(57)【要約】  微生物培養によりカロテノイドを高収率かつ安定的に製造する方法の提供。  コバルト又はコバルト塩を０．００５μｍｏｌ／Ｌ〜２０μｍｏｌ／Ｌの濃度で含有する培地を用いてカロテノイド産生細菌を培養することを特徴とする、カロテノイド産生細菌の培養方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
コバルト又はコバルト塩を０．００５μｍｏｌ／Ｌ〜２０μｍｏｌ／Ｌの濃度で含有する培地を用いてカロテノイド産生細菌を培養することを特徴とする、カロテノイド高産生細菌の培養方法。
【請求項２】
コバルト又はコバルト塩を０．００５μｍｏｌ／Ｌ〜２０μｍｏｌ／Ｌの濃度で含有する培地を用いてカロテノイド産生細菌を培養することを特徴とする、カロテノイド高産生細菌の製造方法。
【請求項３】
コバルト又はコバルト塩を０．００５μｍｏｌ／Ｌ〜２０μｍｏｌ／Ｌの濃度で含有する培地を用いてカロテノイド産生細菌を培養し、得られる培養物からカロテノイドを採取することを特徴とする、カロテノイドの製造方法。 
【請求項４】
培地中のコバルト又はコバルト塩の濃度が、０．００５μｍｏｌ／Ｌ〜８μｍｏｌ／Ｌである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
カロテノイドが、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、リコペン、β−カロテン、アドニルビン、アドニキサンチン、エキネノン、アステロイデノン及び３−ヒドロキシエキネノンからなる群から選ばれる少なくとも一つである請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
カロテノイド産生細菌が、Paracoccus属、Brevundimonas属又はErythrobacter属に属する細菌である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
カロテノイド産生細菌が、１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡであって塩基配列が配列番号１に記載の塩基配列と９５％以上の相同性を有するＤＮＡを含む細菌である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
カロテノイド産生細菌が、E-396株（FERM BP-4283）若しくはA-581-1株（FERM BP-4671）又はそれらの変異株である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項２及び４〜８のいずれか１項に記載の方法によって製造された、カロテノイド高産生細菌。
【請求項１０】
乾燥菌体中にカロテノイドを少なくとも３６ｍｇ／ｇ含む、カロテノイド高産生細菌。
【請求項１１】
コバルトを含有するカロテノイド高産生細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カロテノイド産生細菌によるカロテノイドの微生物学的製造方法に関する。  詳細には、本発明は、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、リコペン、β−カロテン、アドニルビン、アドニキサンチン、エキネノン、アステロイデノン及び３−ヒドロキシエキネノンなどのカロテノイドを産生する微生物の発酵により、当該カロテノイドを製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
カロテノイドは飼料添加物、食品添加物、医薬品等として使用される有用な天然色素である。カロテノイドには、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、リコペン、β−カロテン、アドニルビン、アドニキサンチン、エキネノン、アステロイデノン及び３−ヒドロキシエキネノンなどが含まれる。中でも、アスタキサンチンは養殖魚であるサケ、マス、マダイ等の体色改善剤や、家禽類の卵黄色改善剤のような飼料添加物として有用である。また、天然のアスタキサンチンは安全な食品添加物や健康食品素材として産業上の価値が高い。アドニキサンチン及びアドニルビンは、アスタキサンチンと同様に飼料添加物、食品添加物、医薬品等としての用途が期待されている。【０００３】
さらに、β−カロテンは飼料添加物、食品添加物、医薬品等として使用され、カンタキサンチンは飼料添加物、食品添加物、化粧品等として使用され、ゼアキサンチンは食品添加物、飼料添加物等として使用されている。さらにリコペン、エキネノン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、アステロイデノン等も飼料添加物、食品素材等としての使用が期待される。これらカロテノイドの製造方法としては、化学合成法、天然物からの抽出法、微生物の培養による産生方法などが知られている。【０００４】
アスタキサンチンの化学合成法としてはβ−カロテンの変換による方法（Pure Appl. Chem., 57, 741, 1985（非特許文献１））及びＣ１５ホスホニウム塩から合成する方法（Helv. Chim. Acta, 64, 2436, 1981（非特許文献２））が知られている。天然物からの抽出法として、アスタキサンチンはサケ、マダイ等の魚類及びエビ、カニ、オキアミ等の甲殻類に存在するため、これらより抽出して採取することも可能である。【０００５】
微生物によるカロテノイドの生産方法としては、緑藻類Haematococcus pluvialisによる培養法（特開２００７−９７５８４号公報（特許文献１））、赤色酵母Phaffia rhodozymaによる発酵法（特開平１１−６９９６９号公報（特許文献２））、Paracoccus属に属する細菌（以下、「Paracoccus属細菌」ともいう）による発酵法、Brevundimonas属に属する細菌による発酵法（特開２００６−３４０６７６号公報（特許文献３））、Erythrobacter属に属する細菌による発酵法（特開２００８−２５９４４９号公報（特許文献４））が報告されている。カロテノイドを生産するParacoccus属細菌の例としては、Ｅ−３９６株及びＡ−５８１−１株が挙げられる（特開平７−７９７９６号公報（特許文献５）及びInternational Journal of Systematic Bacteriology (1999), 49, 277-282（非特許文献３））。他のカロテノイド生産性のParacoccus属に属する細菌としては、Paracoccus marcusii MH1株（特表２００１−５１２０３０号公報（特許文献６））、Paracoccus haeundaensis BC74171株（International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2004), 54, 1699-1702（非特許文献４））、Paracoccus属細菌N-81106株（特開２００７−２４４２０５号公報（特許文献７））、Paracoccus zeaxanthinifaciens（International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2003), 53, 231-238（非特許文献５））及びParacoccus sp. PC-1株（ＷＯ  ２００５／１１８８１２号パンフレット（特許文献８））などが挙げられる。【０００６】
しかしながら、前述のカロテノイドの製造方法にはいくつかの問題点があった。例えば、化学合成法で製造したカロテノイドは安全性の観点から消費者に好ましくない印象を与える。天然物から抽出したカロテノイドは化学合成法に比べて製造コストが格段に高い。微生物による製造のうち、緑藻類や酵母の培養による産生は生産性が低いうえにこれらの微生物は強固な細胞壁を持ち、これにより培養物からのカロテノイドの抽出が困難である。【０００７】
一方、Paracoccus属に属する細菌によるカロテノイドの製造では、当該菌体の増殖速度が速い、カロテノイドの生産性が高い、培養物からのカロテノイドの抽出が容易であるなどの利点を有し、いくつかの培養方法及び製造方法が報告されている。【０００８】
例としては、特開２００７−１４３４９２号公報（特許文献９）は培養中に鉄塩を添加する方法、ＷＯ２０１０／０４４４６９号パンフレット（特許文献１０）は培地にアミノ酸を添加する方法、特開２０１１−１８８７９５号公報（特許文献１１）は培地にビオチンを添加する方法、また、特開２０１２−１３９１６４号公報（特許文献１２）は培地に３．６ｍＭ以上となるようにカルシウム化合物を添加する方法を開示する。しかし、Paracoccus属細菌によるカロテノイドの発酵において、培地成分が培養方法及び製造方法にどのように影響するか、その詳細は不明であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００７−９７５８４号公報
【特許文献２】特開平１１−６９９６９号公報
【特許文献３】特開２００６−３４０６７６号公報
【特許文献４】特開２００８−２５９４４９号公報
【特許文献５】特開平７−７９７９６号公報
【特許文献６】特表２００１−５１２０３０号公報
【特許文献７】特開２００７−２４４２０５号公報
【特許文献８】ＷＯ  ２００５／１１８８１２号パンフレット
【特許文献９】特開２００７−１４３４９２号公報
【特許文献１０】ＷＯ２０１０／０４４４６９号パンフレット
【特許文献１１】特開２０１１−１８８７９５号公報
【特許文献１２】特開２０１２−１３９１６４号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Pure Appl. Chem., 57, 741, 1985
【非特許文献２】Helv. Chim. Acta, 64, 2436, 1981
【非特許文献３】International Journal of Systematic Bacteriology (1999), 49, 277-282
【非特許文献４】International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2004), 54, 1699-1702
【非特許文献５】International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2003), 53, 231-238
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、カロテノイド産生細菌によるカロテノイドの製造を目的として培養を実施する際に、培養のバッチによりカロテノイドの生産性が大きく変動し、場合によっては全く当該細菌が生育せず、安定的な製造ができないという重大な課題に直面した。
本発明は、このような実情に鑑みなされたものであり、その目的は微生物培養によりカロテノイドを高収率かつ安定的に製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
培養のバッチにより生産性が変動する原因としては、不適切な通気・撹拌、温度の変動、ｐＨの変動、溶存酸素電極の性能異常、種菌の活性の変動、培地原料のロット間差、水中微量成分の変動、培地滅菌による栄養源の損失や阻害物質の生成、磁気・振動の影響、電気的な刺激、雑菌汚染、装置からの阻害物質混入など種々考えられ、原因究明は困難を極めた。
本発明者らは、上記課題を解決するため多大な労力と時間を費やし、鋭意研究し、幾多の検討を積み重ねた結果、培地中のコバルトがカロテノイド生産細菌の生育及びカロテノイドの生産の重要な因子であり、培地中のコバルト濃度が低すぎた場合は微生物が生育しないこと、及びコバルト濃度が高すぎてもやはり微生物が生育しないことを見出した。さらに、従来の方法では、培地の原料、水あるいは発酵設備金属部などから夾雑物として微量に培地に混入するコバルトの量が適量であるときにはカロテノイド生産細菌の生育が良好でかつカロテノイドの生産濃度が高い培養が成立すること、混入するコバルトの量が適量に達しないときには培養が成立しないために、安定的な製造ができなかったことを本発明者らは突き止めた。【００１３】
また、本発明者らは、培養に必要なコバルトの量が微量であること、培養に適した濃度範囲があることを見出し、従来技術では誰も気づかなかった、培地中のコバルトの濃度がカロテノイド産生細菌の生育及びカロテノイド生産において非常に重要な要素であることを確認した。
即ち、本発明者らは、コバルトがカロテノイド産生細菌の生育及びカロテノイド生産に必須の栄養素であること、またその濃度に適正な範囲があることを初めて明らかにし、本発明のカロテノイド産生細菌によるカロテノイドの微生物学的製造方法を完成させ、製造上の課題を解決し、微生物による安定的なカロテノイドの製造を実現可能にした。【００１４】
本発明は、以下の特徴を有する。
（１）コバルト又はコバルト塩を０．００５μｍｏｌ／Ｌ〜２０μｍｏｌ／Ｌの濃度で含有する培地を用いてカロテノイド産生細菌を培養することを特徴とする、カロテノイド高産生細菌の培養方法。
（２）コバルト又はコバルト塩を０．００５μｍｏｌ／Ｌ〜２０μｍｏｌ／Ｌの濃度で含有する培地を用いてカロテノイド産生細菌を培養することを特徴とする、カロテノイド高産生細菌の製造方法。
（３）コバルト又はコバルト塩を０．００５μｍｏｌ／Ｌ〜２０μｍｏｌ／Ｌの濃度で含有する培地を用いてカロテノイド産生細菌を培養し、得られる培養物からカロテノイドを採取することを特徴とする、カロテノイドの製造方法。 
（４）培地中のコバルト又はコバルト塩の濃度が、０．００５μｍｏｌ／Ｌ〜８μｍｏｌ／Ｌである（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５）カロテノイドが、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、リコペン、β−カロテン、アドニルビン、アドニキサンチン、エキネノン、アステロイデノン及び３−ヒドロキシエキネノンからなる群から選ばれる少なくとも一つである、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。【００１５】
（６）カロテノイド産生細菌が、Paracoccus属、Brevundimonas属又はErythrobacter属に属する細菌である（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７）カロテノイド産生細菌が、１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡであって塩基配列が配列番号１に記載の塩基配列と９５％以上の相同性を有するＤＮＡを含む細菌である、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の方法。
（８）カロテノイド産生細菌が、E-396株（FERM BP-4283）若しくはA-581-1株（FERM BP-4671）又はそれらの変異株である、（１）〜（７）のいずれか１項に記載の方法。
（９）（２）及び（４）〜（８）のいずれか１項に記載の方法によって製造された、カロテノイド高産生細菌。
（１０）乾燥菌体中にカロテノイドを少なくとも３６ｍｇ／ｇ含む、カロテノイド高産生細菌。
（１１）コバルトを含有するカロテノイド高産生細菌。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、培地成分、水などの原料のメーカー、グレード、ロット、生産地の影響や、発酵設備の材質、製造場所等の影響を受けることなく、安定して高い生産性が得られるカロテノイドの生産細菌又はカロテノイドの製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】培地中のコバルト存在濃度と菌体生育OD610及び総カロテノイド生産濃度との関係を示す図である。
【図２】培地中のコバルト存在濃度と菌体生育OD610及び総カロテノイド生産濃度との低濃度域（0.001−0.1μmol/L）の関係を示す図である。
【図３】培地中のコバルト存在濃度と菌体生育OD610及び総カロテノイド生産濃度との高濃度域（1−100μmol/L）の関係を示す図である。
【図４】培地中のコバルト存在濃度と菌体生育OD610及び総カロテノイド生産濃度との低濃度域（0−0.05μmol/L）の関係を示す図である。
【図５】塩化コバルトの添加培地及び無添加培地における総カロテノイド量のバッチ間差を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に限定されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
なお、本明細書の表に記載の数値は、実施した実験に応じて、有効数字や四捨五入される数字の桁数（下1桁、下2桁）などを変えて表記する場合がある。このため、合計値に記載の数値が、各数値を合計した値と一致しない場合がある。
【００１９】
本発明は、カロテノイド産生細菌を安定的に培養し、カロテノイドを製造する方法に関するものであり、本方法は培地中にコバルト又はコバルト塩が所定濃度範囲内に存在させることを特徴とする。
本発明の方法により、カロテノイド産生細菌を安定的に培養し、高濃度のカロテノイドを安定的に製造することが可能になる。
【００２０】
本発明に用いる細菌としては、カロテノイドを産生する細菌であれば何ら限定されず、例えばParacoccus属、Brevundimonas属、Erythrobacter属に属する細菌が挙げられる。
好ましくはParacoccus属に属する細菌、Brevundimonas属に属する細菌又はErythrobacter属に属する細菌が用いられ、より好ましくはParacoccus属に属する細菌が用いられる。Paracoccus属、Erythrobacter属及びBrevundimonas属は、いずれもProteobacteria門、Alphaproteobacteria鋼に分類され、細菌分類学上の共通性があるため、本発明においては、これらの属に属する細菌を使用することが可能である。
【００２１】
Paracoccus属に属する細菌の中では、Paracoccus carotinifaciens、Paracoccus marcusii、Paracoccus haeundaensis及びParacoccus zeaxanthinifaciensが好ましく用いられ、特にParacoccus carotinifaciensが好ましく用いられる。Paracoccus属に属する細菌の具体的な菌株の例として、Paracoccus carotinifaciens E-396株及びParacoccus属細菌A-581-1株（FERM BP-4671）が挙げられ、これらの変異株も本発明に好ましく用いられる。
Erythrobacter属に属するカロテノイド産生細菌としては、例えばErythrobacter JPCC M種（特開2008-259452）、Erythrobacter JPCC O種（特開2008-259449）などが挙げられる。
Brevundimonas属に属するカロテノイド産生細菌としては、例えばBrevundimonas SD212株（特開2009-27995）、Brevundimonas FERM P-20515, 20516株（特開2006-340676）、Brevundimonas vesicularis（Gene, Vol.379, p.101-108, 1 Sep 2006）などが挙げられる。
【００２２】
また、カロテノイド産生細菌として、好ましくは１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号１に記載されるE-396株の塩基配列と高い相同性を有する細菌が用いられる。ここで言う塩基配列の相同性は、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列とは、１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列中のＵ（ウラシル）をＴ（チミン）に置き換えた塩基配列を意味する。
【００２３】
この１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列の相同性に基づいた微生物の分類法は、近年主流になっている。従来の微生物の分類法は、従来の運動性、栄養要求性、糖の資化性など菌学的性質に基づいているため、自然突然変異による形質の変化等が生じた場合に、微生物を誤って分類する場合があった。これに対し、１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列は極めて遺伝的に安定であるので、その相同性に基づく分類法は従来の分類法に比べて分類の信頼度が格段に向上する。
【００２４】
Paracoccus carotinifaciens E-396株の１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列と、他のカロテノイド産生細菌Paracoccus marcusii DSM 11574株、Paracoccus属細菌N-81106株、Paracoccus haeundaensis BC 74171株、Paracoccus属細菌  A-581-1株、Paracoccus zeaxanthinifaciens ATCC 21588株、及びParacoccus sp. PC-1株の１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列との相同性は、それぞれ９９．７％、９９．７％、９９．６％、９９．４％、９５．７％、及び９５．４％であり、これらは分類学上極めて近縁な菌株であることが分かる。よって、これらの菌株はカロテノイドを産生する細菌として一つのグループを形成しているといえる。このため、これらの菌株は本発明に好ましく用いられ、カロテノイドを効率的に産生することができる。
【００２５】
本発明において、カロテノイドの生産性が改良された変異株も用いることができる。改良された変異株の例としては、アスタキサンチン生産能の高い菌株（特開２００１−９５５００）、カンタキサンチンを選択的に多く産生する菌株（特開２００３−３０４８７５）、ゼアキサンチンとβ−クリプトキサンチンを選択的に多く産生する菌株（特開２００５−８７０９７）、リコペンを選択的に産生する菌株（特開２００５−８７１００）を挙げることができる。
カロテノイドの生産性が改良された変異株は、変異処理とスクリーニングにより取得することができる。変異処理する方法は変異を誘発するものであれば特に限定されない。例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）及びエチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）などの変異剤による化学的方法、紫外線照射及びＸ線照射などの物理的方法、遺伝子組換え及びトランスポゾンなどによる生物学的方法などを用いることができる。変異処理される細菌は特に限定されないが、カロテノイド産生細菌であることが好ましい。また、変異株は、自然に起こる突然変異により生じたものでもよい。
【００２６】
変異株のスクリーニング方法は特に限定されないが、例えば、寒天培地上のコロニーの色調で目的の変異株を選択する方法の他、試験管、フラスコ、発酵槽などで変異株を培養し、吸光度、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーなどを利用したカロテノイド色素分析により目的の変異株を選択する方法などが例示される。
変異及びスクリーニングの工程は１回でもよいし、また、例えば突然変異処理とスクリーニングにより変異株を得て、これをさらに変異処理とスクリーニングにより生産性の改良された変異株を取得するというように、変異及びスクリーニング工程を２回以上繰り返してもよい。
【００２７】
本発明に使用するカロテノイド産生細菌の例として挙げられるＥ−３９６株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに以下のとおり国際寄託されている。
国際寄託当局：独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
（旧名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）
〒３０５−８５６６
茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６
識別のための表示：E-396
受託番号：FERM BP-4283
原寄託日：平成５年（１９９３年）４月２７日
【００２８】
また、本発明に使用するカロテノイド産生細菌の他の例として挙げられるＡ−５８１−１株は、上記機関に以下のとおり国際寄託されている。
識別のための表示：A-581-1
受託番号：FERM BP-4671
原寄託日：平成６年（１９９４年）５月２０日
【００２９】
本発明において、上記のカロテノイド産生細菌を所定の濃度のコバルト又はコバルト塩を含有する培地で培養することにより、高濃度のカロテノイドを安定的に生産させることができる。
産生されるカロテノイドは特に限定されないが、例えば、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、リコペン、β−カロテン、アドニルビン、アドニキサンチン、エキネノン、アステロイデノン又は３−ヒドロキシエキネノンであり、好ましくは、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン又はβ−クリプトキサンチンであり、より好ましくは、アスタキサンチン又はゼアキサンチンである。本発明より製造されるカロテノイドは一種でもよいし、複数種が組み合わされていてもよい。
【００３０】
本発明において上記細菌を培養する方法を以下に説明する。
本発明は、コバルト又はコバルト塩を所定濃度で含有する培地を用いてカロテノイド産生細菌を培養する方法に関する。
本発明においてコバルト又はコバルト塩を培地中に添加し、所定の濃度で含有させる方法に特に制限はないが、たとえば、塩化コバルト、硝酸コバルト、ギ酸コバルト、酢酸コバルト、酸化コバルト、臭化コバルト、炭酸コバルト、硫酸コバルト、ナフテン酸コバルト、オレイン酸コバルト、ステアリン酸コバルト、チオシアン酸コバルト、粉末コバルト、シアノコバラミンなどから選ばれるコバルト化合物の１種又は２種以上を所定の濃度範囲内になるように培地に添加する方法が好ましく用いられる。これらのコバルト化合物は無水物でも水和物でも良い。コバルト化合物は、好ましくは培養開始前の仕込み時に培地に添加されるが、培養開始後に単回的、逐次的又は連続的に添加されても良い。
【００３１】
別の添加方法として、コバルトを夾雑物として微量に含有する培地原料を所定のコバルト濃度範囲内になるように添加する方法が用いられる。コバルトを微量に含有する可能性のある培地原料として、たとえば、コーンスティープリカー、ファーマメディア、大豆粕、大豆粉、ピーナッツミール、ソイペプトン、ディスティラーズソルブル、乾燥酵母、酵母エキス、グルコース、シュークロース、糖蜜、鉄塩類、マンガン塩類、銅塩類、亜鉛塩類、モリブデン塩類、ニッケル塩類、セレン塩類、リン酸塩類、マグネシウム塩類、カルシウム塩類、水などを例示することができる。これら培地原料の１種又は２種以上を所定のコバルト濃度範囲内になるように添加する方法を用いることができる。この方法では培地原料中に含有するコバルトの量はメーカー、ロット、産地などにより変動することがあるので、原料中のコバルト含量を適宜管理することもできる。これらのコバルトを夾雑物として微量に含有する培地原料は、好ましくは培養開始前の仕込み時に培地に添加されるが、培養開始後に単回的、逐次的又は連続的に添加されても良い。
【００３２】
さらに別の添加方法としてコバルトを含有する材質からなる発酵設備を用いて所定のコバルト濃度範囲内になるようにコバルトを溶出させながら培養することも可能である。撹拌軸、撹拌軸の軸受け、シール部などにコバルトを含有する超合金を用いてコバルトを溶出させることもこれに含まれる方法である。この方法では、溶出するコバルトの量が設備の状態などにより変動し、少なすぎれば栄養源として不足し、多すぎれば生産を阻害するので、培地中のコバルト濃度を分析して適宜管理することもできる。
上記、コバルト化合物を添加する方法、コバルトを夾雑物として微量に含有する培地原料を添加する方法、及びコバルトを含有する材質の発酵設備から溶出させて添加する方法から選ばれる２種以上を組み合わせることも好ましく行うことができる。
【００３３】
コバルト化合物添加のタイミングとして、シード培地から持ち込まれたコバルトが最終段階の生産用培地で所定の濃度範囲になるようにシード培地に添加する方法、又はシード培地と最終段階の生産培地の両方にコバルトを添加して最終段階の生産培地で所定の濃度範囲内にする方法、培養の最終段階で使用する培地に当該化合物を添加する方法がある。
本発明においては、培地中に含有するコバルト又はコバルト塩の濃度は低すぎても高すぎても微生物の生育及びカロテノイドの生産が十分に行われないことが分かった。この知見は、濃度が低すぎれば栄養源として不足すること、また、高すぎれば微生物の生育及びカロテノイドの生産を阻害するためであると考えられる。
【００３４】
培地中のコバルト又はコバルト塩の下限濃度は、好ましくは０．００５μｍｏｌ／Ｌ以上、０．００６μｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは０．０１μｍｏｌ／Ｌ以上、さらに好ましくは０．０２μｍｏｌ／Ｌ以上である。上限濃度は、好ましくは２０μｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは１０μｍｏｌ／Ｌ以下、９μｍｏｌ／Ｌ以下、８μｍｏｌ／Ｌ以下、７μｍｏｌ／Ｌ以下、６μｍｏｌ／Ｌ以下、５μｍｏｌ／Ｌ以下であり、さらに好ましくは４μｍｏｌ／Ｌ以下、３μｍｏｌ／Ｌ以下、２μｍｏｌ／Ｌであり、最も好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ以下である。  本発明においては、上記上限濃度及び下限濃度を適宜選択して、培養に必要なコバルト等の濃度範囲、例えば、０．００５μｍｏｌ／Ｌ〜２０μｍｏｌ／Ｌ、０．００６μｍｏｌ／Ｌ〜２０μｍｏｌ／Ｌ、０．０１μｍｏｌ／Ｌ〜８μｍｏｌ／Ｌ、０．０２μｍｏｌ／Ｌ〜８μｍｏｌ／Ｌ、０．０２μｍｏｌ／Ｌ〜７μｍｏｌ／Ｌ、０．０２μｍｏｌ／Ｌ〜６μｍｏｌ／Ｌ、０．０２μｍｏｌ／Ｌ〜１μｍｏｌ／Ｌ等の範囲とすることができる。但し、上記範囲は例示であってこれらの濃度範囲に限定されるものではない。
【００３５】
本発明の培養に用いるカロテノイド生産用培地は、所定濃度のコバルト又はコバルト塩を含有する培地であるが、コバルトのほか、カロテノイド産生細菌が生育し、カロテノイドを生産するものであるならば任意の成分を添加することができる。そのような添加物を含有する培地は何れでもよいが、炭素源、窒素源、無機塩類及び必要に応じてビタミン類などを含有する培地が好ましく用いられる。
【００３６】
炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、フルクトース、トレハロース、マンノース、マンニトール及びマルトース等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、プロピオン酸、リンゴ酸、マロン酸及びピルビン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、イソブタノール及びグリセノール等のアルコール類、大豆油、ヌカ油、オリーブ油、トウモロコシ油、ゴマ油及びアマニ油等の油脂類などが挙げられ、中でも好ましくはグルコース又はシュークロースが用いられる。これらの炭素源の中、１種又は２種以上を用いることができる。培養前の培地（始発培地）に添加する量は炭素源の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地１Ｌ当たり１〜１００ｇ、好ましくは２〜５０ｇである。また、炭素源は始発培地に添加するだけでなく、培養途中に逐次的又は連続的に追加供給することも好ましく行われる。
【００３７】
窒素源としては、無機塩として、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウムなどのアンモニウム塩類、硝酸カリウムなどの硝酸塩類、アンモニア及び尿素等の中、１種又は２種以上が用いられる。添加量は窒素源の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地１Ｌに対し０．１ｇ〜２０ｇ、好ましくは０．２〜１０ｇである。
また、有機窒素源としては、例えば、コーンスティープリカー（ろ過処理物を含む）、ファーマメディア、大豆粕、大豆粉、ピーナッツミール、ソイペプトン、ディスティラーズソルブル、乾燥酵母、酵母エキス、カザミノ酸、グルタミン酸、アスパラギン酸などの中、１種又は２種以上が用いられる。添加濃度は窒素源の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、０〜８０ｇ／Ｌ、好ましくは１〜３０ｇ／Ｌである。
【００３８】
無機窒素源及び有機窒素源は、通常始発培地に添加するが、逐次的又は連続的に追加供給することも好ましく行われる。
無機塩類としては、例えば、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウムなどのリン酸塩類、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムなどのマグネシウム塩類、硫酸鉄、塩化鉄などの鉄塩類、塩化カルシウム、炭酸カルシウムなどのカルシウム塩類、炭酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどのナトリウム塩類、硫酸マンガンなどのマンガン塩類、硫酸銅などの銅塩類、硫酸亜鉛などの亜鉛塩類、モリブデン酸ナトリウムなどのモリブデン塩類、硫酸ニッケルなどのニッケル塩類、セレン酸ナトリウムなどのセレン塩類、タングステン酸ナトリウムなどのタングステン塩類、塩化アルミニウムなどのアルミニウム塩類、塩化クロムなどのクロム塩類、ホウ酸及びヨウ化カリウム等の中、１種又は２種以上が用いられる。添加量は無機塩の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地１Ｌに対し０．０００１〜１５ｇである。リン酸塩類、マグネシウム塩類、カルシウム塩類、ナトリウム塩類及び鉄塩類では、０．０２〜１５ｇ／Ｌが好ましく、マンガン塩類、銅塩類、亜鉛塩類、モリブデン塩類、ニッケル塩類、セレン塩類、タングステン塩類、アルミニウム塩類、クロム塩類、ホウ酸、ヨウ化カリウムなどを加える場合には、０．１〜１５ｍｇ／Ｌが好ましい濃度である。無機塩類は通常始発培地に添加するが、逐次的又は連続的に追加供給してもよい。
【００３９】
ビタミン類としては、例えば、シアノコバラミン、リボフラビン、パントテン酸、ピリドキシン、チアミン、アスコルビン酸、葉酸、ナイアシン、ｐ−アミノ安息香酸、ビオチン、イノシトール、コリンなどを用いることができる。添加割合はビタミン類の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地１Ｌに対し０．００１〜１０００ｍｇであり、好ましくは０．０１〜１００ｍｇである。ビタミン類は通常始発培地に添加するが、逐次的又は連続的に追加供給してもよい。
【００４０】
本発明において、培養液の発泡を抑えるために消泡剤が好ましく用いられる。消泡剤の種類は泡の発生を抑制し又は発生した泡を消す作用があり、かつ産生細菌に対する阻害作用の少ないものであれば何れでもよい。たとえば、アルコール系消泡剤、ポリエーテル系消泡剤、エステル系消泡剤、脂肪酸系消泡剤、シリコン系消泡剤、スルフォン酸系消泡剤などを例示することができる。添加量は消泡剤の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地１Ｌに対し０．０１ｇ〜１０ｇである。
【００４１】
消泡剤は通常殺菌前の始発培地に添加する。さらに、培養途中に連続的又は間欠的に追加添加してもよい。培養途中に消泡剤を添加する方法としては、センサーで泡を感知して自動添加する方法、プログラムタイマーで一定時間ごとに添加する方法、生育速度に連動するようにフィード用炭素源、窒素源又はｐＨ調整剤などと混合して添加する方法などを例示できる。始発培地に添加する消泡剤と培養途中に培養液に添加する消泡剤とは同種でもよいが、作用に合わせて異なる種類を用いることもできる。
【００４２】
本発明において、培地の初期ｐＨは２〜１２、好ましくは６〜９、より好ましくは６．５〜８．０に調整する。培養中も上記範囲のｐＨを維持することが好ましい。ｐＨ調整剤としては、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、アンモニア水、アンモニアガス、硫酸水溶液又はこれらの混合物が例示される。
本発明において、培地は滅菌処理した後、細菌の培養に用いられる。滅菌処理は、当業者であれば、適宜行うことができる。例えば、適切な容器中の培地をオートクレーブで加熱滅菌すればよい。あるいは、滅菌フィルターによりろ過滅菌すればよい。
【００４３】
本発明において、カロテノイド産生細菌は、上記のように調製された培地に植菌され、所定の条件で培養される。植菌は、試験管、フラスコあるいは発酵槽などを用いたシード培養により菌株を適宜増やし、得られた培養液をカロテノイド生産用培地に加えることで行う。シード培養に用いる培地は、カロテノイド産生細菌が良好に増殖する培地であれば特に限定されないが、生育に必要な最低限のコバルト又はコバルト塩を含有する必要がある。
【００４４】
培養は、適切な培養容器において行われる。培養容器は培養容量により適宜選択することができ、例えば、試験管、フラスコ、発酵槽などをあげることができる。
培養温度は１５〜４０℃、好ましくは２０〜３５℃、より好ましくは２５℃〜３２℃であり、通常１日〜１８日間、好ましくは２〜１２日間、より好ましくは３〜８日間、好気条件で培養を行う。好気条件としては、例えば、振とう培養又は通気撹拌培養等が挙げられ、溶存酸素濃度を一定の範囲に制御するのが好ましい。溶存酸素濃度の制御は、例えば、攪拌回転数、通気量、内圧などを変化させることにより行うことができる。溶存酸素濃度は好ましくは０．３〜１０ｐｐｍ、より好ましくは０．５〜７ｐｐｍ、さらに好ましくは１〜５ｐｐｍに制御する。
【００４５】
本発明において、カロテノイド産生細菌を培養した後のカロテノイド産生細菌の菌体数はODにより測定することができる。また、カロテノイド産生細菌を培養して得られる培養物中のカロテノイド、又は培養物から採取されたカロテノイドの定量は、高速液体クロマトグラフィーにより行うことができる。上記のようにカロテノイド産生細菌を培養した後、得られる培養物からカロテノイド採取することができる。
培養物は、例えば、培養液、培養上清、菌体濃縮液、湿菌体、乾燥菌体、菌体溶解物などが挙げられる。培養上清は、培養液を遠心処理又はろ過処理することで、培養液から菌体を除いて調製すればよい。菌体濃縮液は、培養液を遠心分離又は膜ろ過濃縮することにより得ることができる。湿菌体は、培養液を遠心又はろ過することにより得ることができる。乾燥菌体は、湿菌体又は菌体濃縮液を一般的な乾燥方法によって乾燥させることにより得ることができる。このようにして得られたカロテノイド含有乾燥菌体はそのまま飼料添加物として用いることができる。
【００４６】
得られた乾燥菌体中には、少なくとも３６ｍｇ／ｇ、例えば３６ｍｇ／ｇ、３７ｍｇ／ｇ、３８ｍｇ／ｇ、３９ｍｇ／ｇ又は４０ｍｇ／ｇのカロテノイドが含まれている。使用する菌体により乾燥菌体中に含まれるカロテノイドの量は変動するが、例えば３６ｍｇ／ｇ〜５０ｍｇ／ｇ、さらに好ましくは３６ｍｇ／ｇ〜４５ｍｇ／ｇのカロテノイドを含む。これらの量を含有する細菌も本発明に含まれる。従って、本発明は、乾燥菌体中に少なくとも３６ｍｇ／ｇのカロテノイドを含有する、カロテノイド高産生細菌（例えばParacoccus属、Brevundimonas属又はErythrobacter属に属する細菌）を提供する。
【００４７】
本発明においてカロテノイドを上記培養物から採取する方法は特に限定されず、カロテノイドが安定に効率よく回収されるいずれの方法でもよい。これらの方法は、当業者であれば公知の抽出、精製技術から適宜選択して行うことができる。また、本発明においては、上記培養物をカロテノイド含有組成物として用いることもできる。
抽出を行う前に、培養物をアルカリ試薬や界面活性剤などを用いた化学的処理、溶菌酵素、脂質分解酵素及びタンパク分解酵素などを用いた生化学処理、又は超音波若しくは粉砕などの物理的処理の中、１つ又は２つ以上の処理を行ってもよい。
例えば、カロテノイドを培養物から抽出する場合、抽出及び洗浄に用いる溶媒は特に限定されないが、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどの低級アルコール類、アセトン、テトラヒドロフラン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジクロロメタン、クロロホルム、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどが挙げられる。
【００４８】
抽出操作中のカロテノイドの酸化を極力防止したい場合には、窒素ガスなどの不活性ガス雰囲気で処理すればよい。また、医薬品や食品で用いられている酸化防止剤を選択して抽出溶媒に加えてもよい。あるいは、これらの処理を組み合わせてもよい。また、光によるカロテノイドの分解を極力防止するために、光を当てない条件下で行ってもよい。
このように得られた抽出物をカロテノイドとしてそのまま用いることが可能であり、さらに精製して使用することもできる。
【００４９】
抽出操作後の抽出物に残存する細菌等を分離する方法は特に限定されないが、膜濾過、遠心分離、デカンテーションなどが用いられる。
抽出液からカロテノイド沈殿物を得る方法としては、一般的には加熱及び／又は減圧濃縮や晶析が挙げられる。この他、低温におけるカロテノイド色素の析出、酸・アルカリ薬剤や各種塩類による析出によってカロテノイド色素を濃縮せずに分離してもよい。工業的に用いる場合には、晶析することが望ましい。
得られたカロテノイド沈殿物は、洗浄のため必要に応じて少量の低級アルコール類などの溶媒を用いて懸濁攪拌させてもよい。洗浄の手法は特に限定されないが、例えば、懸濁攪拌後に濾取する方法又は沈殿物の上から通液する方法等が実用的に好ましい方法として挙げられる。
上記のように得られる培養物、抽出物又は精製物は、カロテノイドとしてそれぞれ単独で用いることもできるし、これらを任意の割合で混合して用いることもできる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
なお、実施例におけるカロテノイド類の定量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて以下のように行った。【００５１】
カラムはInertsil SIL-100A，5μm（φ4.6 mm×250 mm）（ジーエルサイエンス製）を２本連結して使用した。溶出は、移動相であるｎ−ヘキサン：テトラヒドロフラン：メタノール混合液（４０：２０：１）を室温付近一定の温度にて毎分１．０ｍＬ流すことで行った。測定においては、サンプルをテトラヒドロフランで溶解したものを移動相にて１００倍希釈した液２０μＬを注入量とし、カラム溶離液の検出は波長４７０ｎｍで行った。また、定量のための標準品としては、シグマ社製アスタキサンチン（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ９３３５）を用いた。標準液のアスタキサンチン濃度の設定は、標準液の４７７ｎｍの吸光度（Ａ）及び上記条件でＨＰＬＣ分析を行ったときのアスタキサンチンピークの面積百分率％（Ｂ）を測定した後に、以下の式を用いて行った。
アスタキサンチンの濃度（ｍｇ／Ｌ）＝Ａ÷２１５０×Ｂ×１００【００５２】
〔実施例１〕
以下の組成の培地（シュークロース３０ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー３０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム１２水和物３．８ｇ／Ｌ、塩化カルシウム２水和物５．０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物    ０．７ｇ／Ｌ、硫酸鉄７水和物１．０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．２）８ｍｌを内径１８ｍｍの綿栓付き試験管に入れ１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌し、シード用試験管培地を調製した。シード用試験管培地の原料は、十分に菌体の生育することが確認されているロットのものを使用した。
次に以下の組成の培地（グルコース３０ｇ／Ｌ、コーンスティープリカーろ過処理物３０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１．５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム１２水和物３．８ｇ／Ｌ、塩化カルシウム２水和物５．０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物０．７ｇ／Ｌ、硫酸鉄７水和物１．０ｇ／Ｌ、シリコン系消泡剤０．２ｇ／Ｌ）７．２ｍｌを内径１８ｍｍの綿栓付き試験管に入れた生産用試験管培地を５本準備した。生産用試験管培地の原料は、菌体の生育が不十分であることが確認されているロットのものを使用した。【００５３】
上記生産用試験管の１本目（試験管１）には最終的な培地中の濃度（終濃度）が表１に記載の濃度になるように調製した微量金属類の混合水溶液（塩化コバルト６水和物  ０．１ｍｇ/Ｌ＝０.４２μｍｏｌ/Ｌ ）０．８ｍｌを、２本目（試験管２）には表２の濃度になるように核酸類の混合水溶液０．８ｍｌを、３本目（試験管３）には表３の濃度になるようにビタミン類の混合水溶液０．８ｍｌを、４本目（試験管４）には３ｇ／Ｌの濃度になるようにクエン酸三ナトリウム２水和物の水溶液０．８ｍｌを、そして５本目（試験管５）にはイオン交換水０．８ｍｌを添加した。培地は水酸化ナトリウム水溶液又は硫酸水溶液でｐＨ７．２に調整し、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。【００５４】
【表１】
2017115774.tif 000003
【００５５】
【表２】
2017115774.tif 000004
【００５６】
【表３】
2017115774.tif 000005
【００５７】
Paracoccus carotinifaciens E-396株（FERM BP-4283）をシード用試験管培地に植菌し、２８℃で２日間、３００ｓｐｍで振盪培養を行った後、その培養液を５種類の生産用試験管培地にそれぞれ０．０５ｍｌずつ植菌し、２８℃で４日間、３００ｓｐｍで振盪培養を行った。
培養液の菌体生育をOD610（610nmの光学密度）により測定したところ、５種類の生産用試験管培地のうち、微量金属類を添加した試験管だけが良好な生育を示した（表４）。【００５８】
【表４】
2017115774.tif 000006
【００５９】
〔実施例２〕
シード用試験管培地を実施例１に記載の方法と同じ方法で調製した。次に以下の組成の培地（グルコース３０ｇ／Ｌ、コーンスティープリカーろ過処理物３０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１．５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム１２水和物３．８ｇ／Ｌ、塩化カルシウム２水和物５．０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物０．７ｇ／Ｌ、硫酸鉄７水和物１．０ｇ／Ｌ、シリコン系消泡剤０．２ｇ／Ｌ）７．２ｍｌを内径１８ｍｍの綿栓付き試験管に入れた生産用試験管培地を１３本準備した。生産用試験管培地の原料は、菌体の生育が不十分であることが確認されているロットのものを使用した。【００６０】
表１に記載の１２種の微量金属類を別々に表１記載の終濃度になるように０．８ｍｌに調製し、１２本の上記生産用試験管にそれぞれ添加し、残りの１本にはイオン交換水０．８ｍｌを添加した。培地は水酸化ナトリウム水溶液又は硫酸水溶液でｐＨ７．２に調整し、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。
Paracoccus carotinifaciens E-396株（FERM BP-4283）をシード用試験管培地に植菌し、２８℃で２日間、３００ｓｐｍで振盪培養を行った後、その培養液を１３種類の生産用試験管培地にそれぞれ０．０５ｍｌずつ植菌し、２８℃で４日間、３００ｓｐｍで振盪培養を行った。
培養後の菌体生育をOD610により測定したところ、塩化コバルト６水和物を添加した試験管だけが良好な生育を示した（表５）。【００６１】
【表５】
2017115774.tif 000007
【００６２】
〔実施例３〕
シード用試験管培地を実施例１に記載の方法と同じ方法で調製した。次に以下の組成の培地（グルコース３０ｇ／Ｌ、コーンスティープリカーろ過処理物３０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１．５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム１２水和物３．８ｇ／Ｌ、塩化カルシウム２水和物５．０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物０．７ｇ／Ｌ、硫酸鉄７水和物１．０ｇ／Ｌ、シリコン系消泡剤０．２ｇ／Ｌ）７．２ｍｌを内径１８ｍｍの綿栓付き試験管に入れた生産用試験管培地を１２本準備した。生産用試験管培地の原料は、菌体の生育が不十分であることが確認されているロットのものを使用した。【００６３】
塩化コバルト６水和物を終濃度が０、０．０００１、０．００１、０．００２、０．００５、０．０１、０．１、０．２５、１、２、５及び１０ｍｇ／Ｌ  （すなわち０、０．０００４２、０．００４２、０．００８４、０．０２１、０．０４２、０．４２、１．１、４．２、８．４、２１及び４２μｍｏｌ／Ｌ）になるように０．８ｍｌの水溶液として１２本の上記生産用試験管に添加した。培地は水酸化ナトリウム水溶液又は硫酸水溶液でｐＨ７．２に調整し、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。
Paracoccus carotinifaciens E-396株（FERM BP-4283）をシード用試験管培地に植菌し、２８℃で２日間、３００ｓｐｍで振盪培養を行った後、その培養液をコバルト濃度の異なる１２種類の生産用試験管培地にそれぞれ０．０５ｍｌずつ植菌し、２８℃で４日間、３００ｓｐｍで振盪培養を行った。【００６４】
別に準備した塩化コバルト６水和物を添加していない前述の生産用試験管培地中のシード植菌後のコバルト濃度をＩＣＰ−ＭＳ（Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry）を使用して測定したところ０．００２μｍｏｌ／Ｌであった。塩化コバルト無添加培地中に存在するコバルト濃度と添加した塩化コバルトの濃度を合わせて培地中のコバルト存在濃度を算出した（表６）。【００６５】
４日間の培養後、培養液の菌体生育をOD610により、カロテノイドの濃度をＨＰＬＣにより測定した結果を表６に示した。また培地中のコバルト存在濃度と菌体生育OD610及び総カロテノイド生産濃度との関係を図１に示した。また、コバルト存在濃度の高濃度範囲及び低濃度範囲の目盛を拡大してプロットした図を図２〜４に示した。図２〜４により、カロテノイドが産生されるための効果的な濃度範囲として、0.005μmol/L以上、8μmol/L以下、より効果的な濃度範囲として、0.01μmol/L以上、8μmol/L以下、さらに効果的な濃度範囲として、0.02μmol/L以上、8μmol/L以下であることが示された。
コバルト濃度が低すぎると細菌数及びカロテノイド生産量は用量依存的に増加し、高すぎると細菌数及びカロテノイド生産量とも用量依存的に低下し、カロテノイドの生産にはコバルトの適当な濃度範囲が存在することが分かった。【００６６】
【表６】
2017115774.tif 000008
【００６７】
〔実施例４〕
シード用試験管培地を実施例１に記載の方法と同じ方法で調製した。次に、メーカー、ロットの異なる原料を組み合わせ、以下の組成の培地（グルコース３０ｇ／Ｌ、コーンスティープリカーろ過処理物３０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１．５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム１２水和物３．８ｇ／Ｌ、塩化カルシウム２水和物５．０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物０．７ｇ／Ｌ、硫酸鉄７水和物１．０ｇ／Ｌ、シリコン系消泡剤０．２ｇ／Ｌ）を表７に示したＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅの５種作成し、７．２ｍｌを内径１８ｍｍの綿栓付き試験管に入れた生産用試験管培地を２本ずつ計１０本準備した。【００６８】
次に、塩化コバルト６水和物を培地の終濃度が０．１ｍｇ／Ｌ  （すなわち０．４２μｍｏｌ／Ｌ）になるように０．８ｍｌの水溶液として調製し、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅの各１本に添加し、他の各１本には陰性対照としてイオン交換水を０．８ｍｌ添加した。培地は水酸化ナトリウム水溶液又は硫酸水溶液でｐＨ７．２に調整し、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。
Paracoccus carotinifaciens E-396株（FERM BP-4283）をシード用試験管培地に植菌し、２８℃で２日間、３００ｓｐｍで振盪培養を行った後、その培養液をコバルト濃度の異なる５種類（計１０本）の生産用試験管培地にそれぞれ０．０５ｍｌずつ植菌し、２８℃で４日間、３００ｓｐｍで振盪培養を行った。【００６９】
４日間の培養後、培養液の菌体生育をOD610により、カロテノイドの濃度をＨＰＬＣにより測定し、塩化コバルトを添加していないときの結果（別に準備した塩化コバルト６水和物を添加していない生産用試験管培地中のシード植菌後のコバルト濃度をＩＣＰ−ＭＳを使用して測定）を表８に、添加したときの結果を表９に、総カロテノイドの比較を図５に示した。塩化コバルトを添加しなかった場合は、培地原料のメーカー、ロットにより生育及びカロテノイド生産濃度のばらつきが大きかった。特にコバルトの存在濃度が低い培地ロットＡ及びＤではカロテノイド生産濃度が極めて低かった。一方、塩化コバルトを終濃度０．１ｍｇ／Ｌ添加した場合には、培地原料のメーカー、ロットに係わらず、安定して高い細菌の生育性及びカロテノイド生産性が認められ、培地中のコバルト濃度が適切な範囲内にあることの重要性が分かった。【００７０】
【表７】
2017115774.tif 000009
【００７１】
【表８】
2017115774.tif 000010
【００７２】
【表９】
2017115774.tif 000011
【００７３】
〔実施例５〕
Paracocus carotinifaciens E-396株をＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンで変異処理し、0.4mmol/Lのclomazoneを含有する試験管培地で１０日間培養した。この培養液を0.3mmol/Lのfosmydomycinを含有する寒天培地に塗布して培養し、赤色の色調が濃いコロニーを選択した。選択された株の培養液中のカロテノイドを分析し、アスタキサンチン生産性の向上した変異株CF-358株を選択した。
以下の組成の培地（グルコース２０ｇ／Ｌ、コーンスティープリカーろ過処理物５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．５４ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム２．７８ｇ／Ｌ、塩化カルシウム２水和物５．０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物０．７ｇ／Ｌ、硫酸鉄７水和物１．０ｇ／Ｌ、アルコール系消泡剤０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．５）１００ｍｌを５００ｍｌ容量の綿栓付き三角フラスコに入れ１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌し、シード用フラスコ培地５本を調製した。シード用フラスコ培地の原料は、十分に生育することが確認されているロットのものを使用した。【００７４】
次に、以下の組成の培地（グルコース４０ｇ／Ｌ、コーンスティープリカーろ過処理物３０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム０．５ｇ／Ｌ、グルタミン酸ナトリウム１水和物６ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム２．２５ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム１２水和物５．７ｇ／Ｌ、塩化カルシウム２水和物０．１ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇ／Ｌ、硫酸鉄７水和物１．０ｇ／Ｌ、ビオチン０．１ｍｇ／Ｌ、アルコール系消泡剤０．５ｇ／Ｌ）２．０Ｌを５Ｌ容量の発酵槽に入れた生産培地を５基準備した。
塩化コバルト６水和物を終濃度が０、０．０１、０．１、１及び５ｍｇ／Ｌ  （すなわち０、０．０４２、０．４２、４．２及び２１μｍｏｌ／Ｌ）になるように上記生産用発酵槽に添加した。培地は１２１℃で３０分間オートクレーブ滅菌し、冷却後、２０％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを７．２に合わせた。塩化コバルトを添加していない発酵槽培地中のシード植菌後のコバルト濃度をＩＣＰ−ＭＳを使用して測定したところ０．００３μｍｏｌ／Ｌであった。【００７５】
上記で選択した変異株Paracoccus carotinifaciens CF-358株をシード用フラスコ培地に植菌し、２８℃で２日間、１００ｒｐｍで回転振盪培養を行った後、その培養液８０ｍｌを各発酵槽に植菌した。２８℃、ゲージ圧力０．０１ＭＰａで通気量１．５ｖｖｍの通気撹拌培養を５日間行った。培養中ｐＨが７．２を維持するように１５％アンモニア水を自動供給した。培養液中の溶存酸素濃度が２〜４ｐｐｍを維持するように撹拌回転数を自動的に変化させた。アルコール系消泡剤を自動添加して発泡を抑制した。
培養終了時の培養液について、菌体生育をOD610により、カロテノイドの濃度をＨＰＬＣにより測定した（表１０）。塩化コバルトを終濃度で０．０４２〜２１μｍｏｌ／Ｌ添加した場合には高い総カロテノイド生産濃度を示したが、添加しなかった場合には生産濃度は低かった。【００７６】
【表１０】
2017115774.tif 000012
【００７７】
〔実施例６〕
以下の組成の培地（シュークロース３０ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー３０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム１２水和物３．８ｇ／Ｌ、塩化カルシウム２水和物５．０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物０．７ｇ／Ｌ、硫酸鉄７水和物１ｇ／Ｌ、ｐＨ７．２）８ｍｌを内径１８ｍｍの綿栓付き試験管に入れ、１２１℃で１５分間オートクレーブ殺菌し、シード用試験管培地を調製した。シード用試験管培地の原料は、十分に菌体の生育することが確認されているロットのものを使用した。【００７８】
次に以下の組成の培地（グルコース４０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．５４ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム２．７８ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１．５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム２水和物１ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物０．７ｇ／Ｌ、硫酸鉄７水和物０．５ｇ／Ｌ、硫酸マンガン５水和物５ｍｇ／Ｌ、ホウ酸５ｍｇ／Ｌ，硫酸亜鉛７水和物５ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム２水和物２ｍｇ／Ｌ、硫酸銅５水和物２ｍｇ／Ｌ、ヨウ化カリウム１ｍｇ／Ｌ、タングステン酸ナトリウム１ｍｇ／Ｌ、硫酸ニッケル６水和物１ｍｇ／Ｌ、セレン酸ナトリウム０．１ｍｇ／Ｌ、塩化アルミニウム（ＩＩＩ）６水和物０．１ｍｇ／Ｌ、塩化クロム（ＩＩＩ）６水和物０．１ｍｇ／Ｌ、ｍｙｏ−イノシトール５０ｍｇ／Ｌ、アスコルビン酸３０ｍｇ／Ｌ、ピリドキシン塩酸塩２０ｍｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム１５ｍｇ／Ｌ、リボフラビン１０ｍｇ／Ｌ、ｐ−アミノ安息香酸１０ｍｇ／Ｌ、コリン１０ｍｇ／Ｌ、シアノコバラミン５ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩１ｍｇ／Ｌ、葉酸１ｍｇ／Ｌ、ナイアシン１ｍｇ／Ｌ、ビオチン０．１ｍｇ／Ｌ、ポリエーテル系消泡剤０．２ｇ／Ｌ）７．２ｍｌを内径１８ｍｍの綿栓付き試験管に入れたものを７本準備した。生産用試験管培地の原料は、菌体の生育が不十分であることが確認されているロットのものを使用した。【００７９】
塩化コバルト６水和物を終濃度が０、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１及び１０ｍｇ／Ｌ  （すなわち０、０．０００４２、０．００４２、０．０４２、０．４２、４．２及び４２μｍｏｌ／Ｌ）になるように０．８ｍｌの水溶液として調製し、上記生産用試験管にそれぞれ添加した。培地は水酸化ナトリウム水溶液又は硫酸水溶液でｐＨ７．２に調整し、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。
Paracoccus属細菌A-581-1株（FERM BP-4671）をシード用試験管培地に植菌し、２９℃で２日間、３００ｓｐｍで振盪培養を行った後、その培養液をコバルト濃度の異なる７種類の生産用試験管培地にそれぞれ０．０５ｍｌずつ植菌し、２９℃で４日間、３００ｓｐｍで振盪培養を行った。
別に準備した塩化コバルト６水和物を添加していない生産用試験管培地中のシード植菌後のコバルト濃度をＩＣＰ−ＭＳを使用して測定したところ０．００２μｍｏｌ／Ｌであった。【００８０】
４日間の培養後、培養液の菌体生育をＯＤ６１０により、カロテノイドの濃度をＨＰＬＣにより測定した結果を培地中コバルトの総濃度と合わせて表１１に示した。E-396株とは別個に土壌から分離発見されたParacoccus属細菌A-581-1株においても、E-396株と同様にコバルト濃度が低すぎても高すぎても生育及びカロテノイドの生産は著しく低かった。【００８１】
【表１１】
2017115774.tif 000013
【００８２】
〔実施例７〕
シード用試験管培地を実施例１に記載の方法と同じ方法で調製した。次に以下の組成の培地（グルコース３０ｇ／Ｌ、コーンスティープリカーろ過処理物３０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１．５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム１２水和物３．８ｇ／Ｌ、塩化カルシウム２水和物５．０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物０．７ｇ／Ｌ、硫酸鉄７水和物１．０ｇ／Ｌ、シリコン系消泡剤０．２ｇ／Ｌ）７．２ｍｌを内径１８ｍｍの綿栓付き試験管に入れた生産用試験管培地を９本準備した。生産用試験管培地の原料は、菌体の生育が不十分であることが確認されているロットのものを使用した。【００８３】
塩化コバルト６水和物を終濃度が０、０．０００１、０．００１、０．００５、０．０１、０．１、１、５及び１０ｍｇ／Ｌ  （すなわち０、０．０００４２、０．００４２、０．０２１、０．０４２、０．４２、４．２、２１及び４２μｍｏｌ／Ｌ）になるように０．８ｍｌの水溶液として調製し、９本の上記生産用試験管にそれぞれ添加した。培地は水酸化ナトリウム水溶液又は硫酸水溶液でｐＨ７．２に調整し、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。【００８４】
Paracoccus zeaxanthinifaciens ATCC 21588株をシード用試験管培地に植菌し、２８℃で２日間、３００ｓｐｍで振盪培養を行った後、その培養液をコバルト濃度の異なる９種類の生産用試験管培地にそれぞれ０．０５ｍｌずつ植菌し、２８℃で４日間、３００ｓｐｍで振盪培養を行った。
別に準備した塩化コバルト６水和物を添加していない生産用試験管培地中のシード植菌後のコバルト濃度をＩＣＰ−ＭＳを使用して測定したところ０．００２μｍｏｌ／Ｌであった。【００８５】
４日間の培養後、培養液の菌体生育をOD610により、カロテノイドの濃度をＨＰＬＣにより測定した結果を表１２に示した。コバルト濃度が低すぎても高すぎても生育及びカロテノイド生産が著しく低く、Paracoccus zeaxanthinifaciensによるゼアキサンチン及びβ-クリプトキサンチンの生産においても、コバルトの適切な濃度範囲が他のParacoccus属細菌と同様であることが分かった。【００８６】
【表１２】
2017115774.tif 000014
【配列表フリーテキスト】
【００８７】
ｎはa, c, g又はtを表す（存在位置：1350）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年7月6日(2017.7.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コバルト又はコバルト塩を０．００５μｍｏｌ／Ｌ〜２０μｍｏｌ／Ｌの濃度で含有する培地を用いてカロテノイド産生細菌を培養することを特徴とする、カロテノイド高産生細菌の培養方法。
【請求項２】
コバルト又はコバルト塩を０．００５μｍｏｌ／Ｌ〜２０μｍｏｌ／Ｌの濃度で含有する培地を用いてカロテノイド産生細菌を培養し、カロテノイドを安定的に産生するカロテノイド高産生細菌を製造する方法。
【請求項３】
コバルト又はコバルト塩を０．００５μｍｏｌ／Ｌ〜２０μｍｏｌ／Ｌの濃度で含有する培地を用いてカロテノイド産生細菌を培養することにより当該細菌に安定的にカロテノイドを生産させ、得られた培養物からカロテノイドを採取することを特徴とする、カロテノイドの製造方法。 
【請求項４】
コバルト又はコバルト塩を０．００５μｍｏｌ／Ｌ〜２０μｍｏｌ／Ｌの濃度で含有する培地を用いてカロテノイド産生細菌を培養することを特徴とする、カロテノイド産生菌によるカロテノイド産生量を安定化させる方法。
【請求項５】
培地中のコバルト又はコバルト塩の濃度が、０．００５μｍｏｌ／Ｌ〜８μｍｏｌ／Ｌである請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
カロテノイドが、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、リコペン、β−カロテン、アドニルビン、アドニキサンチン、エキネノン、アステロイデノン及び３−ヒドロキシエキネノンからなる群から選ばれる少なくとも一つである請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
カロテノイド産生細菌が、Paracoccus属、Brevundimonas属又はErythrobacter属に属する細菌である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
カロテノイド産生細菌が、１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡであって塩基配列が配列番号１に記載の塩基配列と９５％以上の相同性を有するＤＮＡを含む細菌である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
カロテノイド産生細菌が、E-396株（FERM BP-4283）若しくはA-581-1株（FERM BP-4671）又はそれらの変異株である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項２及び５〜９のいずれか１項に記載の方法によって製造された、カロテノイド高産生細菌。
【請求項１１】
乾燥菌体中にカロテノイドを少なくとも３６ｍｇ／ｇ含む、カロテノイド高産生細菌。
【請求項１２】
コバルトを含有するカロテノイド高産生細菌。
【請求項１３】
コバルト又はコバルト塩を０．００５μｍｏｌ／Ｌ〜２０μｍｏｌ／Ｌの濃度で含有する培地を含む、カロテノイド産生菌によるカロテノイド産生安定化剤。
【国際調査報告】
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