【手続補正書】
【提出日】平成23年11月15日(2011.11.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）還元性成分と、２）次に示す特性を有するＹＡＣ化合物及び／又はその塩とを含有することを特徴とする、皮膚外用剤。
＜ＹＡＣ化合物の特性＞
（１）λmaxを４０５〜４１５ｎｍと、６６０〜６７０ｎｍとに有する。
（２）図１に示す1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有する。
（３）図２に示す13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを有する。
（４）以下の条件でのＨＰＬＣ分析において、１５分前後にシングルピークを示す。
移動相：９０％アセトニトリル
カラム：ＯＤＳ４．６×２５０ｍｍ
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ．
温度：４０℃
検知：紫外部２１０ｎｍ
（５）化学組成式はＣ34Ｈ40Ｏ9であり、質量分析スペクトルは５９３（Ｍ＋Ｈ）
【請求項２】
前記還元性成分は、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体、それらの塩、エラグ酸及びその塩並びにアルブチン及びその塩から選択される１種乃至は２種以上であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤。
【請求項３】
前記ＹＡＣ化合物は、キク科ヨモギ属の植物の抽出物として含有されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の皮膚外用剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
キク科ヨモギ属の植物の抽出物中に含有される、次に示す性状を有するＹＡＣ化合物は、文献未記載の新規化合物である。
＜ＹＡＣ化合物の特性＞
（１）λmaxを４０５〜４１５ｎｍと、６６０〜６７０ｎｍとに有する。
（２）図１に示す1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有する。
（３）図２に示す13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを有する。
（４）以下の条件でのＨＰＬＣ分析において、１５分前後にシングルピークを示す。
移動相：９０％アセトニトリル
カラム：ＯＤＳ４．６×２５０ｍｍ
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ．
温度：４０℃
検知：紫外部２１０ｎｍ
（５）化学組成式はＣ34Ｈ40Ｏ9であり、質量分析スペクトルは５９３（Ｍ＋Ｈ）
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
この様な状況に鑑みて、本発明者らは、光照射により、皮膚が傷害を受けるのを防護する手段を求め、鋭意研究努力を重ねた結果、１）還元性成分と、２）次に示す特性を有するＹＡＣ化合物及び／又はその塩とを含有する皮膚外用剤がその様な特性を備えていることを見出し、発明を完成させるに至った。
＜ＹＡＣ化合物の特性＞
（１）λmaxを４０５〜４１５ｎｍと、６６０〜６７０ｎｍとに有する。
（２）図１に示す1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有する。
（３）図２に示す13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを有する。
（４）以下の条件でのＨＰＬＣ分析において、１５分前後にシングルピークを示す。
移動相：９０％アセトニトリル
カラム：ＯＤＳ４．６×２５０ｍｍ
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ．
温度：４０℃
検知：紫外部２１０ｎｍ
（５）化学組成式はＣ34Ｈ40Ｏ9であり、質量分析スペクトルは５９３（Ｍ＋Ｈ）
即ち、本発明は以下に示すとおりである。
＜１＞１）還元性成分と、２）次に示す特性を有するＹＡＣ化合物及び／又はその塩とを含有することを特徴とする、皮膚外用剤。
＜ＹＡＣ化合物の特性＞
（１）λmaxを４０５〜４１５ｎｍと、６６０〜６７０ｎｍとに有する。
（２）図１に示す1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有する。
（３）図２に示す13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを有する。
（４）以下の条件でのＨＰＬＣ分析において、１５分前後にシングルピークを示す。
移動相：９０％アセトニトリル
カラム：ＯＤＳ４．６×２５０ｍｍ
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ．
温度：４０℃
検知：紫外部２１０ｎｍ
（５）化学組成式はＣ34Ｈ40Ｏ9であり、質量分析スペクトルは５９３（Ｍ＋Ｈ）
＜２＞前記還元性成分は、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体、それらの塩、エラグ酸及びその塩並びにアルブチン及びその塩から選択される１種乃至は２種以上であることを特徴とする＜１＞に記載の皮膚外用剤。
＜３＞前記ＹＡＣ化合物は、キク科ヨモギ属の植物の抽出物として含有されることを特徴
とする、＜１＞又は＜２＞に記載の皮膚外用剤。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
＜１＞本発明の皮膚外用剤の必須成分である還元性成分
本発明の皮膚外用剤は、還元性成分を必須成分として含有することを特徴とする。本発明では、フェーリング反応などの還元性を検定する試験法に於いて陽性の成分を還元性成分として取り扱う。本発明で言う還元性成分を具体的に例示すれば、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体、それらの塩等のアスコルビン酸関連物質、エラグ酸、グラブリジン、センタウレイジン、クラリノン、グラブレン、イソフラボン、イソフラバノンなどのポリフェノール性物質とその塩、ハイドロキノン、アルブチン及びその塩等のハイドロキノン類等が好適に例示でき、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体、それらの塩、エラグ酸及びその塩並びにアルブチン及びその塩等が特に好ましく例示できる。
これらの成分は唯一種を含有させることも出来るし、二種以上を組み合わせて含有させることもできる。本発明の皮膚外用剤に於いて、かかる成分は後記のＹＡＣ化合物とともに働いて、皮膚が光照射によって受けた傷害を初期状態で消去せしめる作用を有する。この様な効果を奏するためには、かかる還元性成分は、総量で皮膚外用剤全量に対して、０．０１〜１０質量％含有されるのが好ましく、より好ましくは０．１〜５質量％である。かかる含有量が少ない場合には、前記効果を奏さない場合が存し、多すぎると効果が頭打ちになり、徒に処方の自由度を損なう場合が存する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
＜２＞本発明の皮膚外用剤の必須成分であるＹＡＣ化合物
本発明の皮膚外用剤の必須成分であるＹＡＣ化合物は次に示す性状を有することを特徴とする。
（性状）
（１）λmaxを４０５〜４１５ｎｍと、６６０〜６７０ｎｍとに有する。
（２）図１に示す1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有する。
（３）図２に示す13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを有する。
（４）以下の条件でのＨＰＬＣ分析において、１５分前後にシングルピークを示す。
（５）化学組成式はＣ34Ｈ40Ｏ9であり、質量分析スペクトルは５９３（Ｍ＋Ｈ）
本発明の化粧料の必須成分であるＹＡＣ化合物の紫外・可視吸収スペクトルは図４に示す。この図より、４０５〜４１５ｎｍと、６６０〜６７０ｎｍとにλmaxが存する特徴が明確に判別できる。本発明の化粧料の必須成分であるＹＡＣ化合物を特定する場合、かかる紫外・可視部吸収特性は非常に有利である。即ち、多波長の検出器を備えたＨＰＬＣを用いて、２１０ｎｍの吸収で分析し、ピークについて４０５〜４１５ｎｍと、６６０〜６７０ｎｍとの吸収を確認し、同様に強い吸収が認められた場合には、本願発明のＹＡＣ化合物である蓋然性が非常に高い。この意味で有力な確認手段となる。本願発明のＹＡＣ化合物は、極性溶媒抽出物の非極性部分に存在する。この為、溶媒で抽出し、抽出溶媒を減圧濃縮などで除去した後に酢酸エチルと水で分液し、酢酸エチル相を採取することにより、濃縮することが出来る。このものをシリカゲルカラムクロマトグラフィーなどを用いて、クロロホルム／メタノール混液系で分画精製することにより単離することが出来る。単離したかどうかについては、以下の条件のＨＰＬＣ分析でシングルピーク（リテンションタイム１５分前後）であるか否かを判別することにより特定することが出来る。図３に分析例を示す。この場合のリテンションタイムは１４．７分である。
（ＨＰＬＣ条件）
移動相：９０％アセトニトリル
カラム：ＯＤＳ４．６×２５０ｍｍ
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ．
温度：４０℃
検知：紫外部２１０ｎｍ
（５）化学組成式はＣ34Ｈ40Ｏ9であり、質量分析スペクトルは５９３（Ｍ＋Ｈ）
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
＜３＞本発明の皮膚外用剤
本発明の皮膚外用剤は、前記必須成分を含有し、光照射の傷害が皮膚細胞に生ずることを抑制する効果を有する。本発明の皮膚外用剤は光の照射に先だって皮膚に投与され、光照射で皮膚が受けたダメージを初期段階で消去する作用を有する。本発明の皮膚外用剤は、皮膚外用医薬、化粧料（医薬部外品を包含する）、皮膚外用雑貨等に適用されるが、化粧料に適応されることが特に好ましい。化粧料としては、例えば、ローション、乳液、クリームなどの基礎化粧料に好ましく適用される。特に好ましい系は乳化剤形であり、油中水乳化剤形の内水相に含有されることが好ましい。油中水乳化剤形としては、例えば、「ベントン３８Ｖ」という名称で市販されている、ジメチルジステアリルアンモニウムクロリド変性ヘクトライトのような有機変性粘土鉱物０．１〜１０質量％とポリエーテル変性メチルポリシロキサン０．１〜５質量％を組み合わせて界面活性剤とした乳化系などが好ましく例示できる。
移動相：９０％アセトニトリル
カラム：ＯＤＳ４．６×２５０ｍｍ
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ．
温度：４０℃
検知：紫外部２１０ｎｍ
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
＜製造例１＞
キク科ヨモギ属ヨモギの全草の乾燥物１００ｇを、細切した後、５００ｍｌのメタノールを加えて３時間、加熱還流し、冷却後濾過にて不溶物を取り除いた後、減圧濃縮し、ついで凍結乾燥し、抽出物１を得た。しかる後に、抽出物１に２００ｍｌの水と２００ｍｌの
酢酸エチルを加え、液液抽出を行い、酢酸エチル相をとり、減圧濃縮し、分画１を得た。分画１を減圧濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて分画精製した。即ち、シリカゲルをクロロホルムで濡らし、カラムに充填し、クロロホルムに溶解させた分画１の濃縮物をチャージし、クロロホルム、１％メタノール含有クロロホルム、５％メタノール含有クロロホルム、１０％メタノール含有クロロホルム次いで１５％メタノール含有クロロホルムを５０ｍｌ流し、流出分を減圧濃縮した。これらの分画を順に分画２、分画３、分画４、分画５、分画６とした。分画１〜６についてα−ジケトンの切断活性を調べたところ、分画３が最も高く４８％であった。分画３を更にクロロホルム・メタノール混液系を溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーで４回精製し（１回目 クロロホルム：メタノール＝１００：０→１：１、２回目 クロロホルム：メタノール＝１００：２→９：１、３回目 クロロホルム：メタノール＝１００：５→８：２、４回目 クロロホルム：メタノール＝１００：０→１００：５）、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（展開溶媒クロロホルム：メタノール＝９５：５）で、５０％硫酸水溶液焼付での呈色でシングルスポットであるアモルファスの分画７を得た。このもののＮＭＲを図１、図２に示す。ＨＰＬＣ（条件は下記の通り）でのチャートを図３に示す。又、紫外部吸収スペクトルは図４に示す。これらの結果より、構造そのものは不明であるものの、分画７は単一物質であることが推測される。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
＜光に対する効果＞
96ウェルのプレートに、ウェル当り５×１０4cellsずつヒト表皮正常メラノサイト（クラボウ）を播種し、Medium 154S培地（クラボウ）にて３７℃、５％CO2の条件下２４時間培養した。サプリメントを添加していないDefined ケラチノサイト −SFM培地（ギブコBRL
）１００μｌに培地交換後、１μｇ／ｍＬ（終濃度）の分画７の存在下、１μｇ／ｍＬ（終濃度）のアスコルビン酸グルコシドの存在下、１μｇ／ｍＬ（終濃度）の分画７と１μｇ／ｍＬ（終濃度）のアスコルビン酸グルコシドの存在下３日間培養を続け、培地を検体を含まないDefined ケラチノサイト −SFM培地（ギブコBRL）１００μｌに交換後、紫外線１０ｍＪを照射し、TaKaRa社より市販されているLDH detection kitを用いて、アポトーシス細胞を定量化した。 陽性対照は紫外線を照射し検体を含まないものとし、陰性対照としては紫外線非照射で検体を含まないものとした。陽性対照のアポトーシス抑制率を０％、陰性対照のアポトーシス抑制率を１００％とし、検体のアポトーシス抑制率を算出した。結果を表２に示す。これより、組合せによりアポトーシスを抑制していることが判る。即ち前記の試験と組み合わせるならば、分画７と還元性成分との組合せにより、光照射で亢進するＭＭＰが細胞に損傷を与え、これがアポトーシスを誘導するのを防いでいると推測される。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
【図１】分画７の化合物の1Ｈ−ＮＭＲを示す図である。
【図２】分画７の化合物の13Ｃ−ＮＭＲを示す図である。
【図３】分画７の化合物のＨＰＬＣチャートを示す図である。
【図４】分画７の化合物の紫外吸収スペクトルを示す図である。
【図５】製造例１における分画７のグルコース−牛血清アルブミンＡＧＥｓ分解能を示す図である。
【図６】分画７の化合物の質量分析スペクトルを示す図である。