【手続補正書】
【提出日】平成24年2月28日(2012.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞又は細胞小器官内酸性化作用を指標とするプロトンポンプ阻害作用を有する物質の鑑別方法であって、
被験物質の存在下及び非存在下の細胞にｐＨ感受性色素を添加し、
細胞又は細胞小器官内に取り込まれた前記ｐＨ感受性色素を検出して、前記細胞又は細胞小器官内の酸性化度を測定し、
被験物質の存在下及び非存在下の細胞の前記酸性化度を比較して、被験物質の酸性化作用を評価し、
前記酸性化作用のある被験物質をプロトンポンプ阻害作用を有する物質と鑑別することを特徴とする、プロトンポンプ阻害作用を有する物質の鑑別方法。
【請求項２】
前記細胞がメラノサイトであり、前記小器官がメラノソームである、請求項１に記載のプロトンポンプ阻害作用を有する物質の鑑別方法。
【請求項３】
ｐＨ感受性色素を検出するとともに、前記細胞内のチロシナーゼを検出する、請求項１又は２に記載のプロトンポンプ阻害作用を有する物質の鑑別方法。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか一項に記載のプロトンポンプ阻害作用を有する物質の鑑別方法により、プロトンポンプ阻害剤と鑑別された、プロトンポンプ阻害剤を含有してなるメラニン産生抑制剤用組成物。
【請求項５】
化粧料（但し、医薬部外品を含む）であることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
皮膚外用医薬であることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
色素異常疾患に対する、予防又は改善のためのものであることを特徴とする、請求項４〜６の何れか一項に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、プロトンポンプ阻害作用を有する物質の細胞又は細胞小器官内酸性化作用を指標とする鑑別方法に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
多様な生体反応を担う生体内の蛋白質は、機能発現の場面において周辺環境（光、pH、酸化還元反応など）に大きな影響を受ける。このため、活性発現に至適なpH範囲を有するものも少なくない。細胞又は細胞小器官内に於ける酸性化度（pH）は、細胞の主要な構成成分であるチャネル（カルシウムチャネル、カリウムチャネルなど）、トランスポーター（モノアミントランスポーター、プロトンポンプなど）、輸送体（糖輸送体、アミノ酸輸送体など）などを介するプロトン輸送により恒常性を維持されている。細胞又は細胞小器官におけるプロトン輸送を担う輸送体の膜ATPase（H+−ATPase）は、細胞又は細胞小器官内における酸性化度（pH）の調整に重要な役割を果たしている。膜ATPase（H+−ATPase）には、ミトコンドリア内膜に存在するF型ATPase群、細胞内の液胞などの細胞内膜に存在するV型ATPase群、形質膜に存在するP型ATPase群が存在し、能動輸送によりプロトンを輸送する。さらに、イオンポンプのひとつであるNa+／K+−ATPaseと共役的に働くことによりプロトンを受動的に細胞外に輸送するNa+／H+交換輸送体も、細胞又は細胞小器官内における酸性化度（pH）を調節する働きをしている（例えば、特許文献１を参照）。細胞又は細胞小器官内に於ける酸性化度（pH）の大きな変化は、生体内蛋白質の立体構造や機能を破壊し、多様な疾患を引き起こす。このため、細胞又は細胞小器官内におけるプロトン濃度を調節する物質は、pH依存性の様々な生体分子が関与する疾患である胃潰瘍（例えば、特許文献２を参照）、糖尿病（例えば、特許文献３を参照）、本態性高血圧、不整脈、狭心病、心肥大、虚血若しくは虚血性再潅流による臓器障害、脳虚血障害（例えば、特許文献４を参照）、色素異常の改善等に対する予防又は治療薬として期待される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
一方、生物学及び化学分野においては、組織又は細胞における酸性化度（pH）を測定する研究が盛んに行われ、これまでに、電気的及び分光光学的技術が開発されてきた。特に、光学的な酸性化度（pH）指示剤を用いる細胞内酸性度（pH）を測定する分野においては、長年、フェノールフタレインをはじめとする吸収指示剤が使用され、視覚的又は機器を用いた測定が行われていた。近年、より少量の指示薬により感度の良い測定を行うことを目的として、吸収指示薬に比較し測定感度に優れる蛍光指示薬（例えば、特許文献５を参照）が測定に広く用いられる様になった。特に、３−（２，４−ジニトロアニリノ）−３'−アミノ−Ｎ−メチルジプロピルアミン（ＤＡＭＰ）は、蛍光指示薬として市販されており、生細胞と共にインキュベートすることにより、酸性pH依存的に細胞内小器官に取り込まれ、ジニトロフェニル基を認識する抗ＤＮＰ抗体と標識二次抗体によりＤＡＭＰが蓄積した酸性顆粒を視覚的又は機器を利用した測定により検出することが可能である。この場合、ＤＡＭＰは、抗原として使用されている。細胞内小器官に於ける酸性化度測定については、メラノソーム内における酸性化検出方法（例えば、非特許文献１を参照）が報告されている。しかしながら、該方法は、ＤＡＭＰが有する３個のニトロ基を抗原として認識する抗体によって検知し、チロシナーゼ関連蛋白の断片の存在位置との関係を調査したものであって、メラニン産生抑制作用との関係は検討されていない。さらに、該方法は、複雑な操作を必要とし、且つ、測定精度が充分に満足のいくものではなかったために、細胞内におけるpHに影響を受ける物質の動向を細かく追跡するため、さらには、細胞内酸性化作用を有し、該酸性化作用により各種の薬効を発現する物質を大量に評価する化合物のスクリーニング等に用いることは困難であった。また、現在、一般的にプロトンポンプ阻害作用を有する物質のスクリーニングに用いられているバインディングアッセイ等の評価方法は、一度に大量の化合物をスクリーニングすることが出来る利点を有するが、細胞内酸性化度を同時に観察することが出来ないため、別途、細胞内酸性化度を確認するための生物評価が必要とされる。加えて、細胞における作用を可視化することも出来ない。このため、一度に大量の化合物の細胞内酸性化度（pH）を直接観察することが出来る簡便な評価方法が求められていた。また、バフィロマイシンやコンカナマイシンなどのプロトンポンプ阻害剤をメラノサイト培地に添加するとメラニン産生が促進し、プロトンポンプ阻害剤を除去するとメラニン産生が低下することは知られている（例えば、非特許文献２を参照）が、ここにおいても細胞、細胞小器官内の酸性化度を可視的に、且つ、簡便に検知する手段は開示されていない。又、プロトンポンプ阻害作用が、皮膚外用剤の設計において重要な意味を持つことは全く認識されておらず、皮膚外用剤の設計のために、皮膚に関連する細胞においてプロトンポンプの作用を鑑別する試みは全く為されていなかった。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
一方、多くの色素異常疾患には、メラニン産生異常が関与していることが知られており、メラニン産生抑制作用を有する物質の研究が盛んに行われている。メラニン産生における律速酵素であるチロシナーゼは、周辺環境のひとつである酸性化度（pH）により酵素活性が変化し、メラノサイト内を中性に変化させることにより、酵素活性及びメラニン産生量が影響されることが報告されている（例えば、非特許文献２を参照）。しかしながら、細胞又は細胞小器官内の酸性化度を調節するプロトンポンプ阻害剤が、メラノサイト或いはメラノソーム内の酸性化を亢進し、pH依存性の酵素であるチロシナーゼ活性を低下させることにより、色素異常関連疾患に有効であることは全く知られていなかった。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
この様な状況に鑑みて、本発明者等は、プロトンポンプ阻害作用を有する物質の機作に着目し、プロトンポンプ阻害剤を可視的、且つ、効率的に鑑別する方法を求めて、鋭意・努力を重ねた結果、細胞又は細胞小器官内における酸性化度を指標とした効率的なプロトンポンプ阻害剤の鑑別方法を見出し、本発明を完成させるに至った。本発明は、以下に示す通りである。
＜１＞細胞又は細胞小器官内酸性化作用を指標とするプロトンポンプ阻害作用を有する物質の鑑別方法であって、
被験物質の存在下及び非存在下の細胞にｐＨ感受性色素を添加し、
細胞又は細胞小器官内に取り込まれた前記ｐＨ感受性色素を検出して、前記細胞又は細胞
小器官内の酸性化度を測定し、
被験物質の存在下及び非存在下の細胞の前記酸性化度を比較して、被験物質の酸性化作用を評価し、
前記酸性化作用のある被験物質をプロトンポンプ阻害作用を有する物質と鑑別することを特徴とする、プロトンポンプ阻害作用を有する物質の鑑別方法。
＜２＞前記細胞がメラノサイトであり、前記小器官がメラノソームである、＜１＞に記載のプロトンポンプ阻害作用を有する物質の鑑別方法。
＜３＞ｐＨ感受性色素を検出するとともに、前記細胞内のチロシナーゼを検出する、＜１＞又は＜２＞に記載のプロトンポンプ阻害作用を有する物質の鑑別方法。
＜４＞ ＜１＞〜＜３＞の何れかに記載のプロトンポンプ阻害作用を有する物質の鑑別方法により、プロトンポンプ阻害剤と鑑別された、プロトンポンプ阻害剤を含有してなるメラニン産生抑制剤用組成物。
＜５＞ 化粧料（但し、医薬部外品を含む）であることを特徴とする、＜４＞に記載の組成物。
＜６＞ 皮膚外用医薬であることを特徴とする、＜４＞に記載の組成物。
＜７＞ 色素異常疾患に対する、予防又は改善のためのものであることを特徴とする、＜４＞〜＜６＞の何れかに記載の組成物。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
【図１】本発明のマメ科ハギ属キハギより得られる抽出物を用いた細胞又は細胞小器官内酸性化作用を示す図である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明において、細胞又は細胞小器官内に於ける酸性化度の大小の程度は、pH感受性色素の染色強度の強さを指標とし判断される。前記pH感受性の色素としては、吸収指示薬、蛍光指示薬などのpH感受性色素が好適に例示出来るが、測定感度の面からpH感受性蛍光色素が好ましい。pH感受性蛍光色素に関し、具体例を挙げれば、アクリジンオレンジ、LysoSensor（登録商標）プローブ（インビトロジェン株式会社）、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）プローブ（インビトロジェン株式会社）、seminaphthorhodafluor（SNARF、インビトロジェン株式会社）、２'，７'−bis（２−Carboxyethyl）−５−（６）−carboｘｙ−fluorescein（BCECF、インビトロジェン株式会社）、carboxyfluorescein（ナカライテクス株式会社）、oregon green dyes（インビトロジェン株式会社）、８−Hydroxypyrene−１，３，６−trisulfonic acid（HTPS、シグマアルドリッチ社）、３−（２，４−ジニトロアニリノ）−３'−アミノ−Ｎ−メチルジプロピルアミン（ＤＡＭＰ、フナコシ株式会社）などが例示出来、これらの内では、３−（２，４−ジニトロアニリノ）−３'−アミノ−Ｎ−メチルジプロピルアミン（ＤＡＭＰ）が特に好ましい。この様なpH感受性蛍光色素は、酸性pH依存的に細胞又は細胞小器官内に取り込まれ、細胞固定後に、pH感受性蛍光色素が蓄積した酸性顆粒を検出することを目的に使用される。pH感受性蛍光色素を検出する方法としては、そのままpH感受性蛍光色素が発する蛍光を測定する方法の他、pH感受性色素の機能性基団を認識する放射性物質などで標識された標識抗体を反応させた後に、前記標識抗体の標識を測定する方法等が存するが、測定感度の面より、抗体を反応させた後に発せられる蛍光を測定する方法が好ましい。また、pH感受性色素を認識する抗体を反応させた後に蛍光を測定する方法に関しては、標識抗体を変えることにより蛍光顕微鏡、光学顕微鏡、電子顕微鏡、レーザー顕微鏡などを利用した視覚的方法、又は、顕微鏡観察により得られた画像を用いた染色強度の解析、蛍光分光光度計を用いた蛍光強度の測定等の定量的な方法などが存し、これらの検出方法によりpH感受性色素の染色度合いの強さを判別することが出来る。これらの内では、標識として蛍光標識を用い、抗ＤＮＰ抗体をＤＡＭＰと反応させ、ニトロ基を抗原として認識する動物の抗体を反応させ、しかる後に前記抗体の動物の蛋白を抗原認識する蛍光標識等、光学的標識の標識抗体で染色し、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、光学的に標識部分を検知し鑑別する方法が好ましく例示出来る。かかる蛍光標識色素が検知された部分においては、色素の濃さに応じて水素イオン濃度（酸性化度）が異なる。色素の濃淡により、水素イオン濃度（酸性化度）の高低を推定することが出来る。色素の発色が濃く、水素イオン濃度（酸性化度）が高いと推定される細胞内又は細胞器官内領域においては、プロトンポンプである膜ATPase（H+−ATPase）、さらには、イオンポンプのNa+／K+−ATPaseと共役的に働くことにより受動的にプロトンを輸送するNa+／H+交換輸送体などの細胞又は細胞内小器官内におけるプロトン濃度を調節する働きを担うプロトンポンプが阻害され、水素イオンの汲み出しが滞り、以って、細胞乃至は細胞器官内が酸性化していると判別でき、細胞を培養する際に被験物質を共存させ���この様な現象を引き起こす物質に付いては、プロトンポンプ阻害剤であると鑑別出来る。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
特に、３−（２，４−ジニトロアニリノ）−３'−アミノ−Ｎ−メチルジプロピルアミン（ＤＡＭＰ）は、pH感受性蛍光色素としてフナコシ株式会社より市販されており、ＤＡＭＰを生細胞と共にインキュベートすることにより、酸性pH依存的に細胞内小器官に取り込まれ、細胞を固定した後、抗ＤＮＰ抗体（ＤＡＭＰのジニトロフェニル基を認識）とニ次抗体によりＤＡＭＰが蓄積した酸性顆粒を検出することが出来るpH感受性蛍光色素である。pH感受性色素としてＤＡＭＰを使用した場合には、標識抗体を変えることにより、蛍光顕微鏡、光学顕微鏡、電子顕微鏡、レーザー顕微鏡などの視覚的方法を用いることが出来る。本発明において、pH感受性色素の発色度合いを指標として推定し、被験物質の存在下又は非存在下での酸性化度を求め、被験物質の酸性化作用を指標とし、プロトンポンプ阻害度を判別することによりプロトンポンプ阻害剤と判断される物質とは、後記の細胞内酸性化作用の評価において、pH感受性蛍光色素の発色強度が、レーザー顕微鏡による目視的観察により発色強度の増強が認められる場合を意味する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
＜本発明の細胞又は細胞小器官内における酸性化度を指標とし、鑑別されたプロトンポンプ阻害剤＞
本発明の主題となる本発明の細胞又は細胞小器官内における酸性化度を指標とするプロトンポンプ阻害剤は、細胞又は細胞小器官内に於けるpHに影響を受ける物質の動向を追跡す
るのに際し、該細胞又は細胞小器官内における酸性化度の大小の程度を、pH感受性色素の発色度合いの強さを指標として推定し、被験物質の存在下又は非存在下での酸性化度を求め、被験物質の酸性化作用を指標とし、そのプロトンポンプ阻害度を判別されることを特徴とする。本発明の細胞又は細胞小器官内における酸性化作用を有する物質は、単純な化学物質、生薬及び動植物からの抽出物とその分画精製物などの混合組成物の総称を意味する。また、本発明において細胞又は細胞小器官内における酸性化作用を有するプロトンポンプ阻害剤に判別される物質とは、後記の細胞内酸性化作用の評価において、pH感受性蛍光色素の発色強度が、レーザー顕微鏡による目視的観察により発光強度の増強が認められる場合を意味する。これは、細胞又は細胞小器官内における酸性化作用が低い物質を配合した場合には、期待されるプロトンポンプ阻害作用が現われないためである。かかるプロトンポンプ阻害剤は、細胞又は細胞内小器官内における酸性化度により活性が変化する様々な生体分子が関与する疾病の治療、予防に好適に用いられる。また、その投与経路は問わないが、病巣に接近して投与する方法が好適に例示出来る。前記疾患としては、例えば、胃潰瘍、高血圧、糖尿病、高脂血症、色素異常症などが好適に例示出来る。胃潰瘍、高血圧、糖尿病、高脂血症に付いては、経口投与されることが好ましく、色素異常症に付いては、経皮投与されることが好ましい。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
さらに、本発明における細胞又は細胞小器官内における酸性化作用を有するプロトンポンプ阻害剤の作用機序としては、細胞又は細胞小器官の膜に存在し能動的なプロトン輸送を担うH+−ATPaseのみならず、Na+／K+−ATPase等のイオンポンプと共役的に働き受動的にプロトンを輸送するNa+／H+交換輸送体などのプロトン輸送に関与するものも包含する。かかる成分は、細胞又は細胞小器官の膜に存在するプロトンポンプであるH+−ATPase、さらには、Na+／K+−ATPaseと共役的に働くNa+／H+−ATPaseに作用し、細胞又は細胞小器官内のプロトンの汲み出しを抑制することにより、細胞又は細胞小器官内における酸性化を誘引する。プロトンポンプ阻害作用を有する物質は、酸性化により細胞又は細胞小器官内の水素イオン濃度を上昇させ、細胞又は細胞小器官内に存在する様々なpH依存性の生体分子の活性を調節することにより、しみ、くすみをはじめとする色素関連異常疾患に関する予防又は治療効果が期待出来る。この様なプロトンポンプ阻害作用を有する物質としては、マメ科に属する植物より得られる抽出物、シソ科に属する植物より得られる抽出物、ユキノシタ科に属する植物より得られる抽出物、サルノコシカケ科の菌類より得られる抽出物、ショウガ科に属する植物より得られる抽出物、ショウブ科に属する植物より得られる抽出物、ウリ科に属する植物より得られる抽出物などが好適例示出来、さらに好ましくは、マメ科ハギ属キハギより得られる抽出物が好適に例示出来る。前記植物の抽出物作製に用いる部位としては、植物体、花、葉、枝、根、果実、樹皮、地上部、木幹、菌核などが好適に例示出来、植物体、地上部、菌核がより好ましい。前記植物は、日本においてその生育が認められる植物であり、本発明の実施例においては、日本で成育された植物を使用した。抽出物は、植物体乃至はその乾燥物１質量部に対して、溶媒を１〜３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬する。浸漬後は、室温まで冷却し、所望により不溶物を除去した後、溶媒を減圧濃縮するなどにより除去することが出来る。しかる後、シリカゲルやイオン交換樹脂を充填したカラムクロマトグラフィーなどで分画精製し、所望の抽出物を得ることが出来る。尚、本発明においては、抽出物とは、抽出物自体、抽出物を分画、精製した分画、抽出物乃至は分画、精製物の溶媒除去物の総称を意味する。かかる成分の組成物における好ましい含有量は、０．０００００１〜２０質量％、より好ましくは、０．００００１質量％〜１０質量％であり、さらに好ましくは、０．０００１質量％〜５質量％である。これは、あまり濃すぎると経皮吸収率が低下し、効果が頭打ちになる場合があり、少なすぎると有効濃度とならない場合があるからである。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
前記抽出溶媒としては、極性溶媒が好ましく、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類から選択される１種乃至は２種以上が好適に例示出来、メタノール溶媒が特に好適に例示出来る。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
＜製造例１：本発明の細胞又は細胞小器官内酸性化作用の評価に使用するマメ科ハギ属キハギより得られる抽出物の製造方法＞
本発明におけるプロトンポンプ阻害作用の評価は、マメ科ハギ属キハギより抽出して用いた。
マメ科ハギ属キハギ（Lespedeza buergeri Miq．） １（ｋｇ）の地上部にメタノール ５（L）を加え還流下、３時間抽出し、吸引濾過により抽出液を得た。得られた抽出液を減圧下にて濃縮し、熱水５００（ｍL）に懸濁した後、エーテルにて連続抽出を３時間行った。エーテル層を減圧下にて濃縮し、褐色のエキス ５．８３（ｇ）を得た。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明の皮膚外用剤においては、前記必須成分以外に、通常化粧料で使用される任意成分を含有することが出来る。この様な任意成分としては、スクワラン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックスなどの炭化水素類、ホホバ油、カルナウバワックス、オレイン酸オクチルドデシルなどのエステル類、オリーブ油、牛脂、椰子油などのトリグリセライド類、ステアリン酸、オレイン酸、レチノイン酸などの脂肪酸、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、オクチルドデカノール等の高級アルコール、スルホコハク酸エステルやポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム等のアニオン界面活性剤類、アルキルベタイン塩等の両性界面活性剤類、ジアルキルアンモニウム塩等のカチオン界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセライド、これらのポリオキシエチレン付加物、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル等の非イオン界面活性剤類、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３−ブタンジオール等の多価アルコール類、増粘・ゲル化剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、色剤、防腐剤、粉体等を含有することができる。製造は、常法に従い、これらの成分を処理することにより、困難なく、為しうる。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
これらの必須成分、任意成分を常法に従って処理し、ローション、乳液、エッセンス、クリーム、パック化粧料、洗浄料などに加工することにより、本発明の皮膚外用剤は製造できる。皮膚に適応させることの出来る剤型であれば、いずれの剤型でも可能であるが、有効成分が皮膚に浸透して効果を発揮することから、皮膚への馴染みの良い、ローション、乳液、クリーム、エッセンスなどの剤型がより好ましい。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
＜本発明のヒト正常メラノサイト（NHEM）を用いた細胞又は細胞小器官内酸性化作用の評価＞
ヒト正常メラノサイト（クラボウ株式会社）を４ウェルLab-Tek chamber slide（Thormo Fisher Scientific社）に１００００cells／cm2播種し、翌日、評価物質を含有した培地 ０．５ｍL／wellに交換し、１時間３０分培養した。コントロールとして被験物質を含まないサンプルを前記同様に調製した。その後、３−（２，４−dinotroanilino）−３'−amino−Ｎ−methyldipropylamine（DAMP、Biomedical Research社）を加え、３０分間培養した。培養終了後、PBSにて洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで室温１５分固定を行った。次いで、PBSにてウェルを洗浄し、０．０１３％digitonin（和光純薬工業株式会社）を添加し、４℃、２分間放置した、その後、１０％FBS／PBSで室温、３０分ブロッキングを行った。抗体反応として抗チロシナーゼ抗体（C-１９：Santa Cruz  Biotechnology, Inc）と抗DAMP抗体（ab２４３１９：abcam）をそれぞれブロッキング溶液で１：１００希釈した溶液を添加し、３７℃、４５分間インキュベーションした。反応終了後、ＰＢＳにてウェルを洗浄し、Ｃｙ３標識ウサギ抗ヤギ抗体（Invitrogen Corporation）とFITC標識ラット抗マウスIgE抗体（American research Products、Inc.）をそれぞれブロッキング溶液で１：１００希釈した溶液を添加し、３７℃、４５分間インキュベーションした。PBSにてウェルを洗浄し、スライドガラスでサンプルを封入し、共焦点レーザー顕微鏡（LSM５１０：Zeiss）にて観察した。本発明に於いて、プロトンポンプ阻害作用を有する物質とは、前記のヒト正常メラノサイトを用いた細胞又は細胞小器官内酸性化作用（プロトンポンプ阻害作用）の評価において、pH感受性蛍光色素の発色強度が、レーザー顕微鏡による目視的観察により発色強度の増強が認められる場合を意味する。結果を図１に示す。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
評価物質無処理のコントロールに比較し、評価物質処理によりDAMPの蛍光強度（緑色）が増強していれば、ヒト正常メラノサイト内の酸性化が亢進したと考えられる。さらに、チ
ロシナーゼの検出も同時に行い、DAMP染色領域と重ねあわせることで酸性化領域とメラノソームの共局在性を確認できる。即ち、チロシナーゼの局在を示す赤色と、酸性化領域の局在を示す緑色が重ね合わさった黄色の発色が認められれば、メラノソーム内が酸性化していることが判る。結果を図１に示すが、図１において、コントロールでは、酸性化度を示す緑色の染色は薄く、チロシナーゼの存在を示す赤色の染色は濃く、これを重ね合わせた写真はほぼ赤色を呈している。一方、マメ科ハギ属キハギより得られる抽出物においては、酸性化度を示す緑色の染色が濃くなっており、チロシナーゼの存在を示す赤色の染色はコントロールと同程度であり、これを重ね合わせた写真は黄色を呈している。図１の結果より、マメ科ハギ属キハギより得られる抽出物は、顕著なメラノサイト内における酸性化作用（プロトンポンプ阻害作用）を有していることが判った。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
＜本発明の植物抽出物のヒト正常メラノサイト（ＮＨＥＭ）を用いたメラニン産生抑制作用＞
前記の植物抽出物に関し、以下に記載の方法に従い、メラニン産生抑制作用を評価した。２４穴プレ−トにヒト正常メラノサイト（クラボウ株式会社）を２２５００（cells/ｃｍ2）播種する。翌日、評価物質を含有する培地 ０．５（ｍL/well）に交換し、０．２５（μCi）２−[２−14C]チオウラシル（GEヘルスケアバイオサイエンス社）を添加し培養を継続した。播種４日後、培地を除去しPBSで１回プレ−トを洗浄した後、細胞生存率を評価するため生細胞数測定試薬SF（ナカライテスク社）溶液を添加した培地に交換し、３７℃、３時間呈色反応を行った。反応後、４５０（nm）の吸光度をマイクロプレートリーダーBenchmark Plus（Bio-Rad Laboratories）を用いて測定した。コントロールとして評価物質を含まないサンプルを前記同様に調製し、コントロールに対する各評価サンプルの吸光度の百分率を求め細胞生存率とした。
メラニン量測定のため吸光度測定後、PBSで１回プレートを洗浄し、TCAを添加し、細胞を溶解した後、蒸留水を加え溶液をバイアルに移した。さらに蒸留水を添加し、溶液を回収した。氷上にて放置後、１５０００ｒｐｍ、５分間遠心した後、上清を除去した。再度、各バイアルに１０％ＴＣＡを添加し、氷上にて放置した。１５０００ｒｐｍ、５分間遠心した後、上清を除去した。残渣にアクアゾール−２（パーキンエルマー社） １（ｍＬ）を添加し、液体シンチレーションカウンター ＬＳＣ−６１００（アロカ社製）にて放射線量を測定した。コントロールとして被験物質を含まないサンプルを前記同様に調製し、コントロールに対する評価物質を含むサンプルの放射線量の百分率を求めメラニン量（％）とした。メラニン産生量の５０％阻害濃度（ＩＣ50値）は、細胞毒性の認められない範囲でＳＡＳ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ９．１．３（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．）を用い算出した。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
表１に示す処方に従い、本発明の皮膚外用剤である化粧料（ローション１）を作製した。また、同様に操作し、「本発明のプロトンポンプ阻害作用を有する抽出物」を水に置換した比較例１を作製した。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
＜紫外線照射後の色素沈着に対する予防効果の検討＞
紫外線照射後炎症を起こし、該炎症部位が色素沈着を起こす特性を有するパネラー（ｎ＝１）を用いて、色素沈着予防効果を検討した。即ち、前腕内側部に１．５ｃｍ×１．５ｃｍの部位を４箇所設け、部位１〜３には最少紅斑量（ＭＥＤ）の１．５倍の紫外線照射を行い、部位１及び２には、照射後直ちにローション１、比較例１をそれぞれ４０μＬ投与し、部位３は照射対照とし、部位４は無処置対照とした。照射後２４時間に紅斑の程度をドレーズの基準（−：無反応、±：擬陽性反応、＋：明瞭な紅斑を伴う反応、＋＋：浮腫を伴う反応）に従って判定し、更に、その１０日後に、色素沈着の指標となる、無処置部位とのＬ値の差をコニカミノルタ色彩色差計ＣＲ４００で計測した。結果を表２に示す。これより、「本発明のプロトンポンプ阻害作用を有する抽出物」を含有する皮膚外用剤には、色素沈着が抑制できることが判る。