(57)【要約】  自己免疫疾患の原因となる自己抗体を、優れた精度で検出できる自己抗体の検出方法を提供する。  本発明の自己抗体の検出方法は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスII分子により提示された変性タンパク質を含む抗原試薬と、サンプルとを接触させる接触工程、および、前記サンプルにおける自己抗体と前記抗原試薬における前記変性タンパク質との複合体を検出する検出工程を含むことを特徴とする。そして、この検出方法により、被検体から単離した生体試料について、前記自己抗体と前記変性タンパク質との複合体を検出することで、その検出結果から、前記被検体について、自己免疫疾患の罹患可能性を試験することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＨＣクラスII分子により提示された変性タンパク質を含む抗原試薬と、サンプルとを接触させる接触工程、および、
前記サンプルにおける自己抗体と前記抗原試薬における前記変性タンパク質との複合体を検出する検出工程を含むことを特徴とする、自己抗体の検出方法。
【請求項２】
前記変性タンパク質が、正常フォールドタンパク質のフォールディングが変性したミスフォールドタンパク質である、請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
前記変性タンパク質が、ＭＨＣクラスII分子の発現系細胞に正常フォールドタンパク質のコード遺伝子を導入することで得られる、ＭＨＣクラスII分子により提示された変性タンパク質である、請求項１または２記載の検出方法。
【請求項４】
前記変性タンパク質が、自己免疫疾患に関与する正常フォールドタンパク質が変性したタンパク質である、請求項１から３のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項５】
前記変性タンパク質が、ＩｇＧ重鎖、サイログロブリン、β２グリコプロテインＩおよび甲状腺刺激ホルモン受容体からなる群から選択された少なくとも一つが変性したタンパク質である、請求項１から４のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項６】
前記ＭＨＣクラスII分子が、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰおよびＨＬＡ−ＤＱからなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１から５のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項７】
前記ＭＨＣクラスII分子が、ＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ２、ＨＬＡ−ＤＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ５、ＨＬＡ−ＤＲ６、ＨＬＡ−ＤＲ７、ＨＬＡ−ＤＲ８、ＨＬＡ−ＤＲ１３、ＨＬＡ−ＤＲ１４、ＨＬＡ−ＤＲ１５、ＨＬＡ−ＤＱ３、ＨＬＡ−ＤＱ６、ＨＬＡ−ＤＱ８、ＨＬＡ−ＤＰ４およびＨＬＡ−ＤＰ５からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１から６のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項８】
前記ＭＨＣクラスII分子と前記変性タンパク質との組合せが、下記（１）から（４）からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１から７のいずれか一項に記載の検出方法。
（１）前記ＭＨＣクラスII分子が、ＨＬＡ−ＤＲを含み、前記変性タンパク質が、ＩｇＧ重鎖の変性タンパク質である
（２）前記ＭＨＣクラスII分子が、ＨＬＡ−ＤＲを含み、前記変性タンパク質が、サイログロブリンの変性タンパク質である
（３）前記ＭＨＣクラスII分子が、ＨＬＡ−ＤＲを含み、前記変性タンパク質が、β２グリコプロテインＩの変性タンパク質である
（４）前記ＭＨＣクラスII分子が、ＨＬＡ−ＤＰを含み、前記変性タンパク質が、甲状腺刺激ホルモン受容体の変性タンパク質である
【請求項９】
サンプルが、被検体から単離した生体試料であり、
請求項１から８のいずれか一項に記載の自己抗体の検出方法によって、前記サンプルにおける自己抗体とＭＨＣクラスII分子により提示された変性タンパク質との複合体を検出する検出工程、および、
前記検出工程における前記複合体の検出結果から、自己免疫疾患の罹患の可能性を試験する試験工程を含むことを特徴とする、自己免疫疾患の罹患の可能性を試験する方法。
【請求項１０】
前記検出工程が、前記複合体の形成量を測定する測定工程である、請求項９記載の試験方法。
【請求項１１】
前記試験工程において、前記測定工程で測定した前記複合体形成量の測定値と基準値とを比較し、前記測定値が前記基準値よりも高い場合に、前記被験者は、前記自己免疫疾患の罹患可能性があるとし、
前記基準値が、健常者から単離した生体試料における前記複合体の形成量である、請求項１０記載の試験方法。
【請求項１２】
請求項１から８のいずれか一項に記載の自己抗体の検出方法に用いる自己抗体の検出試薬であって、
ＭＨＣクラスII分子により提示された変性タンパク質を含むことを特徴とする、自己抗体の検出試薬。
【請求項１３】
請求項１２記載の検出試薬の製造方法であり、
ＭＨＣクラスII分子の発現系細胞に、正常フォールドタンパク質をコードする遺伝子を導入することで、前記正常フォールドタンパク質が変性した前記変性タンパク質が提示されたＭＨＣクラスII分子を調製する調製工程を含むことを特徴とする、検出試薬の製造方法。
【請求項１４】
サンプルが、自己免疫疾患の被検体から単離した生体試料であり、
請求項１から８のいずれか一項に記載の自己抗体の検出方法によって、前記サンプルにおける自己抗体とＭＨＣクラスII分子により提示された変性タンパク質との複合体を検出する検出工程、および、
前記自己抗体との前記複合体を形成した前記変性タンパク質を、前記自己免疫疾患に関連する自己抗体に対する抗原タンパク質と判断する判断工程を含むことを特徴とする、自己免疫疾患に関連する自己抗体に対する抗原タンパク質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己抗体の検出方法、自己免疫疾患の罹患の可能性を試験する方法、自己抗体の検出試薬、自己免疫疾患用の試験試薬、自己抗体の検出試薬の製造方法および自己免疫疾患に関連する自己抗体に対する抗原タンパク質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫疾患の診断には、一般的に、患者の症状等に基づく直接的な判断の他に、自己免疫疾患に特異的な自己抗体の検出に基づく間接的な判断が利用されている。前記自己抗体の検出は、通常、精製した抗原タンパク質を担体に固相化し、この固相化タンパク質との結合を確認するＥＬＩＳＡ法等が採用されている。しかしながら、医師により、症状に基づいて自己免疫疾患と診断された場合でも、それら全ての患者において、ＥＬＩＳＡ法により前記自己抗体が検出できるわけでは無かった。このため、ＥＬＩＳＡ法による自己抗体の検出のみでは偽陰性となることがあり、自己免疫疾患の診断には、その他の判断方法を併用する必要があった。そこで、信頼性に優れる自己免疫疾患の診断を行うために、優れた精度で自己抗体を検出できる方法の確立が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】S．LOIZOU  et.al．、「Measurement  of  anti−cardiolipin  antibodies  by  anenzyme−linked  immunosorbent  assay  （ELISA）：  standardization  and  quantitation  of  results」、Clin．exp．Immunol．、Wiley、1985年、vol.62、p.738-745
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、自己免疫疾患の原因となる自己抗体を、優れた精度で検出できる自己抗体の検出方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記本発明の課題を解決するために、本発明の自己抗体の検出方法は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスII分子により提示された変性タンパク質を含む抗原試薬と、サンプルとを接触させる接触工程、および、前記サンプルにおける自己抗体と前記抗原試薬における前記変性タンパク質との複合体を検出する検出工程を含むことを特徴とする。以下、「ＭＨＣクラスII分子により提示された変性タンパク質」を、「変性タンパク質／ＭＨＣクラスII」ともいう。【０００６】
本発明の自己免疫疾患の罹患の可能性を試験する方法は、サンプルが、被検体から単離した生体試料であり、前記本発明の自己抗体の検出方法によって、前記サンプルにおける自己抗体とＭＨＣクラスII分子により提示された変性タンパク質との複合体を検出する検出工程、および、前記検出工程における前記複合体の検出結果から、自己免疫疾患の罹患の可能性を試験する試験工程を含むことを特徴とする。【０００７】
本発明の自己抗体の検出試薬は、前記本発明の自己抗体の検出方法に用いる自己抗体の検出試薬であって、ＭＨＣクラスII分子により提示された変性タンパク質を含むことを特徴とする。また、本発明の自己免疫疾患の試験試薬は、前記本発明の自己抗体の検出試薬を含むことを特徴とする。【０００８】
本発明の自己抗体の検出試薬の製造方法は、前記本発明の検出試薬の製造方法であり、ＭＨＣクラスII分子の発現系細胞に、正常フォールドタンパク質をコードする遺伝子を導入することで、前記正常フォールドタンパク質が変性した前記変性タンパク質が提示されたＭＨＣクラスII分子を調製する調製工程を含むことを特徴とする。【０００９】
本発明のスクリーニング方法は、自己免疫疾患に関連する自己抗体に対する抗原タンパク質のスクリーニング方法であり、サンプルが、自己免疫疾患の被検体から単離した生体試料であり、前記本発明の自己抗体の検出方法によって、前記サンプルにおける自己抗体とＭＨＣクラスII分子により提示された変性タンパク質との複合体を検出する検出工程、および、前記自己抗体との前記複合体を形成した前記変性タンパク質を、前記自己免疫疾患に関連する自己抗体に対する抗原タンパク質と判断する判断工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
抗原提示細胞内において、タンパク質抗原はペプチド断片に分解され、前記ペプチド断片はＭＨＣクラスII分子に結合して、前記細胞の表面まで運ばれ、前記細胞表面上に提示されることが知られている。しかしながら、本発明者らは、鋭意研究の結果、以下の知見を得た。すなわち、まず、前記ＭＨＣクラスII分子は、分解された前記ペプチド断片を提示するだけでなく、前記細胞の小胞体（ＥＲ）内でミスフォールドされた変性タンパク質と結合し、前記細胞表面に提示すること、さらに、自己抗体が、前記ＭＨＣクラスII分子により細胞表面に提示された前記変性タンパク質を認識して、前記変性タンパク質に結合するとの知見である。これらは、本願の出願当初には報告されていない機構であって、本発明者によって初めて見出されたものである。そして、本発明者らは、前述のように、従来のＥＬＩＳＡ法で使用される精製タンパク質、すなわち、正常にフォールディングされた正常フォールドタンパク質と、前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスIIとを、それぞれ抗原試薬として使用し、自己抗体を検出した結果、前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスIIは、前記正常フォールドタンパク質よりも高い特異性で、自己免疫疾患の患者の自己抗体に認識されることを確認し、本発明を確立にするに至った。このため、自己抗体を検出するための抗原試薬として、前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスIIを使用する本発明によれば、自己免疫疾患に関与する自己抗体を優れた精度で検出できる。そして、例えば、前記正常フォールドタンパク質を使用するＥＬＩＳＡ法では検出できなかった自己抗体を検出できるため、従来のような偽陰性の問題を抑制し、優れた精度で自己免疫疾患の罹患の可能性を判断できる。このため、本発明は、例えば、臨床分野および生化学分野において極めて有用である。【００１１】
前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスIIを抗原試薬とすることにより、前記正常フォールドタンパク質を抗原試薬とするよりも優れた精度で自己抗体の検出が可能である理由は、以下のように考えられる。すなわち、前記サンプルにおける自己抗体は、正常フォールドタンパク質に対しては、交差反応性で結合しているのであって、前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスIIに対しては、特異的に結合しているためと推測される。なお、この推定は本発明を何ら制限しない。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、実施例１Ａにおける、細胞表面のＩｇＧおよびＭＨＣクラスII分子の発現量を示したヒストグラムである。
【図２】図２は、実施例１Ｂにおける、ＩｇＧとＭＨＣクラスII分子との結合を示したウェスタンブロットの写真である。
【図３】図３は、実施例１Ｃにおける、細胞表面のＩｇＧもしくはＭＨＣクラスII分子の発現量またはＭＨＣクラスII分子に提示されたＩｇＧ重鎖へのリウマチ因子もしくはＲＦ６１リウマチ因子の結合量を示したヒストグラムである。
【図４】図４は、実施例１Ｄにおける、ＭＨＣクラスII分子に提示されたＩｇＧへのリウマチ因子陰性もしくは陽性患者由来の血清中のＩｇＭの結合量を示したグラフである。
【図５】図５は、実施例１Ｅにおける、細胞表面におけるＩｇＧ重鎖、もしくはＨＬＡ−ＤＲの発現量、または自己抗体の結合量を示すヒストグラムである。
【図６】図６は、実施例１Ｆにおける、異なるハプロタイプＭＨＣクラスII分子に提示されたＩｇＧへのＲＦの結合量とリウマチ感受性のオッズ比とを比較したグラフである。
【図７】図７は、実施例１Ｇにおける、細胞表面における自己抗体の結合量を示すヒストグラムである。
【図８】図８は、実施例１Ｇにおける、抗HLA-DR/IgGH複合体抗体価（aHLA-DR/IgGH）の標準曲線を示すグラフである。
【図９】図９は、実施例１Ｇにおける、aHLA-DR/IgGH値とＲＦ値とを比較したグラフである。
【図１０】図１０は、実施例２Ａにおける、異なるハプロタイプのＭＨＣクラスII分子を用いたときの細胞表面のサイログロブリン（ＴＧ）の発現量を示すヒストグラムである。
【図１１】図１１は、実施例２Ｂにおける、ＴＧとＭＨＣクラスII分子との結合を示したウェスタンブロットの写真である。
【図１２】図１２は、実施例２Ｃにおける、異なるハプロタイプのＭＨＣクラスII分子に提示されたＴＧへの抗ＴＧ抗体陰性もしくは陽性の橋本病患者または健常者由来の血清中の抗体の結合量を示したヒストグラムである。
【図１３】図１３は、実施例２Ｄにおける、異なるハプロタイプのＭＨＣクラスII分子に提示されたＴＧへの連続希釈した抗ＴＧ抗体陰性または陽性の橋本病患者由来の血清中の抗体の結合量を示したグラフである。
【図１４】図１４は、実施例２Ｅにおける、異なるハプロタイプのＭＨＣクラスII分子に提示されたＴＧへの橋本病患者由来の血清中の抗体の結合量を比較したグラフである。
【図１５】図１５は、実施例３Ａにおける、細胞表面におけるβ２グリコプロテインＩ（β２−ＧＰＩ）もしくはＭＨＣクラスII分子の発現量またはＭＨＣクラスII分子に提示されたβ２−ＧＰＩへの抗カルジオリピン抗体の結合量を示すヒストグラムである。
【図１６】図１６は、実施例３Ｂにおける、異なるハプロタイプのＭＨＣクラスII分子を用いたときの細胞表面のβ２−ＧＰＩの発現量を示すグラフである。
【図１７】図１７は、実施例３Ｂにおける、異なるハプロタイプのＭＨＣクラスII分子に提示されたβ２−ＧＰＩへの抗カルジオリピン抗体の結合量を示すグラフである。
【図１８】図１８は、実施例３Ｃにおける、β２−ＧＰＩとＭＨＣクラスII分子との結合を示したウェスタンブロットの写真である。
【図１９】図１９は、実施例３Ｄにおける、抗HLA-DR/β2-GPI複合体抗体価（aHLA-DR/β2-GPI）の標準曲線を示すグラフである。
【図２０】図２０は、実施例３Ｄにおける、抗リン脂質抗体症候群患者および健常者の血清のHLA-DR/β2-GPI複合体システムによる抗リン脂質抗体算出値（aHLA-DR/β2-GPI値）を示すグラフである。
【図２１】図２１は、実施例３Ｄにおいて、ＡＰＳ患者の血清について、HLA-DR/β2-GPI複合体システムによる自己抗体値（aHLA-DR/β2-GPI値）とＥＬＩＳＡ法による抗リン脂質抗体測定値または抗カルジオリピン抗体測定値とを比較したグラフである。
【図２２】図２２は、実施例４における、細胞表面におけるＴＳＨＲもしくはＭＨＣクラスII分子の発現量、またはＭＨＣクラスII分子に提示されたＴＳＨＲへの自己抗体の結合量を示すヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜自己抗体の検出方法＞
本発明の自己抗体の検出方法は、前述のように、ＭＨＣクラスII分子により提示された変性タンパク質を含む抗原試薬と、サンプルとを接触させる接触工程、および、前記サンプルにおける自己抗体と前記抗原試薬における前記変性タンパク質との複合体を検出する検出工程を含むことを特徴とする。
【００１４】
本発明の検出方法において、前記変性タンパク質は、例えば、正常タンパク質ではないことを意味する。本発明において、前記変性タンパク質は、例えば、正常フォールドタンパク質のフォールディングが変性したミスフォールドタンパク質である。
【００１５】
本発明の検出方法において、前記変性タンパク質が、ＭＨＣクラスII分子の発現系細胞に正常フォールドタンパク質のコード遺伝子を導入することで得られる、ＭＨＣクラスII分子により提示された変性タンパク質であることが好ましい。本発明において、前記変性タンパク質は、例えば、正常タンパク質のフォールディングと比較して、どのようにミスフォールドしているかにはかかわらず、前記発現系細胞に前記正常タンパク質のコード遺伝子を導入することで得られる、ＭＨＣクラスII分子により提示されたタンパク質であることが好ましい。
【００１６】
本発明の検出方法において、さらに、ＭＨＣクラスII分子の発現系細胞に、正常フォールドタンパク質をコードする遺伝子を導入することで、前記正常フォールドタンパク質が変性した前記変性タンパク質が提示されたＭＨＣクラスII分子を調製する調製工程を含むことが好ましい。
【００１７】
本発明の検出方法において、前記変性タンパク質が、例えば、自己免疫疾患に関与する正常フォールドタンパク質が変性したタンパク質である。
【００１８】
本発明の検出方法において、前記変性タンパク質が、例えば、ＩｇＧ重鎖、サイログロブリン、β２グリコプロテインＩおよび甲状腺刺激ホルモン受容体からなる群から選択された少なくとも一つが変性したタンパク質である。
【００１９】
本発明の検出方法において、前記ＭＨＣクラスII分子が、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰおよびＨＬＡ−ＤＱからなる群から選択された少なくとも一つであることが好ましい。本発明において、前記ＭＨＣクラスII分子が、例えば、自己免疫疾患感受性ＭＨＣクラスII分子である。
【００２０】
本発明の検出方法において、例えば、前記ＭＨＣクラスII分子が、ＨＬＡ−ＤＲを含み、前記変性タンパク質が、ＩｇＧ重鎖の変性タンパク質である。これにより、例えば、関節リウマチに関連する自己抗体を検出できる。
【００２１】
本発明において、例えば、前記ＭＨＣクラスII分子が、ＨＬＡ−ＤＲを含み、前記変性タンパク質が、サイログロブリンの変性タンパク質である。これにより、例えば、橋本病に関連する自己抗体を検出できる。
【００２２】
本発明において、例えば、前記ＭＨＣクラスII分子が、ＨＬＡ−ＤＲを含み、前記変性タンパク質が、β２グリコプロテインＩの変性タンパク質である。これにより、例えば、抗リン脂質抗体症候群に関連する自己抗体を検出できる。
【００２３】
本発明において、例えば、前記ＭＨＣクラスII分子が、ＨＬＡ−ＤＰを含み、前記変性タンパク質が、甲状腺刺激ホルモン受容体の変性タンパク質である。これにより、例えば、バセドウ病（Graves病）に関連する自己抗体を検出できる。
【００２４】
本発明の自己抗体の検出方法は、前記検出工程において、前記サンプルにおける「自己抗体」と、前記抗原試薬における「ＭＨＣクラスII分子により提示された変性タンパク質（変性タンパク質／ＭＨＣクラスII）」との複合体を形成させ、これを検出することが特徴であって、その他の工程および条件は、特に制限されない。
【００２５】
本発明において、自己抗体とは、例えば、前記サンプルの由来となる被検体で生産される抗体であって、前記被検体の自己成分（自己抗原）に対する抗体を意味する。具体例として、例えば、動物個体において、前記個体の自己抗原に対して産生される抗体等があげられる。前記自己抗体は、前述のように、自己免疫疾患に関連し、その有無または量の測定が、自己免疫疾患の診断、治療または予後の判定において重要であることが知られている。このため、本発明の自己抗体の検出方法は、例えば、自己免疫疾患の診断等において、非常に有用である。
【００２６】
（１）抗原試薬
本発明において、自己抗体を検出するための抗原試薬は、自己抗体の検出試薬ということもできる。前記抗原試薬は、前述のように、ＭＨＣクラスII分子により提示された変性タンパク質である。前記変性タンパク質の形態は、特に制限されない。一例として、前記抗原試薬は、前記変性タンパク質が前記ＭＨＣクラスII分子の結合溝に結合した、前記変性タンパク質と前記ＭＨＣクラスII分子との複合体の形態があげられる。前記複合体は、例えば、前記複合体のみの形態でもよいし、前記複合体をその表面に提示した細胞（例えば、抗原提示細胞）の形態でもよい。また、その他の例として、前記抗原試薬は、例えば、前記ＭＨＣクラスII分子との結合を解離した、前記変性タンパク質（ＭＨＣクラスII分子未結合の変性タンパク質）の形態でもよい。
【００２７】
本発明において、前記変性タンパク質は、例えば、正常フォールドタンパク質のフォールディングが変性したタンパク質である。前記正常フォールドタンパク質とは、例えば、正常に折りたたまれたタンパク質を意味する。
【００２８】
（２）抗原試薬の調製
本発明において、前記変性タンパク質は、例えば、ＭＨＣクラスII分子の発現系細胞に正常フォールドタンパク質のコード遺伝子を導入することで得られる、ＭＨＣクラスII分子により提示された変性タンパク質であることが好ましい。このため、本発明は、例えば、前記接触工程に先立って、前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスIIを調製する調製工程、すなわち、ＭＨＣクラスII分子の発現系細胞に、正常フォールドタンパク質をコードする遺伝子を導入することで、前記正常フォールドタンパク質が変性した前記変性タンパク質が提示されたＭＨＣクラスII分子を調製する調製工程を含んでもよい。
【００２９】
前記ＭＨＣクラスII分子の発現系細胞に、正常フォールドタンパク質をコードする遺伝子を導入すれば、前述のように、前記発現系細胞において、前記遺伝子から発現したタンパク質は、正常フォールドタンパク質の正常なフォールディングではなく、ミスフォールドが生じ、このミスフォールドされた変性タンパク質が、発現した前記ＭＨＣクラスII分子と結合して、前記細胞の表面に提示される。
【００３０】
前記正常フォールドタンパク質は、例えば、自己免疫疾患に関与するタンパク質であり、具体例として、自己免疫疾患において、自己抗体の結合が知られているタンパク質があげられる。前述のように、従来から自己免疫疾患における自己抗原と考えられているタンパク質を合成し、その精製タンパク質を抗原タンパク質として担体に固定化し、前記抗原タンパク質と自己抗体との結合による複合体形成を検出することで、自己抗体の検出が行われている。しかしながら、同じ塩基配列からタンパク質を生成した場合でも、自己免疫疾患と自己抗体の検出結果との相関関係は、前述のように、従来の正常フォールドタンパク質に対して結合する自己抗体の検出結果よりも、前記ＭＨＣクラスII分子により提示されたミスフォールドされた変性タンパク質に対して結合する自己抗体の検出結果の方が、相関性に優れる。したがって、本発明においては、例えば、従来、自己抗体との結合が知られていた正常フォールドタンパク質のコード遺伝子を、前記ＭＨＣクラスII分子の発現系細胞に導入し、前記コード遺伝子から発現したタンパク質を、ミスフォールドされた変性タンパク質として、前記ＭＨＣクラスII分子により提示させ、これを抗原試薬とすることが好ましい。
【００３１】
前記正常フォールドタンパク質は、特に制限されず、例えば、公知のタンパク質あげられる。前記正常フォールドタンパク質の由来は、特に制限されず、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト動物等があげられ、前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、イヌ、サル、ウサギ、ヒツジ、ウマ等があげられる。
【００３２】
前記正常フォールドタンパク質は、前述のように、自己免疫疾患に関与するタンパク質であり、具体例として、自己抗体との結合が知られているタンパク質があげられる。前記正常フォールドタンパク質は、特に制限されず、例えば、ＩｇＧ重鎖、サイログロブリン、β２グリコプロテインＩ（β２−ＧＰＩ）、インスリン、サイロイドペルオキシダーゼ、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）等、後述する表１に記載したもの等があげられる。そして、本発明において、前記変性タンパク質は、例えば、これらの正常フォールドタンパク質の正常フォールドに対して、ミスフォールドが生じた変性タンパク質である。具体例として、本発明において、ＩｇＧ重鎖の変性タンパク質は、例えば、関節リウマチに関連する自己抗体に対する抗原試薬となり、サイログロブリンの変性タンパク質は、例えば、橋本病に関連する自己抗体に対する抗原試薬となり、β２グリコプロテインＩの変性タンパク質は、抗リン脂質抗体症候群に関連する自己抗体に対する抗原試薬となり、ＴＳＨＲの変性タンパク質は、バセドウ病に関連する自己抗体に対する抗原試薬となる。
【００３３】
前記ＭＨＣクラスII分子の由来は、特に制限されず、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト動物等があげられ、前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、イヌ、サル、ウサギ、ヒツジ、ウマ等があげられる。前記ＭＨＣクラスII分子の由来は、例えば、前記正常タンパク質の由来と同じでもよいし、異なっていてもよい。
【００３４】
前記ＭＨＣクラスII分子は、α鎖およびβ鎖の複合体であり、それぞれの種類は特に制限されず、これらをコードする遺伝子のハロタイプは、特に制限されない。
【００３５】
前記ＭＨＣクラスII分子がヒト由来である場合、前記ＭＨＣクラスII分子のα鎖は、例えば、ＨＬＡ−ＤＰＡ遺伝子座、ＨＬＡ−ＤＱＡ遺伝子座またはＨＬＡ−ＤＲＡ遺伝子座にコードされているＭＨＣクラスII分子のα鎖があげられ、前記ＭＨＣクラスII分子のβ鎖は、例えば、ＨＬＡ−ＤＰＢ遺伝子座、ＨＬＡ−ＤＱＢ遺伝子座またはＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子座にコードされているＭＨＣクラスII分子のβ鎖があげられる。前記各遺伝子座におけるＭＨＣクラスα鎖およびβ鎖のハプロタイプは、特に制限されない。前記ＭＨＣクラスII分子は、例えば、α鎖およびβ鎖のいずれか一方を含む分子であり、α鎖およびβ鎖の両方を含む分子であることが好ましい。
【００３６】
前記ＭＨＣクラスII分子は、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰおよびＨＬＡ−ＤＱ等が好ましく、特に、後述する表１に記載した自己免疫疾患に関連したＭＨＣクラスII分子が例示できる。
【００３７】
前記ＨＬＡ−ＤＲは、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ２、ＨＬＡ−ＤＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ５、ＨＬＡ−ＤＲ６、ＨＬＡ−ＤＲ７、ＨＬＡ−ＤＲ８、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１０、ＨＬＡ−ＤＲ１１、ＨＬＡ−ＤＲ１２、ＨＬＡ−ＤＲ１３、ＨＬＡ−ＤＲ１４、ＨＬＡ−ＤＲ１５、ＨＬＡ−ＤＲ５２、ＨＬＡ−ＤＲ５３等があげられる。前記ＨＬＡ−ＤＲは、例えば、α鎖としてＨＬＡ−ＤＲＡ１等のＨＬＡ−ＤＲＡと、β鎖としてＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４またはＨＬＡ−ＤＲＢ５等のＨＬＡ−ＤＲＢとを含む分子があげられ、具体的には、α鎖として、例えば、ＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１等のアリル、β鎖として、例えば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０７、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１０、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１６、ＨＬＡ−ＤＲＢ３＊０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ４＊０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ５＊０１等のアリルがあげられる。
【００３８】
前記ＨＬＡ−ＤＱは、例えば、ＨＬＡ−ＤＱ１、ＨＬＡ−ＤＱ２、ＨＬＡ−ＤＱ３、ＨＬＡ−ＤＱ４、ＨＬＡ−ＤＱ５、ＨＬＡ−ＤＱ６、ＨＬＡ−ＤＱ７、ＨＬＡ−ＤＱ８等があげられる。前記ＨＬＡ−ＤＱは、例えば、α鎖としてＨＬＡ−ＤＱＡ１等のＨＬＡ−ＤＱＡと、β鎖としてＨＬＡ−ＤＱＢ１等のＨＬＡ−ＤＱＢとを含む分子があげられ、具体的には、α鎖として、例えば、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０２、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０３、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０４、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０５、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０６、β鎖として、例えば、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０４、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６等のアリルがあげられる。
【００３９】
前記ＨＬＡ−ＤＰは、例えば、ＨＬＡ−ＤＰ１、ＨＬＡ−ＤＰ２、ＨＬＡ−ＤＰ３、ＨＬＡ−ＤＰ４、ＨＬＡ−ＤＰ５等があげられる。前記ＨＬＡ−ＤＰは、例えば、α鎖としてＨＬＡ−ＤＰＡ１等のＨＬＡ−ＤＰＡと、β鎖としてＨＬＡ−ＤＰＢ１等のＨＬＡ−ＤＰＢとを含む分子があげられ、具体的には、α鎖として、例えば、ＨＬＡ−ＤＰＡ１＊０１、ＨＬＡ−ＤＰＡ１＊０２、ＨＬＡ−ＤＰＡ１＊０３、ＨＬＡ−ＤＰＡ１＊０４等、β鎖として、例えば、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０２、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９等のアリルがあげられる。
【００４０】
前記各アリルは、特に制限されず、例えば、後述する表１に示す例示があげられる。
【００４１】
前記ＭＨＣクラスII分子は、例えば、前述のように、自己免疫疾患感受性ＭＨＣクラスII分子であってもよい。前記自己免疫疾患感受性ＭＨＣクラスII分子とは、例えば、他のＭＨＣクラスα鎖およびβ鎖のハプロタイプ（アリル）に対して、前記自己免疫疾患を発症する確率が相対的に高いＭＨＣクラスα鎖およびβ鎖の少なくとも一方を含むＭＨＣクラスII分子である。前記ＭＨＣクラスII分子は、例えば、１種類を使用してもよいし、２種類以上を併用してもよい。
【００４２】
前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスIIにおける、前記ＭＨＣクラスII分子と前記変性タンパク質との組合せは、特に制限されない。前記組合せの具体例として、例えば、前記自己免疫疾患、前記ＭＨＣクラスII分子および前記変性タンパク質との関係において、下記表１Ａ〜Ｌの組合せがあげられる。前記組合せは、例えば、１種類を使用してもよいし、２種類以上を併用してもよい。
【００４３】
【表１Ａ】
2015008498.tif 000002
【００４４】
【表１Ｂ】
2015008498.tif 000003
【００４５】
【表１Ｃ】
2015008498.tif 000004
【００４６】
【表１Ｄ】
2015008498.tif 000005
【００４７】
【表１Ｅ】
2015008498.tif 000006
【００４８】
【表１Ｆ】
2015008498.tif 000007
【００４９】
【表１Ｇ】
2015008498.tif 000008
【００５０】
【表１Ｈ】
2015008498.tif 000009
【００５１】
【表１Ｉ】
2015008498.tif 000010
【００５２】
【表１Ｊ】
2015008498.tif 000011
【００５３】
【表１Ｋ】
2015008498.tif 000012
【００５４】
【表１Ｌ】
2015008498.tif 000013
【００５５】
具体例としては、例えば、前記ＭＨＣクラスII分子が、ＨＬＡ−ＤＲを含み、前記変性タンパク質が、ＩｇＧ重鎖の変性タンパク質である場合、関節リウマチに関連する自己抗体を検出できる。前記ＨＬＡ−ＤＲは、例えば、α鎖としてＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１と、β鎖としてＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５からなる群から選択された少なくとも１つとを含む分子が例示できる。また、例えば、前記ＭＨＣクラスII分子が、ＨＬＡ−ＤＲを含み、前記変性タンパク質が、サイログロブリンの変性タンパク質である場合、橋本病に関連する自己抗体を検出できる。前記ＨＬＡ−ＤＲは、例えば、α鎖としてＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１と、β鎖としてＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５およびＨＬＡ−ＤＲＢ４＊０１からなる群から選択された少なくとも１つとを含む分子が例示できる。また、例えば、前記ＭＨＣクラスII分子が、ＨＬＡ−ＤＲを含み、前記変性タンパク質が、β２グリコプロテインＩの変性タンパク質である場合、抗リン脂質抗体症候群に関連する自己抗体を検出できる。前記ＨＬＡ−ＤＲは、例えば、α鎖としてＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１と、β鎖としてＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０７の少なくとも一方とを含む分子が例示できる。また、例えば、前記ＭＨＣクラスII分子が、ＨＬＡ−ＤＰを含み、前記変性タンパク質が、ＴＳＨＲの変性タンパク質である場合、バセドウ病に関連する自己抗体を検出できる。前記ＨＬＡ−ＤＰは、例えば、α鎖としてＨＬＡ−ＤＰＡ１＊０２と、β鎖としてＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５とを含む分子が例示できる。
【００５６】
前記ＭＨＣクラスII分子の発現系細胞は、特に制限されず、例えば、前記ＭＨＣクラスII分子を発現する細胞であり、前記導入された前記正常フォールドタンパク質のコード遺伝子を発現できればよい。前記細胞は、前記ＭＨＣクラスII分子のコード遺伝子を、内在性遺伝子として有する細胞でもよいし、外来性遺伝子として有する細胞でもよい。前者の場合は、例えば、前記ＭＨＣクラスII分子のコード遺伝子を、内在性遺伝子として有する宿主細胞に、前記正常フォールドタンパク質のコード遺伝子を導入すればよく、後者の場合は、宿主細胞に、例えば、前記正常フォールドタンパク質のコード遺伝子と前記ＭＨＣクラスII分子のコード遺伝子とを共導入すればよい。
【００５７】
前記正常フォールドタンパク質のコード遺伝子は、例えば、前記正常フォールドタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｃＤＮＡ）、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター等があげられる。前記ＭＨＣクラスII分子のコード遺伝子は、例えば、前記ＭＨＣクラスII分子をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｃＤＮＡ）、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター等があげられる。
【００５８】
前記各コード遺伝子の導入方法は、特に制限されず、例えば、パーティクルガン等の遺伝子銃による導入法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポソームを用いるリポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、ハイドロダイナミック法、カチオニックリポソーム法、導入補助剤を用いる方法、アグロバクテリウムを介する方法等があげられる。前記リポソームは、例えば、リポフェクタミンおよびカチオニックリポソーム等があげられ、前記導入補助剤は、例えば、アテロコラーゲン、ナノ粒子およびポリマー等があげられる。
【００５９】
前記宿主細胞は、特に制限されず、例えば、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等があげられる。前記動物細胞は、特に制限されず、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、グリア細胞等の免疫系細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。前記細胞は、例えば、ヒト受精卵、ならびに、ヒト胚およびヒト個体内の細胞を除く。また、内在性遺伝子として前記ＭＨＣクラスII分子のコード遺伝子を有する宿主細胞は、例えば、前記免疫系細胞があげられる。
【００６０】
前記発現ベクターは、例えば、前記宿主において、前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現可能なように、機能的に前記ポリヌクレオチドが連結されていればよく、その他の構成は、特に制限されない。
【００６１】
前記発現ベクターは、例えば、骨格となるベクター（以下、「基本ベクター」ともいう）に、前記ポリヌクレオチドを挿入することで作製できる。前記基本ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜決定できる。動物細胞に形質転換を行う場合、前記基本ベクターとして、例えば、ｐＭＥ１８Ｓ、ｐＣＡＧＧＳ等があげられる。
【００６２】
前記発現ベクターは、例えば、前記ポリヌクレオチドの発現を調節する調節配列を有することが好ましい。前記調節配列は、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等があげられる。前記プロモーターの由来は、特に制限されず、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアンウイルス−４０（ＳＶ−４０）、筋βアクチンプロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）等があげられる。前記プロモーターは、この他に、例えば、チミジンキナーゼプロモーター等の組織特異的プロモーター、成長ホルモン調節性プロモーター等の調節性プロモーター、ｌａｃオペロン配列の制御下にあるプロモーター、亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーター等の誘導性プロモーター等があげられる。前記発現ベクターにおいて、前記調節配列の配置は、特に制限されない。前記発現ベクターにおいて、前記調節配列は、例えば、前記ポリヌクレオチドの発現およびこれがコードする前記サブユニットの発現を、機能的に調節できるように配置されていればよく、公知の方法に基づいて配置できる。前記調節配列は、例えば、前記基本ベクターが予め備える配列を利用してもよいし、前記基本ベクターに、さらに、前記調節配列を挿入してもよいし、前記基本ベクターが備える調節配列を、他の調節配列に置き換えてもよい。
【００６３】
前記発現ベクターは、例えば、さらに、選択マーカーのコード配列を有してもよい。前記選択マーカーは、例えば、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等があげられる。
【００６４】
前記宿主細胞の培養方法は、特に制限されず、前記宿主細胞の種類に応じて、適宜決定できる。
【００６５】
このように、前記ＭＨＣクラスII分子の発現系細胞に、前記正常フォールドタンパク質をコードする遺伝子を導入することで、前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスIIを提示する細胞を得ることができる。
【００６６】
本発明は、例えば、前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスIIを提示する細胞を、そのまま抗原試薬として使用してもよいし、前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスIIを提示する細胞から、前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスIIを解離して、これを抗原試薬として使用してもよく、さらに、前記変性タンパク質と前記ＭＨＣクラスII分子との複合体から、前記変性タンパク質を解離して、これを抗原試薬として使用することもできる。この場合、例えば、前記細胞からの前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスIIの精製、または、前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスIIからの前記変性タンパク質の精製を行うことが好ましい。前記精製方法は、特に制限されず、公知の手法を用いることができる。前記精製方法は、例えば、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等があげられる。
【００６７】
本発明は、前記接触工程に先立って、前述のような、前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスIIを調製する調製工程を含んでもよく、さらに、前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスIIを精製する精製工程を含んでもよい。
【００６８】
本発明において、前記抗原試薬は、例えば、前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスIIのみを含んでもよいし、さらにその他の成分を含んでもよい。前記抗原試薬において、前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスIIの種類は、例えば、１種類でもよいし、２種類以上を併用してもよい。
【００６９】
前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスIIは、例えば、遊離した状態で使用してもよいし、担体に固定化した状態で使用してもよい。後者の場合、前記抗原試薬は、例えば、前記その他の成分として前記担体を含む。前記担体は、特に制限されず、例えば、ウェルプレート等のプレート、ビーズ等があげられる。
【００７０】
前記その他の成分は、例えば、水、生理食塩水、緩衝液、生理緩衝液、培地等があげられる。
【００７１】
（３）接触工程
本発明において、前記接触工程は、前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスIIを含む前記抗原試薬と前記サンプルとを接触させる工程である。
【００７２】
前記サンプルは、特に制限されず、例えば、自己抗体を含みうる試料があげられ、例えば、生体試料等があげられる。前記生体試料は、特に制限されず、血液、体液、組織等があげられる。前記血液試料は、例えば、全血、血清、血漿等があげられる。前記体液試料は、特に制限されず、例えば、関節液、尿、唾液等があげられる。前記組織試料は、特に制限されず、例えば、前記自己免疫疾患の標的組織があげられ、具体例として、例えば、甲状腺、膵臓、血管、大脳、小脳、脊髄、眼神経、関節、骨、唾液腺、滑膜、心臓、肝臓等があげられる。前記サンプルの由来は、特に制限されず、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト動物等があげられ、前記非ヒト動物は、例えば、前述の通りである。
【００７３】
前記サンプルは、例えば、液体でも固体でもよく、例えば、取り扱いが容易であることから、液状の形態が好ましい。前記試料が液体の場合、例えば、前記試料の未希釈液をそのままサンプルとして使用してもよく、また、前記試料を媒体に懸濁、分散または溶解した希釈液を前記サンプルとして使用してもよい。前記試料が固体の場合、例えば、前記試料を前記媒体に懸濁、分散または溶解した希釈液を前記サンプルとして使用することが好ましい。前記媒体は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液、生理食塩緩衝液等があげられる。前記緩衝液は、特に制限されず、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、各種のグッド緩衝液等があげられる。
【００７４】
前記接触工程において、例えば、前記サンプルに前記抗原試薬を添加してもよいし、前記抗原試薬に前記サンプルを添加してもよい。前記サンプルと前記抗原試薬との添加割合は、特に制限されない。具体例として、前記サンプルとして血清を使用し、前記抗原試薬として前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスIIを提示する細胞を使用することが好ましい。また、前記血清と前記細胞との添加割合は、特に制限されず、例えば、１０００〜２０００万個（例えば、約５００万個）の細胞に対して、血清０．０１〜１ｍｌであり、前記血清は、例えば、５０〜１００００倍（例えば、約３００倍）に希釈した希釈血清サンプルとして添加することが好ましい。
【００７５】
前記接触工程において、前記サンプルと前記抗原試薬とは、例えば、両者を接触させてから、一定期間インキュベートすることが好ましい。インキュベートの条件は、特に制限されず、温度は、例えば、０〜３７℃、好ましくは０〜１０℃、より好ましくは０〜５℃であり、ｐＨは、例えば、ｐＨ６〜９、好ましくはｐＨ７〜８、より好ましくはｐＨ７．２〜７．６であり、時間は、例えば、３〜１２０分、好ましくは１０〜９０分、より好ましくは３０〜６０分である。
【００７６】
（４）検出工程
本発明において、前記検出工程は、前記サンプルにおける自己抗体と前記抗原試薬における前記変性タンパク質との複合体を検出する検出工程である。前記検出工程において、例えば、前記複合体の有無の確認（定性分析）、前記複合体の量の測定（定量分析）が可能である。前記複合体は前記自己抗体を含むことから、前記複合体の検出により、間接的に、前記自己抗体を検出できる。
【００７７】
前記複合体は、例えば、前記抗原試薬における前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスIIの形態によって異なってもよい。前記抗原試薬が、前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスIIを提示した細胞を含む場合、前記複合体は、例えば、前記自己抗体と、前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスIIを提示した細胞との複合体であり、前記抗原試薬が、前記細胞から解離された前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスIIを含む場合、前記複合体は、例えば、前記自己抗体と前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスIIとの複合体であり、前記抗原試薬が、前記ＭＨＣクラスII分子から解離された前記変性タンパク質を含む場合、前記複合体は、例えば、前記自己抗体と前記変性タンパク質との複合体である。いずれの複合体も、例えば、前記自己抗体と前記変性タンパク質との結合により形成されていることが好ましい。
【００７８】
前記検出工程において、前記複合体を検出する方法は、特に制限されない。前記検出方法としては、例えば、前記複合体における前記自己抗体を検出する物質を使用し、前記検出物質を測定することで、間接的に前記複合体を検出する方法があげられる。
【００７９】
前記検出物質は、例えば、前記自己抗体（一次抗体）に結合する、ポリクローナル抗体等の二次抗体があげられる。前記二次抗体は、例えば、標識物質で標識された抗体が好ましい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体、酵素等があげられる。前記蛍光物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８等のＡｌｅｘａ色素等があげられ、前記同位体は、例えば、安定同位体および放射性同位体があげられ、好ましくは安定同位体である。前記酵素は、特に制限されず、例えば、西洋わさび由来ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ等があげられる。前記標識物質が前記酵素の場合、例えば、前記酵素に対する基質を併用することが好ましく、前記基質は、例えば、前記酵素の触媒反応により、例えば、蛍光、発光等を生じる物質が好ましい。
【００８０】
前記基質は、特に制限されず、例えば、過酸化水素、3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine（TMB）、1,2-Phenylenediamine（OPD）、2,2’-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic  Acid  Ammonium  Salt（ABTS）、3,3’-Diaminobenzidine（DAB）、3,3’-Diaminobenzidine  Tetrahydrochloride  Hydrate（DAB4HCl）、3-Amino-9-ethylcarbazole（AEC）、4-Chloro-1-naphthol（4C1N）、2,4,6-Tribromo-3-hydroxybenzoic  Acid、2,4-Dichlorophenol、4-Aminoantipyrine、4-Aminoantipyrine  Hydrochloride、ルミノール、ルシフェリン等があげられる。
【００８１】
また、前記検出方法は、例えば、前記複合体の形態によって、適宜選択できる。前記複合体が、前記自己抗体と、前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスIIを提示した細胞との複合体の場合、例えば、フローサイトメトリー、蛍光強度計、蛍光顕微鏡等の方法により検出できる。
【００８２】
前記検出工程において、検出条件は、特に制限されず、前記検出方法に応じて、適宜決定できる。
【００８３】
＜自己免疫疾患の罹患の可能性を試験する方法＞
本発明の自己免疫疾患の罹患の可能性を試験する方法は、前述のように、サンプルが、被検体から単離した生体試料であり、前記本発明の自己抗体の検出方法によって、前記サンプルにおける自己抗体と前記ＭＨＣクラスII分子により提示された変性タンパク質（前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスII）との複合体を検出する検出工程、および、前記検出工程における前記複合体の検出結果から、自己免疫疾患の罹患の可能性を試験する試験工程を含むことを特徴とする。
【００８４】
本発明の試験方法は、前記本発明の検出方法によって前記複合体を検出することにより、間接的に前記生体試料の自己抗体を検出することが特徴であって、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の試験方法によれば、優れた精度で自己抗体を検出でき、これに伴い、優れた精度で自己免疫疾患の罹患可能性を試験できる。本発明の試験方法は、特に示さない限り、前記本発明の検出方法の記載を援用できる。
【００８５】
本発明の試験方法において、前記被検体は、特に制限されず、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト動物等があげられ、前記非ヒト動物は、例えば、前述の通りである。
【００８６】
本発明の試験方法において、試験対象の自己免疫疾患は、特に制限されず、例えば、関節リウマチ、橋本病、バセドウ病（Graves病）、抗リン脂質抗体症候群、インスリン自己免疫疾患症候群、天疱瘡、類天疱瘡、強皮症、シェーグレン症候群、グッドパスチャー症候群（Goodpasture症候群）、膜性腎症、ＩｇＡ腎症、全身性エリテマトーデス（ループスエリテマトーゼス）、拡張型心筋症、ＩｇＧ４関連疾患、ANCA関連血管炎、重症筋無力症、原田病、ナルコレプシー、Ｂｕｒｇｅｒ病、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、視神経脊髄炎、原発性胆汁性肝硬変、Ｃｒｏｈｎ病、潰瘍性大腸炎、混合結合組織病、Ｗｅｇｅｎｅｒ肉芽腫症、尋常性白斑、多発性筋炎／皮膚炎、血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、突発性アジソン病、突発性自己免疫性肝炎、自己免疫性膵炎、萎縮性胃炎、原発性硬化性胆管炎、大動脈炎症候群（高安動脈炎）、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性内耳障害、特発性無精子症、急性散在性脳脊髄炎、円形脱毛症、自己免疫性心筋症、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、チャーグ・ストラウス症候群、特発性肺線維症、ギランバレー症候群、硬化性苔癬、顕微鏡的多発血管炎、発作性夜間血色素尿症、再発性多発軟骨炎、サルコイドーシス、スティッフパーソン症候群等があげられる。前記自己免疫疾患と、前記変性タンパク質および前記ＭＨＣクラスIIとの関係の具体例は、例えば、前記表１を参照できる。
【００８７】
具体例として、前述のように、関節リウマチの試験の場合、例えば、前記ＭＨＣクラスII分子が、ＨＬＡ−ＤＲを含む分子であり、前記変性タンパク質が、ＩｇＧ重鎖の変性タンパク質であり、橋本病の試験の場合、例えば、前記ＭＨＣクラスII分子が、ＨＬＡ−ＤＲを含む分子であり、前記変性タンパク質が、サイログロブリンの変性タンパク質であり、抗リン脂質抗体症候群の試験の場合、例えば、前記ＭＨＣクラスII分子が、ＨＬＡ−ＤＲを含む分子であり、前記変性タンパク質が、β２グリコプロテインＩの変性タンパク質であり、バセドウ病の試験の場合、例えば、前記ＭＨＣクラスII分子が、ＨＬＡ−ＤＰを含む分子であり、前記変性タンパク質が、ＴＳＨＲの変性タンパク質である。
【００８８】
前記検出工程は、前述のように、前記本発明の自己抗体の検出方法によって、前記生体試料における自己抗体と前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスIIとの複合体を検出する検出工程である。前記複合体は前記自己抗体を含むことから、前記複合体の検出により、間接的に、前記生体試料における前記自己抗体を検出できる。
【００８９】
前記検出工程は、例えば、前述のように、前記複合体の形成量を測定する測定工程であってもよい。前記形成量の測定方法は、特に制限されず、例えば、前述のような前記複合体の検出方法が採用できる。前記複合体形成量から間接的に自己抗体量を求める方法は、特に制限されず、例えば、前記複合体の測定値と自己抗体量との関係を示す関係式（例えば、検量線を含む）等が利用できる。前記関係式は、例えば、前記自己抗体の量が既知の標準試料を用いて前記検出方法による複合体の検出を行うことで、前記複合体の測定値と前記自己抗体の既知量との関係を示す関係式を求めることができる。この関係式に基づけば、前記複合体の形成量の測定値から、前記関係式に基づいて前記自己抗体量を算出できる。このため、本発明において、「前記複合体の形成量」は、例えば、前記複合体の形成量から間接的に算出した「自己抗体量」ということもできる。
【００９０】
前記試験工程は、前述のように、前記検出工程における前記複合体の検出結果から、自己免疫疾患の罹患の可能性を試験する工程である。前記複合体の検出結果は、例えば、間接的に自己抗体の検出結果といえる。そして、自己抗体は、前記自己免疫疾患の標識となり得ることから、前記複合体の検出結果、すなわち、間接的な自己抗体の検出結果から、例えば、自己免疫疾患の罹患可能性がある、自己免疫疾患の罹患可能性がない等の判断が可能である。前記罹患可能性があるとは、例えば、自己免疫疾患に罹患している、罹患している可能性がある、将来、罹患（発症ともいう）する可能性がある等を意味し、前記罹患可能性がないとは、例えば、罹患していない、罹患していない可能性がある等を意味する（以下、同様）。
【００９１】
前記被検体の罹患可能性は、前記試験工程において、例えば、前記検出工程で前記複合体が検出された場合、前記被検体は、罹患可能性があると判断でき、前記複合体が検出されない場合、前記被検体は、罹患可能性がないと判断できる。
【００９２】
また、前記被検体の罹患可能性は、前記試験工程において、例えば、前記測定工程で測定した前記被検体の複合体形成量の測定値と基準値との比較によって判断できる。具体的には、例えば、前記試験工程において、前記測定値と基準値とを比較し、前記測定値が前記基準値よりも高い場合に、前記被検体は、罹患可能性があるとし、前記測定値が前記基準値よりも低い時に、前記被検体は、前記罹患可能性がないとすることができる。
【００９３】
前記基準値は、特に制限されず、例えば、自己免疫疾患には罹患していない健常者の生体試料における前記複合体の形成量があげられる。また、前記比較対象が、前記複合体の形成量の測定値から算出した自己抗体量の場合、前記健常者の複合体の形成量も、自己抗体量が好ましい。前記健常者の生体試料は、例えば、前記被検者の生体試料と同様の条件で単離した生体試料であることが好ましい。前記健常者の生体試料における前記複合体の形成量は、例えば、前記被検者の生体試料についての前記複合体の検出と、同様の方法および条件で行うことが好ましい。
【００９４】
なお、前記測定値と前記基準値との比較においては、前記複合体が形成された場合の測定値が正の値となることを前提として、罹患可能性の判断を例示したが、前記複合体が形成された場合の測定値が負の値となってもよい。この場合は、例えば、前記試験工程において、前記測定値と基準値とを比較し、前記測定値が前記基準値よりも低い場合に、前記被検体は、罹患可能性があるとし、前記測定値が前記基準値よりも高い時に、前記被検体は、前記罹患可能性がないとすることができる。
【００９５】
＜自己免疫疾患の診断方法＞
前述した本発明の自己免疫疾患の罹患の可能性を試験する方法は、例えば、自己免疫疾患の診断方法ということもできる。すなわち、本発明の自己免疫疾患の診断方法は、前述のように、サンプルが、被検体から単離した生体試料であり、前記本発明の自己抗体の検出方法によって、前記サンプルにおける自己抗体と前記ＭＨＣクラスII分子により提示された変性タンパク質（前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスII）との複合体を検出する検出工程、および、前記検出工程における前記複合体の検出結果から、自己免疫疾患を診断する診断工程を含むことを特徴とする。
【００９６】
本発明の診断方法は、前述した前記本発明の試験方法の記載を援用でき、前記試験方法における罹患可能性の試験は、本発明において、自己免疫疾患に罹患しているか否かの診断を意味する。
【００９７】
＜自己抗体の検出試薬＞
本発明の自己抗体の検出試薬は、前述のように、前記本発明の自己抗体の検出方法に用いる自己抗体の検出試薬であって、ＭＨＣクラスII分子により提示された変性タンパク質を含むことを特徴とする。
【００９８】
本発明の検出試薬は、自己抗体に対する抗原試薬として、前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスIIを含むことが特徴であって、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の検出試薬は、前記本発明の検出方法における前記抗原試薬の記載を援用できる。本発明の検出試薬によれば、優れた精度で自己抗体を検出できる。
【００９９】
前記本発明の自己抗体の検出試薬は、例えば、前記自己抗体の検出に使用でき、前記自己抗体の検出から、前述のように、自己免疫疾患を診断できる。このため、本発明の自己抗体の検出試薬は、自己免疫疾患の診断試薬ということができる。
【０１００】
＜自己抗体の検出試薬の製造方法＞
本発明の自己免疫疾患の検出試薬の製造方法は、前述のように、ＭＨＣクラスII分子の発現系細胞に、正常フォールドタンパク質をコードする遺伝子を導入することで、前記正常フォールドタンパク質が変性した前記変性タンパク質が提示されたＭＨＣクラスII分子を調製する調製工程を含むことを特徴とする。本発明の製造方法は、前記本発明の検出方法における前記抗原試薬の製造に関する記載を援用できる。
【０１０１】
＜自己免疫疾患に関連する自己抗体に対する抗原タンパク質のスクリーニング方法＞
本発明のスクリーニング方法は、自己免疫疾患に関連する自己抗体に対する抗原タンパク質のスクリーニング方法であり、前述のように、サンプルが、自己免疫疾患の被検体から単離した生体試料であり、前記本発明の自己抗体の検出方法によって、前記サンプルにおける自己抗体とＭＨＣクラスII分子により提示された変性タンパク質との複合体を検出する検出工程、および、前記自己抗体との前記複合体を形成した前記変性タンパク質を、前記自己免疫疾患に関連する自己抗体に対する抗原タンパク質と判断する判断工程を含むことを特徴とする。
【０１０２】
本発明のスクリーニング方法によれば、自己免疫疾患に関連する自己抗体に対する抗原タンパク質をスクリーニングできる。前述のように、従来の自己抗体の検出方法では、正常にフォールディングされた正常フォールドタンパク質を抗原試薬としているが、自己免疫疾患の患者について、偽陰性の問題が生じる。このため、前記正常フォールドタンパク質を自己抗原の候補タンパク質としてスクリーニングを行っても、実際には、自己免疫疾患との関連性において優れた信頼性を示す自己抗原のスクリーニングを行えていない可能性がある。これに対して、前記ＭＨＣクラスII分子により提示された変性タンパク質を自己抗原の候補タンパク質とすることによって、例えば、自己免疫疾患との関連性において優れた信頼性を示す自己抗原をスクリーニングすることが可能となる。
【０１０３】
発明のスクリーニング方法は、特に示さない限り、前記本発明の検出方法、前記本発明の試験方法等の記載を援用できる。
【０１０４】
本発明のスクリーニング方法において、前記自己免疫疾患の種類は、特に制限されず、例えば、自己抗原が同定されていない自己免疫疾患でもよいし、自己抗原が推定または同定されている自己免疫疾患でもよい。
【０１０５】
前記検出工程は、前述のように、前記本発明の自己抗体の検出方法によって、前記サンプルにおける自己抗体と前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスIIとの複合体を検出する検出工程である。前記検出工程は、例えば、前述のように、前記複合体の形成量を測定する測定工程であってもよい。
【０１０６】
前記判断工程は、前述のように、前記自己抗体との前記複合体を形成した前記変性タンパク質を、前記自己免疫疾患に関連する自己抗体に対する抗原タンパク質と判断する判断工程である。前記判断工程において、例えば、前記検出工程で前記複合体が検出された場合、前記変性タンパク質を前記抗原タンパク質と判断でき、前記複合体が検出されない場合、前記変性タンパク質は、前記抗原タンパク質ではないと判断できる。
【０１０７】
また、前記抗原タンパク質か否かは、前記試験工程において、例えば、前記測定工程で測定した前記被検体の複合体形成量の測定値と基準値との比較によって判断できる。具体的には、例えば、前記試験工程において、前記測定値と基準値とを比較し、前記測定値が前記基準値よりも高い場合に、前記変性タンパク質を前記抗原タンパク質と判断し、前記測定値が前記基準値よりも低い時に、前記変性タンパク質は前記抗原タンパク質ではないと判断できる。
【０１０８】
前記基準値は、特に制限されず、例えば、自己免疫疾患には罹患していない健常者の生体試料における前記複合体の形成量があげられる。また、前記比較対象が、前記複合体の形成量の測定値から算出した自己抗体量の場合、前記健常者の複合体の形成量も、自己抗体量が好ましい。前記健常者の生体試料は、例えば、前記被検者の生体試料と同様の条件で単離した生体試料であることが好ましい。前記健常者の生体試料における前記複合体の形成量は、例えば、前記被検者の生体試料についての前記複合体の検出と、同様の方法および条件で行うことが好ましい。
【０１０９】
なお、前記測定値と前記基準値との比較においては、前記複合体が形成された場合の測定値が正の値となることを前提として、前記抗原タンパク質か否かの判断を例示したが、前記複合体が形成された場合の測定値が負の値となってもよい。この場合は、例えば、前記判断工程において、前記測定値と基準値とを比較し、前記測定値が前記基準値よりも低い場合に、前記変性タンパク質は前記抗原タンパク質であると判断し、前記測定値が前記基準値よりも高い時に、前記変性タンパク質は前記抗原タンパク質ではないと判断できる。
【実施例】
【０１１０】
（１）発現ベクターの作製
（１−１）HLA-DR発現ベクター、HLA-DP発現ベクター
ヒト末梢血単核細胞（3H  Biomedical社）またはヒト細胞株のｃＤＮＡから、下記表２ＡおよびＢに示すHLA-DRのα鎖およびβ鎖、または下記表３ＡおよびＢに示すHLA-DPのα鎖およびβ鎖をコードするポリヌクレオチドを、それぞれ、ｐＭＥ１８Ｓベクターにクローニングした。なお、前記HLA-DRのｃＤＮＡの配列情報は、IMGT/HLA  Database（http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/index/html）を参照した。前記クローニングにより作製した発現ベクターは、以下、下記表における遺伝子名で示す（以下、同様）。【０１１１】
【表２Ａ】
2015008498.tif 000014
【０１１２】
【表２Ｂ】
2015008498.tif 000015
【０１１３】
【表３Ａ】
2015008498.tif 000016
【０１１４】
【表３Ｂ】
2015008498.tif 000017
【０１１５】
（１−２）抗原タンパク質発現ベクター
マウス脾臓ｃＤＮＡから、下記表４の分泌型ＩｇＧ重鎖、膜型ＩｇＧ重鎖、ＩｇＧ軽鎖、ＩｇαおよびＩｇβをコードするポリヌクレオチドを、それぞれ、ｐＭＥ１８Ｓベクターにクローニングした。ヒト甲状腺ｃＤＮＡから、下記表４のサイログロブリンをコードするポリヌクレオチドを、ｐＭＥ１８Ｓベクターにクローニングした。ヒト末梢血単核球のｃＤＮＡから、下記表４のβ２グリコプロテインＩ（β２−ＧＰＩ）をコードするポリヌクレオチドを、ｐＭＥ１８Ｓベクターにクローニングした。ヒト甲状腺ｃＤＮＡから、下記表４の甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）を、ｐＭＥ１８Ｓベクターにクローニングした。【０１１６】
【表４】
2015008498.tif 000018
【０１１７】
マウス  膜型IgG重鎖(mIgGH)（配列番号1）
GTCTTGTCCCAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTGTGCTGGTGAAACCCACAGAGACCCTCACGCTGACCTGCAGCGTCTCTGGGTTCTCACTCAGCAACGGTAGAATGGGTGTGAGTTGGATCCGTCAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGGTTGGACACATTTTTTCGAATGACGACAAATCTTACACCCCATCTCTGGAGAGCAGGCTCACCATCTCCCAGGACACCTTCAGAAGCCAGGTGGTCCTAACCATTACCAACTTGGCCCCCGTGGACACAGGCACATATTATTGTGCACGAATAAGTCGTTCCATTTATGGGGTGCTTACCCCCGGCAGCGTCTGGGGCCAAGGGACCATGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCCACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGAGCTGCAACTGGAGGAGAGCTGTGCGGAGGCGCAGGACGGGGAGCTGGACGGGCTGTGGACGACCATCACCATCTTCATCACACTCTTCCTGTTAAGCGTGTGCTACAGTGCCACCGTCACCTTCTTCAAGGTGAAGTGGATCTTCTCCTCGGTGGTGGACCTGAAGCAGACCATCATCCCCGACTACAGGAACATGATCGGACAGGGGGCCTAG【０１１８】
（１−３）その他のベクター
下記文献にしたがって、前記表１のHLA-DRB1*04:04に、リンカーペプチド（配列番号２：GSGSGS）とＣｗ３ペプチド（配列番号３：GSHSMRYFYTAVSRPGR）とを結合させたCw3-pep-HLA-DRB1*04:04をコードするポリヌクレオチドを、ｐＭＥ１８Ｓベクターにクローニングした。これにより、ＨＬＡ−ＤＲのペプチド結合溝における結合性が阻害される。
文献：  Scott,  C.  A.  et  al.,  I.  A.  Crystal  structures  of  two  I-Ad-peptide  complexes  reveal  that  high  affinity  can  be  achieved  without  large  anchor  residues.  Immunity  8,  319-329,  (1998).
ヒト末梢血単核球のｃＤＮＡから、下記表５のインバリアント鎖をコードするポリヌクレオチドを、ｐＭＥ１８Ｓベクターにクローニングした。
ＧＦＰをコードする配列番号４に示すポリヌクレオチドを、ｐＭＥ１８Ｓベクターにクローニングした。【０１１９】
【表５】
2015008498.tif 000019
【０１２０】
ＧＦＰ（配列番号４）
atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa【０１２１】
（２）発現ベクターの導入
発現ベクターを導入する宿主細胞として、２９３Ｔ（理化学研究所  バイオリソースセンター）を使用し、トランスフェクション試薬として、ＰＥＩ  ｍａｘ（商品名、Polyscience社製）を使用した。前記２９３Ｔ細胞への前記発現ベクターの導入は、PEI  max（コスモバイオ社）を２ｍｇ／ｍｌとなるように精製水で溶かしたPEI  max溶液を使用した。具体的には、Lipofectamine（商標）  2000（Invitrogen社）の使用説明書に従い、Lipofectamine（商標）  2000に代えて、前記PEI  max溶液を用いて、前記発現ベクターの導入を行った。前記２９３Ｔ細胞は、ＤＭＥＭ培地を使用し、３７℃、培養日数２日の条件下で培養した。【０１２２】
（３）試薬
抗体等の試薬は、特に示さない限り、同じ名称のものは、同じ製品を使用した。【０１２３】
［実施例１］
本実施例１は、関節リウマチの指標である自己抗体の検出に関する。【０１２４】
（実施例１Ａ）
ＨＬＡ−ＤＲとＩｇＧ重鎖とを発現させ、細胞表面に、ＨＬＡ−ＤＲによりＩｇＧ重鎖が提示されることを確認した。【０１２５】
α鎖用発現ベクターとして前記HLA-DRA*01:01ベクター、β鎖用発現ベクターとして前記HLA-DRB1*04:04ベクター、分泌型ＩｇＧ重鎖の前記ｓＩｇＧＨベクターおよび前記ＧＦＰベクターを、２９３Ｔ細胞に導入し、培養した。前記培養後の細胞を、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体または抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体と反応させ、さらに、ＡＰＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体と反応させた。そして、フローサイトメトリーによる分析を行った。具体的には、フローサイトメーター（商品名FACSCalibur（商標）、Becton  Dickinson社）を用いて、ＧＦＰ陽性細胞における細胞表面のＩｇＧ重鎖の発現およびＨＬＡ−ＤＲの発現を確認した。コントロール１は、前記ＨＬＡ−ＤＲ発現ベクターを導入しない以外は同様にして、また、コントロール２は、前記ＨＬＡ−ＤＲ発現ベクターに代えて、前記Cw3-pep-HLA-DRB1*04:04ベクターを導入した以外は、同様にして測定した。前記Cw3-pep-HLA-DRB1*04:04ベクターは、ＨＬＡ−ＤＲのペプチド結合溝へのＩｇＧ重鎖の結合を阻害できる。
・ＡＰＣ標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体：Jackson  ImmunoResearch社 Code: 109-136-098
・フローサイトメトリー用抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体：クローンHL-40、EXBIO社、モノクローナル抗体（mAb）
・ＡＰＣ標識抗マウスＩｇＧ  抗体：Jackson  ImmunoResearch社 Code: 715-136-150【０１２６】
これらの結果を図１に示す。図１は、細胞表面におけるＩｇＧまたはＨＬＡ−ＤＲの発現量を示すヒストグラムである。図１において、横軸は、蛍光強度であり、ＨＬＡ−ＤＲに提示されたＩｇＧ発現量またはＨＬＡ−ＤＲ発現量を示し、縦軸は、細胞のカウント数を示す。図１に示すように、HLA-DRA*01:01、HLA-DRB1*04:04およびＩｇＧ重鎖を導入した細胞（HLA-DR0404）は、細胞表面のＩｇＧおよびＨＬＡ−ＤＲの発現が認められた。一方、前記コントロール１（without  HLA-DR）は、細胞表面のＩｇＧおよびＨＬＡ−ＤＲの発現が認められず、また、前記コントロール２（Cw3-pep-HLA-DR0404）は、細胞表面のＨＬＡ−ＤＲの発現は認められるが、細胞表面のＩｇＧの発現は低かった。以上のことから、細胞表面におけるＩｇＧ重鎖の発現には、HLA-DRが必要であること、また、ＩｇＧ重鎖は、ＨＬＡ−ＤＲのペプチド結合溝に結合し、細胞表面に提示されていることがわかった。なお、ＩｇＧは、重鎖と軽鎖のホモダイマーからなり、両方がなければ、正常にフォールディングされず、抗体として機能しないことが知られている。本実施例では、ＩｇＧ重鎖のみを細胞に導入しており、軽鎖非存在下、重鎖のみが、ＨＬＡ−ＤＲにより細胞表面に発現している。このことから、前記細胞表面に提示されているＩｇＧは、ミスフォールドタンパク質（変性タンパク質）といえる。【０１２７】
（実施例１Ｂ）
ＨＬＡ−ＤＲを免疫沈降し、ＩｇＧ重鎖が、ＨＬＡ−ＤＲのペプチド結合溝で結合していることを確認した。【０１２８】
２９３Ｔ細胞に、α鎖発現用ベクターであるHLA-DRA*01:01の他に、後述する図２の図中に示す組合せとなるように各発現ベクターを導入し、培養した。前記培養後の細胞を、０．５％  ＮＰ−４０液（polyoxyethylene(9)octyiphenyl  ether）に溶解し、前記溶解液について、ビオチン化抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体およびストレプトアビジンセファロース（GEヘルスケア社）を用いて免疫沈降を行った。
・免疫沈降用ビオチン化抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体：クローンL243、ATCC社、mAb【０１２９】
前記免疫沈降したサンプルについて、ウエスタンブロッティングを行った。すなわち、前記サンプルを電気泳動に供し、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体またはウサギ抗ＨＬＡ−ＤＲα抗体と、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体とを用いて、ＩｇＧおよびＨＬＡ−ＤＲを検出した。コントロールは、前記溶解液について、プロテインＡセファロース（GEヘルスケア社）を用いて免疫沈降を行った以外は、同様にして、ウエスタンブロッティングを行った。
・ペルオキシダーゼ標識抗ウサキＩｇＧ抗体：Thermo Fisher
Scientific社 Prod#: 1858415
・ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体：Jackson  ImmunoResearch社 Code: 709-035-149
・ウサギ抗ＨＬＡ−ＤＲα抗体：品番FL-254、Santa  Cruz  Biotechnology,  Inc.社【０１３０】
これらの結果を図２に示す。図２は、ウェスタンブロットの写真である。図２において、写真の上側は、レーン番号および発現ベクターの導入（＋）と未導入（−）を示し、写真の左側は、検出したタンパク質の種類を示す。【０１３１】
図２において、ＩｇＧ重鎖のみを導入した細胞（レーン１）およびＨＬＡ−ＤＲのみを導入した細胞（レーン２−４）は、１段目および３段目の写真に示すように、ＩｇＧ重鎖またはＨＬＡ−ＤＲの発現は確認されたが、２段目の写真に示すように、両者の結合は確認されなかった。これに対して、ＩｇＧ重鎖とリウマチに感受性であるＨＬＡ-ＤＲ４（HLA-DRA*01:01/HLA-DRB1*04:04）とを導入した細胞（レーン５）は、１段目および３段目の写真に示すように、ＩｇＧ重鎖およびＨＬＡ−ＤＲの発現が確認され、且つ、２段目の写真に示すように、両者の結合も確認できた。なお、ＩｇＧ重鎖とリウマチに抵抗性であるＨＬＡ-ＤＲ３（HLA-DRA*01:01/HLA-DRB1*03:01）とを導入した細胞（レーン６）は、ＩｇＧ重鎖およびＨＬＡ−ＤＲの発現が確認されたが、リウマチに感受性であるＨＬＡ-ＤＲ４を導入した細胞（レーン５）と比較して、ＨＬＡ−ＤＲとＩｇＧ重鎖との結合は低下した。また、前記HLA-DRA*01:01／Cw3-pep-HLA-DRB1*04:04を導入した細胞（レーン７）は、ＩｇＧ重鎖およびＨＬＡ−ＤＲの発現が確認されたが、ペプチド結合部位における結合性がペプチドで阻害されているため、レーン５の細胞（ＨＬＡ-ＤＲ４）と比較して、ＨＬＡ−ＤＲとＩｇＧ重鎖との結合が著しく低下した。これらの結果から、ＩｇＧ重鎖の細胞表面への発現には、ＨＬＡ−ＤＲが必要であること、また、ＩｇＧ重鎖は、ＨＬＡ−ＤＲのペプチド結合溝に結合し、細胞表面に提示されていることがわかった。【０１３２】
（実施例１Ｃ）
リウマチ因子（ＲＦ）およびＲＦ６１リウマチ因子抗体（ＲＦ６１、mAb）が、ＨＬＡ−ＤＲに提示されたＩｇＧ重鎖を認識することを確認した。【０１３３】
ＲＦ６１リウマチ因子抗体の重鎖およびラムダ軽鎖の可変部領域をコードするポリヌクレオチドを、それぞれ、アクセッションＮｏ．Ｘ５４４３７およびアクセッションＮｏ．Ｘ５４４３８に基づき合成した。前記重鎖のポリヌクレオチドは、分泌型マウスＩｇＧ１重鎖の定常領域をコードするポリヌクレオチド（アクセッションＮｏ．Ｌ２４７４３７．１）を含むｐＭＥ１８Ｓベクターに、前記ラムダ軽鎖のポリヌクレオチド（アクセッションＮｏ．Ｘ０６８７６）は、ヒトラムダ鎖の定常領域をコードするポリヌクレオチドを含むｐＭＥ１８Ｓベクターに、それぞれ、機能的に連結するよう導入した。次に、前記重鎖を含むベクターおよび前記軽鎖を含むベクターを、前記実施例１Ａと同様にして、２９３Ｔ細胞に導入し、培養した。前記培養後、ＲＦ６１抗体を含む培養上清を回収し、前記上清を、ＲＦ６１として用いた。【０１３４】
前記実施例１Ａと同様にして、α鎖発現用ベクターである前記HLA-DRA*01:01ベクター、β鎖発現用ベクターである前記HLA-DRB1*04:04ベクター、分泌型ＩｇＧ重鎖の前記ｓＩｇＧＨベクターおよび前記ＧＦＰベクターを導入した２９３Ｔ細胞を培養し、前記培養した細胞を各種抗体と反応させ、ＧＦＰ陽性細胞について、フローサイトメトリー分析を行った。具体的には、ＲＦの結合の確認には、前記細胞を、ＲＦを含むリウマチ患者の希釈血清と反応させ、さらに、APC標識抗ヒトＩｇＭ抗体を反応させた。前記希釈血清は、前記患者の血清を３００倍希釈したものを使用した。ＲＦ６１の結合の確認には、予め、前記ＲＦ６１と前記ＡＰＣ標識抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ抗体との２量体を形成させ、前記細胞を、前記２量体と反応させた。また、実施例１Ａと同様に、細胞表面におけるＩｇＧ重鎖またはＨＬＡ−ＤＲの発現の確認には、前記細胞を、前記抗ＩｇＧ抗体または前記抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体と反応させ、さらに、前記ＡＰＣ標識抗マウスＩｇＧ  Ｆａｂ抗体と反応させた。
・APC化抗ヒトＩｇＭ抗体：Jackson  ImmunoResearch社製 Code: 709-136-073【０１３５】
コントロール１は、前記HLA-DR発現ベクターを導入しない以外は同様にして、また、コントロール２は、分泌型ＩｇＧ重鎖のｓＩｇＧＨベクターに代えて、膜型ＩｇＧ重鎖の前記ｍＩｇＧＨベクター、ＩｇＧ軽鎖の前記ＩｇＧＬベクター、前記Ｉｇαベクターおよび前記Ｉｇβベクターを導入した以外は同様にして、フローサイトメトリー分析を行った。【０１３６】
これらの結果を図３に示す。図３は、細胞表面におけるＩｇＧ重鎖もしくはＨＬＡ−ＤＲの発現量、または細胞表面におけるＲＦもしくはＲＦ６１の結合量を示すヒストグラムである。図３において、横軸は、蛍光強度であり、ＨＬＡ−ＤＲに提示されたＩｇＧ重鎖もしくはＨＬＡ−ＤＲの発現量、またはＲＦもしくはＲＦ６１の結合量を示し、縦軸は、細胞のカウント数を示す。図３において、上段は、分泌型ＩｇＧ重鎖を導入した細胞の結果であり、下段は、膜型ＩｇＧ重鎖、ＩｇＧ軽鎖、ＩｇαおよびＩｇβを導入した細胞（コントロール２）の結果である。【０１３７】
図３の上段に示すように、ＨＬＡ−ＤＲと分泌型ＩｇＧ重鎖を導入した細胞（sIgGH）では、細胞表面におけるＩｇＧ重鎖およびＨＬＡ−ＤＲの発現が確認され、且つ、ＲＦおよびＲＦ６１の結合が確認された。これに対して、図３の下段に示すように、コントロール２（mIgGH+L+Igαβ）では、細胞表面におけるＩｇＧ重鎖およびＨＬＡ−ＤＲの発現は確認されたが、ＲＦおよびＲＦ６１の結合は確認されなかった。これは、ＲＦおよびＲＦ６１が、重鎖と軽鎖を含み正常にフォールドされたＩｇＧではなく、ＨＬＡ-ＤＲに提示されたミスフォールドＩｇＧを認識するためと考えられる。これらの結果から、ＲＦおよびＲＦ６１は、正常にフォールディングされたＩｇＧよりも、ＨＬＡ−ＤＲに提示されたミスフォールドＩｇＧ重鎖を認識し、強く結合することがわかった。【０１３８】
（実施例１Ｄ）
リウマチ患者由来の血清中のＩｇＭが、ＨＬＡ−ＤＲに提示されたＩｇＧ重鎖を認識することを確認した。【０１３９】
ＲＦ陽性患者由来の血清を採取し、３００倍に希釈し、ＲＦ（＋）血清サンプル（ｎ＝５）とした。また、ＲＦ陰性患者由来の血清を採取し、ＲＦ（−）血清サンプル（ｎ＝５）とした。２９３Ｔ細胞に、α鎖発現用ベクターである前記HLA-DRA*01:01ベクター、β鎖発現用ベクターである前記HLA-DRB1*04:04ベクター、前記分泌型ＩｇＧ重鎖の前記ＩｇＧＨベクター、前記ＩｇＧ軽鎖ベクターおよび前記ＧＦＰベクターを導入し、培養した。前記培養後の細胞を、前記ＲＦ（＋）サンプルまたは前記ＲＦ（−）サンプルと反応させ、さらに、前記ＡＰＣ化抗ヒトＩｇＭ抗体および前記ＡＰＣ標識ストレプトアビジンを順に反応させた。そして、前記実施例１Ｃと同様にして、フローサイトメトリーにより、前記細胞表面における自己抗体の結合を測定した。コントロールは、前記HLA-DR発現ベクターを導入しない以外は、同様にしてフローサイトメトリー分析を行った。【０１４０】
これら結果を図４に示す。図４は、細胞表面におけるＧＦＰの発現量および自己抗体の結合量を示すグラフである。図４において、横軸は、ＧＦＰの発現量を示し、縦軸は、ＲＦの結合量を示す。図４において、上段は、ＨＬＡ−ＤＲ未導入の細胞（コントロール）の結果であり、下段は、分泌型ＩｇＧ重鎖およびＩｇＧ軽鎖と共にＨＬＡ−ＤＲを導入した細胞の結果である。そして、左の４列が、ＲＦ（−）血清サンプルの結果であり、右の４列が、ＲＦ（＋）血清サンプルの結果である。【０１４１】
図４の下段に示すように、分泌型ＩｇＧ重鎖およびＩｇＧ軽鎖と共にＨＬＡ−ＤＲを導入した細胞（sIgGH+L+HLA-DR0404）は、ＲＦ（−）血清サンプルを用いた場合、自己抗体の結合が確認されず、ＲＦ（＋）血清サンプルを用いた場合に、自己抗体の結合が確認された。これに対して、図４の上段に示すように、ＨＬＡ−ＤＲ未導入の細胞（sIgGH+L）では、ＲＦ（＋）血清サンプルおよびＲＦ（−）血清サンプルの両者において、自己抗体の結合は確認されなかった。これは、ＨＬＡ−ＤＲ未導入の細胞（sIgGH+L）では、分泌型ＩｇＧは、細胞外へ分泌されるのみであり、ＨＬＡ−ＤＲが発現しないことから、ＨＬＡ−ＤＲによって細胞表面にＩｇＧが提示されることがなく、ＩｇＧは細胞表面に存在しないからである。このため、ＲＦ陽性患者由来の血清中のＩｇＭ抗体は、分泌型ＩｇＧのみを導入した細胞には結合しない。これらの結果から、ＲＦ陰性患者ではなく、陽性患者の血清中のみに、ＨＬＡクラスII分子に提示されたＩｇＧに結合するＩｇＭ抗体が存在することがわかった。【０１４２】
（実施例１Ｅ）
異なるハプロタイプのＨＬＡ-ＤＲのＩｇＧ重鎖の提示能およびリウマチ患者由来の血清中のＩｇＭが、前記ＨＬＡ−ＤＲに提示されたＩｇＧ重鎖を認識することを確認した。【０１４３】
α鎖用発現ベクターとして前記HLA-DRA*01:01ベクター、β鎖用発現ベクターとして前記HLA-DRB1*03:01ベクター、前記HLA-DRB1*15:01ベクターおよび前記HLA-DRB1*04:01ベクターのいずれか１つ、前記分泌型ＩｇＧ重鎖の前記ｓＩｇＧＨベクターおよび前記ＧＦＰベクターを、２９３Ｔ細胞に導入した。【０１４４】
前記細胞を培養した後、前記培養細胞について、前記実施例１Ｃと同様にして、フローサイトメトリー分析によって、細胞表面におけるＩｇＧ重鎖およびＨＬＡ−ＤＲの発現量、ならびに、自己抗体の結合量の確認を行った。コントロールは、２９３Ｔ細胞に、ベクターとして、前記分泌型ＩｇＧ重鎖の前記ＩｇＧＨベクターおよび前記ＧＦＰベクターを導入した以外は、同様にして測定した。【０１４５】
これらの結果を、図５に示す。図５は、細胞表面におけるＩｇＧ重鎖、もしくはＨＬＡ−ＤＲの発現量、または自己抗体の結合量を示すヒストグラムである。図５において、横軸は、蛍光強度であり、ＨＬＡ-ＤＲに提示されたＩｇＧ、もしくはＨＬＡ−ＤＲの発現量または自己抗体の結合量を示し、縦軸は、細胞のカウント数を示す。図５において、左列が、前記HLA-DRB1*03:01導入細胞（HLA-DR3）、中列が、前記HLA-DRB1*15:01導入細胞（HLA-DR15）、右列が、前記HLA-DRB1*04:01導入細胞（HLA-DR4）である。また、図５において、陰影をつけたヒストグラムは、前記分泌型ＩｇＧ重鎖を導入した細胞（コントロール）の結果である。【０１４６】
図５において、上段および下段に示すように、いずれのハロタイプのβ鎖を有するＨＬＡ−ＤＲを導入した細胞においても、細胞表面におけるＩｇＧ重鎖およびＨＬＡ−ＤＲの発現が確認された。そして、中段に示すように、ＨＬＡ−ＤＲに提示されたＩｇＧ重鎖の発現とＲＦの結合を確認した結果、いずれのハロタイプのβ鎖を有するＨＬＡ−ＤＲを導入した細胞においても、自己抗体の結合が確認された。これらの結果から、前記ＨＬＡ−ＤＲのハプロタイプにかかわらず、前記ＨＬＡ−ＤＲがＩｇＧ重鎖を提示すること、および前記ＨＬＡ−ＤＲのハプロタイプにかかわらず、前記ＨＬＡ−ＤＲに提示されたＩｇＧ重鎖が自己抗体に認識されることがわかった。【０１４７】
（実施例１Ｆ）
異なるハプロタイプのβ鎖を有するＨＬＡ−ＤＲについて、リウマチ感受性のオッズ比と自己抗原への自己抗体の結合量との相関関係を確認した。【０１４８】
異なるハロタイプのβ鎖を有するＨＬＡ−ＤＲについて、リウマチ感受性のオッズ比は、下記文献を参照した。
参考文献：Raychaudhuri，  S．  et  al．  Five  amino  acids  in  three  HLA  proteins  explain  most  of  the  association  between  MHC  and  seropositive  rheumatoid  arthritis．  Nat．  Genet．  44，  291-296，  （2012）．【０１４９】
α鎖用発現ベクターとして前記HLA-DRA*01:01ベクター、β鎖用発現ベクターとして前記表２の各種HLA-DRBベクター、前記分泌型ＩｇＧ重鎖の前記ｓＩｇＧＨベクターおよび前記ＧＦＰベクターを、２９３Ｔ細胞に導入し、培養した。前記培養細胞について、ＧＦＰ陽性細胞において前記各ＨＬＡ−ＤＲに提示されたＩｇＧ重鎖（自己抗原）と自己抗体との結合量を測定した。具体的には、前記培養細胞について、前記実施例１Ｃと同様にして、フローサイトメトリー分析を行い、ＧＦＰ陽性細胞におけるＲＦの平均蛍光強度を算出した。【０１５０】
そして、前記平均蛍光強度と前記リウマチ感受性のオッズ比との関連性を、ピアソンの積率相関係数（Pearson  product−moment  correlation  coefficient）により解析した。また、コントロールは、前記分泌型ＩｇＧ重鎖の前記ｓＩｇＧＨベクターに代えて前記置換ＨＥＬベクターを導入し、抗Ｆｌａｇ抗体を用いた以外は、同様にして平均蛍光強度を測定し、前記平均蛍光強度と前記リウマチ感受性のオッズ比との関連性を解析した。
・抗Ｆｌａｇ抗体：クローンM2、シグマ社【０１５１】
これらの結果を図６に示す。図６は、自己抗体の結合量を示す平均蛍光強度とリウマチ感受性のオッズ比との関連性を示すグラフである。図６において、横軸は、前記リウマチ感受性のオッズ比を示し、縦軸は、前記自己抗体の結合量の平均蛍光強度を示す。また、図６において、図中の数字は、HLA-DRにおけるHLA-DRB（β鎖）のハプロタイプを示す。【０１５２】
図６に示すように、異なるハプロタイプのＨＬＡ−ＤＲについて、前記ＨＬＡ−ＤＲに提示されたＩｇＧ重鎖への前記自己抗体の結合量と前記リウマチ感受性のオッズ比とは、極めて高い相関性（ｒ＝０．８１、Ｐ＝０．００００４６）を示した。【０１５３】
（実施例１Ｇ）
ＨＬＡ−ＤＲに提示されたＩｇＧ重鎖へのリウマチ患者由来の血清中の自己抗体の結合量とＲＦ値とが相関することを確認した。【０１５４】
（１）関節リウマチ患者由来血清における自己抗体の結合量とＲＦ値との比較
リウマチ患者由来の血清および健常者由来の血清を採取し、３００倍に希釈し、血清サンプルとした。２９３Ｔ細胞に、α鎖発現用ベクターである前記HLA-DRA*01:01ベクター、β鎖発現用ベクターである前記HLA-DRB1*04:04ベクター、前記分泌型ＩｇＧ重鎖の前記ＩｇＧＨベクターおよび前記ＧＦＰベクターを導入し、培養した。前記培養後の細胞を、前記実施例１Ｃと同様にして、フローサイトメトリーで分析を行った。また、前記血清サンプルは、公知のＥＬＩＳＡ法により、ＲＦ値を確認済である。具体的には、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片（Jackson  ImmunoResearch社製）を、９６マイクロウェルプレート（Costar社製）に吸着させた。次に、前記血清サンプルを加え、前記血清サンプル中のＲＦをヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片に結合させた。さらに、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＭ抗体（Jackson  ImmunoResearch社製）と反応させ、前記反応後、検出試薬（BD  OptiEIA（商標）、BD  Bioscience社製）を用い、ペルオキシダーゼ活性を測定した。また、ＲＦ値が１０６０Ｕ／ｍＬの標準血清サンプル（GenWay  Biotech，Inc社製）を用い、同様にしてペルオキシダーゼ活性を測定し、標準曲線を作製した。そして、前記標準曲線に基づき、前記血清サンプルのペルオキシダーゼ活性の測定値から、前記ＲＦ値を算出した。また、コントロールは、前記抗体に代えて、前記ＡＰＣ標識抗ヒトＩｇＭ抗体のみと反応させた以外は同様にして、測定した。【０１５５】
これらの結果を図７に示す。図７は、細胞表面における自己抗体の結合量を示すヒストグラムである。図７において、横軸は、蛍光強度であり、自己抗体の結合量を示し、縦軸は、細胞のカウント数を示し、図の上の数値は、各サンプルの前記ＲＦ値を示す。また、陰影をつけたヒストグラムは、コントロールの結果である。そして、図７において、左３列が、リウマチ患者由来の血清サンプルの結果であり、右３列が、健常者由来の血清サンプルの結果である。【０１５６】
図７に示すように、ＨＬＡ−ＤＲ未導入のコントロールでは、自己抗体の結合は確認されなかった。また、図７に示すように、健常者由来の血清サンプルでは、前記ＲＦ値によらず自己抗体の結合は確認されなかった。これに対し、リウマチ患者由来の血清サンプルでは、前記ＲＦ値と相関的に、自己抗体の結合量が増加した。【０１５７】
（２）ＲＦ標準曲線の作製
前記標準血清サンプルを、０．１％ＢＳＡ含有ＨＡＮＫＳ緩衝液で、１００倍希釈から３．１６倍ずつ希釈し、３．１６×１０６倍希釈までの希釈系列を作成し、これらを標準サンプルとした。前記標準血清サンプルのＲＦ値は、１０６０Ｕ／ｍｌである。【０１５８】
前記ＲＦを含むリウマチ患者の希釈血清に代えて、前記標準サンプルを用いた以外は、前記実施例１Ｃと同様にして、フローサイトメトリー分析により、前記細胞に対する前記標準サンプルのHLA-DR/IgGH複合体を認識する自己抗体の結合量を示す平均蛍光強度を算出した。このように、前記ＨＬＡ−ＤＲと前記ＩｇＧとの複合体を抗原試薬として結合量を測定したことを、以下、「HLA-DR/IgGH複合体システムによる測定」とし、それによって「抗HLA-DR/IgGH複合体抗体価」を評価した。【０１５９】
次に、前記標準サンプルについて、ＲＦ標準曲線を作製した。具体的には、前記ＥＬＩＳＡ法によってＲＦ値が確定している前記標準サンプルの希釈倍率に対応した測定値を暫定的に抗HLA-DR/IgGH複合体抗体価（aHLA-DR/IgGH、自己抗体値）とし、これと、前記HLA-DR/IgGH複合体システムにより測定した前記HLA-DR4/IgGH複合体を認識する自己抗体の結合量を示す平均蛍光強度（human  IgM−MFI）とから、前記ＲＦ標準曲線を作製した。【０１６０】
この結果を図８に示す。図８は、前記ＲＦ標準曲線を示したグラフである。図８において、横軸は、前記HLA-DR/IgGH複合体システムにより測定した、前記標準サンプル中のHLA-DR4/IgGH複合体を認識する自己抗体の結合量を示す平均蛍光強度（Human  IgM−MFI）を示し、縦軸は、前記標準サンプルのＥＬＩＳＡ法による既知の測定値より暫定的に決定した抗HLA-DR/IgGH複合体抗体価（aHLA-DR/IgGH）を示す。【０１６１】
（３）他の疾患患者由来の血清における自己抗体の結合量とＲＦ値との比較
リウマチ患者由来の血清（ｎ＝１１２）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者由来の血清（ｎ＝１９）およびＡＰＳ患者由来の血清（ｎ＝１１７）を採取し、前記（２）と同様にして、フローサイトメトリー分析により、前記細胞に対する前記血清中のHLA-DR4/IgGH複合体を認識する自己抗体の結合量を示す平均蛍光強度を算出した。さらに、前記図８の前記ＲＦ標準曲線に基づいて、間接的にaHLA-DR/IgGH複合体抗体値（HLA-DR/IgGH複合体システムによる自己抗体値）を算出した。コントロールは、健常者由来の血清（ｎ＝１２７）を用い、同様にして、HLA-DR4/IgGH複合体を認識する自己抗体の結合量の測定、および前記検量線に基づくaHLA-DR/IgGH値（HLA-DR/IgGH複合体システムによる自己抗体値）の算出を行った。また、前記血清サンプルは、前記（１）と同様にしてＲＦ値を確認済である。【０１６２】
これらの結果を図９に示す。図９は、aHLA-DR/IgGH値とＲＦ値とを比較したグラフである。図９において、横軸は、aHLA-DR/IgGH値を示し、縦軸は、ＲＦ値を示し、グラフは左から、リウマチ患者（ＲＡ）由来の血清サンプル、ＳＬＥ患者由来の血清サンプル、ＡＰＳ患者由来の血清サンプルおよび健常者（Healthy  donors）由来の血清サンプルを示す。図９に示すように、ＳＬＥ患者由来の血清サンプル、ＡＰＳ患者由来の血清サンプルおよび健常者由来の血清サンプルでは、前記ＲＦ値によらず自己抗体の結合は確認されなかった。これに対し、リウマチ患者由来の血清サンプルでは、前記ＲＦ値と相関的に、aHLA-DR/IgGH値が増加した。これらの結果から、前記ＨＬＡ−ＤＲへ提示されたＩｇＧ重鎖への自己抗体の結合は、リウマチ特異的であることがわかった。【０１６３】
［実施例２］
本実施例２は、橋本病の指標である自己抗体の検出に関する。【０１６４】
（実施例２Ａ）
異なるハプロタイプのβ鎖を有するＨＬＡ−ＤＲとサイログロブリン（ＴＧ）とを発現させ、細胞表面に、前記ＨＬＡ−ＤＲによりＴＧが提示されることを確認した。【０１６５】
α鎖用発現ベクターとして前記HLA-DRB1*01:01ベクター、β鎖用発現ベクターとして前記HLA-DRB1*01:03ベクター、前記HLA-DRB1*14:03ベクター、前記HLA-DRB1*15:01ベクターおよび前記HLA-DRB4*01:03(HLA-DR53)ベクターのいずれか1つ、前記ＴＧベクターおよび前記ＧＦＰベクターを、２９３Ｔ細胞に導入し、培養した。前記培養後の細胞を、抗ヒスチジン抗体と反応させ、さらに、ＡＰＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体と反応させた。そして、前記実施例１Ａと同様に、ＧＦＰ陽性細胞について、フローサイトメトリー分析を行った。コントロール１は、前記HLA-DR発現ベクターを導入しない以外は、同様にして、また、コントロール２は、前記ＡＰＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体のみを使用した以外は、同様にして測定した。
・抗ヒスチジン抗体：Wako社、クローン9F2、モノクローナル抗体（mAb）
・ＡＰＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体：Jackson  ImmunoResearch社製 Code: 715-136-150【０１６６】
これらの結果を、図１０に示す。図１０は、細胞表面におけるＴＧの発現量を示すヒストグラムである。図１０において、横軸は、蛍光強度であり、ＨＬＡ−ＤＲに提示されたＴＧの発現量を示し、縦軸は、細胞のカウント数を示す。また、図１０において、陰影をつけたヒストグラムは、コントロール２の結果である。【０１６７】
図１０に示すように、いずれのハロタイプのβ鎖を有するＨＬＡ−ＤＲを導入した細胞も、細胞表面においてＨＬＡ−ＤＲに提示されたＴＧが確認された。一方、ＨＬＡ−ＤＲ未導入のコントール１（Without  DR）は、ＨＬＡ−ＤＲが発現されず、細胞表面において、ＴＧの発現が認められなかった。これらの結果から、前記ＨＬＡ−ＤＲによってＴＧが提示されることがわかった。【０１６８】
（実施例２Ｂ）
ＨＬＡ−ＤＲを免疫沈降し、ＴＧが、ＨＬＡ−ＤＲと結合していることを確認した。【０１６９】
２９３Ｔ細胞に、α鎖発現用ベクターである前記HLA-DRA*01:01の他に、後述する図１１の図中に示す組合せとなるように各発現ベクターを導入し、培養した。前記培養後の細胞について、前記実施例１Ｂと同様にして、免疫沈降によるサンプル調製およびウエスタンブロッティングを行った。前記ウエスタンブロッティングでは、抗体として、抗ヒトＴＧ抗体または前記ウサギ抗ＨＬＡ−ＤＲα抗体を使用し、ＴＧおよびＨＬＡ−ＤＲを検出した。コントロールは、前記実施例１Ｂと同様に、前記培養後の細胞を溶解したのみである非免疫沈降サンプルを使用した以外は、同様にして、ウエスタンブロッティングを行った。
抗ヒトＴＧ抗体：Dako社【０１７０】
これらの結果を図１１に示す。図１１は、ウェスタンブロットの写真である。図１１において、写真の上側は、レーン番号および発現ベクターの導入（＋）と未導入（−）を示し、写真の左側は、検出したタンパク質の種類を示す。【０１７１】
図１１において、レーン１は、前記コントロールであり、発現は確認されなかった。ＴＧのみを導入した細胞（レーン２）およびＨＬＡ−ＤＲのみを導入した細胞（レーン３）は、１段目と３段目の写真に示すように、ＴＧまたはＨＬＡ−ＤＲの発現は確認されたが、２段目の写真に示すように、両者の結合は確認されなかった。これに対して、ＴＧとＨＬＡ−ＤＲとを導入した細胞（レーン４）は、１段目および３段目の写真に示すように、ＴＧおよびＨＬＡ−ＤＲの発現が確認され、且つ、２段目の写真に示すように、両者の結合も確認できた。これらの結果から、ＴＧの細胞表面への発現には、ＨＬＡ−ＤＲが必要であること、また、ＴＧは、ＨＬＡ−ＤＲに結合して、細胞表面に発現することがわかった。なお、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体および抗ＴＧ抗体を用いた免疫染色により、橋本病患者由来の甲状腺組織においても、同様に、ＨＬＡ−ＤＲにＴＧが提示されていることが確認できた。【０１７２】
（実施例２Ｃ）
橋本病患者由来の血清中のＩｇＧ抗体が、ＨＬＡ−ＤＲに提示されたＴＧを認識することを確認した。【０１７３】
抗ＴＧ抗体陽性（ｎ＝３）の橋本病患者、抗ＴＧ抗体陰性（ｎ＝３）の橋本病患者および健常者（ｎ＝１）から血清を採取し（ｎ＝５３）、０．１％ＢＳＡ含有ＨＡＮＫＳ緩衝液で３００倍に希釈し、血清サンプルとした。ここでいう抗ＴＧ抗体とは、正常にフォールディングされているＴＧに結合する抗体を意味する。【０１７４】
２９３Ｔ細胞に、α鎖用発現ベクターとして前記HLA-DRA*01:01ベクター、β鎖用発現ベクターとして前記HLA-DRB1*01:01（HLA-DR0101）ベクターまたは前記HLA-DRB4*01:03（HLA-DR53）ベクター、前記ＴＧベクターおよび前記ＧＦＰベクターを導入し、培養した。前記培養細胞を、前記血清サンプルと反応させ、さらに、ビオチン化抗ヒトＩｇＧ抗体および前記ＡＰＣ標識ストレプトアビジンを順に反応させた。そして、ＧＦＰ陽性細胞について、前記実施例１Ｃと同様に、フローサイトメトリー分析により、前記細胞に対する前記血清中のＩｇＧ抗体の結合量を測定した。コントロール１は、前記HLA-DR発現用ベクターを導入しない以外は同様にして、また、コントロール２は、サンプルとして、前記健常者由来の血清サンプルを使用した以外は同様にして、測定した。
・ビオチン化抗ヒトＩｇＧ抗体：Jackson  ImmunoResearch社製【０１７５】
これらの結果を図１２に示す。図１２は、血清ＩｇＧ抗体の前記細胞への結合量を示すヒストグラムである。図１２において、横軸は、蛍光強度であり、血清ＩｇＧ抗体の前記細胞への結合量を示し、縦軸は、細胞のカウント数を示す。図１２において、上段は、ＴＧと橋本病抵抗性ＨＬＡ−ＤＲ１（HLA-DRA*01:01/HLA-DRB1*01:01）を導入した細胞（TG/HLA-DR0101）の結果であり、下段は、ＴＧと橋本病感受性のＨＬＡ−ＤＲ５３（HLA-DRA*01:01/HLA-DRB4*01:03）を導入した細胞（TG/HLA-DR53）の結果である。また、図１２において、左側から、Patient1-3の３列は、抗ＴＧ抗体陽性の血清サンプル、Patient4-6の３列は、抗ＴＧ抗体陰性の血清サンプル、右の１列は、健常者由来の血清サンプルを使用した結果である。【０１７６】
図１２に示すように、抗ＴＧ抗体陽性の血清（Patient1-3）を用いた場合、抵抗性ＨＬＡ−ＤＲの細胞（TG/HLA-DR1）および感受性ＨＬＡ−ＤＲの細胞（TG/HLA-DR53）のいずれにおいても、血清ＩｇＧ抗体の結合が確認された。一方、抗ＴＧ抗体陰性の血清（Patient4-6）を用いた場合、抵抗性ＨＬＡ−ＤＲの細胞（TG/HLA-DR1）では、血清ＩｇＧ抗体の結合は確認されなかったが、感受性ＨＬＡ−ＤＲの細胞（TG/HLA-DR53）では、血清ＩｇＧ抗体の結合が確認された。この結果から、感受性ＨＬＡ−ＤＲに提示されたＴＧによれば、正常にフォールディングされたＴＧを抗原とした場合には検出できない橋本病患者由来血清ＩｇＧ抗体（自己抗体）をも検出できることがわかった。このため、前者の正常フォールドタンパク質抗原による自己抗体の検出では、偽陰性となる場合でも、前記自己抗体を検出でき、結果的に、優れた精度で橋本病患者の罹患の危険性の判断が可能といえる。【０１７７】
（実施例２Ｄ）
橋本病患者由来の血清中のＩｇＧ抗体が、ＨＬＡ−ＤＲに提示されたＴＧを認識することを確認した。【０１７８】
抗ＴＧ抗体陽性の橋本病患者由来の血清と抗ＴＧ抗体陰性の橋本病患者由来の血清を、それぞれ、所定の倍率（１００、３００、９００、２，７００、８，１００または２４，３００倍）に希釈し、希釈サンプルとした。【０１７９】
２９３Ｔ細胞に、α鎖用発現ベクターとして前記HLA-DRA*01:01ベクター、β鎖用発現ベクターとして前記HLA-DRB1*01:01（HLA-DR0101）ベクターまたは前記HLA-DRB4*01:03（HLA-DR53）ベクター、前記ＴＧベクターおよび前記ＧＦＰベクターを導入し、培養した。前記培養細胞を、前記希釈サンプルと反応させた以外は、前記実施例２Ｃと同様に、フローサイトメトリー分析により、前記細胞に対する前記血清中のＩｇＧ抗体の結合量を示す平均蛍光強度を算出した。【０１８０】
これらの結果を図１３に示す。図１３は、血清ＩｇＧ抗体の前記細胞への結合量（平均蛍光強度）を示すグラフである。図１３において、横軸は、血清の希釈倍率を示し、縦軸は、ＩｇＧ抗体の結合量に対応する平均蛍光強度を示す。図１３において、左側のグラフが、抗ＴＧ抗体陽性の血清サンプル、右側のグラフが、抗ＴＧ抗体陰性の血清サンプルを使用した結果である。【０１８１】
図１３において、左のグラフに示すように、抗ＴＧ抗体陽性血清のＩｇＧ抗体は、抵抗性ＨＬＡ−ＤＲの細胞（TG/HLA-DR1、■）および感受性ＨＬＡ−ＤＲの細胞（TG/HLA-DR53、●）のいずれ対しても、相対的に低い希釈率で、相対的に高い平均蛍光強度を示し、血清の希釈率の増加にしたがって、平均蛍光強度が低下した。また、抗ＴＧ抗体陰性血清のＩｇＧ抗体は、抵抗性ＨＬＡ−ＤＲの細胞（TG/HLA-DR1、■）に対して、いずれの希釈率でも、平均蛍光強度がほとんど検出できなかったのに対し、感受性ＨＬＡ−ＤＲの細胞（TG/HLA-DR53、●）に対して、相対的に低い希釈率で、相対的に高い平均蛍光強度を示し、血清の希釈率の増加にしたがって、平均蛍光強度が低下した。【０１８２】
（実施例２Ｅ）
橋本病患者由来の血清中のＩｇＧ抗体が、ＨＬＡ−ＤＲに提示されたＴＧを認識することを確認した。【０１８３】
５３名の橋本病患者由来の血清を、前記実施例２Ｃと同様にして３００倍に希釈し、血清サンプルとして使用した以外は、前記実施例２Ｄと同様にして、フローサイトメトリー分析により、ＧＦＰ陽性細胞に対する血清ＩｇＧ抗体の結合量を示す平均蛍光強度を算出した。【０１８４】
これらの結果を図１４に示す。図１４は、血清ＩｇＧ抗体の前記細胞への結合量（平均蛍光強度）を示すグラフである。図１４において、横軸は、抵抗性ＨＬＡ−ＤＲの細胞（TG/HLA-DR1）に対するＩｇＧ抗体の結合量を示し、縦軸は、感受性ＨＬＡ−ＤＲの細胞（TG/HLA-DR53）に対するＩｇＧ抗体の結合量を示す。【０１８５】
図１４に示すように、抵抗性ＨＬＡ−ＤＲの細胞（TG/HLA-DR1）へのＩｇＧ抗体の結合は、一部の橋本病患者由来の血清において検出されたのみであるのに対し、感受性ＨＬＡ−ＤＲの細胞（TG/HLA-DR53）へのＩｇＧ抗体の結合は、全ての橋本病患者由来の血清において検出された。これらの結果から、感受性ＨＬＡ−ＤＲ（ＨＬＡ−ＤＲ５３）に提示されたＴＧを検出抗原として用いることで、より正確に、自己抗体の検出に基づく橋本病患者の診断が可能となることがわかった。【０１８６】
［実施例３］
本実施例３は、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）の指標である自己抗体の検出に関する。【０１８７】
（実施例３Ａ）
ＨＬＡ−ＤＲとβ２グリコプロテインＩ（β２−ＧＰＩ）とを発現させ、細胞表面に、ＨＬＡ−ＤＲによりβ２−ＧＰＩが提示されること、および、抗β２−ＧＰＩ抗体および抗カルジオリピン抗体（ａＣＬ）が、前記ＨＬＡ−ＤＲに提示されたβ２−ＧＰＩを認識することを確認した。【０１８８】
α鎖用発現ベクターとして前記HLA-DRA*01:01ベクター、β鎖用発現ベクターとして前記HLA-DRB1*04:04ベクター、前記β2-GPIベクターおよび前記ＧＦＰベクターを、２９３Ｔ細胞に導入し、培養した。前記培養後の細胞を、抗β２−ＧＰＩ抗体または抗カルジオリピン抗体（ａＣＬ）と反応させ、さらに前記ＡＰＣ標識抗ヒトＩｇＧ抗体と反応させた。そして、前記実施例１Ａと同様に、ＧＦＰ陽性細胞について、フローサイトメトリー分析を行った。コントロール１は、前記β2-GPI発現ベクターのみを導入以外は同様にして、また、コントロール２は、前記ＧＦＰベクターのみを導入した以外は、同様にして測定した。
・抗β２−ＧＰＩ抗体：ポリクローナル抗体、Atlas antibodies社
・ヒト抗カルジオリピン抗体：クローンEY2C9、北海道大学医学部渥美教授より分与、下記論文参照：Ichikawa,  K．,  M．  A．  Khamashta,  T．  Koike,  E．  Matsuura,  and  G．  R．  V．  Hughes．  1994．  P2-Glycoprotein  I  reactivity  of  monoclonal  anticardiolipin  antibodies  from  patients  with  the  antiphospholipid  syndrome．  Arthritis  Rheum．  37:1453．【０１８９】
これらの結果を図１５に示す。図１５は、細胞表面におけるＨＬＡ−ＤＲ発現量もしくはβ２−ＧＰＩ発現量または抗カルジオリピン抗体の結合量を示すヒストグラムである。図１５において、横軸は蛍光強度であり、左のグラフが、ＨＬＡ−ＤＲの発現量を示し、中央のグラフ列が、β２−ＧＰＩの発現量を示し、右のグラフが、抗カルジオリピン抗体の結合量を示す。図１５において、縦軸は、細胞のカウント数を示す。また、図１５において、陰影をつけたヒストグラムは、前記ＧＦＰのみを導入した細胞（コントロール２）の結果である。【０１９０】
図１５に示すように、ＨＬＡ−ＤＲおよびβ２−ＧＰＩを導入した細胞（β2-GPI+HLA-DR4）は、細胞表面においてＨＬＡ−ＤＲに提示されたβ２−ＧＰＩが確認されまた、抗カルジオリピン抗体の結合も認められた。一方、ＨＬＡ−ＤＲ未導入のコントロール１（β2GPI）は、細胞表面において、ＨＬＡ−ＤＲが発現されず、細胞表面において、β２−ＧＰＩの発現が認められず、また、抗カルジオリピン抗体の結合も認められなかった。以上のことから、細胞表面におけるβ２−ＧＰＩの発現には、ＨＬＡ−ＤＲが必要であること、また、抗カルジオリピン抗体は、ＨＬＡ−ＤＲに提示されたミスフォールドβ２−ＧＰＩを認識し、結合することがわかった。【０１９１】
（実施例３Ｂ）
異なるハプロタイプのＨＬＡ−ＤＲによるβ２−ＧＰＩの提示能を確認した。【０１９２】
α鎖用発現ベクターとして前記HLA-DRA*01:01ベクター、β鎖用発現ベクターとして前記表２の各種HLA-DRBベクター、前記β2-GPIベクターおよび前記ＧＦＰベクターを、２９３Ｔ細胞に導入した。【０１９３】
前記細胞を培養した後、前記培養後の細胞について、前記実施例３Ａと同様にして、フローサイトメトリー分析によって、細胞表面におけるβ２−ＧＰＩの発現量および前記抗カルジオリピン抗体の結合量の確認を行った。具体的には、前記フローサイトメトリー分析により、ＧＦＰ陽性細胞における、β２−ＧＰＩおよび抗カルジオリピン抗体の平均蛍光強度を算出した。これらの結果を図１６および図１７に示す。【０１９４】
図１６は、細胞表面におけるβ２−ＧＰＩの発現量を示すグラフである。図１６において、横軸は、平均蛍光強度であり、β２−ＧＰＩの発現量を示し、縦軸は、前記ＨＬＡ−ＤＲＢの種類を示す。【０１９５】
図１６に示すように、いずれの前記ＨＬＡ−ＤＲＢを発現させた場合においても、β２−ＧＰＩの高い発現量が確認できた。これらの結果から、前記ＨＬＡ−ＤＲのハプロタイプにかかわらず、前記ＨＬＡ−ＤＲがβ２−ＧＰＩを提示することがわかった。【０１９６】
次に、図１７は、抗カルジオリピン抗体の結合量を示すグラフである。図１７において、横軸は、平均蛍光強度であり、抗カルジオリピン抗体の結合量を示し、縦軸は、前記ＨＬＡ−ＤＲＢの種類を示す。【０１９７】
図１７に示すように、いずれの前記ＨＬＡ−ＤＲＢを発現させた場合においても、抗カルジオリピン抗体の高い結合量が確認できた。これらの結果から、前記ＨＬＡ−ＤＲのハプロタイプにかかわらず、前記抗カルジオリピン抗体が、前記ＨＬＡ−ＤＲに提示されたβ２−ＧＰＩと結合することがわかった。【０１９８】
（実施例３Ｃ）
ＨＬＡ−ＤＲを免疫沈降し、β２−ＧＰＩが、ＨＬＡ−ＤＲと結合していることを確認した。【０１９９】
２９３Ｔ細胞に、α鎖発現用ベクターである前記HLA-DRA*01:01の他に、後述する図１８の図中に示す組合せとなるように各発現ベクターを導入し、培養した。前記培養後の細胞について、前記実施例１Ｂと同様にして、免疫沈降によるサンプル調製およびウエスタンブロッティングを行った。前記免疫沈降では、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体固定化ビーズ（ビオチン化抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体およびストレプトアビジンセファロース（GEヘルスケア社））を使用し、前記ウエスタンブロッティングでは、抗体として、前記抗β２−ＧＰＩ抗体または前記ウサギ抗ＨＬＡ−ＤＲα抗体と、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体とを使用し、β２−ＧＰＩおよびＨＬＡ−ＤＲを検出した。コントロール１は、前記HLA-DRベクターおよび前記β2-GPIベクターを導入しない以外は、同様にしてウエスタンブロッティングを行った。また、コントロール２は、β２−ＧＰＩの発現確認のため、前記培養後の細胞を溶解したのみである非免疫沈降サンプルを使用した以外は、同様にして、ウエスタンブロッティングを行った。【０２００】
これらの結果を図１８に示す。図１８は、ウェスタンブロットの写真である。図１８において、写真の上側は、レーン番号および発現ベクターの導入（＋）と未導入（−）を示し、写真の左側は、検出したタンパク質の種類を示す。【０２０１】
図１８において、レーン１は、前記コントロール１であり、発現は確認されなかった。β２−ＧＰＩのみ導入した細胞（レーン２）およびＨＬＡ−ＤＲのみを導入した細胞（レーン３）は、２段目および３段目の写真に示すように、β２−ＧＰＩまたはＨＬＡ−ＤＲの発現は確認されたが、１段目の写真に示すように、両者の結合は確認されなかった。これに対して、β２−ＧＰＩとＡＰＳ感受性のＨＬＡ−ＤＲ７（HLA-DRA*01:01/HLA-DRB1*07:01）とを導入した細胞（レーン４）は、２段目および３段目の写真に示すように、β２−ＧＰＩおよびＨＬＡ−ＤＲの発現が確認され、且つ、１段目の写真に示すように、両者の結合も確認できた。これらの結果から、β２−ＧＰＩの細胞表面への発現には、ＨＬＡ−ＤＲが必要であることがわかった。なお、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体および抗β２−ＧＰＩ抗体を用いた免疫染色により、ＡＰＳ患者由来の流産絨毛組織においても、同様に、ＨＬＡ−ＤＲにβ２−ＧＰＩが提示されていることが確認できた。【０２０２】
（実施例３Ｄ）
ＥＬＩＳＡ法を用いない新たなHLA-DR/β2-GPI複合体に対する自己抗体値（aHLA-DR/β2-GPI値）の測定系を構築し、ＡＰＳ患者由来の血清について、自己抗体の間接的な測定を行った。【０２０３】
（１）ＡＰＳ標準曲線の作製
ＡＰＳ患者由来の血清を、０．１％ＢＳＡ含有ＨＡＮＫＳ緩衝液で、１００倍希釈から３．１６倍ずつ希釈し、３．１６×１０６倍希釈までの希釈系列を作成し、これらを標準サンプルとした。前記ＡＰＳ患者由来の血清は、MESACUP（商標）カルジオリピンテストを使用した公知のＥＬＩＳＡ法により、抗カルジオリピン抗体測定値（ａＣＬ）が４７．０Ｕ／ｍｌであることを確認済みである。【０２０４】
２９３Ｔ細胞に、α鎖用発現ベクターとして前記HLA-DRA*01:01ベクター、β鎖用発現ベクターとして前記HLA-DRB1*07:01ベクター、前記β2-GPIベクターおよび前記ＧＦＰベクターを、前記実施例１Ａと同様にして、導入し培養した。そして、前記培養後の細胞を、前記標準サンプルと反応させ、さらに、前記ＡＰＣ標識抗ヒトＩｇＧ抗体と反応させた。そして、ＧＦＰ陽性細胞について、前記実施例３Ａと同様に、フローサイトメトリー分析により、前記細胞に対する前記血清中のHLA-DR7/β2-GPI複合体を認識する自己抗体の結合量を示す平均蛍光強度を算出した。このように、前記ＨＬＡ−ＤＲと前記β２−ＧＰＩとの複合体を抗原試薬として結合量を測定したことを、以下、「HLA-DR/β2-GPI複合体システムによる測定」とし、それによって「抗HLA-DR/β2-GPI複合体抗体価」を評価した。【０２０５】
次に、前記標準サンプルについて、ＡＰＳ標準曲線を作製した。具体的には、前記ＥＬＩＳＡ法によってａＣＬ測定値が確定している前記標準サンプルの希釈倍率に対応した測定値を暫定的に抗HLA-DR/β2-GPI複合体抗体価（aHLA-DR/β2-GPI、自己抗体値）とし、これと、前記HLA-DR/β2-GPI複合体システムにより測定した前記HLA-DR7/β2-GPI複合体を認識する自己抗体の結合量を示す平均蛍光強度（human  IgG−MFI）とから、前記ＡＰＳ標準曲線を作製した。【０２０６】
この結果を図１９に示す。図１９は、前記ＡＰＳ標準曲線を示したグラフである。図１９において、横軸は、前記HLA-DR/GPI複合体システムにより測定した、前記標準サンプル中のHLA-DR7/β2-GPI複合体を認識する自己抗体の結合量を示す平均蛍光強度（human  IgG−MFI）を示し、縦軸は、前記標準サンプルのＥＬＩＳＡ法による既知の測定値より暫定的に決定した抗HLA-DR/β2-GPI複合体抗体価（aHLA-DR/β2-GPI）を示す。【０２０７】
（２）ＡＰＳ患者由来の血清中のaHLA-DR/β2-GPI値の測定
ＡＰＳ患者（ｎ＝１２０）から血清を採取し、０．１％ＢＳＡ含有ＨＡＮＫＳ緩衝液で１００倍に希釈し、血清サンプルとした。前記ＡＰＳ患者由来の血清は、前記（１）と同様に、前記ＥＬＩＳＡ法により抗カルジオリピン抗体測定値（ａＣＬ）を確認済みである。また、公知のＥＬＩＳＡ法により抗β2-GPI抗体値（ａβ2GPI）を確認した。【０２０８】
次に、前記（１）と同様にして、前記培養後の細胞を、前記血清サンプルと反応させ、さらに、前記ＡＰＣ標識抗ヒトＩｇＧ抗体と反応させた。そして、ＧＦＰ陽性細胞について、前記実施例３Ａと同様に、フローサイトメトリー分析により、前記細胞に対する前記血清中のHLA-DR7/β2-GPI複合体を認識する自己抗体の結合量を示す平均蛍光強度を算出した。さらに、前記図１９の前記ＡＰＳ標準曲線に基づいて、間接的にaHLA-DR/β2-GPI複合体抗体値（HLA-DR/GPI複合体システムによる自己抗体値）を算出した。コントロールは、健常者由来の血清（ｎ＝１００）を用い、同様にして、HLA-DR7/β2-GPI複合体を認識する自己抗体の結合量の測定、および前記検量線に基づくaHLA-DR/β2-GPI値（HLA-DR/GPI複合体システムによる自己抗体値）の算出を行った。【０２０９】
まず、図２０に、ＡＰＳ患者由来（ｎ＝１２０）および、健常者由来（ｎ＝１００）の血清サンプルに関する、HLA-DR/GPI複合体システムによる自己抗体値（aHLA-DR/β2-GPI値）の分布を表すグラフを示す。図２０において、横軸は、自己抗体値（aHLA-DR/β2-GPI  Ab）の範囲を示し、縦軸は、各aHLA-DR/β2-GPI値の範囲の人数を示す。また、健常人１００名のaHLA-DR/β2-GPI値の９９パーセンタイルである、１．８Ｕ／ｍＬを基準値とした。図２０において、前記基準値以上のaHLA-DR/β2-GPI値の範囲は、白抜きのバーで、基準値未満のaHLA-DR/β2-GPI値の範囲は、グレーのバーで示している。図２０に示すように、前記ＡＰＳ患者では、１２０名のうち１００名（８３．３％）が、前記基準値を超える値（陽性）となった。そして、ＡＰＳ患者と健常者との間で、前記aβ2-GPI/DR7値は、有意差が確認された（p＝３．３×１０−３３）。これらの結果から、HLA-DR/β2-GPI複合体を抗原試薬とし、前記ＡＰＳ標準曲線を用いて間接的にHLA-DR/GPI複合体システムによる自己抗体値を算出することで、優れた精度でＡＰＳの罹患の危険性を判断できることがわかった。【０２１０】
次に、図２１に、前記ＡＰＳ患者由来の血清サンプルに関する、HLA-DR/GPI複合体システムにより算出した自己抗体値（aHLA-DR/β2-GPI値）と前記ＥＬＩＳＡ法による抗β2-GPI抗体測定値（aβ2GPI）および抗カルジオリピン抗体測定値（aCL）をそれぞれ比較したグラフを示す。（Ａ）において、横軸は、ＥＬＩＳＡ法による抗β2-GPI抗体測定値を示し、（Ｂ）において、横軸は、抗カルジオリピン抗体測定値を示し、（Ａ）および（Ｂ）において、縦軸は、HLA-DR/GPI複合体システムによる自己抗体値（aHLA-DR/β2-GPI値）を示す。（Ａ）において、垂直方向の点線は、抗β2-GPI抗体測定値の基準値（２．２Ｕ／ｍＬ）を示し、（Ｂ）において、垂直方向の点線は、抗カルジオリピン抗体測定値の基準値（１８．５Ｕ／ｍＬ）を示し、（Ａ）および（Ｂ）において、水平方向の点線はaHLA-DR/β2-GPI値の基準値（１．８Ｕ／ｍＬ）を示す。なお、抗β2-GPI抗体測定値の基準値および抗カルジオリピン抗体測定値の基準値は、それぞれ、前記健常者由来の血清サンプルにおける抗β2-GPI抗体測定値および抗カルジオリピン抗体測定値の９９パーセントタイルの値である。また、（Ａ）および（Ｂ）において、白丸（○）は、前記aHLA-DR/β2-GPI値の基準値以上の血清サンプルを示し、黒丸（●）は、前記aHLA-DR/β2-GPI値の基準値未満の血清サンプルを示す。（Ａ）および（Ｂ）において、図中の数字は、各分画の血清サンプルの割合を示す。【０２１１】
図２１（Ａ）に示すように、前記ＡＰＳ患者の３５％が、抗β2-GPI抗体測定値が陽性であるのに対し、前記ＡＰＳ患者の８４．６％が、前記HLA-DR/GPI複合体システムによる自己抗体値が陽性であった。また、（Ｂ）に示すように、前記ＡＰＳ患者の３６．６％が、抗カルジオリピン抗体測定値が陽性であるのに対し、前記ＡＰＳ患者の８３．３％が、前記HLA-DR/GPI複合体システムによる自己抗体値が陽性であった。さらに、（Ａ）および（Ｂ）の左上の分画に示すように、抗β2-GPI抗体測定値または抗カルジオリピン抗体測定値が陰性のＡＰＳ患者の約８０％が、HLA-DR/GPI複合体システムによる自己抗体値では、陽性を示した。これの結果から、HLA-DR/GPI複合体システムを抗原試薬として算出した自己抗体値によれば、例えば、従来のＥＬＩＳＡ法による抗β2-GPI抗体測定値または抗カルジオリピン抗体測定値に対して、優れた精度でＡＰＳ患者を陽性と判断できることがわかった。また、従来のＥＬＩＳＡ法では、陰性と判断されるＡＰＳ患者についても、正しく陽性と判断できることがわかった。このため、本発明によれば、従来の正常フォールドβ２−ＧＰＩを用いたＥＬＩＳＡ法よりも、優れた精度でＡＰＳの罹患の危険性の判断が可能といえる。【０２１２】
［実施例４］
本実施例４は、バセドウ病（Graves病）の指標である自己抗体の検出に関する。【０２１３】
バセドウ病患者由来の血清中の自己抗体が、ＨＬＡ−ＤＲに提示されたＴＳＨＲを認識することを確認した。【０２１４】
バセドウ病患者および健常者から血清を採取し、３００倍に希釈し、血清サンプルとした。前記実施例１Ａと同様にして、α鎖発現用ベクターである前記HLA-DPA*02:02ベクター、β鎖発現用ベクターである前記HLA-DPB*05:01ベクター、前記ＴＳＨＲベクターおよび前記ＧＦＰベクターを導入した２９３Ｔ細胞を培養し、前記培養した細胞を各種抗体または血清とそれぞれ反応させ、ＧＦＰ陽性細胞について、フローサイトメトリー分析を行った。具体的には、バセドウ病患者由来の血清中の自己抗体の結合の確認には、前記細胞を、バセドウ患者の希釈血清と反応させ、さらに、APC標識抗ヒトＩｇＭ抗体を反応させた。また、細胞表面におけるＴＳＨＲまたはＨＬＡ−ＤＰの発現の確認には、前記細胞を、抗ＴＳＨＲ抗体または抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体と反応させ、さらに、前記ＡＰＣ標識抗マウスＩｇＧ  Ｆａｂ抗体と反応させた以外は、前記実施例１Ａと同様にして、フローサイトメトリー分析を行った。
・抗ヒトＴＳＨＲ抗体：Santa  Cruz社製  クローン2C11
・抗ヒトＨＬＡ−ＤＰ抗体：ExBio社製  クローンHL-38【０２１５】
コントロール１は、前記HLA-DP発現ベクターを導入しなかった以外は同様にして、コントロール２は、前記抗体に代えて、前記ＡＰＣ標識抗ヒトＩｇＭ抗体または前記ＡＰＣ標識抗マウスＩｇＧ  Ｆａｂ抗体のみと反応させた以外は同様にして、フローサイトメトリー分析を行った。【０２１６】
これらの結果を図２２に示す。図２２は、細胞表面におけるＴＳＨＲもしくはＭＨＣクラスII分子の発現量、またはＭＨＣクラスII分子に提示されたＴＳＨＲへの自己抗体の結合量を示すヒストグラムである。図２２において、横軸は、蛍光強度であり、ＨＬＡ−ＤＰ、ＴＳＨＲの発現量または前記血清サンプル中の自己抗体の結合量を示し、縦軸は、細胞のカウント数を示す。図２２において、上段は、ＴＳＨＲを導入した細胞（コントロール１）の結果であり、下段は、ＴＳＨＲおよびＭＨＣクラスII分子を導入した細胞の結果である。【０２１７】
図２２の下段に示すように、ＨＬＡ−ＤＲとＴＳＨＲを導入した細胞（ＴＳＨＲ＋ＨＬＡ−ＤＰ５）では、細胞表面におけるＴＳＨＲおよびＨＬＡ−ＤＰの発現が確認され、且つ、バセドウ病（ＧＤ）患者由来の血清サンプル中の自己抗体の結合が確認された。これに対して、図２２の上段に示すように、コントロール１（ＴＳＨＲ）では、細胞表面におけるＴＳＨＲの発現は確認されたが、バセドウ病患者由来の血清サンプル中の自己抗体の結合は確認されなかった。また、いずれの細胞においても、健常者由来の血清サンプル中の抗体との結合は確認されなかった。これらの結果から、バセドウ病患者由来の血清サンプル中の自己抗体は、正常にフォールディングされたＴＳＨＲよりも、ＨＬＡ−ＤＰに提示されたミスフォールドＴＳＨＲを認識し、強く結合することがわかった。【０２１８】
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。【０２１９】
この出願は、２０１３年７月１７日に出願された日本出願特願２０１３−１４８８３３を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【０２２０】
本発明によれば、自己抗体を検出するための抗原試薬として、前記変性タンパク質／ＭＨＣクラスIIを使用することにより、自己免疫疾患に関与する自己抗体を優れた精度で検出でき、これに伴い、偽陰性の問題を抑制し、優れた精度で自己免疫疾患の罹患の可能性を判断できる。このため、本発明は、例えば、臨床分野および生化学分野において極めて有用である。
【図９】
2015008498.tif 000020
【図２１】
2015008498.tif 000021
【図１】
2015008498.tif 000022
【図２】
2015008498.tif 000023
【図３】
2015008498.tif 000024
【図４】
2015008498.tif 000025
【図５】
2015008498.tif 000026
【図６】
2015008498.tif 000027
【図７】
2015008498.tif 000028
【図８】
2015008498.tif 000029
【図１０】
2015008498.tif 000030
【図１１】
2015008498.tif 000031
【図１２】
2015008498.tif 000032
【図１３】
2015008498.tif 000033
【図１４】
2015008498.tif 000034
【図１５】
2015008498.tif 000035
【図１６】
2015008498.tif 000036
【図１７】
2015008498.tif 000037
【図１８】
2015008498.tif 000038
【図１９】
2015008498.tif 000039
【図２０】
2015008498.tif 000040
【図２２】
2015008498.tif 000041
【配列表】
2015008498000001.app
【国際調査報告】
2015008498.tif 000042
2015008498.tif 000043
2015008498.tif 000044
2015008498.tif 000045