【手続補正書】
【提出日】平成24年4月4日(2012.4.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚又は培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害処理してなる、タイトジャンクション傷害皮膚モデル。
【請求項２】
前記皮膚又は皮膚三次元モデルが、培養ヒト皮膚三次元モデルであることを特徴とする、請求項１に記載のタイトジャンクション傷害皮膚モデル。
【請求項３】
前記タイトジャンクションの傷害処理が、中鎖飽和直鎖脂肪酸処理であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のタイトジャンクション傷害皮膚モデル。
【請求項４】
皮膚バリア機能向上成分のスクリーニング用であることを特徴とする、請求項１〜３の何れか１項に記載のタイトジャンクション傷害皮膚モデル。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載のタイトジャンクション傷害皮膚モデルのタイトジャンクション機能の鑑別用であることを特徴とする、タイトジャンクション機能トレーサーキットであって、
標識されていてもよいビオチンと、標識されていてもよいアビジンからなり、前記ビオチン又はアビジンのどちらかは蛍光標識されていることを特徴とする、タイトジャンクション機能トレーサーキット。
【請求項６】
請求項１〜４の何れか１項に記載のタイトジャンクション傷害皮膚モデルを標識されていてもよいビオチンで処理する工程と、標識されていてもよいビオチンで処理したタイトジャンクション傷害皮膚モデルから顕微鏡用切片を切り出す工程と、標識されていてもよいアビジンで当該切片を処理する工程を有する使用態様で使用されることを特徴とする、請求項５に記載のタイトジャンクション機能トレーサーキット。
【請求項７】
請求項１〜４の何れか１項に記載のタイトジャンクション傷害皮膚モデルを被験体で処理し、しかる後に、タイトジャンクション機能の標識処理を行い、しかる後に標識の存在状況よりタイトジャンクション機能を鑑別することを特徴とする、タイトジャンクション機能回復剤の鑑別法。
【請求項８】
タイトジャンクション機能の標識処理が、請求項５又は６に記載のタイトジャンクション
機能トレーサーキットによるものであることを特徴とする、請求項７に記載のタイトジャンクション機能回復剤の鑑別法。
【請求項９】
請求項７又は８に記載のタイトジャンクション機能回復剤の鑑別法において、コントロールに対して有意にタイトジャンクション機能回復を示すことを特徴とする、タイトジャンクション機能回復剤。
【請求項１０】
ε，γ−グルタミルリジン及び／又はパルマリア抽出物であることを特徴とする、請求項９に記載のタイトジャンクション機能回復剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
この様な状況に鑑みて、本発明者らは、タイトジャンクション機能の不全による皮膚バリア機能の低下を改善する成分が、傷害されたタイトジャンクションにおいてどの様にその機能の回復をせしめるかを視覚的に鑑別できる鑑別法を求めて、鋭意研究努力を重ねた結果、カプリン酸処理などで作製したタイトジャンクション傷害皮膚モデルを被験体で処理し、しかる後に、タイトジャンクション機能の標識処理を行い、しかる後に標識の存在状況よりタイトジャンクション機能を鑑別することにより、傷害されたタイトジャンクションの機能回復過程を視覚的に捉えられることを見出し、発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下に示すとおりである。
（１）皮膚又は培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害処理してなる、タイトジャンクション傷害皮膚モデル。
（２）前記皮膚又は皮膚三次元モデルが、培養ヒト皮膚三次元モデルであることを特徴とする、（１）に記載のタイトジャンクション傷害皮膚モデル。
（３）前記タイトジャンクションの傷害処理が、中鎖飽和直鎖脂肪酸処理であることを特徴とする、（１）又は（２）に記載のタイトジャンクション傷害皮膚モデル。
（４）皮膚バリア機能向上成分のスクリーニング用であることを特徴とする、（１）〜（３）の何れかに記載のタイトジャンクション傷害皮膚モデル。
（５）（１）〜（４）の何れかに記載のタイトジャンクション傷害皮膚モデルのタイトジャンクション機能の鑑別用であることを特徴とする、タイトジャンクション機能トレーサーキットであって、標識されていてもよいビオチンと、標識されていてもよいアビジンからなり、前記ビオチン又はアビジンのどちらかは蛍光標識されていることを特徴とする、タイトジャンクション機能トレーサーキット。
（６）（１）〜（４）の何れかに記載のタイトジャンクション傷害皮膚モデルを標識されていてもよいビオチンで処理する工程と、標識されていてもよいビオチンで処理したタイトジャンクション傷害皮膚モデルから顕微鏡用切片を切り出す工程と、標識されていてもよいアビジンで当該切片を処理する工程を有する使用態様で使用されることを特徴とする、（５）に記載のタイトジャンクション機能トレーサーキット。
（７）（１）〜（４）の何れかに記載のタイトジャンクション傷害皮膚モデルを被験体で処理し、しかる後に、タイトジャンクション機能の標識処理を行い、しかる後に標識の存在状況よりタイトジャンクション機能を鑑別することを特徴とする、タイトジャンクション機能回復剤の鑑別法。
（８）タイトジャンクション機能の標識処理が、（５）又は（６）に記載のタイトジャンクション機能トレーサーキットによるものであることを特徴とする、（７）に記載のタイトジャンクション機能回復剤の鑑別法。
（９）（７）又は（８）に記載のタイトジャンクション機能回復剤の鑑別法において、コントロールに対して有意にタイトジャンクション機能回復を示すことを特徴とする、タイ
トジャンクション機能回復剤。
（１０）ε，γ−グルタミルリジン及び／又はパルマリア抽出物であることを特徴とする、（９）に記載のタイトジャンクション機能回復剤。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
＜１＞本発明のタイトジャンクション傷害皮膚モデル
本発明のタイトジャンクション傷害皮膚モデルは、皮膚バリア機能向上成分のスクリーニング用のものであって、皮膚又は培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害処理してなることを特徴とする。前記の皮膚としては、所望により体毛を除去し、生体より採取した皮膚断片であって、表皮顆粒層、表皮基底層及び真皮部分からなるものが好ましく、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウサギの皮膚断片が好ましい。又、前記培養皮膚三次元モデルとしては、ヒト又はヒトを除く動物の皮膚より採取した、正常な（癌化していない）ケラチノサイト、フィブロブラストなどの皮膚細胞を培養し、三次元構造を構築し、皮膚の構造に疑似させたものが好ましく、この様な形態の市販品を購入して使用することもできる。好ましい市販品としては、例えば、倉敷紡績株式会社から販売されている「EFT-400」（正常培養ヒト三次元皮膚モデル）などが好適に例示できる。特に表皮成分のみで構成される「EPI-200」や、USA MaTek社から販売されている「EpiDerm」などがさらに好適に例示できる。かかる皮膚又は培養皮膚三次元モデルは、真皮側又は表皮基底層側から傷害手段を講じてタイトジャンクション部分を傷害する。傷害手段としては、例えば、紫外線や化学物質などが好ましく例示でき、紫外線であれば、波長２８０〜３２０ｎｍの紫外線を７．５〜２００ｍJ／ｃｍ2、さらに好ましくは５０〜１６０ｍJ／ｃｍ2の単位あたりのエネルギー量で照射すればよく、化学的な処置であれば、カプリン酸、カプリル酸などの中鎖長（炭素数８〜１２）の脂肪族飽和直鎖脂肪酸またはその一価金属塩の０．１〜１０ｍM、さらに好ましくは０．５〜２ｍMの溶液を真皮側又は表皮基底層側から、５〜２４時間、さらに好ましくは１０〜１５時間作用させればよい。また、オクルディンやクローディンの細胞外ドメインを認識する中和抗体を使用することもできる。これらの傷害処置の内、特に好ましいものは化学的傷害処置であり、なかでもカプリン酸ナトリウムによる処理が特に好ましい。これはタイトジャンクションに対して均質な損傷がなしうるからである。この様な均質な傷害は、後記の傷害タイトジャンクションの回復促進剤のスクリーニングにおいては、そのメカニズムを的確に鑑別する上で非常に重要な因子となる。処置後傷害手段は直ちに皮膚又は培養皮膚三次元モデルより離脱させる。離脱は、紫外線照射であれば照射を終了することによりできるし、化学的傷害手段であれば、培地又はPBS（リン酸緩衝生理食塩水）などで洗浄することによりなしうる。斯くして得られたタイトジャンクション傷害皮膚モデルは、後記 タイトジャンクション機能回復剤の鑑別法に用いられ、傷害されたタイトジャンクションの回復促進剤のスクリーニングに好適に使用される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
＜２＞本発明のタイトジャンクション機能トレーサーキット
本発明のタイトジャンクション機能トレーサーキットは、標識されていてもよいビオチンと、標識されていてもよいアビジンからなるタイトジャンクション機能トレーサーキットであって、前記ビオチン又はアビジンのどちらかは蛍光標識されていることを特徴とす
る。前記標識としては、例えば、フルオロセイン、ローダミン、フルオテトラメチルローダミン、ダンシルなどの蛍光標識、ルシフェリンなどの発光標識、ガリウムなどの放射性標識、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼなどの酵素標識などが例示でき、感度高く、視覚的にタイトジャンクション機能を鑑別するには、ビオチン又はアビジンのどちらかに蛍光標識を用いることが好ましい。タイトジャンクションの機能を鑑別するためには、本発明のキットでは、標識されていてもよいビオチンを、真皮側又は表皮基底層側から作用させ、表皮顆粒層に向かって作用させる。この時、タイトジャンクションの機能が正常であれば標識されていてもよいビオチンは表皮顆粒層で食い止められ、角層には移動しない。タイトジャンクションの機能が不全であれば、標識されていてもよいビオチンは角層へと移動する。この様な皮膚組織中での、標識されていてもよいビオチンの移動は標識されていてもよいアビジンを作用させることにより、可視化できる。前記アビジンとしては、ビオチンとの不可逆的結合性を有するものであれば、何れも用いることが出来、例えば、ストレプトアビジン等が、その入手の容易性から好適に例示できる。かかるアビジンの標識としては、蛍光標識サクシニルビオチンなど、蛍光標識されていることが好ましい。本発明のキットについて、真皮側又は表皮基底層側より作用させる物質として標識されていてもよいアビジンを選択し、組織中の標識されていてもよいアビジンの可視化手段として標識されていてもよいビオチンを用いることもできるが、タイトジャンクションの機能の正確な鑑別には、真皮側より作用させる物質として標識されていてもよいビオチンを用い、該ビオチンの可視化手段として標識されていてもよいアビジンを用いることがより好ましい。該ビオチンの好ましい市販品としては、EZ-LinkTM-スルフォ-NHS-LC-ビオチン（ピアス社製；PIERCE）などが好適に例示できる。また該アビジンの好ましい市販品としては、ストレプトアビジン-テキサスレッド（オンコジーン社製；ONCOGENE）などが好適に例示される。なお角層と表皮顆粒層の境界については、光学顕微鏡下で撮影した画像をもとに判断してもよいし、角層あるいは表皮顆粒層、好ましくはタイトジャンクションをトレーサーで使用するものと明らかに蛍光波長の異なる蛍光物質で標識することによって蛍光顕微鏡下で同時に判断してもよい。例えばタイトジャンクションに特異的に反応する抗体を用いることができるが、抗オクルディン抗体を用い、蛍光標識二次抗体による染色を併用した二重染色条件で本願の発明を実施することが好適に例示できる。