(57)【要約】  本発明は、ＩＬ−１７に結合し、ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合を阻害するアプタマー；該アプタマーと機能性物質（例えば、親和性物質、標識用物質、酵素、薬物送達媒体、又は薬物など）とを含む複合体；該アプタマー、又は該アプタマーと機能性物質とを含む複合体、を含む医薬、診断薬及び標識剤などを提供する。
2014148638.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉａ）：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ’（Ｍ）ｇ’（Ｘ1）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ’ｇ（Ｍ）ａ’（Ｘ4）ｇ（Ｘ5）ｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｘ5）ｕ’（Ｆ）ｃ（Ｘ7）ａ’（Ｘ2）ｇ（Ｘ6）ｕ’（Ｆ）ｒ（Ｘ3）ａ’（Ｘ3）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ’（Ｘ7）ａ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）
［式中、
ａ、ｇ、ｃ及びｕは、それぞれ、塩基がアデニン、グアニン、シトシン及びウラシルであるＲＮＡを示し、
ｒは、塩基がアデニン又はグアニンであるＲＮＡを示し、
ａ’、ｇ’及びｃ’は、それぞれ、塩基がアデニン、グアニン及びシトシンである、ＲＮＡ又はＤＮＡを示し、
ｕ’は、塩基がウラシルであるＲＮＡ、塩基がウラシルであるＤＮＡ又は塩基がチミンであるＤＮＡを示し、
ヌクレオチドにおける括弧は、そのヌクレオチドの修飾を示し、
（Ｍ）は、ヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がＯ−メチル基で置き換えられていることを示し、
（Ｆ）は、ヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がフッ素原子で置き換えられていることを示し、
（Ｘ1）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、ホスホロチオエート化されているか、又はヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がフッ素原子で置き換えられていることを示し、
（Ｘ2）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、又はヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がフッ素原子で置き換えられていることを示し、
（Ｘ3）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、又はヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がＯ−メチル基で置き換えられていることを示し、
（Ｘ4）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、又はヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がフッ素原子又はＯ−メチル基で置き換えられていることを示し、
（Ｘ5）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、ホスホロチオエート化されていることを示し、
（Ｘ6）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、ホスホロチオエート化されているか、又はヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がＯ−メチル基で置き換えられていることを示し、
（Ｘ7）は、ヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がフッ素原子又はＯ−メチル基で置き換えられていることを示す］
で表される配列を含む、ＩＬ−１７に結合し、ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合を阻害するアプタマー。
【請求項２】
下記式（Ｉａ’）：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ’（Ｍ）ｇ（Ｘ5）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｘ4）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｘ5）ｕ’（Ｆ）ｃ（Ｘ7）ａ（Ｘ2）ｇ（Ｘ5）ｕ’（Ｆ）ｒ（Ｘ3）ａ（Ｘ3）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｘ7）ａ（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）
［式中、ａ、ｇ、ｃ、ｕ及びｒ、ａ’、ｃ’及びｕ’、並びに（Ｍ）、（Ｆ）及び（Ｘ2）〜（Ｘ5）及び（Ｘ7）は式（Ｉａ）と同義であり、
Ｇは、塩基がグアニンであるＤＮＡを示す］
で表される配列を含む、請求項１記載のアプタマー。
【請求項３】
下記式（Ｉ）：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ’（Ｍ）ｇ’（Ｘ1）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ’ｇ（Ｍ）ａ’（Ｘ2）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｕ’（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａ’（Ｘ2）ｇｕ’（Ｆ）ａ（Ｘ3）ａ’（Ｘ3）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ’（Ｆ）ａ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）
［式中、ａ、ｇ、ｃ及びｕ、ａ’、ｇ’、ｃ’及びｕ’、並びに（Ｍ）、（Ｆ）及び（Ｘ1）〜（Ｘ3）は、式（Ｉａ）と同義である。］
で表される配列を含む、請求項１記載のアプタマー。
【請求項４】
下記式（Ｉａ”）：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ’（Ｍ）ｇ（Ｘ5）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｘ7）ｇ（Ｘ5）ｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｘ5）ｕ’（Ｆ）ｃ（Ｘ7）ａ（Ｆ）ｇ（Ｘ6）ｕ’（Ｆ）ｒ（Ｘ3）ａ（Ｘ3）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｘ7）ａ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）
［式中、ａ、ｇ、ｃ、ｕ及びｒ、ａ’、ｃ’及びｕ’、並びに（Ｍ）、（Ｆ）、（Ｘ3）及び（Ｘ5）〜（Ｘ7）は式（Ｉａ）と同義であり、
Ｇは、塩基がグアニンであるＤＮＡを示す］
で表される配列を含む、請求項１記載のアプタマー。
【請求項５】
式（Ｉａ”）において、３’末端側のｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）がｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）である、請求項４に記載のアプタマー。
【請求項６】
式（Ｉａ）、（Ｉａ’）、（Ｉ）又は（Ｉａ”）で表される配列の５’末端に、ＲＮＡの場合にはリボースの２’位のヒドロキシル基がＯ−メチル基で置き換えられていてもよい、塩基がグアニンであるヌクレオチドが付加され、及び／又は３’末端に塩基がシトシンであるヌクレオチドが付加された、請求項１〜５のいずれか一項記載のアプタマー。
【請求項７】
アプタマー番号５２〜９４のいずれかに示される配列を含む、請求項１記載のアプタマー。
【請求項８】
アプタマー番号３〜４９のいずれかに示される配列を含む、請求項３記載のアプタマー。
【請求項９】
塩基長が７０以下である、請求項１〜８のいずれか一項記載のアプタマー。
【請求項１０】
下記式（ＩＩ）：
ｇ（ｘ1）ｇ（ｘ1）ｇ（ｘ1）ｕ（Ｆ）ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇ’（Ｓ）ｇ（ｘ2）ａｇｇａｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ａａｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇｇｕ（Ｆ）ａｃ’（ｘ3）ｃ’（ｘ3）ｃ’（ｘ3）
［式中、
ａ、ｇ、ｃ及びｕは、それぞれ、塩基がアデニン、グアニン、シトシン及びウラシルであるＲＮＡを示し、
ｇ’及びｃ’は、それぞれ、塩基がグアニン及びシトシンである、ＲＮＡ又はＤＮＡを示し、
ヌクレオチドにおける括弧は、そのヌクレオチドの修飾を示し、
（Ｆ）は、ヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基がフッ素原子で置き換えられていることを示し、
（Ｓ）は、ヌクレオチドがＲＮＡの場合に、ホスホロチオエート化されていることを示し、
（ｘ1）は、ヌクレオチドがＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）修飾されているか、又はヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がＯ−メチル基で置き換えられていることを示し、
（ｘ2）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、又はヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がＯ−メチル基で置き換えられていることを示し、
（ｘ3）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、又はＬＮＡ修飾されていることを示す］
で表される配列を含む、ＩＬ−１７に結合し、ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合を阻害するアプタマー。
【請求項１１】
アプタマー番号１又は２に示される配列を含む、請求項１０記載のアプタマー。
【請求項１２】
塩基長が７０以下である、請求項１０又は１１記載のアプタマー。
【請求項１３】
ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ又はポリエチレングリコールで修飾されている、請求項１〜１２のいずれか一項記載のアプタマー。
【請求項１４】
ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ又はポリエチレングリコールが、アプタマーの５’末端及び／又は３’末端に結合している、請求項１３記載のアプタマー。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項記載のアプタマー及び機能性物質を含む複合体。
【請求項１６】
機能性物質が、親和性物質、標識用物質、酵素、薬物送達媒体又は薬物である、請求項１５記載の複合体。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか一項記載のアプタマー或いは請求項１５又は１６記載の複合体を含む医薬。
【請求項１８】
請求項１〜１４のいずれか一項記載のアプタマー或いは請求項１５又は１６記載の複合体を含む炎症性疾患、自己免疫疾患、癌、アレルギー、又は感染症に関連する治療又は予防に用いる医薬。
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれか一項記載のアプタマー或いは請求項１５又は１６記載の複合体を含む診断薬。
【請求項２０】
請求項１〜１４のいずれか一項記載のアプタマー或いは請求項１５又は１６記載の複合体を含む検出用プローブ。
【請求項２１】
請求項１〜１４のいずれか一項記載のアプタマー或いは請求項１５又は１６記載の複合体を含むＩＬ−１７精製用担体；
【請求項２２】
請求項１〜１４のいずれか一項記載のアプタマー或いは請求項１５又は１６記載の複合体を用いることを特徴とする、ＩＬ−１７の検出方法；
【請求項２３】
請求項１〜１４のいずれか一項記載のアプタマー或いは請求項１５又は１６記載の複合体を用いることを特徴とする、ＩＬ−１７の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン１７（ＩＬ−１７）に対するアプタマー及びその利用方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＬ−１７（又はＣＴＬＡ−８）はＴｈ１７細胞などによって分泌されるサイトカインで、炎症性疾患や自己免疫疾患、感染症と深く関係している。ヒトＩＬ−１７はＮ末端にシグナルペプチドを含む１５５アミノ酸から構成される２０〜３０ｋＤａの糖タンパク質である。分子内に６個のシステイン残基と１ヶ所のＮ結合型糖鎖結合部位を有する。成熟体は１３６アミノ酸から成り、通常ダイマーで存在する。【０００３】
ＩＬ−１７ファミリータンパク質としては、ＩＬ−１７Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆの６種類のタンパク質が知られている。一般にＩＬ−１７はＩＬ−１７Ａのことを示す。ＩＬ−１７ＥはＩＬ−２５とも呼ばれている。ヒトＩＬ−１７とヒトＩＬ−１７Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆのアミノ酸配列の相同性はそれぞれ２５、２８、２２、２７、４４％で、ＩＬ−１７Ｆが最も相同性が高い。また、マウスＩＬ−１７とは６３％の相同性を有する。受容体としてＩＬ−１７ＲＡ、ＩＬ−１７ＲＢ、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−１７ＲＤ、ＩＬ−１７ＲＥが知られている。ＩＬ−１７及びＩＬ−１７Ｆはホモダイマー又はヘテロダイマーを形成し、ＩＬ−１７ＲＡ及びＩＬ−１７ＲＣと結合する。ＩＬ−１７とＩＬ−１７ＲＡの結合はＫｄ値が約１０-7と弱く、ＩＬ−１７ＲＣの関与が重要である可能性がある。【０００４】
Ｔｈ１７細胞はＩＬ−１７を産生するＣＤ４+Ｔ細胞である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴｈ１７細胞をＩＬ−２３で刺激するとＩＬ−１７産生が誘導される。一方、Ｔｈ１７細胞の分化誘導にはＴＧＦ−βとＩＬ−６が重要な役割を果たしている。ＴＧＦ−βとＩＬ−６はナイーブＴ細胞に作用して、ＲＯＲγｔ（転写因子）の発現を誘導する。ＲＯＲγｔを欠損させるとＴｈ１７細胞が分化できなくなることや、逆にＲＯＲγｔを強制発現することによりナイーブＴ細胞をＩＬ−１７産生細胞へと分化させられることから、この転写因子がＴｈ１７細胞分化に重要であると考えられている。ＲＯＲγｔの発現誘導にはＩＬ−６によるＳＴＡＴ３の活性化が重要であるが、逆にＩＬ−２によるＳＴＡＴ５の活性化は発現を抑制する。ＩＬ−２は調節性Ｔ細胞の分化に必要であり、ＩＬ−２欠損マウスは重篤な自己免疫を発症するが、これは調節性Ｔ細胞が減少すると同時にＴｈ１７細胞の過剰分化が起こるためであると考えられている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでナイーブＴ細胞をＴＧＦ−β単独で刺激すると、Ｔｈ１７ではなく調節性Ｔ細胞が誘導される。Ｔｈ１細胞が産生するＩＦＮ−γやＴｈ２細胞が産生するＩＬ−４などはＴｈ１７細胞分化に抑制的に働く。【０００５】
ＩＬ−１７がＩＬ−１７受容体に結合すると、Ａｃｔ−１、ＴＲＡＦ６を介してＮＦ−κＢ経路やＭＡＰキナーゼ経路、Ｃ／ＥＢＰ経路が活性化され、炎症性サイトカインやケモカインが誘導される。例えば、ＩＬ−１７はマクロファージに作用してＩＬ−１、ＴＮＦなどの発現を誘導する。この他、線維芽細胞や内皮細胞などの結合組織系細胞、上皮組織系細胞、樹状細胞前駆細胞などの免疫系細胞に作用してＩＬ−６やＩＬ−１など各種サイトカインや受容体の発現を誘導することが知られている。【０００６】
ＩＬ−１７の産生にはＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６などのサイトカインが関与する。一方、これらのサイトカインはＩＬ−１７によって産生が誘導される。ＩＬ−１７は他のサイトカインと相乗的に作用することが知られている。【０００７】
ＩＬ−１７は炎症性疾患や自己免疫疾患などと深い関係にあることがわかっている。関節リウマチ、加齢黄斑変性症、乾癬、全身性エリテマトーデス、ベーチェット病、移植拒絶、腎炎症候群、炎症性腸疾患、喘息、多発性硬化症、歯周病などの患者でＩＬ−１７の発現が上昇していることが知られている。また、ＩＬ−１７欠損マウスでは、関節リウマチのモデルであるコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）、多発性硬化症のモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、ＤＮＦＢやＴＮＣＢによる接触型過敏症反応、メチル化ＢＳＡによる遅延型過敏症反応、ＯＶＡ誘導による気道過敏症反応などが顕著に抑制されることが報告されている。【０００８】
ＩＬ−１７は癌とも関係している。ＳＣＩＤマウスの皮下に非小細胞肺癌細胞を移植したところ、ＩＬ−１７を高発現させたマウスでは癌細胞の増殖が促進されることが報告されている。また、子宮頸癌や卵巣癌とも関係していることが報告されている。【０００９】
ＩＬ−１７は感染症と関係している。ＩＬ−１７受容体ノックアウトマウスはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ感染、Ｔｏｘｓｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ感染などに高感受性である。ＩＬ−１７産生はリポ多糖（ＬＰＳ）やＢｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉやＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなどの菌体成分により誘導される。これらの成分は抗原提示細胞に作用してＩＬ−２３を誘導することにより、ＩＬ−１７産生を促進すると考えられている。ＩＬ−１７ＲノックアウトマウスではＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染後、肺感染局所において好中球の遊走と機能に重要な役割を果たしているＣＸＣＬ１やＣＸＣＬ２、Ｇ−ＣＳＦなどの産生が低下しており、好中球の遊走に障害が認められる。【００１０】
ところで、近年、ＲＮＡアプタマーの治療薬、診断薬、試薬への応用が注目されており、いくつかのＲＮＡアプタマーが臨床段階或いは実用化段階に入っている。２００４年１２月には世界初のＲＮＡアプタマー医薬であるＭａｃｕｇｅｎが加齢黄斑変性症の治療薬として米国で承認された。ＲＮＡアプタマーとはタンパク質などの標的物質に特異的に結合するＲＮＡのことで、ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を用いて作製することができる（特許文献１〜３参照）。ＳＥＬＥＸ法とは、１０14個程度の異なるヌクレオチド配列を持つＲＮＡのプールから、標的物質に特異的に結合するＲＮＡを選別してくる方法である。使用されるＲＮＡは４０残基程度のランダム配列をプライマー配列で挟み込んだ構造をしている。このＲＮＡプールを標的物質と会合させて、フィルターなどを用いて標的物質に結合したＲＮＡのみを回収する。回収したＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲで増幅し、これを次のラウンドの鋳型として用いる。この作業を１０回程度繰り返すことにより、標的物質と特異的に結合するＲＮＡアプタマーを取得することができる場合がある。【００１１】
アプタマー医薬は抗体医薬と同様に細胞外因子を標的にすることができるが、既に公表されている多くの学術論文等を参考にすると、いくつかの点で抗体医薬を上回る可能性がある。例えば、アプタマーは抗体よりも結合力と特異性が高い場合が多々ある。また、免疫排除を受けにくく、抗体特有の抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）や補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）などに起因する副作用は起こらない。デリバリーの観点では、アプタマーは抗体の１／１０程度のサイズであるので、目的の部位まで薬物を送達させることはより容易である。アプタマーは化学合成により生産されるので、各種修飾を容易に入れることができ、大量生産によるコストダウンが可能である。一方で、一般にアプタマーの血中半減期は抗体よりも短い。しかし、この点も毒性を考慮した場合はメリットとなる場合がある。以上の点より、同じ分子を標的にした医薬品であっても、アプタマー医薬は抗体医薬に勝る可能性がある。【００１２】
特許文献４には、上記ＳＥＬＥＸ法により得られた、ＩＬ−１７に結合してＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合を阻害するアプタマーが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第９１／１９８１３号
【特許文献２】国際公開第９４／０８０５０号
【特許文献３】国際公開第９５／０７３６４号
【特許文献４】国際公開第２０１０／００８００１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、ＩＬ−１７に対するアプタマー及びその利用方法などを提供することを目的とする。特に、医薬品用途に適したより良質のアプタマーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、従来公知の抗ＩＬ−１７アプタマーに比べて顕著に高い、ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合阻害活性を有し、ＩＬ−１７の生理活性を阻害できる、極めて良質な抗ＩＬ−１７アプタマーを作製することに成功し、本発明を完成するに至った。【００１６】
即ち、本発明は、以下のとおりである：
［１］下記式（Ｉａ）：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ’（Ｍ）ｇ’（Ｘ1）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ’ｇ（Ｍ）ａ’（Ｘ4）ｇ（Ｘ5）ｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｘ5）ｕ’（Ｆ）ｃ（Ｘ7）ａ’（Ｘ2）ｇ（Ｘ6）ｕ’（Ｆ）ｒ（Ｘ3）ａ’（Ｘ3）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ’（Ｘ7）ａ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）
［式中、
ａ、ｇ、ｃ及びｕは、それぞれ、塩基がアデニン、グアニン、シトシン及びウラシルであるＲＮＡを示し、
ｒは、塩基がアデニン又はグアニンであるＲＮＡを示し、
ａ’、ｇ’及びｃ’は、それぞれ、塩基がアデニン、グアニン及びシトシンである、ＲＮＡ又はＤＮＡを示し、
ｕ’は、塩基がウラシルであるＲＮＡ、塩基がウラシルであるＤＮＡ又は塩基がチミンであるＤＮＡを示し、
ヌクレオチドにおける括弧は、そのヌクレオチドの修飾を示し、
（Ｍ）は、ヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がＯ−メチル基で置き換えられていることを示し、
（Ｆ）は、ヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がフッ素原子で置き換えられていることを示し、
（Ｘ1）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、ホスホロチオエート化されているか、又はヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がフッ素原子で置き換えられていることを示し、
（Ｘ2）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、又はヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がフッ素原子で置き換えられていることを示し、
（Ｘ3）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、又はヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がＯ−メチル基で置き換えられていることを示し、
（Ｘ4）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、又はヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がフッ素原子又はＯ−メチル基で置き換えられていることを示し、
（Ｘ5）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、ホスホロチオエート化されていることを示し、
（Ｘ6）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、ホスホロチオエート化されているか、又はヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がＯ−メチル基で置き換えられていることを示し、
（Ｘ7）は、ヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がフッ素原子又はＯ−メチル基で置き換えられていることを示す］
で表される配列を含む、ＩＬ−１７に結合し、ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合を阻害するアプタマー；
［２］下記式（Ｉａ’）：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ’（Ｍ）ｇ（Ｘ5）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｘ4）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｘ5）ｕ’（Ｆ）ｃ（Ｘ7）ａ（Ｘ2）ｇ（Ｘ5）ｕ’（Ｆ）ｒ（Ｘ3）ａ（Ｘ3）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｘ7）ａ（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）
［式中、ａ、ｇ、ｃ、ｕ及びｒ、ａ’、ｃ’及びｕ’、並びに（Ｍ）、（Ｆ）及び（Ｘ2）〜（Ｘ5）及び（Ｘ7）は式（Ｉａ）と同義であり、
Ｇは、塩基がグアニンであるＤＮＡを示す］
で表される配列を含む、上記［１］に記載のアプタマー；
［３］下記式（Ｉ）：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ’（Ｍ）ｇ’（Ｘ1）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ’ｇ（Ｍ）ａ’（Ｘ2）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｕ’（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａ’（Ｘ2）ｇｕ’（Ｆ）ａ（Ｘ3）ａ’（Ｘ3）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ’（Ｆ）ａ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）
［式中、ａ、ｇ、ｃ及びｕ、ａ’、ｇ’、ｃ’及びｕ’、並びに（Ｍ）、（Ｆ）及び（Ｘ1）〜（Ｘ3）は、式（Ｉａ）と同義である。］
で表される配列を含む、上記［１］に記載のアプタマー；
［４］下記式（Ｉａ”）：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ’（Ｍ）ｇ（Ｘ5）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｘ7）ｇ（Ｘ5）ｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｘ5）ｕ’（Ｆ）ｃ（Ｘ7）ａ（Ｆ）ｇ（Ｘ6）ｕ’（Ｆ）ｒ（Ｘ3）ａ（Ｘ3）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｘ7）ａ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）
［式中、ａ、ｇ、ｃ、ｕ及びｒ、ａ’、ｃ’及びｕ’、並びに（Ｍ）、（Ｆ）、（Ｘ3）及び（Ｘ5）〜（Ｘ7）は式（Ｉａ）と同義であり、
Ｇは、塩基がグアニンであるＤＮＡを示す］
で表される配列を含む、上記［１］に記載のアプタマー；
［５］式（Ｉａ”）において、３’末端側のｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）がｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）である、上記［４］に記載のアプタマー；
［６］式（Ｉａ）、（Ｉａ’）、（Ｉ）又は（Ｉａ”）で表される配列の５’末端に、ＲＮＡの場合にはリボースの２’位のヒドロキシル基がＯ−メチル基で置き換えられていてもよい、塩基がグアニンであるヌクレオチドが付加され、及び／又は３’末端に塩基がシトシンであるヌクレオチドが付加された、上記［１］〜［５］のいずれかに記載のアプタマー；
［７］アプタマー番号５２〜９４のいずれかに示される配列を含む、上記［１］に記載のアプタマー；
［８］アプタマー番号３〜４９のいずれかに示される配列を含む、上記［３］に記載のアプタマー；
［９］塩基長が７０以下である、上記［１］〜［８］のいずれかに記載のアプタマー；
［１０］下記式（ＩＩ）：
ｇ（ｘ1）ｇ（ｘ1）ｇ（ｘ1）ｕ（Ｆ）ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇ’（Ｓ）ｇ（ｘ2）ａｇｇａｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ａａｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇｇｕ（Ｆ）ａｃ’（ｘ3）ｃ’（ｘ3）ｃ’（ｘ3）
［式中、
ａ、ｇ、ｃ及びｕは、それぞれ、塩基がアデニン、グアニン、シトシン及びウラシルであるＲＮＡを示し、
ｇ’及びｃ’は、それぞれ、塩基がグアニン及びシトシンである、ＲＮＡ又はＤＮＡを示し、
ヌクレオチドにおける括弧は、そのヌクレオチドの修飾を示し、
（Ｆ）は、ヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基がフッ素原子で置き換えられていることを示し、
（Ｓ）は、ヌクレオチドがＲＮＡの場合に、ホスホロチオエート化されていることを示し、
（ｘ1）は、ヌクレオチドがＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）修飾されているか、又はヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がＯ−メチル基で置き換えられていることを示し、
（ｘ2）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、又はヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がＯ−メチル基で置き換えられていることを示し、
（ｘ3）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、又はＬＮＡ修飾されていることを示す］
で表される配列を含む、ＩＬ−１７に結合し、ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合を阻害するアプタマー；
［１１］アプタマー番号１又は２に示される配列を含む、上記［１０］に記載のアプタマー；
［１２］塩基長が７０以下である、上記［１０］又は［１１］に記載のアプタマー；
［１３］ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾されている、上記［１］〜［１２］のいずれかに記載のアプタマー；
［１４］ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ又はポリエチレングリコールが、アプタマーの５’末端及び／又は３’末端に結合している、上記［１３］記載のアプタマー；
［１５］［１］〜［１４］のいずれかに記載のアプタマー及び機能性物質を含む複合体；
［１６］機能性物質が、親和性物質、標識用物質、酵素、薬物送達媒体又は薬物である、［１５］に記載の複合体；
［１７］［１］〜［１４］のいずれかに記載のアプタマー或いは［１５］又は［１６］に記載の複合体を含む医薬；
［１８］［１］〜［１４］のいずれかに記載のアプタマー或いは［１５］又は［１６］に記載の複合体を含む炎症性疾患や自己免疫疾患、癌、アレルギー、感染症などの疾患に関連する治療又は予防に用いる医薬；
［１９］［１］〜［１４］のいずれかに記載のアプタマー或いは［１５］又は［１６］に記載の複合体を含む診断薬；
［２０］［１］〜［１４］のいずれかに記載のアプタマー或いは［１５］又は［１６］に記載の複合体を含む検出用プローブ；
［２１］［１］〜［１４］のいずれかに記載のアプタマー或いは［１５］又は［１６］に記載の複合体を含むＩＬ−１７精製用担体；
［２２］［１］〜［１４］のいずれかに記載のアプタマー或いは［１５］又は［１６］に記載の複合体を用いることを特徴とする、ＩＬ−１７の検出方法；
［２３］［１］〜［１４］のいずれかに記載のアプタマー或いは［１５］又は［１６］に記載の複合体を用いることを特徴とする、ＩＬ−１７の精製方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のアプタマー又は複合体は、炎症性疾患や自己免疫疾患、癌、アレルギー、感染症などの疾患に対する医薬、或いは診断薬、試薬として有用であり得る。また本発明のアプタマー又は複合体は、ＩＬ−１７の精製及び濃縮、ＩＬ−１７の標識、並びにＩＬ−１７の検出及び定量に有用であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本発明のアプタマーをリンカーを介してＰＥＧ修飾する場合の代表的な５’末端修飾ＰＥＧ化アプタマーの構造、並びに５’末端及び３’末端修飾ＰＥＧ化アプタマーの構造を示す。
【図２】図２は、ＰＥＧ修飾された本発明のアプタマーによる、マウスＩＬ−２３誘導乾癬モデルに対する抑制効果を示す図である。横軸は、それぞれ、生理理食塩水投与群（ネガティブコントロール群）、抗ＩＬ−１７抗体投与群（ポジティブコントロール群）、及びＰＥＧ修飾されたアプタマー（Ａ：アプタマー番号８；Ｂ：アプタマー番号５１及びアプタマー番号４８）投与群を示す。縦軸はマウス耳介の厚さを示す。図中の各値は、平均値±標準誤差（ｎ＝４又は５）を示し、統計学的有意差は、一元配置分散分析法及びＤｕｎｎｅｔｔ法を用いて解析した（＊：Ｐ＜０．０５）。
【図３】図３は、ＰＥＧ修飾された本発明のアプタマーによる、マウスグルコース−６−リン酸イソメラーゼ誘導関節炎モデルに対する関節炎抑制効果を示す図である。図中、白四角は生理食塩水投与群（コントロール群）を、黒丸はＰＥＧ修飾されたアプタマー（アプタマー番号８）投与群を示す。図中の各値は平均値±標準誤差（ｎ＝１０）を示し、統計学的有意差は、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ−Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ法を用いて解析した（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１）。
【図４】図４は、ＰＥＧ修飾された本発明のアプタマーによる、マウスコラーゲン誘導関節炎モデルに対する関節炎抑制効果を示す図である。図中、白四角は生理食塩水投与群（コントロール群）を、黒丸はＰＥＧ修飾された本発明のアプタマー（Ａ：アプタマー番号８；Ｂ：アプタマー番号６４）投与群を、黒菱形は公知のアプタマー（アプタマー番号５１）投与群を示す。図中の各値は平均値±標準誤差（ｎ＝９又は１０）を示し、統計学的有意差は、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ−Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ法を用いて解析した（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
第一の実施態様において、本発明は、下記式（Ｉａ）：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ’（Ｍ）ｇ’（Ｘ1）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ’ｇ（Ｍ）ａ’（Ｘ4）ｇ（Ｘ5）ｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｘ5）ｕ’（Ｆ）ｃ（Ｘ7）ａ’（Ｘ2）ｇ（Ｘ6）ｕ’（Ｆ）ｒ（Ｘ3）ａ’（Ｘ3）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ’（Ｘ7）ａ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）
［式中、
ａ、ｇ、ｃ及びｕは、それぞれ、塩基がアデニン、グアニン、シトシン及びウラシルであるＲＮＡを示し、
ｒは、塩基がアデニン又はグアニンであるＲＮＡを示し、
ａ’、ｇ’及びｃ’は、それぞれ、塩基がアデニン、グアニン及びシトシンである、ＲＮＡ又はＤＮＡを示し、
ｕ’は、塩基がウラシルであるＲＮＡ、塩基がウラシルであるＤＮＡ又は塩基がチミンであるＤＮＡを示し、
ヌクレオチドにおける括弧は、そのヌクレオチドの修飾を示し、
（Ｍ）は、ヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がＯ−メチル基で置き換えられていることを示し、
（Ｆ）は、ヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がフッ素原子で置き換えられていることを示し、
（Ｘ1）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、ホスホロチオエート化されているか、又はヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がフッ素原子で置き換えられていることを示し、
（Ｘ2）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、又はヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がフッ素原子で置き換えられていることを示し、
（Ｘ3）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、又はヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がＯ−メチル基で置き換えられていることを示し、
（Ｘ4）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、又はヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がフッ素原子又はＯ−メチル基で置き換えられていることを示し、
（Ｘ5）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、ホスホロチオエート化されていることを示し、
（Ｘ6）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、ホスホロチオエート化されているか、又はヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がＯ−メチル基で置き換えられていることを示し、
（Ｘ7）は、ヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がフッ素原子又はＯ−メチル基で置き換えられていることを示す］
で表される配列を含む、ＩＬ−１７に結合し、ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合を阻害するアプタマーを提供する。
【００２０】
また、好ましい実施態様において、本発明は、下記式（Ｉａ’）：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ’（Ｍ）ｇ（Ｘ5）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｘ4）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｘ5）ｕ’（Ｆ）ｃ（Ｘ7）ａ（Ｘ2）ｇ（Ｘ5）ｕ’（Ｆ）ｒ（Ｘ3）ａ（Ｘ3）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｘ7）ａ（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）
［式中、ａ、ｇ、ｃ、ｕ及びｒ、ａ’、ｃ’及びｕ’、並びに（Ｍ）、（Ｆ）及び（Ｘ2）〜（Ｘ5）及び（Ｘ7）は式（Ｉａ）と同義であり、
Ｇは、塩基がグアニンであるＤＮＡを示す］
で表される配列を含む、ＩＬ−１７に結合し、ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合を阻害するアプタマーを提供する。
【００２１】
また、好ましい実施態様において、本発明は、下記式（Ｉ）：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ’（Ｍ）ｇ’（Ｘ1）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ’ｇ（Ｍ）ａ’（Ｘ2）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｕ’（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａ’（Ｘ2）ｇｕ’（Ｆ）ａ（Ｘ3）ａ’（Ｘ3）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ’（Ｆ）ａ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）
［式中、ａ、ｇ、ｃ及びｕ、ａ’、ｇ’、ｃ’及びｕ’、並びに（Ｍ）、（Ｆ）及び（Ｘ1）〜（Ｘ3）は、式（Ｉａ）と同義である。］
で表される配列を含む、ＩＬ−１７に結合し、ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合を阻害するアプタマーを提供する。
【００２２】
また、好ましい実施態様において、本発明は、下記式（Ｉａ”）：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ’（Ｍ）ｇ（Ｘ5）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｘ7）ｇ（Ｘ5）ｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｘ5）ｕ’（Ｆ）ｃ（Ｘ7）ａ（Ｆ）ｇ（Ｘ6）ｕ’（Ｆ）ｒ（Ｘ3）ａ（Ｘ3）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｘ7）ａ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）
［式中、ａ、ｇ、ｃ、ｕ及びｒ、ａ’、ｃ’及びｕ’、並びに（Ｍ）、（Ｆ）、（Ｘ3）及び（Ｘ5）〜（Ｘ7）は式（Ｉａ）と同義であり、
Ｇは、塩基がグアニンであるＤＮＡを示す］
で表される配列を含む、ＩＬ−１７に結合し、ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合を阻害するアプタマーを提供する。
【００２３】
また、好ましい実施態様において、本発明は、式（Ｉａ”）において、３’末端側のｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）がｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）である、ＩＬ−１７に結合し、ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合を阻害するアプタマーを提供する。
【００２４】
アプタマーとは、所定の標的分子に対する結合活性を有する核酸分子をいう。アプタマーは、所定の標的分子に対して結合することにより、所定の標的分子の活性を阻害し得る。本発明のアプタマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾核酸又はそれらの混合物であり得る。本発明のアプタマーはまた、直鎖状又は環状の形態であり得る。
【００２５】
ＩＬ−１７とはＴｈ１７細胞などによって分泌されるサイトカインで、例えばＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｄｅ  ＡＡＨ６７５０５やＮＰ００２１８１で表されるアミノ酸配列を持つタンパク質である。ＩＬ−１７はＩＬ−１７Ａ又はＣＴＬＡ−８と呼ばれることもある。本発明で示すＩＬ−１７は動物体内で作られる他、マウスなどの哺乳細胞、昆虫細胞、大腸菌などの細胞を用いて作製することができ、更に、化学合成によっても作ることができる。培養細胞や化学合成によって作製する場合、容易に変異体を作製することができる。ここで変異体とはアミノ酸が数個置換されたものや一部分のアミノ酸配列を意味し、本来ＩＬ−１７が有している少なくとも一つ以上の活性を有しているタンパク質又はペプチドを意味する。アミノ酸が置換される場合、置換アミノ酸は天然のアミノ酸であってもよいし非天然のアミノ酸であってもよい。本発明で言うＩＬ−１７はこれらの変異体を含む。
【００２６】
ＩＬ−１７受容体とはＩＬ−１７が結合する細胞表面タンパク質で、細胞内のシグナリングを媒介するタンパク質を意味する。ＩＬ−１７受容体ファミリーとしてＩＬ−１７ＲＡ、ＩＬ−１７ＲＢ、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−１７ＲＤ、ＩＬ−１７ＲＥが知られている。本発明で言うＩＬ−１７受容体とは天然のアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよいし、その変異体であってもよい。ここで変異体とはアミノ酸が数個置換されたものや一部分のアミノ酸配列を意味し、ＩＬ−１７に対して結合活性を有するタンパク質又はペプチドを意味する。本発明のアプタマーは、ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合を阻害するものである。
【００２７】
本発明のアプタマーが、ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合を阻害するか否かは、例えば、以下の試験により評価することができる。
測定にはＢＩＡｃｏｒｅ社製のＢＩＡｃｏｒｅ２０００またはＴ１００を用いる。ＣＭ５センサーチップにＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ（２１１８１，ＰＩＥＲＣＥ）を固定化し、そこにＩＬ−１７受容体とＩｇＧのＦｃ部分が融合したタンパク質（例えば、組換えヒトＩＬ−１７Ｒ−Ｆｃキメラ（１７７−ＩＲ，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を固定化する。固定化量は、約２０（２０００の場合）または約１２００ＲＵとする。アナライトとしてＩＬ−１７（約１００又は１５０ｎＭ）とアプタマー（約５０又は１００ｎＭ）とを混合して、１５分間保持し、この混合液をＢＩＡｃｏｒｅ２０００に注入する。ＩＬ−１７のＩＬ−１７受容体への結合を検出する。
数値が低い程、該アプタマーはＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体への結合を強く阻害すると判定する。
【００２８】
好ましい態様によれば、本発明のアプタマーはＩＬ−１７に結合し、ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合を阻害することによって、任意の哺乳動物に由来するＩＬ−１７のシグナリング活性を阻害し得る。哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル）、げっ歯類（例、マウス、ラット、モルモット）、並びにペット、家畜及び使役動物（例、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）が挙げられる。
【００２９】
ＩＬ−１７シグナリング活性を阻害するとは、ＩＬ−１７が保有する任意のシグナリング活性に対する阻害能を意味する。例えば、ＩＬ−１７はＩＬ―１７受容体に結合した後、ＴＲＡＦ６などを介してＮＦ−κＢ経路やＭＡＰキナーゼ経路を活性化することが知られており、これらシグナル伝達経路を介して各種サイトカインやケモカインの産生が誘導される。従って、ＩＬ−１７シグナリング阻害活性とは、ＩＬ−１７シグナル伝達経路の下流に存在する、これらのサイトカインやケモカインなどの産生を阻害する活性のことである。これらサイトカインやケモカインの発現は炎症性細胞の遊走や活性化を導くので、ＩＬ−１７のシグナリング阻害活性とはそれらの活性の阻害をも意味する。
【００３０】
本発明のアプタマーは、ＩＬ−１７に対する結合性、ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合阻害活性等を高めるために、上記式（Ｉａ）、（Ｉａ’）、（Ｉ）及び（Ｉａ”）に示すように、ヌクレオチドの一部が修飾されている。
【００３１】
本明細書において、ヌクレオチドが非修飾であるとは、リボヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基、又はデオキシリボヌクレオチドのリボースの２’位の水素が、他の元素で置換されていないことをいい、ヌクレオチドが修飾されているとは、例えば、リボヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、フッ素原子、又はＯ−メチル基で置き換えられていること、ヌクレオチドがホスホロチオエート化されていること、或いはＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）修飾されていることなどを意味する。「ヌクレオチドがホスホロチオエート化されている」とは、隣接するヌクレオチド間の結合部位にあるリン酸基が硫黄化されている、すなわち、ホスホジエステル結合がホスホロチオエート結合に改変されていることを示し、ＬＮＡ修飾されているとは、ヌクレオチドのリボースの２’位の酸素原子と４’位の炭素原子間がメチレン架橋されていることを示す。
式（Ｉａ）、（Ｉａ’）、（Ｉ）及び（Ｉａ”）に示すような各種の修飾は、自体公知の方法により行うことができる（例えば、Ｓｐｒｏａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９，７３３−７３８；Ｃｏｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９，２６２９−２６３５；Ｈｏｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７３），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２，５１３８−５１４５など参照）。
【００３２】
本発明はまた、上記式（Ｉａ）、（Ｉａ’）、（Ｉ）及び（Ｉａ”）で表される配列の５’末端に、ＲＮＡの場合にはリボースの２’位のヒドロキシル基がＯ−メチル基で置き換えられていてもよい、塩基がグアニンであるヌクレオチドが付加され、及び／又は３’末端に塩基がシトシンであるヌクレオチドが付加された配列を含む、ＩＬ−１７に結合し、ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合を阻害するアプタマーも提供する。
【００３３】
好ましくは、本発明のアプタマーは、以下に示すアプタマー番号３〜４９、及び５２〜９４のいずれかから選択される配列を含むアプタマーであってもよく、或いは、ＩＬ−１７に結合し、ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合を阻害する限り、当該アプタマーの複数の連結物であってもよい。
【００３４】
上記アプタマーの複数の連結物において、連結はタンデム結合にて行われ得る。また、連結に際し、リンカーを利用してもよい。リンカーとしては、ヌクレオチド鎖（例、１〜約２０ヌクレオチド）、非ヌクレオチド鎖（例、−（ＣＨ2）n−リンカー、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−リンカー、ヘキサエチレングリコールリンカー、ＴＥＧリンカー、ペプチドを含むリンカー、−Ｓ−Ｓ−結合を含むリンカー、−ＣＯＮＨ−結合を含むリンカー、−ＯＰＯ3−結合を含むリンカー）が挙げられる。上記複数の連結物における複数とは、２以上であれば特に限定されないが、例えば、２個、３個又は４個であり得る。
【００３５】
本発明のアプタマーの長さは特に限定されず、通常、約２００ヌクレオチド以下であり得るが、総ヌクレオチド数が少なければ、化学合成及び大量生産がより容易であり、かつコスト面でのメリットも大きい。また、化学修飾も容易であり、生体内安定性も高いと考えられる。従って、医薬品用途への適用の観点からすれば、本発明のアプタマーは７０ヌクレオチドよりもさらに短い塩基長であることがより望ましく、好ましくは約５０ヌクレオチド以下であり、より好ましくは約４０ヌクレオチド以下（例、４０ヌクレオチド以下、３９ヌクレオチド以下、３８ヌクレオチド以下、３７ヌクレオチド以下、３６ヌクレオチド以下）であり、最も好ましくは約３５ヌクレオチド以下（例、３５ヌクレオチド以下、３４ヌクレオチド以下、３３ヌクレオチド以下）であり得る。
【００３６】
別の実施態様において、本発明はまた、下記式（ＩＩ）：
ｇ（ｘ1）ｇ（ｘ1）ｇ（ｘ1）ｕ（Ｆ）ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇ’（Ｓ）ｇ（ｘ2）ａｇｇａｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ａａｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇｇｕ（Ｆ）ａｃ’（ｘ3）ｃ’（ｘ3）ｃ’（ｘ3）
［式中、
ａ、ｇ、ｃ及びｕは、それぞれ、塩基がアデニン、グアニン、シトシン及びウラシルであるＲＮＡを示し、
ｇ’及びｃ’は、それぞれ、塩基がグアニン及びシトシンである、ＲＮＡ又はＤＮＡを示し、
ヌクレオチドにおける括弧は、そのヌクレオチドの修飾を示し、
（Ｆ）は、ヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基がフッ素原子で置き換えられていることを示し、
（Ｓ）は、ヌクレオチドがＲＮＡの場合、ホスホロチオエート化されていることを示し、
（ｘ1）は、ヌクレオチドがＬＮＡ修飾されているか、又はヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がＯ−メチル基で置き換えられていることを示し、
（ｘ2）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、又はヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がＯ−メチル基で置き換えられていることを示し、
（ｘ3）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、又はＬＮＡ修飾されていることを示す］
で表される配列を含む、ＩＬ−１７に結合し、ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合を阻害するアプタマーも提供する。
【００３７】
上記式（ＩＩ）で表される配列を含むアプタマーも、式（Ｉａ）、（Ｉａ’）、（Ｉ）及び（Ｉａ”）で表される配列を含むアプタマーと同様に、ヌクレオチドの一部が修飾されている。式（ＩＩ）に示すような修飾は、上述のとおり、自体公知の方法により行うことができる。
【００３８】
好ましくは、本発明のアプタマーは、以下に示すアプタマー番号１又は２の配列を含むアプタマーであってもよく、或いは、ＩＬ−１７に結合し、ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合を阻害する限り、当該アプタマーの複数の連結物であってもよい。
【００３９】
上記アプタマーの複数の連結物において、連結はタンデム結合にて行われ得る。また、連結に際し、リンカーを利用してもよい。リンカーとしては、ヌクレオチド鎖（例、１〜約２０ヌクレオチド）、非ヌクレオチド鎖（例、−（ＣＨ2）n−リンカー、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−リンカー、ヘキサエチレングリコールリンカー、ＴＥＧリンカー、ペプチドを含むリンカー、−Ｓ−Ｓ−結合を含むリンカー、−ＣＯＮＨ−結合を含むリンカー、−ＯＰＯ3−結合を含むリンカー）が挙げられる。上記複数の連結物における複数とは、２以上であれば特に限定されないが、例えば２個、３個又は４個であり得る。
【００４０】
本発明のアプタマーはまた、ＩＬ−１７に対する結合性、ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合阻害活性、安定性等を高めるために、核酸塩基がさらに改変（例、化学的置換）されたものであってもよい。このような改変としては、キャッピングのような３’末端及び５’末端の改変が含まれる。
【００４１】
改変はさらに、ポリエチレングリコール、アミノ酸、ペプチド、ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ、核酸、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、Ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ、Ｌｉｔｈｏｃｏｌｉｃ−ｏｌｅｙｌ、Ｄｏｃｏｓａｎｙｌ、Ｌａｕｒｏｙｌ、Ｓｔｅａｒｏｙｌ、Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ、Ｏｌｅｏｙｌ、Ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ、その他の脂質、ステロイド、コレステロール、カフェイン、ビタミン、色素、蛍光物質、抗癌剤、毒素、酵素、放射性物質、ビオチンなどを末端に付加することにより行われ得る。このような改変については、例えば、米国特許第５，６６０，９８５号、同第５，７５６，７０３号を参照のこと。
【００４２】
特に、改変がＰＥＧの末端付加によって行われる場合、ＰＥＧの分子量は特に限定されないが、好ましくは１０００〜１０００００、より好ましくは２００００〜９００００である。ＰＥＧは、直鎖状であってもよいし、二つ以上の鎖に分岐したもの（マルチアームＰＥＧ）であってもよい。また、ＰＥＧの末端付加については、３’末端又は５’末端の一方の末端のみに付加されても、あるいは３’末端及び５’末端の両端へ付加されてもよい。
このようなＰＥＧとしては特に限定されず、当業者であれば市販あるいは公知のＰＥＧを適宜選択して用いることができる（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｅｇ−ｄｒｕｇ．ｃｏｍ／ｐｅｇ＿ｐｒｏｄｕｃｔ／ｂｒａｎｃｈｅｄ．ｈｔｍｌを参照のこと）が、本発明のアプタマーに適用するＰＥＧの好適例として具体的には、分子量２００００のＣＳ型ＰＥＧやＧＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−２００ＧＳ  日油社製）、分子量４００００の２分岐ＧＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＧＳ２  日油社製）、分子量４００００の２分岐ＴＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＴＳ  日油社製）、分子量４００００の４分岐ＴＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ４−４００ＴＳ  日油社製）、分子量８００００の２分岐ＴＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−８００ＴＳ  日油社製）、または分子量８００００の４分岐ＴＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ４−８００ＴＳ  日油社製）などが挙げられる。
【００４３】
この場合、本発明のアプタマーは、ＰＥＧが末端に直接付加されていてもよいが、その末端にＰＥＧと結合可能な基を有するリンカーなどが付加され、それを介してＰＥＧを本発明のアプタマーに付加することがより好ましい。
【００４４】
ＰＥＧと本発明のアプタマーのリンカーとしては特に限定されず、炭素鎖数や官能基などを結合部位やＰＥＧの種類などに応じて適宜選択することができる。このようなリンカーとしては、例えばアミノ基を有するリンカーが挙げられ、具体的には、５'末端に付加する場合は、ｓｓＨ  Ｌｉｎｋｅｒ（ＳＡＦＣ）またはＤＭＳ（Ｏ）ＭＴ−ＡＭＩＮＯ−ＭＯＤＩＦＩＥＲ（ＧＬＥＮ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ）が、３'末端に付加する場合は、ＴＦＡ  Ａｍｉｎｏ  Ｃ−６  ｌｃａａ  ＣＰＧ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）などが例示される。このリンカーを選択した場合、ＰＥＧには、例えばＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅの活性基を付加した上で、これをリンカー側のアミノ基と反応させることで、本発明のアプタマーとＰＥＧとをリンカーを介して結合することができる。
【００４５】
なおＰＥＧやリンカーとしては、市販のものを好ましく用いることができる。また、ＰＥＧ、リンカーおよび本発明のアプタマーの結合に関する反応条件などは、当業者であれば適宜設定することが可能である。
【００４６】
本発明のアプタマーは、本明細書中の開示及び当該技術分野における自体公知の方法により化学合成することができる。アプタマーは、リン酸基の負電荷を利用したイオン結合、リボースを利用した疎水結合及び水素結合、核酸塩基を利用した水素結合やスタッキング結合など多様な結合様式により標的物質と結合する。特に、構成ヌクレオチドの数だけ存在するリン酸基の負電荷を利用したイオン結合は強く、タンパク質の表面に存在するリジンやアルギニンの正電荷と結合する。このため、標的物質との直接的な結合に関わっていない核酸塩基は置換することができる。特に、ステム構造の部分は既に塩基対が作られており、また、二重らせん構造の内側を向いているので、核酸塩基は、標的物質と直接結合し難い。従って、塩基対を他の塩基対に置換してもアプタマーの活性は減少しない場合が多い。ループ構造など塩基対を作っていない構造においても、核酸塩基が標的分子との直接的な結合に関与していない場合に、塩基の置換が可能である。リボースの２’位の修飾に関しては、まれにリボースの２’位の官能基が標的分子と直接的に相互作用していることがあるが、多くの場合無関係であり、他の修飾分子に置換可能である。このようにアプタマーは、標的分子との直接的な結合に関与している官能基を置換又は削除しない限り、その活性を保持していることが多い。また、全体の立体構造が大きく変わらないことも重要である。
【００４７】
アプタマーは、ＳＥＬＥＸ法及びその改良法（例えば、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０），Ｎａｔｕｒｅ，３４６，８１８−８２２；Ｔｕｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，５０５−５１０）を利用することで作製することができる。ＳＥＬＥＸ法ではラウンド数を増やしたり、競合物質を使用することで、標的物質に対してより結合力の強いアプタマーが濃縮され、選別されてくる。よって、ＳＥＬＥＸのラウンド数を調節したり、及び／又は競合状態を変化させることで、結合力が異なるアプタマー、結合形態が異なるアプタマー、結合力や結合形態は同じであるが塩基配列が異なるアプタマーを得ることができる場合がある。また、ＳＥＬＥＸ法にはＰＣＲによる増幅過程が含まれるが、その過程でマンガンイオンを使用するなどして変異を入れることで、より多様性に富んだＳＥＬＥＸを行うことが可能となる。
【００４８】
ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは標的物質に対して親和性が高い核酸であり、そのことは標的物質の活性部位に結合することを意味しない。従って、ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは必ずしも標的物質の機能に作用するとは限らない。ＩＬ−１７は塩基性タンパク質であり、核酸が非特異的に結合しやすいと考えられる。活性部位に結合しないアプタマーはその標的物質の活性に影響を及ぼさない。実際、コントロールで用いたＲＮＡはＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体の結合を阻害しなかった。
【００４９】
このようにして選ばれた活性のあるアプタマーは、最適化ＳＥＬＥＸを行うことで、更に高性能化することが可能である。最適化ＳＥＬＥＸとは、ある配列が決まっているアプタマーの一部をランダム配列にしたテンプレートや１０〜３０％程度のランダム配列をドープしたテンプレートを作製して、再度ＳＥＬＥＸを行うものである。
【００５０】
ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは７０ヌクレオチド程度の長さがあり、これをそのまま医薬にすることは容易ではない。そこで、試行錯誤を繰り返し、容易に化学合成ができる５０ヌクレオチド程度以下の長さまで短くする必要がある。
ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーはそのプライマー設計に依存して、その後の最小化作業のしやすさが変わる。適切なプライマーを設計しないと、ＳＥＬＥＸによって活性のあるアプタマーが選別できたとしても、その後の開発が不可能となる。本発明では３１ヌクレオチド（アプタマー番号１〜４、６〜１５、１９〜４９、及び５２〜９４）や３３ヌクレオチド（アプタマー番号５及び１６〜１８）でも活性を保持しているアプタマーを得ることができる。
【００５１】
アプタマーは化学合成が可能であるので改変が容易である。アプタマーはＭＦＯＬＤプログラムを用いて二次構造を予測したり、Ｘ線解析やＮＭＲ解析によって立体構造を予測することで、どのヌクレオチドを置換又は欠損することが可能か、また、どこに新たなヌクレオチドを挿入可能かある程度予測することができる。予測された新しい配列のアプタマーは容易に化学合成することができ、そのアプタマーが活性を保持しているかどうか既存のアッセイ系により確認することができる。
【００５２】
得られたアプタマーの標的物質との結合に重要な部分が、上記のような試行錯誤を繰り返すことにより特定できた場合、その配列の両端に新しい配列を付加しても、多くの場合活性は変化しない。新しい配列の長さは特に限定されるものではない。
【００５３】
修飾に関しても配列と同様に高度に設計又は改変可能である。
【００５４】
以上のように、アプタマーは高度に設計又は改変可能である。本発明はまた、所定の配列（例、ステム部分、インターナルループ部分、ヘアピンループ部分及び一本鎖部分から選ばれる部分に対応する配列：以下、必要に応じて固定配列と省略する）を含むアプタマーを高度に設計又は改変可能であるアプタマーの製造方法を提供する。
【００５５】
例えば、このようなアプタマーの製造方法は、下記：
【００５６】
【表１】
2014148638.tif 000003
【００５７】
〔上記において、（Ｎ）ａはａ個のＮからなるヌクレオチド鎖を示し、（Ｎ）ｂは、ｂ個のＮからなるヌクレオチド鎖を示し、Ｎはそれぞれ、同一又は異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴ（好ましくは、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）からなる群より選ばれるヌクレオチドである。ａ、ｂはそれぞれ、同一又は異なって、任意の数であり得るが、例えば１〜約１００、好ましくは１〜約５０、より好ましくは１〜約３０、さらにより好ましくは１〜約２０又は１〜約１０であり得る。〕で表されるヌクレオチド配列からなる単一種の核酸分子又は複数種の核酸分子（例、ａ、ｂの数等が異なる核酸分子のライブラリ）、及びプライマー用配列（ｉ）、（ｉｉ）にそれぞれ対応するプライマー対を用いて、固定配列を含むアプタマーを製造することを含む。
【００５８】
本発明はまた、本発明のアプタマー及びそれに結合した機能性物質を含む複合体を提供する。本発明の複合体におけるアプタマーと機能性物質との間の結合は共有結合、又は非共有結合であり得る。本発明の複合体は、本発明のアプタマーと１以上（例、２又は３個）の同種又は異種の機能性物質とが結合したものであり得る。機能性物質は、本発明のアプタマーに何らかの機能を新たに付加するもの、或いは本発明のアプタマーが保持し得る何らかの特性を変化（例、向上）させ得るものである限り特に限定されない。機能性物質としては、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、単糖、ポリヌクレオチド、ヌクレオチドが挙げられる。機能性物質としてはまた、例えば、親和性物質（例、ビオチン、ストレプトアビジン、標的相補配列に対して親和性を有するポリヌクレオチド、抗体、グルタチオンセファロース、ヒスチジン）、標識用物質（例、蛍光物質、発光物質、放射性同位体）、酵素（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、薬物送達媒体（例、リポソーム、ミクロスフェア、ペプチド、ポリエチレングリコール類）、薬物（例、カリケアマイシンやデュオカルマイシンなどミサイル療法に使用されているもの、シクロフォスファミド、メルファラン、イホスファミド又はトロホスファミドなどのナイトロジェンマスタード類似体、チオテパなどのエチレンイミン類、カルムスチンなどのニトロソ尿素、テモゾロミド又はダカルバジンなどのアルキル化剤、メトトレキセート又はラルチトレキセドなどの葉酸類似代謝拮抗剤、チオグアニン、クラドリビン又はフルダラビンなどのプリン類似体、フルオロウラシル、テガフール又はゲムシタビンなどのピリミジン類似体、ビンブラスチン、ビンクリスチン又はビンオレルビンなどのビンカアルカロイド及びその類似体、エトポシド、タキサン、ドセタキセル又はパクリタキセルなどのポドフィロトキシン誘導体、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン及びミトキサントロンなどのアントラサイクリン類及び類似体、ブレオマイシン及びミトマイシンなどの他の細胞毒性抗生物質、シスプラチン、カルボプラチン及びオキザリプラチンなどの白金化合物、ペントスタチン、ミルテフォシン、エストラムスチン、トポテカン、イリノテカン及びビカルタミド）、毒素（例、リシン毒素、リア毒素及びベロ毒素）が挙げられる。これらの機能性分子は最終的に取り除かれる場合がある。更に、トロンビンやマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、Ｆａｃｔｏｒ Ｘなどの酵素が認識して切断することができるペプチド、ヌクレアーゼや制限酵素が切断できるポリヌクレオチドであってもよい。
【００５９】
本発明のアプタマー又は複合体は、例えば、医薬又は診断薬、検査薬、試薬として使用され得る。特に、炎症性疾患及び自己免疫疾患などの医薬又は診断薬、検査薬、試薬として有用である。
ここで炎症性疾患及び自己免疫疾患などとしては、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、シェーグレン症候群、多発性筋炎（ＰＭ）、皮膚筋炎（ＤＭ）、関節リウマチ（ＲＡ）、変形性関節症（ＯＡ）、炎症性腸疾患（クローン病など）、全身性硬化症（ＰＳＳ）、強皮症、結節性動脈周囲炎（ＰＮ）、甲状腺疾患（バセドウ病、橋本病など）、ギラン・バレー症候群、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、突発性血小板減少性紫斑病、自己免疫溶血性貧血、重症筋無力症（ＭＧ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）I型糖尿病、尋常性乾癬、膿疱性乾癬、喘息、好中球機能異常、好酸球性肺炎、特発性肺線維症、過敏性肺炎、癌（例、食道癌、甲状腺癌、膀胱癌、大腸癌、胃癌、膵臓癌、胸部癌、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、神経芽細胞腫、グリオブラストーマ、子宮癌、子宮頚癌、卵巣癌、ウィルムス腫瘍、前立腺癌、骨肉腫）、移植疾患（例、拒絶反応、移植片対宿主病）、アレルギー（例、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症、蕁麻疹、過敏性肺臓炎）、ＡＮＣＡ関連疾患、デュシャンヌ型筋ジストロフィー、肺気腫、肺水腫、肺結核、過敏性肺臓炎、肺胞タンパク症、肺リンパ脈管筋腫症（ＬＡＭ）、気胸、胸膜炎、術後癒着、子宮内膜症、成人性歯周炎、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、感染症、加齢黄斑変性症、網膜症、緑内障、白内障、ブドウ膜炎、ベーチェット病、肝炎、肝硬変、肝不全、腎梗塞、腎炎、腎不全、膀胱炎、脳梗塞、脳出血、頭蓋内出血、くも膜下出血、高血圧性脳疾患、脳塞栓症、一過性脳虚血発作、骨髄炎、化膿性関節炎、骨粗鬆症、椎間板ヘルニア、痛風などが挙げられる。
【００６０】
また本発明のアプタマー又は複合体は、薬物送達剤、インビボイメージング用プローブ、ＩＬ−１７の血中濃度測定用プローブ、組織染色用プローブ、ＥＬＩＳＡ用プローブ、ＩＬ−１７の分離精製用リガンドとしても使用され得る。
【００６１】
ＩＬ−１７は線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、樹状細胞前駆細胞、骨髄由来間質細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、好中球などの各種細胞に作用することが知られている。ＩＬ−１７はこれらの細胞に作用することで各種サイトカイン、ケモカイン、受容体、接着分子、酵素等の産生及び発現を誘導する。具体的にはＣＸＣＬ１（ＫＣ又はＧｒｏα）、ＣＸＣＬ２（ＭＩＰ２又はＧｒｏβ）、ＣＸＣＬ５（ＬＩＸ）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ−２）、ＣＸＣＬ８（ＩＬ−８）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ１０）、ＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）、ＣＣＬ１１（Ｅｏｔａｘｉｎ）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ３α）、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１９、ＴＮＦ、ＣＳＦ２（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（Ｇ−ＣＳＦ）、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ２）、ＮＯＳ２（ｉＮＯＳ）、ＬＣＮ２（２４ｐ３）、ＤＥＦＢ４（ＢＤ２）、Ｓ１００Ａ７（Ｐｓｏｒｉａｓｉｎ）、Ｓ１００Ａ８（Ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ  Ａ）、Ｓ１００Ａ９（Ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ  Ｂ）、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＥＲＥＧ、ＳＯＣＳ３、ＴＮＦＳＦ１１（ＲＡＮＫＬ）、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、ＴＩＭＰ１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＰＧＥ２、ＳＣＦ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣなどが挙げられる。従って、本発明のアプタマー又は複合体は、これらの細胞及びサイトカイン、ケモカインなどに関係した疾患の医薬又は診断薬、検査薬、試薬として使用され得る。
【００６２】
ＩＬ−１７はＩＬ−１７受容体に結合することでＡｃｔ１やＴＲＡＦ６を活性化し、ＮＦ−κＢ経路やＭＡＰキナーゼ経路、Ｃ／ＥＢＰ経路などを活性化する。従って、本発明のアプタマー又は複合体は、これらのシグナル伝達経路の活性化に関係した疾患の医薬又は診断薬、検査薬、試薬として使用され得る。
【００６３】
本発明のアプタマー又は複合体は、炎症性疾患及び自己免疫疾患など（例、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、シェーグレン症候群、多発性筋炎（ＰＭ）、皮膚筋炎（ＤＭ）、関節リウマチ（ＲＡ）、変形性関節症（ＯＡ）、炎症性腸疾患（クローン病など）、全身性硬化症（ＰＳＳ）、強皮症、結節性動脈周囲炎（ＰＮ）、甲状腺疾患（バセドウ病、橋本病など）、ギラン・バレー症候群、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、突発性血小板減少性紫斑病、自己免疫溶血性貧血、重症筋無力症（ＭＧ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、I型糖尿病、尋常性乾癬、膿疱性乾癬、喘息、好中球機能異常、好酸球性肺炎、特発性肺線維症、過敏性肺炎）、癌（例、食道癌、甲状腺癌、膀胱癌、大腸癌、胃癌、膵臓癌、胸部癌、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、神経芽細胞腫、グリオブラストーマ、子宮癌、子宮頚癌、卵巣癌、ウィルムス腫瘍、前立腺癌、骨肉腫）、移植疾患（例、拒絶反応、移植片対宿主病）、アレルギー（例、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症、蕁麻疹、過敏性肺臓炎）、ＡＮＣＡ関連疾患、デュシャンヌ型筋ジストロフィー、肺気腫、肺水腫、肺結核、過敏性肺臓炎、肺胞タンパク症、肺リンパ脈管筋腫症（ＬＡＭ）、気胸、胸膜炎、術後癒着、子宮内膜症、成人性歯周炎、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、感染症、加齢黄斑変性症、網膜症、緑内障、白内障、ブドウ膜炎、ベーチェット病、肝炎、肝硬変、肝不全、腎梗塞、腎炎、腎不全、膀胱炎、脳梗塞、脳出血、頭蓋内出血、くも膜下出血、高血圧性脳疾患、脳塞栓症、一過性脳虚血発作、骨髄炎、化膿性関節炎、骨粗鬆症、椎間板ヘルニア、痛風の予防又は治療に使用され得る。
【００６４】
本発明の医薬は、医薬上許容される担体が配合されたものであり得る。医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００６５】
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のリガンドを溶解させた液剤、有効量のリガンドを固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の有効成分を懸濁させた懸濁液剤、有効量の有効成分を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
【００６６】
また、本発明の医薬は必要により、味のマスキング、腸溶性或いは持続性などの目的のため、自体公知の方法でコーティングすることができる。コーティングに用いられるコーティング剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、ツイーン８０、プルロニックＦ６８、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート、オイドラギット（ローム社製、ドイツ、メタアクリル酸・アクリル酸共重合体）及び色素（例、ベンガラ、二酸化チタンなど）などが用いられる。当該医薬は、速放性製剤、徐放性製剤のいずれであってもよい。徐放の基材としては、例えば、リポソーム、アテロコラーゲン、ゼラチン、ヒドロキシアパタイト、ＰＬＧＡなどが挙げられる。
【００６７】
非経口的な投与（例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与、腹腔内投与、経鼻投与、経肺投与など）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量或いは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌の溶媒に溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。更に注射液剤以外にも、吸入剤、軟膏剤も可能である。吸入剤の場合、凍結乾燥状態の有効成分を微細化し適当な吸入デバイスを用いて吸入投与又はネブライザーを用いて吸入する等の方法が含まれてもよい。吸入剤には、更に必要に応じて従来より使用されている界面活性剤、油、調味料、シクロデキストリン又はその誘導体等を適宜配合することができる。
【００６８】
ここで界面活性剤としては、例えばオレイン酸、レシチン、ジエチレングリコールジオレエート、テトラヒドロフルフリルオレエート、エチルオレエート、イソプロピルミリステート、グリセリルトリオレエート、グリセリルモノラウレート、グリセリルモノオレエート、グリセリルモノステアレート、グリセリルモノリシノエート、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ポリエチレングリコール４００、セチルピリジニウムクロリド、ソルビタントリオレエート（商品名スパン８５）、ソルビタンモノオレエート（商品名スパン８０）、ソルビタンモノラウエート（商品名スパン２０）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（商品名ＨＣＯ−６０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（商品名ツイーン２０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（商品名ツイーン８０）、天然資源由来のレシチン（商品名エピクロン）、オレイルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名ブリジ９２）、ステアリルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名ブリジ７２）、ラウリルポリオキシエチレン（４）エーテル（商品名ブリジ３０）、オレイルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名ゲナポル０−０２０）、オキシエチレンとオキシプロピレンとのブロック共重合体（商品名シンペロニック）等が挙げられる。油としては、例えばトウモロコシ油、オリーブ油、綿実油、ヒマワリ油等が挙げられる。また、軟膏剤の場合、適当な医薬上許容される基剤（黄色ワセリン、白色ワセリン、パラフィン、プラスチベース、シリコーン、白色軟膏、ミツロウ、豚油、植物油、親水軟膏、親水ワセリン、精製ラノリン、加水ラノリン、吸水軟膏、親水プラスチベース、マクロゴール軟膏等）を用い、有効成分と混合し製剤化し使用する。
【００６９】
吸入剤は常法に従って製造することができる。すなわち、上記本発明のアプタマー又は複合体を粉末又は液状にして、吸入噴射剤及び／又は担体中に配合し、適当な吸入容器に充填することにより製造することができる。また上記本発明のアプタマー又は複合体が粉末の場合は通常の機械的粉末吸入器を、液状の場合はネブライザー等の吸入器をそれぞれ使用することもできる。ここで噴射剤としては従来公知のものを広く使用でき、フロン−１１、フロン−１２、フロン−２１、フロン−２２、フロン−１１３、フロン−１１４、フロン−１２３、フロン−１４２ｃ、フロン−１３４ａ、フロン−２２７、フロン−Ｃ３１８、１，１，１，２−テトラフルオロエタン等のフロン系化合物、プロパン、イソブタン、ｎ−ブタン等の炭化水素類、ジエチルエーテル等のエーテル類、窒素ガス、炭酸ガス等の圧縮ガス等を例示できる。
【００７０】
本発明の医薬の投与量は、有効成分の種類・活性、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．０００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．００５〜約１ｍｇ／ｋｇであり得る。
【００７１】
本発明はまた、本発明のアプタマー又は複合体が固定化された固相担体を提供する。固相担体としては、例えば、基板、樹脂、プレート（例、マルチウェルプレート）、フィルター、カートリッジ、カラム、多孔質材が挙げられる。基板は、ＤＮＡチップやプロテインチップなどに使われているものなどであり得、例えば、ニッケル−ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）基板やガラス基板、アパタイト基板、シリコン基板、アルミナ基板などで、これらの基板にポリマーなどのコーティングを施したものが挙げられる。樹脂としては、例えば、アガロース粒子、シリカ粒子、アクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの共重合体、ポリスチレン架橋ジビニルベンゼン粒子、デキストランをエピクロロヒドリンで架橋した粒子、セルロースファイバー、アリルデキストランとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの架橋ポリマー、単分散系合成ポリマー、単分散系親水性ポリマー、セファロース、トヨパールなどが挙げられ、また、これらの樹脂に各種官能基を結合させた樹脂も含まれる。本発明の固相担体は、例えば、ＩＬ−１７の精製、及びＩＬ−１７の検出、定量に有用であり得る。
【００７２】
本発明のアプタマー又は複合体は、自体公知の方法により固相担体に固定できる。例えば、親和性物質（例、上述したもの）や所定の官能基を本発明のアプタマー又は複合体に導入し、次いで当該親和性物質や所定の官能基を利用して固相担体に固定化する方法が挙げられる。本発明はまた、このような方法を提供する。所定の官能基は、カップリング反応に供することが可能な官能基であり得、例えば、アミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、カルボキシル基が挙げられる。本発明はまた、このような官能基が導入されたアプタマーを提供する。
【００７３】
本発明はまた、ＩＬ−１７の精製及び濃縮方法を提供する。特に本発明はＩＬ−１７を他のファミリータンパク質から分離することが可能である。
従って、一実施態様において、本発明は、（ａ）本発明のアプタマー又は複合体をＩＬ−１７を含むサンプルと接触させて、サンプル中のＩＬ−１７と該アプタマー又は複合体とを結合させる工程、及び（ｂ）該アプタマー又は複合体に結合したＩＬ−１７をサンプルから分離する工程を含む、ＩＬ−１７の精製方法を提供する。
本発明の精製及び濃縮方法は、本発明の固相担体にＩＬ−１７を吸着させ、吸着したＩＬ−１７を溶出液により溶出させることを含み得る。本発明の固相担体へのＩＬ−１７の吸着は自体公知の方法により行うことができる。例えば、ＩＬ−１７を含有する試料（例、細菌又は細胞の培養物又は培養上清、血液）を、本発明の固相担体又はその含有物に導入する。ＩＬ−１７の溶出は、中性溶液等の溶出液を用いて行うことができる。中性溶出液は特に限定されるものではないが、例えばｐＨ約６〜約９、好ましくは約６．５〜約８．５、より好ましくは約７〜約８であり得る。中性溶液はまた、例えば、カリウム塩（例、ＫＣｌ）、ナトリウム塩（例、ＮａＣｌ）、マグネシウム塩（例、ＭｇＣｌ2）、界面活性剤（例、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ、ＮＰ４０）、グリセリンを含むものであり得る。本発明の精製及び濃縮方法はさらに、ＩＬ−１７の吸着後、洗浄液を用いて固相担体を洗浄することを含み得る。洗浄液としては、例えば、尿素、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）、Ｔｒｉｓ、酸、アルカリ、Ｔｒａｎｆｅｒ  ＲＮＡ、ＤＮＡ、Ｔｗｅｅｎ  ２０などの表面活性剤、ＮａＣｌなどの塩を含むものなどが挙げられる。本発明の精製及び濃縮方法はさらに、固相担体を加熱処理することを含み得る。かかる工程により、固相担体の再生、滅菌が可能である。
【００７４】
本発明のアプタマー又は複合体は、検出用プローブ、特にＩＬ−１７の検出用プローブとして利用することができる。アプタマーの標識方法としては特に限定されず、自体公知の方法が適用可能である。このような方法としては、例えば放射性同位元素による標識、蛍光色素や蛍光蛋白質による標識などが挙げられる。
【００７５】
本発明はまた、ＩＬ−１７の検出及び定量方法を提供する。特に本発明はＩＬ−１７を他のファミリータンパク質と区別して検出及び定量することができる。本発明の検出及び定量方法は、本発明のアプタマーを利用して（例、本発明の複合体及び固相担体の使用により）ＩＬ−１７を測定することを含み得る。
従って、一実施態様において、本発明は、（ａ）本発明のアプタマー又は複合体を試験サンプルと接触させて、試験サンプル中のＩＬ−１７と該アプタマー又は複合体とを結合させる工程、及び（ｂ）該アプタマー又は複合体と結合したＩＬ−１７を検出する工程を含む、ＩＬ−１７の検出方法を提供する。
ＩＬ−１７の検出及び定量方法は、抗体の代わりに本発明のアプタマーを用いること以外は、免疫学的方法と同様の方法により行われ得る。従って、抗体の代わりに本発明のアプタマーを用いることにより、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ウエスタンブロット法（例、ウエスタンブロット法における二次抗体の代わりとしての使用）、免疫組織化学的染色法、セルソーティング法等の方法と同様の方法により、検出及び定量を行うことができる。このような方法は、例えば、生体又は生物学的サンプルにおけるＩＬ−１７量の測定やＩＬ−１７が関連する疾患の診断に有用であるだけでなく、抗体の代わりに本発明のアプタマーを用いることにより、ヒトやヒト以外の動物由来の生体サンプルを用いて、或いは生体以外のサンプルを用いて、ＩＬ−１７を検出又は定量する科学的目的や、実験・研究目的など疾患診断目的以外にも有用であり得る。
【００７６】
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【００７７】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。
【実施例】
【００７８】
実施例１−１：ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合を阻害するアプタマーの作製１
以下に記載のアプタマー番号１〜４９で表されるアプタマーは自動合成装置を用いて、ホスホロアミダイト法により、以下のように合成した。固相合成装置において、３’末端を樹脂に担持させたヌクレオチドを出発原料とし、合成用カラムに装着後、脱保護溶液、活性化溶液及び３’末端に隣接するヌクレオチドのβ−シアノエチルホスホロアミダイト、酸化溶液又はＳ化試薬、未反応ヌクレオチドのキャッピング溶液の順に反応溶液を合成用カラムに通し、ヌクレオチド間でホスホジエステル又はホスホロチオエート結合を形成させた。以下同様にして、３’→５’方向に１塩基ずつ延長合成した。その後、固相担体からの切り出しを行い、塩基部分の保護基及びリン酸部分の保護基を脱離させた。その後、カートリッジ精製により所定のアプタマーを得た（例えば特開２０１１−５０３８１を参照のこと）。【００７９】
以下、得られたアプタマーのそれぞれのヌクレオチド配列を示す。なお、ａ、ｇ、ｃ、ｕは、それぞれ、塩基がアデニン、グアニン、シトシン及びウラシルであるＲＮＡを示し、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔは、それぞれ、塩基がアデニン、グアニン、シトシン及びチミンであるＤＮＡを示し、ｍｃは、塩基がメチルシトシンであるＲＮＡを示す。ヌクレオチドにおける括弧は、そのヌクレオチドの修飾を示し、（Ｍ）は、ヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がＯ−メチル基で置き換えられていることを、（Ｆ）は、ヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がフッ素原子で置き換えられていることを示す。（Ｓ）は、ヌクレオチドがホスホロチオエート化されていることを示し、（Ｌ）は、ＬＮＡ修飾されていることを示す。例えば、ｃ（Ｆ）は、リボースの２’位のヒドロキシル基がフッ素原子で置き換えられたシチジンを示し、ａ（Ｍ）はリボースの２’位がＯ−メチル基で置き換えられたアデノシンを示し、ｇ（Ｍ）はリボースの２’位がＯ−メチル基で置き換えられたグアノシンを示す（以下、同様に記載する）。
また各配列の先頭は５’末端であり、終端が３’末端である。【００８０】
アプタマー番号１（配列番号１）：
ｇ（Ｌ）ｇ（Ｌ）ｇ（Ｌ）ｕ（Ｆ）ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇ（Ｓ）ｇａｇｇａｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ａａｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇｇｕ（Ｆ）ａｍｃ（Ｌ）ｍｃ（Ｌ）ｍｃ（Ｌ）【００８１】
アプタマー番号２：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）Ｇｇ（Ｍ）ａｇｇａｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ａａｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇｇｕ（Ｆ）ａＣＣＣ【００８２】
アプタマー番号３：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ＡＣＣＣ【００８３】
アプタマー番号４：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ＣＣＣ【００８４】
アプタマー番号５（配列番号２）：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇＴａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ＡＣＣＣＣ【００８５】
アプタマー番号６：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）Ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇＴａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ＡＣＣＣ【００８６】
アプタマー番号７：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ＣＣＣ【００８７】
アプタマー番号８：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇＴａａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ＣＣＣ【００８８】
アプタマー番号９：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇＴａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ＣＣＣ【００８９】
アプタマー番号１０：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇＴａ（Ｍ）Ａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ＡＣＣＣ【００９０】
アプタマー番号１１：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇＴａ（Ｍ）Ａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ＣＣＣ【００９１】
アプタマー番号１２：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇＴａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ＣＣＣ【００９２】
アプタマー番号１３：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇＴａ（Ｍ）Ａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ＣＣＣ【００９３】
アプタマー番号１４：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇ（Ｆ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇＴａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ＣＣＣ【００９４】
アプタマー番号１５：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇ（Ｆ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇＴａ（Ｍ）Ａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ＣＣＣ【００９５】
アプタマー番号１６：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇＴａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ＣＣＣＣ【００９６】
アプタマー番号１７：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇＴａ（Ｍ）Ａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ＣＣＣＣ【００９７】
アプタマー番号１８：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇＴａａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ＣＣＣＣ【００９８】
アプタマー番号１９：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）Ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇＴａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ＣＣＣ【００９９】
アプタマー番号２０：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）Ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇＴａ（Ｍ）Ａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ＣＣＣ【０１００】
アプタマー番号２１：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇｇ（Ｍ）Ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａｇＴａａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）Ｔａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１０１】
アプタマー番号２２：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇｇ（Ｍ）Ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａｇＴａａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）Ｔａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１０２】
アプタマー番号２３：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇｇ（Ｍ）Ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａｇＴａａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ＴＡｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１０３】
アプタマー番号２４：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇｇ（Ｍ）Ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａｇＴａａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ＴＡｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１０４】
アプタマー番号２５：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇｇ（Ｍ）Ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａｇＴａ（Ｍ）Ａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ＴＡｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１０５】
アプタマー番号２６：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）Ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａｇＴａａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）Ｔａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１０６】
アプタマー番号２７：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）Ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａｇＴａ（Ｍ）Ａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）Ｔａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１０７】
アプタマー番号２８：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）Ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａｇＴａａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）Ｔａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１０８】
アプタマー番号２９：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）Ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａｇＴａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）Ｔａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１０９】
アプタマー番号３０：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）Ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａｇＴａ（Ｍ）Ａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）Ｔａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１１０】
アプタマー番号３１：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）Ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａｇＴａａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ＴＡｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１１１】
アプタマー番号３２：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇｇ（Ｍ）Ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａｇＴａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ＴＡＣＣＣ【０１１２】
アプタマー番号３３：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇｇ（Ｍ）Ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａｇＴａ（Ｍ）Ａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ＴＡＣＣＣ【０１１３】
アプタマー番号３４：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）Ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ＡｇＴａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）Ｔａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１１４】
アプタマー番号３５：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）Ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ＡｇＴａ（Ｍ）Ａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）Ｔａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１１５】
アプタマー番号３６：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ＡＧｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）Ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａｇＴａ（Ｍ）Ａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）Ｔａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１１６】
アプタマー番号３７：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）Ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａｇＴａＡｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）Ｔａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１１７】
アプタマー番号３８：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）Ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａｇＴａ（Ｍ）ａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）Ｔａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１１８】
アプタマー番号３９：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）Ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ＡｇＴａａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）Ｔａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１１９】
アプタマー番号４０：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）Ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ＡｇＴａ（Ｍ）ａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）Ｔａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１２０】
アプタマー番号４１：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａｇＴａａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）Ｔａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１２１】
アプタマー番号４２：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａｇＴａＡｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）Ｔａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１２２】
アプタマー番号４３：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａｇＴａ（Ｍ）ａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）Ｔａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１２３】
アプタマー番号４４：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ＡｇＴａ（Ｍ）ａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）Ｔａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１２４】
アプタマー番号４５：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａｇＴａａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ＣＣＣ【０１２５】
アプタマー番号４６：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）Ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａｇＴａａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ＣＣＣ【０１２６】
アプタマー番号４７：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇＴａａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ＣＣＣ【０１２７】
アプタマー番号４８：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａｇＴａａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ＣＣＣ【０１２８】
アプタマー番号４９：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）Ａｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａｇＴａａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ＣＣＣ【０１２９】
アプタマー番号１〜４９で表されるアプタマーがＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合を阻害するかどうかを、表面プラズモン共鳴法により評価した。
測定にはＢＩＡｃｏｒｅ社製の２０００を用いた。ＣＭ５センサーチップにＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ（２１１８１，ＰＩＥＲＣＥ）を固定化し、そこに、ＩｇＧのＦｃ部分を融合した組換えヒトＩＬ−１７Ｒ−Ｆｃキメラ（１７７−ＩＲ，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を約２０ＲＵに固定化した。アナライトとして、ＩＬ−１７（１００又は１５０ｎＭ）と、アプタマー番号１〜４９で表されるアプタマー（５０又は１００ｎＭ）とを混合して１５分間保持したものを流した。【０１３０】
ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合能の結果を下表２に示す。表２では、本発明のアプタマーによる、ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合能への影響を、ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合量を１００とした場合の相対値として示した。また、先行技術文献である国際公開第２０１０／００８００１号に記載のＩＬ−１７アプタマーを作製し、本発明のアプタマーとの比較のために使用した。作製したアプタマーの配列は以下の通りである。
アプタマー番号５０（配列番号３）：
ｇｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｕ（Ｆ）ａｇｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇｇａｇｇａｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ａａｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇｇｕ（Ｆ）ａｇａｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）。
表２に示す数値は、その数値が低いほどアプタマーがＩＬ−１７と強く結合することを示しており、すなわち、当該アプタマーによるＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合阻害活性が高いことを示している。【０１３１】
【表２−１】
2014148638.tif 000004
【０１３２】
【表２−２】
2014148638.tif 000005
【０１３３】
測定の結果、新たに改変修飾したアプタマーは従来公知のアプタマー（アプタマー番号５０）と比較して、何れも結合阻害活性が上昇した。高い阻害活性を有するアプタマーでは約８倍も結合阻害活性が上昇した。【０１３４】
以上より、本発明のアプタマーは従来公知のアプタマーと比較して、ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合に対して高い阻害活性を有することが示された。【０１３５】
実施例１−２：ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合を阻害するアプタマーの作製２
以下に記載のアプタマー番号５２〜９４で表されるアプタマーは自動合成装置を用いて、実施例１−１と同一の方法により合成した。【０１３６】
以下、得られたアプタマーのそれぞれのヌクレオチド配列を示す。なお、ａ、ｇ、ｃ、ｕは、それぞれ、塩基がアデニン、グアニン、シトシン及びウラシルであるＲＮＡを示し、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、Ｔは、それぞれ、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル及びチミンであるＤＮＡを示し、ｍｃは、塩基がメチルシトシンであるＲＮＡを示す。ヌクレオチドにおける括弧は、そのヌクレオチドの修飾を示し、（Ｍ）は、ヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がＯ−メチル基で置き換えられていることを、（Ｆ）は、ヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がフッ素原子で置き換えられていることを示す。（Ｓ）は、ヌクレオチドがホスホロチオエート化されていることを示し、（Ｌ）は、ＬＮＡ修飾されていることを示す。例えば、ｃ（Ｆ）は、リボースの２’位のヒドロキシル基がフッ素原子で置き換えられたシチジンを示し、ａ（Ｍ）はリボースの２’位がＯ−メチル基で置き換えられたアデノシンを示し、ｇ（Ｍ）はリボースの２’位がＯ−メチル基で置き換えられたグアノシンを示す（以下、同様に記載する）。
また各配列の先頭は５’末端であり、終端が３’末端である。【０１３７】
アプタマー番号５２：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）Ｔｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇＴａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ＣＣＣ【０１３８】
アプタマー番号５３：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇ（Ｓ）Ｔａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ＣＣＣ【０１３９】
アプタマー番号５４：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＵｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇＵａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ＣＣＣ【０１４０】
アプタマー番号５５：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇＴｇａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ＣＣＣ【０１４１】
アプタマー番号５６：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）Ｔｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇ（Ｓ）Ｔａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ＣＣＣ【０１４２】
アプタマー番号５７：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）Ｔｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇ（Ｍ）Ｔａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ＣＣＣ【０１４３】
アプタマー番号５８：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇ（Ｓ）ｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）Ｔｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇ（Ｍ）Ｔａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ＣＣＣ【０１４４】
アプタマー番号５９：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）Ｔｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇ（Ｍ）Ｔａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１４５】
アプタマー番号６０：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）Ｔｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇ（Ｍ）Ｔａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１４６】
アプタマー番号６１：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）Ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）Ｔｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇ（Ｍ）Ｔａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ＣＣＣ【０１４７】
アプタマー番号６２：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇＴａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１４８】
アプタマー番号６３：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）Ｔｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇ（Ｓ）Ｔａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１４９】
アプタマー番号６４：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）Ｔｃ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇ（Ｓ）Ｔａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１５０】
アプタマー番号６５：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇＴａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１５１】
アプタマー番号６６：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）Ｔｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇ（Ｓ）Ｔａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１５２】
アプタマー番号６７：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）Ｔｃ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇ（Ｓ）Ｔａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１５３】
アプタマー番号６８：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇ（Ｓ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）Ａｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１５４】
アプタマー番号６９：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１５５】
アプタマー番号７０：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇ（Ｓ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１５６】
アプタマー番号７１：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇ（Ｓ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１５７】
アプタマー番号７２：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１５８】
アプタマー番号７３：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇ（Ｓ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１５９】
アプタマー番号７４：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇＴａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１６０】
アプタマー番号７５：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇＴａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１６１】
アプタマー番号７６：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）Ａｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１６２】
アプタマー番号７７：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）Ａｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１６３】
アプタマー番号７８：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇＴｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇＴａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１６４】
アプタマー番号７９：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１６５】
アプタマー番号８０：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）Ａｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１６６】
アプタマー番号８１：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）Ｔｃ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇ（Ｓ）Ｔａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１６７】
アプタマー番号８２：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）Ｔｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇ（Ｓ）Ｔａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１６８】
アプタマー番号８３：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇ（Ｓ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１６９】
アプタマー番号８４：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇ（Ｓ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１７０】
アプタマー番号８５：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇ（Ｓ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１７１】
アプタマー番号８６：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）Ｔｃ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇ（Ｓ）Ｔｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１７２】
アプタマー番号８７：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）Ｔｃ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇ（Ｓ）Ｔｇａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１７３】
アプタマー番号８８：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇ（Ｓ）ｕ（Ｆ）ｇａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１７４】
アプタマー番号８９：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）Ｔｃ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇ（Ｓ）Ｔａａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１７５】
アプタマー番号９０：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）Ｔｃ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇ（Ｓ）Ｔａ（Ｍ）ａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１７６】
アプタマー番号９１：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）Ｔｃ（Ｍ）ａ（Ｆ）ｇ（Ｓ）Ｔａａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１７７】
アプタマー番号９２：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇ（Ｓ）ｕ（Ｆ）ａａ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１７８】
アプタマー番号９３：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇ（Ｓ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１７９】
アプタマー番号９４：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｓ）ｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａ（Ｆ）ｇ（Ｓ）ｕ（Ｆ）ａａｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｆ）ａ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）【０１８０】
合成したアプタマーがＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合を阻害するかどうかを、表面プラズモン共鳴法により評価した。
測定にはＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製のＢｉａｃｏｒｅＴ１００を用いた。ＣＭ５センサーチップにＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ（２１１８１，ＰＩＥＲＣＥ）を固定化し、そこに、ＩｇＧのＦｃ部分を融合した組換えヒトＩＬ−１７Ｒ−Ｆｃキメラ（１７７−ＩＲ，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を約７５０ＲＵに固定化した。アナライトとして、ＩＬ−１７（１５０ｎＭ）と、表３に示す各アプタマー（１２．５又は５０ｎＭ）とを混合して１５分間保持したものを流した。【０１８１】
ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合能の結果を下表３に示す。表３では、本発明のアプタマーによる、ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合能への影響を、ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合量を１００とした場合の相対値として示した。なお、本発明のアプタマーと比較するために、従来公知のＩＬ−１７に対するアプタマー（アプタマー番号５０）を使用した。
表３に示す数値は、その数値が低いほどアプタマーがＩＬ−１７と強く結合することを示しており、すなわち、当該アプタマーによるＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合阻害活性が高いことを示している。【０１８２】
【表３】
2014148638.tif 000006
【０１８３】
測定の結果、新たに改変修飾したアプタマーは従来公知のアプタマー（アプタマー番号５０）と比較して、何れも結合阻害活性が上昇した。高い阻害活性を有するアプタマーでは約７倍も結合阻害活性が上昇した。【０１８４】
以上より、本発明のアプタマーは従来公知のアプタマーと比較して、ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合に対して高い阻害活性を有することが示された。【０１８５】
実施例２−１：マウス線維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いた本発明のアプタマーの阻害作用１
マウス線維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３細胞はＩＬ−１７とＴＮＦαの細胞刺激で、細胞外にＩＬ−６を放出する。この性質を利用してＩＬ−１７阻害作用をもつアプタマーの選別を行った。
まず、ヒトＩＬ−１７と実施例１−１で作製したアプタマーとを３７℃で３０分間プレインキュベートした後、マウスＴＮＦα（２ｎｇ／ｍＬ）とともにＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１６５８）に加えた。次いで、２４時間インキュベート後、培養上清を回収し、ＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＢＤバイオサイエンス社）によってＩＬ−６産生量を測定した。ＩＬ−６産生量から各アプタマーのＩＬ−１７阻害作用を確認した。５０％阻害濃度（ＩＣ50値）を下表４及び５に示す。なお、本発明のアプタマーと比較するために、従来公知のＩＬ−１７に対するアプタマー（アプタマー番号５０）を使用した。【０１８６】
【表４】
2014148638.tif 000007
【０１８７】
【表５】
2014148638.tif 000008
【０１８８】
測定の結果、新たに改変修飾したアプタマーは従来公知のアプタマー（アプタマー番号５０）と比較して２倍から５０倍程度活性が上昇した。【０１８９】
以上のことから、本発明のアプタマーは従来公知のアプタマーと比較して、ＩＬ−１７の生理活性を非常に強く阻害することが示された。【０１９０】
実施例２−２：マウス線維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いた本発明のアプタマーの阻害作用２
ヒトＩＬ−１７と実施例１−２で作製したアプタマーとを３７℃で３０分間プレインキュベートした後、マウスＴＮＦα（２ｎｇ／ｍＬ）とともにＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１６５８）に加えた。次いで、２４時間インキュベート後、培養上清を回収し、以下に記載のＥＬＩＳＡ法によってＩＬ−６産生量を測定した。ＩＬ−６産生量から各アプタマーのＩＬ−１７阻害作用を確認した。５０％阻害濃度（ＩＣ50値）を下表６に示す。なお、本発明のアプタマーと比較するために、従来公知のＩＬ−１７に対するアプタマー（アプタマー番号５０）を使用した。【０１９１】
アプタマーのＩＬ−１７阻害作用を検証するＥＬＩＳＡ法：ＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレートを、ＰＢＳで希釈したラット抗マウスＩＬ−６抗体（ＢＤバイオサイエンス社、２μｇ/ｍＬ；１００μＬ/ウェル）を用いて被膜し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、マイクロタイタープレートをＰＢＳ/０.０５％ツイーン２０で３回洗浄した後に、ＰＢＳ/１％ＢＳＡ（２００μＬ/ウェル）を用いて室温で２時間ブロッキングした。次いで、プレートをＰＢＳ/０.０５％ツイーン２０で３回洗浄した。ＰＢＳ/１％ＢＳＡ/０.０５％ツイーン２０を用いて段階希釈したリコンビナントマウスＩＬ−６（ＢＤ  バイオサイエンス社；１００μＬ/ウェル）及び培養上清（１００μＬ/ウェル）をプレートに加えた。室温で２時間インキュベーションした後、プレートをＰＢＳ/０.０５％ツイーン２０で３回洗浄した。次いで、プレートにビオチンコンジュゲートラット抗マウスＩＬ−６抗体（ＢＤ  バイオサイエンス社）を最終希釈１/５００、１００μＬ/ウェルで加え、室温で１時間反応させた。ＰＢＳ/０.０５％ツイーン２０で３回洗浄後、アルカリホスファターゼコンジュゲートストレプトアビジンを最終希釈１/１０００、１００μＬ/ウェルで加えた。室温で３０分後、プレートを再びＰＢＳ/０.０５％ツイーン２０で４回洗浄し、基質(１−Ｓｔｅｐ  ＰＮＰＰ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ；１００μＬ/ウェル)を加えた。１５分後に水酸化ナトリウム水溶液（２Ｎ：５０μＬ/ウェル)を加えて反応を停止し、プレートをマイクロタイターリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で、４０５ｎｍのフィルターを用いて読み取った。【０１９２】
【表６】
2014148638.tif 000009
【０１９３】
測定の結果、新たに改変修飾したアプタマーは従来公知のアプタマー（アプタマー番号５０）と比較して何れも活性が上昇した。高い阻害活性を有するアプタマーでは８０倍程度活性が上昇した。【０１９４】
以上のことから、本発明のアプタマーは従来公知のアプタマーと比較して、ＩＬ−１７の生理活性を非常に強く阻害することが示された。【０１９５】
実施例３：結合組織由来細胞に対する本発明のアプタマーのＩＬ−１７阻害作用
正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）はＩＬ−１７による細胞刺激で細胞外にＩＬ−６を放出する。そこで、結合組織由来細胞の例としてＮＨＤＦを用いて、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ６３，４５５−４６６（２０１１）に記載の方法に従い各アプタマーのＩＬ−１７阻害作用を確認した。【０１９６】
まず、４８ウェルマイクロプレートにＮＨＤＦ（ロンザジャパン株式会社）を播種し、２４時間インキュベートした。次いで、ヒトＩＬ−１７（１又は２ｎｇ／ｍＬ）と、後述の実施例５に記載の方法によりＰＥＧ修飾されたアプタマー（５又は１０ｎｇ／ｍＬ）とを３７℃で６０分間プレインキュベートした後、ＮＨＤＦに加えた。さらに２４時間インキュベート後、培養上清を回収し、酵素免疫定量（ＥＬＩＳＡ）法（Ｅｎｄｏｇｅｎ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ：  Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってＩＬ−６産生量を測定した。ＩＬ−６産生量からＩＬ−１７阻害能を算出した結果を、従来公知のＩＬ−１７に対するアプタマー（アプタマー番号５０）によるＩＬ−１７阻害能を１とした場合の相対比として表７に示す。【０１９７】
【表７】
2014148638.tif 000010
【０１９８】
測定の結果、新たに改変修飾したアプタマーは従来公知のアプタマー（アプタマー番号５０）と比較してＩＬ−１７阻害能が上昇した。【０１９９】
以上のことから、本発明のアプタマーは従来公知のアプタマーと比較して、結合組織由来細胞に対してＩＬ−１７の生理活性を非常に強く阻害することが示された。【０２００】
実施例４：上皮組織由来細胞に対する本発明のアプタマーのＩＬ−１７阻害作用
正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）はＩＬ−１７とＴＮＦαの細胞刺激で、細胞外にＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＣＬ２０を、また、正常ヒト腎臓近位尿細管上皮細胞（ＨＲＰＴＥＣ）はＩＬ−１７の細胞刺激でＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１を放出する。そこで、上皮組織の例としてＮＨＥＫ及びＨＲＰＴＥＣを用いて、本発明のアプタマーのＩＬ−１７阻害作用を確認した。【０２０１】
まず、９６ウェルマイクロプレートにＮＨＥＫ（クラボウ社）又はＨＲＰＴＥＣ（クラボウ社）を播種し、２４時間インキュベートした。次に、ヒトＩＬ−１７（１００ｎｇ／ｍＬ）と、実施例１−１で作製したアプタマーとを３７℃で３０分間プレインキュベートした後、ヒトＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍＬ）とともにＮＨＥＫに加えた。また、同様にヒトＩＬ−１７（１００ｎｇ／ｍＬ）と、実施例１−１で作製したアプタマーとを３７℃で３０分間プレインキュベートした後、ＨＲＰＴＥＣに加えた。さらに２４時間及び４８時間培養した後に培養上清を回収し、ＣＣＬ２０及びＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１をＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｈｕｍａｎ  ＣＣＬ２０／ＭＩＰ−３  ＥＬＩＳＡ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）あるいはＢＤ  Ｃｙｔｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙで測定した。【０２０２】
以下にＮＨＥＫにおける各種アプタマーのＩＬ−１７阻害作用を示す。なお、本発明のアプタマーとの比較のために、従来公知のＩＬ−１７に対するアプタマー（アプタマー番号５０）を使用した。【０２０３】
【表８】
2014148638.tif 000011
【０２０４】
【表９】
2014148638.tif 000012
【０２０５】
【表１０】
2014148638.tif 000013
【０２０６】
以下にＨＲＰＴＥＣにおける各種アプタマーのＩＬ−１７阻害作用を示す。なお、本発明のアプタマーとの比較のために、従来公知のＩＬ−１７に対するアプタマー（アプタマー番号５０）を使用した。【０２０７】
【表１１】
2014148638.tif 000014
【０２０８】
【表１２】
2014148638.tif 000015
【０２０９】
【表１３】
2014148638.tif 000016
【０２１０】
測定の結果、新たに改変修飾したアプタマーは従来公知のアプタマー（アプタマー番号５０）よりＩＬ−１７で誘導されるサイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−８）やケモカイン（ＣＣＬ２０、ＭＣＰ１）の産生を強く抑制した。【０２１１】
以上のことから、本発明のアプタマーは従来公知のアプタマーと比較して、上皮組織の細胞に対してＩＬ−１７の生理活性を非常に強く阻害することが示された。【０２１２】
実施例５：血清中安定性試験I
各アプタマーのヒト血清中における安定性をｉｎ  ｖｉｔｒｏにより評価した。
実施例１−１で作製したアプタマーの５’末端にリンカー（ｓｓＨ  ａｍｉｎｏ  ｌｉｎｋｅｒ又はＣ６  ａｍｉｎｏ  ｌｉｎｋｅｒ）を介して分子量が４０又は８０ｋＤａのＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＧＳ２  日本油脂社製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＴＳ  日本油脂社製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−８００ＧＳ２  日本油脂社製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ４−８００ＧＳ２  日本油脂社製又はＹ−ＮＨＳ−４０Ｋ：Ｙ−ｓｈａｐｅ  Ｊｅｎｋｅｍ社製）を付加し、３’末端にｉｄＴ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ）を付加したアプタマーの改変修飾体をそれぞれ作製した（作製法については、例えば、特許第３６２６５０３号を参照されたい）。
ヒト血清（３６μＬ）に、実施例１−１で作製したアプタマー又は上記ＰＥＧ修飾されたアプタマー（１００μＭ  ２μＬ）を加え、３７℃で静置しつつ、０時間、２４時間、４８時間、９６時間経過時にそれぞれ４．５μＬずつサンプリングして−８０℃で保存した。その後、解凍した各サンプルにプロテアーゼＫ（６ｍｇ／ｍＬ）を０．５μＬずつ添加して３７℃で１０分間静置した後、さらに反応停止液（８Ｍ  尿素、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸、０．０５％ＢＰＢ：ブロモフェノールブルー）を２５．５μＬ加えた後、９５℃で１０分間熱処理を行った。続いて、各サンプルを８Ｍ  尿素存在下でアクリルアミドゲル電気泳動を行うことにより、サンプル中に含有されるアプタマーの分離を行った。次いで、ゲルをＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（タカラバイオ社）で３０分間染色した後、Ｓｔｏｒｍ８４０  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（ＧＥヘルスケアジャパン社）を用いてＲＮＡの蛍光を検出した。得られた像により、残存アプタマーにあたるバンドを定量し、半減期を算出することで各検体の安定性を評価した。各検体の半減期を下表１４に示す。表１４では、上記の従来公知のＩＬ−１７に対するアプタマー（アプタマー番号５０）に加えて、国際公開第２０１０／００８００１号に記載の別のＩＬ−１７アプタマーを作製し、本発明のアプタマーとの比較のために使用した。作製したアプタマーの配列は以下の通りである。
アプタマー番号５１（配列番号４）：
ＧＧＧＧｕ（Ｆ）ａｇｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇｇａｇｇａｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ａａｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇｇｕ（Ｆ）ａＣＣＣＣ）。【０２１３】
【表１４】
2014148638.tif 000017
【０２１４】
測定の結果、新たに改変修飾したアプタマーは従来公知のアプタマー（アプタマー番号５０及び５１）と比較していずれも血清中の半減期が約２〜５倍延長した。更に、ＰＥＧ修飾させることによる半減期の延長は、新たに改変修飾したアプタマーの方が顕著であった。【０２１５】
以上より、本発明のアプタマーは従来公知のアプタマーと比較して、血清中の安定性が有意に向上した。【０２１６】
実施例６：血清中安定性試験II
マウス血清、ヒト血清あるいはリン酸緩衝液（３３μＬ）に、実施例１−１及び１−２で作製したアプタマー（１００μＭ  ２．５μＬ）を加え、３７℃で静置し、２４時間経過時に４μＬをサンプリングして反応停止液（８Ｍ  尿素、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸、０．０５％ＢＰＢ：ブロモフェノールブルー）２４μＬに加えた。−７０℃で保存した後、各サンプルを８Ｍ  尿素存在下でアクリルアミドゲル電気泳動を行うことにより、サンプル中に含有されるアプタマーの分離を行った。次いで、ゲルをＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（タカラバイオ社）で３０分間染色した後、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＩＭＡＧＥＲ ＦＸ （ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いてＲＮＡの蛍光を検出した。得られた像により、残存アプタマーにあたるバンドを富士フィルム社製Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌａｂ ２００５ Ｍｕｌｔｉ Ｇａｕｇｅ Ｖｅｒ３．０を用いて定量し、リン酸緩衝液で得られた結果を１００％として各検体の血清中での残存量を測定した。【０２１７】
【表１５】
2014148638.tif 000018
【０２１８】
【表１６】
2014148638.tif 000019
【０２１９】
測定の結果、新たに改変修飾したアプタマーは従来公知のアプタマー（アプタマー番号５０及び５１）と比較していずれも２４時間後の血清中の残存量は増加した。もっとも安定性の高いアプタマーでは約１５倍、２４時間後の血清中の残存量が増加した。【０２２０】
以上より、本発明のアプタマーは従来公知のアプタマーと比較して、血清中の安定性が有意に向上した。【０２２１】
実施例７：マウス薬物動態試験
アプタマーを１ｍｇ／ｍＬで生理食塩水に溶解し、雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８週齢、チャールス・リバー社）に１ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。５、１５、３０分後、１、２、４、６、８、２４時間後、あるいはさらに４８、７２、９６時間後にそれぞれ血液を採取した。血漿に分離し−７０℃で保存した後、Judith M. Healyら（Pharmaceutical Research ,December 2004, Volume 21, Issue 12, pp 2234-2246）の方法に従い、ＥＬＯＳＡ法（ハイブリダイゼーション法）を用いて本発明のアプタマーについて血漿中の残存核酸濃度を測定した。【０２２２】
【表１７】
2014148638.tif 000020
【０２２３】
測定の結果、新たに改変修飾したアプタマーは従来公知のアプタマー（アプタマー番号５０及び５１）と比較して、半減期がいずれも２〜５倍程度増加した。
以上より、本発明のアプタマーは従来公知のアプタマーと比較して、血中における安定性が有意に向上した。【０２２４】
実施例８：マウス空気嚢炎症モデルにおける本発明のアプタマーのＩＬ−１７阻害作用
改変修飾したアプタマーがＩＬ−１７の生理活性を生体内でも阻害できるか、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ７７，  ８７８−８８７  （２００９）を参考に、マウス空気嚢炎症モデルで確認した。
マウス空気嚢炎症モデルには、雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（７週齢、チャールス・リバー社）マウスを用いた（ｎ＝４又は５）。まず背部の剃毛を行い、その翌日及び４日後に背部皮下に空気を２．５ｍＬ注入した。２回目の空気注入より３日後に、実施例５に記載の方法によりＰＥＧ修飾された本発明のアプタマーを腹腔内投与し、１時間後にＩＬ−１７（０．５ｍｇ）を含む２％カルボメチルセルロース水溶液を空気嚢内に注入しＩＬ−６産生を誘導した。ＩＬ−１７を注入してから２４時間後に空気嚢内の滲出液を回収し、滲出液中のＩＬ−６量をＥＬＩＳＡで測定した。ＩＬ−６産生抑制率（％）を算出した結果を下表１８及び１９に示す。なお、表１８及び１９では、本発明のアプタマーとの比較のために、従来公知のＩＬ−１７に対するアプタマー（アプタマー番号５０及び５１）を使用した。【０２２５】
【表１８】
2014148638.tif 000021
【０２２６】
【表１９】
2014148638.tif 000022
【０２２７】
測定の結果、新たに改変修飾したアプタマーは、同濃度投与での従来公知のアプタマー（アプタマー番号５０及び５１）と比較して、いずれも約２倍から５倍にわたってＩＬ−６産生抑制率が向上していることが確認された。更に、従来公知のアプタマー（アプタマー番号５０及び５１）の投与濃度を１０倍にしても、改変修飾したアプタマーのＩＬ−６産生抑制率の方がいずれも上回っており、本発明のアプタマーのＩＬ−１７阻害活性が生体内でも顕著に上昇していることが確認された。【０２２８】
実施例９−１：マウスＩＬ−２３誘導乾癬モデルに対する炎症抑制効果１
Ｈｅａｔｈｅｒ  Ｌ．  Ｒｉｚｚｏらの方法（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８６，１４９５−１５０２（２０１１））に従い、本発明のアプタマーのＩＬ−２３誘導乾癬モデルに対する抑制作用を調べた。
すなわち、雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７週齢、チャールス・リバー社）の左耳介に０．１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（２０μＬ）のみを、右耳介にはマウスＩＬ−２３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、１μｇ／２０μＬ）をそれぞれ１日１回、４日間連日皮内投与した。その後、実施例２−１に記載の方法によりＰＥＧ修飾された本発明のアプタマー（アプタマー番号８）（５ｍｇ／ｋｇ）を１日１回、連日腹腔内投与した。なお、ポジティブコントロールとして、抗ＩＬ−１７抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、１００μｇ／ｈｅａｄ）を１日１回、１日おきに腹腔内投与し、ネガティブコントロールとして、生理食塩水を１０ｍＬ／ｋｇで１日１回、連日腹腔内投与した。マウスＩＬ−２３の最終投与から２４時間後にダイヤル・シックネス・ゲージ（Ｇ−１Ａ、ＰＥＡＣＯＣＫ社）で両耳介の厚さを測定し、本発明のアプタマーの乾癬様皮膚炎に対する薬効を評価した。【０２２９】
生理食塩水を投与したネガティブコントロール群と比較して、ＰＥＧ修飾された本発明のアプタマー（アプタマー番号８）投与群の耳介厚は有意に減少していた（図２Ａ）。ポジティブコントロールとして使用した抗ＩＬ−１７抗体投与群では、今回用いた投与量では顕著な効果を確認することはできなかった。なお、図中の各値は平均値±標準誤差（ｎ＝４又は５）を示し、統計学的有意差は、一元配置分散分析法及びＤｕｎｎｅｔｔ法を用いて解析した（＊：Ｐ＜０．０５）。【０２３０】
以上の結果は、ＩＬ−１７に対する本発明のアプタマーが乾癬をはじめとした免疫性皮膚疾患の治療薬として利用できることを強く示唆する。【０２３１】
実施例９−２：マウスＩＬ−２３誘導乾癬モデルに対する炎症抑制効果２
Ｈｅａｔｈｅｒ  Ｌ．  Ｒｉｚｚｏらの方法（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８６，１４９５−１５０２（２０１１））に従い、本発明のアプタマーのＩＬ−２３誘導乾癬モデルに対する抑制作用を調べた。
すなわち、雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７週齢、チャールス・リバー社）の左耳介に０．１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（２０μＬ）を、右耳介にはマウスＩＬ−２３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、１μｇ／２０μＬ）をそれぞれ１日１回、４日間連日皮内投与した。その後、実施例２−２に記載の方法によりＰＥＧ修飾された本発明のアプタマー（アプタマー番号４８）（１０ｍｇ／ｋｇ）および同様の方法でＰＥＧ修飾された従来公知のアプタマー（アプタマー番号５１）（１０ｍｇ／ｋｇ）を１日１回、皮内投与する前日から５日間連日腹腔内投与した。なお、ポジティブコントロールとして、抗ＩＬ−１７抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、１００μｇ／ｈｅａｄ）を１日１回、皮内投与する当日から１日おきに腹腔内投与し、ネガティブコントロールとして、生理食塩水を１０ｍＬ／ｋｇで１日１回、皮内投与する前日から５日間連日腹腔内投与した。マウスＩＬ−２３の最終投与から２４時間後にダイヤル・シックネス・ゲージ（Ｇ−１Ａ、ＰＥＡＣＯＣＫ社）で両耳介の厚さを測定し、本発明のアプタマーの乾癬様皮膚炎に対する薬効を評価した。【０２３２】
生理食塩水を投与したネガティブコントロール群と比較して、ＰＥＧ修飾された本発明のアプタマー（アプタマー番号４８）投与群および抗ＩＬ−１７抗体投与群の耳介厚は有意に減少していたが、ＰＥＧ修飾された従来公知のアプタマー（アプタマー番号５１）投与群の耳介厚に有意な差はみられなかった（図２Ｂ）。なお、図中の各値は平均値±標準誤差（ｎ＝５）を示し、統計学的有意差は、一元配置分散分析法及びＤｕｎｎｅｔｔ法を用いて解析した（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１）。【０２３３】
以上の結果は、ＩＬ−１７に対する本発明のアプタマーが乾癬をはじめとした免疫性皮膚疾患の治療薬として利用できることを強く示唆する。【０２３４】
実施例１０：マウスグルコース−６−リン酸イソメラーゼ誘導関節炎モデルに対する炎症抑制効果
Ａ  Ｉｓｈｉｇｕｒｏらの方法（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．６３，４５５−４６６（２０１１））に従い、本発明のアプタマーのグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（ＧＰＩ）誘導関節炎モデルに対する抑制作用を調べた。
すなわち、雄性ＤＢＡ／１マウス（８週齢、チャールス・リバー社）の尾根部に完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ）で乳化したマウスＧＰＩ（３００μｇ／ｈｅａｄ）を皮内投与するとともに、実施例２に記載の方法によりＰＥＧ修飾された本発明のアプタマー（アプタマー番号８）（５ｍｇ／ｋｇ）の投与を開始した。アプタマーは１日１回、隔日で腹腔内に投与された。なお、コントロールとして、生理食塩水を１０ｍＬ／ｋｇで１日１回、隔日で腹腔内に投与した。また、毎日動物を観察し、各肢の炎症の程度を０（無症状）から２（肢全体の発赤と最大の腫脹）までの３段階でスコア化し、本発明のアプタマーの関節炎に対する薬効を評価した。【０２３５】
生理食塩水を投与したコントロール群と比較して、ＰＥＧ修飾された本発明のアプタマー（アプタマー番号８）投与群の関節炎スコアは有意に減少していた（免疫後１１日目及び１２日目、図３）。なお、図中の各値は平均値±標準誤差（ｎ＝１０）を示し、統計学的有意差は、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ−Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ法を用いて解析した（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１）。【０２３６】
以上の結果は、ＩＬ−１７に対する本発明のアプタマーが関節リウマチをはじめとした自己免疫性関節炎の治療薬として利用できることを強く示唆する。【０２３７】
実施例１１−１：マウスコラーゲン誘導関節炎モデルに対する炎症抑制効果１
Ｓ  Ｔｏｙａｍａらの方法（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  １２，Ｒ９２（２０１０））に従い、本発明のアプタマーのコラーゲン誘導関節炎モデルに対する抑制作用を調べた。
すなわち、雄性ＤＢＡ／１マウス（８週齢、チャールス・リバー社）の尾根部に完全アジュバント（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社）で乳化したウシＩＩ型コラーゲン（２００μｇ／ｈｅａｄ、コラーゲン技術研修会）を皮内投与した（実験第１日目）。実験第２２日目に不完全アジュバントで乳化したウシＩＩ型コラーゲンで追加免疫するとともに、実施例２−１に記載の方法によりＰＥＧ修飾した本発明のアプタマー（アプタマー番号８）（５ｍｇ／ｋｇ）を１日１回、１６日間連日腹腔内投与した。なお、コントロールとして、生理食塩水を１０ｍＬ／ｋｇで１日１回、連日腹腔内投与した。毎日動物を観察し、各肢の炎症の程度を０（無症状）から４（肢全体の発赤と最大の腫脹）までの５段階でスコア化し、本発明のアプタマーの関節炎に対する薬効を評価した。【０２３８】
生理食塩水を投与したコントロール群と比較して、ＰＥＧ修飾された本発明のアプタマー（アプタマー番号８）投与群の関節炎スコアは有意に減少していた（図４Ａ）。なお、図中の各値は平均値±標準誤差（ｎ＝９又は１０）を示す。統計学的有意差は、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ−Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ法を用いて解析した（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１）。【０２３９】
実施例１１−２：マウスコラーゲン誘導関節炎モデルに対する炎症抑制効果２
実施例１１−１と同様の方法により、本発明のアプタマーのコラーゲン誘導関節炎モデルに対する抑制作用を調べたが、本発明のアプタマーとしては、実施例２−２に記載の方法によりＰＥＧ修飾した本発明のアプタマー（アプタマー番号６４）（５ｍｇ／ｋｇ）および同様の方法でＰＥＧ修飾した従来公知のアプタマー（アプタマー番号５１）（５ｍｇ／ｋｇ）を使用し、コントロールについては、生理食塩水を１０ｍＬ／ｋｇで１日１回、１６日間連日腹腔内投与した。【０２４０】
生理食塩水を投与したコントロール群と比較して、ＰＥＧ修飾された本発明のアプタマー（アプタマー番号６４）投与群の関節炎スコアは有意に減少していたが、ＰＥＧ修飾した従来公知のアプタマー（アプタマー番号５１）投与群の関節炎スコアに有意な差はみられなかった（図４Ｂ）。なお、図中の各値は平均値±標準誤差（ｎ＝９）を示す。統計学的有意差は、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ−Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ法を用いて解析した（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１）。【０２４１】
関節炎動物モデルとして汎用されているＧＰＩ誘導関節炎モデル（実施例１０）及びコラーゲン誘導関節炎モデル（実施例１１−１及び１１−２）のいずれにおいても本発明のアプタマーの有効性が実証されたことから、ＩＬ−１７に対する本発明のアプタマーが関節リウマチをはじめとした自己免疫性関節炎の治療薬として利用できることがさらに裏付けられた。特に、本発明のアプタマーは従来公知のアプタマーより強い活性を示すことがあきらかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０２４２】
本発明のアプタマー又は複合体は、炎症性疾患や自己免疫疾患、癌、アレルギー、感染症などの疾患に対する医薬、或いは診断薬、試薬として有用であり得る。本発明のアプタマー又は複合体はまた、ＩＬ−１７の精製及び濃縮、ＩＬ−１７の標識、並びにＩＬ−１７の検出及び定量に有用であり得る。【０２４３】
本出願は、日本で出願された特願２０１３−０６０８１７（出願日：２０１３年３月２２日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
2014148638.tif 000023
【図２】
2014148638.tif 000024
【図３】
2014148638.tif 000025
【図４】
2014148638.tif 000026
【配列表】
2014148638000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年10月7日(2015.10.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉａ）：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ’（Ｍ）ｇ’（Ｘ1）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ’ｇ（Ｍ）ａ’（Ｘ4）ｇ（Ｘ5）ｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｘ5）ｕ’（Ｆ）ｃ（Ｘ7）ａ’（Ｘ2）ｇ（Ｘ6）ｕ’（Ｆ）ｒ（Ｘ3）ａ’（Ｘ3）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ’（Ｘ7）ａ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）
［式中、
ａ、ｇ、ｃ及びｕは、それぞれ、塩基がアデニン、グアニン、シトシン及びウラシルであるＲＮＡを示し、
ｒは、塩基がアデニン又はグアニンであるＲＮＡを示し、
ａ’、ｇ’及びｃ’は、それぞれ、塩基がアデニン、グアニン及びシトシンである、ＲＮＡ又はＤＮＡを示し、
ｕ’は、塩基がウラシルであるＲＮＡ、塩基がウラシルであるＤＮＡ又は塩基がチミンであるＤＮＡを示し、
ヌクレオチドにおける括弧は、そのヌクレオチドの修飾を示し、
（Ｍ）は、ヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がＯ−メチル基で置き換えられていることを示し、
（Ｆ）は、ヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がフッ素原子で置き換えられていることを示し、
（Ｘ1）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、ホスホロチオエート化されているか、又はヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がフッ素原子で置き換えられていることを示し、
（Ｘ2）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、又はヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がフッ素原子で置き換えられていることを示し、
（Ｘ3）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、又はヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がＯ−メチル基で置き換えられていることを示し、
（Ｘ4）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、又はヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がフッ素原子又はＯ−メチル基で置き換えられていることを示し、
（Ｘ5）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、ホスホロチオエート化されていることを示し、
（Ｘ6）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、ホスホロチオエート化されているか、又はヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がＯ−メチル基で置き換えられていることを示し、
（Ｘ7）は、ヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がフッ素原子又はＯ−メチル基で置き換えられていることを示す］
で表される配列を含む、ＩＬ−１７に結合し、ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合を阻害するアプタマー。
【請求項２】
下記式（Ｉａ’）：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ’（Ｍ）ｇ（Ｘ5）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｘ4）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｘ5）ｕ’（Ｆ）ｃ（Ｘ7）ａ（Ｘ2）ｇ（Ｘ5）ｕ’（Ｆ）ｒ（Ｘ3）ａ（Ｘ3）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｘ7）ａ（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）
［式中、ａ、ｇ、ｃ、ｕ及びｒ、ａ’、ｃ’及びｕ’、並びに（Ｍ）、（Ｆ）及び（Ｘ2）〜（Ｘ5）及び（Ｘ7）は式（Ｉａ）と同義であり、
Ｇは、塩基がグアニンであるＤＮＡを示す］
で表される配列を含む、請求項１記載のアプタマー。
【請求項３】
下記式（Ｉ）：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ’（Ｍ）ｇ’（Ｘ1）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ’ｇ（Ｍ）ａ’（Ｘ2）ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇｕ’（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａ’（Ｘ2）ｇｕ’（Ｆ）ａ（Ｘ3）ａ’（Ｘ3）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ’（Ｆ）ａ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）
［式中、ａ、ｇ、ｃ及びｕ、ａ’、ｇ’、ｃ’及びｕ’、並びに（Ｍ）、（Ｆ）及び（Ｘ1）〜（Ｘ3）は、式（Ｉａ）と同義である。］
で表される配列を含む、請求項１記載のアプタマー。
【請求項４】
下記式（Ｉａ”）：
ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｍ）ａ’（Ｍ）ｇ（Ｘ5）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）Ｇｇ（Ｍ）ａ（Ｘ7）ｇ（Ｘ5）ｇ（Ｍ）ａ（Ｍ）ｇ（Ｘ5）ｕ’（Ｆ）ｃ（Ｘ7）ａ（Ｆ）ｇ（Ｘ6）ｕ’（Ｆ）ｒ（Ｘ3）ａ（Ｘ3）ｕ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｇ（Ｍ）ｕ（Ｘ7）ａ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）
［式中、ａ、ｇ、ｃ、ｕ及びｒ、ａ’、ｃ’及びｕ’、並びに（Ｍ）、（Ｆ）、（Ｘ3）及び（Ｘ5）〜（Ｘ7）は式（Ｉａ）と同義であり、
Ｇは、塩基がグアニンであるＤＮＡを示す］
で表される配列を含む、請求項１記載のアプタマー。
【請求項５】
式（Ｉａ”）において、３’末端側のｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）ｃ’（Ｍ）がｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）ｃ（Ｍ）である、請求項４に記載のアプタマー。
【請求項６】
アプタマー番号５２〜９４のいずれかに示される配列を含む、請求項１記載のアプタマー。
【請求項７】
アプタマー番号３〜４９のいずれかに示される配列を含む、請求項１記載のアプタマー。
【請求項８】
塩基長が７０以下である、請求項１〜７のいずれか一項記載のアプタマー。
【請求項９】
下記式（ＩＩ）：
ｇ（ｘ1）ｇ（ｘ1）ｇ（ｘ1）ｕ（Ｆ）ａｇ（Ｓ）ｃ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇ’（Ｓ）ｇ（ｘ2）ａｇｇａｇｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ａｇｕ（Ｆ）ａａｕ（Ｆ）ｃ（Ｆ）ｇｇｕ（Ｆ）ａｃ’（ｘ3）ｃ’（ｘ3）ｃ’（ｘ3）
［式中、
ａ、ｇ、ｃ及びｕは、それぞれ、塩基がアデニン、グアニン、シトシン及びウラシルであるＲＮＡを示し、
ｇ’及びｃ’は、それぞれ、塩基がグアニン及びシトシンである、ＲＮＡ又はＤＮＡを示し、
ヌクレオチドにおける括弧は、そのヌクレオチドの修飾を示し、
（Ｆ）は、ヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基がフッ素原子で置き換えられていることを示し、
（Ｓ）は、ヌクレオチドがＲＮＡの場合に、ホスホロチオエート化されていることを示し、
（ｘ1）は、ヌクレオチドがＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）修飾されているか、又はヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がＯ−メチル基で置き換えられていることを示し、
（ｘ2）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、又はヌクレオチドがＲＮＡの場合に、そのリボースの２’位のヒドロキシル基がＯ−メチル基で置き換えられていることを示し、
（ｘ3）は、ヌクレオチドが非修飾であるか、又はＬＮＡ修飾されていることを示す］
で表される配列を含む、ＩＬ−１７に結合し、ＩＬ−１７とＩＬ−１７受容体との結合を阻害するアプタマー。
【請求項１０】
アプタマー番号１又は２に示される配列を含む、請求項９記載のアプタマー。
【請求項１１】
塩基長が７０以下である、請求項９又は１０記載のアプタマー。
【請求項１２】
ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ又はポリエチレングリコールで修飾されている、請求項１〜１１のいずれか一項記載のアプタマー。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項記載のアプタマー及び機能性物質を含む複合体。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか一項記載のアプタマー或いは請求項１３記載の複合体を含む医薬。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか一項記載のアプタマー或いは請求項１３記載の複合体を含む診断薬。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか一項記載のアプタマー或いは請求項１３記載の複合体を含む検出用プローブ。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか一項記載のアプタマー或いは請求項１３記載の複合体を含むＩＬ−１７精製用担体。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか一項記載のアプタマー或いは請求項１３記載の複合体を用いることを特徴とする、ＩＬ−１７の検出方法。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれか一項記載のアプタマー或いは請求項１３記載の複合体を用いることを特徴とする、ＩＬ−１７の精製方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２８】
実施例９−１：マウスＩＬ−２３誘導乾癬モデルに対する炎症抑制効果１
Ｈｅａｔｈｅｒ  Ｌ．  Ｒｉｚｚｏらの方法（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８６，１４９５−１５０２（２０１１））に従い、本発明のアプタマーのＩＬ−２３誘導乾癬モデルに対する抑制作用を調べた。
すなわち、雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７週齢、チャールス・リバー社）の左耳介に０．１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（２０μＬ）のみを、右耳介にはマウスＩＬ−２３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、１μｇ／２０μＬ）をそれぞれ１日１回、４日間連日皮内投与した。その後、実施例５に記載の方法によりＰＥＧ修飾された本発明のアプタマー（アプタマー番号８）（５ｍｇ／ｋｇ）を１日１回、連日腹腔内投与した。なお、ポジティブコントロールとして、抗ＩＬ−１７抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、１００μｇ／ｈｅａｄ）を１日１回、１日おきに腹腔内投与し、ネガティブコントロールとして、生理食塩水を１０ｍＬ／ｋｇで１日１回、連日腹腔内投与した。マウスＩＬ−２３の最終投与から２４時間後にダイヤル・シックネス・ゲージ（Ｇ−１Ａ、ＰＥＡＣＯＣＫ社）で両耳介の厚さを測定し、本発明のアプタマーの乾癬様皮膚炎に対する薬効を評価した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３１】
実施例９−２：マウスＩＬ−２３誘導乾癬モデルに対する炎症抑制効果２
Ｈｅａｔｈｅｒ  Ｌ．  Ｒｉｚｚｏらの方法（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８６，１４９５−１５０２（２０１１））に従い、本発明のアプタマーのＩＬ−２３誘導乾癬モデルに対する抑制作用を調べた。
すなわち、雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７週齢、チャールス・リバー社）の左耳介に０．１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（２０μＬ）を、右耳介にはマウスＩＬ−２３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、１μｇ／２０μＬ）をそれぞれ１日１回、４日間連日皮内投与した。その後、実施例５に記載の方法によりＰＥＧ修飾された本発明のアプタマー（アプタマー番号４８）（１０ｍｇ／ｋｇ）および同様の方法でＰＥＧ修飾された従来公知のアプタマー（アプタマー番号５１）（１０ｍｇ／ｋｇ）を１日１回、皮内投与する前日から５日間連日腹腔内投与した。なお、ポジティブコントロールとして、抗ＩＬ−１７抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、１００μｇ／ｈｅａｄ）を１日１回、皮内投与する当日から１日おきに腹腔内投与し、ネガティブコントロールとして、生理食塩水を１０ｍＬ／ｋｇで１日１回、皮内投与する前日から５日間連日腹腔内投与した。マウスＩＬ−２３の最終投与から２４時間後にダイヤル・シックネス・ゲージ（Ｇ−１Ａ、ＰＥＡＣＯＣＫ社）で両耳介の厚さを測定し、本発明のアプタマーの乾癬様皮膚炎に対する薬効を評価した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３４】
実施例１０：マウスグルコース−６−リン酸イソメラーゼ誘導関節炎モデルに対する炎症抑制効果
Ａ  Ｉｓｈｉｇｕｒｏらの方法（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．６３，４５５−４６６（２０１１））に従い、本発明のアプタマーのグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（ＧＰＩ）誘導関節炎モデルに対する抑制作用を調べた。
すなわち、雄性ＤＢＡ／１マウス（８週齢、チャールス・リバー社）の尾根部に完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ）で乳化したマウスＧＰＩ（３００μｇ／ｈｅａｄ）を皮内投与するとともに、実施例５に記載の方法によりＰＥＧ修飾された本発明のアプタマー（アプタマー番号８）（５ｍｇ／ｋｇ）の投与を開始した。アプタマーは１日１回、隔日で腹腔内に投与された。なお、コントロールとして、生理食塩水を１０ｍＬ／ｋｇで１日１回、隔日で腹腔内に投与した。また、毎日動物を観察し、各肢の炎症の程度を０（無症状）から２（肢全体の発赤と最大の腫脹）までの３段階でスコア化し、本発明のアプタマーの関節炎に対する薬効を評価した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３７】
実施例１１−１：マウスコラーゲン誘導関節炎モデルに対する炎症抑制効果１
Ｓ  Ｔｏｙａｍａらの方法（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  １２，Ｒ９２（２０１０））に従い、本発明のアプタマーのコラーゲン誘導関節炎モデルに対する抑制作用を調べた。
すなわち、雄性ＤＢＡ／１マウス（８週齢、チャールス・リバー社）の尾根部に完全アジュバント（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社）で乳化したウシＩＩ型コラーゲン（２００μｇ／ｈｅａｄ、コラーゲン技術研修会）を皮内投与した（実験第１日目）。実験第２２日目に不完全アジュバントで乳化したウシＩＩ型コラーゲンで追加免疫するとともに、実施例５に記載の方法によりＰＥＧ修飾した本発明のアプタマー（アプタマー番号８）（５ｍｇ／ｋｇ）を１日１回、１６日間連日腹腔内投与した。なお、コントロールとして、生理食塩水を１０ｍＬ／ｋｇで１日１回、連日腹腔内投与した。毎日動物を観察し、各肢の炎症の程度を０（無症状）から４（肢全体の発赤と最大の腫脹）までの５段階でスコア化し、本発明のアプタマーの関節炎に対する薬効を評価した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３９】
実施例１１−２：マウスコラーゲン誘導関節炎モデルに対する炎症抑制効果２
実施例１１−１と同様の方法により、本発明のアプタマーのコラーゲン誘導関節炎モデルに対する抑制作用を調べたが、本発明のアプタマーとしては、実施例５に記載の方法によりＰＥＧ修飾した本発明のアプタマー（アプタマー番号６４）（５ｍｇ／ｋｇ）および同様の方法でＰＥＧ修飾した従来公知のアプタマー（アプタマー番号５１）（５ｍｇ／ｋｇ）を使用し、コントロールについては、生理食塩水を１０ｍＬ／ｋｇで１日１回、１６日間連日腹腔内投与した。
【国際調査報告】
2014148638.tif 000027
2014148638.tif 000028
2014148638.tif 000029
2014148638.tif 000030
2014148638.tif 000031
2014148638.tif 000032