺癌及び悪性リンパ腫からなる群から選択されてよい。一実施形態において、微小胞に含まれる導入遺伝子産物が、例えばCDC6を標的とするshRNA等の、CDC6の発現低下を引き起こすものである場合、治療対象の疾患、例えば癌は、CDC6の発現上昇を伴うものであり得る。
【００８０】
微小胞を医薬組成物において使用する場合、本発明において微小胞に含まれる導入遺伝子又は導入遺伝子産物は疾患の予防及び／又は治療に機能を果たすものである。例えば、そのような導入遺伝子は、PTEN若しくはp16遺伝子等の腫瘍抑制遺伝子であってもよいし、及び／又は細胞増殖制御因子をコードする遺伝子を標的とするshRNA若しくはその前駆体をコードするものであってもよい。一実施形態において、導入遺伝子は、PTEN遺伝子及び／又はCDC6 shRNAをコードする遺伝子である。本実施形態において、医薬組成物は、例えば、導入遺伝子がPTEN遺伝子である本願発明の方法によって製造された微小胞と、導入遺伝子がCDC6 shRNAをコードする遺伝子である本願発明の方法によって製造された微小胞を組み合わせて含んでもよい。別の一実施形態において、導入遺伝子は、p16遺伝子及び／又はCDC6 shRNAをコードする遺伝子である。本実施形態において、医薬組成物は、例えば、導入遺伝子がp16遺伝子である本願発明の方法によって製造された微小胞と、導入遺伝子がCDC6 shRNAをコードする遺伝子である本願発明の方法によって製造された微小胞を組み合わせて含んでもよい。
【００８１】
本発明の医薬組成物は、本発明の微小胞に加えて液体媒体を含む。液体媒体としては、例えば、水、生理学的に許容される緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水等）、プロピレングリコール及びポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等の生体適合性の水性媒体が挙げられる。このような媒体は、滅菌されていることが望ましく、必要に応じて血液と等張に調整されていることが好ましい。
【００８２】
医薬組成物は、製薬上許容される担体を含んでもよい。「製薬上許容される担体」とは、製剤技術分野において通常使用する添加剤をいう。製薬上許容される担体としては、例えば、懸濁剤、等張化剤、緩衝剤、防腐剤等が挙げられる。このような担体は、主として剤形形成を容易にし、また剤形及び薬剤効果を維持するために用いられるものであり、必要に応じて適宜使用すればよい。
【００８３】
懸濁剤としては、例えばモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。等張化剤としては、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。防腐剤としては、例えば塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等が挙げられる。
【００８４】
上記の他、必要であれば矯味矯臭剤、増粘剤、可溶化剤、pH調整剤、希釈剤、界面活性剤、増量剤、安定剤、吸収促進剤、付湿剤、保湿剤、吸着剤、コーティング剤、着色剤、抗酸化剤、香料、甘味剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、崩壊抑制剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、滑沢剤等を含むこともできる。
【００８５】
本発明の医薬組成物は、本発明の微小胞が有する薬理効果を失わない範囲において、他の薬剤を含有することもできる。例えば、医薬組成物は抗生物質を所定量含有していてもよい。
【００８６】
医薬組成物の剤形は、微小胞並びに微小胞に含まれる導入遺伝子産物及び／又はレンチウイルスRNAを不活化させない形態であれば特に限定しない。医薬組成物の剤形は、例えば、液体、固体又は半固体のいずれであってもよい。具体的な剤形としては、例えば、注射剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、点眼剤、点鼻剤、軟膏剤、硬膏剤、シップ剤及び座剤等の非経口剤形又は液剤、カプセル剤、舌下剤、トローチ剤、散剤、錠剤、顆粒剤等の経口剤形が挙げられる。医薬組成物の剤形は好ましくは注射剤等の液剤である。
【００８７】
医薬組成物は、目的とする疾患の治療のために製薬上有効な量を生体に投与することができる。投与する対象となる生体は、脊椎動物、例えば哺乳動物、鳥類、両生類、爬虫類であってもよく、哺乳動物であることが好ましい。哺乳動物としては、例えばイヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、マウス及びラット等の非霊長類、並びにヒト、チンパンジー及びゴリラ等の霊長類が挙げられる。哺乳動物は好ましくはヒトである。
【００８８】
本明細書において「製薬上有効な量」とは、本発明の医薬組成物に含まれる微小胞が、対象とする疾患を予防する、治療する又は症状を軽減する上で必要な用量であって、かつ投与する生体に対して有害な副作用がほとんどないか又は全くない用量をいう。具体的な用量は、予防及び／又は治療対象となる疾患の種類、その発症作用機序、使用する剤形、被験体の情報及び投与経路等によって異なる。ヒトに投与する場合には、製薬上有効な量の範囲及び好適な投与経路は、一般に細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータに基づいて策定される。最終的な投与量は、個々の被験体に応じて、例えば医師の判断により決定し、調整することができる。その際に、勘案される被験体の情報には、病気の進行度若しくは重症度、全身の健康状態、年齢、体重、性別、食生活、薬剤感受性及び治療に対する耐性等が含まれる。一実施形態において、導入遺伝子がタンパク質をコードする場合、本発明の医薬組成物は、1回量当たり、1 x 104〜1 x 108トランスフェクション単位（t.u.）/kg体重、例えば1 x 105〜1 x 107 t.u./kg体重又は2 x 105〜5 x 106 t.u./kg体重を、1回又は複数回、罹患箇所への直接注射又は静脈注射により投与し得る。ここでトランスフェクション単位は、10 μgの本発明のレンチウイルスベクター（例えばプラスミドベクターなどのDNAベクター；例えばpRBL0213T）を用いて導入遺伝子を細胞（例えばヒト胎児腎臓293T細胞）に導入し、その細胞から放出された微小胞（mv）の画分中の導入遺伝子産物（例えば、PTENタンパク質などの、タンパク質）の量を測定し、その測定量（トランスフェクション効率）を、細胞1000個当たり20pgの導入遺伝子産物（例えば、タンパク質）に相当する量が1トランスフェクション単位となるように正規化することによって決定することができる。本発明の医薬組成物を複数回投与する場合は、所定の時間間隔で、例えば1時間、3時間、6時間、12時間毎、又は1日、2日、3日、7日毎、又は1カ月、2カ月、3カ月、6カ月、12カ月毎に投与してもよい。他の非経口投与及び経口投与の場合も上記に準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
【００８９】
医薬組成物の投与は、全身投与又は局所投与のいずれであってもよく、疾患の種類、発症箇所又は進行度等に応じて適宜選択することができる。発症箇所が局部的な疾患であれば、注射又は体内留置カテーテル等により発症箇所（例えば腫瘍）及びその周辺に直接投与する局所投与が好ましい。治療すべき箇所（組織又は器官）に本発明の微小胞を十分量投与することができ、また他の組織に影響を及ぼしにくいからである。一方、転移性癌のように治療箇所を特定できない場合や発症が全身性の疾患の場合には、静脈注射等による全身投与が好ましい。血流を介して本発明の微小胞を全身に行き渡らせることで、診断で発見できない病変部にも投与が可能となるからである。
【００９０】
医薬組成物は、含有される有効成分が失活しないあらゆる適当な方法で投与することができる。例えば、非経口（例えば、注射、エアロゾル、塗布、点眼、点鼻、若しくは体内留置カテーテル）又は経口のいずれであってもよい。好ましくは、注射である。
【００９１】
注射による投与の場合、注入部位は、特に限定しない。本発明の微小胞がその機能を発揮し、医薬組成物の目的を達し得ればいずれの部位であってもよい。注入部位としては、例えば、静脈内、動脈内、肝臓内、筋肉内、関節内、骨髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、皮内、腹腔内、鼻腔内、腸内又は舌下等が挙げられる。一実施形態において、腫瘍へ直接注入することも好ましい。
【００９２】
本発明の医薬組成物を用いて、微小胞に含まれる導入遺伝子産物等による疾患の予防及び／又は治療を効果的に達成することができる。
【００９３】
したがって本発明はまた、本発明の方法により製造された微小胞を、導入遺伝子又は遺伝子導入産物の導入が必要な患者に投与することを含む、患者の治療方法を提供する。患者は、癌、糖尿病、神経変性疾患、免疫機能障害、炎症、肝硬変、動脈硬化、血栓又は感染に罹患していてもよい。好ましくは、患者は癌に罹患している。より具体的には、癌は、例えば大腸癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、胃癌、前立腺癌、甲状腺癌及び悪性リンパ腫からなる群から選択されてよい。一実施形態において、微小胞に含まれる導入遺伝子産物が、例えばCDC6を標的とするshRNA等の、CDC6の発現低下を引き起こすものである場合、治療対象の疾患、例えば癌は、CDC6の発現上昇を伴うものであり得る。患者への微小胞の投与方法及び投与部位は、医薬組成物の投与方法及び投与部位に関して上述したものを使用することができる。
【００９４】
本発明の治療方法により、患者における癌等の疾患を効果的に治療することができる。好ましい一実施形態では、本発明による癌の治療方法は、腫瘍増殖を抑制（低減）することができる。
【００９５】
6. 配列の説明
配列番号１は、プラスミドpRBL0213T、pTHTN及びpRBL001を製造するために使用された、ヒト（Homo sapiens）由来のテロメラーゼ逆転写酵素（TERT）遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列を示す（図２A及びB並びに図３Bを参照）。ヒトTERT遺伝子を含むゲノムDNAの配列はGenbankアクセッション番号AF128893の下で入手可能である。
【００９６】
配列番号２は、プラスミドpRBL0213T、pTHTN及びpRBL001を製造するために挿入された、ヒト（Homo sapiens）由来のTERT転写領域の5'部分のヌクレオチド配列を示す。
【００９７】
配列番号３は、プラスミドpRBL0213T、pTHTN及びpRBL001を製造するために使用された、ヒト（Homo sapiens）由来のTERT遺伝子プロモーター（配列番号１）及びTERT転写領域の5'部分（配列番号２）を含むヌクレオチド配列を示す。配列番号３は、TERT遺伝子の上流配列、全第1エキソン、及び第2エキソンの一部を含む。第1エキソンは、配列番号３の1390位で始まり、1670位で終わる。第2エキソンは配列番号３の1775位で始まる。
【００９８】
配列番号４は、HIV-1 NL4-3株の全長ゲノムDNAのヌクレオチド配列を含む組換えプラスミドpNL4-3クローンの配列を示す（Genbankアクセッション番号M19921）。配列番号４の1位〜9709位のヌクレオチド配列は、HIV-1ゲノムの5' LTR〜3' LTRに相当する。配列番号４の6221位〜8785位のヌクレオチド配列はenvタンパク質をコードする。HIV-1ゲノムの構造については図１Aを参照。
【００９９】
配列番号５は、プラスミドpTHTK中のHIV-1ゲノム領域のヌクレオチド配列、すなわち、pTHTKの5' LTR〜3' LTRのヌクレオチド配列を示す（図１Bを参照）。pNL4-3から配列番号４の6344位〜7611位のヌクレオチド配列を欠失させ、次いで、配列番号４の8650位と8651位の間で制限酵素Hpa IによってpNL4-3を切断させ、配列番号５の7383位〜7674位のヌクレオチド配列がそこに挿入され、pTHTKが製造された。
【０１００】
配列番号６は、プラスミドpRBL0213Tを製造するために使用された、ヒト（Homo sapiens）由来のPTEN CDS（開始コドンから終始コドンまで）のヌクレオチド配列を示す（図２Bを参照）。ヒトPTEN mRNA配列はGenbankアクセッション番号NM_000314の下で入手可能である。
【０１０１】
配列番号７は、ヒト（Homo sapiens）由来のCDC6 CDSのヌクレオチド配列を示す。ヒトCDC6 mRNA配列はGenbankアクセッション番号NM_001254の下で入手可能である。
【０１０２】
配列番号８及び９は、プラスミドpRBL001中に挿入した二本鎖オリゴヌクレオチドの作製に使用された、それぞれ、オリゴヌクレオチド配列Cdc6-5-A及びCdc6-3-Aの配列を示す（図３Bを参照）。
【０１０３】
配列番号１０は、CDC6 shRNAをコードするDNA配列を示す。
【０１０４】
配列番号１１は、プライマーB-NLR8950のヌクレオチド配列を示す。
【０１０５】
配列番号１２は、オリゴヌクレオチドHD-Aのヌクレオチド配列を示す。
【０１０６】
配列番号１３は、オリゴヌクレオチドHD-Sのヌクレオチド配列を示す。
【０１０７】
配列番号１４は、フォワードプライマーBHU5-S2のヌクレオチド配列を示す。
【０１０８】
配列番号１５は、リバースプライマーHDA/SBOTのヌクレオチド配列を示す。
【０１０９】
配列番号１６は、プライマー5' LTRU5のヌクレオチド配列を示す。
【０１１０】
配列番号１７は、プライマー3' NL5850のヌクレオチド配列を示す。
【０１１１】
配列番号１８は、プライマー3' NL8960のヌクレオチド配列を示す。
【０１１２】
配列番号１９は、CDC6 shRNAのアンチセンス配列のヌクレオチド配列を示す。
【０１１３】
配列番号２０は、CDC6 shRNAのリンカーのヌクレオチド配列を示す。
【０１１４】
配列番号２１は、SV40 large T抗原遺伝子の部分断片のヌクレオチド配列を示す。
【０１１５】
配列番号２２は、配列番号６のPTEN遺伝子によってコードされるヒトPTENタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【０１１６】
配列番号２３は、ヒトp16INK4a遺伝子（GenBankアクセッション番号L27211）のヌクレオチド配列（CDS）を示す。
【０１１７】
配列番号２４は、配列番号２３のp16INK4a遺伝子によってコードされるヒトp16INK4aタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【０１１８】
配列番号２５は、プラスミドpCMV p16INK4aのヌクレオチド配列を示す。
【０１１９】
配列番号２６は、ヒトp53遺伝子（GenBankアクセッション番号BC003596）のヌクレオチド配列（CDS）を示す。
【０１２０】
配列番号２７は、配列番号２６のp53遺伝子によってコードされるヒトp53タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【実施例】
【０１２１】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。【０１２２】
［実施例１］
組換えレンチウイルスプラスミドベクター
後述の実施例で使用する組換えレンチウイルスプラスミドベクターは、HIV-1ゲノムDNAベクターpNL4-3に由来する（図１A及び図４A）（Adachi A et al., J. Virol., 1986, p. 284-291）。HIV-1 NL4-3株の全長ゲノムDNA配列を含む組換えpNL4-3クローン配列がGenbankアクセッション番号M19921の下で入手可能である（配列番号４）。組換えレンチウイルスプラスミドベクターpD64V（図４B）は、pNL4-3において、HIV-1 インテグラーゼの64位のアスパラギン酸をバリンへと置換させる突然変異を有する。pD64Vは、カリフォルニア大学ロサンゼルス校（UCLA）分子・医療薬理学科（Department of Molecular and Medical Pharmacology）のDr. Sam Chowから分譲された。【０１２３】
その他の使用する組換えレンチウイルスプラスミドベクターは、コンストラクトpTHTK（図１B）から作製した。pTHTKは、上記pNL4-3に由来する（図１A及びB）。pTHTKは、制限酵素Kpn I及びBgl II処理によって、pNL4-3のヌクレオチド6344〜7611位（配列番号４に基づく；別段指示が無い限り以下同じ）のHIV-1ゲノムDNAを欠失している。具体的には、HIV-1骨格のKpn I（6343〜6348位）及びBgl II（7611〜7616位）の2つの部位を平滑末端にし、再ライゲーションしたことにより、pTHTKは、エンベロープp120糖タンパク質をコードするHIV-1 env遺伝子において欠失を有する。さらにpTHTKは、唯一のHpa I部位（8648〜8653位）で切断し、Mlu Iリンカー（配列番号５の7383〜7674位のヌクレオチド配列）を付加することによって改変されている。pTHTKのHIV-1ゲノム領域（すなわち5'LTR〜3'LTR）のヌクレオチド配列は配列番号５に示す。【０１２４】
クローニングされるDNA断片（導入遺伝子発現カセット）とライゲーションするために、ベクターpTHTKを5'側はMlu I部位で、3'側はXho I部位（8887〜8892位）で切断した。このベクターのMlu I-Xho I部位に導入遺伝子発現カセットを挿入すると、HIV-1 nef遺伝子オープンリーディングフレームが破壊される。nef遺伝子によってコードされるNefタンパク質はウイルス感染及び拡散並びにビリオンの細胞外放出に関与する。そのため、挿入物を含有する（すなわちnef欠損性の）レンチウイルスプラスミドベクターは、野生型HIV-1 NL4-3株とは異なり、CD4+細胞に対してほとんど感染性のないウイルス粒子を製造する。対照的に、VSV/Gで偽型化したRBL0213T、RBL001又はTHTN等については、後述のとおり、Nef欠損性であるかどうかにかかわらず、野生型NL4-3よりも多くのウイルス粒子が出芽した（例えば、図９を参照）。【０１２５】
上記のようにして得られたpTHTK骨格を用いて以下のように組換えレンチウイルスプラスミドベクターを構築した。【０１２６】
(a) pRBL0213T
pRBL0213Tは、hTERT遺伝子プロモーター（hTERTプロモーター）の制御下にヒトPTEN遺伝子をコードするDNAを挿入したプラスミドである（図２B）。【０１２７】
プラスミドpGL-1375をhTERTプロモーターの起源として使用した（Takakura et al., Cancer Res., 1999, p. 551-557）。pGL-1375は、Dr. Satoru Kyo（Kanazawa University of Japan）によって分譲された。pGL-1375において、hTERTプロモーターDNA断片は、Mlu I及びBgl II部位に挿入されている。hTERT 5'上流配列は、Genbankアクセッション番号AF128893の下で入手可能である。hTERTプロモーターDNA断片をpGL-1375から切り出し、pTHTK骨格に挿入した。【０１２８】
ヒトPTEN mRNA配列は、Genbankアクセッション番号NM_000314の下で入手可能である（配列番号６）。pRBL0213Tの構築に用いたPTEN遺伝子をコードするDNAは、ベクターpcDNA3.1/CMV-hPTEN（カリフォルニア大学ロサンゼルス校（UCLA）分子医薬学科Department of Molecular Medicine of University）のDr. Hong Wuから分譲）から切り出した。PTEN遺伝子をコードするDNAをpTHTK骨格にさらに挿入し、pRBL0213Tを作製した。【０１２９】
pRBL0213Tは、hTERTプロモーター配列（配列番号１）、並びにhTERT遺伝子の第1エキソン、及び第2エキソンの一部を含有するhTERT転写領域の5'部分（配列番号２）からなる、配列番号３に示されるヌクレオチド配列と、PTENコード配列とを含む。【０１３０】
(b) pTHTN
pTHTNは、hTERTプロモーターの制御下にSV40 large T抗原遺伝子の部分断片を挿入したプラスミドである（図２C）。【０１３１】
SV40 large T抗原遺伝子の部分断片（配列番号２１）を、pTHTK骨格に挿入したhTERTプロモーターの下流に挿入し、pTHTNを作製した。SV40 large T抗原遺伝子を含むシミアンウイルス40のゲノム配列は、Genbankアクセッション番号NC_001669の下で入手可能である。pTHTNは、hTERTプロモーター配列（配列番号１）、並びにhTERT遺伝子の第1エキソン、及び第2エキソンの一部を含有するhTERT転写領域の5'部分（配列番号２）からなる、配列番号３に示されるヌクレオチド配列と、SV40 large T抗原遺伝子の部分断片（配列番号２１；GenBankアクセッション番号NC_001669のDNA配列のヌクレオチド5175位（HindIII）〜4863位（HaeIII））とを含む。【０１３２】
(c) pRBL001
pRBL001は、hTERTプロモーターの制御下にCDC6 shRNAをコードするDNAを挿入したプラスミド（組換えレンチウイルス粒子THTDを製造するためのプラスミド）である（図３B）。【０１３３】
CDC6 shRNAをコードするDNAの構築に用いた合成オリゴヌクレオチドの配列を以下に示す。【０１３４】
Cdc6-5-A：5'-GATCCCCAGGCACTTGCTACCAGCAATTCAAGAGATTGCTGGTAGCAAGTGCCTTTTTTGGAAA-3'（配列番号８）
Cdc6-3-A: 5'-AGCTTTTCCAAAAAAGGCACTTGCTACCAGCAATCTCTTGAATTGCTGGTAGCAAGTGCCTGGG-3'（配列番号９）
pRBL001の構築において、等モルの合成オリゴヌクレオチドCdc6-5-A及びCdc6-3-Aを混合し、変性させ、再アニールして二本鎖オリゴヌクレオチドを作製した。この二本鎖オリゴヌクレオチドは平滑末端にした後、EcoR V部位でサブクローンベクターpBlueScriptに挿入した。DNAシークエンシングを行い、CDC6二本鎖オリゴヌクレオチドが正しい配列及び配向で挿入されたことを確認した。得られたサブクローンをXba I部位で直鎖化し、平滑末端にし、上に記載したMlu Iリンカーをライゲーションすることによって改変した。hTERTプロモーター配列を含むDNA断片を、Mlu I及びBgl IIでの上記pGL3-1375の消化によって得て、CDC6二本鎖オリゴヌクレオチドを担持するサブクローンベクターにMlu I及びBamH I部位においてクローニングした。得られたサブクローンから、hTERTプロモーター及びCDC6二本鎖オリゴヌクレオチドを含有するDNA断片を、Mlu I及びXho I二重消化により切り出した。得られた断片を精製し、Mlu I及びXho Iで切断してゲル精製したpTHTK骨格に挿入し、pRBL001を作製した。【０１３５】
pRBL001は、hTERTプロモーター配列（配列番号１）、並びにhTERT遺伝子の第1エキソン、及び第2エキソンの一部を含有するhTERT転写領域の5'部分（配列番号２）からなる、配列番号３に示されるヌクレオチド配列と、CDC6 shRNAをコードする配列（配列番号１０）とを含む。CDC6 shRNAは、CDC6 shRNAのアンチセンス配列（配列番号１９）と、リンカー（配列番号２０）と、アンチセンス配列に相補的な配列及び5塩基の3'ポリUオーバーハングからなるセンス配列とを含む。【０１３６】
pRBL001の転写を介して生成される、ヒトCDC6 mRNAを標的とするshRNA（CDC6 shRNA）は、RNA干渉（RNAi）を介してCDC6 mRNA分解を特異的に引き起こすことができ、DNA複製開始因子CDC6タンパク質のノックダウンをもたらす。ヒトCDC6 mRNA配列は、Genbankアクセッション番号NM_001254の下で入手可能である。ヒトCDC6 CDSのヌクレオチド配列は配列番号７に示す。配列番号１９に示すCDC6 shRNAのアンチセンス配列に由来するガイド鎖がCDC6 mRNAに結合してRNAiを引き起こす。【０１３７】
(d) pTHTH
pTHTHは、5'部分（1kb）が欠失しているhTERTプロモーターの制御下にSV40 large T抗原遺伝子の部分断片を挿入したプラスミドである（図４E）。【０１３８】
pTHTHを構築するために、5'の欠失（1kb）及びルシフェラーゼ遺伝子を有する短縮化hTERTプロモーター配列を担持するプラスミドpGL-378（Dr. Satoru Kyo（金沢大学、日本）から分譲）をMlu I＋Hind IIIで切断し、5'部分（1kb）が欠失している短縮化hTERTプロモーター配列を含むDNA断片を得た。このDNA断片を精製し、プラスミドpBluescriptのMlu I及びHind III部位に組み込んでプラスミドpEND-HTPsを作製した。SV40 large T抗原遺伝子の部分断片（配列番号２１）をSV40ゲノムDNAを担持するプラスミドからHind III及びHae IIIによって切り出し、それをpEND-HTPsのHind III及びHinc II部位に挿入した。次いで、得られたプラスミドサブクローンをMlu I及びXho Iで切断し、5'部分（1kb）が欠失している短縮化hTERTプロモーター配列及びSV40 large T抗原遺伝子の部分断片を含む切り出しDNA断片を精製し、pTHTKのMlu I及びXho I部位に挿入してpTHTHを作製した。【０１３９】
pTHTHは、5'部分（1kb）が欠失しているhTERTプロモーター配列、並びにhTERT遺伝子の第1エキソン、及び第2エキソンの一部を含有するhTERT転写領域の5'部分（配列番号２）からなるヌクレオチド配列と、SV40 large T抗原遺伝子の部分断片（配列番号２１）とを含む。【０１４０】
(e) pTHTC
pTHTCは、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターの制御下にSV40 large T抗原遺伝子の部分断片を挿入したプラスミドである（図４F）。【０１４１】
CMVプロモーターをpTHTK骨格に挿入した。SV40 large T抗原遺伝子の部分断片（配列番号２１）を、pTHTKに挿入したCMVプロモーターの下流に挿入し、pTHTCを作製した。【０１４２】
［実施例２］
偽型化組換えレンチウイルス粒子の作製
実施例１に記載のHIV-1 env遺伝子に欠失を有する組換えレンチウイルスプラスミドベクターは、単独では感染性ウイルス粒子を生成することはできない。そこで本実施例では、実施例１に記載の組換えレンチウイルスプラスミドベクターと、水疱性口内炎ウイルス（VSV）のエンベロープ糖タンパク質Gを発現するプラスミドpCMV-VSV/Gの、ヒト胎児腎臓293T細胞における共トランスフェクションを介して、組換えレンチウイルス粒子（偽型）を作製した。pCMV-VSV/Gは、カリフォルニア大学ロサンゼルス校（UCLA）分子・医療薬理学科のDr. Sam Chowから分譲された。具体的な実験手順は以下のとおりである。【０１４３】
1. プラスミドDNAトランスフェクション
15 mlのDMEM/高グルコース（Hyclone, Utah, USA）完全培地（10％ウシ胎仔血清、100ユニット/mlペニシリン及び100 μg/mlストレプトマイシン（Hyclone, Utah, USA）を補充）をT75フラスコに加え、次いで、ヒト胎児腎臓293T細胞を播種した。293T細胞を37℃にて5％ CO2インキュベーター内で増殖させ、継代しながら10個のT75フラスコに増やした。【０１４４】
2 x HEPBS（100ml）を次のように調製した。1gのHepes（酸性塩）、1.6gのNaCl、0.75 mlのNa2HPO4（0.25 M）、及び1mlのKCl（1 M）を適量のddH2Oに溶解させ、溶液のpHをNaOH（5 M）を用いて6.9に調整し、次いで、NaOH（1 M）を用いて7.12〜7.14に微調整した。この溶液に全量100mlまでddH2Oを添加し、得られた溶液を0.22 μm孔径シリンジフィルターに通過させ、2 x HEPBSとした。【０１４５】
以下を50 mlのチューブに加えた。【０１４６】
(a) 170 μgの実施例１に記載のHIV-1 env遺伝子に欠失を有する組換えレンチウイルスプラスミドベクター及び30 μgのpCMV-VSV/Gを含有する500 μlのプラスミドDNA溶液、
(b) 1,650 μlのddH2O、
(c) 350 μlの2 M CaCl2
溶液を穏やかに混合し、次いで2,500 μlの2 x HEPBSを大きな沈殿の形成を回避するように穏やかに撹拌しながら滴下して加え、トランスフェクション混合物とした。【０１４７】
上記トランスフェクション混合物を入れたチューブを室温に20分間置いた。293T細胞を増殖させた10個のT75フラスコから培地を捨て、次いで12 mlの新鮮なDMEM/高グルコース完全培地を各フラスコに加えた。各フラスコに500 μlのトランスフェクション混合物をゆっくり加え、細胞を37℃にて5％ CO2インキュベーター内で8時間インキュベートした。【０１４８】
2. 細胞の培養及び培地の回収
培地を捨て、15 mlの新鮮なDMEM/高グルコース完全培地を各フラスコに加えた。細胞を37℃にて5％ CO2インキュベーター内で36時間インキュベートして、培地（36時間後の培地）を回収した。15 mlの新鮮なDMEM/高グルコース完全培地を各フラスコに加え、細胞を37℃にて5％ CO2インキュベーター内でさらに36時間インキュベートして、培地（72時間後の培地）を回収した。15 mlの新鮮なDMEM/高グルコース完全培地を各フラスコに加え、細胞を37℃にて5％ CO2インキュベーター内でさらに24時間インキュベートして、培地（96時間後の培地）を回収した。回収された培地を含有する各50 mlチューブを3,000 rpm及び4℃にて5分間遠心分離した。【０１４９】
3. 力価測定
200 μlの培地上清を別のチューブに移し、1 x PBSを加えて50〜200倍に希釈した。この希釈した培地上清において、HIV-1 p24抗原ELISAアッセイキット（Coulter Inc., Miami, FL, USA）を用いて、組換えレンチウイルス粒子が感染した細胞から培地中に放出されたウイルス由来タンパク質p24の量を測定することにより、ウイルス粒子の力価を測定した。【０１５０】
4. 精製
上記「2. 細胞の培養及び培地の回収」において遠心分離により回収した培地上清を250 ml高速遠心管に移し、9,000 x g及び4℃にて60分間遠心分離した。得られた上清をVivaspin（登録商標）20(1,000 kDa 分子量カットオフ(mw. co.)) (Sartorius, NY, USA)を用いて限外ろ過し、5倍に濃縮した。得られた溶液にMMP溶液を加えて4℃にて一晩ウイルス粒子を沈殿させた。MMP溶液（300 ml）は、90 gのPEG 8,000（分子生物学グレード）及び30 mlのNaCl (UltraPure)(5 M)を適量のddH2Oに溶解させ、全量300mlまでddH2Oを添加することによって調製した。【０１５１】
ウイルス粒子を沈殿させた溶液を9,000 x g及び4℃にて30分間遠心分離してウイルス粒子を含むペレットを形成させた。上清を捨て、ペレットを10 mlの1 x PBSに再懸濁してウイルス粒子を含む溶液を得た。【０１５２】
一部の溶液中のウイルス粒子をPEG化した（Croyle et al., J. Virol., 2004, Vol. 78, p. 912-921）。PEG化は、約10 mlのウイルス粒子を含む溶液に対して0.4 mlのPEG化溶液（33 mg/mL mPEG-NHS（メトキシ化PEGスクシンイミジルカルボネートNHS, m.w. 10K (NANOCS, USA)）、30 mM HEPES-KOH, pH 7.5、500 mM NaCl）を添加し、室温にて回転プラットフォーム上で60分間インキュベートすることにより行った。【０１５３】
PEG化した又はPEG化していないウイルス粒子を含む溶液を、Slide-A-Lyzerカセット(20 kDa mw. co.) (Thermo Scientific, IL, USA)を用いて4℃にて1 x PBSに対して透析し、2日間、24時間毎に1 x PBSを交換した。透析後のウイルス粒子溶液を、AmiconUltra15 (100 kDa mw. co.) (Millipore, MA, USA)を用いて30倍に濃縮した。この濃縮したウイルス粒子溶液を0.45μm孔径シリンジフィルターに通し、得られた調製物を-80℃にて保存した。【０１５４】
以上の方法により、偽型化組換えレンチウイルス粒子を作製することができた。実施例１に記載の組換えレンチウイルスプラスミドベクターpTHTK、pRBL0213T、pTHTN、pRBL001、pTHTH及びpTHTCから作製された偽型化組換えレンチウイルス粒子を、以降の実施例ではそれぞれTHTK、RBL0213T、THTN、THTD、THTH及びTHTCと称する。【０１５５】
このようにして作製された組換えレンチウイルス粒子は、後述のように種々のヒト増殖細胞並びに非分裂及び分裂細胞に感染することができる。組換えレンチウイルス粒子が感染した標的細胞では、レンチウイルスDNAが合成され、宿主染色体DNAに組み込まれる。したがって、得られた組換えレンチウイルス粒子は、レンチウイルスベクターとして使用できる。【０１５６】
［実施例３］
組換えレンチウイルス粒子の感染性ウイルス粒子作製能力の検討
ライゲーション介在性PCR（LM-PCR）法によって生成されるLTR-Tagの検出に基づき、pTHTK由来の偽型化組換えウイルス粒子THTKが細胞に感染後、感染性ウイルス粒子を作製できるか調べた。【０１５７】
1. pTHTKにおけるBpm I部位の作製
LM-PCRを実行するために、まずpTHTKを改変して、HIV-1ゲノム中に新規Bpm I部位を作製した（図５A）。HIV-1 5' LTR領域には3つの要素（U3、R及びU5）がある。Bpm I部位は、pTHTK中の5' LTRのU5要素の3'末端にオーバーラップPCRを介して作製した。Bpm IはクラスII S制限酵素である。Bpm Iは5'-CTGGAG-3'を認識する。Bpm Iは、この5'-CTGGAG-3'を含む鎖において認識部位の16ヌクレオチド3'側で、及びもう一方の鎖において認識部位の14ヌクレオチド5'側でDNAを切断し、2ヌクレオチドの3'オーバーハングを作製する（図５B）。【０１５８】
図５Cにレンチウイルスゲノムの末端構造を示す。レンチウイルスRNAは、プロウイルスDNAの5’LTRのR要素から3' LTRのR要素までが転写されることによって生成される。つまり、レンチウイルスRNAは、末端の5' LTRのU3要素及び3' LTRのU5要素を有さない。しかし、レンチウイルスRNAがレンチウイルスDNAへと逆転写される際に、3' LTRのU3要素は5' LTRのU3要素に、5' LTRのU5要素は3' LTRのU5要素にコピーされる。そしてこのレンチウイルスDNAが宿主ゲノム内に組み込まれてプロウイルスDNAとなる。【０１５９】
したがって、pTHTKのHIV-1ゲノム中に作製された5' LTRのU5要素中の新規Bpm I部位は、感染細胞においてレンチウイルスDNAが合成されると3' LTRのU5要素にコピーされる。この新規Bpm I部位は、THTKビリオン集合、ウイルス粒子感染、及び感染細胞におけるプロウイルスDNAの組み込みに影響を及ぼさない。この新規Bpm I部位を有するpTHTK由来のウイルス粒子THTKが宿主細胞に感染すると、3' LTRのU5要素中に末端から2ヌクレオチド（5'-CA-3'）離れた位置にコピーされたBpm I部位を有するプロウイルスDNAが宿主ゲノム内に組み込まれる。したがって、感染細胞由来の宿主ゲノムDNAをBpm I処理すると、プロウイルスDNAの組み込み部位から14ヌクレオチド離れた位置で宿主ゲノムDNAが切断される（図５B）。【０１６０】
2. LTR-Tagの調製
HIV-1 Tatタンパク質を発現するヒト子宮頸癌HeLa細胞（HeLa/tat細胞）に、上記の新規Bpm I部位を有するpTHTKから実施例２に記載のように作製したウイルス粒子THTKを共インキュベートすることによって感染させた。HeLa/tat細胞は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校（UCLA）分子・医療薬理学科のDr. Sam Chowから分譲された。感染の3、5、10及び15日後に、HeLa/tat細胞由来の宿主ゲノムDNAを単離した。ゲノムDNAは、Kas I及びXho Iの二重消化に供した。Kas I（637〜642位；配列番号４に基づく。以下同じ）とXho I（8887〜8892位）は、それぞれ、HIV-1ゲノム中の唯一の部位である。Kas I部位は5' LTRの4ヌクレオチド下流にあり、Xho I部位は3' LTRの約190ヌクレオチド上流にある。Kas I及びXho Iの二重消化により、プロウイルスDNAが宿主ゲノムDNAから分離されるが、プロウイルスDNAの5' LTRと3' LTRの配列は宿主ゲノムDNAとともに残る。さらに、Kas I認識部位は、5' LTRに作製したBpm I認識部位（627〜632位）とその16ヌクレオチド下流のBpm I切断部位との間にある。このため、Kas I消化後にBpm I消化しても、5' LTRにおけるBpm I部位に基づくBpm I消化は起こらない。【０１６１】
次に以下の特殊なDNA伸長反応を行った。この反応では、3' LTRの約100ヌクレオチド上流の配列に由来するプライマーを用いるため、プロウイルスDNAの3' LTR及びその下流の宿主ゲノムDNAが顕著に増幅され、混入DNA、具体的にはより上流のプロウイルスDNAに由来するDNAの比率は劇的に減少する。DNA伸長のためのプライマーB-NLR8950のヌクレオチド配列を以下に示す。【０１６２】
B-NLR8950: 5'-B-GTGCCTGGCTAGAAGCACAAG-3' （配列番号１１）
これはビオチン標識されたヌクレオチドであり、配列は、HIV-1 NL4-3株のゲノムDNAの8950〜8970位に由来する。このプライマーを用いて以下のDNA伸長反応を行った。【０１６３】
DNA伸長反応液:
B-NLR8950  50 μM
Kas I+Xho Iで消化した宿主ゲノムDNA  10 μg
dNTPs  200 μM
Taq DNAポリメラーゼ  5ユニット
上記DNA伸長反応液を入れたチューブを94℃にて5分間、55℃にて5分、及び72℃にて30分インキュベートしてDNA伸長反応を行い、ビオチン化DNAを得た。【０１６４】
このビオチン化DNAを、ストレプトアビジン磁気ビーズ（Dynabeads M-280）との結合を介して以下のように精製した。約5 pmolのビオチン化DNAを、40 pmolのDynabeads M-280とチューブ内で混合し、室温にて30分間インキュベートした。チューブを磁気スタンド上に配置し（Dynal MPC stand）、2分間置いた後、TE（pH 8.0）バッファーでビーズを洗浄した。ビーズの洗浄は1 mlのTEを用いて行い、さらに2回洗浄を繰り返した。ビーズを2秒遠心分離し上清を捨て、ビオチン化DNAを精製した。【０１６５】
次いで、ビオチン化DNAをBpm I消化に供した。ビオチン化DNAを37℃にて一晩Bpm I消化し、消化されたビオチン化DNAをDynabeads M-280を介して精製し、その後二本鎖オリゴリンカーとライゲーションした。二本鎖オリゴリンカーの一方の末端は、2ヌクレオチドの3'オーバーハングを有し、Bpm I消化末端と相補的である。二本鎖オリゴリンカーの他方の末端は、3ヌクレオチドの5'オーバーハングを有し、リンカーの自己ライゲーションを効率的に妨げる。二本鎖リンカーを構成するオリゴヌクレオチドHD-A及びHD-S（University of California, UCLAのDr. Sam Chowから）のヌクレオチド配列を以下に示す。【０１６６】
HD-A: 5'-CACGCGTCGCATCATATCTCCAGGTGTGACAG-3' （配列番号１２）
HD-S: 5'-CCTCTGTCACACCTGGAGATATGATGCGACGCGTGNN-3' （配列番号１３）
HD-Sの3'末端の「NN」は、「A」、「T」、「G」及び「C」のあらゆる組み合わせを示す縮重配列である。【０１６７】
二本鎖オリゴリンカーとビオチン化DNAのライゲーションは室温にて16時間行った。二本鎖オリゴリンカーが連結されたビオチン化DNAはDynabeads M-280を介して精製した。【０１６８】
3. LTR-Tagの検出
LTR-Tagを検出するため、PCR増幅を行った。PCR反応において以下のプライマーを用いた。【０１６９】
フォワードプライマーBHU5-S2: 5'-GAGTGCTCAAAGTAGTGGT-3' （配列番号１４）
リバースプライマーHDA/SBOT: 5'-CTGTCACACCTGGAGATATGAT-3' （配列番号１５）
フォワードプライマーとリバースプライマーのヌクレオチド配列は、それぞれ、HIV-1ゲノムDNAの9617〜9636位及び二本鎖オリゴリンカーの一方の鎖HD-Sに由来する。【０１７０】
以下のPCR反応を行った: 94℃、4分、1サイクル; 94℃、60秒; 60℃、30秒; 72℃、90秒; 30サイクル；次いで72℃、10分; 4℃、1〜12時間。PCR反応における鋳型DNAとして上記の二本鎖オリゴリンカーが連結されたビオチン化DNAを用いた。【０１７１】
PCR後、5 μlの各反応物をゲル（2.0 ％アガロース）にロードし、1 x TAE中で泳動した。宿主細胞ゲノムにプロウイルスDNAの組み込みが生じた場合、約138bpのPCR産物（LTR-Tag）が検出される（図６）。【０１７２】
4. 結果
結果を図７に示す。LTR-Tagが検出されること（陽性LTR-Tag）は、プロウイルスDNAが宿主細胞ゲノム内に組み込まれたことを示し、このことはウイルスが宿主細胞に感染したことを意味する。偽型化組換えレンチウイルス粒子THTKは、陽性LTR-Tagを示し、細胞に感染できたことが示された（図７、感染後）。【０１７３】
次に感染細胞の培養培地を回収し、0.45μm孔径フィルターでろ過し、新鮮な培養細胞に添加した（「再感染」）。この細胞からゲノムDNAを単離しLTR-Tagを調べた結果、LTR-Tagは陰性であり、細胞にウイルス粒子が感染していないことが示された（図７、「再感染」後）。つまり、組換えレンチウイルス粒子THTKが感染した細胞からは、感染性ウイルス粒子が生成されなかったことが示された。感染細胞において組換えレンチウイルス粒子が複製不能であるか試験するLM-PCRは正確であり、結果は完全な再現性があり、偽陽性結果、すなわちHIV-1配列の直接PCRによるコンタミネーションはなかった。【０１７４】
以上の結果より、偽型化組換えレンチウイルス粒子THTKは細胞に感染するが、その感染細胞から感染性ウイルス粒子は作製されないことが示された。このことは、偽型化組換えレンチウイルス粒子をレンチウイルスベクターとして使用した本発明の微小胞製造方法において、感染性ウイルス粒子が製造されないことを示している。【０１７５】
［実施例４］
ヌードマウスに移植されたヒト腫瘍への組換えレンチウイルス粒子THTDの直接注入
実施例２に記載のように作製した偽型化組換えレンチウイルス粒子THTDを、ヌードマウスに移植されたヒト乳癌Bcap-37腫瘍へ直接注入する動物実験を行った。動物には、3週間、週2回、腫瘍病巣の複数部位にTHTD（タンパク質量：275μg）を注射により投与し、最終投与48時間後に頸椎脱臼によって安楽死させた。コントロール群における動物には、腫瘍病巣に1 x PBSを注射した。各腫瘍の長さ及び幅の測定は、注射後週2回、標準的キャリパーを用いて行った。動物を頸椎脱臼によって安楽死させた後、腫瘍を取り出して計量し、病理学検査のために処理した。【０１７６】
THTD処理した腫瘍の増殖はコントロール群に対して34.70％阻害され、腫瘍の平均重量はコントロールのものより有意に少なかった（p<0.02）。THTDの注入は、腫瘍組織における強い線維化の発達をもたらし、これにより、腫瘍増殖が抑制された。【０１７７】
以上の結果より、偽型化組換えレンチウイルス粒子THTDはマウスの細胞に感染し、次いでウイルスゲノムにコードされているCDC6 shRNAが細胞内で生成されCDC6の発現を抑制し、その結果、腫瘍の増殖が抑制されたことが示された。このことは、CDC6 shRNAを含む本発明の微小胞が、同様に腫瘍増殖抑制効果を有する可能性を示している。【０１７８】
［実施例５］
hTERTプロモーターによるウイルスゲノムRNAスプライシングの増強
実施例２に記載のように作製した組換えウイルス粒子THTNの遺伝子転写及び遺伝子導入活性を、他の組換えレンチウイルス粒子と比較してRT-PCR法によりRNAスプライシング活性を検出することによって調べた（図８）。【０１７９】
1. ウイルスの感染及び細胞の回収
HIV-1 Tatタンパク質を発現するヒト子宮頸癌HeLa細胞（HeLa/tat細胞）を6ウェルプレート内にウェル当たり約2 x 105細胞播種し、3 ml/ウェルのDMEM/高グルコース完全培地を加えた。倒立顕微鏡下の観察で約80％コンフルエントとなるように、細胞を37℃及び5％ CO2にてインキュベーター内で24時間増殖させた。実施例２に記載されるように作製した偽型化組換えレンチウイルス粒子THTN、THTH若しくはTHTC、又はpNL4-3若しくはpD64Vをヒト胎児腎臓293T細胞にトランスフェクトして作製したウイルス粒子NL4-3若しくはD64Vを、HeLa/tat細胞を増殖させたウェル（各レンチウイルス粒子について2つのウェル）に加えて、細胞に各ウイルスを感染させた。2 x 105個の標的細胞当たり、400 ngのp24ウイルスタンパク質と同等の約4 x 105感染単位のウイルス溶液を各感染に使用した（感染多重度（m.o.i.）は1.3であった）。【０１８０】
一方、偽感染は、「死んだ」THTNビリオンを細胞とインキュベートすることによって行った。そのTHTNビリオンは、100℃で5分間煮沸してそのウイルスが確実に「死ぬ」ようにすることにより調製した。その「死んだ」ウイルスによる偽感染は、細胞へのウイルス粒子の侵入が全くないことを保証することから、RT-PCRアッセイにおいて転写されたウイルスRNAは存在しない。【０１８１】
感染後、細胞を37℃にて5％ CO2インキュベーター内で8時間増殖させた。顕微鏡下で細胞を観察し、細胞が健康でかつコンタミネーションが見られないことを確認した。注意深く培地を捨て、新鮮なDMEM/高グルコース完全培地を3 ml/ウェル加え、細胞を37℃及び5％ CO2にてインキュベーター内で48時間増殖させた。その後1 x PBSを用いて細胞を3回リンスし、ラバーポリスマンを用いてウェルの表面からこそげ取ることによって細胞を回収した。15 mlの低速遠心チューブに細胞を回収し、1 x PBSを12 mlまで加えて3,000 rpmで遠心分離して細胞ペレットを形成させた。上清を捨て、細胞ペレットをドライアイス中で30分間凍結させた。【０１８２】
2. RNA抽出
GTCバッファーを次のように調製した。212 gのチオシアン酸グアニジン(mw. 118.16)、2.2 gのクエン酸ナトリウム(mw. 294.1)及び15 mlのサルコシル(10％ w/v)を適量のddH2Oに溶解させ全量300 mlまでddH2Oを添加した（それぞれ終濃度6M、25 mM及び0.5％）。使用前に20 ml毎に1.4 mlのβ-メルカプトエタノールを加えてGTCバッファーとした。【０１８３】
1,000 μlのGTCバッファーを各チューブ中の細胞ペレットに加え、シリンジを用いて18G1/2針を5回通過させることによって、細胞をホモジナイズした。【０１８４】
次いで各チューブに1,000 μlの水飽和フェノール及び1,000 μlのクロロホルムを加え、ボルテックスによって混合した。次いで各チューブに3 mlの1 M酢酸ナトリウム、pH 5.3を加え、ボルテックスによって混合し、9,000 x g及び4℃にて10分間遠心分離した。形成された上層溶液を新たな50 mlチューブに移し、0.6〜1.0容のイソプロパノールを加えた。チューブを逆さまに5回反転させることによって溶液を混合し、室温で一晩置いた。チューブを30秒間ボルテックスし、200〜300 μlの溶液を1.5 mlのマイクロチューブに移し、13,000 rpm及び4℃にて15分間遠心分離してRNAペレットを形成させた。上清を捨て、RNAペレットを1 mlの75％エタノールでリンスし、13,000 rpm及び4℃にて5分間遠心分離した。上清を捨て、RNAペレットを空気乾燥させた。【０１８５】
3. RT-PCR
RNAペレットを10 μlのddH2Oに再溶解させ、cDNAを増幅させるための逆転写反応及びPCR（RT-PCR）を行った。RT-PCRでは各逆転写について200 μgのRNAを使用した。【０１８６】
逆転写（RT）反応は以下のように行った。10 μlのDNase I消化RNA（約200 μg）、1 μlの10 mM dATP/dCTP/dGTP/dTTPストック、1 μlのRNasein（登録商標）（30ユニット/μl、Promega）、2 μlの10 x PCRバッファー、1μlの0.1 μg/μlランダムプライマー（ランダムヘキサマー）、1 μlの50 mM MgCl2を穏やかに混合し、次いで1 μlのMo-MuLV逆転写酵素（200ユニット/μl）を加え、2秒間遠心分離することによってチューブ内で混合した。チューブを室温にてまず10分、次いで42℃にて60分間インキュベートした。その後、チューブを100℃の水浴中で15分間ボイルし、氷上で5分間冷却した。チューブ内のRT反応液を4本の新しいチューブに分け（各チューブに50 μgのRNAと同等）、さらなる使用のために-80℃で保存した。【０１８７】
次にPCR反応を以下のように行った。2.5 μlのプライマー5' LTRU5（20 μM）、2.5 μlのプライマー3' NL5850（20 μM）若しくはプライマー3' NL8960、5 μlのRT反応液、40 μlのPCR混合物を混合し、PCR反応用のサーマルサイクラー（Applied Biosystems）を用いて以下の温度条件に供した：94℃、4分、1サイクル; 94℃、60秒; 60℃、30秒; 72℃、90秒; 16サイクル；次いで72℃、10分。【０１８８】
用いたプライマーのヌクレオチド配列は以下の通りである。【０１８９】
プライマー5' LTRU5: 5'-TCTGGCTAACTAGGGAACCCACTG-3' （配列番号１６）
プライマー3' NL5850: 5'-GCTATGTCGACACCCAATTCTGAA-3' （配列番号１７）
プライマー3' NL8960: 5'-TGTGCTTCTAGCCAGGCACAAGC-3' （配列番号１８）
上記PCR混合物（6サンプルについて）は、
10 mM dATP/dCTP/dGTP/dTTPストック  6 μl 
32P-α-dCTP （3000 Ci/mmol、10 μCi/μl、GE, USA）  1 μl
10 x PCRバッファー  30 μl
Taq DNAポリメラーゼ （5ユニット/μl）  3 μl
ddH2O  201 μl
を混合し、最終容量240 μlで調製した。【０１９０】
PCR後、20 μlの各PCR反応物に3 μlのDNAローディングバッファーを加え、2.2％アガロースゲルにロードし、1 x TAE中で泳動した。ゲルをラップし、乾燥させ、-80℃にて一晩X線フィルムをゲルに感光させた。X線フィルムを現像し、写真を撮影した。1 x TAEは、242 gのTris Base（分子生物学グレード）、57.1 mlの氷酢酸（分子生物学グレード）、100 mlの0.5 M EDTA，pH 8.0（分子生物学グレード）を適量のddH2Oに溶解させ、全量1,000 mlになるまでddH2Oを加えることによって調製した50 x TAEをddH2Oで50倍に希釈することによって調製した。【０１９１】
異なる組換えレンチウイルス粒子が感染したHeLa/tat細胞において、それぞれの粒子に由来するレンチウイルスRNAのスプライシングを互いに比較した。HIV-1インテグラーゼに欠損があり、HIV-1プロウイルスDNA組み込みに欠損があるウイルス粒子D64Vをネガティブコントロールとして使用した。【０１９２】
4. 結果
プライマー5' LTRU5及び3' NL5850を用いたPCRの結果を図８Bに示す。HIV-1では、様々なウイルスmRNAを形成するように結合された、7つの主要なスプライシングされたRNA断片がある。プライマー5' LTRU5及び3' NL5850によって、それらのうち5つの主要なPCR産物が、全ての試験したレンチウイルス粒子を感染させた細胞で検出された。特に、ウイルスゲノムRNA中にhTERTプロモーターを含むウイルス粒子THTNを感染させた細胞ではRNAスプライシング活性が非常に高く、野生型NL4-3を感染させた場合よりRNAスプライシングレベルは少なくとも100倍高かった。一方、組換えレンチウイルス粒子THTH（hTERTプロモーターの5'部分（1kb）が欠失している）又はTHTC（CMVプロモーターを有する）を感染させた細胞では、野生型ウイルス粒子NL4-3を感染させた場合と比べて、RNAスプライシングのレベルは増加しなかった。【０１９３】
プライマー5' LTRU5及び3' NL8960を用いたPCRの結果を図８Aに示す。プライマー5' LTRU5及び3' NL8960を用いたPCR増幅レベルはレンチウイルス粒子に由来するウイルスゲノムRNAの量を示す。しかし、プライマー5' LTRU5及び3' NL8960を用いたPCRは、効率的にPCR産物を生成することができず、非常に弱いシグナルを示した。ウイルスゲノムRNA中にhTERTプロモーターを含むウイルス粒子THTNを感染させた細胞におけるウイルスゲノムRNAのレベルは、他のウイルス粒子（THTH、THTC又はNL4-3）を感染させた場合と同程度であった。【０１９４】
以上の結果から、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）プロモーターを含むレンチウイルスRNAを担持する偽型化組換えレンチウイルス粒子を感染させた細胞において、レンチウイルスRNAのスプライシングが増強することが示され、これにより、導入遺伝子発現が増強することが示された。【０１９５】
［実施例６］
hTERTプロモーターによる遺伝子導入及び発現の増強
遺伝子導入活性に対するhTERTプロモーターの効果を、p24 ELISAアッセイを用いてウイルスタンパク質発現を指標として調べた。【０１９６】
実施例２で作製した偽型化組換えレンチウイルス粒子THTN、THTH若しくはTHTC、又はウイルス粒子NL4-3若しくはD64Vを、2 x 106細胞で播種された293T細胞及びHeLa/tat細胞に1.0の感染多重度（m.o.i.）で感染させた。感染の際、レンチウイルス粒子中のウイルスゲノムRNAからウイルスゲノムDNAが合成され、宿主細胞ゲノムにプロウイルスゲノムDNAとして組み込まれる。宿主ゲノムへの遺伝子組み込み（遺伝子導入）の結果として発現されるタンパク質、例えばp24ウイルス抗原は、培養培地に分泌され得る。そこで、培地を回収し、HIV-1 p24抗原ELISAアッセイキット（Coulter Inc., Miami, FL, USA）を用いて培地中のウイルス由来タンパク質p24の量を測定することにより、各ウイルス粒子の遺伝子導入活性を調べた。【０１９７】
まず細胞培養培地を感染後の異なる時点で回収した。回収された培地は遠心分離して細胞残屑を取り除き、その後1 x PBSバッファーで希釈してp24アッセイを行った。希釈は、通常、1:50〜1:200とした。その結果、p24のレベルは感染後約36時間で上昇し、感染後72時間でピークに達し、感染後96時間で急激に下降した。そこで、感染後72時間に回収した培地における平均値としてp24レベルを示した。【０１９８】
結果を図９に示す。293T細胞においては、ウイルスゲノムRNA中にCMVプロモーターを含むウイルス粒子THTCを感染させた細胞では、野生型NL4-3を感染させた場合より高いレベルのp24が示された。このことは、293T細胞においてCMVプロモーターが遺伝子導入及び発現を活性化することを示す。このような遺伝子導入及び発現の活性化は、ウイルスゲノムRNA中にhTERTプロモーターを含み、かつ実施例５に示したように活性なRNAスプライシングを示すウイルス粒子THTNにおいてさらに顕著であった。THTNを感染させた293T細胞では、p24のレベルはTHTCを感染させた293T細胞でのレベルを超えていた。一方、hTERTプロモーター配列の5'部分（1kb）が欠失しているウイルス粒子THTHを感染させた293T細胞では、野生型NL4-3を感染させた場合とp24レベルは同程度であった。また、遺伝子導入を引き起こさないD64Vではほとんどp24は検出されなかったことから、p24レベルが遺伝子導入及び発現のレベルを反映することが示された。【０１９９】
次に、HeLa/tat細胞においては、THTC又はTHTHを感染させた細胞において生成されるp24レベルは、野生型NL4-3の場合と同程度であった。ウイルスゲノムRNA中にhTERTプロモーターを含むウイルス粒子THTNを感染させたHeLa/tat細胞において唯一、p24レベルは2,500 ng/mlを超え、他のウイルス粒子の場合より明らかにp24レベルは高かった。【０２００】
以上の結果から、hTERTプロモーターを含むレンチウイルスRNAを担持する偽型化組換えレンチウイルス粒子を感染させた細胞におけるウイルスタンパク質発現の増強からわかるように、hTERTプロモーターによって遺伝子導入及び発現が増強されることが示された。【０２０１】
［実施例７］
hTERTプロモーターに基づく微小胞放出の増強
PTENアッセイにより測定される細胞内又は微小胞（mv）中の導入遺伝子PTENの活性値を指標として、レンチウイルスプラスミドベクターpRBL0213Tを導入した細胞又はウイルス粒子RBL0213Tを感染させた細胞におけるmv放出を調べた。【０２０２】
1. プラスミドDNAトランスフェクション
1.5 mlのマイクロチューブに、200 μlの1 μg/ml pRBL0213T、50 μlの3 M酢酸ナトリウム、pH 5.3を入れ、次いで1 mlの100％エタノールを加えて溶液を混合し、-80℃にて60分間冷却した。次いで、チューブを13,000 rpmにて15分間遠心分離しDNAペレットを形成させ、上清を捨てた。チューブに1 mlの70％エタノールを加え、13,000 rpmにて5分間遠心分離し、上清を注意深く捨て、DNAペレットを空気乾燥した。500 μlのddH2Oを加えDNAペレットを溶解させて、pRBL0213TプラスミドDNA溶液とした。pRBL0213Tは、hTERTプロモーターの制御下にPTEN遺伝子を有する組換えレンチウイルスプラスミドベクターである（図１０D、Lenti.）。【０２０３】
また、以下のプラスミド、pGL3-1375、pcDNA3.1/CMV-hPTEN、及びpRBL016BnのプラスミドDNA溶液を調製した。pGL3-1375（Takakura et al., Cancer Res., 1999, p. 551-557）は、hTERTプロモーターを有するが、PTEN遺伝子を有さず、PTENアッセイのネガティブコントロールとして使用した（図１０A、Empt.）。pcDNA3.1/CMV-hPTENは、一般的なプラスミドpcDNA3.1のCMVプロモーターの制御下にPTEN遺伝子を挿入したプラスミドであり、、PTENアッセイのポジティブコントロールとして使用した（図１０B、Regul.）。pRBL016Bnは、ラット神経成長因子受容体（rNGFR）遺伝子プロモーターの制御下にPTEN遺伝子を有するMo-MLVレトロウイルスプラスミドである（図１０C、Retro.）。【０２０４】
500 μlの上記4種のいずれかのプラスミドDNA溶液（20μgのプラスミドDNA）、400 μlのddH2O、及び75 μlの2 M CaCl2を50 mlの新しいチューブに入れて穏やかに混合した。次いで525 μlの2 x HEPBSを大きな沈殿の形成を回避するように穏やかに撹拌しながら滴下して加えた。チューブを室温に20分間置き、トランスフェクション混合物を得た。【０２０５】
実施例２に記載のようにしてヒト胎児腎臓293T細胞を増殖させたT75フラスコから培地を捨て、次いで12 mlの新鮮なDMEM/高グルコース完全培地を各フラスコに加えた。各フラスコに、1,000 μlの上記トランスフェクション混合物をゆっくり加え、細胞を37℃にて5％ CO2インキュベーター内で8時間インキュベートすることによって、細胞に各プラスミドDNAをトランスフェクトした。次いで培地を捨て、各フラスコに15 mlの新鮮なDMEM/高グルコース完全培地を加え、細胞を37℃にて5％ CO2インキュベーター内で60時間インキュベートした。また、プラスミドDNA溶液の代わりに水を用いて同様の手順により偽トランスフェクションを行った。【０２０６】
2. ウイルス粒子RBL0213Tの感染
実施例２に記載したようにプラスミドpRBL0213Tを用いて組換えレンチウイルス粒子RBL0213Tを作製し、PEG化及び精製した。得られた組換えレンチウイルス粒子RBL0213Tを1.3のm.o.i.で293T細胞、CEM細胞又はHeLa細胞に感染させた。細胞を12時間インキュベートしてウイルス粒子RBL0213Tを感染させ、新鮮な培地を添加して、細胞を48時間増殖させた。【０２０７】
一方、化学的に不活性化されたウイルス粒子は、DMSO（Fluka）中の100 mM AT-2（2,2'-ジピリジルジスルフィド（2,2'-dipyridyl disulfide）（アルドリチオール-2（aldrithiol-2））を調製し、ウイルス粒子を含む溶液に濃度1 mM AT-2となるように添加し、4℃にて一晩処理することによって作製した（Rossio JL, J. Virol., 1998, Vol. 72, p. 7992-8001）。AT-2はビリオン内部タンパク質中のシステインを酸化し、逆転写酵素の働きを阻害することによってウイルスを不活性化する試薬である。AT-2処理によりHIVの感染性はなくなるが、ウイルス表面タンパク質の完全性及びコンフォメーションは維持される。【０２０８】
3. 細胞溶解物の調製
PTENアッセイでは、遊離ホスフェートを含有する溶液は高いバックグラウンドを生じるために好ましくない。バッファー及びチューブはホスフェートフリーであることが推奨される。【０２０９】
上記のトランスフェクション後又は感染後の細胞を新しい50 mlチューブに回収し、3,000 rpmにて5分間遠心分離して細胞を沈殿させた。後述する「4. mv溶解物の調製」で使用するために、培地を新しい50 mlチューブに移した。沈殿させた細胞を30 mlの冷1 x PBSでリンスし、再度遠心分離して細胞を沈殿させ、上清を捨てた。細胞（2 x 106細胞）に250 μlの溶解バッファー（25 mM Tris-HCl, pH 8.0、150 mM NaCl、1％ NP-40、1 mM EDTA、5％グリセロール）を加え、シリンジを用いて24G針を10回通過させることによって細胞をホモジナイズし細胞抽出物を得た。【０２１０】
細胞抽出物を4℃にて回転プラットフォーム上で60分間インキュベートし、13,000 rpm及び4℃にて20分間遠心分離した。上清（細胞溶解物）を新しいチューブに移した。5 μlの細胞溶解物を別のチューブに入れ、次いで1 mlのBio-Radタンパク質アッセイ溶液（Bio-Rad, USA）を加え、OD600を測定した。ウシ血清アルブミンを標準として用いてタンパク質濃度を決定した。さらなる使用のために、残りの細胞溶解物を-80℃にて保存した。【０２１１】
4. mv溶解物の調製
上記「3. 細胞溶解物の調製」で50 mlチューブに移したトランスフェクション後又は感染後の培養培地を、9,000 x g及び4℃で60分間遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、Vivaspin（登録商標）20 (1,000 kDa mw. co.) (Sartorius, Bohemia, NY, USA)を用いて限外ろ過を行い、バッファーをTBS-Dに交換した。TBS-Dは、6.5 mlの1 M Hepes-KOH, pH 7.6、7 mlの5 M NaCl、及び0.25 mlの1 M KClを適量のddH2Oと混合し、全量250 mlまでddH2Oを添加することによって調製したTBS溶液に、使用前に50 mlのTBS溶液当たり500 μlの1 M ジチオスレイトール（DTT）を加えることによって調製した。【０２１２】
このように培地から調製した溶液1〜2 mlに、同容量のPEG 8,000/NaCl溶液を加え、4℃にて回転プラットフォーム上で一晩インキュベートした。PEG 8,000/NaCl溶液（300 ml）は、90 gのPEG 8,000、及び180 mlの5 M NaClを適量のddH2Oと混合し、最終容量300 mlまでddH2Oを添加することによって調製した。【０２１３】
インキュベート後の溶液を13,000 rpmで20分間遠心分離して微小胞（mv）を含むペレットを形成させた。上清を捨て、65 μlの溶解バッファー中にペレットを再懸濁し、4℃にて回転プラットフォーム上で2時間インキュベートしてペレットを溶解させた。この溶液を13,000 rpmで20分間遠心分離し、上清（mv溶解物）を新しいチューブに移した。5 μlのmv溶解物を別のチューブに入れ、OD600を測定しタンパク質濃度を決定した。さらなる使用のために残りのmv溶解物を-80℃で保存した。【０２１４】
5. PTEN免疫沈降（IP）
70 μlの細胞溶解物若しくはmv溶解物（500 μgのタンパク質を含有する）、及び5 μlのマウス抗PTENモノクローナル抗体（クローン6H2.1、1 mg/ml、Upstate, USA）を新しいチューブに入れ、最終容量100μlまでTBS-Dを添加して各IPサンプルを調製した。IPサンプルを4℃にて回転プラットフォーム上で一晩インキュベートした。次いで、各IPサンプルに50 μlの予め洗浄したプロテインA-アガロース溶液（Thermo Scientific, Illinois, USA）を加え、4℃にて回転プラットフォーム上で一晩インキュベートした。インキュベート後のアガロースビーズを1 mlのTBS-Dで洗浄し、6,500 rpmにて5分間遠心分離した。洗浄をさらに3回繰り返した。遠心分離後の上清を捨て、アガロースビーズを75 μlのTBS-Dで再懸濁してアガロースビーズ溶液とし、さらなる使用のために4℃にて保存した。【０２１５】
6. PTENアッセイ
Echelon PTENホスファターゼマラカイトグリーンアッセイ（Echelon Biosciences, Utah, USA）をいくつか改変してPTENアッセイを行った。各アッセイについて、最終容量は元の25 μlから100 μlまでスケールアップし、620 nmでの吸光度はPromega GloMax-Multi Jr. reading system（Promega, USA）を用いて測定した。アッセイでは、液体基質PtdIns(3,4,5)P3（Echelon, Utah, USA）を使用し、アッセイは製造業者のマニュアルに従って行った。各アッセイにおいて、23 μlのTBS-Dバッファー、上記「5. PTEN免疫沈降（IP）」で得られた70 μlのアガロースビーズ溶液、及び7 μlの1 mM PtdIns(3,4,5)P3ストック溶液を混合した。混合物を37℃にて2時間インキュベートした。混合物に450 μlの室温のマラカイトグリーン溶液（Echelon, Utah, USA）を加え、光から保護するために混合物を含むチューブをアルミホイルで覆い、室温で30〜60分間インキュベートした。ブランクとしてマラカイトグリーン溶液を用いて、かつホスファターゼバックグラウンドとして基質を用いて、620 nmにおける吸光度を測定した。3回の異なるトランスフェクション又は感染におけるPTEN活性値を得た。その値から基質における活性値（バックグラウンド）を減算し、得られた値の平均値を得た。【０２１６】
7. 結果
各プラスミドをトランスフェクトした293T細胞における、PTENアッセイの結果を図１１に示す。細胞溶解物においては、CMV強力プロモーターを用いてPTEN遺伝子を転写するRegul.ベクターをトランスフェクトした細胞でPTEN活性が最も高かった。rNGFRプロモーターを用いてPTEN遺伝子を転写するRetro.ベクターのトランスフェクションでも同様にPTEN活性が高かった。hTERTプロモーターを用いてPTEN遺伝子を転写するLenti.ベクターのトランスフェクションでは、Regul.及びRetro.ベクターと比較してPTEN活性値は中程度であった。一方、mv溶解物においては、Lenti.ベクターのトランスフェクションにおいて、Regul.及びRetro.ベクターと比較して、PTEN活性が最も高かった。【０２１７】
図１１に示すmv溶解物におけるPTEN活性の、細胞溶解物におけるPTEN活性に対する比率を図１２に示す。Lenti.ベクターのトランスフェクションにおいて、mv溶解物におけるPTEN活性の比率が最も高かった（27.37％）。また、Lenti.ベクターと同じhTERTプロモーターを用いて遺伝子を転写する、PTEN遺伝子を有さないEmpt.ベクターのトランスフェクションにおけるmv溶解物において、Regul.及びRetro.ベクターよりかなり高いPTEN活性の比率を示したことは注目に値する。これらの結果から、Empt.ベクターのトランスフェクションは、宿主細胞の内因性PTENのmvへの封入を促進し、Lenti.ベクターのトランスフェクションは、内因性及び導入遺伝子産物PTENの両方のmvへの封入を促進し、mvの細胞外環境への放出を増強することが示された。【０２１８】
次いで、ウイルス粒子RBL0213Tを感染させた293T細胞、HeLa細胞及びCEM細胞におけるPTENアッセイの結果を図１３に示す。組換えレンチウイルス粒子RBL0213Tは、感染性であるか不活性化型（偽感染）であるかにかかわらず、細胞とインキュベートさせると、トランスフェクションの場合より細胞は多くのmvを放出した（図１３、mv溶解物）。一方、組換えレンチウイルス粒子RBL0213Tを感染又は偽感染させた細胞の細胞溶解物では、PTEN活性はトランスフェクションの場合とほぼ同程度であった（図１３、細胞溶解物）。但し、ウイルス粒子RBL0213Tを感染させたHeLa細胞溶解物においてはPTEN活性の上昇が見られた。以上のことから、組換えレンチウイルス粒子RBL0213Tの感染は、Lenti.ベクターpRBL0213Tのトランスフェクションと比較して、細胞溶解物中とは異なりmv溶解物中のPTEN活性を増加させる傾向があることが示された。さらに、レンチウイルス粒子の感染は、試験した細胞の中でヒト子宮頸癌HeLa細胞において、導入遺伝子産物PTENを封入するmvをより多く形成させ放出させることが示された（図１３、mv溶解物）。また、ウイルス粒子RBL0213Tの溶液についてPTENアッセイを行った結果、PTEN活性値は非常に小さく（OD620=0.065）、PTENはウイルス粒子にほとんど組み込まれないことが示された。【０２１９】
組換えレンチウイルスプラスミドベクターpRBL0213Tをトランスフェクトした293T細胞又は組換えレンチウイルス粒子RBL0213Tを感染若しくは偽感染した293T、CEM及びHeLa細胞の、mv溶解物におけるPTEN活性の、細胞溶解物におけるPTEN活性に対する比率を図１４に示す。感染（Infect.）及び偽感染（偽）では、偽感染におけるmv放出の非特異的刺激を相殺した値を示す。mv溶解物におけるPTEN活性の、細胞溶解物におけるPTEN活性に対する比率は、感染時に偽感染時より大きいことから、組換えレンチウイルス粒子RBL0213T感染は細胞からのmv放出を増強したことが示された。また、Lenti.ベクターをトランスフェクトした細胞におけるmv放出比率は27.37％であった（図１２）のに対し、組換えレンチウイルス粒子RBL0213Tに感染した細胞におけるmv放出比率は38.75％に達し（図１４）、組換えレンチウイルス粒子RBL0213T感染は、mv放出をさらに顕著に促進したことが示された。【０２２０】
以上の結果から、レンチウイルスRNA中にhTERTプロモーターを含む組換えレンチウイルスプラスミドベクターをトランスフェクトした細胞内では、大量の微小胞が生成され、導入遺伝子産物を担持する微小胞の放出が増強されることが示された。そのようなプラスミドを用いて作製されるレンチウイルス粒子に感染した細胞内では、微小胞放出がより強力に増強されることが示された。【０２２１】
［実施例８］
微小胞の調製
本発明の微小胞（mv）を以下の方法で調製した。【０２２２】
1. プラスミドDNAトランスフェクション又はウイルス感染
15 mlのDMEM/高グルコース（Hyclone, Utah, USA）完全培地（10％ウシ胎仔血清、100ユニット/mlペニシリン及び100 μg/mlストレプトマイシン（Hyclone, Utah, USA）を補充）をT75フラスコに加え、次いで、ヒト胎児腎臓293T細胞を播種した。293T細胞を37℃にて5％ CO2インキュベーター内で増殖させ、継代しながら10個のT75フラスコに増やした。293T細胞に以下のプラスミドDNAトランスフェクション又はウイルス感染を行った。【０２２３】
(A) プラスミドDNAトランスフェクション
以下を50 mlのチューブに加えた。【０２２４】
(a) 170 μgの実施例１に記載の組換えレンチウイルスプラスミドベクターpTHTN又はpRBL001を含有する500 μlのプラスミドDNA溶液、
(b) 1,650 μlのddH2O、
(c) 350 μlの2 M CaCl2
溶液を穏やかに混合し、次いで2,500 μlの2 x HEPBSを大きな沈殿の形成を回避するように穏やかに撹拌しながら滴下して加え、トランスフェクション混合物とした。このトランスフェクション混合物を入れたチューブを室温に20分間置いた。293T細胞を増殖させた10個のT75フラスコから培地を捨て、次いで12 mlの新鮮なDMEM/高グルコース完全培地を各フラスコに加えた。各フラスコに500 μlのトランスフェクション混合物をゆっくり加え、細胞を37℃にて5％ CO2インキュベーター内で8時間インキュベートした。【０２２５】
(B) ウイルス感染
293T細胞を、実施例２に記載されるように作製した偽型化組換えレンチウイルス粒子THTN又はTHTDと、37℃にて5％ CO2インキュベーター内で16時間共インキュベートすることによって感染させた（感染多重度0.3〜0.4）。【０２２６】
2. 細胞の培養及び培地の回収
培地を捨て、15 mlの新鮮なDMEM/高グルコース完全培地を各フラスコに加えた。細胞を37℃にて5％ CO2インキュベーター内で60時間インキュベートして、培地を回収した。【０２２７】
3. 精製
回収された培地を含有する50 mlチューブを3,000 rpm及び4℃にて5分間遠心分離した。このように遠心分離した培地上清を250 ml高速遠心管に移し、9,000 x g及び4℃にて60分間遠心分離した。得られた上清をVivaspin（登録商標）20(1,000 kDa 分子量カットオフ(mw. co.)) (Sartorius, NY, USA)を用いて限外ろ過し、5倍に濃縮した。得られた溶液にMMP溶液を加えて4℃にて一晩mvを沈殿させた。【０２２８】
mvを沈殿させた溶液を9,000 x g及び4℃にて30分間遠心分離してmvを含むペレットを形成させた。上清を捨て、ペレットを10 mlの1 x PBSに再懸濁してmvを含む溶液を得た。【０２２９】
一部の溶液中のmvをPEG化した（Croyle et al., J. Virol., 2004, Vol. 78, p. 912-921）。PEG化は、約10 mlのmvを含む溶液に対して0.4 mlのPEG化溶液（33 mg/mL mPEG-NHS（メトキシ化PEGスクシンイミジルカルボネートNHS, m.w. 10K (NANOCS, USA)）、30 mM HEPES-KOH, pH 7.5、500 mM NaCl）を添加し、室温にて回転プラットフォーム上で60分間インキュベートすることにより行った。【０２３０】
PEG化した又はPEG化していないmvを含む溶液を、Slide-A-Lyzerカセット(20 kDa mw. co.) (Thermo Scientific, IL, USA)を用いて4℃にて1 x PBSに対して透析し、2日間、24時間毎に1 x PBSを交換した。透析後のmv溶液を、AmiconUltra15 (100 kDa mw. co.) (Millipore, MA, USA)を用いて30倍に濃縮した。この濃縮したmv溶液を0.45μm孔径シリンジフィルターに通し、得られた調製物を-80℃にて保存した。【０２３１】
以上の方法により、組換えレンチウイルスプラスミドベクターpTHTN又は偽型化組換えレンチウイルス粒子THTNを用いて導入遺伝子産物であるSV40 large T抗原の部分断片を担持する微小胞Lenti-mv2010を調製した。さらに、組換えレンチウイルスプラスミドベクターpRBL001又は偽型化組換えレンチウイルス粒子THTDを用いて導入遺伝子産物であるCDC6 shRNAを担持する微小胞Lenti-mv2010/CDC6 shRNAを調製した。【０２３２】
［実施例９］
微小胞に含まれるタンパク質の検出
本実施例では微小胞に含まれるタンパク質を調べた。また、微小胞を介した物質の細胞への送達を調べた。【０２３３】
ヒト胎児腎臓293T細胞に、N末端をc-mycでタグ付加したヒトDNAフラップエンドヌクレアーゼ1（c-myc-FEN-1）を発現するプラスミド（pcDNA3.1骨格）をトランスフェクトして、c-mycタグ付加FEN-1を異所的に発現させた。FEN-1は、HIV-1 ウイルスゲノムDNAの成熟及び宿主ゲノムへの組み込みに重要な細胞性ヘルプ因子として機能することが示されている。実施例８に記載されるように作製された、ウイルス粒子THTN感染細胞に由来する微小胞Lenti-mv2010を、上記のc-myc-FEN-1発現プラスミドをトランスフェクトした293T細胞の一部、又はトランスフェクトしていない293T細胞と共インキュベートした。インキュベーションの60時間後に、細胞から核及び細胞質抽出物を調製した。また細胞培養培地を回収し、実施例８の「3. 精製」に記載の方法（但しPEG化を除く）によりmvを調製した。得られた核及び細胞質抽出物、並びにmvをウェスタンブロットにて解析した。【０２３４】
抗HIV-1 Vpu抗体を用いてVpuタンパク質を検出した結果を図１５Aに示す。Vpuタンパク質は、c-myc-FEN-1発現プラスミドをトランスフェクトした後にLenti-mv2010と共インキュベートした293T細胞の細胞質抽出物及びその細胞から放出されたmv中に検出された（図１５A、THTN）が、c-myc-FEN-1発現プラスミドをトランスフェクトしたがLenti-mv2010と共インキュベートしていない293T細胞では検出されなかった（図１５A、pcDNA3.1）。Vpuは、ビリオンの細胞膜へのテセリン（Tetherin）-又はCD317-介在性連結を抑制することによってHIV-1ビリオンの放出を増強するタンパク質である（Sauter et al., Cell, 2010, Vol. 141, p. 392-398）。このことから、組換えレンチウイルス粒子THTNを感染させた293T細胞に由来する微小胞Lenti-mv2010にはウイルスタンパク質Vpuが含まれること、微小胞を介して内容物が他の細胞へと送達されたこと、そしてその送達を受けた細胞から放出される微小胞中にもVpuタンパク質が含まれていたことが示された。【０２３５】
抗HIV-1逆転写酵素（RT）抗体を用いてRTタンパク質を検出した結果を図１５Bに示す。RTタンパク質は、組換えレンチウイルス粒子THTNを感染させた293T細胞に由来する微小胞Lenti-mv2010において検出された（図１５B、Lenti-mv2010）。しかし、RTタンパク質は、AT-2によって化学的に不活性化されたウイルス粒子THTNを偽感染させた293T細胞に由来するmv中に検出されなかった（図１５B、偽）。また、RTタンパク質は、c-myc-FEN-1発現プラスミドをトランスフェクトした後にLenti-mv2010とインキュベートした293T細胞の細胞質抽出物（図１５B、THTN-細胞質）及びこの細胞から調製したmv（図１５B、THTN-mv）において検出された。しかし、RTタンパク質は、c-myc-FEN-1発現プラスミドをトランスフェクトしたがLenti-mv2010と共インキュベートしていない293T細胞から調製したmv（図１５B、mv/pcDNA3.1）においても、未処理の293T細胞（図１５B、293T）においても検出されなかった。このことから、組換えレンチウイルス粒子THTNを感染させた293T細胞に由来する微小胞Lenti-mv2010にはウイルスタンパク質RTが含まれること、微小胞を介して内容物が他の細胞へと送達されたこと、そしてその送達を受けた細胞から放出される微小胞中にもRTタンパク質が含まれていたことが示された。【０２３６】
抗FEN-1抗体を用いて内在性FEN-1及び外来性FEN-1を検出した結果を図１５Cに示す。内在性FEN-1及び外来性FEN-1（すなわちc-myc-FEN-1）は、c-myc-FEN-1発現プラスミドをトランスフェクトした後にLenti-mv2010と共インキュベートした293T細胞から調製した核及び細胞質において検出され、その細胞から放出されたmvにおいて検出された（図１５C、THTN/FEN-1）。Lenti-mv2010と共インキュベートしたがc-myc-FEN-1発現プラスミドをトランスフェクトしていない293T細胞では、内因性FEN-1のみが核と細胞質、並びにその細胞から放出されたmvに検出された（図１５C、THTN）。このことから、細胞内因性タンパク質（FEN-1）及び外来性タンパク質（c-myc-FEN-1）の双方が微小胞に封入されることが示された。【０２３７】
以上の結果から、細胞内で、おそらくウイルスタンパク質Vpu及びエンドソーム輸送選別複合体（ESCRT）と呼ばれる細胞タンパク質輸送系の助力を受けて、微小胞、特にエキソソームにウイルスタンパク質並びに他の細胞内因性及び外来性タンパク質が封入されることが示された。また、微小胞に封入された内容物は他の細胞へ送達されることが示された。【０２３８】
［実施例１０］
微小胞を介した物質の送達
精製されたPEG化mvを介した物質の送達（遺伝子導入）を培養細胞において調べた。【０２３９】
細胞としてc-myc-FEN-1発現プラスミドをトランスフェクトした293T細胞を用いること以外は、実施例８に記載のTHTN感染による微小胞の調製方法に従って、c-myc-FEN-1が封入されたPEG化微小胞Lenti-mv2010/c-myc-FEN-1を調製した。Lenti-mv2010/c-myc-FEN-1を、共インキュベートすることによってヒト子宮頸癌HeLa細胞に導入した。共インキュベートしたHeLa細胞を、抗c-myc抗体を用いた間接免疫蛍光染色に供した。【０２４０】
結果を図１６に示す。図１６Aは抗c-myc抗体染色像を、図１６BはDAPI染色像を、図１６Cは両者を重ね合わせた像を示す。図１６Dはこの重ね合わせた像からPhotoshop（登録商標）（Adobe Systems Inc.）のイメージ「調整」法における色カーブプログラムによって作製した像を示す。図１６Dでは、赤色が濃くなるにつれc-myc-FEN-1レベルが増加し、黄緑色はc-myc-FEN-1が無いことを示す。図１６Dではc-myc-FEN-1を発現している赤色の細胞が多数見られたことから、Lenti-mv2010/c-myc-FEN-1と共インキュベートすることにより多くの細胞にc-myc-FEN1が送達されたことが示された。PEG化微小胞は、非常に安定で活性であるため多くの細胞内に取り込まれ、微小胞に封入された内容物を他の細胞に送達することができることが示された。【０２４１】
［実施例１１］
CDC6 shRNAを担持する微小胞による癌細胞増殖抑制
CDC6 shRNAを担持する微小胞（Lenti-mv2010/CDC6 shRNA）の癌細胞増殖抑制効果を試験した。【０２４２】
ヒト乳癌MCF7細胞、ヒト神経芽細胞腫LA-N-2細胞及び神経芽細胞腫KANR細胞を、実施例８に記載されるように調製したCDC6 shRNAを担持する微小胞Lenti-mv2010/CDC6 shRNAとインキュベートした。コントロールとしては、実施例８に記載されるように調製したSV40 large T抗原の部分断片を担持する微小胞Lenti-mv2010を用いた。次いで、MTT Cell Viability and Proliferation Assay Kit（ScienCell, USA）によって細胞の増殖を調べた。このアッセイでは、生細胞において還元された基質の吸光度を指標として、培養細胞の増殖を定量化する。【０２４３】
結果を図１７に示す。横軸には1細胞当たりのインキュベートしたmv数を示し、縦軸には得られた吸光度の値の、mvとインキュベートしなかった場合に得られた吸光度の値に対する比率（増殖インデックス）を示す。MCF7細胞及びLA-N-2細胞は、Lenti-mv2010/CDC6 shRNAとインキュベートすると増殖が顕著に阻害されたが、Lenti-mv2010（コントロール）とインキュベートしても増殖は阻害されなかった（図１７）。一方、KANR細胞は、Lenti-mv2010/CDC6 shRNAとインキュベートしても増殖が阻害されなかった。MCF7細胞及びLA-N-2細胞ではCDC6発現が上昇しているが、KANR細胞ではCDC6発現がほどんど検出されない。このことから、微小胞に含まれるCDC6 shRNAがCDC6をノックダウンさせ、癌細胞の増殖阻害をもたらしたことが示された。【０２４４】
以上の結果から、CDC6 shRNAを担持する微小胞は、CDC6を発現する癌細胞にCDC6 shRNAを送達し、その増殖を抑制できることが示された。【０２４５】
［実施例１２］
CDC6 shRNAを担持する微小胞による癌細胞増殖抑制の分子メカニズム
Lenti-mv2010/CDC6 shRNAによる癌細胞増殖抑制の分子メカニズムを調べた。高レベルのCDC6タンパク質は、ヒト癌における発癌活性と関連があり、CDC6と腫瘍抑制因子p16INK4aのタンパク質レベルには逆相関があることがわかっている（Gonzalez, S. et al., Nature, 2006, p. 702-706）。MCF7細胞における細胞周期進行はp16INK4aの存在下でも阻害されないが、このことは、癌細胞におけるp16INK4a-Rb経路の不活性化を示す。しかしp16INK4a-Rb経路は、Lenti-mv2010/CDC6 shRNAを介したCDC6ノックダウンによってMCF7癌細胞において再活性化される可能性がある。そこで、p16INK4a-Rb経路の再活性化を調べるため、非放射性免疫沈降キナーゼアッセイを行った。CDC6はCDK4キナーゼ複合体中に見いだされており、Rb-Cリン酸化に必要とされる。【０２４６】
MCF7細胞をLenti-mv2010/CDC6 shRNAとインキュベートすることによってCDC6が除去（ノックダウン）されると、Rb-Cリン酸化が阻害された。p16INK4aのCDK阻害活性は、CDC6をノックダウンさせると少なくとも25倍増加したが、このことからp16INK4a-Rb経路の再活性化が示された。【０２４７】
以上の結果から、CDC6 shRNAを担持する微小胞は、癌細胞内でCDC6をノックダウンし、p16INK4a-Rb経路を再活性化することにより癌細胞増殖抑制に機能することが示された。【０２４８】
［実施例１３］
ウェスタンブロット解析
本実施例では、PTENコード化ベクターをトランスフェクトした細胞のタンパク質抽出物と、その細胞を培養して得られた微小胞の抽出物中のPTENタンパク質をウェスタンブロット解析により検出した。ベクターとしては、実施例７及び図１０に記載したプラスミドベクターpGL3-1375、pcDNA3.1/CMV-hPTEN、pRBL016Bn及びpRBL0213T、並びに実施例２及び７に記載のレンチウイルス粒子ベクターRBL0213Tを用いた。【０２４９】
1.タンパク質抽出物の調製
およそ1 x 106個の293T細胞に対し、上記の各種プラスミドベクターをトランスフェクトした。トランスフェクションの60時間後、実施例７の「3. 細胞溶解物の調製」の記載に従って、細胞を回収し、ペレット化し、ホモジナイズし、上清を回収し細胞性タンパク質抽出物を調製した。【０２５０】
またトランスフェクションの60時間後の培地を回収し、実施例７の「4. mv溶解物の調製」の記載に従ってそこから微小胞溶解物を調製した。【０２５１】
さらにレンチウイルス粒子ベクターRBL0213Tを、実施例７の「2. ウイルス粒子RBL0213Tの感染」の記載に従い、およそ1 x 106個の293T細胞に、完全DMEM培地25 mL中、0.3のm.o.iで感染させた。60時間の感染後、実施例７の「3. 細胞溶解物の調製」の記載に従って、細胞性タンパク質抽出物を調製した。また60時間の感染後の培地を回収し、実施例７の「4. mv溶解物の調製」の記載に従ってそこから微小胞溶解物を調製した。【０２５２】
得られた細胞性タンパク質抽出物（タンパク質約20μg）又は微小胞溶解物（タンパク質約50μg）を、2 x SDSローディングバッファー（4% SDS、250 mM Tris-HCl、pH6.8、3％ βメルカプトエタノール、15％ グリセロール、0.05％ ブロモフェノールブルー）と混合し、沸騰水浴中で15分間インキュベートした。次いで、そのタンパク質サンプルを12％ SDS-PAGEゲル（PreciseTM Protein Gel）で、Thermo Scientific Owl Model P82 Minigel Protein Electrophoresis Systemを用いた電気泳動により分離した。電気泳動後、ゲルからタンパク質をPVDFメンブレンに転写し、マウス抗PTENモノクローナル抗体（一次抗体；クローン6H2.1, MilliPore）、続いてヤギ抗マウス二次抗体（1:5,000希釈、MilliPore）を用いてプローブし、PTENタンパク質を検出した。【０２５３】
その細胞性タンパク質抽出物（レーン1〜5）、及び微小胞溶解物（レーン6〜10）における検出結果を図１８に示す。レーン1及び6はpGL3-1375（Empt.）をトランスフェクトした細胞を示す。レーン2及び7はpcDNA3.1/CMV-hPTEN（Regul.）をトランスフェクトした細胞を示す。レーン3及び8はpRBL016Bn（Retro.）をトランスフェクトした細胞を示す。レーン4及び9はpRBL0213T（Lenti.）をトランスフェクトした細胞を示す。レーン5及び10はRBL0213Tに感染した細胞を示す。【０２５４】
内因性PTENが検出され（レーン1及び6）、また細胞性タンパク質抽出物（レーン2〜5）及び微小胞溶解物（レーン7〜10）中で導入遺伝子産物PTENが検出された。この結果は、導入遺伝子産物PTENが生成され、微小胞中に封入され、その微小胞（遺伝子工学的に作製された微小胞）が細胞から放出されたことを示している。【０２５５】
Regul.、Retro.、又はLenti.をトランスフェクトした細胞から調製した導入遺伝子産物PTENのレベル（レーン2〜4）は、Empt.でトランスフェクトした細胞から調製したもの（レーン1）と比べて2〜3倍増加していた。さらに、RBL0213Tレンチウイルスベクターに感染した細胞から調製した導入遺伝子産物PTENのレベル（レーン5）は内因性PTENのレベル（レーン1）をはるかに上回っていた。【０２５６】
またRBL0213Tレンチウイルスベクター感染細胞を用いて調製した微小胞溶解物中の導入遺伝子産物PTENのレベル（レーン10）は、Empt.、Regul.、Retro、Lenti.をトランスフェクトした細胞から調製した微小胞溶解物中の導入遺伝子産物PTENのレベル（レーン7〜9）と比較して明確に増加していた。これは、本発明に係るウイルス粒子様レンチウイルスベクターによる感染が、導入遺伝子産物を有する微小胞の生成及び放出の促進により適していることを示している。【０２５７】
［実施例１４］
遺伝子工学的に作製された微小胞の腫瘍増殖抑制効果
本実施例では、腫瘍抑制遺伝子産物を担持する遺伝子工学的に作製した微小胞（ここではCytomoxとも称する）を腫瘍内に直接注入することにより、その微小胞の腫瘍増殖抑制効果を調べた。【０２５８】
1. 試験サンプルの調製
以下の試験サンプルを腫瘍内注入に用いた。【０２５９】
i) Cytomox HD（emvp 130001）
実施例７の「4. mv溶解物の調製」及び実施例８に基づき、ヒト胎児腎臓293T細胞をレンチウイルスベクターpRBL001及びpRBL0203の両方によりトランスフェクトし、培養した細胞を沈殿させて培地を回収し、微小胞を調製し、これをCytomox HDと称した。レンチウイルスベクターpRBL001については実施例１に記載されており、ここではCDC6 shRNAを生成するためのベクターとして用いた。レンチウイルスベクターpRBL0203は、pTHTK骨格中のhTERTプロモーターの制御下にヒトp16INK4a遺伝子を挿入したプラスミドであり、実施例１と同様にして作製した。具体的には、p16INK4a cDNAを有するプラスミド構築物であるpCMV p16INK4a（Plasmid 10916; 配列番号２５；Medema et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., (1995) 92(14):6289-6293）をEcoR IとXho Iで切断し、得られた断片（約0.45 kbのp16 cDNA)を、pGL3-1375由来の1.5 kb hTERTプロモーターをMlu I-BamH I部位にクローン化したpEND-HTPlのHind III-Xho I部位に、サブクローニングした。hTERTプロモーター及びその下流のp16INK4a cDNAを含むDNA断片をMlu I及びXho Iで切断し、その2.0 kb断片をpTHTK骨格に挿入してベクターpRBL0203を作製した。【０２６０】
ii) Cytomox p53（emvp 130003）
実施例８に基づき、ヒト胎児腎臓293T細胞をベクターpGLQ-p53EXによりトランスフェクトし、培養した細胞を沈殿させて培地を回収し、微小胞を調製した。ベクターpGLQ-p53EXは、ヒトp53遺伝子（配列番号２６；GenBankアクセッション番号BC003596のCDS）を含むプラスミド発現ベクターである。具体的には、約2.0 kbのヒトp53腫瘍抑制因子cDNAを有するサブクローンベクターpBS-TP53PU（p53 cDNAを有するプラスミドpBSH19由来）をHind IIIによりその3'末端で直鎖化した。生じたHind III部位を平滑化し、次いでベクターのSal I消化を行った。その骨格を精製し、pGL3-378から単離した約0.3 kbのDNA断片（平滑化Xba I末端及びSal I末端を有する）とライゲーションして、pBS-TP53PAを形成した。p53 cDNA断片をpBS-TP53PAからStu I及びSal Iで切断し、pGL3-378ベクターの平滑化Xba I-Sal I部位に挿入し、pGLQ-3UTRを形成した。  約1.4 kbのp53 cDNA（ヒトp53遺伝子のコード領域全体を含む）を別のサブクローンベクターpUTK-p53TTからHind III及びXho Iで切断し、pGLQ-3UTRに挿入し、pGLQ-p53EXを作製した。【０２６１】
iii) Cytomox PTEN（emvp 130006）
実施例７の「4. mv溶解物の調製」及び実施例８に基づき、ヒト胎児腎臓293T細胞をレンチウイルスベクターpRBL0213Tによりトランスフェクトし、培養した細胞を沈殿させて培地を回収し、微小胞を調製し、これをCytomox PTENと名付けた。レンチウイルスベクターpRBL0213Tについては実施例１に記載されており、ここではヒトPTENタンパク質を生成するためのベクターとして用いた。【０２６２】
iv) Cytomox EX（T 130075）
実施例２に記載したようにして、プラスミドpRBL001及びpRBL0203により組換えレンチウイルス粒子RBL001及びRBL0203を作製した。実施例７の「4. mv溶解物の調製」及び実施例８に基づき、このレンチウイルス粒子をヒト胎児腎臓293T細胞に感染させ、感染細胞を沈殿させて培地を回収し、微小胞を調製した。具体的には、細胞に、実施例８に記載のようにしてレンチウイルスベクターRBL001及びRBL0203の両方をトランスフェクトし、感染の60時間後、培地を回収し遠心分離により細胞片を除去した。培地を9,000 g、4℃で60分間高速遠心にかけた。微小胞を精製するため実施例８に記載のようにして上清を回収し、微量のペレットを1x PBSに再懸濁し、透析にかけ、その後Amicon Ultra 15（100 kDa mw. co.）（Millipore）で濃縮した。得られた調製物（微小胞）をCytomox EXと称した。【０２６３】
v) 組換えインターフェロンα-2b（陽性対照）
組換えインターフェロンα-2b（Schering-Plough (Brinny) Co., Ireland）を陽性対照として用いた。【０２６４】
2. 動物
BALB/c-nuマウス（雌；全80匹；SPFグレード；各14〜16グラム）を中国医学科学院実験動物センター（Laboratory Animal Center of Chinese Academy of Medical Sciences）から購入して用いた。【０２６５】
マウスは全て、排気換気システムを備えた動物室で繁殖用に維持された。動物施設の温度は約40〜60％の相対湿度で20〜25℃（±<3℃）に維持した。動物施設はおよそグレード100の清浄空気流量とし、毎日12時間照明点灯し、作業エリアはおよそ150〜300 LX、動物ケージエリアでは100〜200 LXとした。アンモニア濃度を14 mg/m3未満とし、騒音は60dB未満とした。マウスには毎日新たに餌及び飲用水（脱イオン化及び限外濾過したもの）を与えた。【０２６６】
3. 腫瘍移植
BALB/c-nuマウスにヒト乳癌由来Bcap-37株細胞を移植し、Bcap-37腫瘍担持宿主動物を作製した。無菌条件下のバイオセーフティーキャビネットで、その腫瘍担持宿主動物からBcap-37腫瘍を切り出し、腫瘍組織を1x PBSですすいだ。腫瘍崩壊せず良好に増殖した腫瘍域を回収し、メスで2mm3の小片ブロックに切断した。腫瘍ブロックを1x PBSですすぎ、管状針で各マウスの右腋窩の皮膚下に１つずつ移植した。全部で8群（各群10匹）を用意した。腫瘍移植の11日後、腫瘍は110〜120 mm3のサイズに増殖した。【０２６７】
4. 微小胞（Cytomox）の注入
増殖した腫瘍を有する上記マウスに微小胞を注入した。微小胞の腫瘍内注入は、単離した微小胞を含む注射液を用いて各マウスの腫瘍に一週間に２回、３週間にわたって行った。すなわち注射は合計６回行った。【０２６８】
Cytomox HD及びCytomox EXの両方について、最初の３回の注入はより少ない投与量である10.0〜30.0μgタンパク質／kg体重で実施し、その後の３回の注入はより多い投与量である1.0〜3.0mgタンパク質/kg体重で実施した。Cytomox HDを10.0 μgタンパク質/kg体重及びその後1.0 mgタンパク質/kg体重で注入した群をここでは低用量Cytomox HD注入群と称する。Cytomox HDを30.0 μgタンパク質/kg体重及びその後3.0 mgタンパク質/kg体重で注入した群をここでは高用量Cytomox HD注入群と称する。またCytomox EXを同様に注入した他の2つの群をここではそれぞれ低用量Cytomox EX注入群及び高用量Cytomox EX注入群と称する。Cytomox p53及びCytomox PTENについては、最初の３回の注入は10.0μgタンパク質/kg体重、その後の３回の注入は投与量を増加させて1.0mgタンパク質/kg体重で実施した（Cytomox p53注入群及びCytomox PTEN注入群）。陽性対照として、組換えインターフェロンα-2bを250 x 104 IU/kg体重で、マウスの腫瘍内に一週間に２回、三週間にわたり注入した（陽性対照群）。陰性対照として、1 x PBSを腫瘍担持マウスの腫瘍に一週間に２回、三週間にわたり注入した（陰性対照群）。各群の動物は最終投与の48時間後に頸椎脱臼により安楽死させた。死んだマウスから腫瘍を回収し、病理検査のために固定化し処理した。【０２６９】
この結果、この試験では高用量投与の間でさえ試験動物に対する急性毒性効果はなく、動物が遺伝子工学的に作製された微小胞（Cytomox）の注入によって死ぬことはなかった。【０２７０】
5. 体重、並びに腫瘍重量及び腫瘍サイズの測定
マウスの体重を、試験サンプル注入前（腫瘍を含む体重）及び安楽死前に測定した。さらに死亡したマウスの体から腫瘍を取り出した後の体重（正味体重）も測定した。取り出した腫瘍の重量を測定した。【０２７１】
腫瘍重量の測定値に基づき、腫瘍増殖抑制効率を以下のように算出した。【０２７２】
腫瘍増殖抑制効率(I)(％) ＝ [1-(T)／(C)] x 100
T: 各試験サンプル（Cytomox又は陽性対照）を注入した各群での平均腫瘍重量（g）
C: 陰性対照群の平均腫瘍重量（g）
算出された腫瘍増殖抑制効率を表１に示す。
【表１】
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【０２７３】
表１に示すように、組換えインターフェロンα-2bの直接腫瘍病巣注入は、16.06％の腫瘍増殖抑制を引き起こした。Cytomox HDの腫瘍内注入は、腫瘍増殖を高用量（3 mg/回/kg体重）で18.37％抑制し、一方、低用量（1 mg/回/kg体重）では14.67％抑制した。すなわち、腫瘍増殖抑制効果の用量依存的増強が認められた。同様に、Cytomox EXの腫瘍内注入は、腫瘍増殖を高用量（3 mg/回/kg体重）で21.32％抑制し、一方、低用量（1 mg/回/kg体重）で2.83％抑制したことから、やはり腫瘍増殖抑制効果の用量依存的増強が認められた。Cytomoxp53又はCytomox PTENの腫瘍内注入も、腫瘍増殖の抑制をもたらした。これらの結果は、遺伝子工学的に作製された微小胞が、細胞に侵入でき、その導入遺伝子産物の機能が腫瘍細胞に伝達されることを示している。【０２７４】
さらに、試験サンプル注入後、マウスの各腫瘍の長さ及び幅の測定を一週間に２回行った。測定は標準的なキャリパーを用いて行った。測定値に基づき、以下のように腫瘍体積を算出した。【０２７５】
腫瘍体積（mm3）＝（腫瘍の長さ x 腫瘍の幅）２／２
試験サンプル注入の４日後（腫瘍移植の15日後）以降、高用量Cytomox HD注入群、高用量Cytomox EX注入群、及びCytomox PTEN注入群では、陰性対照群と比較して腫瘍体積の増加が測定最終日（腫瘍移植の31日後かつ試験サンプル注入の20日後）まで持続的に抑制された。Cytomox p53注入群でも、試験サンプル注入の12日後以降は腫瘍体積の増加が大幅に抑制された。特に高用量Cytomox HD注入群と高用量Cytomox EX注入群では、陰性対照群と比較した腫瘍体積の差が時間と共に大きくなった。腫瘍移植の31日後（測定最終日）には、腫瘍体積は陰性対照（PBS）で1,250 mm3、インターフェロン-α 2bで約1,000 mm3、Cytomox HD（evmp 130001、高用量）で約950 mm3、Cytomox p53（evmp 130003、高用量）で約1,000 mm3、Cytomox PTEN（evmp 130006、高用量）で約1,100 mm3、及びCytomox EX（T130075、高用量）で約1,000 mm3であった。【０２７６】
6. 腫瘍の病理形態学的評価
取り出した腫瘍を病理検査に供し、その形態を評価した。評価は以下の基準で行った。【０２７７】
「-」：腫瘍病巣の中央域において壊死があるが、線維化はない。【０２７８】
「+」：腫瘍組織における炎症の程度が低く、線維化グレードは低い。【０２７９】
「++」：腫瘍組織における炎症及び崩壊が認められ、線維化が至る所で認められる。【０２８０】
「+++」：腫瘍組織の崩壊による顕著な炎症と最高グレードの線維化が至る所で認められる。【０２８１】
結果を表２に示す。
【表２】
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【０２８２】
表２に示すように、腫瘍抑制遺伝子産物を担持する微小胞の腫瘍病巣への投与は、陰性対照とは異なり、腫瘍組織の崩壊を高頻度で引き起こし、腫瘍における炎症及び線維化を促進した。特に、高用量のCytomox HD又はCytomox EXの腫瘍病巣への注入は、腫瘍塊の中央域における血管形成の欠如による腫瘍壊死とは異なる、腫瘍組織のより高度な炎症及び崩壊と広範囲な線維化をもたらした。崩壊した腫瘍組織が線維化し腫瘍の拡張を阻止したと考えられた。【０２８３】
各群の腫瘍について病理検査で観察された典型的形態を図１９及び２０に示す。【０２８４】
7. 腫瘍のウェスタンブロット解析
Cytomox PTEN注入群及び陰性対照群より取り出した腫瘍から常法によりタンパク質を抽出し、実施例１３の記載に従ってウェスタンブロット解析によりPTENタンパク質を検出した。その結果、陰性対照群の腫瘍（微小胞非注入腫瘍組織）及び微小胞注入群の腫瘍（微小胞注入腫瘍組織）の両方でPTENが検出されたが、微小胞注入腫瘍組織におけるPTENのレベルは、微小胞非注入腫瘍組織と比較して２倍高かった。この結果は、微小胞による細胞侵入及び導入遺伝子／導入遺伝子産物の送達の効率が十分に高いことを示す。さらに、この結果から示されるように、Cytomox PTENを注入された腫瘍細胞におけるPTENレベルの増加に伴って、腫瘍の増殖が抑制された（表１中の9.13％の抑制を参照のこと）。
【産業上の利用可能性】
【０２８５】
本発明は、遺伝子工学的に作製される微小胞の効率的な作製のために有用である。本発明に係る微小胞は、細胞への生物学的物質の送達のために用いることができる。【０２８６】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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