(57)【要約】  がんの予防および／または治療剤として有用な、腫瘍抗原ペプチド等を提供する。  配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号１１のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド、前記ペプチドの少なくとも一つをエピトープペプチドの一つとして含む、複数のエピトープペプチドを連結したポリエピトープペプチド、前記ペプチドもしくはポリエピトープペプチドの少なくともひとつをコードするポリヌクレオチド、およびこれらを有効成分として含有する医薬組成物、ＣＴＬを誘導することを特徴とする、がんの予防および／または治療剤等。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号１１のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号１１のいずれかで表されるアミノ酸配列において、
（１）Ｃ末端のアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したアミノ酸配列、および／または、
（２）Ｎ末端および／またはＣ末端に１個から数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列
からなるペプチド。
【請求項３】
配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号１１のいずれかで表されるアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸をロイシン、バリンまたはイソロイシンに置換したアミノ酸配列からなる、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号１１のいずれかで表されるアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に１アミノ酸付加されたアミノ酸配列からなる、請求項２に記載のペプチド。
【請求項５】
複数のエピトープペプチドを連結したポリエピトープペプチドであって、該エピトープペプチドとして、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドを少なくとも１つ含む、前記ポリエピトープペプチド。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項５に記載のポリエピトープペプチドを有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項７】
アジュバントを含んでなる、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項５に記載のポリエピトープペプチドを有効成分として含有するがんの予防および／または治療用ワクチン。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項５に記載のポリエピトープペプチドを有効成分として含有するがんの予防および／または治療剤。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項５に記載のポリエピトープペプチドを有効成分として含有する、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の誘導剤。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項５に記載のポリエピトープペプチドの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載の発現ベクターを含んでなる、遺伝子導入用組成物。
【請求項１４】
以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）請求項１１に記載のポリヌクレオチド、
（ｂ）請求項１２に記載の発現ベクター
のいずれかを有効成分として含有する、がんの治療または予防のための医薬組成物。
【請求項１５】
以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項５に記載のポリエピトープペプチド、
（ｂ）上記（ａ）記載のペプチドの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチド、
と、抗原提示能を有する細胞とを、in vitroで接触させることを含む、抗原提示細胞の製造方法。
【請求項１６】
以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドまたは請求項５に記載のポリエピトープペプチド、
（ｂ）上記（ａ）記載のペプチドの少なくとも一つをコードするポリヌクレオチド、
のいずれかと、末梢血リンパ球とをin vitroで接触させることを含む、ＣＴＬの誘導方法。
【請求項１７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドとＨＬＡとを含有するＨＬＡマルチマー。
【請求項１８】
請求項１７に記載のＨＬＡマルチマーを含有する診断薬。
【請求項１９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドとＨＬＡとの複合体を認識するＴＣＲ様抗体。
【請求項２０】
請求項１９に記載のＴＣＲ様抗体を含有する腫瘍検出剤。
【請求項２１】
請求項６、７または１４に記載の医薬組成物を有効に適用できる患者を選択するための診断薬であって、請求項１７に記載のＨＬＡマルチマーまたは請求項１９に記載のＴＣＲ様抗体を含む、前記診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんの予防および／または治療剤として有用な、ＯＲ７Ｃ１由来の腫瘍抗原ペプチド等に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体による腫瘍細胞やウイルス感染細胞等の排除には細胞性免疫、とりわけ細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬと称する）が重要な働きをしている。腫瘍細胞の排除の場合、ＣＴＬは、腫瘍細胞上の抗原ペプチド（腫瘍抗原ペプチド）とＭＨＣ（Major Histocompatibility Complex）クラスＩ抗原（ヒトの場合はＨＬＡクラスＩ抗原と称する）との複合体を認識し、腫瘍細胞を攻撃・破壊する。すなわち、腫瘍抗原ペプチドは、腫瘍に特有のタンパク質、すなわち腫瘍抗原タンパク質が細胞内で合成された後、プロテアーゼにより細胞内で分解されることによって生成される。生成された腫瘍抗原ペプチドは、小胞体内でＭＨＣクラスＩ抗原（ＨＬＡクラスＩ抗原）と結合して複合体を形成し、細胞表面に運ばれて抗原提示される。この抗原提示に係る複合体を腫瘍特異的なＣＴＬが認識し、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗腫瘍効果を示す。このような一連の作用の解明に伴い、腫瘍抗原タンパク質または腫瘍抗原ペプチドをいわゆるがん免疫療法剤（がんワクチン）として利用することにより、がん患者の体内のがん特異的ＣＴＬを増強させる治療法が開発されつつある。【０００３】
ＯＲ７Ｃ１（嗅覚受容体ファミリー７、サブファミリーＣ、メンバー１（Olfactory receptor, family 7, subfamily C, member 1）)は、嗅覚受容体ファミリーに属するＧタンパク質共役受容体（G-protein-coupled receptors；GPCR）である。ＯＲ７Ｃ１は、ヒト大腸癌細胞株であるＳＷ４８０細胞、ＨＣＴ１５細胞およびＨＴ２９細胞、ヒト肺癌細胞株であるＬＨＫ２細胞のＳＰ（Side Population）細胞に発現する遺伝子であることが明らかにされている（特許文献１）。ＳＰ細胞はがん幹細胞を多く含む画分であると考えられており、高い造腫瘍能を有することが報告されている。
がん幹細胞は、がんの再発や転移の主要な原因と考えられており、がん治療においてがん幹細胞を標的とし、その増殖、遊走を抑制することの重要性が近年指摘されている。実際に、ＳＷ４８０細胞にＯＲ７Ｃ１に対するｓｉＲＮＡをトランスフェクトすると、ＳＰ細胞分画の比率および造腫瘍能が著しく減少することから、ＯＲ７Ｃ１はがん幹細胞の機能に必須の役割を担っていると考えられている。
更に、ＯＲ７Ｃ１は、正常組織では精巣のみに発現することから、「がん精巣抗原」として分類される。がん精巣抗原はがんワクチンの有望な標的分子として広く認識されている。【０００４】
また、ＯＲ７Ｃ１はがんワクチンの有望な標的分子であり、実際に、ＯＲ７Ｃ１由来の部分ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２４結合性腫瘍抗原ペプチドとして報告されている（特許文献１）。
ところで、上述したように、腫瘍免疫に係るＣＴＬは、腫瘍細胞上の腫瘍抗原ペプチドとＨＬＡクラスＩ抗原との複合体を認識し、腫瘍細胞を攻撃・破壊する。一般に、腫瘍抗原ペプチドのＨＬＡ−Ａ０２拘束性またはＨＬＡ−Ａ２４拘束性はそれぞれ独立したものであり、欧米人および日本人に多いＨＬＡ−Ａ０２およびＨＬＡ−Ａ２４は異なる抗原特異性を示すことが知られている。ＯＲ７Ｃ１についても、ＨＬＡ−Ａ２４に結合可能なＯＲ７Ｃ１由来腫瘍抗原ペプチドは知られているものの（特許文献１）、ＨＬＡ−Ａ０２に結合可能、またはＨＬＡ−Ａ０２およびＨＬＡ−Ａ２４の両方に結合可能なＯＲ７Ｃ１由来腫瘍抗原ペプチドは、未だ見出されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０５０１９０号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ＨＬＡ−Ａ０２およびＨＬＡ−Ａ２４の両方と結合可能な、ＯＲ７Ｃ１由来の腫瘍抗原ペプチド、およびこれを有効成分として含有するがんの予防および／または治療に有用な医薬組成物等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、Genbank Accession No. NP_945182として登録されているＯＲ７Ｃ１（Olfactory receptor, family 7, subfamily C, member 1）（配列番号２）の部分ペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ０２およびＨＬＡ−Ａ２４の両方に結合可能な腫瘍抗原ペプチドを見出した。
また本発明者らは、当該腫瘍抗原ペプチドが、in vivoまたはin vitroにおいてがん特異的ＣＴＬの誘導剤、すなわちがんワクチンとして用いることができることも明らかにした。当該腫瘍抗原ペプチドは、大腸癌、肺癌、卵巣癌等のがん（腫瘍）疾患の予防および／または治療剤として有用である。また、当該腫瘍抗原ペプチドは、大腸癌、肺癌、卵巣癌等のがん（腫瘍）に対する腫瘍マーカーとしても有用である。【０００８】
すなわち本発明は下記に掲げるものである：
〔１〕配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号１１のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
〔２〕配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号１１のいずれかで表されるアミノ酸配列において、
（１）Ｃ末端のアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したアミノ酸配列、または、
（２）Ｎ末端および／またはＣ末端に１個から数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列
からなるペプチド；
〔３〕配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号１１のいずれかで表されるアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸をロイシン、バリンまたはイソロイシンに置換したアミノ酸配列からなる、〔２〕のペプチド；
〔４〕配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号１１のいずれかで表されるアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に１アミノ酸付加されたアミノ酸配列からなる、〔２〕のペプチド；【０００９】
〔５〕複数のエピトープペプチドを連結したポリエピトープペプチドであって、該エピトープペプチドとして、〔１〕〜〔４〕のペプチドを少なくとも１つ含む、前記ポリエピトープペプチド；
〔６〕〔１〕〜〔４〕のペプチドまたは〔５〕のポリエピトープペプチドを有効成分として含有する医薬組成物；
〔７〕アジュバントを含んでなる、〔６〕の医薬組成物；
〔８〕〔１〕〜〔４〕のペプチドまたは〔５〕のポリエピトープペプチドを有効成分として含有するがんの予防および／または治療用ワクチン；
〔９〕〔１〕〜〔４〕のペプチドまたは〔５〕のポリエピトープペプチドを有効成分として含有するがんの予防および／または治療剤；
〔１０〕〔１〕〜〔４〕のペプチドまたは〔５〕のポリエピトープペプチドを有効成分として含有する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の誘導剤；【００１０】
〔１１〕〔１〕〜〔４〕のペプチドまたは〔５〕のポリエピトープペプチドの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチド；
〔１２〕〔１１〕のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター；
〔１３〕〔１２〕の発現ベクターを含んでなる、遺伝子導入用組成物；
〔１４〕以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）〔１１〕のポリヌクレオチド、
（ｂ）〔１２〕の発現ベクター
のいずれかを有効成分として含有する、がんの治療または予防のための医薬組成物。
〔１５〕以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）〔１〕〜〔４〕のペプチドまたは〔５〕のポリエピトープペプチド、
（ｂ）上記（ａ）記載のペプチドの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチド、
と、抗原提示能を有する細胞とを、in vitroで接触させることを含む、抗原提示細胞の製造方法；【００１１】
〔１６〕以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）〔１〕〜〔４〕のペプチドまたは〔５〕のポリエピトープペプチド、
（ｂ）上記（ａ）記載のペプチドの少なくとも一つをコードするポリヌクレオチド、
のいずれかと、末梢血リンパ球とをin vitroで接触させることを含む、ＣＴＬの誘導方法；
〔１７〕〔１〕〜〔４〕のペプチドとＨＬＡとを含有するＨＬＡマルチマー；
〔１８〕〔１７〕のＨＬＡマルチマーを含有する診断薬；および
〔１９〕〔１〕〜〔４〕のペプチドとＨＬＡとの複合体を認識するＴＣＲ様抗体。
〔２０〕〔１９〕のＴＣＲ様抗体を含有する腫瘍検出剤。
〔２１〕〔６〕、〔７〕または〔１４〕の医薬組成物を有効に適用できる患者を選択するための診断薬であって、〔１７〕のＨＬＡマルチマーまたは〔１９〕のＴＣＲ様抗体を含む、前記診断薬。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、ＣＴＬの誘導剤として有用な腫瘍抗原ペプチド、およびこれを有効成分として含有するがんの予防および／または治療に有用な医薬組成物等が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】配列番号３で表されるペプチドの、インターフェロンγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによるin vitroでのＣＴＬ誘導能力の評価結果を示す図である。縦軸は播種細胞５００，０００個あたりのスポット数を表す。ＡはＨＬＡ−Ａ＊０２：０１遺伝子導入マウス、ＢはＨＬＡ−Ａ＊２４：０２遺伝子導入マウスを利用した試験の結果をそれぞれ示す。また、黒棒（「w/ Peptide」）および白棒（「w/o Peptide」）は、それぞれ、ペプチド投与マウス由来の脾細胞を投与ペプチドの存在下および非存在下で再刺激培養した結果を示す。即ち、黒棒と白棒の値の差は、各ペプチドの投与によってマウス生体内で誘導されたペプチド特異的ＣＴＬの数を示す。
【００１４】
【図２】配列番号４で表されるペプチドの、インターフェロンγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによるin vitroでのＣＴＬ誘導能力の評価結果を示す図である。縦軸は播種細胞５００，０００個あたりのスポット数を表す。ＡはＨＬＡ−Ａ＊０２：０１遺伝子導入マウス、ＢはＨＬＡ−Ａ＊２４：０２遺伝子導入マウスを利用した試験の結果をそれぞれ示す。また、黒棒（「w/ Peptide」）および白棒（「w/o Peptide」）は、それぞれ、ペプチド投与マウス由来の脾細胞を投与ペプチドの存在下および非存在下で再刺激培養した結果を示す。即ち、黒棒と白棒の値の差は、各ペプチドの投与によってマウス生体内で誘導されたペプチド特異的ＣＴＬの数を示す。
【００１５】
【図３】配列番号５で表されるペプチドの、インターフェロンγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによるin vitroでのＣＴＬ誘導能力の評価結果を示す図である。縦軸は播種細胞５００，０００個あたりのスポット数を表す。ＡはＨＬＡ−Ａ＊０２：０１遺伝子導入マウス、ＢはＨＬＡ−Ａ＊２４：０２遺伝子導入マウスを利用した試験の結果をそれぞれ示す。また、黒棒（「w/ Peptide」）および白棒（「w/o Peptide」）は、それぞれ、ペプチド投与マウス由来の脾細胞を投与ペプチドの存在下および非存在下で再刺激培養した結果を示す。即ち、黒棒と白棒の値の差は、各ペプチドの投与によってマウス生体内で誘導されたペプチド特異的ＣＴＬの数を示す。
【図４】配列番号６で表されるペプチドの、インターフェロンγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによるin vitroでのＣＴＬ誘導能力の評価結果を示す図である。縦軸は播種細胞５００，０００個あたりのスポット数を表す。ＡはＨＬＡ−Ａ＊０２：０１遺伝子導入マウス、ＢはＨＬＡ−Ａ＊２４：０２遺伝子導入マウスを利用した試験の結果をそれぞれ示す。また、黒棒（「w/ Peptide」）および白棒（「w/o Peptide」）は、それぞれ、ペプチド投与マウス由来の脾細胞を投与ペプチドの存在下および非存在下で再刺激培養した結果を示す。即ち、黒棒と白棒の値の差は、各ペプチドの投与によってマウス生体内で誘導されたペプチド特異的ＣＴＬの数を示す。
【００１６】
【図５】配列番号３で表されるペプチドの、ヒト末梢血単核細胞を用いたＣＴＬ誘導能の評価結果を示す図である。ＡはＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性健常人由来末梢血単核細胞、ＢはＨＬＡ−Ａ＊２４：０２陽性健常人由来末梢血単核細胞を利用した試験の結果をそれぞれ示す。黒棒および白棒は再刺激および非再刺激の結果を示す。即ち、黒棒と白棒の値の差が、ペプチドの刺激培養によって誘導されたペプチド特異的ＣＴＬの数を示す。縦軸は各ウェルで認められたスポット数を、横軸は陽性の各ウェルを示す。また、黒棒はペプチド刺激条件下で検出されたスポットの数を、白棒はペプチド非パルス条件下で検出されたスポット（コントロール）の数を示す。
【図６】配列番号５で表されるペプチドの、ヒト末梢血単核細胞を用いたＣＴＬ誘導能の評価結果を示す図である。ＡはＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性健常人由来末梢血単核細胞、ＢはＨＬＡ−Ａ＊２４：０２陽性健常人由来末梢血単核細胞を利用した試験の結果をそれぞれ示す。黒棒および白棒は再刺激および非再刺激の結果を示す。即ち、黒棒と白棒の値の差が、ペプチドの刺激培養によって誘導されたペプチド特異的ＣＴＬの数を示す。縦軸は各ウェルで認められたスポット数を、横軸は陽性の各ウェルを示す。また、黒棒はペプチド刺激条件下で検出されたスポットの数を、白棒はペプチド非パルス条件下で検出されたスポット（コントロール）の数を示す。
【００１７】
【図７】配列番号６で表されるペプチドの、ヒト末梢血単核細胞を用いたＣＴＬ誘導能の評価結果を示す図である。ＡはＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性健常人由来末梢血単核細胞、ＢはＨＬＡ−Ａ＊２４：０２陽性健常人由来末梢血単核細胞を利用した試験の結果をそれぞれ示す。黒棒および白棒は再刺激および非再刺激の結果を示す。即ち、黒棒と白棒の値の差が、ペプチドの刺激培養によって誘導されたペプチド特異的ＣＴＬの数を示す。縦軸は各ウェルで認められたスポット数を、横軸は陽性の各ウェルを示す。また、黒棒はペプチド刺激条件下で検出されたスポットの数を、白棒はペプチド非パルス条件下で検出されたスポット（コントロール）の数を示す。
【００１８】
【図８】配列番号１１で表されるペプチドの、インターフェロンγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによるin vitroでのＣＴＬ誘導能力の評価結果を示す図である。縦軸は播種細胞５００，０００個あたりのスポット数を表す。ＡはＨＬＡ−Ａ＊０２：０１遺伝子導入マウス、ＢはＨＬＡ−Ａ＊２４：０２遺伝子導入マウスを利用した試験の結果をそれぞれ示す。また、黒棒（「w/ Peptide」）および白棒（「w/o Peptide」）は、それぞれ、ペプチド投与マウス由来の脾細胞を投与ペプチドの存在下および非存在下で再刺激培養した結果を示す。即ち、黒棒と白棒の値の差は、各ペプチドの投与によってマウス生体内で誘導されたペプチド特異的ＣＴＬの数を示す。
【００１９】
【図９】配列番号１１で表されるペプチドの、ヒト末梢血単核細胞を用いたＣＴＬ誘導能の評価結果を示す図である。ＡはＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性健常人由来末梢血単核細胞、ＢはＨＬＡ−Ａ＊２４：０２陽性健常人由来末梢血単核細胞を利用した試験の結果をそれぞれ示す。黒棒および白棒は再刺激および非再刺激の結果を示す。即ち、黒棒と白棒の値の差が、ペプチドの刺激培養によって誘導されたペプチド特異的ＣＴＬの数を示す。縦軸は各ウェルで認められたスポット数を、横軸は陽性の各ウェルを示す。また、黒棒はペプチド刺激条件下で検出されたスポットの数を、白棒はペプチド非パルス条件下で検出されたスポット（コントロール）の数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（１）本発明のペプチド
本発明において「エピトープペプチド」とは、ＭＨＣ（ヒトにおいてはＨＬＡ）と結合して、細胞表面に抗原提示されるペプチドを意味する。エピトープペプチドには、ＭＨＣクラスＩと結合して抗原提示され、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に認識されるエピトープペプチドであるＣＴＬエピトープペプチド、およびＭＨＣクラスＩＩと結合して抗原提示され、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に認識されるエピトープペプチドであるヘルパーエピトープペプチドが含まれる。
エピトープペプチドのうち、腫瘍細胞において特異的にあるいは過剰に発現しているタンパク質由来のペプチドを、特に腫瘍抗原ペプチドという。抗原提示とは、細胞内に存在するペプチドがＭＨＣと結合し、このＭＨＣ／抗原ペプチド複合体が細胞表面に局在化する現象をいう。上述のとおり、細胞表面に提示された抗原はＴ細胞などにより認識された後、細胞性免疫や液性免疫を活性化することが知られており、ＭＨＣクラスＩに提示された抗原は、細胞性免疫を活性化するとともに、ナイーブＴ細胞のＴ細胞受容体に認識され、ナイーブＴ細胞を、細胞傷害活性を有するＣＴＬへと誘導するため、免疫療法に用いられる腫瘍抗原ペプチドとしては、ＭＨＣクラスＩと結合し、抗原提示されるペプチドが好ましい。
【００２１】
本発明において、「腫瘍（tumor）」は、良性腫瘍および悪性腫瘍（がん、悪性新生物）を含む。がん（cancer）は、造血器の腫瘍、上皮性の悪性腫瘍(癌、carcinoma）と非上皮性の悪性腫瘍(肉腫、sarcoma）とを含む。
本発明のペプチドは、一態様において、配列番号２に記載のヒトＯＲ７Ｃ１の部分ペプチドであって、ＭＨＣ、特にＨＬＡと結合するペプチド、好ましくはＭＨＣ、特にＨＬＡにより抗原提示されるペプチド、さらに好ましくはＭＨＣ、特にＨＬＡにより抗原提示されてＣＴＬを誘導可能なペプチドを含む。ＨＬＡにはいくつかの型が存在するが、本発明のペプチドは、好ましくはＨＬＡクラスＩに結合可能であり、より好ましくはＨＬＡ−Ａ０２に結合可能であり、さらに好ましくはＨＬＡ−Ａ０２およびＨＬＡ−Ａ２４の両方に結合可能である。本発明のペプチドは、ＭＨＣに結合する前にプロセシングなどの処理を経てもよく、それらの処理の結果エピトープペプチドを生成するようなペプチドも本発明のペプチドに含まれる。したがって、本発明のペプチドは、エピトープペプチドのアミノ酸配列を含む配列であれば、アミノ酸長は特に限定されない。しかしながら、本発明のペプチドそのものがエピトープペプチドであることが好ましく、したがってアミノ酸長は約９〜約１１アミノ酸程度が好ましい。
【００２２】
本発明のペプチドは、好ましい一態様において、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６に記載のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなるペプチドを含み、より好ましくはこれらのアミノ酸配列はいずれも上記ＯＲ７Ｃ１の部分ペプチドである。さらに好ましくは、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６に記載のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなるペプチドである。配列番号３〜６で表されるペプチドはそれぞれ、上記ＯＲ７Ｃ１のアミノ酸位置１１７〜１２６の１０アミノ酸、２７６〜２８５の１０アミノ酸、１１８〜１２６の９アミノ酸、３４〜４４の１１アミノ酸からなるペプチドであり、いずれのペプチドも、ＨＬＡ−Ａ０２およびＨＬＡ−Ａ２４の両方と結合可能であることが本発明者らにより見出されたものである。
【００２３】
本発明のペプチドは、そのＮ末端および／またはＣ末端が修飾されていてもよい。当該修飾として具体的には、Ｎ−アルカノイル化（例えば、アセチル化）、Ｎ−アルキル化（例えば、メチル化）、Ｃ末端アルキルエステル（例えば、エチルエステル）、およびＣ末端アミド（例えばカルボキサミド）等が挙げられる。
本発明の別の一態様において、本発明のペプチドには、ＭＨＣ、特にＨＬＡと結合するＯＲ７Ｃ１の部分ペプチドであるアミノ酸配列において、Ｎ末端および／またはＣ末端に１から数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるペプチドが含まれる。特に好ましい態様は、上記配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端および／またはＣ末端に１から数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである。Ｎ末端および／またはＣ末端に付加される「１から数個のアミノ酸」は、具体的には１〜５個のアミノ酸を意味し、例えば１個、２個、３個、４個あるいは５個のアミノ酸が挙げられ、特に好ましいのは１個である。
【００２４】
また、本発明の別の一態様において、本発明のペプチドには、ＭＨＣ、特にＨＬＡと結合するＯＲ７Ｃ１の部分ペプチドであるアミノ酸配列において、Ｃ末端のアミノ酸、Ｎ末端のアミノ酸、および／または第２番目のアミノ酸、好ましくはＣ末端のアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したアミノ酸配列からなるペプチドも含まれる。特に好ましい態様は、上記配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６で表されるアミノ酸配列において、Ｃ末端のアミノ酸および／または第２番目のアミノ酸、好ましくはＣ末端のアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したアミノ酸配列からなるペプチドである。本発明において「疎水性アミノ酸」は、分子内極性を有さないアミノ酸を意味し、中でも好ましくは天然アミノ酸であるグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニンおよびトリプトファンを意味する。本発明においては、これらの疎水性アミノ酸の中でも特にロイシン、バリンおよびイソロイシンが好ましい。したがって当該態様における好ましいペプチドには、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、バリンまたはイソロイシンに置換されたもの、例えば配列番号３のペプチドにおいて、Ｃ末端のバリンをイソロイシンに置き換えたペプチド（配列番号１１）などが含まれる。なお、配列番号１１のアミノ酸配列は、ヒトＯＲ７Ｃ１遺伝子（Genbank Accession No. NM_198944、配列番号１）の塩基配列において３７６番目のグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に置換された一塩基多型変異体のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド（すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１２６位のバリン（Ｖ）がイソロイシン（Ｉ）に置換された変異体）におけるアミノ酸位置１１７〜１２６の部分ペプチドのアミノ酸配列と一致する。
【００２５】
当業者は、上記のＮ末端および／またはＣ末端に１から数個のアミノ酸を付加する改変と、Ｃ末端のアミノ酸、Ｎ末端のアミノ酸および／または第２番目のアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換する改変とを組み合わせることができることを理解する。したがって、本発明のペプチドには、ＭＨＣ、特にＨＬＡと結合するＯＲ７Ｃ１の部分ペプチドであるアミノ酸配列において、Ｃ末端のアミノ酸、Ｎ末端のアミノ酸、および／または第２番目のアミノ酸、好ましくはＣ末端のアミノ酸を、疎水性アミノ酸に置換したアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に１から数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるペプチドが含まれる。中でも好ましいのは、配列番号１１で表されるペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に１個、２個、３個、４個あるいは５個のアミノ酸、特に好ましくは１個のアミノ酸が付加されたペプチドである。
【００２６】
本発明のペプチドの合成については、通常のペプチド化学において用いられる既知の方法に準じて行うことができる。かかる既知の方法としては文献（Peptide Synthesis，Interscience，New York，1966； The Proteins，Vol 2，Academic Press Inc.，New York，1976；ペプチド合成，丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発 続 第１４巻・ペプチド合成，広川書店，1991、これらの文献は引用により本願の一部を構成する）などに記載されている方法が挙げられる。
【００２７】
本発明のペプチドは、後述するＣＴＬ誘導方法や、ヒトモデル動物を用いたアッセイ（ＷＯ０２／４７４７４号公報、Int J. Cancer:100,565-570 (2002)）等に供することにより、in vivoでの活性を確認することができる。
【００２８】
本発明のペプチドには、さらに、前記本発明のペプチドを少なくとも１つ含む複数のエピトープペプチドを連結したペプチド（ポリエピトープペプチド）も含まれる。したがって、該ポリエピトープペプチドであって、ＣＴＬ誘導活性を有するペプチドも、本発明のペプチドの具体例として例示することができる。
本発明のポリエピトープペプチドは、具体的には、
（ｉ）本発明のペプチド（エピトープペプチド）および任意の本発明のペプチド以外の１または２以上のＣＴＬエピトープペプチドを直接、または適宜スペーサーを介して連結したペプチド、
（ｉｉ）本発明のペプチドおよび任意の１または２以上のヘルパーエピトープペプチドを直接、または適宜スペーサーを介して連結したペプチド、若しくは、
（ｉｉｉ）上記（ｉ）に記載のポリエピトープペプチドに、さらに１または２以上ヘルパーエピトープペプチドを、直接、または適宜スペーサーを介して連結したペプチド
であって、抗原提示細胞内にてプロセッシングを受け、生じたエピトープペプチドが抗原提示細胞に提示され、ＣＴＬ誘導活性を導くペプチドとして定義され得る。
【００２９】
ここで、（ｉ）における本発明のペプチド以外のＣＴＬエピトープペプチドとしては特に限定はないが、具体的には、ＯＲ７Ｃ１由来のペプチド（例えば、国際公開パンフレット：ＷＯ２０１０／０５０１９０に記載されたペプチド）が挙げられる。
スペーサーとしては、抗原提示細胞内におけるプロセッシングに悪影響を及ぼさないものであれば特に限定されず、好ましくはそれぞれのエピトープペプチドとペプチド結合で連結されるリンカーであり、例えばいくつかのアミノ酸が連結したペプチドリンカーや、両端にアミノ基およびカルボキシル基を有するリンカーなどが挙げられる。具体的にはグリシンリンカーやＰＥＧ（ポリエチレングリコール）リンカーなどが挙げられ、グリシンリンカーとしてはポリグリシン（例えばグリシン６個からなるペプチド；Cancer Sci, vol.103, p150-153）が挙げられ、ＰＥＧリンカーとしては、ＰＥＧの両端にアミノ基およびカルボキシ基を有する化合物由来のリンカーが挙げられる（例えば、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−ＣＯＯＨ；Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 7551-7556）。
【００３０】
本発明のポリエピトープペプチドに含まれる本発明のエピトープペプチドは、１種または２種以上が選択されてよい。すなわち、同一のエピトープペプチドが複数個連結されていてもよいし、複数の異なるエピトープペプチドが連結されたものであってもよい。当然ながら、２種以上のエピトープペプチドが選択される場合であっても、選択されたエピトープペプチドのうちの１種または２種以上が複数個連結されてもよい。本発明のペプチド以外のエピトープペプチドについても、同様に複数種および／または複数個のエピトープペプチドが連結されてよい。本発明のポリエピトープペプチドは、２〜１２個のエピトープペプチドが連結されたものであってよく、好ましくは２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個のエピトープペプチドが連結されており、最も好ましくは２個のエピトープペプチドが連結されている。
ここで、本発明のペプチドに連結させるエピトープペプチドがヘルパーエピトープペプチドの場合、用いられるヘルパーエピトープペプチドとしては、例えばＢ型肝炎ウイルス由来のＨＢＶｃ１２８−１４０や破傷風毒素由来のＴＴ９４７−９６７などが挙げられる。また当該ヘルパーエピトープペプチドの長さとしては、１３〜３０アミノ酸程度、好ましくは１３〜１７アミノ酸程度を挙げることができる。
【００３１】
このような複数のエピトープペプチドを連結させたペプチド（ポリエピトープペプチド）もまた、前述のように一般的なペプチド合成法によって製造することができる。またこれら複数のエピトープペプチドを連結させたポリエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列情報に基づいて、通常のＤＮＡ合成および遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。
すなわち、当該ポリヌクレオチドを周知の発現ベクターに挿入し、得られた組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して作製された形質転換体を培養し、培養物より目的の複数のエピトープを連結させたポリエピトープペプチドを回収することにより製造することができる。これらの手法は、前述のように文献（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory(1983)、DNA Cloning, DM.Glover, IRL PRESS(1985)）に記載の方法などに準じて行うことができる。
【００３２】
以上のようにして製造された複数のエピトープペプチドを連結させたポリエピトープペプチドを、前述のin vitroアッセイや、ＷＯ０２／４７４７４号公報およびInt J. Cancer:100,565-570 (2002)（これらの文献は引用により本願の一部を構成する）に記述のヒトモデル動物を用いたin vivoアッセイに供すること等によりＣＴＬ誘導活性を確認することができる。
本発明のペプチド（ポリエピトープペプチドを含む）は、本明細書に記載のとおり、がんの予防および／または治療などに有用であり、医薬組成物の有効成分とすることができる。また、本発明のペプチドは、がんの予防および／または治療のためのものであってもよい。さらに、本発明は、がんの予防および／または治療のための医薬の製造への本発明のペプチドの使用にも関する。
【００３３】
（２）本発明のポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、前記本発明のペプチドを少なくとも１つコードするポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡやｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、または合成ＤＮＡのいずれであってもよい。また１本鎖、２本鎖のいずれの形態であってもよい。具体的には、例えば配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号１１に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、および配列番号３、４、５、６および１１から選択される任意の２以上のペプチド、または配列番号３、４、５、６および１１から選択されるペプチドおよびヘルパーエピトープを連結させたポリエピトープペプチドを、それぞれ発現可能なようにコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドなどが挙げられる。
【００３４】
本発明のポリヌクレオチドは、１本鎖および２本鎖のいずれの形態もとることができる。本発明のポリヌクレオチドが２本鎖の場合、前記本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入することにより、本発明のペプチドを発現するための組換え発現ベクターを作製することができる。すなわち本発明のポリヌクレオチドの範疇には、本発明の２本鎖型ポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入して作製された組換え発現ベクターも含まれる。
本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のとおり、がんの予防および／または治療などに有用であり、医薬組成物の有効成分とすることができる。また、本発明のポリヌクレオチドは、がんの予防および／または治療のためのものであってもよい。さらに、本発明は、がんの予防および／または治療のための医薬の製造への本発明のポリヌクレオチドの使用にも関する。
【００３５】
本発明で用いる発現ベクターは、用いる宿主や目的等に応じて様々なものを用いることができ、当業者であれば適宜選択することができる。本発明で用い得る発現ベクターとしては、例えばプラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＣＲ３等のプラスミドベクター、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１１などのファージベクターが挙げられる。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＵｒａ３などが挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合には、ｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、ｐＣＥＰ４、ｐＫＣＲ、ｐＣＤＭ８、ｐＧＬ２、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶなどのプラスミドベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。
【００３６】
前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を適宜有していてもよい。また、単離精製が容易になるように、チオレドキシン、Ｈｉｓタグ、あるいはＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）等との融合タンパク質として発現する配列が付加されていてもよい。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ＣＭＶ、ＳＶ４０初期プロモーターなど）を有するＧＳＴ融合タンパク質ベクター（ｐＧＥＸ４Ｔなど）や、Ｍｙｃ、Ｈｉｓなどのタグ配列を有するベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓなど）、さらにはチオレドキシンおよびＨｉｓタグとの融合タンパク質を発現するベクター（ｐＥＴ３２ａ）などを用いることができる。
【００３７】
前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、当該発現ベクターを含有する形質転換細胞を作製することができる。ここで用いられる宿主としては、本発明のポリペプチドが有する機能を損なわない限りいかなる細胞を用いてもよく、例えば大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。大腸菌としては、E.coli  Ｋ−１２系統のＨＢ１０１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＡＤ４９４（ＤＥ３）株などが挙げられる。また酵母としては、Saccharomyces cerevisiaeなどが挙げられる。動物細胞としては、Ｌ９２９細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、２９３−ＥＢＮＡ細胞などが挙げられる。昆虫細胞としてはｓｆ９などが挙げられる。
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の導入方法を用いればよい。具体的にはリン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine、Lipofectin; Gibco-BRL社）を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞を選択することができる。
【００３８】
以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な条件下で培養し続けることにより、本発明のペプチドを製造することができる。得られたペプチドは、一般的な生化学的精製手段により、さらに単離・精製することができる。ここで精製手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。また本発明のペプチドを、前述のチオレドキシンやＨｉｓタグ、ＧＳＴ等との融合タンパク質として発現させた場合は、これら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単離・精製することができる。
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもＲＮＡの形態であっても良い。これら本発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチドのアミノ酸配列情報およびそれによりコードされるＤＮＡの配列情報に基づき、当該技術分野において知られた通常の方法を用いて容易に製造することができる。具体的には、通常のＤＮＡ合成やＰＣＲによる増幅などによって、製造することができる。
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、前記エピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。
【００３９】
（３）本発明のペプチドを有効成分とする、ＣＴＬ誘導剤
本発明のペプチドはＣＴＬ誘導活性を有し、腫瘍抗原ペプチドとして、ＣＴＬ誘導剤となり得る。
すなわち、ＨＬＡ−Ａ０２抗原またはＨＬＡ−Ａ２４抗原が陽性のヒトから末梢血リンパ球を単離し、in vitroで本発明のペプチドを添加して刺激することにより、該ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ０２抗原陽性細胞、またはＨＬＡ−Ａ２４抗原陽性細胞を特異的に認識するＣＴＬを誘導することができる（J.Immunol.,154,p2257,1995）。ここでＣＴＬの誘導の有無は、例えば、抗原ペプチド提示細胞に反応してＣＴＬが産生する種々のサイトカイン（例えばＩＦＮ−γ）の量を、例えばＥＬＩＳＡ法などによって測定することにより、確認することができる。また５１Ｃｒで標識した抗原ペプチド提示細胞に対するＣＴＬの傷害性を測定する方法（５１Ｃｒリリースアッセイ、Int.J.Cancer,58:p317,1994）によっても確認することができる。
また、Int. J. Cancer, 39, 390-396, 1987、 N. Eng. J. Med, 333, 1038-1044, 1995等に記載の方法により、ＣＴＬクローンを樹立することもできる。
【００４０】
本発明のペプチドによって誘導されたＣＴＬは、本発明のペプチドを抗原として提示する細胞に対する傷害作用やリンフォカインの産生能を有する。本発明のペプチドは上述のとおり腫瘍抗原ペプチドであるため、それら機能を介して抗腫瘍作用、好ましくは抗がん作用を発揮することができる。したがって本発明のペプチドおよびそれにより誘導されたＣＴＬは、がんの予防および／または治療のための医薬や医薬組成物の有効成分とすることができる。
本発明のペプチドを有効成分として含有するＣＴＬ誘導剤をがん患者に投与すると、抗原提示細胞のＨＬＡ−Ａ０２抗原またはＨＬＡ−Ａ２４抗原に本発明のペプチドが提示され、ＨＬＡ−Ａ０２抗原またはＨＬＡ−Ａ２４抗原と提示されたペプチドとの結合複合体特異的ＣＴＬが増殖してがん細胞を破壊することができ、その結果、がんを予防および／または治療することができる。したがって、本発明のペプチドを有効成分とするＣＴＬの誘導剤は、好ましくは、ＨＬＡ−Ａ０２抗原またはＨＬＡ−Ａ２４抗原陽性の対象であって、ＯＲ７Ｃ１陽性のがんに罹患している対象に対して使用することができる。ＯＲ７Ｃ１陽性のがんとしては、例えば大腸癌、肺癌、卵巣癌等のがん（腫瘍）などが挙げられ、本発明のＣＴＬ誘導剤は、これらのがんの予防および／または治療のために使用することができる。
【００４１】
ここでがんの「予防」には、患者のがんへの罹患の予防だけでなく、手術により原発巣の腫瘍を切除した患者における再発予防、手術、放射線療法もしくは薬物療法等のがん治療により完全に除去できなかった腫瘍の転移防止等が含まれる。また、がんの「治療」には、がんを縮小させるがんの治癒・症状改善のみでなく、がん細胞の増殖、腫瘍の拡大もしくは原発巣からのがん細胞の転移を抑制する進行防止等が含まれる。
【００４２】
本発明のペプチドを有効成分とするＣＴＬ誘導剤は、配列番号２に記載のＯＲ７Ｃ１陽性のがんに罹患している、ＨＬＡ−Ａ０２またはＨＬＡ−Ａ２４陽性のがん患者に対して特に有効である。具体的には、例えば、大腸癌、肺癌、卵巣癌等のがん（腫瘍）の予防または治療のために使用することができる。
【００４３】
本発明のペプチドを有効成分とするＣＴＬの誘導剤は、単一のＣＴＬエピトープ（本発明のペプチド）を有効成分とするものであっても、また他のペプチド（ＣＴＬエピトープやヘルパーエピトープ）と連結したポリエピトープペプチドを有効成分とするものであってもよい。近年、複数のＣＴＬエピトープ（抗原ペプチド）を連結したポリエピトープペプチドが、in vivoで効率的にＣＴＬ誘導活性を有することが示されている。例えばJournal of Immunology 1998, 161: 3186-3194（本文献は引用により本願の一部を構成する）には、がん抗原タンパク質ＰＳＡ由来のＨＬＡ−Ａ２、−Ａ３、−Ａ１１、−Ｂ５３拘束性ＣＴＬエピトープ（抗原ペプチド）を連結した約３０ｍｅｒのポリエピトープペプチドが、in vivoでそれぞれのＣＴＬエピトープに特異的なＣＴＬを誘導したことが記載されている。またＣＴＬエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたポリエピトープペプチドにより、効率的にＣＴＬが誘導されることも示されている。このようなポリエピトープペプチドの形態で投与した場合、ポリエピトープペプチドが抗原提示細胞内に取り込まれ、その後、細胞内分解を受けて生じた個々の抗原ペプチドがＨＬＡ抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体に特異的なＣＴＬが体内で効率的に増殖し、がん細胞を破壊する。このようにしてがんの治療または予防が促進される。
【００４４】
本発明のペプチドを有効成分とするＣＴＬ誘導剤は、細胞性免疫が効果的に成立するように、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバントと混合して投与、または併用して投与することができる。
【００４５】
アジュバントとしては、文献（例えば、Clin Infect Dis.:S266-70, 2000)に記載のものなど、当該技術分野において既知のアジュバントが適用可能であり、具体的には、例えば、ゲルタイプとして水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびリン酸カルシウムなど、菌体タイプとしてＣｐＧ、モノホスホリルリピドＡ（monophosphoryl lipid A；ＭＰＬ）、コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素、百日咳毒素およびムラミルジペプチド（Muramyl dipeptide；ＭＤＰ）など、油乳濁液タイプ（エマルション製剤）としてフロイント不完全アジュバント、ＭＦ５９およびＳＡＦなど、高分子ナノ粒子タイプとして免疫刺激複合体（Immunostimulatory complex；ISCOMs）、リポソーム、生分解性マイクロスフェア（Biodegradable microsphere）およびサポニン由来のＱＳ−２１など、合成タイプとして非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチドアナログ(Muramyl peptide analogue）、ポリホスファゼンおよび合成ポリヌクレオチドなど、サイトカインタイプとしてＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−１２などを挙げることができる。
また、本発明のペプチドを有効成分とするＣＴＬ誘導剤の剤形としては、特に限定はないが、油乳濁液（エマルション製剤）、高分子ナノ粒子、リポソーム製剤、直径数μｍのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤、マイクロスフェア製剤、マイクロカプセル製剤などが挙げられる。
【００４６】
投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などの既知の任意の投与方法が挙げられる。製剤中の本発明のペプチドの投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
本発明のペプチドを実際に医薬として作用させる手法としては、当該ペプチドを直接体内に導入するin vivo法の他に、ヒトからある種の細胞を採集し体外で本発明のペプチドを作用させ、その細胞を体内に戻すex vivo法があり（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，１２（１５），（１９９４）、およびこれらの引用文献等、これらの文献は引用により本願の一部を構成する）、当業者であれば、かかる手法に適切な細胞、投与方法、投与形態および投与量を選択することができる。
【００４７】
（４）本発明のポリヌクレオチドを有効成分とするＣＴＬ誘導剤
本発明のポリヌクレオチドを発現させた細胞は、本発明のペプチドを抗原として提示する細胞となるため、Ｔ細胞受容体を介してＴ細胞に認識されるという特徴を有する。したがって、本発明のポリヌクレオチドもまたＣＴＬの誘導剤となり得る。誘導されたＣＴＬは、本発明のペプチドによって誘導されたＣＴＬと同様に、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗腫瘍作用、好ましくは抗がん作用を発揮することができる。したがって本発明のポリヌクレオチドは、がんの治療または予防のための医薬や医薬組成物の有効成分とすることができる。本発明のポリヌクレオチドを有効成分として含有するＣＴＬの誘導剤は、例えば、本発明のポリヌクレオチドをがん患者に投与し発現させることで、がんを治療および／または予防し得るものである。
【００４８】
例えば発現ベクターに組み込まれた本発明のポリヌクレオチドを以下の方法によりがん患者に投与すると、抗原提示細胞内で腫瘍抗原ペプチドが高発現する。その後、生じた腫瘍抗原ペプチドがＨＬＡ−Ａ０２抗原またはＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示されることにより、がん特異的ＣＴＬが体内で効率的に増殖し、がん細胞を破壊する。以上のようにして、がんの治療または予防が達成される。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチドを有効成分とするＣＴＬの誘導剤は、好ましくは、ＨＬＡ−Ａ０２抗原またはＨＬＡ−Ａ２４抗原陽性の対象であって、ＯＲ７Ｃ１陽性のがんに罹患した対象に対して使用することができる。ＯＲ７Ｃ１陽性のがんとしては、例えば大腸癌、肺癌、卵巣癌等のがん（腫瘍）などが挙げられ、本発明のＣＴＬ誘導剤は、これらのがんの予防または治療のために使用することができる。
本発明のポリヌクレオチドを投与し細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターによる方法およびその他の方法（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，１２（１５），（１９９４）、およびこれらの引用文献等、これらの文献は引用により本願の一部を構成する）のいずれの方法も適用することができる。
【００５０】
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに本発明のＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【００５１】
本発明のポリヌクレオチドを実際に医薬として作用させるには、当該ポリヌクレオチドを直接体内に導入するin vivo法、およびヒトからある種の細胞を採集し体外で本発明のポリヌクレオチドを該細胞に導入しその細胞を体内に戻すex vivo法がある（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，１２（１５），（１９９４）、およびこれらの引用文献等、これらの文献は引用により本願の一部を構成する）。in vivo法がより好ましい。
本発明のポリヌクレオチドをin vivo法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路および投与形態を適宜選択して投与し得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に注射可能な形態で投与することができる。in vivo法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には有効成分である本発明のポリヌクレオチドを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、医薬上許容されるキャリアー（担体）を加えてもよい。また、本発明のポリヌクレオチドを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
【００５２】
製剤中の本発明のポリヌクレオチドの含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常、ポリヌクレオチドの含量として、０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０ｍｇの本発明のポリヌクレオチドを、数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
当業者であれば、好適な細胞、ベクター、投与方法、投与形態および投与量を適宜選択することが可能である。
【００５３】
また近年、複数のＣＴＬエピトープ（腫瘍抗原ペプチド）を連結したポリエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいはＣＴＬエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたポリエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドが、in vivoで効率的にＣＴＬ誘導活性を有することが示されている。例えばJournal of Immunology 1999, 162: 3915-3925（本文献は引用により本願の一部を構成する）には、ＨＢＶ由来ＨＬＡ−Ａ２拘束性抗原ペプチド６種類、ＨＬＡ−Ａ１１拘束性抗原ペプチド３種類、およびヘルパーエピトープを連結したエピトープペプチドをコードするＤＮＡ（ミニジーン）が、in vivoでそれぞれのエピトープに対するＣＴＬを効果的に誘導したことが記載されている。
したがって、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを１種または２種以上連結させることにより、また場合によっては他のペプチドをコードするポリヌクレオチドも連結させることにより作製されたポリヌクレオチドを、適当な発現ベクターに組み込むことにより、ＣＴＬの誘導剤の有効成分とすることができる。このようなＣＴＬの誘導剤も、前記と同様の投与方法および投与形態をとることができる。
【００５４】
（５）本発明の抗原提示細胞
前記した本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドは、がん患者の治療において、例えば、以下のようにin vitroで利用することができる。すなわち本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかと抗原提示能を有する細胞とをin vitroで接触させることにより、抗原提示細胞を作製することができる。具体的には本発明は、がん患者由来の単離された抗原提示能を有する細胞と、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかをin vitroで接触させることにより、当該細胞の細胞表面にＨＬＡ−Ａ０２抗原またはＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明のペプチドとの複合体を提示させた抗原提示細胞、およびその製造方法を提供するものである。
ここで「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明のペプチドを提示することの可能なＭＨＣ、好ましくはＨＬＡ−Ａ０２抗原またはＨＬＡ−Ａ２４抗原を細胞表面に発現する細胞であれば特に限定されないが、これらのうち、プロフェッショナル抗原提示細胞が好ましく、特に抗原提示能が高いとされる樹状細胞がより好ましい。
【００５５】
また、前記抗原提示能を有する細胞から本発明の抗原提示細胞を調製するために添加される物質としては、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれであってもよい。
本発明の抗原提示細胞は、例えば、がん患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、該細胞に本発明のペプチドをin vitroでパルスして、ＨＬＡ−Ａ０２抗原またはＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明のペプチドとの複合体を提示させることにより得られる(Cancer Immunol.Immunother.,46:82,1998、Ｊ.Immunol.,158,p1796,1997、Cancer Res.,59,p1184,1999）。樹状細胞を用いる場合は、例えば、がん患者の末梢血からフィコール法によりリンパ球を分離し、その後非付着細胞を除き、付着細胞をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４存在下で培養して樹状細胞を誘導し、当該樹状細胞を本発明のペプチドと共に培養してパルスすることなどにより、本発明の抗原提示細胞を調製することができる。
【００５６】
また、前記抗原提示能を有する細胞に本発明のポリヌクレオチドを導入することにより本発明の抗原提示細胞を調製する場合は、当該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であっても、ＲＮＡの形態であってもよい。具体的には、ＤＮＡの場合はCancer Res.,56:p5672,1996やJ.Immunol.,161: p5607,1998（これらの文献は引用により本願の一部を構成する）などを参考にして行うことができ、またＲＮＡの場合はJ.Exp.Med., 184: p465,1996（本文献は引用により本願の一部を構成する）などを参考にして行うことができる。
【００５７】
前記抗原提示細胞はＣＴＬの誘導剤の有効成分とすることができる。当該抗原提示細胞を有効成分として含有するＣＴＬの誘導剤は、抗原提示細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与などが挙げられる。このような抗原提示細胞を有効成分として含有してなるＣＴＬの誘導剤を患者の体内に戻すことにより、ＯＲ７Ｃ１陽性のがんに罹患している患者の体内で、本発明のペプチドを抗原提示するがん細胞に特異的なＣＴＬが効率良く誘導され、結果として本発明のペプチドを抗原提示するＯＲ７Ｃ１陽性のがんを治療することができる。
【００５８】
（６）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）
本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドは、がん患者の治療において、以下のようにin vitroで利用することができる。すなわち本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドのいずれかと末梢血リンパ球とをin vitroで接触させることにより、ＣＴＬを誘導することができる。具体的には本発明は、がん患者由来の末梢血リンパ球と、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかをin vitroで接触させることにより誘導されたＣＴＬ、およびその誘導方法を提供するものである。
【００５９】
例えばメラノーマにおいては、患者本人の腫瘍内浸潤Ｔ細胞を体外で大量に培養して、これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている（J.Natl.Cancer.Inst.,86:1159,1994）。またマウスのメラノーマにおいては、脾細胞を、in vitroで腫瘍抗原ペプチドＴＲＰ−２により刺激し、腫瘍抗原ペプチドに特異的なＣＴＬを増殖させ、該ＣＴＬをメラノーマ移植マウスに投与することにより、転移抑制が認められている（J.Exp.Med.,185:453,1997）。これは、抗原提示細胞のＭＨＣと腫瘍抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識するＣＴＬをin vitroで増殖させた結果に基づくものである。したがって、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを用いて、in vitroで患者末梢血リンパ球を刺激して腫瘍特異的ＣＴＬを増やした後、このＣＴＬを患者に戻す治療法は有用であると考えられる。
【００６０】
当該ＣＴＬはがんの治療剤または予防剤の有効成分とすることができる。該治療剤または予防剤は、ＣＴＬを安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与などが挙げられる。このようなＣＴＬを有効成分として含有してなるがんの治療または予防剤を患者の体内に戻すことにより、本発明のＯＲ７Ｃ１陽性のがんに罹患した患者の体内でＣＴＬによるがん細胞の傷害作用が促進され、がん細胞を破壊することにより、がんを治療することができる。
【００６１】
（７）本発明のペプチドを用いた腫瘍特異的ＣＴＬ検出剤
本発明のペプチド、特に配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、腫瘍特異的ＣＴＬに認識されるため、腫瘍特異的ＣＴＬ検出剤の成分として有用である。したがって、本発明はまた、本発明のペプチドを含む、腫瘍特異的ＣＴＬ検出剤に関する。一態様において、本発明の腫瘍検出剤および腫瘍特異的ＣＴＬ検出剤は、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ０２またはＨＬＡ−Ａ２４とを含有するＨＬＡマルチマー（モノマー、ダイマー、テトラマー、ペンタマーおよびデキストラマー）を含む。
【００６２】
例えば、ＨＬＡテトラマーとは、ＨＬＡのα鎖とβ２ミクログロブリンをペプチド（抗原ペプチド）と会合させた複合体（ＨＬＡモノマー）をビオチン化し、アビジンに結合させることにより４量体化したものを指す（Science 279: 2103-2106(1998)、Science 274: 94-96 (1996))。現在では種々の抗原ペプチドを含有するＨＬＡテトラマーが市販されており（例えば（株）医学生物学研究所より）、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ０２またはＨＬＡ−Ａ２４とを含有するＨＬＡテトラマーを容易に作製することができる。また、ＨＬＡダイマーおよびＨＬＡペンタマーも同様な原理に基づいており、これらにおいては、それぞれ、前記ＨＬＡモノマーが２量体化および５量体化されている。したがって、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ０２またはＨＬＡ−Ａ２４とを含有するＨＬＡマルチマーもまた、本発明の一態様である。
【００６３】
具体的には、例えば配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドとＨＬＡ−Ａ０２またはＨＬＡ−Ａ２４とを含有するＨＬＡテトラマーが挙げられる。当該ＨＬＡテトラマーは、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡等の既知の検出手段により結合したＣＴＬを容易に選別または検出することができるように蛍光標識されていることが好ましい。具体的には、例えばフィコエリスリン（ＰＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ペリジニンクロロフィルプロテイン（ＰｅｒＣＰ）などにより標識されたＨＬＡテトラマーが挙げられる。
【００６４】
ＨＬＡテトラマーの製法例としては、例えば、Science 279: 2103-2106(1998)、Science 274: 94-96 (1996)などの文献に記載のものが挙げられ、簡単に述べると以下のようになる。
まずタンパク質を発現可能な大腸菌や哺乳動物細胞に、ＨＬＡ−Ａ２４あるいはＨＬＡ−Ａ０２のα鎖発現ベクターおよびβ２ミクログロブリン発現ベクターを導入し発現させる。ここでは大腸菌（例えばＢＬ２１）を用いることが好ましい。得られた単量体ＨＬＡ−Ａ２４あるいはＨＬＡ−Ａ０２複合体と本発明のペプチドとを混合し、可溶性のＨＬＡ−ペプチド複合体を形成させる。次にＨＬＡ−ペプチド複合体におけるＨＬＡ−Ａ０２あるいはＨＬＡ−Ａ２４のα鎖のＣ末端部位の配列をＢｉｒＡ酵素によりビオチン化する。このビオチン化されたＨＬＡ−ペプチド複合体と蛍光標識されたアビジンとを４：１のモル比で混合することにより、ＨＬＡテトラマーを調製することができる。なお、前記各ステップにおいて、ゲルろ過等によるタンパク精製を行うことが好ましい。
【００６５】
（８）本発明のペプチドを標的とする腫瘍検出剤
本発明のペプチドは、がん細胞によりＣＴＬエピトープペプチドとして提示されるため、腫瘍マーカーとして利用できる。このため、本発明のペプチドを腫瘍マーカーとして検出可能な物質、例えば、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４もしくはＨＬＡ−Ａ０２との複合体を認識するＴＣＲ（Ｔ細胞抗原受容体）様抗体は、腫瘍検出剤として有用である。したがって、本発明はまた、本発明のペプチドを検出可能な物質を含む、腫瘍検出剤にも関する。本発明のペプチドは、抗原提示細胞、特に樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞にも提示されるため、上記検出剤は、本発明のペプチドを提示する抗原提示細胞の検出にも有用である。
本発明において「ＴＣＲ様抗体」は、断片化された抗原由来のペプチドと主要組織適合性抗原複合体（ＭＨＣ）分子との複合体（ｐＭＨＣ）に対してＴＣＲ様の結合力（抗原認識能）を有する分子である。例えば、Eur J Immunol. 2004;34:2919-29等で報告されているように、腫瘍抗原由来のペプチドとＭＨＣとの複合体を認識するＴＣＲ様抗体は、ＣＴＬが標的とし得る腫瘍抗原ペプチドを提示しているがん細胞、がん細胞を貪食してＭＨＣクラスＩ上に腫瘍抗原ペプチドを提示している樹状細胞などを認識することができる。
【００６６】
また、ウイルス等由来のペプチドとＭＨＣとの複合体を認識する前記ＴＣＲ様抗体は、提示した抗原が感染細胞上でどの様な提示動態およびＣＴＬ応答等を示すのかを、定量的・経時的に解析できる。
前記ＴＣＲ様抗体は、Eur J Immunol. 2004;34:2919-29等で記載されている方法で作製することができる。例えば、ＭＨＣとペプチド複合体をマウス等の動物に免疫することにより複合体特異的な抗体を取得できる。また、ファージディスプレイ法を利用して複合体特異的抗体を取得することも可能である。
【００６７】
（９）腫瘍の検出方法（検査方法、診断方法）
本発明は、前述した本発明のＣＴＬ検出剤または腫瘍検出剤を利用した腫瘍の検出方法（検査方法、診断方法）を提供するものである。
本発明のＣＴＬ検出剤を用いる本発明の検出方法（診断方法）は、典型的には、被験者の血液を採取するか、若しくは腫瘍が疑われる被験組織の一部を生検等で採取し、そこに含まれるＯＲ７Ｃ１由来の腫瘍抗原ペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識するＣＴＬの量を、本発明のＣＴＬ検出剤によって検出・測定することにより、大腸癌、肺癌、卵巣癌等のＯＲ７Ｃ１陽性のがん（腫瘍）の罹患の有無またはその程度を検出、検査または診断するものである。
【００６８】
本発明の腫瘍検出剤を用いる本発明の検出方法（検査方法、診断方法）は、典型的には、被験者の血液を採取するか、若しくは腫瘍が疑われる被験組織の一部を生検等で採取し、そこに含まれるＯＲ７Ｃ１由来の腫瘍抗原ペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を提示する細胞の量を、本発明の腫瘍検出剤によって検出・測定することにより、大腸癌、肺癌、卵巣癌等のＯＲ７Ｃ１陽性のがん（腫瘍）の罹患の有無またはその程度を検出、検査または診断するものである。
本発明の検出（検査、診断）方法は、例えば腫瘍を有する患者において、該腫瘍の改善のために治療薬を投与した場合における、該腫瘍の改善の有無またはその程度を検出（検査、診断）することもできる。さらに本発明の検出（検査、診断）方法は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを有効成分とする医薬を有効に適用できるがん患者の選択や、当該医薬による治療効果の予測や判定などにも利用できる。また、本発明の腫瘍検出剤を用いる態様においては、本発明のペプチドを有効成分とするがんワクチンを投与することにより患者生体内で誘導されるＣＴＬが実際に標的とし得る、腫瘍抗原ペプチドを提示しているがん細胞を検出することが可能である
【００６９】
本発明のＣＴＬ検出剤を用いる本発明の検出(検査)方法の特定の態様は、次の（ａ）および（ｂ）、および任意に（ｃ）の工程を含むものである：
（ａ）被験者から得られた生体試料と本発明のＣＴＬ検出剤とを接触させる工程、
（ｂ）該生体試料中のＯＲ７Ｃ１由来の腫瘍抗原ペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識するＣＴＬの量を、上記ＣＴＬ検出剤が結合した細胞の量を指標として測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の結果をもとに、がんの罹患を判断する工程。
本発明のＣＴＬ検出剤を用いる本発明の診断方法の特定の態様は、上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の工程を含む。
【００７０】
本発明の腫瘍検出剤を用いる本発明の検出(検査)方法の特定の態様は、次の（ｄ）および（ｅ）、および任意に（ｆ）の工程を含むものである：
（ｄ）被験者から得られた生体試料と本発明の腫瘍検出剤とを接触させる工程、
（ｅ）該生体試料中のＯＲ７Ｃ１由来の腫瘍抗原ペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を提示する細胞の量を、上記腫瘍検出剤が結合した細胞の量を指標として測定する工程、
（ｆ）（ｅ）の結果をもとに、がんの罹患を判断する工程。
本発明の腫瘍検出剤を用いる本発明の診断方法の特定の態様は、上記（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）の工程を含む。
ここで用いられる生体試料としては、被験者の生体組織（がん細胞の存在が疑われる組織およびその周辺組織、または血液など）から調製される試料を挙げることができる。具体的には、該組織から調製される末梢血リンパ球を含む試料を挙げることができる。
【００７１】
本発明のＣＴＬ検出剤を用いる本発明の検出方法（検査方法、診断方法）の一態様は、生体試料中の本発明のペプチド特異的ＣＴＬを検出し、その量を測定することによって実施される。具体的には、文献（Science,274:p94,1996、本文献は引用により本願の一部を構成する）に記載の方法に従って蛍光標識したＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体の４量体（ＨＬＡテトラマー）を作製し、これを用いてがんが疑われる患者の末梢血リンパ球中の抗原ペプチド特異的ＣＴＬをフローサイトメーターにより定量することにより行うことができる。
【００７２】
腫瘍の有無の予測、判定、判断または診断は、例えば、被験者の血液や腫瘍が疑われる被験組織における本発明のペプチド特異的ＣＴＬの量、または、本発明のペプチドを提示する細胞の量を測定することにより行うことができる。その際、場合によっては正常な対応組織におけるＯＲ７Ｃ１遺伝子発現レベル、本発明のペプチドレベルまたはＣＴＬレベル等を基準値として、該基準値と被験者から得られた試料における前記レベルとを比較し、両者の違いを判定することによって行うことができる。
ここで被験者の被験組織と正常な対応組織との前記レベルの比較は、被験者の生体試料と正常者の生体試料を対象とした測定を並行して行うことで実施できる。並行して行わない場合は、複数（少なくとも２つ、好ましくは３以上、より好ましくは５以上）の正常な組織を用いて均一な測定条件で測定して得られた本発明のペプチド特異的ＣＴＬの量の平均値または統計的中間値を、正常者の値すなわち基準値として、比較に用いることができる。
【００７３】
被験者が、がんに罹患しているかどうかの判断は、例えば該被験者の組織における本発明のペプチド特異的ＣＴＬの量、または、本発明のペプチドを提示する細胞が、正常者のそれらのレベルと比較して例えば２倍以上、好ましくは３倍以上多いことを指標として行うことができる。
また、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを投与されている被験者において、本発明のペプチド特異的ＣＴＬの量を測定することにより、実際にＣＴＬが誘導されているか否かを判定することも可能である。例えば、該被験者の組織における本発明のペプチド特異的ＣＴＬの量が、正常者のそれらのレベルと比較して例えば２倍以上、好ましくは３倍以上多いことを指標として、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドによる治療が有効であると判定することができる。本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドは、主にワクチンとして作用し、ＣＴＬを誘導することにより抗腫瘍作用を発揮すると考えられることから、ＣＴＬの誘導は、投与した本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドがワクチンとして作用しているか否かを確認するためのいわゆるＰＯＭ（Proof of Mechanism）マーカーとして用いることができる。したがって本発明のＣＴＬ検出剤は、ＰＯＭマーカーとしてのＣＴＬを検出することにより、投与対象において投与したペプチドまたはポリヌクレオチドがワクチンとして作用しているか否かを確認するための診断薬として用いることができる。
【００７４】
（１０）がんの予防および／または治療方法
本発明はまた、対象におけるがんを予防および／または治療する方法であって、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＣＴＬ、抗原提示細胞、ＴＣＲ様抗体からなる群から選択される有効成分の有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法にも関する。
本発明における「対象」は、任意の生物個体を意味し、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体である。本発明において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、がんの予防および／または治療が企図される場合には、典型的にはがんに罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。本発明の一態様において、対象はＨＬＡ−Ａ０２陽性またはＨＬＡ−Ａ２４陽性である。本発明の一態様において、対象はＯＲ７Ｃ１陽性のがんに罹患しているか、罹患するリスクを有する。本発明の一態様において、対象はＨＬＡ−Ａ０２陽性またはＨＬＡ−Ａ２４陽性であり、かつ、ＯＲ７Ｃ１陽性のがんに罹患しているか、罹患するリスクを有する。
【００７５】
本発明の予防／治療方法に用いる本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＣＴＬ、抗原提示細胞および、ＴＣＲ様抗体としては、本明細書に記載の任意のものが挙げられる。本発明における有効量とは、例えば、がんの症状を低減し、またはその進行を遅延もしくは停止する量であり、好ましくは、がんを抑制し、または治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラットなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。有効成分の具体的な用量は、それを必要とする対象に関する種々の条件、例えば、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、剤形、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。
【００７６】
具体的な用量としては、例えば、本発明のペプチドの場合、通常０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。また、本発明のポリヌクレオチドの場合、通常、０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０ｍｇであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。また、本発明のＴＣＲ様抗体の場合、通常、０．０００１ｍｇ〜２０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜２０００ｍｇであり、これを１週間〜４週間に１回投与するのが好ましい。また、投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などの既知の任意の適切な投与方法を用いることができる。また、本発明のペプチドやヌクレオチドを直接体内に投与するin vivo法の他、ヒトからある種の細胞を採集し、体外で本発明のペプチドやポリヌクレオチドを用いてＣＴＬや抗原提示細胞を誘導した後、これらの細胞を体内に戻すex vivo法を用いることもできる。
【００７７】
本発明の予防／治療方法の一態様は、投与する工程の前に、ＨＬＡ−Ａ０２陽性またはＨＬＡ−Ａ２４陽性の対象を予防／治療の対象として選択する工程をさらに含む。本発明のこの態様は、上記選択する工程の前に、対象のＨＬＡ型を決定する工程をさらに含んでもよい。対象のＨＬＡ型の決定は、既知の任意の手法により行うことができる。また、本発明の予防／治療方法の一態様は、投与する工程の前に、ＯＲ７Ｃ１陽性のがんを有する対象を予防／治療の対象として選択する工程をさらに含む。本発明のこの態様は、上記選択する工程の前に、対象におけるＯＲ７Ｃ１陽性のがんを検出する工程をさらに含んでもよい。対象におけるＯＲ７Ｃ１陽性のがんの検出は、上記（９）に記載の腫瘍の検出方法を用いることができる。
【００７８】
本発明の予防／治療方法の一態様は、投与する工程の前に、ＨＬＡ−Ａ０２陽性またはＨＬＡ−Ａ２４陽性であり、かつ、ＯＲ７Ｃ１陽性のがんを有する対象を予防／治療の対象として選択する工程をさらに含む。本発明のこの態様は、上記選択する工程の前に、対象のＨＬＡ型を決定する工程および対象におけるＯＲ７Ｃ１陽性のがんを検出する工程をさらに含んでもよい。ＨＬＡ−Ａ０２陽性またはＨＬＡ−Ａ２４陽性であり、かつ、ＯＲ７Ｃ１陽性のがんを有する対象は、本発明のペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを有効成分として含有する医薬組成物を有効に適用できる対象である。したがって上記（９）に記載の腫瘍の検出方法に用いることができる腫瘍特異的ＣＴＬ検出剤または腫瘍検出剤は、本発明の医薬組成物を用いたがんの処置方法が有効な治療対象を選択する、いわゆるコンパニオン診断用の診断薬として使用可能である。
【００７９】
また、本発明の予防／治療方法の一態様は、本発明の医薬組成物を投与した患者において、本発明の医薬組成物による治療が有効であるか否かを判定し、本発明の医薬組成物による治療が有効な治療対象を選択する工程をさらに含んでもよい。上記（９）に記載されるとおり、本発明の医薬組成物を投与した場合に本発明のペプチド特異的ＣＴＬが誘導される対象は、本発明のペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを有効成分として含有する医薬組成物による治療が有効である対象、すなわち本願医薬組成物を有効に適用できる対象であり、本発明のペプチド特異的ＣＴＬの誘導は、本発明の医薬組成物の治療効果を予測または判定するためのサロゲートマーカーとして用いることができる。したがって、上記（９）に記載の腫瘍の検出方法に用いることができる腫瘍特異的ＣＴＬ検出剤は、本発明の医薬組成物を投与した患者における有効な治療対象を選択するための診断薬、または、上記サロゲートマーカーとしてのＣＴＬを検出することにより、本発明の医薬組成物を投与した患者における当該医薬組成物の治療効果を予測または判定するための診断薬として使用可能である。
本明細書中で言及する全ての特許、出願および他の出版物は、その全体を参照により本明細書に援用する。
【００８０】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【実施例】
【００８１】
実施例１：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１結合モチーフを有するＯＲ７Ｃ１由来ペプチド
ＭＨＣとペプチドの結合予測プログラムであるＢＩＭＡＳ（http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/）およびＩＥＤＢ（MHC-I processing predictions；http://www.iedb.org/)によって、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１への結合が予測されるＯＲ７Ｃ１由来のペプチド（配列番号３、４、５および６で表されるペプチド）を抽出した。これらペプチドをＦｍｏｃ法で化学合成し、ＨＬＡ結合試験およびin vivoのＣＴＬ誘導試験に供した。【００８２】
実施例２：ＯＲ７Ｃ１由来ペプチドのＨＬＡ−Ａ０２およびＨＬＡ−Ａ２４結合性評価
ＯＲ７Ｃ１由来ペプチドのＨＬＡ−Ａ０２およびＨＬＡ−Ａ２４の結合性評価はＭＨＣクラスＩ発現安定化試験によって実施した。当試験ではヒトリンパ芽球様細胞株であるＴ２細胞およびＨＬＡ−Ａ＊２４：０２を人為的に強制発現させたＴ２−Ａ２４細胞を利用した。Ｔ２細胞は細胞質から小胞体へのペプチドの輸送に関与するtransporter associated with antigen processing（ＴＡＰ）を欠損している。ＭＨＣクラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１およびＨＬＡ−Ａ＊２４：０２を含む）は、ペプチドが結合していない状態（empty MHC class I）では、構造が不安定であることが知られる。通常、Ｔ２細胞は細胞表面に低レベルのempty MHC class I分子しか発現できない。しかし、ＭＨＣクラスＩ分子に結合可能なペプチドを添加すると、empty MHC class I分子は該ペプチドと結合して細胞表面で安定化して存在できる。したがって、細胞表面ＭＨＣクラスＩ発現レベルはペプチドのＭＨＣクラスＩ結合親和性に依存することとなる。【００８３】
Ｔ２細胞およびＴ２−Ａ２４細胞は、３７℃、５％ＣＯ２下で継代培養された。ペプチドは、ＯＲ７Ｃ１由来ペプチド（表１に記載のペプチド）、ＨＬＡ−Ａ０２ポジティブコントロールとしてＭｅｌａｎ  Ａ  Ａ２７Ｌペプチド（アミノ酸配列：ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ；配列番号７）、ＨＬＡ−Ａ２４ポジティブコントロールとしてＨＩＶ５８４−５９２ペプチド（アミノ酸配列：ＲＹＬＲＤＱＱＬＬ；配列番号８）、ＨＬＡ−Ａ０２ネガティブコントロールとしてＭＡＧＥ−１１６１−１６９ペプチド（アミノ酸配列：ＥＡＤＰＴＧＨＳＹ；配列番号９）、ＨＬＡ−Ａ２４ネガティブコントロールとしてＶＳＶ５２−５９ペプチド（アミノ酸配列：ＲＧＹＶＹＱＧＬ；配列番号１０）をそれぞれ１００μｇ／ｍＬの濃度で評価した。これらペプチドはＤＭＳＯに溶解され、さらに、ＲＰＭＩ１６０培地で２００倍に希釈された。細胞懸濁液とペプチド溶液とを混合し、５％ＣＯ２、２６℃の条件で１６〜１８時間培養した。温度を３７℃にして、さらに３時間共培養した後、遠心分離して上清を除き、細胞を単離した。単離した細胞を、３％ＦＢＳを含むＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣで蛍光標識した抗ＨＬＡ−Ａ０２抗体（clone:BB7.2；医学生物学研究所）あるいは抗ＨＬＡ−Ａ２４抗体（clone:17A10；医学生物学研究所）を加え、室温で３０分静置した。その後、細胞を、３％ＦＢＳを含むＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液を加え、室温で１０分間静置することで細胞を固定した。固定した細胞は、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｎ）にて、ＦＩＴＣ蛍光強度を計測した。平均蛍光強度（mean fluorescence intensity；ＭＦＩ）の溶媒比を算出し、１．５以上をポジティブと判断した。【００８４】
結果を表１に示す。この結果から、配列番号３、４、５および６で表されるペプチドがいずれも、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１結合性およびＨＬＡ−Ａ２４結合性を示すことがわかった。
【表１】
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【００８５】
実施例３：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１遺伝子導入マウスおよびＨＬＡ−Ａ＊２４：０２遺伝子導入マウスを用いた、in vivoでのＣＴＬ誘導能の評価
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１およびＨＬＡ−Ａ＊２４：０２への結合があると判断されたＯＲ７Ｃ１由来ペプチド（配列番号３、４、５および６）のＣＴＬ誘導能は、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１遺伝子導入マウスおよびＨＬＡ−Ａ＊２４：０２遺伝子導入マウスを用いたin vivoのＣＴＬ誘導試験によって評価した。
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１遺伝子導入マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＣｒＨＬＡ−Ａ２．１ＤＲ１）は、マウスのＭＨＣを欠損し、ヒトのＭＨＣであるＨＬＡ−Ａ＊０２：０１およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１：０１を発現するマウスであり、本マウスを用いることで、ヒトでＣＴＬを誘導し得るペプチドの選択が可能である。一方、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２遺伝子導入マウスは、ヒトのＭＨＣであるＨＬＡ−Ａ＊２４：０２とマウスＭＨＣであるＨ−２ＫｂのキメラＨＬＡを発現するマウスであり、本マウスを用いることで、ＨＬＡ−Ａ２４陽性のヒトでＣＴＬを誘導し得るペプチドの選択が可能である（Int J Cancer. 2002;100:565-70）。ペプチド投与によりＣＴＬが誘導されるか否かは、ペプチドを投与した上記マウス由来の脾細胞を投与ペプチドで再刺激を行った場合に産生されるＩＦＮγを測定することで判断した。【００８６】
具体的には、ペプチドをＰＢＳ（−）で１０ｍｇ／ｍＬに溶解し、等量の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と混合し、エマルション化させた。エマルション化させたペプチドは、マウスの尾根部皮内に５０μｇ／箇所の用量で２箇所投与した。１週間後に、マウスをＣＯ２ガスにより安楽死させたのち脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。ＩＦＮγ産生の測定には、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイキット（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いた。脾細胞調製の前日に、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを抗ＩＦＮγ抗体で処理し、当日に１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地でブロッキングした。調製した脾細胞を０．５×１０６個／ウェルで、ブロッキングしたＥＬＩＳＰＯＴプレートに播種した。ＯＲ７Ｃ１由来ペプチドを、ＤＭＳＯで４０ｍｇ／ｍＬに溶解し、さらに１０％ＲＰＭＩ１６４０培地で２０μｇ／ｍＬに希釈した。希釈したペプチドを、５０μＬ／ウェルでそのペプチドを投与した動物に由来する脾細胞に添加した。ペプチドを添加した脾細胞を、１６〜１８時間、３７℃、５％ＣＯ２下で培養することでin vitroにおけるペプチド再刺激を加えた。培養後に上清を除き、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを、添付のプロトコールに従って発色させた。発色したスポット数は、ＫＳ−ＥＬＩＳＰＯＴによって測定した。【００８７】
ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果は図１、２、３および４に示す。
本試験の結果、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１遺伝子導入マウス由来およびＨＬＡ−Ａ＊２４：０２遺伝子導入マウス由来の脾細胞において、各ペプチド特異的なＩＦＮγ産生が確認されたことより、配列番号３、４、５および６で表されるＯＲ７Ｃ１由来の各ペプチドがＣＴＬ誘導能を持つことがわかった。【００８８】
実施例４：ヒト末梢血単核細胞を用いたＣＴＬ誘導能の評価
配列番号３、５および６で表される３種類のペプチドを添加した場合に、健常人由来末梢血単核細胞よりＣＴＬが誘導されるか評価した。
具体的には、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性あるいはＨＬＡ−Ａ＊２４：０２陽性の健常人由来の末梢血単核細胞（Cellular Technology Limited社製）を１０％ヒト由来血清を含有するＡＩＭ−Ｖ培地でサスペンドしたのち、９６穴Ｕ底プレートの各ウェルに１×１０５個を播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。このとき、ヒトＩＬ−２を１００Ｕ／ｍＬおよび上記ペプチドを２０μｇ／ｍＬで添加した。３日あるいは４日毎に培地を交換し、約２週間後にＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。アッセイの前日に、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを抗ＩＦＮγ抗体で処理し、当日に１０％ヒト由来血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地で約２時間室温にてブロッキングした。培養中のヒト末梢血単核細胞をＡＩＭ−Ｖ培地で洗浄し、ブロッキングしたＥＬＩＳＰＯＴプレートの各ウェルに３分の１量を播種した。このとき、配列番号３、５および６で表されるペプチドで培養したヒト末梢血単核細胞は、任意の２ウェルを混合して１ウェルとした後、各ウェルを再度２ウェルに分けて播種し、一方のウェルにペプチド溶液を添加し、もう一方のウェルはペプチドのみを含まない対照溶液を添加し、非再刺激コントロールとし、それぞれ６０ウェルずつとした。ここで、配列番号３、５および６で表される３種類のペプチドは、ＤＭＳＯで４０ｍｇ／ｍＬに溶解し、さらに１０％ヒト由来血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地で希釈した。最終濃度２０μｇ／ｍＬとなるよう添加し、ヒト末梢血単核細胞を再刺激した。３７℃、５％ＣＯ２下で培養して１６〜１８時間後に上清を除き、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを、添付のプロトコールに従って発色させた。発色したスポット数は、Cellular Technology Limited社製ＥＬＩＳＰＯＴアナライザーで測定した。配列番号３、５および６のＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を図５、６および７にそれぞれに示す。縦軸は各ウェルで認められたスポット数を、横軸は陽性のウェルを示す。また、黒棒はペプチド刺激条件下で検出されたスポットの数を、白棒はペプチド非パルス条件下で検出されたスポット（コントロール）の数を示す。ペプチド刺激時のスポット数が５０個以上あるとともに黒棒と白棒の差が２倍以上ある場合に限って陽性ウェルと判断した。【００８９】
本試験の結果、配列番号３、５および６で表される３種類のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性およびＨＬＡ−Ａ＊２４：０２陽性の健常人由来の末梢血単核細胞より、それらペプチド特異的ＣＴＬを誘導することが判明した。これより、これら３種類のペプチドは、マウスのみならずヒトにおいてＣＴＬ誘導能を持つことがわかった。【００９０】
実施例５：ＯＲ７Ｃ１由来ペプチドのＣ末端アミノ酸置換体ペプチドの評価
（１）ペプチドの合成
配列番号３で表されるペプチドのＣ末端アミノ酸がバリンからイソロイシンに置換されたペプチド（配列番号１１）を、実施例１と同様にＦｍｏｃ法で化学合成し、ＨＬＡ結合試験およびin vivoのＣＴＬ誘導試験に供した。【００９１】
（２）ＨＬＡ−Ａ０２およびＨＬＡ−Ａ２４結合性評価
実施例２と同様の方法で、上記（１）にて合成した配列番号１１で表されるペプチドについて、ＨＬＡ−Ａ０２およびＨＬＡ−Ａ２４の結合性評価を行った。結果を表２に示す。この結果から、配列番号１１で表されるペプチドも、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１結合性およびＨＬＡ−Ａ２４結合性を示すことがわかった。
【表２】
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【００９２】
（３）in vivoでのＣＴＬ誘導能の評価
ＣＴＬ誘導能は、実施例３に倣って、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１遺伝子導入マウスおよびＨＬＡ−Ａ＊２４：０２遺伝子導入マウスを用いたin vivoのＣＴＬ誘導試験によって評価した。具体的には、配列番号１１で表されるペプチドを注射用水で４０ｍｇ／ｍＬに溶解し、等量のＩＦＡと混合し、エマルション化させ、エマルション化させたペプチドをマウスの尾根部皮内に１５０μｇ／箇所の用量で２箇所投与したこと以外は、実施例３と同様に行った。結果を図８に示す。
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１遺伝子導入マウス由来およびＨＬＡ−Ａ＊２４：０２遺伝子導入マウス由来の脾細胞において、該ペプチドに特異的なＩＦＮγ産生が確認されたことより、配列番号１１で表されるペプチドがＣＴＬ誘導能を持つことがわかった。【００９３】
（４）ヒト末梢血単核細胞を用いたＣＴＬ誘導能の評価
配列番号１１で表されるペプチドを添加した場合に、健常人由来末梢血単核細胞よりＣＴＬが誘導されるかについて、実施例４に倣って評価した。具体的には、配列番号１１で表されるペプチドで培養したヒト末梢血単核細胞をＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイに供する際に、任意の２ウェルを混合して１ウェルとすることなく、各ウェルを２ウェルに分けて播種して評価した以外は実施例４と同様に行った。結果を図９に示す。配列番号１１で表されるペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性およびＨＬＡ−Ａ＊２４：０２陽性の健常人由来の末梢血単核細胞より、該ペプチドに特異的なＣＴＬを誘導することが判明し、マウスのみならずヒトにおいてＣＴＬ誘導能を持つことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明により、ＣＴＬの誘導活性を有するＯＲ７Ｃ１由来の腫瘍抗原ペプチド等が提供される。本発明のペプチドは、がんの予防および／または治療剤として有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００９５】
配列番号３：合成ペプチド
配列番号４：合成ペプチド
配列番号５：合成ペプチド
配列番号６：合成ペプチド
配列番号７：合成ペプチド
配列番号８：合成ペプチド
配列番号９：合成ペプチド
配列番号１０：合成ペプチド
配列番号１１：合成ペプチド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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