【手続補正書】
【提出日】平成24年6月14日(2012.6.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
貫通した空孔が複数配置されているシートを用意するシート用意工程と、
用意された細胞を担持させた粒子の懸濁液体を前記シートに接触させる接触工程とを含む細胞保持方法であり、前記空孔が液体とともに前記粒子の１つのみをその空孔内に保持する大きさであることを特徴とする細胞保持方法。
【請求項２】
前記空孔が、対象となる１つの前記粒子を保持可能であり、且つ２つ以上の前記粒子は保持できない大きさであることを特徴とする請求項１に記載の細胞保持方法。
【請求項３】
前記空孔の開口面積が前記粒子の最大断面積の１．０５倍から２．６３倍の範囲内であることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞保持方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか一項に記載の細胞保持方法で細胞を保持する保持工程と、
前記細胞に対する試験を行うために前記細胞に物質を投与する投与工程とを含む細胞試験方法。
【請求項５】
貫通した空孔が複数配置されているシートを保持するための保持手段と、前記シートの空孔に細胞を担持させた粒子を液体と共に配置させるための配置手段と、
以下の手段（Ａ）から手段（Ｅ）の少なくとも１つの手段とを有する細胞処理装置。
（Ａ）前記シートの周囲環境を所定の環境に制御するための制御手段、
（Ｂ）前記シートの空孔に保持された前記粒子の状態を観察するための観察手段、
（Ｃ）前記シートの空孔に保持された前記粒子を前記シートから移送するための移送手段、
（Ｄ）前記シートの空孔の位置を認識する認識手段、
（Ｅ）前記シートの空孔内の液体交換を行うための液体交換手段。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
また、本発明の細胞処理装置は、貫通した空孔が複数配置されているシートを保持するための保持手段と、前記シートの空孔に細胞を担持させた粒子を液体と共に配置させるための配置手段と、以下の手段（Ａ）から手段（Ｅ）の少なくとも１つの手段とを有することを特徴とする。
（Ａ）前記シートの周囲環境を所定の環境に制御するための制御手段、
（Ｂ）前記シートの空孔に保持された前記粒子の状態を観察するための観察手段、
（Ｃ）前記シートの空孔に保持された前記粒子を前記シートから移送するための移送手段、
（Ｄ）前記シートの空孔の位置を認識する認識手段、
（Ｅ）前記シートの空孔内の液体交換を行うための液体交換手段。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明で取り扱う細胞とは、付着依存性細胞、浮遊性細胞、スフェロイド（凝集塊細胞）等をいう。また、その具体的な例として、ヒト子宮頸癌細胞系の細胞、神経細胞、肝細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、幹細胞、中胚葉系幹細胞、胚性幹細胞、グリア細胞、胎性幹細胞、造血幹細胞、肥満細胞、脂肪細胞、神経幹細胞、血球細胞が挙げられる。また、本発明は、主にバイオアッセイに用いる細胞に対して保持、試験及び処理を目的とするため、シート毎に一種類の細胞を粒子３に担持させることが好ましい。これにより、バイオアッセイに必要な数の単一種類の細胞を迅速に且つばらつきが少なく、個別に配列させて保持し、効率よく培養、試験することができる。
ただし、本発明は、１つのシートに２種類以上の細胞を担持させることを制限するものではない。また、異なる種類の細胞を１つのシートに担持させる場合には、シートの保持領域を区分し、区分された各領域に、それぞれ異なる種類の細胞を担持する粒子を配置するとよい。また、領域ごとに区分せずにランダムに粒子を配置する場合は、各粒子に標識（着色等）処理を施し、該標識によって担持される細胞を判別してもよい。また、同一粒子に２種以上の細胞を担持させてもよい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
また、２つ以上の粒子が保持できない大きさとは、少なくとも空孔２に対して２つの粒子の最大断面を幾何学的に配置できない大きさを示す。空孔２の開口面積が粒子の最大断面積の１．０５倍未満であれば空孔２に粒子が配置されにくく、また２．６３倍を超えると複数個配置する場合が多くなる。また、同一のべース１に異なる複数面積の空孔２が設けられていてもよい。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
また、前記シートは、ベース１に複数の貫通した空孔２を有する。その配置は、ベース１のいかなる領域でもよいが、規則的に配列される方が後述する細胞に対する試験や細胞に対する処理の自動化にとって好ましい。また、１つのベース１に設けられる空孔２の個数や配置密度について何ら制限はない。操作上の観点からは、空孔２の直径がおよそ１ｍｍ程度であれば、配置密度が１０個／ｃｍ２〜１００個／ｃｍ２の範囲にあることが好ましい。すなわち１０個／ｃｍ２未満であれば、空孔以外の面積が広く、その領域に水滴が孤立しやすくなる。従って該水滴と共に空孔２以外の領域に粒子が配置され、配列の効率が低下する。また、１００個／ｃｍ２を超えると、空孔２の間の距離が十分取れないために、その後の取り扱いで粒子３を保持する液体４が隣の空孔２で粒子３保持する液体と交じり合う等コンタミネーションしやすくなる不具合が起こりやすい。すなわち、前記シートの面積と空孔２の面積の比（開口率）は、７．９％〜７８．５％の範囲に入ることが好ましい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
液体交換部位を設けたシートの一例を図４に示す。図４においては、１つの粒子３を保持可能な貫通した空孔（粒子保持部位）６に連通した液体交換部位７が設けられている。また、液体交換をより効率的に行うために空孔（粒子保持部位）６に対して連通した複数の液体交換部位７、８を設けても良い。液体交換部位７は、粒子３を保持する空孔（粒子保持部位）６より面積の小さい空孔が好ましい。すなわち、粒子３を保持する空孔（粒子保持部位）６と同等もしくそれ以上の大きな面積であれば、液体交換部位に粒子が保持されて目的の液体交換が難しくなる。また、液体交換部位は貫通した空孔でなく、底のある窪み（ウェル）で構成されることが好ましい。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
本実施形態において前記シートの空孔２内で、粒子３に担持された細胞を培養することが出来る。よって、本実施形態では、貫通した空孔を有するシート９（図９を参照）に細胞を担持した粒子３を保持した後に、貫通した空孔を有するシート９の空孔２内で細胞を培養させる細胞培養工程を有する複数細胞を用いた培養方法を含むことができる。また、細胞培養工程においては細胞増殖のために細胞の各々に対して物質（例えば、細胞の生存を維持するための栄養物質など）を投与することが好ましい。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
（第三実施形態）
本発明の第三実施形態は、細胞処理装置で、少なくとも、貫通した空孔が複数配置されているシートを保持するための保持手段と、前記シートの空孔に細胞を担持させた粒子を液体と共に配置させるための配置手段とを有するうえ、（Ａ）前記シートの周囲環境を所定の環境に制御するための制御手段と、（Ｂ）前記シートの空孔に保持された前記粒子の状態を観察するための観察手段と、（Ｃ）前記シートの空孔に保持された前記粒子を前記シートから移送するための移送手段と、（Ｄ）前記シートの空孔の位置を認識する認識手段と、及び（Ｅ）前記シートの空孔内の液体交換を行うための液体交換手段と、から少なくとも１つの手段を有する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
本実施形態の細胞処理装置の概略は、図９に示されている。本実施形態の配置手段は、可動性ホルダー１０によって構成される。細胞を担持させた粒子３を保持したシート９は可動性ホルダー１０に固定される。可動性ホルダー１０は、シート９をＸ−Ｙの２軸方向に可動させることが出来る。ここで、Ｙ方向は、図９のＸ方向１１に対して垂直な方向（紙面に垂直な方向）を示す。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
本実施形態の付与手段は、化学物質を細胞に作用させる手段として、８ｐｌの液滴を吐出する一軸方向（Ｘ軸）に可動性のインクジェット装置１４によって構成される。
本実施形態の観察手段は、照明部２２及びモニター１５等で構成され、細胞の状態及び変化を画像として捉える手段である。
具体的には、細胞の形状については、前記シート９に保持されている細胞に対して、照明部２２から可視光（白色光：波長３００〜９００ｎｍ）をシート９に保持した粒子３に照射しながらシート９の下方に具備したＣＣＤカメラ（撮像部）２３などで明視野画像を撮影する。ＣＣＤカメラ（撮像部）２３は、シート９の上方、すなわち照明部２２と同じ側に設けることもできる。また、ＣＣＤカメラと細胞との間にレンズ系を備えて細胞を拡大してより細部を観察することもできる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
本実施形態の移送手段は、シート９の特定の空孔２内から他の容器に粒子３を容易に移送する手段である。具体的な例としては、棒状のピンで直接押す方法や空気圧を利用してエアーを吹き付ける方法などを用いることが出来る。また、エアーの代わりに水圧を利用しても良い。粒子３に担持されている細胞に与えるダメージを少なくするには空気圧を利用する方法が好ましい。さらにシート９の下方に容器を配置することで特定の粒子を簡便に高速に特定の容器（例えば、収集容器２１）に移送することが可能になる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
本実施形態の認識手段はセンサー部１７により構成される。具体的に、制御部１６は、シート９の空孔２の位置を認識するセンサー部１７（認識手段（Ｄ））から位置情報を受け取り、可動性ホルダー１０を介してシート９の空孔位置を制御する。
本実施形態の液体交換手段として、Ｚ軸方向２８に可動させることのできる液体交換装置２９を備えている。液体交換装置２９にはガラス製のキャピラリー２４（外径０．６８ｍｍ、内径０．２０ｍｍ）が２本取り付けてあり、送液ポンプ２５を介して、一方は供給液容器２６に、他方は廃液容器２７に接続されている。液体交換を行う場合には、液体交換装置をＺ軸方向に移動させて、キャピラリーの先端をシート９の液体交換部位に、接触させる。次に送液ポンプ２５を駆動して、供給液容器内の液体を供給すると同時に排出させて除く。交換する液体は、電磁バルブ３０を切り替えることにより種類を選択することができる。また。複数の空孔の液体交換を同時に行うために、液体交換装置に複数のキャピラリーを配置することもできる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
直径１０ｃｍのシャーレにガラスビーズを敷き詰め、１０％ウシ胎児血清含有DMEM培地を１２ｍＬ加えた。このシャーレにＨｅＬａ細胞を播種し、３７℃、５％二酸化炭素の条件下に培養することによって、ガラスビーズ上にＨｅＬａ細胞を付着させた。
Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ水溶液を添加することで生細胞を蛍光染色した。
ＨｅＬａ細胞が表面に付着されたガラスビーズの懸濁液１００ｍｌ（２０個／ｍｌ）を前記シートに上部から静かに注ぎ、接触させた後、前記シートから余剰の液体を除去することで、前記空孔中に存在する液体とともに前記シートの空孔の各々に前記ガラスビーズを保持させた。前記シート上の余剰の液体はシートを傾けて落とし、開口部以外の場所に水滴が残らないようにした。
上記の方法で得られたガラスビーズを配置した前記シートの各開口部（空孔）を実体顕微鏡（ライカ社製、Ｓ８ＡＰ０）で観察して各空孔内のガラスビーズの保持状態を観察した。図７に示す様に、ガラスビーズが配置されていることを明瞭に観察することができた。また、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社製
Ｐａｓｃａｌ Ｅｘｃｉｔｅｒ）を用いてガラスビーズ上のＨｅＬａ細胞を観察した。図８に示す様にガラスビーズ上の細胞の形態を明瞭に観察することができた。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
各３種類の細胞の１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ懸濁液を、トリプシン−ＥＤＴＡ処理により回収した。各懸濁液をそれぞれ異なる容器で前記コラーゲンコートポリスチレン粒子と混合し、攪拌しながら培養（３２ｒｐｍ、３７℃、５％二酸化炭素）した。
図５に示す寸法の液体交換部位を設けたシートを使用し、前記コラーゲンコートポリスチレン粒子を含む懸濁液を前記シート上へ静かに注ぎ、接触させた後、前記シートから余剰の液体を除去することで、前記空孔中に存在する液体と共に前記シートの各空孔に前記コラーゲンコートポリスチレン粒子を保持させた。前記シート上の余剰の液体はシートを傾けて落とし、開口部以外の場所に水滴が残らないようにした。この操作を各３種類の細胞に対してそれぞれ別のシートを用いて行った。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
（ＨＥＲ２発現量パラメータの計測）
ブロッキングバッファーへの置換、洗浄、１次抗体溶液滴下、洗浄、２次抗体溶液滴下、洗浄、ＨＲＰの化学発光基質の滴下操作を順次行い、発光量をＣＣＤカメラにて検出した。前記生細胞数パラメータで規格化したＨＥＲ２発現量パラメータの値はＢＴ−２０＜ＭＤＡ−ＭＢ−４５３＜ＳＫ−ＢＲ−３となり、細胞で発現しているタンパク質（ＨＥＲ２発現量）を評価定量する試験を行うことができた。上記試薬を滴下せずに、培養メディウムのみで保持した粒子に対して、圧縮空気供給装置１８から電磁バルブ１９を経由してガス噴射ノズル２０（移送手段（Ｃ））から空気を噴射して、下部に設置された個々の収集容器２１に粒子を落下させた。容器には、培養メディウムが入っていて、回収した細胞をさらに増殖させることができた。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
（実施例３）
（各空孔２に保持された細胞数のばらつき）
実施例２と同様にして、コラーゲンコートポリスチレン粒子に３種類のヒト乳癌細胞（ＢＴ−２０、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、及びＳＫ−ＢＲ−３）を個別に担持させ培養した。図６に示す２２３６個の空孔２が最密に形成されたシートに、コラーゲンコートポリスチレン粒子の懸濁液１００ｍｌ（２０個／ｍｌ）を上部から静かに注ぎ、接触させた後、余剰の液体を除去することで、空孔の各々に細胞担持ビーズを保持させた。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
実施例２に例示した処理装置でＣａｌｃｅｉｎ ＡＭ水溶液を細胞に添加した。生細胞数パラメータ（５１７ｎｍの蛍光量）を各空孔について計測し、各空孔内に保持された細胞数のばらつきσ１を次のようにして計算した。
すなわち各空孔の蛍光量計測値をｆｉとすると、下記数１で算出した平均蛍光量（ただしｎは計測した空孔の数であり、n=2236である）を用いて、下記数２で計算した。
【数１】
2010273655.tif 000001
【数２】
2010273655.tif 000002
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
異なる細胞保持系で計測・計算されたσ１及びσ２を比較すると、BT-20、MDA-MB-453、及びSK-ＢＲ-３の全ての細胞株について、σ２＞σ１であることがわかった。これはマルチウェルプレートへの細胞保持系では播種の際のばらつきが各ウェルで固定されるのに対して、コラーゲンコートポリスチレン粒子との混合培養系では攪拌工程の際に、各粒子に担持される細胞数のばらつきが減少されるためと推察される。
またマルチウェルプレートを用いる系では各ウェルへの分注作業に時間を要し、この間に細胞の懸濁状態が変化してしまうため、ばらつきが大きくなってしまうものと推察される。すなわち本発明の細胞保持方法によれば、２２００個以上のアドレス可能な貫通した空孔に迅速にばらつき少なく細胞を保持することが可能となる。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
１：  ベース（基体）
２：  貫通した空孔
３：  粒子
４：  液体
５：  液滴の着弾位置
６：  粒子保持部位
７、８：  液体交換部位
９： シート
１０：  可動性ホルダー
１１：  Ｘ軸方向
１２：  チャンバー
１３：  温湿度制御装置
１４：  インクジェット装置
１５：  モニター
１６：  制御部
１７：  センサー部
１８：  圧縮空気供給装置
１９：  電磁バルブ
２０：  ガス噴射ノズル
２１：  収集容器
２２：  照明部
２３：  CCDカメラ
２４：  キャピラリー
２５：  送液ポンプ
２６：  供給液容器
２７：  廃液容器
２８：  Ｚ軸方向
２９：  液体交換装置
３０：  電磁バルブ