【手続補正書】
【提出日】平成24年2月16日(2012.2.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
下記一般式（１）で表される化合物、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分とする、プロトンポンプ阻害剤。
【化１】
2010202586.tif 000001
[式中、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立に、水素原子又はプレニル基を表し、Ｒ3、Ｒ6及びＲ7は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、又はプレニル基を表し、Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、又はプレニル基を表す。ただし、Ｒ4とＲ5が結合して環を形成し、式（２）で表される基を表してもよい。]
【化２】
2010202586.tif 000002
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
前記一般式（１）で表される化合物が、下記一般式（３）に表される化合物、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩であることを特徴とする、請求項１に記載のプロトンポンプ阻害剤。
【化３】
2010202586.tif 000003
[式中、Ｒ8、Ｒ11及びＲ12は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、又はプレニル基を表し、Ｒ9及びＲ10は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、又はプレニル基を表す。ただし、Ｒ9とＲ10が結合して環を形成し、式（２）で表される基を表してもよい。]
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４】
プロトンポンプ阻害剤が、Ｎａ+／Ｈ+交換輸送系である、請求項１〜３の何れか一項に記載のプロトンポンプ阻害剤。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
【化１】
2010202586.tif 000004
[式中、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立に、水素原子又はプレニル基を表し、Ｒ3、Ｒ6及びＲ7は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、又はプレニル基を表し、Ｒ4及びＲ5は、そ
れぞれ独立に、水素原子、水酸基、又はプレニル基を表す。ただし、Ｒ4とＲ5が結合して環を形成し、式（２）で表される基を表してもよい。]
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
ＡＴＰ分解エネルギーを利用して細胞膜の内外におけるイオンを、イオン濃度勾配に逆らって能動輸送する働きをする膜タンパク質として、膜ＡＴＰａｓｅが知られている。膜ＡＴＰａｓｅは、輸送するイオンによりＮａ+／Ｋ+−ＡＴＰａｓｅ、Ｈ+−ＡＴＰａｓｅ、Ｃａ2+−ＡＴＰａｓｅなどに分類される。特に、細胞膜の内外におけるプロトン濃度を維持する働きを担うＨ+−ＡＴＰａｓｅとしては、ミトコンドリア内膜に存在するＦ型ＡＴＰａｓｅ群、細胞内の液胞などの細胞膜に存在するＶ型ＡＴＰａｓｅ群、形質膜に存在するＰ型ＡＴＰａｓｅ群が報告されている。Ｐ型ＡＴＰａｓｅに分類されるＨ+／Ｋ+−ＡＴＰａｓｅは、胃壁細胞内の分泌小胞に存在し、胃酸分泌に深く関与することが明らかとなっており、胃潰瘍の治療薬の創薬標的分子として注目されている（例えば、特許文献１を参照）。また、あらゆる細胞に存在するＮａ+／Ｋ+−ＡＴＰａｓｅ と共役的に働くＮａ+／Ｈ+交換輸送蛋白質（ＮＨＥ）は、細胞内のプロトンと細胞外のナトリウムをＡＴＰ非依存的に交換することにより、細胞内のプロトン濃度を調整する（例えば、非特許文献１を参照）。細胞内外におけるプロトン濃度変化は、細胞内外に存在するイオンチャネルや酵素などの生体内分子の機能及び活性に大きく影響を与える（例えば、非特許文献２を参照）。このため、Ｈ+−ＡＴＰａｓｅ及びＮａ+／Ｈ+交換輸送蛋白質（ＮＨＥ）に代表される細胞膜の内外におけるプロトン濃度を維持する働きを担う生体内分子は、細胞内プロトン濃度により機能が変化する生体機能分子が関与する本態性高血圧、不整脈、狭心症、心肥大、糖尿病、虚血若しくは虚血性再潅流による臓器障害、脳虚血障害等の予防又は治療薬に対する創薬標的分子として注目されている。特に、細胞内プロトンを細胞外に輸送することによる胃酸分泌を抑制するプロトンポンプ阻害剤は、直接的に胃酸分泌を抑制する抗潰瘍薬として開発されている。さらに、細胞又は細胞小器官内におけるプロトン濃度を調整し、様々な機能分子（イオンチャネル、酵素等）の活性を制御するプロトンポンプ阻害剤は、プロトン濃度が関与する様々な疾患治療に対し効果が期待されるが、実際には、稀にアナフィラキシー等の副作用を発現する場合が存し、この様なアレルギーに対応する為、同薬効を示す別構造の化合物開発が課題となっている。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
プロトンポンプ阻害剤としては、胃潰瘍治療薬であるオメプラゾール、ランソプラノール等のベンズイミダゾール誘導体がよく知られ、現在、医薬品として使用されている。また、Ｎａ+／Ｈ+交換輸送系を選択的に阻害する化合物としては、エチルイソプロピルアミロリド（ＥＩＰＡ）（例えば、非特許文献２を参照）、グアニジン誘導体（例えば、特許文献２を参照）、イソフラボン誘導体又はキサントン誘導体（例えば、特許文献３を参照）が、既に報告されている。しかしながら、それらの生物活性は十分に満足のいくものではなく、より高い活性及び選択性を有し、体内動態に優れ、副作用の少ない新しい骨格の阻害剤が望まれている。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
さらに、一般式（１）に表される化合物であるフラバノン誘導体は、マメ科ハギ属の植物中に含有されることは既に知られている（例えば、特許文献７を参照）が、一般式（１）に表される化合物、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩、更には、これらを含有するマメ科に属する植物より得られる抽出物が、プロトンポンプ阻害作用、Ｎａ+／Ｈ+交換輸送系阻害剤を有し、本態性高血圧、不整脈、狭心症、心肥大、糖尿病、虚血若しくは虚血性再潅流による臓器障害、脳虚血障害等、色素異常の改善に好適であることは全く知られていない。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
【化３】
2010202586.tif 000005
[式中、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立に、水素原子又はプレニル基を表し、Ｒ3、Ｒ6は及びＲ7、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、又はプレニル基を表し、Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、又はプレニル基を表す。ただし、Ｒ4とＲ5が結合して環を形成し、式（２）で表される基を表してもよい。]
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
【化５】
2010202586.tif 000006
[式中、Ｒ8、Ｒ11及びＲ12は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、又はプレニル基を表し、Ｒ9及びＲ10は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、又はプレニル基を表す。ただし、Ｒ9とＲ10が結合して環を形成し、式（２）で表される基を表してもよい。]
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
＜３＞ 一般式（３）で表される化合物が、Euchrenone a６、Euchrenone a３、amorisinであることを特徴とする、＜１＞又は＜２＞に記載のプロトンポンプ阻害剤。
＜４＞ プロトンポンプ阻害剤が、Na+／H+交換輸送系である、＜１＞〜＜３＞の何れかに記載のプロトンポンプ阻害剤。
＜５＞ ＜１＞〜＜４＞の何れかに記載のプロトンポンプ阻害剤を含有することを特徴とする、組成物。
＜６＞ ＜１＞〜＜４＞の何れかに記載のプロトンポンプ阻害剤を、マメ科ハギ属の植物抽出物として含有することを特徴とする、＜５＞に記載の組成物。
＜７＞ マメ科ハギ属の植物が、キハギ又はトウクサハギであることを特徴とする、＜５＞又は＜６＞に記載の組成物。
＜８＞ 前記一般式（１）に表される化合物及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩が、組成物全量に対し、０．００００１質量％〜５質量％含有されることを特徴とする、＜５＞〜＜７＞の何れかに記載の組成物。
＜９＞ 経口又は経皮投与組成物であることを特徴とする、＜５＞〜＜８＞の何れか一項に記載の組成物。
＜１０＞ 食品、医薬品又は化粧料であることを特徴とする、＜５＞〜＜９＞の何れかに記載の組成物。
＜１１＞ 高血圧症、不整脈、狭心症、心肥大、糖尿病、虚血若しくは虚血再潅流による臓器障害、脳障害、骨粗鬆症、胃潰瘍の予防薬又は治療薬、色素異常の改善用であることを特徴とする、＜５＞〜＜１０＞の何れかに記載の組成物。
＜１２＞ マメ科ハギ属の植物体を溶媒で抽出し、該抽出物を分画し、分画に於けるプロトンポンプ阻害作用を計測し、該プロトンポンプ阻害作用を有する分画を集めて組成物に含有せしめることを特徴とする、＜５＞〜＜１１＞の何れかに記載の組成物。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
＜１＞ 本発明のプロトンポンプ阻害剤の有効成分である一般式（１）に表される化合物
本発明のプロトンポンプ阻害剤は、前記一般式（１）に表される化合物、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分とすることを特徴とする。また、本発明におけるプロトンポンプ阻害剤としては、一般的にプロトンポンプと呼ばれる細胞膜に存在し能動的なプロトン輸送を担うＨ+−ＡＴＰａｓｅのみならず、Ｎａ+／Ｋ+−ＡＴＰａｓｅ等のイオンポンプと共役的に働き受動的にプロトンを輸送するＮａ+／Ｈ+交換輸送体などに作用し、細胞又は細胞小器官内におけるプロトン輸送を阻害することにより、細胞又は細胞小器官内の酸性化を誘引する物質も包含する。ここで、一般式（１）に表される化合物に付いて述べれば、一般式（１）に於いて、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立に、水素原子又はプレニル基を表し、Ｒ3、Ｒ6及びＲ7は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、又はプレニル基を表し、Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、又はプレニル基を表す。ただし、Ｒ4とＲ5が結合して環を形成し、式（２）で表される基を表してもよい。前記Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立に、水素原子又はプレニル基を表し、より好ましくは、プレニル基が好適に例示出来る。前記Ｒ3、Ｒ6及びＲ7は、それぞれ独立に水素原子、水酸基、又はプレニル基を表し、より好ましくは、Ｒ3及びＲ7に関しては、水素原子又は水酸基が、Ｒ6に関しては、水素原子又はプレニル基が、好適に例示出来る。前記Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、プレニル基、又は、Ｒ4とＲ5が結合して環を形成した前記式（２）で表される基を表し、より好ましいものとしては、水酸基、プレニル基、又は前記式（２）に表される基が好適に例示出来る。一般式（１）に表される化合物の内、より好ましいものとしては、一般式（３）に表される化合物が好適に例示出来、これらの内、さらに好ましいものとしては、Euchrenone a６（化合物１）、Euchrenone a３（化合物２）、amorisin（化合物３）が好適に例示出来る。一般式（１）に表される化合物の内、プロトンポンプ阻害作用が認められないLespedezaflavanone H(化合物４）は、除かれることが好ましい。また、本発明において、プロトンポンプ阻害作用を有する物質とは、後述するヒト正常メラノサイト（ＮＨＥＭ）を用いたメラノソーム内酸性化検出（プロトンポンプ阻害作用）試験において、レーザー顕微鏡による目視観察にて、コントロールに比較し評価物質処理により、ｐＨ感受性蛍光色素の発色強度が増強している場合を意味する。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
ここで一般式（３）に表される化合物に付いて述べれば、一般式（３）に於いてＲ8、Ｒ11及びＲ12は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、又はプレニル基を表し、Ｒ9及びＲ10は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、又はプレニル基を表す。ただし、Ｒ9とＲ10が結合して環を形成し、式（２）で表される基を表してもよい。前記Ｒ8、Ｒ11及びＲ12は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、又はプレニル基を表し、より好ましくは、Ｒ8及びＲ12に関しては、水素原子又は水酸基が、Ｒ11に関しては、水素原子又はプレニル基が、好適に例示出来る。前記Ｒ9及びＲ10は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、プレニル基、又は、Ｒ9とＲ10が結合して環を形成した式（２）に表される基を表し、より好ましくは、水酸基、プレニル基、又はＲ9とＲ10が結合して環を形成した式（２）に表される基が好適に例示出来る。ここで、一般式（３）に表される化合物に付いて具体例を挙げれば、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[２，２−ジメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−６−イル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[５−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−６−イル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビ
ス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[７−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−６−イル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[５、７−ジヒドロキシ−２，２−ジメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−６−イル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[２，２−ジメチル−５−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２Ｈ−１−ベンゾピラン−６−イル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[２，２−ジメチル−７−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２Ｈ−１−ベンゾピラン−６−イル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[２，２−ジメチル−５，７−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２Ｈ−１−ベンゾピラン−６−イル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[２，２−ジメチル−５−ヒドロキシ−７−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２Ｈ−１−ベンゾピラン−６−イル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[２，２−ジメチル−７−ヒドロキシ−５−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２Ｈ−１−ベンゾピラン−６−イル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−（４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[２−ヒドロキシフェニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[３−ヒドロキシフェニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[４−ヒドロキシフェニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[２−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）フェニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[３−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）フェニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[４−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）フェニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２���３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[２−ヒドロキシ−３−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）フェニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[２−ヒドロキシ−４−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）フェニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[２−ヒドロキシ−５−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）フェニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[３−ヒドロキシ−２−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）フェニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[３−ヒドロキシ−４−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）フェニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[３−ヒドロキシ−５−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）フェニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[４−ヒドロキシ−２−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）フェニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[４−ヒドロキシ−３−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）フェニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[４−ヒドロキシ−５−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）フェニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[５−ヒドロキシ−２−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）フェニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[５−ヒドロキシ−３−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）フェニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[５−ヒドロキシ−４−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）フェニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[５−ヒドロキシ−４−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）フェニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[２，３−ジヒドロキシ−４−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）フェニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[２，３−ジヒドロキシ−５−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）フェニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[２，４−ジヒドロキシ−３−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）フェニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[２，５−ジヒドロキシ−３−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）フェニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[２，５−ジヒドロキシ−４−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）フェニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[３，４−ジヒドロキシ−２−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）フェニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[３，４−ジヒドロキシ−５−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）フェニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩などが好適に例示出来、これらの内、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[７−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−６−イル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[４−ヒドロキシ−３−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）フェニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[３，４−ジヒドロキシ−５−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）フェニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩が好ましく例示出来、さらに好ましくは、後記の（２S）−６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[７−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−６−イル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン（化合物１、Euchrenone a６）、（２Ｓ）−６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[４−ヒドロキシ−３−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）フェニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン（化合物２、Euchrenone a３）、（２Ｓ）−６，８−ビス（３−メチル−２−ブテン−１−イル）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−[３，４−ジヒドロキシ−５−（３−メチル−２−ブテン−１−イル）フェニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン（化合物３、amorisine）が好ましく例示出来る。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
かかる成分は、細胞膜に存在するプロトンポンプ（Ｈ+−ＡＴＰａｓｅ）阻害作用、又は、イオンポンプであるＮａ+／Ｋ+−ＡＴＰａｓｅと共役的に働くＮａ+／Ｈ+交換輸送系などのプロトンポンプに作用し、細胞又は細胞小器官に於けるプロトン輸送を阻害することにより細胞又は細胞内小器官内における酸性化を誘引する作用に優れる。この様な作用は、プロトンポンプ（Ｈ+−ＡＴＰａｓｅ）を介した細胞外へのプロトン輸送を阻害することにより、胃酸分泌を抑制するほか、細胞又は細胞小器官内の酸性化を誘引することにより、pH依存的に働くイオンチャネル、酵素（例えば、チロシナーゼ等）などの機能分子の生物活性を調整する。この様な細胞又は細胞小器官内におけるプロトンポンプ阻害作用は、高血圧症、不整脈、狭心症、心肥大、糖尿病、虚血若しくは虚血再潅流による臓器障害、脳障害、骨粗鬆症の治療若しくは予防、色素異常の改善及び予防などと深く関与しているため、かかる成分は、前記疾患の予防又は治療薬として期待出来る。かかる作用を有する成分は、前記プロトンポンプ阻害作用（細胞又は細胞小器官内における酸性化作用）、標的部位への集積性及び選択性に優れ、高い安全性及び安定性を有するために、食品、医薬品、化粧料などへの使用が好ましい。この様な効果を奏するために、本発明の組成物に於けるかかる化合物の含有量は、前記の一般式（１）に表される化合物、その異性体及び／又はそれらの薬理学的に許容される塩から選択される１種乃至は２種以上を、総量で０．００００１質量％〜５質量％含有することが好ましく、より好ましくは、０．００００３質量％〜３質量％、さらに好ましくは、０．００００５質量％〜１質量％含有することがより好ましい。これは、少なすぎると前記効果を奏しない場合が存し、多すぎても、効果が頭打ちになり、この系の自由度を損なう場合が存するためである。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
＜Euchrenone ａ６（化合物１）の物理恒数＞
1H-NMR（Acetone-ｄ6）：δ１．４２（６Ｈ、ｓ）、１．７２（６Ｈ、ｓ）、１．７５（３Ｈ、ｓ）、１．８１（３Ｈ、ｓ）、２．８８（１Ｈ、ｄｄ）、３．０６（１Ｈ、ｄｄ）、３．２９（２Ｈ、ｄ）、３．３４（２Ｈ、ｄ）、５．１６（１Ｈ、ｍ）、５．２３（１Ｈ、ｍ）、５．４８（１Ｈ、ｄ）、５．５２（１Ｈ、ｄｄ）、６．２５（１Ｈ、ｄ）、６．３６（１Ｈ、ｓ）、６．５２（１Ｈ、ｓ）、６．５７（１Ｈ、ｓ）、６．８９（１Ｈ、ｓ）、１２．３１（１Ｈ、ｓ）．
これらの示性値は、かかる分画が、Euchrenone a６（化合物１）であることを支持している。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
＜Euchrenone a３（化合物２）の物理恒数＞
1H-NMR（Acetone-ｄ6）：δ１．６１（３Ｈ、ｓ）、１．６３（３Ｈ、ｓ）、１．６７（３Ｈ、ｓ）、１．７１（６Ｈ、ｓ）、２．７７（１Ｈ、ｄｄ）、３．１０（１Ｈ、ｄｄ）、３．３０−３．４０（６Ｈ、ｍ）、５．１３−５．１９（２Ｈ、ｍ）、５．３２−５．４０（２Ｈ、ｍ）、６．８９（１Ｈ、ｄ）、７．２０（１Ｈ、ｄ）、７．３０（１Ｈ、ｓ）．
これらの示性値は、かかる分画が、Euchrenone a３（化合物２）であることを支持している。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
＜amorisin（化合物３）の物理恒数＞
1H-NMR（Acetone-ｄ6）：δ１．７１（６Ｈ、ｓ）、１．７３（３Ｈ、ｓ）、１．７６（６Ｈ、ｓ）、１．８９（３Ｈ、ｓ）、２．７５（１Ｈ、ｄｄ）、２．９８（１Ｈ、ｄｄ）、３．３０−３．４０（６Ｈ、ｍ）、５．１７−５．４８（４Ｈ、ｍ）、６．７１（１Ｈ、ｍ）、６．８５（１Ｈ、ｓ）．
これらの示性値は、かかる分画が、（化合物３）であることを支持している。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
＜Lespedezaflavanone H（化合物４）の物理恒数＞
1H-NMR（Acetone-ｄ6）：δ１．５９（３H、s）、１．６１（３H、s）、１．６４（３H、s）、１．６９（３H、s）、１．７２（３H、s）、１．７６（３H、s）、２．８０（１H、dd）、３．１０（１Ｈ、dd）、３．２６−３．３６（６Ｈ、m）、５．１６−５．２１（２H、m）、５．３０−５．３５（１Ｈ、m）、５．６７（１H、ｄｄ）、６．４９（１Ｈ、s）、７．２０（１H、s）．
これらの示性値は、かかる分画が、Lespedezaflavanone H（化合物４）であることを支持している。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
＜本発明のフラバノン誘導体（化合物１〜４）のメラニン産生抑制作用検討＞
前記の方法により得られたフラバノン誘導体（化合物1〜４）を用い、以下の記載の方法に従い、メラニン産生抑制作用を評価した。
２４穴プレートにヒト正常メラノサイト（クラボウ株式会社）を２２５００（cells/ｃｍ2）播種する。翌日、評価物質を含有する培地 ０．５（mL／well）に交換し、０．２５（μCi）２−[２−14C]チオウラシル（GEヘルスケアバイオサイエンス社）を添加し培養を継続した。播種４日後、培地を除去しPBSで１回プレートを洗浄した後、細胞生存率を評価するため生細胞数測定試薬SF（ナカライテスク社）溶液を添加した培地に交換し、３７℃、３時間呈色反応を行った。反応後、４５０（nm）の吸光度をマイクロプレートリーダーBenchmark Plus（Bio-Rad Laboratories）を用いて測定した。コントロールとして評価物質を含まないサンプルを前記同様に調製し、コントロールに対する各評価物質を含むサンプルの吸光度の百分率を求め細胞生存率とした。
メラニン量測定のため吸光度測定後、PBSで１回プレートを洗浄し、TCAを添加し、細胞を溶解した後、蒸留水を加え溶液をバイアルに移した。氷上に放置後、１５０００ｒｐｍ、５分間遠心した後、上清を除去した。再度、各バイアルに１０％ＴＣＡ ５００（μＬ）を添加し、氷上１５分間放置した。１５０００ｒｐｍ、５分間遠心した後、上清を除去した。残渣にアクアゾール−２（パーキンエルマー社） １（ｍＬ）を添加し、液体シンチレーションカウンター ＬＳＣ−６１００（アロカ社製）にて放射線量を測定した。コントロールとして評価物質を含まないサンプルを前記同様に調製し、コントロールに対する評価物質を含むサンプルの放射線量の百分率を求めメラニン量（％）とした。メラニン産生量の５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）は、細胞毒性の認められない範囲でＳＡＳ software version 9.1.3（SAS Institute Inc.）を用い算出した。本発明に於いて、メラニン産生抑制作用を有する物質とは、ヒト正常メラノサイトを用いたメラニン産生抑制作用評価において、細胞毒性の認められない濃度においてコントロールと比較しメラニン産生量を５０％以下のレベルに低下させる作用を有する場合を意味する。これは、メラニン産生抑制作用が低い物質を配合した場合には、期待されるメラニン産生抑制作用が現われないためである。また、メラニン産生抑制作用を有する陽性対照としては、ハイドロキノンを用いた。結果を表１に表す。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
＜本発明のフラバノン誘導体（化合物１〜４）のWestern Blot法によるチロシナーゼファミリータンパクに対する影響＞
本発明のフラバノン誘導体（化合物1〜４）に関し、以下の手順に従いWestern Blot法によるチロシナーゼファミリータンパク減少作用を検討した。
φ6cmディッシュにヒト正常メラノサイト（クラボウ株式会社）を22500cells／cm2播種し、翌日、評価物質を含む培地 5ｍL/dishに交換し培養を継続した。播種４日後、実施例１に記載の方法に従い細胞生存率を測定した。実施例２に記載の方法に従い、評価物質を含む培地で処理した細胞より細胞抽出液を得た。コントロールとして評価物質を含まないサンプルも前記同様に調製した。12.5%ポリアクリルアミドゲルを用いて、１レーンあたりに細胞抽出液（タンパク量10μｇ）を添加し、SDS-PAGEにて分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜にブロッティングし、3％スキムミルク／0.4％Tween２０含有PBSにて室温１時間ブロッキングを行った。0.4％Tween２０含有PBSにて洗浄後、抗体反応を実施した。１次抗体は、それぞれ抗チロシナーゼ（H-109）抗体、抗TYRP1（H-90）抗体、抗TYRP２（D-18）抗体（いずれもSanta Cruz Biotechnology, Inc.）を0.5％スキムミルク／0.4％Tween２０含有PBSにて1:400希釈し、室温１時間、PVDF膜と共にインキュベーションした。なお、内部標準としてβ−actinを用いた。0.4％Tween２０含有PBSにて洗浄後、ペルオキシダーゼ標識された二次抗体と共に再度室温１時間、PVDF膜をインキュベーションし、抗体反応を行った。反応終了後、0.4％Tween２０含有PBSにて洗浄し、ECLPlus Western Blotting Detection Reagents（GEヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて検出した。本発明に於いて、チロシナーゼファミリータンパク減少作用を有しない物質とは、ヒト正常メラノサイト細胞抽出液を用いたチロシナーゼファミリータンパクに対する影響の検討において、コントロ−ルと比較し、有意なチロシナーゼファミリータンパク減少作用を有しない場合を意味する。結果を図１に示す。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
＜本発明のフラバノン誘導体（化合物１〜４）のメラノソーム内酸性化検出（プロトンポンプ阻害作用）＞
本発明のフラバノン誘導体（化合物１〜４）に関し、以下の手順に従い、生細胞内酸性化（プロトンポンプ阻害作用）検出を行った。
ヒト正常メラノサイト（クラボウ株式会社）を４ウェルLab-Tek chamber slide（Thermo Fisher Scientific社）に１００００cells／cm2播種し、翌日、評価物質を含有する培地 0.5ｍL／wellに交換し、１時間３０分培養した。コントロールとして評価物質を含まないサンプルを前記同様に調製した。その後、３−（２，４−dinitroanilino）−３'−amino−Ｎ−methyldipropylamine（DAMP、Biomedical Research社）を加え、３０分間培養した。培養終了後、PBSにて洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで室温１５分固定を行った。次いで、PBSにてウェルを洗浄し、４℃、２分間放置した、その後、１０％FBS／PBSで室温、３０分ブロッキングを行った。抗体反応として抗チロシナーゼ抗体（C-19：Santa Cruz Biotechnology, Inc）と抗DAMP抗体（ab２４３１９：abcam）をそれぞれブロッキング溶液で1:100希釈した溶液を添加し、３７℃、４５分間インキュベーションした。反応終了後、ＰＢＳにてウェルを洗浄し、Ｃｙ３標識ウサギ抗ヤギ抗体（Invitrogen Corporation）とFITC標識ラット抗マウスIgE抗体（American research Products、Inc.）をそれぞれブロッキング溶液で1:100希釈した溶液を添加し、３７℃、４５分間インキュベーションした。PBSにてウェルを洗浄し、スライドガラスでサンプルを封入し、共焦点レーザー顕微鏡（LSM５１０：Zeiss）にて観察した。本発明に於いて、プロトンポンプ阻害作用を有する物質とは、前記のヒト正常メラノサイトを用いたメラノソーム内酸性化検出（プロトンポンプ阻害作用）評価において、pH感受性蛍光色素の発色強度が、レーザー顕微鏡による目視的観察により発光強度の増強が認められる場合を意味する。結果を図２に示す。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
【表３】
2010202586.tif 000007
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
化粧料１〜３、比較例１を用いて、黒化改善作用を調べた。自由意志で参加したパネラ
ーの上腕内側部に１．５ｃｍ×１．５ｃｍの部位を上下２段に分け、無処置部位１箇所と処置部位４箇所の合計５箇所設け、処置部位に最少紅斑量（MED）の１．５倍紫外線照射を１日１回、３日連続して３回照射した。照射終了後１日より、１日１回２８日連続してサンプル５０μＬを塗布した。４ヶ所の内の１部位には、化粧料１を、別の1部位には、化粧料２を、別の１部位には、化粧料３を、もう１部位には、比較例１を塗布した。塗布終了２４時間後にコニカミノルタ株式会社製の色彩色差計（CR３００）にて標準白色板との色差を求め、これらにより、無処置部位のＬ値に対する△Ｌ値を算出した。結果を表４に示す。これにより、本発明の皮膚外用剤である化粧料は優れた美白作用を有することが分かる。これは、前記の優れたプロトンポンプ阻害作用によるものである。