【手続補正書】
【提出日】平成24年7月4日(2012.7.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドＣＯＧ１３３（配列番号１）の配列を含む５０以下のアミノ酸からなるペプチド、または、ペプチドＣＯＧ１３３（配列番号１）の配列からなるペプチド、を含む組成物であって、
前記ペプチドは、アンテナペディア、ＴＡＴ、ＳｙｎＢ１、ＳｙｎＢ３、ＳｙｎＢ５及びポリアルギニン由来のペプチドからなる群より選択されるＰＴＤにコンジュゲートしている、及び前記ペプチドはＬＤＬ結合活性を有する、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、前記ＰＴＤが、アンテナペディア由来のペプチドである、組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の組成物であって、前記ペプチドコンジュゲートが、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＬＲＶＲＬＡＳＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬからなる、組成物。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物であって、前記ＣＯＧ１３３ペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端に１から１５のアミノ酸が結合している、組成物。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物であって、前記ＣＯＧ１３３ペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端に１アミノ酸が挿入されている、組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の組成物であって、前記ＰＴＤが、ＣＯＧ１３３を含むペプチドのアミノ末端にコンジュゲートしている、組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の組成物であって、前記アンテナペディア由来のＰＴＤが、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号５１）、またはＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号５２）である、組成物。
【請求項８】
請求項６に記載の組成物であって、前記ＴＡＴ由来のＰＴＤが、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号５０）である、組成物。
【請求項９】
請求項６に記載の組成物であって、前記ＳｙｎＢ１由来のＰＴＤが、ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ（配列番号５３）である、組成物。
【請求項１０】
請求項６に記載の組成物であって、前記ＳｙｎＢ３由来のＰＴＤが、ＲＲＬＳＹＳＲＲＲＦ（配列番号５４）である、組成物。
【請求項１１】
請求項６に記載の組成物であって、前記ＳｙｎＢ５由来のＰＴＤが、ＲＧＧＲＬＡＹＬＲＲＲＷＡＶＬＧＲ（配列番号５５）である、組成物。
【請求項１２】
請求項６に記載の組成物であって、前記ポリアルギニン由来のＰＴＤが、ＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号５６）である、組成物。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物を含む、多発性硬化症又はギランバレー症候群の治療または予防のための医薬。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
部位特異的置換
次いで、出願人は体系的にアポＥ１３３−１４９（ＣＯＧ１３３）における各々アミン素をアラニンと置換し、次いで各々アポＥペプチド類似体の活性を測定した。これらの置換に使用される略語は当業者に周知であり、例えば、アポＥ１３３−１４９ペプチドの１４９位でのロイシン（Ｌ）を意味するＬ１４９Ａ（１３３−ＬＲＶＲＬＡＳＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬ−１４９）（配列番号１）はアラニン（Ａ）と置換されており、Ｌ１４９Ａ類似体（１３３−ＬＲＶＲＬＡＳＨＬＲＫＬＲＫＲＬＡ−１４９）（配列番号６５）を示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５２】
手短に言えば、０、０．００５、０．０２５、０．１、１．０、５、１０、または２５ｕｇ／ｍｌのＣＯＧ１３３をマウス血液血漿に添加することによって較正曲線を構成した。これら同じ濃度のＣＯＧ１３３をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）にも添加した。ＣＯＧ１３３を含有する血漿またはＰＢＳを１体積のＰＢＳおよび１体積のＡＴＩ（ＡＴＩ＝アセトニトリル中０．６％トリフルオロ酢酸および３ｕｇ／ｍｌの内部標準ペプチド［ＬＡＶＬＬＡＳＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬ］（配列番号５８））を添加し、ボルテックスし、１５，０００ｘｇで１０分間遠心分離し、上部有機層を抽出試料として採集することによって抽出した。抽出試料を上記（実施例１）の条件下にＬＣ／ＭＳ定量にかけ、信号増大が試料中のＣＯＧ１３３の増大量に直線的に比例したことを示す直線濃度／信号曲線を示した（データを示さず、Ｒ２＝０．９９８４）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】
われわれは、分解過程によって生じうるＣＯＧ１４１０の断片を同定する同様のＬＣ／ＭＳ法を使用した。手短に言えば、ＣＯＧ１４１０を投与したマウスからの血漿を使用することにより、一部の小さめのペプチド断片が、未処置マウスからの血漿には見られないこのＬＣ／ＭＳ法で同定された（データは示さず）。質量分析計でのＭＳ／ＭＳを使用し、これらの断片の部分的配列を得ることにより、少なくとも１つの主要な代謝産物が、トリプシン様プロテアーゼまたはカルボキシペプチダーゼ活性によって無傷ＣＯＧ１４１０の消化に由来しうる断片であるアセチル−ＡＳ−Ａｉｂ−ＬＲＫＬ−Ａｉｂ−ＫＲ（配列番号５９）である可能性が高いと思われる。この断片の存在は、ＣＯＧ１４１０の短い半減期の１つの説明が、トリプシン様プロテアーゼまたはカルボキシペプチダーゼ活性の影響を受けやすいことにあることを示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６１】
側鎖架橋
閉環メタセシス（ＲＣＭ）法を使用することにより、オレフィン側鎖が組込まれ、配列：ＡＳＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬにおける選択残基で側鎖と側鎖を共有結合しうる。ＣＯＧ１４１０は、らせんの一面上の荷電残基のすべておよびらせんの対向面上の疎水性残基のすべてを有する両親媒性アルファらせんを形成するように思われる。大部分の荷電残基のアラニン置換は大幅に抗炎症活性を軽減したため（表１）、荷電残基は側鎖結合法の候補ではない（Ａｉｂ置換が生物活性を増強したＲ１４５を除く）。これは疎水性残基の大部分を側鎖結合法による変更に利用可能なままにする。したがって、以下の架橋結合分子が合成されうるが、ここでＸおよびＺで示されたアミノ酸は、架橋結合オレフィン架橋に結合される側鎖を含有するアミノ酸でありうる。すなわち、ＡＳＨＸＲＫＬＺＫＲＬＬ（配列番号６０）、ＸＳＨＬＲＫＬＺＫＲＬＬ（配列番号６１）、ＡＳＸＬＲＫＬＲＫＺＬＬ（配列番号６２）、およびＡＳＨＸＲＫＬＲＫＲＺＬ（配列番号６３）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６７】
試薬
ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）ペプチドは、マウスＭＯＧタンパク質の残基３５‐５５（ＭＯＧ３５‐５５、ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ（配列番号６４））由来であり、アポＥ類似ペプチド（ＣＯＧ１３３）は、アセチル−ＬＲＶＲＬＡＳＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬ−アミドの配列を有するヒトアポリポタンパク‐Ｅの残基１３３〜１４９由来である。アポＥ逆ペプチド（ＣＯＧ−１４９で示される）は、ここではＣＯＧ１３３のスクランブル対照として処置される。アンテナペディア結合ペプチド（ＣＯＧ１３４、ａｋａＣＯＧ４５０２として示される）は、アンテナぺディアプレフィックスペプチドをＣＯＧ１３３と結合する。ペプチドはすべて、ＲＰ‐ＨＰＬＣによりメリフィールド固相化学および精製によりＦＭＯＣ試薬を使用してＵＮＣでのペプチド合成施設によって合成された。以下の試薬をシグマ（Ｓｉｇｍａ）から購入した。すなわち、百日咳毒素、ＬＰＳ、およびＩＦＮ‐γ。ＴＮＦαおよびＩＬ‐６の定量ＥＬＩＳＡキットをバイオソース（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）から得た。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】改善されたアポＥを含む組成物