(57)【要約】  スーパーコンティニューム光を光源としたCARS顕微鏡でホモダイン干渉計測を行う。パルス間の干渉性が保たれる正常分散の非線形光ファイバーを用いてスーパーコンティニューム光を発生させる。検出光の干渉成分の位相がパルス間で同じになるので積算が可能になり、信号雑音比の向上が可能となる。
2015025389.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
周波数ωPの第１の光を発生するパルスレーザ光源と、
前記第１の光が入射されスーパーコンティニューム光を発生する正常分散の非線形光ファイバーと、
前記スーパーコンティニューム光から前記第１の光より周波数の低い周波数ωSTの第２の光を選択する光学素子と、
前記スーパーコンティニューム光から周波数がωAS=2・ωP -ωST である参照光としての第３の光を選択する光学素子と、
前記第１の光と前記第２の光を同軸状に一致させる光学系と、
前記第１の光と前記第２の光の位相を調整する機構と、
前記同軸状の前記第１の光と前記第２の光を観察試料に集光する対物レンズと、
観察試料を走査する走査機構と、
観察試料から発生したCARS光を検出する対物レンズと、
前記CARS光と前記第３の光とを干渉させる干渉光学系と、
前記干渉光学系によって干渉した干渉光を分光する分光器と、
前記分光器で分光された光を検出する光検出器と、
前記光検出器からの信号を処理する演算装置と、
前記演算装置の情報に基づいて画像を表示する表示装置と、
を有することを特徴とするCARS顕微鏡。
【請求項２】
請求項１に記載のCARS顕微鏡において、
前記非線形光ファイバーは少なくとも前記スーパーコンティニューム光の発生周波数領域において正常分散であることを特徴とするCARS顕微鏡。
【請求項３】
請求項１に記載のCARS顕微鏡において、
前記干渉光は少なくとも二つに分割され、前記分割された干渉光の間の位相差は９０度の整数倍であり、少なくとも位相差の一つは９０度であることを特徴とするCARS顕微鏡。
【請求項４】
請求項１に記載のCARS顕微鏡において、
前記光ファイバーは偏波面保持機能を有することを特徴とするCARS顕微鏡。
【請求項５】
請求項１に記載のCARS顕微鏡において、
前記スーパーコンティニューム光は前記第１の光の周波数ωPを中心に高周波数方向及び低周波数方向に略３０００cm-1のバンド幅を有することを特徴とするCARS顕微鏡。
【請求項６】
請求項１に記載のCARS顕微鏡において、
前記スーパーコンティニューム光の光源スペクトルを測定する機能と、
前記干渉光スペクトルを前記光源スペクトルで補正する機能を有することを特徴とするCARS顕微鏡。
【請求項７】
請求項１に記載のCARS顕微鏡において、
前記第１の光及び前記第２の光を同軸状に一致させる光学系は前記第１の光のスペクトル幅を狭める光学フィルタを有することを特徴とするCARS顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は光学的な分解能を要する光学装置に関し、特に光ビームを絞り込み、光ビームの観察物体に対する照射位置を相対的に変化させて応答信号を取得するCARS顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラマン分光顕微鏡は生物関連の試料を観察するのに非常に有効である。ラマン分光顕微鏡では、観察対象に絞り込んだレーザ光を照射し、発生するラマン散乱光を検出する。ラマン散乱光は励起光周波数から周波数シフトしており、分光器等でスペクトルを取る。観察対象と照射ビームの位置を相対的に変え、走査することでそれぞれの位置での分光スペクトルを得ることができる。このスペクトルをもとに画像化が可能である。それぞれの観察位置でのラマンスペクトルは、そこに存在する分子の振動励起状態を反映したものとなっており、その分子に特徴的なものとなっている。そのスペクトルの特徴を利用することで、生物の細胞を観察しているのであれば、細胞組織内での生体分子の分布が分かる。【０００３】
図２にエネルギー準位図を使ってラマン散乱が起こる過程を示す。ラマン散乱にはストークス散乱とアンチストークス散乱とがあるが、図２ではストークス散乱のみを示した。７０１は分子の振動基底状態を表し、７０２は振動励起状態を表す。周波数ωPのポンプ光を分子に照射すると、中間状態７０３を経て、周波数ωSの光を散乱する。このとき、分子は振動励起状態７０２の一つに帰着する。散乱光の周波数ωSはポンプ光より周波数の低いストークス光となっている。分子の振動励起状態の準位は複数あり、分子の種類によって振動励起状態が異なり、また中間状態から振動励起状態の準位への遷移確率が異なるため、分子特有のスペクトルが形成される。ラマンシフト周波数ΩはΩ＝ωP−ωSで表され、ストークス散乱の場合は正の値となる。アンチストークス光の場合は、始状態が分子の振動励起状態であり、中間準位を経て分子の状態が振動基底状態に帰着する。この場合、ωASをアンチストークス光の周波数とすると、ωP＜ωASとなっており、アンチストークスラマン散乱光の方がポンプ光より周波数が高い。【０００４】
上記のラマン散乱は得られる散乱光の強度が弱いため測定に時間がかかる。強い散乱光が得られる方式として、CARS（Coherent Anti-Stokes Raman Scattering）という非線形ラマン散乱を使用する分光方法がある。この方法でもラマンスペクトルを得ることが可能であり、分子の振動状態が分かる。CARSの発生のためにはピークパワーの高いパルスレーザを用いる。このパルスレーザ光によって発生するCARSは非線形効果によるものであり、その強度はピークパワーが大きくなるとラマン散乱と比べて桁違いに強いものとなる。これにより、高い信号雑音比の信号が得られ、計測時間を格段に短くすることができる。【０００５】
CARSは３次の分極による発光であり、CARSを発生させるためには、ポンプ光、ストークス光、プローブ光が必要とされる。一般的には、光源の数を少なくするために、プローブ光はポンプ光で代用される。この場合、誘起される３次の分極は
［式１］
PAS(3)(ωAS)=|χr(3)(ωAS)+χnr(3)|EP2(ωP)E*S(ωS)
で表される。ここに、χr(3)(ωAS)は３次の電気感受率の分子振動の共鳴項であり、周波数依存性のないχnr(3)は非共鳴項である。また、ポンプ光及びプローブ光の電場をEPで表し、ストークス光の電場はESで表している。式（１）中でESの肩についたアスタリスクは複素共役を示す。CARS光の強度は以下のように表される。【０００６】
［式２］
ICARS(ωAS)∝|PAS(3)(ωAS)|2 
CARS光が発生する機構を分子のエネルギー準位図（図３）を用いて説明する。本図は共鳴項のプロセスを示している。図２と同様に、７０１は分子の振動基底状態を表し、７０２は振動励起状態を表す。周波数ωPのポンプ光と周波数ωSのストークス光を同時に照射する。このとき分子は中間状態７０３を介して、７０２のある振動励起準位に励起される。この励起状態にある分子に周波数ωPのプローブ光を照射すると、中間状態７０４を介して周波数ωASのCARS光を発生しながら、分子は振動基底状態に戻る。このときのCARS光の周波数はωAS＝2・ωP−ωSと表される。【０００７】
式（１）の非共鳴項に関係する一つのプロセスを図４に示す。ストークス光の周波数が振動励起状態ではなく、中間状態７０５を介したプロセスとなる。周波数ωPのポンプ光と周波数ω’Sのストークス光の同時照射により電子等の関与する７０５の中間状態が励起され、さらに周波数ωPのプローブ光を照射することにより、中間状態７０４を介して周波数ωASの非共鳴のCARS光が発生する。ブロードバンドのレーザ光をストークス光として使用した場合などは、図４における周波数ω’Sなどの光が含まれることがある。これらの共鳴CARS光と非共鳴CARS光とは互いにコヒーレントであり、干渉することになる。【０００８】
ラマン散乱は１９２８年に発見されて以来、各種の分子についてスペクトルの研究がなされており、データの蓄積が進んでいる。したがって、このスペクトルデータを参照して分子の同定を行うのが望ましい。CARS光は式（１）、（２）で表されるが、ラマン散乱スペクトルに対応する部分はIm[χr(3)(ωAS)]である。これは共鳴項の複素部分であり、前述したように、非共鳴項χnr(3)と干渉するので、CARSで得られるスペクトル形状はラマン散乱スペクトルIm[χr(3)(ωAS)]とは異なるものとなる。このため、ラマン散乱スペクトルを参照して直接CARSスペクトルを解析することは難しい。【０００９】
CARSスペクトルからラマン散乱スペクトルを抽出する方法の開発は重要な課題であり、いろいろな方式が開発されている（非特許文献１）。たとえば、強度スペクトルから位相スペクトルを回復する方法である最大エントロピー法では数学的な計算を行い、共鳴項の複素部分を求める。あるいは、干渉を利用する方法もある（非特許文献２）。【００１０】
分子構造に敏感なスペクトル領域として指紋領域と呼ばれるラマン散乱スペクトル領域（１８００から８００cm-1）がある。CARS光の検出においても同様な領域のスペクトルが得られることが望ましい。非特許文献１に紹介した方式では励起用のストークス光のスペクトル幅が１４０cm-1程度であり、この領域をカバーできない。この欠点を補うために、光源にフォトニックファイバを使用する方式が非特許文献３に紹介されている。フォトニックファイバに超短パルスレーザを照射することでスーパーコンティニューム光と呼ばれるブロードバンドの光を発生させ、ストークス光として使用するものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】J. P. R. Day, K. F. Domke, G. Rago, H. Kano, H. Hamaguchi, E. M. Vartiainen, and M. Bonn "Quantitative Coherent Anti-Stokes Scattering (CARS) Microscopy," J. Phys. Chem. B, Vol. 115, 7713-7725 (2011)
【非特許文献２】C. L. Evans, E. O. Potma, X. S. and Xie, "Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Spectral Interferometry: Determination of the Real and Imaginary Components of Nonlinear Susceptibility χ(3) for Vibrational Microscopy," Opt. Lett. Vol. 29, 2923-2925 (2004)
【非特許文献３】M. Okuno, H. Kano, P. Leproux, V. Couderc, J. P. R. Day, M. Bonn, and H. Hamaguchi, "Quantitative CARS Molecular Fingerprintig of Single Living Cells with the Use of the Maximum Entropy Method," Angew. Chem. Int. Ed. Vol. 49, 6773-6777 (2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
生体細胞の観察をCARS光で行う方式の有用とされる点に「非侵襲」がある。CARS光を発生させるためには、ポンプ光とストークス光の超短パルス光を同時に照射することになるが、一般的にCARSで使用される両励起光の波長は生体細胞で吸収されない波長を使用する。したがって、ピークパワーが低い状態では「非侵襲」であり、細胞を傷つけないといってよい。しかし、ピークパワーを上げすぎるとマルチフォトンプロセスが起こり細胞に影響を与える可能性があり、「非侵襲」といえども生体細胞に照射するピークパワーは低い方が望ましい。本発明の課題は、励起光のピークパワーを抑えた条件で発生する弱いCARS信号の信号雑音比を向上させることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上述の課題を解決するためのCARS顕微鏡は、周波数ωPの第１のレーザ光と、第１のレーザ光により励起される正常分散の非線形光ファイバーと、非線形光ファイバーから発生したスーパーコンティニューム光（以下、SC光という）中の周波数ωSTの第２のレーザ光と、非線形光ファイバーから発生したSC光中の周波数がωAS=2・ωP -ωST である参照光としての第３のレーザ光と、第１、第２のレーザ光を同軸状に一致させる光学系と、第１、第２のレーザ光の位相を調整する機構と、第１、第２のレーザ光を集光する対物レンズと、観察試料を走査する走査機構と、観察試料から発生したCARS光を検出する対物レンズと、CARS光と第３のレーザ光とを干渉させる干渉光学系と、干渉光を分光する分光器と、分光された光を検出する光検出器と、光検出器からの信号を処理する演算装置と、演算装置の情報に基づいて画像を表示する表示装置とで実現される。【００１４】
測定領域での分子数の変化と分子構造の変化で引き起こされるスペクトルの変化を区別できる方法として、ストークス光としてブロードバンド光を使用する方式を採用する。本発明ではブロードバンド光としてSC光を使用するが、これまで、SC光はCARS信号の信号雑音比を向上できる可能性のあるホモダイン干渉計測の光源として使用されていない。その理由は、CARS光の発生及びホモダイン計測に必要とされるブロードバンドでかつ干渉性を保持したSC光を得ようとすると、数フェムト秒のパルス幅の励起光源が必要になり、実現性が乏しくなるからである。本発明では干渉性の良いSC光を光源として、CARS信号の信号雑音比向上の向上を図る。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によると、レーザパルス毎に発生するCARS光と検出光との干渉光を検出器上で積算することが可能になり、信号雑音比を向上させることができる。正常分散の非線形光ファイバーを使用しないで発生させたSC光のパルス毎の干渉性を維持するためには、パルス幅が１０フェムト秒オーダの超短パルスで励起する必要がある。このような超短パルスレーザ光を発生させるためには現状では高価な固体レーザが必要になる。このためCARS顕微鏡は高価なものとなり、研究用以外での普及は困難となる。正常分散の非線形光ファイバーでは、１００フェムト秒以上のパルス幅のレーザ光でパルス毎の干渉性が保たれる。レーザ光のピークパワーは他の分散の光ファイバーより必要となるが、これはファイバーレーザで対処可能であり、より安価な光学装置構成にすることが可能である。【００１６】
上記した以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明によるCARS顕微鏡の一例を示す図。
【図２】通常のラマン散乱におけるストークス散乱のエネルギー準位図。
【図３】CARSにおけるエネルギー準位図。
【図４】CARSにおける非共鳴光の一例を説明するエネルギー準位図。
【図５】パルスレーザ光の周波数スペクトルを示す図。
【図６】スーパーコンティニューム光の周波数スペクトルを示す図。
【図７】ストークス光として使用されるスーパーコンティニューム光の低周波数領域の周波数スペクトルを示す図。
【図８】参照光として使用されるスーパーコンティニューム光の低周波数領域の周波数スペクトルを示す図。
【図９】正常分散非線形光ファイバーの分散特性の一例を示す図。
【図１０】本発明によるCARS顕微鏡の一例を示す図。
【図１１】本発明によるCARS顕微鏡の一例を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を実施するための形態を、図を用いて説明する。
【実施例１】
【００１９】
図１は、本発明に基づくCARS顕微鏡の一例を示す図である。１４１は例えば２００フェムト秒のパルス幅を有するパルスレーザ光源であり、図５のスペクトルで示す中心周波数ωPのレーザ光１６１（第1の光）を出射する。出射レーザ光の偏光方向はs偏光であり、２５１のビームスプリッタで二つのビームに分けられる。ビームスプリッタを透過したビームは正常分散の特性を示す非線形フォトニック結晶光ファイバー１４２に入射する。入射光は図６の１６２のスペクトルで示すようなスーパーコンティニューム光（SC光）に変換される。SC光は励起光周波数ωPを含んだ広い範囲に及び、パルス間のコヒーレントな性質は保持されている。なお、非線形フォトニック結晶光ファイバー１４２は少なくともSC光の発生周波数領域において正常分散であればよい。【００２０】
図９は、非線形フォトニック結晶光ファイバー１４２の分散特性の一例を示す図である。横軸は波長を表し、λpは第１の光の波長に相当する。縦軸は群遅延の広がりDを表す。矢印１６５で示した波長範囲は図６のSC光１６２の発生周波数範囲に相当する。この波長範囲においてフォトニック結晶ファイバーは正常分散の特性を有しており、群遅延の広がりは負の領域にある。ポンプ光である第１の光の波長λpで群遅延の広がりが最大になり、この波長から遠ざかるにしたがってDは小さくなる。第１の光の波長λpを１０６４nmとしたとき、Dの範囲は−１０ps/km/nmから−３００ps/km/nm程度を想定している。【００２１】
また、SC光の発生する周波数範囲は、第１の光の周波数ωP中心として両側に最大±３０００cm-1に達するのが望ましい。その理由は、生体細胞中の有機物質を観察対象とする場合、２９３０cm-1のCH3あるいは２８５０cm-1のCH2の伸縮振動が対象になることがあり、これらのバンドを含めるためである。しかし、分子の同定に有用なスペクトル範囲は８００から１８００cm-1程度の範囲（指紋領域）にあり、狭い周波数領域のSC光で事足りる場合もある。また、フォトニック結晶ファイバーに偏波面保持機能を付加してもよい。その場合、偏光方向が安定するので、SC光の強度とスペクトル形状も安定する。【００２２】
このSC光はダイクロイックミラー２５７で周波数ωPを境に二つのビームに分けられる。すなわち、このダイクロイックミラーを図７に領域１６３で示される低い周波数の光は透過し、図８のスペクトル１６４で示される領域の高い周波数の光は反射される。ダイクロイックミラー２５７の透過光（第２の光）はミラー２５９で反射され、ダイクロイックミラー２６０を透過し、ブロードバンドの周波数ωSTのストークス光として使用される。一方、ダイクロイックミラー２６０には中心周波数ωPのポンプ光として使用されるレーザ光も入射する。このレーザ光は、ビームスプリッタ２５１で反射され、さらにミラー２５２と光路差調整のためのミラー群２５３，２５４，２５５，２５６で反射された後にダイクロイックミラー２６０に達する。二つのレーザ光は同軸光となり、レンズ２６１と２０８でコリメートされた後、ダイクロイックミラー２１０で反射され、対物レンズ２０１で観察試料２０２に絞り込まれる。観察物体は走査機構１０２で走査できるようになっている。本実施例では、光学系の複雑さを避けるために、観察物体そのものを走査する方式を採用しているが、これに限定されるものではなく、集光スポット自体を走査する光学系を搭載する方式でもよい。観察物体で発生した周波数ωAS =2・ωP -ωSTのCARS光は、対物レンズ２０１とダイクロイックミラー２１０を透過し、反射鏡２１１で反射された後、ハーフビームスプリッタ２１３に入射する。【００２３】
ダイクロイックミラー２５７で反射された高周波領域のレーザ光もSC光であり、周波数（2・ωP -ωST）を含むローカル光すなわち参照光（第３の光）として使用される。参照光はレンズ２５８と２０６でコリメータされた後、偏光ビームスプリッタ２１６とλ／４板の効果を有するフレネルロム波長板２１７を透過し、ミラー２１８でフレネルロム波長板２１７に戻される。ミラー２１８は光路長の調整に使用される。フレネルロム波長板２１７を透過したレーザ光はp偏光になっており、偏光ビームスプリッタ２１６で反射され、ビームスプリッタ２１３に向かう。【００２４】
ハーフビームスプリッタ２１３には偏光方向の異なる光が両方向から入射することになり、それぞれの光は２方向に分割され、２方向に干渉光が出射する。｜EAS(ω)｜の検出のために位相ダイバーシティ検出という方法を用いる。紙面上でハーフビームスプリッタ２１３の右方向に出射してくる干渉光には光学軸が２２．５度傾いたλ／２板の効果を有するフレネルロム波長板２２１が設置されており、集光レンズ２１５で焦点位置に置かれた分光器上に集光される。分光器前の光路中には偏光ビームスプリッタ２２３が設置されており、ｓ方向とｐ方向の成分に干渉光を分解し、それぞれを分光器１０６と分光器１０８で検出する。ここで、観察物体を焦点面の光軸上にある点物体とし、観察物体からのCARS光の周波数ωでの複素振幅、参照光の複素振幅はそれぞれEAS(ω)，ELO(ω)であるものとする。分光器１０６と分光器１０８のそれぞれの波長での差動信号をIC(ω)としたとき、
［式３］
IC(ω)＝α｜EAS(ω)｜・｜ELO(ω)｜cosΦ(ω)
と表わされる。αは信号増幅や分光器効率等を含む係数であり、Φ(ω)は観察物体からのCARS光と参照光との位相差である。また、紙面上でハーフビームスプリッタ２１３の上方向に出射する干渉光には光学軸が４５度傾いたλ／４板の効果を有するフレネルロム波長板２２２が挿入されている。集光レンズ２１４で集光された干渉光は分光器１０５及び１０７で検出される。途中に設置されている偏光ビームスプリッタ２２４によりs偏光とp偏光に分離した後に、それぞれの分光器で検出される。ここで分光器１０５と１０７のそれぞれの波長での差動信号をIS(ω)としたとき、
［式４］
IS(ω)＝α｜EAS (ω)｜・｜ELO(ω)｜sinΦ(ω)
のように表わされる。IC(ω)及びIS(ω)には干渉成分のみが検出されている。演算装置１０９では、
［式５］
I(ω)＝√（IC２(ω)＋IS２(ω)）＝α｜EAS(ω)｜・｜ELO(ω)｜
で示す計算を行う。I(ω)は観察物体のCARS光振幅と参照光の振幅に比例した形となる。したがって、｜ELO(ω)｜の波長依存性が小さい場合は、これを大きくすることにより、｜EAS(ω)｜を増幅した形のI(ω)を得ることが可能となる。一般的にはSC光のスペクトルは平坦ではないので、より正確なスペクトルI(ω)を得るためには、SC光の振幅スペクトルを使用した補正を行う必要がある。【００２５】
次に、CARS光の共鳴項の複素成分の抽出を行い、ラマン散乱スペクトルの抽出を行う。ローカル光とCARS信号光の位相差であるΦ(ω)は、Φ(ω)＝ωτ+θS(ω)+θinst(ω) のように表される。ωτは二つの光の光路差、θS(ω)は共鳴光による位相差、θinst(ω)は装置に由来する位相差である。ここでは、ローカル光の周波数依存性はないものとしている。式（３）、（４）からtanΦ(ω) が求められ、Φ(ω)も決めることができる。まず、観察試料として非共鳴CARS光だけを発生する試料を測定することで、ωτ+θinst(ω)を決めておく。次に、共鳴CARSを発生する観察試料を測定する。これによりθS(ω)を決めることができるので、共鳴成分の複素数部分はI(ω) sinθS(ω)として求めることができる。これにより、ラマン散乱スペクトルに相当するものを得ることができる。分光器における検出はCCD等の検出器を使用してもよい。表示装置１１０には観察物体２０２の走査位置と表示位置の対応をつけた表示がなされる。分子振動に特徴的な周波数位置での共鳴光の複素成分を表示することで、その分子の分布を知ることができる。【００２６】
本実施例においては、多数のパルスを積算している。パルス間の干渉性が失われていると、IC(ω)＝α｜EAS(ω)｜・｜ELO(ω)｜cosΦ(ω) あるいはIS(ω)＝α｜EAS(ω)｜｜ELO(ω)｜sinΦ(ω) の中のΦ(ω)の位相がランダムになってしまい、多数のパルスを積算したIC(ω)あるいはIS(ω)値はゼロになる。しかし、本実施例では正常分散の非線形光ファイバーから発生したSC光を使用しているので、パルス間の干渉性が保たれており、IC(ω)あるいはIS(ω)が、パルス間の干渉性がないためにゼロになることはない。【００２７】
図１０は、本発明によるCARS顕微鏡の透過タイプの実施例を示す図である。CARS光が強く出射される方向は観察物体の形状と大きさで異なる。一般にはCARS光の後方散乱はCARS光を発する分子が含まれている観察物体が大きくなるほど弱くなる。他方、前方散乱は逆の依存性を示す。図１０に示した実施例はこの前方散乱が強い場合のCARS光を検出するための構成となっている。図１の構成と異なる点は、ポンプ光とストークス光の照射方向が観察試料の反対方向から入る点である。すなわち、ダイクロイックミラー２５７を透過したストークス光（第２の光）とミラー２５６で反射されたポンプ光（第1の光）をそれぞれミラー２５９とダイクロイックミラー２６０により同軸光とし、レンズ２６１と２０８でコリメート光とする。コリメートされた同軸レーザ光はミラー２１０で反射された後、対物レンズ２０７で観察試料２０２に絞り込まれる。観察試料から前方方向に発生したCARS光は対物レンズ２０１を透過し、図１の実施例と同様な干渉計測が行われる。【００２８】
図１の実施例と図１０の実施例は別の光学系としたが、光路の切り替えによって、一つの光学系で実施可能である。【００２９】
前述の実施例では互いに直交する直線偏光を干渉させる方式を採用し、位相ダイバーシティ検出を行った。他の方式としては、観察物体からのCARS光と参照光とを互いに直交状態である右円偏光あるいは左円偏光に変換して、干渉させる方法もある。たとえば、CARS光を右円偏光、参照光を左円偏光とする。干渉させた光を検出するための検光子の光学軸を０度、４５度、９０度、１３５度に設定すると、ビームの位相差が相対的に０度、９０度、１８０度、２７０度のものが得られる。これらの信号を組み合わせることで、式（５）で表される信号を得ることができ、前述の実施例と同様な効果を得ることができる。
【実施例２】
【００３０】
図１１は、本発明によるCARS顕微鏡の他の実施例を示す図である。図１１の実施例では、図１の実施例での検出ビーム数を２本にして、簡略化を図っている。ダイクロイックミラー２６０で同軸にされたポンプ光（第1の光）及びストークス光（第２の光）はコリメートされ、光学シャッター２１９を透過し、観察試料２０２に集光される。観察試料から発生した周波数ωAS =2・ωP -ωSTのCARS光はフレネルロム波長板２２５により円偏光に変換され、ミラー２１１によりハーフビームスプリッタ２１３に入射する。また、ダイクロイックミラー２５７で反射された高周波領域のレーザ光（第３の光）はレンズ２５８及び２０６でコリメートされ、周波数（2・ωP -ωST）を含む参照光として使用される。参照光は光学シャッター２０９及び偏光ビームスプリッタ２１６を透過する。その後、フレネルロム波長板２１７で円偏光に変換され、光路長調整用のミラー２１８で反射される。反射された参照光は逆回りの円偏光となり、フレネルロム波長板２１７でp偏光になる。偏光ビームスプリッタ２１６で反射された参照光は、２２．５度傾けられたλ／２板の効果を有するフレネルロム波長板２２６により、偏光方向が４５度傾けられる。参照光はビームスプリッタ２１３に入射し、左側から入射した観察試料からのCARS光と干渉する。重ねあわされた光は集光レンズ２１４に向かい、集光された干渉光は偏光ビームスプリッタ２２４で二分割され、それぞれの分光器１０５及び１０７上に集光される。【００３１】
光学シャッター２１９と２０９が開いているときは、分光器１０５からは
［式６］
SC(ω)=|ELO|2+|EAS(ω)|2+2|ELO EAS(ω)|cosΦ(ω)
で表される信号が出力され、分光器１０７からは
［式７］
SS(ω)=|ELO|2+|EAS(ω)|2+2|ELO EAS(ω)|sinΦ(ω)
で表される信号が出力される。式（６）及び（７）における|ELO|2及び|EAS(ω)|2は一方を遮断することで求めることが可能である。光学シャッター２１９を閉め、光学シャッター２０９を空けておくことで、それぞれの分光器１０５，１０７には|ELO(ω)|2が出力される。逆に光学シャッター２１９を開け、２０９の光学シャッターを閉めることにより、それぞれの分光器には|EAS(ω)|2が出力される。これらの出力から演算装置１０９で|ELO(ω)EAS(ω)|を計算する。【００３２】
更なるスペクトルの補正はストークス光（第２の光）を測定することで可能となる。図示はしないが、対物レンズ２０１の直前に平面鏡を挿入し、光学シャッター２１９を開け、２０９を閉じた状態で分光器１０５，１０７により分光スペクトルを測定する。この分光スペクトルにはストークス光ES(ω)の分光スペクトルが含まれており、式（１）を勘案することでストークス光のスペクトル分布の影響の補正が可能となる。【００３３】
この結果を用いて、前述した干渉を用いる方法により共鳴光による発生する位相差を計算し、共鳴項の複素成分である[|ELO(ω)EAS(ω)|sinθS(ω)]の抽出を行い、ラマン分光と等価な結果を得る。【００３４】
また、本実施例では、ビームスプリッタ２５１で反射された第１の光であるポンプ光の光路にバンドパスフィルタ２２０が挿入されている。パルス光源１４１から出射したレーザ光はSC光のパルス間の干渉性を保持するために、パルス幅の短いものが使用される。このため第１の光のスペクトル幅が広くなっており、これをそのままCARS光の発生のために使用すると所望のスペクトル分解能が得られない場合がある。これ対処するためにスペクトル幅を狭くするバンドパスフィルタが挿入された。【００３５】
なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明によれば、CARS光を用いた高分解能な画像を取得することができ、非侵襲で生体分子の分布あるいは分布の変化を計測するための光学装置を提供することができる。
【符号の説明】
【００３７】
１０２：走査機構、１０５，１０６，１０７，１０８：分光器、１０９：演算装置、１１０：表示装置、１４１：パルスレーザ光源、１４２：正常分散非線形フォトニック結晶ファイバー、２０１：対物レンズ、２０２：観察物体、２０７：対物レンズ、２０９：光学シャッター、２１０：ダイクロイックミラー、２１３：ビームスプリッタ、２１４：集光レンズ、２１６：偏光ビームスプリッタ、２１７：フレネルロム波長板、２１８：ミラー、２２０：バンドパスフィルタ、２２１，２２２：フレネルロム波長板、２２３，２２４：偏光ビームスプリッタ、２２５，２２６：フレネルロム波長板
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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