(57)【要約】【課題】細胞膜を介したイオン又は分子の移動の分析に適した細胞分析システム、細胞分析プログラム及び細胞分析方法提供すること。【解決手段】本技術に係る細胞分析システムは、動き情報抽出部と、動き特性算出部とを具備する。動き情報抽出部は、細胞を経時的に撮像した細胞画像から、細胞膜を介したイオン又は分子の移動に起因する動き情報を抽出する。動き特性算出部は、動き情報の動き特性を算出する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を経時的に撮像した細胞画像から、細胞膜を介したイオン又は分子の移動に起因する動き情報を抽出する動き情報抽出部と、
前記動き情報の動き特性を算出する動き特性算出部と
を具備する細胞分析システム。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞分析システムであって、
前記動き特性と前記細胞画像を重畳させ、動き特性表示画像を生成する画像生成部
をさらに具備する細胞分析システム。
【請求項３】
請求項１に記載の細胞分析システムであって、
前記動き特性に基づいて、細胞膜を介したイオン又は分子の移動を評価する評価部
をさらに具備する細胞分析システム。
【請求項４】
請求項３に記載の細胞分析システムであって、
前記動き特性算出部は、前記動き特性として動き量を算出し、
前記評価部は、前記動き量に基づいてイオン又は分子の移動量を評価する
細胞分析システム。
【請求項５】
請求項３に記載の細胞分析システムであって、
前記動き特性算出部は、前記動き特性として動き量を算出し、
前記評価部は、前記動き量に基づいてイオンチャネル又はイオンチャネル型受容体の活性を評価する
細胞分析システム。
【請求項６】
請求項３に記載の細胞分析システムであって、
前記動き特性算出部は、前記動き特性としてイオンチャネル又はイオンチャネル型受容体の活性化剤又は阻害剤の投与前後における動き変化を算出し、
前記評価部は、前記動き変化に基づいてイオンチャネル又はイオンチャネル型受容体の有無又は存在量を評価する
細胞分析システム。
【請求項７】
請求項３に記載の細胞分析システムであって、
前記動き特性算出部は、前記動き特性としてイオンチャネル型受容体の阻害剤の投与前後における動き変化を算出し、
前記評価部は、前記動き変化に基づいて細胞間で形成されているシナプスの種類又は強さを評価する
細胞分析システム。
【請求項８】
請求項３に記載の細胞分析システムであって、
前記動き特性算出部は、前記動き特性として動き量を算出し、
前記評価部は、前記動き量に基づいてイオンチャネル又はイオンチャネル型受容体に作用する物質の種類又は効果の強さを評価する
細胞分析システム。
【請求項９】
請求項３に記載の細胞分析システムであって、
前記動き特性算出部は、前記動き特性として動き量を算出し、
前記評価部は、前記動き量に基づいて細胞膜を介したイオンの移動又はそれに伴なう水の移動による細胞膜の動き、膨張、収縮及び振動を評価する
細胞分析システム。
【請求項１０】
請求項３に記載の細胞分析システムであって、
前記動き特性算出部は、前記動き特性として動き方向を算出し、
前記動き特性算出部は、前記動き方向に基づいて細胞膜を介したイオン又は分子の流れの方向を評価する
細胞分析システム。
【請求項１１】
請求項３に記載の細胞分析システムであって、
前記動き特性算出部は、前記動き特性として動きの継続時間又は空間的分布を算出し、
前記評価部は、前記動きの継続時間又は空間的分布に基づいて細胞膜を介したイオン又は分子の移動時間又は空間的分布を評価する
細胞分析システム。
【請求項１２】
請求項１に記載の細胞分析システムであって、
前記細胞画像において、前記細胞画像の輝度差分を利用して抽出範囲を指定する範囲指定部をさらに具備し、
前記動き情報抽出部は、前記抽出範囲から前記動き情報を抽出する
細胞分析システム。
【請求項１３】
細胞を経時的に撮像した細胞画像から、細胞膜を介したイオン又は分子の移動に起因する動き情報を抽出する動き情報抽出部と、
前記動き情報の動き特性を算出する動き特性算出部と
として情報処理装置を動作させる細胞分析プログラム。
【請求項１４】
動き情報抽出部が、細胞を経時的に撮像した細胞画像から、細胞膜を介したイオン又は分子の移動に起因する動き情報を抽出し、
動き特性算出部が、前記動き情報の動き特性を算出する
細胞分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、細胞膜を介したイオン又は分子の移動の分析に適した細胞分析システム、細胞分析プログラム及び細胞分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜を通しての分子やイオンの移動（以下、細胞膜間イオン輸送）は、細胞機能にとって重要な膜電位の形成や変動に関わる。細胞膜間イオン輸送は、細胞膜が備えるイオンポンプやイオンチャネル等の特定の分子（タンパク質）によって行われる。イオンポンプは、エネルギーを消費してイオンの移動を行う分子であり、イオンチャネルは膜電位や特定の分子の結合により開閉し、細胞内外の濃度差に応じたイオン移動を行う。【０００３】
細胞膜間イオン輸送は細胞機能にとって非常に重要であり、これを把握することができれば、各種の応用が可能である。例えばイオンチャネルは創薬のターゲットとしても重要である。細胞膜間イオン輸送の評価は従来、パッチクランプを用いた方法（例えば特許文献１参照）や細胞外電場を測定する方法（例えば特許文献２参照）が一般的である。また、蛍光染色を用いて細胞内のイオン濃度を計測する方法（例えば特許文献３、４参照）も利用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−１８４２０７号公報
【特許文献２】特表２００８−５３８２８７号公報
【特許文献３】特表２００６−５２６３８９号公報
【特許文献４】特表２００３−５２７１１３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、パッチクランプや細胞外電場を利用する方法では、細胞膜において測定用の電極が接触している領域に存在するイオンチャネル等によるイオンの移動しか評価することができない。このため、空間分解能は電極のサイズや電極数に依存することになり、電極サイズが大きく、電極数が少ない場合には空間分解能が低く、一方で電極数が多い場合には複雑な装置構成が必要となる。【０００６】
また、蛍光染色を用いる方法では、蛍光物質の導入によるアーチファクト(人的要因によるノイズ）や蛍光の退色が問題となる。このように、従来の測定方法においては、細胞膜間イオン輸送を非染色かつ高分解能で測定することが困難であった。【０００７】
以上のような事情に鑑み、本技術の目的は、細胞膜を介したイオン又は分子の移動の分析に適した細胞分析システム、細胞分析プログラム及び細胞分析方法提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するため、本技術の一形態に係る細胞分析システムは、動き情報抽出部と、動き特性算出部とを具備する。
上記動き情報抽出部は、細胞を経時的に撮像した細胞画像から、細胞膜を介したイオン又は分子の移動に起因する動き情報を抽出する。
上記動き特性算出部は、上記動き情報の動き特性を算出する。【０００９】
上記目的を達成するため、本技術の一形態に係る細胞分析プログラムは、動き情報抽出部と、動き特性算出部ととして情報処理装置を動作させる。
上記動き情報抽出部は、細胞を経時的に撮像した細胞画像から、細胞膜を介したイオン又は分子の移動に起因する動き情報を抽出する。
上記動き特性算出部は、上記動き情報の動き特性を算出する。【００１０】
上記目的を達成するため、本技術の一形態に係る細胞分析方法は、上記動き情報抽出部が、細胞を経時的に撮像した細胞画像から、細胞膜を介したイオン又は分子の移動に起因する動き情報を抽出する。
動き特性算出部が、上記動き情報の動き特性を算出する。
【発明の効果】
【００１１】
以上のように、本技術によれば、細胞膜を介したイオン又は分子の移動の分析に適した細胞分析システム、細胞分析プログラム及び細胞分析方法提供することが可能である。
なお、ここに記載された効果は必ずしも限定されるものではなく、本開示中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本技術の実施形態に係る細胞分析システムの構成を示す模式図である。
【図２】同細胞分析システムの画像取得部が取得する細胞画像の例である。
【図３】同細胞分析システムの抽出範囲指定部が指定する抽出範囲の例である。
【図４】細胞膜を介したイオン又は分子の移動を示す模式図である。
【図５】同細胞分析システムの動き特性算出部が算出する動き特性の例である。
【図６】本技術の実施例１に係る、ｉＰＳ由来神経細胞へのＮａ＋チャネル阻害剤投与後の動き量の変化を表すグラフである。
【図７】本技術の実施例１に係る、ｉＰＳ由来神経細胞へのＫ＋チャネル阻害剤投与後の動き量の変化を表すグラフである。
【図８】。本技術の実施例１に係る、ｉＰＳ由来神経細胞へのＣａ２＋チャネル阻害剤投与後の動き量の変化を表すグラフである。
【図９】本技術の実施例２に係る、ｉＰＳ由来神経細胞へのＧＡＢＡレセプター阻害剤投与後の動き量の変化を表すグラフである。
【図１０】本技術の実施例２に係る、ｉＰＳ由来神経細胞へのＧｌｕレセプター阻害剤投与後の動き量の変化を表すグラフである。
【図１１】本技術の実施例２に係る、ラット大脳皮質神経細胞へのＧＡＢＡレセプター阻害剤投与後の動き量の変化を表すグラフである。
【図１２】本技術の実施例２に係る、ラット大脳皮質神経細胞へのＧｌｕレセプター阻害剤投与後の動き量の変化を表すグラフである。
【図１３】本技術の実施例２に係る、ラット大脳皮質神経細胞へのＧｌｕレセプター阻害剤投与後の個々の細胞についての動き量の変化を表すグラフである。
【図１４】本技術の実施例３に係る、ラット大脳皮質神経細胞における浸透圧による動き量の変化を表すグラフである。
【図１５】本技術の実施例３に係る、ラット大脳皮質神経細胞へのアクアポリン阻害剤投与後の動き量の変化を表すグラフである。
【図１６】本技術の実施例４に係る、動き量と細胞外電場の測定結果を表すグラフである。
【図１７】本技術の実施例４に係る、動き量と細胞外電場の相関を表すグラフである。
【図１８】本技術の実施例５に係る、細胞培養液におけるＮａ＋イオンの有無による動き量の相違を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本技術の一実施形態に係る細胞分析システムは、動き情報抽出部と、動き特性算出部とを具備する。
上記動き情報抽出部は、細胞を経時的に撮像した細胞画像から、細胞膜を介したイオン又は分子の移動に起因する動き情報を抽出する。
上記動き特性算出部は、上記動き情報の動き特性を算出する。
【００１４】
イオン又は分子の細胞内への流入あるいは細胞外への流出によって、細胞膜が観測可能な程度に動くため、細胞画像から抽出される動き情報にはイオン又は分子の移動に起因する情報が含まれている。したがって、動き情報の特性である動き特性に基づいて細胞膜を介したイオン又は分子の移動（以下、細胞膜間イオン輸送）を評価することが可能である。上記構成によれば、細胞に対して染色を施す必要がなく、染色剤による細胞への影響を防止することが可能である。さらに、上記細胞分析システムは、細胞画像に対する画像処理によって細胞膜間イオン輸送を評価することができるため、広い領域に対して高分解能での分析が可能である。
【００１５】
上記細胞分析システムは、
上記動き特性と上記細胞画像を重畳させ、動き特性表示画像を生成する画像生成部
をさらに具備してもよい。
【００１６】
この構成によれば、細胞分析システムはユーザに、視覚的に把握しやすい形で動き特性を表示することができ、ユーザは、動き特性表示画像を参照して、細胞膜を介したイオン又は分子の移動を評価することが可能となる。
【００１７】
上記細胞分析システムは、
上記動き特性に基づいて、細胞膜を介したイオン又は分子の移動を評価する評価部
をさらに具備してもよい。
【００１８】
上述のように、動き情報にはイオン又は分子の移動に起因する情報が含まれているため、評価部は、動き特性に基づいて細胞膜を介したイオン又は分子の移動を評価することが可能である。
【００１９】
上記動き特性算出部は、上記動き特性として動き量を算出し、
上記評価部は、上記動き量に基づいてイオン又は分子の移動量を評価してもよい。
【００２０】
動き量は、イオン又は分子の細胞内への流入量又は細胞外への流出量によって増減する。このため、動き量に基づいてイオン又は分子の移動量を評価することが可能となる。
【００２１】
上記動き特性算出部は、上記動き特性として動き量を算出し、
上記評価部は、上記動き量に基づいてイオンチャネル又はイオンチャネル型受容体の活性を評価してもよい。
【００２２】
動き量は、イオン又は分子の細胞内への流入量又は細胞外への流出量によって増減するため、動き量に基づいてイオン又は分子を通過させるイオンチャネル又はイオンチャネル型受容体の活性を評価することが可能となる。
【００２３】
上記動き特性算出部は、上記動き特性としてイオンチャネル又はイオンチャネル型受容体の活性化剤又は阻害剤の投与前後における動き変化を算出し、
上記評価部は、上記動き変化に基づいてイオンチャネル又はイオンチャネル型受容体の有無又は存在量を評価してもよい。
【００２４】
細胞にイオンチャネル又はイオンチャネル型受容体の活性化剤又は阻害剤を投与すると、イオンチャネル又はイオンチャネル型受容体が抑制され、あるいは活性化される。これにより、イオン又は分子の細胞内への流入量又は細胞外への流出量が変動するため、細胞膜の動きが変化する。したがって、動き変化に基づいてイオンチャネル又はイオンチャネル型受容体の有無又は存在量を評価することが可能となる。
【００２５】
上記動き特性算出部は、上記動き特性としてイオンチャネル型受容体の阻害剤の投与前後における動き変化を算出し、
上記評価部は、上記動き変化に基づいて細胞間で形成されているシナプスの種類又は強さを評価してもよい。
【００２６】
細胞間で形成されるシナプス(細胞間結合）は、特定の化学物質（神経伝達物質）を利用して接続されている細胞を刺激し、信号を伝達する。したがって、特定の神経伝達物質の受容体に対する阻害剤の投与によって神経伝達物質の細胞膜を介した移動が抑制されれば、その神経伝達物質を利用するシナプスが形成されていると評価することができる。神経伝達物質の細胞膜を介した移動は細胞膜の動きに反映されるため、阻害剤の投与前後の動き変化から、シナプスの種類又は強さを評価することが可能となる。
【００２７】
上記動き特性算出部は、上記動き特性として動き量を算出し、
上記評価部は、上記動き量に基づいてイオンチャネル又はイオンチャネル型受容体に作用する物質の種類又は効果の強さを評価してもよい。
【００２８】
上述のように、イオンチャネル又はイオンチャネル型受容体を介したイオンの移動は動き量に基づいて評価することができる。したがって、特定の物質を細胞に投与した際の動き量に基づいて、イオンチャネル又はイオンチャネル型受容体に作用する物質の種類又は効果の強さを評価することが可能となる。
【００２９】
上記動き特性算出部は、上記動き特性として動き量を算出し、
上記評価部は、上記動き量に基づいて細胞膜を介したイオンの移動又はそれに伴なう水の移動による細胞膜の動き、膨張、収縮及び振動を評価してもよい。
【００３０】
細胞内にイオン又は水が流入すると細胞膜が膨張し、細胞外にイオン又は水が流出すると細胞膜が収縮する。また、イオン又は水の流出入が短時間で繰返されることにより、細胞膜が振動する。これらの細胞膜の動きは動き量に反映されるため、動き量にもとづいてイオン又は水の移動による細胞膜の動き、膨張、収縮及び振動を評価することが可能となる。
【００３１】
上記動き特性算出部は、動き特性として動き方向を算出し、
上記動き特性算出部は、上記動き方向に基づいて細胞膜を介したイオン又は分子の流れの方向を評価してもよい。
【００３２】
細胞画像における動き情報は動きの方向を情報を有しているため、特定の動き方向についての動き量から、イオン又は分子が細胞内へ流入しているか細胞外へ流出しているかを評価することが可能となる。
【００３３】
上記動き特性算出部は、動き特性として動きの継続時間又は空間的分布を算出し、
上記評価部は、上記動きの継続時間又は空間的分布に基づいて細胞膜を介したイオン又は分子の移動時間又は空間的分布を評価してもよい。
【００３４】
上述のようにイオン又は分子の細胞膜を介した移動によって細胞画像における動きが生じるため、動きの継続時間は、イオン又は分子の移動時間とみなすことが可能であり、動きの空間的分布からイオン又は分子の空間的分布を推定することが可能となる。
【００３５】
上記細胞分析システムは、
上記細胞画像において、上記細胞画像の輝度差分を利用して抽出範囲を指定する範囲指定部をさらに具備し、
上記動き情報抽出部は、上記抽出範囲から上記動き情報を抽出してもよい。
【００３６】
細胞画像に含まれる細胞が神経細胞である場合、神経細胞の細胞体と神経突起は輝度が大きく異なるため、輝度差分を利用して細胞体を検出し、抽出範囲とすることが可能である。このため、上記構成によれば細胞体のみを抽出範囲として動き特性を算出し、評価に利用することが可能となる。
【００３７】
本技術の一実施形態に係る細胞分析プログラムは、動き情報抽出部と、動き特性算出部ととして情報処理装置を動作させる。
上記動き情報抽出部は、細胞を経時的に撮像した細胞画像から、細胞膜を介したイオン又は分子の移動に起因する動き情報を抽出する。
上記動き特性算出部は、上記動き情報の動き特性を算出する。
【００３８】
本技術の一実施形態に係る細胞分析方法は、上記動き情報抽出部が、細胞を経時的に撮像した細胞画像から、細胞膜を介したイオン又は分子の移動に起因する動き情報を抽出する。
動き特性算出部が、上記動き情報の動き特性を算出する。
【００３９】
本実施形態に係る細胞分析システムについて説明する。
【００４０】
[細胞分析システムの構成]
図１は、本実施形態に係る細胞分析システム１００を示す模式図である。同図に示すように細胞分析システムは、画像取得部１０１、範囲指定部１０２、動き情報抽出部１０３、動き特性算出部１０４、評価部１０５及び画像生成部１０６を有する。これらの各構成は、情報処理装置によって実現されている機能的構成である。
【００４１】
画像取得部１０１は、「細胞画像」を取得する。細胞画像は、分析対象の細胞や細胞群を経時的に撮像した画像であり、動画や連続的に撮像された複数の静止画であるものとすることができる。撮像速度は例えば１〜３０ｆｐｓ（フレーム／ｓ）とすることができる。具体的には、細胞画像は、明視野撮像、暗視野撮像、位相差撮像、蛍光撮像、共焦点撮像、多光子励起蛍光撮像、吸収光撮像、乱光撮像等の各種の光学的な画像撮像方法を利用して撮像された画像であるものとすることができる。
【００４２】
図２は、細胞画像の例であり、複数の神経細胞を含む画像である。画像取得部１０１は、図示しない撮像装置（顕微鏡撮像装置）から細胞画像を取得してもよく、ストレージに格納されている画像やネットワークから供給された画像を細胞画像として取得するものとすることも可能である。画像取得部１０１は、取得した細胞画像を範囲指定部１０２に供給する。
【００４３】
範囲指定部１０２は、細胞画像において「抽出範囲」を指定する。抽出範囲は、後述する動き情報抽出部１０３が動き情報を抽出する範囲である。図３は、細胞画像において、範囲指定部１０２によって指定された抽出範囲（図中、四角枠内）の例である。範囲指定部１０２は、ユーザによって指示された分析対象（細胞単体や細胞群等）にしたがって、抽出範囲を指定するものとすることができる。
【００４４】
具体的には、範囲指定部１０２は、細胞画像に分析対象の細胞や細胞群のみが含まれている場合等には、細胞画像全体を抽出範囲として指定するものとすることができる。また、範囲指定部１０２は、細胞画像に分析対象以外の細胞や細胞群が含まれている場合には、細胞画像の一部範囲のみを抽出範囲として指定するものとすることができる。
【００４５】
範囲指定部１０２は、ユーザによる指示入力を受けて抽出範囲を指定してもよく、画像処理によって細胞を検出し、抽出範囲を指定してもよい。範囲指定部１０２は、細胞画像の輝度差分を利用して細胞を検出することが可能である。細胞画像に含まれる細胞が神経細胞である場合、神経細胞の細胞体と神経突起は輝度が大きく異なるため、輝度差分を利用して細胞体を検出し、抽出範囲とすることが可能である。範囲指定部１０２は、細胞画像と共に指定した抽出範囲を動き情報抽出部１０３に供給する。
【００４６】
動き情報抽出部１０３は、範囲指定部１０２によって指定された抽出範囲から「動き情報」を抽出する。動き情報は、経時的に撮像された細胞画像における動きの情報であり、具体的には、細胞画像における特徴点の時間経過に伴なう動きベクトルであるものとすることができる。動き情報抽出部１０３は、細胞画像に対するブロックマッチング等の画像処理によって動き情報を抽出することができる。
【００４７】
ここで、細胞画像における動きは、細胞膜を介したイオン又は分子の移動（以下、細胞膜間イオン輸送）に起因する。図４は、細胞膜間イオン輸送の模式図である。同図に示すように、イオン（Ｋ＋、Ｎａ＋等）や分子（Ｈ２Ｏ等）は、細胞膜ＭにおけるチャネルＣを介して細胞外から細胞内に流入し、又は細胞内から細胞外へ流出する。なお、チャネルＣはイオンチャネルや分子チャネルあるいはイオンチャネル型受容体である。また、チャネルＣはイオンポンプ又は分子ポンプであってもよい。
【００４８】
以下、イオンチャネル、分子チャネル、イオンチャネル型受容体、分子ポンプ及びイオンポンプ等の細胞膜間イオン輸送を担う構造をイオンチャネル等と表記する。また、イオンチャネル等によって輸送されるイオンや分子をイオン等と表記する。
【００４９】
ここで、本発明者らは、上記細胞膜間イオン輸送によって、細胞膜が観測可能な程度に動くことを見出した。これは、細胞内へイオン等が流入することによる細胞の膨張や細胞外へイオン等が流出することによる細胞の収縮、あるいはイオン等の流出入による振動によるものである。なお、これらの動きは、数時間の間隔で観察される細胞自体の移動による動きとは異なり、数秒あるいはそれ以下の間隔で観察される微小かつ高速な動きである。このように上記動き情報には細胞膜間イオン輸送による影響が含まれており、動き情報を解析することにより、細胞膜間イオン輸送を評価することが可能となる。動き情報抽出部１０３は、抽出した動き情報を、動き特性算出部１０４に供給する。
【００５０】
動き特性算出部１０４は、動き情報から「動き特性」を算出する。動き特性は、動き情報の特性であり、動き速度、動き量、動き変化、動き方向、動きの継続時間、動きの空間的分布、動きの抑制割合又は動き領域量等の動き情報から算出される各種の特性である。なお、動き領域量は、抽出範囲において細胞が存在する領域のうち、動き量が一定以上の領域の割合である。また、動き特性は、抽出範囲におけるこれらの平均値や一定時間におけるこれらの中央値を含んでもよい。
【００５１】
細胞画像の撮像時間において、イオンチャネル等の活性化剤又は阻害剤を細胞に投与することにより、動き特性算出部１０４は投与前後の動きの差異を動き特性として算出することが可能である。具体的には、動き特性算出部１０４は、投与前後における動き速度、動き量、動き方向、動きの空間的分布又は動き領域量等の変化を動き特性として算出することが可能である。
【００５２】
図５は、動き特性の一例である動き量の時間変化を示すグラフである。縦軸は動き量を示し、横軸は時間（細胞画像の撮像時間）を示す。同図は、特定のイオンチャネル阻害剤を投与した細胞について算出された動き量の例であり、イオンチャネル阻害剤の投与時刻（横軸左端）から動き量が減少していることを示す。動き特性算出部１０４は、このような動き特性を算出する。また、動き特性算出部１０４は、動き情報から複数種の動き特性を算出してもよい。動き情報抽出部１０３は、算出した動き特性を評価部１０５に供給する。また、動き情報抽出部１０３は、算出した動き特性を画像生成部１０６に供給してもよい。
【００５３】
評価部１０５は、動き特性に基づいて、細胞膜間イオン輸送を評価する。例えば図５の例では、イオンチャネル阻害剤投与直後の動き量の減少から、イオンチャネル阻害剤によってイオンチャネルの機能が阻害されていることがわかり、時間経過に伴なう動き量の増加から、イオンチャネルの機能が次第に回復していることがわかる。評価部１０５はこの他にも、各種の動き特性に基づいて、細胞膜間イオン輸送を評価することができる。
【００５４】
具体的には評価部１０５は、動き量に基づいてイオン等の移動量を評価することができる。動き量は、イオン等の細胞内への流入量又は細胞外への流出量によって増減するため、動き量に基づいてイオン等の移動量を評価することが可能である。
【００５５】
また、評価部１０５は、動き量に基づいてイオンチャネル等の活性を評価することができる。動き量は、イオン等の細胞内への流入量又は細胞外への流出量によって増減するため、イオンチャネル等の活性が高く、イオン等の流入量又は流出量が大きいと、動き量に反映される。このため、評価部１０５は動き量に基づいてイオンチャネル等の活性を評価することが可能である。
【００５６】
また、評価部１０５は、イオンチャネル等の活性化剤又は阻害剤の投与前後における動き変化に基づいてイオンチャネル等の有無又は存在量を評価することができる。細胞にイオンチャネル等の活性化剤又は阻害剤を投与すると、イオンチャネル等が抑制され、あるいは活性化される。これにより、イオン等の細胞内への流入量又は細胞外への流出量が変動するため、細胞膜の動きが変化する。したがって、動き変化に基づいてイオンチャネル又はイオンチャネル型受容体の有無又は存在量を評価することが可能である。
【００５７】
また、評価部１０５は、イオンチャネル型受容体の阻害剤の投与前後の動き変化に基づいて、細胞間で形成されているシナプスの種類又は強さを評価することができる。細胞間で形成されるシナプス(細胞間結合）は、特定の化学物質（神経伝達物質）を利用して接続されている細胞を刺激し、信号を伝達する。したがって、特定の神経伝達物質の受容体に対する阻害剤の投与によって神経伝達物質の細胞膜を介した移動が抑制されれば、その神経伝達物質を利用するシナプスが形成されていると評価することができる。神経伝達物質の細胞膜を介した移動は細胞膜の動きに反映されるため、阻害剤の投与前後の動き変化から、シナプスの種類又は強さを評価することが可能である。
【００５８】
また、評価部１０５は、動き量に基づいてイオンチャネル等に作用する物質の種類又は効果の強さを評価することができる。イオンチャネル等を介したイオン等の移動は動き量に基づいて評価することができるため、特定の物質を細胞に投与した際の動き量に基づいて、イオンチャネル等に作用する物質の種類又は効果の強さを評価することが可能である。
【００５９】
また、評価部１０５は、動き量に基づいて細胞膜を介したイオンの移動又はそれに伴なう水の移動による細胞膜の動き、膨張、収縮及び振動をを評価することができる。細胞内にイオン等が流入すると細胞膜が膨張し、細胞外にイオン又は水が流出すると細胞膜が収縮する。また、イオン又は水の流出入が短時間で繰返されると、細胞膜が振動する。これらの細胞膜の動きは動き量に反映されるため、動き量にもとづいてイオン又は水の移動による細胞膜の動き、膨張、収縮及び振動を評価することが可能である。
【００６０】
また、評価部１０５は、動き方向に基づいて細胞膜を介したイオン又は分子の流れの方向を評価することができる。特定の動き方向についての動き量は、その方向に移動するイオン等の流れに起因するため、イオン等が細胞内へ流入しているか細胞外へ流出しているかを評価することが可能である。例えば抽出範囲として検出した細胞体の特定の点における動き方向が、細胞体の中心点に向いているか否かによって、イオン等が細胞内に流入したか、細胞外へ流出したかを評価することができる。
【００６１】
また、評価部１０５は、動きの継続時間又は空間的分布に基づいて細胞膜を介したイオン又は分子の移動時間又は空間的分布を評価することができる。上述のように細胞膜間イオン輸送によって細胞画像における動きが生じるため、動きの継続時間は、イオン又は分子の移動時間とみなすことが可能であり、動きの空間的分布からイオン移動やイオンチャネル等の空間的分布を推定することが可能である。
【００６２】
評価部１０５は以上のように、動き特性に基づいて細胞膜間イオン輸送を評価することが可能である。評価部１０５は、評価結果を画像生成部１０６に供給する。
【００６３】
画像生成部１０６は、評価結果を表示する画像を生成する。この際画像生成部１０６は、評価結果と共に動き特性（例えば図５のグラフ）を表示する画像を生成してもよく、動き特性のみを表示する画像を生成し、細胞膜間イオン輸送の評価についてはユーザに任せてもよい。
【００６４】
また、画像生成部１０６は、細胞画像と動き特性を重畳させて動き特性表示画像を生成してもよい。具体的には、画像生成部１０６は、動き特性の大小に応じて色彩を付し、あるいは濃淡を付して細胞画像の対応する位置に重畳させ、動き特性表示画像を生成するものとすることが可能である。
【００６５】
例えば、画像生成部１０６がイオンチャネル阻害剤による動き抑制の割合をカラーマップとして細胞画像に重複させることにより、ユーザは個々の細胞のイオンチャネルの発現の有無や発現量を評価することが可能となる。また、画像生成部１０６がイオンチャネル型受容体の阻害剤による動き抑制の割合をカラーマップとして細胞画像に重複させることにより、ユーザは個々の細胞が形成しているシナプスの入力の種類や強さ、空間的分布を評価することが可能となる。
【００６６】
細胞分析システム１００は以上のように構成されている。上述のように細胞分析システム１００は細胞画像の動き特性から細胞膜間イオン輸送を評価することが可能である。したがって、ユーザは細胞分析システム１００を利用することにより、細胞に対して染色を施す必要がなく、染色剤による細胞への影響を防止することが可能である。さらに、細胞分析システム１００は、細胞画像に対する画像処理によって細胞膜間イオン輸送を評価することができるため、広い領域に対して高分解能での分析が可能である。
【００６７】
具体的には、細胞分析システム１００を利用することにより、イオンチャネル等の活性を非染色で相対定量し、あるいはイオンチャネル等に作用する生理活性物質や薬剤を、非染色でスクリーニングすると共にその効果を相対定量することが可能となる。さらに、個々の細胞に発現するイオンチャネル等の発現の有無、発現量を相対定量することにより、非染色で細胞種のプロファイリングが可能となる。
【００６８】
加えて、分析対象が神経細胞である場合には、個々の神経細胞に入力するシナプスのイオンチャネル型受容体の種類や入力量を相対定量することにより、非染色でのシナプス接続のプロファイリングが可能となる。また、イオンチャネルにより形成される細胞の膜電位変動を非染色で相対定量すること、それによる細胞の状態（分化状態や生きのよさ等）を評価することが可能となる。
【実施例】
【００６９】
[実施例１：電位依存性イオンチャネルによるイオン移動の評価]
電位依存性イオンチャネルは膜電位に依存して開閉し、膜間のイオン濃度勾配に応じたイオン移動を担う分子である。神経細胞の多くは、膜電位が静止しておらず振動しており、電位依存性チャネルも開閉を繰返している。イオンチャネル阻害剤は、イオンチャネルの開閉を阻害し、膜間のイオン移動を阻害する。【００７０】
ｉＰＳ細胞由来神経細胞iCell Neuron(Cellular Dynamics International社製）をチャンバー付き顕微鏡にセットし、対物レンズ２０倍、７．５ｆｐｓ（フレーム／秒）で２６０フレームの動画を撮像し、細胞画像とした。細胞の培養液には各種のイオンチャネル阻害剤を添加した。イオンチャネル阻害剤はＮａ＋チャネル阻害剤であるＴＴＸ（tetrodotoxin)、Ｋ＋チャネル阻害剤であるＴＥＡ（tetraethylammonium）及びＣａ２＋チャネル阻害剤であるNifedipineのいずれかとした。【００７１】
細胞画像を、上記細胞分析システムを利用して解析した。具体的には細胞画像に含まれる個々の神経細胞を抽出範囲としてブロックマッチングにより動き情報を抽出し、動き情報から動き特性として動き量（動き速度平均）を算出した。図６乃至図８は、動き量の算出結果を示すグラフである。図６はＴＴＸを１００ｎｍ添加したiCell Neuron、図７はＴＥＡを１ｍＭ添加したiCell Neuron、図８はNifedipineを１０μＭ添加したiCell Neuronからそれぞれ算出されたものである。なお、各図に示す動き量は、複数個（６個）の神経細部から算出された動き量の平均値である。【００７２】
各グラフにおいて横軸０ｍｉｎはイオンチャネル阻害剤の添加時刻であり、縦軸はイオンチャネル阻害剤の投与前（０ｍｉｎ）を１とする動き量の相対値である。【００７３】
図６乃至図８に示す各グラフにおいては、イオンチャネル阻害剤の添加後に一過性の動き量抑制がみられる。このことから、細胞分析システムを利用することによって、イオンチャネル阻害剤の添加による膜間の相対的なイオン移動の阻害を定量的に測定できることがわかる。【００７４】
[実施例２：イオンチャネル型受容体によるイオン移動の評価]
イオンチャネル型受容体はリガンド（受容体に結合する物質）の結合に依存して開閉し、膜間のイオン濃度に応じたイオン移動を担う分子である。神経伝達物質の多くはイオンチャネル型受容体のリガンドとなり、神経細胞の軸索先端の前シナプスから放出され、後シナプスの受容体を介してシナプスで接続された神経細胞を刺激、又は抑制する。個々の神経細胞は一種類のみの神経伝達物質を放出し、一つのシナプスで関与する神経伝達物質は一つのみである。【００７５】
イオンチャネル型受容体阻害剤は、イオンチャネル型受容体へのリガンドの結合やチャネルの開閉を阻害することで、シナプスを形成した膜間でのイオン移動を抑制する。【００７６】
ｉＰＳ細胞由来神経細胞iCell Neuron(Cellular Dynamics International社製）及びラット大脳皮質初代培養細胞（Lonza社製）をそれぞれ培養チャンバー付き顕微鏡にセットしし、対物レンズ２０倍、７．５ｆｐｓ（iCell Neuron）又は５ｆｐｓ（ラット大脳皮質初代培養細胞）で２６０フレームの動画を撮像し、細胞画像とした。それぞれの細胞の培養液に、各種のイオンチャネル受容体阻害剤を添加した。イオンチャネル受容体阻害剤は、ＧＡＢＡ（gamma-aminobutyrate）レセプター阻害剤であるBicuculline又はＧｌｕ（グルタミン酸）レセプター（非ＮＭＤＡ型）阻害剤であるＣＮＱＸ（6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione）である。【００７７】
細胞画像を、上記細胞分析システムを利用して解析した。具体的には細胞画像に含まれる個々の神経細胞を抽出範囲としてブロックマッチングにより動き情報を抽出し、動き情報から動き特性として動き量を算出した。図９乃至図１２は、動き量の算出結果を示すグラフである。図９はBicucullinを５μＭ添加したiCell Neuron、図１０はＣＮＱＸを５μＭ添加したiCell Neuronからそれぞれ算出されたものである。また、図１１はBicucullinを５μＭ添加したラット大脳皮質初代培養細胞、図１２はＣＮＱＸを５μＭ添加したラット大脳皮質初代培養細胞からそれぞれ算出されたものである。なお、各図に示す動き量は、複数個の神経細部から算出された動き量の平均値である。【００７８】
各グラフにおいて横軸０ｍｉｎはイオンチャネル阻害剤の添加時刻であり、縦軸はイオンチャネル受容体阻害剤の投与前（０ｍｉｎ）を１とする動き量の相対値である。【００７９】
iCell Neuronでは、さまざまな神経伝達物質を放出する細胞が混在しており、多くはＧＡＢＡ作動性神経細胞かＧｌｕ作動性神経細胞である。図９に示すようにiCell Neuronに抑制性の神経伝達物質であるＧＡＢＡの受容体阻害剤を添加すると、動き量が一過性に増加した。また、図１０に示すように、iCell Neuronに興奮性の神経伝達物質であるＧｌｕ（グルタミン酸）の受容体阻害剤を添加すると、動き量が一過性に抑制された。【００８０】
即ち、iCell Neuronでは、ＧＡＢＡを介したシナプスも、Ｇｌｕを介したシナプスも形成されていることを図９及び図１０から把握することが可能である。ＧＡＢＡ受容体阻害剤により自然発火によるシナプス伝達の確率が増加し、Ｇｌｕ受容体阻害剤により同確率が低下することから、シナプス伝達の頻度が動き量に反映されていると考えられる。【００８１】
一方で、ラット大脳皮質初代培養細胞は、そのほとんどがＧｌｕ作動性神経細胞であり、ＧＡＢＡ作動性神経細胞はほとんど含まれない。このため、ラット大脳皮質初代培養細胞を培養すると、Ｇｌｕを介したシナプスは形成され得るが、ＧＡＢＡを介したシナプスは形成されない。図１１では、ＧＡＢＡ受容体阻害剤の添加による動き量の変動がほとんどなく、ＧＡＢＡを介したシナプスが形成されていないことが示されている。また、図１２では、Ｇｌｕ受容体阻害剤の添加によって動き量が減少しており、Ｇｌｕを介したシナプスが形成されていることが示されている。このように、細胞分析システムを利用することによって、分析対象の細胞が特定の神経伝達物質の受容体を有するか否かを評価することが可能である。【００８２】
また、図１３は、ＣＮＱＸ（Ｇｌｕレセプター阻害剤）を５μＭ添加したラット大脳皮質初代培養細胞から算出された動き量を、各細胞毎にプロットしたグラフである。同図に示すように、ラット大脳皮質初代培養細胞には、Ｇｌｕレセプター阻害剤の影響が生じて動き量が減少した細胞と、同阻害剤の影響が生じず、動き量が減少しない細胞が含まれていることがわかる。即ち、細胞分析システムを利用することによって、特定の神経伝達物質に対する受容体を入力としたシナプスが形成された細胞であるか否かを、個々の細胞について評価することが可能であるといえる。【００８３】
[実施例３：膜間のイオン移動に伴なう浸透圧変化による水移動の評価]
細胞膜間では、水チャネルであるアクアポリンを介してのみ、水の移動が行われる。アクアポリンは浸透圧差により開閉し、水移動を担う受動的なチャネル分子である。細胞全体で内外の浸透圧差が生じた場合、アクアポリンが開き、細胞の体積が増減する。イオンチャネルやイオンチャネル型受容体の開閉等による局所的かつ一過性の浸透圧差により、細胞の体積が増減し、あるいは細胞膜が動くことは、これまで明らかになっていない。【００８４】
ラット大脳皮質初代培養細胞（Lonza社製）を培養チャンバー付き顕微鏡にセットし、対物レンズ２０倍、５ｆｐｓで２６０フレームの動画を撮像し、細胞画像とした。細胞の培養液に最終濃度２．５％のガラクトースを添加した。【００８５】
細胞画像を、上記細胞分析システムを利用して解析した。具体的には細胞画像に含まれる個々の神経細胞を抽出範囲としてブロックマッチングにより動き情報を抽出し、動き情報から動き特性として動き量を算出した。図１４は、抽出範囲における動き量の中央値である。左のグラフはガラクトース未添加の場合の値であり、右のグラフはガラクトースを添加した場合の値である。【００８６】
同図に示すように、ガラクトースを添加していない場合、細胞へのＮａ＋やＫ＋の流出入及びそれに伴なう水の流出入により、一定の動き量が発生した。これに対し、ガラクトースを添加し、細胞外の浸透圧を生理的濃度の２倍とすると、動き量がほぼ完全に抑制された。これは、生理的な浸透圧差が崩れたため、イオンの流出入が停止し、それによる浸透圧差が生じなくなったために水の移動が停止したためである。即ち、細胞分析システムを利用することによって、細胞内外の浸透圧差に伴なう水の移動を評価できることがわかる。【００８７】
また、ラット大脳皮質初代培養細胞（Lonza社製）を培養チャンバー付き顕微鏡にセットし、対物レンズ２０倍、７．５ｆｐｓ（iCell Neuron）又は５ｆｐｓ（ラット大脳皮質初代培養細胞）で２６０フレームの動画を撮像し、細胞画像とした。細胞の培養液に、アクアポリンの阻害剤であるＨｇＣｌ２を５μＭ添加した。【００８８】
細胞画像を、上記細胞分析システムを利用して解析した。具体的には細胞画像に含まれる個々の神経細胞を抽出範囲としてブロックマッチングにより動き情報を抽出し、動き情報から動き特性として動き量を算出した。図１５は、動き量の算出結果を示すグラフである。同図において横軸０ｍｉｎはイオンチャネル阻害剤の添加時刻であり、縦軸はＨｇＣｌ２の投与前（０ｍｉｎ）を１とする動き量の相対値である。【００８９】
同図に示すように、ラット大脳皮質初代培養細胞にアクアポリンの阻害剤であるＨｇＣｌ２を添加すると、動き量が一過性に抑制された。なお、５μＭのＨｇＣｌ２の添加では、細胞代謝が抑制されないことが確認されている。したがって、アクアポリン阻害剤によって細胞膜間の水移動を阻害すると、細胞の動きが抑制されることが確認された。即ち、細胞分析システムを利用することによって、細胞膜間の水の移動を評価できることがわかる。【００９０】
[実施例４：動き量と細胞外電場の相関]
多電極アレイ（アルファメッドサイエンティフィック社）にラット大脳皮質神経細胞（Lonza社製）を培養し、２０ｋＨｚのサンプリング周波数で細胞外電場（field potential)を測定した。図１６に測定した細胞外電場を示す。測定値から２００Ｈｚのデータを抽出し、絶対値にした後、０．２秒間の平均をとり、５Ｈｚのデータ（図１６中Field potential細線）とした。【００９１】
電極周縁の細胞の動画像を５ｆｐｓ、２６０フレームで撮像し、細胞画像とした。この細胞画像を上記細胞分析システムを利用して解析した。具体的には細胞画像に含まれる個々の神経細胞を抽出範囲としてブロックマッチングにより動き情報を抽出し、動き情報から動き特性として細胞一個当たりの動き速度平均を算出した（図１６中Motion細線)。【００９２】
細胞外電場と動き量の１０区間の移動平均を算出した（図１６中Field potential太線及びMotion太線）。図１７は、図１６に示した細胞外電場と動き量の移動平均の相関を示すグラフであり、同測定時点の値をプロットしたものである。同図に示すように、細胞外電場と動き量の間には一定の相関がみられることがわかる。【００９３】
[実施例５：細胞内へのイオン流入の評価]
ラット大脳皮質神経細胞（Lonza社製）をチャンバー付き顕微鏡にセットし、対物レンズ２０倍、５ｆｐｓ（フレーム／秒）で２６０フレームの動画を撮像し、細胞画像とした。ラット大脳皮質神経細胞の培養液は、通常の培養液、Ｎａ＋を含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２ＣａＣｌ２及びグルコースを含む）又はＮａ＋を含まないＨＥＰＥＳ緩衝液（ＮａＣｌの代わりにＮ-メチル-Ｄ-グルカミンを含む）とした。Ｎａ＋を含まないＨＥＰＥＳ緩衝液は、Ｎ-メチル-Ｄ-グルカミンにより、Ｎａ＋を含むＨＥＰＥＳ緩衝液と同程度の浸透圧に調整されている。【００９４】
細胞画像を、上記細胞分析システムを利用して解析した。具体的には細胞画像に含まれる個々の神経細胞を抽出範囲としてブロックマッチングにより動き情報を抽出し、動き情報から動き特性として動き量を算出した。図１８は、抽出範囲における動き量の中央値である。なお、動き量は、培養液毎に規格化されている。【００９５】
培養液がＮａ＋を含むＨＥＰＥＳ緩衝液である場合（図中ＨＥＰＥＳ＋Ｎａ）、通常の培養液である場合（図中Ｍｅｄｉｕｍ）と同程度の動き量となった。一方で、培養液がＮａ＋を含まないＨＥＰＥＳ緩衝液である場合（図中ＨＥＰＥＳ−Ｎａ）、動き量は大きく減少した。これにより、Ｎａ＋の細胞への流入によって、細胞の動きが増加しているといえる。【００９６】
なお、本技術は以下のような構成もとることができる。【００９７】
（１）
細胞を経時的に撮像した細胞画像から、細胞膜を介したイオン又は分子の移動に起因する動き情報を抽出する動き情報抽出部と、
上記動き情報の動き特性を算出する動き特性算出部と
を具備する細胞分析システム。【００９８】
（２）
上記（１）に記載の細胞分析システムであって、
上記動き特性と上記細胞画像を重畳させ、動き特性表示画像を生成する画像生成部
をさらに具備する細胞分析システム。【００９９】
（３）
上記（１）又は（２）に記載の細胞分析システムであって、
上記動き特性に基づいて、細胞膜を介したイオン又は分子の移動を評価する評価部
をさらに具備する細胞分析システム。【０１００】
（４）
上記（１）から（３）のうちいずれか１つに記載の細胞分析システムであって、
上記動き特性算出部は、上記動き特性として動き量を算出し、
上記評価部は、上記動き量に基づいてイオン又は分子の移動量を評価する
細胞分析システム。【０１０１】
（５）
上記（１）から（４）のうちいずれか１つに記載の細胞分析システムであって、
上記動き特性算出部は、上記動き特性として動き量を算出し、
上記評価部は、上記動き量に基づいてイオンチャネル又はイオンチャネル型受容体の活性を評価する
細胞分析システム。【０１０２】
（６）
上記（１）から（５）のうちいずれか１つに記載の細胞分析システムであって、
上記動き特性算出部は、上記動き特性としてイオンチャネル又はイオンチャネル型受容体の活性化剤又は阻害剤の投与前後における動き変化を算出し、
上記評価部は、上記動き変化に基づいてイオンチャネル又はイオンチャネル型受容体の有無又は存在量を評価する
細胞分析システム。【０１０３】
（７）
上記（１）から（６）のうちいずれか１つに記載の細胞分析システムであって、
上記動き特性算出部は、上記動き特性としてイオンチャネル型受容体の阻害剤の投与前後における動き変化を算出し、
上記評価部は、上記動き変化に基づいて細胞間で形成されているシナプスの種類又は強さを評価する
細胞分析システム。【０１０４】
（８）
上記（１）から（７）のうちいずれか１つに記載の細胞分析システムであって、
上記動き特性算出部は、上記動き特性として動き量を算出し、
上記評価部は、上記動き量に基づいてイオンチャネル又はイオンチャネル型受容体に作用する物質の種類又は効果の強さを評価する
細胞分析システム。【０１０５】
（９）
上記（１）から（８）のうちいずれか１つに記載の細胞分析システムであって、
上記動き特性算出部は、上記動き特性として動き量を算出し、
上記評価部は、上記動き量に基づいて細胞膜を介したイオンの移動又はそれに伴なう水の移動による細胞膜の動き、膨張、収縮及び振動を評価する
細胞分析システム。【０１０６】
（１０）
上記（１）から（９）のうちいずれか１つに記載の細胞分析システムであって、
上記動き特性算出部は、上記動き特性として動き方向を算出し、
上記動き特性算出部は、上記動き方向に基づいて細胞膜を介したイオン又は分子の流れの方向を評価する
細胞分析システム。【０１０７】
（１１）
上記（１）から（１０）のうちいずれか１つに記載の細胞分析システムであって、
上記動き特性算出部は、上記動き特性として動きの継続時間又は空間的分布を算出し、
上記評価部は、上記動きの継続時間又は空間的分布に基づいて細胞膜を介したイオン又は分子の移動時間又は空間的分布を評価する
細胞分析システム。【０１０８】
（１２）
上記（１）から（１１）のうちいずれか１つに記載の細胞分析システムであって、
上記細胞画像において、上記細胞画像の輝度差分を利用して抽出範囲を指定する範囲指定部をさらに具備し、
上記動き情報抽出部は、上記抽出範囲から上記動き情報を抽出する
細胞分析システム。【０１０９】
（１３）
細胞を経時的に撮像した細胞画像から、細胞膜を介したイオン又は分子の移動に起因する動き情報を抽出する動き情報抽出部と、
上記動き情報の動き特性を算出する動き特性算出部と
として情報処理装置を動作させる細胞分析プログラム。【０１１０】
（１４）
動き情報抽出部が、細胞を経時的に撮像した細胞画像から、細胞膜を介したイオン又は分子の移動に起因する動き情報を抽出し、
動き特性算出部が、上記動き情報の動き特性を算出する
細胞分析方法。
【符号の説明】
【０１１１】
１００…細胞分析システム
１０１…画像取得部
１０２…範囲指定部
１０３…動き情報抽出部
１０４…動き特性算出部
１０５…評価部
１０６…画像生成部
【図１】
2015068329.tif 000003
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１８】
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【図２】
2015068329.tif 000016
【図３】
2015068329.tif 000017
【図１３】
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【図１６】
2015068329.tif 000019
【図１７】
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【国際調査報告】
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2015068329.tif 000022
2015068329.tif 000023
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