(57)【要約】  外来遺伝子を導入することなく、エタノール産生効率の高い発酵菌を得ることを課題とする。さらに、発酵菌の増殖を妨げる有機酸等の増殖阻害物質に耐性のある発酵菌を得ることを課題とする。  育種によって五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノール生産することができるMeyerozyma guilliermondiiに、セルフクローニングによりトランスアルドラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入し、更に育種することによって、エタノール産生能を向上した菌を作成した。
2016088278.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノールを産生する発酵菌であって、
特許微生物寄託センターに寄託番号ＡＢＰ−０１９７６として寄託されている菌をコーストーバー糖液中で育種することにより、
コーンストーバー糖液でのエタノール産生が向上していることを特徴とする高効率エタノール発酵菌。
【請求項２】
請求項１記載の高効率エタノール発酵菌において、
特許微生物寄託センターに寄託番号ＢＰ−０１９６６として寄託されていることを特徴とする高効率エタノール発酵菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
リグノセルロース系バイオマスを用いたバイオエタノール生産において、糖化溶液を発酵するための微生物に関する。【０００２】
特に、リグノセルロース系バイオマスを用いたバイオエタノール生産において、五炭糖（以下、Ｃ５ということもある。）、及び六炭糖（以下、Ｃ６ということもある。）から効率的にエタノール生産することができる微生物に関する。
【背景技術】
【０００３】
バイオエタノールは、バイオマスから産生される枯渇することのない再生可能資源として期待されている。また、バイオエタノールを燃焼させて発生する二酸化炭素はカーボンニュートラルであることから、バイオエタノールの利用が進むことによって、地球温暖化の主な原因である二酸化炭素の上昇を抑制すると考えられている。【０００４】
バイオエタノールは、バイオマスを発酵させ、蒸留してエタノールを精製する。バイオエタノールの収率を高めるために糖化溶液から多くのアルコールを生成する必要がある。バイオエタノール生産の過程で一般的に用いられている酵母は、キシロース、アラビノースなどの五炭糖をアルコールに変換できないため、発酵原料としては六炭糖のみが用いられてきた。【０００５】
原料によって異なるものの典型的なバイオマスには、３５〜４５％のセルロース、２５〜４０％のヘミセルロース、１５〜３０％のリグニンが含まれていると言われている。したがって、六炭糖が重合しているセルロースだけではなく、五炭糖であるキシロース等を主として含有するヘミセルロースを基質として利用することは効率的なエタノール産生につながることになる。【０００６】
キシロースはグルコースの次にバイオマス中に多く含まれている糖であると言われており、五炭糖を効率的に利用することはバイオエタノール生産において大きな課題となっている。【０００７】
これまでに、遺伝子組換えによるキシロース利用能の付与や、キシロースを利用してエタノールを産生する微生物の利用等により、キシロースを少しでも利用する技術が開示されている。【０００８】
特許文献１には、キシローストランスポーター活性を有する遺伝子を宿主細胞に導入することによって、キシロース（Ｃ５）をキシルロースに変換し、解糖系のペントースリン酸経路に組み入れ、発酵に利用する発明が開示されている。【０００９】
特許文献２には、アラビノーストランスポーターを付与した酵母によって、アルコールを生成する技術が開示されている。特許文献１と同様にアラビノース（Ｃ５）をアラビトール、キシルロースを経て解糖系のペントースリン酸経路に組み入れ、発酵に利用するものである。【００１０】
非特許文献１には、大腸菌由来のキシロース資化遺伝子をザイモモナスに組み込むことにより、キシロース資化能を付与することが開示されている。【００１１】
非特許文献２には、ピキア属酵母が、キシロースを利用してエタノールを生産することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開2012-170422号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第2013/189788号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Zhang, M., et al., Science, 1995. Vol. 267, pp. 240-243.
【非特許文献２】Bicho, P.A., et al., Appl. Environ. Microbiol., 1988, Vol. 54, pp. 50-54.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、特許文献１の発明は、Candida guilliermondii由来のキシローストランスポーター活性のあるタンパク質を宿主としてSaccharomyces cerevisiaeに導入している。すなわち外来遺伝子を導入することになる。【００１５】
また、特許文献２の発明もトランスポーター遺伝子は異なるものの、宿主に対して異なる種の遺伝子を導入する発明である。【００１６】
また、非特許文献１に記載の技術は、キシロース資化遺伝子を導入するものであり、上記特許文献１及び２とは技術思想は異なるが、外来遺伝子を導入することに変わりない。【００１７】
そのため、上記特許文献１及び２、非特許文献１はいずれも国連で採択された「生物の多様性に関する条約のバイオセーフティに関するカルタヘナ議定書」を実施するための封じ込め策を講じる必要がある。したがって、バイオセーフティを保証するための施設を必要とすることから、当該菌体を利用してエタノールを生産することはコストの面で不利である。【００１８】
また、非特許文献２に記載の技術によって、ピキア属酵母を利用することは、野生型のピキア属酵母のキシロース利用性が低いため、エタノール産生効率はさほど高くならない。【００１９】
本発明は、外来遺伝子を導入することなく、エタノール産生効率の高い発酵菌を得ることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノールを産生するMeyerozyma guilliermondiiであって、特許微生物寄託センター（日本国  〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に寄託番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１９７６として、２０１４年１２月４日に寄託されている菌（以下、ＡＢＰ−０１９７６株ともいう。）をコーストーバー糖液中で育種することにより、コーンストーバー糖液でのエタノール産生が向上していることを特徴とする。【００２１】
ＡＢＰ−０１９７６菌株は、稲わら由来の糖液中で育種を行い、発酵収率の高い菌を選択することによって得られた高効率エタノール発酵菌に、トランスアルドラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼをセルフクローニングしてさらに発酵収率を高めた菌である。【００２２】
しかしながら、稲わらで育種を行い、選択したためにコーンストーバー由来の糖液中での発酵収率はさほど高くない。そこで、コーンストーバー中で育種を行うことによって、発酵収率の向上した菌を得ることができた。【００２３】
また、本発明の高効率エタノール発酵菌は、五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノールを産生するMeyerozyma guilliermondiiであって、特許微生物寄託センター（日本国  〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９６６（以下、ＢＰ−０１９６６株ともいう。）として、２０１４年１１月１９日に寄託されていることを特徴とする。【００２４】
コーンストーバー由来の糖液中で育種することによって、コーンストーバー糖液に馴化し、発酵収率が向上した菌のうち、特に発酵収率の高いものを特許微生物寄託センターに寄託し、寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９６６を得た。【００２５】
本発明の菌は、育種とMeyerozyma guilliermondii自身の酵素遺伝子を導入した組換えによって得たものであり、カルタヘナ法に則した封じ込め策を必要としない。したがって、バイオセーフティのための特別な施設を必要とせず、従来の設備を使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】親株（N株）、ＢＰ−０１９６４株、ＡＢＰ−０１９７６株、本発明の菌株であるＢＰ−０１９６６の発酵収率を示す図。
【図２】親株（N株）、ＢＰ−０１９６４株、ＢＰ−０１９６６株のエタノール産生能を示す図。
【図３】スラリー発酵でのグルコース、キシロース資化能を示す図。
【図４】スラリー発酵、清澄液発酵での発酵収率を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本件発明の菌株について以下に説明する。
【実施例】
【００２８】
１．菌株の単離
Meyerozyma guilliermondiの親株（Ｎ株）を稲わら由来の糖液を用い育種を行い、エタノール産生能の高い株を選択した。熊谷産の稲わらを、等量の２５％アンモニア水に８０℃３時間漬け込んだ後、アンモニアを放散させた。処理したバイオマスは、ｐＨを４に調整後、アクレモニウムセルラーゼ（Meiji Seika ファルマ社製）を添加して、５０℃７２時間酵素糖化を行った。作成したスラリーはフィルタープレス法にて固液分離を行い液体を回収した。この液体（以下、清澄液ともいう。）を用いて、変異剤を加えながら１９ヶ月馴化培養を行い、発酵性能向上株を選抜した。発酵性能向上株は、一定時間後の生成エタノール量を基準に選抜した。発酵性能の高い菌株を独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに、寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９６４として、寄託した。【００２９】
ここでは示さないが、ＢＰ−０１９６４菌株は、野生型に対して２倍以上エタノールを産生する株であり、さらにＣ６であるグルコースだけではなく、Ｃ５であるキシロースの資化能が向上していることを確認している。【００３０】
次に、ＢＰ−０１９６４菌株にセルフクローニングによりトランスアルドラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入して、さらにエタノール産生能の高い菌を得た。【００３１】
アンモニア処理稲わら液を用い、糖化酵素で処理して糖液を得る際に、副産物として有機酸、アルデヒド、フェノール等の発酵阻害物質が産生する。特に酢酸は約１０００ｍｇ／Ｌと非常に多量に存在し、発酵収率を低下させる。したがって、酢酸による発酵菌の増殖阻害を抑制することができれば、さらにエタノール産生効率を向上させることができる。【００３２】
トランスアルドラーゼは、解糖系から分岐したペントースリン酸経路のセドヘプツロース−７−リン酸（Ｓ７Ｐ）及びグリセルアルデヒド３リン酸（ＧＡＰ）からエリトロース−４−リン酸（Ｅ４Ｐ）及びフルクトース６リン酸（Ｆ６Ｐ）への代謝を触媒する酵素である。この酵素を導入することによって、阻害物質である酢酸存在下でのエタノール収率向上効果が確認されている。【００３３】
トランスアルドラーゼの上流にはキシロースレダクターゼのプロモーターをつなげた。キシロース資化の際に機能するキシロースレダクターゼのプロモーターを用いることによって、トランスアルドラーゼが効率良く作用すると考えられるからである。【００３４】
また、アルコールデヒドロゲナーゼはアセトアルデヒドからエタノールを産生させることができる酵素であり、稲藁糖液に阻害物質として含まれるアルデヒド類を変換し毒性を弱めることができる酵素である。【００３５】
アルコールデヒドロゲナーゼの上流にはＧＡＰＤＨのプロモーターをつなげた。グリセロアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）は解糖系に存在する強力なプロモーターであることから、解糖系の酵素であるアルコールデヒドロゲナーゼのプロモーターとして使用することにより、効率よく作用すると考えられる。【００３６】
したがって、２つの酵素を遺伝子導入により導入した組換え発酵菌を作成することができれば、よりエタノール産生能の高い菌を得ることが期待できる。【００３７】
遺伝子導入は、次の手順を取った。導入したい遺伝子及びそのターミネーター部（以下、遺伝子+ターミネーター部という。）をＰＣＲ増幅する。導入に用いたプロモーター部をＰＣＲ増幅する。これらは何れも本発明で用いた菌株であるMeyerozyma guilliermondiの染色体からＰＣＲ増幅する。【００３８】
ＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片をプロモーター、遺伝子+ターミネーター部の順になるよう、インフュージョン法を用いて、大腸菌用の市販ベクターにクローニングする。クローニングされたベクターを大腸菌に形質転換し、ベクターを増幅する。増幅したベクターからプロモーター及び遺伝子＋ターミネーター部を制限酵素で切出す、あるいは増幅したベクターからＰＣＲ増幅することにより、相同組換用のＤＮＡ断片を得る。【００３９】
キシロースレダクターゼのプロモーターは下記配列番号１及び配列番号２のプライマー、トランスアルドラーゼ遺伝子及びターミネーター部分は下記配列番号３及び４のプライマーを用いて増幅した。
配列番号１：ＡＡＧＧＣＴＴＧＧＧＡＡＣＴＴＴＣＴＴＴ
配列番号２：ＡＧＣＡＡＴＴＧＡＴＧＡＴＴＡＡＴＴＴＴ
配列番号３：ＡＴＧＡＣＣＡＡＴＴＣＴＣＴＴＧＡＡＣＡ
配列番号４：ＡＡＡＴＴＧＴＧＣＣＧＴＧＴＣＡＡＡＣＴ【００４０】
また、ＧＡＰＤＨのプロモーターは具体的には下記配列番号５及び配列番号６のプライマー、トアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びターミネーター部分は下記配列番号７及び８のプライマーを用いて増幅した。
配列番号５：ＧＴＴＧＴＡＧＣＧＧＡＧＧＣＴＣＡＡＴＴ
配列番号６：ＴＧＴＡＴＡＡＴＴＴＡＡＡＴＧＴＧＧＧＴ
配列番号７：ＡＴＧＴＣＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＴＣＣＡＴ
配列番号８：ＣＡＣＣＴＴＧＧＣＴＧＧＡＡＧＴＧＣＴＧ【００４１】
得られたＤＮＡ断片を菌株に相同組換えし、所望の菌株を得た。相同組換にはエレクトロポレーション法を用いた。相同組換用ＤＮＡ断片は、キシロースレダクターゼのプロモーター、トランスアルドラーゼ＋ターミネーター、ＧＡＰＤＨのプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ＋ターミネーターの順となっている。また、この方法により得られた菌株は、遺伝子を導入しているが、セルフクローニングであるため、カルタヘナ法上、非組換菌扱いになる範疇に属するものとなっている。【００４２】
遺伝子導入した菌株からエタノール産生能の高い菌を単離し、特許微生物寄託センターに寄託し寄託番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１９７６を得た。【００４３】
次に、コーストーバー由来の糖液中で４ヶ月馴化培養を行い、コーストーバー由来の糖液中で発酵収率の高い菌株を得て、特許微生物寄託センターに、寄託番号ＢＰ−０１９６６として寄託した。以下に、得られた菌株の発酵収率等性質を示す。【００４４】
２．菌株の性質
２．１  発酵収率
親株、本発明の株の発酵試験を行った。糖濃度の異なる希硫酸処理コーンストーバー由来酵素糖化溶液をｐＨを６に調整した溶液を複数用い、上記株の培養液を培地のＯＤ６００が２．０となるように添加し、３０℃、９６時間培養して得られたエタノール濃度と投入糖化溶液の糖濃度から計算した発酵収率をプロットした。結果を図１に示す。【００４５】
図１に示すように親株であるＮ株は発酵収率が約４８％であるのに対し、育種によって得られた高エタノール産生株ＢＰ−０１９６４は発酵収率が８０％、遺伝子組換えによりトランスアルドラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼを導入することにより得られたＡＢＰ−０１９７６株は発酵収率が８４％、さらにコーンストーバー由来糖液中で育種を行った本発明の株寄託番号ＢＰ−０１９６６株は発酵収率がさらに高く、約８６％となっていた。また、図中△で示しているのは他社の発酵菌の発酵収率であるが、これらの菌に比べても高い発酵収率を示すことは明らかである。【００４６】
さらに、エタノール産生能を比較した。図２は親株であるN株（ＷＴ）、育種により発酵収率を向上させたＢＰ−０１９６４菌株に対する本菌株のエタノール産生を示す。コーンストーバーを希硫酸処理した糖化液をｐＨを６に調整して用い、菌株の培養液を培地のＯＤ６００が２．０となるように添加した。３０℃、９６時間培養した後の培養液中のエタノール量を示す。糖化溶液のグルコースは、６３．２ｇ／Ｌ、キシロースは３４．５ｇ／Ｌであった。エタノール測定はＧＣ−ＦＩＤ（ジーエルサイエンス製：ＧＣ３９０Ｂ）を用いた。【００４７】
図２より明らかなように、野生型に対して２．５倍以上、育種によってエタノール産生能を高めた株に対しても、約１．２倍のエタノールを産生する株を得ることができた。野生株に対してエタノール産生が向上していることから、Ｃ５であるキシロースの資化能が向上していると考えられる。そこで、この菌株のグルコース及びキシロース資化能を確認した。【００４８】
２．２  キシロース資化能の検討
次に、稲わらをアンモニア水で上記と同様に処理した後、アクレモニウムセルラーゼを添加して、５０℃７２時間酵素糖化を行い、作成したスラリーを用いて発酵を行った。【００４９】
スラリー発酵槽はジャケット構造になっており、温度はジャケット部に温水を循環させて調節を行った。また、底部には通気口を設けてあり、底部の通気口からは、フィルタを通した空気を所定量通気し続け、モータに連動したヘラで撹拌を行いながら発酵を行った。【００５０】
スラリー中に含まれるグルコース、キシロース、エタノールの量の経時的な変化の解析を行った。グルコース、キシロースはスラリーをサンプリングし、遠心により得た上清をＨＰＬＣ（東ソー製：ＬＣ−８０２０）測定にかけて測定した。エタノールは上記と同様にＧＣ−ＦＩＤ（ジーエルサイエンス社製、ＧＣ３９０Ｂ）を用いた。結果を図３に示す。【００５１】
Ｃ６であるグルコースが先に消費されるが、その後、スラリー中のグルコースの減少とともにＣ５であるキシロースが消費され、エタノールが産生される。得られた菌は、Ｃ５、Ｃ６ともに資化能を備えていることから、効率よくエタノールを産生することができる。したがって、工業生産的にも有用な菌株である。【００５２】
２．３  スラリー発酵能、清澄液発酵能
バイオエタノール産生を行うときに、スラリー、清澄液、どちらを用いた場合であっても効率よく発酵する菌であることが望ましい。そこで、スラリー、清澄液を用いて発酵収率を比較した。発酵収率は以下の式により計算される。
発酵収率＝得られたエタノール量（ｇ／Ｌ）／発酵開始時の糖液に含まれていたグルコース＋キシロース量（ｇ／Ｌ）／０．５１１４【００５３】
図４に示すように、スラリー発酵であっても、清澄液発酵であっても、同等の性能を発揮することのできる菌株を得ることができた。【００５４】
寄託番号ＢＰ−０１９６６で示される菌は、以上示してきたように、野生型Meyerozyma guilliermondiのキシロース資化能が育種によって強化されており、バイオマスとして稲わら、コーンストーバーどちらを用いた場合であっても効率的にエタノール産生を行うことができる。【００５５】
以上示してきたように、野生型Meyerozyma guilliermondiのキシロース資化能が育種によって強化されており、さらに遺伝子組換えによってエタノール産生能が高い菌株を得ることができた。さらに、バイオマスとして稲わら、コーンストーバーどちらを用いた場合であっても効率的にエタノール産生を行うことができる。
【図１】
2016088278.tif 000003
【図２】
2016088278.tif 000004
【図３】
2016088278.tif 000005
【図４】
2016088278.tif 000006
【配列表】
2016088278000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年9月29日(2016.9.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノールを産生する発酵菌であって、
特許微生物寄託センターに寄託番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１９７６として寄託されている菌をコーンストーバー糖液中で育種することにより、コーンストーバー糖液中でのキシロース資化能が向上しており、
特許微生物寄託センターに寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９６６として寄託されている菌であることを特徴とする高効率エタノール発酵菌。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
ローストランスポーター活性のあるタンパク質を宿主としてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに導入している。すなわち外来遺伝子を導入することになる。
［００１５］
また、特許文献２の発明もトランスポーター遺伝子は異なるものの、宿主に対して異なる種の遺伝子を導入する発明である。
［００１６］
また、非特許文献１に記載の技術は、キシロース資化遺伝子を導入するものであり、上記特許文献１及び２とは技術思想は異なるが、外来遺伝子を導入することに変わりない。
［００１７］
そのため、上記特許文献１及び２、非特許文献１はいずれも国連で採択された「生物の多様性に関する条約のバイオセーフティに関するカルタヘナ議定書」を実施するための封じ込め策を講じる必要がある。したがって、バイオセーフティを保証するための施設を必要とすることから、当該菌体を利用してエタノールを生産することはコストの面で不利である。
［００１８］
また、非特許文献２に記載の技術によって、ピキア属酵母を利用することは、野生型のピキア属酵母のキシロース利用性が低いため、エタノール産生効率はさほど高くならない。
［００１９］
本発明は、外来遺伝子を導入することなく、エタノール産生効率の高い発酵菌を得ることを課題とする。
課題を解決するための手段
［００２０］
本発明は、五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノールを産生するＭｅｙｅｒｏｚｙｍａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉであって、特許微生物寄託センター（日本国  〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に寄託番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１９７６として、２０１４年１２月４日に寄託されている菌（以下、ＡＢＰ−０１９７６株ともいう。）をコーンストーバー糖液中で育種することにより、コーンストーバー糖液でのキシロース資化能が向上しており、特許微生物寄託センター（日本国  〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９６６として、２０１４年１１月１９日に寄託されている菌（以下、ＢＰ−０１９６６株ともいう。）であることを特徴とする。
［００２１］
ＡＢＰ−０１９７６菌株は、稲わら由来の糖液中で育種を行い、発酵収率の高い菌を選択することによって得られた高効率エタノール発酵菌に、トランスアルドラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼをセルフクローニングして
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
さらに発酵収率を高めた菌である。
［００２２］
しかしながら、稲わらで育種を行い、選択したためにコーンストーバー由来の糖液中での発酵収率はさほど高くない。そこで、コーンストーバー中で育種を行うことによって、発酵収率の向上した菌を得ることができた。
［００２３］
［００２４］
［００２５］
本発明の菌は、育種とＭｅｙｅｒｏｚｙｍａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ自身の酵素遺伝子を導入した組換えによって得たものであり、カルタヘナ法に則した封じ込め策を必要としない。したがって、バイオセーフティのための特別な施設を必要とせず、従来の設備を使用することができる。
図面の簡単な説明
［００２６］
［図１］親株（Ｎ株）、ＢＰ−０１９６４株、ＡＢＰ−０１９７６株、本発明の菌株であるＢＰ−０１９６６の発酵収率を示す図。
［図２］親株（Ｎ株）、ＢＰ−０１９６４株、ＢＰ−０１９６６株のエタノール産生能を示す図。
［図３］スラリー発酵でのグルコース、キシロース資化能を示す図。
［図４］スラリー発酵、清澄液発酵での発酵収率を示す図。
発明を実施するための形態
［００２７］
以下、本件発明の菌株について以下に説明する。
実施例
【国際調査報告】
2016088278.tif 000007
2016088278.tif 000008
2016088278.tif 000009
2016088278.tif 000010