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　特願２０００−３４０８７４「ヒト腸内フローラ検出用プローブ又はプライマー」拒絶査定不服審判事件〔平成１４年　５月２１日出願公開、特開２００２−１４２７７１〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
１．手続の経緯
　本願は，平成１２年１１月８日を出願日とする特許出願であって，平成１８年８月１４日に特許請求の範囲について手続補正がされ，平成１９年８月２１日付で拒絶査定がなされ，同年９月２７日に拒絶査定不服審判が請求されたものである。
　
２．本願発明
　本願の請求項１に係る発明（以下，「本願発明」という。）は，平成１８年８月１４日付手続補正書によって補正された特許請求の範囲の請求項１に記載された事項により特定される以下のとおりのものである。
「【請求項１】配列番号１及び２から選ばれる塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列からなるヒト腸内に存在するプレボテラ クラスターに属する未同定菌群検出用プローブ。」
　
３．引用例
　原査定の拒絶の理由で引用された本願出願日前に頒布された刊行物である，Appl. Environ. Microbiol., 1999, Vol.65, No.11, p.4799-4807（以下，「引用例」という。）には，以下の事項が記載されている。
　
（１）「複雑なコミュニティーからの１６Ｓ　ｒＲＮＡをコードする遺伝子の直接的な解析は，ヒト腸内の多くの新規な分子種を明らかにする。」（第４７９９頁，標題）
　
（２）「ヒト腸管は，栄養及び健康に重要な役割を果たす複雑な微生物生態系を持つ。この細菌叢は培養技術によって非常に詳細に研究されてきたが，ヒト大便の顕微鏡的な勘定は，６０乃至８０％の観察可能な細菌が培養できないことを示す。クローン化された１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）配列の比較解析を用いて，我々は，成人男性の大便サンプル中の細菌の多様性（培養される及び培養されない細菌の両方）を調査した。１０サイクルのＰＣＲから得られた２８４のクローンが，８２の分子種（少なくとも９８％の類似性）に分類された。三つの系統学的グループ：Bacteroidesグループ，Clostridium coccoidesグループ，及びClostridium leptumサブグループ　は，クローンの９５％を含んだ。残りのクローンは様々な系統学的クラスターに分布した。回収された分子種のうち２４％だけが記述された生物（それらの配列は公開されたデータベースで入手できる）に対応し，それら全てがヒト大便菌叢の優勢種（例えば，Bacteroides thetaiotaomicron, Fusobacterium prausnitzii, 及びEubacterium rectale）を確立した。しかし，作成されたｒＤＮＡ配列の大多数（７６％）は既知の生物に対応せず，このヒト大腸細菌叢の中で今までに知られていない種に明らかに由来した。」（第４７９９頁，要約）
　
（３）「増幅，クローニング及びスクリーニング　　フォワードプライマー　S-D-Bact-0008-a-S-20（5' AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3'[18]）これはBacteriaドメインを標的とする，及びリバースプライマー　S-Univ-1492-b-A-21（5' ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT 3'[21]），これは全生物を標的とする，がＰＣＲによる細菌の１６Ｓ　ｒＤＮＡの増幅に使用された。・・・精製された産物はｐＵＡｇベクター（Ｒ＆Ｄ Systems Europe Ltd. アビングドン, 英国）に製造者の指示に従い連結した。感受性Escherichia coli DHI細胞が連結産物を用いて熱ショック（４０秒４２℃）により形質転換された。組換え細胞はカナマイシン（50μg　ml-1）及びIPTG（イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド）及びX-Gal（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含むLuria-Bertani培地で選択した。・・・全てのクローンは詳細な配列解析を行った。」（第４８００頁，左欄第１３〜４５行）
　
（４）「配列解析　配列はＰＣＲプライマー結合部位を除くように編集された。新たに決定された配列は，最も近い類縁体を突き止めるために，公開されたデータベース（Ribosomal Databese Project[ＲＤＰ][25]及びGenBank）で入手できるものと比較された。Genetics Computer Group ソフトウエアパッケージ（ＥＧＣＧ version8.00; Peter Rice, The Sanger Centre, ケンブリッジ, 英国）が配列解析に使用された。・・・・ここで使用された一の操作分類単位（ＯＴＵ）又は分子種は，４００乃至４５０の整列された相同なヌクレオチドから２％より少ない相違を有する（大便クローン及び参照菌株の）全ての配列からなる。この閾値はGodonら（１５）の「同じＯＴＵに属するクローンの配列の相違は，一般的に低い（２〜０％）」という結論に基づき，それは１６ＳｒＲＮＡ相同性とＤＮＡ−ＤＮＡ再会合値との比較の結果（３０）とも一般的に一致する結論である。」（第４８００頁，左欄第６２行〜右欄第６行）
　
（５）「ヌクレオチド配列アクセッションナンバー　各ＯＴＵの代表の一つ(単一の代表を持ついくつかのＯＴＵは除く）はほぼ完全に配列を決定し，ＧｅｎＢａｎｋに成人ヒト大便を意味するadhufecの頭字語を付けて登録した（アクセッション番号AF132232からAF132286）。」（第４８００頁，右欄第６５〜６８行）
　
（６）「Bacterpoidesグループ　Bacteroidesグループ（RDP登録番号2.7.1.1）の４つのサブグループの中でのクローンの系統学的分布を図１に示す。E.coliの第４２から４８３位に対応する整列された塩基が，SIMILARITY及びNEIGHBORプログラムでこの系統樹を作成するために使用された。・・・そして４１クローンがPrevotellaサブグループ(2.7.1.1.4）に含まれた。・・・１３ＯＴＵ（６２％）は公開されたデータベース中に近縁の配列（少なくとも９８％の類似性）がなく，潜在的な新種に由来した。３８のPrevotella様クローン（全クローン集合の１３％及びBacteroidesグループのクローンの４３％）が４つの異なるグループに分類された。配列の相違は１．２〜３．２％（完全配列を用いたＧＡＰプログラム）にわたり，４つのＯＴＵはほぼ確実に別々の種に由来することを示す。」(第４８０１頁，左欄下から１９行〜右欄第１１行）
　
（７）「
図１　Bacteroidesグループメンバーの１６ＳｒＤＮＡの部分配列データから算出された系統樹。棒は２％の配列相違を表す。クローン名とサブグループ名に使用された重要な生物は太字である。系統樹はSIMILARITY及びNEIGHBORプログラムで作成された。ブートストラップ値は５００回反復に基づく。垂直な棒はAnaeroflexus集合体（a)，Bacteroides fragilisサブグループ(b)，Prevotellaサブグループ(c)，及びBacteroides distasonisサブグループ(d)に対応する。」(第４８０２頁，図１）
　
（８）「今や，培養に基づく技術の制限により，ヒト腸内細菌叢の組成の知識が完全とはほど遠いことが認識された。実際に，腸内細菌多様性のかなりの細菌群が培養されていないということが，現在，普遍的ではないとしても一般的に信じられている。自生の細菌群は宿主の健康と生理学的機能に決定的な役割を果たす（６，１０，１２）。ヒト腸内の最優勢細菌の詳細な知識は，例えば，どのようにして正常な細菌叢が病原性細菌に対するコロニー形成抵抗性を提供したり，免疫反応を刺激するのかを理解するために重大な意味を持つ。同様に，（例えば，プロバイオティクスやプレバイオティクスを用いる）健康改善のための正常な細菌叢を調節することを目的とした効果的な食事計画（１３，３１）を実行するために，細菌の変化をモニタリングするための正確な方法は絶対的に不可欠である。
　本研究において，われわれは一人のヒト大便サンプルから直接作成されたｒＤＮＡ増幅産物の分子遺伝学的解析を行った。その結果，この菌叢の９５％は３つの主要な系統学的系譜（すなわち，Bacteroides,  Clostridium coccoides，及びClostridium leptumグループ）に割り当てられることが示された。重大なことに，徹底的な系統学的解析は，かなり大多数の観察されたｒＤＮＡの多様性が，ヒト腸内の今までに知られていない優勢な微生物に起因することを明らかにした。我々の直接的な大便解析から得られた詳細な分子多様性の目録は，他の，加齢，食事，腸の病気，及び地理学に基づく研究のためのベースライン及び比較の枠組みとなるであろう。そのような拡張した研究（もう一人の成人，一人の老人，及び数人の乳児）が既に計画されている。さらに，生成された配列は対応する現存の生物（例えばFusobacterium prausnitziiとPrevotellaサブグループ内の新たなクラスターに関連する分子種）の単離を可能にするはずであり，腸の微生物生態系を研究するための強力な手段を提供する，新規な種−及び群−特異的遺伝子プローブの設計の助けにもなるはずである。一人の成人から回収された新規な分子種は，ＰＣＲ増幅の結果から生ずる偏りのない，全細菌叢におけるそれらの寄与を評価するために，いくつかの大便サンプルのドットブロットやin situハイブリダイゼーションによって定量化されるだろう。」（第４８０６頁，左欄下から１９行〜右欄第２０行）
　
　引用例の記載事項（１）〜（８）によれば，引用例には，ヒト大便サンプルから得られたＤＮＡを用いて１６ＳｒＤＮＡをクローニングし，ヒト腸内細菌のプレボテラ属等の未同定細菌由来の配列が得られたことが記載されている。
　
４．対比・判断
　本願発明の「配列番号１及び２からなる塩基配列」について，発明の詳細な説明を参照すると，健康成人３人の糞便から抽出したＤＮＡを鋳型として，全生物に共通なプライマーを用いたＰＣＲにより１６ＳｒＤＮＡを増幅することにより，新規にクローニング及び配列決定されて得られた塩基配列であり（【００２２】−【００２４】），配列番号１又は２の塩基配列からなるプローブは，未同定菌群に属する細菌の１６ＳｒＤＮＡ配列と公知の近縁菌種の塩基配列とを比較・検討した中で，プレボテラクラスターの一部であるＣＡ７５菌群を特異的に検出するように設計されたプローブであること（【００２５】−【００２６】，【００２９】，【００３１】及び図１）が説明されている。
　そして，本願の図１に記載される，ＣＡ７５菌群中のＡＦ１３２２８２で示される塩基配列は，引用例においてクローニングされ，登録された配列である（記載事項（５））。
　そうすると，本願発明と引用例に記載された発明とは，「ヒト腸内に存在するプレボテラクラスターに属する未同定菌群の１６ＳｒＤＮＡ」に関するものである点で一致し，以下の点で相違する。
相違点：本願発明が「配列番号１及び２から選ばれる塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列からなる未同定菌群検出用プローブ」であるのに対し，引用例には配列番号１及び２の塩基配列の記載はなく，未同定菌群検出用プローブも記載されていない点。
　
　上記相違点について検討する。
　引用例の記載事項（８）には，大便サンプルの種類や数を増やしてさらに解析を行うこと，及び生成された配列を基に，新規な種又は群に特異的なプローブを設計し，in situハイブリダイゼーションによる腸内細菌叢の定量化に用いることが示唆されている。
　よって，引用例に示唆されるように，他の大便サンプルを用いた解析を行い，さらに新規な未同定菌種の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を取得すること，及び取得された新規な配列とデータベース上の配列との比較に基づいて，新規な菌群に特異的なプローブを設計することは，当業者が容易に想到し得るものである。
　そして，本願発明のプローブは，従来未同定であったＣＡ７５菌群を検出することができるという効果を奏するものではあるが，新規な菌群特異的プライマーを用いれば，従来未同定の菌群を検出できることは，引用例の記載から予測し得るものであり，ＣＡ７５菌群がヒトの健康や病気にどのように影響を及ぼすかといったＣＡ７５菌群自体の性質は何も明らかにされてはいないから，本願発明のプローブを用いてＣＡ７５菌群を検出できることによって，他の新規なプローブを設計し，他の未同定菌群を検出する場合と比べて，他の菌群の検出からでは得られない有利な情報が得られるというものではない。
　よって，本願発明は，引用例の記載から予測できない有利な効果を奏するものではない。
　
５．請求人の主張について
　請求人は，審判請求書において，以下の主張をしている。
（１）引用例に記載されたＣＡ７５菌群の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列は，本願発明のプライマーの塩基配列に相当する領域には，同一菌群内にミスマッチが存在することから，各菌群を同定・検出するためのプローブのターゲット領域として，選定してみようとすることは通常ありえない。
　
（２）本願発明のプローブの特異的領域の選定は，引用例の配列情報から行えるものではなく，新たな塩基配列情報があって初めてなし得たものである。そしてＧＣ含量や鎖長等を考慮してプローブが設計され，さらに特異性・反応性の選別を行ってはじめて，実用可能なプローブが取得される。インサイチュハイブリダイゼーションにおいて高感度なプローブを見出すことは，特に多くの試行錯誤が必要となる。このように，実用可能なプローブを得ることは，引用例の記載及び本願出願時の技術常識を参酌しても当業者が容易になし得ることではない。　
　
（３）本願発明のプローブを用いてＦＩＳＨ法によりヒト大便中の菌群を検出した場合，大便１ｇあたり１０９cellsレベルで存在する，ヒト腸内の最優勢菌種でありながら，未同定の菌群のみを特異的に同定・検出することが可能となる。これにより，正確で詳細なヒト腸内細菌叢の解析を迅速，簡便に行うことができ，ヒトの健康維持，種々疾病等の予防・治療に関わる腸内細菌叢の役割にについてより重要な情報を入手でき，ヒトの健康維持，種々の疾病等の予防・治療が容易になるという効果が得られる。
　
　請求人の主張について検討する。
　主張（１）については，請求人は，本願発明のプローブと，引用例に記載されたＣＡ７５菌群の塩基配列とにミスマッチが存在することを根拠に，本願発明のプローブを設計することの困難性を主張しているが，上述のように，引用例には，引用例において同定された塩基配列のみならず，更なる大便サンプルから新規な未同定細菌群由来の塩基配列を得てプローブを設計することも示唆されており，そのような新規な未同定菌群に属する菌を全て検出し，他の菌群を検出しないプローブを設計する場合に，当該菌群に特異性の高い領域の配列中にもミスマッチが含まれてしまうことは当然起こり得ることであるし，請求人の指摘する上記ミスマッチは，ターゲット領域の２２又は２３塩基のうちの１塩基に過ぎないから，上記ミスマッチの存在が，本願発明のプローブのターゲット領域を選定することを阻害するものとまではいえない。
　
　次に，主張（２）については，新規な塩基配列情報を得ることは，上述のとおり，引用例において示唆されている。
　そして，本願明細書に記載された新規な配列情報は，引用例において示唆されたとおりに，大便サンプル数を増やして解析を行った結果，特に困難なく得られたものであり，それをもって，本願発明をすることが困難であったということはできない。
　また，１６ＳｒＤＮＡの塩基配列からなる菌群特異的プローブを用いたＦＩＳＨ法により，大便中の細菌叢を検出することは，本願出願日当時，周知技術であり（必要であれば，Microbiology, 1996, Vol.142, p.1097-1106,  Appl. Environ. Microbiol.,1998, Vol.64, No.9, p.3336-3345,  Bioscience Microflora, 2000. Oct., Vol.19, No.2, p.79-84等を参照。），ＧＣ含量や鎖長を考慮した上で菌群に特異的なターゲット領域を選定した後に，プローブが実際に検出する菌群の範囲，すなわち特異性の確認を行うことは，当業者が通常行うことであるから，実用可能なプローブを得るまでにある程度の試行錯誤が必要であるとしても，当業者であれば通常なし得る程度のものといえる。
　さらに，本願明細書の実施例３には，本願発明のプライマーの特異性の確認を行った結果，表４に記載される既知の３５菌種は検出しなかったと説明されているが（【００３１】），該３５種以外の既知の菌種や未知の菌種との反応性は不明であり，本願発明のプローブが，引用例に記載されたＡＦ１３２２８２等をも含めたＣＡ菌群の菌種を全て検出できるか否か，また，ＣＡ菌群以外の菌種は検出しないものであるのか否かも不明である。
　してみると，本願発明のプローブは，ＣＡ７５菌群を検出できるということ以外に，周知のプローブと比べて，格別に特異性が高く，優れたプローブであるということもできない。
　
　最後に，主張（３）については，引用例には，培養技術では細菌叢の６０〜８０％が検出できなかったこと，１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の解析では，培養技術では検出できない細菌群を検出でき，その大多数がヒト腸内細菌の未同定の優勢種に由来したことが記載されている（記載事項（２）及び（８））。すなわち，引用例では，ヒト腸内には優勢種でありながら未同定の菌群が数多く存在することが指摘されている。
　そして，大便から新たな１６ＳｒＤＮＡをクローニングした場合には，腸内に存在する割合の高い最優勢種のＤＮＡの方がクローニングされる確率が高いのは当然であるから，新規に取得された１６ＳｒＤＮＡの配列がそのような最優勢種に由来し，その塩基配列情報によって新規な未同定の最優勢種を検出できるようになることも，引用例の記載から予測し得るものである。
　さらに，引用例には，ヒト腸内の細菌叢をより正確にモニタリングすることで，健康改善等に役立てることについても示唆されている（記載事項（８））。
　
　以上により，請求人の主張（１）〜（３）を採用することはできず，本願発明は，引用例に記載された発明に基づき，当業者が容易に発明をすることができたものである。
　
６．むすび
　したがって，本願の請求項１に係る発明は，特許法第２９条第２項の規定により，特許を受けることができないから，その余の請求項については検討するまでもなく，本願は拒絶をすべきものである。
　よって，結論のとおり審決する。