(57)【要約】  本発明は、非特異性間質性肺炎の臨床診断又は病理組織診断を簡便且つ高精度に行うことを可能とするバイオマーカーを提供することを主な課題とする。  前記課題は、血液試料中に含まれる、抗Ｍｘ１抗体、抗ＮＩＮＪ２抗体、抗ＤＣＸ抗体、抗Ｃ１０ｏｒｆ４９抗体、抗ＺＭＡＴ４抗体、抗ＣＤＣ４２ＳＥ１抗体及び抗ＧＰＴ２抗体からなる群より選択される少なくとも１種の抗体は、非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）のバイオマーカーになり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗Ｍｘ１抗体、抗ＮＩＮＪ２抗体、抗ＤＣＸ抗体、抗Ｃ１０ｏｒｆ４９抗体、抗ＺＭＡＴ４抗体、抗ＣＤＣ４２ＳＥ１抗体及び抗ＧＰＴ２抗体からなる群より選択される少なくとも１種の抗体からなる、非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）のバイオマーカー。
【請求項２】
前記抗体が、抗Ｍｘ１抗体及び抗ＮＩＮＪ２抗体からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１に記載のバイオマーカー。
【請求項３】
前記抗体が、抗Ｍｘ１抗体及び抗ＮＩＮＪ２抗体の組み合わせである、請求項１又は２に記載のバイオマーカー。
【請求項４】
被検動物から採取された血液試料中の、抗Ｍｘ１抗体、抗ＮＩＮＪ２抗体、抗ＤＣＸ抗体、抗Ｃ１０ｏｒｆ４９抗体、抗ＺＭＡＴ４抗体、抗ＣＤＣ４２ＳＥ１抗体及び抗ＧＰＴ２抗体からなる群より選択される少なくとも１種の抗体を検出する工程、
を含む非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）の検査方法。
【請求項５】
前記抗体が、抗Ｍｘ１抗体及び抗ＮＩＮＪ２抗体からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項４に記載の検査方法。
【請求項６】
前記抗体が、抗Ｍｘ１抗体及び抗ＮＩＮＪ２抗体の組み合わせである、請求項４又は５に記載の検査方法。
【請求項７】
前記血液試料が血清である、請求項４〜６のいずれかに記載の検査方法。
【請求項８】
前記抗体の検出が、Ｍｘ１、ＮＩＮＪ２、ＤＣＸ、Ｃ１０ｏｒｆ４９、ＺＭＡＴ４、ＣＤＣ４２ＳＥ１及びＧＰＴ２からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質又はその部分ペプチドからなる抗原を用いて行われる、請求項４〜７のいずれかに記載の検査方法。
【請求項９】
前記検出工程がＥＬＩＳＡ法により行われる、請求項４〜８のいずれかに記載の検査方法。
【請求項１０】
前記抗原が、ＭＨＣクラスII分子により提示された抗原である、請求項４〜９のいずれかに記載の検査方法。
【請求項１１】
被検動物から採取された血液試料中の、抗Ｍｘ１抗体、抗ＮＩＮＪ２抗体、抗ＤＣＸ抗体、抗Ｃ１０ｏｒｆ４９抗体、抗ＺＭＡＴ４抗体、抗ＣＤＣ４２ＳＥ１抗体及び抗ＧＰＴ２抗体からなる群より選択される少なくとも１種の抗体を検出する工程、及び
前記工程で得られた検出結果に基づいてＮＳＩＰを診断するする工程、
を含む非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）の診断方法。
【請求項１２】
Ｍｘ１、ＮＩＮＪ２、ＤＣＸ、Ｃ１０ｏｒｆ４９、ＺＭＡＴ４、ＣＤＣ４２ＳＥ１及びＧＰＴ２からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質又はこれらの部分ペプチドからなる抗原を含む、非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）の検査用試薬。
【請求項１３】
請求項１２に記載の検査用試薬を含む、非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）の診断キット。
【請求項１４】
Ｍｘ１、ＮＩＮＪ２、ＤＣＸ、Ｃ１０ｏｒｆ４９、ＺＭＡＴ４、ＣＤＣ４２ＳＥ１及びＧＰＴ２からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質又はその部分ペプチドからなる抗原の、非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）の検査用試薬の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非特異的間質性肺炎の診断を簡便且つ高精度に行うことが可能なバイオマーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
間質性肺炎は、肺の間質を中心に炎症を来す疾患の総称である。その原因は多彩であり、薬剤、喫煙等の原因が明らかなものや、膠原病随伴性に発症する場合がある他、原因が特定できないものも包含される。原因を特定し得ない間質性肺炎を特発性間質性肺炎（Ｉｄｅｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｓ：ＩＩＰｓ）と総称する。ＩＩＰｓには、予後やステロイド剤に対する反応性の良否によって分類される特発性肺線維症（ＩＰＦ）／通常型間質性肺炎（ＵＩＰ）と非特異的間質性肺炎（ＮＳＩＰ）の２疾患が含まれる。一般に、特発性肺線維症（ＩＰＦ）／通常型間質性肺炎（ＵＩＰ）は予後不良群とされ、非特異的間質性肺炎（ＮＳＩＰ）は予後良好群とされている（例えば非特許文献１を参照）。【０００３】
ここで、ＩＰＦとは「Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ」の略称であり、ＵＩＰとは「Ｕｓｕａｌ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ」の略称である。ＩＰＦは臨床診断名として用いられ、ＵＩＰは病理組織診断名として用いられる名称である。また、ＮＳＩＰとは「Ｎｏｎ-ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ」の略称であり、臨床診断及び病理組織診断の両方において用いられる名称である。更に、病理組織診断において前記名称が用いられる場合には、通常「ＵＩＰパターン」及び「ＮＳＩＰパターン」と表わされることがある。【０００４】
特発性間質性肺炎においてＩＰＦ／ＵＩＰとＮＳＩＰを鑑別することは、患者の予後を予測する上で重要な指標である。一般にＩＰＦ／ＵＩＰは進行性の予後不良疾患とされており、悪化を防ぐため長期に亘る対症療法及び薬物療法とそれによる副作用とのバランスを見極めたうえで治療計画が立てられる。これに対してＮＳＩＰは治療反応性が良く、予後は一般的に良好とされているため、積極的な治療方針がとられる。従って、ＩＰＦ／ＵＩＰとＮＳＩＰを鑑別することは、投薬スケジュールや治療方針を決定する上でも重要な要素となり得る。【０００５】
従来、ＩＰＦ／ＵＩＰとＮＳＩＰの鑑別は外科的肺生検標本の病理組織パターン分類により行われてきた。しかし、外科的肺生検は侵襲性が高く、致死的合併症を起こす可能性があるため、実際の臨床現場では採用されにくいのが現状である（例えば非特許文献２を参照）。非侵襲的な検査方法としては胸部ＣＴ画像検査等が挙げられるが、ＩＰＦ／ＵＩＰとＮＳＩＰを鑑別することは典型例を除いては不可能とされている（例えば非特許文献３を参照）。【０００６】
低侵襲性であり且つ比較的簡便に疾患の罹患の有無、症状の程度を測る手段としては、患者の血液、尿等の体液試料中の特定の抗体、酵素、タンパク質等をバイオマーカーとして利用する方法が挙げられる。間質性肺炎においては、シアル化糖鎖抗原ＫＬ−６（Ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ＫＬ−６）がバイオマーカーとして知られている。ＫＬ−６は間質性肺炎を発症した患者において特異性が高く、間質性肺炎の活動性とも相関するため、臨床的意義の高いマーカーとして用いられている。しかし、ＫＬ−６は間質性肺炎全般に対するマーカーであるため、当該マーカーによってＩＰＦ／ＵＩＰとＮＳＩＰを鑑別することはできない。【０００７】
以上のような背景から、簡便且つ高精度にＩＰＦ／ＵＩＰとＮＳＩＰを鑑別することが可能なバイオマーカーが求められていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】American Thoracic Society/European Respiratory Society international multidisciplinary consensus classification of the idiopathic interstitial pneumonias.  Am J Respir Crit Care Med 2002; 165:277-304.
【非特許文献２】Tiitto L, et al.  Thoracoscopic lung biopsy is a safe procedure in diagnosing usual interstitial pneumonia.  Chest 2005; 128:2375-2380.
【非特許文献３】Raghu G, et al.  An official ATS/ERS/JRS/ALAT statement: idiopathic pulmonary fibrosis: evidence-based guidelines for diagnosis and management.  Am J Respir Crit Care Med 2011; 183:788-824.
【非特許文献４】Travis WD, et al.  Idiopathic nonspecific interstitial pneumonia Report of an Ameican Thoracic Society Project.  Am J Respir Crit Care Med 2008; 177:1338-1347.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、非特異性間質性肺炎の診断を簡便且つ高精度に行うことを可能とするバイオマーカーを提供することを目的とする。更に、本発明は、当該バイオマーカーを用いて、簡便且つ高精度に、非特異性間質性肺炎を診断するための検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行い、ＮＩＳＰ患者においては抗核抗体の値が高い等の自己免疫疾患の性質が強いことに基づいて、自己抗体の中にＩＰＦ／ＵＩＰとＮＳＩＰの２群の鑑別に利用可能なバイオマーカーとなり得る抗体が存在するかどうかを網羅的に検索した。その結果、ＮＳＩＰ患者において特定の自己抗体の抗体価が上昇していることを見出した。本発明は、このような知見に基づいて更に検討を重ねた結果完成されたものである。即ち、本発明は下記に掲げる態様のバイオマーカー、検査方法、検査用試薬、診断キット等を提供する。【００１１】
項１．  抗Ｍｘ１抗体、抗ＮＩＮＪ２抗体、抗ＤＣＸ抗体、抗Ｃ１０ｏｒｆ４９抗体、抗ＺＭＡＴ４抗体、抗ＣＤＣ４２ＳＥ１抗体及び抗ＧＰＴ２抗体からなる群より選択される少なくとも１種の抗体からなる、非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）のバイオマーカー。
項２．  前記抗体が、抗Ｍｘ１抗体及び抗ＮＩＮＪ２抗体からなる群より選択される少なくとも１種である、項１に記載のバイオマーカー。
項３．  前記抗体が、抗Ｍｘ１抗体及び抗ＮＩＮＪ２抗体の組み合わせである、項１又は２に記載のバイオマーカー。
項４．  被検動物から採取された血液試料中の、抗Ｍｘ１抗体、抗ＮＩＮＪ２抗体、抗ＤＣＸ抗体、抗Ｃ１０ｏｒｆ４９抗体、抗ＺＭＡＴ４抗体、抗ＣＤＣ４２ＳＥ１抗体及び抗ＧＰＴ２抗体からなる群より選択される少なくとも１種の抗体を検出する工程、
を含む非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）の検査方法。
項５．  前記抗体が、抗Ｍｘ１抗体及び抗ＮＩＮＪ２抗体からなる群より選択される少なくとも１種である、項４に記載の検査方法。
項６．  前記抗体が、抗Ｍｘ１抗体及び抗ＮＩＮＪ２抗体の組み合わせである、項４又は５に記載の検査方法。
項７．  前記血液試料が血清である、項４〜６のいずれかに記載の検査方法。
項８．  前記抗体の検出が、Ｍｘ１、ＮＩＮＪ２、ＤＣＸ、Ｃ１０ｏｒｆ４９、ＺＭＡＴ４、ＣＤＣ４２ＳＥ１及びＧＰＴ２からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質又はその部分ペプチドからなる抗原を用いて行われる、項４〜７のいずれかに記載の検査方法。
項９．  前記検出工程がＥＬＩＳＡ法により行われる、項４〜８のいずれかに記載の検査方法。
項１０．  前記抗原が、ＭＨＣクラスII分子により提示された抗原である、項４〜９のいずれかに記載の検査方法。
項１１．  被検動物から採取された血液試料中の、抗Ｍｘ１抗体、抗ＮＩＮＪ２抗体、抗ＤＣＸ抗体、抗Ｃ１０ｏｒｆ４９抗体、抗ＺＭＡＴ４抗体、抗ＣＤＣ４２ＳＥ１抗体及び抗ＧＰＴ２抗体からなる群より選択される少なくとも１種の抗体を検出する工程、及び
前記工程で得られた検出結果に基づいてＮＳＩＰを診断するする工程、
を含む非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）の診断方法。
項１２．  Ｍｘ１、ＮＩＮＪ２、ＤＣＸ、Ｃ１０ｏｒｆ４９、ＺＭＡＴ４、ＣＤＣ４２ＳＥ１及びＧＰＴ２からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質又はこれらの部分ペプチドからなる抗原を含む、非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）の検査用試薬。
項１３．  項１２に記載の検査用試薬を含む、非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）の診断キット。
項１４．  Ｍｘ１、ＮＩＮＪ２、ＤＣＸ、Ｃ１０ｏｒｆ４９、ＺＭＡＴ４、ＣＤＣ４２ＳＥ１及びＧＰＴ２からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質又はその部分ペプチドからなる抗原の、非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）の検査用試薬の製造のための使用。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のバイオマーカーによれば、これまで外科的肺生検のような侵襲性の高い方法でしか診断ができなかったＮＳＩＰを、より簡便且つ侵襲性の低い手法により、高精度に診断することができる。また、本発明によれば、前記バイオマーカーの検出を簡便に行うことができる検査用試薬、及び当該検査用試薬を含む診断キットが提供される。【００１３】
本発明のバイオマーカーはＮＳＩＰ患者の血液試料中に高い濃度で検出される一方、ＵＩＰ／ＩＰＦ患者においては正常対照群と有意な差がない。従って、本発明のバイオマーカーを検出することによって、ＵＩＰ／ＩＰＦとＮＳＩＰの鑑別を高精度に行うことができる。ＵＩＰ／ＩＰＦとＮＳＩＰでは予後に大きな差があり、一般的にＮＳＩＰ患者は治療薬に対する反応が良く、予後が良好でとされている。そのため、患者がＮＳＩＰに罹患していると判断された場合に適切な治療薬を選択し、投薬スケジュールを計画することができる。【００１４】
従来、ＮＳＩＰの診断には外科的肺生検を要するため、ＮＳＩＰを対象とした大規模臨床試験は困難であった。しかし、本発明のＮＳＩＰの検査方法によれば、低侵襲的且つ容易に採取可能な血液試料を用いてＮＳＩＰの臨床診断が可能である。従って、ＮＳＩＰを対象とした大規模臨床試験が可能となり、当該分野における治療の進歩に大きく貢献すると予想される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】タンパク質アレイ法により測定した全自己抗体価の分布を疾患ごとに表すグラフである。
【図２】タンパク質アレイ法により測定した抗Ｍｘ１抗体価を疾患ごとに示すグラフである。
【図３】タンパク質アレイ法により測定した抗ＮＩＮＪ２抗体、抗ＤＣＸ抗体、抗Ｃ１０ｏｒｆ４９抗体、抗ＺＭＡＴ４抗体、抗ＣＤＣ４２ＳＥ１抗体及び抗ＧＰＴ２抗体の抗体価を、疾患ごとに示すグラフである。
【図４】タンパク質アレイ法により測定した抗Ｍｘ１抗体価と抗ＮＩＮＪ２抗体価をＮＳＩＰの患者毎に識別したグラフである。
【図５】正常肺組織及び間質性肺炎組織標本を、抗Mx1抗体を用いた免疫組織化学に供した結果を示す写真である。
【図６】ＥＬＩＳＡ法において、固相化に使用したＭｘ１タンパク質の濃度とシグナル強度の関係を示すグラフである。
【図７】Ａは、Ｍｘ１−ＨＬＡ−ＤＲ複合体を提示させた細胞を用いた自己抗体（抗Ｍｘ１抗体）測定の原理を模式的に示した図である。Ｂは、Ｍｘ１−ＨＬＡ−ＤＲ複合体を提示させた細胞を用いて自己抗体（抗Ｍｘ１抗体）を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１．バイオマーカー
本発明の非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）のバイオマーカーは、抗Ｍｘ１抗体、抗ＮＩＮＪ２抗体、抗ＤＣＸ抗体、抗Ｃ１０ｏｒｆ４９抗体、抗ＺＭＡＴ４抗体、抗ＣＤＣ４２ＳＥ１抗体及び抗ＧＰＴ２抗体からなる群より選択される少なくとも１種の抗体からなることを特徴とする。以下、本発明のバイオマーカーについて詳述する。
【００１７】
ここで、用語「非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）」は、狭義には臨床診断名として用いられ、病理組織診断名として用いられる場合には「ＮＳＩＰパターン」と表わされる。一方、単に「ＮＳＩＰ」と表記し、臨床診断名と病理組織診断名の双方の意味において区別されることなく使用される場合もある。本明細書において「ＮＳＩＰ」と表記する場合、特段の規定がない限り、臨床診断名と病理組織診断名の両方を意図するものとする。
【００１８】
本発明のバイオマーカーは、下記（ａ）〜（ｇ）に示す抗体の少なくとも１種を特異的に認識する抗体からなる。
（ａ）抗Ｍｘ１抗体
抗Ｍｘ１抗体は、Ｍｘ１を特異的に認識する抗体である。Ｍｘ１（ｍｙｘｏｖｉｒｕｓ  （ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  １）は、タイプ１−インターフェロンにより誘導される一群の抗ウイルスタンパク質に属し、広範囲のウイルス（インフルエンザ、麻疹、コクサッキー、ＨＢＶ、トゴト等）に対して抗ウイルス活性を示す。Ｍｘ１の具体的なアミノ酸配列及び塩基配列については、アクセッション番号ＮＭ＿００２４６２．２によりＮＣＢＩデータベースに登録されている。
【００１９】
（ｂ）抗ＮＩＮＪ２抗体
抗ＮＩＮＪ２抗体は、ＮＩＮＪ２を特異的に認識する抗体である。ＮＩＮＪ２（ｎｉｎｊｕｒｉｎ  ２）は接着分子の１種であり、末梢神経損傷後の末端側神経におけるシュワン細胞で発現が増強され、神経突起伸長を促進する可能性があるとされている。ＮＩＮＪ２の具体的なアミノ酸配列及び塩基配列については、アクセッション番号ＮＭ＿０１６５３３．４によりＮＣＢＩデータベースに登録されている。
【００２０】
（ｃ）抗ＤＣＸ抗体
抗ＤＣＸ抗体は、ＤＣＸを特異的に認識する抗体である。ＤＣＸ（Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ）は、細胞質タンパク質である。発生過程において神経細胞は、皮質から最終的に分化する部位に達するため長距離の移動をしなければならない。ＤＣＸタンパク質は、微小管の組織化と安定を調節することによって神経細胞の移動を指示すると考えられている。ＤＣＸの具体的なアミノ酸配列及び塩基配列については、アクセッション番号ＮＭ＿１７８１５２．１によりＮＣＢＩデータベースに登録されている。
【００２１】
（ｄ）抗Ｃ１０ｏｒｆ４９抗体
抗Ｃ１０ｏｒｆ４９抗体は、Ｃ１０ｏｒｆ４９を特異的に認識する抗体である。Ｃ１０ｏｒｆ４９（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １０  ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ  ４９）は、胎児軟骨の末梢領域及び軟骨界面における骨軟骨形成前駆細胞の骨形成分化を、ネガティブに制御する可能性が示唆されている。Ｃ１０ｏｒｆ４９の具体的なアミノ酸配列及び塩基配列については、アクセッション番号ＮＭ＿１４５３１４．１によりＮＣＢＩデータベースに登録されている。
【００２２】
（ｅ）抗ＺＭＡＴ４抗体
抗ＺＭＡＴ４抗体は、ＺＭＡＴ４を特異的に認識する抗体である。ＺＭＡＴ４（Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｍａｔｒｉｎ−ｔｙｐｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４）のタンパク質としての機能は未知である。ＺＭＡＴ４の具体的なアミノ酸配列及び塩基配列については、アクセッション番号ＢＣ０１９５９８．１によりＮＣＢＩデータベースに登録されている。
【００２３】
（ｆ）抗ＣＤＣ４２ＳＥ１抗体
抗ＣＤＣ４２ＳＥ１抗体は、ＣＤＣ４２ＳＥ１を特異的に認識する抗体である。ＣＤＣ４２ＳＥ１（ＣＤＣ４２  ｓｍａｌｌ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  １）はＴリンパ球において重合糸状アクチンの集積に関与するタンパク質である。ＣＤＣ４２ＳＥ１の具体的なアミノ酸配列及び塩基配列については、アクセッション番号ＮＭ＿０２０２３９．２によりＮＣＢＩデータベースに登録されている。
【００２４】
（ｇ）抗ＧＰＴ２抗体
抗ＧＰＴ２抗体は、ＧＰＴ２を特異的に認識する抗体である。ＧＰＴ２（ｇｌｕｒａｍｉｃ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ（ａｌａｎｉｎｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）２）は、アラニンと２−オキソグルタル酸からピルビン酸とグルタミン酸を産生するアミノ基転移反応を触媒する酵素である。ＧＰＴ２の具体的なアミノ酸配列及び塩基配列については、アクセッション番号ＮＭ＿１３３４４３．１によりＮＣＢＩデータベースに登録されている。
【００２５】
本発明においては、上記（ａ）〜（ｇ）の抗体のいずれをバイオマーカーとしてもよいが、ＮＳＩＰ患者の血液試料中における抗体価が高く、ＩＰＦ／ＵＩＰ患者の血液試料中の抗体量との差がより顕著であることから、抗Ｍｘ１抗体と抗ＮＩＮＪ２抗体は、本発明のバイオマーカーの好適な例として挙げられる。また、上記（ａ）〜（ｇ）から選択されるいずれか１種の抗体をバイオマーカーとしてもよく、２種以上の抗体の組合せを用いてもよい。とりわけ、非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）の患者において、抗Ｍｘ１抗体陽性を示す場合と抗ＮＩＮＪ２抗体陽性を示す場合に重なりが少ないことが、後述する実施例において確認されており、ＮＳＩＰの検査の精度をより一層高めるという観点から、抗Ｍｘ１抗体と抗ＮＩＮＪ２抗体の双方を組み合わせて、バイオマーカーとして使用することが好ましい。
【００２６】
本発明において抗体のクラスは、検出可能である限り特に限定されず、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ｓＩｇＡ、ＩｇＭ等のいずれであってもよい。本発明において好ましい抗体のクラスとしては、ＩｇＧが例示される。また、前記抗原に対して特異的に結合する限り、抗体の結合性断片（例えば、Ｆ（ａｂ'）2、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ）等についても本発明のバイオマーカーとして使用することができる。
【００２７】
２．非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）の検査方法
本発明は、ＮＳＩＰの検査方法を提供する。本発明の検査方法は、被験動物から採取された血液試料中の、抗Ｍｘ１抗体、抗ＮＩＮＪ２抗体、抗ＤＣＸ抗体、抗Ｃ１０ｏｒｆ４９抗体、抗ＺＭＡＴ４抗体、抗ＣＤＣ４２ＳＥ１抗体及び抗ＧＰＴ２抗体からなる群より選択される少なくとも１種の抗体を検出する工程を含むことを特徴とする。
【００２８】
[検出対象]
本発明の検査方法では、前記バイオマーカー（即ち、前記抗体）が検出対象である。
【００２９】
[血液試料]
本発明において血液試料の由来は特に限定されず、任意の動物とすることができる。より具体的には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜；イヌ、ネコ等のペット；ヒト、サル、オランウータン、チンパンジー等の霊長類が挙げられる。本発明において血液試料の由来として、好ましくは霊長類、更に好ましくはヒトである。
【００３０】
本発明において血液試料の種類は前記バイオマーカーを検出し得る限り特に限定されないが、例えば全血、血清、血漿等が挙げられる。簡便に調製することができ、より正確に前記バイオマーカーを検出するという観点から血清が好適な例として挙げられる。
【００３１】
各種血液試料の採取及び調製は公知の手法に従って行うことができる。例えば、血清であれば、採取された血液（全血）から血球と、フィブリノーゲン（Ｉ因子）、プロトロンビン（ＩＩ因子）、Ｖ因子、ＶＩＩＩ因子等の血液凝固因子を除去して調製することができ、血液を静置した後に得られる上清、あるいは血液を遠心分離に供して得られる上清として得ることができる。血液試料は、必要に応じて、適切な濃度に希釈して使用される。
【００３２】
［抗原］
本発明の検査方法において前記各抗体の検出は、Ｍｘ１、ＮＩＮＪ２、ＤＣＸ、Ｃ１０ｏｒｆ４９、ＺＭＡＴ４、ＣＤＣ４２ＳＥ１及びＧＰＴ２からなる群より選択される少なくとも１種又はその部分ペプチドを抗原として使用し、血液試料中の前記バイオマーカー（抗体）を検出することにより行われる。
【００３３】
本発明の検査方法において血液試料中の前記バイオマーカーを検出するために使用される抗原は、被検動物から採取された血液試料中に存在する前記バイオマーカー（抗体）によって特異的に認識され得る限り特に限定されないが、被験動物と同じ種に属する動物に由来する抗原が好ましい。例えば、被験動物がヒトである場合には、前記バイオマーカーの検出に使用する抗原はヒト由来であることが好ましい。
【００３４】
また、血液試料中の前記バイオマーカーを検出するために使用される抗原は、全長タンパク質であってもよく、抗体に特異的に認識され得る限りその部分ペプチドであってもよい。本発明において、抗原として使用される部分ペプチドとしては、被験動物に由来する抗体によって認識され得る抗原決定基を含むものであればその長さは特に限定されず、前記バイオマーカーとして検出される抗体の種類によって適宜設定され得る。一般に、抗原決定基を構成するアミノ酸残基数が５〜２０個程度とされていることから、部分ペプチドとしては、例えば５個以上のアミノ酸残基により構成されるものが挙げられる。
【００３５】
前記抗原は、公知の手法によって得ることができる。例えば、前記抗原は、前記被検動物として例示されるヒト等の動物から採取することができる。採取は、組織や培養細胞からタンパク質又はペプチドを単離、精製する従来公知の方法に従って行うことができ、例えば、前記抗原を発現している組織又は細胞をホモジナイザーによって破砕した後、細胞可溶化物中の抗原をクロマトグラフィーによって単離精製する方法が挙げられる。
【００３６】
また、前記抗原は、前記抗原をコードする核酸を含む発現ベクターを導入した形質転換体を培養し、培養物から前記抗原を単離、精製することもできる。或いは、前記抗原のアミノ酸配列に基づいて、従来公知のペプチド合成法によりポリペプチドとして調製することもできる。ペプチド合成法としては、例えば、固相合成、液相合成が挙げられ、本発明においてはいずれの方法を用いてもよい。
【００３７】
更に、抗原として使用される部分ペプチドについては、上記方法により製造される各ポリペプチドを、各抗原の種類に応じたペプチダーゼにより切断して調製してもよい。
【００３８】
前記抗原は、リン酸、糖又は糖鎖、リン脂質、脂質、ヌクレオチド等によって修飾されていてもよい。また、前記抗原は、精製処理等を容易に行うために、公知のタグが連結されるものであってもよい。このようなタグとしては、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ等挙げられる。
【００３９】
本発明において、前記抗原は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスII分子と複合体を形成させて提示させた状態で使用してもよい。前記抗原をＭＨＣクラスII分子に提示させた状態にすることによって、より一層優れた精度で前記バイオバーカーの検出可能になる。本明細書において、前記抗原を提示させたＭＨＣクラスII分子を「抗原／ＭＨＣクラスII」と表記することもある。以下、抗原／ＭＨＣクラスIIについて説明する。
【００４０】
（抗原／ＭＨＣクラスII）
前記ＭＨＣクラスII分子の由来は、特に制限されず、例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ウサギ、ヒツジ、ウマ等が挙げられる。前記ＭＨＣクラスII分子の由来は、検査対象となる被検動物の由来と同じでもよいし、異なっていてもよい。
【００４１】
前記ＭＨＣクラスII分子は、α鎖及びβ鎖の複合体であり、それぞれの種類は特に制限されず、これらをコードする遺伝子のハロタイプについても特に制限されない。
【００４２】
前記ＭＨＣクラスII分子がヒト由来である場合、前記ＭＨＣクラスII分子のα鎖として、例えば、ＨＬＡ−ＤＰＡ遺伝子座、ＨＬＡ−ＤＱＡ遺伝子座又はＨＬＡ−ＤＲＡ遺伝子座にコードされているＭＨＣクラスII分子のα鎖が挙げられ、また前記ＭＨＣクラスII分子のβ鎖として、例えば、ＨＬＡ−ＤＰＢ遺伝子座、ＨＬＡ−ＤＱＢ遺伝子座又はＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子座にコードされているＭＨＣクラスII分子のβ鎖が挙げられる。前記各遺伝子座におけるＭＨＣクラスα鎖及びβ鎖のハプロタイプは、特に制限されない。前記ＭＨＣクラスII分子として、好ましくはα鎖及びβ鎖の両方を含む分子が挙げられる。
【００４３】
前記ＭＨＣクラスII分子としては、前記抗原と複合体を形成して提示できることを限度として特に制限されないが、具体的には、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ等が挙げられる。
【００４４】
前記ＨＬＡ−ＤＲとしては、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ２、ＨＬＡ−ＤＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ５、ＨＬＡ−ＤＲ６、ＨＬＡ−ＤＲ７、ＨＬＡ−ＤＲ８、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１０、ＨＬＡ−ＤＲ１１、ＨＬＡ−ＤＲ１２、ＨＬＡ−ＤＲ１３、ＨＬＡ−ＤＲ１４、ＨＬＡ−ＤＲ１５、ＨＬＡ−ＤＲ５２、ＨＬＡ−ＤＲ５３等が挙げられる。また、前記ＨＬＡ−ＤＲとしては、例えば、α鎖としてＨＬＡ−ＤＲＡ１と、β鎖としてＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４又はＨＬＡ−ＤＲＢ５等のＨＬＡ−ＤＲＢとを含む分子が挙げられる。前記ＨＬＡ−ＤＲとして、より具体的には、α鎖として、ＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１等のアリル、β鎖として、例えば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０７、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１０、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１６、ＨＬＡ−ＤＲＢ３＊０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ４＊０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ５＊０１等のアリルが挙げられる。
【００４５】
前記ＨＬＡ−ＤＱとしては、例えば、ＨＬＡ−ＤＱ１、ＨＬＡ−ＤＱ２、ＨＬＡ−ＤＱ３、ＨＬＡ−ＤＱ４、ＨＬＡ−ＤＱ５、ＨＬＡ−ＤＱ６、ＨＬＡ−ＤＱ７、ＨＬＡ−ＤＱ８等が挙げられる。前記ＨＬＡ−ＤＱとしては、例えば、α鎖としてＨＬＡ−ＤＱＡ１等のＨＬＡ−ＤＱＡと、β鎖としてＨＬＡ−ＤＱＢ１等のＨＬＡ−ＤＱＢとを含む分子が挙げられる。具体的には、α鎖として、例えば、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０２、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０３、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０４、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０５、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０６等のアリル、β鎖として、例えば、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０４、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６等のアリルが挙げられる。
【００４６】
前記ＨＬＡ−ＤＰとしては、例えば、ＨＬＡ−ＤＰ１、ＨＬＡ−ＤＰ２、ＨＬＡ−ＤＰ３、ＨＬＡ−ＤＰ４、ＨＬＡ−ＤＰ５等が挙げられる。前記ＨＬＡ−ＤＰとしては、例えば、α鎖としてＨＬＡ−ＤＰＡ１等のＨＬＡ−ＤＰＡと、β鎖としてＨＬＡ−ＤＰＢ１等のＨＬＡ−ＤＰＢとを含む分子が挙げられる。具体的には、α鎖として、例えば、ＨＬＡ−ＤＰＡ１＊０１、ＨＬＡ−ＤＰＡ１＊０２、ＨＬＡ−ＤＰＡ１＊０３、ＨＬＡ−ＤＰＡ１＊０４等のアリル、β鎖として、例えば、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０２、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９等のアリルが挙げられる。
【００４７】
前記ＭＨＣクラスII分子は、自己免疫疾患感受性ＭＨＣクラスII分子であってもよい。前記自己免疫疾患感受性ＭＨＣクラスII分子とは、他のＭＨＣクラスα鎖及びβ鎖のハプロタイプ（アリル）に対して、自己免疫疾患を発症する確率が相対的に高いＭＨＣクラスα鎖及びβ鎖の少なくとも一方を含むＭＨＣクラスII分子である。
【００４８】
前記ＭＨＣクラスII分子は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００４９】
前記ＭＨＣクラスII分子の種類は、提示させるべき抗原の種類に応じて適宜設定すればよいが、例えば、Ｍｘ１を提示させるのに適したＭＨＣクラスII分子として、好ましくはＨＬＡ−ＤＲ；更に好ましくはα鎖がＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１であり、且つβ鎖がＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０７、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１０、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１６、ＨＬＡ−ＤＲＢ３＊０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ４＊０１、及びＨＬＡ−ＤＲＢ５＊０１の中の少なくとも１種であるＨＬＡ−ＤＲ；より好ましくα鎖がＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１であり、且つβ鎖がＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１０、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１４の中の少なくとも１種であるＨＬＡ−ＤＲ；更に好ましくはα鎖がＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１であり、且つβ鎖がＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３であるＨＬＡ−ＤＲ；特に好ましくはα鎖ＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１：０１であり、且つβ鎖がＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３：０４であるＨＬＡ−ＤＲが挙げられる。
【００５０】
前記抗原を提示させたＭＨＣクラスII分子は、ＭＨＣクラスII分子を発現する細胞に前記抗原又はその部分ペプチドをコードする遺伝子を導入することによって得られる。
【００５１】
ＭＨＣクラスII分子を発現する細胞は、前記ＭＨＣクラスII分子のコード遺伝子を、内在性遺伝子として有する細胞（以下、ＭＨＣクラスII分子内在性細胞）でもよく、また外来性遺伝子として有する細胞（以下、ＭＨＣクラスII分子非内在性細胞）でもよい。ＭＨＣクラスII分子内在性細胞を使用する場合は、例えば、前記ＭＨＣクラスII分子のコード遺伝子を、内在性遺伝子として有する宿主細胞に、前記抗原のコード遺伝子を導入すればよい。また、ＭＨＣクラスII分子非内在性細胞を使用する場合は、宿主細胞に、例えば、前記抗原のコード遺伝子と前記ＭＨＣクラスII分子のコード遺伝子とを共導入すればよい。また、遺伝子を細胞に導入する方法は、公知の形質転換法によって行うことができる。
【００５２】
前記ＭＨＣクラスII分子内在性細胞としては、前記免疫系細胞が挙げられる。
【００５３】
前記ＭＨＣクラスII分子非内在性細胞としては、特に制限されないが、例えば、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等があげられる。動物細胞として、具体的には、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、グリア細胞等の免疫系細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等が挙げられる。
【００５４】
ＭＨＣクラスII分子を発現する細胞に前記抗原をコードする遺伝子を導入することによって、当該細胞表面に抗原／ＭＨＣクラスIIを提示する細胞が得られる。本発明では、抗原／ＭＨＣクラスIIを提示する細胞をそのまま前記バイオマーカーの検出に使用してもよく、また抗原／ＭＨＣクラスIIを提示する細胞から抗原／ＭＨＣクラスIIを離して、これをバイオマーカーの測定に使用してもよい。
【００５５】
［バイオマーカーの検出］
本発明の検査方法は、被験動物から採取された血液試料中の前記バイオマーカーの存在の有無を検出することにより行われる。また、本発明の検査方法においては、前記バイオマーカーの検出を、血液試料中の前記バイオマーカーの量を測定することにより行ってもよい。前記バイオマーカーの量を測定することによって、正常対照群やＩＰＦ／ＵＩＰに罹患した被験者における前記バイオマーカーと量的な比較ができ、より精度の高い検査が可能となることから、本発明の検査方法は、好ましくは、血液試料中の前記バイオマーカーの量を測定することによって行われる。
【００５６】
前記抗原を使用して血液試料中に存在する前記バイオマーカーを検出する方法としては、具体的には、前記抗原と血液試料を接触させて、前記抗原と前記バイオマーカー（抗体）との特異的結合を直接的又は間接的に検出する方法が挙げられる。このような検出方法としては、具体的には、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法、免疫沈降法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法、蛍光イムノアッセイ法等のイムノアッセイが例示される。これらのイムノアッセイにより前記バイオマーカーを検出する場合には、前記バイオマーカー（抗体）に特異的に結合する抗体に酵素標識、発色標識、放射標識又は発光標識などの標識を結合し、この標識を検出又は測定することにより行うことができる。
【００５７】
本発明においては、いずれの検出方法を採用しても簡便且つ高精度にＮＳＩＰの臨床診断又は病理組織診断を行うことができるが、例えばＥＬＩＳＡ法が好ましい検出方法として挙げられる。
【００５８】
前記イムノアッセイを実施する際の条件については、血液試料中の前記バイオマーカーと前記抗原との特異的結合を検出し得る限り特に限定されず、従来公知の条件に基づいて設定される。例えば、ＥＬＩＳＡ法により本発明のバイオマーカーを検出する場合、前記抗原又が固定されたマルチウェルプレートの各ウェルに被検動物から採取した血液試料を添加し、ウェル中の抗原と血液試料中のバイオマーカー（抗体）とを反応させる。そして、被験動物由来の抗体に特異的に結合する標識化抗体を各ウェル添加して反応させた後、酵素基質を添加して得られる反応生成物を検出及び／又は定量することによって、血液試料中の前記バイオマーカーの検出及び／又は定量を行うことができる。
【００５９】
ここで、被験動物由来の抗体に特異的に結合する標識化抗体としては、血液試料を採取する被検動物種に基づいて適宜選択され得るが、例えば、被検動物がヒトである場合には、ヒト抗体を特異的に結合する非ヒト標識化抗体（例えば、ウサギ由来抗ヒトＩｇＧ抗体）等が挙げられる。
【００６０】
また、被験動物由来の抗体に特異的に結合する標識化抗体の標識に使用される酵素についても、通常使用されるものから適宜選択して用いることができ、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、エステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ等が挙げられる。また、酵素基質としては、酵素の種類に応じて公知の基質から適宜選択され得るが、例えば、酵素がペルオキシダーゼの場合であれば、３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を基質として使用することができる。
【００６１】
酵素と基質の反応により生じた反応生成物の検出及び／又は定量は、反応生成物の吸光度を測定することによって行うことができ、例えば３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を酵素基質として用いた場合には、４５０ｎｍにおける吸光度を測定することによって実施され得る。
【００６２】
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）であれば、前記抗原を放射性同位元素で標識し、血液試料中の前記バイオマーカーと反応させ免疫複合体を形成させ、放射性同位元素から放出される放射能に基づいて検出することができる。
【００６３】
蛍光イムノアッセイであれば、前記抗原をプレート等に固相化し、そこに血液試料を加えて反応させた後、被験動物の血液試料中に存在する抗体に特異的に結合する抗体を更に反応させて、蛍光発色を検出することにより行うことができる。被験動物由来の抗体に特異的に結合する抗体としては、前記ＥＬＩＳＡ法において記載される通りであり、蛍光色素により標識化されたものを用いる。蛍光色素としては、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＡＰＣ、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５等が例示される。
【００６４】
免疫沈降法であれば、前記抗原と血液試料を反応させて免疫複合体を形成させ、プロテインＡ、プロテインＧ等の活性吸着剤を用いて、不溶化物として沈降させることによって検出することができる。更に、免疫沈降法とウェスタンブロット法を組合せて検出することもできる。より具体的には、ＦＬＡＧ等のタグが連結された前記抗原と血液試料を反応させ、試料中に前記バイオマーカーが存在すれば免疫複合体が形成されるため、前述の活性吸着剤によって沈降させる。そして、得られた沈降物をウェスタンブロット法に供する。即ち、沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離展開し、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜等に転写した後、タグに対する抗体と転写膜上で抗原抗体反応を行うことにより血液試料中に前記バイオマーカーが存在していた場合にはバンドとして検出することができる。
【００６５】
また、前記抗原／ＭＨＣクラスIIを提示する細胞を前記バイオマーカーの検出に使用する場合、当該細胞に血液試料を接触させればよい。当該細胞と血液試料の添加割合については、特に制限されないが、例えば、１０００〜２０００万個（例えば、約５００万個）の細胞に対して、血液試料０．０１〜１ｍｌが挙げられる。また、前記抗原／ＭＨＣクラスIIを提示する細胞を使用する場合、当該細胞と血液試料を接触させてから、一定期間インキュベートすることが好ましい。インキュベートの条件は、特に制限されないが、温度は、例えば、０〜３７℃、好ましくは０〜１０℃、より好ましくは０〜５℃であり、ｐＨは、例えば、ｐＨ６〜９、好ましくはｐＨ７〜８、より好ましくはｐＨ７．２〜７．６であり、時間は、例えば、３〜１２０分、好ましくは１０〜９０分、より好ましくは３０〜６０分である。血液試料にバイオマーカーが存在していれば、前記細胞が提示する抗原／ＭＨＣクラスIIの抗原に対して前記バイオマーカーが特異的に結合するので、当該特異的な結合を前述する手法に従って直接的又は間接的に測定すればよい。
【００６６】
［ＮＳＩＰの罹患可能性の判定］
本発明の検査方法によって、被験動物から採取された血液試料中に前記バイオマーカーが検出された場合、被検動物がＮＳＩＰに罹患していると判断することができる。本発明の検査方法において、「ＮＳＩＰ」と表記する場合、特段の規定がない限り、臨床診断名と病理組織診断名の両方を意図する。即ち、被検動物から採取された血液試料中にバイオマーカーが検出された場合には、被験動物がＮＳＩＰに罹患している、又はＮＳＩＰパターンの組織病変を有していることを意味する。
【００６７】
また、従来使用されている間質性肺炎マーカーＫＬ−６によって間質性肺炎に罹患していることが判明している被検動物（好ましくはヒト）において、本発明のバイオマーカーが検出された場合、当該被検動物は特発性間質性肺炎のＮＳＩＰに罹患していると判断することができる。
【００６８】
また、ＮＳＩＰに罹患した動物（好ましくはヒト）では、血液試料中の本発明のバイオマーカーの量が正常対照群に比較して顕著に上昇している。従って、本発明のバイオマーカーを定量的に検出する場合には、正常対照群の血液試料中のバイオマーカーの量と被検動物の血液試料中のバイオマーカー量を比較することによって、ＮＳＩＰの診断を行うことができる。更に、本発明のバイオマーカーの量は、ＮＳＩＰ患者の血液試料中において上昇するが、ＩＰＦ／ＵＩＰ患者においては正常対照群と有意な差はないことから、本発明のバイオマーカーをＩＰＦ／ＵＩＰとＮＳＩＰの鑑別に利用することもできる。
【００６９】
本発明において、血液試料中に含まれるバイオマーカー量が正常対照群（或いは鑑別対象疾患であるＩＰＦ／ＵＩＰ群）に比較して多いとは、具体的には被験動物のバイオマーカー量が正常対照群（或いは鑑別対象疾患であるＩＰＦ／ＵＩＰ群）の９５パーセンタイル値をカットオフ値と設定し、当該カットオフ値以上である場合が挙げられる。当該カットオフ値以上であれば被験動物がＮＳＩＰに罹患している可能性が高い、又はＮＳＩＰの組織病変を生じている可能性が高いと判断することができる。また、カットオフ値未満であれば、被験動物がＮＳＩＰに罹患している可能性が低い、又はＮＳＩＰの組織病変を生じている可能性が低いと判断してもよい。また、血液試料中の本発明のバイオマーカーの量が多いほど、ＮＳＩＰの症状が重篤であると予測され得る。
【００７０】
本発明のバイオマーカーが検出された場合には、特発性間質性肺炎の中でも一般に予後が良好であるとされているＮＳＩＰであると診断されることから、本発明の検査方法によって被検動物の予後を予測することができる。また、ＮＳＩＰは治療反応性が良好であることに基づいて、ＮＳＩＰの治療及び／又は症状の進行を抑制するための適切な投薬スケジュールや治療計画を立てることができる。
【００７１】
３．ＮＳＩＰの検査用試薬
本発明は、Ｍｘ１、ＮＩＮＪ２、ＤＣＸ、Ｃ１０ｏｒｆ４９、ＺＭＡＴ４、ＣＤＣ４２ＳＥ１及びＧＰＴ２からなる群より選択される少なくとも１種又はその部分ペプチドからなる抗原を含む、非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）の検査用試薬を提供する。
【００７２】
本発明の検査用試薬に用いられる前記抗原については、前述の通りである。
【００７３】
本発明の検査用試薬において、抗原は、不溶化担体上に固定化され提供されてもよい。不溶化担体の素材としては、バイオマーカーの検出を妨げない限り特に限定されず、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリルニトリル、ポリビニルクロライド、フッ素樹脂、架橋デキストラン、紙、シリコン、ガラス、金属、アガロース等を例示することができる。また、これらの材料を２種以上組合せて用いてもよい。不溶化担体の形状としては、例えばマイクロプレート、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、試験管等のいずれの形状であってもよい。また、発明の検査用試薬において、抗原は、前述するように、抗原／ＭＨＣクラスIIとして提供されてもよく、更には抗原／ＭＨＣクラスIIを発現する細胞の状態で提供されてのよい。
【００７４】
不溶化担体上への前記抗原の固定化は、従来公知の方法に従って行うことができる。
【００７５】
不溶化担体上に固定化される抗原の量は、各抗原に対する抗体と特異的に結合するために十分な量であれば特に限定されないが、例えば、不溶化担体に固定化する際に使用される溶液中の抗原の濃度が、２〜１０μｇ／ｍＬ、好ましくは２〜８μｇ／ｍＬ、より好ましくは２〜６μｇ／ｍＬが挙げられる。
【００７６】
本発明の検査用試薬によって検出される前記バイオマーカーが複数の抗原決定基を認識し得る抗体である場合、各抗原に存在する複数の抗原決定基をそれぞれ特異的に認識する抗体（前記バイオマーカー）を網羅的に検出することによって検出感度を向上させ得るという観点から、各抗原は全長タンパク質であることが好ましい。
【００７７】
また、本発明の検査用試薬は、前記抗原の他に、緩衝液、安定化剤、防腐剤等を含んでいてもよく、また、従来公知の方法に従って製剤化されていてもよい。
【００７８】
４．ＮＳＩＰの診断キット
本発明は、前記非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）の検査用試薬を含む、非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）の診断キットを提供する。
【００７９】
本発明の診断キットには、前記試薬の他に、抗体の検出を実施するために必要とされ得る、被験動物由来の抗体に特異的に結合する標識化抗体（例えば、被験動物がヒトであれば、ヒト抗体を特異的に結合する非ヒト標識化抗体）、標識物質の検出剤、溶解剤、洗浄剤、反応停止液、コントロール試料、検査プロトコル等を含んでいてもよい。
【００８０】
５．ＮＳＩＰの診断方法
本発明は、ＮＳＩＰの診断方法を提供する。当該診断方法は、被検動物から採取された血液試料における、抗Ｍｘ１抗体、抗ＮＩＮＪ２抗体、抗ＤＣＸ抗体、抗Ｃ１０ｏｒｆ４９抗体、抗ＺＭＡＴ４抗体、抗ＣＤＣ４２ＳＥ１抗体及び抗ＧＰＴ２抗体からなる群より選択される少なくとも１種の抗体を検出する工程、ならびに前記工程で得られた結果に基づいてＮＳＩＰを診断するする工程、を含むことを特徴とする。
【００８１】
本発明の診断方法において、抗体の測定方法、被検動物がＮＳＩＰに罹患していると判定する基準等については、上述の通りである。
【実施例】
【００８２】
以下、試験例を挙げて、本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００８３】
患者背景
血清は独立行政法人国立病院機構近畿中央胸部疾患センターに通院中の患者より文書による同意を得て採取した。ＩＰＦ  １０例、ＮＳＩＰ  ８例、対象疾患として自己免疫性肺胞タンパク質症（ＰＡＰ）１０例、サルコイドーシス（ＳＡＲ）１０例及び健常人（コントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）と表記する場合がある）１０例より採血後、２，５００ｒｐｍ、１０分間遠心、上清を回収し、実験に使用するまで−８０℃にて保存した（表１）。本試験は厚生労働省の臨床研究に関する倫理指針に則り、大阪大学医学部附属病院及び国立病院機構近畿中央胸部疾患センターの臨床研究倫理審査委員会の承認を経て施行した。【００８４】
【表１】
2014148429.tif 000002
【００８５】
ＮＳＩＰ特異的自己抗体の絞り込み
各患者から採取した血清を下記に示すタンパク質アレイ法に供し、ＮＳＩＰ患者において特異的に抗体価が上昇している自己抗体の検索を行った。【００８６】
タンパク質アレイ法
ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｖ５．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を購入し、取り扱い説明書に従って使用した。同アレイには昆虫細胞（Ｓｆ９）にて作成した約８，０００種のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合全長タンパク質が、それぞれ２点ずつスポットされている。アレイをｑｕａｄｒｉＰＥＲＭ培養皿（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ  Ｏｎｅ）に入れ、ブロッキング緩衝液と４℃で６０分間反応させた後、１：５００希釈した血清と４℃で９０分間、水平振盪機上（５０ｒｐｍ）で反応させた。洗浄後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１：２，０００希釈し、４℃で９０分間反応させた。洗浄後、遠心して乾燥させたアレイ上の各スポットの蛍光強度ｍｅｄｉａｎ値（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｕｎｉｔｓ，  ｒｆｕ）をＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を搭載したマイクロアレイスキャナー（Ａｘｏｎ  ４２００ＡＬ）で読み取った。【００８７】
計算と統計
タンパク質アレイ法によって得たデータはＧｎｊａｔｉｃ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０１０；１０７：５０８８−５０９３、及びＧｎｊａｔｉｃ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００９；３４１：５０−５８に報告されている方法に従って補正、標準化を行った。偽陽性を防ぐため、各抗原タンパク質について２点のスポットの平均値ではなく、２点のうち低い値をその抗原タンパク質の蛍光強度として採用した。【００８８】
抗原タンパク質の蛍光強度を、下記式（１）に従ってratio of interquartile differences (RoIQD)値に変換した。
【数１】
2014148429.tif 000003
（式（１）中、
Xは各抗原タンパク質の蛍光強度、
Q1arrayはアレイ内全抗原タンパク質の蛍光強度のうち低い方から25パーセンタイル値、
Q3arrayはアレイ内全抗原タンパク質の蛍光強度のうち低い方から75パーセンタイル値を表す）【００８９】
その後、ｑｕａｒｔｉｌｅ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎを行い、血清自己抗体価を求めた。Ｑｕａｒｔｉｌｅ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎでは、アレイ毎にＲｏＩＱＤ値の大きさ順に抗原タンパク質を並べ、同じ順位のＲｏＩＱＤ値（本試験例においては４８個のＲｏＩＱＤ値）の平均値を計算し、この平均値を各アレイで同じ順位の抗原タンパク質に対して割り当てる操作を行った。一連の操作によってアレイ間のデータのばらつきを抑えることができるため、血清自己抗体価のアレイ間での比較が可能となる。【００９０】
次に各血清自己抗体のカットオフ値を、下記式（２）に従って求めた。
【数２】
2014148429.tif 000004
（式（２）中、
Q1Agは、それぞれの自己抗体の全抗体価（本研究では48個）の25パーセンタイル値、
Q3Agは、それぞれの自己抗体の全抗体価（本研究では48個）の75パーセンタイル値を表す）
血清自己抗体価がカットオフ値よりも大きい場合のみ、カットオフ値に対する自己抗体価比（ｓ／ｃ）を計算した。【００９１】
最後に、特定の疾患に特異的な自己抗体としてのスコア値を下記式（３）に従って決定した。下記式（３）は、ＰＡＰ患者の場合を例に記載したものである。ここで、疾患群としてはａＰＡＰ１０例、コントロール群としてはその他の疾患群と健常人計３８例を使用した。
【数３】
2014148429.tif 000005
（式（３）中、
Freqは、自己抗体価がカットオフ値より高い症例のパーセンテージ、
Internsityは、カットオフ値に対する自己抗体価比（s/c）の平均値を表す）【００９２】
ＩＰＦ、ＮＳＩＰ、ＳＡＲについても同様に、他３疾患と健常人をコントロール群として、疾患特異的自己抗体としてのスコア値を計算した。【００９３】
各疾患別に、疾患特異的自己抗体としてのスコア値の分布を示す（図１）。疾患に特徴的な分布はなく、類似した分布を示した。いずれの疾患でもスコア２０点台にピークがあり、高スコア側に長く裾野を引く形となった。【００９４】
次に疾患特異的自己抗体と判断するための、スコア値の閾値について検討した。Ｇｎｊａｔｉｃ  Ｓ．らの報告（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０１０；１０７：５０８８−５０９３、及びＪ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００９；３４１：５０−５８）ではスコア＞５を高スコアとして採用しているが、炎症性疾患を対象とした本試験例における検討には不適であると考えられた（図１）。そこで、閾値を漸増する検討を行ったところ、スコア≧５７．１を閾値として設定すると各疾患間の重なりがなくなることを見出し、結果としてＮＳＩＰ  ５１個、ＩＰＦ  ４０個、ａＰＡＰ  ５７個、ＳＡＲ  ４４個の疾患特異的自己抗体を決定することができた。そのうち、ＮＳＩＰ疾患に特異的な自己抗体から特に高スコアを示した７種類の抗体を選択した。下表２に当該７種類の自己抗体のスコアを示す。【００９５】
【表２】
2014148429.tif 000006
【００９６】
また、疾患ごとに抗体価をグラフに示す（図２及び３）。タンパク質アレイによる血清抗Ｍｘ１抗体価は、従来の間質性肺炎マーカーであるＫＬ−６と同様、肺胞タンパク質症（ＰＡＰ）でも上昇した。しかし、抗Ｍｘ１抗体はＩＰＦとＮＳＩＰを比較すると明らかにＮＳＩＰ患者において抗体価が上昇し、ＩＰＦとＮＳＩＰ間における鑑別マーカーとなり得ることが示された（図２）。また、図３に示されるように、抗Ｍｘ１抗体の他にも６種類の自己抗体がＩＰＦとＮＳＩＰ間における鑑別マーカーとなり得ることが示された。更に、図４に、抗Ｍｘ１抗体価と抗ＮＩＮＪ２抗体の抗体価をＮＳＩＰの患者毎に識別したグラフを図４に示す。図４に示されるように、ＮＳＩＰは、抗Ｍｘ１抗体価が高い患者と、抗ＮＩＮＪ２抗体が高い患者に大別され、抗Ｍｘ１抗体陽性と抗ＮＩＮＪ２抗体陽性の重なりが少なかったことから、抗Ｍｘ１抗体と抗ＮＩＮＪ２抗体の双方を鑑別マーカーとして使用することによって、より高精度にＮＳＩＰを診断できることが明らかとなった。【００９７】
免疫組織化学分析による抗Ｍｘ１抗体の検出
本発明者らは、抗Ｍｘ１抗体に着目し、解析を進めた。抗原タンパク質のＭｘ１はＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ（ＩＳＧｓ）と呼ばれ、タイプ１−インターフェロンにより誘導される一群の抗ウイルスタンパク質に属する。インターフェロンシグナルと間質性肺炎の関わりについては、これまでにも報告されている。具体的な試験方法を以下に示す。【００９８】
正常肺組織のホルマリン固定パラフィン包埋標本はＳＵＰＥＲ  ＢＩＯ  ＣＨＩＰＳ社（Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）より購入した。ＮＳＩＰ患者の外科的肺生検標本（ホルマリン固定パラフィン包埋）は国立病院機構近畿中央胸部疾患センターより提供された。一次抗体としてウサギ抗ヒトＭｘ１ポリクローナル抗体を使用した。また二次抗体としてヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を使用した。【００９９】
各標本のパラフィン切片を貼付けたスライドガラスを６０℃で一晩静置した後、キシレンに浸漬し（１０分間(４回）た。その後１００％エタノール、９５％エタノール、８０％エタノール、５０％エタノール、水の順に段階的に脱パラフィン処理を行った。更に、クエン酸緩衝液を用いて抗原賦活化を行った後、内因性ペルオキシダーゼ阻害を行った。【０１００】
その後、抗ヒトＭｘ１抗体（４％ヤギ血清／ＴｒｉｔｏｎＸ−１００加リン酸緩衝溶液（ＰＢＳＴ）で１：４２５に希釈、ウサギ、ポリクローナル抗体；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）１００μＬを各標本に添加し、４℃で一晩インキュベートした後、ＰＢＳＴで洗浄した。洗浄後の標本に、更に４％ヤギ血清／ＰＢＳＴにて２００倍希釈したビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）１００μＬを添加し、室温で６０分間インキュベートした。二次抗体と反応させた標本をＰＢＳＴで洗浄した後、Streptavidin-biotin-peroxidase detection system (Vector Labs Inc.)を用いて発色させた。免疫組織化学分析に供した標本の代表例を図５に示す。【０１０１】
図５に示されるように免疫組織化学分析の結果、正常肺組織においてＭｘ１は気管支上皮内のクララ細胞、肺胞内のマクロファージに発現していた。一方、ＮＳＩＰ患者の肺組織では、ＩＩ型肺胞上皮過形成及び集簇した肺胞マクロファージにおいて高い発現を認めた。即ち、ＮＳＩＰ患者の肺組織においてＭｘ１の局在が変化することによって抗原として認識され、自己抗体（抗Ｍｘ１抗体）が産生されると予測される。【０１０２】
ＥＬＩＳＡ法による抗Ｍｘ１抗体の検出
Ｓｆ９昆虫細胞にて発現させたＭｘ１リコンビナントタンパク質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡより入手）をＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に固相化した。固相化は、ＥＬＩＳＡプレートとＭｘ１リコンビナントタンパク質を４℃にて一晩インキュベートすることにより行った。また、固相化に用いたＭｘ１リコンビナントタンパク質の濃度を１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ又は８μｇ／ｍｌとした。【０１０３】
測定する血清を１００倍希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに固相化したＭｘ１リコンビナントタンパク質と室温にて１時間静置反応させ、リン酸緩衝食塩水で洗浄後、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ（γ  ｃｈａｉｎ）抗体（Ｇｏａｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ，ＭＢＬ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）と室温で１時間静置反応させた。ＴＭＢを用いて発色させた後、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＲＶＯ  ＭＸ１４２０  ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）にて測定した。結果を図６のグラフに示す。【０１０４】
ＮＳＩＰの２症例においては、固相化に用いたＭｘ１タンパク質濃度依存的にシグナルが増強し、４μｇ／ｍｌ以上では頭打ちとなることが示された。一方ＩＰＦ２症例においては、Ｍｘ１タンパク質の濃度依存的なシグナル増加を認められなかった。ＮＳＩＰ患者においては、確かに抗Ｍｘ１抗体が存在することを示すと同時に、抗Ｍｘ１抗体ＥＬＩＳＡで固相化するＭｘ１タンパク質最適濃度は４μｇ／ｍｌであることが示された。【０１０５】
免疫沈降法及びウェスタンブロッティングによる自己抗体（抗Ｍｘ１抗体）の確認
ＮＳＩＰ患者の血清中に抗Ｍｘ１抗体が確かに存在していることを証明するため、免疫沈降法による確認を行った。ＦＬＡＧタグ融合Ｍｘ１タンパク質発現ベクターを作製し、２９３細胞にて過剰発現させ、細胞可溶化物を血清と反応させた。患者血清中にＭｘ１に対する自己抗体が存在すれば、免疫複合体が形成され、プロテインＧセファロースにて沈降させることができる。そして、この沈降物に対して抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロッティング解析を行うことによって、ＮＳＩＰ患者血清中の抗Ｍｘ１抗体の存在を確認することができる。具体的には以下の手順に従って試験を行った。【０１０６】
ＭＴＣ多組織ｃＤＮＡパネル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）の脾組織ｃＤＮＡライブラリーより、下記プライマーセットを用いて、Ｍｘ１ｃＤＮＡを得た。
5'-TTTAAGCTTATGGTTGTTTCCGAAGTG（配列番号１）
5'-TTTTCTAGATTAACCGGGGAACTGGGCAAG（配列番号２）【０１０７】
Ｍｘ１  ｃＤＮＡをｐＦＬＡＧ−ＣＭＶTM−４  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）にクローニングし、発現ベクターを得た。この発現ベクターを２９３細胞にトランスフェクトし、１６時間後に細胞可溶化物を回収した。細胞可溶化物と血清を混合し、４℃にて一晩回転（ｒｏｔａｔｅ）した後、免疫複合体をＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用いて沈降させた。沈降物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ゲル中のタンパク質（沈降物）をニトロセルロース膜に転写した。このニトロセルロース膜を５％スキムミルク溶液中で４℃で一晩ブロッキングした。その後、ＴＢＳで洗浄し、ニトロセルロース膜を抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と室温℃で１時間反応させた。その後、ＴＢＳで洗浄し、更にＥＣＬ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により発色させた。その結果、ＮＳＩＰ患者の血清を用いた場合のみバンドが認められた。【０１０８】
ＭＨＣクラスII分子に提示させたＭｘ１を用いた自己抗体（抗Ｍｘ１抗体）の検出
（１）Ｍｘ１提示ＭＨＣクラスII分子を細胞表面に提示する細胞の調製
まず、以下の方法で、Ｍｘ１提示ＭＨＣクラスII分子を細胞表面に提示する細胞を調製した。【０１０９】
（１−１）ＨＬＡ−ＤＲα発現ベクター及びＨＬＡ−ＤＲβ発現ベクター
ヒト末梢血単核細胞（3H  Biomedical社）又はヒト細胞株のｃＤＮＡから、HLA-DRのα鎖（ＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１：０１）及びβ鎖（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３：０４）をコードするポリヌクレオチドを、それぞれ、ｐＭＥ１８Ｓベクターにクローニングした。なお、前記ＨＬＡ−ＤＲのｃＤＮＡの配列情報は、IMGT/HLA  Database（http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/index/html）を参照した。【０１１０】
（１−２）Ｍｘ１発現ベクター
ヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーから、下記プライマーを用いてＭｘ１ｃをコードするポリヌクレオチドをＰＣＲ法で増幅させ、制限酵素処理（ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ）後、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３ベクターにクローニングした。
Sense primer: 5'-AATAATGAATTCATGGTTGTTTCCGAAGTG-3'（配列番号３）
Anti-sense primer: 5'- TAATAACTCGAGTTAACCGGGGAACTGGG-3' （配列番号４）【０１１１】
（１−３）ＧＦＰ発現ベクター
ＧＦＰをコードする配列番号５に示すポリヌクレオチドを、ｐＭＥ１８Ｓベクターにクローニングした。【０１１２】
（１−４）発現ベクターの導入
前記ＨＬＡ−ＤＲα発現ベクター、ＨＬＡ−ＤＲβ発現ベクター、Ｍｘ１発現ベクター、及びＧＦＰ発現ベクターを、トランスフェクション試薬として、ＰＥＩ  ｍａｘ（商品名、Polyscience社製）を使用し、２９３Ｔ細胞（理化学研究所  バイオリソースセンター）に導入した。２９３Ｔ細胞への前記発現ベクターの導入は、ＰＥＩ  ｍａｘ（コスモバイオ社）を２ｍｇ／ｍｌとなるように精製水で溶かしたＰＥＩ  ｍａｘ溶液を使用した。具体的には、２９３Ｔ細胞を２４穴プレートに２×１０5個／５００μＬ／穴で播き、２４時間培養を行った。次いで、Lipofectamine（商標）  2000（Invitrogen社）の使用説明書に従い、Lipofectamine（商標）  2000に代えて、前記ＰＥＩ  ｍａｘ溶液を用いて、前記発現ベクターの導入を行い、２４時間培養後に、細胞がＧＦＰを発現していることを、蛍光顕微鏡で確認した。【０１１３】
なお、上記条件によって、Ｍｘ１がＨＬＡ−ＤＲと複合化して細胞表面に提示されていることは、標識抗Ｍｘ１抗体及び抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を用いたフローサイトメトリーによる分析や、細胞溶解液を免疫沈降した後に、免疫沈降したサンプルに対して標識抗Ｍｘ１抗体及び抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を用いたウェスタンブロッティングによって確認されている。【０１１４】
（２）Ｍｘ１提示ＭＨＣクラスII分子（Ｍｘ１−ＨＬＡ−ＤＲ複合体）を細胞表面に提示する細胞を用いた血清中の自己抗体（抗Ｍｘ１抗体）の測定
前記で調整した細胞を、間質性肺炎患者３名（ＮＳＩＰ−１、−２及び９）の血清希釈液（１００倍希釈）に再懸濁させ、３７℃で２０分間培養を行った。その後、細胞を洗浄し、Allophycocyanin(ＡＰＣ)で標識した抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体（Jackson ImmunoResearch）を用いて、Ｍｘ１−ＨＬＡ−ＤＲ複合体に結合した自己抗体（抗Ｍｘ１抗体）を標識した。その後、ＨＡＮＫＳ緩衝液に再懸濁させた後に、fluorescence activated cell sorting (ＦＡＣＳ) (FACSCalibur, BD)で、ＡＰＣ陽性細胞の分析を行った。【０１１５】
得られた結果を図７に示す。図７のＡは、本試験においてＡＰＣ陽性細胞の細胞表面を模式的に示した図であり、図７のＢは、ＦＡＣＳ分析の結果（縦軸がＡＰＣ蛍光強度）を示す。図７のＢには、タンパク質アレイによる血清抗Ｍｘ１抗体価を測定した結果も併せて示す。この結果から、Ｍｘ１−ＨＬＡ−ＤＲ複合体を提示している細胞を用いた自己抗体（抗Ｍｘ１抗体）の測定結果は、タンパク質アレイによる血清抗Ｍｘ１抗体価とよく対応しており、Ｍｘ１−ＨＬＡ−ＤＲ複合体を利用することによって自己抗体（抗Ｍｘ１抗体）を効率的且つ高精度に測定できることが確認された。【０１１６】
以上の結果より、抗Ｍｘ１抗体、抗ＮＩＮＪ２抗体、抗ＤＣＸ抗体、抗Ｃ１０ｏｒｆ４９抗体、抗ＺＭＡＴ４抗体、抗ＣＤＣ４２ＳＥ１抗体及び抗ＧＰＴ２抗体は、簡便且つ高精度にＮＳＩＰの検査を行うことが可能なバイオマーカーであり、これらのバイオマーカーはＩＰＦ／ＵＩＰとＮＳＩＰの鑑別においても有用であることが示された。また、特に抗Ｍｘ１抗体及び／又は抗ＮＩＮＪ２抗体をバイオマーカーとすることによって、更に高精度なＮＳＩＰの診断、ＩＰＦ／ＵＩＰとＮＳＩＰの鑑別が可能であることが示された。
【配列表フリーテキスト】
【０１１７】
配列番号１は、Ｍｘ１ｃＤＮＡのクローニングに使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号２は、Ｍｘ１ｃＤＮＡのクローニングに使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号３は、Ｍｘ１ｃＤＮＡのクローニングに使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号４は、Ｍｘ１ｃＤＮＡのクローニングに使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号５は、ＧＦＰｃＤＮＡの塩基配列を示す。
【図１】
2014148429.tif 000007
【図２】
2014148429.tif 000008
【図３】
2014148429.tif 000009
【図４】
2014148429.tif 000010
【図５】
2014148429.tif 000011
【図６】
2014148429.tif 000012
【図７】
2014148429.tif 000013
【配列表】
2014148429000001.app
【国際調査報告】
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2014148429.tif 000015
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