【事件の表示】
　特願２００４−３４２９３０「精製希少糖の大量生産方法」拒絶査定不服審判事件〔平成１８年　６月１５日出願公開、特開２００６−１５３５９１〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
１．手続の経緯・本願発明
　本願は、平成１６年１１月２６日の出願であって、平成１９年１０月１６日付けで拒絶査定がされ、これに対し、同年１２月１７日に拒絶査定不服審判の請求がされたものである。その後、当審において、平成２１年６月２６日付けで拒絶理由が通知され、その応答期間中の同年８月３１日付けで手続補正がなされている。
　本願の請求項１〜３に係る発明は、平成２１年８月３１日付け手続補正書の特許請求の範囲の請求項１〜３に記載された事項により特定されるとおりのものと認められ、その請求項１に係る発明は、以下のとおりである。
「　　【請求項１】
　配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、以下の（イ）〜（チ）の物理化学的性質によって特定されるPseudomonas stutzeri(IPOD FERM BP-08593)由来L-ラムノースイソメラーゼを、酵素を菌体から抽出したものを用いる場合は沈殿させた後に、菌体そのものを用いる場合はそのまま、グルタルアルデヒドにより架橋して共有結合法によって固定化したL-ラムノースイソメラーゼの作用で基質希少糖Ｄ−プシコースから目的希少糖Ｄ−アロースへ変換し、得られる原液は全糖濃度が４０％以上で、Ｄ−アロースを全固形分中２０重量％以上のＤ−アロース原液として得られ、その原液から、溶離液として水を用いて目的希少糖Ｄ−アロース画分と基質希少糖Ｄ−プシコース画分とにクロマト分離すること、該クロマト分離が、基質希少糖と目的希少糖に対し選択的吸着能力を有する吸着剤としてカルシウム型の陽イオン交換樹脂が充填された複数の充填塔を直列かつ無端に連結して原液および溶離液が循環可能な循環系を形成し、該循環系に、原液および溶離液を供給し、前記循環系を、溶離液供給部から目的希少糖画分抜出部までの目的希少糖の脱着帯域、目的希少糖画分抜出部から原液供給部までの目的希少糖の濃縮帯域、原液供給部から基質希少糖画分抜出部までの基質希少糖の吸着帯域、基質希少糖画分抜出部から溶離液供給部までの基質的希少糖の回収帯域の４つの帯域に区分し、各供給部および各抜出部を所定の位置関係を保ちつつ順次循環方向下流側に移行させることにより吸着剤の擬似移動層を形成して、循環液を目的希少糖画分と基質希少糖画分とに連続的にクロマト分離することであることを特徴とする、精製希少糖Ｄ−アロースの生産方法。
　（イ）作用
　Ｄ−グルコースとＤ−フラクトース、Ｄ−アロースとＤ−プシコース、Ｄ−アルトロースとＤ−プシコース、Ｄ−グロースとＤ−ソルボース、Ｌ−グルコースとＬ−フラクトース、Ｌ−マンノースとＬ−フラクトース、Ｌ−アルトロースとＬ−プシコース、Ｌ−タロースとＬ−タガトース、Ｌ−ガラクトースとＬ−タガトース、Ｌ−グロースとＬ−ソルボース、Ｄ−アラビノースとＤ−リブロース、Ｄ−リボースとＤ−リブロース、Ｌ−リボースとＬ−リブロース、Ｌ−アラビノースとＬ−リブロース、Ｌ−リキソースとＬ−キシルロースおよびＬ−キシロースとＬ−キシルロースからなる群から選ばれるアルドースとケトース間の異性化反応をそれぞれ触媒する。
　（ロ）作用ｐＨおよび至適ｐＨ
　作用ｐＨは７．０〜１０．０であり、至適ｐＨは９．０である。
　（ハ）ｐＨ安定性
　種々のｐＨで４℃、１時間保持した場合、ｐＨ６．０〜１１．０の範囲で安定である。
　（ニ）作用温度および至適温度
  作用温度は４０〜６５℃であり、至適温度は６０℃である。
　（ホ）温度安定性
  ４０℃、１０分では安定しており、５０℃、１０分でも９０％以上残存している。
　（ヘ）キレート剤の影響
  キレート剤であるＥＤＴＡ、ＥＧＴＡを活性測定時に共存させても、ほとんど活性は阻害されない。
　（ト）金属イオンの影響
　１ｍＭのコバルトイオンにより約３０％阻害される。
　（チ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量
　約４３，０００である。」（以下、「本願発明」という。）
　
　
２．当審の拒絶理由
　一方、当審において平成２１年６月２６日付けで通知した拒絶の理由の概要は、以下のとおりである。
　
理由１（特許法第３６条第６項第１号）
　本願発明は、特許請求の範囲の記載が、特許法第３６条第６項第１号に規定する要件を満たしていない。
　
理由２（特許法第２９条第２項）
　本願発明１〜５は、その出願前に日本国内又は外国において、頒布された下記の刊行物に記載された発明又は電気通信回線を通じて公衆に利用可能となった発明に基いて、その出願前にその発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。
　
　　　　　　　　　　　　　　　　　記
　
引用例１．国際公開第２００４／０６３３６９号
引用例２．特開２００４−２９８１０５号公報
引用例３．特開２００１−３５４６９０号公報
引用例４．特開２００４−２９８１０６号公報
引用例５．特開平　７−　２４２０８号公報
引用例６．特開２００１−３３４１０３号公報
引用例７．特開平　９−１３２５８６号公報
引用例８．特開２００３−　６１７００号公報
　
　
３．引用刊行物記載の発明
［引用例１］
　当審の拒絶理由において引用され、本願の出願前の平成１６年７月２９日に頒布された刊行物である国際公開第２００４／０６３３６９号（以下、「引用例１」という。）には、以下の記載がある。
［１ａ］「
Pseudomonas
stutzerii
Pseudomonas
stutzerii
［１ｂ］「　本発明でいうL-ラムノースイソメラーゼは、Pseudomonas stutzerii LL172由来のL-ラムノースイソメラーゼであって、配列番号１に記載されるアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列の中の１個以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換され、欠失され、１個以上のアミノ酸が付加されてなるアミノ酸配列を有する。本発明でいう遺伝子（DNA）は、上記のL-ラムノースイソメラーゼをコードする塩基配列を有する。
　すなわち、本発明の対象となるタンパク質としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（L-ラムノースイソメラーゼ）や、該配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつL-ラムノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質を挙げることができる。」（明細書第１５頁第２１行〜第１６頁第１０行）
［１ｃ］「　さらに、
Pseudomonas
stutzerii
　（イ）作用
　 L-ラムノースからL-ラムニュロースへの異性化反応ならびにL-ラムニュロースからL-ラムノースへの異性化を触媒する。D-アロースとD-プシコースの間の異性化にも作用し、D-プシコースからD-アロースを生産することができる酵素である。以上が既知の主たる作用である。さらに本発明者らによりこの度明らかとなったＬ−ラムノースイソメラーゼの新規触媒反応を含めた全ての異性化反応は、イズモリングの第７図，第８図，第９図に示される。基質特異性は表１，２，３参照。
　L-ラムノースおよびL-ラムニュロースを基質とする。のみならず、Ｌ−リキソースおよびＬ−キシルロース、Ｌ−マンノースおよびＬ−フラクトース、Ｄ−リボースおよびＤ−リブロース、Ｄ−アロースおよびＤ−プシコースを基質とする。以上が既知の主たる基質特異性である。第７図，第８図，第９図よりＬ−ラムノースイソメラーゼが単糖の多くを基質とすることが理解できる。
　すなわち、活性の大小はあるものの、Ｌ−ラムノースイソメラーゼが触媒することが確認された異性化反応は第７図中太い黒線で示したものである。一方、異性化反応が確認できなかったものは、太い点線で示した４種であることが一目瞭然に理解できる。
　また、第９図、第１０図に示すように、これも活性の大小はあるものの、ペントースおよびテトロースにおける全異性化活性を持つことを示している。
　（ハ）作用ｐＨおよび至適ｐＨ
　作用ｐＨは７．０〜１０．０であり、至適ｐＨは９．０である。
　（ニ）ｐＨ安定性
　種々のｐＨで４℃、１時間保持した場合、ｐＨ６．０〜１１．０の範囲で安定である。
　（ホ）作用温度および至適温度
　作用温度は４０〜６５℃であり、至適温度は６０℃である。
　（ヘ）温度安定性
　４０℃、１０分では安定しており、５０℃、１０分でも９０％以上残存している。
　（ト）キレート剤の影響
　キレート剤であるＥＤＴＡ、ＥＧＴＡを活性測定時に共存させても、ほとんど活性は阻害されない。
　（チ）金属イオンの影響
　１ｍＭのコバルトイオンにより約３０％阻害される。
　（リ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量
　約４３，０００である。」（明細書第１６頁第１８行〜第１８頁第６行）
［１ｄ］「上記発現系を含んでなる宿主細胞を培養して得られる本発明のタンパク質は、D-アロースの生産に用いることができる。また、かかる本発明のタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。」（明細書第２０頁第１０〜１８行）
［１ｅ］「実施例２の
Pseudomonas
stutzerii
［１ｆ］表２には、Ｄ−プシコースを基質とした場合のアルドースＩの生産物がＤ−アロース、アルドースIIの生産物がＤ−アルトロースであることが記載されている。
［１ｇ］「産業上の利用可能性
　１.Ｌ−ラムノースイソメラーゼを遺伝子工学的手法によって、大量に生産することが可能となり、本酵素を用いたD-アロースを含む各種の希少糖の大量生産法を確立できる。」（明細書第３５頁第１０〜１３行）
　
　上記［１ａ］〜［１ｇ］の記載によれば、引用例１には、
「Ｌ−ラムノースイソメラーゼを固定化してＤ−プシコース基質からＤ−アロースの生産に用いる希少糖の大量生産法であって、
Ｌ−ラムノースイソメラーゼが
Pseudomonas
stutzerii
Pseudomonas
stutzerii
　（イ）作用
　 L-ラムノースからL-ラムニュロースへの異性化反応ならびにL-ラムニュロースからL-ラムノースへの異性化を触媒する。D-アロースとD-プシコースの間の異性化にも作用し、D-プシコースからD-アロースを生産することができる酵素である。以上が既知の主たる作用である。さらに本発明者らによりこの度明らかとなったＬ−ラムノースイソメラーゼの新規触媒反応を含めた全ての異性化反応は、イズモリングの第７図，第８図，第９図に示される。基質特異性は表１，２，３参照。
　L-ラムノースおよびL-ラムニュロースを基質とする。のみならず、Ｌ−リキソースおよびＬ−キシルロース、Ｌ−マンノースおよびＬ−フラクトース、Ｄ−リボースおよびＤ−リブロース、Ｄ−アロースおよびＤ−プシコースを基質とする。以上が既知の主たる基質特異性である。第７図，第８図，第９図よりＬ−ラムノースイソメラーゼが単糖の多くを基質とすることが理解できる。
　すなわち、活性の大小はあるものの、Ｌ−ラムノースイソメラーゼが触媒することが確認された異性化反応は第７図中太い黒線で示したものである。一方、異性化反応が確認できなかったものは、太い点線で示した４種であることが一目瞭然に理解できる。
　また、第９図、第１０図に示すように、これも活性の大小はあるものの、ペントースおよびテトロースにおける全異性化活性を持つことを示している。
　（ハ）作用ｐＨおよび至適ｐＨ
　作用ｐＨは７．０〜１０．０であり、至適ｐＨは９．０である。
　（ニ）ｐＨ安定性
　種々のｐＨで４℃、１時間保持した場合、ｐＨ６．０〜１１．０の範囲で安定である。
　（ホ）作用温度および至適温度
　作用温度は４０〜６５℃であり、至適温度は６０℃である。
　（ヘ）温度安定性
　４０℃、１０分では安定しており、５０℃、１０分でも９０％以上残存している。
　（ト）キレート剤の影響
　キレート剤であるＥＤＴＡ、ＥＧＴＡを活性測定時に共存させても、ほとんど活性は阻害されない。
　（チ）金属イオンの影響
　１ｍＭのコバルトイオンにより約３０％阻害される。
　（リ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量
　約４３，０００である。」の発明（以下、「引用例１発明」という。）が記載されていると認められる。
　
［引用例２］
　当審の拒絶理由において引用され、本願の出願前の平成１６年１０月２８日に頒布された刊行物である特開２００４−２９８１０５号公報（以下、「引用例２」という。）には、以下の記載がある。
［２ａ］「【請求項４】
Ｌ−ラムノースイソメラーゼを菌体から抽出したものを用いる場合は沈殿あるいは結晶化した後に、菌体そのものを用いる場合はそのまま、グルタルアルデヒドを添加し、これにより共有結合の架橋を起こさせ、さらにリジンを添加することで架橋密度をあげて強度を増すことを特徴とするＬ−ラムノースイソメラーゼの固定化法。」
［２ｂ］「【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の固定化の対象とするＬ−ラムノースイソメラーゼは、「ジャーナル・オブ・ファーメンテーション・アンド・バイオエンジニアリング（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」第８５巻、５３９乃至５４１頁（１９９８年）で発表された公知酵素である。Ｌ−ラムノースからＬ−ラムニュロースへの異性化反応ならびにＬ−ラムニュロースからＬ−ラムノースへの異性化を触媒する酵素である。Ｌ−ラムノースイソメラーゼは、Ｄ−アロースとＤ−プシコースの間の異性化にも作用するので、Ｄ−プシコースからＤ−アロースを生産することができる酵素である。
Ｌ−ラムノースイソメラーゼは、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｔｕｔｚｅｒｉｉ
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｔｕｔｚｅｒｉｉ
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｔｕｔｚｅｒｉｉ
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｔｕｔｚｅｒｉｉ
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｔｕｔｚｅｒｉｉ
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｔｕｔｚｅｒｉｉ
例えば、Ｌ−ラムノースイソメラーゼは各種の微生物をＬ−ラムノースを炭素源として培養すると、Ｌ−ラムノースが誘導剤となって菌体内に生産される。酵素を大量に構成的に産生する変異株を用いることは、Ｌ−ラムノースなどの高価な炭素源を必要としないので特に有利である。」
［２ｃ］「【００２１】
実施例
（本発明の固定化酵素の作製例）
Ｉ  新規の固定化（グルタルアルデヒド−リジン架橋法）
（Ａ）  酵素結晶の固定化
（１）菌体１０ｇを破砕し粗酵素液を得る。
（２）４−５．５％のＰＥＧ２００００を撹拌しながら徐々に添加し酵素の均一な結晶が得られるまで静置する（２４−４８時間）。
（３）結晶を生じた粗酵素液に１２．５％グルタルアルデヒドを撹拌しながら、終濃度１％になるように添加し３０分間撹拌した後、３時間以上放置する。
（４）２０％Ｌ−リジンを終濃度１％になるように添加し３０分間撹拌し、３時間以上放置する。
（５）遠心分離により架橋結晶を回収し、グリシン‐ＮａＯＨ緩衝液で２回洗浄する。
以上の条件で活性回収率は約７０％が得られる。
【００２２】
（Ｂ）微生物菌体の固定化
（１）菌体１０ｇを適量のリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁させる。
（２）結晶を生じた粗酵素液に１２．５％グルタルアルデヒドを撹拌しながら、終濃度１％になるように添加し３０分間撹拌した後、３時間以上放置する。
（３）２０％Ｌ−リジンを終濃度１％になるように添加し３０分間撹拌し、３時間以上放置する。
（４）遠心分離により架橋結晶を回収し、グリシン‐ＮａＯＨ緩衝液で２回洗浄する。
以上の条件で活性回収率は約７０％が得られる。
【００２３】
ＩＩ  本発明の固定化酵素の評価
（Ａ）固定化酵素結晶、（Ｂ）固定化微生物菌体とも、活性の約７０％を固定化することができ、１ヶ月以上バイオリアクターに使用できる。すなわち、Ｌ−ラムノースイソメラーゼの固定化酵素結晶および固定化微生物菌体ともに、従来最も広く用いられているイオン交換法と比較するとＤ−アロースなど希少糖の生産法として大きな改善が進んだ。
イオン交換法による固定化法では、活性は約１０％しか固定化できず、しかもバイオリアクターを用いるＤ−アロースの生産には約２週間のみの使用で活性がなくなった。
一方、本発明による固定化法では活性の約７０％が固定化することが可能であり、５０％Ｄ−プシコースをｐＨ９グリシン緩衝液中でのバイオリアクター反応において一ヶ月以上の安定した反応を行うことが可能であった。また、本発明によるＬ−ラムノースイソメラーゼの固定化酵素結晶および固定化微生物菌体ともに粒の大きさが従来法に比べて大きいため、バイオリアクターの送液時の圧力が低いものであった。これらのことよりＤ−アロースをＤ−プシコースから連続生産が可能となった。」
［２ｄ］「【００２４】
【発明の効果】
産業的に希少糖を大量に生産するのに有効に利用できる安定な、高活性の固定化固定化Ｌ−ラムノースイソメラーゼを提供することができる。
低い流れ抵抗を有し、充填されたカラムを通る基質の流速が速い固定化Ｌ−ラムノースイソメラーゼを提供することができる。」
　
［引用例３］
　当審の拒絶理由において引用され、本願の出願前に頒布された刊行物である特開２００１−３５４６９０号公報（以下、「引用例３」という。）には、以下の記載がある。
［３ａ］「【請求項１】  プシコースとフルクトースを含む原液から、溶離液として水を用いてプシコースを多く含むプシコース画分とフルクトースを多く含むフルクトース画分とにクロマト分離する方法において、プシコースとフルクトースに対し選択的吸着能力を有する吸着剤としてカルシウム形の陽イオン交換樹脂が充填された複数の充填塔を直列かつ無端に連結して原液および溶離液が循環可能な循環系を形成し、該循環系に、糖濃度が４０％以上、プシコース組成が２０％以上の原液、および溶離液を供給し、前記循環系を、溶離液供給部からプシコース画分抜出部までのプシコースの脱着帯域、プシコース画分抜出部から原液供給部までのプシコースの濃縮帯域、原液供給部からフルクトース画分抜出部までのプシコースの吸着帯域、フルクトース画分抜出部から溶離液供給部までのフルクトースの回収帯域の４つの帯域に区分し、各供給部および各抜出部を所定の位置関係を保ちつつ順次循環方向下流側に移行させることにより吸着剤の擬似移動層を形成して、循環液をプシコース画分とフルクトース画分とに連続的にクロマト分離することを特徴とするプシコースの分離方法。」
［３ｂ］「【請求項２】  分離したフルクトース画分を原液の製造工程に回収する、請求項１のプシコースの分離方法。」
［３ｃ］「【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、稀少糖類の一つとしてその特性や機能性が注目されるプシコースの分離方法に関し、とくに擬似移動層式のクロマト分離により、プシコースとフルクトースを含む溶液からプシコースを高純度、高回収率で連続的に分離する方法に関する。」
［３ｄ］「【００４８】
【実施例】実施例１
図２に示した擬似移動層式クロマト分離装置１１を用いて、プシコース２５％、フルコトース７５％よりなる全糖濃度４８％のプシコース原液を分離した。Ｎｏ．１〜Ｎｏ．８の各充填塔１２は内径２０ｍｍ、高さ０．４５ｍの円筒形とし、各充填塔１２内にはカルシウム形の強酸性陽イオン交換樹脂“アンバーライト”ＣＲ１２２０（ロームアンドハース社製）を１．１３Ｌ充填した。各充填塔１２内は約６０℃に保持した。この擬似移動層においてプシコース原液および溶離液としての水の供給量（１サイクル当たりの供給量）をそれぞれ以下の条件で運転した。
プシコース原液供給量    ：  ０．０８１Ｌ
水供給量                ：  ０．４８９Ｌ
フルコトース画分抜出量  ：  ０．２８６Ｌ
プシコース画分抜出量    ：  ０．２８６Ｌ
循環流量                ：  ０．９０４Ｌ
１サイクルあたりの時間  ：  ０．７２  Ｈ
定常状態において抜き出されたフルクトース画分およびプシコース画分の糖組成を表３に示す。なおプシコース画分中のプシコースの回収率は９６．０％であった。」
［３ｅ］「【００５０】実施例２
図３に示した擬似移動層式クロマト分離装置４１を用いて、実施例１と同一糖濃度のプシコース原液を下記条件で実施例１と同様にプシコースの分離を行った。Ｎｏ．１〜Ｎｏ．４の各充填塔４４は内径２８ｍｍ、高さ１．０ｍの円筒形とし、各充填塔４４にはカルシウム形の強酸性陽イオン交換樹脂“アンバーライト”ＣＲ１２２０（ロームアンドハース社製）を２．４６Ｌ充填した。充填塔４４内は約６０℃に保持した。この擬似移動層においてプシコース原液および溶離液としての水の供給量を（１サイクル当たりの供給量）をそれぞれ以下の条件で運転した。
プシコース原液供給量    ：  ０．２６８Ｌ
水供給量                ：  １．７７７Ｌ
フルコトース画分抜出量  ：  １．１８６Ｌ
プシコース画分抜出量    ：  ０．８６０Ｌ
循環流量                ：  ０．１８７Ｌ
１サイクルあたりの時間  ：  ０．７６  Ｈ
定常状態において抜き出されたフルクトース画分およびプシコース画分の糖組成を表４に示す。なおプシコース画分中のプシコースの回収率は９８．７％であった。」
　
［引用例４］
　当審の拒絶理由において引用され、本願の出願前の平成１６年１０月２８日に頒布された刊行物である特開２００４−２９８１０６号公報（以下、「引用例４」という。）には、以下の記載がある。
［４ａ］「【請求項８】
Ｄ−アロース生産固定化酵素および／または固定化微生物を用いたバイオリアクターを用いて、Ｄ−アロースに変換可能な基質を含む溶液を通液するに際し、通液する基質を含む溶液として基質のアルコールを含む溶液を用いること、前記基質の一部分をＤ−アロースに変換するために、前記基質を含む溶液と固定化粒子を前記基質をＤ−アロースに変換するのに適当な条件下で接触させること、通液後の前記基質の一部分をＤ−アロースに変換した溶液からＤ−アロースのアルコールに難溶性の性質を利用してＤ−アロースを結晶化させて回収することを特徴とする高純度Ｄ−アロースを連続的に製造する方法。
【請求項９】
結晶化後、Ｄ−アロース結晶を分離回収し、そのろ液をアルコール除去、濃縮することなしにバイオリアクターに再添加する請求項８の高純度Ｄ−アロースを連続的に製造する方法。」
［４ｂ］「【００１５】
Ｄ−プシコース等のＤ−アロースのへの変換に関する酵素反応法による本発明者らによるこれまでの製造法は、Ｄ−アロースの分離回収に関して完全に満足できるものではなく、従って工業的製造をするには未だ不経済な作業を必要としている。
これまでＤ−アロースの生産はＤ−プシコースからＬ−ラムノースイソメラーゼを用いて、Ｄ−プシコースとＤ−アロースの混合した反応液から、緩衝液を除く操作の後に、擬似移動層クロマトグラフィーを用いて分離する方法によって行われてきた。
Ｄ−プシコースは分離カラム中での挙動が幅広いブロードなピークとなるため分離する際に多量の水を要するため、濃縮を多量の水を蒸発させるという全体として非常にコストが高く一番エネルギーを消費する過程である。また酵素反応溶液から緩衝液などの分離工程も煩雑であり、脱イオン反応はエネルギーを要する操作である。この過程を改善すべく、本発明者らは、最もエネルギーの必要な過程をいかに効率よく行うかを検討するという、希少糖生産に最も重要な課題を解決する研究開発の中で生まれた。この発明の特徴は、濃縮という過程をほとんど経ないこと、および酵素反応における緩衝液を除く操作も必要でないということ、操作全体が非常に簡便であると言う大きな利点がある。」
　
［引用例５］
　当審の拒絶理由において引用され、本願の出願前に頒布された刊行物である特開平７−２４２０８号公報（以下、「引用例５」という。）には、以下の記載がある。
［５ａ］「【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、２以上の物質を含む原液中から、吸着材を用いて特定の物質を分離する擬似移動層によるクロマト分離法に関するものであり、例えば、アミノ酸・糖類・核酸・抗生物質・ビタミン等の各種生理活性物質や、食品の分離、精製に用いることができるクロマト分離法に関する。」
［５ｂ］「【００２７】以上のような装置における擬似移動層方式のクロマト分離操作は、いま、原液が弁４４を通じてカラムＣ5 に供給されている時点とすると、溶離液は弁３８を通じてカラムＣ1 に供給され、Ａ成分区分液は弁１２を通じてカラムＣ2 から抜き出され、Ｂ成分区分液は弁２６を通じてカラムＣ6 から抜き出される。なおこの操作時においては、カラムＣ8 およびＣ7 において吸着力が弱い物質の回収帯域（以下、ゾーンＩと言う）が形成され、同様に、カラムＣ6 およびＣ5 において吸着力が強い物質の吸着帯域（以下、ゾーンIIと言う）、カラムＣ4 およびＣ3 において吸着力が強い物質の濃縮帯域（以下、ゾーンIII と言う）、カラムＣ2 およびＣ1 において吸着力が強い物質の脱着帯域（以下、ゾーンIVと言う）が形成されている。」
［５ｃ］「【００３２】実施例１
ラムノース３５．０％、リボース１０％、リキソース１５％、アラビノ一スｌ０％、キシロース３０％よりなる全糖濃度１０％の原料液を図１で説明したフローに準じて擬似移動層式のクロマト分離装置により、溶離液に９０％エタノール溶液を用いてラムノースを分離した。この時、原液の溶媒は溶離液と同じく予め９０％エタノールに調整した。この実施例においては溶離液中のエタノールが各物質の吸着材に対する吸着性に直接関与するものである。
【００３３】なお単位カラムＣ1 〜Ｃ8 は内径ｌ０８ｍｍ、高さ１．８ｍの円筒であり、円筒内には硫酸イオン形の強塩基性陰イオン交換樹脂アンバーライトＣＧ−４００（商標：ロームアンドハース社製）が合計１３２Ｌ（リットル）充填されている。各単位カラム内は７５℃に保持した。この擬似移動層において原料液および溶離液の供給量をそれぞれ６．６Ｌ／ｈ、１６５Ｌ／ｈ、ラムノース区分液およびキシロース区分液の抜き出し量をそれぞれ３３．０Ｌ／ｈ、１３８．６Ｌ／ｈ、で行なった。また、原料液および溶離液供給口ならびにラムノース区分液およびキシロース区分液抜き出し口の移動は３８．０分毎として運転した。
【００３４】定常状態において抜き出されたラムノース区分液とキシロース区分液中の糖組成を表１に示す。なおラムノース区分液中のラムノースの回収率は９５．０％であった。」
　
［引用例６］
　当審の拒絶理由において引用され、本願の出願前に頒布された刊行物である特開２００１−３３４１０３号公報（以下、「引用例６」という。）には、以下の記載がある。
［６ａ］「【００４５】
【実施例】図１に示したクロマト分離装置１を用いて、グルコース５２％、フルクトース４２％、二糖類６％よりなる全糖濃度６０％の原液を、擬似移動層クロマト分離装置で水を溶離液として用いて分離した。図１に示した装置において、各単位充填塔４は内径２０ｍｍ、高さ０．９ｍの円筒形の充填塔４とし、各充填塔４内にカルシウム型の強酸性陽イオン交換樹脂”アンバーライト”ＣＲ１２２０（ロームアンドハース社製）を１．１３Ｌ充填した。各単位充填塔４内は約６０℃に保持した。この擬似移動層において表１の運転工程にしたがい、また、原液および水の供給量（１サイクル当たりの供給量）をそれぞれ以下の条件で運転した。
原液供給量                    ０．０２３Ｌ
水供給量                      ０．２２６Ｌ
グルコース  区分液抜出量      ０．１３６Ｌ
フルクトース区分液抜出量      ０．１１３Ｌ
循環量                        ０．７５４Ｌ
１サイクルあたりの時間        ０．４０  Ｈ
定常状態において抜き出されたグルコース区分液（非吸着質画分：第１の画分）およびフルクトース区分液（吸着質画分：第２の画分）の糖組成を表２に示す。また、その回収率を表３に示す。」
　
　
４．対比
　本願発明と引用例１発明とを対比する。
（ア）引用例１発明の
「Ｌ−ラムノースイソメラーゼが
Pseudomonas
stutzerii
Pseudomonas
stutzerii
および
「　（イ）作用
　 L-ラムノースからL-ラムニュロースへの異性化反応ならびにL-ラムニュロースからL-ラムノースへの異性化を触媒する。D-アロースとD-プシコースの間の異性化にも作用し、D-プシコースからD-アロースを生産することができる酵素である。以上が既知の主たる作用である。さらに本発明者らによりこの度明らかとなったＬ−ラムノースイソメラーゼの新規触媒反応を含めた全ての異性化反応は、イズモリングの第７図，第８図，第９図に示される。基質特異性は表１，２，３参照。
　L-ラムノースおよびL-ラムニュロースを基質とする。のみならず、Ｌ−リキソースおよびＬ−キシルロース、Ｌ−マンノースおよびＬ−フラクトース、Ｄ−リボースおよびＤ−リブロース、Ｄ−アロースおよびＤ−プシコースを基質とする。以上が既知の主たる基質特異性である。第７図，第８図，第９図よりＬ−ラムノースイソメラーゼが単糖の多くを基質とすることが理解できる。
　すなわち、活性の大小はあるものの、Ｌ−ラムノースイソメラーゼが触媒することが確認された異性化反応は第７図中太い黒線で示したものである。一方、異性化反応が確認できなかったものは、太い点線で示した４種であることが一目瞭然に理解できる。
　また、第９図、第１０図に示すように、これも活性の大小はあるものの、ペントースおよびテトロースにおける全異性化活性を持つことを示している。
　（ハ）作用ｐＨおよび至適ｐＨ
　作用ｐＨは７．０〜１０．０であり、至適ｐＨは９．０である。
　（ニ）ｐＨ安定性
　種々のｐＨで４℃、１時間保持した場合、ｐＨ６．０〜１１．０の範囲で安定である。
　（ホ）作用温度および至適温度
　作用温度は４０〜６５℃であり、至適温度は６０℃である。
　（ヘ）温度安定性
　４０℃、１０分では安定しており、５０℃、１０分でも９０％以上残存している。
　（ト）キレート剤の影響
　キレート剤であるＥＤＴＡ、ＥＧＴＡを活性測定時に共存させても、ほとんど活性は阻害されない。
　（チ）金属イオンの影響
　１ｍＭのコバルトイオンにより約３０％阻害される。
　（リ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量
　約４３，０００である。」
は、本願発明の
「配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、以下の（イ）〜（チ）の物理化学的性質によって特定されるPseudomonas stutzeri(IPOD FERM BP-08593)由来L-ラムノースイソメラーゼ」および
「　（イ）作用
　Ｄ−グルコースとＤ−フラクトース、Ｄ−アロースとＤ−プシコース、Ｄ−アルトロースとＤ−プシコース、Ｄ−グロースとＤ−ソルボース、Ｌ−グルコースとＬ−フラクトース、Ｌ−マンノースとＬ−フラクトース、Ｌ−アルトロースとＬ−プシコース、Ｌ−タロースとＬ−タガトース、Ｌ−ガラクトースとＬ−タガトース、Ｌ−グロースとＬ−ソルボース、Ｄ−アラビノースとＤ−リブロース、Ｄ−リボースとＤ−リブロース、Ｌ−リボースとＬ−リブロース、Ｌ−アラビノースとＬ−リブロース、Ｌ−リキソースとＬ−キシルロースおよびＬ−キシロースとＬ−キシルロースからなる群から選ばれるアルドースとケトース間の異性化反応をそれぞれ触媒する。
　（ロ）作用ｐＨおよび至適ｐＨ
　作用ｐＨは７．０〜１０．０であり、至適ｐＨは９．０である。
　（ハ）ｐＨ安定性
　種々のｐＨで４℃、１時間保持した場合、ｐＨ６．０〜１１．０の範囲で安定である。
　（ニ）作用温度および至適温度
  作用温度は４０〜６５℃であり、至適温度は６０℃である。
　（ホ）温度安定性
  ４０℃、１０分では安定しており、５０℃、１０分でも９０％以上残存している。
　（ヘ）キレート剤の影響
  キレート剤であるＥＤＴＡ、ＥＧＴＡを活性測定時に共存させても、ほとんど活性は阻害されない。
　（ト）金属イオンの影響
　１ｍＭのコバルトイオンにより約３０％阻害される。
　（チ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量
　約４３，０００である。」
に相当する。
（イ）引用例１発明の「Ｌ−ラムノースイソメラーゼを固定化」することと本願発明の「酵素を菌体から抽出したものを用いる場合は沈殿させた後に、菌体そのものを用いる場合はそのまま、グルタルアルデヒドにより架橋して共有結合法によって固定化」することとは、「酵素を固定化」する点で共通する。
（ウ）引用例１発明の「Ｌ−ラムノースイソメラーゼ」を「Ｄ−プシコース基質からＤ−アロースの生産に用いる」ことは本願発明の「L-ラムノースイソメラーゼの作用で基質希少糖Ｄ−プシコースから目的希少糖Ｄ−アロースへ変換」することに相当する。
（エ）引用例１発明の「希少糖の大量生産法」は、希少糖として「Ｄ−アロース」を生産するものであるから、本願発明の「希少糖Ｄ−アロースの生産方法」に相当する。
　したがって、両者は、
「配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、以下の（イ）〜（チ）の物理化学的性質によって特定されるPseudomonas stutzeri(IPOD FERM BP-08593)由来L-ラムノースイソメラーゼを、酵素を固定化したL-ラムノースイソメラーゼの作用で基質希少糖Ｄ−プシコースから目的希少糖Ｄ−アロースへ変換する、希少糖Ｄ−アロースの生産方法。
　（イ）作用
　Ｄ−グルコースとＤ−フラクトース、Ｄ−アロースとＤ−プシコース、Ｄ−アルトロースとＤ−プシコース、Ｄ−グロースとＤ−ソルボース、Ｌ−グルコースとＬ−フラクトース、Ｌ−マンノースとＬ−フラクトース、Ｌ−アルトロースとＬ−プシコース、Ｌ−タロースとＬ−タガトース、Ｌ−ガラクトースとＬ−タガトース、Ｌ−グロースとＬ−ソルボース、Ｄ−アラビノースとＤ−リブロース、Ｄ−リボースとＤ−リブロース、Ｌ−リボースとＬ−リブロース、Ｌ−アラビノースとＬ−リブロース、Ｌ−リキソースとＬ−キシルロースおよびＬ−キシロースとＬ−キシルロースからなる群から選ばれるアルドースとケトース間の異性化反応をそれぞれ触媒する。
　（ロ）作用ｐＨおよび至適ｐＨ
　作用ｐＨは７．０〜１０．０であり、至適ｐＨは９．０である。
　（ハ）ｐＨ安定性
　種々のｐＨで４℃、１時間保持した場合、ｐＨ６．０〜１１．０の範囲で安定である。
　（ニ）作用温度および至適温度
  作用温度は４０〜６５℃であり、至適温度は６０℃である。
　（ホ）温度安定性
  ４０℃、１０分では安定しており、５０℃、１０分でも９０％以上残存している。
　（ヘ）キレート剤の影響
  キレート剤であるＥＤＴＡ、ＥＧＴＡを活性測定時に共存させても、ほとんど活性は阻害されない。
　（ト）金属イオンの影響
　１ｍＭのコバルトイオンにより約３０％阻害される。
　（チ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量
　約４３，０００である。」である点で一致し、以下の点で相違している。
［相違点１］酵素の固定化を、本願発明では、菌体から抽出したものを用いる場合は沈殿させた後に、菌体そのものを用いる場合はそのまま、グルタルアルデヒドにより架橋して共有結合法によって行うのに対し、引用例１発明では、具体的な手法が不明である点。
［相違点２］変換された希少糖Ｄ−アロースについて、本願発明では、「得られる原液は全糖濃度が４０％以上で、Ｄ−アロースを全固形分中２０重量％以上のＤ−アロース原液として得られ、その原液から、溶離液として水を用いて目的希少糖Ｄ−アロース画分と基質希少糖Ｄ−プシコース画分とにクロマト分離すること、該クロマト分離が、基質希少糖と目的希少糖に対し選択的吸着能力を有する吸着剤としてカルシウム型の陽イオン交換樹脂が充填された複数の充填塔を直列かつ無端に連結して原液および溶離液が循環可能な循環系を形成し、該循環系に、原液および溶離液を供給し、前記循環系を、溶離液供給部から目的希少糖画分抜出部までの目的希少糖の脱着帯域、目的希少糖画分抜出部から原液供給部までの目的希少糖の濃縮帯域、原液供給部から基質希少糖画分抜出部までの基質希少糖の吸着帯域、基質希少糖画分抜出部から溶離液供給部までの基質的希少糖の回収帯域の４つの帯域に区分し、各供給部および各抜出部を所定の位置関係を保ちつつ順次循環方向下流側に移行させることにより吸着剤の擬似移動層を形成して、循環液を目的希少糖画分と基質希少糖画分とに連続的にクロマト分離する」のに対し、引用例１発明では上記事項が限定されていない点で相違する。
　
　
５．当審の判断
　上記相違点について検討する。
［相違点１］について
　酵素を固定化する際に、菌体から抽出したものを用いる場合は沈殿あるいは結晶化した後に、菌体そのものを用いる場合はそのまま、グルタルアルデヒドを添加し、これにより共有結合の架橋を起こさせることは、引用例２の［２ａ］および［２ｃ］に記載されているように、本願の出願前において公知である。そして、引用例２の固定化の手法は、［２ｄ］に記載されるように「産業的に希少糖を大量に生産するのに有効に利用できる安定な、高活性の固定化固定化Ｌ−ラムノースイソメラーゼを提供すること」を課題としているといえるが、本願発明も明細書の段落【００１８】に「固定化酵素は、例えばL-ラムノースイソメラーゼを共有結合法によって固定化したものを用いる。…この固定化法によって、これまで１週間ほどの安定性であったものが数ヶ月の安定性を持つ固定化酵素を得ることができる。」と記載されているように、安定性を持つ固定化酵素を得ることを課題としているものである。そして、［２ｂ］に記載されるように、引用例２ににおいて用いられた酵素は、本願発明において用いられる酵素と同じ菌株から得られた同じＬ−ラムノースイソメラーゼ活性を有する酵素であるから、本願発明において用いられるＬ−ラムノースイソメラーゼの固定化の手法として、引用例２に記載された手法を採用した場合に、安定に酵素活性を維持できるであろうことは、当業者であれば通常予測しうることである。請求人は、平成２１年８月３１日付けの意見書において、「活性のある酵素を本方法によって得ることは試行錯誤での結果による成功しかない状態にある」と主張しているが、上述のとおり、引用例２の固定化の手法は、本願発明と同じ菌株から得られた同じＬ−ラムノースイソメラーゼ活性を有する酵素において、本願発明が課題とする効果についてすでに実証されているものである。
　したがって、引用例１発明における酵素の固定化を、引用例２に記載された手法を採用し、相違点１における本願発明の構成とすることは、当業者が容易に想到しうることである。
　
［相違点２］について
　本願発明は、明細書の段落【０００４】の記載によれば、「希少糖を含む原液を擬似移動層により連続的に目的希少糖画分としてクロマト分離する精製希少糖の大量生産方法を提供すること」を目的とするものであるが、様々な糖類を分離精製して大量生産する際に、原液を擬似移動層により連続的にクロマト分離することにより行うことは周知である。例えば、引用例３の［３ａ］、［３ｄ］、［３ｅ］には、プシコースとフルクトースを含む原液を擬似移動層を形成してプシコース画分とフルクトース画分とに連続的にクロマト分離することが記載されている。また、引用例４の［４ｂ］には、Ｄ−プシコースとＤ−アロースの混合した反応液から、擬似移動層クロマトグラフィーを用いて分離してＤ−アロースを生産することが記載されている。さらに、引用例５には、糖類の分離、精製に用いることができるクロマト分離法（［５ａ］参照）として、［５ｃ］に、ラムノース、リボース、リキソース、アラビノース、キシロースよりなる原料液を擬似移動層式のクロマト分離装置により、ラムノースを分離したことが記載されている。また、引用例６の［６ａ］には、グルコース、フルクトース、二糖類よりなる原液を、擬似移動層クロマト分離装置で分離することが記載されている。上記周知技術に例示されるように、擬似移動層を用いたクロマト分離は、自然界に多量に存在するものや微量にしか存在しないものを含めた様々な糖類の分離精製に慣用されている分離精製手法であり、引用例４には希少糖Ｄ−プシコースと希少糖Ｄ−アロースの分離に適用することも記載されている。
　また、分離精製を行う際に、一般に原料の濃度が高いほど高純度、高回収率で分離精製が行えることは自明であり、引用例３の［３ａ］、［３ｄ］、［３ｅ］には、全糖濃度が４０％以上で目的物であるプシコース濃度が２０％以上の原液を用いることが記載されており、引用例６の［６ａ］には、全糖濃度が６０％でグルコース５２％、フルクトース４２％を含む原液を用いることが記載されている。
　さらに、糖類を擬似移動層によりクロマト分離を行う際に、カルシウム形の陽イオン交換樹脂を用いることは周知である。例えば、引用例３の［３ａ］には、生産対象糖類としてのプシコースと生産対象糖類ではないフルクトースに対し選択的吸着能力を有する吸着剤としてカルシウム形の陽イオン交換樹脂が充填された複数の充填塔を直列かつ無端に連結して原液および溶離液が循環可能な循環系を形成し、吸着剤の擬似移動層を形成して、循環液をプシコース画分とフルクトース画分とに連続的にクロマト分離することが記載されており、引用例６の［６ａ］には、擬似移動層クロマト分離装置の各充填塔４内にカルシウム型の強酸性陽イオン交換樹脂”アンバーライト”ＣＲ１２２０（ロームアンドハース社製）を１．１３Ｌ充填したことが記載されている。
　また、擬似移動層によりクロマト分離を行う際に、循環系を脱着帯域、濃縮帯域、吸着帯域および回収帯域の４つの帯域に区分することは周知である。例えば、引用例３の［３ａ］には、循環系を、溶離液供給部からプシコース画分抜出部までのプシコースの脱着帯域、プシコース画分抜出部から原液供給部までのプシコースの濃縮帯域、原液供給部からフルクトース画分抜出部までのプシコースの吸着帯域、フルクトース画分抜出部から溶離液供給部までのフルクトースの回収帯域の４つの帯域に区分して吸着剤の擬似移動層を形成し連続的にクロマト分離することが記載されており、引用例５の［５ｂ］には、擬似移動層方式のクロマト分離操作において、吸着力が弱い物質の回収帯域、吸着力が強い物質の吸着帯域、吸着力が強い物質の濃縮帯域、吸着力が強い物質の脱着帯域が形成されることが記載されている。
　したがって、糖の生産方法である引用例１発明において、糖類を分離精製する周知の手法である擬似移動層によるクロマト分離を採用し、その際の原液の濃度を全糖濃度が４０％以上で、Ｄ−アロースを全固形分中２０重量％以上のＤ−アロース原液とすること、カルシウム形の陽イオン交換樹脂を用いること、循環系を脱着帯域、濃縮帯域、吸着帯域および回収帯域の４つの帯域に区分することにより、相違点２における本願発明の構成とすることは、当業者が容易に想到しうることである。
　
　そして、クロマトグラフィーによる分離精製技術は、分離対象物質が自然界に微量に存在するか多量に存在するかに関わりなく移動相と固定相との間の分配係数の差異によって行われるものであり、分離対象物質の製造手法に左右されるものではない。中でも擬似移動層を用いたクロマトグラフィーは、そもそも、糖類のように物理化学的性質が類似するために通常のクロマトグラフのカラムでは分離しにくい物質同士を分離するために複数のカラムを直列で無端となるように連結して分離段数を増やし、大量の原料を分離するために連続的に導入できるようにした技術であるから、希少糖を含めた様々な糖類の分離精製に用いられる周知の擬似移動層の手法が、引用例１発明のＤ−アロースおよびＤ−プシコースを含む混合物の分離精製にも同様の作用効果をもたらすであろうことは、試行錯誤を要することもなく当業者が十分に予測しうることである。
　また、分離精製を行う際の原液の濃度を全糖濃度が４０％以上で、Ｄ−アロースを全固形分中２０重量％以上とすることにより、臨界的な効果の差異を生じるとはいえない。
　したがって、本願発明の効果は、引用例１〜６に記載された発明から当業者が予測できる範囲のものであって、格別なものであるとはいえない。
　
　したがって、本件発明は、引用例１〜６に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。
　
　
６．むすび
　以上のとおり、本願発明は、引用例１〜６に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。
　したがって、その他の請求項に係る発明について言及するまでもなく、本願は拒絶すべきものである。
　よって、結論のとおり審決する。