(57)【要約】  外来遺伝子を導入することなく、エタノール産生効率の高い高効率エタノール発酵菌を提供する。  高効率エタノール発酵菌は、五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノールを産生する発酵菌であって、特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９６２として寄託されている。
2016088274.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノールを産生する発酵菌であって、
特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９６２として寄託されていることを特徴とする高効率エタノール発酵菌。
【請求項２】
請求項１に記載の高効率エタノール発酵菌において、Meyerozyma guilliermondii Ｎ株を、アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液に変異剤を加えた培地で馴化培養して、該培地で生育する菌を選抜することによりエタノール発酵性能が向上していることを特徴とする高効率エタノール発酵菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
リグノセルロース系バイオマスを用いたバイオエタノール生産において、糖化溶液を発酵するための微生物に関する。【０００２】
特に、リグノセルロース系バイオマスを用いたバイオエタノール生産において、五炭糖（以下、Ｃ５糖ということがある。）、及び六炭糖（以下、Ｃ６糖ということがある。）から効率的にエタノール生産することができる微生物に関する。
【背景技術】
【０００３】
バイオエタノールは、バイオマスから産生される枯渇することのない再生可能資源として期待されている。また、バイオエタノールを燃焼させて発生する二酸化炭素はカーボンニュートラルであることから、バイオエタノールの利用が進むことによって、地球温暖化の主な原因である二酸化炭素の上昇を抑制すると考えられている。【０００４】
バイオエタノールは、バイオマスを発酵させ、蒸留してエタノールを精製する。バイオエタノールの収率を高めるために糖化溶液から多くのアルコールを生成する必要がある。バイオエタノール生産の過程で一般的に用いられている酵母は、キシロース、アラビノースなどの五炭糖をアルコールに変換できないため、発酵原料としては六炭糖のみが用いられてきた。【０００５】
原料によって異なるものの典型的なバイオマスには、３５〜４５％のセルロース、２５〜４０％のヘミセルロース、１５〜３０％のリグニンが含まれていると言われている。したがって、六炭糖が重合しているセルロースだけではなく、五炭糖であるキシロース等を主として含有するヘミセルロースを基質として利用することは効率的なエタノール産生につながることになる。【０００６】
キシロースはグルコースの次にバイオマス中に多く含まれている糖であると言われており、五炭糖を効率的に利用することはバイオエタノール生産において大きな課題となっている。【０００７】
これまでに、遺伝子組換えによるキシロース利用能の付与や、キシロースを利用してエタノールを産生する微生物の利用等により、キシロースを少しでも利用する技術が開示されている。【０００８】
特許文献１には、キシローストランスポーター活性を有する遺伝子を宿主細胞に導入することによって、キシロース（Ｃ５糖）をキシルロースに変換し、解糖系のペントースリン酸経路に組み入れ、発酵に利用する発明が開示されている。【０００９】
特許文献２には、アラビノーストランスポーターを付与した酵母によって、アルコールを生成する技術が開示されている。特許文献１と同様にアラビノース（Ｃ５糖）をアラビトール、キシルロースを経て解糖系のペントースリン酸経路に組み入れ、発酵に利用するものである。【００１０】
非特許文献１には、大腸菌由来のキシロース資化遺伝子をザイモモナスに組み込むことにより、キシロース資化能を付与することが開示されている。【００１１】
非特許文献２には、ピキア属酵母が、キシロースを利用してエタノールを生産することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開2012-170422号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第2013/189788号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Zhang, M., et al., Science, 1995. Vol. 267, pp. 240-243.
【非特許文献２】Bicho, P.A., et al., Appl. Environ. Microbiol., 1988, Vol. 54, pp. 50-54.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、特許文献１の発明は、Candida guilliermondii由来のキシローストランスポーター活性のあるタンパク質を宿主としてSaccharomyces cerevisiaeに導入している。すなわち外来遺伝子を導入することになる。また、特許文献２の発明もトランスポーター遺伝子は異なるものの、宿主に対して異なる種の遺伝子を導入する発明である。 【００１５】
また、非特許文献１に記載の技術は、キシロース資化遺伝子を導入するものであり、上記特許文献１及び２とは技術思想は異なるが、外来遺伝子を導入することに変わりない。【００１６】
そのため、上記特許文献１及び２、非特許文献１に記載の発明は、いずれも国連で採択された「生物の多様性に関する条約のバイオセーフティに関するカルタヘナ議定書」を実施するために我が国において施行されているいわゆるカルタヘナ法に則した封じ込め策を講じる必要がある。従って、バイオセーフティを保証するための施設を必要とすることから、当該菌体を利用してエタノールを生産することはコストの面で不利である。【００１７】
また、非特許文献２に記載の技術によって、ピキア属酵母を利用することは、野生型のピキア属酵母はキシロース利用性が低く、エタノール産生効率はさほど高くならない。【００１８】
本発明は、外来遺伝子を導入することなく、エタノール産生効率の高い高効率エタノール発酵菌を得ることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
前記課題を解決するために、本発明の高効率エタノール発酵菌は、五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノールを産生する発酵菌であって、特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９６２として寄託されていることを特徴とする。【００２０】
野生型Meyerozyma guilliermondiは、グルコース資化能に加えてキシロース資化能を備えているとはいうものの、バイオエタノール生産に十分なキシロース利用能を備えているわけではない。これに対して、本発明の高効率エタノール発酵菌（以下、ＢＰ−０１９６２株ということがある。）は、Meyerozyma guilliermondi Ｎ株を親株として菌株育種することによりキシロースの利用効率の高い菌を選抜して得たものである。【００２１】
この結果、本発明の高効率エタノール発酵菌は、外来遺伝子を導入することなく、親株より高いエタノール産生効率を得ることができる。【００２２】
本発明の高効率エタノール発酵菌は、Meyerozyma guilliermondii Ｎ株をアンモニア処理稲わら由来酵素糖化液に変異剤を加えた培地で馴化培養して、該培地で生育する菌を選抜することによりエタノール発酵性能が向上している。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】キシロース資化性とエタノール収率とを示すグラフであり、ＡはＮ株、ＢはＢＰ−０１９６２株を示す。
【図２】アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液におけるＢＰ−０１９６２株によるグルコース及びキシロースの消化量と、エタノールの生成量との経時変化を示すグラフである。
【図３】ＢＰ−０１９６２株とＮ株との希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液における糖濃度と発酵収率との関係を示すグラフである。
【図４】ＢＰ−０１９６２株とＮ株との希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液におけるエタノール生成量の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
次に、添付の図面を参照しながら本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。
【００２５】
子嚢菌系酵母であるMeyerozyma guilliermondiの野生株は、グルコース資化能に加えてキシロース利用能を備えているが、そのキシロース利用能はバイオエタノール生産に十分とは言えない。そこで、本実施形態の高効率エタノール発酵菌は、子嚢菌系酵母であるMeyerozyma guilliermondi Ｎ株を親株として、アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液に変異剤を加えた培地で馴化培養して、該培地で生育する菌を選抜することにより得られた変異株である。
【００２６】
本実施形態の高効率エタノール発酵菌は、本出願人により独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（日本国  〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に寄託されている。受託日は２０１４年１１月１９日、受託番号は、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９６２である。以下、本実施形態の高効率エタノール発酵菌を、ＢＰ−０１９６２株ということがある。
【００２７】
前記アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液は、例えば、次のようにして得たものを用いることができる。まず、埼玉県熊谷市産の稲わらを等量の２５質量％アンモニア水に３０℃の温度で３時間浸漬した後、アンモニアを放散させることにより前処理する。次に、前記前処理が施された稲わらに、ｐＨ調整後、糖化酵素（MeijiSeikaファルマ株式会社製、商品名：アクレモニウムセルラーゼ）を添加し５０℃の温度に７２時間保持して酵素糖化を行い、酵素糖化液を含むスラリーを得る。次に、前記スラリーをフィルタープレスにより固液分離し、回収された液体分を前記アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液とする。前記アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液は、例えば、３〜１５質量％のグルコースと、１〜１０質量％のキシロースとを含んでいる。
【００２８】
前記変異剤としては、例えば、N−エチル−N−ニトロソウレア（ＥＮＵ）、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）等のエチル化剤、５−ブロモ−２´−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）等の塩基類似化合物、ニトロアミン、ニトロソグアニジン等のニトロソ化合物等を用いることができる。
【００２９】
本実施形態の高効率エタノール発酵菌であるＢＰ−０１９６２株は、前記親株を前記アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液に変異剤を加えた培地で馴化培養して、該培地で生育する菌の選抜を繰り返すことにより得られた変異株である。従って、ＢＰ−０１９６２株は、Meyerozyma guilliermondiの野生株又はＮ株に比較して、外来遺伝子を導入することなく、キシロース資化性及びエタノール発酵性能が向上している。
【００３０】
次に、Meyerozyma guilliermondi Ｎ株とＢＰ−０１９６２株とのキシロース資化性とエタノール収率を比較した。
【００３１】
まず、グルコース９７．６ｇ／Ｌ、キシロース４１．５ｇ／Ｌ、酵母エキス１０．０ｇ／Ｌ、ペプトン２０．０ｇ／Ｌを含みｐＨ４．７の合成培地に、Meyerozyma guilliermondiＮ株の培養液を培地のＯＤ６００が２．０となるように添加し、３０℃の温度で１６８時間培養を行った。そして、所定時間毎に前記培地を採取し、グルコースとキシロースとの濃度をＨＰＬＣ（東ソー株式会社製、商品名：ＬＣ−８０２０）により、エタノールの濃度をＧＣ−ＦＩＤ（ジーエルサイエンス株式会社製、商品名：ＧＣ３９０Ｂ）により、それぞれ測定した。キシロース濃度とエタノール濃度との測定結果を図１Ａに示す。
【００３２】
次に、２６質量％のアンモニア処理稲わら由来酵素糖化液を培地とし、該培地にＢＰ−０１９６２株のの培養液を培地のＯＤ６００が２．０となるように添加し、３０℃の温度で１６８時間培養を行った。前記アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液は、グルコース１１２ｇ／Ｌ、キシロース４０．６ｇ／Ｌを含みｐＨ４．５であった。そして、所定時間毎に前記培地を採取し、グルコースとキシロースとの濃度をＨＰＬＣ（東ソー株式会社製、商品名：ＬＣ−８０２０）により、エタノールの濃度をＧＣ−ＦＩＤ（ジーエルサイエンス株式会社製、商品名：ＧＣ３９０Ｂ）により、それぞれ測定した。キシロース濃度とエタノール濃度との測定結果を図１Ｂに示す。
【００３３】
図１Ａ，１Ｂから、Meyerozyma guilliermondi Ｎ株ではキシロース濃度が殆ど変化せず、エタノール濃度も４０ｇ／Ｌを超えないのに対し、ＢＰ−０１９６２株では培養時間が長くなるほどキシロース濃度が低下し、エタノール濃度が４０ｇ／Ｌを超えることがわかる。
【００３４】
従って、ＢＰ−０１９６２株によれば、Ｎ株よりも優れたキシロース資化性及びエタノール発酵性能を備えていることが明らかである。
【００３５】
次に、２６質量％のアンモニア処理稲わら由来酵素糖化液を培地とし、該培地にＢＰ−０１９６２株の培養液を培地のＯＤ６００が２．０となるように添加し、３０℃の温度で１２０時間培養を行った。前記アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液は、グルコース７３．８ｇ／Ｌ、キシロース２８．３ｇ／Ｌを含みｐＨ５．８であった。そして、所定時間毎に前記培地を採取し、グルコースとキシロースとの濃度をＨＰＬＣ（東ソー株式会社製、商品名：ＬＣ−８０２０）により、エタノールの濃度をＧＣ−ＦＩＤ（ジーエルサイエンス株式会社製、商品名：ＧＣ３９０Ｂ）により、それぞれ測定した。結果を図２に示す。
【００３６】
図２から、培養開始から１２０時間後にはグルコース及びキシロースの全量が消化されており、エタノール濃度は培養時間が長くなるほど高くなることがわかる。また、培養開始から４８時間後にはグルコース濃度が殆どゼロになっているが、その後もキシロース濃度は低下し、エタノール濃度は増加を続けていることから、ＢＰ−０１９６２株はグルコースの全量が消化された後は、キシロースを基質としてエタノール発酵を行っていることが明らかである。
【００３７】
次に、希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液を用いて、ＢＰ−０１９６２株とＮ株との発酵収率を比較した。
【００３８】
前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液は、次のようにして得たものを用いた。まず、米国アイオワ州産のコーンストーバを２倍量の３．７質量％硫酸に１７０℃の温度で１０分間浸漬した後、常温に戻すことにより前処理する。次に、前記前処理が施されたコーンストーバにＮａＯＨ水溶液を添加してｐＨ４に調整後、糖化酵素（MeijiSeikaファルマ株式会社製、商品名：アクレモニウムセルラーゼ）を添加し５０℃の温度に７２時間保持して酵素糖化を行い、酵素糖化液を含むスラリーを得る。次に、前記スラリーを遠心分離により固液分離し、回収された液体分をＮａＯＨ水溶液でｐＨ６に調整し、前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液とした。前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液は、例えば、３〜１５質量％のグルコースと、１〜１０質量％のキシロースとを含んでいる。
【００３９】
次に、１５質量％の希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液を培地とし、該培地にＢＰ−０１９６２株の培養液を培地のＯＤ６００が０．５となるように添加し、３０℃の温度で１００時間培養を行った。前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液は、グルコース４５ｇ／Ｌ、キシロース３８ｇ／Ｌを含みｐＨ６であった。そして、前記培養後に前記培地を採取してエタノールの濃度をＧＣ−ＦＩＤ（ジーエルサイエンス株式会社製、商品名：ＧＣ３９０Ｂ）により測定し、次式（１）により発酵収率を算出した。結果を図３に示す。
【００４０】
発酵収率＝生成エタノール濃度/（グルコース濃度＋キシロース濃度）/０．５１１４  ・・・（１）
（グルコース濃度及びキシロース濃度は培養開始前の初期濃度である）
次に、２６質量％の希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液を培地とし、該培地にMeyerozyma guilliermondi Ｎ株の培養液を培地のＯＤ６００が０．５となるように添加し、３０℃の温度で１００時間培養を行った。前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液は、グルコース６４ｇ／Ｌ、キシロース４８ｇ／Ｌを含みｐＨ６であった。そして、前記培養後に前記培地を採取してエタノールの濃度をＧＣ−ＦＩＤ（ジーエルサイエンス株式会社製、商品名：ＧＣ３９０Ｂ）により測定し、式（１）により発酵収率を算出した。結果を図３に示す。
【００４１】
図３から、ＢＰ−０１９６２株は、Ｎ株よりも低濃度の前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液に対して、Ｎ株よりも優れたエタノール発酵性能を備えていることが明らかである。
【００４２】
次に、２０質量％の希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液を培地とし、該培地にＢＰ−０１９６２株とＮ株との培養液を培地のＯＤ６００が２．０となるようにそれぞれ添加し、３０℃の温度で１２０時間培養を行った。前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液は、グルコース５８．８ｇ／Ｌ、キシロース３３．８ｇ／Ｌを含みｐＨ６であった。そして、所定時間毎に前記培地を採取してエタノールの濃度をＧＣ−ＦＩＤ（ジーエルサイエンス株式会社製、商品名：ＧＣ３９０Ｂ）により測定した。結果を図４に示す。
【００４３】
図４から、ＢＰ−０１９６２株は、同濃度の前記希硫酸処理コーンストーバ由来酵素糖化液においても、Ｎ株より優れたエタノール発酵性能を備えていることが明らかである。
【００４４】
また、ＢＰ−０１９６２株は、実験室レベルの規模である１Ｌから、５０００Ｌに変更して発酵を行った場合でも、菌体増殖、グルコース資化、キシロース資化、エタノール産生量のいずれにおいてもほぼ同等の結果を得ることができた。従って、ＢＰ−０１９６２株は、工業生産的にも有用な菌株である。
【符号の説明】
【００４５】
符号なし。
【図１】
2016088274.tif 000003
【図２】
2016088274.tif 000004
【図３】
2016088274.tif 000005
【図４】
2016088274.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成28年9月29日(2016.9.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノールを産生する発酵菌であって、
Ｍｅｙｅｒｏｚｙｍａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ  Ｎ株を、アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液に変異剤を加えた培地で馴化培養して、該培地で生育する菌を選抜することにより、Ｍｅｙｅｒｏｚｙｍａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ  Ｎ株に比較してキシロース資化性及びエタノール発酵性能が向上している菌であり、
特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９６２として寄託されていることを特徴とする高効率エタノール発酵菌。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
ローストランスポーター活性のあるタンパク質を宿主としてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに導入している。すなわち外来遺伝子を導入することになる。また、特許文献２の発明もトランスポーター遺伝子は異なるものの、宿主に対して異なる種の遺伝子を導入する発明である。
［００１５］
また、非特許文献１に記載の技術は、キシロース資化遺伝子を導入するものであり、上記特許文献１及び２とは技術思想は異なるが、外来遺伝子を導入することに変わりない。
［００１６］
そのため、上記特許文献１及び２、非特許文献１に記載の発明は、いずれも国連で採択された「生物の多様性に関する条約のバイオセーフティに関するカルタヘナ議定書」を実施するために我が国において施行されているいわゆるカルタヘナ法に則した封じ込め策を講じる必要がある。従って、バイオセーフティを保証するための施設を必要とすることから、当該菌体を利用してエタノールを生産することはコストの面で不利である。
［００１７］
また、非特許文献２に記載の技術によって、ピキア属酵母を利用することは、野生型のピキア属酵母はキシロース利用性が低く、エタノール産生効率はさほど高くならない。
［００１８］
本発明は、外来遺伝子を導入することなく、エタノール産生効率の高い高効率エタノール発酵菌を得ることを課題とする。
課題を解決するための手段
［００１９］
前記課題を解決するために、本発明の高効率エタノール発酵菌は、五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノールを産生する発酵菌であって、Ｍｅｙｅｒｏｚｙｍａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ  Ｎ株を、アンモニア処理稲わら由来酵素糖化液に変異剤を加えた培地で馴化培養して、該培地で生育する菌を選抜することにより、Ｍｅｙｅｒｏｚｙｍａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ  Ｎ株に比較してキシロース資化性及びエタノール発酵性能が向上している菌であり、特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９６２として寄託されていることを特徴とする。
［００２０］
野生型Ｍｅｙｅｒｏｚｙｍａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉは、グルコース資化能に加えてキシロース資化能を備えているとはいうものの、バイオエタノール生産に十分なキシロース利用能を備えているわけではない。これに対して、本発明の高効率エタノール発酵菌（以下、ＢＰ−０１９６２株ということがある。）は、Ｍｅｙｅｒｏｚｙｍａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉ  Ｎ株を親株として菌株育種することによりキシロース
【国際調査報告】
2016088274.tif 000007
2016088274.tif 000008
2016088274.tif 000009
2016088274.tif 000010