(57)【要約】  Ｈ１Ｎ１ｐｄｍの感染者由来のＰＢＭＣから、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ由来のヘマグルニチンタンパク質のＨＡ２領域中の４０〜５８位に存在するエピトープに結合する３種のヒトモノクローナル抗体を取得した。さらに、これら抗体は、インフルエンザウイルスＡ型のグループ１のＨ１サブタイプ及びＨ５サブタイプに対する中和活性を有していることも見出した。一方、該グループ１に属しているが、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ由来のＨＡ２領域において、４５位のアミノ酸がフェニルアラニンに置換されており、かつ４７位のアミノ酸がグリシンに置換されているＨ２サブタイプに対しては、前記３種の抗体は結合性のみならず、中和活性を示さないことも見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザウイルスＡ型のグループ１のＨ１サブタイプ及びＨ５サブタイプに対する中和活性を有する抗体であって、下記（ａ）及び（ｂ）の特徴を有する抗体
（ａ）Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００／２００９株由来のヘマグルニチンタンパク質のＨＡ２領域中の４０〜５８位に存在するエピトープに結合する
（ｂ）Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００／２００９株由来ののヘマグルニチンタンパク質において、ＨＡ２領域中の４５位のアミノ酸がフェニルアラニンに置換されており、かつ４７位のアミノ酸がグリシンに置換されているタンパク質に結合しない。
【請求項２】
下記（ｃ）〜（ｅ）の特徴をさらに有する、請求項１に記載の抗体。
（ｃ）Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００／２００９株由来のヘマグルニチンタンパク質において、ＨＡ２領域中の４２位のアミノ酸がグリシンに置換されており、４６位のアミノ酸がスレオニンに置換されており、４９位のアミノ酸がアスパラギンに置換されており、かつ５２位のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されているタンパク質に結合する
（ｄ）Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００／２００９株由来のヘマグルニチンタンパク質において、ＨＡ２領域中の１９位のアミノ酸がアスパラギンに置換されており、２１位のアミノ酸がフェニルアラニンに置換されており、かつ４５位のアミノ酸がバリンに置換されているタンパク質に結合する
（ｅ）Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００／２００９株由来のヘマグルニチンにおいて、ＨＡ１領域中の１８９位のアミノ酸がアルギニンに置換されており、２２５位のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されており、かつ３１８位のアミノ酸がリシンに置換されているタンパク質に結合する。
【請求項３】
下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうちのいずれか一に記載の特徴を有する、請求項１又は２に記載の抗体
（ｉ）  配列番号：３〜５に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：８〜１０に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｉｉ）  配列番号：１３〜１５に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１８〜２０に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｉｉｉ）  配列番号：２３〜２５に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２８〜３０に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する。
【請求項４】
下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうちのいずれか一に記載の特徴を有する、請求項１又は２に記載の抗体
（ｉ）  配列番号：２に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：７に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｉｉ）  配列番号：１２に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１７に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列とを含む重鎖可変領域とを保持する
（ｉｉｉ）  配列番号：２２に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２７に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列とを含む重鎖可変領域とを保持する。
【請求項５】
インフルエンザウイルスＡ型のグループ１のＨ９サブタイプに対する中和活性をさらに有する抗体である、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
前記インフルエンザウイルスＡ型のグループ１を５０％中和するために必要とされる抗体の濃度が、３０μｇ／ｍｌ以下である、請求項１〜５のうちのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
ヒト抗体である、請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
請求項１〜７のうちのいずれか一項に記載の抗体をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項１〜７のうちのいずれか一項に記載の抗体を産生する、又は、請求項８に記載のＤＮＡを含む、細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の細胞を培養し、該細胞内又はその培養液から、産生された請求項１〜７のうちのいずれか一項に記載の抗体を回収する工程を含む、抗体の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜７のうちのいずれか一項に記載の抗体を有効成分とする、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザウイルスＡ型のグループ１に対して広域な中和活性を有する抗体に関し、より詳しくは、インフルエンザウイルスＡ型のグループ１のＨ１サブタイプ及びＨ５サブタイプに対する中和活性を有する抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは、季節的に流行して世界中に広まるウイルス性の疾患である。そして、年間３００万〜５００万人が重度の疾病症例となり、約５０００００人が死に至る。また、世界的に流行した数年においては、インフルエンザによる死者の数が何百万人に至ったこともある。２０世紀においては、インフルエンザの世界的な流行が３回生じたが、いずれもヒトに感染し易くなった新株の発生によるものであり、１千万の人を死に至らしめた。【０００３】
時に、新型インフルエンザ株は、既存のインフルエンザウイルスが他の動物種からヒトに広まる際、または既存のヒトに感染ずるインフルエンザウイルス株が、通常トリ又はブタに感染するウイルスから新たな遺伝子を獲得した際に生じる。現に、新型のインフルエンザウイルス株として２００９年４月に発生したブタ起源のパンデミックＨ１Ｎ１（２００９）（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ）は、ヒト、ブタ、トリに感染する各インフルエンザウイルスの遺伝子が組み合わさったものであった。そして、この遺伝子の組み合わせにより、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍはヒトに感染する能力を獲得したため、世界中に迅速に広まることとなり、沢山の重度な症例を引き起こした。また、かかる当時のＨ１Ｎ１ｐｄｍのパンデミック発生の経緯を鑑みれば、１９９０年代のアジアにおいて発生した、Ｈ５Ｎ１と称される高病原性トリインフルエンザウイルス株についても、新たなインフルエンザパンデミックの要因となることが懸念され、常にＨ５Ｎ１由来のパンデミック発生の可能性について注意が払われている。【０００４】
Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ及びＨ５Ｎ１等は、３属（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型）に分類されるインフルエンザウイルスにおいて、いずれもＡ型に属する。Ａ型、Ｂ型及びＣ型の違いは、ウイルス粒子を構成するタンパク質のうち、Ｍ１タンパク質とＮＰタンパク質の抗原性の違いに基づく。また、同じＡ型であっても、エンベロープの表面上の分子である赤血球凝集素（ヘマグルチニン、以下、単に「ＨＡ」とも称する）やノイラミニダーゼ（ＮＡ）の抗原性の違いから、２つのグループに分類され、さらに複数のサブタイプ、複数の亜型、さらに複数の株（分離株）とに分類される。、具体的には、インフルエンザウイルスＡ型は、サブタイプ：Ｈ１、Ｈ２，Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２，Ｈ１３及びＨ１６からなるグループ１と、サブタイプ：Ｈ３、Ｈ４，Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４及びＨ１５からなるグループ２とに分類され、さらにこれらサブタイプにおいては、前述のＨ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１の亜型等に分類される。【０００５】
インフルエンザＡ型ウイルスのＨＡは、頭部領域（球状頭部領域、ｈｅａｄ  ｒｅｇｉｏｎ）と茎領域（ｓｔｅｍ  ｒｅｇｉｏｎ又はｓｔａｌｋ  ｒｅｇｉｏｎ）という構造の異なる領域で構成され、領域はウイルスが標的細胞に結合するための受容体結合部位を含み、ＨＡの血球凝集活性に関与し、茎領域はウイルスのエンベロープと細胞のエンドソーム膜間の膜融合に必要な融合ペプチドを含み、融合活性に関与していることが知られている。【０００６】
また、このようなインフルエンザウイルス感染症に対する治療及び予防においては、いくつかの選択肢がある。例えば、初期のウイルス粒子（ビリオン）放出を阻害するノイラミニダーゼ阻害剤であるザナミビル（リレンザ）及びオセルタミブル（タミフル）、Ｍ２チャンネルのプロトン伝導性を阻害するアマンタジンといった、いくつかの低分子化合物がインフルエンザの治療には用いられている。【０００７】
しかしながら、インフルエンザの治療及び予防における、低分子化合物投与の有効性は発症後４８時間以内に限られている。さらに低分子化合物の過剰な使用は、エスケープ変異から驚くべきほど低い効果を示す耐性ウイルスの発生を招き、それによって、世界中への急速な感染拡大が引き起こされることになる。【０００８】
インフルエンザの予防の別の選択肢としてワクチン接種がある。しかしながら、抗原連続変異として知られている、ウイルスの抗原変異の蓄積のため、その使用には重要な制限が課される。また、現在の季節性インフルエンザワクチンは、ＨＡに対する抗体を主に誘導するものであり、ＨＡの頭部領域を特異的に標的とし、その受容体結合機能を阻害するものである。これらの反応は通常、株特異的なウイルス中和反応であり、それ故、次のインフルエンザの季節に流行するであろうと予測されるウイルス抗原に基づき、毎年改質する必要がある。さらに、パンデミック状況下においては、現に流行中のウイルスを対象とした製剤化が必要となる。一方、ワクチンの開発、製造には時間を要するため、パンデミックに対する治療及び予防において、ワクチン戦略の有効性は乏しいものである。【０００９】
以上の通り、インフルエンザウイルス、特に、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ、Ｈ１Ｎ１ｓｅａ及びＨ５Ｎ１等に対して鋭意研究は進められ、様々な治療法及び予防法が試みられているものの、未だ十分に対応できる方法は確立されておらず、それらの研究、開発が鋭意進められている。【００１０】
かかる現状において、広域なウイルス株に対して、特異性を示すヒトモノクローナル抗体（ＨｕＭＡｂ）は、血清中における長期安定性、高い特異性、低免疫原性といった極めて望ましい特性を有しているため、インフルエンザ等の予防薬及び治療薬として注目を集めている。特に、上記低分子化合物等の薬剤を用いた治療においては、発症後４８時間を越えてしまうと、該化合物を投与してもその有効性は殆ど認められないが、かかる抗体による治療においては発症後４８時間であってもその有効性が期待できる。さらに上述の低分子化合物による治療によって生じることが懸念されるエスケープ変異や、ワクチン戦略においては対応しきれない年々変化するウイルス抗原に大しても、その広域な保護範囲をもって対応することができる。【００１１】
そのため、インフルエンザウイルスに対して広範囲な中和活性を示す抗体が注目され、様々な広域性抗インフルエンザウイルス抗体の研究・開発が進めされている。例えば、インフルエンザウイルスＡ型のグループ１に対する、ヒト及びマウス由来の抗体がにおいて報告されている（非特許文献１〜１０）。また、インフルエンザウイルスＡ型のグループ２に対する抗体が非特許文献１１〜１４において報告されている。さらに、インフルエンザウイルスＡ型のグループ１及び２に対する抗体、並びにインフルエンザウイルスＢ型の山形系統及びビクトリア系統に対する抗体についても非特許文献１１及び１５〜１８、並びに非特許文献１９及び２０において、各々報告されている。また、広域交差反応性を示す中和抗体ＨｕＭＡｂのいくつかは、ＨＡの頭部を認識する抗体であるが（非特許文献７、８、１４、２１〜２４及び２６）、その殆どは、ＨＡの茎領域を認識する抗体である（非特許文献１〜６、８、１９及び２５）。【００１２】
このように、様々な広域交差反応性を示す中和抗体について、研究・開発が進めされているが、未だインフルエンザウイルス、特に近年パンデミックを引き起こしたＨ１Ｎ１ｐｄｍや、今後パンデミックを引き起こすことが懸念されるＨ５Ｎ１が属するインフルエンザウイルスＡ型のグループ１において広範囲に中和活性を示し、治療等に有効な抗体は依然開発されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｗｒａｍｍｅｒｔ  Ｊら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、２０１１年、２０８巻、１８１−１９３ページ
【非特許文献２】Ｅｋｉｅｒｔ  ＤＣら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００９年、３２４巻２４６−２５１ページ
【非特許文献３】Ｓｕｉ  Ｊら、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２００９年、１６巻、２６５−２７３ページ
【非特許文献４】Ｏｋｕｎｏ  Ｙら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、１９９３年、６７巻、２５５２−２５５８ページ
【非特許文献５】Ｔａｎ  ＧＳら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、２０１２年、８６巻、６１７９−６１８８ページ
【非特許文献６】Ｔｈｒｏｓｂｙ  Ｍら、Ｈｅｔｅｒｏｓｕｂｔｙｐｉｃ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｈ５Ｎ１  ａｎｄ  Ｈ１Ｎ１  ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＭ＋  ｍｅｍｏｒｙ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ．、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２００８年、３：ｅ３９４２．
【非特許文献７】Ｅｋｉｅｒｔ  ＤＣら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１２年、４８９巻、５２６−５３２ページ
【非特許文献８】Ｄｅ  Ｍａｒｃｏ  Ｄら、Ａ  ｎｏｎ−ＶＨ１−６９  ｈｅｔｅｒｏｓｕｂｔｙｐｉｃ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｈ１Ｎ１  ａｎｄ  Ｈ５Ｎ１  ｖｉｒｕｓｅｓ．、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２０１２年、７：ｅ３４４１５．
【非特許文献９】Ｋａｓｈｙａｐ  ＡＫら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２００８年、１０５巻、５９８６−５９９１ページ
【非特許文献１０】Ｋａｓｈｙａｐ  ＡＫら、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ２００９  Ｈ１Ｎ１  ｐａｎｄｅｍｉｃ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｂｙ  ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｓｕｒｖｉｖｏｒ−ｂａｓｅｄ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ、２０１０年、６：ｅ１０００９９０．
【非特許文献１１】Ｃｏｒｔｉ  Ｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１１年、３３３巻、８５０−８５６ページ
【非特許文献１２】Ｅｋｉｅｒｔ  ＤＣら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１１年、３３３巻、８４３−８５０ページ
【非特許文献１３】Ｗａｎｇ  ＴＴら、Ｂｒｏａｄｌｙ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｈ３  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｓ．、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ、２０１０年、６：ｅ１０００７９６．
【非特許文献１４】Ｍａｒｇｉｎｅ  Ｉら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、２０１３年、８７巻、４７２８−４７３７ページ
【非特許文献１５】Ｃｌｅｍｅｎｔｉ  Ｎら、Ａ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｗｉｔｈ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｉｇｈｌｙ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ．、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２０１１年、６：ｅ２８００１．
【非特許文献１６】Ｏｈｓｈｉｍａ  Ｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、２０１１年、８５巻、１１０４８−１１０５７ページ
【非特許文献１７】Ｌｅｅ  ＰＳら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２０１２年、１０９巻、１７０４０−１７０４５ページ
【非特許文献１８】Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｒら、Ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｓｉｔｅ  Ｂ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓｅｓ．、ＰＬｏＳ  Ｐａｈｔｏｇ、２００９年、５：ｅ１０００３５０．
【非特許文献１９】Ｙａｓｕｇｉ  Ｍら、Ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｒｏａｄｌｙ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ．、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ、２０１３年、９：ｅ１００３１５０．
【非特許文献２０】Ｄｒｅｙｆｕｓ  Ｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１２年、３３７巻、１３４３−１３４８ページ
【非特許文献２１】Ｏｈｓｈｉｍａ  Ｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、２０１１年、８５巻、１１０４８−１１０５７ページ
【非特許文献２２】Ｗｈｉｔｔｌｅ  ＪＲら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２０１１年、１０８巻、１４２１６−１４２２１ページ
【非特許文献２３】Ｋｒａｕｓｅ  ＪＧら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、２０１１年、８５巻、１０９０５−１０９０８ページ
【非特許文献２４】Ｋｒａｕｓｅ  ＪＧら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、２０１２年、８６巻、６３３４−６３４０ページ
【非特許文献２５】Ｋａｓｈｙａｐ  ＡＫら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２００８年、１０５巻、５９８６−５９９１ページ
【非特許文献２６】Ｅｋｉｅｒｔ  ＤＣら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１２年、４８９巻、５２６−５３２ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、インフルエンザウイルスＡ型のグループ１のＨ１サブタイプ及びＨ５サブタイプに対する中和活性を有する抗体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、前記目的を達成すべく、感染症におけるヒト抗体の有効性に着目した。具体的には、ＳＡＲＳ−ＣｏＶの感染患者及びトリインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１の感染患者に、これらウイルスに感染して既に回復している別の患者から採取した血清を輸血したところ、有意な治療効果が認められたという事例（Ｍａｒａｓｃｏ  ＷＡ，Ｓｕｉ  Ｊ．（２００７）  Ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２５：１４２１−１４３４）を鑑み、インフルエンザウイルスＡ型のグループ１感染者由来のヒト抗体を調製することを試みた。すなわち、ＨＩＮ１ｐｄｍ感染者由来の血液から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製し、さらにフュージョンパートナー細胞であるＳＰＹＭＥＧと融合させることにより、ハイブリドーマを調製した。そして、調製したハイブリドーマからインフルエンザウイルスに特異的な抗体を産生する細胞を選抜した結果、ヒト由来の３種のモノクローナル抗体（ＨｕＭＡｂ）  Ｈ９Ｎ２、１Ｈ１１、２Ｈ５及び５Ｇ２を得ることができた。そして、これら抗体について、その結合性を解析したところ、ＨＩＮ１ｐｄｍのみならず、インフルエンザウイルスＡ型のグループ１に属する他の亜型（ＨＩＮ１ｓｅａ、Ｈ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２）に対しても結合性を示すことを見出した。一方、該グループ１に属するＨ２Ｎ１に対しては、これら３種のいずれの抗体も結合性を示すことはなかった。また、インフルエンザウイルスＡ型のグループ２に属する亜型（Ｈ３Ｎ２及びＨ７Ｎ７）に対しても、これら抗体はいずれも結合性を示すことはなかった。【００１６】
次に、得られた３種のＨｕＭＡｂにつき、インフルエンザウイルス感染症に対する治療及び予防の有効性を検証すべく、これら抗体の中和活性について分析した。その結果、前記３種のＨｕＭＡｂのいずれにおいても、ＨＩＮ１ｐｄｍのみならず、ＨＩＮ１ｓｅａ及びＨ５Ｎ１に対して中和活性を示すことが明らかになった。特に、１Ｈ１１及び５Ｇ２は、さらにＨ９Ｎ２に対しても中和活性を示すことが明らかになった。また、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍに関しては、２００９年に分離された株、２０１１年に分離された株、いずれに対しても前記３種のＨｕＭＡｂは中和活性を示したものの、２０１１年分離株に対する中和活性は２００９年分離株に対するそれと比較して低いものであった。【００１７】
次に、これら抗体のエピトープを同定すべく、プロテアーゼ処理及びそれに続く質量分析による、エピトープマッピング分析を行った結果、３種全てのＨｕＭＡｂに共通したエピトープとして、ヘマグルチニン２（ＨＡ２）サブユニットの茎領域の、より短いα‐へリックス（４０〜５８位のアミノ酸からなる領域）に存在していることを見出した。また意義深いことに、全てのＨｕＭＡｂは、トリプシン処理によるＨＡ前駆体（ＨＡ０）の開裂、及び成熟ＨＡ１／ＨＡ２の分断、並びに低ｐＨ処理によるＨＡ０の構造変化を阻害する活性を有していることも明らかになった。【００１８】
さらに、インフルエンザウイルスに対して広域な中和活性を有する既存の抗体が認識することのできない、ＨＡタンパク質のアミノ酸置換体として、ＨＡ２領域において、Ｑ４２Ｇ、Ｄ４６Ｔ、Ｔ４９Ｎ及びＮ５２Ｄを伴うＨＡタンパク質のアミノ酸置換体、ＨＡ２領域において、Ｄ１９Ｎ、Ｗ２１Ｆ及びＩ４５Ｖを伴うＨＡタンパク質のアミノ酸置換体、ＨＡ１領域において、Ｇ１８９Ｒ、Ｇ２２５Ｄ及びＴ３１８Ｋを伴うＨＡタンパク質のアミノ酸置換体等が知られている。そこで、これらＨＡタンパク質のアミノ酸置換体に対する、前記３種のＨｕＭＡｂの結合性について解析した。その結果、いずれのＨＡタンパク質のアミノ酸置換体に対しても、これら３種のＨｕＭＡｂはいずれも結合できることを見出し、今回得られたＨｕＭＡｂは、既存のインフルエンザウイルスに対して広域な中和活性を有する抗体とは異なるエピトープを認識する抗体であることが明らかになった。【００１９】
さらに、ＮＣＢＩインフルエンザデータベースの＞６０００配列を遺伝的に解析した結果、ＨＡタンパク質のＨＡ２領域において、４７位のアミノ酸がリジンであるＨ１Ｎ１ｐｄｍの数が年々増加していることが見出され、前述のＨ１Ｎ１ｐｄｍ２０１１年分離株に対する低感受性は、２００９年分離株における４７位のアミノ酸がリジンからグルタミン酸への置換が要因であることを見出した。なお、上述の通り、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍにおいて優位な集団となった４７位のアミノ酸がリジンである変異体に対し、２００９年分離株と比較して弱くなっているものの、前記３種のＨｕＭＡｂはいずれも有効な中和活性を示す。したがって、これら３種のＨｕＭＡｂは、近年のＨ１Ｎ１ｐｄｍに対しても依然有効であるとも言える。【００２０】
さらに、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍと同じグループ１に属しながら前記３種のＨｕＭａｂが結合することができないＨ２Ｎ２に関しては、ＨＡタンパク質のＨＡ２領域において、４７位のアミノ酸がリジンからグルタミン酸への置換されていることに加え、４５位のアミノ酸がイソロイシンからフェニルアラニンに置換されていることから、これらアミノ酸置換も、前記３種のＨｕＭＡｂの結合性に影響を与えていることを見出した。【００２１】
実際、当該アミノ酸置換の結合性への影響を確認するため、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍのＨＡタンパク質のＨＡ２領域における、４５位のアミノ酸をイソロイシンからフェニルアラニンヘ、４７位のアミノ酸をグルタミン酸からリジン又はグリシンへ、また４５位のアミノ酸及び４７位のアミノ酸をイソロイシンからフェニルアラニンに、グルタミン酸からグリシンに各々アミノ酸置換を行った変異体を作製した。そして、これら変異体に対する前記３種のＨｕＭＡｂの結合性を評価した結果、前記３種のＨｕＭＡｂは４５位、４７位に個別にアミノ酸置換を入れたものには反応を示したが、４５位、４７位に同時に変異を入れた場合は反応を示さないことが確認され、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は、以下に関する。
＜１＞  インフルエンザウイルスＡ型のグループ１のＨ１サブタイプ及びＨ５サブタイプに対する中和活性を有する抗体であって、下記（ａ）及び（ｂ）の特徴を有する抗体
（ａ）Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００／２００９株由来のヘマグルニチンタンパク質のＨＡ２領域中の４０〜５８位に存在するエピトープに結合する
（ｂ）Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００／２００９株由来のヘマグルニチンタンパク質において、ＨＡ２領域中の４５位のアミノ酸がフェニルアラニンに置換されており、かつ４７位のアミノ酸がグリシンに置換されているタンパク質には結合しない。
＜２＞  下記（ｃ）〜（ｅ）のうちのいずれか一に記載の特徴をさらに有する、＜１＞に記載の抗体。
（ｃ）Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００／２００９株由来のヘマグルニチンタンパク質において、ＨＡ２領域中の４２位のアミノ酸がグリシンに置換されており、４６位のアミノ酸がスレオニンに置換されており、４９位のアミノ酸がアスパラギンに置換されており、かつ５２位のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されているタンパク質に結合する
（ｄ）Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００／２００９株由来のヘマグルニチンタンパク質において、ＨＡ２領域中の１９位のアミノ酸がアスパラギンに置換されており、２１位のアミノ酸がフェニルアラニンに置換されており、かつ４５位のアミノ酸がバリンに置換されているタンパク質に結合する
（ｅ）Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００／２００９株由来のヘマグルニチンタンパク質において、ＨＡ１領域中の１８９位のアミノ酸がアルギニンに置換されており、２２５位のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されており、かつ３１８位のアミノ酸がリシンに置換されているタンパク質に結合する。
＜３＞  下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうちのいずれか一に記載の特徴を有する、請求項１又は２に記載の抗体
（ｉ）  配列番号：３〜５に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：８〜１０に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｉｉ）  配列番号：１３〜１５に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１８〜２０に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｉｉｉ）  配列番号：２３〜２５に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２８〜３０に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する。
＜４＞  下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうちのいずれか一に記載の特徴を有する、請求項１又は２に記載の抗体
（ｉ）  配列番号：２に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：７に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｉｉ）  配列番号：１２に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１７に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列とを含む重鎖可変領域とを保持する
（ｉｉｉ）  配列番号：２２に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２７に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列とを含む重鎖可変領域とを保持する。
＜５＞  インフルエンザウイルスＡ型のグループ１のＨ９サブタイプに対する中和活性をさらに有する抗体である、＜１＞〜＜４＞のうちのいずれか一に記載の抗体。
＜６＞  前記インフルエンザウイルスＡ型のグループ１を５０％中和するために必要とされる抗体の濃度が、３０μｇ／ｍｌ以下である、＜１＞〜＜５＞のうちのいずれか一に記載の抗体。
＜７＞  下記（ｆ）の特徴をさらに有する、＜１＞〜＜６＞に記載の抗体
（ｆ）Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００／２００９株由来のヘマグルニチンタンパク質において、ＨＡ２領域中の４７位のアミノ酸がリシンに置換されているタンパク質に結合する。
＜８＞  下記（ｇ）の特徴をさらに有する、＜１＞〜＜７＞に記載の抗体
（ｇ）  Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００／２００９株由来のヘマグルニチンタンパク質において、ＨＡ１領域中の８６位のアミノ酸がシステインに置換されているタンパク質には結合いない。
＜９＞  ヒト抗体である、＜１＞〜＜８＞のうちのいずれか一に記載の抗体。
＜１０＞  ＜１＞〜＜９＞のうちのいずれか一に記載の抗体をコードするＤＮＡ。
＜１１＞  ＜１＞〜＜９＞のうちのいずれか一に記載の抗体を産生する、又は、＜１０＞に記載のＤＮＡを含む、細胞。
＜１２＞  ＜１１＞に記載の細胞を培養し、該細胞内又はその培養液から、産生された＜１＞〜＜９＞のうちのいずれか一に記載の抗体を回収する工程を含む、抗体の製造方法。
＜１３＞  ＜１＞〜＜９＞のうちのいずれか一に記載の抗体を有効成分とする、医薬組成物。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、インフルエンザウイルスＡ型のグループ１のＨ１サブタイプ及びＨ５サブタイプに対する中和活性を有する抗体を提供することが可能となる。より具体的には、季節性インフルエンザであるＨ１Ｎ１ｓｅａのみならず、パンデミックを引き起こしたＨ１Ｎ１ｐｄｍ、今後パンデミックを引き起こすことが想定されるＨ５Ｎ１に対しても、強い中和活性を示す抗体を提供することが可能である。さらに、近年のＨ１Ｎ１ｐｄｍにおいて、優位な集団となったＨＡ２タンパク質の４７位のアミノ酸がリシンである変異体に対しても中和活性を示す抗体を提供することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＨＡコーディングプラスミドを導入した２９３Ｔ細胞と、インフルエンザウィルスＡ型に対する抗体３種とによる、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）の結果を示す顕微鏡写真である。すなわち、野生型（Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００９由来）ヘマグルニチン（ＨＡ）タンパク質をコードするプラスミドが導入された２９３Ｔ細胞と、本発明の抗体３種（１Ｈ１１、２Ｈ５及び５Ｇ２）とを反応させた結果を示す顕微鏡写真である。なお、陰性対照及び陽性対照として、抗体の代わりにＰＢＳのみを添加した前記細胞及びＣ１７９ＭＡｂと反応させた前記細胞を各々用いた。
【図２】本発明のヒトモノクローナル抗体（ＨｕＭＡｂ）１Ｈ１１の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）の推定アミノ酸配列、並びに前記各領域における相補性決定領域（ＣＤＲ）の推定アミノ酸配列を示す図である。
【図３】本発明のヒトモノクローナル抗体（ＨｕＭＡｂ）２Ｈ５の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）の推定アミノ酸配列、並びに前記各領域における相補性決定領域（ＣＤＲ）の推定アミノ酸配列を示す図である。
【図４】本発明のヒトモノクローナル抗体（ＨｕＭＡｂ）５Ｇ２の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）の推定アミノ酸配列、並びに前記各領域における相補性決定領域（ＣＤＲ）の推定アミノ酸配列を示す図である。
【図５】本発明の３種のＨｕＭＡｂの、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ、Ｈ１Ｎ１ｓｅａ、Ｈ５Ｎ１及びＨ９Ｎ２に対するウィルス中和活性を示すグラフである。すなわち、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ（２００９年分離株及び２０１１年分離株）、Ｈ１Ｎ１ｓｅａの２分離株と、Ｈ５Ｎ１の２分離株と、Ｈ９Ｎ２の１分離株とを、ＨｕＭＡｂのいくつかの希釈系列における中和反応に供した結果を示すグラフである。なお、陰性対照として、抗デング熱ウィルスＨｕＭＡｂであるＤ２３−１Ｇ７Ｃ２を用いた。
【図６】ＣＶ−１細胞を用いた融合阻害アッセイの結果を示す、顕微鏡写真である。すなわち、Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００９をＣＶ−１細胞に感染させ、２４時間インキュベーションした。さらに、図中に示す様々な濃度の本発明の３種の抗体（１Ｈ１１、２Ｈ５及び５Ｇ２）と共に、３７℃にて１時間インキュベートした。そして、ＰＢＳ（ｐＨ５．５）に置き換え、５分間インキュベートした。洗浄後、細胞を更に３時間インキュベートし、次いでメタノールにて固定し、ギムザ染色を施して、観察した結果を示す図である。コントロールとして、抗インフルエンザウィルス抗体  ＨｕＭＡｂの代わりにＣ１７９ＭＡｂを用いた。また、ＨｕＭＡｂにて処理しておらず、未感染のＣＶ−１細胞をモック（Ｍｏｃｋ／−）として用いた。また、ＨｕＭＡｂにて処理しておらず、Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００９感染ＣＶ−１細胞（ウィルスのみ）、または、デング熱に対するコントロールＨｕＭＡｂ２００μｇ／ｍｌにて処理したＡ／Ｓｕｉｔａ／１／２００９感染ＣＶ−１細胞（Ｄ２３−１Ｇ７Ｃ２  （２００μｇ／ｍｌ））も用いた。
【図７】還元（β−ＭＥ＋）又は非還元状態（β−ＭＥ−）にあるＨＡタンパク質に対する、本発明の３種のＨｕＭＡｂを用いたウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。すなわち、Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００９を感染させたＭＤＣＫ細胞を、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）存在下又は非存在下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。そして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルを、１Ｈ１１、２Ｈ５若しくは５Ｇ２を用いた、又はコントロールとして５Ｅ４を用いた、ウェスタンブロッティングに供した結果を示す写真である。
【図８】Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ由来のＨＡタンパク質欠失体（ａ〜ｅ）の構造（図中Ａ）に対する、本発明３種のＨｕＭＡｂの反応性をウェスタンブロッティングにより分析した結果を示す写真（図中Ｂ）である。
【図９】低ｐＨ下にてトリプシン処理したＨ１Ｎ１ｐｄｍ  ＨＡ０タンパク質に対する、ウェスタンブロッティングの結果を示す図である。図中Ａは、低ｐＨにてＨＡ０タンパク質をトリプシン処理し、３種のＨｕＭＡｂ（１Ｈ１１、２Ｈ５及び５Ｇ２）によるウェスタンブロッティングに供した結果を示す、概略図と写真である。なお、陰性対照として、抗Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ由来のＨＡ０タンパク質の球状頭部を認識する抗体  ５Ｅ４を用いた。図中Ｂは、ＨＡ０タンパク質を５Ｅ４（上部）又は１Ｈ１１、２Ｈ５若しくは５Ｇ２（下部）にて先ず処理し、そして低ｐＨ下トリプシンにて処理し、５Ｅ４を用いたウェスタンブロッティングに供した結果を示す、概略図と写真である。
【図１０】３種のＨｕＭＡｂ（１Ｈ１１、２Ｈ５及び５Ｇ２）を各々固定化したカラムに結合させたＨＡタンパク質をトリプシンにて消化し、抗体と相互作用したペプチド断片を質量分析により分析し、それらの結果を、ＨＡ単量体の構造モデル上にマッピングした結果を示す図である。図中、高いスコアを示した２領域をボールで示す。なお、コントロールとして、ＨＡタンパク質の茎領域と相互作用することが知られているマウスモノクローナル抗体Ｃ１７９を用いた。
【図１１】抗インフルエンザウィルスＡ型の存在下、連続して１０代継代したＭＤＣＫ細胞において生じた、エスケープ突然変異体の有無を示す概略図である。すなわち、様々な濃度（０．００２５，０．０２５，０．２５及び２．５μｇ／ｍｌ）の１Ｈ１１、２Ｈ５又は５Ｇ２の存在下、ＭＤＣＫ細胞において、Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００９を連続して１０代継代したことを示す、概略図である。また、コントロールとして、５Ｅ４の存在下、Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００９をＭＤＣＫ細胞と共に１回インキュベートした。そして、Ｐ１〜Ｐ１０のプレートにおいて、細胞変性が確認されたウェルに色を付した。また、１番右端のＰ１０のプレート（５Ｅ４に関しては、Ｐ１のプレート）において、色を付したウェルはゲノムシークエンシング解析に供した。そのシークエンシングの結果、変異体が同定されたウェルには星印を付した（５Ｇ２のプレートにおいては１ウェル、５Ｅ４ｎｏプレートにおいては２ウェルから、変異体が同定されたため、各々星印が、図中付してある）。
【図１２】図１１に示した、抗インフルエンザウィルスＡ型の存在下、継代したＭＤＣＫ細胞において検出された、Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００９のＨＡタンパク質変異体のアミノ酸配列を示す図である。図中、「５Ｇ２＿１＿Ｅｓｃ．ｇｐｔ」は、５Ｇ２の存在下検出されたエスケープ変異体の結果を示し、「５Ｅ４＿１＿Ｅｓｃ．ｇｐｔ」及び「５Ｅ４＿２＿Ｅｓｃ．ｇｐｔ」は、５Ｅ４の存在下検出されたエスケープ変異体２種の結果を示す。
【図１３】Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ２００９年分離株とＨ１Ｎ１ｐｄｍ２０１１年分離株との、ＨＡタンパク質の４０２位迄のアミノ酸配列を比較した結果を示す図である。
【図１４】Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ２００９年分離株とＨ１Ｎ１ｐｄｍ２０１１年分離株との、ＨＡタンパク質の４０３位以降のアミノ酸配列を比較した結果を示す図である。
【図１５】本発明の３種のＨｕＭＡｂと、ＨＡタンパク質のアミノ酸置換体（ＨＡ２領域において、Ｑ４２Ｇ、Ｄ４６Ｔ、Ｔ４９Ｎ及びＮ５２Ｄを伴うアミノ酸置換体、ＨＡ２領域において、Ｄ１９Ｎ、Ｗ２１Ｆ及びＩ４５Ｖを伴うアミノ酸置換体）との反応性を、ウェスタンブロッティングにより分析した結果を示す、写真である。
【図１６】インフルエンザウィルスＡ型の各亜型間における、ＨＡタンパク質のＨＡ２領域中の４０〜５８位のアミノ酸における変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
＜インフルエンザウイルスＡ型のグループ１に対して広域な中和活性を有する抗体＞
後述の実施例において示す通り、本発明者らは、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ（Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００／２００９株）由来のヘマグルニチンタンパク質のＨＡ２領域中の４０〜５８位に存在するエピトープに結合する３種のヒトモノクローナル抗体（１Ｈ１１、２Ｈ５及び５Ｇ２）を取得した。さらに、これら抗体は、インフルエンザウイルスＡ型のグループ１のＨ１サブタイプ及びＨ５サブタイプに対する中和活性を有していることも見出した。一方、該グループ１に属しているが、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ（Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００／２００９株）由来のヘマグルニチンタンパク質のＨＡ２領域において、４５位のアミノ酸がフェニルアラニンに置換されており、かつ４７位のアミノ酸がグリシンに置換されているＨ２サブタイプに対しては、前記３種の抗体は結合性のみならず、中和活性を示さないことも見出した。
【００２５】
したがって、本発明は、インフルエンザウイルスＡ型のグループ１に対して広域な中和活性を有する、下記抗体を提供する。
【００２６】
インフルエンザウイルスＡ型のグループ１のＨ１サブタイプ及びＨ５サブタイプに対する中和活性を有する抗体であって、下記（ａ）及び（ｂ）の特徴を有する抗体
（ａ）Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００／２００９株由来のヘマグルニチンタンパク質のＨＡ２領域中の４０〜５８位に存在するエピトープに結合する
（ｂ）Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００／２００９株由来のヘマグルニチンタンパク質のＨＡ２領域中において、４５位のアミノ酸がフェニルアラニンに置換されており、かつ４７位のアミノ酸がグリシンに置換されているタンパク質に結合しない。
【００２７】
また、インフルエンザウイルスに対して広域な中和活性を有する既存の抗体が認識することのできない、ヘマグルニチン（ＨＡ）タンパク質のアミノ酸置換体として、ＨＡ２領域において、Ｑ４２Ｇ、Ｄ４６Ｔ、Ｔ４９Ｎ及びＮ５２Ｄを伴うアミノ酸置換体、ＨＡ２領域において、Ｄ１９Ｎ、Ｗ２１Ｆ及びＩ４５Ｖを伴うアミノ酸置換体、ＨＡ１領域において、Ｇ１８９Ｒ、Ｇ２２５Ｄ及びＴ３１８Ｋを伴うアミノ酸置換体等が知られている。これらＨＡタンパク質のアミノ酸置換体に対し、後述の実施例において示す通り、本発明の抗体は、いずれのＨＡタンパク質のアミノ酸置換体に対しても結合することができる。したがって、本発明の抗体のより好適な態様として、下記抗体が挙げられる。
【００２８】
下記（ｃ）〜（ｅ）のうちのいずれか一の特徴をさらに有する、前記本発明の抗体
（ｃ）Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００／２００９株由来のヘマグルニチンタンパク質において、ＨＡ２領域中の４２位のアミノ酸がグリシンに置換されており、４６位のアミノ酸がスレオニンに置換されており、４９位のアミノ酸がアスパラギンに置換されており、かつ５２位のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されているタンパク質に結合する
（ｄ）Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００／２００９株由来のヘマグルニチンタンパク質において、ＨＡ２領域中の１９位のアミノ酸がアスパラギンに置換されており、２１位のアミノ酸がフェニルアラニンに置換されており、かつ４５位のアミノ酸がバリンに置換されているタンパク質に結合する
（ｅ）Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００／２００９株由来のヘマグルニチンタンパク質において、ＨＡ１領域中の１８９位のアミノ酸がアルギニンに置換されており、２２５位のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されており、かつ３１８位のアミノ酸がリシンに置換されているタンパク質に結合する。
【００２９】
なお、（ｅ）に関しては、Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／８９（Ｒ）（Ｈ１−ＳＵ１／８９Ｒ）株由来のヘマグルニチンタンパク質に結合することが、さらに好ましい態様として挙げられる（Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／８９（Ｒ）株由来のヘマグルニチンタンパク質については、後述の実施例参照のこと）。
【００３０】
また、後述の実施例において示す通り、（ｅ）の特徴を有する抗体は、既存の広域性中和抗体であるＣ１７９では抑制することのできない、Ｈ１−ＳＵ１／８９Ｒ株に対しても結合することができ、ひいては中和活性を示すことができ得る。
【００３１】
さらに、本発明の抗体においては、（ｃ）〜（ｅ）の特徴を全てさらに有していることがより好ましい。
【００３２】
また、後述の実施例において示す通り、ＮＣＢＩインフルエンザデータベースの＞６０００配列を遺伝的に解析した結果、近年のＨ１Ｎ１ｐｄｍにおいて優位な集団である、ヘマグルニチンタンパク質のＨＡ２領域中の４７位のアミノ酸がリジンであるウイルス株に対しても、本発明の抗体は有効な中和活性を示す。したがって、本発明の抗体のより好適な態様として、下記抗体が挙げられる。
【００３３】
下記（ｆ）の特徴をさらに有する、上記本発明の抗体
（ｆ）Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００／２００９株由来のヘマグルニチンタンパク質において、ＨＡ２領域中の４７位のアミノ酸がリシンに置換されているタンパク質に結合する。
【００３４】
また、後述の実施例において示す通り、５Ｇ２の存在下で培養した１０代目のウェルのインフルエンザウイルスにおいては、ヘマグルニチンタンパク質において、ＨＡ１領域中の８６位のアミノ酸がシステインに置換されているエスケープ変異が同定されている。したがって、本発明の抗体、少なくとも後述の５Ｇ２は、かかる変異体と結合できないことが示唆されるため、下記態様もとり得る。
【００３５】
下記（ｇ）の特徴をさらに有する、上記本発明の抗体
（ｇ）Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００／２００９株由来のヘマグルニチンタンパク質において、ＨＡ１領域中の８６位のアミノ酸がシステインに置換されているタンパク質には結合しない。
【００３６】
本発明の抗体が中和活性を示す「インフルエンザウイルスＡ型のグループ１」とは、オルトミクソウイルス科のＡ型インフルエンザウイルス属に分類されるウイルスのうちの１グループ（グループ１）を意味する。また、本発明の抗体が対象とするインフルエンザウイルスには、季節性（ｓｅａ）インフルエンザのみならず、季節を問わず、また流行の規模が世界的かつ汎発的であるパンデミック型（ｐｄｍ）インフルエンザも含まれる。
【００３７】
また、グループ１には、後述のへマルチニンタンパク質の構造の違いに基づきさらに分けられるサブタイプとて、Ｈ１、Ｈ２，Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２，Ｈ１３及びＨ１６が属しているが、前述の通り、本発明の抗体が対象とするのは、少なくともＨ１及びＨ５である。また、後述の実施例において示す通り、本発明においては、上記結合性を示すことにより、Ｈ９に対しても中和活性を示す抗体も得られている。したがって、本発明の抗体のより好ましい態様としては、インフルエンザウイルスＡ型のグループ１のＨ９サブタイプに対する中和活性をさらに有する抗体が挙げられる。
【００３８】
また、これらサブタイプにおいては、該ウイルスが産生するノイラミニダーゼの種類に応じ、さらに亜型に分類される。かかる亜型としては、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ１Ｎ３、Ｈ１Ｎ４、Ｈ１Ｎ５、Ｈ１Ｎ６、Ｈ１Ｎ７、Ｈ１Ｎ８、Ｈ１Ｎ９、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ４、Ｈ５Ｎ５、Ｈ５Ｎ６、Ｈ５Ｎ７、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ９Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ９Ｎ３、Ｈ９Ｎ４、Ｈ９Ｎ５、Ｈ９Ｎ６、Ｈ９Ｎ７、Ｈ９Ｎ８、Ｈ９Ｎ９が挙げられるが、これらの中で、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２が、本発明の抗体の好適な対象となり得る。
【００３９】
また、これらサブタイプにおいては、分離された場所、分離された順番、分離された年に応じて、さらに株（分離株）に分類される。かかる分離株としては、Ｈ１、Ｈ５又はＨ９に属する限り、特に制限はないが、Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００９（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ−ＳＵ１／０９）、Ａ／Ｏｓａｋａ／１６８／２００９（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ−ＯＳ６８／０９）、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ−０７／０９）、Ａ／Ｓｕｉｔａ／１１７／２０１１（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ−ＳＵ１７／１１）、Ａ／Ｓｕｉｔａ／１０４／２０１１（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ−ＳＵ０４／１１）、Ａ／Ｓｕｉｔａ／１０５／２０１１（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ−ＳＵ０５／１１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１ｓｅａ−ＢＲ５９／０７）、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１ｓｅａ−ＰＲ８／３４）、Ａ／Ｄｕｃｋ／Ｅｇｙｐｔ／ＤＩＢｒ１２／２００７（Ｈ５Ｎ１−ＣＥ１２／０７）、Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｅｇｙｐｔ／ＰＩＭＤ１２−３／２００８（Ｈ５Ｎ１−ＣＥ１２／０８）、Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／１９６６（Ｈ９Ｎ２−ＴＷ１／６６）が、本発明の抗体の好適な対象となり得る。
【００４０】
本発明において「中和活性」とは、前記インフルエンザウイルスが宿主細胞に感染（侵入）及び／又は該細胞における増殖を抑制する活性を意味する。また「抑制」には完全な抑制（阻害）のみならず、部分的な抑制も含まれる。さらに「抑制」には、インフルエンザウイルスの増殖等の低減のみならず、予防、阻止、遅延も含まれる。また、抗体がインフルエンザウイルスに対する中和活性を有するか否かは公知の方法により判定することができる。かかる方法としては、例えば、後述の実施例において示すようなＶＮアッセイが挙げられる。また、当該アッセイにおいて、インフルエンザウイルスを５０％中和するために必要とされる抗体の濃度（例えば、インフルエンザウイルスの増殖を５０％阻害するために必要な抗体の最小濃度）、すなわちＶＮ５０は、通常１００μｇ／ｍｌ未満であれば、該抗体は中和活性を有していると判定することができるが、本発明において、好ましくは３０μｇ／ｍｌ以下であり、より好ましくは１５μｇ／ｍｌ以下であり、さらに好ましくは７μｇ／ｍｌ以下、さらにより好ましくは３μｇ／ｍｌ以下であり、特に好ましくは１μｇ／ｍｌ以下である。
【００４１】
また、本発明においては、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍの２００９年分離株に対するＶＮ５０が、好ましくは３μｇ／ｍｌ以下であり、より好ましくは２μｇ／ｍｌ以下であり、特に好ましくは１μｇ／ｍｌ以下である。また、本発明においては、Ｈ５Ｎ１に対するＶＮ５０が、好ましくは１５μｇ／ｍｌ以下であり、より好ましくは７μｇ／ｍｌ以下である。
【００４２】
本発明における「抗体」は、免疫グロブリンのすべてのクラス及びサブクラスを含む。「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体が含まれ、また抗体の機能的断片の形態も含む意である。「ポリクローナル抗体」は、異なるエピトープに対する異なる抗体を含む抗体調製物である。「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（抗体断片を含む）を意味し、抗原上の単一の決定基を認識するものである。本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。また、本発明の抗体は、自然環境の成分から分離され、及び／又は回収された（即ち、単離された）抗体である。
【００４３】
本発明の抗体が結合する「Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００／２００９株由来のＨＡタンパク質」とは、ヒトを宿主とするインフルエンザウイルスＡ型のグループ１に属するＨ１Ｎ１ｐｄｍであって、日本国の大阪府吹田市において２００９年に２００番目に分離された株に由来するヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質を意味する。ヘマグルチニンは、インフルエンザウイルスが宿主細胞に感染するために、該細胞表面のシアル酸に結合するタンパク質である。ＨＡを構成する同一の３つのモノマーは中心部にαヘリックスを持っており、この頭部領域にシアル酸結合部位がある。またＨＡのモノマーはまず、ＨＡ１領域及びＨＡ２領域を含む前駆体（ＨＡ０）として合成される。この前駆体は後にグリコシル化されて分裂され、ＨＡ１サブユニットとＨＡ２サブユニット、これら２つのサブユニットになる。
【００４４】
なお、本発明において、ヘマグルチニンタンパク質のＨＡ１領域又はＨＡ２領域におけるアミノ酸の番号は、特に断りのない限り、Ｎｏｂｕｓａｗａ  Ｅ，Ａｏｙａｍａ  Ｔ，Ｋａｔｏ  Ｈ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｙ，Ｔａｔｅｎｏ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｍｏｎｇ  １３  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８２：４７５−４８５に記載に基づき、付けられる番号である。すなわち、インフルエンザウイルスＨ３サブタイプ（Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８株）由来のヘマグルチニンタンパク質のＨＡ１領域又はＨＡ２領域を基準としたアミノ酸の番号である。
【００４５】
本発明にかかるＡ／Ｓｕｉｔａ／１／２００／２００９株由来のヘマグルチニンタンパク質は、典型的には、配列番号：３２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質(配列番号：３１に記載のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列からなるタンパク質）である。そのヘマグルチニンタンパク質（配列番号：３２に記載のアミノ酸配列）において、ＨＡ１領域は、１〜３２６位のアミノ酸配列からなる領域（配列番号：３３に記載のアミノ酸配列からなる領域）であり、ＨＡ２領域は、３２７〜５３１位のアミノ酸配列（配列番号：３４に記載のアミノ酸配列からなる領域）からなる領域である。
【００４６】
したがって、本発明にかかるＨＡ１領域中の８６位、１８９位、２２５位及び３１８位は、配列番号：３３に記載のアミノ酸配列においては、各々７７位、１８５位、２２１位及び３１５位に相当する。また、本発明にかかるＨＡ２領域中の１９位、２１位、４０位、４２位、４５位、４６位、４７位、４９位、５２位及び５８位は、配列番号：３４に記載のアミノ酸配列においては、各々１９位、２１位、４０位、４２位、４５位、４６位、４７位、４９位、５２位及び５８位に相当する。
【００４７】
なお、抗体が、前述のＨＡ２領域中の４０〜５８位に存在するエピトープに結合する抗体であるかどうか、また上記（ｂ）〜（ｆ）に記載のＨＡタンパク質のアミノ酸置換体に結合する又はしない抗体であるかどうかは、当業者であれば、後述の実施例に示すような、プロテアーゼ処理後の質量分析、還元条件下又は非還元条件下におけるウェスタンブロッティング、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、トリプシン切断に対する阻害アッセイを利用して評価することができる。また、これら後述の実施例に記載の方法の他、公知の免疫学的解析手法（フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降等）を利用しても評価することができる。また、上記アッセイに用いられる、Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００／２００９株由来のヘマグルニチンタンパク質は、後述の実施例において示す通り、当該株を入手することなく、当業者であれば、前記Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００／２００９株由来のＨＡタンパク質の公知のアミノ酸配列情報に基づき、当該タンパク質をコードするベクターを構築し、細胞に導入することで、適宜発現、調製することができる。さらに、（ｂ）〜（ｆ）に記載のＨＡタンパク質のアミノ酸置換体は、当業者であれば、後述の実施例において示す通り、公知のＡ／Ｓｕｉｔａ／１／２００／２００９株由来のＨＡタンパク質のアミノ酸配列情報に基づき、部位特異的変異導入法を利用して調製することができる。
【００４８】
また、本発明の抗体が結合するアミノ酸を含む部位、すなわち「エピトープ」は、前述のＨＡ２領域中の４０〜５８位に存在する抗原決定基（抗体中の抗原結合ドメインが結合する抗原上の部位）を意味する。したがって、本発明におけるエピトープは、アミノ酸の一次配列中において連続する複数のアミノ酸からなるポリペプチド（線状エピトープ）であってもよく、アミノ酸の一次配列中において隣接していないアミノ酸が、ペプチド又はタンパク質の折り畳み等の三次元構造によって近傍にくることにより形成されるポリペプチド（不連続エピトープ、構造的エピトープ）であってもよい。
【００４９】
また、後述の実施例において示す通り、本発明の抗体は、ヘマグルチニンタンパク質の茎領域を構成する、ＨＡ２領域の４０〜５８アミノ酸からなるαヘリックス構造を認識し得るものである。したがって、本発明の抗体は、前記エピトープからなる高次構造（ＨＡ２領域の４０〜５８アミノ酸からなるαヘリックス構造）依存的に結合し得る抗体であることが好ましく、非還元状態下にあるヘマグルチニンタンパク質に中の前記エピトープに結合し得る抗体であることがより好ましく、βメルカプトエタノール非存在下にあるヘマグルチニンタンパク質中の前記エピトープに結合し得る抗体であることがさらに好ましい。
【００５０】
なお、本明細書においては、例えば、Ａｌａ／Ａ、Ｌｅｕ／Ｌ、Ａｒｇ／Ｒ、Ｌｙｓ／Ｋ、Ａｓｎ／Ｎ、Ｍｅｔ／Ｍ、Ａｓｐ／Ｄ、Ｐｈｅ／Ｆ、Ｃｙｓ／Ｃ、Ｐｒｏ／Ｐ、Ｇｌｎ／Ｑ、Ｓｅｒ／Ｓ、Ｇｌｕ／Ｅ、Ｔｈｒ／Ｔ、Ｇｌｙ／Ｇ、Ｔｒｐ／Ｗ、Ｈｉｓ／Ｈ、Ｔｙｒ／Ｙ、Ｉｌｅ／Ｉ、Ｖａｌ／Ｖと表されるように、アミノ酸を１文字コードまたは３文字コード、またはその両方で表記する。なお、本発明で記載されているアミノ酸配列に含まれるアミノ酸は翻訳後に修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、パルミトイル化、プレニル化、メチル化、アセチル化、ヒドロキシル化、アミド化）を受ける場合もあるが、そのようにアミノ酸が翻訳後修飾された場合であっても当然のことながら本発明で記載されているアミノ酸配列に含まれる。
【００５１】
本発明の抗体の他の好ましい態様としては、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうちのいずれか一に記載の特徴を有する抗体が挙げられる。
（ｉ）  配列番号：３〜５に記載のアミノ酸配列（後述の１Ｈ１１の軽鎖可変領域におけるＣＤＲ１〜３）を保持する抗体又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：８〜１０に記載のアミノ酸配列（後述の１Ｈ１１の重鎖可変領域におけるＣＤＲ１〜３）又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｉｉ）  配列番号：１３〜１５に記載のアミノ酸配列（後述の５Ｇ２の軽鎖可変領域におけるＣＤＲ１〜３）又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１８〜２０に記載のアミノ酸配列（後述の５Ｇ２の重鎖可変領域におけるＣＤＲ１〜３）又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｉｉｉ）  配列番号：２３〜２５に記載のアミノ酸配列（後述の２Ｈ５の軽鎖可変領域におけるＣＤＲ１〜３）又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２８〜３０に記載のアミノ酸配列（後述の２Ｈ５の重鎖可変領域におけるＣＤＲ１〜３）又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する。
【００５２】
また、本発明の抗体のより好ましい態様としては、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうちのいずれか一に記載の特徴を有する抗体が挙げられる。
（ｉ）  配列番号：２に記載のアミノ酸配列（後述の１Ｈ１１の軽鎖可変領域）又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：７に記載のアミノ酸配列（後述の１Ｈ１１の重鎖可変領域）又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｉｉ）  配列番号：１２に記載のアミノ酸配列（後述の５Ｇ２の軽鎖可変領域）又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１７に記載のアミノ酸配列（後述の５Ｇ２の重鎖可変領域）又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列とを含む重鎖可変領域とを保持する
（ｉｉｉ）  配列番号：２２に記載のアミノ酸配列（後述の２Ｈ５の軽鎖可変領域）又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２７に記載のアミノ酸配列（後述の２Ｈ５の重鎖可変領域）又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列とを含む重鎖可変領域とを保持する。
【００５３】
また、上記特定のアミノ酸配列を保持する抗体においては、後述の実施例において示す通り、インフルエンザウイルスＡ型のグループ１のＨ９サブタイプに対する中和活性をさらに有するという観点から、（ｉ）に記載の特徴を有する抗体及び（ｉｉ）に記載の特徴を有する抗体がより好ましい。また、インフルエンザウイルスＡ型のグループ１に感染した細胞間の融合を低濃度にて阻害できるという観点から、（ｉ）に記載の特徴を有する抗体及び（ｉｉｉ）に記載の特徴を有する抗体がより好ましい。さらに、これらの観点に加え、インフルエンザウイルスＡ型のグループ１においてエスケープ変異の発生をより強く抑制するという観点から、（ｉ）に記載の特徴を有する抗体が特に好ましい。
【００５４】
本発明の抗体には、ヒト型化抗体（ヒト化抗体）、ヒト抗体、マウス抗体、キメラ抗体、及び、これら抗体の機能的断片が含まれる。本発明の抗体を医薬としてヒトに投与する場合は、副作用低減の観点から、キメラ抗体、ヒト型化抗体、又はヒト抗体が望ましく、さらに、血清中における長期安定性、高い特異性、低免疫原性という観点から、ヒト抗体が特に望ましい。
【００５５】
本発明において、「ヒト抗体」とは、すべての領域がヒト由来の抗体である。ヒト抗体の作製においては、後述の実施例において示すように、ヒト、例えインフルエンザウイルスＡ型のグループ１の感染症のヒト、例えば患者及び／又はワクチン接種を受けた人由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、効率的な細胞融合を可能とする融合パートナー細胞と融合させることによってハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマから抗ヒトインフルエンザウイルスモノクローナル抗体を得る方法を利用することができる（例えば、ＷＯ２００７／１１９８０８  参照）。また、ヒトＢ細胞より活性のある抗体の産生をスクリーニングする方法、ファージディスプレイ法、免疫することで、ヒト抗体のレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を利用すること等が可能である。ヒト抗体の作製手法は、公知である（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３：６５−９３（１９９５）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１−５９７（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６−１５６（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：７２２−７２７（２０００）、特開平１０−１４６１９４号公報、特開平１０−１５５４９２号公報、特許２９３８５６９号公報、特開平１１−２０６３８７号公報、特表平８−５０９６１２号公報、特表平１１−５０５１０７号公報  参照）。
【００５６】
本発明において「キメラ抗体」とは、ある種の抗体の可変領域とそれとは異種の抗体の定常領域とを連結した抗体である。キメラ抗体は、例えば、抗原をマウスに免疫し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（可変領域）を切り出して、ヒト骨髄由来の抗体定常部（定常領域）遺伝子と結合し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入して産生させることにより取得することができる（例えば、特開平８−２８０３８７号公報、米国特許第４８１６３９７号公報、米国特許第４８１６５６７号公報、米国特許第５８０７７１５号公報  参照）。
【００５７】
また、本発明において「ヒト型化抗体」とは、非ヒト由来の抗体の抗原結合部位（ＣＤＲ）の遺伝子配列をヒト抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）した抗体であり、その作製方法は、公知である（例えば、ＥＰ２３９４００、ＥＰ１２５０２３、ＷＯ９０／０７８６１、ＷＯ９６／０２５７６参照）。
【００５８】
本発明において抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、抗原に結合するものを意味する。本発明にかかる抗体の「機能的断片」の態様としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、及びこれらの重合体が挙げられる。
【００５９】
ここで「Ｆａｂ」とは、１つの軽鎖及び重鎖の一部からなる免疫グロブリンの一価の抗原結合断片を意味する。抗体のパパイン消化によって、また、組換え方法によって得ることができる。「Ｆａｂ’」は、抗体のヒンジ領域の１つ又はそれより多いシステインを含めて、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端でのわずかの残基の付加によって、Ｆａｂとは異なる。「Ｆ（ａｂ’）２」とは、両方の軽鎖と両方の重鎖の部分からなる免疫グロブリンの二価の抗原結合断片を意味する。
【００６０】
「可変領域断片（Ｆｖ）」は、完全な抗原認識及び結合部位を有する最少の抗体断片である。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が非共有結合により強く連結されたダイマーである。「一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」は、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、これらの領域は、単一のポリペプチド鎖に存在する。「ｓｃ（Ｆｖ）２」は、２つの重鎖可変領域及び２つの軽鎖可変領域をリンカー等で結合して一本鎖にしたものである。「ダイアボディー」とは、二つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片であり、この断片は、同一ポリペプチド鎖の中に軽鎖可変領域に結合した重鎖可変領域を含み、各領域は別の鎖の相補的領域とペアを形成している。「多特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。例えば、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現により調製することができる。
【００６１】
本発明の抗体には、望ましい活性（抗原への結合活性、前記中和活性、他の生物学的特性）を減少させることなく、そのアミノ酸配列が修飾された抗体が含まれる。本発明の抗体のアミノ酸配列変異体は、本発明の抗体鎖をコードするＤＮＡへの変異導入によって、またはペプチド合成によって作製することができる。そのような修飾には、例えば、本発明の抗体のアミノ酸配列内の残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を含む。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖または軽鎖の定常領域であってもよく、また、可変領域（フレームワーク領域及びＣＤＲ）であってもよい。ＣＤＲ以外のアミノ酸の改変は、抗原との結合親和性への影響が相対的に少ないと考えられるが、現在では、ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をスクリーニングする手法が公知である（ＰＮＡＳ，１０２：８４６６−８４７１（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：４８５−４９３（２００８）、国際公開第２００２／０５１８７０号、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：２４８８０−２４８８７（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：３４５−３５１（２００８））。
【００６２】
改変されるアミノ酸数は、好ましくは、１０アミノ酸以内、より好ましくは６アミノ酸以内、さらに好ましくは５アミノ酸以内、最も好ましくは３アミノ酸以内（例えば、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。
【００６３】
実際、後述の実施例において得られた１Ｈ１１、２Ｈ５及び５Ｇ２は同様の抗原結合性及び中和活性を示すが、それらのＣＤＲの配列を比較するに、軽鎖可変領域のＣＤＲ１においては、Ｎ末側より１位及び２位のアミノ酸は共にセリンであり、Ｎ末側より５位のアミノ酸はグリシンであり、並びにＣ末側より２位のアミノ酸はアスパラギンであるという共通の配列を有するが、残りの４〜５アミノ酸は異なっている。また、軽鎖可変領域のＣＤＲ２においては、Ｎ末側より１位のアミノ酸はアスパラギンであるという点においては共通しているが、残りの２アミノ酸は異なっている。また、軽鎖可変領域のＣＤＲ３においては、Ｎ末側より３位及び４位のアミノ酸は共にセリンであるという点においては共通しているが、残りの５〜６アミノ酸は異なっている。また、重鎖可変領域のＣＤＲ１においては、Ｎ末側より３位のアミノ酸のみ異なっている。また、重鎖可変領域のＣＤＲ２においては、Ｃ末側より１位のアミノ酸のみ異なっている。また、重鎖可変領域のＣＤＲ３においては、Ｃ末側より１位のアミノ酸のみ異なっている。以上の通り、ＣＤＲにおいてアミノ酸が相違していても、同様の抗原結合性及び中和活性を奏することはできるので、本発明の抗体には、ＣＤＲ等のアミノ酸配列が修飾された抗体も含まれる。
【００６４】
アミノ酸の改変は、好ましくは、保存的な置換である。本発明において「保存的な置換」とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン・アルギニン・ヒスチジン）、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・トレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）で分類することができる。
【００６５】
また「同等の活性を有する」とは、抗原への結合活性、前記中和活性が対象抗体（代表的には、後述の実施例において示す、１Ｈ１１、２Ｈ５又は５Ｇ２）と同等（例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上）であることを意味する。抗原への結合活性は、上述の通り、免疫学的解析手法を利用することにより評価することができる。
【００６６】
また、本発明の抗体の改変は、例えば、グリコシル化部位の数又は位置を変化させる等の抗体の翻訳後プロセスの改変であってもよい。これにより、例えば、抗体のＡＤＣＣ活性を向上させることができる。抗体のグリコシル化とは、典型的には、Ｎ−結合又はＯ−結合である。抗体のグリコシル化は、抗体を発現するために用いる細胞に大きく依存する。グリコシル化パターンの改変は、糖生産に関わる特定の酵素の導入又は欠失等の公知の方法で行うことができる（特開２００８−１１３６６３号公報、米国特許第５０４７３３５号、米国特許第５５１０２６１号、米国特許第５２７８２９９号、国際公開第９９／５４３４２号）。さらに、本発明においては、抗体の安定性を増加させる等の目的で脱アミド化されるアミノ酸若しくは脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより脱アミド化を抑制してもよい。また、グルタミン酸を他のアミノ酸へ置換して、抗体の安定性を増加させることもできる。本発明は、こうして安定化された抗体をも提供するものである。
【００６７】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であれば、抗原（Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００／２００９株由来のＨＡタンパク質、その部分ペプチド、又はこれらを発現する細胞等）で動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段（例えば、塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィー等）によって、精製して取得することができる。
【００６８】
また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法や組換えＤＮＡ法によって作製することができる。
【００６９】
ハイブリドーマ法としては、代表的には、コーラー及びミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞は、前記抗原で免疫された動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ、ニワトリ、ラクダ）の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球などである。免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞又はリンパ球等に対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することが可能である。ミエローマ細胞としては公知の種々の細胞株を使用することが可能である。抗体産生細胞及びミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、好ましくは、同一の動物種起源のものである。ハイブリドーマは、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００／２００９株由来のヘマグルニチンタンパク質のＨＡ２領域中の４０〜５８位に存在するエピトープに結合する等に結合する抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、また、ハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得することができる。
【００７０】
組換えＤＮＡ法は、本発明の抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを細胞（例えば哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞等）に導入し、本発明の抗体を組換え抗体として産生させる手法である（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７  ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００  ＯＸＦＯＲＤ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＰＲＥＳＳ、Ｖａｎｄａｍｍｅ  Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：７６７−７７５（１９９０））。本発明の抗体をコードするＤＮＡの発現においては、重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで細胞を形質転換してもよく、重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで細胞を形質転換してもよい（国際公開第９４／１１５２３号公報  参照）。
【００７１】
本発明の抗体は、上記形質転換した細胞又は上記ハイブリドーマを培養し、これら細胞内又は培養液から回収（分離・精製）し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体の分離・精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。
【００７２】
トランスジェニック動物作製技術を用いて、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物（ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等）を作製すれば、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。
【００７３】
したがって、本発明は、本発明の抗体をコードするＤＮＡ、本発明の抗体を産生する又は本発明の抗体をコードするＤＮＡを含む細胞をも提供することができる。また、当該細胞を培養し、該細胞内又はその培養液から、産生された本発明の抗体を回収する工程を含む、抗体の製造方法を提供することもできる。
【００７４】
また、本発明の抗体においては、能的作用物質と複合体を形成して、イムノコンジュゲート（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成することができる。機能的作用物質は、化学療法剤、毒素（例えば細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素又はそのフラグメント）、若しくは放射性同位体（すなわちラジオコンジュゲート（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ））等の細胞毒性剤、抗生物質、核酸分解酵素、又はそれらの任意の組合せであり得る。化学療法剤、例えばメトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン若しくは他の挿入剤、核酸分解酵素等の酵素及び／又はそのフラグメント、抗生物質、並びに毒素、例えばそのフラグメント及び／又は変異体を含む、小分子毒素又は細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素、並びに下記に開示される様々な抗腫瘍剤又は抗がん剤をイムノコンジュゲートの生成に使用することができる。使用することができる酵素的に活性な毒素及びそのフラグメントとしては例えば、ジフテリア毒素Ａ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、エクソトキシンＡ鎖（シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来のもの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、及びトリコセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｎｅｓ）が挙げられる。当該技術分野で知られる又はそうでなければ入手可能な任意の適切な放射性ヌクレオチド又は放射性作用物質を、ラジオコンジュゲートを抱合する（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）抗体を産生するのに使用することができる。
【００７５】
抗体と細胞毒性剤との複合体は、多様な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）；イミノチオラン（ＩＴ）；イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣＬ等）；活性エステル（スベリン酸ジサクシンイミジル等）；アルデヒド（グルタルアルデヒド等）；ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）；ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等）；ジイソシアネート（トリエン２，６−ジイソシアネート等）；ビス活性（ｂｉｓ−ａｃｔｉｖｅ）フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）；マレイミドカプロイル（ＭＣ）；バリン−シトルリン、プロテアーゼ開裂リンカーにおけるジペプチド部位（ＶＣ）；２−アミノ−５−ウレイドペンタン酸ＰＡＢ＝ｐ−アミノベンジルカルバモイル（リンカーの「自壊（ｓｅｌｆ  ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）」部分）（シトルレン（Ｃｉｔｒｕｌｅｎｅ））；Ｎ−メチル−バリンシトルリン（ここではリンカーペプチド結合が、カテプシンＢによる開裂を防ぐように修飾されている）（Ｍｅ）；抗体のシステインに結合するマレイミドカプロイル−ポリエチレングリコール；Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）；及びＮ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１  カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を用いて作製することができる。例えば、免疫毒素であるリシンを、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３８：  １０９８  （１９８７）に記載のように調製することができる。１４Ｃ（Ｃａｒｂｏｎ−１４）で標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドと抗体との複合体形成に関する例示的なキレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。抗体は腫瘍の事前標的化に用いられる「受容体」（ストレプトアビジン等）と複合体を形成することができ、抗体−受容体複合体を被験体に投与した後、清澄剤を用いて、血液循環から結合していない複合体を除去して、それから細胞毒性剤（例えば放射性ヌクレオチド）と複合体形成する「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。
【００７６】
本発明の抗体は、当該技術分野で既知の技法によって検出可能なマーカーと直接又は間接的に共役することができる。検出可能なマーカーは、例えば分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的な手段によって検出可能な作用物質である。有用な検出可能なマーカーとしては、蛍光色素、化学発光化合物、放射性同位体、高電子密度試薬、酵素、着色粒子、ビオチン又はジオキシゲニンが挙げられるが、これらに限定されない。検出可能なマーカーは、往々にして放射能、蛍光、色又は酵素活性等の測定可能なシグナルを発生する。検出可能な作用物質と複合体形成する抗体を診断目的又は治療目的に使用することができる。検出可能な作用物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射物質、各種陽電子放射断層撮影に用いられる陽電子放射金属、及び非放射常磁性金属イオンが挙げられる。検出可能な物質は、抗体と直接、又は例えば当該技術分野で既知のリンカー等の介在物（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）を介して、当該技術分野で既知の技法を用いて間接的に共役するか又は複合体形成することができる。例えば診断用途の金属イオンと抗体との複合体形成を記載している米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。好適な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族の複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド及びフィコエリトリンが挙げられ、発光物質の例としてはルミノールが挙げられ、生物発光物質の例としてはルシフェリン及びエクオリンが挙げられる。
【００７７】
抗体は二重特異性とすることができる。１つのタンパク質と特異的に結合するとともに、病状及び／又は治療に関連する他の抗原と特異的に結合する二重特異性抗体を、文献に記載されている標準的な手法を用いて産生、単離及び試験する（例えばＰｌｕｃｋｔｈｕｎ＆Ｐａｃｋ，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：８３−１０５（１９９７）、Ｃａｒｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ，４：４６３−４７０  （１９９５）、Ｒｅｎｎｅｒ＆Ｐｆｒｅｕｎｄｓｃｈｕｈ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９９５，Ｎｏ．１４５，ｐｐ．１７９−２０９、Ｐｆｒｅｕｎｄｓｃｈｕｈの米国特許第５，６４３，７５９号、Ｓｅｇａｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ，４：３７７−３８２  （１９９５）、Ｓｅｇａｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １８５：３９０−４０２（１９９２）、及びＢｏｌｈｕｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３４：１−８（１９９１）を参照されたい）。
【００７８】
また、本発明の抗体を免疫リポソームとして配合することができる。抗体を含有するリポソームを、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）、Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０（１９８０）、並びに米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号に記載されるような当該技術分野で既知の方法によって調製する。循環時間が向上したリポソームは米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームはホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含有する脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームを既定の孔径のフィルターへと押し出して、所望の直径のリポソームを得ることができる。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントは、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：２８６−２８８  （１９８２）に記載のようにジスルフィド交換反応によってリポソームと複合体形成することができる。化学療法剤（ドキソルビシン等）が任意にリポソーム内に含まれる。Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８１（１９）：１４８４（１９８９）を参照されたい。
【００７９】
＜インフルエンザウイルスＡ型のグループ１の感染症を予防又は治療する方法＞
本発明は、ヒト被験体においてインフルエンザウイルスＡ型のグループ１の感染症を予防又は治療する方法であって、ヒト被験体に治療的に有効な量の本発明の抗体を投与することを含む、方法を提供する。該方法は患者をインフルエンザウイルスＡ型のグループ１の感染症と診断することを更に含み得る。本発明の抗体を、患者をインフルエンザ感染症と診断する前に、診断中に、及び／又は診断した後に投与することができる。
【００８０】
上記方法は、インフルエンザウイルスＡ型のグループ１の感染症の少なくとも１つの症状の軽減をモニタリングすることを更に含み得る。例えば少なくとも１つの症状は、発熱、頭痛、疲労、悪寒、不快感、筋肉痛、関節痛、鼻閉、咽頭痛、咳、呼吸窮迫、胃痛、又はそれらの任意の組合せを含み得る。本発明の抗体は、インフルエンザＡ型、及び／又はＢ型インフルエンザ及び／又はＣ型インフルエンザ等の他のインフルエンザに関する１つ又は複数の更なる治療薬とともに投与される。その組合せはインフルエンザウイルスＡ型のグループ１を阻害又は治療するのに相乗的に作用することができる。１つ又は複数の更なる治療薬には、例えばノイラミニダーゼ阻害剤、血球凝集素阻害剤、抗炎症剤、又はそれらの任意の組合せが含まれ得る。ノイラミニダーゼ阻害剤には、例えばザナミビル、オセルタミビル、ペラミビル、ラニナミビル、それらの任意の薬学的に許容可能な塩、又はそれらの任意の組合せが含まれ得る。
【００８１】
本発明によれば、２つ以上のインフルエンザ拮抗薬を投与することができる。インフルエンザ拮抗薬の少なくとも１つがインフルエンザウイルスＡ型拮抗薬を含み得る。少なくとも１つのインフルエンザウイルスＢ型拮抗薬を１つ若しくは複数のインフルエンザウイルスＡ型拮抗薬及び／又は１つ若しくは複数のインフルエンザウイルスＣ型拮抗薬と組み合わせることができる。少なくとも１つのインフルエンザ拮抗薬を、インフルエンザウイルス感染症に関する１つ又は複数の更なる治療薬と組み合わせて投与することができる。１つ又は複数のインフルエンザ拮抗薬を含む２つ以上の治療薬の投与は同時投与、連続投与、又は併用投与であってもよい。したがって２つ以上の治療薬を投与する場合、同時に又は同じ方法で又は同じ用量で投与する必要はない。同時投与する場合、２つ以上の治療薬を同じ組成で又は異なる組成で投与してもよい。２つ以上の治療薬を、同じ投与経路又は異なる投与経路を用いて投与してもよい。別々に投与する場合、治療薬を互いの前又は後に投与してもよい。２つ以上の治療薬の投与の順序は変更することができる。１つ又は複数の治療薬のそれぞれの用量は経時的に変えることができる。１つ又は複数の治療薬の種類を経時的に変えることができる。複数回で（ａｔ  ｓｅｐａｒａｔｅ  ｔｉｍｅｓ）投与する場合、２回以上の投与の間隔はどのような期間であってもよい。複数回投与する場合、期間の長さを変えることができる。２つ以上の治療薬の投与の間隔は、０秒、１秒、５秒、１０秒、３０秒、１分、５分、１０分、１５分、２０分、３０分、４５分、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、４時間、５時間、７．５時間、１０時間、１２時間、１５時間、１８時間、２１時間、２４時間、１．５日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、６週間、８週間、３ヶ月、６ヶ月、１年又はそれより長くすることができる。
【００８２】
２つ以上のインフルエンザウイルス拮抗薬は、インフルエンザ感染症又はその症状、例えば発熱を治療又は軽減するのに相乗的に作用することができる。インフルエンザウイルス拮抗薬は、１つ若しくは複数の抗インフルエンザウイルス抗体単独であるか、又は１つ若しくは複数の他のインフルエンザウイルス拮抗薬、例えば小型医薬品、若しくは他の抗インフルエンザウイルス治療薬と組み合わせたものとすることができる。２つ以上の抗インフルエンザウイルス抗体又は少なくとも１つの抗インフルエンザウイルス抗体及び１つ若しくは複数の更なる治療薬は、インフルエンザウイルスＡ型のグループ１の感染症を治療又は軽減するのに相乗的に作用することができる。１つ又は複数の抗インフルエンザウイルス抗体を含む２つ以上の治療薬を相乗効果のある量で投与することができる。したがって、２つ以上の治療薬の投与は同時に、連続して、又は任意の組合せで投与されるかにかかわらず、インフルエンザ感染症の１つ又は複数の症状の軽減に対して相乗効果を有し得る。一次治療薬が二次治療薬を単独で用いた場合よりも二次治療薬の有効性を大きく増大させることができるか、又は二次治療薬が一次治療薬の有効性を増大させることができるか、又はその両方であり得る。２つ以上の治療薬の投与効果は、インフルエンザ感染症の１つ又は複数の症状の軽減に対する効果がそれぞれを単独で投与した場合の相加効果よりも大きくなるようなものであり得る。相乗効果のある量で与えた場合、その量の１つ又は複数の治療薬単独では、インフルエンザ感染症の１つ又は複数の症状に対して実質的な効果がなくとも、１つの治療薬がインフルエンザ感染症の１つ又は複数の症状の軽減に対する１つ又は複数の他の治療薬の有効性を高めることができる。相乗効果の測定及び算出は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ｖｏｌ．  ８５：  Ｎｏｖｅｌ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ＤｒｕｇＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ｐｐ．  ２９７−３２１  （２００３）におけるＴｅｉｃｈｅｒ，  ”Ａｓｓａｙｓｆｏｒ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｓｙｎｅｒｇｙ，”に記載のように、及び／又はＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェアを用いて併用指数（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）（ＣＩ）を算出することによって行うことができる。
【００８３】
＜インフルエンザウイルスＡ型のグループ１の感染症を予防又は治療する薬剤の製造への本発明の抗体の使用＞
本発明は、ヒト被験体におけるインフルエンザウイルスＡ型のグループ１の感染症を予防又は治療する薬剤の製造への本発明の抗体の使用を提供する。本発明はヒト被験体においてインフルエンザウイルスＡ型のグループ１を検出する方法も提供する。該方法はヒト被験体由来のサンプルを本発明の抗体と接触させることを含み得る。該方法は、抗体がインフルエンザウイルスＡ型のグループ１のＨＡ２タンパク質に結合するか否かに基づき、ヒト被験体におけるインフルエンザウイルスＡ型のグループ１の有無を検出することを更に含み得る。
【００８４】
＜本発明の抗体を有効成分とする医薬組成物＞
本発明は、本発明の抗体を有効成分とする医薬組成物（本発明の抗体と、薬理学的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物）を提供する。本発明は、本発明の抗体を備える、インフルエンザウイルスＡ型のグループ１の予防、治療及び検出の少なくとも１つのためのキットを更に提供する。該キットは医薬組成物及び／又は１つ若しくは複数の付加的なインフルエンザウイルス拮抗薬若しくは他の拮抗薬を備え得る。
【００８５】
正確な製剤設計、投与経路及び投与量は、患者の状態を鑑みて個々の医師が選択することができる（例えばＦｉｎｇｌ  ｅｔ．  ａｌ．，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１９７５，Ｃｈ．１  ｐ．Ｉ．を参照されたい）。担当医は毒性又は臓器機能不全に起因して、投与の終了、中断又は調整の時期を決定することができる。反対に担当医は、臨床応答が毒性の起こらない不十分なものであった場合に、治療をより高いレベルに調整することもできる。対象の障害の管理における投与用量（ｍａｇｎｉｔｕｄｅ  ｏｆ  ａｎ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｅｄ  ｄｏｓｅ）は治療対象の障害の重症度及び投与経路によって変わる。障害の重症度は、例えば標準的な予後評価法によって一部評価することができる。用量及び投与頻度は、個々の患者の年齢、体重及び応答に従って変えることができる。上述されるものと同等のプログラムを獣医学において使用することができる。
【００８６】
本発明の実施に対して開示された本明細書の化合物を全身投与に適した剤形（ｄｏｓａｇｅｓ）で配合するのに薬学的に許容可能な担体を使用することは本発明の範囲内である。適切な担体の選択及び好適な製造の実施によって、本発明に関連する組成物、特に溶液として配合されるものを静脈注射等により非経口投与することができる。該化合物は、当該技術分野で既知の薬学的に許容可能な担体を用いて、経口投与に適した剤形で容易に配合することができる。かかる担体によって、本発明に関連する化合物を、治療対象の患者による経口摂取のために錠剤、丸薬、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、錠剤、糖衣錠、溶液剤、懸濁剤等として配合することが可能となる。
【００８７】
治療剤は、時間及び体内の場所に応じた、投与した体内への放出の制御が可能となるようにデポ形態で調製することができる（例えば米国特許第４，４５０，１５０号を参照されたい）。デポ形態の治療剤は、例えば治療剤と、ポリマー等の多孔質又は非多孔質の材料とを含有する埋め込み型組成物とすることができ、ここでは治療剤が該材料によってカプセル封入されているか、又は該材料にわたって及び／又は非多孔質材料の分解によって分散されている。次いでデポ剤を体内の所望の場所に埋め込み、治療剤を所定の速度でインプラントから放出させる。
【００８８】
本発明で使用される治療剤は、担体と治療化合物とを含有する医薬組成物等の組成物として形成することができる。治療剤を含有する医薬組成物には、２つ以上の治療剤が含まれていてもよい。代替的に、医薬組成物は治療剤を他の薬学的に活性な作用物質又は薬物とともに含有していてもよい。
【００８９】
担体は任意の好適な担体であり得る。例えば、担体は薬学的に許容可能な担体であり得る。医薬組成物に関して、担体は溶解性及び活性化合物（複数の場合もあり）に対する反応性の喪失等の物理化学的性質（ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ）、並びに投与経路を考慮して慣例的に使用されるもののいずれであってもよい。下記の医薬組成物に加えて又はその代わりに、本発明の方法の治療化合物をシクロデキストリン包接錯体等の包接錯体又はリポソームとして配合することができる。
【００９０】
本明細書に記載の薬学的に許容可能な担体、例えばビヒクル、アジュバント、賦形剤及び希釈剤は当業者に既知であり、一般に容易に入手可能である。薬学的に許容可能な担体は、活性剤（複数の場合もあり）に対して化学的に不活性であり、使用条件下で有害な副作用又は毒性を有しないものであり得る。担体の選択は、特定の治療剤、及び治療化合物を投与するのに使用される特定の方法によって一部行うことができる。本発明の医薬組成物の多様な好適な配合物が存在する。経口投与、エアロゾル投与、非経口投与、皮下投与、経皮投与、経粘膜投与、腸内投与、髄内注射、直接心室内投与、静脈内投与、鼻腔内投与、眼内投与、筋肉内投与、動脈内投与、髄腔内投与、腹腔内投与、直腸投与及び膣内投与用の下記配合物は例示的なものであり、これらに限定されるものでは決してない。２つ以上の経路を、治療剤を投与するのに使用することができ、場合によっては、特定の経路によって、別の経路よりも迅速かつ効果的な応答がもたらされてもよい。治療対象の特定の障害に応じて、かかる作用物質を配合して、全身又は局所投与することができる。配合法及び投与法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．（１９９０）に見ることができる。
【００９１】
経口投与に適した配合物は、（ａ）液体溶液、例えば水、生理食塩水又はオレンジジュース等の希釈剤に溶解させた有効量の阻害剤、（ｂ）それぞれが固体又は顆粒として所定量の活性成分を含有する、カプセル剤、サシェ剤、錠剤、ロゼンジ剤及びトローチ剤、（ｃ）粉末剤、（ｄ）適切な液体の懸濁液、並びに（ｅ）好適なエマルションを含み得る。液体配合物は、薬学的に許容可能な界面活性剤が添加された又は添加されていない、水並びにアルコール、例えばエタノール、ベンジルアルコール及びポリエチレンアルコール等の希釈剤を含み得る。カプセル形態は、例えば界面活性剤、滑沢剤、並びにラクトース、スクロース、リン酸カルシウム及びコーンスターチ等の不活性フィラーを含有する、通常の硬殻又は軟殻ゼラチン型のものであり得る。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、グアーガム、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、及び他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、崩壊剤、湿潤剤、防腐剤、香味剤、並びに他の薬理学的に相溶性の賦形剤の内の１つ又は複数を含み得る。ロゼンジ形態は、風味剤、通常スクロース及びアカシア又はトラガカント中に阻害剤と、不活性基剤、例えばゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアカシア、エマルション、ゲル等に阻害剤を含有する芳香錠とを含むことができ、さらに加えて当該技術分野で知られるような賦形剤を含むことができる。
【００９２】
口腔に使用することができる医薬製剤としては、ゼラチンでできた押し込み型カプセル、及びゼラチンとグリセロール又はソルビトール等の可塑剤とでできた密封型軟カプセルが挙げられる。押し込み型カプセルは、ラクトース等のフィラー、デンプン等の結合剤、及び／又はタルク又はステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、並びに任意に安定剤と混合して活性成分を含有し得る。軟カプセルでは、活性化合物は脂肪油、流動パラフィン又は液体ポリエチレングリコール等の好適な液体中に溶解又は懸濁し得る。それに加えて、安定剤を添加してもよい。
【００９３】
治療剤は、単独で又は他の好適な構成成分と組み合わせて、吸入投与用のエアロゾル配合物にすることができる。これらのエアロゾル配合物を、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の許容可能な高圧ガスに組み入れることができる。これらのエアロゾル配合物を、ネブライザ又はアトマイザ内のように非加圧製剤用の医薬品として配合することもできる。かかる噴霧配合物を粘膜へと噴霧するのに使用することもできる。局所配合物は当業者にとって既知である。かかる配合物は、本発明では皮膚への塗布に特に適している。
【００９４】
注射用配合物は本発明に準拠するものである。注射用組成物に効果的な医薬担体のパラメータは、当業者にとって既知である（例えばＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈａｌｍｅｒｓ，ｅｄｓ．，ｐａｇｅｓ  ２３８２５０（１９８２）、及びＡＳＨＰ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｄｒｕｇｓ，  Ｔｏｉｓｓｅｌ，４ｔｈ  ｅｄ．，ｐａｇｅｓ  ６２２  ６３０（１９８６）を参照されたい）。注射では、本発明の作用物質を、水溶液中で、好ましくはハンクス液、リンガー液、又は生理食塩緩衝液等の生理学的に相溶性の緩衝液中で配合することができる。かかる経粘膜投与では、障壁に浸透するのに適した浸透剤を配合物に使用する。かかる浸透剤は当該技術分野において一般的に知られている。
【００９５】
非経口投与に適した配合物には、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤及び溶質を含有し得る、配合物を対象となるレシピエントの血液に対して等張にする水性及び非水性の等張滅菌注射溶液と、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤及び防腐剤を含み得る、水性及び非水性の滅菌懸濁液とが含まれ得る。治療剤を、薬学的に許容可能な界面活性剤、例えば石鹸若しくは洗浄剤、懸濁化剤、例えばペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース若しくはカルボキシメチルセルロース、又は乳化剤、及び他の薬学的アジュバントを添加して又は添加せずに、医薬担体中の生理学的に許容可能な希釈剤、例えば水、生理食塩水、水性デキストロース及び関連する糖溶液、アルコール、例えばエタノール若しくはヘキサデシルアルコール、グリコール、例えばプロピレングリコール若しくはポリエチレングリコール、ポリ（エチレングリコール）４００、グリセロール、ジメチルスルホキシド、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール等のケタール、エーテル、油、脂肪酸、脂肪酸エステル若しくはグリセリド、又はアセチル化脂肪酸グリセリドを含む、滅菌液又は液体混合物中で投与することができる。
【００９６】
非経口配合物に使用することができる油としては、石油、動物油、植物油又は合成油が挙げられる。油の具体例としては、落花生油、大豆油、ゴマ油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ワセリン（ｐｅｔｒｏｌａｔｕｍ）及び鉱油が挙げられる。非経口配合物での使用に適した脂肪酸としては、オレイン酸、ステアリン酸及びイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルが、好適な脂肪酸エステルの例である。
【００９７】
非経口配合物での使用に適した石鹸としては、脂肪酸のアルカリ金属塩、アンモニウム塩及びトリエタノールアミン塩が挙げられ、好適な洗浄剤としては、（ａ）例えばジメチルジアルキルアンモニウムハライド及びアルキルピリジニウムハライド等のカチオン性洗浄剤と、（ｂ）例えばアルキル、アリール及びオレフィンのスルホン酸塩、アルキル、オレフィン、エーテル及びモノグリセリドの硫酸塩、並びにスルホコハク酸塩等のアニオン性洗浄剤と、（ｃ）例えば脂肪族アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド及びポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマー等の非イオン性洗浄剤と、（ｄ）例えばアルキル−β−アミノプロピオネート及び２−アルキル−イミダゾリン第四級アンモニウム塩等の両親媒性洗浄剤と、（ｅ）それらの混合物とが挙げられる。
【００９８】
非経口配合物は、溶液中に約０．５重量％〜約２５重量％の薬物を含有し得る。防腐剤及び緩衝液を使用することができる。注射部位の炎症を最小限に抑える又は取り除くために、かかる組成物に、親水性親油性バランス（ＨＬＢ）が約１２〜約１７の１つ又は複数の非イオン性界面活性剤が含有されていてもよい。かかる配合物中の界面活性剤の量は通常、約５重量％〜約１５重量％の範囲である。好適な界面活性剤としては、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、例えばソルビタンオレイン酸モノエステルと、プロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合により形成される、エチレンオキシドと疎水性塩基との高分子量付加物とが挙げられる。非経口配合物は、アンプル及びバイアル等の単回用量又は複数回用量の密封容器内に与えることができ、使用の直前に注射するのに滅菌液体賦形剤、例えば水を添加することしか要求されないフリーズドライ（凍結乾燥）条件下で保存することができる。即席注射溶液及び懸濁液を、先に記載された種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製することができる。
【００９９】
治療剤を乳化基剤又は水溶性基剤等の多様な基剤と混合することによって坐剤にすることができる。膣内投与に適した配合物を、活性成分の他に当該技術分野において適切であることが知られているような担体を含有する、ペッサリー、タンポン、クリーム、ジェル、ペースト、泡沫又は噴霧配合物として与えることができる。
【０１００】
細胞内投与用の作用物質を、当業者に既知の技法を用いて投与することができる。例えば、かかる作用物質をリポソーム内にカプセル封入することができる。リポソームは水性内部を備える球状脂質二重層である。リポソーム形成時に水溶液中に存在する分子が水性内部に組み込まれる。リポソーム内容物は外部の微小環境から保護されるとともに、リポソームが細胞膜と融合することにより、細胞質へと効率的に送達される。さらにその疎水性に起因して、有機小分子を細胞内に直接投与することができる。
【０１０１】
また、本発明の抗体をインフルエンザウイルスＡ型のグループ１の検出に用いる場合、本発明の抗体は、標識したものであってもよい。標識としては、例えば、上述のような、検出可能なマーカーを用いることが可能である。本発明の抗体を検査薬として調剤するには、合目的な任意の手段を採用して任意の剤型でこれを得ることができる。例えば、精製した抗体についてその抗体価を測定し、適当にＰＢＳ等で希釈した後、０．１％アジ化ナトリウム等を防腐剤として加えることができる。また、例えば、ラテックス等に本発明の抗体を吸着させたものについて抗体価を求め、適当に希釈し、防腐剤を添加して用いることもできる。
【０１０２】
また、本発明の検査薬を構成成分として含む、インフルエンザウイルスＡ型のグループ１を検出するためのキットもまた、本発明に含まれる。かかるキットには、本発明の検査薬の他に、例えば、抗原抗体反応（ＥＬＩＳＡ法、免疫組織化学染色法、フローサイトメトリー等）を実施するための種々の試薬（二次抗体、発色試薬、染色試薬、緩衝液、対照標品等）、反応容器、操作器具、及び／又は説明書を含めることができる。
【０１０３】
＜アプタマー＞
インフルエンザ拮抗薬はインフルエンザウイルスA型のグループ１のＨＡタンパク質に結合するアプタマーを含み得る。アプタマーは本発明の抗体と同じ場所／エピトープで及び／又は他の場所／エピトープでＨＡに結合することができる。アプタマーは核酸、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びアミノ酸の内の１つ又は複数を含有することができる。アプタマーは任意の好適な技法又はプロトコルを用いて選択及び作製することができる。例えば、１８ヌクレオチド長〜５０ヌクレオチド長の範囲の可変領域を有するオリゴヌクレオチドライブラリをランオフ転写反応の鋳型として使用して、ＲＮＡアプタマーのランダムプールを作製することができる。次いでこのアプタマープールを非複合体形成マトリクスに暴露して、非特異的な相互作用種を除去することができる。その後残存プールを、固定化した標的とともにインキュベートする。このプールにおけるアプタマー種の大部分は低い親和性を有し、マトリクスに結合したより小さく、より特異的なプールを残して標的を洗い流すことができる。次いでこのプールを溶出して、沈殿させ、逆転写して、ランオフ転写の鋳型として使用することができる。５回の選別後、クローニング及びシークエンシングするアリコートを取り出すことができる。同様の配列が再現性をもって回収されるまで、選別を継続することができる。
【０１０４】
アプタマー作製を、ビーズベースの選別システムを用いて行うことができる。このプロセスでは、各ビーズが、天然ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドとで構成される同一の配列を有するアプタマー群でコーティングされているビーズのライブラリを作製する。１００００００００を超える固有の配列を含有し得るこのビーズライブラリを、蛍光色素等のタグと複合体形成する、血球凝集素（ＨＡ）タンパク質又はその一部、例えば細胞外ドメインに対応するペプチドとインキュベートすることができる。洗浄後、最大の結合親和性を示すビーズを単離することができ、続く合成のためにアプタマー配列を決定することができる。
【実施例】
【０１０５】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【０１０６】
また、本発明の抗体を取得するための材料及び方法、並びに取得した抗体についての評価方法を以下に示す。【０１０７】
＜ヒトモノクローナル抗体（ＨｕＭＡｂ）の調製＞
抗インフルエンザウイルス抗体  ＨｕＭＡｂを産生するハイブリドーマを、フュージョンパートナー細胞であるＳＰＹＭＥＧ（医学生物学研究所社製）を用いて作製した（Ｙａｓｕｇｉ  Ｍ，Ｋｕｂｏｔａ−Ｋｏｋｅｔｓｕ  Ｒ，Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ａ，Ｋａｗａｓｈｉｔａ  Ｎ，Ｄｕ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｒｏａｄｌｙ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ．ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ９：ｅ１００３１５０．、及び、Ｙａｓｕｇｉ  Ｍ，Ｋｕｂｏｔａ−Ｋｏｋｅｔｓｕ  Ｒ，Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ａ，Ｋａｗａｓｈｉｔａ  Ｎ，Ｄｕ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｓｉｔｅ  Ｓｂ  ｉｎ  ｐａｎｄｅｍｉｃ（Ｈ１Ｎ１）２００９  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  Ｊａｐａｎ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８：ｅ７７８９２．参照）。【０１０８】
すなわち先ず、２００９年１０月にＨ１Ｎ１ｐｄｍに感染した患者から血液を取得した。なお、当該患者は、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ由来のＮＰタンパク質を迅速に検出する、プライムチェックＦｌｕ（Ｈ１Ｎ１）２００９（アルフレッサファーマ株式会社製）によって迅速に診断された患者である（Ｍｉｚｕｉｋｅ  Ｒ，Ｓａｓａｋｉ  Ｔ，Ｂａｂａ  Ｋ，Ｉｗａｍｏｔｏ  Ｈ，Ｓｈｉｂａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｒａｐｉｄ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｅｓｔ  ｋｉｔｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｔｈｅ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｏｒ  ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｗｉｎｅ−ｏｒｉｇｉｎ  ｐａｎｄｅｍｉｃ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  Ｈ１Ｎ１．  Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：４９４−４９９．、及び、Ｓａｓａｋｉ  Ｔ，Ｋｕｂｏｔａ−Ｋｏｋｅｔｓｕ  Ｒ，Ｔａｋｅｉ  Ｍ，Ｈａｇｉｈａｒａ  Ｔ，Ｉｗａｍｏｔｏ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗｌｙ−ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｐａｎｄｅｍｉｃ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ  ｖｉｒｕｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７：ｅ５０６７０．参照）。そして、末梢血単核血球（ＰＢＭＣ）を、発症後３、９、１６及び２３日目に採取した血液から、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、密度勾配遠心分離法により回収した、得られたＰＢＭＣは、ポリエチレングリコール♯１５００（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、ＳＰＹＭＥＧ細胞と融合させた。次いで、得られた融合細胞を、１５％ウシ胎児血清及びピポキサンチン‐アミノプテリン‐チミジンを添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて選択的に培養した。【０１０９】
次に、インフルエンザウイルスに対して特異的な抗体をスクリーニングするために、先ず免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）を行った。そして、得られた特異的ＭＡｂ陽性細胞を限界希釈し、さらにＩＦＡにより第２のスクリーニングを行うことにより、クローニングした。次いで、各ウェルあたりＩＦＡ陽性であった単一コロニーから採取したハイブリドーマ細胞を、ハイブリドーマ−ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて拡大培養した。【０１１０】
そして、１００ｍｌのハイブリドーマ培養上清から、ハイトラップ  プロテインＧ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いたアフィニティクロマトグラフィーによって、ＭＡｂを精製した。次いで、スライド−Ａ−ライザー透析カセット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、ＰＢＳに透析した。なお、コントロールＩｇＧとして、デング熱ウイルス血清型２を感染させた患者のＰＢＭＣ由来のＤ２３−１Ｂ３Ｂ９  ＨｕＭＡｂを用いた。【０１１１】
＜ウイルス＞
本実施例においては、６種のインフルエンザウイルスＡ型  Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ分離株（Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００９，Ａ／Ｏｓａｋａ／１６８／２００９，Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９，Ａ／Ｓｕｉｔａ／１１７／２０１１，Ａ／Ｓｕｉｔａ／１０４／２０１１，Ａ／Ｓｕｉｔａ／１０５／２０１１）、２種のインフルエンザウイルスＡ型  Ｈ１Ｎ１ｓｅａ分離株（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７，Ａ／ＰＲ８／１９３４）、１種のインフルエンザウイルスＡ型  Ｈ２Ｎ２分離株（Ａ／Ｉｚｕｍｉ／５／１９６５）、２種のインフルエンザウイルスＡ型  Ｈ３Ｎ２分離株（Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８，Ａ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／２００７）、２種のインフルエンザウイルスＡ型  Ｈ５Ｎ１分離株（Ａ／Ｄｕｃｋ／Ｅｇｙｐｔ／ＤＩＢｒ１２／２００７，Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｅｇｙｐｔ／ＲＩＭＤ１２−３／２００８）、１種のインフルエンザウイルスＡ型  Ｈ７Ｎ７分離株（Ａ／Ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｎｋ／Ｓｈｉｍａｎｅ／１２４Ｒ／１９８０）、１種のインフルエンザウイルスＡ型  Ｈ９Ｎ２分離（Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／１９６６）及び２種のインフルエンザウイルスＢ型分離株（Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６，Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／０４）を用いた。【０１１２】
また、本実施例において用いたウィルス株において、日本の大阪府吹田市（Ｓｕｉｔａ）にて分離された株は、大阪大学微生物病研究所にて分離され、保管されている株である。また、Ａ／Ｏｓａｋａ／１６８／２００９は、大阪府立公衆衛生研究所から譲り受けた株である。その他は、国立感染症研究所（日本）及びＡＴＣＣより入手した株である。また、いずれの株も、当業者であれば、各機関に問い合わせることで入手することは可能である。【０１１３】
ウイルスは、ＭＤＣＫ細胞又は９日齢の孵化トリ卵にて増殖した。また、感染能に関し、フォーカス形成アッセイにて力価測定を行った。すなわち、９６ウェプレートにて、連続的に１０倍段階希釈したウイルスをＭＤＣＫ細胞と共に３７℃にて１時間培養した。そして、３７℃にて１２時間ＰＢＳにてインキュベーションすることにより細胞を洗浄した。次いで、細胞を固定し、インフルエンザＡ株に対する抗体Ｃ４３（Ｏｋｕｎｏ  Ｙ，Ｉｓｅｇａｗａ  Ｙ，Ｓａｓａｏ  Ｆ，  Ｕｅｄａ  Ｓ（１９９３）  Ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  Ｈ１  ａｎｄ  Ｈ２  ｓｔｒａｉｎｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６７：２５５２−２５５８  参照）及びインフルエンザＡ株に対する抗体５Ａ７（Ｙａｓｕｇｉ  Ｍ，Ｋｕｂｏｔａ−Ｋｏｋｅｔｓｕ  Ｒ，Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ａ，Ｋａｗａｓｈｉｔａ  Ｎ，Ｄｕ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）  Ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｒｏａｄｌｙ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ．ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ９：ｅ１００３１５０．  参照）をプローブとして用い、ＩＦＡに供した。感染細胞は、４％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳにおいて、２０分間室温にて固定した。そして、適切に希釈した抗体又はハイブリドーマ培養上清において３７℃にて１時間処理することにより反応させ、次いで、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧと共に３７℃にて４５分間インキュベーションした。【０１１４】
＜ウェスタンブロッティング＞
感染細胞又は遺伝子導入細胞を、βメルカプトエタノールの存在下又は非存在下にて、ローディングバッファーに回収した。そして、電気泳動し、ＰＶＤＦメンブレンにブロットした。次に、ハイブリドーマ培養上清をプローブとして、前記ＰＶＤＦメンブレンと共に３７℃にて１時間培養し、次いで、ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧと共に３７℃にて１時間インキュベーションした。【０１１５】
＜フォーカス形成アッセイ＞
９６ウェプレートにて、連続的に１０倍段階希釈したウイルスをＭＤＣＫ細胞と共に３７℃にて１時間培養した。そして、３７℃にて１２時間ＰＢＳにてインキュベーションすることにより細胞を洗浄した。次いで、細胞を固定し、ＩＦＡに供した。そして、得られたフォーカス形成ユニット（ＦＦＵ）を感染能とした。【０１１６】
＜ＶＮアッセイ＞
ＶＮ試験は、Ｏｋｕｎｏ  Ｙ，Ｔａｎａｋａ  Ｋ，Ｂａｂａ  Ｋ，Ｍａｅｄａ  Ａ，Ｋｕｎｉｔａ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｒａｐｉｄ  ｆｏｃｕｓ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２８：１３０８−１３１３．に記載の方法に若干の改良を加えて行った。すなわち、１００μｇ／ｍｌのＨｕＭＡｂを最少必須培地（ＭＥＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にて連続的に２倍段階希釈し、２００ＦＦＵのウイルスと共に３７℃にて１時間培養した。そして、このようにして調製したウイルス及び抗体混合物を、３７℃にて１時間インキュベーションすることにより、ＭＤＣＫ細胞に吸着させた。１６時間のインキュベーション後、細胞を固定し、ＩＦＡに供した。ウイルス感染を５０％に抑える抗体の濃度を、ＶＮ５０として評価し、代表的なＶＮ力価として用いた。【０１１７】
＜ＨＩアッセイ＞
先ず、ウイルス力価を血球凝集反応アッセイにて測定した。すなわち、ウイルスをＰＢＳにて連続的に２倍段階希釈し、０．７％（ｖ／ｖ）ヒトＯ型赤血球細胞と混合した。室温にて１時間インキュベーションした後、血球凝集単位（ＨＡＵ）を算出した。次に、ＨＩ力価測定は以下のようにして行った。１００μｇ／ｍｌのＨｕＭＡｂを連続的に２倍段階希釈し、５０μｌあたり８ＨＡＵのウイルスサンプルに混合した。３７℃にて１時間インキュベーションした後、前記混合物を更に０．７％（ｖ／ｖ）ヒト赤血球細胞と共に、室温にて１時間インキュベーションした。そして、血球凝集を完全に阻害するＨｕＭＡｂの最低濃度を、ＨＩ力価とした。【０１１８】
＜融合阻害アッセイ＞
細胞間の融合についてのアッセイは、Ｗｈｉｔｔｌｅ  ＪＲ，Ｚｈａｎｇ  Ｒ，Ｋｈｕｒａｎａ  Ｓ，Ｋｉｎｇ  ＬＲ，Ｍａｎｉｓｃｈｅｗｉｔｚ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｂｒｏａｄｌｙ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈａｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ  ｔｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｏｃｋｅｔ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０８：１４２１６−１４２２１．に記載の方法により行った。【０１１９】
すなわち、サル腎臓細胞株ＣＶ−１細胞に、Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００９を１．６ＭＯＩにて感染させた。そして、４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び２．５μｇ／ｍｌアセチル化トリプシン（Ｓｉｇｍａ社製）を添加したＭＥＭにて２４時間培養した後、ＭＥＭにて細胞を洗浄した。洗浄後、希釈ＨｕＭＡｂと共に３０分間インキュベーションした。その後、細胞をＰＢＳ（ｐＨ５．５）にて３７℃５分間処理した。洗浄により培地を完全に除いた後、細胞を３時間インキュベーションした。そして、細胞を純粋なメタノールにて固定し、ギムザ（Ｗａｋｏ社製）にて染色した。【０１２０】
＜エスケープ変異の選択＞
Ｙａｓｕｇｉ  Ｍ，Ｋｕｂｏｔａ−Ｋｏｋｅｔｓｕ  Ｒ，Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ａ，Ｋａｗａｓｈｉｔａ  Ｎ，Ｄｕ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）  Ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｒｏａｄｌｙ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ．ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ９：ｅ１００３１５０．に記載の方法を若干改良して、ＨｕＭＡｂの存在下、Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００９を培養することによって、エスケープ変異を選択した。【０１２１】
すなわち、ＭＤＣＫ細胞を９６ウェルプレートに１ウェルあたり３００００細胞となるよう播種し、１６時間培養した。次に、ウイルス（１００ＦＦＵ／ｍｌ）及び連続的に１０倍段階希釈したＨｕＭＡｂ（０．００２５，０．０２５，０．２５及び２．５μｇ／ｍｌ）を混合し、３７℃にて１時間インキュベーションした。そして、この混合物をＭＤＣＫ細胞と反応させた。３７℃にて１時間反応させた後、細胞をＰＢＳにて洗浄し、０．４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、抗生物質及び２μｇ／ｍｌアセチル化トリプシンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ−１２＋ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ  ２００μｌを補充した。このようにして感染させてから７２時間後、上清を回収して保存した。また、全てのウイルスのストックについて力価を測定し、新たに細胞を感染させるために用いた。そして、１０代継代した後、培養上清中の混合群から、ＨＡ遺伝子の全長をダイレクトシークエンシングした。【０１２２】
＜ダイレクトシークエンシング解析＞
ウイルスのＲＮＡは、ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて抽出し、下記ＨＡプライマーセットを用いたワンステップＲＴ−ＰＣＲ（高忠実度プラチナＴａｑを備えたスーパースクリプトＩＩＩワンステップＲＴ−ＰＣＲシステム、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に供した。
フォワード：５’−ＴＡＴＴＣＧＴＣＴＣＡＧＧＧＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧＧＧ−３’（配列番号：４３）
リバース：５’−ＡＴＡＴＣＧＴＣＴＣＧＴＡＴＴＡＧＴＡＧＡＡＡＣＡＡＧＧＧＴＧＴＴＴＴ−３’ （配列番号：４４）。【０１２３】
得られたＰＣＲ産物はＱｉａクイックＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて精製した。電気泳動後、分離したバンドをＱｉａクイックゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて回収し、シークエンシング解析に供した。【０１２４】
＜ＨｕＭＡｂの可変領域のシークエンシング＞
トータルＲＮＡをＲＮａｓｅミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてハイブリドーマから回収し、オリゴ（ｄｔ）プライマー及びプライムスクリプトＲＴ試薬キット（Ｔａｋａｒａ社製）を用いたＲＴ−ＰＣＲに供した。そして、ＨｕＭＡｂの重鎖及び軽鎖をコードする領域は、下記プライマーを用いたＰＣＲにて増幅した。
５’−ＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＴ−３’（重鎖フォワード、配列番号：４５）及び５’−ＣＴＣＣＣＧＣＧＧＣＴＴＴＧＴＣＴＴＧＧＣＡＴＴＡ−３’（重鎖リバース、配列番号：４６）、
５’−ＡＴＧＧＣＣＴＧＧＲＹＣＹＣＭＹＴＣＹＷＣＣＴＭ−３’（軽鎖フォワード、配列番号：４７）及び５’−ＴＧＧＣＡＧＣＴＧＴＡＧＣＴＴＣＴＧＴＧＧＧＡＣＴ−３’（軽鎖リバース、配列番号：４８）。【０１２５】
得られたＰＣＲ産物はＱｉａクイックＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）．を用いて精製した。電気泳動後、分離したバンドをＱｉａクイックゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて回収した。そして、それらの配列をＢｉｇＤｙｅターミネーターｖ３．１サイクルシークエンシングキット及びＡＢＩプリズム３１００ジェネテックアナライザー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて分析した。次いで、得られた配列を分析し、ＩｇＢＬＡＳＴ  ソフトウェアを備えたＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）での検索に供した。【０１２６】
＜ＨＡプラスミドの構築＞
Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００９株のＨＡ遺伝子はワンステップＲＴ―ＰＣＲにて増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に挿入した。【０１２７】
野生型及びアミノ酸置換を加えた変異体のＨＡ遺伝子は、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙに挿入されたＨＡ遺伝子を鋳型として、標準ＰＣＲ（エクスパンド高忠実プラスＰＣＲシステム、Ｒｏｃｈｅ社製）及び部位特異的変異導入ＰＣＲ（ジーンテイラー部位特異的変異導入システム、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を各々用いて調製した。【０１２８】
各遺伝子は、発現ベクターｐＣＡＧ  ＰＭ２にサブクローニングした。そして、得られた発現プラスミドを、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、その添付の説明書に従って、ヒト腎臓由来の２９３Ｔ細胞に導入した。【０１２９】
＜遺伝的解析＞
インフルエンザウイルスＡ型全ての配列（全長、非重複、非研究用）は、ＮＣＢＩインフルエンザウイルスリソース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌ）よりダウンロードした。【０１３０】
ダウンロードした時点（２０１３年６月５日）で、データベースには１６種全てのインフルエンザウイルスＡ型の配列は２９６１９７個あった。そして、８８９８個のパンデミックＨ１Ｎ１の配列、４３７８個の季節性Ｈ１Ｎ１の配列、２９９３個のＨ５の配列、９９５個のＨ９の配列は、ＢｉｏＥｄｉｔプログラムを用いて、アライメントをかけた。【０１３１】
＜ＩｇＧアイソタイピング＞
ＥＬＩＳＡ用マイクロプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社製）に、ヤギ由来の抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を含有する０．０５Ｍ  重炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．６）を添加し、４℃にて一晩かけインキュベーションし、該抗体にてプレートをコートした。次いで、０，１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて洗浄した後、０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳを添加し、３７℃にて１時間インキュベーションすることにより、ブロッキング処理を施した。再度洗浄した後、ハイブリドーマの培養上清又はコントロールの血清を添加し、３７℃にて２時間インキュベーションした。さらに洗浄した後、ＨＲＰ結合抗ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製）を添加し、３７℃にて１時間インキュベーションした。次いで、５回洗浄した後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジンペルオキシダーゼの基質（ＫＰＬ）を添加し、暗所にて室温下インキュベーションした。その２０分後、２Ｎの硫酸溶液を添加して反応を停止させた。そして、発色現象をＥＬＩＳＡ光度計（Ｂｉｏｔｅｋ  ＥＬＩＳＡ  リーダー、Ｂｉｏｔｅｋ社製）にて波長４５０ｎｍにおける吸光度として評価した。なお、全てのサンプルに対して３回ずつ解析を行った。【０１３２】
〈分子モデリング〉
Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００９及びＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９の結晶構造に基づき、Ｃｎ３Ｄ及びＰｙＭｏｌを用いて、ＨＡタンパク質の構造を構築した。【０１３３】
＜プロテアーゼ感受性アッセイ＞
バキュロウイルスにて発現させた不溶性Ｈ１  ＨＡ（Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００９由来）０．６μｇを、融合後のＨＡ凝集を防ぐために、２５０ｍＭイミダゾール５ｍｌと共にインキュベーションした。そして、各チューブあたり１００μｌになるよう４本のチューブに分注した。これらチューブに、９００μｌのプロテアーゼバッファー（２５０ｍＭイミダゾール、２０μｇ／ｍｌ  トリプシン−ＥＤＴＡ、ｐＨ５．３）を添加し、３７℃にて１時間インキュベーションした。インキュベーション後、混合物を遠心処理し、回収したペレットをウェスタンブロッティングに供した。このウェスタンブロッティングにおいて、一次抗体としてＨｕＭＡｂ  １Ｈ１１、２Ｈ５及び５Ｇ２、そしてコントロールとしてＨ１Ｎ１ｐｄｍの頭部領域に結合するＨｕＭＡｂ  ５Ｅ４を用いた。また、二次抗体としてＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧを用いた。【０１３４】
＜トリプシン切断に対する阻害アッセイ＞
バキュロウイルスにて発現させた不溶性Ｈ１  ＨＡ（Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００９由来）０．６μｇを２５０ｍＭイミダゾール５ｍｌと共にインキュベーションした。そして、各チューブあたり１００μｌになるよう４本のチューブに分注した。１のチューブはコントロールとして用い、６μｇの５Ｅ４及び９００μｌのプロテアーゼバッファー（２５０ｍＭイミダゾール、２０μｇ／ｍｌトリプシン−ＥＤＴＡ、ｐＨ５．３）を更に添加した。【０１３５】
残り３本の各チューブには、ＨｕＭＡｂ（１Ｈ１１、２Ｈ５又は５Ｇ２）を９００ｍｌのプロテアーゼバッファーと共に添加し、混合した。そして、３７℃にて１時間反応させた。インキュベーション後、反応物を遠心処理し、回収したペレットをウェスタンブロッティングによる試験に供した。このウェスタンブロッティングにおいて、一次抗体として５Ｅ４を用いた。また、二次抗体としてＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧを用いた。【０１３６】
＜エピトープについての解析＞
各ＨｕＭＡｂのエピトープ領域は、Ｐｒｚｙｂｙｌｓｋｉの方法（Ｍａｃｈｔ  Ｍ，Ｍａｒｑｕａｒｄｔ  Ａ，Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ  ＳＯ，Ｄａｍｏｃ  Ｅ，  Ｋｏｈ；ｍａｎｎ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）“Ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ”：ｄｉｒｅｃｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｔｅｒｉａｌ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｍａｐｐｉｎｇ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ３７８：１１０２−１１１１．）に従い、プロテアーゼ処理後の質量分析によって分析した。【０１３７】
すなわち、ハイトラップＮＨＳ活性化ＨＰカラムにＨｕＭＡｂを加えることにより、ＨｕＭＡｂ固定カラムを調製した。２μｇ／ｍｌ組み換えＨＡ（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９由来）（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）をカラムに通し、ＰＢＳにて洗浄した後、０．１ｍｇ／ｍｌ修飾トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を加え、３７℃にて２時間インキュベーションした。ＰＢＳにて洗浄後、続いて超純水を通し、ＨｕＭＡｂに結合させたペプチド断片を０．１％トリフルオロ酢酸にて溶出させた。抽出物を濃縮し、ＭＡＬＤＩ  ＴｏＦ  ＭＳにてペプチド断片について解析した。【０１３８】
＜エピトープ配列の調製＞
インフルエンザの配列及び配列情報のファイル（各々、ｉｎｆｌｕｅｎｚａ．ｆａａ及びｉｎｆｌｕｅｎｚａ＿ａａ．ｄａｔ，）は、インフルエンザウィルズリソース（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＩＮＦＬＵＥＮＺＡ）より、２０１３年８月２４日にダウンロードした。エピトープ領域は、ｂｌａｓｔｐサーチを用い、ヘマグルチニン（ＨＡ）の完全配列から、Ｅ−ｖａｌｕｅのカットオフ値を１ｅ−３として探索した（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ，Ｍａｄｄｅｎ  ＴＬ，Ｓｃｈａｆｆｅｒ  ＡＡ，Ｚｈａｎｇ  Ｊ，Ｚｈａｎｇ  Ｚ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５：３３８９−３４０２  参照）。５アミノ酸以上のＣ末又はＮ末において類似性を示さなかった相同領域は、以降の解析において除外した。また、トリ、ヒト及びブタ由来のＨ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ９及びＨ９Ｎ２の配列をｉｎｆｌｕｅｎｚａ＿ａａ．ｄａｔ．に記載の情報に基づき選択した。【０１３９】
＜Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ（２００９）及び季節性Ｈ１Ｎ１の配列＞
データベースからＨ１Ｎ１ｐｄｍ（２００９）及び季節性Ｈ１Ｎ１の配列を選択するため、Ｈ１Ｎ１  ＨＡのアミノ酸全長、並びにＪＴＴマトリックスベースドモデルに基づく最尤法（Ｊｏｎｅｓ  ＤＴ，Ｔａｙｌｏｒ  ＷＲ，Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ＪＭ（１９９２）  Ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｄａｔａ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｃｏｍ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ  ８：２７５−２８２．）を利用して、系統樹を構築した。なお、ギャップ及び欠失データを含む全位置は除外した。また、進化解析はＭＥＧＡ５により行った（Ｔａｍｕｒａ  Ｋ，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  Ｄ，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  Ｎ，Ｓｔｅｃｈｅｒ  Ｇ，Ｎｅｉ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）  ＭＥＧＡ５：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ，  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｄｉｓｔａｎｃｅ，  ａｎｄ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｐａｒｓｉｍｏｎｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌｏ  Ｅｖｏｌ  ２８：２７３１−２７３９．  参照）。【０１４０】
系統発生解析のための配列セットは、ｕｃｌｕｓｔプログラムにより１の代表配列との同一性が９９％以上である非重複配列に置き換えることによって調製した。構築した系統樹から、２００９年以降に採取されたヒトＨ１Ｎ１  ＨＡ配列を最も多く含む１の枝を、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ（２００９）株とみなした。そして、ヒトを宿主とするＨ１Ｎ１ｐｄｍ（２００９）株の配列及び９９％の同一性を示す配列を、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ（２００９）  ＨＡの配列として用いた。同様に、季節性のＨＡ配列セットは、２００９年よりも前のヒトＨ１Ｎ１配列を最も多く含む１の枝から選択した。【０１４１】
＜配列についての集団解析＞
２００９年、２０１０年、２０１１年、２０１２年及び２０１３年にヒトから採取したＨ１Ｎ１ｐｄｍ、ヒトから採取したＨ１Ｎ１ｓｅａ、Ｈ３Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ９及びＨ９Ｎ２、トリから採取したＨ９Ｎ２、並びにブタから採取したＨ３Ｎ２に関し、エピトープの固有配列数を計測した。【０１４２】
以上の方法によって得られた結果を以下に示す。【０１４３】
（実施例１）
＜インフルエンザウイルスＡ型に対するＨｕＭＡｂ（ヒトモノクローナル抗体）の作製＞
インフルエンザ患者から、インフルエンザ発症から２、９、１６及び２３日目に採血し、それらの血液から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製した。なお、その患者はＨＩＮ１ｐｄｍに感染していたと診断されている。そして、前記ＰＢＭＣをフュージョンパートナー細胞であるＳＰＹＭＥＧと融合させ、ハイブリドーマを調製した。【０１４４】
次に、調製したハイブリドーマに関し、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）により、インフルエンザウイルスに特異的な抗体を産生する細胞を選抜した。次いで、特異的な抗体を有していると判定されたウェル上のハイブリドーマを限界希釈し、単一クローンとした。【０１４５】
以上の結果、発症後９日目の血液からは１Ｈ１１及び５Ｇ２、発症後２３日目の血液からは２Ｈ５、計３種のインフルエンザウイルスＡ型に対するＨｕＭＡｂを産生するハイブリドーマを樹立することができた。【０１４６】
次に、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ２００９年分離株、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ２０１１年分離株、Ｈ１Ｎ１ｓｅａ分離株、Ｈ５Ｎ１分離株、Ｈ９Ｎ２分離株、Ｈ２Ｎ２分離株又はＨ３Ｎ２分離株を感染させた、マディン−ダービー−イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を用い、前記３種のＨｕＭＡｂのインフルエンザウイルスＡ型に対する交差反応性について試験した。得られた結果を表１に示す。なお、インフルエンザウイルスＡ型のＮＰに対するマウスモノクローナル抗体Ｃ４３（Ｏｋｕｎｏ  Ｙ，Ｉｓｅｇａｗａ  Ｙ，Ｓａｓａｏ  Ｆ，Ｕｅｄａ  Ｓ（１９９３）  Ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  Ｈ１  ａｎｄ  Ｈ２  ｓｔｒａｉｎｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６７：２５５２−２５５８  参照）及びＰＢＳは、各々陽性対照及び陰性対照として用いた。また、インフルエンザウィルスＢ型のヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質に対して、広域な反応性を示す抗体  ５Ａ７をコントロールとして用いた。【０１４７】
【表１】
2015068781.tif 000002
【０１４８】
なお、表中の「ｎｄ」は未分析（ｎｏｔ  ｄｅｔｅｍｉｎｅｄ）であることを示す（表３においても同じ）。【０１４９】
表１に示した結果から明らかなように、前記３種のＨｕＭＡｂ全て、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ、Ｈ１Ｎ１ｓｅａ、Ｈ５Ｎ１及びＨ９Ｎ２に対して反応性を示した。しかし、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ７及びインフルエンザウイルスＢ型に対してはいずれも反応性を示さなかった。また、ＩＦＡによる染色パターンから、前記３種のＨｕＭＡｂは、インフルエンザウイルスにおいて、そのＨＡタンパク質を認識していることが示唆される。【０１５０】
そこで、各ＨｕＭＡｂのＨ１Ｎ１ｐｄｍタイプのＨＡタンパク質に対する反応性を確認すべく、Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００９由来のＨＡタンパク質をコードするプラスミドが導入された２９３Ｔ細胞に対し、ＩＦＡを行った。その結果、図１に示す通り、前記３種のＨｕＭａｂ全て、２９３Ｔ細胞内のＨ１Ｎ１ｐｄｍのＨＡと反応していることが明らかになった。【０１５１】
また、前記３種のＨｕＭＡｂについてアイソタイプを判定した結果、これら全てののＨｕＭＡｂはＩｇＧ１であることが明らかになった（表２  参照）。さらに、ＨｕＭａｂ３種のＶＨ及びＶＬ領域についてシークエンシング解析を行った結果、生殖細胞系列の重鎖ＩＧＶＨ１−６９、ＩＧＤＨ３−１０ＩＧＪＨ及びＩＧＪＨ６同様の配列を有していることが明らかになった（図２〜４及び表２  参照）。【０１５２】
【表２】
2015068781.tif 000003
【０１５３】
（実施例２）
＜ＨｕＭＡｂの中和活性＞
次に、前記３種のＨｕＭＡｂについて、インビトロでのウイルス中和（ＶＮ）アッセイにより、インフルエンザウイルスに対する中和能を評価した。すなわち先ず、様々な濃度の抗体にて前処理したＭＤＣＫ細胞に、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ（２００９又は２０１１分離株）、Ｈ１Ｎ１ｓｅａ又はＨ９Ｎ２を感染させた。そして、感染した細胞の数を、免疫蛍光染色により計測することにより、前記３種のＨｕＭＡｂの中和能を評価した。得られた結果を図５及び表１に示す。なお、本ＶＮアッセイにおいて、デング熱ウイルスにグローバルな中和活性を示すＨｕＭＡｂとして近年調製されたＤ２３−１Ｇ７Ｃ２を陰性対照として用いた。【０１５４】
図５及び表１に示した結果から明らかなように、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ、Ｈ１Ｎ１ｓｅａ及びＨ５Ｎ１に対し、前記３種全てのＨｕＭＡｂを中和活性を示した。【０１５５】
さらに、ＨｕＭＡｂ  １Ｈ１１及び５Ｇ２は、Ｈ９Ｎ２を中和することもできたが、ＨｕＭＡｂ  ２Ｈ５はＨ９Ｎ２を中和することができなかった。また、Ｈ９Ｎ２に対する中和活性は、ＨｕＭＡｂ  １Ｈ１１及び５Ｇ２の高濃度においてのみ見出された（図５）。【０１５６】
また、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍに対し、前記３種全てのＨｕＭＡｂにおける濃度に応じた中和プロファイルは同様のものであった。しかしながら、中和活性、特にそれらＨｕＭＡｂの低濃度においては、２００９年分離株と比較して、２０１１年分離株に対する中和活性は劣るものであった（図５及び表１）。【０１５７】
また、Ｈ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１に対する前記ＨｕＭａｂの推定ＶＮ５０は、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ２０１１年分離株に対するそれらと同様であった（表１  参照）。しかしながら、低濃度範囲においては、前記ＨｕＭＡｂ３種いずれのＨ１Ｎ１ｐｄｍ２０１１年分離株、Ｈ１Ｎ１ｓｅａ及びＨ５Ｎ１に対する中和プロファイルはかなり異なるものであった。【０１５８】
次に、前記３種のＨｕＭａｂによる中和メカニズムを明らかにするため、ヘマグルチニン阻害（ＨＩ）及び融合阻害のアッセイを行った。得られた結果を表３に示す。また、融合阻害のアッセイに関しては、図６にも結果を示す。なお、コントロールとして、グループ１に属するＨＡに対して広域反応性を示すマウスＭＡｂＣ１７９（Ｏｋｕｎｏ  Ｙ，Ｉｓｅｇａｗａ  Ｙ，Ｓａｓａｏ  Ｆ，Ｕｅｄａ  Ｓ（１９９３）  Ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  Ｈ１  ａｎｄ  Ｈ２  ｓｔｒａｉｎｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６７：２５５２−２５５８  参照）を用いた。また、陰性対照として前記Ｄ２３−１Ｇ７Ｃ２を用いた。【０１５９】
【表３】
2015068781.tif 000004
【０１６０】
なお、表３中、「Ｗｔ」は野生型のＨＡタンパク質を示す。【０１６１】
その結果、表３に示す通り、３種全てのＨｕＭＡｂに関し、それらのＨＩ活性は検出されなかった。【０１６２】
一方、融合阻害アッセイにおいては、図６及び表３に示した結果から明らかな通り、細胞と細胞との融合に対する阻害能は全ての抗体が有していることが認められていた。しかしながら、細胞間の完全に阻害するために要する抗体濃度は、５Ｇ２よりも、１Ｈ１１、２Ｈ５及びＣ１７９の方が低かった。なお、陰性対照であるＤ２３−１Ｇ７Ｃ２は、２００μｇ／ｍｌにおいてでさえも融合阻害活性を認められなかった。【０１６３】
（実施例３）
＜ＨｕＭＡｂのエピトープマッピング＞
上述の通り、前記３種のＨｕＭＡｂ全て、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ由来のＨＡを発現させた２９３T細胞に対して反応性を示した（図１  参照）。そこで、これらＨｕＭＡｂによって認識されるエピトープ領域のマッピングを試み、先ず、ウェスタンブロッティングにより、ＨＡ（Ａ／Ｓｕｉｔａ／１／２００９）に対するＨｕＭＡｂの反応性を試験した。得られた結果を図７に示す。なお、このウェスタンブロッティングにおいては、ＨＡタンパク質の頭部領域を認識するＨｕＭＡｂ  ５Ｅ４（Ｙａｓｕｇｉ  Ｍ，Ｋｕｂｏｔａ−Ｋｏｋｅｔｓｕ  Ｒ，Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ａ，Ｋａｗａｓｈｉｔａ  Ｎ，Ｄｕ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｓｉｔｅ  Ｓｂ  ｉｎ  ｐａｎｄｅｍｉｃ  （Ｈ１Ｎ１）  ２００９  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  Ｊａｐａｎ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８：ｅ７７８９２．  参照）をコントロールとして用いた。【０１６４】
図７に示す通り、コントロールである５Ｅ４を用いた場合には、還元条件下及び非還元条件下のいずれにおいても、ＨＡモノマーを示す７５ｋＤａのバンドが検出された。また、前記３種全てのＨｕＭＡｂは非還元条件下のみにおいてＨＡと反応した。しかしながら、ＨＡ１又はＨＡ２を示す７５ｋＤａ又はサブ７５ｋＤａのバンドを還元条件下において検出することはできなかった。したがって、前記３種のＨｕＭＡｂのエピトープに対する反応は、構造依存的であることが想定された。【０１６５】
実際、前記３種のＨｕＭＡｂと、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ  ＨＡタンパク質のいくつかの断片とを用いてウェスタンブロッティングを行い、それらＨＡ断片に対する前記３種のＨｕＭＡｂの反応性を調べた結果、当該ＨｕＭＡｂはいずれもＨＡ０の全長に対して反応性を示したが、調製した如何なる断片に対して反応することはなかった（図８  参照）。【０１６６】
次に、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ  ＨＡ０タンパク質を低ｐＨ下にてトリプシンにより処理した。そして、それらを前記３種のＨｕＭＡｂを用いたウェスタンブロッティングに供した。その結果、前記３種全てのＨｕＭＡｂは、ＨＡ２の３量体型（ｔＨＡ２）に反応することが明らかになった（図９中のＡ  参照）。【０１６７】
次に、ＨＡ０タンパク質を、先ず前記３種のうちのいずれかのＨｕＭＡｂ又はコントロールとしてＨＡの頭部領域を認識する５Ｅ４にて処理し、その後、前記同様に低ｐＨにてトリプシン処理した上で、５Ｅ４を用いたウェスタンブロッティングに供した。その結果、前記３種のうちのいずれかのＨｕＭＡｂにて前処理したＨＡ０においては、低ｐＨ下のトリプシン処理による、茎領域におけるＨＡ１／ＨＡ２の切断が阻害されていることが明らかになった（図９中のＢ  参照）。【０１６８】
したがって、前記３種のＨｕＭＡｂは、５Ｅ４とは異なり、ＨＡ１頭部を認識するものではなく、ＨＡ２の茎領域を認識する抗体であることが明らかになった。【０１６９】
さらに、前記３種のＨｕＭＡｂが認識するエピトープ領域を同定するため、これらＨｕＭＡｂ及びＨＡタンパク質を、プロテアーゼ感受性アッセイに供し、プロテアーゼ処理後の質量分析によるエピトープマッピングを行った。得られた結果を図１０に示す。【０１７０】
その結果、マスコットサーチにおいて、コントロールを除いて、３種のエピトープについて同様の結果が示された。すなわち、全ウイルスタンパク質の配列データベースにおいて、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９のＨＡタンパク質の配列と一致した。さらに、計算されたスコア閾値に基づき、よりスコアの高い６７を有意と判定した（ｐ＜０．０５）。そして、スコアの結果に基づき、ＨＡ２の４０〜５８位のアミノ酸からなる領域、すなわちＡ／Ｓｕｉｔａ／１／２００／２００９  ＨＡ０の３８４〜４０２位のアミノ酸からなるポリペプチドが、前記３種のＨｕＭＡｂのエピトープであることが明らかになった。なお、前記ＨＡ０タンパク質は、配列番号：２６記載のアミノ酸配列からなるタンパク質のＮ末に、シグナル配列を含む１８アミノ酸を付加したタンパク質である。また、ＨＡ１及びＨＡ２におけるアミノ酸の番号は、（Ｎｏｂｕｓａｗａ  Ｅ，Ａｏｙａｍａ  Ｔ，Ｋａｔｏ  Ｈ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｙ，Ｔａｔｅｎｏ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｍｏｎｇ  １３  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８２：４７５−４８５）の記載の通りである。【０１７１】
したがって、図１０に示す通り、前記３種のＨｕＭＡｂのエピトープは、いずれもＨＡタンパク質の茎領域を構成する、ＨＡ２の４０〜５８アミノ酸からなるαヘリックスにあることが明らかになった。【０１７２】
（実施例４）
＜ＨｕＭＡｂによるエスケープ変異に対する抑制効果＞
様々な濃度（０．００２５〜２．５μｇ／ｍｌ）の前記ＨｕＭＡｂ存在下、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ−ＳＵ１／０９）を感染させたＭＤＣＫを、連続して１０代継代することにより、生じるエスケープ変異について分析した。なお、コントロールとして、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍのＨＡ抗原部位Ｓｂに対するＨｕＭＡｂ  ５Ｅ４を用いた。【０１７３】
図１１に示した通り、１Ｈ１１及び２Ｈ５共に連続して１０代継代した後でさえ、エスケープ変異は生じなかった（図１１）。特に、１Ｈ１１においては、６代目にてＨ１Ｎ１ｐｄｍの細胞変性効果が消失していた。【０１７４】
一方、５Ｇ２及びコントロールである５Ｅ４を用いた場合には、いくつかのウェルにおいて、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍの細胞変性効果が継続的に観察された。【０１７５】
そして、１０代目のウェルからＲＮＡをサンプリングし、それらＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ及びそれに続くシークエンシングにより解析した結果、前記３種のＨｕＭＡｂを用いた場合においては、５Ｇ２存在下で培養したいくつかのウェルを除いて、その殆どはオリジナルとしたウイルスと同じ配列であることが明らかになった。すなわち、図１２に示す通り、５Ｇ２存在下で培養した１０代目のウェルのインフルエンザウイルスにおいては、１アミノ酸の置換（Ｙ８６Ｃ）を伴うエスケープ変異が同定された。【０１７６】
また、コントロールとして５Ｅ４を用いた場合においては、以前このＨｕＭＡｂに関し報告されたエスケープ変異（前記、Ｙａｓｕｇｉ  Ｍら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２０１３年、８：ｅ７７８９２．参照）と同様の部位が変異したものが、今回も検出された。【０１７７】
（実施例５）
＜ＨｕＭＡｂが認識するエピトープ領域における配列変異＞
次に、前記３種のＨｕＭＡｂのエピトープ領域に対応する配列を、インフルエンザウイルスＡ型及びインフルエンザウイルスＢ型のいくつかのサブタイプ間で比較した。比較した配列の全長を図１３及び１４に分けて示す。また、比較した結果の概要を表４に示す。【０１７８】
【表４】
2015068781.tif 000005
【０１７９】
表４に示す通り、注目すべきは、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ２００９年分離株における４７位のアミノ酸はグルタミン酸であった。一方、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ２０１１年分離株においては、リシンであった。このことから、前述のＨｕＭＡｂのこれら分離株に対する中和活性の差を鑑みるに、当該４７位のアミノ酸置換がＨｕＭＡｂの中和活性に影響を与えていることが示唆される。【０１８０】
一方、Ｈ１Ｎ１ｓｅａにおいては、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ２００９年分離株を基準とした場合に、Ａｓｎ４６と共にＧｌｙ４７のアミノ酸置換も共通して検出された。また、Ｈ５Ｎ１及びＨ９Ｎ２においては、Ｇｌｙ４７及びＬｙｓ４７は、各々他のいくつかの部位におけるアミノ酸置換と共に検出された。さらに、Ｇｌｕ４７は、Ｈ３Ｎ２において大抵、他のいくつかの部位におけるアミノ酸置換と共に検出された。また、Ｈ２Ｎ２において、Ｇｌｙ４７及びもう１つの他の置換  Ｐｈｅ４５が同定され、前記３種のＨｕＭＡｂの反応性において４５位のアミノ酸が重要であることが見出された。なお、表４に示す通り、エピトープ領域の殆どにおいて、インフルエンザウイルスＢ型とはその配列はかなり異なっている。【０１８１】
インフルエンザウイルスＡ型に対してグローバルな中和活性を示すＨｕＭＡｂに関し、ＨＡ茎領域において保存されたエピトープが報告されている（非特許文献１〜４、６及び２５）。また、交差反応性を示す抗体として、ＨＡ頭部を認識する抗体も同定されている（非特許文献２、１８、２０〜２４及び２６）。【０１８２】
そこで、これら既存の抗体と、前記３種のＨｕＭＡｂとが、エピトープにおいて共通しているか否かを解析すべく、非特許文献１〜４、６及び２５に記載のＨＡ茎領域を認識する既存の抗体が、認識することのできないＨＡエスケープ変異体２種（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍＨＡから、Ｑ４２Ｇ、Ｄ４６Ｔ、Ｔ４９Ｎ及びＮ５２Ｄのアミノ酸置換を伴う変異体、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍＨＡから、Ｄ１９Ｎ、Ｗ２１Ｆ及びＩ４５Ｖのアミノ酸置換を伴う変異体）を作製した。そして、これら変異体に対する前記３種のＨｕＭＡｂの反応性を、ウェスタンブロッティングにより評価した。得られた結果を図１５に示す。【０１８３】
図１５に示した結果から明らかなように、既存の抗体のＨＡエスケープ変異２種に対し、前記３種のＨｕＭＡｂの反応性が低下することはなかった。したがって、これら３種のＨｕＭＡｂは、過去の報告例とは異なるエピトープを認識していることが明らかになった。【０１８４】
また、ＨＡ１のグループ１に対するグローバルマウス抗体（ＭＡｂ）Ｃ１７９のエピトープも、ＨＡの茎領域に同定されている（Ｄｒｅｙｆｕｓ  Ｃ，Ｌａｕｒｓｅｎ  ＮＳ，Ｋｗａｋｓ  Ｔ，Ｚｕｉｊｄｇｅｅｓｔ  Ｄ，Ｋｈａｙａｔ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）  ｈｉｇｈｌｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂ  ｖｉｒｕｓｅｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：１３４３−１３４８）。また、広域中和活性を示す既存のＨｕＭＡｂ（ＣＲ６２６１、Ｆ１０、ＣＲ９１１４及びＦＩ６）も同様に、このＨＡの茎領域を認識する。そして、そのエピトープは、α−ヘリックスを含む、ＨＡ１のＮ末領域及びＣ末領域（３８、４０、４２、２９１〜２９３及び３１８位のアミノ酸）、並びにＨＡ２のＮ末部分（１８〜２１、３８、４１〜４３、４５、４６、５２及び５６位のアミノ酸）からなる。【０１８５】
そこで、次に、Ｇ１８９Ｒ、Ｇ２２５Ｄ及びＴ３１８Ｋからなるエスケープ変異を伴うＨ１−ＳＵ１／８９Ｒを用い、ＩＦＡにより、それに対する結合能を評価した。なお、この変異株と反応することができないことが明らかになっているＣ１７９を陰性対照として用いた。また、インフルエンザウイルスＡ型のＮＰに対するマウスモノクローナル抗体Ｃ４３を陽性対照として用いた。得られた結果を表５に示す。【０１８６】
【表５】
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【０１８７】
表５に示した結果から明らかなように、前記３種のＨｕＭＡｂはいずれも、オリジナルである野生型（Ｈ１−ＳＵ１／８９）同様に、エスケープ変異（Ｈ１−ＳＵ１／８９Ｒ）に対しても反応した。したがって、ＨＡ１のグループ１に対するグローバルマウス抗体であり、ＨＡの茎領域にエピトープが同定されているＣ１７９とも、前記３種のＨｕＭＡｂはいずれも異なるエピトープに結合していることが明らかになった。また、既存の広域性中和抗体であるＣ１７９では抑制することのできない、Ｈ１−ＳＵ１／８９Ｒ株に対しても、前記３種のＨｕＭＡｂは結合することができ、ひいては中和活性を示すことが示唆された。【０１８８】
（実施例６）
＜アミノ酸置換体を用いたエピトープの同定＞
上述のように、４５位及び４７位のアミノ酸置換が前記３種のＨｕＭＡｂの反応性に重要であることが明らかになったことから、それぞれの部位にアミノ酸置換を行った変異体を作製し、前記３種のＨｕＭＡｂへの反応性を検討した。すなわち、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍのＨＡ２領域の４５位のアミノ酸をイソロイシンからフェニルアラニンヘ、４７位のアミノ酸をグルタミン酸からリジン又はグリシンへ、また４５位のアミノ酸及び４７位のアミノ酸をイソロイシンからフェニルアラニンに、グルタミン酸からグリシンに各々アミノ酸置換を行った変異体を作製し、それら変異体に対する前記３種のＨｕＭＡｂの結合性を、ＩＦＡにより評価した。得られた結果を表３に示す。【０１８９】
その結果、陰性対照である５Ｅ４は全ての変異体に反応を示したが、前記３種のＨｕＭＡｂは４５位、４７位に個別にアミノ酸置換を入れたものには反応を示したが、４５位、４７位に同時に変異を入れた場合は反応を示さなかった。【０１９０】
したがって、前記３種のＨｕＭＡｂとHAタンパク質との結合においては、該タンパク質のＨＡ２領域中の４５位及び４７位のアミノ酸が重要であることが確認された。【０１９１】
（実施例７）
＜インフルエンザウイルスのデータベースにおけるエピトープ領域の比較＞
前記３種のＨｕＭＡｂが認識するエピトープ領域に関し、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ、Ｈ１Ｎ１ｓｅａ、Ｈ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２及びＨ２Ｎ２等のインフルエンザウイルスＡ型のグループ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ１及びＨ７Ｎ７等のインフルエンザウイルスＡ型のグループ２、並びにＨ７Ｎ９由来に対応するヌクレオチド配列を、ＮＣＢＩのインフルエンザウイルスリソースから可能な限りダウンロードした。【０１９２】
その結果、利用することができたヒト感染例に由来するウイルスの配列数は、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍに関し、２００９年においてはｎ＝６１７４であり、２０１０年においてはｎ＝１１３９であり、２０１１年においてはｎ＝７６３であり、２０１２年においてはｎ＝２３２であり、２０１３年においてはｎ＝４８であった。また、Ｈ１Ｎ１ｓｅａに関してはｎ＝１９３６であり、Ｈ５Ｎ１に関してはｎ＝２２３であり、Ｈ９Ｎ２に関してはｎ＝３であり、ヒトＨ２Ｎ２に関してはｎ＝８１であり、Ｈ３Ｎ２に関してはｎ＝５８２１であり、Ｈ７Ｎ２に関してはｎ＝１であり、Ｈ７Ｎ３に関してはｎ＝２であり、Ｈ７Ｎ７に関してはｎ＝４であり、Ｈ７Ｎ９に関してはｎ＝１５であった。なお、図１６においては、個々のインフルエンザウイルスサブタイプの中でデータベースに由来する様々な配列において１％以上の割合を占める配列を、その割合と共に示してある。【０１９３】
図１６に示す通り、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍのアミノ酸配列を比較した結果、Ｌｙｓ４７の配列は年々徐々に増加し、２０１０年において最大の集団となった（具体的には、２００９年において１３．７％、２０１０年において６３．２％、２０１１年において８６．１％、２０１２年において９６．５％、２０１３年において１００％、表６  参照）。このように、このＬｙｓ４７のアミノ酸変異はエスケープ変異となり得るものである。しかしながら、注目すべきは、上述の通り、このアミノ酸置換を有するインフルエンザウイルスに対しても、今回得られた３種のＨｕＭａｂは中和活性を示す、有効な治療効果を奏することができる。【０１９４】
【表６】
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【産業上の利用可能性】
【０１９５】
以上説明したように、本発明によれば、インフルエンザウイルスＡ型のグループ１のＨ１サブタイプ及びＨ５サブタイプに対する中和活性を有する抗体を提供することが可能となる。より具体的には、季節性インフルエンザであるＨ１Ｎ１ｓｅａのみならず、パンデミックを引き起こしたＨ１Ｎ１ｐｄｍ、今後パンデミックを引き起こすことが想定されるＨ５Ｎ１に対しても、強い中和活性を示す抗体を提供することが可能である。さらに、近年のＨ１Ｎ１ｐｄｍにおいて、優位な集団となったＨＡ２タンパク質の４７位のアミノ酸がリシンである変異体に対しても中和活性を示す抗体を提供することが可能である。【０１９６】
したがって、本発明の抗体は、インフルエンザウイルスＡ型のグループ１に関する感染症の治療及び予防において有用である。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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