(57)【要約】  本発明は、オキシトシン受容体遺伝子座の少なくとも１つにおいて、オキシトシン受容体遺伝子のプロモーターの制御下に（i）オキシトシン受容体蛋白質をコードする塩基配列、（ii）IRES配列、及び（iii）部位特異的組み換え酵素をコードする塩基配列を有する、非ヒト動物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オキシトシン受容体遺伝子座の少なくとも１つにおいて、オキシトシン受容体遺伝子のプロモーターの制御下に
（i）オキシトシン受容体蛋白質をコードする塩基配列、
（ii）IRES配列、及び
（iii）部位特異的組み換え酵素をコードする塩基配列
を有する、非ヒト動物。
【請求項２】
IRES配列が、ヒトeIF4G遺伝子に由来するIRES配列である、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項３】
オキシトシン受容体遺伝子座の第３エクソンのコード領域が、
（i）オキシトシン受容体蛋白質をコードする塩基配列、
（ii）IRES配列、及び
（iii）部位特異的組み換え酵素をコードする塩基配列
を含む塩基配列で置換された、請求項１又は２に記載の非ヒト動物。
【請求項４】
部位特異的組み換え酵素が、Creである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
【請求項５】
オキシトシン受容体蛋白質が、Ｃ末端側にタグ配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
【請求項６】
前記部位特異的組み換え酵素により、遺伝子機能が改変され得る塩基配列をさらに有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
【請求項７】
（I）オキシトシン受容体遺伝子座の少なくとも１つにおいて、オキシトシン受容体遺伝子のプロモーターの制御下に
（i）オキシトシン受容体蛋白質をコードする塩基配列、
（ii）IRES配列、及び
（iii）部位特異的組み換え酵素をコードする塩基配列、並びに、
（II）前記部位特異的組み換え酵素により、遺伝子機能が改変され得る塩基配列
を有する非ヒト動物を用いることを特徴とする、オキシトシン受容体及び／又は前記機能が改変され得る遺伝子の機能解析方法。
【請求項８】
下記の塩基配列を含むベクター：
（i）オキシトシン受容体蛋白質をコードする塩基配列、
（ii）IRES配列、及び
（iii）部位特異的組み換え酵素をコードする塩基配列
（iv）オキシトシン受容体遺伝子座の塩基配列と相同組み替え可能な塩基配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１３年１１月５日に出願された、日本国特許出願第２０１３−２２９３１５号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。【０００２】
本発明は、主に特定の塩基配列を有する非ヒト動物に関する。
【背景技術】
【０００３】
オキシトシン（Oxytocin、OXT）は、９つのアミノ酸からなる神経ペプチドホルモンであり、オキシトシン受容体（Oxytocin receptor、OTXR）を介して様々な生理作用、動物の生殖行動などに寄与すると考えられている。これまでにオキシトシン受容体のノックアウトマウスが作成され、乳汁射出が異常となる表現型を示すことが明らかにされている（特許文献１、非特許文献１）。さらに、ノックアウトマウスは、社会行動障害の表現型をも示すことが明らかにされている。しかしながら、オキシトシン−オキシトシン受容体の分子メカニズムについては、さらなる研究が必要である。【０００４】
また、近年は、オキシトシンがオキシトシン受容体を介して、抗鬱作用、抗自閉症作用、抗統合失調作用を表すことが着目されている（非特許文献２〜４）。【０００５】
斯かる状況下、オキシトシン−オキシトシン受容体の系が関与する生理作用等のメカニズム解明、オキシトシンの薬理作用に基づく新規な医薬の開発や薬理試験に用いることができる手段が求められている。【０００６】
ここで、OTXRノックアウトマウスは、ハプロ不全の表現型を示すことが知られている。ハプロ不全とは姉妹染色体同士のうち一方に変異が起った場合、作られるタンパク質の量が不足するために片方の染色体だけではまかないきれずその表現型が優性的に遺伝する現象をいう。オキシトシン受容体のノックアウトマウスは社会認識能の低下、攻撃性上昇、母性行動低下などの行動異常を示す。オキシトシン受容体のハプロタイプのノックアウトマウス（染色体の一方が野生型、もう一方がノックアウト型）は攻撃性については野生型と同様であるが、社会認識能がノックアウトマウスと同様に低下することから社会行動の一部はハプロ不全を示すとされる（非特許文献５）。そのため、OTXR遺伝子を、ノックアウトを含む遺伝子組み換えにより操作する場合、ハプロ不全の影響が問題となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Proc Natl Acad Sci USA 102: 16096-16101 (2005)
【非特許文献２】Psychoneuroendocrinology. 2013 Jun 27. doi:pii: S0306-4530(13)00211-4.
【非特許文献３】Biol Psychiatry. 2012 Dec 15;72(12):982-9.
【非特許文献４】Biol Psychiatry 2010 vol. 67 (7) pp. 692-4
【非特許文献５】J Neuroendocrinol. 2013 Feb;25(2):107-18
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、オキシトシン−オキシトシン受容体の系が関与する生理作用等のメカニズム解明、オキシトシンの薬理作用に基づく新規な医薬の開発や薬理試験に用いることができる非ヒト動物を提供することを主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、鋭意検討の結果、オキシトシン受容体遺伝子座の少なくとも１つにおいて、オキシトシン受容体遺伝子のプロモーターの制御下に（i）オキシトシン受容体蛋白質をコードする塩基配列、（ii）IRES配列、及び（iii）部位特異的組み換え酵素をコードする塩基配列を有する、非ヒト動物が上記課題を解決できることを見出した。【００１０】
すなわち、本願発明は以下の態様を包含する。【００１１】
項１、オキシトシン受容体遺伝子座の少なくとも１つにおいて、オキシトシン受容体遺伝子のプロモーターの制御下に
（i）オキシトシン受容体蛋白質をコードする塩基配列、
（ii）IRES配列、及び
（iii）部位特異的組み換え酵素をコードする塩基配列
を有する、非ヒト動物。【００１２】
項２、IRES配列が、ヒトeIF4G遺伝子に由来するIRES配列である、項１に記載の非ヒト動物。【００１３】
項３、オキシトシン受容体遺伝子座の第３エクソンのコード領域が、
（i）オキシトシン受容体蛋白質をコードする塩基配列、
（ii）IRES配列、及び
（iii）部位特異的組み換え酵素をコードする塩基配列
を含む塩基配列で置換された、項１又は２に記載の非ヒト動物。【００１４】
項４、部位特異的組み換え酵素が、Creである、項１〜３のいずれか１項に記載の非ヒト動物。【００１５】
項５、オキシトシン受容体蛋白質が、Ｃ末端側にタグ配列を有する、項１〜４のいずれか１項に記載の非ヒト動物。【００１６】
項６、前記部位特異的組み換え酵素により、遺伝子機能が改変され得る塩基配列をさらに有する、項１〜５のいずれか１項に記載の非ヒト動物。【００１７】
項７、（I）オキシトシン受容体遺伝子座の少なくとも１つにおいて、オキシトシン受容体遺伝子のプロモーターの制御下に
（i）オキシトシン受容体蛋白質をコードする塩基配列、
（ii）IRES配列、及び
（iii）部位特異的組み換え酵素をコードする塩基配列、並びに、
（II）前記部位特異的組み換え酵素により、遺伝子機能が改変され得る塩基配列
を有する非ヒト動物を用いることを特徴とする、オキシトシン受容体及び／又は前記機能が改変され得る遺伝子の機能解析方法。【００１８】
項８、下記の塩基配列を含むベクター：
（i）オキシトシン受容体蛋白質をコードする塩基配列、
（ii）IRES配列、及び
（iii）部位特異的組み換え酵素をコードする塩基配列
（iv）オキシトシン受容体遺伝子座の塩基配列と相同組み替え可能な塩基配列。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、オキシトシン−オキシトシン受容体の系が関与する生理作用等のメカニズム解明やオキシトシンの薬理作用に基づく新規な医薬の開発や薬理試験に用いることができる新規なツールとなりうる非ヒト動物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例で使用したノックインベクターの構造、及び相同組み換えにより得られる遺伝子の構造を示す。
【図２】サザンブロットハイブリダイゼーションにより解析した結果を示す。１：Oxtr-Cre+/-マウス、２：Oxtr-Cre-Neo+/-マウス、３：野生型（Wt）マウス。(A)３’プローブ、(B)５’プローブ、(C)Neo プローブ。
【図３】乳汁射出能の解析結果を示す。具体的には、分娩及び母性行動に対する遺伝型の効果（Effect of  genotype on parturition and maternal behavior）を示す。野生型（Wt, Oxtr+/+）の雄（Male）とOxtr+/+、Oxtr-/-及びOxtr-Cre+/+の各遺伝子型の雌（Female）との交配（Pairing）における、妊娠した雌マウスの数（No. of pregnant female）、産子数の平均値（Average of litter size）、生存動物の平均値（Average of survivor）及び出生数の合計に対する出生後生存数の割合（％）（Postnatal survivors per total birth %）を示す。
【図４】子宮切片における抗HA抗体による免疫染色の結果を示す。
【図５】Oxtr-Cre+/-:ROSA26+/-マウス（雄）の脳におけるβ-ガラクトシダーゼ抗体による免疫染色像を示す。（Ａ）海馬（Hippocampus）ＣＡ３領域、（Ｂ）DEn (Dorsal endopiriform nucleus)での染色をそれぞれ示す。右図は、それぞれ左図の拡大図（Enlarged view）を示す。
【図６】Oxtr-Cre+/-:ROSA26+/-マウス（雄）の脳におけるX-gal染色の結果を示す。（Ａ）外側中隔（lateral septum（LS））、（Ｂ）海馬（Hippocampus）ＣＡ１及びＣＡ２領域、（Ｃ）海馬ＣＡ３領域及びDEn（Dorsal endopiriform nucleus）、（Ｄ）DEn（Dorsal endopiriform nucleus）での染色をそれぞれ示す。
【図７】ノックインコンストラクトの配列を示す。オキシトシン受容体（Oxytocin receptor）、HAタグ（HA tag）、ヒトeIF4G IRES配列（Human eIF4G IRES sequence）及びCreリコンビナーゼ（Cre recombinase）の塩基配列を含む。
【図８】ノックインコンストラクトの配列を示す（続き）。FRT配列（FRT site）及びPGK-neoの塩基配列を含む。
【図９】AAV-loxP-WGAウイルスの構造を示す。矢印（Coding）は、コード領域の向きを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
１．非ヒト動物
本発明の非ヒト動物は、オキシトシン受容体遺伝子座の少なくとも１つにおいて、オキシトシン受容体遺伝子のプロモーターの制御下に
（i）オキシトシン受容体蛋白質をコードする塩基配列、
（ii）IRES配列、及び
（iii）部位特異的組み換え酵素をコードする塩基配列
を有することを主な特徴とする。
【００２２】
非ヒト動物
本発明の非ヒト動物は、オキシトシン受容体遺伝子座を有するものである限り、いかなる種の非ヒト動物でもよい。ヒトにおけるオキシトシン−オキシトシン受容体の系のモデル系として用いる観点からは、ヒトに近縁なヒト以外の哺乳類であることが好ましい。このような哺乳類としては、サルなどの類人猿、齧歯類（ネズミ目）、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ等が挙げられる。実験動物としての取り扱いが容易であるとの観点から、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等の齧歯類が好ましく、遺伝子組み換え操作を容易に行えるとの観点からマウスがより好ましい。マウスとしては、C56BL/6、C57BL/6、BALB/c等の近交系化された系統に属するマウスが特に好ましい例として挙げられる。
【００２３】
本発明の非ヒト動物は、オキシトシン受容体遺伝子座の少なくとも１つにおいて、オキシトシン受容体遺伝子のプロモーターの制御下に、上記（i）〜（iii）の塩基配列を有する。すなわち、本発明の非ヒト動物は、遺伝子組み換え非ヒト動物（トランスジェニック非ヒト動物）である。上記（i）〜（iii）がノックイインされた非ヒト動物であるとも言える。本明細書において、「本発明のノックイン動物」と記載する場合がある。
【００２４】
本発明の非ヒト動物は、内在性のオキシトシン受容体遺伝子座のうち1つにおいて上記（i）〜（iii）の塩基配列を有するものであっても（ヘテロ体）、内在性のオキシトシン受容体遺伝子座の両方が上記（i）〜（iii）の塩基配列を有するもの（ホモ体）であってもよい。
【００２５】
オキシトシン遺伝子及びオキシトシン遺伝子座
オキシトシン受容体遺伝子は、公知の遺伝子である。オキシトシン受容体遺伝子がコードするオキシトシン受容体タンパク質は、オキシトシンをリガンドとする、７回膜貫通型のＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質）共役受容体である。オキシトシン受容体遺伝子は、魚類（例えば、ゼブラフィッシュ。）、鳥類（例えば、ニワトリ。）、哺乳類（例えば、ヒト、ウシ、マウス。）にかけて高度に保存されている。
【００２６】
オキシトシン受容体遺伝子のmRNAの塩基配列及びオキシトシン受容体タンパク質のアミノ酸配列は、米国生物工学情報センター（NCBI; National Center for Biotechnology Information）が提供するGenBankに登録がされている。例えば、マウスのものは、下記のアクセッション番号で登録されている（複数のリビジョン（revision）が登録されている場合、最新のリビジョンを指すと理解される。）：
マウスオキシトシン受容体mRNA：NM_001081147
マウスオキシトシン受容体タンパク質：NP_001074616
オキシトシン受容体をコードするオキシトシン受容体遺伝子座は、例えばマウスでは、第6染色体上に存在する。マウスのオキシトシン受容体遺伝子座は、４つのエクソンと３つのイントロンから構成され、オキシトシン受容体タンパク質をコードする配列は第３エクソンと第4エクソンに存在する。
【００２７】
（i）オキシトシン受容体蛋白質をコードする塩基配列
オキシトシン受容体タンパク質をコードする塩基配列としては、オキシトシン受容体のcDNA配列が好適な例として挙げられる。別の態様においては、天然の若しくは人工のイントロン配列（例えば、オキシトシン受容体の第３イントロン）で中断された塩基配列であってもよい。マウスのオキシトシン受容体をコードする塩基配列を配列番号１に例示する。
【００２８】
オキシトシン遺伝子の機能を十分に相補するとの観点から、上記（i）の塩基配列がコードするオキシトシン受容体は、それが導入される非ヒト動物由来のものであることが好ましいが、これに限定されない。
【００２９】
当該塩基配列がコードするオキシトシン受容体は、（x）天然のオキシトシン受容体のアミノ酸配列を有するもの、（y）天然のオキシトシン受容体のアミノ酸配列において１個又は複数（例えば、20個以下程度；10個以下程度；9、8、7、6、5、4、3、2個程度）アミノ酸が置換、付加若しくは欠失されたものであってオキシトシン受容体としての機能を有するものを包含する。
【００３０】
オキシトシン受容体タンパク質は、その末端（アミノ末端（N末端）又はカルボキシ末端（C末端）、好ましくはC末端）にタグ配列を有していてもよい。タグ配列を有する場合、発現するオキシトシン受容体タンパク質の局在を、抗体染色などの手法により可視化をすることができる。タグ配列は特に限定されるものではないが、HAタグ（YPYDVPDYA）（配列番号２）、FLAGタグ（DYKDDDDK）（配列番号３)、Mycタグ（EQKLISEEDL）（配列番号４）、V5タグ（GKPIPNPLLGLDST）（配列番号５）などが例示される。
【００３１】
（ii）IRES配列
IRES（Internal Ribosome Entry Sequence）配列は、mRNAのCAP構造に依存しない翻訳開始を可能とする配列を指す。本発明の非ヒト動物はIRES配列を有することで、IRESの下流のタンパク質をコードする塩基配列も効率的に翻訳される。
【００３２】
IRES配列としては、公知のものを使用することができる。例えば、ピコルナウイルスに由来するIRES配列、eIF4G（eukaryotic initiation factor-4G）遺伝子、PDGF2（platelet-derived growth factor 2）遺伝子、VEGF（vascular endothelial growth factor）遺伝子、IGF-II（insulin-like growth factor II）遺伝子などの遺伝子に由来するIRES配列などが例示される。なかでも、ヒトeIF4G遺伝子に由来するIRES配列は、上記（i）の塩基配列がコードするオキシトシン受容体タンパク質の発現量が、野生型のオキシトシン受容体タンパク質の発現量と同程度になるとの観点から好ましい。ヒトeIF4G遺伝子に由来するIRES配列の塩基配列を、配列番号６に示す。
【００３３】
（iii）部位特異的組み換え酵素をコードする塩基配列
部位特異的組み換え酵素とは、特定の認識配列（塩基配列）において若しくは特定の認識配列間で、特異的なDNAの組み換えを引き起こす酵素を指す。部位特異的組み換え酵素の具体例としては、Creリコンビナーゼ、FLPリコンビナーゼなどが例示される。
【００３４】
なお、Creリコンビナーゼの認識配列としてはloxP配列、FLPリコンビナーゼの認識配列としてはFRT配列が挙げられる。
【００３５】
部位特異的組み換え酵素のアミノ酸配列及びこれをコードする塩基配列は公知である。一例としてCreリコンビナーゼをコードする塩基配列を配列番号７に例示する。
【００３６】
配置
本発明の非ヒト動物において、上記（i）〜（iii）の塩基配列は、オキシトシン受容体遺伝子のプロモーターの制御下に配置されている。すなわち、野生型のオキシトシン受容体遺伝子と同様の発現パターン（発現時期、発現細胞、発現強度など。）で、上記（i）〜（iii）の塩基配列を含む転写産物が発現されるように配置がされていればよい。
【００３７】
本発明において、上記（i）〜（iii）の塩基配列は一体として同一の転写産物に転写されること、すなわちポリシストロニック（例えば、バイシストロニック。）な態様で転写されることが好ましい。また、本発明において、上記（i）がコードするオキシトシン受容体蛋白質と上記（iii）がコードする部位特異的組み換え酵素とは、別個のタンパク質として発現すことが好ましい。この場合、上記（i）及び上記（iii）は、それぞれ別個に終始コドンを有する。
【００３８】
本発明の非ヒト動物は、上記（i）〜（iii）の塩基配列をこの順番で有することが好ましいが、これに限定されない。例えば、（iii）、（ii）、（i）の順番で配置されていてもよい。
【００３９】
本発明の好ましい態様の１つにおいて、オキシトシン受容体遺伝子座の第３エクソンのコード領域が上記（i）〜（iii）で置換されている。
【００４０】
その他の構成
本発明の非ヒト動物は、さらに上記部位特異的組み換え酵素により、遺伝子機能が改変され得る塩基配列をさらに有していてもよい。遺伝子機能が改変され得る塩基配列の典型例としては、ゲノム上の機能が改変される遺伝子をコードする塩基配列の全部又は一部が、２つの上記部位特異的組み換え酵素の認識配列により挟まれているものが例示される。
【００４１】
例えば上記部位特異的組み換え酵素がCreリコンビナーゼである場合、機能が改変される遺伝子をコードする塩基配列の全部又は一部が、loxP配列に挟まれている。
【００４２】
作製方法
本発明の非ヒト動物は、公知の遺伝子組み換え技術を用いて作製することができる。一例として、上記（i）〜（iii）がオキシトシン受容体遺伝子のプロモーターの制御下にノックインされた胚性幹細胞（ES細胞）を胚盤胞に導入して得られるキメラ胚を、対象動物の雌の子宮に着床させることにより、キメラ動物を得る方法が例示される。
【００４３】
上記ノックインがされたES細胞は、例えば下記の配列を有するベクターを用いて作製することができる：
（i）オキシトシン受容体蛋白質をコードする塩基配列、
（ii）IRES配列、及び
（iii）部位特異的組み換え酵素をコードする塩基配列
（iv）オキシトシン受容体遺伝子座の塩基配列と相同組み替え可能な塩基配列。
【００４４】
オキシトシン受容体遺伝子座の塩基配列と相同組み替え可能な塩基配列は、好適には、挿入位置の5’側の塩基配列及び3’側の塩基配列を指す。
【００４５】
上記ベクターは、その他に、ネガティブセレクションを行うためのマーカーポジティブセレクション（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子。）、ポジティブセレクションを行うためのマーカー遺伝子（例えば、HSV（単純ヘルペスウイルス）のチミジンキナーゼ（tk）遺伝子、ジフテリアトキシン（DT）遺伝子など。）、大腸菌内で維持及び複製をするために必要な構成（複製開式起点、薬剤耐性遺伝子など。）を必要に応じて有する。
【００４６】
上記マーカー遺伝子は、FLPリコンビナーゼ、Creリコンビナーゼなどの部位特異的組み換え酵素により除去ができるように、該酵素の認識配列で挟まれていることが好ましい。
【００４７】
本発明の非ヒト動物が、上記部位特異的組み換え酵素により、遺伝子機能が改変され得る塩基配列を有している場合、例えば、得られた上記（i）〜（iii）の塩基配列を烏有する非ヒト動物と、遺伝子機能が改変され得る塩基配列を有している非ヒト動物とを交配することによって得ることができる。
【００４８】
２．遺伝子の機能解析方法
本発明はまた、下記（I）及び（II）を有する非ヒト動物を用いることを特徴とする、オキシトシン受容体及び／又は前記機能が改変され得る遺伝子の機能解析方法をも提供する：
（I）オキシトシン受容体遺伝子座の少なくとも１つにおいて、オキシトシン受容体遺伝子のプロモーターの制御下に
（i）オキシトシン受容体蛋白質をコードする塩基配列、
（ii）IRES配列、及び
（iii）部位特異的組み換え酵素をコードする塩基配列、並びに、
（II）前記部位特異的組み換え酵素により、遺伝子機能が改変され得る塩基配列。
【００４９】
上記（I）及び（II）を有する非ヒト動物においては、オキシトシン受容体が発現する細胞で、特異的に、所定の遺伝子の機能が改変される。典型的は、オキシトシン受容体が発現する細胞で、当該遺伝子の機能が喪失される。
【００５０】
このような構成を有する非ヒト動物を用いることで、オキシトシン受容体及び／又は前記機能が改変される遺伝子の機能解析、特にオキシトシン受容体と前記機能が改変される遺伝子との相互作用の機能解析が可能となる。
【００５１】
特に限定されるものではないが、本発明の方法の具体例を以下に挙げる。１つ態様においては、上記「１．」欄に記載の本発明のノックイン動物に、図９に示すAAV-loxP-WGAウイルスを感染させる（特に、脳内などのオキシトシン受容体の発現部位が好ましい。）ことで、上記（I）及び（II）を有する非ヒト動物を作製する。
【００５２】
図９に示すAAV-loxP-WGAウイルスは、目的タンパク質をコードする塩基配列を、プロモーターの向きに対して逆向きに有するため、通常は目的タンパク質が発現しない。ここではWGA（wheat germ agglutinin）タンパク質を一例としてあげるが、これに限定されるものではない。また、目的タンパク質は１種のタンパク質、又は２種以上のタンパク質の融合タンパク質であってもよい。融合タンパク質である場合、融合タンパク質を構成する一例として、蛍光タンパク質が挙げられる。
【００５３】
また、図９に示すAAV-loxP-WGAウイルスにおいて、目的タンパク質をコードする塩基配列は、1対の部位特異的組み換え酵素の認識配列（ここでは、loxP配列を一例としてあげるが、これに限定されるものではない。また、当該loxP配列は、loxPJTZ17とloxP71の組み合わせなどの不可逆反転型であることが好ましい。）で挟まれている。
【００５４】
感染部位で記部位特異的組み換え酵素（ここでは、Creリコンビナーゼを一例としてあげるが、これに限定されるものではない。）が発現している場合、前記部位特異的組み換え酵素が認識配列の対の間での組み換え反応を起こすことにより、目的タンパク質をコードする塩基配列の向きが反転し、目的タンパク質を発現するようになる。
【００５５】
図９に示すAAV-loxP-WGAを用いる場合、Creリコンビナーゼが発現している細胞（すなわち、オキシトシン受容体を発現している細胞。）でのみ組み換えが起こり、WGA-TdTomatoが発現する。なお、TdTomato は蛍光タンパク質である。WGAタンパク質は神経細胞間を順行性に移動するため、オキシトシン受容体を発現する神経細胞の投射先に移動する。例えば、WGAタンパク質を抗体染色によって可視化することにより、投射先の神経細胞を明らかにし、オキシトシン受容体を発現する神経細胞が形成するネットワークの情報が得ることができる。あるいは、蛍光タンパク質によっても可視化を行うことができる。
【００５６】
目的タンパク質は、当業者が解析目的に応じて適宜選択することができる。例えば、WGAタンパク質に替えて狂犬病ウイルスを用いることで、その逆行性から神経細胞の投射元を可視化できる。別の態様においては、目的タンパク質としてコレラトキシン、チミジンカイネースなどの細胞毒性を示すタンパク質を用いることで、オキシトシン受容体を発現する神経を特異的に除去することができる。
【００５７】
さらに別の態様においては、目的タンパク質としてチャネルロドプシン（活性性）、ハロロドプシン（抑制性）などの光受容体分子を用いることで、オキシトシン受容体を発現する神経細胞において光受容体分子を発現させることができる。この場合、例えば、固有の光刺激をあたえることによりオキシトシン受容体を発現する神経細胞のみで、神経細胞の活性化または抑制を行うことが可能となる。このような系をもちいて、社会行動解析を行い、社会行動におけるオキシトシン受容体のより詳細な機能を解明する事が可能となる。
【実施例】
【００５８】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する。
（Oxtr-Creノックインベクターの作製）
オキシトシン受容体（Oxtr）遺伝子のORF（Open Reading Frame；タンパク質をコードする領域）開始点が存在するエクソン３の領域にOxtr cDNA、Cre recinbinase cDNAを組み込みOxtr遺伝子の発現制御によりOxtrとCre recinbinaseを発現することを可能とするOxtr-Creノックインベクターの構築した。【００５９】
Oxtr cDNA、キャップ非依存性翻訳開始に必要なeIF4G由来のIRES、Cre recinbinase cDNA, エクソン２及び３、ポシティブ選択のためのネオマイシン耐性遺伝子、相同領域の５’ａｒｍ及び３’ａｒｍ、大腸菌への形質転換に必要なアンピシリン耐性遺伝子、ポジティブ選別のために必要な遺伝子として薬剤耐性遺伝子とそのプロモーター(pgk-neo), ノックインマウスができた際にpgk-neoを取り除くためのFRT配列、ネガティブ選別のための遺伝子として核酸アナログを細胞毒性のある物質に変化させて細胞を死滅させる性質を持つＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）のチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子（ｍｃ１ｔｋ）等のパーツからなる２０ｋｂのノックインベクターを作製した。【００６０】
（ＥＳ細胞へのノックインベクターの導入）
ノックインベクターを精製し、制限酵素SalI消化によって直鎖状にした。その後、ＥＳ細胞株Ｅ１４ＴＧ２ａに、電気穿孔法の手法を用いて、上記のノックインベクターを導入した。次に薬剤選択により相同組み換えの起こったＥＳ細胞株コロニーを単離、培養しサザンブロットハイブリダイゼーションの手法を用いて、相同性組み換えの起こったコロニーのスクリーニングを行った。【００６１】
（サザンブロッティング）
図１に、使用したノックインベクターの構造、及び相同組み換えにより得られる遺伝子の構造を示す。図１において、一番上に野生型遺伝子の構造、二段目にノックインベクターの構造、一番下に相同組み換えを起こした結果得られる構造を示す。図１において、Ｅ１はエクソン１、Ｅ２はエクソン２、Ｅ３はエクソン３を、それぞれ示す。ＸｂａＩはＸｂａＩ消化部位を、XhoIはXhoI消化部位を、SphIはＳphＩ消化部位を、それぞれ示す。【００６２】
ノックインベクターの配列を配列番号８及び図７に示す。【００６３】
（キメラマウスの作製）
マイクロインジェクションの技術を用いて、相同組み換えを正しく起こしたＥＳ細胞を、マウス胚盤胞に導入した。生殖能を有しない雄マウスと交配させるホルモン処理により擬制妊娠させた仮親マウスの子宮内に、ＥＳ細胞を導入したBL6系統マウス由来胚盤胞を移植し、出産させてキメラマウスを得た。マウスの毛の色により、産まれたマウスの形質を確認した。【００６４】
（ノックインマウスの取得のための交配）
目的とするノックインマウスの取得のため以下の交配を行った。ここでも、毛の色とサザンブロットハイブリダイゼーションにより、産まれたマウスの形質を確認した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊを相手としてキメラマウスと交配させて、Oxtr-Cre-Neo(+/-)マウスを得た。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊとキメラマウスを交配することによって得たヘテロの遺伝子型を有するマウス(Oxtr-Cre-Neo(+/-))は強力なプロモーターPGKの下流にネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）が挿入されている。これらの影響で本来のOxtr遺伝子の発現効果が維持できずにOxtr遺伝子の発現の低下が起こることが予想された。よってOxtr-Cre-Neo(+/-)マウスと全身でFlippase酵素を発現しているFlippaseマウスと交配させて、完全にPGK-Neoが欠損しているヘテロマウスOxtr-Cre(+/-)を作製した。【００６５】
（ノックインマウスゲノムのサザンブロッティング解析）
Oxtr-Cre-Neo(+/-)、Oxtr-Cre(+/-)、野生型マウスの遺伝子型をサザンブロットハイブリダイゼーションにより解析した結果を、図２に示す。Oxtr-Cre-Neo(+/-)、Oxtr-Cre(+/-)、野生型マウスのTail DNAからゲノムを抽出し制限酵素XbaIで消化したものに対し、３’プローブを検出に使用した場合野生型（ＷＴ）マウスにおいては１３．５ｋｂｐの位置にバンドが認められOxtr-Cre-Neo(+/-)、Oxtr-Cre(+/-)マウスにおいて１３．５ｋｂｐと４．７ｋｂｐにバンドが認められた（図２Ａ）。一方、５’プローブを検出に使用した場合、野生型（ＷＴ）マウスにおいては１３．５ｋｂｐ、Oxtr-Cre-Neo(+/-)、Oxtr-Cre(+/-)マウスにおいて１３．５ｋｂｐと９．８ｋｂｐにバンドが認められた（図２B）。Neo プローブを用いた場合、Oxtr-Cre-Neo(+/-)は1．６ｋの位置にバンドが認められ野生型（ＷＴ）、Oxtr-Cre(+/-)においてはその位置にバンドが認められなかった（図２Ｃ）。【００６６】
（Oxtr-Cre（+／+）マウスの乳汁射出能の解析）
Oxtr-Cre(+/-)同士を交配させて得られたOxtr-Cre（+/+）マウスにおいては、OXTR,CREの発現は完全に挿入したOxtr遺伝子,Cre recombinase遺伝子由来であると考えられる。発明者の知見からOxtr-/-雌親マウスより産まれた新生マウスはOxtr-/-雌親マウスから乳汁が射出されないため２４時間以内に１００％死亡することが示されている(Takayanagi Y., Nishimori K. et .al. PNAS 16096-16101 (2005))。そこでOxtr-Cre（+/+）マウスがOxtr遺伝子を発現していることを確認するために雌親マウスの乳汁射出能を調べた。Oxtr-Cre（+/+）雌マウスは新生マウスを出産後、乳汁射出が可能であり離乳期まで新生マウスを育てた。このことによりOxtr-Cre（+/+）はベクター由来のOXTR cDNAが機能していることが示された（図３）。【００６７】
（抗HA抗体による免疫染色）
OTXRは子宮で発現することが知られている。Oxtr-Cre KI（ノックイン）マウスのOxtr-cDNAの3'末端に付加されているHA-tagを確認するために、子宮を用いた抗HA抗体を用いた免疫染色を行った。Oxtr-Creノックインマウスに麻酔をした後、4％paraformaidehydeを用いて灌流固定を行い子宮を取得した。子宮を4％paraformaldehyde (in 0.1M PB)で4℃にて一晩後固定を行った。後固定後の子宮を30％スクロース溶液(in 0.1M PB)に移し、二晩4℃で浸すことで30％スクロースへの置換を行った。十分に置換を行った子宮をドライアイス中に埋め凍結させた後、クライオスタットを用いて30μmの切片を作成した。作成した切片をマスコートに張り付け、室温で一晩乾燥した。サンプルは1×PBSで5分間3回洗浄した後、0.5％ TritonX-100/1×PBSで室温にて30分反応させ、その後1×PBSで10分間洗浄した。その後、5％ Normal Horse Serum/0.3% TritonX-100/1×PBS(ブロッキングバッファー)で室温にて30分ブロッキングを行った。その後、1次抗体 anti-HA rat antibody(1:100)を用いて4℃で18〜24時間反応させた。1×PBSTで5分間3回洗浄した後、二次抗体 Alexa 594 conjugated goat anti-rat IgG antibody (1:500)を室温で二時間反応させた。1×PBSで5分2回洗浄した後、PermaFluorTM Mounting Medium (LVC)で封入した。その結果、子宮においてHA-tagが確認された（図４）。【００６８】
(Oxtr- Cre +/-；Rosa+/-マウスの作成)
OXTR-CreノックインマウスとRosa26レポーターマウスを交配することにより、Cre recombinaseを発現する細胞においてβガラクトシダーゼ遺伝子が発現するマウスを作製した。【００６９】
（Cre recombinaseの発現の確認）
上記で作成したマウスに麻酔をした後、4％paraformaidehydeを用いて灌流固定し脳取得した。脳を4％paraformaldehyde (in 0.1M PB)で4℃にて一晩後固定を行った。後固定後の脳を30％スクロース溶液(in 0.1M PB)に移し、二晩4℃で浸すことで30％スクロースへの置換を行った。十分に置換を行った脳をドライアイス中に埋め凍結させた後、クライオスタット（Leika）を用いて30μmの切片を作成した。サンプルは1×PBSで5分間3回洗浄した後、0.5％TritonX-100/1×PBSで室温にて30分反応させ、その後1×PBSで10分間洗浄した。その後、5％ Normal Horse Serum/0.3% TritonX-100/1×PBS(ブロッキングバッファー)で室温にて30分ブロッキングを行った。その後、1次抗体 anti-βgal mouse antibody(1:300)を用いて4℃で18〜24時間反応させた。1×PBSTで5分間3回洗浄した後、二次抗体 Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG antibody (1:500)を室温で二時間反応させた。1×PBSで5分2回洗浄した後、ゼラチンコートしたスライドガラスに張りつけ、PermaFluorTM Mounting Medium (LVC)で封入し蛍光顕微鏡で観察した。その結果、海馬、Dorsal endopiriform nucleusでCre recombinaseの発現を確認した（図５）。【００７０】
同様に脳切片を調整しX-gal溶液（5mM K3Fe(CN)6、5mM K4Fe(CN)6、2 mM MgCl2を 1×PBに溶かし pH 7.4に合わせ、ここにX-galを1 mg/mlになるように加える）に移し37℃で一晩インキュベートした。切片はエタノール／キシレンで脱水後、Fisher Scientific Permount Mounting Mediumで封入した。その結果、海馬、Dorsal endopiriform nucleusでCre recombinaseの発現に由来する青い染色が認められた(図６)。図５，６よりOXTR-Creノックインマウスは活性を保持したCre recombinaseを発現していることを確認した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年9月3日(2014.9.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オキシトシン受容体遺伝子座の少なくとも１つにおいて、オキシトシン受容体遺伝子のプロモーターの制御下に
（ｉ）オキシトシン受容体蛋白質をコードする塩基配列、
（ｉｉ）ヒトｅＩＦ４Ｇ遺伝子に由来するＩＲＥＳ配列、及び
（ｉｉｉ）部位特異的組み換え酵素をコードする塩基配列
を有する、非ヒト動物。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
オキシトシン受容体遺伝子座の第３エクソンのコード領域が、
（ｉ）オキシトシン受容体蛋白質をコードする塩基配列、
（ｉｉ）ヒトｅＩＦ４Ｇ遺伝子に由来するＩＲＥＳ配列、及び
（ｉｉｉ）部位特異的組み換え酵素をコードする塩基配列
を含む塩基配列で置換された、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項４】
部位特異的組み換え酵素が、Ｃｒｅである、請求項１又は３に記載の非ヒト動物。
【請求項５】
オキシトシン受容体蛋白質が、Ｃ末端側にタグ配列を有する、請求項１、３又は４のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
【請求項６】
前記部位特異的組み換え酵素により、遺伝子機能が改変され得る塩基配列をさらに有する、請求項１、３〜５のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
【請求項７】
（Ｉ）オキシトシン受容体遺伝子座の少なくとも１つにおいて、オキシトシン受容体遺伝子のプロモーターの制御下に
（ｉ）オキシトシン受容体蛋白質をコードする塩基配列、
（ｉｉ）ヒトｅＩＦ４Ｇ遺伝子に由来するＩＲＥＳ配列、及び
（ｉｉｉ）部位特異的組み換え酵素をコードする塩基配列、並びに、
（ＩＩ）前記部位特異的組み換え酵素により、遺伝子機能が改変され得る塩基配列
を有する非ヒト動物を用いることを特徴とする、オキシトシン受容体及び／又は前記機能が改変され得る遺伝子の機能解析方法。
【請求項８】
下記の塩基配列を含むベクター：
（ｉ）オキシトシン受容体蛋白質をコードする塩基配列、
（ｉｉ）ヒトｅＩＦ４Ｇ遺伝子に由来するＩＲＥＳ配列、及び
（ｉｉｉ）部位特異的組み換え酵素をコードする塩基配列
（ｉｖ）オキシトシン受容体遺伝子座の塩基配列と相同組み替え可能な塩基配列。
【国際調査報告】
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