(57)【要約】  培養時において無菌性を維持した培養を実現すると共に、製造後の搬送時において衝撃・振動による閉鎖系培養容器の破損と細胞への影響の回避を可能とする。閉鎖系培養容器１０１は、細胞及び/または培地を保持する培養容器２０１、２０２と、培養容器を保持する保持部材２０３、２０４等により、閉鎖された培養空間を有すると共に、保持部材は、培養空間とは独立した半開放の空洞２２１を有する。また、保持部材は、コネクタ部２１４を囲う蓋固定リング２２０を備えることにより、搬送時において衝撃が加わっても破損することがない。
2016016950.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養容器と、前記培養容器を保持する保持部材を備え、
前記培養容器と前記保持部材は、培養に必要な液体或いは気体の送液或いは送気を行うコネクタ部を除いて閉鎖された培養空間を形成し、
前記保持部材は前記培養空間とは独立した空間を有する閉鎖系培養容器を用いて細胞培養を行い、
前記独立した空間により前記閉鎖系培養容器に対する衝撃を緩衝する、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞培養装置であって、
前記独立した空間は半開放の空洞であり、前記閉鎖系培養容器の外部との間で気体の移動が自由である、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項３】
請求項１に記載の細胞培養装置であって、
前記独立した空間は、前記閉鎖系培養容器内の温度分布を均一化する、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項４】
請求項１に記載の細胞培養装置であって、
前記独立した空間は、前記閉鎖系培養容器の重量を軽減する、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項５】
請求項１に記載の細胞培養装置であって、
前記培養容器と前記保持部材の間に弾性素材を有する、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項６】
請求項１に記載の細胞培養装置であって、
前記保持部材は、前記コネクタ部が貫通する蓋部材を備える、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項７】
請求項１に記載の細胞培養装置であって、
前記保持部材は、前記コネクタ部を囲うリング形状を備える、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項８】
請求項７に記載の細胞培養装置であって、
前記リング形状の上端は前記コネクタ部の上端より上にある、
ことを特徴とした細胞培養装置。
【請求項９】
細胞が保持される培養容器と、
前記培養容器を保持する保持部材を備え、
前記培養容器と前記保持部材は、培養に必要な液体或いは気体の送液或いは送気を行うコネクタ部を除いて閉鎖された培養空間を形成し、
前記保持部材は前記培養空間とは独立した空間を有し、前記独立した空間により衝撃を緩衝する、
ことを特徴とする閉鎖系培養容器。
【請求項１０】
請求項９に記載の閉鎖系培養容器であって、
前記独立した空間は、前記容器内の温度分布を均一化する、
ことを特徴とする閉鎖系培養容器。
【請求項１１】
請求項９に記載の閉鎖系培養容器であって、
前記独立した空間は、前記容器の重量を軽減する、
ことを特徴とする閉鎖系培養容器。
【請求項１２】
請求項９に記載の閉鎖系培養容器であって、
前記培養容器と前記保持部材の間に弾性素材を有する、
ことを特徴とする閉鎖系培養容器。
【請求項１３】
請求項９に記載の閉鎖系培養容器であって、
前記保持部材は、前記コネクタ部が貫通する蓋部材を備える、
ことを特徴とする閉鎖系培養容器。
【請求項１４】
請求項１３に記載の閉鎖系培養容器であって、
前記保持部材は、前記蓋部材を固定し、前記コネクタ部を囲う蓋固定リングを備える、
ことを特徴とする閉鎖系培養容器。
【請求項１５】
請求項１４に記載の閉鎖系培養容器であって、
前記蓋固定リングの上端は前記コネクタ部の上端より上にある、
ことを特徴とした閉鎖系培養容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、閉鎖系培養容器により細胞又は組織を培養する細胞培養技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞を原料とし製造した再生組織を用い臓器等の機能を回復させる再生医療は、従来治療法のなかった疾病に対する根治療法として期待される。治療対象は皮膚、角膜、食道、心臓、骨、軟骨等と多岐に渡り、その臨床応用例も急増している。再生組織の製造工程では患者自身又は他者から採取した生体試料を分離・精製し、増幅・組織化等の加工を行う。この工程は細胞処理施設(CPC：Cell Processing Center)において、医薬品等の製造管理及び品質管理の基準である適正製造基準(GMP：Good Manufacturing Practice)を満たした標準手順書(SOP：Standard Operating Procedure)に従い実施する。よってCPCの運用には多大なコストと専門の培養技術を有した人材を必要とする。加えて製造工程は手作業を中心とするため、製造量の増加には限界がある。低生産性と製造コスト高が再生医療の普及の妨げとなっており、製造工程の中で特に労力とコストを要する培養作業の自動化が求められている。培養作業の自動化により省力化、コストダウン、大量生産が可能となる。【０００３】
自動培養装置の例として、閉鎖空間を有した閉鎖系培養容器を自動で取り扱う装置がある。閉鎖系培養容器は培養時において流路チューブ等が常時接続された状態であり、培養空間の閉鎖性を維持した状態のまま自動培養装置は細胞播種、培地交換、顕微鏡観察等を自動で実施する。これにより生物学的汚染リスクが低減する利点を得る。自動培養装置で製造後の再生組織は、自動培養装置から閉鎖系培養容器に収容された状態で装置から取り出し、移植を行う手術室まで搬送する。この時、再生組織の品質を維持した状態で搬送する必要がある。【０００４】
この自動培養装置に用いる閉鎖系培養容器の例として、特許文献１に示すような閉鎖系培養容器及び自動培養装置が開示されている。ここでの閉鎖系培養容器は２層の培養槽を有し、培地等を供給または排出する流路が常時連結可能である。また、培養槽が１層である閉鎖系培養容器を使用する自動培養装置が特許文献２において開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ１２／００８３６８
【特許文献２】特開２００７−３１２６６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１、２が示す通り、自動培養装置内で閉鎖系培養容器を用いた再生組織の製造が既に実現されている。細胞種に応じた培養槽の層数の選択も可能であり、種々の再生組織を製造可能である。これらの技術では、閉鎖系の培養容器を使用しているため、培養時における無菌性の維持が可能なだけでなく、製造後の再生組織の搬送においても閉鎖系培養容器に収容された状態で無菌性を維持したまま手術室まで運ぶことが可能である。【０００７】
しかしながら自動培養後の閉鎖系培養容器の搬送時において、無菌性の維持だけでなく、衝撃及び振動に対する対策も必要である。搬送時において閉鎖系培養容器に対し衝撃が加わり培養容器が破損した場合、培養時より有していた閉鎖性が破綻し再生組織に対する無菌性が失われる。つまり再生医療治療に使用することはできなくなる。また搬送中に再生組織に対し振動または衝撃が与えられることにより、再生組織を構成する細胞に対し何らかの影響が生じる危険性もある。例えば、上皮系細胞の培養では培養途中において振動または衝撃を与えることはなく、振動・衝撃が生じる搬送時の環境は細胞に対し培養時とは異なるものである。よって振動・衝撃の影響は少ない程好ましい。【０００８】
特許文献１、２において開示された閉鎖系培養容器は、培養時における無菌性の維持を実現可能であるが、再生医療治療を安全に行うためには、さらに、搬送時における衝撃・振動による閉鎖系培養容器の破損や細胞への影響を回避する機能が必要である。このような機能の搭載により、培養時だけでなく培養後においても再生組織の品質維持が可能となる。【０００９】
本発明の目的は、このような課題に鑑み、無菌性を維持した培養を実現すると共に、培養後の搬送時において衝撃・振動による破損と細胞への影響の回避を可能とする細胞培養装置、及び閉鎖系培養容器を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の目的を達成するため、本発明においては、培養容器と培養容器を保持する保持部材を備え、培養容器と保持部材は、培養に必要な液体或いは気体の送液或いは送気を行うコネクタ部を除いて閉鎖された培養空間を形成し、保持部材は培養空間とは独立した空間を有する閉鎖系培養容器を用いて細胞培養を行い、独立した空間により閉鎖系培養容器に対する衝撃を緩衝する構成の細胞培養装置を提供する。【００１１】
また、上記の目的を達成するため、本発明においては、細胞が保持される培養容器と、培養容器を保持する保持部材を備え、培養容器と保持部材は、培養に必要な液体或いは気体の送液或いは送気を行うコネクタ部を除いて閉鎖された培養空間を形成し、保持部材は培養空間とは独立した空間を有し、独立した空間により衝撃を緩衝する構成の閉鎖系培養容器を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、培養時において無菌性を維持した培養を実現すると共に、製造後の搬送時において衝撃・振動による閉鎖系培養容器の破損と細胞への影響の回避が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１に係る自動培養装置の一構成を示す図である。
【図２Ａ】実施例１に係る閉鎖系培養容器の一構成例を示す断面図である。
【図２Ｂ】実施例１に係る閉鎖系培養容器の一構成例を示す組図である。
【図２Ｃ】実施例１に係る閉鎖系培養容器の一構成例を示す上面図である。
【図２Ｄ】実施例１に係る閉鎖系培養容器の一構成例を示す斜視図である。
【図３】実施例１に係る閉鎖系培養容器を含む流路回路の一例を示す図である。
【図４】実施例１に係る細胞培養装置の制御機構の一例を示す図である。
【図５】実施例１に係る細胞培養装置の稼働時のフローの一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。なお、異なる図面における同一番号は同一物を示している。
【実施例１】
【００１５】
実施例１は、培養容器と培養容器を保持する保持部材を備え、培養容器と保持部材は、培養に必要な液体或いは気体の送液或いは送気を行うコネクタ部を除いて閉鎖された培養空間を形成し、保持部材は培養空間とは独立した空間を有する閉鎖系培養容器を用いて細胞培養を行い、独立した空間により閉鎖系培養容器に対する衝撃を緩衝する構成の細胞培養装置、及び装置で用いる閉鎖系培養容器の実施例である。【００１６】
図１を用いて、本実施例の閉鎖系培養容器を用い自動で培養を行う自動培養装置の構成要素を説明する。自動培養装置は、培養温度である３７℃にて細胞を培養する空間であるインキュベータ１０３、内部に培地の入った培地ボトル１０６、及び培養上清を回収する培養上清バッグ１１３を保管する冷蔵庫１１１、閉鎖系培養容器１０１へ５％ＣＯ２を含む空気等を供給する気体供給部１０５、自動培養装置を制御する制御部１０２等から成る。インキュベータ１０３内には培養容器部１０４内に細胞を培養する閉鎖系培養容器１０１を有する。閉鎖系培養容器１０１の個数は１個でも複数個でも良い。【００１７】
また閉鎖系培養容器１０１は、図示を省略した流路チューブ等を介し、培地ボトル１１２、培養上清バッグ１１３等と常時連結している。閉鎖系培養容器１０１内の細胞は顕微鏡１０８により適宜観察する。閉鎖系培養容器１０１に対し、培地等を送液する電磁弁、チューブポンプ等の送液機構１０９を含む駆動系を有する流路部１０７が設置されている。また、ＣＯ２、Ｏ２センサ１１４で気体供給部１０５から供給される気体の濃度制御を行うための検出を行う。なお、制御部１０２内には電源ボックスが内蔵されており、またパーソナルコンピュータ（PC）等を用いた制御用端末１１０の入出力部をユーザインタフェース部として種々のパラメータ設定等を行うことが可能である。【００１８】
本実施例の自動培養装置は、閉鎖系培養容器１０１への細胞懸濁液の送液による細胞播種、温度及び気体環境等を維持する培養、古い培地を排出し新しい培地を供給する培地交換、顕微鏡１０８による細胞観察等を実施する。自動培養装置の実施する工程を本例では細胞播種、培地交換、培養、顕微鏡観察としたが、一部の工程を手作業により代替しても適用可能であることは云うまでもない。【００１９】
図２Ａ−図２Ｄを用い、本実施例の細胞培養装置の閉鎖系培養容器１０１の基本的な構成要素を説明する。閉鎖系培養容器を構成する培養容器、保持部材の素材は、滅菌処理による無菌化が可能である必要がある。素材を例えばポリスチレンとする場合、使用前にγ線照射またはエチレンオキシダイド気体処理による滅菌操作を施し、無菌化が可能であるとする。上記ではポリスチレンを例としたが、生体試料にとって有害ではない素材で滅菌が可能であれば適用可能であることは云うまでもない。また有害物質等を発することのない、医療用途の品質のものが好ましい。【００２０】
図２Ａは本実施例の閉鎖系培養容器１０１の断面図、図２Ｂはその組図、図２Ｃは上から見た上面図、図２Ｄはその上部からの斜視図を示している。本実施例の閉鎖系培養容器１０１は、細胞が保持される培養容器と培養容器を保持する保持部材から成り、２種類の培養容器２０１及び２０２を保持部材の内部に保持している。培養容器２０１及び２０２の内部には細胞及び培地を保持し、細胞を培養することが可能である。言い換えるなら、培養容器と保持部材は細胞を培養する培養空間を形成している。【００２１】
培養容器２０１は、一般に細胞培養に使用される市販品の培養皿を使用することが可能である。ＢＤ社製、コーニング社製、グライナー社製等があり、使用可能な製品は限定されない。また、セルシード社製の温度応答性培養皿器への適用も可能である。市販品の培養皿の使用を可能とすることにより、細胞培養時において接着、伸展、増殖、分化等の細胞動態は同等となる。臨床へ適用可能な医療機器承認を取得済のものを使用することも可能である。市販品の培養皿以外のものも使用可能であり、使用者の用途に合わせ適応できる。材質はＰＣ、ＰＳ等の可塑性と共に剛性を有するプラスチック、或いはガラス素材等がある。【００２２】
また、培養容器２０２はインサート型培養容器であり、再生組織をその内部に有している。インサート型培養容器は市販のセルカルチャーインサート容器でよく、ＢＤ社製、コーニング社製、グライナー社製等があり、使用可能な製品は限定されない。また、セルシード社製の温度応答性セルカルチャーインサート容器への適用も可能である。セルカルチャーインサート容器の底面は多孔性膜であり、例えば直径０．４μｍ程度の孔を多数有する。これにより、上層及び下層間にて、培地及び液性因子の移動が可能となる。材質はＰＣ、ＰＳ、ポリエチレンテレフタラート（以下ＰＥＴと略記）等の可塑性と共に剛性を有するプラスチックがある。【００２３】
本図では培養容器を２０１及び２０２の２種類を使用した例を示しており、この場合は培養槽が２層となる。上皮系細胞をフィーダーレイヤー法により培養する場合等に使用することが可能である。また図では示さないが、培養容器２０１のみを使用し、培養槽を１層とすることも可能である。この場合、心筋細胞、歯根膜細胞等の培養に使用することが可能である。【００２４】
続いて、本実施例の閉鎖系培養容器における保持部材について詳細に説明する。図２Ａに示す構成の閉鎖型培養用容器１０１の保持部材は、主に本体容器２０３、押さえ部２０４、蓋部材２０５から成る。全体としての外形は、一例として円筒形状の容器である。これらの培養容器、保持部材から成る閉鎖系培養容器は、培養容器２０１及び２０２において細胞及び培地を保持する。本体容器２０３は、底面に開口部２０６を有している。これにより培養容器２０１の底面の外側が露出するため、細胞観察時に鮮明な画像を得られる利点を得る。尚、開口部２０６を形成していない構成でも使用することができ、細胞観察時に鮮明な画像を得られない可能性はあるものの、閉鎖性がより高まるという利点を代わりに得る。また本体容器２０３は、培養容器２０１を設置側とは反対側に半開放の空洞２２１を有する。半開放の空洞２２１は、閉鎖系培養容器１０１として培養容器及び保持部材を組み上げた状態において、閉鎖された培養空間とは異なる空間である。【００２５】
本実施例の構成にあっては、開口部２０６に隣接して、リング形状のゴムシートである第一の弾性体２０７が設置され、第一の弾性体２０７を介し本体容器２０３内に培養容器２０１が設置される。培養容器２０１と本体容器２０３は、押さえ部２０４により一体化された状態となる。押さえ部２０４は筒状の形状であり、中空の節部２０８を有している。節部２０８に、外形が逆円錐台状のインサート型培養容器である培養容器２０２を受ける逆円錐台状の貫通穴２０９が設けられている。節部２０８の下面は培養容器２０１の円周上縁の全てに渡り接している。押さえ部２０４は、培養容器２０１の上方より、本体容器２０３の内円周に沿ってはめ合いにより着脱可能な状態で半固定される。すなわち、本体容器２０３の内筒面に設けられたはめ合い突起２１０が、押さえ部２０４の外筒面に設けられた段部付きのはめ合い溝２１１と係合し、押さえ部２０４と本体容器２０３との間に回転角度を与えた時、はめ合い突起２１０がはめ合い溝２１１の段部に係合し、押さえ部２０４と本体容器２０３の一体化が完了する。【００２６】
このとき同時に培養容器２０１の底面に位置する第一の弾性体２０７は、培養容器２０１と押さえ部２０４に挟まれ圧力を受け弾性変形し、結果として本体容器２０３と培養容器２０１を気密に封止する。尚、一体化した状態から押さえ部２０４に対し逆方向に回転角度を与えると、押さえ部２０４と本体容器２０３は分離する。また、はめ合い突起２１０とはめ合い溝２１１の組み合わせが３組以上あれば、本体容器２０３と押さえ部２０４の位置関係を水平に維持できる。押さえ部２０４と本体容器２０３を水平に着脱可能に固定する手段としては、ねじ結合等、他の手段を用いても良い。【００２７】
また、押さえ部２０４は培養容器２０１を保持する一方で、インサート型培養容器である培養容器２０２を節部１０８の上部平面に保持可能である。培養容器２０２は上面に図２Ｂ、図２Ｄに示すようにフランジ部２１２を有する。フランジ部２１２と平行面をなす底面には物質透過膜２１３が設けられている。培養容器２０２は、物質透過膜２１３の上にて細胞及び培地を保持し、培養を行う。【００２８】
本実施例の閉鎖系培養容器１０１の蓋部材２０５は、円形若しくはほぼ円形（以下、単に円形として説明する）の平面形状である。４個のポートを有し、これらを総称して以下コネクタ部２１４とする。それぞれのポートは、培養容器２０２へ培地等を供給する第１ポート２１５、培養容器２０２から培地等を排出する第２ポート２１６、培養容器２０１へ培地等を供給する第３ポート２１７、培養容器２０１から培地等を排出する第４ポート２１８である。コネクタ部２１４は剛性をもった管路であり、蓋部材２０５の上面から下面へと貫通穴が通じている。言い換えれば、閉鎖系培養容器１０１の外側から内側へ、コネクタ部２１４は通じている。【００２９】
図２Ｂにおいて、Ｏ１は閉鎖系培養容器の中心である。この中心Ｏ１は本体容器２０３、押さえ部２０４、蓋部材２０５、培養容器２０１の中心とも一致する。Ｏ２は培養容器２０２の中心である。すなわち本実施例の培養容器２０２は、閉鎖系培養容器内において偏心して配置されている。これは以下に説明する好適なコネクタ部２１４の配置の結果によるものである。尚、閉鎖系培養容器１０１や培養容器２０１、２０２は円形に限定されるものではない。例えば正六角形、楕円形等、円形以外のものでも良く、それらの図形全体の中心をＯ１、Ｏ２として、同様に偏心して配置すれば良い。【００３０】
コネクタ部２１４において、第１ポート２１５は、培養容器２０２内で、培養容器２０２の上端より少し下位に開口端が配置される。第２ポート２１６は、培養容器２０２内で、培養容器２０２の物質透過膜２１３の高さに近接して配置され、かつ、物質透過膜２１３の外周位置付近に開口端が近接して配置される。第３ポート２１７は、培養容器２０１の上端より少し下位に開口端が配置される。第４ポート２１８は、培養容器２０１の内側底面の高さに近接して配置され、かつ、培養容器２０１の内側外縁付近の位置に開口端が配置される。【００３１】
加えて、第１ポート２１５と第２ポート２１６は、培養容器２０２の容器中心Ｏ２より一方の側（図２ＢではＯ２より右側の領域）に集約する。また第３ポート２１７と第４ポート２１８は、培養容器２０１の容器中心Ｏ１よりも一方の側で、かつ、第１ポート２１５と第２ポート２１６と同じ側（図２ＡではＯ１より右側の領域）に集約する。すなわちコネクタ部２１４は、閉鎖系培養容器の容器中心Ｏ１に対し同じ側の領域にあり、かつ、培養容器２０２の容器中心Ｏ２とは反対側の領域に、集約して配置される。特に、第２ポート２１６と第４ポート２１８は、培養容器２０１の中心Ｏ１か、もしくは培養容器２０２の中心Ｏ２から見て同じ側で、かつ半径方向の同じ直線上に配置する。蓋部材２０５は、Ｏリングである第二の弾性体２１９を介し本体容器２０３に固定される。図２Ａに示す様に、本実施例においては、蓋部材２０５の外周は、下段が上段よりも大きな外径を有する上下２段の段部構造になっている。【００３２】
本体容器２０３の上部には第二の弾性体２１９を保持できる溝が設けられ、第二の弾性体２１９はこの溝に蓋部材２０５との接触面を露出して格納される。本体容器２０３の溝より外側には雄ねじが設けられており、これが蓋固定リング２２０に設けられた雌ねじに螺合される。蓋固定リング２２０は中央に開口部を持ち、内径は蓋部材２０５の外周の下段の段部構造の外径に対応している。閉鎖系培養容器の本体容器２０３の上面開口部に第二の弾性体２１９を介し蓋部材２０５を設置し、蓋固定リング２２０を本体容器２０３の外周のねじ部にねじで固定することにより、蓋部材２０５が本体容器２０３に固定される。蓋固定リング２２０は、蓋部材２０５及び本体容器２０３を固定した段階で、蓋固定リング２２０の上端がコネクタ部２１４の上端よりも高い位置にある。これによりコネクタ部２１４は蓋固定リング２２０により衝撃及び振動から保護する。詳細は図２Ｄにおいて説明する。【００３３】
以上より、本実施例の閉鎖系培養容器１０１が形成する培養空間は、コネクタ部２１４を除き、気密に封止される。また、ねじ固定なので、水平状態で本体容器２０３から蓋部２０５を外すときも、本体容器２０３内の細胞及び培地に対し外力が付与されることはほとんどない。よって自動培養装置による閉鎖系培養容器を用いた培養において、閉鎖系培養容器に対し流路チューブ等が常時接続された状態であるため、培養空間の閉鎖性を維持した状態のまま自動培養装置は細胞播種、培地交換、顕微鏡観察等を自動で実施することが可能となる。これにより生物学的汚染リスクが低減する利点を得る。また自動培養装置で製造後の再生組織は、自動培養装置から閉鎖系培養容器に収容された状態で装置から取り出し、移植を行う手術室まで搬送することが可能となる。よって培養空間の閉鎖性により搬送時から移植を行う開封時までも無菌性を維持することができる。【００３４】
次に、図２Ｄに示した本実施例の閉鎖系培養容器１０１の斜視図を用い、閉鎖系培養容器が有する衝撃及び振動の影響を回避する機能について説明する。前述の通り閉鎖系培養容器１０１は、培養容器２０１、２０２と、保持部材である主に本体容器２０３、押さえ部２０４、蓋部材２０５により構成された閉鎖された培養空間を有する。その部分を囲うように本体容器２０３は半開放の空洞２２１を有する。この空洞２２１は図２Ａの断面図に示すように、閉鎖系培養容器１０１の下方側が開いたような形状をしている。半開放の空洞２２１を有することにより、閉鎖系培養容器１０１に対し側面方向からの衝撃及び振動が加わった場合、緩衝が可能となる。保持部材の材質はＰＣ、ＰＳ、ＰＥＴ等の可塑性と共に剛性を有するプラスチックを例として想定しているが、これらは多少なりのたわみを有するためである。【００３５】
さらに半開放の空洞２２１により、培養容器２０１、２０２及び保持部材において培養空間を形成している部分を保護し、その部分における破損を回避する。閉鎖系容器１０１に対し特に衝撃が加わる場合、閉鎖系容器の最外殻に対し最初に加わる。つまり本体容器２０３において、半開放の空洞２２１の外側に位置する部分に対し最初に衝撃が加わる。よって半開放の空洞２２１の内側に位置する培養空間は、緩衝されることとなる。特に培養空間は移植の時点まで閉鎖性を有し、それにより清浄性を維持していることが必要だが、衝撃により破損等が生じ培養空間の閉鎖性が破綻する危険性を、半開放の空洞２２１により低減することが可能となる。【００３６】
また、図２Ｄに示すように、閉鎖系培養容器の４個のポート２１５−２１８からなるコネクタ部は、蓋固定リング２２０に周囲を囲われている。このコネクタ部の近傍において特に衝撃が生じた場合、衝撃はコネクタ部の各ポート２１５−２１８に直接加わらず、最初に蓋固定リング２２０に加わることとなる。つまりコネクタ部に対しても衝撃に対する影響の回避が可能である。【００３７】
さらに鉛直方向の衝撃及び振動に関しては、図２Ａが示すように閉鎖系培養容器内には第一の弾性体２０７と第二の弾性体２１９が設置されている。これらはシリコーン、ゴム等の素材である。よって鉛直方向に対し衝撃または振動が生じた場合、それらの設置による緩衝の効果を得ることが可能である。【００３８】
尚、ここで示した本実施例の構成は、追加的に３個の異なる効果を得ることができる。以下順次説明する。１個目は、図１に示したように閉鎖系培養容器１０１はインキュベータ１０３の内部に設置され、インキュベータの中では一般に温度が３７℃に維持されている。半開放の空洞２２１の存在により、半開放の空洞２２１の内部までインキュベータ１０３により３７℃まで温められた空気が入り込むことが可能である。また半開放の空洞２２１の存在により閉鎖系培養容器１０１における表面積は、半開放の空洞２２１が存在しない場合に比べ、広くなる。よって熱伝導性が向上する。コネクタ部２１４を保護している蓋固定リング２２０においても同様に、蓋固定リング２２０においてコネクタ部２１４を保護する機能を有していない鉛直方向に低い形状である場合に比べ、閉鎖系培養容器１０１における表面積は広くなる。同様に蓋固定リング２２０により熱伝導性が向上する。【００３９】
以上により、結果として閉鎖系培養容器１０１における温度分布の均一化、熱伝導性の向上が期待される。ここから導かれる利点は２点ある。１点目は、閉鎖系培養容器内の温度が均一かつ速やかに培養温度(３７℃)に達することが可能となるため、細胞の活性も一様となることが期待できる。これは再生組織の製造再現性の向上に寄与する。２点目は、閉鎖系培養容器内の温度分布が均一であるため、結露が生じる可能性を低減できる。特に蓋部材２０５の温度が周囲よりわずかでも下がった場合、蓋部材２０５において結露が生じる。結露により、顕微鏡により取得する細胞画像が不鮮明となる危険性がある。特に自動培養装置においては、人手ではなく装置が自動で細胞画像を撮影する。加えて細胞画像の取得は、各培養工程時点において撮影する必要があり、万が一不鮮明な画像しか得られず再度の撮影を試みようとしても、時間が異なれば別の評価結果となってしまう。ある時点における細胞画像は、その時点でしか得ることはできない。以上の利点は自動培養装置において大変重要なものである。【００４０】
２個目の追加的な利点は、半開放の空洞２２１を有することにより、閉鎖系培養容器１０１は軽量化する。これは自動培養開始前の閉鎖系培養容器の設置時、自動培養後の搬送時、再生組織を取り出す移植時において、閉鎖系培養容器のハンドリングが容易となる利点となる。加えて半開放の空洞２２１の存在により、特に射出成型により閉鎖系培養容器を製造する場合、材良費の削減効果も得る。【００４１】
３個目の追加的な利点は、仮に閉鎖系培養容器１０１の周囲に蓄熱材或いはヒータを設置した状態で培養したり、蓄熱材を設置した状態で搬送したりする場合、蓋固定リング２２０が鉛直方向に高さを有した形状であるため、周囲を覆った蓄熱材の中からの取り出しが容易となる。閉鎖系培養容器１０１の周囲に設置する蓄熱材或いはヒータは、高さ方向に高ければ高い程、閉鎖系培養容器を温める効果が向上する。しかし高すぎることにより閉鎖系培養容器を蓄熱材或いはヒータから取り出しづらくなると、例えば自動培養後の搬送時、再生組織を取り出す移植時等における閉鎖系培養容器のハンドリングが困難となってしまう。ここで蓋固定リング２２０が鉛直方向に高さを有した形状であることにより、蓄熱材或いはヒータを例えば閉鎖系培養容器の培養空間程度の高さまで高くしたとしても、そこから飛び出たような蓋固定リング２２０を把持することにより、蓄熱材或いはヒータから容易に取り出せることとなる。また、図２Ｄに示したように、蓋固定リング２２０は、その外表面に凹凸形状を施すことにより把持し易く、また装着取り外しが容易な構成となっており、この点からもハンドリングが容易である。【００４２】
図３により、本実施例の閉鎖系培養容器を用い、自動培養装置にて再生組織を製造する場合の流路回路の一例を説明する。図１の構成にあっては、送液機構１１３を備える流路部１０７として簡略的に図示したが自動培養装置の流路回路においては、閉鎖系培養容器への培地の供給または排出に関する送液を制御する送液制御部を備える。閉鎖系培養容器内へ直接送気する場合は、送気制御手段も備える。閉鎖系培養容器の一部を気体透過膜とする等の構成とする場合、気体透過膜を介し気体を送気することとなるが、その場合はインキュベータ自体が送気手段となる。図３の流路回路の例では前者の構成を示している。【００４３】
また図３では、自動培養装置において使用する観察手段としての顕微観察ユニット３２０も示している。また本例では後述するように、図１の細胞ボトル１０６として細胞ボトル３０７、３１６を２個使用するが、これはフィーダーレイヤー法による上皮系細胞の培養を例としているためである。前述の通り培養容器一個で培養槽を１層とした培養の場合は細胞ボトルを１個のみを使用する。また図３では閉鎖系培養容器１０１が１個の場合を示しているが、閉鎖系培養容器を並列的に配置することにより同時に複数個の閉鎖系培養容器に対する自動培養が可能である。【００４４】
図３の流路回路例において、閉鎖系培養容器１０１の第１ポート２１５には、送液制御部の第１容器開閉弁３０１が流路チューブにより接続されている。その上流は２分岐され、一方は第１ポンプ３０２に接続され、もう一方は第１排気開閉弁３０３に接続され、さらにその上流にはフィルタが接続され、フィルタのもう一方の接続口は大気に解放されている。第１容器開閉弁３０１及び第１排気開閉弁３０３に使用する弁機構は、例えば電磁弁である。第１ポンプ３０２に使用するポンプは、例えばローラポンプである。フィルタは、流路外から気体を取り込み流路内の気圧を調整するものであり、例えば０．２２μｍ以上の粒子を通さない品質のものを使用する。【００４５】
第１ポンプ３０２の上流は２分岐され、一方は第１細胞開閉弁３０４に接続され、もう一方は第１培地切換え弁３０５に接続する。第１細胞開閉弁３０４の上流は２分岐され、一方は第１細胞減圧弁３０６に接続され、その上流はフィルタに接続し、もう一方は第１細胞ボトル３０７に接続される。第１細胞ボトル３０７には、培養目的とする細胞が培地に懸濁した状態で保持されている。第１細胞ボトル３０７には、導入管と内部の気圧を調整するフィルタが設けられる。【００４６】
閉鎖系培養容器の第３ポート２１７には、第２容器開閉弁３０８が流路チューブにより接続され、その上流は２分岐され、一方は第２ポンプ３０９の方向に接続され、もう一方は第２排気開閉弁３１０に接続されている。さらにその上流にはフィルタが接続され、フィルタのもう一方の接続口は大気に解放されている。第２ポンプ３０９の上流と下流は各々２分岐され、第２ポンプ３０９を短絡するように流路チューブが並行的に接続され、その間に第２気体開閉弁３１１が接続される。第２ポンプ３０９の上流は２分岐され、一方は第２細胞開閉弁３１２に接続され、もう一方は再度２分岐され、一方は第１気体開閉弁３１３に接続され、もう一方は第２培地切換弁３１４に接続されている。第２細胞開閉弁３１２の上流は２分岐され、一方は第２細胞減圧弁３１５に接続され、その上流はフィルタに接続し、もう一方は第２細胞ボトル３１６に接続される。第２細胞ボトル３１６の構成は、内部に培養目的とする細胞が培地に懸濁した状態で保持される。第２細胞ボトル３１６には、導入管と内部の気圧を調整するフィルタが設けられる。【００４７】
第１培地切換え弁３０５と第２培地切換え弁３１４の上流は共に予熱機構３１７に接続され、その上流は２分岐され培地ボトル３１８と培地減圧弁３１９とに接続する。培地ボトル３１８は図１の培地ボトル１１２に対応し、その内部には培地が保持されており、培地は冷蔵庫１１１により冷蔵保持されている。細胞培養時には培地は予熱機構３１７にて予熱した後、閉鎖系培養容器１０１へ送液する。【００４８】
第１気体開閉弁３１３の上流には加湿ボトル３２１が接続され、加湿ボトル３２１の上流には、例えば最適濃度で加圧された炭酸気体が充填されたガスボンベ３２２が接続される。培養中の培地はｐＨ値が変化することを回避するため、定期的に例えば炭酸気体により閉鎖系培養容器内の気体を交換する必要がある。加えて培地の蒸発による培地成分の濃縮も防止する必要がある。ガスボンベ３２２により送気した炭酸気体は加湿ボトル３２１において最適湿度に加湿され、閉鎖系培養容器まで送気される。【００４９】
細胞培養容器の第２ポート２１６には流路チューブにより第４ポンプ３２３に接続され、その下流は第４容器開閉弁３２４に接続され、その下流は上層用培養上清バッグ３２５に接続される。第４ポート２１８には流路チューブにより第３ポンプ３２６に接続され、その下流は第３容器開閉弁３２７に接続され、その下流は下層用培養上清バッグ３２８に接続される。上層用培養上清バッグ３２５及び下層用培養上清バッグ３２８は、図１の上清バッグ１１３に対応し、培養途中において培養上清を無菌的に回収し、培地成分分析により培養状況の正常性を確認しても良い。その場合、無菌的に回収するための別の培養上清ボトルを並列的に設置する。【００５０】
閉鎖系培養容器１０１を設置したステージ３２９の観察用開口部３３０の下方には、顕微観察ユニット３２０が配置されている。閉鎖系培養容器の上方には顕微観察ユニット３２０の一部である照射光部３３１が配置されている。顕微観察ユニット３２０と照射光部３３１で図１の顕微鏡１０８に対応している。また、ステージ３２９は顕微観察ユニット３２０の有する上下駆動装置により、閉鎖系培養容器内における観察場所を変更することが可能である。【００５１】
図４は本実施例の閉鎖系培養容器を含む自動培養装置の機能構成を説明するブロック図である。制御部１０２により制御される各構成要素が、インキュベータ１０３の内部に配置された閉鎖系培養容器１０１に接続された全体構成図である。尚、インキュベータ１０３内に配置されるものは、前述の閉鎖系培養容器１０１、或いは自動培養装置内に設置された培養容器部１０４であることは言うまでもない。なお、細胞ボトル・培地ボトル・培養上清バッグ４１２は、図１の細胞ボトル１０６、培地ボトル１１２、培養上清バッグ１１３に対応するが、図１に示したように、細胞ボトルについては、インキュベータ１０３に配置することが望ましい。【００５２】
図４において、制御部１０２には、インキュベータ１０３の温度を制御するための温度調節部４０４と、閉鎖系培養容器内の気体濃度を制御するための、気体供給部１０５及び気体濃度調節部４０６と、閉鎖系培養容器内の培地を自動で交換するための流路回路に設置されたポンプ４０７と、それぞれの構成要素の動作を制御することを目的とした細胞観察用の顕微鏡１０８、ＣＯ２・Ｏ２センサ１１４が接続されている。ポンプ４０７は、図３のポンプ群３０２、３０９、３２３、３２６に対応することはいうまでもない。【００５３】
制御部１０２と制御用端末１１０とその表示画面は、ＣＰＵ（Central Processing Unit；中央処理部）から成る処理部、記憶部や、ディスプレイ、キーボードから成る入出力部等を備えた通常のコンピュータの、処理部とディスプレイの表示画面に対応している。制御部１０２は、その記憶部に記憶された各種プログラムを、ＣＰＵ上で動作させる。これにより、温度調整部４０４、気体供給部１０５、ポンプ４０７、顕微鏡１０８、ＣＯ２・Ｏ２センサ１１４、気体濃度調整部４０６、細胞ボトル・培地ボトル・培養上清バッグ４１２により、インキュベータ１０３中の培養環境を制御し、閉鎖系培養容器１０１中での所定の培養工程の実施を可能とする。【００５４】
気体濃度調節部４０６は、閉鎖系培養容器１０１に直接接続されている必要はない。温度調節部４０４、気体濃度調節部４０６と、ＣＯ２・Ｏ２センサ１１４がインキュベータ１０３に接続された構成でも構わない。この構成の場合、閉鎖系培養容器１０１へは容器外から気体を供給する必要があるため、閉鎖系培養容器１０１の蓋部の一部に、ＰＣ、ＰＳ、ポリメチルペンテン等の気体透過性を有した透明な薄膜を溶着し、閉鎖系培養容器１０１内部の気体交換を可能とすることで細胞培養を可能とすることができる。【００５５】
以上の機能を有する本実施例の閉鎖系培養容器を含む自動培養装置を用い、再生組織を製造し、製造後に搬送する時の一連の手順を図５に示す。【００５６】
＜ステップＳ１：スタート＞
事前に閉鎖系培養容器を含む閉鎖系流路を自動培養装置に設置する。閉鎖系流路は閉鎖系培養容器１０１、細胞懸濁液の入った細胞ボトル１０６、培地の入った培地ボトル１１２、培養上清を回収する培養上清バッグ１１３等と、それらをつなぐ流路回路の流路チューブから成る。閉鎖系流路を設置後、設置正常性を確認する。【００５７】
続いて自動培養装置を起動させる。作業者が制御部１０２にある操作部のスタートスイッチを押すか、あるいは制御用端末１１０の入力部を使って起動する。尚、装置内はあらかじめ消毒或いは除菌の実施により清浄な環境となっている。続いて制御用端末１10のディスプレイの操作画面にて自動培養装置の内部環境が適切であることを確認する。例えばインキュベータ１０３の温度が３７℃であることを確認する。これらの数値は限定的なものでなく、例えば温度は０℃から４５℃の範囲より選択可能である。【００５８】
＜ステップＳ２：スケジュール決定＞
自動培養装置の実施する自動培養スケジュールを決定する。細胞播種、培地交換、培養上清回収、気体交換、顕微鏡観察、検査用組織回収、移植用組織回収等の操作を行う日時、液量等の条件を制御用端末１１０の入力部より入力する。【００５９】
＜ステップＳ３：細胞播種＞
適切な電磁弁を開閉後、ポンプを作動させ細胞ボトル１０６より細胞懸濁液を吸引する。細胞懸濁液を閉鎖系培養容器１０１まで送液する。全ての閉鎖系培養容器に対し播種終了後、閉鎖系培養容器を設置する培養容器ベースに取り付けたアクチュエータを作動させ培養容器ベースへ傾きを与え揺動し細胞分布を一様化する。【００６０】
＜ステップＳ４：細胞の培養＞
細胞播種直後、各培養容器の内部へ所定量の気体を送気する気体交換を行う。気体交換は培養期間中、１日に数回程度の頻度でも実施する。供給する気体は例としてＣＯ２濃度５％を含む空気を用いる。気体は各閉鎖系培養容器へガスボンベから気体フロメータにより流量を制御し加湿ボトルを通し、水分子を飽和させた状態で供給する。閉鎖系培養容器１０１へ送気後の不要な気体はフィルタを介し流路外へ排出する。フィルタは必要に応じ流路内の圧力を調整する。フィルタは、例えば０．２２μｍ以上の粒子を通さない品質のものを使用する。【００６１】
その後は閉鎖系培養容器を水平に静置した状態で所定時間、培養する。培養中はインキュベータにより３７℃に維持する。装置内の空気はファンにより常に攪拌し、温度分布が常に一様となるようにする。尚、装置にパーティクルカウンタや生菌数計測装置を取り付け、清浄度のモニタリングにより製造安全性の向上が可能である。【００６２】
＜ステップＳ５：顕微鏡による観察＞
自動培養装置内に設置した顕微鏡を用い細胞画像を取得する。自動培養装置内に設置した光源を適宜発光させ、細胞に焦点を合わせ撮像する。取得した細胞画像は制御部１０２内の記憶部のデータベースに保存し、自動培養装置の制御用端末１１０のディスプレイ上で閲覧し細胞の状態を作業者が適宜確認する。また自動細胞撮影時以外は作業者が必要に応じ顕微鏡を手作業で操作し、細胞の観察、撮影を行う。【００６３】
＜ステップＳ６：培地交換＞
培地交換は培養期間中、数日に一度の頻度で実施する。冷蔵庫内の培地ボトル１１２で４℃にて保管されている培地を予熱ボトルまで送液し予熱する。最初に閉鎖系培養容器１０１から古い培地を排出する。この時、アクチュエータにより閉鎖系培養容器を傾け排出効率を向上させる。排出後、速やかに新しい培地を閉鎖系培養容器内へ供給する。古い培地は最終的に培養上清バッグ１１３へ排出する。必要に応じ培養上清バッグ内の培養上清を回収し、培地成分分析により細胞の生育状態を評価する。尚、培地交換は古い培地が入った状態で新しい培地を押し出す方式により実施しても構わない。【００６４】
＜ステップＳ７：検査用組織の回収＞
Ｓ５０で移植予定日の前日であることが確認された場合、複数個の閉鎖系培養容器を同時培養している場合は、閉鎖系培養容器の一部を検査用に回収する。自動培養装置の扉を開け、検査用の閉鎖系培養容器１０１の流路チューブを熱溶着等の手段により無菌切断し取り出す。取り外した閉鎖系培養容器は安全キャビネット又はCPC外へ搬送し、速やかに検査を実施する。例えば生体試料の細胞数、生存率、特定タンパク質の発現等を評価する。【００６５】
＜ステップＳ８：移植直前の培養及び培地交換＞
ステップＳ４と同じ操作による培養を行う。そしてステップＳ９を実施する直前に、ステップＳ６と同じ操作による培地交換を行う。必要に応じステップＳ５と同じ操作による顕微鏡観察も実施する。【００６６】
＜ステップＳ９：移植用組織の回収及び搬送＞
ステップＳ７による評価の結果、移植に適した状態と判定した場合、生体試料を回収し再生医療治療に用いる。Ｓ７同様、閉鎖系培養容器を閉鎖系流路から無菌的に分離させインキュベータ１０３から取り出す。必要に応じ安全キャビネット内へ運び処理を行う。【００６７】
出荷室にて短距離用又は長距離用の輸送容器内へ閉鎖系培養容器を収容する。蓄熱材、気密容器、包装等を用いることで輸送中の全行程にわたり温度、圧力、衝撃等の影響を回避する。その状態で輸送容器をCPC外へ運び出し、手術室まで必要に応じ車両、鉄道、航空機、手運び等の手段により輸送する。【００６８】
手術室での治療前には、必要に応じ受入検査として顕微鏡による細胞観察を行う。短距離輸送の場合は輸送直前と状態はほとんど変わらないことが想定されるため、作業者の判断により実施しなくともよい。【００６９】
＜ステップＳ１０：移植＞
手術室へ到着後、再生組織を閉鎖系培養容器から取り出す。開封時、閉鎖系培養容器の外側は菌等の生物や粒子が付着している可能性があるため、閉鎖系培養容器内が清浄性を維持するよう無菌的に開封する。【００７０】
＜ステップＳ１１：終了＞
培養に用いた閉鎖系流路を取り外す。続いて、装置の内部へ適切な操作により、滅菌ガスによる滅菌或いはエタノールによる消毒を施し、清浄な状態にする。自動培養装置の各種ソフトを終了させ、自動培養装置の作動を終了させる。【００７１】
以上のように構成された本実施例の閉鎖系培養容器を含む自動培養装置の好適な形態によれば、培養時において無菌性を維持した培養を実現すると共に、製造後の搬送時において衝撃・振動による閉鎖系培養容器の破損と細胞への影響の回避を可能とすることが可能となる。結果として再生医療治療を安全に実施することができる。【００７２】
以上説明したように、本実施例の細胞培養装置において培養に使用する閉鎖系培養容器は、細胞及び/または培地を保持する培養容器と、培養容器を保持する保持部材により、閉鎖された培養空間を有し、保持部材は、培養空間とは独立した半開放の空洞を有し、これにより、閉鎖系培養容器に対し衝撃が加わった場合、衝撃の緩衝が可能となる。また、半開放の空洞により、培養容器及び保持部材において培養空間を形成している部分を保護し、その部分における破損を回避することができる。更に、閉鎖系培養容器は、閉鎖系培養容器に対し流路チューブ等を常時接続するコネクタ部は、閉鎖系培養容器の搬送時において衝撃が加わっても破損することがないよう、保持部材の蓋固定リングにより囲われた場所に位置する構成を有することにより、培養時だけでなく培養後の搬送時において、閉鎖系培養容器に対する衝撃及び振動の影響を回避し、結果として培養後も閉鎖系培養容器内において無菌性の維持が可能となる。【００７３】
なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明のより良い理解のために詳細に説明したのであり、必ずしも説明の全ての構成を備えるものに限定されものではない。【００７４】
また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることが可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。【００７５】
更に、上述した各構成、機能、制御部等は、それらの一部又は全部を、例えば集積回路で設計する等によりハードウェアで実現しても良いし、それらの一部又は全部を実現するプログラムを作成することによりソフトウェアで実現しても良いことは言うまでもない。
【符号の説明】
【００７６】
１０１  閉鎖系培養容器
１０２  制御部
１０３  インキュベータ
１０４  培養容器部
１０５  気体供給部
１０６  細胞ボトル
１０７  流路部
１０８  顕微鏡
１０９  送液機構
１１０  制御用端末
１１１  冷蔵庫
１１２  培地ボトル
１１３  培養上清バッグ
１１４  ＣＯ２・Ｏ２センサ
２０１、２０２  培養容器
２０３  本体容器
２０４  押さえ部
２０５  蓋部材
２０６  開口部
２０７  第一の弾性体
２０８  節部
２０９  貫通穴
２１０  はめ合い突起
２１１  はめ合い溝
２１２  フランジ部
２１３  物質透過膜
２１４  コネクタ部
２１５、２１６、２１７、２１８  第１、第２、第３、第４ポート
２１９  第二の弾性体
２２０  蓋固定リング
２２１  半開放の空洞
３０１  第１容器開閉弁
３０２、３０９、３２６、３２３  第１、第２、第３、第４ポンプ
３０３、３１０  第１、第２排気開閉弁
３０４、３１２  第１細胞開閉弁
３０５、３１４  第１、第２培地切換弁
３０６、３１５  第１、第２細胞減圧弁
３０７、３１６  第１、第２細胞ボトル
３０８  第２容器開閉弁
３１１、３１３  第２、第１気体開閉弁
３１７  予熱機構
３１８  培地ボトル
３１９  培地減圧弁
３２０  顕微観察ユニット
３２１  加湿ボトル
３２２  ガスボンベ
３２４  第４容器開閉弁
３２５  上層用培養上清バッグ
３２７  第３容器開閉弁
３２８  下層用培養上清ボトル
３２９  ステージ
３３０  観察用開口部
３３１  照射光部
４０４  温度調節部
４０６  気体濃度調節部
４０７  ポンプ
４１０  表示画面
４１１  温度センサ
４１２  細胞ボトル・培地ボトル・培養上清バッグ
【図１】
2016016950.tif 000003
【図２Ａ】
2016016950.tif 000004
【図２Ｂ】
2016016950.tif 000005
【図２Ｃ】
2016016950.tif 000006
【図２Ｄ】
2016016950.tif 000007
【図３】
2016016950.tif 000008
【図４】
2016016950.tif 000009
【図５】
2016016950.tif 000010
【国際調査報告】
2016016950.tif 000011
2016016950.tif 000012
2016016950.tif 000013
2016016950.tif 000014