(57)【要約】  濃縮効果の持続性を向上させるとともに泳動時の発熱抑制を実現したポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルと、当該ゲルを備えた電気泳動装置を提供する。本発明に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、濃縮ゲルおよび当該濃縮ゲルとは異なるｐＨに調整されている分離ゲルを含み、濃縮ゲルおよび上記分離ゲルのうちの少なくとも一方には、アクリルアミドバッファーが共有結合されている。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
濃縮ゲルおよび上記濃縮ゲルとは異なるｐＨに調整されている分離ゲルを含み、
上記濃縮ゲルおよび上記分離ゲルのうちの少なくとも一方には、アクリルアミドバッファーが共有結合されていることを特徴とするポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル。
【請求項２】
上記濃縮ゲルに、ｐＫａが、６．２〜８．５の範囲であるアクリルアミドバッファーが架橋されていることを特徴とする請求項１に記載のポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル。
【請求項３】
上記分離ゲルに、ｐＫａが、８．５〜９．３の範囲であるアクリルアミドバッファーが架橋されていることを特徴とする請求項１または２に記載のポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル。
【請求項４】
上記濃縮ゲルのｐＨは、６．６〜７．５の範囲に調整されており、
上記分離ゲルのｐＨは、８．４〜８．８の範囲に調整されていることを特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載のポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル。
【請求項５】
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルであることを特徴とする請求項１から４までの何れか１項に記載のポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか一項に記載のポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルと、
陰極と、
上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルに対して、上記陰極とは反対側に配置された陽極と、
上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの上記陰極側に添加される陰極バッファーと、を備えている電気泳動装置。
【請求項７】
上記陰極バッファーは、フロントイオンおよびトレイリングイオンを含んでいることを特徴とする請求項６に記載の電気泳動装置。
【請求項８】
上記陰極バッファーのバッファー濃度は、２０〜５０ｍＭの範囲に調整されており、
上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルのバッファー濃度は、１５０〜５００ｍＭの範囲に調整されていることを特徴とする請求項６または７に記載の電気泳動装置。
【請求項９】
一次元目の電気泳動をおこなう第一泳動部と、二次元目の電気泳動をおこなう第二泳動部とを有し、
上記第二泳動部の電気泳動用ゲルが上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルであることを特徴とする請求項６から８までの何れか１項に記載の電気泳動装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル、および当該ゲルを備えた電気泳動装置に関し、より詳細には、濃縮ゲルおよび当該濃縮ゲルとは異なるｐＨに調整されている分離ゲルを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルと、これを備えた電気泳動装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、界面活性剤であるＳＤＳでタンパク質を処理するとＳＤＳがタンパク質の分子量に応じた量比（１：１．４）で結合することを利用したタンパク質の分析方法である。ＳＤＳが結合したＳＤＳ−タンパク質複合体は、ＳＤＳ分子を構成する親水性イオンのＳＯ４２−基によって負の電荷を持つため、ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル（以下、単にゲルを記載することがある）に電流を流すと、当該ゲル中のＳＤＳ−タンパク質複合体は陽極に泳動する。また、当該ゲル中をＳＤＳ−タンパク質複合体が通過するときに分子ふるい効果が発生するために、分子量の小さいタンパク質ほど早く移動する。そのため、その移動度から見かけの分子量を割り出すことが可能である。【０００３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで用いられる一般的なゲルの一つとして、ゲル濃度および含有緩衝液のｐＨが異なる２層から構成され、非特許文献１に記載されていように、泳動上流側にｐＨ６．８のトリシン緩衝液を含むゲルを有し、このゲルの泳動下流側にｐＨ８．８のトリシン緩衝液を含むゲルを有してなる２層のゲルがある。【０００４】
タンパク質サンプル（ＳＤＳ−タンパク質複合体）は、泳動上流側のｐＨ６．８のゲルではタンパク質の分離は起こらずに濃縮を受ける。そのため、泳動上流側のｐＨ６．８のゲルは「濃縮ゲル」と称される（「スタッキングゲル」と称されることもある）。一方、泳動下流側のｐＨ８．８のゲルではタンパク質が分子量により分離されるため、当該ゲルは「分離ゲル」と称される。【０００５】
ｐＨ６．８の濃縮ゲル中では、泳動が早い（ゲル内を早く移動する）順に、陰極側の泳動用緩衝液の陰極バッファーに含まれる塩素イオン、タンパク質サンプル、当該陰極バッファーに含まれるグリシンの順番で泳動される。陰極バッファーに含まれるグリシンはｐＨ６．８の緩衝液を含む濃縮ゲル中で１０％程度の解離度であるために陽極への移動が遅くなる。一方、陰極バッファーに含まれる塩素イオンは陽極に早く移動する。このとき、塩素イオンとグリシンとの間が他よりも高抵抗になるため電圧が上昇し、塩素イオンとグリシンとの間で泳動されるタンパク質サンプルが先端の塩素イオンの境界に濃縮される。【０００６】
このように濃縮ゲルにおいてタンパク質サンプルを濃縮することにより、分離ゲルでの分離が良好となり、分離ゲルにおいてシャープなバンドを検出することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】羊土社「改訂第３版  タンパク質実験ノート  下  分離同定から機能解析へ」、岡田雅人・宮崎香  編
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上述のようにｐＨが異なる緩衝液を含有したゲル同士が接触してなる電気泳動用ゲルの場合、時間の経過により互いの緩衝液が混合するという問題がある。時間の経過により、分離ゲルの緩衝液が濃縮ゲルに混入することによって、濃縮ゲルの濃縮効果が失われ、タンパク質サンプルの分離解像度が著しく低下する。そのため、泳動実施者が泳動毎にゲルを作製しているという実情がある。したがって、時間が経過しても濃縮ゲルが濃縮効果を維持することができるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの開発が求められている。【０００９】
また、濃縮ゲルおよび分離ゲルに含有される緩衝液は、上述したｐＨ条件下で電荷を有するため、電圧印加により移動する。これにより、ゲル内に高い電流値が検出され、発熱の原因となる。発熱は、ゲルの膨張を引き起こして電気泳動分離パターンを悪化させる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
そこで、本願発明者らは、分離ゲルに導入されるまでにタンパク質サンプルが濃縮される形態でありながら、濃縮効果の持続性を向上させるとともに泳動時の発熱を抑制することができるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの開発に成功し、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明は、濃縮効果の持続性の向上と、泳動時の発熱抑制とを実現したポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルを提供するとともに、当該ゲルを備えた電気泳動装置を提供することを目的としている。【００１２】
具体的には、上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、濃縮ゲルおよび上記濃縮ゲルとは異なるｐＨに調整されている分離ゲルを含み、上記濃縮ゲルおよび上記分離ゲルのうちの少なくとも一方には、アクリルアミドバッファーが共有結合されていることを特徴としている。【００１３】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る電気泳動装置は、上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルと、陰極と、上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルに対して、上記陰極とは反対側に配置された陽極と、上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの上記陰極側に添加される陰極バッファーと、を備えていることを特徴としている。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の一態様によれば、アクリルアミドバッファーがポリアクリルアミドゲルに固定化されることにより経時的なアクリルアミドバッファーの拡散を防ぎ、濃縮ゲルにおける濃縮効果の持続性が向上するポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルを提供することができる。また、本発明の一態様によれば、アクリルアミドバッファーの移動量の減少により発熱が抑制され分解能が向上するポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルを提供することができる。そして、本発明の一態様によれば、濃縮効果の持続性を向上させ、且つ泳動時の発熱を抑制した当該ゲルを備えた電気泳動装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの一実施形態を作製するための器具を示す斜視図である。
【図２】図１に示す器具に本発明の一実施形態におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルを作製している様子を示す斜視図である。
【図３】本発明に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの一実施形態を模式的に示したものであり、アクリルアミドバッファーがゲルに共有結合されている様子を示す図である。
【図４】本発明に係る電気泳動装置の一実施形態である自動化二次元電気泳動装置を示す図である。
【図５】本発明に係る電気泳動装置の一実施形態である自動化二次元電気泳動装置を示す図である。
【図６】本発明に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの一実施形態を用いた実施例および比較例において得られる分離パターンを示す図である。
【図７】本発明に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの一実施形態を用いた実施例および比較例において得られる分離パターンを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
〔実施形態１〕
本発明に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルおよび当該ゲルの作製方法の一実施形態、並びに当該ゲルを備えた電気泳動装置の一実施形態を以下に説明する。
【００１７】
〔１〕ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル
本発明に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、タンパク質の分離は起こらず濃縮を受ける濃縮ゲル（スタッキングゲル）と、当該濃縮ゲルとは異なるｐＨに調整されたタンパク質の分離がおこなわれる分離ゲルとを含有する。なお、本発明におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、濃縮ゲルおよび分離ゲルのほかに他のゲル（層）を含み得る。
【００１８】
なお、本実施形態１では電気泳動によって分離をおこなうサンプルとして、タンパク質を挙げて説明するが、サンプルはタンパク質に限定されるものではなく、ゲル電気泳動を使用して分離することができる複数の独特の分子種の混合物であるか、もしくは複数ではなくゲル電気泳動がおこなわれた後にゲル内の或る位置に局在する物質である。サンプルの具体例としては、生物材料（例えば、生物個体、体液、細胞株、組織培養物、もしくは組織断片）からの調製物、または、市販の試薬などが挙げられる。例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが挙げられる。
【００１９】
本実施形態１におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、界面活性剤としてＳＤＳを含む変性ゲルである。なお、本発明はＳＤＳを含む変性ゲルに限定されるものではなく、変性作用を有する界面活性剤としてＳＤＳ以外の界面活性剤を含むものであってもよい。また、界面活性剤以外の変成作用を有する物質（例えば尿素やホルムアルデヒドなど）を含む変性ゲルであってもよい。更には、本発明に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、非変性ゲルであってもよい。非変性ゲルは、変性剤を含有しないポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルをいう。非変性ゲル（すなわち未変性ゲル）は、未変性ゲル電気泳動において使用され、この場合、ランニング緩衝液および試料緩衝液にも変性剤を含まない。
【００２０】
また、本実施形態１におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法による電気泳動に用いられるゲルである。しかしながら、本発明はＳＤＳ−ＰＡＧＥに限定されるものではなく、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動全般に適用することができる。
【００２１】
また、本実施形態１におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、そのサイズは問わない。ここで、本実施形態１におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの厚さをｚ方向に沿って定義し、ｚ方向に対して垂直であるｘ方向およびｙ方向によって定義されるｘ−ｙ平面をする。本発明に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルのサイズは、例えば、ｘ−ｙ平面のサイズが１０ｃｍ×１０ｃｍ程度であって厚さが１ｍｍ程度の比較的小型のサイズから、ｘ−ｙ平面のサイズが３０ｃｍ×３０ｃｍ程度であって厚さが１ｍｍ程度の比較的大型のサイズのものまで、電気泳動の用途や電気泳動装置の大きさに応じて適宜選択すること可能である。
【００２２】
本実施形態１におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、後述する電気泳動装置の一対の電極間に配置され、電圧印加によって内部に電流が流れる。ここで、本実施形態では、電流の流れる方向、すなわちサンプルの泳動方向をｙ方向とする。すなわち、一対の電極の一方の電極（陰極）は、本実施形態１におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルよりもｙ方向に沿って上流側に配置され、他方の電極（陽極）は当該ゲルよりもｙ方向に沿って下流側に配置される。そして、本実施形態１におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルに含有される濃縮ゲルと分離ゲルとは、濃縮ゲルが分離ゲルよりも泳動方向上流側に位置する。そして、両ゲルは泳動方向に対して垂直方向（ｘ方向）に沿って界面を有する。
【００２３】
なお、本実施形態１に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、濃縮ゲルおよび分離ゲルにアクリルアミドバッファーが共有結合されている点に特徴がある。よって、それ以外のポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの条件（例えば、濃縮ゲルの体積、分離ゲルの体積、ゲル内での当該境界面の位置等）については、従来周知のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲルを参考にして適宜選択することができる。
【００２４】
なお、本願明細書におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルのポリアクリルアミドとは、アクリルアミドモノマーとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ビスまたはビスアクリルアミド）との混合物をいい、このアクリルアミドおよびビスが、架橋されて分枝状の分子構造を形成したものが本願明細書におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルである。また、本願明細書における、共有結合されているアクリルアミドバッファーとは、緩衝作用を有するアクリルアミド誘導体である。
【００２５】
・濃縮ゲル
本実施形態１におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルに含有される濃縮ゲルは、ｐＨが、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．８の範囲に調整されている。より好ましくは、ｐＨ６．６〜ｐＨ７．５の範囲に調整され、一例としてｐＨ６．８に調整されている。このようにｐＨ条件が調整された濃縮ゲルでは、タンパク質は分離されずに濃縮を受ける。なお、濃縮の原理は周知であるため、ここでの説明は省略する。
【００２６】
また、濃縮ゲルには、アクリルアミドバッファーが共有結合されている。アクリルアミドバッファーはビニル基を有しているため、アクリルアミドモノマーを共有結合でゲルに固定化することができる。
【００２７】
濃縮ゲルにアクリルアミドバッファーが共有結合されていることにより、アクリルアミドバッファーが濃縮ゲルから分離ゲルに移動することがない。そのため、先述した時間経過による濃縮ゲルの濃縮効果の低下が生じず、また、泳動中の発熱も生じない。
【００２８】
濃縮ゲルに共有結合されるアクリルアミドバッファーは、ｐＫａが既知であるアクリルアミド誘導体から選択すればよい。例えば、これらに限定するものではないが、下記一般式で表すバッファーの中の１つまたは複数から選択すればよい。
【００２９】
【化１】
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【００３０】
また、濃縮ゲルには、ｐＫａが１．０〜１２．０の範囲であるアクリルアミドバッファーが共有結合されている。より好ましくは、ｐＫａが６．２〜８．５の範囲であるアクリルアミドバッファーが共有結合されている。この範囲であるアクリルアミドバッファーが濃縮ゲルに共有結合されていることにより、タンパク質が先行イオンである塩素イオンとトレイリングイオンであるグリシンとの間に挟まれて塩素イオン境界に濃縮される効果が生じる。
【００３１】
なお、濃縮ゲルに共有結合されたアクリルアミドバッファーは、濃縮ゲルに含有されたｐＨ緩衝液と同じｐＨに調整された緩衝剤である。
【００３２】
濃縮ゲルに共有結合されているアクリルアミドバッファーの濃度は、５０〜２００ｍＭの範囲であることが好ましく、１００〜１５０ｍＭの範囲とすることがより好ましい。この範囲であることにより、好ましい緩衝能を有することができ、タンパク質の濃縮が可能となる。
【００３３】
濃縮ゲルは、アクリルアミドバッファーが共有結合されていれば、その他の組成は従来周知の濃縮ゲルの組成を適用することができるほか、濃縮ゲルの機能を阻害しない範囲で添加剤を含有し得る。
【００３４】
・分離ゲル
本実施形態１におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルに含有される分離ゲルは、ｐＨが８．０〜９．２の範囲に調整されている。より好ましくは、ｐＨが８．４〜８．８の範囲に調整され、一例としてｐＨ８．８に調整されている。このようにｐＨ条件が調整された分離ゲルでは、濃縮ゲルによって濃縮されたタンパク質サンプルの分離が起こる。なお、分離の原理は周知であるためここでの説明は省略する。
【００３５】
また、分離ゲルには、アクリルアミドバッファーが架橋されているため、当該アクリルアミドバッファーが分離ゲルから濃縮ゲルに移動することがない。そのため、先述した時間経過による濃縮ゲルの濃縮効果の低下が抑制され、また、泳動中の発熱も抑制される。
【００３６】
具体的には、分離ゲルには、ｐＫａが１．０〜１２．０の範囲であるアクリルアミドバッファーが共有結合されている。より好ましくは、ｐＫａが８．５〜９．３の範囲であるアクリルアミドバッファーが共有結合されている。この範囲においてアクリルアミドバッファーが分離ゲルに共有結合されていることにより、解像度の高い分離結果を得ることができる。
【００３７】
なお、分離ゲルに共有結合されたアクリルアミドバッファーは、分離ゲルに含有されたｐＨ緩衝液と同じｐＨに調整された緩衝剤である。
【００３８】
分離ゲルに共有結合されているアクリルアミドバッファーの濃度は、５０〜２００ｍＭの範囲であることが好ましく、１００〜１５０ｍＭの範囲とすることがより好ましい。この範囲であることにより、好ましい緩衝能を有することができ、タンパク質の分離が可能となる。
【００３９】
分離ゲルに共有結合されるアクリルアミドバッファーは、ｐＫａが既知であるアクリルアミド誘導体から選択すればよい。例えば、これらに限定するものではないが、下記一般式で表すバッファーの中の１つまたは複数から選択すればよい。
【００４０】
【化２】
2015093301.tif 000004
【００４１】
分離ゲルは、アクリルアミドバッファーが共有結合されていれば、その他の組成は従来周知の分離ゲルの組成を適用することができるほか、分離ゲルのサンプル分離を阻害しない範囲で添加剤を含有し得る。
【００４２】
図３に、アクリルアミドバッファーが共有結合されているゲルを模式的に示す。なお、図３中のＲはカルボキシル基または３級アミン等である。図３に示すポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、アクリルアミドおよびビスアクリルアミドが、架橋されて分枝状の分子構造を形成しているところに、アクリルアミドバッファーが架橋（共有結合）されている。
【００４３】
以上のように本実施形態１におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、ｐＨが異なる緩衝液を含有した濃縮ゲルおよび分離ゲルが互いに接触した状態で存在しているが、これら濃縮ゲルおよび分離ゲルのそれぞれにおいて、ｐＨ緩衝液に含まれるアクリルアミドバッファーが共有結合されているため、互いの緩衝液が混合することがない。よって、時間の経過により分離ゲルの緩衝液によって濃縮ゲルの濃縮効果が低減する虞がなく、保存性に優れたポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルを実現することができる。
【００４４】
また、濃縮ゲルおよび分離ゲルに含有される緩衝液は上述したｐＨ条件下で電荷を有するが、本実施形態１によれば、当該緩衝液に含まれる緩衝剤であるアクリルアミドバッファーが共有結合されているため、電圧印加によりゲル内を緩衝液が移動することがない。これにより、ゲル内に電流が過剰に流れることがなく、不都合な発熱を発生することがない。したがって、ゲルの膨張を引き起こすことがなく、良好な電気泳動分離パターンを検出することができるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルを提供することができる。
【００４５】
〔２〕ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの作製方法
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲルである本実施形態１におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、従来周知のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲルの作製方法を提供して作製することができる。
【００４６】
図１および図２は、本実施形態１におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの作製に用いる器具の斜視図である。図１には、２枚の絶縁材からなるゲル板１をそれぞれのゲル形成面が内側になるようにして配置し、クリップ２で止めている様子を示している。このとき、２枚のゲル板１の間にはスペーサー（不図示）を配設して本実施形態１におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの厚さに相当する分の隙間を設けている。そして、この隙間に、チューブ３を用いてゲル用溶液を充填する。スペーサーは、２枚のゲル板１の側部と下部とに配置されており、２枚のゲル板１の上部には配置しない。これにより、２枚のゲル板１の上部からチューブ３を介してゲル用溶液を２枚のゲル板１の隙間に充填することができる。
【００４７】
ゲル用溶液は、分離ゲル用溶液と濃縮ゲル用溶液とをそれぞれ準備する。分離ゲル用溶液は、従来周知の分離ゲル作製用のアクリルアミドモノマー溶液（組成は、９．７％アクリルアミド、０．３％ビスアクリルアミド、３７５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、０．１％ＴＥＭＥＤ、０．０５％ＡＰＳ）に、アクリルアミドバッファー（ｐＫａ８．８）を１００ｍＭの濃度になるように添加して作製し、濃縮ゲル用溶液は、従来周知の濃縮ゲル作製用のアクリルアミドモノマー溶液（組成は、２．９１％アクリルアミド、０．０９％ビスアクリルアミド、０．０５％ＴＥＭＥＤ、０．０３％ＡＰＳ）に、アクリルアミドバッファー（ｐＫａ６．８）を１００ｍＭの濃度になるように添加して作製する。
【００４８】
まず分離ゲル用溶液を２枚のゲル板１の隙間に充填する。充填に際して、重合開始剤を添加して充填する。また、このとき、充填された分離ゲル用溶液の液面（上面）が２枚のゲル板１の上部よりも下になるように充填量を調整する。
【００４９】
充填が完了したら所定時間放置して分離ゲル用溶液をゲル化させる。ゲル化に際して、従来周知の方法で分離ゲル用溶液の液面上に蒸留水（不図示）を重層する。ゲル化した状態を図２に示している（分離ゲル４）。
【００５０】
分離ゲル用溶液がゲル化した後、重層していた蒸留水を除去し、分離ゲル用溶液の液面上に濃縮ゲル用溶液を重層する。充填に際して、重合開始剤を添加して充填する。充填が完了したら所定時間放置して分離ゲル用溶液をゲル化させる。ゲル化した状態を図２に示している（濃縮ゲル５）。なお、図２では濃縮ゲル用溶液の液面（上面）がゲル板１の上部よりも下になっているが、本発明はこれに限定されるものではなく、また、濃縮ゲル用溶液の液面（上面）とゲル板１の上部とを一致させたのちに、従来周知のサンプルアプライ用のウエルを作成するためのコームを挿し込んでも良い。充填が完了したら所定時間放置して濃縮ゲル用溶液をゲル化させる。
【００５１】
以上の手順によって本実施形態１におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルを作製することができる。
【００５２】
〔３〕電気泳動装置
次に、本発明に係る電気泳動装置の一実施形態として、自動化二次元電気泳動装置４００を例に挙げて説明する。
【００５３】
図４は、本実施形態１における自動化二次元電気泳動装置４００の要部構成を示す。
【００５４】
図４中の（ａ）は自動化二次元電気泳動装置４００の要部構成を示す斜視図である。図４中の（ｂ）は、等電点電気泳動ゲル２００が保持部４４０を介して支持アーム４３１に結合される構成を示す。図４中の（ｃ）は、自動化二次元電気泳動装置４００において用いられる二次元目電気泳動部４２０の構成を示す断面図および上面図である。
【００５５】
本実施形態１における自動化二次元電気泳動装置４００は、台座としての固定手段４０１の上に、等電点電気泳動器具を含む一次元目電気泳動部（第一泳動部）４１０と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥをおこなうための二次元目電気泳動部（第二泳動部）４２０と、上記支持アーム４３１と、固定手段４０１および／または支持アーム４３１を移動して双方の相対位置を変更させる駆動手段４０４とを有している。
【００５６】
自動化二次元電気泳動装置４００では、サンプルが、まず一次元目電気泳動部４１０にて第１方向（図４中Ｙ方向）に分離され、緩衝液の平衡化を経た後に、二次元目電気泳動部４２０にて第２方向（図４中Ｘ方向）に分離される。これは、駆動手段４０４が支持アーム４３１をＸ軸方向およびＺ軸方向へ移動可能に保持していることにより実現される。
【００５７】
（一次元目電気泳動部）
一次元目電気泳動部４１０には、複数の槽が設けられている。一次元目電気泳動部４１０について、図５を用いて更に説明する。
【００５８】
図５は、自動化二次元電気泳動装置４００の断面図である。一次元目電気泳動部４１０は、単一の絶縁体に複数の槽４１１・４１２が設けられた構成を有している。
【００５９】
そのうちの第一試薬槽４１１は、一次元目分離を行うまでの工程に必要な試薬を格納するためのものであり、第２試薬槽４１２は、一次元目分離後で二次元目分離前に必要な試薬を格納するためのものである。具体的には、第一試薬槽４１１は、ゲル配置槽４１１ａ、サンプル槽４１１ｂ、膨潤槽４１１ｃ、等電点電気泳動器具としての第一分離槽４１１ｄからなる。
【００６０】
また、第２試薬槽４１２は、第１平衡化槽４１２ａ、染色槽４１２ｂ、洗浄槽４１２ｃ、第２平衡化槽４１２ｄからなる。第１平衡化槽４１２ａは、第１方向分離に用いた緩衝液を置換させて、第１方向分離後に行う染色の効率を上げるための緩衝液を格納するために設けられることが好ましい。洗浄槽４１２ｃは、蛍光色素を格納した染色槽４１２ｂにて付着した過剰な蛍光色素を洗浄する緩衝液を格納するために設けられることが好ましい。第２平衡化槽４１２ｄは、第２方向分離を行うために好ましい試薬が格納されており、例えば、等電点電気泳動ゲル２００のタンパク質を還元する試薬、該タンパク質をＳＤＳ化する試薬が格納されている。また、第２方向分離の方法に応じて、緩衝液、界面活性剤、酵素、相互作用物質などが格納されてもよい。
【００６１】
ここで、駆動手段４０４による支持アーム４３１の移動について説明する。駆動手段４０４は、まず、支持アーム４３１をゲル配置槽４１１ａの所望のＸ位置まで駆動し、次いで支持アーム４３１を所望のＺ位置まで下降させる。続いて、ゲル配置槽４１１ａに配置したゲル付き保持体４０を、制御手段により支持アーム４３１への吸着を制御する。支持アーム４３１への吸着の制御は、例えば電磁弁を用いれば自動制御され得る。駆動手段４０４は、支持アーム４３１に吸着させたゲル付き保持体４０を図５中の矢印４０２の方向へ移動し、これにより、等電点電気泳動ゲル２００は、一次元目電気泳動部４１０に設けられた各槽において所望の処理が施され、引き続き二次元目電気泳動部４２０へ搬送される。
【００６２】
すなわち、一次元目電気泳動部４１０では、サンプルを等電点電気泳動ゲル２００に導入する工程、等電点電気泳動ゲル２００を膨潤させる工程と、等電点電気泳動ゲル２００に電圧を印加してサンプルを第１方向に分離する工程と、等電点電気泳動ゲル２００中の分離サンプルを染色する工程と、二次元目電気泳動部４２０での環境に平衡化する工程とがおこなわれる。このように一次元目電気泳動部４１０では、等電点電気泳動ゲルへのサンプルの添加と等電点電気泳動ゲル２００の膨潤とを別々に行うことにより、膨潤速度を向上させることができる。
【００６３】
なお、等電点電気泳動器具である第一分離槽４１１ｄには、等電点電気泳動（一次元目分離）に必要な緩衝液が充填される。ただし、膨潤槽４１１ｃ内に格納される試薬が一次元目分離に必要な緩衝液を含む場合は、第一分離槽４１１ｄ内に一次元目分離に必要な緩衝液を充填しなくてもよい。第一分離槽４１１ｄでは、一対の電極（不図示）に第１電圧印加手段４０５により電圧を印加されることにより、等電点電気泳動ゲル２００中のサンプルが分離される。
【００６４】
（二次元目電気泳動部）
二次元目電気泳動部４２０には、上述したポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル）１０が具備されており、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル１０において、一次元目電気泳動部４１０から搬送された等電点電気泳動ゲル２００に含まれた分離サンプルが、第１方向と異なる第２方向にさらに分離（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）される。
【００６５】
二次元目電気泳動部４２０は、ゲル板である下部絶縁板４２１と上部絶縁板４２２とを重ね合わせた絶縁部４２０ａに、上部絶縁板４２２を貫いて下部絶縁部に設けられた第１緩衝液槽４２８ａおよび第２緩衝液槽４２８ｂを有している。また、下部絶縁板４２１には、上部絶縁板４２２との間にＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル１０を覆いかつ収納するためのゲル収納部１０’が設けられている。ゲル収納部１０’に収納されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル１０は下部絶縁板４２１および上部絶縁板４２２からなる絶縁部４２０ａに覆われ、第１開口部４２５および第２開口部４２６において絶縁部４２０ａの外部と接触可能である。
【００６６】
第１開口部４２５および第２開口部４２６は、二次元目電気泳動部４２０に設けられた第１緩衝液槽４２８ａおよび第２緩衝液槽４２８ｂにそれぞれ面している。第２方向へのサンプル分離を実行するために、第１緩衝液槽４２８ａおよび第２緩衝液槽４２８ｂには、ゲル収納部１０’に収納されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル１０と第１開口部４２５および第２開口部４２６を介して接する第１緩衝液および第２緩衝液（陰極バッファーを含有する溶液）がそれぞれ充填される。第１緩衝液槽４２８ａおよび第２緩衝液槽４２８ｂには第１電極４２９ａおよび第２電極４２９ｂが設けられており、第１電極４２９ａおよび第２電極４２９ｂを介して第２電圧印加手段４０６によってＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル１０に電圧が印加されると、第１開口部４２５から第２開口部４２６に向かって電流が流れる。このとき、等電点電気泳動ゲル２００中の分離サンプルと、分子量マーカーとが第２開口部４２６から第１開口部４２５に向かって展開／分離される。
【００６７】
ここで、第２緩衝液槽４２８ｂに充填される陰極バッファーを含有する溶液の陰極バッファーは、フロントイオン（例えば、塩素イオンなど）およびトレイリングイオン（グリシン、トリシンなど）を含む。フロントイオンおよびトレイリングイオンが陰極バッファーに含まれていることにより、バンドの濃縮効果を奏することができる。なお、本発明では、フロントイオンとトレイリングイオンを含まないバッファーを陰極バッファーとして用いることも可能である（例えばＭＯＰＳ系、ＭＥＳ系のバッファー）。フロントイオンとトレイリングイオンを含まないバッファーであっても上述した発熱の抑制効果はある。しかしながら、トレイリングイオンを含む系以外では濃縮効果がないため、フロントイオンおよびトレイリングイオンが含まれているバッファーを陰極バッファーとすることが好ましい。また、陰極バッファーのバッファー濃度は、２５〜５０ｍＭの範囲に調整されている。ここで、ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルのバッファー濃度を１５０〜５００ｍＭの範囲に調整して、陰極バッファーのバッファー濃度よりも高く設定することにより、ゾーン電気泳動が可能となり、タンパク質のバンドをシャープにする効果がある。
【００６８】
また、図４中の（ｃ）に示すように、第２開口部４２６の形状に関して、第２緩衝液槽４２８ｂにおいて上部絶縁板４２２を貫く開口の幅は、対応する下部絶縁板４２１の溝幅より広い。この差分によって、図５に示すように、第２開口部４２６から挿入したゲル付き保持体４０の等電点電気泳動ゲル２００と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル１０とを密着させ得、その結果、一次元目電気泳動を終えた等電点電気泳動ゲル２００中のサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離を首尾よくおこない得る。
【００６９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル１０に等電点電気泳動ゲル２００を接着させるために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル１０を覆う絶縁部４２０ａは等電点電気泳動ゲル２００とＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル１０とを密着させる部位を有していなければならない。このような部位は第２開口部４２６であっても、第１開口部４２５と第２開口部４２６との間にさらなる開口部４２６’が設けられてもよい。
【００７０】
また、等電点電気泳動ゲル２００とＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル１０とを密着させるために、第２開口部４２６からＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル１０が突出していることが好ましく、密着度を増すためには突出したＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル１０に凹凸がないことがより好ましい。なお、第２開口部４２６からＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル１０が突出していない場合は、第２開口部４２６に等電点電気泳動ゲル２００とＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル１０とを密着させるための接着部材（図示せず）が設けられていればよい。好ましい接着部材としては、アガロース、低粘度（１〜３％程度）のアクリルアミドなどのゲル、グリセリン、ポリエチレングリコール、ヒドロキシプロピルセルロースなどの高粘調液が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
なお、一次元目電気泳動部４１０、二次元目電気泳動部４２０およびゲル付き保持体４０を、サンプルごとに交換して用いる場合があることを想定して、これらの固定手段４０１への固定は着脱可能でかたちであることが好ましい。そのための機構としては、真空吸着機構以外に、挟固定機構、磁力固定機構および静電吸着機構が挙げられるが、これらに限定されない。また、真空吸着機構を採用する場合は、真空吸着プレートを介して固定することが好ましい。
【００７２】
また、固定手段４０１の直下には、図５に示す冷却手段４０９（例えば、放熱手段）が設けられてもよい。冷却手段４０９を採用することにより、電気泳動時の一次元目電気泳動部４１０および二次元目電気泳動部４２０の温度を一定に保つことができる。
【００７３】
なお、本実施形態１では、電気泳動装置として自動化二次元電気泳動装置を説明したが、本発明は二次元電気泳動装置に限定されるものではなく、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのみをおこなう電気泳動装置（一般的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ装置も含む）であっても勿論良い。
【００７４】
また、本実施形態１において説明した自動化二次元電気泳動装置は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル１０を水平面に沿って配設（横置き）した形態であるが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲルを垂直面に沿って配設（縦置き）した形態であってもよい。
【００７５】
〔実施形態２〕
本発明の他の実施形態を説明すれば、以下のとおりである。なお、説明の便宜上、前記実施形態にて説明した部材と同じ機能を有する部材については説明を省略する。
【００７６】
上述の実施形態１では、分離ゲルおよび濃縮ゲルの双方においてアクリルアミドバッファーがゲルに共有結合した態様を説明した。しかしながら、本発明はこれに限定されるものではない。例えば、本実施形態３では、濃縮ゲルのみにおいてアクリルアミドバッファーがゲルに共有結合している。すなわち、本実施形態３では、分離ゲルにアクリルアミドバッファーは共有結合していない。
【００７７】
このように、分離ゲルおよび濃縮ゲルのうちの濃縮ゲルのみにおいてアクリルアミドバッファーを共有結合させた態様であっても、濃縮ゲルに共有結合されたアクリルアミドバッファーが分離ゲルに移動することはない。そのため、時間が経過したとしても、濃縮ゲルには、所定のｐＫａを有するバッファーが残存するため、濃縮ゲルのｐＨが変動することを抑制し、濃縮ゲルでの濃縮効果の低減を抑えることができる。また、濃縮ゲルにおいてバッファーが移動しないため、発熱を抑えることができる。
【００７８】
〔実施形態３〕
本発明の他の実施形態を説明すれば、以下のとおりである。なお、説明の便宜上、前記実施形態にて説明した部材と同じ機能を有する部材については説明を省略する。
【００７９】
上述の実施形態１では、分離ゲルおよび濃縮ゲルの双方においてアクリルアミドバッファーがゲルに共有結合した態様を説明した。しかしながら、本発明はこれに限定されるものではない。例えば、本実施形態３では、分離ゲルのみにおいてアクリルアミドバッファーがゲルに共有結合している。すなわち、本実施形態３では、濃縮ゲルにアクリルアミドバッファーは共有結合していない。
【００８０】
このように、分離ゲルおよび濃縮ゲルのうちの分離ゲルのみにおいてアクリルアミドバッファーを共有結合させた態様であっても、分離ゲルに共有結合されたアクリルアミドバッファーが濃縮ゲルに移動することはない。そのため、時間が経過したとしても、濃縮ゲルには、分離ゲルから異なるｐＨのバッファーが混入することがなく、濃縮ゲルのｐＨが変動することを抑制し、濃縮ゲルでの濃縮効果の低減を抑えることができる。また、分離ゲルにおいてバッファーが移動しないため、発熱を抑えることができる。
【００８１】
〔まとめ〕
本発明の態様１に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用１０）は、濃縮ゲル５および上記濃縮ゲルとは異なるｐＨに調整されている分離ゲル４を含み、上記濃縮ゲル５および上記分離ゲル４のうちの少なくとも一方には、アクリルアミドバッファーが共有結合されていることを特徴としている。
【００８２】
上記の構成によれば、アクリルアミドバッファーが共有結合されているゲルから当該アクリルアミドバッファーが遊離することがない。なお、共有結合されているアクリルアミドバッファーとは、緩衝作用を有するアクリルアミド誘導体である。
【００８３】
これにより、時間の経過により濃縮ゲルおよび分離ゲルの各々のバッファーが混合することを抑制することができる。そのため、本発明の態様１に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、時間が経過しても濃縮ゲルが濃縮効果を維持することができる。
【００８４】
そのため、泳動実施者が泳動毎にゲルを作製する必要がなく、例えば電気泳動装置を製造する側で装置にゲルを装填することが可能であり、電気泳動の自動化に寄与することができる。
【００８５】
また、共有結合されているアクリルアミドバッファーは電圧印加によってもゲル内を移動することがない。そのため、ゲル内に電流が過剰に流れることがなく、不都合な発熱を発生することがない。したがって、ゲルの膨張を引き起こすことがなく、良好な電気泳動分離パターンを検出することができるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルを提供することができる。
【００８６】
よって、分離ゲルに導入されるまでにタンパク質サンプルが濃縮される形態でありながら、濃縮効果の持続性を向上させるとともに泳動時の発熱抑制を実現したポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルを提供することができる。
【００８７】
なお、仮に２層をなさない中性ゲルを電気泳動用ゲルとして用いた場合、２層構成であることに起因した上述の問題点は解消される。しかしながら、本発明のように分離ゲルと濃縮ゲルの２層構成のゲルのほうが、上記濃縮効果が高い為に分離が良く、シャープなバンドが検出することができる。したがって、２層構成であることのメリットに加えて、上述の問題点が解消された本発明のポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、従前の電気泳動用ゲルに比べて優位であるといえる。
【００８８】
本発明の態様２に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、上記態様１において、上記濃縮ゲル５に、ｐＫａが、６．２〜８．５の範囲であるアクリルアミドバッファーが架橋されていることが好ましい。これにより、陰極バッファーに含まれるグリシンの解離度が低い為に陽極への移動が遅くなり、濃縮ゲル中を移動するタンパク質が濃縮される。
【００８９】
本発明の態様３に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、上記態様１または２において、上記分離ゲル４に、ｐＫａが、８．５〜９．３の範囲であるアクリルアミドバッファーが架橋されていることが好ましい。この範囲のｐＫａのアクリルアミドバッファーが架橋されていることにより、分離ゲル中を移動するタンパク質が分子ふるい効果によって分離される。
【００９０】
本発明の態様４に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、上記態様１または３において、上記濃縮ゲル５のｐＨが、６．６〜７．５の範囲に調整されており、上記分離ゲル４のｐＨが、８．４〜８．８の範囲に調整されていることが好ましい。これにより、濃縮ゲルではタンパク質を分離せずに濃縮し、濃縮したタンパク質を分離ゲルにおいて良好に分離することができる。
【００９１】
本発明の態様５に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、上記態様１から４において、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルとすることができる。
【００９２】
上記の構成によれば、濃縮効果の持続性を向上させるとともに、泳動時の発熱抑制を実現して、時間が経過しても高い分離解像度を維持したＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲルを提供することができる。
【００９３】
本発明の態様６に係る電気泳動装置（自動化二次元電気泳動装置４００）は、上記態様１から４の何れに記載のポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルと、陰極（第２電極４２９ｂ）と、上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルに対して、上記陰極（第２電極４２９ｂ）とは反対側に配置された陽極（第１電極４２９ａ）と、上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの上記陰極側（第２緩衝液槽４２８ｂ）に添加される陰極バッファーと、を備えていることを特徴としている。
【００９４】
上記の構成によれば、上述したポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの効果を享受した電気泳動装置を提供することができる。
【００９５】
本発明の態様７に係る電気泳動装置は、上記態様６において、上記陰極バッファーは、フロントイオンおよびトレイリングイオンを含むことができる。
【００９６】
本発明の態様８に係る電気泳動装置は、上記態様６または７において、上記陰極バッファーのバッファー濃度が、２０〜５０ｍＭの範囲に調整されており、上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルのバッファー濃度が、１５０〜５００ｍＭの範囲に調整されていてもよい。ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルのバッファー濃度を、陰極バッファーよりも高い濃度とすることにより、ゾーン電気泳動が奏効する。
【００９７】
本発明の態様９に係る電気泳動装置は、上記態様６から８において、一次元目の電気泳動をおこなう第一泳動部（一次元目電気泳動部４１０）と、二次元目の電気泳動をおこなう第二泳動部（二次元目電気泳動部４２０）とを有し、上記第二泳動部の電気泳動用ゲルが上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルであってもよい。
【００９８】
上記の構成によれば、上述した効果を奏するポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルを第二泳動部の電気泳動用ゲルとして具備しており、二次元電気泳動の完全な自動化を実現することができる。
【００９９】
従前では、上述した理由から第二泳動部の電気泳動用ゲルは泳動実施者によって作製する必要があった。すなわち、二次元電気泳動装置の一部を自動化することはできても、当該ゲルの準備は泳動実施者自らがおこなわなくてはならなかった。しかしながら、上記の構成によれば、泳動を実施する（遥か）前からゲルを装置内に設置することが可能となる。そのため、泳動実施者がおこなう作業といえば例えばサンプルの調整のみであり、電気泳動に関する操作の一切を装置によって自動化することが可能である。
【０１００】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。さらに、各実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を組み合わせることにより、新しい技術的特徴を形成することができる。
【実施例】
【０１０１】
（１．試料タンパク質の前処理）
マウス肝臓組織から試料タンパク質を調製した。まず、マウス肝臓組織から、血管および血液溜をなるべく避けて０．４ｇの試料を秤取り、氷上で冷却した５ｍＬガラステフロン（登録商標）ホモジナイザーに入れた。ホモジナイザー内の試料に、４℃に冷却した５〜６倍量（２ｍＬ）の溶解バッファー（５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２０％グリセロール、０．３Ｍ  ＮａＣｌ）およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加し、氷上で摩砕した（３０００〜４０００ｒｐｍ）。その後、１０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。上清を回収した後、１６０００×ｇで３０分間、４℃で遠心分離した。再度上清を回収し、タンパク質定量を行い、濃度を算定した後、−８０℃で保存した。【０１０２】
続いて、アセトン沈殿による脱塩および濃縮によりタンパク質を精製した。まず、マウス肝臓組織から得られたタンパク質溶液試料を１．５〜２．０ｍＬのマイクロチューブに入れた。マイクロチューブ内の試料に、８〜９倍量の冷アセトン（−２０℃）を添加し、−２０℃にて約２時間保温した。続いて、１４０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。上清（アセトン画分）を廃棄し、チューブのフタを空けたまま２〜３分間放置し、アセトンを飛ばした。【０１０３】
（２．バッファーが共有結合したＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル１０の作製）
図１に示すようなゲル作製器具を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル（１０）を作製した。まず、１ｍｍのスペーサーおよびパッキンを挟んだ２枚のガラス板（１）をクリップ（２）によって固定した。注入管（３）から、ガラス板の間に、ｐＨ８．８のトリス緩衝液を含むアクリルアミドモノマー溶液（９．７％アクリルアミド、０．３％ビスアクリルアミド、３７５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、０．１％ＴＥＭＥＤ、０．０５％ＡＰＳ）を添加して、約７割まで充填した後、表層に水を重層して、３０分間室温にて重合を行い、分離ゲルを形成した。【０１０４】
次に、水を除いて、分離ゲル上に、ｐＫａ６．８のアクリルアミドバッファーを含むアクリルアミドモノマー溶液（２．９１％アクリルアミド、０．０９％ビスアクリルアミド、１００ｍＭ アクリルアミドバッファー（ｐＫａ６．８）、０．０５％ＴＥＭＥＤ、０．０３％ＡＰＳ）を充填し、平坦なコームを被せることにより、アクリルアミドモノマー溶液の表面が空気に触れないようにして、約２時間室温にて重合させて、濃縮ゲル５を形成した。これにより、濃縮ゲルおよび分離ゲルを備えた二層のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲルを作製した（図２参照）。【０１０５】
（３．二次元電気泳動：一層のゲルとの対比）
シャープマニファクチュアリングシステム社製のＡｕｔｏ２Ｄにより二次元電気泳動を行なった。実施例としては、２．において作製した二層のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲルを用い、比較例としては、保存性を考慮して作製されている市販の一層（ｐＨ８．８）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲルを用いた。【０１０６】
まず、１．においてマウス肝臓から調製した可溶性のタンパク質を試料として二次元電気泳動を行なった。陰極バッファーとしては、２５ｍＭトリス塩基、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳＤを含む水溶液を用いた。結果を図６に示す。実施例に係るＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル（図６の（ａ））では、比較例に係るＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル（図６の（ｂ））に比べて、分子量方向のスポットをシャープに検出することができた。【０１０７】
また、抗体（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）を試料として二次元電気泳動を行った。一次元目の電気泳動条件は、次の通りとした。
Ｓｔｅｐ１：２００Ｖ，５分間一定
Ｓｔｅｐ２：１０００Ｖ，５分間リニアグラジエント
Ｓｔｅｐ３：１０００Ｖ，５分間一定
Ｓｔｅｐ４：４０００Ｖ，１０分間リニアグラジエント
Ｓｔｅｐ５：４０００Ｖ，１０分間一定
Ｓｔｅｐ６：７０００Ｖ，１０分間リニアグラジエント
Ｓｔｅｐ７：７０００Ｖ，２０分間一定
その後、２次元電気目電気泳動は、次の通りとした。
Ｓｔｅｐ１:１０ｍＡ、１０分間一定
Ｓｔｅｐ２：２０ｍＡ、３５分間
二次元電気泳動結果を図７に示す。比較例に係るＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル（図７の（ｂ））では、スポットが縦に伸びる現象が発生していた。これは、非還元条件下の抗体が約１６０ｋＤａと非常に大きな分子であることに起因する。一方、実施例に係るＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル（図７の（ａ））では、濃縮ゲルにおいて濃縮効果が得られるため、抗体を試料とした場合でも、スポットが縦に伸びる現象を抑制することができた（図７の（ａ））。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥをおこなう電気泳動装置や、二次元電気泳動装置に利用することができる他、例えば創薬研究開発にも利用可能であり、また診断用医療関係機器へ応用することも可能である。
【符号の説明】
【０１０９】
１  ゲル板
２  クリップ
３  チューブ
４  分離ゲル
５  濃縮ゲル
１０  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル（ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル）
１０’  ゲル収納部
４０  ゲル付き保持体
２００  等電点電気泳動ゲル
４００  自動化二次元電気泳動装置
４１０  一次元目電気泳動部（第一泳動部）
４１１  第一試薬槽
４１２  第２試薬槽
４２０  二次元目電気泳動部（第二泳動部）
４２１  下部絶縁板
４２２  上部絶縁板
４２８ａ  第１緩衝液槽
４２８ｂ  第２緩衝液槽
４２９ａ  第１電極
４２９ｂ  第２電極
【図１】
2015093301.tif 000005
【図２】
2015093301.tif 000006
【図３】
2015093301.tif 000007
【図４】
2015093301.tif 000008
【図５】
2015093301.tif 000009
【図６】
2015093301.tif 000010
【図７】
2015093301.tif 000011
【国際調査報告】
2015093301.tif 000012
2015093301.tif 000013
2015093301.tif 000014
2015093301.tif 000015