【手続補正書】
【提出日】平成24年5月22日(2012.5.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キク科ノコギリソウ属（Achillea sp.）の植物体の抽出物であることを特徴とする、グルタチオン産生促進剤。
【請求項２】
前記キク科ノコギリソウ属（Achillea sp.）の植物がセイヨウノコギリソウ（Achillea millefolium）であることを特徴とする、請求項１に記載のグルタチオン産生促進剤。
【請求項３】
前記グルタチオンの産生促進剤に於いて、γ-グルタミルシステイン合成酵素の発現の促進を機作に含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載のグルタチオン産生促進剤。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載のグルタチオン産生促進剤を含有する、グルタチオン産生促進用の経口投与組成物。
【請求項５】
次に示す疾患予防及び／又は改善のための、請求項４に記載のグルタチオン産生促進用の経口投与組成物。
（疾患）しみ、にきび、アトピー性皮膚炎、動脈硬化、糖尿病、薬物中毒、妊娠中毒、白内障、慢性肝疾患、腎疾患、肺疾患
【請求項６】
請求項１〜３の何れか１項に記載のグルタチオン産生促進剤の製造方法であって、前記キク科ノコギリソウ属（Achillea sp.）の植物体を、冷アルコール溶液に２４時間浸漬し、濾過後凍結乾燥して抽出物を得ることを特徴とする、製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、キク科ノコギリソウ属（Achillea sp.）の植物体の抽出物を含有する、グルタチオン産生促進剤に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
本発明は、この様な状況下為されたものであり、グルタチオン産生促進剤を提供することを課題とする。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
この様な状況に鑑みて、本発明者らはグルタチオン産生促進作用を有する物質を求めて、鋭意研究努力を重ねた結果、キク科ノコギリソウ属（Achillea sp.）の植物体の抽出物にその様な作用を見出し、発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下に示すとおりである。
（１）キク科ノコギリソウ属（Achillea sp.）の植物体の抽出物であることを特徴とする、グルタチオン産生促進剤。
（２）前記キク科ノコギリソウ属（Achillea sp.）の植物がセイヨウノコギリソウ（Achillea millefolium）であることを特徴とする、（１）に記載のグルタチオン産生促進剤。（３）前記グルタチオンの産生促進剤に於いて、γ-グルタミルシステイン合成酵素の発現の促進を機作に含むことを特徴とする、（１）又は（２）に記載のグルタチオン産生促進剤。
（４）（１）〜（３）の何れかに記載のグルタチオン産生促進剤を含有する、グルタチオン産生促進用の経口投与組成物。
（５）次に示す疾患予防及び／又は改善のための、（４）に記載のグルタチオン産生促進用の経口投与組成物。
（疾患）しみ、にきび、アトピー性皮膚炎、動脈硬化、糖尿病、薬物中毒、妊娠中毒、白内障、慢性肝疾患、腎疾患、肺疾患
（６）（１）〜（３）の何れかに記載のグルタチオン産生促進剤の製造方法であって、前記キク科ノコギリソウ属（Achillea sp.）の植物体を、冷アルコール溶液に２４時間浸漬し、濾過後凍結乾燥して抽出物を得ることを特徴とする、製造方法。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明によれば、グルタチオン産生促進剤を提供することができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
＜１＞本発明のグルタチオン産生促進剤の必須成分であるキク科ノコギリソウ属（Achillea sp.）の植物体抽出物
本発明のグルタチオン産生促進剤は、キク科ノコギリソウ属（Achillea sp.）の植物体抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。前記キク科ノコギリソウ属の植物としては、ノコギリソウ（Achillea alpina L.）、セイヨウノコギリソウ（Achillea millefolium）等が挙げられるが、セイヨウノコギリソウ（Achillea millefolium）が特に好適に
例示できる。抽出物の作製に用いる植物部位としては、地上部が好適に例示できる。
抽出に際して、植物体乃至はその乾燥物は予め、粉砕或いは細切して抽出効率を向上させるように加工することが好ましい。抽出は、植物体乃至はその乾燥物１質量部に対して、溶媒を１〜３０質量部加えて室温以下で２４時間浸漬することが好ましいが、４℃前後で２４時間浸漬することが特に好ましい。前記抽出溶媒としては、極性溶媒が好ましく、水、エタノ−ル、イソプロピルアルコ−ル、ブタノ−ル等のアルコ−ル類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジエチルエ−テル、テトラヒドロフラン等のエ−テル類から選択される１種乃至は２種以上が好適に例示でき、３０〜８０質量％、より好ましくは３０質量％エタノ−ル含有水溶液が特に好適に例示できる。浸漬後は室温に戻し、析出した不溶物を濾過により除去した後、溶媒を減圧濃縮等により除去することができるが、凍結乾燥による除去が特に好ましい。溶媒を除去した粉末組成物は、このまま粉末の状態で使用しても良いが、しかる後に、水と酢酸エチル、水とブタノ−ル等の液液抽出や、シリカゲルやイオン交換樹脂を充填したカラムクロマトグラフィ−等で分画精製しても良い。この様な抽出方法により得られた抽出物で、生体内のグルタチオン合成酵素の発現を促進することによりグルタチオン産生を促進し、活性酸素種の関与する多様な疾患に対する治療効果をもたらすことが期待される。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
＜２＞本発明のグルタチオン産生促進剤を含有する経口投与組成物
本発明のグルタチオン産生促進剤を含有する組成物は、生体内に於いてグルタチオンの産生を高める目的で経口投与組成物として投与するもの、皮膚内のグルタチオン産生量を高める目的で経皮的に投与されるものが存する。経口投与組成物としては、例えば、菓子やパン、麺等の一般食品、カプセル剤や、錠剤の形態を取る、健康増進の目的を有する食品群（例えば、特定保健用食品等）、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤や、錠剤の形態を取る、経口投与医薬等が例示でき、それぞれの製剤で許容される任意成分を含有することができる。この様な任意成分としては、食品であれば、塩、砂糖、グルタミン酸ナトリウム、イノシン酸ナトリウム、酢等の調味成分、着色成分、フレーバー等の矯臭成分、増粘剤、乳化・分散剤、保存料、安定剤等が好適に例示でき、健康増進の目的を有する食品群や医薬であれば、結晶セルロース、乳糖等の賦形剤、アラビヤガムやヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤、クロスカルメロースナトリウム、デンプン等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、矯味、矯臭剤、着色剤等が好ましく例示できる。これらを常法に従って処理することにより、本発明の経口投与組成物は製造することができる。この時、キク科ノコギリソウ属の植物体の抽出物は、総量で、組成物全量に対して、１〜１０質量、より好ましくは３〜８質量％含有されることが好ましい。斯くして得られた、本発明の経口投与組成物は、それを飲用することにより、生体内のグルタチオン量を増加させる作用に優れる。この様な作用を発揮させるためには、前記植物の抽出物を総量で、１日あたり、１０〜１０００ｍｇを１回乃至は数回に分けて飲用することが好ましい。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
＜試験例１＞グルタチオン産生量測定試験
ヒト肝ガン由来細胞株ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ-１１９９７）を用いてグルタチオン産生量の測定試験を実施した。１０容量％牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ社製）を含むＲＰＭ
Ｉ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）に細胞を懸濁し、培養プレートに播種し、ＣＯ２インキュベーター（９５容量％空気、５容量％二酸化炭素）内、３７℃の条件下で２４時間培養した。２４時間培養後、ジメチルスルホキシドにて懸濁した各抽出物を乾燥固形物量として培地中に２０μｇ／ｍｌの濃度で含む試料添加培地に交換し、さらに２４時間培養した。細胞を回収し、その後−３０℃で凍結、融解することで細胞を破砕し、細胞内のグルタチオンを溶出させた。１０００ｘｇで１５分間、２０℃で遠心し、上清を測定試料とした。ＧＳＨ／ＧＳＳＧ−４１２キット（ＯＸＩＳＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いてグルタチオン量を測定した。即ち、グルタチオン標準品、ブランク、測定試料２００μlを、各々のキュベットへ入れ、キット付属のクロモジェン２００μlと酵素液２００μlを各キュベットに加え、室温で５分間インキュベートした。その後各キュベットにキット付属のＮＡＤＰＨ液２００μlを添加し、４１２ｎｍの吸光度の変化を３分間測定した。グルタチオン量は、同時に設定したグルタチオン標準品にて作成した検量線から計算した。これらを元に、グルタチオン産生促進値（検体存在下のグルタチオン産生量／検体非存在下のグルタチオン産生量）を求めた。この値が１．４以上の場合（４０％促進）、その検体はグルタチオン産生促進作用を有すると判断した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
＜試験例２＞γ-グルタミルシステインシンセターゼ（ＧＣＳ）遺伝子の定量試験
上記試験例１と同様の方法でＨｅｐＧ２を培養し、ジメチルスルホキシドにて懸濁した各抽出物を乾燥固形物量として培地中に２０μｇ／ｍｌの濃度で含む試料添加培地に交換し、さらに６時間培養した。その後細胞を回収し、ＲＮＡｓｐｉｎＭｉｎｉ ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡを用いて、以下に示すようにリアルタイムＲＴ-ＰＣＲ法によりγ-グルタミルシステインシンセターゼ（ＧＣＳ）遺伝子の定量試験を実施した。即ち、１μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型とし、ＧＣＳ合成プライマー（ＳＩＧＭＡ  ＧＥＮＯＳＹＳ社製、配列番号１、配列番号２）及びＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  １ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて逆転写反応を行った。逆転写反応によって得られたＧＣＳのｃＤＮＡを滅菌水にて１００倍希釈し、鋳型ｃＤＮＡとした。Ｅｘ  Ｔａｑ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲ反応を行った後に電気泳動を行った。得られたバンドは画像ソフトを用いて画像として取り込み、ＩｍａｇｅＪ（アメリカ国立衛生研究所製）を用いてバンドの濃淡を数値化した。ＧＣＳ遺伝子の発現量は、β-アクチン遺伝子についても同様に検討した発現量（合成プライマーはＳＩＧＭＡ  ＧＥＮＯＳＹＳ社製、配列番号３、配列番号４）の相対値として表した。設計した合成プライマーの塩基配列及びＰＣＲ反応条件は以下の通りである。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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