【手続補正書】
【提出日】平成24年10月25日(2012.10.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物であって、画分分子量が５０００以下の画分であることを特徴とする、低分子量ロイヤルゼリー画分。
【請求項２】
ロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物が、画分分子量が５０００以下の限外濾過膜を用いて得られるものであることを特徴とする、請求項１に記載の低分子量ロイヤルゼリー画分。
【請求項３】
前記低分子量ロイヤルゼリー画分からなるセラミド分泌促進剤。
【請求項４】
前記セラミド分泌促進作用が、角化細胞から細胞間脂質へのセラミド分泌促進作用によるものであることを特徴とする、請求項３に記載のセラミド分泌促進剤。
【請求項５】
前記セラミド分泌促進作用が、タイトジャンクション機能促進作用によるものであることを特徴とする、請求項３又は４に記載のセラミド分泌促進剤。
【請求項６】
タイトジャンクション機能促進作用が、経上皮細胞電気抵抗値（TER：transepithelial electrical resistance）を向上せしめる作用であることを特徴とする、請求項５に記載のセラミド分泌促進剤。
【請求項７】
請求項３〜６の何れか一項に記載のセラミド分泌促進剤を含有する皮膚外用剤。
【請求項８】
請求項３〜６の何れか一項に記載のセラミド分泌促進剤を皮膚外用剤全量に対し、０．００００１質量％〜１０質量％含有することを特徴とする、請求項７に記載の皮膚外用剤。
【請求項９】
肌荒れ改善、又は、抗老化用であることを特徴とする、請求項７又は８に記載の皮膚外用剤。
【請求項１０】
前記ロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物を含有する皮膚外用剤の製造方法であって、ロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物を限外濾過し、画分分子量が５０００以下の画分を得た後、当該画分を皮膚外用剤に含有させることを特徴とする、皮膚外用剤の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
セラミドは、スフィンゴシンと脂肪酸がアミド結合したスフィンゴ脂質であり、角化細胞（keratinocytes）が角層細胞（corneocytes）になる直前にラメラボディより細胞外に放出されたグルコシルセラミドやスフィンゴミエリンが、角層において酵素反応によりセラミドへと変換され、角層細胞間脂質成分となる。詳しくは、角化細胞におけるラメラボディには、リン脂質、グルコシルセラミド、スフィンゴミエリン、コレステロ−ルなどの脂質に加え、スフィンゴミエリナ−ゼやβ−グルコセレブロシダ−ゼ等の酵素が存在し、これらが角化細胞外に放出され、角層細胞間において酵素変換を受けることにより細胞間脂質であるセラミドが供給される（例えば、非特許文献１を参照）。この様な過程では、角化細胞内において合成されるセラミドの標的部位への配向が阻害されることなどの理由により、角化細胞内におけるセラミド合成、細胞間脂質のセラミド供給量、更には、肌改善作用との間には直線的な関係が存在しない。また、角層細胞間脂質中におけるセラミド量の減少は、バリア機能又は保湿機能の機能低下に深く関与するため、皮膚外用剤などの形態によりセラミドを直接的に補給する試みも行われている（例えば、特許文献１を参照）が、いずれの方法においても、前記皮膚症状に対する満足のいく予防又は改善効果が得られておらず、新たな作用機序を介し予防又は改善効果を発揮する物質が求められていた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
タイトジャンクション（TJ）は、細胞の周囲にベルト状に存在し、隣り合った細胞同士を密着させ隙間を塞ぐと共に、連続的に細胞を繋ぎ止める役割を果たしている。表皮の顆粒層に存在し細胞同士を密着させるTJは、水や物質が細胞間隙を透過するのを防ぎ、バリア機能を維持するために重要な役割を果たしている（例えば、非特許文献２、非特許文献３を参照）。また、TJには、前記の物理的機能に加え、TJを介する物質の移送調節に関わる生物活性、例えば、カルシウムイオン透過性を調節しイオン分布の均衡を保つことにより、表皮細胞の分化、成熟、更には、肌状態に影響を及ぼすことなどが知られている（例えば、非特許文献４を参照）。しかしながら、セラミドの移送との関わりに付いては全く知られていないし、TJの機能を促進することにより、角層細胞間脂質の構成成分、取り分け、セラミド分泌量が増加すること、更には、肌荒れ又は抗老化現象に対する予防又は改善に有効であることは全く知られていなかった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
また、角層細胞間脂質中のセラミド量を増加させる成分としては、ニコチン酸及びその誘導体（例えば、特許文献１を参照）、α−トコフェリルリン酸誘導体（例えば、特許文献２を参照）、コメ、クズ、アンズ、スイカズラ、ユキノシタ等より得られる植物抽出物（例えば、特許文献３を参照）、マンネンダケより得られる抽出物（例えば、特許文献４を参照）等にセラミド合成促進作用が存することが知られている。しかしながら、表皮細胞のラメラボディに存するセラミド、並びに、グルコシルセラミドやスフィンゴミエリン等のセラミド関連物質の分泌を促進することにより角層細胞間脂質中におけるセラミド量を増加させる作用を有する成分、即ち、セラミド分泌促進剤に関しては、全く知られていなかった。さらに、ロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物に角質細胞間脂質中におけるセラミド量を増加させるセラミド分泌促進作用が存すること、加えて、ロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物を精製することによりその効果が高められることは全く知られていなかった。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明はこの様な状況下において為されたものであり、肌荒れ改善又は抗老化用に好適な、低分子量ロイヤルゼリー画分を含有する皮膚外用剤を提供することを課題とする。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
この様な状況に鑑みて、本発明者等は、肌荒れ改善又は抗老化用に好適な、新規なセラミド分泌促進剤を求めて鋭意努力を重ねた結果、ロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物に優れたセラミド分泌促進作用が存することを見出した。また、限外濾過等の方法によりロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物を精製することにより、分子量５０００以下の画分に優れたセラミド分泌促進作用が存することを見出した。また、このロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物が有するセラミド分泌促進作用は、顆粒層に存在するTJの機能促進作用と深く関係していることを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明の内容は、以下に示す通りである。
＜１＞ ロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物であって、画分分子量が５０００以下の画分であることを特徴とする、低分子量ロイヤルゼリー画分。
＜２＞ ロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物が、画分分子量が５０００以下の限外濾過膜を用いて得られるものであることを特徴とする、＜１＞に記載の低分子量ロイヤルゼリー画分。
＜３＞ 前記低分子量ロイヤルゼリー画分からなるセラミド分泌促進剤。
＜４＞ 前記セラミド分泌促進作用が、角化細胞から細胞間脂質へのセラミド分泌促進作用によるものであることを特徴とする、＜３＞に記載のセラミド分泌促進剤。
＜５＞ 前記セラミド分泌促進作用が、タイトジャンクション機能促進作用によるものであることを特徴とする、＜３＞又は＜４＞に記載のセラミド分泌促進剤。
＜６＞ タイトジャンクション機能促進作用が、経上皮細胞電気抵抗値（TER：transepithelial electrical resistance）を向上せしめる作用であることを特徴とする、＜５＞に記載のセラミド分泌促進剤。
＜７＞ ＜３＞〜＜６＞の何れかに記載のセラミド分泌促進剤を含有する皮膚外用剤。
＜８＞ ＜３＞〜＜６＞の何れかに記載のセラミド分泌促進剤を皮膚外用剤全量に対し、０．００００１質量％〜１０質量％含有することを特徴とする、＜７＞に記載の皮膚外用剤。
＜９＞ 肌荒れ改善、又は、抗老化用であることを特徴とする、＜７＞又は＜８＞に記載の皮膚外用剤。
＜１０＞ 前記ロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物を含有する皮膚外用剤の製造方法であって、ロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物を限外濾過し、画分分子量が５０００以下の画分を得た後、当該画分を皮膚外用剤に含有させることを特徴とする、皮膚外用剤の製造方法。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
【図１】本発明のロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物より得られる分子量５，０００以下の画分、又は、分子量５，０００より大きい画分のＴＥＲ値測定の結果に関する図である。
【図２】本発明のロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物より得られる分子量５，０００以下の画分、又は、分子量５，０００より大きい画分のセラミド分泌促進作用評価の測定結果に関する図である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
＜本発明のセラミド分泌促進剤＞
本発明の皮膚外用剤は、ロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物を精製した分子量５０００以下の画分を含有することを特徴とする。セラミドは、スフィンゴシンと脂肪酸がアミド結合したスフィンゴ脂質の一種であり、角層細胞間脂質の重要な構成成分である。本発明のセラミド分泌促進剤であるロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物を精製することにより得られる分子量５０００以下の画分は、角層細胞間脂質におけるセラミド含有量を増加させる作用を有する。本発明のセラミド分泌促進剤としては、角化細胞内のラメラボディに存在するセラミド関連物質（セラミド、並びに、グルコシルセラミド及びスフィンゴミエリン等のセラミド前駆体）の分泌促進作用を有する物質が好ましく、具体的には、後述する「正常ヒト表皮細胞を用いたセラミド分泌量の評価」において、ベヒクルに比較し、セラミド分泌量が増加した物質が好適に例示出来、さらに好ましいものとしては、ベヒクルに比較し、セラミド分泌量が統計的に有意に増加している物質が好適に例示出来る。また、前記の角化細胞のラメラボディに存在するセラミド関連物質の分泌促進作用は、TJ機能促進作用により誘導されるものであることが好ましい。TJの機能促進作用は、経上皮細胞電気抵抗値（TER：transepithelial electrical resistance）を測定し、当該測定値を指標として推定することが出来る。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
前記のTJ機能促進作用は、例えば、特開２００７−１７６８３０号公報に記載の「表皮角化細胞層膜を介しての物質移動の抑制による皮膚バリア機能の測定」に記載された方法に従い、正常ヒト表皮角化細胞（NHEK）を用い、経上皮細胞電気抵抗値（TER：transepithelial electrical resistance）を測定することにより評価することが出来る。また、該方法以外にTJ機能促進作用を評価する方法としては、前記非特許文献４に記載の３次元表皮モデル又は生体皮膚を用いたビオチン標識拡散トレ−サ−による物質移動確認法、培養細胞シ−トを用いたＦＩＴC-dextran透過性試験法、フリ−ズフラクチャ−法によるTJストランド観察にてストランドの出来具合を判別する等により機能を類推する方法などが存するが、操作の簡便性、測定感度及び精度等を考慮した場合、前記のＴＥＲ値測定が好ましい。本発明におけるTJ機能促進作用を有する物質を具体的に挙げれば、後述する「ヒト表皮角化細胞を用いたTJ機能の評価」において、各ＴＥＲ値測定時間の何れかにおいて、被検試料を添加したサンプルのＴＥＲ値が、コントロ−ルのＴＥＲ値に比較し高い物質などが好適に例示出来る。前記TJ機能促進作用を有する物質の内、より好ましいものとしては、ＴＥＲ値を測定した何れかの濃度において、全ての測定時間（初期値を除く）において、被検試料を添加したサンプルのＴＥＲ値が、コントロ−ルのＴＥＲ値に比較し高い物質が好適に例示出来る。後述の通り、当該試験方法をはじめとするTJ機能評価系によりTJ機能促進作用が認められた物質には、セラミド分泌促進作用も認められる。この様な角化細胞内のラメラボディから角層細胞間脂質へのセラミド関連物質の分泌促進作用は、カルシウムイオンなどの様々な情報伝達物質等の透過性を調節し、細胞内情報伝達系に影響を与えることにより発揮されると考えられる。従って、TJの機能促進作用を以って、角化細胞のラメラボディより角層細胞間脂質に分泌されセラミド含有量が上がる作用を推定すること、即ち、セラミドの分泌促進作用の代替値として、前記のTJの機能促進作用を用いることも出来る。かかる作用を有する成分を、TJ機能促進作用を機作とするセラミド分泌促進剤と見なすことが出来る。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
前記のＴＪ機能促進作用を作用機序とするセラミド分泌促進剤としては、ロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物を精製した分子量５，０００以下の画分が好適に例示出来る。ロイヤルゼリー蛋白質の化学的組成は、生産地により、多少の差異はあるが、水分６５〜７０％、蛋白質１５〜２０％、炭水化物１０〜１５％、脂肪１．７〜６％、灰分０．７〜２％含むとされている。ロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物の生物学的・薬理学的作用に付いては、老化予防作用、酵素作用、抗菌作用、抗腫瘍作用、血液・循環器に対する作用などが知られている。本発明のセラミド分泌促進剤であるロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物を精製した分子量５，０００以下の画分は、ロイヤルゼリー、乾燥ロイヤルゼリー等のあらゆるロイヤルゼリーから調整することが可能である。特に、ロイヤルゼリー加水分解物は、ロイヤルゼリー、乾燥ロイヤルゼリー等よりアルコ−ル、多価アルコ−ル、水又はそれらの混合物を使用し蛋白質を抽出後、プロテア−ゼなどの蛋白質分解酵素、塩酸、硫酸等の酸溶液で加水分解して調整することが可能である。ロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物は、それらを溶液状で使用することも出来るし、それらを乾燥し粉体状にして使用することも出来る。さらに、前記のロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物は、濾過（限外濾過を含む）、遠心分離等の工程を加え精製することが好ましい。使用するプロテア−ゼには、特段の限定はなく、微生物由来や植物由来のプロテア−ゼ、中性プロテア−ゼ、アルカリプロテア−ゼをはじめ、ペプシン、トリプシンなどの動物由来のプロテア−ゼなど、通常工業的に使用されているものを広く利用することが出来、これらのプロテア−ゼを数種類組み合わせて使用することも可能である。本発明のロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物としては、前述したロイヤルゼリー及び／又はその加水分解物を精製した分子量５，０００以下の画分であれば、特段の限定なく適応することが出来るが、より好ましいものとしては、ロイヤルゼリー水溶液を酵素により処理し、酵素を失活させた後、精製、滅菌濾過したロイヤルゼリー由来の糖蛋白質の加水分解物（以下、片倉チッカリン株式会社製のものに限って、「ロイヤルビオサイト」と称する場合も存する）を精製した分子量５，０００以下の画分が好適に例示出来る。また、該ロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物は、前述した方法に従い製造することも出来るし、山田養蜂場（岡山県苫田郡）、片倉チッカリン株式会社等より市販されているロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物を使用することも出来る。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明のセラミド分泌促進剤であるロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物を精製した分子量５０００以下の画分は、皮膚外用剤全量に対し、０．００００１質量％〜１０質量％、より好ましくは、０．０００１質量％〜５質量％、さらに好ましくは、０．００１質量〜３質量％含有させることが好ましい。これは、セラミド分泌促進剤の含有量が、少なすぎると角化細胞内のラメラボディに存在するセラミド関連物質の分泌を促進する作用が発揮されず、多すぎても、効果が頭打ちになり、この系の自由度を損なう場合が存するためである。また、かかる成分は、表皮の角化細胞内のラメラボディに存するセラミド関連物質の分泌を促進する作用、標的部位への集積性及び選択性に優れ、高い安全性及び安定性を有するために、医薬、食品、化粧料などへの使用が好ましい。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
＜本発明のセラミド分泌促進剤を含有する皮膚外用剤＞
本発明の皮膚外用剤は、必須成分としてセラミド分泌促進剤であるロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物を精製した分子量５，０００以下の画分を含有することを特徴とする。本発明におけるセラミド分泌促進剤は、角層細胞間脂質におけるセラミド含有量を増加させる作用を有する物質を意味する。本発明のセラミド分泌促進剤としては、角化細胞内のラメラボディに存在するセラミド関連物質（セラミド、並びに、グルコシルセラミド及びスフィンゴミエリン等のセラミド前駆体）の分泌促進作用を有する物質が好ましく、具体的には、後述する「正常ヒト表皮細胞を用いたセラミド分泌量の評価」において、ベヒクルに比較し、セラミド分泌量が増加した物質が好適に例示出来、さらに好ましいものとしては、べヒクルに比較し、セラミド分泌量が統計的に有意に増加している物質が好適に例示出来る。また、前記の角化細胞のラメラボディに存在するセラミド関連物質の分泌促進作用は、TJ機能促進作用により誘導されるものであることが好ましい。言い換えれば、角化細胞におけるセラミド合成を阻害するものであってはならないし、角層細胞間脂質におけるセラミド量を増加させるものでなければならない。TJの機能促進作用は、経上皮細胞電気抵抗値（TER：transepithelial electrical resistance）を測定し、当該測定値を指標として推定することが出来る。本発明のセラミド分泌促進剤は、単純な化学物質、動植物由来の抽出物とその分画精製物などの混合精製物のいずれでもよい。本発明の皮膚外用剤には、前記セラミド分泌促進剤を、唯１種含有させることも出来るし、２種以上を組み合わせて含有させることも出来る。本発明の皮膚外用剤は、セラミド分泌促進剤を配合することにより、肌荒れ改善、並びに、老化現象に対する予防又は改善効果を発揮する。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
これらの必須成分、任意成分を常法に従って処理し、ロ−ション、乳液、エッセンス、クリ−ム、パック化粧料、洗浄料などに加工することにより、本発明の皮膚外用剤は製造できる。皮膚に適応させることの出来る剤型であれば、いずれの剤型でも可能であるが、有効成分が皮膚に浸透して効果を発揮することから、皮膚への馴染みの良い、ロ−ション、乳液、クリ−ム、エッセンスなどの剤型がより好ましい。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
以下に、実施例をあげて、本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明がかかる実施例にのみ、限定されないことは言うまでもない。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
＜本発明の低分子量ロイヤルゼリー画分の製造方法＞
本発明における精製前のロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物は、例えば、特開２００２−２０２２６号公報に記載の方法に従い製造することも出来るし、片倉チッカリン株式会社等により市販されているロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物として入手することも出来る。また、本発明のロイヤルゼリー及び／又はその加水分解物を精製した分子量５，０００以下、又は、分子量５，０００より大きい画分は、前記精製前のロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物を、市販の限外濾過膜（例えば、ミリポア社製）により限外濾過等の精製方法により分子量５，０００以下及び分子量５，０００より大きい画分に分離することが出来る。本発明の実施例においては、片倉チッカリン株式会社より購入したロイヤルゼリー蛋白質由来の加水分解物を用い、市販の限外濾過膜（Centricut、コスモバイオ社製）を使用し、分子量５，０００以下及び分子量５，０００より大きい画分に分画濾過したものを被験物質として用いた。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
＜ヒト表皮角化細胞を用いたTJ機能の評価１＞
凍結正常ヒト表皮角化細胞（NHEK）（倉敷紡績株式会社製）を解凍し、０．１５mM−Ca２＋含有培養液（Humedia−KG２：倉敷紡績株式会社製）にて、３７℃、５％二酸化炭素雰囲気下にて培養した。この正常ヒト表皮角化細胞（NHEK）をMillicell Tissue Culture Plate（ミリポア社製）にコ−ニング社製トランズウェル（直径１２mm、ポリエチレンテレフタレ−ト０．４μｍポア）をセットし、上層０．５ｍｌ、下層１．５ｍｌの前記培養液を入れ、１×１０５cells／cm２で播種し、さらに７２時間培養した。サブコンフルエントになったことを確認し、１．４５mM−Ca２＋含有Humedia−KG２培地に交換し、その後９６時間培養した。その後、前記ロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物より得られる分子量５０００以下（図１A中、「ロイヤルビオサイト（MW５，０００以下）」と記載）、又は、分子量５，０００以上（図１B中、「ロイヤルビオサイト（MW５，０００以上）」と記載）の画分を含有する培養液に交換して、培養を継続し、一定時間後にＴＥＲ（Transepithelial Electrical Resistance）値（Ω・cｍ２）を測定する。また、前記のロイヤルゼリー蛋白質由来の加水分解物を含有しない培養液にて培養したサンプルをコントロ−ル（図１A及び図１B中、水と記載）とし、ＴＥＲ値を測定した。ロイヤルゼリー由来の加水分解物より精製された分子量５，０００以下、又は、分子量５，０００より大きい画分の濃度は、（v/v％）で表示する。結果を図１A及び図１Bに示す。図１A及び図１Bにおいて、縦軸は、ＴＥＲ値（Ω・cｍ２））、横軸は、測定時間を表す。発明におけるTJ機能促進作用を有する物質とは、本評価系において、各ＴＥＲ値測定時間の何れかにおいて、被験物質を添加したサンプルのＴＥＲ値が、コントロ−ルのＴＥＲ値に比較し高い物質を意味する。図１A及び図１Bの結果より、ロイヤルゼリー蛋白質由来の加水分解物より限外濾過操作を経て精製された本発明のロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物の分子量５０００以下の画分（図１A、「「ロイヤルビオサイト」（MW ５，０００以下の画分）」と記載）は、顕著なタイトジャンクション機能促進作用が認められた。一方、ロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物の分子量５，０００より大きい画分（図１B中、「ロイヤルビオサイト（MW５，０００より大きい画分）」と記載）には、タイトジャンクション機能促進作用はほとんど認められなかった。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
＜正常ヒト表皮細胞を用いたセラミド分泌量の評価１＞
凍結正常ヒト表皮角化細胞（NHEK）（倉敷紡績株式会社製）を解凍し、培養液（Humedia−KG２：倉敷紡績株式会社製）にて、サブコンフルエントになるまで培養した。トリプシン処理により、４８well plate（０．７５cm２/well）に１×１０５cells/cm２となるように播種した。その際、バックグランド補正のため、Cer-FL非導入用の細胞も用意した。播種３日目に培養培地を１．４５mM Ca２＋ Humedia-KG２培地に置換し、分化誘導を行った。Ca２＋添加後３日目にCer-FL導入細胞のみ培地を７．５μM Cer-FLを含有する１．４５mM Ca２＋ Humedia KG２ １５０μL／wellに置換し、４℃にて３０分間静置し、Cer-FLを細胞膜に吸着させた。Cer-FL溶液を抜き取り、１．４５mM Ca２＋ Humedia KG２ ２００μL／wellで２回洗浄した後、３７℃、５％−CO２で３０分間培養し、エンドサイト−シスにより細胞内にCer-FLを取り込ませた。５％ defatted BSAを含有した１．４５mM Ca２＋ Humedia KG２ ２００μL／wellに置換し、４℃にて１０分間静置する操作を２回〜４回繰り返し、細胞膜に吸着した残存Cer-FLを除去した。1mM C１０を含有する１．４５mM Ca２＋ Humedia KG２ ３００μL／wellに置換し、３７℃、５％−CO２で４時間培養した。それぞれの培地を回収し、９６well plateに２００μLずつ加え、蛍光プレ−トリ−ダ−にて蛍光強度（励起４８５nm／蛍光５３５nm）を測定した。1mM
C１０を含有する１．４５mM Ca２＋ Humedia
KG２ ３００μL／wellにロイヤルゼリー蛋白質由来の加水分解物を限外濾過により精製した分子量５，０００以下の画分（図２中、「ロイヤルビオサイト（MW５，０００以下の画分）」と記載）、又は、分子量５，０００より大きい画分（図２中、「ロイヤルビオサイト（MW５，０００以より大きい画分）」と記載）を含有させた溶液を調整し、培地を回収した後の細胞に３００μL／wellを加え、培養を続けた。１６時間後にそれぞれ培地を回収し、蛍光強度を測定した。結果を図２に示す。図２の縦軸は、限外濾過により精製した分子量５０００以下及び分子量５０００より大きい画分の「ロイヤルビオサイト」画分のセラミド分泌量（単位：counts）を評価し、コントロ−ル群の値を１０００としてその各群の相対値として表示した。本発明におけるセラミド分泌量を促進する作用がある物質とは、ベヒクルに比較し、セラミド分泌量が増加した物質を意味する。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
図２の結果より、本発明のセラミド分泌促進剤であるロイヤルゼリー蛋白質及び／又はその加水分解物より得られる各画分（図２中、「ロイヤルビオサイトMW５，０００以下の画分」、並びに、「ロイヤルビオサイト MW５，０００より大きい画分」の各画分）のセラミド分泌促進作用を評価したところ、０．０００１（v/v%）の濃度において、分子量５０００以下の画分に統計的に有意なセラミド分泌促進作用が認められた。前記結果より、TJの機能促進作用を有する物質は、角化細胞のラメラボディより角層細胞間脂質に分泌されたセラミド含量を増加させることが認められた。