(57)【要約】  本発明は、がん細胞の培養上清の存在下でｉＰＳ細胞を培養すること含む、がん幹細胞を含む細胞集団を得る方法に関する。
2014148562.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん細胞の培養上清の存在下でｉＰＳ細胞を培養すること含む、がん幹細胞を含む細胞集団を得る方法。
【請求項２】
ｉＰＳ細胞がヒト由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
２週間〜２ヶ月間培養を行う、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
得られた細胞集団ががん細胞を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法により得られた細胞集団。
【請求項６】
請求項５に記載の細胞集団中のがん幹細胞を単離することを含む、がん幹細胞を得る方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法より得られたがん幹細胞。
【請求項８】
がん治療薬のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法：
（１）請求項５に記載のがん幹細胞を含む細胞集団または請求項７に記載のがん幹細胞と、がん治療薬の候補物質とを接触させる工程、および
（２）前記細胞集団または細胞に対する前記候補物質の作用を評価する工程。
【請求項９】
前記細胞集団または細胞の増殖を阻害する候補物質を選択する工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項５に記載のがん幹細胞を含む細胞集団と、がん治療薬の候補物質とを接触させる、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
ヒアルロン酸の存在下でＣＤ４４発現細胞を含む細胞集団を非接着培養にて培養すること含む、ＣＤ４４発現細胞の濃縮方法。
【請求項１２】
細胞集団がヒト由来である、請求項１１に記載の方法。  
【請求項１３】
２〜２０日間培養を行う、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法によりＣＤ４４発現細胞が濃縮された細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん幹細胞を含む細胞集団を得る方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは遺伝子の疾患として、基本的に４つ以上の遺伝子が経年により続けて変異し、その変異の影響が蓄積することで発症するという「発がん多段階説」が信じられている。発症したがんは、臓器別、あるいは特異的に発現している細胞表面蛋白質などの違いにより多くの種類があるものの、それぞれは、単一のがん細胞からなる均一な組織として考えられている。このため、個々のがん治療薬、特に、分子標的がん治療薬と呼ばれるものは、特異的に発現している蛋白質等の「分子標的」を指向した単一のあるいは限られた種類のがん細胞を攻撃するものとなっており、がん細胞表面に発現している蛋白質あるいは、がん細胞から体液中に放出されることなどで存在する「腫瘍マーカー」等のバイオマーカーで、その特異性を特定診断し、治療薬・治療方法が決められることが標準的である。【０００３】
がんの難治性の原因として、がん幹細胞の関与が提唱されている（がん幹細胞説）。様々ながん（患者組織）より、がん幹細胞が単離され報告されているが、その存在割合の低さ、安定した培養維持の困難さが単離精製を困難なものとし、大規模な研究、解析を妨げている。すべてのがん幹細胞が単離されているわけでもない。腫瘍組織内のがん細胞の種類は患者毎に異なり、不均一であり、かつまた限定的と考えられる。このため、すべての種類のがん細胞を把握することが容易ではないこともあって、がん幹細胞の存在自体について、あるいはがんの進展増悪に果たす役割に否定的な見解を表明する研究者も多い。特許文献１（参照により本明細書に含まれる）は、がん幹細胞を用いた殺がん幹細胞物質のスクリーニング方法を開示する。【０００４】
従来のがん治療薬によるがん治療では、がんの再発、転移といった問題が常につきまとい、治療効果は、「５年生存率」などのように表現され、全生存期間（OS）あるいは延命効果がエンドポイント（指標）となっている。つまり、現実的には、がんの「根治」は困難というのが一般的である。これは、分子標的治療薬を含めたがん治療薬が、結果として、集団内の特定のがん細胞のみに効果を示し、不均一性を示す残りのがん細胞やがん幹細胞には薬効を示さないため、治療行為によって、こうした残りのがん細胞やがん幹細胞の増殖を助ける結果となり、再発・転移につながることで、がんが「根治」されることが少ないと推測される。新たな治療方法、治療標的の探索だけでなく、がん細胞の「不均一性」の理解と対策が、求められている。【０００５】
がん幹細胞の濃縮には、ＣＤ１３３やＣＤ４４などのマーカータンパク質を指標として、マグネティックビーズ(非特許文献１（参照により本明細書に含まれる）, Miltenyi Biotec社製Diamond CD133 Isolation Kit)を用いて単離する方法やフローサイトメトリーによって分離と回収を行う方法（非特許文献２（参照により本明細書に含まれる））、レーザーマイクロダイセクション（Leica社製 LMD6500 & LMD7000）などがある。単離または分離したがん幹細胞の培養と維持には、ヒアルロン酸を重合したゲル、あるいはヒアルロン酸とゼラチンを重合したゲル（非特許文献３（参照により本明細書に含まれる）, Sigma-Aldrich社製  Hystem）、コラーゲンゲル（日本ベクトン・ディッキンソン社製  マトリゲル）などが使用され得る。従来のＣＤ４４発現細胞の単離技術は高価な装置や試薬が必要であり、装置を用いる場合は設置するためのスペースと専門的な技術が必要であった。また、分離した細胞の維持を重合したゲル中やゲル表面で行う必要があったため、蛍光タンパク質の発現が無い細胞の場合、あるいは染色等が不可能な場合、明視野では観察が非常に困難であった。さらに、均一なゲルの作製が難しく、細胞の状態を常に一定に保つのは難しかった。また、培養後の細胞の回収や継代および細胞から分泌される因子等の回収が非常に困難であった。細胞に薬剤や成長因子、サイトカイン等を曝露するのが難しいという問題もあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−１３３８０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Jin et al. 2008. Neuroscience; 154,541-550.
【非特許文献２】Griguer et al. 2008. PlosOne; 3(11)e3655.
【非特許文献３】Rehfeldt et al. 2012 Integr.Biol.; 4,422-430.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、がん幹細胞を含む細胞集団（特に、がん細胞を含む細胞集団）を得る方法を提供することを目的とする。本発明はまた、ＣＤ４４発現細胞の濃縮方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ｉＰＳ細胞の培養によりがん幹細胞を初めて誘導することにあり、誘導されたがん幹細胞から分化するがん細胞が混在することもあるが、混在するがん細胞を除去して使用することができる。また、がん幹細胞にはＣＤ４４を高発現している細胞が多く存在することが知られている。がん幹細胞を濃縮するために培地にヒアルロン酸を添加すると、ＣＤ４４高発現細胞の濃縮が予想外にも効率的になることなどを見つけて本発明を完成した。具体的には、以下に例示するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
１．がん細胞の培養上清の存在下でｉＰＳ細胞を培養すること含む、がん幹細胞を含む細胞集団を得る方法。
２．ｉＰＳ細胞がヒト由来である、前記１に記載の方法。
３．２週間〜２ヶ月間培養を行う、前記１または２に記載の方法。
４．得られた細胞集団ががん細胞を含む、前記１〜３のいずれかに記載の方法。
５．前記１〜４のいずれかに記載の方法により得られた細胞集団。
６．前記５に記載の細胞集団中のがん幹細胞を単離することを含む、がん幹細胞を得る方法。
７．前記６に記載の方法より得られたがん幹細胞。
８．がん治療薬のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法：
（１）前記５に記載のがん幹細胞を含む細胞集団または前記７に記載のがん幹細胞と、がん治療薬の候補物質とを接触させる工程、および
（２）前記細胞集団または細胞に対する前記候補物質の作用を評価する工程。
９．前記細胞集団または細胞の増殖を阻害する候補物質を選択する工程をさらに含む、前記８に記載の方法。
１０．前記５に記載のがん幹細胞を含む細胞集団と、がん治療薬の候補物質とを接触させる、前記８または９に記載の方法。
１１．ヒアルロン酸の存在下でＣＤ４４発現細胞を含む細胞集団を非接着培養にて培養すること含む、ＣＤ４４発現細胞の濃縮方法。
１２．細胞集団がヒト由来である、前記１１に記載の方法。
１３．２〜２０日間培養を行う、前記１１または１２に記載の方法。
１４．前記１１〜１３のいずれかに記載の方法によりＣＤ４４発現細胞が濃縮された細胞集団。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、生体内の腫瘍を構成する種々のがん幹細胞を含む細胞集団および各種がん幹細胞を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】miPS -LLCcm細胞による腫瘍の形成。
【図２】miPS -LLCcm細胞から形成された腫瘍の組織学的評価。
【図３】miPS -LLCcm細胞から形成された腫瘍の免疫染色結果の説明図。
【図４】Matrigel(登録商標)中で管腔形成した細胞。
【図５】miPS -LLCcm細胞由来悪性腫瘍からの初代培養とその浮遊培養。初代培養は、miPS -LLCcm細胞をヌードマウスに移植し、形成された腫瘍塊から得られた細胞を示す。浮遊培養は、miPS -LLCcm細胞を血清不含の培地で培養して得られたスフェロイドを示す。左の写真はGFPの発現を示す。
【図６】miPS -LLCcm細胞のスフェロイドから形成された腫瘍の免疫染色。
【図７】左）代表的ながん抑制遺伝子であるp53の発現。右）がんの浸潤、転移に関わるマトリックスメタロプロテアーゼ２（MMP2）の発現。
【図８】幹細胞マーカーの発現。
【図９】球面自己組織化マッピングによるマウスがんiPS-CSCの遺伝子発現プロファイルの視覚化。図中、上段左から２番目および３番目および下段左から１番目および２番目の細胞では、主に中心部に赤（ｉＰＳ細胞と比較して高発現している遺伝子）、その周辺に青（ｉＰＳ細胞と比較して発現量が低い遺伝子）が表示されている。上段左から４番目および下段左から３番目および４番目の細胞では、主に右部分に赤、左部分に青が表示されている。
【図１０】個別細胞間の遺伝子発現比較。
【図１１−１】がん細胞の培養上清の存在下で培養したヒトｉＰＳ細胞（１）。
【図１１−２】がん細胞の培養上清の存在下で培養したヒトｉＰＳ細胞（２）。
【図１１−３】がん細胞の培養上清の存在下で培養したヒトｉＰＳ細胞（３）。
【図１１−４】がん細胞の培養上清の存在下で培養したヒトｉＰＳ細胞（４）。
【図１１−５】がん細胞の培養上清の存在下で培養したヒトｉＰＳ細胞（５）。
【図１２】ヒトiPS細胞からのがん幹細胞の誘導。
【図１３】rBC2LCN-FITCによるポドカリキシンの検出。
【図１４】rBC2LCN-FITC非添加時の写真。
【図１５】ヌードマウスでの腫瘍形成。
【図１６】OCC-hiPS-29細胞における幹細胞の誘導。
【図１７】OCC-hiPS-29細胞の自己複製能。
【図１８】球面自己組織化マッピングによるヒトがんiPS-CSCの遺伝子発現プロファイルの視覚化。図中、左側の黒い部分に青（ｉＰＳ細胞と比較して発現量が低い遺伝子）が表示されている。右下および左下部分（下段左から４番目および５番目の細胞）または右下部分（その他の細胞）に、赤（ｉＰＳ細胞と比較して高発現している遺伝子）が表示されている。
【図１９】ヒトグリオーマ由来U251MG細胞を用いた実験の概略図。
【図２０】ヒアルロン酸（ＨＡ）添加培地での培養。
【図２１】ＨＡ濃度の検討。
【図２２】非接着系ディッシュ上での培養。With:ＨＡ添加培地。Without：ＨＡ無添加培地（通常培地）。
【図２３】細胞塊からの細胞分離と自己複製。
【図２４−１】ＣＤ４４遺伝子発現量の比較。Ａ: A172細胞。
【図２４−２】ＣＤ４４遺伝子発現量の比較。Ｂ: U251MG細胞。
【図２４−３】ＣＤ４４遺伝子発現量の比較。Ｃ: U251MG-P1細胞。
【図２５】U251MG細胞に対するU251MG-P1細胞のＣＤ４４遺伝子発現量。
【図２６】ＨＡ添加培地で培養したU251MG細胞による腫瘍形成。
【図２７】ＣＤ４４タンパク質発現量の比較。Ａ：接着系ディッシュおよび通常培地。Ｎ：非接着系ディッシュおよび通常培地。Ｈ：非接着系ディッシュおよびＨＡ添加培地。
【図２８】アストロサイトマーカータンパク質（GFAP）の検出。
【図２９】SkOv-3細胞のＨＡ添加培地での培養。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．がん幹細胞を含む細胞集団を得る方法
ｉＰＳ細胞は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物由来の細胞である。哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル由来の細胞が挙げられる。ｉＰＳ細胞は、好ましくは霊長類または齧歯類由来であり、さらに好ましくはヒトまたはマウス由来であり、さらにより好ましくはヒト由来である。ｉＰＳ細胞としては、iPS-MEF-Ng-20D17、iPS-MEF-Ng-178B-5、iPS-MEF-Fb/Ng-440A-3、iPS-MEF-Ng-492B-4、iPS-Stm-FB/gfp-99-1、iPS-Stm-FB/gfp-99-3、iPS-Hep-FB/Ng/gfp-103C-1、iPS-L1、iPS-S1、253G1、409B2、454E2、HiPS-RIKEN-1A、HiPS-RIKEN-2A、HiPS-RIKEN-12A、Nips-B2などを用いることができる。
【００１３】
がん細胞は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物由来の細胞である。哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル由来の細胞が挙げられる。がん細胞は、好ましくは霊長類または齧歯類由来であり、さらに好ましくはヒトまたはマウス由来であり、さらにより好ましくはヒト由来である。がん細胞としては、肺がん細胞、胚性癌腫細胞、悪性黒色腫、乳がん細胞、大腸がん細胞、膵臓がん細胞、脳腫瘍細胞、肝臓がん細胞、肝細胞がん細胞、消化官がん細胞、卵巣癌細胞、白血病細胞、リンパ腫細胞などが例示される。例えば、がん細胞として、LLC、P19-CL6、B16-F10、BALB MC.E12、A172、U251-MG、MDA-MB-415、MDA-MB-231、T-47D、ZR-75-1、SK-BR-3、BT-549、MCF7、HT-29、PANC1、SKOV3、HepG2、Huh-7、PLC/PRF-5、ECC、CW-2、PMF-ko14、MY、MOLT4、KLM-1、PK8、PK59、A549、Li-7、OVCAR-3、Lu99B、RERF-LC-KJ、OVK18、RERF-LC-AIなどの細胞を使用することができる。ある態様において、がん細胞は、LLC、P19-CL6、B16-F10、BALB MC.E12、A172、MDA-MB-415、T-47D、BT-549、HT-29、SKOV3、MY、MOLT4、PK59、A549、Li-7、OVCAR-3、Lu99B、およびRERF-LC-KJから選択される。ある態様において、がん細胞は、A172、MDA-MB-415、T-47D、BT-549、HT-29、SKOV3、MY、MOLT4、PK59、A549、Li-7、OVCAR-3、Lu99B、RERF-LC-KJから選択される。
【００１４】
ｉＰＳ細胞と培養上清を得るためのがん細胞の由来は、一致していてもしていなくてもよい。例えばヒトのｉＰＳ細胞を、マウス、ラット、またはサル由来のがん細胞の培養上清の存在下に培養してもよい。ある態様において、ｉＰＳ細胞と培養上清を得るためのがん細胞の由来は同一である。
【００１５】
がん細胞の培養上清を得るための培地としては、使用するがん細胞に応じで選択した任意の細胞培養用の培地を用いることができ、例えば、ＤＭＥＭ、グラスゴーＭＥＭ（ＧＭＥＭ）、ＥＭＥＭ、ＭＥＭα、ＲＰＭＩ−１６４０、ハムＦ−１０、Medium 199、Ames' Medium、BGJb Medium、EHAA、CMRL-1066 Medium、Fischer's Medium、IMDM、Leibovitz、McCoy's 5A Modified Medium、NCTC Medium、Swim's S-77 Medium、Waymouth Medium、William's Medium E、ハムＦ−１２、ＭＣＤＢ培地等が挙げられるが、これらに限定されない。がん細胞の培養上清は、例えば、培養器中80%コンフルエントに達したがん細胞を新たな培地で洗浄後、さらに新たな培地中で２４時間〜７２時間、好ましくは２４時間〜４８時間培養を継続し、取得する。培養上清を取得するための培地は、血清を含んでいてもよく、含まなくてもよい。培養上清は、0.45μm孔または0.22μm孔のフィルターを通してから使用してもよい。がん細胞の培養上清の液性画分にがん幹細胞を誘導する因子が含まれていると考えられることから、がん細胞の培養上清から細胞片やエキソソームなどの巨大分子を除いた液性画分を、本発明の方法における「がん細胞の培養上清」として用いてもよい。
【００１６】
ｉＰＳ細胞を培養するための培地としては、任意の幹細胞培養用の培地を用いることができ、例えば、ＤＭＥＭ、Ｒｅｐｒｏ  ＦＦ２またはＲｅｐｒｏ  ｓｔｅｍ（リプロセル社）、NON-ESSENTIAL AMINO ACID、200 mM L-GLUTAMINE、KSR、および0.1M 2-MERCAPTOETHANOL/PBSを含むDMEM-F12培地等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
ｉＰＳ細胞は、がん細胞の培養上清の存在下、約２週間〜２ヶ月間、好ましくは約４週間〜２ヶ月間、培養する。例えば、ｉＰＳ細胞の培地の一部（例えば、半分）または全部を、１〜４日に一回、がん細胞の培養上清と置き換えて培養すればよい。得られた細胞集団にがん幹細胞が含まれることは、ヌードマウスでの悪性腫瘍形成能、具体的には標本作製後の病理診断（活発な細胞分裂像、異型細胞、血管新生等の有無）により確認することができる。また、インビトロでの血管構造形成能の評価、p53に代表されるがん抑制因子の遺伝子発現変動、CD44等の既知のがん幹細胞マーカーの発現などにより確認することもできる。
【００１８】
がん幹細胞は、分化能を有する細胞であり、最終的にそれ以上分化しないがん細胞に至る。がん幹細胞はｉＰＳ細胞とがん細胞の間に位置する細胞であり、分化の程度の異なる種々のがん幹細胞が存在する。本発明の方法により得られる細胞集団は、種々のがん幹細胞を含む不均一な細胞集団であり、がん細胞を含んでいてもよい。本発明の方法により得られる細胞集団は、セルソーターなどにより分化の程度の異なる各がん幹細胞に分離することができ、公知の手法に従い細胞１個ずつに分離することもできる。また、がん幹細胞は単一の細胞の自己複製によってスフェロイドを形成すると考えられることから、スフェロイド培養によるシングルセルクローニングを行い、個々の細胞に分離することもできる。
【００１９】
本発明により、多能性を有するｉＰＳ細胞から生体内の腫瘍を構成する種々のがん幹細胞を含む細胞集団をインビトロで作成することができる。本発明により得られる細胞集団は、ｉＰＳ細胞から誘導する時間が十分短いので、遺伝子変異の導入は行われていないと考えられる。すなわち、本発明によれば、遺伝子変異の積み重ねのない多種類のがん幹細胞を網羅的に誘導することができる。本発明により得られる細胞集団およびがん幹細胞を用いることで、生体内に生成するがん細胞およびがん幹細胞を網羅的かつ体系的に解析・研究することができる。例えば、次世代シークエンサー等による網羅的遺伝子発現解析やエピジェネティック解析、プロテオーム解析、メタボローム解析を行い、細胞情報としてデータベース化し、がん治療薬の開発に利用することができる。
【００２０】
本発明の方法で得られた細胞集団またはがん幹細胞は、がん治療薬のスクリーニング方法に用いることができる。本発明の方法で得られた細胞集団またはがん幹細胞とがん治療薬の候補物質とを接触させる方法としては、がん治療薬の候補物質を本発明の方法で得られた細胞集団またはがん幹細胞の培地に添加する方法が挙げられる。
【００２１】
候補物質は、例えば、有機低分子化合物、核酸、糖質、脂質、アミノ酸、タンパク質、抗体、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリ、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリ、天然成分（微生物、動植物、海洋生物等由来の成分など）である。候補物質の培地中の濃度としては、１ｐｐｂ〜1％程度、好ましくは１ｐｐｍ〜０．１％程度が例示される。候補物質が水に溶けにくい場合にはエタノール、ＤＭＳＯなどの適当な有機溶媒に溶かしたり、候補物質と無毒性の酸又は塩基との塩として培地中に溶解させることができる。
【００２２】
候補物質の作用は、例えば細胞増殖を指標として評価することができる。本発明の方法で得られたがん幹細胞を含む細胞集団またはがん幹細胞の細胞増殖を阻害する候補物質は、がん治療薬として有用な物質として選択される。細胞増殖を評価する方法としては、生細胞数を顕微鏡でカウントする方法、ＭＴＴアッセイ法、トリパンブルー色素排除試験法、細胞内ＡＴＰ測定法、Ｒｅｓａｚｕｒｉｎ代謝活性試験法（ＱＢｌｕｅアッセイ法）、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイ法などが挙げられる。例えば、対照と比較して、細胞増殖を１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは５０%以上阻害する候補物質を、がん治療薬として有用な物質として選択する。
【００２３】
２．ＣＤ４４発現細胞の濃縮方法
ＣＤ４４は、1回膜貫通型糖蛋白質ヒアルロン酸レセプターであり、グリオーマ等のがん細胞の表面に特異的に高発現し、ヒトすい臓がん、前立腺がん、乳がんなどのがん幹細胞マーカーであることが知られている。ＣＤ４４は、細胞凝集、細胞周囲のマトリックスの保持、マトリックス−細胞間のシグナリング、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）の配向性制御（細胞遊走、浸潤）などの機能を有する。
【００２４】
ＣＤ４４発現細胞を含む細胞集団は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物由来の細胞集団である。哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル由来の細胞が挙げられる。ＣＤ４４発現細胞を含む細胞集団は、好ましくは霊長類または齧歯類由来であり、さらに好ましくはヒトまたはマウス由来であり、さらにより好ましくはヒト由来である。ＣＤ４４発現細胞を含む細胞集団は、ＣＤ４４をウエスタンブロッティングや免疫染色等、タンパク質レベルでの検出が可能であるＣＤ４４高発現細胞を含むことが好ましい。ある態様において、ＣＤ４４発現細胞はがん幹細胞である。ＣＤ４４発現細胞を含む細胞集団としては、U251MG細胞およびA172細胞（ヒトグリオーマ）、SkOv-3細胞（ヒト卵巣癌）、4T1細胞（マウス乳癌）、MDA-MB-231細胞（ヒト乳癌）、AsPC-1細胞（ヒト膵臓癌）、PC-3細胞（ヒト前立腺癌）などを使用することができる。
【００２５】
ヒアルロン酸は、N-アセチルグルコサミンとグルクロン酸の二糖繰り返し単位から構成される。本発明に用いるヒアルロン酸の分子量は、５００〜２００００００万程度、好ましくは１０００〜１５０００００程度、より好ましくは３０００〜１００００００程度である。本発明の方法においては、天然のヒアルロン酸をそのまま使用してもよく、酵素（ヒアルロニダーゼ）による分解または酸による加水分解により分子量を低下させた低分子量化ヒアルロン酸を使用してもよい。
【００２６】
本明細書において、単に「ヒアルロン酸」と記載した場合には、高分子ヒアルロン酸と低分子ヒアルロン酸の両方を含む。「高分子ヒアルロン酸」は、分子量１０万以上、好ましくは３０万以上、より好ましくは５０万以上、さらに好ましくは７０万以上、特に１００万以上のヒアルロン酸を指す。天然から得られるヒアルロン酸は、これらの分子量の大きな(高分子量の)「ヒアルロン酸」に該当する。
【００２７】
ヒアルロン酸を酵素または酸もしくはアルカリなどを用いて化学的に処理することで、低分子量化したヒアルロン酸、あるいは天然由来のヒアルロン酸から分子量が一定以下のヒアルロン酸を分離することで、本発明で使用する「低分子ヒアルロン酸」を得ることができる。「低分子ヒアルロン酸」は、分子量１０万以下のヒアルロン酸を指し、分子量の上限は１０万、７万、５万、３万、１万、５千程度であり、分子量の下限は、５００、１０００、２０００、３０００程度である。
【００２８】
ヒアルロン酸は、ニワトリのとさか、臍帯などの動物由来のものであってもよく、乳酸菌、連鎖球菌などの微生物に由来するものであってもよい。
【００２９】
ヒアルロン酸は、培地中の濃度が、０．１μｇ／ｍｌ〜５０００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは１μｇ／ｍｌ〜３０００μｇ／ｍｌ程度、より好ましくは５μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌ程度、さらにより好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ程度となるよう添加される。
【００３０】
ＣＤ４４発現細胞を含む細胞集団の培養方法および培養条件としては、各細胞の種類に応じた一般的な培養方法および培養条件を採用できる。ヒアルロン酸を添加する培地としては、任意の細胞培養用の培地を用いることができ、例えば、ＤＭＥＭ、グラスゴーＭＥＭ（ＧＭＥＭ）、ＥＭＥＭ、ＭＥＭα、ＲＰＭＩ−１６４０、ハムＦ−１２、ＭＣＤＢ培地等が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、これらの培地に、ペニシリン、ストレプトマイシンなどの抗生物質、血清、各種の増殖因子もしくは分化誘導因子等を添加してもよい。
【００３１】
培養容器は、非接着培養に適したフラスコ、シャーレ、ペトリディッシュ、プレート、組織培養用チューブ、トレイ、培養バッグ、ローラーボトル、またはホローファイバー等の任意の培養容器又は培養皿であってよい。ある実施形態において、培養容器は細胞非接着性の内底面を有する培養容器である。細胞非接着性の内底面には、スフェロイド(細胞塊)の形成を阻害しない程度に培養細胞が接着してもよく、全く接着しなくてもよい。
【００３２】
細胞非接着性の内底面を有する培養容器は、任意の公知のまたは市販の細胞非接着性の培養容器であってよく、例えば、ポリスチレン等の汎用プラスチックを射出成型した、特別な表面処理を行わない培養容器、不織布または多孔性フィルムの足場を備えた培養容器、微細な凹凸面を備えたプラスチック成型の培養容器、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、エチレンビニルアルコール共重合体などの親水性の高い物質から形成された培養容器、容器の表面を界面活性剤やリン脂質などの表面性能を親水性にし得る物質でコーティングした培養容器、プラズマ処理などの表面処理によって親水性を付与した培養容器が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００３３】
培養細胞の数は培養容器の容量、細胞の種類、最終的なスフェロイドの大きさ等を考慮して適宜決定されるが、例えば、培地１ｍＬ辺り104個〜107個、好ましくは104個〜106個の終濃度で培養容器に播種される。培養は、振とう培養でも静置培養でもよい。培養液の交換は、スフェロイドが形成される限り特に限定されないが、例えば１日１回または２回以上行ってもよく、２〜４日に１回の交換でもよい。培養液の交換の前に遠心分離などの処理を行い、細胞を沈殿させたあとに培養液を交換することもできる。培養期間は、２〜２０日間程度、好ましくは２〜１４日程度、より好ましくは５〜１４日程度である。培養温度は、３７℃前後が好ましい。
【００３４】
非接着培養の条件下、ヒアルロン酸の存在下でＣＤ４４発現細胞を含む細胞集団を培養することにより、ＣＤ４４発現細胞のスフェロイドが形成され、ＣＤ４４発現細胞が濃縮される。本発明の方法においてスフェロイドを形成したＣＤ４４発現細胞は、ＣＤ４４の発現量が上昇し、さらに細胞の増殖が促進され、細胞の機能も亢進している。濃縮されたＣＤ４４発現細胞は、公知の方法により単離、精製することができる。
【００３５】
スフェロイドの大きさとしては、通常、直径が１０〜５００μｍ程度、好ましくは５０〜２００μｍ程度である。スフェロイドは大きくなりすぎると内部に栄養が浸透しにくくなるため、適当なサイズに達するとスフェロイドを分離するのが望ましい。得られたスフェロイドは細胞をばらばらにした後、再度非接着培養を行うことにより繰り返しスフェロイドを形成することができる。スフェロイドの形成によりＣＤ４４発現細胞を濃縮することができ、スフェロイド形成を繰り返すことにより、より純粋な(形質の均質な) ＣＤ４４発現細胞を得ることができる。
【００３６】
以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。
【実施例】
【００３７】
実施例１．マウスiPS細胞からのがん幹細胞の誘導
（１）マウスiPS細胞の培養
マウスiPS細胞（iPS-MEF-Ng-20D17、理研セルバンクより購入）はDMEM培地 （15% FCS, 0.1mM NEAA, 2mM L-グルタミン, 0.1mM 2-メルカプトエタノール, 1000U/ml LIF, 50U/ml ペニシリン, 50U/ml ストレプトマイシン含有）をもちい３７℃、５％CO2下、MEF細胞上で培養維持した。本実験に用いたマウスiPS細胞は、未分化状態ではGFP遺伝子を安定に発現し、分化すると発現しなくなる（Okita, K. et al. Nature 448: 313-317 (2007)、参照により本明細書に含まれる）。【００３８】
（２）がん細胞の培養上清（コンディションドメディウム（conditioned medium））の調製
マウスルイス肺がん細胞株LLC細胞は１０％血清を含むDMEM培地で培養した。マウス胚性癌腫細胞P19-CL6細胞は１０％血清を含むαMEM培地（１０％FCS, 50U/ml ペニシリン, 50U/ml ストレプトマイシン含有）で培養した。マウス悪性黒色腫細胞B16-F10細胞、及び乳がん細胞BALB MC.E12細胞は１０％血清を含むMEM培地（１０％FCS, 50U/ml ペニシリン, 50U/ml ストレプトマイシン含有）で３７℃、５％CO2下で培養した。各々の細胞をコンフルエント状態まで培養し、その培養上精を回収、0.45μmのフィルターをもちいて濾過し、コンディションドメディウムとした。【００３９】
（３）がん幹細胞の誘導（コンディションドメディウム）
7x105個のマウスiPS細胞を60mm径のゼラチンコートディッシュに播種しなおし、DMEM培地 （15% FCS, 0.1mM NEAA, 2mM L-グルタミン, 0.1mM 2-メルカプトエタノール, 50U/ml ペニシリン, 50U/ml ストレプトマイシン含有）で培養した。細胞を播種した翌日より毎日、培地の半量を各種がん細胞より調整したコンディションドメディウムに置き換え４週間培養した。マウスiPS細胞に増殖が確認された場合はトリプシン処理により細胞を回収し、7x105個の細胞をDMEM培地 （15% FCS, 0.1mM NEAA, 2mM L-グルタミン, 0.1mM 2-メルカプトエタノール, 50U/ml ペニシリン, 50U/ml ストレプトマイシン含有）を用いて、新しい60mm径のゼラチンコートディッシュに播種しなおし、８時間後に当量のコンディションドメディウムを加え培養を継続した。本培養を４週間継続した。誘導後の細胞はDMEM培地 （15% FCS, 0.1mM NEAA, 2mM L-グルタミン, 0.1mM 2-メルカプトエタノール, 50U/ml ペニシリン, 50U/ml ストレプトマイシン含有）で維持した。【００４０】
（４）がん幹細胞の誘導（共培養）
0.4μg/ml マイトマイシンCを処理して増殖阻害を誘導した各種がん細胞（1.5x105個）を60mm径ゼラチンコートディッシュに播種し、翌日マウスiPS細胞（5x105個）を播種した。マウスiPS細胞の増殖が見られた場合は継代を行い、４週間誘導を行った。コントロールとして、フィーダー細胞であるMEF細胞と共培養したiPS細胞を用いた。【００４１】
（５）造腫瘍性評価
iPS細胞より誘導したがん幹細胞の造腫瘍能の評価はヌードマウス（Balb/c Slc-nu/nu  6-8週齢  メス）を用いて行った（図１）。4x106個のmiPS-LLCcm細胞を100μlのDMEM培地（１０％血清を含む）に懸濁し、ヌードマウスの背中に皮下注射により移植した。４週間後、形成された腫瘍を切除し、１０％中性ホルマリン緩衝液（和光純薬）で２４時間固定後、パラフィン包埋し、３μmの厚さの切片を作成し、ヘマトキシリン／エオシン染色を行った。他の細胞についても同様に実験を行った。【００４２】
各種がん細胞の培養上清の存在下で培養したiPS細胞から得た細胞集団をヌードマウスに移植すると、悪性腫瘍が生じることが確認された（表１）。図２は、miPS-LLCcm細胞を移植して形成された腫瘍の組織学的解析結果を示す。一方、iPS細胞では奇形腫(良性)が生じ、悪性腫瘍は生じなかった。
【表１】
2014148562.tif 000003
cm: コンディションドメディウム
c:共培養【００４３】
（６）腫瘍切片の免疫染色
腫瘍切片はキシレンを用いて脱パラフィン処理し、１０mMクエン酸緩衝液（pH6）中で９５℃５分加熱し、その後プロテアーゼK消化（３７℃、３０分）により抗原の賦活化を行った。抗GFP抗体（岡山大学佐藤あやの准教授より提供、1:200）、抗サイトケラチン抗体（抗pan-Cytokeratin(AE1/AE3)抗体、Santa Cruz社 1:200）、抗CD3１抗体（Santa Cruz社 1:200）を用いて染色を行った。ビオチン化二次抗体（Vector社）、ABC reagent （Vector社）、DAB（Vector社）により発色させ、対比染色としてヘマトキシリン染色をおこなった。【００４４】
miPS-LLCcm細胞より生じた腫瘍は、GFPのみ発現している細胞（GFP+ CK-）、サイトケラチンのみ発現している細胞（GFP- CK+）、及び両者の発現が見られない細胞（GFP- CK-）からなっていることが見いだされた（図３）。GFP+細胞は、未だ未分化な状態である細胞を示しており、CK+細胞は上皮系細胞へ分化した細胞を示す。両者が陰性の細胞は、サイトケラチンを発現するに至っていない上皮系分化の途中の細胞、或いは、上皮系以外（少なくともサイトケラチンを発現しない）細胞へ分化していることを示している。このことは、腫瘍は様々な細胞からなる不均一な集団であることを示している。【００４５】
（７）インビトロ管腔形成試験および免疫染色
1.4x105個のmiPS-LLCcm細胞をMatrigel(登録商標)（BD社）コートした8 ウェル  チャンバースライド（BD社）に播種し、EGM2培地（Takara社）を用いて２４時間培養し、血管管腔様構造を形成させた。その後、4%パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、抗CD31抗体（Santa Cruz社 1:200）、Texas Red標識二次抗体をもちいて免疫染色を行った。DAPIにより細胞の核を染色し、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡で観察した。【００４６】
miPS-LLCcm細胞は、血管様管腔構造を形成することが観察された。この構造に含まれる細胞を血管内皮マーカーCD31について染色すると、GFP陽性且つCD31陽性（GFP＋、CD31＋）、GFP陽性且つCD31陰性（GFP＋、CD31−）、GFP陰性且つCD31陽性（GFP−、CD31＋）、両者陰性（GFP−、CD31−）の細胞からなっていることが見いだされた(図４)。このことは、本発明で得られる細胞集団は、血管新生に関わる細胞へと分化し、少なくとも４種類の細胞からなる血管を試験管内で形成しうる能力を持っている細胞集団であることを示している。【００４７】
（８）スフェロイド細胞の造腫瘍性評価
miPS-LLCcm細胞がヌードマウスに形成した腫瘍より公知の方法で初代培養を行い、miPS-LLCcm primary細胞を樹立した。この細胞は、GFP陽性の細胞とGFP陰性の細胞（GFP陽性細胞より分化した細胞と考えられる）を含んでいる。この細胞を、トリプシン処理により、単細胞まで分離し、2 x 104個／mlで非表面処理ディッシュに播種した（浮遊培養）。培地は、血清を含まないDMEM培地 （ 0.1mM NEAA, 2mM L-グルタミン, 0.1mM 2-メルカプトエタノール, 50U/ml ペニシリン, 50U/ml ストレプトマイシン含有）を使用した。培養は７〜１０日行い、スフェロイドの形成を観察した。形成されたスフェロイドはGFP陽性であった。この結果は、スフェロイドは足場非依存的に、単一の細胞より形成され、且つ、未分化状態であることを示しており、miPS-LLCcm細胞の自己複製能を示すものである（図５）。スフェロイドをトリプシンにより単一細胞まで分離したのち、1x105個以上の細胞数でヌードマウスに移植すると、再び悪性腫瘍を形成した。その形態は、初代の腫瘍と同様の、GFP陽性細胞、CK陽性細胞、および両者が陰性の細胞からなり、新生血管に富んだものであった。（図６）。この結果は、miPS-LLCcm細胞は移植を繰り返しても形態的に同様の腫瘍を形成していることを示している。【００４８】
なお、LLC細胞のコンディションドメディウムを用いたがん幹細胞の誘導開始から２週間の時点でコンディションドメディウムの添加をやめ、その後、通常培養を３週間行った細胞でスフェロイド形成実験を行うと、GFP陽性スフェロイドの形成が観察された。【００４９】
（９）スフェロイド細胞の肺転移
上記（８）のスフェロイドより回収した細胞1x105個をヌードマウスの尾静脈より移植し、４週間後、肺に形成された腫瘍を観察した。その腫瘍より公知の方法で初代培養を行いmiPS-LLCcm LMT細胞を樹立した。この細胞は、DMEM培地 （15% FCS, 0.1mM NEAA, 2mM L-グルタミン, 0.1mM 2-メルカプトエタノール, 50U/ml ペニシリン, 50U/ml ストレプトマイシン含有）で維持した。miPS細胞、miPS-LLCcmスフェロイド、miPS-LLCcm LMTスフェロイド、およびLLC細胞よりRNeasy kit (50)  (QIAGEN)を使用しRNAを精製し、RT-PCRによりp53遺伝子およびMMP2遺伝子の発現量を比較した。【００５０】
本発明の細胞集団をヌードマウスの尾静脈に注入することにより肺転移が生じた。miPS-LLCcm細胞から形成したスフェロイド細胞では、miPS細胞と比較してがん抑制遺伝子であるp53の発現が低下していた（図７左）。また、肺で形成された腫瘍より初代培養し樹立したがん幹細胞株miPS-LLCcm LMTでは、がんの浸潤および転移に関わるマトリックスメタロプロテアーゼ２（MMP2）の発現が顕著に高かった（図７右）。この結果は、miPS-LLCcm細胞内にMMP2高発現がん幹細胞が含まれており、この細胞が優先的に肺に浸潤し腫瘍を形成したことを示唆する。【００５１】
（１０）幹細胞マーカーの発現
miPS細胞（フィーダー培養およびフィーダーレス培養）、miPS-LLCcm細胞、miPS-LLCcm primary細胞、およびmiPS-LLCcmスフェロイド、並びにそれらが形成するテラトーマおよび悪性腫瘍内での幹細胞マーカー遺伝子の発現を、RT-PCRによって確認した。RNeasy kit (50)  (QIAGEN)(細胞からの精製)およびTRIzol(Invitrogen)（組織からの精製）を使用した。未分化マーカー遺伝子は Takahashi, Yamanakaの報告（Cell 126, 663-676, 2006、参照により本明細書に含まれる）に提示されているものを検証した。対照として、フィーダーに用いたMEF細胞の発現を確認した。その結果、本発明で得られた細胞群では、未分化マーカー遺伝子の発現が確認され、また、腫瘍においてもテラトーマと比較して発現が上昇しているものが多く見られた（図８）。【００５２】
（１１）マイクロアレイを用いた遺伝子発現解析
本実験で得た細胞集団について、RNeasy kit (50)  (QIAGEN)を用いた方法、もしくはTRIzol (Invitorogen)を用いた方法でRNAを抽出した。その後、50μg以下のRNAに対してDNase I処理を行い、再度RNeasy kit (50) (QIAGEN) にて精製を行った。【００５３】
7.5μg分のRNAを2mM oligo dT、1mM dATP、1mM dCTP、1mM dGTP、0.2mM dTTP、0.8mM アミノアルキル化dUTP存在下でSuperScriptII (Invitorogen)を用いて逆転写し、cDNAを合成した。cDNA合成後、RNase H処理を行った。合成したcDNAはエタノール沈殿により回収し、6.7mlの0.1M NaHCO3(pH 8.0) に溶解し、当量 (6.7μl) のCy3ダイを加え、遮光、25℃ 、120分反応させた。Cy3標識cDNAはQIAquickカラム（QIAGEN）により精製した。Cy3標識cDNAを用いて、本発明者らが作製したマウス細胞表面タンパク質遺伝子アレイスライドに対して、55℃、15時間ハイブリダイゼーションを行い、FLA8000 scanner (Fuji Film)、によりGenePix(登録商標) Pro5.1 software (Axon instrument)により蛍光強度の検出、解析を行った。【００５４】
マイクロアレイで検出したCy3の蛍光強度から、miPS細胞の各遺伝子発現量を基準とし、各々の細胞内での発現量を相対的な数値として球面自己組織化マップ上でクラスタリングし、miPS細胞と比較して変化率の高い遺伝子を視覚化した（図９）。その結果、生成するがん幹細胞を含む細胞集団のマッピングの表現型に幾つかのパターンが存在することを見出した（図９）。この結果は、同じiPS細胞を用いても、用いる条件により、異なる機能、性質のがん幹細胞が生成することを示唆する。【００５５】
個々の細胞間での比較のため、マイクロアレイで検出したCy3の蛍光強度を正規化し、比較を行う細胞の値の対数をプロットした散布図を作成し、遺伝子の発現様式を比較した (図１０)。miPS-MC.E12co(miPS細胞をBALB MC.E12細胞と共培養して得られた細胞集団)の腫瘍形成前後（図１０左）や、miPS-LLCcmとmiPS-LLCcm LMT(miPS-LLCcm細胞の肺転移細胞：高転移能のiPS-CSCと考えられる)との間（図１０右）でも、遺伝子の発現の変動が観察された。【００５６】
実施例２．ヒトiPS細胞からのがん幹細胞の誘導
（１）がん細胞の培養上清（コンディションドメディウム）の調製
表２に示すがん細胞株を、10%  FBS,1％  ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM培地あるいはRPMI1460培地で、接着培養用ディッシュ(直径100 mm, TPP社製)を用いて、37℃、５% CO2条件下で培養した。
【表２−１】
2014148562.tif 000004
【表２−２】
2014148562.tif 000005
【表２−３】
2014148562.tif 000006
【表２−４】
2014148562.tif 000007
【表２−５】
2014148562.tif 000008
【表２−６】
2014148562.tif 000009
【表２−７】
2014148562.tif 000010
【００５７】
80％コンフルエントになったディッシュの培地を取り除き、5％ FBSを含むDMEMあるいはRPMI1460培地で１回洗浄後、同培地中で培養した。培地を交換してから24時間後に培養上清を回収し、300×g、10分、4℃の条件で遠心した。さらに2000×g、10分、4℃の条件で遠心して、0.22 μm孔のフィルターに通し、この培養上清をコンディションドメディウムとした。【００５８】
（２）ヒトiPS細胞のフィーダレス培養
ヒトiPS細胞（201B、ＲＩＫＥＮ  ＢＲＣ）（Takahashi, K. et al., Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131: 861-872 (2007)、参照により本明細書に含まれる）をLaminin-5（リプロセル社製）コートしたディッシュ(直径60 mm, TPP社製)に播種し、5 ng/mlのbFGFを含むRepro FF2培地（リプロセル社製）を用いて、37℃、2% CO2条件下で培養した。フィーダレスで未分化安定状態になるまで、毎日、培地を全量交換し、継代は一週間で一回の頻度でおこなった。【００５９】
（３）がん幹細胞の誘導
がん細胞株から回収したそれぞれのコンディションドメディウムと、Repro FF2またはRepro stem（リプロセル社製）、もしくはbFGFを添加していないヒトiPS幹細胞用培地（NON-ESSENTIAL AMINO ACID、200 mM L-GLUTAMINE、KSR、および0.1M 2-MERCAPTOETHANOL/PBSを含むDMEM-F12培地）とを１：１の比で混合し、分化誘導培地とした。未分化で安定な状態のヒトiPS細胞にそれぞれの誘導化培地を曝露し、分化を誘導した。分化誘導中は毎日、半量の培地交換を行い、２週間に１〜２回の継代をおこなった。分化誘導期間は少なくとも28日間、長くとも2か月間とした。培養は37℃、2％ CO2条件下でおこなった。【００６０】
分化誘導を28日間行った細胞を、倒立型顕微鏡IX81(Olympus)を用いて観察し、顕微鏡用デジタルカメラDP71(Olympus)を用いてMetaMorphで画像の取り込みを行った（図１１−１〜図１１−５）。OCC-hiPS-1は、28日間の誘導後も幹細胞性を維持したまま増殖し続け、さらに以下に説明するようにＳＣＩＤマウスで腫瘍を形成したことから、がん幹細胞化の誘導が確認できた。OCC-hiPS-3、5、8、10、12、19、20、および23-28は、同様に28日間の誘導後も幹細胞性を維持したまま増殖し続けた。がん幹細胞の誘導は、コンディションドメディウムによって誘導化効率に差があることが判った（図１２）。【００６１】
rBC2LCN-FITC (和光純薬工業株式会社製)によってがん幹細胞の誘導後の細胞株の幹細胞性を確認した。rBC2LCN-FITCにより検出されるポドカリキシンはヒト多能性幹細胞に特異的な糖タンパク質リガンドである。検出はrBC2LCN-FITCのプロトコルに従って行った。rBC2LCNと反応して緑色蛍光を示す細胞が検出され（図１３右）、幹細胞性を有することが判った。また、rBC2LCNを添加しない場合は緑色蛍光が検出されなかった（図１４）。【００６２】
ヒトiPS細胞から誘導された細胞集団（OCC-hiPS-1）をHBSSに懸濁し、Balb/c-nu/nuヌードマウスあるいはCB17 scidマウスの精巣にそれぞれ移植した。CB17 scidマウスでの腫瘍形成が認められたOCC-hiPS-1細胞移植マウスから腫瘍を摘出し、初代培養を行った（図１５）。腫瘍の一部は4%パラホルムアルデヒドりん酸緩衝液で固定した。【００６３】
初代培養細胞株（OCC-hiPS-29細胞）を、Laminin-5コートをしたディッシュ上、A172細胞培養上清を用いた分化誘導用培地中で37℃、2% CO2条件下で培養した。継代は３〜４日に１回の頻度でおこなった。OCC-hiPS-29細胞においてもrBC2LCN-FITCと反応する幹細胞様の細胞が検出された（図１６）。OCC-hiPS-29細胞を非接着ディッシュ上でA172細胞培養上清を用いた分化誘導用培地中で2〜5日間培養した。細胞の密度が濃い部分が形成され、一部では細胞塊(sphere)が形成された。【００６４】
OCC-hiPS-29細胞の細胞塊をアクターゼ 溶液（SIGMA社製）で処理した後、無血清培地（インスリン-トランスフェリン-亜セレン酸ナトリウム 培地サプリメント（Sigma-Aldrich社製）、NON-ESSENTIAL AMINO ACID（SIGMA社製）、200 mM L-GLUTAMINE（ナカライテスク社製）、を含むDMEM-F12（SIGMA社製）） に分散し、同培地で10日間、非接着系ディッシュ（直径10 mm, 培地量10 ml）でスフェロイド培養すると細胞塊を形成し、自己複製能を有することが示された（図１７）。【００６５】
本実験で得たOCC-hiPS-6、OCC-hiPS-10、OCC-hiPS-12、OCC-hiPS-16、OCC-hiPS-17、OCC-hiPS-19、OCC-hiPS-20、OCC-hiPS-25、およびOCC-hiPS-27について、RNeasy kit (50)  (QIAGEN)を用いた方法、もしくはTRIzol (Invitorogen)を用いた方法でRNAを抽出した。マイクロアレイはAgilent Expression Array解析（１色法）（タカラバイオ株式会社  委託解析）によって行った。マイクロアレイで検出したCy3の蛍光強度から、各々の細胞内での発現量を相対的な数値とし、球面自己組織化マップ上でクラスタリングして各細胞内での遺伝子発現量を視覚化した。その結果、生成するがん幹細胞を含む細胞集団のマッピングの表現型に複数のパターンが存在することがわかった（図１８）。この結果は、マウスと同様に、同じiPS細胞を用いても用いる条件により、異なる機能、性質のがん幹細胞が生成することを示唆する。【００６６】
実施例３．ヒアルロン酸を用いたＣＤ４４発現細胞の濃縮
（１）概略
ヒトグリオーマ由来U251MG細胞を用いた実験の概略を図１９に示した。通常の接着系ディッシュ上で培養した細胞を継代する際、ヒアルロン酸（ＨＡ）を添加した培地中に移して非接着系ディッシュで培養し、さらに継代して非接着系ディッシュ上で細胞塊を作製した。細胞塊をヌードマウスに接種して担がんを作製した後、接着系ディッシュ上で初代培養（U251MG-P1とした）を行った。初代培養細胞を再びＨＡ添加培地に継代して非接着ディッシュ上で培養した。【００６７】
（２）ヒアルロン酸添加培地を用いた培養
ヒトグリオーマ由来A172細胞およびU251MG細胞、並びにU251MG-P1細胞をそれぞれ非接着ディッシュ上でＨＡを添加した培地（100 μg/ml ヒアルロン酸ナトリウム（和光純薬社製  ヒアルロン酸ナトリウム,鶏冠製）、10% FBS、50 U/ml ペニシリン、および 50 μg/ml ストレプトマイシンを含むDMEM）上と添加していない通常の培地（10% FBS、50 U/ml ペニシリン、および 50 μg/ml ストレプトマイシンを含むDMEM）上で2〜5日間培養した。ＨＡを添加しない場合には殆ど細胞が増殖しなかったが（図２０にはU251MG-P1の結果のみを示した）、ＨＡを添加した場合には細胞の密度が濃い部分が形成され、一部では細胞塊が形成された（図２０.各右端）。またこれらの細胞は通常の接着系ディッシュ上では増殖が認められたので用いた細胞の状態は良好であると考えられた（図２０.各左端）。【００６８】
A172細胞およびU251MG細胞をそれぞれ非接着ディッシュ上でＨＡを添加した培地（0-100 μg/ml ヒアルロン酸ナトリウム、10% FBS、50 U/ml ペニシリン、および 50 μg/ml ストレプトマイシンを含むDMEM）上で5日培養した（図２１）。いずれの濃度でも細胞塊を形成するのが確認されたが、100 μg/mlの濃度で一様に細胞塊が観察できた。この添加濃度と200 μg/mlを添加した場合との差が認められなかったため、以後の試験では100 μg/mlをＨＡ添加濃度とした。【００６９】
また、同様に非接着系ディッシュ上で2週間培養した結果、ＨＡを添加した場合はいずれの細胞も細胞塊を形成し、細胞塊の周辺ではディッシュ表面に接着している細胞も観察された（図２２．With）。ＨＡ無添加の場合は細胞塊の形成は観察されたが、ＨＡを添加した場合と比較して細胞塊の数が少なく、直径が約200 μmに成長すると塊が崩壊した、或いは成長が止まった様子が観察され、特にA172細胞では顕著であった（図２２．Without）。【００７０】
（３）細胞塊形成能の確認
ＨＡ添加培地で作製したA172細胞、U251MG細胞、およびU251MG-P1細胞の細胞塊をAccutase溶液（Sigma-Aldrich社製）で懸濁して細胞を分散させた後、それぞれを再びＨＡ添加培地、非接着系ディッシュ上で2週間培養した（図２３）。いずれの細胞も再び細胞塊を形成し、細胞塊の周辺にはディッシュ表面に接着した細胞が観察され、細胞塊の自己複製能があることが示された。【００７１】
（４）CD44遺伝子発現量の比較
A172細胞、U251MG細胞、およびU251MG-P1細胞を接着系ディッシュおよび通常培地上または非接着系ディッシュおよびＨＡ添加培地上でそれぞれ培養した細胞からRNAを抽出し、CD44遺伝子発現量をqPCR法によって解析した（図２４−１〜図２４−３）。U251MG細胞とU251MG-P1細胞は、非接着系ディッシュおよび通常培地上で培養した細胞からもRNA抽出と比較を行った。【００７２】
接着系ディッシュでの通常培養と比較して非接着系ディッシュでの通常培養はＣＤ４４遺伝子発現が亢進しているが、非接着系ディッシュおよびＨＡ添加培地上で培養することで更に発現量が高くなり、U251MG細胞では接着系ディッシュおよび通常培地上での培養と比較して約2.2 倍になった。【００７３】
U251MG細胞とU251MG-P1細胞の接着系ディッシュおよび通常培地上での培養をそれぞれ行い、これら２つの細胞間でのＣＤ４４遺伝子発現量を比較した（図２５）。U251MG-P1はU251MGよりも発現量が約3.9 倍高くなっていた。これらの結果から、本培養法によって、すなわちU251MG細胞を非接着系ディッシュおよびＨＡ添加培地上でスフェロイド培養することによって、ＣＤ４４遺伝子発現を誘導すること、あるいはＣＤ４４遺伝子発現量が高い細胞を選択的に生育させることが可能であることが判った。さらに、U251MG-P1細胞をヌードマウスに移植し、担がんを摘出して初代培養することによって得られた細胞（U251MG-P2）では、親株の細胞と比較して恒常的にＣＤ４４遺伝子発現量が高かった（データ非提示）。【００７４】
（５）ＨＡ添加培地でスフェロイド培養（ITS+, FBS-）したU251MG細胞の腫瘍形成能
ＨＡ添加培地で５日間培養した後、スフェロイド培養（100 μg/ml ヒアルロン酸ナトリウムおよびITS（Sigma-Aldrich社製）を添加した培地での培養）を２週間、非接着系ディッシュ（直径10 mm, 培地量10 ml）で行い、U251MG細胞をヌードマウスBalb/c-nu/nu、メス、４週齢に移植して４週間観察した（図２６）。１〜３枚のディッシュから集めた細胞をそれぞれマウスの左腹部に移植した。右腹部には通常培養したU251MG細胞を107個、それぞれ移植した。ディッシュ２枚以上から集めた細胞の移植によって担がんが形成された。107個の細胞を移植後４０日目の腫瘍体積（腫瘍短辺２ｘ腫瘍長辺）/2）は、1642.8 mm3 (n=2)であった。通常培養したU251MG細胞では同条件で同細胞数を移植しても腫瘍が形成されなかったことから、本発明の方法により得られた細胞集団は腫瘍形成能を有していることが示された。【００７５】
（６）ＨＡ添加培地でスフェロイド培養した細胞のＣＤ４４タンパク質発現量
A172細胞およびU251MG細胞それぞれを、接着系ディッシュおよび通常培地上（Ａ）、非接着系ディッシュおよび通常培地上（Ｎ）、および非接着系ディッシュおよびＨＡ添加培地上（Ｈ）で培養し、ＣＤ４４タンパク質発現量をウエスタンブロッティング法によって比較した（図２７）。細胞から抽出した総タンパク質を10 μgずつ泳動し、1次抗体として抗ＣＤ４４マウスモノクローナル抗体（片山化学社製）およびHRP標識抗マウスIgG抗体（CSTジャパン社製）を用いた。また、抗β−アクチン抗体（CSTジャパン社製）とHRP標識抗ラビットIgG抗体（CSTジャパン社製）を用いて、構成的に発現しているタンパク質の内部指標として、β−アクチンを検出した。【００７６】
どちらの細胞株においても非接着系ディッシュ上で培養することによってＣＤ４４タンパク質の発現量が上昇し、ＨＡ添加培地での培養によって更に発現量が上昇していた。【００７７】
（７）U251MG-P1におけるアストロサイトマーカータンパク質の検出
U251MG-P1細胞がグリオーマ由来の細胞であることを確認するため、接着系ディッシュおよび通常培地上で、U251MG細胞、U251MG-P1細胞、およびU251MG-P2細胞（U251MG-P1細胞をヌードマウスに移植し、担がんを摘出して初代培養した細胞）を培養して、アストロサイトのマーカータンパク質であるGFAPタンパク質をウエスタンブロッティング法で検出した（図２８）。また、GFAPを発現していない細胞(ヒト卵巣がん由来SkOv-3細胞）から抽出したタンパク質をネガティブコントロールとして用いた。それぞれの細胞から抽出した総タンパク質を10 μgずつ泳動して、抗GFAP抗体（Santa Cruz Biotechnology社製）とHRP標識抗マウスIgG抗体（CSTジャパン社製）を用いて検出した。構成的に発現しているタンパク質の内部指標として、β−アクチンを検出した。【００７８】
それぞれの細胞株について、図２８では、U251MG細胞を０、U251MG-P1細胞をP1、U251MG-P2細胞をP2、SkOv-3細胞をSkOv-3と表記した。U251MG-P1およびU251MG-P2細胞は接着系ディッシュで培養するとGFAPを発現していることが確認された。【００７９】
（８）SkOv-3細胞のＨＡ培養
SkOv-3細胞およびSkOv-3-P1細胞（SkOv-3細胞をマウスに接種後に担がんを摘出して初代培養した細胞）それぞれを、U251MG細胞と同様に、非接着ディッシュおよびＨＡ添加培地（100 μg/ml ヒアルロン酸ナトリウム（和光純薬社製  ヒアルロン酸ナトリウム,鶏冠製）、10% FBS、50 U/ml ペニシリン、および 50 μg/ml ストレプトマイシンを含むRPMI1640）上、または非接着ディッシュおよび通常培地（10% FBS、50 U/ml ペニシリン、および 50 μg/ml ストレプトマイシンを含むRPMI1640）上で４日間培養した（図２９）。【００８０】
SkOv-3細胞はＨＡ添加培地では細胞塊が観察されたが、ＨＡを添加しない培地（ＨＡ−、通常培地）で細胞塊が観察されなかった。SkOv-3-P1細胞はＨＡ存在下では細胞塊が大きくなり、周囲にはディッシュ表面上に接着している細胞が多く観察された。ＨＡを添加しない培地（通常培地）では、ディッシュ表面に僅かに接着している細胞が小さな細胞塊を形成していたが、ＨＡ添加培地下での培養と比較すると生育が遅く、細胞塊も小さかった。接着系ディッシュ上ではＨＡの有無による差は殆ど認められず、正常に成長した（データ非提示）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【国際調査報告】
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