(57)【要約】  本発明の課題は、インフルエンザウイルスに対して高い結合活性及び高い中和活性を有する新規な抗体を提供することである。本発明によれば、特定の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）及び重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDRを有する重鎖可変領域と、特定の軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）及び軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDRを有する軽鎖可変領域とを有する、Ｈ１型インフルエンザウイルス及び／又はＨ５型インフルエンザウイルスを中和する抗体が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）から（２９）の何れかに記載の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）及び重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDRを有する重鎖可変領域と、下記（１）から（２９）の何れかに記載の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）及び軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDRを有する軽鎖可変領域とを有する、Ｈ１型インフルエンザウイルス及び／又はＨ５型インフルエンザウイルスを中和する抗体。
（１）配列番号１のVH CDR1、配列番号２のVH CDR2、配列番号３のVH CDR3、配列番号４のVL CDR1、配列番号５のVL CDR2、配列番号６のVL CDR3
（２）配列番号７のVH CDR1、配列番号８のVH CDR2、配列番号９のVH CDR3、配列番号１０のVL CDR1、配列番号１１のVL CDR2、配列番号１２のVL CDR3
（３）配列番号１３のVH CDR1、配列番号１４のVH CDR2、配列番号１５のVH CDR3、配列番号１６のVL CDR1、配列番号１７のVL CDR2、配列番号１８のVL CDR3
（４）配列番号１９のVH CDR1、配列番号２０のVH CDR2、配列番号２１のVH CDR3、配列番号２２のVL CDR1、配列番号２３のVL CDR2、配列番号２４のVL CDR3
（５）配列番号２５のVH CDR1、配列番号２６のVH CDR2、配列番号２７のVH CDR3、配列番号２８のVL CDR1、配列番号２９のVL CDR2、配列番号３０のVL CDR3
（６）配列番号３１のVH CDR1、配列番号３２のVH CDR2、配列番号３３のVH CDR3、配列番号３４のVL CDR1、配列番号３５のVL CDR2、配列番号３６のVL CDR3
（７）配列番号３７のVH CDR1、配列番号３８のVH CDR2、配列番号３９のVH CDR3、配列番号４０のVL CDR1、配列番号４１のVL CDR2、配列番号４２のVL CDR3
（８）配列番号４３のVH CDR1、配列番号４４のVH CDR2、配列番号４５のVH CDR3、配列番号４６のVL CDR1、配列番号４７のVL CDR2、配列番号４８のVL CDR3
（９）配列番号４９のVH CDR1、配列番号５０のVH CDR2、配列番号５１のVH CDR3、配列番号５２のVL CDR1、配列番号５３のVL CDR2、配列番号５４のVL CDR3
（１０）配列番号５５のVH CDR1、配列番号５６のVH CDR2、配列番号５７のVH CDR3、配列番号５８のVL CDR1、配列番号５９のVL CDR2、配列番号６０のVL CDR3
（１１）配列番号６１のVH CDR1、配列番号６２のVH CDR2、配列番号６３のVH CDR3、配列番号６４のVL CDR1、配列番号６５のVL CDR2、配列番号６６のVL CDR3
（１２）配列番号６７のVH CDR1、配列番号６８のVH CDR2、配列番号６９のVH CDR3、配列番号７０のVL CDR1、配列番号７１のVL CDR2、配列番号７２のVL CDR3
（１３）配列番号７３のVH CDR1、配列番号７４のVH CDR2、配列番号７５のVH CDR3、配列番号７６のVL CDR1、配列番号７７のVL CDR2、配列番号７８のVL CDR3
（１４）配列番号７９のVH CDR1、配列番号８０のVH CDR2、配列番号８１のVH CDR3、配列番号８２のVL CDR1、配列番号８３のVL CDR2、配列番号８４のVL CDR3
（１５）配列番号８５のVH CDR1、配列番号８６のVH CDR2、配列番号８７のVH CDR3、配列番号８８のVL CDR1、配列番号８９のVL CDR2、配列番号９０のVL CDR3
（１６）配列番号９１のVH CDR1、配列番号９２のVH CDR2、配列番号９３のVH CDR3、配列番号９４のVL CDR1、配列番号９５のVL CDR2、配列番号９６のVL CDR3
（１７）配列番号９７のVH CDR1、配列番号９８のVH CDR2、配列番号９９のVH CDR3、配列番号１００のVL CDR1、配列番号１０１のVL CDR2、配列番号１０２のVL CDR3
（１８）配列番号１０３のVH CDR1、配列番号１０４のVH CDR2、配列番号１０５のVH CDR3、配列番号１０６のVL CDR1、配列番号１０７のVL CDR2、配列番号１０８のVL CDR3
（１９）配列番号１０９のVH CDR1、配列番号１１０のVH CDR2、配列番号１１１のVH CDR3、配列番号１１２のVL CDR1、配列番号１１３のVL CDR2、配列番号１１４のVL CDR3
（２０）配列番号１１５のVH CDR1、配列番号１１６のVH CDR2、配列番号１１７のVH CDR3、配列番号１１８のVL CDR1、配列番号１１９のVL CDR2、配列番号１２０のVL CDR3
（２１）配列番号１２１のVH CDR1、配列番号１２２のVH CDR2、配列番号１２３のVH CDR3、配列番号１２４のVL CDR1、配列番号１２５のVL CDR2、配列番号１２６のVL CDR3
（２２）配列番号１２７のVH CDR1、配列番号１２８のVH CDR2、配列番号１２９のVH CDR3、配列番号１３０のVL CDR1、配列番号１３１のVL CDR2、配列番号１３２のVL CDR3
（２３）配列番号１３３のVH CDR1、配列番号１３４のVH CDR2、配列番号１３５のVH CDR3、配列番号１３６のVL CDR1、配列番号１３７のVL CDR2、配列番号１３８のVL CDR3
（２４）配列番号１３９のVH CDR1、配列番号１４０のVH CDR2、配列番号１４１のVH CDR3、配列番号１４２のVL CDR1、配列番号１４３のVL CDR2、配列番号１４４のVL CDR3
（２５）配列番号１４５のVH CDR1、配列番号１４６のVH CDR2、配列番号１４７のVH CDR3、配列番号１４８のVL CDR1、配列番号１４９のVL CDR2、配列番号１５０のVL CDR3
（２６）配列番号１５１のVH CDR1、配列番号１５２のVH CDR2、配列番号１５３のVH CDR3、配列番号１５４のVL CDR1、配列番号１５５のVL CDR2、配列番号１５６のVL CDR3
（２７）配列番号１５７のVH CDR1、配列番号１５８のVH CDR2、配列番号１５９のVH CDR3、配列番号１６０のVL CDR1、配列番号１６１のVL CDR2、配列番号１６２のVL CDR3
（２８）配列番号１６３のVH CDR1、配列番号１６４のVH CDR2、配列番号１６５のVH CDR3、配列番号１６６のVL CDR1、配列番号１６７のVL CDR2、配列番号１６８のVL CDR3
（２９）配列番号１６９のVH CDR1、配列番号１７０のVH CDR2、配列番号１７１のVH CDR3、配列番号１７２のVL CDR1、配列番号１７３のVL CDR2、配列番号１７４のVL CDR3
【請求項２】
重鎖可変部および軽鎖可変部がそれぞれ以下の（１）〜（２９）のいずれかに示される配列番号に示されるアミノ酸配列からなる、請求項１記載の抗体。
（１）配列番号１７６及び配列番号１７８
（２）配列番号１８０及び配列番号１８２
（３）配列番号１８４及び配列番号１８６
（４）配列番号１８８及び配列番号１９０
（５）配列番号１９２及び配列番号１９４
（６）配列番号１９６及び配列番号１９８
（７）配列番号２００及び配列番号２０２
（８）配列番号２０４及び配列番号２０６
（９）配列番号２０８及び配列番号２１０
（１０）配列番号２１２及び配列番号２１４
（１１）配列番号２１６及び配列番号２１８
（１２）配列番号２２０及び配列番号２２２
（１３）配列番号２２４及び配列番号２２６
（１４）配列番号２２８及び配列番号２３０
（１５）配列番号２３２及び配列番号２３４
（１６）配列番号２３６及び配列番号２３８
（１７）配列番号２４０及び配列番号２４２
（１８）配列番号２４４及び配列番号２４６
（１９）配列番号２４８及び配列番号２５０
（２０）配列番号２５２及び配列番号２５４
（２１）配列番号２５６及び配列番号２５８
（２２）配列番号２６０及び配列番号２６２
（２３）配列番号２６４及び配列番号２６６
（２４）配列番号２６８及び配列番号２７０
（２５）配列番号２７２及び配列番号２７４
（２６）配列番号２７６及び配列番号２７８
（２７）配列番号２８０及び配列番号２８２
（２８）配列番号２８４及び配列番号２８６
（２９）配列番号２８８及び配列番号２９０
【請求項３】
抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、F(ab')２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化V領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化V領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載の抗体をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項１から３のいずれか１項に記載の抗体を生成蓄積させ、培養物から抗体を採取することを含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の抗体の製造方法。
【請求項８】
請求項１から３の何れか１項に記載の抗体を含有する、医薬組成物。
【請求項９】
請求項１から３の何れか１項に記載の抗体を含有する、インフルエンザに対する受動免疫療法剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザウイルスに対して中和活性を示す抗インフルエンザウイルス抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは、オルソミクソウィルス科に属する直径約１００ｎｍの粒子サイズを有するＲＮＡエンベロープウィルスであり、内部タンパクの抗原性に基づいて、Ａ、ＢおよびＣ型に分けられる。インフルエンザウィルスは、脂質二重層構造を有するウィルスエンベロープに取り囲まれた内部ヌクレオキャプシドまたは核タンパク質と会合したリボ核酸（ＲＮＡ）のコアと、外部糖タンパク質からなる。ウィルスエンベロープの内層は、主としてマトリックスタンパク質で構成され、外層は大部分が宿主由来脂質物質で構成される。インフルエンザウイルスのＲＮＡは、分節構造をとる。世界中で大流行するインフルエンザは、Ａ型インフルエンザウイルスによるものである。Ａ型は、ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）の２種類のエンベロープ糖タンパク質を有し、抗原性の違いによってＨＡでは１６種、ＮＡでは９種のサブタイプに区別されている。【０００３】
昨今、高病原性Ｈ５Ｎ１型トリインフルエンザウイルスが世界的に猛威を振るっており、いつヒトからヒトへ感染する新型ウイルスが登場してパンデミックを引き起こしてもおかしくない状況である。その対策として、世界的なウイルス検査体制が整備され、治療薬としてのタミフル等の大量備蓄、ワクチンの開発・製造・備蓄が進められている。しかし、それはいつどのような形で登場するか、その際、タミフル等は治療効果を示すのか、開発されたワクチンは有効なのか、それをいつ誰に接種するのか、そもそも厳戒態勢をいつ始め、いつ解除するのか、など多くの課題があいまいな形で残されたまま事態は進行している。これは、まだ実際には登場していない病原菌やウイルスに対してワクチンや治療薬を準備するという、人類史上初体験となる状況を迎えているためである。特に、ワクチン開発における課題点として、インフルエンザウイルスゲノムには、毎年多くの変異がへマグルチニン遺伝子に導入されてantigenic drift （抗原性の変化）を起こし、それがエピデミックな流行の原因となっていると考えられている。従って、流行する型と合わないワクチンを接種すると、その予防効果が期待できない。従来、インフルエンザウイルスに対して抗体治療薬（予防薬）を開発することが試みられなかった理由は、antigenic driftにより折角開発した薬が、開発した頃には中和できるはずのウイルスの性質が変化しており、役に立たないことを危倶するがためである。【０００４】
本発明者らは、１個体から採取した大量のＢリンパ球から作製したファージディスプレイヒト抗体ライブラリーを、１９６８〜２００４年の間に分離された１２のＨ３Ｎ２型インフルエンザウイルス株に対してスクリーニングした結果、中和活性を示す大半のクローンは抗へマグルチニン抗体であり、それらは１９６８〜１９７３年に分離されたウイルス株、１９７７〜１９９３年に分離されたウイルス株、または１９９７〜２００３年に分離されたウイルス株を特異的に中和する３つの群に大別されることを見出した （非特許文献１）。このことは、インフルエンザウイルスに対する抗体治療薬（予防薬）を開発しても意味がないという従来の常識を翻すものであるが、ファージ抗体ライブラリーは重鎖と軽鎖の組合せが必ずしも生体内を反映しない等の理由から、これまで真剣に検討されてこなかった。【０００５】
このような状況の下、３グループが独自に、Ｈ５型インフルエンザウイルスを中和するヒトモノクローナル抗体の単離に成功した（特許文献１、２、非特許文献２〜４）。これらの抗体は、Ｈ５型だけでなく、他のサブタイプ （例えば、Ｈ１型など）のインフルエンザウイルスに対しても中和活性を有することが示された。しかし、ヘマグルチニンの１６種のサブタイプ（Ｈ１〜Ｈ１６）は抗原性の違いによって大きく２つのグループ（グループ１および２）に分類される。【０００６】
さらに、Ｈ１型、Ｈ２型、Ｈ５型、Ｈ６型、Ｈ８型、Ｈ９型、Ｈ１１型、Ｈ１２型、Ｈ１３型およびＨ１６型インフルエンザウイルスからなるグループ１より選択される少なくとも１つのインフルエンザウイルスと、Ｈ３型、Ｈ４型、Ｈ７型、Ｈ１０型、Ｈ１４型およびＨ１５型インフルエンザウイルスからなるグループ２より選択される少なくとも１つのインフルエンザウイルスとを中和する単離された抗体が報告されている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】Ｗ０２００７／１３４３２７
【特許文献２】Ｗ０２００８／０２８９４６
【特許文献３】ＷＯ２０１２／０２９９９７
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Virology Vol.397, pp.322-330,2010
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.105,pp.5986-5991,2008
【非特許文献３】PLOS ONE, Vol.3,PP.5986-5991,e3942,2008
【非特許文献４】Nature Structural＆Molecular Biology,Vol.16,pp.265-273,2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
来るべきＨ５Ｎ１型インフルエンザのパンデミックや、さらにその先に予想されるＨ７，Ｈ９型ウイルスによるパンデミックに備え、抗原性の変化を予測してワクチンをデザインするという従来のインフルエンザに対する予防コンセプトに代わる、より普遍的で確実な新規コンセプトに基づく予防手段の開発が大いに望まれる。本発明の目的は、インフルエンザウイルスに対して高い結合活性及び高い中和活性を有する新規な抗体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、Ｈ１型インフルエンザウイルスを中和できる新規な抗体を取得することに成功し、本発明を完成するに至った。【００１１】
即ち、本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］ 下記（１）から（２９）の何れかに記載の重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）及び重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）からなるCDRを有する重鎖可変領域と、下記（１）から（２９）の何れかに記載の軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）及び軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）からなるCDRを有する軽鎖可変領域とを有する、Ｈ１型インフルエンザウイルス及び／又はＨ５型インフルエンザウイルスを中和する抗体。
（１）配列番号１のVH CDR1、配列番号２のVH CDR2、配列番号３のVH CDR3、配列番号４のVL CDR1、配列番号５のVL CDR2、配列番号６のVL CDR3
（２）配列番号７のVH CDR1、配列番号８のVH CDR2、配列番号９のVH CDR3、配列番号１０のVL CDR1、配列番号１１のVL CDR2、配列番号１２のVL CDR3
（３）配列番号１３のVH CDR1、配列番号１４のVH CDR2、配列番号１５のVH CDR3、配列番号１６のVL CDR1、配列番号１７のVL CDR2、配列番号１８のVL CDR3
（４）配列番号１９のVH CDR1、配列番号２０のVH CDR2、配列番号２１のVH CDR3、配列番号２２のVL CDR1、配列番号２３のVL CDR2、配列番号２４のVL CDR3
（５）配列番号２５のVH CDR1、配列番号２６のVH CDR2、配列番号２７のVH CDR3、配列番号２８のVL CDR1、配列番号２９のVL CDR2、配列番号３０のVL CDR3
（６）配列番号３１のVH CDR1、配列番号３２のVH CDR2、配列番号３３のVH CDR3、配列番号３４のVL CDR1、配列番号３５のVL CDR2、配列番号３６のVL CDR3
（７）配列番号３７のVH CDR1、配列番号３８のVH CDR2、配列番号３９のVH CDR3、配列番号４０のVL CDR1、配列番号４１のVL CDR2、配列番号４２のVL CDR3
（８）配列番号４３のVH CDR1、配列番号４４のVH CDR2、配列番号４５のVH CDR3、配列番号４６のVL CDR1、配列番号４７のVL CDR2、配列番号４８のVL CDR3
（９）配列番号４９のVH CDR1、配列番号５０のVH CDR2、配列番号５１のVH CDR3、配列番号５２のVL CDR1、配列番号５３のVL CDR2、配列番号５４のVL CDR3
（１０）配列番号５５のVH CDR1、配列番号５６のVH CDR2、配列番号５７のVH CDR3、配列番号５８のVL CDR1、配列番号５９のVL CDR2、配列番号６０のVL CDR3
（１１）配列番号６１のVH CDR1、配列番号６２のVH CDR2、配列番号６３のVH CDR3、配列番号６４のVL CDR1、配列番号６５のVL CDR2、配列番号６６のVL CDR3
（１２）配列番号６７のVH CDR1、配列番号６８のVH CDR2、配列番号６９のVH CDR3、配列番号７０のVL CDR1、配列番号７１のVL CDR2、配列番号７２のVL CDR3
（１３）配列番号７３のVH CDR1、配列番号７４のVH CDR2、配列番号７５のVH CDR3、配列番号７６のVL CDR1、配列番号７７のVL CDR2、配列番号７８のVL CDR3
（１４）配列番号７９のVH CDR1、配列番号８０のVH CDR2、配列番号８１のVH CDR3、配列番号８２のVL CDR1、配列番号８３のVL CDR2、配列番号８４のVL CDR3
（１５）配列番号８５のVH CDR1、配列番号８６のVH CDR2、配列番号８７のVH CDR3、配列番号８８のVL CDR1、配列番号８９のVL CDR2、配列番号９０のVL CDR3
（１６）配列番号９１のVH CDR1、配列番号９２のVH CDR2、配列番号９３のVH CDR3、配列番号９４のVL CDR1、配列番号９５のVL CDR2、配列番号９６のVL CDR3
（１７）配列番号９７のVH CDR1、配列番号９８のVH CDR2、配列番号９９のVH CDR3、配列番号１００のVL CDR1、配列番号１０１のVL CDR2、配列番号１０２のVL CDR3
（１８）配列番号１０３のVH CDR1、配列番号１０４のVH CDR2、配列番号１０５のVH CDR3、配列番号１０６のVL CDR1、配列番号１０７のVL CDR2、配列番号１０８のVL CDR3
（１９）配列番号１０９のVH CDR1、配列番号１１０のVH CDR2、配列番号１１１のVH CDR3、配列番号１１２のVL CDR1、配列番号１１３のVL CDR2、配列番号１１４のVL CDR3
（２０）配列番号１１５のVH CDR1、配列番号１１６のVH CDR2、配列番号１１７のVH CDR3、配列番号１１８のVL CDR1、配列番号１１９のVL CDR2、配列番号１２０のVL CDR3
（２１）配列番号１２１のVH CDR1、配列番号１２２のVH CDR2、配列番号１２３のVH CDR3、配列番号１２４のVL CDR1、配列番号１２５のVL CDR2、配列番号１２６のVL CDR3
（２２）配列番号１２７のVH CDR1、配列番号１２８のVH CDR2、配列番号１２９のVH CDR3、配列番号１３０のVL CDR1、配列番号１３１のVL CDR2、配列番号１３２のVL CDR3
（２３）配列番号１３３のVH CDR1、配列番号１３４のVH CDR2、配列番号１３５のVH CDR3、配列番号１３６のVL CDR1、配列番号１３７のVL CDR2、配列番号１３８のVL CDR3
（２４）配列番号１３９のVH CDR1、配列番号１４０のVH CDR2、配列番号１４１のVH CDR3、配列番号１４２のVL CDR1、配列番号１４３のVL CDR2、配列番号１４４のVL CDR3
（２５）配列番号１４５のVH CDR1、配列番号１４６のVH CDR2、配列番号１４７のVH CDR3、配列番号１４８のVL CDR1、配列番号１４９のVL CDR2、配列番号１５０のVL CDR3
（２６）配列番号１５１のVH CDR1、配列番号１５２のVH CDR2、配列番号１５３のVH CDR3、配列番号１５４のVL CDR1、配列番号１５５のVL CDR2、配列番号１５６のVL CDR3
（２７）配列番号１５７のVH CDR1、配列番号１５８のVH CDR2、配列番号１５９のVH CDR3、配列番号１６０のVL CDR1、配列番号１６１のVL CDR2、配列番号１６２のVL CDR3
（２８）配列番号１６３のVH CDR1、配列番号１６４のVH CDR2、配列番号１６５のVH CDR3、配列番号１６６のVL CDR1、配列番号１６７のVL CDR2、配列番号１６８のVL CDR3
（２９）配列番号１６９のVH CDR1、配列番号１７０のVH CDR2、配列番号１７１のVH CDR3、配列番号１７２のVL CDR1、配列番号１７３のVL CDR2、配列番号１７４のVL CDR3【００１２】
［２］  重鎖可変部および軽鎖可変部がそれぞれ以下の（１）〜（２９）のいずれかに示される配列番号に示されるアミノ酸配列からなる、請求項１記載の抗体。
（１）配列番号１７６及び配列番号１７８
（２）配列番号１８０及び配列番号１８２
（３）配列番号１８４及び配列番号１８６
（４）配列番号１８８及び配列番号１９０
（５）配列番号１９２及び配列番号１９４
（６）配列番号１９６及び配列番号１９８
（７）配列番号２００及び配列番号２０２
（８）配列番号２０４及び配列番号２０６
（９）配列番号２０８及び配列番号２１０
（１０）配列番号２１２及び配列番号２１４
（１１）配列番号２１６及び配列番号２１８
（１２）配列番号２２０及び配列番号２２２
（１３）配列番号２２４及び配列番号２２６
（１４）配列番号２２８及び配列番号２３０
（１５）配列番号２３２及び配列番号２３４
（１６）配列番号２３６及び配列番号２３８
（１７）配列番号２４０及び配列番号２４２
（１８）配列番号２４４及び配列番号２４６
（１９）配列番号２４８及び配列番号２５０
（２０）配列番号２５２及び配列番号２５４
（２１）配列番号２５６及び配列番号２５８
（２２）配列番号２６０及び配列番号２６２
（２３）配列番号２６４及び配列番号２６６
（２４）配列番号２６８及び配列番号２７０
（２５）配列番号２７２及び配列番号２７４
（２６）配列番号２７６及び配列番号２７８
（２７）配列番号２８０及び配列番号２８２
（２８）配列番号２８４及び配列番号２８６
（２９）配列番号２８８及び配列番号２９０【００１３】
［３］  抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、F(ab')２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化V領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化V領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、［１］又は［２］に記載の抗体。
［４］  ［１］から［３］のいずれか１項に記載の抗体をコードするＤＮＡ。
［５］  ［４］に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
［６］  ［５］に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。【００１４】
［７］  ［６］に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に［１］から［３］のいずれか１項に記載の抗体を生成蓄積させ、培養物から抗体を採取することを含む、［１］から［３］のいずれか１項に記載の抗体の製造方法。
［８］  ［１］から［３］の何れか１項に記載の抗体を含有する、医薬組成物。
［９］  ［１］から［３］の何れか１項に記載の抗体を含有する、インフルエンザに対する受動免疫療法剤。
［１０］［１］から［３］の何れか１項に記載の抗体を生体に投与することを含む、インフルエンザに対する受動免疫療法。
［１１］インフルエンザに対する受動免疫療法剤として使用するための［１］から［３］の何れか１項に記載の抗体。
［１２］インフルエンザに対する受動免疫療法剤の製造のための、［１］から［３］の何れか１項に記載の抗体の使用。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、group1に属する全インフルエンザウイルスに対して単独抗体にて万能性をもってかつ、ヒトの治療に十分な中和活性を有するヒト抗体を提供することができる。また、group2に属するインフルエンザにも中和活性を保持しうる抗体を提供する。すなわち該中和抗体を受動免疫することにより、antigenic driftはもとよりantigenic shift が起こった時に発生する現在未知のインフルエンザが流行した際（例えば鳥インフルエンザのパンデミック）でも、本発明抗体によって有効にインフルエンザを予防または治療することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ワクチン接種と血液採取のスケジュールを示す。
【図２】図２は、代表クローンの中和カイネティクス活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書において、インフルエンザウイルスは、現在知られているグループ1のサブタイプ、及び将来単離、同定されるサブタイプをも含む。インフルエンザウイルスの現在知られているサブタイプとしては、ヘマグルチニンのＨｌ〜１６から選ばれる型とノイラミニダーゼのＮ１〜９から選ばれる型との組合せからなるサブタイプが挙げられる。
【００１８】
インフルエンザウイルスは、ヘマグルチニンの抗原性の違いによって２グループに大別されている。本明細では、Ｈ１型、Ｈ２型、Ｈ５型、Ｈ６型、Ｈ８型、Ｈ９型、Ｈ１１型、Ｈ１２型、Ｈ１３型およびＨ１６型インフルエンザウイルスからなる群をグループ１とし、Ｈ３型、Ｈ４型、Ｈ７型、Ｈ１０型、Ｈ１４型およびＨ１５型インフルエンザウイルスからなる群をグループ２とする。本グループのカテゴリー選別の際には、ノイラミニダーゼの型は考慮されない。将来単離、同定される新規サブタイプについても、ヘマグルチニンのアミノ酸配列の類似性に基づいて、グループ１またはグループ２に分類される。
【００１９】
本発明の抗体は好ましくは、上記グループ１（Ｈ１型、Ｈ２型、Ｈ５型、Ｈ６型、Ｈ８型、Ｈ９型、Ｈｌ１型、Ｈ１２型、Ｈ１３型およびＨ１６型）より選択される少なくとも１つのインフルエンザウイルスと、上記グループ２（Ｈ３型、Ｈ４型、Ｈ７型、Ｈ1０型、Ｈ１４型およびＨ１５型） より選択される少なくとも１つのインフルエンザウイルスとを中和する抗体である。より好ましくは、本発明の中和抗体は、グループ１のうち少なくともＨ１型および／またはＨ５型インフルエンザウイルスを中和するものである。特に好ましくは、本発明の中和抗体は、Ｈ１型〜Ｈ１６型インフルエンザウイルスすべてを中和するものである。
【００２０】
本発明の中和抗体は、以下の工程（１）から（５）を含む方法により製造することができる。
（１）１個体から採取した約１０８個以上のＢ細胞に由来する抗体クローンを含む抗体ライブラリーを提供する工程
（２）グループ１のサブタイプのいずれかのインフルエンザウイルスまたは該ウイルスのへマグルチニンタンパク質もしくはその細胞外ドメインを抗原として、（１）の抗体ライブラリーと接触させ、該抗原と反応する抗体クローンを網羅的に選抜する工程
（３）（２）で選抜された各抗体クローンから抗体分子を回収する工程
（４）（３）で得られた各抗体について、グループ１より選択される少なくとも１つのインフルエンザウイルスと、グループ２より選択される少なくとも１つのインフルエンザウイルスとに対する中和活性を試験する工程
（５）インフルエンザウイルスを中和した抗体を産生するクローンを用いて該抗体を産生させ、該抗体を回収する工程
【００２１】
抗体ライブラリー作製のための抗体産生細胞であるＢ細胞を採取するドナーは、インフルエンザウイルスに感染歴のある任意の哺乳動物（例えば、ヒト、ブタ、ウマ等）もしくは鳥類（ニワトリ、カモなど）であれば特に制限はなく、本発明の中和抗体を受動免疫する対象に応じて、それと同種の動物を適宜選択することができるが、好ましくはヒトである。ヒトの場合、ドナーの年齢、性別、ワクチン接種の有無等は特に制限されないが、インフルエンザウイルスの感染経験が多いことが望ましいので、好ましくは２０歳以上、より好ましくは３０歳以上、さらに好ましくは４０歳以上、特に好ましくは５０歳以上であるが、これらに限定されない。過去一定期間、Ａ型インフルエンザを発症した履歴のないヒトがより望ましい。
【００２２】
通常の抗体ライブラリー作製に用いられるＢ細胞の採取のための採血量は２０〜３０ｍＬ程度であり、この量の血液中に含まれるＢ細胞の量は約１０7個である。高病原性Ｈ５Ｎ１型トリインフルエンザウイルスに対するヒト中和抗体を単離したいずれのグループも、複数の提供者から通常量の血液を採取してそれらを合わせることにより、約１０10クローンの抗体ライブラリーを作製しているのに対し、本発明者らは、あるサブタイプのへマグルチニンに結合する抗体を徹底的（網羅的）に取得することを意図して、全抗体レパートリーを反映するサイズの抗体ライブラリーの作製を試みた。即ち、通常1回のヒトからの採血量としては２００〜３００ｍｌ程度が限度であり、したがって、この方法では、採取できるＢ細胞量はせいぜい約１０８個である。そこで、本発明者らは、アフェレーシスを用いることによりそれ以上の量の血液中に含まれるＢ細胞を１個体より採取した。好ましくは、本発明の目的に用いられる抗体ライブラリーは、１０９個以上のＢ細胞から構築される。例えば、ヒト１個体から約１０9個のＢ細胞を採取するためには、アフェレーシスにより約３Ｌの血液からＢ細胞を分取すればよい。
抗体ライブラリー作製のための抗体産生細胞は、１個体由来の約１０８個以上、好ましくは、１０９個以上のＢ細胞が含有される限り、別個体由来の抗体産生細胞をさらに含んでもよい。具体的には、例えば、アフェレーシスにより約３Ｌ相当量の単核球を回収した後、例えば、Ficoll-Paque密度勾配などによりＢ細胞を単離・回収することができる。
【００２３】
抗体ライブラリーとしては、例えば、ファージディスプレイライブラリー、ＥＢウイルスによりＢ細胞を不死化して得られるライブラリー、Ｂ細胞とミエローマ細胞とを融合して得られるハイブリドーマライブラリーなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ファージディスプレイライブラリーを用いることができる。
【００２４】
本明細書における、ファージディスプレイヒト抗体ライブラリーの作製方法としては、例えば、以下のものが挙げられるが、これに限定されない。
用いられるファージは特に限定されないが、通常繊維状ファージ（Ffバクテリオファージ）が好ましく用いられる。ファージ表面に外来タンパク質を提示する方法としては、 g3p (cp3)、 g6p (cp6)  〜g9p (cp9)のコートタンパク質のいずれかとの融合タンパク質として該コートタンパク質上で発現・提示させる方法が挙げられるが、よく用いられるのはcp3もしくはcp8のＮ末端側に融合させる方法である。ファージディスプレイベクターとしては、1）ファージゲノムのコートタンパク質遺伝子に外来遺伝子を融合した形で導入して、ファージ表面上に提示されるコートタンパク質をすべて外来タンパク質との融合タンパク質として提示させるものの他、2）融合タンパク質をコードする遺伝子を野生型コートタンパク質遺伝子とは別に挿入して、融合タンパク質と野生型コートタンパク質とを同時に発現させるものや、3）融合タンパク質をコードする遺伝子を有するファージミドベクターを持つ大腸菌に野生型コートタンパク質遺伝子を有するへルパーファージを感染させて融合タンパク質と野生型コートタンパク質とを同時に発現するファージ粒子を産生させるものなどが挙げられるが1）の場合は大きな外来タンパク質を融合させると感染能力が失われることがあるため、そのような場合、抗体ライブラリーの作製のためには2）または3）のタイプが用いられる。
【００２５】
具体的なべクターとしては、Holtら（Curr. Opin. Biotechno., 11: 445-449, 2000）に記載されるものが例示される。例えば、pCESl（J. Biol. Chem., 274:18218-18230,1999 参照）は、1 つのラクトースプロモーターの制御下にcp3 のシグナルペプチドの下流にkＬ鎖定常領域をコードするDNAとcp3 シグナルペプチドの下流にCH3をコードする DNA, His-tag, C-myc tag,アンバー終止コドン(TAG)を介してcp3コード配列とが配置された Fab 発現型ファージミドベクターである。アンバー変異を有する大腸菌に導入すると cp3 コートタンパク質上に Fab を提示するが、アンバー変異を持たない HB2151 株などで発現させると可溶性Fab抗体を産生する。また、scFv発現型ファージミドベクターとしては、例えばpHEN1（J. Mol. Biol.,  222:581-597,1991）等が用いられる。
【００２６】
一方、ヘルパーファージとしては、例えば M13-K07, VCSM13 等が挙げられる。また、別のファージディスプレイベクターとして、抗体遺伝子の3‘末端とコートタンパク質遺伝子の５’末端にそれぞれシステインをコードするコドンを含む配列を連結し、両遺伝子を同時に別個に(融合タンパク質としてではなく)発現させて、導入されたシステイン残基同士によるS-S結合を介してファージ表面のコートタンパク質上に抗体を提示し得るようにデザインされたものMorphosys社のCysDisplayＴＭ技術）等も挙げられる。
【００２７】
本明細書において、調製される抗体ライブラリーの種類としては、ナイーブ／非免疫ライブラリー、合成ライブラリー、免疫ライブラリー等が挙げられる。
ナイーブ／非免疫 （non-immunized） ライブラリーは、正常な動物が保有するVHおよびVL遺伝子をRT-PCR により取得し、それらをランダムに上記のファージディスプレイベクターにクローニングして得られるライブラリーである。通常、正常動物の末梢血、骨髄、肩桃腺などのりンパ球（好ましくは末梢血リンパ球）由来の mRNA 等が鋳型として用いられる。疾病履歴などのＶ遺伝子のバイアスをなくすため、抗原感作によるクラススイッチが起こっていないIg M由来の mRNA のみを増幅したものを特にナイーブライブラリーと呼んでいる。代表的なものとしては、 CAT 社のライブラリー（J. Mol. Biol., 222:581-597,1991; Nat. Biotechnol.,14:309-314,1996 参照）、MRC 社のライブラリー（Annu. Rev. Immunol., 12:433-455,1994 参照）、Dyax 社のライブラリー（J. Biol. Chom.(「Chem.」に変更) , 1999（上述）； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 14: 7969-7974, 2000参照）等が挙げられる。
【００２８】
合成ライブラリーは、ヒトB細胞内の機能的な特定の抗体遺伝子を選び、  Ｖ遺伝子断片の、例えばCDR脇等の抗原結合領域の部分を適当な長さのランダムなアミノ酸配列をコードする DNA で置換し、ライブラリー化したものである。最初から機能的なscFvやFab を産生するVHおよびVL遺伝子の組み合わせでライブラリーを構築できるので、抗体の発現効率や安定性に優れているとされる。代表的なものとしては、Morphosys 社の HuCAL ライブラリー（J. Mol. Biol., 296:  57-86,  2000 参照）、 Biolnvent 社のライブラリー（Nat. Biotechnol,  18:852,  2000 参照）、 Crucell 社のライブラリー（Proc. Natl. Acad. sci. USA, 92:3938, 1995 ;  J.Immumol. Methods,  272:219-233,  2003 参照）等が挙げられる。合成ライブラリーを用いる場合は、重鎖可変部のＶ遺伝子断片としてＶＨ１−６９もしくはＶＨ1−ｅ遺伝子断片を用いることが望ましい。
【００２９】
免疫（innunized）ライブラリーは、ワクチン接種を受けた者など、標的抗原に対する血中抗体価が上昇したヒトから採取したリンパ球、あるいは体外免疫法により標的抗原を人為的に免疫したヒトリンパ球等から、上記ナイーブ／非免疫ライブラリーの場合と同様にしてmRNA を調製し、RT-PCR 法によってVHおよびVL遺伝子を増幅し、ライブラリー化したものである。最初から目的の抗体遺伝子がライブラリー中に含まれるので、比較的小さなサイズのライブラリーからでも目的の抗体を得ることができる。しかし、ワクチン接種により接種したウイルスのサブタイプに特異的な抗体が増幅されるので、ヒトの場合、 Ｈ１〜Ｈ３型の、それに対する抗体が数多く体内に存在すると見積もられるへマグルチニンサブタイプのインフルエンザウイルスをワクチン接種すると、サブタイプ内の特定の分離株のみしか中和できない狭い範囲の中和活性を有する抗体が増幅されて、目的の中和抗体が隠れてしまう恐れがある。したがって、ワクチン接種する場合は、これまで広い範囲での感染が報告されていないサブタイプ（例えば、ヒトの場合、Ｈ５，Ｈ９等）のインフルエンザウイルスのワクチンを接触することが好ましい。
【００３０】
ライブラリーの多様性は大きいほどよいが、現実的には、以下のパニング操作で取り扱えるファージ数(1011〜1013ファージ）と通常のパニングでクローンの単離および増幅に必要なファージ数（100〜1,000ファージ／クローン）を考慮すれば、108〜1011クローン程度が適当である。好ましくは、VHおよびVL遺伝子についてそれぞれ109および106クローン、FabもしくはscFVクローン数として1010〜1011クローンである。
【００３１】
EBウイルスによる不死化により抗体ライブラリーを作製する方法としては、例えば PLos Medicine 4 (5) : e178 0928-9936 （2007）に記載の方法が挙げられるが、これに限定されない。大多数の人は伝染性単核球症の無症状感染としてEBウイルスに感染した経験があるので免疫を有しているが、通常のEBウイルスを用いた場合にはウイルス粒子も産生されるので、適切な精製を行うべきである。ウイルス混入の可能性のないシステムとして、Ｂリンパ球を不死化する能力を保持するがウイルス粒子の複製能力を欠損した組換えEBウイルス（例えば、潜伏感染状態から溶解感染状態への移行のスイッチ遺伝子における欠損など）を用いることもまた好ましい。
【００３２】
マーモセット由来の B95-8 細胞は EB ウイルスを分泌しているので、その培養上清を用いれば容易にBリンパ球をトランスフォームすることができる。この細胞を例えば血清及びペニシリン／ストレプトマイシン（P／S）添加培地  （例：RPM11640）もしくは細胞増殖因子を添加した無血清培地で培養した後、濾過もしくは遠心分離等により培養上清を分離し、これに抗体産生Ｂリンパ球を適当な濃度（例：約107細胞／mL）で浮遊させて、通常 20〜40℃、好ましくは 30〜37℃で通常0.5〜2時間程度インキュベートすることにより抗体産生Ｂ細胞株を得ることができる。ヒトの抗体産生細胞が混合リンパ球として提供される場合、大部分の人はEB ウイルス感染細胞に対して傷害性を示すＴリンパ球を有しているので、トランスフォーメーション頻度を高めるためには、例えばヒツジ赤血球等とEロゼットを形成させることによってＴリンパ球を予め除去しておくことが好ましい。また、可溶性抗原を結合したヒツジ赤血球を抗体産生Ｂリンパ球と混合し、パーコール等の密度勾配を用いてロゼットを分離することにより標的抗原に特異的なリンパ球を選別することができる。さらに、大過剰の抗原を添加することにより抗原特異的なＢリンパ球はキャップされて表面に IgG を提示しなくなるので、抗IgG抗体を結合したヒツジ赤血球と混合すると抗原非特異的なBりンパ球のみがロゼットを形成する。従って、この混合物からパーコール等の密度勾配を用いてロゼット非形成層を採取することにより、抗原特異的Bりンパ球を選別することができる。
【００３３】
トランスフォーメーションによって無限増殖能を獲得した抗体分泌細胞は、抗体分泌能を安定に持続させるためにマウスもしくはヒトの骨髄腫細胞と戻し融合させることができる。骨髄腫細胞としては、例えばマウス骨髄腫細胞としてNS-1、P3Ul、SP2／0、AP-1等が、ヒト骨髄腫細胞としてSKO-007、GM 1500-6TG-2、LICR-LON-HMy2、UC729-6等が挙げられる。
【００３４】
細胞融合により抗体ライブラリーを作製する方法としては、通常のモノクロ−ナル抗体作製のためのハイブリドーマ調製を準用することができる。即ち、ドナーから採取したＢ細胞と、上記の骨髄腫細胞とを融合させることにより、抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。
【００３５】
融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法［ネイチャー(Nature）、256 巻、495頁（1975年）］に従って実施することができる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（PEG）やセンダイウイルスなどが挙げられるが、好ましくは PEG  などが用いられる。PEGの分子量は特に制限はないが、低毒性で且つ粘性が比較的低いPEG1000〜PEG6000 が好ましい。PEG濃度としては例えば１０〜８０％程度、好ましくは３０〜５０％程度が例示される。PEGの希釈用溶液としては無血清培地（例：RPMl1640）、5〜20％程度の血清を含む完全培地、りン酸緩衝生理食塩水（PBS）、トリス緩衝液等の各種緩衝液を用いることができる。所望により DMSO （例：10〜20％程度）を添加することもできる。融合液の PHとしては、例えば4〜10程度、好ましくは6〜8程度が挙げられる。
【００３６】
Ｂ細胞数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は、通常1:1〜20:1 程度であり、通常 20〜40℃、好ましくは 30〜37℃で通常 1〜10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００３７】
ハイブリドーマのスクリーニング、育種は通常HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、5〜20％FCS を含む動物細胞用培地（例: RPM11640）もしくは細胞増殖因子を添加した無血清培地で行われる。ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンの濃度としては、例えばそれぞれ約0.1mM, 約 0.4μM および約 0.016mM 等が挙げられる。ヒトーマウスハイブリドーマの選択にはウワバイン耐性を用いることができる。ヒト細胞株はマウス細胞株に比べてウワバインに対する感受性が高いので、10-７〜10-3M 程度で培地に添加することにより未融合のヒト細胞を排除することができる。
【００３８】
ハイブリドーマの選択にはフィーダー細胞やある種の細胞培養上清を用いることが好ましい。フィーダー細胞としては、ハイブリドーマの出現を助けて自身は死滅するように生存期間が限られた異系の細胞種、ハイブリドーマの出現に有用な増殖因子を大量に産生し得る細胞を放射線照射等して増殖力を低減させたもの等が用いられる。例えば、マウスのフィーダー細胞としては、牌細胞、マクロファージ、血液、胸腺細胞等が、ヒトのフィーダー細胞としては、末梢血単核細胞等が挙げられる。細胞培養上清としては、例えば上記の各種細胞の初代培養上清や種々の株化細胞の培養上清が挙げられる。
【００３９】
標的抗原に対する抗体をファージディスプレイ法で選別する工程をパニングという。具体的には、グループ１のサブタイプいずれかのインフルエンザウイルスまたは該ウイルスのへマグルチニンタンパク質もしくはその細胞外ドメインを固定化した担体と、ファージライブラリーとを接触させ、非結合ファージを洗浄除去した後、結合したファージを担体から溶出させ、大腸菌に感染させて該ファージを増殖させる、という一連の操作を２〜４回程度繰り返すことにより、抗原特異的な抗体を提示するファージを濃縮する。本発明の場合、抗原となるインフルエンザウイルスは、ホルマリン処理により不活性されていてもよい。
【００４０】
各サブタイプのへマグルチニンをコードするｃＤＮＡ配列は公知であり、通常の遺伝子組換え技術を用いて、所望のサブタイプの組換えへマグルチニンを製造することができる。さらに、ヘマグルチニンの三量体細胞外ドメイン構造は、Nature, Vol.289, PP.373-378,1981に記載の方法に準じて調製することができる。
【００４１】
抗原を固定化する担体としては、通常の抗原抗体反応やアフィニティークロマトグラフィーで用いられる各種担体、例えばアガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス、金属などからなるマイクロプレート、チューブ、メンブレン、カラム、ビーズなど、さらには表面プラズモン共鳴 （SPR）のセンサーチップなどが挙げられる。抗原の固定化には物理的吸着を用いてもよく、また、通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。例えばビオチンー（ストレプト）アビジン系等が好ましく用いられる。非結合ファージの洗浄には、BSA 溶液などのブロッキング液（1-2 回）、Tween 等の界面活性剤を含む PBS（3-5 回）などを順次用いることができる。クエン酸緩衝液（PHS）などの使用が好ましいとの報告もある。特異的ファージの溶出には、通常酸（例：0.1M 塩酸など） が用いられるが、特異的プロテアーゼによる切断（例えば、抗体遺伝子とコートタンパク質遺伝子との連結部にトリプシン切断部位をコードする遺伝子配列を導入することができる。この場合、溶出するファージ表面には野生型コートタンパク質が提示されるので、コートタンパク質のすべてが融合タンパク質として発現しても大腸菌への感染・増殖が可能となる）や可溶性抗原による競合的溶出、あるいはS-S結合の還元（例えば、前記した CySDisplayTMでは、パニングの後、適当な還元剤を用いて抗体とコートタンパク質とを解離させることにより抗原特異的ファージを回収することができる）による溶出も可能である。酸で溶出した場合は、トリスなどで中和した後で溶出ファージを大腸菌に感染させ、培養後、常法によりファージを回収する。
尚、抗原を担体に固定化する代わりに、酵母ディスプレイを用いて細胞膜上にへマグルチニン三量体を発現させることもできる。
【００４２】
パニングにより抗原特異的抗体を提示するファージが濃縮されると、これらを大腸菌に感染させた後プレート上に播種してクローニングを行う。再度ファージを回収し、抗体価測定法（例： ELISA、RIA、 NA 等）やFACS（fluorescence activated cell sorting）あるいは SPR（Surface Plasmon Resonanoe）を利用した測定により抗原結合活性を確認する。
【００４３】
上記で得られたファージ抗体クローンを大腸菌に感染させて、培養上清から抗体を回収する工程としては、例えば、ファージディスプレイベクターとして抗体遺伝子とコートタンパク質遺伝子の連結部にアンバー終止コドンが導入されたべクターを用いる場合には、該ファージをアンバー変異を持たない大腸菌（例：HB2151 株）に感染させると、可溶性抗体分子が産生されペリプラズムもしくは培地中に分泌されるので、細胞壁をリゾチームなどで溶解して細胞外画分を回収し、上記と同様の精製技術を用いて行うことができる。His-tagやc-myc tag を導入しておけば、IMACや抗c-myc 抗体カラムなどを用いて容易に精製することができる。また、パニングの際に特異的プロテアーゼによる切断を利用する場合には、該プロテアーゼを作用させると抗体分子がファージ表面から分雛されるので、同様の精製操作を実施することにより目的の抗体を精製することができる。本発明の場合、抗体の中和活性は、 Fab 型よりＩｇＧ型の完全抗体の方が 100〜1000 倍程度高いので、後述の実施例の通り、得られたファージクローンからプラスミドＤＮＡを回収し、ＩｇＧのＦcに結合するドメインに相当する配列を遺伝子操作により付加し、大腸に形質転換を行い、培養する。培養上清から回収された抗体を lgG セファロースカラムで精製した後、中和活性の検定に供試する。
【００４４】
EBウイルスによる不死化や細胞融合により得られた抗体産生細胞株から目的の抗体を選抜する方法としては、例えば、上記の抗原を蛍光標識して不死化細胞や融合細胞と反応させた後、蛍光活性化セルソーター（FACS: Fluorescence-Activated Cell Sorter）を用いて抗原と結合する細胞を分離することによっても選択することができる。この場合、標的抗原に対する抗体を産生するハイブリドーマや不死化B細胞を直接選択することができるので、クローニングの労力を大いに軽減することが可能である。
【００４５】
標的抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローニングには種々の方法が使用できる。
アミノプテリンは多くの細胞機能を阻害するので、できるだけ早く培地から除去することが好ましい。但し、ヒトハイブリドーマについては通常融合後 4〜6週間程度はアミノプテリン添加培地で維持される。ヒポキサンチン、チミジンはアミノプテリン除去後 1 週間以上後に除去するのが望ましい。クローンが出現し、その直径が 1mm程度になれば培養上清中の抗体量の測定が可能となる。
【００４６】
抗体量の測定は、例えば標的抗原またはその誘導体あるいはその部分ぺプチドを直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質（例：125I,131I, 3H, 14C）、酵素  （例：β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素）、蛍光物質  （例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート）、発光物質  （例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン）などで標識した抗免疫グロブリンIgG抗体（もとの抗体産生細胞が由来する動物と同一種の動物由来のIgG に対する抗体が用いられる）またはプロティンＡを加え、固相に結合した標的抗原に対する抗体を検出する方法、抗 IgG抗体またはプロティンAを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、上記と同様の標識剤で標識した標的抗原またはその誘導体あるいはその部分べプチドを加え、固相に結合した標的抗原に対する抗体を検出する方法などによって行うことができる。
【００４７】
クローニング方法としては限界希釈法が通常用いられるが、軟寒天を用いたクローニングや FACS を用いたクローニング（上述）も可能である。限界希釈法によるクローニングは、例えば以下の手順で行うことができるがこれに限定されない。
上記のようにして抗体量を測定して陽性ウェルを選択する。適当なフィーダー細胞を選択して 96 ウェルプレートに添加しておく。抗体陽性ウェルから細胞を吸い出し、完全培地（例：10％FCS（Fetal Bovine/Calf Serum）およびP/S添加 RMP11640）中に 30 細胞/mL の密度となるように浮遊させ、フィーダー細胞を添加したウェルプレートに 0.1mL（3細胞/ウェル）加え、残りの細胞懸濁液を10 細胞/mL に希釈して別のウェルに同様にまき（1細胞/ウェル）、さらに残りの細胞懸濁液を 3 細胞/mLに希釈して別のウェルにまく（0.3 細胞／ウェル）。  目視可能なクローンが出現するまで 2〜3 週間程度培養し、抗体量を測定．陽性ウェルを選択し、再度クローニングする。ヒト細胞の場合はクローニングが比較的困難なので、10 細胞／ウェルのプレートも調製しておく。通常 2回のサブクローニングでモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることができるが、その安定性を確認するためにさらに数ケ月間定期的に再クローニングを行うことが望ましい。
【００４８】
ハイブリドーマはインビトロまたはインビボで培養することができる。
インビトロでの培養法としては、上記のようにして得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、細胞癌度を例えば105〜106細胞/mL程度に保ちながら、また、 FCS 濃度を徐々に減らしながら、ウェルプレートから徐々にスケールアップしていく方法が挙げられる。
インビボでの培養法としては、例えば、腹腔内にミネラルオイルを注入して形質細胞腫（MOPC）を誘導したマウス（ハイブリドーマの親株と組織適合性のマウス）に、5〜10日後に 106〜107 細胞程度のハイブリドーマを腹腔内注射し、2〜5週間後に麻酔下に腹水を採取する方法が挙げられる。
【００４９】
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法［例：塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例： DEAE, QEAE）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法など］に従って行われる。
以上のようにして、ハイブリドーマを温血動物の生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から抗体を採取することによって、特定のへマグルチニンサブタイプのインフルエンザウイルスに結合するモノクローナル抗体をスクリーニングすることができる。
【００５０】
本発明における中和活性の試験方法としては、例えば、フォーカス形成阻害試験（J. Clin. Miorobiol.  Vol.28, PP1308-1313 （1990））が挙げられる。即ち、被検抗体の存在下および非存在下にインフルエンザウイルスと宿主細胞とを接触させ、宿主細胞へのウイルス感染によるフォーカス形成を被検抗体が有意に阻害するか否かにより、中和活性の有無やその程度を判定する。
【００５１】
中和活性が試験されるインフルエンザウイルスのサブタイプは特に制限されないが、グループ1では少なくともＨ１型インフルエンザウイルスを含むことが好ましい。
【００５２】
中和活性試験の結果、グループ1より選択される少なくとも1つのインフルエンザウイルスを中和することが確認された抗体分子を産生するクローンを用い、当該抗体分子を大量に製造することができる。使用した抗体ライブラリーがフアージディスプレイライブラリーの場合、目的の中和抗体の Fab や scFv を提示するファージクローンを大腸菌に感染させて培養し、Fab型抗体やscFv型抗体を調製してもよいが、中和活性を顕著に増強する目的で、それらを IgG型に変換することがより好ましい。例えば、FabからＩｇＧへの変換は、ファージＤＮＡからＶＨＣＨ１およびＶＬＣＬをコードする断片を切り出し、Ｆc領域をコードする断片を含むプラスミド中に挿入することにより重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡを含むプラスミドを構築し、これをＣＨＯ細胞などの動物細胞にトランスフェクトして培養することにより、培養上清中にＩｇＧ型抗体を分泌させることにより行うことができる。得られた抗体は、自体公知の方法により精製・回収することができる。
また、使用した抗体ライブラリーがＥＢウイルス不死化Ｂ細胞や細胞融合によるハイブリドーマの場合、上記のようにインビトロまたはインビボで抗体分子を産生させ、常法により精製することにより回収することができる。
【００５３】
得られた中和抗体について、免疫系が採用しているステップ  （体胞突然変異と選択）を模倣して in vitro で抗原に対するアフィニティーを増強させることができる。抗体遺伝子への変異導入の方法としては、 chain shuffling法、修復系を欠損し変異を起こしやすい大腸菌やエラープローンＰＣＲを用いたランダム変異導入法、ＣＤＲウォーキングなどが挙げられる。抗原に対するアフィニティーが向上した中和抗体の選択は、変異導入によってできた変異ライブラリーからの高親和性中和抗体をスクリーニングすることにより行われる。例えば、 1）選択に用いる抗原量を低濃度にして高アフィニティーの抗体ファージを回収する方法、 2）洗浄条件を厳しく設定し抗原からはずれにくい抗体ファージを回収する方法、 3）桔抗反応を利用した方法などが用いられ得る。
【００５４】
上記のようにして得られた本発明の中和抗体の多くは、重鎖可変部Ｖ領域としてＶＨ１-６９  もしくはＶＨ１-ｅ遺伝子を利用している。この点は、これまでに報告されている、グループ１の複数のサブタイプのインフルエンザウイルスを中和する種々の抗体と共通する特徴である。
現在までの報告にある、ヒトインフルエンザに対する中和抗体をモノクローナル抗体レベルでそのキャラクターを検証した場合、対象エピトープはインフルエンザのヘマグルチニン（HA）の頭部（head）であり、特定の株とそれと相同性の高い一部の亜型内の株にのみ中和活性を有するのが一般的である。これは、ヒトにとってのインフルエンザの抗原性、免疫原性がHAの頭部（head）に極めて高く、インフルエンザも進化の過程でその変異個所をHAに集中させた事に起因する。
よって同一亜型内の連続変異に対応できる広い中和能を有する万能中和抗体を得るためには抗原免疫原生の低いと考えられる部分に対する抗体を作成する事が有効である。
本発明ではこれら問題を解決する抗体として、変異が起こりにくい幹部（stem）に対する抗体を取得し、同一亜型内の連続変異のみならず、亜型を飛び越えた不連続変異に対応すら出来る抗体の発明に成功した。過去に本発明の発明者らは、インフルエンザのHA頭部の中で唯一変異の難しい個所である、シアル酸ポケットに対する抗体を作成し、亜型を飛び越えて中和活性を有するモノクローナル抗体の作成に成功している（特許文献３、Ohshima  N等  ２０１１  J  Virol  ８５（２１））。
【００５５】
抗体は、Ｂ細胞分化の過程で免疫グロブリン遺伝子の再編成、即ち、重鎖可変部のＶ、Ｄ、Ｊ領域の組換えまたは軽鎖可変部のＶ、Ｊ領域の組換えが生じた後、さらに可変領域の塩基配列に体細胞突然変異が誘発される。その結果、抗原に対してより親和性の高い可変部を有する抗体を生み出しうる。従って、Ｂ細胞由来の抗体クローンである本発明の中和抗体は、元々の免疫グロブリン遺伝子に体細胞突然変異が生じたアミノ酸配列を有する中和抗体をも含みうる。また、中和抗体とインフルエンザウイルス抗原との抗原抗体複合体形成に際して、ヘマグルチニン分子との接触点が全て重鎖可変部であるため、中和抗体のインフルエンザウイルスとの親和性に実質的に寄与すると考えられる部位は重鎖可変部であると予想された。また、本発明の中和抗体では抗原との結合に関して相補性決定領域３（ＣＤＲ３）の寄与が小さいので、重鎖可変部Ｖ領域に存在する相補性決定領域１および２がより重要である。本明細書において、重鎖可変部Ｖ領域（軽鎖可変部Ｖ領域）とは、重鎖（軽鎖）の可変部を構成する再編成後のＶ領域を指し、例えば、フレームワーク領域１、２および３と相補性決定領域１および２を含む領域であり得る。また、重鎖（軽鎖）可変部は、抗体をＦａｂ領域のうちの定常部ではない部分を指し、例えば、フレームワーク領域１、２および３と相補性決定領域１、２および３を含む領域であり得る。
【００５６】
具体的な例としては、重鎖可変部および軽鎖可変部がそれぞれ以下の（１）〜（２９）のいずれかに示される配列番号に示されるアミノ酸配列からなる抗体が挙げられる。
（１）配列番号１のVH CDR1、配列番号２のVH CDR2、配列番号３のVH CDR3、配列番号４のVL CDR1、配列番号５のVL CDR2、配列番号６のVL CDR3
（２）配列番号７のVH CDR1、配列番号８のVH CDR2、配列番号９のVH CDR3、配列番号１０のVL CDR1、配列番号１１のVL CDR2、配列番号１２のVL CDR3
（３）配列番号１３のVH CDR1、配列番号１４のVH CDR2、配列番号１５のVH CDR3、配列番号１６のVL CDR1、配列番号１７のVL CDR2、配列番号１８のVL CDR3
（４）配列番号１９のVH CDR1、配列番号２０のVH CDR2、配列番号２１のVH CDR3、配列番号２２のVL CDR1、配列番号２３のVL CDR2、配列番号２４のVL CDR3
（５）配列番号２５のVH CDR1、配列番号２６のVH CDR2、配列番号２７のVH CDR3、配列番号２８のVL CDR1、配列番号２９のVL CDR2、配列番号３０のVL CDR3
（６）配列番号３１のVH CDR1、配列番号３２のVH CDR2、配列番号３３のVH CDR3、配列番号３４のVL CDR1、配列番号３５のVL CDR2、配列番号３６のVL CDR3
（７）配列番号３７のVH CDR1、配列番号３８のVH CDR2、配列番号３９のVH CDR3、配列番号４０のVL CDR1、配列番号４１のVL CDR2、配列番号４２のVL CDR3
（８）配列番号４３のVH CDR1、配列番号４４のVH CDR2、配列番号４５のVH CDR3、配列番号４６のVL CDR1、配列番号４７のVL CDR2、配列番号４８のVL CDR3
（９）配列番号４９のVH CDR1、配列番号５０のVH CDR2、配列番号５１のVH CDR3、配列番号５２のVL CDR1、配列番号５３のVL CDR2、配列番号５４のVL CDR3
（１０）配列番号５５のVH CDR1、配列番号５６のVH CDR2、配列番号５７のVH CDR3、配列番号５８のVL CDR1、配列番号５９のVL CDR2、配列番号６０のVL CDR3
（１１）配列番号６１のVH CDR1、配列番号６２のVH CDR2、配列番号６３のVH CDR3、配列番号６４のVL CDR1、配列番号６５のVL CDR2、配列番号６６のVL CDR3
（１２）配列番号６７のVH CDR1、配列番号６８のVH CDR2、配列番号６９のVH CDR3、配列番号７０のVL CDR1、配列番号７１のVL CDR2、配列番号７２のVL CDR3
（１３）配列番号７３のVH CDR1、配列番号７４のVH CDR2、配列番号７５のVH CDR3、配列番号７６のVL CDR1、配列番号７７のVL CDR2、配列番号７８のVL CDR3
（１４）配列番号７９のVH CDR1、配列番号８０のVH CDR2、配列番号８１のVH CDR3、配列番号８２のVL CDR1、配列番号８３のVL CDR2、配列番号８４のVL CDR3
（１５）配列番号８５のVH CDR1、配列番号８６のVH CDR2、配列番号８７のVH CDR3、配列番号８８のVL CDR1、配列番号８９のVL CDR2、配列番号９０のVL CDR3
（１６）配列番号９１のVH CDR1、配列番号９２のVH CDR2、配列番号９３のVH CDR3、配列番号９４のVL CDR1、配列番号９５のVL CDR2、配列番号９６のVL CDR3
（１７）配列番号９７のVH CDR1、配列番号９８のVH CDR2、配列番号９９のVH CDR3、配列番号１００のVL CDR1、配列番号１０１のVL CDR2、配列番号１０２のVL CDR3
（１８）配列番号１０３のVH CDR1、配列番号１０４のVH CDR2、配列番号１０５のVH CDR3、配列番号１０６のVL CDR1、配列番号１０７のVL CDR2、配列番号１０８のVL CDR3
（１９）配列番号１０９のVH CDR1、配列番号１１０のVH CDR2、配列番号１１１のVH CDR3、配列番号１１２のVL CDR1、配列番号１１３のVL CDR2、配列番号１１４のVL CDR3
（２０）配列番号１１５のVH CDR1、配列番号１１６のVH CDR2、配列番号１１７のVH CDR3、配列番号１１８のVL CDR1、配列番号１１９のVL CDR2、配列番号１２０のVL CDR3
（２１）配列番号１２１のVH CDR1、配列番号１２２のVH CDR2、配列番号１２３のVH CDR3、配列番号１２４のVL CDR1、配列番号１２５のVL CDR2、配列番号１２６のVL CDR3
（２２）配列番号１２７のVH CDR1、配列番号１２８のVH CDR2、配列番号１２９のVH CDR3、配列番号１３０のVL CDR1、配列番号１３１のVL CDR2、配列番号１３２のVL CDR3
（２３）配列番号１３３のVH CDR1、配列番号１３４のVH CDR2、配列番号１３５のVH CDR3、配列番号１３６のVL CDR1、配列番号１３７のVL CDR2、配列番号１３８のVL CDR3
（２４）配列番号１３９のVH CDR1、配列番号１４０のVH CDR2、配列番号１４１のVH CDR3、配列番号１４２のVL CDR1、配列番号１４３のVL CDR2、配列番号１４４のVL CDR3
（２５）配列番号１４５のVH CDR1、配列番号１４６のVH CDR2、配列番号１４７のVH CDR3、配列番号１４８のVL CDR1、配列番号１４９のVL CDR2、配列番号１５０のVL CDR3
（２６）配列番号１５１のVH CDR1、配列番号１５２のVH CDR2、配列番号１５３のVH CDR3、配列番号１５４のVL CDR1、配列番号１５５のVL CDR2、配列番号１５６のVL CDR3
（２７）配列番号１５７のVH CDR1、配列番号１５８のVH CDR2、配列番号１５９のVH CDR3、配列番号１６０のVL CDR1、配列番号１６１のVL CDR2、配列番号１６２のVL CDR3
（２８）配列番号１６３のVH CDR1、配列番号１６４のVH CDR2、配列番号１６５のVH CDR3、配列番号１６６のVL CDR1、配列番号１６７のVL CDR2、配列番号１６８のVL CDR3
（２９）配列番号１６９のVH CDR1、配列番号１７０のVH CDR2、配列番号１７１のVH CDR3、配列番号１７２のVL CDR1、配列番号１７３のVL CDR2、配列番号１７４のVL CDR3
【００５７】
また、上記（１）〜（２９）の抗体について、重鎖と軽鎖の塩基配列とアミノ酸配列を以下の表１に示す。
【００５８】
【表１】
2015025900.tif 000002
【００５９】
本発明の上記２９種の抗体の重鎖のアミノ酸配列を表２に示し、軽鎖のアミノ酸配列を表３に示す。
【００６０】
【表２】
2015025900.tif 000003
【００６１】
【表３】
2015025900.tif 000004
【００６２】
本発明の中和抗体が認識するエピトープを明らかにすることができれば、該エピトープのアミノ酸配列を含むべプチド（抗原性を有するアミノ酸配列）はインフルエンザウイルス用ワクチンまたは該抗原性を有するべプチドをコードする塩基配列を含む核酸（遺伝子）はインフルエンザ検査用試薬、検査用試薬キットとして有用である。免疫学的反応性エピトープを特定する方法としては、公知の方法で決定することができるが、例えば、１）ヘマグルチニンを酵素処理又は化学的処理により調製した限定分解物と本発明で取得した中和抗体のＩｇＧ型抗体の反応性を調べる方法、 ２）アミノ酸配列データベースを参照して合成したオーバーラップペプチドと本発明で取得した中和抗体のＩｇＧ型抗体の反応性を調べる方法などが挙げられる。
【００６３】
（本発明の抗体の製造）
Ｈ鎖またＬ鎖の発現ベクターを作製し、宿主細胞に発現させ、分泌した上清の回収・精製により抗体を取得することができる。
【００６４】
具体的には、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする他のＤＮＡ分子と連結することによって、完全長重鎖遺伝子を取得することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤの定常領域でよいが、最も好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２の定常領域である。ＩｇＧ１定常領域配列は、Ｇｍ（１）、Ｇｍ（２）、Ｇｍ（３）やＧｍ（１７）など、異なる個人間で生じることが知られている任意の様々な対立遺伝子またはアロタイプでよい。これらのアロタイプは、ＩｇＧ１定常領域中の天然に存在するアミノ酸置換に相当する。
【００６５】
ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする他のＤＮＡ分子と連結することによって、完全長Ｌ鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）を取得することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、κまたはλの定常領域でよい。κ定常領域は、Ｉｎｖ（１）、Ｉｎｖ（２）やＩｎｖ（３）など、異なる個人間で生じることが知られている任意の様々な対立遺伝子でよい。λ定常領域は、３つのλ遺伝子のいずれかに由来するものでよい。
【００６６】
上記のように得られたＨ鎖またＬ鎖をコードするＤＮＡを発現ベクター中に挿入することにより、発現ベクターを作製し、宿主細胞に発現させ、分泌した上清の回収・精製により抗体を取得することができる。発現ベクターには、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、カリフラワーモザイクウイルスやタバコモザイクウイルスなどの植物ウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームなどが挙げられる。発現ベクターおよび発現調節配列は、使用する発現用宿主細胞と適合するように選択する。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別々のベクター中に挿入することができるし、また両方の遺伝子を同じ発現ベクター中に挿入することもできる。抗体遺伝子を、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片上の相補的な制限部位とベクターの連結、または制限部位が存在しない場合には平滑末端連結）によって発現ベクター中に挿入する。
【００６７】
好都合なベクターは、上記に記載のように任意のＶＨまたはＶＬ配列を容易に挿入し発現させることができるように工学的に作製された適当な制限部位を有する機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬイムノグロブリン配列をコードするものである。そのようなベクターでは、通常、挿入されたＪ領域中のスプライス供与部位とヒトＣドメインに先行するスプライス受容部位の間で、またヒトＣＨエキソン内に存在するスプライス領域でもスプライシングが起こる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流にある天然の染色体部位で起こる。組換え発現ベクターはまた、宿主細胞由来の抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることもできる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドがインフレームでイムノグロブリン鎖のアミノ末端と連結するようにベクター中にクローン化することができる。シグナルペプチドは、イムノグロブリンシグナルペプチドでもよく、あるいは異種性シグナルペプチド（すなわち非イムノグロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）でもよい。
【００６８】
本発明の抗体の発現ベクターは、抗体遺伝子および制御配列に加えて、宿主細胞中でのベクターの複製を制御する配列（例えば複製起点）や選択マーカー遺伝子などのさらなる配列を有してよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する。例えば、通常、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞上に、Ｇ４１８、ハイグロマイシンやメトトレキセートなどの薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子には、デヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ−宿主細胞でメトトレキセート選択／増幅とともに使用する）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｇ４１８選択用）、およびグルタミン酸合成酵素遺伝子がある。
【００６９】
以上の方法で作製された抗体遺伝子発現ベクターにより宿主細胞を形質転換する。宿主細胞としては細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、本発明の抗体を産生させることが可能であればいかなる細胞でもよいが、動物細胞が好ましい。動物細胞として、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ/ｄｈｆｒ (−)細胞ＣＨＯ/ＤＧ４４細胞、サル由来細胞ＣＯＳ細胞(A.Wright& S.L.Morrison, J.Immunol.１60, ３３９３-３４０２ (１９９８))、ＳＰ２／Ｏ細胞(マウスミエローマ)(K.Motmans et al., Eur.J.Cancer Prev.５,５１２-５１９9(１９９６),R.P.Junghans et al.,Cancer Res.５０,１４９５-１５０２ (１９９０)) など挙げられる。また、形質転換にはリポフェクチン法(R.W.Malone et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８６,６００７ (１９８９), P.L.Felgner et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA  ８４,７４１３ (１９８７)、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法(F.L.Graham & A.J.van der Eb,Virology ５２,４５６-４６７(１９７３))、ＤＥＡＥ-Ｄｅｘｔｒａｎ法等が好適に用いられる。
【００７０】
形質転換体を培養した後、形質転換体の細胞内又は培養液より抗体を分離する。抗体の分離・精製には、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて利用することができる。
【００７１】
（抗体断片）
本発明の抗体を基にして又は本発明の抗体をコードする遺伝子の配列情報を基にして抗体断片を作製することができる。抗体断片としてはＦａｂ、Ｆａｂ'、F(ab')２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ抗体が挙げられる。
【００７２】
Ｆａｂは、ＩｇＧをシステイン存在下パパイン消化することにより得られる、Ｌ鎖とＨ鎖可変領域、並びにＣＨ１ドメイン及びヒンジ部の一部からなるＨ鎖フラグメントとから構成される分子量約５万の断片である。本発明では、上記抗体をパパイン消化することにより得ることができる。また、上記抗体のＨ鎖の一部及びＬ鎖をコードするＤＮＡを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりＦａｂを調製することもできる。
【００７３】
Ｆａｂ'は、後述のF(ａｂ')２のＨ鎖間のジスルフィド結合を切断することにより得られる分子量が約５万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化し、還元剤を用いてジスルフィド結合を切断することにより得られる。また、Ｆａｂ同様に、Ｆａｂ'をコードするＤＮＡを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。
【００７４】
Ｆ(ａｂ')２は、ＩｇＧをペプシン消化することにより得られる、Ｌ鎖とＨ鎖可変領域、並びにＣＨ１ドメイン及びヒンジ部の一部からなるＨ鎖フラグメントとから構成される断片（Ｆａｂ'）がジスルフィド結合で結合した分子量約１０万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化することにより得られる。また、Ｆａｂ同様に、Ｆ(ａｂ')２をコードするＤＮＡを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。
【００７５】
ｓｃＦｖは、Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域とからなるＦｖを、片方の鎖のＣ末端と他方のＮ末端とを適当なペプチドリンカーで連結し一本鎖化した抗体断片である。ペプチドリンカーとしては例えば柔軟性の高い（ＧＧＧＧＳ）３などを用いることができる。例えば、上記抗体のＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡとペプチドリンカーをコードするＤＮＡを用いてｓｃＦｖ抗体をコードするＤＮＡを構築し、これを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりｓｃＦｖを調製することができる。
【００７６】
ｄｓＦｖは、Ｈ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域の適切な位置にＣｙｓ残基を導入し、Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域とをジスルフィド結合により安定化させたＦｖ断片である。各鎖におけるＣｙｓ残基の導入位置は分子モデリングにより予測される立体構造に基づき決定することができる。本発明では例えば上記抗体のＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域のアミノ酸配列から立体構造を予測し、かかる予測に基づき変異を導入したＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域をそれぞれコードするＤＮＡを構築し、これを適当なベクターに組み込み、そして当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりｄｓＦｖを調製することができる。
【００７７】
尚、適当なリンカーを用いてｓｃＦｖ抗体、ｄｓＦｖ抗体などを連結させたり、ストレプトアビジンを融合させたりして抗体断片を多量体化することもできる。
【００７８】
（医薬組成物）
本発明の中和抗体は、グループの枠組みを越えて（グループの枠組みを超えて中和することのできる抗体ではない）あらゆるへマグルチニンサブタイプのインフルエンザウイルスを中和することができるので、 antigenic drift による季節性インフルエンザだけでなく、antigenic shift によるパンデミックに対しても有効な予防および／または治療手段となり得る。(antigenic shiftも同じグループ1内でのshiftであればすなわち有効かも知れない)その範囲は、該中和抗体を投与することにより、グループ１のサブタイプのインフルエンザウイルスに対する受動免疫を行うことができ、任意のインフルエンザウイルスの感染により発症した患者に対する治療効果、および発症もしくは感染のおそれのある対象に対する予防効果が期待できる。しかも、本発明の中和抗体は、元々ヒト体内に存在した抗体であるため、副作用の危険がまずないと考えられる。
【００７９】
本発明の中和抗体は、それ自体として、あるいは薬理学的に許容し得る担体とともに混合して医薬組成物とした後に、インフルエンザに対する受動免疫療法剤として用いることができる。
ここで、薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、賦形剤、溶剤（分散剤） 、溶解補助剤、懸濁化剤、安定化剤、等張化剤、緩衝剤、pH 調節剤、無痛化剤などとして配合される。また必要に応じて、保存剤、抗酸化剤などの製剤添加物を用いることもできる。
賦形剤の好適な例としては、乳糖、白糖、D-マンニトール、D-ソルビトール、デンプン、α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アラビアゴム、プルラン、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどが挙げられる。
【００８０】
溶剤の好適な例としては、注射用水、生理的食塩水、リンゲル液、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油、綿実油などが挙げられる。
溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、D-マンニトール、トレハロース、安息香酸べンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどが挙げられる。
懸濁化剤の好適な例としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化べンザルコニウム、塩化べンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子；ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる。
【００８１】
安定化剤の好適な例としては、ヒト血清アルブミン（HSA）、ピロ亜硫酸ナトリウム、ロンガリット、メタ亜硫酸水素ナトリウムなどが挙げられる。
等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、 D-マンニトール、 D-ソルビトール、ブドウ糖などが挙げられる。
緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。
pＨ調節剤の好適な例としては、塩酸、水酸化ナトリウムなどの酸または塩基が上げられる。  無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコールなどが挙げられる。
保存剤の好適な例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸塩などが挙げられる。
【００８２】
前記医薬組成物の剤形としては、例えば注射剤 （例：皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、動脈内注射剤など）、点滴剤等の注入型製剤が挙げられる。
医薬組成物は、製剤技術分野において慣用の方法、例えば日本薬局方に記載の方法等により製造することができる。以下に、製剤の具体的な製造法について詳述する。医薬組成物中の抗体含量は、剤形、投与量などにより異なるが、例えば約0.1ないし 100重量％である。
【００８３】
例えば、注射剤は、抗体を分散剤（例：ポリソルベート80,ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 60,ポリエチレングリコール，カルボキシメチルセルロース，アルギン酸ナトリウムなど）、保存剤 （例：メチルパラベン，プロピルパラベン，ベンジルアルコール，クロロブタノール，フェノールなど）、等張化剤（例：塩化ナトリウム，グリセリン， D-マンニトール，D-ソルビトール，ブドウ糖など）などと共に水性溶剤（例：蒸留水，生理的食塩水，りンゲル液等）あるいは油性溶剤（例：オリーブ油，ゴマ油，綿実油，トウモロコシ油などの植物油、プロピレングリコール等）などに溶解、懸濁あるいは乳化することにより製造される。この際、所望により溶解補助剤（例：サリチル酸ナトリウム，酢酸ナトリウム等）、安定化剤（例：ヒト血アルブミン等）、無痛化剤（例: ベンジルアルコール等）等の添加物を用いてもよい。注射液は、必要に応じて例えばメンブレンフィルター等を用いた演過滅菌などの滅菌処理を行い、通常、アンプル等の適当な容器に充填される。
【００８４】
注射剤は、上記液剤を真空乾燥などによって粉末とし、用時溶解（分散）して使用することもできる。真空乾燥法の例としては、凍結乾燥法、スピードバックコンセントレーター（SAVANT 社）を用いる方法などが挙げられる。凍結乾燥を行う際には、-10℃以下に冷却されたサンプルを用いて、実験室では、フラスコ中で、工業的にはトレイを用いて、あるいはバイアル中で凍結乾燥させることが好ましい。スピードバックコンセントレーターを用いる場合は、0〜30℃程度で、約20mmHg 以下、好ましくは約10mmHg以下の真空度で行われる。乾燥させる液剤中には、リン酸塩などの緩衝剤を添加してpHを3〜10  程度とすることが好ましい。真空乾燥により得られる粉末製剤は長期間安定な製剤として、用時注射用水、生理食塩水、リンゲル液等に溶解、もしくはオリーブ油，ゴマ油，綿実油，トウモロコシ油、プロピレングリコール等に分散することにより注射剤とすることができる。
【００８５】
必要に応じて、上記抗体に他の治療用薬剤を併用することもできる。例えば、治療薬剤としては、タミフル、リレンザ、アマンタジンなどが挙げられる。
あるいは、必要に応じて、上記抗体に他の治療用薬剤を結合させることもできる。抗体は、インフルエンザウイルスが存在する部位またはその近傍に薬剤を運搬するとともに、ウイルスの細胞への侵入を阻害し、一方、薬剤は、ウイルスを死滅させるか、インフルエンザの症状を治療、軽減又は改善する。薬剤は、インフルエンザの治療薬剤として使用されている、又は使用されようとする、すべての薬剤を含む。そのような薬剤は、例えば合成又は天然の、低分子量又は高分子量の、タンパク質性又は非タンパク質性の、或いは核酸又はヌクレオチド性の物質である。抗体と薬剤との結合は、好ましくはりンカーを介して行われる。りンカーは、例えば置換又は未置換の脂肪族性アルキレン鎖を含み、その両末端に、抗体又は薬剤の官能基と結合可能な基、例えばN-ヒドロキシスクシンイミド基、エステル基、チオール基、イミドカルボネート基、アルデヒド基などを含むものである（抗体工学入門、地人書館、1994年）。
必要に応じて、医薬を細胞内に運搬しやすくするために、リポソームに封入することもできる。好ましいりポソームは、正電荷りポソーム、正電荷コレステロール、膜透過性べプチド結合リポソームなどである（中西守ら，タンパク質核酸酵素 44:1590-1596 （1999）、二木史朗，化学と生物 43:649-653 （2005）、Clinical Cancer research 59:4325-4333 （1999）など）
【００８６】
本発明の中和抗体の投与は、非経口投与、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮投与などである。
抗体の有効成分量は、 1回の用量あたり 100〜2,500μg/mlである、或いはヒト成人患者体重lkgあたり 1.0〜10mgの量であるが、これらに限定されないものとする。
投与回数は、例えば１〜２週間に１回の頻度で１〜数回の投与又は２〜３週間に１回の投与で約２ケ月間である。
【００８７】
本発明の中和抗体は、ヒトのインフルエンザの予防および／または治療用としてだけでなく、ニワトリ等の鳥類、ブタ、ウマなどの非ヒト噛乳動物に投与することにより、それらの動物におけるインフルエンザの予防および／または治療用としても用いることができ、そうすることにより、ヒトへの感染のリスクを未然に低減することができる。これらの動物に適用する場合でも、上記と同様の製剤化手法が用いられ得る。
【００８８】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００８９】
［材料及び方法］
材料
スクリーニング用＜抗原ウイルス＞
次のインフルエンザウイルスを本研究で使用した。A/H1N1pdm: A/California/7/2009pdm (Cal09), A/Brisbane/59/2007(Bri07).
括弧内にはウイルス株の省略形を示した。【００９０】
キャラクタライズ（ELISA, HI活性、中和活性用)
次のインフルエンザウイルスを本研究で使用した。A/H1N1pdm: A/California/7/2009pdm (Cal09), A/Suita/1/2009pdm (Sui09); A/H1N1: A/New Caledonia/20/1999 (NC99), A/Solomon Islands/3/2006 (SI06), A/Brisbane/59/2007(Bri07). A/H3N2: A/Panama/2007/1999. A/H5N1: A/Indonesia/5/2005/PR8-IBCDC-RG2. 括弧内にはウイルス株の省略形を示した。【００９１】
＜ファージ抗体ライブラリーの構築＞
ワクチン接種と血液採取のスケジュールを図１に示す。
2009年に、1947年生まれのドナーに、A/California/7/2009 パンデミックワクチン株を2回(11月2日と16日)接種した。ドナーからの血液採取は、ワクチン接種前に2回(10月30日と11月2日)、第一回ワクチン接種後1回(11月9日)、そして第2回ワクチン接種後に5回(11月17日、23日、30日、12月7日、14日)行った。10月30日(ワクチン接種前)と12月14日(ワクチン接種後)に採取した血液より、巨大ファージ抗体ライブラリーを調製した。【００９２】
ファージ抗体ライブラリーは、既報の方法で構築した(Okada J,他2010. Virology 397:322-330)。1947年生まれのドナーのワクチン接種前後における単核球を、アフェレーシスにより血液3リットルから回収した。細胞は、ワクチン接種前は8.0 x 108個、ワクチン接種後では1.2 x 109 個のBリンパ球を含んでいた。巨大な抗体ライブラリーは、既報の通りファージディスプレー法で構築した(Marks JD, 他、1991. J. Mol. Biol. 222:581-597)。ライブラリーサイズは、ワクチン接種前の血液からは、重鎖1.6 x 109クローン、軽鎖2.0 x 109クローン、Fabとしては1.4 x 1010クローンであり、ワクチン接種後の血液からは、重鎖3.2 x 109クローン、軽鎖1.3 x 109クローン、Fabとしては2.6 x 1010クローンであった。【００９３】
抗体取得法
＜ライブラリーのスクリーニング＞
ウイルス粒子に結合したクローンは、既報の通りパニング法により選択した(Iba Y, 他、1997. Gene 194:35-46)。フォルマリン処理を行ったCal09またはBri07株のH1N1型ウイルス粒子を抗原としてスクリーニングに使用した。2または3回のパニングの後、溶出したファージを大腸菌(DH12S)に感染させ、100μg/mlアンピシリンおよび0.2%グルコースを含むLBプレートで培養した。ファージミドの入った大腸菌コロニーを単離し、100μg/mlアンピシリン、0.05%グルコースおよび1mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)を含む2xYT培地中で、30℃で一晩培養した。その大腸菌培養中に、Fab-cp3型の抗体が培地中に分泌された(Morino K,他、2001. J. Immunol. Meth. 257:175-184)。Fab-cp3型抗体を含む培養上清でELISAを行い、スクリーニングに使用したH1N1ウイルスとH3N2ウイルス株に対する結合活性を測定した。H1ウイルス株のみに結合するクローンを選択し、更なる解析を行った。【００９４】
抗体評価法
<ELISA>
ホルマリンで処理したウイルス粒子を96 well maxisorp immunoplate(Nunc)にコーティングし、大腸菌培養上清中のFab-cp3型抗体をそれぞれのwellに添加した。ウサギ抗cp3抗体(MBL)でインキュベーションした後、wellをさらにperoxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L chain; MBL)でインキュベートした。HRP基質(OPD, 和光純薬工業株式会社)をそれぞれのwellに添加し、発色させた。硫酸の添加によりペルオキシダーゼ反応を止めた後、492nmの波長でのサンプルの吸光度を測定した。【００９５】
<シークエンス解析>
単離した抗体クローンのVHフラグメントの塩基配列は、GenomeLab Dye Terminator Cycle Sequencing - Quick Start Kit (Beckman Coulter)とCEQ2000 DNA Analysis System (Beckman Coulter)を使って決定した。VHシークエンスプライマーとしてT7ETZ (5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’)を使用した。【００９６】
＜ウエスタンブロット＞
フォルマリンで不活化したワクチン株を非還元下でSDS-PAGEに供し、Immobilon-P membrane(Millipore)に転写した。メンブレンは大腸菌培養上清中のFab-cp3型抗体でインキュベートした。rabbit anti-cp3 Ab (MBL)でインキュベート後、さらに、peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L chain; MBL)でインキュベートした。バンドをECL Plus Western blotting Detection Regents (GE Healthcare) とChemical-luminescence imaging system (Light Capture; ATTO)を使って検出した。【００９７】
＜ウイルス中和活性測定>
フォーカス減少率アッセイを行った(Okuno Y,他、1990. J. Clin. Microbiol. 28:1308-13131)。200または500μg/mlのFab-PP型抗体を、等量の100 FFUのインフルエンザウイルスと混合し、96 well plate上に生育させたMDCK細胞に添加した。インキュベート後、細胞を血清無添加のMEMで洗浄し、0.4% BSAを含むMEM中で、37oCで15時間培養した。細胞をエタノールで固定し、PAP (ペルオキシダーゼと抗ペルオキシダーゼ) 複合体で反応させた。1個以上の細胞で形成されたフォーカス数を数え、フォーカス減少率を結果として示した。【００９８】
＜赤血球凝集抑制(HI)アッセイ>
HIテストは以前に述べた方法で行った(Okuno Y,他、1990. J. Clin. Microbiol. 28:1308-13131)。160μg/mlの精製したFab-PP型抗体を段階希釈し、wellあたり4 HAユニットのウイルスとインキュベートした。0.75%のモルモット血清をそれぞれのwellに添加し、30-60分室温でインキュベートした。赤血球凝集を阻害するFab-PP型抗体の最も低い濃度（μg/ml）を、結果として示した。【００９９】
抗体作製法（Fab、IgG）
＜精製Fab-PP型抗体の作製＞
Fab-cp3型抗体を、既報の方法（Ito W, 他、1993. J. Biol. Chem. 268:20668-20675）で、Fab-PP型(PはプロテインAのシングルFc結合ドメインを表すに変換し、IgG Sepharose (GE Healthcare)で精製した。【０１００】
＜IgG型抗体の作製＞
（１）ＩｇＧ抗体を発現するｐｌａｓｍｉｄの作製
ファージ抗体（ｓｃＦｖ）の遺伝子はＶＨ-ＶＬの順で並んでおり、ＶＨとＶＬは、以下のリンカーで接続したｓｃＦｖの構造をしている。
リンカー（配列番号２９１）：
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
一方ファージ抗体（Ｆab）の遺伝子はＶＨ-CH1-His, ＶＬ-CL-PIIIの順で並んでおり上記接続用のリンカーは存在しない。【０１０１】
まず、ＶＨ,ＶＬで使用していると推定されるヒト生殖系列の遺伝子をＩＭＧＴ (*)で検索する。
(*) ＩＭＧＴ : http://www.imgt.org
ＩＭＧＴの検索結果を参考にして、ファージ抗体のＩｇＧ化をおこなった。ＶＨ配列をヒトＩｇG１の定常領域と連結した。ＶＬは不足部分に関してもっとも近い生殖系列遺伝子と接続した遺伝子を作製した。5’側にＮｈｅＩ、3’側にＥｃｏＲＩを付加したH鎖、Ｌ鎖遺伝子をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社で全合成した。合成した重鎖、軽鎖の遺伝子はそれぞれ別々の発現ベクターに組み込んだ。すなわちH鎖、L鎖それぞれの人工合成遺伝子をＮｈｅＩとＥｃｏＲＩで切断し、発現ベクターｐＣＡＧＧＳのＮｈｅＩとＥｃｏＲＩ部位に組み込み、抗体Ｈ鎖発現ベクター、およびＬ鎖発現ベクターを得た。これらの発現ベクターを構築後ヒト細胞にて強制発させ抗体を得た（特許第４８７０３４８号の内容を参照）。【０１０２】
［結果］
代表クローンの活性を表４に示す。【０１０３】
【表４】
2015025900.tif 000005
【０１０４】
最初の3列は、スクリーニングによって単離されたクローンのグループ番号と各グループに含まれているクローンの種類数および単離クローン数を示している。クローンが使用しているGermline geneは、全てのGermline geneと代表クローンのVHアミノ酸配列を比較することで同定し、その同一性を%で示した。CDR3領域のアミノ酸配列を示した。4種類のH1N1株(NC99, SI06, Bri07とCal09)と1種類のH3N2株(Pan99)への結合活性は、enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)によって検出した。492nmでの吸光度により示した。100または250 μg/mlの濃度でのFab-PP型抗体のH1N1, H5N1, H3N2株に対する中和活性は、フォーカス減少法により測定した。減少率は%で示した。Fab-PP抗体のHI活性は、H1N1株(Bri07とCal09)株に対して測定した。赤血球凝集を抑制する最も低いFab-PP型抗体の濃度(μg/ml)を示した。 【０１０５】
＜本発明で得られた抗体の中和カイネティクス解析＞
IgG型抗体のインフルエンザウイルス株に対する中和カイネティクス測定
精製した完全ヒト型IgG抗体を、0.4%のBSAが入ったMEMで200 μg/mLおよび100 μg/mLに調整後、100 μg/mLの溶液をさらに4段階希釈した。この抗体溶液に、約100 Focus forming unitsの入った等量のインフルエンザウイルス液を加え、37℃で1時間中和反応を行った。96 well plateで培養したMDCK細胞をPBS(-)で洗浄後、中和反応液を30μL/wellずつ添加し、37℃で1時間反応をさせた。反応液を除き、細胞をPBS(-)で1回洗浄後、0.4%のBSAが入ったMEMを50μL/wellずつ添加し、CO2存在下、37℃で16時間培養した。培養液を除いたのち、細胞をエタノール固定し、乾燥させた。Peroxydase anti-peroxydase complexを用いる酵素抗体法（PAP法) により感染細胞を染色し、感染細胞を数えて感染抑制率を算出した。【０１０６】
インフルエンザウイルス株
以下のウイルス株を中和活性測定に使用した。最後のかっこ内は略号である。
H1N1; A/Bribane/59/2007 (Bri/07)
H1N1 2009 pandemic; A/Suita/1/2009 (Sui/09)
H2N2; A/Okuda/1957 (OK/57)
H5N1; A/Indonesia/5/2005 (H5N1) /PR-IBCDC-RG2 (clade2.1) (Ind/05)
H3N2; A/Panama/2007/1999 (Pan/99)【０１０７】
中和活性測定を行った完全ヒト型IgG抗体
F081-007, F083-115, F083-336, F045-092
（本実施例に用いたコントロール抗体F045-092について）
1973年生まれのヒトよりアフェレーシスにより3L相当量の成分血採取。
ファージ抗体ライブラリーを作製後、H3N2インフルエンザウイルス株に対するスクリーニングにより単離した抗HA (ヘマグルチニン) 抗体クローン。
1968年から2011年のH3ウイルス株に対し非常に強い中和活性を幅広く示し、その結合領域がヘマグルチニン頭部のレセプター結合ポケットをエピトープとしている可能性が高い。
さらにこの抗体は、H1, H2, H5株に対しても、中和活性を示す。すなわちこの抗体は少なくてもグループ１、グループ２のインフルエンザウイルスを幅広く中和出来る万能抗体である。（特許文献３）【０１０８】
結果
測定を行った3種類の抗体 (F081-007, F083-115, F083-336) は、検討を行ったグループ1に属するウイルス株 (H1N1, H2N2, H5N1) に対し、どれもF045-092抗体よりIC50値で90-900倍高い中和活性を示した。
特に、H1N1パンデミック株 (Sui/09) 株に対しては、F045-092抗体では中和活性は検出されなかったが、これら3抗体のIC50値は0.09-0.23 μg/mLであった。
また、F081-007抗体はすべての株において非常に高い中和活性を示したが、H5N1株 (Ind/05) に対しては、F045-092抗体の約900倍近いIC50値を示した(0.36μg/mL)。
さらに、F083-115抗体は、H3N2株に対する中和活性も、弱いながら検出された(IC50値 225μg/mL)。
これらの結果より、とりわけグループ１において本発明抗体は先行技術の特許文献３にある抗体に比して、圧倒的に強い中和カイネティクスを有する事が証明された。（表５及び図２）【０１０９】
【表５】
2015025900.tif 000006
【図１】
2015025900.tif 000007
【図２】
2015025900.tif 000008
【配列表】
2015025900000001.app
【国際調査報告】
2015025900.tif 000009
2015025900.tif 000010
2015025900.tif 000011
2015025900.tif 000012