【手続補正書】
【提出日】平成24年3月8日(2012.3.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変志賀毒素ポリペプチドまたはその触媒的に活性の断片であって、該ポリペプチドの細胞毒性を低下させるが細胞毒性を除去しないアミノ酸改変を含み、配列番号22に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも約９０％の配列同一性を有し、かつ、アミノ酸位置38および/または219に対応する位置における改変を含む、改変志賀毒素ポリペプチドまたはその触媒的に活性の断片、
ここで、該アミノ酸改変が、配列番号22に示すアミノ酸配列を含む志賀毒素A1サブユニット(SA1)におけるアミノ酸位置38および/または219に対応するアミノ酸位置の一方または両方の置換を含み、それにより改変志賀毒素ポリペプチドが非改変志賀毒素ポリペプチドより低い細胞毒性を示し；
触媒的に活性の断片の触媒活性が、N-グリコシダーゼ活性もしくはポリヌクレオチド:アデノシングリコシダーゼ活性またはその両方であり； かつ、
非改変志賀毒素ポリペプチドが、大腸菌の種の志賀毒素ポリペプチドであるかまたは赤痢菌の種の志賀毒素ポリペプチドである。
【請求項２】
SA1が切型のものである、請求項１の改変志賀毒素ポリペプチド。
【請求項３】
以下を含む複合体:
請求項１または２の改変志賀毒素ポリペプチドまたはその触媒的に活性の断片である標的化物質； および
細胞表面受容体に結合し、毒素をインターナライズさせ、それにより該複合体が細胞表面受容体に結合する結果、受容体を担持する細胞への標的化物質のインターナリゼーションを起こす標的化剤、ここで、該標的化剤は、単球走化性タンパク質-1(MCP-1)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、好酸球走化性タンパク質1(エオタキシン-1)、エオタキシン-2、エオタキシン-3、ストローマ細胞由来因子-1β(SDF-1β)、SDF-1α、SDF-2、マクロファージ阻害タンパク質1α (MIP-1α)、MIP-1β、MIP-1γ、MIP-2、MIP-2α、MIP-2β、MIP-3、MIP-3β、MIP-3α、MIP-4、MIP-5、ランテス(RANTES) タンパク質、インターロイキン-8 (IL-8)、増殖制御タンパク質α(GRO-α)、インターフェロン誘導タンパク質10(IP-10)、マクロファージ由来ケモカイン(MDC)、顆粒球走化性タンパク質2(GCP-2)、上皮由来好中球活性化タンパク質78(ENA-78)、血小板塩基性タンパク質(PBP)、ガンマインターフェロン誘導モノカイン(MIG)、血小板因子4(PF-4)、ヘモフィルトレートCCケモカイン1(HCC-1)、胸腺および活性化制御ケモカイン(TARC)、リンホタクチン、ルングキン、C10、肝臓発現ケモカイン(LEC)、エクソダス-2(SLC)、胸腺発現ケモカイン(TECK)、皮膚T-細胞誘引ケモカイン(CTACK)、粘膜関連上皮ケモカイン(MEC)、シングルCモチーフ1-β(SCM-1β)、インターフェロン誘導T-細胞アルファ化学誘引物質(I-TAC)、乳房および腎臓-発現ケモカイン(BRAK)、フラクタルカイン、およびB細胞-誘引ケモカイン1(BCA-1)、ならびにその断片から選択され、免疫エフェクター細胞上のケモカイン受容体に特異的に結合し、結合した標的化物質の受容体を担持する免疫エフェクター細胞へのインターナリゼーションを起こし、免疫エフェクター細胞の遊走、活性化または増殖を阻害する、ケモカインまたはその一部である。
【請求項４】
以下の成分:(標的化剤)n、(L)q、および(標的化物質)m、を含む請求項３の複合体、ここで:
Lは、標的化剤の標的化物質への結合のためのリンカーであり;
mおよびnは、独立に選択され、１から６の間の整数(１および６を含む)であり; および、
qは、１から４の間の整数(１および４を含む)であり、それにより、得られる複合体が標的化受容体に結合し、インターナライズされ、標的化物質が送達される;
結果として得られる複合体は標的化剤と相互作用し標的化剤をインターナライズする受容体に結合し、それにより標的化物質が受容体を担持する細胞にインターナライズされる;および、
複合体が複数の標的化物質を含む場合、標的化物質は同一であるかまたは異なっており、複合体が複数の標的化剤を含む場合、標的化剤は同一であるかまたは異なっている、複合体。
【請求項５】
mおよびnの各々が1である請求項４の複合体。
【請求項６】
qが1であり、nが2であり、かつ、mが1である請求項４の複合体。
【請求項７】
免疫エフェクター細胞が、活性化された白血球である、請求項３〜６いずれかに記載の複合体。
【請求項８】
免疫エフェクター細胞が、単球、マクロファージ、樹状細胞、T細胞、B細胞、好酸球、好塩基球、肥満細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、および好中球から選択される、請求項３〜６いずれかに記載の複合体。
【請求項９】
標的化剤および標的化物質、またはその活性の断片が、共有結合またはイオン結合を介して直接結合している、請求項３〜８いずれかに記載の複合体。
【請求項１０】
請求項３〜９のいずれかの複合体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項１１】
請求項１０の核酸分子を含むプラスミド。
【請求項１２】
請求項１１のプラスミドを含む宿主細胞。
【請求項１３】
以下の工程を含む、毒性が低下した改変リボゾーム不活性化タンパク質(RIP)またはその活性の断片を選択する方法:
a)RIP、またはその活性の断片をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する工程;
b)細胞を培養する工程;
c)生育した細胞を単離する工程;
d)生育した細胞のなかから、生育し、RIP、またはその活性の断片を発現する細胞を単離する工程、ここで、RIPまたは断片は、工程a)において導入された核酸分子によってコードされるものと比較して改変を含む；および
e)単離された細胞において発現された改変RIP、またはその活性の断片を同定または単離または精製する工程。
【請求項１４】
工程b)において、細胞がRIP阻害剤を含まない培地で培養される請求項１３の方法。
【請求項１５】
工程c)またはd)の後に、さらに以下の工程を含む請求項１３または１４の方法:
RIPを発現する単離された細胞を拡張させる工程。
【請求項１６】
工程b)においてRIP阻害剤である選択的モジュレーターの存在下で細胞を培養することをさらに含む請求項１３の方法。
【請求項１７】
RIP阻害剤がアデニン類似体である請求項１６の方法。
【請求項１８】
RIPが志賀毒素であり、アデニン類似体が4-アミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン(4-APP)である請求項１７の方法。
【請求項１９】
細胞が原核細胞である請求項１３〜１８のいずれかの方法。
【請求項２０】
導入された核酸分子によってコードされるRIPが、I型RIP、またはその活性の断片であるか、または、II型RIP、その触媒サブユニット、またはその活性の断片である請求項１３〜１９のいずれかの方法。
【請求項２１】
RIPが、ジアンチン30、ジアンチン32、リチニン、サポリン-1、サポリン-2、サポリン-3、サポリン-4、サポリン-5、サポリン-6、サポリン-7、サポリン-8、サポリン-9、PAP、PAPII、PAP-R、PAP-S、PAP-C、マパルミン、ドデカンドリン、ブリョジン-L、ブリョジン、ブリョジンII、クラビン、コリシン-1、コリシン-2、ルフィン-A、ルフィン-B、ルフィン-S、19K-PSI、15K-PSI、9K-PSI、アルファ-キリロウィン、ベータ-キリロウィン、ゲロニン、モモルディン、モモルディン-II、モモルディン-Ic、ミラビリス属抗ウイルスタンパク質(MAP)、MAP-30、アルファ-モモルカリン、ベータ-モモルカリン、トリコサンチン、TAP-29、トリコキリン、オオムギ RIPI、オオムギRIPII、トリチン、アマRIP、トウモロコシRIP 3、トウモロコシRIP 9、トウモロコシRIPX、アスパリン-1、およびアスパリン2から選択されるI型RIPであるか、または、
RIPが、志賀毒素(Stx)、志賀様毒素II(Stx2)、ボルケンシン、リシン、ニグリン-CIP-29、アブリン、ヴィルクミン、モデッシン、エブリチン-α、エブリチン-β、エブルチン-γ、およびポルレクチンから選択されるII型RIPである、
請求項２０の方法。
【請求項２２】
さらに以下の工程を含む、請求項１３〜２１のいずれかの方法:
a)同定されたRIP、またはその活性の断片をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する工程;
b)RIP阻害剤の存在下で細胞をインキュベートする工程、ここでRIP阻害剤の量が、RIPポリペプチドの毒性を低減するように選択される;および、
c)RIPまたはその活性の断片が生産される条件下で細胞を培養する工程;および、
d)工程c)のRIPを精製する工程。
【請求項２３】
以下の工程を含む、リボソーム不活性化タンパク質(RIP)、またはその活性の断片の宿主細胞における生産を上昇させる方法: 
a)RIP、またはその活性の断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を宿主細胞に導入する工程、ここで、RIPをコードする核酸分子が、リガンドをコードするヌクレオチド配列を含み、それにより該分子がリガンド-毒素複合体をコードする;
b)RIP阻害剤の存在下で細胞をインキュベートする工程、ここでRIP阻害剤の量がRIPの毒性を低減するように選択される;および、
c)RIP阻害剤の非存在下で培養された場合と比べて、RIP、またはその活性の断片がより多い量にて生産される条件下で細胞を培養する工程。
【請求項２４】
工程c)のRIPを精製する工程をさらに含むことにより、発現または精製またはその両方をされたRIPの量が、RIP阻害剤の非存在下での量よりも多くなる請求項２３の方法。
【請求項２５】
導入された核酸によってコードされるRIPが、I型RIP、またはその活性の断片であるか、または、II型RIP、その触媒サブユニットまたはその活性の断片である、請求項２３または２４の方法。
【請求項２６】
RIPが、ジアンチン30、ジアンチン32、リチニン、サポリン-1、サポリン-2、サポリン-3、サポリン-4、サポリン-5、サポリン-6、サポリン-7、サポリン-8、サポリン-9、PAP、PAPII、PAP-R、PAP-S、PAP-C、マパルミン、ドデカンドリン、ブリョジン-L、ブリョジン、ブリョジン II、クラビン、コリシン-1、コリシン-2、ルフィン-A、ルフィン-B、ルフィン-S、19K-PSI、15K-PSI、9K-PSI、アルファ-キリロウィン、ベータ-キリロウィン、ゲロニン、モモルディン、モモルディン-II、モモルディン-Ic、ミラビリス属抗ウイルスタンパク質(MAP)、MAP-30、アルファ-モモルカリン、ベータ-モモルカリン、トリコサンチン、TAP-29、トリコキリン、オオムギRIPI、オオムギRIPII、トリチン、アマRIP、トウモロコシRIP3、トウモロコシRIP9、トウモロコシRIPX、アスパリン-1、およびアスパリン2から選択されるI型RIPであるか、または、
RIPが、志賀毒素(Stx)、志賀様毒素II(Stx2)、志賀様毒素I、ボルケンシン、リシン、ニグリン-CIP-29、アブリン、ヴィルクミン、モデッシン、エブリチン-α、エブリチン-β、エブルチン-γ、およびポルレクチンから選択されるII型RIPである、
請求項２５の方法。
【請求項２７】
RIP阻害剤がアデニン類似体である請求項２６の方法。
【請求項２８】
アデニン類似体が4-アミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン(4-APP)である請求項２７の方法。
【請求項２９】
宿主細胞が大腸菌である請求項１３〜２８のいずれかの方法。
【請求項３０】
リガンド-毒素複合体が融合タンパク質である請求項２３〜２９のいずれかの方法。
【請求項３１】
リガンド-毒素複合体におけるリガンドが、ケモカイン受容体標的化剤、非ケモカインサイトカイン、ホルモン、増殖因子、細胞表面受容体に特異的な抗体、TNFスーパーファミリーリガンド、およびパターン認識 受容体(PRR)リガンドから選択される；および/または
ケモカイン受容体標的化剤が、ケモカイン、またはケモカイン受容体に結合するケモカインの断片、またはケモカイン受容体に特異的に結合する抗体、または該受容体に結合する抗体の断片である請求項２３〜３０のいずれかの方法。
【請求項３２】
ケモカイン受容体標的化剤が、単球走化性タンパク質-1(MCP-1)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、好酸球走化性タンパク質1(エオタキシン-1)、エオタキシン-2、エオタキシン-3、ストローマ細胞由来因子-1β(SDF-1β)、SDF-1α、SDF-2、マクロファージ阻害タンパク質1α(MIP-1α)、MIP-1β、MIP-1γ、MIP-2、MIP-2α、MIP-2β、MIP-3、MIP-3β、MIP-3α、MIP-4、MIP-5、ランテス (RANTES)タンパク質、インターロイキン-8(IL-8)、増殖制御タンパク質α(GRO-α)、インターフェロン誘導タンパク質10(IP-10)、マクロファージ由来ケモカイン(MDC)、顆粒球走化性タンパク質2(GCP-2)、上皮由来好中球活性化タンパク質78(ENA-78)、血小板塩基性タンパク質 (PBP)、ガンマインターフェロン誘導モノカイン(MIG)、血小板因子4(PF-4)、ヘモフィルトレートCCケモカイン1(HCC-1)、胸腺および活性化制御ケモカイン(TARC)、リンホタクチン、ルングキン、C10、肝臓発現ケモカイン(LEC)、エクソダス-2(SLC)、胸腺発現ケモカイン(TECK)、皮膚T-細胞誘引ケモカイン(CTACK)、粘膜関連上皮ケモカイン(MEC)、シングルCモチーフ1-β(SCM-1β)、インターフェロン誘導T-細胞アルファ化学誘引物質(I-TAC)、乳房および腎臓-発現ケモカイン(BRAK)、フラクタルカイン、およびB細胞-誘引ケモカイン1(BCA-1)、およびそれらの対立遺伝子または種変異体から選択されるケモカインである、請求項３１の方法。
【請求項３３】
RIP が、改変志賀毒素または改変を含むその活性の断片である請求項２３〜３２のいずれかの方法。
【請求項３４】
リガンド-毒素複合体が配列番号42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、または67のいずれかに示すアミノ酸 残基の配列を含む請求項２３〜３３のいずれかの方法。
【請求項３５】
同定されたRIPを含む複合体を調製することをさらに含む請求項２３〜３４のいずれかの方法。
【請求項３６】
毒素が志賀毒素サブユニットA1(SA1)である請求項１３〜３５のいずれかの方法。
【請求項３７】
SA1が、配列番号22または24に示すアミノ酸残基の配列を含む、請求項３６の方法。