【手続補正書】
【提出日】平成24年1月31日(2012.1.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
3つの別々の領域を含む融合タンパク質であって、その各領域が、タンパク質導入領域、細胞小器官局在化シグナル、及び成熟ミトコンドリア転写因子A (TFAM)ポリペプチドからなる群から独立に選択される、前記融合タンパク質。
【請求項２】
前記細胞小器官局在化シグナルが、核局在化シグナル、ミトコンドリア局在化シグナル、又は葉緑体局在化シグナルからなる群から選択される、請求項1記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記ミトコンドリア局在化シグナルが、スーパーオキシドジスムターゼのミトコンドリア局在化シグナルを含む、請求項20記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記タンパク質導入領域が、8〜15個の正荷電アミノ酸を含む、請求項1〜3のいずれか1項記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記成熟TFAMが、成熟ヒトTFAMである、請求項1〜4のいずれか1項記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記成熟TFAMが、配列番号210のアミノ酸56-259を含む、請求項1〜5のいずれか1項記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記成熟TFAMが、マウス、ラット、シロイヌナズナ、線虫、及びショウジョウバエからなる群から選択される種由来のものである、請求項1〜6のいずれか1項記載の融合タンパク質。
【請求項８】
対象の細胞におけるミトコンドリアのミトコンドリア機能を改変するための組成物であって、請求項1〜7のいずれか1項記載の融合タンパク質を含む、前記組成物。
【請求項９】
前記細胞が、癌細胞である、請求項8記載の組成物。
【請求項１０】
前記細胞が、脳細胞である、請求項8記載の組成物。
【請求項１１】
前記対象が、アルツハイマー病に罹患している、請求項9記載の組成物。
【請求項１２】
前記対象が、パーキンソン病に罹患している、請求項9記載の組成物。
【請求項１３】
前記対象が、神経変性脳状態、及び成人発症糖尿病からなる群から選択される年齢関連障害に罹患している、請求項8記載の組成物。
【請求項１４】
ポリヌクレオチド、及びミトコンドリアに送達するために該ポリヌクレオチドをパッケージするのに有効量の融合タンパク質をさらに含む、請求項8〜13のいずれか1項記載の組成物。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドが、前記ミトコンドリアゲノム全体をコードするミトコンドリアレプリコンである、請求項14記載の組成物。
【請求項１６】
ミトコンドリアDNAにおける遺伝的突然変異を代償するための組成物であって、
該遺伝的突然変異に対応する野生型ポリヌクレオチドに機能的にリンクされた発現要素を含むミトコンドリアレプリコン、及び、
該ミトコンドリアレプリコンをパッケージするのに有効量の請求項1〜6のいずれか1項記載の融合タンパク質を含み、
該遺伝的突然変異が、ヌル変異、欠失、逆位、置換、及び転位からなる群から選択される、前記組成物。
【請求項１７】
前記ミトコンドリアDNAにおける遺伝的突然変異がmtDNAのものであって、該mtDNA突然変異が、tRNAleu- A3243G、A3251G、A3303G、T3250C、T3271C、及びT3394C；tRNALys- A8344G、G11778A、G8363A、T8356C; ND1- G3460A；ND4- A10750G、G14459A；ND6-T14484A；12S rRNA-A1555G；MTTS2-C12258A；ATPアーゼ6-T8993G、T8993C；tRNASer(UCN)-T7511C；11778及び14484、LHON突然変異；並びにND2、ND3、ND5、チトクロムb、チトクロム酸化酵素I〜III、及びATPアーゼ8における突然変異又は欠失である、請求項16記載の組成物。
【請求項１８】
対象におけるミトコンドリア疾患の代償に使用するための組成物であって、
該ミトコンドリア疾患を代償するポリペプチドをコードする野生型ポリヌクレオチドに機能的にリンクされた発現要素を含むミトコンドリアレプリコン、及び、
該ミトコンドリアレプリコンをパッケージするのに有効量の請求項1〜6のいずれか1項記載の融合タンパク質を含み、
該ミトコンドリア疾患が以下からなる群から選択される、前記組成物：
複合体I欠損症；複合体IV欠損症；複合体V欠損症；チトクロムc酸化酵素 (COX)欠損症、 LHON (レーバー遺伝子視神経萎縮)；MM（ミトコンドリアミオパチー）；LIMM（致死性乳児性ミトコンドリアミオパチー）; MMC（母性ミオパチー及び心筋症）；NARP (神経原性筋力低下、運動失調症、及び網膜色素変性症)；ライ病；FICP（致死性乳児性心筋症プラス(Fatal Infantile Cardiomyopathy Plus)）、MELAS関連心筋症；MELAS (乳酸アシドーシス及び脳卒中様症状を伴うミトコンドリア脳筋症);LDYT（レーバー視神経萎縮及びジストニア）；MERRF（ミオクローヌスてんかん及び赤色ぼろ線維）；MHCM(母性遺伝性肥大型心筋症)；CPEO (慢性進行性外眼筋麻痺症候群)；KSS (キーンズ-セイアー症候群)；DM（真性糖尿病）；DMDF（真性糖尿病及び聴覚消失）; CIPO（ミオパチー及び眼筋麻痺を伴う慢性腸偽妨害（Chronic Intestinal Pseudoobstruction with myopathy and Ophthalmoplegia））；DEAF（母性遺伝性聴覚消失又はアミノグリコシド誘導性聴覚消失）；PEM（進行性脳症）；SNHL（感音難聴）；脳筋症；ミトコンドリア細胞症；拡張型心筋症；GER（胃腸逆流）；DEMCHO（認知症及び舞踏病）；AMDF（運動失調、ミオクローヌス）；運動不耐；ESOC（てんかん、脳卒中、視神経萎縮症、及び認知低下）；FBSN（家族性両側線条体壊死）；FSGS（巣状分節性糸球体硬化症）；LIMM（致死性乳児性ミトコンドリアミオパチー）;MDM（ミオパチー及び真性糖尿病）；MEPR（ミオクローヌスてんかん及び精神運動性退縮）；MERME（MERRF/MELAS重複疾患）；MHCM（母性遺伝性肥大型心筋症）；MICM（母性遺伝性心筋症）；MILS（母性遺伝性ライ症候群）；ミトコンドリア性脳心筋症（Mitochondrial Encephalocardiomyopathy）；多臓器性ミトコンドリア疾患（ミオパチー、脳症、失明、難聴、末梢性ニューロパチー）；NAION（非動脈炎性前側虚血性視神経症（Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy））；NIDDM（インスリン非依存性糖尿病）；PEM（進行性脳症）；PME（進行性ミオクローヌスてんかん）；MIDD（母性遺伝性糖尿病及び聴覚消失）；並びに、MODY（若年発症成人型糖尿病）、及びMNGIE（ミトコンドリア神経胃腸脳症）。
【請求項１９】
前記ミトコンドリアレプリコンが、前記ミトコンドリアゲノム全体をコードする、請求項16〜18のいずれか1項記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
特定なポリヌクレオチドを細胞小器官へ標的することを達成することは、該開示された組成物を、特定な細胞小器官標的シグナルを発現することにより改質し、達成することができる。これらの配列は、特定の細胞小器官を標的とするが、いくつかの実施態様において、標的シグナルの細胞小器官との相互作用は、従来の受容体：リガンド相互作用を介さず生じる。真核細胞は、様々な分離した膜結合コンパートメント、又は細胞小器官を含む。各細胞小器官の構造、及び機能は、大体は構成ポリペプチドのその独特の補体によって決定される。しかしながら、これらのポリペプチドの大部分は、細胞質でその合成が始まる。従って、細胞小器官生合成、及び維持管理には、新しく合成されたタンパク質を、その適切なコンパートメントへ標的できることが必要である。これは、多くの場合、アミノ末端シグナル配列と同様に、翻訳後修飾、及び二次構造により達成される。ミトコンドリアに関して、いくつかのアミノ末端標的シグナルが推定されてきており、ミトコンドリア局在化シグナルを有する遺伝子及びタンパク質を部分的に表１に含める。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
別の実施態様は、真核細胞の細胞小器官などの、細胞の細胞小器官をトランスフェクトする方法を提供する。該細胞を、ポリヌクレオチド結合ポリペプチドをポリヌクレオチドと組合せて含む複合体で接触させることによる。ここで、該ポリヌクレオチド結合ポリペプチドは、PTD、及び任意に標的シグナル、又は領域を含む。該標的シグナルはポリペプチドで、改質、又は未改質され、該複合体の表面に提示され得る。それにより、該複合体が、該標的細胞、又は細胞小器官と特異的に会合できる。典型的な標的シグナルは、核局在化シグナル、表１に示されたタンパク質及び遺伝子の標的シグナルなどのミトコンドリア標的シグナル、及び他の正味正の電荷を有するシグナルを含む。細胞を該複合体で接触させることは、ある意味では、該複合体、又は該ポリヌクレオチドを該細胞の細胞質に導入することである。さらに、該複合体は、その特異的な標的細胞小器官、又は該細胞の細胞内領域と会合し、該ポリヌクレオチドを該細胞小器官に導入することができる。該ポリヌクレオチドの該細胞小器官への導入は、該複合体の表面で発現するタンパク質導入領域を介して、該ポリヌクレオチドを細胞小器官膜を越えて導入することで達成できる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
また別の実施態様は、非核性細胞小器官のゲノムを改質する方法を提供する。この方法は、細胞を、酵素ポリペプチドで接触することを含み、該酵素ポリペプチドはPTD、及び該酵素ポリペプチドに機能的にリンクされた標的シグナルを含む。該酵素ポリペプチドは、ヌクレアーゼ、又は該非核性細胞小器官のゲノムにある制限酵素切断部位に特異的な制限酵素であり得る。代わりとして、該酵素ポリペプチドは、異種の核酸にあるが該非核性細胞小器官に内在性の核酸にない、部位で核酸を切断することができる。酵素ポリペプチドを単独で、又はポリヌクレオチドと組合せて送達することができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
細胞小器官局在化シグナルは、当業者に知られており、任意のこれらのシグナルを用いて、該複合体が該標的細胞小器官を標的とすることができる。本開示における使用に適した局在化配列は、下記に記載されている。Emanuelsonらの論文「そのN末端アミノ酸配列に基づく、タンパク質の細胞内局在の予測」Journal of Molecular Biology. 300(4):1005-16, 2000 Jul 21、及びCline、及びHenryの論文、「核にコードされた葉緑体タンパク質の輸入、及び経路」Annual Review of Cell & Developmental Biology. 12:1-26, 1996であり、その開示は、その全体が、引用により本明細書に取り込まれるものとする。より具体的に、リンクされたタンパク質、又は核酸に、ミトコンドリアを標的とさせる、ミトコンドリア局在シグナルを有するタンパク質及び遺伝子を表１に示す。リンクされたタンパク質、又は核酸に、葉緑体を標的とさせる、葉緑体局在シグナルを有するポリペプチドをコードするタンパク質及び核酸を表２に示す。一実施態様において、該ミトコンドリア、又は葉緑体局在化シグナルを、ウイルス表面タンパク質に機能的にリンクする。当然のことながら、表１、及び２に示された配列の一部、または全体を、細胞小器官標的シグナルとして用いることができる。 
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４７】
【数２】
2011137001.tif 000001
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４８】
【数３】
2011137001.tif 000002
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４９】
【数４】
2011137001.tif 000003
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５０】
【数５】
2011137001.tif 000004
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５１】
【表３】
2011137001.tif 000005