【誤訳訂正書】
【提出日】平成24年7月23日(2012.7.23)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質キナーゼＣ修飾物質により処理された単核細胞から生成される、
ことを特徴とする多能性幹細胞。
【請求項２】
前記蛋白質キナーゼＣ修飾物質が、Ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ−１やＧｏ６９７６或いはそれらを組合わせたものであることを特徴とする請求項１に記載の多能性幹細胞。
【請求項３】
前記蛋白質キナーゼＣ修飾物質が、ＧＭ−ＣＳＦやＳＤＦ或いはそれらを組合わせたものであることを特徴とする請求項１に記載の多能性幹細胞。
【請求項４】
前記蛋白質キナーゼＣ修飾物質が、コラーゲンやフィブロネクチン或いはそれらを組合わせたものであることを特徴とする請求項１に記載の多能性幹細胞。
【請求項５】
活性化単核細胞の蛋白質キナーゼＣβ２により、単核細胞を多能性幹細胞に分化する、
ことを特徴とする多能性幹細胞の形成方法。
【請求項６】
前記活性化単核細胞の蛋白質キナーゼＣβ２は、蛋白質キナーゼＣ修飾物質として、Ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ−１やＧｏ６９７６或いはそれらを組合わせたものを使用することを特徴とする請求項５に記載の多能性幹細胞の形成方法。
【請求項７】
前記蛋白質キナーゼＣβ２が、ＧＭ−ＣＳＦやＳＤＦ或いはそれらを組合わせたものであることを特徴とする請求項５に記載の多能性幹細胞の形成方法。
【請求項８】
前記蛋白質キナーゼＣ修飾物質が、コラーゲンやフィブロネクチン或いはそれらを組合わせたものであることを特徴とする請求項５に記載の多能性幹細胞の形成方法。
【請求項９】
多能性幹細胞に分化誘導因子を添加し、培地において、培養されることにより形成される、
ことを特徴とする標的細胞。
【請求項１０】
骨細胞であり、前記培地が低ブドウ糖ＤＭＥＭで、分化誘導因子がｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅやβ−グリセロリン酸、アスコルビン酸或いはそれらを組合わせたものであることを特徴とする請求項９に記載の標的細胞。
【請求項１１】
軟骨細胞であり、前記培地が低ブドウ糖ＤＭＥＭで、分化誘導因子がｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅやトランスフォーミング成長因子−β１或いはそれらを組合わせたものであることを特徴とする請求項９に記載の標的細胞。
【請求項１２】
神経細胞であり、前記培地がα−ＭＥＭで、分化誘導因子がメルカプトエタノールやレチノイン酸、Ｌ−グルタミン、Ｎ２補助剤、Ｂ２７補助剤或いはそれらを組合わせたものであることを特徴とする請求項９に記載の標的細胞。
【請求項１３】
心筋細胞であり、前記培地がＩＭＤＭで、分化誘導因子が５−アザシチジンであることを特徴とする請求項９に記載の標的細胞。
【請求項１４】
腎臓細胞であり、前記培地がＥｍｂｒｙｏ Ｍｅｄｉｕｍで、分化誘導因子が白血病抑制因子であることを特徴とする請求項９に記載の標的細胞。
【請求項１５】
肺臓細胞であり、前記培地がＤＭＥＭで、分化誘導因子がインシュリンや繊維芽細胞成長因子或いはそれらを組合わせたものであることを特徴とする請求項９に記載の標的細胞。
【請求項１６】
肝臟細胞であり、前記培地が低ブドウ糖ＤＭＥＭで、分化誘導因子が肝細胞増殖因子や繊維芽細胞成長因子或いはそれらを組合わせたものであることを特徴とする請求項９に記載の標的細胞。
【請求項１７】
骨格筋細胞であり、前記培地がＤＭＥＭで、分化誘導因子が５−アザシチジンであることを特徴とする請求項９に記載の標的細胞。
【請求項１８】
脂肪細胞であり、前記培地がＤＭＥＭで、分化誘導因子がｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅとｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ、インシュリン及びｍｅｔｈｙｌ−ｉｓｏｂｕｔｙｌｘａｎｔｉｎｅであることを特徴とする請求項９に記載の標的細胞。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】多能性幹細胞、その形成方法、および標的細胞
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有性細胞を多能性幹細胞（Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）に分化する方法に関し、このような多能性幹細胞が更に標的細胞に分化し、例えば、軟骨細胞や神経細胞及び骨細胞等で、このような多能性幹細胞を損傷組織の部位に注入すると、多能性幹細胞が、組織細胞に分化して、修復作用が得られ、また、標的細胞を損傷組織細胞の部位に注入しても、修復作用が得られるものに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、骨髄幹細胞（ｎａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）と臍帯血幹細胞（ｃｏｒｅ ｂｌｏｏｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）は、主な、幹細胞を取得する２種類のソースである。このような幹細胞の取得量は、極めて少なく、また、異種に対して排他性を有するため、今において、臨床上の細胞治療の素材としてよく利用されている。その中、ＣＤ３４＋（ＣＤ３４陽性）の造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ
ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＨＳＣ）が、一番応用され、それは、ヒトＣＤ３４抗体により分離された幹細胞である。しかしながら、ＣＤ３４＋の造血幹細胞は、一般の成人体内において、総数量が少なく、骨髄において、約１００，０００個の血液細胞から、１個のＣＤ３４＋造血幹細胞が収集され、取得できる幹細胞の数量が極めて少なく、また、異種に対して排他性を有するため、臨床上の応用は、大きく制限され、相対的に、成功率が低くなる。そのため、現在において、幹細胞（ｓｔｅｍ
Ｃｅｌｌ）を研究する者は、体外の細胞培養により、ＣＤ３４＋幹細胞を大量に増殖できる方法と経路を捜しているが、このような幹細胞も、異種に対して排他性を有する。上記の要因により、骨髄幹細胞の臨床応用上において、制限される欠点がある。
【０００３】
１９９０年から、臍帯血も、幹細胞研究者の視線を来す。それは、臍帯血に、骨髄より豊富のＣＤ３４＋幹細胞を有するためであり、また、骨髄のＣＤ３４＋幹細胞に比較して、臍帯血のＣＤ３４＋幹細胞が、より良い分化能力を持つ。そのため、近年、世界の国々において、将来の医学研究や臨床応用のソースとして、婦人生産後の臍帯血を保存するための臍帯血バンクを、陸続と設立する。しかしながら、骨髄より、臍帯血に、幹細胞が比較的に多いが、血液細胞に対する比例が、依然として低いため、体外培養により、十分の数量を取得して細胞医療用途に利用することが必要である。また、臍帯血の特別の冷凍保存に、普通の人が負担できない膨大なコストが必要とし、また、長期に保存過程において、細胞が、任意の温度変化により、死亡するから、不安定性が向上される。臍帯血幹細胞による治療の時、また、免疫学上の組織和合性（Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）の問題を顧慮しなければならなく、即ち、排他性の問題を顧慮しなければならなく、そうでなければ、病者の体内免疫系により臍帯血幹細胞を排他して、治療の成功率が低減され、最悪の場合、治療が失敗する。組織和合性の一対組合せ実験に必要とするコストは、一般として、臍帯血幹細胞を保存するコストより高いから、組織和合性が同じ幹細胞を捜すことが、更に困難になる。
【０００４】
骨髄と臍帯血幹細胞は、医学と臨床応用において、下の問題点がある。（１）幹細胞は、骨髄と臍帯血の幹細胞の数量が多くないため、体外培養により、数量を増加する必要があるが、幹細胞の体外の自己複製（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）により良い培養環境や方法がない。（２）臍帯血バンクが、臍帯血を永久に保存できると断言するが、解凍後の幹細胞の生存率と再凍細胞の生存率が安定的ではなく、また、前記の説明した要因により、不安定的である。（３）骨髄幹細胞を取得するため、病者が骨髄穿刺による痛みを忍耐しなければならなく、また、過程においての麻酔によるリスクがある。（４）臍帯血幹細胞で治療する時、免疫学上の組織和合性の問題を顧慮して、病者の体内免疫系により排他作用を防止する必要がある。（５）１人にとって、臍帯血幹細胞の採集が、一生に１回のチャンスしかない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的の１は、少なくとも一つの単核細胞と少なくとも一つの蛋白質キナーゼＣ修飾物質により、直接に単核細胞から分化される多能性幹細胞を提供する。
【０００６】
本発明目的の２は、多能性幹細胞と少なくとも一つの分化誘導因子により、当該多能性幹細胞から分化される例えば、軟骨細胞や神経細胞及び骨細胞等である標的細胞を提供する。
【０００７】
本発明目的の３は、多能性幹細胞を直接に損傷組織細胞の部位に注入して、当該多能性幹細胞が組織細胞に分化し、修復作用が得られる多能性幹細胞修復剤を提供する。
【０００８】
本発明目的の４は、少なくとも一つの標的細胞を直接に損傷組織細胞の部位に注入して、修復作用が得られる標的細胞修復剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、例えば、血液中の単核細胞である単核細胞（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｔｅｄ）を完全に多能性幹細胞に分化する。単核細胞は、数量が少なくとも血液中の白血球細胞の１／１０である、例えば、単球（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ）であり、一般の正常人の周辺白血球細胞濃度が、１ミリリットルに約５，０００乃至１０，０００個であり、これで試算すると、単核細胞濃度が、周辺血液中において、少なくとも、１ミリリットルに約５００乃至１，０００個である。また、１００ミリリットルの周辺血液であれば、単核細胞の数量が、５０，０００乃至１００、０００個になる。本発明によれば、この５０，０００乃至１００、０００個の単核細胞を完全に多能性幹細胞に分化することができる。また、血液の採集量を制御するだけで、多能性幹細胞の取得量を制御できる。本発明の進歩性の１は、血液中の単核細胞を多能性幹細胞に分化し、これによる数量が、骨髄や臍帯血の幹細胞の千倍か万倍になり、場合によれば、もっと多くなり、骨髄や臍帯血の幹細胞は、それに比較できないものであり、本発明進歩性の２は、排他作用が完全になく、自体の細胞を自体に注入するため、排他作用を顧慮する必要が無く、例えば、骨髄や臍帯血の幹細胞については、免疫学上の組織和合性の排他作用を顧慮しなければならない。また、本発明において、単核細胞は、単一球状細胞核を有する細胞を指す。
【００１０】
本発明による最大の進歩性は、何時でも実験を繰り返すことができ、成功率が、ほぼ百パーセントであり、また、血液の取得が簡単で、例えば採血により、何時でも利用でき、そのため、冷凍保存の問題がない。臍帯血幹細胞の採集のように、一生に１回しかできず、また、骨髄幹細胞の採集のように、病者が骨髄穿刺による痛みを忍耐しなければならなく、また、過程においての麻酔によるリスクがあり、そして、長時間の冷凍保存が必要し、応用上のコストが高いだけでなく、幅広く適用することが因難である問題は、解決される。
【００１１】
本発明は、例えば、軟骨細胞や神経細胞及び骨細胞等の標的細胞に分化できる多能性幹細胞に関する。上記より、多能性幹細胞が、骨髄や臍帯血幹細胞と同じように原始細胞の最も重要な分化誘導機能を有することが証明された。当該標的細胞は、損傷組織細胞に対して修復機能を持ち、例えば、軟骨細胞を損傷関節の軟骨の部位に接種することにより、損傷軟骨の修復や再建ができる。また、例えば、神経細胞を損傷神経の部位に接種することにより、直接に神経の修復に有利である。本発明に係わる多能性幹細胞は、生物の任意の細胞に分化でき、また、生物の任意の損傷組織細胞の修復に適用でき、例えば、肝組織細胞や脳組織細胞、神経細胞、軟骨組織細胞、脂肪細胞、眼球組織細胞、聴覚組織細胞、膵臓組織細胞、心臓組織細胞、筋肉細胞、皮膚細胞、骨組織細胞、胆嚢組織細胞、血管組織細胞、腎臓組織細胞、骨髄組織細胞、肺臓組織細胞、毛嚢組織細胞、腸胃組織細胞、消化器系組織細胞或いは生殖器系組織細胞等であり、また、本発明は、自体細胞を注入するため、排他性や他の副作用がない。
【００１２】
本発明は、直接に多能性幹細胞を損傷組織細胞の部位に接種することにより、直接に損傷組織細胞を修復や再建できる組織細胞修復剤を提供する。例えば、Ａ病者の多能性幹細胞をＡ病者の損傷心筋の組織細胞の部位に接種することにより、多能性幹細胞が直接に心筋細胞に分化し、直接に修復や再建の目的を達成でき、骨髄や臍帯血幹細胞の治療史上において、既に成功の事例があり、例えば、幹細胞を骨髄に注入することにより、白血病を治療でき、病者の造血機能が正常に戻り、また、例えば、心筋梗塞の病者であれば、幹細胞を直接に損傷心筋の部位に注入し、心筋の機能が回復や改善でき、以上の事例は、ニュースや新聞雑誌或いはネットワークにより報道されている。肝機能不全や腎機能不全についても、同じの効果が得られる。多能性幹細胞により、生物の任意の損傷組織細胞を修復や再建できる。例えば、肝組織細胞や脳組織細胞、眼球組織細胞、聴覚組織細胞、膵臓組織細胞、心臓組織細胞、筋肉細胞、皮膚細胞、骨組織細胞、胆嚢組織細胞、神経細胞、軟骨組織細胞、血管組織細胞、脂肪細胞、腎臓組織細胞、骨髄組織細胞、肺臓組織細胞、毛嚢組織細胞、腸胃組織細胞、消化器系組織細胞及び生殖器系組織細胞等であり、本発明は、自体細胞を注入するため、排他性や副作用がない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
実施例１
多能性幹細胞の調製
ヘパリン（Ｈｅｐａｒｉｎ）抗凝固剤を含有する無菌真空採血管や無菌採血注射器により、２０ｍｌの血液を採集する。蛍光を含有するヒトＣＤ１４単クローン抗体（ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ
ＣＤ１４ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ＦＩＴＣ）を利用して、採集した血液中の例えば単球（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ）である単核細胞を分離し、また、流動細胞計測器（Ｆｌｏｗ
Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）により単核細胞を単独に分離して無菌試験管に収集し、そして、分離された単核細胞を、１０％のＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ ＵＳＡ）を含有する培地の中に注入する。
【００１４】
実施例１の具体例１
例えばＧｏ６９７６である蛋白質キナーゼＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｃ）抑制修飾物質を、培養液の中においての濃度が０.１−１０mＭになるように、細胞培養液に添加し、３０分の作用後、培養液の中においての濃度が５−１５mＭになるように、例えばｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ−１である蛋白質キナーゼＣ活性化修飾物質を添加する。そして、３７℃の５％のＣＯ２を含有する培養器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で１５−２１日に細胞を培養する。培地において、単核細胞が直接に多能性幹細胞に分化誘導し、その分化誘導率が、約百パーセントである。
【００１５】
実施例１の具体例２
そして、具体的の実施例１を説明し、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）と間質細胞由来因子（ＳＤＦ、Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ
Ｆａｃｔｏｒ）を細胞培養液に添加し、濃度を１００−１，０００Ｕ／ｍｌと１０−１００ｎＭに維持し、そして、細胞を３７℃、５％のＣＯ２を含有する培養器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で３−７日に培養する。培地において、ＣＤ１４＋単核細胞が直接に多能性幹細胞に分化誘導し、その分化誘導率がほぼ百パーセントである。
【００１６】
実施例１の具体例３
培養皿に一層のコラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ）やフィブロネクチン（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）を固定し、１０％のＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ ＵＳＡ）を含有する培地を培養皿に添加する。また、分離された単核細胞を培養皿に注入する。そして、細胞を、３７℃、５％のＣＯ２を含有する培養器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で７−１４日に培養する。培地において、ＣＤ１４＋単核細胞が直接に多能性幹細胞に分化する。
【００１７】
また、本実施例において、単核細胞を分離する方法は、ヒトＣＤ１４抗体を連結する磁性ビードにより分離し、磁性細胞選別器（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｏｒ）単核細胞を収集するのが、公知の方法である。本実施例において、単核細胞のソースは、血液検体に限らない。その結果は、図（１）のようである。多能性幹細胞を、無菌生理食塩水で、少なくとも３回清浄し、最後に、１０００回転の遠心速度で１０分により上清液を除去して、濃縮した多能性幹細胞を無菌注射器内に収集し、これにより、直接に損傷組織細胞の部位に注射して、修復することに供されることができる。本実施例において、蛋白質キナーゼＣ修飾物質は、Ｇｏ６９７６やｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＤＦ、コラーゲン、フィブロネクチン或いるその組合わせる物だけでなく、蛋白質キナーゼＣの活性を抑制できる物質や活性化蛋白質キナーゼＣの物質或いは同じ効果を有するものとその組合わせる者であればよい。
【００１８】
実施例２
蛍光を含有するヒトＣＤ１４単クローン抗体で多能性幹細胞を測定し、流動細胞計測器（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）による測定結果は、多能性幹細胞がＣＤ１４陽性反応（ＣＤ１４＋）を示す。０.５ｍｌの多能性幹細胞懸濁液を試験管に入れ込み、そして、１０μｌの蛍光を含有するヒトＣＤ１４単クローン抗体（ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ
ＣＤ１４ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＦＩＴＣ）を添加し、そして、４℃に３０分置いてから、遠心機で１０分（１０００回転）処理して、上清液を除去し、そして、生理食塩水で、３回清浄し、また、５ｍｌの生理食塩水を添加して多能性幹細胞と均一に混合し、そして、遠心機で１０分（１０００回転）処理して、上清液を除去し、清浄ステップを３回繰り返し、最後に清浄された多能性幹細胞を直接に流動細胞計測器（ＦＡＣＳｃａｎ、ＢＥＣＴＯＮ
ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）により蛍光測定し、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ１４ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＦＩＴＣと多能性幹細胞が結合すれば、蛍光陽性反応を示し、逆に、陰性反応を示し、本実施例２の測定結果は、陽性反応である。流動細胞計測器による測定する測定方法は、公知的である。
【００１９】
実施例３
多能性幹細胞を骨細胞培地（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｍｅｄｉｕｍ）に入れ込み、当該骨培地は、骨細胞分化誘導因子を含有する低ブドウ糖ＤＭＥＭ培地（ｌｏｗ−ｇｌｕｃｏｓｅ
ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉａ）、Ｇｉｂｃｏ）で、例えば、１００ｎＭのｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅと１０ｍＭのβ−グリセロリン酸（β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及び１００mｇ／ｍｌのアスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）等を、同時にＣＯ２培養器に入れ込んで１４日に培養すると、多能性幹細胞が直接に骨細胞（Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ、ＯＢ）に分化する。
【００２０】
実施例４
骨細胞（Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ、ＯＢ）の鑑定
Ａｌｉｚａｒｉｎ化学染色法と細胞内アルカリホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｐｈａｔａｓｅ）は、それぞれ、一般の骨細胞の鑑定方法で、公知的である。図２（Ａ）は、Ａｌｉｚａｒｉｎ化学染色法により測定した細胞間のカルシウムイオンの堆積状態（赤い領域で、２００倍拡大である）。図２（Ｂ）は、細胞内アルカリホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ
ｐｈｏｐｈａｔａｓｅ）の測定結果である。多能性幹細胞（対比基準細胞として）と骨細胞を、それぞれ、等量細胞の懸濁液を作り、そして、細胞を粉砕してから、それぞれの比色管に１ｍｌの細胞懸濁液を添加し、そして、それぞれの比色管に更に０.３ｍｌのアルカリホスファターゼである比色剤ｐＮＰＰ（ｐ−ｎｉｔｏｒｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、そして、１５分放置すると、直ちに、４０５ｎｍ（波長）で各比色管の吸光度を比色測定し、比色剤ｐＮＰＰとアルカリホスファターゼが作用すると、黄色い変化が発生し、アルカリホスファターゼの含量が多ければ、黄色いが濃くなる。図2Ｂは、測定結果であり、骨細胞内アルカリホスファターゼの活性／濃度が、多能性幹細胞の約６倍に高くなる。
【００２１】
実施例５
多能性幹細胞を軟骨細胞培地（Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｍｅｄｉｕｍ）に入れ込み、軟骨細胞培地は、軟骨細胞分化誘導因子を含有するｌｏｗ−ｇｌｕｃｏｓｅ
ＤＭＥＭで、例えば、１００ｎＭのｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅと１０ｎｇ／ｍｌのトランスフォーミング成長因子−β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ
ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ１、ＴＧＦ−β１）を、同時にＣＯ２培養器に入れ込んで２１日に培養すると、多能性幹細胞が直接に軟骨細胞（Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）に分化する。
【００２２】
実施例６
軟骨細胞（Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）の鑑定
図２Ｃは、顕微鏡で観察した結果であり、殆どの細胞が、典型的な軟骨細胞の形態である多角形（Ｐｏｌｙｇｏｎａｌ）を有する。図２Ｄは、更に、Ｓａｆｒａｎｉｎ
Ｏの組織染色法で軟骨細胞の中の粘液質（Ｍｕｃｉｎ）（赤い部分）の生成を鑑定し、公知的である基本鑑定方法である。
【００２３】
実施例７
多能性幹細胞を神経細胞培地（Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ｍｅｄｉｕｍ）に入れ込み、神経細胞培地は、神経細胞分化誘導因子を含有するα-ＭＥＭ（ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）で、例えば、５０mＭのメルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）と１mＭのレチノイン酸（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、０.５ｍＭのＬ−グルタミン（Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、１％のＮ２補助剤（１％のＮ２ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）及び２％のＢ２７補助剤（２％のＢ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を、同時にＣＯ２培養器に入れ込んで１４日に培養すると、多能性幹細胞が直接に神経細胞（Ｎｅｕｒｏｎ
Ｃｅｌｌ）に分化する。
【００２４】
実施例８
神経細胞（Ｎｅｕｒｏｎ Ｃｅｌｌ）の鑑定
神経細胞が専有する２種類の蛋白であるＧＡＤ（ｇｌｕｔａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）とＮｅｓｔｉｎを測定し、公知的である基本鑑定方法である。蛍光を含有する抗ＧＡＤ抗体と蛍光を含有する抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体で、更に免疫蛍光細胞を染色し、ＧＡＤとＮｅｓｔｉｎとが、陽性蛍光反応である。図２Ｅと図２Ｆを参照する。
【００２５】
また、多能性幹細胞が、他の標的細胞に分化することができ、例えば、骨格筋細胞や心筋細胞、腎臓細胞、肺臓細胞或いは肝臟細胞等である。
【００２６】
例えば、多能性幹細胞を骨格筋細胞培地（ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｙｏｇｅｎｉｃ ｍｅｄｉｕｍ）に入れ込み、骨格筋細胞培地は、骨格筋細胞分化誘導因子を含有するＤＭＥＭで、例えば、１０mＭの５−アザシチジン（５−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）をＣＯ２培養器に入れ込んで２４時間に培養して、また、細胞培地を新鮮のＤＭＥＭに入れ替えてから、細胞を７乃至１１日に培養し、多能性幹細胞が直接に骨格筋細胞（ｓｋｅｌｅｔａｌ
ｍｕｓｃｌｅ Ｃｅｌｌ）に分化する。
【００２７】
例えば、多能性幹細胞を心筋細胞培地（ｃａｒｄｉｏｍｙｃｇｅｎｉｃ ｍｅｄｉｕｍ）に入れ込み、心筋細胞培地は、心筋細胞分化誘導因子を含有するＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）で、例えば、３mＭの５−アザシチジン（５−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）を、ＣＯ２培養器に入れ込んで２４時間に培養して、また、細胞培地を新鮮のＩＭＤＭに入れ替えてから、細胞を５乃至７日に培養する。この時、３mＭの５−アザシチジン（５−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）を含有するＩＭＤＭである心筋細胞培地により細胞を２４時間に処理して、細胞を新鮮のＩＭＤＭで７乃至１４日に培養することにより、多能性幹細胞が直接に心筋細胞（ｃａｒｄｉｍｙｏｃｙｔｉｃ
Ｃｅｌｌ）に分化する。
【００２８】
例えば、多能性幹細胞を第１型コラーゲンコーティング（coating）の培養皿に入れ込み、また、培養皿に、予めに腎臓細胞培地が入れ込まれておられ、腎臓細胞分化培地は、腎臓細胞分化誘導因子を含有するＥｍｂｒｙｏ
Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄａｉｍｉｐｐｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）培地で、例えば、１０ｎｇ／ｍｌの白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ
Ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ））を、ＣＯ２培養器に入れ込んで３乃至４週間に培養し、また、３乃至５日に置きに、新鮮の１０ｎｇ／ｍｌのＬＩＦを含有するＥｍｂｒｙｏ
Ｍｅｄｉｕｍ培地に入れ替えることにより、多能性幹細胞が直接に腎臓細胞（ｒｅｎａｌ Ｃｅｌｌ）に分化する。
【００２９】
例えば、多能性幹細胞を肺臓細胞培地に入れ込み、肺臓細胞培地は、肺臓細胞分化誘導因子を含有するＤＭＥＭで、例えば、１０mg／ｍｌのインシュリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）と１００ｎｇ／ｍｌの繊維芽細胞成長因子−１（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−１、ＦＧＦ−１）、２００ｎｇ／ｍｌの繊維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ−２）、５０ｎｇ／ｍｌの繊維芽細胞成長因子−７（ＦＧＦ−７）、８００ｎｇ／ｍｌの繊維芽細胞成長因子−９（ＦＧＦ−９）、１，０００ｎｇ／ｍｌの繊維芽細胞成長因子−１０（ＦＧＦ−１０）及び１，０００ｎｇ／ｍｌの繊維芽細胞成長因子−１８（ＦＧＦ−１８）を、ＣＯ２培養器に入れ込んで２乃至３週間に培養し、また、３乃至５日に置きに肺臓細胞分化誘導因子を有する新鮮のＤＭＥＭに入れ替えることにより、多能性幹細胞が直接に肺臓細胞（ｌｕｎｇ
Ｃｅｌｌ）に分化する。
【００３０】
例えば、多能性幹細胞を肝臟細胞培地（Ｈｅｐａｔｏｇｅｎｉｃ ｍｅｄｉｕｍ）に入れ込み、肝臟細胞培地は、肝臟細胞分化誘導因子を含有するｌｏｗ
ｇｌｕｃｏｓｅ−ＤＭＥＭで、例えば、５０ｎｇ／ｍｌの肝細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＨＧＦ）と１００ｎｇ／ｍｌの繊維芽細胞成長因子−４（ＦＧＦ−４）を、ＣＯ２培養器に入れ込んで２乃至３週間に培養し、また、３乃至５日に置きに新鮮の肺臓細胞分化誘導因子を含有するｌｏｗ
ｇｌｕｃｏｓｅ−ＤＭＥＭに入れ替えることにより、多能性幹細胞が直接に肝臟細胞（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）に分化する。
【００３１】
例えば、多能性幹細胞を脂肪細胞分化培地に入れ込み、脂肪細胞分化培地は、１０％のウシ血清を含有し、そして、脂肪細胞分化誘導因子−１μＭのｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅと０.５ｍＭのｍｅｔｈｙｌ−ｉｓｏｂｕｔｙｌｘａｎｔｉｎｅ、１０μｇ／ｍｌのｉｎｓｕｌｉｎ及び１００ｍＭのｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ）を含有するＤＭＥＭで、それをＣＯ２培養器に入れ込んで７２時間に培養し、そして、培地を、１０％のウシ血清を含有し、そして、脂肪細胞分化誘導因子−１０μｇ／ｍｌのｉｎｓｕｌｉｎを含有するＤＭＥＭに入れ替えて、そして、ＣＯ２培養器に入れ込んで６−１０日に培養することにより、多能性幹細胞が直接に脂肪細胞に分化する。
【００３２】
多能性幹細胞は、多機能性の分化能力を有するため、様々の標的細胞に分化でき、多能性幹細胞が存在した場合、異なる培地や分化誘導因子を使用すれば、異なる標的細胞に分化でき、例えば、腎細胞培地や心筋細胞培地等である。例えば実施例３と５及び７のような分化された細胞である標的細胞は、少なくとも、無菌生理食塩水で３回清浄し、１０００回転の遠心速度で１０分に処理して、上清液を除去し、当該濃縮された標的細胞を無菌注射器内に収集してから、直接に自体の損傷組織細胞の部位に注射することにより、修復することができる。
【００３３】
実施例９
単核細胞の蛋白質キナーゼＣの鑑定
実施例１のような単核細胞を、Ｇｏ６９７６とＢｒｙｏｓｔａｔｉｎ−１に入れ込んでから、０時間と０.２５時間、０.５時間、１時間、２時間、６時間、１２時間及び２４時間に、それぞれ、サンプリングして、培地の単核細胞の蛋白質キナーゼＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｋｉｎａｓｅ Ｃ）の変化を測定する。図１は、０時間の時、単核細胞の蛋白質キナーゼＣの電気泳動の変化図で、結果として、単核細胞の細胞質に、αとβ１、β２、g、i／l及びzである６種類のハイポタイプの蛋白質キナーゼＣが含有され、図３において、Ｍoが単核細胞の蛋白質で、ｐｃが蛋白質キナーゼＣである陽性対照組である。単核細胞を粉砕して、直接に粉砕した後の１μｌの溶液について、蛋白質電気泳動を３０分に分析し、それをＮＣ ｐａｐｅｒに転写してから、ウシ血清によりＮＣ ｐａｐｅｒのブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）し、また、抗蛋白質キナーゼＣの各ハイポタイプの抗体（冷光を結合済み）で、ＮＣ
ｐａｐｅｒ上に蛋白質キナーゼＣがあるかどうか測定し、例えば抗蛋白質キナーゼＣのa抗体に結合された冷光が、ＮＣ ｐａｐｅｒ上に転写された蛋白質キナーゼＣのaに結合し、最後に、清水でＮＣ ｐａｐｅｒを３回清浄して、フィルム露光により結果が手に入れられる。図３は、その結果である。
【００３４】
図４は、０時間と０.２５時間、０.５時間、１時間、２時間、６時間、１２時間及び２４時間に、単核細胞の細胞質（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ）と細胞膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）においての蛋白質キナーゼＣの電気泳動の変化図であり、任意のハイポタイプの蛋白質キナーゼＣが活性化された後、一部の細胞質が細胞膜に転位（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）し、また、同時に濃度の変化が見られる。ｍＰＫＣは、細胞膜の蛋白質キナーゼＣのハイポタイプの電気泳動を測定し、ｃＰＫＣは、細胞質の蛋白質キナーゼＣのハイポタイプの電気泳動を測定する。図４から分かるように、蛋白質キナーゼＣのβ２だけが活性化される。単核細胞の蛋白質キナーゼＣのβ２が活性化されれば、単核細胞を多能性幹細胞に分化することができる。単核細胞の蛋白質キナーゼＣのβ２が活性化された任意の物は、蛋白質キナーゼＣのβ２の活性化修飾物質になり、当該蛋白質キナーゼＣのβ２の活性化修飾物質は、単一の物質や複合の物質である。図３の実験方法により、粉砕された単核細胞を高速に遠心し、上清液について、細胞質の蛋白質キナーゼＣのハイポタイプの電気泳動を測定し、沈殿した細胞屑について、細胞膜の蛋白質キナーゼＣのハイポタイプの電気泳動を測定する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１Ａ】２００倍顕微鏡拡大の単球写真
【図１Ｂ】２００倍顕微鏡拡大の多能性幹細胞写真
【図２Ａ】骨細胞のＡｌｉｚａｒｉｎ染色結果の２００倍顕微鏡拡大写真
【図２Ｂ】骨細胞内のアルカリホスファターゼの測定値棒図
【図２Ｃ】４００倍顕微鏡拡大の多角形態の軟骨細胞写真
【図２Ｄ】４００倍顕微鏡拡大の染色後の軟骨細胞写真で、粘液質（Ｍｕｃｉｎ）が赤い。
【図２Ｅ】４００倍顕微鏡拡大の神経細胞写真で、ＧＡＤ蛋白が蛍光陽性反応である。
【図２Ｆ】４００倍顕微鏡拡大の神経細胞写真で、Ｎｅｓｔｉｎ蛋白が蛍光陽性反応である。
【図３】蛋白質キナーゼＣの電気泳動測定
【図４】２４時間の蛋白質キナーゼＣの電気泳動測定