(57)【要約】本発明は、2本鎖DNA中の発生した脱塩基部位の反対側にあるグアニンを検出するプロセスであって、（１）2本鎖DNA中の脱塩基部位を酵素により位置選択的に切断する第１ステップ、（２）脱塩基部位の反対側にあるグアニンの2位アミノ基を修飾剤により修飾する第２ステップ、（３）第１ステップ及び第２ステップを行って得られた修飾後の2本鎖DNAを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅産物の有無を調べる第３ステップを含む(但し、第１ステップと第２ステップの順序は問わない)、グアニン・脱塩基部位の有無を検出する方法を提供する。
2015136999.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
2本鎖DNA中の発生した脱塩基部位の反対側にあるグアニンを検出するプロセスであって、（１）2本鎖DNA中の脱塩基部位を酵素により位置選択的に切断する第１ステップ、（２）脱塩基部位の反対側にあるグアニンの2位アミノ基を修飾剤により修飾する第２ステップ、
（３）第１ステップ及び第２ステップを行って得られた修飾後の2本鎖DNAを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅産物の有無を調べる第３ステップを含む(但し、第１ステップと第２ステップの順序は問わない)、グアニン・脱塩基部位の有無を検出する方法。
【請求項２】
2本鎖DNA中の発生した脱塩基部位の反対側にあるグアニンを検出するプロセスであって、（１）2本鎖DNA中の脱塩基部位を酵素により位置選択的に切断する第１ステップ、（２）脱塩基部位の反対側にあるグアニンの2位アミノ基を修飾剤により修飾する第２ステップ、
（３）第１ステップ及び第２ステップを行って得られた修飾後の2本鎖DNAを鋳型とするリアルタイムPCR反応を行い、増幅産物を定量する第３ステップを含む(但し、第１ステップと第２ステップの順序は問わない)、グアニン・脱塩基部位の定量法。
【請求項３】
2本鎖DNA中の脱塩基部位を位置選択的に切断するエンドヌクレアーゼ、グアニンの2位アミノ基を修飾するグリオキサール又はその誘導体を含む、2本鎖DNAを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅産物の有無を調べることにより、そのグアニン・脱塩基サイトの有無を検出するためのキット。
【請求項４】
前記エンドヌクレアーゼが大腸菌由来のエンドヌクレアーゼIIIである、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
グリオキサールの誘導体は一個以上の芳香環あるいはアルキル基を有する、請求項３に記載のキット。
【請求項６】
グリオキサールまたはその誘導体の極性溶媒をさらに含む、請求項３〜５のいずれかに記載のキット。
【請求項７】
2本鎖DNA中の発生した脱塩基部位の反対側にあるグアニンを検出するプロセスであって、（１）脱塩基と孤立したグアニンを有する2本鎖DNAの孤立グアニン残基をビオチン化するステップ、（２）ビオチン化された2本鎖DNAをアビジンカラムにて精製するステップ、（３）精製されたビオチン化2本鎖ＤＮＡを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応を行い増幅産物において塩基配列の変異の有無を調べるステップを含む、グアニン・脱塩基部位の位置を検出する方法。 
【請求項８】
脱塩基と孤立したグアニンを有する2本鎖DNAの孤立グアニン残基をビオチン化する試薬、アビジンカラムを含むグアニン・脱塩基部位の位置を検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DNA中のグアニン・脱塩基部位の有無を検出又は定量する方法、グアニン・脱塩基部位の位置を検出する方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物細胞の染色体ＤＮＡにおいて、ＣＧジヌクレオチド配列からなるＣｐＧアイランドのシトシンの５位は、メチル化および脱メチル化反応が知られている。このＣｐＧアイランドのシトシンのメチル化及び脱メチル化反応は、遺伝子の転写制御機構を制御している。通常、ある遺伝子のプロモーター領域には、ＣｐＧアイランドを多く含む領域が存在し、この遺伝子のプロモーター領域シトシンのメチル化の有無により、当該遺伝子の転写のスイッチオン・オフの役割を果たす。シトシンのメチル化は古く研究されたが、その脱メチルシトシン反応の詳細は長い間不明であったが、最近、5-メチルシトシンが、脱アミノ化反応あるいは5-ヒドロキシメチルシトシンへの酸化反応により、二重らせん構造から出っ張った状態になり、N-グリコシド部位が酵素による加水分解を経てグアニンの反対側に脱塩基部位（apyrimidinic site: AP 部位）が生じることが非特許文献１で明らかにされた（図１）。【０００３】
脱メチルシトシン反応は酵素によって制御されている。一方、哺乳動物細胞ではゲノムDNAの塩基が化学物質への曝露、紫外線やＸ線の照射、酸化ストレスへの曝露などに曝されるので、一日あたりランダムに50,000から200,000個の脱離を起こし、脱塩基部位を作る。その結果、DNAの4つの塩基の脱離によって生成されるアセタール構造を有するデオキシリボースが平衡反応で開環し、アルデヒドに変わることが知られている（図２）。これらのDNAの脱塩基損傷は遺伝子の転写翻訳に深く関わるので、その解析は重要である。現在は、先行技術（非特許文献2 、特許文献1）で開示されたビオチン化ヒドロキシアミン化合物類が販売されている。その試薬は、脱塩基損傷部位を特異的に結合させ、ビオチン化とアビジン・酵素複合体との特異的結合を利用して、酵素による発色または発光を検出するものである。この検出法は、一般に広く用いられ、感度も高く、定量性にも優れている。しかし、この試薬はDNA上の4つの塩基の平均的な脱塩基部位の量を測定するものであり、DNAにおける脱塩基部位の場所やその相補鎖側にある塩基の種類を特定することは不可能である。【０００４】
ホルムアルデヒド、グリオギザールやその誘導体であるケトキサール化合物は1本鎖のRNAやDNAのグアニンの2位アミノ基と反応することが古くから知られている（非特許文献3）。特に、グリオギザールとその誘導体であるケトキサールはグアニンと反応し、3つの環構造をつくることが知られている。その反応収率は最近質量分析で計測され、グアニン基がDNAに存在する位置によっては大きくバラツキ、９〜８９％の範囲であることがわかった（非特許文献４）。しかし、1本鎖のDNAにあるグアニンが９〜８９％の範囲で修飾されても、１０％以上の未反応DNAはポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として十分であり、２のN剰で増幅するPCRにほとんど影響を与えないものと考えられる。【０００５】
DNAの脱塩基部位を基質とするエンドヌクレアーゼは、大腸菌由来のエンドヌクレアーゼＩＶおよびAPEIヌクレアーゼと、大腸菌Ｎｔｈなど由来のＤＮＡエンドヌクレアーゼIIIの２つのタイプがある。前者は、二重鎖ＤＮＡにある脱塩基部位を認識し、3’OHと5’リン酸の間で開裂する。後者は、酵素がデオキシリボースの脱塩基部位との間のシッフ塩基の形成を介して、シッフ塩基のベータ脱離によって５‘リン酸がリボースから解離する。一方、２本鎖DNAで発生した脱塩基部位の反対側にある塩基が化学修飾された場合、エンドヌクレアーゼの活性中心にあるアミノ酸残基がDNAに結合しなくなることが予想される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO2009/082020
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Cortellino S, et al. 2011 Cell 146, 67-79
【非特許文献２】Biochemistry 1993, 32, 8276-8283
【非特許文献３】BIOCHIMICA BIOPHYSICA ACTA 31 1959
【非特許文献４】Chemical Research in Toxicology 2005、18  730-739
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、DNA上に発生した脱塩基部位の反対側にグアニンが存在することを検出するとともにDNAのどの部分に存在するかを検出することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、鋭意研究を進めた結果、DNA中に発生した脱塩基・グアニンサイトを検出するため、DNA中に発生した脱塩基部位を切断するステップと、その反対側にあるグアニン基を化学修飾するステップを含む、PCRの増幅反応によるグアニン・脱塩基部位を検出する方法、または、DNA中に発生した脱塩基部位を切断しないで、その反対側にあるグアニン基を化学修飾するステップとアビジンカラムによるビオチン化したＤＮＡの精製ステップを含む、PCRの反応によるグアニン・脱塩基部位を含むＤＮＡ断片の増幅を採用することにより上述した課題を解決することができることを明らかにした。【００１０】
本発明は、以下のDNA中のグアニン・脱塩基部位の有無又は位置を検出する方法、グアニン・脱塩基部位定量法及びキットを提供するものである。
項１．  2本鎖DNA中の発生した脱塩基部位の反対側にあるグアニンを検出するプロセスであって、（１）2本鎖DNA中の脱塩基部位を酵素により位置選択的に切断する第１ステップ、（２）脱塩基部位の反対側にあるグアニンの2位アミノ基を修飾剤により修飾する第２ステップ、
（３）第１ステップ及び第２ステップを行って得られた修飾後の2本鎖DNAを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅産物の有無を調べる第３ステップを含む(但し、第１ステップと第２ステップの順序は問わない)、グアニン・脱塩基部位の有無を検出する方法。
項２．  2本鎖DNA中の発生した脱塩基部位の反対側にあるグアニンを検出するプロセスであって、（１）2本鎖DNA中の脱塩基部位を酵素により位置選択的に切断する第１ステップ、（２）脱塩基部位の反対側にあるグアニンの2位アミノ基を修飾剤により修飾する第２ステップ、
（３）第１ステップ及び第２ステップを行って得られた修飾後の2本鎖DNAを鋳型とするリアルタイムPCR反応を行い、増幅産物を定量する第３ステップを含む(但し、第１ステップと第２ステップの順序は問わない)、グアニン・脱塩基部位の定量法。
項３．  2本鎖DNA中の脱塩基部位を位置選択的に切断するエンドヌクレアーゼ、グアニンの2位アミノ基を修飾するグリオキサール又はその誘導体を含む、2本鎖DNAを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅産物の有無を調べることにより、そのグアニン・脱塩基サイトの有無を検出するためのキット。
項４．  前記エンドヌクレアーゼが大腸菌由来のエンドヌクレアーゼIIIである、項３に記載のキット。
項５．  グリオキサールの誘導体は一個以上の芳香環あるいはアルキル基を有する、項３に記載のキット。
項６．  グリオキサールまたはその誘導体の極性溶媒をさらに含む、項３〜５のいずれかに記載のキット。
項７．  2本鎖DNA中の発生した脱塩基部位の反対側にあるグアニンを検出するプロセスであって、（１）脱塩基と孤立したグアニンを有する2本鎖DNAの孤立グアニン残基をビオチン化するステップ、（２）ビオチン化された2本鎖DNAをアビジンカラムにて精製するステップ、（３）精製されたビオチン化2本鎖ＤＮＡを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応を行い増幅産物において塩基配列の変異の有無を調べるステップを含む、グアニン・脱塩基部位の位置を検出する方法。 
項８．  脱塩基と孤立したグアニンを有する2本鎖DNAの孤立グアニン残基をビオチン化する試薬、アビジンカラムを含むグアニン・脱塩基部位の位置を検出するためのキット。
【発明の効果】
【００１１】
DNAの脱塩基部位を基質とするエンドヌクレアーゼは、大腸菌由来のエンドヌクレアーゼＩＶおよびAPEIヌクレアーゼと、大腸菌Ｎｔｈなど由来のＤＮＡエンドヌクレアーゼIIIの２つのタイプがある。前者は、二重鎖ＤＮＡにある脱塩基部位を認識し、3’OHと5’リン酸の間で開裂する。後者は、酵素がデオキシリボースの脱塩基部位との間のシッフ塩基の形成を介して、シッフ塩基のベータ脱離によって５‘リン酸がリボースから解離する。一方、２本鎖DNAで発生した脱塩基部位の反対側にある塩基が化学修飾された場合、エンドヌクレアーゼの活性中心にあるアミノ酸残基トリプトファンがDNAに結合しなくなることが期待できるので、脱塩基側鎖がＰＣＲテンプレートになっているのに対して、大腸菌Ｎｔｈなど由来のＤＮＡエンドヌクレアーゼIIIは脱塩基側鎖を切断し、PCR反応の増幅はできなくなることが新たにわかった（実施例3）。よって、2本鎖ＤＮＡの中にグアニン・脱塩基があるかどうかを識別できる。【００１２】
本発明によれば、ＧＣ塩基対からシトシンが脱離してグアニンが残ったDNA上の脱塩基部位の有無及び位置を正確に検出することができ、このような脱塩基部位の定量も行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】グアニン・脱塩基部位の生成を伴うDNA脱メチル化経路
【図２】デオキシリボースとヒドロキシルアミンとのシッフ塩基の形成を示す。
【図３】２本鎖DNAのビオチン化を示す。
【図４】実施例２の電気泳動の結果を示す。
【図５】実施例３の電気泳動の結果を示す。
【図６】実施例４の電気泳動の結果を示す。
【図７】実施例５の電気泳動の結果を示す。
【図８】実施例６の電気泳動の結果を示す。
【図９】実施例７の電気泳動の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のグアニン・脱塩基部位の有無を検出する方法は、以下の第１ステップから第３ステップを含む。
【００１５】
また、本発明のグアニン・脱塩基部位の定量法は、グアニン・脱塩基部位の有無を検出する方法と同じ第１ステップと第２ステップを含み、第３ステップをリアルタイムPCRとすることで、定量を行う。なお、第１ステップと第２ステップの順序は問わず、第１ステップの後に第２ステップを行ってもよく、第２ステップの後に第１ステップを行ってもよい。第１ステップと第２ステップを行った後第３ステップを行う。
【００１６】
（１）第１ステップ
第１ステップでは、2本鎖DNA中の脱塩基部位を位置選択的に切断する。この位置選択的な切断には、酵素を使用する。使用可能な酵素としては、エンドヌクレアーゼが挙げられ、好ましくはエンドヌクレアーゼIIIが挙げられ、より好ましくは大腸菌由来のエンドヌクレアーゼIIIが挙げられる。
【００１７】
第１ステップは、測定対象とするＤＮＡを含む水溶液にエンドヌクレアーゼなどの酵素を適量、DNA 10pmolあたり例えば1〜10000ユニット程度添加し、３７℃前後の温度下に５分〜１０時間程度反応させることにより行うことができる。
【００１８】
（２）第２ステップ
グアニンの2位アミノ基を修飾剤により修飾して、PCR反応により塩基の伸長が行われないようにする。このような修飾剤としてはグリオキサール又はその誘導体が挙げられる。グリオキサールの誘導体は、一個以上の芳香環あるいはアルキル基を有する化合物が挙げられる。本発明で使用される、修飾剤としては、例えば下記式（Ｉ）の化合物が挙げられる。
【００１９】
【化１】
2015136999.tif 000003
【００２０】
(式中、Ｒ１、Ｒ２は同一又は異なって水素原子、アルキル基、置換基を有していてもよいアリール基が挙げられる。Ｒ３とＲ４は、同一又は異なってアルコキシ基、置換されていてもよいアラルキルオキシ基を示すか、Ｒ３とＲ４はそれらが結合している炭素原子と一緒になってカルボニル基、アルキレンジオキシ基を表す。)
アルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、ヘキシル、シクロヘキシルなどの炭素数１〜６、好ましくは炭素数１〜４の直鎖、環状又は分岐を有するアルキル基が挙げられる。
【００２１】
アリール基としては、フェニル基、ナフチル基が挙げられ、好ましくはフェニル基が挙げられる。
【００２２】
アラルキルオキシ基としては、ベンジルオキシ、フェネチルオキシ、ナフチルメチルオキシが挙げられる。アラルキルオキシ基(アリールアルキルオキシ黄)の置換基はアリール部分に有し得る。)
【００２３】
アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシなどの直鎖又は分岐を有する炭素数１〜６のアルコキシ基が挙げられる。
【００２４】
アルキレンジオキシ基としては、エチレンジオキシ、プロピレンジオキシ、ブチレンジオキシなどが挙げられる。  
アリール基、アラルキルオキシ基の置換基としては、ＯＨ、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシなどのアルコキシ、ＳＨ、メチルチオ、エチルチオなどのアルキルチオ、アミノ、メチルアミノ、エチルアミノなどのモノアルキルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノなどのジアルキルアミノ、アセチルアミノなどのアルカノイルアミノ、ＣＯＯＨ、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ブトキシカルボニルなどのアルコキシカルボニル、フェノキシカルボニルなどのアリールカルボニル、ベンジルオキシカルボニルなどのアラルキルカルボニル、カルバモイル（ＣＯＮＨ２）、メチルカルバモイル、エチルカルバモイルなどのモノアルキルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイルなどのジアルキルカルバモイル、ＣＮ，ハロゲン原子（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ）、ＮＯ２、アセチルなどのアルカノイルなどが挙げられる。これらの置換基は、アリール基に対し、１〜５個、好ましくは１〜３個有し得る。
【００２５】
好ましいグリオキサール誘導体としては、フェニルグリオキサール、トリメトキシフェニルグリオキサールあるいはこれらのアセタールもしくはケタールが挙げられる。
【００２６】
グリオキサール又はその誘導体などの修飾剤は、DNA 6pmolあたり0.01μmolから1000μmol程度添加し、室温から40℃程度の温度下に1〜24時間程度反応させることで塩基対を形成していない脱塩基部位のグアニン残基を修飾することができる。修飾剤との反応溶媒は、水であってもよく、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ジメチルアセトアミド、ジオキサン、Ｎ-メチルピロリドンなどの極性溶媒を使用するのが好ましい。
【００２７】
グリオキサール又はその誘導体などの修飾剤で修飾されたグアニン残基はPCR反応に関与することができず、この修飾グアニン残基のあるところでPCR反応は停止する。
【００２８】
（３）第３ステップ
第３ステップでは、修飾剤で修飾した2本鎖DNAを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅産物の有無を調べる。塩基対を形成していない脱塩基部位のグアニン残基がグリオキサール又はその誘導体などの修飾剤で修飾されると、修飾グアニン残基のところでPCR反応が止まり、長いPCR生成物が得られなくなる。PCRのプライマーは、修飾グアニン残基の５‘側と３’側のものを使用する。PCRは、リアルタイムPCRが好ましい。リアルタイムPCRを行うことで、グアニン・脱塩基部位を定量することができる。PCRは２０〜３５サイクル程度、好ましくは２０〜３０サイクル程度行う。
【００２９】
PCRに使用するプライマーは、グアニン・脱塩基部位（G/APサイト）の位置の前後のプライマーを使用することで、特定の位置におけるG・APの存在を検出・定量することができる。G/APサイトの検出対象としては、例えばがん化などの各種疾患に関与する遺伝子のプロモーターを挙げることができる。プロモーターにG/APサイトが生じると遺伝子の発現に大きな影響を与える。遺伝子のプロモーター部位以外にも遺伝子のコーディング領域など任意のDNAの位置がG/APサイトの検出対象となる。
【００３０】
或いは、本発明の方法は、トータルのゲノムDNA或いはその一部(例えば特定の染色体)についても分析することができる。その場合、ゲノムDNAを制限酵素で平滑末端に切断し、その両側に別々のアダプターをつけ、その後は、アタプターの配列を基にPCR反応を行うことにより、トータルのゲノムDNA或いはその一部におけるG/APサイトの総数を決定することができる。
【００３１】
本発明のグアニン・脱塩基部位の位置を検出する方法は、以下の３つのステップを含む。
【００３２】
（１）ビオチン化ステップ
脱塩基と孤立したグアニンを有する2本鎖DNAの孤立グアニン残基（AP部位のグアニン残基）のビオチン化は、2本鎖DNAとビオチン化試薬を反応させることにより行うことができる。
【００３３】
ビオチン化試薬としては、図３に示される2-Oxohex-5-ynal（非特許文献５、Chem Commun 2013、49、4012-4）のようなアセチレン基（−Ｃ≡Ｃ）の導入試薬と図３に示されるAzide-PEO3-Biotinのようなビオチン基とアジド基を有する試薬を組み合わせて使用することができる。2-Oxohex-5-ynalはケトアルデヒト基とアセチレン基を有するため、グアニンと反応させることができると同時に、アセチレンを使ってクリック反応でビオチン化することもできる。その結果、未修飾ＤＮＡを取り除くことが可能となった。さらに、アビジンカラムにて精製される2本鎖オリゴDNAのグアニン基鎖側は修飾によって完全にマスクされたから、PCR反応による伸長反応によってグアニンからアデニンへの変異することを初めて見出した（実施例６、図３）。一方、特許文献１で示されたヒドロキシルアミンビオチン化試薬は脱塩基鎖側をマスクするため、PCR反応の生成される断片においてグアニンのままの状態であることが明らかになった。
【００３４】
AP部位のグアニンと2-Oxohex-5-ynalが反応することでAP部位のグアニン残基にアセチレン基（−Ｃ≡Ｃ）が導入され、次いでビオチン基とアジド基を有する試薬と反応させて、アセチレン基とアジド基のClick反応によるビオチン基の導入が行われる。アセチレン基導入試薬としては、アセチレン基とアルデヒド基を有する他の試薬を使用してもよい。また、ビオチン化基導入試薬としては、アジド基とビオチン化基を有する他の試薬を使用してもよい。
【００３５】
アセチレン基の導入反応は、2本鎖DNAに対し実施例6で示されるような適量(過剰量でもよい)のアセチレン基導入試薬をリン酸緩衝液などの適当な溶媒中で、室温〜40℃付近の温度で１〜24時間反応させることにより有利に進行する。
【００３６】
ビオチン基の導入反応（Click反応）は、アセチレン基が導入された2本鎖DNAに対し実施例6で示されるような適量(過剰量でもよい)のビオチン基導入試薬、CuBr及びTBTAをTE緩衝液などの適当な溶媒中で、室温〜40℃付近の温度で１〜24時間反応させることにより有利に進行する。
【００３７】
（２）アビジンカラムによる精製ステップ、
ビオチン化された2本鎖DNAの精製は、アビジンカラムを使用して常法に従い行うことができる。この精製ステップにより、ビオチン化された2本鎖DNAのみが得られ、これについてPCR反応を行うことで、AP部位の位置の検出が可能である。この精製工程なしにPCR反応を行った場合、非ビオチン化2本鎖DNAも増幅し、それにより位置の検出ができなくなる。
【００３８】
（３）ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
精製されたビオチン化2本鎖ＤＮＡを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応は、常法に従い行うことができる。得られた増幅産物についてシーケンスを行い、G→Aの変異を調べることによりAP部位の位置を検出することができる。脱塩基側鎖を鋳型として増幅する場合、一旦脱塩基側のところに2本鎖の平滑末端ができ、Taqポリメラーゼによってアデニンがその平滑末端に挿入されるために、ＡＰ部位はＧからＡに変わる。
【００３９】
（４）キット
グアニン・脱塩基部位の有無を検出もしくは定量するための本発明のキットは、以下の成分を含む
(i)2本鎖DNAの脱塩基部位を位置選択的に切断する酵素、好ましくはエンドヌクレアーゼ、より好ましくは大腸菌由来のエンドヌクレアーゼIII
(ii) 脱塩基部位の反対側にある塩基対を形成していないグアニン残基を選択的に修飾する修飾剤、好ましくはグリオキサール又はその誘導体、より好ましくは式（Ｉ）で示されるグリオキサール又はその誘導体。
(ii’)修飾反応の溶媒（例えばDMSO、DMFなど）
(iii)PCR反応に必要な成分、例えばTaq DNA PolymeraseなどのDNAポリメラーゼ、PCRバッファー、dNTPミックス、プライマーミックス、溶媒(水)
などが挙げられる。
【００４０】
グアニン・脱塩基部位の位置を検出するための本発明のキットは、以下の成分を含む
(i)AP部位の孤立グアニン残基のビオチン化試薬、例えば2-Oxohex-5-ynalのようなアセチレン基（−Ｃ≡Ｃ）の導入試薬とAzide-PEO3-BiotinのようなClick反応でビオチン基を導入する試薬の組み合わせ。
(ii) アビジンカラム
(iii) PCR反応に必要な成分、例えばTaq DNA PolymeraseなどのDNAポリメラーゼ、PCRバッファー、dNTPミックス、プライマーミックス、溶媒(水)
などが挙げられる。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことは言うまでもない。【００４２】
実施例１
本発明で使用するグアニン・脱塩基部位を含む2本鎖オリゴDNAは以下の方法で作製した。人工合成したｄＵを含む100merオリゴDNA（20131226U）がウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）によって処理されたのち、人工合成した100merのオリゴDNA（20131226G）とハイブリダイゼーションさせることで作製した。100merオリゴDNA（20131226U）は、5'TGA CTT GCC ACC TAT AGA CAG CCC TTG CTC TCC TGC AGA GTT TGG CAA TGA CTC UGG TCA CTG CAT CTG TGG GAC CTG GCT CAG TCT GCC AAC TTC ACT G3'を表し、DNA（20131226G）は5'CAG TGA AGT TGG CAG ACT GAG CCA GGT CCC ACA GAT GCA GTG ACC GGA GTC ATT GCC AAA CTC TGC AGG AGA GCA AGG GCT GTC TAT AGG TGG CAA GTC A 3'を表す。100merオリゴDNA（20131226U）100 pmolを１×ＵＤＧバッファー（６００μｌ）で溶かし、９０℃で１分加熱し氷冷した後、ＵＤＧ（３０ｕｎｉｔ，６μｌ）を加え、３７℃、1時間反応を行った。反応後、その相補鎖である100merのオリゴDNA（20131226G）を同じモル数を加え、９０℃で10分間加熱して、室温になるまで放置した。反応液の2本鎖DNAをNucleospin Gel and PCR Clean upキットに含まれるシリカゲルにて吸着させ、0.5 M溶液リン酸緩衝液 pH 7.4または5 mM Tris-HClの緩衝液pH 8.5でグアニン・脱塩基部位を含む2本鎖オリゴDNA溶出させた。【００４３】
実施例２
実施例1の0.5 M溶液リン酸緩衝液 pH 7.4で溶出2本鎖オリゴDNA （10μｌ、6pmol）と10μｌの0.3 M GlyoxalのDMSO液と混合し３７℃で12時間インキュベーションした。反応後、NAP-5カラムに載せ、10 mM TE緩衝液で溶出した。LA Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Vｅｎｔ（ Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ Ｔａｑを用いたＰＣＲにて、オリゴDNA断片の増幅を行った。PCR反応は９５℃，１分間の前反応の後、９５℃，３０秒―５５℃，３０秒−72℃，30秒を３０サイクル繰り返した。プライマーは、FW: 5'CAG TGA AGT TGG CAG ACT GAG C3'、Rev：5'CTG ACT TGC CAC CTA TAG ACA GC3'、MidRev:5'CTG CAG AGT TTG GCA ATG ACT CC3'を使用した（図４）。結果、脱塩基部位の反対側にあるグアニンを含む2本鎖のオリゴDNAはGlyoxalで反応させても、DNAポリメラーゼ連鎖反応の増幅に全く影響を与えないことがわかった。【００４４】
実施例３：エンドヌクレアーゼ処理後にGlyoxyalとの反応
実施例1で5 mM Tris-HClの緩衝液pH 8.5で溶出させた2本鎖オリゴDNA液20pmolを60 unit APE1またはEndonuclease IVと３７℃、1時間反応を行った。反応液中の2本鎖オリゴDNAをNucleospin Gel and PCR Clean upキットのシリカゲルにて吸着させ、0.5 M溶液リン酸緩衝液 pH 7.4で溶出させた。一方、endonuclease IIIの場合、実施例１の100 pmol オリゴDNAのUDG反応液に直接300 unitを加え３７℃、1時間反応を行った。反応液をNucleospin Gel and PCR Clean upキットにて精製し、0.5 M溶液リン酸緩衝液 pH 7.4で溶出させた。それぞれ2本鎖オリゴDNA を（10μｌ、6pmol）と10μｌの0.3 M GlyoxalのDMSO液と混合し３７℃で12時間インキュベーションした。反応後、NAP-5カラムに載せ、10 mM TE緩衝液で溶出した。LA ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲにて、オリゴDNA断片の増幅を行った。その結果、EndoIIIとGlyoxalで処理した場合のみ、DNAポリメラーゼによる増幅が止まった（図５）。【００４５】
実施例４
実施例３のエンドヌクレアーゼIIIで切断した2本鎖オリゴDNA （10μｌ、6pmol）と10μｌの0.3 M GlyoxalのDMSO液またはリン酸緩衝液と混合し３７℃で12時間インキュベーションした。反応後、NAP-5カラムに載せ、10 mM TE緩衝液で溶出した。LA ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲにて、オリゴDNA断片の増幅の確認を行った。図６のように、DMSO溶液が良い結果を与えた。【００４６】
実施例５
実施例３のエンドヌクレアーゼIIIで切断した2本鎖オリゴDNA （10μｌ、6pmol）と10μｌの0.3 M Glyoxal、Phenylglyoxal、TrimethoxyphenylglyoxalのDMSO液と混合し、３７℃で12時間インキュベーションした。反応後、NAP-5カラムに載せ、10 mM TE緩衝液で溶出した。LA ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応２０サイクルまたは３０サイクルを行い、オリゴDNA断片の増幅の確認を行った。
図７のように、Glyoxalの反応性が最も高いことがわかった。【００４７】
実施例６
実施例１で述べた作製法で調製したグアニン・脱塩基サイトを含む2本鎖オリゴDNA 500 ngをリン酸緩衝液と非特許文献５で開示された2-Oxohex-5-ynalのDMSO溶液（０．３Ｍ）と混合し、３７℃で12時間インキュベーションした。反応後、G-50 microカラムに載せ、0.05mlの10 mM TE緩衝液で溶出した。回収した溶液に0.1 M CuBr溶液  0.01 ml、0.1 M  TBTA溶液0.02mlとAzido-PEO3-Biotin   0.002 M 0.02 ml（すべてJena bioscience社）を混合し、３７℃で2時間インキュベーションした。反応物を遠心した後、NAP-5カラムに載せ、0.5mlの10 mM TE緩衝液で溶出した。次に、0.5 mlアビジンカラム（Pierce社）にて精製したのち、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ反応で増幅した。さらに、PCR産物をpGEM T-vector（Promega社）にクローニングした後、DNAの塩基配列を決定した。その結果、脱塩基に向いているグアニンからアデニンに変異したことが明らかになった(図８)。【００４８】
実施例７
また、制限酵素によるＰＣＲ産物の配列の確認実験も行った。実施例６のように2-Oxohex-5-ynalによる修飾したのち、NEB buffer 4の溶液中でＣＣＧＧの配列を認識する制限酵素ＭｓｐＩを用いて反応させ、２％agaroseゲル中での電気泳動を行った。その結果からＰＣＲ産物（100 bp）を切断できないことがわかった（電気泳動３）。この結果からも、グアニンからアデニンへ変異したことが支持された。一方、グアニン・脱塩基サイトを含む2本鎖オリゴDNA 500 ngと市販のヒドロキシアミノビオチン化合物と混合し、リン酸緩衝液中に３７℃で2時間インキュベーションした。反応物は、ＮＡＰ−５カラムに載せ、0.5mlの10 mM TE緩衝液で溶出した後に、アビジンカラムにて精製した。精製したビオチン化された2本鎖オリゴＤＮＡを鋳型とし、前記の条件でＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲにて、DNA断片の増幅を行った。増幅した断片をNucleospin Gel and PCR Clean upキットで精製したのち、ＮＥＢ buffer 4緩衝液で希釈してＣＣＧＧの配列を認識する制限酵素ＭｓｐＩを用いて反応させた。２％agaroseゲル中での電気泳動の結果から、2本鎖のＤＮＡが完全に切断されることがわかった（電気泳動２）。さらに、ビオチン化処理なしのグアニン・脱塩基サイトを含む2本鎖オリゴDNA 1ngを鋳型とし、前記の条件でＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲにて、DNA断片の増幅を行った。反応物をNucleospin Gel and PCR Clean upキットで精製したのち、ＣＣＧＧの配列を認識する制限酵素ＭｓｐＩを用いて反応させ、２％agaroseゲル中での電気泳動を行った。その結果、2本鎖のバンドであることがわかった（電気泳動１）。脱塩基側鎖と孤立したグアニン側鎖のそれぞれがＰＣＲ反応の鋳型になっているからである(図９)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年9月30日(2016.9.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
2本鎖DNA中の発生した脱塩基部位の反対側にあるグアニンを検出するプロセスであって、（１）2本鎖DNA中の脱塩基部位を酵素により位置選択的に切断する第１ステップ、（２）脱塩基部位の反対側にあるグアニンの2位アミノ基を修飾剤により修飾する第２ステップ、
（３）第１ステップ及び第２ステップを行って得られた修飾後の2本鎖DNAを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅産物の有無を調べる第３ステップを含む(但し、第１ステップと第２ステップの順序は問わない)、グアニン・脱塩基部位の有無を検出する方法。
【請求項２】
2本鎖DNA中の発生した脱塩基部位の反対側にあるグアニンを検出するプロセスであって、（１）2本鎖DNA中の脱塩基部位を酵素により位置選択的に切断する第１ステップ、（２）脱塩基部位の反対側にあるグアニンの2位アミノ基を修飾剤により修飾する第２ステップ、
（３）第１ステップ及び第２ステップを行って得られた修飾後の2本鎖DNAを鋳型とするリアルタイムPCR反応を行い、増幅産物を定量する第３ステップを含む(但し、第１ステップと第２ステップの順序は問わない)、グアニン・脱塩基部位の定量法。
【請求項３】
2本鎖DNA中の脱塩基部位を位置選択的に切断するエンドヌクレアーゼ、グアニンの2位アミノ基を修飾するグリオキサール又はその誘導体を含む、2本鎖DNAを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅産物の有無を調べることにより、そのグアニン・脱塩基サイトの有無を検出するためのキット。
【請求項４】
前記エンドヌクレアーゼが大腸菌由来のエンドヌクレアーゼIIIである、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
グリオキサールの誘導体は一個以上の芳香環あるいはアルキル基を有する、請求項３に記載のキット。
【請求項６】
グリオキサールまたはその誘導体の極性溶媒をさらに含む、請求項３〜５のいずれかに記載のキット。
【請求項７】
2本鎖DNA中の発生した脱塩基部位の反対側にあるグアニンを検出するプロセスであって、（１）脱塩基と孤立したグアニンを有する2本鎖DNAの孤立グアニン残基をビオチン化するステップ、（２）ビオチン化された2本鎖DNAをアビジンカラムにて精製するステップ、（３）精製されたビオチン化2本鎖ＤＮＡを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応を行い増幅産物において塩基配列の変異の有無を調べるステップを含む、グアニン・脱塩基部位の位置を検出する方法。 
【請求項８】
請求項７に記載の方法に用いるためのキットであって、脱塩基と孤立したグアニンを有する2本鎖DNAの孤立グアニン残基をビオチン化する試薬及びアビジンカラムを含むグアニン・脱塩基部位の位置を検出するためのキット。
【国際調査報告】
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