【手続補正書】
【提出日】平成23年11月15日(2011.11.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
１）リンドウ科センブリ属の植物体の抽出物と、２）次に示す特性を有するＹＡＣ化合物及び／又はその塩とを含有することを特徴とする、皮膚外用剤。
＜ＹＡＣ化合物の特性＞
（１）λmaxを４０５〜４１５ｎｍと、６６０〜６７０ｎｍとに有する。
（２）図１に示す1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有する。
（３）図２に示す13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを有する。
（４）以下の条件でのＨＰＬＣ分析において、１５分前後にシングルピークを示す。
移動相：９０％アセトニトリル
カラム：ＯＤＳ４．６×２５０ｍｍ
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ．
温度：４０℃
検知：紫外部２１０ｎｍ
（５）化学組成式はＣ34Ｈ40Ｏ9であり、質量分析スペクトルは５９３（Ｍ＋Ｈ）
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
リンドウ科センブリ属の植物体の抽出物は、該抽出物の２０μｇ／ｍＬの濃度での存在下、ヒト肝ガン由来細胞株ＨｅｐＧ２を培養した場合において、非存在下に比して、グルタチオンの産生量を少なくとも４０％増加させる作用を有することを特徴とする、請求項１に記載の皮膚外用剤。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
一方、リンドウ科センブリ属の植物は、開花期の全草を乾燥したものを生薬として民間療法において、腹痛の抑制、消化促進、食欲増進の目的で使用されており、化粧料の分野に於いても、その抽出物を血行促進（例えば、特許文献４を参照）或いは発毛促進（例えば、特許文献５を参照）の目的などで使用されている。しかしながらリンドウ科センブリ属の植物体の抽出物が細胞に於いて、グルタチオンの産生量を増加させる作用を有することは全く知られていない。又、キク科ヨモギの植物体に含有される、次に示す特性を有するＹＡＣ化合物及び／又はその塩は、文献未記載の新規化合物であり、当然その薬効についても全く知られていない。更に、これらを組み合わせて皮膚外用剤に含有させることにより、著しいくすみ改善効果を示すことも全く知られていない。
＜ＹＡＣ化合物の特性＞
（１）λmaxを４０５〜４１５ｎｍと、６６０〜６７０ｎｍとに有する。
（２）図１に示す1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有する。
（３）図２に示す13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを有する。
（４）以下の条件でのＨＰＬＣ分析において、１５分前後にシングルピークを示す。
移動相：９０％アセトニトリル
カラム：ＯＤＳ４．６×２５０ｍｍ
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ．
温度：４０℃
検知：紫外部２１０ｎｍ
（５）化学組成式はＣ34Ｈ40Ｏ9であり、質量分析スペクトルは５９３（Ｍ＋Ｈ）
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
この様な状況に鑑みて、本発明者らは、スキンケアにより、くすみの存在そのものに対応する手段を求めて、鋭意研究努力を重ねた結果、１）リンドウ科センブリ属の植物体の抽出物と、２）次に示す特性を有するＹＡＣ化合物及び／又はその塩とを含有する、皮膚外用剤がその様な作用を有していることを見出し、発明を完成させるに至った。
＜ＹＡＣ化合物の特性＞
（１）λmaxを４０５〜４１５ｎｍと、６６０〜６７０ｎｍとに有する。
（２）図１に示す1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有する。
（３）図２に示す13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを有する。
（４）以下の条件でのＨＰＬＣ分析において、１５分前後にシングルピークを示す。
移動相：９０％アセトニトリル
カラム：ＯＤＳ４．６×２５０ｍｍ
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ．
温度：４０℃
検知：紫外部２１０ｎｍ
即ち、本発明は以下に示すとおりである。
＜１＞１）リンドウ科センブリ属の植物体の抽出物と、２）次に示す特性を有するＹＡＣ化合物及び／又はその塩とを含有することを特徴とする、皮膚外用剤。
＜ＹＡＣ化合物の特性＞
（１）λmaxを４０５〜４１５ｎｍと、６６０〜６７０ｎｍとに有する。
（２）図１に示す1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有する。
（３）図２に示す13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを有する。
（４）以下の条件でのＨＰＬＣ分析において、１５分前後にシングルピークを示す。
移動相：９０％アセトニトリル
カラム：ＯＤＳ４．６×２５０ｍｍ
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ．
温度：４０℃
検知：紫外部２１０ｎｍ
（５）化学組成式はＣ34Ｈ40Ｏ9であり、質量分析スペクトルは５９３（Ｍ＋Ｈ）
＜２＞リンドウ科センブリ属の植物体の抽出物は、該抽出物の２０μｇ／ｍＬの濃度での存在下、ヒト肝ガン由来細胞株ＨｅｐＧ２を培養した場合において、非存在下に比して、グルタチオンの産生量を少なくとも４０％増加させる作用を有することを特徴とする、＜１＞に記載の皮膚外用剤。
＜３＞複合乳化剤形であることを特徴とする、＜１＞又は＜２＞に記載の皮膚外用剤。
＜４＞前記複合乳化剤形は、水相を連続相とし、該連続相中に油滴及び油中水乳化滴が分散した形態の剤形であることを特徴とする、＜３＞に記載の皮膚外用剤。
＜５＞１）リンドウ科センブリ属の植物体の抽出物と、２）次に示す特性を有するＹＡＣ化合物及び／又はその塩とを、ともに水相中に分散した油中水乳化滴の油相中に含有することを特徴とする、＜４＞に記載の皮膚外用剤。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
＜手技＞
ヒト肝ガン由来細胞株ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ；CRL-11997）を用いてグルタチオン産生
量の測定試験を実施した。１０容量％牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ社製）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）に細胞を懸濁し、培養プレートに播種し、ＣＯ2インキュベーター（９５容量％空気、５容量％二酸化炭素）内、３７℃の条件下で２４時間培養した。２４時間培養後、ジメチルスルホキシドにて懸濁した各抽出物を乾燥固形物量として培地中に２０μｇ／ｍｌの濃度で含む試料添加培地に交換し、さらに２４時間培養した。
細胞を回収し、その後−３０℃で凍結、融解することで細胞を破砕し、細胞内のグルタチオンを溶出させた。１０００ｘｇで１５分間、２０℃で遠心し、上清を測定試料とした。ＧＳＨ／ＧＳＳＧ−４１２キット（ＯＸＩＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて、ＤＴＮＢ法により、グルタチオン量を測定した。即ち、グルタチオン標準品、ブランク、測定試料２００μＬを、各々のキュベットへ入れ、キット付属のクロモジェン２００μＬと酵素液２００μＬを各キュベットに加え、室温で５分間インキュベートした。その後各キュベットにキット付属のＮＡＤＰＨ液２００μＬを添加し、４１２ｎｍの吸光度の変化を３分間測定した。グルタチオン量は、同時に設定したグルタチオン標準品にて作成した検量線から計算した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
＜２＞本発明の化粧料の必須成分であるＹＡＣ化合物
本発明の化粧料の必須成分であるＹＡＣ化合物は次に示す性状を有することを特徴とする。
（性状）
（１）λmaxを４０５〜４１５ｎｍと、６６０〜６７０ｎｍとに有する。
（２）図１に示す1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有する。
（３）図２に示す13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを有する。
（４）以下の条件でのＨＰＬＣ分析において、１５分前後にシングルピークを示す。
（５）化学組成式はＣ34Ｈ40Ｏ9であり、質量分析スペクトルは５９３（Ｍ＋Ｈ）
本発明の化粧料の必須成分であるＹＡＣ化合物の紫外・可視吸収スペクトルは図４に示す。この図より、４０５〜４１５ｎｍと、６６０〜６７０ｎｍとにλmaxが存する特徴が明確に判別できる。本発明の化粧料の必須成分であるこの化合物を特定する場合、かかる紫外・可視部吸収特性は非常に有利である。即ち、多波長の検出器を備えたＨＰＬＣを用いて、２１０ｎｍの吸収で分析し、ピークについて４０５〜４１５ｎｍと、６６０〜６７０ｎｍとの吸収を確認し、同様に強い吸収が認められた場合には、本願発明のＹＡＣ化合物である蓋然性が非常に高い。この意味で有力な確認手段となる。本願発明のＹＡＣ化合物は、極性溶媒抽出物の非極性部分に存在する。この為、溶媒で抽出し、抽出溶媒を減圧濃縮などで除去した後に酢酸エチルと水で分液し、酢酸エチル相を採取することにより、濃縮することが出来る。このものをシリカゲルカラムクロマトグラフィーなどを用いて、クロロホルム／メタノール混液系で分画精製することにより単離することが出来る。単離したかどうかについては、以下の条件のＨＰＬＣ分析でシングルピーク（リテンションタイム１５分前後）であるか否かを判別することにより特定することが出来る。図３に分析例を示す。この場合のリテンションタイムは１４．７分である。
（ＨＰＬＣ条件）
移動相：９０％アセトニトリル
カラム：ＯＤＳ４．６×２５０ｍｍ
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ．
温度：４０℃
検知：紫外部２１０ｎｍ
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
斯くして得られたＹＡＣ化合物は、シリカゲルを担体とする薄層クロマトグラフィー（展開液、クロロホルム：メタノール＝９５：５〜８：２）においてシングルスポットを呈し、ＡＧＥｓ分解活性を示す。ＡＧＥｓ分解活性は、簡易的にはα−ジケトンの切断活性の強さを指標とし、定量化することが出来る。即ち、１−フェニル−１，２−プロパンジオンとともにインキュベートし、切断によって生じる安息香酸を吸光度で定量し、安息香酸の生成量が多いほどＡＧＥｓ分解能が高いと判別できる。これよりｖｉｖｏに近い評価としては、実際にグルコースと牛血清アルブミンとをインキュベートして作成したＡＧＥｓを分解せしめ、分解量を定量し、かかる分解量を指標にＡＧＥｓ分解能を定量する方法も存する。本発明の化粧料の必須成分であるＹＡＣ化合物はこの様な方法でＡＧＥｓ分解能を定量した場合、α−ジケトンの分解において４０〜６０％程度の分解率を呈し、牛アルブミンＡＧＥｓに対しては、１０-3質量％で６５〜８０％程度の分解率を呈する。この性質を利用して本発明の化粧料の必須成分であるＹＡＣ化合物はＡＧＥｓ分解剤として化粧料等に配合し、光照射などで生じたＡＧＥｓを速やかに分解し、この蓄積を防ぐことが出来る。以下に、これらの評価方法の手順を示す。本発明の化粧料に於いては、かかるＡＧＥｓ分解作用がくすみ改善、特にメラニン産生抑制剤で改善しにくいくすみの改善に有用であると考えられる。本発明の化粧料に於いてはかかるＡＧＥｓ分解作用を明確に発現するドーズでのＹＡＣ化合物の含有が好ましい。具体的には、１０-4〜１０-2質量％含有させることが特に好ましい。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
＜３＞本発明の皮膚外用剤
本発明の皮膚外用剤は、前記必須成分を含有し、乳化剤形であることを特徴とする。前記乳化剤形としては、水中油乳化剤形、油中水乳化剤形、複合乳化剤形の何れもが適用可能であり、特に複合乳化剤形が好ましい。複合乳化剤形には、油中水中油剤形や水中油中水剤形のように、エマルションの分散している滴の構造自身が複合化しているタイプ（分散滴複合タイプ）と、連続相は油相なり、水相なりの一相であり、分散滴が油滴、油中水滴分散或いは水滴、水中油滴分散などのように分散滴が多様化しているタイプ（分散滴多様化タイプ）とが存し、本発明の皮膚外用剤では、分散滴多様化タイプが特に好ましい。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
前記の分散滴多様化タイプの複合乳化剤形であって、水相を連続相とし、ここに油滴と油中水乳化滴が混在して分散する剤形の場合、必須成分である有機変性粘土鉱物は、連続相である水相に分散している油中水乳化滴中に含有することが好ましい。又、この場合、分散する油滴は、アルカリを含有する、予め水酸化レシチンを溶解させた水相に、脂肪酸を含む油相を加え、水中油乳化組成物を形成せしめ、これに有機変性粘土鉱物を含む油中水乳化組成物を加え、所望により均質化し調整することが好ましい。この様な形態を採用することにより、乳化滴、油滴と水相の界面が強化され乳化安定性が向上する。又、水相中に分散する油中水乳化滴は、経皮吸収性に優れるので、有効成分である前記必須成分はここに含有させることが好ましい。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
【図１】ＹＡＣ化合物の1Ｈ−ＮＭＲを示す図である。
【図２】ＹＡＣ化合物の13Ｃ−ＮＭＲを示す図である。
【図３】ＹＡＣ化合物のＨＰＬＣチャートを示す図である。
【図４】ＹＡＣ化合物の紫外吸収スペクトルを示す図である。
【図５】ＹＡＣの化合物の質量分析スペクトルを示す図である。
【図６】ＹＡＣ化合物のグルコース−牛血清アルブミンＡＧＥｓ分解作用の測定結果を示す図である。