(57)【要約】  本発明の課題は、ポリフェノール混合物から４量体以上のポリフェノールを精度よく分離して、比較的に高純度の４量体以上のポリフェノールを製造する方法を提供することにある。本発明に係る特定ポリフェノールの製造方法では、酸を含まない溶離液を用いて、ポリフェノール混合物から４量体以上のポリフェノールがゲル濾過分画される。また、ゲル濾過分画には、例えば、液体クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いることができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸を含まない溶離液を用いて、ポリフェノール混合物から４量体以上のポリフェノールをゲル濾過分画する
特定ポリフェノールの製造方法。
【請求項２】
前記溶離液の組成を変化させながらゲル濾過分画する
請求項１に記載の特定ポリフェノールの製造方法。
【請求項３】
ゲル濾過材として、グリセロプロピル基を化学結合させたシリカ粒子が用いられる
請求項１または２に記載の特定ポリフェノールの製造方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の特定ポリフェノールの製造方法により製造される４量体以上のポリフェノールを含有する特定ポリフェノール。
【請求項５】
３量体以下のポリフェノールの含有率が１０質量％以下である
特定ポリフェノール。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、飲食品、サプリメントおよび医薬品等に有用な特定のポリフェノールおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリフェノールは、「癌や動脈硬化など、様々な病気の原因といわれる活性酸素の働きを抑制する」、「アレルギーの抑制効果やストレス抑制効果がある」と言われている。このため、ポリフェノールを含む植物や、その植物の加工物および抽出物等が、飲食品、サプリメントおよび医薬品等の分野で、原料や添加剤として幅広く用いられている。特に、カカオには、他の植物と比べ、ポリフェノールが豊富に含まれる。このため、カカオ粉末やカカオエキスは、そのような原料、添加剤として特に注目されている。【０００３】
カカオ由来のポリフェノール（以下「カカオポリフェノール」ともいう）としては、例えば、単量体であるカテキン、２量体であるプロシアニジンＢ２、３量体であるプロシアニジンＣ１、４量体であるシンナムタンニンＡ２等が挙げられる。【０００４】
ところで、従来、生体に対して前述のような様々な作用や効果を与えるものは、カカオポリフェノールのうち、腸管から吸収可能な重合度３以下（すなわち単量体、２量体および３量体）のポリフェノール成分であると考えられてきた。このような事情から、過去に「カカオポリフェノールから（±）−カテキン、（±）−エピカテキンおよびそれらのプロシアニジン（２量体、３量体を含む）を分離する方法」が提案されていたり（例えば、特表２００９−５０１１６１号公報等）、「カカオポリフェノールから「カテキン、エピカテキンおよびそれらのプロシアニジン」又は「高級プロシアニジン」を抽出分離する方法」が提案されたりしている（例えば、特表２００３−５３５１１１号公報）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００９−５０１１６１号公報
【特許文献２】特表２００３−５３５１１１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところが、近年、４量体以上のポリフェノールにも有益な作用や効果あるいは用途があることが判明している。【０００７】
そこで、本発明の課題は、ポリフェノール混合物から４量体以上のポリフェノールを精度よく分離して、比較的に高純度の４量体以上のポリフェノールを製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１局面に係る特定ポリフェノールの製造方法では、酸を含まない溶離液（以下「酸不含有溶離液」ともいう）を用いて、ポリフェノール混合物から４量体以上のポリフェノールがゲル濾過分画される。なお、ここにいう「ポリフェノール」とは、フェノール性水酸基を複数で有する植物成分の総称である。また、ここにいう「ポリフェノール混合物」とは、例えば、カカオエキスである。さらに、４量体以上のポリフェノール（以下「特定ポリフェノール」ともいう）は、４量体以上のプロシアニジンであることが好ましい。なお、「プロシアニジン」とは、カテキンやエピカテキン等のカテキン類のオリゴマーである。また、ポリフェノール又はプロシアニジンの重合度の上限は、２０であることが好ましい。また、ゲル濾過分画には、例えば、液体クロマトグラフィー（高速液体クロマトグラフィーを含む）、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いることができる。また、このとき、ゲル濾過材として、グリセロプロピル基を化学結合させたシリカ粒子を用いることが好ましい。【０００９】
なお、この特定ポリフェノールの製造方法において、ゲル濾過分画では、溶離液としての酸不含有溶離液の組成を変化させることが好ましい。そして、酸不含有溶離液の組成は、少なくとも４段階で変化させることが好ましい。この特定ポリフェノールに、３量体以下のポリフェノールが混入することを有効に抑制することができるからである。【００１０】
本願発明者らの鋭意検討の結果、この特定ポリフェノールの製造方法を利用すると、ポリフェノール混合物から４量体以上のポリフェノールを精度よく分離して、比較的に高純度の４量体以上のポリフェノールを製造することができることが明らかとなった。このとき、この特定ポリフェノールでは、カテキン、エピカテキンおよび３量体以下のプロシアニジンを含有しないことが好ましい。ただし、これは、カテキン、エピカテキンおよび３量体以下のプロシアニジンを「実質的に」含有しないことを意味する。つまり、この特定ポリフェノールは、「カテキン、エピカテキンおよび３量体以下のポリフェノールの総質量」に対する「４量体以上のポリフェノールの総質量」の比が９以上、好ましくは１０以上、より好ましくは１１以上、さらに好ましくは１２以上であるポリフェノール混合物であると言い換えることもできる。なお、この比の上限は無限大（∞）であり、この比が高ければ高い程に好ましいが、例えば、この比の上限は１００である。【００１１】
本発明の第２局面に係る特定ポリフェノールは、３量体以下のポリフェノールの含有率が１０質量％以下である。なお、３量体以下のポリフェノールの含有率は９質量％以下であることが好ましく、８質量％以下であることがより好ましく、７質量％以下であることがさらに好ましく、６質量％以下であることが特に好ましく、５質量％以下であることが最も好ましい。【００１２】
このとき、ポリフェノールとして、例えば、カカオポリフェノールを用いると、その安全性や風味・物性等の観点から、特定ポリフェノールは、飲食品用原料（素材、組成物）、サプリメント用原料（素材、組成物）および医薬品用原料（素材、組成物）等として、好ましく、飲食品用原料およびサプリメント用原料として、より好ましく、飲食品用原料として、さらに好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１に係るゲル濾過分画の結果を示すチャートである。
【図２】実施例２に係るゲル濾過分画の結果を示すチャートである。
【図３】実施例２に係るゲル濾過分画後の各画分に含まれる高重合度プロシアニジンの含有率の解析結果を示すチャートである（ａ）カカオエキス（ＣＬＰｒ）、ｂ）低重合画分（ＣＬＰｒ−Ｌ）、ｃ）高重合画分（ＣＬＰｒ−Ｈ））。
【図４】比較例１に係るゲル濾過分画の結果を示すチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の実施の形態に係る４量体以上のカカオプロシアニジン（以下「高重合プロシアニジン」ともいう）は、カカオエキスをゲル濾過分画することによって得ることができる。なお、このゲル濾過分画では、溶離液として「酸を含まない溶離液」が使用される。なお、カカオエキスは、市販品等を購入してもよいし、公知の方法によって、カカオ豆・カカオ粉末から抽出してもよい。本発明の実施の形態に用いることができる「カカオ豆」は、産地や生育状況、焙焼の有無等により制限されることはない。
【００１５】
ゲル濾過分画には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＦＣ）等の公知の手段を用いることができる。なお、実験室規模では操作の容易さや再現性の観点から、ＨＰＬＣを用いることが好ましく、実験室規模と同等の分画効率を得られる範囲において、パイロットプラント規模や実機規模へのスケールアップも可能である。かかる場合、ゲル濾過材の一態様として、順相分離用の「グリセロプロピル基を化学結合させたシリカ粒子」を用いて、極性の低い分子から溶出される（本発明では、重合度が低いポリフェノールから順に溶出される）原理を利用し、ＨＰＬＣ、ＧＦＣ等を実行することが好ましい。
【００１６】
ここにいう「酸を含まない溶離液」とは、溶離液に一般的に添加される酢酸、リン酸、ギ酸、トルフルオロ酢酸等を実質的に含まない溶離液を意味する。なお、本発明の実施の形態では、このような溶離液としては、例えば、アセトニトリル・メタノール等の極性有機溶媒、水、これらの混合溶液が好適に用いられる。なお、「酸を含まない」とは、３量体以下のカカオポリフェノールと４量体以上のカカオポリフェノール（カカオプロシアニジン）とのゲル濾過分画に実質的に影響を及ぼさないことを基準として判断することができる。
【実施例】
【００１７】
以下に、実施例を示して、本発明をより詳細に説明する。なお、本発明は、以下に示す実施例に限定されることはない。また、以下において、「低重合」との用語は、重合度が１以上３以下、すなわち単量体〜３量体であることを意味し、「高重合」との用語は、重合度が４以上、すなわち４量体以上であることを意味する。【００１８】
＜実施例１＞
（１）原料液の調製
エクアドル原産のカカオエキス（以下「ＣＬＰｒ」ともいう）の濃度が３０ｍｇ／ｍＬとなるように、ＣＬＰｒをメタノール水溶液（５０質量％）に溶解させた後に、このＣＬＰｒ溶液を、孔径が０．４５μｍの再生セルロース膜で濾過して、原料液を調製した。【００１９】
（２）ゲル濾過分画
高速液体クロマトグラフィー（以下「ＨＰＬＣ」ともいう）システムの環境条件を、以下に示すように設定した。そして、上述の原料液を５０μＬでＨＰＬＣシステムに注入し、原料液の注入後の８分から１６分の溶離画分を低重合画分（以下「ＣＬＰｒ−Ｌ」ともいう）とし、原料液の注入後の１７分から２５分の溶離画分を高重合画分（以下「ＣＬＰｒ−Ｈ」ともいう）として、それぞれを分画採取した（図１参照）。図１に示される通り、本実施例では、３量体と４量体のピークが完全に離れている。このため、ＣＬＰｒ−Ｌには、主にカテキン、エピカテキンならびにそれらの２量体および３量体が含まれ、ＣＬＰｒ−Ｈには、主に４量体以上のプロシアニジンが含まれている。つまり、各画分に含まれる高重合プロシアニジンの含有率、各画分の収率は、後述する実施例２の結果と同様であった。なお、この分画点としては、ＣＬＰｒ-Ｈに可能な限り、カテキン、エピカテキンならびにそれらの２量体および３量体のプロシアニジンが含まれない時点を設定した。【００２０】
（ＨＰＬＣシステムの環境条件）
・装置：セミ分取用液体クロマトグラフィーシステム（島津社製、システム構成：ＬＣ−６ＡＤ，２台、ＣＢＭ−２０Ａ、ＣＴＯ−２０Ａ、ＳＩＬ−１０ＡＦ、ＳＰＤ−２０Ａ、ＦＲＣ−１０Ａ、ＬＣｓｏｌｕｔｉｏｎソフトウェア）
・カラム：Ｄｅｖｅｒｏｓｉｌ  １００  Ｄｉｏｌ−５  ８．０×３００ｍｍ
・流速：２．４ｍｌ／分
・検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ
・溶離液：アセトニトリルおよびメタノール水溶液（９７質量％）
・グラジエント：（メタノール水溶液（９７質量％）の質量％）  ０（０分）、２０（４〜９分）、４０（１３〜１８分）、０（２０〜３０分）【００２１】
＜実施例２＞
（１）原料液の調製
実施例１と同様にして、ＣＬＰｒを調製した。
（２）ゲル濾過分画
ＨＰＬＣシステムの環境条件を、以下に示すように変更し、上述の原料液を１９６０μＬでそのＨＰＬＣシステムに注入した。そして、原料液の注入後の４５分から８５分の溶離画分をＣＬＰｒ−Ｌとし、原料液の注入後の９０分から１３５分の溶離画分をＣＬＰｒ−Ｈとした以外は、実施例１と同様にして、それぞれを分画採取した（図２参照）。【００２２】
（ＨＰＬＣシステムの環境条件）
・装置：大量分取用液体クロマトグラフィーシステム（島津社製、システム構成：ＬＣ−８Ａ，２台、ＦＣＶ−１３０ＡＬ、ＳＩＬ−１０ＡＰ、ＳＰＤ−２０ＡＶ、ＦＲＣ−１０Ａ、ＬＣｓｏｌｕｔｉｏｎソフトウェア）
・ガードカラム：Ｄｅｖｅｒｏｓｉｌ  １００  Ｄｉｏｌ−１０  ５０×１００ｍｍ
・本カラム：Ｄｅｖｅｒｏｓｉｌ  １００  Ｄｉｏｌ−１０  ５０×３００ｍｍ
・流速：２０．８ｍｌ／分
・検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ
・溶離液：アセトニトリルおよびメタノール水溶液（９７質量％）
・グラジエント：（メタノール水溶液（９７質量％）の質量％）  ０（０分）、２０（２４〜５４分）、４０（７８〜１０８分）、０（１２０〜１８０分）【００２３】
（３）各画分に含まれる高重合プロシアニジンの含有率の解析
上述のＣＬＰｒ−ＬおよびＣＬＰｒ−Ｈの各溶離画分をそれぞれ２〜４ｍＬで採取し、遠心エバポレーターにて、それぞれを乾固した。次いで、その乾固した各溶離画分を、１００μＬのメタノール水溶液（５０質量％）で、それぞれ再溶解させて、サンプルとした。【００２４】
上記の各サンプルを、Ｋｅｌｍらの方法に準拠したプロシアニジン類順相ＨＰＬＣ測定法（Kelm, M.A. et al. J. Agric Food Chem 2006, 54(5); p.1571-1576  参照）を用いて、エピカテキン等量で分析したところ、図３に示される分析チャートおよび表１に示される結果が得られた。【００２５】
【表１】
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【００２６】
ＣＬＰｒ−Ｈには、４量体以上のプロシアニジンが９０質量％以上で含まれていた。一方、ＣＬＰｒ−Ｌでは、４量体以上のプロシアニジンが検出されなかった。なお、これらのプロシアニジンは、逆相ＨＰＬＣ分析の手法に準じて、エピカテキンで検量線を作成し、各重合度のプロシアニジン濃度をエピカテキン当量として算出することにより定量した。【００２７】
（４）各画分の収率
上述のＣＬＰｒ−ＬおよびＣＬＰｒ−Ｈの各溶離画分を、エバポレーターで減圧し、有機溶媒を除去して濃縮した。そして、この濃縮された溶離画分を超純水で洗浄しながら金属容器に移し、−８０℃で凍結乾燥させた。そして、各溶離画分の重量を秤量して、ＣＬＰｒ−ＬおよびＣＬＰｒ−Ｈの各収率を求めたところ、ＣＬＰｒ−Ｌの収率は３３％であり、ＣＬＰｒ−Ｈの収率は４０％であった。【００２８】
＜比較例１＞
（１）原料液の調製
実施例１と同様にして、ＣＬＰｒを調製した。
（２）ゲル濾過分画
ＨＰＬＣシステムの環境条件を、以下に示すように変更し、上述の原料液を５０μＬでそのＨＰＬＣシステムに注入した。そして、原料液の注入後の８分から１８．５分の溶離画分をＣＬＰｒ−Ｌとし、原料液の注入後の１９分から３０分の溶離画分をＣＬＰｒ−Ｈとした以外は、実施例１と同様にして、それぞれを分画採取した（図４参照）。図４に示される通り、本比較例では、３量体と４量体のピークが接近している。このため、ＣＬＰｒ−Ｈには、カテキン、エピカテキンならびにそれらの２量体および３量体のプロシアニジンが比較的に多量に含まれており、高純度なＣＬＰｒ−Ｈを得ることが困難であった。【００２９】
（ＨＰＬＣシステムの環境条件）
・装置：セミ分取用液体クロマトグラフィーシステム（島津社製、システム構成：ＬＣ−６ＡＤ，２台、ＣＢＭ−２０Ａ、ＣＴＯ−２０Ａ、ＳＩＬ−１０ＡＦ、ＳＰＤ−２０Ａ、ＦＲＣ−１０Ａ、ＬＣｓｏｌｕｔｉｏｎソフトウェア）
・カラム：Ｄｅｖｅｒｏｓｉｌ  １００  Ｄｉｏｌ−５  ８．０×３００ｍｍ
・流速：２．４ｍｌ／分
・検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ
・溶離液：酢酸アセトニトリル溶液（２質量％）および酢酸・メタノール水溶液（酢酸：２質量％，メタノール９５質量％）
・グラジエント：（酢酸・メタノール水溶液の質量％）  ０（０分）、４０（１８〜２３分）、０（２５〜３５分）【００３０】
＜実施例および比較例の結果からの考察＞
「実施例１および実施例２に係るゲル濾過分画の結果を示す図１および図２」と「比較例１に係るゲル濾過分画の結果を示す図４」とを対比すると、前者における３量体の検出ピークと４量体の検出ピークとの時間間隔が、後者における時間間隔よりも長くなっていることが分かる。このため、実施例１および実施例２では、従前よりも高純度の高重合プロシアニジン（すなわち、４量体以上のプロシアニジン）を分画することができたものと考えられる。通常、ポリフェノール粗精製物よりポリフェノールを精度よく分画するためには、ゲル濾過分画の溶離液に酸を添加することが一般的である。これに対し、本実施例に係るゲル濾過分画方法では、敢えて酸を添加しないことにより３量体の検出ピークと４量体の検出ピークの時間間隔を広げることができた。そして、その結果、高純度の高重合プロシアニジンを得ることができた。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明に係る特定ポリフェノールの製造方法では、高純度の高重合カカオプロシアニジン（すなわち、４量体以上のカカオプロシアニジン）を得ることができる。なお、本発明に係る特定ポリフェノールの製造方法は、カカオ粉末およびカカオエキスから高重合プロシアニジンをゲル濾過分画により抽出することに限られず、ポリフェノールを含む他の植物や飲食品、例えば、茶、果実（ぶどう、りんご、ブルーベリー等）、穀類（ごま、大豆、そば等）もしくはこれらの粉末、またはこれらの抽出物からポリフェノールをゲル濾過分画により抽出する際にも応用することができる。【００３２】
また、本発明に係る特定ポリフェノールの製造方法により製造した高重合プロシアニジンは、例えば、血糖値コントロール剤等の医薬品等の有効成分として利用することができるだけでなく、飲食品、サプリメント等に添加して利用することもできる。なお、これらの医薬品等は、経口投与されてもよいし、経管投与されてもよいし、経腸投与されてもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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