(57)【要約】  本発明は、（１）転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する発現調節領域；及び（２）前記発現調節領域に結合可能な転写活性化因子をコードする核酸であって、前記発現調節領域に動作可能に接続された核酸を含む発現カセット、該発現カセットを用いる哺乳動物細胞における目的産物の発現方法、目的産物を発現する細胞の製造方法、および哺乳動物細胞における目的産物の製造方法、ならびに該発現カセットを含むキットを提供する。
2014092094.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）及び（２）を含む発現カセット:
（１）転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する発現調節領域；及び
（２）前記発現調節領域に結合可能な転写活性化因子をコードする核酸であって、前記発現調節領域に動作可能に接続された核酸。
【請求項２】
転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する発現調節領域に、更に目的産物を発現させるための核酸が動作可能に接続された請求項１に記載の発現カセット。
【請求項３】
転写活性化因子が、免疫不全ウイルスのＴａｔ又は機能的に相同なその変異体である、請求項１または２に記載の発現カセット。
【請求項４】
転写活性化因子結合領域が、免疫不全ウイルスのトランス活性化応答配列又はそれに機能的に相同な配列である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の発現カセット。
【請求項５】
哺乳動物細胞における目的産物の発現方法であって、下記（ａ）及び（ｂ）を含む方法：
（ａ）第１の発現調節領域と当該発現調節領域に動作可能に接続された転写活性化因子をコードする核酸とを含む第１の発現カセット、並びに、第２の発現調節領域と当該発現調節領域に動作可能に接続された目的産物を発現させるための核酸とを含む第２の発現カセットを細胞に導入する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を培養する工程、
ここで、前記第１の発現調節領域及び前記第２の発現調節領域は、第１の発現カセットにコードされている転写活性化因子が結合する転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する。
【請求項６】
哺乳動物細胞における目的産物の発現方法であって、下記（ａ）及び（ｂ）を含む方法：
（ａ）転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する発現調節領域に、更に目的産物を発現させるための核酸が動作可能に接続された請求項１に記載の発現カセットを細胞に導入する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を培養する工程。
【請求項７】
転写活性化因子が、免疫不全ウイルスのＴａｔ又は機能的に相同なその変異体である、請求項５または６に記載の発現方法。
【請求項８】
転写活性化因子結合領域が、免疫不全ウイルスのトランス活性化応答配列又はそれに機能的に相同な配列である、請求項５〜７のいずれか１項に記載の発現方法。
【請求項９】
目的産物を発現する細胞の製造方法であって、
第１の発現調節領域と当該発現調節領域に動作可能に接続された転写活性化因子をコードする核酸とを含む第１の発現カセット、並びに、第２の発現調節領域と当該発現調節領域に動作可能に接続された目的産物を発現させるための核酸とを含む第２の発現カセットを哺乳動物細胞に導入する工程を含み、
ここで、前記第１の発現調節領域及び前記第２の発現調節領域は、第１の発現カセットにコードされている転写活性化因子が結合する転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する、方法。
【請求項１０】
目的産物を発現する細胞の製造方法であって、
転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する発現調節領域に、更に目的産物を発現させるための核酸が動作可能に接続された請求項１に記載の発現カセットを哺乳動物細胞に導入する工程を含む方法。
【請求項１１】
転写活性化因子が、免疫不全ウイルスのＴａｔ又は機能的に相同なその変異体である、請求項９または１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
転写活性化因子結合領域が、免疫不全ウイルスのトランス活性化応答配列又はそれに機能的に相同な配列である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
哺乳動物細胞における目的産物の製造方法であって、下記（ａ）及び（ｂ）を含む方法：
（ａ）請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法により目的産物を発現させる工程；及び
（ｂ）発現した目的産物を得る工程。
【請求項１４】
下記（１）及び（２）を含むキット：
（１）第１の発現調節領域と当該発現調節領域に動作可能に接続された転写活性化因子をコードする核酸とを含む第１の発現カセット；及び
（２）第２の発現調節領域と当該発現調節領域に動作可能に接続されるように目的産物を発現させるための核酸を挿入可能な部位を包含する第２の発現カセット、
ここで、前記第１の発現調節領域及び前記第２の発現調節領域は、第１の発現カセットにコードされている転写活性化因子が結合する転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する。
【請求項１５】
第１の発現カセットと第２の発現カセットがそれぞれ異なる核酸構築物に搭載されている、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
第１の発現カセットと第２の発現カセットが同一の核酸構築物に搭載されている、請求項１４に記載のキット。
【請求項１７】
第１の発現カセットが更に、第１の発現調節領域に動作可能に接続されるように目的産物を発現させるための核酸を挿入可能な部位を包含する、請求項１に記載の発現カセットを含むキット。
【請求項１８】
転写活性化因子が免疫不全ウイルスのＴａｔ又は機能的に相同なその変異体である、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１９】
転写活性化因子結合領域が免疫不全ウイルスのトランス活性化応答配列又はそれに機能的に相同な配列である、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学的産物の製造に有用な発現カセット、及び当該発現カセットの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質等のポリペプチド産生には、原核生物、酵母、昆虫細胞、原虫、哺乳動物細胞等に、プラスミドベクターやウイルスベクターを用いてポリペプチドをコードする核酸を導入し、宿主細胞内のタンパク質産生システムを用いて転写・翻訳させる方法が用いられている。なかでも哺乳動物細胞を用いた方法は、翻訳後修飾がヒトと同じであること、哺乳動物由来のタンパク質の折りたたみを正確に行えること等から、タンパク質工学分野、分子遺伝学分野のみならず、免疫工学分野、遺伝子治療分野、医薬品製造分野の研究又は臨床への応用に適している。【０００３】
しかしながら、哺乳動物細胞を用いた組換えタンパク質の産生方法では、原核生物や酵母を用いた方法と比べると、産物が十分得られない場合が多い。この問題の解決を目的とする技術として、例えば、ヒト細胞における組換えタンパク質発現系において、トランス活性化系を持つタンパク質発現系にエピソーム維持系及び強力なプロモーター／エンハンサーを付加した技術（特許文献１）や、ヒト免疫不全ウイルス１型（以下、ＨＩＶ−１）のトランス活性化応答配列（Ｔｒａｎｓ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｒｅｇｉｏｎ、以下、ＴＡＲと記載する）結合因子であるヒト由来ＴＲＢＰのＴＡＲへの結合作用により、ＣＭＶプロモーターとＴＡＲを有する発現調節領域の制御下で、タンパク質の発現を向上させる技術（非特許文献１）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００２／０２７００５号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２７８巻、第４４４０−４４４８頁（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、煩雑な操作なく目的産物等を高発現させる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、目的産物の発現量を向上させる方法を鋭意検討した。この結果、転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する発現調節領域に、前記結合領域に結合する転写活性化因子をコードする核酸を動作可能に接続した発現カセットを創製した。そして、前記カセットを第１の発現カセット（以下、転写活性化因子発現カセットとも称する）とする哺乳動物細胞への導入と、転写活性化因子発現カセットと同じ転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する発現調節領域に、目的産物を発現させるための核酸配列を動作可能に接続した第２の発現カセット（以下、目的産物発現カセットとも称する）の哺乳動物細胞への導入を組み合わせることによって、目的産物の発現量が向上することを見出し、本発明を完成させた（図１）。本発明によれば、ポリペプチドの産生のみならず、ＲＮＡやウイルスベクターの産生も高効率で達成される。【０００８】
本発明を概説すれば、本発明は
［１］下記（１）及び（２）を含む発現カセット:
（１）転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する発現調節領域；及び
（２）前記発現調節領域に結合可能な転写活性化因子をコードする核酸であって、前記発現調節領域に動作可能に接続された核酸、
［２］転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する発現調節領域に、更に目的産物を発現させるための核酸が動作可能に接続された［１］に記載の発現カセット、
［３］転写活性化因子が、免疫不全ウイルスのＴａｔ又は機能的に相同なその変異体である、［１］または［２］に記載の発現カセット、
［４］転写活性化因子結合領域が、免疫不全ウイルスのトランス活性化応答配列又はそれに機能的に相同な配列である、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の発現カセット、
［５］哺乳動物細胞における目的産物の発現方法であって、下記（ａ）及び（ｂ）を含む方法：
（ａ）第１の発現調節領域と当該発現調節領域に動作可能に接続された転写活性化因子をコードする核酸とを含む第１の発現カセット、並びに、第２の発現調節領域と当該発現調節領域に動作可能に接続された目的産物を発現させるための核酸とを含む第２の発現カセットを細胞に導入する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を培養する工程、
ここで、前記第１の発現調節領域及び前記第２の発現調節領域は、第１の発現カセットにコードされている転写活性化因子が結合する転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する、
［６］哺乳動物細胞における目的産物の発現方法であって、下記（ａ）及び（ｂ）を含む方法：
（ａ）転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する発現調節領域に、更に目的産物を発現させるための核酸が動作可能に接続された［１］に記載の発現カセットを細胞に導入する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を培養する工程、
［７］転写活性化因子が、免疫不全ウイルスのＴａｔ又は機能的に相同なその変異体である、［５］または［６］に記載の発現方法、
［８］転写活性化因子結合領域が、免疫不全ウイルスのトランス活性化応答配列又はそれに機能的に相同な配列である、［５］〜［７］のいずれか１つに記載の発現方法、
［９］目的産物を発現する細胞の製造方法であって、
第１の発現調節領域と当該発現調節領域に動作可能に接続された転写活性化因子をコードする核酸とを含む第１の発現カセット、並びに、第２の発現調節領域と当該発現調節領域に動作可能に接続された目的産物を発現させるための核酸とを含む第２の発現カセットを哺乳動物細胞に導入する工程を含み、
ここで、前記第１の発現調節領域及び前記第２の発現調節領域は、第１の発現カセットにコードされている転写活性化因子が結合する転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する、方法、
［１０］目的産物を発現する細胞の製造方法であって、
転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する発現調節領域に、更に目的産物を発現させるための核酸が動作可能に接続された［１］に記載の発現カセットを哺乳動物細胞に導入する工程を含む方法、
［１１］転写活性化因子が、免疫不全ウイルスのＴａｔ又は機能的に相同なその変異体である、［９］または［１０］に記載の製造方法、
［１２］転写活性化因子結合領域が、免疫不全ウイルスのトランス活性化応答配列又はそれに機能的に相同な配列である、［９］〜［１１］のいずれか１つに記載の製造方法、
［１３］哺乳動物細胞における目的産物の製造方法であって、下記（ａ）及び（ｂ）を含む方法：
（ａ）［５］〜［８］のいずれか１つに記載の方法により目的産物を発現させる工程；及び
（ｂ）発現した目的産物を得る工程、
［１４］下記（１）及び（２）を含むキット：
（１）第１の発現調節領域と当該発現調節領域に動作可能に接続された転写活性化因子をコードする核酸とを含む第１の発現カセット；及び
（２）第２の発現調節領域と当該発現調節領域に動作可能に接続されるように目的産物を発現させるための核酸を挿入可能な部位を包含する第２の発現カセット、
ここで、前記第１の発現調節領域及び前記第２の発現調節領域は、第１の発現カセットにコードされている転写活性化因子が結合する転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する、
［１５］第１の発現カセットと第２の発現カセットがそれぞれ異なる核酸構築物に搭載されている、［１４］に記載のキット、
［１６］第１の発現カセットと第２の発現カセットが同一の核酸構築物に搭載されている［１４］に記載のキット、
［１７］第１の発現カセットが更に、第１の発現調節領域に動作可能に接続されるように目的産物を発現させるための核酸を挿入可能な部位を包含する、［１］に記載の発現カセットを含むキット、
［１８］転写活性化因子が免疫不全ウイルスのＴａｔ又は機能的に相同なその変異体である［１４］〜［１７］のいずれか１つに記載のキット、
［１９］転写活性化因子結合領域が免疫不全ウイルスのトランス活性化応答配列又はそれに機能的に相同な配列である、［１４］〜［１８］のいずれか１つに記載のキット、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、細胞内での転写活性化因子の供給に有用な、転写活性化因子発現カセットが提供される。また、この転写活性化因子発現カセットと、前記転写活性化因子が結合する転写活性化因子結合領域に相当する配列を発現調節領域に有する目的産物発現カセットとを用いた、目的産物の発現方法および製造方法ならびに目的産物を発現する細胞の製造方法が提供される。更に、前記方法に使用されるキットが提供される。本発明は、タンパク質工学分野、分子遺伝学分野のみならず、免疫工学分野、遺伝子治療分野、医薬品製造分野の基礎研究又は臨床応用において非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の概念を示す図である。図Ａは、一般的な目的産物発現カセットの概略図である。図Ｂは、Ｔａｔを発現する転写活性化因子発現カセット、及びＴＡＲに相当する配列を有する発現調節領域を含む目的産物発現カセットを用いた、本発明の発現方法の概略図である。
【図２】実施例２−（１）において調製した細胞ライゼートをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した結果を示す図である。
【図３】各試験条件におけるＴａｔシグナル強度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書において発現カセットとは、目的産物を発現させるために必要な要素を含んだ核酸構築物を指す。具体的には、少なくともプロモーターを含む発現調節領域と、前記発現調節領域に動作可能に接続された、目的産物を発現させるための核酸とを含む核酸構築物を指す。
【００１２】
本明細書において、目的産物を発現させるための核酸に関して「動作可能に接続された」とは、目的産物が発現できるように、発現調節領域に対して適切な位置で目的産物を発現させるための核酸が配置されていることを意味する。一般的に、発現調節領域は目的産物を発現させるための核酸に対してｃｉｓになるように動作可能に配置するが、目的産物を発現させるための核酸に直接隣接している必要はなく、またＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）配列や２Ａペプチドをコードする配列等を介して配置された複数の目的産物を発現させるための核酸に配置されていても良い。目的産物を発現させるための核酸が複数配置される場合、同一の目的産物を発現させる核酸が複数配置されていても良く、また異なる目的産物を発現させるための核酸が複数配置されていても良い。
【００１３】
本明細書において発現調節領域とは、発現カセットにおける目的産物の発現をコントロールする領域を指す。具体的には、プロモーターを含む領域を指す。発現調節領域は、更に、転写の調節に関わる各種の調節配列を含んでいても良い。本発明を特に限定するものではないが、本発明におけるプロモーターとしては、哺乳類細胞で機能する任意のプロモーターが例示され、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＰＧＫプロモーター等の恒常的発現プロモーター、Ｕ３プロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター等が好適に例示される。これらのプロモーターの他、公知の誘導性プロモーター、組織・器官特異的プロモーター、時期特異的プロモーター、又はそれらと機能的同等性を有する変異配列等を本発明に使用しても良い。本発明におけるプロモーターとしては、下記に述べる転写活性化因子結合領域と由来の異なるプロモーターが好適に例示され、転写効率が高いＣＭＶプロモーターが特に好適に例示される。
【００１４】
本発明の発現カセットにおける発現調節領域には、転写効率を上昇させることを目的として、プロモーターの周辺や転写開始点下流の非翻訳領域に、転写活性化因子結合領域に相当する配列が配置される。ここで転写活性化因子結合領域に相当する配列としては、ＲＮＡである転写活性化因子結合領域の塩基配列もしくは前記配列に相当するＤＮＡ配列が例示される。転写活性化因子結合領域は、特定の転写活性化因子との相互作用（結合／かい離）により、その発現カセットに含まれる遺伝子の転写効率を上昇させる配列である。転写活性化因子結合領域に相当する配列は、必要に応じて発現ベクターの複数か所に、あるいは繰り返し配列として使用しても良い。前記の相互作用は転写活性化因子結合領域から転写されたＲＮＡと転写活性化因子との間で起こる。転写活性化因子結合領域としては、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２及びＳＩＶ等の免疫不全ウイルスの５’末端反復配列（ＬＴＲ）内に存在するＴＡＲが例示される。ＴＡＲは、免疫不全ウイルスのＬＴＲ内に存在する高次構造を形成する領域であり、ここに転写活性化因子Ｔａｔ（Ｔｒａｎｓ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ）が結合すると免疫不全ウイルスＲＮＡの転写が促進される。従って、本発明の態様においては、転写により生成したｍＲＮＡ上に転写活性化因子結合領域が形成されるよう、前記の発現調節領域が構築される。本発明における転写活性化因子結合領域に相当する配列としては、配列表の配列番号２で示されるＨＩＶ−１由来のＴＡＲに相当する配列を含む核酸が特に好適に例示される。また、本発明に利用されるＴＡＲの塩基配列は、野生型由来の塩基配列であっても、それに機能的に相同な塩基配列であっても良い。機能的に相同な塩基配列としてはＴａｔとの結合能を有するものであれば特に限定はないが、配列表の配列番号２に記載の塩基配列に対して９５％以上、好ましくは９８％以上の相同性を持つ塩基配列からなるものが例示される。
【００１５】
本明細書において転写活性化因子とは、ＲＮＡ結合能をもつタンパク質であって、単独で、あるいは二量体や複合体を形成してＲＮＡに結合し、プロモーターに依存している転写の効率を更に上昇させるように働く因子を指す。転写活性化因子としては、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、及びＳＩＶ等の免疫不全ウイルスの転写活性化因子であるＴａｔ、ヒト由来のトランス活性化因子であるＴＲＢＰが例示される。本発明における転写活性化因子としては、配列表の配列番号１で表されるＨＩＶ−１の転写活性化因子であるＴａｔが特に好適に例示される。Ｔａｔは、免疫不全ウイルスのＬＴＲに含まれるＴＡＲに結合することによって免疫不全ウイルスＲＮＡの転写を促進する因子である。したがって、転写開始点より下流にＴＡＲを有する発現調節領域からの転写は、Ｔａｔによって促進される。また、本発明に利用されるＴａｔは、野生型であってもその変異体であっても良い。変異体としてはＴＡＲとの結合能を有するものである限り特に限定はないが、配列表の配列番号１に記載の塩基配列にコードされるアミノ酸配列に対して９５％以上、好ましくは９８％以上の同一性を持つアミノ酸配列からなる変異体が例示される。
【００１６】
本発明により提供される転写活性化因子発現カセットは、プロモーターと、転写活性化因子結合領域に相当する配列とを有する発現調節領域に、前記結合領域に結合する転写活性化因子をコードする核酸を動作可能な状態で、好ましくは転写開始部位と翻訳開始部位の間に転写活性化因子結合領域に相当する配列が位置するように接続することによって作製することができる。更に好ましくは転写活性化因子結合領域に相当する配列と転写活性化因子をコードする核酸は、例えば５００塩基以下、好ましくは３００塩基以下、更に好ましくは１００塩基以下のＤＮＡ断片を介在して接続することによって作製することができる。このようにして作製された転写活性化因子発現カセットは、発現した転写活性化因子が、同カセットから転写されるｍＲＮＡ上の転写活性化因子結合領域に相互作用することで、転写活性化因子の更なる発現が促進されるという、正のフィードバック効果を持つことを特徴とする。
【００１７】
本発明における目的産物の発現カセットは、プロモーターと、転写活性化因子結合領域に相当する配列とを有する発現調節領域に、目的産物を発現させるための核酸を動作可能な状態で接続することによって作製することができる。これらの核酸は、所望の産物が得られれば天然由来のものであっても人工合成のものであっても良い。また、これらの核酸の塩基配列は、天然型の塩基配列であっても良く、天然型の塩基配列において１以上の塩基が置換、欠失、及び／又は挿入されてなる塩基配列であっても良い。前記の転写活性化因子結合領域は、併用する転写活性化因子発現カセットから発現される転写活性化因子が結合する配列である。目的産物としては、特に限定はないが、例えば、蛍光タンパク質や各種成長因子、酵素、抗体等のポリペプチドが例示される。また、必ずしも翻訳を経たものである必要はなく、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びアンチセンスＲＮＡ等、転写産物である核酸でも良い。
【００１８】
本発明の発現方法は、前記の転写活性化因子発現カセット、及び前記の目的産物発現カセットを細胞に導入し、その細胞を培養することで達成される。本発明の発現方法における転写活性化因子発現カセット、及び目的産物発現カセットの２種のカセットの発現調節領域は、ぞれぞれ、転写活性化因子発現カセットにより発現する転写活性化因子が結合する転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する。
【００１９】
本発明の目的産物を発現する細胞の製造方法は、前記の転写活性化因子発現カセット、及び前記の目的産物発現カセットを細胞に導入することにより達成される。
【００２０】
本発明における転写活性化因子発現カセット、及び目的産物発現カセットの２種のカセットは、それぞれ異なる核酸構築物に搭載されたものであっても、同一の核酸構築物に搭載されたものであっても良い。同一の核酸構築物に搭載される場合は、前記第１の発現調節領域と第２の発現調節領域を単一の発現調節領域で賄うことができる。即ち、単一の前記発現調節領域に、転写活性化因子をコードする核酸と目的産物を発現させるための核酸を共に動作可能な状態で接続することもできる。この場合、例えば転写活性化因子をコードする核酸配列と目的産物を発現させるための核酸配列の間に、ＩＲＥＳ配列や２Ａペプチドをコードする配列等を挿入することができる。ＩＲＥＳ配列や２Ａペプチドをコードする配列を挿入する場合、これらの配列の上流に目的産物を発現させるための核酸配列を、下流に転写活性化因子をコードする核酸配列を配置しても良く、またその逆であっても良い。
【００２１】
本発明の好適な態様では、前記の発現カセットはプラスミドベクターやウイルスベクターに搭載して使用される。前記プラスミドベクターには特に限定はないが、好適には哺乳動物用発現プラスミドベクターである、ｐＢＡｐｏ−ＣＭＶ  ＤＮＡ、ｐＩＲＥＳ  Ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ（以上、タカラバイオ社製）等が例示される。また、ウイルスベクターには特に限定はないが、好適にはレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター等が例示され、それぞれ市販品を使用できる。また、両発現カセットは、それぞれ一種類ずつ使用しても、複数種類使用しても良い。例えば、下記実施例１０に記載のように２種類以上の異なる目的産物発現カセットを含む核酸構築物を本発明の発現方法に使用しても良く、ｓｈＲＮＡライブラリーの発現カセットを含む核酸構築物やｓｉＲＮＡライブラリーの発現カセット等を含む核酸構築物を本発明の方法に使用しても良い。また、１種類の目的産物発現カセットを複数個含む核酸構築物を本発明の方法に使用しても良い。
【００２２】
本発明の方法において発現カセットが導入される細胞としては、特に本発明を限定するものではないが、哺乳動物細胞が好適に例示される。哺乳動物細胞としては、本発明の方法により目的産物の発現が達成されるのであれば限定はない。例えば、ヒト細胞においては、接着系又は浮遊系のＨＥＫ２９３細胞や２９３Ｔ細胞、２９３Ｆ細胞、２９３ＦＴ細胞（いずれもライフテクノロジーズ社製）、Ｇ３Ｔ−ｈｉ細胞（タカラバイオ社製：国際公開第０６／０３５８２９号パンフレット）、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）、ＭＯＬＴ−４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８２）、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌ社製）等が例示される。ヒト以外の霊長類細胞としては、ＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１）等が、げっ歯類細胞としては、ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ＨｅＰａ１−６細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１８３０）等が例示される。
【００２３】
本発明において、発現カセットを細胞に導入する方法には特に限定はないが、導入された発現カセットを含む核酸構築物が一過性に、あるいは恒常的に細胞に維持される公知の導入方法が例示される。例えばプラスミドベクターの導入方法としては、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、ポリエチレンイミン法、エレクトロポレーション法等が例示される。導入には、市販の試薬、例えばＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−２９３  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（ライフテクノロジーズ社製）、ＦｕＧｅｎｅ（登録商標；プロメガ社製）等を用いても良い。ここで、核酸構築物を細胞に導入し、導入された核酸構築物をゲノムに取り込んだ細胞を選択的に増殖させる方法等により、導入した核酸構築物を染色体上に保持する細胞を取得することもできる。また、ウイルスベクターを用いる場合は、その性質に応じた適切な方法で細胞に感染させれば良い。これら核酸導入方法には市販のキット等を使用できることは言うまでもない。
【００２４】
本発明の発現方法における細胞の培養の条件は、所望の細胞の増殖、目的産物の取得が達成できる条件であれば特に限定はない。例えば、通常の細胞培養で使用される条件で行うことができる。例えば温度３０〜３７℃、湿度９０〜１００％、ＣＯ２濃度３〜１０％での培養が例示される。
【００２５】
本発明の目的産物の製造方法は、本発明の発現方法を使用して目的産物を得ることで達成される。目的産物を得る方法に特に限定はなく、例えば細胞及び／又は培養上清から当業者に公知の技術を用いて目的産物を得れば良い。本発明の製造方法では、目的産物は必ずしも単離する必要はない。即ち、目的産物を含む培養物そのものの取得、培養物からの粗生成物の取得（例えば培養上清の取得）も、本発明における「目的産物を得る」の意味に含まれる。また、更に公知の方法を利用して目的産物を抽出、濃縮、もしくは精製することができる。
【００２６】
本発明の方法は、単一のポリペプチドやＲＮＡを得る態様に限らない。例えば複数のタンパク質と核酸からなるウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターの製造方法も、本発明の一態様である。前記ウイルスベクターの製造方法としては、ウイルスベクター製造に必要なタンパク質の発現カセットとウイルス粒子に封入される核酸の発現カセットを、転写因子発現カセットとともに細胞に導入し、その細胞をウイルスベクターの生産に適した条件で培養し、細胞内及び／又は培養上清に生産されたウイルスベクターを取得する方法が例示される。
【００２７】
本発明の方法には、更に、本発明の発現カセットの転写効率を上昇させるポリペプチド等を用いることができる。前記のポリペプチドとしては、例えばＥＬＬ２、ＡＦＦ４、ＥＮＬ、ＡＦ９、またｐ−ＴＥＦｂや、それを構成するＣｙｃｌｉｎＴ１、ｃｄｋ９等の転写伸長因子が例示される。更にＲＮＡポリメラーゼＩＩを用いることもできる。これらのポリペプチドは、公知の方法を用いて細胞中で発現させても良い。
【００２８】
本発明により、本発明の発現カセットを含有するキットも提供される。一態様では、本発明のキットは、前記の転写活性化因子発現カセットを含有するキットである。別の態様では、本発明のキットは、前記の転写活性化因子発現カセット、並びに、この転写活性化因子が結合する転写活性化因子結合領域に相当する配列を有する発現調節領域、及び前記発現調節領域に動作可能に接続されるように目的産物を発現させるための核酸を挿入可能な部位を包含する発現カセット（目的産物発現用カセット）を含有するキットである。例えば、転写活性化因子発現カセットを搭載したベクターと目的産物発現用カセットを搭載したベクターの組合せ、あるいはこれら両カセットを搭載したベクターが、本発明のキットの態様として例示される。両カセットを搭載したベクターにおいては、単一の発現調節領域で転写活性化因子と目的産物を発現させてもよい。本発明のキットに使用されるベクターとしては、特に限定されるものではないが、プラスミドベクターやウイルスベクターが例示される。また、本発明のキットは、取扱説明書、核酸導入用やクローニング用の試薬、および／または宿主細胞等を更に含んでも良い。宿主細胞を更に含む場合、本発明の転写活性化因子発現カセットが予めその宿主細胞に導入されていても良い。本発明のキットは、前記の本発明の方法の実施に特に有用である。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００３０】
実施例１  ＴａｔとＴＡＲを用いた転写活性化因子発現カセット、及び目的産物発現カセットの構築【００３１】
（１）転写活性化因子発現カセット：ｐＣＭＶＴＡＲ−Ｔａｔプラスミドの構築
ｐＢＡｐｏ−ＣＭＶ  ＤＮＡ（タカラバイオ社製）のマルチクローニングサイトに、ＨＩＶ−１のＮＬ４−３株由来のＴａｔをコードする核酸（配列番号１）を挿入し、ｐＣＭＶ−Ｔａｔプラスミドを構築した。ここでｐＢＡｐｏ−ＣＭＶ  ＤＮＡとは、サイトメガロウイルス由来のプロモーター（ＣＭＶ  ＩＥプロモーター）及び単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼのポリＡシグナルから構成される、哺乳類細胞用の遺伝子発現プラスミドである。続いてＨＩＶ−１のＬＴＲ由来のＴＡＲに相当する配列を含む核酸（配列番号３）をＰＣＲにて取得し、この核酸を前記ｐＣＭＶ−ＴａｔプラスミドのＣＭＶプロモーターとＴａｔをコードする核酸の間に挿入して、ｐＣＭＶＴＡＲ−Ｔａｔプラスミドを作製した。ここで、ｐＣＭＶＴＡＲ−Ｔａｔプラスミドは、前記プラスミドから発現したＴａｔが、同プラスミドのＴＡＲに結合することで、更にＴａｔ発現が促進されるという、正のフィードバック効果を持つことを特徴とする。【００３２】
（２）目的産物発現カセット：ｐＣＭＶＴＡＲ−ＡｃＧＦＰ１プラスミドの構築
ｐＢＡｐｏ−ＣＭＶ  ＤＮＡのマルチクローニングサイトに、配列番号３で示す核酸を挿入し、ｐＣＭＶ−ＴＡＲプラスミドを構築した。次に、前記ｐＣＭＶ−ＴＡＲプラスミドのＴＡＲの下流に位置するマルチクローニングサイトに、蛍光タンパク質ＡｃＧＦＰ１をコードする核酸を挿入し、ｐＣＭＶＴＡＲ−ＡｃＧＦＰ１プラスミドを構築した。また、コントロールとしてｐＢＡｐｏ−ＣＭＶ  ＤＮＡのマルチクローニングサイトにＡｃＧＦＰ１をコードする核酸を挿入し、ｐＣＭＶ−ＡｃＧＦＰ１プラスミドを構築した。【００３３】
実施例２  Ｔａｔ発現によるＡｃＧＦＰ１発現増強作用
（１）ＡｃＧＦＰ１蛍光強度による評価
表面処理された１２ウェルプレート（ベクトン・ディッキンソン社製）に接着性の２９３Ｔ細胞を１ウェルあたり２．５×１０５個／１ｍＬで播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５％）で培養した。培地にはウシ胎児血清（ＦＢＳ、ライフテクノロジーズ社製）を１０％となるよう添加したＤＭＥＭ培地（シグマ・アルドリッチ社製）を用いた。２４時間の培養後、培養細胞にプラスミドを導入した。導入は、用いたプラスミドの種類と量（１ウェルあたり）が異なる９種類の試験条件を設けて実施した。各試験条件において用いたプラスミドの種類と量を、表１に示す。なお、プラスミドの導入は、ＴｒａｎｓＩＴ−２９３を用いてキット添付のプロトコールに従って行った。【００３４】
【表１】
2014092094.tif 000003
【００３５】
導入後の細胞は、ＣＯ２インキュベーターで２日間培養した。導入の翌日に、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地で各ウェルの培地を交換し、２日間の培養終了後、細胞を回収した。回収した細胞のうち、５×１０５個の細胞を、ＰＢＳ（ライフテクノロジーズ社製）で洗浄した後、５０μＬの１×ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ  （５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ６．８、  １０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、  ２％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ  （ＳＤＳ）、０．００５％  ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ、  １００  ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を添加し、９５℃、５分間の熱処理を行い、細胞ライゼートとした。残りの細胞は、フローサイトメトリーに供し、細胞中に発現したＡｃＧＦＰ１による蛍光を測定した。蛍光が観測された細胞の平均蛍光強度を表２に示す。【００３６】
【表２】
2014092094.tif 000004
【００３７】
その結果、Ｔａｔ発現プラスミドを使用しない条件（試験条件１）では、ＡｃＧＦＰ１蛍光強度が低かった。一方、Ｔａｔ発現プラスミドを使用した条件下（試験条件３〜８）では、各Ｔａｔ発現プラスミドの使用量に相関してＡｃＧＦＰ１蛍光強度が高まった。更に、Ｔａｔ発現プラスミドとして本発明の転写活性化因子発現カセットを有するｐＣＭＶＴＡＲ−Ｔａｔプラスミドを使用した条件下（試験条件６〜８）では、顕著に蛍光強度が高まった。特に０．２μｇのｐＣＭＶＴＡＲ−Ｔａｔを使用した条件（試験条件８）では、試験条件１と比較して１０倍以上の蛍光強度が得られた。このことから、ＡｃＧＦＰ１発現は、Ｔａｔの存在によって高まり、かつＴａｔ発現量に相関することが示された。更に、ｐＣＭＶＴＡＲ−Ｔａｔプラスミドの正のフィードバック効果でＴａｔ発現が高まることにより、ＡｃＧＦＰ１発現が顕著に増強することが示された。【００３８】
（２）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による評価
実施例２−（１）で調製した細胞ライゼートを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに１レーンあたり細胞２×１０４個分アプライし、電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルをクマシーブリリアントブルーで染色した。染色されたゲル画像を図２に示す。次に、染色されたゲル画像をスキャナーで取り込み、画像解析ソフトウェアＬｕｍｉｎｏＳｈｏｔ（登録商標）  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２．０（タカラバイオ社製）を用いてＡｃＧＦＰ１のバンドのシグナル強度を算出した。なお、シグナル強度の算出は以下のように行った。まず、各レーンの２５ｋＤａ付近に存在するＡｃＧＦＰ１のバンドと、１５ｋＤａ付近の２９３Ｔ細胞由来タンパク質のバンドのシグナル強度を数値化した。次に、１５ｋＤａ付近の２９３Ｔ細胞由来タンパク質のバンドのシグナル強度を基準として、ＡｃＧＦＰ１のバンドのシグナル強度を補正した。更に、ＡｃＧＦＰ１のバンドのシグナル強度補正値から、ネガティブコントロール（レーン９）の２５ｋＤａ付近のシグナル強度を差し引き、得られた値をＡｃＧＦＰ１のバンドのシグナル強度とした。その結果を表３に示す。【００３９】
【表３】
2014092094.tif 000005
【００４０】
図２に示す通り、ｐＣＭＶ−ＡｃＧＦＰ１プラスミドを用いた条件下（レーン１）では、ＡｃＧＦＰ１のバンドは全く確認することができなかった。一方、Ｔａｔ発現プラスミドを用いた条件下（レーン３〜８）では、ＡｃＧＦＰ１をメジャーバンドとして確認することができた。
また、表３に示す通り、Ｔａｔ発現プラスミドを使用した条件（試験条件３〜８）では、各Ｔａｔ発現プラスミドの使用量に相関してシグナル強度が上昇した。また、ｐＣＭＶＴＡＲ−Ｔａｔを使用した条件（試験条件６〜８）では、ｐＣＭＶ−Ｔａｔを使用した条件（試験条件３〜５）と比較して、顕著にシグナル強度が上昇した。このことから、ＡｃＧＦＰ１発現は、Ｔａｔの存在によって高まり、かつＴａｔ発現量に相関することが示された。更に、ｐＣＭＶＴＡＲ−Ｔａｔプラスミドの正のフィードバック効果でＴａｔ発現が高まることにより、ＡｃＧＦＰ１発現は顕著に増強されたことが推測された。【００４１】
実施例３  ｐＣＭＶＴＡＲ−ＴａｔのＴａｔタンパク質発現増強効果
実施例２と同様に、接着性の２９３Ｔ細胞へＡｃＧＦＰ１発現プラスミド及びＴａｔ発現プラスミドを導入した。なお、本実施例では、培養担体として表面処理された６ウェルプレート（ベクトン・ディッキンソン社製）を用い、１ウェルあたりの細胞播種条件を６×１０５個／２．５ｍＬとした。導入に用いたプラスミドの種類と量を表４に示す。【００４２】
【表４】
2014092094.tif 000006
【００４３】
導入後の細胞は、ＣＯ２インキュベーターで１日間培養した後、回収した。回収した細胞の一部をフローサイトメトリーに供し、実施例２と同様の顕著なＡｃＧＦＰ１発現増強効果を確認した。残りの細胞のうち、１×１０６個を用いて実施例２と同様に細胞ライゼートを調製した。このライゼートをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、抗ＨＩＶ−１  Ｔａｔ抗体（アブカム社製）、及びサンプル間の電気泳動量の評価用として抗α−ｔｕｂｕｌｉｎ抗体（セルシグナリングテクノロジー社製）を用いてウェスタンブロッティングを行った。抗体の検出にはＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用い、検出は化学発光検出装置ＬｕｍｉｎｏＳｈｏｔ（登録商標）１４０（タカラバイオ社製）を用いて取り込み、各シグナル強度を数値化し、（Ｔａｔシグナル強度／α−Ｔｕｂｕｌｉｎシグナル強度）を算出し、これを補正されたＴａｔシグナル強度とした。その結果を図３に示す。
図３より、Ｔａｔ発現プラスミドとして、本発明の転写活性化因子発現カセットを有するｐＣＭＶＴＡＲ−Ｔａｔを使用することでｐＣＭＶ−Ｔａｔと比較して明らかにＴａｔ発現量が向上することが示された。従って、ＡｃＧＦＰ１の発現増強はＴａｔの発現増強効果によることが示された。【００４４】
実施例４  浮遊性２９３細胞でのＡｃＧＦＰ１発現増強作用
（１）ＡｃＧＦＰ１蛍光強度による評価
浮遊性の２９３細胞の培養システムであるＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジー社製）を用い、キットのプロトコールに従って１２５ｍＬフラスコに浮遊性の２９３細胞を２×１０７個／２０ｍＬの条件で播種、培養し、ＡｃＧＦＰ１発現プラスミドを導入した。各試験条件において用いたプラスミドの種類と量を表５に示す。【００４５】
【表５】
2014092094.tif 000007
【００４６】
導入後の細胞は、ＣＯ２インキュベーターで２日間培養した。その後、フローサイトメトリーに供し、細胞中に発現したＡｃＧＦＰ１による蛍光を測定した。蛍光が観測された細胞の平均蛍光強度を表６に示す。【００４７】
【表６】
2014092094.tif 000008
【００４８】
その結果、接着性の２９３Ｔ細胞と同様に、浮遊性２９３細胞でもｐＣＭＶＴＡＲ−ＴａｔとｐＣＭＶＴＡＲ−ＡｃＧＦＰ１を使用した条件（試験条件３，４）でＡｃＧＦＰ１発現が顕著に増強することが示された。【００４９】
実施例５  転写活性化因子発現カセット、及び目的産物発現カセットを同一分子に持つプラスミドの構築
ｐＣＭＶＴＡＲ−ＡｃＧＦＰ１プラスミドのＡｃＧＦＰ１をコードする配列の下流にピコルナウイルス由来のＩＲＥＳ配列及びＴａｔをコードする核酸（配列番号１）を挿入したプラスミドを構築し、ｐＣＭＶＴＡＲ−ＡｃＧＦＰ１−ＩＲＥＳ−Ｔａｔと命名した。【００５０】
実施例６  Ｔａｔ発現によるＡｃＧＦＰ１発現増強作用
実施例５で構築したｐＣＭＶＴＡＲ−ＡｃＧＦＰ１−ＩＲＥＳ−Ｔａｔを用いて、接着性２９３Ｔ細胞でのＡｃＧＦＰ１発現増強作用を評価した。評価は実施例２と同様に行った。ただし、１ウェルあたりの細胞播種条件を１．５×１０５個／１ｍLとした。各試験条件において用いたプラスミドの種類と量を表７に示す。【００５１】
【表７】
2014092094.tif 000009
【００５２】
導入後の細胞は、ＣＯ２インキュベーターで２日間培養した。その後、フローサイトメトリーに供し、細胞中に発現したＡｃＧＦＰ１による蛍光を測定した。蛍光が観測された細胞の平均蛍光強度を表８に示す。【００５３】
【表８】
2014092094.tif 000010
【００５４】
その結果、ｐＣＭＶＴＡＲ−ＡｃＧＦＰ１−ＩＲＥＳ−Ｔａｔを用いた条件（試験条件２）で、ＡｃＧＦＰ１発現が顕著に増強することが示された。つまり、本発明の転写因子発現カセットと目的産物発現カセットは、単一のプラスミドに搭載しても目的産物の発現を増強する。【００５５】
実施例７  分泌型タンパク質Ｇ−ＣＳＦ発現プラスミドの構築
ｐＣＭＶ−ＡｃＧＦＰ１、ｐＣＭＶＴＡＲ−ＡｃＧＦＰ１及びｐＣＭＶＴＡＲ−ＡｃＧＦＰ−ＩＲＥＳ−Ｔａｔの、ＡｃＧＦＰ１をコードする核酸の代わりに顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）をコードする核酸を挿入したプラスミドを構築し、それぞれ、ｐＣＭＶ−Ｇ−ＣＳＦ、ｐＣＭＶＴＡＲ−Ｇ−ＣＳＦ、ｐＣＭＶＴＡＲ−Ｇ−ＣＳＦ−ＩＲＥＳ−Ｔａｔと命名した。【００５６】
実施例８  Ｔａｔ発現によるＧ−ＣＳＦ発現増強作用
実施例７で構築したＧ−ＣＳＦ発現プラスミドを用いて、接着性２９３Ｔ細胞及び浮遊性２９３細胞でのＧ−ＣＳＦ発現増強作用を評価した。接着性２９３Ｔ細胞への遺伝子導入は実施例２と同様に行った。なお、細胞播種条件は、５×１０５個／２ｍＬとした。浮遊性２９３細胞への導入は実施例４と同様に行った。なお、細胞播種条件は、１２５ｍＬフラスコに４．５×１０７個／３０ｍＬとした。各試験条件において用いたプラスミドの種類と量を表９に示す。【００５７】
【表９】
2014092094.tif 000011
【００５８】
導入後の細胞は、ＣＯ２インキュベーターで培養し、２、５及び７日目に培養上清を０．０８ｍｌずつサンプリングした。サンプリングした培養上清は、Ｇ−ＣＳＦ量の測定に用いられた。測定は、Ｈｕｍａｎ  Ｇ−ＣＳＦ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＩＢＬ社製）を用いて、キットのプロトコールに従った。その結果を表１０に示す。【００５９】
【表１０】
2014092094.tif 000012
【００６０】
その結果、細胞外分泌タンパク質であるＧ−ＣＳＦにおいてもＴＡＲとＴａｔを用いた本発明の発現カセットを用いた条件（試験条件３〜５，９〜１１）で大幅な発現量の向上が示された。【００６１】
実施例９  抗ヒトＣＤ３抗体発現プラスミドの構築
ｐＣＭＶＴＡＲ−ＡｃＧＦＰ１の、ＡｃＧＦＰ１をコードする核酸の代わりに抗ヒトＣＤ３抗体の重鎖又は軽鎖をコードする核酸を挿入したプラスミドをそれぞれ構築し、ｐＣＭＶＴＡＲ−ＨＣ、ｐＣＭＶＴＡＲ−ＬＣと命名した。【００６２】
実施例１０
実施例９で構築した抗ヒトＣＤ３抗体発現プラスミドを用いて、接着性２９３Ｔ細胞及び浮遊性２９３細胞での抗ヒトＣＤ３抗体発現増強作用を評価した。接着性２９３Ｔ細胞への導入は実施例２と、浮遊性２９３細胞への導入は実施例８と同様に行った。各試験条件において用いたプラスミドの種類と量を表１１に示す。【００６３】
【表１１】
2014092094.tif 000013
【００６４】
導入後の細胞は、ＣＯ２インキュベーターで培養し、２、５及び７日目に培養上清を０．０４ｍｌずつサンプリングした。サンプリングした培養上清は、抗ＣＤ３抗体産生量の測定に用いられた。測定はＭｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ＥＩＡ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、キットのプロトコールに従った。その結果を表１２に示す。【００６５】
【表１２】
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【００６６】
その結果、抗ヒトＣＤ３抗体においてもＴＡＲとＴａｔを用いた本発明の発現カセットを用いた条件（試験条件２，５）で大幅な発現量の向上が示された。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明は、タンパク質工学分野、分子遺伝学分野のみならず、免疫工学分野、遺伝子治療分野、医薬品製造分野の基礎研究又は臨床応用において非常に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００６８】
SEQ ID NO:1: Tat coding sequence
SEQ ID NO:2: Nucleic acid sequence corresponding to TAR
SEQ ID NO:3: Nucleic acid sequence including sequence corresponding to TAR
【図１】
2014092094.tif 000015
【図２】
2014092094.tif 000016
【図３】
2014092094.tif 000017
【配列表】
2014092094000001.app
【国際調査報告】
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2014092094.tif 000019
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